ES2957567T3 - Anticuerpos humanizados y de afinidad madurada contra FcRH5 y procedimientos de uso - Google Patents

Anticuerpos humanizados y de afinidad madurada contra FcRH5 y procedimientos de uso Download PDF

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Ji Li
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Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-FcRH5, incluidos anticuerpos anti-FcRH5 que comprenden un dominio de unión a FcRH5 y un dominio de unión a CD3 (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos dependientes de células T (TDB) FcRH5), y a métodos para utilizarlos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos humanizados y de afinidad madurada contra FcRH5 y procedimientos de uso
La presente solicitud contiene un listado de secuencias que se ha presentado electrónicamente en formato ASCII. Dicha copia ASCII, creada el 14 de junio de 2016, se denomina 50474-134WO2_Sequence_Listing_6_14_16_ST25 y tiene un tamaño de 133.004 bytes.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos que se unen a FcRH5 y CD3 y a procedimientos de uso de los mismos.
Antecedentes de la invención
Los trastornos proliferativos celulares, tales como cáncer, se caracterizan por el crecimiento incontrolado de subpoblaciones celulares. Son la causa principal de muerte en el mundo desarrollado y la segunda causa principal de muerte en los países en desarrollo, con más de 14 millones de nuevos casos de cáncer diagnosticados y produciéndose más de ocho millones de muertes por cáncer cada año. El Instituto Nacional del Cáncer ha estimado que más de medio millón de estadounidenses morirán de cáncer en 2016, lo que representa casi una de cada cuatro muertes en el país. A medida que la población anciana ha envejecido, la incidencia de cáncer ha aumentado simultáneamente, ya que la probabilidad de desarrollar cáncer es más de dos veces más alta después de los setenta años. Por tanto, la prevención y tratamiento del cáncer representa una carga social importante y cada vez mayor.
El gen de tipo receptor de Fc 5 (FcRH5, también conocido como FcRL5 o IRTA2) pertenece a una familia de seis genes identificados recientemente de la superfamilia de las inmunoglobulinas (SFIg). Esta familia de genes está estrechamente relacionada con los receptores de Fc con la estructura genómica conservada, la composición del dominio Ig extracelular y los motivos de señalización tirosínicos de inhibición del receptor inmunitario (ITIM) y de activación del receptor inmunitario (ITAM) (Davis et al. Eur. J. Immunol. 35:674-80, 2005). Se han descrito seis miembros de la familia de receptores FcRH/IRTA: FcRH1/IRTA5, FcRH2/IRTA4, FcRH3/IRTA3, FcRH4/IRTA1, FcRH5/IRTA2 y FcRH6 (Polson et al. Int. Immunol. 18(9):1363-1373, 2006. Los ADNc de FcRH codifican glucoproteínas transmembrana de tipo I con múltiples dominios extracelulares tipo Ig y dominios citoplásmicos que contienen motivos de señalización tirosínicos de inhibición y/o activación del receptor inmunitario de consenso. Los genes de FcRH están estructuralmente relacionados y sus productos proteicos comparten un 28-60 % de identidad extracelular entre sí. También comparten un 15-31 % de identidad con sus parientes FcR más cercanos. Existe un alto grado de homología entre las diferentes FcRH.
Se desconoce(n) el/los ligando(s) para FcRH5, pero se ha implicado a FcRH5 en la proliferación potenciada y la expresión posterior de isotipo durante el desarrollo de linfocitos B sensibilizados con antígeno (Dement-Brown et al. J. Leukoc. Biol. 91:59-67, 2012). El locus FcRH5 tiene tres isoformas principales de ARNm (FcRH5a, FcRH5b y FcRH5c). Las principales isoformas de la proteína FcRH5 codificadas por estos transcritos comparten una secuencia de aminoácidos común hasta el residuo 560, que presenta un péptido señalizador común y seis dominios tipo Ig extracelulares. FcRH5a representa una glucoproteína secretada de 759 aminoácidos con ocho dominios tipo Ig seguidos de 13 aminoácidos predominantemente polares únicos en su extremo C. FcRH5b diverge de FcRH5a en el residuo aminoacídico 560 y se extiende por un tramo corto de 32 residuos adicionales, cuya hidrofobia es compatible con su acoplamiento a la membrana plasmática por medio de un anclaje GPI. FcRH5c es la isoforma más larga cuya secuencia se desvía de FcRH5a en el aminoácido 746. FcRH5c codifica una glucoproteína transmembrana de tipo I de 977 aminoácidos con nueve dominios extracelulares tipo Ig que albergan ocho potenciales sitios de glucosilación unidos a N, un dominio transmembrana de 23 aminoácidos y un dominio citoplásmico de 104 aminoácidos con tres motivos de unión SH2 de consenso que tienen un consenso ITIM.
Los genes de FcRH se agrupan en medio de los genes de FcR clásicos (F<cy>RI, F<cy>RII, F<cy>RII, F<cy>RII y F<ce>RI) en la región 1q21-23 del cromosoma 1. Esta región contiene una de las anomalías cromosómicas secundarias más frecuentes asociadas con el fenotipo maligno en los tumores hematopoyéticos, especialmente en el mieloma múltiple (Hatzivassiliou et al. Immunity. 14:277-89, 2001). FcRH5 se expresa solo en el linaje de linfocitos B, comenzando tan temprano como los prelinfocitos B, pero no alcanza la expresión completa hasta la fase de linfocitos B maduros. A diferencia de la mayoría de las otras proteínas de superficie específicas de linfocitos B conocidos (por ejemplo, CD20, CD19 y CD22), FcRH5 continúa expresándose en células plasmáticas, mientras que otros marcadores específicos de linfocitos B se regulan a la baja (Polson et al. Int. Immunol. 18:1363-73, 2006). Además, el ARNm de FcRH5 se sobreexpresa en líneas celulares de mieloma múltiple con anomalías 1q21 detectadas por matrices de oligonucleótidos (Inoue Am. J. Pathol. 165:71-81, 2004). El patrón de expresión indica que FcRH5 podría ser una diana para los tratamientos basados en anticuerpos para el tratamiento del mieloma múltiple. El mieloma múltiple es una neoplasia maligna de las células plasmáticas caracterizada por lesiones esqueléticas, insuficiencia renal, anemia e hipercalcemia, y es esencialmente incurable con los tratamientos actuales. Los tratamientos farmacológicos actuales para el mieloma múltiple incluyen combinaciones del inhibidor del proteosoma bortezomib (VELCADE®), el inmunomodulador lenalidomida (REVLIMID®) y el corticoide dexametasona.
El tratamiento basado en anticuerpos monoclonales (AcM) se ha convertido en una importante modalidad de tratamiento para el cáncer. Los tratamientos basados en anticuerpos específicos contra FcRH5c y los procedimientos de detección pueden ser en particular eficaces, ya que reconocen específicamente la FcRH5 asociada a la membrana de la célula diana en lugar de los anticuerpos que reconocen tanto las isoformas solubles como las de membrana de FcRH5. Sin embargo, solo el último dominio tipo Ig de FcRH5 (dominio tipo Ig 9) es una región extracelular única que diferencia entre las tres isoformas principales de FcRH5 (por ejemplo, FcRH5a, FcRH5b y FcRH5c), y existe una homología significativa entre los dominios tipo Ig dentro de FcRH5. Además, el último dominio tipo Ig está altamente conservado entre FcRH1, FcRH2, FcRH3 y FcRH5. Cualquier tratamiento basado en anticuerpos dirigido específicamente contra FcRH5 debe tener una reactividad cruzada mínima con otros FcRH para evitar efectos adversos inespecíficos (por ejemplo, FcRH3 se expresa en linfocitos NK normales). En vista de lo anterior, existe una necesidad no cubierta en el campo de agentes seguros y eficaces para su uso en el tratamiento de trastornos proliferativos celulares (por ejemplo, cánceres, por ejemplo, cánceres positivos para FcRH5, por ejemplo, mieloma múltiple).
Sumario de la invención
La presente invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto. A lo largo de la descripción y las figuras, dichos ejemplos, aspectos o modos de realización que no están de acuerdo con la invención se divulgan en el presente documento solo con propósitos ilustrativos.
La presente invención proporciona anticuerpos anti-FcRH5 (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos dependientes de linfocitos T (TDB) contra FcRH5), composiciones y procedimientos de uso de los mismos para el tratamiento de trastornos proliferativos celulares (por ejemplo, cánceres, por ejemplo, cánceres positivos para FcRH5, por ejemplo, mieloma múltiple).
En algunos modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 comprende un dominio de unión que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 104 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105.
En algunos modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 comprende un dominio de unión que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107.
En algunos modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 comprende un dominio de unión que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 84 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85.
En algunos modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 comprende un dominio de unión que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 87.
En algunos modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 comprende un dominio de unión que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 88 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 89.
En algunos modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 comprende un dominio de unión que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 90 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 91.
En algunos modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 comprende un dominio de unión que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 92 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 93.
En algunos modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 comprende un dominio de unión que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 97.
En algunos modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 comprende un dominio de unión que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 98 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 99.
En algunos modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 comprende un dominio de unión que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 100 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 101.
En algunos modos de realización de uno cualquiera de los aspectos precedentes, el anticuerpo anti-FcRH5 se une a un epítopo en el dominio tipo Ig 9 de FcRH5. En algunos modos de realización, el epítopo comprende una porción de los aminoácidos 743-850 de SEQ ID NO: 114. En algunos modos de realización, el dominio de unión se une a FcRH5 humana, FcRH5 de macaco cangrejero (cyno) o ambas.
En algunos modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 se une a FcRH5 humana con una K<d>de entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 20 nM. En algunos modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 se une a FcRH5 humana con una K<d>de entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 10 nM.
En algunos modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 se une a FcRH5 de cyno con una K<d>de entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 50 nM.
En otros modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 comprende una mutación del sitio de aglucosilación. En algunos modos de realización, la mutación del sitio de aglucosilación es una mutación por sustitución. En algunos modos de realización, la mutación del sitio de aglucosilación reduce la función efectora del anticuerpo anti-FcRH5. En algunos modos de realización, la mutación por sustitución está en el residuo aminoacídico N297, L234, L235, D265 y/o P329 (numeración EU). En algunos modos de realización, la mutación por sustitución se selecciona del grupo que consiste en N297G, N297A, L234A, L235A, D265A y P329G. En algunos modos de realización, la mutación por sustitución es una mutación N297G.
En otros modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 es un anticuerpo IgG.
En algunos modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 es un fragmento de anticuerpo que se une a FcRH5. En algunos modos de realización, el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en fragmentos bis-Fab, Fab, Fab'-SH, Fv, scFv y (Fab')2. En algunos modos de realización, el fragmento de anticuerpo es un fragmento bis-Fab.
En otros modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 es un anticuerpo de longitud completa.
En algunos modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 es un anticuerpo monoespecífico.
En algunos modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 es un anticuerpo multiespecífico. En algunos modos de realización, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo biespecífico. En algunos modos de realización, el anticuerpo biespecífico comprende un segundo dominio de unión que se une al grupo de diferenciación 3 (CD3). En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión se une a un epítopo en CD3 que comprende el residuo aminoacídico Glu6 de CD3. En algunos modos de realización, el epítopo comprende además uno o más residuos aminoacídicos adicionales seleccionados del grupo que consiste en Gln1, Asp2 y Met7 de CD3. En algunos modos de realización, el epítopo comprende los residuos aminoacídicos Gln1, Asp2 y Glu6 de CD3. En algunos modos de realización, el epítopo comprende los residuos aminoacídicos Gln1, Asp2, Glu6 y Met7 de CD3. En algunos modos de realización, el epítopo no comprende el residuo aminoacídico Glu5 de CD3. En algunos modos de realización, el epítopo no comprende los residuos aminoacídicos Gly3 y Glu5 de CD3. En algunos modos de realización, el epítopo consiste en los residuos aminoacídicos Gln1, Asp2, Glu6 y Met7 de CD3. En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión se puede unir a un polipéptido CD3 humano o a un polipéptido CD3 de cyno. En algunos modos de realización, el polipéptido CD3 humano o el polipéptido CD3 de cyno es un polipéptido CD3e humano o un polipéptido CD3e de cyno, respectivamente. En algunos modos de realización, el polipéptido CD3 humano o el polipéptido CD3 de cyno es un polipéptido CD3y humano o un polipéptido CD3y de cyno, respectivamente. En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión se une al polipéptido CD3e humano con una K<d>de 100 nM o menor. En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión se une al polipéptido CD3<e>humano con una K<d>de entre aproximadamente 10 μM y aproximadamente 100 nM. En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión se une al polipéptido CD3e humano con una K<d>de entre aproximadamente 100 μM y aproximadamente 50 nM. En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión se une al polipéptido CD3<e>humano con una K<d>de entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 10 nN.
En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión comprende las siguientes seis HVR: (a) una HVR-H1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115, (b) una HVR-H2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116, (c) una HVR-H3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117, (d) una HVR-L1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118, (e) una HVR-L2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119, y (f) una HVR-L3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120. En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión comprende las siguientes seis HVR: (a) una HVR-H1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115; (b) una HVR-H2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116, (c) una HVR-H3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121, (d) una HVR-L1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118, (e) una HVR-L2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119, y (f) una HVR-L3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123. En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133, (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134, o (c) un dominio VH como en (a) y un dominio VL como en (b). En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión comprende las siguientes FR de región variable de la cadena pesada: (a) una FR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125, (b) una FR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 126, (c) una FR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127, y (d) una FR-H4 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128. En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133. En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión comprende además las siguientes FR de región variable de la cadena ligera: (a) una FR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129, (b) una FR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 130, (c) una FR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131, y (d) una FR-L4 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 132. En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión comprende un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134. En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134.
En otros modos de realización, el segundo dominio de unión comprende las siguientes seis HVR: (a) una HVR-H1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115, (b) una HVR-H2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116, (c) una HVR-H3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121, (d) una HVR-L1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118, (e) una HVR-L2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119, y (f) una HVR-L3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 124. En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 137, (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 138, o (c) un dominio VH como en (a) y un dominio VL como en (b). En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión comprende las siguientes FR de región variable de la cadena pesada: (a) una FR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125, (b) una FR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 126, (c) una FR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127, y (d) una FR-H4 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128. En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 137. En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión comprende además las siguientes FR de región variable de la cadena ligera: (a) una FR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129, (b) una FR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 130, (c) una FR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131, y (d) una FR-L4 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 132. En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión comprende un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 138. En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 137 y (b) un dominio V<l>que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 138.
En otros modos de realización, el segundo dominio de unión comprende las siguientes seis HVR: (a) una HVR-H1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 139, (b) una HVR-H2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 140, (c) una HVR-H3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 141, (d) una HVR-L1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 142, (e) una HVR-L2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 143, y (f) una HVR-L3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 144. En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153, (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 154, o (c) un dominio VH como en (a) y un dominio VL como en (b). En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión comprende las siguientes FR de región variable de la cadena pesada: (a) una FR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 145, (b) una FR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 146, (c) una FR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 147, y (d) una FR-H4 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 148. En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153. En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión comprende además las siguientes FR de región variable de la cadena ligera: (a) una FR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 149, (b) una FR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150, (c) una FR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 151, y (d) una FR-L4 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 152. En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión comprende un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 154. En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 154.
En otros modos de realización, el segundo dominio de unión comprende las siguientes seis HVR: (a) una HVR-H1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 155, (b) una HVR-H2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 156, (c) una HVR-H3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 157, (d) una HVR-L1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 158, (e) una HVR-L2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159, y (f) una HVR-L3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 160.
En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión comprende las siguientes seis HVR: (a) una HVR-H1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 155, (b) una HVR-H2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 162, (c) una HVR-H3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 157, (d) una HVR-L1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 158, (e) una HVR-L2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159, y (f) una HVR-L3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 160. En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 172, (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 173, o (c) un dominio VH como en (a) y un dominio VL como en (b). En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión comprende las siguientes FR de región variable de la cadena pesada: (a) una FR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 164, (b) una FR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 165, (c) una FR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 166, y (d) una FR-H4 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 167. En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 172. En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión comprende además las siguientes FR de región variable de la cadena ligera: (a) una FR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 168, (b) una FR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 169, (c) una FR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 170, y (d) una FR-L4 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 171. En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión comprende un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 173. En algunos modos de realización, el segundo dominio de unión comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 172 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 173.
En otros modos de realización, el dominio VL2 está enlazado a un dominio CL (CL2) y el VH2 está enlazado a un dominio CH1 (CH12), en el que el CL2 comprende una región cargada (CRz) y el CH12 comprende una región cargada (CRs), y en el que la CRz en el CL2 forma un par cargado con la CRs en el CH12. En algunos modos de realización, la CRz comprende un residuo aminoacídico básico y la CRs comprende un residuo ácido. En algunos modos de realización, la CRz comprende una mutación por sustitución V133K (numeración EU). En algunos modos de realización, la CRz consiste en la mutación por sustitución V133K. En algunos modos de realización, la CRs comprende una mutación por sustitución S183<e>(numeración EU). En algunos modos de realización, la CRs consiste en la mutación por sustitución S183E.
En otros modos de realización, el dominio VL2 está enlazado a un dominio CL (CL2) y el VH2 está enlazado a un dominio CH1 (CH12), en el que (a) el CL2 comprende una o más mutaciones en los residuos aminoacídicos F116, L135, S174, S176 y/o T178 (numeración EU) y (b) el CH12 comprende una o más mutaciones en los residuos aminoacídicos A141, F170, S181, S183 y/o V185 (numeración UE). En algunos modos de realización, la CL2 comprende una o más de las siguientes mutaciones por sustitución: F116A, L135V, S174A, S176F y/o T178V. En algunos modos de realización, la CL2 comprende las siguientes mutaciones por sustitución: F116A, L135V, S174A, S176F y T178V. En algunos modos de realización, el CH12 comprende una o más de las siguientes mutaciones por sustitución: A141I, F170S, S181M, S183A y/o V185A. En algunos modos de realización, el CH12 comprende las siguientes mutaciones por sustitución: A141I, F170S, S181M, S183A y V185A. En algunos modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 comprende uno o más dominios constantes de la cadena pesada, en el que el uno o más dominios constantes de la cadena pesada se seleccionan de un primer dominio CH2 (CH2i), un primer dominio CH3 (CH3i), un segundo dominio CH2 (CH22) y un segundo dominio CH3 (CH32). En algunos modos de realización, al menos uno de los uno o más dominios constantes de la cadena pesada está apareado con otro dominio constante de la cadena pesada. En algunos modos de realización, el CH3i y el CH32 comprenden cada uno una protuberancia (Pi) o una cavidad (Ci), y en el que la Pi o la Ci en el CH3i se puede situar en la Ci o la Pi, respectivamente, en el CH32. En algunos modos de realización, el CH3i y el CH32 se encuentran en una interfase entre la Pi y la Ci. En algunos modos de realización, el CH2i y el CH22 comprenden cada uno (P2) o una cavidad (C2), y en el que la P2 o la C2 en el CH2i se puede situar en la C2 o la P2, respectivamente, en el CH22. En algunos modos de realización, el CH2i y el CH22 se encuentran en una interfase entre la P2 y la C2.
En otro aspecto, la invención presenta un anticuerpo anti-FcRH5 que se une a FcRH5 y CD3, en el que el anticuerpo anti-FcRH5 comprende: (a) un brazo anti-FcRH5 que comprende un primer dominio de unión que comprende un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 104 y un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105, en el que el brazo anti-FcRH5 comprende una cadena ligera que comprende mutaciones por sustitución Q38E y V133K y una cadena pesada que comprende mutaciones por sustitución Q39K, S183E y N297G, y (b) un brazo anti-CD3 que comprende un segundo dominio de unión que comprende un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 y un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134, en el que el brazo anti-CD3 comprende una cadena ligera que comprende mutaciones por sustitución Q38K y V133E y una cadena pesada que comprende mutaciones por sustitución Q39E, S183K y N297G (numeración UE).
En otro aspecto, la invención presenta un anticuerpo anti-FcRH5 que se une a FcRH5 y CD3, en el que el anticuerpo anti-FcRH5 comprende: (a) un brazo anti-FcRH5 que comprende un primer dominio de unión que comprende un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 104 y un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105, en el que el brazo anti-FcRH5 comprende una cadena ligera que comprende mutaciones por sustitución Q38K y V133E y una cadena pesada que comprende mutaciones por sustitución Q39E, S183K y N297G, y (b) un brazo anti-CD3 que comprende un segundo dominio de unión que comprende un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 y un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134, en el que el brazo anti-CD3 comprende una cadena ligera que comprende mutaciones por sustitución Q38E y V133K y una cadena pesada que comprende mutaciones por sustitución Q39K, S183E y N297G (numeración UE).
En otro aspecto, la invención presenta un anticuerpo anti-FcRH5 que se une a FcRH5 y CD3, en el que el anticuerpo anti-FcRH5 comprende: (a) un brazo anti-FcRH5 que comprende un primer dominio de unión que comprende un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 104 y un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105, en el que el brazo anti-FcRH5 comprende una cadena ligera que comprende mutaciones por sustitución Q38E y V133K y una cadena pesada que comprende mutaciones por sustitución Q39K, S183E y N297G, y (b) un brazo anti-CD3 que comprende un segundo dominio de unión que comprende un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 y un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134, en el que el brazo anti-CD3 comprende una cadena ligera que comprende mutaciones por sustitución Q38K, F116A, L135V, S174A, S176F y T178v y una cadena pesada que comprende mutaciones por sustitución Q39E, A141I, F170S, S181M, S183A, V185A y N297G (numeración UE).
En otro aspecto, la invención presenta un anticuerpo anti-FcRH5 que se une a FcRH5 y CD3, en el que el anticuerpo anti-FcRH5 comprende: (a) un brazo anti-FcRH5 que comprende un primer dominio de unión que comprende un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 104 y un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105, en el que el brazo anti-FcRH5 comprende una cadena ligera que comprende mutaciones por sustitución Q38K y V133E y una cadena pesada que comprende mutaciones por sustitución Q39E, S183K y N297G, y (b) un brazo anti-CD3 que comprende un segundo dominio de unión que comprende un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 y un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134, en el que el brazo anti-CD3 comprende una cadena ligera que comprende mutaciones por sustitución Q38E, F116A, L135V, S174A, S176F y T178<v>y una cadena pesada que comprende mutaciones por sustitución Q39K, A141I, F170S, S181M, S183A, V185A y N297G (numeración UE).
En algunos modos de realización de uno cualquiera de los aspectos de la invención, el anticuerpo anti-FcRH5 tiene un aclaramiento tras la inyección intravenosa de entre aproximadamente 10 ml/kg/día y aproximadamente 35 ml/kg/día. En algunos modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 tiene un aclaramiento tras la inyección intravenosa de aproximadamente 10 ml/kg/día a aproximadamente 20 ml/kg/día en un ratón. En algunos modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 tiene un aclaramiento tras la inyección intravenosa de aproximadamente 12 ml/kg/día a aproximadamente 16 ml/kg/día en un ratón. En algunos modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 tiene un aclaramiento tras la inyección intravenosa de aproximadamente 20 ml/kg/día a aproximadamente 40 ml/kg/día en un cyno. En algunos modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 tiene un aclaramiento tras la inyección intravenosa de aproximadamente 25 ml/kg/día a aproximadamente 35 ml/kg/día en un cyno. En algunos modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 tiene un aclaramiento tras la inyección intravenosa de aproximadamente 30 ml/kg/día a aproximadamente 35 ml/kg/día en un cyno.
En otro aspecto, la invención presenta un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención.
En otro aspecto, la invención presenta un vector que comprende un ácido nucleico aislado del aspecto previo.
En otro aspecto, una célula huésped comprende un vector del aspecto previo.
En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula de mamífero. En algunos modos de realización, la célula de mamífero es una célula de ovario de hámster chino (CHO). En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula procariota. En algunos modos de realización, la célula procariota es una célula de E. coli.
En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo anti-FcRH5 de uno cualquiera de los aspectos precedentes de la invención, el procedimiento comprende cultivar la célula huésped del aspecto previo en un medio de cultivo. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además recuperar el anticuerpo anti-FcRH5 de la célula huésped o del medio de cultivo. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además cultivar una segunda célula huésped que comprende un segundo ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-CD3 que comprende un dominio de unión que se une a CD3. En algunos modos de realización, la célula huésped se cocultiva. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además recuperar el anticuerpo anti-FcRH5 biespecífico de las células huésped o del medio de cultivo.
En otro aspecto, la invención presenta un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo anti-FcRH5 de uno cualquiera de los aspectos previos y un agente citotóxico.
En otro aspecto, la invención presenta una composición que comprende un anticuerpo anti-FcRH5 de uno cualquiera de los aspectos de la invención. En algunos modos de realización, la composición comprende además un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. En algunos modos de realización, el excipiente farmacéuticamente aceptable es un tampón, vehículo, estabilizador o conservante. En algunos modos de realización, la composición es una composición farmacéutica. En algunos modos de realización, la composición comprende además un antagonista de unión al eje PD-1 o un agente terapéutico adicional.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 de uno cualquiera de los aspectos precedentes de la invención para su uso como medicamento.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 de uno cualquiera de los aspectos precedentes de la invención para su uso en el tratamiento o retraso de la progresión de un cáncer positivo para FcRH5 en un sujeto que lo necesite.
En otro aspecto, la invención presenta un anticuerpo anti-FcRH5 de uno cualquiera de los aspectos precedentes de la invención para su uso en la mejora de la función inmunitaria en un sujeto que tiene un cáncer positivo para FcRH5. En algunos modos de realización, el cáncer positivo para FcRH5 es un cáncer de linfocitos B. En otro aspecto, el cáncer de linfocitos B se selecciona del grupo que consiste en mieloma múltiple (MM), leucemia linfocítica crónica (LLC), linfoma de células del manto (LCM), linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG) y linfoma folicular (LF). En otro modo de realización, el cáncer de linfocitos B es MM.
En otro aspecto, se proporciona el uso de un anticuerpo anti-FcRH5 o una composición de uno cualquiera de los aspectos previos en la fabricación de un medicamento para tratar o retrasar la progresión de un cáncer positivo para FcRH5 en un sujeto. En otro aspecto, se proporciona que la invención presenta el uso de un anticuerpo anti-FcRH5 o una composición de uno cualquiera de los aspectos previos en la fabricación de un medicamento para potenciar la función inmunitaria en un sujeto que tiene un cáncer positivo para FcRH5. En algunos modos de realización, el cáncer positivo para FcRH5 es un cáncer de linfocitos B. En algunos modos de realización, el cáncer de linfocitos B se selecciona del grupo que consiste en MM, LLC, LCM, LDLBG y LF. En algunos modos de realización, el cáncer de linfocitos B es m M.
En otro aspecto, la invención presenta un anticuerpo de la invención para su uso en un procedimiento para tratar o retrasar la progresión de un cáncer positivo para FcRH5 en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto un anticuerpo anti-FcRH5 de uno cualquiera de los aspectos precedentes de la invención. En otro aspecto, la invención presenta un anticuerpo de la invención para su uso en un procedimiento para potenciar la función inmunitaria en un sujeto que tiene un cáncer positivo para FcRH5, comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-FcRH5 de cualquiera de los aspectos precedentes de la invención. En algunos modos de realización, el cáncer positivo para FcRH5 es un cáncer de linfocitos B. En algunos modos de realización, el cáncer de linfocitos B se selecciona del grupo que consiste en MM, LLC, LCM, LDLBG y LF. En algunos modos de realización, el cáncer de linfocitos B es MM. En algunos modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 se une a (a) una molécula de FcRH5 localizada en una célula diana y (b) una molécula de CD3 localizada en una célula efectora inmunitaria. En algunos modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 activa la célula efectora inmunitaria tras la unión a la molécula de FcRH5 y la molécula de CD3. En algunos modos de realización, la célula efectora inmunitaria activada puede ejercer un efecto citotóxico y/o un efecto apoptótico sobre la célula diana. En algunos modos de realización, la célula diana es una célula plasmática. En algunos modos de realización, la célula plasmática es una célula plasmática de vida corta. En algunos modos de realización, la célula plasmática es una célula plasmática de vida larga. En algunos modos de realización, la célula plasmática es una célula de mieloma. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende administrar al sujeto el anticuerpo anti-FcRH5 a una dosificación de aproximadamente 0,01 mg/kg/semana a aproximadamente 50 mg/kg/semana. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende administrar al sujeto el anticuerpo anti-FcRH5 a una dosificación de aproximadamente 0,1 mg/kg/semana a aproximadamente 10 mg/kg/semana. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende administrar al sujeto el anticuerpo anti-FcRH5 a una dosificación de aproximadamente 1 mg/kg/semana.
En otros modos de realización, el procedimiento comprende además administrar al sujeto un antagonista de unión al eje PD-1 o un agente terapéutico adicional. En algunos modos de realización, el antagonista de unión al eje PD-1 o el agente terapéutico adicional se administra antes o después de la administración del anticuerpo anti-FcRH5. En algunos modos de realización, el antagonista de unión al eje PD-1 o el agente terapéutico adicional se administra simultáneamente con el anticuerpo anti-FcRH5. En algunos modos de realización, el antagonista de unión al eje PD-1 se selecciona del grupo que consiste en un antagonista de unión a PD-L1, un antagonista de unión a PD-1 o un antagonista de unión a PD-L2. En algunos modos de realización, el antagonista de unión al eje PD-1 es un antagonista de unión a PD-L1. En algunos modos de realización, el antagonista de unión a PD-L1 se selecciona del grupo que consiste en MPDL3280A (atezolizumab), MDX-1105 MEDI4736 (durvalumab) y MSB0010718C (avelumab). En algunos modos de realización, el antagonista de unión a PD-L1 es MPDL3280A (atezolizumab). En algunos modos de realización, el antagonista de unión al eje PD-1 es un antagonista de unión a PD-1. En algunos modos de realización, el antagonista de unión a PD-1 se selecciona del grupo que consiste en MDX 1106 (nivolumab), MK-3475 (pembrolizumab), CT-011 (pidilizumab), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001 y REGN2810. En algunos modos de realización, el antagonista de unión al eje PD-1 es un antagonista de unión a PD-L2. En algunos modos de realización, el antagonista de unión a PD-L2 es un anticuerpo o una inmumoadhesina. En algunos modos de realización, el sujeto recibe un corticoide, un inmunomodulador (IMiD), un inhibidor del proteosoma (IP) o una combinación de los mismos. En algunos modos de realización, el corticoide es un glucocorticoide. En algunos modos de realización, el glucocorticoide es dexametasona. En algunos modos de realización, el IMiD es lenalidomida. En algunos modos de realización, el IP es bortezomib.
En otros modos de realización, el procedimiento comprende administrar el anticuerpo anti-FcRH5, antagonista de unión al eje PD-1, corticoide, IMiD, IP o una combinación de los mismos, de uno cualquiera de los aspectos precedentes, por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, tópica, oral, transdérmica, intraperitoneal, intraorbitaria, por implantación, por inhalación, por vía intratecal, intraventricular o intranasal. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende administrar el anticuerpo anti-FcRH5, antagonista de unión al eje PD-1, corticoide, IMiD, IP o una combinación de los mismos por vía intravenosa. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende administrar el anticuerpo anti-FcRH5, antagonista de unión al eje PD-1, corticoide, IMiD, IP o una combinación de los mismos por vía subcutánea. En algunos modos de realización de uno cualquiera de los aspectos precedentes, el sujeto es un ser humano.
En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para detectar FcRH5 en una muestra biológica de un sujeto, en el que el procedimiento comprende: (a) poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-FcRH5 de uno cualquiera de los aspectos de la invención en condiciones que permitan la unión del anticuerpo anti-FcRH5 a una FcRH5 natural en la muestra biológica, y (b) detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-FcRH5 y una FcRH5 natural en la muestra biológica. En algunos modos de realización, la muestra biológica es una muestra de sangre. En algunos modos de realización de este aspecto, el sujeto es un ser humano.
En otro aspecto, la invención presenta un kit que comprende un anticuerpo anti-FcRH5 de uno cualquiera de los aspectos precedentes de la invención y un prospecto del envase que comprende instrucciones para usar el anticuerpo anti-FcRH5 para tratar o retrasar la progresión de un cáncer positivo para FcRH5 en un sujeto. En otro aspecto, la invención presenta un kit que comprende un anticuerpo anti-FcRH5 de uno cualquiera de los aspectos precedentes de la invención y un prospecto del envase que comprende instrucciones para usar el anticuerpo anti-FcRH5 para potenciar la función inmunitaria en un sujeto que tiene un cáncer positivo para FcRH5. En algunos modos de realización de estos aspectos, el sujeto es un ser humano.
Breve descripción de los dibujos
La fig. 1A es un diagrama esquemático que muestra una configuración de diseño racional ejemplar (configuración 1) de un TDB contra FcRH5 que tiene dominios VL, VH, CL y CH1 que incluyen una o más regiones cargadas. Para la configuración 1, los dominios VHi, CL<i>, VL2 y CH12 contienen regiones cargadas básicas y los dominios VL1, CH11, VH2 y CL2 contienen regiones cargadas ácidas.
La fig. 1B es un diagrama esquemático que muestra una configuración de diseño racional ejemplar (configuración 2) de un TDB contra FcRH5 que tiene dominios VL, VH, CL y CH1 que incluyen una o más regiones cargadas. Para la configuración 2, los dominios VH1, CLi, VL2 y CH12 contienen regiones cargadas ácidas y los dominios VLi, CH1i, VH2 y CL2 contienen regiones cargadas básicas.
La fig. 1C es un diagrama esquemático que muestra una configuración de diseño de rosetta ejemplar (configuración 1) de un TDB contra FcRH5 que tiene dominios VL, VH, CL y CH1 que incluyen una o más regiones cargadas. Para la configuración 1, los dominios VHi, CLi y VL2 contienen regiones cargadas básicas, y los dominios VLi, CH1i y VH2 contienen regiones cargadas ácidas. Adicionalmente, el dominio CH12 contiene una cavidad y el dominio CL2contiene una protuberancia. La cavidad y la protuberancia se representan como un recuadro negro en la interfase CH12/CL2.
La fig. 1D es un diagrama esquemático que muestra una configuración de diseño de rosetta ejemplar (configuración 2) de un TDB contra FcRH5 que tiene dominios VL, VH, CL y CH1 que incluyen una o más regiones cargadas. Para la configuración 2, los dominios VHi, CLi y VL2 contienen regiones cargadas ácidas, y los dominios VLi, CH11y VH2 contienen regiones cargadas básicas. Adicionalmente, el dominio CHI2 contiene una cavidad y el dominio CL2 contiene una protuberancia. La cavidad y la protuberancia se representan como un recuadro negro en la interfase CH12/CL2.
La fig. 1E es un diagrama esquemático que muestra una configuración de diseño de rosetta ejemplar alternativo (configuración 1 alternativa) de un TDB contra FcRH5 que tiene dominios VL, VH, CL y CH1 que incluyen una o más regiones cargadas. Para la configuración 1 alternativa, los dominios VL1, VH2 y CL2 contienen regiones cargadas ácidas, y los dominios VH1, CH12 y VL2 contienen regiones cargadas básicas. Adicionalmente, el dominio CH1i contiene una cavidad y el dominio CL1 contiene una protuberancia. La cavidad y la protuberancia se representan como un recuadro negro en la interfase CH1i/CLi.
La fig. 1F es un diagrama esquemático que muestra una configuración de diseño de rosetta ejemplar alternativo (configuración 2 alternativa) de un TDB contra FcRH5 que tiene dominios VL, VH, CL y CH1 que incluyen una o más regiones cargadas. Para la configuración 2 alternativa, los dominios VL1, VH2 y CL2 contienen regiones cargadas básicas, y los dominios VH1, CH12 y VL2 contienen regiones cargadas ácidas. Adicionalmente, el dominio CH1i contiene una cavidad y el dominio CLi contiene una protuberancia. La cavidad y la protuberancia se representan como un recuadro negro en la interfase CH1i/CLi.
La fig. 2 es una alineación de las secuencias del dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpos anti-FcRH5 seleccionados. Los cambios respecto a 1G7 (véase la publicación de EE. UU. n.° 2015-0098900) se muestran en recuadros oscuros. Las regiones hipervariables (HVR) se indican mediante líneas encima y/o debajo de las alineaciones. Estas secuencias del dominio VL también se divulgan como SEQ ID NO: 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99 y 101.
La fig. 3 es una alineación de las secuencias del dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpos anti-FcRH5 seleccionados. Los cambios respecto al clon 1G7 (véase la publicación de EE. UU. n.° 2015-0098900) se muestran en recuadros oscuros. Las regiones hipervariables (HVR) se indican mediante líneas encima y/o debajo de las alineaciones. Estas secuencias del dominio VH también se divulgan como SEQ ID NO: 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 y 100.
La fig. 4 es una tabla que muestra el impacto sobre la afinidad de unión de las sustituciones aminoacídicas en la posición 52 de los anticuerpos anti-FcRH5 indicados.
La fig. 5A es una alineación de las secuencias del dominio variable de la cadena pesada (VH) de hu1G7.v85 y hu1G7.v93. Los cambios respecto a la secuencia de la línea germinal humana hlGHV4-59*01 se muestran en recuadros sombreados. Las regiones hipervariables (HVR) se indican mediante marcas encima de las alineaciones. Estas secuencias del dominio VH también se divulgan como SEQ ID NO: 104 (hu1G7.v85) y 106 (hu1G7.v93).
La fig. 5B es una alineación de las secuencias del dominio variable de la cadena ligera (VL) de hu1G7.v85 y hu1G7.v93. Los cambios respecto a la secuencia de la línea germinal humana hIGKV1-16*01 se muestran en recuadros sombreados. Las regiones hipervariables (HVR) se indican mediante marcas encima de las alineaciones. Estas secuencias del dominio VL también se divulgan como SEQ ID NO: 105 (hu1G7.v85) y 107 (hu1G7.v93).
