JP2023519304A - 多発性骨髄腫における免疫療法の標的およびその同定方法 - Google Patents

多発性骨髄腫における免疫療法の標的およびその同定方法 Download PDF

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Abstract

多発性骨髄腫と主に関連する表面タンパク質が、抗多発性骨髄腫治療を開発するための潜在的標的として同定される。一実施形態によると、多発性骨髄腫細胞と関連する同定されたタンパク質のエピトープに特異的に結合する抗体が生成される。次いでこれら抗体を使用して、患者の多発性骨髄腫細胞への細胞傷害性薬剤の送達を標的することができ、またはこれを使用して多発性骨髄腫患者を処置するためのＣＡＲ Ｔ細胞を調製することができる。【選択図】図１Ｂ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月２７日に出願の米国暫定特許出願第６３／０００６９４号の優先権を主張し、その開示は、本明細書に明示的に組み込まれる。
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本出願と同時に提出される２０２１年３月２２日に作成され、「３３５０２２＿ＳＴ２５」と命名された１４９０キロバイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイルと特定されるコンピュータ読み込み可能なヌクレオチド／アミノ酸配列表が、その全体を参照により組み込まれる。
多発性骨髄腫（ＭＭ）、別名形質細胞骨髄腫は、抗体を通常産生する白血球の一種である形質細胞のがんである。世界的には、多発性骨髄腫は、２０１５年に４８８０００人が罹患し、１０１１００人が死亡した。米国において、多発性骨髄腫は、年間１０００００人当たり６．５人が発症し、０．７％の人が、その人生におけるどこかの時点で罹患する。処置しなければ、典型的な生存は、７カ月間である。現在の処置によると、生存は、通常４～５年間である。
免疫療法により腫瘍抗原を標的することが、がん処置の有望な手法として急速に発展している。免疫療法は、抗体に媒介されるチェックポイントの遮断および改変されたＴ細胞の成功に基づくものである。ＭＭにおいて、ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）を標的するモノクローナル抗体、抗体－薬物コンジュゲート、二重特異性抗体構築物、およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、ＭＭ患者の生存を有意に改善する。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞に関係する２０件を超える臨床試験データは、再発および／または難治性ＭＭの患者が、客観的奏功を実現しうることを実証した。
過去２５年間にわたって多発性骨髄腫（ＭＭ）の処置は目覚ましく進歩してきたが、骨髄腫は依然として不治の病であり、難治性再発性ＭＭ（ＲＲＭＭ）または高リスク細胞遺伝学の患者にとって特に予後が悪い。リンパ性悪性腫瘍患者におけるＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の優れた成功は、ＭＭを処置するためのＣＡＲ Ｔ細胞の開発を促した。ＢＣＭＡ（別名ＴＮＦＲＳＦ１７）は、プロテアソーム阻害薬および免疫調節薬による処置を含めた先行処置を少なくとも３回受けたＲＲＭＭ患者に対する、ＣＡＲ Ｔ細胞を生成するのに利用される第１の表面標的である。抗体コンジュゲートおよび二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ；２つの連結された単鎖可変断片を有し、１＋１の抗原結合価を有する特有の人工二重特異性モノクローナル抗体）によるＢＣＭＡの標的化は、ＭＭの処置に有効性があることが実証されている。ＢＣＭＡを標的する両方の免疫療法が、ＦＤＡによってＲＲＭＭ患者に対する画期的地位を認められた。これら臨床試験の全ては、高度に前処置されたＲＲＭＭにおいて抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が深い応答を誘導する能力について素晴らしい結果を実証するが、にもかかわらず、寛解は持続されず、患者の大多数は最終的に再発する。抵抗力の機序の１つは、低ＢＣＭＡもしくはＢＣＭＡ陰性サブクローンの出現による抗原の消失または下方調節にある。他の標的を同定することは、ＢＣＭＡ ＣＡＲ療法に失敗した患者に治療的選択肢を提供し、および／または抗原逃避のリスクを限定する組合せ戦略を設計するのに不可欠である。ＣＡＲ Ｔ細胞療法の成功の最も重要な決定要素の１つは、標的抗原の選択であり；理想的な標的は、全ての腫瘍細胞、がん幹細胞、ほとんどの患者において高発現されており、正常な相対物および全身のほとんどの器官に存在するべきでない。そのため、骨髄腫表面のプロテオームを研究することは、免疫療法のさらなる標的を同定し、疾患生物学において変更されたサーフェスオーム（ｓｕｒｆａｃｅｏｍｅ）の役割を理解するのに重要である。実際に、表面タンパク質は、骨髄微小環境の骨髄腫操作を支持する調節機序を媒介しうる。
本目的のために、本開示の一態様は、高品質の質量分析方法論の使用を対象とし、統合型バイオインフォマティクスツールを生成して、固有の遺伝的背景を持つＭＭ細胞系および原発性ＭＭ患者試料の細胞表面を偏りなく正確にマップする。これらは、細胞内タンパク質と比較して存在量が低く、疎水性が高く、激しい翻訳後修飾で存在する表面タンパク質を研究する課題の克服に役立った。本開示によると、本方法は、ＢＣＭＡを超える代替的なＣＡＲ Ｔ細胞治療法を設計するために使用されうるさらなる標的を同定するために提供される。
本開示は、多発性骨髄腫患者を診断し、処置するための抗体およびＣＡＲ Ｔ細胞を含む新規薬物を開発するために免疫療法の標的として利用されうる候補細胞表面抗原を同定することを対象とする。本発明の抗体を使用して、フローサイトメトリーのような診断目的の疾患マーカーを同定することもできる。一実施形態によると、本明細書に開示される同定された標的は、悪い予後の特徴と有意に関連する（すなわち高リスクＭＭと関連する）表面標的を示す多発性骨髄腫（ＭＭ）患者を同定し、処置するためのマーカーとしての機能を果たす潜在性を有する。
一実施形態によると、方法は、多発性骨髄腫細胞に特異的であり、免疫療法の標的として使用されうる標的細胞表面抗原を同定するために提供される。一実施形態において、本方法は、ビオチン標識し、続いて質量分析（ＭＳ）を使用して固有の遺伝的異常を持つ多発性骨髄腫細胞系の表面特異的プロテオーム分析を実行する工程を含む。さらなる実施形態において、ＭＭ患者のＲＮＡ－ｓｅｑデータセットが調査され、正常組織と比較してＭＭ患者において遺伝子発現が上昇した表面タンパク質を同定する。一実施形態において、方法は、多発性骨髄腫細胞に特異的な標的細胞表面抗原を同定するために提供され、本方法は、ＭＭ患者の表面標識タンパク質の質量分析およびＲＮＡ－ｓｅｑデータセットの分析を含み、標的細胞表面抗原として両方の分析に共通のタンパク質を同定する。
一実施形態によると、配列番号１から配列番号１５５の配列を有する細胞表面ポリペプチドが、ＭＭ細胞と関連していると同定された。したがって、配列番号１～１５５のペプチドは、ＭＭを処置するための免疫に基づく治療戦略に対する標的を表す。一実施形態によると、配列番号１～１５５からなる群から選択されるポリペプチドに特異的に結合する抗体が、提供される。一実施形態によると、抗体はモノクローナル抗体である。抗体断片も、本発明に包含され、断片は、全抗体と同じエピトープに結合する能力を保持する。
一実施形態によると、細胞表面ポリペプチドＩＬ１２ＲＢ１、ＳＬＣ５Ａ３、ＣＣＲ１、ＡＮＫＨ、ＩＬ２７ＲＡ、Ｓ１ＰＲ４、ＴＬＲ１、ＫＣＮＡ３、ＰＳＥＮ２、ＢＣＭＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＬＩＬＲＢ４、ＩＬ６Ｒ、ＩＴＧＢ７、ＬＲＰ１０、ＦＣＲＬ３、ＩＦＮＧＲ１、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＣＯ３Ａ１、ＬＩＬＲＢ１、ＰＬＸＮＡ３、ＳＬＣ１７Ａ５、ＣＤ２８、ＬＡＸ１、ＮＥＭＰ１、ＴＭＥＭ１５４、ＳＥＭＡ４Ａ、Ｃ１０ｏｒｆ５４、ＩＴＭ２Ｃ、ＬＹ９、ＳＬＡＭＦ７、ＩＴＧＡ４、ＬＲＲＣ８Ａ、ＬＲＲＣ８Ｄ、ＣＤ３２０、ＫＣＮＮ４、ＰＬＸＮＣ１、ＣＤ３７、ＳＥＬＰＬＧ、ＤＡＧＬＢ、ＡＢＣＣ４、ＡＤＡＭ９、ＣＤ４、ＣＤ１８０、ＣＤ４８、ＣＤ４０、ＭＣＵＲ１、ＡＢＣＣ５、ＩＬ６ＳＴ、ＬＲＰ８、ＳＬＣ５Ａ６、ＳＬＣ７Ａ６、ＨＬＡ－Ｆ、ＩＣＡＭ２、ＬＥＰＲＯＴ、ＩＴＧＡＬ、ＴＭＥＭ６３Ａ、ＣＭＴＭ７、ＩＬ１０ＲＢ、ＮＤＣ１、ＰＴＰＲＣＡＰ、ＡＮＴＸＲ２、ＡＢＣＡ７、ＦＣＧＲ２Ｂ、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＳＴＳ、ＡＢＨＤ１２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＨＶＣＮ１、ＳＬＣ３９Ａ１０、ＥＭＰ３、ＡＢＣＣ１、ＳＬＣ２６Ａ６、ＳＬＣ６Ａ６、ＣＣＲ１０、ＳＬＣ３０Ａ１、ＳＬＣ２３１Ａ１、ＡＤＣＹ３、ＩＦＮＡＲ１、ＰＴＰＲＪ、ＣＬＤＮＤ１、ＳＬＣ３０Ａ５、ＳＬＣ６Ａ９、ＡＤＡＭ１５、ＩＧＦ２Ｒ、ＩＮＳＲ、ＮＯＴＣＨ２、ＣＤ５３、ＳＬＣ１２Ａ９、ＳＬＣ１５Ａ４、ＣＥＭＩＰ２、ＡＤＡＭ１７、ＭＰＺＬ１およびＴＡＣＩが、ＭＭ細胞と関連すると同定された。したがって、これらのペプチドは、ＭＭを処置するための免疫に基づく治療戦略に対する標的を表す。一実施形態によると、これらポリペプチドのうち１つに特異的に結合する抗体が、提供される。一実施形態によると、抗体はモノクローナル抗体である。抗体断片も、本発明に包含され、断片は、全抗体と同じエピトープに結合する能力を保持する。
一実施形態によると、細胞表面ポリペプチドＩＬ１２ＲＢ１、ＣＣＲ１、ＬＩＬＲＢ４、ＦＣＲＬ３、ＩＦＮＧＲ１、ＳＬＡＭＦ６、ＬＡＸ１、ＳＥＭＡ４Ａ、ＩＴＧＡ４、ＬＲＲＣ８ＤおよびＣＤ３２０が、ＭＭ細胞と関連すると同定されている。したがって、これらのペプチドは、ＭＭを処置するための免疫に基づく治療戦略に対する標的を表す。一実施形態によると、これらポリペプチドのうち１つに特異的に結合する抗体が、提供される。一実施形態によると、抗体はモノクローナル抗体である。抗体断片も、本発明に包含され、断片は、全抗体と同じエピトープに結合する能力を保持する。
