CN102369214B - 三价、双特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及三价、双特异性抗体，用于制备其的方法，包含所述抗体的药物组合物及其应用。本发明的三价、双特异性抗体包含全长抗体，所述全长抗体特异性结合于第一抗原并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成，和融合于所述重链的一条的C‑端的VH结构域，和融合于另一条所述重链的C‑端的VL结构域，其中所述VH结构域和所述VL结构域在一起形成特异性结合于第二抗原的抗原结合位点。

Description

三价、双特异性抗体
本发明涉及三价、双特异性抗体，用于制备它们的方法，包含所述抗体的药物组合物，及其应用。
发明背景
最近已经开发了广泛多样的多特异性重组抗体形式，例如通过例如将IgG抗体形式和单链结构域进行融合形成的四价双特异性抗体(见，例如Coloma，M.J.，等，NatureBiotech(自然生物技术)15(1997)159-163；WO 2001/077342；和Morrison，S.L.，NatureBiotech(自然生物技术)25(2007)1233-1234)。
还开发了能够结合两种以上的抗原的一些其它新的形式，其中抗体核心结构(IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)不再被保持，诸如双抗体(diabodies)、三链抗体或四链抗体(tetrabodies)、微型抗体(minibodies)、一些单链形式(scFv，双-scFv)(Holliger，P.，等，Nature Biotech(自然生物技术)23(2005)1126-1136；Fischer，N.，和Léger，O.，Pathobiology(病理生物学)74(2007)3-14；Shen，J.，等，Journal of ImmunologicalMethods(免疫学方法杂志)318(2007)65-74；Wu，C.，等，Nature Biotech.(自然生物技术)25(2007)1290-1297)。
所有这些形式使用接头来将抗体核心(IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)融合于其它的结合蛋白(例如scFv)，或融合例如两个Fab片段或scFvs(Fischer，N.，和Léger，O.，Pathobiology(病理生物学)74(2007)3-14)。要注意的是，可能技术人员想通过维持与天然存在的抗体的高度类似性来保持通过Fc受体结合介导的效应子功能，如例如补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
在WO 2007/024715中，报道了双重可变的结构域免疫球蛋白作为改造的多价和多特异性结合蛋白。在US 6,897,044中报道了具有生物活性的抗体二聚体的制备方法。在US7,129,330中报道了具有至少四个彼此通过肽接头连接的可变结构域的多价Fv抗体构建体。在US 2005/0079170中报道了二聚体和多聚体抗原结合结构。在US 6,511,663中报道了三价或四价单特异性抗原结合蛋白，其包含通过连接结构彼此共价结合的三个或四个Fab片段，所述蛋白不是天然免疫球蛋白。在WO 2006/020258中报道了这样的四价双特异性抗体，其可以在原核细胞和真核细胞中有效表达，并且用于治疗和诊断方法中。在US 2005/0163782中报道了在包含两种类型的多肽二聚体的混合物中将通过至少一个链间二硫键连接的二聚体与不通过至少一个链间二硫键连接的二聚体分离或优先合成通过至少一个链间二硫键连接的二聚体的方法。在US 5,959,083中报道了双特异性四价受体。在WO 2001/077342中报道了具有三个或多个功能性抗原结合位点的改造的抗体。
在WO 1997/001580中报道了多特异性和多价抗原结合多肽。WO 1992/004053报道了同型缀合物(homoconjugates)，其典型地由结合相同抗原决定簇的IgG类的单克隆抗体制备，通过合成交联共价连接。在WO 1991/06305中报道了对于抗原具有高亲和力的低聚单克隆抗体，其中分泌典型地是IgG类的低聚物，其具有两种以上的免疫球蛋白单体，所述免疫球蛋白单体缔合在一起形成四价或六价IgG分子。在US 6,350,860中报道了绵羊来源的抗体和改造的抗体构建体，其可以用于治疗其中干扰素γ活性是致病性的疾病。在US2005/0100543中，报道了可靶向的构建体，所述构建体是双特异性抗体的多价载体，即可靶向的构建体的每个分子可以作为两种以上双特异性抗体的载体。在WO 1995/009917中报道了遗传改造的双特异性四价抗体。在WO 2007/109254中，报道了由稳定的scFv组成或包含稳定的scFv的稳定的结合分子。
发明简述
本发明的第一个方面是三价、双特异性抗体，其包括：
a)全长抗体，其特异性结合于第一抗原并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成；
b)多肽，其由下述组成：
ba)抗体重链可变结构域(VH)；或
bb)抗体重链可变结构域(VH)和抗体恒定结构域1(CH1)，
其中所述多肽的VH结构域的N-端通过肽连接体(connector)融合于所述全长抗体的两条重链的一条的C-端；
c)多肽，其由下述组成：
ca)抗体轻链可变结构域(VL)，或
cb)抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)，
其中所述多肽的VL结构域的N-端通过肽连接体融合于所述全长抗体的两条重链的另一条的C-端；
并且其中在b)中的多肽的抗体重链可变结构域(VH)和在c)中的多肽的抗体轻链可变结构域(VL)在一起形成特异性结合于第二抗原的抗原结合位点。
本发明的另一个方面是编码根据本发明所述的三价、双特异性抗体的核酸分子。
本发明的又一个方面是包含所述三价、双特异性抗体的药物组合物。
根据本发明所述的三价、双特异性抗体在一方面显示由于它们与不同抗原结合所导致的新的性质，并且在另一方面由于它们的稳定性、低聚集性和药物动力学性质和生物学性质而适合于生产和药物配制。由于它们的Ig核心，它们仍旧保持天然抗体的性质如ADCC和CDC。
发明详述
本发明的一个方面是三价、双特异性抗体，其包括：
a)全长抗体，其特异性结合于第一抗原并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成；
b)多肽，其由下述组成：
ba)抗体重链可变结构域(VH)；或
bb)抗体重链可变结构域(VH)和抗体恒定结构域1(CH1)，
其中所述多肽的VH结构域的N-端通过肽连接体(connector)融合于所述全长抗体的两条重链的一条的C-端；
c)多肽，其由下述组成：
ca)抗体轻链可变结构域(VL)，或
cb)抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)，
其中所述多肽的VL结构域的N-端通过肽连接体融合于所述全长抗体的两条重链的另一条的C-端；
并且其中在b)中的多肽的抗体重链可变结构域(VH)和在c)中的多肽的抗体轻链可变结构域(VL)在一起形成特异性结合于第二抗原的抗原结合位点。
任选地，在b)中的多肽的抗体重链可变结构域(VH)和在c)中的多肽的抗体轻链可变结构域(VL)通过在下述位置之间引入二硫键而通过链间二硫化物桥(disulfidebridge)连接并且稳定：
i)重链可变结构域位置44到轻链可变结构域位置100，
ii)重链可变结构域位置105到轻链可变结构域位置43，或
iii)重链可变结构域位置101到轻链可变结构域位置100(总是根据Kabat的EU索引编号)。
引入非天然的二硫化物桥进行稳定的技术例如描述在WO 94/029350，Rajagopal，V.，等，Prot.Engin.(1997)1453-59；Kobayashi，H.，等；核药物和生物学(NuclearMedicine&Biology)，卷25，(1998)387-393；或Schmidt，M.，等，原癌基因(Oncogene)(1999)18，1711-1721中。在一个实施方案中，在b)和c)中的多肽的可变结构域之间的任选的二硫键在重链可变结构域位置44和轻链可变结构域位置100之间。在一个实施方案中，在b)和c)中的多肽的可变结构域之间的任选的二硫键在重链可变结构域位置105和轻链可变结构域位置43之间(总是根据Kabat的EU索引编号)。在一个实施方案中，优选在单链Fab片段的可变结构域VH和VL之间不具有所述任选的二硫化物稳定的三价、双特异性抗体。
术语“全长抗体”指由两条“全长抗体重链”和两条“全长抗体轻链”组成的抗体(见图1)。“全长抗体重链”是这样的多肽，其在N端到C端方向由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定重链结构域1(CH1)，抗体铰链区(HR)，抗体重链恒定结构域2(CH2)，和抗体重链恒定结构域3(CH3)组成，缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3；并且在IgE亚类的抗体的情形中，任选地还包括抗体重链恒定结构域4(CH4)。优选地，“全长抗体重链”是在N端到C端方向由VH，CH1，HR，CH2和CH3组成的多肽。“全长抗体轻链”是在N端到C端方向由抗体轻链可变结构域(VL)，和抗体轻链恒定结构域(CL)组成的多肽，缩写为VL-CL。所述抗体轻链恒定结构域(CL)可以是κ(kappa)或λ(lambda)。两条全长抗体链通过在CL结构域和CH1结构域之间的多肽间二硫键和全长抗体重链的铰链区之间的多肽间二硫键连接在一起。典型的全长抗体的实例是天然抗体如IgG(例如，IgG1和IgG2)，IgM，IgA，IgD，和IgE)。根据本发明所述的全长抗体可以来自单一物种，例如人，或它们可以是嵌合的或人源化的抗体。根据本发明所述的全长抗体包含分别由VH和VL对形成的两个抗原结合位点，这两个抗原结合位点都特异性结合于相同的抗原。所述全长抗体的重链或轻链的C端指在所述重链或轻链的C端的最后的氨基酸。
在b)中的多肽的抗体重链可变结构域(VH)的N-端和在c)中的多肽的抗体轻链可变结构域(VL)指在VH或VL结构域的N-端的最后的氨基酸。
根据本发明所述的全长抗体的CH3结构域可以通过“凸起-进入-孔洞(knob-into-holes)”技术进行改变，所述凸起-进入-孔洞技术用在例如WO 96/027011，Ridgway，J.B.，等，Protein Eng 9(1996)617-621；和Merchant，A.M.，等，Nat Biotechnol(自然生物技术)16(1998)677-681中的若干实例进行了详细描述。在该方法中，两个CH3结构域的相互作用表面被改变以增加包含这两个CH3结构域的两条重链的杂二聚体化。(两条重链的)两个CH3结构域的每个可以是“凸起”，而另一个是“孔洞”。引入二硫化物桥进一步稳定了杂二聚体(Merchant，A.M.，等，Nature Biotech(自然生物技术)16(1998)677-681；Atwell，S.，等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)270(1997)26-35)并增加了产量。
因此，在本发明的一个方面中，所述三价、双特异性抗体进一步的特征在于：
全长抗体的一条重链的CH3结构域和全长抗体的另一条重链的CH3结构域的每个在包括抗体CH3结构域之间的初始界面的界面连接(meet)；
其中所述界面被改变以促进二价、双特异性抗体的形成，其中所述改变特征在于：