La fig. 6A es una alineación de las secuencias del dominio variable de la cadena pesada (VH) de hu1G7.v85. 1G7 y consenso H4. Los cambios respecto al clon 1G7 humanizado, de afinidad madurada y refinado (véase la publicación de EE. UU. n.° 2015-0098900) se muestran en recuadros sombreados. Las regiones hipervariables (HVR) se indican mediante marcas encima de las alineaciones. La secuencia del dominio VH de hu1G7.v85 se divulga como SEQ ID NO: 104.
La fig. 6B es una alineación de las secuencias del dominio variable de la cadena ligera (VL) de hu1G7.v85, 1G7 y consenso KI. Los cambios respecto al clon 1G7 humanizado, de afinidad madurada y refinado se muestran en recuadros sombreados. La secuencia del dominio VL de hu1G7.v85 se divulga como SEQ ID NO: 105.
La fig. 7A muestra la secuencia de dominio variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo anti-FcRH5 hu1G7.v93 (SEQ ID NO: 106).
La fig. 7B muestra la secuencia de dominio variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo anti-FcRH5 hu1G7.v93 (SEQ ID NO: 107).
La fig. 8 es un gráfico que muestra el valor de anticuerpos de los anticuerpos 1G7.v85 y 1G7.v87.
La fig. 9A es una superposición de histogramas que comparan la unión de TDB contra FcRH5/38E4.v1 que tienen diferentes brazos anti-FcRH5 (es decir, m1G7 ("TDB 1G7"), 1G7.v85 ("TDB 1G7.v85") y 1G7.v1.4 ("TDB 1G7.v1.4")) con células que sobreexpresan FcRH3.
La fig. 9B es un gráfico que muestra que TDB 1 G7.v85 no provoca la depleción de los linfocitos citolíticos naturales (NK) a concentraciones de ≤20 jg/ml; TDB 1G7.v85 tiene una mediana de CE50 de 25 ng/ml en células plasmáticas (CP).
La fig. 10A es una serie de gráficos que comparan la capacidad del TDB contra FcRH5 1G7.v1.4/38E4.v1 ("TDB 1 G7.v1.4") para unirse a FcRH3, FcRH5 humana y FcRH5 de cyno.
La fig. 10B es una serie de gráficos que comparan la capacidad del TDB 1G7.v85 para unirse a FcRH3, FcRH5 humana y FcRH5 de cyno.
La fig. 10C es una serie de gráficos que comparan la capacidad del FcRH5 1G7/38E4.v1 ("TDB 1G7") para unirse a FcRH3, FcRH5 humana y FcRH5 de cyno.
La fig. 10D es una serie de gráficos que comparan la capacidad de un anticuerpo de control para unirse a FcRH3, FcRH5 humana y FcRH5 de cyno.
La fig. 11A muestra la secuencia de la secuencia del dominio variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo anti-FcRH5 humanizado derivado de conejo hu7D8.L1H2. La secuencia del dominio VH de hu7D8.L1H2 se divulga como SEQ ID NO: 108.
La fig. 11B muestra la secuencia de la secuencia del dominio variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo anti-FcRH5 humanizado derivado de conejo hu7D8.L1H2. La secuencia del dominio VL de hu7D8.L1H2 se divulga como SEQ ID NO: 109.
La fig. 12A muestra la secuencia de las secuencias del dominio variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo anti-FcRH5 derivado de ratón 17B1. La secuencia del dominio VH de 17B1 se divulga como SEQ ID NO: 110.
La fig. 12B muestra la secuencia de la secuencia del dominio variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo anti-FcRH5 derivado de ratón 17B1. La secuencia del dominio VL de 17B1 se divulga como SEQ ID NO: 111.
La fig. 13A muestra la secuencia de las secuencias del dominio variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo anti-FcRH5 derivado de ratón 15G8. La secuencia del dominio VH de 15G8 se divulga como SEQ ID NO: 112.
La fig. 13B muestra la secuencia de la secuencia del dominio variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo anti-FcRH5 derivado de ratón 15G8. La secuencia del dominio VL de 15G8 se divulga como SEQ ID NO: 113.
La fig. 14 es una serie de gráficos que muestran la afinidad de unión de la variante humanizada de anticuerpos anti-FcRH5 derivados de conejo 7D8.Rb y h7D8.L1H2 por FcRH5 humana y FcRH5 de cyno.
La fig. 15 es una serie de gráficos que muestran que los TDB contra FcRH5 1G7.v85 y hu1G7.v93/38E4.v1 ("TDB 1G7.v93") se unen con una afinidad comparable tanto a la FcRH5 humana como a la FcRH5 de cyno.
Las figs. 16A-16B son gráficos que muestran el análisis cinético de la unión del TDB 1G7.v85 a FcRH5 humana y FcRH5 de cyno con constantes de disociación (K<d>) de 2,35 nM y 6,76 nM, respectivamente, medidas por BIACORE® en un formato de captura hlgG usando un modelo de unión 1:1 de afinidad monovalente.
Las figs. 17A-17B son gráficos que demuestran el incremento de la toxicidad celular inducida por FcRH5 de células MOLP-2 (es decir, células de mieloma múltiple humano que expresan endógenamente FcRH5) usando variantes humanizadas y de afinidad madurada de 1G7 formateadas en anticuerpos biespecíficos dependientes de linfocitos T (TDB) que tienen el brazo de unión a CD3 de 38E4.v1 (véase la publicación PCT n.° w O 2015-095392 A1). En la Fig. 17A, se evaluaron los TDB 1G7, hu1G7.v1.1/38E4.v1 ("TDB 1G7.v1.1"), hu1G7.v1.2/38E4.v1 ("TDB 1G7.v1,2"), hu1G7.v1.3/38E4.v1 ("TDB 1G7.v1,3") y TDB 1G7.v1,4. En la Fig. 17B se evaluaron los TDB 1G7.v1.4, hu1G7.v1.5/38E4.v1 (“TDB 1G7.v1.5”), hu1G7.v1.13/38E4.v1 (“TDB 1G7.v1.13”), hu1G7.v1.7/38E4.v1 (“TDB 1G7.v1.7”) y hu1G7.v1.13.1/38E4.v1 (“1G7.v1.13.1”). El TDB 1G7.v.1.4 mejoró la destrucción de células diana (CE50) de 5 a 13 veces con respecto al TDB 1G7 murino (n = 10).
Las figs. 18A-18D son gráficos que comparan la capacidad del TDB 1G7.v1.4 y el TDB 1G7.v85 para activar linfocitos T (fig. 18A), destruir células MOLP-2 diana (fig. 18B), destruir células plasmáticas de cyno diana (fig. 18C) y destruir linfocitos B de cyno diana (fig. 18D).
La fig. 19A es una serie de histogramas que comparan la capacidad del TDB 1G7.v85 y el TDB hu1G7.v87/38E4.v1 ("TDB 1G7.v87") para unirse y reaccionar de forma cruzada con células SVT2 de ratón que expresan FcRH5 humana (panel 1), FcRH5 de cyno (panel 2) y FcRH3 humana (panel 3).
Las figs. 19B-19D son gráficos que comparan la capacidad del TDB 1G7.v85 y el TDB 1G7.v87 para destruir células MOLP-2 diana (fig. 19B), destruir linfocitos B humanos (fig. 19C) y destruir linfocitos B de cyno (fig. 19D).
Las figs. 20A-20D son gráficos que muestran una capacidad reducida del TDB 1G7.v85 para unirse a FcRH5 después de someterse a una prueba de estrés con 2,2'-azobis(2-amidopropano)diclorhidrato (AAPH) (fig. 20B) o una prueba de estrés con luz (fig. 20D), en comparación con los respectivos controles sin estrés (figs. 20A y 20C). La fig. 21A es un gráfico que muestra el análisis de distribución por tamaño del TDB 1G7.v85. El TDB 1G7.v85 perdió un 0,1 % del pico de monómero después de dos semanas de estrés en una solución de his-acetato a pH 5.5.
La fig. 21B es un gráfico que muestra la heterogeneidad de la carga del TDB 1G7.v85. El TDB 1G7.v85 perdió un 7,7 % del pico de monómero después de dos semanas de estrés en una solución de his-acetato a pH 5,5.
La fig. 22A es un gráfico que muestra que el TDB 1G7.v85 no tiene ningún cambio observable en el perfil de masa reducida de la masa de la cadena ligera después de dos semanas de estrés en una solución de his-acetato a pH 5.5.
La fig. 22B es un gráfico que muestra que el TDB 1G7.v85 no tiene ningún cambio observable en el perfil de masa reducida de la masa de la cadena pesada después de dos semanas de estrés en una solución de his-acetato a pH 5.5.
La fig. 23A es una inmunoelectrotransferencia de fosfo-SLP76 de linfocitos CD8 periféricos de un donante sano estimuladas con 1 μg/ml del TDB 1G7/UCHT1.v9, TDB 10A8/UCHT1.v9 (“TDB 10A8”) y TDB anti-gD/UCHT1.v9 (“TDB anti-gD”), y células que expresan FcRH5 humana con marca de expresión de gD N terminal. Se usó la transferencia para SLP76 total, indicativo de la señalización de TCR, para confirmar una carga de muestra igual. La fig. 23B es un gráfico que muestra la destrucción de células diana de FcRH5 con TDB 1G7/UCHT1.v9 o bien TDB anti-gD y linfocitos T CD8+.
La fig. 23C es un diagrama esquemático de la construcción de FcRH5 truncada con el epítopo gD ahora proximal a la membrana.
La fig. 23D es un gráfico que muestra la destrucción de células diana usando la construcción de FcRH5 truncada con TDB 1G7 o TDB anti-gD. La actividad del TDB 1G7/UCHT1.v9 proximal se incrementó 25 veces (CE50 = 20 μM), y el TDB anti-gD fue capaz de mediar eficazmente la destrucción de células (CE50 = 0,19 nM) cuando se eliminó la interferencia causada por el ECD. La construcción truncada se expresó en células 293. La fig. 23E es un gráfico que muestra que la destrucción de células diana para cinco TDB contra FcRH5 alternativos que reconocen el epítopo proximal a la membrana (líneas discontinuas) es equivalente a la destrucción mediada por el TDB 1G7/UCHT1.v9 y significativamente mejor que la del TDB 10A8.
La fig. 24A es una superposición de histogramas de análisis de citometría de flujo de células SVT2 originales, gD-FcRH5 de longitud completa y gD-FcRH5-dominio 9.
La fig. 24B es un gráfico que muestra el porcentaje de destrucción de células diana por TDB 1G7/UCHT1.v9, TDB 2H7/UCHT1.v9 (“TDB 2H7”), TDB 3G7/UCHT1.v9 (“TDB 3G7”), TDB 10A8 y TDB anti-gD.
La fig. 25A es un histograma superpuesto de seis líneas celulares (vector SVT2, SVT2-FcRH1, SVT2-FCRH2, SVT2-FcRH3, SVT2-FcRH4 y SVT2-FcRH5), que muestra que el T<d>B 1G7.v85 se une a FcRH5, pero no a otros miembros de la familia.
La fig. 25B es una superposición de histogramas de tres líneas celulares (293 originales, 293-FcRH5 de longitud completa y 293-FcRH5-D9-deleción), que muestra que el TDB 1G7.v85 se une al dominio proximal a la membrana de FcRH5.
La fig. 25C es un histograma superpuesto de tres líneas celulares (SVT2-vector, SVT2-huFcRH5 y SVT2-cyno FcRH5), que muestra que TDB 1G7.v85 se une a FcRH5 de cyno y FcRH5 humana.
Las figs. 26A-26D son histogramas superpuestos de tres líneas celulares (SVT2-vector, SVT2-huFcRH5 y SVT2-cyno FcRH5), que muestran la unión del TDB 1G7/38E4.v1 ("TDB 1G7") a la línea celular de mieloma múltiple (M<m>) y células primarias. Se muestran histogramas superpuestos para el isotipo-PE y TDB 1G7 para células MOLP-2 (fig. 26A), linfocitos B CD20+ humanos (fig. 26B), células plasmáticas CD38+CD138+ humanas (fig. 26C) y células tumorales de MM CD38+CD138+ de aspirado de médula ósea de MM (fig. 26D).
La fig. 27A es un gráfico que muestra la activación dependiente de la dosis de linfocitos CD8+ tras la estimulación con células diana (MOLP-2) y TDB 1G7, detectada mediante análisis de citometría de flujo.
La fig. 27B es un gráfico que muestra la destrucción dependiente de células diana por TDB 1G7. El inserto muestra una superposición de citometría de flujo de la línea celular original Fox-NY y los clones transfectados para expresar un nivel bajo o alto de FcRH5 humana. Las barras de error son la desviación estándar de los triplicados.
Las figs. 27C-27E son gráficos que muestran que TDB 1G7 indujo una respuesta de proliferación de CD8 (5 días), detectada midiendo la dilución de la intensidad de fluorescencia de CSFE por citometría de flujo. Solo linfocitos CD8+ humanos marcados con CFSE (fig. 27C), cocultivo con MOLP-2 (fig. 27D) o cocultivo con MOLP-2 y 1000 ng/ml de TDB 1G7.V85 (fig. 27E).
La fig. 27F es un gráfico que muestra la destrucción de células dependiente de la diana con TDB contra FcRH5 que contienen diferentes brazos anti-CD3 (por ejemplo, UCHT1.v9, 38E4.v1 y 40G5c) (véase la publicación PCT n.° WO 2015/095392 A1).
Los brazos anti-CD3 38E4.v1 (K<d>monovalente 0,5 nM, BIACORE®), UCHT1.v9 (K<d>monovalente = 2,5 nM, BIACORE® y Scatchard) y 40G5c (K<d>monovalente = 51 nM, BIACORE®) se aparearon cada uno con el brazo anti-FcRH5 de m1G7 (K<d>= 11 nm, BIACORE®) y se sometió a prueba la unión a linfocitos CD8+ humanos purificados.
La fig. 27G es un gráfico que muestra la destrucción de células dependiente de la diana con TDB 1G7 y 1G7/38E4.v1 bis-Fab ("bis-Fab 1G7").
La fig. 28A es un gráfico que muestra la expresión de FcRH5 en células tumorales de mieloma múltiple primario, linfocitos B periféricos de donantes sanos y células plasmáticas de médula ósea. La expresión de FcRH5 se analizó mediante citometría de flujo y se normalizó a la expresión en control interno y de ensayo de MOLP-2. El nivel relativo de FcRH5 se calculó como sigue: (Media geométrica de FcRH5 de “X”/Media geométrica de control de isotipo de “X”)/(Media geométrica de FcRH5 de MOLP-2/Media geométrica de control de isotipo de MOLP-2).
La fig. 28B es un gráfico que muestra la actividad citotóxica del TDB 1G7.v85 en células plasmáticas humanas. Se cultivaron células mononucleares de médula ósea (CMMO) humanas con TDB 1G7.v85 y se analizó el número de linfocitos CD38+CD138+ vivos mediante citometría de flujo.
La fig. 28C es un gráfico que muestra la actividad citotóxica del TDB 1G7.v85 en diferentes células de mieloma primario derivadas de pacientes. Los CMMO de mieloma humano se cocultivaron con linfocitos T CD8+ aislados de un donante sano y TBD 1G7.v85.
La fig. 28D es un gráfico que muestra que una expresión muy baja de FcRH5 en las células diana es suficiente para una potente actividad destructora. El número de copias de FcRH5 por célula se determinó mediante el ensayo de Scatchard.
La fig. 28E (superior) es un gráfico que muestra el análisis qRT-PCR de los niveles de ARNm de FcRH5 en biopsias de médula ósea de pacientes con mieloma de alto riesgo con ganancia de 1q21. El nivel de expresión del ARNm se calculó mediante el procedimiento delta Ct (dCt). El análisis estadístico se realizó usando una prueba de la U de Mann-Whitney. (Inferior) Son imágenes de análisis FISH en biopsias de mieloma múltiple primario que muestran diploide normal de 1q21 (izquierda) y una mezcla de aproximadamente tres a seis copias de 1q21 (derecha). Una muestra de tumor se identificó como ganancia de 1q21 cuando >20 % de las células tumorales puntuadas tenían tres o más copias del locus 1q21.3.
La fig. 29A es una superposición de histogramas del isotipo-PE y el clon anti-FcRH5 1G7-PE, que representa la expresión de FcRH5 en linfocitos B CD20+ de cyno.
La fig. 29B es una superposición de histogramas del isotipo-PE y el clon anti-FcRH5 1G7-PE, que representa la expresión de FcRH5 en linfocitos B en células plasmáticas CD45-CD20-CD38+PC+ de cyno.
Las figs. 29C-29D son gráficos que muestran actividad citotóxica comparable dependiente de la dosis entre linfocitos T CD8+ de cyno y linfocitos T CD8+ humanos en un ensayo de destrucción in vitro usando SVT2-cyno-FcRH5 (fig. 29C) y MOLP-2 (fig. 29D) con linfocitos T CD8+ humanos o linfocitos T CD8+ de cyno.
La fig. 29E es un gráfico que muestra la actividad de destrucción in vitro de TDB 1G7.v85 en linfocitos B CD20+ de cyno (n = 14).
La fig. 29F es un gráfico que muestra la actividad de destrucción in vitro de TDB 1G7.v85 en células plasmáticas CD45-CD20-CD38+PC+ de médula ósea de cyno de ocho donantes diferentes (n = 8).
La fig. 30A es un gráfico que muestra que los linfocitos T humanos esplénicos aislados de bazos de ratones NOD/SCID gamma humanizados (NSG) tienen una actividad comparable a los linfocitos T humanos periféricos de donantes sanos.
La fig. 30B es un gráfico que muestra que el tratamiento con TDB 1G7 induce la regresión de tumores de xenoinjerto con MOLP-2 subcutáneos en ratones NSG humanizados. Los ratones se trataron con una dosis intravenosa única de vehículo o TDB 1G7.v85 a 0,5 mg/kg. Se indican el volumen tumoral medio (línea gruesa negra), los volúmenes tumorales individuales (líneas finas) y la media del grupo de control (línea discontinua).
La fig. 31A es un gráfico que muestra la concentración sérica de TDB contra FcRH5 representada gráficamente durante la duración del estudio después de la administración de una dosis única de TDB 1G7.v85 a 1 mg/kg, 2 mg/kg o 4 mg/kg a tres animales/grupo. A continuación, se muestra una tabla que muestra los parámetros farmacodinámicos.
La fig. 31B es un gráfico que muestra la concentración sérica de TDB contra FcRH5 (TDB 1G7.v85 y TDB 1G7.v87/38E4.v1 ("TDB 1G7.v87")) representada gráficamente durante la duración del estudio después de la administración de una dosis única de TDB anti-gD a 3 mg/kg o TDB contra FcRH5 a 0,3 mg/kg o 3 mg/kg a tres animales/grupo. A continuación, se muestra una tabla que muestra los parámetros farmacodinámicos.
Las figs. 31C-31D son gráficos que muestran la activación transitoria de linfocitos T inducida por TDB 1 G7.v85 en sangre periférica de cyno después de la administración intravenosa de una dosis única de vehículo o TDB 1 G7.v85 (1 mg/kg, 2 mg/kg o 4 mg/kg) a tres animales/grupo.
Las figs. 31E-31H son gráficos que muestran el recuento absoluto de linfocitos B CD20+ en sangre periférica (fig.
31E), bazo (fig. 31F), ganglio linfático mandibular (fig. 31G) y médula ósea (fig. 31H) en cyno después de la administración intravenosa de dosis única de vehículo o TDB 1G7.v85 (1 mg/kg, 2 mg/kg o 4 mg/kg) a tres animales/grupo. Las figs. 31F-31H se representan gráficamente con la media del grupo y el error estándar de la media (EEM).
La fig. 31I es un gráfico que muestra que TDB 1G7.v85 provoca la depleción de las células plasmáticas de la médula ósea en cyno, con representación de EEM medido en el grupo.
La fig. 31J es un gráfico que muestra el cambio de la respuesta del nivel de IgG de cyno al tratamiento, calculado usando la fórmula {(nivel de IgG antes de la dosis)-(nivel de IgG al final del estudio)}/(nivel de IgG antes de la dosis) X 100. La diferencia entre antes de la dosis previa y después del tratamiento se analiza mediante una prueba de la T para datos independientes. Los datos se representan gráficamente con la media del grupo y el error estándar de la media (EEM).
Las figs. 32A-32B son gráficos que muestran el recuento absoluto de linfocitos T CD4+ en sangre periférica (fig.
32A) y linfocitos T CD8+ (fig. 32B) en cuatro grupos de animales después de la administración intravenosa de una dosis única de vehículo, T<d>B 1<g>7.<v>85 a 1 mg/kg, TDB 1G7.v85 a 2 mg/kg o TDB 1G7.v85 a 4 mg/kg.
La fig. 32C es un gráfico que muestra la disminución en el recuento absoluto de linfocitos B CD20+ en los ganglios linfáticos mesentéricos después del tratamiento con TDB 1G7.v85. Se representa gráficamente como animales individuales y grupo medio con EEM.
La fig. 32D es un gráfico que muestra la ocupación de FcRH5 después de la administración intravenosa de una dosis única de TDB 1G7.v85 a 1 mg/kg, 2 mg/kg o 4 mg/kg.
Las figs. 33A-33F son gráficos que muestran el cambio en la concentración de las citocinas IL-6 (fig. 33A), IL-2 (fig.
33B), IFN-<y>(fig. 33C), IL-1Ra (fig. 33D), IL-5 (fig. 33E) y MCP-1 (fig. 33F) en cuatro grupos de animales después de la administración intravenosa de una dosis única de vehículo, TBD 1G7.v85 a 1 mg/kg, TDB 1G7.v85 a 2 mg/kg y TDB 1G7.v85 a 4 mg/kg.
La fig. 34 es una serie de gráficos que muestran que el tratamiento con TDB 1G7.v85 induce la expresión de PD1 en linfocitos T humanos. Los linfocitos T CD8+ se estimularon durante 48 horas con las células diana de TDB 1G7.v85 y MOLP-2 y, a continuación, se analizaron mediante citometría de flujo.
La fig. 35A es un gráfico que muestra el porcentaje de PD1+ en linfocitos T CD8+ en cyno después de una administración intravenosa de dosis única de vehículo, 1 mg/kg, 2 mg/kg y 4 mg/kg de TDB 1 G7.v85. El tratamiento con TDB 1G7.v85 da como resultado la inducción de PD1 en linfocitos T de cyno in vivo.
La fig. 35B es un gráfico que muestra el porcentaje de PD1+ en linfocitos T CD4+ en cyno después de una administración intravenosa de dosis única de vehículo, 1 mg/kg, 2 mg/kg y 4 mg/kg de TDB 1G7.v85.
Las figs. 36A-36D son gráficos que muestran la expresión de PD-1 en linfocitos T CD4+ de sangre (fig. 36A), linfocitos T CD8+ del bazo (fig. 36B), linfocitos T<c>D8+ del ganglio linfático (fig. 36C) y linfocitos T CD8+ de la médula ósea (fig. 36D), según lo analizado por FACS siete días después de la dosificación con TDB 1G7.v85 o vehículo.
Las figs. 37A-37B son gráficos que muestran la capacidad del TDB 1G7.v85 para redirigir la actividad de los linfocitos T CD8+ preestimulados para destruir células HEK-293T que expresan FcRH5 y PD-1 ("células 293-FcRH5-PD-L1") en presencia o ausencia de un anticuerpo anti-PD-L1 o anti-PD-1. La curva de la fig. 37A se representa gráficamente con la media y el error estándar (EE) de triplicados.
La fig. 38A es un gráfico que muestra la destrucción de células diana de SVT2-FcRH5 por TDB 1G7.v85 en presencia y ausencia de dexametasona (Dex).
La fig. 38B es una serie de gráficos que muestran la liberación de citocinas (es decir, IL-2, IL-6, TNF-a e IFN-y) después del tratamiento con TDB 1G7.v85 en presencia y ausencia de Dex 1 |<j>M.
La fig. 39 es un dibujo esquemático que muestra la producción de bis-Fab a partir de IgG1 humana.
La fig. 40A es un gráfico que muestra la unión de FcRH5 por bis-Fab A-D y F(ab')2A según lo determinado por un ensayo ELISA.
La fig. 40B es un gráfico que muestra la unión de CD3 por bis-Fab A-D y F(ab')2A según lo determinado por un ensayo ELISA.
La fig. 41 es un gráfico que muestra la cantidad de activación de linfocitos T mediada por la diana por bis-Fab A-D y F(a )222A.
Descripción detallada de la invención
I. Definiciones
El término "aproximadamente" como se usa en el presente documento se refiere al intervalo de error normal para el valor respectivo fácilmente conocido para el experto en la técnica en este campo técnico. La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) modos de realización que se refieren a ese valor o parámetro per se.
Una "región estructural humana aceptora" para los propósitos en el presente documento es una región estructural que comprende la secuencia de aminoácidos de una región estructural del dominio variable de la cadena ligera (VL) o una región estructural del dominio variable de la cadena pesada (VH) derivada de una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana, como se define a continuación. Una región estructural humana aceptora "derivada de" una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de la misma, o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunos modos de realización, el número de cambios de aminoácidos es de 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos o 2 o menos. En algunos modos de realización, la región estructural humana aceptora de VL es idéntica en secuencia a la secuencia de la región estructural de inmunoglobulina humana de VL o la secuencia de la región estructural consenso humana.
"Afinidad" se refiere a la intensidad de la suma total de las interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y se puede representar, en general, por la constante de disociación (K<d>). La afinidad se puede medir por procedimientos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Los modos de realización ilustrativos y ejemplares específicos para medir la afinidad de unión se describen en lo que sigue.
Un anticuerpo "de afinidad madurada" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVR), en comparación con un anticuerpo original que no posee dichas alteraciones, dando como resultado dichas alteraciones una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno.
La expresión "anticuerpo anti-FcRH5" o "un anticuerpo que se une a FcRH5" se refiere a un anticuerpo que se puede unir a FcRH5 con una afinidad suficiente, de modo que el anticuerpo sea útil como agente diagnóstico y/o terapéutico al dirigirse a FcRH5. En un modo de realización, el grado de unión de un anticuerpo anti-FcRH5 a una proteína distinta de FcRH5 no relacionada es de menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a FcRH5 como se mide, por ejemplo, por un radioinmunoanálisis (RIA). En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo que se une a FcRH5 puede tener una constante de disociación (K<d>) de ≤1<j>M, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0,1 nM, ≤0,01 nM o ≤0,001 nM (por ejemplo, 10'8 M o menos, por ejemplo, de 10'8 M a 10'13 M, por ejemplo, de 10'9 M a 10'13 M). En determinados modos de realización, un anticuerpo anti-FcRH5 se une a un epítopo de FcRH5 que se conserva entre FcRH5 de especies diferentes.
Las expresiones "anticuerpo anti-CD3" y "un anticuerpo que se une a CD3" se refieren a un anticuerpo que se puede unir a CD3 con una afinidad suficiente, de modo que el anticuerpo sea útil como agente diagnóstico y/o terapéutico al dirigirse a CD3. En un modo de realización, el grado de unión de un anticuerpo anti-CD3 a una proteína distinta de CD3 no relacionada es de menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a CD3 como se mide, por ejemplo, por un radioinmunoanálisis (RIA). En determinados modos de realización, un anticuerpo que se une a<c>D3 tiene una constante de disociación (K<d>) de ≤1 |<j>M, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0,1 nM, ≤0,01 nM o ≤0,001 nM (por ejemplo, 10<-8>M o menos, por ejemplo, de 10<-8>M a 10-13 M, por ejemplo, de 10<-9>M a 10-13 M). En determinados modos de realización, un anticuerpo anti-CD3 se une a un epítopo de CD3 que se conserva entre CD3 de especies diferentes.
El término "anticuerpo" se usa en el presente documento en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, bis-Fab), siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.
Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan, a bis-Fab; Fv; Fab; Fab'; Fab'-SH; F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
Por "dominio de unión" se quiere decir una parte de un compuesto o una molécula que se une específicamente a un epítopo, antígeno, ligando o receptor diana. Los dominios de unión incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, policlonales, recombinantes, humanizados y quiméricos), fragmentos de anticuerpo o porciones de los mismos (por ejemplo, fragmentos bis-Fab, fragmentos Fab, F(ab')2, anticuerpos scFv, SMIP, anticuerpos de dominio, diacuerpos, minicuerpos, scFv-Fc, aficuerpos, nanocuerpos y dominios VH y/o VL de anticuerpos), receptores, ligandos, aptámeros y otras moléculas que tienen un compañero de unión identificado.
Como se usa en el presente documento, el término "región cargada" se refiere a la localización de un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) que incluye uno o más (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) aminoácidos básicos o ácidos que pueden formar un par de carga con una región cargada afín que tiene uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) o aminoácidos básicos o ácidos, cuando la región cargada y su región cargada afín tienen carga relativa total opuesta.
Como se usa en el presente documento, el término "par de carga" se refiere al enlace que se forma entre dos regiones cargadas de carga total opuesta.
Un "agente quimioterápico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterápicos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN®); sulfonatos de alquilo tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilmelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol; colquicinas; ácido betulínico; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecán) (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecán, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipósido; criptoficinas (en particular, criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, uramustina; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos enediinas (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina gamma 1I y calicheamicina omega I1 (véase, por ejemplo, Nicolaou et al.,Angew. Chem Inti. Ed. Engl. 33:183-186, 1994); CDP323, un inhibidor oral de integrina alfa-4; dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina; así como el cromóforo neocarzinostatina y cromóforos afines de antibióticos de la cromoproteína enediina), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinornicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluyendo ADRIAMICINA®, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina, doxorrubicina HCl liposoma inyectable (DOXIL®), doxorrubicina liposómica TLC D-99 (MYOCET®), doxorrubicina liposómica peglilada (CAELYX®) y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tales como metotrexato, gemcitabina (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), capecitabina (XELODA®), una epotilona y 5-fluoruracilo (5-FU); combretastatina, análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales tales como la aminoglutetimida, mitotano, trilostano; rellenos de ácido fólico tales como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitanosinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; el complejo de polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, Oreg., EE. UU.); razoxano; rizoxina; sizofurano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2-triclorotrietilamina; tricotecenos (en especial, toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósidos ("Ara-C"); tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), formulación de paclitaxel en nanopartículas genomanipuladas con albúmina (ABRAXANE™) y docetaxel (TAXOTERE®, Rhome-Poulene Rorer, Antony, Francia); cloranbucilo; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; agentes de platino tales como cisplatino, oxaliplatino (por ejemplo, ELOXATIN®) y carboplatino; vincas, que impiden que la polimerización de tubulina pueda formar microtúbulos, incluyendo vinblastina (VELBAN®), vincristina (ONCOVINA®), vindesina (ELDISIN®, FILDESIN®) y vinorelbina (NAVELBINE®); etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; leucovovina; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluormetilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico, incluyendo bexaroteno (TARGRETIN®); bisfosfonatos tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®), etidronato (DIDROCAL®), NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA®), alendronato (FOSA<m>A<x>®), pamidronato (AREDIA®), tiludronato (SKELID®) o risedronato (ACTONEL®); troxacitabina (un análogo 1,3-dioxolano-nucleósido de citosina); oligonucleótidos antisentido, en particular los que inhiben la expresión de genes en vías de señalización que intervienen en la proliferación celular anómala tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R); (por ejemplo, erlotinib (Tarceva™)); y VEGF-A que reducen la proliferación celular; vacunas tales como la vacuna THERATOPE® y vacunas de tratamiento génico, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; inhibidor de la topoisomerasa 1 (por ejemplo, LURTOTECAN®); rmRH (por ejemplo, ABARELIX®); BAY439006 (sorafenib; Bayer); SU-11248 (sunitinib, SUTENT®, Pfizer); perifosina, inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib o etoricoxib), inhibidor del proteosoma (por ejemplo, PS341); bortezomib (VELCA<d>E®); CCI-779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; inhibidor de Bcl-2 tal como oblimersén sódico (GENASENSE®); pixantrona; inhibidores del EGFR; inhibidores de tirosina-cinasa; inhibidores de serinatreonina cinasa tales como rapamicina (sirólimus, RAPAMUNE®); inhibidores de farnesiltransferasa tales como lonafarnib (SCH 6636, SARASAR™); y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores, tales como CHOP, una abreviatura del tratamiento combinado de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona; y FOLFOX, una abreviatura del régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y ácido folínico, y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores.
Los agentes quimioterápicos como se define en el presente documento incluyen "agentes antihormonales" o "tratamientos endocrinos" que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de las hormonas que pueden promover el crecimiento del cáncer. Pueden ser hormonas en sí mismas, incluyendo, pero sin limitarse a: antiestrógenos y moduladores selectivos de los receptores de estrógenos (MSRE), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno FARESTON; inhibidores de la aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestania, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA® y anastrozol ARIMIDEX®; y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprorelina y goserelina; así como troxacitabina (un análogo de nucleósido citosina de 1,3-dioxolano); oligonucleótidos antisentido, en particular los que inhiben la expresión de genes en las vías de señalización implicadas en la proliferación celular anómala, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf y H-Ras; ribocimas, tales como un inhibidor de la expresión de VEGF (por ejemplo, ribocima ANGIOZYME®) y un inhibidor de la expresión de HER2; vacunas, tales como vacunas de tratamiento génico, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; inhibidor de topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; vinorelbina y esperamicinas (véase la pat. de EE. UU. n.° 4.675.187) y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores.
El término "fármaco inmunomodulador" o "IMiD" se refiere a una clase de fármacos que modifican la respuesta del sistema inmunitario o el funcionamiento del sistema inmunitario, tal como mediante la estimulación de la formación de anticuerpos y/o la inhibición de la actividad de las células sanguíneas periféricas, e incluyen, pero no se limitan a, talidomida (a-N-ftalimido-glutarimida) y sus análogos, REVLIMID® (lenalidomida), ACTI-MID™ (pomalidomida), OTEZLA® (apremilast) y sales o ácidos farmacéuticamente aceptables de los mismos.
El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.
El término "FcRH5", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier FcRH5 natural que resulte de la producción de una proteína FcRH5 en una célula. El término incluye FcRH5 de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos y macacos cangrejeros) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. El término también incluye variantes naturales de FcRH5, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de una secuencia de proteína FcRH5 humana ejemplar se muestra en SEQ ID NO: 114. La secuencia de aminoácidos de una proteína FcRH5 de macaco cangrejero ejemplar se muestra en SEQ ID NO: 215.
El término "grupo de diferenciación 3" o "CD3", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier CD3 natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos, tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo, incluyendo, por ejemplo, las cadenas CD3<e>,<c>D3<y>, CD3a y CD3p. El término engloba el CD3 no procesado "de longitud completa" (por ejemplo, CD3<e>o CD3<y>no procesado o no modificado), así como cualquier forma de CD3 que resulte del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de CD3, incluyendo, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. CD3 incluye, por ejemplo, la proteína CD3<e>humana (RefSeq n.° NP_000724 de NCBI), que tiene 207 aminoácidos de longitud, y la proteína CD3<y>humana (RefSeq n.° NP_000064 de NCBI), que tiene 182 aminoácidos de longitud.
La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseído por su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 5, £, y y M, respectivamente.
Se entiende que los modos de realización de la invención descritos en el presente documento incluyen "que comprende", "que consiste en" y "que consiste esencialmente en" modos de realización.
El término "agente citotóxico" como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o previene una función celular y/o provoca la muerte o destrucción celular. Los agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, isótopos radioactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu); agentes o fármacos quimioterápicos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes); agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de las mismas, tales como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas, tales como toxinas de micromoléculas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas; y los diversos agentes antitumorales o antineoplásicos divulgados a continuación.
Un "trastorno" es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento, incluyendo, pero sin limitarse a, trastornos o enfermedades crónicas y agudas, incluyendo aquellas afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión.
Los términos "trastorno proliferativo celular" y "trastorno proliferativo" se refieren a trastornos que se asocian con algún grado de proliferación celular anómala. En un modo de realización, el trastorno proliferativo celular es cáncer. En un modo de realización, el trastorno proliferativo celular es un tumor.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por crecimiento/proliferación celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, mieloma, carcinoma, linfoma (por ejemplo, linfoma hodgkiniano y no hodgkiniano), blastoma, sarcoma y leucemia. En algunos modos de realización, el cáncer es un cáncer positivo para FcRH5. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen mieloma múltiple (MM), leucemia linfocítica crónica (LLC), linfoma de células del manto (LCM), linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG), linfoma folicular (LF), leucemia mieloide aguda (LMA), síndrome mielodisplásico (SMD), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia mielomonocítica crónica, leucemia promielocítica aguda (LPA), trastorno mieloproliferativo crónico, leucemia trombocítica, leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B precursores (pre-B-ALL), leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T precursores (pre-T-ALL), enfermedad de mastocitos, leucemia de mastocitos, sarcoma de mastocitos, sarcomas mieloides, leucemia linfocítica y leucemia indiferenciada. En algunos modos de realización, el cáncer es un cáncer de linfocitos B. En particular, el cáncer puede incluir afecciones que implican la producción de un exceso de anticuerpos, tal como la gammapatía monoclonal, amiloidosis de cadena ligera, gammapatía monoclonal de importancia indeterminada y plasmocitomas solitarios, plasmocitomas aislados y plasmocitomas extramedulares.
"Tumor", como se usa en el presente documento, se refiere a todo crecimiento y proliferación de células neoplásicas, ya sea maligno o benigno, y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos. Los términos "cáncer", "canceroso", "trastorno proliferativo celular", "trastorno proliferativo" y "tumor" no son mutuamente excluyentes como se hace referencia en el presente documento.
Las "funciones efectoras" se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor de Fc; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B); y activación de linfocitos B.