一実施形態によると、配列番号１～１１５からなる群から選択されるポリペプチドに結合する抗体または抗体断片が、提供される。一実施形態によると、抗体または抗体断片は、配列番号１～１０からなる群から選択されるポリペプチドに結合する。一実施形態によると、抗体または抗体断片は、配列番号１１～２０からなる群から選択されるポリペプチドに結合する。一実施形態によると、抗体または抗体断片は、配列番号２１～３０からなる群から選択されるポリペプチドに結合する。一実施形態によると、抗体または抗体断片は、配列番号３１～４０からなる群から選択されるポリペプチドに結合する。一実施形態によると、抗体または抗体断片は、配列番号４１～５０からなる群から選択されるポリペプチドに結合する。一実施形態によると、抗体または抗体断片は、配列番号５１～６０からなる群から選択されるポリペプチドに結合する。一実施形態によると、抗体または抗体断片は、配列番号６１～７０からなる群から選択されるポリペプチドに結合する。一実施形態によると、抗体または抗体断片は、配列番号７１～８０からなる群から選択されるポリペプチドに結合する。一実施形態によると、抗体または抗体断片は、配列番号８１～９０からなる群から選択されるポリペプチドに結合する。一実施形態によると、抗体または抗体断片は、配列番号９１～１００からなる群から選択されるポリペプチドに結合する。一実施形態によると、抗体または抗体断片は、配列番号１０１～１１０からなる群から選択されるポリペプチドに結合する。一実施形態によると、抗体または抗体断片は、配列番号１１１～１２０からなる群から選択されるポリペプチドに結合する。一実施形態によると、抗体または抗体断片は、配列番号１２１～１３０からなる群から選択されるポリペプチドに結合する。一実施形態によると、抗体または抗体断片は、配列番号１３１～１４０からなる群から選択されるポリペプチドに結合する。一実施形態によると、抗体または抗体断片は、配列番号１４１～１４７からなる群から選択されるポリペプチドに結合する。
一実施形態によると、配列番号１６８～２０８からなる群から選択されるポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体が、提供される。一実施形態によると、モノクローナル抗体が提供され、抗体は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号３７、配列番号４２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５７、配列番号７９、配列番号１１２および配列番号１０４からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０、９５または９９％の配列同一性を有するポリペプチドに特異的に結合する。
一実施形態によると、モノクローナル抗体が提供され、抗体は、ＣＣＲ１（配列番号６０）、ＣＤ３２０（配列番号５６）、ＦＣＲＬ３（配列番号５７）、ＩＦＮＧＲ１（配列番号７９）、ＩＬ１２ＲＢ１（配列番号１９）、ＩＴＧＡ４（配列番号４２）、ＬＩＬＲＢ４（配列番号２０）、ＬＲＲＣ８Ｄ（配列番号１１２）、ＳＥＭＡ４Ａ（配列番号１０４）、ＳＬＡＭＦ６（配列番号３７）およびＴＮＦＲＳＦ１７（配列番号１６７）からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０、９５または９９％の配列同一性を有するポリペプチドに特異的に結合する。
一実施形態によると、モノクローナル抗体が提供され、抗体は、ＩＬ１２ＲＢ１、ＣＣＲ１（配列番号６０）、ＬＩＬＲＢ４（配列番号２０）、ＦＣＲＬ３（配列番号５７）、ＩＦＮＧＲ１（配列番号７９）、ＳＬＡＭＦ６（配列番号３７）、ＳＥＭＡ４Ａ（配列番号１０４）、ＩＴＧＡ４（配列番号４２）、ＬＲＲＣ８Ｄ（配列番号１１２）およびＣＤ３２０（配列番号５６）からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０、９５または９９％の配列同一性を有するポリペプチドに特異的に結合する。
一実施形態によると、モノクローナル抗体が提供され、抗体は、配列番号１～１５５または１６８～２０８からなる群から選択されるポリペプチド、任意選択で配列番号１６８～２０８からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０、９５または９９％の配列同一性を有するポリペプチドに特異的に結合する。
一実施形態によると、本明細書に開示される抗体のいずれも、任意選択で、抗体に連結された検出可能なマーカーおよび／または細胞傷害性薬剤をさらに含む。
一実施形態によると、本明細書に開示される抗体のいずれかを２、３、４、５、６、７、８、９個またはより多く含む組成物が、提供され、抗体の多くは、配列番号１から配列番号１５５のポリペプチドによって提示される異なるエピトープを各々結合する。
一実施形態によると、本明細書に開示される抗体のいずれかは、固体支持体に連結される。一実施形態において、本明細書に開示される抗体のいずれかは、検出可能な標識に共有結合で連結される。一実施形態において、本明細書に開示される抗体のいずれかは、細胞傷害性薬剤に共有結合で連結される。
一実施形態によると、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供され、キメラ抗原受容体は、
配列番号１～１５５からなる群から選択されるポリペプチドの１つもしくは複数のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片、
膜貫通ドメイン；および
Ｔ－細胞抗原受容体鎖を含み、膜貫通ドメインは、抗体またはその抗原結合断片とＴ－細胞抗原受容体鎖とを連結する。
一実施形態によると、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供され、キメラ抗原受容体は、
配列番号１～１５５からなる群から選択されるポリペプチドの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合する抗体単鎖可変断片、膜貫通ドメイン；およびＴ－細胞抗原受容体鎖を含み、膜貫通ドメインは、抗体単鎖可変断片とＴ－細胞抗原受容体鎖とを連結する。一実施形態において、キメラ抗原受容体のＴ－細胞抗原受容体鎖は、ＣＤ３ζ鎖（ゼータ鎖）を含む。一実施形態において、キメラ抗原受容体は、配列番号１～２５からなる群から選択されるポリペプチド、または配列番号２５～５０からなる群から選択されるポリペプチド、または配列番号５０～７５からなる群から選択されるポリペプチド、または配列番号７５～１００からなる群から選択されるポリペプチド、または配列番号１００～１２５からなる群から選択されるポリペプチドに特異的に結合する。一実施形態によると、キメラ抗原受容体は、抗体単鎖可変断片と膜貫通ドメインの間に位置するヒンジ領域をさらに含む。
一実施形態によると、修飾されたＴ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）が提供され、Ｔ細胞は、配列番号１～１５５からなる群から選択されるポリペプチドに特異的に結合する本開示のキメラ抗原受容体を発現するために形質転換される。一実施形態において、キメラ抗原受容体のＴ－細胞抗原受容体鎖は、ＣＤ３ζ鎖（ゼータ鎖）である。
一実施形態において、本明細書に開示される抗体、キメラ抗原受容体またはＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかを含み、任意選択で薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、静脈内または腹膜内を含めた任意の適切な投与経路のための標準的な技術を使用して配合されうる。
一実施形態によると、多発性骨髄腫を処置する方法が提供される。一実施形態において、本方法は、そのような処置を必要とする患者に本開示の抗体、キメラ抗原受容体またはＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかの治療量を投与する工程を含む。一実施形態において、組成物は、本明細書に開示される抗体、キメラ抗原受容体またはＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかおよび薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物として投与される。
一実施形態によると、ＭＭを処置する方法は、配列番号１～１５５からなる群から選択されるポリペプチドに特異的に結合するキメラ抗原受容体を発現するＣＡＲ Ｔ細胞を投与する工程を含む。一実施形態において、処置は、ＢＣＭＡまたは抗原ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３８、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＩＴＧＢ７、ＣＤ２２９、ＣＤ５６、ＴＡＣＩ、ＣＤ１９およびＣＤ７０を含むＭＭにある他の公知の表面候補標的を指向するＣＡＲ Ｔ細胞の同時投与を含めた、熟練の施術者に公知の、他の公知の治療的処置と組み合わせて遂行される。
図１Ａ～Ｄは標的ＭＭ遺伝子を同定する工程を表す図である。図１Ａは、異なる７種のＭＭ細胞系の表面タンパク質のビオチン化、それに続く分光測定分析の略図である。各細胞系は、示した通りの染色体再配置およびｐ５３突然変異の特有の組合せを持つ。この分析により、４７６１個のタンパク質に対応する５４５４個のｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤを同定した。図１Ｂは、細胞表面分子の注釈を生成するために使用した統合されたデータベースの略図である。各リポジトリについて、細胞表面分子の注釈に使用した方法論および相対的サイズを示した。これは、０が、細胞表面位置にないタンパク質を、５が、５つ全てのレポジトリにおいて検出されたタンパク質を意味するスコアリングシステムとしての機能も果たす。スコア当たりのＩＤ数も示される。多発性骨髄腫患者９０４名から得られた１６４６２個の転写産物が、細胞表面分子に対して注釈された。図１Ｃは、細胞系における質量分析計分析と原発性患者試料におけるＲＮＡ－ｓｅｑによって検出されたスコア３以上の細胞表面分子の間の重なりを示すベン図である。図１Ｄは、標的ＭＭ遺伝子を同定する工程を表す図である。細胞表面分子の発現レベルが分析され、患者遺伝子の発現平均から１ＳＤ未満の発現の分子を除外することにより、３２６個の表面タンパク質がさらなる分析のために選択されたことを示す図である。 図１Ａ～Ｄは標的ＭＭ遺伝子を同定する工程を表す図である。図１Ａは、異なる７種のＭＭ細胞系の表面タンパク質のビオチン化、それに続く分光測定分析の略図である。各細胞系は、示した通りの染色体再配置およびｐ５３突然変異の特有の組合せを持つ。この分析により、４７６１個のタンパク質に対応する５４５４個のｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤを同定した。図１Ｂは、細胞表面分子の注釈を生成するために使用した統合されたデータベースの略図である。各リポジトリについて、細胞表面分子の注釈に使用した方法論および相対的サイズを示した。これは、０が、細胞表面位置にないタンパク質を、５が、５つ全てのレポジトリにおいて検出されたタンパク質を意味するスコアリングシステムとしての機能も果たす。スコア当たりのＩＤ数も示される。多発性骨髄腫患者９０４名から得られた１６４６２個の転写産物が、細胞表面分子に対して注釈された。図１Ｃは、細胞系における質量分析計分析と原発性患者試料におけるＲＮＡ－ｓｅｑによって検出されたスコア３以上の細胞表面分子の間の重なりを示すベン図である。