CN104768976A - Her3结合多肽 - Google Patents

Her3结合多肽 Download PDF

Info

Publication number
CN104768976A
CN104768976A CN201380051353.8A CN201380051353A CN104768976A CN 104768976 A CN104768976 A CN 104768976A CN 201380051353 A CN201380051353 A CN 201380051353A CN 104768976 A CN104768976 A CN 104768976A
Authority
CN
China
Prior art keywords
her3
binding peptide
her3 binding
sequence
fusion rotein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201380051353.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104768976B (zh
Inventor
马格达莱纳·马尔姆
约翰·洛夫布罗姆
斯特凡·斯托尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Affibody AB
Original Assignee
Affibody AB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Affibody AB filed Critical Affibody AB
Publication of CN104768976A publication Critical patent/CN104768976A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104768976B publication Critical patent/CN104768976B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/088—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins conjugates with carriers being peptides, polyamino acids or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)

Abstract

本公开内容涉及与人类表皮生长因子受体3(HER3)结合的多肽并涉及此类多肽在成像和治疗中的用途。本公开内容提供了包含HER3结合基序的HER3结合多肽，该基序由氨基酸序列EKYX4AYX7EIWX11LPNLTX17X18QX20AAFIGX26LX28D组成。

Description

HER3结合多肽
发明领域
本公开内容涉及与人类表皮生长因子受体3(本文中被称为HER3)结合的多肽，并且涉及此类多肽在成像和治疗中的用途。
背景
包括EGFR(ErbB1或HER1)、ErbB2(HER2)、ErbB3(ERBB3或HER3)和ErbB4(HER4)的跨膜酪氨酸激酶受体中的表皮生长因子受体家族通过细胞内信号通路的复杂网络参与调节关键细胞功能(例如细胞增殖、存活、分化和迁移)。由于HER3的无活性的酪氨酸激酶结构域，HER3与该家族的其它受体不同，并因此通过配体引起的与其它酪氨酸激酶受体一起形成的异源二聚体来传递信号(Guy等人,Proc Natl Acad Sci 91:8132-8136(1994)；Sierke等人,Biochem J 322(Pt 3):757-763(1997))。结果，该受体在肿瘤进展中的意义长期以来是个谜。但是，最近，HER3作为其家族成员的变构的激酶激活剂已被感兴趣。特别地由HER2和HER3形成的异二聚体被称为是下游细胞内信号转导的异常强烈的激活剂(Jura等人，ProcNatl Acad Sci 106:21508-21613(2009)；Citri等人，Exp Cell Res 284:54-65(2003))。这种HER2-HER3信号转导对甚至被认为是在HER2驱动的乳腺癌中的致瘤单位(Holbro T等人，Pro Natl Acad Sci 100:8933-8938(2003))。另外，HER3受体的上调已显示在体外和体内在过表达HER2的乳腺癌中对酪氨酸激酶抑制剂的抵抗发挥重要作用(Sergina等人,Nature 445:437-441(2007)；Kong等人,PLoS One 3:e2881(2008)；Garrett等人,ProcNatl Acad Sci 108:5021-5026(2011))。
但是，在人类癌症中HER3的重要性并不局限于HER2驱动的乳腺癌。还显示HER3是HER3过表达的前列腺癌异种移植物的体内致肿瘤性所需要的、通过自分泌信号转导回路来维持卵巢癌的亚类的体内增殖，并且参与ER+乳腺癌细胞系的内分泌耐受，仅举几个例子(Soler等人,Int J Cancer125:2565-2575(2009)；Sheng Q等人,Cancer Cell 17:412-412(2010)；Liu等人,Int J Cancer 120:1874-1882(2007)；Frogne等人Breast Cancer ResTreat 114:263-275(2009))。总而言之，这些发现证明HER3信号通路作为在人类癌症中的重要的治疗靶点的潜力。另外，HER3表达具有预后价值，因为高水平的受体表达与过表达HER2的患者相比，与显著地较短的存活时间有关(Tanner等人,J Clin Oncol 24(26):4317-23(2006)，Reschke等人,Clin Cancer Res 14(16):5188-97(2008))。
最近被批准的针对EGFR和HER2受体的疗法的相对大的比例基于单克隆抗体。与ErbB家族的被很好地研究的EGFR和HER2受体成员形成对比，抗HER3抗体的用途有相对较少的报道。Ullrich和合作者已报道抗HER3单克隆抗体在乳腺癌的细胞模型中抑制HER3介导的信号转导(vander Horst等人,Int J Cancer 115(4):519-27(2005))。但是，尽管已报道了几种利用全长单克隆抗体的成功的癌症治疗研究，但是这类剂对于靶向实体肿瘤(不是对于诊断也不是对于治疗剂装载目的)并不总是最佳的。治疗效果取决于药物遍及肿瘤的有效分布，并且分子成像取决于在肿瘤吸收和周围正常组织之间的高的比例。由于肿瘤渗透率(包括溢出)与分子的大小负相关，相对较大的抗体分子(例如IgG)固有地具有差的组织分布和渗透能力。而且，对于分子成像，抗体的异常地长的体内半衰期导致相对较高的血液信号以及从而相对较差的肿瘤-血液反差。
最近，利用组合蛋白工程生成了源自来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的结构域B的，基于Z结构域的3-螺旋束支架的小的多的HER3特异的分子(Kronqvist等人,Protein Eng Des Sel 24:385-396(2010)；WO2011/056124)。这些对HER3具有亚纳摩尔级亲和力的Z变体被证实在体外通过阻断配体引起的HER3信号转导具有对乳腺癌细胞系的抗增殖效应(等人,PLoS One 7:e40023(2012))。这些生长抑制效应被进一步证实是在Z变体分子和配体调蛋白(heregulin)之间的竞争性HER3结合的结果。
但是，由于该受体在肿瘤细胞中的相对低的表达，HER3受体的体内靶向可能是有挑战的。已报道了每细胞103至104个受体的典型表达水平(Aguilar等人,Oncogene 18:6050-6062(1999)；Robinson等人,Br J Cancer99:1415-1425(2008))。除了高的肿瘤吸收之外，在肿瘤中延长的保留时间对药物的有效的治疗效果是十分重要的。由于高的血管通透性并快速地扩散至肿瘤，小的靶向剂诸如源自Z结构域的多肽具有在肿瘤中以高水平积累的能力(Schmidt和Wittrup,Mol Cancer Ther 8:2861-2871(2009))。但是，低分子量的未结合蛋白将会被快速地从肿瘤清除并且然后通过肾从循环清除。结果，小尺寸靶向剂对癌细胞的高亲和力对于增加的肿瘤保留是十分重要的。而且，对于具有低表达(每细胞104靶蛋白或更少)的受体蛋白的有效靶向，最近的结果暗示小的多肽(例如源自Z结构域的多肽)的亲和力应该尽可能地高，优选地具有以低皮摩尔级计或更小的结合常数KD(Tolmachev等人(2012),J Nucl Med 53(6):953-60)。
因为HER3可与EGF家族的其它成员在相同的肿瘤细胞上被表达，靶向HER3和EGF家族的另一个成员的双特异分子的制备最近已引起一些兴趣。此类双特异性分子可例如被用作靶向载体用于在分子成像应用中增加靶向的特异性以及同时地靶向HER3和在肿瘤上表达的另一种抗原。
发明描述
本公开内容的目的是提供一组新颖的HER3结合剂，其以高亲和力结合HER3。
本公开内容的另一个目的是提供一组新颖的HER3结合剂，其例如可被用于靶向HER3表达细胞、此类HER3表达细胞的分子成像和/或HER3相关状况的治疗。
本公开内容的另一个目的是提供一组经限定的HER3结合剂，该组与以前在WO2011/056124中限定的HER3结合多肽的组不同。
因此，根据本发明的一方面，提供了HER3结合多肽，包含HER3结合基序(BM)，该基序由选自以下的氨基酸序列组成：
i)EKYX4AYX7EIW X11LPNLTX17X18QX20AAFIGX26LX28D
其中，彼此独立地，
X4选自A、E、L、M、N、Q、R、S和T；
X7选自F和Y；
X11选自E和Q；
X17选自K、N、R和V；
X18选自F、M、N、R、T、Y和W；
X20选自A和K；
X26选自K和S；
X28选自E和Q；以及
ii)与在i)中限定的序列具有至少96％同一性的氨基酸序列。
以上关于HER3结合多肽的序列的类的限定是基于几种新颖的多肽变体的序列的分析，所述几种新颖的多肽变体选自基于以前显示展示HER3结合并在WO2011/056124中公开的序列而设计的文库。这些多肽转而是源自葡萄球菌蛋白A的结构域之一的母本支架的随机变体。
鉴定的HER3结合基序或“BM”对应于母本支架的靶结合区域，该区域构成在三螺旋束蛋白结构域内的两个α螺旋。在母本支架中，两个BM螺旋的变化的氨基酸残基组成用于与抗体的恒定的Fc部分相互作用的结合表面。通过结合表面残基的随机变异和随后的变体的选择，结合表面的Fc相互作用能力最初地被与HER3相互作用的能力代替，如在WO2011/156124中所描述的。在导致本公开内容的研究中，生成了新的序列，其出乎意料地显示出例如与适合用于分子成像的亲和力参数相关的优越的性能。
如技术人员将认识到的，诸如如本文限定的多肽的HER3结合能力的任何多肽的功能取决于多肽的三级结构。因此对多肽的氨基酸序列进行较小的改变而不大程度地影响其三级结构和功能是可能的。
因此，在一个实施方案中，多肽包括序列i)的BM的修饰的变体，其使得产生的序列与属于由序列i)限定的类的序列至少96％相同。在一些实施方案中，此类改变可在如本文公开的HER3结合多肽的序列的所有位置进行。在其它实施方案中，此类改变可仅在也被称为支架氨基酸残基处的非可变位置进行。在此类情况中，在可变位置即以“X”(例如以上限定的BM的X4、X7、X11、X17、X18、X20、X26和X28)表示的位置改变是不被允许的。例如，属于多个氨基酸残基的某一功能分组(例如疏水性、亲水性、极性等)中的氨基酸残基可被取代为来自相同功能组的另一个氨基酸残基是可能的。
可如以下计算如遍及说明书所使用的术语“％同一性”。利用CLUSTALW算法(Thompson等人,Nucleic Acids Research,22:4673-4680(1994))将查询序列与靶序列比对。在窗口中进行对应于最短的对齐序列的比较。在一些实例中最短的对齐序列可以是靶序列。在其它实例中，查询序列可构成最短的对齐序列。在每一个位置的氨基酸残基均被比较，并且在查询序列中具有靶序列中相同的对应的位置的百分比被报告为％同一性。
在一个实施方案中，发明提供了如以上限定的HER3结合多肽，其中，在序列i)中，彼此独立地，
X4选自A、E、M、N、Q、S和T；
X7选自F和Y；
X11为Q；
X17选自K和R；
X18选自M、Y和W；
X20为K；
X26为K；
X28为Q。
在一个实施方案中，在序列i)中的X4选自A、E、M、N、Q、S和T。在更特定的实施方案中，在序列i)中的X4选自N和Q。在更加特定的实施方案中，在序列i)中的X4为N。在另一个实施方案中，在序列i)中的X4为Q。
在一个实施方案中，在序列i)中的X11为Q。
在一个实施方案中，在序列i)中的X17选自K、N和R。在另一个实施方案中，在序列i)中的X17选自K和R。在更特定的实施方案中，在序列i)中的X17为K。在另一个实施方案中，在序列i)中的X17为R。
在一个实施方案中，在序列i)中的X18选自M、Y和W。在更特定的实施方案中，在序列i)中的X18选自Y和W。在更加特定的实施方案中，在序列i)中的X18为Y。在另一个实施方案中，在序列i)中的X18为W。在另一个实施方案中，在序列i)中的X18为M。
在一个实施方案中，在序列i)中的X17X18选自KW、KY、KM和RY。
在一个实施方案中，在序列i)中的X20为K。
在一个实施方案中，在序列i)中的X26为K。
在一个实施方案中，在序列i)中的X28为Q。
在一个实施方案中，序列i)符合以下四个条件I、II、III和IV中的至少两个：
I)X11为Q；
II)X17X18选自KW、KY、KM和RY；
III)X20为K；
IV)X28为Q。
在更特定的实施方案中，序列i)符合条件I、II、III和IV中的至少三个，诸如所有四个。
如在随后的实验部分详细描述的，HER3结合变体的选择导致鉴定个别的HER3结合基序(BM)序列。这些序列组成根据这方面的HER3结合多肽的个别实施方案。个别HER3结合基序的序列呈现在图1中并且如SEQID NO:1-35。因此，在这方面的一些实施方案中，提供了HER3结合多肽，其中BM序列i)选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:35中的任一个，诸如选自SEQ ID NO:1-10中的任一个，诸如选自SEQ ID NO:1-2。在一个具体实施方案中，所述序列为SEQ ID NO:2。在另一个具体实施方案中，所述序列为SEQ ID NO:1。
在本公开内容的一些实施方案中，如以上限定的BM“形成”三螺旋束蛋白结构域的“部分”。这被理解为意思是将BM的序列“插入”或“接枝(grafted)”到原始三螺旋束结构域的序列，以使得BM置换在原始结构域中的相似的结构基序。例如，不希望被理论束缚，考虑BM组成三螺旋束的三个螺旋中的两个，并且能因此置换任何三螺旋束内的此类双螺旋基序。如技术人员将认识到的，三螺旋束结构域的双螺旋被两个BM螺旋置换必须被执行而以使得不影响多肽的基本结构。即，根据发明的该实施方案的多肽的Cα主链的整体折叠与其所形成部分的三螺旋束蛋白结构域的整体折叠基本上相同，例如具有相同顺序的二级结构的相同元件等。因此，如果根据发明的该实施方案的多肽具有与原始的结构域相同的折叠，根据发明的BM“形成”三螺旋束结构域的“部分”，意味着共享基本的结构特性，那些特性例如导致相同的CD谱。技术人员知道其它的相关参数。
在具体的实施方案中，HER3结合基序(BM)因此形成三螺旋束蛋白结构域的部分。例如，BM可在所述三螺旋束蛋白结构域内与互相连接的环基本上组成两个α螺旋。在具体的实施方案中，所述三螺旋束蛋白结构域选自细菌受体蛋白的结构域。此类结构域的非限制性实例为来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的五种不同的三螺旋结构域，诸如结构域B、及其衍生物。在一些实施方案中，三螺旋束蛋白结构域为蛋白Z的变体，其源自葡萄球菌蛋白A的结构域B。
在发明的HER3结合多肽形成三螺旋束蛋白结构域的部分的实施方案中，HER3结合多肽可包括选自以下的氨基酸序列：
iii)K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL NDXdQ；
其中
[BM]为如以上限定的HER3结合基序；
Xa选自A和S；
Xb选自N和E；
Xc选自A、S和C；
Xd选自A和S；以及
iv)与在iii)中限定的序列中的任何一个具有至少89％同一性的氨基酸序列。
所述氨基酸序列iv)可与在iii)中限定的序列中的任何一个具有至少91％、诸如至少93％、诸如至少95％、诸如至少97％的同一性。
在如以上限定的HER3结合多肽的一个实施方案中，在序列iii)中的Xa为A。在如以上限定的HER3结合多肽的可替代实施方案中，在序列iii)中的Xa为S。
在如以上限定的HER3结合多肽的一个实施方案中，在序列iii)中的Xb为N。在可替代实施方案中，在序列iii)中的Xb为E。
在如以上限定的HER3结合多肽的一个实施方案中，在序列iii)中的Xc为A。在可替代实施方案中，在序列iii)中的Xc为S。在仍然另一个可替代实施方案中，在序列iii)中的Xc为C。
在如以上限定的HER3结合多肽的一个实施方案中，在序列iii)中的Xd为A。在可替代实施方案中，在序列iii)中的Xd为S。
在如以上限定的HER3结合多肽的一个实施方案中，在序列iii)中Xa为A；Xb为N；Xc为A并且Xd为A。
在如以上限定的HER3结合多肽的另外的实施方案中，在序列iii)中Xa为A；Xb为N；Xc为C并且Xd为A。
在如以上限定的HER3结合多肽的另外的实施方案中，在序列iii)中Xa为S；Xb为E；Xc为S并且Xd为S。
在如以上限定的HER3结合多肽的另外的实施方案中，在序列iii)中Xa为S；Xb为E；Xc为C并且Xd为S。
在仍然另外的实施方案中，在根据发明的HER3结合多肽的以上限定中序列iii)选自SEQ ID NO:36-70，特别地选自SEQ ID NO:36-45，诸如选自SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37。在具体实施方案中，序列iii)为SEQ IDNO:37。在另一个具体实施方案中，序列iii)为SEQ ID NO:36。
在另外的实施方案中，还提供了如以上限定的HER3结合多肽，其包括选自以下的氨基酸序列：
v)YAK-[BM]-DPSQS SELLXc EAKKL NDSQA P；
其中[BM]为如以上限定的HER3结合基序且Xc选自S和C；以及
vi)与在v)中限定的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，提供了HER3结合多肽，其包括选自以下的氨基酸序列：
vii)FNK-[BM]-DPSQS ANLLXc EAKKL NDAQA P；
其中[BM]为如以上限定的HER3结合基序且Xc选自A和C；以及
viii)与在以上vii)中限定的序列中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。
如以上所讨论的，与以上氨基酸序列相比包含较小的改变且不大程度地影响其三级结构和功能的多肽也在本公开内容的范围内。因此，在一些实施方案中，如以上限定的HER3结合多肽可例如具有与由v)或vii)限定的序列至少92％、至少94％、至少96％、或至少98％相同的序列。
在一些实施方案中以及如在以下实施例中所公开的，HER3结合基序可形成多肽的部分，所述多肽包括选自以下的氨基酸序列：
ADNNFNK-[BM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK；
ADNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；
ADNKFNK-[BM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK；
ADAQQNNFNK-[BM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK；
AQHDE-[BM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK；
VDNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK；以及
AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK；
其中[BM]为如以上限定的HER3结合基序。
在一个实施方案中，HER3结合多肽包括选自以下的氨基酸序列：
ix)AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK；
其中[BM]为如以上限定的HER3结合基序，以及
x)与在ix)中限定的序列具有至少91％同一性的氨基酸序列。
再一次，与以上氨基酸序列相比包含较小的改变且不大程度地影响其三级结构和功能的多肽也在本公开内容的范围内。因此，在一些实施方案中，如以上限定的HER3结合多肽可例如具有与由ix)限定的序列至少93％、至少94％、至少96％、或至少98％相同的序列。
在此类多肽中的序列ix)可选自SEQ ID NO:71-105中的任一个。具体地，序列ix)可选自SEQ ID NO:71-80中的任一个，诸如选自SEQ IDNO:71-72。在该多肽的特定实施方案中，序列ix)为SEQ ID NO:72。在另一个特定实施方案中，序列ix)为SEQ ID NO:71。
以上限定的类的HER3结合多肽表现出与以前已知的通常组的HER3结合多肽(即在WO2011/056124中呈现的那些)相比有益的结合特性。特别地，在本公开内容的HER3结合多肽的一个实施方案中，所述HER3结合多肽和人类HER3之间的相互作用的解离速率(koff)与包含氨基酸序列SEQID NO:107的比较HER3结合多肽(comparative HER3binding polypeptide)和人类HER3之间的相互作用的解离速率(koff)相比，降低至少四倍，如利用相同的实验条件测量的。在另一个实施方案中，本文限定的HER3结合多肽使得所述解离速率(koff)与包含SEQ ID NO:107的HER3结合多肽的解离速率(koff)相比降低至少8倍，诸如降低至少12倍，诸如降低至少15倍。在更特定的实施方案中，所述解离速率(koff)与包含SEQ ID NO:107的HER3结合多肽的解离速率(koff)相比降低至少20倍。
在根据本公开内容的HER3结合多肽的一个实施方案中，所述HER3结合多肽和人类HER3之间的相互作用使得相互作用的KD值为至多1×10-9M，诸如至多1×10-10M，诸如至多1×10-11M。
可例如利用在或Proteon XPR仪器中的表面等离子体共振和/或利用如在其后的实施例中的荧光激活细胞分选术来定性或定量地测量这些动力学参数，以及其它。
技术人员将理解可对根据在本文中公开的任何方面的HER3结合多肽进行各种修饰和/或添加以使多肽适合于特定的应用而不脱离本公开内容的范围。例如，本文公开的任何HER3结合多肽可包含另外的C末端和/或N末端氨基酸。如此的多肽应当被理解为在多肽链中的第一和/或最末位置处(即在N-和/或C-末端)具有另外的氨基酸残基的多肽。因此，在一个实施方案中，如在本文中限定的HER3结合多肽可包含任何适合数目的另外的氨基酸残基，例如至少一个另外的氨基酸残基。可单个地或共同地添加每一个另外的氨基酸残基以例如改进多肽的生产、纯化、体内或体外稳定、偶联、或检测。为了化学偶联的目的，此类另外的氨基酸残基可包含添加的一个或更多个氨基酸残基。这种情况的一个实例是半胱氨酸残基的添加。此类另外的氨基酸残基还可提供用于多肽的纯化或检测的“标签”，诸如用于与对标签特异的抗体相互作用或在His6标签和HEHEHE标签的情况下用于固相金属亲和色谱(IMAC)的His6标签、HEHEHE标签或“myc”(c-myc)标签或“FLAG”标签。
可通过化学缀合(利用已知的有机化学方法)的方法或通过任何其它方法，诸如将HER3结合多肽表达为融合蛋白，将如以上讨论的另外的氨基酸偶联至HER3结合多肽。
如以上所讨论的另外的氨基酸可例如构成一个或更多个多肽结构域。
另外的多肽结构域可为HER3结合多肽提供另一种功能，诸如例如另一种结合功能、或酶促功能、或有毒的功能(例如免疫毒素)、或荧光信号传导功能、或治疗功能、或诊断功能、或预后功能，或其组合。
另外的多肽结构域还可为HER3结合多肽提供相同结合功能。因此，如在本文中公开的HER3结合多肽可包含至少两个HER3结合多肽单体单元，其氨基酸序列可以是相同的或不同的。多肽的多聚体形式可包含合适的数目的结构域，每一个具有HER3结合基序，并且每一个形成多聚体内的“单体”。这些结构域可都具有相同的氨基酸序列，但是可替代地，它们可具有不同的氨基酸序列。具体地，如在本文中所公开的HER3结合多肽可形成同源二聚体或异源二聚体。
换言之，在本公开内容的第二方面中，提供了融合蛋白或缀合物，所述融合蛋白或缀合物包含由如在本文中描述的HER3结合多肽组成的第一部分；以及由具有期望的生物活性的多肽组成的第二部分。期望的生物活性的实例包括但不局限于治疗活性、结合活性、诊断活性、预后活性和酶促活性，以及其组合。
在一个实施方案中，所述第二部分选自由人类内源性酶、激素、生长因子、趋化因子、细胞因子和淋巴因子组成的组。在另一个实施方案中，所述第二部分为能选择性地与靶分子相互作用的结合多肽，所述靶分子诸如选自由白蛋白、HER3、HER2、EGFR、IGF1R、cMet、VEGFR和PDGFR组成的组的靶分子。因此，第二或另外的部分可为HER3结合多肽提供另一种结合功能。可替代地，所述第二或另外的部分可为HER3结合多肽提供另一种HER3结合功能。因此，HER3结合多肽的多聚体形式(诸如，但不局限于二聚体、三聚体和四聚体形式)落在所述公开内容的范围内。如以上所声明的，多聚体单元可都具有相同的氨基酸序列，但是可替代地，其可具有不同的氨基酸序列。
如以上所描述的，本公开内容还包括HER3结合多肽、包含至少一个HER3结合多肽单体单元和对另一个靶具有结合亲和力的至少一个单体单元的融合蛋白或缀合物。此类其它的靶可选自其它的表皮生长因子受体，诸如具体地HER2和EGFR，或如果合适选自其它的靶，诸如但不局限于IGF1R、cMet、VEGFR和PDGFR。多肽的此类异源多聚体形式可包含合适数目的具有至少一个HER3结合基序的结构域，以及合适数目的具有授予对一个或更多个其它的靶的亲和力的结合基序的结构域。针对在这一点上的可能性的详细讨论参见例如WO2011/056124，其对在本文中呈现的新颖的HER3结合多肽是等同地相关的。
预期的结合多肽的非限制性列表包括选自由以下组成的组的多肽：抗体及其基本上保持抗体结合活性的片段和结构域；微体、maxybodies、亲和多聚体(avimers)和其它小的二硫键结合的蛋白；以及源自选自由以下组成的组的支架的结合蛋白：葡萄球菌蛋白A及其结构域、其它的三螺旋结构域、脂质运载蛋白、锚蛋白重复结构域、纤维素结合结构域、γ晶体、绿色荧光蛋白、人类细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4、蛋白酶抑制剂诸如库尼兹结构域、PDZ结构域、SH3结构域、肽适体、葡萄球菌核酸酶、淀粉酶抑肽、III型纤连蛋白结构域、转铁蛋白、锌指和芋螺毒素。
其中根据本发明的HER3结合多肽构成第一部分并且第二部分和/或另外的部分具有除了结合HER3之外的其它功能的根据本公开内容的融合蛋白或缀合物也落在该公开内容的范围内。融合多肽或缀合物的第二部分和/或另外的一个/多个部分可合适地具有期望的生物活性。因此，在一个实施方案中，提供了包含另外的部分的如在本文中所描述的融合蛋白或缀合物，所述另外的部分由具有与第二部分相同或不同的另外的、期望的生物活性的多肽组成。根据本发明的融合蛋白或缀合物的实例包括其中第二部分具有治疗活性、结合活性、酶促活性，为治疗上有效的多肽或为选自由人类内源性酶、激素、生长因子、趋化因子、细胞因子和淋巴因子组成的组，并且另外的部分为能选择性地与靶分子相互作用的结合多肽的融合蛋白或缀合物。在另一个实例中，第二部分和另外的部分为能选择性地与靶分子相互作用的结合多肽，其中所述靶分子可以是相同的或不同的。
在一些实施方案中，第二部分或另外的一个/多个部分可包含增加HER3结合多肽的体内半衰期的部分。如由技术人员所理解的，增加的或延长的半衰期意思是特定的分子从血液的减缓的清除。有很多已知的策略用于体内延长特定多肽的半衰期，诸如与抗体的Fc结构域偶联(Fc偶联)或与白蛋白偶联。另一个实例是与半衰期延长部分偶联，所述半衰期延长部分例如将在体内与血清白蛋白缔合的肽或蛋白。具体地，半衰期延长部分可以是白蛋白结合部分。白蛋白结合部分可例如由天然存在的多肽、或其白蛋白结合片段、或工程多肽组成。工程多肽可以产生新颖的或增加的特性(诸如对分子诸如白蛋白的结合亲和力)为目的通过使天然存在的起始多肽经受蛋白工程技术而源自天然存在的起始多肽，所述蛋白工程技术诸如以定点或随机的方法突变和改变。此种工程白蛋白结合多肽可例如为蛋白支架的变体，该变体被针对此变体对白蛋白的特异性结合亲和力而选择。在特定的实施方案中，蛋白支架可选自葡萄球菌蛋白G的结构域或其衍生物，诸如例如来自链球菌(Streptococcus)菌株G148的蛋白G的结构域GA1、结构域GA2和结构域GA3，特别是结构域GA3。
因此，在HER3结合多肽的一个实施方案中，另外的氨基酸构成链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域(GA或ABD)或其衍生物。在WO2009/016043和WO2012/004384中公开了可作为第二部分和/或另外的部分被包含在本文中所描述的与HER3结合多肽的融合蛋白或缀合物中的的白蛋白结合结构域的非限制性实例。不希望被理论束缚，预期此类融合蛋白或缀合物与血清白蛋白体内结合，并且得益于其较长的半衰期，其增加了多肽自身的净半衰期(net half life)(参见例如WO91/01743)。当对例如哺乳类动物受试者施用时，包含如以上限定的白蛋白结合部分的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物的药代动力学曲线因此类似于血清白蛋白的药代动力学曲线。ABD及其衍生物与人类血清白蛋白(HSA)，以及来自诸如小鼠和大鼠的其它物种的血清白蛋白十分强烈地结合。
链球菌蛋白G的ABD及其已知的变体大约46个氨基酸长。因此，当如在本文中所描述的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物包含ABD部分或其衍生物时，HER3结合分子的整体大小是相对较小的。当例如对哺乳动物受试者诸如人类受试者施用时，HER3结合分子的白蛋白结合部分将会与血清白蛋白非共价地缔合，并且多肽可因此得益于减少的肾清除率和在表皮细胞中增加的再循环。而且，与缺少相应的半衰期延长部分的多肽相比，包含半衰期延长部分的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物不仅可表现出延长的体内半衰期，还可表现出减轻的体内免疫学反应(参见例如WO 2005/097202)。
对于包含根据本发明的HER3结合多肽的融合蛋白或缀合物的在本文中的说明，应注意的是第一部分、第二部分和另外的部分的命名是为了清楚的原因而进行以区别一方面根据本发明的一种或更多种HER3结合多肽，以及另一方面表现其它功能的部分。这些命名并非意图指在融合蛋白或缀合物的多肽链中的不同结构域的实际顺序。因此，例如，所述第一部分可不限制在融合蛋白或缀合物的N末端、在中间、或在C-末端出现。
可利用已知的有机化学方法通过共价偶联使如以上所描述的另外的一个或更多个多肽结构域连接至HER3结合多肽。可替代地，包含另外的一个或更多个多肽结构域的HER3结合多肽可例如在用于多肽的重组表达的系统中被表达为一个或更多个融合多肽，或可直接地或通过接头(例如氨基酸接头)以任何其它的方式连接。有用的氨基酸接头的非限制性实例选自G、GS、[G2S]n、[G3S]n、[G4S]n、GS[G4S]n，其中n为在1和7之间诸如在1和2之间的整数；[S2G]m、[S3G]m、[S4G]m，其中m为在1和7之间的整数；以及VDGS。
公开内容还包括还包含细胞毒性剂的根据第一方面的HER3结合多肽以及根据第二方面的融合蛋白或缀合物的实施方案，所述细胞毒性剂诸如选自由以下组成的组的细胞毒性剂：阿里他汀(auristatin)、蒽环霉素、刺孢霉素、考布他汀、阿霉素、倍癌霉素(duocarmycin)、CC-1065抗肿瘤抗生素、海鞘素、格尔德霉素、美登木素生物碱、甲氨蝶呤、真菌毒素、紫杉醇、蓖麻毒素、bouganin、白树毒素、假单胞菌外毒素38(PE38)、白喉毒素(DT)、及其类似物，及其衍生物及其组合。
在其它的实施方案中，例如为了多肽的体内或体外检测的目的，公开的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物还包含标记物，诸如选自由荧光染料和金属、发色团染料、化学发光化合物和生物发光蛋白、酶、放射性核素和颗粒组成的组的标记物。
所述标记物可被用于直接地标记多肽，但是非直接的标记也是预期的。在一些实施方案中，被标记的HER3结合多肽作为还包含具有期望的生物活性的第二部分的融合蛋白或缀合物的部分存在。在一些例子中标记物可仅被偶联至HER 3结合多肽，在一些例子中被偶联至缀合物或融合蛋白的HER3结合多肽和第二部分两者。而且，标记物可仅被偶联至第二部分并且不偶联至HER3结合部分也是可能的。因此在仍然另一个实施方案中，提供了HER3结合多肽、包含第二部分的融合蛋白或缀合物，其中所述标记物仅被偶联至第二部分。当提及被标记的多肽时，这应被理解为提及如在本文中所描述的多肽的所有方面，包括包含HER3结合多肽和第二部分和任选地另外的部分的融合蛋白和缀合物。
因此，被标记的多肽可仅包含HER3结合多肽和例如适合用于医学成像或适合用于治疗的放射性核素，该放射性核素可被螯合或共价地偶联至HER3结合多肽。可替代地，被标记的多肽或可包含HER3结合多肽、适合用于医学成像或适合的放射性核素、和第二部分诸如具有期望的生物活性(例如治疗效果)的小分子。
由于在标记的多肽和HER3之间的强烈缔合，可使用标记的多肽使HER3表达细胞(诸如在癌症肿瘤内的细胞)的存在可视化。
大部分的放射性核素具有金属的性质并且金属典型地不能与存在于蛋白和肽中的元素形成稳定的共价键。由于这一原因，具有放射性金属的蛋白和肽的标记用螯合剂即多齿配体的使用来进行，多齿配体与金属离子形成非共价化合物，称为螯合物。在白蛋白结合多肽、融合蛋白或缀合物的一个实施方案中，通过螯合环境的供应使放射性核素的并入能够进行的，通过螯合环境的供应放射性核素可被配位、螯合或络合至多肽。
螯合剂的一个实例是螯合剂的聚氨基聚羧酸酯的类型。此类聚氨基聚羧酸酯螯合剂的两类可被区分：大环螯合剂和无环螯合剂。
在一个实施方案中，HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物包含由通过半胱氨酸残基的巯基基团或赖氨酸残基的ε氨基基团偶联至HER3结合多肽的聚氨基聚羧基螯合剂提供的螯合环境。
对于放射性同位素铟、镓、钇、铋、放射性锕系元素和放射性镧系元素最常使用的大环螯合剂是DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)的不同衍生物。在一个实施方案中，通过DOTA或其衍生物提供HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物的螯合环境。更特别地，在一个实施方案中，通过使DOTA衍生物1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三-乙酸-10-马来酰亚胺基乙基乙酰胺(马来酰亚胺基单酰胺-DOTA)与所述多肽反应来获得由本公开内容包括的螯合多肽。
另外地，1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)及其衍生物可被用作螯合剂。因此，在一个实施方案中，提供了HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中聚氨基聚羧基螯合剂是1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸或其衍生物。
最常使用的无环聚氨基聚羧基螯合剂是DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)的不同衍生物。因此，具有由二亚乙基三胺五乙酸或其衍生物提供的螯合环境的多肽也被本公开内容包括。
在一个实施方案中，提供了如在本文中所描述的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物，所述HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物包含适合用于医学成像的放射性核素，所述放射性核素选自由99mTc、61Cu、64Cu、66Ga、67Ga、68Ga、110mIn、111In、44Sc和86Y组成的组；或具有适合用于治疗的放射性核素，所述放射性核素选自由225Ac、212Bi、213Bi、67Cu、166Ho、177Lu、212Pb、149Pm、153Sm、227Th和90Y组成的组，其中放射性核素通过螯合环境与HER3结合多肽络合。在一个具体的实施方案中，放射性核素选自由99mTc、111In、64Cu和68Ga组成的组。在一个实施方案中，放射性元素选自9mTc和111In。
NOTA的使用提供了用于SPECT(Tolmachev等人,Bioconjug Chem 22:894-902(2011)；Hescamp等人,J NucI Med 53:143-153(2012))的用111In对Z多肽的稳定标记，以及用于PET(Hescamp等人，上述)的用68Ga或18F(利用18F-AIF化学反应(McBride等人,J Nucl Med 50:991-8(2009))对Z多肽的稳定标记。另外，如果注射后最佳成像时间比6h更多，相同的螯合剂可被用于用长寿命正电子发射体64Cu(Prasanphanich等人,Proc Nat Acad Sci104:12462-7(2007)，Fournier等人,EJNMMI Res 2:8(2012))稳定标记。
另外地，技术人员还可预见能螯合诸如“裸露的”Me、Me＝O、O＝Me＝O、Me≡N、Me(CO)3、或HYNIC-Me-共配体核心(其中Me为Tc或Re的放射性同位素)之类的核心的很多其他的螯合剂，所述核心在肽合成期间被特异性附连至多肽位点或利用已知的用于放射标记的偶联化学反应偶联至重组地产生的多肽。优选地，此类螯合剂具有亲水的特征。
在本公开内容的相关方面，提供了包含如在本文中限定的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物以及至少一种药学上可接受的赋形剂或载体的组合物。在一个实施方案中，所述组合物包含至少一种另外的活性剂，诸如治疗剂。合适的治疗剂可以是增强HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物的活性的剂或具有例如影响HER3相关状况(诸如癌症)的不同的方面的不同作用模式的剂。另外的活性剂的非限制性实例为选自由以下组成的组的治疗剂：免疫刺激剂、放射性核素、毒剂、酶、招募效应细胞的因子以及光敏剂。
应理解根据本公开内容的HER3结合多肽自身可被用作治疗剂或诊断剂；或作为用于靶向其它的治疗或诊断剂的工具，具有例如对HER3的直接或非直接的影响。直接的治疗效果可例如伴随抑制HER3信号转导。对于非直接的效果，一个实施方案提供了根据本发明的HER3结合多肽与治疗剂的组合。在如此的组合中的可证明有用的治疗剂的非限制性实例是免疫刺激剂、放射性核素、毒剂、酶、招募效应细胞(例如T细胞或NK细胞)的因子以及光敏剂。因此，在一个实施方案中，提供了HER3结合多肽自身、或作为被包含于根据本公开内容的HER3结合组合(诸如融合蛋白、缀合物或组合物)中的HER3结合多肽用于治疗。
HER3还可充当有价值的标志物以预测某些癌症的预后，所述癌症诸如结肠癌、子宫内膜癌、胃癌、神经胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌、头颈鳞状细胞癌、肺癌、黑色素瘤、成髓细胞瘤、神经上皮瘤、卵巢癌、佩吉特氏病、乳头状甲状腺癌、前列腺癌、皮肤鳞状细胞癌、移行细胞癌和前庭神经鞘瘤。例如，已显示HER3表达具有预后价值，因为受体表达的高水平和与过表达HER2的患者相比显著地较短的存活时间有关。