Una "cantidad eficaz" de un compuesto, por ejemplo, un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención o una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) del mismo, es al menos la cantidad mínima requerida para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado, tal como una mejora medible o prevención de un trastorno particular (por ejemplo, un trastorno proliferativo celular, por ejemplo, cáncer). Una cantidad eficaz en el presente documento puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del paciente, y la capacidad del anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad eficaz también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del tratamiento se compensa con los efectos terapéuticamente beneficiosos. Para su uso profiláctico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados tales como eliminar o reducir el riesgo, reducir la gravedad o retrasar la aparición de la enfermedad, incluyendo síntomas bioquímicos, histológicos y/o de comportamiento de la enfermedad, sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. Para su uso terapéutico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados clínicos tales como disminuir uno o más síntomas que resultan de la enfermedad, incrementar la calidad de vida de los que padecen la enfermedad, disminuir la dosis de otros medicamentos requeridos para tratar la enfermedad, potenciar el efecto de otro medicamento tal como por medio de selección, retrasar la progresión de la enfermedad y/o prolongar la supervivencia. En el caso de cáncer o tumor, una cantidad eficaz del fármaco puede tener el efecto de reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño tumoral; inhibir (es decir, ralentizar en cierta medida o, deseablemente, detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar en cierta medida y, deseablemente, detener) la metástasis tumoral; inhibir en cierta medida el crecimiento tumoral; y/o aliviar en cierta medida uno o más de los síntomas asociados con el trastorno. Una cantidad eficaz se puede administrar en una o más administraciones. Para los propósitos de la presente invención, una cantidad eficaz de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para conseguir un tratamiento profiláctico o terapéutico directa o indirectamente. Como se entiende en el contexto clínico, una cantidad eficaz de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica se puede lograr o no junto con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Por tanto, una "cantidad eficaz" se puede considerar en el contexto de administrar uno o más agentes terapéuticos, y un único agente se puede considerar que se administra en una cantidad eficaz si, junto con uno o más de otros agentes, se puede lograr o se logra un resultado deseable.
El término "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. En un modo de realización, una región Fc de la cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxílico de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede o no estar presente. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de los residuos aminoacídicos en la región Fc o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences o f Proteins o f Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
"Región estructural" o "FR" se refiere a los residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste, en general, en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen, en general, en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1 )-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
El término "célula positiva para FcRH5" se refiere a una célula que expresa FcRH5 en su superficie. En algunos modos de realización, FcRH5 es uno o más de FcRH5a, FcRH5b, FcRH5c, identificador UniProt Q96RD9-2 y/o FcRH5d. En algunos modos de realización, FcRH5 es FcRH5c.
El término "cáncer positivo para FcRH5" se refiere a un cáncer que comprende células que expresan FcRH5 en su superficie. Con el fin de determinar si una célula expresa FcRH5 en la superficie, se considera que la expresión del ARNm de FcRH5 se correlaciona con la expresión de FcRH5 en la superficie celular. En algunos modos de realización, la expresión del ARNm de FcRH5 se determina mediante un procedimiento seleccionado entre hibridación in situ y RT-PCR (incluida la RT-PCR cuantitativa). De forma alternativa, la expresión de FcRH5 en la superficie celular se puede determinar, por ejemplo, usando anticuerpos contra FcRH5 en un procedimiento tal como inmunohistoquímica, FACS, etc. En algunos modos de realización, FcRH5 es uno o más de FcRH5a, FcRH5b, FcRH5c, identificador UniProt Q96RD9-2 y/o FcRH5d. En algunos modos de realización, FcRH5 es FcRH5c.
Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento.
El término "formas glucosiladas de FcRH5" se refiere a formas naturales de FcRH5 que se modifican después de la traducción mediante la adición de residuos de carbohidratos.
Un "agente inhibidor del crecimiento", cuando se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula in vitro o bien in vivo. En un modo de realización, el agente inhibidor del crecimiento es un anticuerpo inhibidor del crecimiento que evita o reduce la proliferación de una célula que expresa un antígeno al que se une el anticuerpo. En otro modo de realización, el agente inhibidor del crecimiento puede ser uno que reduce significativamente el porcentaje de células en fase S. Los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un lugar distinto de la fase S), tales como agentes que inducen la interrupción de G1 y la interrupción de la fase M. Los bloqueantes de fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), taxanos e inhibidores de topoisomerasa II tales como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopósido y bleomicina. Estos agentes que interrumpen la G1 también actúan extendiéndose a la interrupción de la fase S, por ejemplo, los agentes alquilantes del ADN, tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluoruracilo y Ara-C. Otra información se puede encontrar en MendeIsohn e Israel, eds., The Molecular Basis of Cancer, capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs", por Murakami et al. (W.B. Saunders, Filadelfia, 1995), por ejemplo, p. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos antineoplásicos derivados ambos del árbol del tejo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado del tejo europeo, es un análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamblaje de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos evitando la despolimerización, lo que da como resultado la inhibición de mitosis en células.
Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas" que incluyen la célula transformada primaria y la descendencia derivada de la misma independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento.
Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos. Los anticuerpos humanos se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en la técnica, incluyendo colecciones de presentación en fagos. Hoogenboom y Winter. J. Mol. Biol. 227:381,1991; Marks et al. J. Mol. Biol. 222:581, 1991. También están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos los procedimientos descritos en Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al. J. Immunol., 147(1):86-95, 1991. Véase también van Dijk y van de Winkel. Curr. Opin. Pharmacol.
5:368-74, 2001. Los anticuerpos humanos se pueden preparar administrando el antígeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir dichos anticuerpos en respuesta a la exposición antigénica, pero con locus endógenos que se han desactivado, por ejemplo, xenorratones inmunizados (véanse, por ejemplo, las pat. de EE. UU. n.° 6.075.181 y 6.150.584 con respecto a la tecnología XENOMOUSE™). Véase también, por ejemplo, Li et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:3557-3562, 2006 en relación con anticuerpos humanos generados por medio de una tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos.
Una "región estructural consenso humana" es una región estructural que representa los residuos aminoacídicos que se producen lo más comúnmente en una selección de secuencias de la región estructural de VL o VH de inmunoglobulina humana. En general, la selección de secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias del dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al., Sequences o f Proteins o f Immunological Interest, quinta edición, publicación del NIH 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. En un modo de realización, para el VL, el subgrupo es el subgrupo kappa I como en Kabat et al., supra. En un modo de realización, para el VH, el subgrupo es el subgrupo III como en Kabat et al., supra.
Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácido de HVR no humanas y residuos de aminoácido de FR humanas. En determinados modos de realización, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado puede comprender, opcionalmente, al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización.
El término "región hipervariable" o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que tienen una secuencia hipervariable ("regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR") y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables") y/o contienen los residuos de contacto con antígeno ("contactos con antígeno"). En general, los anticuerpos comprenden seis HVR: tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Las HVR ejemplares en el presente documento incluyen:
(a) bucles hipervariables que se producen en los residuos aminoacídicos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987);
(b) CDR que se producen en los residuos aminoacídicos 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50 65 (H2) y 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences o f Proteins o f Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) contactos con el antígeno que se producen en los residuos aminoacídicos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) y 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262:732-745, 1996); y
(d) combinaciones de (a), (b) y/o (c), que incluyen los residuos aminoacídicos de HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) y 94-102 (H3).
A menos que se indique de otro modo, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, los residuos de FR) se numeran en el presente documento de acuerdo con Kabat et al., supra.
Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado con una o más moléculas heterólogas, incluyendo pero sin limitarse a un agente citotóxico.
Un "sujeto" o un "individuo" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En determinados modos de realización, el sujeto o individuo es un ser humano.
Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural. En algunos modos de realización, se purifica un anticuerpo a más de un 95 % o 99 % de pureza, como se determina, por ejemplo, por electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Para una revisión de los procedimientos para la evaluación de la pureza de anticuerpo, véase, por ejemplo, Flatman et al. J. Chromatogr. B 848:79-87, 2007.
Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que contienen habitualmente la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural.
Un "ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-FcRH5" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpo (o fragmentos de las mismas), incluyéndose dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico en un único vector o vectores separados, y estando dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico presente(s) en una o más localizaciones en una célula huésped.
Un "ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-CD3" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpo (o fragmentos de las mismas), incluyéndose dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico en un único vector o vectores separados, y estando dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico presente(s) en una o más localizaciones en una célula huésped.
El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes dichas variantes en general en cantidades pequeñas. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un determinante individual en un antígeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar que requiera la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo pero sin limitarse al procedimiento de hibridoma, procedimientos de ADN recombinante, procedimientos de presentación en fagos y procedimientos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los locus de inmunoglobulina humana; describiéndose en el presente documento dichos procedimientos y otros procedimientos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales.
Un "anticuerpo no marcado" se refiere a un anticuerpo que no está conjugado con un resto heterólogo (por ejemplo, un resto citotóxico) o radiomarcador. El anticuerpo no marcado puede estar presente en una formulación farmacéutica.
Los "anticuerpos naturales" se refieren a moléculas de inmunoglobulina naturales con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG naturales son glucoproteínas heterotetrámeras de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que se unen con disulfuro. Del extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). De forma similar, del extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio ligero variable o dominio variable de la cadena ligera, seguida de un dominio ligero constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (k) y lambda (A), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.
El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en los envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias en relación con el uso de dichos productos terapéuticos.
El término "antagonista de unión al eje PD-1" es una molécula que inhibe la interacción de un compañero de unión al eje PD-1 con uno o más de sus compañeros de unión, para eliminar la disfunción de los linfocitos T resultante de la señalización en el eje de señalización de PD-1, siendo un resultado el restablecimiento o potenciación de la función de los linfocitos T (por ejemplo, proliferación, producción de citocinas, destrucción de células diana). Como se usa en el presente documento, un antagonista de unión al eje PD-1 incluye un antagonista de unión a PD-1, un antagonista de unión a PD-L1 y un antagonista de unión a PD-L2.
El término "antagonistas de unión a PD-1" se refiere a una molécula que disminuye, bloquea, inhibe, anula o interfiere en la transducción de señales resultante de la interacción de PD-1 con uno o más de sus compañeros de unión, tales como PD-L1, PD-L2. En algunos modos de realización, el antagonista de unión a PD-1 es una molécula que inhibe la unión de PD-1 a uno o más de sus compañeros de unión. En un modo de realización específico, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a PD-L1 y/o PD-L2. Por ejemplo, los antagonistas de unión a PD-1 incluyen anticuerpos anti-PD-1, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, inmunoadhesinas, proteínas de fusión, oligopéptidos y otras moléculas que disminuyen, bloquean, inhiben, anulan o interfieren con la transducción de señales resultante de la interacción de PD-1 con PD-L1 y/o PD-L2. En un modo de realización, un antagonista de unión a PD-1 reduce la señal coestimuladora negativa mediada por o a través de proteínas de la superficie celular expresadas en la señalización mediada por linfocitos T a través de PD-1, de modo que hace que un linfocito T disfuncional sea menos disfuncional (por ejemplo, potenciando las respuestas efectoras al reconocimiento de antígenos). En algunos modos de realización, el antagonista de unión a PD-1 es un anticuerpo anti-PD-1. En un modo de realización específico, un antagonista de unión a PD-1 es MDX-1106 (nivolumab). En otro modo de realización específico, un antagonista de unión a PD-1 es MK-3475 (pembrolizumab). En otro modo de realización específico, un antagonista de unión a PD-1 es CT-011 (pidilizumab). En otro modo de realización específico, un antagonista de unión a PD-1 es AMP-224. En otro modo de realización específico, un antagonista de unión a PD-1 es MED1-0680. En otro modo de realización específico, un antagonista de unión a PD-1 es PDR001. En otro modo de realización específico, un antagonista de unión a PD-1 es REGN2810.
El término "antagonista de unión a PD-L1" se refiere a una molécula que disminuye, bloquea, inhibe, anula o interfiere en la transducción de señales resultante de la interacción de PD-L1 con uno o bien más de sus compañeros de unión, tales como PD-1, B7-1. En algunos modos de realización, un antagonista de unión a PD-L1 es una molécula que inhibe la unión de PD-L1 a sus compañeros de unión. En un modo de realización específico, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a PD-1 y/o B7-1. En algunos modos de realización, los antagonistas de unión a PD-L1 incluyen anticuerpos anti-PD-L1, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, inmunoadhesinas, proteínas de fusión, oligopéptidos y otras moléculas que disminuyen, bloquean, inhiben, anulan o interfieren en la transducción de señales resultante de la interacción de PD-L1 con uno o más de sus compañeros de unión, tales como PD-1, B7-1. En un modo de realización, un antagonista de unión a PD-L1 reduce la señal coestimuladora negativa mediada por o a través de proteínas de superficie celular expresadas en la señalización mediada por linfocitos T a través de PD-L1 para hacer que un linfocito T disfuncional sea menos disfuncional (por ejemplo, potenciando las respuestas efectoras con respecto al reconocimiento antigénico). En algunos modos de realización, un antagonista de unión a PD-L1 es un anticuerpo anti-PD-L1. Todavía en otro modo de realización específico, un anticuerpo anti-PD-L1 es MPDL3280A (atezolizumab, comercializado como TECENTRIQ™ con información de medicamentos de la OMS (Denominación común internacional para sustancias farmacéuticas), DCI recomendada: Lista 74, vol. 29, n.° 3, 2015 (véase la página 387)). En otro modo de realización específico, un anticuerpo anti-PD-L1 es MDX-1105. En otro modo de realización específico, un anticuerpo anti-PD-L1 es MSB0015718C. Todavía en otro modo de realización específico, un anticuerpo anti-PD-L1 es MEDI4736.
El término "antagonista de unión a PD-L2" se refiere a una molécula que disminuye, bloquea, inhibe, anula o interfiere en la transducción de señales resultante de la interacción de PD-L2 con uno o bien más de sus compañeros de unión, tales como PD-1. En algunos modos de realización, un antagonista de unión a PD-L2 es una molécula que inhibe la unión de PD-L2 a uno o más de sus compañeros de unión. En un modo de realización específico, el antagonista de unión a PD-L2 inhibe la unión de PD-L2 a PD-1. En algunos modos de realización, los antagonistas de PD-L2 incluyen anticuerpos anti-PD-L2, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, inmunoadhesinas, proteínas de fusión, oligopéptidos y otras moléculas que disminuyen, bloquean, inhiben, anulan o interfieren en la transducción de señales resultante de la interacción de PD-L2 con uno o más de sus compañeros de unión, tal como PD-1. En un modo de realización, un antagonista de unión a PD-L2 reduce la señal coestimuladora negativa mediada por o a través de proteínas de la superficie celular expresadas en la señalización mediada por linfocitos T a través de PD-L2, de modo que hace que un linfocito T disfuncional sea menos disfuncional (por ejemplo, potenciando las respuestas efectoras al reconocimiento de antígenos). En algunos modos de realización, un antagonista de unión a PD-L2 es una inmunoadhesina.
El término "proteína", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier proteína natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. El término engloba proteína sin procesar "de longitud completa", así como cualquier forma de la proteína que resulte del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de la proteína, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas.
El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin tener en consideración ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Se puede lograr la alineación para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, se generan valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde se ha registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. Se debe compilar el programa ALIGN-2 para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. El programa ALIGN-2 establece todos los parámetros de comparación de secuencias y no varían.
En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B (que se puede parafrasear de forma alternativa como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue:
100 veces la fracción X/Y
donde X es el número de residuos aminoacídicos puntuados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos aminoacídicos en B. Se apreciará que si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se establezca específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa informático ALIGN-2.
El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene ningún componente adicional que sea inaceptablemente tóxico para un sujeto al que se le administraría la formulación.
Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.
Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural del individuo al que se está tratando, y que se puede realizar para la profilaxis o bien durante la evolución de una patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación de la enfermedad y remisión o pronóstico mejorado. En algunos modos de realización, se usan los anticuerpos de la invención para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.
Como se usa en el presente documento, "retrasar la progresión" de un trastorno o enfermedad significa aplazar, dificultar, ralentizar, retardar, estabilizar y/o posponer el desarrollo de la enfermedad o trastorno (por ejemplo, un trastorno proliferativo celular, por ejemplo, cáncer). Este retraso puede tener duraciones de tiempo variables dependiendo de los antecedentes de la enfermedad y/o del individuo al que se está tratando. Como es evidente para un experto en la técnica, un retraso suficiente o significativo puede englobar, en efecto, la prevención, ya que el individuo no desarrolla la enfermedad. Por ejemplo, se puede retrasar un cáncer en fase tardía, tal como el desarrollo de metástasis.
El término "epítopo" se refiere al sitio particular en una molécula de antígeno al que se une un anticuerpo. En algunos modos de realización, el sitio particular en una molécula de antígeno al que se une un anticuerpo se determina mediante la huella del radical hidroxilo (por ejemplo, el dominio de unión a FcRH5). En algunos modos de realización, el sitio particular en una molécula de antígeno al que se une un anticuerpo se determina mediante cristalografía.
Por "reducir" o "inhibir" se quiere decir la capacidad de provocar una disminución global, por ejemplo, de un 20 % o mayor, de un 50 % o mayor, o de un 75 %, 85 %, 90 %, 95 % o mayor. En determinados modos de realización, reducir o inhibir puede hacer referencia a la función efectora de un anticuerpo que está mediada por la región Fc de anticuerpo, incluyendo específicamente dichas funciones efectoras la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP).
El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural tienen, en general, estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales (FR) conservadas y tres regiones hipervariables (HVR). (Véase, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007)). Un dominio VH o VL único puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular se pueden aislar usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para cribar una colección de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véase, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887, 1993; Clarkson et al. Nature 352:624-628, 1991.
Una "región Fc variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia natural en virtud de al menos una modificación aminoacídica, preferentemente una o más sustituciones aminoacídicas. Preferentemente, la región Fc variante tiene al menos una sustitución aminoacídica en comparación con una región Fc de secuencia natural o con la región Fc de un polipéptido original, por ejemplo de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones aminoacídicas y, preferentemente, de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones aminoacídicas en una región Fc de secuencia natural o en la región Fc del polipéptido original. La región Fc variante en el presente documento poseerá preferentemente al menos aproximadamente un 80 % de homología con una región Fc de secuencia natural y/o con una región Fc de un polipéptido original y, lo más preferentemente, al menos aproximadamente un 90 % de homología con la misma, más preferentemente al menos aproximadamente un 95 % de homología con la misma.
El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al que se une. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Determinados vectores pueden dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que se unen de forma funcional. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión".
Como se usa en el presente documento, "administrar" quiere decir un procedimiento de administración de una dosificación de un compuesto (por ejemplo, un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención, un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención) o una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica, por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención) a un sujeto. Las composiciones utilizadas en los procedimientos descritos en el presente documento se pueden administrar, por ejemplo, por vía intramuscular, intravenosa, intradérmica, percutánea, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, i ntraarti cular, i ntraprostáti ca, i ntrapleural, i ntratraqueal, i ntranasal, i ntravítrea, i ntravag i nal, i ntrarrectal, tópica, intratumoral, peritoneal, subcutánea, subconjuntival, intravesicular, mucosal, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, oral, tópica, local, por inhalación, por inyección, por infusión, por infusión continua, por perfusión localizada con baño de células diana directo, por catéter, por lavado, en cremas o en composiciones lipídicas. El procedimiento de administración puede variar dependiendo de diversos factores (por ejemplo, el compuesto o composición que se administra y la gravedad de la afección, enfermedad o trastorno que se trata).
II. Composiciones y procedimientos
En un aspecto, la invención se basa, en parte, en anticuerpos anti-FcRH5. En determinados modos de realización, los anticuerpos anti-FcRH5 son multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos) y se unen, además de a FcRH5 o a un fragmento de la misma, a una segunda molécula biológica (por ejemplo, un antígeno de superficie celular, por ejemplo, un marcador de linfocitos T, por ejemplo, CD3 (por ejemplo, CD3e y/o CD3y)). Los anticuerpos de la invención son útiles, por ejemplo, para diagnosticar y/o tratar o retrasar la progresión de un trastorno proliferativo celular (por ejemplo, cáncer, por ejemplo, un cáncer positivo para FcRH5, por ejemplo, mieloma múltiple) en un sujeto.
A. Anticuerpos anti-FcRH5 ejemplares
En un caso particular, el anticuerpo anti-FcRH5 puede ser 1G7.v85.
En algunos casos, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 que tiene un dominio de unión que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 104 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105.
En un caso particular, el anticuerpo anti-FcRH5 puede ser 1G7.v93.
En algunos casos, por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 que tiene un dominio de unión que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107.
En un caso particular, el anticuerpo anti-FcRH5 puede ser 1G7.v1.1. En algunos casos, por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 que tiene un dominio de unión que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 84 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85.
En un caso particular, el anticuerpo anti-FcRH5 puede ser 1G7.v1.2. En algunos casos, por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 que tiene un dominio de unión que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 87.
En un caso particular, el anticuerpo anti-FcRH5 puede ser 1G7.v1.3. En algunos casos, por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 que comprende un dominio de unión que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 88 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 89.
En un caso particular, el anticuerpo anti-FcRH5 puede ser 1G7.v1.4. En algunos casos, por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 que tiene un dominio de unión que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 90 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 91.
En un caso particular, el anticuerpo anti-FcRH5 puede ser 1G7.v1.5.
En algunos casos, por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 que tiene un dominio de unión que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 92 y (b) un dominio V<l>que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 93.
En un caso particular, el anticuerpo anti-FcRH5 puede ser 1G7.v1.7. En algunos casos, por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 que tiene un dominio de unión que incluye (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 96 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 97.
En un caso particular, el anticuerpo anti-FcRH5 puede ser 1G7.v1.13. relacionado con el mismo. En algunos casos, por ejemplo, un anticuerpo anti-FcRH5 puede incluir un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 98 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 99.
En un caso particular, el anticuerpo anti-FcRH5 puede ser 1G7.v1.13.1. En algunos casos, por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 que incluye (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 100 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 101.
En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo monoclonal humano, humanizado o quimérico. En algunos casos, el anticuerpo anti-FcRH5 es un anticuerpo IgG. El anti-FcRH5 puede ser un anticuerpo de longitud completa y/o un anticuerpo monoespecífico. En determinados modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 se puede unir a un epítopo en el dominio 9 tipo Ig de FcRH5. Por ejemplo, el epítopo puede comprender una porción de los aminoácidos 743-850 de SEQ ID NO: 114. En algunos casos, el anticuerpo anti-FcRH5 se une a FcRH5 humana o FcRH5 de macaco cangrejero (cyno), o a ambas. En otros casos, el dominio de unión no se une específicamente a FcRH1, FcRH2, FcRH3 o FcRH4.
En algunos casos, el anticuerpo anti-FcRH5 tiene un aclaramiento después de la inyección intravenosa de entre aproximadamente 10 ml/kg/día a aproximadamente 45 ml/kg/día (por ejemplo, aproximadamente 1 ml/kg/día, 5 ml/kg/día, 10 ml/kg/día, 11 ml/kg/día, 12 ml/kg/día, 13 ml/kg/día, 14 ml/kg/día, 15 ml/kg/día, 16 ml/kg/día, 17 ml/kg/día, 18 ml/kg/día, 19 ml/kg/día, 20 ml/kg/día, 21 ml/kg/día, 22 ml/kg/día, 23 ml/kg/día, 24 ml/kg/día, 25 ml/kg/día, 26 ml/kg/día, 27 ml/kg/día, 28 ml/kg/día, 29 ml/kg/día, 30 ml/kg/día, 31 ml/kg/día, 32 ml/kg/día, 33 ml/kg/día, 34 ml/kg/día, 35 ml/kg/día, 36 ml/kg/día, 37 ml/kg/día, 38 ml/kg/día, 39 ml/kg/día, 40 ml/kg/día, 41 ml/kg/día, 42 ml/kg/día, 43 ml/kg/día o 44 ml/kg/día).
En algunos casos, el anticuerpo anti-FcRH5 tiene un aclaramiento después de la inyección intravenosa de aproximadamente 1 ml/kg/día a aproximadamente 5 ml/kg/día, aproximadamente 6 ml/kg/día a aproximadamente 10 ml/kg/día, aproximadamente 11 ml/kg/día a aproximadamente 15 ml/kg/día, aproximadamente 16 ml/kg/día a aproximadamente 20 ml/kg/día, aproximadamente 21 ml/kg/día a aproximadamente 25 ml/kg/día, aproximadamente 26 ml/kg/día a aproximadamente 30 ml/kg/día, aproximadamente 31 ml/kg/día a aproximadamente 35 ml/kg/día, aproximadamente 36 ml/kg/día a aproximadamente 40 ml/kg/día, aproximadamente 41 ml/kg/día a aproximadamente 45 ml/kg/día en un ratón. En algunos casos, el anticuerpo anti-FcRH5 tiene un aclaramiento tras la inyección intravenosa de aproximadamente 10 ml/kg/día a aproximadamente 35 ml/kg/día en un ratón. En algunos casos, el anticuerpo anti-FcRH5 tiene un aclaramiento tras la inyección intravenosa de aproximadamente 10 ml/kg/día a aproximadamente 20 ml/kg/día en un ratón. En algunos casos, el anticuerpo anti-FcRH5 tiene un aclaramiento tras la inyección intravenosa de aproximadamente 12 ml/kg/día a aproximadamente 16 ml/kg/día en un ratón.
En algunos casos, el anticuerpo anti-FcRH5 tiene un aclaramiento después de la inyección intravenosa de aproximadamente 1 ml/kg/día a aproximadamente 5 ml/kg/día, aproximadamente 6 ml/kg/día a aproximadamente 10 ml/kg/día, aproximadamente 11 ml/kg/día a aproximadamente 15 ml/kg/día, aproximadamente 16 ml/kg/día a aproximadamente 20 ml/kg/día, aproximadamente 21 ml/kg/día a aproximadamente 25 ml/kg/día, aproximadamente 26 ml/kg/día a aproximadamente 30 ml/kg/día, aproximadamente 31 ml/kg/día a aproximadamente 35 ml/kg/día, aproximadamente 36 ml/kg/día a aproximadamente 40 ml/kg/día, aproximadamente 41 ml/kg/día a aproximadamente 45 ml/kg/día en un cyno. En algunos casos, el anticuerpo anti-FcRH5 tiene un aclaramiento tras la inyección intravenosa de aproximadamente 20 ml/kg/día a aproximadamente 40 ml/kg/día en un cyno. En algunos casos, el anticuerpo anti-FcRH5 tiene un aclaramiento tras la inyección intravenosa de aproximadamente 25 ml/kg/día a aproximadamente 35 ml/kg/día en un cyno. En algunos casos, el anticuerpo anti-FcRH5 tiene un aclaramiento tras la inyección intravenosa de aproximadamente 30 ml/kg/día a aproximadamente 35 ml/kg/día en un cyno.
En un modo de realización, se mide la K<d>por un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA). En un modo de realización, se realiza un RIA con la versión de Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno. Por ejemplo, se mide la afinidad de unión en solución de los Fab por el antígeno equilibrando los Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125I) en presencia de una serie de valoraciones de antígeno no marcado, capturando, a continuación, el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881, 1999). Para establecer las condiciones para el ensayo, se recubren placas de múltiples pocillos MICROTITER® (Thermo Scientific) durante la noche con 5 |jg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6) y posteriormente se bloquean con seroalbúmina bovina al 2 % (p/v) en PBS durante de dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente (Nunc, n.° 269620), se mezcla [125I]-antígeno 100 μM o 26 μM con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, consecuente con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., Cáncer Res. 57:4593-4599, 1997). A continuación, el Fab de interés se incuba durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un periodo más largo (por ejemplo, de aproximadamente 65 horas) para garantizar que se alcanza el equilibrio. Después de esto, se transfieren las mezclas a la placa de captura para su incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). A continuación, se retira la solución y se lava la placa ocho veces con polisorbato 20 (TWEEN-20®) al 0,1 % en PBS. Cuando las placas se han secado, se añaden 150 jl/pocillo de centelleador (MICROSCINT-20™; Packard) y se cuentan las placas en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Se eligen concentraciones de cada Fab que den menos de o igual a un 20 % de unión máxima para su uso en ensayos de unión competitiva.
De acuerdo con otro modo de realización, K<d>se mide usando un ensayo de resonancia de plasmón superficial BIACORE®. Por ejemplo, se realiza un ensayo usando un BIACORE®-2000 o un BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips CM5 con antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). En un modo de realización, los chips de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) se activan con clorhidrato de N-etil-N-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, a 5 |jg/ml (~0,2 |jM) antes de su inyección a un caudal de 5 jl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie de factor dos de Fab (de 0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo polisorbato 2o (TWEEN-20™) (PBST) al 0,05 % a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 jl/min. Se calculan las tasas de asociación (kas) y las tasas de disociación (kdis) usando un modelo simple de unión uno a uno de Langmuir (programa informático de evaluación de BIACORE®, versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la proporción kdis/kas. Véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881, 1999. Si la velocidad de asociación supera 106 M 'V mediante el ensayo de resonancia de plasmones superficiales anterior, entonces la velocidad de asociación se puede determinar usando una técnica de extinción fluorescente que mide el incremento o disminución en la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo (forma Fab) anti-antígeno 20 nM en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con interrupción de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
2. Fragmentos de anticuerpo
En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, los fragmentos bis-Fab, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv y scFv, y otros fragmentos descritos a continuación. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134, 2003. Para una revisión de los fragmentos scFv, véanse, por ejemplo, Plückthun, en The Pharmacology o f Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), págs. 269-315, 1994; véanse también el documento WO 93/16185; y las patentes de<e>E. UU. n.° 5.571.894 y 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')2que comprenden residuos de epítopos de unión al receptor de rescate y que tienen una semivida in vivo incrementada, véase la patente de EE. UU. n.° 5.869.046.
Los fragmentos de anticuerpo en los que los dos Fab están enlazados a través de bis-maleimida se denominan en el presente documento bismaleimido-(thio-Fab) 2 o bis-Fab.
Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134, 2003; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, 1993. También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134, 2003.
Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas, incluyendo pero sin limitarse a, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.
3. Anticuerpos quiméricos y humanizados
En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo quimérico. Se describen determinados anticuerpos quiméricos, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984. En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En otro ejemplo, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo de "clase cambiada" en el que se ha cambiado la clase o subclase con respecto a la del anticuerpo original. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
En determinados modos de realización, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Típicamente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad en seres humanos, mientras se conservan la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano original. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, las CDR, (o porciones de las mismas) se derivan de un anticuerpo no humano y las FR (o porciones de las mismas) se derivan de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante humana. En algunos modos de realización se sustituyen algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado por los residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se derivan los residuos de HVR), por ejemplo, para restablecer o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.
Los anticuerpos humanizados y los procedimientos para prepararlos se revisan, por ejemplo, en Almagro et al., Front. Biosci. 13:1619-1633, 2008, y se describen además en, por ejemplo, Riechmann et al., Nature 332:323-329, 1988; Queen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:10029-10033, 1989; las patentes de EE. UU. n.° 5.821.337, 7.527.791, 6.982,321 y 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34, 2005 (que describe el injerto de región determinante de la especificidad (SDR)); Padlan Mol. Immunol. 28:489-498, 1991 (que describe el "rebarnizado"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60, 2005 (que describe el "reordenamiento de FR"); Osbourn et al., Methods 36:61-68, 2005 y Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260, 2000 (que describen el enfoque de "selección guiada" para el reordenamiento de FR).
Las regiones estructurales humanas que se pueden usar para la humanización incluyen, pero no se limitan a: regiones estructurales seleccionadas usando el procedimiento de "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims et al., J. Immunol., 151:2296, 1993); regiones estructurales derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de la cadena ligera o pesada (véanse, por ejemplo, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285, 1992; y Presta et al., J. Immunol., 151:2623, 1993); regiones estructurales maduras (mutadas somáticamente) humanas o regiones estructurales de la línea germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro et al., Front. Biosci. 13:1619-1633, 2008); y regiones estructurales derivadas del cribado de colecciones de FR (véanse, por ejemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684, 1997; y Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618, 1996).
4. Anticuerpos humanos
En determinados aspectos que se analizan solo como referencia, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo humano. Se pueden producir anticuerpos humanos usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Se describen anticuerpos humanos en general en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74, 2001 y Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459, 2008.
Se pueden preparar anticuerpos humanos administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos inalterados o anticuerpos inalterados con regiones variables humanas en respuesta a una exposición antigénica. Dichos animales típicamente contienen todos o una porción de los locus de inmunoglobulina humana, que remplazan los locus de inmunoglobulina endógena o que están presentes de forma extracromosómica o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En dichos ratones transgénicos, los locus de inmunoglobulina endógena, en general, se han inactivado. Para una revisión de los procedimientos para obtener anticuerpos humanos de animales transgénicos, véase Lonberg, Nat. Biotech.
23:1117-1125, 2005. Véanse también, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 6.075.181 y 6.150.584 que describen la tecnología XENOMOUSE™; la patente de EE. UU. n.° 5.770.429 que describe la tecnología HuMab®; la patente de EE. UU. n.° 7.041.870 que describe la tecnología K-M MOUSE® y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2007/0061900, que describe la tecnología VelociMouse®). Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por dichos animales se pueden modificar además, por ejemplo, por combinación con una región constante humana diferente.
También se pueden preparar anticuerpos humanos por procedimientos basados en hibridoma. Las líneas celulares de heteromieloma ratón-humano y mieloma humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos se han descrito (véase, por ejemplo, Kozbor, J. Immunol., 133: 3001, 1984; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86, 1991). Los anticuerpos humanos generados por medio de la tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos también se describen en Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562, 2006. Los procedimientos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales a partir de líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268, 2006 (que describe hibridomas humano-humano). La tecnología de hibridoma humano (tecnología de trioma) también se describe en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937, 2005 y Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91, 2005.
También se pueden generar anticuerpos humanos aislando secuencias de dominio variable del clon Fv seleccionadas de colecciones de presentación en fagos derivadas de humano. A continuación, se pueden combinar dichas secuencias de dominio variable con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de colecciones de anticuerpos se describen a continuación.
5. Anticuerpos derivados de colecciones
Se pueden aislar los anticuerpos de la invención cribando colecciones combinatorias para determinar anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, una variedad de procedimientos son conocidos en la técnica para generar colecciones de presentación en fagos y cribar dichas colecciones para determinar los anticuerpos que poseen las características de unión deseadas. Dichos procedimientos se revisan, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in M olecularBiology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) y se describen además, por ejemplo, en McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1992; Marks y Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310, 2004; Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093, 2004; Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472, 2004; y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132, 2004.
En determinados procedimientos de presentación en fagos, los repertorios de genes de VH y VL se clonan por separado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en colecciones de fagos, que, a continuación, se pueden cribar para determinar el fago de unión a antígeno como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12:433-455, 1994. Los fagos típicamente presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab. Las colecciones de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad con respecto al inmunógeno sin el requisito de construir hibridomas. De forma alternativa, se puede clonar el repertorio sin exposición previa (por ejemplo, de un ser humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos para una amplia gama de antígenos propios y también no propios sin ninguna inmunización como se describe por Griffiths et al., EMBO J, 12:725-734, 1993. Finalmente, también se pueden preparar sintéticamente colecciones sin exposición previa clonando segmentos génicos V no reordenados a partir de células madre y usando cebadores de PCR que contienen una secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y conseguir el reordenamiento in vitro, como se describe por Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381-388, 1992. Las publicaciones de patente que describen colecciones de fagos con anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: la patente de EE. UU. n.° 5.750.373 y las publicaciones de patente de EE. UU. n.° 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 y 2009/0002360. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de colecciones de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo humano en el presente documento.
6. Anticuerpos multiespecíficos, incluyendo anticuerpos biespecíficos dependientes de linfocitos T (TDB) contra FcRH5
En uno cualquiera de los aspectos anteriores, el anticuerpo anti-FcRH5 proporcionado en el presente documento es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos sitios diferentes. En determinados modos de realización, los anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos epítopos diferentes de FcRH5.
En determinados modos de realización, una de las especificidades de unión es por FcRH5 y la otra es por CD3 (por ejemplo, CD3e o CD3y). Dichos anticuerpos anti-FcRH5 biespecíficos también se denominan anticuerpos biespecíficos dependientes de linfocitos T (TDB) contra FcRH5 o TDB contra FcRH5. En algunos casos, el segundo dominio de unión se une a un epítopo en CD3 que comprende el residuo aminoacídico Glu6 de CD3. En algunos casos, el epítopo comprende además uno o más residuos aminoacídicos adicionales seleccionados del grupo que consiste en Gln1, Asp2 y Met7 de CD3. En algunos casos, el epítopo comprende los residuos aminoacídicos Gln1, Asp2 y Glu6 de CD3. En algunos casos, el epítopo comprende los residuos aminoacídicos Gln1, Asp2, Glu6 y Met7 de CD3. En algunos casos, el epítopo no comprende el residuo aminoacídico Glu5 de CD3. En algunos casos, el epítopo no comprende los residuos aminoacídicos Gly3 y Glu5 de CD3. En algunos casos, el epítopo consiste en los residuos aminoacídicos Gln1, Asp2, Glu6 y Met7 de CD3.
En algunos otros casos, el segundo dominio de unión se puede unir a un polipéptido CD3 humano o a un polipéptido CD3 de cyno. En algunos casos, el polipéptido CD3 humano o el polipéptido CD3 de cyno es un polipéptido Cd 3e humano o un polipéptido CD3e de cyno, respectivamente. En algunos casos, el polipéptido CD3 humano o el polipéptido CD3 de cyno es un polipéptido CD3<y>humano o un polipéptido CD3<y>de cyno, respectivamente.