図１Ｄは、標的ＭＭ遺伝子を同定する工程を表す図である。細胞表面分子の発現レベルが分析され、患者遺伝子の発現平均から１ＳＤ未満の発現の分子を除外することにより、３２６個の表面タンパク質がさらなる分析のために選択されたことを示す図である。 図１Ａ～Ｄは標的ＭＭ遺伝子を同定する工程を表す図である。図１Ａは、異なる７種のＭＭ細胞系の表面タンパク質のビオチン化、それに続く分光測定分析の略図である。各細胞系は、示した通りの染色体再配置およびｐ５３突然変異の特有の組合せを持つ。この分析により、４７６１個のタンパク質に対応する５４５４個のｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤを同定した。図１Ｂは、細胞表面分子の注釈を生成するために使用した統合されたデータベースの略図である。各リポジトリについて、細胞表面分子の注釈に使用した方法論および相対的サイズを示した。これは、０が、細胞表面位置にないタンパク質を、５が、５つ全てのレポジトリにおいて検出されたタンパク質を意味するスコアリングシステムとしての機能も果たす。スコア当たりのＩＤ数も示される。多発性骨髄腫患者９０４名から得られた１６４６２個の転写産物が、細胞表面分子に対して注釈された。図１Ｃは、細胞系における質量分析計分析と原発性患者試料におけるＲＮＡ－ｓｅｑによって検出されたスコア３以上の細胞表面分子の間の重なりを示すベン図である。図１Ｄは、標的ＭＭ遺伝子を同定する工程を表す図である。細胞表面分子の発現レベルが分析され、患者遺伝子の発現平均から１ＳＤ未満の発現の分子を除外することにより、３２６個の表面タンパク質がさらなる分析のために選択されたことを示す図である。 図１Ａ～Ｄは標的ＭＭ遺伝子を同定する工程を表す図である。図１Ａは、異なる７種のＭＭ細胞系の表面タンパク質のビオチン化、それに続く分光測定分析の略図である。各細胞系は、示した通りの染色体再配置およびｐ５３突然変異の特有の組合せを持つ。この分析により、４７６１個のタンパク質に対応する５４５４個のｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤを同定した。図１Ｂは、細胞表面分子の注釈を生成するために使用した統合されたデータベースの略図である。各リポジトリについて、細胞表面分子の注釈に使用した方法論および相対的サイズを示した。これは、０が、細胞表面位置にないタンパク質を、５が、５つ全てのレポジトリにおいて検出されたタンパク質を意味するスコアリングシステムとしての機能も果たす。スコア当たりのＩＤ数も示される。多発性骨髄腫患者９０４名から得られた１６４６２個の転写産物が、細胞表面分子に対して注釈された。図１Ｃは、細胞系における質量分析計分析と原発性患者試料におけるＲＮＡ－ｓｅｑによって検出されたスコア３以上の細胞表面分子の間の重なりを示すベン図である。図１Ｄは、標的ＭＭ遺伝子を同定する工程を表す図である。細胞表面分子の発現レベルが分析され、患者遺伝子の発現平均から１ＳＤ未満の発現の分子を除外することにより、３２６個の表面タンパク質がさらなる分析のために選択されたことを示す図である。 図２Ａ～図Ｃは、候補標的のエンリッチ分析を示す図である。図１Ｄにおいて選択された３２６個の表面タンパク質が、ＳＴＲＩＮＧによって分析された。平均局所機能および／または物理的局所クラスタリング係数０．３２６およびＰＰＩエンリッチｐ値＜１．０ｅ－１６で、予想（１０９個）より多い（４９０個）有意な数のエッジが同定された。黄色において最大クラスタである。最大クラスタ（タンパク質２２７個／３２６個）は、免疫経路と関連して機能的にエンリッチされたタンパク質を含む（図２Ａ）。他の２つのクラスタはトランスポータおよび接着分子を含む（図２Ｂ）。他の２つのクラスタはトランスポータおよび接着分子を含む。ＫＥＧＧコレクションによる最大クラスタのさらなるエンリッチ分析が、図２Ｃに示される。リアクトーム（Ｒｅａｃｔｏｍｅ）コレクションによる最大クラスタのさらなるエンリッチ分析が、示される。 図２Ａ～図Ｃは、候補標的のエンリッチ分析を示す図である。図１Ｄにおいて選択された３２６個の表面タンパク質が、ＳＴＲＩＮＧによって分析された。平均局所機能および／または物理的局所クラスタリング係数０．３２６およびＰＰＩエンリッチｐ値＜１．０ｅ－１６で、予想（１０９個）より多い（４９０個）有意な数のエッジが同定された。黄色において最大クラスタである。最大クラスタ（タンパク質２２７個／３２６個）は、免疫経路と関連して機能的にエンリッチされたタンパク質を含む（図２Ａ）。他の２つのクラスタはトランスポータおよび接着分子を含む（図２Ｂ）。他の２つのクラスタはトランスポータおよび接着分子を含む。ＫＥＧＧコレクションによる最大クラスタのさらなるエンリッチ分析が、図２Ｃに示される。リアクトーム（Ｒｅａｃｔｏｍｅ）コレクションによる最大クラスタのさらなるエンリッチ分析が、示される。 図２Ａ～図Ｃは、候補標的のエンリッチ分析を示す図である。図１Ｄにおいて選択された３２６個の表面タンパク質が、ＳＴＲＩＮＧによって分析された。平均局所機能および／または物理的局所クラスタリング係数０．３２６およびＰＰＩエンリッチｐ値＜１．０ｅ－１６で、予想（１０９個）より多い（４９０個）有意な数のエッジが同定された。黄色において最大クラスタである。最大クラスタ（タンパク質２２７個／３２６個）は、免疫経路と関連して機能的にエンリッチされたタンパク質を含む（図２Ａ）。他の２つのクラスタはトランスポータおよび接着分子を含む（図２Ｂ）。他の２つのクラスタはトランスポータおよび接着分子を含む。ＫＥＧＧコレクションによる最大クラスタのさらなるエンリッチ分析が、図２Ｃに示される。リアクトーム（Ｒｅａｃｔｏｍｅ）コレクションによる最大クラスタのさらなるエンリッチ分析が、示される。 潜在的生物学的関連性がある標的（免疫関連経路に含まれる分子２２７個）と治療的関連性がある標的（正常組織における発現が極めて少ない分子９４個）を重ねたベン図である。６７個の共通の標的が共通である。それら６７個の標的のうち２４個は、原発性患者において最も好ましい発現プロファイルを示し、患者試料における検証に使用され：ＣＣＲ１、ＣＤ２８、ＣＤ３２０、ＦＣＲＬ３、ＩＦＮＧＲ１、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ２７ＲＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ６Ｒ、ＩＴＧＡ４、ＫＣＮＮ４、ＬＡＸ１、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ４、ＬＲＲＣ８Ａ、ＬＲＲＣ８Ｄ、ＰＬＸＮＡ３、ＰＬＸＮＣ１、Ｓ１ＰＲ４、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＥＭＡ４Ａ、ＳＬＡＭＦ６、ＴＬＲ１およびＢＣＭＡを含んだ。
定義
別段の規定がない限り、本明細書に使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書に使用される用語「約」は、記載されている値もしくは値の範囲より１０パーセント大きいまたは小さいことを意味するが、任意の値もしくは値の範囲をこのより広い定義のみに指定することを意図するものではない。用語「約」の後の各値または値の範囲は、記載されている絶対値または値の範囲の実施形態を包含することも意図される。
本明細書では、用語「生来の」または「天然の」は、天然に見出される条件を定義する。「生来のＤＮＡ配列」は、天然の手段によって作製された天然に存在するＤＮＡ配列であるが、遺伝子工学（例えば分子生物学／形質転換技術を使用する）によって生成されたＤＮＡ配列ではない。
本明細書では、用語「固体支持体」は、可溶性分子と連結（好ましくは共有結合）を形成しうる溶媒不溶性基材に関する。支持体は、それだけには限らないが、細胞もしくはバクテリオファージ粒子などの天然の生物学的、または、それだけには限らないが、アクリルアミド誘導体、ガラス、プラスチック、アガロース、セルロース、ナイロン、二酸化ケイ素もしくは磁化粒子などの合成的のいずれかでありうる。支持体は、粒子状形態またはモノリシック構造の小片もしくはシートでありうる。そのような支持体の表面は、固形状でも多孔性でもよく、任意の簡便な形状のものでもよい。
用語「連結された」または類似の用語は、２つの基の間の接続のことを指す。連結は、共有、イオンもしくは水素結合、または２つのコンパウンドもしくは物質を互いに結合する他の相互作用を含みうる。
本明細書では、用語「精製された」および類似の用語は、生来の環境において分子またはコンパウンドに通常不随する他の成分に対する分子またはコンパウンドのエンリッチに関する。用語「精製された」は、特定の分子の完全な純度が過程の間に達成されたことを必ずしも示さない。本明細書では「高度に精製された」コンパウンドとは、純度９０％より高いコンパウンドのことを指す。
「治療的薬剤」、「医薬品」または「薬物」とは、患者における疾病、苦痛、疾患または傷害の処置（防止、診断、緩和、または治癒を含む）に使用されうる任意の治療的もしくは予防的薬剤のことを指す。
本明細書では、用語「薬学的に許容可能な担体」は、リン酸緩衝生理食塩水、水などの標準的な医薬用担体、油／水または水／油乳剤などの乳剤および様々な型の湿潤剤のいずれかを含む。本用語は、米国連邦政府の監督官庁によって承認されているまたはヒトを含めた動物に使用するための米国薬局方に記載されている薬剤のいずれも包含する。
本明細書では、用語「処置」は、特定の障害もしくは症状と関連する病徴を緩和すること、および／または前記病徴を防止もしくは除去することを含む。例えば、がんの処置は、がん細胞の成長および／もしくは分裂を防止するまたは減速させる、ならびにがん細胞を死滅させること含む。
本明細書では、用語「抗体」とは、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体またはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片などその結合断片のことを指す。本明細書に開示される抗体には、モノクローナル、多重特異的、ヒトまたはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、細胞内で作られる抗体（すなわち、細胞内抗体）および上記のいずれかのエピトープ結合断片があるが、これに限定されない。本発明の免疫グロブリン分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）または免疫グロブリン分子のサブクラスでありうる。
本明細書では、本明細書に記載される抗体の「生物学的に活性な断片」という用語は、標的エピトープに対する特異的結合能力を保持する、それぞれの全長抗体の天然または合成部分を包含する。
本明細書では、用語「非経口」は、皮下、静脈内または筋肉内投与を含む。
本明細書では、「高発現」など発現レベルの特徴付けは、Ｐｅｒｎａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３２、５０６～５１９頁、２０１７年１０月９日において確立されたパラメータに基づいており、その技術は、本明細書に明確に組み込まれる。３つのプロテオームデータベースを１つにまとめることによって、低、中および高発現に対するカットオフが確立され、本発明の文脈において使用された。