因此，在本公开内容的另一个方面，提供如在本文中所描述的HER3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，用作药剂、诊断剂或预后剂。在一个实施方案中，所述多肽、融合蛋白、缀合物或组合物调节HER3功能或信号转导。在本文中术语“调节”指改变HER3的活性，诸如使HER3亚等位基因部分地抑制或完全地抑制HER3信号转导或功能。在一个实施方案中，所述多肽、融合蛋白、缀合物或组合物抑制HER3信号转导并且因此作为药剂具有治疗效果。诊断剂和/或预后剂可包含调节或抑制HER3信号转导的多肽、融合蛋白、缀合物或组合物。但是，不调节或抑制HER3信号转导的所述多肽、融合蛋白、缀合物或组合物可同样地被用作预后或诊断剂。
在一个实施方案中，提供HER3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，用于在HER3相关状况诸如癌症的治疗、诊断或预后中使用。在一个实施方案中，所述癌症选自由癌症疾病组成的组，诸如结肠癌、子宫内膜癌、胃癌、神经胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌、头颈鳞状细胞癌、肺癌、黑色素瘤、成髓细胞瘤、神经上皮瘤、卵巢癌、佩吉特氏病、乳头状甲状腺癌、前列腺癌、皮肤鳞状细胞癌、移行细胞癌和前庭神经鞘瘤。在一个实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌。以HER3的过表达为特征的其它癌症疾病也可适合于用公开的HER3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物来治疗。
在另一方面，提供检测HER3的方法，包括：提供怀疑含有HER3的样品；使所述样品与如在本文中所描述的HER3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物接触；以及检测HER3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物的结合以指示在样品中HER3的存在。在一个实施方案中，所述方法还包括中间洗涤步骤用于在接触样品后移除未结合的多肽、融合蛋白、缀合物或组合物。
在一个实施方案中，提供用于确定受试者中HER3的存在的方法，诸如诊断或预后方法，所述方法包括以下步骤：
使受试者或从受试者分离的样品与如在本文中所描述的HER3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物接触，以及
获得对应于已结合于所述受试者中或与所述样品结合的HER3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物的量的值。
在一个实施方案中，所述方法还包括中间洗涤步骤用于在接触受试者或样品之后且在获得值之前移除未结合的多肽、融合蛋白、缀合物或组合物。
在一个实施方案中，所述方法还包括将所述值与参照比较的步骤。可通过数值、阈值或视觉指示剂对所述参照评分，例如基于显色反应。技术人员将领会本领域已知的与参照比较的不同方式可以是适合使用的。
在一个实施方案中，所述方法在体内进行。
在一个实施方案中，所述方法在体外进行。
在此方法的一个实施方案中，所述受试者为哺乳动物受试者，诸如人类受试者。
在仍然另一相关方面，提供用于受试者诸如哺乳动物受试者(诸如人类受试者)的身体的体内成像的方法，所述受试者患有或者怀疑患有以HER3的过表达为特征的HER3相关状况，诸如癌症，所述方法包括以下步骤：
将如在本文中描述的放射标记的多肽、融合多肽或缀合物施用至哺乳动物受试者的身体内，其中放射性核素适合用于成像；以及
在施用放射标记的多肽的1-72小时内，利用医学成像仪器获得受试者身体的至少一部分的一个或更多个图像，所述一个或更多个图像指示身体内放射性核素的存在。
所述医学仪器可例如为γ照相机、PET扫描仪或SPECT扫描仪。技术人员将知道其它的什么医学成像仪器可适合使用。技术人员还将知道，由实体肿瘤和HER3表达表现的任何癌症可通过所述方法来体内可视化。
在相关的方面，提供治疗HER3相关状况的方法，包括对需要其的受试者施用有效量的如在本文中所描述的HER3结合多肽、融合蛋白、偶联剂或组合物。因此，在治疗方法中，用根据本发明的HER3结合多肽、融合蛋白、偶联剂或组合物治疗受试者。在所述方法的更特别的实施方案中，如在本文中所描述的HER3结合多肽、融合蛋白、偶联剂或组合物调节(诸如抑制)HER3功能或信号转导。在所述方法的更特定的实施方案中，HER3结合多肽、融合蛋白、偶联剂或组合物与受试者中细胞表面上表达的HER3的结合抑制HER3信号转导。
在一个实施方案中，所述HER3相关状况为癌症，诸如选自由癌症疾病组成的组的癌症，诸如结肠癌、子宫内膜癌、胃癌、神经胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌、头颈鳞状细胞癌、肺癌、黑色素瘤、成髓细胞瘤、神经上皮瘤、卵巢癌、佩吉特氏病、乳头状甲状腺癌、前列腺癌、皮肤鳞状细胞癌、移行细胞癌和前庭神经鞘瘤。在一个实施方案中，所述癌症选自由乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌组成的组。表现为实体肿瘤和HER3表达的任何癌症。
在另外的方面，提供编码如以上所描述的HER3结合多肽的多核苷酸，以及包含此多核苷酸的表达载体。如此的表达载体可例如通过在宿主细胞中表达能够生成HER3结合多肽。
尽管已参考多种示例性实施方案描述了发明，但是本领域技术人员应理解可进行多种改变并且等同物可替代其元素而不脱离本发明的范围。另外，可进行很多修改以使特定情况或分子适应于本发明的教导而不脱离其实质范围。因此，意图本发明不被局限于预期用于实施该发明的任何特定实施方案，而是本发明将包括落入所附的权利要求书的范围内的所有实施方案。
附图简述
图1是包含在本发明的HER3结合多肽中的HER3结合基序的实例(SEQ ID NO:1-35)；根据本发明的49-mer HER3结合多肽的实例(SEQ IDNO:36-70)；根据本发明的58-mer HER3结合多肽的实例(SEQ IDNO:71-105)；之前公布的HER3特异性Z变体Z05416(SEQ ID NO:106)和Z05417(SEQ ID NO:107)；以及白蛋白结合多肽PP013(SEQ ID NO:109)的氨基酸序列的列表。
图2显示了来自在实施例1中描述的丙氨酸扫描实验的流式细胞术分析的结果。X轴展示用丙氨酸逐个取代的HER3结合多肽中的13种残基，并且Y轴展示与HER3结合相对应的FL-2荧光强度和与表面表达水平(通过HSA结合监测)相对应的FL-6荧光强度的比。
图3显示了来自实施例2中描述的肉葡萄球菌(S.carnosus)上展示的亲和力成熟文库Sc:ZHER3LIB2的荧光激活细胞分选的密度图。y轴展示HER3结合信号(FL-2)并且X轴展示表面表达水平(FL-6)。点状图显示来自原始未分选的文库的细胞以及分别地在第一、第二、第三和第四轮选择中分离的细胞。仅显示了来自标记策略2(S2)的结果，但是对于标记策略1(S1)观察到相似的结果。对于HER3结合信号的比较，显示了参照多肽Z05417的点状图。
图4显示了如在实施例3中所描述的十种亲和力成熟的HER3结合多肽Z08694-Z08703的生物传感器解离速率排序。(A)从在固定的人类HER3-Fc上注射的Sc:ZHER3LIB2分离的纯化的Z变体的传感图。Z08698和Z08699的传感图被突出显示(深灰色且如所指示的)。其它亲和力成熟的变体(Z08694-Z08697和Z08700-Z08703)的传感图以黑色显示。为了比较，在分析中包括参照多肽Z05417(浅灰色)。(B)通过评价每种Z变体分子的koff值与Z05417的解离速率相比的倍数变化来进行解离速率排序(kd＝koff)。
图5显示了如在实施例3中所描述的通过SPR和CD来评价的亲和力成熟的HER3结合多肽的热稳定性。(A)在90℃热处理之前(黑)和之后(灰)将50nM如所指示的Z08698和Z08699注射在ProteOn XPR36仪器中固定的人类HER3-Fc上。(B)当从20℃至90℃加热HER3特异性Z变体Z08698和Z08699时在221nm处获得的可变温度测量(Variable temperaturemeasurement,VTM)光谱。(C)如所指示的Z08698和Z08699在VTM之前(黑)和之后(灰)于20℃下在从250至195nm的波长范围处的CD谱。如在图中所看到的，在VTM之前和之后记录的光谱完全地重叠。
图6显示了如在实施例4中所描述的放射标记的Z变体分子与多种HER3表达细胞的体外结合特异性。将细胞与1nM放射标记的(A)Z08698或(B)Z08699一起孵育1h。对于受体的预饱和(封闭)，将0.7μM未标记的Z变体分子添加至对照组。数据呈现为增加的放射性即细胞结合(三个细胞皿的平均值)的百分比并显示了标准偏差。由未封闭和封闭的细胞的摄取之间的差异是统计上显著的(p<0.05)。
图7显示了来自如在实施例5中所描述的进行的放射标记的Z08699在具有LNCaP前列腺癌异种移植物的小鼠中的生物分布研究的数据。来自注射后6h的数据表示为每克注射的活性的百分比(n＝4)并显示了标准偏差。
图8显示了来自如在实施例7中所描述的用两种Z变体Z08698(空心正方形)和Z08699(空心圆形)抑制调蛋白诱导的增殖的结果。将每种结合物的稀释系列与固定浓度的HRG(200pM)混合并在rHSA的存在下与MCF-7细胞一起孵育五天。y轴展示平均吸光度值±SD，其与活细胞的数目成比例，并且x轴展示Z变体的浓度。
图9显示了来自如在实施例8中所描述的HER3磷酸化测定的结果，其中在4nM HER3和rHSA的存在下评价了Z变体Z08698(空白柱)和Z08699(条纹柱)的抑制能力。以平均吸光度值±SD的形式给出数据，其与磷酸化HER3的量成比例。虚线指示由阳性对照(4nM HRG)引起的响应。条纹线指示由阴性对照(测定培养基)引起的响应。
图10显示了如在实施例10中所描述的利用放射标记的Z08699变体(99mTc(CO3)-HEHEHE-Z08699)对小鼠中的LS174T结肠癌异种移植物中HER3表达的成像。在注射后4h获取microSPECT/CT图像。箭头指向肝(L)、肾(K)、和肿瘤(T)。
图11显示了注射1μg(0.8MBq)111In-HEHEHE-Z08698-NOTA(左)和111In-HEHEHE-Z08699-NOTA(右)4h后，具有HER3表达BT474异种移植物的小鼠的γ照相机图像。
现在将通过依照本发明进行的实验的非限制性说明来进一步阐述本发明。除非另有说明，贯穿全文使用常规的化学和分子生物学方法。
实施例
实施例1
新一代HER3结合Z变体的合理设计
在该实施例中，基于选自之前的亲和力成熟文库(Kronqvist等人，2010，上述)的HER3结合多肽Z05416(SEQ ID NO:106)和Z05417(SEQ IDNO:107)，以及基于来自如在该实施例中描述的通过荧光激活细胞分选术(FACS)评价的Z05416的丙氨酸扫描分析的结果来构建亲和力成熟文库。材料和方法
HER3和HSA的标记：利用生物素-XX Microscale Protein Labeling试剂盒(Invitrogen,目录号B30010)根据供应商的建议进行重组人类HER3/Fc嵌合体(R&D Systems,目录号348-RB-050)的生物素酰化，所述重组人类HER3/Fc嵌合体在这里表示为HER3-Fc。利用氨基酸分析来确定标记的蛋白的浓度。在NaHCO3(0.1M，pH 8.5)中使HER3的胞外结构域(SinoBiological Inc.,目录号10201-H08H)与生物素羧酸、琥珀酰亚胺酯缀合1.5h，所述HER3的胞外结构域在这里表示为HER3-ECD。随后，添加甘氨酸以终止反应，然后利用PD MiniTrap G-25柱(GE Healthcare,目录号28-9180-07)根据制造商的建议将缓冲液交换为PBS(10mM磷酸盐、137mM NaCl、2.68mM KCl、pH 7.4)。利用Alexa 647琥珀酰亚胺酯(Invitrogen,目录号A20006)根据供应商的建议荧光标记人类血清白蛋白(HSA；Sigma,目录号A-3782)。将蛋白缓冲液更换为PBS(10mM磷酸盐、137mM NaCl、2.68mM KCl、pH 7.4)或补充0.1％F108NF表面活性剂的PBS(PBSP；BASF Corporation,目录号30085231)，以移除任何多余的荧光团。
丙氨酸扫描诱变：之前选择的如在Kronqvist等人(2010，上述)中描述的Z变体Z05416被用作模板用于12种突变体的构建，其中用丙氨酸取代在位置9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、32和35处的残基，每种突变体取代一处。利用编码Z05416的载体(pSCZ05416(Kronqvist等人,2010上述))和编码各自的丙氨酸取代体(repalcement)的寡核苷酸(使用密码子GCG)来进行常规的定向位点诱变。在另外的突变体中，通过相同的方法将在Z05416内位置28处的原始丙氨酸残基取代为缬氨酸(使用密码子GTG)。用NheI和XhoI限制酶(New England Biolabs)消化基因序列并利用T4DNA连接酶(New England Biolabs)根据供应商的建议将其连接至已用相同的酶消化的葡萄球菌展示载体pSCZ1(Kronqvist等人,ProteinEngineering Design&Selection 21:247-255(2008))。大肠杆菌(E.coli)菌株RR1ΔM15(Rüther,Nucleic Acids Res 10:5765-5772(1982))被用作宿主用于质粒构建，并用JETSTAR试剂盒(Genomed,目录号220020)根据供应商的建议进行制备。BigDye Thermo循环测序试剂和ABI Prism 3700仪器(Applied Biosystems,Foster City,CA)被用于证实每种质粒中丙氨酸或缬氨酸突变的存在。将构建体转化至可电转化的肉葡萄球菌(S.carnosus)TM300，如在Lofblom等人(J Appl Microbiol 102:736-747(2007)中所描述的。
丙氨酸和缬氨酸突变体的FACS分析：将展示丙氨酸和缬氨酸突变体的葡萄球菌细胞接种至10ml补充有酵母提取物(TSB-YE；Merck,Darmstadt,Germany)和20μg/ml氯霉素的胰蛋白酶大豆肉汤，并在37℃150rpm的搅动下过夜生长。用800μl补充有0.1％F108NF表面活性剂的PBS(PBSP；pH 7.4；BASF Corporation,目录号30085231)洗涤来自过夜培养物的106个细胞。通过离心(3500×g，4℃，6min)使细胞沉淀并在50μl含有生物素化的5nM HER3-Fc的PBSP中重悬。以温和的混合通过在室温下孵育2h来达到平衡结合。用180μl冰冷的PBSP洗涤细胞，然后在200μl含有150nM Alexa 647缀合的HSA和链霉亲和素-Alexa 488缀合物的冰冷的PBSP中在黑暗中孵育40min。用180μl冰冷的PBSP洗涤一次后，在200μl冰冷的PBSP中重悬细胞，然后为流式细胞术分析。利用FACS Vantage SE(BD Biosciences,San Jose,CA)流式细胞仪测量平均荧光强度(MFI)。使用新制备的溶液在不同天一式两份地进行实验。
文库设计：设计新的文库，其中使在Z分子中的13个位置偏向基于HER3结合Z变体Z05416和Z05417(Kronqvist等人,2010上述)的序列的氨基酸残基。用对应于氨基酸：A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、Y、V、W(在所有的位置排除C、D、P)的17种密码子使每个位置随机化，且以较高的比例掺入基于HER3结合Z变体Z05416和Z05417的氨基酸残基，以产生大约每分子三个突变的平均突变频率(表1)。还以来自以上所述的丙氨酸扫描实验的结果标准化每个位置的随机化频率，导致在重要位置的较少突变，且反之亦然(表1)。
从Sloning Biotechnology GmbH(Pucheim,Germany)订购编码HER3结合多肽的螺旋1和螺旋2中部分随机化的位置、侧翼为限制位点XhoI和SacI的双链DNA的文库(5'-CTC GAG GCG GAA GCC AAATAC GCC AAA GAA NNN NNN NNN GCG NNN NNN GAG ATC NNNNNN TTA CCT AAC TTA ACC NNN NNN CAA NNN NNN GCC TTC ATCNNN AAA TTA NNN GAT GAC CCA AGC CAG AGC TCT C'(SEQ IDNO:108；随机化的密码子显示为NNN)。表1中给出了新文库中13个可变Z位置的氨基酸残基的理论分布。
表1：文库设计
文库构建及克隆：利用Phusion DNA聚合酶(Finnzymes,目录号F530L)在11个循环的PCR过程中扩增文库。利用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,目录号28106)根据供应商的建议来纯化PCR产物。随后，通过XhoI和SacI-HF(New England Biolabs)限制酶来消化文库寡核苷酸，并通过制备型凝胶电泳(2％琼脂糖凝胶)利用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,目录号28704)来纯化。肉葡萄球菌表达载体pSCZ1的修改版本(Kronqvist等人,2008上述)被XhoI和SacI-HF酶限制并通过如以上所描述的制备型凝胶电泳纯化。利用T4DNA连接酶以载体与插入物的1:5的摩尔比将文库寡核苷酸连接至载体，然后为苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀用于DNA片段的纯化和浓缩。然后，通过电穿孔法将文库编码质粒(library-encoding plasmid)电转化至可电转化的大肠杆菌SS320(Lucigen,目录号60512-1)并利用ABIPrism 3700仪器(Applied Biosystems,Foster City,CA)通过BigDye Thermo循环测序对各个克隆测序用于文库验证。随后利用JETSTAR Maxi试剂盒(Genomed目录号220020)分离文库质粒，通过苯酚-氯仿提取纯化并通过异丙醇沉淀浓缩。最后，如之前(Lofblom等人,2007，上述)所描述的通过电穿孔法将文库(以下表示为SC:ZHER3LIB2)转化入可电转化的肉葡萄球菌。
文库质量分析：将SC:ZHER3LIB2的等份(至少十倍文库大小，即多于6.7×108)接种至100ml具有20μg/ml氯霉素的TSB-YE并在37℃以及150rpm下过夜生长。16h后，用1ml PBSP洗涤107个细胞一次。通过离心(3500×g，4℃，6min)使细胞沉淀并在含有225nM Alexa 647缀合的HSA的PBSP中重悬并在黑暗中在室温下孵育1h。用1ml冰冷的PBSP洗涤一次之后，在300μl冰冷的PBSP中重悬细胞，然后为流式细胞术分析。利用MoFlo Astrios细胞分选仪(Beckman Coulter)流式细胞仪来测量平均荧光强度(MFI)。
结果
HER3结合多肽的丙氨酸和缬氨酸突变体的FACS分析：丙氨酸扫描诱变被用于研究已知HER3结合物Z05416对人类HER3-Fc的胞外结构域的高亲和力结合位点。Z支架中13个原始随机化的残基各自被取代成丙氨酸或缬氨酸氨基酸，并将每种构建体亚克隆进葡萄球菌展示载体用于随后的向葡萄球菌宿主的转化。将展示13种取代体的葡萄球菌细胞与生物素化的HER3-Fc一起孵育。然后，洗涤细胞并与链霉亲和素-Alexa 488缀合物和HSA一起孵育用于结合至与Z变体分子融合的白蛋白结合蛋白(ABP)以监测表面表达水平和抗原结合信号的标准化。洗涤之后，利用流式细胞术来分析每种丙氨酸和缬氨酸取代体对HER3结合的影响。结果显示在位置9、10和17处的丙氨酸取代显著地降低对HER3-Fc的亲和力，表明这些位置参与靶结合(图2)。而且，在残基27处的丙氨酸取代显示出对靶轻微地增加的亲和力，表明原始的残基未使靶结合被影响至较大的程度。
