MX2013009664A

MX2013009664A - Anticuerpos del cea.

Info

Publication number: MX2013009664A
Application number: MX2013009664A
Authority: MX
Inventors: Ralf Hosse; Ekkehard Moessner; Pablo Umana; Thomas U Hofer
Original assignee: Roche Glycart Ag
Priority date: 2011-03-02
Filing date: 2012-02-29
Publication date: 2013-10-30
Also published as: PT2681244T; EA201300978A1; AU2012222463B9; RS56793B1; CL2013002203A1; WO2012117002A1; ECSP13012859A; US9206260B2; HK1187056A1; NZ614125A; US20180079827A1; AU2012222463B2; US8642742B2; MX347590B; SG192972A1; HUE036229T2; CO6781491A2; LT2681244T; AU2012222463A1; BR112013021460A2

Abstract

La presente invención proporciona moléculas de unión a antígeno (ABMs) que se unen a CEA unido a membrana, incluyendo ABMS con propiedades terapéuticas mejoradas, y métodos de utilización de las mismas.

Description

ANTICUERPOS DEL CEA SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente europea n° 11 156665.9, presentada el 2 de marzo de 2011 , la exposición de la cual se incorpora en la presente memoria como referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a moléculas de unión a antígeno (ABMs). En realizaciones particulares, la presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales recombinantes, incluyendo anticuerpos quiméricos, primatizados o humanizados que se unen al antígeno carcinoembrionario humano (CEA).

ANTECEDENTES El antígeno carcinoembrionario (CEA) y los anticuerpos anti-CEA El antígeno carcinoembrionario (CEA, también conocido como CEACAM-5 ó CD66e) es una glucoproteína que presenta un peso molecular de aproximadamente 180 kDa. El CEA es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas y contiene siete dominios que se unen a la membrana celular mediante un anclaje glucosilfosfatidilinositol (GPI) (Thompson J.A., J. Clin. Lab. Anal. 5:344-366, 1991). Entre los siete dominios se incluyen un único dominio variable N-terminal de Ig y seis dominios (Al -B 1 -A2-B2-A3-B3) homólogos del dominio constante de Ig (Hefta L. J. et al. , Cáncer Res. 52:5647-5655, 1992).

La familia del CEA humano contiene 29 genes, de los cuales se expresan 18:7 pertenecen al subgrupo del CEA y 11 , al subgrupo de las glucoproteínas específicas del embarazo. Se cree que varios miembros del subgrupo del CEA presentan propiedades de adhesión celular. Se cree que CEA presenta un papel en la inmunidad innata (Hammarstrom S., Semin. Cáncer Biol. P(2):67-81, 1999). Debido a la existencia de proteínas estrechamente relacionadas con el CEA, puede resultar difícil cultivar anticuerpos anti-CEA que sean específicos del CEA con reactividad cruzada mínima con otras proteínas estrechamente relacionadas.

Desde hace mucho tiempo se ha reconocido que el CEA es un antígeno asociado a tumores (Gold y Freedman, J. Exp. Med. 121 :439-462, 1965; Berinstein N.L., J. Clin. Oncol. 20:2197-2207, 2002). Originalmente clasificado como proteína expresada únicamente en tejido fetal, ahora se ha identificado que el CEA se encuentra presente en varios tejidos adultos normales. Estos tejidos principalmente son de origen epitelial, incluyendo células de los tractos gastrointestinal, respiratorio y urogenital, y células del colon, cérvix, glándulas sudoríparas y próstata (Nap et al. , Tumour Biol. 9(2-3):145-53, 1988; Nap et al, Cáncer Res. 52(8):2329-2339, 1992).

Los tumores de origen epitelial, así como sus metástasis, contienen CEA como antígeno asociado a tumor. Aunque la presencia misma de CEA no implica transformación en una célula cancerosa, la distribución del CEA es indicativa. En el tejido normal, el CEA generalmente se expresa sobre la superficie apical de la célula (Hammarstrom S., Semin. Cáncer Biol. 9(2):67-81, 1999), provocando que resulte inaccesible a anticuerpos en el flujo sanguíneo. En contraste con el tejido normal, el CEA tiende a expresarse en toda la superficie de las células cancerosas (Hammarstrom S., Semin. Cáncer Biol. 9(2):67-81 (1999)). Este cambio del patrón de expresión provoca que el CEA resulte accesible a la unión de anticuerpos en las células cancerosas. Además, se incrementa la expresión del CEA en las células cancerosas. Adicionalmente, la expresión incrementada de CEA induce un incremento de las adhesiones intercelulares, que pueden conducir a la metástasis (Marshall J., Semin. Oncol. 30(a, supl. 8):30-6, 2003).

El CEA resulta fácilmente escindido de la superficie celular, liberándose en el flujo sanguíneo a partir de tumores, directamente o mediante el sistema linfático. Debido a dicha propiedad, el nivel de CEA sérico ha sido utilizado como marcador clínico para el diagnóstico de cánceres y el cribado para la recurrencia de algunos cánceres, en particular el cáncer colorrectal (Goldenberg D.M., The International Journal of Biological Markers 7:183-188, 1992; Chau I. et al, J. Clin. Oncol. 22:1420-1429, 2004; Flamini et al, Clin. Cáncer Res. 12(23):6985-6988, 2006). Esta propiedad también supone uno de los retos de la utilización del CEA como diana, debido a que el CEA sérico se une a la mayoría de los anticuerpos anti-CEA disponibles actualmente, dificultando que alcance su diana sobre la superficie celular y limitando los potenciales efectos clínicos.

Se han preparado múltiples anticuerpos monoclonales contra CEA con fines de investigación, como herramientas diagnósticas y con fines terapéuticos (por ejemplo Nap et al, Cáncer Res. 52(8):2329-2339, 1992; Sheahan et al, Am. J. Clin. Path. 94:157-164, 1990; Sakurai et al, J. Surg. Oncol. 42:39-46, 1989; Goldenberg D.M., The International Journal ofBiological Markers 7:183-188, 1992; Ledermann J.A., Br. J. Cáncer 58:654, 1988; Ledermann J.A., Br. J. Cáncer 68:69-73, 1993; Pedley R.B. et al, Br. J. Cáncer 68:69-73, 1993; Boxer G.M. et al, Br. J. Cáncer 65:825-831 , 1992).

Chester et al. han aislado un anticuerpo anti-CEA de una sola cadena a partir de una biblioteca de expresión fágica para su utilización en la radioinmunodetección y radioinmunoterapia (patente US n° 5.876.691) y posteriormente se humanizó el anticuerpo (patente US n° 7.232.888). También se han aislado anticuerpos anti-CEA a partir de bibliotecas humanas de expresión fágica (patente US n° 5.872.215). Se preparó el anticuerpo monoclonal de ratón PR1A3 mediante fusión de células de mieloma NS 1 (P3 NS 1 /I- Ag-4- 1 ) con células de bazo procedentes de ratones inmunizados con epitelio colorrectal normal (Richman P.I. y Bodmer W.F., Int. J. Cáncer 39:317-328, 1987). PR1A3 reacciona fuertemente con los carcinomas colorrectales, tanto los bien diferenciados como los pobremente diferenciados, y presenta ventajas respecto a otros anticuerpos reactivos con el epitelio colorrectal debido a que su antígeno aparentemente se encuentra fijo en los tumores y no aparece en el sistema linfático ni en los nodulos linfáticos normales que drenan un tumor (Granowska M. et al. , Eur. J. Nucí. Med.20:690-698, 1989). Por ejemplo, PR1 A3 reaccionó con 59/60 tumores colorrectales (Richman P.I. y Bodmer W.F., Int. J. Cáncer 39:317-328, 1987), mientras que el anticuerpo B72.3 reactivo con CEA reaccionó únicamente con 75% de los tumores colorrectales (Mansi L. et al , Int. J. Rad. Appl. Instrum. B 16(2):127-35, 1989).

El mapeado de epítopos de PRl A3 demostró que el anticuerpo presenta como diana el dominio B3 y el anclaje GPI de la molécula de CEA (Durbin H. et ai, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :4313-4317, 1994) . En consecuencia, el anticuerpo PR 1 A3 se une únicamente al CEA unido a membrana, y no a la forma soluble de CEA que puede encontrarse en el flujo sanguíneo de los pacientes de cáncer. Debido a esta propiedad de unión, es improbable que el anticuerpo PRl A3 resulte secuestrado por el CEA sérico; por el contrario, puede presentar como diana CEA expresado sobre células cancerosas. El epítopo unido a PRl A3 es un epítopo conformacional, no un epítopo lineal, que se cree contribuye a la pérdida de la unión de PRl A3 al CEA soluble (Stewart et al. , Cáncer Immunol. Immunother. 47:299-06, 1999).

El anticuerpo PR1A3 fue humanizado previamente mediante injertación de las CDRs del anticuerpo parental murino en las regiones 1 a 3 del marco de la cadena pesada del anticuerpo humano RF-TS3'CL (que conserva el marco murino 4 de PRl A3) y las regiones del marco de la cadena ligera del anticuerpo REI (Stewart et al, Cáncer Immunol. Immunother. 47:299-06, 1999). Esta versión humanizada de PRl A3 conservaba especificidad para el CEA expresado en superficie con una afinidad similar a la del anticuerpo murino (Stewart et al., Cáncer Immunol. Immunother. 47:299-06, 1999; patente US n° 5.965.710). Se demostró que un anticuerpo PR1A3 humanizado (PRl A3h) inducía la eliminación dirigida de las líneas celulares de cáncer colorrectal (Conaghhan P. J. et al. , Br. J. Cáncer 98(7):1217-1225). Sin embargo, la afinidad de PRl A3h para CEA es relativamente baja.

Los anticuerpos anti-CEA marcados radioactivamente han sido utilizados en ensayos clínicos en pacientes con cáncer colorrectal. Por ejemplo, se ha utilizado el minicuerpo quimérico T84.66 (cT84.66) marcado con 123I en un estudio clínico piloto de pacientes con cáncer colorrectal. El minicuerpo marcado radioactivamente logró dirigirse a las células diana de cáncer (Wong J.Y. et al, Clin. Cáncer Res. 10(15):5014-21, 2004). En otro ejemplo, se sometió a ensayo labetuzumab-131I, un anticuerpo anti-CEA humanizado marcado radioactivamente, en radioinmunoterapia de adyuvante en pacientes con metástasis hepáticas de cáncer colorrectal y se encontró que proporcionaba una ventaja de supervivencia prometedora (Liersch T. et al., Ann. Surg. Oncol. 14(9):2577-90, 2007).

Glucosilación de anticuerpos El componente oligosacárido puede afectar significativamente a propiedades relevantes a la eficacia de una glucoproteína terapéutica, incluyendo la estabilidad física, la resistencia al ataque de proteasas, las interacciones con el sistema inmunológico, la farmacocinética y la actividad biológica específica. Dichas propiedades pueden depender no sólo de la presencia o ausencia, sino también de las estructuras específicas de los oligosacáridos Pueden alcanzarse algunas generalizaciones sobre la relación entre estructura del oligosacárido y función de la glucoproteína. Por ejemplo, determinadas estructuras oligosacáridas median en la eliminación rápida de la glucoproteína del flujo sanguíneo mediante interacciones con proteínas de unión a carbohidrato específicas, mientras que otras pueden unirse a anticuerpos y desencadenar reacciones inmunológicas no deseadas (Jenkins N. et al., Nature Biotechnol. 14:975-81, 1996).

Las células de mamífero son los huéspedes preferentes para la producción de glucoproteínas terapéuticas, debido a su capacidad para glucosilar proteínas de la manera más compatible para la aplicación en el ser humano (Cumming et al. , Glycobiology 1 :115-30, 1991 ; Jenkins N. et al. , Nature Biotechnol. 14:975-981, 1996). Las bacterias muy raramente glucosilan las proteínas, y al igual que otros tipos de huéspedes comunes, tales como levaduras, hongos filamentosos, células de insecto y vegetales, proporcionan patrones de glucosilación asociados a la rápida eliminación del flujo sanguíneo, a interacciones inmunológicas no deseables, y en algunos casos específicos, a una actividad biológica reducida. Entre las células de mamífero, las células de ovario de hámster chino (CHO) han sido las utilizadas más comúnmente durante las últimas dos décadas. Además de proporcionar patrones de glucosilación adecuados, estas células permiten la generación consistente de líneas celulares clónales altamente productivas genéticamente estables. Pueden cultivarse hasta densidades elevadas en biorreactores simples utilizando medio libre de suero, y permiten el desarrollo de procedimientos biológicos seguros y reproducibles. Entre otras células animales utilizadas comúnmente se incluyen las células renales de hámster neonato (BHK) y las células de mieloma de ratón NSO- y SP2/0. Más recientemente, también se ha sometido a ensayo la producción de animales transgénicos (Jenkins etal., Nature Biotechnol. 14:975-81, 1996).

Todos los anticuerpos contienen estructuras de carbohidrato en posiciones conservadas en las regiones constantes de cadena pesada, presentando cada isotipo una serie diferente de estructuras de carbohidrato N-ligadas, que afectan variablemente al ensamblaje, secreción o actividad funcional de la proteína (WrightA. yMorrison S.L., TrendsBiotech. 75:26-32, 1997). La estructura del carbohidrato N-ligado unido varía considerablemente dependiendo del grado de procesamiento, y puede incluir oligosacáridos ricos en mañosa, de múltiples ramificaciones, así como oligosacáridos complejos biantenarios (Wright A. y Morrison S.L., Trends Biotech. 75:26-32, 1997). Típicamente se produce un procesamiento heterogéneo de las estructuras oligosacáridas nucleares unidas en un sitio de glucosilación particular, de manera que incluso los anticuerpos monoclonales pueden encontrarse en múltiples glucoformas. De manera similar, se ha demostrado que las diferencias principales en la glucosilación de los anticuerpos se producen entre líneas celulares, y que se observan incluso diferencias menores en una línea celular dada cultivada bajo condiciones de cultivo diferentes (Lifely M.R. et al, Glycobiology 5(8):813-22, 1995.

Una manera de obtener grandes incrementos de potencia, manteniendo simultáneamente un procedimiento simple de producción y potencialmente evitando efectos secundarios no deseables significativos, es incrementar las funciones efectoras naturales mediadas por células de los anticuerpos monoclonales mediante la manipulación de su componente oligosacárido, tal como se describe en Umaña P. et al. , Nature Biotechnol. 17: 176-180, 1999, y en la patente WO n° 6.602.684, el contenido completo de la cual se incorpora como referencia en la presente memoria. Los anticuerpos de tipo IgGl, los anticuerpos utilizados más comúnmente en la inmunoterapia del cáncer, son glucoproteínas que presentan un sitio de glucosilación N-ligada conservado en Asn297 en cada dominio CH2. Los dos oligosacáridos complejos biantenarios unidos a Asn27 se encuentran enterrados entre los dominios CH2, formando contactos extensivos con el esqueleto polipeptídico, y su presencia resulta esencial para que el anticuerpo medie en funciones efectoras, tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Lifely M. R. et al, Glycobiology 5:813-822, 1995; Jefferis R. et al, Immunol. Rev. 163:59-76, 1998; Wright A. y Morrison S.L., Trends Biotechnol. 75:26-32 (1997)).

Umaña et al. han demostrado anteriormente que la sobreexpresión de la ß(1 ,4)-?-acetilglucosarniniltransferasa III ("GnTIII"), una glucosiltransferasa que cataliza la formación de oligosacáridos bisectados en células de ovario de hámster chino (CHO), incrementa significativamente la actividad ADCC in vitro de un anticuerpo monoclonal quimérico anti-neuroblastoma (chCE7) producido por las células CHO manipuladas (ver Umana P. et al, Nature Biotechnol. 17:176-180, 1 99, y la publicación de patente internacional WO n° 99/54342, el contenido completo de la cual se incorpora como referencia en la presente memoria). El anticuerpo chCE7 pertenece auna gran clase de mAbs no conjugados que presentan una elevada afinidad y especificidad rumorales, pero que presentan demasiada poca potencia para resultar clínicamente útiles en el caso de que se produzcan en líneas celulares industriales estándares, que no presentan el enzima GnTIII (Umana P. et al, Nature Biotechnol. 17: 176- 180, 1999). Este estudio fue el primero que demostró que podían obtenerse grandes incrementos de la actividad de ADCC mediante la manipulación de las células productoras de anticuerpos para que produjesen GnTIII, lo que también conducía a un incremento de la proporción de oligosacáridos bisectados asociados a la región constante (Fe), incluyendo oligosacáridos no fucosilados bisectados, por encima de los niveles observados en anticuerpos naturales.

Sigue existiendo una necesidad de enfoques terapéuticos mejorados con diana en CEA, en particular CEA unido a membrana, para el tratamiento de cánceres.

BREVE DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la invención proporciona una molécula variante de unión a antígeno (ABM), tal como un anticuerpo, que se une al antígeno carcinoembrionario (CEA) unido a membrana. En una realización, la ABM presenta una estabilidad incrementada comparado con su molécula parental. En una realización, la ABM presenta una estabilidad incrementada y mantiene su afinidad de unión, o presenta una afinidad de unión mejorada, para el CEA unido a membrana en comparación con su molécula parental. En una realización, la ABM es estable a una temperatura que es por lo menos 0,5, 1,0, 1,5 ó 2,0 grados centígrados más alta que la de su molécula parental. En una realización, el incremento de estabilidad se mide utilizando un ensayo de dispersión lumínica dinámica. En algunas realizaciones, la molécula parental de comparación es el anticuerpo PR1 A3 ó la versión humanizada del anticuerpo PR1A3. En una realización, la molécula parental de comparación es una versión humanizada del anticuerpo PR1 A3 que comprende la región variable de cadena pesada CH7A (SEC ID n° 101) y la región variable de cadena ligera 2F1 (SEC ID n° 209). En una realización, la molécula variante de unión a antígeno es estable a 67 grados centígrados o más alta, según mediciones mediante, por ejemplo, un ensayo de dispersión lumínica dinámica. En una realización, la molécula variante de unión a antígeno se une a CEA unido a membrana a una ¾ de 100 nM o inferior. En una realización, la molécula variante de unión a antígeno se une a CEA unido a membrana a una Kj de 10 nM o inferior.

En una realización, la ABM comprende una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 1 , SEC ?) n° 2, SEC ID n° 3, SEC ID n° 5, SEC ID n° 6, SEC ID n° 7, SEC ID n° 8, SEC ID n° 9, SEC ID n° 10 y SEC ID n° 12, una CDR2 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 13, SEC ID n° 14, SEC ID n° 15, SEC ID n° 16, SEC ID n° 17, SEC ID n° 18, SEC ID n° 19, SEC ID n° 20, SEC ID n° 21, SEC ID n° 22, SEC ID n° 23 y SEC ?) n° 24, y una CDR3 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 217, SEC ID n° 218, SEC ID n° 219, SEC ID n° 220, SEC ID n° 221, SEC ?) n° 222, SEC ID n° 223 y SEC ID n° 224. En una realización, la ABM comprende una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 36, SEC ID n° 37, SEC ID n° 38, SEC ID n° 39, SEC ID n° 40, SEC ID n° 41 , SEC ID n° 42, SEC ID n° 43, SEC ID n° 44 y SEC ID n° 45, y una CDR2 de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 46 y SEC ID n° 47, SEC ID n° 48, SEC ID n° 49, SEC ID n° 50, SEC ID n° 51 , SEC ID n° 52, SEC ID n° 53, SEC ID n° 54 y SEC ID n° 55, y una CDR3 de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 56. En otra realización, la región variable de cadena pesada de la ABM comprende la CDR1 de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 1 , la CDR2 de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 13, una CDR3 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 217, SEC ID n° 218, SEC ID n° 219, SEC ID n° 220, SEC ID n° 221, SEC ID n° 222, SEC ID n° 223 y SEC ID n° 224, y la región variable de cadena ligera de la ABM comprende la CDR1 de cadena ligera de SEC ID n° 39, la CDR2 de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 49, y la CDR3 de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 56. En una realización adicional, la ABM comprende los residuos de marco de CH1A1A (SEC ED n° 261) o CH1A1B (SEC ID n° 262).

En una realización, la región variable de cadena pesada de la ABM comprende una secuencia de amioácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 233, SEC ID n° 234, SEC ID n° 235, SEC ID n° 239, SEC ID n° 241, SEC ID n° 242, SEC ID n° 243, y SEC ID n° 247 y la región variable de cadena ligera de la ABM comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a la secuencia SEC ID n° 209. En una realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada de la ABM que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo de SEC BD n° 233, SEC ID n° 234, SEC ID n° 235, SEC ID n° 239, SEC ID n° 241, SEC ID n° 242, SEC ID n° 243, y SEC ID n° 247, y una región variable de cadena ligera de la ABM que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC DD n° 209. En algunas realizaciones, la ABM comprende una región Fe, por ejemplo una región Fe de IgG humana. En determinadas realizaciones, la ABM es un anticuerpo o fragmento del mismo, tal como un anticuerpo completo, un fragmento scFv, un fragmento Fv, un fragmento F(ab')2, un minicuerpo, un diacuerpo, un triacuerpo o un tetracuerpo.

Otro aspecto de la invención proporciona un anticuerpo aislado que se une a CEA unido a membrana, en el que el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 1 , SEC ID n° 2, SEC ID n3, SEC ID n° 5, SEC ID n° 6, SEC ID n° 7, SEC ID n° 8, SEC ED n° 9, SEC ID n° 10 y SEC ID n° 12, una CDR2 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 13, SEC ID n° 14, SEC ID n° 15, SEC ED n° 16, SEC ED n° 17, SEC ED n° 18, SEC ED n° 19, SEC ED n° 20, SEC ED n° 21, SEC ED n° 22, SEC ED n° 23 y SEC ID n° 24, y una CDR.3 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ED n° 217, SEC ED n° 218, SEC ED n° 219, SEC ED n° 220, SEC ED n° 221, SEC ED n° 222, SEC ED n° 223 y SEC ED n° 224.

En una realización, el anticuerpo presenta una estabilidad incrementada comparado con su molécula parental. En una realización, el anticuerpo es estable a una temperatura que es por lo menos 0,5, 1,0, 1,5 ó 2,0 grados centígrados más alta que la de su molécula parental. En una realización, el incremento de estabilidad se mide utilizando un ensayo de dispersión lumínica dinámica. En algunas realizaciones, la molécula parental de comparación es el anticuerpo PR1 A3 ó la versión humanizada del anticuerpo PR1A3. En una realización, la molécula parental de comparación es una versión humanizada del anticuerpo PR1 A3 que comprende la región variable de cadena pesada CH7A (SEC ED n° 101 ) y la región variable de cadena ligera 2F 1 (SEC ED n° 209). En una realización, el anticuerpo es estable a 67 grados centígrados o a una temperatura superior, según mediciones mediante, por ejemplo, un ensayo de dispersión lumínica dinámica. En una realización, el anticuerpo se une a CEA unido a membrana a una Kd de 100 nM o inferior. En una realización, el anticuerpo se une a CEA unido a membrana a una Kd de 10 nM o inferior.

En una realización, el anticuerpo también comprende una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ED n° 36, SEC ED n° 37, SEC ED n° 38, SEC ED n° 39, SEC ID n° 40, SEC ED n° 41 , SEC ED n° 42, SEC ED n° 43, SEC ED n° 44 y SEC ED n° 45, y una CDR2 de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ED n° 46 y SEC ED n° 47, SEC ED n° 48, SEC ED n° 49, SEC ED n° 50, SEC ED n° 51 , SEC ED n° 52, SEC ED n° 53, SEC ED n° 54 y SEC ED n° 55, y una CDR3 de cadena ligera de SEC ED n° 56. En una realización, la región variable de cadena pesada del anticuerpo comprende la CDR1 de cadena pesada de SEC ID n° 1, la CDR2 de cadena pesada de SEC ID n° 13, una CDR3 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 217, SEC ID n° 218, SEC ID n° 219 SEC ID n° 220, SEC ? n° 221 , SEC ID n° 222, SEC ID n° 223 y SEC ID n° 224; y la región variable de cadena ligera del anticuerpo que comprende la CDR1 de cadena ligera de SEC ID n° 39, la CDR2 de cadena ligera de SEC ID n° 49, y la CDR3 de cadena ligera de SEC ID n° 56. En uan realización adicional, el anticuerpo comprende los residuos de marco de CH1A1A (SEC ID n° 261) o CH1A1B (SEC ?) n° 262). En una realización, la región variable de cadena pesada del anticuerpo comprende una secuencia de amioácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 233, SEC ID n° 234, SEC ID n° 235, SEC ID n° 239, SEC ID n° 241 , SEC ID n° 242, SEC ID n° 243, y SEC ID n° 247 y la región variable de cadena ligera del anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a la secuencia SEC ID n° 209. En una realización, la región variable de cadena pesada del anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 233, SEC ID n° 234, SEC ID n° 235, SEC ID n° 239, SEC ID n° 241, SEC ID n° 242, SEC ID n° 243, y SEC ID n° 247, y una región variable de cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID n° 209.

En determinadas realizaciones, la ABM o anticuerpo de las realizaciones anteriormente indicadas se une al mismo epítopo, o es capaz de competir para la unión con el mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal murino PR1A3.

En una realización, la ABM o el anticuerpo comprende una región Fe que ha sido glucomanipulada. En una realización, por lo menos aproximadamente 20% a aproximadamente 100% de los oligosacáridos N-ligados en la región Fe del anticuerpo glucomanipulado son no fucosilados. En una realización, por lo menos aproximadamente 20% a aproximadamente 100% de los oligosacáridos N-ligados en la región Fe glucomanipulada son bisectados. En una realización, por lo menos aproximadamente 20% a aproximadamente 50% de los oligosacáridos N-ligados en la región Fe glucomanipulada son bisectados no íücosilados. En una realización, la ABM o anticuerpo glucomanipulado presenta por lo menos una función efectora incrementada. La función efectora incrementada es, por ejemplo, una afinidad de unión a receptor Fe incrementada, una citotoxicidad celular mediada por anticuerpos (ADCC) incrementada, una unión a células NK incrementada, una unión a macrófagos incrementada, una unión a monocitos incrementada, una unión a células polimorfonucleares incrementada, señalización directa inductora de apoptosis, maduración de células dendríticas incrementada y cebado de células T incrementado. En una realización, la ABM o anticuerpo glucomanipulado presenta un incremento de la ADCC de por lo menos aproximadamente 40% a aproximadamente 100% en comparación con la molécula de unión a antígeno parental no glucomanipulada.

Otro aspecto de la invención proporciona un polinucleótido aislado codificante de la ABM o anticuerpo de cualquiera de las realizaciones anteriormente indicadas. Otro aspecto de la invención proporciona un polinucleótido aislado codificante de la ABM o anticuerpo de cualquiera de las realizaciones anteriormente indicadas. Otro aspecto de la invención proporciona una célula huésped que comprende dicho vector.

Otro aspecto de la invención proporciona una composición que comprende la ABM o anticuerpo de cualquiera de las realizaciones anteriormente indicadas y un portador farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la invención proporciona un método para inducir la lisis celular de una célula tumoral, que comprende poner en contacto la célula tumoral con la ABM o anticuerpo de cualquiera de las realizaciones anteriormente indicadas. En algunas realizaciones, la célula tumoral es una célula de cáncer colorrectal, NSCLC (cáncer pulmonar de células no pequeñas), célula de cáncer gástrico, célula de cáncer pancreático o células de cáncer de mama. En una realización, la lisis celular se induce mediante citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos de la ABM o anticuerpo.

Otro aspecto de la invención proporciona un método de tratamiento de un sujeto que presenta un cáncer que expresa anormalmente CEA, comprendiendo el método la administración en el sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de la ABM o anticuerpo de cualquiera de las realizaciones anteriormente indicadas.

Otro aspecto de la invención proporciona un método de incrementar el tiempo de supervivencia en un sujeto que presenta un cáncer que expresa anormalmente CEA, comprendiendo el método la administración en dicho sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de la ABM o anticuerpo de cualquiera de las realizaciones anteriormente indicadas. En una realización, el cáncer es cáncer colorrectal, cáncer pulmonar de células no pequeñas (NSCLC), cáncer gástrico, cáncer pancreático o cáncer de mama.

En determinadas realizaciones de estos métodos, la ABM, anticuerpo o composición se administra en combinación con quimioterapia o terapia de radiación. En una realización, el sujeto es un ser humano.