実施形態
本開示は、ＭＭにおける細胞表面候補標的の発現の出願者の分析に基づく。異なる７種のＭＭ細胞系の表面タンパク質のビオチン化、それに続く分光測定分析により、４７６１個タンパク質に対応する５４５４個のｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤを同定した。図１Ｂに詳述される通り、統合されたデータベースを使用して細胞表面分子の注釈を生成した。細胞表面分子の注釈と発現レベルに基づく除外の組合せ（図１Ｃおよび図１Ｄを参照のこと）により、ＳＴＲＩＮＧによるさらなる分析のための３２６個の表面タンパク質を同定した。
ヒートマップは、全身のいくつかの正常組織および器官における選択された９４個の標的のタンパク質の注釈を表す。これら分子は、これまでに報告されているＨｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｐ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓデータベース（Ｐｅｒｎａ，Ｆら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２０１７年）を１つにまとめることによって選択された。造血組織以外の任意の正常組織において高発現の分子を除外した。３つのプロテオームデータベースのうち２つ未満で利用可能な注釈の分子を、除外した。９４個の標的は、細胞表面ポリペプチドＩＬ１２ＲＢ１、ＳＬＣ５Ａ３、ＣＣＲ１、ＡＮＫＨ、ＩＬ２７ＲＡ、Ｓ１ＰＲ４、ＴＬＲ１、ＫＣＮＡ３、ＰＳＥＮ２、ＢＣＭＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＬＩＬＲＢ４、ＩＬ６Ｒ、ＩＴＧＢ７、ＬＲＰ１０、ＦＣＲＬ３、ＩＦＮＧＲ１、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＣＯ３Ａ１、ＬＩＬＲＢ１、ＰＬＸＮＡ３、ＳＬＣ１７Ａ５、ＣＤ２８、ＬＡＸ１、ＮＥＭＰ１、ＴＭＥＭ１５４、ＳＥＭＡ４Ａ、Ｃ１０ｏｒｆ５４、ＩＴＭ２Ｃ、ＬＹ９、ＳＬＡＭＦ７、ＩＴＧＡ４、ＬＲＲＣ８Ａ、ＬＲＲＣ８Ｄ、ＣＤ３２０、ＫＣＮＮ４、ＰＬＸＮＣ１、ＣＤ３７、ＳＥＬＰＬＧ、ＤＡＧＬＢ、ＡＢＣＣ４、ＡＤＡＭ９、ＣＤ４、ＣＤ１８０、ＣＤ４８、ＣＤ４０、ＭＣＵＲ１、ＡＢＣＣ５、ＩＬ６ＳＴ、ＬＲＰ８、ＳＬＣ５Ａ６、ＳＬＣ７Ａ６、ＨＬＡ－Ｆ、ＩＣＡＭ２、ＬＥＰＲＯＴ、ＩＴＧＡＬ、ＴＭＥＭ６３Ａ、ＣＭＴＭ７、ＩＬ１０ＲＢ、ＮＤＣ１、ＰＴＰＲＣＡＰ、ＡＮＴＸＲ２、ＡＢＣＡ７、ＦＣＧＲ２Ｂ、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＳＴＳ、ＡＢＨＤ１２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＨＶＣＮ１、ＳＬＣ３９Ａ１０、ＥＭＰ３、ＡＢＣＣ１、ＳＬＣ２６Ａ６、ＳＬＣ６Ａ６、ＣＣＲ１０、ＳＬＣ３０Ａ１、ＳＬＣ２３１Ａ１、ＡＤＣＹ３、ＩＦＮＡＲ１、ＰＴＰＲＪ、ＣＬＤＮＤ１、ＳＬＣ３０Ａ５、ＳＬＣ６Ａ９、ＡＤＡＭ１５、ＩＧＦ２Ｒ、ＩＮＳＲ、ＮＯＴＣＨ２、ＣＤ５３、ＳＬＣ１２Ａ９、ＳＬＣ１５Ａ４、ＣＥＭＩＰ２、ＡＤＡＭ１７、ＭＰＺＬ１、およびＴＡＣＩを含む。
潜在的生物学的関連性がある標的（免疫関連経路に含まれる分子２２７個）と治療的関連性がある標的（正常組織における発現が極めて少ない分子９４個）を重ねたベン図から、６７個の共通の標的が明らかになった（図３を参照のこと）。それら６７個の標的のうち２４個は、原発性患者において最も好ましい発現プロファイルを示し、患者試料における検証に使用され：ＣＣＲ１、ＣＤ２８、ＣＤ３２０、ＦＣＲＬ３、ＩＦＮＧＲ１、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ２７ＲＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ６Ｒ、ＩＴＧＡ４、ＫＣＮＮ４、ＬＡＸ１、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ４、ＬＲＲＣ８Ａ、ＬＲＲＣ８Ｄ、ＰＬＸＮＡ３、ＰＬＸＮＣ１、Ｓ１ＰＲ４、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＥＭＡ４Ａ、ＳＬＡＭＦ６、ＴＬＲ１およびＢＣＭＡを含んだ。
実施例２に記載のさらなる分析は、一部の態様において免疫療法を生成するための標的である産物をコードする以下の１２個の遺伝子：ＣＣＲ１（配列番号１５６）、ＣＤ３２０（配列番号１５７）、ＦＣＲＬ３（配列番号１５８）、ＩＦＮＧＲ１（配列番号１５９）、ＩＬ１２ＲＢ１（配列番号１６０）、ＩＴＧＡ４（配列番号１６１）、ＬＡＸ１（配列番号１６２）、ＬＩＬＲＢ４（配列番号１６３）、ＬＲＲＣ８Ｄ（配列番号１６４）、ＳＥＭＡ４Ａ（配列番号１６５）、ＳＬＡＭＦ６（配列番号１６６）およびＴＮＦＲＳＦ１７（配列番号１６７）をさらに同定した。
ウェスタンブロット分析は、２５名のＭＭ患者において正常な臍帯血ＣＤ３４＋細胞と比較して１１個の選択された標的の発現を同定し、これらのタンパク質が標的として特に興味深いことが明らかになった。ＢＣＭＡを対照として使用した。ＶＣＰを搭載対照として使用した。特に、ウェスタンブロット分析によって同定されたタンパク質は、ＩＬ１２ＲＢ１、ＣＣＲ１、ＬＩＬＲＢ４、ＦＣＲＬ３、ＩＦＮＧＲ１、ＳＬＡＭＦ６、ＬＡＸ１、ＳＥＭＡ４Ａ、ＩＴＧＡ４、ＬＲＲＣ８ＤおよびＣＤ３２０を含む。
少なくとも１つの実施形態によると、質量分析計分析により５４５４個のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤが明らかになり、ＭＭＲＦコンパスにより１６４６２個の転写産物が明らかになった。この分析の共通の標的から、表面スコア３以上（≧）を持つタンパク質が合計４０１個明らかになった。原発性患者試料における高発現遺伝子（平均発現が、中央値より大きい［＞］）（ＭＭＲＦ）との重なりを決定し、各遺伝子の平均発現を算出し；低発現遺伝子（平均より１ＳＤ低い）を除去し、カットオフを超える発現を有する遺伝子を選択し、３２６個の表面タンパク質を同定した。
３つのデータベース（ＨＰＡ、ＨＰＭおよびＰＤＢ）のうち少なくとも２つからの正常組織の注釈および造血組織以外の任意の組織において高発現するタンパク質の除外から、３２６個の標的のうち９４個を同定した。免疫関連＋治療的価値の分析により、この数は６７個の標的に減少した。高リスク細胞遺伝学分析は、高リスクに対して標準的なリスクにおいて発現の減少している標的を除外し、原発性ＭＭ試料における検証は、ＣＣＲ１（配列番号１５６）、ＣＤ３２０（配列番号１５７）、ＦＣＲＬ３（配列番号１５８）、ＩＦＮＧＲ１（配列番号１５９）、ＩＬ１２ＲＢ１（配列番号１６０）、ＩＴＧＡ４（配列番号１６１）、ＬＡＸ１（配列番号１６２）、ＬＩＬＲＢ４（配列番号１６３）、ＬＲＲＣ８Ｄ（配列番号１６４）、ＳＥＭＡ４Ａ（配列番号１６５）およびＳＬＡＭＦ６（配列番号１６６）として同定された１１個の標的をもたらす。
少なくとも１つの実施形態によると、配列番号１～１５５からなる群から選択される配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体が、提供される。一部の実施形態において、（配列番号１５６）、（配列番号１５７）、（配列番号１５８）、（配列番号１５９）、（配列番号１６０）、（配列番号１６１）、（配列番号１６２）、（配列番号１６３）、（配列番号１６４）、（配列番号１６５）、および（配列番号１６６）からなる群から選択される配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体が、提供される。そのような抗体は、診断目的で検出可能なマーカーに連結されうる。別法として、抗体は、細胞傷害性薬剤に連結され得、ＭＭ細胞へ細胞毒素の標的化送達のために、コンジュゲートされた抗体を患者に投与されうる。
少なくとも１つの実施形態において、表１に開示されるペプチド（配列番号１～１５５）、または（配列番号１５６）、（配列番号１５７）、（配列番号１５８）、（配列番号１５９）、（配列番号１６０）、（配列番号１６１）、（配列番号１６２）、（配列番号１６３）、（配列番号１６４）、（配列番号１６５）、および（配列番号１６６）からなる群から選択される配列を含むポリペプチドに対して生成される抗体を使用して、抗体単鎖可変断片を生成することができ、次いでその断片を使用して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を調製することができる。抗体単鎖可変断片は、短いリンカーペプチドで接続される免疫グロブリンの軽（ＶＬ）および重（ＶＨ）鎖で構成されるキメラタンパク質である。本開示によると、ＶＬおよびＶＨ領域は、配列番号１～１５５のポリペプチド、または（配列番号１５６）、（配列番号１５７）、（配列番号１５８）、（配列番号１５９）、（配列番号１６０）、（配列番号１６１）、（配列番号１６２）、（配列番号１６３）、（配列番号１６４）、（配列番号１６５）、および（配列番号１６６）からなる群から選択される配列を含むポリペプチドから選択される標的抗原に対するそれらの結合能力についてあらかじめ選択される。一部の実施形態において、ＶＬとＶＨ領域の間のリンカーは、柔軟性のためにその中にグリシンおよびセリンの区間ならびに追加の溶解度のためにグルタミン酸およびリジンの区間を含む親水性残基からなる。