文库构建和克隆：基于之前选择的HER3结合多肽Z05416和Z05417以及来自丙氨酸扫描的结果来设计新的文库。设计的文库的理论大小为5.6×106个克隆，包括具有多达3个突变的Z变体。将DNA片段的文库克隆至葡萄球菌表达载体。个体文库成员的序列分析验证了与理论设计相一致的密码子分布以及低移码突变的比例(1.8％)。突变频率比预期的13种氨基酸中的3种略微低；发现平均每克隆2个突变。将文库转化至肉葡萄球菌，产生大约6.7×107个个体克隆的多样性。
文库质量分析：为了验证突变体文库SC:ZHER3LIB2的Z变体被功能性地展示在细菌表面，将来自文库的葡萄球菌细胞与荧光标记的HSA一起孵育并利用流式细胞术分析。结果显示文库的大约80％在细胞表面表达具有功能性ABP融合的全长蛋白。如此已经成功构建HER3结合多肽的新的突变文库。
实施例2
HER3结合Z变体的选择、筛选和表征
材料和方法
细胞标记和利用FACS的葡萄球菌细胞分选：将在实施例1中设计的文库SC:ZHER3LIB2的等份(至少十倍文库大小，即，多于6.7×108个变体)接种至具有10μg/ml氯霉素的TSB-YE中并在37℃和150rpm下过夜生长。第二天，通过离心(6000rpm，6min，4℃)收获细胞并在PBSP中洗涤，然后添加如在实施例1中所描述的被生物素化的HER3-ECD。以温和的搅动在室温下孵育细胞，直到达到平衡结合。用冰冷的PBSP进行洗涤，然后用5μg/ml与藻红蛋白缀合的链霉亲和素(SAPE；Invitrogen,目录号S21388)和300nM Alexa 647缀合的HSA在冰上在黑暗中孵育30min。在冰冷的PBSP中再次洗涤细胞并最后重悬。文库被标记并利用Astrios(Beckman Coulter)流式细胞仪总共分选四轮。对于第1轮和第2轮分选，用5nM生物素化的HER3-ECD标记文库，而利用具有1nM(策略1)或5nM(策略2)生物素化的HER3-ECD的两个不同的标记策略来进行第3轮分选。在策略2中，通过随后将细胞与5nM未生物素化的HER3-ECD一起在室温下孵育1h，然后用SAPE和HSA-Alexa647标记，文库另外地经受解离速率筛选(off-rate selection)。在第4轮分选之前，来自第3轮分选的两种策略通过以下经受解离速率筛选：首先将细胞与1nM生物素化的HER3-ECD一起孵育；然后洗涤细胞，然后添加1nM未生物素化的HER3-ECD在室温下持续4h。对于每一轮分选，在流式细胞仪中分析与大约十倍文库大小相对应的大量细胞，并且具有最高比例的与细胞表面表达产物结合的HER3的顶部级分的细胞(大约0.1-0.5％)被门控出并被分选入具有TSB-YE的微量离心管。随后，将分选的细胞接种至补充氯霉素(1μg/ml)的TSB-YE用于过夜增殖，然后为下一个分选轮。最后，将第3轮和第4轮分选之后分离的细胞涂在含有氯霉素的琼脂板上。
测序：在第3轮和第4轮分选后进行个体葡萄球菌克隆的测序：挑选来自每种选择策略的96个个体克隆用于利用ABI Prism 3700仪器(AppliedBiosystems,Foster City,CA)的BigDye Thermo循环测序反应。
细胞结合(on-cell)亲和力排序：将基于测序结果选择的40个个体SC:ZHER3LIB2克隆接种至具有氯霉素(10μg/ml)的TSB-YE并在37℃和150rpm下过夜生长。然后通过离心使细胞沉淀并在PBSP中洗涤，然后在0.5nM或0.2nM生物素化的HER3-ECD中重悬。以温和的搅动在室温下孵育1h之后，用冰冷的PBSP洗涤细胞并用5μg/ml终浓度的SAPE和300nM浓度的Alexa 647缀合的HSA在冰上标记30min。最后，在冰冷的PBSP中洗涤并重悬细胞。基于Gallios(Beckman Coulter)流式细胞仪中来自HER3结合的平均荧光强度(MFI)和细胞表面表达信号之间的比对所有样品排序。另外，分析前体Z变体Z05417用于比较。
结果
用于改良的Z变体的分离的流式细胞术分选：对于成熟的HER3结合Z变体的分离，使葡萄球菌文库经受四轮FACS。通过改变分选参数和门控，并且还通过减少靶浓度以及在较后轮分选并入解离速率筛选，贯穿整个选择过程选择严格性被修改。在第3轮分选之前，如在材料和方法部分所描述的利用不同的标记策略(称为策略1和策略2)，选择方案被分成两个不同的轨道。
流式细胞仪中文库的靶结合特性的可视化揭示了在每轮分选中HER3阳性克隆的富集(图3)。另外，贯穿整个分选可观察到与被包括作为参照的前体Z变体Z05417相比具有提高的HER3结合信号的结合物的富集。策略1和2都给出相似的结果。在FACS的第3轮和第4轮之后，将分离的细胞涂在半固体培养基上用于个体候选物的测序和表征。
测序：第3轮分选之后，鉴定130个总读段中的70个独特的序列，而在第4轮且最后轮之后鉴定出142个读段中的37个独特的序列。这些结果表明在第3轮和第4轮分选之间个体HER3结合克隆的富集。
细胞结合亲和力的排序：通过确定HER3结合信号和表面表达水平的比，通过流式细胞术对来自第3轮或第4轮分选的40个独特的克隆进行亲和力排序。分析的克隆的绝大部分显示出与前体HER3结合多肽Z05417相比，对HER3提高的亲和力。在图1中以及在列为SEQ ID NO：71-105的序列中列出了具有提高的亲和力的这些结合物的58-mer Z变体的氨基酸序列。在图1中以及在列为SEQ ID NO：1-35的序列中列出了这些Z变体的推断的HER3结合基序。在图1中以及在列为SEQ ID NO：36-70的序列中列出了预计组成这些Z变体的每一个中的完整三螺旋束的49-mer多肽的氨基酸序列。
实施例3
选择的HER3结合Z变体的制备和表征
在该实施例中，来自实施例2中所描述的细胞结合亲和力的排序的前10个候选物(Z08694-Z08703；SEQ ID NO:71-80；参见图1)被再克隆并从大肠杆菌细胞提取物中纯化为C-末端His6加标签的Z变体，并根据稳定性和对HER3的结合亲和力进行进一步表征。
材料和方法
Z变体的克隆、蛋白表达和纯化：利用引入NdeI和XhoI限制位点的引物，通过PCR从菌落扩增编码在实施例2中选择的十种HER3结合多肽的DNA序列(Z08694-Z08703；SEQ ID NO:71-80)。随后将Z变体克隆至NdeI和XhoI限制的表达载体pET26+(Novagen)，用于呈格式Z#####-LEHHHHHH的具有C-末端His6标签的单体Z变体的编码。通过热激法将质粒转化进Rosetta(DE3)大肠杆菌细胞。在TSB-YE中在37℃下培养细胞，并且当OD600已达到大约1时，通过添加IPTG(异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷)至1mM的终浓度来诱导蛋白表达。在25℃下过夜孵育后，通过在4℃下4000rpm离心8min来收获细胞。在裂解缓冲液(7M盐酸胍、47mM Na2HPO4、2.65mM NaH2PO4、10mM Tris-HCl、100mM NaCl)中重悬细胞沉淀物并在37℃和150rpm下孵育2h。随后，通过在4℃下16000rpm离心20min将细胞碎片移除。分离上清液并在变性条件下利用HisPurTM Cobalt树脂(Thermo Scientific,目录号89965)通过IMAC来纯化Z变体。利用Slide-A-Lyzer透析试剂盒(3.5kDa临界值)(Thermo Scientific)通过透析将缓冲液交换为PBS。通过LC/MS(Agilent Technologies 6520ESI-Q-TOF)和SDS-PAGE来验证纯化的Z变体的分子量和纯度。通过在280nm处的吸光度测量来确定蛋白浓度。
通过生物传感器分析的解离速率排序：在ProteOn XPR36仪器(Bio RadLaboratories,CA,USA)上利用PBS+0.05％吐温(PBST)作为运行缓冲液以及15mM NaOH用于再生来进行所有的生物传感器测定。在所有的实验中，进行来自每个样品对空白表面的响应的减法以使缓冲液的贡献最小化。利用标准磺基-NHS/EDAC胺偶联化学反应将重组体人类和鼠HER3-Fc(分别地R&D systems,目录号348-RB-050和4518-RB-050)固定在单独的GLC芯片(Bio Rad Laboratories,CA,USA)上。在10nM NaAc，pH 4.5中将配体稀释至10μg/ml的终浓度并且最终固定水平为大约3000RU。通过以100μl/min的流速在固定的配体上注射25nM的每种Z变体，使纯化的多肽经受解离速率排序；将缔合时间和解离时间分别地设定为120秒和1800秒。一式两份分析每种Z变体，并通过将曲线与解离阶段拟合来确定与之前报道的Z变体Z05417的Koff值(Kronqvist等人,2010上述)相比，每种HER3特异性Z变体的解离速率的倍数变化。
在热处理之前和之后HER3结合的生物传感器分析：使25nM和50nM浓度的Z变体Z08698和Z08699经受90℃的热处理15min。通过在热处理之前和之后，以100μl/min的流速将400μl的每种样品分别注射在固定的人类和小鼠HER3上评价与HER3的结合。
圆二色谱：在PBS中将Z变体Z08698和Z08699稀释至0.2mg/ml并使经受圆二色性分析。对于每种Z变体，利用Jasco J-810分光偏振计(JascoScandinavia AB)和具有1mm的光学路径长度的小室在20℃下记录在250-195nm处的CD谱。另外，进行可变温度测量(VTM)以确定解链温度(Tm)。在VTM中，当温度以5℃/min的温度斜率从20℃升高至90℃的过程中，在220nm处测量吸光度。
通过生物传感器分析确定亲和力：对Z变体Z08698和Z08699确定平衡解离常数(KD)。如以上所述的，GLC传感器芯片(Bio Rad Laboratories,CA,USA)固定有人类HER3-Fc，最终固定水平为大约650RU。将每种Z变体的两倍稀释系列一式两份注射在固定的人类HER3上，对于Z08698在从7.2至1.8nM的范围且对于Z08699在从6.8至1.7nM的范围(蛋白浓度通过氨基酸分析确定)。将流速设定至50μl/min并且分别持续300s和4h追踪缔合和解离。通过将传感图与Langnuir单位点结合模型拟合来确定缔合速率(kon)和解离速率(koff)以及KD值。
结果
蛋白表达和纯化：呈Z#####-His6格式的十种单体Z变体分子(Z08694-Z08703)获得良好制备水平的可溶性产物并且通过SDS-PAGE分析评价制备的批次的纯度超过95％。针对所有的纯Z变体分子，LC/MS分析验证了正确的分子量。
通过生物传感器分析的解离速率排序：在固定有人类HER3-Fc的传感器芯片表面上注射如以上所述的表达的十种Z变体，并且在30分钟期间追踪解离。所有的Z变体分子产生与HER3的相似结合曲线，与前体变体Z05417相比具有大程度地降低的解离速率(图4A)。由于分离的Z变体分子的很慢的解离速率，在这个阶段没有确定绝对解离常数。相反，确定了与之前报道的Z05417的koff值(Kronqvist等人,2010上述)相比解离常数的倍数变化，以根据亲和力排序结合物(图4B)。所有纯化的亲和力成熟的Z变体与Z05417相比具有降低至少8倍的解离速率。两种最好的结合物Z08698和Z08699显示出最低的koff值，该最低的koff值对应于比Z05417的解离速率慢大约21倍的解离速率。
在热处理之前和之后HER3结合的生物传感器分析：通过表面等离子体共振(SPR)技术来评价在90℃下加热处理之前和之后，HER3和Z变体Z08698以及Z08699之间的相互作用。在加热之前和之后，在固定的人类和小鼠HER3-Fc上注射Z变体分子，并且比较获得的结合曲线。如在图5A中所显示的，在加热处理之前和之后，Z08698和Z08699与人类HER3-Fc结合的传感图重叠，证明Z变体分子的结合能力不受升高的温度处理的影响。针对分析的两种Z变体浓度(25nM和50nM)，以及针对加热之前和之后鼠HER3受体的结合观察到相同的结果。这些结果表明Z变体例如适合用药物-缀合物诸如放射性核素标记，因为此类标记程序经常需要将蛋白加热至高的温度。
圆二色谱：根据VTM，确定Z08698和Z08699的Tm分别为64℃和65℃(图5B)。因此，这些Z变体分子证实与其前体Z05416和Z05417相比提高的热稳定性，所述前体Z05416和Z05417分别具有61℃和57℃的Tm值。另外，在可变温度测量之前和之后在从250-195nm范围的波长处获得的光谱显示，Z08698和Z08699两者均保持其α螺旋结构并且在加热至90℃之后完全地再折叠，如通过在加热之前和之后产生的光谱之间的重叠所显示的(图5C)。
通过生物传感器分析确定亲和力：利用生物传感器技术来确定Z变体Z08698和Z08699的解离常数KD。在固定的人类HER3-Fc上注射每种结合物的稀释系列并通过对单位点结合模型的非线性回归来确定KD值。对Z08698获得的亲和力被评价为50pM以及对Z08699的被评价为21pM(表2)，表示当将最强的结合物Z08699与参照多肽Z05417相比时大约30倍的亲和力提高。亲和力成熟的Z变体的降低的KD值归因于与Z05417相比显著地较慢的解离速率，其转而归因于在实施例2中描述的分选程序中的解离速率筛选的成功并入。
表2.如通过SPR确定的两种Z变体对人类HER3的亲和力
Z变体 KD(pM，平均值±SD)a kon(M-1s-1，平均值)a Koff(s-1，平均值)a
Z08698 50±5.0 8.3×105 4.1×10-5
Z08699 21±2.4 1.9×106 3.9×10-5
a在同一天以一式两份的每种浓度进行
实施例4
评价Z变体的HER3特异性结合的体外细胞测定
在该实施例中，用99mTc放射标记具有C-末端His6标签的Z变体Z08698和Z08699并分析其对一系列不同的癌症细胞系的体外细胞结合特性。
材料和方法
Z变体的标记：如之前关于其它Z变体描述的(Orlova等人,Journal ofNuclear Medicine 47:512-519(2006))，利用IsoLink试剂盒(Covidien)用99mTc在His6标签处标记如在实施例3中描述制备的具有C-末端His6标签的Z变体Z08698和Z08699。简单来说，将500μl来自Ultra-TechneKowgenerator(Covidien)的以无菌0.9％NaCl洗脱的(200-320MBq)99mTc-高锝酸盐溶液添加至IsoLink试剂盒的IsoLink羰基标记试剂。在100℃下孵育混合物20min。将40μl混合物转移至含有各个Z变体(50μg，大约6.8nmol，在40μl PBS中)的溶液并在50℃下孵育。孵育60min后，通过快速薄层层析(ITLC；利用Tec-Control Chromatography条带，DARK GREEN，来自Biodex Medical Systems,目录号150-771)并用PBS洗脱来分析标记产率。在CycloneTM Storage Phosphor System上测量放射性沿着薄层色谱带的分布并利用OptiQuantTM图像分析软件(PerkinElmer)分析。利用NAP-5脱盐柱(GE Healthcare)来纯化标记的Z分子，用PBS预平衡并洗脱。利用由SDS-PAGE交互验证的ITLC来评价每种制备物的纯度。
标记的Z变体与HER3表达细胞的结合特异性：利用LS174T结肠直肠癌、NCI-N87胃癌、MCG7乳腺癌、LNCaP和DU-145前列腺癌细胞系(American Type Tissue Culture Collection,ATCC,通过LGC Promochem,Sweden)来评价99mTc(CO)3-Z08698-His6和99mTc(CO)3-Z08699-His6与HER3表达细胞结合的特异性。根据之前描述的方法(Orlova等人，(2006)，上述)进行体外特异性测试。简单来说，将放射标记的Z变体分子的溶液(1nM)添加至6个培养皿(每个含有大约2×106个细胞)。对于封闭，添加0.7μM未标记的Z变体分子，15min后添加放射标记的缀合物以使受体饱和。在加湿的保温箱中在37℃下孵育细胞1h。之后，收集培养基并利用胰蛋白酶-EDTA溶液(在缓冲液中的0.25％胰蛋白酶、0.02％EDTA,Biochrom AG,Berlin,Germany)使细胞分离。利用配备有3-英寸NaI(TI)检测器的自动化γ计数器(1480WIZARD,Wallac Oy,Turku,Finland)来测量在培养基和细胞两者中的放射性，并计算结合放射性的细胞的分数。利用GraphPad Prism(版本4.00针对Windows GraphPad Software,San Diego California USA)通过非配对双尾t检验来统计评价关于细胞摄取的数据以确定任何显著的差异(p<0.05)。
结果
Z变体的标记：利用IsoLink试剂盒的放射标记提供了对99mTc(CO)3-Z08698-His6的43±6％的产率以及对99mTc(CO)3-Z08699-His6的73±12％的产率。用一次性NAP-5柱纯化后，两种标记的缀合物的纯度都大于97％。
标记的Z变体对HER3表达细胞的结合特异性：进行结合特异性测试以评价99mTc(CO)3-Z08698-His6和99mTc(CO)3-Z08699-His6对HER3表达细胞的结合是否是受体介导的。受体通过与相同而未标记的Z变体分子预孵育的饱和显著地(p<0.05)减少放射标记的Z变体分子的结合，暗示了特异性结合(图6)。
实施例5
HER3结合Z变体的体内生物分布研究
该实施例描述了利用在实施例3中证实与鼠HER3交叉相互作用的Z08698和Z08699的放射标记的缀合物在小鼠中进行的体内研究。首先，正常小鼠被用于研究生物分布特性，以及被用于测试两种放射标记的Z变体分子在HER3正常地表达的器官诸如在肺、肝、胃、小肠和唾腺中的体内积累的特异性。第二，在含前列腺癌异种移植物的裸鼠中进一步评价放射标记的Z08699的生物分布和肿瘤靶向特性。
材料和方法
利用如在实施例4中所述标记的99mTc(CO)3-Z08698-His6和99mTc(CO)3-Z08699-His6Z变体进行生物分布研究。依照关于实验室动物的保护的国家法律计划并进行动物研究，并被动物研究的当地伦理委员会批准。
在正常NMRI小鼠中的生物分布研究：在4只雌性NMRI小鼠的组(平均重量24.5±1.6g)中静脉注射99mTc(CO)3-Z08698-His6或99mTc(CO)3-Z08699-His6(在100μl PBS中65kBq每小鼠)。通过用未标记的Z变体分子稀释，调节注射的蛋白剂量至每小鼠1μg(0.13nmol)或10μg(1.3nmol)。在注射后(pi)4h时，通过注射致死剂量的麻醉品(每克体重20μl Ketalar-Rompun；Ketalar(50mg/ml,Pfizer)；Rompun(20mg/ml,Bayer))处死4只小鼠的组，然后以用肝素(5000IE/ml,Leo Pharma)冲洗的注射器心脏穿刺并放血。收集血液、肺、肝、脾、胃、小肠、肾、子宫、唾腺、肌肉和骨的样品并称重，并利用配备有3-英寸NaI(TI)检测器的自动化γ计数器(1480WIZARD,Wallac Oy,Turku,Finland)来测量其放射性。在100-160keV的能量范围中测量锝-99m放射性。将数据对背景校正。将组织摄取计算为每克注射的放射性的百分比(％IA/g)。在尸体中的放射性被计算为％IA每全样品。利用GraphPad Prism(版本4.00针对WindowsGraphPad Software)通过非配对双尾t检验来统计评价生物分布数据以确定任何显著的差异(p<0.05)。
在具有肿瘤的裸鼠中的生物分布研究：HER3表达前列腺癌异种移植物被用于研究99mTc(CO)3-Z08699-His6的体内肿瘤靶向特性。将50％Matrigel中的LNCaP细胞(6×106)植入到雄性BALB/C nu/nu小鼠的右后腿中。在植入后4周、在0.8±0.4g的肿瘤重量时进行生物分布实验。在实验时，平均动物重量为20.1±0.6g。为了评价HER3表达器官中的摄取是否是可饱和的，在三只小鼠的组中静脉注射99mTc(CO)3-Z08699-His6(在100μlPBS中85kBq每小鼠)。通过用未标记的Z08699-His6分子稀释，调节注射的蛋白剂量至0.1μg(0.013nmol)或1μg(0.13nmol)每小鼠。注射后6h处死动物，并如以上所述测量并分析生物分布。
