JP2021508471A - 抗vegf抗体のvegf受容体遮断選択性を改善する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書で別段の定義がない限り、本発明に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって通常理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈で特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本開示の方法及び技術は、一般的に、当技術分野で周知の従来の方法に従って実行される。一般的に、本明細書に記載されている生化学、酵素学、分子生物学、細胞生物学、微生物学、遺伝学、タンパク質及び核酸化学並びにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法は、当技術分野で周知であり、通常使用されているものである。
本発明は、VH及びVLドメインの同族ペアによって形成される抗原結合部位を含む、VEGFに結合する抗体のVEGFR遮断選択性を改善する方法に関し、ここで、抗体は、VEGF分子のVEGF−R1結合領域及びVEGF−R2結合領域と重複するVEGFのエピトープに結合する。本発明の方法は、(a)VEGFに結合する抗体の第1及び第2の抗原結合部位によって結合されたVEGF二量体の複合体(VEGF二量体抗体複合体)の三次構造の分析を提供することと、(b)抗体のVHドメイン又はVLドメインに位置する少なくとも1つのアミノ酸残基を同定することであって、第1の抗原結合部位内のアミノ酸残基及び第2の抗原結合部位内のアミノ酸残基が、VEGF二量体抗原複合体において空間的に近接して配置されている、同定することと、(c)工程(b)で同定された少なくとも1つのアミノ酸残基を、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸で置換することとを含む。本発明の方法を用いて、VEGF−R1へのVEGF結合よりもVEGF−R2へのVEGF結合を優先的に阻害する(VEGFR遮断選択性)抗体が提供される。
ヒト抗VEGF抗体(抗体VEGF−0089)の生成
VEGF−R1ドメイン2並びにVEGF−R3ドメイン2及び3と複合したヒトVEGF二量体の結晶構造のオーバーレイが図1に示されている。この重ね合わせは、両方のVEGF受容体がVEGF二量体の非常に類似した領域に結合すること、したがって、VEGF−R1とVEGF−R2の両方の受容体へのVEGF結合を同じように阻害しないVEGFに結合する抗体を生成することが非常に難しいように見えることを示している。これと一致して、当技術分野で既知の複数の抗VEGF抗体のうち、VEGF−R1へのVEGF結合ではなくVEGF−R2へのVEGF結合を選択的に遮断する抗体はわずかしか報告されていない。
簡単に言うと、12〜16週齢のウサギ(n=3)を、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)(自社製)に結合した組換えヒトVEGF−121タンパク質で免疫した。すべての動物を、完全フロイントアジュバント(CFA)で乳化されたタンパク質400μgで皮内投与により0日目に免疫し、続いて1、2、6、11、14週目にタンパク質エマルジョン200μgによる交互の筋肉内注射及び皮下注射で免疫した。採血は、4回目の免疫化から免疫処置後4日目、5日目、及び6日目に行った。ELISAによる免疫原特異的ウサギ及びヒト特異的免疫グロブリン力価測定のために血清を調製し、末梢単核細胞を分離してB細胞クローニングプロセスで抗原特異的B細胞の供給源として使用した。
ウサギ末梢血単核細胞(PBMC)の分離:免疫したウサギの血液サンプルを採取した。全血を含むEDTAを1×PBS(PAA)で2倍に希釈した後、lympholyte mammal(Cedarlane Laboratories)を製造元の仕様に従って使用して密度遠心分離を行った。PBMCを1×PBSで2回洗浄した。
生成されたヒト抗VEGF抗体(抗体VEGF−0089)の特徴
抗体VEGF−0089のFab断片のVEGF結合を、下記のように表面プラズモン共鳴(SPR)によって評価した。
抗His捕捉抗体(GE Healthcare 28995056)を、標準のアミンカップリング化学を用いてシリーズSセンサチップC1(GE Healthcare 29104990)に固定化し、500〜1000共鳴単位(RU)の表面密度を得た。ランニング及び希釈緩衝液として、HBS−P+(HEPES 10mM、NaCl 150mM、pH7.4、0.05%Surfactant P20)を使用し、測定温度をそれぞれ25℃及び37℃に設定した。hVEGF−A121は表面に捕捉され、5〜35RUの範囲の捕捉レベルが得られた。抗VEGF抗体の希釈系列(0.37〜30nm)を120秒間注入し、解離を流速30μl/分で少なくとも600秒間監視した。表面は、グリシン 10mM、pH1.5を60秒間注入することにより再生された。バルク屈折率の差は、ブランク注入を差し引くことにより、及び捕捉されたhVEGF−A121なしの対照フローセルから得られた応答を差し引くことにより修正した。速度定数は、Biacore Evaluationソフトウェア内のLangmuir 1:1結合モデルを使用して計算した。