一部の態様において、抗体単鎖可変断片は、一般に膜貫通ドメインを介して細胞内免疫細胞シグナル伝達ドメインに次いで共有結合で連結されて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を創出しうる。一部の態様において、免疫細胞シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージおよび／または骨髄性細胞でありうる。例えば、一部の態様において、抗体単鎖可変断片は、一般に膜貫通ドメインを介して細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインに次いで共有結合で連結されて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を創出しうる。そのようなＣＡＲは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージおよび／または骨髄性細胞などの免疫細胞内で発現される場合、特定のタンパク質を標的する新しい能力を免疫細胞に与えることができる。したがって、配列番号１～１５５からなる群から選択されるポリペプチド、または（配列番号１５６）、（配列番号１５７）、（配列番号１５８）、（配列番号１５９）、（配列番号１６０）、（配列番号１６１）、（配列番号１６２）、（配列番号１６３）、（配列番号１６４）、（配列番号１６５）、および（配列番号１６６）からなる群から選択される配列を含むポリペプチドに特異的に結合するＣＡＲを含むＣＡＲ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージおよび／もしくは骨髄性細胞は、ＭＭ患者を処置するために使用されてよい。特に、一部の実施形態において、ＣＡＲ Ｔ細胞は、患者自身の細胞を単離し、配列番号１～１５５からなる群から選択されるポリペプチドに対する特異性を有するＣＡＲをコードしている核酸配列でＴ細胞を形質転換することによって調製される。特に、一部の実施形態において、ＣＡＲ Ｔ細胞は、同種Ｔ細胞を準備し、配列番号１～１５５、１５６～１６７ならびに１６８～２０８からなる群から選択され、任意選択で（配列番号１５６）、（配列番号１５７）、（配列番号１５８）、（配列番号１５９）、（配列番号１６０）、（配列番号１６１）、（配列番号１６２）、（配列番号１６３）、（配列番号１６４）、（配列番号１６５）、および（配列番号１６６）からなる群から選択されるポリペプチドに対する特異性を有するＣＡＲをコードしている核酸配列でＴ細胞を形質転換することによって調製される。上記細胞型のいずれに対しても、自家または同種いずれの手法も利用されうるものと理解される。実施形態によると、ＭＭ患者を処置する方法は、療法の必要があるＭＭ患者に１、２、３、４、５個もしくはより多くのＣＡＲ Ｔ細胞、ＣＡＲ ＮＫ細胞、ＣＡＲマクロファージおよび／もしくはＣＡＲ骨髄性細胞を投与する工程を含み、ＣＡＲ Ｔ細胞のそれぞれは、配列番号１～１５５からなる群から選択されるポリペプチド、または（配列番号１５６）（配列番号１５７）（配列番号１５８）（配列番号１５９）（配列番号１６０）（配列番号１６１）（配列番号１６２）（配列番号１６３）（配列番号１６４）（配列番号１６５）および（配列番号１６６）からなる群から選択される配列を含むポリペプチド上に存在する異なる抗原を標的する。
少なくとも１つの実施形態によると、ＣＣＲ１（配列番号１５６）、ＣＤ３２０（配列番号１５７）、ＦＣＲＬ３（配列番号１５８）、ＩＦＮＧＲ１（配列番号１５９）、ＩＬ１２ＲＢ１（配列番号１６０）、ＩＴＧＡ４（配列番号１６１）、ＬＡＸ１（配列番号１６２）、ＬＩＬＲＢ４（配列番号１６３）、ＬＲＲＣ８Ｄ（配列番号１６４）、ＳＥＭＡ４Ａ（配列番号１６５）、ＳＬＡＭＦ６（配列番号１６６）およびＴＮＦＲＳＦ１７（配列番号１６７）の遺伝子産物に特異的に結合する抗体が、提供される。一実施形態において、配列番号１６８～２０８からなる群から選択される配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体が、提供される。そのような抗体は、診断目的で検出可能なマーカーに連結されうる。別法として、抗体は、細胞傷害性薬剤に連結され得、ＭＭ細胞へ細胞毒素の標的化送達のために、コンジュゲートされた抗体を患者に投与されうる。
一部の実施形態において、表１に開示されるペプチド（配列番号１６８～２０８）に対して生成される抗体を使用して、抗体単鎖可変断片を生成することができ、次いでその断片を使用して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を調製することができる。抗体単鎖可変断片は、短いリンカーペプチドで接続される免疫グロブリンの軽（ＶＬ）および重（ＶＨ）鎖で構成されるキメラタンパク質である。本開示によると、ＶＬおよびＶＨ領域は、配列番号１６８～２０８のポリペプチドから選択される標的抗原に対するそれらの結合能力についてあらかじめ選択される。一実施形態において、ＶＬとＶＨ領域の間のリンカーは、柔軟性のためにその中にグリシンおよびセリンの区間ならびに追加の溶解度のためにグルタミン酸およびリジンの区間を含む親水性残基からなる。
抗体単鎖可変断片は、一般に膜貫通ドメインを介して細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインに次いで共有結合で連結されて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を創出しうる。そのようなＣＡＲは、Ｔ細胞内で発現される場合、特定のタンパク質を標的する新しい能力をＴ細胞に与えることができる。したがって、配列番号１６８～２０８からなる群から選択されるポリペプチドに特異的に結合するＣＡＲを含むＣＡＲ Ｔ細胞は、ＭＭ患者を処置するために使用されてよい。特に、一部の実施形態において、ＣＡＲ Ｔ細胞は、患者自身の細胞を単離し、配列番号１６８～２０８からなる群から選択されるポリペプチドに対する特異性を有するＣＡＲをコードしている核酸配列でＴ細胞を形質転換することによって調製される。一実施形態によると、ＭＭ患者を処置する方法は、療法の必要があるＭＭ患者に１、２、３、４、５個もしくはより多くのＣＡＲ Ｔ細胞を投与する工程を含み、ＣＡＲ Ｔ細胞のそれぞれは、配列番号１６８～２０８からなる群から選択されるポリペプチド上に存在する異なる抗原を標的する。
一実施形態によると、本開示のＣＡＲの膜貫通ドメインは、細胞膜にまたがる疎水性アルファらせんを含む。膜貫通ドメインは、原形質膜にＣＡＲを固定し、細胞外抗原認識ドメイン（すなわち、抗体単鎖可変断片）を細胞内シグナル伝達領域と架橋する。一実施形態において、ＣＡＲは、抗原認識ドメインと膜貫通ドメインの間に位置するヒンジ領域をさらに含む。理想的なヒンジは、ｓｃＦｖ受容体頭部の柔軟性を増強させ、ＣＡＲとその標的抗原の間の空間的制約を減少させる。これは、抗原結合およびＣＡＲ－Ｔ細胞と標的細胞の間のシナプス形成を促進する。一実施形態において、ヒンジ配列は、ＩｇＧ、ＣＤ８およびＣＤ２８を含めた他の免疫分子の膜近傍領域に基づく。
ＣＡＲの細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、細胞内で発現した場合、細胞内部にとどまることになる。抗原が、外部の抗原認識ドメインに結合した後、ＣＡＲ受容体は、互いにクラスタを形成し、活性化シグナルを伝達する。次いで、受容体の内部細胞質端は、Ｔ細胞内部でシグナル伝達を永続させる。正常なＴ細胞活性化は、ＣＤ３ゼータの細胞質ドメインに存在する免疫受容体チロシン型活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）のリン酸化を利用する。この過程を模倣するために、一実施形態において、本開示のＣＡＲＳは、主要なＣＡＲエンドドメイン成分としてＣＤ３ゼータの細胞質ドメインを含む。
Ｔ細胞は、活性化後に持続するために、ＣＤ３シグナル伝達に加えて共刺激分子も必要とする。さらなる実施形態において、ＣＡＲ受容体のエンドドメインは、当業者に公知の共刺激タンパク質由来の１つまたは複数のキメラドメインも含む。ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）およびＣＤ１３７を含めた様々な共刺激分子由来のシグナル伝達ドメインが、成功裏に試験されてきた。さらなる実施形態において、ＣＤ２８または４－１ＢＢ、ＣＤ２８－４１ＢＢもしくはＣＤ２８－ＯＸ４０、およびＩＬ－２、ＩＬ－５、ＩＬ－１２などのサイトカインのような共刺激ドメインはＣＡＲ受容体のエンドドメインに付加され、Ｔ細胞活性を増やすことができる。
実施形態１によると、標的多発性骨髄腫関連表面抗原を同定する方法が提供され、前記方法は、
第１の多発性骨髄腫試料および第２の多発性骨髄腫試料において細胞表面タンパク質を発現する複数の遺伝子を同定する工程と、
造血細胞と無関係な対照遺伝子より高い発現レベルを有する前記第１の多発性骨髄腫試料から核酸を選択し、検出された発現が上昇している核酸に対応するタンパク質を同定して、選択したタンパク質の第１のプールに指定する工程と、
前記第２の骨髄腫試料から単離されたタンパク質に対して質量分析を行って、正常組織と比較して前記第２の多発性骨髄腫においてより高濃度で存在するタンパク質を同定し、そのようなタンパク質が、選択されたタンパク質の第２のプールを表す工程と、
前記第１および第２のプールから脳、脊髄、腸、肝臓および腎臓内で高発現のタンパク質を除外して、タンパク質の修正された第１および第２のプールを作製する工程と、
標的多発性骨髄腫関連表面抗原としてタンパク質の前記第１および第２の修正されたプールに共通のタンパク質を同定する工程とを含む。
実施形態２によると、実施形態１の方法が提供され、前記第１の多発性骨髄腫試料および第２の多発性骨髄腫試料は、同じ組織供給源から採取される。
実施形態３によると、実施形態１の方法が提供され、前記第１の多発性骨髄腫試料は、ＭＭ患者から発現される遺伝子の核酸プールであり、第２の多発性骨髄腫試料は、ＭＭ細胞系において発現されるタンパク質を表す。
実施形態４によると、実施形態１～３のいずれか１つの方法が提供され、標的多発性骨髄腫関連表面抗原の正常組織試料における発現レベルは、正常組織試料のタンパク質発現レベル分布の正常なピークより約１標準偏差超下回る。
実施形態５によると、実施形態１～４のいずれか１つの方法であって、ｍＲＮＡを測定して、選択されたタンパク質の第１のプールのタンパク質を同定するために使用される核酸の発現レベルが決定される。
実施形態６によると、実施形態１～５のいずれか１つの方法が提供され、タンパク質は、実施例２に開示される公開されている５つのデータベースと比較してスコアを割り当てる統合型コンピュータツールの使用に基づいて、細胞表面タンパク質として同定される。
実施形態７によると、実施形態１～５のいずれか１つの方法が提供され、タンパク質の前記第１のプールが、
多発性骨髄腫患者からのＲＮＡ－ｓｅｑデータセットを分析して、実施例２に開示される５つの公開されているデータベースと比較してスコアを割り当てる統合型コンピュータツールの使用に基づいて、表面標的を同定する工程と、
低発現遺伝子（平均より１ＳＤ低い）を除去する工程と、
造血組織以外の任意の正常組織において高発現のタンパク質を除外する工程と、
によって同定され、残りのタンパク質が、タンパク質の前記第１のプールを構成する。
実施形態８によると、標的多発性骨髄腫関連表面抗原を同定する方法が提供され、前記方法は、
多発性骨髄腫患者からのＲＮＡ－ｓｅｑデータセットを分析して、実施例２に開示される５つの公開されているデータベースと比較してスコアを割り当てる統合型コンピュータツールの使用に基づいて、表面標的を同定する工程と、
低発現遺伝子（平均より１ＳＤ低い）を除去する工程と、
造血組織以外の任意の正常組織において高発現のタンパク質を除外する工程と、
を含み、残りのタンパク質が、標的多発性骨髄腫関連表面抗原を構成する。
実施形態９によると、配列番号１～１５５もしくは１６８～２０８からなる群から選択されるポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体、または配列番号１～１５５もしくは１６８～２０８からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体が提供される。
実施形態１０によると、実施形態９のモノクローナル抗体が提供され、抗体は、配列番号１６８～２０８からなる群から選択されるポリペプチドに特異的に結合する。