a)一条重链的CH3结构域被改变，
从而使得在所述二价、双特异性抗体中，在与另一条重链的CH3结构域的初始界面连接(meet)的一条重链的CH3结构域的初始界面中，
氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替代，由此在一条重链的CH3结构域的界面中产生突起，所述突起可定位在另一条重链的CH3结构域的界面中的腔中，
并且
b)另一条重链的CH3结构域被改变，
从而在所述三价、双特异性抗体中，在与第一CH3结构域的初始界面连接(meet)的第二CH3结构域的初始界面中，
氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替代，由此在第二CH3结构域的界面中产生腔，在第一CH3结构域的界面中的突起可定位于所述腔中。
优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)组成的组中。
优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)组成的组中。
在本发明的一个方面中，两个CH3结构域通过引入半胱氨酸(C)作为每个CH3结构域相应位置的氨基酸从而可以在两个CH3结构域之间形成二硫化物桥而被进一步改变。
在优选的实施方案中，所述三价、双特异性包含在“凸起链(knobs chain)”的CH3结构域中的T366W突变，和在“孔洞链(hole chain)”的CH3结构域中的T366S，L368A，Y407V突变。还可以使用另外的在CH3结构域之间的链间二硫化物桥(Merchant，A.M.，等NatureBiotech(自然生物技术)16(1998)677-681)，例如通过在“凸起链”的CH3结构域中引入Y349C突变，在“孔洞链”的CH3结构域中引入E356C突变或S354C突变来进行。因此，在另一个优选的实施方案中，所述三价、双特异性抗体在两个CH3结构域的一个中包含Y349C，T366W突变，在两个CH3结构域的另一个中包含E356C，T366S，L368A，Y407V突变，或所述三价、双特异性抗体在两条CH3结构域的一个中包含Y349C，T366W突变，在两个CH3结构域的另一个中包含S354C，T366S，L368A，Y407V突变(在一个CH3结构域中的另外的Y349C突变和在另一个CH3结构域中的另外的E356C或S354C突变形成链间二硫化物桥)(编号总是根据Kabat的EU索引进行)。但是还可以备选地或另外地使用如由EP 1 870 459A1所述的其它凸起-进入-孔洞技术。关于所述三价、双特异性抗体的优选实例是在“凸起链”的CH3结构域中的R409D；K370E突变和在“孔洞链”的CH3结构域中的D399K；E357K突变(编号总是根据Kabat的EU索引进行)。
在另一个优选的实施方案中，所述三价、双特异性抗体在“凸起链”的CH3结构域中包含T366W突变，在“孔洞链”的CH3结构域中包含T366S，L368A，Y407V突变，并且另外在“凸起链”的CH3结构域中包含R409D；K370E突变，在“孔洞链”的CH3结构域中包含D399K；E357K突变。
在另一个优选的实施方案中，所述三价、双特异性抗体在两个CH3结构域的一个中包含Y349C，T366W突变，在两个CH3结构域的另一个中包含S354C，T366S，L368A，Y407V突变，或所述三价、双特异性抗体在两个CH3结构域的一个中包含Y349C，T366W突变，在两个CH3结构域的另一个中包含S354C，T366S，L368A，Y407V突变，另外在“凸起链”的CH3结构域中包含R409D；K370E突变，在“孔洞链”的CH3结构域中包含D399K；E357K突变。
根据本发明所述的双特异性抗体包含三个抗原结合位点(A)全长抗体包含两个相同的特异性结合于第一抗原的抗原结合位点，和B)在b)中的多肽的抗体重链可变结构域(VH)和在c)中的多肽的抗体轻链可变结构域(VL)在一起形成一个特异性结合于第二抗原的抗原结合位点。术语“结合位点”或“抗原结合位点”用于本文时指各个抗原实际上所特异性结合的根据本发明所述的双特异性抗体的区域。在全长抗体中的抗原结合位点或由在b)中的多肽的抗体重链可变结构域(VH)和在c)中的多肽的抗体轻链可变结构域(VL)形成的抗原结合位点分别由抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)组成的对形成。
特异性结合于需要的抗原的抗原结合位点可以来自a)针对抗原的已知抗体或b)通过使用特别是抗原蛋白或核酸或其片段的从头免疫方法或通过噬菌体展示获得的新抗体或抗体片段。
本发明的抗体的抗原结合位点包含六个互补性决定区(CDRs)，其在不同程度上有助于结合位点对于抗原的亲和力。存在三种重链可变结构域CDRs(CDRH1，CDRH2和CDRH3)和三种轻链可变结构域CDRs(CDRL1，CDRL2和CDRL3)。CDR和构架区(FRs)的程度通过与氨基酸序列的汇编数据库进行比较来确定，所述氨基酸序列中那些区域根据序列之间的可变性来确定。
抗体特异性指抗体对于抗原的特定表位的选择性识别。天然抗体，例如是单特异性的。根据本发明所述的“双特异性抗体”是具有两种不同的抗原结合特异性的抗体。如果抗体具有超过一种特异性，识别的表位可以与单抗原或一种以上的抗原相关。术语“单特异性”抗体，用于本文时指具有一个或多个分别结合于相同抗原的相同表位的结合位点的抗体。术语“价”在本申请中使用时指结合位点在抗体分子上存在的具体数量。例如，天然抗体或根据本发明所述的全长抗体具有两个结合位点并且是二价的。象这样，术语“三价”指在抗体分子中存在三个结合位点。根据本发明所述的双特异性抗体是“三价”的。术语“三价、双特异性”抗体用于本文时指具有三个抗原结合位点的抗体，其中两个抗原结合位点结合于相同的抗原(或抗原的相同表位)，第三个抗原结合位点结合于不同抗原或相同抗原的不同表位。本发明的抗体具有三个结合位点，并且是双特异性的。
本发明的另一个实施方案是三价、双特异性抗体，所述三价、双特异性抗体包含：
a)全长抗体，其特异性结合于第一抗原并且由下述组成：
aa)两条抗体重链，所述抗体重链从N-端到C-端方向由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定重链结构域1(CH1)、抗体铰链区(HR)、抗体重链恒定结构域2(CH2)和抗体重链恒定结构域3(CH3)组成；和
ab)两条抗体轻链，所述抗体轻链从N-端到C-端方向由抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)组成；和
b)多肽，其由下述组成：
ba)抗体重链可变结构域(VH)；或
bb)抗体重链可变结构域(VH)和抗体恒定结构域1(CH1)，
其中所述多肽的VH结构域的N-端通过肽连接体融合于所述全长抗体的两条重链的一条的C-端，其中所述肽连接体是至少5个氨基酸，优选地25-50个氨基酸的肽；
c)多肽，所述多肽由下述组成：
ca)抗体轻链可变结构域(VL)，或
cb)抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)；
其中所述多肽的VL结构域的N-端通过肽连接体融合于所述全长抗体的两条重链的另一条的C-端；
其中所述肽连接体与b)中的肽连接体相同；
并且其中b)中的多肽的抗体重链可变结构域(VH)和c)中的多肽的抗体轻链可变结构域(VL)在一起形成特异性结合于第二抗原的抗原结合位点。
在该实施方案中，优选地，所述三价、双特异性抗体在两个CH3结构域的一个中包含T366W突变，在两个CH3结构域的另一个中包含T366S，L368A，Y407V突变，更优选地，所述三价、双特异性抗体在两个CH3结构域的一个中包含Y349C，T366W突变，在两个CH3结构域的另一个中包含D356C，T366S，L368A，Y407V突变(在一个CH3结构域中另外的Y349C突变和在另一个CH3结构域中的另一个D356C突变形成链间二硫化物桥)。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明所述的三价、双特异性抗体特征在于：
a)所述全长抗体特异性结合于ErbB-3，包含SEQ ID NO：1的序列作为重链可变结构域，包含SEQ ID NO：2的序列作为轻链可变结构域
b)所述在b)中的多肽包含SEQ ID NO：3的序列作为重链可变结构域；和
c)所述在c)中的多肽包含SEQ ID NO：4的序列作为轻链可变结构域。
在本发明的另一个方面中，根据本发明所述的三价、双特异性抗体包含：
a)结合于第一抗原的全长抗体，所述全长抗体由两条抗体重链VH-CH1-HR-CH2-CH3和两条抗体轻链VL-CL组成；
(其中优选地，两个CH3结构域的一个包含Y349C，T366W突变，两个CH3结构域的另一个包含S354C，T366S，L368A，Y407V突变)；
b)多肽，所述多肽由下述组成：
ba)抗体重链可变结构域(VH)；或
bb)抗体重链可变结构域(VH)和抗体恒定结构域1(CH1)，
其中所述多肽的VH结构域的N-端通过肽连接体融合于所述全长抗体的两条重链的一条的C-端，
c)多肽，所述多肽由下述组成：
ca)抗体轻链可变结构域(VL)，或
cb)抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)；
其中所述多肽的VL结构域的N-端通过肽连接体融合于所述全长抗体的两条重链的另一条的C-端；
并且其中在b)中的多肽的抗体重链可变结构域(VH)和在c)中的多肽的抗体轻链可变结构域(VL)在一起形成特异性结合于第二抗原的抗原结合位点。
本发明的另一个实施方案是三价、双特异性抗体，所述抗体包含
a)特异性结合于人ErbB-3的全长抗体，所述全长抗体由下述组成：
aa)两条抗体重链，所述抗体重链从N-端到C-端方向由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定重链结构域1(CH1)、抗体铰链区(HR)、抗体重链恒定结构域2(CH2)和抗体重链恒定结构域3(CH3)组成；和
ab)两条抗体轻链，所述抗体轻链从N-端到C-端方向由抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)(VL-CL)组成；和
b)特异性结合于人c-Met)的一个单链Fv片段，
其中b)中的所述单链Fv片段通过肽连接体，在所述全长抗体的重链或轻链的C-端或N-端(优选地在重链的C-端)融合于在a)中的所述全长抗体；
其中所述肽连接体是至少5个氨基酸的肽，优选地25-50个氨基酸的肽。
优选地，所述三价、双特异性抗体还在全长抗体的两个CH3结构域的一个中包含Y349C，T366W突变，在全长抗体的两个CH3结构域的另一个中包含S354C(或E356C)，T366S，L368A，Y407V突变。
本发明的另一个实施方案是三价、双特异性抗体，所述三价、双特异性抗体包含：
a)全长抗体，所述全长抗体特异性结合于人ErbB-3，并且由下述组成：
aa)两条抗体重链，所述抗体重链从N-端到C-端方向由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定重链结构域1(CH1)、抗体铰链区(HR)、抗体重链恒定结构域2(CH2)和抗体重链恒定结构域3(CH3)组成；和
ab)两条抗体轻链，所述抗体轻链从N-端到C-端方向由抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)组成；和
b)多肽，所述多肽由下述组成：
ba)抗体重链可变结构域(VH)；或
bb)抗体重链可变结构域(VH)和抗体恒定结构域1(CH1)，
