ES2591102T3 - Aislamiento de cinco genes novedosos que codifican nuevos melanomas de tipo receptor de Fc implicados en la patogénesis del linfoma/melanoma - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo dirigido a una proteína IRT4 humana, en donde la secuencia de aminoácidos de la proteína IRTA4 humana se expone en la Figura 18D1-18D2.

Description

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sobre dispersiones de metafase humana normales abarcando el clon PAC 49A16 (Fig. 13) la

región lq21 de la línea germinal en el punto de rotura de FR4. Derecha, imagen teñida con DAPI de

la misma dispersión de metafase.

Figuras 9A-9B.

Estructura de los ADNc de IRTA1 e IRTA2. Figs.9A, 9B) Representación esquemática de los ADNc

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de IRTA1 (Fig. 9A) e IRTA2 (Fig. 9B) completos. Los recuadros rellenos, grandes representan

dominios codificantes y los recuadros estrechos representan las regiones no traducidas (UTR). El

sitio pronosticado para la escisión de la peptidasa señal está marcado por medio de una punta de

flecha

y se obtuvo de acuerdo con el servidor Red Informática Mundial SignalIP en

http://www.cbs.dtu.dk/service/SignalIP. El algoritmo de predicción de dominios transmembrana es

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descrito por Tusnady et al., 1998. SP, péptido señal; EC, dominio extracelular; Ig, de tipo

inmunoglobulina; TM, dominio transmembrana; CIT, dominio citoplásmico; A(n), cola poli A; GPI,

glicofosfatidil inositol. En la (Fig. 9A), las flechas en la UTR 3' indican diferentes sitios de adición de

poliadenilación utilizados en el ADNc de IRTA1. En la (Fig. 9B), se sombrean de manera diferente

las regiones UTR 3' de las isoformas de IRTA2. Las barras debajo de las regiones UTR en la (Fig.

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9A) y la (Fig. 9B) identifican las sondas utilizadas para el análisis de transferencia Northern en la

Figura 12.

Figuras 10A-10B.Comparación de las secuencias de aminoácidos de IRTA1 e IRTA2 con miembros de la familia de receptores de Fc Fig. 10A) Alineamiento de secuencias múltiples de los dos primeros (arriba) y el tercero (abajo) dominios extracelulares para Ig de IRTA1 e IRTA2 para los miembros de la familia

20 de receptores de Fc. Las secuencias se compararon utilizando el programa ClustalW (Thompson et al., 1994). Los recuadros sombreados de color negro indican aminoácidos conservados entre todas las secuencias; los recuadros sombreadas de color gris oscuro indican aminoácidos conservados entre al menos la mitad de las secuencias; los recuadros sombreados en color claro indican las sustituciones conservativas. Fig. 10B) Alineamiento de los dominios de unión a SH2 de

25 IRTA1 e IRTA2 con los motivos de consenso ITAM e ITIM. Las posiciones de aminoácidos conservados están en negrita. El símbolo X representa cualquier aminoácido.

Figuras 11A-11B-4. Patrón de expresión de IRTA1. Fig. 11A) Panel izquierdo. Análisis de transferencia Northern de la expresión del ARNm de IRTA1 en tejidos del sistema inmunitario humano. Cada calle contiene 2 mg de ARNm. La posición de los marcadores de peso molecular de ARN se representa en el lado

30 derecho de la transferencia. Las posiciones de los transcritos de ARNm de IRTA1 y GAPDH se muestran por medio de flechas. (Se incluyó una sonda de GAPDH en la hibridación como un control interno -sonda marcada 0,15 ng + no marcada 50 ng). Panel derecho. Análisis de transferencia Northern de la expresión de IRTA1 en el ARN total de la línea celular ER/EB (10 mg por calle). Para este experimento, las células fueron cultivadas en presencia de estrógeno (1

35 mg/mz), seguido de la retirada de estrógeno durante los momentos indicados. Las flechas indican las posiciones de los ARNm correspondientes. a, b y c corresponden a especies poliadeniladas diferencialmente de IRTA1. La misma transferencia se eliminó y se volvió a sondear con una sonda de ADNc MYC (exón 2) para verificar la detención de G0/G1 celular. El análisis densitométrico de los niveles de ARNm de IRTA1 se representa en el gráfico de columnas

40 adyacente. La sonda de ADNc utilizada se muestra como una barra continua por debajo del esquema de ARNm de IRTA1 en la Figura 9A. Fig.11B-1-11B-4) Análisis de hibridación in situ de la expresión de IRTA1 en secciones seriadas de amígdala humana. 1. Sonda IRTA1 efectora 2. Sonda IRTA1 antisentido 3. Tinción H & E 4. Señal IRTA1 antisentido superpuesta sobre una sección teñida con H & E. GC, centro germinal, MargZ, zona marginal

45 Figura 12A-12B-4. Patrón de expresión de IRTA2. Fig. 12A) Análisis de transferencia Northern de la expresión de ARNm de IRTA2 en múltiples tejidos humanos (panel izquierdo) y en diversas líneas celulares linfoides y no linfoides (panel derecho). Cada calle contiene 2 mg de ARNm. Las posiciones de los transcritos de IRTA2 y GAPDH se muestran por medio de flechas. a, b, c y d corresponden a isoformas de ARNm de IRTA2 de corte y empalme alternativo. RD, NC42 y CB33, líneas de células

50 B linfoblastoides transformadas con virus de Epstein-Barr; EREB, línea celular linfoblastoide B transformada con EBV condicional; FR4, línea de células de plasma; MOLT4 y HUT78, líneas de células T; HL60 y U937, líneas de células mielomonocíticas; K562, línea celular eritroide. La sonda de ADNc utilizada se muestra como una barra continua debajo del esquema del ARNm de IRTA2 en la Figura 9B. Figs.12B-1-12B-4) Análisis de hibridación in situ de la expresión de IRTA2 en la

55 amígdala humana. Fig. 12B-1. Sonda de ADNc de IRTA2 efectora, Fig. 12B-2. Sonda de ADNc de IRTA2 antisentido, Fig. 12B-3. Tinción H & E, Fig. 12B-4. Señal de la sonda de ADNc de IRTA2 antisentido superpuesta sobre la sección teñida con H & E. GC, centro germinal, MargZ, zona marginal

Figura 13. Mapa de la región lq21 de la línea germinal que abarca el punto de rotura FR4 y la organización

60 genómica de IRTA1 e IRTA2. Los cebadores utilizados para amplificar los exones de IRTA1 a partir de ADNc de bazo están marcados por medio de puntas de flecha en el panel superior. Los recuadros de color negro y claro indican exones codificantes y no codificantes respectivamente.

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MMTV o MoMLV), virus del bosque Semliki o virus SV40. Adicionalmente, las células que han integrado de forma estable el ADN en sus cromosomas se pueden seleccionar introduciendo uno o más marcadores que permiten la selección de células anfitrionas transfectadas. Los marcadores pueden proporcionar, por ejemplo, prototrofía a un anfitrión auxótrofo, resistencia a biocidas o resistencia a metales pesados tales como el cobre. El gen marcador seleccionable puede ser directamente ligado a las secuencias de ADN que se van a expresar, o puede ser introducido en la misma célula por medio de transformación simultánea.

Los elementos reguladores requeridos para la expresión incluyen secuencias promotoras que se van a unir a ARN polimerasa y secuencias de inicio de la transcripción para la unión al ribosoma. También se pueden necesitar elementos adicionales para la síntesis óptima del ARNm. Estos elementos adicionales pueden incluir señales de empalme, así como potenciadores y señales de terminación. Por ejemplo, un vector de expresión bacteriano incluye un promotor tal como el promotor lac y para el inicio de la transcripción la secuencia de Shine-Dalgarno y el codón de inicio AUG. De un modo similar, un vector de expresión eucariótico incluye un promotor heterólogo u homólogo para la ARN polimerasa II, una señal de poliadenilación aguas abajo, el codón de inicio AUG, y un codón de terminación para la separación del ribosoma. Tales vectores se pueden obtener comercialmente o se pueden ensamblar a partir de las secuencias descritas por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo los métodos descritos anteriormente para construir vectores en general.