実施形態１１によると、実施形態９のモノクローナル抗体が提供され、抗体は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号３７、配列番号４２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５７、配列番号７９、配列番号１１２および配列番号１０４からなる群から選択されるポリペプチドに特異的に結合する。
実施形態１２によると、実施形態９～１１のいずれか１つのモノクローナル抗体が提供され、抗体は、ＣＣＲ１（配列番号６０）、ＣＤ３２０（配列番号５６）、ＦＣＲＬ３（配列番号５７）、ＩＦＮＧＲ１（配列番号７９）、ＩＬ１２ＲＢ１（配列番号１９）、ＩＴＧＡ４（配列番号４２）、ＬＩＬＲＢ４（配列番号２０）、ＬＲＲＣ８Ｄ（配列番号１１２）、ＳＥＭＡ４Ａ（配列番号１０４）およびＳＬＡＭＦ６（配列番号３７）からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドに特異的に結合する。
実施形態１３によると、実施形態９～１２のいずれか１つのモノクローナル抗体が提供され、抗体は、配列番号１～１５５または１６８～２０８からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドに特異的に結合する。
実施形態１４によると、実施形態９～１２のいずれか１つのモノクローナル抗体が提供され、抗体は、配列番号１～１５５または１６８～２０８からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドに特異的に結合する。
実施形態１５によると、実施形態９～１４のいずれか１つのモノクローナル抗体が提供され、前記抗体は、抗体に共有結合で連結された検出可能な標識をさらに含む。
実施形態１６によると、実施形態９～１４のいずれか１つのモノクローナル抗体が提供され、前記抗体は、抗体に連結された細胞傷害性薬剤をさらに含む。
実施形態１７によると、実施形態９～１５のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片；
膜貫通ドメイン；および
免疫細胞抗原受容体鎖を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供され、膜貫通ドメインは、抗体またはその抗原結合断片と免疫細胞抗原受容体鎖とを連結する。
実施形態１８によると、実施形態１７のキメラ抗原受容体が提供され、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１６８～２０８からなる群から選択されるポリペプチドに特異的に結合する。
実施形態１９によると、実施形態１７のキメラ抗原受容体が提供され、抗体またはその抗原結合断片は、ＣＣＲ１（配列番号６０）、ＣＤ３２０（配列番号５６）、ＦＣＲＬ３（配列番号５７）、ＩＦＮＧＲ１（配列番号７９）、ＩＬ１２ＲＢ１（配列番号１９）、ＩＴＧＡ４（配列番号４２）、ＬＩＬＲＢ４（配列番号２０）、ＬＲＲＣ８Ｄ（配列番号１１２）、ＳＥＭＡ４Ａ（配列番号１０４）およびＳＬＡＭＦ６（配列番号３７）からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドに特異的に結合する。
実施形態２０によると、実施形態１７のキメラ抗原受容体が提供され、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１～１５５または１６８～２０８からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％の相同性を有するポリペプチドの１つもしくは複数のエピトープを結合する。
実施形態２１によると、実施形態１７のキメラ抗原受容体が提供され、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１～１５５または１６８～２０８からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチドの１つもしくは複数のエピトープを結合する。
実施形態２２によると、実施形態１７のキメラ抗原受容体が提供され、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号３７、配列番号４２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５７、配列番号７９、配列番号１１２および配列番号１０４からなる群から選択されるポリペプチドに特異的に結合する。
実施形態２３によると、実施形態１７～２２のいずれか１つのキメラ抗原受容体が提供され、前記抗体または抗原結合断片は、抗体単鎖可変断片を含む。
実施形態２４によると、抗体単鎖可変断片と膜貫通ドメインの間に位置するヒンジ領域をさらに含む、実施形態２３のキメラ抗原受容体が提供される。
実施形態２５によると、実施形態１６～２３のいずれか１つのキメラ抗原受容体を発現するように修飾されたＴ細胞が提供される。
実施形態２６によると、実施形態２５のＴ細胞が提供され、Ｔ細胞は、腫瘍浸潤白血球である。
実施形態２７によると、実施形態１７～２４のいずれか１つのキメラ抗原受容体を発現するように修飾されたＮＫ細胞が提供される。
実施形態２８によると、実施形態１７～２４のいずれか１つのキメラ抗原受容体を発現するように修飾された骨髄性細胞が提供される。
実施形態２９によると、実施形態１７～２４のいずれか１つのキメラ抗原受容体を発現するように修飾されたマクロファージが提供される。
実施形態３０によると、実施形態２５または２６のＴ細胞が提供され、Ｔ－細胞抗原受容体鎖は、ＣＤ３ζ鎖（ゼータ鎖）である。
実施形態３１によると、医薬組成物は、実施形態９～１６のいずれか１つの抗体、実施形態１７～２４のいずれか１つのキメラ抗原受容体、実施形態２５もしくは２６のＴ細胞、実施形態２７のＮＫ細胞、実施形態２８の骨髄性細胞または実施形態２９のマクロファージを含む。
実施形態３２によると、多発性骨髄腫を処置する方法が提供され、前記方法は、そのような処置を必要とする患者に実施形態３１の医薬組成物を投与する工程を含む。
実施形態３３によると、単離された免疫応答性細胞が提供され、細胞は、ＣＣＲ１（配列番号６０）、ＣＤ３２０（配列番号５６）、ＦＣＲＬ３（配列番号５７）、ＩＦＮＧＲ１（配列番号７９）、ＩＬ１２ＲＢ１（配列番号１９）、ＩＴＧＡ４（配列番号４２）、ＬＩＬＲＢ４（配列番号２０）、ＬＲＲＣ８Ｄ（配列番号１１２）、ＳＥＭＡ４Ａ（配列番号１０４）およびＳＬＡＭＦ６（配列番号３７）からなる群から選択されるポリペプチド、または前記タンパク質のいずれかに対して９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドに存在する抗原に結合する抗原認識受容体を含む。
実施形態３４によると、実施形態３３の単離された免疫応答性細胞が提供され、抗原は、ＩＬ１２ＲＢ１（配列番号１９）、ＬＩＬＲＢ４（配列番号２０）、ＳＬＡＭＦ６（配列番号３７）、ＣＣＲ１（配列番号６０）およびＣＤ３２０（配列番号５６）からなる群から選択されるポリペプチドに存在する。
実施形態３５によると、実施形態３３または３４の単離された免疫応答性細胞が提供され、前記抗原認識受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
実施形態３６によると、実施形態３５の単離された免疫応答性細胞が提供され、前記抗原認識受容体は、ＣＡＲである。
実施形態３７によると、実施形態３６の単離された免疫応答性細胞が提供され、前記ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３Ｃ鎖、ＣＤ９７、ＣＤ１ ｌａＣＤ １８、ＣＤ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ １５４、ＣＤ８、ＯＸ４０、４－ＩＢＢ、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインまたはそれらの組合せである。
実施形態３８によると、実施形態３３～３７のいずれか１つの単離された免疫応答性細胞が提供され、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ヒト胚性幹細胞、およびリンパ球様細胞が分化されうる多能性幹細胞からなる群から選択される。
実施形態３９によると：
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原認識受容体、および
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原認識受容体を含み、
第１の抗原および第２の抗原のそれぞれが、ＣＣＲ１（配列番号６０）、ＣＤ３２０（配列番号５６）、ＦＣＲＬ３（配列番号５７）、ＩＦＮＧＲ１（配列番号７９）、ＩＬ１２ＲＢ１（配列番号１９）、ＩＴＧＡ４（配列番号４２）、ＬＩＬＲＢ４（配列番号２０）、ＬＲＲＣ８Ｄ（配列番号１１２）、ＳＥＭＡ４Ａ（配列番号１０４）ならびにＳＬＡＭＦ６（配列番号３７）からなる群から選択され、第１の抗原および第２の抗原が異なっている、単離された免疫応答性細胞が提供される。
実施形態４０によると、実施形態３７の単離された免疫応答性細胞が提供され、前記抗原認識受容体のそれぞれが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり、任意選択で、前記抗原認識受容体は、ＣＡＲである。
実施形態４１によると、対象に実施形態３３～４０のいずれか１つの免疫応答性細胞の有効量を投与する工程を含む、対象において腫瘍負荷を減少させる方法が提供される。
実施例１
表面ビオチン化およびＭＳ分析
多発性骨髄腫は、有意な分子異質性によって特徴付けられるので、公知の７つのおよび固有のＭＭ細胞系を、さらなる分析のために選択した。７つの細胞系は：表１に開示される、ｐ５３突然変異およびｔ（４；１４）を持つＯＰＭ－２、ｔ（４；１４）および８ｑ＋を含むＮＣＩ－Ｈ９２９、ｔ（１４；１６）およびｔ（８；１４）を含むＪＪＮ３、ｐ５３ ｎｕｌｌおよびｔ（４；１４）、ｔ（１４；１６）およびｔ（８；１４）を含むＫＭＳ１１、Ｕ２６６ ｐ５３ ｍｕｔおよびｔ（１１；１４）、ｐ５３ ＷＴおよびｔ（１２；１４）を含むＡＭＯ－１ならびにｐ５３ ｍｕｔ、ｔ（１６；２２）、ｔ（８；２２）およびＫＲａｓ ｍｕｔを含むＲＰＭＩ－８２２６である。
Figure 2023519304000002
ビオチン標識に続いて質量分析（ＭＳ）を使用して、固有の遺伝的異常を持つこれら７つの多発性骨髄腫細胞系の表面特異的プロテオーム分析を行った。細胞表面タンパク質を、生細胞上で、ビオチンで標識し；ビオチンタグ付けしたタンパク質を、次いでアビジンビーズ上に捕捉し、トリプシンで消化し、質量分析およびデータ独立注釈（ＤＩＡ）によって分析した。