其中所述多肽的VH结构域的N-端通过肽连接体融合于所述全长抗体的两条重链的一条的C-端，其中所述肽连接体是至少5个氨基酸的肽，优选25-50个氨基酸的肽；
c)多肽，所述多肽由下述组成：
ca)抗体轻链可变结构域(VL)，或
cb)抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)；
其中所述多肽的VL结构域的N-端通过肽连接体融合于所述全长抗体的两条重链的另一条的C-端；
其中所述肽连接体与在b)中的肽连接体相同；
并且其中在b)中的多肽的抗体重链可变结构域(VH)和在c)中的多肽的抗体轻链可变结构域(VL)在一起形成特异性结合于人c-Met的抗原结合位点。
本发明的全长抗体包含一个或多个免疫球蛋白种类的免疫球蛋白恒定区。免疫球蛋白种类包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE同种型，并且在IgG和IgA的情形中，包括它们的亚型。在优选的实施方案中，本发明的全长抗体具有IgG型抗体的恒定结构域结构。
术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”用于本文中时，指单一氨基酸组成的抗体分子制剂。
术语“嵌合抗体”指一种抗体，其包括来自一种来源或物种的可变区，即结合区，以及源自不同来源或物种的恒定区的至少一部分，所述抗体通常通过重组DNA技术进行制备。优选包括鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它优选形式是这样的那些，其中恒定区已经被从初始抗体的恒定区开始进行修饰或改变以产生按照本发明的特性，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合。也将这种“嵌合”抗体称作“类别转换抗体”。嵌合抗体是被表达的免疫球蛋白基因的产物，该基因包括编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段。制备嵌合抗体的方法包括在本领域众所周知的常规重组DNA技术和基因转染技术。见，例如，Morrison，S.L.，等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad Sci.USA)81(1984)6851-6855；US 5,202,238和US 5,204,244。
术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中的构架或“互补性决定区”(CDR)已经被修饰为包括与母体免疫球蛋白相比特异性不同的免疫球蛋白的CDR。在一个优选实施方案中，将鼠CDR移植到人抗体的构架区以制备“人源化抗体”。见例如，Riechmann，L.，等，自然(Nature)332(1988)323-327；和Neuberger，M.S.，等，自然(Nature)314(1985)268-270。特别优选的CDRs对应于识别以上指出的关于嵌合抗体的抗原的那些代表性序列。本发明涵盖的“人源化抗体”的其它形式是这样的那些，其中恒定区已经另外被从初始抗体的恒定区开始进行修饰或改变以产生按照本发明的特性，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合。
用于本文时，术语“人抗体”意欲包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的(van Dijk，M.A.，和van de Winkel，J.G.，当前化学生物学观点(Curr.Opin.Chem.Biol).5(2001)368-374)。人抗体还可以在转基因动物(例如小鼠)中产生，所述转基因动物在免疫时能够在缺乏内源免疫球蛋白生成的条件下产生人抗体的全部所有组成成分或选择部分(selection)。在所述种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击时产生人抗体(见例如Jakobovits，A.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)90(1993)2551-2555；Jakobovits，A.，等.，Nature(自然)362(1993)255-258；Brüggemann，M.，等.，Year Immunol.(免疫学年度)7(1993)33-40)。人抗体还可以在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom，H.R.，和Winter，G.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)227(1992)381-388；Marks，J.D.，等.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)222(1991)581-597)。Cole，S.P.C.，等和Boerner，P.，等的技术也可以用于制备人单克隆抗体(Cole，S.P.C.，等.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体和癌症治疗)，Alan R.Liss，p.77-96(1985)；和Boerner，P.，等.，J.Immunol.(免疫学杂志)147(1991)86-95)。如已经对按照本发明的嵌合和人源化抗体所提及地，术语“人抗体”用于本文中时还包括这样的抗体，其在恒定区内进行修饰以产生按照本发明的特性，特别是关于C1q结合和/或FcR结合，例如通过“类别转换”即改变或突变Fc部分(例如由IgG1到IgG4和/或IgG1/IgG4突变)。
用于本文时，术语“重组人抗体”意欲包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如分离自宿主细胞，诸如NS0或CHO细胞的抗体或分离自人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)的抗体，或利用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。这种重组人抗体具有处于重排形式的可变区和恒定区。按照本发明的重组人抗体已经经历了体内体细胞高变。因此，重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是尽管源自并涉及人种系VH和VL序列，但在体内可能不天然存在于人抗体种系所有组成成分中的序列。
“可变结构域”(轻链(VL)的可变结构域，重链(VH)的可变区)用于本文中时，表示直接参与抗体与抗原结合的每对轻链和重链对。可变人轻链和重链的结构域具有相同的一般结构且每个结构域包括4个构架(FR)区，所述构架区的序列普遍保守，其通过3个“高变区”(或互补性决定区，CDRs)相连接。构架区采用β-折叠构象且CDR可以形成连接β-折叠结构的环。每条链中的CDR通过构架区以其三维结构保持并与来自另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在按照本发明的抗体的结合特异性/亲和力方面发挥特别重要的作用并因此提供本发明的另一个目的。
用于本文时，术语“高变区”或“抗体的抗原结合部分”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包括来自“互补性决定区”或“CDRs”的氨基酸残基。“构架”或“FR”区是除本文中定义的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链和重链从N端到C端包括结构域FR1，CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。各条链上的CDR通过所述构架氨基酸分开。特别地，重链的CDR3是最有助于抗原结合的区域。按照Kabat，E.A.等，免疫目的的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，公众健康服务，国家健康研究所(Public Health Service，National Institutes of Health)，Bethesda，MD.(1991))的标准定义确定CDR和FR区域。
用于本文时，术语“结合”或“特异性结合”指在体外测定法中，优选地在用纯化的野生型抗原的等离子共振测定(plasmon resonance assay)(BIAcore，GE-HealthcareUppsala，Sweden)中，抗体与抗原的表位的结合。结合的亲和力由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的缔合的速率常数)，kD(解离常数)和KD(kD/ka)定义。结合或特异性结合意为10-8mol/l以下，优选地10-9M到10-13mol/l的结合亲和力(KD)。因此，根据本发明的三价、双特异性抗体以10-8mol/l以下，优选10-9M到10-13mol/l的结合亲和力(KD)特异性结合于对其具有特异性的每种抗原。
抗体与FcγRIII的结合可以通过BIAcore测定法(GE-Healthcare，Uppsala，Sweden)进行研究。结合的亲和力由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的缔合的速率常数)，kD(解离常数)和KD(kD/ka)定义。
术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面分组(groupings)，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，和或特定的带电特性。表位是被抗体结合的抗原区域。
在某些实施方案中，当抗体在蛋白和/或大分子的复杂混合物中优选识别其靶抗原时，将该抗体称为与抗原特异性结合。
术语“肽连接体”用于本发明时指具有氨基酸序列的肽，所述肽优选地是合成来源的。将根据本发明所述的这些肽连接体用于将在b)和c)中的多肽与全长抗体的重链C-端融合从而形成根据本发明所述的三价、双特异性抗体。优选地，所述肽连接体是具有至少5个氨基酸长度的氨基酸序列的肽，优选地具有10-100个氨基酸长度的氨基酸序列的肽，更优选地具有25-50个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。优选地，在b)和c)中的所述肽连接体是具有至少25个氨基酸长度的相同的肽，优选地具有25-50个氨基酸长度的相同的肽，并且更优选地，所述肽连接体是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，并且(x＝3，n＝6，7或8，并且m＝0，1，2或3)或(x＝4，n＝3，4，5，6，或7并且m＝0，1，2或3)，优选地x＝4并且n＝5，6，或7。
在另一个实施方案中，根据本发明所述的三价、双特异性抗体特征在于所述全长抗体是人IgG1亚类的，或具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类的。
在另一个实施方案中，根据本发明所述的三价、双特异性抗体特征在于所述全长抗体是人IgG2亚类的。
在另一个实施方案中，根据本发明所述的三价、双特异性抗体特征在于所述全长抗体是人IgG3亚类的。
在另一个实施方案中，根据本发明所述的三价、双特异性抗体特征在于所述全长抗体是人IgG4亚类的，或具有另外的突变S228P的人IgG4亚类的。