结果
在正常小鼠中的生物分布研究：在雌性NMRI小鼠中注射4h后评价99mTc(CO)3-Z08698-His6和99mTc(CO)3-Z08699-His6的生物分布。两种缀合物被快速地从血液和非HER3表达组织诸如骨和肌肉清除。在HER3表达组织(肺、肝、胃、小肠和唾腺)中，在较高注射蛋白剂量(10μg，1.3nmol)下两种缀合物的摄取(％IA/g)都较低。这种结果表明了可饱和的摄取，这是HER3特异性靶向的强烈证据。
在具有肿瘤的小鼠中的生物分布研究：图7中呈现了在含LNCaP异种移植物的裸鼠中99mTc(CO)3-Z08699-His6的生物分布。与正常NMRI小鼠的数据一致，蛋白剂量的增加引起在肝、胃和唾腺中的摄取的减少。在较高的蛋白剂量下存在增加的肿瘤摄取的趋势，但是该增加不是统计上显著的(当以0.1μg和1μg的剂量注射时分别地1.9±0.8％IA/g和2.9±0.8％IA/g)。蛋白剂量的增加导致显著更高的肿瘤与血液、肿瘤与唾腺、肿瘤与肝和肿瘤与骨的比。总而言之，在具有肿瘤的小鼠中生物分布研究的结果，暗示例如利用对HER3特异性靶向的放射标记的Z08699对前列腺癌中HER3表达的成像是可行的。因此，利用本文公开的新一代高亲和力Z变体将提供例如超越之前分离的HER3特异Z变体诸如Z05416和Z05417的益处，由于与其它组织相比HER3在肿瘤细胞中相对低的表达，尽管Z05416和Z05417具有对HER3的亚纳摩尔级的亲和力，不认为其提供足够的对比度用于成像。
实施例6
选择的与白蛋白结合结构域融合的HER3结合Z变体的制备
在该实施例中，将来自在实施例2中描述的细胞结合亲和力的排序的两种HER3结合Z变体(Z08698和Z08699)以及两种参照Z变体Z05416和Z05417再克隆为与白蛋白结合结构域PP013(SEQ ID NO:109)的融合体，并从大肠杆菌细胞提取物纯化。
材料和方法
Z变体的亚克隆：基本上如在WO2009/077175中所描述的对在本文中描述的其它Z变体的来进行该亚克隆。从pAY01449载体扩增单体Z变体。利用标准分子生物学技术实施用于具有N-末端和/或C-末端融合的Z变体分子的构建的亚克隆策略。利用不同的引物对进行PCR并且对生成的基因片段纯化并在连接酶缓冲液中使杂交。在pAY03362载体中亚克隆杂交的基因片段，提供C-末端PP013融合体。将HER3结合Z变体亚克隆为单体，并且由该表达载体编码的精确构建体为MGSSLQ-[Z#####]-VDSS-[PP013]。
培养和纯化：用含有每种各自的Z变体的单体基因片段的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Novagen)并在补充有50μg/ml卡那霉素的1lTSB+YE培养基(具有酵母提取物的胰蛋白酶大豆肉汤)中在37℃下培养。在OD600＝1时，添加0.17mM的终浓度的IPTG以诱导蛋白表达并将培养物在37℃下再孵育5小时。通过离心收获细胞。在添加有7U/ml(Merck,目录号1.01654.001)的TST缓冲液(25mM Tris-HCl,1mM EDTA,200mM NaCl,0.05％吐温20,pH 8.0)中重悬含Z变体的细胞沉淀物并通过超声处理使破碎。将裂解物通过离心(>20min、25000g、4℃)澄清并上样至1ml预填充的用TST缓冲液预平衡的亲和琼脂糖。用5倍柱体积(CV)的TST缓冲液洗涤后，接着用3倍CV的5mM NH4Ac pH 5.5洗涤，用2倍CV的0.1M HAc洗脱结合的Z变体。在PD-10脱盐柱(GEHealthcare,目录号17-0851-01)上将每种Z变体转移至PBS(2.68mM KCl、0.47mM KH2PO4、137mM NaCl、8.1mM Na2HPO4、pH 7.4)。利用ND-1000分光光度计并利用各个蛋白的消光系数通过在280nm处测量吸光度来确定蛋白浓度。通过用考马斯蓝染色的SDS-PAGE来分析终产物的纯度。在Agilent 1100LC/MSD系统(Agilent Technologies)上利用HPLC-MS分析来确定每种纯化的蛋白变体的特性。
结果
Z变体的亚克隆：选择Z变体用于在表达载体pAY03362中亚克隆。克隆导致包含四种单体Z05416、Z05417、Z08698和Z08699中的一种与白蛋白结合结构域PP013融合的四种融合蛋白。
培养和纯化：被构建为单体且具有C-末端ABD的两种创造性的Z变体Z08698和Z08699在大肠杆菌中表达良好。通过在280nm处测量吸光度的分光光度法确定的从2g细菌沉淀物亲和纯化的Z变体的量，对于不同的Z变体在从3mg至6mg的范围。评价制备的Z变体的纯度超过95％，如通过SDS-PAGE分析所评价的。通过HPLC-MS确认每种蛋白变体的正确分子量。
实施例7
在体外增殖测定中HER3结合Z变体的抑制能力的评价
在该实施例中，在利用MCF-7细胞的体外测定中测试如在实施例6中所描述的在其C-末端与PP013融合的Z变体Z08698和Z08699抑制调蛋白(heregulin)引起的增殖的能力。
材料和方法
测试了全部如在实施例6中所描述的制备的具有C-末端白蛋白结合融合配偶体(partner)的Z变体Z08698、Z08699、Z05416和Z05417。如所推荐的在完全培养基(补充丙酮酸钠(Lonza)、非必需氨基酸(Lonza)、盘尼西林/链霉素(Lonza)和10％胎牛血清(FCS)(Gibco)的含L-glut(Lonza)的RPMI1640培养基)中增殖细胞系MCF-7(ATCC HTB-22)。在实验当天，在不含补充物的RPMI 1640中将细胞洗涤两次并在测定培养基(含有丙酮酸钠、非必需氨基酸、盘尼西林/链霉素、9μΜ重组人类血清白蛋白(rHSA,Novozymes)+2％透析的FCS(Gibco)的含L-glut的RPMI 1640培养基)中重悬。通过在测定培养基中将Z变体与200pM HRG(NRG1-β1/HRG1-β1EGF结构域，R&D Systems)混合来分析Z变体阻断调蛋白(HRG)诱导的增殖的能力。用固定浓度(200pM)的HRG在5倍稀释系列中滴定分子。以100μl体积在96孔细胞培养板中进行滴定。每孔添加1500个细胞(100μl)并将板在37℃、5％CO2下孵育五天。孵育之后，利用细胞计数试剂盒-8(CCK-8,Fluka,Sigma Aldrich)进行在每个孔中的活细胞的数目的确定。每孔添加19μl在RPMI 1640培养基中稀释两倍的CCK-8细胞增殖试剂并在4h后利用酶标仪(Victor3,Perkin Elmer)在450nm处测量吸光度。通过对四参数剂量响应曲线的非线性回归来评价关于细胞生长的数据，并利用GraphPadPrism(版本5.01针对Windows,GraphPad Software)确定半数最大抑制浓度(IC50)。
结果
HRG诱导的增殖测定的评价：在图8中显示了结果。在HRG诱导的增殖测定中确定了与白蛋白结合结构域融合的Z变体Z08698和Z08699的半数最大抑制浓度IC50。将每种结合物的稀释系列与固定浓度的HRG混合并在rHSA的存在下与MCF-7细胞一起孵育五天。通过四参数剂量响应曲线的非线性回归来确定IC50值。得到的Z08698和Z08699的IC50值分别为0.4nM和0.6nM，表示与参照多肽Z05417相比在体外阻断能力上分别约100倍和70倍的提高。
实施例8
评价HER3结合Z变体在HER3磷酸化测定中的抑制能力的体外细胞测定
在该实施例中，测试了制备的具有C-末端白蛋白结合结构域的Z变体Z08698和Z08699的抑制HER3磷酸化的能力。
材料和方法
如在实施例6中所描述的制备具有C-末端PP013融合配偶体的Z变体Z08698和Z08699并测试。如建议的在完全培养基中增殖细胞系MCF-7。
细胞裂解产物制备：以1×106细胞/5ml的浓度将MCF-7细胞接种在60×15mm细胞培养皿(Corning)中并允许其在完全培养基中生长24h。将培养基交换为测定培养基，4h后开始实验。在具有固定HRG浓度(4nM)的测定培养基中将Z变体Z08698和Z08699稀释至4、40和400nM并与细胞一起在37℃下孵育10min。将细胞置于冰上并用冰冷的PBS洗涤两次。在2ml冰冷的含1mM活化的原钒酸钠(Sigma)的PBS中用细胞刮使细胞松散，转移至管并在预冷(4℃)的离心机中以400g离心3min。丢弃上清并且每106个细胞添加100μl裂解缓冲液((1％NP-40,20mM Tris(pH8.0),137mM NaCl，10％甘油，2mM EDTA,1mM活化的原钒酸钠)。在4℃下孵育30min后，在预冷(4℃)的离心机中以13000×g持续15min离心微量离心管中的样品。收集来自每只管的上清液并如下用于磷酸化HER3ELISA。
磷酸化HER3ELISA：根据制造商的说明使用用于检测磷酸化的HER3的人类磷酸化ErbB3ELISA试剂盒(R&D Systems)。用在PBS中4μg/ml的抗HER3抗体在室温下过夜包被96孔半区板(96-well half area plate)。用在PBS中的1％BSA在室温下对板洗涤并封闭2h。洗涤后，将50μl在“稀释剂#12”(1％NP-40,20mM Tris(pH 8.0),137mM NaCl,10％甘油,2mM EDTA,1mM活化的原钒酸钠)中1:20稀释的细胞裂解物添加至每个孔。将板孵育2h，用在“稀释剂#14”(20mM Tris,137mM NaCl,0.05％吐温20,0.1％BSA,pH 7.2-7.4)中1:2000稀释的HRP标记的抗磷酸化酪氨酸抗体洗涤并孵育2h。洗涤板并添加底物(R&D Systems)。大约20min后，用2M H2SO4终止反应并利用酶标仪(Victor3,Perkin Elmer)在450nm和570nm处读板。
结果
HER3磷酸化测定：在图9中显示了结果。确定了在MCF-7细胞中抑制HRG诱导的HER3磷酸化的能力。将每种结合物的稀释系列与固定浓度的HRG混合并在rHSA的存在下与MCF-7细胞一起孵育10min。在400nM的浓度时，Z变体Z08698和Z08699以89％的程度抑制HER3磷酸化。效果随Z变体的浓度的下降而下降，并且在40nM时，Z08698和Z08699分别以67％和51％的程度抑制HER3磷酸化。在4nM时，效果消失。这些结果表示与参照多肽Z05417相比体外阻断能力具有约10倍的提高，如通过磷酸化评价的。
实施例9
二聚HER3结合Z变体的抑制能力的评价
在该实施例中，在利用MCF-7细胞的体外测定中测试了呈Z-PP013-Z格式的含有与白蛋白结合PP013融合的Z08698的二聚Z变体抑制调蛋白诱导的信号转导的能力。评价了在Z和白蛋白结合部分之间分别具有GGGGS的一个或四个重复的两种不同的接头长度，即Z08698-G4S-PP013-G4S-Z08698和Z08698-(G4S)4-PP013-(G4S)4-Z08698。
材料和方法
克隆和制备：基本上如在实施例6中所描述的并应用标准分子生物学技术使用并入NdeI和AscI限制位点的引物来进行二聚Z变体的亚克隆。HER3结合Z变体亚克隆为与PP013融合的二聚体，并且由表达载体编码的精确构建体分别为M-[Z08698]-GAP(GGGGS)TS-[PP013]-GT(GGGGS)PR-[Z08698]和M-[Z08698]-GAP(GGGGS)4TS-[PP013]-GT(GGGGS)4PR-[Z08698]。在大肠杆菌中表达蛋白变体并基本上如在实施例6中所描述的将其纯化，但是在亲和色谱步骤之后且最后的缓冲液交换为PBS之前添加制备型反相高效液相色谱法(RP-HPLC)纯化步骤。
体外细胞测定：将MCF-7细胞(ATCC HTB-22)用胰蛋白酶消化并以25000细胞每孔接种在EnSpire-LFC微孔板(Perkin Elmer,目录号6055408)中并允许在完全培养基中在37℃下生长20h。在实验当天，将细胞用汉克平衡盐溶液(HBSS；Sigma,目录号H9269)洗涤一次。每孔添加100μl HBSS并将板在待被用于测定读取的EnSpire仪器(Perkin Elmer)内在环境温度下孵育1.5h。通过将M-[Z08698]-GAP(GGGGS)TS-[PP013]-GT(GGGGS)PR-[Z08698]和M-[Z08698]-GAP(GGGGS)4TS-[PP013]-GT(GGGGS)4PR-[Z08698]与在HBSS中的1nM HRG混合来分析这些Z-PP013-Z变体分别地阻断调蛋白诱导的信号转导的能力。包括单体Z08698-PP013用于比较。在130μl/孔的最后测定体积中用固定浓度的HRG(1nM)在5倍稀释系列中滴定分子。通过EnSpire仪器每60s持续1h记录刺激物的添加后动态质量的再分布。从剂量响应曲线确定半数最大抑制浓度(IC50)。
结果
获得的Z08698-G4S-PP013-G4S-Z08698、Z08698-(G4S)4-PP013-(G4S)4-Z08698和Z08698-PP013的IC50值分别地为0.7nM、0.6nM和1nM。因此，通过Z-PP013-Z形式的二聚体构建体增加了抑制调蛋白诱导的信号转导的能力。在Z和白蛋白结合部分之间的接头长度的影响是微小的。Z08698-PP013变体(1nM)的IC50值与在实施例7中描述的增殖测定中获得的结果是一致的，在实施例7中显示其比参照多肽Z05417-PP013更优越。
实施例10
利用 99m Tc(CO) 3 标记的Z变体对小鼠中的HER3表达异种移植物成像
在该实施例中，调查了利用放射标记的HER3特异Z变体用于成像的可行性。用99mTc(CO)3标记在N-末端具有HEHEHE-标签的Z08699并将其注射入LS174T结肠直肠癌异种移植的小鼠。注射4h后通过microSPECT/CT使肿瘤可视化。
材料和方法
Z变体的克隆、制备和标记：使用并入NdeI和XhoI限制位点和N-末端HEHEHE-标签的密码子的引物通过PCR来扩增编码Z08699的DNA。除了在IMAC纯化之后添加制备型反相高效液相色谱法(RP-HPLC)纯化步骤，基本上如在实施例3中所描述的进行HEHEHE-Z08699的亚克隆和制备。选择组氨酰基-谷氨酰基-组氨酰基-谷氨酰基-组氨酰基-谷氨酰基-(HEHEHE)-标签取代His6标签，因为其具有更良好的生物分布情况，特别是降低的肝摄取，但是仍然允许IMAC纯化(Tolmachev等人,BioconjugChem 21:2013-2022(2010))。如在实施例4中所描述的进行利用IsoLink试剂盒用99mTc(CO)3标记。
体内成像：用99mTc(CO)3-HEHEHE-Z08699(1.6MBq/1μg)注射含皮下LS174T结肠直肠癌异种移植物的Balb/c nu/nu小鼠。注射后4h时，使动物安乐死并在死后切离膀胱以提高成像质量。然后通过microSPECT(FOV:8cm,75A10准直仪，在200-250keV下获得，32次投射)进行静态全身断层检查。通过CT检查动物用于解剖关联。
结果
在图10中呈现了对具有肿瘤的小鼠(LS174T结肠癌异种移植物)施用99mTc(CO)3-HEHEHE-Z086994h后获得的microSPECT图像。肿瘤是清晰可见的。还看到在肾和肝中放射性的积累。
实施例11
利用 111 In标记的Z变体对小鼠中HER3表达异种移植物成像
在该实施例中，进一步调查了利用放射性HER3特异Z变体用于成像的可行性。适合于SPECT或PET成像的与一些放射性核素形成稳定复合物的NOTA螯合剂通过独特的C-末端半胱氨酸与HEHEHE-Z08698和HEHEHE-Z08699缀合。将分子用111In标记并注射入BT474乳腺癌异种移植的小鼠。注射后4h通过SPECTγ照相机成像使肿瘤可视化。
材料和方法
NOTA偶联的Z变体的克隆和制备：基本上如在实施例3中所描述的克隆并表达各自具有C-末端半胱氨酸残基的HEHEHE-Z08698和HEHEHE-Z08699。在1×PBS中重悬收获的细胞并通过弗氏细胞压碎器的使用使破裂。将样品加热处理达到70℃并孵育10min，然后在冰上冷却10min。通过离心(10min，30000g，4℃)澄清裂解物。用20nM DTT在40℃下持续30min还原Z变体的半胱氨酸。通过在PD-10柱上将缓冲液交换为20mM NH4醋酸盐，pH 5.5来去除过量DTT。用三倍摩尔过量的螯合剂马来酰亚胺-NOTA(CheMatech,目录号C101)进行NOTA缀合。在40℃下孵育混合物40min。通过RP-HPLC来进行从未缀合的螯合剂中的纯化。通过HPLC-MS来确认每种NOTA-偶联的Z变体的正确分子量并进行CD测量以验证保持的结构完整性。
用 111 In标记：将在100μl 20mM NH4醋酸盐，pH 5.5中的HEHEHE-Z08698-NOTA或HEHEHE-Z08699-NOTA(40μg，6nmol)与54μl111In-氯化物溶液(40MBq)混合。在85℃下孵育混合物1h。通过用0.2M柠檬酸，pH 2.0洗脱的ITLC(如在实施例4中所描述的)来分析标记效率。根据制造商的说明利用一次性NAP-5柱(GE Healthcare)纯化缀合物。
体内成像：用1μg(0.8MBq)111In-HEHEHE-Z08698-NOTA或111In-HEHEHE-Z08699-NOTA注射具有肿瘤的小鼠(BT474乳腺癌异种移植物)。注射后4h，使动物安乐死并在死后切离膀胱以提高成像质量。利用配备有中等能量通用(MEGP)准直仪的GE Infiniaγ照相机进行静态平面成像。在256×256矩阵中以3的放大系数获得静态图像(20min)。
结果
每种NOTA-缀合的Z变体的正确分子量被HPLC-MS确认并且发现纯度超过95％。CD测量验证了保持的螺旋结构以及加热达到90℃之后可逆折叠。111In-HEHEHE-Z08698-NOTA和111In-HEHEHE-Z08699-NOTA的放射化学产率分别地为97％和96％。
在图11中显示了分别注射111In-HEHEHE-Z08698-NOTA和111In-HEHEHE-Z08699-NOTA 4h后具有肿瘤的小鼠的γ照相机图像。肿瘤是清晰可见的并且图像显示高的肾清除率，在血液和除肝和肾之外的其它器官中具有极小的背景。对于111In-HEHEHE-Z08698-NOTA血液清除更好，其导致较低的背景放射性。
总结，在实施例10和11中公开的结果显示，利用本文公开的HER3特异性高亲和力Z变体对在恶性肿瘤中HER3表达的放射性核素成像是可行的，尽管在肿瘤中低的HER3表达以及在正常组织中的背景表达。通过优化标记化学反应和示踪剂量可获得提高的成像对比度。
实施例12
通过施用HER3结合Z变体体内抑制肿瘤生长
为了显示如本文公开的HER3结合Z变体体内抑制肿瘤生长，对异种移植的小鼠施用Z变体并监测肿瘤生长。一个有用的此类HER3表达肿瘤模型是ACHN异种移植物模型。
为了获得用于异种移植物实验的细胞，在含有10％胎牛血清的MEM培养基(Lonza,目录号12-611)中体外培养ACHN细胞(CRL-1611，LGCstandards)。通过将5-10×106个ACHN细胞皮下注射入NMRI nu/nu小鼠(Charles River)的右腋下来长成ACHN肿瘤。利用卡尺每周三次测量肿瘤的长和宽来测量肿瘤体积。肿瘤体积计算为长×宽2×0.44。根据普遍接受的原则，当肿瘤体积达到大约200mm3时开始研究。将小鼠随机分成含有相似的肿瘤大小分布的组。
为了用HER3结合Z变体抑制肿瘤生长，用20、2或0.2mg/kg无内毒素Z变体或媒介物对照(PBS缓冲液)静脉注射小鼠(每组10只)。在三周期间每周重复注射三次。通过利用卡尺每周测量肿瘤体积三次，并同时记录每只小鼠的体重，来追踪治疗效果。通过Students t-检验来评价在研究结束时在处理组和媒介物组之间在平均肿瘤体积上的差异。
预期以上实验的结果显示肿瘤生长被本文公开的HER3结合Z变体的剂量依赖性抑制。
实施方案的逐项列表
1.HER3结合多肽，包含HER3结合基序(BM)，该基序由选自以下的氨基酸序列组成：
i)EKYX4AYX7EIW X11LPNLTX17X18QX20AAFIGX26LX28D
其中，彼此独立地，
X4选自A、E、L、M、N、Q、R、S和T；
X7选自F和Y；
X11选自E和Q；
X17选自K、N、R和V；
X18选自F、M、N、R、T、Y和W；
X20选自A和K；
X26选自K和S；
X28选自E和Q；以及