Estos vectores se pueden introducir en una célula anfitriona adecuada para formar un sistema vector anfitrión para producir las proteínas de la invención. Los métodos de elaboración de sistemas de vectores anfitriones son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Las células anfitrionas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas (incluyendo células Gram positivas), células de levadura, células fúngicas, células de insecto y células animales. Las células animales adecuadas incluyen, pero no se limitan a células HeLa, células Cos, células CV1 y diversas células de mamíferos primarias. Se pueden utilizar numerosas células de mamíferos como anfitriones, incluyendo, pero no limitadas a, fibroblastos de ratón, células NIH-3T3, células CHO, células HeLa, células Ltk y células COS. Las células de mamíferos pueden ser transfectadas por métodos bien conocidos en la técnica tales como precipitación con fosfato cálcico, electroporación y microinyección.

Se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos capaces de hibridar específicamente con una secuencia única incluida dentro de la secuencia de la molécula de ácido nucleico aislada que codifica la proteína IRTA4, o fragmento(s) de la misma, que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 18D-1-18D-2. En otros aspectos, las moléculas de ácido nucleico aisladas se marcan con un marcador detectable. En otras realizaciones adicionales de las moléculas de ácido nucleico aisladas, el marcador detectable se selecciona del grupo que consiste en un isótopo radiactivo, enzima, colorante, biotina, una marca fluorescente o una marca quimioluminiscente.

Se describen un método para detectar una neoplasia maligna de las células B o un tipo de neoplasia maligna de las células B en una muestra de un sujeto en donde la neoplasia maligna de las células B comprende una reordenación cromosómica lq21, que comprende:

a) poner en contacto la muestra de ARN obtenida del sujeto con la molécula de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos contiguos capaces de hibridar específicamente con una secuencia única incluida dentro de la secuencia de un ARN aislado que codifica la proteína IRTA4 humana en condiciones que permiten la hibridación del ARN de la etapa (a) con la molécula de ácido nucleico capaz de hibridar específicamente con una secuencia única incluida dentro de la secuencia de un ARN aislado que codifica la proteína IRTA humana, en donde la molécula de ácido nucleico está marcada con un marcador detectable; y b) detectar cualquier hibridación en la etapa (a) en donde la detección de hibridación indica la presencia de neoplasia maligna de las células B o un tipo de neoplasia maligna de las células B en la muestra.

La detección de la hibridación de ARN que codifica las proteínas IRTA indicará que una neoplasia maligna es una neoplasia maligna de las células B. Más específicamente, la detección de hibridación del ARN que codifica la proteína IRTA indica que la neoplasia maligna de células B es un linfoma de células B de Tejido Linfoide Asociado a la Mucosa (MALT). La detección de hibridación de ARN que codifica las proteínas IRTA4 e IRTA5 indica que la neoplasia maligna de las células B es un linfoma de células del manto. En una realización del método descrito anteriormente, la neoplasia maligna de células B comprende una reordenación cromosómica lq21. Un experto utilizará el método descrito anteriormente como ayuda para el diagnóstico junto con otros métodos convencionales de detección/diagnóstico de neoplasias malignas, p. ej., patología de una muestra de tumor, que puede indicar linfoma y a continuación el método descrito anteriormente, restringirá la neoplasia maligna a un linfoma de células B

o más específicamente a un linfoma de células B MALT) o un linfoma de células del manto como se ha discutido anteriormente.

Un experto en la técnica está familiarizado con los métodos conocidos de detección de hibridación de moléculas de ácido nucleico con oligonucleótidos de ácido nucleico, es decir, sondas de ácido nucleico que codifican una proteína de interés para métodos de diagnóstico. Las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas IRTA de la presente invención son útiles para detectar neoplasias malignas de las células B. Un experto en la técnica

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reconocerá que las variaciones del método descrito anteriormente para la detección de una neoplasia maligna de las células B en una muestra incluyen, pero no se limitan a, digestión del ácido nucleico de la muestra con enzimas de restricción y separación de los fragmentos de la molécula de ácido nucleico así obtenidos por medio de fraccionamiento por tamaños antes de la hibridación.

En un aspecto del método descrito anteriormente para la detección de una neoplasia maligna de células B en una muestra de un sujeto, el marcador detectable es un isótopo radiactivo, una enzima, un colorante, biotina, una marca fluorescente o una marca quimioluminiscente. En una realización preferida, como se define en las reivindicaciones, la neoplasia maligna de células B se selecciona del grupo que consiste en linfoma de células B, mieloma múltiple, linfoma de Burkitt, linfoma de la zona marginal, linfoma difuso de células grandes y linfoma de las células foliculares. En una realización, el linfoma de células B es linfoma de células B del Tejido Linfoide Asociado a la Mucosa (MALT). En otra realización preferida, el linfoma de células B es linfoma no Hodgkin.

También se describe un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia capaz de hibridar específicamente con una molécula de ARNm que codifica una proteína IRTA4 humana con el fin de evitar la expresión en exceso de la molécula de ARNm.

En aspectos adicionales de cualquiera de los oligonucleótidos de moléculas de ácido nucleico descritos anteriormente que codifican la proteína IRTA4, el ácido nucleico puede ser ADN genómico o ADNc.

Un experto en la técnica está familiarizado con los mecanismos convencionales para la hibridación de ácido nucleico de oligonucleótidos, por ejemplo, Ausubel, F.M. et al. Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, Nueva York, 1998), por ejemplo condiciones restrictivas de 65°C en presencia de una concentración de sal elevada. Tales condiciones se utilizan para la hibridación de ácido nucleico completamente complementario, mientras que las condiciones que no son restrictivas se utilizan para la hibridación de ácidos nucleicos que no son totalmente complementarios.

Según se utiliza en la presente memoria, la frase "hibridar específicamente" representa la capacidad de una molécula de ácido nucleico para reconocer una secuencia de ácido nucleico complementaria a ella misma y para formar segmentos de doble hélice mediante enlaces de hidrógeno entre pares de bases complementarias. Según se utiliza en la presente memoria, una "secuencia única" es una secuencia específica sólo para las moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína IRTA4. La tecnología de sondas de ácido nucleico es bien conocida para los expertos en la técnica que apreciarán fácilmente que tales sondas pueden variar mucho de longitud y pueden estar marcadas con una marca detectable, tal como un radioisótopo o colorante fluorescente, para facilitar la detección de la sonda. La detección de moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína IRTA4 es útil como prueba de diagnóstico para cualquier proceso de enfermedad en el que los niveles de expresión de la proteína IRTA4 correspondiente están alterados. Las moléculas de sonda de ADN se producen mediante la inserción de una molécula de ADN que codifica la proteína IRTA4 de mamífero o sus fragmentos en vectores adecuados, tales como plásmidos o bacteriófagos, seguido de la inserción en las células anfitrionas bacterianas adecuadas y la replicación y la recolección de las sondas de ADN, todo ello utilizando bien los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el ADN puede ser extraído de un producto lisado celular utilizando fenol y etanol, digerido con las enzimas de restricción correspondientes a los sitios de inserción del ADN en el vector (comentado en la presente memoria), sometido a electroforesis, y separado por corte del gel resultante. Las sondas de oligonucleótidos son útiles para la hibridación 'in situ' o con el fin de localizar tejidos que expresan esta familia de genes IRTA, y para otros análisis de hibridación para determinar la presencia de estos genes (moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas IRTA4) o su ARNm en diversos tejidos biológicos. Adicionalmente, los oligonucleótidos sintetizados (producidos por un sintetizador de ADN) complementarios a la secuencia de una molécula de ADN que codifica una proteína IRTA4 son útiles como sondas para estos genes, para su ARNm asociado, o para el aislamiento de genes relacionados por escrutinio de homología de bibliotecas genómicas o de ADNc, o mediante el uso de técnicas de amplificación tales como la Reacción en Cadena de la Polimerasa.