优选地，根据本发明所述的三价、双特异性抗体特征在于所述全长抗体是人IgG1亚类的，或具有另外的突变S228P的人IgG4亚类的。
目前已经发现，根据本发明所述的三价、双特异性抗体具有提高的特征如生物学或药理学活性，药物动力学性质或毒性。它们可以例如用于治疗疾病如癌症。
在另一个实施方案中，根据本发明所述的三价、双特异性抗体特征在于特异性结合于ErbB3和c-Met。术语“恒定区”用于本申请时指除了可变区之外的抗体的结构域的总合。恒定区不直接涉及抗原的结合，但是显示不同的效应子功能。取决于它们重链的恒定区的氨基酸序列，抗体被分为下述类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的一些可以被进一步分为亚类如IgG1，IgG2，IgG3和IgG4，IgA1和IgA2。对应于不同种类的抗体的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。可以在所有5种抗体种类中发现的轻链恒定区(CL)被称为κ(kappa)和λ(lambda)。
术语“来自人来源的恒定区”在本申请中使用时，指亚类IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4的人抗体的恒定重链区和/或恒定轻链κ或λ区域。这样的恒定区是现有技术中公知的并且例如由Kabat，E.A.，描述(见，例如Johnson，G.和Wu，T.T.，核酸研究(Nucleic Acids Res.)28(2000)214-218；Kabat，E.A.，等.，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)72(1975)2785-2788)。
当IgG4亚类的抗体显示减少的Fc受体(FcγRIIIa)结合时，其它IgG亚类的抗体显示强烈的结合。然而，Pro238，Asp265，Asp270，Asn297(失去Fc糖)，Pro329，Leu234，Leu235，Gly236，Gly237，Ile253，Ser254，Lys288，Thr307，Gln311，Asn434，和His435是这样的残基，其如果改变的话，还提供减少的Fc受体结合(Shields，R.，L.，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276(2001)6591-6604；Lund，J.，等，FASEB J.9(1995)115-119；Morgan，A.，等，免疫学(Immunology)86(1995)319-324；EP 0 307 434)。
在一个实施方案中，根据本发明所述的抗体与IgG1抗体比较具有减少的FcR结合，并且所述全长母体抗体涉及IgG4亚类的FcR结合或具有突变S228，L234，L235和/或D265的IgG1或IgG2亚类的FcR结合，和/或包含PVA236突变。在一个实施方案中，在全长母体抗体中的突变是S228P，L234A，L235A，L235E和/或PVA236。在另一个实施方案中，在全长母体抗体中的突变在IgG4中是S228P，在IgG1中是L234A和L235A。
抗体的恒定区直接涉及ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用)和CDC(补体依赖的细胞毒性)。补体激活(CDC)由补体因子C1q与大多数IgG抗体亚类的恒定区结合而起始。C1q与抗体的结合由在所谓的结合位点的定义的蛋白-蛋白相互作用所导致。这样的恒定区结合位点在现有技术中是已知的，并且例如由Lukas，T.J.，等，免疫学杂志(J.Immunol.)127(1981)2555-2560；Brunhouse，R.和Cebra，J.J.，分子免疫学(Mol.Immunol.)16(1979)907-917；Burton，D.R.，等，自然(Nature)288(1980)338-344；Thommesen，J.E.，等，分子免疫学(Mol.Immunol.)37(2000)995-1004；Idusogie，E.E.，等，免疫学杂志(J.Immunol.)164(2000)4178-4184；Hezareh，M.，等，病毒学杂志(J.Virol.)75(2001)12161-12168；Morgan，A.，等，免疫学(Immunology)86(1995)319-324；和EP 0 307434所描述。所述恒定区结合位点例如特征在于氨基酸L234，L235，D270，N297，E318，K320，K322，P331，和P329(根据Kabat的EU索引编号)。
术语“抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)”指在存在效应细胞时，由根据本发明的抗体裂解人靶细胞。ADCC优选地通过用根据本发明的抗体在存在效应细胞时处理表达抗原的细胞的制备物进行测量，所述效应细胞如新鲜分离的PBMC或来自暗黄覆盖层的纯化的效应细胞，如单核细胞或天然杀伤(NK)细胞或永久生长的NK细胞系。
术语“补体依赖的细胞毒性(CDC)”指由补体因子C1q与大多数IgG抗体亚类的Fc部分结合而起始的过程。C1q与抗体的结合由在所述结合位点的限定的蛋白-蛋白相互作用所导致。这些Fc部分结合位点是现有技术已知的(见上)。这些Fc部分结合位点例如特征在于氨基酸L234，L235，D270，N297，E318，K320，K322，P331，和P329(根据Kabat的EU索引编号)。亚类IgG1，IgG2和IgG3的抗体通常显示包括C1q和C3结合的补体激活，而IgG4不激活补体系统并且不结合C1q和/或C3。
单克隆抗体的细胞介导的效应子功能可以通过改造它们的寡糖成分而得以增强，如在Umana，P.，等，自然生物技术(Nature Biotechnol.)17(1999)176-180，和US 6,602,684中所述。IgG1型抗体是最常用的治疗性抗体，其是在每个CH2结构域的Asn297具有保守的N-连接的糖基化位点的糖蛋白。与Asn297附着的两个复合双触角寡糖隐藏在CH2结构域之间，形成了与多肽主链的广泛接触，并且它们的存在对于抗体介导效应子功能诸如抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)是必要的(Lifely，M.R.，等，糖生物学(Glycobiology)5(1995)：813-822；Jefferis，R.，等，免疫学综述(Immunol Rev).163(1998)：59-76；Wright，A.和Morrison，S.L.，生物技术趋势(Trends Biotechnol.)15(1997)：26-32)。Umana，P.，等自然生物技术(Nature Biotechnol.)17(1999)176-180和WO 99/54342显示，β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(“GnTIII”)，一种催化平分型(bisected)寡糖形成的糖基转移酶，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的过量表达，显著增加了抗体的体外ADCC活性。在Asn297糖的组成上的改变或其消除也影响FcγR和C1q的结合(Umana，P.，等，自然生物技术(NatureBiotechnol.)17(1999)176-180；Davies，J.，等，生物技术生物工程(Biotechnol.Bioeng.)74(2001)288-294；Mimura，Y.，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276(2001)45539-45547；Radaev，S.，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276(2001)16478-16483；Shields，R.L.，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276(2001)6591-6604；Shields，R.L.，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)277(2002)26733-26740；Simmons，L.C.，等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)263(2002)133-147)。
增强单克隆抗体的细胞介导的效应子功能的方法例如在WO 2005/018572，WO2006/116260，WO 2006/114700，WO 2004/065540，WO 2005/011735，WO 2005/027966，WO1997/028267，US 2006/0134709，US 2005/0054048，US 2005/0152894，WO 2003/035835，WO2000/061739中进行报道。
令人惊奇地，作为本发明的一个实施方案的双特异性<ErbB3-c-Met>抗体与它们的母体<ErbB3>和/或<c-Met>抗体相比，显示对靶抗原的减少的下调和内化作用。因此，在本发明的一个优选实施方案中，双特异性抗体是糖基化的(如果其包含IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚类的Fc部分，优选地IgG1或IgG3亚类的Fc部分)，在Asn297具有糖链，其中在所述糖链中的岩藻糖的量是65％以下(根据Kabat的编号)。在另一个实施方案中，岩藻糖在所述糖链中的量在5％-65％，优选地20％-40％。根据本发明所述的“Asn297”意为在Fc区域的约位置297定位的氨基酸天冬酰胺。基于抗体的微小序列变化，Asn297也可以定位在位置297上游或下游的一些氨基酸上(通常不超过±3个氨基酸)，即在位置294-300之间。在一个实施方案中，根据本发明所述的糖基化的抗体IgG亚类是人IgG1亚类的，具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类的，或IgG3亚类的。在另一个实施方案中，在所述糖链中N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)的量是1％以下和/或N-端α-1，3-半乳糖的量是1％以下。糖链优选地显示与在CHO细胞中重组表达的抗体的Asn297连接的N-连接的聚糖的特征。
术语“糖链显示与在CHO细胞中重组表达的抗体的Asn297附着的N-连接的聚糖的特征”指在根据本发明所述的全长母体抗体的Asn297的糖链具有与在未修饰的CHO细胞中表达的相同抗体，例如如在WO 2006/103100中报道的那些抗体相同的结构和糖残基序列，除了岩藻糖残基之外。
术语“NGNA”用于本申请时指糖残基N-羟乙酰神经氨酸。
人IgG1或IgG3在Asn297发生糖基化，如核心岩藻糖基化的双触角复合寡糖糖基化，末端为多至两个Gal残基。IgG1或IgG3亚类的人恒定重链区由Kabat，E.A.，等，免疫目的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版.公众健康服务(Public Health Service)，国家健康研究所(National Institutes of Health)，Bethesda，MD.(1991)，和由Brüggemann，M.，等，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361；Love，T.W.，等，酶学方法(Methods Enzymol.)178(1989)515-527中详细报道。根据末端Gal残基的量，将这些结构称为G0，G1(α-1，6-或α-1，3-)，或G2聚糖残基(Raju，T.S.，BioprocessInt.1(2003)44-53)。抗体Fc部分的CHO型糖基化例如由Routier，F.H.，糖缀合物杂志(Glycoconjugate J).14(1997)201-207描述。在未进行糖修饰的CHO宿主细胞中重组表达的抗体通常在Asn297进行岩藻糖基化，量为至少85％。全长母体抗体的修饰的寡糖可以是杂合的或复合的。优选地，所述平分型，还原/未岩藻糖基化的寡糖是杂合的。在另一个实施方案中，所述平分型、还原/未岩藻糖基化的寡糖是复合的。