Otro aspecto de la invención proporciona la utilización de la ABM o anticuerpo de cualquiera de las realizaciones anteriormente indicadas en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un sujeto que presenta un cáncer que expresa anormalmente CEA. En una realización, el cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste de cáncer colorrectal, cáncer pulmonar de células no pequeñas (NSCLC), cáncer gástrico, cáncer pancreático o cáncer de mama.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIGURA 1 muestra un diagrama esquemático del antígeno CEA (CEAC AM-5 , CD66e). El anticuerpo PRl A3 se une específicamente al dominio B3 del antígeno en el caso de que se una a la membrana celular.

La FIGURA 2 muestra la actividad ADCC incrementada de un anticuerpo PRl A3 quimérico glucomanipulado en comparación con anticuerpo PRl A3 quimérico no glucomanipulado con PBMCs humanas como efectoras.

La FIGURA 3 muestra la actividad de unión a antígeno de un anticuerpo PR1 A3 humanizado que comprende un constructo de región variable de cadena pesada, CH7A, y un constructo de región variable de cadena ligera, CL1A, en comparación con el anticuerpo PR1A3 quimérico.

La FIGURA 4 muestra los sitios de aleatorización para generar una biblioteca de anticuerpos para la maduración de afinidad de la cadena ligera del anticuerpo PR1 A3 humanizado. Se aleatorizaron las posiciones marcadas con una X.

La FIGURA 5 muestra los sitios de aleatorización para generar una biblioteca de anticuerpos para la maduración de afinidad de la cadena pesada del anticuerpo PR1A3 humanizado. Se aleatorizaron las posiciones marcadas con una X.

La FIGURA 6 muestra la actividad de unión de los anticuerpos anti-CEA de afinidad madurada derivados de un anticuerpo PR1A3 humanizado que comprende un constructo de región variable de cadena pesada CH7ArF9 y un constructo de región variable de cadena ligera CL1 ArHl 1.

La FIGURA 7 muestra los resultados de un estudio de eficacia en ratones SCID/bg que recibieron la administración por vía intraesplénica de células del carcinoma colorrectal humano LS 174T con el fin de crear un modelo de tumor ortotópico. Se inicio la terapia de anticuerpos siete días después mediante inyección de los anticuerpos a una dosis de 25 mg/kg de peso corporal, seguido de dos inyecciones por semana adicionales. "CH7A" representa un anticuerpo humanizado que comprende las CDRs de PR1 A3 tal como se indica en la presente memoria. "SM3E" se refiere a un anticuerpo anti-CEA generado previamente. "GA201 " representa un anticuerpo anti-EGF humanizado utilizado a modo de control positivo. "PBS" se refiere a una solución salina tamponada con fosfato, que se utilizó a modo de control negativo. Se estimó la supervivencia según los criterios de terminación definidos por la autoridad reguladora suiza.

La FIGURA 8 muestra los resultados de un estudio de eficacia en ratones SCED bg que recibieron una inyección intravenosa de células de carcinoma pulmonar A549, en donde se injertaba el tumor en el pulmón de los animales. Se inicio la terapia de anticuerpos siete días después mediante inyección de los anticuerpos a una dosis de 25 mg kg de peso corporal, seguido de dos inyecciones por semana adicionales. "CH7A", "SM3E" y "GA201 " son tal como se indica en la figura 7, anteriormente. La denominación "CH7 ArF9 CLl A rHl 1 " representa una variante del anticuerpo CH7A con cadenas pesada y ligera de afinidad madurada. La denominación "ge" indica que el anticuerpo ha sido glucomanipulado para que presente u número reducido de oligosacáridos fücosilados en la región Fe. El término "vehículo" se refiere al control negativo. Las células de carcinoma pulmonar A549 son fuertemente positivas para la expresión de EGFR y débilmente positivas para la expresión de CEA.

La FIGURA 9 muestra los resultados de un estudio de eficacia en ratones SCUVbg que recibieron una inyección intraesplénica de células de carcinoma gástrico MKN45, que genera metástasis tumoral en el hígado de los animales. Las denominaciones "CH7ArF9 CLl A rHl 1 ", "SM3E", "ge" y "PBS" son tal como se ha indicado en las figuras 7 y 8, anteriormente.

La FIGURA 10 muestra el análisis cinético de los clones de afinidad madurada: (a) muestra un sensograma de Fabs anti-CEA con una cadena pesada de afinidad madurada CH7A H4E9 (SEC ID n° 199) conjuntamente con la cadena ligera no madurada CLl A (SEC ID n° 105), una cadena ligera de afinidad madurada CLl A pAC 18 (SEC ID n° 209) en combinación con la cadena pesada no madurada CH7A, y una combinación de las mismas, CH7A H4E9 y CLl A pAC 18 (SEC ID n° 199 y n° 209); (b) resumen del análisis cinético de los clones de afinidad madurada.

La FIGURA 11 muestra una visión general esquemática de la estrategia de PCR de la aleatorización de CDR1 y CDR2 de la cadena pesada del anticuerpo anti-CEA CH7A humanizado.

La FIGURA 12 muestra una visión general esquemática de la estrategia de PCR de la aleatorización de CDR1 y CDR2 de la cadena ligera del anticuerpo anti-CEA CLl A humanizado.

La FIGURA 13 muestra una visión general esquemática de la estrategia de PCR de la aleatorización de CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo anti-CEA CH7A humanizado.

La FIGURA 14 muestra una visión general esquemática de la estrategia de PCR de la aleatorización de CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo anti-CEA CLl A humanizado.

La FIGURA 15 muestra la afinidad de unión de los anticuerpos anti-CEA para CEA unido a membrana sobre células diana MKN45. Los anticuerpos anti-CEA humanizados con cadena ligera de afinidad madurada (panel A, CH7A, CLlArH7 ó CH7A, CLl ArHl 1) o cadenas pesada y ligera de afinidad madurada (panel B, CH7A rB9, CLl A rHl 1 G2(l)) que han sido convertidos en IgG muestran una unión mejorada en comparación con el anticuerpo de control (CH7A, CLl A).

La FIGURA 16 muestra los resultados de un ensayo de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) con anticuerpos de afinidad madurada (CH7ArB9, CL 1 A rH 11 G2( 1 ), CH7Arf9, CLl ArHl 1G2(1) y CH7A, CLl A rHl 1 G2(l)) en comparación con anticuerpos de control (CH7A, CLl A G2(R2)).

La FIGURA 17 muestra los resultados de un ensayo de unión celular para el anticuerpo anti- CEA con cadena pesada CHIA en comparación con el anticuerpo quimérico de ratón-humano chPRlA3.

La FIGURA 18 muestra los resultados de un ensayo de unión de anticuerpos anti-CEA con cadena pesada CH1A1, CH1A2, CH1 A3 ó CH1A4 y cadena ligera 2F1.

La FIGURA 19 muestra los resultados de un ensayo de estabilidad de anticuerpos anti-CEA con cadena pesada CH1A1, CH1 A2, CH1 A3 ó CH1A4.

La FIGURA 20 muestra el resultado de un análisis de resonancia de plasmón superficial (SPR) de anticuerpos anti-CEA generados a partir de CH1 Al.

La FIGURA 21 muestra el resultado de ensayos de unión celular de anticuerpos anti-CEA generados a partir de CH 1 A 1.

La FIGURA 22 muestra mediciones de resonancia de plasmón superficial (SPR) de la afinidad (medida en la forma bivalente) de anticuerpos anti-CEA de estabilidad manipulada en comparación con la cadena pesada de 5HFF12 parental.

Las FIGURAS 23 y 24 muestran los resultados de un ensayo de estabilidad para el anticuerpo de afinidad madurada 5HFF12 en comparación con su cadena pesada parental CH7A con las mutaciones puntuales individuales introducidas que se seleccionaron en 5HFF12.

La FIGURA 25 muestra el análisis de resonancia de plasmón superficial de las variantes combinadas de marco y CDR-H3.

La FIGURA 26 muestra la actividad ADCC de las variantes de marco basadas en CHAI A.

La FIGURA 27 muestra la actividad ADCC de las variantes de marco basadas en CHAI A.

La FIGURA 28 muestra la actividad ADCC de las variantes combinadas de marco y CDR-H3.

La FIGURA 29 muestra la actividad ADCC de las variantes combinadas de marco y CDR-H3.

La FIGURA 30 muestra la eficacia del anticuerpo anti-CEA glucomanipulado CH1A1A (Y98A/D99Y) x 2F1 en un modelo de xenoinjerto de carcinoma colorrectal en ratones SCID transgénicos para el CD16 humano.

La FIGURA 31 muestra la eficacia del anticuerpo anti-CEA glucomanipulado CH1A1A (Y98A/D99Y) x 2F1 en un modelo de xenoinjerto de carcinoma pulmonar A549 en ratones SCID transgénicos para el CD16 humano.

La FIGURA 32 muestra las secuencias de aminoácidos de las CDRs de las diversas ABMs anti-CEA.

La FIGURA 33 muestra las secuencias de aminoácidos de los constructos de cadena ligera de diversos ABMs anti-CEA.

La FIGURA 34A-B muestra las secuencias de aminoácidos de CDRs de cadenas pesada y ligera de afinidad madurada y afinidades de unión asociadas.

La FIGURA 35 muestra las constantes de afinidad para las diversas secuencias de anticuerpo de afinidad madurada.

La FIGURA 36 muestra las secuencias de aminoácidos de CDR-H3 de diversas ABMs anti-CEA.

La FIGURA 37A-C muestra las secuencias de aminoácidos de VH de diversas ABMs anti- CEA.

La FIGURA 38 muestra las alineaciones de secuencia de aminoácidos de regiones VH de diversos anticuerpos anti-CEA de estabilidad madurada.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Los términos se utilizan en la presente memoria tal como se utilizan generalmente en la técnica, a menos que se definan de otro modo a continuación.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "molécula de unión a antígeno" se refiere en su sentido más amplio a una molécula que se une específicamente a un determinante antigénico. Un ejemplo no limitativo de una molécula de unión a antígeno es un anticuerpo o fragmento del mismo que conserva la capacidad de unión a un antígeno específico. Más concretamente, tal como se utiliza en la presente memoria, una "molécula de unión a antígeno que se une a antígeno carcinoembrionario (CEA) humano unido a membrana" es una ABM que se une específciamente a CEA, más particualrmente a CEA de superficie celular o unido a membrana. La expresión "se une específicamente" se refiere a que la unión es selectiva para el antígeno y puede discriminarse de interacciones no deseadas o no específicas.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpo" pretende incluir moléculas completas de anticuerpo, incluyendo anticuerpos monoclonales, policlonales y multiespecíficos (por ejemplo biespecíficos), así como fragmentos de anticuerpo que presentan una región Fe y que conservan la especificidad de unión, y proteínas de fusión que incluyen una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina y que conservan la especificidad de unión. También se encuentran comprendidos los fragmentos de anticuerpo que conservan la especificidad de unión, incluyendo, aunque sin limitación, fragmentos de VH, fragmentos de VL, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos scFv, fragmentos Fv, minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos (ver, por ejemplo, Hudson y Souriau, Nature Med. 9: 129-134, 2003).

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "dominio de unión a antigeno" se refiere a la parte de una molécula de unión a antígeno que comprende el área que se une específicamente, y es complementaria, a parte o la totalidad de un antígeno. En el caso de que el antígeno sea grande, una molécula de unión a antígeno podría sólo unirse a una parte particular del antígeno, denominándose a esta parte, epítopo. Un dominio de unión a antígeno puede ser proporcionado por, por ejemplo, uno o más dominios variables de anticuerpo. Preferentemente, un dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y una región variable de cadena pesada de anticuerpo (VH).

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "de afinidad madurada" en el contexto de las moléculas de unión a antígeno (por ejemplo anticuerpos) se refiere a una molécula de unión a antígeno que se deriva de una molécula de unión a antígeno de referencia, por ejemplo mediante mutación, que se une al mismo antígeno, preferentemente que se une al mismo epítopo, que el anticuerpo de referencia, y que presenta una afinidad más alta para el antígeno que para la molécula de unión a antígeno de referencia. La maduración de la afinidad generalmente implica la modificación de uno o más residuos aminoácidos en una o más CDRs de la molécula de unión a antígeno. Típicamente, la molécula de unión a antígeno de afinidad madurada se une al mismo epítopo que la molécula de unión a antígeno de referencia inicial.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "afinidad de unión" se expresa generalmente en términos de constantes de asociación o disociación de equilibrio (Ka o Kd, respectivamente), que a su vez son proporciones recíprocas de constantes de tasa de disociación y asociación (kd y ka, respectivamente). De esta manera, las afinidades equivalentes pueden comprender diferentes constantes de tasa, con la condición de que la proporción entre las constantes de tasa siga siendo la misma.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "región Fe" se refiere a una región C-terminal de una cadena pesada de IgG. Aunque los límites de la región Fe de una cadena pesada de IgG pueden variar ligeramente, la región Fe de cadena pesada de IgG humana habitualmente se define que se encuentra comprendida entre el residuo aminoácido en la posición Cys226 y el extremo carboxilo-terminal.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina" pretende incluir las variantes alélicas naturales de la región Fe de una inmunoglobulina, así como variantes que presentan alteraciones que producen sustituciones, adiciones o deleciones pero que no reducen sustancialmente la capacidad de la inmunoglobulina de mediar en funciones efectoras (tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos). Por ejemplo, puede delecionarse uno o más aminoácidos del extremo N-terminal o C-terminal de la región Fe de una inmunoglobulina sin pérdida sustancial de la función biológica. Dichas variantes pueden seleccionarse según normas generales que es conocido de la técnica que presentan un efecto mínimo sobre la actividad (ver, por ejemplo, Bowie J.U. et al., Science 247:1306-10, 1990).

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "CEA humana unida a membrana" se refiere a un antígeno carcinoembrionario (CEA) humano que se une a una parte de membrana de una célula o a la superficie de una célula, en particular a la superficie de una célula tumoral. La expresión "CEA humano unido a membrana" puede, bajo determinadas circunstancias, referirse a CEA que no se encuentra unido a la membrana de una célula, pero que ha sido construido para que conserve el epítopo al que se une el anticuerpo PRl A3. La expresión "CEA soluble" se refiere a antígeno carcinoembrionario humano que no se encuentra unido o que ha sido escindido de una membrana celular o de la superficie celular (por ejemplo una superficie de célula tumoral) y/o que, típicamente, no conserva el epítopo conformacional al que se une el anticuerpo PRl A3. El CEA soluble puede encontrarse, por ejemplo, en el flujo sanguíneo o linfático de un sujeto que presenta cáncer.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "ninguna reactividad cruzada sustancial contra CEA soluble" se refiere a que una molécula (por ejemplo una molécula de unión a antígeno) no reconoce o se une específicamente a CEA soluble, particularmente en comparación con CEA unido a membrana. Por ejemplo, una molécula de unión a antígeno puede unirse a entre menos de aproximadamente 10% y menos de aproximadamente 5% del CEA soluble, o puede unirse a CEA soluble en una cantidad seleccionada de entre el grupo que consiste de menos de aproximadamente 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,2% ó 0,1%, preferentemente menos de aproximadamente 2%, 1% ó 0,5% del CEA soluble, y más preferentemente menos de aproximadamente 0,2% ó 0,1% del CEA soluble.

Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos "fusión" y "quimérico", utilizados en referencia a polipéptidos tales como los AbMs, se refieren a polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos derivadas de dos o más polipéptidos heterólogos, tales como partes de anticuerpos procedentes de diferentes especies. Para las ABMs quiméricas, por ejemplo, los componentes que no se unen no antígeno pueden derivarse de una amplia diversidad de especies, incluyendo primates, tales como chimpancés y seres humanos. La región constante de la ABM quimérica generalmente es sustancialmente idéntica a la región constante de un anticuerpo humano natural; la región variable del anticuerpo quimérico generalmente comprende una secuencia que se deriva de un anticuerpo anti-CEA recombinante que presenta la secuencia de aminoácidos de la región variable del PR1 A3 murino. Los anticuerpos humanizados son una forma particularmente preferente de anticuerpos de fusión o quimérico.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "humanizado" se utiliza para referirse a una molécula ligante de antígeno derivada en parte de una molécula ligante de antígeno no humana, por ejemplo un anticuerpo murino que conserva, o que conserva sustancialmente, las propiedades de unión a antígeno de la molécula parental pero que es menos inmunogénica en el ser humano. Lo anterior puede llevarse a cabo mediante diversos métodos (denominados en la presente memoria "humanización"), incluyendo, aunque sin limitarse a ellos: (a) la injertación de los dominios variables no humanos completos en regiones constantes humanas con el fin de generar anticuerpos quiméricos, (b) la injertación de únicamente las CDRs no humanas (por ejemplo la molécula donante de unión a antígeno) en regiones constantes y de marco (por ejemplo una molécula receptora de unión a antígeno) humanas con o sin retención de residuos de marco críticos (por ej emplo aquellos que resultan importantes para conservar una buena afinidad de unión a antígeno o funciones de anticuerpo), o (c) trasplantar los dominios variables no humanos completos, aunque "enmascarándolos" con una sección de tipo humano mediante sustitución de residuos de superficie. Dichos métodos se dan a conocer en Jones et al., Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81 :6851 -6855, 1984; Morrison y Oi, Adv. Immunol. 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al, Science 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun. 28:489-498, 1991 ; Padlan, Molec. Immun. 31(3): 169-217, 1994, la totalidad de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad en la presente memoria. Existen de manera general tres regiones determinantes de complementariedad, o CDRs (CDR1, CDR2 y CDR3) en cada una de las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo, que se encuentran flanqueadas por cuatro subregiones de marco (es decir, FR1 , FR2, FR3 y FR4) en cada uno de los dominios variables de cadena pesada y de cadena ligera de un anticuerpo: FR1 -CDR1 -FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Puede encontrarse un comentario sobre los anticuerpos humanizados en, entre otras referencias, la patente US n° 6.632.927, y en la solicitud publicada de patente US n° 2003/0175269, ambas incorporadas como referencia en su totalidad en la presente memoria. La humanización también puede llevarse a cabo mediante el trasplante de CDRs truncadas que contienen únicamente los residuos aminoácidos determinantes de especificidad para la CDR dada en un marco seleccionado. La expresión "residuos determinantes de especificidad* se refiere a aquellos residuos que participan directamente en la interacción específica con el antígeno y/o que resultan necesarios para la unión específica de antígeno. En general, únicamente un quinto a un tercio de los residuos en una CDR dada participan en la unión a antígenos. Los residuos determinantes de especificidad en una CDR particular pueden identificarse mediante, por ejemplo, el cálculo de los contactos interatómicos a partir del modelado tridimensional y la determinación de la variabilidad de las secuencias en una posición de residuo dada según los métodos descritos en Padlan et al. , FASEB J. 9(1):133-139, 1995, el contenido de la cual se incorpora como referencia en la presente memoria en su totalidad.

En algunos casos, los residuos de la región marco (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Además, las moléculas de unión a antígeno humanizadas pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se llevan a cabo para refínar adicionalmente la actividad de la molécula de unión a antígeno. En general, la molécula de unión a antígeno humanizada comprende sustancialmente la totalidad de por lo menos un, y típicamente dos, domimos variables, en los que la totalidad, o sustancialmente la totalidad, de las regiones hipervariables corresponden a las de una inmunoglobulina no humana, y la totalidad o sustancialmente la totalidad de las FRs corresponden a las de una secuencia de inmunoglobulina humana. La molécula de unión a antígeno humanizada opcionalmente también comprende por lo menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente la de una inmunoglobulina humana (ver, por ejemplo, Jones et al, Nature 321:522-525, 1986; Reichmanneí al, Nature 332:323-329, 1988, y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992).

De manera similar, tal como se utiliza en la presente memoria, el término "primatizado" se utiliza para referirse a una molécula de unión a antígeno derivada de una molécula de unión a antígeno no de primate, por ejemplo un anticuerpo murino que conserva, o que conserva sustancialmente, las propiedades de unión a antígeno de la molécula parental pero que es menos inmunogénica en primates.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "variante" (o "análogo") se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido específicamente mencionado de la invención en inserciones, deleciones y sustituciones creadas utilizando, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante. Concretamente, pueden sintetizarse variantes recombinantes codificantes de dichos polipéptidos o de polipéptidos similares, o seleccionarse mediante la utilización de la "redundancia" del código genético. Pueden introducirse diversas sustituciones de codones, tales como cambios silenciosos que producen diversos sitios de restricción, para optimizar la clonación en un vector plásmido o vírico en un sistema procariótico o eucariótico particular. Las mutaciones en la secuencia polinucleótida pueden reflejarse en el polipéptido o dominios de otros péptidos añadidos al polipéptido para modificar las propiedades de una parte cualquiera del polipéptido, a fin de modificar características tales como las afinidades de unión a ligandos, las afinidades entre cadenas o la tasa de degradación/renovación.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "molécula variante de unión a antígeno anti-CEA" se refiere a una molécula que difiere en la secuencia de aminoácidos respecto de una secuencia de aminoácidos de una molécula "parental" de unión a antígeno anti-CEA en virtud de la adición, deleción y/o sustitución de uno o más residuos aminoácidos en la secuencia parental de anticuerpo. En una realización específica, la variante comprende una o más sustituciones de aminoácidos en una o más regiones mpervariables of CDRs de la cadena pesada y/o ligera de la molécula parental de unión a antígeno. Por ejemplo, la variante puede comprender por lo menos una, por ejemplo entre aproximadamente una y aproximadamente diez (es decir, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10), y preferentemente entre aproximadamente dos y aproximadamente cinco sustituciones en una o más regiones hipervariables o CDRs (es decir, 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6 regiones hipervariables o CDRs) de la molécula parental de unión a antígeno. Una molécula variante de unión a antígeno anti-CEA también puede comprender una o más adiciones, deleciones y/o sustituciones en una o más regiones marco de la cadena pesada o de la cadena ligera. Habitualmente, la variante presenta una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% respecto a las secuencias de dominio variable de cadena pesada o ligera de la molécula parental de unión a antígeno, típicamente por lo menos aproximadamente 80%, 90%, 95% ó 99%. La identidad con respecto a la secuencia se define en la presente memoria como el porcentaje de residuos aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos a los del anticuerpo parental, tras alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para alcanzar el máximo porcentaje de identidad de secuencia. Ninguna de las extensiones, deleciones o inserciones N-terminales, C-terminales o internas en la secuencia del anticuerpo debe interpretarse que afecta a la identidad o a la homología de secuencia. La molécula variante de unión a antígeno conserva la capacidad de unirse a CEA humano unido a membrana. En una realización, la ABM anti-CEA se une al mismo epítopo que la molécula parental de unión a antígeno. En una realización, la ABM anti-CEA compite para la unión a CEA humano unido a membrana con la molécula parental de unión a antígeno. En una realización, la ABM anti-CEA se une a CEA humano unido a membrana y no se una a CEA humano soluble. La ABM anti-CEA presenta propiedades que son superiores a las de la molécula parental de unión a antígeno. Por ejemplo, la variante puede presentar una mayor afinidad de unión, una estabilidad incrementada y/o una capacidad mejorada de inducir citotoxicidad celular mediada por anticuerpos in vitro e in vivo. En una realización, la ABM anti-CEA presenta una estabilidad incrementada y conserva o mejora la afinidad de unión para CEA unido a membrana y conserva o mejora la capacidad de inducir citotoxicidad celular mediada por anticuerpos in vitro e in vivo.

Para analizar dichas propiedades, debe compararse de manera general una molécula variante de unión a antígeno y la molécula parental de unión a antígeno en el mismo formato; por ejemplo, una forma Fab de la molécula variante de unión a antígeno a una forma Fab de la molécula parental de unión a antígeno o una forma de longitud completa de la molécula variante de unión a antígeno a una forma de longitud completa de la molécula parental de unión a antígeno. En una realización, la molécula variante de unión a antígeno presenta por lo menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 veces más actividad biológica que la molécula parental de unión a antígeno. En una realización, la molécula variante de unión a antígeno es una variante de estabilidad manipulada que presenta una estabilidad incrementada en comparación con la molécula parental de unión a antígeno. La estabilidad puede someterse a ensayo mediante cualquier método conocido de la técnica y mediante los métodos descritos en la presente memoria, concretamente en los Ejemplos 3 a 6. En realizaciones específicas, la molécula variante de unión a antígeno presenta por lo menos aproximadamente 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 40, 50 ó 100 veces más estabilidad que la molécula parental de unión a antígeno.

En algunas realizaciones, la molécula variante de unión a antígeno muestra una estabilidad incrementada que se mide como un cambio en el parámetro de estabilidad en comparación con la molécula parental de unión a antígeno. En algunas realizaciones, la molécula variante de unión a antígeno presenta un cambio en el parámetro de estabilidad de por lo menos aproximadamente 1 ,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 40, 50 ó 100 veces comparado con la unión del antígeno paretal. Un parámetro de estabilidad es, por ejemplo, la temperatura a la que la molécula variante de unión a antígeno se despliega o desnaturaliza, la presión a la que la molécula variante de unión a antígeno se despliega o desnaturaliza, o el tiempo necesario para desanturalizarse o desplegarse la molécula variante de unión a antígeno bajo condiciones diseñadas para inestabilizar la molécula variante de unión a antígeno. En una realización, el incremento de estabilidad se incrementa mediante un ensayo térmico de desnaturalización, por ejemplo mediante calorimetría de escaneo diferencial (DSC). En una realización, el incremento de estabilidad se determina mediante un ensayo de desnaturalización química. En una realización, el incremento de estabilidad se determina mediante un ensayo de desnaturalización química. En otra realización, la estabilidad de la molécula variante de unión a antígeno se determina utilizando un ensayo de polarización de fluorescencia. En una realización, la estabilidad de la molécula variante de unión a antígeno se determina utilizando un ensayo de dispersión lumínica dinámica (DLS) (ver los Ejemplos y, por ejemplo, Nobbmann U. et al. , Biotech. Genetic Eng. Rev. 24: 117-128, 2007). El ensayo DLS realiza un seguimiento de la integridad de una molécula, tal como un anticuerpo, en el que, en general, un incremento de la dispersión lumínica indica despligue o desnaturalización de la proteína. El ensayo DLS de las moléculas puede examinarse como función de la temperatura o desnaturalizantes químicos con el fin de comparar las estabilidades relativas. Aquellas moléculas que permanecen en su conformación nativa incremento reducido o nulo de las propiedades del ensayo DLS) se considera que son estables bajo las condiciones de ensayo. En una realización, la molécula variante de unión a antígeno es estable a una temperatura que es por lo menos 0,25, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 ó 10,0 grados centígrados superior a la de la ABM parental, u otra molécula de referencia apropiada, al analizarse utilizando un ensayo de dispersión lumínica dinámica. En una realización, la molécula variante de unión a antígeno es estable a 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 grados centígrados o a una temperatura superior. La estabilidad térmica puede medirse, por ejemplo, utilizando un ensayo DLS, DSC o de polarización de fluorescencia. En una realización, la estabilidad térmica de la molécula variante de unión a antígeno se mide utilizando un ensayo DLS. En una realización, el ensayo DLS se llevó a cabo utilizando 1 mg/ml de la ABM o ABM variante en un tampón de histidina 20 mM y NaCl 140 mM, a pH 6,0. El ensayo DLS se lleva a cabo desde 25°C, con un incremento por etapas de la temperatura de 0,05°C/minuto.

El término "parentaF* referido a una molécula de unión a antígeno se refiere a una ABM que se utiliza como punto de partida o base para la preparación de la variante. En una realización específica, la molécula parental de unión a antígeno presenta una región marco humana y, en caso de encontrarse presente, presenta una o más regiones constantes de anticuerpo humanas. Por ejemplo, el anticuerpo parental puede ser un anticuerpo humanizado o humano.

