BRPI0615397A2 - molécula de ligação a antìgeno modificada, polinucleotìdeo isolado que codifica um polipeptìdeo, vetor, método de produção da referida molécula, composição farmacêutica que a contém, bem como uso da mesma - Google Patents

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Pablo Umana
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Abstract

MOLéCULA DE LIGAçãO A ANTIGENO MODIFICADA, POLINUCLEOTIDEO ISOLADO QUE CODIFICA UM POLIPEPTIDEO, VETOR, MéTODO DE PRODUçãO DA REFERIDA MOLéCULA, COMPOSIçãO FARMACêUTICA QUE A CONTéM, BEM COMO USO DA MESMA. A presente invenção refere-se à moléculas de ligação a antígeno-modificadas (ABMs). Em modalidades particulares, a presente invenção se refere a anticorpos monoclonais recombinantes ou fragmentos, incluindo anticorpos quiméricos, primatizados ou humanizados ou fragmentos, tendo capacidade alterada de mediar a atividade de sinalização celular através de um antígeno-alvo e/ou capacidade alterada de mediar a reticulação de um ou mais antígenos-alvo. Além disso, a presente invenção se refere à moléculas de ácido nucléico que codificam tais ABMs modificadas e vetores e células hospedeiras compreendendo tais moléculas de ácido nucléico. A invenção ainda se refere a métodos para produção das ABMs modificadas da invenção e a métodos de uso dessas ABMs modificadas no tratamento de doenças. Além disso, a presente invenção se refere à ABMs modificadas com glicosilação modificada tendo propriedades terapêuticas aperfeiçoadas, incluindo anticorpos com ligação aumentada ao receptor Fc e função efetuadora aumentada.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULADE LIGAÇÃO A ANTÍGENO MODIFICADA, POLINUCLEOTÍDEO ISOLA-DO QUE CODIFICA UM POLIPEPTÍDEO, VETOR, MÉTODO DE PRODU-ÇÃO DA REFERIDA MOLÉCULA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA QUEA CONTÉM, BEM COMO USO DA MESMA".
Antecedentes da Invenção
Campo da Invenção
A presente invenção se refere à moléculas de ligação a antígeno(ABMs). Em modalidades particulares, a presente invenção se refere a anticor-pos monoclonais recombinantes ou fragmentos, incluindo anticorpos ou frag-mentos quiméricos, primatizados ou humanizados, tendo capacidade alteradade mediar a atividade de sinalização celular por um antígeno-alvo e/ou capaci-dade alterada de mediar a reticulação de um ou mais antígenos-alvo. Além dis-so, a presente invenção se refere à moléculas de ácido nucléico que codificamtais ABMs e vetores e células hospedeiras compreendendo tais moléculas deácido nucléico. A invenção ainda se refere a métodos para produção das ABMsda invenção e a métodos de uso dessas ABMs no tratamento de uma doença.Além disso, a presente invenção se refere à ABMs com glicosilação modificadatendo propriedades terapêuticas aperfeiçoadas, incluindo anticorpos com Iiga-ção aumentada ao receptor Fc e função efetuadora aumentada.
Antecedente da Técnica
Anticorpos, também denominados imunoglobulinas, têm umaestrutura básica compreendendo quatro cadeias polipeptídicas: duas cadei-as pesadas (H) idênticas emparelhadas com duas cadeias leves (L) idênti-cas. Cada cadeia pesada e leve compreende uma região variável (VH e VL1respectivamente) e uma região constante (CH e CL, respectivamente). Aregião CH tem 3 domínios (CH1, CH2 e CH3), enquanto que a menor regiãoCL tem apenas um domínio (simplesmente referido como CL). Cada regiãoVH e LH compreende 3 regiões de determinação de complementaridade (C-DRs) flanqueadas por 4 regiões de "framework" na seguinte ordem: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3- CDR3-FR4. As CDRs são a parte mais variável daregião V e determinam a especificidade por antígeno do anticorpo. Juntas,uma VH e VL emparelhadas formam o sítio de ligação a antígeno e anticor-pos bivalentes têm dois de tais sítios de ligação a antígeno. Deve ser obser-vado que essa estrutura básica de anticorpo pode ser modificada de váriasformas (por exemplo, através de geração de fragmentos da estrutura) aomesmo tempo em que retêm ou mesmo melhora funções desejadas e/ou aatividade de ligação a antígeno.
A interface entre os domínios a esse VH e CH1 compreende a-minoácidos conservados. Essa área de contato pode ser descrita como "uni-ão molecular de esfera- e - soquete". Essa união determina o "movimentode cotovelo" e também o assim denominado "ângulo de cotovelo" das regi-ões VH e VL com relação às regiões CH1 e CL e impede que um contatorígido se forme entre as regiões VeC (Lesk e Chothia, Nature (1988)335(8): 188-190)). O soquete da união em esfera - e - soquete é formadapor resíduos de aminoácidos na região de "framework" VH, especificamenteaqueles nas posições 11, 110 e 112 (de acordo com o sistema de numera-ção de Kabat e outros, (1987) Sequences of Proteins of Immunological Inte-rest, 49 ed. (Public Health Services, NIH, Washington, DC)). (Vide Lesk eChothia, Nature (1988) 335(8): 188-190). A "esfera" dessa união em esfera -e - soquete é encontrada no domínio CH1 e é formada principalmente pelosdois aminoácidos nas posições 148 e 149 (Vide Landolfi e outros, J. Immu-nol. (2001) 166: 1748-1754; Lesk e Chothia, Nature (1988) 335(8): 188-190)(em que os resíduos CH1 que formam a "esfera" são numerados 149 e 150,respectivamente). Diferenças nos aminoácidos nessas posições podem ori-entar o ângulo de cotovelo que é formado entre as regiões V e C e, portanto,a orientação do dímero VH-VL (vide Lesk e Chothia, Nature (1988) 335(8):188-190). Os resíduos de aminoácido que ocupam essas posições VH sãoaltamente conservados entre as seqüências de imunoglobulina (vide, porexemplo, Lesk e Chothia, Nature (1988) 335(8): 188-190). Todos os resíduosenvolvidos nessa união (por exemplo, posições 11, 110, 112, 148 e 149) es-tão localizados na região de "framework" (por exemplo, resíduos 11, 110 e112) ou no domínio constante (por exemplo, 148 e 149 (de acordo com Lan-dolf e outros; posições 149 e 150 de acordo com Lesk e Clothia) e não pare-cem estar diretamente envolvidos na ligação ao antígeno. Landolfi e outros,J. Immunol. (2001) 166: 1748-1754.
Além de mediar funções efetuadoras, tais como citotoxicidadecélula-mediada dependente (ADCC) e citotoxicidade complemento-dependente (CDC) , anticorpos monoclonais podem modular funções celula-res através de indução ou inibição das vias de sinalização celular. Por e-xemplo, foi mostrado que anticorpos monoclonais mediam a reticulação aantígeno, ativam receptores de morte (por exemplo, através de facilitação deoligomerização de receptores ou imitando a ligação ao ligante) e bloqueandoa sinalização celular ligante-mediada em diferenciação de crescimento celu-lar e/ou vias de proliferação (vide, por exemplo, Ludwig e outros, Oncogene(2003)22:9097-9106).
A apoptose, ou morte celular programada, pode ser disparadapor diversos mecanismos diferentes. Por exemplo, a ativação de vias de si-nalização através de "receptores de morte" membrana celular-ligados, porexemplo, membros da superfamília do fator de necrose de tumor (TNFR)1pode levar à indução de apoptose. Da mesma forma, dimerização ou reticu-lação de antígeno na superfície, por exemplo, CD20, pode também induzir àapoptose (vide, por exemplo, Ludwig e outros, Oncogene (2063) 22: 9097-9106).
Permanece uma necessidade por abordagens terapêuticas in-tensificadas que objetivam antígenos associados à sinalização celular inclu-indo, mas não limitado a, a indução de apoptose, para o tratamento de do-enças em primatas incluindo, mas não limitado a, seres humanos.
Breve Sumário da Invenção ,
Reconhecendo o tremendo potencial terapêutico de moléculasde ligação antígeno (ABMs) modificadas que têm capacidade alterada demediar a atividade de sinalização celular por um antígeno-alvo e/ou capaci-dade alterada de mediar a reticulação de um ou mais antígeno-alvo, os pre-sentes inventores desenvolveram tais ABMs, bem como um método para aprodução de tais ABMs. Inter alia, esse método envolve produção de anti-corpos quiméricos recombinantes ou fragmentos quiméricos dos mesmos. Aeficácia dessas ABMs modificadas é ainda intensificada através de manipu-lação do perfil de glicosilação da região Fc do anticorpo.
Conseqüentemente, em um aspecto, a invenção é dirigida a umamolécula de ligação a antígeno-modificada compreendendo uma região vari-ável de cadeia pesada ou de cadeia leve compreendendo pelo menos umasubstituição de resíduo de aminoácido de uma molécula de ligação a antíge-no precursora , em que a referida substituição resulta em atividade de sinali-zação celular alterada de um antígeno-alvo quando a referida molécula deligação a antígeno-modificada está em complexo com o referido antígeno-alvo. Em uma modalidade particular, a atividade de sinalização celular alte-rada é apoptose. Em uma modalidade, a molécula de ligação a antígeno-modificada tem uma capacidade aumentada de induzir à apoptose. Em outramodalidade, a molécula de ligação a antígeno-modificada tem uma capaci-dade reduzida de induzir à apoptose.
Em outro aspecto, a invenção é dirigida a uma molécula de liga-ção a antígeno-modificada compreendendo uma região variável de cadeiapesada ou de cadeia leve compreendendo pelo menos uma substituição deresíduo de aminoácido em pelo menos uma região de "framework" da referi-da região variável de cadeia pesada ou de cadeia leve quando comparadocom a região variável de cadeia pesada ou de cadeia leve de uma moléculade ligação a antígeno precursora, em que a referida molécula de ligação aantígeno tem capacidade alterada de mediar a reticulação de um ou maisantígenos-alvo como um resultado da referida substituição.
Em uma modalidade, a molécula de ligação a antígeno-modificada da presente invenção compreende uma substituição na FR1 daregião variável de cadeia pesada. Em outra modalidade, a substituição com-preende uma substituição selecionada do grupo consistindo em pelo menos2, pelo menos 3 ou pelo menos 4 aminoácidos.
Em uma modalidade, a substituição compreende uma substitui-ção da FR1 inteira da região variável de cadeia pesada. Em uma outra mo-dalidade, a FR1 inteira é substituída por uma FR1 de VH de linhagem germi-nativa. Em modalidades particulares, a FR1 de VH de linhagem germinativacompreende uma seqüência de aminoácido nas posições 8 a 13 de Kabatselecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID N0.73, SEQID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102,' SEQ ID NO: 103,SEQ ID NO: 104 e SEQ ID NO: 105.
Uma modalidade a ABMs modificada compreende uma substitu-ição na FR1 da região variável de cadeia pesada a qual compreende umasubstituição de um resíduo de aminoácido em uma ou mais das posições 8,9, 10, 11, 12 ou 13 de Kabat.
Em uma modalidade particular, a substituição na FR1 da regiãovariável de cadeia pesada compreende uma substituição do resíduo de ami-noácido na posição 8 de Kabat. Em uma modalidade mais específica, asubstituição na FR1 da região variável de cadeia pesada compreende umasubstituição do resíduo de aminoácido na posição 8 de Kabat por um resí-duo de aminoácido selecionado do grupo consistindo em arginina e glicina.
Em outra modalidade particular, a substituição na FR1 da regiãovariável de cadeia pesada compreende uma substituição do resíduo de ami-noácido na posição 9 de Kabat. Em uma modalidade mais específica, asubstituição na FR1 da região variável de cadeia pesada compreende umasubstituição do resíduo de aminoácido na posição 9 de Kabat por um resí-duo de aminoácido selecionado do grupo consistindo em prolina, glicina, se-rina e histidina.
Em uma modalidade particular, a substituição na FR1 da regiãovariável de cadeia pesada compreende uma substituição do resíduo de ami-noácido na posição 10 de Kabat. Em uma modalidade mais específica, asubstituição na FR1 da região variável de cadeia pesada compreende umasubstituição do resíduo de aminoácido na posição 10 de Kabat por um resí-duo de aminoácido selecionado do grupo consistindo em glutamato, treoni- na, glicina, alanina, e valina.
Em outra modalidade particular, a substituição na FR1 da regiãovariável de cadeia pesada compreende uma substituição do resíduo de ami-noácido na posição 11 de Kabat. Em uma modalidade específica, a substitu-ição na FR1 da região variável de cadeia pesada compreende uma substitui-ção do resíduo de aminoácido na posição 11 de Kabat por qualquer resíduode aminoácido, menos leucina. Em outra modalidade específica a substitui-ção compreende uma substituição do resíduo de aminoácido na posição 11de Kabat por um aminoácido nãò polar. Em outra modalidade específica, asubstituição compreende um substituição do resíduo de aminoácido na posi-ção 11 de Kabat por um resíduo de aminoácido selecionado do grupo con-sistindo em leucina, isoleucina, serina, e fenilalanina. Em uma modalidadeparticular, a substituição compreende uma substituição do resíduo de ami-noácido na posição 11 de Kabat por uma leucina.
Em outra modalidade particular, a substituição na FR1 da regiãovariável de cadeia pesada compreende uma substituição do resíduo de ami-noácido na posição 12 de Kabat. Em uma modalidade específica, a substitu-ição compreende uma substituição do resíduo de aminoácido na posição 12de Kabat por um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindoem lisina, valina, leucina, e isoleucina.
Em outra modalidade particular, a substituição na FR1 da regiãovariável de cadeia pesada compreende uma substituição dos resíduos deaminoácido nas posições 11 e 12 de Kabat. Em uma modalidade específica,a substituição compreende uma substituição do resíduo de aminoácido naposição 11 de Kabat por uma valina e na posição 12 de Kabat por uma lisi-na; uma substituição do resíduo de aminoácido na posição 11 de Kabat poruma leucina e na posição 12 de Kabat por uma valina; uma substituição doresíduo de aminoácido na posição 11 de Kabat por uma valina e na posição12 de Kabat por uma isoleucina; ou uma substituição do resíduo de aminoá-cido na posição 11 de Kabat por uma valina e na posição 12 de Kabat poruma valina.
Em outra modalidade particular, a substituição na FR1 da regiãovariável de cadeia pesada compreende uma substituição do resíduo de ami-noácido na posição 13 de Kabat. Em uma modalidade específica, a substitu-ição compreende uma substituição do resíduo de aminoácido na posição 13de Kabat por um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindoem lisina, arginina, glutamina e glutamato.
Em outro aspecto da presente invenção, substituição na ABMcompreende substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido na FR4da região variável de cadeia pesada. Em uma modalidade particular, a subs-tituição na FR4 da região variável de cadeia pesada compreende uma subs-tituição de um resíduo de aminoácido em uma ou mais das posições 110 ou112 de Kabat.
Em uma modalidade particular, a substituição compreende umasubstituição do resíduo de aminoácido na posição 110 de Kabat por um ami-noácido selecionado do grupo consistindo em leucina, isoleucina, treoninaou serina. Em uma modalidade mais específica, a substituição compreendeuma substituição do resíduo de aminoácido na posição 110 de Kabat poruma isoleucina.
Em outra modalidade, a substituição compreende uma substitui-ção do resíduo de aminoácido na posição 112 de Kabat por um aminoácidoselecionado do grupo consistindo em valina, leucina, isoleucina ou treonina.Em uma modalidade mais específica, a substituição compreende uma subs-tituição do resíduo de aminoácido na posição 112 de Kabat por uma isoleu-cina.
Em um aspecto, a presente invenção é ainda dirigida a uma mo-lécula de ligação a antígeno-modificada compreendendo um domínio CH1compreendendo pelo menos uma substituição de resíduo de aminoácidoquando comparado com o domínio CH1 de um polipeptídeo precursor, emque a substituição resulta em atividade de sinalização celular alterada de umantígeno-alvo quando a molécula de ligação a antígeno-modificada está emcomplexo com o antígeno-alvo.
Em outro aspecto, a presente invenção é ainda dirigida a umamolécula de ligação a antígeno-modificada compreendendo um domínioCH1 compreendendo pelo menos uma substituição de resíduo de aminoáci-do quando comparado com o domínio CH1 de um polipeptídeo precursor,em que a molécula de ligação a antígeno tem capacidade alterada de mediara reticulação de um ou mais antígeno-alvo como um resultado da substitui-ção.
Em uma modalidade particular, a substituição no CH1 compre-ende uma substituição de um resíduo de aminoácido em uma ou mais dasposições 148, 149 ou 150. Em uma modalidade mais específica, a substitui-ção compreende uma substituição do resíduo de aminoácido na posição 149por uma leucina. Em outra modalidade, a substituição compreende umasubstituição do domínio CH1 inteiro. Em outra modalidade, a substituiçãocompreende uma substituição de um domínio CH1 de IgG por um domínioCHVde IgM.
Em outro aspecto, a invenção é dirigida a uma molécula de liga-ção a antígeno-modificada compreendendo pelo menos uma substituição deaminoácido, em que a referida substituição compreende uma substituição deum resíduo de aminoácido na cadeia leve na região da interface entre asrégios variável e constante, em que a substituição resulta em atividade desinalização celular alterada de uma molécula de ligação a antígeno-alvoquando a referida molécula de ligação a antígeno-modificada está em com-plexo com o referido antígeno-alvo. r
Em outro aspecto, a invenção é dirigida a uma molécula de liga-ção a antígeno-modificada compreendendo pelo menos um substituição deaminoácido, em que a referida substituição compreende uma substituição deum resíduo de aminoácido na cadeia leve na região da interface entre asregiões variável e constante, em que a referida molécula de ligação a antí-geno-modificada tem capacidade alterada de. mediar a reticulação de um oumais antígeno-alvo como um resultado da referida substituição.
Em uma modalidade particular, a substituição na região variávelde cadeia leve da ABM compreende uma substituição de um aminoácido emuma ou mais das posições 10, 12, 39, 40, 41, 80, 81, 83, 84, 103, 105, 106,e 108 de Kabat. Em uma modalidade particular, a substituição na região va-riável de cadeia leve da ABM compreende uma substituição de um resíduode aminoácido em uma ou mais das posições 40, 80, 83, 105 ou 106 de Ka-bat.Em outra modalidade particular, a substituição na cadeia leve daABM compreende uma substituição de um resíduo de aminoácido em umaou mais das posições 40, 80, 83, 105 ou 106 de Kabat por um aminoácidonão polar.
Em outra modalidade particular, a substituição na cadeia leve daABM compreende uma substituição de um resíduo de aminoácido na posi-ção 40 de Kabat por uma alanina.
Em outra modalidade particular, a substituição na cadeia leve daABM compreende uma substituição de um resíduo de aminoácido na posi-ção 80 de Kabat por uma prolina.
Em outra modalidade particular, a substituição na cadeia leve daABM compreende uma substituição de um resíduo de aminoácido na posi-ção 83 de Kabat por uma fenilalanina.
Em outra modalidade particular, a substituição na cadeia leve daABM compreende uma substituição de um resíduo de aminoácido na posi-ção 105 de Kabat por uma alanina.
Em outra modalidade particular, a substituição na cadeia leve daABM compreende uma substituição de um resíduo :de aminoácido na posi-ção 106 de Kabat por uma alanina. Em uma modalidade mais particular, asubstituição na cadeia leve da ABM compreende uma substituição de umresíduo de aminoácido na posição 106 de Kabat, em que a molécula de liga-ção a antígeno tem capacidade reduzida de induzir à apoptose.
Em algumas modalidades as substituições da presente invençãocompreendem uma combinação de quaisquer substituições de resíduo deamiríoácido nas regiões variável e/ou constante de cadeia pesada e/ou leve,conforme descrito aqui.
Em uma aspecto, a(s) substituição(ões) na(s) ABMs modificadasda presente invenção resulta em uma atividade de sinalização celular altera-da de um antígeno-alvo quando a ABM modificada está em complexo com oantígeno-alvo.
Em um aspecto da invenção, a atividade de sinalização celularalterada é atividade agonista aumentada. Em uma modalidade, a atividadeagonista aumentada é selecionada do grupo consistindo em indução de a-poptose e indução de diferenciação celular.
Em outro aspecto da invenção, a atividade sinalização celularalterada é atividade antagonista aumentada. Em uma modalidade, a ativida-de antagonista é bloqueio de uma via de sinalização celular selecionada dogrupo consistindo em sobrevivência celular, crescimento celular, proliferaçãocelular e angiogênese.
Em um outro aspecto, a molécula de ligação a antígeno-modificada da presente invenção se liga especificamente ao CD20 humano.Em outro aspecto, a molécula de ligação a antígeno-modificada se liga es-pecificamente a um membro da superfamília do receptor de TNF humano.Em uma modalidade particular, a superfamília do receptor de TNF humano éselecionada do grupo consistindo em TNFR1, CD95, TRAILR1, TRAILR2,EDAR e p75NGFR.
Em outro aspecto da invenção, a molécula de ligação a antíge-no-modificada se liga especificamente a um receptor de tirosina quínase. Emuma modalidade particular, a quinase de tirosina de receptor é selecionadado grupo consistindo em HER1 (EGFR1), HER2/neu, HER3, HER4, IGF-1R,FGFR5 PDGFR, VEGFR1, VEGFR2 e VEGFR3. Em uma modalidade maisespecífica, a quinase de tirosina de receptor é HER1 (EGFR1).
Em outro aspecto, a presente invenção, é ainda dirigida a umaABM modificada que pode ser selecionada de, mas não está limitada a, ogrupo consistindo em um anticorpo inteiro, um fragmento Fab, ou uma prote-ína de fusão dos mesmos, um fragmento F(ab')2 ou uma proteína de fusãodo mesmo, um minicorpo, um diacorpo, um triacorpo e um tetracorpo. Emuma modalidade particular, a ABM modificada é quimérica ou totalmentehumana. Em uma modalidade mais particular, a ABM modificada quimérica éhumanizada. Em outra modalidade particular, a ABM modificada é multies-pecífica. Em uma modalidade mais particular, a ABM modificada é biespecí-fica.
Em outro aspecto, a molécula de ligação a antígeno precursorade acordo com a presente invenção compreende uma região variável de ca-deia pesada selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 55, SEQ IDNO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60,SEQ ID NO: 61 e SEQ ID NO: 62.
Em outro aspecto, a molécula de ligação a antígeno precursorade acordo com a presente invenção compreende uma cadeia leve selecio-nada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 130, SEQ IDNO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133 e SEQ ID NO: 134.
Em outro aspecto, a presente invenção é também dirigida a umaABM modificada ainda compreendendo uma região Fc humana. De acordocom uma modalidade, a região Fc da ABM modificada foi modificada para teroligossacarídeos alterados. Em uma modalidade mais específica, a regiãoFc foi modificada para ter uma proporção diminuída de resíduos de fucosecomparado com uma região Fc não modificada. Em outra modalidade espe-cífica, a região Fc tem uma proporção aumentada de oligossacarídeos bis-seccionados comparado com uma região Fc não modificada. Em outra mo-dalidade específica, os oligossacarídeos modificados são um complexo bis-seccionado. Em outra modalidade específica, os oligossacarídeos modifica-dos tem uma proporção aumentada de oligossacarídeos bisseccionados nãofucosilados na região Fc comparado com uma região Fc não modificada. Emoutra modalidade específica, a região Fc tem uma proporção aumentada deresíduos de GIcNAc para resíduo de fucose na região Fc modificada compa-rado com uma região Fc não modificada. Em outra modalidade específica,os oligossacarídeos bisseccionados não fucosilados não híbridos. Em outramodalidade específica os oligossacarídeos bisseccionados não fucosilados .estão em complexo.
De acordo com outro aspecto, o antígeno-alvo de acordo com apresente invenção é um receptor na superfície celular selecionado do grupoconsistindo em um receptor de transporte na membrana, um receptor proteí-na G-ligado e um receptor enzima-ligado. Em uma modalidade particular oreceptor de transporte na membrana é um receptor canal-ligado. Em outramodalidade particular, o receptor enzima-ligado é selecionado do grupo con-sistindo em ciclases de adenilato de receptor, quínases de tirosina de recep-tor, receptores quinase de tirosina-associados, fosfatases de tirosina de re-ceptor e quínases de serina/treonina de receptor.
Em outro aspecto, a invenção é relacionada a uma composiçãofarmacêutica compreendendo a ABM modificada da invenção. Considera-seque a composição farmacêutica pode ainda compreender um veículo, umadjuvante farmaceuticamente aceitável ou uma combinação dos mesmos.
A presente invenção é também dirigida a um método de trata-mento de uma doença tratável por atividade de sinalização celular alteradaem um paciente, o método compreendendo administração, ao paciente, deuma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêuticacompreendendo a ABM modificada de acordo com a invenção e um veículofarmaceuticamente aceitável.
Em outro aspecto, a invenção é dirigida a um polinucleotídeoisolado que codifica um polipeptídeo compreendendo uma região variável decadeia pesada ou de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesa-da ou de cadeia leve compreende pelo menos uma substituição de resíduode aminoácido em pelo menos uma região de "framework" quando compa-rado com uma região variável de cadeia pesada ou de cadeia leve precurso-ra e em que a substituição resulta em atividade de sinalização celular altera-da de um antígeno-alvo quando o polipeptídeo está em complexo com o an-tígeno-alvo.
Em um outro aspecto, a invenção é dirigida a um polinucleotídeoisolado que codifica um polipeptídeo compreendendo uma região variável decadeia pesada ou de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesa-da ou de cadeia leve compreende pelo menos uma substituição de resíduode aminoácido em pelo menos uma região de "framework" quando compa-rado com uma região variável de cadeia pesada ou de cadeia leve precurso-ra e em que o polipeptídeo tem capacidade alterada de mediar a reticulaçãode um ou mais antígeno-alvo como um resultado da substituição.
Em uma modalidade, um polinucleotídeo de acordo com a pre-sente invenção codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreendeuma cadeia pesada ou uma cadeia leve de anticorpo. Em uma modalidade,o polinucleotídeo de acordo com a presente invenção codifica um polipeptí-deo, em que o polipeptídeo compreende uma proteína de fusão. A presenteinvenção é também dirigida a polipeptídeos codificados pelos polinucleotí-deos da presente invenção.
A presente invenção é também dirigida a um vetor compreen-dendo um polinucleotídeo de acordo com a invenção e uma célula hospedei-ra compreendendo um vetor.
A invenção é ainda dirigida a um polinucleotídeo que codifica umpolipeptídeo compreendendo uma região variável de cadeia pesada ou decadeia leve a qual compreende pelo menos uma substituição de resíduo deaminoácido em pelo menos uma região de "framework" da região variável decadeia pesada ou de cadeia leve quando comparado com a região variávelde cadeia pesada ou de cadeia leve de uma molécula de ligação a antígenoprecursora, em que o polipeptídeo é uma ABM modificada de acordo com ainvenção.
A presente invenção é também dirigida a uma célula hospedeiramanipulada para expressar pelo menos um ácido nucléico que codifica umpolipeptídeo tendo atividade-de β(1,4)-Ν- acetilglicosaminiltransferase Ill emuma quantidade suficiente para modificar os oligossacarídeos na região Fcde um polipeptídeo produzido pela célula hospedeira, em que o polipeptídeoé uma ABM modificada de acordo com a invenção. Em uma modalidade, opolipeptídeo tendo atividade de β(1,4)-Ν- acetilglicosaminiltransferase Ill éum polipeptídeo de fusão. Em uma modalidade particular, o polipeptídeo defusão compreende,o domínio cataiítico da β(1,4)-Ν- acetilglicosaminiltransfe-rase III; Em outra modalidade, o polipeptídeo de fusão ainda compreende odomínio de localização no Golgi de um polipeptídeo residente no Golgi hete-rólogo. O domínio de localização no Golgi pode ser selecionado de, mas nãoestá limitado a, o grupo consistindo do domínio de localização de manosida-se I, do domínio de localização de β(1,2)-Ν- acetilglicosaminiltransferase I,do domínio de localização de β(1,2)-Ν- acetilglicosaminiltransferase II, dodomínio de localização de manosidase I e do domínio de localização de fu-cosiltransferase com núcleo de α1 -6.Em uma modalidade, a ABM modificada compreende uma regi-ão equivalente à região Fc da IgG humana.
Em uma outra modalidade, a ABM modificada produzida pelacélula hospedeira da presente invenção exibe afinidade de ligação ao recep-tor Fc aumentada e/ou função efetuadora aumentada como um resultado damodificação de oligossacarídeos. De acordo com a presente invenção, afunção efetuadora aumentada é selecionada do grupo consistindo em citoto-xicidade celular Fc-mediada aumentada, ligação aumentada à células NK,ligação aumentada a macrófagos, ligação aumentada à células polimorfonu-cleares, ligação aumentada a monócitos, sinalização direta para indução deapoptose aumentada, maturação aumentada de células dendríticas e inicia-ção aumentada de células T. Em uma modalidade, o receptor Fc é um re-ceptor de ativação de Fcy. Em outra modalidade, o receptor Fc é um recep-tor FcyRIIIA.
A célula hospedeira da presente invenção pode ser selecionadado grupo que inclui, mas não está limitado a, uma célula CHO, uma célulaHEK293-EBNA, uma célula BHK, uma célula NSO, uma célula SP2/0, umacélula de ^ieloma YO, uma célula de mieloma de camundongo P3X63, umacélula PER, uma célula PER.C6 ou uma célula de hibridoma.
Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um métodopara produção de uma ABM modificada compreendendo uma região variávelde cadeia pesada ou de cadeia leve compreendendo pelo menos uma subs-tituição de resíduos de aminoácido em pelo menos uma região de "frame-work" da região variável de cadeia pesada ou de cadeia leve quando compa-rado com a região variável de cadeia pesada ou de cadeia lé've de uma ABMprecursora, em que a substituição resulta em atividade de sinalização celularalterada de um antígeno-alvo quando a ABM modificada está em complexocom o antígeno-alvo, o método compreendendo: (i) cultura da célula hospe-deira da presente invenção sob condições que permitem a expressão dopolinucleotídeo; e (ii) recuperação da ABM modificada do meio de cultura.
Em um outro aspecto, a invenção é dirigida a um método para aprodução de uma ABM modificada compreendendo uma região variável decadeia pesada ou de cadeia leve compreendendo pelo menos uma substitui-ção de resíduo de aminoácido em pelo menos uma região de "framework" daregião variável de cadeia pesada ou de cadeia leve quando comparado coma região variável de cadeia pesada ou de cadeia leve de uma molécula deligação a antígeno precursora, em que a molécula de ligação a antígeno-modificada tem capacidade alterada de mediar a reticulação como um resul-tado da substituição, o método compreendendo: (i) cultura da célula hospe-deira da presente invenção sob condições que permitem a expressão dopolinucleotídeo; e (ii) recuperação da ABM modificada do meio de cultura.
Em um outro aspecto, a invenção é dirigida a um método de al-teração da capacidade de uma ABM de facilitar a formação de complexoscompreendendo o antígeno-alvo da ABM1 o método compreendendo: substi-tuição de pelo menos um resíduo de aminoácido em pelo menos uma regiãode "framework" da região variável de cadeia pesada ou de cadeia leve deuma ABM precursora. Em uma modalidade, a ABM aumenta a indução deapoptose em uma célula expressando o antígeno-alvo. Em outra modalida-de, a invenção aumenta a indução de diferenciação celular em uma célulaexpressando o antígeno-alvo.
A presente invenção é também dirigida a um método de induçãode apoptose em uma célula, o método compreendendo contato da célulacom uma ABM modificada compreendendo uma região variável de cadeiapesada ou de cadeia leve a qual compreende pelo menos uma substituiçãode resíduo de aminoácido em pelo menos uma região de "framework" dareferida região de região variável de cadeia pesada ou de cadeia leve quan-do comparado com a região variável de cadeia pesada ou de cadeia leve deuma ABM precursora, em que a ABM modificada tem capacidade aumenta-da de induzir à apoptose quando comparado com o polipeptídeo precursor.Em uma modalidade particular, a célula é uma célula tumorígena. Em umamodalidade, o contato ocorre in vivo.
Em outro aspecto, a presente invenção é também dirigida a ummétodo de tratamento de uma doença ou distúrbio que é tratável através deatividade de sinalização celular alterada de um antígeno-alvo, o métodocompreendendo administração, ao indivíduo que precisa do mesmo, de umaquantidade terapeuticamente eficaz de uma ABM modificada, em que a ABMmodificada compreende uma região variável de cadeia pesada ou de cadeialeve compreendendo pelo menos uma substituição de aminoácido em pelomenos uma região de "framework" da região variável de cadeia pesada oude cadeia leve comparado com a região variável de cadeia pesada ou decadeia leve de uma ABM precursora e em que a substituição resulta em ati-vidade de sinalização celular alterada de um antígeno-alvo quando a ABMmodificada está em complexo com o antígeno-alvo.
Em um outro aspecto, a invenção é dirigida a um método de tra-tamento de uma doença ou distúrbio que é tratável através da capacidadealterada de mediar a reticulação de um ou mais antígenos-alvo, o métodocompreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, deuma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ABM modificada, em que aABM modificada compreende uma região variável de cadeia pesada ou decadeia leve compreendendo pelo menos uma substituição de aminoácido empelo menos uma região de "framework" da região variável de cadeia pesadaou de cadeia leve comparado com a região variável de cadeia pesada ou decadeia leve de uma ABM precursora e em que a ABM modificada tem capa-cidade alterada de mediar a reticulação de um ou mais antígenos-alvo comoum resultado da substituição.
Em uma modalidade particular, a ABM modificada administradade acordo com a presente invenção compreende uma região variável de ca-deia pesada selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 4, SEQ IDNO: 36 e SEQ ID NO: 3$. ;
Em um aspecto, a doença ou distúrbio a ser tratado com umaABM modificada da presente invenção é um distúrbio de proliferação celular.Em uma modalidade, o distúrbio de proliferação celular é câncer. Em outroaspecto, a doença ou distúrbio a ser tratado com uma ABM modificada dapresente invenção é um distúrbio de células B. Em uma modalidade especí-fica, o distúrbio de células B é um Iinfoma de células B.
A presente invenção é também dirigida ao uso de uma ABM mo-dificada de acordo com a presente invenção para a fabricação de um medi-camento para o tratamento ou profilaxia de câncer.
Em uma modalidade particular, a presente invenção é tambémdirigida ao uso de uma ABM modificada de acordo com a presente invençãopara a fabricação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia decâncer, em que o referido câncer é selecionado do grupo consistindo emIinfoma de células B, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer de cabeçae pescoço, câncer de pele, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncerovariano, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de rim e câncer decérebro.
Em outra modalidade particular, a presente invenção é tambémdirigida ao uso de uma ABM modificada de acordo com a presente invençãopara a fabricação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia decâncer, em que a referida molécula de ligação a antígeno é usada em umaquantidade terapeuticamente eficaz de cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 15mg/kg. Em uma outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz éde cerca de 1,5 mg/kg a cerca de 12 mg/kg. Em uma outra modalidade, aquantidade terapeuticamente eficaz étde cerca de 1,5 mg/kg a cerca de 4,5mg/kg. Em uma outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz éde cerca de 4,5 mg/kg a cerca de 12 mg/kg. Em uma outra modalidade, aquantidade terapeuticamente eficaz é cerca de 1,5 mg/kg. Em uma outramodalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz é cerca de 4,5 mg/kg. Emuma outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz é cerca de 12mg/kg.
A presente invenção é também dirigida a um método para o tra-tamento ou profilaxia de câncer compreendendo administração de umaquantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica dainvenção a um paciente que precisa da mesma. Em uma modalidade parti-cular, o câncer é selecionado do grupo consistindo em Iinfoma de células B,câncer de mama, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço, câncer depele, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer ovariano, câncer de có-lon, câncer de próstata, câncer de rim e câncer de cérebro.A presente invenção é também dirigida a um método para o tra-tamento ou profilaxia de uma condição ou lesão pré-cancerígena compreen-dendo administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da compo-sição farmacêutica de acordo com a reivindicação 85 ou 158 a um pacienteque precisa da mesma. Em uma modalidade particular, a condição ou lesãopré-cancerígena é selecionada do grupo consistindo em Ieucoplasia oral,queratose actínica (queratose solar), pólipos pré-cancerígenos do cólon oureto, displasia epitelial gástrica, displasia adenomatosa, síndrome de câncerde cólon de não-polipose hereditária (HNPCC), esôfago de Barrett, displasiade bexiga e condições cervicais pré-cancerígenas.
A presente invenção é também dirigida a uma molécula de liga-ção a antígeno-modificada da presente invenção para uso no tratamento ouprofilaxia de câncer. Em uma modalidade particular, o câncer é selecionadodo grupo consistindo em Iinfoma de células B, câncer de mama, câncer debexiga, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele, câncer pancreático,câncer de pulmão, câncer ovariano, câncer de cólon, câncer de próstata,câncer de rim e câncer de cérebro.
A preseeie invenção é também dirigida a uma molécula de liga-ção a antígeno-modificada da presente invenção para uso no tratamento ouprofilaxia de uma condição ou lesão pré-cancerígena. Em uma modalidadeparticular, a condição ou lesão pré-cancerígena é selecionada do grupo con-sistindo em Ieucoplasia oral, queratose actínica (queratose solar), pólipospré-cancerígenos do cólon ou reto, displasia epitelial gástrica, displasia ade-nomatosa, síndrome de câncer de cólon de não-polipose hereditária(HNPCC), esôfago de Barrett, displasia de bexiga e condições cervicaís pré-cancerígenas.
A presente invenção é também dirigida a uma molécula de liga-ção a antígeno-modificada de acordo com a presente invenção para uso emterapia de um distúrbio que é relacionado à atividade de sinalização celularalterada e/ou reticulação alterada de um ou mais antígenos-alvo.
Breve Descrição das Figuras
Figura 1. Alinhamento de seqüência de aminoácido de váriasestruturas de região variável de cadeia pesada de anticorpo anti-CD20. Aseqüência de aminoácido da região variável de cadeia pesada do anticorpomonoclonal 1F5 é usada como a seqüência de referência. Diferenças emaminoácidos com relação ao 1F5 estão sombreadas.
Figura 2. Ligação de diferentes anticorpos anti-CD20 humaniza-dos à células B de Raji. O B-Iyl precursor (quimérico) é comparado com a-quele de duas variantes de cadeia pesada humanizadas que foram identifi-cados como induzindo à forte apoptose (BHH2 e BHH6), bem como aquelesderivados da variante B- HL8 (humanizada, não apoptótica) que se supunharestaurar esse efeito (B-HL11 a 17). Todas as variantes de cadeia pesadahumanizada foram emparelhadas com a mesma variante de cadeia leve hu-manizada do BKV1.
Figura 3. Ligação de rituximab (O) e chB-lyl (Δ) a CD20 sobrecélulas de Iinfoma B de Raji
Figura 4. Comparação de apoptose anticorpo-dependente portrês anticorpos anti-CD20. chB-lyl wt representa uma estrutura de anticorpoB-Iyl quimérico tendo uma região variável de murino e uma região constantehèimana. BHH2-BKV1 representa uma variante humanizada compreendendoCDRs de B-Iyl de murino e regiões de "framework" humanas derivadas degenes de V de linhagem germinativa humana da classe VH1 para a cadeiapesada e emparelhadas com a cadeia leve de B-Iyl humanizado, BKV1.BHL8-BKV1 wt representa uma variante humanizada compreendendo CDRsde B-Iyl de murino e regiões de "framework" humanas derivadas de doisgenes de V de linhagem germinativa humana com a cadeia leve de B-Iyl .humanizado, BKV1. ' ;
Figura 5. Comparação de apoptose anticorpo-dependente porcinco variantes humanizadas do anticorpo anti-CD20 B-Iyl. BHH2-BKV1 re-presenta uma variante humanizada compreendendo CDRs de B-Iyl de muri-no e regiões de "framework" humanas derivadas da classe VH1 para a ca-deia leve (BHH2) e emparelhadas com a cadeia leve de B-Iyl humanizada,BKV1. BHL8-BKV1 wt representa uma variante humanizada compreendendoCDRs de B-Iyl de murino e regiões de "framework" derivadas de dois genesV de linhagem germinativa humana diferentes e emparelhados com a cadeialeve do B-Iyl humanizado, BKV1. BHL14-BKV1 representa um derivado deBHL8, com uma substituição de valina para Iisina na posição 12 de Kabat euma substituição de valina para metionina na posição 48 de Kabat da regiãovariável de cadeia pesada e emparelhada com a estrutura de cadeia leve doBKV1. BHL15-BKV1 W1 é também derivado do BHL8, com uma substituiçãode glicina para serina na posição 16 de Kabat e uma substituição de valinapara metionina na posição 48 de Kabat da região variável de cadeia pesadae emparelhada com a estrutura de cadeia leve do BKV1. BHL16-BKV1 W1 éderivado do BHL8, com uma substituição de Ieucina para valina na posição20 de Kabat e uma substituição de valina para metionina na posição 48 deKabat da região variável de cadeia pesada e emparelhada com a estruturade cadeia leve do BKV1. BHL17-BKV1 W1 é derivado do BHL8, com umasubstituição de valina para metionina na posição 48 de Kabat da região vari-ável de cadeia pesada e emparelhada com a estrutura de cadeia leve doBKV1.
Figura 6. Comparação de apoptose anticorpo-dependente emcélulas Z-138 pelo anticorpo monoclonal anti-CD20 C2B8 e duas?varianteshumanizadas de anticorpo B-Iyl. BHH2-BKV1 e BHL13-BKV1. BHH2-BKV1representa uma variante humanizada compreendendo CDRs de B-Iyl demurino e regiões de "framework" humanas derivadas de genes de V de li-nhagem germinativa humana da classe VH1 para a cadeia pesada e empa-relhado com a cadeia leve de B-Iyl humanizado, BKV1. BHL13-BKV1 é deri-vado do BHL8 (vide figura 5 acima), com uma substituição de leuçina porvalina na posição 11 de Kabat e uma substituição de valina por metionina naposição 48 de Kabat na região variável de cadeia pesada e emparelhadacom uma cadeia leve de BKV1.
Figura 7. Depleção de células-β pelo rituximab (o) e chB-ly1 (■)em sangue íntegro das três diferentes classes de genotipo FcYRIIIa-158V/F:(A) sangue íntegro de doador F/F, homozigótico para o receptor de menorafinidade; (B) sangue íntegro de doador F/V, heterozigótico para o receptorde afinidade; e (C) sangue íntegro de um doador V/V, homozigótico para oreceptor de maior afinidade.
Figura 8. Perfil de MALDI-TOF de um anticorpo B-Iyl glico-manipulado, quimérico. (A) Tabela detalhando os percentuais de picos espe-cíficos; (B) Espectro para B-Iyl glico-manipulado B-Iyl; (C) Espectro para B-ly1 glico-manipulado quimérico tratado com Endo-H.
Figura 9. Ligação de diferentes anticorpos anti-CD20 humaniza-dos à células-β de Raji. As diferenças entre a estrutura B-HH2 e as estrutu-ras B-HL8 e B-HL11 estão localizadas nas regiões de "framework" 1 e 2 comtodas as três CDRs sendo idênticas. B-HL8 e B-HL11 têm suas seqüênciasFR1 e FR2 derivadas da classe VH3 humana, enquanto que a "framework"completa de B-HH2 é derivada de VH1 humana. B-HL11 é um derivado deB-HL8 com a única mutação GIuIGIn, com Gln sendo o resíduo de aminoá-cido na estrutura B-HH2. Isso significa que a troca GIuIGIn não altera a afi-nidade ou intensidade de ligação. As outras diferenças entre HH2 e B-HL8são 14 resíduos FR, dos quais um ou mais influenciarão o comportamentode ligação a antígeno desse anticorpo.
Figura 10. Ligação de anticorpo anti-CD20 humanizado BHL4-BKV1 à células-alvo de Raji. A estrutura B-HL4 é derivada do anticorpo B-HH2 através de substituição da FR1 do B-HH2 por aquele da seqüência delinhagem germinativa humana IGHV1-45 (No. de Ac. X92209). Essa estrutu-ra mostra capacidade de ligação a antígeno grandemente diminuída, a des-peito de ter diferentes aminoácidos em quatro posições dentro da FR1. Es-ses resíduos estão localizados nas posições 2, 14, 28 e 30 de acordo com anumeração de Kabat. Desses, as posições 28 e 30 parecem ser posições deinfluência, uma^vez que ela,? são parte da definição de CDR1 de Chothia.
Figura 11. Comparação do comportamento de ligação entre B-HH1 , B-HH2, B-HH3 (todos emparelhados com a cadeia leve de B-Iyl hu-manizada, BKV1) e o anticorpo precursor B-Iyl. Os dados mostram que to-dos os Abs mostram um valor de EC5O similar, mas a estrutura B-HH1 se ligacom uma intensidade/estequiometria menor do que as variantes B-HH2 e B-HH3. B-HH1 pode ser distinguido de B-HH2 e B-HH3 por suas regiões deCDR1 e CDR2 parcialmente humanas (definição de Kabat), bem como opolimorfismo Ala/Thr na posição 28 (numeração de Kabat). Isso indica que aposição 28, a CDR1 completa e/ou a CDR2 completa é importante para ainteração anticorpo/antígeno.