根据本发明，“岩藻糖的量”意为与在Asn297附着的所有糖结构的总和(例如，复合、杂合和高甘露糖结构)相比的在Asn297的糖链中所述糖的量，所述糖的量通过MALDI-TOF质谱测量并且计算为平均值。岩藻糖的相对量是包含岩藻糖的结构相对于在N-糖苷酶F处理的样品中由MALDI-TOF鉴定的所有糖结构(例如，复合、杂合和低聚和高甘露糖结构，分别的)的百分比。
根据本发明所述的抗体由重组方式产生。因此，本发明的一个方面是编码根据本发明所述的抗体的核酸，并且另一个方面是包含编码根据本发明所述的抗体的核酸的细胞。用于重组生产的方法是现有技术中广泛已知的并且包含在原核细胞和真核细胞中的蛋白表达，以及随后的抗体分离和通常纯化为药用纯度。对于将前述抗体在宿主细胞中的表达，将编码各个修饰的轻链和重链的核酸通过标准方法插入表达载体中。在适合的原核或真核宿主细胞如CHO细胞，NS0细胞，SP2/0细胞，HEK293细胞，COS细胞，PER.C6细胞，酵母，或大肠杆菌细胞中进行表达，并且将所述抗体从细胞(上清液或裂解后的细胞)中回收。用于重组生产抗体的一般方法是现有技术中公知的，并且例如在Makrides，S.C.，ProteinExpr.Purif.17(1999)183-202；Geisse，S.，等，Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，分子生物技术(Mol.Biotechnol.)16(2000)151-160；Werner，R.G.，DrugRes(药物研究).48(1998)870-880的综述文章中描述。
根据本发明所述的三价、双特异性抗体适当地从培养基中通过常规免疫球蛋白纯化方法分离，所述纯化方法如，例如蛋白A-琼脂糖，羟基磷灰石层析法，凝胶电泳，透析或亲和层析法。编码所述单克隆抗体的DNA和RNA容易地使用常规方法进行分离和测序。杂交瘤细胞可以充当所述DNA和RNA的来源。一旦被分离，可以将DNA插入表达载体中，所述表达载体接着被转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞如HEK 293细胞，CHO细胞，或骨髓瘤细胞中，从而在宿主细胞中获得重组单克隆抗体的合成。
所述三价、双特异性抗体的氨基酸序列变体(或突变体)通过将适合的核苷酸变化引入抗体DNA中，或通过核苷酸合成进行制备。然而，这样的修饰可以仅在例如如上述的非常有限的范围内进行。例如，修饰不改变上述提及的抗体特征如IgG同种型和抗原结合，但是可以提高重组生产的产率、蛋白稳定性或有利于纯化。
术语“宿主细胞”用于本申请时是指可以被改造从而产生根据本发明所述的抗体的细胞系统的任何种类。在一个实施方案中，将HEK293细胞和CHO细胞用作宿主细胞。用于本文时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可交替使用，且全部这些名称都包括后代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试者细胞和由其来源的培养物，而不考虑转移数。还理解所有的后代的DNA含量可能不精确一致，这归因于有意或无意的突变。包括在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的变异后代。
在NS0细胞中的表达记述在，例如，Barnes，L.M.，等.，细胞技术学(Cytotechnology)32(2000)109-123；Barnes，L.M.，等.，生物技术和生物工程(Biotech.Bioeng.)73(2001)261-270中。瞬时表达记述在，例如，Durocher，Y.，等.，核酸研究(Nucl.Acids.Res.)30(2002)E9中。可变结构域的克隆记述在Orlandi，R.，等.，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86(1989)3833-3837；Carter，P.，等.，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89(1992)4285-4289；和Norderhaug，L.，等.，免疫学方法杂志(J.Immunol.Method)204(1997)77-87中。优选的瞬时表达系统(HEK 293)记述在Schlaeger，E.-J.，和Christensen，K.，在细胞技术学(Cytotechnology)30(1999)71-83中和Schlaeger，E.-J.，在免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)194(1996)191-199中。
适合用于原核生物的控制序列，例如包括启动子，任选地操纵子序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子和多腺苷酸化信号。
当核酸在被置于与另一个核酸序列的功能关系中，是“可操作地连接的”。例如，前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接，条件是其表达为参与多肽分泌的前蛋白；启动子或增强子与编码序列可操作地连接，条件是其影响序列的转录；或核糖体结合位点与编码序列可操作地连接，条件是其被定位为促进翻译。一般地，“可操作地连接的”意指被连接的DNA序列是连续的，且在分泌前导序列的情形中，是连续的且在可读框中。然而，增强子不必须是连续的。连接通过在方便的限制性位点处的连接来实现。如果所述位点不存在，则合成的寡核苷酸适体或接头根据常规实践使用。
通过标准技术，包括碱/SDS处理，CsCl分级(CsCl banding)，柱层析法，琼脂糖凝胶电泳，和其它本领域公知的技术，进行抗体的纯化从而消除细胞成分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白。见Ausubel，F.，等，编辑，现代分子生物学中的方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)，Greene Publishing和Wiley Interscience，NewYork(1987)。不同的方法是充分建立的并且广泛用于蛋白纯化，如用微生物蛋白进行的亲和层析法(例如，蛋白A或蛋白G亲和层析法)，离子交换层析法(例如阳离子交换(羧甲基树脂)，阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式的交换)，亲硫吸附(例如，用β-巯基乙醇和其它SH配体)，疏水相互作用或芳香吸附层析法(例如用苯基-琼脂糖、氮杂-arenophilic树脂，或间氨基苯基硼酸)，金属螯合亲和层析法(例如用Ni(II)-和Cu(II)-亲和力材料)，大小排阻层析和电泳方法(如凝胶电泳，毛细管电泳)(Vijayalakshmi，M.，A.，应用生物化学生物技术(Appl.Biochem.Biotech).75(1998)93-102)。
本发明的一个方面是包含根据本发明所述的抗体的药物组合物。本发明的另一个方面是将根据本发明所述的抗体用于制备药物组合物的应用。本发明的另一个方面是用于制备包含根据本发明所述的抗体的药物组合物的方法。在另一个方面中，本发明提供包含与药用载体一起配制的根据本发明所述的抗体的组合物，例如药物组合物。
本发明的一个实施方案是用于治疗癌症的根据本发明所述的三价、双特异性抗体。
本发明的另一个方面是用于治疗癌症的所述药物组合物。
本发明的另一个方面是根据本发明所述的抗体用于制备治疗癌症的药物的应用。
本发明的另一个方面是通过向需要所述治疗的患者施用根据本发明所述的抗体治疗遭受癌症的患者的方法。
用于本文时，“药物载体”包括生理相容的任何和所有的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗试剂和吸附延缓试剂等。优选地，所述载体适合用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊或表皮施用(例如通过注射或输注)。
本发明的组合物可以通过多种本领域已知的方法施用。如技术人员清楚地，施用的路径和/或方式将根据需要的结果变化。为了通过某些施用路径施用本发明的化合物，可能需要用防止其失活的材料包被所述化合物，或使所述化合物与防止其失活的材料共同施用。例如，所述化合物可以在适合的载体中施用于受试者，所述载体例如是脂质体或稀释剂。药用稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。药物载体包括无菌水溶液或分散体和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。这些介质和药剂用于药物活性物质是本领域已知的。
术语“肠胃外施用”和“肠胃外地施用”用于本文时意为除了肠和局部施用之外的施用方式，通常通过注射施用，并且包括，但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、角质下(subcuticular)、关节内、囊下、蛛网膜下、脊内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
术语癌症用于本文时指增生性疾病，如淋巴瘤(lymphomas)，淋巴细胞性白血病(lymphocytic leukemias)，肺癌(lung cancer)，非小细胞肺(NSCL)癌(non small celllung(NSCL)cancer)，支气管肺泡细胞肺癌(bronchioloalviolar cell lung cancer)，骨癌(bone cancer)，胰腺癌(pancreatic cancer)，皮肤癌(skin cancer)，头或颈癌(cancerof the head or neck)，皮肤或眼内黑素瘤(cutaneous or intraocular melanoma)，子宫癌(uterine cancer)，卵巢癌(ovarian cancer)，直肠癌(rectal cancer)，肛区癌(cancerof the anal region)，胃癌(stomach cancer)，胃癌(gastric cancer)，结肠癌(coloncancer)，乳腺癌(breast cancer)，子宫癌(uterine cancer)，输卵管癌(carcinoma ofthe fallopian tubes)，子宫内膜癌(carcinoma of the endometrium)，子宫颈癌(carcinoma of the cervix)，阴道癌(carcinoma of the vagina)，外阴癌(carcinoma ofthe vulva)，霍奇金病(Hodgkin′s Disease)，食管癌(cancer of the esophagus)，小肠癌(cancer of the small intestine)，内分泌系统癌(cancer of the endocrine system)，甲状腺癌(cancer