Esta invención proporciona una proteína IRTA4 purificada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las Figuras 18D-1-18D-2 (SEQ ID NO: 7). En una realización, la proteína IRTA4 es IRTA4 humana.

Con el fin de facilitar la comprensión de la sección de Detalles Experimentales siguiente, ciertos métodos y/o términos que aparecen con frecuencia se describen mejor en Sambrook, et al. (1989) y Harlow y Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, Nueva York: 1988.

Esta invención proporciona uno o varios anticuerpos dirigidos a un epítopo de proteína IRTA4 purificada, o uno o varios fragmentos de los mismos, que tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en las Figuras 18D-1-18D-2.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpo" incluye, pero no se limita a, anticuerpos tanto de origen natural como de origen no natural. Específicamente, el término "anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, y fragmentos de unión de los mismos. Además, el término "anticuerpo" incluye anticuerpos quiméricos y anticuerpos completamente sintéticos, y fragmentos de los mismos. Los anticuerpos policlonales y monoclonales pueden ser "purificados", lo que significa que los anticuerpos policlonales y monoclonales están libres de cualquier otro anticuerpo. Según se utiliza en la presente memoria, anticuerpo parcialmente purificado significa

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quimioterapéutico.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de los oligonucleótidos o de los anticuerpos descritos anteriormente y un portador farmacéuticamente aceptable. En la invención sujeto una "cantidad eficaz" es cualquier cantidad de un oligonucleótido o un anticuerpo que, cuando se administra a un sujeto que padece una enfermedad o anomalía contra las que el oligonucleótido o anticuerpo son eficaces, causa una reducción, remisión o regresión de la enfermedad o anomalía. En la práctica de esta invención, el "portador farmacéuticamente aceptable" es cualquier portador fisiológico conocido para los expertos normales en la técnica útil en la formulación de composiciones farmacéuticas.

Los portadores farmacéuticamente aceptables son bien conocidos para los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a tampón fosfato 0,01-0,1 M y preferiblemente 0,05 M o solución salina al 0,8%. Adicionalmente, tales portadores farmacéuticamente aceptables pueden ser soluciones, suspensiones, y emulsiones acuosas o no acuosas. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo solución salina y medios tamponados. Los portadores parenterales incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, solución de Ringer con lactato añadido o aceites fijados. Los vehículos intravenosos incluyen fluidos y reponedores de nutrientes, reponedores de electrolitos tales como los basados en dextrosa de Ringer, y similares. También pueden estar presentes otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares.

En una realización preferida, el portador farmacéutico puede ser un líquido y la composición farmacéutica estaría en forma de una solución. En otra realización igualmente preferida, el portador farmacéuticamente aceptable es un sólido y la composición está en la forma de un polvo o un comprimido. En una realización adicional, el portador farmacéutico es un gel y la composición está en forma de un supositorio o una crema. En una realización adicional, el compuesto se puede formular como parte de un parche transdérmico farmacéuticamente aceptable.

Un portador sólido puede incluir una o más sustancias que también pueden actuar como agentes aromatizantes, lubricantes, solubilizantes, agentes de suspensión, cargas, antiapelmazantes, coadyuvantes de compresión, aglutinantes o agentes disgregantes de comprimidos; también puede ser un material encapsulante. En los polvos, el portador es un sólido finamente dividido que está mezclado con el ingrediente activo finamente dividido. En los comprimidos, el ingrediente activo se mezcla con un portador que tiene las propiedades de compresión necesarias en proporciones adecuadas y se compacta en la forma y el tamaño deseados. Los polvos y los comprimidos contienen preferiblemente hasta 99% del ingrediente activo. Los portadores sólidos adecuados incluyen, por ejemplo, fosfato de calcio, estearato de magnesio, talco, azúcares, lactosa, dextrina, almidón, gelatina, celulosa, polivinilpirrolidina, ceras de bajo punto de fusión y resinas de intercambio iónico.

Los portadores líquidos se utilizan en la preparación de soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, elixires y composiciones presurizadas. El ingrediente activo se puede disolver o suspender en un portador líquido farmacéuticamente aceptable tal como agua, un disolvente orgánico, una mezcla de ambos o aceites o grasas farmacéuticamente aceptables. El portador líquido puede contener otros aditivos farmacéuticos adecuados tales como solubilizantes, emulsionantes, tampones, conservantes, edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes de suspensión, agentes espesantes, colorantes, reguladores de la viscosidad, estabilizantes u osmorreguladores. Los ejemplos adecuados de portadores líquidos para administración oral y parenteral incluyen agua (que contiene parcialmente aditivos como los anteriores, p. ej., derivados de celulosa, preferentemente solución de carboximetilcelulosa sódica), alcoholes (incluyendo alcoholes monohidroxilados y alcoholes polihidroxilados, p. ej. glicoles) y sus derivados, y aceites (p. ej., aceite de coco fraccionado y aceite de cacahuete). Para la administración parenteral, el portador también puede ser un éster oleoso tal como oleato de etilo y miristato de isopropilo. Los portadores líquidos estériles son útiles en composiciones estériles en forma líquida para la administración parenteral. El portador líquido para composiciones presurizadas puede ser un hidrocarburo halogenado u otro propelente farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones farmacéuticas líquidas que son soluciones o suspensiones estériles se pueden utilizar, por ejemplo, mediante inyección intramuscular, intratecal, epidural, intraperitoneal o subcutánea. Las soluciones estériles también se pueden administrar por vía intravenosa. Los compuestos se pueden preparar como una composición sólida estéril que se puede disolver o suspender en el momento de la administración utilizando agua estéril, solución salina, u otro medio inyectable estéril apropiado. Se pretende que los portadores incluyan los aglutinantes, agentes de suspensión, lubricantes, aromatizantes, edulcorantes, conservantes, colorantes, y recubrimientos necesarios e inertes.

La composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido o el anticuerpo se puede administrar oralmente en forma de una solución o suspensión estéril que contiene otros solutos o agentes de suspensión, por ejemplo, suficiente solución salina o glucosa para hacer la solución isotónica, sales biliares, acacia, gelatina, monooleato de sorbitán, polisorbato 80 (ésteres oleato de sorbitol y sus anhídridos copolimerizados con óxido de etileno) y similares.

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La composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido o el anticuerpo también se puede administrar por vía oral en forma de una composición líquida o sólida. Las composiciones adecuadas para administración oral incluyen formas sólidas, tales como píldoras, cápsulas, gránulos, comprimidos y polvos, y formas líquidas, tales como soluciones, jarabes, elixires, y suspensiones. Las formas útiles para la administración parenteral incluyen soluciones, emulsiones, y suspensiones estériles.

Las dosificaciones óptimas que se van a administrar pueden ser determinadas por los expertos en la técnica, y variarán con el inhibidor concreto en uso, la fuerza de la preparación, el modo de administración, y el progreso del estado de enfermedad o anomalía. Otros factores que dependen del sujeto concreto a tratar darán como resultado la necesidad de ajustar las dosificaciones, incluyendo la edad del sujeto, el peso, el sexo, la dieta y el tiempo de administración.

Esta invención se entenderá mejor a partir de los Detalles Experimentales siguientes. Sin embargo, un experto en la técnica apreciará fácilmente que los métodos y resultados específicos comentados son meramente ilustrativos de la invención como se describe más completamente en las reivindicaciones siguientes.