Figura 12. Comparação do comportamento de ligação entre B-HL1, B-HH1 e o anticorpo precursor B-Iyl. Os dados mostraram a ausênciade qualquer atividade de ligação na estrutura B-HL1 e cerca de metade daintensidade/estequiometria de ligação da B-HH1 comparado com B-Iyl. B-HL1, bem como B-HH1, são projetadas baseado em "framework" aceitado-ras derivadas da classe VH1 humana. Dentre outras diferenças, a posição71 (numeração de Kabat) da estrutura B-HL1 é uma diferença que se desta-ca, indicando sua importância putativa para a ligação a antígeno.
Figura 13. Comparação do comportamento de ligação entre aestrutura de cadeia pesada do anticorpo anti-CD30 B-HL2 e B-HL3 a seuantígeno. Em ambos os casos, a seqüência VL de murino foi combinadacom as cadeias pesadas humanizadas. Os dados mostraram que as estrutu-ras B-HL2 e B-HL3 não mostram atividade de ligação ao CD20.
Figura 14. Efeito apoptótico de anticorpos anti-CD20 sobre célu-las Z-138MCL.
Figura 15. Apoptose sobre anticorpos anti-CD20. Detalhes doensaio: 5 χ 105 células/cavidade foram cultivadas em lâminas com 24 cavi-dades (5 χ 105 células/ml) em meio de cultura. Uma concentração final de 10μg/ml do respectivo anticorpo, PBS para o controle negativo ou controle po-sitivo de Camptotecina (CPT) a 5 mM, foram adicionados às cavidades. Asamostras foram incubadas o/n (16 h), coradas com AnnV-FITC e analisadasatravés çje FACS. Os ensaios foram realizados em triplicata. (*): Sinal paraPBS apenas subtraído (PBS sozinho proporcionou 8% e 2% de AnnV+ paracélulas PR-1 e Z-138, respectivamente). Os anticorpos usados foram: C2B8(quimérico, não glico-manipulado); BHH2-BKV1 (humanizado, não glico-manipulado). Nota: esse ensaio não envolve quaisquer células efetuadorasadicionais, apenas alvos mais anticorpo ou controles.
Figura 16. Morte célula-objetivada de anticorpos anti-CD20 comcélulas efetuadoras imunes. Detalhes do ensaio: depleção de células-β emsangue íntegro normal foi determinada através de incubação durante a noitee análise com relação ao CD19+/CD3+ através de FACS. ADCC foi determi-nada usando PBMCs como efetuadores com uma incubação de 4 h e umaproporção de efetuador:alvo de 25:1. A morte alvo foi medida através de re-tenção de Calceína com relação à Iise com detergente (100%) e à Iise semanticorpo (0%). Anticorpos usados foram: C2B8 (quimérico, forma não glico-manipulada); BHH2-BKV1-peso (humanizado, forma não glico-manipuladade BHH2-BKV1); BHH2-BKV1-GE (humanizado, forma glico-manipulada deBHH2-BKV1).
Figura 17. Perfil de MALDI/TOF-MS de oligossacarídeos de FcPNGaseF-Iiberados de anticorpo anti-CD20 humano B-Iyl de IgGI humani-zado BHH2-BKV1.
Figura 18. Perfil de MALDI/TOF-MS de oligossacarídeos de FcPNGaseF-Iiberados de anticorpo anti-CD20 humano B-Iyl de IgGI humani-zado BHH2-BKV1g1. Glico-manipulação foi realizada através de co-expressão, em células hospedeiras, de genes de anticorpo e um gene quecodifica uma enzima com atividade catalítica de β-1,4-Ν- acetilglicosaminil-transferase Jil (GnT-III).
Figura 19. Perfil de MALDI/TOF-MS de oligossacarídeos de FcPNGaseF-Iiberados de anticorpo anti-CD20 humano B-Iyl de IgGI humani-zado BHH2-BKV1g2. Glico-manipulação foi realizada através de co-expressão, em células hospedeiras, de genes de anticorpo e genes que co-dificam uma atividade catalítica de β-1,4-Ν- acetilglicosaminiltransferase Ill(GnT-III) e codificam uma enzima com atividade catalítica de a-manosidaseII no Golgi.
Figura 20. Ligação de anticorpos não glico-manipulados e glico-manipulados (versão g2; vide Figuras 17-19 para perfis de glicosilação) aoreceptor FcgamaRIIIa humano mostrada sobre a superfície de células CHOexpressando CD16 recombinante.
Figura 21. Efeito apoptótico de anticorpos anti-CD20 não-Fc-manipulados e Fc-manipulados sobre células de MCL Z-138. Detalhes doensaio: 5 χ 105 células/cavidade foram cultivadas em lâminas com 24 cavi-dades (5 χ 105 células/ml) em meio de cultura. Uma concentração final de 10μg/ml do respectivo anticorpo ou PBS para o controle negativo, foi adiciona-da às cavidades. As amostras foram incubadas o/n (16 h), coradas comAnnV-FITC e analisadas através de FACS. Os ensaios foram realizados emtriplicata. Os anticorpos usados foram: C2B8 = rituximab (quimérico, formanão-glico-manipulada); BHH2-BKV1 (humanizado, forma não-glico-manipulada, vide Figuras 17-19 para perfil de glicosilação); BHH2-BKV1g1(humanizado, glico-manipulado); BHH2-BKV1g2 (humanizado, glico-manipulado). Nota: esse ensaio não envolve quaisquer células efetuadorasadicionais, apenas alvos mais anticorpo ou controles. (*): Sinal para PBSapenas foi subtraído.
Figura 22. Ligação de diferentes anticorpos anti-CD20 humani-zados à células B de Raji. A estrutura de cadeia pesada humanizada BHH2é comparada com seus derivados BHH4 e BHH7. Também mostradas sãovariantes que se dirigem à influência das posições 28 e 30 de Kabat (BHH8e BHH9).
Figura 23. Efeito de troca de um único aminoácido sobre a apop-tose por anticorpos anti-CD20 sobre células de MCL Z-138. Detalhes do en*saio: 5 χ 105 células/cavidade foram cultivadas em lâminas com 24 cavida-des (5 χ 105 células/ml) em meio de cultura. Uma concentração final de 10μg/ml do respectivo anticorpo ou PBS para o controle negativo (sem Ab), foiadicionada às cavidades. As amostras foram incubadas o/n (16 h), coradascom AnnV-FITC e analisadas através de FACS. Os ensaios foram realizadosem triplicata. Os anticorpos usados foram: C2B8 = rituximab (quimérico, for-ma não-glico-manipulada); BHH2-BKV1 '(humanizado, forma nãó-glico-manipulada); BHH2 (humanizado, não-glico-manipulado), BHH2-A (um deri-vado de BHH2 com uma substituição de valina por Ieucina na posição 11 deKabat) e BHH2-B (um derivado de BHH2 com uma substituição de Iisina porvalina na posição 12 de Kabat), os dois últimos emparelhados com uma ca-deia leve de BKV1. A Kd da ligação a antígeno permanece inalterada pelasubstituição. Nota: esse ensaio não envolve quaisquer células efetuadorasadicionais, apenas alvos mais anticorpo ou controles.Figura 24. Efeito de troca de um único aminoácido sobre a apop-tose por anticorpos anti-CD20 anteriormente inativos sobre células de MCLZ-138. Detalhes do ensaio: 5 χ 105 células/cavidade foram cultivadas emlâminas com 24 cavidades (5 χ 105 células/ml) em meio de cultura. Umaconcentração final de 10 μg/ml do respectivo anticorpo ou PBS para o con-trole negativo, foi adicionada às cavidades. As amostras foram incubadaso/n (16 h), coradas com AnnV-FITC e analisadas através de FACS. Os en-saios foram realizados em triplicata. Os anticorpos usados foram: C2B8 =rituximab (quimérico, forma não-glico-manipulada); BHL8 (humanizado, não-glico-manipulado), BHL13 (um derivado de BHL8 com uma substituição deIeucina por valina na posição 11 de Kabat e uma substituição de valina pormetionina na posição 48 de Kabat) e BHL14 (um derivado de BHL8 comuma substituição de valina por Iisina na posição 12 de Kabat e uma substitu-ição de valina por metionina na posição 48 de Kabat), os três últimos empa-relhados com uma cadeia leve de BKV1. Nota: esse ensaio não envolvequaisquer células efetuadoras adicionais, apenas alvos mais anticorpo oucontroles.
Figura 25. Efeito de troca de um único aminoáoido dentro da ca-deia leve sobre a apoptose por anticorpos anti-CD20 sobre células dé MCLZ-138. Detalhes do ensaio: 5 χ 105 células/cavidade foram cultivadas emlâminas com 24 cavidades (5 χ 105 células/ml) em meio de cultura. Umaconcentração final de 10 μg/ml do respectivo anticorpo ou PBS para o con-trole negativo, foi adicionada às cavidades. As amostras foram incubadaso/n (16 h), coradas com AnnV-FITC e analisadas através de FACS. Os en-saios foram realizados em triplicata.; Os anticorpos usados foram BHH2-A(um derivado de BHH2 com uma substituição de valina por Ieucina na posi-ção 11 de Kabat) emparelhado com uma cadeia leve de BKV1, BHH6 (umderivado de BHH2 com uma substituição de metionina por isoleucina na po-sição 34 de Kabat) emparelhado com uma cadeia leve de BKV1 e BHH6emparelhado com uma cadeia leve de BKV14 (um derivado de BKV1 comuma substituição de isoleucina por alanina na posição 106 de Kabat).
Figura 26. Representação tridimensional de uma "união em esfe-ra-e-soquete" na interface entre os domínios VH e CH1.Descrição Detalhada da Invenção
Os termos são usados aqui conforme geralmente usado na téc-nica, menos que de outro modo definido como segue e aqui.
Conforme usado aqui, o termo molécula de ligação a antígeno(ABM) se refere, em seu sentido mais amplo, a uma molécula que se ligaespecificamente a um determinante antigênico. Por "se liga especificamente"entenda-se que a ligação é seletiva para o antígeno e pode ser discriminadade interações indesejadas ou não específicas. Conforme usado aqui, o ter-mo molécula de ligação a antígeno-modificada (ou ABM modificada) se des-tina a se referir a uma ABM compreendendo pelo menos uma substituiçãode resíduo de aminoácido na região variável de cadeia pesada e/ou regiãoCH1 e/ou pelo menos uma substituição de resíduo de aminoácido na regiãovariável de cadeia leve e/ou região CL.
Conforme usado aqui, o termo anticorpo se destina a incluir mo-léculas de anticorpo inteiro, incluindo anticorpos monoclonais, policlonais emulti-específicos (por exemplo, bi-específicos), bem como fragmentos deanticorpo tendo a região Fc e retendo a especificidade de ligação e proteínasde fusão que incluem uma região equivalente à região Fc de uma imunoglo-bulina e que retêm a especificidade de ligação. Também abrangidos sãofragmentos de anticorpo que retêm a especificidade de ligação incluindo,mas não limitado a, fragmentos VH, fragmentos VL, fragmentos Fab, frag-mentos F(ab')2, fragmentos scFv, fragmentos Fv, minicorpos, diacorpos, tria-corpos e tetracorpos (vide, por exemplo, Hudson e Souriau, Nature Med. 9:129-134 (2003), incorporado aqlii por referência ém sua totalidade). Tam-bém abrangidos são anticorpos humanizados, primatizados e quiméricos.Conforme usado aqui, anticorpo inteiro se refere a uma molécula de imuno-globulina compreendendo duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, cadauma das quais compreende uma região variável e constante.
Conforme usado aqui, o termo região variável se destina a sereferir ao domínio N-terminal de uma cadeia pesada ou leve de imunoglobu-lina. De acordo com uma modalidade da presente invenção, uma ABM modi-ficada pode compreender um fragmento funcional de uma região variável.
Conforme usado aqui, o termo região variável de cadeia pesadase destina a se referir ao domínio N-terminal de uma cadeia pesada de imu-noglobulina. Em um exemplo, a região variável de cadeia pesada é definidapelas posições 1 a 113 de Kabat (com possíveis inserções em resíduos par-ticulares, conforme designado por Kabat e outros, U.S. Dept. of Health andHuman Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interesf (1983)).De acordo com uma modalidade da presente invenção, uma ABM modifica-da pode compreender um fragmento funcional de uma região variável decadeia pesada.
Conforme usado aqui, o termo região variável de cadeia pesadase destina a se referir ao domínio C-terminal de uma cadeia pesada de imu-noglobulina. Existem cinco classes que ocorrem naturalmente de regiõesvariáveis de cadeia pesada: IgA1 IgG, IgE, IgD e IgM. Em um exemplo, a re-gião variável de cadeia pesada compreende um domínio CH1, um domínioCH2 e um domínio CH3.
Conforme usado aqui, o termo região CH1 se destina a se referirao domínio da cadeia pesada de uma imunoglobulina que é exatamente C-terminal à região variável e N-terminal à região de dobradiça. Em uma imu-noglobulina do tipo IgG, por exemplo, CH1 é normalmente definido pelasposições 114 a 228 de Kabat.
Conforme usado aqui, o termo apoptose se destina a se referir àmorte celular programada, a qual é caracterizada por determinados eventoscelulares, tais como fragmentação nuclear e/ou formação de corpos apoptó-tjcos através de condensação do citoplasma, membranas plasmáticas" e/ouorganelas.
Conforme usado aqui, o termo atividade agonista se destina a sereferir à atividade de uma agente (por exemplo, uma molécula de ligação aantígeno) quando ele interage com (por exemplo, se liga a) uma moléculaassociada com uma superfície celular e inicia ou induz a uma reação.
Conforme usado aqui, o termo atividade antagonista se destina ase referir à atividade de uma agente (por exemplo, uma molécula de ligaçãoa antígeno) quando ele interage com (por exemplo, se liga a uma moléculasobre uma célula e impede o início ou indução de uma reação ou descontí-nua uma reação em andamento.
Conforme usado aqui, os termos fusão e quimérico, quando u-sados em referência a polipeptídeos, tais como ABMs, se referem a polipep-tídeos compreendendo seqüências de aminoácido derivadas de dois ou maispolipeptídeos heterólogos, tais como porções de anticorpos de diferentesespécies. Para ABMs quiméricas, por exemplo, os componentes de não -ligação a antígeno podem ser derivados de uma ampla variedade de espé-cies, incluindo primatas, tais como chimpanzés e seres humanos. A regiãoconstante da ABM quimérica é, mais preferivelmente, substancialmente i-dêntica à região constante de um anticorpo humano natural; a região variá-vel do anticorpo quimérico é, mais preferivelmente, derivada de uma molécu-la de ligação a antígeno não-humana (isto é, doadora) que se liga especifi-camente a um antígeno de interesse. A ABM quimérica pode compreender aregião variável inteira do doador; alternativamente, o anticorpo quiméricopode compreender um anticorpo humanizado ou primatizado. Anticorposhumanizados são uma forma particularmente preferida de anticorpo de fusãoou quimérico.
Conforme usado aqui, o termo humanizado é usado para se re-ferir a uma molécula de ligação a antígeno derivada de uma molécula deligação a antígeno não-humana, por exemplo, um anticorpo de murino, queretêm ou retêm substancialmente as propriedades de ligação a antígeno damolécula precursora, mas o qual é menos imunogênico em seres humanos.Isso pode ser obtido através de vários métodos, incluindo (a) enxertagemdos domínios variáveis não-humanos sobre regiões constantes humanaspara gerar anticorpos quiméricos, (b) enxertagem apenas das CDRs não-humanas sobre as regiões de "framework" e constante humanas (por exem-plo, aquelas que são de importância para retenção de boa afinidade de liga-ção a antígeno ou funções do anticorpo) ou (c) transplante dos domínios va-riáveis não-humanos inteiros, mas "ocultando" os mesmos com uma seçãosemelhante à humana através de substituição de resíduos na superfície.Tais métodos são descritos em Jones e outros, Morrison e outros, Proc. NatLAcad. Sci., 81: 6851-6855 (1984); Morrison e Oi, Adv. Immunol, 44: 65-92(1988); Verhoeyen e outros, Science, 239: 1534-1536 (1988); Padlan, Molec.Immun., 28: 489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31 (3): 169-217 (1994),todos os quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade .
Geralmente, existem 3 regiões de determinação de complemen-taridade ou CDRs (CDR1, CDR2 e CDR3) em cada um dos domínios variá-veis de cadeia pesada e leve de um anticorpo, as quais são flanqueadas porquatro sub-regiões de "framework" (isto é, FR1, FR2, FR3 e FR4) em cadaum dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve de um anticorpo: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Uma discussão de anticorpos humani-zados pode ser encontrada inter alia, na Patente U.S. No. No. 6.632.927 eno Pedido U.S. publicado No. 2003/0175269, ambos os quais são incorpora-dos por referência em sua totalidade aqui.
Similarmente, conforme usado aqui, o termo primatizado é usa-do para se referir a uma molécula de ligação a antígeno derivada de umamolécula de ligação a antígeno de não-primata, por exemplo, um anticorpode murino, que retêm ou retêm substancialmente as propriedades d® ligaçãoa antígeno da molécula precursora, mas o qual é menos imunogênica emprimatas.
No caso onde existem duas ou mais definições de um termo asquais são usadas e/ou aceitas dentro da técnica, a definição do termo con-forme usado aqui se destina a incluir todos de tais significados, a menos queexplicitamente estabelecido o contrário. Um exemplo específico é o uso dotermo "região de determinação de" complementaridade" ("CDR") para des-crever o antígeno não contínuo combinando sítios encontrados dentro daregião variável de polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Essa região emparticular foi descrita por Kabat e outros, U.S. Dept. of Health and HumanServices, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) e porChothia e outros, J Mol Biol. 196: 901-917 (1987), os quais são incorporadosaqui por referência, onde as definições incluem sobreposição ou subconjun-tos de resíduos de aminoácido quando comparados uns contra os outros.Todavia, a aplicação da definição para se referir a uma CDR de um anticor-po ou variantes do mesmo se destina a estar dentro do escopo do termo,conforme definido e usado aqui. Os resíduos de aminoácido apropriados osquais abrangem as CDRs1 conforme definido por cada uma das referênciascitadas acima, são apresentados abaixo na Tabela I como uma comparação.Os número exatos dos resíduos os quais abrangem uma CDR em particularvariarão, dependendo da seqüência e do tamanho da CDR. Aqueles habili-tados na técnica podem determinar rotineiramente quais resíduos compre-endem uma CDR em particular dada a seqüência de aminoácido da regiãovariável do anticorpo.
TABELA I. Definições de CDR1
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1 Numeração de todas as definições de CDR na Tabela 1 de acordo com asconversões de numeração apresentadas por Kabat e outros (vide abaixo).
2 OxAbM" se refere às CDRs conforme definido pelo software de modifica-ção de anticorpo "AbM" da Oxford Molecular
Kabat e outros também definiram um sistema de numeraçãotambém definiram um sistema de numeração para seqüências de domíniovariável que é aplicável a qualquer anticorpo. Aqueles versados na técnicapodem, inequivocadamente, atribuir esse sistema de "numeração de Kabaf'a qualquer seqüência de domínio variável, sem contar com quaisquer dadosexperimentais além da seqüência em si. Conforme usado aqui, "numeraçãode Kabat" se refere ao sistema de numeração apresentado por Kabat e ou-tros, U.S. Dept. of Health e Human Services, "Sequence of Proteins of Im-munological Interest" (1983). A menos que de outro modo especificado, refe-rências à numeração de posições de resíduo de aminoácido específicas emuma ABM são de acordo com o sistema de numeração de Kabat. As se-qüência da listagem de seqüência não são numeradas de acordo com o sis-tema de numeração de Kabat.
Conforme usado aqui, um polipeptídeo tendo "atividade de GnTI-II" se refere a polipeptídeos que são capazes de catalisar a adição de umresíduo de N-acetilglicosamina (GIcNAc) em uma ligação β-1-4 ao manosí-deo β-ligado do núcleo de trimanosila de oligossacarídeos N-ligados. Issoinclui polipeptídeos de fusão exibindo atividade enzimática similar a, masnão necessariamente idêntica a, uma atividade de β(Ι,4)-Ν- acetilglicosami-niltransferase III, também conhecida como 4-beta-N-acetilglicosaminil-transferase de β-1,4-manosil- glicoproteína (EC 2.4.1.144), de acordo com oNomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Mo-lecular Biology (NC-IUBMB), conforme medido em um ensaio biológico emparticular, com ou sem dependência de dose. No caso onde dependência dedose existe, ela não precisa ser idêntica àquela da GnTHI, mas antes, subs-tancialmente similar à dose-dependência em uma determinada atividadequando comparado com a GnTIII (isto é, o polipeptídeo candidato exibirámaior atividade ou não mais do>que cerca de 25 vezes menos e, de prefe-rência, não mais do que cerca de 10 vezes menos atividade e, ainda maispreferivelmente, não mais do que cerca de 3 vezes menos atividade comrelação à GnTIII).
Conforme usado aqui, o termo variante (ou análogo) se refere aum polipeptídeo diferindo de um polipeptídeo especificamente mencionadoda invenção por inserções, deleções, e substituições de aminoácido criadas^usando, poj exemplo, técnicas de DNA recombinante. Variantes das ABMsda presente invenção incluem moléculas de ligação a antígeno quiméricas,primatizadas ou humanizadas, em que um ou vários dos resíduos de amino-ácido são modificados através de substituição, adição e/ou deleção, de umaforma tal que não afeta substancialmente a afinidade de ligação a antígeno.Orientação para determinação de quais resíduos de aminoácido podem sersubstituídos, adicionados ou deletados sem eliminar atividades de interesse,pode ser encontrada através de comparação da seqüência do polipeptídeoem particular com aquela de peptídeos homólogos e minimizando o númerode alterações da seqüência de amínoácido em regiões de alta homologia(regiões conservadas) ou através de substituição de aminoácidos por umaseqüência de consenso.
Alternativamente, variantes recombinantes que codificam essesmesmos ou polipeptídeos similares podem ser sintetizadas ou selecionadasfazendo uso da "redundância" no código genético. Várias substituições decódon, tais como as alterações silenciosas as quais produzem vários sítiosde restrição, podem ser introduzidas para otimizar a clonagem em um plas-mídeo ou vetor viral ou a expressão em um sistema procariota ou eucariotaem particular. Mutações na seqüência de polinucleotídeo podem ser refleti-das no polipeptídeo ou domínios de outros peptídeos adicionados ao poli-peptídeo para modificar as propriedades de qualquer parte do polipeptídeo,alterar características tais como afinidades de ligação a ligante, afinidadesintercadeia ou taxa de degradação/reconstrução.
Conforme usado aqui, substituição de resíduo de amínoácido sedestina a se referir à substituição de um ou mais aminoácidos em uma se-qüência de referência (por exemplo, uma molécula precursora, tal como umamolécula de ligação a antígeno). Em uma modalidade, substituição de resí-duo de aminoácido pode ser obtida, por exemplo, através de uma mutaçãode ponto na seqüência de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeoquando comparado com uma seqüência precursora. Em outra modalidade,substituição de um resíduo de aminoácido pode ser obtida através de substi-tuição da região de "framework" inteira do polipeptídeo precursor, por exem-plo, por uma régião de "framework" de uma seqüência VH de linhagem geri·minâtiva que compreende o aminoácido desejado na posição a ser substituí-da em referência ao precursor.
Substituições de aminoácido "conservativas" são aquelas feitassubstituindo um aminoácido por outro aminoácido tendo propriedades estru-turais e/ou químicas similares, isto é, substituições conservativas de amino-ácido e podem ser feitas com base na similaridade na polaridade, carga, so-lubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou a natureza anfifática dos resí-duos envolvidos. Por exemplo, aminoácidos não polares (hidrofóbicos) inclu-em glicina, alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofanoe metionina; aminoácidos neutros polares incluem serina, treonina, cisteína,tirosina, asparagina e glutamina; aminoácidos positivamente carregados(básicos) incluem arginina, Iisina e histidina; e aminoácidos negativamentecarregados (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. "inserções"ou "deleções" estão, de preferência, na faixa de cerca de 1 a 20 aminoáci-dos, mais preferivelmente 1 a 10 aminoácidos. A variação permitida pode serexperimentalmente determinada fazendo sistematicamente inserções, dele-ções ou substituições de aminoácidos em uma molécula de polipeptídeo u-sando técnicas de DNA recombinante e avaliando as variantes recombinan-tes resultantes com relação à atividade.
Conforme usado aqui, o termo molécula de ligação a antígenoprecursora ou molécula precursora se refere a um pòlipéptídeo tendo umaseqüência de aminoácido em particular codificada por uma seqüência depolinucleõtídeo. A seqüência da molécula precursora (isto é, a seqüênciaprecursora) serve como uma seqüência de referência para fazer substitui-ções de resíduo de aminoácido que alteram a capacidade da molécula resul--ttante (por exemplo, uma molécula de ligação a antígeno-modificada) de in-duzir ou bloquear a atividade de sinalização celular e/ou reticulação de antí-geno. Da mesma forma, a atividade de uma molécula precursora serve comoa referência quando de determinação se uma substituição tem um efeito so-bre a via de sinalização celular e/ou reticulação de antígeno e, onde relevan-te a extensão desse efeito. Uma seqüência contendo uma ou mais substitui-ções de aminoácido em comparação com ό seu precursor (por exemplo,uma ABM modificada) pode, por sua vez, servir como uma seqüência pre-cursora para outras substituições.
Conforme usado aqui, o termo atividade de sinalização celularalterada se destina a se referir um aumento ou diminuição na capacidade deuma ABM de induzir ou inibir a atividade de sinalização celular de um antí-geno-alvo.
Conforme usado aqui, o termo reticulação alterada de um oumais antígenos-alvo se destina a se referir a um aumento ou diminuição nacapacidade de uma ABM de se manter em proximidade intima umas com asoutras e/ou em proximidade íntima com outras moléculas membrana-associadas e/ou em uma conformação mais favorável para interação de an-tígenos-alvo que são capazes de formação de complexos (por exemplo, a-través de reticulação de proteínas ou oligomerização de receptores mem-brana-associados) para iniciar as vias de sinalização celular.
Conforme usado aqui, mecanismo de sinalização celular ou ati-vidade de sinalização celular se destina a se referir à via de sinalização intei-ra (isto é, transdução de sinal) que leva a um evento celular ou função bioló-gica em particular, bem como quaisquer etapas de sinalização ao longo davia.
Por um ácido nucléico ou polinucleotídeo tendo uma seqüênciade nucleotídeo pelo menos, por exemplo, 95% "idêntica" a uma seqüênciade nucleotídeo de referência da presente invenção, entenda-se que a se-qüência de nucleotídeo do polinucleotídeo é idêntica à seqüência de refe-rência, exceto que a seqüência de polinucleotídeo pode incluir até cinco mu-tações de ponto por cada 100 nucleotídeos da seqüência de nucleotídeo dereferência. Em outras palavras, para obter um polinucleotídeo tendo umaseqüência de nucleotídeo pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de nu-cleotídeo de referência, até 5% dos nucleotídeos na seqüência de referênciapodem deletados ou substituídos por outros nucleotídeos ou um número denucleotídeos até 5% dos nucleotídeos totais na seqüência de referência po-de ser inserido na seqüência de referência.
Como um assunto prático, se qualquer molécula de ácido nucléi-co ou polipeptídeo em particular é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%,97%, 98% ou 99% idêntica a uma seqüência de nucleotídeo ou seqüênciade polipeptídeo da presente invenção, pode ser determinado convencional-mente usando programas de computador conhecidos. Um método preferidopara determinação da melhor combinação global entre uma seqüência dequery (uma seqüência da presente invenção) e uma seqüência em questão,também referido como um alinhamento de seqüência global, pode ser de-terminado usando o programa de computador FASTDB baseado no algorit-mo de Brutlag e outros, Comp. App. Biosci. 6: 237-245 (1990). Em um ali-nhamento de seqüência, as seqüências de query e em questão são ambasseqüências de DNA. Uma seqüência de RNA pode ser comparada conver-tendo U1S em T's. O resultado do referido alinhamento de seqüência global éa identidade percentual. Parâmetros preferidos usados em um alinhamentoFASTDB de seqüências de DNA para calcular a identidade percentual são:Matriz = Unitária, k-tuple = 4, Penalidade por Combinação Errônea = I, Pena-lidade por União = 30, Extensão do Grupo de Randomização = 0, Escore deCorte = I, Penalidade por GAP = 5, Penalidade por Tamanho de Gap 0,05,Tamanho de Janela = 500 ou o comprimento da seqüência de nucleotídeoem questão, o que for menor.
Se a seqüência em questão é mais curta do que a seqüência dequery em virtude de deleções 5' ou 3', não em virtude de deleções internas,uma correção manual deve ser feita nos resultados. Isso é porque o progra-ma FASTDB não leva em conta truncamentos 5' e 3' da seqüência em ques-tão quando de cálculo da identidade percentual. Para seqüências em ques-tão truncadas nas extremidades 5' ou 3',e-3om relação à seqüência de query,a identidade percentual é corrigida calculando-se o número de bases da se-qüência de query que são 5' e 3' da seqüência em questão, as quais não sãocombinadas/alinhadas, como um percentual das bases totais da seqüênciade query. Se um nucleotídeo é combinado/alinhado é determinado pelos re-sultados do alinhamento de seqüência FASTDB. Esse percentual é, então,subtraído da identidade percentMal, calculada através do programa FASTDBacima uSando os parâmetros específicos, para chegar a um escore final deidentidade percentual. Esse escore corrigido é aquele que é usado para finsda presente invenção. Apenas bases fora das bases 5' e 3' da seqüência emquestão, conforme visualizado pelo alinhamento FASTDB, as quais não sãocombinadas/alinhadas com a seqüência de query, são calculadas para finsde ajuste manual do escore de identidade percentual.
Por exemplo, uma seqüência em questão com 90 bases é ali-nhada a uma seqüência de query com 100 bases para determinar a identi-dade percentual. As deleções ocorrem na extremidade 5' da seqüência emquestão e, portanto, o alinhamento FASTDB não mostra uma combina-ção/alinhamento das primeiras 10 bases na extremidade 5'. As 10 bases nãoemparelhadas representam 10% da seqüência (números de bases nas ex-tremidades 5' e 3' não combinadas / número total de bases na seqüência dequery, de modo que 10% são subtraídos do escore de identidade percentualcalculado pelo programa FASTDB. Se as 90 bases restantes foram perfei-tamente combinadas, a identidade percentual final seria de 90%. Em outroexemplo, uma seqüência em questão com 90 bases é comparada com umaseqüência de query com 100 bases. Nesse caso, as deleções são deleçõesinternas, de modo que não existem bases sobre a extremidade 5' ou 3' daseqüência em questão, as quais não são combinadas/alinhadas com aquery. Nesse caso, a identidade percentual calculada pelo FASTDB não émanualmente corrigida. Mais uma vez, apenas bases sobre a extremidade 5'e 3' da seqüência em questão as quais não são combinadas/alinhadas coma seqüência de query são manualmente corrigidas. Nenhuma outra correçãomanual é feita para fins da presente invenção.
Por um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido pelomenos, por exemplo, 95% "idêntica" a uma seqüência de aminoácido dequery da presente invenção, entenda-se que a seqüência de aminoácido dopolipeptídeo em questão é idêntica à seqüência de query, exceto que a se-qüência de polipeptídeo em questão pode incluir até cinco alterações de a-minoácido por cada 100 aminoácidos da seqüência de aminoácido de query.Em outras palavras, para obter um polipeptídeo tendo uma seqüência deançinoácido pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoácido"dequery, até 5% dos resíduos de aminoácido na seqüência em questão podemser inseridos, deletados ou substituídos por outro aminoácido. Essas altera-ções da seqüência de referência podem ocorrer nas posições amino ou car-bóxi terminais da seqüência de aminoácido de referência ou em qualquerlugar entre essas posições terminais, interespaçadas individualmente entreos resíduos na seqüência de referência ou em um ou mais grupos contínuosdentro da seqüência de referência.Como um assunto prático, se qualquer polipeptídeo em particu-lar é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico aum polipeptídeo de referência pode ser determinado convencionalmente u-sando programas de computador conhecidos. Um método preferido paradeterminação da melhor combinação global entre uma seqüência de query(uma seqüência da presente invenção) e uma seqüência em questão, tam-bém referido como um alinhamento de seqüência global, pode ser determi-nado usando o programa de computador FASTDB baseado no algoritmo deBrutlag e outros, Comp. App. Biosci. 6: 237-245 (1990). Em um alinhamentode seqüência, as seqüências de query e em questão são ambas seqüênciasde nucleotídeo ou ambas seqüências de aminoácido. O resultado do referidoalinhamento de seqüência global é a identidade percentual. Parâmetros pre-feridos usados em um alinhamento de aminoácido pelo FASTDB são: Matriz= PAM, k-tuple = 2, Penalidade por Combinação Errônea = I, Penalidade porUnião = 20, Extensão do Grupo de Randomização = 0, Escore de Corte = I,Penalidade por GAP = 5, Penalidade por Tamanho de Gap 0,05, Tamanhode Janela = 500 ou o comprimento da seqüência de nucleotídeo em ques-tão, o-que for menor,
Se a seqüência em questão é mais curta do que a seqüência dequery em virtude de deleções N- ou C-terminais, não em virtude de deleçõesinternas, uma correção manual deve ser feita nos resultados. Isso é porqueo programa FASTDB não leva em conta truncamentos N- e C-terminais daseqüência em questão quando de cálculo da identidade percentual. Paraseqüências em questão truncadas nos N- e C-términos, com relação à se-qüência de query, a identidade percentual é corrigida c"alculando-ss o núme-ro de número de resíduos da seqüência de query que são N- e C-terminaisda seqüência em questão, as quais não são combinados/alinhados com oresíduo em questão correspondente como um percentual das bases totaisda seqüência de query. Se um resíduo é combinado/alinhado é determinadopelos resultados do alinhamento de seqüência FASTDB. Esse percentual é,então, subtraído da identidade percentual, calculado através do programaFASTDB acima usando os parâmetros especificados, para chegar a um es-core final de identidade percentual. Esse escore corrigido é aquele que éusado para fins da presente invenção. Apenas resíduos nos N- e C-términosda seqüência em questão, os quais não são combinados/alinhados com aseqüência de query, são considerados para fins de ajuste manual do escorede identidade percentual. Isto é, apenas posições do resíduo de query forados resíduos N- e C-terminais mais distantes da seqüência em questão.
Por exemplo, uma seqüência em questão com 90 resíduos deaminoácido é alinhada com uma seqüência de query com 100 resíduos paradeterminar a identidade percentual. A déleção ocorre no N-término da se-qüência em questão e, portanto, o alinhamento FASTDB não mostra umacombinação/alinhamento dos primeiros 10 resíduos no N-término. Os 10 re-síduos não emparelhados (número de resíduos nos N- e C-términos nãocombinados/ número total de resíduos na seqüência de query), de modo que10% são subtraídos do escore de identidade percentual calculado pelo pro-grama FASTDB. Se os 90 resíduos restantes foram perfeitamente combina-dos, a identidade percentual final seria de 90%. Em outro exemplo, uma se-qüência em questão com 90 resíduos é comparada com uma seqüência dequery com 100 resíduos. Nesse caso, as deleções são deleções internas, demodo que não existem resíduos nos N- ou C-términos da seqüência emquestão, os quais não são combinados/alinhados com a query. Nesse caso,a identidade percentual calculada pelo FASTDB não é manualmente corrigi-da. Mais uma vez, apenas resíduos nas posições fora das extremidades N- eC-terminais da seqüência em questão, conforme visualizado no alinhamentoFASTDB, os quais não são combinados/alinhados com a seqüência dequery são manualmente corrigidos. Nenhuma outra correção manual tem deser feita para fins da presente invenção.
Conforme usado aqui, um ácido nucléico que "hibridiza sob con-dições estringentes" a uma seqüência de ácido nucléico da invenção se refe-re a um polinucleotídeo que se hibridiza em uma incubação durante a noite a42°C em uma solução compreendendo formamida a 50%, 5x SSC (NaCI a750 mM, citrato de sódio a 75 mM), fosfato de sódio a 50 mM (pH de 7,6), 5xsolução de Denhardt, sulfato de dextrana a 10% e 20 pg/ml de DNA de es-perma de salmão desnaturado, seguido por lavagem dos filtros em 0,1 χ SSCa cerca de 65 °C.
Conforme usado aqui, o termo região Fc se destina a se referir auma região C-terminal de uma cadeia pesada de IgG. Embora os limites daregião Fc de uma cadeia pesada de IgG possam variar ligeiramente, a regi-ão Fc de cadeia pesada de IgG humana usualmente é definida como se es-tendendo do resíduo de aminoácido na posição Cys226 ao carbóxi término.
Conforme usado aqui, o termo região equivalente à região Fc deuma imunoglobuiina se destina a incluir variantes alélicas que ocorrem natu-ralmente da região Fc com uma imunoglobuiina, bem como variantes tendoalterações as quais produzem substituições, adições ou deleções, mas asquais não diminuem substancialmente a capacidade da imunoglobuiina demediar funções efetuadoras (tal como citotoxicidade celular anticorpo-dependente). Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser deletadosdo N-término ou C-término da região Fc de uma imunoglobuiina sem perdasubstancial de função biológica. Tais variantes podem ser selecionadas deacordo com normais gerais conhecidas na técnica, de modo a ter efeito mí-nimo sobre a atividade. (Vide, por exemplo, Bowi®; J. U. e outros, Science247: 1306-10 (1990)). Em uma modalidade, uma região equivalente à regiãoFc pode também formar parte de uma proteína de fusão heteróloga. Em al-gumas modalidades, uma região equivalente à região Fc também abrangeuma região correspondente de outra classe de cadeia pesada de imunoglo-buiina (por exemplo, IgA, IgE, IgD e IgM).
Conforme usado aqui, o termo domínio de localização no Golgise refere à seqüência de aminoácido de um polipeptídeo residente no Golgio qual é responsável por ancoragem do polipeptídeo na localização dentrodo complexo de Golgi. Geralmente, domínios de localização compreendem"caudas" amino terminais de uma enzima.
Conforme usado aqui, o termo função efetuadora se refere àque-las atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de uma se-qüência nativa ou região Fc variante de seqüência de aminoácido) de umanticorpo. Exemplos de funções efetuadoras de anticorpo incluem, mas nãoestão limitadas a, afinidade de ligação ao receptor Fc, citotoxicidade celularanticorpo-dependente (ADCC), fagocitose celular anticorpo-dependente(ADCP), secreção de citocina, captação de antígeno complexo imune—mediada por célula apresentando antígeno, sub-regulação de receptores nasuperfície celular, etc.
Conforme usado aqui, os termos manipular, manipulado, mani-pulação, glico-manipular, glico-manipulado, glico-manipulação e manipula-ção de glicosilação são considerados como incluindo qualquer manipulaçãodo padrão de glicosilação de um polipeptídeo que ocorre naturalmente ourecombinante, tal como uma molécula de ligação a antígeno (ABM) ou frag-mento da mesma. Manipulação de glicosilação inclui manipulação metabóli-ca da maquinaria de glicosilação de uma célula, incluindo manipulações ge-néticas das vias de síntese de oligossacarídeos para obter glicosilação alte-rada de gIIcoproteínas expressas em célula. Em uma modalidade, a manipu-lação de glicosilação é uma alteração na atividade de glicosiltransferase. Emuma modalidade particular, a manipulação resulta em atividade de glicosa-miniltransferase e/ou atividade de fucosiltransferase alterada.
Conforme usado aquiro termo célula hospedeira cobre qualquertipo de sistema celular o qual pode ser manipulado para gerar os polipeptí-deos e moléculas de ligação a antígeno da presente invenção. Células hos-pedeiras incluem células cultivadas, por exemplo, células cultivadas de ma-mífero, tais como células CHO, células BHK, células HEK293-EBNA, célulasNSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de camun-dongo P3X63, células PER, células. PER.C6 e células de hibridoma, célulasdé levedo, cçlulas de inseto e células de planta, para mencionar umas pou-cas mas também células compreendendo dentro de um animal transgênico,planta transgênica ou planta cultivada ou tecido animal. Em uma modalida-de, a célula hospedeira é manipulada para permitir a produção de uma mo-lécula de ligação a antígeno com glicoformas modificadas. Em uma modali-dade preferida, a molécula de ligação a antígeno é um anticorpo, fragmentode anticorpo ou proteína de fusão. Em determinadas modalidades, a célulahospedeira foi ainda manipulada para expressar níveis aumentados de umou mais polipeptídeos tendo atividade de GnTIII. Em outras modalidades, ascélulas hospedeiras foram manipuladas para ter atividade de a1,6-fucosiltransferase central eliminada, reduzida ou inibida. O termo atividadede oc1,6-fucosiltransferase central abrange a expressão do gene de a1,6-fucosiltransferase central, bem como interação da enzima a1,6-fucosiltransferase central com seu substrato.
Conforme aqui usado, o termo citotoxicidade celular Fc-mediadainclui citotoxicidade celular anticorpo-dependente e citotoxicidade celularmediada por uma proteína de fusão-Fc solúvel contendo uma região Fc hu-mana, Ela é um mecanismo imune que leva à Iise de "células anticorpo-objetivadas" por "células efetuadoras imunes humanas", em que:
As células efetuadoras imunes humanas são uma população deleucócitos que mostram receptores Fc sobre sua superfície, através do quaiselas se ligam à região Fc de anticorpos ou proteínas de fusão-Fc e desem-penham funções efetuadoras. Tal população pode incluir, mas não está limi-tada a células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e/ou células as-sassinas naturais (NK).
AstCeIuIas anticorpo-objetivadas são células ligadas pelos anti-corpos ou proteínas de fusão-Fc. Os anticorpos ou proteínas de fusão-Fc seligam às células-alvo via a parte de proteína N-terminal da região Fe.
Conforme usado aqui, o termo citotoxicidade celular Fc-mediadaaumentada é definido como um aumento no número de "células anticorpo-objetivadas" que são submetidas à Iise em um determinado tempo, em umadeterminada concentração de anticorpo ou uma proteína de fusão-Fc, nomeio que circunda as células-alvo, através do mecanismo de citotoxicidade*celular Fc-mediada definido acima e/ou uma redução na concentração deanticorpo ou uma proteína de fusão-Fc, no meio que circunda as células-alvo, requerido para obter a Iise de um determinado número de "células anti-corpo-objetivadas" em um determinado tempo, através do mecanismo decitotoxicidade celular anticorpo-mediada. O aumento na citotoxicidade celu-lar Fc-mediada é com relação à citotoxicidade celular mediada pelo menosanticorpo ou proteína de fusão-Fc, produzida pelo mesmo tipo de célulashospedeiras usando os mesmos métodos padrões de produção, purificação,formulação e armazenamento, os quais são conhecidos por aqueles versa-dos na técnica, mas que não foram produzidas por células hospedeiras ma-nipuladas para expressar a glicosiltransferase GnTIII através dos métodosdescritos aqui.
Por anticorpo tendo citotoxicidade celular anticorpo-dependenteaumentada (ADCC) entenda-se um anticorpo, conforme esse termo é defini-do aqui, tendo ADCC aumentada, conforme determinado através de qual-quer método adequado conhecido por aqueles versados na técnica. Um en-saio de ADCC aceito é descrito nos Exemplos apresentados aqui abaixo.Outro ensaio de ADCC in vitro aceito é como segue:
1) o ensaio usa células-alvo que são conhecidas por expressar oantígeno-alvo reconhecido pela região de ligação a antígeno do anticorpo;
2) o ensaio usa células mononucleares de sangue periférico hu-mano (PBMCs) isoladas de sangue de um doador saudável aleatoriamenteescolhido, como células efetuadoras;
3) o ensaio é realizado de acordo com o seguinte protocolo:
i) as PBMCs são isoladas usando procedimentos de centrifuga-ção em densidade padrões e são suspensas a 5 χ 106 células/ml em meiode cultura de célula RPMI;
ii) as células-alvo são crescidas através de métodos de culturatecidual padrões, coletadas da fase de crescimento exponencial com umaviabilidade maior do que 90%, lavadas em meio de cultura de célula RPMI,rotuladas com 100 micro-Curies de 51Cr, lavadas duas vezes com meio.decultura de células e resuspensas em meio de cultura de célula em um densi-dade de 105 células/ml;
iii) 100 microlitros da suspensão de célula-alvo final acima sãotransferidos para cada cavidade de uma lâmina de microtitulação com 96cavidades;
iv) o anticorpo é serialmente diluído de 4000 ng/ml para 0,04ng/ml em meio de cultura de célula e 50 microlitros das soluções de anticor-po resultantes são adicionados às células-alvo na lâmina de microtitulaçãocom 96 cavidades, testando em triplicata várias concentrações de anticorpocobrindo a faixa de concentração toda acima;
v) para controles com liberação máxima (MR), 3 cavidades adi-cionais na lâmina contendo as células-alvo rotuladas recebem 50 microlitrosde uma solução aquosa a 2% (V/V) de detergente não-iônico (Nonidet, Sig-ma, St. Louis), ao invés da solução de anticorpo (ponto iv acima);
vi) para controles de liberação espontânea (SR), 3 cavidadesadicionais na lâmina contendo as células-alvo rotuladas recebem 50 microli-tros de meio de cultura de células RMPI ao invés da solução de anticorpo(ponto iv acima);
vii) a lâmina de microtitulação com 96 cavidades é, então, centri-fugada a 50 χ g durante 1 minuto e incubada durante 1 hora a 4 °C;
viii) 50 microlitros da suspensão de PMBC (ponto i acima) sãoadicionados a cada cavidade para proporcionar uma proporção de célulasefetuadoras:alvo de 25:1 e as lâminas são colocadas em uma incubadorasob atmosfera de 5% de CO2 a 37 0C durante 4 horas;
ix) o sobrenadante isento de células de cada cavidade é coleta-do e a radioatividade experimentalmente liberada (ER) é quantificada usan-do um contador gama;
χ) o percentual de Iise específica é calculado para cada concen-tração de anticorpo de acordo com a fórmula (ER-MR)/(MR-SR) χ 100, ondeER é a radioatividade média quantificada (vide ponto ix acima) para essaconcentração de anticorpo, MR é a radioatividade média quantificada (videponto ix acima) para os controles de MR (vide ponto ν acima) e SR é a ra-dioatividade média quantificada (vide ponto ix acima) para os controles deSR (vide ponto vi acima);
4) "ADCC aumentada" é definida como um aumento no percen-tual máximo de Iise específica observada dentro da faixa de concentração deanticorpo testada acima e/ou uma redução na concentração de anticorporequerida para obter metade do percentual máximo de Iise específica obser-vado dentro da faixa de concentração de anticorpo testada acima. O aumen-to na ADCC é com relação à ADCC, medida com o ensaio acima, mediadapelo mesmo anticorpo, produzida pelo mesmo tipo de células hospedeiras,usando os mesmos métodos padrões de produção, purificação, formulação earmazenamento, os quais são conhecidos por aqueles versados na técnica,mas que não foi produzida por células hospedeiras manipuladas para super-expressar GnTIII.