of the thyroid gland)，甲状旁腺癌(cancer of the parathyroidgland)，肾上腺癌(cancer of the adrenal gland)，软组织肉瘤(sarcoma of softtissue)，尿道癌(cancer of the urethra)，阴茎癌(cancer of the penis)，前列腺癌(prostate cancer)，膀胱癌(cancer of the bladder)，肾癌或输尿管癌(cancer of thekidney or ureter)，肾细胞癌(renal cell carcinoma)，肾盂癌(carcinoma of therenal pelvis)，间皮瘤(mesothelioma)，肝细胞癌(hepatocellular cancer)，胆管癌(biliary cancer)，中枢神经系统(CNS)肿瘤(neoplasms of the central nervoussystem(CNS))，脊椎轴肿瘤(spinal axis tumors)，脑干胶质瘤(brain stem glioma)，多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme)，星形细胞瘤(astrocytomas)，神经鞘瘤(schwanomas)，室管膜瘤(ependymonas)，成髓细胞瘤(medulloblastomas)，脑膜瘤(meningiomas)，鳞状细胞癌(squamous cell carcinomas)，垂体腺瘤(pituitaryadenoma)，和埃文斯肉瘤(Ewing’s sarcoma)，包括上述癌症任一的难治性形式，或一种或多种上述癌症的组合。
这些组合物还可以包含辅药如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。防止微生物的存在可以通过灭菌方法，见上文和通过包含各种抗细菌和抗真菌药剂，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保。可能需要在组合物中包含等渗剂，如糖、氯化钠等。此外，可以通过包含延缓吸附的试剂如单硬脂酸铝和明胶来导致可注射药物形式的延长的吸收。
不管所选择的施用路径为何，可以以适合的水合形式使用的本发明的化合物，和/或本发明的药物组合物通过本领域技术人员已知的常规方式配制到药用剂型中。
在本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化从而获得这样的活性成分的量，其对于特定的患者、组合物和施用方式有效获得需要的治疗反应，而不会对于患者具有毒性。选定的剂量水平将取决于多种药物动力学因素包括所用的本发明的特定组合物的活性、施用路径、施用时间、使用的特定化合物的排泄速率、治疗的延续时间、与所用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、待治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康和以前的医疗病史，以及医疗领域已知的类似因素。
所述组合物必需是无菌和可流动的，到所述组合物可通过注射器递送的程度。除了水之外，所述载体优选地是等渗缓冲的盐水溶液。
适当的流动性可以例如通过使用涂层如卵磷脂，在分散体的情形中通过维持需要的颗粒大小和通过使用表面活性剂来维持。在许多情形中，优选在所述组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇如甘露醇或山梨醇和氯化钠。
用于本文中时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可交替使用，且全部这些名称都包括子代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试细胞和由其来源的培养物，而不考虑转移的次数。还理解所有的子代的DNA含量可能不精确一致，这归因于有意或无意的突变。包括在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的变异子代。在意指不同名称时，通过上下文其将是清楚的。
术语“转化”用于本文中时，指将载体/核酸转移到宿主细胞中的过程。如果将无难以克服的细胞壁屏障的细胞用作宿主细胞，则转染例如通过如Graham，F.L.，和van derEb.A.J.，Virology(病毒学)52(1973)456-467所述的磷酸钙沉淀法来进行。然而，还可以使用其它将DNA引入细胞的方法，诸如通过核注射或通过原生质体融合。如果使用原核细胞或包含实质细胞壁结构的细胞，例如一种转染方法是利用氯化钙的钙处理，如Cohen，S.N，等，PNAS(美国科学院院报).69(1972)2110-2114所述。
用于本文中时，“表达”指将核酸转录为mRNA的过程和/或将转录的mRNA(也称为转录物)随后翻译为肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和被编码的多肽共同称为基因产物。如果多核苷酸源自基因组DNA，则在真核细胞中的表达可以包括mRNA的剪接。
“载体”是核酸分子，特别是自体复制的，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞之中和/或之间。该术语包括主要功能为将DNA或RNA插入细胞(例如，染色体整合)的载体，主要功能是复制DNA或RNA的复制载体，和功能是转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。还包括提供多于一种上述功能的载体。
“表达载体”是多核苷酸，其在引入到合适的宿主细胞中时能够被转录和翻译为多肽。“表达系统”通常指包括表达载体的适当宿主细胞，所述表达载体可以起作用产生所需的表达产物。
氨基酸序列的描述
SEQ ID NO：1重链可变结构域<ErbB3>HER3克隆29
SEQ ID NO：2轻链可变结构域<ErbB3>HER3克隆29
SEQ ID NO：3重链可变结构域<c-Met>Mab 5D5
SEQ ID NO：4轻链可变结构域<c-Met>Mab 5D5
SEQ ID NO：5重链<ErbB3>HER3克隆29
SEQ ID NO：6轻链<ErbB3>HER3克隆29
SEQ ID NO：7重链<c-Met>Mab 5D5
SEQ ID NO：8轻链<c-Met>Mab 5D5
SEQ ID NO：9重链<c-Met>Fab 5D5
SEQ ID NO：10轻链<c-Met>Fab 5D5
SEQ ID NO：11重链1<ErbB3-c-Met>Her3/Met_KHSS
SEQ ID NO：12重链2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_KHSS
SEQ ID NO：13轻链<ErbB3-c-Met>Her3/Met_KHSS
SEQ ID NO：14重链1<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKH
SEQ ID NO：15重链2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKH
SEQ ID NO：16轻链<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKH
SEQ ID NO：17重链1<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKHSS
SEQ ID NO：18重链2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKHSS
SEQ ID NO：19轻链<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKHSS
SEQ ID NO：20重链1<ErbB3-c-Met>Her3/Met_1C
SEQ ID NO：21重链2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_1C
SEQ ID NO：22轻链<ErbB3-c-Met>Her3/Met_1C
SEQ ID NO：23重链1<ErbB3-c-Met>Her3/Met_6C
SEQ ID NO：24重链2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_6C
SEQ ID NO：25轻链<ErbB3-c-Met>Her3/Met_6C
SEQ ID NO：26人IgG1的重链恒定区
SEQ ID NO：27人IgG1的重链恒定区
SEQ ID NO：28人轻链κ恒定区
SEQ ID NO：29人轻链λ恒定区
提供下面的实施例、序列表和附图帮助理解本发明，本发明的真实范围在所附的权利要求书中给出。要理解的是可以在不背离本发明精神的情况下在提出的方法中进行修改。
附图描述
图1.不具有CH4结构域的全长抗体的示意性结构，所述全长抗体特异性结合于第一抗原1，以典型的顺序具有两对包含可变结构域和恒定结构域的重链和轻链。
图2.根据本发明所述的三价、双特异性抗体的示意图，所述抗体包含特异性结合于第一抗原1的全长抗体，
a)图2a两条多肽VH和VL融合于所述全长抗体(两者的VH和VL结构域在一起形成特异性结合第二抗原2的抗原结合位点)；
b)图2b两条多肽VH-CH1和VL-CL融合于所述全长抗体(两者的VH和VL结构域在一起形成特异性结合第二抗原2的抗原结合位点)。
图3.根据本发明所述的三价、双特异性抗体的示意图，其包含特异性结合于第一抗原1的全长抗体，两条多肽VH和VL融合于所述全长抗体(两者的VH和VL结构域在一起形成特异性结合于第二抗原2的抗原结合位点)，所述全长抗体具有“凸起和孔洞”。
图4.根据本发明所述的三价、双特异性抗体的示意图，其包含特异性结合于第一抗原1的全长抗体，两条多肽VH和VL融合于所述全长抗体(两者的VH和VL结构域在一起形成特异性结合于第二抗原2的抗原结合位点，其中这些VH和VL结构域包含在位置VH44和VL100之间的链间二硫化物桥)，所述全长抗体具有“凸起和孔洞”。
图5.双特异性抗体与癌细胞的细胞表面的结合。
图6.双特异性Her3/c-Met抗体形式抑制HGF-诱导的c-Met受体磷酸化作用。
图7.双特异性Her3/c-Met抗体形式抑制HRG-诱导的Her3受体磷酸化作用。
图8.双特异性Her3/c-Met抗体形式抑制HGF-诱导的HUVEC增殖。
图9.双特异性Her3/c-Met抗体形式抑制癌细胞系A431中的增殖。
图10.分析双特异性Her3/c-Met抗体形式对在癌细胞系A431中HGF-诱导的细胞-细胞播散(分散)的抑制。
实验方法
实施例
材料和方法
重组DNA技术
将标准方法用于操作DNA，如在Sambrook，J.，等，分子克隆：实验室手册(Molecular cloning：A laboratory manual)；冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)，冷泉港，纽约，1989中所述。根据生产商的说明书使用分子生物学试剂。
DNA和蛋白质序列分析和序列数据处理