Detalles experimentales

Primera serie de experimentos

El análisis molecular de las translocaciones cromosómicas asociadas con el mieloma múltiple (MM) ha indicado que la patogénesis de esta neoplasia maligna puede ser heterogénea, estando asociada con varios oncogenes distintos incluyendo BCL-1, MUM-1 y FGFR3. Las anomalías estructurales del cromosoma 1q21, incluyendo la translocación con el cromosoma 14q32, representan aberraciones citogenéticas frecuentes asociadas con el mieloma múltiple. Con el fin de identificar los genes implicados en estas translocaciones, se clonaron las regiones del punto de rotura correspondientes a ambos derivados de una t(1;14)(q21;q32) detectable en la línea celular de plasmacitoma humano FR4. El análisis de las secuencias del punto de rotura mostró que implicaban una recombinación recíproca entre el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina (IgH) en 14q32 y secuencias desconocidas en 1q21. El locus normal correspondiente a la región 1q21 implicada en la translocación se clonó y se identificaron los genes adyacentes a la región del punto de rotura por medio de una estrategia de captura del exón. Se encontraron dos genes, localizados a una distancia de 20 Kb entre sí, en la región que abarcaba el punto de rotura en 1q21. El primer gen, denominado MUM-2 (mieloma múltiple 2) se expresa como un transcrito de ARNm de 2,5 Kb detectable en el bazo y los ganglios linfáticos. La clonación y secuenciación del ADNc de MUM-2 completo pronostica una glicoproteína de la superficie celular de 515 aminoácidos que contiene cuatro dominios de tipo Ig extracelulares, uno transmembrana y un dominio citoplasmático y que comparten 37% de identidad (51% de homología) con el receptor I gamma de Fc sobre sus tres primeros dominios extracelulares. En las células FR4, los puntos de rotura de la translocación interrumpen el dominio codificante de MUM-2 y lo yuxtaponen al locus IgH en la misma orientación transcripcional. Como consecuencia, los transcritos MUM-2 específicos de FR4 estructuralmente anormales (3,0, 5,2 y 6,0 Kb) en los ganglios linfáticos y el bazo codifican una proteína con un dominio extracelular que contiene seis dominios de tipo Ig homólogos a los miembros de las familias de receptores Fc gamma y de adherencia de tipo Ig. La estructura de los genes MUM-2 y MUM-3 y su participación directa en una translocación asociada a MM sugieren que estos genes codifican los receptores de la superficie celular novedosos importantes para la función de los linfocitos normales y las neoplasias malignas de las células B.

Segunda serie de experimentos

Procedimientos experimentales

Líneas celulares

Las líneas celulares de MM utilizadas en este estudio (FR4, U266, JJN3, EJM, SKMM1, RPMI-8226, XG1, XG2, XG4, XG6, XG7) han sido referidas previamente (Tagawa et al., 1990), (Jernberg et al., 1987), (Hamilton et al., 1990; Jackson et al., 1989), (Eton et al., 1989), (Zhang et al., 1994). La línea celular FR4 se estableció en el laboratorio de uno de los autores (S.T.). Las líneas celulares U266, JJN3 y EJM fueron donaciones del Dr. K. Nilsson (Universidad de Uppsala, Uppsala, Suecia) y la línea celular SKMM-1 fue una donación A.N. Houghton (Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Nueva York, NY). Las cinco líneas de células XG se obtuvieron del Dr. Bernard Klein y se cultivaron en presencia de 1 ng/ml de IL-6 humana recombinante como se ha descrito previamente (Zhang et al., 1994). Las líneas celulares BL con anomalías lq21 se han descrito previamente (Polito et al., 1995), (Magrath et al., 1980) y se cultivaron en RPMI, FCS al 10%.

Selección de la biblioteca genómica y de ADNc y análisis de la secuencia de ADN

Se construyeron dos bibliotecas genómicas a partir de ADN genómico de FR4 por medio de digestión completa con BamHI o por medio de digestión parcial con Sau3AI y posterior ligación de las fracciones purificadas en gel en el vector de fago 1DASH-II (Stratagene). La biblioteca de BamHI se escrutó con una sonda XhoI-BamHI de 4,2 kb derivada del locus de Ca y la biblioteca Sau3AI se escrutó con una sonda 5'Sa descrita previamente (Bergsagel et al., 1996). Se escrutó una biblioteca de ADN de placenta humana (Stratagene) con una sonda 1.0EH (Figuras 8A8C) para obtener el locus 1q21 de la línea germinal. El escrutinio de la biblioteca y el aislamiento de la placa se

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llevaron a cabo de acuerdo con los procedimientos establecidos (Sambrook et al., 1989). Los clones de ADNc de IRTA1 e IRTA2 se aislaron a partir de una biblioteca de ADNc oligo-dT/cebada al azar construida a partir de ARN de bazo humano normal (Clontech). La sonda de ADNc de IRTA1 utilizada para el escrutinio de la biblioteca se obtuvo a partir de la RT-PCR de ADNc de bazo humano utilizando los cebadores que flanquean los exones 1 y 3. La secuenciación del ADN se llevó a cabo en un secuenciador automatizado ABI 373 (Applied Biosystems). Las búsquedas de homología de secuencia se llevaron a cabo a través del servidor de correo electrónico BLAST en el Centro Nacional de Información Biotecnológica, Bethesda, MD.

Aislamiento de PAC y YAC y captura de exones

Los clones de PAC humanos se obtuvieron mediante escrutinio de una biblioteca PAC humana aplicada sobre membranas de nailon (Research Genetics), con la sonda de 1,0 EH (Figuras 8A-8C). Se escrutó la biblioteca de YAC humanos Zeneca (antes ICI) (Anand et al., 1990) obtenida del United Kingdom Human Genome Mapping Resource center (UK-HGMP) utilizando una estrategia de agrupamiento basada en la PCR. La captura de exones se realizó utilizando el sistema de captura de exones (Gibco BRL), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Aislamiento de clones finales de PAC/YAC, electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) y análisis de hibridación con fluorescencia en situ (FISH)

La extracción de ADN de PAC se realizó de acuerdo con los métodos de lisis alcalina convencionales (Drakopoli N et al., 1996). Se utilizó un método de PCR vectorette para aislar sondas terminales de PAC y YAC (Riley et al., 1990), como se ha descrito previamente (Iida et al., 1996). El análisis de PFGE se realizó de acuerdo con protocolos convencionales (Drakopoli N et al., 1996) utilizando el sistema CHEF Mapper (BioRad, Hercules, CA). El marcaje con biotina del ADN de PAC, la preparación de cromosomas y FISH se realizaron como se ha descrito previamente (Rao et al., 1993).

Análisis de transferencia Southern y Northern, RACE y RT-PCR

Los análisis de transferencia Southern y Northern se realizaron como se ha descrito previamente (Neri et al., 1991). Para los análisis de transferencia Northern se preparó el ARN total por el método del tiocianato de guanidinio y se seleccionó el ARN poli(A) utilizando cuentas recubiertas con poli(T) (Kit Oligotex de Quigen). Para las transferencias Northern, se cargaron 2 mg de ARN poli(A) por calle. Se obtuvieron filtros Northern de múltiples tejidos de Clontech. La RACE se realizó utilizando el kit de Amplificación de ADNc Marathon (Clontech) y ADNc de bazo Marathon-Ready. La síntesis de la primera hebra de ADNc se realizó utilizando el sistema SuperScript RT-PCR (Gibco BRL).

Hibridación in situ

Se transcribieron sondas de ARNc antisentido y efectoras que contenían digoxigenina con ARN polimerasa T3 y T7, respectivamente, a partir de plásmidos pBluescript KS+ linealizados que contenían la región codificante de los ADNc (nucleótidos 62-1681 de IRTA1 y 18 a 2996 de IRTA2.) Se congeló instantáneamente tejido tonsilar humano hiperplásico extirpado quirúrgicamente de niños del Babies Hospital, Columbia Presbyterian Medical Center en hielo seco en polvo. Las secciones del criostato se almacenaron durante varios días a -80 grados C antes del procesamiento. La hibridación no radiactiva in situ se realizó esencialmente como se ha descrito (Frank et al., 1999), excepto que el tiempo de fijación en paraformaldehído al 4% se aumentó a 20 minutos, y se omitió el tratamiento con proteinasa K. La rigurosidad de la hibridación fue de 68 grados C, en 5X SSC, formamida al 50%. La tinción de los anticuerpos anti-digoxigenina conjugados con fosfatasa alcalina se desarrolló con el sustrato BCIP/NBT.