Molécula de Ligação a Antíqeno com Substituições de Aminoácido de Ca-deia Pesada e/ou Cadeia Leve
Em um aspecto, a presente invenção é dirigida à ABMs compre-endendo regiões V e/ou regiões C de cadeia pesada e/ou cadeia leve e àdescoberta de que a capacidade dessas ABMs de produzir atividade de si-nalização celular induzida de um antígeno-alvo e/ou mediar a reticulação deantígeno-alvo pode ser intensificada (isto é, induzida ou aumentada) ou re-duzida (isto é, inibida ou diminuída) através de tais modificações. Assim, apresente invenção proporciona polipeptídeos, incluindo ABMs, tendo regiõesV e/ou regiões C de cadeia pesada e/ou cadeia leve modificadas, seqüên-cias de ácido nucléico (por exemplo, vetores) que codificam tais polipeptí-deos, métodos para a geração de polipeptídeos tendo regiões V e/ou regiõesC de cadeia pesada e/ou cadeia leve modifiçadas e métodos para uso dosmesmos no tratamento de várias doenças e distúrbios.
Sabe-se que vários mecanismos estão envolvidos na eficáciaterapêutica de anticorpos, incluindo citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC), citotoxicidade complemento-dependente (CDC) e aindução de interrupção de crescimento ou apoptose e o bloqueio ou inibiçãode crescimento celular, proliferação celular, sobrevivência celular e/ou outroseventos celulares. Por pxemplo, casos de indução de morte celular e outroseventos de sinalização celular por anticorpos monocionais agonistas foramreportados. Cerisano e outros mostraram a indução de morte celular caspa-se-dependente caracterizada por características semelhantes à apoptose(incluindo exposição à fosfatidil-serina (PS), alterações morfológicas e/oucaptação de iodeto de propídio (PI)), bem como agregação homotípica decélulas de sarcoma de Ewing, através de estimulação com anticorpos ago-nistas contra a glicoproteína na transmembrana, CD99 (por exemplo, MAbanti-CD99013 e MAb 0662) (Cerisano e outros, Oncogene 23: 5664-5674(2003)). Da mesma forma, Hahn e outros reportaram a ativação de vias desinalização de MAPK através de encaixe de CD99 com anticorpos monoclo-nais anti-CD99 (por exemplo, DN16 e YG32), os quais levaram à agregaçãohomotípica de células (Hahn e outros, FEBS Letters 470: 350-354 (2000)).Pettersen e outros identificaram um novo domínio funcional de CD99 quepôde ser ativado pelo anticorpo monoclonal anti-CD99, Ad20, ativação aqual induziu à apoptose em células T transformadas (Pettersen e outros, J.Immunol. 166: 4931-4942 (2001)). Anticorpos monoclonais contra CD47 (porexemplo, B6H12) também podem induzir à morte celular caspase-dependente, a qual está associada às vias de sinalização de reorganizaçãocitoesquelética (Mateo e outros, Blood 100: 2882- 2890 (2002)). Cada umadas referências acima é incorporada aqui por referência em sua totalidade.
Em outros exemplos, foi mostrado que determinados anticorposcontra CD20 (por exemplo, rituximab e tositumomab) e CD52 (CAMPATH-1H) induzem diretamente à apoptose em células tumorígenas. Vide Ludwig eoutros, Oncogene 22: 9097-9106 (2003). Para o rituximab e vários outrosanticorpos monoclonais rsom pouca ou nenhuma atividade de sinalização(anti-CD19, CD21, CD22 e Her2), a capacidade de induzir à apoptose ouinterromper o crescimento foi intensificada através de conversão químicados anticorpos em homodímeros de IgG-IgG. Ghetie e outros, Proc. Natl.Acad. Sci 94: 7509-14 (1997). Foi especulado que a intensificação foi emvirtude de sinalização negativa aumentada e/ou hiper-cruzamento atravésdos homodímeros de anticorpo tetravalentes. Ghetie e outros, Proc. Natl.Acsgi. Sei. 94: 7509-14 (1997). Retículação e apoptose aumentada tambémforam obtidas através do uso de anticorpos secundários ou células acessó-rias trazendo receptor Fc. Vide Jazhirehi e Bonavida, Oncogene 24: 2121-43(2005). Cada uma das referências mencionadas acima é aqui incorporadapor referência em sua totalidade.
Sem desejar estar preso à teoria, os presentes inventores de-terminaram que modificações nos resíduos de aminoácido na região de do-bradiça de cotovelo de uma molécula de ligação a antígeno podem afetar acapacidade da ABM de induzir ou inibir a atividade de sinalização e/ou reti-culação de antígeno-alvo. O ângulo da região de dobradiça de cotovelo con-trola a orientação da região V com relação à região C de uma imunoglobuli-na e, como tal, facilita as interações de anticorpos com antígeno e proteínasefetuadoras. Vide Lesk e Chothia, Nature 335: 188-90 (1988). Lesk e Cho-thia identificaram os resíduos que compõem a união em esfera-e-soquetemolecular da região de dobradiça de cotovelo em anticorpos, isto é, posições11, 110 e 112 de Kabat na região VH e posições 149 e 150 na região CH1, enotaram o alto grau de conservação, através dos anticorpos, de resíduosque compõem essa união. Lesk e Chothia, Nature 335: 188-90 (1988) (aquiincorporados por referência em sua totalidade). Contudo, eles não fizerammodificações nos resíduos da esfera-e-soquete ou nos resíduos em sua pro-ximidade. Landolfi e outros mostraram que modificações nas posições 10-13de Kabat no AF2, um anticorpo de neutralização contra IFNy humano, resul-tou em uma perda significativa na atividade de neutralização do anticorpo,mas não afetou a ligação do anticorpo a seu antígeno-alvo. Landolfi e outros,J. Immunol. 166: 1748-54 (2001) (aqui incorporado por referência em suatotalidade). Contudo, Landolfi e outros não mostraram um efeito sobre a ca- í*pacidade de um anticorpo de induzir à sinalização celular ou mediar a reticu-lação a antígeno.
Com uma ABM multivalente, a capacidade de alterar a orienta-ção dos sítios de ligação a antígeno permite ajustar a proximidade de unida-des de antígeno ligadas quando elas estão em complexo com os múltiplossítios de ligação a antígeno. A proximidade das unidades antigênicas umascom as outras facilita maior ou menor interação (por exemplo, reticjjlação,dimerização, etc.) entre as unidades antigênicas. Por exemplo, se o ângulode cotovelo de cada par VH/VL-CH1/CL em uma ABM é orientado de modoque os sítios de ligação a antígeno são mantidos em proximidade íntima unscom os outros, as unidades antigênicas ligadas (por exemplo, moléculas dereceptor na superfície) também serão mantidas em proximidade íntima umascom as outras ou mantidas em uma conformação que é mais favorável parainteração. Essa proximidade ou alteração conformacional pode mediar inte-rações, por exemplo, reticulação e oligomerização, entre os antígenos liga-dos. Por outro lado, orientação dos sítios de ligação a antígeno de modo queeles estejam afastados ou tenham uma conformação menos favorável podeimpedir os mesmos de interagir.
Resíduos de aminoácido na interface VL-CL também podem sermodificados para afetar a orientação do sítio de ligação a antígeno. Por e-xemplo, os resíduos 40, 80, 83, 105 e 106 de Kabat nas frameworks de regi-ão variável de cadeia leve estão localizados na interface VL/CL.
A atividade de quaisquer mecanismos de sinalização celular po-de ser afetada (isto é, induzida ou inibida) pelas ABMs da presente inven-ção. Em um aspecto da invenção, os mecanismos de sinalização celular en-volvidos são aqueles iniciados através de proteínas de receptor na superfíciecelular, incluindo proteínas de receptor na superfície celular canal de íons-ligadas, proteína G-Iigadas e enzima-ligadas. Vide, de modo geral, Capítulo15: Cell Signaling em MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL, Alberts e ou-tros, eds., (3a ed. 1994) (incorporado aqui por referência). Assim, por exem-plo, as atividades de sinalização celular da presente invenção incluem, masnão estão limitadas a, aquelas as quais resultam em apoptose, diferenciaçãocelular, crescimento celular, proliferação celular e sobrevivência celular, bemcomo qualquer uma das etapas de sinalização ao longo da via. Em uma mo-dalidade, a atividade de sinalização celular ocorre através de um receptorenzima-ligado; em uma modalidade particular, o receptor enzima-ligado éuma quinase de tirosina de receptor. Em outra modalidade, a atividade desinalização celular é através de um receptor canal de íons-ligado.
As regiões V e/ou regiões C de cadeia pesada ou cadeia levemodificadas das ABMs da presente invenção diferem das regiões do poli-peptídeo precursor não modificado (por exemplo, uma molécula de ligação aantígeno precursora) por pelo menos uma substituição de aminoácido. Opolipeptídeo "precursor", "de iniciação" ou "não modificado" compreende, depreferência, pelo menos uma porção de uma cadeia pesada ou cadeia levede anticorpo e pode ser preparado usando métodos disponíveis na técnicapara a geração de polipeptídeos compreendendo uma região V de cadeiapesada ou região CH1 ou porção das mesmas e/ou uma cadeia leve C ouregião C ou porção da mesma. Em modalidades específicas, o polipeptídeoprecursor é uma molécula de ligação a antígeno e compreende pelo menosuma porção de uma região VH ou VL. Em determinadas modalidades, umaregião V de cadeia pesada e/ou de cadeia leve modificada pode ser gerada(por exemplo, de acordo com os métodos descritos aqui) e pode ser fundidaa um polipeptídeo heterólogo de escolha, tal como um anticorpo Fe. Em umamodalidade da presente invenção, uma ABM modificada ou fragmento damesma compreende uma proteína de fusão, em que uma região V de cadeiapesada modificada ou fragmento da mesma é fundida a uma região constan-te de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo em IgA, IgG, IgE, IgDe IgM ou um fragmento ou derivado da mesma. Em uma modalidade particu-lar, a região constante de cadeia pesada é IgG. Em outra modalidade dapresente invenção, uma ABM modificada ou fragmento da mesma compre-ende uma proteína de fusão, em que uma região V de cadeia leve modifica-da ou fragmento da mesma é usado para fundir a uma região constante decadeia leve selecionada do grupo consistindo em IgA, IgG, IgE, IgD e IgM ouum fragmento ou derivado da mesma. Em uma modalidade particular, a re-gião constante de cadeia leve é IgG. Em modalidades específicas, os poli-peptídeos da invenção compreendem um anticorpo inteiro (por exemplo,IgG) compreendendo cadeias leves e cadeias pesadas tendo uma região Vde cadeia pesada e/ou de cadeia leve modificada.
Polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo compreendendouma região V de cadeia pesada modificada ou região CH1 ou região V decadeia leve ou região CL podens ser preparados através de métodos conhe-cidos na técnica usando a orientação do presente relatório descritivo paraseqüências particulares. Esses métodos incluem, mas não estão limitados a,preparação, através de mutagênese sítio-dirigida (ou oligonucleotídeo-mediada), mutagênese por PCR e mutagênese por cassete, de um ácidonucléico previamente preparado que codifica o polipeptídeo. Mutagênesesítio-dirigida é um método preferido para preparação de variantes com subs-tituição. Esse método é bem-conhecido na técnica (vide, por exemplo, Cartere outros, Nucleic Acids Res. 13: 4431-4443 (1985) e Kunkel e outros, Proc.Natl. Acad. Sci USA 82: 488 (1987), ambos os quais são aqui incorporadospor referência). Resumidamente, na realização de mutagênese sítio-dirigidade DNA, o DNA de iniciação é alterado primeiro através de hibridização deum oligonucleotídeo que codifica a mutação desejada em um único filamentode tal DNA de iniciação. Após hibridização, uma DNA polimerase é usadapara sintetizar uma segunda filamento inteira, usando o oligonucleotídeo hi-bridizado como um iniciador e usando o único filamento do DNA de iniciaçãocomo um modelo. Assim, o oligonucleotídeo que codifica a mutação deseja-da é incorporado no DNA do filamento duplo resultante.
Mutagênese por PCR é também adequada para fazer variantesde seqüência de aminoácido do polipeptídeo de iniciação não modificado(vide, por exemplo, Vallette e outros, Nue. Aeids Res. 17: 723-733 (1989),incorporado aqui por referência). Resumidamente, quando pequenas quanti-dades do DNA modelo são usadas como material de iniciação em uma PCR,iniciadores que diferem ligeiramente quanto à seqüência da região corres-pondente em um DNA modelo podem ser usados para gerar quantidadesrelativamente grandes de um fragmento de DNA-específico que difere daseqüência do modelo apenas nas posições onde os iniciadores diferem domodelo.
Outro método para a preparação de variantes de ABM, mutagê-nese por cassete, é baseado na técnica descrita por Wells e outros, Gene34: 315-323 (1985), incorporado aqui por referência. O material de iniciaçãoé o plasmídeo (ou outro vetor) compreendendo o DNA de polipeptídeo deiniciação a ser/nodifiçado. O(s) códon(s) no DNA de iniciação a sofrer muta-ção é(são) identificado(s). Deve haver um único sítio de endonuclease derestrição sobre cada lado do(s) sítio(s) de mutação identificado(s). Se ne-nhum de tais sítios de restrição existe, eles podem ser gerados usando ométodo de mutagênese oligonucleotídeo-mediada descrito acima para intro-duzir os mesmos em locais apropriados no DNA do polipeptídeo de inicia-ção. O DNA de plasmídeo é cortado nesses sítios para linearizá-lo. Um oli-gonucleotídeo de filamento duplo que codifica a seqüência do DNA entre ossítios de restrição, mas contendo a(s) mutação(ões) desejada(s) é sintetiza-do usando procedimentos padrões, em que os dois filamentos do oligonu-cleotídeo são sintetizados separadamente e, então, hibridizados juntos u-sando técnicas padrões. Esse oligonucleotídeo de filamento duplo é referidocomo o cassete. Esse cassete é projetado para ter extremidades 5' e 3' quesão compatíveis com as extremidades do plasmídeo linearizado, de modoque ele pode ser diretamente ligado ao plasmídeo. Esse plasmídeo agoracontém a seqüência de DNA com mutação.
Alternativa ou adicionalmente, a seqüência de aminoácido dese-jada que codifica uma variante polipeptídica pode ser determinada e umaseqüência de ácido nucléico que codifica tal variante de seqüência de ami-noácido pode ser gerada sinteticamente.
A seqüência de aminoácido do polipeptídeo precursor pode sermodificada para gerar uma ABM tendo uma região V de cadeia pesada mo-dificada e/ou região CH1 modificada e/ou uma região V de cadeia leve modi-ficada e/ou região GL modificada, com capacidade alterada de induzir à ati-vidade de sinalização celular de um antígeno-alvo quando a ABM modificadaestá em complexo com (por exemplo, ligada a) o antígeno-alvo. A atividadede sinalização celular pode ser atividade agonista ou atividade antagonista.De acordo com um aspecto da invenção, atividade agonista é induzida poruma molécula de ligação a antígeno-modificada quando ela se liga a um re-ceptor membrana celular-associado e inicia uma via de sinalização celular.Em uma modalidade específica, a via de sinalização celular é uma via deapoptose. Em outra modalidade, a via de sinalização celular é uma via dediferenciação celular. De acòrdo com outro aspecto da invenção,'atividadeantagonista por uma molécula de ligação a antígeno-modificada ocorre, porexemplo, quando a ABM se liga a um receptor membrana celular-associadoe impede a indução de uma via de sinalização celular ou rompe um sinal emandamento. Atividade antagonista pode ser obtida, por exemplo, através debloqueio da ligação e subseqüente transdução de sinal de um Iigante endó-geno e/ou impedindo a reticulação ou oligomerização de receptores ou ou-tras moléculas que seriam necessárias para a indução de uma via de sinali-zação celular. Em uma modalidade, a via de sinalização celular que é inibidaou rompida é uma via de crescimento celular. Em outra modalidade, a via desinalização celular que é inibida ou rompida é uma via de divisão celular. Emoutra modalidade, a via de sinalização celular que é inibida ou rompida éuma via de sobrevivência celular.
Da mesma forma, a seqüência de aminoácido do polipeptídeoprecursor pode também ser modificada para gerar uma ABM tendo uma re-gião V de cadeia pesada modificada ou região C modificada (por exemplo,uma região CH1 modificada) e/ou uma região V de cadeia leve modificadae/ou região CL modificada, com capacidade alterada de mediar a reticulaçãode um ou mais antígenos-alvo quando a ABM modificada está em complexocom (por exemplo, ligada a) o(s) antígeno(s) alvo. Em uma modalidade, osantígenos-alvo ligados (por exemplo, moléculas de receptor na superfíciecelular) são mantidos em proximidade íntima uns com os outros e/ou umaconformação mais favorável para interação do que eles estariam pela ABMprecursora não modificada correspondente, desse modo, aumentando a reti-culação e oligomerização entre os antígenos. Em outra modalidade, os antí-genos-alvo ligados (por exemplo, moléculas de receptor na superfície celu-lar) são mantidos afastados uns dos outros e/ou em uma conformação me-nos favorável para interação do que eles estariam pela ABM precursora nãomodificada correspondente, desse modo, reduzindo ou impedindo a reticula-ção e oligomerização entre os antígenos ligados. Em uma modalidade parti-cular, a reticulação ou oligomerização aumentada resulta em apoptose au-mentada. Em outra modalidade, a reticulação ou oligomerização aumentadaresulta em diferenciação celular aumentada. Em outra modalidade, a redu-ção na reticulação ou oligomerização resulta em crescimento celular diminu-ído, divisão celular diminuída ou sobrevivência celular diminuída.
Modificações substanciais nas propriedades biológicas da regiãoV de cadeia pesada ou região CH1 ou na região V de cadeia leve ou regiãoCL podem ser realizadas selecionando substituições que diferem significati-vamente quanto a seu efeito sobre a manutenção de (a) a estrutura da parteprincipal do polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como umaconformação em folha ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molé-cula no sítio alvo ou (c) o volume da cadeia lateral. Resíduos que ocorremnaturalmente estão divididos em classes baseado em propriedades em co-mum da cadeia lateral:
(1) hidrofóbicos: met, ala, vai, leu, ile;
(2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr;
(3) ácidos: asp, glu;
(4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;
(5) resíduos que influenciam a orientação de cadeia: gly, pro; e
(6) aromáticos: trp, tyr, phe.
Substituições não conservativas requererão troca de um mem-bro de uma dessas classes por um membro de outra classe. Substituiçõesconservativas requererão troca de um membro de uma dessas classes poroutro membro da mesma classe.
Polipeptídeos Exemplificativos Compreendendo ABMs ModificadasEm um aspecto, a presente invenção é relacionada à moléculasde ligação a antígeno com modificações de aminoácido que alteram a capa-cidade das ABMs de induzir à atividade de sinalização celular e/ou mediar areticulação de antígenos. Em uma modalidade, a modificação da ABM com-preende pelo menos uma substituição de resíduo de aminoácido em pelomenos uma região de "framework" da região variável de cadeia pesada oude cadeia leve quando comparado com uma molécula precursora. Em umamodalidade particular, a substituição substitui um resíduo de aminoácido naFR1 de cadeia pesada. Em uma modalidade preferida, a modificação naABM compreende uma substituição de um resíduo de aminoácido em umaou mais das posições 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 de Kabat na região variável decadeia pesada. Em outra modalidade, a modificação na ABM compreendeuma substituição de um resíduo de aminoácido na FR4 de cadeia pesada.Em uma modalidade particular, a modificação na ABM compreende umasubstituição de um resíduo de aminoácido em uma ou mais das posições110 ou 112 de Kabat na região variável de cadeia pesada. Em outra modali-dade, a modificação na ABM compreende pelo menos uma substituição deresíduo de aminoácido na cadeia leve na interface entre as regiões V e C.
Em uma modalidade mais particular, a modificação na ABM compreendeuma substituição de um resíduo de aminoácido em uma ou mais das posi-ções 40, 80, 83, 105 ou 106 de Kabat.
Em uma modalidade, um aminoácido pode ser substituído atra-vés de geração de uma mutação de ponto na seqüência precursora que re-sulta na alteração desejada no(s) resíduo(s) de aminoácido. Alternativamen-te, a modificação na ABM pode compreender substituição de uma região de"framework" inteira de uma molécula precursora por uma região de "frame-work" que compreende um resíduo de aminoácido desejado em uma posi-ção em particular. Em uma modalidade particular, a modificação na ABMcompreende substituição da FR1 de uma molécula precursora pela FR1 co-dificada pela seqüência de um gene variável de linhagem germinativa.
Em outra modalidade da invenção, a ABM compreende pelomenos uma região CH1 e modificação da ABM compreende pelo menosuma substituição de resíduo de aminoácido quando comparado com um po-lipeptídeo precursor. Em uma modalidade em particular, a modificação daABM compreende substituição de um ou mais resíduos de aminoácido nasposições 148, 149 e/ou 150 na região variável de cadeia pesada.
Em outro aspecto, a invenção é dirigida à moléculas de ligação aantígeno-modificadas compreendendo uma ou mais CDRs truncadas deuma molécula de ligação a antígeno precursora. Tais CDRs truncadas conte-rão, no mínimo, os resíduos de aminoácido de determinação de especifici-dade para a dada CDR. Por "resíduo de determinação de especificidade"entenda-se aqueles resíduos que estão diretamente envolvidos na interaçãocom o antígeno. Em geral, apenas cerca de um quinto a um terço dos resí-duos em uma dada CDR participam da ligação a antígeno. Os resíduos dedeterminação de especificidade em uma CDR em particular podem ser iden-tificados, por exemplo, através de computação de contatos interatômicos apartir de modelamento tridimensional e determinação da variabilidade deseqüência em uma dada posição de resíduo de acordo com os métodosdescritos em Padlan e outros, FASEB J. 9(1): 133-139 (1995), os conteúdosdo qual são aqui incorporados por referência em sua totalidade.
Conseqüentemente, a invenção é também dirigida a um polinu-cleotídeo isolado compreendendo pelo menos uma região de determinaçãode complementaridade de uma molécula precursora ou uma variante ou for-ma truncada da mesma contendo pelo menos os resíduos de determinaçãode especificidade para a referida região de determinação de complementari-dade, em que o referido polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo defusão. De preferência, tais polinucleotídeos isolados codificam um polipeptí-deo de fusão que é uma molécula de ligação a antígeno-modificada. Emuma modalidade, o polinucleotídeo compreende três regiões de determina-ção de complementaridade da molécula precursora ou variantes ou formastruncadas das mesmas contendo pelo menos os resíduos de determinaçãode especificidade para cada uma das referidas três regiões de determinaçãode complementaridade. Em outra modalidade, o polinucleotídeo codifica aregião variável inteira da cadeia leve ou cadeia pesada de um anticorpoquimérico (por exemplo, humanizado). A invenção é ainda dirigida a polipep-tídeos codificados por tais polinucleotídeos.
Em outra modalidade, a invenção é dirigida a uma molécula deligação a antígeno-modificada compreendendo pelo menos uma região dedeterminação de complementaridade de uma molécula precursora ou umavariante ou forma truncada da mesma contendo pelo menos os resíduos dedeterminação de especificidade para a referida região de determinação decomplementaridade e compreendendo uma seqüência derivada de um poli-peptídeo heterólogo. Em uma modalidade, a molécula de ligação a antígeno-modificada compreende três regiões de determinação de complementarida-de da molécula precursora ou variantes ou formas truncadas das mesmascontendo pelo menos os resíduos de determinação de especificidade paracada uma das referidas três regiões de determinação de complementarida-de. Em outro aspecto, a molécula de ligação a antígeno-modificada compre-ende a região variável de uma cadeia leve ou pesada de anticorpo. Em umamodalidade particularmente útil, a molécula de ligação a antígeno é um anti-corpo quimérico, por exemplo, humanizado. A invenção é também dirigida amétodos de fabricação de tais moléculas de ligação a antígeno-modificadase ao uso das mesmas no tratamento de uma doença, incluindo distúrbios deproliferação celular.
Sabe-se que vários mecanismos estão envolvidos na eficáciaterapêutica de anticorpos, incluindo citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC), citotoxicidade complemento-dependente (CDC) e indu-ção de interrupção de crescimento, diferenciação celular ou apoptose.
A presente invenção é dirigida à ABMs modificadas que têm ca-pacidade aumentada de induzir à apoptose comparado com a ABM precur-sora não modificada correspondente. Por exemplo, uma ABM precursoraque tem pouca ou nenhuma capacidade de induzir à apoptose pode ser mo-dificada de acordo com a presente invenção para gerar uma ABM modifica-da que tem a capacidade de induzir à apoptose ou que tem a capacidadeaumentada de induzir à apoptose. A presente invenção é também dirigida àABMs modificadas que têm capacidade aumentada de induzir à interrupçãode crescimento ou diferenciação celular quando comparada com a ABM pre-cursora não modificada correspondente. Por exemplo, uma ABM precursoraque tem pouca ou nenhuma capacidade de induzir à interrupção de cresci-mento ou diferenciação celular pode ser modificada de acordo com a pre-sente invenção para gerar uma ABM modificada que tem a capacidade deinduzir à interrupção de crescimento ou diferenciação ou que tem uma capa-cidade aumentada de induzir à interrupção de crescimento ou diferenciação.
Com relação a anticorpos anti-CD20 em particular, por exemplo,a maioria da evidência experimental indica que o rituximab opera através demecanismos efetuadores convencionais medidos através de ensaios deCDC e ADCC. Similarmente, foi mostrado que a resistência de diferentescélulas de Iinfoma ao rituximab in vivo é uma função de sua sensibilidade àCDC in vitro. Em contraste, o modo de ação in vivo de outro anticorpo anti-CD20 que foi aprovado para uso terapêutico, B1, não requer atividade decomplemento nem de células assassinas naturais (NK). Antes, a eficácia doB1 in vivo é em virtude de sua capacidade de induzir à apoptose potente.Em geral, anticorpos monoclonais anti-CD20 caem em duas categorias dis-tintas, baseado em seu mecanismo de ação na erradicação de células delinfoma. Anticorpos anti-CD20 do tipo I utilizam primariamente a complemen-to para matar as células-alvo, enquanto que anticorpos do tipo Il operam a-través de mecanismos diferentes, primariamente apoptose. Rituximab e 1F5são exemplos de anticorpos anti-CD20 do tipo I, enquanto que B1 é um e-xemplo de um anticorpo do tipo II. Vide, por exemplo, Cragg, M S. e Glennie,M.J., Blood 103(7): 2738-2743 (Abril de 2004); Teeling, J.L. e outros, Blood104(6): 1793-1800 (Setembro de 2004), os conteúdos todos dos quais sãoaqui incorporados por referência.
O Pedido de Patente U.S. Publicado No. 2005/0123546 paraUmafia e outros (o qual é aqui incorporado por referência em sua totalidade)descreve o primeiro caso conhecido no qual um anticorpo anti-CD20 do tipo Ifoi manipulado para ter funções efetuadoras aumentadas, tal como ADCC, egerar capacidade potente de apoptose, alterando eficazmente o anticorpoanti-CD20 do tipo I em um anticorpo anti-CD20 do tipo II. Em uma modalida-de, a presente invenção é dirigida a um anticorpo anti-CD20 modificadocompreendendo uma substituição em uma região variável de cadeia pesadaou de cadeia leve comparado com um anticorpo anti-CD20 precursor do tipoI, em que as substituições resultam em uma indução aumentada de apopto-se pelo anticorpo anti-CD20 modificado. Em outra modalidade, a presenteinvenção é dirigida a anticorpos anti-CD20 do tipo Il manipulados tendoADCC aumentada como um resultado de manipulação para função efetua-dora aumentada e sem perda de capacidade substancial de induzir à apop-tose. Em uma modalidade, os anticorpos anti-CD20 do tipo Il compreendemuma substituição em um ou mais aminoácidos na região variável de cadeiapesada ou de cadeia leve comparado com uma molécula precursora. Emoutra modalidade, os anticorpos anti-CD20 do tipo I e/ou do tipo Il foram ma-nipulados para ter um padrão alterado de glicosilação na região Fe. Em umamodalidade particular, a glicosilação alterada da ABM modificada compreen-de um nível aumentado de resíduos de complexo bisseccionado na regiãoFe. Em outra modalidade particular, a glicosilação alterada da ABM modifi-cada compreende um nível reduzido de resíduos de fucose na região Fc.Vide Pub. de Pedido de Patente U.S. No.20040093621 para Shitara e ou-tros, os conteúdos todos da qual são incorporados por referência. Em outramodalidade, os anticorpos anti-CD20 do tipo I e/ou do tipo Il sofreram mani-pulação de polipeptídeo, conforme ensinado na Pat. U.S. No. 6.737.056 paraPresta ou Pub. de Pedido de Patente U.S. No. 2004 0185045 (Macrogenics)ou Pub. de Pedido de Patente U.S. No. 2004 0132101 (Xencor), os conteisdos todos das quais são aqui incorporados por referência. A invenção é ain-da dirigida a métodos de fabricação de tais anticorpos do tipo I ou do tipo Ilmanipulados e a métodos de uso de tais anticorpos no tratamento de váriosdistúrbios de células B, incluindo Iinfomas de células B.ABMs Quiméricas e Humanizadas Modificadas
Anticorpos de camundongo/humanos quiméricos foram descri-tos. Vide, por exemplo, Morrison, S. L. e outros, PNAS 11: 6851-6854 (No-vembro de 1984); Publicação de Patente Européia No. 173494; Boulianna,G. L. e outros, Nature 312: 642 (Dezembro de 1984); Neubeiger, M. S. e ou-tros, Nature 314: 268 (Março de 1985); Publicação de Patente Européia No.125023; Tan e outros, J Immunol. 135: 8564 (Novembro de 1985); Sun, L Ke outros, Hybridoma 5(1): 517 (1986); Sahagan e outros, J. Immunol. 137:1066- 1074 (1986). Vide, de modo geral, Muron, Nature 312: 597 (Dezembrode 1984); Dickson, Genetic Engineering News 5(3) (Março de 1985); Marx,Science 229: 455 (Agosto de 1985); e Morrison, Science 229: 1202-1207(Setembro de 1985). Robinson e outros, na Publicação PCT NúmeroWO/88104936 descrevem um anticorpo quimérico com uma região constan-te humana e uma região variável de murino, tendo especificidade por umepítopo de CD20; a porção de murino do anticorpo quimérico das referênciasde Robinson é derivada do anticorpo monoclonal de camundongo 2H7 (ga-ma 2b, kapa). Embora a referência mencione que o anticorpo quimérico de-sejado é um "candidato a prime" para o tratamento de distúrbios de célulasB, essa afirmação pode ser encarada como não mais do que uma sugestãopor aqueles versados na técnica para determinar se essa sugestão é precisaou não para esse anticorpo em particular, particularmente porque a referên-cia carece de quaisquer dados para sustentar uma afirmativa de eficácia te-rapêutica e, de modo importante, dados usando mamíferos de ordem supe-rior, tais como primatas ou seres humanos.
Metodologias para a geração de anticorpos quiméricos estãodisponíveis para aqueles versados na técnica. Por exemplo, as cadeias levee pesada podem ser expressas separadamente usando, por exemplo, a ca-deia leve de imunoglobulina e cadeias pesadas de imunoglobulina em plas-mídeos separados ou sobre um único vetor (por exemplo, policistrônico).Essas podem ser purificadas e montadas in vitro em anticorpos completos;metodologias para realizar tal montagem foram descritas. Vide, por exemplo,Scharff, M., Harvey Lectures 69: 125 (1974). Parâmetros de reação in vitropara a formação de anticorpos de IgG a partir de cadeias leves e pesadasisoladas também foram descritos. Vide, por exemplo, Sears e outros, Bio-chem. 16(9): 2016-25 (1977).
Em uma modalidade particularmente preferida, a ABM quiméricada presente invenção é um anticorpo humanizado. Métodos para humaniza-ção de anticorpos não-humanos são conhecidos na técnica. Por exemplo,ABMs humanizadas da presente invenção podem ser preparadas de acordocom os métodos da Pat. U.S. No. 5.225.539 para Winter, Pat. U.S. No.6.180.370 para Queen e outros ou Pat. U.S. No. 6.632.927 para Adair e ou-tros, Pub. de Pedido de Pat. U.S. No. 2003/0039649 para Foote; Pub. dePedido de Pat. U.S. No. 2004/0044187 para Sato e outros; ou Pub. de Pedi-do de Pat. U.S. No. 2005/0033028 para Leung e outros, os conteúdos todosde cada uma das quais são aqui incorporados por referência. De preferên-cia, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácido in-traduzidos a partir de uma fonte a qual é não-humana. Esses resíduos deaminoácido não-humanos são freqüentemente referidos como resíduos "im-portados", os quais são, tipicamente, tomados de um domínio variação de"importação". Humanização pode ser realizada essencialmente seguindo ométodo de Winter e outros (Jones e outros, Nature, 321: 522-525 (1986);Riechmann e outros, Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen e outros, Sci-ence, 239: 1534-1536 (1988)), através de substituição de seqüências de re-gião hiper-variável pelas seqüências correspondentes de um anticorpo hu-mano. Conseqüentemente, tais anticorpos "humanizados" são anticorposquiméricos (Pat. U.S. No. 4.816.567) em que substancialmente menos doque um domínio variável humano intacto foi substituído pela seqüência cor-respondente de uma espécie não-humana. Na prática, anticorpos humaniza-dos são, tipicamente, anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de re-gião hiper-variável e possivelmente alguns resíduos de Fr são substituídospor resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores. Os anticorposanti-CD20 humanizados em questão compreenderão regiões constantes deimunoglobulina humana.
A escolha de domínios variáveis humanos, leves e pesados, aserem usados na fabricação dos anticorpos humanizados é de muita impor-tância para reduzir a antigenicidade. De acordo com o assim denominadométodo de "melhor adaptação", a seqüência do domínio variável de um anti-corpo de roedor é selecionada contra a biblioteca inteira de seqüências dedomínio variável humana conhecidas. A seqüência humana a qual está maispróxima daquela do roedor é, então, aceita como a região de "framework"humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims e outros, J. Immunol, 151:2296 (1993); Chothia e outros , J Moi Biol, 196: 901 (1987)). Outro métodode seleção da seqüência de "framework" humana é comparar a seqüênciade cada sub-região individual da "framework" inteira de roedor (isto é, FR1 ,FR2, FR3 e FR4) ou alguma combinação das sub-regiões individuais (porexemplo, FR1 e FR2) contra uma biblioteca de seqüências de região variávelhumana conhecidas que correspondem à sub-região de "framework" huma-na (por exemplo, conforme determinado pela numeração de Kabat) e esco-lher a seqüência humana para cada sub-região ou combinação que é maispróxima daquela do roedor (Leung, Publicação de Pedido de Patente U.S.No. 2003/0040606A1, publicada em 27 de Fevereiro de 2003). Outro métodousa uma região de "framework" em particular derivada da seqüência de con-senso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo em particular decadeias leves ou pesadas. A mesma "framework" pode ser usada para vá-rios anticorpos humanizados diferentes (Carter e outros, Proc. Natl. Acad.Sci USA, 89: 4285 (1992); Presta e outros, J Immunol., 151: 2623 (1993), osconteúdos todos de cada um dos quais são aqui incorporados por referênciaem suas totalidades).
É ainda importante que os anticorpos sejam humanizados comretenção da alta afinidade pelo antígeno e outras propriedades biológicasfavoráveis. Para obter esse objetivo, de acordo com um método preferido,anticorpos humanizados são preparados através de um processo de análisedas seqüências precursoras e vários produtos humanizados conceituais u-sando os modelos tridimensionais das seqüências precursoras e humaniza-das. Modelos tridimensionais de imunoglobulina podem ser gerados usandoprogramas de computador familiares para aqueles versados na técnica (porexemplo, exemplo lnsightl, Accelrys Inc. (anteriormente MSI) ou emhttp://swissmodel.expasv.org/ descrito por Schwede e outros, Nucleic AcidsRes. 2003 (13): 3381-3385). Inspeção desses modelos permite análise doprovável papel dos resíduos no funcionamento da seqüência de imunoglobu-lina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade daimunoglobulina candidata de se ligar a seu antígeno. Dessa forma, resíduosde FR podem ser selecionados e combinados a partir do recipiente e se-qüências de importação, de modo que a característica desejada do anticor-po, tal como manter afinidade pelo(s) antígeno(s) alvo, é obtida. Em geral, osresíduos da região hiper-variável estão direta e mais substancialmente en-volvidos na influência da ligação a antígeno.
Em outra modalidade, as moléculas de ligação a antígeno dapresente invenção são manipuladas para ter afinidade de ligação intensifica-da, por exemplo, de acordo com os métodos descritos na Pub. de Pedido dePatente U.S. No. 2004/0132066 para Balint e outros, os conteúdos todos daqual são aqui incorporados por referência.
Em uma modalidade preferida, a presente invenção é dirigida aum polinucleotídeo isolado compreendendo uma seqüência que codifica umpolipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido conforme mostrado nasTabelas 3 e/ou 5 abaixo. A invenção é ainda dirigida a um ácido nucléicoisolado compreendendo uma seqüência pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%,96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma seqüência de nucleotídeo mostradanas Tabelas 2 e/ou 4 abaixo. Em outra modalidade, a invenção é dirigida aum ácido nucléico isolado compreendendo uma seqüência que codifica umpolipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido pelo menos 80%, 85%,90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma seqüência de aminoáci-do nas Tabelas 3 e/ou 5 abaixo. A invenção também abrange um ácido nu-cléico isolado compreendendo uma seqüência que codifica um polipeptídeotendo a seqüência de aminoácido de qualquer uma das estruturas nas Tabe-las 3 e/ou 5, com substituições conservativas de aminoácido. Em determina-das modalidades, qualquer um dos polinucleotídeos ou polipeptídeos dasTabelas 2-5 pode ser excluído. Portanto, por exemplo, em determinadasmodalidades, a ABM modificada e/ou o polinucleotídeo que codifica a ABMmodificada não compreende qualquer ou todas de SEQ ID NO: 3, SEQ IDNO: 4, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 38.Em outro exemplo, em determinadas modalidades, a ABM modificada dapresente invenção não compreende qualquer ou todas de SEQ ID NOs: 55-62.
Em outra modalidade, a presente invenção é dirigida a um poli-peptídeo isolado compreendendo uma seqüência de aminoácido conformemostrado nas Tabelas 3 e/ou 5 abaixo. A invenção é ainda dirigida a Um po-lipeptídeo isolado compreendendo uma seqüência codificada por uma se-qüência de nucleotídeo mostrada nas Tabelas 2 e/ou 4 abaixo. Em outramodalidade, a invenção é dirigida a um polipeptídeo isolado compreendendouma seqüência de aminoácido pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%,97%, 98% ou 99% idêntica a uma seqüência de aminoácido nas Tabelas 3e/ou 5 abaixo. A invenção também abrange um polipeptídeo isolado com-preendendo uma seqüência de aminoácido de qualquer uma das estruturasnas Tabelas 3 e/ou 5, com substituições conservativas de aminoácido. Emdeterminadas modalidades, qualquer um dos polinucleotídeos ou polipeptí-deos das Tabelas 2-5 pode ser excluído. Portanto, por exemplo, em deter-minadas modalidades, o polipeptídeo não compreende uma seqüência deaminoácido correspondendo a ou codificada por qualquer ou todas de SEQID NO: 3, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO: 35, SEQ ID N0.36, SEQ ID NO: 37 ouSEQ ID NO: 38. Em outro exemplo, em determinadas modalidades, a ABMmodificada da presente invenção não compreende qualquer ou todas deSEQ ID N-: 55-62.
Tabela 2
<table>table see original document page 63</column></row><table><table>table see original document page 64</column></row><table><table>table see original document page 65</column></row><table><table>table see original document page 66</column></row><table><table>table see original document page 67</column></row><table><table>table see original document page 68</column></row><table><table>table see original document page 69</column></row><table><table>table see original document page 70</column></row><table>
Tabela 3
<table>table see original document page 70</column></row><table><table>table see original document page 71</column></row><table><table>table see original document page 72</column></row><table><table>table see original document page 73</column></row><table><table>table see original document page 74</column></row><table>
Em outra modalidade particular, a presente invenção é dirigida aum polinucleotídeo isolado compreendendo uma seqüência que codifica umpolipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido derivada de uma seqüên-cia precursora mostrada na figura 1 e Tabela 6 e compreendendo pelo me-nos uma substituição de aminoácido em pelo menos uma região de FR decadeia pesada. Em outra modalidade, a presente invenção é dirigida a umpolipeptídeo isolado compreendendo uma seqüência de aminoácido deriva-da de uma seqüência precursora mostrada na figura 1 e Tabela 6 e compre-endendo pelo menos uma substituição de aminoácido em pelo menos umaregião FR de cadeia pesada.
Tabela 6
<table>table see original document page 75</column></row><table><table>table see original document page 76</column></row><table>
Em um aspecto, as ABMs modificadas da presente invençãopodem compreender uma substituição de uma região de "framework" inteiracomparado com a ABM precursora. Assim, por exemplo, a presente inven-ção é ainda dirigida a um polinucleotídeo isolado compreendendo uma se-qüência que codifica um polipeptídeo tendo pelo menos uma FR de cadeiapesada derivada de uma seqüência VH de linhagem germinativa humana.Em uma modalidade preferida, a seqüência de linhagem germinativa VHhumana na região FR1 ou nas posições 8-13 de Kabat é derivada de qual-quer uma das seqüências identificadas na Tabela 7 abaixo. Essas seqüên-cias estão disponíveis do banco de dados IMGT(http://imgt.cines.fr:8104/textes/ IMGTrepertoire) e cada seqüência conformeidentificado por seu número de acesso é expressamente incorporada aquipor referência em sua totalidade.
Tabela 7
<table>table see original document page 76</column></row><table><table>table see original document page 77</column></row><table>
Em outra modalidade, a presente invenção é dirigida a um poli-nucleotídeo isolado compreendendo uma seqüência que codifica um poli-peptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido nas posições 8 a13 de Kabat da região variável de cadeia pesada ou qualquer subconjuntodas mesmas (por exemplo, posições 9 a 12, posições 10-12, etc.) de acordocom qualquer uma das seqüências apresentadas na Tabela 8 abaixo. Emoutra modalidade, a presente invenção é dirigida a um polinucleotídeo isola-do compreendendo uma seqüência de aminoácido nas posições 8 a 13 deKabat ou qualquer subconjunto das mesmas (por exemplo, posições 9 a 12,10 a 12, etc.) de acordo com qualquer uma das seqüências apresentadas naTabela 8 abaixo.
Tabela 8
<table>table see original document page 77</column></row><table><table>table see original document page 78</column></row><table>
Em outra modalidade, a presente invenção é dirigida a um poli-nucleotídeo isolado compreendendo uma seqüência que codifica um poli-peptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido nas posições 108 a113 de Kabat da região variável de cadeia pesada ou qualquer subconjuntodas mesmas (por exemplo, posições 110 a 112, posições 110 e 112, etc.).
Em uma modalidade particular, a seqüência nas posições 108 a 113 é mos-trada na Tabela 9 abaixo. Em outra modalidade, a presente invenção é diri-gida a um polipeptídeo isolado compreendendo uma seqüência de aminoá-cido nas posições 108 a 113 de Kabat ou qualquer subconjunto das mesmas(por exemplo, posições 110 a 112, posições 110 e 112, etc.) de acordo comqualquer uma das seqüências apresentadas na Tabela 9 abaixo.<table>table see original document page 79</column></row><table>
Em outra modalidade, a presente invenção é dirigida a um vetorde expressão e/ou uma céiala hospedeira a qual compreende um ou maispolinucleotídeos isolados da presente invenção.
Geralmente, qualquer tipo de linhagem de célula cultivada podeser usada para expressar as ABMs da presente invenção. Em uma modali-dade preferida, células CHO, células BHK, células HEK293-EBNA, célulasNSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de camun-dongo P3X63, células PER, células PER.C6 e células de hibridoma, célulasde levedo, células de inseto ou células de planta são usadas como a linha-gem de célula de base para gerar as células hospedeiras manipuladas dainvenção.