在Kabat，E.A.，等，(1991)，免疫目的的蛋白序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，第5版，NIH出版号91-3242中提供关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息。根据EU编号(Edelman，G.M.，等，PNAS 63(1969)78-85；Kabat，E.A.，等，(1991)，免疫目的的蛋白序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)，第5版，NIH出版号91-3242)对抗体链的氨基酸进行编号。使用GCG′s(GeneticsComputer Group，Madison，Wisconsin)软件包10.2版本和Infomax′s Vector NTI Advancesuite版本8.0来用于序列产生、作图、分析、注释和举例说明。
DNA测序
DNA序列通过在sequiServe(Vaterstetten，德国)和Geneart AG(Regensburg，德国)进行的双链测序来确定。
基因合成
需要的基因区段由GeneartAG(Regensburg，德国)从合成的寡核苷酸和PCR产物通过自动的基因合成进行制备。将侧邻单一限制性核酸内切酶切割位点的基因区段克隆到pGA18(ampR)质粒中。将质粒DNA从转化的细菌进行纯化，并且浓度通过UV光谱法进行测定。通过DNA测序证实亚克隆的基因片段的DNA序列。用5’-BamHI和3’-XbaI限制性酶切位点合成编码“凸起-进入-孔洞”Her3(克隆29)抗体重链(其在CH3结构域中携带T366W突变，具有通过(G4S)n肽连接体连接的C-端5D5VH区域)和“凸起-进入-孔洞”Her3(克隆29)抗体重链(携带T366S，L368A和Y407V突变，具有通过(G4S)n肽连接体连接的C-端5D5VL区域)的基因区段。以类似的方式，通过用侧邻的BamHI和XbaI限制性酶切位点进行基因合成来制备编码“凸起-进入-孔洞”Her3(克隆29)抗体重链(在CH3结构域中携带S354C和T366W突变，具有通过(G4S)n肽连接体连接的C-端5D5 VH区域)以及“凸起-进入-孔洞”Her3(克隆29)抗体重链(携带Y349C，T366S，L368A和Y407V突变，具有通过(G4S)n肽连接体连接的C-端5D5VL区域)的DNA序列。最后，用侧邻的BamHI和XbaI限制性酶切位点合成编码Her3(克隆29)和5D5抗体的未修饰的重链和轻链的DNA序列。设计所有的构建体具有编码前导肽(MGWSCIILFLVATATGVHS)的5’-末端DNA序列，所述前导肽靶向蛋白用于在真核细胞中分泌。
表达质粒的构建
将Roche表达载体用于构建编码所有的重链(heavy)VH/或VL融合蛋白和轻链蛋白的表达质粒。所述载体由下述元件构成：
-作为选择性标记的潮霉素抗性基因，
-EB病毒(Epstein-Barr virus，(EBV))的复制起点，oriP，
-载体pUC18的复制起点，其允许该质粒在大肠杆菌(E.coli)中复制
-β-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性，
-来自人巨细胞病毒(HCMV)的立即早期增强子和启动子，
-人1-免疫球蛋白多腺苷酸化(“poly A”)信号序列，和
-独特的BamHI和XbaI限制性酶切位点。
CSP＝erl.；PCT wird am 30.03.10 per Fahrer beim EPAeingereicht-->Terminmw
如所描述的，通过基因合成制备免疫球蛋白融合基因，其包含重链或轻链构建体以及具有C端VH和VL结构域的“凸起-进入-孔洞”构建体，将该融合基因克隆进入pGA18(ampR)质粒。将带有合成的DNA区段和Roche表达载体的pG18(ampR)质粒用BamHI和XbaI限制性酶(Roche Molecular Biochemicals)消化并进行琼脂糖凝胶电泳。然后将纯化的重链和轻链编码DNA区段连接到分离的Roche表达载体BamHI/XbaI片段，产生最终表达载体。将最终表达载体转化到大肠杆菌细胞中，分离表达质粒DNA(Miniprep)并进行限制性酶分析和DNA测序。将正确的克隆在150ml LB-Amp培养基中培养，再次分离质粒DNA(Maxiprep)并通过DNA测序确认序列完整性。
在HEK293细胞中的免疫球蛋白变体的瞬时表达
根据生产商的说明书，使用FreeStyleTM 293表达系统(Invitrogen，USA)通过人胚肾293-F细胞的瞬时转染来表达重组免疫球蛋白变体。简言之，将混悬液FreeStyleTM 293-F细胞在FreeStyleTM 293表达培养基中，在37℃/8％CO2进行培养，并在转染当天将细胞以1-2x106活细胞/ml的密度接种在新鲜的培养基中。使用325μl的293fectinTM(Invitrogen，德国)和250μg 1∶1摩尔比率的重链和轻链质粒DNA在Opti-MEMI培养基(Invitrogen，USA)中制备DNA-293fectinTM复合物，最终转染体积为250ml。使用325μl的293fectinTM(Invitrogen，德国)和250μg 1∶1∶2摩尔比率的“凸起-进入-孔洞”重链1和2和轻链质粒DNA在Opti-MEMI培养基(Invitrogen，USA)中制备“凸起-进入-孔洞”DNA-293fectin复合物，最终转染体积为250ml。在转染后7天，通过在14000g离心30分钟并通过无菌滤器(0.22μm)过滤收集包含抗体的细胞培养物上清液。将上清液贮存在-20℃直到纯化。
纯化三价双特异性和对照抗体
通过使用蛋白A-琼脂糖TM(Protein A-SepharoseTM)(GE保健(GE Healthcare)，Sweden)的亲和层析法和Superdex200大小排阻层析法，将三价双特异性抗体和对照抗体从细胞培养物上清液中纯化出来。简言之，将无菌过滤的细胞培养物上清液施加到HiTrapProteinA HP(5ml)柱上，所述柱用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4，1mM KH2PO4，137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7.4)平衡。将未结合的蛋白用平衡缓冲液洗出。将抗体和抗体变体用0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH 2.8洗脱，并将包含蛋白的级分用0.1ml 1M Tris，pH 8.5中和。接着，合并洗脱的蛋白级分，用Amicon超离心滤器装置(MWCO：30K，Millipore)将其浓缩到3ml的体积，并负载到用20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0平衡的Superdex200 HiLoad 120ml 16/60凝胶过滤柱(GE保健(GE Healthcare)，Sweden)上。将具有低于5％的高分子量团聚体的包含纯化的双特异性抗体和对照抗体的级分合并并以1.0mg/ml的等分试样贮存在-80℃。通过对纯化的5D5单克隆抗体进行木瓜蛋白酶消化并随后通过蛋白A层析法去除污染的Fc结构域来产生Fab片段。在用20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0平衡的Superdex200HiLoad120ml 16/60凝胶过滤柱(GE保健(GE Healthcare)，Sweden)上进一步纯化未结合的Fab片段，将其合并并以1.0mg/ml的等分试样贮存在-80℃。
纯化的蛋白的分析
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm的光密度(OD)确定纯化的蛋白样品的蛋白浓度。通过在存在和不存在还原剂(5mM 1，4-二硫苏糖醇)进行SDS-PAGE，并用考马斯亮蓝进行染色来分析双特异性抗体和对照抗体的纯度和分子量。根据生产商的说明书使用NuPAGEPre-Cast凝胶系统(Invitrogen，USA)(4-20％Tris-甘氨酸凝胶)。在25℃，使用在200mM KH2PO4，250mM KCl，pH 7.0运行缓冲液中的Superdex 200分析大小排阻柱(GE保健(GE Healthcare)，Sweden)，通过高效SEC分析双特异性抗体和对照抗体样品的团聚体含量。将25μg蛋白以0.5ml/min的流速注射到柱上，并在50分钟内等度洗脱。对于稳定性分析，将1mg/ml浓度的纯化蛋白在4℃和40℃温育7天，接着通过高效SEC评估。在通过用肽-N-糖苷酶F(罗氏分子生物化学(Roche Molecular Biochemicals))酶促处理去除N-聚糖之后，通过NanoElectrospray Q-TOF质谱来证实还原的双特异性抗体轻链和重链的氨基酸主链的完整性。
c-Met磷酸化测定法
在HGF刺激前一天，将5x105A549细胞接种在6孔板的每孔中的含有0.5％FCS(胎牛血清)的RPMI中。次日，用包含0.2％BSA(牛血清白蛋白)的RPMI替换生长培养基一小时。接着，将5μg/mL的双特异性抗体加入培养基中，并将细胞温育10分钟，之后以50ng/mL的终浓度加入HGF再历时10分钟。将细胞用包含1mM钒酸钠的冰冷PBS洗涤1次，之后将它们置于冰上并在细胞培养板中用100μL裂解缓冲液(50mMTris-Cl pH7.5，150mM NaCl，1％NP40，0.5％DOC，牛胰蛋白酶抑制剂，0.5mM PMSF，1mM钒酸钠)裂解。将细胞裂解物转移到eppendorf管中，并使裂解在冰上进行30分钟。使用BCA方法(Pierce)确定蛋白浓度。在4-12％的Bis-Tris NuPage凝胶(Invitrogen)上分离30-50μg的裂解物，并将凝胶上的蛋白转移到硝化纤维素膜上。将膜用包含5％BSA的TBS-T封闭1小时，并用针对Y1230，1234，1235的磷酸-特异性的c-Met抗体(44-888，Biosource)根据生产商的说明书进行显影。用结合于未磷酸化的c-Met的抗体(AF276，R&D)再次探测免疫印迹。
Her3(ErbB3)磷酸化测定法
将2x105MCF7细胞接种在12-孔板每孔中的完全生长培养基(RPMI1640，10％FCS)中。将细胞在2天内培养到90％汇合。接着，将培养基用包含0.5％FCS的饥饿培养基替换。次日，在加入500ng/mL调蛋白(R&D)之前1小时，以指定的浓度补充各种抗体。在加入调蛋白之后，将细胞再培养10分钟，之后收集细胞并进行裂解。使用BCA方法(Pierce)确定蛋白浓度。将30-50μg的裂解物在4-12％的Bis-Tris NuPage凝胶(Invitrogen)上分离，并将凝胶上的蛋白转移到硝化纤维素膜上。将膜用包含5％BSA的TBS-T封闭1小时，并用特异性识别Tyr1289的磷酸-特异性Her3/ErbB3抗体(4791，Cell Signaling)进行显影。
分散测定法(Scatter Assay)
将A549(4000细胞/孔)或A431(8000细胞/孔)在化合物处理的前一天以200μL的总体积接种在96-孔E-板(Roche，05232368001)的含有0.5％FCS的RPMI中。用实时细胞分析仪器(Real Time Cell Analyzer machine)来过夜监测粘附和细胞生长，其中每15分钟进行监测阻抗的扫描(sweep)。次日，将细胞与PBS中的5μL各种抗体稀释物进行预先温育，每5分钟进行扫描。30分钟后，加入产生20ng/mL的终浓度的2.5μL HGF溶液，并使实验再进行72小时。监测即时变化，其中每分钟进行扫描，历时180分钟，随后在余下的时间每15分钟进行扫描。
FACS
a)结合测定法