En casos particulares, el segundo dominio de unión se une al polipéptido CD3e humano con una constante de disociación (K<d>) de ≤1 |<j>M, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0,1 nM, ≤0,01 nM o ≤0,001 nM (por ejemplo, 10‘8 M o menos, por ejemplo, de 10‘8 M a 10‘13 M, por ejemplo, de 10‘9 M a 10‘13 M). Por ejemplo, en algunos casos, el segundo dominio de unión se une al polipéptido CD3e humano con una K<d>de ≤100 nM (por ejemplo, ≤90 nM, ≤80 nM, ≤70 nM, ≤60 nM, ≤50 nM, ≤40 nM, ≤30 nM, ≤20 nM, ≤10 nM, ≤5 nM, ≤1 nM, ≤750 μM, ≤500 μM, ≤250 μM, ≤100 μM, ≤50 μM, ≤25 μM, ≤10 μM, ≤5 μM o ≤1 μM) o menor.
En algunos casos, por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5, en el que el segundo dominio de unión comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis regiones hipervariables (HVR) seleccionadas de (a) una HVR-H1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115; (b) una HVR-H2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116; (c) una HVR-H3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; (d) una HVR-L1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118; (e) una HVR-L2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119; y (f) una HVR-L3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120.
En algunos casos, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5, en el que el segundo dominio de unión comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis regiones hipervariables (HVR) seleccionadas de (a) una HVR-H1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115, (b) una HVR-H2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116, (c) una HVR-H3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121, (d) una HVR-L1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118, (e) una HVR-L2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119, y (f) una HVR-L3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123. En algunos casos, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5, en el que el segundo dominio de unión incluye un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 %) con, o la secuencia de, SEQ ID NO: 133 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 %) con, o la secuencia de, SEQ ID NO: 134. En algunos casos, el anticuerpo anti-FcRH5 incluye un segundo dominio de unión que comprende al menos una (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4) de las regiones estructurales de la cadena pesada FR-H1, FR-H2, FR-H3 y FR-H4 que comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 125, 126, 127 y 128, respectivamente. En algunos casos, el segundo dominio de unión comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133. En algunos casos, el segundo dominio de unión incluye además al menos una (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4) de las regiones estructurales de la cadena ligera FR-L1, FR-L2, FR-L3 y FR-L4 que comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 129, 130, 131 y 132, respectivamente. En algunos casos, el segundo dominio de unión comprende un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134. En algunos casos, el segundo dominio de unión incluye un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134. En consecuencia, en algunos casos, una variante de semianticuerpo de un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención se puede aparear con una variante de semianticuerpo del anticuerpo anti-CD3 38E4.v1 para formar un TDB contra FcRH5 (es decir, un TDB anti-FcRH5/38E4.v1).
En algunos casos, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5, en el que el segundo dominio de unión comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis regiones hipervariables (HVR) seleccionadas de (a) una HVR-H1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115, (b) una HVR-H2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116, (c) una HVR-H3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122, (d) una HVR-L1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118, (e) una HVR-L2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119, y (f) una HVR-L3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123. En algunos casos, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5, en el que el segundo dominio de unión incluye un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 %) con, o la secuencia de, SEQ ID NO: 135 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 %) con, o la secuencia de, SEQ ID NO: 136. En algunos casos, el anticuerpo anti-FcRH5 incluye un segundo dominio de unión que comprende al menos una (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4) de las regiones estructurales de la cadena pesada FR-H1, FR-H2, FR-H3 y FR-H4 que comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 125, 126, 127 y 128, respectivamente. En algunos casos, el segundo dominio de unión comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 135. En algunos casos, el segundo dominio de unión incluye además al menos una (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4) de las regiones estructurales de la cadena ligera FR-L1, FR-L2, FR-L3 y FR-L4 que comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 129, 130, 131 y 132, respectivamente. En algunos casos, el segundo dominio de unión comprende un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 136. En algunos casos, el segundo dominio de unión incluye un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 135 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 136. En consecuencia, en algunos casos, una variante de semianticuerpo de un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención se puede aparear con una variante de semianticuerpo del anticuerpo anti-CD3 38E4.v1 para formar un TDB contra FcRH5 (es decir, un TDB anti-FcRH5/38E4.v1).
En algunos casos, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5, en el que el segundo dominio de unión comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis regiones hipervariables (HVR) seleccionadas de (a) una HVR-H1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115, (b) una HVR-H2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116, (c) una HVR-H3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121, (d) una HVR-L1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118, (e) una HVR-L2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119, y (f) una HVR-L3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 124. En algunos casos, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5, en el que el segundo dominio de unión incluye un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 %) con, o la secuencia de, SEQ ID NO: 137 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 %) con, o la secuencia de, SEQ ID NO: 138. En algunos casos, el anticuerpo anti-FcRH5 incluye un segundo dominio de unión que comprende al menos una (por ejemplo, 1, 1,2, 3 o 4) de las regiones estructurales de la cadena pesada FR-H1, FR-H2, FR-H3 y FR-H4 que comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 125, 126, 127 y 128, respectivamente. En algunos casos, el segundo dominio de unión comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 137. En algunos casos, el segundo dominio de unión incluye además al menos una (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4) de las regiones estructurales de la cadena ligera FR-L1, FR-L2, FR-L3 y FR-L4 que comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 129, 130, 131 y 132, respectivamente. En algunos casos, el segundo dominio de unión comprende un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 138. En algunos casos, el segundo dominio de unión incluye un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 137 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 138. En consecuencia, en algunos casos, una variante de semianticuerpo de un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención se puede aparear con una variante de semianticuerpo del anticuerpo anti-CD338E4.v11 para formar un TDB contra FcRH5 (es decir, un TDB anti-FcRH5/38E4.v11).
En algunos casos, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5, en el que el segundo dominio de unión comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis regiones hipervariables (HVR) seleccionadas de (a) una HVR-H1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 139, (b) una HVR-H2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 140, (c) una HVR-H3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 141, (d) una HVR-L1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 142, (e) una HVR-L2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 143, y (f) una HVR-L3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 144. En algunos casos, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5, en el que el segundo dominio de unión incluye un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 %) con, o la secuencia de, SEQ ID NO: 153 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 %) con, o la secuencia de, SEQ ID NO: 154. En algunos casos, el anticuerpo anti-FcRH5 incluye un segundo dominio de unión que comprende al menos una (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4) de las regiones estructurales de la cadena pesada FR-H1, FR-H2, FR-H3 y FR-H4 que comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 145, 146, 147 y 148, respectivamente. En algunos casos, el segundo dominio de unión comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153. En algunos casos, el segundo dominio de unión incluye además al menos una (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4) de las regiones estructurales de la cadena ligera FR-L1, FR-L2, FR-L3 y FR-L4 que comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 149, 150, 151 y 152, respectivamente. En algunos casos, el segundo dominio de unión comprende un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 154. En algunos casos, el segundo dominio de unión incluye un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 154. En consecuencia, en algunos casos, una variante de semianticuerpo de un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención se puede aparear con una variante de semianticuerpo del anticuerpo anti-CD3 hu40G5c para formar un TDB contra FcRH5 (es decir, un TDB anti-FcRH5/hu40G5c).
En algunos casos, por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5, en el que el segundo dominio de unión comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis regiones hipervariables (HVR) seleccionadas de (a) una HVR-H1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 155; (b) una HVR-H2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 156; (c) una HVR-H3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 157; (d) una HVR-L1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 158; (e) una HVR-L2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159; y (f) una HVR-L3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 160.
En algunos casos, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5, en el que el segundo dominio de unión comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis regiones hipervariables (HVR) seleccionadas de (a) una HVR-H1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 155, (b) una HVR-H2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 162, (c) una HVR-H3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 157, (d) una HVR-L1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 158, (e) una HVR-L2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159, y (f) una HVR-L3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 160. En algunos casos, por ejemplo, el segundo dominio de unión incluye un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 %) con, o la secuencia de, SEQ ID NO: 172 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 %) con, o la secuencia de, SEQ ID NO: 173. En algunos casos, por ejemplo, el anticuerpo anti-FcRH5 incluye un segundo dominio de unión que comprende al menos una (por ejemplo, 1,2, 3 o 4) de las regiones estructurales de la cadena pesada FR-H1, FR-H2, FR-H3 y FR-H4 que comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 164, 165, 166 y 167, respectivamente. En algunos casos, el segundo dominio de unión comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 172. En algunos casos, el segundo dominio de unión incluye además al menos una (por ejemplo, 1,2, 3 o 4) de las regiones estructurales de la cadena ligera FR-L1, FR-L2, FR-L3 y FR-L4 que comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 168, 169, 170 y 171, respectivamente. En algunos casos, el segundo dominio de unión comprende un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 173. En algunos casos, el segundo dominio de unión incluye un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 172 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 173. En consecuencia, en algunos casos, una variante de semianticuerpo de un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención se puede aparear con una variante de semianticuerpo del anticuerpo anti-CD3 huUCHT 1.v9 para formar un TDB contra FcRH5 (es decir, un TDB anti-FcRH5/huUCHT 1.v9).
En algunos casos, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5, en el que el dominio VL2 está enlazado a un dominio CL (CL2) y el VH2 está enlazado a un dominio CH1 (CH12), en el que el CL2 comprende una región cargada (CR7) y CH12 comprende una región cargada (CRs), y en el que la CRs en el CH12 forma un par de carga con la CRz en el CL2. En algunos casos, la CRs comprende un residuo aminoacídico básico y la CR7 comprende un residuo aminoacídico ácido. En algunos casos, la CRs comprende una mutación por sustitución S183K (numeración EU). En algunos casos, la CRs consiste en la mutación por sustitución S183K. En algunos casos, la CR7 comprende una mutación por sustitución V133E (numeración EU). En algunos casos, la CR7 consiste en la mutación por sustitución V133E.
En algunos casos, por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5, en el que el dominio VL2 está enlazado a un dominio CL (CL2) y el VH2 está enlazado a un dominio CH1 (CH12), en el que el CL2 comprende una o más mutaciones en los residuos aminoacídicos F116, L135, S174, S176 y/o T178 (numeración EU) y el CH12 comprende una o más mutaciones en los residuos aminoacídicos A141, F170, S181, S183 y/o V185 (numeración UE). En algunos casos, la CL2 comprende una o más de las siguientes mutaciones por sustitución: F116A, L135V, S174A, S176F y/o T178V. En algunos casos, la CL2 comprende las siguientes mutaciones por sustitución: F116A, L135V, S174A, S176F y T178V. En algunos casos, el CH12 comprende una o más de las siguientes mutaciones por sustitución: A141I, F170S, S181M, S183A y/o V185A. En algunos casos, el CH12 comprende las siguientes mutaciones por sustitución: A141I, F170S, S181M, S183A y V185A.
En algunos casos, el dominio VL1 está enlazado a un dominio constante de la cadena ligera (CL) (CL1) y el VH<í>está enlazado a un dominio constante de la cadena pesada (CH1) (CH11), en el que el CL1 comprende una región cargada (CR5) y el CH11 comprende una región cargada (CR6), y en el que la CR6 en el CH11 forma un par de carga con la CR5 en el CL1. En algunos casos, la CR6 comprende un residuo aminoacídico básico y la CR5 comprende un residuo aminoacídico ácido. En algunos casos, la CR6 comprende una mutación por sustitución S183K (numeración EU). En algunos casos, la CR6 consiste en la mutación por sustitución S183K. En algunos casos, la CR5 comprende una mutación por sustitución V133E (numeración EU). En algunos casos, la CR5 consiste en la mutación por sustitución V133E.
En algunos casos, por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5, en el que el dominio VL2 está enlazado a un dominio CL (CL2) y el VH2 está enlazado a un dominio CH1 (CH12), en el que el CL2 comprende una región cargada (CR7) y el CH12 comprende una región cargada (CRs), y en el que la CRz en el CL2 forma un par cargado con la CRs en el CH12. En algunos casos, la CR7 comprende un residuo aminoacídico básico y la CRs comprende un residuo ácido. En algunos casos, la CR7 comprende una mutación por sustitución V133K (numeración EU). En algunos casos, la CR7 consiste en la mutación por sustitución V133K. En algunos casos, la CRs comprende una mutación por sustitución S183E (numeración EU). En algunos casos, la CRs consiste en la mutación por sustitución S ^3E .
En algunos casos, por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5, en el que el dominio VL2 está enlazado a un dominio CL (CL2) y el VH2 está enlazado a un dominio CH1 (CH12), en el que el CL2 comprende una o más mutaciones en los residuos aminoacídicos F116, L135, S174, S176 y/o T17s (numeración EU) y el CH12 comprende una o más mutaciones en los residuos aminoacídicos A141, F170, S ^ 1 , S ^ 3 y/o V1s5 (numeración UE). En algunos casos, la CL2 comprende una o más de las siguientes mutaciones por sustitución: F116A, L135V, S174A, S176F y/o T17sV. En algunos casos, la CL2 comprende las siguientes mutaciones por sustitución: F116A, L135V, S174A, S176F y T17sV. En algunos casos, el CH12 comprende una o más de las siguientes mutaciones por sustitución: A141I, F170S, S ^1 M , S ^ 3 A y/o V1s5A. En algunos casos, el CH12 comprende las siguientes mutaciones por sustitución: A141I, F170S, S1<s>1<m>, S ^ 3 A y V1s5A. En algunos casos, el anticuerpo anti-FcRH5 comprende uno o más dominios constantes de la cadena pesada, en el que el uno o más dominios constantes de la cadena pesada se seleccionan de un primer dominio CH2 (CH21), un primer dominio CH3 (CH31), un segundo dominio CH2 (CH22) y un segundo dominio CH3 (CH32). En algunos casos, al menos uno de los uno o más dominios constantes de la cadena pesada está apareado con otro dominio constante de la cadena pesada. En algunos casos, el CH31 y el CH32 comprenden cada uno una protuberancia (P1) o una cavidad (C1), y la P1 o la C1 en el CH31 se puede situar en la C1 o la P1, respectivamente, en el CH32. En algunos casos, el CH31 y el CH32 se encuentran en una interfase entre la Pi y la Ci. En algunos casos, el CH2i y el CH22 comprenden cada uno (P2) o una cavidad (C2), y la P2 o la C2 en el CH21 se puede situar en la C2 o la P2, respectivamente, en el CH22. En algunos casos, el CH21 y el CH22 se encuentran en una interfase entre la P2 y la C2.
7. Variantes de anticuerpo
En determinados aspectos puramente ilustrativos, se contemplan variantes de la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos anti-FcRH5 de la invención (por ejemplo, anticuerpos anti-FcRH5 biespecíficos de la invención que se unen a FcRH5 y a una segunda molécula biológica, por ejemplo, CD3, tales como anticuerpos TDB contra FcRH5 de la invención o variantes de los mismos). Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se pueden preparar variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o por síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede preparar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno.
a. Variantes de sustitución, inserción y deleción
En determinados aspectos puramente ilustrativos, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones aminoacídicas. Los sitios de interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las HVR y las FR. Se muestran sustituciones conservadoras en la tabla 1 bajo el encabezado "sustituciones preferentes". Se proporcionan cambios más sustanciales en la tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones ejemplares" y como se describe además a continuación en referencia a las clases de cadena lateral aminoacídica. Se pueden introducir sustituciones aminoacídicas en un anticuerpo de interés y cribar los productos para determinar una actividad deseada, por ejemplo, unión a antígeno retenida/mejorada, inmunogenicidad disminuida, o ADCC o CDC mejorada.
TABLA 1. Sustituciones aminoacídicas ejemplares y preferentes
Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con propiedades de cadena lateral comunes:
(1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) ácidos: Asp, Glu;
(4) básicos: His, Lys, Arg;
(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;
(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservadoras supondrán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.
Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para otro estudio tendrá(n) modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad incrementada, inmunogenicidad reducida) en relación con el anticuerpo original y/o habrá(n) conservado sustancialmente determinadas propiedades biológicas del anticuerpo original. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo de afinidad madurada, que se puede generar convenientemente, por ejemplo, usando técnicas de maduración de la afinidad basadasen presentación en fagos tales como las descritas en el presente documento. En resumen, se mutan uno o más residuos de HVR y los anticuerpos variantes se presentan en fagos y se criban para determinar una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión).
Se pueden preparar alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Dichas alteraciones se pueden realizar en "puntos calientes" de HVR, es decir, residuos codificados por codones que experimentan una mutación con alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196, 2008), y/o residuos que entran en contacto con el antígeno, sometiéndose a prueba el VH o VL variante resultante para determinar la afinidad de unión. La maduración de la afinidad por construcción y reselección de colecciones secundarias se ha descrito, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al. ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). En algunos aspectos puramente ilustrativos de la maduración de afinidad, se introduce diversidad en los genes variables elegidos para la maduración por cualquiera de una variedad de procedimientos (por ejemplo, PCR propensa a error, reordenamiento de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). A continuación, se crea una colección secundaria. A continuación, se criba la colección para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro procedimiento para introducir diversidad implica enfoques dirigidos a HVR, en los que se aleatorizan varios residuos de HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez). Se pueden identificar específicamente los residuos de HVR implicados en la unión a antígeno, por ejemplo, usando mutagénesis o modelado por barrido de alanina. A menudo se seleccionan, en particular, CDR-H3 y CDR-L3.
En determinados aspectos puramente ilustrativos, se pueden producir sustituciones, inserciones o deleciones dentro de una o más HVR, siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno. Por ejemplo, se pueden preparar alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se proporciona en el presente documento) que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión en las HVR. Dichas alteraciones pueden estar, por ejemplo, fuera de los residuos en contacto con el antígeno en las HVR. En determinados aspectos puramente ilustrativos de las secuencias de VH y VL variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR está inalterada o bien no contiene más de una, dos o tres sustituciones aminoacídicas.
Un procedimiento útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que se pueden seleccionar como diana para la mutagénesis se llama "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe por Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este procedimiento se identifican un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos con carga, tales como arg, asp, his, lys y glu) y se reemplazan por un aminoácido neutro o con carga negativa (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno se ve afectada. Se pueden introducir otras sustituciones en las localizaciones de aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De forma alternativa, o adicionalmente, una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos adyacentes se pueden seleccionar o eliminar como candidatos para sustitución. Se pueden cribar variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.
Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxiterminales que varían en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de residuos aminoacídicos únicos o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que incrementa la semivida en suero del anticuerpo.
b. Variantes de glucosilación
En determinados modos de realización, los anticuerpos anti-FcRH5 de la invención se pueden alterar para incrementar o disminuir el grado en el que el anticuerpo se glucosila. La adición o deleción de sitios de glucosilación a un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención se puede conseguir convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se cree o elimine uno o más sitios de glucosilación. La adición o eliminación de un sitio de glucosilación puede alterar la función efectora de un anticuerpo, tal como un anticuerpo anti-FcRH5 (por ejemplo, un TDB contra FcRH5). En algunos modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 (por ejemplo, un TDB contra FcRH5) puede contener una mutación del sitio de aglucosilación. En algunos modos de realización, la mutación del sitio de aglucosilación es una mutación por sustitución. En algunos modos de realización, la mutación del sitio de aglucosilación reduce la función efectora del anticuerpo anti-FcRH5 en al menos un 1 % o más (por ejemplo, un 2 %, un 3 %, un 4 %, un 5 %, un 6 %, un 7 %, un 8 %, un 9 %, un 10 %, un 20 %, un 30 %, un 40 %, un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 % o un 90 % o más). En algunos modos de realización, la mutación por sustitución está en el residuo aminoacídico N297, L234, L235, D265 y/o P329 (numeración EU). En algunos modos de realización, la mutación por sustitución se selecciona del grupo que consiste en N297G, N297A, L234A, L235A, D265A y P329G. En algunos modos de realización, la mutación por sustitución es una mutación N297G.
Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, se puede alterar el carbohidrato unido a la misma. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero típicamente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que se fija en general por un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32, 1997. El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa fijada a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura oligosacárida biantenaria. En algunos modos de realización se pueden preparar modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención para crear variantes de anticuerpo con determinadas propiedades mejoradas.
En un modo de realización, se proporcionan variantes de anticuerpo anti-FcRH5 que tienen una estructura de carbohidrato que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fc. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en dicho anticuerpo puede ser de un 1 % a un 80 %, de un 1 % a un 65 %, de un 5 % a un 65 % o de un 20 % a un 40 %. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena glucídica en Asn297, con respecto a la suma de todas las glucoestructuras unidas a Asn297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y de alto contenido en manosa) como se mide por espectrometría de masas MALDI-TOF, como se describe en el documento WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo de asparagina localizado en aproximadamente la posición 297 en la región Fc (numeración EU de los residuos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también se puede localizar aproximadamente ± 3 aminoácidos hacia 5' o hacia 3' de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia pequeñas en los anticuerpos. Dichas variantes de fucosilación pueden tener una función ADCC mejorada. Véanse, por ejemplo, la publicación de patente de EE. UU. n.° US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.). Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpo "desfucosilado" o "carente de fucosa" incluyen: los documentos US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249, 2004; Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614, 2004. Los ejemplos de líneas celulares que pueden producir anticuerpos desfucosilados incluyen células CHO Led13 carentes de fucosilación de proteínas (Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545, 1986; la sol. de pat. de EE. UU. n.° US 2003/0157108 A1, Presta, L; y el documento WO 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente en el ejemplo 11) y líneas celulares con genes inactivados, tales como el gen de alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO con genes inactivados (véanse, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng 87: 614, 2004; Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng, 94(4):680-688, 2006; y el documento WO2003/085107).
Se proporcionan además variantes de anticuerpos anti-FcRH5 con oligosacáridos bisegmentados, por ejemplo, en las que un oligosacárido biantenario unido a la región Fc del anticuerpo está bisegmentado por GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una fucosilación reducida y/o una función ADCC mejorada. Se describen ejemplos de dichas variantes de anticuerpos, por ejemplo, en el documento WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); la patente de EE. UU. n.° 6.602.684 (Umana et al.); y el documento US 2005/0123546 (Umana et al.). También se proporcionan variantes de anticuerpo con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido fijado a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una función CDC mejorada. Dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en los documentos WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); y WO 1999/22764 (Raju, S.).
c. Variantes de dominios VH, VL, CH1 y CL
En determinados aspectos puramente ilustrativos, se pueden introducir una o más modificaciones de aminoácidos en el dominio variable de la cadena pesada (VH, por ejemplo, VHi y/o VH2), dominio variable de la cadena ligera (VL, por ejemplo, VL1 y/o VL2), dominio constante de la cadena pesada (CH1, por ejemplo, CH1i y/o CH12) y/o dominio constante de la cadena ligera (CL, por ejemplo, CL1y/o CL2) de un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención (por ejemplo, un anticuerpo anti-FcRH5 biespecífico de la invención que se une a FcRH5 y a una segunda molécula biológica, por ejemplo, un anticuerpo TDB contra FcRH5 de la invención o variante del mismo). Los dominios VH, VL, CH1 y/o CL pueden tener modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) en una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) posiciones de aminoácidos.
En aspectos puramente ilustrativos particulares, las sustituciones aminoacídicas comprenden residuos aminoacídicos ácidos y/o básicos. Las modificaciones de aminoácidos pueden formar regiones cargadas dentro de los dominios VH, VL, CH1 y/o CL (por ejemplo, regiones que comprenden residuos aminoacídicos ácidos y/o básicos). Las regiones cargadas dentro de los dominios VH, VL, CH1 y/o CL pueden interactuar con una segunda región cargada de carga total opuesta para formar un par de carga. Por ejemplo, las modificaciones de aminoácidos pueden mediar en la formación de un par de carga entre regiones cargadas presentes dentro de los dominios VLi y VHi del brazo FcRH5 de un TDB. En algunos casos, las modificaciones de aminoácidos pueden mediar en la formación de un par de carga entre regiones cargadas presentes dentro de los dominios CLi y CH1i del brazo FcRH5 de un TDB. En algunos casos, las modificaciones de aminoácidos pueden mediar en la formación de un par de carga entre regiones cargadas presentes dentro de los dominios VL2 y VH2 del segundo brazo de un TDB (por ejemplo, el brazo CD3 del TDB). En algunos casos, las modificaciones de aminoácidos pueden mediar en la formación de un par de carga entre regiones cargadas presentes dentro de los dominios CL2 y CH12 del segundo brazo de un TDB (por ejemplo, el brazo CD3 del TDB). En las figs. 1A-1D se presentan configuraciones ejemplares de TDB contra FcRH5 que contienen variantes de dominio VH, VL, CH1 y/o CL.
En determinados modos de realización, un anticuerpo anti-FcRH5 (por ejemplo, un anticuerpo anti-FcRH5 biespecífico de la invención que se une a FcRH5 y a una segunda molécula biológica, por ejemplo, CD3, tal como un anticuerpo TDB contra FcRH5 de la invención) comprende una o más modificaciones asimétricas en las regiones CH1 y/o CL para facilitar el emparejamiento correcto de la cadena pesada/ligera. En otros modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 comprende además una o más modificaciones en la región Fc para facilitar la heterodimerización de los dos brazos (por ejemplo, un brazo anti-FcRH5 y un brazo anti-CD3) del anticuerpo anti-FcRH5 (por ejemplo, TDB contra FcRH5).
En algunos modos de realización, el dominio CH1i comprende una sustitución aminoacídica en S183 (numeración EU) y el dominio CLi comprende una sustitución aminoacídica en V133 (numeración EU). En otros modos de realización, la cadena ligera del primer brazo (por ejemplo, un brazo de unión a FcRH5) del anticuerpo anti-FcRH5 es una cadena kappa. En algunos modos de realización, la cadena ligera del segundo brazo (por ejemplo, un brazo de unión anti-CD3) del anticuerpo anti-FcRH5 es una cadena kappa. En determinados modos de realización, las cadenas ligeras en ambos brazos del anticuerpo anti-FcRH5 (por ejemplo, el brazo de unión a FcRH5 y el brazo de unión a CD3) son cadenas kappa.
En algunos modos de realización, el dominio CH1i comprende una mutación S183E y el dominio CLi comprende una mutación V133K. En otros modos de realización, el dominio CH11comprende una mutación S183K y el dominio CLi comprende una mutación V133E.
En algunos modos de realización, el dominio CH1i comprende una mutación S183K, el dominio CLi comprende una mutación V133E, el dominio CH12 comprende una mutación S183E y el dominio CL2 comprende una mutación V133K.
En algunos modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 comprende además una mutación de botón (por ejemplo, protuberancia) en el dominio CH3i y una mutación de ojal (por ejemplo, cavidad) en el dominio CH32. En determinados modos de realización, la mutación de botón comprende una mutación T366W (numeración EU). En determinados modos de realización, la mutación de ojal comprende al menos una, al menos dos o las tres mutaciones T366S, L368A e Y407V(numeración UE). En determinados modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 comprende además una mutación T366W en la primera cadena pesada y mutaciones T366S, L368A e Y407Ven la segunda cadena pesada.
En algunos modos de realización, el dominio CH1i comprende las mutaciones A141I, F170S, S181M, S183A y V185A y el dominio CLi comprende las mutaciones F116A, L135V, S174A, S176F y T178V. En determinados otros modos de realización, el dominio CH1i comprende mutaciones A141I, F170S, S181M, S183A y V185A, el dominio CLi comprende mutaciones F116A, L135V, S174A, S176F y T178V, el dominio CH12 comprende una mutación S183E y el dominio CL2 comprende una mutación V133K.
d. Variantes de la región Fc
En determinados modos de realización, se pueden introducir una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc de un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención (por ejemplo, un anticuerpo anti-FcRH5 biespecífico de la invención que se une a FcRH5 y a una segunda molécula biológica, por ejemplo, CD3, tal como un anticuerpo TDB de la invención o una variante del mismo), generando de este modo una variante de la región Fc (véase, por ejemplo, la publicación de EE. UU. n.° 2012/0251531). En determinados otros modos de realización, un anticuerpo anti-FcRH5 comprende una o más modificaciones en la región Fc para facilitar la heterodimerización de los dos brazos (por ejemplo, un brazo anti-FcRH5 y un brazo anti-CD3) del anticuerpo anti-FcRH5 (por ejemplo, TDB contra FcRH5).
La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprenda una modificación aminoacídica (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácido.
En determinados modos de realización, la invención contempla una variante de anticuerpo anti-FcRH5 que posee algunas, pero no todas, las funciones efectoras, que la convierten en un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo in vivo sea importante, aunque determinadas funciones efectoras (tales como el complemento y ADCC) sean innecesarias o perjudiciales. Se pueden realizar ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/depleción de las actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de unión al receptor de Fc (FcR) para garantizar que el anticuerpo carezca de unión a FcyR (de ahí que probablemente carezca de actividad ADCC), pero retenga su capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar en la ADCC, los linfocitos NK, solo expresan Fc(RIII, mientras que los monocitos expresan Fc(RI, Fc(RII y Fc(RIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch et al., Annu. Rev. Immunol. 9:457-492, 1991. Los ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describen en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362 (véase, por ejemplo, Hellstrom et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 83:7059-7063, 1986) y Hellstrom et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 82:1499-1502, 1985; y 5.821.337 (véase Bruggemann et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361, 1987). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayo no radioactivos (véanse, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, se puede evaluar in vivo, la actividad de ADCC de la molécula de interés, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 95:652-656, 1998. También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo no se puede unir a C1q y de ahí que carezca de actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento se puede realizar un ensayo de CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163, 1996; Cragg, M.S. et al., Blood.
101:1045-1052, 2003; y Cragg, M.S. y M.J. Glennie Blood. 103:2738-2743, 2004). También se pueden realizar determinaciones de unión a FcRn y aclaramiento/semivida in vivo usando procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkova, S.B. et al., Int'I. Immunol. 18(12):1759-1769, 2006).
Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patentes de EE. UU. n.° 6.737.056 y 8.219.149). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácido 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el mutante de Fc llamado "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 con alanina (patente de EE. UU. n.° 7.332.581 y 8.219.149).
En determinados modos de realización, la prolina en la posición 329 de una región Fc humana natural en el anticuerpo se sustituye con glicina o arginina o un residuo aminoacídico lo suficientemente grande como para destruir el sándwich de prolina dentro de la interfase del receptor Fc/Fc.gamma. que se forma entre la prolina 329 de la Fc y los residuos de triptófano Trp87 y Trp110 de FcgRIII (Sondermann et al., Nature. 406:267-273, 2000). En determinados modos de realización, el anticuerpo comprende al menos una sustitución aminoacídica adicional. En un modo de realización, la sustitución aminoacídica adicional es S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D o P331S y, en todavía otro modo de realización, la al menos una sustitución aminoacídica adicional es L234A y L235A de la región Fc de IgG1 humana o S228P y L235E de la región Fc de IgG4 humana (véase, por ejemplo, el documento US 2012/0251531) y, en todavía otro modo de realización, la al menos una sustitución aminoacídica adicional es L234A y L235A y P329G de la región Fc de IgG1 humana.
Se describen determinadas variantes de anticuerpo con una mejora o disminución en la unión a FcR (véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.737.056; el documento WO 2004/056312 y Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2) 6591-6604, 2001).
En determinados modos de realización, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o más sustituciones aminoacídicas que mejoran la ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración EU de los residuos).
En algunos modos de realización, se realizan alteraciones en la región Fc, que dan como resultado una unión a C1q y/o una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) alteradas (es decir, mejoradas o disminuidas), por ejemplo, como se describe en la patente de<e>E. UU. n.° 6.194.551, el documento WO 99/51642 e Idusogie et al. J. Immunol. 164:4178-4184, 2000.
Se describen anticuerpos con semividas incrementadas y unión mejorada al receptor Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587, 1976; Kim et al., J. Immunol. 24:249, 1994), se describen en el documento US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Estos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Dichas variantes de Fc incluyen aquellas con sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311.312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, la sustitución del residuo 434 de la región Fc (patente de EE. UU. n.° 7.371.826).
Véanse también Duncan et al., Nature 322:738-40, 1988; patente de EE. UU. n.° 5.648.260; patente de EE. UU. n.° 5.624.821; y documento WO 94/29351 en relación con otros ejemplos de variantes de la región Fc.
En determinados modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 comprende una mutación del sitio de aglucosilación. La mutación del sitio de aglucosilación puede ser una mutación por sustitución. La mutación del sitio de aglucosilación puede reducir la función efectora del anticuerpo anti-FcRH5, en comparación con una versión sin mutación, en al menos un 1 % (por ejemplo, un 2 %, un 3 %, un 4 %, un 5 %, un 6 %, un 7 %, un 8 %, un 9 %, un 10 %, un 20 %, un 30 %, un 40 %, un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 % o un 90 %) o más. En algunos casos, la mutación por sustitución está en el residuo aminoacídico N297, L234, L235, D265 y/o P329 (numeración EU). Adicionalmente, la mutación por sustitución se puede seleccionar del grupo que consiste en N297G, N297A, L234A, L235A, D265A y P329G. En casos particulares, la mutación por sustitución es una mutación N297G.
e. Variantes de botón y ojal
También se pueden producir variantes de botón y ojal de anticuerpos en los que una modificación aminoacídica (por ejemplo, una sustitución) de uno o más (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) residuos aminoacídicos crea una protuberancia (botón) o una cavidad (ojal). En algunos casos, la protuberancia localizada en un polipéptido del anticuerpo se puede posicionar dentro de la cavidad localizada en un segundo polipéptido del anticuerpo, de modo que los dos polipéptidos constituyentes del anticuerpo se puedan encontrar en una interfase entre la protuberancia y la cavidad. Se puede formar una protuberancia mediante la sustitución de uno o más residuos aminoacídicos por uno o más residuos aminoacídicos de mayor tamaño. Se puede formar una cavidad mediante la sustitución de uno o más residuos aminoacídicos por uno o más residuos aminoacídicos de tamaño más pequeño. La protuberancia o cavidad se puede introducir en cualquiera de los brazos de un anticuerpo anti-FcRH5 (por ejemplo, un TDB contra FcRH5 (por ejemplo, el brazo anti-FcRH5 o el brazo anti-CD3)). Las modificaciones de botón y ojal (por ejemplo, del dominio Fc) son, en particular, útiles para incrementar el rendimiento, la homogeneidad y la estabilidad totales de los anticuerpos biespecíficos (por ejemplo, TDB). En algunos casos (por ejemplo, cuando el par protuberanciacavidad se localiza en las interfases LC/HC (por ejemplo, VH y VL o CL y CH1)), las modificaciones de aminoácidos que introducen modificaciones de botón y ojal pueden reducir el intercambio de cadenas ligeras. En algunos modos de realización, la protuberancia se forma introduciendo una mutación T366W en un brazo de un anticuerpo anti-FcRH5 (por ejemplo, el brazo anti-FcRH5 o el brazo anti-CD3). En algunos modos de realización, la mutación T366W está en el brazo anti-FcRH5. En algunos modos de realización, la mutación T366W está en el brazo anti-CD3. En algunos modos de realización, se forma una cavidad introduciendo una mutación T366W, L368A y/o Y407Ven un brazo de un anticuerpo anti-FcRH5 (por ejemplo, el brazo anti-FcRH5 o el brazo anti-CD3). En algunos modos de realización, una mutación T366W, L368a , y/o Y407Vestá en el brazo anti-FcRH5. En algunos modos de realización, una mutación T366W, L368A, y/o Y407Vestá en el brazo anti-CD3.
Las técnicas para preparar anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen especificidades diferentes (véanse Milstein y Cuello, Nature 305:537 (1983)), documento WO 93/08829, y Traunecker et al., EMBO J. 10:3655 (1991)), y genomanipulación por "botón en ojal" (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.731.168). La genomanipulación de "botón en ojal" de anticuerpos multiespecíficos se puede utilizar para generar un primer brazo que contiene un botón y un segundo brazo que contiene el ojal al que se puede unir el botón del primer brazo. Por ejemplo, los anticuerpos TDB de la invención pueden contener un botón localizado en su brazo anti-CD3 y un ojal localizado en su brazo dirigido al tumor. De forma alternativa, los anticuerpos TDB de la invención pueden contener un botón localizado en su brazo dirigido al tumor y un ojal localizado en su brazo anti-CD3. Los anticuerpos multiespecíficos también se pueden genomanipular usando tecnología de cruce de inmunoglobulina (también conocida como intercambio de dominio Fab o formato CrossMab) (véase, por ejemplo, el documento WO2009/080253; Schaefer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108:11187-11192 (2011)). Los anticuerpos multiespecíficos también se pueden preparar genomanipulando los efectos de conducción electrostática para preparar moléculas heterodímeras de Fc de anticuerpos (documento WO 2009/089004A1); reticulando dos o más anticuerpos o fragmentos (véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.676.980, y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); usando cremalleras de leucina para producir anticuerpos biespecíficos (véanse, por ejemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); usando tecnología de "diacuerpos" para preparar fragmentos de anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); y usando dímeros de Fv monocatenarios (sFv) (véase, por ejemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); y preparando anticuerpos triespecíficos como se describe, por ejemplo, en Tutt et al. J. Immunol.
147:60 (1991).
f. Variantes de anticuerpo genomanipulado con cisteína
En determinados modos de realización, puede ser deseable crear anticuerpos genomanipulados con cisteína, por ejemplo, "thioMAb", en los que uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen por residuos de cisteína. En modos de realización particulares, los residuos sustituidos se producen en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir esos residuos por cisteína, los grupos tiol reactivos se sitúan, de este modo, en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo a otros restos, tales como restos de fármaco o restos de conector-fármaco, para crear un inmunoconjugado, como se describe además en el presente documento. En determinados modos de realización, se puede sustituir por cisteína uno cualquiera o más de los siguientes residuos: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fc con las cadenas pesadas. Se pueden generar anticuerpos genomanipulados con cisteína como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.521.541.
g. Derivados de otros anticuerpos
En determinados modos de realización, un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención (por ejemplo, anticuerpo anti-FcRH5 biespecífico de la invención que se une a FcRH5 y a una segunda molécula biológica, por ejemplo, CD3, tal como un anticuerpo TDB de la invención o una variante del mismo) proporcionado en el presente documento se puede modificar además para que contenga restos no proteínicos adicionales que se conocen en la técnica y están disponibles fácilmente. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitantes de polímeros hidrosolubles incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o bien copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(nvinilpirrolidona)/polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de poli(óxido de propileno)/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico) y mezclas de los mismos. El polietilenglicol-propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y, si se une más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, se puede determinar el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización en base a consideraciones que incluyen, pero sin limitarse a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se van a mejorar, independientemente de si el derivado de anticuerpo se usará en un tratamiento en condiciones definidas, etc.