Las "sustituciones" de aminoácidos pueden resultar en la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que presente propiedades estructurales y/o químicas similares, por ejemplo sustituciones conservadoras de aminoácidos. Pueden realizarse sustituciones "conservadoras" de aminoácidos basándose en similitudes de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza antipática de los residuos implicados. Por ejemplo, entre los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) se incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; entre los aminoácidos neutros polares se incluyen glicina, serina, treonina, cisterna, tirosina, asparagina y glutamina; entre los aminoácidos cargados positivamente (básicos) se incluyen arginina, lisina e histidina; y entre los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) se incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Las "inserciones" o "deleciones" generalmente son de entre aproximadament 1 y aproximadamente 20 aminoácidos, más concretamente de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 aminoácidos, y todavía más concretamente, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5 aminoácidos. Las sustituciones no conservadoras implican el intercambio de un miembro de una de dichas clases por uno de otra clase. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos también pueden resultar en la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que presente propiedades estructurales y/o químicas diferentes, por ejemplo la sustitución de un aminoácido de un grupo (por ejemplo polar) por otro aminoácido de un grupo diferente (por ejemplo básico). La variación permitida puede determinarse experimentalmente realizando sistemáticamente inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en una molécula de polipéptido utilizando técnicas de ADN recombinante y sometiendo a ensayo las variantes recombinantes que resultan para su actividad.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "Fv de una cadena", o "scFv", se refiere a un fragmento de anticuerpo que comprende un dominio VH y un dominio VL en forma de una única cadena polipeptídica. Típicamente, los dominios de VH y de VL se unen mediante una secuencia conectora. Ver, por ejemplo, Pluckthun, en: The PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg and Moore, editores, Springer-Verlag, New York, páginas 269 a 315, 1994.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "miiúcuerpo" se refiere a un derivado scFv homodimérico bivalente que contiene una región constante, típicamente la región CH3 de una inmunoglobulina, preferentemente IgG, más preferentemente IgG 1 , como región de dimerización. Generalmente, la región constante se conecta al scFv mediante una región bisagra y/o una región conectora. Pueden encontrarse ejemplos de proteínas minicuerpo en Hu et al. Cáncer Res. 56: 3055-61 , 1996.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "diacuerpo" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de unión a antígeno, comprendiendo los fragmentos un dominio variable de cadena pesada (VH) conectados a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Mediante la utilización de un conector excesivamente corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se fuerza el apareamiento de los dominios con los dominios complementarios de otra cadena, creando dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen en mayor detalle en, por ejemplo, las patentes EP n° 404.097, WO n° 93/11161 y en Hollinger et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993. Un triacuerpo resulta de la formación de un trímero trivalente de tres scFvs, rindiendo tres sitios de unión, y un tetracuerpo es un tetrámero tetravalente de cuatro scFvs, resultando en cuatro sitios de unión.

En el caso de que existan dos o más defiiciones de una expresión que se utilice y/o se encuentre aceptada en la técnica, la definición del término utilizada en la presente memoria pretenderá incluir la totalidad de dichos sigificados, a menos que se indique explícitamente lo contrario. Un ejemplo específico es la utilización de la expresión "región determinante de complementariedad" ("CDR") para referirse a los sitios de unión a antígeno no contiguos (también conocidos como regiones de unión a antígeno) presentes dentro de la región variable de polipéptidos tanto pesados como ligeros. Las CDRs también se denominan "regiones hipervariables" y esta expresión se utiliza intercambiablemente en la presente memoria con el término "CDR" en referencia a las partes de la región variable que forman las regiones de unión a antígeno. Esta región particular ha sido descrita por Kabat et al, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 1986, y por Chothia et al, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987, incorporándose como referencia en la presente memoria, en las que las definiciones incluyen residuos aminoácidos solapantes o subconjuntos de aminoácidos al compararlas entre sí. Sin embargo, la aplicación de cualquiera de las definiciones para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes de la misma pretende encontrarse comprendida dentro del alcance de la expresión según se define y se utiliza en la presente memoria. Los residuos aminoácidos apropiados que comprenden las CDRs tal como se definen en cada uan de las referencias citadas se proporcionan a continuación, en la Tabla 1, a modo comparativo. El número exacto de residuos que comprende una CDR particular varía dependiendo de la secuencia y tamaño de la CDR. El experto en la materia podrá determinar rutinariamente qué residuos comprende una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.

TABLA 1. Definiciones de CDR1 numeración de todas las definiciones de CDR en la Tabla 1 sigue las convenciones de numeración proporcionadas por Kabat et al. (ver posteriormente). 2 "AbM" con una "b" minúscula, tal como se utiliza en la Tabla 1 , se refiere a las CDRs según la definición del programa informático de modelado de anticuerpos "AbM" de Oxford Molecular.

Kabat et al. también han definido un sistema de numeración para las secuencias de dominio variable que resulta aplicable a cualquier anticuerpo. El experto ordinario en la materia podrá asignar inequívocamente este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de dominio variable sin basarse en ningún dato experimental más allá de la secuencia misma. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración proporcionado por Kabat et al. , U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 1983. A menos que se indique lo contrario, las referencias a la numeración de posiciones específicas de residuos aminoácidos en una ABM siguen el sistema de numeración de Kabat. Las secuencias del listado de secuencias (es decir, SEC ID n° 1 a n° 216) no están numeradas según el sistema de numeración de Kabat. Sin embargo, al experto ordinario en la materia le resultará familiar cómo convertir las secuencias en el listado de secuencias a numeración de Kabat.

La referencia a un ácido nucleico o polinucleótido que presenta una secuencia de nucleótidos por lo menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia de nucleótidos de referencia de la presente invención, se pretende decir que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia, excepto en que la secuencia polinucleótida puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales porcada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que presente una secuencia de nucleótidos por lo menos 95% idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia pueden delecionarse o sustituirse por otro nucleótido, o puede insertarse en la secuencia de referencia un grupo de nucleótidos de hasta 5% de los nucleótidos totales de la secuencia de referencia.

En la práctica, puede determinarse convencionalmente si alguna molécula particular de ácido nucleico o de polipéptido es idéntica por lo menos al 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% a una secuencia de nucleótidos o polipeptídica de la presente invención utilizando programas informáticos conocidos. Un método para deten inar la correspondencia global óptima entre una secuencia problema (una secuencia de la presente invención) y una secuencia de base de datos, también denominado alineación global de secuencias, puede determinarse utilizando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al, Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990. En una alineación de secuencias, las dos secuencias, la problema y la de la base de datos, son secuencias de ADN. Puede compararse una secuencia de ARN mediante la conversión de los U en T. El resultado de dicha alineación global de secuencias se expresa en porcentaje de identidad. Los parámetros preferentes utilizados en una alineación de FASTDB de las secuencias de ADN para calcular el porcentaj e de identidad son: Matriz=unitaria, k-tuplo=4, penalización por no apareamiento= 1 , penalización por unión=30, longitud de grupo de aleatorización=0, puntuación de corte=l, penalización por hueco=5, penalización por tamaño de hueco=0,05, tamaño de ventana=500 ó la longitud de la secuencia de aminoácidos de base de datos, la que sea más corta.

En el caso de que la secuencia de base de datos sea más corta que la secuencia problema debido a deleciones 5' ó 3', no debido a deleciones internas, debe realizarse una corrección manual de los resultados. Lo anterior se debe a que el programa FASTDB no considera los truncados 5' y 3' de la secuencia de base de datos al calcular el porcentaje de identidad global. Para secuencias de base de datos truncadas en los extremos 5' ó 3' respecto a la secuencia problema, se corrige el porcentaje de identidad calculando el número de bases de la secuencia problema que se encuentran 5' y 3' respecto a la secuencia de base de datos, que no corresponden/no se encuentran alineados, como porcentaje del total de bases de la secuencia problema. Se determina si un nucleótido es correspondiente/se encuentra alineado a partir de los resultados de la alineación de secuencias de FASTDB. A continuación, se resta este porcentaje del porcentaje de identidad, calculado por el programa FASTDB anteriormente indicado utilizando los parámetros especificados, para llegar a un valor final de porcentaje de identidad. Esta puntuación corregida es la utilizada para los fines de la presente invención. Únicamente las bases fuera de las bases 5 ' y 3 ' de la secuencia de base de datos, tal como se visualizan en la alineación de FASTDB, que no sean correspondientes/se encuentren alineadas con la secuencia problema, se calculan con el fin de ajustar manualmente la puntuación de porcentaje de identidad.

Por ejemplo, una secuencia de base de datos de 90 bases se alinea con una secuencia problema de 100 bases para determinar el porcentaje de identidad. La deleción se produce en el extremo 5' de la secuencia de base de datos y por lo tanto, la alineación de FASTDB no muestra una correspondencia/alineación de las primeras bases en el extremo 5'. Los 10 residuos no apareados representan 10% de la secuencia (número de residuos en los extremos 5' y 3' no correspondientes/número total de bases en la secuencia problema), de manera que se resta 10% del valor de porcentaje de identidad calculado por el programa FASTDB. En el caso de que los restantes 90 residuos fueran perfectamente correspondientes, el porcentaje de identidad final sería del 90%. En otro ejemplo, se compara una secuencia de base de datos de 90 bases con una secuencia problema de 100 bases. En esta ocasión las deleciones son internas, de manera que no existen residuos en los extremos 5' ó 3' de la secuencia de base de datos que no sean correspondientes/no se encuentren alineados con la secuencia problema. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. Nuevamente, únicamente las bases 5' y 3' de la secuencia de base de datos que no sean correspondientes/no se encuentren alineados con la secuencia problema se corrigen manualmente. No se realiza ninguna otra corrección manual para los fines de la presente invención.

Al indicar que un polipéptido presenta una secuencia de aminoácidos por lo menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia de aminoácidos problema de la presente invención, se hace referencia a que la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la base de datos es idéntica a la secuencia problema excepto en que la secuencia polipeptídica de la base de datos puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos problema. En otras palabras, para obtener un polipéptido que presente una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos problema, pueden insertarse, delecionarse o sustituirse por otro aminoácido hasta 5% de los residuos aminoácidos en la secuencia de la base de datos. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones amino-terminales o carboxi-terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier sitio entre dichas posiciones terminales, entremezcladas individualmente entre residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

En la práctica, si cualquier polipéptido particular es idéntico por lo menos al 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% respecto a un polipéptido de referencia puede detemiinarse convencionalmente utilizando programas informáticos conocidos. Un método para determinar la correspondencia global óptima entre una secuencia problema (una secuencia de la presente invención) y una secuencia de base de datos, también denominado alineación global de secuencias, puede determinarse utilizando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al, Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990. En una alineación de secuencias, las secuencias problema y de base de datos son ambas secuencias de nucleótidos o son ambas secuencias de aminoácidos. El resultado de dicha alineación global de secuencias se expresa como porcentaje de identidad. Los parámetros preferentes utilizados en una alineación de aminoácidos de FASTDB son: Matriz=PAM 0, k-tuplo=2, penalización por no apareamiento=l, penalización por unión=20, longitud de grupo de aleatorización=0, puntuación de corte=l, tamaño de ventana=longitud de la secuencia, penalización por hueco=5, penalización por tamaño de hueco=0,05, tamaño de ventana=500 ó la longitud de la secuencia de aminoácidos de base de datos, la que sea más corta.

En el caso de que la secuencia de base de datos sea más corta que la secuencia problema debido a deleciones N-terminales o C-terminales, no debido a deleciones internas, debe realizarse una corrección manual de los resultados. Lo anterior se debe a que el programa FASTDB no considera los truncados N-terminales y C-terminales de la secuencia de base de datos al calcular el porcentaje de identidad global. Para secuencias de base de datos truncadas en los extremos N-terminal y C-terminal respecto a la secuencia problema, se corrige el porcentaje de identidad calculando el número de residuos de la secuencia problema que son N-terminales y C-terminales respecto a la secuencia de base de datos que no corresponden/no se encuentran alineados con un residuo correspondiente de la secuencia de base de datos, como porcentaje del total de bases de la secuencia problema. Se determina si un residuo es correspondiente/se encuentra alineado a partir de los resultados de la alineación de secuencias de FASTDB. A continuación, se resta este porcentaje del porcentaje de identidad, calculado por el programa FASTDB anteriormente indicado utilizando los parámetros especificados, para llegar a un valor final de porcentaje de identidad. Este valor final de porcentaje de identidad es el utilizado para los fines de la presente invención. Unicamente se consideran los residuos en los extremos N-terminal y C-terminal de la secuencia de base de datos que no son correspondientes/no se encuentran alineados con la secuencia problema, para los fines de ajustar manualmente el valor de porcentaje de identidad. Es decir, únicamente posiciones de residuos de la secuencia problema situados fuera de los residuos N-terminales y C-terminales más alejados de la secuencia de base de datos.

Por ejemplo, una secuencia de base de datos de 90 residuos aminoácidos se alinea con una secuencia problema de 100 residuos para determinar el porcentaje de identidad. La deleción se produce en el extremo N-terminal de la secuencia de base de datos y por lo tanto, la alineación de FASTDB no muestra una correspondencia aineación de los primeros 10 residuos desde el extremo N-terminal. Los 10 residuos no apareados representan 10% de la secuencia (número de residuos en los extremos N-terminal y C-terminal no correspondientes/número total de residuos en la secuencia problema), de manera que se resta 10% del valor de porcentaje de identidad calculado por el programa FASTDB. En el caso de que los restantes 90 residuos fueran perfectamente correspondientes, el porcentaje de identidad final sería del 90%. En otro ejemplo, se compara una secuencia de base de datos de 90 residuos con una secuencia problema de 100 residuos. En esta ocasión las deleciones son internas, de manera que no existen residuos en los extremos N-terminal o C-terminal de la secuencia de base de datos que no sean correspondientes/no se encuentren alineados con la secuencia problema. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. Nuevamente, únicamente las posiciones de los residuos más allá de los extremos N-terminal y C-terminal de la secuencia de base de datos, tal como las muestra la alineación de FASTDB, que no son correspondientes/no se encuentran alineados con la secuencia problema son corregidas manualmente. No debe realizarse ninguna otra corrección manual para los fines de la presente invención.

El porcentaje de identidad de los polinucleótidos y/o polipéptidos también puede determinarse utilizando los programas BLAST disponibles del National Center for Biotechnology Information (NCBI), con los parámetros por defecto indicados en los programas.

Tal como se utiliza en la presente memoria, un ácido nucleico que "se hibride bajo condiciones restrictivas" con una secuencia de ácidos nucleicos de la invención se refiere a un polinucleótido que se híbrida bajo condiciones especificadas, por ejemplo en una incubación durante la noche a 42°C en una solución que comprende formamida al 50%, 5x SSC (NaCl 750 mM, citrato sódico 75 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5x solución de Denhardt, dextrán sulfato al 10% y 20 µg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, seguido del lavado de los filtros en 0,lx SSC a aproximadamente 65°C.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "un polipéptido que presenta actividad de GnTIIF se refiere a polipéptidos que son capaces de catalizar la adición de un residuo N-acetilglucosamina (GlcNAc) en enlace ß- 1-4 al manósido ß-ligado del núcleo trimanosilo de los oligosacáridos religados. Lo anterior incluye los polipéptidos de fusión que muestran una actividad enzimática similar, aunque no necesariamente idéntica, a una actividad de ß(1,4)-?-acetilglucosarniniltransferasa III, también conocida como P-l,4-manosil-glucoproteína 4-ß-?-acetilglucosarninil-transferasa (EC 2.4.1.144), según el comité de nomenclatura del International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB), medida en un ensayo biológico particular, con o sin dependencia de la dosis. En el caso de que exista dependencia de la dosis, ésta no es necesariamente idéntica a la de GnTÜI, sino que, por el contrario, es sustancialmente similar a la dependencia de la dosis en una actividad dada en comparación con la GnTIII (es decir, el polipéptido candidato muestra una actividad mayor, o no superior a aproximadamente 25 veces menos y, preferentemente, no superior a aproximadamente diez veces menos, y más preferentemente, no superior a aproximadamente tres veces menos actividad que GnTUI).

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "dominio de localización en Golgi" se refiere a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido residente en el Golgi que es responsable del anclaje del polipéptido en una localización dentro del complejo de Golgi. Generalmente, los dominios de localización comprenden "colas" ammoterminales de un enzima.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "función efectora" se refiere a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe (una región Fe de secuencia nativa o región Fe de secuencia variante de aminoácidos) de un anticuerpo. Entre los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, afinidad de unión a receptor Fe, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), secreción de citoquinas, incorporación de antígenos por parte de células presentadoras de antígeno mediada por complejo inmunológico, regulación negativa de receptores de superficie celular, etc.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "manipular, manipulado, manipulación", particularmente con el prefijo "gluco", así como la expresión "manipulación mediante glucosilación", se considera que incluyen cualquier manipulación del patrón de glucosilación de un polipéptido natural o recombinante o fragmento del mismo. La glucomanipulación incluye la manipulación metabólica de la maquinaria de glucosilación de una célula, incluyendo manipulaciones genéticas de las rutas de síntesis de oligosacáridos para conseguir la glucosilación alterada de las glucoproteínas expresadas en estas células. Además, la manipulación mediante glucosilación incluye los efectos de mutaciones y del ambiente celular sobre la glucosilación. En una realización, la manipulación mediante glucosilación es una alteración de la actividad de glucosiltransferasa. En una realización particular, la manipulación resulta en una actividad glucosaminiltransferasa y/o actividad fucosiltransferasa alterada.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "célula huésped" cubre cualquier tipo de sistema celular que pueda manipularse para generar los polipéptidos y moléculas de unión a antígeno de la presente invención. En una realización, la célula huésped se manipula para permitir la producción de una molécula de unión a antígeno con glucoformas modificadas. En una realización preferente, la molécula de unión a antígeno, o molécula variante de unión a antígeno, es un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o proteína de fusión. En determinadas realizaciones, las células huésped han sido manipuladas adicionalmente para expresar niveles incrementados de uno o más polipéptidos que presentan actividad de GnTffl. Entre las células huésped se incluyen células en cultivo, por ejemplo células de mamífero en cultivo tales como células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, células de levadura, células de insecto y células vegetales, entre otras, aunque también células comprendidas dentro de un animal transgénico, planta transgénica o tejido vegetal o animal en cultivo.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "citotoxicidad celular mediada por Fe" incluye la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad celular mediada por una proteína de fusión de Fe soluble que contiene una región Fe humana. Es un mecanismo inmunológico que conduce a la lisis de "células diana" por parte de "células inmunológicas efectoras humanas".

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "células inmunológicas efectoras humanas" se refiere a una población de leucocitos que expresan receptores de Fe sobre su superficie a través de los cuales se unen a la región Fe de moléculas de unión a antígeno o de proteínas de fusión con Fe y llevan a cabo funciones efectoras. Dicha población puede incluir, aunque sin limitarse a ellas, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y/o células asesinas naturales (NK).

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "células diana" se refiere a células a las que se unen específicamente moléculas de unión a antígeno que comprenden una región de Fe (por ejemplo anticuerpos o fragmentos de los mismos que comprenden una región Fe) o proteínas de fusión con Fe. Las moléculas de unión a antígeno o proteínas de fusión de Fe se unen a las células diana a través de la parte proteína que es N-terminal respecto a la región Fe.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "citotoxicidad celular mediada por Fe incrementada" se define como un incremento del número de "células diana" que resultan lisadas en un tiempo dado, a una concentración dada de molécula de unión a antígeno o de proteína de fusión con Fe, en el medio circundante a las células diana, por el mecanismo de citotoxicidad celular mediada por Fe definido anteriormente, y/o una reducción de la concentración de molécula de unión a antígeno o de la proteína de fusión de Fe, en el medio circundante a las células diana, necesaria para conseguir la lisis de un número dado de "células diana" en un tiempo dado por el mecanismo de citotoxicidad celular mediada por Fe. El incremento de la citotoxicidad celular mediada por Fe es relativa a la citotoxicidad celular mediada por la misma molécula de unión a antígeno o proteína de fusión de Fe, producida por el mismo tipo de células huésped, utilizando los mismos métodos estándares de producción, purificación, formulación y almacenamiento (que son conocidos por el experto en la materia), pero que no ha sido producido por células huésped que han sido manipuladas para que presenten un patrón alterado de glucosilación (por ejemplo para expresar la glucosiltransferasa, GnTIH u otras glucosiltransferasas) mediante los métodos descritos en la presente memoria.

La expresión "molécula de unión a antígeno que presenta una citotoxicidad celular mediada or anticuerpos (ADCC) incrementada" se refiere a una molécula de unión a antígeno, tal como se define este término en la presente memoria, que presenta una ADCC incrementada según se determina mediante cualquier método adecuado conocido por el experto ordinario en la materia. Un ensayo in vitro de ADCC aceptado es el siguiente: 1) el ensayo utilizó células diana que es conocido que expresaban el antígeno diana reconocido por la región de unión a antígeno del anticuerpo, el ensayo utiliza células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) humanas, aisladas a partir de sangre de un donante sano seleccionado aleatoriamente, a modo de células efectoras, el ensayo se lleva a cabo según el protocolo siguiente: se aislan las PBMCs utilizando procedimientos estándares de centrifugación en gradiente de densidad y se suspenden a una densidad de 5x 106 células/ml en medio de cultivo celular RPMI, se cultivaron las células diana mediante métodos de cultivo de tejido estándares, se recolectan de la fase de crecimiento exponencial con una viabihdad superior al 90%, se lavaron en medio de cultivo celular RPMI, se marcan con 100 µ??t?eß de 51Cr, se lavaron dos veces con medio de cultivo celular, y se resuspendieron en medio de cultivo celular a una densidad de 10S células/ml, se transfieren 100 microlitros de la suspensión final de células diana anteriormente indicada a cada pocilio de una placa de microtitulación de 96 pocilios, el anticuerpo se diluyó en serie entre 4.000 ng ml y 0,04 ng/ml en medio de cultivo celular y se añadieron 50 microlitros de las soluciones de anticuerpo resultantes a las células diana en la placa de microtitulación de 96 pocilios, realizando un ensayo por triplicado de diversas concentraciones de anticuerpo que cubrían el intervalo completo de concentraciones anteriormente indicado, para los controles de liberación máxima (MR), 3 pocilios adicionales en la placa que contiene las células diana marcadas recibieron 50 microlitros de una solución acuosa al 2% (v/v) de detergente no iónico (Nonidet, Sigma, St. Louis) en lugar de la solución de anticuerpos (punto iv, anteriormente), vi) para los controles de liberación espontánea (SR), 3 pocilios adicionales en la placa que contiene las células diana marcadas reciben 50 microlitros de medio de cultivo celular RPMI en lugar de la solución de anticuerpos (punto iv, anteriormente), vii) la placa de microtitulación de 96 pocilios seguidamente se centrifuga a 50xg durante 1 minuto y se incuba durante 1 hora a 4°C, viii) se añaden 50 microlitros de la suspensión de PBMCs (punto i, anteriormente) a cada pocilio, rindiendo una proporción de célula efectora:diana de 25:1, y las placas se introducen en un incubador bajo una atmósfera de 5% de C02 a 37°C durante 4 horas, ix) se recolecta el sobrenadante libre de células de cada pocilio y la radioactividad liberada experimentalmente (ER) se cuantifica utilizando un contador gamma, x) se calcula el porcentaje de lisis específica para cada concentración de anticuerpo según la fórmula (ER-MR)/(MR-SR) x 100, en la que ER es la radioactividad media cuantificada (ver el punto ix, anteriormente) para la concentración de anticuerpos correspondiente, MR es la radioactividad media cuantificada (ver el punto ix, anteriormente) para los controles MR (ver el punto v, anteriormente), y SR es la radioactividad media cuantificada (ver el punto ix, anteriormente) para los controles SR (ver el punto vi, anteriormente), 4) se define "ADCC incrementada" como un incremento del porcentaje máximo de lisis específica observada dentro del intervalo de concentraciones de anticuerpo sometido a ensayo anteriormente, y/o una reducción de la concentración de anticuerpos necesaria para alcanzar la mitad del porcentaje máximo de lisis específica observado dentro del intervalo de concentraciones de anticuerpo sometido a ensayo anteriormente. El incremento de ADCC es respecto a la ADCC, medida con el ensayo anteriormente indicado, mediada por el mismo anticuerpo, producida por el mismo tipo de células huésped, utilizando los mismos métodos estándares de producción, purificación, formulación y almacenamiento, que son conocidos por el experto en la materia, pero que no ha sido producido por células huésped manipuladas para sobreexpresar GnTIII.

Moléculas, polipéptidos y polinucleótidos de unión a antígeno anti-CEA El antígeno CEA ha sido utilizado desde hace mucho tiempo como marcador de cáncer con fines diagnósticos. Se expresa a niveles anormales (por ejemplo se sobreexpresa y/o se distribuye en un patrón diferente en la célula) en muchos tejidos tumorales en comparación con tejidos no tumorales del mismo tipo celular. Sin embargo, debido a que CEA generalmente se escinde de la superficie de la célula tumoral y la mayor parte de los anticuerpos anti-CEA disponibles también se unen al CEA soluble, los anticuerpos de CEA no conjugados generalmente no son utilizados con fines terapéuticos. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CEA que se encuentran actualmente en ensayos piloto se administran en forma de conjugados radioactivos. Se encuentran implicados varios mecanismos en la eficacia terapéutica de los anticuerpos anti-CEA, incluyendo la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Un nivel incrementado de la expresión de CEA estimula un nivel incrementado de adhesión intercelular, lo que puede conducir a la metástasis de las células cancerosas (Marshall J., Semin. Oncol. 30(3), supl. 8:30-36). De esta manera, las moléculas de unión anti-CEA también podrían desempeñar un papel en la inhibición de la adhesión celular mediada por CEA y la metástasis de las células cancerosas.

En un aspecto, la invención se refiere a una molécula variante de unión a antígeno (por ejemplo un anticuerpo o fragmento del mismo) que comprende una o más (por ejemplo una, dos, tres, cuatro, cinco o seis) CDRs del anticuerpo PRl A3 murino, en el que una de las CDRs presenta una sustitución de por lo menos un residuo aminoácido en comparación con la CDR correspondiente de PRl A3, y en el que la molécula variante de unión a antígeno presenta una afinidad mejorada para CEA, preferentemente para CEA unido a membrana, en comparación con una molécula parental PR1A3 de unión a antígeno. La solicitud de patente internacional WO n° 2011/023787 describe moléculas de unión a antígeno anti-CEA con afinidad mejorada para CEA en comparación con una molécula parental PR1 A3 de unión a antígeno.

En otro aspecto, la invención se refiere a una molécula variante de unión a antígeno que comprende una o más (por ejemplo una, dos, tres, cuatro, cinco o seis) CDRs del anticuerpo PR1 A3 murino, en el que por lo menos una de las CDRs presenta una sustitución de por lo menos un residuo aminoácido en comparación con la CDR correspondiente de PR1A3, y en el que la molécula variante de unión a antígeno presenta una estabilidad incrementada en comparación con una molécula parental PR1A3 de unión a antígeno. En una realización, la molécula parental PR1A3 de unión a antígeno es una molécula PR1A3 de unión a antígeno humanizada. En una realización, la molécula parental PR1A3 de unión a antígeno comprende la región variable de cadena pesada de CH7A (SEC ID n° 101). En una realización, la molécula parental PR1A3 de unión a antígeno comprende la región variable de cadena pesada CH7A (SEC ID n° 101) y la región variable de cadena ligera 2F1 (SEC ID n° 209). Dicha CDR o CDRs pueden ser CDRs truncadas y contienen, como n ínimo, los residuos determinantes de especificidad (SDRs), según se define esta expresión en la presente memoria, para una CDR dada. En una realización, la molécula variante de unión a antígeno comprende por lo menos una (por ejemplo una, dos, tres, cuatro, cinco o seis) de las CDRs seleccionadas de entre SEC ID n0 l a 3, 5 a 10, 12 a 56 y 217 a 224 (fig. 32 y fig. 36), comprendiendo los residuos de las CDRs que retienen la unión específica. En otra realización, la molécula variante de unión a antígeno comprende por lo menos una (por ejemplo una, dos, tres, cuatro, cinco o seis) de las CDRs seleccionadas de entre SEC ED n° 1 a 3, 5 a l0, 12 a 56 y217 a 224, o una variante o forma truncada de las mismas que contiene los residuos determinantes de especificidad de dicha CDR, y que comprende una secuencia derivada de un polipéptido heterólogo. En una realización específica, en la que la molécula variante de unión a antígeno comprende una CDR1 variante de cadena pesasda de PR1A3, la HCDR1 presenta un glutamato sustituido por una valina en la posición Kabat n° 31. En una realización específica, en la que la molécula variante de unión a antígeno comprende una CDR3 variante de cadena pesada de PR1 A3, la HCDR3 presenta una alanina sustituida por una tirosina en la posición Kabat n° 98 o una tirosina sustituida por un aspartato en la posición Kabat n° 99. En una realización específica, en la que la molécula variante de unión a antígeno comprende una CDR3 variante de cadena pesada de PR1 A3, la HCDR3 presenta una alanina sustituida por una tirosina en la posición Kabat n° 98 y una tirosina sustituida por un aspartato en la posición Kabat n° 99.