Transfección, inmunoprecipitación y transferencia Western.

Se transfectaron de manera transitoria células 293 (ATCC), cultivadas en DMEM, FCS al 10%, de acuerdo con el método de fosfato de calcio convencional, con constructos de expresión transitoria pMT2T y pMT2T-IRTAI/Ca. Este último fue generado utilizando el producto de la RT-PCR de IRTA1/Ca de FR4. Las células (2x106 de transfectantes y 2x107 de líneas celulares restantes) se solubilizaron en tampón de lisis Triton X-100 (NaCl 150 mM, Tris-HCl 10 mM [pH 7,4], TX-100 al 1%, BSA al 0,1%) en presencia de un cóctel de inhibidores de proteasa (Roche Biochemicals). Los productos lisados se incubaron a 4°C durante 2 horas con 4 mg/ml del anticuerpo monoclonal Núm. 117-332-1 (Yu et al., 1990) (Tanox Biosystems, Inc, Houston, Texas) que se originaron contra la porción extracelular del péptido de membrana IgA. Los complejos inmunitarios se aislaron con proteína G-Sepharose (Pharmacia) antes de la electroforesis sobre geles en gradiente al 10-20% de Tris-HCl (BioRad) y de la inmunotransferencia, utilizando 15 mg/ml del anticuerpo Núm. 117-332-1. Los resultados se visualizaron por medio de ECL (Amersham).

Resultados

Clonación Molecular de la t(1;14)(q21;q32)

Las translocaciones cromosómicas que involucran al locus de la cadena pesada de Ig (IGH) se producen a menudo dentro o cerca de regiones de cambio de IgH como resultado de eventos de recombinación de cambio "ilegítimos" (Dalla-Favera et al., 1983; Chesi et al., 1996; Chesi et al., 1998). Los puntos de rotura se pueden detectar mediante

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análisis de hibridación por transferencia Southern como alelos reordenados en los que las secuencias de la región constante (CH) de IGH han perdido su asociación sinténica con las secuencias de la región de unión (JH) de IGH y de cambio 5' (S) (Dalla-Favera et al., 1983; Neri et al., 1988; Neri et al., 1991; Bergsagel et al., 1996). Este análisis ha llevado a la identificación de varios compañeros cromosómicos para el locus IgH en B-NHL y MM (Taub et al., 1982; Dalla-Favera et al., 1983; Neri et al., 1988; Neri et al., 1991; Ye et al., 1993; Chesi et al., 1996; Richelda et al., 1997; Iida et al., 1997; Dyomin et al., 1997; Dyomin et al., 2000). Los autores de la presente invención emplearon la misma estrategia con el fin de clonar la región del punto de rotura de 1q21 en FR4, una línea celular de mieloma que porta una t(1;14)(q21;q32), según lo determinado por análisis citogenético (Tagawa et al., 1990; Taniwaki M, resultados no publicados). Dos "fragmentos ilegítimamente reordenados se identificaron en el locus de la cadena pesada C en FR4 mediante análisis de transferencia Southern (datos no mostrados), y se clonaron a partir de bibliotecas de fagos construidas a partir de ADN genómico de FR4. El mapeo de restricción, la hibridación por transferencia Southern y la secuenciación de nucleótidos parcial de dos fagos genómicos (clones lambda FR4B-5 y  FR4S-a, Figura 8A) demostraron que contenían los puntos de rotura cromosómicos de una translocación equilibrada recíproca entre el locus C1 en 14q32 y secuencias distintas de IGH. A continuación se utilizó una sonda (1.0EH) que representaba estas secuencias distintas de IgH (Figura 8A) para clonar el correspondiente locus genómico normal a partir bibliotecas genómicas humanas del cromosoma artificial del fago PI (PAC), y el cromosoma artificial de levadura (YAC). El análisis de hibridación fluorescente in situ (FISH) de las propagaciones de la metafase humana normal utilizando el clon PAC no quimérico de 100 kb 49A16 que abarca la región del punto de rotura (véase más abajo, Figura 13), identificó el locus cromosómico compañero como derivado de la banda 1q21 (Figura 8C). El mapeo de un único locus dentro del cromosoma 1 se confirmó por hibridación de dos sondas no repetitivas a ADN de un panel de híbridos de células somáticas representativo de cromosomas humanos individuales (datos no mostrados). Estos resultados fueron compatibles con la clonación de secuencias que abarcan la t(1;14)(q21;q32) en FR4.

El análisis de secuencia de las regiones de punto de rotura en los cromosomas derivados y el alineamiento con los loci 14q32 y lq21 de la línea germinal revelaron que el punto de rotura se había producido en el intrón entre CH3 y el exón transmembrana de C1 en el cromosoma 14. Aunque la región del punto de rotura estaba desprovista de secuencias señal de recombinación (RSS) o secuencias de señal de cambio (Kuppers et al., 1999), la secuencia CTTAAC (subrayada en la Figura 8B) estaba presente en ambos cromosomas 14 y 1 de la línea germinal en la unión del punto de rotura. Una copia de esta secuencia estaba presente en cada uno de los cromosomas derivados, con una ligera modificación en la copia der(1) (mutación puntual en el último nucleótido: C a G). Los nucleótidos AT que preceden a CTTAAC en el cromosoma 1 también estaban presentes en ambos cromosomas derivados (Figura 8B). La translocación no dio lugar a ninguna pérdida de secuencias en el cromosoma 1. Por otro lado, en la porción del cromosoma 14 de der(1) los autores de la presente invención observaron dos deleciones aguas arriba de la unión del punto de rotura: una deleción de 16 nucleótidos (GGCACCTCCCCTTAAC) y una deleción de 4 nucleótidos (TGCA) 6 nucleótidos aguas arriba (Figura 8B). Estas observaciones indican que la t(1;14)(q21;q32) en las células FR4 representa una translocación recíproca equilibrada posiblemente facilitada por la presencia de secuencias homólogas. (CTTAAC) en ambos cromosomas.

La región del punto de rotura de lq21 contiene genes que codifican nuevos miembros de la superfamilia de receptores de inmunoglobulina

Los autores de la presente invención investigaron a continuación si la región del cromosoma lq21 que abarca el punto de rotura de la translocación en FR4 contiene una unidad transcripcional. El ADN de los clones de PAC parcialmente solapantes 49A16 y 210K22 (Figura 13) fueron clonados por medio de "pistola génica" en plásmidos, secuenciados y analizados para determinar la homología con genes conocidos en bases de datos del genoma humano. Paralelamente, se buscaron los genes candidato en el PAC 49A16 por medio de una estrategia de captura de exones (Church et al., 1994).

El mapeo de los exones candidato sobre los clones genómicos de lq21 reveló que el punto de rotura de FR4 se había producido entre dos exones atrapados (véase más abajo, Figura 13), que pertenecían al mismo transcrito, ya que podrían estar conectados por RT-PCR utilizando ARN de bazo. A continuación, se utilizó este producto de RT-PCR como sonda para escrutar una biblioteca de ADNc de bazo con el fin de aislar clones completos correspondientes a este transcrito. Se identificaron dos conjuntos de clones de ADNc, que pertenecían a dos transcritos distintos y que compartían una identidad de secuencia de ARNm de 76% dentro de la región de la sonda de 443 pb. Los clones de ADNc completos para ambos transcritos se obtuvieron mediante amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) en ADNc de bazo humano que generó productos de extensión 5' y 3'.