En otro modo de realización, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y un resto no proteínico que se pueden calentar selectivamente por exposición a radiación. En un modo de realización, el resto no proteínico es un nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605, 2005). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, pero no se limita a, longitudes de onda que no dañan células normales, pero que calientan el resto no proteínico hasta una temperatura a la que las células próximas al anticuerpo-resto no proteínico se destruyen.
B. Composiciones y procedimientos recombinantes
Los anticuerpos anti-FcRH5 de la invención (por ejemplo, anticuerpos anti-FcRH5 biespecíficos de la invención que se unen a FcRH5 y a una segunda molécula biológica, por ejemplo, CD3, tales como anticuerpos TDB de la invención o variantes de los mismos) se pueden producir usando procedimientos y composiciones recombinantes, por ejemplo, como se describe en la patente de Ee . UU. n.° 4.816.567. En un modo de realización, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-FcRH5 descrito en el presente documento. En un modo de realización, la célula huésped es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO). En un modo de realización, la célula huésped es procariota, por ejemplo, una célula de E. coli. En un modo de realización, se proporciona un procedimiento de preparación de un anticuerpo anti-FcRH5, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, como se proporciona anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y, opcionalmente, recuperar el anticuerpo de la célula huésped (o medio de cultivo de células huésped). En otro modo de realización, el procedimiento comprende además cultivar una segunda célula huésped que comprende un segundo ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-CD3 que comprende un dominio de unión que se une a CD3. En algunos modos de realización, la célula huésped se cocultiva. Otro modo de realización comprende recuperar el anticuerpo anti-FcRH5 biespecífico de las células huésped o del medio de cultivo. En algunos modos de realización, los anticuerpos anti-FcRH5 y anti-CD3 se producen en la misma célula huésped (por ejemplo, un enfoque de una célula). En algunos modos de realización, los anticuerpos anti-FcRH5 y anti-CD3 se producen en células huésped separadas (por ejemplo, un enfoque de dos células).
En los enfoques de una célula y dos células, se introducen uno o más plásmidos que codifican el TDB contra FcRH5 (por ejemplo, un semianticuerpo contra FcRH5 y un semianticuerpo contra CD3) en una o más células huésped para el cultivo y la expresión del TDB. En un caso, un único plásmido puede codificar tanto el semianticuerpo contra FcRH5 como el semianticuerpo contra CD3. De forma alternativa, los semianticuerpos los pueden codificar plásmidos separados. En otro caso, la cadena pesada de cada semianticuerpo se codifica en un primer plásmido, mientras que la cadena ligera de cada semianticuerpo se codifica en un segundo plásmido. En el enfoque de una célula, el TDB contra FcRH5 se produce en un único huésped. En el enfoque de dos células, el TDB contra FcRH5 se produce expresando los semianticuerpos en huéspedes separados (por ejemplo, cultivos separados de las mismas células huésped o cultivos separados de diferentes células huésped). En el enfoque de dos células, los dos huéspedes se pueden cultivar en el mismo recipiente o en recipientes diferentes. Los dos cultivos huésped se pueden combinar antes de la lisis y la purificación del TDB contra FcRH5 o los dos semianticuerpos se pueden purificar por separado.
En algunos modos de realización, un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención (por ejemplo, un anticuerpo anti-FcRH5 biespecífico de la invención que se une a FcRH5 y a una segunda molécula biológica, por ejemplo, CD3, tal como un anticuerpo TDB contra FcRH5 de la invención) que se ha modificado para incluir modificaciones asimétricas (por ejemplo, mutaciones de los dominios CH1, CL y/o Fc descritos anteriormente) se produce usando un enfoque de una célula, lo que da como resultado un emparejamiento correcto mejorado de cadena pesada/cadena ligera y/o rendimiento mejorado del anticuerpo anti-FcRH5 en comparación con un anticuerpo anti-FcRH5 que no se ha modificado para que incluya las modificaciones asimétricas.
Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de vectores que codifican el anticuerpo incluyen las células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos en bacterias, en particular, cuando no se necesitan la glucosilación ni la función efectora de Fc. Para la expresión de los fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.648.237, 5.789.199 y 5.840.523 (véanse, por ejemplo, Charlton, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), págs. 245-254, que describen la expresión de los fragmentos de anticuerpo en E. coli.) Después de la expresión, se puede aislar el anticuerpo de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente.
Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como los hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican anticuerpos, incluyendo cepas de hongos y levaduras con vías de glucosilación que se han "humanizado", dando como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o totalmente humano. Véanse Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414, 2004, y Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215, 2006.
Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo glucosilado también derivan de organismos pluricelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus, que se pueden usar junto con células de insecto, en particular, para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.
También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).
También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas de células de mamífero que se adapten a su cultivo en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293, como se describe, por ejemplo, en Graham et al., J. Gen Virol. 36:59, 1977; células de riñón de cría de hámster (BHK); células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol. Reprod. 23:243-251, 1980); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA); células de riñón canino (MDCK); células de hígado de rata búfalo (BRL3A): células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); células de tumor mamario de ratón (MMT 060562); células TR1, como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68, 1982; células MRC-5; y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO DHFR' (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980); y líneas de células de mieloma, tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki et al. Methods in Molecular Biology, 248:255-268, 2003.
C. Ensayos
Los anticuerpos anti-FcRH5 (por ejemplo, anticuerpos anti-FcRH5 biespecíficos de la invención que se unen a FcRH5 y a una segunda molécula biológica, por ejemplo, CD3, tales como anticuerpos TDB de la invención o variantes de los mismos) se pueden identificar, cribar o caracterizar por sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas mediante diversos ensayos conocidos en la técnica.
1. Ensayos de unión y otros ensayos
En un aspecto, un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención se somete a prueba para determinar su actividad de unión a antígeno, por ejemplo, por procedimientos conocidos, tales como ELISA, inmunoelectrotransferencia, etc.
En otro aspecto, se pueden usar ensayos de competencia para identificar un anticuerpo que compite con un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención por su unión a FcRH5.
En un ensayo de competencia ejemplar, se incuba FcRH5 inmovilizada en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une a FcRH5 y un segundo anticuerpo no marcado que se somete a prueba para determinar su capacidad para competir con el primer anticuerpo por su unión a FcRH5. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, se incuba FcRH5 inmovilizada en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de la incubación en condiciones propicias para la unión del primer anticuerpo a FcRH5, se retira el exceso de anticuerpo no unido y se mide la cantidad de marcador asociado con FcRH5 inmovilizada. Si la cantidad de marcador asociado con FcRH5 inmovilizada se reduce sustancialmente en la muestra de prueba en relación con la muestra de control, entonces eso indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo por la unión a FcRH5. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual. Ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
2. Ensayos de actividad
En un aspecto se proporcionan ensayos para identificar anticuerpos anti-FcRH5 de los mismos que tienen actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, la unión a FcRH5, o a un fragmento peptídico del mismo, ya sea in vivo, in vitro o ex vivo. En el caso de un anticuerpo anti-FcRH5 multiespecífico (por ejemplo, biespecífico) de la invención (por ejemplo, un anticuerpo TDB que tiene un brazo anti-FcRH5 y un brazo que reconoce una segunda molécula biológica, por ejemplo, CD3), la actividad biológica también puede incluir, por ejemplo, activación de células efectoras (por ejemplo, activación de linfocitos T (por ejemplo, linfocitos T CD8+ y/o CD4+)), expansión de la población de células efectoras (es decir, un incremento en el recuento de linfocitos T), reducción de la población de células diana (es decir, una disminución en la población de células que expresan la segunda molécula biológica en sus superficies celulares) y/o destrucción de células dianas. Se proporcionan anticuerpos que tienen dicha actividad biológica in vivo y/o in vitro. En determinados modos de realización, se somete a prueba un anticuerpo de la invención para determinar dicha actividad biológica como se describe en detalle en los ejemplos del presente documento a continuación.
En algunos modos de realización, la actividad del anticuerpo anti-FcRH5 (por ejemplo, TDB contra FcRH5) comprende la capacidad de mantener la destrucción de linfocitos B y/o la activación de linfocitos T citotóxicos. En determinados modos de realización, un anticuerpo TDB contra FcRH5 de la invención se somete a prueba para determinar dicha destrucción de linfocitos B y/o activación del efecto citotóxico de la actividad biológica de linfocitos T mediante cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, en particular, los ejemplos. En algunos modos de realización de cualquiera de estos ensayos de actividad, las CMSP se pueden aislar de sangre completa de donantes sanos mediante separación por Ficoll. En particular, se puede extraer sangre humana en jeringuillas heparinizadas y las CMSP se aíslan usando Leucosep y Ficoll Paque Plus. Si fuera necesario, los linfocitos T<c>D4+ y T CD8+ se pueden separar con los kits de Miltenyi de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Además, las células se pueden lavar en medio RPMI que contiene FBS al 10 %, complementado con GlutaMax, penicilina y estreptomicina, y añadir ~0,2 millones de células suspendidas a una placa de fondo en U de 96 pocillos. Las células se pueden cultivar en RPMI1640 complementado con FBS al 10 % a 37 °C en una estufa de incubación para cultivos de células estándar humidificada. Para los ensayos de destrucción de células BJAB, se pueden incubar 20.000 células BJAB con células efectoras como huCMSP o linfocitos T purificados según las proporciones indicadas por ensayo, en presencia de diversas concentraciones de anticuerpos TDB durante 24 horas. Para los ensayos de destrucción de linfocitos B endógenos, se pueden incubar 200.000 huCMSP con diversas concentraciones de anticuerpos TDB durante 24 horas.
Después de su cultivo, se pueden lavar las células con tampón para FACS (BSA al 0,5 %, acida de Na al 0,05 % en PBS). A continuación, se pueden teñir las células en tampón para FACS, lavar con tampón para FACS y suspender en 100 |jl de tampón para FACS que contenga 1 |jg/ml de yoduro de propidio. Se pueden recoger los datos en un citómetro de flujo FACSCalibur y analizar usando FlowJo. Los linfocitos B vivos se pueden seleccionar como linfocitos B CD19+ negativos para IP o CD20+ negativos para IP mediante FACS, y se puede obtener un recuento de células absoluto con microesferas de FITC añadidas a la mezcla de reacción como control de recuento interno. El porcentaje (%) de destrucción de las células se puede calcular en base a controles no tratados con TDB. Los linfocitos T activados se pueden detectar mediante expresión en la superficie de CD69 y CD25 usando anti-CD69-FITC y anti-CD25-PE.
D. Inmunoconjugados
La invención también proporciona inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención, por ejemplo, un anticuerpo anti-FcRH5 multiespecífico, por ejemplo, un TDB contra FcRH5 descrito en el presente documento conjugado a uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes o fármacos quimioterápicos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal o fragmentos de las mismas) o isótopos radioactivos.
En un modo de realización, un inmunoconjugado es un conjugado anticuerpo-fármaco (CAF) en el que un anticuerpo se conjuga a uno o más fármacos, que incluyen, pero no se limitan a, un maitansinoide (véanse las patentes de EE. UU. n.° 5.208.020, 5.416.064 y la patente europea EP 0425 235 B1); una auristatina, tal como los restos del fármaco monometilauristatina DE y Df (MMAE y MMAF) (véanse las patentes de EE. UU. n^ 5.635.483 y 5.780.588 y 7.498.298); una dolastatina; una caliqueamicina o derivado de la misma (véanse las patentes de EE. UU. n^ 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001 y 5.877.296; Hinman et al., Cáncer Res. 53:3336-3342,1993; y Lode et al., Cáncer Res. 58:2925-2928, 1998); una antraciclina, tal como daunomicina o doxorrubicina (véanse Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523, 2006; Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362, 2006; Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721, 2005; Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834, 2000; Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532, 2002; King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343, 2002; y la patente de EE. UU. n.° 6.630.579); metotrexato; vindesina; un taxano, tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel y ortataxel; un tricoteceno; y CC1065.
En otro modo de realización, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo anti-FcRH5 (por ejemplo, un anticuerpo anti-FcRH5 multiespecífico, por ejemplo, un t Db contra FcRH5) como se describe en el presente documento conjugado a una toxina enzimáticamente activa o fragmento de la misma, incluyendo, pero sin limitarse a, cadena A de difteria, fragmentos activos que no se unen de la toxina diftérica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos.
En otro modo de realización, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo anti-FcRH5 (por ejemplo, un anticuerpo anti-FcRH5 multiespecífico, por ejemplo un TDB contra FcRH5) descrito en el presente documento conjugado con un átomo radiactivo para formar un radioconjugado. Una variedad de isótopos radiactivos están disponibles para la producción de radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212,<p>32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando se usa el radioconjugado para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios gammagráficos, por ejemplo, tc99m o I123, o un marcador de espín para resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como resonancia magnética, RM), tal como yodo-123, de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.
Los conjugados de un anticuerpo y un agente citotóxico se pueden preparar usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometilo) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis-(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno-2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098, 1987. El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionúclido al anticuerpo. Véase el documento WO94/11026. El conector puede ser un "conector escindible" que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede usar un conector lábil en ácido, conector sensible a peptidasa, conector fotolábil, conector de dimetilo o conector que contiene disulfuro (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131, 1992; patente de EE. UU. n.° 5.208.020).
Los inmunoconjugados o CAF en el presente documento contemplan expresamente, pero no se limitan a, dichos conjugados preparados con reactivos de reticulación, incluyendo, pero sin limitarse a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB, y SVSB ((4-vinilsulfona)benzoato de succinimidilo), que están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, EE. UU.).
E. Formulaciones farmacéuticas
Las formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención (por ejemplo, un anticuerpo anti-FcRH5 biespecífico de la invención que se une a FcRH5 y a una segunda molécula biológica, por ejemplo, CD3, por ejemplo, un TDB contra FcRH5) se preparan mezclando dicho anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con uno o más vehículos, tampones, estabilizadores y/o conservantes farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edición, Osol, A. Ed. (1980)),- en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos farmacéuticamente aceptables, en general, no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína) y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Los vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares en el presente documento incluyen además agentes de dispersión intersticial de fármacos, tales como glucoproteínas de hialuronidasa activa a pH neutro soluble (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas de hialuronidasa PH-20 soluble humana, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinadas sHASEGP ejemplares y procedimientos de uso, incluyendo rHuPH20, se describen en las publicaciones de patente de EE. UU. n.° 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glucosaminoglucanasas adicionales tales como condroitinasas.
Se describen formulaciones de anticuerpo liofilizadas ejemplares en la patente de EE. UU. n.° 6.267.958. Las formulaciones de anticuerpos acuosas incluyen las descritas en la patente de EE. UU. n.° 6.171.586 y el documento WO2006/044908, incluyendo estas últimas formulaciones un tampón acetato-histidina.
La formulación en el presente documento también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se vean afectadas de forma adversa entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar además un agente terapéutico adicional (por ejemplo, un agente quimioterápico, un agente citotóxico, un agente inhibidor del crecimiento y/o un agente antihormonal, tales como los enumerados en el presente documento anteriormente). Dichos ingredientes activos están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito previsto.
Se pueden atrapar ingredientes activos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metacilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edición, Osol, A. Ed. (1980).
En algunos casos, la composición puede comprender un antagonista de unión al eje PD-1 y/o un agente terapéutico adicional. Por ejemplo, el antagonista de unión al eje PD-1 se puede seleccionar del consistente de MPDL3280A (atezolizumab), YW243.55.S70, MDX-1105, MEDI473 (durvalumab) y MSB0010718C (avelumab), MDX 1106 (nivolumab), MK-3475 (pembrolizumab), CT-011 (pidilizumab), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001, REGN2810y BGB-108. Adicionalmente, una composición que comprende un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención (por ejemplo, un TDB contra FcRH5) puede comprender un corticoide, un inmunomodulador (IMiD), un inhibidor del proteosoma (IP) o una combinación de los mismos.
Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas.
Las formulaciones que se van a usar para su administración in vivo son en general estériles. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.
F. Composiciones y procedimientos terapéuticos
Cualquiera de los anticuerpos anti-FcRH5 de la invención (por ejemplo, anticuerpos anti-FcRH5 biespecíficos de la invención que se unen a FcRH5 y a una segunda molécula biológica, por ejemplo, CD3, por ejemplo, un TDB contra FcRH5) se puede usar en procedimientos terapéuticos.
En un aspecto se proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 para su uso como medicamento. En otros aspectos, se proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 para su uso en el tratamiento o retraso de la progresión de un trastorno proliferativo celular (por ejemplo, cáncer, por ejemplo, un cáncer positivo para FcRH5, por ejemplo, mieloma múltiple (MM)) y/o mejorar una función inmunitaria en un individuo. En determinados modos de realización se proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 para su uso en un procedimiento de tratamiento. En determinados modos de realización, se proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 para su uso en un procedimiento de tratamiento de un individuo que tiene un trastorno proliferativo celular (por ejemplo, cáncer, por ejemplo, un cáncer positivo para FcRH5, por ejemplo, MM) que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-FcRH5. En un modo de realización de este tipo, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.
En otros modos de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 para su uso para potenciar la función inmunitaria en un individuo que tiene un trastorno proliferativo celular, tal como un cáncer positivo para FcRH5 (por ejemplo, MM). En determinados modos de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 para su uso en un procedimiento para potenciar la función inmunitaria en un individuo que tiene un trastorno proliferativo celular que comprende administrar al individuo un anticuerpo anti-FcRH5 eficaz para activar células efectoras (por ejemplo, linfocitos T, por ejemplo, linfocitos T CD8+ y/o CD4+) que pueden ejercer un efecto citotóxico y/o apoptótico en las células diana (por ejemplo, una célula que expresa una segunda molécula biológica reconocida por anticuerpo anti-FcRH5 de la invención, tal como un anticuerpo TDB contra FcRH5 de la invención) en un individuo. El anticuerpo anti-FcRH5 se puede unir tanto a una molécula de FcRH5 localizada en una célula diana como a una molécula de CD3 localizada en una célula efectora inmunitaria. La célula diana puede ser una célula plasmática, tal como una célula plasmática de vida larga o corta. Adicionalmente, la célula diana puede ser una célula de mieloma. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un ser humano.
En otro aspecto, se proporciona el uso de un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención en la fabricación o preparación de un medicamento. En un modo de realización, el medicamento es para el tratamiento de un trastorno proliferativo celular (por ejemplo, cáncer, por ejemplo, un cáncer positivo para FcRH5, por ejemplo, MM). En otro modo de realización, el medicamento es para su uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno proliferativo celular, que comprende administrar a un individuo que tiene un trastorno proliferativo celular o una cantidad eficaz del medicamento. En un modo de realización de este tipo, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.
En otro modo de realización, el medicamento es para activar células efectoras que activan células efectoras (por ejemplo, linfocitos T, por ejemplo, linfocitos T CD8+ y/o CD4+) que pueden ejercer un efecto citotóxico y/o apoptótico en células diana (por ejemplo, una célula que expresa una segunda molécula biológica reconocida por un anticuerpo anti-FcRH5 de la invención, tal como un anticuerpo TDB contra FcRH5 de la invención) en un individuo. En otro modo de realización, el medicamento es para su uso en un procedimiento para potenciar la función inmunitaria en un individuo que tiene un trastorno proliferativo celular que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para activar células efectoras (por ejemplo, linfocitos T, por ejemplo, linfocitos T CD8+ y/o CD4+), expandir (incrementar) una población de células efectoras, reducir una población de células dianas (por ejemplo, una célula que expresa una segunda molécula biológica reconocida por anticuerpo anti-FcRH5 de la invención, tal como un anticuerpo TDB contra FcRH5 de la invención) y/o destruir una célula diana (por ejemplo, una célula tumoral diana). Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un ser humano.
En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para tratar un trastorno proliferativo celular (por ejemplo, cáncer). El cáncer positivo para FcRH5 puede ser un cáncer de linfocitos B. En algunos casos, el cáncer de linfocitos B puede ser mieloma múltiple (m M), leucemia linfocítica crónica (LLC), linfoma de células del manto (LCM), linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG) y/o linfoma folicular (LF). En casos particulares, el cáncer de linfocitos B es MM. En otros casos, el cáncer positivo para FcRH5 es un cáncer de linfocitos B. El procedimiento puede comprender administrar a un individuo que tiene dicho trastorno proliferativo celular (por ejemplo, cáncer, por ejemplo, cáncer positivo para FcRH5, por ejemplo, mieloma múltiple (MM)) una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-FcRH5. En un modo de realización de este tipo, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un ser humano.
Los anticuerpos de la invención se pueden usar solos o bien en combinación con otros agentes en un tratamiento. Por ejemplo, se puede coadministrar un anticuerpo de la invención con al menos un agente terapéutico adicional. En determinados modos de realización, un agente terapéutico adicional es un antagonista de unión al eje PD-1 tal como MPDL3280A (atezolizumab), MDX-1105, MEDI473 (durvalumab) y MSB0010718C (avelumab), MDX 1106 (nivolumab), MK-3475 (pembrolizumab) CT-011 (pidilizumab), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001 y/o REGN2810. Adicionalmente, también se puede administrar a un sujeto un corticoide, un inmunomodulador (IMiD), un inhibidor del proteosoma (IP) o una combinación de los mismos a un sujeto. En un modo de realización, el glucocorticoide es dexametasona. En algunos modos de realización, el IMiD es lenalidomida. En algunos modos de realización, el IP es bortezomib.
Dichas politerapias indicadas anteriormente engloban la administración combinada (donde se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma formulación o en formulaciones separadas) y la administración separada, caso en el que la administración del anticuerpo de la invención se puede producir antes de, simultáneamente a y/o después de la administración del agente o agentes terapéutico(s) adicional(es). En un modo de realización, la administración del anticuerpo anti-FcRH5 y la administración de un agente terapéutico adicional se producen en aproximadamente un mes, o en aproximadamente una, dos o tres semanas, o en aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis días, entre sí.
Un anticuerpo de la invención (y/o cualquier agente terapéutico adicional) se puede administrar por cualquier medio adecuado, incluyendo por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, tópica, oral, transdérmica, intraperitoneal, intraorbitaria, por implantación, por inhalación, intratecal, intraventricular o intranasal. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. En el presente documento se contemplan diversas pautas posológicas incluyendo, pero sin limitarse a, administraciones individuales o múltiples durante diversos puntos temporales, administración en bolo e infusión pulsada.
Los anticuerpos de la invención se formularán, dosificarán y administrarán de forma consecuente con las buenas prácticas médicas. Los factores para su consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, la pauta de administración y otros factores conocidos por los médicos. No es necesario, pero el anticuerpo se formula opcionalmente con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores analizados anteriormente. Estos se usan en general en las mismas dosificaciones y con las vías de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine empíricamente/clínicamente que es apropiada.
Para la prevención o tratamiento de la enfermedad (por ejemplo, trastorno proliferativo celular, por ejemplo, cáncer, por ejemplo, cáncer positivo para FcRH5, por ejemplo, MM), la dosificación apropiada de un anticuerpo de la invención (cuando se usa solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, el tipo de anticuerpo, la gravedad y evolución de la enfermedad, si se administra el anticuerpo con propósitos preventivos o terapéuticos, tratamiento previo, anamnesis del paciente y respuesta al anticuerpo y el criterio del médico especialista. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente una vez o durante una serie de tratamientos.
Como una propuesta general, la cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-FcRH5 administrada a un ser humano estará en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal del paciente, ya sea mediante una o más administraciones. En algunos modos de realización, el anticuerpo usado es de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 55 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 25 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 15 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 mg/kg o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1 mg/kg administrados diariamente, por ejemplo. En un modo de realización, un anticuerpo anti-FcRH5 descrito en el presente documento se administra a un ser humano a una dosis de aproximadamente 100 mg, aproximadamente 200 mg, aproximadamente 300 mg, aproximadamente 400 mg aproximadamente 500 mg, aproximadamente 600 mg, aproximadamente 700 mg, aproximadamente 800 mg, aproximadamente 900 mg, aproximadamente 1000 mg, aproximadamente 1100 mg, aproximadamente 1200 mg, aproximadamente 1300 mg o aproximadamente 1400 mg el día 1 de ciclos de 21 días. La dosis se puede administrar como una dosis única o como dosis múltiples (por ejemplo, 2 o 3 dosis), tal como infusiones. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento en general se mantendría hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Una dosificación ejemplar del anticuerpo estaría en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Por tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). En algunos modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 se administra a una dosificación de aproximadamente 0,01 mg/kg/semana a aproximadamente 10 mg/kg/semana. En otros modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 se administra a una dosificación de 0,1 mg/kg/semana a aproximadamente 10 mg/kg/semana. En otros modos de realización, el anticuerpo anti-FcRH5 se administra a una dosificación de aproximadamente 1 mg/kg/semana.
Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o, por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo anti-FcRH5). Se puede administrar una dosis de carga inicial mayor, seguido de una o más dosis menores. La progresión de este tratamiento se sigue fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.
En algunos modos de realización, los procedimientos pueden comprender además un tratamiento adicional. El tratamiento adicional puede ser radioterapia, cirugía, quimioterapia, tratamiento génico, tratamiento con ADN, tratamiento vírico, tratamiento con ARN, inmunoterapia, trasplante de médula ósea, nanoterapia, tratamiento con anticuerpos monoclonales o una combinación de los anteriores. El tratamiento adicional puede ser en forma de tratamiento adyuvante o neoadyuvante. En algunos modos de realización, el tratamiento adicional es la administración de un inhibidor enzimático de moléculas pequeñas o agente antimetastático. En algunos modos de realización, el tratamiento adicional es la administración de agentes limitantes de efectos secundarios (por ejemplo, agentes destinados a disminuir la aparición y/o la gravedad de los efectos secundarios del tratamiento, tales como agentes antieméticos, etc.). En algunos modos de realización, el tratamiento adicional es radioterapia. En algunos modos de realización, el tratamiento adicional es cirugía. En algunos modos de realización, el tratamiento adicional es una combinación de radioterapia y cirugía. En algunos modos de realización, el tratamiento adicional es irradiación gamma. En algunos modos de realización, el tratamiento adicional puede ser una administración separada de uno o más de los agentes terapéuticos descritos anteriormente.
G. Composiciones y procedimientos para diagnóstico y detección
En determinados modos de realización, cualquiera de los anticuerpos anti-FcRH5 de la invención es útil para detectar la presencia de FcRH5 en una muestra biológica. El término "detectar", como se usa en el presente documento, engloba la detección cuantitativa o cualitativa. En determinados modos de realización, una muestra biológica comprende una célula o tejido.
En un modo de realización se proporciona un anticuerpo anti-FcRH5 para su uso en un procedimiento de diagnóstico o detección. En otro aspecto se proporciona un procedimiento de detección de la presencia de FcRH5 natural en una muestra biológica. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-FcRH5 como se describe en el presente documento en condiciones propicias para la unión del anticuerpo anti-FcRH5 a FcRH5 natural, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-FcRH5 y FcRH5 natural. Dicho procedimiento puede ser un procedimiento in vitro o in vivo. En algunos casos, la muestra biológica es una muestra de sangre. En algunos casos, el sujeto es un ser humano.
En determinados modos de realización, se proporcionan anticuerpos anti-FcRH5 marcados. Los marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores o restos que se detectan directamente (tales como marcadores fluorescentes, cromóforos, electrodensos, quimioluminiscentes y radioactivos), así como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente de EE. UU. n.° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalacinodionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, pgalactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables y similares.
H. Artícu los de fabricación
En otro aspecto, la invención presenta un artículo de fabricación que contiene un anticuerpo de la invención y, por tanto, materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de trastornos proliferativos celulares (por ejemplo, cáncer, por ejemplo, un cáncer positivo para FcRH5, por ejemplo, mieloma múltiple (MM)) en un sujeto (por ejemplo, un ser humano). El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución i.v., etc. Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que por sí misma o combinada con otra composición es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y que puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de la invención. La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un agente citotóxico o de otro modo terapéutico adicional. El artículo de fabricación en este modo de realización de la invención puede comprender además un prospecto del envase que indique que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular. De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas. En algunos casos, el kit incluye un prospecto del envase que contiene instrucciones para usar el anticuerpo para tratar o retrasar la progresión de un cáncer positivo para FcRH5 (por ejemplo, MM) en un sujeto. En otros casos, el kit incluye un prospecto del envase que comprende instrucciones para usar el anticuerpo para potenciar la función inmunitaria en un sujeto que tiene un cáncer positivo para FcRH5 (por ejemplo, MM).
MI. Ejemplos
Ejemplo 1. Generación de anticuerpos anti-FcRH5
Inmunizaciones y cribado
Se inmunizaron ratones BALB/c (Charles River, Hollister, CA) con 2 |jg, 10 |jg o 100 |jg/inyección por ratón. Los antígenos se suspendieron en adyuvante de monofosforil lípido A (MPL)/dicorinomicolato de trehalosa (TDM) (Ribi) o adyuvante de Freund y se inyectaron en la almohadilla plantar, el peritoneo o la base de la cola de cada animal inmunizado. Los ratones recibieron un total de 9 a 18 dosis y de 1 a 2 refuerzos de prefusión en PBS solo por medio de la almohadilla plantar, por vía intraperitoneal (i.p.) y/o vía del corvejón de 2 a 4 días antes de la fusión. La campaña de inmunización A, descrita en la publicación de EE. UU. n.° 2015/0098900, produjo el anticuerpo anti-FcRH5 original 1G7, que se optimiza y caracteriza adicionalmente en el presente documento.
A. Campaña de inmunización B
Para producir anticuerpos específicos de la isoforma para el dominio Ig proximal a la membrana de FcRH5, se inmunizaron ratones con proteína E11 (aminoácidos 745-850 de SEQ ID NO: 114) con una marca de expresión de His N terminal que se expresó en células CHO. Se inmunizaron cinco ratones con 10 μg de proteína E11 marcada con His en adyuvante Ribi por vía i.p. Los ratones recibieron 18 dosis seguidas de dos refuerzos de prefusión en PBS solo a través de la vía i.p. siete y cuatro días antes de la fusión. Después de 18 dosis de la proteína E11 recombinante, se analizó el suero para detectar anticuerpos que se unen a FcRH5 usando FACS y mediante valoración en ELISA usando E11 como antígeno. Se detectó una reactividad significativa para las células SVT2 que expresaban FcRH5 humana de longitud completa, FcRH5 de cyno de longitud completa o proteína E11, pero no células SVT2 transfectadas con vector, lo que indica que los anticuerpos de unión a FcRH5 estaban presentes en los sueros de los cinco ratones inmunizados. Después de 20 dosis, los linfocitos de los ratones inmunizados se sometieron a electrofusión con células de mieloma de ratón P3X63Ag8U.1.22.
Se sometió a prueba la unión de los clones a proteínas recombinantes E11 humanas y de cyno mediante ELISA. Ocho clones que tenían reactividad cruzada tanto con FcRH5 humana como de cyno en ELISA se sometieron a prueba para determinar la unión a células SVT2 que expresaban FcRH5 humana de longitud completa, FcRH5 de cyno de longitud completa o proteína E11 mediante FACS. Los ocho clones se unieron a células SVT2 que expresaban el dominio de E11 humana, el dominio transmembrana y dominios citoplásmicos.
Para someter a prueba la unión a células cancerosas que expresan endógenamente FcRH5 o que se transfectaron con FcRH5, se levantaron las células usando EDTA/PBS y se suspendieron 1 x 105 células en 100 pl y se incubaron con anticuerpos primarios (1 volumen de sobrenadante de subclon cuantificado sin IgG, 4 μg/ml de sobrenadante de subclon cuantificado con IgG o 2 μg/ul de anticuerpos monoclonales purificados). Se lavaron las células dos veces con tampón FACS (PBS, BSA al 1 %, EDTA 2 mM) y se incubaron con una dilución 1:1000 de anticuerpo anti-ratón caprino secundario marcado con PE o 1:100 de APC anti-ratón caprino. Se lavaron las células dos veces con tampón FACS y se realizó un análisis de citometría de flujo en un FACSCalibur. El marcado directo con xenón de los anticuerpos se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen), según estuviera indicado. Sin embargo, solo tres de los clones se unieron a células que expresaban FcRH5 humana de longitud completa y ninguno se unió a células que expresaban FcRH5 de cyno de longitud completa (tabla 2).
TABLA 2. Unión de AcM de la campaña de inmunización B en FACS a células que sobreexpresan FcRHI, 2, 3, 4 y 5 humanas, dom inio de E11 humana y FcRH5 de macaco cangrejero
* Dominio de E11, dominio transmembrana y dominios citoplasmáticos de FcRH5 humana
B. Campaña de inmunización y caracterización de AcM C
Para la campaña de inmunización C, se produjo proteína E11 marcada con His N terminal en células CHO. Los ratones se inmunizaron con una inyección inicial de 100 μg de proteína E11 en adyuvante completo de Freund en la base de la cola. Los ratones recibieron un total de 17 dosis, seguidas de un refuerzo de prefusión en PBS solo a través de las vías i.p. y en el corvejón dos días antes de la fusión (tabla 3).
TABLA 3. Pauta de inmunización para la campaña de inmunización C
Después de 15 dosis de la proteína E11 recombinante seguidas de inyecciones conjuntas de las proteínas E11 recombinante humana y de cyno, se analizó el suero para detectar anticuerpos que se unen a FcRH5 usando FACS y mediante valoración en ELISA usando la proteína E11 como antígeno. Se detectó una reactividad significativa para las células SVT2 que expresaban FcRH5 humana de longitud completa, FcRH5 de cyno de longitud completa o el dominio de E11 humana, dominio transmembrana y dominios citoplasmáticos, pero no células SVT2 transfectadas con vector, lo que indica que los anticuerpos de unión a FcRH5 estaban presentes en los sueros de los cinco ratones inmunizados. Después del refuerzo final en PBS, los linfocitos de los ratones inmunizados se sometieron a electrofusión con células de mieloma de ratón P3X63Ag8U.1.22.
Se sometió a prueba la unión de los clones a proteínas E11 recombinantes humanas y de cyno y la unión a células SVT2 que expresaban FcRH5 humana de longitud completa; FcRH5 de cyno de longitud completa; FcRH1, FcRH2, FcRH3 o FcRH4 humanas de longitud completa; o dominio de E11 humana, dominio transmembrana y dominios citoplasmáticos de FcRH5 por FACS. Hubo 44 clones positivos para la proteína E11 humana y 32 clones positivos para la proteína E11 de cyno en ELISA. De ellos, se identificaron un total de 16 clones que se unieron a células que expresaban FcRH5 humana y células que expresaban FcRH5 de cyno, pero no células que expresaban FcRH1, FcRH2, FcRH3 o FcRH4, lo que indica reactividad específica entre especies de FcRH5 (tabla 4).
TABLA 4. Propiedades de unión de anticuerpos monoclonales obtenidos de la campaña de inmunización C
* Dominio de E11, dominio transmembrana y dominios citoplasmáticos de FcRH5 humana.
§ Resonancia de plasmón superficial BIACORE® KD, afinidad monovalente. Los experimentos con el dominio de E11 humana se realizaron de 1 a 3 veces y se promediaron. Los experimentos con el dominio de E11 de cyno se realizaron una vez para cada anticuerpo.
No se obtuvieron clones recombinantes para el anticuerpo 23E2.
La IgG purificada de los 16 clones de anticuerpos monoclonales (AcM) seleccionados se caracterizó adicionalmente por su unión a células que expresan FcRH5 humana de forma endógena (células MOLP-2). Se demostró que un total de ocho clones de AcM se unían a las células de mieloma MOLP-2. Se descubrió que dos de estos ocho clones de AcM eran redundantes en base al análisis de secuencia y uno no se clonó molecularmente. Los seis clones de AcM positivos para MOLP-2 clonados molecularmente se expresaron de forma recombinante como IgG2a murina y se sometieron a prueba para determinar la afinidad mediante resonancia de plasmón superficial en un aparato BIACORE® T200 en un formato de captura de IgG.
En resumen, se capturaron los anticuerpos de prueba en las cubetas de lectura 2, 3 o 4, con la cubeta de lectura 1 como referencia en un chip CM5 de proteína A Serie S (GE Life Sciences, Piscataway, NJ). Se usó como analito un fragmento de proteína FcRH5, con un caudal de 30 |jl/minuto. Entre inyecciones, la superficie de captura se regeneró mediante una inyección de 30 segundos de glicina 10 mM, pH 1,5 a un caudal de 10 jl/minuto. Se evaluaron las interacciones a 25 °C en HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,05 % (HBSP). Los datos de referencia de la cubeta de lectura de referencia y de la inyección de tampón solo se restaron antes del análisis cinético. La información cinética se calculó ajustando los datos a un modelo de unión 1:1. La resta de referencia y el ajuste de datos se realizaron usando el programa informático BIAe Evaluation (GE Life Sciences, Piscataway, NJ).
Las afinidades monovalentes de estos anticuerpos por el dominio de E11 humana variaron entre 0,5 nM y 68 nM, mientras que las afinidades por el dominio de E11 de macaco cangrejero variaron entre 9,1 nM y 338 nM (tabla 4). Solo un clon tenía una afinidad por el dominio de E11 humana que fue superior a la del anticuerpo 1G7, AcM 15G8. Sin embargo, la diferencia de Kd entre los dominios de E11 humana y de macaco cangrejero fue de aproximadamente 20 veces, lo que hizo que este clon no fuera adecuado para un desarrollo clínico posterior. Además, a pesar de la alta afinidad de este clon de anticuerpo por el dominio de E11 humana aislado, la unión de este clon de anticuerpo a las células MOLP-2 fue muy débil; era más débil que la de los clones con afinidades más bajas por el dominio de E11 humana aislado, lo que indica que este clon no se unía bien a la proteína FcRH5 humana natural.