より具体的には、ビオチンによる標識を、表面タンパク質だけがビオチン化試薬に曝露されることを確実にする手順を使用して行った。Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ａ４４３９０）を使用して、表面タンパク質を標識し、単離した。簡潔には、細胞を、膜不透過性スルホ－ＮＨＳ－ＳＳ－ビオチン試薬で、ＲＴにおいて１０分間インキュベートし、インキュベーション後、過剰な標識試薬を除去し、細胞を数回洗浄して、溶解前に結合していないあらゆる標識試薬を除去した。ビオチン化タンパク質を、ニュートラアビジン樹脂に捕捉し、非特異的に結合しているあらゆる非ビオチン化タンパク質を、樹脂を繰り返し洗浄することによって除去した。ＭＳ分析の前に、ニュートラアビジン樹脂に結合しているビオチン化タンパク質を、終夜のトリプシン切断により樹脂から遊離させた。消化されたペプチドを脱塩し、ＳｔａｇｅＴｉｐを使用して精製し、脱塩されたペプチドを、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎにおいて１７０分間のＬＣ勾配を使用するＬＣ－ＭＳ／ＭＳおよびＤＩＡ法によって分析した。試料特異的ライブラリ（ＳＳＬ）を、各試料からの同量の消化されたタンパク質を使用して生成した。ＭＳ生データを、Ｓｐｅｃｔｒｏｎａｕｔソフトウェアを使用してＳＳＬで検索した。タンパク質発現の定量化を、ラベルフリー定量化（ＬＦＱ）を使用して行った。これにより、４７６１個のタンパク質に対応する５４５４個のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤの不偏プールを生成した（図１Ａ）。
表２ 質量分析によって同定された１５５個のタンパク質。
Figure 2023519304000003
Figure 2023519304000004
Figure 2023519304000005
Figure 2023519304000006
Figure 2023519304000007
Figure 2023519304000008
Figure 2023519304000009
Figure 2023519304000010
Figure 2023519304000011
Figure 2023519304000012
Figure 2023519304000013
Figure 2023519304000014
Figure 2023519304000015
実施例２
さらなるＭＭ表面タンパク質分析
実施例１に記載の７つの多発性骨髄腫細胞系の表面特異的プロテオームの分析において同定された４７６１個のタンパク質に対応する５４５４個のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤの不偏プールを、さらなる分析に供した。
細胞表面位置でタンパク質を正確に検出することを可能にするバイオインフォマティクスツールが存在しないため、表面タンパク質を注釈するための統合されたスコアリングデータベースを開発した。この目的のために、原形質膜に局在する分子の同定において異なる方法論を使用して、公開されている５つのデータベースを１つにまとめた：＃１（Ｄｉａｚ－Ｒａｍｏｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ２０１１年、１３４、１８３～１８７頁、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｍｌｅｔ．２０１０．０９．０１６）を文献から手作業でキュレーションした；＃２（Ｂａｕｓｈ－Ｆｌｕｃｋら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２０１８年、１１５、Ｅ１０９８８～Ｅ１０９９７頁、ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１８０８７９０１１５．）を、ドメイン特異的タンパク質の特徴に対して訓練し、一組のαらせん形膜貫通タンパク質に対して試験したランダムフォレスト分類子を使用して計算機的にコンパイルした；＃３（Ｔｏｗｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２０１６年、１１３、３６０３～３６０８頁、ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１５２１２５１１１３）を、ＧＯおよびＵｎｉｐｒｏｔ注釈を使用して計算機的にコンパイルし、それに続いて膜貫通ドメイン予測およびシグナルペプチド予測を行った；＃４（ｄａ Ｃｕｎｈａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２００９年、１０６、１６７５２～１６７５７頁、ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０９０７９３９１０６）を、膜貫通ドメイン予測によって計算機的にコンパイルした；＃５（Ｔｈｕｌｅら）を、抗体に基づく免疫蛍光顕微鏡検査によって実験的に決定した。本発明者らの統合型コンピュータデータベースにおいて、各ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤを、それが同定されたデータベース数に基づいてスコアし、０は、タンパク質がいずれにも見られなかったことを意味し、５は、５つ全てにおいてタンパク質が見出されたことを意味する（図１Ｂ）。この統合型コンピュータツールに基づいて、カットオフ１は、１２２９個のｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ、カットオフ２は６９９個のｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ、カットオフ３は４４８個のｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ、カットオフ４は２６０個のｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤおよびカットオフ５は６３個のｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤを含む。さらなる分析には、細胞表面位置について高レベルの確実性を表す表面スコア３以上のタンパク質を選択した。
９０４名のＭＭ患者の遺伝子発現データを提供するＣｏＭＭｐａｓｓ ＲＮＡ－ｓｅｑデータセットを統合した。この統合型手法は、患者集団に関連する表面標的を同定するのに役立った。本発明者らの表面スコアリングシステムを、ＭＭ患者からの１６４６２個の転写産物に適用し、表面スコア３より高い４０２個の標的を同定し、ＭＳにより検出した（図１Ｃ）。患者において平均遺伝子発現から１ＳＤを算出することによって、患者における高発現遺伝子と重複する上面タンパク質３２６個をさらに選択した。各遺伝子の平均発現を算出し、低発現遺伝子（平均より１ＳＤ未満）を除去し、カットオフを超える発現を有する遺伝子を選択した（３２６個の転写産物を維持した）（図１Ｄ）。注目すべきことに、患者遺伝子の発現は、非単峰形の発現を示した７つの転写産物（ＮＣＡＭ１、ＴＰＢＧ、ＲＯＢ１、ＬＡＭＰ５、ＡＰＰ、ＰＴＲＣＡＰ、ＰＬＸＡＮ２）を除いて単峰形であった。
３２６個の表面タンパク質のこの群は、公知のＭＭ関連表面タンパク質を含み、ＢＣＭＡ、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＣＩ、ＬＹ９、ＣＤ３８などそのうちのいくつかは、臨床および臨床前研究において標的されている。また、ＭＭ患者に対する臨床試験において現在調査されているＧＰＣＲ５ＤおよびＦＣＲＬ５は、患者におけるトランスクリプトーム分析では同定されたが、ＭＳ分析ではそれらのタンパク質発現を検出しなかったので、このリストに含まれない。
ＭＭサーフェスオームは、免疫関連タンパク質で主に構成される
これら候補表面タンパク質の機能に対する洞察を得るために、機能的エンリッチ分析を実行し、それらが、３つの主要な機能的クラスタ：１）免疫媒介性経路に含まれるタンパク質、２）トランスポータ、３）ストロマへの接着を媒介するタンパク質、に分けられうることを見出した。免疫媒介性経路に関連する表面タンパク質（一番上のクラスタ）は、３２６個の分子のうち２２７個を含み、したがって、免疫細胞と骨髄腫細胞との相互作用を媒介する可能性がある。
Ｋｅｇｇおよびリアクトームコレクションを用いて表面タンパク質のこの群をさらに探索することによって、サイトカイン依存的機序およびＮＫ媒介性細胞毒性は、濃縮された機序を表すことが判明した。これらの発見は、ＭＭの免疫生物学におけるこれまでの研究と一致するが、これら機序を媒介する表面タンパク質の詳細なプロファイルは、これまで不明なままであるまたは部分的にしか知られていない。
正常組織の注釈から標的可能な抗原を同定する
治療的に関連する標的を同定するために、白血病用としてこれまでに確立されているパイプラインを使用した。これは、ヒトプロテオーム注釈に関する３つの公共のプロテオームのデータベース（Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＭａｐおよびＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ＤａｔａＢａｓｅ）を組み合わせており、４２個の正常組織および器官のパネル中の各候補タンパク質の注釈が可能になった。そこで、造血組織以外の任意の正常組織において高発現しており、３つのデータベースのうち２つ未満において利用可能な注釈があるタンパク質を除外した。これにより、３２６個の標的のうち正常組織において発現が極めて少ない９４個を同定した。このリストは、ＢＣＭＡ、ＳＬＡＭＦ７、ＩＴＧＢ７、ＴＡＣＩおよびＬｙ９を含む。正常組織におけるそれらの発現に基づいて９４個の標的それぞれをランク付けもして、それにより、オンターゲットの腫瘍外毒性を予測した。
免疫関連タンパク質（２２７個）のリストを、正常組織において好ましいプロファイルを持つタンパク質のリストと重ねることにより、機能的および治療的の両方に関連性のある標的を６７個入手した（図３）。その後者のリストは、ＭＭの免疫療法に対する現在の臨床前試験において標的されるＢＣＭＡ、ＣＤ２２９、ＳＬＡＭＦ７、ＩＴＧＢ７、ＴＡＣＩをなお含んでいる。
原発性患者試料の検証により１１個の標的を同定する
正常組織における発現に基づいて、原発性ＭＭ患者試料におけるさらなる検証のために２４個の標的を選択した。これら標的のうち１１個は、ＣＣＲ１（配列番号６０）、ＣＤ３２０（配列番号５６）、ＦＣＲＬ３（配列番号５７）、ＩＦＮＧＲ１（配列番号７９）、ＩＬ１２ＲＢ１（配列番号１９）、ＩＴＧＡ４（配列番号４２）、ＬＩＬＲＢ４（配列番号２０）、ＬＲＲＣ８Ｄ（配列番号１１２）、ＳＥＭＡ４Ａ（配列番号１０４）およびＳＬＡＭＦ６（配列番号３７）ならびにＢＣＭＡを含み、一部の態様において、これらの標的は、修飾もしくは合成されたキメラ抗原受容体、抗体もしくはその抗体結合断片、および前述を含有または発現するＴ細胞を含む免疫細胞に組み込まれうる。

Claims (39)

  1. 第１の多発性骨髄腫試料及び第２の多発性骨髄腫試料において細胞表面タンパク質を発現する複数の遺伝子を同定する工程と、
    造血細胞と無関係な対照遺伝子より高い発現レベルを有する前記第１の多発性骨髄腫試料から核酸を選択し、検出された発現が上昇している核酸に対応する前記タンパク質を同定して、選択したタンパク質の第１のプールに指定する工程と、