将A431脱附并计数。将1.5x105细胞接种在锥形96孔板的每孔中。离心细胞(1500rpm，4℃，5min)，并将其在50μL稀释系列的处于PBS(含有2％FCS(胎牛血清))中的各种双特异性抗体中在冰上温育30分钟。再次离心细胞，并将其用包含2％FCS的200μL PBS洗涤1次，随后用稀释在包含2％FCS的PBS中针对人Fc的藻红蛋白-偶联的抗体(JacksonImmunoresearch，109116098)进行30分钟的第二次温育。将细胞用200μL包含2％FCS的PBS离心洗涤2次，再次在BD CellFix溶液(BD Biosciences)中悬浮，并在冰上温育至少10分钟。通过流式细胞术(FACS Canto，BD)确定细胞的平均荧光强度(mfi)。以至少一式两份的两次独立染色确定Mfi。使用FlowJo软件(TreeStar)进一步处理流式细胞术光谱。使用XLFit4.0(IDBS)和剂量反应单位点模型(dose response one site model)205确定半最大结合。
b)内化测定法
将细胞脱附并计数。将5x105个细胞置于eppendorf管中的50μL完全培养基中，并用5μg/mL的各种双特异性抗体在37℃温育。在指定的时间点后，将细胞贮存在冰上，直到结束时程。随后，将细胞转移到FACS管中，离心(1500rpm，4℃，5min)，用PBS+2％FCS洗涤，并在50μL针对人Fc的藻红蛋白-偶联的二次抗体(Jackson Immunoresearch，109116098)中温育30分钟，所述二次抗体在PBS(包含2％FCS)中稀释。再次离心细胞，用PBS+2％FCS洗涤，并通过流式细胞术(FACS Canto，BD)确定荧光强度。
c)交联实验
将HT29细胞脱附，计数，并分成两个细胞群，将所述细胞群根据生产商的说明书分别用PKH26和PKH67(Sigma)染色。在每个染色群中，取5x105个细胞，将其合并并用10μg/mL的在完全培养基中的各种双特异性抗体进行温育30和60分钟。在指定的时间点后，将细胞贮存在冰上，直到结束时程。将细胞离心(1500rpm，4℃，5min)，用PBS+2％FCS洗涤，并通过流式细胞术(FACS Canto，BD)确定荧光强度。
细胞滴度发光测定法(Cell Titer Glow Assay)
使用细胞滴度发光测定法(Promega)量化细胞存活力和增殖。根据生产商的说明书进行测定法。简言之，在合乎需要的时间阶段，将细胞以100μL的总体积培养在96-孔板中。对于增殖测定法，将细胞从温箱中移去，并将其在室温放置30分钟。加入100μL的细胞滴度发光试剂，并将多孔板置于轨道摇动器上达2分钟。在15分钟后，在微量培养板阅读器(Tecan)上对发光进行量化。
Wst-1测定法
进行Wst-1存活力和细胞增殖测定法作为终点分析，检测代谢活性细胞的数量。简言之，将20μL的Wst-1试剂(Roche，11644807001)加入200μL的培养基中。将96孔板再温育30分钟到1小时，直到染料浓烈显影。在微量培养板阅读器(Tecan)上，在450nm的波长量化染色强度。
设计被表达和纯化的三价、双特异性<ErbB3-c-Met>抗体
在表1中：根据上述一般方法来表达和纯化基于全长ErbB-3抗体(HER3克隆29)和C-met抗体(c-Met 5D5)的VH和VL结构域的三价、双特异性<ErbB3-c-Met>抗体，其具有在表1中显示的各种特征。HER3克隆29和c-Met 5D5的相应VH和VL在序列表中进行提供。
表1：表达和纯化具有表1中的VHVL-Ab-命名的三价、双特异性抗体<ErbB3-c-Met>(还见下面的实施例和图3c中)
实施例1(图5)：
双特异性抗体与癌细胞的细胞表面的结合
在基于流式细胞术的测定法中，在A431癌细胞上分析双特异性抗体与它们各自在细胞表面上的受体的结合性质。将细胞用单特异性或双特异性的初次抗体温育，并且用与荧光团偶联的二次抗体检测这些抗体与它们的相关受体的结合，所述荧光团特异性结合于初次抗体的Fc。将初次抗体的稀释系列物的平均荧光强度针对抗体的浓度作图从而获得S形结合曲线。通过仅用二价5D5和Her3克隆29抗体进行温育来验证c-Met和Her3的细胞表面表达。Her3/c-Met_KHSS抗体容易地结合于A431的细胞表面。在这些实验设定下，抗体可以仅通过其Her3部分结合，并且因此平均荧光强度未超过单独的Her3克隆29的染色。
实施例2(图6)：
由双特异性Her3/c-Met抗体形式抑制HGF-诱导的c-Met受体磷酸化
为了证实c-Met部分在双特异性抗体中的功能性，进行了c-Met磷酸化测定法。在该实验中，在暴露于HGF之前，将A549肺癌细胞或HT29结肠直肠癌细胞用双特异性抗体或对照抗体处理。接着，裂解细胞，并检查c-Met受体的磷酸化作用。如可以通过在免疫印迹中出现磷酸-c-Met特异性条带所观察到的，可以用HGF刺激两种细胞系。
实施例3(图6)：
由双特异性Her3/c-Met抗体形式抑制HRG-诱导的Her3受体磷酸化
为了证实Her3部分在双特异性抗体中的功能性，进行了Her3磷酸化测定法。在该实验中，在暴露于HRG(调蛋白)之前，将MCF7细胞用双特异性抗体或对照抗体处理。接着，裂解细胞，并检查Her3受体的磷酸化作用。Her3/c-Met_KHSS抑制Her3受体磷酸化作用的程度与母体Her3克隆29的程度相同，说明抗体的Her3结合和功能性并没有被三价抗体形式所损害。
实施例4(图8)：
双特异性Her3/c-Met抗体形式对HGF-诱导的HUVEC增殖的抑制
进行HUVEC增殖测定以证实HGF的促有丝分裂作用。向HUVEC加入HGF导致增殖的2倍增加。加入浓度范围与双特异性抗体相同的人IgG对照抗体对细胞增殖没有影响，而5D5Fab片段抑制HGF-诱导的增殖。Her3/c-Met_KHSS的滴定证实抗体较弱的抑制作用(图8)。这种作用对于Her3/Met-6C抗体更为显著，说明更长的连接体提高抗体的功效。这证实了c-Met成分在三价抗体形式中的功能性。
实施例5(图9)：
双特异性Her3/c-Met抗体形式抑制癌细胞系A431的增殖
如果将A431接种在血清减少的培养基中，加入HGF除了诱导分散(scattering)外，还诱导较弱的促有丝分裂作用。应用这个来分析Her3/c-Met_KHSS对HGF处理的A431增殖的影响。事实上，所述双特异性抗体可以大大抑制HGF-诱导的增殖增加(15％)。对照人IgG1抗体对HGF促进的A431细胞生长没有影响。
实施例6(图10)：
分析双特异性Her3/c-Met抗体形式对在癌细胞系A431中HGF-诱导的细胞-细胞播散(分散)的抑制
HGF-诱导的分散包括细胞的形态变化，导致细胞成为圆形，伪足状的突起，纺锤状的结构和细胞一定程度的活动性。实时细胞分析仪(Roche)良好地测量了给定细胞培养物孔的阻抗，并且因此能够间接监测细胞形态和增殖的变化。将HGF加入A431和A549细胞，导致阻抗的变化，将其作为时间的函数进行监测。Her3/c-Met_KHSS和Her3/Met-6C抑制HGF-诱导的分散，其中Her3/Met-6C更为有效(20.7％和43.7％分散抑制)(图10)。

Claims (11)

1.三价、双特异性抗体，所述抗体由以下组成：
a)全长抗体，所述全长抗体特异性结合于第一抗原并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成；
b)多肽，所述多肽由下述组成：
ba)抗体重链可变结构域(VH)；或
bb)抗体重链可变结构域(VH)和抗体恒定结构域1(CH1)，
其中所述多肽的VH结构域的N-端通过肽连接体融合于所述全长抗体的两条重链的一条的C-端；
c)多肽，所述多肽由下述组成：
ca)抗体轻链可变结构域(VL)，或
cb)抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)，
其中所述多肽的VL结构域的N-端通过肽连接体融合于所述全长抗体的两条重链的另一条的C-端；
并且其中在b)中的多肽的抗体重链可变结构域(VH)和在c)中的多肽的抗体轻链可变结构域(VL)在一起形成特异性结合于第二抗原的抗原结合位点，
其中在b)和c)中的肽连接体是长度在25到50个氨基酸之间的相同的肽，其中在b)和c)中的所述肽连接体是相同的肽，其中所述肽连接体是
(GxS)n或(GxS)nGm，其中G是甘氨酸，S是丝氨酸，并且x＝3，n＝6，7或8，和m＝0，1，2或3，或x＝4，n＝3，4，5，6，或7，和m＝0，1，2或3，
其中所述全长抗体是人IgG亚类，
一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域的每个在包括抗体CH3结构域之间的初始界面的界面处连接；
其中所述界面被改变以促进二价、双特异性抗体的形成，其中所述改变特征在于：
i)所述一条重链的CH3结构域被改变，
从而使得在所述二价、双特异性抗体中，在与所述另一条重链的CH3结构域的初始界面连接的所述一条重链的CH3结构域的初始界面中，
氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替代，由此在所述一条重链的CH3结构域的界面中产生突起，所述突起可定位在所述另一条重链的CH3结构域的界面中的腔中，
并且
ii)所述另一条重链的CH3结构域被改变，
从而在所述三价、双特异性抗体中，在与第一CH3结构域的初始界面连接的第二CH3结构域的初始界面中，
氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替代，由此在所述第二CH3结构域的界面中产生腔，在所述第一CH3结构域的界面中的突起可定位于所述腔中
其中所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸组成的组，
其中所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸和缬氨酸组成的组。
2.根据权利要求1所述的三价、双特异性抗体，其特征在于：
在i)中的CH3结构域存在T366W突变，和
在ii)中的CH3结构域存在T366S，L368A，Y407V突变。
3.根据权利要求2的三价、双特异性抗体，其特征在于：
两个CH3结构域进一步通过引入半胱氨酸(C)作为每个CH3结构域的相应位置的氨基酸从而能够在两个CH3结构域之间形成二硫化物桥而被改变，其特征在于
在i)中的CH3结构域存在Y349C，T366W突变；和
在ii)中的CH3结构域存在S354C，T366S，L368A，Y407V突变。
4.根据权利要求1-3中任一项的三价、双特异性抗体，其特征在于：
在b)中的多肽的抗体重链可变结构域(VH)和在c)中的多肽的抗体轻链可变结构域(VL)通过在下述位置之间引入二硫键而通过链间二硫化物桥连接并且稳定：
i)重链可变结构域位置44到轻链可变结构域位置100，
ii)重链可变结构域位置105到轻链可变结构域位置43，或
iii)重链可变结构域位置101到轻链可变结构域位置100。
5.根据权利要求4所述的三价、双特异性抗体，其特征在于
在b)中的多肽的抗体重链可变结构域(VH)和在c)中的多肽的抗体轻链可变结构域(VL)通过在下述位置之间引入二硫键而通过链间二硫化物桥连接并且稳定：
i)重链可变结构域位置44到轻链可变结构域位置100。
6.药物组合物，其包含根据权利要求1-5的三价、双特异性抗体。
7.核酸，其编码根据权利要求1-5的三价、双特异性抗体。
8.根据权利要求1-3的三价、双特异性抗体，其用于治疗癌症。
9.根据权利要求4的三价、双特异性抗体，其用于治疗癌症。
10.根据权利要求5的三价、双特异性抗体，其用于治疗癌症。
11.根据权利要求1-5的三价、双特异性抗体用于制备治疗癌症的药物的应用。
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