ABMs Modificadas Ainda Compreendendo Regiões Fc e Variantes de Regi-ão Fc
Em uma modalidade, as ABMs da presente invenção compreen-dendo uma ou mais substituições de aminoácido nas regiões V e/ou CH1 decadeia pesada e/ou nas regiões V e/ou C de cadeia leve podem ainda com-preender uma região Fc humana. Em uma modalidade específica, a regiãoconstante humana é IgGI, conforme apresentado em SEQ ID NOs: 80 e 81e apresentado abaixo:
Seqüência de nucleotídeo de IgGI (SEQ ID NO: 80)ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTG AACTCCTG GGG G G ACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCC AAAACCC AAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAG£CCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGASeqüência de aminoácido de IgGI (SEQ ID NO: 81)TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Contudo, variantes e isoformas da região Fc humana tambémsão abrangidas pela presente invenção. Por exemplo, regiões Fc variantesadequadas para uso na presente invenção podem ser produzidas de acordocom os métodos ensinados na Pat. U.S. No. 6.737.056 para Presta (varian-tes de região Fc com função efetuadora alterada em virtude de uma ou maismodificações de aminoácido); ou nos Pedidos de Pat. U.S. Nos. 60/439.498;60/456.041; 60/514.549; ou WO 2004/063351 (regiões Fc variantes com afi-nidade de ligação aumentada em virtude de modificação de aminoácido); ouno Pedido de Pat. U.S. No. 10/672.280 ou WO 2004/099249 (variantes de Fccom ligação alterada ao FcyR em virtude de modificação de aminoácido), osconteúdos de cada um dos quais são incorporados aqui por referência emsua totalidade.
Em outro aspecto da invenção, as ABMs compreendendo umaou mais substituições de aminoácido nas regiões V e/ou CH1 de cadeia pe-sada e/ou nas regiões V e/ou C de cadeia leve podem ainda compreenderuma variante de região Fc. Pode-se manipular uma região Fc para produziruma variante com afinidade de ligação alterada por um ou mais FcRs. Pode-se, por exemplo, modificar um ou mais resíduos de aminoácido da região Fcde forma a alterar (por exemplo, aumentar ou diminuir) a ligação a um FcR,conforme descrito no Pedido de Pat. Provisório No. 60/678.776, aqui incor-porado por referência em sua totalidade. Geralmente, se fará uma substitui-ção de aminoácido em um ou mais dos resíduos da região Fc identificadoscomo afetando a ligação ao FcR de forma a gerar tal variante de região Fe.Em modalidades preferidas, não mais do que cerca de dez resíduos da regi-ão Fc serão deletados ou substituídos. As regiões Fc aqui compreendendouma ou mais modificações de aminoácido (por exemplo, substituições) rete-râo, de preferência, pelo menos cerca de 80% e de preferência pelo menoscerca de 90% e, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 95% da se-qüência de região Fc precursora ou de uma região Fc humana de seqüêncianativa.
Pode-se também fazer regiões Fc modificadas por inserção deaminoácido, variantes as quais têm função efetuadora alterada. Por exem-plo, pode-se introduzir pelo menos um resíduo de aminoácido (por exemplo,um a dois resíduos de aminoácido e geralmente não mais do que dez resí-duos) adjacentes a uma ou mais das posições da região Fc identificadasaqui como tendo um impacto sobre a ligação ao FcR. Por adjacente enten-da-se dentro de um a dois resíduos de aminoácido de um resíduo de regiãoFc identificado aqui. Tais variantes de região Fc podem mostrar ligação aoFcR e/ou função efetuadora intensificada ou diminuída. De forma a gerar taisvariantes com inserção, pode-se avaliar uma estrutura de co-cristal de umpolipeptídeo compreendendo uma região de ligação de um FcR (por exem-plo, o domínio extracelular do FcR de interesse) e a região Fc na qual o(s)resíduo(s) de aminoácido tem(têm) de ser inserido(s) (vide, por exemplo,Sondermann e outros, Nature 406: 267 (2000); Deisenhofer, Biochemistry 20(9): 2361-2370 (1981); e Burmeister e outros, Nature 3442: 379-383, (1994),todos os quais são aqui incorporados por referência) de forma a projetar ra-cionalmente uma região Fc modificada que exibe, por exemplo, capacidadeaperfeiçoada de ligação ao FcR.
Através de introdução das modificações de seqüência de amino-ácido apropriadas em uma região Fc precursora, pode-se gerar uma regiãoFc variante a qual (a) media uma ou mais funções efetuadoras na presençade células efetuadoras humanas mais ou menos eficazmente e/ou (b) a qualse liga a um receptor Fcy (FcyR) ou ao receptor Fc neonatal (FcRn) com me-lhor afinidade do que o polipeptídeo precursor. Tais regiões Fc modificadasgeralmente compreenderão pelo menos uma modificação de aminoácido naregião Fc.
Em modalidades preferidas, a região Fc de polipeptídeo precur-sora é uma região Fc humana, por exemplo, uma região Fc humana nativade IgGI (alótipos A e não-A), lgG2, lgG3, lgG4 humana e todos os alotiposconhecidos ou descobertos de qualquer espécie. Tais regiões têm seqüên-cias tais como aquelas divulgadas no Pedido de Patente U.S. Provisório No.60/678.776, o qual é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
Em determinadas modalidades, de forma a gerar uma ABMcompreendendo uma ou mais substituições de aminoácido nas regiões Ve/ou CH1 de cadeia pesada e/ou regiões V e/ou C de cadeia leve e aindacompreendendo uma região Fc modificada com função efetuadora aperfei-çoada (por exemplo, ADCC), o polipeptídeo precursor tem, de preferência,atividade de ADCC preexistente (por exemplo, o polipeptídeo precursorcompreende uma região Fc de IgGI ou lgG3 humana). Em algumas modali-dades, uma região Fc com ADCC aperfeiçoada media a ADCC de modosubstancialmente mais eficaz do que um anticorpo com uma região Fe deIgGI ou lgG3 nativa.
Em modalidades particulares, modificação(ões) de aminoácidoé(são) introduzida(s) no domínio CH2 da região Fc precursora.
Os polipeptídeos da invenção tendo regiões Fc modificadas po-dem ser submetidos a uma ou mais de tais modificações, dependendo douso desejado ou pretendido do polipeptídeo. Tais modificações podem en-volver, por exemplo, alteração adicional da seqüência de aminoácido (substi-tuição, inserção e/ou deleção de resíduos de aminoácido), fusão a polipeptí-deo(s) heterólogo(s) e/ou modificações covalentes. Essas outras modifica-ções podem ser feitas antes de, simultaneamente com ou após a(s) modifi-cação(ões) de aminoácido divulgada(s) acima, as quais resultam em umaalteração na ligação ao receptor Fc e/ou função efetuadora.
Alternativa ou adicionalmente, pode ser útil combinar modifica-ções de aminoácido com uma ou mais de outras modificações de aminoáci-do que alteram a ligação a C1q e/ou função de citotoxicidade complemento-dependente da região Fe. O polipeptídeo de iniciação de interesse particulara esse respeito aqui é um que se liga ao C1q e mostra citotoxicidade com-plemento-dependente (CDC). Substituições de aminoácido descritas aquipodem servir para alterar a capacidade do polipeptídeo de iniciação de seligar ao C1q e/ou modificar sua função de citotoxicidade complemento-dependente (por exemplo, para reduzir e, de preferência, eliminar essas fun-ções efetuadoras). Contudo, polipeptídeos compreendendo substituições emuma ou mais das posições descritas com ligação a C1q e/ou função de cito-toxicidade complemento-dependente (CDC) aperfeiçoada são consideradosaqui. Por exemplo, o polipeptídeo de iniciação pode ser incapaz de se ligarao C1q e/ou mediar a CDC e pode ser modificado de acordo com os ensi-namentos aqui de modo que ele adquire essas outras funções efetuadoras.Além disso, polipeptídeos com atividade de ligação a C1q preexistente, op-cionalmente ainda tendo a capacidade de mediar a CDC, podem ser modifi-cados de modo que uma ou ambas dessas atividades sejam intensificadas.Modificações de aminoácido que alteram o C1q e/ou modificam sua funçãode citotoxicidade complemento-dependente são descritos, por exemplo, noWO00/42072, o qual é incorporado aqui por referência.
Conforme descrito acima, pode-se projetar uma região Fc ouporção da mesma com função efetuadora alterada, por exemplo, através demodificação da ligação ao C1q e/ou ligação ao FcR e, desse modo, alterar aatividade de CDC e/ou atividade de ADCC. Por exemplo, pode-se gerar umaregião Fc modificada com ligação aperfeiçoada ao C1q e ligação aperfeiçoa-da ao FCyRIII (por exemplo, tendo atividade de ADCC e atividade de CDCaperfeiçoadas). Alternativamente, onde se deseja que a função efetuadoraseja reduzida ou eliminada, pode-se manipular uma região Fc modificadacom atividade de CDC reduzida e/ou atividade de ADCC reduzida. Em ou-tras modalidades, pode-se aumentar apenas uma dessas atividades e op-cionalmente também reduzir a outra atividade, por exemplo, para gerar umaregião Fc modificada com atividade de ADCC aperfeiçoada, mas atividadede CDC reduzida e vice-versa.
Outro tipo de substituição de aminoácido serve para alterar opadrão de glicosilação do polipeptídeo. Isso pode ser obtido, por exemplo,através de deleção de uma ou mais porções de carboidrato encontradas nopolipeptídeo e/ou adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estãopresentes no polipeptídeo. Glicosilação de polipeptídeos é, tipicamente, N-ligada ou O-ligada. N-Iigada se refere à fixação da porção carboidrato à ca-deia lateral de um resíduo de asparagina. As seqüências peptídicas aspara-gina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exce-to prolina, são as seqüências de reconhecimento para fixação enzimática daporção carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença dequalquer uma dessas seqüências peptídicas em um polipeptídeo cria umsítio de glicosilação em potencial. Glicosilação O-ligada se refere à fixaçãode um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidróxi-aminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidróxiprolina ou5-hidróxilisina também possam ser usadas.
Em algumas modalidades, a presente invenção proporcionacomposições compreendendo uma modificação de um polipeptídeo precur-sor tendo uma região Fc, em que a região Fc modificada compreende pelomenos uma modificação de resíduo de aminoácido na superfície (vide, porexemplo, Deisenhofer, Biochemistry, 28; 20(9): 2361-70, Abril de 1981 eWO00/42072, ambos os quais são aqui incorporados por referência). Emoutras modalidades, a presente invenção proporciona composições compre-endendo uma modificação do polipeptídeo precursor tendo uma região Fe,em que a região Fc modificada compreende pelo menos uma modificação deresíduo de aminoácido não na superfície. Em outras modalidades, a presen-te invenção compreende uma variante de um polipeptídeo precursor tendouma região Fc, em que a variante compreende pelo menos uma modificaçãode aminoácido na superfície e pelo menos uma modificação de aminoácidonão na superfície.
A eficácia terapêutica das ABMs modificadas da presente inven-ção pode ser ainda intensificada através de produção das mesmas em umacélula hospedeira que tenha sido glico-manipulada para ter expressão alte-rada de pelo menos uma glicosiltransferase de modificação de glicoproteína.Em uma modalidade, a célula hospedeira glico-manipulada ainda expressaum ou mais dos seguintes: um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeotendo atividade de GnTIII, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeotendo atividade de Manll ou um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeotendo atividade de GaIT. Em uma modalidade preferida, a célula hospedeiraexpressa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade deGnTIII ou atividade de Manll. Em outra modalidade preferida, a célula hos-pedeira expressa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo ati-vidade de GnTIII, bem como um polinucleotídeo que codifica um polipeptí-deo tendo atividade de ManlI. Em ainda outra modalidade preferida, o poli-peptídeo tendo atividade de GnTIII é um polipeptídeo de fusão compreen-dendo o domínio de localização no Golgi de um polipeptídeo residente noGolgi. Em outra modalidade preferida, a expressão das ABMs modificadasda presente invenção em uma célula hospedeira que expressa um polinu-cleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de GnTIII resulta emABMs modificadas com afinidade de ligação aumentada pelo receptor Fc efunção efetuadora aumentada. Conseqüentemente, em uma modalidade, apresente invenção é dirigida a uma célula hospedeira compreendendo (a)um ácido nucléico isolado compreendendo uma seqüência que codifica umpolipeptídeo tendo atividade de GnTIII; e (b) um polinucleotídeo isolado quecodifica uma ABM da presente invenção, tal como um anticorpo quimérico,primatizado ou humanizado que se liga ao CD20 humano. Em uma modali-dade preferida, o polipeptídeo tendo atividade de GnTIII é um polipeptídeode fusão compreendendo o domínio catalítico de GnTIII e o domínio de loca-lização no Golgi é o domínio de localização de manosidase II. Métodos parageração de tais polipeptídeos de fusão e uso dos mesmos para produzir an-ticorpos com funções efetuadoras aumentadas são descritos no Pedido dePatente U.S. Provisório No. 60/495.142 e Pub. de Pedido de Pat. U.S.No.2004/0241817, os conteúdos todos de cada um dos quais são aqui ex-pressamente incorporados por referência. Em outra modalidade preferida, aABM quimérica é um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo tendoa especificidade de ligação do anticorpo B-Iyl de murino. Em uma modalida-de particularmente preferida, o anticorpo quimérico compreende uma Fchumana. Em outra modalidade preferida, o anticorpo é primatizado ou hu-manizado.
Em uma modalidade, um ou mais polinucleotídeos que codificamuma ABM da presente invenção podem ser expressos sob o controle de umpromotor constitutivo ou, alternativamente, um sistema de expressão regula-do. Sistemas de expressão regulados adequados incluem, mas não estãolimitados a, um sistema de expressão tetraciclina-regulado, um sistema deexpressão ecdisona-induzível, um sistema de expressão lac-comutado, umsistema de expressão glicocorticóide-induzível, um sistema promotor tempe-ratura-induzível e um sistema de expressão metal de metalotioneína-induzível. Se vários ácidos nucleicos diferentes que codificam uma ABM dapresente invenção são compreendidos dentro do sistema da célula hospe-deira, alguns deles podem ser expressos sob o controle de um promotorconstitutivo, enquanto que outros são expressos sob o controle de um pro-motor regulado. O nível máximo de expressão é considerado como sendo omaior nível possível de expressão estável de polipeptídeo que não tem umefeito adverso significativo sobre a taxa de crescimento celular e será deter-minado usando experimentação de rotina. Níveis de expressão são determi-nados através de métodos geralmente conhecidos na técnica, incluindo aná-lise de Western blot usando um anticorpo específico para a ABM ou um anti-corpo específico para uma tag peptídica fundida à ABM; e análise de Nor-thern blot. Em uma outra alternativa, o polinucleotídeo pode ser operativa-mente ligado a um gene repórter; os níveis de expressão de uma ABM modi-ficada tendo substancialmente a mesma especificidade de ligação de umanticorpo precursor são determinados através de medição de um sinal corre-lacionado com o nível de expressão do gene repórter. O gene repórter podeser transcrito junto com o(s) ácido(s) nucléico(s) que codifica(m) os referidospolipeptídeos de fusão que uma única molécula de mRNA; suas respectivasseqüências de codificação podem ser ligadas através de um sítio de entradaribossômica interno (IRES) ou por um intensificador de tradução revestimen-to-independente (CITE). O gene repórter pode ser traduzido junto com pelomenos um ácido nucléico que codifica uma ABM modificada tendo substan-cialmente a mesma especificidade de ligação de um anticorpo precursor, demodo que uma única cadeia polipeptídica seja formada. Os ácidos nucleicosque codificam as ABMs da presente invenção podem ser operativamenteligados ao gene repórter sob o controle de um único promotor, de modo queo ácido nucléico que codifica o polipeptídeo de fusão e o gene repórter se-jam transcritos em uma molécula de RNA a qual é, alternativamente, unidaem duas moléculas de RNA mensageiro (mRNA) distintas; um dos mRNAsresultantes é traduzido na referida proteína repórter e o outro é traduzido noreferido polipeptídeo de fusão.Expressão de ABMs Modificadas
Métodos os quais são bem-conhecidos por aqueles versados natécnica podem ser usados para construir vetores de expressão contendo aseqüência de codificação de uma ABM modificada tendo substancialmente amesma especificidade de ligação de um anticorpo precursor junto com sinaisde controle de transcrição/tradução apropriados. Esses métodos incluemtécnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação inwVo/recombinação genética. Vide, por exemplo, as técnicas descritas emManiatis e outros, MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory, Ν. Y. (1989) e Ausubel e outros, CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associatesand Wiley Interscience, N.Y (1989).
Uma variedade de sistemas de vetor de expressão-hospedeiropode ser utilizada para expressar a seqüência de codificação das ABMs dapresente invenção. De preferência, células de mamífero são usadas comosistemas de célula hospedeira transfectados com DNA de plasmídeo recom-binante ou vetores de expressão de DNA recombinante contendo a seqüên-cia de codificação da proteína de interesse e a seqüência de codificação dopolipeptídeo de fusão. Mais preferivelmente, células CHO, células ΗΕΚ293-EBNA, célula BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, cé-lulas de mieloma de camundongo P3X63, células PER, células PER.C6 oucélulas de hibridoma, outras células de mamífero, células de levedo, célulasde inseto ou células de planta são usadas como um sistema de célula hos-pedeira. Alguns exemplos de sistemas de expressão e métodos de seleçãosão descritos nas referências a seguir e referências nas mesmas: Borth eoutros, Biotechnoi Bioen. 71(4): 266-73 (2000-2001), em Werner e outros,Arzneimittelforschung/Drug Res. 48(8): 870-80 (1998), em Andersen eKrummen, Curr. Op. Biotechnol. 13: 117-123 (2002), em Chadd e Chamow,Curr. Op. Biotechnol. 12: 188-194 (2001) e em Giddings, Curr. Op. Biotech-nol. 12: 450-454 (2001). Em modalidades alternativas, outros sistemas decélula eucariota podem ser considerados, incluindo células de Ievedo trans-formadas com vetores de expressão de Ievedo recombinante contendo aseqüência de codificação de uma ABM da presente invenção, tal como ossistemas de expressão ensinados no Pedido de Pat. U.S. N9 60/344.169 eWO 03/056914 (métodos para a produção de glicoproteína semelhante àhumana em uma célula hospedeira eucariota não-humana) (os conteúdos decada um dos quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade);sistemas de células de inseto com vetores de expressão virais recombinan-tes (por exemplo, báculo vírus) contendo a seqüência de codificação de umaABM modificada tendo substancialmente a mesma especificidade de ligaçãode um anticorpo precursor; sistemas de célula de planta infectados com ve-tores de expressão virais recombinantes (por exemplo, vírus mosaico dacouve-flor, CaMV; vírus mosaico de tabaco, TMV) ou vetores de expressãode plasmídeo recombinante (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo a se-qüência de codificação da ABM da invenção incluindo, mas não limitado a,os sistemas de expressão ensinados na Pat. U.S. N9 6.815.184 (métodospara expressão e secreção de polipeptídeos biologicamente ativos a partirde duckweed geneticamente manipulada); WO 2004/057002 (produção deproteínas glicosiladas em células de planta briófita através de introdução deum gene de glicosil transferase) e WO 2004/024927 (métodos de geração deproteína não vegetal heteróloga extracelular em protoplasta de musgo); ePedidos de Pat. U.S. N2s 60/365.769, 60/368.047 e WO 2003/078614 (pro-cessamento de glicoproteína em plantas transgênicas compreendendo umaenzima GnTIII funcional em mamífero) (os conteúdos de cada um dos quaissão aqui incorporados por referência em sua totalidade); ou sistemas de cé-lulas animais infectadas com vetores de expressão viral recombinantes (porexemplo, adenovírus, vírus da varíola) incluindo linhagens de células mani-puladas para conter múltiplas cópias do DNA que codifica uma ABM modifi-cada tendo substancialmente a mesma especificidade de ligação de um an-ticorpo precursor estavelmente amplificado (CHO/dhfr) ou estavelmente am-plificado em cromossomas duplamente diminutos (por exemplo, linhagens decélulas de murino). Em uma modalidade, o vetor compreendendo o(s) poli-nucleotídeo(s) que codifica a ABM da invenção é policistrônico. Também, emuma modalidade, a ABM discutida acima é um anticorpo ou um fragmento domesmo. Em uma modalidade preferida, a ABM é anticorpo humanizado.
Para os métodos da presente invenção, expressão estável ge-ralmente é preferida à expressão transitória porque ela obtém, tipicamente,resultados mais reproduzíveis e também é mais passível de produção emlarga escala. Em vez de usar vetores de expressão os quais contêm origensvirais de replicação, as células hospedeiras podem ser transformadas comos respectivos ácidos nucleicos de codificação controlados por elementos decontrole de expressão apropriados (por exemplo, promotor, intensificador,seqüências, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc.) e ummarcador selecionável. Após a introdução de DNA estranho, células manipu-ladas podem ser deixadas crescer durante 1-2 dias em meio enriquecido e,então, trocado por um meio seletivo. Um marcador selecionável no plasmí-deo recombinante confere resistência à seleção e permite a seleção de célu-las as quais têm estavelmente integrado o plasmídeo em seus cromossomase crescem para formar focos os quais, por sua vez, podem ser clonados eexpandidos em linhagens de células.
Uma série de sistemas de seleção pode também ser usada in-cluindo, mas não limitada a, quinase de timidina de herpes simplex (Wigler eoutros, Cell 11: 223 (1977)), fosforribosiltransferase de hipoxantina-guanina(Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48: 2026 (1962)) e genesde fosforribosiltransferase de adenina (Lowy e outros, Cell 22: 817 (1980)),os genes podem ser empregados em células tk", hgprt" ou aprf, respectiva-mente. Também, resistência anti-metabólito pode ser usada como a base deseleção por genes de dhfr, o qual confere resistência ao metotrexato ((Wiglere outros, Natl Acad. Sei. USA 77: 3567 (1989); O1Hare e outros, Proc. NatlAcad. Sci USA 78: 1527 (1981)); gpt o qual confere resistência ao ácido mi-cofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl Acad. Sci USA 78: 2072 (1981)); neo,o qual confere e semelhantes ao aminoglicosídeo G-418 (Colberre-Garapin eoutros, J. Mol Biol 150: 1 (1981)); e higro, o qual confere resistência à higro-micina (Santerre e outros, Gene 30: 147 (1984). Recentemente, genes sele-cionáveis adicionais foram descritos, isto é, trpB, o qual permite que as célu-las utilizem indola em lugar de triptofano; hisD, o qual permite que as célulasutilizem histidinol em lugar de histidina (Hartman & Mulligan, Proc. Natl Acad.
Sci USA S5: 8047 (1988); o sistema de sintase de glutamina; e ODC (decar-boxilase de ornitina), o qual confere resistência ao inibidor decarboxilase deornitina, , 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DEMÓ (McConlogue, em: CurrentCommunications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.(1987)).
Expressão de ABMs Modificadas compreendendo Regiões Fc com Gli-cosilação Alterada
Em outro aspecto, a presente invenção é ainda dirigida a ummétodo para modificação do perfil de glicosilação das ABMs modificadascompreendendo pelo menos uma substituição de aminoácido na região V ouCH1 que são produzidas por uma célula hospedeira, compreendendo ex-pressão na referida célula hospedeira de um ácido nucléico que codifica umaABM modificada da invenção e um ácido nucléico que codifica um polipeptí-deo com atividade de GnTIII ou um vetor compreendendo tais ácidos nuclei-cos. De preferência, o polipeptídeo modificado é IgG ou um fragmento domesmo compreendendo a região Fe. Em uma modalidade particularmentepreferida, a ABM é um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo.Em outra modalidade, a célula hospedeira é manipulada para co-expressar aABM da invenção, GnTIII e manosidase Il (Manll).
As ABMs modificadas produzidas pelas células hospedeiras dainvenção exibem afinidade de ligação ao receptor Fc aumentada e/ou funçãoefetuadora aumentada como um resultado da modificação. Em uma modali-dade particularmente preferida, a ABM modificada é um anticorpo humani-zado ou um fragmento do mesmo contendo a região Fe. De preferência, aafinidade de ligação pelo receptor Fc é aumentada é ligação aumentada aum receptor de ativação de Fcy, tal como um receptor, FcyRIIIa. A funçãoefetuadora aumentada é, de preferência, um aumento em um ou mais dosseguintes: citotoxicidade celular, anticorpo-dependente aumentada, fagocito-se celular anticorpo-dependente aumentada (ADCP)1 secreção aumentadade citocina, captação de antígeno complexo imunemediada aumentada porcélulas que apresentam antígeno, citotoxicidade celular Fc-mediada, ligaçãoaumentada à células NK1 ligação aumentada a macrófagos, ligação aumen-tada à células polimorfonucleares (PMNs), ligação aumentada a monócitos,reticulação aumentada de anticorpos alvo-ligados, sinalização direta queinduz à apoptose aumentada, maturação aumentada de células dendríticas e"priming" (iniciação) aumentado de células T.
Funções efetuadoras podem ser medidas e/ou determinadasatravés de vários ensaios conhecidos por aqueles versados na técnica. Vá-rios ensaios para medir funções efetuadoras, incluindo afinidade de ligaçãoao receptor Fc e citotoxicidade complemento-dependente, são descritos naPublicação de Pedido US Nq 2004/0241817A1, o qual é aqui incorporado porreferência em sua totalidade. Secreção de citosina pode ser medida, por e-xemplo, usando um ELISA em sanduíche vide, por exemplo, McRae e ou-tros, J. immunol. 164: 23-28 (2000) e o protocolo de ELISA em sanduíche decitosina disponível em www.bdbiosciences.com/pharminqen/protocols ouatravés dos métodos descritos em Takahashi e outros, British J. PharmacoL137: 315-322 (2002), cada um dos quais é aqui incorporado por referênciaem sua totalidade. Maturação de células dendríticas, por exemplo, pode serdeterminada usando ensaios conforme apresentado por Kalergis e Ravetch,J. Exp. Med. 195: 1653-59 (2002), o qual é aqui incorporado por referênciaem sua totalidade. Exemplos de ensaios de apresentação/captação de antí-geno e fagocitose são proporcionados por Gresham e outros, J. Exp. Med.191: 515-28 (2000); Krauss e outros, J. Immunol 153: 1769-77 (1994); e Ra-fiq e outros, J. Clin. Invest. 110: 71-79 (2002) e Hamano e outros, J. Immu-nol. 164: 6113-19 (2000), cada um dos quais é aqui incorporado por referên-cia em sua totalidade. Sub-regulação de receptores na superfície celular po-de ser medida, por exemplo, através dos métodos apresentados por Liao eoutros, Blood 83: 2294-2304 (1994), o qual é aqui incorporado por referênciaem sua totalidade. Métodos gerais, protocolos e ensaios podem ser encon-trados em CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK, Celis, J.E., ed.,(2- e<±, 998) o qual é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Estádentro da capacidade daqueles versados na técnica adaptar os métodos,protocolos e ensaios mencionados acima para uso com a presente invenção.
A presente invenção é também dirigida a um método para pro-dução de uma ABM da presente invenção, tendo oligossacarídeos modifica-dos em uma célula hospedeira compreendendo (a) cultura de uma célulahospedeira manipulada para expressar pelo menos um ácido nucléico quecodifica um polipeptídeo tendo atividade de GnTIII sob condições as quaispermitem a produção de uma ABM de acordo com a presente invenção, emque o referido polipeptídeo tendo atividade de GnTIII é expresso em umaquantidade suficiente para modificar os oligossacarídeos na região Fc dareferida ABM produzida pela referida célula hospedeira; e (b) isolamento dareferida ABM. Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo tendo atividadede GnTIII é um polipeptídeo de fusão compreendendo o domínio catalíticode GnTIII. Em uma modalidade particularmente preferida, o polipeptídeo defusão ainda compreende o domínio de localização no Golgi de um polipeptí-deo residente no Golgi.
De preferência, o domínio de localização no Golgi é o domíniode localização de manosidase Il ou GnTI. Alternativamente, o domínio delocalização no Golgi é selecionado do grupo consistindo em: o domínio delocalização de manosidase I, o domínio de localização de GnTII e o domíniode localização de uma fucosiltransferase com núcleo de a-1,6. As ABMsproduzidas através dos métodos da presente invenção têm afinidade de li-gação pelo receptor Fc é aumentada é ligação aumentada a um receptor deativação de Fcy, tal como um receptor, FcyRIIIa. A função efetuadora au-mentada é, de preferência, um aumento em um ou mais dos seguintes: cito-toxicidade celular, anticorpo-dependente aumentada, fagocitose celular anti-corpo-dependente aumentada (ADCP), secreção aumentada de citocina,captação de antígeno complexo imunemediada aumentada por células queapresentam antígeno, citotoxicidade celular Fc-mediada, ligação aumentadaà células NK, ligação aumentada a macrófagos, ligação aumentada à célulaspolimorfonucleares (PMNs), ligação aumentada a monócitos, reticulaçãoaumentada de anticorpos alvo-ligados, sinalização direta que induz à apop-tose aumentada, maturação aumentada de células dendríticas e iniciaçãoaumentado de células Τ. A afinidade de ligação aumentada ao receptor Fc é,de preferência, ligação aumentada a receptores de ativação Fc, tal comoFcyRIIIa. Em uma modalidade particularmente preferida, a ABM é um anti-corpo humanizado ou um fragmento do mesmo.
Em outra modalidade, a presente invenção é dirigida a uma ABMmodificada tendo substancialmente a mesma especificidade de ligação deum anticorpo precursor produzido através dos métodos da invenção o qualtem uma proporção aumentada de oligossacarídeos bisseccionados na regi-ão Fc do referido polipeptídeo. Considera-se que tal ABM compreende anti-corpos e fragmentos dos mesmos compreendendo a região Fe. Em umamodalidade preferida, a ABM é um anticorpo humanizado. Em uma modali-dade, o percentual de oligossacarídeos bisseccionados na região Fc da ABMé pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 60%, pelo menos 70%,pelo menos 80% ou pelo menos 90% e, mais preferivelmente, pelo menos90-95% dos oligossacarídeos totais. Em ainda outra modalidade, a ABMproduzida através dos métodos da invenção tem uma proporção aumentadade oligossacarídeos não fucosilados na região Fc como um resultado damodificação de seus oligossacarídeos através dos métodos da presente in-venção. Em uma modalidade, o percentual de oligossacarídeos não fucosi-lados é pelo menos 50%, de preferência pelo menos 60% a 70%, mais pre-ferivelmente 75%. Os oligossacarídeos não fucosilados podem ser do tipohíbrido ou complexo. Em uma modalidade particularmente preferida, a ABMproduzida pelas células hospedeiras e métodos da invenção têm uma pro-porção aumentada de oligossacarídeos não fucosilados bisseccionados naregião Fe. Os oligossacarídeo não fucosilados bisseccionados podem serhíbridos ou complexos. Especificamente, os métodos da presente invençãopodem ser usados para produzir ABMs nas quais pelo menos 15%, maispreferivelmente pelo menos 20%, mais preferivelmente pelo menos 25%,mais preferivelmente pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo menos35% dos oligossacarídeos na região Fc da ABM são bisseccionados nãofucosilados. Os métodos da presente invenção também podem ser usadospara produzir polipeptídeos nos quais pelo menos 15%, mais preferivelmentepelo menos 20%, mais preferivelmente pelo menos 25%, mais preferivel-mente pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo menos 35% dos oligos-sacarídeos na região Fc do polipeptídeo são bisseccionados não fucosila-dos.
Em outra modalidade, a presente invenção é dirigida a uma ABMmodificada tendo substancialmente a mesma especificidade de ligação deum anticorpo precursor manipulado para ter função efetuadora aumentadae/ou afinidade de ligação aumentada ao receptor Fc, produzida através dosmétodos da invenção. De preferência, a função efetuadora aumentada é umou mais dos seguintes: citotoxicidade celular, anticorpo-dependente aumen-tada, fagocitose celular anticorpo-dependente aumentada (ADCP), secreçãoaumentada de citocina, captação de antígeno complexo imunemediada au-mentada por células que apresentam antígeno, citotoxicidade celular Fc-mediada, ligação aumentada à células NK, ligação aumentada a macrófa-gos, ligação aumentada à células polimorfonucleares (PMNs), ligação au-mentada a monócitos, reticulação aumentada de anticorpos alvo-ligados,sinalização direta que induz à apoptose aumentada, maturação aumentadade células dendríticas e iniciação aumentado de células T. Em uma modali-dade preferida, a afinidade de ligação aumentada ao receptor Fc é ligaçãoaumentada a um receptor de ativação Fc, mais preferivelmente FcyRIIIa. Emuma modalidade, a ABM modificada é um anticorpo, um fragmento de anti-corpo contendo a região Fc ou uma proteína de fusão que inclui uma regiãoequivalente à região Fc de uma imunoglobulina. Em uma molécula particu-larmente preferida, a ABM é um anticorpo humanizado.Composições farmacêuticas compreendendo as ABMs modificadas
A presente invenção é dirigida ainda à composições farmacêuti-cas compreendendo as ABMs modificadas da presente invenção e um veí-culo farmaceuticamente aceitável.
Qualquer material veículo convencional pode ser utilizado. Omaterial veículo pode ser orgânico ou inorgânico adequado para administra-ção eteral, percutânea ou parenteral. Veículos adequados incluem, água,gelatina, goma arábica, lactose, amido, estearato de magnésio, talco, óleosvegetais, polialquileno glicóis, geléia de petróleo e semelhantes. Além disso,os preparados farmacêuticos podem conter outros agentes farmaceutica-mente aceitáveis. Aditivos adicionais, tais como agente de flavorização, es-tabilizantes, agentes de emulsificação, tampões e semelhantes podem seradicionados de acordo com as práticas aceitas de composição farmacêutica.
A frase "farmaceuticamente aceitável" é empregada aqui para sereferir àqueles compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagemos quais são, dentro do escopo do julgamento médico, adequados para usoem contato com tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade, irrita-ção, resposta alérgica excessiva ou outro problema ou complicação, comen-surável com uma proporção benefício/risco razoável.
A presente invenção é ainda dirigida a tais composições farma-cêuticas para uso no tratamento ou profilaxia de câncer. A presente inven-ção é ainda dirigida a um método de tratamento ou profilaxia de câncercompreendendo administração de uma quantidade terapeuticamente eficazda composição farmacêutica da presente invenção.
De preferência, o câncer é selecionado do grupo consistindo emcâncer de mama, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço, câncer depele, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer ovariano, câncer de có-lon, câncer de próstata, câncer de rim e câncer de cérebro.
A presente invenção é ainda dirigida a tais composições farma-cêuticas para uso no tratamento ou profilaxia de uma condição ou lesão pré-cancerígena. A presente invenção é ainda dirigida a um método para o tra-tamento ou profilaxia de uma condição ou lesão pré-cancerígena compreen-dendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da com-posição farmacêutica da invenção.
De preferência, a condição ou lesão pré-cancerígena é selecio-nada do grupo consistindo em Ieucoplasia oral, queratose actínica (querato-se solar), pólipos pré-cancerígenos do cólon ou reto, displasia epitelial gás-trica, displasia adenomatosa, síndrome de câncer de cólon de não-poliposehereditária (HNPCC), esôfago de Barrett, displasia de bexiga e condiçõescervicais pré-cancerígenas.
A presente invenção ainda proporciona métodos para a geraçãoe uso de sistemas de célula hospedeira para a produção de glicoformas dasABMs modificadas da presente invenção, tendo afinidade de ligação aumen-tada ao receptor Fc1 de preferência ligação aumentada a receptores de ati-vação Fc e/ou tendo funções efetuadoras aumentadas, incluindo citotoxici-dade celular anticorpo-dependente. A metodologia de glico-manipulação quepode ser usada com as ABMs modificadas da presente invenção foi descritaem maiores detalhes na Patente U.S. N2 6.602.684 e Pedido de PatenteU.S. Provisório No. 60/441.307 e WO 2004/065540, os conteúdos totais decada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade. AsABMs modificadas da presente invenção podem, alternativamente, ser glico-manipuladas para ter resíduos de fucose reduzidos na região Fc de acordocom as técnicas divulgadas no EP 1 176 195 A1, os conteúdos totais do qualé aqui incorporado por referência.
Geração de Linhagens de Célula para Produção de ABMs Modificadas comPadrão de Glicosilacão Alterada
A presente invenção proporciona sistemas de expressão de cé-lula hospedeira para a geração das ABMs modificadas da presente invençãotendo padrões de glicosilação modificados. Em particular, a presente inven-ção proporciona sistemas de célula hospedeira para geração de glicoformasdas ABMs modificadas da presente invenção tendo um valor terapêutico a-perfeiçoado. Portanto, a invenção proporciona sistemas de expressão decélula hospedeira selecionados ou manipulados para expressar um polipep-tídeõ tendo atividade de GnTIII. Em uma modalidade, o polipeptídeo tendoatividade de GnTIII é um polipeptídeo de fusão compreendendo o domíniode localização no Golgi de um polipeptídeo residente no Golgi heterólogo.
Especificamente, tais sistemas de expressão de célula hospedei-ra podem ser manipulados para compreender uma molécula de ácido nucléi-co recombinante que codifica um polipeptídeo tendo atividade de GnTIII, o-perativamente ligado a um sistema promotor constitutivo ou regulado.Em uma modalidade específica, a presente invenção proporcio-na uma célula hospedeira que foi manipulada para expressar pelo menos umácido nucléico que codifica um polipeptídeo de fusão tendo atividade de Gn-Tlll e compreendendo o domínio de localização no Golgi de um polipeptídeoresidente no Golgi heterólogo. Em uma aspecto, a célula hospedeira é mani-pulada com uma molécula de ácido nucléico compreendendo pelo menosum gene que codifica um polipeptídeo de fusão tendo atividade de GnTIII ecompreendendo o domínio de localização no Golgi de um polipeptídeo resi-dente no Golgi heterólogo.
Em geral, qualquer tipo de linhagem de célula cultivada, incluin-do as linhagens de célula discutidas acima, pode ser usado como uma basepara manipular as linhagens de célula hospedeira da presente invenção. Emuma modalidade preferida, células CHO, células HEK293-EBNA, célulaBHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mielo-ma de camundongo P3X63, células PER, células PER.C6 ou células de hi-bridoma, outras células de mamífero, células de levedo, células de inseto oucélulas de planta são usadas como a linhagem de célula de base para geraras células hospedeiras manipuladas da invenção.
A invenção é considerada como abrangendo quaisquer célulashospedeiras manipuladas expressando um polipeptídeo tendo atividade deGnTIII, incluindo um polipeptídeo de fusão que compreende o domínio delocalização no Golgi de um polipeptídeo residente no Golgi heterólogo con-forme definido aqui.
Um ou vários ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeotendo atividade de GnTIII podem ser expressos sob o controle de um promo-tor constitutivo ou, alternativamente, um sistema de expressão regulado.Tais sistemas são bem-conhecidos na técnica e incluem os sistemas descri-tos acima. Se vários diferentes ácidos nucleicos que codificam polipeptídeosde fusão tendo atividade de GnTIII e compreendendo o domínio de Iocaliza-ção no Golgi de um polipeptídeo residente no Golgi heterólogo são compre-endidos dentro do sistema de célula hospedeira, alguns deles podem serexpressos sob o controle de um promotor constitutivo, enquanto que outrossão expressos sob o controle de um promotor regulado. Níveis de expressãodos polipeptídeos de fusão tendo atividade de GnTIII são determinados atra-vés de métodos geralmente conhecidos na técnica, incluindo análise deWestern blot, análise de Northern blot, análise de expressão de gene repór-ter ou medição de atividade de GnTIII. Alternativamente, uma Iecitina podeser empregada a qual se liga a produtos biossintéticos da GnTIII1 por exem-plo, E4-PHA lectina. Alternativamente, um ensaio funcional o qual mede aligação aumentada ao receptor Fc ou função efetuadora aumentada media-da por anticorpos produzidos pelas células manipuladas com o ácido nucléi-co que codifica um polipeptídeo com atividade de GnTIII pode ser usado.
Identificação de Transfectantes ou Transformantes que expressam a proteí-na tendo um padrão de qlicosilacão modificado
As células hospedeiras as quais contêm a seqüência de codifi-cação de uma ABM modificada da presente invenção e as quais expressamos produtos genéticos biologicamente ativos podem ser identificadas atravésde pelo menos quatro abordagens gerais: (a) hibridização de DNA-DNA ouDNA-RNA; (b) a presença ou ausência de funções de gene "marcador"; (c)avaliação do nível de transcrição, conforme medido pela expressão dos res-pectivos transcritos de mRNA na célula hospedeira; e (d) detecção do produ-to genético conforme medido através de um imunoensaio ou através de suaatividade biológica.
Na primeira abordagem, a presença da seqüência de codificaçãode uma ABM modificada da presente invenção e da seqüência de codifica-ção do polipeptídeo tendo atividade de GnTIII podem ser detectadas atravésde hibridização de DNA-DNA ou DNA-RNA usando sondas compreendendoseqüências de nucleotídeo que são homólogas às respectivas seqüênciasde codificação, respectivamente, ou porções ou derivados das mesmas.
Na segunda abordagem, o vetor de expressão recombinan-te/sistema hospedeiro pode ser identificado e selecionado baseado na pre-sença ou ausência de determinadas funções de gene "marcador" (por exem-plo, atividade de quinase de timidina, resistência a antibióticos, resistênciaao metotrexato, fenotipo de transformação, oclusão de formação de corpobaculovírus, etc.)· Por exemplo, se a seqüência de codificação da ABM mo-dificada da invenção ou um fragmento da mesma e a seqüência de codifica-ção do polipeptídeo tendo atividade de GnTIII são inseridas dentro de umaseqüência de gene marcador do vetor, recombinantes contendo as respecti-vas seqüências de codificação podem ser identificados pela ausência dafunção do gene marcador. Alternativamente, um gene marcador pode sercolocado aleatoriamente còm as seqüências de codificação sob o controledo mesmo ou de um promotor diferente usado para controlar a expressãodas seqüências de codificação. Expressando o marcador em resposta à in-dução ou seleção indica expressão da seqüência de codificação da ABMmodificada da invenção e da seqüência de codificação do polipeptídeo tendoatividade de GnTIII.
Na terceira abordagem, a atividade transcricional para a regiãode codificação da ABM modificada da invenção ou um fragmento da mesmae da seqüência de codificação do polipeptídeo tendo atividade de GnTIII po-de ser avaliada através de ensaios de hibridização. Por exemplo, RNA podeser isolado e analisado através de Northern blot usando uma sonda homólo-ga às seqüência de codificação da ABM modificada da invenção ou umfragmento das mesmas e à seqüência de codificação do polipeptídeo tendoatividade de GnTIII ou porções particulares da mesma. Alternativamente, osácidos nucleicos totais da célula hospedeira podem ser extraídos e analisa-dos com relação à hibridização a tais sondas.
Na quarta abordagem, a expressão dos produtos de proteínapode ser avaliada imunologicamente, por exemplo, através de Western blots,imunoensaios tal como radioimuno-precipitação, imuno ensaios enzima-ligados e semelhantes. O teste final do sucesso do sistema de expressão,contudo, envolve a detecção dos produtos genéticos biologicamente ativos.Geração e uso de ABMs modificadas tendo função efetuadora aumentadaincluindo citotoxicidade celular anticorpo-dependente
Em modalidades preferidas, a presente invenção proporcionaglicoformas de ABMs modificadas quiméricas tendo substancialmente amesma especificidade de ligação do anticorpo B-Iyl de murino e tendo fun-ção efetuadora aumentada, incluindo citotoxicidade celular anticorpo-dependente. Manipulação de glicosilação de anticorpos foi anteriormentedescrita. Vide, por exemplo, Patente U.S. No. 6.602.684, incorporada aquipor referência em sua totalidade.
Experimentos clínicos de anticorpo monoclonais não conjugados(mAbs) para o tratamento de alguns tipos de câncer têm proporcionandorecentemente resultados encorajadores. Dillman, Câncer Biother. & Radio-pharm. 12: 223-25 (1997); Deo e outros, Immunology Today 18: 127 (1997).Uma IgGI não conjugada quimérica foi aprovada para Iinfoma não Hodgkinde célula B folicular ou de baixo grau. Dillman, Câncer Biother. & Radio-pharm. 12: 223-25 (1997), enquanto que outro mAb não conjugado, umaIgGI humanizada que objetiva tumores sólidos de mama, também mostrouresultados promissores em experimentos clínicos na fase III. Deo e outros,Immunology Today 18: 127 (1997). Os antígenos desses dois mAbs são al-tamente expressos em suas respectivas células tumorígenas e os anticorposmediam destruição potente de tumor por células efetuadoras in vitro e in vi-vo. Em contraste, muitos outros mAbs não conjugados com especificidadesde tumor finas não podem disparar funções efetuadoras de potência sufici-ente para serem clinicamente úteis. Frost e outros, Câncer 80: 311 '-33(1997); Surfus e outros, J. Immunother. 19: 184-91 (1996) para alguns des-ses mAbs mais fracos, terapia adjunta com citosina está sendo atualmentetestada. A adição de citosinas pode estimular a citotoxicidade celular anti-corpo-dependente (ADCC) aumentando a atividade e o número de linfócitosem circulação. Frost e outros, Câncer 80: 317-33 (1997); Surfus e outros, J.Immunother. 19:184-91 (1996). A ADCC, um ataque lítico sobre células anti-corpo-objetivadas, é disparada quando de ligação de receptores de leucóci-tos à região constante (Fc) de anticorpos. Deo e outros, Immunology Today18:127(1997).