ii)与在i)中限定的序列具有至少96％同一性的氨基酸序列。
2.根据项1所述的HER3结合多肽，其中在序列i)中，彼此独立地，
X4选自A、E、M、N、Q、S和T；
X7选自F和Y；
X11为Q；
X17选自K和R；
X18选自M、Y和W；
X20为K；
X26为K；
X28为Q。
3.根据项1所述的HER3结合多肽，其中在序列i)中的X4选自A、E、M、N、Q、S和T。
4.根据任一前述项所述的HER3结合多肽，其中在序列i)中的X4选自N和Q。
5.根据项4所述的HER3结合多肽，其中在序列i)中的X4为N。
6.根据项4所述的HER3结合多肽，其中在序列i)中的X4为Q。
7.根据任一前述项所述的HER3结合多肽，其中在序列i)中的X11为Q。
8.根据任一前述项所述的HER3结合多肽，其中在序列i)中的X17选自K、N和R，诸如选自K和R。
9.根据项8所述的HER3结合多肽，其中在序列i)中的X17为K。
10.根据项8所述的HER3结合多肽，其中在序列i)中的X17为R。
11.根据任一前述项所述的HER3结合多肽，其中在序列i)中的X18选自M、Y和W。
12.根据任一项11所述的HER3结合多肽，其中在序列i)中的X18选自Y和W。
13.根据项12所述的HER3结合多肽，其中在序列i)中的X18为Y。
14.根据项12所述的HER3结合多肽，其中在序列i)中的X18为W。
15.根据项11所述的HER3结合多肽，其中在序列i)中的X18为M。
16.根据任一前述项所述的HER3结合多肽，其中在序列i)中的X17X18选自KW、KY、KM和RY。
17.根据任一前述项所述的HER3结合多肽，其中在序列i)中的X20为K。
18.根据任一前述项所述的HER3结合多肽，其中在序列i)中的X26为K。
19.根据任一前述项所述的HER3结合多肽，其中在序列i)中的X28为Q。
20.根据任一前述项所述的HER3结合多肽，其中序列i)满足以下四个条件I、II、III和IV中的至少两个：
I)X11为Q；
II)X17X18选自KW、KY、KM和RY；
III)X20为K；
IV)X28为Q。
21.根据项20所述的HER3结合多肽，其满足所述四个条件I、II、III和IV中的至少三个。
22.根据项21所述的HER3结合多肽，其满足所有所述四个条件I、II、III和IV。
23.根据任一前述项所述的HER3结合多肽，其中序列i)选自SEQ IDNO:1-35中的任何一种。
24.根据项23所述的HER3结合多肽，其中序列i)选自SEQ IDNO:1-10中的任何一种。
25.根据项24所述的HER3结合多肽，其中序列i)选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
26.根据项25所述的HER3结合多肽，其中序列i)为SEQ ID NO:2。
27.根据项25所述的HER3结合多肽，其中序列i)为SEQ ID NO:1。
28.根据任一前述项所述的HER3结合多肽，其中所述HER3结合基序形成三螺旋束蛋白结构域的部分。
29.根据项28所述的HER3结合多肽，其中所述HER3结合基序基本上形成在所述三螺旋束蛋白结构域内的具有内部连接环的双螺旋的部分。
30.根据项29所述的HER3结合多肽，其中所述三螺旋束蛋白结构域选自细菌受体的结构域。
31.根据项30所述的HER3结合多肽，其中所述三螺旋束蛋白结构域选自来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的结构域或其衍生物。
32.根据任一前述项所述的HER3结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
iii)K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL NDXdQ；
其中
[BM]为如项1-27任一项中限定的HER3结合基序；
Xa选自A和S；
Xb选自N和E；
Xc选自A、S和C；
Xd选自A和S；
以及
iv)与在iii)中限定的序列具有至少89％同一性的氨基酸序列。
33.根据项32所述的HER3结合多肽，其中在序列iii)中Xa为A。
34.根据项32所述的HER3结合多肽，其中在序列iii)中Xa为S。
35.根据项32-34中任一项所述的HER3结合多肽，其中在序列iii)中的Xb为N。
36.根据项32-34中任一项所述的HER3结合多肽，其中在序列iii)中的Xb为E。
37.根据项32-36中任一项所述的HER3结合多肽，其中在序列iii)中的Xc为A。
38.根据项32-36中任一项所述的HER3结合多肽，其中在序列iii)中的Xc为S。
39.根据项32-36中任一项所述的HER3结合多肽，其中在序列iii)中的Xc为C。
40.根据项32-39中任一项所述的HER3结合多肽，其中在序列iii)中的Xd为A。
41.根据项32-39中任一项所述的HER3结合多肽，其中在序列iii)中的Xd为S。
42.根据项32所述的HER3结合多肽，其中在序列iii)中Xa为A；Xb为N；Xc为A且Xd为A。
43.根据项32所述的HER3结合多肽，其中在序列iii)中Xa为A；Xb为N；Xc为C且Xd为A。
44.根据项32所述的HER3结合多肽，其中在序列iii)中Xa为S；Xb为E；Xc为S且Xd为S。
45.根据项32所述的HER3结合多肽，其中在序列iii)中Xa为S；Xb为E；Xc为C且Xd为S。
46.根据项32-45中任一项所述的HER3结合多肽，其中序列iii)选自SEQ ID NO:36-70中的任一种。
47.根据项46所述的HER3结合多肽，其中序列iii)选自SEQ IDNO:36-45中的任一种。
48.根据项47所述的HER3结合多肽，其中序列iii)选自SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37。
49.根据项48所述的HER3结合多肽，其中序列iii)为SEQ ID NO:37。
50.根据项48所述的HER3结合多肽，其中序列iii)为SEQ ID NO:36。
51.根据项1-32中任一项所述的HER3结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
v)YAK-[BM]-DPSQS SELLXc EAKKL NDSQA P；
其中[BM]为如在项1-27任一项中限定的HER3结合基序且Xc选自S和C；以及
vi)与在v)中限定的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
52.根据项1-32中任一项所述的HER3结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
vii)FNK-[BM]-DPSQS ANLLXc EAKKL NDAQA P；
其中[BM]为如在项1-27任一项中限定的HER3结合基序且Xc选自A和C；以及
viii)与在vii)中限定的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
53.根据项1-31中任一项所述的HER3结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
ADNNFNK-[BM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK；
ADNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；
ADNKFNK-[BM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK；
ADAQQNNFNK-[BM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK；
AQHDE-[BM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK；
VDNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK；以及
AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK；
其中[BM]为如在项1-27任一项中限定的HER3结合基序。
54.根据项1-51中任一项所述的HER3结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
ix)AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK；
其中[BM]为如在项1-27任一项中限定的HER3结合基序，以及
x)与在ix)中限定的序列具有至少91％同一性的氨基酸序列。
55.根据项54所述的HER3结合多肽，其中序列ix)选自SEQ IDNO:71-105。
56.根据项55所述的HER3结合多肽，其中序列ix)选自SEQ IDNO:71-80。
57.根据项56所述的HER3结合多肽，其中序列ix)选自SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72。
58.根据项57所述的HER3结合多肽，其中序列ix)为SEQ ID NO:72。
59.根据项57所述的HER3结合多肽，其中序列ix)为SEQ ID NO:71。
60.根据任一前述项所述的HER3结合多肽，其中与在包含氨基酸序列SEQ ID NO:107的比较HER3结合多肽和人类HER3之间相互作用的解离速率(koff)相比，在所述HER3结合多肽和人类HER3之间的相互作用的解离速率(koff)降低至少四倍，如利用相同的实验条件测量的。
61.根据项60所述的HER3结合多肽，其中所述解离速率(koff)降低至少8倍，诸如降低至少12倍，诸如降低至少15倍。
62.根据项61所述的HER3结合多肽，其中所述解离速率(koff)降低至少20倍。
63.根据任一前述项所述的HER3结合多肽，其中在所述HER3结合多肽和人类HER3之间的相互作用的KD值为至多1×10-9M，诸如至多1×10-10M，诸如至多1×10-11M。
64.根据任一前述项所述的HER3结合多肽，还包含至少一个另外的氨基酸残基。
65.融合蛋白或缀合物，包含
a)第一部分，所述第一部分由根据任一前述项所述的HER3结合多肽组成；和
b)第二部分，所述第二部分由具有期望的生物活性的多肽组成。
66.根据项65所述的融合蛋白或缀合物，其中所述期望的生物活性为治疗活性。
67.根据项65所述的融合蛋白或缀合物，其中所述期望的生物活性为结合活性。
68.根据项65所述的融合蛋白或缀合物，其中所述期望的生物活性为酶促活性。
69.根据项66所述的融合蛋白或缀合物，其中具有期望的生物活性的第二部分为治疗活性多肽。
70.根据项65所述的融合蛋白或缀合物，其中具有期望的生物活性的第二部分选自由人类内源性酶、激素、生长因子、趋化因子、细胞因子和淋巴因子组成的组。
71.根据项67所述的融合蛋白或缀合物，其中具有结合活性的第二部分为能选择性的与靶分子相互作用的结合多肽。
72.根据项71所述的融合蛋白或缀合物，其中所述靶分子选自由白蛋白、HER3、HER2、EGFR、IGF1R、cMet、VEGFR和PDGFR组成的组。
73.根据项65-72中任一项所述的融合蛋白或缀合物，包含由具有另外的、期望的生物活性的多肽组成的另外的部分，所述另外的、期望的生物活性可与第二部分的相同或不同。
74.根据项73所述的融合蛋白或缀合物，其中第二部分为如在项66-70任一项中限定的，并且另外的部分为如在项71-72任一项中限定的。
75.根据项73所述的融合蛋白或缀合物，其中第二部分和另外的部分的每一个各自地为如在项71-72任一项中限定的。
76.根据任一前述项所述的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物，还包含细胞毒性剂。
77.根据项76所述的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中细胞毒性剂选自由以下组成的组：阿里他汀、蒽环霉素、刺孢霉素、考布他汀、阿霉素、倍癌霉素、CC-1065抗肿瘤抗生素、海鞘素、格尔德霉素、美登木素生物碱、甲氨蝶呤、真菌毒素、紫杉醇、蓖麻毒素、bouganin、白树毒素、假单胞菌外毒素38(PE38)、白喉毒素(DT)、及其类似物，及其衍生物及其组合。
78.根据任一前述项所述的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物，还包含标签。
79.根据项78所述的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中所述标签选自由以下组成的组：荧光染料和金属、发色团染料、化学发光化合物和生物发光蛋白、酶、放射性核素和颗粒。
80.根据任一前述项所述的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物，包含由通过半胱氨酸残基的巯基基团或赖氨酸残基的胺基基团缀合至HER3结合多肽的聚氨基聚羧基螯合剂提供的螯合环境。
81.根据项80所述的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中聚氨基聚羧基螯合剂为1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸或其衍生物。
82.根据项81所述的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸衍生物为1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三-乙酸-10-马来酰亚胺基乙基乙酰胺。
83.根据项80所述的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中聚氨基聚羧基螯合剂为1,4,7-三氮环壬烷-1,4,7-三乙酸或其衍生物。
84.根据项80所述的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中聚氨基聚羧基螯合剂为二亚乙基三胺五乙酸或其衍生物。
85.根据项78-84中任一项所述的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物，包含适合用于医学成像的放射性核素，所述放射性核素选自由99mTc、61Cu、64Cu、66Ga、67Ga、68Ga、110mIn、111In、44Sc和86Y组成的组；或具有适合用于治疗的放射性核素，所述放射性核素选自由225Ac、212Bi、213Bi、67Cu、166Ho、177Lu、212Pb、149Pm、153Sm、227Th和90Y组成的组，其中放射性核素通过螯合环境与HER3结合多肽复合。
86.根据项85所述的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中放射性核素选自由99mTc、111In、64Cu和68Ga组成的组。
87.根据项86所述的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中放射性核素选自99mTc和111In。
88.组合物，包含根据任一前述项所述的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物以及至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。
89.根据项88所述的组合物，还包含至少一种另外的活性剂。
90.根据项89所述的组合物，其中所述至少一种另外的活性剂为治疗剂。
91.根据项90所述的组合物，其中所述治疗剂选自由免疫刺激剂、放射性核素、毒剂、酶、招募效应细胞的因子和光敏剂组成的组。
92.根据项1-87中任一项所述的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物或根据项88-91中任一项所述的组合物，用于作为药物、诊断剂或预后剂使用。
93.根据项92所述的用于使用的HER3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其中所述多肽、融合蛋白、缀合物或组合物调节HER3信号转导，诸如抑制HER3信号转导。
94.根据项92或93所述的用于使用的HER3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，用于在HER3相关状况的治疗、诊断或预后中使用。
95.根据项94所述的用于使用的HER3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其中所述HER3相关状况为癌症。
96.根据项95所述的用于使用的HER3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其中所述癌症选自由乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌组成的组。
97.检测HER3的方法，包括提供怀疑含有HER3的样品；使所述样品与根据项1-87中任一项所述的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物或根据项88-91中任一项所述的组合物接触；以及检测HER3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物的结合以指示在样品中HER3的存在。
98.用于确定在受试者中HER3的存在的方法，该方法包括以下步骤：-使受试者、或从受试者分离的样品与根据项1-87中任一项所述的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物或根据项89-91中任一项所述的组合物接触，以及
-获得与已在所述受试者中或与所述样品结合的HER3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物的量相对应的值。
99.根据项98所述的方法，还包括将所述值与参照比较的步骤。
100.根据项97-99中任一项所述的方法，其中所述方法在体内进行。
101.根据项97-99中任一项所述的方法，其中所述方法在体外进行。
102.患有或怀疑患有以HER3的过表达为特征的癌症的受试者的身体的体内成像的方法，该方法包括以下步骤：
-将放射标记的根据项85-87中任一项所述的多肽、融合多肽或缀合物施用至哺乳动物受试者的身体内，其中放射性核素适合用于成像；以及
-在施用放射标记的多肽的1-72小时内，利用医学成像仪器获得受试者身体的至少一部分的一个或更多个图像，所述一个或更多个图像指示身体内放射性核素的存在。
103.根据项98-102所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物受试者，诸如人类受试者。
104.治疗HER3相关状况的方法，包含对需要其的受试者施用有效量的根据项1-87中任一项所述的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物或根据项89-91中任一项所述的组合物。
105.根据项104所述的方法，其中所述HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物或组合物抑制HER3信号转导。
106.根据项104或105所述的方法，其中所述HER3相关状况为癌症。
107.根据项106所述的方法，其中所述癌症选自由乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌组成的组。
108.多核苷酸，编码根据项1-75中任一项所述的HER3结合多肽或融合蛋白。
109.表达载体，包含根据项108所述的多核苷酸。
110.宿主细胞，包含根据项109所述的表达载体。
111.制备根据项1-75中任一项所述的多肽的方法，包括表达根据项108所述的多核苷酸。
112.制备根据项1-75中任一项所述的多肽的方法，包括以下：
-在允许所述多肽从所述表达载体表达的条件下培养根据项110所述的宿主细胞，以及
-分离多肽。