En una realización, la molécula variante de unión a antígeno comprende una CDR3 de cadena pesada seleccionada de entre SEC ID n° 217 a 224 (fig. 36) y dos CDRs de cadena pesada (por ejemplo HCDR1 y HCDR2) seleccionadas de entre SEC ID n° 1 a 3, 5 a 10 y 12 a 24 y/o tres CDRs de cadena ligera (por ejemplo LCDR1, LCDR2 y LCDR3) seleccionadas de entre SEC ID n" 36 a 56, o una variante o forma truncada de los mismos que contiene por lo menos los residuos determinantes de especificidad de cada una de las CDRs. En una realización más específica, la molécula variante de unión a antígeno comprende una CDR3 de cadena pesada seleccionada de entre SEC ID n° 217 a 224 y dos CDRs de cadena pesada (por ejemplo HCDR1 y HCDR2) seleccionadas de entre SEC ID n0 I a 3, 5 a l0 y l2 a 24 y/o tres CDRs de cadena ligera (por ejemplo LCDR1, LCDR2 y LCDR3) seleccionadas de entre SEC ID n° 36-56 . En otra realización, la molécula variante de unión a antígeno comprende la región o regiones variables de una cadena ligera y/o pesada de anticuerpo, preferentemente una región variable tanto de cadena pesada como de cadena ligera. En una realización más particular, la región variable de cadena pesada y/o ligera se selecciona de entre las regiones variables de cadena pesada y/o ligera seleccionadas de entre SEC ID n° 99 a 108, SEC ID n° 188 a 216, y SEC ID n° 225 a 248 (fig. 33 y fig. 37A-C) o una combinación de las mismas, en las que, la región variable de cadena pesada y ligera no es una combinación de SEC ID n° 99 y SEC ID n° 103 ó SEC ID n° 100 y SEC ID n° 104. En algunas realizaciones, la cadena pesada comprende los residuos marco deCHl Al A (SEC ID n° 261) O CH1A1B (SEC DD n° 262) (fig. 37C). En una realización, la molécula variante de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada seleccionada de entre SEC ID n° 225, SEC ID n° 226, SEC ID n° 231 , SEC ID n° 234, SEC ID n° 235, SEC ID n° 239, SEC ED n° 241 , SEC ID n° 242, SEC ID n° 243 ó SEC ID n° 247.

En una realización, la molécula variante de unión a antígeno es un anticuerpo quimérico, más concretamente, un anticuerpo humanizado. En otra realización, la molécula variante de unión a antígeno comprende una región Fe. En otra realización, la molécula variante de unión a antígeno es de afinidad madurada. En otra realización, la molécula variante de unión a antígeno se manipula para que presente una estabilidad incrementada (de estabilidad madurada). En otra realización, la molécula variante de unión a antígeno presenta una actividad ADCC incrementada en comparación con PR1 A3. En una realización, la ADCC incrementada de la molécula variante de unión a antígeno se debe a un incremento de la afinidad de la molécula variante de unión a antígeno del CEA unido a membrana, por ejemplo mediante maduración de la afinidad u otros métodos de mejora de la afinidad (ver Tang eí al., J. Immunol. 179:2815-2823, 2007, el contenido completo de la cual se incorpora como referencia en la presente memoria). En otra realización, la molécula variante de unión a antígeno comprende una región Fe que ha sido glucomanipulada. En otro aspecto, la invención también se refiere a métodos de preparación de dichas moléculas variantes de unión a antígeno y a su utilización en el tratamiento de enfermedades, particularmente trastornos de la proliferación celular, en la que se expresa CEA, particularmente en la que CEA se expresa a niveles anormales (por ejemplo se sobreexpresa o se expresa en un patrón diferente en la célula) en comparación con el tejido normal del mismo tipo celular. Entre dichos trastornos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el cáncer colorrectal, NSCLC (cáncer pulmonar de células no pequeñas), el cáncer gástrico, el cáncer pancreático y el cáncer de mama. Los niveles de expresión del CEA pueden determinarse mediante métodos conocidos de la técnica y los descritos en la presente memoria (por ejemplo mediante ensayo inmunohistoquímico, ensayo de inmuno fluorescencia, ensayo inmunoenzimático, ELISA, citometría de flujo, radioinmunoensayo, transferencia western, unión de ligandos, actividad de quinasa, etc.).

En otro aspecto, la invención también se refiere a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que comprende una o más (por ejemplo una, dos, tres, cuatro, cinco o seis) regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo PR1 A3 murino, o variantes o formas truncadas de las mismas que contiene por lo menos los residuos determinantes de especificidad de dichas regiones determinantes de complementariedad. Típicamente, dichos polinucleótidos aislados codifican uno o más polipéptidos de fusión que forman una molécula de unión a antígeno. En una realización, el polinucleótido comprende una secuencia codificante de una o más (por ejemplo una, dos, tres, cuatro, cinco o seis) de las CDRs seleccionadas de entre SEC ID n0 l a 3, 5 a l0, 12 a 56 y 217 a 224, comprendiendo los residuos de las CDRs que retienen la unión específica. En una realización, el polinucleótido comprende una secuencia que codifica por lo menos tres CDRs de cadena pesada (por ejemplo HCDR1 , HCDR2 y HCDR3) y/o tres CDRs de cadena ligera (por ejemplo LCDR1 , LCDR2 y LCDR3 seleccionadas de entre SEC ID n° 1 a 3, 5 a 10, 12 a 56 y 217 a 224, o variantes o formas truncadas de las mismas que contienen por lo menos los residuos determinantes de especificidad (SDRs) de cada una de dichas tres regiones determinantes de complementariedad. En una realización más específica, el polinucleótido codifica un polipéptido que comprende una CDR3 de cadena pesada seleccionada de entre SEC ID n° 217 a 224 y dos CDRs de cadena pesada (por ejemplo HCDR1 y HCDR2) seleccionadas de entre SEC ID n° 1 a 3, 5 a 10 y 12 a 24 y/o tres CDRs de cadena ligera (por ejemplo LCDR1, LCDR2 y LCDR3) seleccionadas de entre SEC ID n° 36-56. En otra realización, el polinucleótido codifica un polipéptido que comprende la región o regiones variables de una cadena ligera y/o pesada de anticuerpo. Los polinucleótidos codificantes de los polipéptidos de región variable de las cadenas pesada y ligera pueden expresarse en uno o más vectores de expresión. En una realización más particular, el polinucleótido codificante de una región variable de cadena pesada y/o ligera seleccionada de entre SEC ID n° 99 a 108, SEC ID n° 188 a 216 y SEC ID n° 225-248 se selecciona de entre el grupo de los polinucleótidos de SEC ID n° 159 a 187 y SEC ID n° 249 a 256 ó una combinación de los mismos, en los que las regiones variables de las cadenas pesada y ligera no se encuentran codificadas poruña combinación de SEC E) n° 11 y SEC ?) n° 115 ó SEC ID n° 112 y SEC ID n° 116. En una realización, los polipéptidos de región variable de las cadenas pesada y ligera codificados por los polinucleótidos se combinan formando un anticuerpo quimérico, más concretamente un anticuerpo humanizado. En una realización específica, en la que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica la CDR1 de cadena pesada de PR1A3 o una variante de la misma, dicho polinucleótido codifica un glutamato sustituido por una valina en la posición Kabat n° 31. En una realización específica, en la que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una CDR3 de cadena pesada de PRl A3 ó una variante de la misma, dicho polinucleótido codifica una alanina sustituida por una tirosina en la posición Kabat n° 98 ó una tirosina sustituida por un aspartato en la posición Kabat n° 99. En una realización específica, en la que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica CDR3 de cadena pesada de PR1A3 o una variante de la misma, dicho polinucleótido codifica una alanina sustituida por una tirosina en la posición Kabat n° 98 y una tirosina sustituida por un aspartato en la posición Kabat n° 99. En una realización, el polinucleótido codifica una alanina sustituida por una tirosina en la posición Kabat n° 98 ó una tirosina sustituida por un aspartato en la posición Kabat n° 99 en el marco de CH1A1A (SEC ID n° 261) o CH1A1B (SEC ID n° 262 ). En una realización, el polinucleótido comprende una secuencia que codifica la cadena pesada de SEC ID n° 225, SEC ID n° 226, SEC ID n° 231, SEC ID n° 234, SEC ID n° 235, SEC ID n° 239, SEC ID n° 241, SEC ID n° 242, SEC ID n° 243 ó la secuencia SEC ID n° 247. En otra realización, el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una región Fe. La invención se refiere además a los polipéptidos codificados por dichos polinucleótidos.

En un aspecto, la presente invención se refiere a moléculas de unión a antígeno o moléculas variantes de unión a antígeno (por ejemplo un anticuerpo o fragmento del mismo) y a polipéptidos que presentan la misma especificidad de unión del anticuerpo PR1A3 murino (por ejemplo la unión al mismo epítopo del CEA unido a membrana) y que presentan actividades biológicas comparables o mejoradas (por ejemplo una afinidad mejorada para CEA unido a membrana, una estabilidad incrementada y/o una ADCC incrementada). En una realización, la molécula variante de unión a antígeno se une al mismo epítopo que la molécula parental de unión a antígeno. En una realización, la molécula variante de unión a antígeno compite para la unión a CEA humano unido a membrana con la molécula parental de unión a antígeno. En una realización, la molécula variante de unión a antígeno se une a CEA humano unido a membrana y no se une a CEA humano soluble. En un aspecto, la presente invención se refiere a moléculas de unión a antígeno y a una molécula variante de unión a antígeno y polipéptidos que presentan una estabilidad incrementada en comparación con el anticuerpo PR1A3 murino o una variante humanizada del mismo. En un aspecto, la presente invención se refiere a moléculas de unión a antígeno y moléculas variantes de unión a antígeno (por ejemplo un anticuerpo o fragmento del mismo) y polipéptidos que se unen a CEA unido a membrana y que presentan una estabilidad incrementada en comparación con un anticuerpo PR1A3 humanizado que comprende la región variable de cadena pesada de CH7A (SEC ID n° 101). En un aspecto, la presente invención se refiere a moléculas de unión a antígeno y moléculas variantes de unión a antígeno (por ejemplo un anticuerpo o fragmento del mismo) y polipéptidos que se unen a CEA unido a membrana y que presentan una estabilidad incrementada en comparación con un anticuerpo PR1A3 humanizado que comprende la región variable de cadena pesada CH7A (SEC K) n° 101 ) y la región variable de cadena ligera 2F 1 (SEC ID n° 209).

En una realización, la molécula variante de unión a antígeno o polipéptido comprende por lo menos una (por ejemplo una, dos, tres, cuatro, cinco o seis) de las CDRs seleccionadas de entre SEC ID n° 1 a 3, 5 a 10, 12 a 56 y 217 a 224 (figs. 32 y 36). En una realización, la molécula o polipéptido variante de unión a antígeno comprende: (a) una secuencia de CDR1 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID n° 1, SEC ID n° 2, SEC ID n° 3, SEC ID n° 5, SEC ID n° 6, SEC ID n° 7, SEC ID n° 8, SEC ID n° 9, SEC ID n° 10 y SEC ID n° 12; (b) una secuencia de CDR2 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID n° 13, SEC ID n° 14, SEC ID n° 15, SEC ID n° 16, SEC ID n° 17, SEC ID n° 18, SEC ID n° 19, SEC ID n° 20, SEC ID n° 21, SEC ID n° 22, SEC ID n° 23 y SEC ID n° 24, y (c) una secuencia de CDR3 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID n° 217, SEC ID n° 218, SEC ID n° 219, SEC ID n° 220, SEC ID n° 221 , SEC ID n° 222, SEC ID n° 223 y SEC ID n° 224. En otra realización, la molécula o polipéptido variante de unión a antígeno comprende: (a) una secuencia de CDR1 de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID n° 36, SEC ID n° 37, SEC ID n° 38, SEC ID n° 39, SEC ID n° 40, SEC ID n° 41 , SEC ID n° 42, SEC ID n° 43, SEC ID n° 44 y SEC ID n° 45; (b) una secuencia de CDR2 de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID n° 46 y SEC ID n° 47, SEC ID n° 48, SEC ID n° 49, SEC ID n° 50, SEC ID n° 51, SEC ED n° 52, SEC ID n° 53, SEC ID n° 54 y SEC ID n° 55; y (c) una CDR3 de cadena ligera de SEC ID N° 56. En algunas realizaciones, la molécula o polipéptido variante de unión a antígeno que comprende las CDRs también comprende los residuos de marco de CH1A1A (SEC ID n° 261) o CH1 A1B (SEC ID n° 262).

En un aspecto, la invención se refiere a una molécula o polipéptido variante de unión a antígeno que se une a CEA humano unido a membrana que comprende una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera. En una realización, la región variable de cadena pesada y/o ligera se selecciona de entre las regiones variables de cadena pesada y/o ligera seleccionadas de entre SEC ID n° 99-108, SEQ ID NOs: 188-216, and SEQ ID NOs: 225-248 (Fig.33 and Fig.37A-C). En una realización, la región variable de cadena pesada comprende un polipéptido que presenta la secuencia de cualquiera de entre SEC ID n° 225 a 248. En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia de cualquiera de las secuencias SEC ID n° 225 a 248.

En una realización, la región variable de cadena pesada comprende un polipéptido que presenta la secuencia SEC ID n° 233, SEC ID n° 234, SEC ID n° 235, SEC ID n° 239, SEC ID n° 241, SEC ?) n° 242, SEC ID n° 243 y SEC ID n° 247. En otra realización, la región variable de cadena pesada comprende un polipéptido que presenta una identidad de por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% respecto a la secuencia SEC ID n° 233, SEC ID n° 234, SEC ID n° 235, SEC ID n° 239, SEC ID n° 241, SEC ED n° 242, SEC ID n° 243, y SEC ID n° 247. En una realización, la región variable de cadena ligera comprende un polipéptido que presenta la secuencia SEC ID n° 209. En otra realización, la región variable de cadena pesada comprende un polipéptido que presenta una identidad de por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% respecto a la secuencia SEC ID n° 209.

En una realización, la molécula de unión a antígeno, molécula variante de unión a antígeno o polipéptido que se une a CEA humano unido a membrana, comprende una región variable de cadena pesasda y una región variable de cadena ligera. En una realización específica, la región variable de cadena pesada comprende un polipéptido que presenta la secuencia SEC ID n° 4, a continuación: QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTEX1X2MX3WVRQAPGQG LEWMGX4INTKX5GEAX6YX7EEFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAED TAVYYCARWDX8X9X10YXUX12X13X14DYWGQGTTVTVSS en la que X1 es Y o F; X2 es S o G; X3 es N o S; X4es W o Y; X5 es N, T o S; X6es T o N; X7 es V o I; X8 esF o A; X9 es Y, A, V, F o S; X10 es D, H, W, E, o Y; X" es V, L o F; X12 es E, K o Q; X13 es A o T; y X14 es M o L.

En una realización específica, la región variable de cadena ligera comprende un polipéptido que presenta la secuencia SEC ID n° 11 , a continuación: DIQMTQSPSSLSAS VGDRVTITCKASX 15X16X 17X 18X 19X20 VAWYQQKPGKAPKX21 L IYX22ASX23X24X25X26GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQ GTKLEIK en la que X15 es Q, ?, ? ? ?; X16 es N, A, Y, I, K, T o F; X17 es V, A, G o M; X,8 es G, S, T, o L; X19 es T, N, P o A; X20 es N o Y; X21 es P o L; X22 es S, L o W; X23 es Y, N o H; X24 es R, L, P o H; X25 es Y, S, Q, K, E, F o P; y X26 es S, G, I o R.

En otro aspecto, la invención se refiere además a polinucleótidos aislados codificantes de las moléculas de unión a antígeno, a moléculas variantes de unión a antígeno o polipéptidos que se unen a CEA unido a membrana. En una realización, el polinucleótido comprende una secuencia que codifica por lo menos tres CDRs de cadena pesada (por ejemplo HCDR1 , HCDR2 y HCDR3) y/o tres CDRs de cadena ligera (por ejemplo LCDR1, LCDR2 y LCDR3 seleccionadas de entre SEC ID n° 1 a 3, S a 10, 12 a 56 y 217 a 224, o variantes o formas truncadas de las mismas que contienen por lo menos los residuos determinantes de especificidad (SDRs) de cada una de dichas tres regiones determinantes de complementariedad. En una realización más específica, el polinucleótido codifica un polipéptido que comprende una CDR3 de cadena pesada seleccionada de entre SEC E) n° 217 a 224 y dos CDRs de cadena pesada (por ejemplo HCDR1 y HCDR2) seleccionadas de entre SEC ID n° l a 3, 5 a l0 y l2 a 24 y/o tres CDRs de cadena ligera (por ejemplo LCDR1 , LCDR2 y LCDR3) seleccionadas de entre SEC ID n° 36-56. En otra realización, el polinucleótido codifica un polipéptido que comprende la región o regiones variables de una cadena ligera y/o pesada de anticuerpo. Los polinucleótidos codificantes de los polipéptidos de región variable de las cadenas pesada y ligera pueden expresarse en uno o más vectores de expresión. En una realización más particular, el polinucleótido codificante de una región variable de cadena pesada y/o ligera seleccionada de entre SEC ID n° 99 a 108, SEC ID n° 188 a 216, y SEC ?) n° 225 a 248 se selecciona de entre el grupo de polinucleótidos seleccionados de entre SEC ID n° 159 a 187 y SEC ID n° 249 a 256 ó una combinación de los mismos, en los que las regiones variables de las cadenas pesada y ligera no se encuentran codificadas por una combinación de SEC ID n° 11 y SEC ID n° 115 ó SEC ID n° 112 y SEC ?) n° 116. En una realización, los polipéptidos de región variable de las cadenas pesada y ligera codificados por los polinucleótidos se combinan formando un anticuerpo quimérico, más concretamente un anticuerpo humanizado.

En una realización, la molécula de unión a antígeno, la molécula variante de unión a antígeno o el polipéptido que se une a CEA unido a membrana comprende una región Fe. En una realización más específica, la molécula de unión a antígeno, la molécula variante de unión a antígeno, o el polipéptido se glucomanipulan para que presenten un patrón alterado de glucosilación en la región Fe. En una realización particular, la afinidad para el CEA unido a membrana de la molécula o polipéptido variante de unión a antígeno se encuentra incrementada en comparación con la del anticuerpo PR1A3 parental. En otra realización, la estabilidad de la molécula o polipéptido variante de unión a antígeno se encuentra incrementada en comparación con la del anticuerpo PR1A3 parental. En otra realización, la molécula o polipéptido variante de unión a antígeno presenta una actividad de ADCC incrementada. En una realización, la ADCC incrementada de la molécula o polipéptido variante de unión a antígeno se debe a un incremento de la afinidad del polipéptido para CEA unido a membrana, por ejemplo mediante maduración de afinidad u otros métodos de mejora de la afinidad.

En otro aspecto, la invención también se refiere a la utilización de la molécula de unión a antígeno y de la molécula o polipéptido variante de unión a antígeno en el tratamiento de enfermedades, particularmente trastornos de la proliferación celular, en la que se expresa CEA, particularmente en la que CEA se expresa a niveles anormales (por ejemplo se sobreexpresa o se expresa en un patrón diferente en la célula) en comparación con el tejido normal del mismo tipo celular. Entre dichos trastornos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el cáncer colorrectal, NSCLC (cáncer pulmonar de células no pequeñas), el cáncer gástrico, el cáncer pancreático y el cáncer de mama. Los niveles de expresión del CEA pueden determinarse mediante métodos conocidos de la técnica y los descritos en la presente memoria (por ejemplo mediante ensayo inmunohistoquímico, ensayo de inmunofluorescencia, ensayo inmunoenzimático, ELISA, citometría de flujo, radioinmunoensayo, transferencia western, unión de ligandos, actividad de quinasa, etc.).

En una realización particular, la invención se refiere a una molécula humanizada de unión a antígeno o a una parte o fragmento de la misma que se une a CEA unido a membrana, comprendiendo una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de cualquiera de entre SEC ID n° 225 a 248. En otra realización, la invención se refiere a una molécula humanizada de unión a antígeno o a una parte o fragmento de la misma que se une a CEA unido a membrana, comprendiendo una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de cualquiera de entre SEC ID n° 105, 108 ó 207 a 216. En una realización particular, la molécula humanizada de unión a antígeno o a una parte o fragmento de la misma que se une a CEA unido a membrana comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de cualquiera de entre SEC ID n° 225 a 248 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de cualquiera de entre SEC ID n° 105, 108 ó 207 a 216. En una realización, la molécula humanizada de unión a antígeno comprende además una región constante de cadena pesada humana y/o una región constante de cadena ligera humana. Dichas regiones constantes se describen en la presente memoria y son conocidas de la técnica. En una realización más particular, la molécula humanizada de unión a antígeno comprende una región Fe, más particularmente, una región Fe que ha sido glucomanipulada.

Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son conocidos de la técnica. Por ejemplo, pueden prepararse ABMs humanizadas de la presente invención según los métodos de la patente US n° 5.225.539, de Winter; de la patente US n° 6.180.370, de Queen et al., o de la patente US n° 6.632.927, de Adair et ai, el contenido completo de cada una de las cuales se incorpora como referencia en la presente memoria. Preferentemente, en un anticuerpo humanizado se han introducido uno o más residuos aminoácidos procedentes de una fuente no humana. Estos residuos aminoácidos no humanos con frecuencia se denominan residuos "importados", los cuales típicamente se obtienen de un dominio variable "importado". La humanización esencialmente puede llevarse a cabo siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et ai, Nature 321 :522-525, 1986; iechmann et al, Nature 332:323-327, 1988; Verhoeyen et ai, Science 239:1534-1536, 1988), mediante la sustitución de secuencias de región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente US n° 4.816.567), en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. Típicamente, los anticuerpos humanizados son anticuerpos humanos en los que algunos residuos de región hipervariable y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en un anticuerpo no humano (por ejemplo de roedor). Los anticuerpos anti-CEA humanizados de la invención opcionalmente comprenden regiones constantes procedentes de una inmunoglobulina humana.

La elección de dominios variables de cadena ligera y pesada para preparar los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método denominado de "ajuste óptimo", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo donante (por ejemplo de roedor) se criba frente a la biblioteca completa de secuencias de región variable humanas conocidas. La secuencia humana más similar a la del donante (por ejemplo de roedor) seguidamente se acepta como la región marco humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims etai, J. Immunol. 151 :2296, 1993; Chothia e/ a/., J. Mol. Biol. 196:901, 1987). Otro método para seleccionar la secuencia de marco humana es comparar la secuencia de cada subregión individiual del marco donante (por ejemplo de roedor) completo (es decir, FR1 , FR2, FR3 y FR4) o alguna combinación de las subregiones individuales (por ejemplo FR1 y FR2) frente a una biblioteca de secuencias de región variable humanas que corresponden a dicha subregión de marco (por ejemplo según se determine a partir de la numeración Kabat) y seleccionar la secuencia humana para cada subregión o combinación que sea más similar a la de roedor (solicitud publicada de patente US n° 2003/0040606A1, de Leung, publicada el 27 de febrero de 2003). Otro método utiliza una región de marco particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas (Cárter et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:4285, 1992; Presta et al, J. Immunol. 151 :2623, 1993). En una realización, las regiones de marco humanas se seleccionan de entre una colección de secuencias de línea germinal humana. Dichas colecciones de secuencias de línea germinal humana pueden encontrarse en bases de datos tales como IMGT o VBase. Las regiones de marco pueden seleccionarse individualmente (por ejemplo la región FR1 -3 seleccionada para el aceptor para las regiones variables de cadena pesada y/o ligera de las ABMs anti-CEA humanizadas pueden encontrarse codificadas en diferentes genes de línea germinal) o como parte del mismo gen de línea germinal. En una realización más específica, la FR1-3 de cadena pesada se encuentra codificada por la secuencia de gen de línea germinal de inmunoglobulina humana IGHV7_4_1 *02 (n° de acceso X62110, SEC ID n° 114). En otra realización específica, la FR1 -3 de cadena ligera se encuentra codificada por la secuencia de gen de línea germinal de inmunoglobulina humana IM GT_h VK_ 1 39 (n° de acceso X59315, SEC ID n° 1 18). En otra realización específica, la FR4 de cadena pesada se encuentra codificada por la secuencia del gen de línea germinal JH6 (ver n° de acceso de GenBank M63030). En otra realización específica, la FR4 de cadena ligera se encuentra codificada por la secuencia del gen de línea germinal JK2 (ver n° de acceso de GenBank X61584).

Resulta generalmente deseable que las moléculas de unión a antígeno, tales como anticuerpos y fragmentos de los mismos, se humanicen conservando la alta afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Por consiguiente, en una realización, se preparan anticuerpos humanizados mediante el análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina se encuentran comúnmente disponibles y resultarán familiares para el experto en la materia. Se encuentran disponibles programas informáticos que ilustran y muestran estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias candidatas de inmunoglobulina seleccionadas. El análisis de dichas expresiones ayuda a determinar el papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia candidata de inmunoglobulina, por ejemplo el análisis de los residuos que influyen sobre la capacidad de la inmunoglobulina candidata de unirse a su antígeno. De esta manera, pueden seleccionarse y combinarse residuos de FR procedentes del receptor y secuencias importadas de manera que se consiga la característica deseada del anticuerpo, tal como una afinidad incrementada para el antígeno o antígenos diana. En general, los residuos de la región hipervariable se encuentran directa y más sustancialmente implicados en la influencia sobre la unión a antígeno.

En un aspecto, la invención se refiere a moléculas de unión a antígeno anti-CEA humanizadas de afinidad madurada y/o variantes con propiedades y características deseables que incluyan, aunque sin limitarse a ellas: una fuerte afinidad de unión para el antígeno CEA (en particular CEA unido a membrana), no presentando reactividad cruzada sustancial contra CEA soluble; una capacidad para inducir lisis celular de células que expresan CEA in vitro y ex vivo, preferentemente de una manera dependiente de la dosis; una capacidad de inhibir la adhesión celular in vitro mediada por CEA; una capacidad de inhibir el crecimiento de tejido tumoral y/o de inducir la regresión de tejido tumoral (por ejemplo tal como se demuestra en modelos tumorales (por ejemplo de xenoinjerto de ratón)).

Tal como se describe en la presente memoria, en algunas realizaciones, las moléculas variantes de unión a antígeno de la invenicón presentan una afinidad de unión incrementada, por ejemplo debido a la maduración de la afinidad de un anticuerpo parental que comprende una o más CDRs del anticuerpo PR1A3. La afinidad de las moléculas de unión a antígeno y de las moléculas variantes de unión a antígeno de la invención puede determinarse mediante métodos conocidos de la técnica y tal como se describe en la presente memoria. En una realización específica, las moléculas humanizadas o variantes de unión a antígeno de la invención se unen a CEA humano, preferentemente a CEA unido a membrana, con una constante de afinidad monovalente (KD) no superior a un valor de entre aproximadamente 1 µ? y aproximadamente 0,001 nM, más concretamente no superior a entre aproximadamente 800 nM y aproximadamente 1 nM, y todavía más concretamente no superior a un valor de entre aproximadamente 550 nM y aproximadamente 10 nM. En una realización específica, la molécula variante de unión a antígeno es un anticuerpo de afinidad madurada o fragmento del mismo que se une a CEA unido a membrana con un valor de la constante de afinidad monovalente (KD) no superior a un valor de entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 10 nM. En una realización, la molécula variante de unión a antígeno es un anticuerpo de afinidad madurada o fragmento del mismo que se une a CEA unido a membrana con un valor de la constante de afinidad monovalente (KD) no superior a un valor de entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 0,01 nM. En una realización, la molécula variante de unión a antígeno es un anticuerpo de afinidad madurada o fragmento del mismo que se une a CEA unido a membrana con un valor de la constante de afinidad monovalente (KD) no superior a un valor de entre aproximadamente 10 nM y aproximadamente 0,1 nM. En una realización, la molécula variante de unión a antígeno es un anticuerpo de afinidad madurada o fragmento del mismo que se une a CEA unido a membrana con un valor de la constante de afinidad monovalente (KD) de 100 nM, 10 nM, 1 nM, 0,1 nM o inferior. En algunas realizaciones, la molécula variante de unión a antígeno es un anticuerpo de estabilidad madurada (manipulado para que presente una estabilidad incrementada) o fragmento del mismo que conserva la afinidad de unión incrementada de su molécula parental de afinidad madurada. En una realización, la molécula variante de unión a antígeno se une al CEA unido a membrana con una afinidad más alta que su unión a CEA liberado. En una realización, la molécula variante de unión a antígeno se une al CEA unido a membrana con una afinidad 1 ,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20 ó más veces superior a la que se une a CEA liberado.