Uma abordagem diferente, mas complementar, ao aumento deatividade de ADCC de IgGIs não conjugadas é manipular a região Fc doanticorpo. Estudos de manipulação de proteína mostraram que FcyRs inte-ragem com a região de dobradiça inferior do domínio CH2 da IgG. Lund eoutros, J. Immunol 157: 4963- 69 (1996) . Contudo, a ligação ao FcyR tam-bém requer a presença de oligossacarídeos covalentemente presos naAsn297 conservada do domínio da região CH2 Lund e outros, J. Immunol157: 4963- 69 (1996); Wright e Morrison1 Trends Biotech: 15: 26-31 (1997),sugeriram que o oligossacarídeos e o polipeptídeo contribuem ambos dire-tamente para o sítio de interação ou que o oligossacarídeos é requerido paramanter uma conformação de polipeptídeo ativo no CH2. Modificação da es-trutura do oligossacarídeo pode, portanto, ser explorada como um meio paraaumentar a afinidade da interação.
Uma molécula IgG traz dois oligossacarídeos N-Iigados em suaregião Fc, um sobre cada cadeia pesada. Como qualquer glicoproteína, umanticorpo é produzido como uma população de glicoformas as quais compar-tilham a mesma parte principal de polipeptídeo, mas têm diferentes oligossa-carídeos presos nos sítios de glicosilação. Os oligossacarídeos normalmenteencontrados na região Fc de IgG no soro são do tipo bi-antenário complexo(Wormald e outros, Biochemistry 5(5: 130-38 (1997)), com um baixo nível deácido siálico terminal e N-acetilglicosamina de bi-secção (GIcNAc) e um grauvariável de galactosilação terminal e fucosilação de núcleo. Alguns estudossugerem que a estrutura mínima de carboidrato requerida para ligação aoFcyR repousa dentro do núcleo de oligossacarídeo. Lund e outros, J. Immu-nol. 757: 4963-69 (1996).
As linhagens de célula derivadas de camundongo ou hâmsterusadas na indústria e academia para produção de mAbs terapêuticos nãoconjugados normalmente prendem aos determinantes de oligossacarídeosrequeridos aos sítios de Fe. IgGs expressas nessas linhagens de célula ca-recem, contudo, da GIcNAc de bi-secção encontrada em baixas quantidadesem IgGs no soro Lifely e outros, Glycobiology 375: 813-22 (1995). O anticor-po derivado de célula de rato atingiu uma atividade máxima de ADCC e vis-cosidade similar como anticorpos CAMPATH-1H produzidos nas linhagensde célula-padrões, mas em concentrações significativamente menores deanticorpo.
O antígeno CAMPATH normalmente está presente em altos ní-veis sobre células de Iinfoma e esse mAb quimérico tem alta atividade deADCC na ausência de uma GIcNAc de bi-secção. Lifely e outros, Glycobio-logy 375: 813-22 (1995) na via de glicosilação N-ligada, uma GIcNAc de bi-secção é adicionada pela GnTIII. . Schachter, Biochem. Cell Biol. 54:163-81(1986).
Estudos anteriores usaram uma única linhagem de célula CHOque produz anticorpo, que foi previamente manipulada para expressar, deum modo externamente regulado, diferentes níveis de uma enzima de genesGnTIII clonado (Umana, P., e outros, Natüre Biotechnol. 77: 176-180 (1999)).Essa abordagem estabeleceu, pela primeira vez, uma correlação rigorosaentre a expressão de GnTIII e a atividade de ADCC do anticorpo modificado.Assim, a invenção considera um anticorpo quimérico recombinante ou umfragmento do mesmo com a especificidade de ligação do anticorpo B-lyl demurino, tendo glicosilação alterada resultante de atividade aumentada deGnTIII A atividade aumentada de GnTIII resulta em um aumento no percen-tual de oligossacarídeos bisseccionados, bem como em uma diminuição nopercentual de resíduos de fucose, na região Fc da ABM modificada. Esseanticorpo, ou fragmento do mesmo, tem afinidade de ligação aumentada aoreceptor Fc e função efetuadora aumentada. Além disso, a invenção é dirigi-da a um fragmento de anticorpo e proteínas de fusão compreendendo umaregião que é equivalente à região Fc de imunoglobulinas.Aplicações Terapêuticas das ABMs modificadas de acordo com os métodosde acordo com os métodos.
No sentido mais amplo, as ABMs modificadas da presente in-venção podem ser usadas para objetivar células in vivo ou in vitro que ex-pressão um antígeno-alvo, em particular, onde o referido antígeno-alvo éexpresso sobre a superfície celular. As células expressando um antígeno-alvo podem ser objetivadas para fins diagnósticos ou terapêuticos. Em umaspecto, as ABMs modificadas da presente invenção podem ser usadas pa-ra alterar a atividade de sinalização de célula em células expressando umantígeno-alvo. Em outro aspecto, as ABMs modificadas da presente inven-ção podem ser usadas para alterar a reticulação e/ou oligomerização de umou mais antígenos-alvo. Antígenos-alvo para as ABMs modificadas da pre-sente invenção podem ser receptores na superfície celular incluindo, masnão limitado a, CD20, CD21, CD22, CD19, CD47, CD99, CD2, CD45, HER1(EGFR), Her2/neu, Her3, Her4, receptores TRAIL (por exemplo, TRAILR1,TRAILR2), TNFR, receptores FGF (por exemplo, FGFR1), receptores IGF,receptores PDGF, receptores VEGF e outros receptores associados à super-fície celular. Em uma modalidade particular, o antígeno-alvo é CD20. AsABMs modificadas da invenção também atuam para interromper o ciclo celu-lar, causar apoptose das células-alvo (por exemplo, células tumorígenas)inibir a angiogênese e/ou causar diferenciação de células-alvo.
Em outro aspecto, a invenção é dirigida a um método para tra-tamento de uma doença que é tratável através de atividade de sinalizaçãocelular alterada de um antígeno-alvo e/ou através de capacidade alterada demediar a reticulação de um ou mais antígenos-alvo compreendendo adminis-tração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ABM modificadada presente invenção a um indivíduo que precisa do mesmo. Em uma moda-lidade específica, a ABM modificada é um anticorpo. Em uma modalidademais específica, o anticorpo é humanizado. Exemplos de doenças para asquais as ABMs modificadas podem ser administradas incluem, mas não es-tão limitadas a, doenças ou distúrbios de proliferação celular, doenças oudistúrbios auto-imunes e doenças ou distúrbios relacionados à infecção bac-teriana ou viral.
Em uma modalidade, a doença ou distúrbio é um distúrbio deproliferação celular. Exemplos de distúrbios de proliferação celular que po-dem ser tratados por uma ABM da presente invenção incluem, mas não es-tão limitados a, neoplasmas, cânceres, malignidades e/ou tumores localiza-dos no abdômen, osso, mama, sistema digestivo, fígado, pâncreas, peritô-nio, glândulas endócrinas (adrenal, paratireóide, pituitária, testículo, ovário,timo, tiróide), olho, cabeça e pescoço, sistema nervoso (central e periférico),sistema linfático, pélvis, pele, tecidos moles, baço, região torácica e sistemaurogenital. Neoplasmas, cânceres, malignidades e/ou tumores particularesque podem ser tratados com as ABMs da invenção incluem, mas não estãolimitados a, carcinomas de célula epidérmica e escamosa, gliomas, câncerpancreático, câncer ovariano, câncer de próstata, câncer de mama, câncerde bexiga, câncer de cabeça e pescoço, carcinomas de células renais, cân-cer de cólon, câncer cólon-retal, câncer de pulmão, câncer de cérebro, me-lanoma maligno, leucemia, linfomas, Iinfomas de célula T, mieloma múltiplo,câncer gástrico, câncer cervical, carcinoma endometrial, câncer esofageal,câncer de fígado, câncer cutâneo, carcinoma do trato urinário, coriocarcino-ma, câncer faringeal, câncer laringeal, tecomatose, androblastoma, hiperpla-sia do endométrio, endometriose, ernbrioma, fibrossarcoma, sarcoma de Ka-posi, hemangioma, hemangioma cavernoso, angioblastoma, retinoblastoma,astrocitoma, neurofibroma, oligodendroglioma, meduloblastoma, ganglioneu-roblastoma, glioma, rhabdmiossarcoma, hamartoblastoma, sarcoma osteo-gênico, leiomiosarcoma, sarcoma da tiróide, sarcoma de Ewing e tumor deWilms.
Similarmente, outros distúrbios de proliferação celular tambémpodem ser tratados com as ABMs modificadas da presente invenção. Exem-plos de tais distúrbios de proliferação celular incluem, mas não limitados a,hipergamaglobulinemia, distúrbios lipoproliferativos, paraproteinemias, púr-pura, sarcoidose, síndrome de Sezary, macroglobulinemia de Waldenstron,doença de Gaucher1 histiositose e qualquer outra doenças de proliferaçãocelular, além de neoplasia, localizada em um sistema de órgão listado aci-ma.
Exemplos de doenças ou distúrbios auto-imunes incluem, masnão estão limitados a, trombocitopenias imunemediadas, tais como tromboci-topenia púrpura idiopática aguda e trombocitopenia púrpura idiopática crôni-ca, dermatomiosite, coréia de Sydenham, nefrite por lúpus, febre reumática,síndromes poliglandulares, púrpura de Henoch-Schonleinm nefrite pós-estreptocócica, eritema nosodum, arterite de Takayasu, doença de Addison,eritema multiforme, poliarterite nodosa, espondilite anquilosante, síndromede Goodpasture, tromboangiíte obliterans, cirrose biliar primária, tiroidite deHashimoto1 tirotoxicose, hepatite crônica ativa, polimiosite/dermatomiosite,policondrite, pênfigo vulgaris, granulomatose de Wegener1 nefropatia mem-branosa, esclerose lateral amiotrófica, tabes dorsalis, polimiaglia, anemiaperniciosa, glomerulonefrite de progressão rápida e alveolite fibrosante, res-postas infamatórias, tais como doenças inflamatórias da pele, incluindo pso-ríase e dermatite (por exemplo, dermatite atópica); escleroderma sistêmico eesclerose; respostas associadas à doença inflamatória do intestino (tal comodoença de Crohn e colite ulcerativa); síndrome de dificuldade respiratória(incluindo síndrome de dificuldade respiratória em adultos; ARDS); dermati-te; meningite; encefalite; uveíte; colite; glomerulonefrite; condições alérgicas,tais como eczema e asma e outras condições envolvendo infiltração de célu-Ias T e respostas inflamatórias crônicas; aterosclerose; deficiência de ade-são leucocitária; artrite reumatóide; lúpus eritematoso sistêmico (SLE); dia-betes mellitus (por exemplo, diabetes mellitus do tipo 1 ou diabetes mellituspor deficiência de insulina); esclerose múltipla; síndrome de Reynayd; tiroidi-te auto-imune; encefalomielite alérgica; síndrome de Sjorgen; diabetes cominício juvenil; e respostas imunes associadas à hiperssensibilidade aguda eretardada mediada por citocinas e linfócitos T tipicamente encontrados emtuberculose, sarcoidose; polimiosite, granulomatose e vasculite; anemia per-niciosa (doença de Addison); doenças envolvendo diapedese leucocitária;distúrbio inflamatório do sistema nervoso central (CNS); síndrome de lesãomúltipla de órgão; anemia hemolítica (incluindo, mas não limitado a, crioglo-binemia ou anemia Coombs-positiva); miastenia gravis; doenças mediadaspelo complexo antígeno-anticorpo; doença da membrana de base anti-glomerular; síndrome anti-fosfolipídio; neurite alérgica; doença de Graves;síndrome miastênica de Lambert-Eaton; pênfigo bolhoso; pênfigo; poliendo-crinopatias auto-imunes; doença de Reiter; síndrome de Stiffman; doença deBehcet; arterite de células gigantes; nefrite do complexo imune; nefropatiapor IgA; polineuropatias por IgM; trombocitopenia púrpura imune (ITP); outrombocitopenia auto-imune, etc.
As ABMs modificadas da presente invenção podem ser usadassozinhas ou em combinação com outros tratamentos ou agentes terapêuti-cos para tratar distúrbios que são tratáveis através de aumento ou diminui-ção da atividade de sinalização e/ou reticulação de um ou mais antígenos-alvo. Em uma modalidade, ABMs modificadas da presente invenção podemser usadas sozinhas para objetivar e matar células tumorígenas in vivo. AsABMs modificadas também podem ser usadas em conjunto com um agenteterapêutico apropriado para tratar carcinoma humano. Por exemplo, asABMs modificadas podem ser usadas em combinação com métodos de tra-tamento padrões ou convencionais, tais como quimioterapia, terapia de radi-ação ou podem ser conjugadas ou ligadas a um fármaco ou toxina terapêuti-ca, bem como a uma Iinfocina ou um fator de crescimento inibitório de tumor,para a distribuição do agente terapêutico ao local do carcinoma. Em modali-dades particulares, os conjugados das ABMs modificadas da presente in-venção incluem (1) imunotoxinas (conjugados da ABM modificada e umaporção citotóxica) e (2) ABMs modificadas rotuladas (por exemplo, radio-rotuladas, enzima-rotuladas ou fluorocroma-rotuladas) nas quais o rótuloproporciona um meio para a identificação de complexos imunes que incluema ABM rotulada. As ABMs modificadas também podem ser usadas para in-duzir à Iise através do processo natural de complemento e interagir com cé-lulas citotóxicas anticorpo-dependentes normalmente presentes.
A porção citotóxica da imunotoxina pode ser um fármaco citotó-xico ou uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana ou vegetalou um fragmento enzimaticamente ativo ("cadeia A") de tal toxina. Toxinasenzimaticamente ativas e fragmentos dos mesmos usados são cadeia A dedifteria, fragmentos ativos de não ligação da toxina de difteria, cadeia A deexotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, cadeia A deabrina, cadeia A de monodecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii,proteínas de diantina, proteínas de Fitolacca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonariaofficinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina e enomicina. Emoutra modalidade, as ABMs modificadas são conjugadas a fármacos anti-câncer de pequena moléculas. Conjugados da ABM modificada e tais por-çoes citotóxicas são feitos usando uma variedade de agentes de acoplamen-to de proteína bifuncionais. Exemplos de tais reagentes são SPDP, IT, deri-vados bifuncionais de imidoésteres, tal como HCI de dimetil adipimidato, és-teres ativos, tal como suberato de dissuccinimidila, aldeídos, tal como gluta-raldeído, compostos de bis-azido, tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodia-mina, diisocianatos, tal como 2,6-diisocianato de tolileno e compostos deflúor bis-ativos, tal como 1,5- difluoro-2,4-dinitrobenzeno. A porção de Iise deuma toxina pode ser unida ao fragmento Fab das ABMs modificadas. Toxi-nas apropriadas adicionais são conhecidas na técnica, conforme evidencia-do, por exemplo, no Pedido de Patente U.S. publicado No. 2002/0128448,incorporado aqui por referência em sua totalidade.
Em uma modalidade, a molécula de ligação a antígeno da pre-sente invenção é conjugada a uma porção adicional, tal como um radiorrótu-lo ou uma toxina. Tais ABMs modificadas conjugadas podem ser produzidasatravés de numerosos métodos que são bem-conhecidos na técnica.
Uma variedade de radionuclídeos são aplicáveis à presente in-venção e aqueles versados na técnica são creditados com a capacidade dedeterminar prontamente qual radionuclídeo é mais apropriado sob uma vari-edade de circunstâncias. Por exemplo 131 iodo é um radionuclídeo bem-conhecido usado para imunoterapia objetivada. Contudo, a utilidade clínicado 131iodo pode estar limitada por vários fatores, incluindo: meia-vida físicade oito dias; dealogenação de anticorpo iodinado no sangue e nos locais detumor; e características de emissão (por exemplo, grande componente-gama) os quais podem ser sub-ótimos para depósito dose-localizado no tu-mor. Com o advento de agentes de quelação superiores, a oportunidade defixação de grupos de quelação de metal à proteínas tem aumentado as opor-tunidades de utilizar outros radionuclídeos, tais como 111 índio e 90Itrio. 90Itrioproporciona vários benefícios para utilização em aplicação radioimuno-terapêuticas: a meia-vida de 64 horas do 90Itrio é longa o bastante para per-mitir acúmulo de anticorpo pelo tumor e, diferente do 131 iodo, por exemplo, o90trio é um beta emissor puro de alta energia sem irradiação gama associa-da em seu decay, com uma faixa em tecido de 100 a 1000 diâmetros de cé-lula. Além disso, a quantidade mínima de radiação que penetra permite aadministração ambulatorial de anticorpos rotulados com 90ítrio. Adicional-mente, internalização de anticorpo rotulado não é requerida para morte celu-lar e a emissão local de radiação ionizante seria letal para células tumoríge-nas adjacentes carecendo do antígeno-alvo.
Dosagens de único tratamento eficazes (isto é, quantidades te-rapeuticamente eficazes) de ABMs modificadas rotuladas com 90Itrio da pre-sente invenção oscilam de entre cerca de 5 e cerca de 75 mCi, mais preferi-velmente entre cerca de 10 e cerca de 40 mCi. Dosagens não-ablativas demedula para um único tratamento eficaz de 131 iodo da presente invençãooscilam de entre cerca de 5 e cerca de 70 mCi, mais preferivelmente entrecerca de 5 e cerca de 40 mCi. Dosagens âblativas para um único tratamentoeficaz (isto é, pode requerer transplante de medula óssea autólogo) de anti-corpos rotulados com 131 iodo da presente invenção oscilam de entre cercade 30 e cerca de 60 mCi, mais preferivelmente entre cerca de 50 e menosdo que cerca de 500 mCi. Em conjunto com um anticorpo quimérico de a-cordo com a presente invenção, levando-se em conta a meia-vida em circu-lação mais longa vis-a-vis anticorpos de murino, dosagens não-ablativas namedula para um único tratamento eficaz de anticorpos quiméricos rotuladoscom 131iodo oscilam entre cerca de 5 e 40 mCi, mais preferivelmente menosdo que cerca de 30 mCi. Critérios para formação de imagem, por exemplo,para o rótulo 101 índio são, tipicamente, menos que cerca de 5 mCi.
Com relação aos anticorpo radiorrotulados da presente inven-ção, terapia com os mesmos pode ocorrer também usando um único trata-mento de terapia ou usando múltiplos tratamentos . Em virtude do compo-nente radio-nuclídeo, é preferido que, antes de tratamento, células troncoperiféricas ("PSC") ou medula óssea ("BN") sejam "coletadas" para pacientesexperimentando toxicicidade na medula óssea potencialmente fatal resultan-te de radiação. BM e/ou PSC são coletadas usando técnicas padrões e, en-tão, purgadas e congeladas para possível reinfusao. Adicionalmente, é maispreferido que, antes de tratamento, um estudo de dosimetria diagnostica u-sando um anticorpo diagnóstico rotulado (por exemplo, usando 101 índio) sejaconduzido no paciente, uma finalidade do qual é assegurar que o anticorpoterapeuticamente rotulado (por exemplo, usando 90Itrio) não se torne desne-cessariamente "concentrado" em qualquer órgão ou tecido normal.Em uma modalidade, uma ABM modificada glico-manipuladaquimérica da presente invenção é conjugada à cadeia A de ricina. Mais van-tajosamente, a cadeia A de ricina é desglicosilada e produzida através demeios recombinantes. Um método vantajoso de fabricação da imunotoxinade ricina é descrito em Vitetta e outros, Science 238, 1098 (1987), aqui in-corporado por referência.
Quando usados para matar células cancerígenas humanas oufins diagnósticos in vitro, os conjugados serão, tipicamente, adicionados aomeio de cultura de célula em uma concentração de pelo menos cerca de 10nM. A formulação e um modo de administração para uso in vitro não sãocríticos. Formulações aquosas que são compatíveis com o meio de culturaou o meio de perfusão normalmente serão usadas. Citotoxicidade pode serlida através de técnicas convencionais para determinar a presença ou o graude câncer.
Conforme discutido acima, um produto radio-farmacêutico citotó-xico para o tratamento de câncer pode ser feito através de conjugação a umisótopo radiativo (por exemplo, I, Y, Pr) a uma ABM modificada e/ou glico-manipulada quimérica da presente invenção. O termo "porção citotóxica",conforme usado aqui, se destina a incluir tais isótopos.
Em outra modalidade, Iipossomas são enchidos com um fárma-co citotóxico e os Iipossomas são revestidos com as ABMs da presente in-venção. Em virtude do fato de muitas das moléculas-alvo para as ABMs mo-dificadas da presente invenção serem expressas sobre a superfície celular(por exemplo, existem tantas moléculas de CD20 sobre a superfície das cé-lulas B malignas, esse método permite distribuição de grandes quantidadesde fármaco ao tipo correto de célula).
Técnicas para conjugação de tais agentes terapêuticos a anti-corpos são bem-conhecidas (vide, por exemplo, Arnon e outros, "MonoclonalAntibodies for Immunotargeting of Drugs in Câncer Therapy", em MonoclonalAntibodies and Câncer Therapy, Reisfeld e outros (eds.), páginas 243-56(Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom e outros, "Antibodies For Drug Delivery",em Controlled Drug Delivery {2- Ed.), Robinson e outros, (eds.), páginas623-53 (Mareei Defcker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of CytotoxicAgents In Câncer Therapy; A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biolo-gical and Clinicai Applications, Pinchera e outros (eds.), páginas 475-506(1985); e Thorpe e outros, "The Preparation e Cytotoxic Properties Of Anti-body-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982) (cada um dosquais é aqui incorporado por referência em sua totalidade).
Ainda outras aplicações terapêuticas para as ABMs da invençãoincluem conjugação ou ligação, por exemplo, através de técnicas de DNArecombinante, a uma enzima capaz de converter um pró-fármaco em umfármaco citotóxico e o uso desse conjugado de anticorpo-enzima em combi-nação com o pró-fármaco para converter o pró-fármaco em um agente cito-tóxico no local do tumor (vide, por exemplo, Senter e outros, "Anti-TumorEffects of Antibody-alkaline Phosphatase", Proc. NatL Acad. Sci USA 55:4842-46 (1988); "Enhancement ofthe in vitro e in vivo Antitumor Activites ofPhosphorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Anti-body-Alkaiine Phosphatase Conjugates", Câncer Research 49: 5789-5792(1989); e Senter, "Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates: ANew Approach to Câncer Therapy," FASEB J. 4: 188-193 (1990)).
Ainda outro uso terapêutico para as ABMs da invenção envolveo uso, não conjugado, na presença de complemento ou como parte de umconjugado de anticorpo-fármaco ou anticorpo-toxina, para remover célulastumorígenas da medula óssea de pacientes com câncer. De acordo com es-sa abordagem, medula óssea autóloga podem ser purgadas ex vivo atravésde tratamento com o anticorpo e a medula infundida de volta no paciente(vide, por exemplo, Ramsay e outros, "Bone Marrow Purging Using Mono-clonal Antibodies", J. Clin. Immunol, 8(2): 81 -88 (1988)).
Além disso, considera-se que a invenção compreende uma ca-deia de imunoglobulina simples compreendendo domínios de ligação a antí-geno que permitem substancialmente a mesma especificidade de ligaçãoque o anticorpo precursor (por exemplo, polipeptídeos compreendendo asCDRs do anticorpo precursor) e ainda compreendendo um polipeptídeo detoxina. As imunotoxinas com cadeia simples da invenção podem ser usadaspara tratar carcinoma humano in vivo.
Similarmente, uma proteína de fusão compreendendo pelo me-nos uma região de ligação a antígeno de uma ABM da invenção unida a pelomenos uma porção funcionalmente ativa de uma segunda proteína tendoatividade anti-tumor, por exemplo, Iinfocina ou oncostatina, pode ser usadapara tratar carcinoma humano in vivo.
A presente invenção proporciona um método para matar seleti-vamente células tumorígenas expressando receptores na superfície celularincluindo, mas não limitado a CD20, HER1 (EGFR), Her2/neu, Her3, Her4,receptores TRAIL (por exemplo, TRAILR1, TRAILR2), TNFR, receptoresFGF (por exemplo, FGFR1), receptores IGF, receptores PDGF, receptoresVEGF e outros receptores associados à superfície celular. Esse métodocompreende relação da ABM modificada da invenção (conjugada, por exem-plo, como uma imunotoxina ou não conjugada) com as referidas células tu-morígenas. Essas células tumorígenas podem ser de um carcinoma huma-no.
Adicionalmente, a presente invenção proporciona um método detratamento de carcinomas (por exemplo, carcinomas humanos) in vivo. Essemétodo compreende administração, a um indivíduo, de uma quantidade far-maceuticamente eficaz de uma composição contendo pelo menos uma dasABMs modificadas da invenção (conjugadas, por exemplo, como uma imu-notoxina ou não conjugadas.)
Em um outro aspecto, a invenção é dirigida a um método aper-feiçoado para o tratamento de distúrbios proliferativos de células-β, incluindolinfoma de células-β, bem como uma doença auto-imune produzida, no todoou em parte, por auto-anticorpos patogênicos, baseado em depleção de cé-lulas-β compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamen-te eficaz de uma ABM da presente invenção a um ser humano que precisado mesmo. Em uma modalidade preferida, a ABM é um anticorpo anti-CD20glico-manipulado com uma especificidade de ligação substancialmente amesma que aquela do anticorpo B-Iyl de murino. Em outra modalidade pre-ferida, o anticorpo é humanizado. Nesse aspecto da invenção, as ABMs dainvenção são usadas para privar o sangue de células-β normais durante umperíodo de tempo prolongado.
De acordo com a prática da presente invenção, o indivíduo podeser um ser humano, eqüino, suíno, bovino, murino, canino, felino, e aves.
Outros animais de sangue quente também são inclusos na presente inven-ção.
A invenção em questão ainda compreende métodos para a inibi-ção do crescimento de células tumorígenas humanas, tratamento de um tu-mor em um indivíduo e tratamento de uma doença do tipo proliferativo emum indivíduo. Esses métodos compreendem a administração, ao indivíduo,de uma quantidade eficaz da composição da invenção.
Em uma modalidade, a invenção se refere a uma ABM de acor-do com a presente invenção para uso no tratamento ou profilaxia de câncer,uma condição ou lesão pré-cancerígena ou um distúrbio auto-imune. Emainda outra modalidade, a invenção se refere a uma ABM de acordo com apresente invenção para uso como um medicamento para o tratamento ouprofilaxia de câncer, uma condição ou lesão pré-cancerígena ou uma doençaauto-imune. O câncer pode ser, por exemplo, Iinfoma de células-β, câncer depulmão, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCL), câncer de pul-mão de células bronquialveolares, câncer de osso, câncer pancreático, cân-cer de pele, câncer da cabeça e pescoço, melanoma cutâneo ou intra ocular,câncer uterino, câncer ovariano, câncer retal, câncer da região anal, câncerde estômago, câncer gástrico, câncer de colón, câncer de mama, cânceruterino, carcinoma das trompas falopianas, carcinoma do endométrio, carci-noma do cérvix, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, doença de Hodg-kin, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema en-dócrino, câncer da glândula tiróide, câncer da glândula paratireóide, câncerda glândula adrenal, sarcoma de tecidos moles, câncer da uretra, câncer dopênis, câncer de próstata, câncer da bexiga, câncer do rim ou ureter, carci-noma de células renais, carcinoma da pélvis renal, mesotelioma, câncer he-patocelular, câncer biliar, leucemia aguda ou crônica, Iinfomas linfocíticos,neoplasmas do sistema nervoso central (CNS), tumores do eixo espinhal,glioma do tronco cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwano-mas, ependimomas, meduloblastomas, menigiomas, carcinomas de célulasescamosas, adenomas da pituitária, incluindo versões resistentes de qual-quer um dos cânceres acima ou uma combinação de um ou mais dos cânce-res acima. A condição ou lesão pré-cancerígena inclui, por exemplo, o grupoconsistindo em Ieucoplasia oral, queratose actínica (queratose solar), pólipospré-cancerígenos do cólon ou reto, displasia epitelial gástrica, displasia ade-nomatosa, síndrome de câncer de cólon de não-polipose hereditária(HNPCC), esôfago de Barrett, displasia de bexiga e condições cervicais pré-cancerígenas.
De preferência, o câncer é selecionado do grupo consistindo emlinfoma de células-β, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer de cabeçae pescoço, câncer de pele, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncerovariano, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de rim e câncer decérebro. Exemplos de distúrbios auto imunes são fornecidos acima.
Ainda outra modalidade é o uso da ABM de acordo com a pre-sente invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento ouprofilaxia de câncer ou para o tratamento ou profilaxia de uma condição oulesão pré-cancerígena. Câncer e condição ou lesão pré-cancerígena sãodefinidos conforme acima.
É evidente, portanto, que a presente invenção abrange composi-ções farmacêuticas, combinações, usos e métodos para tratamento de car-cinomas humanos. Por exemplo, a invenção inclui composições farmacêuti-cas para uso no tratamento de carcinomas humanos compreendendo umaquantidade farmaceuticamente eficaz de um anticorpo da presente invençãoe um veículo farmaceuticamente aceitável.
As composições de ABM da invenção podem ser administradasusando modos convencionais de administração incluindo, mas não limitadoa, intravenosa, intraperitoneal, oral, intralinfática ou administração diretamen-te no tumor. Administração intravenosa é preferida.
Em um aspecto da invenção, formulações terapêuticas contendoas ABMs da invenção são preparadas para armazenamento através de mis-tura de um anticorpos tendo o grau desejado de pureza com veículos, exci-pientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Reming-ton's Pharmaceutical Sciences 16ã edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma deformulações Iiofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipientes ou esta-bilizantes aceitáveis são não tóxicos para os recipientes nas dosagens econcentrações empregadas e incluem tampões, tais como fosfato, citrato eoutros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metioni-na; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloretode hexametônio; cloreto benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcoolbutílico ou benzílico; alquil parabenos, tais como metil ou propil parabeno;catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos debaixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas taiscomo albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos,tal como polivinilpirrolidona; aminoácido, tais como, glicina, glutamina, aspa-ragína, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos* dissacarídeos e outroscarboidratos, incluindo, glicose, manose ou dextrinas; agentes de quelação,tal como EDTA; açúcares, tais como, sacarose, manitol, trealose ou sorbitol;contra-íons de formação de sal, tal como sódio; complexos de metal (porexemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não-iônicos, tais co-mo TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG).
Formulações de ABM anti-CD20 exemplificativas são descritasno W098/56418, expressamente incorporado aqui por referência. Essa pu-blicação descreve uma formulação multi-dose líquida compreendendo 40mg/mL de rituximab, acetato a 25 mM, trealose a 150 mM, álcool benzílico a0.9%, polissorbato 20 a 0,02% em um pH de 5,0 que tem uma vida útil mí-nima de 2 anos de armazenamento a 2-8°C. Outra formulação anti-CD20 deinteresse compreende 10 mg/mL de rituximab em 9,0 mg/mL de cloreto desódio, 7,35 mg/mL de dihidrato de citrato de sódio, 0,7 mg/mL de polissorba-to 80 e água estéreo para injeção, pH de 6,5. Na presente invenção, rituxi-mab pode ser substituído por uma ABM modificada da presente invenção.
Formulações Iiofilizadas adaptadas para administração subcutâ-nea são descritas no W097/04801. Tais formulações Iiofilizadas podem serreconstituídas com um diluente adequado para uma alta concentração deproteína e a formulação reconstituída pode ser administrada subcutanea-mente ao mamífero a ser tratado aqui.
A formulação aqui também pode conter mais de um compostoativo, conforme necessário para a indicação que está sendo tratada em par-ticular, de preferência, aqueles com atividades complementares que não afe-tam adversamente uns aos outros. Por exemplo, pode ser desejável propor-cionar ainda um agente citotóxico, agente quimioterapêutico, citocina ou a-gente imunossupressor (por exemplo, um o qual atua sobre células T, talcomo ciclosporina ou um anticorpo que se liga à células T, por exemplo, umo qual se liga ao LFA-1). A quantidade eficaz desses outros agentes depen-de da quantidade de antagonista presente na formulação, do tipo de doen-ças ou distúrbio ou tratamento e dos outros fatores discutidos acima. Essesgeralmente são usados na mesma dosagem e com as vias de administraçãoconforme usado aqui antes ou de cerca de 1 a 99% das dosagens emprega-das aqui antes.
Os ingredientes ativos podem também estar contidos em micro-cápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de coacervação oupolimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de gelatina ou hidro-ximetil celulose e microcápsulas de (poli)metilmetacrilato, respectivamente,em sistemas de distribuição de fármaco coloidais (por exemplo, lipossomas,microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas)ou em microemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington1S Phar-maceutical Sciences 16ã edição, Osol, A. Ed. (1980).
Preparados com liberação sustentada podem ser feitos. Exem-plo adequados de preparados com liberação sustentada incluem matrizessemipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o antagonista,matrizes as quais estão na forma de artigos formatados, por exemplo, filmesou microcápsulas. Exemplos de matrizes com liberação sustentada incluempoliésteres, hidrogéis (por exemplo, (poli)2-hidróxietil- metacrilato ou álcool(poli)vinílico, polilactídeos (Pat. U.S. Nq 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e Yetil-L-glutamato, etileno- acetato de vinila não degradável, co-polímeros de ácido láctico- ácido glicólico degradáveis, tal como o LUPRONDEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolida e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
As formulações a serem usadas para administração in vivo de-vem ser estéreis. Isso é prontamente obtido por meio de filtração através demembranas de filtração estéreis.
As composições da invenção podem estar em uma variedade deformas de dosagem as quais incluem, mas não estão limitadas a, soluçõesou suspensões líquidas, comprimidos, pílulas, pós, supositórios, microcápsu-las ou microvesículas poliméricas, lipossomas e soluções injetáveis ou infu-síveis. A forma preferida depende do modo de administração e da aplicaçãoterapêutica.
As composições da invenção também incluem, de preferência,veículos e adjuvantes convencionais farmaceuticamente aceitáveis conheci-dos na técnica, tais como albumina de soro humano, permutadores de íons,alumina, lecitina, substâncias tampão tais como fosfatos, glicina, ácidos sór-bico, sorbato de potássio e sais ou eletrólitos, tal como sulfato de protamina.
O modo mais eficaz de administração e o regime de dosagempara as composições farmacêuticas da presente invenção dependem dagravidade e do curso da doença, da saúde do paciente e da resposta ao tra-tamento e do julgamento do médico que faz o tratamento. Conseqüentemen-te, as dosagens das composições deverão ser tituladas para o paciente indi-vidual. Todavia, uma dose eficaz das composições da presente invençãogeralmente estará na faixa de cerca de 0,01 a cerca de 2000 mg/kg.
As moléculas descritas aqui podem estar em uma variedade deformas de dosagem as quais incluem, mas não estão limitadas a, soluçõesou suspensões líquidas, comprimidos, pílulas, pós, supositórios, microcápsu-las ou microvesículas poliméricas, lipossomas e soluções injetáveis ou infu-síveis. A forma preferida depende do modo de administração e da aplicaçãoterapêutica.
As dosagens da presente invenção podem, em alguns casos,ser determinadas através do uso de biomarcadores previsíveis. Biomarcado-res previsíveis são marcadores moleculares que são usados para determinar(isto é, observar e/ou quantificar) um padrão de expressão e/ou ativação degenes ou proteínas tumor-relacionadas ou componentes celulares de umavia de sinalização tumor-relacionada. Elucidação dos efeitos biológicos deterapias objetivadas em tecido de tumor e correlação desses efeitos com aresposta clínica ajuda a identificar as vias de sobrevivência e crescimentopredominantes operativas em tumores, desse modo, estabelecendo um perfilde prováveis respondendores e, inversamente, proporcionando uma razãopara projetar estratégias para superar a resistência à terapia. Por exemplo,onde a ABM modificada é um anticorpo específico para EGFR, bio-marcadores para terapia anti-EGFR podem compreender uma ou mais mo-léculas que estão a jusante na via de sinalização de EGFR, levando a umdistúrbio de proliferação celular incluindo, mas não limitado a, Akt, RAS,RAF, MAPK, ERKI, ERK2, PKC, STAT3, STAT5 (Mitchell, Nature Biotech.22: 363-364 (2004); Becker, Nature Biotech 22: 15-18 (2004); Tsao e Herbst,Signal4: 4-9 (2003)). Biomarcadores para terapia anti-EGFR também podemcompreende receptores do fator de crescimento, tais como EGFR, ErbB-2(HER2/neu) e ErbB-3 (HER3) e podem ser prognósticos positivos ou negati-vos de resposta do paciente à terapia anti-EGFR. Por exemplo, o receptorde fator de crescimento ErbB-3 (HER3) foi determinado como sendo um bi-omarcador prognóstico negativo para o anticorpo anti-EGFR ABX-EGF (Pub.de Pedido de Patente U.S. No. 2004/0132097 A1)
Biomarcadores prognósticos podem ser medidos através de en-saios celulares que são bem-conhecidos na técnica incluindo, mas não Iimi-tado a, imunoistoquímica, citometria de fluxo, imunofluorescência, ensaiosde captura-e-detecção e ensaios de fase reversa e/ou ensaios apresentadosna Pub. de Pedido de Patente U.S. No. 2004/0132097 A1, os conteúdos to-dos do qual são aqui incorporados por referência. Biomarcadores prognósti-cos de terapia anti-EGFR, em si, podem ser identificados de acordo com astécnicas ensinadas na Pub. de Pedido de Patente U.S. Ng 2003/0190689A1,os conteúdos da qual são aqui incorporados por referência.
Assim, em um aspecto, a presente invenção proporciona um mé-todo para o tratamento de um distúrbio que está relacionado à sinalizaçãocelular alterada ou desregulada por um antígeno-alvo e/ou capacidade alte-rada de mediar a reticulação e/ou oligomerização de um ou mais antígenos-alvo compreendendo prognóstico de uma resposta à terapia com uma ABMmodificada em um ser humano que precisa de tratamento avaliando umaamostrado ser humano antes de terapia com um ou uma pluralidade de rea-gente que detectam a expressão e/ou ativação de biomarcadores prognósti-cos para um distúrbio que está relacionado à sinalização celular alterada oudesregulada por um antígeno-alvo e/ou capacidade alterada de mediar areticulação e/ou oligomerização de um ou mais antígenos-alvo (tal comocâncer); determinação de um padrão de expressão e/ou ativação de um oumais dos biomarcadores prognósticos, em que o padrão prevê a resposta doser humano à terapia com a ABM modificada; e administração a um ser hu-mano que é previsto como respondendo positivamente ao tratamento com aABM modificada, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma com-posição compreendendo uma ABM modificada da presente invenção. Con-forme usado aqui, um ser humano que é previsto como respondendo positi-vamente ao tratamento com uma ABM modificada é um para o qual a ABMmodificada terá um efeito mensurável sobre a doença ou distúrbio que é re-lacionado à sinalização celular alterada ou desregulada por um antígeno-alvo e/ou capacidade alterada de mediar a reticulação e/ou oligomerizaçãode um ou mais antígenos-alvo (por exemplo, regressão/retração de tumor) epara o qual os benefícios da terapia com ABM modificada não são suplanta-dos por efeitos adversos (por exemplo, toxicidade). Conforme usado aqui,uma amostra significa qualquer amostra biológica de um organismo, particu-larmente um ser humano, compreendendo uma ou mais células, incluindocélulas simples de qualquer origem, amostras de tecido ou biópsia as quaistenham sido removidas de órgãos tais como mama, pulmão, trato gastrintes-tinal, pele, cérvix, ovário, próstata, rim, cérebro, cabeça e pescoço, ou qual-quer outro órgão ou tecido do corpo e outras amostras corporais incluindo,mas não limitado a esfregaços, escarro, secreções, fluído cérebro - espi-nhal, bile, sangue, fluído linfático, urina e fezes.A composição compreendendo uma ABM modificada da presen-te invenção será formulada, dosada e administrada de um modo consistentecom a boa prática médica. Fatores para considerar nesse contexto incluem adoença ou distúrbio que está sendo tratado em particular, o mamífero queestá sendo tratado em particular, o local de distribuição do agente, o métodode administração, o esquema de administração e outros fatores conhecidospelos praticantes de medicina. A quantidade terapeuticamente eficaz do an-tagonista a ser administrada será orientada por tais considerações.
Como uma proposição geral, a quantidade terapeuticamente efi-caz do anticorpo administrada parenteralmente por dose estará na faixa decerca de 0,1 a 20 mg/kg de peso corporal do paciente por dia, com a faixainicial típica de antagonista sendo usada na faixa de cerca de 2 a 10 mg/kg.
Também preferivelmente, a ABM modificada é usada em umaquantidade terapeuticamente eficaz de cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 15mg/kg.
Também mais preferivelmente, a ABM modificada é usada emuma quantidade terapeuticamente eficaz de cerca de 1,5 mg/kg a cerca de12mg/kg.
Também mais preferivelmente, a ABM modificada é usada emuma quantidade terapeuticamente eficaz de cerca de 1,5 mg/kg a cerca de4,5 mg/kg.
Também mais preferivelmente, a ABM modificada é usada emuma quantidade terapeuticamente eficaz de cerca de 4,5 mg/kg a cerca de12 mg/kg.
Mais preferivelmente, a ABM modificada é usada em uma quan-tidade terapeuticamente eficaz de cerca de 1,5 mg/kg.
Também mais preferivelmente, a ABM modificada é usada emuma quantidade terapeuticamente eficaz de cerca de 4,5 mg/kg.
Também mais preferivelmente, a ABM modificada é usada emuma quantidade terapeuticamente eficaz de cerca de 12 mg/kg.
Em uma modalidade preferida, a ABM modificada é um anticor-po, de preferência um anticorpo humanizado. Dosagens adequadas para talanticorpo não conjugado estão, por exemplo, na faixa de cerca de 20 mg/ma cerca de 1000 mg/m. Em uma modalidade, a dosagem do anticorpo diferedaquela presentemente recomendada para o rituximab. Por exemplo, pode-se administrar ao paciente uma ou mais doses de substancialmente menosdo que cerca de 375 mg/m2 de anticorpo, por exemplo, onde a dose está nafaixa de cerca de 20 mg/m2 a cerca de 250 mg/m2, por exemplo, de cerca de50 mg/m2 a cerca de 200 mg/m2.
Além disso, pode-se administrar uma ou mais doses iniciais doanticorpo seguido por uma ou mais doses subseqüentes, em que a dosemg/m2 do anticorpo nas doses subseqüentemente excede a dose mg/m2 doanticorpo na(s) dose(s) inicial(ais). Por exemplo, a dose inicial pode estar nafaixa de cerca de 20 mg/m2 a cerca de 250 mg/m2 (por exemplo, de cerca de50 mg/m2 a cerca de 200mg/m2) e a dose subseqüente pode estar na faixade cerca de 250 mg/m2 a cerca de 1000 mg/m2.
Conforme notado acima, contudo, essas quantidades sugeridasde ABM modificada estão sujeitas a uma grande cota de discernimento tera-pêutico. O fator chave na seleção de uma dose e um esquema apropriados éo resultado obtido, conforme indicado acima. Por exemplo, doses relativa-mente maiores podem ser necessárias inicialmente para o tratamento dedoenças agudas e em andamento. Para obter os resultados mais eficazes,dependendo da doença ou distúrbio, o antagonista é administrado tão logo oprimeiro sinal, diagnóstico ou aparecimento ou ocorrência da doença ou dis-túrbio quanto possível ou durante remissões da doença ou distúrbio.
A ABM modificada da presente invenção é administrada atravésde quaisquer meios adequados, incluindo parenteral, subcutânea, intraperi-toneal, intrapulmonar e intranasal e, se desejado, para tratamento imunos-supressor, administração intralesional. Infusões parenterais incluem adminis-tração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutâ-nea. Além disso, o antagonista pode ser, adequadamente, administrado a-través de infusão pulsada, por exemplo, com doses decrescentes do anta-gonista. De preferência, a dosagem é fornecida através de injeções, maispreferivelmente injeções intravenosas ou subcutâneas dependendo, em par-te, se a administração é breve ou crônica.
Pode-se administrar outros compostos, tais como agentes cito-tóxicos, agentes quimioterapêuticos, agentes imunossupressores e/ou cito-cinas com os antagonistas aqui. A administração combinada inclui co-administração, usando formulações distintas ou uma única formulação far-macêutica, e administração consecutiva em qualquer ordem em que, de pre-ferência, há um período de tempo enquanto ambos (ou todos) os agentesativos exercem simultaneamente suas atividades biológicas.
Será claro que a dose da composição da invenção requeridapara obter curas pode ser ainda reduzida com otimização do esquema.
De acordo com a prática da invenção, o veículo farmacêuticopode ser um veículo lipídico. O veículo lipídico pode ser um fosfolipídio. Ain-da, o veículo lipídico pode ser um ácido graxo. Também, o veículo lipídicopode ser um detergente. Conforme usado aqui, um detergente é qualquersubstância que altera a tensão de superfície de um líquido, geralmente redu-zindo-a.
Em um exemplo da invenção, o detergente pode ser um deter-gente não-iônico. Exemplos de detergentes não-iônicos incluem, mas nãoestão limitados a, polissorbato 80 (também conhecido com Tween 80 oumonooleato de polioxietilenossorbitan), Brij e Triton (por exemplo, Triton WR-1339 e Triton A-20).
Alternativamente, o detergente pode ser um detergente iônico.Um exemplo de um detergente iônico inclui, mas não está limitado a, brome-to de alquiltrimetilamônio.
Adicionalmente, de acordo com a invenção, o veículo lipídicopode ser um lipossoma. Conforme usado no presente pedido, um "liposso-ma" é qualquer vesícula ligada à membrana a qual contém quaisquer molé-culas da invenção ou combinações das mesmas.