    前記第２の骨髄腫試料から単離されたタンパク質に対して質量分析を行って、正常組織と比較して前記第２の多発性骨髄腫においてより高濃度で存在するタンパク質を同定し、そのようなタンパク質が、選択されたタンパク質の第２のプールを表す工程と、
    前記第１及び第２のプールから脳、脊髄、腸、肝臓及び腎臓内で高発現のタンパク質を除外して、タンパク質の修正された第１及び第２のプールを作製する工程と、
    標的多発性骨髄腫関連表面抗原としてタンパク質の前記第１及び第２の修正されたプールに共通のタンパク質を同定する工程とを含む、標的多発性骨髄腫関連表面抗原を同定する方法。
  2. 第１の多発性骨髄腫試料及び第２の多発性骨髄腫試料が、同じ組織供給源から採取される、請求項１に記載の方法。
  3. 第１の多発性骨髄腫試料が、ＭＭ患者から発現される遺伝子の核酸プールであり、第２の多発性骨髄腫試料が、ＭＭ細胞系において発現されるタンパク質を表す、請求項１に記載の方法。
  4. 標的多発性骨髄腫関連表面抗原の正常組織試料における発現レベルが、正常組織試料のタンパク質発現レベル分布の正常なピークより約１標準偏差超下回る、請求項１に記載の方法。
  5. ｍＲＮＡを測定して、選択されたタンパク質の第１のプールのタンパク質を同定するために使用される核酸の発現レベルが決定される、請求項１に記載の方法。
  6. 配列番号１～１５５又は１６８～２０８からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドに特異的に結合する、モノクローナル抗体。
  7. 配列番号１６８～２０８からなる群から選択されるポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体。
  8. 前記抗体が、配列番号１９、配列番号２０、配列番号３７、配列番号４２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５７、配列番号７９、配列番号１１２及び配列番号１０４からなる群から選択されるポリペプチドに特異的に結合する、請求項６に記載のモノクローナル抗体。
  9. 前記抗体が、ＣＣＲ１（配列番号６０）、ＣＤ３２０（配列番号５６）、ＦＣＲＬ３（配列番号５７）、ＩＦＮＧＲ１（配列番号７９）、ＩＬ１２ＲＢ１（配列番号１９）、ＩＴＧＡ４（配列番号４２）、ＬＩＬＲＢ４（配列番号２０）、ＬＲＲＣ８Ｄ（配列番号１１２）、ＳＥＭＡ４Ａ（配列番号１０４）及びＳＬＡＭＦ６（配列番号３７）からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドに特異的に結合する、請求項６～８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  10. 前記抗体が、配列番号１～１５５又は１６８～２０８からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドに特異的に結合する、請求項６～８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  11. 前記抗体が、配列番号１～１５５又は１６８～２０８からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドに特異的に結合する、請求項６～８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  12. 前記抗体に共有結合で連結された検出可能な標識をさらに含む、請求項６～１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  13. 前記抗体に連結された細胞傷害性薬剤をさらに含む、請求項６～１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  14. 配列番号１～１５５もしくは１６８～２０８からなる群から選択されるポリペプチドの１つ又は複数のエピトープに結合する抗体又はその抗原結合断片、
    膜貫通ドメイン；及び
    免疫細胞抗原受容体鎖を含み、
    前記膜貫通ドメインが、前記抗体又はその抗原結合断片と前記免疫細胞抗原受容体鎖とを連結する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
  15. 抗体又はその抗原結合断片が、配列番号１６８～２０８からなる群から選択されるポリペプチドに特異的に結合する、請求項１４に記載のキメラ抗原受容体。
  16. 抗体又はその抗原結合断片が、ＣＣＲ１（配列番号６０）、ＣＤ３２０（配列番号５６）、ＦＣＲＬ３（配列番号５７）、ＩＦＮＧＲ１（配列番号７９）、ＩＬ１２ＲＢ１（配列番号１９）、ＩＴＧＡ４（配列番号４２）、ＬＩＬＲＢ４（配列番号２０）、ＬＲＲＣ８Ｄ（配列番号１１２）、ＳＥＭＡ４Ａ（配列番号１０４）及びＳＬＡＭＦ６（配列番号３７）からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドに特異的に結合する、請求項１４に記載のキメラ抗原受容体。
  17. 抗体又はその抗原結合断片が、配列番号１～１５５又は１６８～２０８からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％の相同性を有するポリペプチドの１つもしくは複数のエピトープと結合する、請求項１４に記載のキメラ抗原受容体。
  18. 抗体又はその抗原結合断片が、配列番号１～１５５又は１６８～２０８からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチドの１つもしくは複数のエピトープを結合する、請求項１７に記載のキメラ抗原受容体。
  19. 抗体又はその抗原結合断片が、配列番号１９、配列番号２０、配列番号３７、配列番号４２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５７、配列番号７９、配列番号１１２及び配列番号１０４からなる群から選択されるポリペプチドに特異的に結合する、請求項１５に記載のキメラ抗原受容体。
  20. 抗体又は抗原結合断片が、抗体単鎖可変断片を含む、請求項１５～１９のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
  21. 抗体単鎖可変断片と膜貫通ドメインの間に位置するヒンジ領域をさらに含む、請求項２０に記載のキメラ抗原受容体。
  22. 請求項２０又は２１に記載のキメラ抗原受容体を発現するように修飾されたＴ細胞。
  23. 前記Ｔ細胞が、腫瘍浸潤白血球である、請求項２２に記載のＴ細胞。
  24. 請求項１５～２１に記載のキメラ抗原受容体を発現するように修飾されたＮＫ細胞。
  25. 請求項１５～２１に記載のキメラ抗原受容体を発現するように修飾された骨髄性細胞。
  26. 請求項１５～２１に記載のキメラ抗原受容体を発現するように修飾されたマクロファージ。
  27. 前記Ｔ－細胞抗原受容体鎖が、ＣＤ３ζ鎖（ゼータ鎖）である、請求項２２に記載のＴ細胞。
  28. 請求項６～１２のいずれか１項に記載の抗体、請求項１５～２１のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体、請求項２２もしくは２３に記載のＴ細胞、請求項２４に記載のＮＫ細胞、請求項２３２５に記載の骨髄性細胞又は請求項２６に記載のマクロファージを含む医薬組成物。
  29. 多発性骨髄腫の処置を必要とする患者に請求項２４に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、多発性骨髄腫を処置する方法。
  30. ＣＣＲ１（配列番号６０）、ＣＤ３２０（配列番号５６）、ＦＣＲＬ３（配列番号５７）、ＩＦＮＧＲ１（配列番号７９）、ＩＬ１２ＲＢ１（配列番号１９）、ＩＴＧＡ４（配列番号４２）、ＬＩＬＲＢ４（配列番号２０）、ＬＲＲＣ８Ｄ（配列番号１１２）、ＳＥＭＡ４Ａ（配列番号１０４）及びＳＬＡＭＦ６（配列番号３７）からなる群から選択される抗原に結合する抗原認識受容体を含む、単離された免疫応答性細胞。
  31. 抗原が、ＩＬ１２ＲＢ１（配列番号１９）、ＬＩＬＲＢ４（配列番号２０）、ＳＬＡＭＦ６（配列番号３７）、ＣＣＲ１（配列番号６０）及びＣＤ３２０（配列番号５６）からなる群から選択される、請求項３０に記載の単離された免疫応答性細胞。
  32. 抗原認識受容体が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項３０又は３１に記載の単離された免疫応答性細胞。
  33. 抗原認識受容体が、ＣＡＲである、請求項３２に記載の単離された免疫応答性細胞。
  34. ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３Ｃ鎖、ＣＤ９７、ＣＤ１ ｌａＣＤ １８、ＣＤ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ １５４、ＣＤ８、ＯＸ４０、４－ＩＢＢ、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン又はそれらの組合せである、請求項３３に記載の単離された免疫応答性細胞。
  35. 前記細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ヒト胚性幹細胞、及びリンパ球様細胞が分化されうる多能性幹細胞からなる群から選択される、請求項３０～３４のいずれか１項に記載の単離された免疫応答性細胞。
  36. （ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原認識受容体、及び
    （ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原認識受容体を含み、
    前記第１の抗原及び前記第２の抗原のそれぞれが、ＣＣＲ１（配列番号６０）、ＣＤ３２０（配列番号５６）、ＦＣＲＬ３（配列番号５７）、ＩＦＮＧＲ１（配列番号７９）、ＩＬ１２ＲＢ１（配列番号１９）、ＩＴＧＡ４（配列番号４２）、ＬＩＬＲＢ４（配列番号２０）、ＬＲＲＣ８Ｄ（配列番号１１２）、ＳＥＭＡ４Ａ（配列番号１０４）ならびにＳＬＡＭＦ６（配列番号３７）からなる群から選択され、前記第１の抗原及び前記第２の抗原が異なっている、単離された免疫応答性細胞。
  37. 抗原認識受容体のそれぞれが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項３６に記載の単離された免疫応答性細胞。
  38. 抗原認識受容体のそれぞれが、ＣＡＲである、請求項３６に記載の単離された免疫応答性細胞。
  39. 対象に請求項３０～３８のいずれか１項に記載の免疫応答性細胞の有効量を投与する工程を含む、対象において腫瘍負荷を減少させる方法。
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