En una realización, la molécula variante de unión a antígeno de la invención típicamente se une al mismo epítopo que el reconocido por el anticuerpo PRl A3 de ratón, o es capaz de competir con el anticuerpo PRl A para la unión a CEA unido a membrana. Para el cribado de anticuerpos que se unen al epítopo sobre CEA humano unido a un anticuerpo de interés (por ejemplo aquellos que bloquean la unión del anticuerpo PR1A3 a CEA humano), puede llevarse a cabo un ensayo de bloqueo cruzado rutinario, tal como el descrito en ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, editores Harldw y Lañe, 1988. Alternativamente, puede llevarse a cabo el mapeado de epítopos, por ejemplo tal como se describe en Champe et ai, J. Biol. Chem. 270: 1388-1394, 1995, para determinar si el anticuerpo se une a un epítopo de interés.

En una realización, las moléculas variantes de unión a antígeno específicas para el CEA humano se preparan a partir de una molécula parental de unión a antígeno anti-CEA que comprende por lo menos una CDR del anticuerpo monoclonal PR1A3, en las que el anticuerpo parental anti-CEA se une al mismo epítopo que el anticuerpo PRl A3 y es capaz de competir con PRl A3 para la unión a antígeno. En una realización, la molécula parental de unión a antígeno comprende por lo menos una, dos, o típicamente tres, CDRs de cadena pesada del anticuerpo PRl A3 ; en otra realización, la molécula parental de unión a antígeno comprende por lo menos una, dos, o típicamente tres, CDRs de cadena ligera del anticuerpo PR1A3; en otra realización, la molécula parental de unión a antígeno comprende las tres CDRs de cadena pesada y las tres CDRs de cadena ligera del anticuerpo PRl A3. Preferentemente, en el caso de que la molécula variante de unión a antígeno comprenda la HCDRl de PRl A3, dicha HCDRl comprende una sustitución de glutamato por valina en la posición Kabat n° 31. Las ABMs variantes típicamente presentan una mayor afinidad para CEA que la molécula parental. En una realización, las ABMs variantes presentan una estabilidad incrementada en comparación con la parental. En una realización, las ABMs variantes presentan una estabilidad incrementada en comparación con la parental. En una realización, la ABM variante comprende una región Fe. En una realización, la ABM variante ha sido glucomanipulada. En una realización, la ABM variante presenta una actividad de ADCC incrementada en comparación con el ABM parental. En una realización particular, la ADCC incrementada es el resultado de la afinidad incrementada que se alcanza, por ejemplo, mediante maduración de la afinidad del ABM parental, generando el ABM variante. En una realización más particular, el incremento de ADCC es de entre por lo menos aproximadamente 40% y aproximadamente 100% en comparación con dicha molécula parental de unión a antígeno. En otra realización particular, el ABM variante incrementa la ADCC entre por lo menos aproximadamente 10% y aproximadamente 100% en un ensayo de citotoxicidad in vitro. En una realización más particular, el ABM variante es entre por lo menos aproximadamente 10 y aproximadamente 1.000 veces más potente en la inducción de la ADCC a una concentración dada que el anticuerpo PR1 A3 murino. En otra realización particular, la actividad de ADCC incrementada es el resultado de la glucomanipulación de la región Fe. En otra realización particular, la actividad de ADCC incrementada es el resultado de la combinación de afinidad incrementada y glucomanipulación.

En una realización, las moléculas variantes de unión a antígeno de la invención comprenden una o más sustituciones de aminoácido en por lo menos una CDR. El número de sustituciones de aminoácido puede encontrarse comprendido entre uno y diez (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10), preferentemente entre dos y cinco (por ejemplo 2, 3, 4 ó 5). En una realización, por lo menos una CDR de cadena pesada comprende una o más sustituciones de aminoácido. En otra realización, por lo menos una CDR de cadena ligera comprende una o más sustituciones de aminoácido. En otra realización, por lo menos una CDR de cadena pesada comprende una o más sustituciones y por lo menos una CDR de cadena ligera comprende una o más sustituciones. Preferentemente, en el caso de que la molécula variante de unión a antígeno comprenda HCDR1 de PR1 A3, dicha HCDR1 comprende una sustitución de glutamato por valina en la posición Kabat n° 31.

Se consiguen modificaciones sustanciales de las propiedades biológicas de las moléculas de unión a antígeno mediante la selección de sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de: (a) la estructura del esqueleto polipeptídico en el área de la sustitución, por ejemplo en una conformación de hoja o de hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Las moléculas variantes de unión a antígeno que comprenden sustituciones de aminoácidos pueden presentar actividades biológicas mejoradas, por ejemplo una afinidad de unión a antígeno mejorada y una ADCC incrementada, en comparación con la molécula parental de unión a antígeno. Pueden introducirse sustituciones de aminoácidos mediante diversas técnicas conocidas de la técnica, incluyendo, aunque sin limitación, mutagénesis sitio-dirigida y/o maduración de la afinidad de la molécula parental de unión a antígeno, por ejemplo mediante expresión fágica.

Con el fin de identificar los sitios candidatos, por ejemplo residuos de región hipervariable, para la modificación, puede llevarse a cabo mutagénesis por escaneo de alaninas con el fin de encontrar residuos que contribuyan significativamente a la unión de antígenos. Alternativamente, o adicionalmente, puede resultar beneficioso analizar una estructura cristalina de un complejo de antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contracto entre el anticuerpo y CEA humano. Dichos residuos de contacto y los residuos vecinos son candidatos para la sustitución según métodos conocidos de la técnica y/o indicados en la presente memoria. Tras generarse dichas variantes, el panel de variantes puede cribarse mediante métodos conocidos de la técnica y/o descritos en la presente memoria y pueden seleccionarse anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes, para el desarrollo posterior.

Puede utilizarse la expresión fágica para generar un repertorio de secuencias de región hipervariable de una molécula parental de unión a antígeno que contenga una o más mutaciones aleatorias de aminoácidos. Por ejemplo, se mutan varios sitios de región hipervariable (por ejemplo 6 ó 7 sitios) con el fin de generar todas las sustituciones de aminoácido posibles en cada sitio. Alternativamente, puede llevarse a cabo mutagénesis aleatoria en regiones variables de cadena pesada y/o ligera. Pueden generarse mutaciones mediante técnicas conocidas de la técnica, incluyendo, aunque sin limitación, la utilización de cebadores de mutagénesis, el control del número de ciclos y la utilización de los análogos de nucleótido mutagénicos 8-oxo-dGTP y dPTP durante la amplificación por PCR. Las variantes de anticuerpo generadas de esta manera se expresan de un modo monovalente a partir de partículas de fago filamentoso en forma de fusiones con el producto del gen III de MI 3 empaquetadas dentro de cada partícula. A continuación, las variantes expresadas fágicamente se criban para sus actividades biológicas (por ejemplo la afinidad de unión), tal como se da a conocer en la presente memoria, y los candidatos que presenten una o más actividades mejoradas se utilizan para el desarrollo posterior. Pueden encontrarse métodos para preparar bibliotecas de expresión fágica en Huse etal., Science 246:1275-1281, 1989; Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:4363-4366, 1991, el contenido completo de la cual se incorpora como referencia en la presente memoria. Un método alternativo para identificar las moléculas de unión a antígeno de afinidad madurada puede encontrarse en, por ejemplo, la patente US n° 7.432.063, de Balint et al., el contenido completo de la cual se incorpora como referencia en la presente memoria.

En algunas realizaciones, las moléculas de unión a antígeno y las moléculas variantes de unión a antígeno de la presente invención comprenden una región Fe, preferentemente una región Fe humana. Las secuencias y estructuras de las regiones Fe son conocidas de la técnica y han sido caracterizadas. En una realización específica, la región constante humana es IgGl, tal como se indica en SEC ID n° 121 y n° 122.

Sin embargo, también se encuentran comprendidas en la presente invención variantes e isoformas de la región Fe humana. Por ejemplo, pueden producirse regiones Fe variantes adecuadas para la utilización en la presente invención según los métodos que se enseñan en la patente US n° 6.737.056, de Presta (regiones Fe variantes con función efectora alterada debida a una o más modificaciones de aminoácidos), o en la solicitudes de patente US n° 60/439.498, n° 60/456.041, n° 60/514.549 ó patente WO n° 2004/063351 (regiones variantes Fe con afinidad de unión incrementada debida a la modificación de aminoácidos) o en la solicitud de patente US n° 10/672.280 ó en la patente WO n° 2004/099249 (variantes de Fe con unión alterada a FcyR debido a modificaciones de aminoácidos), el contenido de cada una de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad en la presente memoria. En una realización particular, las ABMs anti-CEA y las ABMs variantes comprenden una región Fe que ha sido glucomanipulada para alterar la actividad de función efectora de la ABM (por ejemplo de reducción de la fucosilación, de mejora de la afinidad de unión a receptor de Fe, de incremento de la ADCC, etc.). Los métodos de glucomanipulación que pueden utilizarse se describen en detalle posteriormente en la presente memoria y son conocidos de la técnica.

En una realización, la molécula de unión a antígeno o molécula variante de unión a antígeno de la presente invención se conjuga con un grupo adicional, tal como un mareaje radioactivo o una toxina. Dichas moléculas conjugadas de unión a antígeno pueden producirse mediante numerosos métodos que son bien conocidos de la técnica. Los conjugados de ABM anti-CEA de la invención se describen en detalle posteriormente en la presente memoria, en la sección titulada "Conjugados de molécula de unión a antígeno anti-CEA".

Vectores de expresión y células huésped En un aspecto, la presente invención se refiere a un vector de expresión y/o a una célula huésped que comprende uno o más polinucleótidos aislados de la presente invención. Por ejemplo, la célula huésped o el vector de expresión comprende uno o más cualesquiera de los polinucleótidos o polinucleótidos codificantes de los polipéptidos, ABMs y/o ABMs variantes indicadas en la presente memoria. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir una ABM que se une a CEA humano unido a membrana, comprendiendo el método: cultivar una célula huésped que comprende uno o más polinucleótidos aislados de la presente invención o un vector de expresión que comprende uno o más polinucleótidos aislados de la presente invención en un medio bajo condiciones que permiten la expresión de dicho polinucleótido o polinucleótidos, en el que dicho polinucleótido o polinucleótidos codifica uno o más polipéptidos que forman parte de la ABM, y recuperar dicha ABM, en donde dicha ABM o una parte de la misma se une a CEA unido a membrana.

Generalmente, puede utilizarse cualquier tipo de línea celular en cultivo para expresar la ABM de la presente invención. En una realización preferente, se utilizan células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 ó células de hibridoma, otras células de mamífero, células de levadura, células de insecto o células vegetales como línea celular de fondo para generar las células huésped manipuladas de la invención.

En una realización específica, la célula huésped o el vector de expresión comprende uno o más polinucleótidos codificantes de una ABM anti-CEA tal como se proporciona en la presente memoria. En una realización, se ha madurado la afinidad del anticuerpo. El anticuerpo de afinidad madurada generalmente presenta una afinidad de unión mejorada respecto a la del anticuerpo de referencia a partir del que se deriva el anticuerpo de afinidad madurada. En otra realización, el anticuerpo presenta propiedades terapéuticas deseables, incluyendo, aunque sin limitación: fuerte afinidad de unión para el antígeno CEA, en particular CEA unido a membrana, no no presentando reactividad cruzada sustancial contra CEA soluble; capacidad para inducir lisis celular de células que expresan CEA in vitro y ex vivo, preferentemente de una manera dependiente de la dosis; capacidad de inhibir la adhesión celular in vitro mediada por CEA; capacidad para inhibir el crecimiento de tejido tumoral y/o para inducir la regresión de tejido tumoral en modelos tumorales en ratones (por ejemplo de xenoinjerto en el ratón). En otra realización, el anticuerpo presenta una estabilidad incrementada en comparación con el anticuerpo parental a partir del que se derivó el anticuerpo más estable. En otra realización, el anticuerpo variante o fragmento del mismo comprende una Fe humana.

En una realización, puede expresarse uno o varios polinucleótidos codificantes de un ABM de la presente invención bajo el control de un promotor constitutivo o, alternativamente, un sistema de expresión regulada. Entre los sistemas de expresión regulada adecuados se incluyen, aunque sin limitación, un sistema de expresión regulado por tetraciclina, un sistema de expresión inducible por eedisona, un sistema de expresión de interruptor lac, un sistema de expresión inducible por glucocorticoides, un sistema promotor inducible térmicamente y un sistema de expresión inducible por metal de metalotioneína. En el caso de que se encuentren comprendidos varios ácidos nucleicos diferentes codificantes de un ABM de la presente invención dentro del sistema de célula huésped, algunos de ellos pueden expresarse bajo el control de un promotor constitutivo, mientras que otros se expresan bajo el control de un promotor regulado. El nivel de expresión máximo se considera el nivel más alto posible de expresión estable de polipéptido que no presenta un efecto adverso significativo sobre la tasa de crecimiento celular, y se determina mediante experimentación rutinaria. Los niveles de expresión se determinan mediante métodos generalmente conocidos de la técnica, incluyendo el análisis de transferencia western utilizando un anticuerpo específico para el ABM o un anticuerpo específico para una etiqueta péptido fusionada con el ABM, y el análisis de transferencia northern. En una alternativa adicional, el polinucleótido puede ligarse operablemente a un gen informador; los niveles de expresión de un ABM dado a conocer en la presente memoria se determinan mediante la medición de una señal correlacionada con el nivel de expresión del gen informador. El gen informador puede transcribirse conjuntamente con el ácido o ácidos nucleicos codificantes de dicho ABM en forma de una sola molécula de ARNm; las secuencias codificantes respectivas pueden unirse mediante un sitio interno de entrada ribosómica (IRES) o mediante un intensificador de traducción independiente de caperuza (CITE). El gen informador puede traducirse conjuntamente con por lo menos un ácido nucleico codificante de un ABM dado a conocer en la presente memoria, de manera que se forma una única cadena polipeptídica. Los ácidos nucleicos codificantes de un ABM de la presente invención pueden ligarse operablemente con el gen informador bajo el control de un único promotor, de manera que el ácido nucleico codificante del ABM y el gen informador se transcriben en una molécula de ARN que se procesa alternativamente en dos moléculas separadas de ARN mensajero (ARNm); uno de los ARNm resultantes se traduce en dicha proteína informadora y la otra se traduce en el ABM.

Pueden utilizarse métodos que son bien conocidos por el experto en la materia para construir vectores de expresión que contienen la secuencia codificante de un ABM anti-CEA proporcionado en la presente memoria conjuntamente con señales apropiadas de control transcripcional/traduccional. Entre dichos métodos se incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y la recombinación in v/vo/recombinación genética. Ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis et al. , MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989) y en Ausubel et al, CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BlOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989.

Puede utilizarse una diversidad de sistemas de huésped- vector de expresión para expresar la secuencia codificante de los ABMs de la presente invención. Preferentemente se utilizan células de mamífero como sistemas de células huésped transfectados con vectores de expresión de ADN plasmídico recombinante o de cósmido de ADN que contienen la secuencia codificante de la proteína de interés y la secuencia codificante del polipéptido de fusión. Más preferentemente se utilizan células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 ó células de hibridoma, otras células de mamífero, células de levadura, células de insecto o células vegetales como sistema de célula huésped. Se describen algunos ejemplos de sistema de expresión y métodos de selección en las referencias siguientes y referencias citadas en las mismas: Borth et al, Biotechnol. Bioen. 71(4):266-73, 2000-2001, en: Wemer etal., Arzneimittelforschung/Drug Res.48(8):870-80, 1998, en: Andersen y Krummen, Curr. Op. Biotechnol. 13:117-123, 2002, en Chadd y Chamow, Curr. Op. Biotechnol. 12:188-194, 2001, y en Giddings, Curr. Op. Biotechnol. 12: 450-454, 2001.

En realizaciones alternativas, pueden utilizarse otros sistemas de células huésped eucariótica, incluyendo células de levadura transformadas con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen la secuencia codificante de un ABM de la presente invención, tales como los sistemas de expresión enseñados en la solicitud de patente US n° 60/344.169 y en las patentes WO n° 60/344.169 y n° 03/056914 (métodos para producir glucoproteínas de tipo humano en una célula huésped eucarióticas no humanas) (el contenido de cada una de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad); sistemas de células de insecto infectadas por vectores de expresión víricos recombinantes (por ejemplo baculovirus) que contienen la secuencia codificante de un anti-CEA; sistemas de células vegetales infectados por vectores de expresión víricos recombinantes (por ejemplo virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmido recombinante (por ejemplo el plásmido Ti) que contienen la secuencia codificante del ABM de la invención, incluyendo, aunque sin limitación, los sistemas de expresión enseñados en la patente US n° 6.815.184 (métodos para la expresión y secreción de polipéptidos biológicamente activos procedentes de lenteja de agua genéticamente manipulada); las patentes WO n° 2004/057002 (producción de proteínas glucosiladas en células de briófito mediante la introducción de un gen de glucosiltransferasa) y n° 2004/024927 (métodos de generación de proteína no vegetal heteróloga extracelular en protoplasto de musgo), y solicitudes de patente US n° 60/365.769 y n° 60/368.047 y patente WO n° 2003/078614 (procesamiento de glucoproteínas en plantas transgénicas que comprenden un enzima GnTIII de mamífero funcional) (el contenido de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad en la presente memoria), o sistemas de células animales infectados por vectores de expresión víricos recombinantes (por ejemplo de adenovirus, virus Vaccinia), incluyendo líneas celulares manipuladas para que contengan múltiples copias del ADN codificante de un ABM anti- CEA quimérico amplificado establemente (CHO/dhfr) o amplificado inestablemente en cromosomas dobles diminutos (por ejemplo líneas celulares murinas). En una realización, el vector que comprende el polinucleótido o polinucleótidos codificantes del ABM de la invención es policistrónico. Además, en una realización, el ABM comentado anteriormente es un anticuerpo o un fragmento del mismo. En una realización, el ABM es un anticuerpo de afinidad madurada. En una realización, el ABM es un anticuerpo de estabilidad madurada.

La expresión estable resulta generalmente preferente a la expresión transitoria debido a que típicamente consigue resultados más reproducibles y que también permiten más fácilmente la producción a gran escala; sin embargo, se encuentra comprendido dentro de los conocimientos del experto en la materia la determinación de si la expresión transitoria resulta mejor para una situación particular. En lugar de utilizar vectores de expresión que contienen orígenes víricos de replicación, las células huésped pueden transformarse con los ácidos nucleicos codificantes respectivos controlados por los elementos apropiados de control de la expresión (por ejemplo secuencias de promotor o intensificador, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Tras la introducción de ADN foráneo, las células manipuladas pueden crecer durante 1 ó 2 días en un medio enriquecido y después pasarse a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante proporciona resistencia a la selección y permite la selección de células que han integrado establemente el plásmido en sus cromosomas y crecen formando focos que, a su vez, pueden clonarse y expandirse formando líneas celulares. Pueden utilizarse varios sistemas de selección, entre ellos, aunque sin limitación, los genes de la timidina quinasa del virus del herpes simplex (Wigler et ai, Cell 11 :223, 1977), de la hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 48:2026, 1962) y de la adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et ai, Cell 22:817, 1980), los cuales pueden utilizarse en células tk\ hgprt" o aprt', respectivamente. Además, puede utilizarse la resistencia a metabolitos como base de la selección para los genes dhfr, que proporciona resistencia al metotrexato (Wigler et al, Nati. Acad. Sci. USA 77:3567, 1989; O'Hare et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:1527, 1981); gpt, que proporciona resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y Berg, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:2072, 1981); neo, que proporciona resistencia al aminoglucósido G-418 (Colberre-Garapin et al, J. Mol. Biol. 1 0:1, 1981); e hygro, que proporciona resistencia a la higromicina (Santerre et al, Gene 30:147, 1984). Recientemente se han descrito otros genes seleccionables: trpB, que permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano; hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman y Mulligan, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:8047, 1988); el sistema de la glutamina sintasa, y la ODC (ornitina descarboxilasa), que proporciona resistencia al inhibidor de la ornitina descarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue, en: Current Communications in Molecular Biology, editado por Cold Spring Harbor Laboratory, 1987).

La presente invención se refiere además a un método para modificar el perfil de glucosilación de los ABMs de la presente invención que son producidos por una célula huésped, comprendiendo expresar en dicha célula huésped un ABM de la invención y un ácido nucleico codificante de un polipéptido con una actividad de glucosiltransferasa, o un vector que comprende dichos ácidos nucleicos. Entre los genes con actividad glucosiltransferasa se incluyen la ß(1,4)-?-acetilglucosaminiltransferasa ?? (GnTIII), la a-manosidasa ? (Manll), la ß(1 ,4)-galactosiltransferasa (GalT), la P(l,2)-N-acetüglucosairániltransferasa I (GnTI) y la ß(1,2)-?-acetilglucosaminiltransferasa II (GnTII). En una realización, se expresa en la célula huésped una combinación de genes con actividad de glucosiltransferasa (por ejemplo GnTIII y Manll). De manera similar, un método también comprende la expresión de uno o más polinucleótidos codificantes del ABM en una célula huésped en la que un gen glucosiltransferasa ha sido interrumpido o de otro modo desactivado (por ejemplo una célula huésped en la que la actividad del gen codificante de la al ,6-fücosiltransferasa nuclear ha sido desactivado). En otra realización, los ABMs de la presente invención pueden producirse en una célula huésped que expresa además un polinucleótido codificante de un polipéptido que presenta actividad de GnTIII para modificar el patrón de glucosilación. En una realización específica, el polipéptido que presenta actividad de GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio de localización en Golgi de un polipéptido residente en Golgi. En otra realización preferente, la expresión de los ABMs de la presente invención en una célula huésped que expresa un polinucleótido codificante de un polipéptido que presenta actividad de GnTIII resulta en ABMs con afinidad de unión incrementada a receptor de Fe y/o una función efectora incrementada. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en una realización, la presente invención se refiere a una célula huésped que comprende: (a) un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia codificante de un polipéptido que presenta actividad de GnTIII, y (b) un polinucleótido aislado codificante de un ABM de la presente invención, tal como un anticuerpo quimérico, primatizado o humanizado que se une al CEA humano. En una realización preferente, el polipéptido que presenta actividad de GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio catalítico de GnTIII y el dorninio de localización en Golgi es el dominio de localización de la manosidasa II. Los métodos para generar dichos polipéptidos de fusión y para utilizarlos para producir anticuerpos con funciones efectoras incrementadas se dan a conocer en la solicitud provisional de patente US n° 60/495.142 y en la patente US n° 2004/0241817, el contenido completo de las cuales se incorpora expresamente como referencia en la presente memoria. En una realización particular, el ABM modificado producido por la célula huésped presenta una región constante de IgG o un fragmento de la misma que comprende la región Fe. En otra realización particular, el ABM es un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo que comprende una región Fe.

Los ABMs con glucosilación alterada producidos por las células huésped de la invención típicamente muestran una afinidad de unión incrementada al receptor de Fe y/o una función efectora incrementada como resultado de la modificación de la célula huésped (por ejemplo mediante expresión de un gen de glucosiltransferasa). Preferentemente, la afinidad de unión incrementada a receptor de Fe es la unión incrementada a un receptor de Fcy activador, más preferentemente el receptor FcyRffla. La función efectora incrementada preferentemente es un incremento de uno o más de los siguientes: citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos incrementada, fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) incrementada, secreción de citoquinas incrementada, incorporación incrementada de antígenos por parte de células presentadoras de antígeno mediada por complejo inmunológico, citotoxicidad celular mediada por Fe incrementada, unión a células NK incrementada, unión a macrófagos incrementada, unión a células polimorfonucleares (PMNCs) incrementada, unión a monocitos incrementada, entrecruzamiento de anticuerpos unidos a diana incrementado, señalización directa inductora de apoptosis incrementada, maduración de células dendríticas incrementada o cebado de células T incrementado.

Generación y utilización de ABMs que presentan una función efectora incrementada, incluyendo citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos En un aspecto, la presente invención proporciona glucoformas de ABMs anti-CEA (por ejemplo ABMs variantes) que presentan una función efectora incrementada, incluyendo citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. La manipulación mediante glucosilación de los anticuerpos ha sido descrita anteriormente. Ver, por ejemplo, la patente US n° 6.602.684, incorporada en la presente memoria como referencia en su totalidad. Los métodos para producir ABMs a partir de células huésped que presentan una actividad alterada de genes implicados en la glucosilación también se describen en la presente memoria en detalle (ver, por ejemplo, la sección titulada "Vectores de expresión y células huésped", anteriormente). También se consigue un incremento de la ADCC de las ABMs de la presente invención mediante el incremento de la afinidad de la molécula de unión a antígeno para el CEA unido a membrana, por ejemplo mediante maduración de la afinidad u otros métodos de mejora de la afinidad (ver Tang et al., J. Immunol. 179:2815-2823, 2007). Las combinaciones de diferentes enfoques también se encuentra comprendidas dentro de la presente invención.

Algunos ensayos clínicos de anticuerpos monoclonales (mAbs) no conjugados destinados al tratamiento de algunos tipos de cáncer recientemente han proporcionado resultados alentadores (Dillman, Cáncer Biother. &Radiopharm. 12:223-25, 1997; Oeoetal., Immunology Today 18:127, 1997. Se ha aprobado una IgGl quimérica no conjugada para el linfoma no Hodgkin de células B folicular o de grado bajo (Dillman, Cáncer Biother. &Radiopharm. 12:223-25, 1997), mientras que otro mAb no conjugado, una IgGl humanizada con diana en tumores mamarios sólidos, también ha mostrado resultados prometedores en ensayos clínicos de fase III (Deo et al, Immunology Today 18:127, 1997). Los antígenos de estos dos mAbs se expresan a nivel elevado en sus células tumorales respectivas y los anticuerpos median en una potente destrucción tumoral por parte de células efectoras in vitro e in vivo. En contraste, muchos otros mAbs no conjugados con especificidades tumorales finas no pueden inducir funciones efectoras de potencia suficiente para resultar clínicamente útiles (Frost et al, Cáncer 80:317-33, 1997; Surfus et al, J. Immunother. 19:184-91 , 1996). Para algunos de estos mAbs más débiles, en la actualidad se está investigando la terapia complementaria de citoquinas. La adición de citoquinas puede estimular la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) mediante el incremento de la actividad y número de linfocitos circulantes (Frost et al, Cáncer 80:317-33, 1997; Surfus et a/., J. Immunother. 19:184-91, 1 96) . La ADCC, un ataque lítico a las células diana, resulta inducida por la unión de receptores de los leucocitos a la región constante (Fe) de los anticuerpos (Deo et al. , Immunology Today 18:127, 1997) .

Un enfoque diferente, aunque complementario, al incremento de la actividad de ADCC de las IgGl s no conjugadas es manipular la región Fe del anticuerpo. Algunos estudios de manipulación de proteínas han demostrado que los FcyRs interactúan con la región bisagra inferior del dominio CH2 de IgG (Lund et al. , J. Immunol. 157:4963-69, 1996). Sin embargo, la unión de FcyR también requiere la presencia de oligosacáridos unidos covalentemente a la Asn297 conservada en la región CH2 (Lund et al, J. Immunol. 157:4963-69, 1996; Wright y Morrison, Trends Biotech. 15:26-31, 1997), sugiriendo que tanto el oligosacárido como el polipéptido contribuyen directamente al sitio de interacción o que el oligosacárido resulta necesario para mantener una conformación polipeptídica de CH2 activo. Por lo tanto, podría explorarse la modificación de la estructura de los oligosacáridos como medio para incrementar la afinidad de la interacción.