384ウェルのストレプトアビジンプレート(Nunc/Microcoat#11974998001)を、ビオチン化VEGF−R1 0.25μg/ml又はビオチン化VEGF−R2 0.5μg/ml(社内生産、DPBS(1×)中各25μl/ウェル)(PAN、#P04−36500))でコーティングした。プレートを室温で1時間インキュベートした。並行して、濃度0.7nmのVEGF−121−His(自社生産)をさまざまな希釈(500nmの濃度から始めて12×1:2希釈段階)で抗体とインキュベートした。このプレインキュベーション工程は、384ウェルPPプレート(Weidmann Medical Technology、#23490−101)で1×OSEP緩衝液(ビデスト水、10×、Roche、#11 666 789 001+0.5%ウシ血清アルブミン画分V、無脂肪酸、Roche、#10 735 086 001+0.05%Tween 20)中で行った。プレートを室温で1時間インキュベートした。VEGF−R1/VEGF−R2でコーティングしたストレプトアビジンプレートをPBST緩衝液 90μl/ウェル(ビデスト水、10×PBS Roche#11666789001+0.1%Tween 20)で3回洗浄した後、VEGF抗体プレインキュベーションプレートからのサンプル25μlを、コーティングしたストレプトアビジンプレートに移し、その後室温で1時間インキュベートした。PBST緩衝液 90μl/ウェルで3回洗浄した後、1×OSEP中の検出抗体 25μl/ウェル(抗His POD、Bethyl、#A190−114P、1:12000)に加えた。室温で1時間インキュベートした後、プレートをPBST緩衝液 90μlで3回洗浄した。TMB 25μl(Roche、#11 835 033 001)をすべてのウェルに同時に加えた。室温で10分間インキュベートした後、Tecan Safire 2リーダーの370nm/492nmで信号が検出された。
VEGF二量体と複合した抗体VEGF−0089のX線結晶学及びエピトープ決定
上記のようなVEGF−0089 Fab断片の結晶構造を、当該分野で既知の標準的な方法に従って分析した。
二量体複合体VEGF−A121−VEGF−0089 Fabの複合体形成及び精製複合体形成のために、VEGF−0089 Fab断片とヒトVEGF−A121(Peprotech)を1.1:1のモル比で混合した。4℃で一晩16時間インキュベートした後、MES 20mM、NaCl 150mM、pH6.5のSuperdex200(16/600)カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーにより複合体を精製した。二量体複合体を含有する画分をプールし、1.44mg/mlに濃縮した。
−VEGF二量体アミノ酸F17、M18、D19、Y21、Q22、R23、Y25、H27、P28、I29、E30、M55、N62、L66、N100、K101、C102、E103、C104、R105及びP106内の個々のVEGF−A121分子の一方、並びに
−VEGF二量体アミノ酸E30、K48、M81及びQ87内の個々のVEGF−A121分子のもう一方
でVEGF−A121二量体上のエピトープに結合する。
VEGF−0089の改良型変異体の提供
実施例3に記載の理論に基づいて、2つの抗体分子ではなく優先的に1つの抗体分子のみがVEGF二量体に同時に結合できることを促進するために、VEGF−0089抗体を改変した。図3に示すVEGF二量体抗体複合体の三次構造から、抗体のVHドメイン内の2つの領域、すなわちH−CDR2とH−FR3が、互いに空間的に近接していることがわかる。VEGF二量体への2つの抗体分子の同時結合を回避するために、この領域のより小さな側鎖体積を有するアミノ酸を置換するためにより大きなアミノ酸を使用するアミノ酸置換によって、これらの領域を改変した。実施例では、芳香族アミノ酸を使用して、元のVEGF−0089アミノ酸配列に含まれるアミノ酸を置換した。理論は、この場合2つの抗体分子のVEGF二量体への結合が立体的に妨げられ、VEGF−R1へのVEGF結合ではなく、VEGF−R2へのVEGF結合の観察される優先的阻害がさらに顕著になるというものであった。
VEGF−0089の改良型変異体のVEGFR遮断選択性
改良された抗体Fab断片の存在下でのVEGF−R1及びVEGF−R2へのVEGFの結合を、実施例2に記載されるように試験した。表2に列挙されているすべての抗体Fab断片を試験した。結果は図7〜図10に示されている。
VEGF−0089の改良型変異体のVEGF結合親和性
抗体の親和性を、実施例2に記載されている方法と同じ方法を使用してSPRによって決定した。表2に列挙されているすべての抗体Fab断片を試験した。結果は表3に示されている。
VEGF−0089の改良型変異体の化学的安定性
改良された抗体Fab断片の化学的安定性を以下のように試験した。