Ejemplo 2. Generación y caracterización de variantes de anticuerpos anti-FcRH5 de las campañas de inmunización A y C
A. Humanización de anticuerpos monoclonales anti-FcRH5 de la campaña de inmunización A
El anticuerpo anti-FcRH5 1G7 de la campaña de inmunización A, descrito en la publicación de EE. UU. n.° 2015/0098900, se humanizó mediante el procedimiento de injerto HVR como se describe previamente (Presta et al., Cáncer Res. 57:4593-4599, 1997), excepto que las regiones estructurales consenso VH4 y V<k>1 (Dennis, Current Trends in Monoclonal Ant. Develop, and Manufac. 9-28, 2010) se usaron como regiones estructurales aceptadoras. El injerto de cadena pesada también incluía residuos murinos en las posiciones estructurales de Kabat 37, 48, 67, 71, 73, 78, 93 y 94, y el injerto de cadena ligera también incluía residuos murinos en las posiciones estructurales 36 y 43 para una apropiada presentación de HVR y contacto de dominio VH/VL. Los números de los residuos son de acuerdo con Kabat et al. (Sequences of proteins of immunological interest, 5.a edición., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). La secuencia de 1G7 humanizado, denominada en el presente documento hu1G7.v1 o 1G7.v1, se muestra en las figs. 2 y 3.
B. Maduración de afinidad y caracterización de variantes hu1G7.v1
Para potenciar la potencia, el anticuerpo humanizado hu1G7.v1 se maduró en afinidad usando la presentación en fagos. En resumen, se exhibieron colecciones aleatorias del fragmento de anticuerpo Fab en la superficie del bacteriófago M13 y se analizaron en busca de proteínas de unión para el fragmento de proteína FcRH5 biotinilado. Se identificaron las mutaciones favorecidas mediante secuenciación de ADN de clones individuales. Se postuló que estas mutaciones favorecidas daban lugar a variantes con afinidad mejorada (Li et al., MAbs. 6:437-445, 2014). Se sometió a prueba la afinidad de los clones de anticuerpos con mutaciones seleccionadas mediante resonancia de plasmón superficial (tablas 5A y 5B).
En resumen, se generó una superficie de captura de IgG humana en un chip CM5 Serie S usando acoplamiento de amina y el kit de captura de IgG humana (GE Life Sciences, Piscataway, NJ). A continuación, se capturaron los anticuerpos de prueba en las cubetas de lectura 2, 3 o 4, con la cubeta de lectura 1 usada como referencia. Se usó como analito un fragmento de proteína FcRH5, con un caudal de >30 jl/minuto. Entre inyecciones, la superficie de captura se regeneró mediante una inyección de 30 segundos de cloruro de magnesio 3 M o glicina 10 mM, pH 1,5. Se evaluaron las interacciones a 25 °C en HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM y Tween 20 al 0,05 % (HBSP). Los datos de referencia de la cubeta de lectura de referencia y de la inyección de tampón solo se restaron antes del análisis cinético. La información cinética se calculó ajustando los datos a un modelo de unión 1:1. La resta de referencia y el ajuste de datos se realizaron usando el programa informático BIAe Evaluation (GE Life Sciences, Piscataway, NJ).
Para los experimentos iniciales de cribado de afinidad, se capturaron los anticuerpos directamente de los medios de cultivo clarificados recogidos después de la transfección transitoria de células Expi293 (Invitrogen) (tablas 5A-5B). La capacidad de cada anticuerpo para unirse a un fragmento de proteína FcRH5 se evaluó a 100 nM y 500 nM (Expt. 1, tablas 5A-5B) o 0 nM, 20 nM, 100 nM y 500 nM (Expt. 2, tablas 5A-5B). La asociación y la disociación se monitorizaron a un caudal de 30 jl/min, durante 180 s y 600 s, respectivamente. Todas las secuencias presentes dentro de la tabla 5A se divulgan en SEQ ID NO: 4-6 (es decir, el amplio consenso de FcRH5 L1, L2, L3). Todas las secuencias presentes en la tabla 5B se divulgan en SEQ ID NO: 1-3 (es decir, el amplio consenso de FcRH5 H1, H2, H3). Se observaron mejoras de afinidad de hasta 5,2 veces (tabla 5A). Como cada mutación individual no proporcionó las mejoras buscadas, se decidió combinar varias mutaciones concentrándose en las mutaciones de VL S30R, I32L, A51G, S52Y, Y53N, T56S, H91Q, Y92F, S93Q y S94P y las mutaciones de VH S28K, L29T y S56T.
TABLA 5A. Cribado de afinidad de anticuerpos seleccionados
TABLA 5B. Cribado de afinidad de anticuerpos seleccionados
Las colecciones de presentación en fagos de anticuerpos se diseñaron usando mutagénesis dirigida al sitio tanto dura como blanda. Las colecciones L188 y L189 usaron mutagénesis blanda para mutar los residuos de VL 27-34, 50-56, 91-94 y 96 (L188) o los residuos de VH 28-35, 50-58 y 95-100d (L189). En las posiciones de mutagénesis, los oligonucleótidos de mutagénesis blanda utilizaron el 91 % del nucleótido que codifica el original y el 3 % de cada uno de los otros nucleótidos. Las colecciones L190 y L191 usaron mutagénesis dura (codones NNK) para mutar los residuos de VL 27-34, 50-56 y 89-96 (L190) o los residuos de VH 28-35, 50-58 y 95-100d (L191), un codón a la vez, con hasta tres HVR mutadas simultáneamente (Li et al., MAbs. 6:437-445, 2014).
Se realizaron hasta cuatro rondas de selección para la unión al fragmento de proteína FcRH5. Las selecciones se realizaron tanto en fase sólida (proteína diana adsorbida directamente en microplacas) como en solución. Para las selecciones en solución, se usó proteína diana biotinilada para permitir la captura de complejos fago-anticuerpodiana. Los clones con mutaciones seleccionadas se expresaron en células Expi293 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) y los sobrenadantes se cribaron mediante resonancia de plasmón superficial.
Se generaron colecciones de presentación en fagos de anticuerpos mediante mutagénesis de Kunkel (Kunkel et al., Methods in Enzymology, 154:367-382, 1987) usando como molde ADN monocatenario producido en bacterias CJ236 y purificado usando el kit Qiagen QIAprep Spin M13 (QIAGEN, Inc., Valencia, CA). El ADN molde para las colecciones de maduración de afinidad inicial contenía codones de terminación en aquellas HVR seleccionadas para mutagénesis; el ADN molde para la colección de fagos "específica" posterior que se describe a continuación no utilizó codones de terminación de HVR molde. A menos que se establezca de otro modo, los residuos en las regiones variables del anticuerpo se numeran de acuerdo con el sistema de Kabat. Las enzimas se adquirieron de New England Biolabs (Ipswich, MA). Las reacciones de mutagénesis de Kunkel se limpiaron usando minicolumnas giratorias QIAprep (QIAGEN, Inc., Valencia, CA) y se transformaron en XLI Blue E. coli (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) mediante electroporación. Después de la recuperación en medio SOC a 37 °C, se infectaron los cultivos con fagos auxiliares y se incubaron a 37 °C durante 0,5-2 horas adicionales antes de añadir los antibióticos carbenicilina y kanamicina. A continuación, se incubaron los cultivos a 37 °C durante 4-5 horas adicionales, seguido de una incubación adicional durante la noche a 30 °C. Se purificaron los bacteriófagos a partir del medio de cultivo clarificado mediante precipitación con aproximadamente 1/6 del volumen de reactivo de precipitación (PEG al 20 %, cloruro sódico 2,5 M). Se sedimentaron los fagos precipitados mediante centrifugación y se solubilizaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se aclaró adicionalmente la solución por centrifugación a 14.000 g. Se almacenaron los fagos purificados en glicerol al 50 % en un congelador a -20 °C y se volvieron a solubilizar en PBS antes de su uso.
En un enfoque de diseño racional, se combinaron seis mutaciones de VL identificadas a partir de los experimentos con fagos (S30R, I32L, A51G, T56S, H91Q y S94P) con la mutación de humanización de VL adicional S43A y se evaluaron en pares para evaluar la compatibilidad (tabla 6). Para la evaluación de la compatibilidad de las mutaciones de VL seleccionadas (tabla 6), se capturaron los anticuerpos directamente de los medios de cultivo clarificados recogidos después de la transfección transitoria de células Expi293. La unión del fragmento de proteína FcRH5 se evaluó a 6 nM, 19 nM, 56 nM, 167 nM y 500 nM a un caudal de 30 |jl/min. La asociación y la disociación se monitorizaron durante 300 s y 600 s, respectivamente. Las secuencias divulgadas en la tabla 6 son aminoácidos individuales (es decir, el número en la parte superior de la columna es el número de aminoácidos dentro de la secuencia del anticuerpo). Los resultados indicaron que las mutaciones de VL I32L y H91Q, aunque mejoraron individualmente la afinidad, no beneficiaron la afinidad cuando se combinaron. Sin embargo, las otras secuencias sometidas a prueba dieron mejoras de afinidad incrementales de hasta cuatro veces en comparación con el control hu1G7.v1. En base a estos resultados, se diseñaron los anticuerpos hu1G7.v1.1, hu1G7.v1.2, hu1G7.v1.3 y hu1G7.v1.4 (figs. 2 y 3). El anticuerpo hu1G7.v1.1 se diseñó para que incorporara las seis mutaciones de VL S30R, I32L, A51G, T56S, H91Q y S94P. El anticuerpo hu1G7.v1.2 se diseñó para que incorporara las diez mutaciones de VL S30R, I32L, A51G, S52Y, Y53N, T56S, H91Q, Y92F, S93Q y S94P. Los anticuerpos hu1G7.v1.3 y hu1G7.v1.4 se basaron en hu1G7.v1.1 y se diseñaron para omitir I32L (hu1G7.v1.3) o bien H91q (hu1G7.v1.4).
TABLA 6. Análisis combinatorio de mutaciones identificadas por medio presentación en fagos de anticuerpos
También se diseñó una colección de fagos específica para investigar mutaciones de interés (mutaciones de VL S30R, I32L, A51G, S52Y, Y53N, T56S, H91Q, Y92F, S93Q, S94P; mutaciones de VH S28K, L29T, S56T) en muchas combinaciones diferentes. En un esfuerzo por incrementar aún más la similitud con las secuencias de anticuerpos humanos, la colección de fagos específica también permitió una variación limitada en las posiciones estructurales de la siguiente manera: S43A en el LC, L48I en el HC y/o N73T en el HC. Se obtuvieron aproximadamente 108 transformantes. Se realizaron las selecciones usando el fragmento de proteína FcRH5 como "cebo". Inicialmente se realizaron las selecciones con proteína diana inmovilizada en fase sólida, y se usaron las selecciones en fase en solución en rondas posteriores. Se derivaron los anticuerpos hu1G7.v1.5, hu1G7.v1.7, hu1G7.v1.13 y hu1G7.v1.13.1 (figs. 2 y 3) de esta colección.
Los datos de secuenciación de experimentos con la colección de fagos específica también respaldaron el concepto (tablas 5A-5B) de interacción negativa entre las mutaciones de VL I32L y H91Q. Después de cinco rondas de selección en fagos y análisis posterior de 163 secuencias de VL, se descubrió que la frecuencia de glutamina en la posición 91 de VL era mucho mayor en presencia de Ile32 (49/70 clones) que en presencia de Leu32 (5/93 clones). Este efecto no se observó en la colección no seleccionada, en la que se observó Gln91 en el 50 % (9/18) de los clones analizados que contenían leucina en la posición 32. Estos resultados sugirieron una selección negativa de clones que contenían tanto I32L como H91Q, a pesar del enriquecimiento positivo de cada una de estas mutaciones en otros contextos.
La susceptibilidad a la oxidación se investigó incubando el anticuerpo con diclorhidrato de 2,2'-azobis(2-metilpropionamidina) (AAPH) 1 mM durante 16 horas, seguido de digestión con tripsina para crear péptidos que se pudieran analizar usando análisis de cromatografía de líquidos (CL) y espectrometría de masas (EM). Para cada péptido en la muestra, se adquirieron los tiempos de retención a partir de la CL, así como información exacta con alta resolución sobre la fragmentación de iones de péptidos y masas (información de la secuencia de aminoácidos) en la EM. Se tomaron cromatogramas de iones extraídos (CIE) para los péptidos de interés (iones de péptidos naturales y modificados) a partir de los conjuntos de datos en un margen de ±10 ppm y se integraron los picos para determinar el área. Se calcularon los porcentajes relativos de modificación para cada muestra como sigue: (área del péptido modificado) I (área del péptido modificado más el área del péptido natural) x 100. A continuación, estos porcentajes relativos se compararon entre el control y las muestras tratadas con AAPH.
Después de una incubación de 16 horas a 40 °C en presencia de AAPH 1 mM, se observó un incremento en la oxidación de HVR-H2 Trp52 y Met64 (un 44,5 % y un 52,7 %, respectivamente). Además, la oxidación de Trp52 se incrementó del 2 % al 62 % después del estrés con luz, y la mutación de Trp-52HC dio como resultado una pérdida de afinidad de las variantes 1G7.v1.4, según lo medido por BIACORE® (fig. 4). Se investigaron los reemplazos de Trp52 por fenilalanina, tirosina, leucina o histidina y los reemplazos de Met64 por fenilalanina, isoleucina, valina o leucina en el contexto de las cadenas ligeras de los anticuerpos hu1G7.v1, hu1G7.v1.3, hu1G7.v1.4, hu1G7.v1.5, hu1G7.v1.6 y hu1G7.v1.7 (figs. 2 y 3). En particular, la mutación de W52 a F, Y, L o H dio como resultado valores de K<d>de 119 nM, 131 nM, 92 nM y 60,4 nM, respectivamente. Mientras que la mutación de M64 a V en 1G7.v85 dio como resultado una K<d>de 2,5 nM. Para el cribado de afinidad de las variantes HVR-H2 Trp52 y Met64 (tabla 7), los anticuerpos se expresaron mediante transfección transitoria de células Expi293 y se purificaron usando columnas de punta que se empaquetaron a medida con resina de afinidad MabSelect SuRe (Glygen Corp., Columbia, MD & GE Life Sciences, Piscataway, NJ). Los anticuerpos de control hu1G7.v1 y hu1G7.v1.5 se expresaron mediante transfección transitoria de células 293T y se purificaron con MabSelect SuRe. La unión del fragmento de proteína FcRH5 a los anticuerpos capturados se monitorizó a 100 nM y 500 nM. La asociación y la disociación se monitorizaron a un caudal de 40 μl/min, durante 180 s y 300 s, respectivamente. Los resultados, que se muestran en la tabla 7, demostraron que HVR-H2 Met64 se puede mutar a valina a la vez que se mantiene una alta afinidad por FcRH5.
Se seleccionó el anticuerpo hu1G7.v1.4 en base a la afinidad y la selectividad por FcRH5 frente a otros miembros de la familia FcRH. Para mejorar la resistencia de este anticuerpo a la oxidación, también se incorporó a la región VH la mutación M64V descrita en la tabla 7. El anticuerpo resultante hu1G7.v1.4.M64V se denominó hu1G7.v85 (figs. 5A-5B) y se produjo como IgG bivalente y como anticuerpo biespecífico dependiente de linfocitos T (TDB). La secuencia de hu1G7.v85 se presenta en las figs. 6A-6B y la fig. 5A-5B. En la tabla 8 se muestra un análisis cinético de hu1G7.v85. Se muestra el análisis de hu1G7.v1.4 a modo de comparación. Las diferencias observadas en la K<d>de hu1G7.v1.4 (tablas 7 y 8) se encuentran dentro de la variación experimental esperada para estas moléculas.
También se produjo una versión sin afinidad madurada de hu1G7.v.1, hu1G7.v87, que posee las HVR 1G7 de ratón en la región estructural humanizada descrita anteriormente, con una mutación M64V para mejorar la resistencia a la oxidación.
TABLA 7. Cribado de afinidad de las variantes HVR-H2 en las posiciones 52 y 54 de hu1G7.v1
TABLA 8. Análisis cinético de hu1G7.v1.4 y hu1G7.v85 en form atos hlgG1 y TDB
Un procedimiento de maduración de afinidad adicional utilizó la secuenciación de Sanger para aleatorizar las posiciones de HVR de la cadena pesada; sin embargo, no se identificaron mutaciones deseables por este procedimiento. Por lo tanto, se amplió el número de posiciones sometidas a prueba para las variantes y la profundidad de cribado mediante secuenciación de última generación (secuenciación Illumina). Se diseñó una colección en la que las posiciones seleccionadas en la región variable de la cadena pesada se aleatorizaron con un codón NNK, que codifica cualquier aminoácido o un codón de terminación ámbar. El diseño permite solo un cambio de aminoácido en las regiones variables del anticuerpo por clon. Las posiciones se seleccionaron entre HVR y posiciones estructurales en contacto directo o proximales a HVR. Se aleatorizaron las posiciones de Kabat 1,2, 24 a 40, 43, 45 a 78, 80 a 83, 85, 86, 91 y 93 a 102. Se creó la colección mediante síntesis de ADN (GeneWiz), produciendo 75 fragmentos de ADN lineales independientes con una posición en cada fragmento aleatorizada con el codón NNK. Los fragmentos de ADN lineal se agruparon y clonaron en un vector de presentación en fagos de fragmentos Fab monovalentes (Lee et al., J. Immunol. Methods 284:119-132, 2004) que contenía la región variable de la cadena ligera sin mutaciones de maduración de afinidad. Los productos de unión se sometieron a electroporación en E. coli XL-1, se sobreinfectaron con el fago auxiliar M13 KO7 (New England Biolabs) y se cultivaron como se describe. Se seleccionaron las proteínas de unión en tres rondas de clasificación con FcRH5 humana o de macaco cangrejero en pistas paralelas. Para estas selecciones, se usaron placas ELISA recubiertas con neutravidina (Pierce) para capturar el dominio 8 de FcRH5 humana o de macaco cangrejero biotinilado a 50 ng/ml en PBS. Se incubó el fago (1 DO268/ml) con FcRH5 inmovilizada durante dos horas a temperatura ambiente y se eliminó el fago no unido lavando 10 veces con PBS. La colección y el fago seleccionado se usaron para infectar E. coli XL-1, se extrajo el ADN del plásmido y se amplificaron los insertos mediante una amplificación por PCR de 15 ciclos usando la ADN polimerasa Phusion (New England Biolabs), seguido de purificación de los amplicones en gel de agarosa. El ADN del fago de la colección original (2 DO268) se extrajo con un kit de purificación de ADN M13 (Qiagen) y se usaron 200 ng de ADN como molde para amplificar los insertos usando las mismas condiciones que anteriormente. Se secuenciaron los amplicones mediante secuenciación Illumina como se describe previamente (Koenig et al., J. Biol. Chem. 290:21773-21786, 2015). Se filtraron las secuencias y se analizaron como se describe previamente (Koenig et al., J. Biol. Chem. 290:21773-21786, 2015), retirando todas las secuencias con más de una mutación en la región variable, las secuencias con mutaciones que no se ajustaban al uso de codones NNK degenerados y las secuencias con codones de terminación. Se calculó el enriquecimiento dividiendo la frecuencia de una mutación dada en una posición dada en la muestra clasificada por la frecuencia de la misma mutación en la muestra no clasificada (colección inicial), como se describe previamente (Fowler et al., Nat. Methods 7:741-746, 2010), usando la siguiente fórmula: Ev=log2((Rv,s / £ R x,s )/(Rv,i/ £ R x ,i)), en la que Ev es el enriquecimiento de un mutante, Rv,s es el número de lecturas con la mutación v en la posición s en la población clasificada, Rx,s es el número de lecturas en la población clasificada con mutaciones en la misma posición que la variante Rv,s, Rv,i es el número de lecturas del mismo mutante que Rv,s en la población no clasificada de entrada y Rx,i es la suma de todas las variantes en la población no clasificada de entrada con mutaciones en la misma posición que variante Rv,i. Las puntuaciones de Ev para selecciones con FcRH5 humana y de cyno se muestran en las tablas 9 y 10, respectivamente, y los recuadros grises representan mutaciones que no se identificaron en la muestra seleccionada o en la colección.
La tabla 11 muestra las mutaciones con puntuaciones de al menos 0,5 en selecciones con FcRH5 humana y al menos 0 en selecciones con FcRH5 de macaco cangrejero. En la tabla 11, las mutaciones seleccionadas para un análisis adicional (es decir, mutaciones que son al menos levemente favorecidas para unirse a FcRH5 humana y que son neutras o mejores para unirse a FcRH5 de macaco cangrejero) están resaltadas en negro o gris, y la mutación L29T identificada por secuenciación de Sanger está resaltada en gris. Un total de 11 posiciones tenían mutaciones que cumplían estos criterios, con múltiples variantes en algunas posiciones. Una posición tenía una mutación que introdujo un sitio de glucosilación (G54N) y no se seleccionó para caracterización adicional. Otra variante, l29T, se identificó mediante cribado con secuenciación de Sanger, pero solo se identificó en clones con la mutación S56T. Esa variante mostró una mejora promedio en la afinidad de solo 1,2 veces. El mutante S56T tuvo una fuerte puntuación de enriquecimiento negativo de -2,1 (tabla 9), lo que sugiere que la mutación L29T puede tener un efecto beneficioso que quedó oscurecido por la presencia de la segunda mutación S56T en el doble mutante. De las otras nueve posiciones, se seleccionó la mutación con la puntuación más alta excepto para las posiciones 1 y 65, donde se seleccionaron dos mutaciones. Estas variantes se prepararon mediante síntesis de ADN (GenWiz) y se expresaron como IgG1 humana en combinación con la cadena ligera de hu1G7.v1 (sin mutaciones de maduración de afinidad) en células Expi293 en cultivos de 1 ml. Las variantes de IgG1 humana se purificaron mediante cromatografía con proteína A y se sometieron a prueba en BIACORE® para determinar su afinidad. De las dos mutaciones sometidas a prueba, solo dos, L29T y S100P, tuvieron un impacto significativo en la afinidad cuando se sometieron a prueba en BIACORE® con FcRH5 humana soluble. La mutación L29T sola mejoró la afinidad en ese contexto en 2,2 veces, mientras que la mutación S100P mejoró la afinidad en 3 veces. Estas mutaciones se sometieron a prueba de forma aislada y en combinación en el contexto de una cadena ligera de afinidad madurada con las mutaciones I32L, A51G, T56S y S94P presentes en hu1G7.v86. La L29T en la cadena pesada mejoró la afinidad de hu1G7.v86 en aproximadamente 2 veces, similar al efecto en el contexto de una cadena ligera sin mutaciones. Por el contrario, la S100P, que en el contexto de una cadena ligera sin mutaciones mejoró la afinidad en 3 veces, mejoró la afinidad de hu1G7.v86 en 1,5 veces. Combinadas, las mutaciones L29<t>y S100P mejoraron la afinidad de hu1G7.v86 en 2,5 veces. Por lo tanto, incluso usando prospección profunda con secuenciación de última generación y sometiendo a prueba muchas posiciones estructurales además de las posiciones de CDR para mutaciones favorecidas en la cadena pesada, solo se pudo lograr una mejora de 2,5 veces en la afinidad. Los resultados indicaron que las mutaciones que contribuyeron significativamente a la afinidad cuando se sometieron a prueba individualmente tuvieron un impacto mucho menor en las moléculas que ya tenían otras mutaciones. Esto fue en particular cierto en el caso de la mutación S100P en la cadena pesada que, individualmente, mejoró la afinidad de hu1G7.v1 en aproximadamente 3 veces, pero, en el contexto de una molécula con las mutaciones de cadena ligera I32L, A51G, T56S y S94P y la mutación de cadena pesada L29T, tuvo poco impacto adicional en la afinidad (tabla 12, comparación con hu1G7.v91 y hu1G7.v93; la secuencia de hu1G7.v93 se presenta en las figs. 7A-7B). Por tanto, mientras que se podían lograr mejoras significativas en la afinidad añadiendo varias mutaciones a la cadena ligera, se podía lograr una mejora relativamente pequeña introduciendo mutaciones en la cadena pesada.
TABLA 9. Puntuaciones de enriquecim iento de mutaciones en hu1G7.v1 seleccionadas con FcRH5 humana
TABLA 10. Puntuaciones de enriquecimiento de mutaciones en hu1G7.v1 seleccionadas con FcRH5 de macaco cangrejero
TABLA 11. Mutaciones con puntuaciones de enriquecim iento de al menos 0,5 en selecciones con FcRH5 humana (tabla 9) y puntuaciones de enriquecimiento de al menos 0 en selecciones con FcRH5 de macaco cangrejero (tabla 10)
TABLA 12. Afinidades de las variantes de hu1G7 con mutaciones identificadas mediante secuenciación profunda de colecciones de presentación en fagos seleccionadas con FcRH5
Ejemplo 3. Generación y caracterizaciónin vitrode TDB contra FcRH5 ejemplares
Los anticuerpos anti-FcRH5 descritos en el presente documento se usaron para generar anticuerpos biespecíficos dependientes de linfocitos T (TDB) que comprenden los determinantes de unión del anti-FcRH5 humana en un brazo y un anti-CD3s humano en el otro brazo. Los determinantes de unión a FcRH5 incluían los clones de anticuerpos monoclonales humanizados y de afinidad madurada 1G7, 1G7.v85 y 1G7.v87. Los determinantes de unión humanizados para anti-CD3s incluyeron el clon de anticuerpo de alta afinidad 38E4.v1, el clon de alta afinidad 38E4.v11 y el clon de baja afinidad 40G5 (CE50 para hCD3s = 1,0 nM, 50 μM y 13 nM, respectivamente). Los clones anti-CD338E4.v1, 38E4.v11 y 40G5c se unen a un polipéptido CD3s humano (un fragmento del polipéptido CD3s humano que consiste en los aminoácidos 1-26 o 1-27 (SEQ ID NO: 174)) y el residuo aminoacídico Glu5 de CD3s no es necesario para la unión (véanse también la publicación PCT n.° WO 2015/095392 y publicación de EE. UU. n.° 2015-0166661).
Se caracterizaron los TDB contra FcRH5 ejemplares para evaluar su potencial terapéutico. Se descubrió que las moléculas de TDB contra FcRH5 de longitud completa humanizadas destruyen las células plasmáticas humanas y las células tumorales de mieloma primario derivadas de pacientes en dosis extremadamente bajas (μM) y desencadenan una proliferación potente de linfocitos T. Los TDB contra FcRH5 fueron eficaces para suprimir el crecimiento de xenoinjertos de mieloma in vivo y dieron como resultado la depleción completa de linfocitos B y células plasmáticas en primates a niveles de dosis bien tolerados que se esperaba que saturaran la diana. La depleción completa de las células plasmáticas proporcionó pruebas convincentes de la eficacia en el microambiente de la médula ósea. La actividad de los TDB contra FcRH5 se correlacionó con el nivel de expresión de la diana (por ejemplo, expresión de FcRH5), lo que sugiere que los pacientes con mieloma de alto riesgo con ganancia de copias del cromosoma 1q pueden ser especialmente sensibles a esta inmunoterapia.
Materiales y procedimientos
A. Anticuerpos
a. Producción de TDB
1. Enfoque de diseño racional
Para optimizar la expresión e incrementar el rendimiento de los TDB, se genomanipularon mutaciones en los dominios Fc, VH, VL, CH1 y CL de los anticuerpos anti-FcRH5 (por ejemplo, TDB contra FcRH5) para impulsar la formación de monómeros de anticuerpos adecuados. En particular, las modificaciones de aminoácidos que introdujeron regiones cargadas en los dominios VH, VL, CH1 y/o CL proporcionaron un mecanismo para reducir el emparejamiento incorrecto de la cadena pesada y cadena ligera. Las regiones cargadas afines que tienen cargas totales opuestas se unen y ayudan en el emparejamiento apropiado de la cadena pesada y cadena ligera, incrementando el rendimiento de producción total de un anticuerpo anti-FcRH5 (por ejemplo, un TDB contra FcRH5). En las figs. 1A-1B se presentan configuraciones de diseño racional ejemplares, incluyendo modificaciones aminoacídicas de los dominios Fc, VH, VL, CH1 y CL.
2. Enfoque de diseño de rosetta
Además, o como alternativa, para optimizar la expresión y aumentar el rendimiento de los TDB, se genomanipularon mutaciones en los dominios Fc, VH, VL, CH1 y CL de los anticuerpos anti-FcRH5 (por ejemplo, TDB contra FcRH5) para impulsar la formación de monómeros de anticuerpos adecuados. El enfoque de diseño de rosetta proporcionó un mecanismo adicional para impulsar el emparejamiento apropiado de la cadena pesada y cadena ligera, además de mutaciones de regiones cargadas, en forma de mutaciones de botón y ojal en los dominios CH1 y CL. En las figs. 1C-1F se presentan configuraciones de diseño de rosetta ejemplares, incluyendo modificaciones aminoacídicas de los dominios Fc, VH, VL, CH1 y CL.
3. Enfoque de una célula para la producción de TDB contra FcRH5
En un enfoque, los TDB contra FcRH5 se pueden producir mediante el cultivo de células huésped que se han cotransfectado con dos plásmidos, cada uno de los cuales codifica uno de los dos brazos del TDB contra FcRH5 (por ejemplo, un primer plásmido que codifica un semianticuerpo anti-FcRH5 y un segundo plásmido que codifica un semianticuerpo anti-CD3). La transfección de células huésped (por ejemplo, células bacterianas, de mamífero o de insecto) se realizó en un formato de placa de 96 pocillos. Para cribar la producción de TDB contra FcRH5, se pueden seleccionar y evaluar aproximadamente entre 2000 y 3000 clones mediante ELISA y fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo (HTRF) de IgG intacta para determinar su capacidad para unirse al antígeno diana, FcRH5. Se seleccionaron clones que producían TDB contra FcRH5 que se pueden unir a FcRH5, o a un fragmento del mismo, para expansión y cribado adicional (por ejemplo, para unión a CD3). A continuación, se pueden seleccionar los mejores clones para un análisis adicional en base al porcentaje de anticuerpos biespecíficos (AcBe) producidos, al valor y a la calificación del rendimiento (PQ).
En la solicitud de patente internacional n.° PCT/US16/28850 se describe un enfoque ejemplar de una célula que se puede usar para producir el TBD contra FcRH5 de la invención.
4. Enfoque de dos células para la producción de TDB contra FcRH5
De forma alternativa, los TDB contra FcRH5 se pueden producir cultivando los hemímeros de anticuerpos (por ejemplo, semianticuerpos) por separado (es decir, en dos líneas celulares diferentes) usando fermentación de alta densidad celular y, a continuación, aislando cada semianticuerpo independientemente mediante cromatografía con proteína A. A continuación, los semianticuerpos purificados se pueden combinar, por ejemplo, en una proporción molar 1:1 e incubarse en Tris 50 mM, pH 8,5 en presencia de DTT 2 mM durante 4 horas para permitir la hibridación y la reducción de disulfuros en la región bisagra. La diálisis frente al mismo tampón sin DTT durante 24-48 horas dio como resultado la formación de enlaces disulfuro entre cadenas.
Los TDB se pueden producir de forma alternativa mediante transfección de dos plásmidos, cada uno de los cuales codifica los distintos brazos del TDB, en células huésped separadas. Las células huésped se pueden cocultivar o cultivar por separado. La transfección de células huésped se puede realizar en un formato de placa de 96 pocillos. Para cribar la producción de TDB, se seleccionan y evalúan entre 2000 y 3000 clones mediante ELISA y fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo (HTRF) de IgG intacta para determinar su capacidad para unirse a un antígeno seleccionado (por ejemplo, FcRH5). Se seleccionan clones que producían TDB que se pueden unir a FcRH5, o a un fragmento del mismo, para expansión y cribado adicional. Se seleccionan los mejores clones para un análisis adicional en base al porcentaje de anticuerpos biespecíficos (AcBe) producidos, al valor y a la PQ.
5. Métodos de producción ejemplares
En un ejemplo, usando esta estrategia, los TDB contra FcRH5 se produjeron mediante una estrategia de cocultivo que usaba células de E. coli que expresaban un semianticuerpo (ojal) y células de E. coli que expresaban el segundo semianticuerpo (botón) que se cultivaron juntas en matraces agitadores en una proporción predeterminada de modo que se produjeran cantidades similares de cada semianticuerpo (véanse, Spiess et al., Nat. Biotechnol. 31(8):753-8, 2013; publicación PCT n.° WO 2011/069104). A continuación, se recogió el caldo bacteriano cocultivado, se rompieron las células en un microfluidificador y se purificaron los anticuerpos por afinidad con la proteína A. Se ha observado que, durante la microfluidización y la captura de la proteína A, los dos brazos se hibridaron y formaron puentes disulfuro entre cadenas bisagra.
En otro ejemplo, se produjeron anticuerpos biespecíficos de longitud completa como se describe previamente (Junttila et al. Cáncer Res. 74:5561-5571, 2014; Sun et al., Science Trans. Med. 7:287ra270, 2015). En resumen, los dos semianticuerpos (por ejemplo, anti-FcRH5 (por ejemplo, variantes optimizadas de 1G7) y anti-CD3 (por ejemplo, 38E4.v1)) que contenían mutaciones de "botón" u "ojal" en sus dominios CH3 se expresaron mediante transfección transitoria de células CHO y, a continuación, se purificaron por afinidad con proteína A. Se incubaron cantidades iguales de los dos semianticuerpos con un exceso molar de 200 de glutatión reducido a pH 8,5 durante la noche a 32 °C para impulsar la formación de los enlaces disulfuro botón-ojal. El anticuerpo biespecífico ensamblado (por ejemplo, TDB contra FcRH5) se purificó de los contaminantes a través de cromatografía de interacción hidrófoba. Los TDB contra FcRH5 purificados se caracterizaron para determinar su pureza mediante espectrometría de masas, cromatografía de exclusión por tamaño (CET) y electroforesis en gel.
b. Purificación de TDB contra FcRH5
Los TDB contra FcRH5 se purificaron de los contaminantes mediante cromatografía de interacción hidrófoba (CIH). El material resultante se analizó para determinar los niveles de endotoxinas usando un sistema de prueba portátil Endosafe y, según fue necesario, el contenido de endotoxinas se redujo lavando la proteína con Triton X-114 al 0,1 %. Los pesos moleculares de los TDB se analizaron mediante espectrometría de masas (CL-ESI/TCF) como se describe anteriormente (Jackman et al., The Journal o f Biological Chemistry. 285:20850-9, 2010). Los TDB contra FcRH5 también se analizaron mediante cromatografía analítica de exclusión por tamaño en una columna Zenix SEC-300 (Sepax Technologies USA) usando un sistema 1:100 HPLC de Agilent. La presencia de fragmentos de anticuerpos residuales se cuantificó mediante electroforesis utilizando un Bioanalizador 2100 y un Chip Protein 230.
c. Anticuerpos marcados
Todos los anticuerpos marcados directamente para citometría de flujo, excepto los que se mencionan de otro modo, se adquirieron de BD Bioscience. Se adquirió anti-PD-1 humano de Affymetrix. El anti-IgG humana caprino y el anti-IgG de ratón caprino se adquirieron de Jackson Immunoresearch. El anti-PC-FITC (clon Vs38c) se adquirió de DAKO. El anticuerpo SLP-76 para inmunoelectrotransferencia se adquirió de Cell Signaling Technology. El p-SLP76 (Ser376) se generó en Genentech, Inc.
Para la detección de FcRH5 a partir de muestras de mieloma múltiple (MM) y linfocitos B y plasma de donantes sanos mediante FACS, Southern Biotec marcó el anticuerpo anti-FcRH5 1G7 con PE. Para microscopía, los TDB se marcaron con Alexa Fluor 647 usando el kit de marcado de proteínas apropiado (ThermoFisher) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los TDB se dializaron en PBS, pH 7,2 antes del marcado y se logró de forma rutinaria una proporción tinte/proteína de ~4.
B. Ensayos de estabilidad molecular
Para evaluar la estabilidad molecular de los TDB contra FcRH5, se realizaron pruebas de estrés térmico a de 30 °C a 40 °C durante cuatro semanas. Los TDB contra FcRH5 se incubaron a 1 mg/ml en his-acetato 20 mM, sacarosa 240 mM, pH 5,5, y se evaluaron después de 2 semanas. Los TDB se evaluaron para determinar un cambio de <5 % en la N-desaminación/D-isomerización, un cambio de <2,5 % en la pérdida de monómero por CET y un cambio de <16 % en la pérdida de pico principal por cromatografía de intercambio iónico a las 2 semanas. El tampón para CET usado fue KCI 0,25 M, K3PO40,2 M, pH 6,3. La CL-EM se realizó en condiciones reducidas usando TCEP a 60 °C durante 10 minutos. El análisis por CL-EM/EM se realizó mediante el mapeo de péptidos trípticos de RCM con reducción de DTT, protección con IAA y digestión a pH 8,2.
Se llevó a cabo un ensayo de oxidación de AAPH para evaluar <35 % de oxidación de Trp y <1,1 Met Ox/Met256. Los TDB contra FcRH5 se incubaron a una concentración de 1,0 mg/ml y se sometieron a estrés en AAPH 1 mM durante 16 horas. También se llevó a cabo un ensayo de oxidación por luz para evaluar Trp OX/TrpOX_ApoMabW53 >0,5. Para el ensayo de oxidación por luz, se incubaron los TDB a una concentración de 1,0 mg/ml durante 48 horas y se expusieron a la luz durante 2,4 millones de lux-horas. La oxidación se evaluó mediante análisis por CL-EM/EM con mapeo de péptidos trípticos de RCM con reducción de DTT, protección con IAA y digestión a pH 8,2.