Una molécula de IgG porta dos oligosacáridos N-ligados en su región Fe, uno en cada cadena pesada. Al igual que cualquier glucoproteína, un anticuerpo es producido en forma de población de glucoformas que comparten el mismo esqueleto polipeptídico pero que presentan diferentes oligosacáridos unidos a los sitios de glucosilación. Los oligosacáridos normalmente presentes en la región Fe de la IgG sérica son de tipo biantenario complejo (Wormald et al. , Biochemistry 36: 130-38, 1997), con un nivel bajo de ácido siálico tenninal y N-acetilglucosamina bisectada (GlcNAc), y un grado variable de galactosilación terminal y fucosilación nuclear. Algunos estudios sugieren que la estructura de carbohidrato mínima necesaria para la unión de FcyR se encuentra dentro del núcleo oligosacárido (Lund et al, J. Immunol. 157:4963-69, 1996).

Las líneas celulares derivadas de ratón o de hámster utilizadas en la industria y en las universidades para la producción de mAbs terapéuticos no conjugados normalmente unen los determinantes oligosacáridos necesarios a los sitios Fe. Las IgGs expresadas en dichas líneas celulares, sin embargo, no presentan el GlcNAc biantenario presente en cantidades reducidas en las IgGs séricas. Lifely et al, Glycobiology 318:813-22, 1995. En contraste, recientemente se ha observado que una IgGl humanizada producida por mieloma de ratón (CAMPATH-1H) portaba un GlcNAc bisectado en alguna de sus glucoformas (Lifely et al. , Glycobiology 318:813 -22, 1995). El anticuerpo derivado de células de rata alcanzó una actividad de ADCC in vitro máxima de nivel similar al de los anticuerpos CAMPATH-1H producidos en líneas celulares estándares, aunque a concentraciones de anticuerpo significativamente inferiores.

El antígeno CAMPATH normalmente se encuentra presente a niveles elevados sobre células de linfoma, y este mAb quimérico presenta una actividad ADCC elevada en ausencia de un GlcNAc bisectado (Lifely et al, Glycobiology 318:813-22, 1995). En la ruta de glucosilación N-ligada, GnTIII añade un GlcNAc biantenario (Schachter, Biochem. Cell Biol. 64: 163-81 , 1986).

Estudios anteriores utilizaron una única línea celular CHO productora de anticuerpos que había sido previamente manipulada para expresar, de un modo externamente regulado, diferentes niveles de un gen clonado del enzima GnTIII (Umaña P. et al. , Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)). Este enfoque estableció por primera vez una correlación rigurosa entre la expresión de una glucosiltransferasa (por ejemplo GenTffl) y la actividad de ADCC del anticuerpo modificado. De esta manera, la invención contempla una ABM variante (por ejemplo una ABM de afinidad madurada) que se una a CEA unido a membrana, que comprende una región Fe o una región equivalente a una región Fe, que presenta una glucosilación alterada que resulta de la modificación del nivel de expresión de un gen de glucosiltransferasa en la célula huésped productora de ABM. En una realización específica, la modificación del nivel de expresión génica es un incremento de la actividad de GnTIII. La actividad incrementada de GnTIII resulta en un incremento del porcentaje de oligosacáridos bisectados, así como en una reducción del porcentaje de residuos de fucosa, en la región Fe del ABM. Este anticuerpo, o fragmento del mismo, presenta una afinidad incrementada de unión al receptor de Fe y una función efectora incrementada.

La presente invención también se refiere a un método para producir un ABM anti-CEA de la presente invención que presenta oligosacáridos modificados, que comprende: (a) cultivar una célula huésped manipulada para expresar por lo menos un ácido nucleico codificante de un polipéptido que presenta actividad de glucosiltransferasa bajo condiciones que permiten la producción de un ABM según la presente invención, en el que dicho polipéptido que presenta actividad de glucosiltransferasa se exprsa en una cantidad suficiente para modificar los oligosacáridos en la región Fe de dicho ABM producido por dicha célula huésped, y (b) aislar dicho ABM. En una realización, el polipéptido que presenta actividad de glucosiltransferasa es GnTIII. En otra realización, existen dos polipéptidos que presentan actividad de glucosiltransferasa. En una realización particular, los dos péptidos que presentan actividad de glucosiltransferasa son GnTIII y Manll. En otra realización, el polipéptido que presenta actividad de glucosiltransferasa es un polipéptido de fusión que comprende el dominio catalítico de GnTIII. En una realización más específica, el polipéptido de fusión comprende además el dominio de localización en Golgi de un polipéptido residente en el Golgi. Preferentemente, el dominio de localización en Golgi es el dominio de localización de la manosidasa II o GnTI. Alternativamente, el dominio de localización en el Golgi se selecciona de entre el grupo que consiste de: el dominio de localización de la manosidasa I, el dominio de localización de GnTII y el dominio de localización de la al, 6-fucosiltransferasa nuclear. Los ABMs producidos mediante los métodos de la presente invención presentan una afinidad de unión a receptor de Fe incrementada y/o una función efectora incrementada. Generalmente, la función efectora incrementada es una o más de las siguientes: citotoxicidad celular mediada por Fe incrementada (incluyendo la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) incrementada, la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) incrementada, la secreción de citoquinas incrementada, la incorporación incrementada de antígeno por parte de células presentadoras de antígeno mediada por complejo inmunológico, la unión a células NK incrementada, la unión a macrófagos incrementada, la unión a monocitos incrementada, la unión a células polimorfonucleares incrementada, la señalización directa inductora de apoptosis incrementada, el entrecruzamiento de anticuerpos unidos a diana incrementado, la maduración de células dendríticas incrementada o el cebado de células T incrementado. La unión a receptor de Fe incrementada preferentemente es la unión incrementada a un receptor de Fe activador, tal como FcyRIIIa. En una realización particularmente preferente, el ABM es un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo.

En una realización, el porcentaje de oligosacáridos N-ligados bisectados en la región Fe de los ABM es de entre por lo menos aproximadamente 10% y aproximadamente 100%, específicamente de por lo menos aproximadamente 50%, más específicamente, de por lo menos aproximadamente 60%, de por lo menos aproximadamente 70%, de por lo menos aproximadamente 80%, o de por lo menos entre aproximadamente 90% y 95% del total de oligosacáridos. En todavía otra realización, la molécula de unión a antígeno o molécula variante de unión a antígeno producida mediante los métodos de la invención presenta una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fe como resultado de la modificación de sus oligosacáridos mediante los métodos de la presente invención. En una realización, el porcentaje de oligosacáridos no fucosilados es de entre por lo menos aproximadamente 20% y aproximadamente 100%, específeiamente de por lo menos aproximadamente 50%, de entre por lo menos aproximadamente 60% y aproximadamente 70%, y más específicamente de por lo menos aproximadamente 75%. Los oligosacáridos no fucosilados pueden ser de tipo híbrido o complejo. En todavía otra realización, la molécula de unión a antígeno o molécula variante de unión a antígeno producida mediante los métodos de la invención presenta una proporción incrementada de oligosacáridos bisectados en la región Fe como resultado de la modificación de sus oligosacáridos mediante los métodos de la presente invención. En una realización, el porcentaje de oligosacáridos bisectados es de entre por lo menos aproximadamente 20% y aproximadamente 100%, específicamente de por lo menos aproximadamente 50%, de entre por lo menos aproximadamente 60% y aproximadamente 70%, y más específicamente de por lo menos aproximadamente 75%. En una realización particularmente preferente, los ABM producidos por las células huésped y mediante los métodos de la invención presentan una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados bisectados en la región Fe. Los oligosacáridos no fucosilados biantenarios pueden ser híbridos o complejos. Específicamente, los métodos de la presente invención pueden utilizarse para producir moléculas de unión a antígeno en las que entre por lo menos aproximadamente 10% y aproximadamente 100%, específicamente por lo menos aproximadamente 15%, más específicamente entre por lo menos aproximadamente 20% y aproximadamente 50%, más específicamente entre por lo menos aproximadamente 20% y aproximadamente 25%, y más específicamente entre por lo menos aproximadamente 30% y aproximadamente 35% de los oligosacáridos en la región Fe de la molécula de unión a antígeno o molécula variante de unión a antígeno son no fucosilados biasectados. Los ABMs de la presente invención también pueden comprender una región Fe en la que entre por lo menos aproximadamente 10% y aproximadamente 100%, específicamente por lo menos aproximadamente 15%, más específicamente entre por lo menos aproximadamente 20% y aproximadamente 25%, y más específicamente entre por lo menos aproximadamente 30% y aproximadamente 35% de los oligosacáridos en la región Fe del ABM son no fucosilados híbridos bisectados.

En otra realización, la presente invención se refiere a una molécula de unión a antígeno anti-CEA (por ejemplo un ABM variante) manipulado para que presente una función efectora incrementada y/o una afinidad de unión a receptor de Fe incrementada, producida mediante los métodos de la invención. La función efectora incrementada puede incluir, aunque sin limitación, uno o más de los siguientes: citotoxicidad celular mediada por Fe incrementada (incluyendo la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) incrementada, la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) incrementada, la secreción de citoquinas incrementada, la incorporación incrementada de antígeno por parte de células presentadoras de antígeno mediada por complejo inmunológico, la unión a células NK incrementada, la unión a macrófagos incrementada, la unión a monocitos incrementada, la unión a células polimorfonucleares incrementada, la señalización directa inductora de apoptosis incrementada, el entrecruzamiento de anticuerpos unidos a diana incrementado, la maduración de células dendríticas incrementada o el cebado de células T incrementado. En una realización preferente, la unión a receptor de Fe incrementada es la unión incrementada a un receptor de Fe activador, más preferentemente FcyRIIIa. En una realización, la molécula de unión a antígeno o molécula variante de unión a antígeno es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo que contiene la región Fe, o una proteína de fusión que incluye una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina. En una realización particularmente preferente, la molécula de unión a antígeno o molécula variante de unión a antígeno es un anticuerpo humanizado de afinidad madurada.

La presente invención proporciona además métodos para la generación y utilización de sistemas de células huésped para la producción de glucoformas de los ABMs de la presente invención, que presentan una afinidad de unión a receptor de Fe incrementada, preferentemente unión incrementada a receptores de Fe activadores y/o que presentan funciones efectoras incrementadas, incluyendo la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. La metodología de glucomanipulación que puede utilizarse con los ABMs de la presente invención ha sido descrita en mayor detalle en la patente US n° 6.602.684, en la solicitud publicada de patente US n° 2004/0241817 Al, en la solicitud publicada de patente US n° 2003/0175884 Al, en la solicitud provisional de patente US n° 60/441.307, y en la patente WO n° 2004/065540, el contenido completo de las cuales se incorpora como referencia en la presente memoria en su totalidad. Los ABMs de la presente invención alternativamente pueden glucomanipularse para que presenten una cantidad reducida de residuos fiicosa en la región Fe según las técnicas dadas a conocer en la solicitud publicada de patente US n° 2003/0157108 (Genentech), o en el documento EP n° 1.176.195 Al , en las patentes WO n° 03/085119 y n° 03/085119 y en las solicitudes publicadas de patente US n° 2003/0115614, n° 2004/093621, n° 2004/110282, n° 2004/110704 y n° 2004/132140 (Kyowa). El contenido de cada uno de dichos documentos se incorpora como referencia en su totalidad en la presente memoria. Los ABMs glucomanipulados de la invención también pueden producirse en sistemas de expresión que producen glucoproteínas modificadas, tales como las que se enseñan en la solicitud publicada de patente US n° 60/344.169 y en la patente WO n° 03/056914 (GlycoFi, Inc.) o en las patentes WO n° 2004/057002 y n° 2004/024927 (Greenovation), el contenido de cada una de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad en la presente memoria.

Generación de líneas celulares para la producción de proteínas con un patrón de glucosilación alterado En un aspecto, la presente invención proporciona sistemas de expresión de células huésped para la generación de los ABMs de la presente invención que presentan patrones de glucosilación modificados. En particular, la presente invención proporciona sistemas de células huésped para la generación de glucoformas de los ABMs de la presente invención que presentan un valor terapéutico mejorado. Por lo tanto, la invención proporciona sistemas de expresión de células huésped seleccionados o manipulados para expresar un polipéptido que presenta una actividad de glucosiltransferasa. En una realización específica, la actividad de glucosiltransferasa es una actividad de GnTUI. En una realización, el polipéptido que presenta actividad de GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio de localización en Golgi de un polipéptido heterólogo residente en Golgi. Específicamente, dichos sistemas de expresión de células huésped pueden manipularse para comprender una molécula recombinante de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido que presenta actividad de GnTIII, operablemente ligada a un sistema promotor constitutivo o regulado.

En una realización específica, la presente invención proporciona una célula huésped que ha sido manipulada para expresar por lo menos un ácido nucleico codificante de un polipéptido de fusión que presenta actividad de GnTIII y que comprende el dominio de localización en Golgi de un polipéptido heterólogo residente en el Golgi. En un aspecto, la célula huésped se manipula con una molécula de ácidos nucleicos que comprende por lo menos un gen codificante de un polipéptido de fusión que presenta actividad de GnTIII y que comprende el dominio de localización en el Golgi de un polipéptido heterólogo residente en el Golgi.

Generalmente, puede utilizarse cualquier tipo de línea celular en cultivo, incluyendo las líneas celulares comentadas anteriormente, como fondo para manipular las líneas celulares huésped de la presente invención. En una realización preferente, se utilizan células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 ó células de hibridoma, otras células de mamífero, células de levadura, células de insecto o células vegetales como línea celular de fondo para generar las células huésped manipuladas de la invención.

Se contempla que la invención comprenda cualquier célula huésped manipulada que exprese un polipéptido que presente actividad de glucosiltransferasa, por ejemplo actividad de GnTffi, incluyendo un polipéptido de fusión que comprende el dominio de localización en Golgi de un polipéptido heterólogo residente en el Golgi tal como se define en la presente memoria.

Uno o varios ácidos nucleicos codificantes de un polipéptido que presenta actividad de glucosiltransferasa, por ejemplo actividad de GnTIII, pueden expresarse bajo el control de un promotor constitutivo o, alternativamente, un sistema de expresión regulada. Dichos sistemas son bien conocidos de la técnica, e incluyen los sistemas comentados anteriormente. En el caso de que varios ácidos nucleicos diferentes codificantes de polipéptidos de fusión que presenten actividad de glucosiltransferasa, por ejemplo actividad de GnTIII, y que comprendan el dominio de localización en el Golgi de un polipéptido heterólogo residente en el Golgi, se encuentren comprendidos dentro del sistema de células huésped, algunas de ellas podrán expresarse bajo el control de un promotor constitutivo, mientras que otras se expresarán baj o el control de un promotor regulado. Los niveles de expresión de los polipéptidos de fusión que presentan actividad de glucosiltransferasa, por ejemplo actividad de GnTIII, se determinan mediante métodos generalmente conocidos de la técnica, incluyendo el análisis de transferencia western, el análisis de transferencia northern, el análisis de la expresión de genes informadores o la medición de la actividad de glucosiltransferasa, por ejemplo de la actividad de GnTIII. Alternativamente, puede utilizarse una lectina que se une a productos biosintéticos de GnTIII, por ejemplo la lectina E4-PHA. Alternativamente, puede utilizarse un ensayo funcional que mide la unión incrementada de receptor de Fe o una función efectora incrementada mediada por anticuerpos producidos por las células manipuladas con el ácido nucleico codificante de un polipéptido que presenta actividad de glucosiltransferasa, por ejemplo actividad de GnTIII.

Identificación de transfectantes o transformantes que expresan la proteína que presenta un patrón de glucosilación modificado Las células huésped que contienen la secuencia codificante de un ABM anti-CEA variante (por ejemplo un ABM humanizado de afinidad y/o estabilidad madurada) y que expresa los productos génicos biológicamente activos puede identificarse mediante por lo menos cuatro enfoques generales: (a) hibridación ADN-ADN o ADN-ARN, (b) la presencia o ausencia de funciones génicas "marcadoras", (c) la evaluación del nivel de transcripción medido mediante la expresión de los transcritos de ARNm respectivos en la célula huésped, y (d) la detección del producto génico medido mediante inmunoensayo o a partir de su actividad biológica.

En el primer enfoque, la presencia de la secuencia codificante de un anti-CEA variante y/o la secuencia codificante del polipéptido que presenta actividad de glucosiltransferasa (por ejemplo GnTIII) puede detectarse mediante hibridación ADN-ADN o ADN-ARN utilizando sondas que comprenden las secuencias de nucleótidos que son homologas de las secuencias codificantes respectivas, respectivamente, o partes o derivados de las mismas.

En el segundo enfoque, puede identificarse el sistema de vector de expresión recombinante/huésped y seleccionarse basándose en la presencia o ausencia de determinadas funciones génicas "marcadoras" (por ejemplo la actividad de timidina quinasa, la resistencia a antibióticos, la resistencia al metotrexato, un fenotipo de transformación, la formación de cuerpos de oclusión en baculovirus, etc.). Por ejemplo, en el caso de que la secuencia codificante del ABM de la invención, o de un fragmento del mismo, y/o la secuencia codificante del polipéptido que presenta actividad de glucosiltransferasa (por ejemplo GnTIII) se inserten dentro de una secuencia génica marcadora del vector, los recombinantes que contienen las secuencias codificantes respectivas pueden identificarse a partir de la ausencia de la función del gen marcador. Alternativamente, puede situarse un gen marcador en tándem con las secuencias codificantes bajo el control del mismo promotor o de promotores diferentes utilizados para controlar la expresión de las secuencias codificantes. La expresión del marcador en respuesta a la inducción o selección indica la expresión de la secuencia codificante del ABM de la invención y/o de la secuencia codificante del polipéptido que presenta actividad de glucosiltransferasa (por ejemplo GnTIII).

En el tercer enfoque, la actividad transcripcional de la región codificante del ABM de la invención, o de un fragmento del mismo y/o la secuencia codificante del polipéptido que presenta actividad de glucosiltransferasa (por ejemplo GnTIII) pueden evaluarse mediante ensayos de hibridación. Por ejemplo, puede aislarse el ARN y analizarse mediante transferencia northern utilizando una sonda homóloga de las secuencias codificantes del ABM de la invención, o de un fragmento de las mismas, y/o la secuencia codificante del polipéptido que presenta actividad de glucosiltransferasa (por ejemplo GnTIII) o partes particulares de la misma. Alternativamente, pueden extraerse los ácidos nucleicos totales de la célula huésped y someterse a ensayo para la hibridación de dichas sondas.

En el cuarto enfoque, la expresión de los productos proteicos puede evaluarse inmunológicamente, por ejemplo mediante transferencias western, inmunoensayos tales como la radioinmunoprecipitación, inmunoensayos ligados a enzima y similares. El ensayo definitivo del éxito del sistema de expresión, sin embargo, implica la detección de los productos génicos biológicamente activos.

Aplicaciones terapéuticas y métodos de utilización de moléculas de unión a antígeno anti- CEA La invención también se refiere a un método para la localización in vivo o in vitro de células que expresan CEA Las células que expresan CEA pueden localizarse con fines terapéuticos (por ejemplo para tratar un trastorno mediante la localización de células que expresan CEA para su destrucción por el sistema inmunológico). En una realización, la presente invención se refiere a un método para localizar células que expresan CEA en un sujeto, comprendiendo la administración en el sujeto de una composición que comprende un ABM de la invención. Las células que expresan CEA también pueden localizarse con fines diagnósticos (por ejemplo para determinar si expresan CEA, normal o anormalmente). De esta manera, la invención también se refiere a métodos para detectar la presencia de CEA o de una célula que expresa CEA, in vivo o in vitro. Un método para detectar la expresión de CEA según la presente invención comprende poner en contacto una muestra que debe someterse a ensayo, opcionalmente con una muestra de control, con un ABM de la presente invención, bajo condiciones que permitan la formación de un complejo entre el ABM y el CEA. A continuación, se detecta la formación de complejo (por ejemplo mediante ELISA u otros métodos conocidos de la técnica). Al utilizar una muestra de control con la muestra de ensayo, cualquier diferencia estadísticamente significativa en la formación de complejos de ABM-CEA al comparar las muestras de ensayo y de control es indicativa de la presencia de CEA en la muestra de ensayo.

En un aspecto, los ABMs y/o ABMs variantes de la presente invención pueden utilizarse para localizar células in vivo o in vitro que expresan CEA. Las células que expresan CEA pueden localizarse con fines diagnósticos o terapéuticos. En un aspecto, los ABMs de la presente invención pueden utilizarse para detectar la presencia de CEA en una muestra. CEA se expresa anormalmente (por ejemplo se sobreexpresa) en muchos tumores humanos en comparación con la expresión en tejido no tumoral del mismo tipo celular. De esta manera, los ABMs y/o ABMs variantes de la invención resultan particularmente útiles en la prevención de la formación de tumores, en la erradicación de tumores y en la inhibición del crecimiento o metástasis tumorales. Los ABMs y/o ABMs variantes de la invención también actúan deteniendo el ciclo celular, provocando la apoptosis de las células diana (por ejemplo células tumorales) e inhibiendo la angiogénesis y/o diferenciación de las células diana. Los ABMs y/o ABMs variantes de la invención pueden utilizarse para tratar cualquier tumor que exprese CEA. Entre las malignidades particulares que pueden tratarse con los ABMs y/o ABMs variantes de la invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el cáncer colorrectal, el cáncer pulmonar de células no pequeñas, el cáncer gástrico, el cáncer pancreático y el cáncer de mama.

Los ABMs anti-CEA y/o ABMs variantes dados a conocer en la presente memoria pueden utilizarse para inhibir el crecimiento tumoral o para eliminar células tumorales. Por ejemplo, los ABMs anti-CEA pueden unirse a CEA que se encuentra sobre la membrana o la superficie celular de las células cancerosas e inducir, por ejemplo, la ADCC u otra eliminación de las células cancerosas mediada por efectores. Los ABMs anti-CEA y/o ABMs variantes pueden humanizarse, específicamente de afinidad y/o estabilidad madurada, más específicamente pueden ser glucomanipulados, de estabilidad y afinidad maduradas.

Los ABMs y/o ABMs variantes alternativamente pueden utilizarse solos con el fin de bloquear la actividad del antígeno CEA, particularmente mediante la interferencia física con su unión a otro compuesto. Por ejemplo, las moléculas de unión a antígeno y las moléculas variantes de unión a antígeno pueden utilizarse para bloquear la adhesión celular mediada por el CEA.

Los ABMs anti-CEA y/o ABMs variantes de la invención se administran en un mamífero, preferentemente en un ser humano, en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable, tal como las comentadas anteriormente, incluyendo aquéllas que pueden administrarse en un ser humano por vía intravenosa en forma de un bolo o mediante infusión continua durante un periodo de tiempo, mediante las vías intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación. Los ABMs también se administran convenientemente por las vías intratumoral, peritumoral, intralesional o perilesional, con el fin de ejercer efectos terapéuticos locales además de sistémicos. Se espera que la vía intraperitoneal resulte particularmente útil, por ejemplo en el tratamiento de los tumores colorrectales.

Para el tratamiento de la enfermedad, la dosis correcta del ABM y/o ABM variante dependerá del tipo de enfermedad que debe tratarse, de la severidad y curso de la enfermedad, de las terapias anteriores, de la historia clínica del paciente y de la respuesta al anticuerpo, y del criterio del médico responsable. El ABM convenientemente se administra en el paciente de una vez o en una serie de tratamientos.

La presente invención proporciona un método para eliminar selectivamente células tumorales que expresan el CEA. Este método comprende hacer reaccionar las moléculas de unión a antígeno o los conjugados (por ejemplo la inmunotoxina) de la invención con dichas células tumorales. Estas células tumorales pueden proceder de un carcinoma humano, incluyendo el carcinoma colorrectal, el carcinoma pulmonar de células no pequeñas (NSCLC), el carcinoma gástrico, el carcinoma pancreático y el carcinoma mamario.

En una realización, la presente invención proporciona un método para inhibir la adhesión celular mediada por CEA de una célula tumoral. Este método comprende poner en contacto dicha célula tumoral con las moléculas de unión a antígeno o moléculas variantes de unión a antígeno de la invención o los conjugados de las mismas. Estas células tumorales pueden proceder de células humanas, incluyendo células de cáncer colorrectal, células de cáncer pulmonar de células no pequeñas (NSCLC), células de cáncer gástrico, células de cáncer pancreático y células de cáncer mamario.

Además, la presente invención proporciona un método para tratar los carcinomas (por ejemplo los carcinomas humanos) in vivo. Este método comprende administrar en un sujeto una cantidad farmacéuticamente efectiva de una composición que contiene por lo menos una de las moléculas de unión a antígeno o los inmunoconjugados (por ejemplo la inmunotoxina) de la invención.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para tratar cánceres caracterizados por la sobreexpresión del CEA, incluyendo, aunque sin limitación, las células de cáncer colorrectal, NSCLC (cáncer pulmonar de células no pequeñas), células de cáncer gástrico, células de cáncer pancreático y células de cáncer mamario, mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de las moléculas de unión a antígeno anti-CEA o moléculas variantes de unión a antígeno dadas a conocer en la presente memoria.

En una realización adicional, la invención se refiere a un método para inducir la regresión del tejido tumoral en un sujeto utilizando moléculas de unión a antígeno anti-CEA o moléculas variantes de unión a antígeno dadas a conocer en la presente memoria. Entre los ejemplos no limitativos de tejido tumoral se incluyen tumor colorrectal, tumor pulmonar de células no pequeñas, tumor gástrico, tumor pancreático y tumor mamario. En una realización particular, el tejido tumoral es un tumor colorrectal.

Según la práctica de la presente invención, el sujeto puede ser un sujeto humano, equino, porcino, bovino, murino, canino, felino y aviar. Otros animales de sangre caliente también se encuentran incluidos en la presente invención.

La invención proporciona además métodos para inhibir el crecimiento de las células tumorales, tratar un tumor en un sujeto y tratar una enfermedad de tipo proliferativo en un sujeto. Estos métodos comprenden la administración en el sujeto de una cantidad efectiva de la composición de la invención.

En otro aspecto, la invención se refiere a la utilización de las moléculas de unión a antígeno anti-CEA o molécula variantes de unión a antígeno dadas a conocer en la presente memoria para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad relacionada con la expresión anormal del CEA. En una realización particular, la enfermedad es un cáncer que sobreexpresa el CEA, incluyendo, aunque sin limitación, tumor colorrectal, tumor pulmonar de células no pequeñas, tumor gástrico, tumor pancreático y tumor mamario. En una realización particular, el tumor es un tumor colorrectal.

Conjugados de moléculas de unión a antígeno anti-CEA La invención también proporciona inmunoconjugados que comprenden un ABM anti-CEA o ABM variante en la presente memoria conjugado con uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes quimioterapéuticos o fármacos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo proteínas toxinas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, füngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas) o isótopos radioactivos.

En una realización, un inmunoconjugado de anticuerpo-fármaco (ADC), en el que un anticuerpo se conjuga con uno o más fármacos, incluyendo, aunque sin limitación, un maitansinoide (ver las patentes US n° 5.208.020, 5.416.064 y la patente europea n° EP 0425 235 B 1 ); una auristatina, tal como las fracciones DE y DF de fármaco monometillauristatina (MMAE y MMAF) (ver las patentes US n° 5.635.483 y n° 5.780.588 y n° 7.498.298), una dolastatina, una caliqueamicina o derivado de la misma (ver patentes US n° 5.712.374, n° 5.714.586, n° 5.739.116, n° 5.767.285, n° 5.770.701, n° 5.770.710, n° 5.773.001 y n° 5.877.296; Hinman et al, Cáncer Res. 53:3336-3342, 1993, y Lode et al, Cáncer Res. 58:2925-2928, 1998; una antraciclina tal como daunornicina o doxorrubicina (ver Kratz et al. , Current Med. Chem. 13 :477-523, 2006; Jeffrey et al, Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362, 2006; Torgov et al, Bioconj. Chem. 16:717-721, 2005; Nagy et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:829-834, 2000; Dubowchik et al, Bioorg. & Med. Chem. Letters 12: 1529-1532, 2002; King etal, J. Med. Chem. 45:4336-4343, 2002; y la patente US n° 6.630.579); metotrexato, vindesina, un taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel y ortataxel; un tricoteceno, y CC1065.

En otra realización, un inmunoconjugado comprende un ABM anti-CEA o ABM variante tal como se indica en la presente memoria conjugado con una toxina enzimáticamente activa o fragmento de la misma, incluyendo, aunque sin limitación, cadena A diftérica, fragmentos activos no ligantes de la toxina diftérica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas deAleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, cretina, inhibidor de Saponaria qfficinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos.