Os exemplos abaixo explicam a invenção em maiores detalhes.Os preparados e exemplos a seguir são fornecidos para permitir que aquelesversados na técnica compreendam e pratiquem mais claramente a presenteinvenção. A presente invenção, contudo, não está limitada, quanto ao esco-po, pelas modalidades exemplificadas, as quais se destinam a ilustrar osaspectos únicos da invenção apenas e métodos os quais são funcionalmen-te equivalentes estão dentro do escopo da invenção. Na verdade, váriasmodificações da invenção, além daquelas descritas aqui, se tornarão eviden-tes para aqueles versados na técnica a partir da descrição precedente e de-senhos em anexo. Tais modificações se destinam a cair dentro do escopodas reivindicações em anexo.
Exemplos
A menos que de outro modo especificado, referências à nume-ração de posições de resíduo de aminoácido específicas nos Exemplos aseguir são de acordo com o sistema de numeração de Kabat.Exemplo 1
Materiais e Métodos
Clonagem e Expressão de anticorpo B-Iyl recombinanteCélulas de hibridoma expressando B-Iyl (vide, por exemplo,Poppema, S. e outros, 1987, Proceedings of the 9Q Biotest Symposium, Insti-tute of Education, Londres, (Sonneborn, H.H. e Tills, D, Eds.); Ling, N.R. eoutros, 1987, em Leucocyte Typing Conference III: White cell differentiationantigens, 302-355, Oxford University Press, Oxford. (AJ. McMichaeI, Ed.);Knapp, W. 1990. Leukocyte Typing Conference TV Proceedings, Oxford Uni-versity Press, Oxford) foram crescidas em RPMI contendo FBS a 10% e L-glutamina a 4 mM. 6 χ 106 células com uma viabilidade > 90% foram coleta-das e RNA total foi isolado usando um kit Qiagen RNAeasy midi. cDNAs quecodificam as cadeias pesada e leve variáveis do B-Iyl foram amplificadasatravés de RT-PCR. A reação de RT-PCR foi realizada usando as seguintescondições: 30 min a 50 0C para a síntese de cDNA de primeira filamento;desnaturação inicial de 15 min a 95 °C; 30 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min a45 °C, 1,5 min a 72 °C; e uma etapa final de alongamento durante 10 min a72 °C. O tamanho esperado dos produtos de PCR foi confirmado através deeletroforese. Os produtos de PCR foram clonados em vetores de E. coli eseqüenciamento de DNA confirmou que os genes que codificam as cadeiaspesada e leve variáveis foram isolados.Para construção de vetores de expressão-de B-Iyl quimérico,seqüências sinalizadoras sintéticas e sítios de restrição apropriados foramfundidos às cadeias variáveis através de reações de PCR adicionais. Apósuma confirmação final da seqüência de DNA correta das cadeias variáveis,elas foram combinadas com as regiões constantes de IgGI humana corres-pondentes. Uma vez que os genes foram construídos, eles foram clonadossob o controle do promotor de MPSV e a montante de um sítio de poliA sin-tético, usando dois vetores distintos, um para cada cadeia, resultando nosplasmídeos pETR1808 (vetor de expressão de cadeia pesada) e pETR1813(vetor de expressão de cadeia leve). Cada vetor trazia uma seqüência OriPde EBV.
B-Iyl quimérico foi produzido através de co-transfecção de célu-las HEK293-EBNA com vetores pETR1808 e pETR1813 usando uma abor-dagem de transfecção com fosfato de cálcio. Células HEK293 -EBNA emcrescimento exponencial foram transfectadas através do método com fosfatode cálcio. As células foram crescidas como culturas em monocamadas ade-rentes em frascos T usando meio de cultura DMEM suplementado comoFCS a 10% e foram transfectadas quando elas estivam entre 50 e 80% con-fluentes. Para a transfecção de um frasco T75, 8 milhões de células foramcultivadas 24 horas antes de transfecção em 14 ml de meio de culturaDMEM suplementado com FCS (a 10% v/v final), 250 μg/ml de neomicina eas células foram colocadas a 37 0C em uma incubadora com uma atmosferade 5% de CO2 durante a noite. Para cada frasco T75 a ser transfectado, umasolução de DNA, CaCI2 e água foi preparada através de mistura de 47 μg deDNA total de vetor de plasmídeo dividido igualmente entre os vetores de ex-pressão de cadeia pesada e leve, 235 μΙ de uma solução de CaCI2 a 1M eadicionando água até um volume final de 459 μΙ. A essa solução, 469 μΙ deHEPES a 50 mM, NaCI a 280 mM, solução de Na2HPO4 a 1,5 mM em um pHde 7,05 foram adicionados, misturados imediatamente durante 10 s e deixa-dos descansar em temperatura ambiente durante 20 s. A suspensão foi dilu-ída com 12 ml de DMEM suplementado com FCS a 2% e adicionado ao T75em lugar do meio existente. As células foram incubadas a 37 °C, 5% de CO2durante cerca de 17 a 20 horas, então, meio foi substituído por 12 ml deDMEM, FCS a 10%. Para a produção do anticorpo não modificado "chB-Ly1", as células foram transfectadas apenas com vetores de expressão deanticorpo pET1808 e pETR1813 em uma proporção de 1:1. Para a produçãodo anticorpo glico-manipulado "chB-Lyl-ge", as células foram co-transfectadas com quatro plasmídeos, dois para expressão de anticorpo(pETR1808 e pETR1813), um para expressão de uma fusão de GnTIII-polipeptídeo (pETR1519) e um para expressão de manosidase Il (pCLF9)em uma proporção de 4:4:1:1, respectivamente. No dia 5 pós-transfecção, osobrenadante foi coletado, centrifugado durante 5 min a 1200 rpm, seguidopor uma segunda centrifugação durante 10 min a 4000 rpm e mantido a 4°C.
chB-Lyl e chB-Lyl -ge foram purificados do sobrenadante de cultura usandotrês etapas cromatográficas seqüenciais, cromatografia em Proteína A, cro-matografia de troca de cátióhs e uma etapa de cromatografia por exclusãode tamanho sobre uma coluna Superdex 200 (Amersham Pharmacia) tro-cando o tampão para solução salina tamponada com fosfato e coletando opico de anticorpo monomérico dessa última etapa. A concentração de anti-corpo foi estimada usando um espectrofotômetro a partir da absorbância a280 nm.
Análise de oliqossacarídeo
Oligossacarídeos foram enzimaticamente liberados dos anticor-pos através de digestão com PNGaseF, com os anticorpos sendo imobiliza-dos sobre uma membrana de PVDF ou em solução.
A solução de digestão resultante contendo os oligossacarídeosliberados foi diretamente preparada para análise por MALD/TOF-MS ou foiainda digerida com glicosidase EndoH antes de preparação da amostra paraanálise por MALDI/TOF-MS.
Método de liberação de oliqossacarídeo para anticorpos imobilizados emmembrana de PVDF
As cavidades de uma lâmina com 96 cavidades feitas com umamembrana de PVDF (Immobilon P, Millipore, Bedford, Massachusetts) foramumedecidas com 100 μΙ de metanol e o líquido foi extraído através da mem-brana de PVDF usando vácuo aplicado à derivação de vácuo Multiscreen(Millipore, Bedford, Massachusetts). As membranas de PVDF foram lavadastrês vezes com 300 μΙ de água. As cavidades foram, então, lavadas com 50μl de tampão RCM (Uréia a 8M, Tris a 360 mM, EDTA a 3,2 mM, pH de 8,6).Entre 30-40 μρ de anticorpo foram carregados em uma cavidade contendo10 μl de tampão RCM. O líquido na cavidade foi extraído através da mem-brana através de aplicação de vácuo e a membrana foi subseqüentementelavada duas vezes com 50 μΙ de tampão RCM. A redução das ligações dedissulfeto foi realizada através da adição de 50 μΙ de ditiotreitol a 0,1 M émRCM e incubação a 37 0C durante 1 h.
Após redução, um vácuo foi aplicado para remover a solução deditiotreitol da cavidade. As cavidades foram lavadas três vezes com 300 μΙde água antes de realização da carboximetilação nos resíduos de cisteínaatravés da adição de 50 μΙ de ácido iodo acético a 0,1 M em tampão RCM eincubação em temperatura ambiente no escuro durante 30 min.
Após carboximetilação, as cavidades foram extraídas com vácuoe subseqüentemente lavadas três vezes com 300 μΙ de água. A membranade PVDF foi, então, bloqueada, para impedir adsorção da endoglicosidase,através de incubação de 100 μΙ de uma solução aquosa a 1% de polivinilpir-rolidona 360 em temperatura ambiente durante 1 hora. O reagente de blo-queio foi, então, removido através de ligeiro vácuo, seguido por três lava-gens com 300 μΙ de água.
Oligossacarídeos N-Iigados foram liberados através da adiçãode 2,5 mil de peptídeo-N-glicosidase F (N-glicanase recombinante, GLYKO,Novato, CA) e 0,1 mil de Sialidase (GLYKO, Novato, CA), para removerquaisquer resíduos de monossacarídeo carregados em potencial, em umvolume final de 25 μΙ em NaHCO3 a 20 mM, pH de 7,0. Digestão foi realizadadurante 3 horas a 37 °C.
Método de liberação de oliqossacarídeo para anticorpos em solução
Entre 40 e 50 μg de anticorpo foram misturados com 2,5 mU dePNGaseF (Glyko, E.U.A.) em Tris a 2 mM, pH de 7,0, em um volume final de25 μl e a mistura foi incubada durante 3 horas a 37 °C.Uso de digestão com endoalicosidase H de oliqossacarídeos PNGaseF-liberados para a atribuição de estruturas de oligossacarídeo bisseccionadohíbrido a picos de oliqossacarídeo neutro em MALDI/TOF-MS
Os oligossacarídeos liberados com PNGaseF foram subseqüen-temente digeridos com Endoglicosidase H (EC 3.2.1.96). Para a digestãocom EndoH1 15 mil de EndoH (Roche, Suíça) foram adicionados à digestãode PNGaseF (método de anticorpo em solução acima) para proporcionar umvolume final de 30 μl e a mistura foi incubada durante 3 horas a 37 °C. En-doH cliva entre os resíduos de N-acetilglicosamina do núcleo de quitobiosede oligossacarídeos N-ligados. A enzima pode digerir apenas oligomanose eglicanas do tipo mais híbrido, enquanto que oligossacarídeos do tipo com-plexo não são hidrolisados.
Preparação de amostra para MALDI/TOF-MS
As digestões enzimáticas contendo os oligossacarídeos libera-dos foram incubadas durante mais 3 h em temperatura ambiente após a adi-ção de ácido acético até uma concentração final de 150 mM e foram subse-qüentemente passadas através de 0,6 ml de uma resina de troca de cátions(resina AG50W-X8, forma de hidrogênio, 100-200 mesh, BioRad, Suíça) a-condicionada em uma coluna de cromatografia Micro-bio-spin (BioRad, Suí-ça) para remover os cátions e proteínas. Um microlitro da amostra resultantefoi aplicado a uma lâmina-alvo de aço inoxidável e misturado, sobre a lâmi-na, com 1 μl de matriz sDHB. A matriz sDHB foi preparada através de disso-lução de 2 mg de ácido 2,5-diidróxibenzóico mais 0,1 mg de ácido 5-metóxi-salicílico em 1 ml de etanol/cloreto de sódio aquoso a 10 mM a 1:1 (v/v). Asamostras foram secas ao ar, 0,2 μΙ de etanol foram aplicados e as amostrasforam finalmente deixadas re-cristalizar sob ar.
MALDI/TOF-MS
O espectrômetro de massa para MALDI-TOF usado para adquiriros espectros de massa era um Voyager Elite (Perspective Biosystems). Oinstrumento foi operado na configuração linear, com uma aceleração de 20kV e retardo de 80 ns. Calibração externa usando padrões de oligossacarí-deo foi usada para atribuição de massa dos íons. Os espectros de 200 pon-tos de laser foram resumidos para obter o espectro final.Depleção de células B de todo o sangue
495 μΙ de sangue heparinizado de um doador saudável foramtransformados em alíquotas em tubos de poliestireno de 5 ml, 5 μΙ de amos-tras de anticorpo 100 vezes concentradas (concentração final de 1-1000ng/ml) ou PBS apenas foram adicionados e os tubos foram incubados a 37°C. Após 24 h, 50 ml de sangue foram transferidos para um tubo novo e co-rados com anti-CD3-FITC, anti-CD19-PE e anti-CD45-CyChrome (Becton-Dickinson) durante 15 min em temperatura ambiente no escuro. Antes deanálise, 500 μΙ de tampão FACS (PBS contendo FCS a 2% e EDTA a 5 mM)foram adicionados aos tubos. A fluorescência de CD3-FITC e CD19-PE dasamostras de sangue foi analisada através de citometria de fluxo ajustandoum limiar sobre o CD45-CyChrome. Depleção de células B foi determinadaatravés de plotagem da proporção de células B CD19+ para células T CD3+.Ligação de anticorpo anti-CD20 à células de Raii
200.000 células em 180 μΙ de tampão FACS (PBS contendo FCSa 2% e EDTA a 5 mM) foram transferidas para tubos de poliestireno de 5 ml.Em seguida, 20 μΙ de amostras de anticorpo anti-CD20 10 vezes concentra-das (concentração final de 1 -5000 ng/ml) ou PBS apenas foram adicionadose os tubos foram incubados a 4 0C durante 30 min. Subseqüentemente, a-mostras foram lavadas duas vezes com tampão FACS e empelotadas a 300χ g durante 30 min. O sobrenadante foi aspirado e as células foram captadasem 100 μΙ de tampão FACS. Em seguida, 1 μΙ de fragmentos F(ab')2-FITCanti-Fc-específicos (Jackson Immuno Research Laboratories, EUA) foi adi-cionado e os tubos foram incubados a 4 0C durante 30 min. As amostras fo-ram lavadas duas vezes com tampão FACS e captadas em 500 μΙ de tam-pão FACS contendo 0,5 μg/ml de Pl para análise através de citometria defluxo. A ligação foi determinada através de plotagem da fluorescência médiageométrica contra as concentrações de anticorpo.
Exemplo 2
Abordagem do Aceitador de Alta HomologiaA busca pela "framework" aceitadora de anticorpo de alta homo-logia foi realizada através de alinhamento da seqüência de proteína B-Iyl decamundongo a uma coleção de seqüências de linhagem germinativa huma-na e pegando aquela seqüência humana que mostrou a maior identidade deseqüência. Aqui, a seqüência VH1_10 (locus 1-e, Ac. No. DP-88) do bancode dados VBase foi escolhida como a seqüência aceitadora de "framework"de cadeia pesada e a seqüência IGKV2-40 (Ac. No X59314) do banco dedados MGT foi escolhida como sendo o aceitador de "framework" para a ca-deia leve. Sobre essas duas frameworks âceitadoras, as três regiões de de-terminação de complementaridade (CDRs) dos domínios variáveis pesado eleve de camundongo foram enxertadas. Uma vez que a região 4 de "frame-work" não é parte da região variável do gene V de linhagem germinativa, oalinhamento para essa posição foi feito individualmente. A região JH4 foiescolhida para a cadeia pesada e a região JK4 foi escolhida para a cadeialeve. Modelamento molecular do domínio de imunoglobulina projetado reve-lou um ponto requerendo potencialmente os resíduos de aminoácido de mu-rino em vez daqueles humanos foram da CDR. Re-introdução dos resíduosde aminoácido de murino na "framework" humana geraria as assim denomi-nadas re-mutações. Por exemplo, o resíduo de aminoácido aceitador huma-no na posição 27 de Kabat sofreu remutação para um resíduo de tirosina.Variantes de anticorpo humanizadas foram projetadas, as quais incluíam ouomitiam as re-mutações. A cadeia leve de anticorpo humanizado não reque-reu quaisquer re-mutações. Após projetar as seqüências de proteína, se-qüências de DNA que codificam essas proteínas foram sintetizadas confor-me detalhado abaixo.
Abordagem de "framework" misturada
De forma a evitar introdução de remutações em posições de re-síduo de aminoácido críticas (críticas para reter boa afinidade de ligação aantígeno ou funções de anticorpo) da "framework" aceitadora humana, foiinvestigado se a região de "framework" 1 (FR1) inteira ou as regiões de"framework" 1 (FR1) e 2 (FR2) juntas, poderiam ser substituídas por se-qüências de anticorpo humano já tendo resíduos doadores ou aqueles fun-cionalmente equivalentes, naquelas posições importantes na seqüência delinhagem germinativa humana natural. Para essa finalidade, as frameworks 1e 2 de VH da seqüência de B-Iyl de camundongo foram alinhadas individu-almente às seqüências de linhagem germinativa humanas. Aqui, a maioridentidade de seqüência não era importante e não foi usada para escolhadas frameworks aceitadoras mas, antes, combinação de vários resíduos crí-ticos foi admitida como sendo mais importante. Esses resíduos críticos com-preendem os resíduos 24, 71 e 94 (numeração de Kabat) e também aquelesresíduos nas posições 27, 28 e 30 (numeração de Kabat), os quais repou-sam fora da definição de CDR1 por Kabat, mas freqüentemente estão envol-vidos na ligação a antígeno. A seqüência de IMGT IGHV3-15 (Ac. NoX92216) foi escolhida como uma adequada. Após ter projetado as seqüên-cias de proteína, seqüências de DNA que codificam essas proteínas foramsintetizadas conforme detalhado abaixo. Usando essa abordagem, nenhumaremutação foi requerida para a cadeia pesada ou leve, de forma a reter bonsníveis de ligação a antígeno.
Síntese dos genes de anticorpo
Após ter projetado a seqüência de aminoácido da região V deanticorpo humanizado, a seqüência de DNA tinha de ser gerada. Os dadosde seqüência de DNA das regiões de "framework" individuais foram encon-trados em bancos de dados para seqüências de linhagem germinativa hu-mana. A seqüência de DNA das regiões de CDR foi tomada dos dados decDNA de murino correspondentes. Com essas seqüências, a seqüência deDNA inteira foi virtualmente montada. Tendo esses dados de seqüência deDNA, sítios de restrição diagnósticos foram introduzidos na seqüência virtu-al, através de introdução de mutações silenciosas, criando sítios de reco-nhecimento para endonucleases de restrição. Para obter a cadeia de DNAfísica, síntese de gene foi realizada (por exemplo, Wheeler e outros, 1995).Nesse método, oligonucleotídeos são projetados a partir dos genes de inte-resse, de modo que uma série de oligonucleotídeos são derivados da fila-mento de codificação e uma outra série é da filamento de não-codificação.As extremidades 5' e 3' de cada oligonucleotídeo (exceto as primeira e últi-ma na fileira) sempre mostram seqüências complementares dos dois inicia-dores derivados da filamento oposta. Quando de colocação desses oligonu-cleotídeos em um tampão de reação adequado para qualquer polimeraseestável ao calor e adição de Mg2+, dNTPs e uma DNA polimerase, cada oli-gonucleotídeo é estendido a partir de sua extremidade 3'. A extremidade 3'recentemente formada de um iniciador, então, se anela com o próximo inici-ador da filamento oposta e estende sua seqüência ainda sob condições a-dequadas para alongamento de cadeia de DNA mocfe/o-dependente. O pro-duto final foi clonado em um vetor convencional para propagação em E. coli.
Produção de anticorpo
As seqüências líderes de cadeia pesada e leve humanas (parasecreção) foram adicionadas a montante das seqüências de região variávelacima e essas foram, então, unidas a montante das seqüências de cadeiapesada e leve constante kapa de IgGI humana, respectivamente, usandotécnicas padrão de biologia molecular. As seqüências de DNA de cadeiapesada e leve de anticorpo completo resultantes foram subclonadas nos ve-tores de expressão de mamífero (um para a cadeia leve e um para a cadeiapesada) sob o controle do promotor de MPSV e a montante de um sítio poliAsintético, cada vetor trazendo uma seqüência OriP de EBV, conforme descri-to no Exemplo 1 acima. Anticorpos foram produzidos conforme descrito noExemplo 1 acima, isto é, através de co-transfecção de HEK293-EBNA comos vetores de expressão de cadeia pesada e leve de anticorpo de mamífero,coletando o meio de cultura condicionado 5 a 7 dias pós-transfecção e purifi-cando os anticorpos selecionados através de cromatografia por afinidade deProteína A, seguido por cromatografia de troca de cátions e uma etapa decromatografia por exclusão de tamanho final para isolar anticorpos de IgGImonoméricos puros. Os anticorpos foram formulados em uma solução defosfato de potássio a 25 mM, cloreto de sódio a 125 mM, solução de glicina a100 mM, pG de 6,7. Variantes glico-manipuladas das variantes de anticorpohumanizadas foram produzidas através de co-transfecção dos vetores deexpressão de anticorpo com um vetor de expressão de glicosiltransferaseGnTIII ou junto com um vetor de expressão de GnTIII mais um vetor de ex-pressão de manosidase Il de Golgi, conforme descrito para o anticorpo qui-mérico no Exemplo 1 acima. Anticorpos glico-manipulados foram purificadose formulados conforme descrito acima para os anticorpos não-glico-manipulados. Os oligossacarídeos presos à região Fc dos anticorpos foramanalisados através de MALDI/TOF-MS, conforme descrito abaixo.Análise de oliqossacarídeo
O método de liberação de oligossacarídeo para anticorpos emsolução. Entre 40 e 50 μg de anticorpo foram misturados com 2,5 mU dePNGaseF (Glyko, E.U.A.) em Tris a 2 mM, pH de 7,0, em um volume final de25 microlitros e a mistura foi incubada durante 3 horas a 37 °C.Preparação de amostra para MALDI/TOF-MS
As digestões enzimáticas contendo os oligossacarídeos libera-dos foram incubadas durante mais 3 h em temperatura ambiente após a adi-ção de ácido acético até uma concentração final de 150 mM e foram subse-qüentemente passadas através de 0,6 ml de resina de troca de cátions (resi-na AG50W-X8, forma de hidrogênio, malha 100-200, BioRad, Suíça) acondi-cionada em uma coluna de cromatografia Micro-bio-spin (BioRad, suíça) pa-ra remover os cátions e proteínas. Um microlitro da amostra resultante foiaplicado a uma lâmina-alvo de aço inoxidável e misturado, sobre a lâmina,com 1 μΙ de matriz sDHB. A matriz sDHB foi preparada através de dissolu-ção de 2 mg de ácido 2,5-diidroxibenzóico mais 0,1 mg de ácido 5-metóxi-salicílico em 1 ml de etanol/cloreto de sódio aquoso a 10 mM a 1:1 (v/v). Asamostras foram secas ao ar, 0,2 μΙ de etanol foram aplicados e as amostrasforam finalmente deixadas re-cristalizar sob ar.MALDI/TOF-MS
O espectrômetro de massa para MALDI-TOF usado para adquiriros espectros de massa era um Voyager Elite (Perspective Biosystems). Oinstrumento foi operado na configuração linear, com uma aceleração de 20kV e retardo de 80 ns. Calibração externa usando padrões de oligossacarí-deo foi usada para atribuição de massa dos íons. Os espectros de 200 pon-tos de laser foram resumidos para obter o espectro final.Ensaio de ligação a antíaenoAs variantes de anticorpo humanizado monoméricas purificadasforam testadas com relação à ligação a CD20 humano sobre células B alvode Iinfoma de Raji usando um ensaio baseado em citometria de fluxo, con-forme descrito para o anticorpo B-Iyl quimérico no Exemplo 1, acima.Ligação de glicovariantes de IgGI monoméricas à células NK e a linhagemde células CHO expressando FcvRIlIA
Células NK humanas foram isoladas de células mononuclearesde sangue periférico recentemente isoladas (PBMC) aplicando um enrique-cimento de seleção negativa para células CD16- e CD56-positivas (sistemaMACS, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach/Alemanha). A pureza de-terminada através de expressão de CD56 estava entre 88-95%. Células NKrecentemente isoladas foram incubadas em PBS sem íons de cálcio e mag-nésio (3 χ 105 células/ml) durante 20 minutos a 37 0C para remover a IgGassociada à células NK. As células foram incubadas a 106 células/ml em di-ferentes concentrações de anticorpo anti-CD20 (O, 0,1, 0,3, 1,3, 10 pg/ml)em PBS, BSA a 0,1%. Após várias lavagens, a ligação de anticorpo foi de-tectada através de incubação com IgG F(ab')2-específica anti-humana deF(ab')2 de cabra FITC-conjugada a 1:200 (Jackson ImmunoReasearch, WestGrove, PA/EUA) e CD56-PE anti-humano (BD Biosciences, Allschwil/Suíça).Os fragmentos F(ab')2 anti-FcgamaRIIIA 3G8 (Ancell, Bayport, MN/EUA)foram adicionados em uma concentração de 10 μg/ml para competir com aligação de glicovariantes de anticorpo (3 μΙ/ml). A intensidade de fluorescên-cia relativa às variantes de anticorpo ligadas foi determinada para célulasCD56-positivas sobre um FACSCaIibur (BD Biosciences, Allschwil /suíça).Células CHO foram transfectadas através de eletroporação (280 V, 950 pF,0,4 cm) com um vetor de expressão que codifica a cadeia α e a cadeia γ deFcgamaRIIIA-VaII58. Transfectantes foram selecionados através da adiçãode 6 μg/ml de puromicina e clones estáveis foram analisados através deFACS usando 10 μΙ de anticorpo monoclonal anti-FcgamaRIII 3G8 FITC-conjugado (BD Biosciences, Allschwil/Suíça) para 106 células. Ligação deIgGI à células CHO expressando FcgamaRIIIA-Va1158 foi realizada analo-gamente à ligação de células NK descrita acima.Ensaio de ADCC
Células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC)foram usadas como células efetuadoras e foram preparadas usando Histo-paque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, M063178 EUA) e seguindoessencialmente as instruções do fabricante. Em resumo, sangue venoso foitirado com seringas heparinizadas de voluntários. O sangue foi diluído a1:0,75-1,3 com PBS (não contendo Ca++ ou Mg+*) e colocado em camadassobre Histopaque-1077. O gradiente foi centrifugado a 400 χ g durante 30min em temperatura ambiente (RT) sem pausas. A interfase contendo aPBMC foi coletada e lavada com PBS (50 ml por célula a partir de dois gra-dientes) e coletada através de centrifugação a 300 χ g durante 10 minutosem RT. Após ressuspensão do pélete com PBS, as PBMCs foram contadase lavadas uma segunda vez através de centrifugação a 200 χ g durante 10minutos em RT. As células foram, então, ressuspensas no meio apropriadopara os procedimentos subseqüentes.
A proporção de efetuador para alvo usada para os ensaios deADCC foi de 25:1 e 10:1 para células PBMC e NK, respectivamente. As célu-las efetuadoras foram preparadas em meio ADVI-V na concentração apro-priada de forma a adicionar 50 μΙ por cavidade de lâminas com 96 cavidadesde fundo redondo. As células-alvo eram células de Iinfoma B humano (porexemplo, células Raji) crescidas em DMEM contendo FCS a 10%. Célulasalvo foram lavadas em PBS, contadas e re-suspensas em AIM-V a 0,3 mi-lhões por ml de forma a adicionar 30.000 células em 100 μΙ por microcavida-de. Os anticorpos foram diluídos em AIM-V, adicionados em 50 μΙ às células-alvo pré-colocadas em lâminas e deixados se ligar aos alvos durante 10 mi-nutos em RT. Então, as células efetuadoras foram adicionadas e a lâmina foiincubada durante 4 horas a 37 0C em uma atmosfera umidificada contendo5% de CO2. Morte de células-alvo foi avaliada através de medição de libera-ção de dehidrogenase de Iactato (LDH) de células danificadas usando o kitde Detecção de Citotoxicidade (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Suíça). Após aincubação de 4 horas, as lâminas foram centrifugadas a 800 χ g. 100 μΙ desobrenadante de cada cavidade foram transferidos para uma nova lâminacom 96 cavidades de fundo plano transparente. 100 μΙ de tampão de subs-trato colorido do kit foram adicionados por cavidade. Os valores de Vmax dareação colorida foram determinados em um leitor ELISA a 490 nm durantepelo menos 10 min usando o software SOFTmax PRO software (MolecularDevices, Sunnyvale, CA94089, EUA). A liberação espontânea de LDH foimedida a partir de cavidades contendo apenas células-alvo e efetuadoras,mas nenhum anticorpo. A liberação máxima foi determinada a partir de cavi-dades contendo apenas células-alvo e Triton X-100 a 1%. O percentual demorte anticorpo-mediada específica foi calculado como segue: ((x- SR)/(MR- SR)* 100, onde χ é a média da Vmax em uma concentração específica, SR éa média de Vmax da liberação espontânea e MR é a média de Vmax da libera-ção máxima.
Ensaio de citotoxicidade complemento-dependente
Células alvo foram contadas, lavadas com PBS, ressuspensasem AIM-V (Invitrogen) a 1 milhão de células por ml. 50 μΙ de células foramcolocados por cavidade em uma lâmina de fundo plano com 96 cavidades.Diluições de anticorpo foram preparadas em AIM-V e adicionadas em 50 μΙàs células. Anticorpos foram deixados se ligar às células durante 10 minutosem temperatura ambiente. Complemento de soro humano (QuideI) foi recen-temente descongelado, diluído 3 vezes com AIM-V e adicionado em 50 μΙ àscavidades. Complemento de coelho (Cedarlane Laboratories) foi preparadoconforme descrito pelo fabricante, diluído 3 vezes com AIM-V e adicionadoem 50 μΙ às cavidades. Como um controle, fontes de complemento foramaquecidas durante 30 min a 56 0C antes de adição ao ensaio. As lâminas deensaio foram incubadas durante 2 horas a 37 °C. Morte de células foi deter-minada medindo a liberação de LDH. Resumidamente, as lâminas foramcentrifugadas a 300 χ g durante 3 min. 50 μΙ de sobrenadante por cavidadeforam transferidos para uma nova lâmina com 96 cavidades e 50 μΙ do rea-gente de ensaio do Kit Cytotoxicity (Roche) foram adicionados. Uma medi-çâo cinética com o leitor ELISA determinou a Vmax correspondente à concen-tração de LDH no sobrenadante. A liberação máxima foi determinada atra-vés de incubação das células na presença de Triton X-100 a 1%.Ensaio de deplecão de células B em todo o sangue
Depleção de células B normais em todo o sangue pelos anticor-pos anti-CD20 foi realizada conforme descrita no Exemplo 1 acima.
Ensaio de apoptose
A potência apoptótica dos anticorpos foi avaliada através de in-cubação do anticorpo a 10 μg/ml (condições de saturação com relação àligação ao antígeno) com ás células-alvo (em uma concentração de células-alvo de 5 χ 105 células/ml) durante a noite (16-24 h). Amostras foram cora-das com AnnV-FITC e analisadas através de FACS. O ensaio foi feito emtriplicatas.
Detecção é realizada através de citometria de fluxo acompa-nhando o aparecimento de marcadores apoptóticos, tais como anexina V efosfatidil serina. Controle negativo (sem apoptose induzida) não contémqualquer anticorpo, mas apenas solução salina tamponada com fosfato.Controle positivo (apoptose máxima) contém 5 micromolar do indutor fortede apoptose Camptotecina (CPYT).
Resultados e Discussão
Comparação da ligação de antígeno CD20 humano de variantesde anticorpo B-HH1, B-HH2, B-HH3, em complexo com a cadeia leve de B-ly1 humanizado (BKV1) e o anticorpo quimérico precursor chB-ly1 (descritono Exemplo 1 acima) mostra que todos os anticorpos têm um valor de EC50similar, mas a estrutura B-HH1 se liga com uma intensidade/estequiometriamenor do que as variantes B-HH2 e B-HH3 (figura 11). B-HH1 pode ser dis-tinguida da B-HH2 e B-HH3 por suas regiões de CDR1 e CDR2 parciais (de-finição de Kabat), bem como o polimorfismo Ala/Thr na posição 28 (numera-ção de Kabat). Isso indica que a posição 28, a CDR1 completa e/ou a CDR2completa são importantes para interação anticorpo/antígeno.
A comparação de B-HL1, B-HH1 e o anticorpo precursor chB-ly1quimérico mostrou ausência de qualquer atividade de ligação na estrutura B-HL1 e cerca de metade de intensidade de ligação/estequiometria da B-HH1comparado com o B-ly1 (figura 12). A B-HL1, bem como B-HH1 são projeta-das baseado em frameworks aceitadoras derivadas da classe VH1 humana.Entre outras diferenças, a posição 71 (numeração de Kabat) da estrutura B-HL1 é uma diferença marcante, indicando sua importância putativa para aligação a antígeno. O aminoácido na posição 71 é um dos resíduos que de-termina a estrutura em Ioop canônica da CDR2 da cadeia pesada. Aqui, ala-nina ou um equivalente funcional da mesma (por exemplo, leucina, valina outreonina (vide, por exemplo, Morea e outros, Methods 20: 267-279 (2000))parece ser importante para a ligação a antígeno, enquanto que a argininaparece ser prejudicial para a ligação a antígeno.
Quando de comparação dos dados de ligação a antígeno dasFiguras 2 e 9, as variantes BHH2-BKV1, BHL8-BKV1 e BHLI1-BKV1 mos-tram boa afinidade de ligação, dentre as diferentes variantes de anticorpohumanizado testadas, ao CD20 humano sobre a superfície de células huma-nas. A despeito de valores de EC50 similares para ligação a antígeno, essasvariantes diferem fortemente quando a seu comportamento de induzir à a-poptose em células-alvo CD20 positivas (vide Figuras 4-6, 14, 15). Uma vezque o anticorpo B-Iyl original mostrou baixa indução de apoptose, os pre-sentes inventores determinaram as diferenças entre a estrutura do anticorpoB-Iyl precursor e as estruturas B-HL8 e B-HH2. Sete resíduos foram identifi-cados na cadeia pesada da B-HH2 que não estavam presentes nas cadeiaspesadas da B-HL8 ou do B-Iyl precursor: Gln1, Ala9, VaM 1, Lys12, Ser16,Val20 e Met48. Todos os sete desses resíduos estão localizados nas regiõesde "framework" do domínio VH. A probabilidade de contato direto com antí-geno era improvável, exceto para Glnl. Para determinar se um único dessesresíduos sozinho era responsável pela propriedade de indução de apoptoserecentemente gerada, sete variantes da cadeia pesada de B-HH8 foram ge-radas, que poderiam restaurar potencialmente o comportamento apoptóticoda estrutura B-HH2: B- HL11 (tendo a mutação Ê1Q), B-HL1 (G9A, V48M),B-HL13 (L1 IV, V48M), B-HL14 (V12K, V48M), B-HL15 (G16S, V48M), B-HL16 (L20V, V48M) e B-HL17 (V48M). Vide SEQ ID NOs: 32, 34, 36, 38, 40,42 e 44 (as quais, conforme apresentado na Listagem de Seqüência, nãosão numeradas de acordo com Kabat, mas cuja numeração de Kabat podeser prontamente determinada por aqueles versados na técnica). As proprie-dades de ligação a antígeno dessas variantes não diferem drasticamentecom relação aos valores de EC50 e estequiometria (vide figura 2). Contudo,uma diferença pronunciada pode ser encontrada em sua capacidade de in-duzir à apoptose (Figuras 4-6, 14, 15 e 24). A estrutura com as modificaçõesL11V, V48M, B-HL12, aumentou significativamente a capacidade de induzirà apoptose (vide figura 24). A modificação V48M, sozinha, contudo, não temum efeito visível (vide figura 5). Conseqüentemente, os resíduos nas posi-ções 11 e 12 de Kabat influenciaram o comportamento apoptótico até grandeponto. Esses resíduos não afetam a ligação a antígeno diretamente, masantes influenciam a interface entre os domínios VH e CH1 e, assim, atuamvia uma modificação do ângulo de cotovelo.
A estrutura B-HL4 é derivada do anticorpo B-HH2 através desubstituição da FR1 da B-HH2 por aquele da seqüência de linhagem germi-nativa humana IGHV1-45 (Ac. No X92209). Essa estrutura mostra capacida-de de ligação a antígeno grandemente diminuída, a despeito de ter diferen-tes aminoácidos em apenas quatro posições dentro da FR1. Esses resíduosestão localizados nas posições 2, 14, 28 e 30 (numeração de Kabat). Des-sas, as posições 28 e 30 puderam estar em uma posição de influência, umavez que elas são parte da definição de Chothia de CDR1. Em variantes B-HH8 e 9 (com a cadeia leve BKV1), as posições 28 e 30 são modificadascomparado com a seqüência do B-Iyl precursor. Conforme observado nafigura 22, a propriedade de ligação não sofre significativamente se treoninaou treonina 30 estão presentes (figura 22). Nenhuma remutação foi intro-duzida na cadeia leve humanizada, a qual tinha as CDR1, CDR2 e CDR3 deKabat completas enxertadas. Na indução de apoptose (vide Figuras 14, 15 e21), a variante mais potente era a variante de B-Iyl humanizada BHH2-BKV1 (ainda mais potente do que o chB-lyl original e muito mais potente doque um anticorpo com uma seqüência idêntica ao rituximab, C2B8). Outrasvariantes humanizadas que podem recuperar a apoptose aumentada são: B-HL13 e B-HL14 (derivadas de BHL8), BHH8 (""framework" misturada"), B-HH9 {""framework" misturada" com uma remutação para examinar o efeitode S30T) e B-HH6 (derivado M34I de B-HH2). A variante BHH4 é outra vari-ante de B-Iyl humanizada que não introduz quaisquer seqüências não-humanas adicionais. As variantes B-HH5, B-HH6 e B-HH7 são derivados daestrutura B-HH2 com uma região CDR1 de Kabat parcialmente humanizada.
Propriedades importantes do anticorpo B-Iyl humanizado sãoque ele é um tipo de anticorpo anti-CD20 conforme definido em Cragg, M.S.e Glennie, MJ., Blood 103(7): 2738-2743 (Abril de 2004). Portanto, ele nãoinduz, quando de ligação ao CD20, a qualquer resistência significativa naextração com detergente não-iônico de CD20 da superfície de células hu-manas CD20+, usando o ensaio descrito para essa finalidade em Polyak, MJ.e Deans, J.P., Blood 99(9): 3256-3262 (2002). Ele induziu a significativamen-te menos resistência à extração com detergente não-iônico de CD20 do queo anticorpo C2B8 (outro anticorpo anti-CD20 com uma seqüência idêntica aorituximab (vide Pub. de Patente U.S. No. 2003 0003097 para Ref.)). Confor-me esperado de um anticorpo anti-CD20 do tipo II, o B-Iyl humanizado nãotem qualquer atividade de Iise complemento-mediada significativa e mostrouuma atividade de Iise complemento-mediada muito menor do que o anticorpoanti-CD20 C2B8 (lgG1 quimérica com seqüência idêntica ao rituximab). Ou-tra propriedade importante do anticorpo B-Iyl humanizado (variante B-HH2B-KV1) era que ele é muito potente no ensaio de agregação homotípica.Nesse ensaio, células humanas CD20-positivas, células Daudi, foram incu-badas em meio de cultura de célula durante até 24 horas a 37 0C em umaatmosfera com 5% de CO2 em uma incubadora de células de mamífero, con-forme descrito em detalhes em Deans e outros, com o anticorpo em umaconcentração de 1 micrograma por ml e, em paralelo, em uma concentraçãode 5 microgramas por ml. Como uma comparação, incubação de controleparalela das células foi realizada sob condições idênticas usando o anticorpoanti-CD20 C2B8. Em diferentes pontos de tempo, incluindo 8 horas e 24 ho-ras de incubação, as células foram inspecionadas visualmente usando ummicroscópio. Descobriu-se que o anticorpo B-Iyl humanizado levou a umaforte agregação homotípica, com agregados sendo significativamente maio-res do que aqueles induzidos através da adição do anticorpo de controleC2B8. Além disso e consistente com o anticorpo sendo um anticorpo anti-CD20 do tipo II, ele induziu a níveis maiores de apoptose quando célulashumanas CD20-positivas foram incubadas com o anticorpo B-Iyl humaniza-do, com relação a um controle sob condições idênticas usando o anticorpode IgGI C2B8 quimérico com seqüência idêntica ao rituximab.
Variantes glico-manipuladas dos anticorpos humanizados foramproduzidas através de co-expressão de glicosiltransferase GnTHI, junto comos genes de anticorpo, em células de mamífero. Isso levou a um aumento nafração de oligossacarídeos não fucosilados presos à região Fc dos anticor-pos, incluindo oligossacarídeos não fucosilados bisseccionados, conformetinha sido descrito no WO 2004/065540 (Figuras 17-19). Os anticorpos glico-manipulados tinham níveis significativamente maiores de ligação aos recep-tores FcgamaRIII humanos (figura 20) e uma maior atividade de ADCC tam-bém (figura 16) com relação ao anticorpo não glico-manipulado e com rela-ção ao anticorpo C2B8. O anticorpo humanizado B-Iyl também era mais po-tente na indução de depleção de células B humanas em um ensaio com todoo sangue (figura 16) do que o anticorpo de controle C2B8. Isso era verdadei-ro para o anticorpo B-Iyl não glico-manipulado e para a versão glico-manipulada do mesmo. O anticorpo glico-manipulado era aproximadamente1000 vezes mais potente do que o anticorpo anti-CD20 de controle C2B8 nadepleção de células B no ensaio com todo o sangue. Essa comparação éimportante para as formas humanizadas não glico-manipuladas e glico-manipuladas de anticorpo B-Iyl, porque ela mostrou que, em ensaios, asatividades dependentes de receptor Fc combinadas, tal como ADCC, maislise complemente-mediada, mais indução de apoptose, ambas as formas deB-Iyl eram significativamente mais potentes do que o C2B8, embora ambasas formas de B-Iyl tenham atividade de Iise complemento-mediada dramati-camente menor. As atividades de morte celular receptor Fc-dependente,ADCC e indução de apoptose foram apresentadas nessa atividade superiordas variantes de anticorpo B-Iyl humanizado. Além disso, no ensaio de a -poptose, as formas não glico-manipuladas e glico-manipuladas desse anti-corpo anti-CD20 do tipo Il eram potentes, com as variantes Fc-manipuladascom afinidade de ligação aumentada aos receptores Fcgama sendo aindamais potentes na indução de apoptose do que a variante não-Fc-manipuladae com todas as variantes sendo significativamente mais potentes do que oanticorpo de controle C2B8. O mecanismo exato para agregação homotípicaintensificada e indução de apoptose mediada pelos anticorpos anti-CD20 dotipo II não é conhecido e ligação concomitante à outras moléculas sobre asuperfície de células CD20-positivas, tais como receptores Fc gama, podeinfluenciar essa propriedade importante. Portanto, foi importante demonstrarque anticorpos anti-CD20 do tipo Il que tinham sido manipulados em suaregião Fc para afinidade de ligação aumentada a receptores Fc gama, inclu-indo FcgamaRIII e com um aumento associado na atividade de ADCC, aindaeram capazes de induzir à forte apoptose, mesmo mais do que a agregaçãohomotípica e não-Fc-manipulada. Indução de apoptose é importante umavez que, in vivo, existem locais no corpo onde as células CD20-positivas al-vo podem ser encontradas, mas onde acesso à células FcgamaRIIl-positivasé mais difícil do que no sangue (por exemplo, nódulos linfáticos). Nesse lo-cais, a indução de apoptose pelo anticorpo anti-CD20, em si, pode ser cruci-al para a boa eficácia da terapia com anticorpo anti-CD20 em seres huma-nos, para o tratamento de malignidades hematológicas, tais como Iinfomasnão-Hodgkin e leucemia linfocítica crônica de células B e para o tratamentode doenças auto-imunes, tais como artrite reumatóide e lúpus, via uma a-bordagem de depleção de células Β. A afinidade de ligação aumentada aoFcgamaRIII e maior ADCC do anticorpo anti-CD20 do tipo Il Fc-manipuladohumanizado pode também ser um atributo muito importante para tais terapi-as. Finalmente, a atividade de Iise complemento-mediada reduzida ou negli-genciável desse anticorpo anti-CD20 do tipo II, incluindo variantes humani-zadas e Fc-manipuladas, também pode ser importánte, uma vez que maiorativação de complemento por anticorpos anti-CD20 foi correlacionada comefeitos colaterais indesejáveis aumentados.
Exemplo 3
Para examinar adicionalmente resíduos que influenciam a ativi-dade apoptótica, seis variantes da cadeia pesada de BHH2 foram geradas:BHH2-A (V11L) (SEQ ID NO: 124), BHH2-B (K12V) (SEQ ID NO: 125), B-HH2-C (A9G) (SEQ ID NO: 126), BHH2-D (E10G) (SEQ ID NO: 127), BHH2-E (T1.101) (SEQ ID NO: 128) e BHH2-F (S1121) (SEQ ID NO: 129). Essasestruturas variantes foram testadas com relação à ligação a um antígeno-alvo (CD20) através dos métodos descritos aqui acima. Todas as seis estru-turas variantes retiveram a atividade de ligação.
Essas estruturas variantes de cadeia pesada também foram tes-tadas com relação ao efeito apoptótico através de métodos descritos aquiacima. Cinco das estruturas, BHH2-B, BHH2-C, BHH2-D, BHH-2E e BHH-2F, tinham o mesmo potencial apoptótico que a estrutura precursora BHH2.Contudo, a capacidade da BHH2-A (V11L) de induzir à apoptose era signifi-cativamente diminuída em comparação com a BHH2 (vide figura 23).