La estructura esquemática del ADNc que representa el primer transcrito se representa en la Figura 9A. El uso alternativo de los tres posibles sitios de poliadenilación en su región no traducida 3’ da lugar a tres especies de ARNm de 2,6, 2,7 y 3,5 kb, que codifican la misma supuesta proteína de 515-aminoácidos (Figura 9A). Las características pronosticadas de esta proteína incluyen un péptido señal, de acuerdo con la regla [-3, -1] (von Heijne, 1986), cuatro dominios extracelulares de tipo Ig que llevan tres sitios de glicosilación potenciales unidos a (N) de asparragina (Figura 9A), uno transmembrana de 16 aminoácidos y un dominio citoplasmático de 106 aminoácidos, con tres supuestos dominios de unión de homología 2 a Src (SH2) consenso (Unkeless y Jin, 1997) (Figura 10B). Estos dominios de unión a (SH2) muestran características de motivos tanto ITAM (Motivo Inmunorreceptor basado en la Activación de Tirosina D/EX7D/EX2YXXL/IX6-8YXXL/I; donde X indica los residuos no conservados) (Reth,

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1989) como motivos ITIM (Motivo de Inhibición de Inmunorreceptor basado en Tirosina -S/V/L/IYXXL/V, donde X indica residuos no conservados) (Unkeless y Jin, 1997). Como se muestra en la Figura 10B, los primeros dos dominios de unión a SH2 están espaciados por 8 aminoácidos, en consonancia con el motivo ITAM consenso. A diferencia del consenso, el residuo glutamato (E) se posiciona cuatro en lugar de dos aminoácidos antes de la primera tirosina (Y) (Figura 10B), y la posición +3 con respecto a la tirosina (Y) está ocupada por valina (V) en lugar de leucina (L) o isoleucina (I) (Cambier, 1995). Los tres dominios se ajustan al consenso ITIM y cada uno está codificado por un exón separado, como es el caso de ITIM. Así, su disposición puede dar lugar a tres ITIM o posiblemente a un ITAM y un ITIM. La estructura general de esta proteína sugiere que representa un nuevo receptor transmembrana de la superfamilia de Ig y por lo tanto se denominó IRTA1 (gen 1 Asociado a la Translocación del Receptor Inmunitario 1).

El segundo ADNc comparte homología con IRTA1 (68% de identidad de nucleótidos para la longitud del mensaje de IRTA1 que codifica su dominio extracelular) y fue denominado IRTA2. El locus IRTA2 es más complejo que IRTA1 y se transcribe en tres isoformas de ARNm principales (IRTA2a, IRTA2b, IRTA2c) de diferente peso molecular (2,8, 4,7 y 5,4 kb respectivamente), cada uno con un propia única región no traducida 3' (Figura 9B). Adicionalmente, un transcrito de 0,6 kb (Figura 12A) surge del uso de una señal de poliadenilación temprana en el nucleótido 536 de IRTA2. Las tres isoformas de la proteína IRTA2 pronosticadas codificadas por estos transcritos comparten una secuencia de aminoácidos común hasta el residuo 560, que presenta un péptido señal común y seis dominios de tipo Ig extracelulares (Figura 9B). IRTA2a codifica una glicoproteína secretada de 759 aa con ocho dominios de tipo Ig seguido de 13 aminoácidos predominantemente polares únicos en su extremo C. IRTA2b diverge de IRTA2a en el residuo de aminoácido 560, y se extiende a lo largo de un corto tramo de 32 residuos adicionales, cuyo carácter hidrófobo es compatible con su acoplamiento a la membrana plasmática a través de un ancla de GPI (Ferguson y Williams, 1988). IRTA2c es la isoforma más larga cuya secuencia se desvía de IRTA2a en el aminoácido 746. Codifica una glicoproteína transmembrana de tipo I de 977 aa con nueve dominios de tipo Ig extracelulares, que alberga ocho sitios de glicosilación unidos a N potenciales, uno transmembrana de 23 aminoácidos y un dominio citoplásmico de 104 aminoácidos con tres motivos de unión a SH2 consenso (Figura 10B). Cada uno de los sitios de unión a SH2 en IRTA2c coincide con el consenso ITIM (Figura 10B) y es codificado por un exón separado. Estos rasgos sugieren que IRTA2c es un receptor transmembrana novedoso de la superfamilia de Ig con isoformas secretadas y unidas a GPI.

Homología entre las proteínas IRTA y los receptores de la superfamilia de inmunoglobulinas

El alineamiento de aminoácidos de la totalidad de los dominios extracelulares de las proteínas IRTA1 e IRTA2 entre sí y con otros miembros de la superfamilia de Ig reveló una homología notable entre ellos (identidad de 47% y similitud de 51%) y una homología inferior, pero llamativa con la familia de proteínas receptoras de Fc gamma. Esta homología era más fuerte en las posiciones de aminoácidos conservados entre las diferentes clases de receptores de Fc. Entre los receptores de Fc, el receptor de IgG de la alta afinidad FCGRI (CD64) compartió los más altos niveles de homología con los tres primeros dominios Ig de IRTA1 e IRTA2 (identidad de 37% y similitud de 50%) a lo largo de toda su porción extracelular (Figura 10A). Se observaron niveles inferiores de homología entre las proteínas IRTA y los dominios extracelulares de otras moléculas de la superficie celular, incluyendo la molécula de adherencia endotelial de plaquetas humanas (PECAM1), la molécula de adherencia celular de linfocitos B (CD22) y la glicoproteína biliar 1 (BGP1) (22-25% de identidad, 38-41% de homología).

No existe homología aparente entre las IRTA y los miembros de la familia de receptores de Fc en sus dominios citoplásmicos. En contraste, existe una homología de aminoácidos significativa entre IRTA1 y PECAM1 (identidad de aminoácidos de 31% y homología de 45%), IRTA2c y BGP1 (identidad de 30%, homología de 35%) e IRTA2c y PECAM1 (28% de identidad, 50% de homología) (Figura 10B). Estas homologías sugieren el empleo de rutas de señalización aguas abajo similares por parte de estas proteínas diferentes.

IRTA1 e IRTA2 normalmente se expresan en subpoblaciones específicas de células B

El patrón de expresión normal de los ARNm de IRTA1 e IRTA2 se analizó primero por hibridación de transferencia de Northern del ARN derivado de diferentes tejidos humanos normales y de las líneas celulares humanas que representan diferentes linajes hematopoyéticos y etapas de desarrollo de células B.

Se detectó la expresión de IRTA1 a un nivel muy bajo en ARN de bazo y ganglios linfáticos humanos (Figura 11A, panel izquierdo) y fue indetectable en todos los otros tejidos humanos analizados, incluyendo el hígado fetal, médula ósea, pulmón, placenta, intestino delgado, riñón, hígado, colon, músculo esquelético, corazón y cerebro (datos no mostrados). Entre las líneas de células B, la expresión de IRTA1 estaba ausente en líneas de células que representan células pre-B y células B del centro germinal, células plasmáticas y células de origen eritroide, células T y mieloide (datos no mostrados, véase Materiales y Métodos). La expresión fue detectable a niveles muy bajos solamente en líneas celulares linfoblastoides (LCL) inmortalizadas con EBV, que representan una subpoblación (inmunoblastos) situada aguas abajo de las células B del centro germinal en la diferenciación de células B. Sin embargo, la expresión se indujo en células ER/EB privadas de estrógeno que, al estar inmortalizadas por un genoma de EBV recombinante en el que el gen EBNA2 se fusiona con el receptor de estrógeno, proliferan en presencia de estrógeno, mientras se detienen en la fase G0/G1 tras la privación de estrógeno (Kempkes et al., 1995). La expresión de IRTA1 era apenas detectable en estas células en presencia de estrógeno, pero fue inducida (10 veces) después

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de la detención G0/G1 tras la retirada de estrógenos (Figura 11A, panel derecho). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que IRTA1 se expresa en una subpoblación linfoide presente en el bazo y los ganglios linfáticos y, presumiblemente, representada por células B en reposo.