En otra realización, un inmunoconjugado comprende un ABM anti-CEA o ABM variante tal como se indica en la presente memoria conjugado con un átomo radioactivo para formar un conjugado radioactivo. Se encuentra disponible una diversidad de isótopos radioactivos para la producción de conjugados radioactivos. Entre los ejemplos se incluyen At21 ', I131, 1125, Y90, Re186, Re100, Sm1 , ?G , P , Pb¿,¿ y los isótopos radioactivos de Lu. En el caso de que el conjugado radioactivo se utilice para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios escintigráficos, por ejemplo tc99m o I123, o un mareaje de espín para la obtención de imágenes por resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como obtención de imágenes por resonancia magnética, RMI), tal como yodo- 123 nuevamente, yodo-131, indio-111, flúor- 19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno- 17, gadolinio, manganeso o hierro.

Los conjugados de anticuerpo y agente citotóxico se preparan utilizando una diversidad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, tales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), ciclohexán-1-carboxilato de succimmidil-4-(N-maleirnidometilo) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCl de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehidos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis( -azidobenzoil)hexanodiamina), derivados bis-diazonio (tales como bis-^-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de bis-flúor activo (tales como l,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina tal como se describe en Vitetta et al, Science 238:1098, 1987. El ácido l -isotiocianatobencil-3-metildietilén- triaminapentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono- 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionucleótido con el anticuerpo. Ver la patente WO n° 94/1 1026. El conector puede ser un "conector escindible" que facilite la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede utilizarse un conector lábil a los ácidos, un conector sensible a la peptidasa, un conector fotolábil, un conector dimetilo o un conector que contenga disulfuros (Chari et al., Cáncer Res. 52: 127-131 , 1992; patente US n° 5.208.020).

Los inmunoconjugados o ADCs en la presente memoria contemplan expresamente, aunque sin limitación, los conjugados preparados con reactivos de entrecruzamiento, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato), que se encuentran disponibles comercialmente (por ejemplo de Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL, USA).

Composiciones, formulaciones, dosis y vías de administración En un aspecto, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden los ABMs anti-CEA o ABMs variantes de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable. La presente invención se refiere además a la utilización de dichas composiciones farmacéuticas en el método de tratamiento de enfermedades, tales como cáncer, o en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de enfermedades, tales como el cáncer. Concretamente, la presente invención se refiere a un método para el tratamiento de una enfermedad, y más particularmente, para el tratamiento del cáncer, comprendiendo el método la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de la invención.

En un aspecto, la presente invención comprende composiciones farmacéuticas, combinaciones y métodos para tratar carcinomas humanos, por ejemplo el carcinoma colorrectal. Por ejemplo, la invención incluye composiciones farmacéuticas para la utilización en el tratamiento de carcinomas humanos, que comprenden una cantidad farmacéuticamente efectiva de un anticuerpo de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones de ABM de la invención pueden administrarse utilizando modos convencionales de administración, incluyendo, aunque sin limitación, la administración intravenosa, intraperitoneal, oral, intralinfática o la administración directamente en el tumor. La administración intravenosa resulta preferente.

En un aspecto de la invención, las formulaciones terapéuticas que contienen los ABMs de la invención se preparan para el almacenamiento mediante la mezcla de un anticuerpo que presenta el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol A., editor, 1980) en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables resultan no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones utilizadas.

Las formulaciones que deben utilizarse para la administración in Vivo deben ser estériles. Lo anterior se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

El modo de administración y régimen de dosificación más efectivos para las composiciones farmacéuticas de la presente invención dependen de la severidad y curso de la enfermedad, de la salud del paciente y de la respuesta al tratamiento y del criterio del médico responsable. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, las dosis de las composiciones deben titularse adaptándose al paciente individual. Sin embargo, una dosis efectiva de las composiciones de la presente invención generalmente se encontrará comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 2.000 mg/kg.

Las moléculas indicadas en la presente memoria pueden encontrarse en una diversidad de formas de dosificación, incluyendo, aunque sin limitación, soluciones o suspensiones líquidas, tabletas, pildoras, polvos, supositorios, microcápsulas o microvesículas poliméricas, liposomas, y soluciones inyectables o infusionables. La forma preferente depende del modo de administración y de la aplicación terapéutica.

La composición que comprende un ABM de la presente invención se formula, dosifica y administra de un modo consistente con las buenas prácticas médicas. Entre los factores para la consideración en el presente contexto se incluyen la enfermedad o trastorno particular bajo tratamiento, el mamífero particular bajo tratamiento, la condición clínica del paciente individual, la causa de la enfermedad o trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los profesionales médicos. La cantidad terapéuticamente efectiva del antagonista que debe administrarse se regulará a partir de dichas consideraciones.

Artículos fabricados En otro aspecto de la invención, se proporciona un artículo fabricado que contiene materiales que resultan útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos indicados anteriormente. El artículo fabricado comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en el paquete sobre el recipiente o asociado al mismo. Entre los recipientes adecuados se incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, bolsas de solución I.V., etc. Los recipientes pueden formarse a partir de una diversidad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que resulta, por sí misma o en combinación con otra composición, efectiva para tratar, prevenir y/o diagnosticar la condición, y puede presentar una abertura de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que presente un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica). Por lo menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de la invención. La etiqueta o prospecto en el paquete indica que la composición se utiliza para el tratamiento de la condición de elección. Además, el artículo fabricado puede comprender: (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo de la invención, y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un agente citotóxico adicional u otro agente de otro modo terapéutico. El artículo fabricado en la presente realización de la invención puede comprender además un prospecto en el paquete que indique que las composiciones pueden utilizarse para tratar una condición particular. Alternativamente, o adicionalmente, el artículo fabricado puede comprender adicionalmente un segundo (o tercer) recipiente que comprenda un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer o solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y para el usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

Se entiende que cualquiera de los artículos fabricados anteriormente indicados puede incluir un inmunoconjugado de la invención en sustitución o adicionalmente a un ABM anti-CEA.

Los ejemplos posteriormente explican la invención en mayor detalle. Las preparaciones y ejemplos siguientes se proporcionan para permitir que el experto en la materia entienda más claramente y ponga en práctica la presente invención. Sin embargo, la presente invención no se encuentra limitada en su alcance a las realizaciones ejemplificadas, que pretenden ser ilustraciones de aspectos individuales de la invención únicamente, y los métodos que son funcionalmente equivalentes se encuentran comprendidos dentro del alcance de la invención. En efecto, diversas modificaciones de la invención además de aquéllas descritas en la presente invención se pondrán de manifiesto al experto en la materia a partir de la descripción anterior y dibujos adjuntos. Dichas modificaciones se pretende que se encuentren comprendidas dentro del alcance según las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos A menos que se indique lo contrario, las referencias a la numeración de posiciones específicas de residuos aminoácidos en los Ejemplos, a continuación, siguen el sistema de numeración de Kabat.

Ejemplo 1 Generación de bibliotecas de maduración de afinidad Biblioteca de Hl/H2 Para la generación de una biblioteca de maduración de afinidad aleatorizada en la región HCDR1 y HCDR2, se aleatorizaron los tripletes codificantes de las posiciones F32 G33 en CDR1 y de las posiciones W50 N52 T52a K52b T54 E56 T58 en CDR2. En una primera etapa, se amplificó un fragmento de ADN (fragmento 1) utilizando pMS22 como molde y los cebadores MS-43 (SEC ID n° 123) y EAB-679 (SEC ID n° 127) que contiene las posiciones aleatorizadas de CDR1 (fig. 11). Utilizando el mismo molde, los cebadores MS-56 (SEC ID n° 126) y MS-52 (SEC ID n° 124) amplificaron un segundo fragmento (fragmento 2) que presentaba una región solapante con el extremo 3' del fragmento 1. Entre las condiciones de amplificación se incluyeron una etapa inicial de incubación de 5 minutos a 94°C, seguido de 25 ciclos, consistiendo cada uno de una etapa de desnaturalización de 1 minuto a 94°C, de hibridación durante 1 minuto a 55°C y de alargamiento durante 20 segundos y 50 segundos a 72°C, para los fragmentos 1 y 2, respectivamente. Se llevó a cabo al final una última etapa de incubación de 10 minutos a 72°C. Ambos fragmentos se purificaron en un gel de agarosa. Una PCR solapante de extensión con los fragmentos 1 y 2 utilizando los cebadores MS-43 (SEC ID n° 123) y EAB-680 (SEC ID n° 128), que incluía las posiciones aleatorizadas de CDR2, generó un fragmento con ambas CDRs aleatorizadas (fragmento 3). Para el ensamblaje de los fragmentos 1 y 2, se utilizaron cantidades equimolares de fragmento 1 y fragmento 2. Las condiciones de amplificación incluían una etapa inicial de incubación de 5 minutos a 94°C, seguido de 5 ciclos sin incubadores, consistiendo cada ciclo de una etapa de desnaturalización de 1 minuto a 94°C, una etapa de hibridación de 1 minuto a 55°C y una etapa de alargamiento de 40 segundos a 72°C. Tras la adición de los cebadores exteriores, se llevaron a cabo 20 ciclos adicionales utilizando los mismos parámetros. Un cuarto fragmento (fragmento 4) que se solapa con la región 3' del fragmento 3 se amplificó por PCR utilizando nuevamente pMS22 como molde y los cebadores MS-55 (SEC ID n° 125) y MS-52 (SEC ID n° 124). Tras la purificación en gel, una extensión final por PCR solapante con los fragmentos 3 y 4 como moldes y los cebadores MS-43 y MS-52 generó un fragmento que contenía CL y partes de VH. Para ello, se utilizaron cantidades equimolares de los fragmentos 3 y 4. Las condiciones de amplificación incluían una etapa inicial de incubación de 5 minutos a 94°C, seguido de 5 ciclos sin incubadores, consistiendo cada ciclo de una etapa de desnaturalización de 1 minuto a 94°C, una etapa de hibridación de 1 minuto a 55°C y una etapa de alargamiento de 80 segundos a 72°C. Tras la adición de los cebadores exteriores, se llevaron a cabo 20 ciclos adicionales utilizando los mismos parámetros. A continuación, el fragmento resultante se purificó en gel y se ligó con pMS22 tras la digestión con Ncol/Nhel.

Biblioteca de L1/L2 Para la generación de una biblioteca de maduración de afinidad aleatorizada en la región LCDR1 y LCDR2, se aleatorizaron los tripletes que codificaban las posiciones Q27, N28, V29, G30, T31, N32 en CDRl y las posiciones Y49, S50, Y53, R54, Y55, S56 en CDR2. En una primera etapa, se amplificó un fragmento de ADN (fragmento 1) utilizando pMS22 como molde y los cebadores EAB-685 (SEC ID n° 129) y EAB-681 (SEC ID n° 133) que contiene las posiciones aleatorizadas de CDRl (fig. 12). Utilizando el mismo molde, los cebadores EAB-686 (SEC ID n° 130) y EAB-687 (SEC ID n° 131) amplificaron un segundo fragmento (fragmento 2) que presentaba una región solapante con el extremo 3' del fragmento 1. Entre las condiciones de amplificación se incluyeron una etapa inicial de incubación de 5 minutos a 94°C, seguida de 25 ciclos, consistiendo cada uno de una etapa de desnaturalización de 1 minuto a 94°C, de hibridación durante 1 minuto a 55°C y de alargamiento durante 60 segundos a 72°C, para los fragmentos 1 y 2, respectivamente. Se llevó a cabo al final una última etapa de incubación de 10 minutos a 72°C. Ambos fragmentos se purificaron en un gel de agarosa. Una PCR solapante de extensión con los fragmentos 1 y 2 utilizando los cebadores EAB-685 (SEC ID n° 129) y EAB-682 (SEC ID n° 134), que incluía las posiciones aleatorizadas de CDR2, generó un fragmento con ambas CDRs aleatorizadas (fragmento 3). Para el ensamblaje de los fragmentos 1 y 2, se utilizaron cantidades equimolares de fragmento 1 y fragmento 2. Las condiciones de amplificación incluían una etapa inicial de incubación de 5 minutos a 94°C, seguido de 5 ciclos sin incubadores, consistiendo cada ciclo de una etapa de desnaturalización de 1 minuto a 94°C, una etapa de hibridación de 1 minuto a 55°C y una etapa de alargamiento de 60 segundos a 72°C. Tras la adición de los cebadores exteriores, se llevaron a cabo 20 ciclos adicionales utilizando los mismos parámetros. Un cuarto fragmento (fragmento 4) que se solapa con la región 3' del fragmento 3 se amplificó por PCR utilizando nuevamente pMS22 como molde y los cebadores EAB-688 (SEC ?) n° 132) y EAB-687 (SEC ID n° 131). Tras la purificación en gel, una extensión final mediante PCR solapante utilizando los fragmentos 3 y 4 como moldes y los cebadores EAB-685 (SEC ED n° 129) y EAB-687 (SEC ID n° 131) generó un fragmento que contenía VL y partes de CL. Para ello, se utilizaron cantidades equimolares de los fragmentos 3 y 4. Las condiciones de amplificación incluían una etapa inicial de incubación de 5 minutos a 94°C, seguido de 5 ciclos sin incubadores, consistiendo cada ciclo de una etapa de desnaturalización de 1 minuto a 94°C, una etapa de hibridación de 1 minuto a 55°C y una etapa de alargamiento de 80 segundos a 72°C. Tras la adición de los cebadores exteriores, se llevaron a cabo 20 ciclos adicionales utilizando los mismos parámetros. A continuación, este fragmento se ligó con pMS22 tras la digestión con HindHI/SacI.

Bibliotecas de H3 Para la generación de bibliotecas de maduración de afinidad aleatorizadas en la región HCDR3, se aleatorizaron tripletes codificantes de las posiciones W95, D96, F97, Y98, D99, Yl 00, VI 00a, ElOOb, AlOOc y MIOOd siguiendo dos enfoques diferentes: (1) aleatorización del segmento completo (biblioteca completa de H3), o (2) aleatorización individual de cada posición, resultando en diez sub-bibliotecas. Las sub-bibliotecas que contenían clones con posiciones individualmente aleatorizadas se agruparon tras la transformación en bacterias (biblioteca agrupada de H3). Para la aleatorización de la región HCDR3, los fragmentos se amplificaron por PCR utilizando un cebador que se hibridaba con el extremo 3' de CL y los cebadores que incluyen las secuencias aleatorizadas de HCDR3 (fig. 13). A continuación, se llevó a cabo una extensión mediante PCR solapante con un segundo fragmento que se solapaba con el extremo 3' del fragmento 1, y comprendía el extremo de VH y la región 5' de CH1. A continuación, los fragmentos ensamblados se ligaron en pMS22 tras la digestión con Sacl/Nhel. Para la generación de la biblioteca agrupada de H3, diez fragmentos de ADN se amplificaron por PCR separadamente utilizando cada uno de los cebadores AC7-AC16 (SEC ED n° 135, SEC ID n° 144) en combinación con el cebador EAB-749 (SEC ID n° 146) . Para la generación de la biblioteca completa de L3, se utilizaron los cebadores AC 17 (SEC ID n° 145) y EAB-749 (SEC ID n° 146). Se utilizó el plásmido pMS22 como molde. Las condiciones de amplificación incluían una etapa inicial de incubación de 5 minutos a 94°C, seguida de 25 ciclos, consistiendo cada uno de una etapa de desnaturalización de 1 minuto a 94°C, una etapa de hibridación de 1 minuto a 55°C y una etapa de alargamiento de 36 segundos a 72°C, seguida de una etapa final de incubación de 10 minutos a 72°C. Lo anterior resultó en fragmentos de aproximadamente 580 pb de longitud que se purificaron en un gel de agarosa. Para la extensión por PCR solapante, se amplificó un segundo fragmento utilizando el cebador EAB-750 (SEC ID n° 147) o EAB-751 (SEC ID n° 148) en combinación con EAB-752 (SEC ID n° 149). Aunque el cebador EAB-750 (SEC ID n° 147) presentaba una secuencia solapante con los cebadores de aleatonzación AC7-11 (SEC ID n° 139), EAB-751 (SEC ID n° 148) compartía homologías de secuencia con los cebadores de aleatorización AC12-17 (SEC ?) n° 140-145). Las condiciones de amplificación incluían una etapa inicial de incubación de 5 minutos a 94°C, seguida de 25 ciclos, consistiendo cada uno de una etapa de desnaturalización de 1 minuto a 94°C, una etapa de hibridación de 1 minuto a 55°C y una etapa de alargamiento de 12 segundos a 72°C, seguida de una etapa final de incubación de 10 minutos a 72°C. Los fragmentos resultantes presentaban una longitud de aproximadamente 180 pb. Para el ensamblaje de ambos fragmentos, se utilizaron cantidades equimolares de fragmento 1 y el fragmento correspondiente 2. Las condiciones de amplificación incluían una etapa inicial de incubación de 5 minutos a 94°C, seguido de 5 ciclos sin incubadores, consistiendo cada ciclo de una etapa de desnaturalización de 1 minuto a 94°C, una etapa de hibridación de 1 minuto a 55°C y una etapa de alargamiento de 60 segundos a 72°C. Tras la adición de los cebadores exteriores EAB-749 (SEC ID n° 146) y EAB-752 (SEC ID n° 149), se llevaron a cabo 20 ciclos adicionales utilizando los mismos parámetros. Al final, se llevó a cabo al final una etapa final de incubación de 10 minutos a 72°C. A continuación, se ligaron los fragmentos purificados en gel en pMS22 tras la digestión con Sacl/Nhel y las ligaciones purificadas se transformaron en bacterias TG1 mediante electroporación.

Bibliotecas de L3 Para la generación de bibliotecas de maduración de afinidad aleatorizadas en la región CDR3 de la cadena ligera, los tripletes codificantes de las posiciones Y91, Y92, T93, Y94 y L95a se aleatorizaron en todo el segmento (biblioteca completa de L3) o individualmente, resultando en cinco sub-bibliotecas. Las sub-bibliotecas que contenían clones con posiciones individualmente aleatorizadas se agruparon tras la transformación en bacterias (biblioteca agrupada de L3). Para la generación de las cinco sub-bibliotecas, cinco fragmentos de ADN se amplificaron por PCR utilizando cada uno de los cebadores AC1-AC5 (SEC ID n° 150-154) en combinación con el cebador MS43 (SEC ID n° 123). Para la generación de la biblioteca completa de L3, se utilizó la combinación de cebadores ACÓ (SEC ID n° 155) y MS43 (SEC ID n° 123) (fig. 14). Seutilizó el plásmido pMS22 como molde. Las condiciones de amplificación incluían una etapa inicial de incubación de 5 minutos a 94°C, seguida de 25 ciclos, consistiendo cada uno de una etapa de desnaturalización de 1 minuto a 94°C, una etapa de hibridación de 1 minuto a 55°C y una etapa de alargamiento de 25 segundos a 72°C, seguida de una etapa final de incubación de 10 minutos a 72°C. Los fragmentos resultantes que comprendían las posiciones 1 a 104 del dominio VL se purificaron en un gel de agarosa y se utilizaron como molde para una amplificación por PCR adicional. Todas las reacciones se llevaron a cabo con el cebador EAB-746 (SEC ID n° 156), que presentaba una secuencia solapante con los cebadores de aleatorización MS43 (SEC ID n° 123) utilizando las condiciones indicadas anteriormente. Los fragmentos purificados, así como pMS22, fueron digeridos con Ncol/Xhol. En las cinco sub-bibliotecas, se ligaron 0,5 µg de inserción con 0,5 µg de pACl 6. Para la biblioteca completa de L3, la ligación se llevó a cabo con 9,8 µg de inserción y 9,8 µg de pMS22. Las ligaciones purificadas se transforaron en bacterias TG1 mediante electroporación.

Generación de los antígenos Debido a que los anticuerpos PR1 A3 tanto murinos como humanizados reconocen únicamente CEA humano unido a membrana y no CEA liberado, se generó una proteína quimérica recombinante que contenía el epítopo de PR1 A3 para la maduración in vitro de la afinidad de PRl A3 humanizado (SEC ID n° 7 y n° 8). La generación de esta proteína híbrida se llevó a cabo tal como se describe en Steward et al, 1999. Brevemente, se sustituyó la secuencia de ADN del dominio B de la glucoproteína biliar humana (BGP) por la secuencia del dominio B3 del CEA humano, el cual contiene el epítopo de PR1A3. Como resultado, la secuencia codificaba una proteína híbrida que comprendía los dominios N y Al de BGP, el dominio B3 del CEA y el dominio A2 de BGP (N-Al -B3-A2, NABAhu). A continuación, este producto de fiisión se unió a la parte Fe de la IgGl humana (NABAhu-Fc) (Steward et al, Cáncer Immunol. Immunother. 47:299-306, 1999) o se fusionó con una secuencia codificante del sitio de corte de proteasa de precisión, una etiqueta avi y una etiqueta (His)6 (NABAhu-avi-his) (SEC ID n° 158). Se purificó NABAhu-Fc a partir del sobrenadante de una línea celular CHO establemente transfretada utilizando una columna de proteína A. Se transfectó transitoriamente NABAhu-avis-his (SEC ID n° 158) en células HEK293, expresando establemente la proteína EBNA derivada del EBV. Un plásmido cotransfectado simultáneamente codificante de una biotina ligasa permitió la biotinilación in vivo específica de la etiqueta avi. A continuación, se purificó la proteína mediante cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC) seguido de filtración en gel. Maduración de afinidad de PR1 A3 humanizado La generación de Fabs de PR1 A3 humanizado de afinidad madurada se llevó a cabo mediante expresión fágica mediante protocolos estándares (Silacci et al., Proteomics 5(9):2340-2350, 2005). Las selecciones con todas las bibliotecas de maduración de afinidad se llevaron a cabo en solución siguiendo el procedimiento siguiente: 1. unión de ~1012 partículas fagémidas de cada biblioteca de maduración de afinidad con NABAhu-avis-his biotinilado 100 nM durante 0,5 horas en un volumen total de 1 mi. 2. Captura de NABAhu-avis-his biotinilado y partículas fágicas específicamente unidas mediante la adición de 5,4x107 perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina, durante 10 minutos; 3. lavado de las perlas utilizando 5-1 Ox 1 mi de PBS/Tween20 y 5-10x 1 mi de PBS; 4. elución de partículas fágicas mediante la adición de 1 mi de TEA (trietilamina) 100 mM durante 10 minutos y neutralización mediante la adición de 500 µ? de Tris 1 M/HC1, pH 7,4, y 5. reinfección de bacterias E. coli TG1 en crecimiento exponencial, infección con fago ayudante VCSM 13 y posterior precipitación con PEG NaCl de las partículas fagémidas que debían utilizarse en rondas de selección posteriores. Las selecciones se llevaron a cabo en 3 a 5 rondas utilizando concentraciones de antígeno constantes o decrecientes (de 10"7 M a 2x10"9 M). En la ronda 2, captura del antígeno: se formaron complejos de fagos utilizando placas con neutravidina en lugar de perlas con estreptavidina. Se identificaron los ligantes específicos mediante ELISA del modo siguiente: 100 µ? de NABAhu-avis-his biotinilado 10 nM en cada pocilio se recubrieron sobre placas con neutravidina. Se añadieron sobrenadantes bacterianos que contenían Fab y se detectaron los Fabs ligantes a partir de sus etiquetas Flag mediante la utilización de un anticuerpo secundario anti-FlagHRP. Se expresaron en bacterias los clones positivos en el ELISA en forma de fragmentos Fab solubles en formato de 96 pocilios y los sobrenadantes se sometieron a un experimento de cribado cinético utilizando un BIACORE T100. Se identificaron los clones que expresaban Fabs con las constantes de afinidad más altas y se secuenciaron los fagémidos correspondientes.

Purificación de Fabs y medición de los parámetros cinéticos Para el análisis exacto de los parámetros cinéticos, se purificaron Fabs a partir de cultivos bacterianos. Se inoculó un cultivo de 500 mi y se indujo con IPTG 1 mM a una D06oo de 0,9. Las bacterias se incubaron a 25°C durante la noche y se recolectaron mediante centrifugación. Tras la incubación del pellet resuspendido durante 20 minutos en 25 mi de tampón PPB (Tris-HCl 30 mM, pH 8, EDTA 1 mM, sacarosa al 20%), las bacterias se centrifugaron nuevamente y se recolectó el sobrenadante. Esta etapa de incubación se repitió una vez con 25 mi de una solución 5 mM de MgS04. Los sobrenadantes de ambas etapas de incubación se agruparon, se filtraron y se cargaron en una columna IMAC (His Gravitrap, GE Healthcare). A continuación, la columna se lavó con 40 volúmenes. Tras la elución (NaCl 500 mM, imidazol 500 mM, NaH2P0420 mM, pH 7,4), el eluido se tamponó nuevamente utilizando las columnas PD10 (GE Healthcare). Los parámetros cinéticos de los Fabs purificados seguidamente se estudiaron mediante análisis de PSR en serie de dilución de 200 nM a 6,25 nM.

Ejemplo 2 El anticuerpo PR 1 A3 se quimerizó para preparar una región constante de IgG 1 /kappa humana y se expresó utilizando la tecnología GlycoMab con el fin de disponer de un alto grado de azúcares afucosilados en la región Fe. Se compararon los anticuerpos glucomanipulados y no glucomanipulados a una proporción de efector a diana de 25:1. La cantidad máxima de eliminación de células diana dependiente de anticuerpos se duplicó mediante glucomanipulación de la región Fe (figura 2). Se consiguió un incremento adicional de la eliminación celular mediante el incremento de la proporción de efector a diana (figura 2).

Se humanizó PR1 A3 utilizando marcos idénticos a las secuencias de línea germinal humana. La secuencia de IMGT IGHV7-4-1 *02 (n° de acceso X62110) era el aceptor de VH humanizado y MGT_hVK_l_39 (n° de acceso X59315) era el aceptor para la humanización de VL. Un anticuerpo PR1A3 humanizado que comprende un constructo de región variable de cadena pesada CH7A y un constructo de región variable de cadena ligera CLIA mostraron una unión satisfactoria a células de carcinoma de colon humano medida mediante citometría de flujo (figura 3)· Se llevó a cabo una maduración de la afinidad de PR1 A3 mediante expresión fágica utilizando protocolos estándares descritos en detalle en el Ejemplo 1 , en la presente memoria. El anticuerpo PR1A3 humanizado parental que se utilizó para la maduración de la afinidad comprendía un constructo de región variable de cadena pesada CH7A y un constructo de región variable de cadena ligera CLIA. Las Tablas 3 a 6, posteriormente, muestran las bibliotecas utilizadas para la maduración de la afinidad. Para la biblioteca de Ll /L2, se mantuvieron constantes las posiciones valina 29, alanina 50 ó serina 51 dentro de las CDRs. Para la biblioteca de H1 H2, se mantuvieron constantes las posiciones isoleucina 51 , glicina 55 ó alanina 57 dentro de las CDRs (figuras 4 y 5).

Un constructo de región variable de cadena pesada de afinidad madurada, CH7A rF9 y un constructo de región variable de cadena ligera de afinidad madurada, CLIA rHl 1, se emparejaron con los constructos parentales de región variable de cadena ligera y de región variable de cadena pesada, respectivamente, y entre sí. Todos los anticuerpos se convirtieron en IgGl/kappa humana y se midió mediante citometría de flujo la unión a la línea celular CEA-positiva MK 45. Los anticuerpos que comprendían una región variable de cadena pesada o ligera de afinidad madurada o ambas regiones variables de cadena pesada o ligera de afinidad madurada mostraron una característica de unión mejorada en comparación con el anticuerpo parental humanizado (figura 6). Las figuras 6, 10 y 15 muestran varios ejemplos en los que las cadenas ligera y pesada maduradas contribuyen independientemente a una afinidad incrementada. El anticuerpo parental CH7A CLIA presenta la intensidad de señal más baja, así como el valor de EC50 más alto en las figuras 6 y 15. La cadena ligera madurada desplazaba los valores de EC5o a valores más bajos, mientras que las cadenas pesadas maduradas (rF9 en la figura 6, y rB9 en la figura 15) desplazaron la intensidad de señal de fluorescencia total en una medición mediante citometría de flujo. La figura 10 muestra las contribuciones individuales de la cadena pesada y de la cadena ligera medidas mediante metodología Biacore. La combinación de dichas dos cadenas incrementa la afinidad todavía más. Además, tal como se muestra en la figura 16, la mejora de la afinidad conduce a una mejora de las características de ADCC.