O efeito apoptótico de substituições de um único aminoácido nacadeia leve do B-Iyl humanizado (BKV1) também foi examinado através dageração de cinco variantes: BKV-10 (P40A) (SEQ ID NO: 130), BKV-11(A80P) (SEQ ED NO: 131), BKV-12 (V83F) (SEQ ID NO: 132), BKV-13(E105A) (SEQ ID NO: 133) e BKV-14 (I106A) (SEQ ID NO: 134). As estrutu-ras BKV-11, BKV-12, BKV-13 e BKV-14 foram testadas com relação à liga-ção ao antígeno-alvo (CD20) através dos métodos descritos aqui acima e foideterminado que todas as quatro retinham a atividade de ligação. Essasquatro estruturas variantes de cadeia leve também foram testadas com rela-ção ao efeito apoptótico através dos métodos descritos aqui acima. O poten-cial apoptótico da BKV-11, BKV-12 e BKV-13 não foi alterado por suas res-pectivas substituições. Contudo, a BKV-14 demonstrou uma capacidade re-duzida de induzir à apoptose em comparação com a BKV1 (vide, por exem-pio, figura 25).
Todas as publicações, tais como livros texto, artigos de jornal,entradas no GenBank e pedidos e pedidos de patente publicados menciona-dos no presente relatório descritivo são aqui incorporados por referência atéo mesmo ponto como se cada publicação ou pedido de patente individualfosse específica e individualmente indicado como sendo incorporado porreferência.LISTAGEM DE SEQUENCIA
<110> GIycArt Biotechnology AG
<120> Moléculas de ligação a antígeno-modificadas com atividade de sinali-zação celular alterada<130> 1975.056PC01<150> US 60/711.454<151 > 26/08/2005<160> 134
<170> Patentln Versão 3.3<210> 1<211> 357<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HH1 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano<400> 1
caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctgggagttc agtgaaggtc 60tcctgcaagg cttccggata caccttcagc tattcttgga tgagctgggt gcggcaggcc 120cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180gcacagaaat tccaaggaag agtcacaátt accgccgaca aatccactag cacagcctat 240atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggçcgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 2<211> 119<212> PTR
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HH1 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano<400> 2Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Tyr Ser20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
<210> 3<211> 357<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HH2 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano
<400>4
caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctgggagttc agtgaaggtc ; 60tcctgcaagg cttccggata cgccttcagc tattcttgga tgaactgggt gcggcaggcc 120cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat 240atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 2<211> 119<212> PTR
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Estrutura Β-ΗΗ2 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano
<400>4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lye Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys'85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp-lGly Gln Gly100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115
<210> 5<211 >366<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HH3 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano
<400>5caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctgggagttc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttccggata cgccttcagc tattcttgga tgaactgggt gcggcaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga taetgactac 180
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agcacc 366
<210> 6<211> 119<212> PTR
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura Β-ΗΗ3 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano<400>6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15
Ser vai Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Leu Cys85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210> 7<211> 357<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HΗ4 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano
<400>7
caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctggagcttc agtgaaggtctcctgcaagg tctccggata cgcgttcagc tattcttgga tgaactgggt gcggcággcccctggacaag ggctçgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactacaatgggaaat tçaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctatàtggagçtgá gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtctttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca
<210>8<211> 119<212> PTR
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HH4 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano<400>8
Gln Val Qln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp65 70
Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr75 80Met Glu Jjeu Ser Ser Leu Arg Ser Glii Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Tip Gly Gln Gly100 105 110
Thr Leu-Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 9<211> 357<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HH5 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano<400>9
caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctgggagttc agtgaaggtc 60tcctgcaagg cttccggata cgcgttcagc tattcttgga tgagctgggt gcggcaggcg 120cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat 240atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggcogtgt attactgtgc aagaaatgtc 300tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 10<211> 119<212> PTR
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HH5 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Qly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser20 25 30Trp Met Ser Trp Val Arg Glii Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cye85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115
<210> 11<211 >357<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HH6 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano
<400> 11
caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctgggagttc agtgaaggtc 60tcctgcaagg cttceggata^ cgccttcagc tattcttgga tcaattgggt gcggcaggcg 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180
aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat 240
atggagcega gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300tttgatggtt actggcttgt; ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 12<211> 119<212> PTR
<213> Seqüência artificial<220><223> Estrutura Β-ΗΗ6 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser20 25 30 .. ..
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 .... 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Xle Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Qlu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Asn Val phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115<210> 13<211> 357<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HH7 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano<400> 13
caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa; gttaagaagc ctgggagttc agtgaaggtc 60tcctgcaagg cttccggata cgccttcagc tattcttgga tctcgtgggt gcggcaggcg 120cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatccãctag cacagcctat 240atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 14<211> 357<212> PTR
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura Β-ΗΗ7 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano<400> 14
Cys Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Ala Tlir Thr Gly Gly Thr Gly Cys1 5 10 15
Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Cys Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Thr20 25 30
Thr Ala Ala Gly Ala Ala GIy Cys Cys Thr Gly Gly Gly Ala Gly Thr35 40 45
Thr Cys Ala Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr
50 55 60
Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Thr Thr Cys Cys Gly Gly Ala Thr Ala65 70 75 , 80
Cys Gly Cys Cys Thr Thr Cys Ala Gly Cys Thr Ala Thr Thr Cys Thr85 90 95
Thr Gly Gly Ala Thr Cys Thr Cys Gly Thr Gly Gly Gly Thr Gly Cys100 105 110
Gly Gly Cys Ala Gly Gly Cys Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala115 120 125
Ala Gly Gly Gly Cys Thr Cys Gly Ala Gly Thr Gly Gly Ala Thr Gly130 135 140
Gly Gly Ala Cys Gly Gly Ala Thr Cys Thr Thr Thr Cys Cys Cys Gly145 150 155 160Gly cys Gly Ala Thr Gly Gly Gly Gly Ala Thr Ala Cys Thr Gly Ala165 170 175
Cys Thr Ala Cys Ala Ala Thr Gly Gly Gly Ala Ala Ala Thr Thr Cys180 185 190
Ala Ala Gly Gly Gly Cys Ala Gly Ala Gly Thr Cys Ala Cys Ala Ala195 200 205
Thr Thr Ala Cys Cys Gly Cys Cys Gly Ala Cys Ala Ala Ala Thr Cys210 215 220
Cys Ala Cys Thr Ala Gly Cys Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Ala Thr.225 230 235 240
Ala Thr Gly Gly Ala Gly Cys Thr Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys245 250 255
Thr Gly Ala Gly Ala Thr Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys260 265 270
Gly Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr275 280 285
Gly Cys Ala Ala Gly Ala Ala Ala Thr Gly Thr Cys Thr Thr Thr Gly290 295 300
Ala Thx Gly Gly Thr Thr Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr Thr Gly Thr305 310 315 320
Thr Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala325 330 335
Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Thr Cys Thir340 345 350
Cys Cys Thr Cys Ala355
<210> 15<211> 357<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura Β-ΗΗ8 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano<400> 15
caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctggcgcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttccggata caccttcaca tacagctgga tgaactgggt gcggcaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180
aafcgggaaat tcaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300
tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 3 57
<210> 16<211> 119<212> PTR
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HH8 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys LyB Pro Gly Ala15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Gys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Ser20 25 30
Trp Met Asn Tarp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115
<210> 17<211> 357<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HH9 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano
<400> 17
eaggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctggcgcctc agtgaaggtc 60tectgcaagg cttccggata caccttcagc tattcttgga tgaactgggt geggcaggce 120cctggacaag ggetcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatecactag eacagcctat 240atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaecgt ctcctca 357
<210> 18<211> 357<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HH9 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Tyr Ser20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115
<210> 19<211> 357<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HL1 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano<400> 19
caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctggggcctc actgaaggtc 60tcctgcaagg cttccggata caccttcacc tattcttgga tgcactgggt gcggcaggcc 120cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180gcacagaaat tccaaggaag agtcacaatg acacgggaca cgtccacttc caccgtctat 240atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 20<211> 119<212> PTR
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HL1 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano<400> 20Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Ser20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115
<210> 21<211 >357<212> DNA
<21Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HL2 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano
<400> 21
gaggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctggggccac cgtgaagatc 60tcctgcaagg tgtccggata caccttcacc tattcttgga tgcactgggt gcagcaggcc 120cctggaaagg ggctcgagtg gatgggacgg atcfcttcccg gcgatgggga tactgactac 180gcagagaaat tccaaggaag agtcacaatc acagccgaca cgtccactga caccgcctat 240atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aaccaatgtc 300tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 22
<211> 119<212> PTR<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HL2 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Ser
20 25 30
Trp Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Glu Lys Phe50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Thr Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115
<210> 23<211> 357<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HL3 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano<400> 23
gaggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctggggccac cgtgaagatc 60tcctgcaagg tgtccggata caccttcacc tattcttgga tgaactgggt gcagcaggcc 120cctggaaagg ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180
aatgggaaat tcaagggaag agtcacaatc acagccgaca cgtccactga caccgcctat 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aaccaatgtc 300
tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 24<211> 119<212> PTR
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HL3 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala GlU Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Ser20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Alá Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Thr Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115
<210> 25<211 >357<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HL4 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano<400> 25
cagatgcaat tggtgcagtc. tggcgctgaa gttaagaaga ccgggagttc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttccggata caccttcacc tattcttgga tgagctgggt gcggcaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180
gcacagaaat tccaaggaag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300
tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagct 360
agcacc 366
<210> 26<211> 119<212> PTR
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HL4 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano<400> 26
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Ser20 25 30
Trp Met ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Glii Lys Phe50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115
<210> 27<211> 357<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HL8 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano
<400> 27
gaagtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtcaagc ctggcgggtc cctgcggctc 60tcctgtgcag cctctggatt cacatttagc tattcttgga tgaactgggt gcggcaggct 120cctggaaagg gcctcgagtg ggtgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatfc accgccgaca aatccactag cacagcctat 240atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 28
<211> 119
<212> PTR
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Estrutura B-HL8 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lye Phe50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115
<210> 29<211> 456<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HL10 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano<400> 29
cggaattcgg cccaccggtg gccaccatgg actggacctg gaggatcctc ttcttggtgg 60cagcagccac aggagcccac tccgaagtgc agctggtgga gtctggagga ggcttggtca 120agcctggcgg gtccctgcgg ctctcctgtg cagcctctgg attcgcattc agctattctt 180ggatgaactg ggtgcggcag gctcctggaa agggcctcga gtgggfcggga cggatctttc 240ccggcgatgg ggatactgac tacaatggga aattcaaggg cagagtcaca attaccgccg 300acaaatccac tagcacagcc tatatggagc tgagcagcct gagatctgag gacacggccg 360tgtattactg tgcaagaaat gtctttgatg gttactggct tgtttactgg ggccagggaa 420ccctggtcac cgtctcctca gctagcgaat tctcga 456
<210> 30<211> 119<212> PTR
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HL10 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Tyr Ser20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115
<210> 31<211 >357<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HL11 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano
<400> 31
caggtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtcaagc ctggcgggtc cctgcggctc 60tcctgtgcag cctctggatt cacatttagc tattcttgga tgaactgggt gcggcaggct 120cctggaaagg gcctcgagtg ggtgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat 240atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357<210> 32<211> 119<212> PTR
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HL11 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro, Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys PheSO 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110
Ttir Leu Vai: Thr Val Ser Ser
115 <210> 33<211> 456<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HL12 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano<400> 33
cggaattcgg cccaccggtg gccaccatgg actggacctg gaggatcctc ttcttggtgg 60
cagcagccac aggagctcac tccgaagtgc agctcgtgga gtctggagca ggcttggtca 120
agcctggcgg gtccctgcgg ctctcctgcg cagcctctgg attcacattt agctattctt 180
ggatgaactg ggtgcggcag gctcctggaa agggcctcga gtgggtggga cggatctttc 240
ccggcgatgg ggatactgac tacaatggga aattcaaggg cagagtcaca attaccgccg 300
acaaatccac tagcacagcc tatatggagc tgagcagcct gagatctgag gacacggccg 360
tgtattactg tgcaagaaat gtctttgatg gttactggct tgtttactgg ggccagggaa 420
ccctggtcac cgtctcctca gctagcgaat tctcga 456
<210> 34
<211> 119
<212> PTR
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Estrutura B-HL12 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Ásn Gly Lys Phe50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210> 35<211> 456<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Estrutura B-HL13 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano
<400> 35
cggaattcgg cccaccggtg gccaccatgg actggacctg gaggatcctc ttcttggtgg 60cagcagccac aggagctcac tccgaagtgc agctcgtcga gtctggagga ggcgtggtca 120agcctggcgg gtccctgcgg ctctcctgcg cagcctctgg attcacattt agctattctt 180ggatgaactg ggtgcggcag gctcctggaa agggcctcga gtgggtggga cggatctttc 240ccggcgatgg ggatactgac tacaatggga aattcaaggg cagagtcaca attaccgccg 300acaaatccac tagcacagcc tatatggagc tgagcagcct gagatctgag gacacggccg 360tgtattactg tgcaagaaat gtctttgatg gttactggct tgtttactgg ggccagggaa 420ccctggtcac cgtctcctca gctagcgaat tctcga 456
<210> 36<211> 119<212> PTR
<213> Seqüência artificial<22Q>
<223> Estrutura B-HL13 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu GlU Trp Met35 40 45Gly Arg Ile Phe Pro Gly50
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Alá Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
<210> 37<211> 456<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HL14 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano<400> 37
cggaattcgg cccaccggtg gccaccatgg actggacctg gaggatcctc ttcttggtgg 60cagcagccac aggagctcac tccgaagtgc agctggtcga gtccggagga ggcttgaaga 120agcctggcgg gtccctgcgg ctctcctgcg cagcctctgg attcacattt agctattctt 180ggatgaactg ggtgcggcag gctcctggaa agggcctcga gtgggtggga cggatctttc 240ccggcgatgg ggatactgac tacaatggga aattcaaggg cagagtcaca attaccgccg 300acaaatccac tagcacagcc tatatggagc tgagcagcct gagatctgag gacacggccg .360tgtattactg tgcaagáaat gtctttgàtg gttactggct tgtttactgg ggccagggaa 420ccctggtcac cgtctcctca gctagcgaat tctcga 456
<210> 38<211> 119<212> PTR
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HL14 de uma molécula de ligação a antígeno-modificada
Asp -Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe55 60de camundongo/ser humano<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Lys Lys Pro Gly Gly15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45
Gly Arg Ile50
Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser15
<210> 39<211 >456<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HL15 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano<400> 39
cggaattcgg cccaccggtg gccaccatgg actggacctg gaggatcctc ttcttggtgg 60cagcagccac aggagcccac tccgaagtgc agctggfcgga gtctggagga ggcttggtca 120agcctggctc ttccctgcgg ctctcctgcg cagcctctgg attcacattt agctattctt 180ggatgaactg ggtgcggcag gctcctggaa agggcctcga gtgggtggga cggatctttc 240ccggcgatgg ggatactgac tacaatggga aattcaaggg cagagtcaca attaccgccg 300acaaatccac tagcacagcc tatatggagc tgagcagcct gagatctgag gacacggccg 360tgtattactg tgcaagaaat gtctttgatg gttactggct tgtttactgg ggccagggaa 420ccctggtcac cgtctcctca gctagcgaat tctcga 456
<210> 40<211> 119<212> PTR
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HL15 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadâde camundongo/ser humano<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser20 25 30
Trp Met Aen Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai. Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115
<210> 41<211> 456<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HL16 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano
<400> 41
cggaattcgg cccaccggtg gccaccatgg actggacctg gaggatcctc ttcttggtgg 60
cagcagccac aggagcccac tccgaagtgc agctggtgga gtctggagga ggcttggtca 120
agcctggcgg gtccctgcgg gtcagctgcg cagcctctgg attcacattt agctattctt 180
ggatgaactg ggtgcggcag gctcctggaa agggcctcga gtgggtggga cggatctttc 240
ccggcgatgg ggatactgac tacaatggga àattcaaggg cagagtcaca attaccgccg 300
acaaatccac tagcacagcc tatâtggagc tgagcagcct gagatctgag gacacggccg 360
tgtattactg tgcaagaaat gtctttgatg gttaotggct tgtttactgg ggccagggaa 420
ccctggtcac cgtctcctca gctagcgaat tctcga 456
<210> 42<211> 119<212> PTR
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HL16 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110
Thr Leu Val ITir Val Ser Ser115
<210> 43<211> 456<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HL17 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano
<400> 43
cggaattcgg cccaccggtg gccaccatgg actggacctg gaggatcctc ttcttggtgg 60cagcagccac aggagcccac tccgaagtgc agctggtgga gtctggagga ggcttggtca 120agcctggcgg gtccctgcgg ctctcctgcg cagcctctgg attcacattt agctattctt 180ggatgaactg ggtgcggcag gctcctggaa agggcctcga gtgggtggga cggatctttc 240ccggcgatgg ggatactgac tacaatggga aattcaaggg cagagtcaca attaccgccg : 300acaaatccac tagcacagcc tatatggagc tgagcagcct gagatctgag gacacggccg 360tgtattactg tgcaágaaat gtctttgatg gttactggct tgtttactgg ggccagggaa 420ccctggtcac cgtctcctca gctagcgaat tctcga 456
<210> 44<211> 119<212> PTR
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HL17 de uma molécula de ligação a antígeno-modificadade camundongo/ser humano
<400> 44GXu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thf Ser Thr Ala TVr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 45
<211 >57
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 45
atggactgga cctggaggat cctcttcttg gtggcagcag ccacaggagc ccactcc 57
<210> 46<211> 19<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 46
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly1 5 10 15
Ala His Ser
<210> 47<211> 345
<212> DNA
<213> seqüência artificial
<220>
<223> B-KV1 de uma molécula de ligação a antígeno de camundongo/serhumano modificada
<400> 47
gâtatcgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtoa cccctggaga gcccgccagc 60attagctgca ggtctagcaa gagcctcttg cacagcaatg gcatcactta ttt.gtattgg 120tacctgcaaa agccagggca gtctccacag ctcctgattt atcaaatgtc caaccttgtc 180tctggcgtcc ctgaccggtt ctccggatcc gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240agcagggtgg aggctgagga tgttggagtt tattactgcg ctcagaatct agaacttcct 300tacaccttcg gcggagggac caaggtggag atcaaacgta cggtg 345
<210> 48<211> 114<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> B-KV1 de uma molécula de ligação a antígeno de camundongo/serhumano modificada<400> 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asa85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 HO
Arg Thr<210> 49<211> 66<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 49
atggacatga gggtccccgc tcagctcctg ggcctcctgc tgctctggtt cccaggtgcc 60aggtgt ' 66
<210> 50<211 >22<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 50
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys20
<210> 51<211> 360<212> DNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Estrutura I-HHD de uma molécula de ligação a antígeno de camun-dongo/ser humano modificada<400> 51
caggtgcagc tggtgcagtc tggggçtgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60tcctgcaagg cctctggttt cacattçact gactacaaga tacactgggt gcgacaggcc 120cctggacaag ggctcgagtg gatgggatat ttcaacccta acagcggtta tagtacctac 180gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagactatcc 300coaggcggtt actatgttat ggatgcctgg ggccaaggga ccaccgtgac cgtctcctca 360
<210> 52<211>120<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Estrutura I-HHD de uma molécula de ligação a antígeno de camun-dongo/ser humano modificada<400> 52
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lye Pro Gly Ser1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser <3ly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30
Lys Ile His Trp Vál Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45
Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120
<210> 53<211> 366<212> DNA
<213> seqüência artificial<220><223> Estrutura M-HHA de uma molécula de ligação a antígeno de camun-dongo/ser humano modificada<400> 53
gaagtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtcaagc ctggcgggtc cctgcggctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacatttagc aactattgga tgaactgggt gcggcaggct 120
cctggaaagg gcctcgagtg ggtgggagag atcagattga aatccaataa cttcggaaga 180
tattacgctg caagcgtgaa gggccggttc accatcagca gagatgattc caagaacacg 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgaagacc gaggatacgg ccgtgtatta ctgtaccaea 300
tacggcaact acgttgggca ctacttcgac cactggggcc àagggaccac cgtcaccgtc 360
tccagt 366
<210> 54<211> 122<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Estrutura M-HHA de uma molécula de ligação a antígeno de camun-dongo/ser humano modificada<400> 54
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Gys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Gly Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr Tyr Ala Ala50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr85 90 95Tyr Cys Thr Thr Tyr Gly Asn Tyr Val Gly His Tyr Phe Asp His Trp100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120
<210> 55<211> 122<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Polipeptídeo quimérico de camundongo/ser humano IF5-VH<400> 55
Gln Val Gln Leu Arg Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Ser His Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Thr115 120
<210> 56<211> 120<212> PRT
<213> seqüência artificial<220><223> Polipeptídeo quimérico de camundongo/ser humano B9E9-VH<400> 56
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Ala Gln Leu Arg Pro Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser115 120
<210> 57<211> 121<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Polipeptídeo quimérico de camundongo/ser humano C2B8-VH<400> 57
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Gys85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn. Val Trp Gly100 105 HO
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala115 120
<210> 58<211> 121<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Polipeptídeo quimérico de camundongo/ser humano 2H7-VH<400> 58
Gln Ala Tyr Leu Gln Qln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala1 5 10 15
Ser . Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Qlu Trp Ile35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60
Lys Qly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 .75 BO
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Qlu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe.Asp Val Trp100 105 HO
Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser115 120<210> 59<211> 119<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Polipeptídeo quimérico de camundongo/ser humano B-IyI-VH<400> 59
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Leu Arg Pro Gly Gln Gly Leii Glu Trp Ile35 40 45
Gly Arg Xle Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala115
<2Í0> 60<211 > 122<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Polipeptídeo quimérico de camundongo/ser humano 2F2-VH<400> 60Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120
<210> 61<211> 122<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Polipeptídeo quimérico de camundongo/ser humano 7D8-VH<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Asp Arg1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe His Asp Tyr20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Dys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Thr Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120<210> 62<211> 125<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Polipeptídeo quimérico de camundongo/ser humano 11B8-VH<400> 62
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
l 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr His
20 25 3 0
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Ile Ile Gly Thr Gly Gly Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95
Arg Aep Tyr Tyr Gly Ala Gly Ser Phe Tyr Asp Gly Leu Tyr Gly Met100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120 125<210> 63<211> 6<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 8-13 de Kabat de molécula de ligação aantígeno de camundongo/sèr humano modificada
<400> 63
Qly Ala Glu Val Lys Lys1 5
<210> 64<211> 6<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 8-13 de Kabat de molécula de ligação aantígeno de camundongo/ser humano modificada<400> 64
Gly Pro Thr Leu Val Lys5
<210> 65 <211> 6<212> PRT<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições de Kabat de molécula de ligação a antí-geno de camundongo/ser humano modificada<400> 65
Gly Pro Val Leu Val Lys1 5
<210> 66<211> 6<212> PRT<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 8-13 de Kabat de molécula de ligação aantígeno de camundongo/ser humano modificada
<400> 66
Gly Pro Ala Leu Val Lys
1 5
<210> 67<211> 6<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 8-13 de Kabat de molécula de ligação aantígeno de camundongo/ser humano modificada<400> 67
Gly Gly Gly Leu Val Gln1 5
<210> 68<211> 6<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 8-13 de Kabat de molécula de ligação aantígeno de camundongo/ser humano modificada<400> 68
Gly Gly Gly Leu Val Lys1 5
<210> 69<211> 6<212> PRT<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 8-13 de Kabat de molécula de ligação aantígeno de camundongo/ser humano modificada<400> 69
Gly Gly Gly Leu Val Glu1 5
<210> 70<211> 6<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 8-13 de Kabat de molécula de ligação aantígeno de camundongo/ser humano modificada<400> 70
Gly Gly Gly Val Val Arg
1 <210> 71<211> 6<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 8-13 de Kabat de molécula de ligação aantígeno de camundongo/ser humano modificada<400> 71
Gly Gly Gly Val Val Gln1 5
<210> 72
<211> 6
<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 8-13 de Kabat de molécula de ligação aantígeno de camundongo/ser humano modificada<400> 72
Gly Gly Val Val Val Gln1 5<210> 73<211> 6<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 8-13 de Kabat de molécula de ligação aantígeno de camundongo/ser humano modificada<400> 73
Gly Gly Gly Leu Ile Gln1 5
<210> 74<211> 6<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 8-13 de Kabat de molécula de ligação aantígeno de camundongo/ser humano modificada<400> 74
Arg Gly Val Leu Val Gln1 5
<210> 75<211> 6<212> PRT<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 8-13 de Kabat de molécula de ligação aantígeno de camundongo/ser humano modificada<400> 75
Gly Pro Gly Leu Val Lys1 5
<210> 76<211> 6<212> PRT<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 8-13 de Kabat de molécula de ligação aantígeno de camundongo/ser humano modificada
<400> 76
Gly Ser Gly Leu Val Lys1 5
<210>77<211> 6<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 8-13 de Kabat de molécula de ligação aantígeno de camundongo/ser humano modificada<400> 77
Gly Ala Gly Leu Leu Lys1 5
<210> 78<211> 6<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 8-13 de Kabat de molécula de ligação aantígeno de camundongo/ser humano modificada<400> 78
Gly Ser Glu Leu Lys Lys1 5
<210> 79<211> 6<212> PRT<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 8-13 de Kabat de molécula de ligação aantígeno de camundongo/ser humano modificada
<400> 79
Gly His Glu Val Lys Gln1 5
<210> 80
<211> 987
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 80
accaagggcc catcggtctt cçccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 60
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 120
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttoccggctg tcctacagtc ctcaggiactc 180
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgecc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 240
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagcaga gcccaaatct 300
tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 360
gttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 420
acatgcgtgg tgatggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttoaa ctggtaogtg 480
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 540
taccgtgtgg toagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 600
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 660
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 720
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 780
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 840
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag çtcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 900
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 960
agcctctccc tgtctccggg taaatga 987
<210> 81<211> 328<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 81Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr1 5 10 15
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro20 25 30
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val35 40 45
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser50 55 60
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile65 70 75 80
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala85 90 95
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala100 105 HO
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro115 120 125
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val130 135 140
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr vai145 150 155 160
Asip Gly Val Glu Val His Asn Ala lYs Thr Pro Arg Glu Glu Gln165 170 175
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln180 185 190
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala195 200 205
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro210 215 220
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr225 230 235 240
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser245 250 255
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr260 265 270
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr275 280 285
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe290 295 300
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys305 310 315 320
Ser Leu Ser
Leu Ser Pro Gly Lys325
<21Ó> 82
<211> 618
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 82
ctcatgaata tgcaaâtaac ctgagattta ctgaagtaaa tacagatctg tcctgtgccc 60
tgagagçatc acccagcaac cacatctgtc ctctagagaa tcccctgaga gctccgttcc 120
tcaccatgga ctggacctgg aggatcctct tcttggtggc agcagccaca ggtaagaggc 180
tccctagtcc cagtgatgag:aaagaggatt gagtccagtc cagggagatc tcatccactt 240
ctgtgttctc tccacaggag cccactccca ggtgcagctg gtgcagtctg gggctgaggt 300
gaagaagcct ggggcctcag tgaaggtctc ctgcaaggct tctggatacã ccttcaccgg 360
ctactatatg cactgggtgc gacaggoccc tggacaaggg cttgagtgga tgggacggat 420
caaccctaac agtggtggca caaactatgc acagaagttt cagggcaggg tçaccagtac 480
cagggacacg tccatcagca cagcctacat ggagctgagc aggctgagat ctgacgacac 540
ggtcgtgtat tactgtgcga gagacacagt gtgaaaaccc acatcctgag ggtgtcagaa 600
accccaggga ggaggcag 618<210> 83<211> 613<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 83
ccagctccac cctcctctgg gttgaaaaag ccgagcacag gtaccagctc agtgactcct 60
gtgcaccacc atggacacac tttgctccac gctcctgctg ctgaccatcc cttcatgtga 120
gtgctgtggt cagggactcc ttcacgggtg aaacatcagt tttcttgttt gtgggcttca 180
tcttcttatg ctttctccac aggggtcttg tcccagatca ccttgaagga gtctggtcct 240
acgctggtga aacccacaca gaccctcacg ctgacctgca cottctctgg gttctcactc 300
agcactagtg gagtgggtgt gggctggatc cgtcagcccc caggaaaggc cctggagtgg 360
cttgcactca tttattggaa tgatgataag cgctacagcc catctctgaa gagcaggctc 420
accatcacca aggacacctc caaaaaccag gtggtcctta caatgaccaa catggaccct 480
gtggacacag ccacatatta ctgtgcacac agaccacaaa gacacagccc agggcacctc 540
ctgtacaaaa acccaggctg cttctcattg gtgctccctc cccacctctg cagaacagga 600
aagtctgtct gct 613
<210> 84<211 >456<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 84
agtgactcct gtgccccacc atggacacac tttgctacac actcctgctg ctgaccaccc 60cttcctgtga gtgctgtggt cagggacttc ctcagaagtg aaacatcagt tgtctccttt 120gtgggcttca tcttcttatg tcttctccac aggggtcttg tcccaggtca ccttgaagga 180gtctggtcct gtgctggtga aacccacaga gaccctcacg ctgacctgca ccgtctctgg 240gttctcactc agcaatgcta gaatgggtgt gagctggatc cgtcagcccc cagggaaggc 300cctggagtgg cttgcacaca ttttttcgaa tgacgaaaaa tcctacagca catctctgaa 360gagcaggctc accatctcca aggacacctc caaaagccag gtggtcctta ccatgaccaa 420catggaccct gtggacacag ccacatatta ctgtgcacgg ataccacaga gacacagccc 480aggatgcctc ctgtacaaga acctagctgc atctcagtgg tgctccctcc ctacctctgc 540agaaca
<210> 85<211> 460<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 85
atggacatac tttgttccac gctcctgcta ctgactgtcc cgtcctgtga gtgctgtggt 60
çaggtagtac ttcagaagca aaaaatctat tctctccttt gtgggcttca tcttcttatg 120
tcttctccac aggggtctta tcccaggtca ccttgaggga gtctggtcct gcgctggtga 180
aacccacaca gaccctcaca ctgacctgca ccttotctgg gttctcactc agcactagtg 240
gaatgtgtgt gagctggatc cgtcagcccc cagggaaggc cctggagtgg cttgcactca 300
ttgattggga tgatgataaa tactacágca catctctgaa gaccaggctc accatctcca 360
aggacacctc caaaaaccag gtggtoctta caatgaccaa catggaccct gtggacacag 420
ccacgtatta ctgtgcacgg ataccacaga gacaçaccca 460
<210> 86<211> 877<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 86
àcagcctatt cctccagcat cccactagag cttcttatat agtaggagac atgcaâatag 60
ggccctccct ctactgatga aaaccaaccc aaccctgacc ctgcaggtct cagagaggag 120
ccttagccct ggactccaag gcctttccac ttggtgatca gcactgagca cagaggactc 180
accatggaat tggggctgag ctgggttttc cttgttgcta ttttagaagg tgattcatgg 240
aaaactagga agattgagtg tgtgtggata tgagtgtgag aaacagtgga tttgtgtggc 300
agtttctgac cttggtgtct ctttgtttgc aggtgtccag tgtgaggtgc agctggtgga 360
gtctggggga ggcttggtcc agcctggggg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg 420
attcacettt agtagctatt ggatgagctg ggtccgccag gctccaggga aggggctgga 480
gtgggtggcc aacataaagc aagatggaag tgagaaatac tatgtggact ctgtgaaggg 540
ccgattcacc atctccagag acaacgccaa gaactcactg tatctgcaaa tgaacagcct 600
gagagccgag gacacggctg tgtattactg tgcgagagac acagtgaggg gaagtcagtg 660
tgagcccaga cacaaacctc cctgcagggg tcccttggga ccaccagggg gcgacagggc 720
attgagcact gggctgtctc cagggcaggt gcaggtgctg ctgagggctg gcttcctgtc 780
gcggtctggg gctgcctcgt cgtcaaattt ccccaggaac ttctccagat ttacaattct 840
gtactgacat ttcatgtctc taaatgcaat acttttt 877
<210> 87<211> 557<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 87
ccaggagttt ccattcggtg atcagcactg aacacagagg actcaccatg gagtttgggc 60
tgagctgggt tttccttgtt gctataataa aaggtgattt atggagaact agagacattg 120
agtggacgtg agtgagataa gcagtgaata tatgtggcag tttctgacta ggttgtctct 180
gtgtttgcag gtgtccagtg tcaggtgcag ctggtggagt ctgggggagg cttggtcaag 240
cctggagggt ccctgagact ctcctgtgca gcctctggat tcaccttcag tgactactac 300
atgagctgga tccgccaggc tccagggaag gggctggagt gggtttcata cattagtagt 360
agtggtagta ccatatacta cgcagactct gtgaagggcc gattcaccafc ctccagggac 420
aacgccaaga actcactgta tctgcaaatg aacagcctga gagccgagga cacggccgtg 480
tattactgtg cgagagacac agtgagggga agtcagtgtg agcccagaca caaacctccc 540
tgcagggggt cccttgg 557
<210> 88<211> 727<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 88
agatttaaga accttgcacc tggtacccgt tgctcttctt gtaaccattt gtcttttaag 60
ttgtttatca ctctgtaact attttgatta ttttgattct tgcatgtttt tacttctgta 120
aaattattac atttgagtcc ctctcccctt cctaaaccta ggtataàaat ttactcgagc 180
cccttcctcg tggccgagag aattttgagc atgagctgtc tctttggcag ccggcttaat 240
aaaggactct taattcgtct caaagtgtgg cgttttctta àctcacctgg gtacaacagt 300
gcagctggtg gagtctgggg gaggcttggt agagcctggg gggtccctga gactctcctg 360
tgcagcctct ggattcacct tcagtaacag tgacatgaac tgggtccgcc aggctccagg 420
aaaggggctg gagtgggtat cgggtgttag ttggaatggc agtaggacgc actatgcaga 480
ctctgtgaag ggccgattca tcatctccag agacaattcc aggaacttcc tgtatcagca 540
aatgaacagc ctgaggcccg aggacatggc tgtgtattac tgtgtgagaa acactgtgag 600
aggacggaag tgtgagccca gacacaaacc tcctgcagga acgttggggg aaatcagctg 660
cagggggcgc tcaagaccca ctcatcagag tcaaccccag agcaggtgca catggaggct 720
gggtttt 727
<210> 89<211> 514<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 89
ggactcgcca tggagtttgg gctgagctgg gttttccttg ttgctatttt aaaaggtgat 60
tcatggatca atagagatgt tgagtgtgag tgaacacgag tgagagaaac agtggatttg 120
tgtggcagtt tctgaccagg gtgtctctgt gtttgcaggt gtccagtgtg aggtgcagct 180
SSftggagtct gggggaggtg tggtacggcc tggggggtcc ctgagactct cctgtgcagc 240
ctctggattc acctttgatg attatggcat gagctgggtc cgccaagctc cagggaaggg 300
gctggagtgg gtctctggta ttaattggaa tggtggtagc acaggttatg cagactctgt 360
gaagggccga ttcaccatct ccagagacaa cgccaagaac tccctgtatc tgcaaatgaa 420
CagtCtgaga gccgaggaca cggccttgta tcactgtgcg agagacacag tgaggggaag 480
ccagtgagag cccagacaca aacgtccctg cagg 514
<210> 90<211> 412<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 90
tgattcatgg agaaatagag agactgagtg tgagtgaaca tgagtgagaa aaactggatt 60tgtgtggcat tttçtgataa cggtgtcctt ctgtttgcag gtgtccagtg tcaggtgcag 120ctggtggagt ctgggggagg cgtggtccag cctgggaggt ccctgagact ctcctgtgca 180gcgtctggat tcaccttcag tagctatggc atgcactggg tccgccaggc tccaag-nag 240gggctggagt gggtggcagt tatatggtat gatggaagta ataaatacta tgcagactcc 300gtgaagggcc gattcaccat ctccagagac aattccaaga acacgctgta tctgcaaatg 360aacagcctga gagccgagga cacggctgtg tattactgtg cgagagacac ag 412
<210> 91<211> 970<212> DNA<213> Homo sapiens<220>
<211> misc_feature<222> (43)...(43)
<223> n é a, c, g ou t<220><211> misc_feature<222> (824)...(824)<223> η é a, c, g ou t<400> 91
catctgttac agaactcatt atatagtagg agacatccaa atngggtccc tccctctgct 60gatgaaaacc agcccagccc tgaccctgca gctctgggag aggagcccca gccctgagat 120
tcccaggtgt ttccattcgg tgatcagcac tgaacacaga gaacgcacca tggagtttgg 180
actgagctgg gttttccttg ttgctatttt aaaaggtgat tcatggataa atagagatgt 240
tgagtgtgag tgaacatgag tgagagaaac agtggatatg tgtggcagtg tctgaccagg- 300
gtgtctctgt gtttgcaggt gtccagtgtg aagtgcagct ggtggagtct gggggagtcg 360
tggtacagcc tggggggtcc ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc acctttgatg 420
attataccat gcactgggtc cgtcaagctc cggggaaggg tctggagtgg gtctctctta 480
ttagttggga tggtggtagc acatactatg cagactctgt gaagggccga ttcaccatct . 540
ccagagacaa cagcaaaaac tccctgtatc tgcaaatgaa cagtctgaga actgaggaca 600
ccgccttgta,ttactgtgca aaagatacac agtgagggga agtcagcgag agcccagaca 660
aaaacctcgc tgcaggaaga caggaggggc ctgggctgca gaggccactc aagacacact 720
gagcataggg ttaactctgg gacaagttgc tcaggaaggt taagagctgg tttcctttca 780gagtcttcac aaatttctcc atctaacagt ttccccagga accngtctag atctgtgatc ; 840ttggatctgc tgaaactgcc tgtgtcacct ;870
<210> 92
<211> 724<212> DNA<213> Homo sapiens<220>
<211> misc_feature<222> (560)...(560)<223> η é a, c, g ou t<400> 92
ccattcggtg atcagcactg aacacagagg actcaccatg gagttttggc tgagctgggt 60tttccttgtt gctattttaa aaggtgattc atggagaact agagatattg agtgtgagtg 120aacacgagtg agagaaacag tggatatgtg tggcagtttc taaccaatgt ctctgtgttt 180gcaggtgtcc agtgtgaggt gcagctggtg. gagtctggag gaggcttgat ccagcctggg 240gggtccctga gactctcctg tgcagcctct gggttcaccg tcagtagcaa ctacatgagc 300tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtgggtct cagttattta tagcggtggt 360ágcacatact acgcagactc cgtgaagggc cgattcacca tctccagaga caattccaag 420aacacgctgt atcttcaaat gaacagcctg agagccgagg acacggccgt gtattactgt 480gcgagagaca cagtgagggg aagtcattgt gcgcccagac acaaacctcc ctgcaggaac 540gctgggggga aatcagcggn agggggcgct caggagccac tgatcagagt cagccccgga 600ggcaggtgca gatggaggct gatttccttg tcaggatgtg gggacttttg tcttcttctg 660acgggttccc aagt caggggaacc tctctaagtt tagcattctg tgcctatgaa cgtcttctct 720 724
<210> 93<211> 288<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 93
gaggtgcagc tggtggagtc tcggggágtc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cctctggatt caccgtcagt agcaatgaga tgagctgggt ccgccaggct 120ccagggaagg gtctggagtg ggtctcatcc attagtggtg gtagcacata ctacgcagac IBOtccaggaagg gcagattcac catctccaga gacaattcca agaacacgct gcatcttcaa 240atgaacagcc tgagagctga ggacacggct gtgtattact gtaagaaa 288
<210> 94<211> 626<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 94
catccctttt cacctcttta tacaaaggca ccacctacat gcaaatcctc acttaggcac 60
ccacaggaaa ccaccacaca tttccttaaa ttcagggtcc agctcacatg ggaaatactt 120
tctgagagct catgggcctc ctgcacaaga acatgaaaca cctgtggttc ttcctcctcc 180
tggtggcagc tcccagatgt gagtgtctca aggctgcaga catgggggta tgggaggtgc 240
ctctgatccc agggctcact gtgggtctct ctgttcacag gggtcctgtc tcaggtgcag 300
ctgcaggagt cgggcccagg actggtgaag cctccgggga ccctgtccct cacctgcgct 360
gtctctggtg gctccatcag cagtagtaac tggtggagtt gggtccgcca gcccocaggg 420
aaggggctgg agtggattgg ggaaatctat catagtggga gcaccaacta caacccgtcc 480
ctcaagagtc gagtcaccat atcagtagac aagtccaaga accagttctc cctgaagctg 540
agctctgtga ccgccgcgga cacggccgtg tattgctgtg cgagagacac agtgagggga 600
ggtgagtgtg agcccagaca caaacc 626<210> 95<211> 299<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 95
cagctgcagc tgcaggagtc cggctcagga çtggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actcctggag ctggatccgg 120cagccaccag ggaagggcct ggagtggatt gggtaeatct atcatagtgg gagcacctac 180tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acaggtccaa gaaccagttc 240tccctgaagc tgagctctgt gaccgccgcg gacacggccg tgtattactg tgccagaga 299
<210> 96<211> 410<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 96
gggtcctgtc ccaggtgcag ctacagcagt ggggcgcagg actgttgaag ccttcggaga 60ccctgtccct cacctgcgct gtctatggtg ggtccttcag tggttactac tggagctgga 120tccgccagcc cccagggaag gggctggagt ggattgggga aatcaatcat agtggaagca 180ccaactacaa cccgtccctc aagagtcgag tcaccatatc agtagacacg tccaagaacc 240agttctccct gaagctgagc tctgtgaccg ccgcggacac ggctgtgtat tactgtgcga 300gaggcacagt gaggggaggt gagtgtgagc ccagacaaa.a acctccctgc aggtaggcag 360agggggcggg cgcaggtact gctcaagacc agcaggtggc gcgcggcgcc 410
<210> 97<211> 700<212> DNA<213> Homo sapiens<220>
<211> misc_feature<222> (19)... (19)<223> η é a, c, g ou t<220>
<211> misc_feature<222> (46)... (46)<223> η é a, c, g ou t
<400> 97
aggttctggg ttataaacnc tgtagactcc tcccttcagg gcaggntgac caactatgca 60
aatgcaagtg ggggcctccc cacttaaacc cagggctccc ctccacagtg agtctccctc 120
actgcccagç tgggatctca gggcttcatt ttctgtcctc caccatcatg gggtcaaccg 180
ccatcctcgc cctcctcctg gctgttctcc aaggtcagtc ctgccgaggg cttgaggtca 240
cagaggagaa cgggtggaaa ggagcccctg attcaaattt tgtgtctccc ccacaggagt 300
ctgttccgag gtgcagctgg.tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct 360
gaagatctcc tgtaagggtt ctggatacag ctttaccagc tactggatcg gctgggtgcg 420
ccagatgccc gggaaaggcc tggagtggat ggggatcatc tatcctggtg actctgatac 480
cagatacagc ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gccgacaagt ccatcagcac 540
cgcctacctg cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag 600
acacacagtg agagaaacca gccccgagcc cgtctaaaac cctçcacacc gcaggtgcag 660
aatgagctgc tagagactca ctccccaggg gcctctctat 700
<210> 98<211 >650<212> DNA
<213> Homo sapiens<220>
<211> misc_feature<222> (621)... (621)<223> η é a, c, g ou t<400> 98
agggcagtca ccagagctcc agacaatgtç tgtctccttc ctcatcttcc tgcccgtgct 60
gggcctccca tggggtcagt gtcagggaga tgccgtattc acagcagcat tcacagactg 120
aggggtgttt cactttgctg tttccttttg tctccaggtg tcctgtcaca ggtacágctg 180
cagcagtcag gtccaggact ggtgaagccc tcgcagaccc tctcactcac ctgtgccatc 240
tccggggaca gtgtctctag caacagtgct gcttggaact ggatcaggca gtccccatcg 300
agaggccttg agtggctggg aaggacatac tacaggtcca agtggtataa tgattatgca 360
gtatctgtga aaagtcgaat aaccatcaac ccagacacat ccaagaacca gttctccctg 420
cagctgaact ctgtgactcc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcaag agacacagtg 480
aggggaagtc agtgtgagcc cagacacaaa cctccctgca gggatgctca ggaccccaga 540
aggcacccag cactacçagc gcagggccca gacçaggagc aggtgtggag ttaagcaaaa 600
atggaacttc ttgctgtgtc ntaaactgtt gttgtttttt tttttttttt 650<210> 99<211> 388<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 99
taaggggctc cccagtcact gggctgaggg agaaaccagc acagtcaagt gagacttcat 60gcactcccat ctcctctcca caggtgccca ctcccaggtg cagctggtgc aatctgggtc 120tgagttgaag aagcctgggg cctcagtgaa ggtttcctgc aaggcttctg gatacacctt 180cactagctat gctatgaatt gggtgcgaca ggcccctgga caagggcttg agtggatggg 240atggatcaac accaacactg ggaacccaac gtatgcccag ggcttcacag gacggtttgt 300cttctccttg gacacctctg tcagcacggc atatcfcgcag atctgcagcc taaaggctga 360ggacactgcc gtgtattact gtgcgaga 388
<210> 100<211> 294<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 100
caggtgcagc tggtgcagtc tggccatgag gtgaagcagc ctggggcctc agtgaaggtc 60tcctgcaagg cttctggtta cagtttcacc acctatggta tgaattgggt gccacaggcc 120cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg ttcaacacct acactgggaa cccaacatat 180gcccagggct tcacaggacg gtttgtcttc tccatggaca ectctgccag cacagcatac 240ctgcagatca gcagcctaaa ggctgaggac atggcçatgt attactgtgc gaga 294
<210> 101<211> 6<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 108-113 de Kabat de uma molécula deligação a antígeno de camundongo/ser humano modificada<400> 101
Gly Ala Glu Leu Lys Lys1 5
<210> 102<211> 6<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 108-113 de Kabat de uma molécula deligação a antígeno de camundongo/ser humano modificada
<400> 102
Gly Ala Glu Val Val Lys1 5
<210> 103<211>6<212> PRT
<213> seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 108-113 de Kabat de uma molécula deligação a antígeno de camundongo/ser humano modificada
<400> 103
Gly Gly Glu Val Lys Lys
1 5
<210> 104<211> 6<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 108-113 de Kabat de uma molécula deligação a antígeno de camundongo/ser humano modificada
<400> 104
Gly Ala Gly Val Lys Lys1 5
<210> 105<211> 6<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 108-113 de Kabat de uma molécula deligação a antígeno de camundongo/ser humano modificada
<400> 105
Gly Gly Gly Val Val Lys1 5
<210> 106<211> 6<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 108-113 de Kabat de uma molécula de
ligação a antígeno de camundongo/ser humano modificada<400> 106
Leu Val Thr Val Ser Ser1 5
<210> 107<211> 6<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 108-113 de Kabat de uma molécula deligação a antígeno de camundongo/ser humano modificada
<400> 107
Leu Val Ile Val Ser Ser1 5
<210> 108
<211> 6
<212> PRT
<213> seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 108-113 de Kabat de uma molécula deligação a antígeno de camundongo/ser humano modificada<400> 108Leu Val Tlir Val Ile Ser1 5
<210> 109
<211> 6
<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 108-113 de Kabat dé uma molécula deligação a antígeno de camundongo/ser humano modificada<400> 109
Leu VaZ Ile Val Ile Ser1 5
<210> 110<211> 6<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 108-113 de Kabat de uma molécula deligação a antígeno de camundongo/ser humano modificada<400> 110
Leu Val Gly Val Ser Ser1 5
<210> 111<211> 6<212> PRT<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 108-113 de Kabat de uma molécula deligação a antígeno de camundongo/ser humano modificada<400> 111
Leu Val Thr Val Gly Ser1 5
<210> 112
<211> 6<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 108-113 de Kabat de uma molécula deligação a antígeno de camundongo/ser humano modificada
<400> 112Leu Val Gly Val Gly Ser1 5
<210> 113
<211> 6
<212> PRT
<213> seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 108-113 de Kabat de uma molécula deligação a antígeno de camundongo/ser humano modificada<400> 113
Leu Val Ala Val Ser Ser1 5
<210> 114<211> 6<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 108-113 de Kabat de uma molécula deligação a antígeno de camundongo/ser humano modificada<400> 114
Leu Val Thr Val Ala Ser1 5
<210> 115<211> 6<212> PRT
<213> seqüência artificial<220><223> Seqüência Vh nas posições 108-113 de Kabat de uma molécula deligação a antígeno de camundongo/ser humano modificada<400> 115
Leu Val Ala Val Ala Ser
1 5
<210> 116<211> 6<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 108-113 de Kabat de uma molécula deligação a antígeno de camundongo/ser humano modificada
<400> 116
Leu Val Val Val Ser Ser1 5
<210> 117<211>6<212> PRT<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 108-113 de Kabat de uma molécula deligação a antígeno de carriundongo/ser humano modificada<400> 117
Leu VaI Thr Val Vai Ser1 5
<210> 118
<211 > 6
<212> PRT
<213> seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 108-113 de Kabat de uma molécula deligação a antígeno de camundongo/ser humano modificada<400> 118Leu Val Val Val Val Ser1 5
<210> 119<211> 6<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 108-113 de Kabat de uma molécula deligação a antígeno de camundongo/ser humano modificada<400> 119
Leu Val Leu Val Ser Serl 5
<210> 120<211> 6<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 108-113 de Kabat de uma molécula deligação a antígeno de camundongo/ser humano modificada
<400> 120
Leu Val Thr Val Leu Ser
1 5<210> 121<211> 6<212> PRT<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 108-113 de Kabat de uma molécula deligação a antígeno de camundongo/ser humano modificada<400> 121
Leu Val Leu Val Leu Ser1 5
<210> 122
<211> 6<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 108-113 de Kabat de uma molécula deligação a antígeno de camundongo/ser humano modificada
<400> 122
Leu Val Ser Val Ser Ser1 5
<210> 123
<211> 6
<212> PRT
<213> seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência Vh nas posições 108-113 de Kabat de uma molécula deligação a antígeno de camundongo/ser humano modificada
<400> 123
Leu Val Thr Val Thr Ser1 5
<210> 124<211> 119<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HH2A de uma molécula de ligação a antígeno de camun-dongo/ser humano modificada<400> 124
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser '20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115
<210> 125<211> 119<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HH2B de uma molécula de ligação a antígeno de carnun-dongo/ser humano modificada<400> 125
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ser1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 ; 40, . . 45 ,
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu, Val Tyr Trp, Gly Gln Gly100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115
<210> 126<211> 119<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HH2C de uma molécula de ligação a antígeno de camun-dongo/ser humano modificada
<400> 126
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 .40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115
<210> 127<211> 119<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HH2D de uma molécula de ligação a antígeno de camun-dongo/ser humano modificada
<400> 127
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Gly Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser20 25 30
Tarp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45
Gly Arg Ile Plie Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala85 90
Ala Arg Asn Val Phe Asp Qly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115
<210> 128<211> 119<212> PRT<213> seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-HH2E de uma molécula de ligação a antígeno de camun-dongo/ser humano modificada
<400> 128
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15
Val Tyr Tyr Cys95Ser Val Lys Val Ser Gye Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 .... 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110
Thr Leu Val Ile Val Ser Ser115
<210> 129<211> 119<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-RH2F de uma molécula de ligação a antígeno de camun-dongo/ser humano modificada<400> 129
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ile Ser115
<210> 130<211> 115<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-BK10 de uma molécula de ligação a antígeno de camundongo/ser humano modificada<400> 130
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu. Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Ala Gly Gln Ser
35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser ,Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 " 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn85 90 95Leu Glu ieu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110
Arg Thr Val115
<210> 131<211> 115<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-BK11 de uma molécula de ligação a antígeno de camun-dongo/ser humano modificada
<400> 131
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45
Pró Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 · 80
Ser Arg Val Glu Pro Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 HO
Arg Thr Val115
<210> 132<211> 115<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Estrutura Β-ΒΚ12 de uma molécula de ligação a antígeno de camun-dongo/ser humano modificada<400> 132
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Phe Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110
Arg Thr Val
115 120<210> 133<211> 115<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-BK13 de uma molécula de ligação a antígeno de camun-dongo/ser humano modificada<400> 133
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1 5 10 15Glu Pro Ala Ser Xle Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Aep Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn85 90 95
Leu Glu JDeu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Ala Ile Lys10Õ 105 110
Arg Thr Val115
<210> 134<211> 115<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> Estrutura B-BK14 de uma molécula de ligação a antígeno de camun-dongo/ser humano modificada<400> 134
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ala Lys100 105 HO
Arg Thr Val115

Claims (59)

1. Molécula de ligação a antígeno modificada, caracterizada pelofato de que compreende uma região variável de cadeia pesada ou de cadeialeve compreendendo pelo menos uma substituição de resíduo de aminoáci-do em pelo menos uma região de "framework" da referida região variável decadeia pesada ou cadeia leve quando comparado à região variável de ca-deia pesada ou cadeia leve de uma molécula de ligação a antígeno precur-sora, e em que a referida substituição resulta em atividade de sinalizaçãocelular alterada de um antígeno-alvo quando a referida molécula de ligaçãoa antígeno modificada está complexada com o referido antígeno-alvo, com acondição de que a referida molécula de ligação a antígeno modificada exclui:SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:- 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:- 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40, SEQID NO: 42, e SEQ ID NO: 44.