Para investigar más el fenotipo y la distribución en los tejidos de las células que expresan IRTA1, los autores de la presente invención realizaron la hibridación in situ en tejido tonsilar humano utilizando una sonda de ADNc antisentido de IRTA1 (Figura 11B). Se procesaron las secciones seriadas para la hibridación in situ con una sonda de ADNc efectora de control (Panel Núm. 1 en la figura 11B), una sonda de ADNc antisentido (Panel Núm. 2) y tinción con hematoxilina y eosina (H & E) (Panel Núm. 3) para esbozar la arquitectura del tejido linfoide. La señal de hibridación de IRTA1 fue excluida del centro germinal y la zona de manto de los folículos y se concentró característicamente en la zona perifolicular con infiltraciones en la región intraepitelial (Figuras 11B-2, 11B-4). En esta región, sólo las células B fueron positivas tal como se documenta mediante la tinción con marcadores específicos de células B (IgD, no mostrado), y mediante análisis immnunohistoquímico con anticuerpos anti-IRTA1 y anti-B (CD20, PAX5), anti-T (CD3), y anti-monocitos (CD68) (no mostrados; G. Cattoretti et al., manuscrito en preparación.). Esta área perifolicular es la "zona marginal" equivalente a la amígdala, lo que representa un compartimiento de células B funcionalmente distinta que contiene la mayoría de las células B de memoria y las células B monocitoides (de Wolf-Peeters et al., 1997). Junto con el análisis de transferencia Northern de tejidos normales y líneas celulares, estos resultados indican que IRTA1 se expresa en una subpoblación de células B maduras en reposo topográficamente ubicada en la región perifolicular e intraepitelial, sitios ricos en células B de memoria.

En el caso de IRTA2, el análisis de transferencia Northern detectó todas las especies empalmadas alternativamente en ARNm de ganglio linfático, bazo, médula ósea e intestino delgado humanos, con una preponderancia relativa de la isoforma IRTA2a (Figura 12A, panel izquierdo). Entre las líneas de células hematopoyéticas de origen linfoide y no linfoide sometidas a ensayo, la expresión de IRTA2 se restringió a las líneas de células B con un fenotipo post-centro germinal inmunoblástico (Figura 12A, panel derecho). De manera similar a IRTA1, estaba ausente de las líneas celulares derivadas de células pre-B, centroblastos del centro germinal, células plasmáticas, células T, células eritroides y células mieloides (Figura 12A, panel derecho).

El análisis de hibridación in situ de tejido tonsilar humano, utilizando el ADNc de IRTA2c como sonda, fue compatible con los resultados del análisis de transferencia Northern. El ARNm de IRTA2 fue excluido en gran parte de la zona del manto del centro germinal, con la excepción de unas pocas células positivas (Figuras 12B-2, 12B4). Dentro del centro germinal, la zona oscura, representada por centroblastos, apareció negativa para IRTA2, mientras que la zona clara, rica en centrocitos, fue fuertemente positiva (Figuras 12B-2, 12B-4). Finalmente, el ARNm de IRTA2 se detectó en la región equivalente de la "zona marginal" fuera de los folículos de los centros germinales y en las regiones intraepiteliales e interfoliculares de la amígdala. Este patrón es compatible con la especificidad de IRTA2 para los centrocitos y las células post-B del centro germinal. Comparando sus patrones de expresión, los autores de la presente invención concluyen que ambos son específicos para las células B maduras, pero IRTA2 tiene un patrón más amplio de expresión que incluye centrocitos y células B interfoliculares, mientras IRTA1 está restringida a las células B de la zona marginal, muy probablemente células de memoria.

Organización genómica de los genes IRTA1 e IRTA2

Para entender las consecuencias de las anomalías lq21 sobre la estructura y la expresión de los genes IRTA1 e IRTA2, los autores de la presente invención determinaron primero la organización de sus loci genómicos. El gen IRTA1 contiene 11 exones con un tamaño genómico total de 24,5 kb (Figura 13). Se encontró que el locus IRTA2 abarcaba una región genómica de aproximadamente 40 kb (Figura 13). Los tres productos empalmados alternativamente de IRTA2 comparten sus primeros 8 exones, en cuyo punto IRTA2b no utiliza el siguiente sitio de empalme, y termina introduciendo su región UTR 3'. Las isoformas IRTA2a y 2c se empalman en el exón 9, entrando IRTA2a en su UTR 3' después del exón 11 y empalmando IRTA2c en el exón 12 y extendiéndose hasta el exón 18 (Figura 13).

Basándose en los datos de secuenciación, los autores de la presente invención determinaron que los genes IRTA1 e IRTA2 se encuentran a 21 kb el uno del otro, yuxtapuestos en la misma orientación transcripcional (Figura 13) que se extiende desde el telómero (5') hacia el centrómero (3'). En el locus lq21, están estrechamente conectados el uno al otro, así como a tres genes adicionales que habían clonado recientemente los autores de la presente invención a través de su homología con las IRTA (I.M., manuscrito en preparación). Los cinco genes son contiguos, cubriendo una región de ~300 kb en 1q21. Esta región se encuentra en el intervalo entre los puntos de rotura de lq21 referidos anteriormente. Basándose en la distancia entre clones genómicos que albergan los genes respectivos en el mapa Whitehead Institute Radiation Hybrid, se estima que el locus de IRTA1-2 se encuentra aproximadamente a 0,8 Mb de distancia del locus MUC1 hacia el telómero (N.P., datos no publicados; Dyomin et al., 2000; Gilles et al., 2000) y a menos de o igual a 7 Mb del locus FCGRIIB hacia el centrómero (N.P., datos no publicados).

La translocación t(1;14)(q21;q32) genera una proteína de fusión IRTA1/Ca1 en la línea celular de mieloma FR4

El análisis comparativo de restricción y de la secuencia de nucleótidos de la línea germinal frente a las secuencias reordenadas de los loci Ca1 e IRTA1 mostró que la translocación había fusionado las secuencias en el intrón 2 del

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gen IRTA1 a las secuencias intrónicas entre CH3 y el exón transmembrana de Ca1 en la misma orientación transcripcional (Figura 14A). Esto sugiere que, si las secuencias de IRTA1 se expresaban en el locus translocado, el sitio donante intacto en el límite 3' del exón IRTA1 y el sitio aceptor intacto en el 5' de Ca1 podrían ser utilizados para generar un ARNm de fusión IRTA1/Ca1, y posiblemente una proteína de fusión IRTA1/Ca1.

Con el fin de someter a ensayo esta predicción, los autores de la presente invención analizaron la expresión del ARNm de IRTA1 en FR4 por medio de análisis de transferencia Northern utilizando una sonda de ADNc de IRTA1 derivada del exón 1 (Figura 14A). Esta sonda detectaba un mensaje de 0,8 kb en FR4 que estaba ausente de otras líneas de células B, y era más corto que el mensaje normal de 2,5 kb detectable en células ER/EB (Figura 14B). Los autores de la presente invención clonaron este transcrito por medio de RT-PCR del ARNm de FR4 utilizando cebadores derivados de secuencias en el límite 5' del exón 1 de IRTA1 y el límite 3' del exón citoplásmico C (Figura 14A). Se obtuvo un producto de RT-PCR de FR4, pero no de la línea celular DAKIKI que expresa la IgA de la superficie de tipo salvaje, u otras líneas celulares que carecen de una translocación t(1;14) (datos no mostrados). El análisis de secuenciación directa del producto de PCR indicó que el empalme había ligado de manera precisa IRTA1 y Ca1 en los sitios de empalme canónicos y determinó que el transcrito de fusión tenía 820 pb de longitud.

El análisis del producto de proteína pronosticado indicó que el empalme IRTA1/C1 había dado lugar a una fusión entre el péptido señal IRTA1 y los dos primeros aminoácidos extracelulares, con el espaciador largo extracelular de 32 aminoácidos, el dominio transmembrana y la cola citoplasmática del receptor de IgA1 de membrana (mIgA1) (Figura 14C). Para el análisis de la expresión de esta proteína de fusión en extractos de proteína FR4, los autores de la presente invención utilizaron un anticuerpo dirigido contra residuos de aminoácidos extracelulares específicos para la isoforma transmembrana de C1 (Yu et al., 1990) para la inmunoprecipitación, seguido de transferencia Western. Los resultados de los autores de la presente invención demuestran que las células FR4, pero no una línea celular de control (DAKIKI) que expresa IgA de la superficie de tipo salvaje, expresan una proteína de 9,8 kDa acorde con el tamaño pronosticado de la proteína de fusión IRTA1/C1 (Figura 14D). Estos resultados muestran que el alelo translocado codifica una proteína de fusión, compuesta por el péptido señal y los dos primeros residuos extracelulares de IRTA1 (1-7 aminoácidos) fusionado a los dominios transmembrana y citoplásmicos codificados por C1 (71 aminoácidos). En contraste con la expresión en exceso de IRTA1/Ca1 en der(14), no se detectó expresión en FR4 para el transcrito recíproco Ca1/IRTA1 o para el gen IRTA2 intacto en der(1).