Las afinidades de unión de las CDRs de las cadenas pesada y ligera de afinidad madurada se determinaron mediante Biacore y se listan en las figuras 34A y B.

La FIGURA 35 resume las constantes de afinidad para las diversas secuencias de anticuerpo de afinidad madurada. Se lista el anticuerpo PR1 A3 parental, así como varias combinaciones de cadena ligera y cadena pesada de secuencias maduradas y no maduradas. Todos los valores se obtuvieron mediante tecnología Biacore mediante la medición de las constantes de tasa de asociación (ko„) y de disociación (koff) de los diversos constructos de anticuerpo solubles en formato Fab en un chip Biacore con reactivo NABA-avi-his inmovilizado (SEC ID n° 158) como antígeno. La constante de afinidad se indica como ¾.

Ejemplo 3 El marco aceptor utilizado para generar los anticuerpos anti-CEA de afinidad madurada indicado en el Ejemplo 2 era de la clase VH7 humana. Con el fin de incrementar la estabilidad, se utilizó una secuencia de marco aceptor más estable como base para la manipulación de la estabilidad del anticuerpo. Basándose en la homología de las secuencias del anticuerpo PR1 A3 murino y la premisa de que las secuencias derivadas de VH1 deberían presentar una estabilidad intrínseca más alta que VH7, o los números pares de los clanes de VH humano (Ewert S., Hubert T., Honegger A. y Plückthun A., J. Mol. Biol. 325:531-553, 2003), se utilizó la secuencia IGHV-1-18, n° de acceso M99641, como el nuevo marco aceptor. La injertación convencional del bucle de CDR del anticuerpo PR1A3 condujo a la generación del constructo CHIA (SEC ID n° 279). Desafortunadamente, esta molécula no mostraba una actividad de unión significativa hacia el antígeno CEA. Se comparó la actividad de unión de este constructo con la actividad de unión del anticuerpo quimérico PR1A3 que incluía dominios variables derivados de ratón a diversas concentraciones. Se utilizaron células BxPC3 para la unión específica de los anticuerpos a CEA y se midió la intensidad de unión mediante análisis FACS. Figura 17.

Con el fin de recuperar la afinidad de unión, se introdujeron varias retromutaciones en la secuencia de CHIA para generar las nuevas cadenas pesadas CH1A1 (SEC ID n° 257) , CH1A2 (SEC ID n0258), CHlA3 (SEC ID n0 259) yCHlA4 (SEC E) n0 260). CH1A1 incluye la mutación puntual doble M69F/T71L. Las últimas tres variantes presentan los marcos completos 1, 2 ó 3, respectivamente, sustituidos por la contrapartida murina. La figura 18 muestra la unión de dichos constructos emparejados con la cadena ligera 2F1 (SEC ID n° 209). En este ensayo, se analizó a diversas concentraciones la unión celular de las variantes de anticuerpo basadas en CH 1 A a células MKN-45 expresantes de CEA. La cadena ligera 2F1 de afinidad madurada era idéntica en todos los anticuerpos sometidos a ensayo excepto por el anticuerpo parental en el que se utilizó la cadena ligera original CL1A. Se determinó la fluorescencia media mediante análisis FACS. La figura 19 muestra las estabilidades de dichos constructos emparejados con la cadena ligera 2F1, medidas mediante dispersión lumínica dinámica (DLS) de las muestras. Se llevó a cabo el ensayo DLS utilizando 1 mg/ml de los anticuerpos en un tampón de histidina 20 mM y NaCl 140 mM a pH 6,0. El ensayo se llevó a cabo partiendo de 25°C con un incremento de la temperatura en etapas de 0,05°C/minuto hasta alcanzar 70°C. Todos los anticuerpos analizados en este ensayo presentaban 2F1 como la cadena ligera.

Debido a que CH1 Al todavía mantenía la estabilidad original y también mostraba cierta unión significativa (aunque algo menos que CH1A4, que era de afinidad más alta aunque de menor estabilidad), se seleccionó este constructo para la optimización adicional de la unión. Se generaron las nuevas cadenas pesadas CH1 Al A (SEC ID n° 261), CH1 A1B (SEC ID n° 262), CH1 A1C (SEC ID n° 263), CH1 AID (SEC ID n° 264), CH1A1E (SEC ID n° 265), CH1A1F (SEC ID n° 266) y CH1 A1G (SEC ID n° 267). Estas esencialmente son variantes de CH1 Al con sólo unas cuantas retromutaciones en las regiones FR1 y FR3. Las figuras 20 y 21 muestran que todas sus afinidades son comparables, aunque todavía ligeramente inferiores al constructo humanizado CH7A basado en VH7. La figura 20 muestra sensogramas de Proteon (Biacore) obtenidos para la unión de las variantes de marco basadas en CH1 Al a la proteína quimérica NABA que porta antígeno CEA. Se inmovilizó NABA biotinilado sobre un chip recubierto con neutravidina y se utilizaron anticuerpos como analitos a concentraciones de 100, 50, 25, 12,5, 6,25 y 0 nM. Se incluyeron el clon precursor CH1A1 y el anticuerpo parental CH7A para la comparación directa. La cadena ligera 2F1 era idéntica para todos los anticuerpos sometidos a ensayo. La figura 21 muestra la intensidad de unión de las siete variantes basadas en CH1A1 que portan mutaciones de marco adicionales. Los anticuerpos se incubaron con las células MKN45 expresantes de CEA en una serie de concentraciones y se midió la intensidad de unión mediante análisis de FACS. Se incluyó el clon precursor CH1A1 para la comparación directa. Todos los anticuerpos sometidos a ensayo en el ensayo presentaban 2F1 como la cadena ligera. Se seleccionaron las variantes CH1 Al A y CH1 A1B como variantes finales de la inmunización basada en VH1 basándose en sus rendimientos de purificación comparativamente superiores y su comportamiento monomérico.

Ejemplo 4 Los residuos de CDR-H3 que habían sido seleccionados en el procedimiento de maduración de afinidad se introdujeron individualmente en la secuencia de PR1A3 para someter a ensayo una estabilidad incrementada del anticuerpo. Figura 36.

La FIGURA 22 muestra las mediciones de resonancia de plasmón superficial (SPR) de la afinidad (medida en la forma bivalente) de cada anticuerpo hacia el antígeno CEA (reactivo NABA tal como describen Stewart et al. , Cáncer Immunol. Immunother.47:299-306, 1999). En la figura 22 se muestran sensogramas de Proteon (Biacore) obtenidos para la unión de las variantes de anticuerpo CDR-H3 a la proteína quimérica NABA que porta antígeno CEA. Se inmovilizó NABA biotinilado sobre un chip recubierto con neutravidina y se utilizaron anticuerpos como analitos a concentraciones de 100, 50, 25, 12,5, 6,25 y 0 nM. Se incluyeron el clon precursor 5HFF12 de afinidad madurada y el anticuerpo parental CH7A para la comparación directa. Todos los anticuerpos sometidos a ensayo presentaban 2F 1 como la cadena ligera. La variante CH7A (W95 Y) no mostrada actividad medible en este ensayo; todas las demás variantes mostraban afinidades para la diana similares en un factor de diez. La afinidad relativa de cada una, medida en la forma bivalente, era la siguiente: 5HFF12 > CH7A (Y98A/D99Y) > CH7A (Y98A) > CH7A > CH7A (E102Q) > CH7A (D99Y) > CH7A (D99H) > CH7A (A103T) > CH7A (V101F) > CH7A (W95Y).

Se llevó a cabo el análisis de DLS de los anticuerpos en comparación con su precursor 5HFF12 y el anticuerpo parental que portaba la cadena pesada CH7A. La cadena ligera 2F1 era idéntica para todos los anticuerpos analizados en el presente experimento. Figuras 23 y 24. Los resultados de este análisis proporcionaron la ordenación por niveles de estabilidad siguiente: CH7A (D99Y) > CH7A (Y98A/D99Y) > CH7A (V101F) > CH7A (D99H) > CH7A (A103T) > CH7A (W95Y) > CH7Ax2Fl ( = PR1A3) > 5HFF12. Se llevó a cabo el ensayo DLS utilizando 1 mg/ml de los anticuerpos en un tampón de histidina 20 mM y NaCl 140 mM a pH 6,0. El ensayo se llevó a cabo partiendo de 25°C, con un incremento de la temperatura en etapas de 0,05°C/rninuto hasta alcanzar 70°C. .

Se seleccionó el doble muíante (Y98A/D99Y) (SEC ID n° 223) para una manipulación adicional de la estabilidad, ya que mostraba una estabilidad elevada conservando una afinidad elevada para la diana CEA.

Ejemplo 5 El doble imitante (Y98A/D99Y) del derivado humanizado de PR1 A3, CH7A, se introdujo en las variantes finales de los constructos de humanización basados en VH1, CH1A1A y CH1 A1B.

Se obtuvieron sensogramas de Proteon (Biacore) para la unión de las variantes combinadas de marco y CDR-H3 con la proteína quimérica NABA portadora de antígeno CEA. Se inmovilizó NABA biotinilado sobre un chip recubierto con neutravidina y se utilizaron anticuerpos como analitos a concentraciones de 100, 50, 25, 12,5, 6,25 y 0 nM. Se incluyeron el clon precursor 5L1A10 y el anticuerpo parental CH7A para la comparación directa. Todos los anticuerpos sometidos a ensayo en el presente ensayo presentaban 2F1 como la cadena ligera. Figura 25.

Ejemplo 6 Los constructos CH1 Al A y CH1 A1B mostraban actividad de ADCC. La ADCC mediada por las variantes CHIAlAyCHIAlB, su variante precursora CH1 Al y la variante parental CH7 A, se midió tras 4 horas a partir de la liberación de lactato deshidrogenasa utilizando las células MKN45 como células diana (T) y PBMC humanas como células efectoras (E) a proporciones E:T de 25 : 1. La liberación de lactato deshidrogenasa es proporcional a la lisis de las células diana y se muestra como porcentaje de citotoxicidad. Figura 26. Se confirmó la actividad de ADCC de dichas variantes mediante medición de la liberación de calceína utilizando las células MKN45 como células diana (T) y las PBMCs humanas como células efectoras (E) a proporciones E:T de 25: 1. La liberación de la calceína es proporcionan a la lisis de las células diana y se muestra como porcentaje de citotoxicidad, valores de media ± desviación estándar. Figura 27.

También se observó actividad de ADCC para los constructos CH1A1A y CH1A1B que contenían CDRH3 de afinidad madurada con la doble mutación Y98 A/D99Y. Se midió la ADCC mediada por las variantes combinadas de marco y CDR-H3 y el anticuerpo parental portador de CH7A, tras 24 horas a partir de la liberación de lactato deshidrogenasa utilizando células MKN45 (figura 28) o LS 174T (figura 29) como células diana y PBMCs humanas como células efectoras a proporciones E:T de 5:1. Aunque las células MKN45 expresan CEA a niveles elevados, la expresión de CEA es moderada en las células LS 174T. La liberación de la lactato deshidrogenasa es proporcional a la lisis de las células diana y se muestra como porcentaje de citotoxicidad. Todos los anticuerpos sometidos a ensayo en los ensayos de ADCC presentaban 2F1 como la cadena ligera.

Ejemplo 7 La versión glucomanipulada del anticuerpo anti-CEA que comprende la cadena pesada CH1 Al A (98/99) y la cadena ligera 2F1 se sometió a ensayo para su eficacia en un modelo de xenoinjerto de carcinoma colorrectal en ratones SCID transgénicos para CD16 humano. Las condiciones de ensayo del modelo se proporcionan posteriormente. Los resultados del ensayo indican que este anticuerpo anti-CEA proporciona un beneficio de supervivencia en comparación con un control de vehículo. Figura 30.

Animales: Los ratones SCID CD16 transgénicos hembra; de 7 a 9 semanas de edad al inicio del experimento (adquiridos de Charles River, Francia) se mantuvieron bajo condiciones libres de patógenos específicos con ciclos diarios de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad de acuerdo con directrices convenidas (GV-Solas, Felasa, TierschG). El protocolo del estudio experimental fue revisado y autorizado por las autoridades adrriinistrativas locales. Tras su llegada, los animales se mantuvieron durante una semana para su aclimatación y observación. Se llevó a cabo un seguimiento continuo periódico de su estado de salud.

Cultivo celular y aplicación: Se cultivaron células LS174T (células de carcinoma de colon humano; European Collection of Cell Culture) en medio DMEM que contenía FCS al 10% (PAA Laboratories, Austria). Las células se cultivaron a 37°C en una atmósfera saturada de agua con 5% de CO2. Se utilizó el pase 24 in vitro para la inyección intraesplénica, con una viabilidad de 97%.

Inyección de células tumorales: El día de la inyección, se recolectaron células tumorales LS 174T de los matraces de cultivo (Greiner Bio-One) utilizando tripsina-EDTA (Gibco, Suiza) y se transfirieron a 50 mi de medio de cultivo, se lavaron una vez y se resuspendieron en medio AIM V (Gibco, Suiza). Se realizó una pequeña incisión en el sitio abdominal izquierdo de ratones SCID/beige anestesiados. Se abrió la piel y el músculo y se inyectaron treinta microlitros (3x106 células LS174T en medio AimV) de suspensión celular en el ápex del bazo. Se suturó en primer lugar el músculo y después la piel abdominal con sutura absorbible (Monosyn® 3-0, Braun).

Tratamiento: Todos los anticuerpos anti-CEA y el vehículo correspondiente se administraron i.v. una vez a la semana. Tres dosis en total. Se administraron 625 g de anticuerpo en cada inyección en cada ratón. Las diluciones de anticuerpo se prepararon frescas a partir de solución madre antes de la utilización y se formularon en histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0 a una concentración de anticuerpo de 4,38 mg/ml.

Ejemplo 8 La versión glucomanipulada del anticuerpo anti-CEA que comprendía la cadena pesada CH1 Al A (Y98/D99Y) y la cadena ligera 2F1 se sometió a ensayo para su eficacia en un modelo de xenoinjerto de carcinoma pulmonar A549 en ratones SCID transgénicos para CD 16 humano. Las condiciones de ensayo del modelo se proporcionan posteriormente. Los resultados del ensayo indican que este anticuerpo anti-CEA proporciona un beneficio de supervivencia dependiente de la dosis en comparación con un control de vehículo. Figura 31.

Animales: Se mantuvieron treinta y cinco ratones SCID CD 16 transgénicos hembra; de 7 a 9 semanas de edad al inicio del experimento (Charles iver, Francia) bajo condiciones libres de patógenos específicos con ciclos diarios de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad de acuerdo con directrices convenidas (GV-Solas, Felasa, TierschG). El protocolo del estudio experimental fue revisado y autorizado por las autoridades administrativas locales. Tras su llegada, los animales se mantuvieron durante una semana para su aclimatación y observación. Se llevó a cabo un seguimiento continuo periódico de su estado de salud.

Cultivo celular y aplicación: Se cultivaron células A549 (células NSCLC humanas; American Tissue Culture Collection) en medio DMEM que contenía FCS al 10% (PAA Laboratories, Austria). Las células se cultivaron a 37°C en una atmósfera saturada de agua con 5% de CO2.

Tratamiento: Los ratones recibieron inyección i.v. el día de estudio 0 con lxlO6 célula A549. Se inició la administración de anticuerpo el día de estudio 7 y se continuó con 2 inyecciones semanales adicionales.

Grupos de tratamiento: Ratones: 35 ratones SCID-CD16Tg, N=7 en cada grupo.

Células: células A549, 5 millones/ratón Compuesto y programa terapéutico: Vehículo 3q7d CH1A1 A(Y98A/D99Y) x 2F1 (500 µg) 3q7d (25 mg/kg) CH1A1A(Y98A/D99Y) x 2F1 (200 µ§) 3q7d (10 mg/kg) CH1A1A(Y98A/D99Y) x 2F1 (100 µg) 3q7d (5 mg/kg) CH1A1 A(Y98A/D99Y) x 2F1 (50 µg) 3q7d (1 mg/kg) Aunque la invención anteriormente expuesta ha sido descrito en cierto detalle a título ilustrativo y ejemplar para los fines de claridad de comprensión, las descripciones y ejemplos no deben interpretarse como limitativos del alcance de la invención. Las exposiciones de toda la literatura de patentes y científica citadas en la presente memoria se incorporan expresamente en su totalidad como referencia.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Molécula variante de unión a antígeno (ABM) que se une al antígeno carcinoembrionario humano (CEA) unido a membrana, en la que el ABM es estable a una temperatura que es por lo menos 0,5, 1 ,0, 1 ,5 ó 2,0 grados centígrados superior a la que lo es el anticuerpo PR1A3 ó una versión humanizada del anticuerpo PR1 A3.

2. ABM según la reivindicación 1, en el que el incremento de estabilidad se mide utilizando un ensayo de dispersión lumínica dinámica.

3. ABM según la reivindicación 1 ó 2, en el que el anticuerpo PR1A3 ó versión humanizada del anticuerpo PR1A3 es una versión humanizada del anticuerpo PR1A3 que comprende la región variable de cadena pesada CH7A (SEC ID n° 101 ) y la región variable de cadena ligera 2F1 (SEC ?) n° 209).

4. ABM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el ABM comprende una región variable de cadena pesada que comprende: una CDR1 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 1 , SEC ?) n° 2, SEC ID n° 3, SEC ID n° 5, SEC ID n° 6, SEC ID n° 7, SEC ID n° 8, SEC ID n° 9, SEC ID n° 10 y SEC ID n° 12, una CDR2 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 13, SEC ID n° 14, SEC ID n° 15, SEC ID n° 16, SEC ID n° 17, SEC ID n° 18, SEC ID n° 19, SEC ID n° 20, SEC ID n° 21, SEC ID n° 22, SEC ID n° 23 y SEC ID n° 24, y una CDR3 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 217, SEC ID n° 218, SEC ID n° 219, SEC ID n° 220, SEC ID n° 221 , SEC ID n° 222, SEC ID n° 223 y SEC ID n° 224.

5. ABM según la reivindicación 4, en el que el ABM comprende una región variable de cadena ligera que comprende: una CDR1 de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 36, SEC ? n° 37, SEC ID n° 38, SEC ID n° 39, SEC ID n° 40, SEC ID n° 41 , SEC ID n° 42, SEC ID n° 43, SEC ID n° 44 y SEC ID n° 45, y una CDR2 de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 46, SEC ID n° 47, SEC ID n° 48, SEC ID n° 49, SEC ID n° 50, SEC ID n° 51 , SEC ID n° 52, SEC ID n° 53, SEC ID n° 54 y SEC ? n° 55, y una CDR3 de cadena ligera de SEC ID n° 56.

6. ABM según la reivindicación 5, en el que la región variable de cadena pesada comprende: la CDR1 de cadena pesada de SEC ID n° 1, la CDR2 de cadena pesada de SEC ID n° 13, una CDR3 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 217, SEC ID n° 218, SEC ? n° 219, SEC ID n° 220, SEC ID n° 221 , SEC ID n° 222, SEC ID n° 223 y SEC ID n° 224, y en el que la región variable de cadena ligera comprende: la CDR1 de cadena ligera de SEC ID n° 39, la CDR2 de cadena ligera de SEC ID n° 49, y la CDR3 de cadena ligera de SEC ID n° 56.

7. ABM según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que el ABM comprende los residuos de marco de CH1A1A (SEC ID n° 261) o CH1A1B (SEC ID n° 262).

8. ABM según la reivindicación 7, en el que la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de amioácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 234, SEC ID n° 235, SEC ID n° 239, SEC ID n° 241, SEC ID n° 242 y SEC ID n° 247 y la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a la secuencia SEC ID n0 209.

9. Molécula variante de unión a antígeno (ABM) que se une al antígeno carcinoembrionario humano (CEA) unido a membrana, en la que la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 233, SEC ID n° 234, SEC ID n° 235, SEC ID n° 239, SEC ID n° 241 , SEC ID n° 242, SEC ID n° 243 y SEC ID n° 247, y en la que la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID n° 209.

10. ABM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el ABM comprende una región Fe.

11. ABM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el ABM es un anticuerpo o fragmento del mismo seleccionado de entre el grupo que consiste de: un anticuerpo completo, un fragmento scFv, un fragmento Fv, un fragmento F(ab')2, un minicuerpo, un diacuerpo, un triacuerpo y un tetracuerpo.

12. ABM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el ABM se une al mismo epítopo, o es capaz de competir para la unión con el mismo epítopo, que el anticuerpo monoclonal murino PR1 A3.

13. ABM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el ABM se une a CEA unido a membrana con una Kd de 100 nM, 10 nM, 1 nM o inferior.

14. Anticuerpo aislado que se une a CEA unido a membrana, en el que el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende: una CDRl de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 1 , SEC ID n° 2, SEC ID n° 3, SEC ID n° 5, SEC ID n° 6, SEC ID n° 7, SEC ID n° 8, SEC ID n° 9, SEC ID n° 10 y SEC ID n0 12, una CDR2 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ED n° 13, SEC ID n° 14, SEC ID n° 15, SEC ID n° 16, SEC ID n° 17, SEC ID n° 18, SEC ID n° 19, SEC ID n° 20, SEC ID n° 21, SEC ID n° 22, SEC ID n° 23 y SEC ID n° 24, y una CDR3 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 217, SEC ID n° 218, SEC ?) n° 219, SEC ID n° 220, SEC ID n° 221 , SEC ID n° 222, SEC ID n° 223 y SEC ID n° 224, en el que el anticuerpo es estable a una temperatura que es por lo menos 0,5, 1,0, 1,5 ó 2,0 grados centígrados inferior a la que lo es el anticuerpo PR1A3 ó versión humanizada del anticuerpo PR1A3.

15. Anticuerpo según la reivindicación 14, en el que el incremento de estabilidad se mide mediante un ensayo de dispersión lumínica dinámica.

16. Anticuerpo según la reivindicación 14 ó 15, en el que el anticuerpo PR1 A3 ó versión humanizada del anticuerpo PR1A3 es una versión humanizada del anticuerpo PR1A3 que comprende la región variable de cadena pesada CH7A (SEC ID n° 101) y la región variable de cadena ligera 2F1 (SEC ID n° 209).

17. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que comprende: una CDRl de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 36, SEC ID n° 37, SEC ID n° 38, SEC ID n° 39, SEC ID n° 40, SEC ID n° 41 , SEC ID n° 42, SEC ID n° 43, SEC ID n° 44 y SEC ID n° 45, y una CDR2 de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 46, SEC ID n° 47, SEC ID n° 48, SEC ID n° 49, SEC ID n° 50, SEC ID n° 51 , SEC ID n° 52, SEC ID n° 53, SEC ID n° 54 y SEC ID n° 55, y una CDR3 de cadena ligera de SEC ID n° 56.

18. Anticuerpo según la reivindicación 17, en el que la región variable de cadena pesada comprende: la CDR1 de cadena pesada de SEC ?) n° 1, la CDR2 de cadena pesada de SEC ID n° 13, una CDR3 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 217, SEC ID n° 218, SEC ID n° 219, SEC ID n° 220, SEC ID n° 221, SEC ID n° 222, SEC ID n° 223 y SEC ID n° 224, y en el que la región variable de cadena ligera comprende: la CDR1 de cadena ligera de SEC ED n° 39, la CDR2 de cadena ligera de SEC ID n° 49, y la CDR3 de cadena ligera de SEC ID n° 56.

19. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en el que el anticuerpo comprende los residuos de marco de CH1 Al A (SEC ID n° 261) o CH1A1B (SEC ID n° 262).

20. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, en el que la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de amioácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 233, SEC ID n° 234, SEC ID n° 235, SEC ID n° 239, SEC ?) n° 241 , SEC ID n° 242, SEC ID n° 243 y SEC ID n° 247 y la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a la secuencia SEC ID n° 209.

21. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20, en el que las realizaciones de anticuerpo se unen al mismo epítopo, o son capaces de competir para la unión con el mismo epítopo, que el anticuerpo monoclonal murino PR1A3.

22. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21, en el que el ABM se une a CEA unido a membrana con una Kd de 100 nM, 10 nM, 1 nM o inferior.

23. Anticuerpo que se une al antígeno carcinoembrionario humano (CEA) unido a membrana, en el que la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC BD n° 233, SEC ID n° 234, SEC ID n° 235, SEC ID n° 239, SEC ID n° 241 , SEC ID n° 242, SEC ED n° 243 y SEC ID n° 247, y en la que la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID n° 209.

24. ABM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 ó anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 23, en el que el ABM o anticuerpo comprende una región Fe que ha sido glucomanipulada.

25. ABM o anticuerpo según la reivindicación 24, en el que por lo menos entre aproximadamente 20% y aproximadamente 100% de los oligosacáridos N-ligados en dicha región Fe no se encuentran fucosilados.

26. ABM o anticuerpo según la reivindicación 24, en el que por lo menos entre aproximadamente 20% y aproximadamente 100% de los oligosacáridos N-ligados en dicha región Fe son bisectados.

27. ABM o anticuerpo según la reivindicación 24, en el que por lo menos entre aproximadamente 20% y aproximadamente 50% de los oligosacáridos N-ligados en dicha región Fe son bisectados no fucosilados.

28. ABM o anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, en el que el ABM o anticuerpo presenta por lo menos una función efectora incrementada.

29. ABM o anticuerpo según la reivindicación 28, en el que por lo menos una función efectora incrementada se selecciona de entre el grupo que consiste de: afinidad de unión a receptor de Fe incrementada, eitotoxicidad celular mediada por anticuerpos (ADCC) incrementada, unión a células NK incrementada, unión a macrófagos incrementada, unión a monocitos incrementada, unión a células polimorfonucleares incrementada, señalización directa inductora de apoptosis, maduración de células dendríticas incrementada y cebado de células T incrementado.

30. ABM o anticuerpo según la reivindicación 29, en el que el ABM o anticuerpo presenta una ADCC incrementada de entre por lo menos aproximadamente 40% y aproximadamente 100% en comparación con la molécula parental de unión a antígeno no glucomanipulada.

31. Polinucleótido aislado codificante del ABM o anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30.

32. Vector que comprende el polinucleótido según la reivindicación 31.

33. Célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 32.

34. Composición que comprende el ABM o anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 y un portador farmacéuticamente aceptable.

35. Método de inducción de lisis celular de una célula tumoral, comprendiendo el método poner en contacto la célula tumoral con el AMB o anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 ó la composición según la reivindicación 34.

36. Método según la reivindicación 35, en el que la célula tumoral se selecciona de entre el grupo que consiste de células de cáncer colorrectal, NSCLC (cáncer pulmonar de células no pequeñas), células de cáncer gástrico, células de cáncer pancreático y células de cáncer de mama.

37. Método según la reivindicación 35, en el que la lisis celular resulta inducida por la citotoxicidad dependiente de anticuerpos del ABM o anticuerpo.

38. Método de tratamiento de un suj eto que presenta un cáncer que expresa anormalmente CEA, comprendiendo el método la administración en el sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva del ABM o anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 ó de la composición según la reivindicación 34.

39. Método de incremento del tiempo de supervivencia en un sujeto que presenta un cáncer que expresa anormalmente CEA, comprendiendo el método la administración en el sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva del ABM o anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 o de la composición según la reivindicación 34.

40. Método según la reivindicación 38 ó 39, en el que el cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste de cáncer colorrectal, cáncer pulmonar de células no pequeñas (NSCLC), cáncer gástrico, cáncer pancreático y cáncer de mama.

41. Método según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 40, en el que el ABM o anticuerpo o composición se administra en combinación con quimioterapia o terapia de radiación.

42. Método según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 41 , en el que el sujeto es un ser humano.

43. Utilización del ABM o anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 ó de la composición según la reivindicación 34, en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un sujeto que presenta un cáncer que expresa niveles anormales de CEA.

44. Utilización según la reivindicación 43, en el que el cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste de cáncer colorrectal, cáncer pulmonar de células no pequeñas (NSCLC), cáncer gástrico, cáncer pancreático y cáncer de mama.

45. Invención tal como se ha descrito en la presente memoria. RESU EN La presente invención proporciona moléculas de unión a antígeno (ABMs) que se unen a CEA unido a membrana, incluyendo ABMS con propiedades terapéuticas mejoradas, y métodos de utilización de las mismas.