Claims (20)

1.HER3结合多肽，所述HER3结合多肽包含HER3结合基序(BM)，所述基序由选自以下的氨基酸序列组成：
i)EKYX4AYX7EIW X11LPNLTX17X18QX20AAFIGX26LX28D
其中，彼此独立地，
X4选自A、E、L、M、N、Q、R、S和T；
X7选自F和Y；
X11选自E和Q；
X17选自K、N、R和V；
X18选自F、M、N、R、T、Y和W；
X20选自A和K；
X26选自K和S；
X28选自E和Q；以及
ii)与在i)中限定的序列具有至少96％同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的HER3结合多肽，其中在序列i)中，彼此独立地，
X4选自A、E、M、N、Q、S和T；
X7选自F和Y；
X11为Q；
X17选自K和R；
X18选自M、Y和W；
X20为K；
X26为K；
X28为Q。
3.根据任一前述权利要求所述的HER3结合多肽，其中序列i)满足所有以下四个条件I、II、III和IV：
I)X11为Q；
II)X17X18选自KW、KY、KM和RY；
III)X20为K；
IV)X28为Q。
4.根据任一前述权利要求所述的HER3结合多肽，其中序列i)选自SEQ ID NO:1-35中的任一种。
5.根据任一前述权利要求所述的HER3结合多肽，其中所述HER3结合基序形成三螺旋束蛋白结构域的部分。
6.根据任一前述权利要求所述的HER3结合多肽，所述HER3结合多肽包括选自以下的氨基酸序列：
ix)AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK；
其中[BM]为如在权利要求1-4任一项中限定的HER3结合基序，以及
x)与在ix)中限定的序列具有至少91％同一性的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的HER3结合多肽，其中序列ix)选自SEQ IDNO:71-105。
8.根据任一前述权利要求所述的HER3结合多肽，其中当与包含氨基酸序列SEQ ID NO:107的比较HER3结合多肽和人类HER3之间的相互作用的解离速率(koff)相比，在所述HER3结合多肽和人类HER3之间的相互作用的解离速率(koff)降低至少四倍，如利用相同的实验条件测量的。
9.根据任一前述权利要求所述的HER3结合多肽，其中在所述HER3结合多肽和人类HER3之间的相互作用的KD值为至多1×10-9M，诸如至多1×10-10M，诸如至多1×10-11M。
10.融合蛋白或缀合物，所述融合蛋白或缀合物包含：
a)第一部分，所述第一部分由根据任一前述权利要求所述的HER3结合多肽组成；和
b)第二部分，所述第二部分由具有期望的生物活性的多肽组成。
11.根据权利要求10所述的融合蛋白或缀合物，其中所述期望的生物活性选自由治疗活性、结合活性和酶促活性组成的组。
12.根据任一前述权利要求所述的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物，还包含标签，其中所述标签选自由以下组成的组：荧光染料和金属；发色团染料；化学发光化合物和生物发光蛋白、酶、放射性核素和颗粒。
13.组合物，所述组合物包含根据任一前述权利要求所述的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物以及至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物或根据权利要求13所述的组合物，用于作为药物、诊断剂或预后剂使用。
15.根据权利要求1-12中任一项所述的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物或根据权利要求13所述的组合物，用于在HER3相关状况的治疗、诊断或预后中使用。
16.根据权利要求15所述的用于使用的HER3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其中所述HER3相关状况为癌症，诸如选自由乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌组成的组的癌症。
17.检测HER3的方法，所述方法包括：提供怀疑含有HER3的样品；使所述样品与根据权利要求1-12中任一项所述的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物或根据权利要求13所述的组合物接触；以及检测所述HER3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物的结合以指示所述样品中HER3的存在。
18.患有或怀疑患有以HER3的过表达为特征的癌症的受试者身体的体内成像的方法，所述方法包括以下步骤：
-将根据权利要求12所述的放射标记的多肽、融合多肽或缀合物施用至哺乳动物受试者的身体内，其中所述放射性核素适合用于成像；以及
-在施用所述放射标记的多肽的1-72小时内，利用医学成像仪器获得受试者身体的至少一部分的一个或更多个图像，所述一个或更多个图像指示所述身体内所述放射性核素的存在。
19.治疗HER3相关状况的方法，所述方法包括对需要其的受试者施用有效量的根据权利要求1-12中任一项所述的HER3结合多肽、融合蛋白或缀合物或根据权利要求13所述的组合物。
20.多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1-11中任一项所述的HER3结合多肽或融合蛋白。
CN201380051353.8A 2012-10-05 2013-10-03 Her3结合多肽 Active CN104768976B (zh)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261710051P 2012-10-05 2012-10-05
EP12187457 2012-10-05
US61/710,051 2012-10-05
EP12187457.2 2012-10-05
US201361753963P 2013-01-18 2013-01-18
EP13151882.1 2013-01-18
EP13151882 2013-01-18
US61/753,963 2013-01-18
PCT/EP2013/070605 WO2014053586A1 (en) 2012-10-05 2013-10-03 Her3 binding polypeptides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104768976A true CN104768976A (zh) 2015-07-08
CN104768976B CN104768976B (zh) 2020-09-22