C. Cultivo celular y generación de líneas celulares estables
Se cultivaron células HEK-293T y HEK-T que expresan el complejo 1G4 TOR y componentes clave de señalización de TOR (James et al., Nature 487:64-69, 2012) en DMEM (Sigma Aldrich). Todas las demás líneas celulares se cultivaron en RPMI. Todos los medios se complementaron con FBS inactivado por calor al 10 % (Life Technologies), HEPES 1 mM (Lonza), glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 |jg/ml (Sigma Aldrich).
Para evaluar la formación de sinapsis inmunitarias, se infectaron células SVT2 con retrovirus que codifican FcRH5 de longitud completa que tiene una marca de gD N terminal o bien con virus que codifican una FcRH5 truncada (es decir, FcRH5 que incluye una deleción de los aminoácidos 1-744) que tiene una marca de gD N terminal. Para evaluar la dependencia de la diana de la eliminación de TDB contra FcRH5, se infectaron células FOX-NY con lentivirus que codifican FcRH5 de longitud completa. A continuación, se seleccionaron clones derivados de células individuales con niveles de expresión diferenciales de FcRH5 con 2 jg/m l de puromicina.
Para evaluar el efecto de la señalización de PD-1/PD-L1 en la actividad de TDB contra FcRH5, se infectaron células 293 con lentivirus que codifican FcRH5 seguido de la transfección de un plásmido que codifica PD-L1 humano usando lipofectamina (Invitrogen).
D. Ensayo de unión celular a radioligando
El anticuerpo anti-FcRH5 1G7.v85 se yodó usando el procedimiento lodogen a una actividad específica de 20 μCi/|jg. Las mezclas de reacción de competencia que contenían una concentración fija de anticuerpo yodado y concentraciones decrecientes de anticuerpo no marcado diluido en serie se colocaron en placas de 96 pocillos. Las líneas celulares que expresan FcRH5 humana endógena (por ejemplo, MOLP-2, RI-1, kA r PAS 620 y KMS21-BM) se lavaron con tampón de unión, que consistía en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero fetal bovino (FBS) al 2 %, HEPES 50 mM (pH 7,2) y acida de sodio al 0,1 % y, a continuación, se añadieron a las placas de 96 pocillos. Las reacciones de competencia con las células se sometieron a ensayo por triplicado para cada concentración de anticuerpo no marcado y se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente. Después de dos horas de incubación, se transfirieron las reacciones de competencia a una placa de filtro Multiscreen de Millipore (Billerica, MA) y se lavaron cuatro veces con tampón de unión para separar el anticuerpo yodado libre del unido. Los filtros secados al aire se contaron en un contador gamma Wallac Wizard 2470 (PerkinElmer Life and Analytical Sciences Inc.; Wellesley, MA) y se evaluaron los datos de unión usando el programa informático NewLigand (Genentech), que usa el algoritmo de ajuste de Munson y Robard para determinar la afinidad de unión del anticuerpo (Munson et al. Anal. Biochem. 107:22-39, 1980).
E. Vectores y transfección transitoria para m icroscopía
Se fusionó FcRH5 que tiene un marca de gD N terminal con la proteína fluorescente mRuby2 insertando primero FcRH5 en el vector lentivírico pHR-SIN, antes de unir la secuencia de ADN de mRuby2 en este vector, creando de este modo pHR-FcRH5-mRuby2. El promotor SFFV en este vector se reemplazó posteriormente con el promotor mHSP, creando pHRI-FcRH5-mRuby2, que utiliza un promotor más débil que pHR, lo que permite niveles de expresión más fisiológicos de FcRH5-Ruby. Los vectores que expresan LCK, ZAP70, CSK/CBP y CD45 se han descrito previamente (James et al., Nature. 487:64-69, 2012). La construcción de CD45 usada fue la isoforma RO o bien una construcción que contenía el dominio citoplásmico de CD45 con los dominios transmembrana y extracelular de CD43, que se sabe que imita la función de CD45. Antes de transfectar las construcciones, se sembraron células HEK con una confluencia de aproximadamente el 60 % en placas de 6 pocillos. A continuación, se transfectaron los vectores de forma transitoria en proporciones apropiadas usando GeneJuice (Novagen), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células se usaron en experimentos 24-48 horas después de la transfección.
F. Obtención de imágenes y análisis de m icroscopía
Para obtener imágenes de los conjugados de células, se recogieron del cultivo 3 x 105 células de cada tipo celular del que se iban a obtener imágenes y se resuspendieron en 100 j l de TDB 20 nM en RPMI-1640 (sin rojo fenol). Después de una incubación de 20-30 min para permitir la conjugación celular, se lavaron las células con PBS, se resuspendieron en medio para obtención de imágenes DMEMgfp2 (Evrogen) y se añadieron a placas para obtención de imágenes de 35 mm (Mattek). Se usó un sistema de microscopio confocal de disco giratorio Andor para obtener imágenes de las células a 37 °C. Se analizaron todas las imágenes y se manipularon todas las imágenes presentadas de manera equivalente usando ImageJ. Se sustrajeron las imágenes presentadas del fondo y, a continuación, se recortaron para centrarse en el par de células y se optimizó el contraste. El grado de agrupamiento y segregación de proteínas se determinó usando la intensidad de las proteínas marcadas con fluorescencia en la membrana plasmática. Se seleccionó la membrana plasmática dibujando manualmente una línea y la intensidad de fluorescencia promedio de la membrana plasmática dentro de la interfase célula-célula, se dividió por la intensidad de fluorescencia promedio de la membrana plasmática fuera de la interfase célula-célula para calcular el grado de agrupamiento o segregación. Para generar una imagen de la interfase de un par de células conjugadas por TDB de un apilamiento z, el apilamiento de imágenes primero se desconvolucionó y, a continuación, se recortó para resaltar la región de la interfase usando el software Huygens.
G. Ensayos de activación de linfocitos T y de citotoxicidad in vitro
Se marcaron las células diana con carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Life Technology, n.° C34554). Se mezclaron las células diana marcadas con CFSE y los linfocitos CD8+ purificados en una proporción 3:1 de células efectoras a células diana (E:T) y se incubaron con TDB durante 48 horas. Al final de la incubación, se analizaron las células con citometría de flujo en un FACSCalibur en formato de automatización. Se contó el número de células diana vivas seleccionando células CFSE+/negativas para IP. El porcentaje de citotoxicidad se calculó como sigue: % de citotoxicidad (número de células diana vivas sin TDB - número de células diana vivas con TDB)/(número de células diana vivas sin TDB) X 100.
a. Líneas celulares del ensayo de citotoxicidad in vitro
La separación de las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y los linfocitos CD8+, Cell Titer Glo (Promega) y los ensayos de viabilidad basados en citometría de flujo (48 h) se llevaron a cabo como se describe previamente en Junttila et al., Cancer Res. 74:5561-5571,2014. Se usaron linfocitos CD8+ como efectores en una proporción efector/diana de 3:1.
b. Muestras de células plasmáticas humanas y de mieloma múltiple primario
Se diluyó el aspirado de médula ósea humana de donantes sanos (ALLCELLS) en PBS y se aislaron las células mononucleares de médula ósea (CMMO) mediante separación por gradiente convencional (Lymphoprep, STEMCELL). Se usó un ensayo de viabilidad de citometría de flujo para someter a prueba el efecto del tratamiento con TDB contra FcRH5 de 72 h en células plasmáticas CMMO. Se adquirieron CMMO humanas congeladas de pacientes con MM de Conversant Bio. Se mezclaron las CMMO de mieloma con linfocitos T CD8+ de donantes sanos recién aislados y se trató el cocultivo con TDB contra FcRH5 durante 72 h. Se contaron los linfocitos CD38+CD138+ negativos para IP mediante citometría de flujo.
H. Ensayos de activación y proliferación de linfocitos T
El ensayo de activación de linfocitos T se ha descrito previamente en Junttila et al., Cáncer Res. 74:5561-5571, 2014. Se marcaron los linfocitos T CD8+ recién aislados con CFSE y se mezclaron con células diana (por ejemplo, células MOLP-2) en una proporción 1:1 y se cocultivaron con 1 jg/m l de TDB durante 48 horas o cinco días. Se tiñeron las células con anti-CD8-APC (b D Bioscience, n.° 555634), anti-CD69-PE (BD Bioscience, n.° 555531) y/o anti-CD25-APC (BD Bioscience, n.° 555434) y se analizó la dilución de la intensidad de fluorescencia de CFSE mediante citometría de flujo.
I. Análisis de citometría de flu jo para células plasmáticas de cyno
Se diluyeron (1:10) los aspirados de médula ósea de cyno en tampón de lisis ACK (Life Technology, n.° AI 0492) dos veces. Se tiñeron las células de la médula ósea de cyno con anti-CD45, anti-CD20 y anti-CD38. Después del lavado, se fijaron las células y se permeabilizaron con el kit IntraStain (DAKO). A continuación, se tiñeron las células con anti-PC (clon Vs38c). Las células plasmáticas de cyno se clasificaron por citometría de flujo como CD45-CD20-CD38+PC+.
J. Análisis ELISA para determinar el nivel de IgG de cyno
Se cuantificó la IgG sérica de cyno total usando ELISA intercalado basado en colorimetría estándar. Se usaron un anti-IgG de mono caprino (Bethyl A140-202A) y un anti-IgG de mono caprino conjugado con peroxidasa de rábano picante (PRP) (Bethyl A140-202P) como anticuerpo de captura y detección, respectivamente. Se usó IgG de cyno (Cell Sciences CSI20163A) como estándar de cuantificación de proteínas.
K. Análisis por inmunoelectrotransferencia
Se trataron los linfocitos T CD8+ humanos recién aislados y las células 293T-FcRH5 (proporción 2:1) con 1 jg/ml de TDB 1G7.v85/38E4.v1 (“TDB 1G7.v85”), 10A8/38E4.v1 (“TDB 10A8”) o anti-gD/38E4.v1 (“TDB anti-gD”) y se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4 °C y se lisaron con tampón de lisis RIPA (Cell Signaling Technology). Se detectaron pSLP76 (Ser376) y SLP76 usando anticuerpos y procedimientos de inmunoelectrotransferencia estándar.
Resultados
A. Afinidad de unión de TDB contra FcRH5
Entre los TDB contra FcRH5 producidos había moléculas que comprendían el clon 1G7 como el dominio de unión a FcRH5 y clones seleccionados como el dominio de unión a CD3, incluyendo 38E4.v1, 40G5c y 38.E4.v11. Se generaron los anticuerpos hu1G7.v1.1 (“TDB 1G7.v1.1”), hu1G7.v1.2 (“TDB 1G7.v1.2”), hu1G7.v1.3 (TDB 1G7.v1.3”), hu1G7.v1.4 (“TDB 1G7.v1.4”), hu1G7.v1.5 (“TDB 1G7.v1.5”), hu1G7.v1.7 (“TDB 1G7.v1.7”), hu1G7.v1.13 (“TDB 1G7.v1.13”) y hu1G7.v1.13.1 (“TDB 1G7.v1.13.1”) como TDB contra FcRH5 con un brazo anti-CD3 38E4.v1 y se determinó mediante BIACORE®, en general, como se describe en el presente documento, que tienen una alta afinidad por el fragmento de proteína FcRH5 soluble (tabla 13). Las pruebas de expresión de 1G7.v85 y 1G7.v87 en formatos de semianticuerpo que incluyen mutantes de "botón" dieron un valor por encima de la barra de desastre (fig. 8).
TABLA 13. Evaluación de afinidad de ocho variantes de afinidad madurada seleccionadas en form ato TDB
B. Unión y reactividad cruzada de TDB contra FCRH5
Se usaron células SVT2 de ratón transfectadas con FcRH5 humana, FcRH5 de cyno, FcRHI, FcRH2, FcRH3 y FcRH4 humanas para someter a prueba la unión y la reactividad cruzada de los TDB contra FcRH5. El procedimiento se llevó a cabo como sigue. Las células SVT2 cultivadas se levantaron usando un tampón de disociación de células sin enzimas (Sigma, n.° C5914). Se suspendieron 1 x 105 células en 100 |jl y se incubaron con TDB contra FcRH5 a 3 jg/ml. A continuación, se lavaron las células con tampón FACS (PBS, BSA al 1 %, EDTA 2 mM) y se incubaron con anti-Fc PE humano caprino (Jackson Immunoresearch, n.° 109-116-170) a una dilución 1:100. Se lavaron las células dos veces con tampón FACS antes de que se llevara a cabo un análisis de citometría de flujo en un FACSCalibur.
Después de la humanización y la maduración de afinidad de 1G7 murino, se generaron ocho variantes de afinidad madurada en formato TDB. Los TDB 1G7 optimizados se generaron en formato de "botón en ojal" con 38E4.v1 como brazo anti-CD3. Las ocho variantes mostraron una afinidad incrementada de 5 a 15 veces con respecto al TDB 1G7 murino por BIACORE® en el formato TDB (tabla 13). Todas las variantes demostraron unión negativa a FcRH1 o FcRH4, con diferentes grados de unión positiva a FcRH2 o FcRH3. El TDB 1G7.v1.4 mostró la menor reactividad cruzada con FcRH2 y FcRH3 (tabla 14). También se evaluó mediante FACS la unión de TDB contra FcRH5 que contenían diferentes brazos anti-FcRH5 (es decir, 1G7, 1G7.v85 o 1G7.v1.4) a FcRH3 (fig. 9A).
TABLA 14. Unión y reactividad cruzada de TDB contra FcRH5
Las capacidades de los TDB 1 G7.v1.4, 1 G7.v85 y 1G7 para unirse a huFcRH5 y huFcRH3 se evaluaron mediante análisis BIACORE® (figs. 10A-10D). Las afinidades de T<d>B 1G7.v85 y TDB 1<g>7.<v>1.4 fueron comparables. El TDB 1G7.v1.4 se unió a FcRH5 humana y FcRH3 humana con una Kd de 2,4 nM y ~80 nM, respectivamente, y el TDB 1G7.v85 se unió a FcRH5 humana y FcRH3 humana con una K<d>de 2,4 nM y ~90 nM, respectivamente (figs. 10A-10D). También se generaron variantes anti-FcRH5 adicionales hu7D8.L1H2, 17B1-VH66, 17B1 y 15G8 (secuencias presentadas en las figs. 11A-13B) en el formato TDB con el brazo anti-CD3 38E4.v1. Se sometió a prueba la unión de los TDB hu7D8.L1H2, 17B1 y 15G8 a FcRH5 humana y de cyno. Los resultados se presentan en la fig. 14 y en la tabla 4.
La comparación de la unión del TDB 1G7.v85 y el TDB 1G7.v93 a FcRH5 humana y FcRH5 de cyno se llevó a cabo mediante análisis BIACORE® (fig. 15). El TDB 1G7.v85 presentó una Kd de 2,1 nM para la unión a FcRH5 humana y una Kd de 7,8 nm para la unión a FcRH5 de cyno. El TDB 1G7.v93 presentó una Kd de 1,1 nM para FcRH5 humana y de 8,1 nm para FcRH5 de cyno.
Se llevaron a cabo experimentos de caracterización cinética (véase la tabla 8). En estos experimentos, se analizó la unión del fragmento de proteína FcRH5 soluble a anticuerpos purificados en formato de anticuerpo TDB humano a seis concentraciones diferentes distintas de cero (una serie de diluciones 1:3, una concentración inyectada dos veces como réplica). Se fijó el caudal en 40 |jl/min y se monitorizaron la asociación y disociación durante 600 s. El análisis cinético de la afinidad de TDB 1G7.v85 monovalente usando un formato de captura hlgG y un modelo de unión 1:1 produjo una Kd para FcRH5 humana y FcRH5 de cyno de 2,4 nM y 6,8 nM, respectivamente (figs. 16A-16B). La mutación de Met-64HC propenso a la oxidación a Val en el TDB 1G7.v85 no afectó a la afinidad de unión.
C. Ensayos de citotoxicidad in vitro
Para evaluar la función de las variantes de TDB contra FcRH5 humanizado, se sometió a prueba la citotoxicidad celular en células FcRH5 MOLP-2 que expresan endógenamente FcRH5. Todas las variantes mostraron una actividad de destrucción de células diana similar, pero una actividad significativamente incrementada en comparación con el 1G7 murino (figs. 17A-17B). En el caso de la variante TDB 1G7.v1.4, la CE50 mejoró de 5 a 13 veces en relación con el TDB 1G7 murino (n = 10).
En base a su alta actividad citotóxica y baja reactividad cruzada con otros miembros de la familia, se seleccionó el TDB 1G7.v1.4 para un análisis adicional. Para incrementar la estabilidad de la molécula de TDB, el brazo 1G7.v1.4 se mutó en los sitios de oxidación potenciales, generando de este modo una versión refinada, 1G7.v85. Se evaluaron las dos versiones, 1G7.v1.4 y 1G7.v85, en el formato TDB en diversos ensayos, incluyendo la activación de linfocitos T, la actividad de destrucción de células diana MOLP-2, la depleción in vitro de linfocitos B de cyno y la depleción de células plasmáticas de cyno (figs. 18A-18D). En todos los ensayos sometidos a prueba, el TDB 1G7.v85 se comportó de manera indistinguible del TDB 1G7.v1.4.
El TDB 1G7.v87 humanizado y refinado también se comparó con el TDB 1G7.v85. En consonancia con su menor afinidad, el TDB 1G7.v87 presentó una unión reducida a FcRH5 humana en relación con el TDB 1G7.v85, como se indica mediante análisis de citometría de flujo (fig. 19A). 1G7.v87 también mostró reactividad cruzada negativa con FcRH3.
Se evaluó la citotoxicidad de células diana del TDB 1G7.v87 y el TDB 1G7.v85 en células MOLP-2CD8+ (fig. 19B) y en CMSP de cuatro donantes sanos (figs. 19C). En todos los donantes, el TDB 1G7.v87 fue negativo para la destrucción de linfocitos B humanos, mientras que el TDB 1G7.v85 mostró cierto grado de actividad de destrucción positiva. También se sometieron a prueba CMSP de cyno de cuatro donantes sanos (fig. 19D). La clasificación de las CE50 de tres versiones de TDB 1G7 es consecuente en los tres donantes. El TDB 1G7.v87 es comparable al TDB 1G7 murino, pero tiene una actividad significativamente menor que el TDB 1G7.v85. El TDB 1G7.v87 mostró una actividad de destrucción significativamente más débil que el<t>D<b>1G7.v85 en linfocitos B de cyno in vitro. También se evaluó la actividad de TDB 1G7.v85 en linfocitos NK humanos y se descubrió que no tenía actividad de destrucción ≤20 jg/m l (fig. 9B). La CE50 de TDB 1G7.v85 fue de 5 a 8 veces mejor que la de TDB 1G7.v87.
D. Evaluación molecular de la estabilidad de TDB contra FcRH5
La estabilidad química de hu1G7.v1 antes de la maduración de afinidad indicó susceptibilidad a la oxidación en Met-64HC y Trp-52HC. Las muestras de TDB 1G7.v85 se sometieron a estrés mediante AAPH y pruebas de estrés con luz y se evaluaron para determinar la unión a FcRH5 mediante BIACORE®. El TDB 1G7.v85 demostró una unión reducida para FcRH5 después de las pruebas de AAPH y de estrés con luz en comparación con un control sin estrés (figs. 20A-20D). Se evaluó la estabilidad del monómero y la heterogeneidad de carga del TDB 1G7.v85 mediante cromatografía de exclusión por tamaño (CET) y enfoque isoeléctrico capilar con imágenes (icIEF), respectivamente, después de someterse a estrés en un tampón de pH bajo (his-acetato, pH 5,5) durante 2 semanas (figs. 21A-21B). El cambio observable en la pérdida del pico de monómero fue pequeño tanto para la estabilidad del monómero (0,1 %) como para la heterogeneidad de la carga (7,7 %) (figs. 21A-21B). Además, no hubo cambios observables en la masa de la cadena ligera ni de la cadena pesada de TDB 1G7.v85 después de dos semanas de estrés por pH bajo (figs. 22A-22B). Después del estrés térmico a 30 °C durante 2 semanas, la pérdida del pico de monómero fue del 0,1 % por CET y del 8 % por icIEF.
E. Se requiere un epítopo proximal a la membrana para la señalización eficiente de TCR y la actividad de destrucción de TDB contra FcRH5
Para caracterizar los acontecimientos moleculares que dan lugar a la activación del receptor de linfocitos T (TCR) tras la estimulación por TDB contra FcRH5, se utilizó un sistema reconstituido (James et al., Nature. 487:64-69, 2012) que permite investigar de manera controlada los acontecimientos iniciales que dan lugar a la activación del receptor. Usando linfocitos CD8 de donantes sanos, el TDB 1G7/UCHT1.v9 dio como resultado una fosforilación de SLP76 muy potente, indicativa de la señalización de TCR, y una destrucción eficiente mediada de células diana (figs. 23A-23B; CE50 = 0,5 nM). Por el contrario, el TDB anti-gD, que se dirige a un epítopo distal a la membrana, no dio como resultado una señalización de TCR detectable y no pudo mediar la destrucción de linfocitos T (figs.
23A-23B). También se confirmó que la actividad de TDB venía dictada por la localización del epítopo y el tamaño del dominio extracelular dirigiéndose a células que expresaban una diana fuertemente truncado que retenía los epítopos 1G7 y gD (fig. 23C). La actividad del T<d>B 1G7/UCHT1.v9 proximal se incrementó 25 veces (fig. 23D; CE50 = 20 μM), y el TDB contra gD fue capaz de mediar eficazmente la destrucción de células (CE50 = 0,19 nM) cuando se eliminó la interferencia causada por el ECD. La posibilidad de que el nivel de expresión de la diana diferencial sea la causa de la diferencia de actividad entre líneas celulares se excluyó mediante análisis FACS (fig.
24A).
Para demostrar que las diferencias en la actividad de destrucción estaban relacionadas con el epítopo en lugar de ser propiedades de los clones de anticuerpos específicos, se sometieron a prueba un total de cinco clones de anticuerpos únicos dirigidos al dominio proximal a la membrana para el FcRH5 en formato TDB y se demostró que la actividad de cada clon era ~20 veces mayor en comparación con 10A8 (fig. 23E). El nivel de expresión endógena de FcRH5 en mieloma múltiple es bajo (por ejemplo, de ~100 a ~2000 copias/célula) y comparable con el de la línea celular de mieloma MOLP-2 (por ejemplo, ~2200 copias/célula). Cuando los linfocitos T se redirigieron para destruir células MOLP-2, solo los TDB proximales a la membrana indujeron la destrucción de las células MOLP-2. Dirigirse a la región intermedia de FcRH5 usando el TDB 10A8 no dio lugar a una activación de TCR suficientemente alta requerida para destruir las células de mieloma (fig. 24B).
F. TDB contra FcRH5 induce la destrucción celular dependiente de la diana y la proliferación de linfocitos T
En la fig. 18A se descubrió que el TDB 1G7.v1.4 y el TDB 1G7.v85 tenían capacidades de activación de linfocitos T indistinguibles. El TDB 1G7.v85 se evaluó en cuanto a la especificidad del epítopo 1G7 y la reactividad cruzada con cyno (figs. 25A-25C). El TDB 1G7/38E4.v1 (“TDB 1G7”) se unió a células m Ol P-2, linfocitos B de donantes sanos, células plasmáticas de médula ósea y células tumorales de mieloma primario como se esperaba (figs. 26A-26D). El análisis preclínico de la actividad del TDB 1G7 se inició mediante la caracterización del mecanismo de acción usando linfocitos CD8 de donantes sanos. El tratamiento con TDB 1G7 de células que expresan la diana dio como resultado una activación de linfocitos T dependiente de la dosis (fig. 27A). La actividad citotóxica del TDB 1G7 fue exclusiva de las células positivas diana y se correlacionó con el nivel de expresión de FcRH5 (fig. 27B). La activación de linfocitos T por estimulación con TDB 1G7 y células diana dio lugar a una proliferación potente de linfocitos T. En cinco días, el 95 % de los linfocitos CD8 habían sufrido hasta seis divisiones celulares, como se demostró por la dilución del tinte fluorescente CSFE (figs. 27C-27E). Se evaluó además la contribución del brazo anti-CD3 y del dominio Fc a la actividad citotóxica del TDB, y se descubrió que se requería un brazo anti-CD3 de alta afinidad, mientras que no se requería un dominio Fc, para lograr la actividad citotóxica (figs. 27F-27G).
G. TDB FcRH5 media en la destrucción potente de células plasmáticas normales y células de mieloma primario derivadas de pacientes
La expresión de FcRH5 en células de mieloma múltiple CD138+CD38+ y células plasmáticas de médula ósea normales se estudió usando TDB 1G7.v85 y FACS. Todas las células tumorales derivadas de pacientes y todas las células plasmáticas normales expresaron FcRH5 en todas las muestras, lo que sugiere una prevalencia del 100 % en el mieloma (fig. 28A). Se detectó una variabilidad considerable entre pacientes en cuanto al nivel de expresión en el mieloma. En general, el nivel de expresión en las células tumorales no fue significativamente elevado en comparación con las células plasmáticas normales, lo que sugiere que, probablemente, no era factible desarrollar un TDB contra FcRH5 que no afecte a las células plasmáticas normales y sea específico de las células tumorales. El nivel de expresión en los linfocitos B normales es consecuente y significativamente menor en comparación con las células plasmáticas normales y las células tumorales de mieloma múltiple.
El gen de FcRH5 se localiza en el punto de ruptura cromosómico en 1q21 (Hatzivassiliou et al., Immunity. 14:277-289, 2001). El análisis de ~20 biopsias de mieloma múltiple primario demostró una asociación significativa entre la expresión de ARN de FcRH5 y la ganancia de 1q21 (fig. 28E), lo que demuestra que la translocación cromosómica puede dar lugar a una sobreexpresión de FcRH5 en pacientes con mieloma de alto riesgo.
La capacidad del TDB 1G7.v85 para destruir células plasmáticas se analizó dirigiéndose a células mononucleares de médula ósea (CMMO) aisladas de aspirados de médula ósea de donantes sanos (fig. 28B). El TDB 1G7.v85 indujo la destrucción de células plasmáticas de forma dependiente de la dosis, altamente eficaz y potente (CE50 = 85-180 μM). Se detectó una actividad potente similar cuando CMMO de pacientes con mieloma múltiple se sometió a tratamiento con TDB 1G7.v85 (fig. 28C). Se detectó casi el 100 % de destrucción de células de mieloma con alta potencia (CE50 = 60-1200 μM), independientemente de los antecedentes de tratamiento in vitro.
Como la expresión de FcRH5 es variable en el mieloma (fig. 28A) y la actividad de TDB 1G7.v85 se correlaciona con el nivel de expresión (fig. 28D), también se investigó si los pacientes en el extremo inferior del espectro de expresión responderían al TDB contra FcRH5. La línea celular de mieloma MOLP-2 se identificó como una línea celular de referencia que tiene un nivel de expresión de FcRH5 que es similar a la expresión promedio en células plasmáticas y células de MM primario (fig. 28A). También identificamos varias líneas celulares de cáncer que expresan niveles extremadamente bajos de la diana y determinamos la cantidad de FcRH5 por célula mediante análisis de Scatchard. El intervalo de sitios de unión a FcRH5 en estas líneas celulares varió desde 2200 hasta tan solo 160 por célula. A pesar de un número de copias de diana muy bajo, el TDB 1G7.v85 indujo una destrucción potente de todas las líneas celulares sometidas a prueba (CE50 = 2-230 μM). Los cálculos de ocupación indicaron que tan solo ~50 moléculas de TDB (un 2 % de ocupación en MOLP-2; CE50 = 58 μM) fueron suficientes para inducir la activación de los linfocitos T y la apoptosis de las células diana.
En resumen, FcRH5 se expresa en todos los pacientes con mieloma. Los TDB contra FcRH5 pueden destruir células plasmáticas humanas y células tumorales de mieloma primario derivadas de pacientes en dosis de μM. Dado que se requieren muy pocos TDB para redirigir la actividad de los linfocitos T, la molécula destruye de forma potente las células con una expresión muy baja de la diana. Los resultados sugieren que los TDB contra FcRH5 tienen el potencial de ser ampliamente activos en pacientes con mieloma y no respaldan la exclusión de pacientes del tratamiento basado en el nivel de expresión de FcRH5.
H. El macaco cangrejero (cyno) es un modelo apropiado de seguridad y eficacia para TDB contra FcRH5
El análisis FACS de linfocitos B periféricos y células plasmáticas de médula ósea confirmó que FcRH5 se expresa en todo el linaje de linfocitos B en cyno de forma similar a en los seres humanos (figs. 29A-29B; Polson et al., Int. Immunol. 18:1363-1373, 2006). Las secuencias de aminoácidos de FcRH5 humana y de cyno son idénticas en un 89 %, y el TDB 1G7.v85 se une a FcRH5 de cyno y CD3 con una afinidad comparable. El tratamiento in vitro de células diana que expresan FcRH5 de cyno o células MOLP-2 que expresan FcRH5 humana dio como resultado una destrucción potente usando linfocitos T periféricos de seres humanos o cyno con una eficacia comparable (figs. 29C-29D). La adición de TDB 1G7.v85 a muestras de CMSP/CMMO de cyno dio como resultado una destrucción potente y dependiente de la dosis de linfocitos B de cyno (fig. 29E) y células plasmáticas de médula ósea (fig. 29F). En la fig. 18C, se descubrió que el TDB 1 G7.v1.4 y TDB 1 G7.v85 tenían capacidades de destrucción de células plasmáticas de cyno indistinguibles. Estos resultados validan a cyno como un modelo apropiado de seguridad y eficacia para anti-FcRH5/CD3.
Ejemplo 4. Caracterizaciónin vivode TDB contra FcRH5 ejemplares
Materiales y procedimientos
A. Estudios de eficacia in vivo en modelos murinos
a. Modelo de xenoinjerto de ratón huNSG/MOLP-2
Se obtuvieron ratones hembra humanizados NOD.Cg-Prkdcscid ll2rgtm1Wjl/SzJ (NOD/scid gamma; NSG) de The Jackson Laboratory. El día de la inoculación celular, se inocularon 0,2 ml de células tumorales MOLP-2 a cinco animales a una concentración de 100 millones de células/ml, en HBSS/matrigel, por vía subcutánea en el costado derecho. Tan pronto como los volúmenes del tumor alcanzaron un intervalo de volumen de 100-250 mm3, los animales se aleatorizaron en dos grupos, un grupo de vehículo y uno de tratamiento, y los primeros tratamientos se administraron en ese momento (día 0). Todos los tratamientos se administraron una vez por semana mediante inyección intravenosa (i.v.) en la vena de la cola para un total de cuatro dosis. Se trató al grupo de vehículo con 0,1 ml de acetato de histidina 20 mM, pH 5,5, sacarosa 240 mM, tampón TW-20 al 0,02 %. Se trató al grupo de tratamiento con 0,1 ml de TDB 1G7.v85 a una concentración de 0,5 mg/kg. Se midieron los tumores 1-2 veces por semana con calibradores durante la duración del estudio, y se midieron los pesos corporales de los animales al menos una vez por semana. Durante la duración de este estudio, se realizaron observaciones clínicas dos veces por semana para monitorizar la salud de los animales.
B. Estudio toxicológico en macacos cangrejeros
Se evaluaron la tolerabilidad, el perfil de toxicidad, la farmacocinética (FC) y la farmacodinámica (FD) del TDB anti-FcRH5 en macacos cangrejeros (cynos) macho sin tratamiento previo en Charles River Laboratories (CRL). Se trató a los cynos con una dosis única, infusión intravenosa (1 h) de vehículo, 1, 2 o 4 mg/kg de TDB 1G7.v85 y se les realizó la autopsia siete días después del tratamiento. Se monitorizó de cerca a los animales para observaciones clínicas detalladas, frecuencia respiratoria y temperatura corporal durante las primeras cinco horas y en el momento del sacrificio. Se recogieron diariamente observaciones clínicas en la jaula y los pesos corporales. Las muestras de sangre se extrajeron mediante venopunción por medio de la vena femoral antes del estudio y en puntos temporales seleccionados a lo largo del estudio para análisis de hematología, química sérica, coagulación y niveles totales de anticuerpos FC y criterios de valoración de FD. La FC consistió en mediciones de citocinas (IL-1 p, IL-1RA, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12/23, IL-13, IL-17, G-CSF, GM-CSF, IFN-<y>, TNF-a, y MCP-1), citometría de flujo de linfocitos T, linfocitos B, linfocitos NK, linfocitos T activados, PD-1 y IgG de cyno circulante. Se recogió médula ósea en animales anestesiados mediante aspiración del húmero antes del estudio y antes de la autopsia el día 8 para la evaluación de linfocitos B y células plasmáticas mediante citometría de flujo. En la autopsia, se midieron los pesos de los órganos y se examinaron minuciosamente los órganos y tejidos seleccionados mediante examen macroscópico y microscópico. Se evaluaron los ganglios linfáticos esplénicos, mesentéricos y mandibulares para detectar linfocitos T, linfocitos B y linfocitos NK. Todos los procedimientos se realizaron de conformidad con la "Animal Welfare Act, the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (Ley de bienestar animal, guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio) y la Office of Laboratory Animal welfare (oficina para el bienestar de los animales de laboratorio).
C. Estudio FC/FD en macacos cangrejeros y ratones
Se determinaron las concentraciones de TDB contra FcRH5 en suero mediante ELISA genérico. Se usó anticuerpo anti-IgG humana ovino como el reactivo de captura y se usó anti-IgG humana caprino conjugado a peroxidasa de rábano picante (PRP) como el reactivo de detección. Se analizó el análisis de la concentración sérica con el tiempo de las muestras disponibles mediante un modelo no compartimental con entrada de bolo i.v. (Phoenix™ WinNonlin®, versión 6.3; Pharsight Corporation; Mountain View, CA). En el análisis de datos se usaron el tiempo nominal de recogida de muestras y las concentraciones de dosis nominales. Todo el análisis TK se basó en datos de animales individuales.
Resultados
A. TDB contra FcRH5 suprime el crecim iento de tumores de MOLP-2 establecidos en ratones reconstituidos con células inmunitarias humanas
El modelado de la actividad antimieloma de TDB contra FcRH5 en ratones es complicado, ya que los anticuerpos anti-CD3 no reaccionan de forma cruzada con CD3 de ratón y no existe un ortólogo de FcRH5 en ratones. Por lo tanto, se estableció un modelo de ratón con un sistema inmunitario humano reconstituido mediante el trasplante de células madre hematopoyéticas humanas seleccionadas CD34+ en ratones irradiados (ratones huNSG). Los linfocitos CD8+ humanos recogidos de bazos de ratones huNSG pudieron destruir células MOLP2 in vitro con una eficacia comparable a los linfocitos CD8+ periféricos humanos de donantes sanos (fig. 30A). Veinte semanas después del trasplante, se inocularon cinco millones de células MOLP-2 por vía subcutánea a los ratones huNSG. Se trató a los ratones con tumores establecidos de 100-200 mm3 con una única dosis i.v. de vehículo o 0,5 mg/kg de TDB contra FcRH5. El tratamiento con TDB contra FcRH5 dio como resultado la regresión del tumor en todos los animales (fig. 30B), lo que indica que el tratamiento con TDB contra FcRH5 suprime el crecimiento tumoral in vivo.
B. TDB contra FcRH5 tiene una semivida sérica prolongada
Se diseñó un estudio de dosis única para evaluar la seguridad, eficacia, propiedades farmacocinéticas (FC) y farmacodinámicas (FD) de TDB 1G7.v85 en primates no humanos. Se trató a los cynos con una única dosis intravenosa de infusión lenta de vehículo o 1-4 mg/kg de TDB 1G7.v85. Se monitorizó de cerca a los animales para detectar efectos adversos. Se recogieron muestras de sangre a las 0, 2, 6 y 24 h para análisis de citocinas, análisis de patología clínica y respuesta FC/FD. El estudio finalizó siete días después de la administración del tratamiento. El TDB contra FcRH5 demostró una exposición proporcional a la dosis (Cmáx y ABC) entre 1 y 4 mg/kg y se aclaró a 29-33 ml/día/kg en todas las cohortes (fig. 3 lA ) y la Cmáx al nivel de dosis de 4 mg/kg fue de 129 |jg/ml. Esto es ~2000 veces mayor que lo requerido para alcanzar la CE50 in vitro que destruye las células plasmáticas humanas y MOLP-2. También se realizó un estudio FC en ratones SCID.bg, que no se presentan unión, y se descubrió que el TDB 1G7.v85 tenía tasas de aclaramiento comparables a las del TDB anti-gD (fig. 31B). Los cálculos de ocupación del receptor sugirieron acoplamiento a FcRH5 casi saturado en linfocitos B de sangre periférica a la Cmáx en todos los niveles de dosis (fig. 32D). Estos resultados demostraron que el TDB 1G7.v85 tiene una semivida in vivo prolongada y respalda una pauta de dosificación semanal o menos frecuente.
C. TDB contra FcRH5 provoca la depleción de linfocitos B y células plasmáticas de la médula ósea en cyno
El análisis FACS de sangre periférica demostró un efecto farmacológico potente en todos los niveles de dosis. El tratamiento con TDB 1G7.v85 dio como resultado la activación de linfocitos T y linfocitopenia transitoria (respuesta de marginación) en 24 horas (figs. 31C-31D). Los linfocitos B permanecieron indetectables en la sangre siete días después de la dosis, lo que sugiere su depleción por el TDB 1 G7.v85 (fig. 31E). Por el contrario, los linfocitos CD4+ y CD8+ se recuperaron al final del estudio (figs. 32A-32B). Todos los niveles de dosis dieron como resultado la depleción completa de los linfocitos B en el bazo y la médula ósea (figs. 31F y 31H). El tratamiento con FcRH5 indujo una fuerte depleción dependiente de la dosis de linfocitos B también de los ganglios linfáticos (figs. 31G y 32C).