抗体サンプルをHis/HisCl 20mM、NaCl 140mM、pH6.0で調合し、3つのアリコートに分け、1つのアリコートはそれぞれPBSに再緩衝し、2つのアリコートは元の調合のままにした。PBSアリコートと1つのHis/HisClアリコートを1mg/mlで40℃(His/NaCl)又は37℃(PBS)で2週間(2w)インキュベートし、PBSサンプルは合計4週間(4w)までさらにインキュベートした。3つ目の対照アリコートサンプルは−80℃で保存した。インキュベーションが終了した後、サンプルを相対的な活性濃度(Biacore;各バインダーの両方のストレスを加えたアリコートの活性濃度をストレスのない4℃のアリコートに正規化)、凝集(SEC)及び断片化(キャピラリー電気泳動又はSDS−PAGE)について分析し、未処理の対照と比較した。
Claims (15)
- VHドメインとVLドメインの同族ペアによって形成された抗原結合部位を含むVEGFに結合する抗体のVEGFR遮断選択性を改善する方法であって、前記抗体は、VEGF分子のVEGF−R1結合領域及びVEGF−R2結合領域と重複するVEGFのエピトープに結合し、前記方法が、
(a)VEGFに結合する前記抗体の第1及び第2の抗原結合部位によって結合されたVEGF二量体の複合体(VEGF二量体抗体複合体)の三次構造の分析を提供するステップと、
(b)前記抗体の前記VHドメイン又は前記VLドメインに位置する少なくとも1つのアミノ酸残基を同定するステップであって、前記第1の抗原結合部位内のアミノ酸残基及び前記第2の抗原結合部位内のアミノ酸残基が、前記VEGF二量体抗原複合体において空間的に近接して配置されている、同定するステップと、
(c)ステップb)で同定された前記少なくとも1つのアミノ酸残基を、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸で置換するステップと
を含む、方法。 - 前記抗体が、配列番号01のVH及び配列番号02のVLを特徴とする抗体と同じ又は重複するエピトープに結合する、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体が、VEGF−A121の二量体上の立体配座エピトープに結合し、VEGF−A121が、配列番号36のアミノ酸配列を含み、前記エピトープが、
− 前記VEGF二量体内の個々のVEGF−A121分子の一方にアミノ酸F17、M18、D19、Y21、Q22、R23、Y25、H27、P28、I29、E30、M55、N62、L66、N100、K101、C102、E103、C104、R105及びP106、及び
− 前記VEGF二量体内の個々のVEGF−A121分子のもう一方にアミノ酸E30、K48、M81及びQ87
を含む、請求項1又は2に記載の方法。 - より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸が、芳香族アミノ酸である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの置換されたアミノ酸残基が、前記抗体の重鎖可変ドメインに位置する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの置換されたアミノ酸残基が、前記抗体の重鎖CDR内に位置する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの置換されたアミノ酸残基が、前記抗体のH−CDR2内に位置する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記置換された少なくとも1つのアミノ酸残基が、前記抗体の重鎖FR内に位置する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記置換された少なくとも1つのアミノ酸残基が、前記抗体のH−FR3内に位置する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、(a)配列番号03のアミノ酸配列を含むCDR−H1と、(b)配列番号04のアミノ酸配列を含むCDR−H2と、(c)配列番号05のアミノ酸配列を含むCDR−H3と、(d)配列番号06のアミノ酸配列を含むCDR−L1と、(e)配列番号07のアミノ酸配列を含むCDR−L2と、(f)配列番号08のアミノ酸配列を含むCDR−L3とを含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、配列番号01を含むVHと、配列番号02を含むVLとを含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法により提供されるVEGFに結合する抗体。
- VEGFに結合する抗体であって、VEGFへの前記抗体の結合が、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法により提供されるVEGF受容体VEGF−R1へのVEGF結合を有意に阻害することなく、VEGF受容体VEGF−R2へのVEGF結合を有意に阻害する、抗体。
- 請求項1〜13の方法により提供される抗体をコードする単離された核酸。
- 請求項14に記載の核酸を含む宿主細胞。
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