Con la excepción de FR4, no se detectó expresión de ARNm de IRTA1 en ninguna otra línea celular de mieloma o linfoma, independientemente del estatus de su banda cromosómica 1q21 (datos no mostrados). Por lo tanto, la fusión IRTA1/Ca representa un evento raro en las aberraciones de lq21.

Desregulación frecuente de la expresión de IRTA2 en líneas celulares que portan anomalías de lq21

Con el fin de establecer la relación física entre otros puntos de rotura de lq21 y el locus de IRTA1/2, los autores de la presente invención realizaron un análisis FISH con el PAC 49A16 en el panel de líneas celulares BL y MM de los autores de la presente invención. De diez líneas celulares BL analizadas, siete con dup(1) (q21q32) y tres con translocaciones lq21 (AS283A, BL104, BL136), los autores de la presente invención detectaron tres señales correspondientes al locus de IRTA1/IRTA2 en siete de las primeras y dos de las últimas, en consonancia con dup(1) (q21q32) en el primer caso y dup(1) (q21q32) seguido de un punto de rotura de translocación en lq21 en el segundo (Tabla 1). El análisis FISH de AS283A y BL136, utilizando sondas que abarcan el locus de IRTA y con clones genómicos vecinos, situó el punto de rotura de los cromosomas derivados fuera del locus de IRTA en ambas líneas celulares, a una distancia de >800 kb hacia el centrómero en AS283A y >800 kb hacia el telómero en BL136 (N.P., resultados no publicados). En consonancia con este hallazgo, el análisis de 30 casos de tumores primarios MM por medio de FISH de interfase con el YAC de 300 kb 23GC4 (Figura 13), mostró que 15 casos (50% del total analizado) tenían más de dos señales de FISH en interfase (datos no mostrados), mientras que el FISH de dos colores con dos clones de PAC que flanqueaban las fronteras centroméricas y teloméricas de YAC no detectó ninguna escisión de estas dos sondas en ninguno de los casos. Estos resultados indican que, con la excepción de FR4, los puntos de rotura de las aberraciones de lq21 en BL o MM no están dentro de o en estrecha proximidad con la región genómica definida por IRTA1 e IRTA2. Sin embargo, el resultado coherente de cualquiera dup(1) (q21q32) (véase la Tabla 1) o dup(1) (q21q32) seguido de translocaciones desequilibradas (AS283A, BL136, XG2, XG7 en la Tabla 1) es la trisomía o tetrasomía parcial de la región de lq21 que contiene los genes de IRTA.

Tabla 1. Resumen de los datos del cariotipo y FISH en el locus IRTA1/IRTA2 5

Tipo de tumor

Citogenética PAC 49A16 Número de copias del locus IRTA por FISH Expresión de ARNm de IRTA2

Linfoma de Burkitt

AS283A

der(4) t(1;4) (q21; q35) der(4), normal 1 3 ++++++

MC116

duplq21 duplq21 3 +++

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Tipo de tumor

Citogenética PAC 49A16 Número de copias del locus IRTA por FISH Expresión de ARNm de IRTA2

CA46

duplq21 duplq21 3 +++

PA682

duplq21 duplq21 3 ++

BrgIgA

duplq21 duplq21 3 ++

BL32

duplq21 duplq21 3 -

BL92

duplq21 duplq21 3 ++

BL103

invduplq21 duplq21 3 +

BL104

t(1;3)(q21;p25) der(1) 2 +

BL136

der(1)(qpterlq21::q21) der(1) 3 ++

Mieloma múltiple

XG2

der(1) t(1;?)(q21;?) der 19 t(1;19)(q12;?) dex(1), normal 1 der(19) 3 ++++

XG7

der(9) t(1;9)(q12;?) der(19) t(1;19)(q12;?) der(1) t(1;?)(q21;?)x2 der(9) der(19) der(1) x2 4 -

A continuación, los autores de la presente invención investigaron si estas aberraciones tenían un efecto sobre la expresión del ARNm de IRTA2. Con este fin, los autores de la presente invención utilizaron una sonda de ADNc correspondiente a la región no traducida 5' de IRTA2 para escrutar una transferencia Northern con un panel de líneas celulares de B-NHL y MM carentes de o que mostraban anomalías cromosómicas en lq21. Los resultados muestran que la mayoría (diez de doce) líneas BL con cromosomas lq21 normales carecen esencialmente de expresión de IRTA2, coincidiendo con el hecho de que los BL derivan de centroblastos GC que normalmente carecen de expresión de IRTA2 (Figura 15A, panel izquierdo). Por el contrario, la mayoría de las líneas BL que portan anomalías en lq21 (diez de doce) muestran claramente una regulación al alza del ARNm de IRTA2 (Figura 15A, panel derecho), que oscilan de 2 a 50 veces sobre los niveles basales detectados en BL con lq21 normal. Entre las líneas celulares de mieloma, IRTA2 era expresada en exceso en una de cada tres líneas que muestran anomalías en 1q21 (XG2), mientras que no se expresaba en ninguna de las siete con lq21 normal (Figura 15B).

Estos resultados muestran una fuerte correlación entre la presencia de aberraciones cromosómicas lq21 y la desregulación de la expresión de ARNm de IRTA2 en BL y sugieren que las trisomías del locus IRTA2 pueden desregular su expresión en este subtipo de linfoma (véase la Discusión).

Discusión

Los esfuerzos descritos en la presente memoria para identificar genes implicados en las aberraciones cromosómicas que afectan a la banda lq21 en el Mieloma Múltiple y el linfoma de células B, condujeron al descubrimiento de que IRTA1 e IRTA2, dos miembros fundadores de una nueva subfamilia de receptores relacionados dentro de la familia de inmunorreceptores; las secuencias de ácido nucleico completas que codifican las proteínas IRTA1 e IRTA2 son proporcionadas en la presente memoria, así como las secuencias de aminoácidos de las proteínas IRTA1 e IRTA2 codificadas. Con posterioridad tres genes adicionales de los miembros de esta subfamilia de receptores relacionados fueron aislados, IRTA3, IRTA4, e IRTA5, cuyas secuencias de ácido nucleico completas se proporcionan en la presente memoria, así como las secuencias de aminoácidos de las proteínas IRTA3, IRTA4, e IRTA5 codificadas. Estos resultados tienen implicaciones para la biología normal de las células B, así como para el papel de las aberraciones de 1q21 en la linfomagénesis.

IRTA1 e IRTA2 son miembros fundadores de una nueva subfamilia dentro de la superfamilia de Ig

Varias características compartidas entre los dos genes de IRTA y sus proteínas codificadas sugieren que forman una nueva subfamilia dentro de la superfamilia de inmunorreceptores. En primer lugar, comparten un mayor grado de homología entre sí en sus dominios extracelulares que con otros miembros de la superfamilia tanto en su secuencia de ARNm (identidad de 68%) como de proteína (identidad de 47%). En segundo lugar, comparten homología en sus dominios citoplásmicos, marcados por la presencia de motivos de señalización de tipo ITAM e ITIM en el contexto de las secuencias de aminoácidos homólogas. En tercer lugar, IRTA1 e IRTA2 pertenecen a una subfamilia más grande de cinco genes que muestra mayor homología intrafamiliar y una estrecha agrupación dentro de una región de ~300 kb en lq21 (I.M. et al., Manuscrito en preparación). Su organización genómica sugiere que un gen ancestral común

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Claims (1)

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