La depleción de las células plasmáticas de la médula ósea de cyno in vivo es un criterio de valoración de eficacia clave en el desarrollo preclínico de anti-FcRH5/CD3. Se detectó depleción completa de las células plasmáticas en los animales tratados con dosis de 2-4 mg/kg (fig. 31l). El tratamiento con TDB 1G7.v85 también dio como resultado una reducción dependiente de la dosis de IgG de cyno, un criterio de valoración secundario esperado resultante de la depleción de las células plasmáticas. Teóricamente, la depleción completa de las células plasmáticas debería disminuir el nivel de IgG ~30-40 % en el día 7. La reducción medida en IgG de cyno fue del 37 % en el grupo de 2 mg/kg y del 44 % en el grupo de 4 mg/kg (fig. 31J). En resumen, los TDB 1G7.v85 indujeron una respuesta potente de FD en cyno, consecuente con su mecanismo de acción. La depleción completa de las células plasmáticas proporciona pruebas convincentes de la eficacia en el microambiente de la médula ósea.
D. TDB contra FcRH5 se tolera bien en cyno
El TDB 1G7.v85 se tolera bien en cyno a niveles de dosis de ≤4 mg/kg. Los efectos adversos leves/moderados que se detectaron fueron similares en todos los niveles de dosis y no se pudo ver una respuesta clara a la dosis. Las observaciones clínicas se limitaron a incrementos reversibles de la temperatura corporal que variaron entre 0,4 y 1,6 °C dentro de las cuatro horas posteriores a la dosis. Los efectos sobre la hematología consistieron en la esperada linfocitopenia aguda y reversible atribuida a la marginación. Como era de esperar, se detectaron pruebas de un estado proinflamatorio agudo y reversible (incremento en la CRP, fibrinógeno, tiempo de protrombina y tiempo de tromboplastina parcial activada). El tratamiento provocó un incremento reversible de ALT, AST y bilirrubina total.
Consecuente con el mecanismo de acción, el TDB 1G7.v85 indujo una liberación de citocinas rápida, en general, leve/moderada (figs. 33A-33F). Todos los niveles de dosis indujeron una respuesta proinflamatoria (incluyendo IL-6, IL-5, IFN-g, IL-2, IL-13, G-CSF y MCP-1) y una respuesta antiinflamatoria para contrarrestar esto (IL1R) con un pico a las 2-6 h. Todas las citocinas revirtieron al nivel normal en 24 horas. No se observaron signos de liberación extensa o prolongada de citocinas. Un análisis histopatológico extenso que incluyó un análisis detallado del sistema nervioso central (SNC) no reveló una toxicidad significativa para los órganos. En resumen, en el estudio no se alcanzó la dosis máxima tolerada. El TDB 1G7.v85 se toleró bien a niveles de dosis que se espera que saturen la diana y sean suficientes para la depleción completa de los linfocitos B y las células plasmáticas. No se detectó respuesta a la dosis en los efectos adversos.
Ejemplo 5. Politerapias de FcRH5
Para examinar posibles politerapias de FcRH5, se sometió a prueba un TDB contra FcRH5 en combinación con cada uno de los dos antagonistas de unión al eje PD-1 ejemplares. Estos experimentos demostraron que, si bien la señalización de retroalimentación de PD-1/PD-L1 podría reducir la destrucción mediada por TDB contra FcRH5, el bloqueo de PD-L1 superó esta inhibición, lo que dio como resultado una eficacia terapéutica mejorada.
Materiales y procedimientos
A. Anticuerpos
Todos los anticuerpos marcados para citometría de flujo, excepto los que se mencionan de otro modo, se adquirieron de BD Bioscience. El anticuerpo anti-PD-1 usado fue KEYTRUDA® (pembrolizumab) y el anticuerpo anti-PD-L1 se generó en Genentech, Inc. El anti-IgG humana caprino y el anti-IgG de ratón caprino se adquirieron de Jackson Immunoresearch. El anti-PC-FITC (clon Vs38c) se adquirió de DAKO.
B. Ensayo de inducción y citotoxicidad de PD-1 con anti-PD-L1
Se mezclaron linfocitos T CD8+ humanos aislados recientes con células MOLP-2 en una proporción 1:1 y se cocultivaron en presencia de 1000 ng/ml de TDB 1G7.v85 durante 48 horas. Se tiñeron las células con un anticuerpo anti-CD8 marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) ("anti-CD8-FITC"), un anticuerpo anti-CD69 conjugado con ficoeritrina (PE) ("anti-CD69-PE") y un anticuerpo anti-PD-1 conjugado con aloficocianina (APC) ("anti-PD-1-APC"), y se analizaron mediante citometría de flujo. Se preparó un ensayo de citotoxicidad de células HEK-293T que expresan FcRH5 y PD-L1 ("células 293-FcRH5-PD-L1"), como se describe en general en el presente documento, con o sin 10 mg/ml de anticuerpo anti-PD-L1 o anti-PD-1 y se analizó mediante citometría de flujo.
C. Cultivo celular y generación de líneas celulares estables
El efecto de la señalización de PD-1/PD-L1 en la actividad de TDB 1G7.v85 se evaluó infectando células HEK-293T con lentivirus que codifican FcRH5, seguido de la transfección de un plásmido codificante de PD-L1 humano usando lipofectamina (Invitrogen).
D. Ensayos de activación de linfocitos T y de citotoxicidad in vitro
Las células diana se marcaron con carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Life Technology, n.° C34554). Se mezclaron las células diana marcadas con CFSE y los linfocitos CD8+ purificados en una proporción 3:1 de células efectoras a células diana (E:T) y se incubaron con TDB 1G7.v85 durante de 24 a 48 horas. Al final de la incubación, se analizaron las células con citometría de flujo en un FACSCalibur en formato de automatización. Se contó el número de células diana vivas seleccionando células CFSE+/negativas para IP. El porcentaje de citotoxicidad se calculó como sigue: % de citotoxicidad (número de células diana vivas sin TDB - número de células diana vivas con TDB)/(número de células diana vivas sin TDB) X 100.
Resultados
A. El bloqueo de PD-1/PD-L1 potencia la actividad de TDB contra FcRH5
Una fuerte señal de estimulación de TCR puede dar lugar a una retroalimentación inmunosupresora que restringe la actividad de los linfocitos T. La vía PD-1/PD-L1 es un componente crítico de esta retroalimentación y un mecanismo de escape inmunitario validado terapéuticamente en varias indicaciones tumorales. PD-L1 se expresa con frecuencia en células tumorales de mieloma (Gorgun et al., Amer. Assoc. for Cáncer Res. 21:4607-4618, 2015) y su señalización puede limitar la actividad de los linfocitos T en pacientes con mieloma. PD-1 está ausente en los linfocitos T en reposo, se induce tras la activación de los linfocitos T y limita la actividad de los linfocitos T en la infección crónica (Zou et al., Science Tran. Med. 8:328rv324, 2016). La estimulación con TDB 1G7.v85 (48 h) de linfocitos CD8+ de donantes sanos humanos en presencia de células que expresan FcRH5 dio como resultado una inducción significativa de PD-1 en linfocitos T (fig. 34). La señal de retroalimentación también se activa in vivo. Se observó un incremento significativo de linfocitos T positivos para PD-1 en linfocitos T de cyno a todos los niveles de dosis. Se detectó inducción de PD-1 en linfocitos CD8+ y CD4+ en sangre, bazo, ganglios linfáticos y médula ósea (figs. 35A-35B y 36A-36D).
Se evaluó la destrucción de células diana mediada por TDB 1G7.v85 con linfocitos CD8+ sensibilizados en presencia y ausencia de antagonistas de PD-1/PD-L1. La eficacia del TDB 1G7.v85 para sensibilizar los linfocitos T CD8+ para destruir las células diana que expresan PD-L1 fue modesta (fig. 37A). El bloqueo de la señalización de PD-1/PD-L1 usando el anticuerpo anti-PD-L1 incrementó significativamente la eficacia de la destrucción mediada por TDB 1G7.v85 (fig. 37A). En un experimento particular, se mezclaron linfocitos CD8+ sensibilizados con células 293-FcRH5-PD-L1 y se trataron con TDB 1G7.v85 solo o en combinación con un anticuerpo anti-PD-L1 o bien con el anticuerpo anti-PD-1 (pembrolizumab) (fig. 37B). El tratamiento combinado con un anticuerpo anti-PD-L1 o un anticuerpo anti-PD-1 (pembrolizumab) potenció significativamente la eficacia de TDB 1G7.v85. La CE50 para ambos procedimientos de tratamiento combinado fue de 0,4 ng/ml, mientras que la CE50 para el tratamiento con T<d>B 1G7.v85 solo fue de 0,63 ng/ml (fig. 37B).
Estos resultados demuestran que la activación de linfocitos T mediada por TDB 1G7.v85 da lugar a la inducción de PD-1 en linfocitos T in vitro e in vivo. Estos resultados demuestran además que la señalización de PD-1/PD-L1 puede limitar la destrucción mediada por TDB contra FcRH5 y que el bloqueo de PD-L1 puede superar esta inhibición y dar lugar a una eficacia mejorada. Estos datos respaldan el uso de TDB contra FcRH5 en combinación con un antagonista de unión al eje PD-1, tal como un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-PD-L1.
B. La dexametasona reduce la respuesta de las citocinas a la primera dosis sin afectar a la actividad de TDB contra FcRH5
También se evaluó la destrucción de células diana en presencia y ausencia de dexametasona (Dex), un componente del tratamiento de referencia en el mieloma que tiene efectos antiinflamatorios e inmunosupresores (fig. 38A). La CI50 para el TDB 1G7.v85 en tampón o en DMSO fue de 7 μM y 6 μM, respectivamente. En presencia de Dex 0,1<|j>M o 1<|j>M, la CI50 para el TDB 1G7.v85 fue de 16 μM y 25 μM, respectivamente. El tratamiento combinado con Dex tuvo solo un efecto modesto sobre la eficacia de<t>D<b>1G7.v85 y redujo significativamente los niveles de IL-2, IL-6, TNF-a e IFN-y. Estos resultados demuestran que la dexametasona se puede usar en combinación con el tratamiento con TDB contra FcRH5 para mitigar una respuesta de las citocinas a la primera dosis en pacientes (fig. 38B).
Ejemplo 6. Producción y pruebas de bis-Fab contra FcRH5
A. Preparación de thio-Fab y bisagra-cys-Fab y producción de proteínas
Para preparar fragmentos de anticuerpos con grupos sulfhidrilo libres, se introdujeron sustituciones de cisteína (Cys) en construcciones de anticuerpos en diversas posiciones en los dominios variables o constantes de las cadenas ligeras o cadenas pesadas mediante mutagénesis dirigida al sitio para crear thioMAb, como se describe previamente en Junutula et al., J. Immunol Methods 332(1-2):41-52, 2008. Los thio-Fab se generaron enzimáticamente a partir de thioMAb mediante dilución de thioMAb a 1 mg/ml en Tris 25 mM, pH 8,0, seguido de digestión enzimática a 37 °C durante 1 hora usando Lys-C (Wako Chemicals USA, Inc., Richmond, VA) en una proporción 1:1000 (peso:peso) de enzima a anticuerpo. La digestión con Lys-C se detuvo con 5 j M del inhibidor de proteasa tosil-L-lisina clorometilcetona (TLCK) (Bachem, Torrence, CA) y se purificó mediante cromatografía de intercambio catiónico en una columna Hi-Trap SP FF de 5 ml (GE Healthcare, Piscataway, NJ) usando un tampón de acetato de sodio 50 mM y un gradiente de 10 volúmenes de columna (VC) de NaCl de 0-300 mM. A veces, los thio-Fab producidos por este procedimiento se denominan "thio-Fab enzimáticos" en el presente documento. En otro enfoque, se subclonaron construcciones de ADN que codifican Fab que tienen un residuo de Cys genomanipulado o construcciones de ADN que codifican fragmentos de la cadena pesada que contienen un residuo de Cys natural en la región bisagra en vectores de expresión plasmídica y se expresaron directamente en células CHO. Los thio-Fab producidos por este procedimiento se denominan "thio-Fab recombinantes" en el presente documento. Se usó un tercer enfoque para los anticuerpos que carecían de un residuo de Cys genomanipulado y se basó en el/los residuo(s) de Cys natural(es) presente(s) en la región bisagra de IgG. Este procedimiento se usa para producir "bisagra-cys-Fab" y se describe con más detalle a continuación.
Para la preparación de bisagra-cys-Fab a partir de anticuerpos naturales que no contienen una cisteína genomanipulada para su uso en reacciones de síntesis, se usó el siguiente procedimiento enzimático, como se representa en el panel 1 de la fig. 39. Ambos anticuerpos originales FcRH5 y CD3 se digirieron con tratamiento con pepsina (1 % p/p) en tampón de acetato de sodio a pH 4,5. Después de la digestión durante 1 hora, se aisló el F(ab')2de la mezcla de digestión mediante captura en una resina de intercambio catiónico SP-HP y se purificó mediante un gradiente de sal de 10 VC de NaCl 0-1 M. A continuación, se redujo el F(ab')2en un tampón que contenía MES 25 mm, pH 5,8, EDTA 2 mM y NaCl 300 mM. Después de la reducción con TCEP 1 mM, los Fab se oxidaron, como se representa en el panel 2 de la fig. 39, mediante la adición de DHAA 5 mM para volver a formar el puente disulfuro entre la cadena pesada y la cadena ligera. Se observó de forma rutinaria que, en estas condiciones de reacción, solo se volvía a formar el puente disulfuro entre la cadena pesada y la cadena ligera; los dos residuos de cisteína en la región bisagra permanecieron sin oxidar.
Los dos tioles libres (residuos de Cys) en la bisagra, como se representa en el panel 2 de la fig. 39, a continuación, se hicieron reaccionar con un equivalente 1 M de N-etilmaleimida (NEM) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). A continuación, se hizo reaccionar la mezcla resultante que contenía Fab modificados individualmente, modificados doblemente y sin modificar, como se representa en el panel 3 de la fig. 39, con un exceso del agente de reticulación de bis-maleimida.
Estas condiciones de reacción proporcionaron tres productos: Fabs con un agente de reticulación y un NEM, Fab con dos NEM y Fab que contienen solo un agente de reticulación. Se descubrió que los Fab que contenían solo un agente de reticulación no tenían cisteína libre. Por tanto, en estas condiciones de reacción, un solo agente de reticulación reaccionó muy eficazmente con ambas cisteínas dando como resultado una molécula en la que el agente de reticulación había ciclado las cisteínas. El material que comprende los tres productos de reacción anteriores se purificó de la mezcla de reacción (para eliminar los componentes de reacción no deseados) mediante filtración en gel y se usó en el acoplamiento con otros bisagra-cys-Fab, como se muestra en el panel 4 de la fig.
39, preparados de forma similar o con thio-Fab. Solo los bisagra-cys-Fab o thio-Fab preparados como se describe y que contenían un agente de reticulación, una maleimida libre y un sulfhidrilo libre pudieron reaccionar en las reacciones de síntesis de bis-Fab descritas en detalle a continuación.
B. Expresión y purificación de proteínas
Para facilitar la purificación, los Fab se expresaron con una marca Flag o His. La expresión en células CHO se llevó a cabo mediante procedimientos estándar. La purificación por afinidad después del cultivo celular se llevó a cabo usando resina anti-Flag mAb o resina de perlas de níquel. Los thio-Fab purificados se caracterizaron por SDS-PAGE y espectrometría de masas. A menudo, estas caracterizaciones mostraron incrementos de masa de 275 Da y 306 Da. Se descubrió que estos incrementos de masa eran aductos de disulfuro en la cisteína no apareada que se eliminaron por reducción y oxidación para preparar los thio-Fab para la reticulación con bismaleimida. La reducción y oxidación de thio-Fab se llevó a cabo como sigue. En primer lugar, los thio-Fab se redujeron durante 24 horas mediante la adición de tris(2-carboxietil)fosfina HCI (TCEP-HCl; también denominado TCEP) 2 mM (Pierce [Thermo Fisher Scientific], Rockford, IL) en un tampón que contenía MES 25 mM, pH 5,8, 300 ml de NaCl y EDTA 5 mM. Después de la reducción, la proteína se oxidó mediante la adición de ácido deshidroascórbico (DHAA) 5 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Los thio-Fab aislados se analizaron mediante SDS-PAGE y espectrometría de masas para garantizar que las proteínas se reducían y oxidaban apropiadamente.
C. Síntesis de bis-Fab
Se podían usar dos tipos diferentes de agentes de reticulación para enlazar covalentemente los dos Fab: bismaleimida y el par de adaptadores DBCO-PEG-maleimida/bromoacetamida-PEG-Acida.
Conjugación usando agentes de reticulación de bis-maleimida
En la primera etapa de la síntesis de bis-Fab se usaron thio-Fab o bisagra-cys-Fab con una cisteína no apareada. En general, el thio-Fab o bisagra-cys-Fab estaba en el mismo tampón en el que se llevó a cabo la reducción (fig.
39, panel 1) y oxidación (fig. 39, panel 2) (MES, pH 5,8, EDTA 2 mM y NaCl 300 mM) a una concentración de proteína de 1 mg/ml. Había dos posibles productos de reacción no deseados en esta etapa: dímeros de disulfuro y dímeros reticulados. Tener una concentración de proteína de 1 mg/ml en esta fase de la síntesis fue un rasgo característico importante de la reacción porque la dimerización se minimizó a esa concentración de proteína. Además, el control de la reacción usando un tampón de pH bajo con EDTA ayudó a minimizar la dimerización.
Se añadió a la mezcla de reacción un exceso de cinco veces de agente de reticulación de bis-maleimida (Quanta BioDesign, Powell, OH), como se representa en el panel 3 de la fig. 39. Este exceso de cinco veces de agente de reticulación también fue útil para minimizar la dimerización no deseable. Se incubó la reacción a temperatura ambiente (TA) o a 37 °C durante cuatro horas hasta que se completó. A continuación, se concentró la mezcla hasta un volumen adecuado para la filtración en gel. Se usó una columna Tricom S-200 de 22 ml (GE Healthcare, Piscataway, NJ) para la síntesis de cantidades de |jg a mg. Esta primera etapa de filtración en gel permitió la eliminación del agente de reticulación no usado proporcionando un thio-Fab o bisagra-cys-Fab purificado conjugado al agente de reticulación. Las condiciones descritas anteriormente típicamente dieron como resultado al menos un 90 % o más del producto deseado. Ningún thio-Fab o bisagra-cys-Fab permaneció como tiol libre, ya que todos estaban conjugados a un agente de reticulación o unidos por puente disulfuro a otro thio-Fab o bisagracys-Fab a través de las cisteínas no apareadas. El thio-Fab aislado y purificado (o bisagra-cys-Fab) más la especie reticulante se añadieron a continuación al segundo thio-Fab (o bisagra-cys-Fab) y se concentró hasta 5 mg/ml o más, en general, hasta un volumen adecuado para la filtración en gel, como se representa en el panel 4 de la fig.
39. Una concentración de proteína de al menos 5 mg/ml durante esta fase de la síntesis fue importante para completar la reacción. Las concentraciones de proteína menores dieron como resultado la formación de solo pequeñas cantidades de dímeros bis-Fab reticulados. Sin estar ligado a ninguna teoría, se planteó la hipótesis de que un efecto estérico o una variable relacionada con la viscosidad que impedía la formación de dímeros de bis-Fab reticulados se superaba incrementando las concentraciones de los reactivos. Además, se sometió a prueba un intervalo de concentraciones de proteína de hasta 65 mg/ml inclusive. Se descubrió una correlación entre la concentración de proteína y el tiempo de reacción, de modo que cuanto mayor era la concentración de proteína, más rápido se completaba la reacción. Después de 2-24 horas a temperatura ambiente o a 37 °C, la reacción se completó según lo determinado por la espectrometría de masas. En general, un reactivo estaba en exceso y permaneció desacoplado en la mezcla final.
Conjugación usando DBCO-PEG-maleimida/bromoacetamida-PEG-Acida
Uno de los Fab purificados y desbloqueados se hizo reaccionar en un exceso 5 molar de DBCO-PEG-maleimida (n.° 760676, Sigma) en HEpES 50 mM pH 8, mientras que el otro Fab se hizo reaccionar con un exceso 5 molar de Acida-PEG-maleimida (n.° 21097 BroadPharm) en HEPES 50 mM pH 8. Después de una hora de incubación a 37 °C, se comprobó la reacción mediante espectrometría de masas para verificar que la reacción se había completado. Los Fab conjugados se purificaron del exceso de agente de reticulación mediante CET y, posteriormente, se mezclaron en una proporción 1:1 y se ajustaron a una concentración superior a 5 mg/ml y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente.
Independientemente del agente de reticulación usado, la reacción completada se purificó de nuevo mediante filtración en gel; esta vez se recogió el pico dimérico, que contenía el bis-Fab de 100 kD reticulado de forma irreversible a través del aminoácido de cisteína libre (en el caso de thio-Fab) o a través de la cisteína desapareada localizada en la región bisagra (en el caso de bisagra-cys-Fab sin genomanipulación). A menudo, el progreso de la reacción durante ambas etapas se monitorizaba mediante espectrometría de masas que mostraba claramente la presencia de ambos reactivos y la formación del producto bis-Fab. La pureza del producto deseado después de la segunda filtración en gel se determinó mediante espectrometría de masas y SDS-PAGE. Tras la reducción y el análisis SDS-PAGE, se observó una reticulación irreversible por la presencia de una banda de 50 kD que representa cadenas reticuladas no reducibles. Usando el procedimiento descrito anteriormente a pequeña escala, típicamente, se lograron rendimientos de microgramos con cantidades de microgramos de materiales de partida. Además, a mayor escala, se lograron típicamente rendimientos de miligramos a partir de cantidades de miligramos de materiales de partida.
D. Síntesis de bis-Fab dirigidos a CD3 y FcRH5
Se generaron bis-Fab biespecíficos obtenidos a partir de dos anticuerpos diferentes que se dirigen a CD3 y FcRH5. El anticuerpo original anti-CD3 usado podía ser cualquier anticuerpo anti-CD3, tal como 38E4v.1,38E4.v11 o 40G5. En un modo de realización, el bis-Fab utiliza 38E4.v1 como componente anti-CD3, con una secuencia de la cadena ligera de SEQ ID NO: 134 y una secuencia de la cadena pesada de SEQ ID NO: 133. El anticuerpo original del anticuerpo anti-FcRH5 usado también puede ser cualquier anti-FcRH5, por ejemplo, los anticuerpos descritos en el presente documento, tales como hu1G7.v85 y hu1G7.v87. Específicamente, un bis-Fab ejemplificado incluye una secuencia de la cadena ligera variable de s Eq ID NO: 105 y una secuencia de la cadena pesada variable de SEQ ID NO: 104.
Para cada uno de estos anticuerpos, se produjeron thio-Fab recombinantes en células CHO como se describe anteriormente. A continuación, se sintetizaron los bis-Fab a partir de los thio-Fab en un formato combinatorio usando una matriz de síntesis, comenzando con aproximadamente 2 mg de cada thio-Fab. Se combinaron los diferentes thio-Fab para sintetizar cuatro moléculas únicas de bis-Fab. Se recuperó aproximadamente un mg de cada bis-Fab de la síntesis para los ejemplos mostrados, pero se esperaba que los rendimientos variaran dependiendo de los diferentes thio-Fab. Cada uno de los bis-Fab recibió un identificador único. Se analizó la pureza de cada bis-Fab mediante SDS-PAGE y espectrometría de masas usando procedimientos estándar bien conocidos en la técnica.
Usando el enfoque de recombinación de matriz descrito anteriormente, se sintetizó una serie de variantes estructurales bis-Fab derivadas de CD3 y FcRH5. Se eligieron cuatro puntos de unión tio diferentes para sintetizar los bis-Fab; una de las posiciones estaba en la cadena pesada del brazo thio-Fab anti-CD3 (por ejemplo, en la posición 76 (Cys76Hc)), una posición estaba en la cadena ligera del brazo thio-Fab anti-CD3 (por ejemplo, en la posición 22 (Cys22Lc)), una de las posiciones estaba en la cadena pesada del brazo thio-Fab anti-FcRH5 (por ejemplo, en la posición 114 (Cys114Hc)) y una posición estaba en la cadena ligera del brazo thio-Fab anti-FcRH5 (por ejemplo, en la posición 149 (Cys149Lc)). Se pueden utilizar otras posiciones para la inserción de las cisteínas requeridas. Los Fab que contenían puntos de unión a tio se derivaron de tres fuentes diferentes; (1) thioMAb con sustituciones de cisteína que se digirieron con lisina-C para liberar el thio-Fab del anticuerpo, (2) thio-Fab con sustituciones de cisteína que se expresaron directamente y se purificaron a partir de células CHO, y (3) bisagracis-Fab generados por el procedimiento enzimático descrito anteriormente para la unión de un único agente de reticulación a la región bisagra de un anticuerpo sin genomanipulación después de la digestión con pepsina. Este enfoque dio como resultado diferentes puntos de sustitución en thio-Fab para la recombinación con otros thio-Fab, proporcionando por tanto variantes estructurales (véase la tabla 15).
Tabla 15. Posición de Cys genomanipulada en cada Fab y números bis-Fab correspondientes
E. Actividad biológica de bis-Fab contra FcRH5
Después, se sometió a prueba la capacidad de unión de cada una de las variantes estructurales de bis-Fab a cada uno de los antígenos (es decir, CD3 y FcRH5) mediante ELISA. El bis-Fab generado mediante la unión de la Cys en la región bisagra se asemejaba a la arquitectura de un anticuerpo natural y sirvió como control. Si bien todas las construcciones de bis-Fab tenían una capacidad similar de unión a FcRH5 (fig. 40A), la mayoría de los bis-Fab mostraron una unión reducida a CD3 en comparación con el bis-Fab de referencia (fig. 40B). Se evaluó la actividad biológica en un ensayo de activación de linfocitos T in vitro que sirvió como sustituto de la actividad de destrucción de linfocitos T (fig. 41). Este ensayo usó una línea de células Jurkat (Jurkat-Dual, Invivogen) transfectada de forma estable con un indicador de luciferasa bajo el control del factor de transcripción NF-kB, y la ventaja de usar este ensayo sobre un ensayo de destrucción de linfocitos T fue que la cantidad de células que se podía utilizar era ilimitada. En los ensayos de destrucción de células CMSP, el número de pruebas estaba limitado por el número de células que se podían obtener de un solo donante. El ensayo se llevó a cabo como sigue. Se eligió una línea celular apropiada, tal como MOLP-2, como célula diana y se cocultivó con células Jurkat. Se añadieron 10.000 células diana de la línea celular y 50.000 células efectoras (Jurkat) por pocillo (10.000 células diana por pocillo, 200 |jl de volumen total, con una proporción diana:efector = 1:5), con o sin la presencia de bis-Fab. Después de la incubación durante la noche, se sometió a ensayo la actividad de luciferasa en 10 j l del sobrenadante de los diferentes pocillos usando 50 j l de QUANTI-LUC (Invivogen), y se cuantificó la luminiscencia en un instrumento luminómetro Envision (Perkin Elmer).
De forma interesante, aunque las secuencias de HVR de cada variante de bis-Fab generada para el anti-CD3 o el anti-FcRH5 no se alteraron en la generación de los propios bis-Fab, la cantidad máxima de estimulación de linfocitos T observada para cada bis-Fab mostró una variación entre un bis-Fab y otro, simplemente en función de la posición de la reticulación con cisteína genomanipulada. Sin estar ligado a ninguna teoría, esto puede tener implicaciones sobre cómo se puede modular la toxicidad y/o la potencia de un bis-Fab para adaptarse a una necesidad terapéutica o diagnóstica particular. Otra observación fue que algunos bis-Fab (por ejemplo, bis-Fab C) tenían una afinidad significativamente reducida hacia CD3, aun teniendo una actividad de activación de linfocitos T comparable a la del F(ab')2A de referencia (figs. 40B y 41, tabla 15).
F. Actividad biológica de bis-Fab contra FcRH5 usando linfocitos B humanos endógenos
Se sometió a prueba la eficacia biológica de cada variante de bis-Fab en un ensayo de destrucción de linfocitos T dependiente de bis-Fab para la destrucción de linfocitos B endógenos periféricos, como sigue: Se añadieron 200.000 hCMSP aisladas de cada uno de los tres donantes sanos por pocillo con o sin bis-Fab. Después de una incubación de 48 h, se tiñeron las células con un antígeno de superficie celular apropiado de la línea celular diana (linfocitos B = CD20) (5 jl/pocillo) y yoduro de propidio para evaluar la viabilidad celular y, a continuación, se analizaron por FACS. Se calcularon las actividades de destrucción dependientes de bis-Fab de acuerdo con la siguiente ecuación: % de destrucción = (1 - número de células vivas con bis-Fab/número de células vivas sin bis-Fabs) x 100. Como control positivo se usó un F(ab')2que se derivó de un anticuerpo TDB contra FcRH5 de “botón en ojal” en el que los brazos anti-CD3 y anti-FcRH5 de cada Fab tenían la misma secuencia que los usados para los bis-Fab sometidos a prueba (excepto sin las mutaciones puntuales con cisteína genomanipulada) (véase, por ejemplo, Ridgway et al., Protein Eng., 9:617-621, 1996). En general, los resultados demostraron reproducibilidad, a pesar de usar diferentes células de donantes.
Se calcularon las cantidades de bis-Fab contra FcRH5 sometidos a prueba en el presente documento requeridas para lograr la lisis semimáxima de los linfocitos B humanos endógenos periféricos, o el valor de potencia de CE50 expresado en ng/ml, para cada bis-Fab sometido a prueba anteriormente. En general, se esperaba que las tendencias en la potencia de cada bis-Fab sometido a prueba en el ensayo de linfocitos B humanos endógenos siguieran los resultados determinados en el ensayo ELISA descrito anteriormente (figs. 40A-40B).

Claims (43)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo contra homólogo del receptor de tipo 5 (FcRH5) o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo, en el que el anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo comprende un dominio de unión que comprende:
(a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 104 y un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105;
(b) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106 y un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107;
(c) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 84 y un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85;
(d) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86 y un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 87;
(e) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 88 y un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 89;
(f) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 90 y un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 91;
(g) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 92 y un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 93;
(h) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96 y un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 97;
(i) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 98 y un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 99; o
(j) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 100 y un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 101.
2. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo se une a un epítopo en el dominio 9 tipo Ig de FcRH5.
3. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de la reivindicación 2, en el que el epítopo comprende una porción de los aminoácidos 745-850 de SEQ ID NO: 114.
4. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo comprende una mutación del sitio de aglucosilación.
5. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de la reivindicación 4, en el que la mutación del sitio de aglucosilación es una mutación por sustitución en el residuo aminoacídico N297, D265 y/o P329 de acuerdo con la numeración EU.
6. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de la reivindicación 4 o 5, en el que la mutación del sitio de aglucosilación es una mutación por sustitución seleccionada del grupo que consiste en N297G, N297A, D265A y P329G.
7. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de la reivindicación 6, en el que la mutación por sustitución es una mutación por sustitución N297G.
8. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el anticuerpo anti-FcRH5 es un anticuerpo monoclonal, humanizado o quimérico.
9. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de la reivindicación 8, en el que el anticuerpo anti-FcRH5 es un anticuerpo humanizado.
10. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el anticuerpo anti-FcRH5 es un anticuerpo de longitud completa.
11. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo es un anticuerpo multiespecífico.
12. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de la reivindicación 11, en el que el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo biespecífico que comprende un segundo dominio de unión que se une al grupo de diferenciación 3 (CD3).
13. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de la reivindicación 12, en el que el segundo dominio de unión comprende las siguientes seis HVR:
(a) una HVR-H1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115;
(b) una HVR-H2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116;
(c) una HVR-H3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117;
(d) una HVR-L1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118;
(e) una HVR-L2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119; y
(f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120; o
en el que el segundo dominio de unión comprende las siguientes seis HVR:
(a) una HVR-H1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115;
(b) una HVR-H2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116;
(c) una HVR-H3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121;
(d) una HVR-L1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118;
(e) una HVR-L2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119; y
(f) una HVR-L3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123.
14. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de la reivindicación 12, en el que el segundo dominio de unión comprende:
(a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 y
(b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134.
15. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de la reivindicación 12, en el que el segundo dominio de unión comprende:
(a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 137 y
(b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 138.
16. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de la reivindicación 12, en el que el segundo dominio de unión comprende:
(a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153 y
(b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 154.
17. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de la reivindicación 12, en el que el segundo dominio de unión comprende:
(a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 172 y
(b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 173.
18. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y 11-17, en el que el fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 se selecciona del grupo que consiste en fragmentos bis-Fab, Fab, Fab'-SH, Fv, scFv y (Fab')2.
19. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 12-17, en el que el anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo comprende uno o más dominios constantes de la cadena pesada, y en el que el uno o más dominios constantes de la cadena pesada se seleccionan de un primer dominio CH2 (CH2i), un primer dominio CH3 (CH3i), un segundo dominio CH2 (CH22) y un segundo dominio CH3 (CH32).
20. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de la reivindicación 19, en el que al menos uno de los uno o más dominios constantes de la cadena pesada se aparea con otro dominio constante de la cadena pesada.
21. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de la reivindicación 20, en el que el CH3i y el CH32 comprenden cada uno una protuberancia (Pi) o una cavidad (Ci), y en el que la Pi o la Ci en el CH3i se puede situar en la Ci o la Pi, respectivamente, en el CH32.
22. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de la reivindicación 21, en el que el CH3i y el CH32 se encuentran en una interfase entre la Pi y la Ci.
23. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de la reivindicación 21 o 22, en el que la Pi comprende una mutación por sustitución T366W de acuerdo con la numeración EU.
24. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 21-23, en el que la Ci comprende mutaciones por sustitución T366S, L368A e Y407Vde acuerdo con la numeración EU.
25. Uno o más ácidos nucleicos aislados que codifican el anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-24.
26. Uno o más vectores que comprenden el uno o más ácidos nucleicos aislados de la reivindicación 25.
27. Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-24 y un agente citotóxico.
28. Una composición que comprende el anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-24, que comprende además un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
29. La composición de la reivindicación 28, en la que la composición comprende además un antagonista de unión al eje PD-1 o un agente terapéutico adicional.
30. La composición de la reivindicación 29, en la que el antagonista de unión al eje PD-1 se selecciona del grupo que consiste en un antagonista de unión a PD-L1, un antagonista de unión a PD-1 o un antagonista de unión a PD-L2.
31. La composición de la reivindicación 30, en la que el antagonista de unión al eje PD-1 es un antagonista de unión a PD-L1, opcionalmente en la que el antagonista de unión a PD-L1 se selecciona del grupo que consiste en MPDL3280A (atezolizumab), MDX-1105, MEDI4736 (durvalumab) y MSB0010718C (avelumab), opcionalmente en la que el antagonista de unión a PD-L1 es MPDL3280A (atezolizumab).
32. La composición de la reivindicación 30, en la que el antagonista de unión al eje PD-1 es un antagonista de unión a PD-1, opcionalmente en la que el antagonista de unión a PD-1 se selecciona del grupo que consiste en MDX 1106 (nivolumab), MK-3475 (pembrolizumab), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001 y REGN2810.
33. La composición de la reivindicación 30, en la que el antagonista de unión al eje PD-1 es un antagonista de unión a PD-L2, opcionalmente en la que el antagonista de unión a PD-L2 es un anticuerpo o una inmunoadhesina.
34. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-24 para su uso en el tratamiento o retraso de la progresión de un cáncer positivo para FcRH5 en un sujeto que lo necesite.
35. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-24 para su uso en la potenciación de la función inmunitaria en un sujeto que tiene un cáncer positivo para FcRH5.
36. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo para su uso de la reivindicación 34 o 35, en el que el cáncer positivo para FcRH5 es un cáncer de linfocitos B.
37. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 34-36, en el que el anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo se va a administrar al sujeto a una dosis de aproximadamente 0,01 mg/kg/semana a aproximadamente 50 mg/kg/semana.
38. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 34-37, en el que el anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo se va a administrar al sujeto con un antagonista de unión al eje PD-1 y/o un agente terapéutico adicional.
39. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo para su uso de la reivindicación 38, en el que el antagonista de unión al eje PD-1 y/o el agente terapéutico adicional se van a administrar antes de, de forma simultánea a, o después de la administración del anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo.
40. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo para su uso de la reivindicación 38 o 39, en el que el antagonista de unión al eje PD-1 se selecciona del grupo que consiste en un antagonista de unión a PD-L1, un antagonista de unión a PD-1 o un antagonista de unión a PD-L2.
41. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo para su uso de la reivindicación 40, en el que el antagonista de unión al eje PD-1 es un antagonista de unión a PD-L1, opcionalmente en el que el antagonista de unión a PD-L1 se selecciona del grupo que consiste en MPDL3280A (atezolizumab), MDX-1105, MEDI4736 (durvalumab) y MSB0010718C (avelumab), opcionalmente en el que el antagonista de unión a PD-L1 es MPDL3280A (atezolizumab).
42. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo para su uso de la reivindicación 40, en el que el antagonista de unión al eje PD-1 es un antagonista de unión a PD-1, opcionalmente en el que el antagonista de unión a PD-1 se selecciona del grupo que consiste en MDX 1106 (nivolumab), MK-3475 (pembrolizumab), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001 y REGN2810.
43. El anticuerpo anti-FcRH5 o fragmento de anticuerpo de unión a FcRH5 del mismo para su uso de la reivindicación 40, en el que el antagonista de unión al eje PD-1 es un antagonista de unión a PD-L2, opcionalmente en el que el antagonista de unión a PD-L2 es un anticuerpo o una inmunoadhesina.
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