2. Molécula de ligação a antígeno modificada, caracterizada peiofato de que compreende uma região variável de cadeia pesada ou cadeialeve compreendendo pelo menos uma substituição de resíduo de aminoáci-do em pelo menos uma região de "framework" da referida região variável decadeia pesada ou cadeia leve quando comparada à região variável de ca-deia pesada ou cadeia leve de uma molécula de ligação a antígeno precur-sora, e em que a referida molécula de ligação a antígeno modificada possuicapacidade alterada de mediar a reticulação de um ou mais antígenos-alvocomo um resultado da referida substituição, com a condição de que a referi-da molécula de ligação a antígeno modificada exclui: SEQ ID NO: 2, SEQ IDNO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:- 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQID NO: 32, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, e SEQ ID NO: 44.
3. Molécula de ligação a antígeno modificada de acordo com areivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a referida molécula deligação a antígeno precursora exclui a SEQ ID NO: 59.
4. Molécula de ligação a antígeno modificada de acordo com areivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a referida substituiçãoestá na referida região variável de cadeia pesada.
5. Molécula de ligação a antígeno modificada de acordo com areivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a referida substituição estána FR1 da referida região variável de cadeia pesada.
6. Molécula de ligação a antígeno modificada de acordo com areivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a FR1 inteira da referida regi-ão variável de cadeia pesada é substituída por uma VH FR1 de linhagemgerminativa.
7. Molécula de ligação a antígeno modificada de acordo com areivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a referida FR1 compreendeuma seqüência de aminoácido nas posições 8 a 13 de Kabat selecionada dogrupo consistindo em: SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65,SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 68, SEQ IDNO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74,SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ IDNO: 79, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO:-104, e SEQ ID NO: 105.
8. Molécula de ligação a antígeno modificada de acordo com areivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a referida substituição emFR1 da referida região variável de cadeia pesada compreende uma substitu-ição de um resíduo de aminoácido em uma ou mais das posições 8, 9, 10,-11, 12 ou 13 de Kabat.
9. Molécula de ligação a antígeno modificada de acordo com areivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a referida substituição emFR1 da referida região variável de cadeia pesada compreende uma substitu-ição do resíduo de aminoácido na posição 11 de Kabat.
10. Molécula de ligação a antígeno modificada de acordo com areivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a referida substituição com-preende uma substituição do resíduo de aminoácido na posição 11 de Kabatpor uma valina.
11. Molécula de ligação a antigeno modificada de acordo com areivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a referida substituição emFRI da referida região variável de cadeia pesada compreende uma substitu-ição do resíduo de aminoácido na posição 12 de Kabat.
12. Molécula de ligação a antigeno modificada de acordo com areivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a referida substituição com-preende uma substituição do resíduo de aminoácido na posição 12 de Kabatpor uma lisina.
13. Molécula de ligação a antigeno modificada de acordo com areivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a referida substituição emFR1 da referida região variável de cadeia pesada compreende uma substitu-ição dos resíduos de aminoácido nas posições 11 e 12 de Kabat.
14. Molécula de ligação a antigeno modificada de acordo com areivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a referida substituição com-preende uma substituição de um resíduo de aminoácido na posição 11 deKabat por uma valina e na posição 12 de Kabat por uma lisina.
15. Molécula de ligação a antigeno modificada de acordo com areivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a referida substituição com-preende uma substituição de um resíduo de aminoácido na posição 11 deKabat por uma Ieucina e na posição 12 de Kabat por uma valina.
16. Molécula de ligação a antigeno modificada de acordo com areivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a referida substituição com-preende substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido em FR4 dareferida região variável de cadeia pesada.
17. Molécula de ligação a antigeno modificada de acordo com areivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a referida substituição emFR4 da referida região variável de cadeia pesada compreende uma substitu-ição de um resíduo de aminoácido em uma ou mais das posições 110 ou-112 de Kabat.
18. Molécula de ligação a antigeno modificada de acordo com areivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a referida substituição éna referida região variável de cadeia leve.
19. Molécula de ligação a antígeno modificada de acordo com areivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a referida substituição nareferida região variável de cadeia leve compreende uma substituição de umresíduo de aminoácido em uma ou mais das posições 40, 80, 83, 105 ou 106de Kabat.
20. Molécula de ligação a antígeno modificada de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida atividade de sinali-zação celular alterada é atividade agonista aumentada.
21. Molécula de ligação a antígeno modificada de acordo com areivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a referida atividade agonistaaumentada é indução de apoptose.
22. Molécula de ligação a antígeno modificada de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida atividade de sinali-zação celular alterada é atividade antagonista aumentada.
23. Molécula de ligação a antígeno modificada de acordo com areivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a referida molécula deligação a antígeno modificada se liga especificamente ao CD20 humano.
24. Molécula de ligação a antígeno modificada de acordo com areivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a referida molécula deligação a antígeno modificada se liga especificamente a um receptor de tiro-sina quinase.
25. Molécula de ligação a antígeno modificada de acordo com areivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o referido receptor de tirosi-na quinase é selecionado do grupo consistindo em HER1 (EGFR1),HER2/neu, HER3, HER4, IGF-1R, FGFR1 PDGFR, VEGFR1, VEGFR2 eVEGFR3.
26. Molécula de ligação a antígeno modificada de acordo com areivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a referida molécula deligação a antígeno precursora compreende uma região variável de cadeiapesada selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO:-56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQID NO: 61, e SEQ ID NO: 62.
27. Molécula de ligação a antígeno modificada de acordo com areivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende ainda umaregião Fc humana.
28. Molécula de ligação a antígeno modificada de acordo com areivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a referida região Fc foi mo-dificada para ter oligossacarídeos alterados.
29. Molécula de ligação a antígeno modificada de acordo com areivindicação 28, caracterizada pelo fato de que a referida região Fc foi mo-dificada para ter uma proporção diminuída de resíduos de fucose comparadocom uma região Fc não-modificada.
30. Molécula de ligação a antígeno modificada de acordo com areivindicação 28, caracterizada pelo fato de que a referida região Fc possuiuma proporção aumentada de resíduos de GIcNAc para resíduos de fucosena região Fc modificada comparado com uma região Fc não-modificada.
31. Molécula de ligação a antígeno modificada, caracterizadapelo fato de que compreende um domínio CH1 compreendendo pelo menosuma substituição de resíduo de aminoácido quando comparado com o domí-nio CH1 de um polipeptídeo precursor, em que a referida substituição resultaem atividade de sinalização celular alterada de um antígeno-alvo quando areferida molécula de ligação a antígeno modificada está complexada com oreferido antígeno-alvo ou capacidade alterada de mediar a reticulação de umou mais antígenos-alvo como um resultado da referida substituição.
32. Molécula de ligação a antígeno modificada de acordo com areivindicação 31, caracterizada pelo fato de que a referida substituição emCH1 compreende uma substituição de um resíduo de aminoácido em umaou mais das posições 148, 149 ou 150.
33. Polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo, carac-terizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesadaou cadeia leve, em que a referida região variável de cadeia pesada ou ca-deia leve compreende pelo menos uma substituição de resíduo de aminoá-cido em pelo menos uma região de "framework" quando comparado comuma região variável de cadeia pesada ou cadeia leve precursora e em que areferida substituição resulta em atividade de sinalização celular alterada deum antígeno-alvo quando o referido polipeptídeo está complexado com oreferido antígeno-alvo ou capacidade alterada de mediar a reticulação de umou mais antígenos-alvo como um resultado da referida substituição, com acondição de que a referida molécula de ligação a antígeno modificada exclui:SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:-10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:-28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40, SEQID NO: 42, e SEQ ID NO: 44.
34. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 33,caracterizado pelo fato de que a referida molécula de ligação a antígenoprecursora exclui a SEQ ID NO: 59.
35. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o polinu-cleotídeo como definido na reivindicação 33.
36. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compre-ende o vetor como definido na reivindicação 35.
37. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que é manipu-lada para expressar pelo menos um ácido nucléico que codifica um polipep-tídeo tendo atividade de 3(1,4)-N-acetil glucosaminil transferase Ill em umaquantidade suficiente para modificar os oligossacarídeos na região Fc de umpolipeptídeo produzido pela referida célula hospedeira, em que o referidopolipeptídeo é uma molécula de ligação a antígeno modificada, como defini-da na reivindicação 1 ou 2.
38. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 37, carac-terizada pelo fato de que a referida molécula de ligação a antígeno produzi-da pela referida célula hospedeira exibe função efetuadora aumentada comoum resultado da referida modificação de oligossacarídeo.
39. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 38, carac-terizada pelo fato de que a referida função efetuadora aumentada é citotoxi-cidade celular Fc-mediada aumentada.
40. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 39, carac-terizada pelo fato de que a referida função efetuadora aumentada é apopto-se induzida por sinalização direta aumentada.
41. Método para produção de uma molécula de ligação a antíge-no modificada compreendendo uma região variável de cadeia pesada oucadeia leve compreendendo pelo menos uma substituição de resíduo de a-minoácido em pelo menos uma região de "framework" da referida região va-riável de cadeia pesada ou cadeia leve quando comparado com a regiãovariável de cadeia pesada ou cadeia leve de uma molécula de ligação a an-tígeno precursora, e em que a referida substituição resulta em atividade desinalização celular alterada de um antígeno-alvo quando a referida moléculade ligação a antígeno modificada está complexada com o referido antígeno-alvo, com a condição de que a referida molécula de ligação a antígeno modi-ficada exclui: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8,SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ IDNO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26,SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 36, SEQ IDNO: 40, SEQ ID NO: 42, e SEQ ID NO: 44,o referido método sendo caracterizado pelo fato de que compre-ende:(i) cultura da célula hospedeira, como definida na reivindicação-36, sob condições que permitem a expressão do referido polinucleotídeo; e(ii) recuperação da referida molécula de ligação a antígeno modi-ficada do meio de cultura.
42. Método para produção de uma molécula de ligação a antíge-no modificada compreendendo uma região variável de cadeia pesada oucadeia leve compreendendo pelo menos uma substituição de resíduo de a-minoácido em pelo menos uma região de "framework" da referida região va-riável de cadeia pesada ou cadeia leve quando comparado com a regiãovariável de cadeia pesada ou cadeia leve de uma molécula de ligação a an-tígeno precursora, e em que a referida substituição resulta em capacidadealterada de mediar a reticulação como um resultado da referida substituição,com a condição de que a referida molécula de ligação a antígeno modificadaexclui: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ IDNO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ IDNO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40,SEQ ID NO: 42, e SEQ ID NO: 44,o referido método sendo caracterizado pelo fato de que compre-ende: (i) cultura da célula hospedeira, como definida na reivindicação-36, sob condições que permitem a expressão do referido polinucleotídeo; e(ii) recuperação da referida molécula de ligação a antígeno modi-ficada do meio de cultura.
43. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende a molécula de ligação a antígeno modificada, como definida nareivindicação 1, 2 ou 31, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
44. Uso da molécula de ligação a antígeno, como definida nareivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de ummedicamento para o tratamento ou profilaxia de câncer ou uma condição oulesão pré-cancerígena.
45. Uso de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelofato de que o referido câncer é selecionado do grupo consistindo em Iinfomade células B, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pes-coço, câncer de pele, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer ovaria-no, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de rim e câncer de cérebro.
46. Uso de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelofato de que a referida condição ou lesão pré-cancerígena é selecionada dogrupo consistindo em Ieucoplasia oral, queratose actínica (queratose solar),pólipos pré-cancerígenos do cólon ou reto, displasia epitelial gástrica, displa-sia adenomatosa, síndrome de câncer de cólon com não-polipose hereditária(HNPCC), esôfago de Barrett, displasia de bexiga e condições cervicais pré-cancerígenas.
47. Uso de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelofato de que a referida molécula de ligação a antígeno é usada em uma quan-tidade terapeuticamente eficaz de cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 15 mg/kg.
48. Molécula de ligação a antígeno modificada de acordo com areivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de ser para uso como um medi-camento no tratamento ou profilaxia de um distúrbio que está relacionado àatividade de sinalização celular alterada e/ou reticulação alterada de um oumais antígenos-alvo.
49. Molécula de ligação a antígeno modificada de acordo com areivindicação 48, caracterizada pelo fato de que a referida atividade de sina-lização celular alterada é apoptose aumentada.
50. Molécula de ligação a antígeno modificada de acordo com areivindicação 48, caracterizada pelo fato de que o referido distúrbio é umdistúrbio de células B.
51. Molécula de ligação a antígeno modificada de acordo com areivindicação 48, caracterizada pelo fato de que o referido antígeno-alvo éCD20.
52. Uso de uma molécula de ligação a antígeno modificadacompreendendo uma região variável de cadeia pesada ou cadeia leve para apreparação de um medicamento para indução de apoptose em uma célula,caracterizado pelo fato de que a referida região variável de cadeia pesadaou cadeia leve compreende pelo menos uma substituição de resíduo de a-minoácido em pelo menos uma região de "framework" da referida região va-riável de cadeia pesada ou cadeia leve quando comparado com a regiãovariável de cadeia pesada ou cadeia leve de uma molécula de ligação a an-tígeno precursora, e em que a referida molécula de ligação a antígeno modi-ficada possui capacidade aumentada de induzir à apoptose comparado como referido polipeptídeo precursor, com a condição de que a referida moléculade ligação a antígeno modificada exclui: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ IDNO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32,SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, e SEQ ID NO: 44.
53. Uso de uma molécula de ligação a antígeno modificada, ca-racterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para otratamento de uma doença ou distúrbio que é tratável através de atividadede sinalização celular alterada de um antígeno-alvo, em que a referida molé-cula de ligação a antígeno modificada compreende uma região variável decadeia pesada ou cadeia leve compreendendo pelo menos uma substituiçãode aminoácido em pelo menos uma região de "framework" da referida regiãovariável de cadeia pesada ou cadeia leve comparado com a região variávelde cadeia pesada ou cadeia leve de uma molécula de ligação a antígenoprecursora, e em que a referida substituição resulta em atividade de sinali-zação celular alterada de um antígeno-alvo quando a referida molécula deligação a antígeno modificada está complexada com o referido antígeno-alvo, com a condição de que a referida molécula de ligação a antígeno modi-ficada exclui: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8,SEQ ID NO: 10, SEQ !D NO: 12, SEQ !D NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ IDNO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26,SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 36, SEQ IDNO: 40, SEQ ID NO: 42, ou SEQ ID NO: 44 .
54. Uso de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelofato de que a referida atividade de sinalização celular alterada é induçãoaumentada de apoptose.
55. Uso de uma molécula de ligação a antígeno modificada, ca-racterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para otratamento de uma doença ou distúrbio que é tratável através de alteraçãoda capacidade de mediar a reticulação de um ou mais antígenos-alvo, emque a referida molécula de ligação a antígeno compreende uma região vari-ável de cadeia pesada ou cadeia leve compreendendo pelo menos umasubstituição de aminoácido em pelo menos uma região de "framework" dareferida região variável de cadeia pesada ou cadeia leve comparado com aregião variável de cadeia pesada ou cadeia leve de uma molécula de ligaçãoa antígeno precursora, e em que a referida molécula de ligação a antígenomodificada possui capacidade alterada de mediar a reticulação de um oumais antígenos-alvo como um resultado da referida substituição, com a con-dição de que a referida molécula de ligação a antígeno modificada exclui:SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:-10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:-28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40, SEQID NO: 42, e SEQ ID NO: 44.
56. Uso de acordo com a reivindicação 52, 53 ou 55, caracteri-zado pelo fato de que a referida molécula de ligação a antígeno precursoraexclui a SEQ ID NO: 59.
57. Uso de acordo com a reivindicação 53 ou 55, caracterizadopelo fato de que a referida doença ou distúrbio é um distúrbio de proliferaçãocelular.
58. Uso de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelofato de que o referido distúrbio de proliferação celular é câncer.
59. Uso de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelofato de que o referido câncer é um Iinfoma de células B.
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Families Citing this family (122)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002339845B2 (en) 2001-08-03 2009-03-26 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
ES2527871T3 (es) 2003-05-01 2015-02-02 Imclone Llc Anticuerpos completamente humanos dirigidos contra el receptor del factor de crecimiento 1 similar a la insulina humana
TR201809892T4 (tr) 2003-11-05 2018-07-23 Roche Glycart Ag Fc reseptörüne bağlanma afinitesi ve artırılmış efektör fonksiyonu bulunan antijen bağlayan moleküller.
CN103981190A (zh) 2005-02-07 2014-08-13 罗氏格黎卡特股份公司 结合egfr的抗原结合分子，编码它的载体，及其应用
JP2009501141A (ja) 2005-06-17 2009-01-15 イムクローン システムズ インコーポレイテッド 転移性骨癌の治療のための受容体アンタゴニスト
KR101460932B1 (ko) * 2005-08-26 2014-11-12 로슈 글리카트 아게 변형된 세포 신호 활성을 가진 개질된 항원 결합 분자
JP5198289B2 (ja) 2006-02-03 2013-05-15 イムクローン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 前立腺癌の治療用アジュバントとしてのｉｇｆ−ｉｒアンタゴニスト
AR062223A1 (es) * 2006-08-09 2008-10-22 Glycart Biotechnology Ag Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas
CN103435696B (zh) 2007-06-25 2016-10-12 艾斯巴技术-诺华有限责任公司 修饰抗体的方法和具有改善的功能性质的修饰抗体
JP5209723B2 (ja) * 2007-09-05 2013-06-12 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー Ｉ型及びｉｉ型抗ｃｄ２０抗体による組合せ治療
US20090098118A1 (en) 2007-10-15 2009-04-16 Thomas Friess Combination therapy of a type ii anti-cd20 antibody with an anti-bcl-2 active agent
US20090110688A1 (en) * 2007-10-24 2009-04-30 Georg Fertig Combination therapy of type ii anti-cd20 antibody with a proteasome inhibitor
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090169550A1 (en) * 2007-12-21 2009-07-02 Genentech, Inc. Therapy of rituximab-refractory rheumatoid arthritis patients
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
JP5597553B2 (ja) * 2008-03-13 2014-10-01 バイオテスト・アクチエンゲゼルシヤフト 疾患治療剤
RU2540013C2 (ru) * 2008-03-13 2015-01-27 Биотест Аг Средство для лечения заболевания
SG190627A1 (en) * 2008-03-13 2013-06-28 Biotest Ag Agent for treating disease
PT2268310T (pt) * 2008-03-25 2016-08-23 Roche Glycart Ag Uso de um anticorpo anti-cd20 do tipo ii com citotoxicidade celular acrescida dependente de anticorpo (adcc) em combinação com ciclofosfamida, vincristina e doxorubicina para tratar linfomas não-hodgkin
US20100260668A1 (en) * 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
SG190572A1 (en) * 2008-04-29 2013-06-28 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AR072001A1 (es) * 2008-06-03 2010-07-28 Abbott Lab Inmunoglobulina con dominio variable dual y usos de la misma
KR20110016959A (ko) * 2008-06-03 2011-02-18 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
RU2011104348A (ru) * 2008-07-08 2012-08-20 Эбботт Лэборетриз (Us) Иммуноглобулины с двойным вариабельным доменом против простагландина е2 и их применение
WO2010034590A1 (en) * 2008-09-29 2010-04-01 Biotest Ag Composition for treating disease
US20100247484A1 (en) * 2009-03-31 2010-09-30 Heinrich Barchet Combination therapy of an afucosylated antibody and one or more of the cytokines gm csf, m csf and/or il3
WO2010112193A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
PT2417156E (pt) 2009-04-07 2015-04-29 Roche Glycart Ag Anticorpos trivalentes, biespecíficos
KR20110124369A (ko) 2009-04-07 2011-11-16 로슈 글리카트 아게 이중특이적 항­ｅｒｂｂ­3／항­ｃ­ｍｅｔ 항체
KR20110124368A (ko) 2009-04-07 2011-11-16 로슈 글리카트 아게 이중특이적 항―ｅｒｂｂ―２／항―ｃ―ｍｅｔ 항체
WO2010138184A2 (en) * 2009-05-27 2010-12-02 Synageva Biopharma Corp. Avian derived antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
UY32808A (es) * 2009-07-29 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas como dominio variable dual y usos de las mismas
TWI409079B (zh) * 2009-08-14 2013-09-21 Roche Glycart Ag 非典型岩藻醣化ｃｄ２０抗體與苯達莫斯汀（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）之組合療法
JP2013501741A (ja) * 2009-08-14 2013-01-17 ロシュ グリクアート アーゲー アフコシル化ｃｄ２０抗体とフルダラビン及び／又はミトキサントロンの併用療法
TWI412375B (zh) 2009-08-28 2013-10-21 Roche Glycart Ag 人類化抗ｃｄｃｐ１抗體
TW201113037A (en) 2009-08-28 2011-04-16 Hoffmann La Roche Antibodies against CDCP1 for the treatment of cancer
IN2012DN02737A (pt) * 2009-09-01 2015-09-11 Abbott Lab
AR078161A1 (es) 2009-09-11 2011-10-19 Hoffmann La Roche Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento.
SG179196A1 (en) 2009-09-16 2012-04-27 Genentech Inc Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
WO2011047262A2 (en) * 2009-10-15 2011-04-21 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
GB0920944D0 (en) 2009-11-30 2010-01-13 Biotest Ag Agents for treating disease
SI2516469T1 (sl) 2009-12-22 2016-05-31 Roche Glycart Ag Protitelesa proti her3 in uporabe le-teh
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
CA2795544A1 (en) 2010-04-27 2011-11-03 Roche Glycart Ag Combination therapy of an afucosylated cd20 antibody with a mtor inhibitor
BR112013002535A2 (pt) 2010-08-03 2019-09-24 Hoffmann La Roche biomarcadores de leucemia linfocítica crônica (cll)
AR082461A1 (es) 2010-08-03 2012-12-12 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
AR082693A1 (es) * 2010-08-17 2012-12-26 Roche Glycart Ag Terapia de combinacion de un anticuerpo anti-cd20 afucosilado con un anticuerpo anti-vegf
JP5758004B2 (ja) 2010-08-24 2015-08-05 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ジスルフィドによって安定化されたＦｖ断片を含む二重特異性抗体
KR20130139884A (ko) 2010-08-26 2013-12-23 애브비 인코포레이티드 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
TW201302793A (zh) 2010-09-03 2013-01-16 Glaxo Group Ltd 新穎之抗原結合蛋白
KR20130088170A (ko) 2010-12-16 2013-08-07 로슈 글리카트 아게 비푸코실화 ｃｄ20 항체와 ｍｄｍ2 저해제와의 조합 치료
WO2012085111A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
CA2824824A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Monovalent antigen binding proteins
CN103502271B (zh) 2011-02-28 2016-10-26 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗原结合蛋白
MX2014002996A (es) 2011-09-23 2014-05-28 Roche Glycart Ag Anticuerpos anti - egfr/anti - igf-1r bisespecificos.
CN110680920A (zh) * 2011-09-30 2020-01-14 中外制药株式会社 诱导针对靶抗原的免疫应答的抗原结合分子
US20130302274A1 (en) * 2011-11-25 2013-11-14 Roche Glycart Ag Combination therapy
CA2861610A1 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Abbvie Inc. Dual specific binding proteins directed against il-13 and/or il-17
MX2014009565A (es) 2012-02-10 2014-11-10 Genentech Inc Anticuerpos monocatenarios y otros heteromultimeros.
BR112014032193A2 (pt) 2012-06-27 2017-06-27 Hoffmann La Roche métodos de produção de anticorpos biespecíficos e de determinação de combinação, anticorpo biespecífico, formulação e uso de anticorpo biespecífico
WO2014001325A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
KR20210111353A (ko) 2012-11-01 2021-09-10 애브비 인코포레이티드 항-ｖｅｇｆ／ｄｌｌ4 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
EP2727942A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Bispecific antibodies against human EGFR, HER2, and HER3
US20150259430A1 (en) 2012-11-05 2015-09-17 Mab Discovery Gmbh Method for the production of multispecific antibodies
EP2727943A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Trispecific antibodies against human EGFR, HER2 and HER3
EP2727941A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Method for the production of multispecific antibodies
AR094403A1 (es) 2013-01-11 2015-07-29 Hoffmann La Roche Terapia de combinación de anticuerpos anti-her3
EP2762496A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 EngMab AG Method for the selection of antibodies against BCMA
US9963513B2 (en) 2013-02-05 2018-05-08 Engmab Sàrl Method for the selection of antibodies against BCMA
CA2906057A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Genentech, Inc. Antibody formulations
JP2016522793A (ja) 2013-03-15 2016-08-04 アッヴィ・インコーポレイテッド ＩＬ−１βおよび／またはＩＬ−１７に対して指向された二重特異的結合タンパク質
JP6422956B2 (ja) 2013-10-11 2018-11-14 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 多重特異性ドメイン交換共通可変軽鎖抗体
WO2015082446A1 (en) 2013-12-02 2015-06-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of cancer using an anti-cdcp1 antibody and a taxane
RU2016128726A (ru) 2013-12-17 2018-01-23 Дженентек, Инк. Способы лечения злокачественных опухолей с использованием антагонистов связывания по оси pd-1 и антитела против cd20
ES2905777T3 (es) 2014-05-30 2022-04-12 Shanghai Henlius Biotech Inc Anticuerpos anti-receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR)
BR112017004393A2 (pt) 2014-09-15 2018-02-27 Genentech Inc formulações de anticorpo
DK3262071T3 (da) 2014-09-23 2020-06-15 Hoffmann La Roche Fremgangsmåde til anvendelse af anti-CD79b-immunkonjugater
US20170313779A1 (en) * 2014-11-05 2017-11-02 The University Of Chicago Methods and compositions pertaining to human cerebral cavernous malformations
JP6721590B2 (ja) 2014-12-03 2020-07-15 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 多重特異性抗体
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
US20160346387A1 (en) * 2015-05-11 2016-12-01 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating lupus nephritis
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
MX2017016651A (es) * 2015-06-24 2018-05-14 Hoffmann La Roche Anticuerpos contra csf-1r humano para su uso en la induccion de linfocitosis en linfomas o leucemias.
EP3108897A1 (en) 2015-06-24 2016-12-28 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies against human csf-1r for use in inducing lymphocytosis in lymphomas or leukemias
EP3313887A2 (en) 2015-06-26 2018-05-02 MAB Discovery GmbH Monoclonal anti-il-1racp antibodies
CA2989936A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Genentech, Inc. Type ii anti-cd20 antibody for use in organ transplantation
EP3670535A1 (en) 2015-08-03 2020-06-24 EngMab Sàrl Monoclonal antibodies against bcma
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
EP3178848A1 (en) 2015-12-09 2017-06-14 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies
CN115920030A (zh) 2015-12-09 2023-04-07 豪夫迈·罗氏有限公司 Ii型抗cd20抗体用于降低抗药物抗体形成
JP2019517991A (ja) 2016-03-01 2019-06-27 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 低減したａｄｃｐを有するオビヌツズマブ及びリツキシマブ変異体
WO2017173410A1 (en) * 2016-04-01 2017-10-05 Amgen Inc. Chimeric receptors to flt3 and methods of use thereof
WO2017184553A1 (en) * 2016-04-18 2017-10-26 Baylor College Of Medicine Cancer gene therapy targeting cd47
EP3241845A1 (en) 2016-05-06 2017-11-08 MAB Discovery GmbH Humanized anti-il-1r3 antibodies
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
EP3257866A1 (en) 2016-06-17 2017-12-20 Academisch Medisch Centrum Modified anti-tnf antibody and use thereof in the treatment of ibd
US10277886B2 (en) 2016-07-19 2019-04-30 Gopro, Inc. Mapping of spherical image data into rectangular faces for transport and decoding across networks
CN110167964B (zh) 2016-11-02 2023-12-01 百时美施贵宝公司 组合用于治疗多发性骨髓瘤的针对bcma和cd3的双特异性抗体和免疫药物
ES2847973T3 (es) 2016-12-20 2021-08-04 Hoffmann La Roche Politerapia de anticuerpos biespecíficos anti-CD20/anti-CD3 y agonistas de 4-1BB (CD137)
EP3401332A1 (en) 2017-05-08 2018-11-14 MAB Discovery GmbH Anti-il-1r3 antibodies for use in inflammatory conditions
KR20200014304A (ko) 2017-06-02 2020-02-10 에프. 호프만-라 로슈 아게 암의 치료를 위한 제ii형 항-cd20 항체 및 항-cd20/항-cd3 이중특이적 항체
CN110869391A (zh) 2017-07-26 2020-03-06 豪夫迈·罗氏有限公司 用BET抑制剂,Bcl-2抑制剂和抗CD20抗体的组合疗法
US11623965B2 (en) * 2017-08-16 2023-04-11 Bristol-Myers Squibb Company Prodruggable antibodies, prodrugs thereof, and methods of use and making
WO2019036855A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Adagene Inc. ANTI-CD137 MOLECULES AND THEIR USE
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
JP7159332B2 (ja) 2018-03-13 2022-10-24 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト ４－１ｂｂアゴニストと抗ｃｄ２０抗体の治療的組み合わせ
CN112996801A (zh) * 2018-11-26 2021-06-18 北卡罗来纳州大学 用于捕获宿主细胞蛋白的肽配体
AU2018451747A1 (en) 2018-12-06 2021-06-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of diffuse large B-cell lymphoma comprising an anti-CD79b immunoconjugates, an alkylating agent and an anti-CD20 antibody
BR112021022815A2 (pt) 2019-05-14 2021-12-28 Genentech Inc Métodos para tratar linfoma folicular, kits, imunoconjugados e polatuzumabe vedotina
EP3986925A1 (en) * 2019-06-19 2022-04-27 F. Hoffmann-La Roche AG Method for the generation of a trivalent antibody expressing cell by targeted integration of multiple expression cassettes in a defined organization
AU2020322031A1 (en) * 2019-07-31 2022-03-10 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Multivalent DNA antibody constructs and use thereof
AU2020345913A1 (en) 2019-09-12 2022-02-24 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating lupus nephritis
BR112022007216A2 (pt) 2019-10-18 2022-08-23 Genentech Inc Métodos para tratamento de linfoma difuso, kit e imunoconjugado
CN111411079A (zh) * 2020-03-27 2020-07-14 北京时合生物科技有限公司 细胞培养方法、改造抗体、细胞培养基、细胞产品及其应用
CA3175530A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates
CA3207090A1 (en) 2021-01-06 2022-07-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy employing a pd1-lag3 bispecific antibody and a cd20 t cell bispecific antibody
JP2024511970A (ja) 2021-03-15 2024-03-18 ジェネンテック， インコーポレイテッド ループス腎炎の治療の組成物及び方法
CN117396232A (zh) 2021-05-12 2024-01-12 基因泰克公司 使用抗cd79b免疫缀合物治疗弥漫性大b细胞淋巴瘤的方法
KR20240046524A (ko) 2021-08-07 2024-04-09 제넨테크, 인크. 미만성 거대 b-세포 림프종을 치료하기 위해 항-cd79b 면역접합체를 사용하는 방법
WO2024102734A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating childhood onset idiopathic nephrotic syndrome

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
BR9609743A (pt) 1995-07-27 1999-03-02 Genentech Inc Formulação reconstituída estável método para a preparação de uma formulação artigo manufaturado e uso da formação
US6001358A (en) 1995-11-07 1999-12-14 Idec Pharmaceuticals Corporation Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof
UA76934C2 (en) * 1996-10-04 2006-10-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Reconstructed human anti-hm 1.24 antibody, coding dna, vector, host cell, method for production of reconstructed human antibody, pharmaceutical composition and drug for treating myeloma containing reconstructed human anti-hm 1.24 antibody
ES2190087T3 (es) 1997-06-13 2003-07-16 Genentech Inc Formulacion estabilizada de un anticuerpo.
CA2325346A1 (en) 1998-04-03 1999-10-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Humanized antibody against human tissue factor (tf) and process for constructing humanized antibody
WO1999054342A1 (en) 1998-04-20 1999-10-28 Pablo Umana Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
CA2328986A1 (en) * 1998-05-20 1999-11-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Gene recombinant antibodies
AU3041100A (en) * 1999-01-05 2000-07-24 Unilever Plc Binding of antibody fragments to solid supports
US6737056B1 (en) * 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
PL209786B1 (pl) 1999-01-15 2011-10-31 Genentech Inc Przeciwciało zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1, przeciwciało wiążące czynnik wzrostu śródbłonka naczyń oraz immunoadhezyna
ES2420835T3 (es) 1999-04-09 2013-08-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para controlar la actividad de las moléculas inmunofuncionales
US6815184B2 (en) * 2000-07-31 2004-11-09 Biolex, Inc. Expression of biologically active polypeptide in duckweed
AU2002213357A1 (en) 2000-10-20 2002-05-06 Idec Pharmaceuticals Corporation Variant igg3 rituxan r and therapeutic use thereof
RU2306952C2 (ru) * 2001-01-31 2007-09-27 Байоджен Айдек Инк. Лечение в-клеточных злокачественных опухолей с использованием комбинации применений, связанных с антителами, уменьшающими количество b-клеток, и с иммуномодулирующими антителами
JP2005500018A (ja) 2001-04-02 2005-01-06 アイデック ファーマスーティカルズ コーポレイション ＧｎＴＩＩＩと同時発現する組換え抗体
US7321026B2 (en) 2001-06-27 2008-01-22 Skytech Technology Limited Framework-patched immunoglobulins
MXPA05000511A (es) 2001-07-12 2005-09-30 Jefferson Foote Anticuepros super humanizados.
AU2002339845B2 (en) * 2001-08-03 2009-03-26 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
IL159422A0 (en) * 2001-09-20 2004-06-01 Cornell Res Foundation Inc Methods and compositions for treating or preventing skin disorders using binding agents specific for prostate-specific membrane antigen
US20040093621A1 (en) * 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
EP1467615B2 (en) 2001-12-27 2017-03-22 GlycoFi, Inc. Methods to engineer mammalian-type carbohydrate structures
US7432063B2 (en) * 2002-02-14 2008-10-07 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods for affinity maturation
CA2476166C (en) * 2002-02-14 2011-11-15 Immunomedics, Inc. Anti-cd20 antibodies and fusion proteins thereof and methods of use
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
JP5350573B2 (ja) 2002-03-19 2013-11-27 スティヒティング ディーンスト ランドバウクンディフ オンデルズーク 植物におけるｇｎｔｉｉｉ発現
DK1490405T3 (da) * 2002-03-21 2007-12-27 Lilly Co Eli Antagonistiske humane anti-hFas-igand-antistoffer og fragmenter deraf
US20030190689A1 (en) * 2002-04-05 2003-10-09 Cell Signaling Technology,Inc. Molecular profiling of disease and therapeutic response using phospho-specific antibodies
US20040132097A1 (en) 2002-06-19 2004-07-08 Bacus Sarah S. Method for predicting response to epidermal growth factor receptor-directed therapy
US7425619B2 (en) * 2002-08-14 2008-09-16 Macrogenics, Inc. FcγRIIB specific antibodies and methods of use thereof
SI1539966T1 (sl) 2002-09-12 2010-10-29 Greenovation Biotech Gmbh Postopek za produkcijo proteinov
EP1578947A4 (en) * 2002-12-02 2006-12-06 Abgenix Inc ANTIBODIES AGAINST A2 PHOSPHOLIPASE AND USES
WO2004057002A2 (en) 2002-12-20 2004-07-08 Greenovation Biotech Gmbh Production of heterologous glycosylated proteins in bryophyte cells
US7960512B2 (en) * 2003-01-09 2011-06-14 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
AU2004204494B2 (en) 2003-01-09 2011-09-29 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
KR101498588B1 (ko) 2003-01-22 2015-03-05 로슈 글리카트 아게 융합 구성체와 Ｆｃ 수용체 결합 친화도 및 이펙터 기능이 증가된 항체를 생성하기 위한 이의 용도
CA2513113A1 (en) * 2003-01-23 2004-08-05 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
BRPI0408317A (pt) * 2003-03-14 2006-03-07 Pharmacia Corp anticorpos do receptor de igf-i para o tratamento de cáncer
JP2007526220A (ja) * 2003-06-05 2007-09-13 ジェネンテック・インコーポレーテッド Ｂ細胞疾患の併用療法
CA2537055A1 (en) * 2003-08-22 2005-04-21 Medimmune, Inc. Humanization of antibodies
TR201809892T4 (tr) * 2003-11-05 2018-07-23 Roche Glycart Ag Fc reseptörüne bağlanma afinitesi ve artırılmış efektör fonksiyonu bulunan antijen bağlayan moleküller.
CN1947012A (zh) * 2003-12-23 2007-04-11 瑞纳神经科学公司 激动剂抗－trkC抗体和使用其的方法
EP1720908A2 (en) * 2004-02-17 2006-11-15 Absalus, Inc. Super-humanized antibodies against respiratory syncytial virus
US7501121B2 (en) * 2004-06-17 2009-03-10 Wyeth IL-13 binding agents
WO2006031825A2 (en) * 2004-09-13 2006-03-23 Macrogenics, Inc. Humanized antibodies against west nile virus and therapeutic and prophylactic uses thereof
PE20061329A1 (es) * 2004-12-15 2006-12-08 Neuralab Ltd Anticuerpos ab humanizados para mejorar la cognicion
WO2006133148A2 (en) * 2005-06-03 2006-12-14 Genentech, Inc. Method of producing antibodies with modified fucosylation level
KR101460932B1 (ko) * 2005-08-26 2014-11-12 로슈 글리카트 아게 변형된 세포 신호 활성을 가진 개질된 항원 결합 분자

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