Family

ID=50434382

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380051353.8A Active CN104768976B (zh) 2012-10-05 2013-10-03 Her3结合多肽

Country Status (7)

Country Link
US (1) US9745350B2 (zh)
EP (1) EP2904013B1 (zh)
JP (1) JP6440618B2 (zh)
KR (1) KR102191655B1 (zh)
CN (1) CN104768976B (zh)
HK (1) HK1207657A1 (zh)
WO (1) WO2014053586A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5960598B2 (ja) 2009-11-04 2016-08-02 アフィボディ・アーベー Ｈｅｒ３結合ポリペプチド
WO2015189431A1 (en) * 2014-06-13 2015-12-17 Affibody Ab New polypeptide
US11241511B2 (en) 2016-12-29 2022-02-08 The General Hospital Corporation HER3 peptides for imaging and radiotherapy
WO2019232418A1 (en) * 2018-06-01 2019-12-05 Northwestern University Spatial mapping of kidney functions

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101952302A (zh) * 2007-12-21 2011-01-19 阿菲博迪公司 具有her2亲和性的新多肽
WO2011056124A1 (en) * 2009-11-04 2011-05-12 Affibody Ab Her3 binding polypeptides

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
JP4871126B2 (ja) 2003-07-04 2012-02-08 アフィボディ・アーベー Ｈｅｒ２に対する結合親和性を有するポリペプチド
EP1732613A2 (en) 2004-04-06 2006-12-20 Affibody AB Use of serum albumin binding peptides conjugates for the preparation of a medicament
GB0524788D0 (en) 2005-12-05 2006-01-11 Affibody Ab Polypeptides
EP3248617A3 (en) 2007-02-16 2018-02-21 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Antibodies against erbb3 and uses thereof
ES2346178T3 (es) 2007-07-31 2015-11-02 Affibody Ab Nuevas composiciones, procedimientos y usos de unión de la albúmina
WO2009019117A1 (en) 2007-08-03 2009-02-12 Affibody Ab Igf-1r binding polypeptides and their use
ATE527353T1 (de) 2007-12-19 2011-10-15 Affibody Ab Pdgf-bindendes polypeptid aus protein a
US9211344B2 (en) 2010-07-09 2015-12-15 Affibody Ab Polypeptides

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101952302A (zh) * 2007-12-21 2011-01-19 阿菲博迪公司 具有her2亲和性的新多肽
WO2011056124A1 (en) * 2009-11-04 2011-05-12 Affibody Ab Her3 binding polypeptides

Also Published As

Publication number Publication date
KR20150083840A (ko) 2015-07-20
JP6440618B2 (ja) 2018-12-19
KR102191655B1 (ko) 2020-12-16
US20150252079A1 (en) 2015-09-10
HK1207657A1 (zh) 2016-02-05
WO2014053586A1 (en) 2014-04-10
JP2015533121A (ja) 2015-11-19
CN104768976B (zh) 2020-09-22
US9745350B2 (en) 2017-08-29
EP2904013B1 (en) 2018-11-07
EP2904013A1 (en) 2015-08-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Malm et al. Inhibiting HER3-mediated tumor cell growth with affibody molecules engineered to low picomolar affinity by position-directed error-prone PCR-like diversification
Pruszynski et al. Targeting breast carcinoma with radioiodinated anti-HER2 Nanobody
DK2590993T3 (en) Polypeptides
US10370433B2 (en) Compositions and methods for diagnosis and treatment of cancer
CN104327179A (zh) 具有her2亲和性的新多肽
CN108602888A (zh) 抑制癌症生长的结合分子
CN103288935A (zh) 多肽
CN109485726B (zh) 放射性标记抗纳米抗体在癌症的预后、诊断中的应用
Rinne et al. PET and SPECT imaging of the EGFR family (RTK class I) in oncology
CN109071621A (zh) 对降钙素基因相关肽特异性的新型蛋白
Pan et al. Site-specific PEGylation of an anti-CEA/CD3 bispecific antibody improves its antitumor efficacy
WO2012040824A1 (en) Anti-ceacam6 antibodies and uses thereof
JP2014515600A5 (zh)
Yun et al. A high-affinity repebody for molecular imaging of EGFR-expressing malignant tumors
CN104768976A (zh) Her3结合多肽
Liu et al. Potent and specific fusion toxins consisting of a HER2‑binding, ABD‑derived affinity protein, fused to truncated versions of Pseudomonas exotoxin A
Bass et al. In vivo evaluation of a novel format of a bivalent HER3-targeting and albumin-binding therapeutic affibody construct
Rinne et al. Targeting tumor cells overexpressing the human epidermal growth factor receptor 3 with potent drug conjugates based on affibody molecules
Albone et al. Generation of therapeutic immunoconjugates via Residue-Specific Conjugation Technology (RESPECT) utilizing a native cysteine in the light chain framework of Oryctolagus cuniculus
KR20240041935A (ko) 항-trop2 단일 도메인 항체 및 이의 응용
Wei et al. CF750‐A33scFv‐Fc‐Based Optical Imaging of Subcutaneous and Orthotopic Xenografts of GPA33‐Positive Colorectal Cancer in Mice
WO2016059057A1 (en) Vegfr-2 binding polypeptides

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant