JP2002543093A - Ｖｅｇｆの選択的阻害による癌処置のための組成物および方法 - Google Patents

Ｖｅｇｆの選択的阻害による癌処置のための組成物および方法

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Abstract

(57)【要約】 ２つのＶＥＧＦレセプターのうち１つ（ＶＥＧＦＲ２）へのＶＥＧＦの結合のみを特異的に阻害する抗体が開示される。これらの抗体は、脈管形成を効率的に阻害し、そしてさらにその特異性に起因して改善された安全性を有する。従って、本発明は、癌および他の脈管形成障害を処置するための、新しい抗体ベースの組成物、方法および組合せたプロトコルを提供する。有利な免疫結合体およびプロドラッグ組成物ならびにこれらの新しいＶＥＧＦ特異的抗体を使用する方法もまた、提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） 本願は、同時係属中の米国仮出願番号６０／１３１，４３２（１９９９年４月
２８日出願）に対する優先権を主張し、本願の本文および図面の全体が、棄権す
ることなく本明細書中で参考として特に援用される。米国政府は、国立保健研究
所の譲渡番号１ＲＯ１ ＣＡ７４９５１、５ＲＯ ＣＡ５４１６８およびＴ３２
ＧＭ０７０６２に従って、本発明の権利を所有する。
【０００２】 （１．発明の分野） 本発明は一般に、抗体、脈管形成および腫瘍の処置の分野に関する。より詳細
には、本発明は、２つのＶＥＧＦレセプターの一方（ＶＥＧＦＲ２）のみに結合
するＶＥＧＦを特異的に阻害する抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。このような抗体は
脈管形成を阻害し、そして腫瘍後退を誘導し、そしてさらにそれらの特異的具ロ
ッキング特性に起因して改良された安全性を有する。本発明の抗体ベースの組成
物および方法はまた、免疫結合体および他の治療的結合体、プロドラッグを含む
その結合体を含有するキットおよび方法の使用に及ぶ。
【０００３】 （２．関連技術の説明） 化学治療剤に対する腫瘍細胞耐性は、臨床腫瘍学において有意な問題を示す。
実際に、これは、この分野の特定の進歩にもかかわらず、ヒト癌のほとんどの流
行形態の多くが、効果的な化学治療に未だ耐性である主な原因の１つである。
【０００４】 別の腫瘍処置ストラテジーは、「免疫毒素」の使用であり、ここで抗腫瘍細胞
抗体は毒素を腫瘍細胞に送達するために使用される。しかし、化学治療アプロー
チと共通して、免疫毒素治療はまた、充実性腫瘍に適用した場合、重要な欠点を
被る。例えば、抗原陰性または抗原欠損細胞は残存し、腫瘍を再増殖するか、ま
たはさらなる転移を導き得る。
【０００５】 抗体ベースの治療に対する充実性腫瘍の耐性に関するさらなる理由は、腫瘍塊
が一般に、抗体および免疫毒素のような高分子薬剤に対して不浸透性であること
である（Ｂｕｒｒｏｗｓら、１９９２；Ｄｖｏｒａｋら、１９９１ａ；Ｂａｘｔ
ｅｒおよびＪａｉｎ，１９９１）。腫瘍内の物理的拡散距離および間質圧の両方
は、このタイプの治療に対する有意な制限である。従って、充実性腫瘍（これは
全てのヒト癌の９０％より多くを占める）は、抗体および免疫毒性処置に対する
さらに証明された耐性を有する。
【０００６】 さらに最近のストラテジーは、充実性腫瘍の脈管形成を標的にしている。腫瘍
細胞自体よりむしろ、腫瘍の血管を標的にすることは、耐性腫瘍細胞の発達を導
きそうになく、そして標的細胞が容易に受容可能であるという点において特定の
利点を有する。さらに、多くの腫瘍細胞は、それらの酸素および栄養素に関して
単一の血管に頼っているため、血管の破壊は、抗腫瘍効果の増幅を導く（Ｂｕｒ
ｒｏｗｓおよびＴｈｏｒｐｅ、１９９４ａ；１９９４ｂ）。代表的な血管標的ス
トラテジーは、米国特許第５，８５５，８６６号および同第５，９６５，１３２
号に記載され、これらは特に、抗細胞性薬剤および毒素の腫瘍血管のマーカーへ
の標的送達を記載する。
【０００７】 血管標的アプローチの別の効果的なバージョンは、細胞血管内で発現または吸
着されたマーカーに対して凝固因子を標的にすることである（Ｈｕａｎｇら、１
９９７；米国特許第５，８７７，２８９、同第６，００４，５５５号、および同
第５， 、 号（米国出願番号０８／４８２，３６９（１９９８年１０
月２０日特許証発行料金支払））。毒素よりむしろ凝血薬を腫瘍血管に送達する
ことは、減少した免疫原性のさらなる利点、および毒素の副作用のさらに低い危
険性を有する。米国特許第５，８７７，２８９号に記載されるように、このよう
な腫瘍特異的「凝血薬」における使用に好ましい凝固因子は、短縮形態のヒト凝
固誘導タンパク質、組織因子（ＴＦ）、血液凝固の主なイニシエータである。
【０００８】 毒素および凝固因子の腫瘍血管への特異的送達は、腫瘍処置における有意な進
歩を示すが、特定の周辺腫瘍細胞はこのような治療によって生じる腫瘍内破壊が
に勝り得る。従って、抗脈管形成ストラテジーは、米国特許第５，８５５，８６
６号および同第５，８７７，２８９号の腫瘍破壊方法との組み合わせた用途を有
する。
【０００９】 抗脈管形成腫瘍処置ストラテジーは、一般に充実性腫瘍の周辺における、出芽
血管の増殖を阻害することに基づく。これらの治療は主に、微小転移巣の危険性
を減らすため、またはより従来的なインターベンション（例えば、手術または化
学治療）の後、充実性腫瘍のさらなる増殖を阻害するために用いられる。
【００１０】 脈管形成は、既存の血管および／または循環内皮幹細胞からの新しい血管の発
生である（Ａｓａｈａｒａら、１９９７；Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、１９９８；Ｆｏ
ｌｋｍａｎおよびＳｈｉｎｇ、１９９２）。脈管形成は、多くの生理学的プロセ
ス（例えば、胚形成、創傷治癒および月経）において重要な役割をはたす。脈管
形成はまた、特定の病理学的現象において重要である。充実性腫瘍増殖および転
移における役割に加えて、脈管形成成分を有する他の注目すべき状態は、関節炎
、乾癬、および糖尿病網膜症である（ＨａｎａｈａｎおよびＦｏｌｋｍａｎ、１
９９６；ＦｉｄｌｅｒおよびＥｌｌｉｓ、１９９４）。
【００１１】 脈管形成は、正常組織および悪性組織において、脈管形成刺激薬、および標的
組織および遠隔部位において産生される脈管形成インヒビターのバランスによっ
て調節される（Ｆｉｄｌｅｒら、１９９８；ＭｃＮａｍａｒａら、１９９８）。
血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ、血管浸透性因子、ＶＰＦとしても公知）は、
脈管形成の一次刺激薬である。ＶＥＧＦは、底酸素および腫瘍変異によって引き
起こされ、そして様々な組織によって産生され得る多機能性サイトカインである
（Ｋｅｒｂｅｌら、１９９８；Ｍａｚｕｒｅら、１９９６）。
【００１２】 病理状態における脈管形成の一次刺激薬としてのＶＥＧＦの認識は、ＶＥＧＦ
活性をブロックする様々な試みに至った。阻害性抗ＶＥＧＦレセプター抗体、可
溶性レセプター構築物、アンチセンスストラテジー、ＶＥＧＦに対するＲＮＡア
プタマー、および低分子量ＶＥＧＦレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）イン
ヒビターは、全て、ＶＥＧＦシグナル伝達を妨害する際の使用が提案されている
（Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒら、１９９８）。実際に、ＶＥＧＦに対するモノクロー
ナル抗体は、ヒト腫瘍異種移植増殖およびマウスにおける腹水形成を阻害するこ
とが示されている（Ｋｉｍら、１９９３；Ａｓａｎｏら、１９９８；Ｍｅｓｉａ
ｎｏら、１９９８；Ｌｕｏら、１９９８ａ；１９９８ｂ；Ｂｏｒｇｓｔｒｏｍら
、１９９６；１９９８）。
【００１３】 上記の研究は、充実性腫瘍増殖におけるＶＥＧＦの重要性、および腫瘍治療の
ための標的としてのその可能性を強調しているが、ＶＥＧＦ誘導脈管形成を阻害
するさらなる薬剤の同定は、治療的選択肢の数を拡大する際の利点となる。より
特異的にＶＥＧＦレセプター結合を阻害する治療剤の開発は、それらの抗腫瘍効
果が改良された特異性によって実質的に損なわれない限り、重要な進歩を示す。
【００１４】 （発明の要旨） 本発明は、新規の治療組成物、ならびに抗脈管形成および抗腫瘍処置において
使用するための方法を提供することによって、従来技術における特定の欠点を克
服する。本発明は、２つの一次ＶＥＧＦレセプターの一方（ＶＥＧＦＲ２）のみ
に結合するＶＥＧＦを特異的に阻害する抗体に基づく。このような抗体は脈管形
成を阻害し、そして他の抗ＶＥＧＦ抗体（すでに臨床試験されているものを含む
）と同じぐらい効果的に腫瘍後退を誘導し、そしてさらに、それらの特異的遮断
特性に起因する改良された安全性を有する。本発明の組成物および方法はまた、
特定の部類の提供される抗体を使用する、免疫結合体および組み合わせ（プロド
ラッグを含む）の使用まで拡大する。
【００１５】 本発明の特定の利点は、提供される抗体が、ＶＥＧＦＲ１には結合せず、ＶＥ
ＧＦＲ２のみに結合するＶＥＧＦを阻害することである。これは、ＶＥＧＦＲ２
およびＶＥＧＦＲ１の両方に結合するＶＥＧＦを阻害する従来技術の主要抗体（
Ａ４．６．１を含む）と対照する。特にマクロファージ移動および化学走性、な
らびに破骨細胞および軟骨吸収機能において、ＶＥＧＦＲ１は脈管形成と無関係
の重要な生物学的役割を有するため、ＶＥＧＦＲ２媒介性脈管形成のみを阻害す
る現在の能力は別の利点である。マクロファージが宿主抗腫瘍応答をさらに媒介
し得るという点において、および、例えば、小児癌の処置における、骨代謝が悪
影響ではないという点において、これは注目すべき臨床的利点に変わる。
【００１６】 さらなる利点は、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ１への結合は本発明の抗体の存在にお
いて維持されるため、これらがＶＥＧＦＲ１に結合したＶＥＧＦ（これは腫瘍内
皮上でアップレギュレートされる）に結合することによって、腫瘍血管へ治療薬
を特異的に送達するために使用される。従って、免疫結合体の状況において、本
発明は、抗脈管形成特性および腫瘍破壊特性の両方を同じ分子内に有する薬剤を
提供する。
【００１７】 ＶＥＧＦＲ２により媒介される、ＶＥＧＦの生存シグナルを中和するために提
供される組成物の能力において、さらなる利点が存在する。従って、本発明の裸
の結合した抗体は、他の治療薬および／または結合剤、特にそれらの破壊特性を
妨げるＶＥＧＦの能力のため、インビボで最大の有効性を達成しない方法および
薬剤との相乗的な組み合わせを形成する。
【００１８】 従って、本発明は、ＶＥＧＦＲ２レセプターに結合するＶＥＧＦを特異的にブ
ロックするか、または本質的にＶＥＧＦＲ２レセプターのみに結合するＶＥＧＦ
をブロックする抗体を提供する。このような抗体は、ＶＥＧＦＲ１レセプター（
Ｆｌｔ−１）に結合するＶＥＧＦを有意に阻害することなく、ＶＥＧＦＲ２レセ
プター（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に結合するＶＥＧＦを有意に阻害する。従って、
これらの抗体は、ＶＥＧＦＲ２レセプター（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に結合するＶ
ＥＧＦを阻害し、ＶＥＧＦＲ１レセプター（Ｆｌｔ−１）に結合するＶＥＧＦを
実質的に阻害せず、インビボで抗脈管形成効果および抗腫瘍効果を示し、そして
マクロファージ走化性、破骨細胞または軟骨吸収細胞の機能を有意に阻害しない
。
【００１９】 従って、本発明の抗体は、簡単に「ＶＥＧＲＦ２−遮断、非ＶＥＧＦＲ１−遮
断、抗ＶＥＧＦ抗体」と呼ばれる。さらにより簡単には、これらは「ＶＥＧＦＲ
２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体」と呼ばれ、これは本発明の全ての組成物、用途および
方法に関する簡潔さのために使用される。「ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体
」は、ＶＥＧＦＲ２レセプターに結合するＶＥＧＦをブロックするＶＥＧＦに対
する抗体である。このような抗体はＶＥＧＦＲ２レセプター自体に対する抗体で
はないことが明らかである。
【００２０】 本発明以前に、ＶＥＧＦＲ２レセプターに結合するＶＥＧＦを特異的にブロッ
クする抗ＶＥＧＦ抗体を生成する動機付けはなく、そのような抗体のいずれの利
点も想定されなかった。重要なことに、遮断抗体は増殖因子とそのレセプター（
単数または複数）の相互作用を物理的に妨げる必要があり、そして増殖因子上の
レセプター結合部位はサイズ制限されるため、このような特異的ＶＥＧＦＲ２遮
断抗ＶＥＧＦ抗体が開発され得るという示唆はなかった。
【００２１】 しかし、本明細書中で開示される本発明者らの驚くべき発見の観点から、この
分野はここで、このような特異的阻害抗ＶＥＧＦ抗体が調製され、そして異なる
利点を有し得るという知識を提供する。本願はさらに、候補ＶＥＧＦＲ２遮断抗
ＶＥＧＦ抗体を生成するための方法論、および候補物のプールから実際のＶＥＧ
ＦＲ２遮断特異的抗体を同定するために必要とされるアッセイの慣用技術の局面
を記載する。従って、本発明の観点において、ある範囲のＶＥＧＦＲ２遮断抗Ｖ
ＥＧＦ抗体が、ＶＥＧＦＲ１レセプターを経由するＶＥＧＦのシグナル伝達を阻
害することなく、かつ顕著な欠点およびそれに関連する副作用のない、脈管形成
の阻害、および脈管形成疾患および腫瘍の処置に関与する様々な実施形態におい
て作製および使用され得る。
【００２２】 本明細書全体にわたって使用される場合、用語「ａ」および［ａｎ」は、上限
がその後詳細に記載される場合を除いて、「少なくとも１つ」、「少なくとも第
１の」、「１つ以上の」、または「複数の」参照成分または工程を意味する意図
で使用される。従って、本明細書中で使用される場合、「抗体」とは、「少なく
とも第１の抗体」を意味する。組み合わせの実施可能な制限およびパラメーター
は、任意の単一の薬剤の量のように、本開示の観点において当業者に公知である
。
【００２３】 「ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に結合するＶＥＧ
Ｆを特異的に阻害する」抗体は、ここで、競合および／または機能性アッセイに
より同定され得る。簡潔さのために好ましいアッセイは、ＥＬＩＳＡに基づく競
合アッセイである。競合アッセイにおいて、ＶＥＧＦを可変量の試験抗体（例え
ば、１００倍〜１０００倍過剰モル）と予備混合または混和し、試験抗体がＶＥ
ＧＦＲ２に結合するＶＥＧＦを減少する能力を決定する。ＶＥＧＦは、予め標識
されそして直接検出され得るか、または（二次）抗ＶＥＧＦ抗体または二次およ
び三次抗体検出システムを使用して検出され得る。このような競合アッセイのＥ
ＬＩＳＡフォーマットが好ましいフォーマットであるが、任意のタイプの免疫競
合アッセイが実施され得る。
【００２４】 全く関係のない抗体（非遮断抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体を含む）の存在下
でＶＥＧＦＲ２に結合するＶＥＧＦは、このような競合アッセイにおけるコント
ロールの高値（１００％）である。試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下に
おける、ＶＥＧＦＲ２に結合するＶＥＧＦの有意な減少は、ＶＥＧＦレセプター
ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に結合するＶＥＧＦを有意に阻害する試験
化合物を示す。
【００２５】 有意な減少は、「再現可能な」、すなわち、一貫して観測される結合の減少で
ある。本明細書の用語における、「有意な減少」は、ＶＥＧＦに対する抗体の約
１００倍と約１０００倍過剰モルとの間の任意の量において、少なくとも約４５
％、約５０％、約５５％、約６０％、または約６５％の（ＶＥＧＦＲ２に結合す
るＶＥＧＦの）再現可能な減少として定義される。
【００２６】 本発明の好ましい特徴は、提供される抗体がＶＥＧＦＲ１に結合するＶＥＧＦ
を実質的に阻害しないことであるため、ＶＥＧＦＲ２に結合するＶＥＧＦの中程
度の有意な減少を示す抗体は、それらがＶＥＧＦＲ１に結合するＶＥＧＦを実質
的に阻害しない限りは、なお有用である。それにもかかわらず、より好ましい抗
体は、ＶＥＧＦＲ２に結合するＶＥＧＦを阻害するより有意な能力を有する抗体
である。これらの抗体は、ＶＥＧＦに対する抗体の約１００倍と１０００倍過剰
モルとの間の任意の量において、少なくとも７０％、約７５％、または約８０％
まで、ＶＥＧＦＲ２に結合するＶＥＧＦを減少する再現可能な能力を示す抗体で
ある。本発明を実施する必要はないが、少なくとも約８５％、約９０％、約９５
％またはさらに高くまでＶＥＧＦＲ２に結合するＶＥＧＦを減少する抗体は、決
して除外されない。
【００２７】 抗ＶＥＧＦ抗体、またはそれらの抗原結合フラグメント（これらは、ＶＥＧＦ
レセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）に結合するＶＥＧＦを有意に阻害するこ
となく、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／ｆｌＫ−１）に結合するＶ
ＥＧＦを阻害する）は、ＶＥＧＦＲ１を使用せず、上記のような単純な競合アッ
セイにより容易に確認される。
【００２８】 有意な減少の欠如は、「再現可能な」、すなわち、一貫して観測される「結合
の実質的な維持」である。本明細書中の用語における「結合の実質的な維持」は
、ＶＥＧＦに対する抗体の約１００倍と１０００倍過剰モルとの間の任意の量に
おいて、少なくとも６０％、約７５％、約８０％、または約８５％の（ＶＥＧＦ
Ｒ２に結合するＶＥＧＦにおける）再現可能な維持として定義される。
【００２９】 ＶＥＧＦＲ１に結合するＶＥＧＦを実質的に阻害しない抗体を使用する意図は
、ＶＥＧＦＲ１により媒介される生物学的機能を維持することである。従って、
抗体は、生物学的応答がＶＥＧＦにより誘導されるのに十分な、ＶＥＧＦＲ１に
結合するＶＥＧＦを維持することのみを必要とする。それでもなお、より好まし
い抗体は、ＶＥＧＦＲ１に結合するＶＥＧＦを維持するより有意な能力を有する
抗体である。これらの抗体は、ＶＥＧＦに対する抗体の約１００倍と約１０００
倍過剰モルとの間の任意の量において、少なくとも８８％、約９０％、約９２％
、約９５％、または約９８〜９９％のレベルで、ＶＥＧＦＲ１に結合するＶＥＧ
Ｆを維持する再現可能な能力を示す抗体である。
【００３０】 ＶＥＧＦＲ２に結合するＶＥＧＦをより実質的に阻害する抗体は、ＶＥＧＦＲ
１の結合のさらなる減少を許容し得るようであることが理解される。同様に、抗
体がＶＥＧＦＲ２に結合するＶＥＧＦの中程度の減少を有する場合、ＶＥＧＦＲ
１への結合の維持はより厳密に追求されるべきである。
【００３１】 抗体がＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に結合するＶ
ＥＧＦを阻害することを同定および／または確認するための別の好ましい結合ア
ッセイは、同時沈降アッセイである。同時沈降アッセイは、溶液中の１つ以上の
レセプターへのＶＥＧＦの結合をブロックする抗体の能力を試験する。このよう
なアッセイにおいて、ＶＥＧＦまたは検出可能に標識されたＶＥＧＦは、適切な
形態のレセプターと共にインキュベートされる。
【００３２】 免疫沈降アッセイまたは同時沈降アッセイを実施するための多くの様式がある
。本発明の場合において、「適切な形態のレセプター」は、問題のＶＥＧＦＲ２
レセプター、またはそのレセプターの細胞外ドメインであり得る。次いで免疫沈
降は、標準試薬と同様に、ＶＥＧＦＲ２レセプターに対する抗体、またはＶＥＧ
Ｆが結合する部位とは異なるレセプターの細胞外ドメインの存在を必要とする。
本発明は、他の「適切な」形態のＶＥＧＦレセプター、すなわち、Ｆｃ抗体部分
に結合したレセプターの細胞外ドメインを提供する。このようなレセプター／Ｆ
ｃ構築物は、タンパク質Ａベースの組成物のような有用な免疫沈降組成物と共に
インキュベートすることによって沈降され得る。
【００３３】 適切なレセプターに関係なく、好ましくは、免疫沈降アッセイまたは同時沈降
アッセイが、コントロールを用いて実施される。ＶＥＧＦのみが選択したレセプ
ターに結合する能力は、抗ＶＥＧＦ抗体の非存在下での沈降により確認されるべ
きである。好ましくは、並行インキュベーションが、コントロールとして作用す
る公知の結合特性を有する抗体の存在下または非存在下で行われる。最も好まし
くは、遮断コントロールおよび非遮断コントロール抗体の両方を使用するアッセ
イが、並行して行われる。
【００３４】 次いで、任意の結合免疫学的種は、例えば、効果的な免疫沈降組成物（例えば
、プロテインＡ組成物またはプロテインＡセファロースビーズ）とのインキュベ
ートによって免疫沈降される。次いで、この沈降物は、ＶＥＧＦの存在について
試験される。最初のインキュベーションにおけるＶＥＧＦが、検出可能に標識さ
れたＶＥＧＦ（例えば、放射能標識したＶＥＧＦ）であった場合、免疫沈降物に
おけるＶＥＧＦは、直接検出され得る。免疫沈降物における任意の未標識ＶＥＧ
Ｆは、その他の適切な手段によって（例えば、ゲル分離および抗ＶＥＧＦ抗体で
の免疫検出によって）検出され得る。
【００３５】 抗体のＶＥＧＦレセプター（例えば、ＶＥＧＦＲ２）に結合するＶＥＧＦを遮
断する能力は、共沈殿アッセイのようなアッセイにおいて容易に定量化され得る
が、定量の結果はまた有益である。定量化は、標識化ＶＥＧＦの直接測定によっ
て（すなわち、例えば、免疫検出されたＶＥＧＦのデンシトメトリー分析によっ
て）達成され得る。従って、再現可能な（すなわち、一貫して観察される）ＶＥ
ＧＦＲ２に結合するＶＥＧＦを阻害する能力を示す抗体は、検出され得、そして
有用な抗体は、上記で概要された定量基準に従って選択され得る。
【００３６】 ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）に結合するＶＥＧＦを有意に
阻害しない、抗ＶＥＧＦ抗体はまた、ＶＥＧＦＲ２ではなくてＶＥＧＦＲ１を用
いて上記のような共沈殿アッセイを行うことによって容易に同定され得る。従っ
て、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）に結合するＶＥＧＦを有意
に阻害しないが、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に結
合するＶＥＧＦを阻害する、抗ＶＥＧＦ抗体はまた、このような方法を用いて容
易に同定され得る。
【００３７】 本願はまた、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に結合
するＶＥＧＦを有意に阻害する抗体を、同定および／または確認するために種々
の機能的アッセイを提供する。これらは、一般的には、特定の規定された生物学
的応答を担うレセプターとしてのＶＥＧＦＲ２の同定に関する。上記の競合型ア
ッセイよりも好ましくないが、このアッセイは、無細胞系においておこなわれ、
かつ最も再現性、確実性、省力性、および経済的であり、以下のアッセイは、そ
れでもなお、本発明の文脈において有用である。
【００３８】 例えば、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ媒介性内皮細胞増殖を
阻害する（ＶＥＧＦのマイトジェン活性を阻害する）能力について試験すること
によって同定され得る。任意の適切なアッセイは、試験抗体を有するかまたは有
しないＶＥＧＦの存在下で種々の内皮細胞のいずれかを用いて使用され得る。好
ましくは、２連アッセイは、平行して行われる（例えば、ＶＥＧＦを有しないア
ッセイおよび規定された特徴（遮断および遮断しないの両方）のコントロール抗
体を有するアッセイ）。内皮細胞増殖は決定され、そして好ましくは比色アッセ
イを含む、細胞数を決定する任意の容認可能な手段によって正確に定量される。
【００３９】 ＶＥＧＦ媒介性内皮細胞増殖を阻害する能力を有する抗体は、約２５％、３０
％、３５％、４０％、４５％または５０％あるいはその程度のＶＥＧＦ媒介性内
皮細胞増殖の一貫して観察された阻害を一般的に示す。このような範囲における
阻害は、インビボでの新脈管形成を阻害するのに十分な特徴を有する抗体を示す
。より有意な阻害活性を有する抗体は、本発明から除外されない。
【００４０】 本発明に従って抗体を同定するためのさらなる機能的アッセイは、ＶＥＧＦ誘
導性リン酸化のブロックを試験するためにアッセイされる。任意の適切なアッセ
イは、ネイティブかまたは組換えのリン酸化可能ＶＥＧＦＲ２のいずれかの形態
を発現する、種々の内皮細胞のいずれかを用いて使用され得る。細胞は、適切な
時間で試験されるべき抗体の存在または非存在下でＶＥＧＦとインキュベートさ
れる。好ましくは、２連アッセイは、平行して行われる（例えば、ＶＥＧＦを有
しないアッセイおよび規定される特徴（遮断および遮断しないの両方）のコント
ロール抗体を有するアッセイ）。
【００４１】 ＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦ誘導性リン酸化は、決定され、そして好ましくは任意
の受容可能な手段によって正確に定量化される。一般的には、ＶＥＧＦＲ２は、
さらなる分析のために免疫沈降された。ＶＥＧＦＲ２のリン酸化の程度は、直接
決定され得る。例えば、この細胞は、32Ｐ標識ＡＴＰとともにインキュベートさ
れ得、これは、免疫沈降したＶＥＧＦＲ２内の32Ｐの直接の定量化を可能にする
。好ましくは、免疫沈降したＶＥＧＦＲ２は、その他の手段によって（例えば、
ゲル分離およびリン酸化チロシン残基に結合する抗体との免疫検出によって）分
析される。ＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦ誘導性リン酸化を阻害する能力を有する抗体
は、一般的には、リン酸化されたＶＥＧＦＲ２のレベルにおいて一貫して観察さ
れる減少を示す。
【００４２】 本発明に従ってＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体を同定するためのなおさらな
る機能的アッセイは、ＶＥＧＦ誘導性脈管透過性の阻害を試験するためにアッセ
イされる。任意のこのようなアッセイが使用されるが、特定の適切なアッセイは
、Ｍｉｌｅｓ透過性アッセイである。ここで動物（例えば、モルモット）は、色
素（Ｅｖａｎ青色素）とともに注射され、そしてこの動物の皮膚における色素の
外観は、試験抗体の存在または非存在下でＶＥＧＦの供給後に決定される。好ま
しくは、２連研究は、平行して行われる（例えば、ＶＥＧＦを有しない研究およ
び規定された特徴（遮断および遮断しないの両方）のコントロール抗体を有する
研究）。この動物の皮膚における色素の外観は、代表的にはこの動物の背面にお
けるスポット（例えば、青のスポット）であり、これは撮影および測定され得る
。
【００４３】 ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体は、一貫して観察される低濃度（例えば、Ｖ
ＥＧＦに対して１００倍または１０００倍のモル濃度過剰で提供される場合）で
の阻害としてＶＥＧＦ誘導性脈管透過性を阻害する。ＶＥＧＦＲ２に結合するＶ
ＥＧＦを遮断しない抗体は、ＶＥＧＦ誘導性脈管透過性の任意の有意な阻害を示
さない。一般的には、高濃度（例えば、ＶＥＧＦに対して１０倍のモル濃度）で
のみＶＥＧＦ誘導性透過性を遮断する抗体は、本発明に従う特徴を有する抗体で
はない。
【００４４】 新脈管形成因子、従って抗脈管形成因子の広範に受容可能な機能的アッセイは
、新生血管形成の角膜のマイクロポケットアッセイおよびニワトリ漿尿膜のアッ
セイ（ＣＡＭ）アッセイである。米国特許第５，７１２，２９１号は、角膜マイ
クロポケットアッセイおよびＣＡＭアッセイが、新脈管形成の疾患の極めて広範
の処置において使用する因子の同定を十分に予測することを示すことを参考とし
て本明細書中で特に援用される。
【００４５】 米国特許第５，００１，１１６号はまた、ＣＡＭアッセイを記載する目的に関
して本明細書中で参考として特に援用される。本質的には、受精したニワトリの
胚は、３日目または４日目にそれらの殻から除去し、そして試験化合物を含むメ
チルセルロースディスクが、漿尿膜上に移植される。この胚は、約４８時間後に
試験され、そして鮮明な無血管域が、メチルセルロースディスクの周辺に現れる
場合、この区域の直径が測定される。米国特許第５，７１２，２９１号に開示さ
れるように、本発明の文脈においてこの目的に関して本明細書中で参考として特
に援用され、任意の無血管域の外観は、抗脈管形成因子を証明するのに十分であ
る。この大きな区域は、この抗体がより効果的である。
【００４６】 新脈管形成の角膜マイクロポケットアッセイは、ラットまたはウサギの角膜を
使用して実施され得る。このインビボモデルは、米国特許第５，７１２，２９１
号および同第５，８７１，７２３号（各々は、証明の目的について本明細書中で
参考として特に援用される）によって証明されるように臨床学的な有用性の予測
をするのに広範に受容される。本発明に特に関連することは考えられないが、こ
れらは、それ自体が不活性であるが、活性な化合物を生じるように代謝される化
合物を一般的に認識するので、この角膜アッセイは、ＣＡＭアッセイにおいて望
ましい。
【００４７】 本発明において、この角膜マイクロポケットアッセイを使用して、抗脈管形成
因子を同定する。これは、一貫して観察され、かつ好ましくは顕著であるこの角
膜内の血管の数の減少によって示されるように脈管形成における有意な減少によ
って証明される。このような応答は、この試験基質と接触される場合、好ましく
は維持される増殖の証明を示さない予備の新芽および／またはヘアピンループの
みを示すこれらの角膜として定義される。
【００４８】 本発明の例示的なＶＥＧＦＲ２遮断抗体、抗ＶＥＧＦ抗体（および抗原結合フ
ラグメント）としては、以下の抗体を含む： （ａ）ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に結合するＶＥ
ＧＦを有意に阻害する抗体； （ｂ）ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）に結合するＶＥＧＦを有
意に阻害しない抗体； （ｃ）ＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦ誘導性リン酸化を阻害し、そして好ましくは有意
に阻害する抗体； （ｄ）ＶＥＧＦ誘導性脈管透過性を阻害し、そして好ましくは有意に阻害する抗
体； （ｅ）ＶＥＧＦ媒介性内皮細胞増殖を阻害し、そして好ましくは有意に阻害する
抗体； （ｆ）脈管形成を阻害し、そして好ましくは有意に阻害する抗体； （ｇ）マクロファージ、破骨細胞または軟骨吸収細胞のＶＥＧＦＲ１媒介性の刺
激または活性化を有意に阻害しない抗体；および （ｈ）血管化腫瘍を有する動物への投与の際に腫瘍脈管構造および腫瘍支質に局
部集中する抗体。
【００４９】 本発明の特定の局面は、ＶＥＧＦＲ２レセプターに結合するＶＥＧＦを特異的
に阻害し、インビボで有意な抗腫瘍効果を有し、そしてＶＥＧＦＲ１レセプター
に結合するＶＥＧＦを阻害しなかった抗体の本発明者の最初の驚くべき発見に基
づいている。特定の実施形態において、本発明は、従って規定されたエピトープ
特異性の抗体を提供し、ここでそのような抗体、またはその抗原結合フラグメン
トは、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と同一のエピ
トープに本質的に結合する。
【００５０】 特許請求の範囲に記載されている発明は、本明細書に従って可能にされ、そし
て技術的参考文献、ノウハウ、および出発物質を用意に利用可能にする。それに
も関わらず、２Ｃ３モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株のサン
プルは、２０００年３月２７日に提出され、アメリカンタイプカルチャーコレク
ション（ＡＴＣＣ）（アメリカ合衆国 バージニア２０１１０−２２０９、マナ
サス、ユニバーシティー ブールバ−ド１０８０１）に寄託物として２０００年
３月２８日に受理され、そしてＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５を
２０００年４月１１日に付与された。この寄託物は、特許手続上の微生物の寄託
の国際的承認に関するブダペスト条約およびその規定（ブタペスト条約）の下で
作製された。この作製されたハイブリドーマは、関連する特許請求の範囲ととも
に米国特許の発行に基づいてブタペスト条約の条件の下でＡＴＣＣによって入手
可能である。この寄託されたハイブリドーマの利用可能性は、その政府の特許法
に従って任意の政府の権力の下で付与された権利に違反して本発明を実施するた
めのライセンスと解釈するべきではない。
【００５１】 特定の好ましい組成物は、従って少なくとも第１の抗ＶＥＧＦ抗体、またはそ
の抗原結合フラグメント、あるいは少なくとも第１の精製された抗ＶＥＧＦ抗体
またはその抗原結合フラグメントを含む組成物（この抗原結合フラグメントは、
実質的にモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と同一のエ
ピトープに結合する）；少なくとも第１のモノクローナル抗体、またはその抗原
結合フラグメントを含む組成物（この抗原結合フラグメントは、本質的にモノク
ローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と同一のエピトープでＶＥ
ＧＦに結合する）；および少なくとも第１の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体、ま
たはその抗原結合フラグメントを含む組成物（これらの抗原結合フラグメントは
、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と同一のエピトー
プに結合する）である。
【００５２】 それにも関わらず、特定のその他の組成物、抗体、方法、ならびに特に本発明
の第１医療用途および第２医療用途は、抗ＶＥＧＦ抗体、またはモノクローナル
抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）自体以外にモノクローナル抗体２Ｃ
３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と同一、または実質的に同一であるエピトー
プに結合するその抗原結合フラグメントに関する。
【００５３】 用語モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）「とおおよそ
、実質的に、または本質的に同一、あるいは同一のエピトープに結合する」は、
このモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と「交差反応」
する抗体を意味する。「交差反応抗体」は、ＶＥＧＦに結合するためにモノクロ
ーナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と効果的に競合し得るように
、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に、また
は本質的に同一、あるいは同一のエピトープまたは「エピトープ部位」を認識す
る、それに結合する、またはそれに免疫特異性を有する抗体である。「２Ｃ３交
差反応抗体」は、簡潔に「２Ｃ３様抗体」および「２Ｃ３ベース抗体」と呼ばれ
、そしてこのような用語は、本明細書中で交互に使用され、そして組成物、使用
および方法に適用される。
【００５４】 モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）とおおよそ、実質
的に、または本質的に同一、あるいは同一のエピトープに結合する１つ以上の抗
体の同定は、その好都合な特徴を有する２Ｃ３が提供される以上は、現在簡単な
技術内容である。交差反応抗体の同定は、参照抗体と比較して決定されるので、
この参照抗体（２Ｃ３）およびこの試験抗体の結合は、モノクローナル抗体２Ｃ
３と同一または実質的に同一のエピトープに結合する抗体を同定するために決し
て必要でないエピトープを実際に決定することが、理解される。しかし、２Ｃ３
によって結合されるこのエピトープに対する多数の情報は、本明細書中に含まれ
、そしてエピトープマッピングは、Ｃｈａｍｐｅら（１９９５）（特に本明細書
中で参考として援用される）によって記載のようにさらに実施され得る。
【００５５】 交差反応抗体の同定は、抗体の競合が評価され得る、種々の免疫学的スクリー
ニングアッセイのいずれか１つを使用して容易に決定され得る。全てのこのよう
なアッセイは、当該分野で慣用的であり、そして本明細書中でさらに詳細に記載
される。１９９７年８月２６日に刊行された米国特許第５，６６０，８２７号は
、所定の抗体（例えば、２Ｃ３）と同一または実質的に同一のエピトープに結合
する抗体を作製する方法に関与する本教示をなおさらに補足することを含む目的
に関して特に本明細書中で参考として援用される。
【００５６】 例えば、試験されるべきこの試験抗体が、異なる供給源の動物から得られるか
、または同等の異なるアイソタイプである場合、このコントロール（２Ｃ３）お
よび試験抗体が、混合（または前吸着）される、サンプル競合アッセイが使用さ
れ得、そしてＶＥＧＦ抗原組成物に適用される。「ＶＥＧＦ抗原組成物」によっ
て、本明細書中に記載の２Ｃ３結合ＶＥＧＦ抗原を含む任意の組成物（例えば、
ＶＥＧＦはない）が意味される。従って、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット
に基づくプロトコルは、このような単純な競合研究における使用のために適切で
ある。
【００５７】 特定の実施形態において、抗原組成物に適用する前の期間にこのコントロール
抗体（２Ｃ３）とこの試験抗体の変化量（例えば、１：１０または１：１００）
をプレ混合する。他の実施形態において、このコントロールおよび試験抗体の変
化量は、抗原組成物に曝露の間に単に混合され得る。いずれにしても、種または
アイソタイプの２次抗体を使用することによって、結合したコントロール抗体の
みを検出し得、コントロール抗体の結合は、実質的に同一のエピトープを認識す
る試験抗体の存在によって減少される。
【００５８】 コントロール抗体と任意の試験抗体（種またはアイソタイプに関係なく）との
間の抗体競合研究を実施することにおいて、まず検出標識（例えば、その後の同
定を可能にするビオチンまたは酵素標識（さらに放射能標識））を用いてコント
ロール（２Ｃ３）を標識し得る。これらの場合において、標識コントロール抗体
を試験されるべき試験抗体と種々の比（例えば、１：１０または１：１００）で
プレ混合またはインキュベートし、（必要に応じて適切な期間の後）次いで標識
コントロール抗体の活性をアッセイし、そして潜在的に競合する試験抗体が、イ
ンキュベーション中に含まれなかったコントロール値を用いてこれと比較する。
【００５９】 このアッセイはまた、抗体ハイブリダイゼーションに基づく免疫学的アッセイ
の範囲のいずれか１つであり得、そしてこのコントロール抗体は、それらの標識
を検出する手段によって（例えば、ビオチン化抗体の場合、ストレプトアビジン
を用いてか、または酵素標識に関連する発色性基質（例えば、ペルオキシダーゼ
酵素とともに３，３’，５，５’−テトラメチルベンジン（ＴＭＢ）基質）を用
いることによってか、あるいは放射能標識を単に検出することによって）検出さ
れる。コントロール抗体と同一のエピトープに結合する抗体は、結合を効果的に
競合し得、従って、結合した標識の減少によって証明されるようにコントロール
抗体結合を有意に減少する。
【００６０】 完全に無関係な抗体の非存在下でのこの（標識した）コントロール抗体の反応
は、コントロールの高値である。コントロールの低値は、競合が起こり、そして
標識化抗体の結合を減少する場合、標識化（２Ｃ３）抗体を正確に同一の型（２
Ｃ３）の未標識の抗体とインキュベートすることによって得られる。試験アッセ
イにおいて、試験抗体の存在下での標識化抗体の反応性の有意な減少は、同一の
エピトープを認識する試験抗体を示す（すなわち、この標識（２Ｃ３）抗体と「
交差反応」する抗体）。
【００６１】 有意な減少は、「再現可能」である（すなわち、結合の減少が一貫して観察さ
れる）。本発明の用語において「有意な減少」は、約１：１０と約１：１００と
の間の任意の比で少なくとも約７０％、約７５％または約８０％の（ＥＬＩＳＡ
においてＶＥＧＦに結合する２Ｃ３の）再現可能な減少として定義される。なお
よりストリンジェントな交差遮断活性を有する抗体は、約１：１０と約１：１０
０との間の任意の比で少なくとも約８２％、約８５％、約８８％、約９０％、約
９２％、または約９５％あるいはその程度の（ＥＬＩＳＡまたはその他の適切な
アッセイにおいてＶＥＧＦに結合する２Ｃ３の）再現可能な減少を示す。本発明
を実施するのに決して必要でないが、約９９％、約９８％、約９７％、または約
９６％あるいはその程度のＶＥＧＦに結合する２Ｃ３の再現可能な減少を示すよ
うな交差遮断の競合または近競合は、確実に除外されない。
【００６２】 本発明は、モノクローナル抗体２Ｃ３によって例示されるか、ＡＴＣＣ ＰＴ
Ａ １５９５ハイブリドーマによって産生されるか、またはこのようなモノクロ
ーナル抗体の抗原結合フラグメントである。モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣ
Ｃ ＰＴＡ １５９５）として実質的に同一のエピトープと結合する、モノクロ
ーナル抗ＶＥＧＦ抗体を産生するハイブリドーマは、本発明の別の局面である。
【００６３】 本発明は、少なくとも第１の免疫原性ＶＥＧＦ成分を用いて、動物を免疫する
工程、および免疫された動物からモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ
１５９５）で実質的に交差反応する抗体を選択する工程を包含するプロセスに
よって調製されるモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と
して実質的に同一のエピトープと結合する、抗ＶＥＧＦ抗体；ならびに少なくと
も第１の免疫原性ＶＥＧＦ成分を用いて、動物を免疫する工程、および免疫され
た動物からＶＥＧＦに対する２Ｃ３抗体の結合を実質的に減少させる抗体を同定
することによって交差反応する抗ＶＥＧＦを選択する工程を包含するプロセスに
よって調製されるモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と
して実質的に同一のエピトープと結合する、抗ＶＥＧＦ抗体を、さらに提供する
。
【００６４】 モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエ
ピトープに結合し、そしてＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−
１）に結合するＶＥＧＦを特異的に阻害する、抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗原
結合フラグメント；ならびにモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １
５９５）と実質的に同じエピトープに結合し、そしてＶＥＧＦレセプターＶＥＧ
ＦＲ１（Ｆｌｔ−１）に結合するＶＥＧＦを実質的に阻害することなく、ＶＥＧ
ＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に結合するＶＥＧＦを阻害す
る、抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗原結合フラグメントが、本発明の他の局面を
形成する。
【００６５】 このような特性の組み合わせを有する抗体は、レセプター競合、ＥＬＩＳＡ、
共沈、および／または機能的アッセイ、ならびに上記の２Ｃ３交差反応性アッセ
イの１以上または組み合わせによって容易に同定され得る。ＶＥＧＦＲ２に結合
するＶＥＧＦを一貫して有意に減少させ、そしてＶＥＧＦＲ１に結合するＶＥＧ
Ｆを一貫して有意に阻害しない、２Ｃ３様抗体の定量評価に関する誘導は、上記
の通りである。
【００６６】 ２Ｃ３は、ＶＥＧＦＲ２コートＥＬＩＳＡウエルに結合するＶＥＧＦの量を、
ＶＥＧＦよりも１００倍および１０００倍を超えるモル数で、それぞれ約２６％
および１９％減少させることが本明細書において示された。これらの数字は、そ
れぞれ約７４％および８１％の、ＶＥＧＦＲ２に結合するＶＥＧＦの減少に等し
い。２Ｃ３は、ＶＥＧＦＲ２コートＥＬＩＳＡウエルに結合するＶＥＧＦの量を
、ＶＥＧＦよりも１００倍および１０００倍を超えるモル数で、それぞれ約９２
％および１０５％維持することが本明細書中において示された。
【００６７】 ＶＥＧＦＲ２に結合するＶＥＧＦをより実質的に阻害する、２Ｃ３様抗体また
は交差反応性抗体が、ＶＥＧＦＲ１との結合において、より低い耐性を有し得る
ことがさらに理解される。同様に、抗体がＶＥＧＦＲ２に結合するＶＥＧＦにお
いて穏やかな減少を有する場合、ＶＥＧＦＲ１への結合の維持は、より厳密に追
跡されなければならない。
【００６８】 従って、本発明のさらに例示的な抗ＶＥＧＦ抗体（および抗原結合フラグメン
ト）は、以下： （ａ）ウエスタンブロットでＶＥＧＦに結合することによってアッセイされる
ように、非立体配置的に独立したＶＥＧＦエピトープに結合する抗体； （ｂ）遊離ＶＥＧＦに結合する抗体； （ｃ）ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に結合するＶ
ＥＧＦを有意に阻害する抗体； （ｄ）ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）に結合するＶＥＧＦを
有意に阻害しない抗体； （ｅ）ＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦ誘導リン酸化を阻害、および好ましくは有意に
阻害する抗体； （ｆ）ＶＥＧＦ誘導血管透過性を阻害、および好ましくは有意に阻害する抗体
； （ｇ）ＶＥＧＦ媒介内皮細胞増殖を阻害、および好ましくは有意に阻害する抗
体； （ｈ）血管形成を阻害、および好ましくは有意に阻害する抗体； （ｉ）マクロファージ、破骨細胞または軟骨吸収細胞のＶＥＧＦＲ１媒介刺激
または活性化を有意に阻害しない抗体； （ｊ）血管新生腫瘍で動物へ投与する際に、腫瘍血管および腫瘍ストローマに
局在化する抗体；ならびに （ｋ）モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）として同一
かまたは実質的に同一のエピトープと結合する抗体である。
【００６９】 本発明に関連する、組成物、免疫結合体、医薬品、配合、カクテル、キット、
第１および第２医学的使用ならびに全方法の以下の記載において、用語「抗体」
および「免疫結合体」、またはその抗原結合領域は、具体的に記載または科学的
な用語から明らかにされない限り、ＶＥＧＦＲ２遮断、抗−ＶＥＧＦ抗体の範囲
および特異的な２Ｃ３交差反応抗体を言及する。
【００７０】 本明細書において使用されるように、用語「抗体」および「免疫結合体」は、
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含む、任意の免疫学的な結合剤を広
範に言及する。重鎖における定常ドメインのタイプに依存して、抗体は、５つの
主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのｌつに割り当て
られる。これらの数種は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４など
のようなサブクラスまたはアイソタイプにさらに分類される。イムノグロブリン
の異なるクラスに対応する、重鎖定常ドメインを、それぞれα、δ、ε、γおよ
びμと呼ぶ。このサブユニット構造およびイムノグロブリンの異なるクラスの３
次元構造は、周知である。
【００７１】 一般に、抗原結合領域以外の抗体が、本発明において使用される場合、ＩｇＧ
および／またはＩｇＭが、好ましい。なぜならば、これらは、生理学的状態にお
いて最も一般的な抗体であり、そしてこれらは、実験室の設定において最も容易
に実施されるからである。
【００７２】 哺乳動物の抗体の「軽鎖」は、２種の明らかに異なるタイプ：カッパ（κ）お
よびラムダ（λ）に割り当てられ、これらは、定常ドメインのアミノ酸配列に基
づく。本発明の抗体において、κまたはλ軽鎖の使用は、本質的に好ましくない
。
【００７３】 モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）またはその誘導体の使用がより好ましい。Ｍ
Ａｂｓは、特定の利点（例えば、再現性および大規模の産生）を有すると認識さ
れ、これらは、医療処置に適切である。従って、本発明は、マウス、ヒト、サル
、ラット、ハムスター、ウサギおよびさらにカエルまたはトリの原種のモノクロ
ーナル抗体を提供する。マウス、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体が、一般
に好ましい。
【００７４】 当業者に理解されるように、免疫学的結合剤は、全ての種由来の全ての抗体、
およびその抗原結合フラグメントに及ぶ用語「抗体」に含まれ、これには、２量
体、３量体および多量体の抗体；部位特異的抗体；化学的抗体；ヒトおよびヒト
化抗体；組換えおよび遺伝子組換え抗体；ならびにそのフラグメントが挙げられ
る。
【００７５】 従って、用語「抗体」は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を言及する
ために使用され、そしてこの用語は、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、単一
のドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単一鎖Ｆｖ）、直鎖抗体、ダイア
ボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）などのような抗体フラグメントを含む。種々の抗体
ベース構造およびフラグメントを調製および使用するための技術は、当該分野で
周知である（Ｋａｂａｔら、１９９１（本明細書においてその参考として特に援
用される）を参照のこと）。特にダイアボディーは、ＥＰ４０４，０９７および
ＷＯ９３／１１１６１（それぞれ本明細書においてその参考として特に援用され
る）にさらに記載される。一方、直鎖抗体は、Ｚａｐａｔａら（１９９５）（本
明細書においてその参考として特に援用される）にさらに記載される。
【００７６】 特定の実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも第１抗−ＶＥＧＦ抗
体を含み、この第１抗−ＶＥＧＦ抗体は、配列番号７または配列番号９のアミノ
酸配列と少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好まし
くは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ま
しくは少なくとも約９５％またはと同じアミノ酸配列のアミノ酸配列領域を含む
少なくとも第１可変領域を含む、少なくとも第１可変領域を含む。ここで、上記
抗−ＶＥＧＦ抗体は、２Ｃ３抗体によって例示されるような、本発明のＶＥＧＦ
Ｒ２−遮断、抗−ＶＥＧＦ抗体の生物学的な特性を少なくとも実質的に保持する
。
【００７７】 本発明のこれらおよび他の抗−ＶＥＧＦ抗体配列に関する同一性または相同性
は、配列番号７または配列番号９の配列、または配列をアニーリングおよびギャ
ップを導入した後の本発明の別の抗−ＶＥＧＦ抗体の配列と同じ候補配列中のア
ミノ酸残基の割合として本明細書中において定義され、必要であれば、配列同一
性の最大の割合を達成する。配列比較のために使用されるＶＥＧＦＲ２−遮断、
抗−ＶＥＧＦ抗体の実質的に同一、またはさらにより有効な生物学的特性の維持
は、特に重要である。このような比較は、例えば、本明細書において記載される
１以上の種々のアッセイを使用して、容易に実施される。
【００７８】 特定の好ましい実施形態において、本発明の抗−ＶＥＧＦ抗体は、配列番号７
または配列番号９のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列領域を含む少なくとも第
１可変領域を含む。これは、配列番号６または配列番号８の核酸配列によってコ
ードされるアミノ酸配列領域を含む可変領域によって例示される。このような配
列は、重鎖および軽鎖の可変領域のＣＤＲ１−３（相補的決定領域）を含む、２
Ｃ３ＳｃＦｖのＶｈおよびＶκの配列である。
【００７９】 他の好ましい実施形態において、オリジナルのＶＥＧＦＲ２−遮断、抗−ＶＥ
ＧＦ抗体（例えば２Ｃ３）と比較して、増強したまたは優れた特性を有する、第
２世代の抗体が提供される。例えば、第２世代の抗体は、より強力な結合親和性
、ＶＥＧＦＲ２に結合するＶＥＧＦのより有効な遮断、ＶＥＧＦＲ２に結合する
ＶＥＧＦのより特異的な遮断、ＶＥＧＦＲ１に結合するＶＥＧＦのさらに弱い遮
断、ＶＥＧＦ誘導された内皮細胞の増殖および／または移動を阻害するための増
強した能力、ＶＥＧＦ誘導された血管透過性を阻害するための優れた能力、なら
びに好ましくは、血管新生化腫瘍を含む、インビボにおいてＶＥＧＦ誘導血管形
成を阻害および血管疾患を処置するするための増加した能力を有し得る。
【００８０】 有効な第２世代抗体を同定するための比較が、例えば、本明細書に詳細に記載
される１以上の種々のアッセイを使用して、容易に処理および定量される。２Ｃ
３抗体によって例示されるように、本発明のＶＥＧＦＲ２−遮断、抗−ＶＥＧＦ
抗体と比較して、少なくとも約１０倍、好ましくは少なくとも２０倍、およびよ
り好ましくは少なくとも約５０倍の増強した生物学的特性または活性を有する第
２世代抗体、本発明によって意図される。
【００８１】 特定の実施形態において、使用される抗体は、「ヒト化」、部分的ヒトまたは
ヒト抗体である。「ヒト化」抗体は、一般にマウス、ラットまたは非ヒト種から
のキメラモノクローナル抗体であり、ヒト定常領域および／または種々の領域ド
メイン（「部分的ヒトキメラ抗体」）を有する。本発明において使用される種々
のヒト化モノクローナル抗体は、キメラ抗体であり、ここでマウス、ラットまた
は他の非ヒトモノクローナル抗体の、少なくとも第１抗原結合領域、または相補
性決定領域（ＣＤＲ）が、ヒト抗体定常領域または「フレームワーク」上に作動
可能に結合または「接ぎ木」されている。
【００８２】 本明細書中の使用のための「ヒト化」モノクローナル抗体はまた、非ヒト種か
らのモノクローナル抗体であり得、ここで、１つ以上の選択されたアミノ酸が、
ヒト抗体中でより一般に観察されるアミノ酸に交換されている。これは、慣用的
な組換え技法、特に部位特異的変異誘発の使用により容易に達成され得る。
【００８３】 「ヒト化」よりむしろ完全にヒトの抗体もまた調製され、そして本発明におい
て用いられ得る。このような抗体はまた、健常被験体から得られ得る。これを達
成するために、抗原提示細胞および抗体産生細胞を含む、ヒト被験体からの混合
末梢血リンパ球の集団を単に得、そしてこの細胞集団を、免疫学的に有効な量の
アミノリン脂質サンプルと混合することによりインビトロで刺激する。このヒト
抗ＶＥＧＦ抗体産生細胞が一旦得られると、ハイブリドーマおよび／または組換
え抗体産生に用いられる。
【００８４】 ヒトモノクローナル抗体産生のためのさらなる技法は、トランスジェニック動
物、好ましくはトランスジェニックマウスを免疫化することを包含し、これは、
免疫学的に有効な量のＶＥＲＦサンプルをともなうヒト抗体ライブラリーを含む
。これはまた、ハイブリドーマおよび／または組換え抗体産生においてさらなる
操作のためのヒト抗ＶＥＧＦ抗体産生細胞を生成し、末梢血細胞よりもむしろ脾
細胞が、トランスジェニック動物またはマウスから容易に得られ得るという利点
を持つ。
【００８５】 本発明に従ってＶＥＧＦＲ２遮断、抗−ＶＥＧＦ抗体は、以下を含むプロセス
および方法によって容易に調製され得る： （ａ）候補抗体産生細胞を調製する工程；および （ｂ）候補抗体産生細胞から抗体を選択する工程であって、ＶＥＧＦＲ２（Ｋ
ＤＲ／Ｆｌｋ−１）に結合するＶＥＧＦを有意に阻害し、そしてＶＥＧＦレセプ
ターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）に結合するＶＥＧＦを有意に阻害しない、工程
。
【００８６】 本発明に従った他の抗体は、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ
１５９５）と実質的に交差反応する抗体を選択することによって容易に調製され
得る。適切な調製プロセスおよび方法は、以下を含む： （ａ）候補抗体産生細胞を調製する工程；および （ｂ）モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に
交差反応する抗体を、候補抗体産生細胞から選択する工程。
【００８７】 適切な抗体産生細胞を調製し、そしてそれから抗体を得る１つのプロセスは、
所与の患者においてインサイチュで実施され得る。すなわち、患者に、免疫原性
的に有効な量の免疫原性ＶＥＧＦサンプルを単に提供することで、適切な抗体生
成を生じる。従って、この抗体は、抗体産生細胞からなお「得られる」が、宿主
から離れて単離され、そして引き続き、患者に提供されなければならないことは
なく、自然に腫瘍血管系に局在化し、そしてその生物学的抗腫瘍効果を奏し得る
。しかし、このような実施形態は、顕著な特異性の欠如に起因して好ましくない
。
【００８８】 適切な抗体産生細胞がまた得られ得、引き続いて、抗体は、末梢血液リンパ球
をインビトロにおいてＶＥＧＦで刺激することによって単離および／または精製
され得る。
【００８９】 他の方法は、少なくとも第１免疫原性ＶＥＧＦ成分を含む免疫化組成物を動物
に投与する工程、ならびにＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に結合するＶＥ
ＧＦを有意に阻害し、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）に結合す
るＶＥＧＦを有意に阻害しない抗体、および必要に応じてモノクローナル抗体２
Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に交差反応する抗体を、免疫化し
た動物から選択する工程を包含する。これらの方法は、以下の工程を包含する： （ａ）少なくとも１用量、および必要に応じて１以上の用量の免疫学的に有効
量の免疫原性ＶＥＧＦサンプル（例えば、第１ヒトＶＥＧＦ成分、実質的に完全
長のＶＥＧＦ成分、または組換えヒトＶＥＧＦ）で動物に投与することにより動
物を免疫化する工程；ならびに （ｂ）適切な抗体産生細胞を免疫化した動物から得る工程であって、例えば、
抗体産生細胞は、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に結合するＶＥＧＦを有
意に阻害し、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）に結合するＶＥＧ
Ｆを有意に阻害しない抗体、および必要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（Ａ
ＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に交差反応する抗体をを産生する、工程。
【００９０】 免疫的に有効量のＶＥＧＦサンプルを、ＶＥＧＦ結合体としてまたは任意の適
切なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバント）と組み合わせて投与
し得る。任意の経験的技術または改変は、免疫原性を増加するために使用され得
る。インタクトな実質的に完全長のヒトＶＥＧＦが、一般的に免疫原として好ま
しい。
【００９１】 免疫化プロセスの性質または免疫される動物の種類に関係なく、適切な抗体産
生細胞は、その免疫される動物から得られ、そして好ましくは、人の手によって
さらに操作される。本明細書中で使用される場合、「免疫された動物」は、他に
明確に記載しない限り、非ヒト動物である。任意の抗体産生細胞が使用され得る
が、最も好ましくは、抗体産生細胞の供給源として脾臓細胞が得られる。抗体産
生細胞は、以下を包含する調製工程において使用され得る： （ａ）抗ＶＥＧＦ抗体産生細胞を不死細胞と融合して、本発明に従ってモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマを調製する工程、ならびに （ｂ）このハイブリドーマから本発明に従って適切な抗ＶＥＧＦ抗体を得る工
程。
【００９２】 「適切な」抗ＶＥＧＦ抗体産生細胞、ハイブリドーマおよび抗体は、ＶＥＧＦ
Ｒ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体を産生するか、ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体と
して存在する細胞、ハイブリドーマおよび抗体であり、このＶＥＧＦＲ２−遮断
抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に対するＶＥＧＦ結合
を有意に阻害し、そしてＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）に対す
るＶＥＧＦ結合を有意には阻害せず、そして必要に応じてモノクローナル抗体２
Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に交差反応する抗体である。
【００９３】 従って、ハイブリドーマに基づくモノクローナル抗体調製方法は、以下を包含
する方法を包含する： （ａ）少なくとも１用量の（必要に応じて１用量より多くの）免疫学的に有効
量の免疫原性ＶＥＧＦサンプル（好ましくは、インタクトなヒトＶＥＧＦサンプ
ル）を動物に投与することによって、この動物を免疫する工程； （ｂ）免疫された動物からモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのコレクシ
ョンを調製する工程； （ｃ）本発明に従って少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、
必要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質
的に交差反応する抗ＶＥＧＦ抗体を産生する少なくとも第１のハイブリドーマを
このコレクションから選択する工程；および （ｄ）少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体を
提供するために少なくとも第１の抗体産生ハイブリドーマを培養する工程；なら
びに、好ましくは、 （ｅ）培養された少なくとも第１のハイブリドーマから第１のＶＥＧＦＲ２−
遮断抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体を得る工程。
【００９４】 モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に交差反
応する抗ＶＥＧＦ抗体を同定する際に、この選択工程は、以下を包含し得る： （ａ）ＶＥＧＦサンプルをモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １
５９５）および候補抗体の有効量と接触させる工程；および （ｂ）ＶＥＧＦサンプルに対する２Ｃ３抗体の結合を実質的に減少する、候補
抗体の能力を決定する工程であって；ここで、このＶＥＧＦサンプルに対する２
Ｃ３抗体の結合を実質的に減少する候補抗体の能力が、モノクローナル抗体２Ｃ
３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合する抗ＶＥ
ＧＦ抗体の指標である、工程。
【００９５】 選択工程は、さらに以下を包含し得る： （ａ）第１のＶＥＧＦを、有効な結合量のモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣ
Ｃ ＰＴＡ １５９５）を接触させる工程、およびＶＥＧＦに結合する２Ｃ３の
量を決定する工程； （ｂ）第２ＶＥＧＦを、有効な結合量のモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ
ＰＴＡ １５９５）と、有効競合量の候補抗体と組み合わせて接触させる工程
、および候補抗体の存在下でＶＥＧＦに結合する２Ｃ３の量を決定する工程；な
らびに （ｃ）ＶＥＧＦに結合する２Ｃ３の量を、好ましくは少なくとも約８０％減少
する候補抗体を選択することによって、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ
ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合する抗ＶＥＧＦ抗体を同定
する工程。
【００９６】 非ヒト動物が免疫化のために使用される場合、このようなハイブリドーマから
得られるモノクローナル抗体は、しばしば非ヒト構成（ｍａｋｅ ｕｐ）を有す
る。このような抗体は、必要に応じて、当該分野で公知であるような、そして本
明細書中でさらに記載されるような、ヒト化プロセス、移植または変異に供され
得る。あるいは、ヒト抗体遺伝子ライブラリーを含むトランスジェニック動物（
例えばマウス）が使用され得る。従って、このような動物の免疫化は、直接、適
切なヒト抗体の生成を生じる。
【００９７】 適切な抗体産生細胞（最も好ましくはハイブリドーマ）の産生の後に、ヒト抗
体または非ヒト抗体を産生するか否かにかかわらず、モノクローナル抗体をコー
ドする核酸は、「組換え」モノクローナル抗体を調製するためにクローン化され
得る。任意の組換えクローニング技術（抗体コード核酸配列の合成をプライムす
るためのＰＣＲTMの使用を含む）が利用され得る。従って、なおさらに適切なモ
ノクローナル抗体調製方法は、以下のように抗体産生細胞を使用する工程を包含
する方法を包含する： （ａ）適切な抗ＶＥＧＦ抗体産生細胞（好ましくは、ハイブリドーマ）から少
なくとも第１の適切な抗ＶＥＧＦ抗体をコードする核酸分子またはセグメントを
得る工程；および （ｂ）本発明に従って、組換えＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦモノクローナル
抗体を得るために、組換え宿主細胞において、この核酸またはセグメントを発現
する工程。
【００９８】 しかし、組換えモノクローナル抗体の調製に理想的に適する他の強力な組換え
技術が利用可能である。このような組換え技術は、ファージミドライブラリーに
基づくモノクローナル抗体調製方法を包含し、これは、以下を包含する： （ａ）少なくとも１用量の（必要に応じて１用量より多くの）免疫学的に有効
量の免疫原性ＶＥＧＦサンプル（例えば、インタクトなヒトＶＥＧＦサンプル）
を動物に投与することによって、この動物を免疫する工程； （ｂ）免疫された動物の抗体産生細胞（好ましくは脾臓）から単離されたＲＮ
Ａを発現するコンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリーを調製
する工程； （ｃ）少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じてモ
ノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に交差反応す
るものを発現する少なくとも第１のクローンをファージミドライブラリーから選
択する工程； （ｄ）少なくとも第１の選択されたクローンからＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧ
Ｆ抗体をコードする核酸を得る工程、および少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮
断抗ＶＥＧＦ抗体を提供するために組換え宿主細胞においてこの核酸を発現する
工程；ならびに、好ましくは、 （ｅ）少なくとも第１のクローンから得られた核酸によって発現される少なく
とも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体を得る工程。
【００９９】 また、このようなファージミドライブラリーに基づく技術において、ヒト抗体
遺伝子ライブラリーを保有するトランスジェニック動物が使用され得、組換えヒ
トモノクローナル抗体を産生する。
【０１００】 第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体核酸セグメントの調製方法に関係な
く、さらに適切な抗体核酸セグメントは、標準的な分子生物学技術によって容易
に調製され得る。任意の改変体、変異体または第二世代のＶＥＧＦＲ２−遮断抗
ＶＥＧＦ抗体核酸セグメントが本発明の使用に適することを確認するために、核
酸セグメントは、本発明に従って、ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体の発現を
確認するために試験される。好ましくは、改変体、変異体または第二世代の核酸
セグメントはまた、標準的な、より好ましくは、標準的なストリンジェントハイ
ブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションを確認するために試験さ
れる。例示的に適切なハイブリダイゼーション条件は、約７％ドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）、約０．５Ｍ ＮａＰＯ4、約１ｍＭ ＥＤＴＡ中、約５０℃
でのハイブリダイゼーション；および約１％ＳＤＳ、約４２℃での洗浄を包含す
る。
【０１０１】 種々の組換えモノクローナル抗体が、ヒト由来または非ヒト由来に関わらず、
容易に調製され得るので、本発明の処置方法は、患者において少なくとも第１の
ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体の生物学的有効量を発現する少なくとも第１
の核酸セグメントを動物または患者に提供することによって実施しされ得る。「
ＶＥＧＦＲ２−遮断、抗ＶＥＧＦ、２Ｃ３様または２Ｃ３に基づく抗体を発現す
る核酸セグメント」は、一般的に、少なくとも発現構築物の形態であり、ウイル
ス内または組換え宿主細胞内で構成される発現構築物の形態であり得る。本発明
の好ましい遺伝子治療ベクターは、一般的に、組換えレトロウイルス、単純ヘル
ペスウイルス（ＨＳＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、サ
イトメガロウイルス（ＣＭＶ）などの中で構成されるようなウイルスベクターで
ある。
【０１０２】 本発明は、さらに、少なくとも第１の精製されたＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧ
Ｆ抗体、またはその抗原結合フラグメント、必要に応じてモノクローナル抗体２
Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と基本的に同じエピトープに結合するもの
を含む組成物を提供する。このような組成物は、研究所の研究における使用のた
めに薬学的に受容可能な組成物であり得る。薬学的組成物の点で、これらは、好
ましくは、静脈内投与のような、非経口的な投与のために処方され得る。
【０１０３】 本発明は、ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体（２Ｃ３−交差反応性抗体、２
Ｃ３様抗体または２Ｃ３に基づく抗体を含む）についての多くの方法および使用
を提供する。全ての方法に関して、記載された方法において、用語「ａ」および
「ａｎ」は、「少なくとも１」、「少なくとも第１の」、「１以上」、または「
複数」の工程（具体的に記載される場合を除く）を意味するために使用される。
これは、特に、処置方法における投与工程に関連する。従って、異なる用量が本
発明に使用され得るだけでなく、異なる数の用量（例えば、注射）が、複数注射
まで、そして複数注射を含んで使用され得る。組み合わせ治療が、抗ＶＥＧＦ治
療抗体の投与の前、後、またはその間に投与されて、使用され得る。
【０１０４】 重要な生物学的意味を有する種々の有用なインビトロ方法および使用が提供さ
れる。第１に、ＶＥＧＦを結合する方法およびその使用が提供され、これは、一
般的に、ＶＥＧＦを含む組成物（好ましくは、自由な（ｆｒｅｅ）（非レセプタ
ー結合）ＶＥＧＦ）を含む組成物を、少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗Ｖ
ＥＧＦ抗体、またはその抗原結合フラグメント、必要に応じてモノクローナル抗
体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合する
抗体と、有効に接触する工程を包含する。
【０１０５】 ＶＥＧＦを検出する方法、およびその使用が提供され、これは、一般的に、Ｖ
ＥＧＦを含むと疑われる組成物を、少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥ
ＧＦ抗体、またはその抗原結合フラグメント、必要に応じてモノクローナル抗体
２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するも
のと、ＶＥＧＦ／抗体複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で接触させる
工程、およびそのように形成される複合体を検出する工程を包含する。この検出
の方法および使用は、例えば、新脈官形成および腫瘍に対する診断において、生
物学的サンプルと関連して使用され得、これに基づく診断キットもまた提供され
る。
【０１０６】 本発明は、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２に結合するＶＥＧＦを優先的また
は特異的に阻害する方法およびその使用を提供し、これは、一般的に、ＶＥＧＦ
存在下で、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）を発現する内皮細胞を含む細胞
または組織の集団を、生物学的に有効量の少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断
抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ
１５９５）と実質的に同じエピトープに結合するもの、またはその抗原結合フラ
グメントを含む組成物と、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２に結合するＶＥＧＦ
を阻害するのに有効な条件下で接触する工程を包含する。
【０１０７】 ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１に結合するＶＥＧＦを実質的に阻害すること
なく、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２に結合するＶＥＧＦを実質的に阻害する
方法、およびその使用が提供される。これらの方法は、ＶＥＧＦの存在下で、Ｖ
ＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）およびＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）を発現す
る内皮細胞の集団を含む細胞または組織の集団を、生物学的に有効量の少なくと
も第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じてモノクローナル抗体
２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合する抗
ＶＥＧＦ抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む組成物と、ＶＥＧＦレセ
プターＶＥＧＦＲ１に結合するＶＥＧＦを有意に阻害しないで、ＶＥＧＦレセプ
ターＶＥＧＦＲ２に結合するＶＥＧＦを阻害するのに有効な条件下で接触させる
工程を包含する。
【０１０８】 本発明のさらなる方法およびその使用は、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ１と
呼ばれるＶＥＧＦレセプターの生物学的な役割を分析する工程においてであり、
これは、以下の工程を包含する： （ａ）ＶＥＧＦならびにＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）およびＶＥＧＦ
Ｒ１（Ｆｌｔ−１）を発現する細胞の集団を含む生物学的組成物または組織を、
生物学的に有効量の少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要
に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に
同じエピトープに結合する抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗原結合フラグメントを
含む組成物と接触する工程；および （ｂ）ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体の、ＶＥＧＦに対する少なくとも第
１の生物学的応答に対する効果を決定する工程であって、ここで： （ｉ）ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体の存在下での生物学的応答におけ
る変化が、ＶＥＧＦＲ２レセプターによって媒介される応答の指標であり；そし
て （ｉｉ）ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体の存在下での生物学的応答の維
持が、ＶＥＧＦＲ１レセプターによって媒介される応答の指標である、工程。
【０１０９】 ＶＥＧＦ誘導内皮細胞増殖および／または遊走（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を特異
的に阻害する方法および使用を含む増殖阻害方法およびその使用が提供され、こ
れは、一般的に、ＶＥＧＦおよび内皮細胞の集団を含む細胞または組織の集団を
、生物学的に有効量の少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必
要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的
に同じエピトープに結合するもの、またはＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体の
抗原結合フラグメントを含む組成物と、ＶＥＧＦ誘導内皮細胞増殖および／また
は遊走を阻害するのに有効な条件下で接触させる工程を包含する。
【０１１０】 ＶＥＧＦ誘導マクロファージ化学走性を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦ誘
導内皮細胞増殖および／または遊走を阻害する方法およびその使用が提供され、
これは、一般的に、内皮細胞、マクロファージおよびＶＥＧＦを含む細胞または
組織の集団を、生物学的に有効量の少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥ
ＧＦ抗体、必要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９
５）と実質的に同じエピトープに結合するもの、または抗ＶＥＧＦ抗体の抗原結
合フラグメントを含む組成物と、ＶＥＧＦ誘導マクロファージ化学走性を有意に
阻害することなく、ＶＥＧＦ誘導内皮細胞増殖および／または遊走を阻害するの
に有効な条件下で接触させる工程を包含する。
【０１１１】 マクロファージ、破骨細胞または軟骨吸収細胞のＶＥＧＦ刺激を有意に阻害す
ることなく、ＶＥＧＦ誘導内皮細胞増殖および／または遊走、ならびに必要に応
じて新脈官形成を阻害する方法およびその使用がさらに提供される。この方法は
、一般的に、内皮細胞およびマクロファージ、破骨細胞または軟骨吸収細胞の内
の少なくとも一つを含む細胞または組織の集団を、生物学的に有効量の少なくと
も第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じてモノクローナル抗体
２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するも
の、または抗体の抗原結合フラグメントを含む組成物と、マクロファージ、破骨
細胞または軟骨吸収細胞のＶＥＧＦ刺激を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦ誘
導内皮細胞増殖および／または遊走、あるいは新脈官形成を阻害するのに有効な
条件下で接触させる工程を包含する。
【０１１２】 前述の方法および使用は、インビトロおよびインビボで実行され得る。後者の
場合、ここで、組織または細胞は、動物内に配置され、そして抗ＶＥＧＦ抗体が
動物に投与される。両方の場合に、方法および使用は、血管形成を阻害する方法
および使用になる。これは、潜在的に脈管形成性の血管を含む組織、または潜在
的に脈管形成性の血管の集団（すなわち、可能性としてＶＥＧＦに曝露されるも
の）を、脈管形成を阻害するのに効果的な条件下で、抗脈管形成組成物（生物学
的に効果的な量の少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体（必要に
応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に
同じエピトープ、またはその抗原結合フラグメントに結合するもの）を含む）に
接触させる工程を包含する。
【０１１３】 潜在的に脈管形成性の血管の集団がエキソビボで維持される場合、本発明は、
薬物開発プログラムにおいて有用性を有する。インビトロスクリーニングアッセ
イにおいては、確実な陽性コントロールおよび陰性コントロールが、新脈管形成
を阻害または促進する薬物の開発において、および脈管形成プロセスに対するさ
らなる情報の描写において、第１の工程として有用である。潜在的に脈管形成性
の血管の集団が動物または患者内に配置される場合、抗脈管形成性組成物が、治
療の形態として動物に投与される。
【０１１４】 従って、前述の阻害方法のそれぞれの立場から、「生物学的に有効な量」とは
、ＶＥＧＦ誘導内皮細胞増殖および／または細胞移動を阻害し；ＶＥＧＦ誘導マ
クロファージ走化性を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦ誘導内皮細胞増殖およ
び／または細胞移動を阻害し；マクロファージ、破骨細胞、または軟骨吸収細胞
のＶＥＧＦ刺激を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦ誘導内皮細胞増殖および／
または細胞移動もしくは新脈管形成を阻害し；そして全体として、血管増殖もし
くは新脈管形成を阻害するのに有効な様式で血管内皮細胞の増殖および／または
移動を減弱するのに有効な、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体（必要に応じ２Ｃ
３−ベースの抗体）の量である。
【０１１５】 従って、本発明は、ＶＥＧＦ誘導性新脈管形成を阻害する方法、およびその阻
害における使用、ならびに好ましくは、マクロファージ、破骨細胞、または軟骨
吸収細胞のＶＥＧＦ刺激を有意に阻害することなく、脈管形成性疾患を処置する
方法およびその処置における用途を提供する。この方法は、一般に、内皮細胞お
よび少なくとも１つのマクロファージ、破骨細胞、または軟骨吸収細胞を含む細
胞または組織の集団を、組成物と接触させる工程を包含する。この組成物は、生
物学的に有効な量の少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体（必要
に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的
に同じエピトープ、またはこの抗体の抗原結合フラグメントに、ＶＥＧＦ誘導新
脈管形成を阻害するのに有効で、かつマクロファージ、破骨細胞、または軟骨吸
収細胞のＶＥＧＦ刺激を有意に阻害することなく、脈管形成性疾患を処置するの
に有効な条件下で、結合するもの）を含む。
【０１１６】 骨代謝に有意な副作用を生じることなく、ＶＥＧＦ誘導性新脈管形成を阻害す
る方法およびその阻害における用途、そして好ましくは抗脈管形成疾患を処置す
る方法およびその処置における用途がさらに提供される。この方法は、一般に、
血管内皮細胞および少なくとも１つのマクロファージ、破骨細胞、または軟骨吸
収細胞を含む脈管形成性血管の組織または集団を、組成物と接触させる工程を包
含する。この組成物は、生物学的に有効な量の少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−
遮断抗ＶＥＧＦ抗体（必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ Ｐ
ＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープ、またはこの抗体の抗原結合フラグ
メントに、ＶＥＧＦ誘導新脈管形成を阻害するのに有効で、かつマクロファージ
、破骨細胞、または軟骨吸収細胞の活性を有意に障害しないことにより、骨代謝
に有意な副作用を生じることなく、脈管形成性疾患を処置するのに有効な条件下
で、結合するもの）を含む。
【０１１７】 抗脈管形成性薬物のスクリーニング（インビトロ）および治療（インビボ）は
、所望されない、不適切な、異常な、過剰なおよび／または病理的な血管新生に
より特徴付けられる任意の疾患または障害を有するか、またはそのような疾患を
発症する危険性がある、動物および患者の立場から提供される。異常な新脈管形
成が広範な疾患および障害において生じること、任意の受容可能なモデル系にお
いて、効果的であることが一旦示された所定の抗脈管形成治療が、新脈管形成に
関連する全範囲の疾患および障害を処置するのに用いられ得ることが、当業者に
周知である。
【０１１８】 本発明の方法および用途は、特に、任意の形態の血管新生された腫瘍；黄斑変
性症（加齢性黄斑変性を含む）；関節炎（慢性関節リウマチを含む）；アテロー
ム性動脈硬化症およびアテローム斑；糖尿病性網膜症および他の網膜症；甲状腺
過形成（グレーブス病を含む）；血管腫；血管新生緑内障；および乾癬を有する
か、またはそのような疾患を発症する危険性がある、動物および患者における使
用を意図している。
【０１１９】 本発明の方法および用途は、動静脈奇形（ＡＶＭ）、髄膜腫および血管再狭窄
（血管形成術後の再狭窄を含む）を有するか、またはそのような疾患を発症する
危険性がある、動物および患者の処置をさらに意図している。治療方法および用
途の他の意図される標的は、血管線維腫、皮膚炎、子宮内膜症、血友病性関節、
過形成性瘢痕、炎症性疾患および障害、化膿性肉芽腫、強皮症、滑膜炎、トラコ
ーマおよび血管癒着、を有するか、またはそのような疾患を発症する危険性があ
る、動物および患者である。
【０１２０】 米国特許第５，７１２，２９１号（本明細書において参考として詳細に援用さ
れる）に記載のように、前述のいくらか好ましい処置群の各々は、決して、本発
明により処置されるべきである状態の網羅的な型ではない。米国特許第５，７１
２，２９１号は、特定の特異的な目的のために本明細書において参考として援用
される。この目的は、抗脈管形成治療により効果的に処置され得る多数の他の状
態を同定する目的；一旦、新脈管形成阻害化合物の規定されたカテゴリーが開示
および請求されば、全ての脈管形成性疾患の処置が統一された概念を示す目的（
本発明の場合、ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体（必要に応じ、モノクローナ
ル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合
するもの））；ならびに全ての脈管形成性疾患の処置が単一のモデル系のみに由
来するデータにより可能であることを示す目的、を含む。
【０１２１】 なおさらなる局面において、そして本明細書において参考として援用される米
国特許第５，７１２，２９１号に記載の様に、本発明の方法および使用は、血管
結合組織の異常増殖、赤鼻、後天性免疫不全症候群、動脈閉塞、アトピー性角膜
炎、細菌性潰瘍、ベーチエット病、血液産生腫瘍（ｂｌｏｏｄ ｂｏｒｎｅ ｔ
ｕｍｏｒ）、頚動脈閉塞性疾患、化学熱傷、脈絡膜血管新生、慢性炎症、慢性網
膜剥離、慢性ブドウ膜炎、慢性硝子体炎、コンタクトレンズ疲弊、角膜移植片拒
絶、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、クローン病、イールズ病、流行性角結
膜炎、真菌性潰瘍、単純疱疹感染、帯状疱疹感染、過粘稠度症候群、カポジ肉腫
、白血病、脂質変性、ライム病、辺縁角質炎、モーレン潰瘍、癩以外のマイコバ
クテリア感染、近視、眼の血管新生疾患、視神経乳頭の先天的な構造上の欠損、
オスラーウェーバー症候群（オスラー−ウェーバーＲｅｎｄｕ）、骨関節炎、ペ
ージエット病、毛様体輪炎（ｐａｒｓ ｐｌａｎｉｔｉｓ）、類天疱瘡、ｐｈｙ
ｌｅｃｔｅｎｕｌｏｓｉｓ、多発性動脈炎、レーザー後合併症、原生動物感染、
弾性線維性偽性黄色腫、翼状片角膜炎乾燥症、放射状角膜切開術、網膜血管新生
、未熟児網膜症、水晶体後方線維増殖症、サルコイド、強膜炎、鎌状赤血球貧血
、シェーグレン症候群、固形腫瘍、シュタルガルト病、スティーブンジョンソン
病、上部辺縁角膜炎、梅毒、全身性エリテマトーデス、テリエン辺縁変性、トキ
ソプラズマ症、外傷、ユーイング肉腫の腫瘍、神経芽細胞腫の腫瘍、骨肉腫の腫
瘍、網膜芽細胞腫の腫瘍、横紋筋肉腫の腫瘍、潰瘍性大腸炎、静脈閉塞、ビタミ
ンＡ欠失およびヴェーゲナーサルコイドーシスを有するか、またはそのような疾
患を発症する危険性がある、動物および患者の処置を意図する。
【０１２２】 本発明はさらに、動脈炎を有するか、または動脈炎を発症する危険性のある、
動物および患者の処置のための方法および用途を提供する。これは、通常、本明
細書において参考として詳細に援用される、米国特許第５，７５３，２３０号に
記載の免疫学的因子を用いた動脈炎の処置による。米国特許第５，９７２，９２
２号がまた、本明細書において参考として詳細に援用されており、糖尿病、寄生
生物病、異常な創傷治癒、手術後過形成、火傷、傷害または外傷、毛髪成長不全
、排卵および黄体形成の阻害、子宮での着床阻害および胚発生の阻害に関連する
所望されない新脈管形成の処置に対する抗脈管形成ストラテジーの適用をなおさ
らに例証する。従って、前述の条件の全てが本発明の方法および使用による処置
のために意図される。
【０１２３】 米国特許第５，６３９，７５７号は、本明細書において参考としてさらに詳細
に援用され、移植片拒絶の一般的処置に対する抗脈管形成のストラテジーの使用
を例証する。ＶＥＧＦ阻害に基く抗脈管形成ストラテジーを用いた、肺炎症、ネ
フローゼ症候群、子癇前症、心内膜液浸出（心膜炎に関連するものを含む）およ
び胸水の処置は、ＷＯ ９８／４５３３１（本明細書において参考として詳細に
援用されている）に記載されている。従って、前述の任意の状態を有するか、ま
たはそれを発症する危険性のある動物および患者は、本発明の方法および使用に
よる処置を意図される。
【０１２４】 ＷＯ ９８／１６５５１（本明細書において参考として詳細に援用される）に
記載されるように、ＶＥＧＦ機能を拮抗（アンタゴナイズ）する生物学的分子は
また、所望されない血管透過性により特徴付けられる疾患および障害の処置にお
ける使用に適切である。従って、本明細書の方法および用途の、ＶＥＧＦ拮抗抗
体は、所望されない血管透過性により特徴付けられる疾患および障害（例えば、
脳腫瘍に伴う浮腫、悪性腫瘍に伴う腹水、メグズ（メイグス）症候群、肺炎症、
ネフローゼ症候群、心内膜液浸出および胸水など）を有するか、またはそれを発
症する危険性のある動物および患者の処置に適用可能である。
【０１２５】 前述の疾患全ての処置は、統合された本発明内で可能であるが、本発明の方法
および使用の特に好ましい局面は、血管新生した固体腫瘍、転移性腫瘍または原
発性腫瘍からの転移を有するか、または発症する危険性のある動物および患者へ
の抗脈管形成療法の適用である。
【０１２６】 ＶＥＧＦ誘導脈管形成を阻害する方法およびこの阻害における使用、そして好
ましくは、マクロファージ、破骨細胞、または軟骨吸収細胞のＶＥＧＦ刺激を有
意に阻害することなく、抗腫瘍効果または改善された抗腫瘍効果をもたらす、方
法およびこれにおける使用が、さらに提供される。この方法は、一般に、血管内
皮細胞および少なくとも１つのマクロファージ、破骨細胞、または軟骨吸収細胞
を含む、組織、腫瘍環境または脈管形成性血管の集団を、組成物と接触させる工
程を包含する。この組成物は、生物学的に有効な量の少なくとも第１のＶＥＧＦ
Ｒ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体（必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣ
Ｃ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープ、またはこの抗体の抗原結合
フラグメントに、マクロファージ、破骨細胞、または軟骨吸収細胞のＶＥＧＦ刺
激を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦ誘導新脈管形成を阻害するのに有効で、
かつ抗腫瘍効果もしくは改善された抗腫瘍効果を発揮するのに有効な条件下で、
結合するもの）を含む。
【０１２７】 従って、本発明はさらに、新脈管形成に関連するガンの全ての形態を含む、新
脈管形成に関連する疾患を処置する方法およびこの処置における使用を提供する
。この方法は、このような疾患またはガンを有する動物または患者に、治療上有
効な量の少なくとも第１の薬学的組成物（ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体（
必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実
質的に同じエピトープ、またはこのようなＶＥＧＦ抗体の抗原結合フラグメント
もしくは免疫結合体に結合するもの）を投与する工程を包含する。
【０１２８】 本発明は、非結合体化抗体または裸の抗体およびそのフラグメントを用いる抗
脈管形成方法、ならびに免疫結合体を用いる血管標的方法（ここで、抗体または
その抗原結合フラグメントは、治療剤に作動可能に結合される）の両方を組み合
わせる。従って、他に特に言及するか、または科学用語において明白にされない
限り、本明細書において用いる場合、用語「抗体およびそのフラグメント」は、
「結合体化されていないかまたは裸の」抗体またはフラグメントを意味する。こ
れは、別の薬剤（特に治療薬または診断薬）には結合されていない。これらの定
義は、抗体の改変（例えば、単に例としてであるが、抗体の生物学的半減期、親
和性、結合活性、もしくは他の特性を改善するような改変、または抗体と他のエ
フェクターとの組み合わせ）を除外しない。
【０１２９】 本発明の抗脈管形成処置の方法および使用はまた、結合体化されていないかま
たは裸の抗体および免疫結合体の両方の使用を包含する。免疫結合体ベースの抗
脈管形成処置方法においては、抗体またはその抗原結合フラグメントが、好まし
くは、第２の抗脈管形成因子（第１の抗脈管形成因子である、抗ＶＥＧＦ抗体自
体）に作動可能に連結される。結合された抗脈管形成因子は、直接または間接の
抗脈管形成効果を有する因子であり得る。
【０１３０】 抗脈管形成処置方法および使用は、新脈管形成に関連する疾患（新脈管形成に
関連するガンの全ての形態を含む）を有する動物または患者に、治療的に有効な
量の少なくとも第１の薬学的組成物を投与する工程を包含する。この薬学的組成
物は、結合体化されていないかもしくは裸のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体
、またはその抗原結合フラグメント（必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３
（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合する）を含む
。同様に、投与された抗体は、第２の抗脈管形成因子と作動可能に会合され得る
。
【０１３１】 転移性ガンを処置するための方法、およびその処置における使用は、転移性ガ
ンを有する動物および患者に、治療的に有効な量の少なくとも１つの薬学的組成
物を投与する工程を包含する。この薬学的組成物は、少なくとも第１の結合体化
されていないかもしくは裸のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗
原結合フラグメント（必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ Ｐ
ＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するもの）を含む。さらなる
方法は、投与された抗体が、第２の抗脈管形成因子と作動可能に連結され得る方
法である。
【０１３２】 原発性ガンからの転移を減少させるための方法および減少させるにおける使用
は、原発性ガンを有するかまたは原発性ガンについて処置された動物および患者
に、治療的に有効な量の少なくとも１つの第１の結合体化されていないかもしく
は裸のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗原結合フラグメントを
投与する工程を包含する；ここでこの結合体化されていないかもしくは裸のＶＥ
ＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗原結合フラグメントは、必要に応
じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同
じエピトープに結合する。同様に、投与された抗体は、第２の抗脈管形成因子と
作動可能に会合され得る。
【０１３３】 新脈管形成に関連する疾患（新脈管形成に関連するガンの全ての形態を含む）
を処置するための方法、およびその処置における使用は、このような疾患（例え
ば、血管新生化腫瘍）を有する動物または患者に、少なくとも第１の結合体化さ
れていないかもしくは裸のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、（必要に応じて
、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエ
ピトープまたはその抗原結合フラグメントに結合するもの）を、この疾患部位も
しくは血管新生腫瘍内の新脈管形成を阻害するのに効果的な量で、投与する工程
をさらに含む。同様に、投与された抗体は、第２の抗脈管形成因子と作動可能に
会合され得る。
【０１３４】 新脈管形成に関連する疾患（新脈管形成に関連するガンの全ての形態を含む）
を処置するための方法、およびその処置における使用は、このような疾患または
ガンを有する動物または患者に、少なくとも第１の結合体化されていないかもし
くは裸のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、（必要に応じて、モノクローナル
抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合す
るもの）、またはその抗原結合フラグメントを、ＶＥＧＦがＶＥＧＦレセプター
ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に結合するのを阻害して、これにより、こ
の疾患またはガンの部位内の新脈管形成を阻害するのに効果的な量で、投与する
工程をさらに含む。投与された抗体は、あるいは、第２の抗脈管形成因子と作動
可能に会合され得る。
【０１３５】 新脈管形成に関連する疾患（新脈管形成に関連するガンの全ての形態を含む）
を処置するための方法、およびその処置における使用はまた、血管新生腫瘍を有
する動物または患者に、治療的に有効な量の少なくとも第１の結合体化されてい
ないかもしくは裸のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、（必要に応じて、モノ
クローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトー
プまたはその抗原結合フラグメントに結合するもの）、を投与する工程を包含す
る；ここで、抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦがＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（
Ｆｌｔ−１）に結合するのを有意に阻害することなく、ＶＥＧＦがＶＥＧＦレセ
プターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に結合するのを実質的に阻害する。
同様に、投与された抗体は、第２の抗脈管形成因子と作動可能に会合され得る。
【０１３６】 新脈管形成に関連する疾患（新脈管形成に関連するガンの全ての形態を含む）
を処置するためのなおさらなる方法、およびその処置における使用は、このよう
な疾患、ガンまたは血管新生腫瘍を有する動物または患者に、治療的に有効な量
の少なくとも第１の結合体化されていないかもしくは裸のＶＥＧＦＲ２−遮断抗
ＶＥＧＦ抗体、（必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ
１５９５）と実質的に同じエピトープまたはその抗原結合フラグメントに結合
するもの）を投与する工程を包含する；ここで、抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦが
ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）に結合するのを有意に阻害する
ことなく、ＶＥＧＦがＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）
に結合するのを実質的に阻害し、これにより動物におけるマクロファージ走化性
を有意に障害することなく、疾患部位、ガンまたは血管新生腫瘍内の新脈管形成
を阻害する。投与された抗体は、第２の抗脈管形成因子と作動可能に会合され得
る。
【０１３７】 新脈管形成に関連する疾患（新脈管形成に関連するガンの全ての形態を含む）
を処置するためのなおさらなる方法、および処置における使用は、このような疾
患、ガンまたは血管新生腫瘍を有する動物または患者に、治療的に有効な量の少
なくとも第１の結合体化されていないかもしくは裸のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥ
ＧＦ抗体、（必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １
５９５）と実質的に同じエピトープまたはその抗原結合フラグメントに結合する
もの）を投与する工程を包含する；ここで、抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦがＶＥ
ＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）に結合するのを有意に阻害すること
なく、ＶＥＧＦがＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に結
合するのを実質的に阻害し、これにより動物におけるマクロファージ、破骨細胞
、および／または軟骨吸収細胞の活性を有意に阻害することなく、疾患部位、ガ
ンまたは血管新生腫瘍内の新脈管形成を阻害する。同様に、投与された抗体は、
第２の抗脈管形成因子と作動可能に会合され得る。
【０１３８】 新脈管形成に関連した疾患（新脈管形成に関連した癌の全ての形態を含む）を
処置するための方法およびその処置の際の使用は、このような疾患（例えば、血
管新生化腫瘍）を有する動物または患者に、少なくとも第１の結合体化されてい
ないかまたは裸のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じて、モノクロー
ナル抗体２３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合
するもの、またはそれらの抗原−結合フラグメントを、骨代謝に有意な悪影響を
およぼすことなく、疾患部位または血管新生化された腫瘍内の新脈管形成を阻害
するのに有効な量で投与する工程をさらに包含する。
【０１３９】 上記の抗−血管形成処置の方法および使用は、一般に、哺乳動物または患者に
、全身的に（例えば、経皮的注射、筋肉注射、静脈内注射などによって）、薬学
的に有効な組成物を投与する工程を包含する。しかし、血管形成部位（単数また
は複数）（腫瘍または腫瘍内の血管内皮細胞を含む）に治療用薬剤が局在化する
ことが可能である投与の任意の経路は、受容可能である。従って、送達の他の適
切な経路として、経口、直腸、経鼻、局所、膣が挙げられる。米国特許第５，７
１２，２９１号は、血管形成の疾患または障害の処置と組み合わせて含まれ得る
投与の種々の経路のさらなる説明のために参考として本明細書中に特に援用され
る。
【０１４０】 関節炎の処置のための使用および方法について、本明細書中において参考とし
て特に援用される米国特許第５，７５３，２３０号に他の免疫学的薬剤について
記載されるように、例えば、滑液包内投与が使用され得る。眼に関連する状態に
ついて、眼の処方および投与が考慮される。
【０１４１】 本明細書中で使用される「投与」は、抗血管形成効果および／または抗腫瘍効
果を発揮するのに有効な量および時間の、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体また
は２Ｃ３ベースの治療剤の提供または送達を意味する。タンパク様の治療剤の受
動的な投与は、一般に、一部、その簡潔さおよび再現性のために好ましい。
【０１４２】 しかし、用語「投与」は、本明細書中において、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ
抗体または２Ｃ３ベースの治療剤が腫瘍血管系に送達されるかまたは他の方法で
提供される任意かつ全ての手段をいうように使用される。従って、「投与」は、
ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの治療剤を、腫瘍への送達
を生じるのに有効な様式で産生する細胞の提供を含む。このような実施形態にお
いて、選択的に浸透可能な膜、構造または移植可能なデバイス、概して治療を中
断するために除去され得るものに、細胞を処方または包装することが所望され得
る。外因性のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３様物投与が、さらに
一般的に好ましく、これは、用量が綿密にモニターかつ制御されることを可能に
する非侵襲性の方法を表す。
【０１４３】 本発明の治療学的方法および使用はまた、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体ま
たは２Ｃ３ベースの治療剤を、腫瘍の近傍または腫瘍へのそれらの局在において
、それらの発現を生じるのに有効な様式でコードする核酸の提供に拡張する。裸
ＤＮＡ送達、組換え遺伝子およびベクター、細胞ベースの送達のような任意の遺
伝子治療技術（患者の細胞などのエキソビボ操作を含む）が使用され得る。
【０１４４】 なおさらなる実施形態において、本発明は、疾患に関連した血管形成の血管に
選択された治療剤または診断学的薬剤を送達するための、および送達する際の方
法を提供する。このような実施形態は、好ましくは、腫瘍または腫瘍内血管系ま
たは間質にも選択された治療剤または診断学的薬剤を送達するために使用され、
そして、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体またはそれらの抗原結合フラグメント
、必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ１５９５）と実
質的に同じエピトープに結合するものに、診断学的薬剤または治療用薬剤が作動
可能に結合される少なくとも第１の免疫結合体を含む生物学的に有効な量の組成
物を、血管新生化された腫瘍を有する哺乳動物または患者に投与する工程を包含
する。
【０１４５】 本発明の標的化局面を内在する作用の機構を理解することはこのような実施形
態を実施するために必要とされないが、本発明の抗体が、それらの上に発現され
たＶＥＧＦＲ１に結合したＶＥＧＦに結合することによって血管形成および腫瘍
の血管系に、結合した薬剤を送達すると考えられる。従って、本発明のこれらの
方法および使用は、血管形成の血管、腫瘍または腫瘍内血管系に、選択された治
療剤または診断学的薬剤を送達することに関し、血管形成の血管、腫瘍または腫
瘍内血管系で発現されるか、過剰発現されるか、またはアップレギュレートされ
るＶＥＧＦＲ１に結合したＶＥＧＦに抗体が結合することを可能にするのに有効
な様式で、少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体またはそれらの抗
原結合フラグメント、必要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴ
Ａ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するものに、診断学的薬剤また
は治療用薬剤が作動可能に結合される免疫結合体を含む、生物学的に有効な量の
組成物を、処置が必要な哺乳動物または患者に投与する工程、すなわち、血管形
成の血管、腫瘍または腫瘍内血管系のＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ１に診断学的薬剤ま
たは治療用薬剤を送達する工程を包含する。
【０１４６】 腫瘍または腫瘍内血管系または間質への選択された治療薬剤の送達は、血流を
止めるために、または特に腫瘍血管系内の血流を止めるために；破壊するために
、または特に腫瘍血管系を破壊するために；および壊死を誘発するために、また
は腫瘍内の特異的な壊死を誘発するために、作用する。従って、これらの方法お
よび使用は、血管形成された腫瘍を有する哺乳動物または患者を処置するための
方法として要約され得、この方法は、作動可能に治療薬剤に結合される、ＶＥＧ
ＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ
ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するもの、またはそれら
の抗原結合フラグメントを含む少なくとも第１の免疫結合体を含む、治療学的に
有効な量の少なくとも第１の薬学的組成物を、哺乳動物または患者に投与する工
程を包含する。
【０１４７】 本発明における使用のための「治療学的に有効な量」は、少なくとも一部の腫
瘍または腫瘍内の血管内皮細胞を特異的に殺傷するために；少なくとも一部の腫
瘍または腫瘍内血管内皮細胞に細胞死を特異的に誘発するために；少なくとも一
部の腫瘍または腫瘍内血管に特異的に凝固を促進するために；腫瘍の少なくとも
一部の血液輸送血管を特異的に閉塞または破壊するために；少なくとも一部の腫
瘍内に特異的に壊死を誘発するために；および／または選択された哺乳動物また
は患者への投与の際に腫瘍の後退または寛解を誘発するために、有効な、ＶＥＧ
ＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの免疫結合体の量である。このよ
うな効果が達成される一方で、正常で健康な組織内の血管内皮細胞への結合がほ
とんどまたは全くないか、あるいは正常で健康な組織内の血管内皮細胞の殺傷が
ほとんどまたは全くないことを示し；健康で正常な組織内の血管の閉塞または破
壊の際の凝固がほとんどまたは全くないことを示し；そして哺乳動物または患者
の正常で健康な組織におよぼす無視できるまたは扱いやすい有害な副作用を示す
。
【０１４８】 従って、腫瘍血管系内の凝固を促進する状況、または腫瘍血管系を破壊する状
況、および／または腫瘍関質に結合する状況、および／または腫瘍壊死をもたら
す状況において、本明細書中で使用される用語「好ましくは」および「特に」は
、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの免疫結合体が、実質的
に腫瘍間質、血管系および腫瘍部位に制限される間質の結合、凝固、破壊および
／または腫瘍壊死を達成するように機能することを意味し、そして哺乳動物また
は被験体の正常で健康な組織内の凝固、破壊および／または組織壊死に実質的に
拡張しない。従って、健康な細胞および組織の構造および機能は、本発明の実施
によって実質的に弱められずに維持される。
【０１４９】 本発明の抗体は、ＶＥＧＦＲ１に関連したＶＥＧＦに結合することによって血
管形成および腫瘍の血管系に薬剤を有効に送達するが、他の方法および使用が治
療学的薬剤を腫瘍間質に送達することに基づいて作動し、ここでそれは付近の血
管への治療学的効果を発揮する。これらの方法および使用は、腫瘍間質内の非レ
セプター結合ＶＥＧＦに免疫結合体を結合するのに有効な量で、少なくとも第１
のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体、またはそれらの抗原結合フラグメント、必
要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的
に同じエピトープに結合するものに作動可能に結合された治療学的薬剤を含む免
疫結合体を、血管形成腫瘍を有する哺乳動物または患者に投与する工程を包含す
る。
【０１５０】 これらの方法および使用は、腫瘍間質内で免疫結合体を局在化するのに有効な
量で、少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体、またはそれらの抗原
結合フラグメント、必要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ
１５９５）と実質的に同じエピトープに結合するものに作動可能に結合された
治療学的薬剤を含む免疫結合体を、血管形成腫瘍を有する哺乳動物または患者に
投与し、その結果、結合された治療用薬剤が、周囲の腫瘍血管系および／または
腫瘍細胞に抗腫瘍効果を発揮する工程を包含する。
【０１５１】 本発明の組成物ならびに方法および使用は、作動可能に少なくとも第１の治療
用薬剤または診断用薬剤に結合される、少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２遮断抗Ｖ
ＥＧＦ抗体、またはそれらの抗原結合フラグメント、必要に応じてモノクローナ
ル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合
するものを含む、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの免疫結
合体を含む組成物に拡張する。ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベ
ースの治療用結合体は、好ましくは、放射線療法薬剤、抗血管形成薬剤、細胞死
誘発薬剤、抗チューブリン薬剤、抗細胞性薬剤または細胞障害性薬剤、あるいは
凝血薬（凝固因子）に連結される。
【０１５２】 従って、本発明は抗体が少なくとも第１の治療用薬剤または診断用薬剤に作動
可能に結合される、ある範囲の結合体化された抗体およびそれらのフラグメント
を提供する。用語「免疫結合体」は、抗体と別の有効な薬剤との有効な結合を規
定するために広く使用され、専ら任意の型の有効な結合をいうことは意図されな
ず、そして特に化学的「結合体化」に限定されない。組換え融合タンパク質が、
特に考慮される。送達薬剤または標的化薬剤が標的に結合し得、そして治療用薬
剤または診断用薬剤が送達の際に十分に機能的である限り、結合の態様は適切で
ある。
【０１５３】 抗体の糖質部分を介する薬剤の結合がまた、考慮される。糖化（Ｏ−結合およ
びＮ−結合の両方）が、抗体内で天然に起こる。組換え抗体は、所望される場合
、追加の糖化部位を再生または生成するために改変され、これは、適切なアミノ
酸配列（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ、Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒ）を
抗体の一次配列内に操作することによって容易に達成される。
【０１５４】 ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの治療用結合体の使用、
および関連した方法および使用のための現在好ましい薬剤は、抗体および／また
は特定の腫瘍の型または患者について選択された抗体の効果を補足するかまたは
向上する薬剤である。「抗体の効果を補足するかまたは向上する治療用薬剤」と
して、放射線療法薬剤、抗血管形成薬剤、細胞死誘発薬剤および抗チューブリン
薬物、本明細書中における使用のために好ましい任意の１つ以上の薬剤が挙げら
れる。
【０１５５】 好ましい薬剤と、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体
との結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）は、「免疫
結合体」を与え、ここで、このような免疫結合体は、しばしば、向上された、さ
らに相乗的な抗腫瘍特性を有する。この様式における使用のための現在好ましい
抗血管形成薬剤は、アンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、エンドスタ
チン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、アンギオポイエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉ
ｎ）、バスクロスタチン（ｖａｓｃｕｌｏｓｔａｔｉｎ）、カンスタチン（ｃａ
ｎｓｔａｔｉｎ）およびマスピン（ｍａｓｐｉｎ）のいずれか１つである。現在
好ましい抗チューブリン薬物として、コルヒチン、タキソール、ビンブラスチン
、ビンクリスチン、ビンデスチンおよびコンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｔａ
ｓｔａｔｉｎ）の１つ以上が挙げられる。
【０１５６】 抗細胞性薬剤および細胞障害性薬剤の使用は、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗
体または２Ｃ３ベースの「免疫毒素」を生じ、一方で、凝固因子の使用は、ＶＥ
ＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの「コアグリガンド（ｃｏａ
ｇｕｌｉｇａｎｄ）」を生じる。少なくとも２つの治療用薬剤（例えば、１つ以
上の放射線療法薬剤、抗血管形成薬剤、細胞死誘発薬剤、抗チューブリン薬物、
抗細胞性薬剤および細胞障害性薬剤および凝固因子の組み合わせ）の使用もまた
考慮される。
【０１５７】 特定の適用において、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの
治療剤は、内皮細胞を殺傷する能力または内皮細胞の増殖または細胞分裂を抑制
する能力を有する細胞障害性薬剤、細胞増殖抑制性薬剤または他の抗細胞性薬剤
に作動可能に結合される。適切な抗細胞性薬剤として、化学療法薬剤、ならびに
細胞毒素および細胞増殖抑制性薬剤が挙げられる。細胞増殖抑制性薬剤は、一般
に、標的細胞の天然の細胞循環を乱し、好ましくはその結果細胞が細胞循環から
取り除かれる、薬剤である。
【０１５８】 代表的な化学療法薬剤として、ステロイド；サイトカイン；抗代謝産物（例え
ば、サイトカインアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキセートまたはア
ミノプテリン）；アントラサイクリン；ミトマイシンＣ；ビンカアルカロイド；
抗生物質；デメコルチン；エトポシド；ミトラマイシン；および抗腫瘍アルキル
化剤（例えば、クロランブシルまたはメルファラン）が挙げられる。実際には、
本明細書中の表Ｃに開示される薬剤のいずれかが使用され得る。特定の好ましい
抗細胞性薬剤は、ＤＮＡ合成インヒビター（例えば、ダウノルビシン、ドキソル
ビシン、アドリアマイシンなど）である。
【０１５９】 特定の治療適用において、他の潜在的な薬剤と比較して、毒素部分は、大部分
の毒素が細胞殺傷効果を送達するはるかに大きな能力のために、好ましい。従っ
て、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体構築物にための
特定の好ましい抗細胞性薬剤は、植物由来毒素、真菌由来毒素、または細菌由来
毒素である。代表的な毒素として、エピポドフィロ毒素（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙ
ｌｌｏｔｏｘｉｎ）；細菌性内毒素または細菌性内毒素の脂質Ａ部分；リボソー
ム不活性化タンパク質（例えば、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）またはゲロニン（
ｇｅｌｏｎｉｎ））；α−サルチン（α−ｓａｒｃｉｎ）；アスペルジリン（ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｉｎ）；レストリクトチン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）；リ
ボヌクレアーゼ（例えば、胎盤リボヌクレアーゼ）；ジフテリア毒素およびシュ
ードモナス体外毒素が挙げられる。
【０１６０】 好ましい毒素は、Ａ鎖毒素（例えば、リシンＡ鎖）である。最も好ましい毒素
部分は、しばしば、糖質残基を改変または除去するように処理されているリシン
Ａであり、「脱グリコシル化したＡ鎖（ｄｇＡ）」と呼ばれる。脱グリコシル化
したリシンＡ鎖は、その極度の効力、長い寿命のため、そしてそれが臨床的な等
級および規模で製造することが経済的に容易であるため、好ましい。組換えリシ
ンＡ鎖および／または短縮型リシンＡ鎖がまた、使用され得る。
【０１６１】 腫瘍標的化および免疫毒素による処置のために、以下の特許および特許出願が
、特に、抗細胞性薬剤および細胞障害性薬剤に関する本教示をさらに補足するた
めに、本明細書中において参考として援用される：米国出願第０７／８４６，３
４９号；同第０８／２９５，８６８（米国特許第６，００４，５５４号）；同第
０８／２０５，３３０号（米国特許第５，８５５，８６６号）；同第０８／３５
０，２１２号（米国特許第５，９６５，１３２号）；同第０８／４５６，４９５
号（米国特許第５，７７６，４２７号）；同第０８／４５７，４８７号（米国特
許第５，８６３，５３８号）；同第０８／４５７，２２９号および同第０８／４
５７，０３１（米国特許第５，６６０，８２７号）および同第０８／４５７，８
６９号（米国特許第６，０５１，２３０号）。
【０１６２】 本発明の２Ｃ３ベースの抗ＶＥＧＦ抗体または他のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧ
Ｆ抗体は、抗チューブリン薬物に連結され得る。本明細書中で使用される「抗チ
ューブリン薬物」は、好ましくは、細胞有糸分裂に必要なチューブリン活性（好
ましくは、チューブリン重合またはチューブリン脱重合）を直接的または間接的
に阻害することによって、細胞有糸分裂を阻害する任意の薬剤、薬物、プロドラ
ッグまたはそれらの組み合わせを意味する。
【０１６３】 本明細書中での使用のための現在好ましい抗チューブリン薬物は、コルヒチン
；タキサン（例えば、タキソール）；ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラス
チン、ビンクリスチンおよびビンデシン）；およびコンブレタスタチン（ｃｏｍ
ｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）である。代表的なコンブレタスタチンは、コンブレタ
スタチンＡ、Ｂおよび／またはＤ（Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３、Ａ−４、Ａ−５、
Ａ−６、Ｂ−１、Ｂ−２、Ｂ−３、Ｂ−４、Ｄ−１およびＤ−２を含む）および
それらのプロドラッグ形態である。
【０１６４】 ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの治療剤は、凝固を促進
し得る成分（すなわち、凝固剤）を含み得る。ここで、標的化抗体は、凝固を直
接的にまたは間接的に刺激する因子に、例えば別の抗体を介して、直接的にまた
は間接的に連結され得る。
【０１６５】 このような使用のための好ましい凝固因子は、Ｔｉｓｓｕｅ Ｆａｃｔｏｒ（
ＴＦ）およびＴＦ誘導体（例えば、短縮型のＴＦ（ｔＴＦ）、二量体化ＴＦ、三
量体化ＴＦ、重合体化ＴＦ／多量体化ＴＦ、および第ＶＩＩ因子を活性化する能
力に欠ける変異体ＴＦ）である。他の適切な凝固因子として、ビタミンＫ依存凝
固剤（例えば、第ＩＩ／ＩＩａ因子、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ
因子および第Ｘ／Ｘａ因子）；Ｇｌａ改変を欠くビタミンＫ依存凝固因子；Ｒｕ
ｓｓｅｌｌクサリヘビ毒液第Ｘ因子活性化剤；血小板活性化化合物（例えば、ト
ロンボキサンＡ2およびトロンボキサンＡ2シンターゼ）；およびフィブリン溶解
のインヒビター（例えば、α２−抗プラスミン）が挙げられる。
【０１６６】 コアグリガンドを用いる腫瘍標的化および処置は、以下の特許および特許出願
に記載され、それらの各々は、特にコアグリガンドおよび凝固因子に関する本教
示をなおさらに補強するために参考として本明細書中に援用される：米国出願第
０７／８４６，３４９号；同第０８／２０５，３３０（米国特許第５，８５５，
８６６号）；同第０８／３５０，２１２号（米国特許第５，９６５，１３２号）
；同第０８／２７３，５６７号；同第０８／４８２，３６９号（米国特許第５，
＿＿，＿＿号；１９９８年１０月２０日に特許証発行料金支払い）；同第０８／
４８５，４８２号；同第０８／４８７，４２７号（米国特許第６，００４，５５
５号）；同第０８／４７９，７３３号（米国特許第第５，８７７，２８９号）；
および同第０８／４７２，６３１；同第０８／４７９，７２７号および同第０８
／４８１，９０４号（米国特許第６，０３６，９５５号）。
【０１６７】 免疫結合体および免疫毒素の調製は、一般的に当該分野において周知である（
例えば、本明細書中において参考として援用される米国特許第４，３４０，５３
５号を参照のこと）。以下の特許および特許出願は、免疫毒素の発生、精製およ
び使用に関する本教示をなおさらに補充するために参考として本明細書中にさら
に援用される：米国出願第０７／８４６，３４９号；同第０８／２９５，８６８
（米国特許第６，００４，５５４号）；同第０８／２０５，３３０号（米国特許
第５，８５５，８６６号）；同第０８／３５０，２１２号（米国特許第５，９６
５，１３２号）；同第０８／４５６，４９５号（米国特許第５，７７６，４２７
号）；同第０８／４５７，４８７号（米国特許第５，８６３，５３８号）；同第
０８／４５７，２２９号および同第０８／４５７，０３１（米国特許第５，６６
０，８２７号）および同第０８／４５７，８６９号（米国特許第６，０５１，２
３０号）。
【０１６８】 免疫結合体および免疫毒素の調製において、特定のリンカーの使用を通して利
点が達成され得る。例えば、立体的に「かさ高い（ｈｉｎｄｅｒｅｄ）」ジスル
フィド結合を含むリンカーは、インビボにおけるそれらのより大きな安定性のた
めに、好ましく、従って作用部位での結合の前の、毒素部分の放出を防止する。
一般に、作用の意図される部位（この点で、結合体が良好な「放出」特性を有す
ることが所望される）を除く身体のいかなる箇所に見出される条件下でインタク
トなままである結合体を有することが所望される。
【０１６９】 使用される特定の毒素化合物に依存して、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体ま
たは２Ｃ３−ベースの抗体および毒素化合物を作動可能に接着するペプチドスペ
ーサーを提供することが必要であり得る。ここで、このペプチドスペーサーは、
ジスルフィド結合したループ構造に折り畳まれ得る。次いで、ループ内のタンパ
ク質分解性切断が、ヘテロダイマーポリペプチドを産生し、ここで、抗体および
毒素化合物は、単一のジスルフィド結合のみによって結合される。
【０１７０】 特定の他の毒素化合物が利用される場合、非切断性ペプチドスペーサーが、Ｖ
ＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３−ベースの抗体および毒素化合物を
作動可能に接着するように提供され得る。非切断性ペプチドスペーサーとともに
使用され得る毒素は、それ自体がタンパク質分解性切断によって細胞傷害性ジス
ルフィド結合形態に変換され得る毒素である。このような毒素化合物の例は、Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素化合物である。
【０１７１】 種々の化学療法剤および他の薬物がまた、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体ま
たは２Ｃ３−ベースの治療法に首尾良く結合体化され得る。抗体に結合体化され
る例示的な抗悪性腫瘍薬としては、ドキソルビシン、ダウノマイシン、メトトレ
キサートおよびビンブラスチンが挙げられる。さらに、他の薬剤（例えば、ネオ
カルチノスタチン、マクロマイシン（ｍａｃｒｏｍｙｃｉｎ）、トレニモン（ｔ
ｒｅｎｉｍｏｎ）およびα−アマニチン）の接着が記載されている（米国特許第
５，６６０，８２７号；同第５，８５５，８６６号；および同第５，９６５，１
３２号を参照のこと；各々は、本明細書中で援用される）。
【０１７２】 本発明者らの以前の研究のうちの１つに鑑みて、コアグリガンド（ｃｏａｇｕ
ｌｉｇａｎｄ）の調製は、ここでまた、容易に行われる。ＶＥＧＦＲ２遮断抗Ｖ
ＥＧＦ抗体または２Ｃ３−ベースの抗体との、１つ以上の凝固因子の作動可能な
会合は、直接的な連結（イムノトキシンについての上記の連結のような）であり
得る。あるいは、作動可能な会合は、間接的な接着（例えば、抗体が、第二の結
合領域、好ましくは、凝固因子に結合する、抗体または抗体の抗原結合領域に作
動可能に接着する場合）であり得る。凝固因子は、特に、共有結合が使用されて
分子を結合する場合に、機能的凝固部位とは異なる部位で、ＶＥＧＦＲ２遮断抗
ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３−ベースの抗体に接着されるべきである。
【０１７３】 間接的に結合したコアグリガンドは、頻繁に、二重特異性抗体に基づく。二重
特異性抗体の調製はまた、当該分野で周知である。一つの調製方法は、一方に標
的化された腫瘍成分についての特異性を有し、そして他方に凝固剤についての特
異性を有する抗体の分離調製を含む。次いで、２つの選択された抗体由来のペプ
シンＦ（ａｂ’γ）2フラグメントが生成され、その後、分離したＦａｂ’γＳ
Ｈフラグメントを提供するように、各々が還元される。次いで、結合されるべき
２つのパートナーのうちの１つに対するＳＨ基が、架橋試薬（例えば、ｏ−フェ
ニレンジマレイミド）を用いてアルキル化されて、１つのパートナー上に遊離の
マレイミド基を提供する。次いで、このパートナーは、チオエーテル結合によっ
て、他に結合体化されて、所望のＦ（ａｂ’γ）2ヘテロ結合体を与え得る（Ｇ
ｌｅｎｎｉｅら、１９８７；本明細書中に参考として援用される）。他のアプロ
ーチ（例えば、ＳＰＤＰまたはプロテインＡを用いた架橋）がまた、実施され得
る。
【０１７４】 二重特異性抗体を生成するための別の方法は、２つのハイブリドーマを融合さ
せて、クアドローマを形成する。本明細書中で使用されるように、用語「クアド
ローマ」は、２つのＢ細胞ハイブリドーマの生産的融合を記載するために使用さ
れる。この標準的技術を使用して、ハイブリドーマを生成する２つの抗体を融合
して娘細胞を与え、次いで、クロノタイプの免疫グロブリン遺伝子の両方のセッ
トの発現を維持する細胞が選択される。
【０１７５】 クアドローマを生成する好ましい方法は、親ハイブリドーマのうちの少なくと
も１つの酵素欠損変異の選択を含む。次いで、この第一の変異ハイブリドーマ細
胞株を、例えば、その連続的生存を妨げるヨードアセトアミドに、致死的に曝露
された第二のハイブリドーマの細胞に融合する。細胞融合は、致死的に処理され
たハイブリドーマから、その酵素欠損についての遺伝子を獲得することによって
、第一のハイブリドーマのレスキューを可能にし、そして第一のハイブリドーマ
への融合を介した第二のハイブリドーマのレスキューを可能にする。同じアイソ
タイプであるが、異なるサブクラスの免疫グロブリンの融合が好ましいが、必要
とはされない。混合されたサブクラスの抗体は、好ましいクアドローマの単離の
ための代替のアッセイの場合に使用され得る。
【０１７６】 マイクロタイター同定実施形態、ＦＡＣＳ、免疫蛍光染色、イディオタイプ特
異的抗体、抗原結合競合アッセイおよび抗体の特徴付けの分野で一般的な他の方
法が使用されて、好ましいクアドローマを同定し得る。クアドローマの単離後、
二重特異性抗体が、他の細胞生成物から離れて精製される。これは、免疫グロブ
リン精製の分野の当業者に公知の、種々の抗体単離手順によって果たされ得る（
例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１
９８８を参照のこと；本明細書中で参考として援用される）。プロテインＡセフ
ァロースカラムまたはプロテインＧセファロースカラムが好ましい。
【０１７７】 免疫結合体、イムノトキシンおよびコアグリガンドの調製において、組換え発
現が利用され得る。選択されたＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３−
ベースの抗体および治療剤、毒素または凝固薬をコードする核酸配列が、発現ベ
クターにおいて、インフレームで接着する。従って、組換え発現は、核酸の翻訳
を生じ、所望の免疫結合体を産生する。化学的架橋剤およびアビジン：ビオチン
架橋がまた、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３−ベースの抗体に治
療剤を結合し得る。
【０１７８】 以下の特許および特許出願が、コアグリガンド調製、精製および使用（二重特
異性抗体コアグリガンドを含む）に関する本教示をいっそうさらに補う目的のた
めに、本明細書中に参考として各々が援用される：米国出願番号０７／８４６，
３４９；０８／２０５，３３０（米国特許第５，８５５，８６６号）；０８／３
５０，２１２（米国特許第５，９６５，１３２号）；０８／２７３，５６７；０
８／４８２，３６９（米国特許第５，＿，＿号；１９９８年１０月２０日に、特
許証発行料金を支払い）；０８／４８５，４８２；０８／４８７，４２７（米国
特許第６，００４，５５５号）；０８／４７９，７３３（米国特許第５，８７７
，２８９号）；０８／４７２，６３１；および０８／４７９，７２７および０８
／４８１，９０４（米国特許第６，０３６，９５５号）。
【０１７９】 放射線療法剤、抗脈管形成因子、アポトーシス誘導因子、抗チューブリン薬物
、毒素および凝固薬との免疫結合体（化学的結合体によって調製されるにせよま
たは組換え発現によって調製されるにせよ）は、生物学的に遊離可能な結合およ
び／または選択的切断可能スペーサーもしくはリンカーを利用し得る。このよう
な組成物は、好ましくは、循環の間に適度に安定であり、そして疾患部位または
腫瘍部位への送達に際して、優先的または特異的に放出される。
【０１８０】 特定の好ましい例は、酸感受性スペーサーであり、ここで、コルヒチンまたは
ドキソルビシンに結合したＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体が特に意図される。
他の好ましい例は、特異的もしくは優先的に存在するか、または疾患部位（例え
ば、腫瘍環境）内で活性である、ペプチダーゼおよび／またはプロテイナーゼの
ための切断部位を含むペプチドリンカーである。疾患部位または腫瘍部位への免
疫結合体の送達は、凝固因子の切断および凝固因子の比較的特異的な放出を生じ
る。
【０１８１】 ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、プラスミン、プラスミノーゲン、ＴＧＦβ
、スタフィロキナーゼ（ｓｔａｐｈｙｌｏｋｉｎａｓｅ）、トロンビン、第ＩＸ
ａ因子、第Ｘａ因子またはメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）（例えば、間質コラ
ゲナーゼ、ゼラチナーゼまたはストロメライシン）についての切断部位を含むペ
プチドリンカーは、米国特許第５，８７７，２８９号（本明細書中でこのような
目的のために参考として援用され、そして本明細書中の表Ｂ２において、さらに
例示される）に記載され、そしてこの米国特許第５，８７７，２８９号によって
可能にされるように、特に好ましい。
【０１８２】 ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体はまた、誘導体化されて、官能基を導入し、
生物学的に遊離可能な結合を介した治療剤の接着を可能にし得る。従って、標的
化抗体が誘導体化されて、側鎖を導入し、ヒドラジド基、ヒドラジン基、一級ア
ミン基または二級アミン基を終端し得る。治療剤は、シッフ塩基結合、ヒドラゾ
ンまたはアシルヒドラゾン結合もしくはヒドラジドリンカーを介して結合体化さ
れ得る（米国特許第５，４７４，７６５号および同第５，７６２，９１８号、各
々は、本明細書中で参考として具体的に援用される）。
【０１８３】 本来抗脈管形成性であろうと脈管標的化ベースであろうと、本発明の組成物お
よび方法は、他の治療法および診断法と組み合わせて使用され得る。本発明に従
って、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体と「組み合わせた」使用のための生物学
的因子（好ましくは、診断剤または治療剤）（例えば、２Ｃ３ベースの抗体）と
いう点では、用語「組み合わせた」は、簡潔に使用されて、実施形態の範囲にわ
たる。「組み合わせた」用語は、特に明記しない限り、科学用語から明らかであ
り、従って、組み合わせた組成物、医薬、カクテル、キット、方法ならびに第一
の医療用使用および第二の医療用使用の種々の型に適用する。
【０１８４】 従って、本発明の「組み合わせた」実施形態は、例えば、ＶＥＧＦＲ２遮断抗
ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体が、裸の抗体であり、そしてその抗体に
作動可能に接着しない、薬剤または治療剤と組み合わせて使用される場合を含む
。このような場合において、薬剤または治療剤は、非標的化形態または標的化形
態で使用され得る。「非標的化形態」において、薬剤（特に、治療剤）は、一般
的に、当該分野におけるその標準的使用に従って使用される。「標的化形態」に
おいて、薬剤は、一般的に、脈管形成疾患部位または腫瘍へ薬剤または治療剤を
送達する、異なる抗体または標的化領域に作動可能に接着する。生物学的薬剤の
このような標的化形態の使用（診断法および治療法の両方）がまた、当該分野で
かなり標準的である。
【０１８５】 本発明の他の「組み合わせた」実施形態において、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧ
Ｆ抗体または２Ｃ３ベースの抗体は、免疫結合体であり、ここで、抗体は、それ
自体、薬剤または治療剤と作動可能に会合するか、または結合する。特定の好ま
しい例において、薬剤（診断剤および治療剤を含む）は、「２Ｃ３標的化薬剤」
である。作動可能な接着は、本明細書中に記載され、そして当該分野で公知のよ
うに、直接的接着および間接的接着のすべての形態を含む。
【０１８６】 「組み合わせた」使用（特に、治療剤と組み合わせたＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥ
ＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体という点において）はまた、組み合わせた組
成物、医薬、カクテル、キット、方法ならびに第一の医療用使用および第二の医
療用使用を含み、ここで、治療剤は、プロドラッグの形態にある。このような実
施形態において、薬物の機能的形態へプロドラッグを変換し得る活性化成分は、
本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体と、再び作
動可能に会合し得る。
【０１８７】 特定の好ましい実施形態において、治療組成物、組み合わせ、医薬、カクテル
、キット、方法ならびに第一の医療用使用および第二の医療用使用は、「２Ｃ３
プロドラッグ組み合わせ」である。当業者によって理解されるように、用語「２
Ｃ３プロドラッグ組み合わせ」は、特に明記しない限り、２Ｃ３ベースの抗体が
、活性薬物にプロドラッグを変換し得る成分に作動可能に接着することを意味し
、２Ｃ３ベースの抗体が、プロドラッグ自体に接着することを意味しない。しか
し、本発明のプロドラッグ実施形態が、２Ｃ３プロドラッグ組み合わせとして使
用される必要条件は存在しない。従って、プロドラッグは、当該分野において使
用される任意の様式（ＡＤＥＰＴおよび他の形態を含む）で使用され得る。
【０１８８】 従って、組み合わせた組成物、医薬、カクテル、キット、方法ならびに第一の
医療用使用および第二の医療用使用が、好ましくは、診断剤およびより好ましく
は、治療剤という点において記載され、組み合わせとしては、裸の抗体および免
疫結合体である、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、２Ｃ３ベースの抗
体）が挙げられ、ここで、本発明のインビボ実施形態の実施は、裸の抗体または
免疫結合体および生物学的因子、診断剤または治療剤の、前投与、同時投与また
は引き続く投与を含む；いくつかの結合体化形態または非結合体化形態の限りは
、抗体のいくつかの形態、および生物学的因子、診断剤または治療剤のいくつか
の形態の供給全体が達成される。
【０１８９】 本発明の特に好ましい組み合わせた組成物、方法および使用は、ＶＥＧＦＲ２
遮断抗ＶＥＧＦ抗体およびエンドスタチンを含むものである（米国特許第５，８
５４，２０５号、特に、本明細書中で参考として援用される）。これらは、ＶＥ
ＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３構築物が、裸の抗体または免疫結合体
である場合を含み：そして免疫結合体の場合、ここで、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥ
ＧＦ抗体または２Ｃ３は、エンドスタチン（必要に応じて、アンギオテンシンを
伴う）と結合し；ここで、組み合わせた治療方法または使用は、エンドスタチン
（必要に応じて、アンギオテンシンを伴う）の前投与、同時投与または引き続く
投与を含み；いくつかの結合体化形態または非結合体化形態の限りは、２Ｃ３、
エンドスタチンおよび必要に応じてアンギオテンシンの供給全体が達成される。
コラゲナーゼと作動可能に会合する、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２
Ｃ３ベースの抗体がまた、コラゲナーゼとして提供され、腫瘍に特異的に送達さ
れる場合、インサイチュでエンドスタチンを産生し、類似の利益を達成する。
【０１９０】 腫瘍に対する本発明の効果の、上述の説明および他の説明は、単純化のために
なされ、操作の組み合わせた様式、接着因子の型などを説明する。この記述的ア
プローチは、本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗
体の有利な性質の、控えめな表現または単純化のいずれかのように解釈されるべ
きではない。従って、このような抗体自身が、抗脈管形成性質およびＶＥＧＦ中
和性質（例えば、ＶＥＧＦの生存機能を中和する）ことが理解され、そしてこの
ような抗体の免疫結合体が、これらの性質を維持し、そしてこれらの性質を接着
因子の性質と結合することが理解される；そしてさらに、抗体および任意の接着
因子の組み合わせた効果が、代表的には、増大されそして／または拡大されるこ
とが理解される。
【０１９１】 従って、本発明は、組成物、薬学的組成物、治療キットおよび医療用カクテル
を提供し、これらは、必要に応じて、少なくとも第一の組成物またはコンテナ中
に、生物学的に有効量の少なくとも第一のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必
要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ１５９５）と実質的
に同じエピトープに結合するものを含むか、またはこのような抗ＶＥＧＦ抗体の
、抗原結合フラグメントもしくは免疫結合体を含む；そして生物学的に有効量の
少なくとも第二の生物学的因子、成分または系を含む。
【０１９２】 「少なくとも第二の生物学的因子、成分または系」は、しばしば、治療剤もし
くは診断剤、成分または系であるが、しばしば、治療剤もしくは診断剤、成分ま
たは系ではない。例えば、少なくとも第二の生物学的因子、成分または系は、抗
体の改変のための成分および／または抗体への他の因子の接着のための成分を含
み得る。特定の好ましい第二の生物学的因子、成分または系は、プロドラッグ、
またはプロドラッグを作製しそして使用するための成分であり、この成分は、プ
ロドラッグ自身を作製するための成分および本発明の抗体を適応させるための成
分を含み、このようなプロドラッグまたはＡＤＥＰＴ実施形態において機能する
。
【０１９３】 治療剤または診断剤が、少なくとも第二の生物学的因子、成分または系として
含まれる場合、このような治療法および／または診断法は、代表的には、脈管形
成疾患と関係した使用のためのものである。このような因子は、米国特許第５，
７１２，２９１号、同第５，７５３，２３０号、同第５，９７２，９２２号、同
第５，６３９，７５７号、ＷＯ９８／４５３３１およびＷＯ９８／１６５５１（
各々は、本明細書中で参考として具体的に援用される）のいずれか１つに開示さ
れるような、疾患または障害の、処置または診断における使用に適切な因子であ
る。
【０１９４】 処置されるべき疾患が癌である場合、「少なくとも第二の抗癌因子」は、治療
キットまたはカクテルに含まれる。用語「少なくとも第二の抗癌因子」は、ＶＥ
ＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３構築物（第一の抗癌因子である）を参
照して選択される。従って、本発明の抗体は、化学療法剤、放射線療法剤、サイ
トカイン、抗脈管形成因子、アポトーシス誘導因子または抗癌イムノトキシンも
しくはコアグリガンドと組み合わせられ得る。
【０１９５】 本明細書中で使用されるように、「化学療法剤」は、悪性腫瘍の処置において
使用される、古典的な化学療法剤または薬物をいう。この用語は、他の化合物が
、抗癌効果を発揮する点において、化学療法剤として専門的に記載され得るとい
う事実にもかかわらず、単純化のために使用される。しかし、「化学療法」は、
当該分野において、異なる意味を有するようになり、そしてこの標準的な意味に
従って使用されている。多くの例示的な化学療法剤が、本明細書中で記載される
。当業者は、容易に化学療法剤の使用および適切な用量を理解するが、用量は、
本発明と組み合わせて使用される場合に減少され得る。
【０１９６】 「化学療法剤」とまたよばれ得る新規のクラスの薬物は、アポトーシスを誘導
する因子である。このような薬物のうちのいずれか１つ以上（遺伝子、ベクター
、アンチセンス構築物およびリボザイムを含む）はまた、適切なように、本発明
と組み合わせて使用され得る。現在好ましい第二の因子は、抗脈管形成因子（例
えば、アンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、エンドスタチン（ｅｎｄ
ｏｓｔａｔｉｎ）、バスキュロスタチン（ｖａｓｃｕｌｏｓｔａｔｉｎ）、カン
スタチン（ｃａｎｓｔａｔｉｎ）およびマスピン（ｍａｓｐｉｎ））である。
【０１９７】 他の例示的な抗癌因子としては、例えば、ネオマイシン、ポドフィロトキシン
、ＴＮＦ−α、αvβ3アンタゴニスト、カルシウムイオノフォア、カルシウムフ
ラックス誘導因子、およびその任意の誘導体またはプロドラッグが挙げられる。
現在好ましい抗チューブリン薬物としては、コルヒチン、タキソール、ビンブラ
スチン、ビンクリスチン、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｃｉｎｅ）、コンブレタス
タチン（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）またはその誘導体もしくはプロドラッ
グが挙げられる。
【０１９８】 抗癌イムノトキシンまたはコアグリガンドは、抗癌因子にさらに適切である。
「抗癌イムノトキシンまたはコアグリガンド」あるいは標的化因子／治療剤構築
物は、標的化因子（腫瘍細胞、腫瘍脈管構造または腫瘍ストロマの、標的可能成
分または接近可能成分に結合し、そして治療剤（細胞傷害性因子（イムノトキシ
ン）および凝固因子（コアグリガンド）を含む）に作動可能に接着する、抗体ま
たはその抗原結合フラグメントを含む）に基づく。腫瘍細胞、腫瘍脈管構造また
は腫瘍ストロマの、「標的可能成分または接近可能成分」は、好ましくは、表面
発現成分、表面接近可能成分、または表面局在化成分であるが、ネクローシス細
胞、またはそうでなければ傷害性腫瘍細胞あるいは血管内皮細胞から放出される
成分（サイトゾルおよび／または核の腫瘍細胞抗原を含む）がまた標的化され得
る。
【０１９９】 抗体標的化剤および非抗体標的化剤の両方が用いられ得、これには以下が挙げ
られる：ＶＥＧＦおよびＦＧＦのような増殖因子；腫瘍脈管構造に特異的に結合
するトリペプチドＲ−Ｇ−Ｄを含有するペプチド；ならびにアネキシンおよび関
連するリガンドのような他の標的化成分。
【０２００】 抗腫瘍細胞イムノトキシンまたはコアグリガンドは、Ｂ３（ＡＴＣＣ ＨＢ
１０５７３）、２６０Ｆ９（ＡＴＣＣ ＨＢ ８４８８）、Ｄ６１２（ＡＴＣＣ
ＨＢ ９７９６）およびＫＳ１／４と称される抗体からなる群により例証され
る抗体を含み得る。このＫＳ１／４抗体は、ベクターｐＧＫＣ２３１０（ＮＲＲ
Ｌ Ｂ−１８３５６）またはベクターｐＧ２Ａ５２（ＮＲＲＬ Ｂ−１８３５７
）を含む細胞から得られた。
【０２０１】 壊死腫瘍細胞から放出される細胞内成分に結合する抗体またはその抗原結合領
域を含む、抗腫瘍細胞標的化剤もまた意図される。好ましくは、このような抗体
は、透過性となるように誘導され得る細胞中、または実質的にすべての壊死細胞
および正常細胞の細胞ゴースト中に存在するが、哺乳動物の正常な生細胞の外側
では存在しないかもしくはアクセス可能でない、不溶性の細胞内抗原に結合する
、モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントである。
【０２０２】 米国特許第５，０１９，３６８号、同第４，８６１，５８１号、および同第５
，８８２，６２６号（各々、Ａｌａｎ Ｅｐｓｔｅｉｎおよび共同研究者らに対
して発行）は、インビボにおいて悪性細胞からアクセス可能となる細胞内抗原に
特異的な抗体を作製および使用する方法を、よりさらに記載および教示する目的
で、各々詳細に、本明細書中で参考として援用される。記載される抗体は、哺乳
動物悪性細胞の内部細胞性成分に対して十分に特異的であるが、外部細胞性成分
に対しては特異的ではない。例示的な標的としては、ヒストンが挙げられるが、
壊死腫瘍細胞から特異的に放出されるすべての細胞内成分が、包含される。
【０２０３】 血管新生化腫瘍を有する動物または患者への投与に際して、インビボで生じそ
して悪性細胞の少なくとも一部分に壊死を引き起こす腫瘍リモデリングのプロセ
スに起因して、血管新生化腫瘍は天然に壊死腫瘍細胞を含むという事実によって
、このような抗体は、悪性細胞に局在化する。さらに、腫瘍壊死を増強する他の
治療と組合せたこのような抗体の使用は、標的化療法およびその後の治療の有効
性を増強させるために供される。
【０２０４】 従って、抗体のこれらの型は、一般的に本明細書中に開示されるように、アン
ギオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）と直接的または間接的に結合させる
ように使用され得、そして血管新生化腫瘍内の壊死悪性細胞にアンギオポエチン
を投与するように使用され得る。
【０２０５】 米国特許第５，０１９，３６８号、同第４，８６１，５８１号、および同第５
，８８２，６２６号（各々、本明細書中で参考として援用される）においても開
示されるように、これらの抗体は、組合せ診断方法（以下を参照のこと）および
抗腫瘍治療の有効性を測定するための方法において使用され得る。このような方
法は、一般的に、標識化バージョンの抗体の調製および投与、ならびに壊死組織
内に優先的に結合された内部細胞性成分標的への標識化抗体の結合を測定するこ
とを包含する。それによって、この方法は、壊死組織を画像化する。ここで、局
在化した抗体濃度は、腫瘍の存在の指標であり、そして抗腫瘍治療によって殺傷
された細胞のゴーストを示す。
【０２０６】 抗腫瘍支質イムノトキシンまたはコアグリガンドは、フィブリン、ＲＩＢＳま
たはＬＩＢＳへの結合により例証されるように、一般的に、結合組織成分、基底
膜成分、または活性化血小板成分に結合する抗体を含む。
【０２０７】 抗腫瘍脈管構造のイムノトキシンまたはコアグリガンドは、血管新生化腫瘍の
血液輸送血管（好ましくは腫瘍内血管）の表面発現成分、表面アクセス可能成分
、または表面局在化成分に結合するリガンド、抗体またはそれらのフラグメント
を含み得る。このような抗体は、血管新生化腫瘍の腫瘍内血管の表面発現成分に
結合する抗体を含む。これには、以下が挙げられる：腫瘍内脈管構造細胞表面レ
セプター（例えば、エンドグリン（ＴＥＣ−４抗体およびＴＥＣ−１１抗体））
、ＴＧＦβレセプター、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＶＣＡＭ−１、ＩＣ
ＡＭ−１、ＰＳＭＡ、ＶＥＧＦ／ＶＰＦレセプター、ＦＧＦレセプター、ＴＩＥ
、αvβ3インテグリン、プレイオトロピン、エンドシアリンならびにＭＨＣクラ
スＩＩタンパク質。この抗体はまた、腫瘍内血管のサイトカイン誘導性成分また
は凝血剤誘導性成分に結合し得る。特定の好ましい薬剤は、アミノリン脂質（例
えば、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルエタノールアミン）に結合す
る。
【０２０８】 他の抗腫瘍脈管構造イムノトキシンまたはコアグリガンドは、腫瘍内脈管構造
細胞表面レセプターに結合するリガンドまたは増殖因子に結合する抗体またはそ
れらのフラグメントを含み得る。このような抗体は、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ（ＧＶ３
９およびＧＶ９７抗体）、ＦＧＦ、ＴＧＦβ、ＴＩＥに結合するリガンド、腫瘍
関連フィブロネクチンアイソフォーム、散乱因子／肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、
血小板因子４（ＰＦ４）、ＰＤＧＦおよびＴＩＭＰと結合する抗体を含む。これ
らの抗体またはそれらのフラグメントはまた、リガンド：レセプター複合体また
は増殖因子：レセプター複合体に結合し得るが、リガンドもしくは増殖因子また
はレセプターがリガンド：レセプター複合体または増殖因子：レセプター複合体
中にない場合、リガンドにも増殖因子にもレセプターにも結合し得ない。
【０２０９】 抗腫瘍細胞、抗腫瘍支質または抗腫瘍脈管構造抗体−治療剤構築物は、植物由
来毒素、真菌由来毒素、または細菌由来毒素のような抗脈管形成剤、アポトーシ
ス誘発剤、抗チューブリン薬、細胞傷害性薬剤を含み得る。リシンＡ鎖および脱
グリコシル化リシンＡ鎖が、しばしば好ましい。抗腫瘍細胞、抗腫瘍支質または
抗腫瘍脈管構造抗体−治療剤構築物は、凝血剤（直接的または間接的に作用する
凝固因子）に結合する凝固因子または第２の抗体結合領域（凝固因子に結合する
）を含み得る。組織因子または組織因子誘導体（例えば、短縮された組織因子）
との作動可能な結合が、しばしば好ましい。
【０２１０】 本発明の組成物、キット、および／または医薬に関して、治療剤の併用有効量
は、単一の容器もしくは容器手段内に含まれても、または異なる容器もしくは容
器手段内に含まれてもよい。反応混液は、一般的に、併用使用のために共に混合
される。静脈内投与のために処方される薬剤が、しばしば好ましい。画像化成分
もまた、含まれ得る。キットはまた、少なくとも第１の抗体、および１以上の他
に含まれる生物学的薬剤の使用に関する指示書を備え得る。
【０２１１】 該して、少なくとも第２の抗癌剤は、ＶＥＧＦＲ２−遮断（ＶＥＧＦＲ２−ｂ
ｌｏｃｋｉｎｇ）、抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの治療剤と実質的に同時
に、動物または患者に投与され得る（例えば、単一の薬学的組成物から、または
密接して一緒に投与される２つの薬学的組成物から）。
【０２１２】 あるいは、少なくとも第２の抗癌剤は、ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体ま
たは２Ｃ３ベースの治療剤の投与に対して逐次的な時間に、動物または患者に投
与され得る。「逐次的な時間」は、本明細書中で使用される場合、「時差的（ｓ
ｔａｇｇｅｒｅｄ）」を意味し、その結果、少なくとも第２の抗癌剤は、ＶＥＧ
ＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの治療剤の投与と異なる時点で
、動物または患者に投与される。一般的に２つの薬剤は、その２つの薬剤が、そ
れらの個々の治療効果を発揮するのを可能にするに有効な時間間隔を隔てた時点
で投与される（すなわち、２つの薬剤は、「生物学的に有効な時間間隔」で投与
される）。少なくとも第２の抗癌剤は、ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体また
は２Ｃ３ベースの治療剤の前に、生物学的に有効な時間に動物または患者に投与
され得るか、あるいは、それらの治療剤に対して逐次的に、生物学的に有効な時
間に動物または患者に投与され得る。
【０２１３】 従って、本発明は、血管新生化腫瘍を有する動物または患者を処置するための
方法を提供し、この方法は、以下を包含する： （ａ）腫瘍負荷量を実質的に減少させる第１の処置に、動物または患者を供す
る工程；および （ｂ）引き続いて、任意の残存する腫瘍細胞からの転移を阻害するに有効な量
で、少なくとも第１の抗脈管形成剤を、この動物または患者に投与する工程であ
って；ここで、この第１の抗脈管形成剤は、少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮
断抗ＶＥＧＦ抗体またはその抗原結合フラグメントであるか、必要に応じて、モ
ノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピト
ープに結合するものであり；必要に応じて、この抗体またはフラグメントは、第
２の抗脈管形成剤と作動可能に連結される、工程。
【０２１４】 好ましい第１の処置としては、外科的切除および化学療法介入が挙げられる。
併用される抗脈管形成剤（例えば、アンギオポエチン２または腫瘍標的化アンギ
オポエチン２構築物）もまた使用され得る。
【０２１５】 血管新生化腫瘍を有する動物または患者についての他の処置方法は、以下を包
含する： （ａ）実質的に腫瘍壊死を誘導するに有効な量で、第１の抗体−治療剤構築物
を、動物または患者に投与する工程であって；ここで、この第１の抗体−治療剤
構築物は、腫瘍細胞、腫瘍脈管構造または腫瘍支質の表面発現成分、表面アクセ
ス可能成分、または表面局在化成分に結合する第１の抗体またはその抗原結合フ
ラグメントに作動可能に連結された治療剤を含む、工程；および （ｂ）引き続いて、任意の残存する腫瘍細胞からの転移を阻害するに有効な量
で、第２の抗体を、この動物または患者に投与する工程であって；ここで、この
第２の抗体は、少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体またはその
抗原結合フラグメントであるか、必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（Ａ
ＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するものであり；
そしてさらに必要に応じて、この抗体またはフラグメントは、第２の抗脈管形成
剤と作動可能に連結される、工程。
【０２１６】 特に好ましい実施形態では、本発明は、プロドラッグおよびＡＤＥＰＴと組合
せての使用のための、ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体および２Ｃ３ベースの
抗体を提供する。このような組成物、配合物（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）、医薬
品、キット、方法および使用において、ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体もし
くは２Ｃ３ベースの抗体またはそれらのフラグメントは、変換能力または酵素学
的能力を提供するように改変されるか、または少なくとも１つのプロドラッグを
その薬物の活性形態に変換し得る少なくとも第１の変換剤または酵素に作動可能
に連結（好ましくは、共有結合または結合体化）される。
【０２１７】 酵素的または酵素に結合体化された抗体またはフラグメントは、「プロドラッ
グ」の最初の別個の処方物と組合せられる。プロドラッグは、不活性または弱い
活性の形態の薬物であり、これは、ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２
Ｃ３抗体に付随した酵素的能力、変換機能または酵素との接触に際して、活性形
態の薬物に変換される。
【０２１８】 従って、好ましくは別個の組成物および／または容器中に、以下を含むキット
が提供される： （ａ）生物学的有効量の少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体
もしくは２Ｃ３ベースの抗体、またはそれらのフラグメントであって、これらは
酵素学的機能を有し、好ましくはここで、この抗体またはフラグメントは、少な
くとも第１の酵素と作動可能に連結されるか、共有結合されるか、または結合体
化される、生物学的有効量の少なくとも第１の第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥ
ＧＦ抗体もしくは２Ｃ３ベースの抗体、またはそれらのフラグメント；および （ｂ）生物学的有効量の少なくとも第１の実質的に不活性なプロドラッグであ
って、ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体もしくは２Ｃ３抗体、またはフラグメ
ントの酵素学的機能、またはそれらに結合されるか、連結されるか、もしくは結
合体化された酵素によって、実質的に活性な薬物に変換される、生物学的有効量
の少なくとも第１の実質的に不活性なプロドラッグ。
【０２１９】 本発明はさらに、以下を包含する、有利な方法および使用を提供する： （ａ）少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体もしくは２Ｃ３ベ
ースの抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントを含む、生物学的有効量の少
なくとも第１の薬学的組成物を、血管新生化腫瘍を有する動物または患者に投与
する工程であって、ここで、この抗体またはフラグメントは、酵素学的機能を有
し、好ましくはここで、この抗体またはフラグメントは、少なくとも第１の酵素
と作動可能に連結されるか、共有結合されるか、または結合体化され；ここで、
この抗体またはフラグメントは、投与後に、血管新生化腫瘍の脈管構造、腫瘍内
脈管構造、または支質に局在化する、工程；および （ｂ）引き続いて、有効な期間後に、生物学的有効量の少なくとも１つの実質
的に不活性なプロドラッグを含む、生物学的有効量の少なくとも第２の薬学的組
成物を、動物または患者に投与する工程であって；ここで、このプロドラッグは
、この血管新生化腫瘍の脈管構造、腫瘍内脈管構造、または支質内に局在化され
たＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体もしくは２Ｃ３抗体、またはフラグメント
の酵素学的機能、またはそれらに連結されるか、結合されるか、または結合体化
された酵素によって、実質的に活性な薬物に変換される、工程。
【０２２０】 特定の他の実施形態では、本発明の抗体および免疫結合体は、１以上の診断剤
、代表的に、新脈管形成性疾患に関連した使用のための診断剤と組合せられ得る
。従って、一定範囲の診断用組成物、キット、および方法が、本発明に包含され
る。
【０２２１】 癌の診断および処置に関して、本発明の診断用および画像化用の組成物、キッ
トおよび方法は、インビボおよびインビトロでの診断を包含する。例えば、血管
新生化腫瘍は、診断的に有効な量の腫瘍診断成分（これは、インビボでの診断用
画像化剤に作動可能に結合された、腫瘍細胞、腫瘍脈管構造、または腫瘍支質の
アクセス可能な成分に結合する少なくとも第１の結合領域を含む）を使用して、
画像化され得る。
【０２２２】 腫瘍画像化は、好ましくは、腫瘍脈管構造または腫瘍支質のアクセス可能な成
分に結合する少なくとも第１の結合領域を含む診断成分を使用して、血管新生化
腫瘍の支質および／または脈管構造の画像を提供するように実施される。任意の
適切な結合領域または抗体（例えば、治療用構築物に関して上記されたもの）が
、使用され得る。検出可能に標識されたＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体もし
くは２Ｃ３ベースの抗体構築物を使用することによって、特定の利点が提供され
、ここで、形成される画像は、使用される治療剤の結合部位に予言的である。
【０２２３】 検出可能に標識されたインビボ腫瘍診断剤（ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗
体もしくは２Ｃ３ベースの抗体であっても、そうでなくても良い）は、以下を含
み得る：Ｘ線検出可能化合物（例えば、ビスマス（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、ラ
ンタン（ＩＩＩ）、または鉛（ＩＩ））；放射性イオン（例えば、銅67、ガリウ
ム67、ガリウム68、インジウム111、インジウム113、ヨウ素123、ヨウ素125、ヨ
ウ素131、水銀197、水銀203、レニウム186、レニウム188、ルビジウム97、ルビ
ジウム103、テクネチウム99m、またはイットリウム90）；核磁気スピン共鳴同位
体（例えば、コバルト（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、クロム（ＩＩＩ）、ジスプロシウ
ム（ＩＩＩ）、エルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（
ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）
、ニッケル（ＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、バナジウ
ム（ＩＩ）、またはイッテルビウム（ＩＩＩ））；あるいはローダミンまたはフ
ルオレセイン。
【０２２４】 腫瘍処置の前の前画像化は、以下によって実施され得る： （ａ）腫瘍細胞、腫瘍脈管構造（好適）または腫瘍支質（好適）のアクセス可
能な成分に結合する少なくとも第１の結合領域に作動可能に連結された診断剤（
ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体もしくは２Ｃ３ベースの抗体構築物に作動可
能に連結された診断剤）を含む、診断的に有効な量の薬学的組成物を、動物また
は患者に投与する工程；および （ｂ）引き続いて、腫瘍細胞、腫瘍血管（好適）または腫瘍支質（好適）に結
合された、検出可能に標識された第１の結合領域（すなわち、ＶＥＧＦＲ２−遮
断抗ＶＥＧＦ抗体もしくは２Ｃ３ベースの抗体）を検出する工程であって；これ
によって、腫瘍、腫瘍脈管構造および／または腫瘍支質の画像を得る、工程。
【０２２５】 癌の処置はまた、以下によって実施され得る： （ａ）腫瘍結合剤、またはＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体もしくは２Ｃ３
ベースの抗体に作動可能に連結された診断剤を含む、診断的に最少の量の少なく
とも第１の検出可能に標識された腫瘍結合剤（好ましくは、ＶＥＧＦＲ２−遮断
抗ＶＥＧＦ抗体もしくは２Ｃ３ベースの抗体構築物）を、血管新生化腫瘍を有す
る動物または患者に投与し、それによって腫瘍、腫瘍脈管構造（好適）、または
腫瘍支質（好適）の検出可能な画像を形成することによって、血管新生化腫瘍の
画像を形成する工程；および （ｂ）引き続いて、少なくとも第１の裸のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体
もしくは２Ｃ３抗体または治療剤−抗体構築物の治療的に最適な量を、このよう
な抗体を使用して、同じ動物または患者に投与し、それによって抗腫瘍効果をも
たらす工程。
【０２２６】 従って、画像化および処置の処方物または医薬が提供され、これは一般的に、
以下を含む： （ａ）診断的に有効な量の検出可能に標識された腫瘍結合剤（好ましくは、Ｖ
ＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体構築物）を含む第１
の薬学的組成物であって、腫瘍結合剤またはＶＥＧＦＲ２−遮断、抗ＶＥＧＦ抗
体もしくは２Ｃ３ベースの抗体に作動可能に連結された、検出可能な薬剤を含む
、第１の薬学的組成物；および （ｂ）治療的有効量の少なくとも１つの裸のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗
体もしくは２Ｃ３抗体、またはこのような抗体を用いた治療剤−抗体構築物を含
む、第２の薬学的組成物。
【０２２７】 本発明はまた、生物学的有効量の少なくとも１つの診断剤を含む、少なくとも
１つの第一の組成物または薬学的組成物を含むインビトロの診断キットを提供す
し、診断剤は、少なくとも第一のＶＦＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じ
て、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じ
エピトープに結合するもの、またはその抗原結合フラグメントと作動可能に連結
される。
【０２２８】 本発明はなおさらに、診断剤が、その本体の外、好ましくは動物または患者か
ら得られる生物学的サンプルにおいて行われる試験と関連した使用のために意図
される、組み合わされたキットを提供する。それとして、本発明は、一般的に少
なくとも二つの異なる容器において、少なくとも第一の組成物、薬学的組成物ま
たは医薬カクテル（ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｏｃｋｔａｉｌ）を含み、これらは
、生物学的有効量の少なくとも第一のＶＥＧＦＲ２遮断、抗ＶＥＧＦ抗体、必要
に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的
に同じエピトープに結合するもの、またはこのような抗ＶＥＧＦ抗体の抗原結合
フラグメントまたは免疫結合体；およびインビトロの使用のために、生物学的有
効量の少なくとも一つの診断薬剤、成分または系を含む）、キットを提供する。
【０２２９】 「インビトロでの使用のための診断剤、成分または系」は、脈管形成の要素を
有する１つ以上の疾患の診断を可能にする、任意の診断剤または薬剤の組み合わ
せである。従って、インビトロでの診断は、以下のいずれか１つで開示されるよ
うな疾患または障害に関連した診断または予後の情報の作成において使用するの
に適切な診断を含む：米国特許第５，７１２，２９１号、同第５，７５３，２３
０号、同第５，９７２，９２２号、同第５，６３９，７５７号、 ＷＯ ９８／
４５３３１およびＷＯ ９８／１６５５１（各々が詳細に、参考として本明細書
中に援用される）。
【０２３０】 癌診断および処置の点で、インビトロでの診断薬は、腫瘍細胞、腫瘍脈管構造
（好ましくは）または腫瘍支質（好ましくは）の接近可能な成分に結合する、少
なくとも第一の結合領域を含む診断成分（これは、インビトロ診断試験により直
接的にまたは間接的に検出可能な「検出可能な因子またはレポーター因子」に作
動可能に結合される）を好ましくは含む。インビトロで直接的に検出可能な「検
出可能な因子またはレポーター因子」は、免疫蛍光検査により検出可能な、放射
性標識およびレポーター薬剤のような因子を含む。
【０２３１】 インビトロで間接的に検出可能な「検出可能な因子またはレポーター因子」は
、さらなる内因性因子と共に機能する因子（例えば、色素基質と接触して、着色
産物を生成する検出可能な酵素）を含む。インビトロでの間接的な検出はまた、
検出可能な成分またはレポーター成分あるい系に及ぶ。これらは、第一の結合領
域に免疫特異性を有する少なくとも１つの検出抗体と組み合わせて、腫瘍細胞、
腫瘍脈管構造（好ましくは）または腫瘍支質（好ましくは）のアクセス可能な成
分に結合する第一の結合領域を含む。「検出抗体」は、好ましくは、直接的また
は間接的に検出可能な因子（例えば、放射性標識または酵素）に結合する「２次
抗体」である。あるいは、「２次および３次抗体検出系」が使用され得、この系
は、１次検出抗体に対して免疫特異性を有する２次検出抗体と組み合わせて、第
一の結合領域に対する免疫特異性を有する１次検出抗体を含み、この２次検出抗
体は、直接的または間接的に検出可能な因子に結合される。
【０２３２】 （例示的実施形態の説明） 固形腫瘍および癌腫は、人類における全ての癌の９０％以上の割合を占める。
モノクローナル抗体およびイムノトキシンの使用はリンパ腫および白血病の治療
において検討されてきたが、これらの薬剤は、癌腫および他の固形腫瘍に対する
臨床試験では、期待に反して効果がなかった（ＡｂｒａｍおよびＯｌｄｈａｍ、
１９８５）。抗体を基礎とする処置が効果が不十分であることの主な理由は、高
分子が容易に固形腫瘍に輸送されないことである。腫瘍塊内に一旦はいっても、
これらの分子は、腫瘍細胞間の固い結合、線維性支質、間質の圧勾配、および結
合部位障壁の存在に起因して均一に分布され得ない（Ｄｖｏｒａｋら、１９９１
）。
【０２３３】 固形腫瘍を処置するための新しい戦略の開発において、腫瘍細胞よりもむしろ
腫瘍の血管の標的化を含む方法が明白な利点を提供する。腫瘍血管の効果的な破
壊またはブロックは、腫瘍を通じる血流を停止させ、そして腫瘍細胞死の殺到を
生じる。抗体―トキシンおよび抗体−凝集素構築物は、特異的な標的化および腫
瘍血管の破壊にすでに有効に用いられ、腫瘍壊死を生じる（Ｂｕｒｒｏｗｓら、
１９９２；ＢｕｒｒｏｗｓおよびＴｈｏｒｐｅ、１９９３；ＷＯ９３／１７７１
５；ＷＯ９６／０１６５３；米国特許第５，８５５，８６６号；同第５，８７７
，２８９号；同第５，９６５，１３２号；同第６，０５１，２３０号；同第６，
００４，５５５号；米国特許出願第０８／４８２，３６９号（１９９８年１０月
２０日に発行料金支払い済み）；それぞれ、本明細書において参考として援用さ
れる）。
【０２３４】 抗体、増殖因子または他の結合リガンドが腫瘍血管へ凝固剤を特異的に送達す
るために用いられる場合、このような薬剤は、「コアグリガンド（ｃｏａｇｕｌ
ｉｇａｎｄｓ）」と名付けられる。現在、コアグリガンドに用いるのに好ましい
凝固剤は、短縮化組織因子（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｆａｃｔｏｒ
（ｔＴＦ）である（Ｈｕａｎｇら、１９９７；ＷＯ ９６／０１６５３；米国特
許５，８７７，２８９号）。ＴＦは、血液凝固の主要な開始因子（ｉｎｉｔｉａ
ｔｏｒ：イニシエーター）である（Ｒｕｆら、１９９１）。損傷の部位では、血
液中の第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子は、脈管周囲組織における細胞の上のＴＦに接触
し、そして結合する。ＴＦ：ＶＩＩａ複合体は、リン脂質表面の存在下において
、第ＩＸ因子および第Ｘ因子を活性化する。次に、これは、トロンビンおよびフ
ィブリンの形成、そして最終的に血餅の形成を導く（ＲｕｆおよびＥｄｇｉｎｇ
ｔｏｎ、１９９４）。
【０２３５】 腫瘍内皮で利用可能である（しかし、正常な内皮には大きく欠乏している）適
切な標的分子の範囲は、記載されている。例えば、以下のような、発現された標
的が、利用され得る：エンドグリン、Ｅセレクチン、Ｐセレクチン、ＶＣＡＭ−
１、ＩＣＡＭ−１、ＰＳＭＡ、ＴＩＥ、ＬＡＭ−１と反応性のリガンド、ＶＥＧ
Ｆ／ＶＰＦレセプター、ＦＧＦレセプター、αVβ3インテグリン、プレイトロピ
ンまたはエンドシアリン（米国特許５，８５５，８６６号、同第５，８７７，２
８９号および同第６，００４，５５５号；Ｂｕｒｒｏｗｓら、１９９２；Ｂｕｒ
ｒｏｗｓおよびＴｈｏｒｐｅ，１９９３；Ｈｕａｎｇら，１９９７；それぞれは
、本明細書において参考として援用される）。
【０２３６】 天然の腫瘍環境またはヒトによる以下の介入により誘導可能な他の標的はまた
、標的可能な存在である。これは米国特許第５，７７６，４２７号、および同第
６，０３６，９５５号；それぞれは本明細書に参考として援用されている）に記
載されている。正常組織における事前の抑制および腫瘍血管誘導と組み合わせて
用いた場合、ＭＨＣクラスＩＩ抗原はまた、標的として使用され得る（米国特許
第５，７７６，４２７号；同第６，００４，５５４号および同第６，０３６，９
５５号；それぞれは、本明細書において参考として援用される）。
【０２３７】 吸着された標的は、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦβ、ＨＧＦ、ＰＦ４、ＰＤＧＦ
、ＴＩＭＰ、ＴＩＥに結合するリガンド、または腫瘍関連フィブロネクチンアイ
ソフォームのような別の適切なグループである（米国特許第５，８７７，２８９
号、および同第５，９６５，１３２号；それぞれは、本明細書において参考とし
て援用される）。フィブロネクチンのアイソフォームは、レセプターのインテグ
リンファミリーに結合するリガンドである。腫瘍関連フィブロネクチンアイソフ
ォームは、腫瘍血管および腫瘍支質の両方の標的化可能な成分である。
【０２３８】 このような臨床的標的化適用のための１つの現在好まれるマーカーは、レセプ
ター関連ＶＥＧＦである。実際、ＶＥＧＦの集合：レセプター複合体は、現在ま
でに観察される腫瘍脈管構造の最も特異的なマーカーの１つである （米国特許
第５，８７７，２８９号；同第５，９６５，１３２号および同第６，０５１，２
３０号；Ｌｉｎ−Ｋｅら、１９９６；Ｄｖｏｒａｋら、１９９１ｂ）。
【０２３９】 ＶＥＧＦ：レセプター複合体は、腫瘍内皮に対する薬物または他のエフェクタ
ーの特異的な送達のための、魅力的な標的を提示する。−−なぜなら、腫瘍は、
サイトカインおよび増殖因子で富化され、そしてなぜなら、ＶＥＧＦレセプター
は、ほとんどの固形腫瘍において見出される低酸素状態下でアップレギュレート
されるからである（Ｍａｚｕｒｅら、１９９６；Ｆｏｒｓｙｔｈｅら、１９９６
；Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら、１９９６；Ｇｅｒｂｅｒら、１９９７；Ｋｒｅ
ｍｅｒら、１９９７）。腫瘍の微小環境に特異的なリガンドおよびそのレセプタ
ーの両方のアップレギュレートは、正常組織における上皮と比較して、腫瘍血管
内皮において高濃度で占められたレセプターに導く（米国特許第５，８７７，２
８９号および同第５，９６５，１３２号）。Ｄｖｏｒａｋおよび仲間はまた、Ｖ
ＥＧＦのＮ末端に対して指向されたウサギポリクローナル抗体が、マウス保有（
ｂｅａｒｉｎｇ）同系腫瘍に注射後、選択的に腫瘍血管を染色する（Ｌｉｎ−Ｋ
ｅら、１９９６）。
【０２４０】 臨床的介入に対する標的としてのＶＥＧＦの役割は、免疫毒素またはコアグリ
ガンド治療に限られない。実際、ＶＥＧＦは、固形腫瘍の新脈管形成に関与する
鍵となる因子の１つであり（Ｆｅｒｒａｒａ、１９９５；Ｐｏｔｇｅｎｓら、１
９９５）、強力な透過性因子（Ｓｅｎｇｅｒら、１９８３；Ｓｅｎｇｅｒら、１
９９０；Ｓｅｎｇｅｒら、１９８６）および内皮細胞マイトジェン（Ｋｅｃｋら
、１９８９；Ｃｏｎｎｏｌｌｙら、１９８９；Ｔｈｏｍａｓ、１９９６）である
。ＶＥＧＦと新脈管形成との間の関連は、ＶＥＧＦ介入の目的とされる種々の治
療的ストラテジーの提案に導いた（Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒら、１９９８）。
【０２４１】 （Ａ．ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦレセプター） 血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、低酸素および腫瘍変異によりにより誘導さ
れる多機能性サイトカインである。ＶＥＧＦは、胚発生における血管ネットワー
クの発生および維持の初期の刺激薬である。これは、強力な透過性誘導因子、内
皮細胞走化性因子、内皮生存因子、および内皮細胞増殖因子である（Ｔｈｏｍａ
ｓ。１９９６；Ｎｅｕｆｅｌｄら、１９９９）。この活性は、正常胚発生に必要
とされる（Ｆｏｎｇら、１９９５；Ｓｈａｌａｂｙら、１９９５）。なぜなら、
ＶＥＧＦの１つまたは両方の対立遺伝子の標的化された破壊は、胚性致死を生じ
るからである（Ｃａｒｍｅｌｉｅｅｔら、１９９６；Ｆｅｒｒａｒａら、１９９
６）。
【０２４２】 ＶＥＧＦは、多数の生理学的および病理学的プロセスにおいて新脈管形成また
は脈管形成を駆動する重要な因子であり、創傷治癒（Ｆｒａｎｋら、１９９５；
Ｂｕｒｋｅら、１９９５）、糖尿病性網膜症（Ａｌｏｎ、１９９５；Ｍａｌｅｃ
ａｚｅ、１９９４）、乾癬（Ｄｅｔｍａｒら、１９９４）、アテローム性動脈硬
化症（Ｉｎｏｕｅら、１９９８）、慢性関節リウマチ（Ｈａｒａｄａら、１９９
８；Ｎａｇａｓｈｉｍａら、１９９９）、固形腫瘍増殖（Ｐｌａｔｅら、１９９
４；Ｃｌａｆｆｅｙら１９９６）を含む。
【０２４３】 広範な種々の細胞および組織は、ＶＥＧＦを産生し、ＶＥＧＦは、同じ遺伝子
によりコードされるスプライス改変体である、少なくとも５つのアイソフォーム
（１２１、１４５、１６５、１８９および２０６アミノ酸）に存在する（Ｈｏｕ
ｃｋら、１９９１；Ｆｅｒｒａｒａら、１９９１；Ｔｉｓｃｈｅｒら、１９９１
）。２つのより小さいアイソフォーム（１２１および１６５）は、細胞から分泌
される（Ｈｏｕｃｋら、１９９１；Ａｎｔｈｏｎｙら、１９９４）。分泌される
ＶＥＧＦは、モノマーが２つのジスルフィド結合により結合される３８〜４６ｋ
Ｄａとの間の偏性（ｏｂｌｉｇａｔｅ）ダイマーである。
【０２４４】 ＶＥＧＦダイマーは、高い親和性で２つの十分に特徴化されたレセプター（Ｖ
ＥＧＦＲ１（ＦＬＴ−１）およびＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１））に結合
し、これらのレセプターは内皮細胞で選択的に発現される（Ｆｌｔ−１およびＦ
ｌｋ−１は、マウスの相同体である）。ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２に対す
るＶＥＧＦ結合のＫdは、それぞれ、１５〜１００ｐＭおよび４００〜８００ｐ
Ｍである（Ｔｅｒｍａｎ １９９４）。最近同定された第３細胞表面タンパク質
（ニューロピリン−１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１））はまた、高い親和性によ
りＶＥＧＦに結合する（Ｏｌａｎｄｅｒら、１９９１；ＤｅＶｒｉｅｓら、１９
９２；Ｔｅｒｍａｎら、１９９２；Ｓｏｋｅｒら、１９９８）。
【０２４５】 ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２は、ＩＩＩ型レセプターチロシンキナーゼ（
ＲＴＫ ＩＩＩ）ファミリーのメンバーであり、このファミリーは、７つの細胞
外ＩｇＧ様リピート、単一の架橋（ｓｐａｎｎｉｎｇ）膜貫通ドメイン、および
細胞内スプリット（ｓｐｌｉｔ）チロシンキナーゼドメインにより特徴付けられ
る（ＭｕｓｔｏｎｅｎおよびＡｌｉｔａｌｏ、１９９５）。非常に最近まで、Ｖ
ＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２が、内皮細胞においてほとんど独占的に発現され
ていると考えられていた（ＭｕｓｔｏｎｅｎおよびＡｌｉｔａｌｏ、１９９５）
。ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２が、内皮細胞増殖、移動、および分化を刺激
することに関して異なる機能を有すると報告されているが（Ｗａｌｔｅｎｂｅｒ
ｇｅｒら、１９９４；Ｇｕｏら、１９９５）、各レセプターがＶＥＧＦ生物学お
よび内皮細胞ホメオスタシスにおいて果たす正確な役割は、本発明の以前には明
確に規定されていなかった。
【０２４６】 ノックアウトマウスを用いた最近の研究は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１およびＶ
ＥＧＦＲ２の各々が脈管形成、新脈管形成および胚発生に不可欠であることを示
した（Ｆｏｎｇら、１９９５；Ｓｈａｌａｂｙら、１９９５；Ｈｉｒａｔｓｕｋ
ａら、１９９８）。致死ノックアウトの研究において、各レセプターの欠損に関
連した表現型は、異なった。ＶＥＧＦＲ２の標的化された破壊は、内皮細胞分化
に欠陥があり、そして卵黄嚢の血糖を形成できないか、または脈管形成を終える
ことができない胚を生じる（Ｓｈａｌａｂｙら、１９９５）。ＶＥＧＦＲ１ヌル
変異体は、脈管形成障害、内皮細胞の乱された集合、および血管の拡張を示す（
Ｆｏｎｇら、１９９５；Ｈｉｒａｔｓｕｋａら、１９９８）。ＶＥＧＦＲ１は、
明らかにきわめて重要な生物学的役割を有する。
【０２４７】 ＶＥＧＦＲ１は、より低いチロシンキナーゼ活性を有するが、ＶＥＧＦＲ１は
、ＶＥＧＦＲ２よりＶＥＧＦに対してより高い親和性を有する。これは、ＶＥＧ
ＦＲ１の細胞外ドメインが、特に重要であることを示唆する。この仮説は、イン
タクトなＶＥＧＦ結合ドメインを残す一方、ＶＥＧＦＲ１のチロシンキナーゼド
メインが欠失されたノックアウトマウスにおける研究からの結果により強く示唆
された（Ｈｉｒａｔｓｕｋａら、１９９８）。ＶＥＧＦＲ１−チロシンキナーゼ
欠陥胚は、正常な血管を発生し、そして限定された期間まで生存した（Ｈｉｒａ
ｔｓｕｋａら、１９９８）。
【０２４８】 初期ノックアウト（Ｆｏｎｇら、１９９５；Ｓｈａｌａｂｙら、１９９５）に
加えて、Ｈｉｒａｔｓｕｋａら（１９９８）の研究は、ＶＥＧＦＲ１が重要な生
物学的役割を有することを示す。しかし、チロシンキナーゼシグナルは、決定的
な因子ではないようである。ＶＥＧＦＲ１ノックアウトマウス由来のマクロファ
ージは、ＶＥＧＦ誘導走化性を示さず（Ｈｉｒａｔｓｕｋａら、１９９８；参考
として本明細書中で援用される）、それにより、ＶＥＧＦに対するこの重要な生
物学的応答を媒介するのに関わるレセプターとしてＶＥＧＦＲ１が関係すること
を示したことは興味深い。
【０２４９】 あるグループが、ＶＥＧＦ誘導有糸分裂、および透過性における優性シグナル
レセプターである、ＶＥＧＦＲ２を報告した（Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら、１
９９４；Ｚａｃｈａｒｙ、１９９８；ＫｏｒｐｅｌａｉｎｅｎおよびＡｌｉｔａ
ｌｏ、１９９８）。マクロファージ移動および走化性における機能が、上記のＨ
ｉｒａｔｓｕｋａら（１９９８）の研究において立証されているが、内皮細胞機
能におけるＶＥＧＦＲ１の役割は、ほとんど明らかではない。
【０２５０】 Ｃｌａｕｓｓら（１９９６；本明細書中で参考として援用される）はまた、Ｖ
ＥＧＦＲ１が、単球活性および走化性において重要な役割を有することを報告し
た。実際、マクロファージ／単球系統の細胞は、ＶＥＧＦＲ１のみを発現し、こ
のレセプターは、単球補充およびプロコアギュラント活性を媒介するのに関係す
るレセプターである（Ｃｌａｕｓｓら、１９９６）。単球およびマクロファージ
におけるＶＥＧＦＲ１に対するＶＥＧＦ結合はまた、細胞内カルシウムを惹起し
、そしてチロシンリン酸化を誘導することにより作用する（Ｃｌａｕｓｓら、１
９９６）。
【０２５１】 ＶＥＧＦレセプターに対するＶＥＧＦダイマーの結合は、レセプター二量体化
を誘導すると考えられる。次いで、レセプターの二量体化は、それぞれ、ＶＥＧ
ＦＲ２およびＶＥＧＦＲ１の細胞内側における、特異的なチロシン残基（Ｙ８０
１およびＹ１１７５、ならびにＹ１２１３およびＹ１３３３）の自己リン酸基転
移を引き起こす。これは、シグナルトランスダクションカスケードに導き、この
カスケードは、ホスホリパーゼＣγ（ＰＬＣγ）およびホスファチジルイノシト
ール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の活性ならびに細胞内カルシウムイオンの増大を
含む（ＨｏｏｄおよびＭｅｉｎｉｎｇｅｒ、１９９８；Ｈｏｏｄら、１９９８；
ＫｒｏｌｌおよびＷａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ、１９９８）。
【０２５２】 多くのグループが、一酸化窒素（ＮＯ）がＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦ活性後に産
生されることを示しているが、ＶＥＧＦ誘導シグナルにおけるさらに下流の細胞
内事象は、あまり明らかではない（ＨｏｏｄおよびＭｅｉｎｉｎｇｅｒ、１９９
８；Ｈｏｏｄら、１９９８；ＫｒｏｌｌおよびＷａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ、１９
９８）。ＶＥＧＦＲ１ではなくＶＥＧＦＲ２の活性が、ＶＥＧＦにより、Ｓｒｃ
およびＲａｓ−ＭＡＰキナーゼカスケード（ＭＡＰキナーゼ、ＥＲＫ １および
ＥＲＫ ２を含む）を活性化することもまた示された（Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅ
ｒら、１９９４、１９９６；ＫｒｏｌｌおよびＷａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ、１９
９７）。
【０２５３】 特に、Ｆｌｔ−１チロシンキナーゼ欠陥マウスが、生存可能であり、そして正
常な管を発生するように、内皮細胞機能におけるＶＥＧＦＲ１の役割は、ほとん
ど明らかではない（Ｈｉｒａｔｓｕｋａら、１９９８）。内皮におけるＶＥＧＦ
Ｒ１の主な生物学的役割が、非シグナルリガンド結合分子、またはＶＥＧＦＲ２
に対してＶＥＧＦを提示するのに必要とされ得る、「おとり」レセプターとして
の役割であることが示唆されている。
【０２５４】 ＶＥＧＦと病理学的脈管形成状態との間の関連が、ＶＥＧＦ活性をブロックす
る種々の試みを促している。これらは、ＶＥＧＦに対する特定の中和抗体の発生
を含む（Ｋｉｍら、１９９２；Ｐｒｅｓｔａら、１９９７；Ｓｉｏｕｓｓａｔら
、１９９３；Ｋｏｎｄｏら、１９９３；Ａｓａｎｏら、１９９５）。ＶＥＧＦレ
セプターに対する抗体もまた、記載されている（例えば、米国特許第５，８４０
，３０１号および同第５，８７４，５４２号、ならびに、本発明に引き続いて、
ＷＯ ９９／４０１１８において記載される）。米国特許第５，８４０，３０１
号および同第５，８７４，５４２号が、実際、ＶＥＧＦ自体ではなく、ＶＥＧＦ
レセプターをブロックすることが、種々の理由のために都合が良いことを示唆し
ている。
【０２５５】 可溶性レセプター構築物（ＫｅｎｄａｌｌおよびＴｈｏｍａｓ、１９９３；Ａ
ｉｅｌｌｏら、１９９５；Ｌｉｎら、１９９８；Ｍｉｌｌａｕｅｒら、１９９６
）、チロシンキナーゼインヒビター（Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒら、１９９８）、ア
ンチセンスストラテジー、ＲＮＡアプタマーおよびＶＥＧＦまたはＶＥＧＦレセ
プターに対するリボザイムもまた、報告されている（Ｓａｌｅｈら、１９９６；
Ｃｈｅｎｇら、１９９６；Ｋｅら、１９９８；Ｐａｒｒｙら、１９９９；各々が
参考として本明細書中に援用される）。
【０２５６】 （Ｂ．抗ＶＥＧＦ抗体） （Ｂ１．抗体特性の範囲） 種々の阻害方法の応用は、ＶＥＧＦシグナル伝達を妨害することにより、新脈
管形成のブロッキングおよび／または腫瘍増殖の抑制のいずれかにおいて少なく
ともいくらか効果的であると示されている。実際に、ＶＥＧＦに対するモノクロ
ーナル抗体は、マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片増殖、および腹水形成を阻害
すると示されている（Ｋｉｍら、１９９３；Ａｓａｎｏら、１９９５；１９９８
；Ｍｅｓｉａｎｏら、１９９８；Ｌｕｏら、１９９８ａ；１９９８ｂ；Ｂｏｒｇ
ｓｔｒｏｍら、１９９６；１９９８）。
【０２５７】 抗体Ａ４．６．１は、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２の両方に対するＶＥＧ
Ｆの結合をブロックし得る、高親和性の抗ＶＥＧＦ抗体である（Ｋｉｍら、１９
９２；Ｗｉｅｓｍａｎｎら、１９９７；Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８）。Ａ４．６
．１のＦａｂフラグメントにより結合されたＶＥＧＦの、アラニン走査突然変異
誘発およびＸ線結晶学は、Ａ４．６．１が結合するＶＥＧＦのエピトープがアミ
ノ酸８９〜９４のあたりに中心を有することを示した。この構造的データは、Ａ
４．６．１が、最もありそうには立体障害により、ＶＥＧＦがＶＥＧＦＲ２に結
合することを完全に阻害するが、ＶＥＧＦがＶＥＧＦＲ１に結合することを阻害
することを実証する（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８；Ｋｅｙｔら、１９９６；各々
が、本明細書中に参考として援用される）。
【０２５８】 Ａ４．６．１は、現在まで文献において最も広範囲に利用されている、中和抗
ＶＥＧＦ抗体である。これは、マウスにおける種々のヒト腫瘍の増殖およびＶＥ
ＧＦ誘導血管透過性を阻害することが示されている（Ｂｒｅｍ、１９９８；Ｂａ
ｃａら、１９９７；Ｐｒｅｓｔａら、１９９７；Ｍｏｒｄｅｎｔｉら、１９９９
；Ｂｏｒｇｓｔｒｏｍら、１９９９；Ｒｙａｎら、１９９９；Ｌｉｎら、１９９
９；各々が、具体的に本明細書中に参考として援用される）。Ａ４．６．１はま
た、十分に特徴付けられたヒト卵巣癌マウスモデルにおける腹水形成、および新
規な転移マウスモデルにおける腫瘍播種を阻害する。Ａ４．６．１は、一価ファ
ージディスプレイ技術により最近ヒト化され、そして現在は、抗癌剤としての第
Ｉ段階の臨床試行中である（Ｂｒｅｍ、１９９８；Ｂａｃａら、１９９７；Ｐｒ
ｅｓｔａら、１９９７；各々が、本明細書中に参考として援用される）。
【０２５９】 ＶＥＧＦに対する中和抗体を用いた当該分野におけるいくつかの成功にもかか
わらず、本発明者らは、新たな抗体（特に、ＶＥＧＦＲ１（ＦＴＬ−１）および
／またはＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）との相互作用の、より正確に規定
された様式を有するもの）が、種々の理由から有利であることを理解した。例え
ば、２つのＶＥＧＦレセプターのうちの一方のみとのＶＥＧＦの相互作用を選択
的にブロックする、抗ＶＥＧＦ抗体の開発は、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２
の両方を発現する細胞におけるＶＥＧＦにより活性化される経路の、より正確な
分析を、可能にする。
【０２６０】 本発明者らは、１つのレセプター（ＶＥＧＦＲ２）のみに結合するＶＥＧＦを
ブロックした、規定されたエピトープ特異性の抗体が、同様に、臨床的利点を、
もちろん、これらのインビボでの環境内での阻害効果の維持に依存して、有し得
ると考えた。Ｈｉｒａｔｓｕｋａら（１９９８）のノックアウトマウスでの試験
は、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２の両方が、重要な生物学的役割を有するこ
とを示す。本発明の前に、２つのレセプターのうちの一方のみにより、ＶＥＧＦ
により媒介される効果を阻害することに関する、治療的調査のための現実的な機
会は、効果的なあつらえの阻害的薬剤の欠乏により、妨害された。
【０２６１】 本発明者らは、最初に、種々のエピトープ特異性および特性を有する、ある範
囲の新たな抗ＶＥＧＦ抗体を開発した。ＶＥＧＦ：レセプター（Ｆｌｋ−１）複
合体またはＶＥＧＦ自体に対するモノクローナル抗体を分泌する、６群のハイブ
リドーマを提供する。抗体群のうちの５つはＶＥＧＦのそのレセプターへの結合
を妨害しないが、１つは、この相互作用をブロックし（２Ｃ３群）、そして内皮
細胞のＶＥＧＦにより媒介される増殖を、阻害した。
【０２６２】 ３Ｅ７、ＧＶ３９Ｍ、および２Ｃ３の群の抗体（これらは全て、ヒト腫瘍異種
移植片を有するマウスに静脈内注射した後に、腫瘍に選択的に局在化する）は、
現在、固形腫瘍の脈管構造または結合組織の標的化、画像化および処置において
使用するために、好ましい。
【０２６３】 ＶＥＧＦ：レセプター複合体を認識する本発明のモノクローナル抗体は、ヒト
腫瘍異種移植片を有するマウスに注射した後に、腫瘍内皮細胞へと選択的に局在
化する。２Ｃ３群のモノクローナル抗体は、腫瘍の脈管周囲の結合組織、および
周囲の腫瘍脈管にも、著しく局在化する。
【０２６４】 Ｎ末端を認識する抗体は、ＥＬＩＳＡにより、レセプター結合ＶＥＧＦと反応
する。ＧＶ３９Ｍおよび１１Ｂ５は、非レセプター結合ＶＥＧＦとは対照的に、
レセプター結合ＶＥＧＦに対する高い特異性を示す。恐らく、Ｎ末端上のＧＶ３
９Ｍおよび１１Ｂ５により認識されるエピトープは、構造的であり、そしてＶＥ
ＧＦがそのレセプターに結合する場合に、作製される。これらの抗体は両方Ｉｇ
Ｍであり、従って大きさが大きいという事実は、これらのＶＥＧＦ：レセプター
複合体に対する選択性にとって重要であり得る。
【０２６５】 抗Ｎ末端抗体は、ＶＥＧＦにより媒介される内皮細胞増殖を阻害しなかった。
このことは、ＶＥＧＦのＮ末端がレセプター相互作用に関与しないこと、および
ＶＥＧＦのＮ末端に対する抗体がＶＥＧＦにより媒介されるシグナル伝達を妨害
しないことを示唆する。
【０２６６】 対照的に、２Ｃ３は、３ｎＭのＩＣ50で、内皮細胞のＶＥＧＦにより媒介され
る増殖を阻害する。ＫＤＲ発現内皮細胞（ＡＢＡＥ細胞）を用いる125Ｉ−ＶＥ
ＧＦ結合試験は、２Ｃ３が、ＶＥＧＦのＫＤＲへの結合を、濃度依存の様式でブ
ロックすることを実証した。従って、２Ｃ３は、ＶＥＧＦのそのレセプターへの
結合を妨害することにより、インビトロで、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２）により媒介
されるＶＥＧＦ活性を中和し得る。
【０２６７】 免疫組織化学的分析は、ＧＶ３９Ｍ、１１Ｂ５、３Ｅ７、および７Ｇ３が、脈
管内皮の断片に直接適用される場合に、脈管内皮と中程度〜強力に反応すること
を、明らかにした。ＧＶ３９Ｍは、腫瘍内非細胞に対する最も高い特異性を示し
、腫瘍細胞または結合組織の染色がかなり少ない。１１Ｂ５、３Ｅ７、および７
Ｇ３は、低濃度で適用される場合に、内皮細胞を優先的に染色するが、より高い
濃度において、腫瘍細胞および結合組織を別々に染色する。
【０２６８】 １１Ｂ５、３Ｅ７および７Ｇ３で観察される染色パターンは、ＶＥＧＦの特定
のコンホメーションについて優先を有さないＶＥＧＦに対するポリクローナル抗
体を使用する場合に見られる染色の型に代表的である（Ｌｉｎ−Ｋｅら、１９９
６；Ｐｌａｔｅら、１９９４；Ｃｌａｆｆｅｙら、１９９６）。ＧＶ３９Ｍによ
る内皮の選択的な染色は、これがこれらの細胞上のＶＥＧＦ：レセプター複合体
に結合することを示唆し、そしてレセプターの内皮細胞位置、およびＧＶ３９Ｍ
がＥＬＩＳＡにおいてＶＥＧＦ：ｓＦｌｋ−１に選択的に結合するという事実と
一致する。
【０２６９】 同様に、３Ｅ７および７Ｇ３のより広い染色パターンは、これらが遊離ＶＥＧ
Ｆおよびレセプター結合ＶＥＧＦの両方を認識する能力に一致する。しかし、１
１Ｂ５は、内皮に対してより制限された染色パターンを有すると予測された。な
ぜなら、これは、捕捉ＥＬＩＳＡにおいてＶＥＧＦ：Ｆｌｋ−１を強く好むから
である（表２を参照のこと）。１１Ｂ５が、間質成分に結合するＶＥＧＦを認識
し得ることは可能であり、腫瘍断片におけるより広い反応性パターンを与える。
【０２７０】 ３Ｅ７およびＧＶ３９Ｍは、インビボで、腫瘍組織の脈管内皮細胞に選択的に
局在化し、一方で２Ｃ３は、内皮に加えて、腫瘍の脈管周囲の結合組織に局在化
する。腫瘍を有するマウスへの静脈内注射の２４時間後に、３Ｅ７は、腫瘍以外
のいかなる組織の内皮でも検出可能ではなかった。他方で、ＧＶ３９Ｍもまた、
腎臓の糸球内の内皮細胞または血管間膜細胞に結合する。ＧＶ３９Ｍの、マウス
腎臓血管間膜細胞との反応性の理由は、明らかではない。抗体が、腎臓の正常な
内皮細胞上のＶＥＧＦ：レセプター複合体に結合することが、可能である（Ｔａ
ｋａｈａｓｈｉら、１９９５）。しかし、同型の株１０腫瘍を有するモルモット
における局在化試験は、ＧＶ３９Ｍが腫瘍血管に局在化するが、他の正常な組織
における糸球または脈管には局在化しないことを示した。
【０２７１】 ３Ｅ７およびＧＶ３９Ｍが腫瘍内皮に特異的に局在化する能力は、恐らく、少
なくとも２つの要因の結果である。第一に、ＶＥＧＦ：レセプター複合体は、腫
瘍血管に対して比較的豊富である。なぜなら、低酸素性腫瘍微小環境は、腫瘍細
胞によるＶＥＧＦ発現を、そして内皮細胞によるＶＥＧＦレセプター発現を、刺
激するからである。第二に、腫瘍血管は、正常な血管より透過性であり（Ｙｕａ
ｎら、１９９６）、このことは、抗体が、脈管の管腔から離れた面に濃縮してい
るようであるＶＥＧＦ：レセプター複合体に、より多くアクセスすることを可能
にし得る（Ｌｉｎ−Ｋｅら、１９９６；Ｈｏｎｇら、１９９５）。
【０２７２】 Ｌｉｎ−Ｋｅおよび共同研究者らによる以前の研究（１９９６）において、ラ
ットＶＥＧＦのＮ末端に指向されるウサギポリクローナル抗体は、ＴＡ３／Ｓｔ
マウス乳癌またはＭＯＴ卵巣癌を有するマウスへの注射後に、腫瘍内皮細胞に局
在化することが見出された。対照的に、全ＶＥＧＦタンパク質に指向するウサギ
ポリクローナル抗体（Ａｂ−６１８）は、これらの腫瘍においても、腫瘍自体の
他の位置においても、内皮細胞に特異的に局在化しなかった。
【０２７３】 これらの結果に基づいて、Ｌｉｎ−Ｋｅら（１９９６）は、ＶＥＧＦが毛細血
管内皮と会合した後にＶＥＧＦのＮ末端が抗体を結合する能力を有すること、お
よび無細胞ＶＥＧＦまたは非内皮細胞と結合したＶＥＧＦのプールが、非Ｎ末端
エピトープに指向する抗ＶＥＧＦ抗体を濃縮するには十分ではないことを、結論
付けた（Ｌｉｎ−Ｋｅら、１９９６）。ＶＥＧＦのＮ末端に指向する３Ｅ７およ
びＧＶ３９Ｍを用いた本結果は、これらの結論を支持する。
【０２７４】 しかし、２Ｃ３群の抗体（これは、ＶＥＧＦの非Ｎ末端エピトープに指向する
）がマウスの固形腫瘍の脈管構造および脈管周囲の結合組織の両方に局在化する
という、本発明の知見は、Ｌｉｎ−Ｋｅら（１９９６）の研究より顕著に驚くべ
きことである。本発明は、ＶＥＧＦの「プール」が、腫瘍支質に存在し、そして
実際に、腫瘍質量における２Ｃ３の濃縮を可能にすることを、提唱する。このよ
うな腫瘍支質の標的化は、以前の刊行物の研究からは予測し得なかった。本発明
者らは、ＶＥＧＦが、腫瘍中のヘパリンスルフェートプロテオグリカン（ＨＳＰ
Ｇ）に結合し得ることを考慮するが、作用の機構の理解は、本発明を実施する際
に特に必要ではない。
【０２７５】 本発明の初期の結論は、ＧＶ３９Ｍ群および３Ｅ７群の抗体はマウスの腫瘍内
皮細胞に選択的に局在化するが、２Ｃ３群の抗体は、腫瘍内皮細胞および腫瘍の
脈管周囲の結合組織に局在化する、ということである。ＶＥＧＦおよびそのレセ
プターの分布は、マウスおよびヒトにおいて類似であるので、これらの抗体は、
ガン患者において類似のパターンの局在化を示すことが、考慮される。従って、
ＧＶ３９Ｍおよび３Ｅ７は、ヒトにおける腫瘍脈管に治療薬または診断薬剤の送
達における使用が予測され、一方で２Ｃ３群の抗体は、腫瘍脈管および腫瘍結合
組織への、治療剤または診断薬剤の標的化のためのビヒクルとして、考慮される
。
【０２７６】 （Ｂ２．ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体および抗２Ｃ３抗体） ２Ｃ３群の抗体のさらなる研究は、なおさらなる驚くべき特性を明らかにし、
本発明の効果的な組成物および使用を生じた。
【０２７７】 ＥＬＩＳＡ、レセプター結合アッセイおよびレセプター活性化アッセイを使用
してなされた、本発明の重要は発見は、２Ｃ３群のモノクローナル抗体が、ＶＥ
ＧＦのＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／ＦＬＫ−１）との相互作用を選択的にブロックす
るが、ＶＥＧＦＲ１（ＦＬＴ−１）との相互作用をブロックしないことである。
２Ｃ３抗体は、ＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦにより誘導されるリン酸化を阻害し、そ
してＶＥＧＦにより誘導される透過性をブロックし、このことは、ＶＥＧＦＲ２
をＶＥＧＦにより誘導される透過性の原因となるレセプターとして関連させる。
２Ｃ３抗体はまた、強力な抗腫瘍活性を有し、当該分野において認証されている
ヒト癌の動物モデルにおいて、種々の確立されたヒト固形腫瘍の増殖を停止させ
る。
【０２７８】 これらの発見は、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２の両方を発現する細胞にお
いて、ＶＥＧＦにより活性化される経路を分析する際に、２Ｃ３が有用ではない
ことを実証し、腫瘍の増殖および生存のプロセスにおけるＶＥＧＦＲ２活性の重
要性を強調している。より重要なことには、これらは、治療的介入の独自の様式
を提供し、マクロファージ走化性、破骨細胞および軟骨吸収細胞の機能（ＶＥＧ
ＦＲ１により媒介される）の付随した阻害なしに、ＶＥＧＦＲ２により誘導され
る新脈管形成の特異的な阻害を可能にする。
【０２７９】 従って、２Ｃ３を考慮する発見は、初めて、ＶＥＧＦＲ２のみに結合してＶＥ
ＧＦＲ１には結合しないＶＥＧＦを阻害する、抗ＶＥＧＦ抗体の作製および使用
の動機および手段を提供する。このような抗体は、簡潔に「ＶＥＧＦＲ２遮断抗
ＶＥＧＦ抗体」と称され、当該分野における利点を示し、そして多数の利点を提
供する（いずれも、結合体化していない、すなわち「裸の」形態での使用、およ
び他の治療薬剤と結合体化した、すなわち会合した場合の使用の意味で）。
【０２８０】 本発明のインビトロ結合研究（精製レセプタータンパク質を用いてＥＬＩＳＡ
および同時沈降アッセイを利用する）は、２Ｃ３が、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２へ
の結合をブロックすることを実証した。驚くべきことに、２Ｃ３は、どのアッセ
イにおいてもＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ１への結合を阻害しなかった。最初の結果を
確認するために結合ＥＬＩＳＡを異なる構成において反復した。各々の構成にお
いて、その結果は、２Ｃ３はＶＥＧＦ：ＶＥＧＦＲ１相互作用を妨げないことを
示した。これらの研究のコントロールとして、モノクローナル抗体３Ｅ７（ＶＥ
ＧＦのＮＨ2−末端に対する抗体）を使用した。これは、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ
１に対する結合も、ＶＥＧＦＲ２に対する結合も妨げなかった。
【０２８１】 従って、本発明の抗体の２Ｃ３群は、ＶＥＧＦに対する他の遮断抗体（Ａ４．
６．１を含む）を超えて有意に改善されている。Ａ４．６．１抗ＶＥＧＦ抗体は
、ＶＥＧＦがＶＥＧＦレセプター両方に結合することをブロックする。結晶学的
研究および変異誘発研究により、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ１についての結
合エピトープが、ＶＥＧＦダイマーの２つの対称的な極に向かって集中している
ことが示された（Ｗｉｅｓｍａｎｎら、１９９７；Ｍｕｌｌｅｒら、１９９７）
。２つのレセプターと相互作用するＶＥＧＦ上の結合決定基は、部分的に重複し
、かつダイマー表面にまたがる異なる４つのセグメント上に分布する（Ｍｕｌｌ
ｅｒら、１９９８）。抗体Ａ４．６．１は、両方のレセプターのレセプター結合
領域内にあるＶＥＧＦの領域に結合する（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８）。２Ｃ３
がＶＥＧＦＲ２結合部位の近くに存在する領域に結合するが、ＶＥＧＦＲ１結合
部位には結合しないことが提唱される。
【０２８２】 レセプターのＶＥＧＦ誘導リン酸化に対する２Ｃ３の効果についての研究によ
り、ＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦ誘導リン酸化をブロックすることが示された。これ
はまた、上記で議論されるデータに対応し、そしてＶＥＧＦ誘導増殖における役
割をさらに固める。
【０２８３】 他の研究からの結果と同様に、ＶＥＧＦＲ１の一致したＶＥＧＦ誘導リン酸化
は、実証できなかった（Ｄｅ Ｖｒｉｅｓら、１９９２；Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇ
ｅｒら、１９９４；Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈら、１９９６；Ｌａｎｄｇｒｅｎら
、１９９８）。従って、２Ｃ３が、ＶＥＧＦＲ１のＶＥＧＦ７誘導リン酸化を阻
害するか否かを容易に判定することはできなかった。ＶＥＧＦＲ１リン酸化に対
するＶＥＧＦの低能力は、ＶＥＧＦＲ１が、内皮細胞上のシグナル伝達レセプタ
ーではなく、ＶＥＧＦを捕捉し、かつＶＥＧＦＲ２を介したシグナル伝達を増幅
するデコイレセプターとして働き得ることを示唆することを導き得る（Ｈｉｒａ
ｔｓｕｋａら、１９９８）。しかし、ＶＥＧＦ結合によるＶＥＧＦＲ１のチロシ
ンリン酸化は、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）を用いてＫｕｐｐｒｉｏｎら
（１９９８）により、そしてＶＥＧＦＲ１を過剰発現するＮＩＨ ３Ｔ３細胞を
用いてＳａｗａｎｏら（１９９６）により報告されている。さらに、Ｗａｌｔｅ
ｎｂｅｒｇｅｒら（１９９４）は、ＶＥＧＦ誘導ＶＥＧＦＲ１活性化がインビト
ロキナーゼアッセイを用いた結果として起こり得ることを示した。ＶＥＧＦＲ１
のＶＥＧＦ誘導リン酸化に対する２Ｃ３の効果、またはその欠如は、前述の細胞
型の１つまたはインビトロキナーゼアッセイを用いて決定し得た。
【０２８４】 本発明の図２のＥＬＩＳＡデータおよび細胞結合データは、２Ｃ３抗体がＶＥ
ＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２両方を発現する細胞への結合からＶＥＧＦを完全に
はブロックしないことを示す。２Ｃ３がＶＥＧＦＲ１へのＶＥＧＦ結合をブロッ
クしないという事実は、２Ｃ３抗体が、内皮細胞および他の細胞型の、生物学に
おけるＶＥＧＦＲ１の役割を表す際に有効なツールであることを意味する。
【０２８５】 ２Ｃ３がＶＥＧＦをそのレセプターを活性化することからブロックする際に示
す選択性の機能的結果を、モルモットにおけるＭｉｌｅｓ透過性アッセイを用い
て試験した。２Ｃ３およびＡ４．６．１両方が、ＩｇＧがＶＥＧＦより少なくと
も１０倍モル濃度で過剰にある場合に、ＶＥＧＦ誘導透過性を阻害した。３Ｅ７
およびコントロール抗体は、１０００倍モル濃度過剰ですら、ＶＥＧＦ誘導透過
性を阻害しなかった。これらの結果は、ＶＥＧＦＲ２がＶＥＧＦ誘導透過性に関
与することを示す。
【０２８６】 ＶＥＧＦ−Ｃの新規の形態および２つのウイルス誘導ＶＥＧＦ−Ｅ改変体がＶ
ＥＧＦＲ２を結合するが、ＶＥＧＦＲ１を結合しないという最近の報告に従うこ
の知見は、血管透過性を増強する能力をなお維持する。（Ｊｏｕｋｏｖら、１９
９８；Ｏｇａｗａら、１９９８；Ｍｅｙｅｒら、１９９９）。おそらく、種々の
形態のＶＥＧＦは、ＮＯ生成を引き起こすＶＥＧＦＲ２を介してシグナルを伝達
し、このことは、次いで、血管透過性の増加を引き起こす（ＨｏｏｄおよびＧｒ
ａｎｇｅｒ、１９９８；Ｈｏｏｄら、１９９８；ＫｒｏｌｌおよびＷａｌｔｅｒ
ｎｂｅｒｇｅｒ、１９９８；Ｍｕｒｏｈａｒａら、１９９８；Ｋｕｐｐｒｉｏｎ
ら、１９９８；Ｓａｗａｎｏら、１９９６；Ｆｕｊｉｉら、１９９７；Ｐａｒｅ
ｎｔｉら、１９９８）。このことは、ＮＯ生成がＶＥＧＦＲ２活性化の結果に対
して示されたので、ＶＥＧＦＲ２関与で間接的に示される。しかし、Ｃｏｕｐｅ
ｒら（１９９７）のように、対照的に、ＶＥＧＦにより誘導された血管透過性の
増加とインビトロでのＶＥＧＦＲ１発現との間の強い相関を見出したいくつかの
証拠もまた存在する。
【０２８７】 ２Ｃ３は、インビボで複数の異なるヒト腫瘍型の増殖を阻害した。１週間に２
回与えた１００μｇの２Ｃ３の効果は、マウスが有する皮下のＮＣＩ−Ｈ３５８
ＮＳＣＬＣおよびＡ６７３横紋筋肉腫腫瘍において同一であり、ここで、約１
５０ｍｍ3サイズの小節にまで、腫瘍の増殖を効率的に制限した。同様の応答が
他の腫瘍小節において見られた（例えば、ＨＴ２９およびＬＳ１７４Ｔ（共に結
腸のヒト腺腫））。
【０２８８】 ２Ｃ３による腫瘍増殖抑制の規模は、異なる中和抗ＶＥＧＦ抗体を用いて他の
研究者らにより報告されたもの（Ａｓａｎｏら、１９９８；Ｍｅｓｉａｎｏら、
１９９８）と同様である。モノクローナルラット抗マウスＶＥＧＦＲ２抗体はま
た、抗脈管形成機構（Ｓｋｏｂｅら、１９９７）を介して、マウスにおける悪性
ヒトケラチノサイトの増殖を強くブロックした。２Ｃ３の有効性（他の研究者ら
が異なる抗ＶＥＧＦ抗体を用いて見出したものと類似である）は、腫瘍脈管形成
および腫瘍増殖におけるＶＥＧＦの役割をさらに示す。しかし、２Ｃ３は、本明
細書中で議論される特異的阻害特性に基づいて、より安全な治療剤を提供する。
【０２８９】 ヒトの状態により近い設定においてＶＥＧＦ活性を阻害する効果を分析するた
めに、腫瘍を確立したマウスを、２Ｃ３で処置した。この設定において、２Ｃ３
処置は、２つの攻撃的なヒト腫瘍であるＡ６７３横紋筋肉腫およびＬＳ１７４Ｔ
結腸腺腫腫瘍の増殖を有意に遅延させた。２Ｃ３抗体は、マウス保有ＮＣＩ−Ｈ
３５８ ＮＳＬＣＬ腫瘍において有意な腫瘍後退を引き起こした。
【０２９０】 ２Ｃ３またはＡ４．６．１で処置された腫瘍は、処置の約１０週間後、それら
の元々の大きさの、それぞれ３０％および３５％まで消失した。処置が、過去１
００日まで伸長されることが可能にされた研究において、さらにより有意な後退
が観察された。この結果は、ＶＥＧＦが腫瘍内皮についての有糸分裂シグナル以
上を提供することを示す。
【０２９１】 腫瘍の静止より、むしろ後退という事実が観察されたことは、ＶＥＧＦが腫瘍
内皮についての脈管形成シグナル以上を提供することを示唆する。Ｂｅｎｊａｍ
ｉｎら（１９９９）は、腫瘍は、周辺内皮細胞との接触が確立されてた未熟な血
管の大きな画分を含むこと、そしてこれらの血管が生存についてＶＥＧＦに依存
することを、最近報告した。ＶＥＧＦの中和が、これらの未熟な血管に、アポト
ーシスを起こし、それによって、腫瘍内に存在する血管ネットワークの減少を引
き起こすことが可能である。血管再構築の動態過程が腫瘍を生じることもまた可
能であり、血管形成および血管後退の両方に関係し、そしてＶＥＧＦの中和は、
血管後退に向うネットシフトにつながる血管形成を予防する。
【０２９２】 ２Ｃ３が、Ａ４．６．１と同様に完全に腫瘍の増殖を抑制するという発見（よ
りそうでない場合）は、腫瘍血管形成におけるＶＥＧＦＲ２の主要な役割を示す
。多段階の血管形成は、内皮細胞走化性、メタロプロテイナーゼ産生、浸潤、増
殖および分化を必要とする。ＶＥＧＦＲ１は、これらのプロセスにおいて役割を
有し得ないか、またはＶＥＧＦに結合し、そしてシグナル伝達レセプター、ＶＥ
ＧＦＲ２に提示することによるプロセスにおいて補助し得る。
【０２９３】 腫瘍の処置における２Ｃ３とＡ４．６．１についての比較図は、高度に関連す
る：２Ｃ３は、わずかによりＡ４．６．１より効果的であるが、ＶＥＧＦＲ２に
結合するのみであり、ＶＥＧＦＲ１に結合しない。従って、現在の研究は、ＶＥ
ＧＦ媒介性腫瘍血管形成においてＶＥＧＦＲ１が著しい役割を果たさないことを
示し、そしてさらにＶＥＧＦＲ１特異的インヒビターが腫瘍血管形成に影響し得
ないことを示す。これらの結果はまた、２Ｃ３がＡ４．６．１と同様であるか、
またはより効果的であり、一方より少ない副作用を生じることを示す。
【０２９４】 ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２への結合およびＶＥＦＧＲ２の活性化を特異的にブロ
ックする能力は、臨床的な関連性の２つの領域における重要性を有する。第１に
、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）は、マクロファージおよび単球細胞が、ＶＥＧＦ
Ｒ１を発現し、そしてＶＥＧＦＲ１シグナル伝達を介してＶＥＧＦに対して走化
的に応答する際に、腫瘍におけるマクロファージおよび単球の補充において重要
な役割を果たすと考えられる（Ｃｌａｕｓｓら、１９９６；Ｈｉｒａｔｓｕｋａ
ら、１９９８；Ａｋｕｚａｗａら、２０００）。マクロファージの活性化におい
て、ｆｌｔ−１遺伝子の転写は、Ｅｇｒ−１の誘導を通じて刺激される。Ｅｇｒ
−１は、ヒトｆｌｔ−１プロモーターにおけるオーバーラップＥｇｒ−１／Ｓｐ
１転写因子結合部位に結合し、ｆｌｔ−１遺伝子が直接のＥｇｒ−１の標的であ
り、転写因子がマクロファージの分化において優性に誘導される証拠を提供する
（Ａｋｕｚａｗａら、２０００）。
【０２９５】 硬直抗腫瘍応答を産生するために必要とされるマクロファージの活性化を維持
するために、ＶＥＧＦＲ１シグナル伝達の阻害が避けられるべきである。本発明
によって提供されるＶＥＧＦＲ１の特異的な遮断は、従って、腫瘍療法において
Ａ４．６．１に勝る重要な利点を提供する。なぜなら、マクロファージの浸潤が
、障害されず、これらの細胞が、壊死細胞から腫瘍細胞細片を除去し、腫瘍の収
縮を促進することを可能にするからである。ＶＥＧＦＲ２遮断を使用して、抗Ｖ
ＥＧＦ抗体（例えば、２Ｃ３）はまた、マクロファージが浸潤し、腫瘍細胞への
直接の細胞を殺す効果を有することによって全体の抗腫瘍効果に寄与することを
可能にする。
【０２９６】 確かに、本発明は、抗血管形成治療のすべての形態における使用に有利な因子
を独自に提供する。それらの因子は、ＶＥＧＦ血管形成活性をブロックする能力
によって有利であるが、ＶＥＧＦＲ１を通じて媒介されるＶＥＧＦの他の有利な
作用（例えば、免疫および骨細胞への作用）を阻害しない。臨床的に重要性なの
第２の領域は、本発明に従って調製され、インビボで、破骨細胞および軟骨吸収
細胞の有益な効果を阻害しないで機能する抗体の能力に関する。これは、存在す
るＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体療法（２Ｃ３を含む）の使用を意味し、骨お
よび／または軟骨への副作用に関連しない。
【０２９７】 インビボでの研究は、ＶＥＧＦが、軟骨内の骨形成の間の肥大性軟骨リモデリ
ング、骨形成および血管形成に共役し、そしてＶＥＧＦが、軟骨リモデリングに
必須であることを示した（Ｇｅｒｂｅｒら、１９９９；参考として具体的に本明
細書中に援用される）。可溶性ＶＥＧＦＲ１レセプターキメラタンパク質（Ｆｌ
ｔ−（１−３）−ＩｇＧ）の投与によるＶＥＧＲ１を介したＶＥＧＦシグナル伝
達の不活性化は、軟骨細胞の漸増および／または分化を減少することによって小
柱骨形成および肥大性軟骨細胞領域の増大を障害することが示された（Ｇｅｒｂ
ｅｒら、１９９９）。
【０２９８】 ＶＥＧＦが、インビボでの破骨細胞機能を支持してマクロファージコロニー刺
激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を置換し得ることがさらに示された（Ｎｉｉｄａら、１９
９９；参考として具体的に本明細書中に援用される）。Ｍ−ＣＳＦ遺伝子に変異
を生じる破骨細胞に欠失を有する大理石骨病（ｏｐ／ｏｐ）マウスを使用する研
究において、組換えヒトＭ−ＣＳＦ（ｒｈＭ−ＣＳＦ）の注射は、破骨細胞漸増
および生存を可能にする。最近の研究において、組換えヒトＶＥＧＦの一度の注
射が、ｏｐ／ｏｐマウスにおいて破骨細胞漸増を同様に誘導することが示された
（Ｎｉｉｄａら、１９９９）。
【０２９９】 Ｎｉｉｄａら、（１９９９）は、破骨細胞が優性にＶＥＧＦＲ１を発現し、そ
して破骨細胞漸増に対する組換えヒト胎盤増殖因子１の活性がｒｈＶＥＧＦのも
のに比較できるので、破骨細胞（ｏｐ／ｏｐ）マウスにおけるＶＥＧＦシグナル
伝達の有益な効果は、ＶＥＧＦレセプター１（ＶＥＧＦ−１）を介して媒介され
ることを報告した。これらの著者は、ＶＥＧＦが阻害された後に（ＶＥＧＦＲ１
レセプターキメラタンパク質、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｃを使用する）、ｒｈＭ−ＣＳ
Ｆ誘導破骨細胞は死ぬが、このような効果は、ｒｈＭ−ＣＳＦの同時注射によっ
て抑制されることをさらに示した。ｒｈＭ−ＣＳＦまたは内因性ＶＥＧＦによっ
て支持される破骨細胞は、インビボでの活性における有意な差を示さなかった（
Ｎｉｉｄａら、１９９９）。
【０３００】 大理石骨病の年齢に関連した回復を起こす変異体ｏｐ／ｏｐマウスは、破骨細
胞数における増加を伴う。Ｎｉｉｄａら（１９９９）の研究において、ほとんど
の破骨細胞は、抗ＶＥＧＦ抗体の注射後に消失し、内因的に産生されたＶＥＧＦ
が、変異体マウスにおける破骨細胞の出現の原因であることを実証した。さらに
、ｒｈＶＥＧＦは、インビトロでの破骨細胞の分化を支持してｒｈＭ−ＣＳＦを
置換した。これらの結果は、Ｍ−ＣＳＦおよびＶＥＧＦが、破骨機能を支持して
重なる機能を有し、そしてＶＥＧＦが、ＶＥＧＦＲ−１レセプターを介して作用
することを実証する（Ｎｉｉｄａら、１９９９）。
【０３０１】 従って、２Ｃ３、ＶＥＧＦＲ２遮断の第１、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体が、ＶＥ
ＧＦを、ＶＥＧＦＲ１を結合し、そして活性化することをブロックしないが、Ｖ
ＥＧＦがＶＥＧＦＲ２を結合し、そして活性化することをブロックすることが結
論付けられ得る。このようなＶＥＧＦＲ２阻害の抗腫瘍効果は、明白に実証され
る。これらの結果は、ＶＥＧＦＲ２が、透過性を媒介し、そして腫瘍血管形成に
おけるその役割をハイライトするＶＥＧＦレセプターであることを示す。従って
、本発明はさらに、固体腫瘍の処置のための治療としてのＶＥＧＦ阻害を確証す
る。より重要には、本発明は、新しいＶＥＧＦＲ２遮断の範囲、抗ＶＥＧＦ抗体
（例えば、治療介入のための２Ｃ３に基いた抗体）、そして特に腫瘍および他の
疾患における血管形成を阻害する安全、かつ有効な薬剤としての使用を提供する
。
【０３０２】 本発明の利点は、副作用の欠失に限定されない。しかし、これらは、特に骨障
害を有する子供および患者の処置において著しい利点を有する重要な特徴であり
、本発明の抗体は多数の他の利点を有する。
【０３０３】 例えば、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦまたは２Ｃ３抗体に基づく抗体結合体は
、腫瘍環境に治療因子を送達するために使用され得る。実際に、２Ｃ３抗体は、
インビボでの投与の際に腫瘍脈管構造および腫瘍支質の両方に結合し、正常器官
または組織における脈間管構造にも結合組織にも結合しないことが本明細書中で
示される。本発明の抗体に基づく治療構築物は、従って、１分子内に２つの機能
を結合する利点を有する：抗体またはそのフラグメントの抗脈管形成特性および
治療因子の特性は、付着について選択される。
【０３０４】 ＶＥＧＦＲ２が、内皮上のキーレセプターであるので、ＶＥＧＦＲ２への遮断
ＶＥＧＦの結合は、抗脈管形成効果に重要である。この文脈において、ＶＥＧＦ
Ｒ１は、内皮上で発現されるが、非シグナル伝達であるか、または受動的である
。従って、ＶＥＧＦＲ１に結合するＶＥＧＦをブロックする本発明の抗体の無能
は、抗脈管形成および抗腫瘍因子としてのそれらの有効性に対する結果を伴わな
い。実際に、先行技術の遮断抗体と共に生じるＶＥＧＦＲ１に結合するＶＥＧＦ
を阻害するよりもむしろ、ＶＥＧＦに結合する本発明の抗体の能力および、さら
にＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ１相互作用を実質的に妨害しない能力は、これらの新し
い抗体の薬剤送達特性を増強する。
【０３０５】 本発明者らは、遮断抗体は、レセプターに結合されていない腫瘍局在化ＶＥＧ
Ｆに結合することによって腫瘍環境へ治療因子を送達するために機能するとさら
に期待されることを理解した。具体的には、本発明者らは、このような抗体は、
腫瘍支質においてＶＥＧＦに結合し、そしてそこに治療因子を送達することを理
解した。これは、内皮周辺に薬剤の貯蔵所を提供し、血管内皮細胞に細胞毒性ま
たは他の破壊性の効果を引き起こし、そして抗腫瘍効果を発揮する。
【０３０６】 支質または結合組織と結合したＶＥＧＦは、伝統的な意味でＶＥＧＦレセプタ
ー（すなわち、細胞表面レセプター）に結合していない。むしろ、ＶＥＧＦは、
ＶＥＧＦの基礎的な領域を介して１以上の結合組織成分（プロテオグリカン（例
えば、ヘパラン硫酸プロテオグリカン）を含む）に結合している。これらの配列
（およびそれらをコードするエキソン）は、ＶＥＧＦ１２１タンパク質（および
根底にあるＤＮＡ）内にないので、このアイソフォームは、有意な量で支質に存
在するべきではない。腫瘍支質におけるＶＥＧＦは、「遊離した」としばしば呼
ばれるが、腫瘍内にまだ局在化しており、「遊離した」は非レセプター結合を基
本的に意味する。
【０３０７】 本発明者らは、両方のレセプターではなく、１つのレセプターに結合するＶＥ
ＧＦをブロックする抗体が、脈管構造上のＶＥＧＦに結合したレセプターに結合
することによって、治療薬剤を腫瘍環境に送達し得ることをさらに推論する。こ
れは、本発明の最も多くの利点の１つである。すなわち、抗体の規定は、ＶＥＧ
ＦＲ２へ結合するＶＥＧＦをブロックし、それ故、ＶＥＧＦからの脈管形成シグ
ナルの阻害するが、ＶＥＧＦＲ１に結合するＶＥＧＦをブロックしない。他の細
胞型および組織におけるＶＥＧＦＲ１を介したＶＥＧＦシグナル伝達を維持する
ことによって全身性副作用を減少することに加えて、これらの抗体は、腫瘍脈管
構造上のＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ１複合体に局在化し、そして直接そこに、治療因
子を送達し得る。
【０３０８】 ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２の両方は、正常組織における内皮細胞とは反
対に、腫瘍内皮細胞上で上方制御される。ＶＥＧＦＲ１は、腫瘍脈管内皮上で高
度に発現され、本発明の標的とする局面を特に有効にする。実際に、ＶＥＧＦＲ
１は、内皮において「非シグナル伝達」であるが、より高いレベルでない場合に
、少なくともＶＥＧＦＲ２と同じレベルで発現される。この減少の根底にある因
子は、低酸素症およびＶＥＧＦの両方に応答してＶＥＧＦＲ１が上方制御され、
一方でＶＥＧＦＲ２は、ＶＥＧＦに応答して上方制御されるのみであり、そして
低酸素症によって影響されないことである。
【０３０９】 内皮に対するＶＥＧＦＲ１の役割は、不確かなままであるが、ＶＥＧＦＲ１は
、デコイレセプターとして作用し得、ＶＥＧＦを「捕捉」し、そしてリガンドを
シグナル伝達レセプター、ＶＥＧＦＲ２に渡す。これを実現するために、デコイ
レセプターが、シグナル伝達レセプター（実際の場合である）よりも、より高い
ＶＥＧＦに対する親和性を有することが期待される。この点において、そしてお
そらく、増強された発現レベルのためにもまた、本発明のＶＥＦＧＲ２遮断、非
ＶＥＧＲＦ１遮断抗体は、腫瘍の処置のために理想的な送達因子である。これら
の抗体の治療結合体は、ＶＥＧＦＲ２を通じた新脈管形成および存在する脈管構
造の破壊を、ＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ１レセプター複合体に治療因子を送達するこ
とによって同時に阻害し得る。
【０３１０】 本発明者らは、本発明の抗体の有益な抗脈管形成および腫瘍局在化特性の説明
としての上記の科学推理に決して限定されない。本発明の有用性は、自明であり
、そして根底にある理論が実行されることは必要としないが、本発明者らは、代
替のメカニズムを考慮し、このメカニズムによってＶＥＧＦＲ２遮断、非ＶＥＧ
ＦＲ１遮断抗体が、腫瘍脈管構造に有効にかつ特異的に局在化し得ると考えた。
【０３１１】 このような抗体は、ＶＥＧＦに結合し得、細胞表面上のＮｐｎ−ｄ１または別
のまだ特徴付けられていないＶＥＧＦ結合タンパク質に関連するか、または、内
非細胞の表面上でヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合したＶＥＧＦに結合し得
る。抗体の局在化はまた、血管に関連するタンパク質のＶＥＧＦファミリーの別
のメンバー（すなわち、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ）に結合す
ることによっても増強され得るが、これはより可能性が低い。
【０３１２】 本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦまたは２Ｃ３抗体の別の有利な特性は、
ＶＥＧＦＲ２を介して媒介されるこれらの抗体が生存シグナルまたはＶＥＧＦの
「保護効果」を中和することである。自身がより有効な抗体を作製することに加
えて、この特性は、ＶＥＧＦの生存機能によって妨害される他の因子と組み合わ
せることによってそれらを特に有用にする。
【０３１３】 例えば、ＶＥＧＦは、内皮を放射線治療から保護する。従って、本発明の裸の
抗体および免疫複合体の両方は、放射線治療と組み合わされる使用に理想的であ
る。まださらなる利点は、放射線療法因子に付着した、このような抗体の使用に
よって提供される。この型の構築物は、以下の３つの利点を有する：（１）抗体
部分を通じた抗脈管形成効果を及ぼすこと；（２）放射線治療因子の送達を通じ
た腫瘍脈管構造破壊効果を及ぼすこと；および（３）ＶＥＧＦの典型的な生存シ
グナルが、放射線治療因子の効果を相殺することから防ぐこと。
【０３１４】 類似の相乗的な効果を有する他の構築物は、抗チューブリン薬剤またはプロド
ラッグ、抗アポトーシス因子および他の抗脈管形成因子と関連するＶＥＧＦＲ２
遮断抗ＶＥＧＦ抗体である。アポトーシスを引き起こす因子または薬剤の作用は
、ＶＥＧＦによってアンタゴナイズされる。従って本発明は、このような因子の
有効性を、ＶＥＧＦを中和することによって改善する。ＶＥＧＦの生存シグナル
はまた、この治療を限定するエンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）に反対す
る。従って、エンドスタチンと組み合わされた使用において、本発明のＶＥＧＦ
Ｒ２遮断抗ＶＥＧＦ、または２Ｃ３抗体は、ＶＥＧＦを中和し、そしてエンドス
タチンの抗腫瘍効果を増幅する。２Ｃ３または他のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ
抗体はまた、腫瘍にコラゲナーゼを特異的に送達するために使用され得、ここで
コラゲナーゼは、インサイチュでエンドスタチンを産生し、類似の利点を達成す
る。
【０３１５】 すべてのこのように増強された、または相乗作用の組み合わせにおいて、抗体
および他の因子は、別々に投与され得るか、または第２の因子が、特異的な送達
のために抗体に連結され得る（すなわち、ＶＥＧＦＲ１への標的化された送達）
。エンドスタチンとの組み合わせにおいて、化学結合体または組換え融合タンパ
ク質が好ましい。なぜなら、これらは、エンドスタチンの短い半減期を相殺する
からであり、エンドスタチンの短い半減期は現在、潜在的なエンドスタチン療法
の限定である。組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）との組み合わせ、ま
たは標的化された形態の組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）はまた、使
用され得る。
【０３１６】 本発明の治療のさらなる利点は、間隙の圧力を下げる能力を含む。ＶＥＧＦ媒
介性の増加した浸透性が、間隙の圧力に寄与するので、ＶＥＦＲ２を介する減少
されたシグナル伝達は、浸透性および間隙圧力の両方を減少する。順番に、薬剤
が全体の腫瘍組織横断する障壁を、これは減少し、その結果、脈管構造から遠い
腫瘍細胞は殺され得る。長期の治療はまた、本発明の組成物が無視できるか、ま
たはより低い免疫原性を有さない場合に達成され得る。
【０３１７】 （Ｂ３．２Ｃ３抗体ＣＤＲ配列） 用語「可変性」は、本明細書中で抗体に関連して使用される場合、可変性ドメ
インの特定の部分を意味する。このドメインは、抗体の間の配列において、大規
模に異なる。この用語は、特定の抗体に対する各特定の抗体の結合および特異性
において使用される。しかし、可変性は、抗体の可変性ドメインに渡って、一様
に分配されない。それは、「超可変性領域」と呼ばれる３つのセグメントに集中
される。超可変性領域は、軽鎖および重鎖可変領域の両方にある。
【０３１８】 可変ドメインのより高度に保存された部分は、枠組み領域（ＦＲ）と呼ばれる
。ネイティブな重鎖および軽鎖の可変ドメインの各々は、４つのＦＲ（それぞれ
ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）を含み、大部分はβシート立体配置を採
用し、３つの超可変性領域に結合され、連結するループを形成し、そしていくつ
かの場合、βシート構造の一部を形成する。
【０３１９】 各鎖における超可変領域は、ＦＲに近接して一緒に保持され、そして他の鎖か
らの超可変領域は、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、１９
９１、参考として本明細書中に具体的に援用される）。定常ドメインは、抗原へ
の抗原の結合に直接に関係しないが、種々のエフェクター機能（例えば、抗原依
存性細胞性毒性における抗原の関与）を示す。
【０３２０】 用語「超可変性領域」は、本明細書中で使用される場合、抗体のアミノ酸残基
を言い、抗原結合の原因である。超可変領域は、「相補性決定領域」または「Ｃ
ＤＲ」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基２４〜３
４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）および重鎖可変ドメ
インにおける３１〜３５（Ｈ１）、５０〜５６（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ
３）；Ｋａｂａｔら、１９９１、参考として本明細書中に具体的に援用される）
および／または「超可変領域ループ」からの残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン
における残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３
）および重鎖可変ドメインにおける２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）お
よび９６〜１０１（Ｈ３））を含む。「枠組み」または「ＦＲ」残基は、本明細
書中で定義される超可変領域残基よりも可変ドメイン残基である。
【０３２１】 ２Ｃ３ ＳｃＦｖフラグメントのＶｈおよびＶｋ鎖のＤＮＡおよび推定アミノ
酸配列は、本明細書中に配列番号６、７、８および９として提供される。これら
の配列は、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のＣＤＲ１〜３を含む。
【０３２２】 本明細書中に記載されるように（第Ｃ３章）、生物学的分子に関する構造的お
よび機能的情報の規定について、相当する範囲、または改良された分子でさえも
産生され得る。これは、２Ｃ３抗体によって例示される本発明のＶＥＧＦＲ２遮
断抗ＶＥＧＦ抗体を適用する。抗原結合および抗原の他の機能的特性が、保存さ
れなければならないが、相当する、そしてさらに改善された抗体（一旦参考抗体
が産生された）を作製する当該分野における非常に高度の技術が存在する。この
ような技術的熟練は、本明細書中で提供される配列および情報に関して、さらな
る抗体の産生に適用される。この抗体は、改善された、または別の望まれる特徴
を有する。
【０３２３】 等価な抗体については、特定のアミノ酸は、相互作用的結合能力の明らかな損
失なしで、抗体定常ドメインフレームワーク領域または抗体可変ドメインフレー
ムワーク領域における他のアミノ酸と置換され得る。このような変化が、この抗
体部分をコードするＤＮＡ配列においてなされること、およびこの変化が、天然
において保存的であること（セクションＣ３、表Ａにおけるコドン情報、および
部位特異的変異原性を支持する技術的詳細を参照のこと）が好ましい。自然には
、なされるべき変化の数は限定されるが、これは当業者に公知である。
【０３２４】 他の型の改変体は、それらが産生される親抗体に関する改良された生物学的特
性を有する抗体である。このような改変体（すなわち、第二世代化合物）は、代
表的には、親抗体の１以上の置換された超可変領域残基を含む置換改変体である
。このような置換改変体を産生するための便利な方法は、ファージディスプレイ
を用いる親和成熟である。
【０３２５】 ファージディスプレイを用いる親和成熟においては、いくつかの超可変領域部
位（例えば、６〜７部位）は、変異して各部位におけるすべての可能なアミノ酸
置換を生じる。このように産生された抗体改変体は、各粒子内に詰め込まれたＭ
１３の遺伝子ＩＩＩ産物と融合する場合、一価の様式で繊維状ファージ粒子から
表示される。次いで、ファージディスプレイされた改変体は、本明細書中に開示
されるようなそれらの生物学的活性（例えば、結合親和力）についてスクリーニ
ングされる。改変のための候補超可変領域部位を同定するために、アラニン走査
変異原性を行い、抗原結合に著しく寄与する超可変領域残基を同定し得る。
【０３２６】 あるいは、またはさらに、抗原−抗体複合体の結晶構造は、抗体とＶＥＧＦと
の間の接点を同定するために描写され、分析されることが意図される。このよう
な接触残基および隣接残基は、置換の候補である。一旦このような改変体が生成
すると、改変体のパネルは、本明細書中に記載されるようにスクリーニングに供
され、そして１以上の関連するアッセイにおいて類似の特性を有するが、異なる
特性または優れた特性さえも有する抗体は、さらなる開発のために選択される。
【０３２７】 従って、本発明のさらなる局面は、ＶＥＧＦＲ２遮断抗体（抗ＶＥＧＦ抗体）
重鎖および軽鎖（例えば、２Ｃ３重鎖および軽鎖）のＣＤＲ領域をコードする単
離されたＤＮＡセグメントおよび組換えベクター、ならびにＤＮＡ技術の適用を
通した組換え宿主細胞の作製および使用に関連し、これらは、このようなＣＤＲ
領域を発現する。
【０３２８】 従って、本発明は、任意の動物（好ましくは、ヒトまたはマウス）から単離可
能なＤＮＡセグメントに関し、これは全ゲノムＤＮＡを含まず、そしてＶＥＧＦ
Ｒ２遮断抗体（抗ＶＥＧＦ抗体）重鎖および軽鎖（例えば、２Ｃ３重鎖および軽
鎖）のＣＤＲ領域を発現し得る。本明細書中で使用される場合、用語「ＤＮＡセ
グメント」は、特定の種の全ゲノムＤＮＡを含まずに単離されたＤＮＡ分子をい
う。用語「ＤＮＡセグメント」には、ＤＮＡセグメントおよびこのようなセグメ
ントのより小さいフラグメント、ならびに組換えベクター（例えば、プラスミド
、コスミド、ファージ、ウイルスなどを含む）もまた含まれる。
【０３２９】 同様に、コードセグメントまたはＶＥＧＦＲ２遮断抗体（抗ＶＥＧＦ抗体）重
鎖および軽鎖（例えば、２Ｃ３重鎖および軽鎖）の精製ＣＤＲ領域をコードする
単離された遺伝子部分を含むＤＮＡセグメントは、ＤＮＡセグメントといい、こ
のようなコード配列（特定の局面においては、調節配列）を含み、他の天然に存
在する遺伝子またはタンパク質コード配列から実質的に離れて単離される。この
局面においては、用語「遺伝子」は、機能的タンパク質、ポリペプチドまたはペ
プチドコードユニットをいうために単純さのために使用される。この機能的用語
は、ネイティブな抗体コード配列および適切な抗原結合タンパク質、ポリペプチ
ドまたはペプチドを発現するか、または発現するように適応され得るより小さな
操作された配列を含む。
【０３３０】 「他のコード配列から実質的に離れて単離される」とは、目的のコードセグメ
ントまたは単離された遺伝子部分は、ＤＮＡセグメントのコード領域の重要な部
分を形成し、そしてこのＤＮＡセグメントは、天然に存在するコードＤＮＡの大
きい部分（例えば、大きな染色体フラグメントまたは他の機能的遺伝子またはｃ
ＤＮＡコード領域）を含まないことを意味する。当然、これは最初に単離された
ＤＮＡセグメントをいい、そして人の手によってそのセグメントに後から加えさ
れた遺伝子またはコード領域を排除しない。
【０３３１】 特定の実施形態においては、本発明は、単離されたコードセグメントまたは単
離された遺伝子部分、およびＶＥＧＦＲ２遮断抗体（抗ＶＥＧＦ抗体）重鎖およ
び軽鎖（例えば、２Ｃ３重鎖および軽鎖）のＣＤＲ領域をコードするＤＮＡ配列
を組み込む組換えベクターに関し、これは少なくとも約７５％、より好ましくは
、少なくとも約８０％、より好ましくは、少なくとも約８５％、より好ましくは
、少なくとも約９０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％のアミノ酸
配列領域あるいは配列番号７または配列番号９のアミノ酸配列と同一のそのよう
なアミノ酸配列を含み；ここでこのＣＤＲ領域は、配列番号７または配列番号９
のアミノ酸配列のＣＤＲ領域の生物学的特性を少なくとも実質的に維持する。
【０３３２】 本明細書中で開示されるように、これらの配列は、特定の生物学的に機能的に
等価なアミノ酸または「保存的置換」を含み得る。他の配列は、当業者に公知で
ありそして本明細書中でさらに記載されるように、ＣＤＲまたはＣＤＲ含有抗体
の特性を改良するために故意に操作された、機能的に非等価なアミノ酸または「
非保存的置換」を含み得る。
【０３３３】 アミノ酸および核酸配列は、さらなる残基（例えば、さらなるＮ末端もしくは
Ｃ末端アミノ酸または５’もしくは３’配列）を含み得、そしてこの配列が上記
の基準（好ましくは、タンパク質発現が関与する生物学的タンパク質活性の維持
または改良を含む）に合う限り、さらになお本発明の配列に一致することもまた
理解される。末端配列の付加は、コード領域およびまた制御領域の５’部分また
は３’部分のいずれかに隣接する種々の非コード配列を含む。
【０３３４】 従って、本発明の核酸セグメントは、他のＤＮＡ配列（例えば、プロモーター
、ポリアデニル化シグナル、付加的制限酵素部位、多重クローニング部位、他の
コードセグメントなど）と組み合わされ得、その結果それらの全体の長さはかな
り変化し得る。従って、ほとんど任意の長さの核酸フラグメントが利用され得、
その全長は、好ましくは、意図される組換えＤＮＡプロトコルにおける調製およ
び使用の容易さによって制限されることが予想される。
【０３３５】 従って、組換えベクターは、本発明のさらなる局面を形成する。特に有用なベ
クターは、ＤＮＡセグメントのコード部分がプロモーターの制御下で配置される
ベクターであることが予想される。一般的に、排他的ではないが、組換えまたは
異種プロモーターが利用される（すなわち、プロモーターは通常、それらの天然
の環境においてはコード配列を伴わない）。プロモーターが、発現のために選択
された細胞型、生物体において、または動物においてさえ、ＤＮＡセグメントの
発現を効率的に指向する限り、このようなプロモーターは、細菌プロモーター、
ウイルスプロモーター、真核生物プロモーターおよび哺乳動物プロモーターを含
み得る。
【０３３６】 タンパク質発現のためのプロモーターおよび細胞型の組み合わせの使用は、分
子生物学分野の当業者に公知である。使用されるプロモーターは、構成的（また
は誘導性）であり得、そして適切な条件下で使用されて導入ＤＮＡセグメントの
高レベルの発現を指向し得、例えば組換えタンパク質またはペプチドのラージス
ケールでの産生において有利である。
【０３３７】 本発明の核酸配列の発現は、当業者に公知であり、かつ本明細書中にさらに記
載される１以上の任意の標準的な技術によって、都合よく達成され得る。例えば
、融合タンパク質の組換え発現についての後の記載は、核酸レベルで別のコード
配列に作動可能に会合していない抗体および抗体フラグメントに、同様によく当
てはまる。 （Ｂ４．ポリクローナル抗体） 抗体を調製および特徴付けるための手段は、当該分野において周知である。（
例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照
のこと；本明細書中で参考として援用される）。ポリクローナル抗血清を調製す
るために、動物を免疫原性ＶＥＧＦ組成物で免疫し、そして抗血清をこの免疫し
た動物から収集する。広範な動物種が、抗血清の生成のために使用され得る。代
表的に、抗抗血清の生成のために使用される動物は、ウサギ、マウス、ラット、
ハムスター、モルモット、またはヤギである。ウサギの比較的大容量の血液が理
由で、ウサギは、ポリクローナル抗体の産生のために好ましい選択である。
【０３３８】 ポリクローナル抗体の産生において使用されるＶＥＧＦ免疫原組成物の量は、
免疫原ならびに免疫に使用される動物の性質に依存して変動する。以下の種々の
経路が、本発明のＶＥＧＦ免疫原を投与するために使用され得る；皮下、筋内、
皮内、静脈内、腹腔内、および脾臓内。ポリクローナル抗体の産生は、免疫後の
種々の時点で免疫された動物の血液をサンプリングすることによって、モニター
され得る。第２の、追加免疫注射もまた与えられ得る。追加免疫する工程および
力価測定する工程のプロセスは、適切な力価が達成されるまで反復される。所望
の力価レベルが得られた時点で、この免疫した動物を採血し得、そして血清が単
離および保存され得る。動物はまた、モノクローナル抗体を産生するために使用
され得る。
【０３３９】 当該分野において周知のように、特定の組成物の免疫原性は、アジュバントと
して公知の免疫応答の非特異的刺激物質の使用によって増強され得る。例示的な
アジュバントとしては完全フロイントアジュバント（殺傷されたＭｙｃｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含有する、免疫応答の非特異的刺激
物質）；不完全フロイントアジュバント；および水酸化アルミニウムアジュバン
トが挙げられる。
【０３４０】 ＶＥＧＦをキャリアと連結することによってか、またはＶＥＧＦをキャリアに
カップリングすることによって達成され得るように、宿主免疫系を追加免疫する
こともまた所望され得る。例示的なキャリアは、キーホールリンペットヘモシア
ニン（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。オボアルブミン、
マウス血清アルブミン、またはウサギ血清アルブミンのような他のアルブミンも
また、キャリアとして使用され得る。当該分野においてまた公知であるように、
所定の組成は、その免疫原性において変動し得る。しかし、ＶＥＧＦに対する抗
体の産生は著しくは困難でない。
【０３４１】 （Ｂ５．モノクローナル抗体） モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を産生するための種々の方法がまた、現在当該
分野において十分に周知である。最も標準的なモノクローナル抗体の産生技術は
、一般的に、ポリクローナル抗体を調製するための技術と同じ系に沿って開始す
る（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８；本明細書
中で参考として援用される）。ポリクローナル抗体応答は、免疫原性ＶＥＧＦ組
成物を用いて動物を免疫することによって開始され、そして所望の力価レベルが
得られる時点で、その免疫した動物を用いてＭＡｂを産生し得る。
【０３４２】 ＭＡｂは、米国特許第４，１９６，２６５号（これは、本明細書中で参考とし
て援用される）に例示される技術のような、周知技術の使用を通して容易に調製
され得る。代表的に、この技術は、選択されたＶＥＧＦ免疫原組成物を用いて適
切な動物を免疫することを含む。免疫する組成物は、抗体産生細胞を刺激するの
に有効な様式で投与される。マウスおよびラットのような齧歯類は好ましい動物
であるが、ウサギ、ヒツジ、およびカエルの細胞の使用もまた可能である。ラッ
トの使用は、特定の利点を与え得る（Ｇｏｄｉｎｇ、１９８６、第６０〜６１頁
；本明細書中で参考として援用される）が、マウスが好ましい。そして、ＢＡＬ
Ｂ／ｃマウスは、最も慣用的に使用され、そして一般により高率で安定な融合物
を与えるので最も好ましい。
【０３４３】 免疫後に、ＶＥＧＦを産生する潜在能を有する体細胞（詳細には、Ｂリンパ球
（Ｂ細胞））が、ＭＡｂ産生プロトコルにおける使用のために選択される。これ
らの細胞は、生検された脾臓、扁桃、もしくはリンパ節から、または末梢血サン
プルから獲得され得る。脾臓細胞および末梢血細胞が好ましい。前者は、脾臓細
胞が分裂形質芽球段階にある抗体産生細胞の豊富な供給源であるからであり、後
者は、末梢血が容易に利用可能であるからである。しばしば、一団の動物が免疫
され、そして最高の抗体力価を有する動物の脾臓が取り出され、そして注射器で
この脾臓をホモジネートすることによって脾臓リンパ球が得られる。代表的に、
免疫したマウス由来の脾臓は、約５×１０7〜２×１０8のリンパ球を含む。
【０３４４】 次いで、免疫した動物由来の抗ＶＥＧＦ抗体産生Ｂリンパ球は、不死化骨髄腫
細胞の細胞（一般的には、免疫された動物と同じ種の細胞）と融合される。ハイ
ブリドーマ産生融合手順における使用に適切な骨髄腫細胞株は、好ましくは非抗
体産生であり、高い融合効率を有し、そして、次いで所望の融合細胞（ハイブリ
ドーマ）のみの増殖を支持する特定の選択培地中で増殖し得なくさせる酵素欠損
を有する。
【０３４５】 当業者に公知のように、多くの骨髄腫細胞のうちの任意の細胞が使用され得る
（Ｇｏｄｉｎｇ、第６５〜６６頁、１９８６；Ｃａｍｐｂｅｌｌ、第７５〜８３
頁、１９８４；各々は、本明細書中で参考として援用される）。例えば、免疫し
た動物がマウスである場合、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、
ＮＳｌ／１．Ａｇ ４ ｌ、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ
−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７、およびＳ１９４／５ＸＸ０ Ｂｕ
ｌが使用され得；ラットについて、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３
、ＩＲ９８３Ｆ、４Ｂ２１０、または上記に列挙されたマウス細胞株のうちの１
つが使用され得；そしてＵ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯ
Ｎ−ＨＭｙ２、およびＵＣ７２９−６はすべて、ヒト細胞融合に関連して有用で
ある。
【０３４６】 抗体産生脾臓細胞または抗体産生リンパ節細胞、および骨髄腫細胞のハイブリ
ッドを生成するための方法は、通常、細胞膜の融合を促進する因子（化学的また
は電気的）の存在下で、４：１の比率で体細胞を骨髄腫細胞と混合する工程を包
含するが、この比率はそれぞれ約２０：１〜約１：１まで変動し得る。センダイ
ウイルスを使用する融合方法は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７
５；１９７６；各々、本明細書中で参考として援用される）によって記載されて
おり、そしてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、３７％（ｖ／ｖ）Ｐ
ＥＧ）を使用する融合方法は、Ｇｅｆｔｅｒら（１９７７；本明細書中で参考と
して援用される）に記載されている。電気的に誘導された融合方法の使用もまた
適切である（Ｇｏｄｉｎｇ、第７１〜７４頁、１９８６；本明細書中で参考とし
て援用される）。
【０３４７】 融合手順は通常、低い頻度（約１×１０-6〜１×１０-8）で生存可能なハイブ
リッドを生成する。しかし、これは問題を提起しない。なぜなら、生存可能な融
合ハイブリッドは、選択培地中で培養することによって、親の非融合細胞（特に
、通常は無限に分裂しつづける、非融合骨髄腫細胞）から識別されるからである
。選択培地は、一般に、組織培養培地中でのヌクレオチドのデノボ合成をブロッ
クする薬剤を含む培地である。例示的かつ好ましい薬剤は、アミノプテリン、メ
トトレキサート、およびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキサ
ートは、プリンおよびピリミジンの両方のデノボ合成をブロックし、一方、アザ
セリンは、プリン合成のみをブロックする。アミノプテリンまたはメトトレキサ
ートが使用される場合、ヌクレオチドの供給源としてヒポキサンチンおよびチミ
ジンを倍地に補充する（ＨＡＴ培地）。アザセリンが使用される場合、ヒポキサ
ンチンを培地に補充する。
【０３４８】 好ましい選択培地は、ＨＡＴである。ヌクレオチドサルベージ経路を機能し得
る細胞のみが、ＨＡＴ培地中で生存し得る。骨髄腫細胞は、サルベージ経路の重
要な酵素（例えば、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲ
Ｔ）を欠損し、そしてそれらは生存し得ない。Ｂ細胞はこの経路を機能し得るが
、それらは培養中で限られた寿命を有し、そして一般に約２週間以内に死滅する
。従って、選択培地中で生存し得る細胞のみが、骨髄腫細胞およびＢ細胞から形
成されたそれらのハイブリッドである。
【０３４９】 この培養は、特定のハイブリドーマが選択されるハイブリドーマの集団を提供
する。代表的に、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレート中での単
一クローン希釈によって細胞を培養し、次いで所望の抗ＶＥＧＦ反応性について
個々のクローンの上清を試験すること（約２〜３週間後）によって、実施される
。このアッセイは、高感度で、単純で、そして迅速であるべきである（例えば、
ラジオイムノアッセイ、酵素免疫検定法、細胞傷害性アッセイ、プラークアッセ
イ、ドット免疫結合アッセイ（ｄｏｔ ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａ
ｙ）など）。
【０３５０】 次いで、選択されたハイブリドーマを段階希釈し、そして個々のＶＥＧＦ抗体
産生細胞株にクローン化する。次いで、このクローンは無限に増殖されて、ＭＡ
ｂを提供する。細胞株は、２つの基本的様式でＭＡｂ産生のために利用され得る
。ハイブリドーマのサンプルは、もともとの融合物のために体細胞および骨髄腫
細胞を提供するために使用された型の組織適合性動物に注射（しばしば、腹膜腔
内へ）され得る。この注射された動物は、融合された細胞ハイブリッドによって
産生される特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発症する。次いで、この
動物の体液（例えば、血清または腹水）を穿刺して、高濃度でＭＡｂを提供し得
る。個々の細胞株はまた、インビトロで培養され得る。ここで、ＭＡｂは培養培
地中に自然に分泌され、ここからＭＡｂは高濃度で容易に獲得され得る。
【０３５１】 いずれかの手段によって産生されたＭＡｂは、一般に、例えば、濾過、遠心法
、および種々のクロマトグラフィー方法（例えば、ＨＰＬＣまたはアフィニティ
ークロマトグラフィー）（これらの精製技術はすべて、当業者に周知である）を
使用して、さらに精製される。これらの精製技術は各々、混合物の他の成分から
所望の抗体を分離するための分別を含む。抗体の調製に特に適切な分析方法とし
ては、例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーおよび／
またはプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーが挙げられる。
【０３５２】 （Ｂ６．ファージミドライブラリー由来の抗体） 組換え技術は、今や、一定範囲の抗体をコードする組換え遺伝子に由来する所
望の特異性を有する抗体の調製を可能にしている（Ｖａｎ Ｄｉｊｋら、１９８
９；本明細書中に参考として援用される）。特定の組換え技術は、免疫した動物
の脾臓から単離されたＲＮＡから調製されるコンビナトリアル免疫グロブリンフ
ァージ発現ライブラリーの免疫学的スクリーニングによる抗体遺伝子の単離を包
含する（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８６；ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ
、１９９１；各々が本明細書中に参考として援用される）。
【０３５３】 このような方法のために、コンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライ
ブラリーは免疫した動物の脾臓から単離されたＲＮＡから調製され、そして適切
な抗体を発現するファージミドは、抗原を発現する細胞およびコントロール細胞
を用いてパニングすることにより選択される。従来のハイブリドーマ技術を超え
るこのアプローチの利点は、約１０4倍もの多くの抗体が１回で生成およびスク
リーニングされ得ること、ならびに新たな特異性がＨ鎖およびＬ鎖の組み合わせ
により生成されることである。このことは、生成される適切な抗体の割合をさら
に増大させる。
【０３５４】 細菌中で、多様な抗体分子の大きなレパートリーを生成するための１つの方法
は、ベクターとしてバクテリオファージλを利用する（Ｈｕｓｅら、１９８９；
本明細書中に参考として援用される）。λベクターを使用する抗体の生成は、Ｄ
ＮＡ配列の重鎖および軽鎖集団を別々の開始ベクターへクローニングすることを
包含する。このベクターは、引き続きランダムに組み合わされて、抗体フラグメ
ントを形成するために重鎖および軽鎖の同時発現を指向する単一のベクターを形
成する。重鎖および軽鎖のＤＮＡ配列は、選択された抗原で免疫された動物に由
来する脾臓細胞（またはそれらのハイブリドーマ）から単離されたｍＲＮＡの増
幅により（好ましくは、ＰＣＲTMまたは関連増幅技術により）得られる。重鎖お
よび軽鎖の配列は、代表的には、開始ベクターへの重鎖および軽鎖セグメントの
クローニングを容易にするために、増幅されたＤＮＡセグメントの末端に制限部
位を組み込むプライマーを使用して増幅される。
【０３５５】 完全にまたは部分的に合成的である抗体結合部位（すなわちパラトープ）の大
きなライブラリーを作製およびスクリーニングするための別の方法は、糸状ファ
ージ（例えば、Ｍ１３、ｆｌまたはｆｄ）に由来するディスプレイベクターを利
用する。これらの糸状ファージディスプレイベクター（「ファージミド」ともい
われる）は、多様かつ新規な免疫特異性を有するモノクローナル抗体の大きなラ
イブラリーを生じる。この技術は、糸状ファージ複製のアセンブリ段階の間に遺
伝子産物および遺伝子を連結するための手段として、糸状ファージコートタンパ
ク質膜アンカードメインを使用し、そしてこれは、コンビナトリアルライブラリ
ーから抗体をクローニングおよび発現するために使用されている（Ｋａｎｇら、
１９９１；Ｂａｒｂａｓら、１９９１；各々が本明細書中に参考として援用され
る）。
【０３５６】 糸状ファージディスプレイのためのこの一般的技術は、米国特許第５，６５８
，７２７号（本明細書中に参考として援用される）に記載される。大部分の一般
的認識において、この方法は、単一のベクター系を使用して、抗体遺伝子レパー
トリーから予め選択されたリガンド−結合特異性を同時クローニングおよびスク
リーニングするための系を提供する。予め選択されたリガンド−結合能力につい
てライブラリーの単離されたメンバーをスクリーニングすることにより、ライブ
ラリーに由来するメンバーをコードする遺伝子を単離するための簡便な手段を用
いて、発現された抗体分子の結合能力の相関づけが可能になる。
【０３５７】 発現およびスクリーニングの関連づけは、機能的抗体のアセンブリを可能にす
るための細菌細胞のペリプラズムへの融合ポリペプチドの標的化と、目的のライ
ブラリーメンバーの簡便なスクリーニングを可能にするためのファージアセンブ
リの間の糸状ファージ粒子のコートへの融合タンパク質の標的化との組み合わせ
により達成される。ペリプラズム標的化は、融合ポリペプチド中の分泌シグナル
ドメインの存在により提供される。ファージ粒子への標的化は、融合ポリペプチ
ド中の糸状ファージコートタンパク質膜アンカードメイン（すなわち、ｃｐＩＩ
Ｉ由来か、またはｃｐＶＩＩＩ由来の膜アンカードメイン）の存在により提供さ
れる。
【０３５８】 糸状ファージベースのコンビナトリアル抗体ライブラリーの多様性は、重鎖お
よび軽鎖の遺伝子のシャッフリングにより、ライブラリーのクローニングされた
重鎖遺伝子の１つ以上の相補性決定領域を改変することにより、または誤りがち
な（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ポリメラーゼ連鎖反応によりライブラリーへラン
ダム変異を導入することにより増大され得る。ファージミドライブラリーをスク
リーニングするためのさらなる方法は、米国特許第５，５８０，７１７号；同第
５，４２７，９０８号；同第５，４０３，４８４号；および同第５，２２３，４
０９号（各々が本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【０３５９】 大きなコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングするための別の方
法が開発され、この方法は、Ｍ１３、ｆｌまたはｆｄのような糸状バクテリオフ
ァージの表面での多様な重鎖および軽鎖配列の集団の発現を利用する（米国特許
第５，６９８，４２６号；本明細書中に参考として援用される）。多様な重鎖（
Ｈｃ）および軽鎖（Ｌｃ）配列の２つの集団は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ TM ）により合成される。これらの集団は、発現のために必要なエレメントを含む
、別個のＭ１３ベースのベクターにクローニングされる。重鎖ベクターは、重鎖
配列の翻訳がｇＶＩＩＩ−Ｈｃ融合タンパク質を生成するように、遺伝子ＶＩＩ
Ｉ（ｇＶＩＩＩ）コートタンパク質配列を含む。２つのベクターの集団は、Ｈｃ
およびＬｃの配列を含むベクター部分のみが単一の環状ベクターに連結されるよ
うに、ランダムに組み合わされる。
【０３６０】 組み合わされたベクターは、Ｍ１３での２つのポリペプチドのアセンブリおよ
び表面発現のためにＨｃおよびＬｃの配列の両方の同時発現を指向する（米国特
許第５，６９８，４２６号；本明細書中に参考として援用される）。組み合わせ
工程は、単一のベクターに２つの多様な集団内の異なるＨｃコ−ド配列およびＬ
ｃコード配列をランダムに結びつける。各々の独立したベクターから与えられた
このベクター配列は、生存ファージの生成のために必要である。さらに、擬ｇＶ
ＩＩＩ配列は２つの開始ベクターのうちの一方のみに含まれるので、Ｌｃ会合ｇ
ＶＩＩＩ−Ｈｃ融合タンパク質としての機能的抗体フラグメントの同時発現は、
ベクター配列が単一のベクター内に連結されるまではファージ表面で達成され得
ない。
【０３６１】 抗体ライブラリーの表面発現は、アンバーサプレッサー株において行われる。
Ｈｃ配列とｇＶＩＩＩ配列との間のアンバー停止コドンは、非サプレッサー株に
おいて２つの成分を連結しない。非サプレッサー株から生成されたファージを単
離し、そしてサプレッサー株を感染させることは、発現の間に、ｇＶＩＩＩ配列
にＨｃ配列を連結させる。感染後にサプレッサー株を培養することは、ｇＶＩＩ
Ｉ融合タンパク質（ｇＶＩＩＩ−Ｆａｂ融合タンパク質）としてライブラリー内
の全ての抗体種をＭ１３ファージの表面で同時発現させることを可能にする。あ
るいは、このＤＮＡは、非サプレッサー株から単離され得、次いで、同じ効果を
達成するようにサプレッサー株に導入され得る。
【０３６２】 表面発現ライブラリーは、標準的アフィニティー単離手順により予め選択され
た分子を結合する特異的Ｆａｂフラグメントについてスクリーニングされる。こ
のような方法としては、例えば、パニング（ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ、
１９８８；本明細書中に参考として援用される）、アフィニティークロマトグラ
フィーおよび固相ブロッティング手順が挙げられる。パニングは、高力価のファ
ージが容易に、迅速かつ少容量でスクリーニングされ得るので好ましい。さらに
、この手順は、集団内の微量なＦａｂフラグメント種を選択し得る。この微量の
フラグメント種は、他の方法では検出不能であり、そして実質的に均質な集団に
まで増殖されない。選択されたＦａｂフラグメントは、このファージ集団の増殖
後に、ポリペプチドをコードする核酸を配列決定することにより特徴づけられ得
る。
【０３６３】 抗体の多様なライブラリーを作製し、所望の結合特異性についてスクリーニン
グするための別の方法は、米国特許第５，６６７，９８８号および同第５，７５
９，８１７号（各々が、本明細書中に参考として援用される）に記載される。こ
の方法は、免疫グロブリン可変重鎖および可変軽鎖の可変ドメインのＣＤＲ領域
に縮重、ならびにファージミドの表面での変異誘発したポリペプチドのディスプ
レイを組み込むために、縮重オリゴヌクレオチドおよびプライマー伸長反応を用
いるファージミドライブラリーの形態での、ヘテロダイマーの免疫グロブリン分
子のライブラリーの調製を包含する。それ以降、ディスプレイタンパク質は、予
め選択された抗原に結合する能力についてスクリーニングされる。
【０３６４】 ヘテロダイマー免疫グロブリン分子を生成するための方法は、一般に、（１）
目的の重鎖または軽鎖のＶ領域コード遺伝子をファージミドディスプレイベクタ
ーに導入すること；（２）無作為化された結合部位をファージミドディスプレイ
タンパク質ベクターへ、抗体Ｖ領域遺伝子のＣＤＲに対する相同性の領域を含み
、そして無作為化したコード配列を生成するための縮重領域を含むオリゴヌクレ
オチドでのプライマー伸長により導入して、各々がファージミド表面ディスプレ
イタンパク質上に提示される異なる推定結合部位を発現し得るディスプレイベク
ターの大きな集団を形成すること；（３）糸状ファージ粒子の表面でディスプレ
イタンパク質および結合部位を発現させること；ならびに（４）アフィニティー
技術（例えば、予め選択された抗原に対するファージ粒子のパニング）を用いて
表面発現したファージ粒子を単離（スクリーニング）し、このことによって、予
め選択された抗原に結合する結合部位を含むディスプレイタンパク質を含む１種
以上のファージミドを単離することを包含する。
【０３６５】 抗体の多様なライブラリーを作製し、そして所望の結合特異性についてスクリ
ーニングするためのこの方法のさらなるバリエーションは、米国特許第５，７０
２，８９２号（本明細書中に参考として援用される）に記載される。この方法に
おいては、重鎖配列のみが用いられ、この重鎖配列は、ＣＤＲＩ超可変領域また
はＣＤＲＩＩＩ超可変領域のいずれかをコードする全てのヌクレオチド位置で無
作為化され、そしてＣＤＲにおける遺伝的可変性は、任意の生物学的プロセスと
は独立して生成される。
【０３６６】 この方法において、２つのライブラリーを操作して、重鎖遺伝子構造の骨格内
のオリゴヌクレオチドモチーフを遺伝的にシャッフルする。ＣＤＲＩまたはＣＤ
ＲＩＩＩのいずれかのランダム変異によって、重鎖遺伝子の超可変領域は、高度
に多様な配列の収集物を生じるように再構築された。変異した遺伝子配列の収集
物によりコードされる重鎖タンパク質は、２つの免疫グロブリン鎖の一方のみを
必要とするが、免疫グロブリンの結合特性の全てを有する潜在能力を保有した。
【０３６７】 詳細には、この方法は、免疫グロブリン軽鎖タンパク質の非存在下で行われる
。改変した重鎖タンパク質を提示するファージライブラリーは、固定化されたリ
ガンドとともにインキュベートされて、固定化されたリガンドに特異的に結合す
る組換えタンパク質をコードするクローンが選択される。次いで、結合したファ
ージを固定化されたリガンドから解離し、そして細菌宿主細胞中での増殖により
増幅させる。個々のウイルスプラーク（各々が異なる組換えタンパク質を発現す
る）は拡大され、次いで、個々のクローンは結合活性についてスクリーニングさ
れ得る。
【０３６８】 （Ｂ７．ヒトリンパ球由来の抗体） インビトロ免疫、または抗原刺激をまた使用して、ヒト抗ＶＥＧＦ抗体を生成
し得る。このような技術を使用して、正常な健全な被験体由来の末梢血リンパ球
を単にインビトロにおいてＶＥＧＦで抗体産生細胞を刺激することにより刺激し
得る。 このような「インビトロ免疫」は、一般的に、リンパ球の混合集団（混
合リンパ球培養物、ＭＬＣ）中での非免疫Ｂリンパ球の抗原特異的活性化を含む
。インビトロ免疫はまた、Ｂ細胞増殖因子およびＢ細胞分化因子ならびにリンホ
カインにより支持され得る。これらの方法により産生される抗体は、しばしば、
ＩｇＭ抗体である（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋら、１９８６；本明細書中に参考とし
て援用される）。
【０３６９】 別の方法が記載され（米国特許第５，６８１，７２９号、本明細書中に参考と
して援用される）、ここで、主にＩｇＧ（またはＩｇＡ）抗体を産生するヒトリ
ンパ球が得られ得る。この方法は、一般的な意味において、免疫不全動物へヒト
リンパ球を移植し、その結果、ヒトリンパ球が動物の身体内に「取りこまれ」；
抗原に特異的な抗体を産生するヒトリンパ球を生成するように所望の抗原を用い
て動物を免疫し；そして動物から抗体を産生するヒトリンパ球を回収する工程を
包含する。従って、産生されたヒトリンパ球を使用して、抗体を産生するヒトリ
ンパ球を不死化し、抗体を産生する得られた不死化ヒト起源リンパ球をクローニ
ングし、そしてクローニングされた不死化ヒト起源リンパ球から所望の抗原に特
異的なモノクローナル抗体を回収することによりモノクローナル抗体を産生し得
る。
【０３７０】 この技術において使用され得る免疫不全動物は、動物にヒトリンパ球が移植さ
れた場合に拒絶を示さない免疫不全動物である。このような動物は、物理的、化
学的、または生物学的な処置により人工的に調製され得る。任意の免疫不全動物
が使用され得る。ヒトリンパ球は、ヒト末梢血、脾臓、リンパ節、扁桃腺などか
ら得られ得る。
【０３７１】 動物における移植されたヒトリンパ球の「取りこみ」は、単に動物にヒトリン
パ球を投与することにより達成され得る。投与経路は制限されず、そして例えば
、皮下、静脈内、または腹腔内であり得る。ヒトリンパ球の用量は制限されず、
そして通常は、動物あたり１０6〜１０8のリンパ球であり得る。次いで、免疫不
全動物は、所望のＶＥＧＦ抗原で免疫される。
【０３７２】 免疫後、ヒトリンパ球が、任意の慣習的な方法により、血液、脾臓、リンパ節
または他のリンパ組織から回収される。例えば、単核細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈ
ｙｐａｑｕｅ（比重：１．０７７）遠心法により分離され得、そしてプラスチッ
クディッシュ吸着法により単球が回収され得る。免疫不全動物由来の夾雑細胞は
、動物細胞に特異的な抗血清を用いることにより取り除かれ得る。抗血清は、例
えば、免疫不全動物の脾臓細胞で第２の異なる動物を免疫し、そして異なる免疫
動物から血清を回収することにより得られ得る。抗血清での処置は、任意の段階
で実施され得る。ヒトリンパ球はまた、マーカーとして、細胞表面上で発現され
るヒト免疫グロブリンを使用する免疫学的方法により回収され得る。
【０３７３】 これらの方法により、一つ以上の選択されたＶＥＧＦエピトープに特異的なＩ
ｇＧ抗体およびＩｇＡ抗体を主に産生するヒトリンパ球が得られ得る。次いで、
モノクローナル抗体が、不死化、選択、細胞増殖、および抗体産生によりヒトリ
ンパ球から得られる。
【０３７４】 （Ｂ８．ヒト抗体ライブラリーを含有するトランスジェニックマウス） 組換え技術は、今や抗体の調製のために利用可能である。上記に開示される組
換え免疫グロブリンファージ発現ライブラリーに加えて、別の分子クローニング
アプローチは、抗体をヒト抗体ライブラリーを含有するトランスジェニックマウ
スから調製することである。このような技術は、米国特許第５，５４５，８０７
号に記載され、これは、本明細書に参考として援用される。
【０３７５】 最も一般的な意味において、これらの方法は、その生殖系統に、ヒト起源の免
疫グロブリンの少なくとも一部をコードする遺伝子材料か、または免疫グロブリ
ンのレパートリーをコードするように再編成され得る遺伝子材料を挿入したトラ
ンスジェニック動物の産生を包含する。挿入された遺伝子材料は、ヒト供給源か
ら産生され得るか、または合成により産生され得る。その材料は、公知の免疫グ
ロブリンの少なくとも一部をコードし得るか、または改変された免疫グロブリン
の少なくとも一部をコードするように改変され得る。
【０３７６】 挿入された遺伝子材料は、トランスジェニック動物において発現され、挿入さ
れたヒト免疫グロブリン遺伝子材料に少なくとも部分的に由来する免疫グロブリ
ンを産生する。その遺伝子材料は、たとえ、その挿入された遺伝子材料が、生殖
系列の誤った位置に、または誤った相対位置に組み込まれたとしても、その一部
が挿入された遺伝子材料に由来する免疫グロブリンのレパートリーが、産生され
得るように、トランスジェニック動物において再編成されることが見出される。
【０３７７】 その挿入された遺伝子材料は、プラスミドおよび／またはコスミドのような原
核生物ベクターにクローン化されたＤＮＡの形態であり得る。より大きなＤＮＡ
フラグメントは、酵母人工染色体ベクターを使用して（Ｂｕｒｋｅら、１９８７
；本明細書中に参考として援用される）、または染色体フラグメントを導入する
ことにより（ＲｉｃｈｅｒおよびＬｏ、１９８９；本明細書中に参考として援用
される）挿入される。その挿入された遺伝子材料は、従来の様式で宿主に（例え
ば、注入によって、または他の手順によって、受精卵または胚性幹細胞に）導入
され得る。
【０３７８】 好ましい局面において、得られるトランスジェニック動物が、免疫グロブリン
を産生するときに、挿入されたヒト遺伝子材料のみを使用するように、免疫グロ
ブリン定常領域をコードする遺伝子材料をはじめから保有しない宿主動物が利用
される。これは、関連する遺伝子材料を欠失する天然に存在する変異体宿主を使
用して、または人工的に、例えば、細胞株で、関連する遺伝子材料が除去されて
いる宿主を究極的に作製するために、変異体を作製することによってのいずれか
で、達成され得る。
【０３７９】 宿主動物が免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子材料を保有する場合、
トランスジェニック動物は、天然に存在する遺伝子材料および挿入された遺伝子
材料を保有し、そして天然に存在する遺伝子材料、挿入された遺伝子材料、およ
び両方のタイプの遺伝子材料の混合物に由来する免疫グロブリンを産生する。こ
の場合、その所望の免疫グロブリンは、トランスジェニック動物に由来するハイ
ブリドーマを、例えば、抗体遺伝子発現の対立遺伝子排除の現象または示差的染
色体損失を利用して、スクリーニングすることによって得られ得る。
【０３８０】 一旦適切なトランスジェニック動物が調製されると、その動物は、所望の免疫
原で単に免疫される。挿入される材料の性質に依存して、その動物は、外来起源
のその遺伝子材料が、免疫グロブリンの一部のみをコードする場合、例えば、混
合されたマウス／ヒト起源のキメラ免疫グロブリンを産生し得る；または、その
動物は、外来起源の遺伝子材料が、免疫グロブリン全体をコードする場合、完全
に外来の免疫グロブリン（例えば、完全にヒト起源の）を産生し得る。
【０３８１】 ポリクローナル抗血清は、免疫に続いて、トランスジェニック動物から産生さ
れ得る。免疫グロブリン産生細胞は、目的の免疫グロブリンを産生する動物から
除去され得る。好ましくは、モノクローナル抗体は、トランスジェニック動物か
ら、例えば、その動物由来の脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合し、そして得られるハ
イブリドーマをスクリーニングして所望の抗体を産生するものを選択することに
よって、産生される。このようなプロセスのための適切な技術は、本明細書に記
載される。
【０３８２】 代替のアプローチにおいて、その遺伝子材料は、所望の抗体が、動物の血清の
ような体液、またはミルク、初乳もしくは唾液のような外部分泌液において産生
されるような様式で、動物に組み込まれ得る。例えば、インビトロでヒト免疫グ
ロブリンの少なくとも一部をコードする遺伝子材料を、ミルクタンパク質をコー
ドする哺乳動物の遺伝子に挿入し、次いで、その遺伝子をその哺乳動物の受精卵
に、例えば、注入により、導入することによって、その卵は、挿入されたヒト免
疫グロブリン遺伝子材料に少なくとも部分的に由来する免疫グロブリンを含有す
るミルクを産生する成体雌哺乳動物に成長し得る。次いで、所望の抗体は、ミル
クから回収され得る。このようなプロセスを行うための適切な技術は、当業者に
公知である。
【０３８３】 上記のトランスジェニック動物は、通常、単一のアイソタイプの、より詳細に
はＢ細胞成熟に必須であるアイソタイプ（例えば、ＩｇＭおよびたぶんＩｇＤ）
のヒト抗体を産生するために利用される。ヒト抗ＶＥＧＦ抗体を産生するための
別の好ましい方法は、米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２
５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６１１
，０１６号；および同第５，７７０，４２９号（各々が本明細書に参考として援
用される）に記載される技術を使用することである。そこでは、Ｂ細胞発生のた
めに必要とされるアイソタイプから他のアイソタイプへ変換し得るトランスジェ
ニック動物が記載される。
【０３８４】 Ｂリンパ球の発生において、その細胞は、まず生産的に再編成されたＶHおよ
びＶL領域によって決定される結合特異性を有するＩｇＭを産生する。その結果
、各Ｂ細胞およびその子孫細胞は、同じＬおよびＨ鎖Ｖ領域を有する抗体を合成
するが、これらは、Ｈ鎖のアイソタイプを交換し得る。ミューまたはデルタ定常
領域の使用は、交互のスプライシングによって大部分決定され、ＩｇＭおよびＩ
ｇＤが、単一の細胞において同時発現されることを可能にする。他の重鎖アイソ
タイプ（γ、α、およびε）は、遺伝子再編成事象が、Ｃミューエキソンおよび
Ｃデルタエキソンを削除した後に、天然においてのみ発現される。この遺伝子の
再編成プロセスは、アイソタイプスイッチングと呼ばれ、代表的には、各重鎖遺
伝子のすぐ上流に位置する（デルタを除く）いわゆるスイッチセグメント間の組
換えによって生じる。個々のスイッチセグメントは、２ｋｂと１０ｋｂとの間の
長さであり、そして主に短い反復した配列からなる。
【０３８５】 これらの理由により、導入遺伝子は、転写調節配列を、アイソタイプスイッチ
ングに利用されるべき各スイッチ領域の約１〜２ｋｂ上流内に組み込んでいるこ
とが好ましい。これらの転写調節配列は、好ましくは、プロモーターおよびエン
ハンサーエレメントを含み、そしてより好ましくは、スイッチ領域に天然に結合
する（すなわち、生殖系統の構成において生じる）５’隣接（すなわち、上流）
領域を含む。１つのスイッチ領域からの５’隣接配列は、導入遺伝子構築のため
に異なるスイッチ領域に作動可能に連結され得るが、いくつかの実施形態では、
導入遺伝子構築物に組み込まれている各スイッチ領域は、天然に存在する生殖系
統構成においてすぐ上流に存在する５’隣接領域を有することが好ましい。免疫
グロブリンスイッチ領域配列に関連する配列情報は、公知である（Ｍｉｌｌｓら
、１９９０；Ｓｉｄｅｒａｓら、１９８９；各々、参考として本明細書に援用さ
れる）。
【０３８６】 米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；第５，６２５
，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号；および第５，
７７０，４２９号に記載される方法では、トランスジェニック動物内に含まれる
ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、アイソタイプのスイッチングに至るＢ細胞発
達の経路を通じて正確に機能する。従って、この方法では、これらの導入遺伝子
は、アイソタイプスイッチングおよび以下の１つ以上を生成するように構築され
る：（１）高レベルおよび細胞型特異的発現、（２）機能的遺伝子再配置、（３
）対立遺伝子排除の活性化および対立遺伝子排除に対する応答、（４）十分な一
次レパートリーの発現、（５）シグナル伝達、（６）体細胞過剰変異、および（
７）免疫応答の間の導入遺伝子抗体遺伝子座の支配。
【０３８７】 導入遺伝子機能に対する重要な要件は、広範な範囲の抗原に対する二次免疫応
答の引金となるために十分に多様性である一次抗体レパートリーの生成である。
再配置された重鎖遺伝子鎖は、各々がいくつかのエキソンによりコードされる、
シグナルペプチドエキソン、可変領域エキソンおよび多ドメイン定常領域の領域
のタンデムアレイからなる。これらの定常領域遺伝子の各々は、異なるクラスの
免疫グロブリンの定常部分をコードする。Ｂ細胞発達の間に、Ｖ領域近位定常領
域は欠失し、新たな重鎖クラスの発現に至る。各重鎖クラスについて、ＲＮＡス
プライシングの選択的パターンが、膜貫通免疫グロブリンおよび分泌された免疫
グロブリンの両方を生じる。
【０３８８】 ヒト重鎖遺伝子座は、２Ｍｂにまたがるほぼ２００Ｖ遺伝子セグメント、約４
０ｋｂにまたがるほぼ３０Ｄ遺伝子セグメント、３ｋｂ内のクラスターである６
つのＪセグメント、およびほぼ３００ｋｂにわたって広がる９つのの定常領域遺
伝子セグメントからなる。全長遺伝子座は、第１４染色体の長腕の遠位部分のほ
ぼ２．５Ｍｂにまたがる。６つの公知のＶHファミリーのすべてのメンバー、Ｄ
およびＪ遺伝子セグメント、ならびにμ、δ、γ３、γ１およびα１定常領域を
含む重鎖導入遺伝子フラグメントは公知である（Ｂｅｒｍａｎら、１９８８；参
考として本明細書に援用される）。すべての必要な遺伝子セグメントおよびヒト
軽鎖遺伝子座からの調節配列を含むゲノムフラグメントもまた同様に構築される
。
【０３８９】 首尾良く再配置された免疫グロブリン重鎖および軽鎖導入遺伝子の発現は、通
常、トランスジェニック非ヒト動物において内因性免疫グロブリン遺伝子の再配
置を抑制することによって優性効果を有する。しかし、特定の実施形態では、例
えば、導入遺伝子と内因性Ｉｇ配列との間のトランススイッチングにより、ヒト
可変領域および非ヒト（例えばマウス）定常領域を含むハイブリッド免疫グロブ
リン鎖が形成され得ないように、内因性Ｉｇ遺伝子座の完全不活性化を行うこと
が所望される。胚性幹細胞技術および相同的組換えを用い、内因性免疫グロブリ
ンレパートリーを容易に排除し得る。さらに、内因性Ｉｇ遺伝子の抑制は、アン
チセンス技法のような種々の技法を用いて達成され得る。
【０３９０】 本発明の他の局面では、トランススイッチされた免疫グロブリンを生成するこ
とが所望され得る。このようなキメラトランススイッチ免疫グロブリンを含む抗
体は、例えば、宿主細胞においてエフェクター機能の保持のために、非ヒト（例
えばマウス）定常領域を有することが所望される種々の適用のために用いられ得
る。マウス定常領域の存在は、ヒト定常領域に比べ、例えば、このようなキメラ
抗体がマウス疾患モデルにおいて試験され得るように、マウスエフェクター機能
（例えば、ＡＤＣＣ、マウス補体固定化）を提供するという利点を与え得る。動
物試験の次に、ヒト可変領域コード配列が、例えば、ＰＣＲTM増幅または供給源
（ハイブリドーマクローン）からのｃＤＮＡクローニングにより単離され、そし
てヒト治療使用により適切なヒト配列抗体をコードするための所望のヒト定常領
域をコードする配列にスプライスされ得る。
【０３９１】 （Ｂ９．ヒト化抗体） 一般に、ヒト抗体は、ヒト治療における使用に少なくとも３つの可能な利点を
有する。第１に、そのエフェクター部分はヒトであるので、例えば、補体依存性
細胞傷害性（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）によって標的細
胞をより効率的に破壊するために、ヒト免疫系の他の部分とより良好に相互作用
し得る。第２に、ヒト免疫系は、異物として抗体を認識しない。第３に、ヒト循
環中の半減期は、天然に存在するヒト抗体と類似であり、より少なくかつより少
ない用量を与えることを可能にする。
【０３９２】 ヒト抗ＶＥＧＦ抗体を調製する種々の方法が本明細書中に提供される。ヒト抗
体に加えて、「ヒト化」抗体は多くの利点を有する。「ヒト化」抗体は、一般に
、ヒト定常および／または可変領域ドメインまたは特定の変更を保持する、マウ
ス、ラット、ハムスター、ウサギまたはその他の種からのキメラまたは変異体モ
ノクローナル抗体である。いわゆる「ヒト化」抗ＶＥＧＦ抗体を生成するための
技法は、当業者に周知である。
【０３９３】 ヒト化抗体もまた、先行する利点を共有する。第１に、エフェクター部分はな
おヒトである。第２に、ヒト免疫系は、フレームワークまたは定常領域を異物と
して認識せず、そしてそれ故、このような注入抗体に対する抗体応答は、完全に
異物であるマウス抗体に対してより少ない。第３に、注入されたヒト化抗体は、
注入されたマウス抗体とは反対に、天然に存在するヒト抗体により類似する半減
期を有し、またより少なくかつより少ない頻度の用量を与える。
【０３９４】 ヒト化抗体を産生する多くの方法が記載されている。新たな人工タンパク質分
子または「キメラ」抗体を形成するための、タンパク質ジスルフィド結合を通じ
て連結される抗体ドメインの制御された再配置が利用され得る（Ｋｏｎｉｅｃｚ
ｎｙら、１９８１；本明細書中に参考として援用される）。組換えＤＮＡ技術も
また、マウス抗体可変軽鎖および重鎖ドメインと、ヒト抗体軽鎖および重鎖定常
ドメインとをコードするＤＮＡ配列間の遺伝子融合を構築するために用いられ得
る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４；本明細書中に参考として援用される）。
【０３９５】 マウスモノクローナル抗体の抗原結合部分または相補性決定領域（ＣＤＲ）を
コードするＤＮＡ配列を、ヒト抗体重鎖および軽鎖のフレームワークをコードす
るＤＮＡ配列中に分子手段により挿入し得る（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８
）。発現された組換え産物は、「新形態」またはヒト化抗体と呼ばれ、そしてヒ
ト抗体軽鎖または重鎖およびマウスモノクローナル抗体の抗原認識部分であるＣ
ＤＲのフレームワークを含む。
【０３９６】 ヒト化抗体を生成する別の方法が、米国特許第５，６３９，６４１号に記載さ
れ、本明細書中に参考として援用される。この方法は、再現により、可変領域に
おいてヒト表面の提示に起因する改良された治療効力を有するヒト化げっ歯類抗
体を提供する。この方法では：（１）抗体重鎖および軽鎖可変領域のプールの位
置アラインメントを生成し、重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面曝露位
置のセットを与える。ここで、すべての可変領域に対するアラインメント位置は
、少なくとも約９８％同一である；（２）重鎖および軽鎖可変領域フレームワー
ク表面曝露アミノ酸残基のセットがげっ歯類抗体（またはそのフラグメント）に
対して規定される；（３）このげっ歯類表面曝露アミノ酸残基のセットに最も近
接して同一である、重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面曝露アミノ酸残
基のセットが同定される；（４）工程（２）で規定された重鎖および軽鎖可変領
域フレームワーク表面曝露アミノ酸残基のセットが、げっ歯類抗体の相補性決定
領域の任意の残基の任意の原子の５Å内にあるようなアミノ酸残基を除いて、工
程（３）で同定された重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面曝露アミノ酸
残基のセットで置換される；および（５）結合特異性を有するヒト化げっ歯類抗
体が産生される。
【０３９７】 ヒト化抗体の産生についての類似の方法は、米国特許第５，６９３，７６２号
；同第５，６９３，７６１号；同第５，５８５，０８９号；および同第５，５３
０，１０１号（各々が本明細書中で参考として援用される）に記載される。これ
らの方法は、１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびドナー免疫グロブリンに
由来するさらなるアミノ酸ならびに受け入れているヒト化免疫グロブリンに由来
するフレームワーク領域を有するヒト化免疫グロブリンを産生することを包含す
る。各々のヒト化免疫グロブリン鎖は、通常、ＣＤＲに加えて、ドナー免疫グロ
ブリン中のＣＤＲに直接隣接する１以上のアミノ酸または分子モデリングにより
推定される約３Å以内の１以上のアミノ酸のような、ＣＤＲと相互作用して結合
親和性をもたらし得るドナー免疫グロブリンフレームワークに由来するアミノ酸
を含む。重鎖および軽鎖は、米国特許第５，６９３，７６２号；同第５，６９３
，７６１号；同第５，５８５，０８９号；および同第５，５３０，１０１号（各
々が本明細書中で参考として援用される）に記載される種々の位置基準の、いず
れか１つ、任意の組合せ、または全てを使用することによって、各々設計され得
る。インタクトな抗体に組み合わされる場合、ヒト化免疫グロブリンは、ヒトに
おいて実質的に非免疫原性であり、そして本来の抗原に対するドナー免疫グロブ
リンと実質的に同じ親和性を保持する。
【０３９８】 ヒト化抗体を産生するためのさらなる方法は、米国特許第５，５６５，３３２
号および同第５，７３３，７４３号（各々が本明細書中で参考として援用される
）に記載される。この方法は、抗体をヒト化する概念を、本明細書中にもまた詳
細に記載されるファージミドライブラリーと組み合わせる。一般的な意味では、
この方法は、目的の抗原に対する抗体または抗体の集団の抗原結合部位に由来す
る配列を利用する。従って、単一のげっ歯類抗体について、抗体の抗原結合部位
の部分を含む配列は、組み合せて完全な抗原結合部位を作製し得るヒト抗体の配
列の多様なレパートリーと組み合せられ得る。
【０３９９】 このプロセスにより作製される抗原結合部位は、本来のげっ歯類抗体の配列の
部分のみが同様の様式にて抗原と接触するようであるという点で、ＣＤＲグラフ
ティング（ｇｒａｆｔｉｎｇ）により作製される抗原結合部位とは異なる。選択
されたヒト配列は、配列において異なるようであり、そして本来の結合部位のそ
れらからの抗原と代替的に接触する。しかし、抗原に対する本来の配列の部分の
結合ならびに抗原およびその抗原結合部位の形状により課される制約は、抗原の
同じ領域またはエピトープに対するヒト配列の新たな接触を駆動するようである
。従って、このプロセスは、「エピトープインプリント選択」（ＥＩＳ）と呼ば
れている。
【０４００】 動物の抗体で開始して、１つのプロセスは、部分的にヒト抗体である抗体の選
択を生じる。このような抗体は、治療において直接的にまたは少数の重要な残基
の変更の後に使用されるべきヒト抗体と配列において十分に類似し得る。ヒト配
列を有する選択された抗体のげっ歯類成分の間の配列の差異は、例えば、個々の
残基の部位特異的変異誘発によってか、またはループ全体のＣＤＲグラフティン
グによって、ヒト配列の残基で異なる残基を置換することによって最小化され得
る。しかし、完全なヒト配列を有する抗体もまた、作製され得る。従って、ＥＩ
Ｓは、それぞれ、動物または部分的なヒト抗体と同じエピトープに結合する部分
的なヒト抗体またはそれぞれ、動物または部分的なヒト抗体と同じエピトープに
結合する完全なヒト抗体を作成するための方法を提供する。ＥＩＳにおいて、抗
体フラグメントのレパートリーは、糸状ファージの表面上に提示され得、そして
抗原結合活性を有するフラグメントをコードする遺伝子は、抗原へのファージの
結合によって選択され得る。
【０４０１】 本発明の使用に意図される抗体をヒト化するためのさらなる方法は、米国特許
第５，７５０，０７８号；同第５，５０２，１６７号；同第５，７０５，１５４
号；同第５，７７０，４０３号；同第５，６９８，４１７号；同第５，６９３，
４９３号；同第５，５５８，８６４号；同第４，９３５，４９６号；および同第
４，８１６，５６７号（各々は、本明細書中で参考として援用される）に記載さ
れる。ＷＯ９８／４５３３１およびＷＯ９８／４５３３２は、特に有益であり、
かつ抗ＶＥＧＦ抗体に適用される場合のヒト化の原理をさらに例示するために、
本明細書中で参考として援用される。
【０４０２】 （Ｂ１０．ＰＣＲTMによる変異誘発） 部位特異的変異誘発は、基礎となるＤＮＡの特異的な変異誘発を通して、個々
の抗体の調製において有用な技術である。この技術はさらに、ヒト化しようとし
なかろうと、ＤＮＡ内に１以上のヌクレオチド配列の変化を導入することによっ
て、１以上の前述の考慮を援用して、配列改変体を調製および試験するすばやい
能力を提供する。
【０４０３】 多くの方法が、変異誘発における使用について適切であるが、ポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲTM）の使用は、一般的に現在好ましい。この技術は、所定のＤＮ
Ａ配列中に所望の変異を導入するための迅速かつ効率的な方法を提供する。以下
のテキストは、所定の配列によってコードされるアミノ酸を変えるために使用さ
れ得るような、配列中に点変異を導入するＰＣＲTMの使用を特に記載する。この
方法の適応もまた、ＤＮＡ分子中に制限酵素部位を導入するために適切である。
【０４０４】 この方法において、合成オリゴヌクレオチドは、増幅したセグメントの一方の
端に点変異を組み込むために設計される。ＰＣＲTMの後に、増幅したフラグメン
トは、クレノーフラグメントで処理することによって、平滑末端にされ、次いで
、この平滑末端フラグメントは、配列分析を容易にするためにベクター中に連結
され、そしてサブクローニングされる。
【０４０５】 変異誘発することを所望するテンプレートのＤＮＡを調製するために、このＤ
ＮＡは、高コピー数のベクター（例えば、ｐＵＣ１９）中に、変異される領域に
隣接する制限部位を使用して、サブクローニングされる。次いで、テンプレート
のＤＮＡは、プラスミドのミニプレップを使用して調製される。親配列に基づく
が、所望の点変異を含みかつ制限酵素部位によってその５’末端に隣接される、
適切なオリゴヌクレオチドプライマーが、自動化合成機を使用して合成される。
約１５塩基程度のテンプレートＤＮＡに相同なプライマーが、一般に必要とされ
る。プライマーは、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製され得る
が、これは、ＰＣＲTMの使用について絶対に必要ではない。次いで、このオリゴ
ヌクレオチドの５’末端は、リン酸化されるべきである。
【０４０６】 このテンプレートＤＮＡは、所望の点変異を含むオリゴヌクレオチドプライマ
ーを使用して、ＰＣＲTMによって増幅されるべきである。増幅緩衝液中のＭｇＣ
ｌ2の濃度は、一般に約１５ｍＭである。一般に、約２０〜２５サイクルのＰＣ
ＲTMが、以下の通りに実行されるべきである：９５℃にて３５秒の変性；５０℃
にて２分のハイブリダイゼーション；および７２℃にて２分の伸長。ＰＣＲTMは
、一般に、７２℃での約１０分間の最後のサイクルの伸長を含む。最後の伸長工
程の後に、約５ユニットのクレノーフラグメントが、反応混合物に添加され、約
３０℃にてさらに１５分間インキュベートされるべきである。クレノーフラグメ
ントのエキソヌクレアーゼ活性は、末端を平らにし、そして平滑末端クローニン
グに適切にするために必要とされる。
【０４０７】 得られた反応混合物は、一般に、この増幅が推定される産物を生じたことを確
認するために、非変性アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動によって分
析されるべきである。次いで、大部分のミネラルオイルを除去し、クロロホルム
で抽出して残っているオイルを除去し、緩衝化フェノールで抽出し、次いで１０
０％エタノールを用いる沈澱により濃縮することによって、反応混合物を処理す
る。次に、このオリゴヌクレオチドに使用された隣接配列で切断する制限酵素を
用いて増幅したフラグメントのおよそ半分を消化するべきである。この消化した
フラグメントは、低ゲル化／融点アガロースゲル上にて精製される。
【０４０８】 このフラグメントをサブクローニングするため、そして点変異を調べるために
、平滑末端のライゲーションによって、適切に消化されたベクター中に２つの増
幅したフラグメントをサブクローニングする。これは、ミニプレップを使用して
、プラスミドＤＮＡが引き続き調製され得るＥ．ｃｏｌｉを形質転換するために
使用される。次いで、プラスミドＤＮＡの増幅した部分は、正確な点変異が作製
されたことを確認するためにＤＮＡ配列決定によって分析される。Ｔａｑ ＤＮ
Ａポリメラーゼは、ＤＮＡフラグメント中にさらなる点変異を導入するので、こ
れは、重要である。
【０４０９】 点変異の導入はまた、一連のＰＣＲTM工程を使用してもたらされ得る。この手
順において、この変異を含む２つのフラグメントは、互いにアニールされ、そし
て相互に開始する合成によって伸長される。次いで、このフラグメントは、第２
のＰＣＲTM工程によって増幅され、それによって上記のプロトコルに必要とされ
る平滑末端のライゲーションを回避する。この方法において、テンプレートＤＮ
Ａの調製、オリゴヌクレオチドプライマーの作製および第１のＰＣＲTM増幅は、
上記のように実行される。しかし、このプロセスにおいて、選択されたオリゴヌ
クレオチドは、約１５〜約２０個の間の塩基のストレッチについてテンプレート
ＤＮＡと相同なはずであり、そしてまた約１０塩基以上だけで互いに重複しなけ
ればならない。
【０４１０】 第２のＰＣＲTM増幅において、上記の条件を使用して、各々の増幅したフラグ
メントおよび各々の隣接する配列プライマーを使用して、そして約２０〜約２５
の間のサイクルについてＰＣＲTMを実行する。再度、このフラグメントをサブク
ローニングし、そして上記に概説した工程を使用して点変異が正確であったこと
を調べる。
【０４１１】 前述の方法のいずれかを使用して、可能な限り小さなフラグメントを増幅する
ことによって、変異を導入することが、一般に好ましい。もちろん、パラメータ
（例えば、ＧＣ含量およびこのオリゴの長さによって一般に影響される、オリゴ
ヌクレオチドの融解温度）はまた、注意深く考慮されるべきである。これらの方
法の実行、および必要な場合、それらの最適化は、当業者に公知であり、そして
本明細書中に参考として援用される、種々の刊行物（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５）
にさらに記載される。
【０４１２】 部位特異的変異誘発を実行する場合に、表Ａは、参考として用いられ得る。
【０４１３】
【表１】
【０４１４】 （Ｂ１１．抗体フラグメントおよび誘導体） 本来のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体の供給源とは無関係に、インタクトな
抗体、抗体マルチマー、または抗体の種々の機能的な抗原結合領域のいずれか１
つは、本発明において使用され得る。例示的な機能領域は、抗ＶＥＧＦ抗体のｓ
ｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2フラグメントを含む。こ
のような構築物を調製するための技術は、当業者に周知であり、そして本明細書
中にてさらに例示される。
【０４１５】 抗体構築物の選択は、種々の因子によって影響され得る。例えば、延長した半
減期は、腎臓内のインタクトな抗体の能動的な再吸収（免疫グロブリンのＦｃ片
の特性）から生じ得る。従って、ＩｇＧベースの抗体は、それらのＦａｂ’対応
物よりも遅い血中クリアランスを示すことが予測される。しかし、Ｆａｂ’フラ
グメントベースの組成物は、一般に、より良好な組織浸透能力を示す。
【０４１６】 抗体フラグメントは、非特異的チオールプロテアーゼであるパパインによる免
疫グロブリン全体のタンパク質分解によって得られ得る。パパイン消化により、
２つの同一の抗原結合フラグメント（「Ｆａｂフラグメント」および残りの「Ｆ
ｃフラグメント」と呼ばれ、Ｆａｂフラグメントは、各々が単一の抗原結合部位
を有する）が得られる。
【０４１７】 パパインはまず、活性部位中のスルフヒドリル基を、システイン、２−メルカ
プトエタノールまたはジチオスレイトールで還元することによって活性化されな
ければならない。ストック酵素中の重金属は、最大の酵素活性を補償するために
、ＥＤＴＡ（２ｍＭ）でのキレート化によって除去されるべきである。酵素およ
び基質は、通常、１：１００の重量比で一緒に混合される。インキュベーション
の後に、この反応は、ヨードアセトアミドを用いるチオール基の不可逆的なアル
キル化によってか、または単純に透析によって停止され得る。この消化の終了は
、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニターされ、そして種々の画分は、プロテインＡ
−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅまたはイオン交換クロマトグラフィーによって分離される
べきである。
【０４１８】 ウサギおよびヒト起源のＩｇＧからのＦ（ａｂ’）2フラグメントの調製のた
めの通常の手順は、酵素のペプシンによる限定されたタンパク質分解である。こ
の条件（１００×抗体過剰ｗ／ｗ酢酸緩衝液中ｐＨ４．５、３７℃）は、抗体が
重鎖内のジスルフィド結合のＣ末端側にて切断されることを示唆する。マウスＩ
ｇＧの消化の速度は、サブクラスで変動し得、そして条件は、有意な量の完全に
分解されたＩｇＧを避けるように選択されるべきである。特に、ＩｇＧ2bは、完
全な分解を受けやすい。他のサブクラスは、最適な結果を生じるために異なるイ
ンキュベーション条件（これらの全ては、当該分野で公知である）を必要とする
。
【０４１９】 インタクトな抗体のペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有するＦ（ａ
ｂ’）2フラグメントが得られ、そしてなお抗原を架橋し得る。ペプシンによる
ラットＩｇＧの消化は、０．１Ｍ 酢酸緩衝液、ｐＨ４．５、中での透析、次い
で１％ ｗ／ｗペプシンを用いる４時間のインキュベーションを含む条件を必要
とする；ＩｇＧ1およびＩｇＧ2a消化は、初めに４℃で１６時間の０．１Ｍホル
メート緩衝液、ｐＨ２．８、続いて酢酸緩衝液に対して透析される場合に、改善
される。ＩｇＧ2bは、０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．８中のｓｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ Ｖ８ プロテアーゼ（３％ｗ／ｗ）における３７℃で４時間のイ
ンキュベーションでより一貫した結果を生じる。
【０４２０】 Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメ
イン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１以上
のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端でのいくつかの残基
の付加によって、Ｆａｂフラグメントと異なる。Ｆ（ａｂ’）2抗体フラグメン
トは、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として
、本来生成された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングは公知である。
【０４２１】 「Ｆｖ」フラグメントは、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小
の抗体フラグメントである。この領域は、密接した共有結合（ｃｏｎ−ｃｏｖａ
ｌｅｎｔ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）した１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖
可変ドメインとのダイマーから構成される。各可変ドメインの３つの超可変領域
が、ＶH−ＶLダイマーの表面上の抗原結合部位を規定するように相互作用するこ
とは、この構成内にある。集合的に、６つの超可変領域は、抗体に抗原結合特異
性を与える。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に対して特異的な３つの
超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえ、全結合部位よりも低い親和力である
が、抗原を認識しかつ結合する能力を有する。
【０４２２】 「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶHおよびＶLドメ
インを含み、ここでこれらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般
的に、Ｆｖポリペプチドは、ＶHドメインとＶLドメインとの間のポリペプチドリ
ンカーをさらに含み、これはｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成するこ
とを可能にする。
【０４２３】 以下の特許および特許出願は、抗体の機能的な抗原結合領域（抗ＶＥＧＦ抗体
のｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2フラグメントを含む
）の調製および使用に関する本教示をなおさらに補足する目的のために、本明細
書中に参考として具体的に援用される：米国特許第５，８５５，８６６号；同第
５，９６５，１３２号；同第６，０５１，２３０号；同第６，００４，５５５号
；および同第５，８７７，２８９号；ならびに米国特許出願第０８／４８２，３
６９号（１９９８年１０月２０日に特許証発行料金が支払われた）。ＷＯ９８／
４５３３１もまた、抗体の可変領域、超可変領域、および相補性決定領域（ＣＤ
Ｒ）（ を含む）の調製をなおさらに記載および教示することを含む目的の
ために、本明細書中に参考として援用される。
【０４２４】 「ｄｉａｂｏｄｙ」は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体フラグメント
であり、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶH−ＶL）において軽鎖可
変ドメイン（ＶL）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶH）を含む。同じ鎖上で２
つのドメインの間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることによ
って、これらのドメインは、別の鎖の相補ドメインと対を形成することを強いら
れ、そして２つの抗原結合部位を作製する。ｄｉａｂｏｄｙは、ＥＰ４０４，０
９７およびＷＯ９３／１１１６１（各々、本明細書中に参考として具体的に援用
される）に記載される。「線形抗体（ｌｉｎｅａｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」（こ
れは、二特異的または一特異的であり得る）は、Ｚａｐａｔａら（１９９５）（
本明細書中に参考として具体的に援用される）に記載されるように、一対の抗原
結合領域を形成する一対のタンデム型Ｆｄセグメント（ＶH−ＣH１−ＶH−ＣH１
）を含む。
【０４２５】 抗体のＦａｂ’フラグメントまたは抗原結合フラグメントの使用において、組
織貫通に対する付帯利益と共に、その半減期を増加するようにフラグメントを改
変することにより、さらなる利点を引き出し得る。種々の技術（例えば、抗体分
子自身の操作または改変、およびまた不活性なキャリアへの結合）が使用され得
る。薬剤を標的に送達するのではなく、半減期を増加させるただ一つの目的のた
めに、任意の結合が注意深くアプローチされるべきであり、その際にＦａｂ’お
よび他のフラグメントは、組織を貫通するように選択される。それでもなお、非
タンパク質ポリマー（例えば、ＰＥＧなど）への結合が意図される。
【０４２６】 従って、結合ではなく改変は、抗体フラグメントをより安定にし、そして／ま
たは身体における異化作用の速度を減少させるように、抗体フラグメントの構造
を改変することに基づく。このような改変の１つのメカニズムは、Ｌ−アミノ酸
の代わりのＤ−アミノ酸の使用である。このような改変の導入は、得られた分子
がなお所望の生物学的特性を保持していることを確実にするために、得られた分
子の厳密な試験を次に必要とすることを当業者は理解する。さらなる安定化改変
は、Ｎ末端もしくはＣ末端のいずれか、またはその両方への、安定化部分の付加
の使用を含み、これは、一般的には生物学的分子の半減期を延ばすために使用さ
れる。例示のみの目的で、アシル化またはアミノ化によって末端を改変すること
を所望し得る。
【０４２７】 本発明と共に使用するための適度な結合型改変は、サルベージレセプター結合
エピトープを抗体フラグメントに組み込む工程を包含する。これを達成するため
の技術としては、抗体フラグメントの適切な領域の変異、または抗体フラグメン
トに付着するペプチドタグとしてのエピトープの組み込みが挙げられる。ＷＯ９
６／３２４７８は、このような技術をさらに説明する目的のために、本明細書中
に参考として具体的に援用される。サルベージレセプター結合エピトープは、代
表的には、抗体フラグメントの類似の位置に移されるＦｃドメインの１つまたは
２つのラップ（ｌｏｐ）由来の３つ以上のアミノ酸の領域である。ＷＯ９８／４
５３３１のサルベージレセプター結合エピトープは、本発明と共に使用するため
に、本明細書中に参考として援用される。
【０４２８】 （Ｂ１２．結合アッセイおよび機能アッセイ） 本発明は、動物およびヒト処置レジメンにおいて有意な用途を有するが、多く
の他の実用的用途（多くのインビトロ用途を含む）もまた有する。特定のこれら
の用途は、抗体または免疫複合体の特異的結合特性に関する。本発明のそれらの
すべての化合物には、少なくとも１つの抗体要素が含まれ、これらは最初の抗体
が使用され得る実質的にすべての結合実施形態において使用され得る。
【０４２９】 付着薬剤の存在は、関連する場合、有利な特性を提供するが、任意の結合アッ
セイにおける第１の抗体領域の利用を否定しない。従って、適切に有用な結合ア
ッセイとしては、本明細書中にさらに記載されるような、当該分野において通常
使用される結合アッセイ（例えば、イムノブロット、ウエスタンブロット、ドッ
トブロット、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、免疫組織学、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ
）、免疫沈降、アフィニティークロマトグラフィーなど）が挙げられる。
【０４３０】 特定の標準的な結合アッセイは、抗原が固体支持体マトリックス（例えば、ニ
トロセルロース、ナイロンまたはそれらの組み合わせ）に固定されている（例え
ば、イムノブロット、ウエスタンブロットおよび関連するアッセイにおけるよう
な）アッセイである。他の重要なアッセイは、ＥＬＩＳＡである。すべてのこの
ようなアッセイは、血管形成疾患の診断において適用され得るように、ＶＥＧＦ
の検出における使用のために容易に適用され得る。本発明の薬剤はまた、免疫組
織化学において；蛍光標示式細胞分取、フローサイトメトリーまたはフロー微蛍
光測定において；免疫沈降において；抗原精製実施形態（例えば、アフィニティ
ークロマトグラフィー（二特異的抗体の場合をも含む）、１以上の抗原の同時の
１工程急速精製）；ならびに本明細書中で示される情報を与えられた当業者に公
知の多くの他の結合アッセイにおいて、新しく冷凍したパラフィン包埋組織ブロ
ックおよびホルマリン固定したパラフィン包埋組織ブロックの両方と共に使用さ
れ得る。
【０４３１】 本抗体のさらなる実用的用途は、機能的アッセイにおけるコントロールとして
である。これらは、多くのインビトロおよびエキソビボアッセイおよび系ならび
に動物モデル研究を含む。本発明の抗体の結合特性および機能的特性が特に特異
的である場合（すなわち、これらがＶＥＧＦの（ＶＥＧＦＲ１ではなく）ＶＥＧ
ＦＲ２への結合およびＶＥＧＦＲ２を介したシグナル伝達を阻害する）、このよ
うな「コントロール」用途は、実際に非常に有用である。本発明のこのような実
用的適用から利益を得るアッセイとしては、例えば、ＶＥＧＦ媒介内皮細胞増殖
、ＶＥＧＦ誘導リン酸化およびＶＥＧＦ誘導血管浸透性に関連するアッセイ、な
らびに新生血管形成の角膜マイクロポケットアッセイおよびニワトリ絨毛尿膜（
ＣＡＭ）アッセイが挙げられる。これらのアッセイ系はまた、インビトロまたは
エキソビボ薬物スクリーニングアッセイに発展し、ここで十分に規定された特性
を有する生物学的材料の本提供は、特に重要である。
【０４３２】 （Ｃ．免疫結合体） 本発明は、抗血管形成方法における使用のための非常に効果的な裸の抗体また
は非結合抗体を提供するが、ＶＥＧＦＲ２遮断抗体（抗ＶＥＧＦ抗体）または２
Ｃ３に基づく免疫結合体、イムノトキシンおよびコアグリガンド（ｃｏａｇｕｌ
ｉｇａｎｄ）もまた本明細書によって提供される。ＶＥＧＦＲ２遮断抗体（抗Ｖ
ＥＧＦ抗体）または２Ｃ３に基づく治療的結合体における使用のための現在好ま
しい薬剤は、放射線療法剤（本明細書中に開示される放射線診断によって例示さ
れるような）、抗血管形成剤、アポトーシス誘導剤、抗チューブリン剤、抗細胞
剤または抗細胞傷害剤および凝血剤（凝固因子）である。
【０４３３】 免疫結合体、イムノトキシンおよびコアグリガンドを生成するために、当業者
に公知であり、かつ本明細書中でさらに開示されるように、組換え発現を使用し
て融合タンパク質を作製し得る。同様に、免疫結合体、イムノトキシンおよびコ
アグリガンドは、アビジン：ビオチン架橋または任意の化学的結合および抗体結
合体に関して開発された架橋技術を用いて生成され得る。
【０４３４】 （Ｃ１．毒素および抗細胞性薬剤） 特定の適用のために、治療剤は、内皮細胞の増殖または細胞分裂を消失または
抑制する能力を有する、細胞傷害性薬剤または薬理学的薬剤、特に細胞傷害性薬
剤、細胞分裂抑制剤か、そうでなければ抗細胞性薬剤である。一般に、本発明の
これらの局面は、ＶＥＧＦＲ２を遮断、抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３様抗体に結
合されて、そして活性な形態で標的化される内皮に送達され得る任意の薬理学的
薬剤の使用を意図する。
【０４３５】 例示的な抗細胞性薬剤には、化学療法剤および細胞毒が挙げられる。使用され
得る化学療法剤には以下が挙げられる：ホルモン（例えば、ステロイド）；代謝
拮抗薬（例えば、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキセート
またはアミノプテリン）；アントラサイクリン；マイトマイシンＣ；ビンカアル
カロイド類；デメコルチン；エトポシド：ミトラマイシン：抗腫瘍アルキル化剤
（例えば、クロラムブシルまたはメルファラン）。他の実施形態は、サイトカイ
ンのような薬剤を含み得る。基本的には、標的化された内皮細胞の部位での血液
成分への標的化、インターナリゼーション、放出および／または提示を可能にす
る様式で、抗体に首尾良く結合され得るか、またはそれと会合され得る限り、任
意の抗細胞性薬剤が使用され得る。
【０４３６】 例えば、標的抗原が、毒性化合物による効率的な中毒と一致する経路によって
インターナライズしない場合、化学療法剤（例えば、抗腫瘍薬物、サイトカイン
、代謝拮抗薬、アルキル化剤、ホルモンなど）を標的化することが望まれる場合
のような状況が存在し得る。種々の化学療法剤および他の薬理学的薬剤（ドキソ
ルビシン、ダウノマイシン、メトトレキセート、ビンブラスチン、ネオカルチノ
スタチン、マクロマイシン、トレニモン（ｔｒｅｎｉｍｏｎ）およびα−アマニ
チンを含む）は、現在では、抗体に首尾良く結合され、そして薬理学的に機能す
ることが示されている。
【０４３７】 他の状況において、細胞毒に基づく治療由来の任意の潜在的な副作用が、ＤＮ
Ａ合成インヒビター（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アドリアマイ
シンなど）の使用によって除去され得る。従って、これらの薬剤は、本発明にお
ける使用のための抗細胞性薬剤の好ましい例である。
【０４３８】 細胞分裂抑制剤に関して、そのような化合物は、一般に、標的細胞の天然の細
胞周期を、好ましくはその細胞が細胞周期からはずされるように妨害する。例示
的な細胞分裂抑制剤は含む。
【０４３９】 ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体に結合され得る、
広範な種々のネガティブが公知である。例には、いくつか例を挙げると、例とし
て以下が挙げられる多くの有用な植物由来毒素、真菌由来毒素または細菌由来毒
素が挙げられる：種々のＡ鎖毒素、特にリシンＡ鎖；リボソーム不活化タンパク
質（例えば、サポリンまたはゲロニン）；α−サルシン；アスペルギリン；レス
トリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）；リボヌクレアーゼ（例えば、胎盤
リボヌクレアーゼ）；ジフテリア毒素；およびｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素。
【０４４０】 毒素のうち、リシンＡ鎖が好ましい。本発明に関する使用のための最も好まし
い毒素部分は、炭水化物残基を改変または除去するように処理された毒素Ａ鎖、
いわゆる脱グリコシル化Ａ鎖（ｄｇＡ）である。脱グリコシル化リシンＡ鎖は、
その極度の有効性、より長い寿命のため、そして臨床等級および規模での製造に
経済的に適切であるために好ましい。
【０４４１】 最も小さな分子であるが、にもかかわらず適切な生物学的応答を提供すること
が可能な分子を使用することは、薬理学的見地から望ましくあり得る。例えば、
十分な抗細胞応答を提供するより小さなＡ鎖ペプチドを使用することが望まれ得
る。この目的のために、リシンＡ鎖は、Ｎａｇａｒａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）による
３０のＮ末端アミノ酸の除去によって「切り詰め」され得、そしてなお十分な毒
素活性を保持し得ることが発見されている。所望される場合、この切り詰めされ
たＡ鎖は、本発明に従って結合体において使用され得ることが提案される。
【０４４２】 あるいは、毒素Ａ鎖部分への組換えＤＮＡ技術の適用は、本発明によるさらな
る利益を提供することが理解され得る。生物学的に活性なリシンＡ鎖のクローニ
ングおよび発現が達成されているという点で、現在では、より小さいまたは他の
様式の改変体ペプチドであるが、にもかかわらず適切な毒素活性を示す改変体ペ
プチドを同定および調製することが可能である。さらに、現在では、リシンＡ鎖
がクローニングされているという事実によって、部位特異的変異誘発の適用が可
能であり、それを通じて、Ａ鎖由来ペプチドが容易に調製およびスクリーニング
され得、そして本発明と組み合わせての使用のためのさらなる有用な部分が得ら
れる。
【０４４３】 （Ｃ２．凝固因子） 本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体は、凝固
を直接的または間接的に刺激し得る成分に連結され、コアグリガンドを形成し得
る。ここで、この抗体は、凝血薬または凝固因子に直接的に連結され得るか、ま
たは凝血薬もしくは凝固因子を結合し、次いでそれらを放出する第２の結合領域
に連結され得る。本明細書中で使用される用語「凝血薬」および「凝固因子」を
各々使用して、適切な条件下、好ましくは特定のインビボ環境（例えば、腫瘍血
管構造）に提供される場合に、凝固を直接的または間接的に刺激し得る成分をい
う。
【０４４４】 好ましい凝固因子は、組織因子組成物（例えば、切り詰めされたＴＦ（ｔＴＦ
）、ダイマーＴＦ分子、マルチマーＴＦ分子および変異体ＴＦ分子）である。「
切り詰めされたＴＦ（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ＴＦ）」（ｔＴＦ）は、膜結合欠損
に、この特性における変化をもたらすために十分なアミノ酸配列を除去すること
によってされているＴＦ構造をいう。この状況において「十分な量」とは、ＴＦ
分子を膜中に進入させるか、またはＴＦタンパク質の機能的な膜結合を他の様式
で媒介するに元々十分な、膜貫通アミノ酸配列の量である。従って、このような
「十分な量の膜貫通配列」の除去は、リン脂質膜結合能を欠損した切り詰めされ
た組織因子タンパク質またはポリペプチドを生じ、その結果、このタンパク質は
、実質的に、リン脂質膜に有意に結合しない可溶性タンパク質である。従って、
切り詰めされたＴＦは、実質的に、標準的なＴＦアッセイにおいて第ＶＩＩ因子
を第ＶＩＩａ因子に変換し得ず、そしてなお第ＶＩＩａ因子の存在下で第Ｘ因子
を活性化することを含む、いわゆる触媒活性を保持する。
【０４４５】 米国特許第５，５０４，０６７号は、そのような切り詰めされた組織因子タン
パク質をさらに記載する目的のために、特に本明細書中において参考として援用
される。好ましくは、本発明のこれらの局面における使用のための組織因子は、
一般に、タンパク質の膜貫通領域および細胞質領域（アミノ酸２２０〜２６３）
を欠く。しかし、切り詰めされたＴＦ分子が、２１９アミノ酸という正確な長さ
の分子に限定される必要はない。
【０４４６】 組織因子組成物はまた、ダイマーとして有用であり得る。任意の切り詰めされ
た組織因子構築物、変異された組織因子構築物、または他の組織因子構築物は、
本発明における使用のためにダイマー形態で調製され得る。当業者に公知のよう
に、このようなＴＦダイマーは、分子生物学および組換え発現の標準的な技術を
使用することによって調製され得る。ここで２つのコード領域は、インフレーム
に調製され、そして発現ベクターから発現される。同様に、種々の化学結合技術
が、ＴＦダイマーの調製と組み合わせて使用され得る。個々のＴＦモノマーは、
結合の前に誘導体化され得る。すべてのこのような技術は、当業者に容易に公知
である。
【０４４７】 所望される場合、組織因子ダイマーまたはマルチマーは、生物学的に放出可能
な（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ−ｒｅｌｅａｓａｂｌｅ）結合（例えば、選択的
に切断可能なリンカーまたはアミノ酸配列）を介して結合され得る。例えば、腫
瘍環境内で優先的に配置されるか、または活性である酵素についての切断部位を
含むペプチドリンカーが意図される。そのようなペプチドリンカーの例示的な形
態は、ウロキナーゼ、プラスミン、トロンビン、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子また
はメタロプロテイナーゼ（例えば、コラーゲナーゼ、ゲラチナーゼまたはストロ
メライシン）によって切断されるペプチドリンカーである。
【０４４８】 特定の実施形態において、組織因子ダイマーはさらに、後にリン脂質膜と組織
因子の機能的会合を（特定の所定の条件下のみであるが）強化するために、妨げ
られた疎水性膜挿入部分を含み得る。切り詰めされた組織因子の状況において記
載される場合、疎水性膜会合配列は、一般に、それらの疎水性の性質に起因して
、リン脂質環境との会合を促進するアミノ酸のストレッチである。同様に、脂肪
酸は、潜在的な膜挿入部分を提供するために使用され得る。
【０４４９】 このような膜挿入配列は、それらの付着がＴＦ構築物の機能的特性を妨げない
限り、ＴＦ分子のＮ末端もしくはＣ末端のいずれかに位置され得るか、または一
般に膜の任意の他の点に付加され得る。妨げられた挿入部分の意義は、ＴＦ構築
物が腫瘍環境に位置するまで、それは非機能性を保持し、そして疎水性付加が、
接近可能になり、そしてなおさらに膜との物理的会合を促進するのを可能にする
ことである。再度、生物学的に放出可能な結合および選択的に切断可能な配列が
、この点において特に有用であり、結合または配列のみが、腫瘍環境内の局在化
および特定の酵素または他の生物活性分子への曝露の際に切断または他の様式で
改変されることが意図される。
【０４５０】 他の実施形態において、ｔＴＦ構築物は、マルチマーまたはポリマーであり得
る。この状況において、「ポリマー構築物」は、３以上の組織因子構築物を含む
。「マルチマーＴＦ構築物またはポリマーＴＦ構築物」は、少なくとも第２およ
び第３のＴＦ分子または誘導体に作動可能に結合された第１のＴＦ分子または誘
導体を含む構築物である。マルチマーは、約３〜約２０のこのようなＴＦ分子を
含み得る。マルチマーまたはポリマー内の個々のＴＦ単位はまた、所望される場
合、選択的に切断可能なペプチドリンカーまたは他の生物学的に放出可能な結合
によって連結され得る。再度、上記に議論されたＴＦダイマーに関して、構築物
は、組換え操作および発現を用いるか、または標準的な合成化学を用いるかのい
ずれかで容易に作製され得る。
【０４５１】 本発明の状況において有用ななおさらなるＴＦ構築物は、第ＶＩＩ因子を活性
化する能力が欠損している変異体である。そのような「第ＶＩＩ因子活性化変異
体」は、一般に、機能的な第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子を結合し、第Ｘ因子をタンパ
ク質分解性に活性化するが、第ＶＩＩ因子をタンパク質分解性に活性化する能力
が実質的に存在しないＴＦ変異体として本明細書中において定義されている。従
って、そのような構築物は、第ＶＩＩ因子活性化活性を欠くＴＦ変異体である。
【０４５２】 そのような第ＶＩＩ因子活性化変異体が、腫瘍特異的凝固を促進する際に機能
する能力は、腫瘍血管構造へのそれらの特異的送達、および血漿中における低い
レベルでの第ＶＩＩａ因子の存在に基づく。そのような第ＶＩＩ因子活性化変異
体標的化剤結合体の投与の際に、変異体は、血管新生化腫瘍の血管構造内に局在
化される。局在化の前に、ＴＦ変異体は、一般に、第ＶＩＩ因子を第ＶＩＩａ因
子に変換し得ないことに基づいて、任意の他の身体部位における凝固を促進し得
ない。しかし、次いで、腫瘍領域内の局在化および蓄積の際に、変異体は、外因
性の凝固経路を開始するために血漿から十分な第ＶＩＩａ因子と出会い、腫瘍特
異的血栓症を導く。外因性の第ＶＩＩａ因子もまた患者に投与され得る。
【０４５３】 種々の第ＶＩＩ因子活性化変異体のうちの任意の１つ以上が調製され、本発明
と組み合わせて使用され得る。第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子についてのＴＦ分子上の
認識部位に関して、有意な量の科学知識が存在する。従って、第ＶＩＩ活性化領
域が、一般にＴＦ分子のおよそアミノ酸１５７〜およそアミノ酸１６７の間に位
置することが理解される。しかし、この領域の外側の残基もまた、第ＶＩＩ活性
化活性に関連することが判明し得、従ってＴＦ配列のおよそアミノ酸１０６〜お
よそアミノ酸２０９に一般に位置する残基の任意の１つ以上に変異を導入するこ
とが考慮され得る（ＷＯ９４／０７５１５；ＷＯ９４／２８０１７；各々、本明
細書中において参考として援用される）。
【０４５４】 種々の他の凝固因子は、以下に示される薬剤によって例示されるように、本発
明と組み合わせて使用され得る。トロンビン、第Ｖ／Ｖａ因子および誘導体、第
ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子および誘導体、第ＩＸ／ＩＸａ因子および誘導体、第
Ｘ／Ｘａ因子および誘導体、第ＸＩ／ＸＩａ因子および誘導体、第ＸＩＩ／ＸＩ
Ｉａ因子および誘導体、第ＸＩＩＩ／ＸＩＩＩａ因子および誘導体、第Ｘ因子ア
クチベーターおよび第Ｖ因子アクチベーターが、本発明において使用され得る。
【０４５５】 ラッセルクサリヘビ蛇毒第Ｘ因子アクチベーターは、本発明における使用につ
いて意図される。ラッセルクサリヘビ蛇毒中に存在する第Ｘ因子アクチベーター
について特異的なモノクローナル抗体もまた産生されており、そして二重特異性
結合リガンドの部分として因子を特異的に送達するために使用され得る。
【０４５６】 トロンボキサンＡ2は、血小板ミクロソーム中の酵素シクロオキシゲナーゼお
よび酵素トロンボキサンシンテターゼの連続的作用によって、エンドペルオキシ
ドから形成される。トロンボキサンＡ2は血小板によって容易に産生され、そし
て血小板凝集を生成するその能力が理由で強力な血管収縮薬である。トロンボキ
サンＡ2およびその活性なアナログは、本発明の用途のために意図される。
【０４５７】 トロンボキサンシンターゼ、および血小板活性化プロスタグランジンを合成す
る他の酵素もまた、本発明の状況において「凝固薬」として使用され得る。トロ
ンボキサンシンターゼに対するモノクローナル抗体、およびトロンボキサンシン
ターゼのイムノアフィニティ精製は公知であり；ヒトトロンボキサンシンターゼ
についてのｃＤＮＡも同様である。
【０４５８】 α２−抗プラスミン、すなわち、α２−プラスミンインヒビターは、プラスミ
ノーゲンアクチベーターによって誘導されるフィブリン血餅の溶解を効率的に阻
害するように機能する、ヒト血漿において天然に存在するプロテイナーゼインヒ
ビターである。α２−抗プラスミンは、特に強力なインヒビターであり、そして
本発明の用途のために意図される。
【０４５９】 α２−抗プラスミンについてのｃＤＮＡ配列が利用可能である場合、組換え発
現および／または融合タンパク質が好ましい。α２−抗プラスミンに対するモノ
クローナル抗体もまた利用可能であり、これは本発明の二重特異性結合リガンド
の実施形態において使用され得る。これらの抗体は、標的部位に外因性α２−抗
プラスミンを送達するために使用されるか、または内因性α２−抗プラスミンを
収集し、そして標的領域内でそれを濃縮するために使用され得る。
【０４６０】 （Ｃ３．抗チューブリン薬） 一連の薬物は、チューブリン活性との干渉を介してその効果を行使する。チュ
ーブリンの機能は、有糸分裂および細胞の生存能力に不可欠であるので、特定の
「抗チューブリン薬」は、強力な化学療法剤である。いくつかの周知であってか
つ本発明とともに使用するための現在好ましい抗チューブリン薬は、コルヒチン
；タキサン（例えば、タキソール）；ビンカアルカロイド類（例えば、ビンブラ
スチン、ビンクリスチンおよびビンデスチン）；およびコンブレタスタチン（ｃ
ｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）である。他の適切な抗チューブリン薬は、サイト
カラシン類（Ｂ、Ｊ、Ｅを含む）、ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）、オ
ーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）ＰＥ、パクリタキセル、ウスチロキシン
（ｕｓｔｉｌｏｘｉｎ）Ｄ、リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）、１０６９Ｃ８５
、コルセミド（ｃｏｌｃｅｍｉｄ）、アルベンダゾール、アザトキシン（ａｚａ
ｔｏｘｉｎ）およびノコダゾールである。
【０４６１】 米国特許第５，８９２，０６９号、同第５，５０４，０７４号、および同第５
，６６１，１４３号（各々本明細書中に詳細に参考として援用される）に記載さ
れるように、コンブレタスタチン類は、一般に細胞有糸分裂を阻害するエストラ
ジオール誘導体である。本発明と組合せて使用され得る例示的なコンブレタスタ
チンとしては、コンブレタスタチンＡ、Ｂおよび／またはＤを基本とするコンブ
レタスタチンならびに米国特許第５，８９２，０６９号、同第５，５０４，０７
４号、および同第５，６６１，１４３号に記載されるコンブレタスタチンが挙げ
られる。コンブレタスタチンＡ−１、Ａ−２、Ａ−３、Ａ−４、Ａ−５、Ａ−６
、Ｂ−１、Ｂ−２、Ｂ−３およびＢ−４は、上記の型の例である。
【０４６２】 米国特許第５，５６９，７８６号および同第５，４０９，９５３号は、コンブ
レタスタチンＡ−１、Ａ２、Ａ−３、Ｂ−１、Ｂ−２、Ｂ−３およびＢ−４の各
々の単離、構造的特徴付けおよび合成、ならびにこのようなコンブレタスタチン
を使用して新生物性増殖を処置するための処方物および方法を記載する目的のた
めに、本明細書中に参考として援用される。任意の１つ以上のこのようなコンブ
レタスタチンは、本発明と組合せて使用され得る。
【０４６３】 米国特許第５，８９２，０６９号、同第５，５０４，０７４号、同第５，６６
１，１４３号および同第４，９９６，２３７号（各々詳細に本明細書中で参考と
して援用される）に記載されるように、コンブレタスタチンＡ−４はまた、本発
明と共に使用され得る。米国特許第５，５６１，１１２号は、適切なコンブレタ
スタチンＡ−４プロドラッグ（これらは、本発明とともに組合せて使用すること
が意図される）を適切に記載するために、本明細書中に参考として援用される。
【０４６４】 米国特許第４，９４０，７２６号（本明細書中に参考として詳細に援用される
）は、コンブレタスタチンＤ−１および「コンブレタスタチンＤ−２」と称され
る大環状ラクトンを詳細に記載し、これらは、本発明の組成物および方法と組み
合わせて使用され得る。米国特許第５，４３０，０６２号（本明細書中に参考と
して詳細に援用される）は、抗癌活性を有するスチルベン誘導体およびコンブレ
タスタチンアナログに関し、これらは本発明と組合せて使用され得る。
【０４６５】 （Ｃ４．抗脈管形成剤） 本発明は、組合せた抗脈管形成を特に提供する。アンギオポエチンは、ＶＥＧ
Ｆファミリーのメンバーと同様に、血管内皮に特異的な増殖因子である（Ｄａｖ
ｉｓおよびＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ、１９９９：Ｈｏｌａｓｈら、１９９９；本
明細書中で参考として援用される）。最初に記載されたアンギオポエチンは、天
然に存在するレセプター賦活体またはアゴニストであるアンギオポエチン−１（
Ａｎｇ−１；配列番号１および配列番号２）、および天然に存在するレセプター
アンタゴニストであるアンギオポエチン−２（Ａｎｇ−２；配列番号３および配
列番号４）であった。この両方は、内皮細胞チロシンキナーゼレセプターＴｉｅ
２によって作用する。
【０４６６】 ２つの新しいアンギオポエチンである、アンギオポエチン−３（マウス）およ
びアンギオポエチン−４（ヒト）もまた同定された（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、
１９９９）。アンギオポエチン−３は、（Ａｎｇ−２のような）アンタゴニスト
として作用するようであるが、アンギオポエチン−４は、（Ａｎｇ−１のような
）アゴニストとして機能するようである（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、１９９９）
。アンギオポエチン−３と呼ばれるタンパク質はまた、ヒト心臓からクローニン
グされ、そして内皮細胞に対してマイトジェン効果を有さないと報告された（Ｋ
ｉｍら、１９９９）。
【０４６７】 ＶＥＧＦは、血管発達の早期の段階のために必要であるが、アンギオポエチン
−１は、一般に、血管新生のより後期の段階に必要とされる。従って、ＶＥＧＦ
は、内皮細胞分化、増殖および初期の血管形成を促進するように作用する。アン
ギオポエチン−１は、Ｔｉｅ２レセプターを介して、成熟管の維持および安定化
を促進するように作用する。従って、アンギオポエチン−１は、成熟因子または
安定化因子であり、これは、内皮細胞と周囲の支持細胞との間の相互作用を促進
することにより未成熟の血管を成熟した血管に変換する（Ｈｏｌａｓｈら、１９
９９）。
【０４６８】 アンギオポエチン−１は、虚血性組織において血管再生を増強すること（Ｓｈ
ｙｕら、１９９８）、およびＶＥＧＦまたはａＦＧＦの形態のいずれかに曝露さ
れた血管網の生存を増加すること（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓら、１９９
９）が示されている。これらの著者らはまた、アンギオポエチン−１が、同じ形
態のａＦＧＦの撤退によって誘発されるＨＵＶＥＣにおけるアポトーシス死を妨
げることを示した（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓら、１９９９）。そのよう
なデータは、ヒト内皮細胞に対するアンギオポエチン−１の直接的な役割、およ
び分化した内皮細胞の生存を促進することによって血管構造を安定化する他の血
管形成分子との相互作用と一致する。
【０４６９】 アンギオポエチン−１は、成熟シグナルおよび安定性シグナルを伝達するので
、本発明者らは、標的アンギオポエチン−１の送達に関する本発明の局面につい
て注意深く考えた。本発明者らは、アンギオポエチン−１は、成熟因子であるの
で、腫瘍血管を増殖因子非依存性にすると推論した。従って、発明の１つの局面
は、標的管のＶＥＧＦ非応答性特性を固めるための非標的化アンギオポエチン−
１の使用に関する。
【０４７０】 腫瘍結合リガンドを使用して、アンギオポエチン−１分子を腫瘍血管に送達す
ることは、５００，０００のオーダーのアンギオポエチン分子を管腔に容易に送
達すると推論される。これは、Ｔｉｅ２レセプター系を圧倒し、全体としてＴｉ
ｅ２レセプターをアンギオポエチン−１リガンドで飽和させる。従って、アンギ
オポエチン−２は、結合し得ないので、アンギオポエチン−２およびＶＥＧＦの
組合せた効果（以下の考察を参照のこと）は、阻害される。
【０４７１】 アンギオポエチン−１の腫瘍ヘの送達、好ましくは腫瘍脈管構造への送達をま
た種々の他の抗癌ストラテジーと共に使用して、本明細書中に詳細に記載される
ように、組合された治療的効果を達成する。少なくともいくらかの壊死を誘発す
る治療に対する腫瘍の代表的な応答は、脈管再生を開始することである。アンギ
オポエチン−１のシグナルは、血管を成熟に向かわせるので、これらを除去する
ことはできず、そして初期の治療剤により誘発される腫瘍塊の損失を補うことが
できない。したがってこれらの観測は、アンギオポエチン送達の発明（すなわち
、従来の化学療法薬を含む任意の１つ以上の抗癌剤との組み合わせたアンギオポ
エチン−１標的化の組合された使用）の別の好ましい局面を提供する。
【０４７２】 送達に対するアンギオポエチン−１の作用は、基本的に脈管再成形機能（ｒｅ
ｍｏｄｅｌｉｎｇ）を予防することである。これが単独で使用されても、治療剤
と組合せて使用されても、アンギオポエチン−１標的化の価値は、この治療的ア
プローチにおける固有の安全性により特に増強される。アンギオポエチン−１治
療に対する有意な欠点は存在しない。ある量の標的化Ａｎｇ−１が非腫瘍組織に
誤まって与えられるという起こりそうもない事象においてさえ、その結果起こる
全てのことは、標的領域における脈管構造が、より安定になり、かつ／または休
止状態になることである。これに関して、Ａｎｇ−１はまた、抗炎症剤として使
用され得る。
【０４７３】 アンギオポエチン−２は、腫瘍標的治療における使用、特に本発明のＶＥＧＦ
阻害と組合せた使用のために、現在では好ましい薬剤である。しかし、異なる条
件下、特に変化するＶＥＧＦレベルで、アンギオポエチン２の特異な効果に起因
して、本発明者らは、標的化アンギオポエチン−２送達に関する本発明の局面を
注意深く再考した。
【０４７４】 アンギオポエチン−２はまた、Ｔｉｅ２レセプターのリガンドであるが、一般
的にはアンギオポエチン−１により媒介される血管成熟／安定化を中和する。従
ってこれはアンギオポエチン−１のアンタゴニストであり、毛細構造を乱すよう
に作用する。適切な条件下では、アンギオポエチン−２は、ネガティブシグナル
を標的細胞に伝達し、そしてアンギオポエチン−２により誘発された不安定化は
、脈管の後退をもたらす。このことは、腫瘍、好ましくは腫瘍脈管構造へのアン
ギオポエチン−２の標的化送達において開拓されるアンギオポエチン−２の第１
の特徴である。 単に送達する充分なアンギオポエチン−２（これは、２Ｃ３の
ようなＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体を使用して容易に達成可能である）は、
腫瘍環境において存在し得る任意の他のシグナルを圧倒し、そして脈管後退を促
進する。天然の環境においてアンギオポエチン間に注意深く制御された相互作用
が存在するので、後退に有利な系の異常な偏りは、絶え間ないアンギオポエチン
−２シグナル伝達により、アンギオポエチン−１およびＶＥＧＦの両方の効果を
消去し得る。
【０４７５】 従って、腫瘍標的化アンギオポエチン−２の単独使用は、特に治療的介入の初
期の機構として、腫瘍血管後退を誘発するために有利になるように用いられ得る
。けれども一般的には、アンギオポエチン−２により誘発される不安定化が、脈
管後退または再生のいずれかをもたらし得る。他の脈管形成刺激の非存在下、特
にＶＥＧＦの非存在下では、脈管後退に至るのは不安定化であるが；一方、高レ
ベルのＶＥＧＦの存在下での不安定化は、脈管形成応答を促進する（Ｈｏｌａｓ
ｈら、１９９９）。
【０４７６】 アンギオポエチン−２に応答して不安定化を受ける脈管は、他の刺激に曝露す
ることにより後退から「救出」され得る。従って、アンギオポエチン−２は、内
皮細胞を他の脈管形成刺激に応答性にし、そして規定された条件下で脈管形成応
答を促進する。特に、ＶＥＧＦは、ａｎｇ−２不安定化細胞を増殖させ得、そし
て初期の新脈管を形成させ得る（Ａｓａｈａｒａら、１９９８；Ｈｏｌａｓｈら
、１９９９）。実際、腫瘍組織におけるアンギオポエチン−２発現は、報告され
ており（Ｔａｎａｋａら、１９９９）、ここでＶＥＧＦと組み合わさって作用し
て、脈管形成を促進するということが推定された（Ｓｔｒａｔｍａｎｎら、１９
９８）。アンギオポエチン−２およびＶＥＧＦにより開始される新脈管形成は、
これらの分子を「共脈管形成性（ｃｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）」にする。
【０４７７】 特定の腫瘍型における血管に対するアンギオポエチン−２のポジティブおよび
ネガティブの効果を説明するための統合されたモデルは、これまでに報告されて
いる（Ｈｏｌａｓｈら、１９９９）。このモデルにおいて、アンギオポエチン−
２誘発不安定化は、周囲の宿主脈管構造から血管を選出する（ｃｏｏｐｔｉｎｇ
）ことにより生じる、腫瘍における有意な脈管後退を最初に引き起こす。腫瘍に
付随する内皮細胞により産生される高レベルのアンギオポエチン−２は、アンギ
オポエチン−１の低レベルで構成性の発現により明確に発生される生存シグナル
を無効にする。従って、アンギオポエチン−２は、アポトーシス後退について選
出された脈管をマークする（Ｈｏｌａｓｈら、１９９９）。しかし、生じた腫瘍
壊死にもかかわらず、生存する腫瘍細胞は、その生存を確実にするためにＶＥＧ
Ｆをアップレギュレートする。ＶＥＧＦは、アンギオポエチン−２からの後退シ
グナルを無効にし、そして実際脈管発生を促進するので（Ｈｏｌａｓｈら、１９
９９）、次いでＶＥＧＦおよびアンギオポエチン−２の同時発現は、腫瘍末梢に
おいて頑健な脈管形成を生じる。
【０４７８】 一見したところ矛盾しているように思われるが、アンギオポエチン−２の作用
は、他の存在するシグナル、特にＶＥＧＦに基づいて説明され得、そして多くは
予測され得る。別の脈管形成シグナルの非存在下においてアンギオポエチン−２
は、脈管を不安定化させ、そして未成熟にし、後退に至る。刺激、特にＶＥＧＦ
の存在下において、脈管が二次的な脈管形成刺激を受容するように「準備される
」と、アンギオポエチン−２により引き起こされる不安定化は、実際に脈管形成
を生じる。従って、多数の調節因子の脈管形成効果は、少なくとも部分的に、微
小血管内皮細胞におけるアンギオポエチン−２活性のオートクラインループの調
節により達成されると考えられる（ＭａｎｄｏｒｉｏｔａおよびＰｅｐｐｅｒ，
１９９８）。
【０４７９】 アンギオポエチン−２の二重の生物学的役割は、本発明者らに、腫瘍環境にお
ける他のシグナル、特にＶＥＧＦを説明するさらなる治療的ストラテジーを開発
させた。アンギオポエチン−２およびＶＥＧＦは、協調して脈管形成を刺激する
ので、本発明の好ましい局面は本発明のＶＥＧＦ阻害抗体と組み合わせて、腫瘍
標的化アンギオポエチン−２送達を使用する。これにより、アンギオポエチン−
２が後退において作用し、脈管形成において作用しないことを確実にする。
【０４８０】 上述の説明を考慮して、本発明は、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体（例えば
、２Ｃ３）を提供し、この抗体は、アンギオポエチン−１、アンギオポエチン−
２、アンギオポエチン−３および／またはアンギオポエチン−４のいずれか１つ
以上に作動可能に連結されるか、そうでなければ機能的に関連するということが
理解される。例示的なアンギオポエチン−１組成物は、配列番号１（ＤＮＡ）お
よび配列番号２（タンパク質）であり、一方アンギオポエチン−２組成物は、配
列番号３（ＤＮＡ）および配列番号４（タンパク質）により例示される。アンギ
オポエチン−３は、アンタゴニストであり、一般的にアンギオポエチン−２のよ
うに使用され；アゴニストアンギオポエチン−４は、アンギオポエチン−１の様
式で使用され得る。Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａらの論文（１９９９）は、アンギオポ
エチン−３およびアンギオポエチン−４に関する本明細書の教示をさらに補充す
る目的のために、参考として詳細に援用される。
【０４８１】 さらに、アンギオポエチンの融合タンパク質はまた、本発明における使用が想
像される。一例は、本明細書中に配列番号５として含まれる安定なＡｎｇ−１−
Ａｎｇ−２融合タンパク質である。このタンパク質は、アミノ酸７７で始まるア
ンギオポエチン−１配列に融合される、アンギオポエチン−２の最初の７３残基
、ＤＡＰＬＥＹ配列まで、を含む。これはまた、アンギオポエチン−１配列にお
いて位置２６５に変異を有し、ここでＣｙｓは、Ｓｅｒで置換される。
【０４８２】 本発明と共に使用するための他の抗脈管形成剤としては、アンギオスタチンお
よびエンドスタチンが挙げられる。アンギオスタチンは、米国特許第５，７７６
，７０４号；同第５，６３９，７２５号および同第５，７３３，８７６号におい
て開示されている。これらの各々は、本明細書中に参考として援用される。アン
ギオスタチンは、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定されるよう
に、約３８ｋＤａ〜約４５ｋＤａの分子量を有するタンパク質であり、これは、
プラスミノーゲン分子のほぼクリングル領域１〜４を含む。アンギオスタチンは
、一般に、インタクトなマウスプラスミノーゲン分子のアミノ酸番号９８から開
始するマウスプラスミノーゲンのフラグメントと実質的に類似のアミノ酸配列を
有する。
【０４８３】 アンギオスタチンのアミノ酸配列は、種の間でわずかに変化する。例えば、ヒ
トアンギオスタチンにおいて、このアミノ酸配列は、上記のマウスプラスミノー
ゲンフラグメントの配列と実質的に類似であるが、活性なヒトアンギオスタチン
配列は、インタクトなヒトプラスミノーゲンアミノ酸配列のアミノ酸番号９７ま
たは９９のいずれかで開始し得る。さらに、ヒトプラスミノーゲンは、類似の抗
脈管形成活性を有するので、マウス腫瘍モデルにおいて示されるように使用され
得る。
【０４８４】 アンギオスタチンおよびエンドスタチンは、マウスにおいて、腫瘍増殖を阻害
するだけでなく腫瘍後退もまたもたらす能力が実証された最初の新脈管形成イン
ヒビターであるので、これらは熱心な研究の焦点となる。エラスターゼ、マクロ
ファージメタロエラスターゼ（ＭＭＥ）、マトリリシン（ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ
）（ＭＭＰ−７）、および９２ｋＤａゼラチナーゼＢ／ＩＶ型コラゲナーゼ（Ｍ
ＭＰ−９）を含む、プラスミノーゲンからアンギオスタチンを生成することが示
される複数のプロテアーゼが存在する。
【０４８５】 ＭＭＥは、腫瘍においてプラスミノーゲンからアンギオスタチンを生成し得、
そして顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）は、アンギオスタ
チンの生成を誘導するマクロファージによってＭＭＥの発現をアップレギュレー
トする。アンギオスタチン生成におけるＭＭＥの役割は、ＭＭＥが患者由来の肝
細胞癌の臨床サンプルにおいて実際に発現されるという知見によって支持される
。アンギオスタチンを生成し得ると考えられる別のプロテアーゼは、ストロメラ
イシン−１（ＭＭＰ−３）である。ＭＭＰ−３は、インビトロにおいてプラスミ
ノーゲンからアンギオスタチン様フラグメントを生成することが示されている。
アンギオスタチンについての作用機構は現在のところ明らかではなく、これが、
プログラム化された細胞死または有糸分裂の阻止を受けるように内皮細胞を誘導
する内皮細胞上の同定されていない細胞表面レセプターに結合すると推定されて
いる。
【０４８６】 エンドスタチンは、さらにより強力な抗新脈管形成および抗腫瘍剤であるよう
であり、そしてＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、２Ｃ３）に連結する
ために特に好ましい。エンドスタチンは、マウスにおける多くの腫瘍モデルにお
いて後退を生じることにおいて有効である。腫瘍は、エンドスタチンに対する耐
性を発生させず、そして複数のサイクルの処置後に、腫瘍は、休眠状態に進入し
、この間、これらは容量において増加しない。この休眠状態において、アポトー
シスを受ける腫瘍細胞の割合は増加し、そして本質的に同じサイズをとどめる集
団を生じた。
【０４８７】 ＦｏｌｋｍａｎおよびＯ’Ｒｅｉｌｅｙらへの米国特許第５，８５４，２０５
号（本明細書中で参考として詳細に援用される）は、内皮細胞増殖および脈管形
成のインヒビターとしてのエンドスタチンおよびその使用に関する。エンドスタ
チンタンパク質は、コラーゲンＸＶＩＩＩ型のＣ末端フラグメントに対応し、そ
してこのタンパク質は、種々の供給源から単離され得る。米国特許第５，８５４
，２０５号はまた、エンドスタチンが、コラーゲンＸＶＩＩＩ型、コラーゲンＸ
Ｖ型、またはＢＯＶＭＰＥ１プロガストリン（ｐｒｅｇａｓｔｒｉｃ）エステラ
ーゼのフラグメントのアミノ酸配列を有し得るということを教示する。エンドス
タチンの他の抗脈管形成タンパク質、特にアンギオスタチンとの組み合わせはま
た、米国特許第５，８５４，２０５号に記載され、その結果、組合された組成物
は、脈管形成依存性腫瘍塊を効果的に後退させ得る。
【０４８８】 エンドスタチンおよびアンギオスタチンは、本発明に従う腫瘍送達に好ましい
薬剤である。バスキュロスタチン（ｖａｓｃｕｌｏｓｔａｔｉｎ）、カンスタチ
ン（ｃａｎｓｔａｔｉｎ）およびマスピン（ｍａｓｐｉｎ）はまた、好ましい薬
剤である。エンドスタチンは、特に最も好ましい薬剤の１つである。エンドスタ
チン２Ｃ３融合タンパク質は、本明細書中に記載されるように、調製され得る。
化学的に結合されたエンドスタチン−２Ｃ３構築物の種々の形態はまた、本出願
に記載される。
【０４８９】 （Ｃ５．アポトーシス誘発剤） 本発明はまた、腫瘍内の任意の細胞（腫瘍細胞および腫瘍脈管内皮細胞を含む
）においてアポトーシスを誘発する。多くの抗癌剤は、その作用機構の一部とし
て、アポトーシス誘発効果を有し得るが、特定の薬剤は、以下に記載されるよう
に、主要な機構としてこのことを用いて、発見されるか、設計されるかまたは選
択された。
【０４９０】 多くの形態の癌において、腫瘍抑制遺伝子（例えば、ｐ５３）における変異が
報告されている。ｐ５３の不活性化は、アポトーシスの促進の不全を生じる。こ
の不全によって、癌細胞は、細胞死へと運命付けられるよりむしろ、腫瘍形成を
進行させる。従って、腫瘍抑制因子の送達もまた、細胞死を刺激するために本発
明での使用が意図される。例示的な腫瘍抑制因子としては、ｐ５３、網膜芽細胞
腫遺伝子（Ｒｂ）、ウィルムス腫瘍（ＷＴ１）、ｂａｘα、インターロイキン−
１ｂ−変換酵素およびファミリー、ＭＥＮ−１遺伝子、神経芽細胞腫Ｉ型（ＮＦ
１）、ｃｄｋインヒビターｐ１６、結腸直腸癌遺伝子（ＤＣＣ）、家族性腺腫症
ポリポーシス遺伝子（ＦＡＰ）、多発性腫瘍抑制遺伝子（ＭＴＳ−１）、ＢＲＣ
Ａ１ならびにＢＲＣＡ２が挙げられるがこれらに限定されない。
【０４９１】 使用のために好ましいのは、ｐ５３（米国特許第５，７４７，４６９号；同第
５，６７７，１７８号；および同第５，７５６，４５５号；各々は、参考として
本明細書中に援用される）、網膜芽細胞腫、ＢＲＣＡ１（米国特許第５，７５０
，４００号；同第５，６５４，１５５号；および同第５，７１０，００１号；同
第５，７５６，２９４号；同第５，７０９，９９９号；同第５，６９３，４７３
号；同第５，７５３，４４１号；同第５，６２２，８２９号；および同第５，７
４７，２８２号；各々は、参考として本明細書中に援用される）、ＭＥＮ−１（
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ９３２３６号）およびアデノウイルスＥ１Ａ（米国特
許第５，７７６，７４３号；参考として本明細書中に援用される）の遺伝子であ
る。
【０４９２】 ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、２Ｃ３）により送達され得る他の
組成物としては、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬと称
される）をコードする遺伝子、およびＴＲＡＩＬポリペプチド（米国特許第５，
７６３，２２３号；参考として本明細書中に援用される）；米国特許第５，６０
５，８２６号（参考として本明細書中に援用される）２４ｋＤアポトーシス関連
プロテアーゼ；Ｆａｓ関連因子１、ＦＡＦ１（米国特許第５，７５０，６５３号
；参考として本明細書中に援用される）が挙げられる。インターロイキン−１β
−変換酵素およびファミリーのメンバー（これらもまた、アポトーシスを刺激す
ることが報告されている）の提供もまた、本発明のこれらの局面における使用の
ために意図される。
【０４９３】 以下のような化合物もまた使用され得る；カルボスチリル（ｃａｒｂｏｓｔｙ
ｒｉｌ）誘導体（米国特許第５，６７２，６０３号；および同第５，４６４，８
３３号；各々は、参考として本明細書中に援用される）；分枝状アポトーシス原
性（ａｐｏｇｅｎｉｃ）ペプチド（米国特許第５，５９１，７１７号；参考とし
て本明細書中に援用される）；ホスホチロシンインヒビターおよび非加水分解性
ホスホチロシンアナログ（米国特許第５，５６５，４９１号；および同第５，６
９３，６２７号；各々は、参考として本明細書中に援用される）；ＲＸＲレチノ
イドレセプターのアゴニスト（米国特許第５，３９９，５８６号；参考として本
明細書中に援用される）；さらには、抗酸化剤（米国特許第５，５７１，５２３
号；参考として本明細書中に援用される）。チロシンキナーゼインヒビター（例
えば、ゲニステイン）もまた、細胞表面レセプター（ＶＥＧＦＲ１）を標的化す
る本発明の薬剤に連結され得る（参考として本明細書中に援用される米国特許第
５，５８７，４５９号により支持されるように）。
【０４９４】 （Ｃ６．生物学的機能性等価物） ２Ｃ３ベースの抗体または任意の他のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体の等価
物またはさらなる改良物が、今や、一般には上記に提供される物質を出発点とし
て使用して作製され得る。改変および変化が、このような抗体の構造中になされ
得、そしてさらに類似または他の様式の所望の特徴を有する分子を入手し得る。
例えば、特定のアミノ酸が、相互作用性結合能（例えば、アミノリン脂質、ＰＳ
およびＰＥへの結合）のかなり大きな損失なしに、タンパク質構造において他の
アミノ酸の代わりに置換され得る。これらの考察もまた、毒素、抗脈管形成剤、
アポトーシス誘発剤および凝血薬などにあてはまる。
【０４９５】 タンパク質の生物学的機能活性を規定するのは、タンパク質の相互作用能力お
よび性質であるので、特定のアミノ酸配列置換がタンパク質配列（または、当然
のことながら基礎のＤＮＡ配列）中でなされ得、にもかかわらず類似（アゴニス
ト）の特性を有するタンパク質を入手し得る。従って、種々の変化が、それらの
生物学的有用性または活性のかなり大きな損失なく、抗体または治療剤の配列（
または、基礎のＤＮＡ配列）になされ得ることが意図される。基礎のＤＮＡ配列
を変異することから作製される生物学的機能性等価物は、本明細書中の表Ａにお
いて提供されるコドン情報、および部位特異的変異誘発に関する支持する技術的
詳細を用いてなされ得る。
【０４９６】 分子の所定の部分内になされ得、なお受容可能なレベルの等価な生物学的活性
を有する分子を生じ得る変化の数に対して限界が存在するという概念が、「生物
学的機能性等価物」タンパク質またはペプチドの定義に固有であることもまた、
当業者に十分に理解される。従って、生物学的機能性等価物タンパク質およびペ
プチドは、本明細書中において、ほとんどまたはすべてではないが特定のアミノ
酸が置換され得るタンパク質およびペプチドとして規定される。当然のことなが
ら、異なる置換を有する複数の異なるタンパク質／ペプチドは、本発明に従って
容易に作製および使用され得る。
【０４９７】 アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖の置換の相対的類似性（例えば、それ
らの疎水性、親水性、電荷、サイズなど）に基づく。アミノ酸側鎖置換のサイズ
、形状および型の分析によって、アルギニン、リジンおよびヒスチジンはすべて
正に荷電した残基であること；アラニン、グリシンおよびセリンはすべて類似の
サイズであること；そして、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン
はすべて一般的に類似の形状であることが示される。従って、これらの考察に基
づいて、アルギニン、リジンおよびヒスチジン；アラニン、グリシンおよびセリ
ン；ならびにフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、本明細書中
において、生物学的機能性等価物として規定される。
【０４９８】 より定量的な変化を生じさせる際に、アミノ酸の疎水親水指数が考慮され得る
。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷特徴に基づいて疎水親水指数を指定
されており、これらは以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．
２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シ
スチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシ
ン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファ
ン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（
−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギ
ン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびア
ルギニン（−４．５）。
【０４９９】 タンパク質に相互作用性生物学的機能を付与する際の疎水親水アミノ酸指数の
重要性は、一般に当該分野において理解される（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔ
ｌｅ、１９８２、本明細書中で参考として援用される）。特定のアミノ酸が、類
似の疎水親水指数またはスコアを有する他のアミノ酸の代わりに置換され得、そ
してなお類似の生物学的活性を保持することは公知である。疎水親水指数に基づ
いた変化を生じさせる際に、疎水親水指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好
ましく、±１以内である置換が特に好ましく、そして±０．５以内である置換が
さらにより特に好ましい。
【０５００】 従って、アミノ酸が、類似の親水性値を有する別のアミノ酸の代わりに置換さ
れ、そしてなお生物学的に等価なタンパク質を入手し得ることが理解される。米
国特許第４，５５４，１０１号（本明細書中で参考として援用される）において
詳述されるように、以下の親水性値が、アミノ酸残基に指定されている：アルギ
ニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グ
ルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）
；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリ
ン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システ
イン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−０．５）；ロイシン（
−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラ
ニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【０５０１】 親水性値に基づいた変化を生じさせる際に、親水性値が±２以内であるアミノ
酸の置換が好ましく、±１以内である置換が特に好ましく、そして±０．５以内
である置換がさらにより特に好ましい。
【０５０２】 （Ｃ７．融合タンパク質および組換え発現） 本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの免疫結合体は
、分子生物学技術を使用して、融合タンパク質として容易に調製され得る。任意
の融合タンパク質は、本明細書中に記載され、そして当該分野で公知の任意の治
療剤を使用して、設計および作製され得る。融合タンパク質技術は、２つの部分
が選択的に切断可能なペプチド配列により結合される融合タンパク質を調製する
ために容易に適合される。現在好ましい融合タンパク質は、エンドスタチンを含
む融合タンパク質である。任意の他の治療剤伴う場合エンドスタチンは、抗体の
末端またはＣＤＲと別の任意の点に連結され得る。エンドスタチンのような治療
剤はまた、「一体化して」調製され得、ここでこれらは、標的化後に薬剤の放出
を可能にするために、選択的に切断可能なペプチドに好ましくは付随する。
【０５０３】 このような目的を達成するための組換えＤＮＡ技術の使用は、現在、当業者に
標準的操作である。これらの方法としては、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技
術、合成技術、およびインビボ組換え／遺伝的組換えが挙げられる。さらに、Ｄ
ＮＡ合成およびＲＮＡ合成は、自動合成装置を使用して実施され得る（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（本明細書中に参考として援用される）に記載さ
れる技術を参照のこと）。
【０５０４】 このような融合タンパク質の調製は、一般的に、所望の融合タンパク質をコー
ドする単一のコード領域を調製するために、第１および第２のＤＮＡコード領域
の調製、およびそのような領域をインフレームで機能的に連結または結合するこ
とを伴う。本発明の状況において、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ
３様抗体のＤＮＡ配列は、治療剤をコードするＤＮＡ配列とインフレームで連結
される。構築物のどの部分がＮ末端領域またはＣ末端領域として調製されるかが
、特に関連するとは一般に考えられない。
【０５０５】 一旦、所望のコード領域が生成されると、発現ベクターが作製される。発現ベ
クターは、挿入されたＤＮＡ領域の上流に、そのＤＮＡの転写を促進するように
作用し、そして従ってコードされる組換えタンパク質の発現を促進するように作
用する１つ以上のプロモーターを含む。これが、「組換え発現」の趣意である。
【０５０６】 ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの免疫結合体のいわゆる
「組換え」バージョンを獲得するために、これは組換え細胞内で発現される。原
核生物系または真核生物系における発現のためのＤＮＡセグメントの操作は、組
換え発現における当業者に一般的公知の技術によって実施され得る。実質的に任
意の発現系が、このＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの免疫
結合体構築物の発現において使用され得ると考えられる。
【０５０７】 そのようなタンパク質は、真核生物発現系（例えば、ＣＨＯ細胞）において首
尾良く発現され得る。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＱＥ−６０のような細菌発現系
が、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの免疫結合体の大規模
調製および引き続く精製のために特に有用であると考えられる。ｃＤＮＡはまた
細菌系において発現され、発現されるそのコードタンパク質はβ−ガラクトシダ
ーゼ、ユビキチン、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍグルタチオン
Ｓ−トランスフェラーゼなどを伴う融合物として発現され得る。細菌発現は、使
用の容易さ、およびそれによって得られる物質の品質に関して、真核生物発現を
超える利点を有すると考えられる。
【０５０８】 微生物発現に関して、組換え宿主細胞における遺伝子の発現と関連して本発明
の開示をなおさらに補充する目的のために、米国特許第５，５８３，０１３号；
同第５，２２１，６１９号；同第４，７８５，４２０号；同第４，７０４，３６
２号；および同第４，３６６，２４６号が、本明細書中で参考として援用される
。
【０５０９】 組換え的に生成されるＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの
免疫結合体物は、ヒト投与のために精製および処方され得る。あるいは、免疫結
合体コードする核酸は、遺伝子治療を通して送達され得る。裸の組換えＤＮＡま
たはプラスミドが使用され得るが、リポソームまたはベクターの使用が好ましい
。特定ウイルスが、レセプター媒介性エンドサイトーシスを介して細胞に進入す
る能力、および宿主細胞ゲノムに組込みそして安定的および効率的にウイルス遺
伝子を発現する能力は、それらを、哺乳動物細胞内に外来遺伝子を移入させるた
めの魅力的な候補にさせている。本発明における使用のために好ましい遺伝子治
療ベクターは、一般的にウイルスベクターである。
【０５１０】 レトロウイルスは、それらの遺伝子を宿主ゲノム中に組込むそれらの能力、大
量の外来性遺伝物質を移入させるそれらの能力、広範なスペクトルの種および細
胞型に感染するそれらの能力、および特定の細胞株にパッケージングされるそれ
らの能力に起因して、遺伝子送達ベクターとして見こまれている。他のウイルス
（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウ
イルス（ＣＭＶ）、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（例えば、米国特許第
５，１３９，９４１号（本明細書中で参考として援用される）に記載されるウイ
ルス）もまた、遺伝子移入のためのベクターとして作用されるように操作され得
る。
【０５１１】 外来性遺伝物質を受容し得るいくつかのウイルスは、それらが適応し得るヌク
レオチドの数、およびそれらが感染する細胞の範囲において限定されるが、これ
らのウイルスは、遺伝子発現を首尾良くもたらすことが実証されている。しかし
、アデノウイルスは、それらの遺伝産物を宿主ゲノム中に組込まず、従って遺伝
子発現のために宿主の複製を必要としない。これは、迅速な遺伝子発現、効率的
な遺伝子発現、異種遺伝子発現についてそれらを理想的に適合させる。複製欠損
した感染性ウイルスを調製する技術は、当該分野において周知である。
【０５１２】 特定のさらなる実施形態において、遺伝子治療ベクターはＨＳＶである。ＨＳ
Ｖを魅力的なベクターにする因子は、ゲノムの大きさおよび組織化である。ＨＳ
Ｖは大きいので、複数の遺伝子または発現カセットを組込むことは、より小さな
他のウイルス系よりもあまり問題ではない。さらに、変動する性能（例えば、時
間的、強度）を有する種々のウイルスコントロール配列の利用能は、他の系にお
けるよりも高い程度で発現を制御することを可能にする。ウイルスが比較的少数
でスプライシングされるメッセージを有し、遺伝子操作をさらに容易にすること
もまた有用である。ＨＳＶはまた、操作が比較的容易であり、そして高い力価ま
で増殖され得る。
【０５１３】 もちろん、ウイルス送達系を使用する際には、所望されない夾雑物（例えば、
不完全干渉ウイルス粒子または内毒素、および他の発熱物質）を本質的に含まな
いようにするために十分にビリオンを精製し、その結果、ベクター構築物を受容
する細胞、動物、または個体において不都合な反応を全く引き起こさないことが
所望される。ベクターを精製する好ましい手段としては、浮遊密度勾配の使用（
例えば、塩化セシウム勾配遠心分離）が挙げられる。
【０５１４】 （Ｃ８．抗体結合体） ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体は、「イムノトキシ
ン」を調製するために、抗細胞性薬剤またはネガティブに結合体化され得るか；
あるいは凝固を直接的または間接的に刺激して、それによって「コアグリガンド
」を形成し得る成分と作動可能に会合され得る。コアグリガンドにおいて、抗体
は、直接的または間接的な凝固因子に直接的に連結され得るか、あるいは直接的
なまたは間接的な凝固因子を結合し、次いで放出する第２の結合領域に連結され
得る。「第２の結合領域」アプローチは、一般に、第２の結合領域として凝血薬
結合抗体を使用して、それによって二重特異的な抗体構築物を生じる。二重特異
性抗体の調製および使用は、一般に、当該分野において周知であり、そして本明
細書中にさらに開示される。
【０５１５】 イムノトキシン、コアグリガンドおよび二重特異性抗体の調製において、組換
え発現が用いられ得る。この選択された抗体をコードする核酸配列は、選択され
た毒素、凝血薬、または第２の結合領域をコードする核酸配列に、インフレーム
（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）で結合され、発現ユニットまたはベクターを作製する。組
換え発現は、新しい核酸の翻訳を生じ、所望のタンパク質産物を生じる。タンパ
ク質結合リガンドではなく抗体をコードする核酸が用いられるが、組換えアプロ
ーチは、本明細書中上記のアプローチと本質的に同じである。
【０５１６】 結合体技術に戻ると、イムノトキシンの調製は、一般に、当該分野において周
知である。しかし、特定の利点は、イムノトキシンの調製において、および引き
続く臨床での投与のためのそれらの精製においての両方で、特定の好ましい技術
の適用を通じて達成され得る。例えば、ＩｇＧベースのイムノトキシンが、代表
的には、それらのＦａｂ’対応物よりも良好な結合能力および遅い血中クリアラ
ンスを示すが、Ｆａｂ’フラグメントベースのイムノトキシンは、一般に、Ｉｇ
Ｇベースのイムノトキシンと比較した場合に、より良好な組織浸透能力を示す。
【０５１７】 さらに、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体に毒素部分
を結合体化するために首尾よく用いられ得る、多くの型のジスルフィド結合含有
リンカーが公知であるが、特定のリンカーは、一般に、薬理学的な特徴および能
力の差異に基づいて、他のリンカーよりも好ましい。例えば、立体的に「妨害さ
れる」ジスルフィド結合を含むリンカーが、インビボでのそれらのより大きな安
定性に起因して好まれ、それによって作用部位での結合の前に毒素部分の放出を
防ぐ。
【０５１８】 ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体に結合体化され得る
、広汎な種々のネガティブ（植物由来の毒素、真菌由来の毒素および細菌由来の
毒素（例えば、リシンＡ鎖または脱グリコシル化Ａ鎖）が、公知である。標的化
剤への毒素Ａ鎖の架橋は、特定の場合において、ジスルフィド機能を示す架橋剤
を必要とする。このことに対する理由は、不明であるが、一旦この因子が標的細
胞にこの毒素を「送達する」と、標的化剤から容易に放出可能である特定の毒素
部分に対する必要性に起因するようである。
【０５１９】 各々の型の架橋剤、ならびに架橋が実行される方法は、得られた結合体の薬力
学を変動する傾向がある。最終的には、放出可能な毒素が意図される場合には、
意図される作用部位を除く身体中のいたるところ（結合体が良好な「放出」特徴
を有することが好ましい点）に見出される条件下でインタクトなままである結合
体を有することが所望される。従って、特定の架橋スキーム（特に、使用される
特定の架橋試薬および架橋される構造を含む）は、いくらか重要である。
【０５２０】 融合タンパク質の部分として使用される特定の毒素化合物に依存して、標的化
剤に作動可能に結合する抗体および毒素化合物を提供することが必要であり得る
。次いで、ループ内のタンパク質分解性切断は、ヘテロダイマーポリペプチドを
生じ、ここで抗体および毒素化合物は、１個のジスルフィド結合によってのみ連
結されている。このような毒素の例は、リシンＡ鎖毒素である。
【０５２１】 特定の他の毒素化合物が利用される場合、非切断性ペプチドスペーサーが、Ｖ
ＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体および融合タンパク質の
毒素化合物を作動可能に連結するために提供される。非切断性ペプチドスペーサ
ーと組み合せて使用され得る毒素は、それ自体、タンパク質分解性切断によって
細胞傷害性ジスルフィド結合形態に変換され得る毒素である。このような毒素化
合物の例は、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｍａｓ外毒素化合物である。
【０５２２】 化学療法剤（例えば、抗腫瘍薬物、他のサイトカイン、代謝拮抗物質、アルキ
ル化剤、ホルモンなど）を標的化することが所望されるような、標的抗原が、イ
ムノトキシンよる効率的な中毒と一致する経路によって内在化しない場合のよう
な状況が存在し得る。種々の化学療法剤および他の薬理学的薬剤は、現在、抗体
に首尾よく結合体化されており、そして薬理学的に機能することが示されている
。調査されている例示的な抗腫瘍性因子は、ドキソルビシン、ダウノマイシン、
メトトレキセート、ビンブラスチン、および種々の他の因子を含む。さらに、他
の因子（例えば、ネオカルジノスタチン（ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）
、マクロマイシン（ｍａｃｒｏｍｙｃｉｎ）、トレニモン（ｔｒｅｎｉｍｏｎ）
およびα−アマニチンの部分が、記載されている。
【０５２３】 凝固因子が、本発明と組み合せて使用される場合、抗体に対する任意の共有結
合は、その機能的に凝固する部位とは別の部位に作製されるべきである。従って
、この組成物は、各々の領域が重要な障害なしにその意図された機能を実行する
ようにする、任意の作動可能な様式にて「連結される」。従って、この抗体は、
ＶＥＧＦに結合し、そして凝固因子は、血餅化を促進する。
【０５２４】 （Ｃ９．生化学架橋剤） 上記に提供される一般の情報に加えて、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体また
は２Ｃ３ベース抗体は、特定の好ましい生化学架橋剤を使用して、抗細胞性薬剤
またはネガティブに結合体化され得る。架橋試薬は、２つの異なる分子の官能基
を共に結ぶ分子架橋を形成するために使用される。段階的な様式にて２つの異な
るタンパク質を連結するために、所望されないホモポリマー形成を排除するヘテ
ロ二官能性架橋剤が、使用され得る。例示的なヘテロ二官能性架橋剤は、表Ｂ１
において参照される。
【０５２５】
【表２】
【０５２６】 ヘテロ二官能性架橋剤は、２つの反応基（一方は、一般に、第１級アミン基（
例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）と反応し、そして他方は、一般にチオ
ール基（例えば、ピリジルジスルフィド、マレイミド、ハロゲンなど）と反応す
る）を含む。第１級アミン反応基を通じて、この架橋剤は、あるタンパク質（例
えば、選択された抗体またはフラグメント）のリジン残基と反応し得、このチオ
ール反応基を通じて、第１のタンパク質と既に結び付けられている架橋剤は、他
のタンパク質（例えば、凝血薬）のシステイン残基（遊離のスルフヒドリル基）
と反応する。
【０５２７】 従って、組成物は、一般に、架橋の目的に利用可能な官能基を有するか、また
は有するように誘導体化される。この要件は、広汎な種々の基がこの様式におい
て使用され得るという点で限定的であるとは考えられない。例えば、第一級アミ
ン基または第二級アミン基、ヒドラジド基またはヒドラジン基、カルボキシル基
、アルコール基、ホスフェート基、あるいはアルキル化基は、結合および架橋の
ために使用され得る。
【０５２８】 架橋剤の２つの反応基の間のスペーサーアームは、種々の長さおよび化学組成
を有し得る。より長いスペーサーアームは、結合体成分のより良好な可撓性を可
能にし、その一方、架橋におけるいくつかの特定の成分（例えば、ベンゼン基）
は、反応基にさらに安定性を、または種々の局面の作用に化学結合の耐性の増大
（例えば、還元剤への耐性のジスルフィド結合）を与え得る。ペプチドスペーサ
ー（例えば、Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ａｌａ）の使用もまた
、意図される。
【０５２９】 血中にて合理的な安定性を有する架橋剤が用いられることが好ましい。標的化
剤および毒素因子または凝固因子を結合体化するために首尾よく用いられ得る、
多くの型のジスルフィド結合含有リンカーが、公知である。立体的に妨害される
ジスルフィド結合を含むリンカーが、インビボでより大きな安定性を生じること
を証明し得、このことは、作用部位での結合の前に因子の放出を妨げる。従って
、これらのリンカーは、連結剤の１つの好ましい群である。
【０５３０】 イムノトキシンにおける使用に最も好ましい架橋試薬のうちの１つは、ＳＭＰ
Ｔである。ＳＭＰＴは、隣接するベンゼン環およびメチル基により「立体的に妨
害」されているジスルフィド結合を含む、二官能性架橋剤である。ジスルフィド
結合の立体障害は、チオレートアニオン（組織および血中に存在し得るグルタチ
オンのような）による攻撃から結合を保護し、それによって腫瘍部位への結合し
た薬剤の送達の前に結合体の脱カップリングを防ぐため際に役立つ機能を提供す
ると考えられる。ＳＭＰＴ剤はまた、本発明の二重特異性リガンドと組み合せて
使用され得ることが意図される。
【０５３１】 多くの他の公知の架橋試薬のように、ＳＭＰＴ架橋試薬は、官能基（例えば、
システインのＳＨまたは第一級アミン（例えば、リジンのε−アミノ基））を架
橋する能力を与える。別の可能な型の架橋剤は、切断性ジスルフィド結合（例え
ば、スルホスクシンイミジル−２−（ｐ−アジドサリチルアミド）エチル−１，
３’−ジチオプロピオネート）を含有する、ヘテロ二官能性感光性フェニルアジ
ドを含む。Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル基は、第一級アミノ基と反応し、
そしてフェニルアジド（光分解の際）は、任意のアミノ酸残基と非選択的に反応
する。
【０５３２】 妨害された（ｈｉｎｄｅｒｅｄ）架橋剤に加えて、妨害されていないリンカー
もまた、本明細書に従って用いられ得る。保護されたジスルフィドを含まないか
または生成しないと考えられる、他の有用な架橋剤には、ＳＡＴＡ、ＳＰＤＰお
よび２−イミノチオレンが挙げられる。このような架橋剤の使用は、当該分野に
おいて十分に理解されている。
【０５３３】 一旦結合体化されると、この結合体は、非結合体化標的化剤および非結合体化
治療剤から、ならびに他の夾雑物から分離される。多数の精製技術が、結合体を
臨床的に有用にするに十分な程度の純度の結合体を提供する使用に利用可能であ
る。サイズ分離（例えば、ゲル濾過、ゲル浸透、または液体高速クロマトグラフ
ィー）に基づく精製方法は、一般に、最も有用である。他のクロマトグラフィー
技術（例えば、Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ分離）もまた、使用され得る。
【０５３４】 （Ｃ１０．生物学的に放出可能なリンカー） 任意の結合部分は、血液において合理的な安定性を有し、疾患部位または腫瘍
部位に標的化する前に、付着した薬剤の実質的な放出を予防することが、好まし
いけれども、特定の局面において、生物学的に放出可能な結合および／または選
択的に切断可能なスペーサーまたはリンカーの使用が、意図される。「生物学的
に放出可能な結合」および「選択的に切断可能なスペーサーまたはリンカー」は
、循環において合理的な安定性をなお有する。
【０５３５】 従って、本発明のＶＥＧＦＲ−２遮断抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、２Ｃ３様抗体
）は、生物学的に放出可能な結合を介して１以上の治療剤に結合され得る。Ｓｃ
Ｆｖフラグメントは、特定の実施形態において好ましいけれども、ＶＥＧＦＲ２
遮断抗−ＶＥＧＦ抗体、または「標的抗体もしくは薬剤」の任意の形態は、使用
され得、これは、インタクトな抗体を含む。
【０５３６】 「生物学的に放出可能な結合」または「選択的に加水分解可能な結合」は、唯
一または優先的に特定の条件下で、放出可能、切断可能、または加水分解である
すべての結合を含む。これは、米国特許第５，４７４，７６５号および同第５，
７６２，９１８号（各々は、本明細書中で特異的に参考文献として援用される）
に記載されるように、ジスルフィド結合およびトリスルフィド結合ならびに酸標
識結合が挙げられる。
【０５３７】 治療剤または治療薬物の本発明の抗体への付着のための酸感応性スペーサーの
使用は、特に意図される。このような実施形態において、治療剤または治療薬物
は、細胞内の酸区画内で放出される。酸感応性放出は、細胞外で起こり得るが、
特定の標識の後、好ましくは腫瘍部位に対して起こることが意図される。特定の
現状で好ましい例としては、酸感応性スペーサーを介してコルヒチンまたはドキ
ソルビシンに結合された２Ｃ３様抗体が挙げられる。抗体の糖質部分を介する付
着はまた、意図される。このような実施形態において、治療剤または治療薬物は
、細胞内の酸性区画内で放出される。
【０５３８】 標的抗ＶＥＧＦ抗体はまた、生物学的に放出可能な結合を介して治療剤の付着
を可能にする官能基を導入するように誘導され得る。従って、標的抗体は、ヒド
ラジド基、ヒドラジン基、１級アミン基または２級アミン基において側鎖ターミ
ネートを導入するように誘導され得る。治療剤は、Ｓｃｈｉｆｆの塩基結合、ヒ
ドラゾンもしくはアシルヒドラゾン結合またはヒドラジドリンカーを介して結合
体化され得る（米国特許第５，４７４，７６５号および同第５，７６２，９１８
号、各々は、本明細書中で参考として特異的に援用される）。
【０５３９】 米国特許第５，４７４，７６５号および同第５，７６２，９１８号（各々は、
本明細書中で参考として特異的に援用される）に記載されるように、標的抗ＶＥ
ＧＦ抗体は、酵素感応性の１以上の生物学的に放出可能な結合（ペプチド結合、
エステル、アミド、リン酸ジエステルおよびグリコシドが挙げられる）を介して
治療剤に操作可能に付着され得る。
【０５４０】 本発明の好ましい局面は、優先的に疾患部位、特に、腫瘍環境内に位置する、
ペプチターゼおよび／またはプロテイナーゼに対する少なくとも第１切断部位を
含むペプチドリンカーの使用に関する。従って、付着された治療剤の抗体媒介送
達は、疾患部位または腫瘍環境内で特異的に切断を生じ、活性薬剤の特異的放出
を生じる。特定のペプチドリンカーは、再構築に関する１以上の酵素によって認
識される切断部位を含む。
【０５４１】 ウロキナーゼ、プロ−ウロキナーゼ、プラスミン、プラスミノゲン、ＴＧＦβ
、スタフィロキナーゼ、トロンビン、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子またはメタロプ
ロテイナーゼ（例えば、間質性コラゲナーゼ、ゲラチナーゼ、またはストロメラ
イシン）に対する切断部位を含むポリペプチドリンカーは、特に好ましい。米国
特許第６、００４、５５５、米国特許第５，８７７，２８９および米国出願番号
０８／４８２，３６９（１９９８年、１０月２０日発行、料金支払い済）は、さ
らなる記載ならびに標的薬剤−治療剤構築（生物学的に放出可能な結合ならびに
選択的に切断可能なリンカーおよびペプチドを含む）を作製かつ使用する方法を
可能にする目的のために、本明細書中で参考として特異的に援用される。特に、
１９９９年３月２日に発行された米国特許第５，８７７，２８９号は、さらなる
記載ならびに標的薬剤−治療剤構築（ウロキナーゼ、プラスミン、トロンビン、
第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子またはメタロプロテイナーゼ（例えば、間質性コラゲ
ナーゼ、ゼラチナーゼ、またはストロメライシン）によって腫瘍環境内で切断さ
れる選択的に切断可能なペプチドリンカーを含む）を作製かつ使用する方法を可
能にする目的のために、本明細書中で特異的に参考として援用される。
【０５４２】 現状で好ましい選択的に切断可能なペプチドリンカーは、プラスミンまたはメ
タロプロテイナーゼ（「マトリックスメタロプロテアーゼ」または「ＭＭＰ」と
しても公知である）（例えば、間質性コラゲナーゼ、ゼラチナーゼまたはストロ
メリシン）に対する切断部位を含むリンカーである。本発明に関して使用され得
るさらなるペプチドリンカーとしては、例えば、表Ｂ２中に列挙されるリンカー
が挙げられる。
【０５４３】
【表３】 （Ｃ１１．二重特異性抗体） 二重特異性抗体は、本発明のコアグリガンドおよび組合された抗脈管形成の局
面において特に有用である。しかし二重特異性抗体は、一般的に、一本のアーム
がＶＥＧＦ（必要に応じて２Ｃ３と実質的にに同じエピトープ）に結合し、そし
て二重特異性抗体が治療剤に（一般に抗原結合部位とは異なる部位で）結合する
限り、使用され得る。ＰＳおよびＰＥの両方に結合する二重特異性抗体もまた、
使用され得る。
【０５４４】 一般に、二重特異性抗体の調製はまた、当該分野において周知である。１つの
方法は、一方で、標的抗原に対する特異性を有する抗体を、他方で、（本明細書
でのように）凝集剤を、別々に調製することを含む。ペプシンのＦ（ａｂ’γ） 2 フラグメントを、２つの選択した抗体から調製し、続いて各々を還元し、別々
のＦａｂ’γSHフラグメントを提供する。次に、カップリングする２つのパート
ナーの１つにあるＳＨ基を、ｏ−フェニレンジマレイミドのような架橋剤を用い
てアルキル化し、遊離のマレイミド基を１つのパートナー上に提供する。次にこ
のパートナーを、チオエーテル結合の手段によって他方と結合させ、所望のＦ（
ａｂ’γ）2ヘテロ結合体を生成し得る。ＳＰＤＰまたはプロテインＡを用いて
架橋を行うか、または三重特異性構築物を調製する他の技術が、公知である。
【０５４５】 二重特異性抗体を生成する他の方法は、２つのハイブリドーマを融合して、ク
アドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ）を形成することである。本明細書において使用
する場合、用語「クアドローマ」は、２つのＢ細胞ハイブリドーマの融合産物を
記載するために使用される。ここで、標準的な技術を用いて、２つの抗体産生ハ
イブリドーマを融合して、娘細胞を産生し、そして免疫グロブリン遺伝子のクロ
ーン型の両方のセットの発現を維持する細胞が、次いで選択される。
【０５４６】 クアドローマを産生する好ましい方法は、親ハイブリドーマの少なくとも１つ
の酵素を欠失する変異体の選択を包含する。次に、この第１の変異型ハイブリド
ーマ細胞株は、その連続する生存を妨げる、例えば、ヨードアセトアミドに致死
的に曝露された第２のハイブリドーマの細胞に融合される。細胞融合は、致死的
に処理されたハイブリドーマから、その酵素欠失についての遺伝子を獲得するこ
とにより、第１のハイブリドーマの救済、および第１のハイブリドーマとの融合
を介する第２のハイブリドーマの救済を可能とする。同一のアイソタイプである
が、異なるサブクラスの免疫グロブリンの融合が好ましいが、しかし必要ではな
い。好ましいクアドローマの単離のための代替的なアッセイが存在すれば、混合
されたサブクラスの抗体は、使用可能である。
【０５４７】 より詳細には、クアドローマの開発およびスクリーニングの１つの方法は、第
１の選択されたＭＡｂを分泌するハイブリドーマ株を得る工程、およびこのハイ
ブリドーマを、必須の代謝酵素（ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトラ
ンスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ））について欠失させる工程を包含する。ハイブリ
ドーマの欠失変異体を得るために、細胞を、８−アザグアニンの漸増濃度（１×
１０-7Ｍ〜１×１０-5Ｍ）の存在下で増殖させる。変異体を、限界希釈によって
サブクローニングし、そしてそのヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（
ＨＡＴ）感受性について試験する。この培養培地は、例えば、１０％ ＦＣＳ、
２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１ｍＭ ペニシリン−ストレプトマイシンを補充
したＤＭＥＭからなり得る。
【０５４８】 第２の所望のＭＡｂを産生する相補的なハイブリドーマ細胞株を使用して、標
準的な細胞融合技術によって、クアドローマを生成する。手短には、４．５×１
０7のＨＡＴ感受性の第１の細胞を、２．８×１０7ＨＡＴ耐性の第２の細胞（不
可逆的生化学的インヒビターであるヨードアセトアミドの致死用量（リン酸緩衝
化生理食塩水中に５ｍＭ）で、融合前に３０分間氷上で前処理した）と混合する
。細胞融合は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して誘導し、そしてこ
の細胞を９６ウェルのマイクロ培養プレート中にプレートする。クアドローマを
、ＨＡＴ含有培地を使用して選択する。二重特異性抗体含有培養物を、例えば、
固相アイソタイプ特異的ＥＬＩＳＡおよびアイソタイプ特異的免疫蛍光染色を使
用して、同定する。
【０５４９】 二重特異性抗体を同定するための、１つの同定実施形態において、マイクロタ
イタープレートのウェル（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
Ｌａｂｗａｒｅ）を、親ハイブリドーマ抗体の１つと特異的に相互作用し、そし
て両方の抗体との交差反応性を有さない試薬で、コートする。プレートを洗浄し
、ブロックし、そして試験する上清（ＳＮ）を各ウェルに添加する。プレートを
室温で２時間インキュベートし、上清を棄て、プレートを洗浄し、そして希釈し
たアルカリホスファターゼ−抗−抗体結合体を、室温で２時間添加する。プレー
トを洗浄し、そしてホスファターゼ基質（例えば、ｐ−ニトロフェニルホスフェ
ート（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ））を各ウェルに添加する。プレートをイ
ンキュベートし、３Ｎ ＮａＯＨを各ウェルに添加して反応を停止し、そしてＥ
ＬＩＳＡリーダーを使用して、ＯＤ410値を測定する。
【０５５０】 別の同定実施形態において、ポリＬ−リジンを用いて前処理したマイクロタイ
タープレートを使用して、各ウェルに標的細胞の１つを結合し、次にその細胞を
固定化し（例えば、１％ グルタルアルデヒドを使用する）、そして二重特異性
抗体を、インタクトな細胞に結合するその能力について試験する。さらに、ＦＡ
ＣＳ、免疫蛍光染色、イデオタイプ特異的抗体、抗原結合競合アッセイ、および
抗体の特徴付けの分野において一般的な他の方法を、本発明の方法と組み合わせ
て使用し、好ましいクアドローマを同定し得る。
【０５５１】 クアドローマの単離に続いて、二重特異性抗体を他の細胞性産物から精製する
。この精製は、免疫グロブリン精製の分野において当業者に公知の、種々のタン
パク質単離手順によって達成され得る。抗体を調製する手段、および特徴付ける
手段は、当該分野において周知である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１９８８を参照のこと）。
【０５５２】 例えば、選択されたクアドローマの上清をプロテインＡセファロースカラムま
たはプロテインＧセファロースカラムを通過させて、ＩｇＧを結合させる（アイ
ソタイプに依存する）。次に結合した抗体を、例えば、ｐＨ５．０クエン酸緩衝
液を使用して溶出する。ＢｓＡｂを含む溶出画分を、等張緩衝液に対して透析す
る。あるいは、溶出液をまた、抗−免疫グロブリンセファロースカラムを通過さ
せる。次に、ＢｓＡｂを、３．５Ｍ 塩化マグネシウムを用いて溶出する。次に
、この方法において精製されたＢｓＡｂを、例えば、上記の標的細胞のアイソタ
イプ特異的ＥＬＩＳＡおよび免疫蛍光染色アッセイによって、結合活性について
試験する。
【０５５３】 精製されたＢｓＡｂおよび親抗体はまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動と、その
後の銀染色またはクマシー染色によって、特徴付け、および単離され得る。この
手順は、親抗体の一方が、他方の抗体よりも大きな分子量を有し、ＢｓＡｂのバ
ンドが２つの親抗体の中間に移動する場合に、可能である。サンプルの還元は、
２つの見掛け上異なる分子量を有する重鎖の存在を確認する。
【０５５４】 （Ｄ．薬学的組成物） 本発明の薬学的組成物は、一般に、少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥ
ＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体（薬学的に受容可能なキャリアまたは水性媒体
中に、溶解または分散した）の有効量を含む。組み合わせ治療もまた意図され、
そして同じ型の基礎をなす薬学的組成物を、単一医薬および組み合わせ医薬の両
方について使用し得る。
【０５５５】 句「薬学的に受容可能、または薬理学的に受容可能」とは、必要に応じて、動
物またはヒトに投与された場合、有害な、アレルギー性のまたは他の有害な反応
を生じない分子全体または組成物をいう。獣医学的使用、本発明に等しく包含さ
れ、そして「薬学的に受容可能な」処方物は、臨床的および／または獣医学的使
用の両方のための処方物を含む。
【０５５６】 本明細書において使用する場合、「薬学的に受容可能なキャリア」としては、
任意のおよび全ての、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張
剤および吸着遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質のための、そのよう
な媒体および薬剤の使用は、当該分野において周知である。任意の従来の媒体ま
たは薬剤が、活性成分と不適合である場合を除いて、治療的組成物中でのその使
用が意図される。ヒトへの投与のために、調製物は、ＦＤＡ官庁の生物製剤の基
準によって必要とされる、滅菌性、発熱性、一般的安全性および純度の基準を充
たすべきである。補助的な活性成分もまた、組成物中に組込まれ得る。
【０５５７】 「単位用量」処方物は、特定の時機に合わせられた送達に適合される投与成分
の用量または副用量を含む。例えば、例示的な「単位用量」処方物は、日用量も
しくは日用量単位もしくは日副用量または週用量もしくは週用量単位もしくは週
副用量などを含む処方物である。
【０５５８】 （Ｄ１．注射可能処方物） 本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体ベース抗体もしくは２Ｃ３ベース抗
体または免疫結合体は、最もしばしば、非経口投与（例えば、序静脈内、筋肉内
、皮下、経皮を介する注射のための処方、またはぜん動投与および腫瘍もしくは
疾患部位（腔内投与）中への直接滴下を含む他の経路のための処方）のために処
方される。治療剤−標的化剤構築物を活性成分として含有する水性組成物の調製
は、本明細書の開示を参照すれば、当業者に公知である。代表的には、そのよう
な組成物は、水溶液または懸濁液のいずれかにおいて、注射可能な薬剤として調
製され得る；注射前の液体への添加において、溶液または懸濁液を調製するため
の使用に適切な固体形態もまた調製され得る；そしてその調製物はまた、乳化さ
れ得る。
【０５５９】 注射での使用に適切な薬学的形態としては、滅菌水溶液または滅菌懸濁液；ゴ
マ油、ピーナッツオイル、または水性プロピレングリコールを含む処方物；およ
び滅菌注射可能溶液または滅菌注射可能懸濁液の即時調製のための滅菌粉末、が
挙げられる。全ての場合において、その形態は、滅菌であるべきであり、そして
注射可能性が存在する程度に流動性であるべきである。それは、製造および保存
の条件下において安定であるべきであり、そして微生物（例えば、細菌および真
菌）の混入作用に対して、保護されるべきである。
【０５６０】 ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体または免疫結合体組
成物は、中性または塩の形態において、滅菌水性組成物中に処方され得る。遊離
の塩基、または薬理学的に受容可能な塩としての溶液は、界面活性剤（例えば、
ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合された水中で調製され得る。薬学
的に受容可能な塩としては、酸添加塩（タンパク質の遊離のアミノ基を用いて形
成される）、および無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）または有機酸（例えば
、酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸）などを用いて形成
される塩などが挙げられる。遊離のカルボキシ基を用いて形成される塩はまた、
無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水
酸化鉄（ＩＩＩ））および有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチル
アミン、ヒスチジン、プロカイン）などから誘導され得る。
【０５６１】 適切なキャリアとしては、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グ
リセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）
、それらの適切な混合物、ならびに植物油を含む、溶媒および分散媒体が挙げら
れる。多くの場合において、等張剤（例えば、糖類または塩化ナトリウム）を含
むのが好ましい。適切な流動性は、例えば、コーティング剤（例えば、レシチン
）の使用によって、分散の場合において必要とされる粒子サイズの維持によって
、および／または界面活性剤の使用によって、維持され得る。
【０５６２】 貯蔵および使用の通常の条件下において、全てのそのような調製物は、防腐剤
を含有し、微生物の増殖を防ぐべきである。微生物の作用の防止は、種々の抗細
菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソル
ビン酸、チメロサールなど）によってもたらされ得る。注射可能な組成物の長期
の吸収は、遅延型吸収剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチ
ン）の組成物中での使用によってもたらされ得る。
【０５６３】 処方の際、または処方前に、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベ
ース抗体または免疫結合体は、広範に透析され、所望されない低分子物質を除去
するか、および／または、適切な場合、所望のビヒクル中へのより容易な処方の
ために凍結乾燥されるべきである。滅菌の注射可能溶液は、必要とされる量の活
性薬剤を、適切な溶媒中に、上記に列挙した他の種々の成分とともに取り込まれ
、必要に応じて、その後に濾過滅菌されることにより調製される。一般に、分散
剤は、種々の滅菌活性成分を、塩基性分散媒体および上記に列挙される必要とさ
れる他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に取り込まれることにより、調製される
。
【０５６４】 滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性
成分、および以前に滅菌濾過されたその溶液由来の任意のさらなる所望の成分の
粉末を生じる真空乾燥およびフリーズドライ技術である。
【０５６５】 本発明に従う適切な薬学的組成物は、一般に、受容可能な薬学的希釈剤または
賦形剤（例えば、滅菌水溶液）と混合されたある量のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧ
Ｆ抗体または２Ｃ３ベース抗体または免疫結合体を含み、意図される使用に依存
して、ある範囲の最終濃度を生じる。調製の技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｍａｃｋ Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８０（本明細書において参考として援
用される）によって例示されるように、一般に当該分野において周知である。エ
ンドトキシンの混入は、安全なレベルに最小限に維持されるべきである（例えば
、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満）ことを理解するべきである。さらに、ヒト
への投与について、調製物は、ＦＤＡ官庁の生物製剤基準によって必要とされる
、滅菌性、発熱性、一般的安全性および純度の基準を充たすべきである。処方の
際に、抗体または免疫結合体溶液は、投薬量処方と適合する様式において、およ
びそのような治療的有効量において、投与される。
【０５６６】 （Ｄ２．徐放性処方物） ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体または免疫結合体溶
液の処方物は、種々の投薬形態（例えば、上記の注射可能な溶液の型）において
容易に投与されるが、他の薬学的に受容可能な形態（例えば、錠剤、ピル、カプ
セルまたは経口投与のための他の固体、座剤、腟坐薬、経鼻溶液またはスプレー
、エアロゾル、吸入剤、リポソーム形態など）もまた意図される。投与形態の型
は、処置される疾患または障害に適合される。
【０５６７】 薬学的「遅放性」カプセルまたは「徐放性」組成物または調製物が、使用され
得、そして一般的に適用可能である。徐放性処方物は、一般に、長期間にわたっ
て一定の薬物レベルを生じるように設計され、そして本発明に従うＶＥＧＦＲ２
遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体または免疫結合体を送達するために
使用され得る。
【０５６８】 徐放性調製物の適切な例としては、抗体または免疫結合体を含む固形疎水性ポ
リマーの半浸透性マトリックスが挙げられ、これらのマトリックスは、成形され
た物品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。徐放性マト
リックスの例としては、以下が挙げられる：ポリエステル；ヒドロゲル（例えば
、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコー
ル））；ポリラクチド（例えば、米国特許第３，７７３，９１９号）；Ｌ−グル
タミン酸およびγエチルＬ−グルタメートのコポリマー；非分解性エチレン−酢
酸ビニル；分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅ
ｐｏｔＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリドアセテートから
なる注射可能なミクロスフェア））；およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ
酪酸。
【０５６９】 エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、分子を
１００日間にわたって放出し得、特定のヒドロゲルは、タンパク質をより短期間
で放出する。カプセル化抗体が身体内に長時間残留する場合、３７℃で湿気に曝
露される結果としてこれらは変性または凝集し得、従って生物学的活性を減少し
、かつ／または免疫原性を変化する。合理的なストラテジーは、関与する機構に
依存した安定化に利用可能である。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド相互
変換を介した分子間Ｓ−Ｓ結合形成に関与する場合、安定化は、スルフヒドリル
残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加物の使用
、特定のポリマーマトリクス組成物の開発などによって達成される。
【０５７０】 （Ｄ３．リポソームおよびナノカプセル） 特定の実施形態において、リポソームおよび／またはナノカプセルもまた、Ｖ
ＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体または免疫結合体ととも
に使用され得る。リポソームの処方および使用は、以下に要約されるように、当
業者に、一般に公知である。
【０５７１】 リポソームは、水性媒体中に分散されるリン脂質から形成され、そして自発的
に多層の同心の二重層ビヒクル（多層ビヒクル（ＭＬＶ）とも称する）を形成す
る。ＭＬＶは、一般に、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理
は、中心に水溶液を含有する、直径２００〜５００Åの範囲の小さな単層のビヒ
クル（ＳＵＶ）を生じる。
【０５７２】 リン脂質は、水中に分散される場合、水に対する脂質のモル比に依存して、リ
ポソーム以外の多様な構造を形成し得る。低い比において、リポソームは、好ま
しい構造である。リポソームの物理学的特徴は、ｐＨ、イオン強度、および二価
カチオンの存在に依存する。リポソームは、イオンおよび極性物質に対する低い
透過性を示し得るが、高温において、その透過性を顕著に変化させる相転移を受
ける。相転移は、ゲル状態として公知の密接に充填された、規則正しい構造から
、流体状態として公知の疎に充填された、より規則正しくない構造への変化を含
む。これは、特徴的な相転移温度において生じ、そしてイオン、糖および薬物の
透過性を増加する。
【０５７３】 リポソームは、４つの異なる機構を通じて、細胞と相互作用する：マクロファ
ージおよび好中球のような細網内皮系の食細胞によるエンドサイトーシス；非特
異的な弱い疎水的な力、もしくは静電的な力のいずれかによるか、または細胞表
面成分との特異的な相互作用による細胞表面への吸着；リポソーム含有物の細胞
質への同時放出をともなう、リポソームの脂質二重層の形質膜への挿入による形
質細胞膜との融合；および、リポソームの内容物の会合をいずれもともなわない
、リポソーム脂質の、細胞膜または細胞内（オルガネラ）膜への移入、あるいは
その逆。１つより多い機構が同時に作動し得るが、リポソームの処方を変化させ
ることは、作動する機構を変更し得る。
【０５７４】 ナノカプセルは、一般に、安定にかつ再現性のある方法において、化合物を捕
獲し得る。細胞内へのポリマー性の過剰負荷に起因する副作用を避けるために、
そのような超微細粒子（約０．１μｍのサイズ）が、インビボで分解され得るポ
リマーを使用して設計されるべきである。これらの要求を満たす生分解性ポリア
ルキル−シアノアクリレートナノ粒子は、本発明における使用において意図され
、そしてそのような粒子は、容易に作製され得る。
【０５７５】 （Ｄ４． 眼性処方物） 血管原性成分を有する多くの疾患は、眼に関する。例えば、本発明に従って処
置され得る、角膜新生血管形成に関する疾患としては、糖尿病網膜症、未熟児網
膜症、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障および水晶体後線維増殖症、流行性角結
膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズ過剰装着、アトピー性角膜炎、上輪
部角膜炎、翼状角膜炎症候群、シェーグレン、酒性挫瘡、フリクテン症（ｐｈｙ
ｌｅｃｔｅｎｕｌｏｓｉｓ）、梅毒、マイコバクテリア感染、脂質変性、化学的
焼灼、微生物潰瘍、真菌潰瘍、単純疱疹感染、帯状疱疹感染、カポージ肉腫、モ
ーレン潰瘍、テリエン辺縁変性、辺縁角質溶解、外傷、リウマチ様動脈炎、全身
性狼瘡、多発性動脈炎、ヴェーゲナー類肉腫症、強膜炎、スティーヴンズ−ジョ
ンソン疾患、天疱瘡（ｐｅｒｉｐｈｉｇｏｉｄ）放射状角膜切開、ならびに角膜
移植片拒絶が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５７６】 本発明に従って処置され得る、網膜／脈絡膜新生血管形成に関する疾患は、糖
尿病性網膜症、黄斑変性、鎌状赤血球貧血、類肉腫、梅毒、弾性線維性仮性黄色
腫、パジェット病、静脈閉鎖、動脈閉鎖、頸動脈閉塞性疾患、慢性ブドウ膜炎／
ビトリティス（ｖｉｔｒｉｔｉｓ）、マイコバクテリア感染、ライム病、全身性
エリトマトーデス、未熟児網膜症、イールズ病、べチュット病、網膜炎または脈
絡膜炎を引き起こす疾患、推定眼ヒストプラスマン症、ベスト病、近視、視神経
乳頭欠損、スターガート疾患、パースプラニティス（ｐａｒｓ ｐｌａｎｉｔｉ
ｓ）、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、トキソプラスマ症、外傷およびレーザー
後合併症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５７７】 本発明に従って処置され得る他の疾患としては、皮膚潮紅（角の新生血管形成
）および血管結合組織または繊維質組織の異常増殖（糖尿病に関係してもしなく
ても、増殖性硝子体網膜症のすべての形態を含む）によって引き起こされる疾患
が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５７８】 従って、本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体ベースの抗体および２Ｃ３
ベースの抗体ならびに免疫結合体は、眼性溶液として使用するために適切な薬学
的組成物の調製において有利に使用され得、この薬学的組成物は、硝子体内およ
び／または房内（ｉｎｔｒａｃａｍｅｒａｌ）投与のための組成物を含む。前述
の障害または他の障害の処置のために、本発明のＶＥＧＦＲ２遮断組成物、抗Ｖ
ＥＧＦ抗体組成物または２Ｃ３ベースの抗体組成物のいずれかは、従来の薬学的
慣行（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ」第１５編、１４８８〜１５０１頁（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈ
ｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）を参照のこと）に従って調製された眼性
調製物の形態で処置の必要な非験体の眼に投与される。
【０５７９】 眼性調製物は、薬学的に受容可能な溶液、懸濁液または軟膏中に約０．０１〜
１重量％、好ましくは約０．０５〜約０．５重量％の濃度でＶＥＧＦＲ２遮断抗
ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体を含む。濃度のいくらかの変更は、使用
する特定の化合物、処置される被験体の状態などに依存して必要に生じ、そして
処置の担当者は、個々の被験体について最も適切な濃度を決定する。眼性調製物
は、好ましくは、滅菌水溶液の形態であり、所望の場合、さらなる成分、例えば
、防腐剤、緩衝液、弾力剤、酸化防止剤および安定剤、非イオン性湿潤剤または
浄水剤、粘性増加剤などを含む。
【０５８０】 このような溶液において使用するための適切な防腐剤としては、塩化ベンズア
ルコニウム、塩化ベンズエトニウム、クロロブタノール、チメロサールなどが挙
げられる。適切な緩衝液としては、約ｐＨ６とｐＨ８との間、好ましくは、約ｐ
Ｈ７とｐＨ７．５との間のｐＨを維持するために十分な量の、ホウ酸、炭酸水素
ナトリウムおよびカリウム、ホウ酸ナトリウムおよびカリウム、炭酸ナトリウム
およびカリウム、酢酸ナトリウム、ビリン酸（ｂｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ナトリ
ウムなどが挙げられる。適切な弾力剤は、デキストラン４０、デキストラン７０
、デキストロース、グリセリン、塩化カリウム、プロピレングリコール、塩化ナ
トリウム、などであり、眼性溶液の塩化ナトリウム当量は、０．９±０．２％の
範囲である。
【０５８１】 適切な酸化防止剤おおび安定剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、二亜硫酸水
素ナトリウム、チオ亜硫酸ナトリウム、チオ尿素などが挙げられる。適切な湿潤
剤および浄水剤としては、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロキサ
マー２８２およびチロキサポールが挙げられる。適切な粘性増加剤としては、デ
キストラン４０、デキストラン７０、ゼラチン、グリセリン、ヒドロキシエチル
セルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ラノリン、メチルセルロー
ス、ペトロラタム、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニ
ルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなどが挙げられる。眼性調製物は、
例えばドロップの形態で従来の方法によってか、または眼性溶液中に眼を浸すこ
とによって処置の必要な被験体の眼に局所的に投与される。
【０５８２】 （Ｄ５．局所処方物） 広範な意味で、局所投与のための処方物は、口（頬側）を介してかつ皮膚を通
して送達するための処方物を含む。「局所送達システム」はまた、投与される成
分を含む経皮的パッチを含む。皮膚を通す送達は、所望の場合、イオン注入また
は電気的運搬によってさらに達成され得る。
【０５８３】 口において局所投与するための適切な処方物は、風味のある基礎原料の成分、
通常は、ショ糖およびアカシアまたはトラガカントを含むロゼンジ；不活性基礎
原料（例えば、ゼラチンおよびグリセリン）の活性成分またはショ糖およびアカ
シアを含む香錠；ならびに適切な液体キャリアで投与される成分を含むうがい薬
が挙げられる。
【０５８４】 皮膚に局所投与するための適切な処方物としては、軟膏、クリーム、ゲルおよ
び泥膏（薬学的に受容可能なキャリアで投与される成分を含む）が挙げられる。
局所使用（例えば、クリーム、軟膏およびゲルで）のためのＶＥＧＦＲ２−遮断
抗ＶＥＧＦまたは２Ｃ３ベース抗体の処方物としては、当該分野で周知のような
、脂肪性基剤または水溶性軟膏剤の調製物が挙げられる。例えば、これらの組成
物は、野菜オイル、動物性脂肪、が挙げられ、そしてより好ましくは、石油から
得た半個体炭化水素が挙げられ得る。使用される特定の成分は、白色軟膏、黄色
軟膏、セチルエステルワックス、オレイン酸、オリーブオイル、パラフィン、ペ
トロラタム、白色ペトロラタム、鯨蝋、グリセリンデンプン、白色ワックス、黄
色ワックス、ラノリン、無水ラノリンおよびモノステアリン酸グリセリルが挙げ
られ得る。種々の水溶性軟膏剤が、使用され得、グリコールエーテルおよび誘導
体、ポリエチレングリコール、ポリオキシル４０ステアレート、ならびにポリソ
ルベートが挙げられる。
【０５８５】 直腸投与のための処方物は、適切な塩基（例えば、ココアバターまたはサリチ
レートを含む）とともに坐剤として与えられ得る。窒投与のための適切な処方物
は、さらなる活性成分（例えば、当該分野で適切であると知られるキャリア）を
含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、泥膏、包状物、またはスプレー
処方物として与えられ得る。
【０５８６】 （Ｄ６．鼻性処方物） 鼻経路および呼吸器経路を介する局所送達は、種々の状態を処置するために意
図される。これらの送達経路はまた、薬剤を全身性循環に送達するために適切で
ある。従って、鼻性投与のための適切なキャリアにおける活性成分の処方物は、
本発明内に含まれ、例えば、鼻性溶液、スプレー、エアロゾルおよび吸入抗原が
挙げられる。キャリアが個体である場合、処方物は、例えば、２０〜５００ミク
ロンの範囲の粒子サイズを有する粗散剤が挙げられ、例えば、鼻に近接して維持
される散剤のコンテナから鼻経路を通る急速な吸入によって投与される。
【０５８７】 キャリアが液体である適切な処方物は、鼻投与において有用である。鼻溶液は
、通常は、ドロップまたはスプレーで鼻経路に投与されるように設計される水溶
液であり、そしてそれらが、多くの局面において鼻分泌と類似であり、通常の線
毛作用が維持されるように調製される。従って、鼻水溶液は、通常、等張性であ
り、そして５．５〜６．５のｐＨを維持するようにわずかに緩衝化される。さら
に、必要な場合、眼性調製物において使用される防腐剤と類似の抗菌防腐剤およ
び適切な薬物安定剤は、処方物中に含まれ得る。種々の市販の鼻性調製物は、公
知であり、そして例えば、抗生物質および抗ヒスタミン剤が挙げられ、ぜん息予
防に使用される。
【０５８８】 吸入薬および吸入剤は、薬物または化合物の患者の呼吸樹への送達のために設
計される薬学的調製物である。蒸気または霧が、投与され、そして有効領域に到
達する。この経路はまた、薬剤を全身性循環に送達するために使用され得る。吸
入薬は、鼻または口呼吸性経路によって投与され得る。吸入薬溶液の投与は、こ
の液滴が十分に良質でかつサイズが均一であり、その結果、この霧が、細気管支
に到達する場合にのみ、有効である。
【０５８９】 製品の別のグループ（吸入薬としても公知であり、そして時には、吸入剤とい
われる）は、特異的送達システムの使用によって呼吸経路に運ばれる良質の散剤
薬物または液体薬物（例えば、薬学的エアロゾル）を含み、液体ガス噴霧剤中に
薬物の溶液または懸濁液を維持する。適切なバルブおよび口アダプターを通して
放出される場合、吸入薬の測定用量は、患者の呼吸路に進められる。粒子サイズ
は、この型の調製物の投与において主に重要である。肺腔への穿通のための最適
粒子サイズは、０．５〜７μｍのオーダーであると、報告されてきた。良質の霧
は、加圧エアロゾルによって産生され、それによって、それらの使用の利点が、
考慮される。
【０５９０】 （Ｅ．治療用キット） 本発明はまた、本発明の処置方法における使用のためのＶＥＧＦＲ２遮断抗Ｖ
ＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体または免疫結合体を含む治療用キットを提供
する。そのようなキットは、一般に、適切な容器手段において、少なくとも１つ
のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体または免疫結合体の
薬学的に受容可能な処方物を含有する。このキットはまた、診断／造影または組
み合わせ治療のいずれかのための、他の薬学的に受容可能な処方物を含む。例え
ば、そのようなキットは、化学治療剤または放射線治療剤；抗脈管形成剤；抗腫
瘍細胞抗体；および／あるいは抗腫瘍脈管構造性または抗腫瘍支質性のイムノト
キシンまたはコアグリガンドのある範囲の任意の１つ以上を含み得る。
【０５９１】 このキットは、任意のさらなる成分を含むか、または含まないＶＥＧＦＲ２遮
断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体または免疫結合体を含む１つの容器（
容器手段）を有し得るか、あるいは各所望の薬剤のために別々の容器を有し得る
。組み合わせ治療剤が提供される場合、単一の溶液が、モル等価の組み合わせに
おいてか、または１つの成分が他の成分より過剰においてのいずれかで、予め混
合され得る。あるいは、キットの各ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ
３ベース抗体または免疫結合体および他の抗癌剤成分は、患者への投与前に、異
なる容器中で別々に維持され得る。
【０５９２】 このキットの成分が、１つ以上の液体中で提供される場合、液体は、好ましく
は、水溶液であり、特に滅菌水溶液が好ましい。しかし、このキットの成分は、
乾燥粉末において提供され得る。試薬または成分が乾燥粉末として提供される場
合、この粉末は、適切な溶媒の添加によって再構成され得る。この溶媒もまた別
の容器中で提供され得ることが意図される。
【０５９３】 キットの容器は、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボ
トル、シリンジ、または他の容器手段を含み、これらの中でＶＥＧＦＲ２遮断抗
ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体または免疫結合体および任意の他の所望の
薬剤が、好ましくは適切なアリコートで、配置され得る。別々の成分が含まれる
場合、このキットはまた、一般に第２のバイアルまたは他の容器を含み、これら
の中にこの成分が配置され、別々に設計された用量での投与を可能にする。この
キットは、滅菌の、薬学的に受容可能な緩衝液または他の希釈剤を含むための第
２／第３の容器手段もまた、含み得る。
【０５９４】 このキットはまた、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体
または免疫結合体を動物または患者に投与するための手段（例えば、１つ以上の
針またはシリンジ、あるいは点眼剤、ピペット、または他のそのような装置）を
含み、その手段によって、この処方物が、動物に注入され得るか、または身体の
疾患領域に適用され得る。本発明のキットはまた、代表的に、バイアルなど、お
よび他の成分を、市販のために密接な拘束において含む手段（例えば、射出成形
またはブロー成形したプラスチック容器）を含み、これらの手段の中で、所望の
バイアルおよび他の装置が配置され、そして保持される。
【０５９５】 （Ｆ．抗脈管形成治療） 本発明は、例えば、種々の疾患および障害に寄与する、異常な脈管形成を有す
る動物および患者を処置するために、使用され得る。これらのうちで最も普及し
た、および／または臨床的に重要なものは、癌処置の分野以外に、以下を含む：
関節変形、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症
、加齢性黄斑変性、グレーヴズ病、血管性再狭窄（以下の再狭窄を含む：血管形
成術、動静脈機能不全（ＡＶＭ）、髄膜腫、血管腫および血管新生緑内障）。介
入についての他の潜在的な標的には、以下が挙げれらる：血管線維腫、アテロー
ム性動脈硬化症斑、角膜移植新生血管形成、血友病性関節、肥大性瘢痕、オース
ラー−ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫水晶体後線維増殖症、強皮症、トラコー
マ、脈管接着、滑膜炎、皮膚炎、種々の他の炎症性疾患および障害、ならびに子
宮内膜症。本発明によって処置可能なさらなる疾患および障害、ならびにこのよ
うな脈管形成障害の統一的な基礎が、以下に記載される。
【０５９６】 新脈管形成が関連する１つの疾患は、慢性関節リウマチであり、ここで、関節
の滑膜内壁における血管は、新脈管形成を起こす。新しい脈管ネットワークの形
成に加えて、内皮細胞は、パンヌス増殖および軟骨破壊に導く、因子および反応
性酸素種を放出する。新脈管形成に関連する因子は、慢性関節リウマチの慢性的
な炎症状態に能動的に寄与し、そして維持するのを助け得る。新脈管形成に関連
する因子はまた、変形性関節症において役割を有し、関節の破壊に寄与する。
【０５９７】 Ｈａｒａｄａら（１９９８，本明細書中で参考として具体的に援用される）は
、ＶＥＧＦが、慢性関節リウマチの病因に関係し、そしてさらに、ＶＥＧＦの血
清濃度の測定が、慢性関節リウマチの疾患活性をモニターするための、非侵襲性
の有用な方法であることを示した。このことは、慢性関節リウマチと関連する本
発明の治療的用途および診断的用途を支持する。
【０５９８】 Ｎａｇａｓｈｉｍａら（１９９９，具体的に、本明細書中で参考として援用さ
れる）は、培養されたリウマチ滑膜細胞におけるＶＥＧＦに対する抗リウマチ薬
物の阻害効果を記載する。ＶＥＧＦは、慢性関節リウマチの滑膜において恒常的
に発現される。公知の抗リウマチ薬物（ブシラミン（ＢＵＣ））は、その作用機
構内に、滑膜細胞によるＶＥＧＦ産生の阻害を含むことが示されている。従って
、ＢＵＣの抗リウマチ効果は、滑膜細胞によるＶＥＧＦ産生の阻害を介して、リ
ウマチ滑膜における新脈管形成および滑膜増殖の抑制によって媒介される。抗リ
ウマチ治療としての本発明の使用は、この現存する治療薬のＶＥＧＦ阻害作用に
よって支持される。
【０５９９】 新脈管形成によって媒介される疾患の別の例は、眼血管新生疾患である。この
疾患は、眼の構造（例えば、網膜または角膜）への新しい血管の侵入によって特
徴付けられる。それは、失明に最も一般的な原因であり、そして約２０の眼の疾
患に関係する。加齢性黄斑変性において、関連した視覚問題は、網膜色素上皮の
真下での維管束組織の増殖を有するブルーフ膜における欠陥を介する脈絡膜毛細
管の内殖によって引き起こされる。脈管形成損傷はまた、糖尿病性網膜症、未熟
児網膜症、角膜移植拒絶、血管新生緑内障および水晶体後線維増殖症と関連する
。
【０６００】 角膜新生血管形成に関連する他の疾患には、以下が挙げられるが、これらに限
定されない：流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠損、コンタクトレンズ過剰装着（ｏ
ｖｅｒｗｅａｒ）、萎縮性角膜炎、上輪部角膜炎、翼状角膜炎乾燥症、シェーグ
レン症（ｓｊｏｇｒｅｎｓ）、しゅさ性挫瘡、フリクテン症（ｐｈｙｌｅｃｔｅ
ｎｕｌｏｓｉｓ）、梅毒、マイコバクテリア感染、脂質変性、化学的やけど、細
菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純疱疹感染、帯状疱疹感染、原虫感染、カポージ肉腫
、モーレン潰瘍、テリエン辺縁変性、辺縁角膜炎、慢性関節リウマチ、全身性狼
瘡、多発性動脈炎、外傷、ヴェーゲナー類肉腫症、強膜炎、スティーヴンズ−ジ
ョンソン疾患、脈絡放射状角膜切開、および角膜移植片（ｇｒａｐｈ）拒絶。
【０６０１】 網膜／脈絡膜新生血管形成に関連する疾患には、以下が挙げられるが、これら
に限定されない：糖尿病性網膜症、黄斑変性、鎌状赤血球貧血、サルコイド、梅
毒、弾性線維性仮性黄色腫、パジェット病、静脈閉鎖、動脈閉鎖、頸動脈閉塞性
疾患、慢性ブドウ膜炎／硝子体炎（ｖｉｔｒｉｔｉｓ）、マイコバクテリア感染
、ライム病、全身性エリテマトーデス（ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｉｓ）、未熟児
網膜症、イールズ病、ベチェット病（Ｂｅｃｈｅｔｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、網膜
症または脈絡膜炎を引き起こす感染、推定眼ヒストプラスマ症、ベスト病、近視
、視神経乳頭の先天的な構造上の欠損、シュタルガルト病、扁平部炎、慢性網膜
剥離、過粘稠度症候群、トキソプラスマ症、外傷およびレーザー処置後の合併症
。
【０６０２】 他の疾患には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ルベオーシス（
角の新生血管形成）に関連する疾患、および増殖性硝子体網膜症の全ての形態を
含む維管束組織または線維性組織の異常増殖によって引き起こされる疾患。
【０６０３】 慢性炎症はまた、病理学的新脈管形成に関連する。潰瘍性大腸炎およびクロー
ン病のようなこのような疾患状態は、新しい血管の炎症性組織への内殖とともに
、組織学的変化を示す。南アメリカに見出されるバルトネラ症（細菌性感染）は
、脈管内皮細胞の増殖によって特徴付けられる慢性的な段階を生じ得る。
【０６０４】 新脈管形成に関連する別の病理学的役割は、アテローム性動脈硬化症に見出さ
れる。血管の管腔内に形成されるプラークは、脈管形成刺激活性を有することが
示されている。ヒト冠動脈硬化性病変におけるＶＥＧＦの発現は、Ｉｎｏｕｅら
（１９９８、具体的に、本明細書中で参考として援用されている）によって立証
されている。このことは、ヒト冠状動脈硬化の進行において、および閉塞性冠疾
患における再疎通プロセスにおけるＶＥＧＦの病態生理学的重要性を明らかにす
る。本発明は、このような状態のための有効な処置を提供する。
【０６０５】 小児期の最も頻繁な脈管形成疾患の１つは、血管腫である。ほとんどの場合に
おいて、腫瘍は良性であり、そして介入なく退行する。より重篤な場合において
、腫瘍は、大きな空洞性かつ浸潤性の組織に進行し、そして臨床的な合併症を作
り出す。血管腫の全身的な形態である、血管腫症（ｈｅｍａｎｇｉｏｎｍａｔｏ
ｓｅｓ）は、高い死亡率を有する。現在使用される治療法を用いて処置され得な
い治療耐性血管腫が存在する。
【０６０６】 新脈管形成はまた、オースラー−ウェーバー−ランデュ病、つまり遺伝性出血
性毛細管拡張症のような遺伝性疾患に見出される損傷についての原因である。こ
れは、血管またはリンパ管の複数の小さな血管腫、腫瘍によって特徴付けられる
遺伝疾患である。血管腫は、皮膚および粘膜に見出され、しばしば、鼻出血（鼻
血）または胃腸出血によって、ならびにときどき肺および肝動静脈瘻を伴って生
じる。
【０６０７】 新脈管形成はまた、生殖および創傷治癒のような通常の生理学的プロセスに関
係する。新脈管形成は、排卵、およびまた、受精後の胞胚の着床において重要な
工程である。新脈管形成の阻止により、排卵をブロックするために、または胞胚
による着床を防止するために無月経を誘導し得る。
【０６０８】 創傷治癒において、過剰修復または線維増殖症は、外科手順の有害な副作用で
あり得、そして新脈管形成によって引き起こされ得るか、または悪化され得る。
接着は、手術の頻繁な合併症であり、そして小腸閉塞症のような問題に導く。
【０６０９】 所望でない脈管浸透性によって特徴付けられる疾患および障害はまた、本発明
によって処置され得る。これらは、脳腫瘍と関連した水腫、悪性疾患と関連した
腹水、メグズ症候群、肺炎症、ネフローゼ症候群、心内膜液浸出および胸水を含
み、ＷＯ ９８／１６５５１に開示され、本明細書中で参考として援用される。
【０６１０】 以下の節に記載されるように、先の疾患および障害の各々は、全ての型の腫瘍
とともに、例えば、米国特許第５，７１２，２９１号（具体的に、本明細書中で
参考として援用される）に記載されるように、当該分野の知識にしたがって、本
発明によって効果的に処置され、統合された利益が、脈管形成疾患の処置への抗
脈管形成ストラテジーの適用から生じる。
【０６１１】 本発明の抗体および／または免疫結合体は、最も好ましくは、腫瘍の処置にお
いて利用される。新脈管形成が重要である腫瘍は、悪性腫瘍および良性腫瘍を含
み、例えば、神経腫、神経線維腫、トラコーマおよび化膿性肉芽腫である。新脈
管形成は、固形腫瘍形成および転移において、特に顕著である。しかし、新脈管
形成はまた、血液生成腫瘍（ｂｌｏｏｄ−ｂｏｒｎ ｔｕｍｏｒ）（例えば、白
血病）、および白血球の非制限増殖が起こる骨髄の種々の急性または慢性の腫瘍
性疾患（通常、貧血、障害性血液凝固、およびリンパ節、肝臓および脾臓の膨大
を伴う）に関連する。新脈管形成はまた、白血病様の腫瘍を生じる、骨髄におけ
る異常において役割を果たす。
【０６１２】 新脈管形成は、腫瘍転移の２つの段階において重要である。一次腫瘍の血管新
生において、新脈管形成は、細胞が、血液流に入ること、そして身体内を循環す
ることを可能にする。腫瘍が一次部位を離れ、そして二次の転移部位に定着した
後、新管脈形成は、新しい腫瘍が増殖し得、そして拡大する前に、生じなくては
ならない。従って、新脈管形成の防止は、腫瘍の転移を妨げ得、そして１次部位
における腫瘍性増殖を含み得、他の治療法、特に、治療剤−標的化薬剤構築物に
よる処置を可能にする（以下を参照のこと）。
【０６１３】 本発明によって提供されるＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体および２Ｃ３ベー
ス抗体法または免疫結合体法は、従って、脈管成分を有する任意の悪性腫瘍の処
置に広範囲に適用可能である。腫瘍、特に血管新生化された、悪性腫瘍の処置に
、本発明の抗体および／または免疫結合体を使用する際に、薬剤は、単独でか、
または例えば、化学療法剤、放射線療法剤、アポトーシス剤、抗脈管形成剤およ
び／あるいはイムノトキシンまたはコアグリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄ）
と組み合せて使用され得る。
【０６１４】 処置のための代表的な血管新生化腫瘍は、固形腫瘍、特に癌であり、これらは
酸素および養分の供給のために、脈管成分を必要とする。本発明を使用して処置
され得る例示的な固形腫瘍としては、肺、胸部、卵巣、胃、膵臓、喉頭、食道、
精巣、肝臓、耳下腺、胆管、結腸、直腸、頚部、子宮、子宮内膜、腎臓、膀胱、
前立腺、甲状腺の腫瘍、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌腫、メラノーマ、グリオー
ム、神経芽細胞腫などが挙げられるが、これらに限定されない。ＷＯ ９８／４
５３３１は、抗ＶＥＧＦ抗体を使用して、効果的に処理され得る種々の腫瘍型を
さらに例示するために、本明細書中で参考として援用される。
【０６１５】 腫瘍の維持および転移における新脈管形成の役割の知識は、乳癌のような癌に
対する予後インディケーターに導く。一次癌に見出される新生血管形成の量は、
侵襲性乳癌において最も激しい新生血管形成の範囲における微小血管密度を計測
することによって決定された。高レベルの微小血管は、腫瘍再発と相関すること
が見出された。本発明の治療による新脈管形成の制御は、このような腫瘍の再発
を減少するか、または打ち消す。
【０６１６】 本発明は、固形腫瘍が存在する任意の患者の処置における使用に対して考慮さ
れる。ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体ベースの組成物の特定の特性の観点から
、本発明の治療剤は、減少した副作用を有する。特定の利点は、マクロファージ
によって媒介され、そして骨組織に対する不利な効果を欠く、腫瘍に対する宿主
免疫応答の維持または増強を生じる。本発明は、従って、小児癌および骨粗しょ
う症および他の骨欠損症を有するか、またはこれらが進行する危険性のある患者
の処置のための選択の抗脈管形成治療であり得る。
【０６１７】 全ての悪性疾患および固形腫瘍は、本発明によって処置され得るが、本発明の
非結合体化ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体および２Ｖ３抗体は、より脈管形成
的な腫瘍を有する患者、または転移の危険性を有する患者の処置における使用の
ために、特に考慮される。
【０６１８】 本発明はまた、予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）処置または予防（ｐｒｏ
ｐｈｙｌａｃｔｉｖｅ）処置として意図される。本発明のこれらの局面は、本発
明が、転移性腫瘍の播種の早い段階において転移性癌または腫瘍細胞を有し得る
、一次腫瘍を提示する患者を処置する能力を含む。抗脈管形成ストラテジーとし
て、本発明はまた、腫瘍の進行に対して中程度または高度の危険性の被験体の腫
瘍進行を防止するために使用され得、予後試験および／または遺伝性癌に苦しむ
近親類に基づく。
【０６１９】 本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体および２Ｖ３抗体の結合体化形態ま
たはイムノトキシン形態は、固形腫瘍を破壊または脱バルク化（ｄｅ-ｂｕｌｋ
ｉｎｇ）における使用について、特に考慮される。本発明のこれらの局面は、本
発明の非結合体化抗脈管形成抗体とともに、または他の抗脈管形成アプローチと
ともに使用されうる。
【０６２０】 本発明の処置方法の免疫結合体およびプロドラッグ形態は、以下の２つの特性
を有する単一の治療剤を提供する別の利点を有することが当業者に明らかである
：抗体の固有の抗脈管形成特性および取り付けられた薬剤の治療特性（例えば、
細胞毒性、凝固性、アポトーシス性など）。従って、本発明の抗体の結合体化お
よびプロドラッグ処置形態は、癌治療の分野にわたって信じられないほどの広範
な有用性を有する。
【０６２１】 本発明の異なる局面と関係する使用についてより適切な患者に関して本明細書
中に提供されるガイダンスは、特定の患者のプロフィールが、本発明による処置
についての患者の選択を補助し得るという教示として意図される。特定の患者の
予備選択、または患者のカテゴリーは、血管新生化腫瘍、または上記のような他
の脈管形成疾患を有する全ての患者の処置に関係する本発明の有用性を、いかな
る方法でも否定しない。さらなる考慮は、本発明によって提供される腫瘍に対す
る攻撃が、腫瘍をさらなる治療処置を受けやすくさせ、その結果、引き続く処置
は全体的な相乗効果を生じるか、完全な寛解または治癒を導きさえする。
【０６２２】 任意の特定の型の腫瘍が本発明を使用する処置から除外されることは考えられ
ない。しかし、腫瘍細胞の型は、他の治療剤、特に化学療法剤および抗腫瘍細胞
イムノトキシンを組合せた本発明の使用に関連し得る。本発明の治療の非結合体
化および結合体化の局面は、腫瘍血管系増殖を阻害する抗脈管形成効果を含む。
結合体化およびプロドラッグ処置局面は、さらに、腫瘍血管系を破壊するか、ま
たは閉鎖する。その血管系は実質的または全体的に全ての固形腫瘍で同じである
ために、本発明の方法論は、腫瘍細胞自体の特定の表現型または遺伝子型に無関
係に、全ての固形腫瘍の処置に広範に、または全体的に適用可能であることが理
解される。
【０６２３】 ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体または免疫結合体
構築物の治療的有効用量は、例えば、本明細書中に詳述される研究に示されるよ
うに、動物モデルからのデータを使用して容易に決定可能である。固形腫瘍を保
持する実験動物は、臨床環境に移行する前に適切な治療用量を最適化するために
、しばしば使用される。このようなモデルは、効果的な抗癌ストラテジーを予測
する際に非常に信頼性があることが公知である。例えば、固形腫瘍を保持するマ
ウス（例えば、本実施例で使用される）は、前臨床試験において広範に使用され
る。本発明者らは、このような分野で受容されるマウスモデルを使用して、最小
の毒性で有益な抗腫瘍効果を与える治療剤の作用範囲を決定した。
【０６２４】 非結合体化ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体を、抗
脈管形成治療において使用する際に、当業者はまた、臨床処置のための用量の処
方を補助するために、他の公開されたデータを使用し得る。例えば、本発明の抗
体は、当該分野の抗体に対して、異なる利点を有するが、他の抗ＶＥＧＦ抗体を
用いる処置に関する文献における情報は、なお、処置プロトコルおよび用量を設
計または最適化するために、本出願のデータおよび教示と組み合せて使用され得
る。
【０６２５】 例えば、Ｂｒｏｇｓｔｒｏｍら（１９９９）（具体的に、本明細書中で参考と
して援用される）は、ＭＡｂ Ａ４．６．１を使用して、インビボでの乳癌新脈
管形成におけるＶＥＧＦの重要性を記載した。本発明の２Ｃ３様の抗体は、Ａ４
．６．１との比較研究において、等価なまたは改良された抗腫瘍応答を示したが
、これらの抗体はまた、乳癌の処置において有意な有用性を有する。本発明者ら
は、当業者によって理解されるように、乳癌を有する患者が、代表的に、中年ま
たは老年の集団の女性であることをさらに認め、ここで、骨粗しょう症に関する
関与もまた、明らかである。従って、本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体
または２Ｃ３ベースの抗体は、骨代謝に対する不利な効果を引き起こさないさら
なる利点を有し、そして骨粗しょう症を有するか、またはその進行の危険性を有
する乳癌患者における使用に対して好ましくはない。
【０６２６】 同じ型の利点は、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体および２Ｃ３ベースの治療
剤を、小児癌の処置のための好ましい薬物にする。癌を有する子供において、健
全なかつ実質的な骨成長を維持する必要性は、明らかである。ＶＥＧＦＲ２遮断
抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、２Ｃ３）は、破骨細胞および軟骨吸収細胞の活性を実
質的に損なわせず、これらは、骨の成長において重要であるので、２Ｃ３は、他
の抗体（例えば、Ａ４．６．１）に比べて重要な利点を有する。
【０６２７】 Ｂｒｏｇｓｔｒｏｍら（１９９９）（具体的に、本明細書中で参考として援用
される）は、ＭＡｂ Ａ４．６．１は、ドキソルビシンと組み合せて使用される
場合、有意な腫瘍後退を生じることを報告した。このことは、さらに、種々の癌
を処置する際に、有意な臨床的な結果を達成するために、ＶＥＧＦＲ２遮断抗Ｖ
ＥＧＦ抗体と従来の細胞毒性剤または化学治療剤とを組み合わせた使用を支持す
る。非結合体化ドキソルビシンおよびドキソルビシンプロドラッグ配合物の両方
が、考慮される。
【０６２８】 Ｆｅｒｒａｒａおよび共同研究者らはまた、腫瘍保有マウスにおけるマウス抗
ＶＥＧＦモノクローナル抗体の効力および濃度−応答、ならびにヒト処置への推
定について報告した（Ｍｏｒｄｅｎｔｉら、１９９９、具体的に本明細書中で参
考として援用される）。これらの研究は、マウス抗ＶＦＧＦモノクローナル抗体
の濃度−応答関係を評価するために設計され、その結果、抗体の組換えヒト化形
態の有効血漿濃度が、癌患者において評価され得る。Ｍｏｒｄｅｎｔｉら（１９
９９）は、ヌードマウスにおける満足のいく腫瘍抑制が、マウス抗体の用量を使
用して達成され、この用量は、必要とされる有効範囲におけるヒト用途に対して
治療抗体を維持するのに有効な臨床的な投薬レジメンを規定するために、ヒト系
に容易に適用され得ると結論した。従って、本発明の技術を受容するマウスモデ
ルからのデータはまた、本明細書中に記載されるような、当業者に公知の技術に
加えて、Ｍｏｒｄｅｎｔｉら（１９９９）に報告された分析のタイプを使用して
適切なヒト用量に変換され得る。
【０６２９】 サルにおける組換えヒト化形態のＧｅｎｅｎｔｅｃｈの抗ＶＥＧＦ抗体（本明
細書中に特に参考として援用されるＲｙａｎら，１９９９）の前臨床安全性評価
の結果は、特定の候補治療剤に伴う欠点を例示するために役立つ。この抗体はこ
の動物において薬理学的活性を有するが、これらの研究においてサルは、過従属
栄養軟骨細胞、肋軟骨下骨板形成、および成長板（ｇｒｏｗｔｈ ｐｌａｔｅ）
の血管侵襲における用量関連増加により特徴付けられる骨端軟骨形成異常を示す
。このような欠点は、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体および２Ｃ３ベースの治
療剤の使用においては明らかでない。この使用は、ＶＥＧＦＲ１により媒介され
る軟骨吸収細胞および軟骨細胞におけるＶＥＧＦ結合およびシグナル伝達を阻害
しない。
【０６３０】 Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈのヒト化モノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体の前臨床的薬理学
、種間比較（ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ ｓｃａｌｉｎｇ）および組織分布に対
するさらなる研究によるデータは、Ｌｉｎら（１９９９，本明細書中に参考とし
て援用される）により報告された。これらの研究は、マウス、ラット、サル、お
よびウサギにおいて行われており、後者（ウサギ）は、125Ｉ標識抗体が使用さ
れている。マウス、ラットおよびサルからの薬理学的データを、ヒトにおける相
対成長的（ａｌｌｏｍｅｔｒｉｃ）比較を使用してヒト化対応抗体の薬物動態を
推定するために使用した。従って、適切な投薬量情報を、ヒトの病理状態（例え
ば、慢性関節リウマチ、眼の新生血管形成および癌）の処置のために開発し得る
。
【０６３１】 抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１のヒト化バージョンを、抗癌剤のような臨床試験
において使用した（Ｂｒｅｍ，１９９８；Ｂａｃａら，１９９７；Ｐｒｅｓｔａ
ら，１９９７；各々が本明細書中に参考として援用される）。従って、このよう
な臨床データもまた、本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体および２Ｃ３処
置の治療用量を設計する場合の参照供給源として考慮し得る。本発明は、腫瘍保
有マウスの研究においてＡ４．６．１と同程度に２Ｃ３が有効であることを示す
が、ＶＥＧＦがＶＥＧＦＲ２媒介作用のみを阻害することに対する特異性は利点
である。ＷＯ９８／４５３３１はまた、本明細書中に参考として援用されて、処
置において使用され得るヒト化抗ＶＥＧＦ抗体の用量を例示する。
【０６３２】 腫瘍治療における結合体化ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベー
スの免疫結合体の使用に対して、当業者は、有益な効果を達成するために腫瘍血
管系に広範な治療剤を送達するという成功に関する化学文献および特許文献を参
照し得る。これらの文献としては、米国特許第５，８５５，８６６号；同第５，
８７７，２８９号；同第５，９６５，１３２号；同第６，０５１，２３０号；同
第６，００４，５５５号；同第５，７７６，４２７号；同第６，００４，５５４
号；および同第６，０３６，９５５号；ならびに米国特許出願第０８／４８２，
３６９号（登録費は１９９８年１０月２０日に支払われた）の各々が挙げられ、
これらは、このような治療薬剤−標的化薬剤構築物の使用をさらに記載する目的
で、本明細書中に参考として援用される。
【０６３３】 当該分野で公知のように、臨床処置に進める前に、前臨床試験と関係するガイ
ドラインとして使用され得る、現実的目的が存在する。しかし、臨床への他のＶ
ＥＧＦ抗体の普及、本明細書中で示された受容されるモデルにおいてすでに実証
された抗腫瘍効果、および現在のストラテジーの増強された安全性を鑑みて、本
発明は、臨床的処置に対する最初の道を治療剤にもたらす。従って、前臨床試験
は、最も有利な抗体、用量または組み合わせを選択するために利用され得る。
【０６３４】 任意の一貫して検出可能な抗脈管形成効果、転移の阻害、腫瘍血管系破壊、腫
瘍血栓症、壊死および／または一般的抗腫瘍効果を生じる、任意のＶＥＧＦＲ２
遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体または免疫結合体の用量または組
合せられた医薬は、有用な発明を規定する。本発明はまた、腫瘍の血管下流に対
して効果的であり得る。すなわち、本発明は、排出（ｄｒａｉｎｉｎｇ）血管の
少なくともサブセットを標的化し、特に、腫瘍から放出されたサイトカインが、
これらの血管に作用する場合に、これらの抗原性プロフィールを変化する。
【０６３５】 ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体または免疫結合体
の用量または組み合わせ治療の抗脈管形成および／または腫瘍効果が、意図され
た治療範囲の下端に向かうような状況下でさえ、この治療が、特定の腫瘍標的ま
たは患者の状況における他の全ての公知の治療となお等価であるか、またはより
効果的でさえあることがあり得ることもまた理解される。特定の腫瘍および状態
が中期間または長期間効果的に処置され得ないことは臨床医に不幸にも明らかで
あるが、特に一般的に提案されている他のストラテジーと少なくともほぼ同様に
効果的である場合、それは、本発明の治療の有用性を否定しない。
【０６３６】 血管新生化腫瘍の処置のための、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ
３ベースの抗体もしくは免疫結合体構築物または組み合わせの治療薬の適切な用
量を設計する際に、当業者は、臨床投与のための適切な用量に到達するために、
本明細書中に記載される動物研究および文献における技術的常識から容易に推定
し得る。動物からヒトへの用量のコンバージョンを達成するために、当業者は、
実験動物の単位質量あたり投与される薬剤の質量を計算し、そして好ましくは、
実験動物とヒト患者との間の体表面積（ｍ2）の差異を計算する。全てのこのよ
うな計算は、当業者に周知でありそして慣用的である。
【０６３７】 例えば、マウス研究において２Ｃ３の成功用量を採用して、そして質量および
表面積に基づく標準的計算を適用すると、ヒト患者における使用に効果的な用量
は、約１ｍｇ／ｍ2〜約１０００ｍｇ／ｍ2、好ましくは、約５０ｍｇ／ｍ2〜約
５００ｍｇ／ｍ2、そして最も好ましくは、約１０ｍｇ／ｍ2〜約１００ｍｇ／ｍ 2 である。これら用量は、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース
の裸の抗体およびＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの免疫結
合体について適切であるが、この用量は、抗脈管形成剤として使用するための、
裸のまたは非結合体化抗体に関連した使用に好ましい。
【０６３８】 従って、この情報を使用して、本発明者らは、ヒト投与のための有用な低用量
のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体または免疫結合体は
、約１ｍｇ／ｍ2、２ｍｇ／ｍ2、３ｍｇ／ｍ2、４ｍｇ／ｍ2、５ｍｇ／ｍ2、６
ｍｇ／ｍ2、７ｍｇ／ｍ2、８ｍｇ／ｍ2、９ｍｇ／ｍ2、１０ｍｇ／ｍ2、１２ｍ
ｇ／ｍ2、１５ｍｇ／ｍ2、２０ｍｇ／ｍ2、２５ｍｇ／ｍ2、約３０ｍｇ／ｍ2、
３５ｍｇ／ｍ2、４０ｍｇ／ｍ2、４５ｍｇ／ｍ2または約５０ｍｇ／ｍ2であり；
そしてヒト投与のための有用な高用量のこのような抗体または免疫結合体は、約
６００ｍｇ／ｍ2、６５０ｍｇ／ｍ2、７００ｍｇ／ｍ2、７５０ｍｇ／ｍ2、８０
０ｍｇ／ｍ2、８５ｍｇ／ｍ2、９００ｍｇ／ｍ2、９２５ｍｇ／ｍ2、９５０ｍｇ
／ｍ2、９７５ｍｇ／ｍ2または約１０００ｍｇ／ｍ2である。ヒト投与のための
有用な中程度の用量のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体
または免疫結合体は、約５５ｍｇ／ｍ2、６０ｍｇ／ｍ2、７０ｍｇ／ｍ2、８０
ｍｇ／ｍ2、９０ｍｇ／ｍ2、１００ｍｇ／ｍ2、１２５ｍｇ／ｍ2、１５０ｍｇ／
ｍ2、１７５ｍｇ／ｍ2、２００ｍｇ／ｍ2、２５０ｍｇ／ｍ2、３００ｍｇ／ｍ2
、３５０ｍｇ／ｍ2、４００ｍｇ／ｍ2、４５０ｍｇ／ｍ2、５００ｍｇ／ｍ2、５
２５ｍｇ／ｍ2、５５０ｍｇ／ｍ2または約５７５ｍｇ／ｍ2などの低用量と高用
量との間の任意の用量であることが意図される。
【０６３９】 上記に引用されたいずれかの例示的用量を用いる任意の特定の範囲または特定
の記載された範囲の間の任意の中間の値が意図される。ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥ
ＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの免疫結合体が使用される場合、凝固薬免疫複合体
が一般的に毒素免疫結合体より高用量で使用され得ることがまた理解される。
【０６４０】 一般に、約１０〜１００ｍｇ／ｍ2、約１０〜９０ｍｇ／ｍ2、約１０〜８０ｍ
ｇ／ｍ2、約２０〜１００ｍｇ／ｍ2、約２０〜９０ｍｇ／ｍ2、約２０〜８０ｍ
ｇ／ｍ2、約３０〜１００ｍｇ／ｍ2、約３０〜９０ｍｇ／ｍ2、約３０〜８０ｍ
ｇ／ｍ2、約１５〜１００ｍｇ／ｍ2、約２５〜１００ｍｇ／ｍ2、約３５〜１０
０ｍｇ／ｍ2、約１５〜９０ｍｇ／ｍ2、約２５〜９０ｍｇ／ｍ2、約３５〜９０
ｍｇ／ｍ2の間の投薬量範囲、あるいはＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または
２Ｃ３ベースの抗体もしくは免疫結合体のそのような投薬量範囲が好ましい。こ
れらの記載の範囲にかかわらず、本明細書中に提示されたパラメーターおよび詳
細なガイダンスを考慮して、活性または最適な範囲でのさらなる変更は、本発明
の範囲内であることが理解される。
【０６４１】 従って、他の薬剤と組合わせにおいて、低用量がより適切であり得、そして特
に、ＶＥＧＦＲ２にのみ結合するＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体および２Ｃ３
ベースの抗体の増強された安全性、ならびにＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体お
よび２Ｃ３ベースの抗凝固薬および抗脈管形成免疫結合体のなおさらに増強され
た安全性を考慮すると、高用量がなお許容され得ることは理解されるべきである
。ヒトまたはヒト化抗体（および必要に応じて、ヒト抗凝固薬または抗脈管形成
タンパク質）の使用は、健常組織における有意な毒性または副作用の機会をさら
に減少して、本発明を臨床使用のためにさらに安全にする。
【０６４２】 本発明の治療レジメの意図は、一般的に、受け入れられない毒性に関連するレ
ベル未満の用量をなお維持しながら、有意な抗腫瘍効果を生成することである。
用量自体の変化に加えて、投与レジメはまた、処置ストラテジーを最適化するた
めに採用され得る。１つの処置プロトコルは、約１ｍｇ／ｍ2〜１０００ｍｇ／
ｍ2、好ましくは、約５０ｍｇ／ｍ2〜５００ｍｇ／ｍ2、そして最も好ましくは
、約１０ｍｇ／ｍ2〜約１００ｍｇ／ｍ2のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体また
は２Ｃ３ベースの抗体もしくは免疫結合体、あるいはこれらを含む治療カクテル
（ｔｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃｏｃｋｔａｉｌ）を、１週間に１〜３回、好ましく
は、静脈内または筋肉内投与により、最も好ましくは、静脈内投与により投与す
ることである。
【０６４３】 特定の用量の投与において、当業者は、好ましくは薬学的受容可能な組成物（
無菌性、発熱性、純度および一般的な安定性のＦＤＡ基準に従う）を患者に全身
的に提供する。静脈内注射が、一般的に好ましい。約１時間または２時間などの
期間にわたって連続注入を使用することもまた意図される。
【０６４４】 当然、広範な使用の前に、臨床試験が実施される。臨床試験の実行の種々のエ
レメント（患者の処置およびモニタリングを含む）は、本発明の開示に照らして
当業者に公知である。以下の情報は、このような治験を確立する際の使用のため
の一般的なガイドラインとして提示されている。
【０６４５】 第１のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの処置研究につい
て選択される患者は、従来の治療の少なくとも１つの過程に応答せず、そして身
体検査、実験技術、および／またはＸ線撮影手段によって決定されるような客観
的に測定可能な疾患を有する。いずれの化学療法も、本研究に入る少なくとも２
週間前に停止する。マウスモノクローナル抗体または抗体部分を使用する場合、
患者はマウス免疫グロブリンに対するアレルギーの病歴を有さない。
【０６４６】 特定の利点は、三管腔ポート（ｔｒｉｐｌｅ ｌｕｍｅｎ ｐｏｒｔ）を有す
る中心静脈カテーテルの留置を使用する際に見出される。ＶＥＧＦＲ２遮断抗Ｖ
ＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの薬剤は、例えば、０．２２μフィルターを使用
して濾過され、そして適切に（例えば、生理食塩水で）１００ｍｌの最終用量に
希釈される。使用の前に、この試験サンプルはまた、同様の様式で濾過され、そ
してＡ280を測定することによって濾過の前後でその濃度を評価される。予想さ
れる回収率は、８７％〜９９％の範囲内であり、次いで、タンパク質の損失につ
いての調整が補正される。
【０６４７】 ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体もしくは結合体は
、約４〜２４時間の期間にわたって投与され、各患者は、２〜７日間の間隔で２
〜４回の注入を受ける。投与はまた、７日間にわたって一定速度の注入によって
実施され得る。任意の用量レベルで与えられる注入は、観察される任意の毒性に
依存する。従って、グレードＩＩの毒性が、任意の単回注入後または一定速度注
入の間の特定の期間で達した場合、毒性が改善されない限り、さらなる用量を中
止するか、またはその一定速度注入を停止する。漸増用量のＶＥＧＦＲ２遮断抗
ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの治療剤は、約６０％の患者が、任意のカテゴ
リーにおいて、受け入れられないグレードＩＩＩまたはＩＶの毒性を示すまで、
患者群に投与される。この値の２／３である用量が、安全用量として定義される
。
【０６４８】 身体検査、腫瘍測定、および実験室試験は、もちろん、処置前および１ヶ月後
までの間隔で実施される。実験室試験としては、全血球計数、血清クレアチニン
、クレアチニンキナーゼ、電解質、尿素、ＳＧＯＴ、窒素、ビリルビン、アルブ
ミン、および全血清タンパク質が挙げられる。処置後６０日までに採取された血
清サンプルは、投与された治療剤、およびそのいずれかの部分に対する抗体の存
在について放射免疫アッセイによって評価される。任意の標準的アッセイ（例え
ば、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡのような）を使用する、血清の免疫学的分析は、Ｖ
ＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの治療剤の薬物動態およびク
リアランスの評価を可能にする。
【０６４９】 抗腫瘍応答を評価するために、患者を、最後の注入の、４８時間後〜１週間後
に、そして再び３０日後に試験するべきである。触知可能な疾患が存在した場合
、全ての塊の二つの垂直直径（ｐｅｒｐｅｎｄｉｃｕｌａｒ ｄｉａｍｅｔｅｒ
）を、処置の間毎日、治療完了後１週間以内、および３０日で測定すべきである
。触知可能でない疾患を測定するために、連続ＣＴスキャンが、胸部、腹部、お
よび骨盤の全体を通して、１ｃｍ間隔で、４８時間〜１週間で、そして３０日で
再び実施され得る。組織サンプルはまた、組織学的におよび／あるいはフローサ
イトメトリーにより、疾患部位から、または適切であれば血液もしくは体液サン
プルからの生検を用いて評価されるべきである。
【０６５０】 臨床応答は、受容可能な基準により規定され得る。例えば、完全な応答は、処
置の１カ月後、全ての測定可能な腫瘍がみられないことにより規定され得る。こ
れに対し、部分的な応答は、処置の１カ月後に、増大を示す腫瘍部位なしでの、
全ての評価可能な腫瘍小節の垂直直径の積の和の５０％またはそれ以上の減少に
より規定され得る。同様に、混合応答は、処置の１カ月後に、一つ以上の部位で
の進行を伴った、全ての測定可能な病巣の垂直直径の積の５０％以上の減少によ
り規定され得る。
【０６５１】 上記のような臨床試験の結果を鑑みて、さらにより正確な処置レジメが処方さ
れ得る。そうであったとしても、投与量におけるいくらかのバリエーションは、
処置される被験体の状態に依存して、後で必要であり得る。投与に責任をもつ医
者は、本開示に鑑みて、個々の被験体に適切な用量を決定し得る。このような最
適化および調節は、当該分野において慣用的に実施され、そして過剰な実験量を
けっして反映しない。
【０６５２】 （Ｇ．組合わせ治療） 脈管形成疾患（例えば、関節炎、乾癬、アテローム硬化症、糖尿病性網膜症、
加齢性黄斑変性、グレーブス病、血管再狭窄、血管腫および血管新生緑内障（あ
または上記の他の疾患））または固形腫瘍を処置するために使用される場合、本
発明は、他の治療と組合わされ得る。
【０６５３】 本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの処置方法は、
患者が示す特定の腫瘍、疾患または障害の処置において、一般的に使用される他
の任意の方法と組み合わせられ得る。特定の治療的アプローチが、患者の状態に
、それ自体で有害であることが公知でなく、そしてＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ
抗体または２Ｃ３ベースの処置を有意に相殺しない限り、本発明とのその組み合
わせが意図される。
【０６５４】 固形腫瘍処置と関連して、本発明は、古典的なアプローチ（例えば、手術、放
射線治療、化学療法など）との組み合わせにおいて使用され得る。それゆえ、本
発明は、組み合わせ治療を提供し、そこでは、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体
または２Ｃ３ベースの構築物が、手術、または放射線処置と、同時に、その前に
、またはその後に使用される；または従来の化学療法剤、放射線療法剤、または
抗血管形成剤、あるいは標的化イムノトキシンまたはコアグリガンドとともに、
その前に、またはその後に、患者に投与される。
【０６５５】 本発明と放射線療法、放射線療法薬剤、抗脈管形成薬剤、アポトーシス誘導薬
剤および抗チューブリン薬物とを組合わせた使用は、特に好ましい。このような
薬剤の多くの例は、本発明の免疫結合体とともに、上記で記載される。治療結合
体の一部として使用するために最初に記載された任意の薬剤はまた、別々に使用
され得るが、本発明と実施可能に組合わせても使用され得る。
【０６５６】 １つ以上の薬剤がＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの治療
との組み合わせにおいて使用される場合、組み合わされた結果が、各処置が別々
に実施されるときに観察される効果の相加である必要性はない。少なくとも相加
的効果が、一般的に、望ましいが、単一の治療の１つを超える増加した抗腫瘍効
果が有益である。また、組み合わせ処置が相乗効果を示す特定の要件は存在しな
いが、これは、もちろん可能であり、かつ有利である。
【０６５７】 組み合わせられた抗腫瘍治療を実施するために、動物内でそれらの組み合わさ
れた抗腫瘍作用を生じるに効果的な様式で別の抗癌剤と組み合わせて、ＶＥＧＦ
Ｒ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの構築物を動物に単に投与する。従
って、その薬剤は、腫瘍血管系内にそれらを組み合わせて存在させ、かつ腫瘍環
境においてそれらの組み合わされた作用が生じるに、有効な量および有効な時間
で提供される。この目的を達成するために、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体ま
たは２Ｃ３ベースの治療剤および抗癌剤が、同時に、単一の組成物または異なる
投与経路を用いる２つの異なる組成物のいずれかにおいて、動物に投与され得る
。
【０６５８】 あるいは、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの処置は、抗
癌剤処置の前に、または続いて、例えば、数分から数週間および数ヶ月にわたる
間隔でなされ得る。当業者は、抗癌剤およびＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体ま
たは２Ｃ３ベースの薬剤は、腫瘍に対して有利な組合わせ効果を発揮することを
確認する。
【０６５９】 大部分の抗癌剤は、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗
脈管形成治療の前に与えられ得る。しかし、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体ま
たは２Ｃ３ベースの免疫結合体が使用される場合、種々の抗癌剤が同時に、また
は続いて投与され得る。
【０６６０】 癌の処置における物質の組み合わせの一般的な使用は、周知である。例えば、
米国特許第５、７１０、１３４号（本明細書中に参考として援用される）は、非
毒性物質または「プロドラッグ」との組み合わせにおいて腫瘍において壊死を誘
導する成分を開示する。壊死プロセスにより放出された酵素は、非毒性の「プロ
ドラッグ」を切断して、毒性の「薬物」にし、これは、腫瘍細胞死を導く。また
、米国特許第５，７４７，４６９号（本明細書中に参考として援用される）は、
ｐ５３およびＤＮＡ損傷因子（ＤＮＡ ｄａｍａｇｉｎｇ ａｇｅｎｔ）をコー
ドするウイルスベクターの組み合わされた使用を開示する。任意のこのような類
似のアプローチが、本発明とともに使用され得る。
【０６６１】 いくつかの状況において、有意に処置期間を延長（それぞれの投与間に数日（
２、３、４、５、６または７）、数週間（１、２、３、４、５、６、７または８
）あるいはさらに数ヶ月（１、２、３、４、５、６、７または８）の経過）する
ことは、望ましくさえあり得る。これは、１つの処置が、実質的に腫瘍を破壊す
ることを意図し（例えば、手術及び化学療法）、そして別の処置が、微小転移巣
または腫瘍の再増殖を予防することを意図する（例えば、抗脈管形成ベースの治
療）状況において、有利である。抗脈管形成剤は、手術後に慎重に投与されて、
効率的な創傷治癒を可能にすべきである。
【０６６２】 ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの薬剤または抗癌剤のい
ずれかの一つを超える投与が利用されることがまた、想定される。これらの薬剤
は、１日おきまたは１週間おきに、交換可能に投与され得る；または一連のＶＥ
ＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの処置が行われ、次いで、一連
の抗癌剤治療が行なわれ得る。いずれにせよ、組み合わせ治療を用いて腫瘍の後
退を達成するために、必要とされる全ては、投与時間にかかわらず、抗腫瘍効果
を発揮するに有効な組み合わされた量で両方の薬剤を送達することである。
【０６６３】 手術に関して、任意の外科的介入が、本発明との組み合わせにおいて実施され
得る。放射線療法と関連して、腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡ損傷を誘導する任意
の機構（例えば、γ照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、およびさらに電子発光
（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｅｍｉｓｓｉｏｎ）など）が意図される。腫瘍細胞へ
の指向されたラジオアイソトープの送達がまた意図され、そしてこれは、標的化
抗体または他の標的化手段、および好ましくは、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗
体（例えば、２Ｃ３）との関連において使用され得る。
【０６６４】 サイトカイン治療はまた、組み合わされた治療レジメの有効なパートナーであ
ることが実証された。種々のサイトカインは、そのような組み合わせアプローチ
において使用され得る。サイトカインの例には、以下が挙げられる：ＩＬ−１α
、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７
、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、Ｔ
ＧＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＬＡ
Ｆ、ＴＣＧＦ、ＢＣＧＦ、ＴＲＦ、ＢＡＦ、ＢＤＧ、ＭＰ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、Ｔ
ＭＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ。サイトカインは、臨床
的な指標（例えば、患者の状態、およびサイトカインの相対的な毒性）と一致す
る標準的なレジメに従って投与される。ウテログロビン（ｕｔｅｒｏｇｌｏｂｉ
ｎ）をまた使用して、転移を予防または阻害し得る（米国特許第５，６９６，０
９２号；本明細書中に参考として援用される）。
【０６６５】 （Ｇ１．化学療法剤） 特定の実施形態において、本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２
Ｃ３ベースの治療薬剤は、化学療法剤と組み合わせて投与され得る。種々の化学
療法剤は、本明細書中に開示される組合わせ処置方法において使用され得る。例
示として意図される化学療法剤としては、以下が挙げられる：例えば、アドリア
マイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、カルミノマイシン、ダウノマイ
シン、ドキソルビシン、タモキシフェン、タキソール、タキソテール、ビンクリ
スチン、ビンブラスチン、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｕｂｉｎｅ）、エトポ
シド（ＶＰ−１６）、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、シトシンアラビノシド
、シクロホスファミド、チオテパ、メトトレキセート、カンプトセシン、アクチ
ノマイシン−Ｄ、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、アミノプテリ
ン、コンブレタスタチン（ｃｏｎｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）、ならびにそれらの
誘導体およびプロドラッグ。
【０６６６】 当業者に理解されるように、適切な用量の化学療法剤は、一般に、臨床治療に
おいてすでに利用されてきており、ここで、この化学療法剤は、単独で、または
他の化学療法剤と組み合わせて投与される。例示のみのために、シスプラチンの
ような薬剤、および他のＤＮＡアルキル化剤が使用され得る。シスプラチンは、
癌を処置するために広範に使用され得、臨床適用において使用される有効な用量
は、総計３つの経路について３週間毎に５日間２０ｍｇ／ｍ2である。シスプラ
チンは、経口で吸収されず、従って、注射を介して、静脈内で、皮下で、腫瘍内
で、または腹腔内で送達されねばならない。
【０６６７】 さらに有用な薬剤は、ＤＮＡ複製、有糸分裂、および染色体分離に干渉する化
合物を含む。このような化学療法剤化合物には、アドリアマイシン（ドキソルビ
シンとしてもまた公知である）、エトポシド、ベラパミル、ポドフィロトキシン
などが挙げられる。新形成の処置のための臨床設定において広範に使用されるの
で、これらの化合物は、静脈内では、アドリアマイシンについて２１日間隔で２
５〜７５ｍｇ／ｍ2からエトポシドについては３５〜５０ｍｇ／ｍ2までの範囲の
用量で、静脈内にボーラス注射を通じて、または経口的に静脈内用量の２倍で、
投与される。
【０６６８】 ポリヌクレオチド前駆体の合成および忠実度を崩壊させる薬剤もまた使用され
得る。特に有用なものは、広範な試験を受け、そして容易に利用可能な薬剤であ
る。そのようなものとして、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような薬剤は
，新形成組織によって優先的に使用され、新形成細胞に対する標的化のためにこ
の薬剤を特に有用にさせる。非常に毒性の５−ＦＵは、広範囲のキャリア（局所
を含む）において適用可能であるが、３〜１５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量を有
する静脈内投与が一般に使用される。
【０６６９】 組合せ治療に関する例示的な化学療法剤は、表Ｃにおいて列挙される。そこで
列挙される各薬剤は、例示的であり、そして限定することを意味しない。当業者
は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ」第１５版、第３３章（特に６２４頁〜６５２頁）に指向される。投薬量に
おける改変は、おそらく、処置されるべき被験体の状態に依存して生じる。処置
を施す医師は、個々の被験体について適切な用量を決定し得る。
【０６７０】
【表４】 （Ｇ２．抗新脈管形成） 正常な生理学的条件下では、ヒトまたは動物は、非常に特異的な制限された状
況においてのみ抗新脈管形成を受ける。例えば、新脈管形成は、通常、創傷治癒
、胎児および胚発生、ならびに黄体、子宮内膜および胎盤の形成において観察さ
れる。制御されていない（持続性のおよび／または調節されていない）新脈管形
成は、種々の疾患状態に関連し、ならびに腫瘍転移の間に生じる。
【０６７１】 制御された新脈管形成および制御されていない新脈管形成はともに、類似の様
式において進行すると考えられている。内皮細胞および周皮細胞（基底膜によっ
て囲まれる）は、毛細血管を形成する。新脈管形成は、内皮細胞および白血球に
より放出される酵素によって基底膜の侵食で開始する。次いで、内皮細胞（これ
は、血管の内腔に沿う）は、基底膜を通って突出する。新脈管形成刺激因子は、
内皮細胞を、腐食された基底膜を通じて遊走するように誘導する。遊走する細胞
は、親血管から「新芽」を形成し、ここで、この内皮細胞は有糸分裂を受け、そ
して増殖する。内皮新芽は、互いに合わせられて、新たな血管を作製する毛細血
管わなを形成する。
【０６７２】 ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３に基づく本発明は、任意の１つ
以上の抗脈管形成治療と組み合わせて使用され得る。ＶＥＧＦを阻害する他の因
子との組み合わせもまた含まれ、他の因子としては、例えば、他の中和抗体（Ｋ
ｉｍら、１９９２；Ｐｒｅｓｔａら、１９９７；Ｓｉｏｕｓｓａｔら、１９９３
；Ｋｏｎｄｏら、１９９３；Ａｓａｎｏら、１９９５）、可溶性レセプター構築
物（ＫｅｎｄａｌｌおよびＴｈｏｍａｓ、１９９３；Ａｉｅｌｌｏら、１９９５
；Ｌｉｎら、１９９８；Ｍｉｌｌａｕｅｒら、１９９６）、チロシンキナーゼイ
ンヒビター（Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒら、１９９８）、アンチセンスストラテジー
、ＲＮＡアプタマーおよびＶＥＧＦに対するリボザイムまたはＶＥＧＦレセプタ
ー（Ｓａｌｅｈら、１９９６；Ｃｈｅｎｇら、１９９６；Ｋｅら、１９９８；Ｐ
ａｒｒｙら、１９９９；各々は、参考として本明細書中で援用される）が挙げら
れる。アンタゴニスト特性を有するＶＥＧＦの改変体もまた、ＷＯ９８／１６５
５１（具体的に参考として本明細書中で援用される）に記載されるように、使用
され得る。
【０６７３】 抗脈管形成治療は、抗脈管形成因子の供給または脈管形成因子の阻害に基づき
得る。脈管形成因子の阻害は、ＶＥＧＦを阻害について記載される１以上の方法
により達成され得る。ここで、中和抗体、可溶性レセプター構築物、小分子イン
ヒビター、アンチセンス、ＲＮＡアプタマーおよびリボザイムを含む方法が全て
使用され得る。例えば、脈管形成に対する抗体は、米国特許第５，５２０，９１
４号（具体的に、参考として本明細書中で援用される）に記載されるように使用
され得る。ＦＧＦが新脈管形成と関連する場合、ＦＧＦインヒビターもまた使用
され得る。ある例は、グリコサミノグリカン（例えば、アルカラン硫酸（ａｒｃ
ｈａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ）を含む、それらの反復単位として２−Ｏ−硫化ウ
ロン酸で配列において変更しているＮ−アセチルグルコサミンを有する化合物で
ある。このような化合物は、米国特許第６，０２８，０６１号（具体的に、参考
として本明細書中で援用される）に記載され、そして本明細書と共に使用され得
る。
【０６７４】 種々の疾患状態で顕著であるように、新脈管形成の処置に有用である多数のチ
ロシンキナーゼインヒビターが、現在公知である。これらとしては、例えば、米
国特許第５，６３９，７５７号（具体的に、参考として本明細書中で援用される
）の４−アミノピロール［２，３−ｄ］ピリミジンが挙げられる。これはまた、
本発明と組み合わせて使用され得る。ＶＥＧＤＲ２レセプターを介するチロシン
キナーゼシグナル伝達を媒介し得る有機分子のさらなる例は、キナゾリン化合物
および米国特許第５，７９２，７７１号（具体的に、脈管形成疾患の処置におけ
る本発明と共に使用するためのさらなる組み合わせを記載する目的で、参考とし
て本明細書中で援用される）の組成物である。
【０６７５】 他の化学クラスの化合物はまた、新脈管形成を阻害することが示されており、
そして本発明と組み合わせて使用され得る。例えば、米国特許第５，９７２，９
２２号（具体的に、参考として本明細書中で援用される）に記載されるステロイ
ド（例えば、新脈管形成の４，９（１１）−ステロイドおよびＣ２１−酸化ステ
ロイド）じは、併用治療において使用され得る。米国特許第５，７１２，２９１
号および同第５，５９３，９９０号（各々、参考として本明細書中で援用される
）は、サリドマイドならびに関連する化合物、前駆体、アナログ、代謝物および
加水分解産物を記載する。これらもまた、新脈管形成を阻害するために本発明と
組み合わせて使用され得る。米国特許第５，７１２，２９１号および同第５，５
９３，９９０号における化合物は、経口的に投与され得る。組合せ治療に関して
有用である、さらなる例示的な抗新脈管形成剤は、表Ｄに列挙される。ここで列
挙される各薬剤は、例示であって、限定することを意味しない。
【０６７６】
【表５】 新脈管形成の阻害における使用のための特定の好ましい化合物は、アンギオス
タチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、エンドステイン、バスキュロスタチン（ｖ
ａｓｃｕｌｏｓｔａｔｉｎ）、カンスタチン（ｃａｎｓｔａｔｉｎ）およびマス
ピン（ｍａｓｐｉｎ）である。このような薬剤は、本発明の免疫結合体と組み合
わせて上記される。しかし、これらは、組み合わせて使用され得るが、接合体形
成する。接合体形態で上記される他の好ましい薬剤はまた、アンギオポイエチン
（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｓｔｉｎ）（具体的に、アンギオポイエチン−２）であり
、これは、本発明との組み合わせ使用のために意図される。
【０６７７】 特定の抗脈管形成治療は、腫瘍の後退を引き起こすことが既に示されており、
細菌性多糖 ＣＭ１０１および抗体ＬＭ６０９が含まれる。ＣＭ１０１は、細菌
性ポリサッカリドであり、これは、腫瘍において新血管炎症を誘導する能力にお
いて十分に特徴付けられている。ＣＭ１０１は、補体系の活性化を刺激する脱分
化した内皮上で発現されるレセプターに結合し、そして架橋する。それはまた、
腫瘍を選択的に標的するサイトカイン駆動化炎症応答を開始する。これは、発現
ＶＥＧＦおよびそのレセプターをダウンレギュレートする固有の抗病理新脈管形
成剤である。ＣＭ１０１は、現在、抗癌剤として臨床試験中であり、そしてこれ
と組み合わせて使用され得る。
【０６７８】 トロンボスポンジン（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）（ＴＳＰ−１）および
血小板因子４（ＰＦ４）もまた、本発明と合わせて使用され得る。これらはとも
に、へパリンと会合する新脈管形成インヒビターであり、そしてまた血小板α−
顆粒において見出される。ＴＳＰ−１は、細胞外マトリクスの構成成分である、
大きな４５０ｋＤａのマルチドメイン糖タンパク質である。ＴＳＰ−１は、ＨＳ
ＰＧ、フィブロネクチン、ラミニン、および種々の型のコラーゲンを含む、細胞
外マトリクスにおいて見出される多くのプロテオグリカン分子に結合する。ＴＳ
Ｐ−１は、インビトロにおいて内皮細胞遊走および増殖、ならびにインビボにお
いて新脈管形成を阻害する。ＴＳＰ−１はまた、形質転換された内皮細胞の悪性
表現型および腫瘍形成を抑制し得る。腫瘍抑制遺伝子ｐ５３は、ＴＳＰ−１の発
現を直接的に調節することが示されており、その結果、ｐ５３活性の損失は、Ｔ
ＳＰ−１生成における劇的な減少、および腫瘍が開始する新脈管形成を付随する
増大を生じる。
【０６７９】 ＰＦ４は、ケモカインのＣＸＣ ＥＬＲファミリーのメンバーである７０ａａ
タンパク質あり、これは、インビトロにおける内皮細胞の増殖およびインビボに
おける新脈管形成を強力に阻害し得る。腫瘍内に投与された、またはアデノウイ
ルスベクターによって送達されたＰＦ４は、腫瘍増殖の阻害を生じ得る。
【０６８０】 インターフェロンおよびメタロプロテイナーゼインヒビターは、本発明と併用
され得る、２つの他のクラスの天然に存在する脈管形成インヒビターである。イ
ンターフェロンの抗内皮活性は、１９８０年代初期から公知であるが、阻害の機
構は、未だ明確でない。これらが内皮細胞の移動を阻害し得ること、およびこれ
らが、腫瘍細胞による新脈管形成プロモーターの産生を阻害する能力によってお
それく媒介される、インビボでのいくつかの抗新脈管形成活性を有することは公
知である。血管腫瘍は具体的に、インターフェロンに感受性であり、例えば、増
殖中の血管腫はＩＦＮαで首尾よく処置され得る。
【０６８１】 メタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ）は、天然に存在するマ
トリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のインヒビターのファミリーであり、
これもまた、新脈管形成を阻害し得、そして併用処置プロトコルにおいて使用さ
れ得る。ＭＭＰは、新脈管形成プロセスにおいて重要な役割を果たす。なぜなら
、これらは、血管網を拡大または再構築する場合、内皮細胞および線維芽細胞が
移動するマトリックスを分解するからである。実際、ＭＭＰの１つのメンバーで
あるＭＭＰ−２は、おそらくこの目的のためにインテグリンαｖβ３を介して活
性化された内皮と会合することが示されている。この相互作用がＭＭＰ−２のフ
ラグメントによって崩壊されられる場合、次いで新脈管形成はダウンレギュレー
トされ、そして腫瘍増殖において阻害される。
【０６８２】 新脈管形成を阻害する多くの薬理学的物質が存在し、これらの任意の１以上が
本発明と組合せて使用され得る。これらの物質としては、ＡＧＭ−１４７０／Ｔ
ＮＰ−４７０、サリドマイド、およびカルボキシアミドトリアゾール（ＣＡＩ）
が挙げられる。フマギリンは、１９９０年に新脈管形成の強力なインヒビターで
あることが見出されており、そしてそれ以来、フマギリンの合成アナログである
、ＡＧＭ−１４７０およびＴＮＰ−４７０が開発されてきた。これら両方の薬物
は、インビトロでの内皮細胞増殖およびインビボでの新脈管形成を阻害する。Ｔ
ＮＰ−４７０は、ヒトの臨床試験で広範に研究され、そのデータは長期の投与が
最適であることを示唆する。
【０６８３】 サリドマイドは、元来鎮静薬として使用されていたが、強力な催奇形物質であ
ることが見出され、そして中止された。１９９４年に、サリドマイドは新脈管形
成インヒビターであることが見出された。サリドマイドは現在、抗癌剤および血
管性の眼疾患の処置として臨床試験されている。
【０６８４】 ＣＡＩは新脈管形成の低分子量の合成インヒビターであり、これは、アクチン
の再組織化、内皮細胞の移動およびコラーゲンＩＶ上での延展を妨げる、カルシ
ウムチャネルブロッカーとして作用する。ＣＡＩは生理学的に達成可能な濃度で
新生血管形成を阻害し、そして癌患者によって経口的に十分許容される。ＣＡＩ
を用いた臨床試験によって、処置前に進行性の疾患を有する癌患者の４９％にお
いて疾患の安定化を生じた。
【０６８５】 ヘパリンまたはヘパリンフラグメントの存在下のコルチゾンは、内皮細胞増殖
をブロックすることによってマウスにおいて腫瘍増殖を阻害することが示された
。ステロイドおよびヘパリンの相加的な阻害効果に関与する機構は明らかでない
が、ヘパリンが内皮細胞によるステロイドの取り込みを増加させ得ると考えられ
る。この混合物は、新しく形成された毛細血管の下の基底膜の溶解を増加させる
ことが示されており、そしてこれはまた、相加的な血管抑制（ａｎｇｉｏｓｔａ
ｔｉｃ）効果についての可能性のある説明である。ヘパリン−コルチゾール結合
体はまた、インビボでの強力な血管抑制効果活性および抗腫瘍効果活性を有する
。
【０６８６】 さらに特定の新脈管形成インヒビター（抗侵襲性因子（Ａｎｔｉ−Ｉｎｖａｓ
ｉｖｅ Ｆａｃｔｏｒ）、レチノイン酸およびパクリタキセル（米国特許第５，
７１６，９８１号；参考として本明細書中に援用される）；ＡＧＭ−１４７０（
Ｉｎｇｂｅｒら、１９９０；参考として本明細書中に援用される）；サメ軟骨抽
出物（米国特許第５，６１８，９２５号；参考として本明細書中に援用される）
；アニオン性ポリアミドオリゴマーまたはアニオン性ポリ尿素オリゴマー（米国
特許第５，５９３，６６４号；参考として本明細書中に援用される）；オキシン
ドール（ｏｘｉｎｄｏｌｅ）誘導体（米国特許第５，５７６，３３０号；参考と
して本明細書中に援用される））；エストラジオール誘導体（米国特許第５，５
０４，０７４号；参考として本明細書中に援用される）；およびチアゾールピリ
ミジン誘導体（米国特許第５，５９９，８１３号；参考として本明細書中に援用
される）を含むが、これらに限定されない）はまた、本発明の併用使用のための
、抗新脈管形成組成物としての使用が意図される。
【０６８７】 αvβ3インテグリンのアンタゴニストを含む組成物はまた、本発明と組合せて
新脈管形成を阻害するために使用され得る。米国特許第５，７６６，５９１号（
参考として本明細書中に援用される）に開示されるように、ＲＧＤ含有ポリペプ
チドおよびその塩（環状ポリペプチドを含む）は、αvβ3インテグリンアンタゴ
ニストの適切な例である。
【０６８８】 αvβ3インテグリンに対する抗体ＬＭ６０９もまた、腫瘍後退を誘導する。イ
ンテグリンαvβ3アンタゴニスト（例えば、ＬＭ６０９）は、新脈管形成性内皮
細胞のアポトーシスを誘導して、静止状態の血管を影響を受けないままにする。
ＬＭ６０９または他のαvβ3アンタゴニストはまた、αvβ3とＭＭＰ−２（ＭＭ
Ｐ−２は、内皮細胞および線維芽細胞の移動に重要な役割を果たすと考えられる
タンパク質分解性の酵素である）との相互作用を阻害することによって作用し得
る。米国特許第５，７５３，２３０号は、新脈管形成を阻害するために本発明と
組み合わせるためのαvβ3（ビトロネクチンαvβ3）に対する抗体を記載するた
めに参考として本明細書中で具体的に援用される。
【０６８９】 この場合の新脈管形成性内皮のアポトーシスは、残りの血管網に対するカスケ
ード効果を有し得る。腫瘍の拡大しようとするシグナルに対して腫瘍血管網が完
全に応答するのを阻害することは、実際には、その血管網の部分的または完全な
崩壊を開始して、腫瘍細胞の死および腫瘍容積の減少を生じる。エンドスタチン
およびアンギオスタチンが類似の様式で機能することが可能である。ＬＭ６０９
が静止状態の血管に影響を与えないが腫瘍後退を引き起こし得るという事実は、
腫瘍中の全ての血管が、抗腫瘍効果を得るために処置の標的とされる必要がある
わけではないということを強く示唆する。
【０６９０】 Ｔｉｅ２レセプターを介するシグナル伝達を変更することに基づく治療処置の
他の方法もまた、例えば、Ｔｉｅ２活性化を遮断し得る可溶性Ｔｉｅ２レセプタ
ー（Ｌｉｎら、１９９８）を使用して、本発明と組み合わせて使用され得る。組
換えアデノウイルス遺伝子治療を使用するこのような構築物の送達は、癌を治療
する際および転移を減少する際に効果的であることが示されている（Ｌｉｎら、
１９９８）。
【０６９１】 （Ｇ３．アポトーシス誘発因子） ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの治療剤はまた、アポト
ーシスを誘発するための方法と有利に組合され得る。種々のアポトーシス誘発因
子は、本発明の免疫結合体と組み合わされて上記されている。任意のこのような
アポトーシス誘発因子は、本発明の抗体に連結されることなく、本発明と組み合
わされて使用され得る。
【０６９２】 免疫結合体として上記されるアポトーシス誘発因子の他に、アポトーシス、す
なわちプログラムされた細胞死を阻害する多くの癌遺伝子が記載されている。こ
の範疇における例示的な癌遺伝子としては、ｂｃｒ−ａｂｌ、ｂｃｌ−２（ｂｃ
ｌ−１、サイクリンＤ１と異なる；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１４７４５，Ｘ０
６４８７；米国特許第５，６５０，４９１号；および同第５，５３９，０９４号
；各々は、参考として本明細書中に援用される）およびＢｃｌ−ｘ１、Ｍｃｌ−
１、Ｂａｋ、Ａ１、Ａ２０を含むファミリーのメンバーが挙げられるがこれらに
限定されない。ｂｃｌ−２の過剰発現は、Ｔ細胞リンパ腫において最初に発見さ
れた。ｂｃｌ−２は、Ｂａｘ（アポトーシス経路中のタンパク質）に結合し、そ
してＢａｘを不活性化することによって癌遺伝子として機能する。ｂｃｌ−２機
能の阻害は、Ｂａｘの不活性化を妨げ、そしてアポトーシス経路を進行させる。
【０６９３】 このクラスの癌遺伝子の阻害（例えば、アンチセンスヌクレオチド配列を使用
する）は、アポトーシスの増強が所望される局面において、本発明での使用が意
図される（米国特許第５，６５０，４９１号；同第５，５３９，０９４号および
同第５，５８３，０３４号；各々は、参考として本明細書中に援用される）。
【０６９４】 （Ｇ４．イムノトキシンおよびコアグリガンド） 本発明の抗アミノリン脂質結合体に基づく処置方法は、他のイムノトキシンお
よび／またはコアグリガンドと組合せて使用され得、ここで、その標的化をする
部分（例えば、抗体またはリガンド）は、腫瘍細胞、腫瘍脈管構造または腫瘍支
質の比較的特異的なマーカーに指向される。上記に議論した化学療法剤および抗
新脈管形成剤に共通して、他の標的化された毒素または凝固剤の併用した使用は
、一般に、相加的であり、相加的よりも顕著に大きく、またはさらには相乗的な
、抗腫瘍の結果を生じる。
【０６９５】 一般的に言えば、本発明のこれらのさらなる局面での使用のための抗体または
リガンドは、好ましくは、接近可能な腫瘍抗原を認識し、これらは、優先的に、
または具体的には腫瘍部位で発現される。抗体またはリガンドはまた、好ましく
は高い親和性の特性を示し；そして抗体、リガンド、またはそれらの結合体は、
生存を持続させる正常細胞（例えば、心臓、腎臓、脳、肝臓、骨髄、結腸、乳房
、前立腺、甲状腺、胆嚢、肺、副腎、筋肉、神経線維、膵臓、皮膚、またはヒト
体内の他の生存を維持させる器官もしくは組織）から選択される１以上の組織に
対するインビボでの有意な副作用を発揮しない。本明細書中で使用される場合、
用語「有意な副作用」は、インビボで投与される場合に、無視可能なまたは臨床
的に管理し得る副作用（例えば、化学療法の間に通常遭遇する副作用）のみを生
じる、抗体、リガンドまたは抗体結合体をいう。
【０６９６】 本発明と組合せて使用されるこれらの第二の抗癌剤の少なくとも１つの結合領
域は、腫瘍領域への毒素または凝固因子を送達し得る（すなわち、腫瘍部位内へ
局在し得る）成分である。このような標的化する薬剤は、腫瘍細胞、腫瘍脈管構
造または腫瘍支質の成分に対して指向され得る。この標的化する薬剤は、一般に
、腫瘍細胞、腫瘍脈管構造または腫瘍支質の、表面に発現されるか、表面に接近
可能か、または表面に局在される成分に結合する。しかし、一旦、腫瘍脈管構造
および腫瘍細胞の破壊が始まると、内部成分は放出され、実質的に任意の腫瘍成
分のさらなる標的化を可能にする。
【０６９７】 多くの腫瘍細胞抗原が記載されており、そのいずれの抗原も、本発明の併用さ
れる局面と関連して標的として使用され得る。さらなるイムノトキシンおよびコ
アグリガンドの標的化のための適切な腫瘍細胞抗原は、抗体Ｂ３（米国特許第５
，２４２，８１３号；参考として本明細書中に援用される；ＡＴＣＣ ＨＢ １
０５７３）；ＫＳＩ／４（米国特許第４，９７５，３６９号；参考として本明細
書中に援用される；ベクターＮＲＲＬ Ｂ−１８３５６および／またはＮＲＲＬ
Ｂ−１８３５７を含む細胞から得られる）；２６０Ｆ９（ＡＴＣＣ ＨＢ ８
４８８）；およびＤ６１２（米国特許第５，１８３，７５６号；参考として本明
細書中に援用される；ＡＴＣＣ ＨＢ ９７９６）によって認識される抗原を含
む。当業者は、抗腫瘍細胞抗体を産生する他の適切な細胞株を同定するために、
任意の後年のＡＴＣＣカタログもまた調べ得る。
【０６９８】 腫瘍脈管構造標的化のために、標的化する抗体またはリガンドは、しばしば、
血管形成された腫瘍の腫瘍内血管によって発現されるか、それに吸着されるか、
その上に誘導されるか、またはさもなければそこに局在されるマーカーに結合す
る。適切に発現される標的分子としては、例えば、エンドグリン、Ｅ−セレクチ
ン、Ｐ−セレクチン、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＰＳＭＡ（Ｌｉｕら、１９
９７）、ＴＩＥ、ＬＡＭ−１に反応性のリガンド、ＶＥＧＦ／ＶＰＦレセプター
、ＦＧＦレセプター、αvβ3インテグリン、プレイオトロピン（ｐｌｅｉｏｔｒ
ｏｐｉｎ）、およびエンドシアリン（ｅｎｄｏｓｉａｌｉｎ）が挙げられる。吸
着される適切な標的は、例えば、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦβ、ＨＧＦ、ＰＦ４
、ＰＤＧＦ、ＴＩＭＰ、ＴＩＥに結合するリガンド、および腫瘍関連フィブロネ
クチンアイソフォームのような標的である。例えば、以下のような、サイトカイ
ンおよび凝固剤によって自然におよび人工的に誘導され得る抗原もまた標的化さ
れ得る；ＥＬＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＬＡＭ−１に反応性のリ
ガンド、エンドグリン、さらにＭＨＣクラスＩＩ（例えば、ＩＬ−１、ＴＮＦ−
α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４および／またはＴＮＦ−βによって、サイトカイン誘
導性）；ならびにＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＰＤＧＦおよびＩＣＡＭ−
１（例えば、トロンビン、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第Ｘ／Ｘａ因子および／または
プラスミンによって、凝固剤誘導性）。
【０６９９】 以下の特許および特許出願は、腫瘍脈管構造の発現された、吸着された、誘導
された、または局在されたマーカーに対して指向されるイムノトキシンの調製お
よび使用に関する本発明の教示をなおさらに補完する目的のために、参考として
本明細書中に具体的に援用される：米国出願第０８／４８２，３６９号（１９９
８年１０月２０日に登録料支払済）米国特許第５，８５５，８６６号、同第５，
９６５，１３２号、同第６，０５１，２３０号、同第６，００４，５５５号、同
第５，８７７，２８９号、同第６，００４，５５４号、同第５，７７６，４２７
号、同第５，８６３，５３８号、同第５，６６０，８２７号および同第５，０３
６，９５５号。
【０７００】 さらなる腫瘍血管標的組成物および方法は、これらの標的アミノリン脂質（例
えば、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミン（近年、腫
瘍血管のアクセス可能かつ特異的なマーカーであることが発見された））を含む
。抗アミノリン脂質抗体のみの投与は、血栓症および腫瘍の後退を誘発するに十
分である。従って、本発明は、非接合体、抗ホスファチジルセリンおよび／また
はホスファチジルエタノールアミン抗体；またはこのような抗体の免疫接合体が
使用され得る。
【０７０１】 以下の仮出願は、抗アミノリン脂質抗体およびイムノトキシンの調製および使
用に関する本発明の教示をなおさらに補完する目的のために、参考として本明細
書中に具体的に援用される：仮出願第６０／０９２，６７２号（１９９８年７月
１３日出願）および同第６０／０９２，５８９号（１９９８年７月１３日出願）
。出願番号６０／０９２，５８９号はさらに、腫瘍血管に対する毒物および凝血
薬を送達する際の使用のため、ならびに血栓症および腫瘍の後退を増加するため
に、アミノリン酸脂質結合タンパク質接合体（例えば、アネキシン接合体）の使
用に関する本発明の教示をなおさらに補完する目的のために、参考として本明細
書中に具体的に援用される。
【０７０２】 適切な腫瘍支質標的としては、腫瘍細胞外マトリックスもしくは支質の成分、
またはその中に結合される以下を含む成分が挙げられる；基底膜マーカー、ＩＶ
型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸、プロテオグリカン、フィブロネクチン
、活性化血小板、ＬＩＢＳおよびテネイシン。このような使用に好ましい標的は
、ＲＩＢＳである。
【０７０３】 以下の特許および特許出願は、腫瘍支質を標的する薬剤の調製および使用に関
する本発明の教示をなおさらに補完する目的のために、参考として本明細書中に
具体的に援用される：米国特許第５，８７７，２８９号ならびに米国特許出願第
０８／４８２，３６９号（米国特許第５， ， 号；登録料支払済）；
同第０８／４８５，４８２号；同第０８／４８７，４２７号（米国特許第６，０
０４，５５５号）；同第０８／４７９，７３３号（米国特許第５，８７７，２８
９号）；同第０８／４７２，６３１号および同第０８／４７９，７２７号および
同第０８／４８１，９０４号（米国特許第６，０３６，９５５号）。
【０７０４】 第２の抗癌治療剤は、ＶＥＧＦＲ２−ブロッキング剤、抗ＶＥＧＦ抗体または
２Ｃ３ベースのイムノトキシンにおける使用について本明細書中に記載される任
意の細胞傷害性薬剤またはさもなければ抗細胞性薬剤に作動可能に結合され得る
。しかし、適切な抗細胞性薬剤はまた、放射性同位体を含む。リシンＡ鎖および
脱グリコシル化Ａ鎖（ｄｇＡ）またはさらにゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）のよう
な毒素部分が好ましい。任意の１以上のアンギオポエチン、またはその融合物は
また、併用療法のための第２の免疫結合体（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）
の一部として用いられ得る。
【０７０５】 本発明での任意の使用のための第２の標的化された因子は、凝固を促進し得る
標的化された成分（すなわち、コアグリガンド）を含み得る。ここで、この標的
化する抗体またはリガンドは、直接的または間接的に（例えば、別の抗体を介し
て）、直接的または間接的に凝固を刺激する任意の因子（ＶＥＧＦＲ２−ブロッ
キング剤、抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースのコアグリガンドにおける使用に
ついて本明細書中に記載された因子のいずれかを含む）に連結され得る。このよ
うな使用のために好ましい凝固因子は、組織因子（ＴＦ）およびＴＦ誘導体（例
えば、短縮型ＴＦ（ｔＴＦ）、二量体および多量体ＴＦ、ならびに第ＶＩＩ因子
活性化能が欠損した変異ＴＦ）である。
【０７０６】 癌の処置における併用使用のためのイムノトキシンおよびコアグリガンドの有
効用量は、１週間あたり約１回の頻度でＩＶ経路を介して投与する場合、約０．
１ｍｇ／ｋｇと約２ｍｇ／ｋｇとの間、そして好ましくは約０．８ｍｇ／ｋｇと
約１．２ｍｇ／ｋｇとの間である。用量決定におけるいくらかの変動が、処置さ
れる被験体の状態に依存して必ず生じる。投与の責任を負う医師は、個々の被験
体について適切な用量を決定する。
【０７０７】 （Ｇ５．ＡＤＥＰＴおよびプロドラッグ治療） 本発明のＶＥＧＦＲ２ブロッキング剤、抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの
抗体は、プロドラッグと組み合わせて使用され得、ここでＶＥＧＦＲ２ブロッキ
ング剤、抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体は、プロドラッグ活性化成分
（例えば、抗体に接触した際にのみ、プロドラッグをより活性な形態へ変換する
プロドラッグ活性化酵素）と作動可能に付随される。この技術は、一般に「ＡＤ
ＥＰＴ」と称され、そして例えば、ＷＯ９５／１３０９５；ＷＯ９７／２６９１
８、ＷＯ９７／２４１４３および米国特許第４，９７５，２７８号および同第５
，５６８，５６８号（これらは、各々具体的に本明細書中に参考として援用され
る）において記載される。
【０７０８】 本明細書中で使用される場合、用語「プロドラッグ」は、プロドラッグが基づ
く親の薬物と比較して（腫瘍血管内皮細胞を含む）標的細胞に対する減少した細
胞傷害性または他の抗細胞性効果を及ぼす生物学的にかまたは薬学的に活性な物
質の前駆体または誘導体形態をいう。好ましくは、プロドラッグまたは前駆体形
態は、有意な減少を及ぼすか、またはより好ましくは、「ネイティブ」または親
の形態と比較して、無視できる細胞傷害性または抗細胞性効果を及ぼす。「プロ
ドラッグ」は、活性化されているかまたは変換されて、その薬物のより活性な親
の形態を生じ得る。
【０７０９】 薬物を作製しそして使用する技術的能力は、当業者の範囲内である。Ｗｉｌｌ
ｍａｎら（１９８６）およびＳｔｅｌｌａら（１９８５）は、種々のプロドラッ
グの作製方法および使用方法に関する記載および技術をさらに供給する目的のた
めに参考として本明細書中に各々具体的に援用される。本発明の文脈で使用され
得る例示的なプロドラッグ構築物としては、以下が挙げられるがこれらに限定さ
れない：ホスフェート含有プロドラッグ（米国特許第４，９７５，２７８号）、
チオホスフェート含有プロドラッグ、サルフェート含有プロドラッグ、ペプチド
ベースのプロドラッグ（米国特許第５，６６０，８２９号；同第５，５８７，１
６１号；同第５，４０５，９９０号；ＷＯ９７／０７１１８）、Ｄ−アミノ酸改
変プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ（米国特許第５，５６１，１１９号
；同第５，６４６，２９８号；同第４，９０４，７６８号、同第５，０４１，４
２４号）、βラクタム含有プロドラッグ、必要に応じて置換されたフェノキシア
セトアミド含有プロドラッグ（米国特許第４，９７５，２７８号）、必要に応じ
て置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグおよびさらには５−フルオ
ロシトシン（米国特許第４，９７５，２７８号）および５−フルオロウリジンプ
ロドラッグなど（これらの特許の各々は、本明細書中に参考として具体的に援用
される）。
【０７１０】 プロドラッグの形態で使用され得る治療剤または細胞傷害性薬物の型は、実質
的には限られる。より細胞傷害性薬剤は、このような送達の形態には好ましく、
たとえば、コアグラント（プロドラッグとしての使用にあまり好ましくない）の
送達より好ましい。プロドラッグが実質的に不活性であり、そして「放出された
」かまたは活性化された薬物が、実質的にかまたは意図される目的のための活性
を有するように構築物を設計することが、プロドラッグの形成において必要とさ
れる全てである。
【０７１１】 もとのプロドラッグに関する種々の改良もまた、ＷＯ ９５／０３８３８０；
ＥＰ ７５１，１４４（アントラサイクリン）；ＷＯ ９７／０７０９７（シク
ロプロピルインドール）；およびＷＯ ９６／２０１６９に開示されるように、
公知でありかつ本明細書との使用について意図される。例えば、Ｋｍが減少した
プロドラッグは、米国特許第５，６２１，００２号（本明細書中に参考として特
に援用される）に記載され、これは本発明の状況において使用され得る。細胞内
にて実行されるプロドラッグ治療もまた、ＷＯ ９６／０３１５１（本明細書中
に参考として特に援用される）に例示されるように公知であり、そして本明細書
を用いて実施され得る。
【０７１２】 ＡＤＥＰＴにおける使用のために、そのプロドラッグをより活性な薬物へと活
性化または変換する因子が、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３に基
づく抗体に作動可能に結合される。従って、このＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗
体または２Ｃ３様抗体は、脈管形成部位内、好ましくは腫瘍血管系および支質内
で、プロドラッグ変換能力を局在化し、活性薬物がそのような領域のみで産生さ
れ、そして循環中または健常組織においては産生されないようにする。
【０７１３】 ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３様抗体に結合してプロドラッグ
活性化にて機能し得る酵素としては、ホスフェート含有プロドラッグと組み合わ
せた使用のためのアルカリホスファターゼ（米国特許第４，９７５，２７８号）
；スルフェート含有プロドラッグと組み合わせた使用のためのアリールスルファ
ターゼ（米国特許第５，２７０，１９６号）；ペプチドに基づくプロドラッグと
組み合わせた使用のためのペプチダーゼおよびプロテアーゼ（例えば、セラチア
プロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ（米国特
許第５，６６０，８２９号；同第５，５８７，１６１号；同第５，４０５，９９
０号）およびカテプシン（カテプシンＢおよびＬを含む））；Ｄ−アミノ酸修飾
プロドラッグと組み合わせた使用のためのＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ
；グリコシル化プロドラッグと組み合わせた使用のための炭水化物切断酵素（例
えば、β−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼ）（米国特許第５，５６１
，１１９号；同第５，６４６，２９８号）；β−ラクタム含有プロドラッグと組
み合わせた使用のためのβ−ラクタマーゼ；アミノ窒素にてフェノキシアセトア
ミド基またはフェニルアセトアミド基で誘導体化された薬物と組み合わせた使用
のためのペニシリンアミダーゼ（例えば、ペニシリンＶアミダーゼ（米国特許第
、９７５，２７８号）またはペニシリンＧアミダーゼ）；ならびに５−フルオロ
シトシンに基づくプロドラッグ（米国特許第４，９７５，２７８号）と組み合わ
せた使用のためのシトシンデアミナーゼ（米国特許第５，３３８，６７８号；同
第５，５４５，５４８号）が、挙げられるがこれらに限定されず、これらの特許
各々は、本明細書中に参考として特に援用される。
【０７１４】 酵素活性を有する抗体（触媒抗体または「アブザイム」として公知）もまた、
プロドラッグを活性な薬物へと変換するために使用され得る。従って、ＶＥＧＦ
Ｒ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３様抗体に基づくアブザイムは、本発明の別
の局面を形成する。アブザイムを生成する技術的能力もまた、Ｍａｓｓｅｙら（
１９８７）（このアブザイムの教示を補足する目的で、本明細書中に参考として
特に援用される）に例示されるように、当業者の範囲内に存在する。カルバメー
ト位置（例えば、窒素マスタードアリールカルバメート）でプロドラッグの分解
を触媒し得る触媒抗体が、ＥＰ ７４５，６７３（本明細書中に参考として特に
援用される）に記載されるように、さらに意図される。
【０７１５】 （Ｈ．診断法および画像化） 本発明はさらに、インビトロおよびインビボでの診断法および画像化法を提供
する。このような方法は、いかなる脈管形成疾患についても（関節炎、乾癬およ
び固形腫瘍により例証されるが、本明細書中に開示される脈管形成疾患すべてを
含む）診断情報、予後情報または画像情報を生成する際の使用に適用可能である
。腫瘍診断および画像化の分野の外側で、本発明のこれらの局面は、インビトロ
での診断試験（好ましくは、サンプルが非侵襲的に得られかつ高スループットア
ッセイにて試験され得るか、そして／または曖昧および確認における臨床診断が
望まれるかのいずれか）における使用に最も好ましい。
【０７１６】 （Ｈ１．免疫検出法およびキット） なおさらなる実施形態において、本発明は、ＶＥＧＦを結合、精製、除去、定
量さもなければ一般には検出するため、そして脈管形成疾患を診断するための、
免疫検出法に関する。本発明のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、２
Ｃ３）が、インビボ（下記）にて、単離された組織サンプル、生検またはスワブ
において、そして／またはホモジナイズされた組織サンプルにおいて、ＶＥＧＦ
を検出するために使用され得る。このような免疫検出法は、明らかな診断的有用
性を有するが、また、非臨床サンプルに（例えば、抗原サンプルの力価測定など
において）も適用を有する。
【０７１７】 種々の有用な免疫検出法の工程は、科学文献（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａら、
（１９８７、本明細書中に参考として援用される））に記載されている。一般に
は、免疫結合法は、ＶＥＧＦを含むと疑われるサンプルを得る工程、およびその
サンプルをＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、２Ｃ３）と、免疫複合
体の形成を可能にするに有効な条件下で接触させる工程を包含する。このような
方法において、その抗体は、固体支持体に、例えば、カラムマトリックスの形態
で結合され得、そしてＶＥＧＦを含むと疑われるサンプルが、その固定された抗
体に適用される。
【０７１８】 より好ましくは、その免疫結合法は、サンプル中のＶＥＧＦの量を検出または
定量するための方法を含み、この方法は、結合プロセスの間に形成されたすべて
の免疫複合体の検出または定量を必要とする。ここで、ＶＥＧＦを含むと疑われ
るサンプルを得、そしてそのサンプルを、本明細書に従う抗体と接触させ、次い
で、特定の条件下で形成された免疫複合体の量を検出または定量する。
【０７１９】 分析される生物学的サンプルは、ＶＥＧＦを含むと疑われる任意のサンプルで
あり得、一般的には、脈管形成疾患を有すると疑われる動物または患者由来であ
る。そのサンプルは、組織切片または標本、生検、スワブまたはスミア試験サン
プル、ホモジナイズされた組織抽出物、あるいはそのようなものの分離形態また
は精製形態であり得る。
【０７２０】 免疫複合体（一次免疫複合体）の形成を可能にするに有効な条件下でかつそれ
を可能にするに十分な時間の間、選択した生物学的サンプルをその抗体と接触さ
せることは、一般には、そのサンプルに抗体組成物を単に添加し、そして存在す
るすべてのＶＥＧＦとその抗体が免疫複合体を形成する（すなわち、結合する）
に十分に長い時間その混合物をインキュベートすることである。この時点の後、
そのサンプル−抗体組成物（例えば、組織切片、ＥＬＩＳＡプレート、ドットブ
ロット、またはウェスタンブロット）が、一般には洗浄されて、非特異的結合し
たすべての抗体種が除去されて、一次免疫複合体中の特異的に結合した抗体のみ
検出することが可能になる。
【０７２１】 免疫複合体の検出は、当該分野で周知であり、そして多数のアプローチの適用
を介して達成され得る。これらの方法は、一般的には、標識またはマーカー（例
えば、当該分野で公知の任意の放射性、蛍光性、生物学的または酵素的な、タグ
もしくは標識）の検出に基づく。このような標識の使用に関する米国特許として
は、第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３
５０号；３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，
１４９号および同第４，３６６，２４１号（各々が、本明細書中で参考として援
用される）が挙げられる。色素形成基質との接触に際して有色生成物を生成する
酵素の使用が、一般的に好ましい。二次結合リガンド（例えば、第２の抗体また
はビオチン／アビジンリガンド結合配置）もまた、当該分野で公知であるように
、使用され得る。
【０７２２】 検出において使用されるＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、２Ｃ３）
自体は、検出可能な標識に連結され得、次いでこの標識が簡単に検出され、それ
により組成物中の一次免疫複合体の量を決定することが可能になる。
【０７２３】 好ましくは、この一次免疫複合体は、本発明の抗体について結合親和性を有す
る第２の結合リガンドによって検出される。この場合において、その第２の結合
リガンドは、検出可能な標識に連結され得る。この第２の結合リガンド自体は、
しばしば抗体であり、従って、「二次」抗体と呼ばれ得る。この一次免疫複合体
は、この標識された二次結合リガンドまたは抗体と、二次免疫複合体の形成を可
能にするに有効な条件下かつそれを可能にするに十分な時間の間、接触される。
次いで、この二次免疫複合体は、一般的には、非特異的に結合したすべての標識
二次抗体またはリガンドを除去するために洗浄され、次いでその二次免疫複合体
中の残りの標識が検出される。
【０７２４】 さらなる方法は、２工程アプローチによる一次免疫複合体の検出を含む。第１
の抗体に結合親和性を有する第２の結合リガンド（例えば、抗体）が、上記のよ
うに二次免疫複合体を形成するために使用される。洗浄の後、その二次免疫複合
体は、その第２の抗体に結合親和性を有する第３の結合リガンドまたは抗体と、
免疫複合体（三次免疫複合体）の形成を可能にするに有効な条件下かつそれを可
能にするに十分な時間、接触させられる。この第３のリガンドまたは抗体は、そ
のようにして形成された三次免疫複合体の検出を可能にする、検出可能な標識に
連結される。この系は、所望ならば、シグナル増幅を提供し得る。
【０７２５】 脈管形成疾患を有する患者の臨床診断またはモニタリングにおいて、ＶＥＧＦ
の検出、または正常な被検体由来の対応する生物学的サンプルにおけるレベルと
比較したＶＥＧＦのレベルの増加が、脈管形成疾患を有する患者の指標である。
【０７２６】 しかし、当該分野で公知であるように、このような臨床診断は、この方法に基
礎基づいて孤立しては行われないだろう。当業者は、バイオマーカーの有意な発
現（ポジティブな同定を示す）とバイオマーカーの低レベル発現またはバックグ
ラウンド発現との間を識別することに非常に精通している。実際、バックグラウ
ンド発現レベルは、しばしば、「カットオフ」を形成するために使用され、この
カットオフを超える染色の増加が、有意またはポジティブと記録される。
【０７２７】 （Ｈ２．画像化） 本発明のこれらの局面は、腫瘍画像化方法ならびに組み合わせた腫瘍処置およ
び画像化方法における使用に好ましい。一つ以上の検出可能な因子に結合させた
ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３に基づく抗体は、それ自体が腫瘍
の画像化においてか、または腫瘍のプレ画像化に使用して、処置の前に信頼性の
ある画像を形成することが構想される。このよな組成物および方法はまた、他の
任意の脈管形成疾患または状態（特に、非悪性腫瘍、アテローム性動脈硬化症、
そして内部画像化が診断目的または予後目的について望まれる状態または処置を
設計するために望まれる状態）の画像化および診断に適用され得る。
【０７２８】 ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３に基づく画像化抗体は、一般的
に、検出可能な標識に作動可能に付着したかもしくは結合したＶＥＧＦＲ２遮断
抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３に基づく抗体を含む。「検出可能な標識」は、それ
らの特異的な機能特性、または化学的特徴に起因して検出され得る化合物あるい
はエレメントであり、その使用により、それらが付着する成分が検出可能になり
、そして所望であれば、さらに定量可能になる。インビボでの診断プロトコルま
たは「画像化方法」のための抗体結合体において、非侵襲的方法を用いて検出さ
れ得る標識が必要である。
【０７２９】 抗体および結合リガンドにそれらを付着させる方法のような多くの適切な画像
化剤が、当該分野において公知である（例えば、米国特許第５，０２１，２３６
号および同第４，４７２，５０９号を参照のこと。両方とも本明細書中に参考と
して援用される）。特定の付着方法は、例えば、抗体に付着されたＤＴＰＡのよ
うな有機キレート剤を使用する金属キレート複合体の使用を含む（米国特許第４
，４７２，５０９号）。モノクローナル抗体はまた、グルタルアルデヒドまたは
過ヨウ素酸塩のような結合剤の存在下で酵素と反応され得る。フルオレセインマ
ーカーとの結合体は、これらの結合剤の存在下で、またはイソチオシアネートと
の反応により、調製される。
【０７３０】 検出可能な標識の例は、常磁性イオンである。この場合、適切なイオンとして
は、以下が挙げられる：クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、
鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（Ｉ
ＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（Ｉ
ＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ
）、ホルミウム（ＩＩＩ）、およびエルビウム（ＩＩＩ）（ガドリニウムが特に
好ましい）。
【０７３１】 他の状況（例えば、Ｘ線画像化）において有用なイオンは、以下を含むがそれ
らに限定されない：ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）および特に
ビスマス（ＩＩＩ）。蛍光標識には、ローダミン、フルオレセイン、およびレノ
グラフィンが挙げられる。ローダミンおよびフルオレセインは、しばしば、イソ
チオシアネート中間体を介して結合される。
【０７３２】 診断的適用のための放射性同位体の場合、適切な例としては、以下が挙げられ
る：14炭素、51クロム、36塩素、57コバルト、58コバルト、銅67、152Ｅｕ、ガ
リウム67、3水素、ヨウ素123、ヨウ素125、ヨウ素131、インジウム111、59鉄、3 2 リン、レニウム186、レニウム188、75セレニウム、35硫黄、テクネチウム99m、
およびイットリウム90。125Ｉは、しばしば、特定の実施形態において使用する
ために好ましく、そしてテクネチウム99mおよびインジウム111はまた、しばしば
、それらが低エネルギーでありかつ広範囲での検出に適しているために好ましい
。
【０７３３】 本発明における使用のための放射性標識されたＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗
体または２Ｃ３に基づく抗体が、当該分野で周知の方法により生成され得る。例
えば、放射性同位体金属イオンを抗体に結合するために、しばしば使用される中
間体官能基は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）およびエチレンジ
アミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）である。
【０７３４】 モノクローナル抗体はまた、ヨウ化ナトリウムまたはヨウ化カリウム、および
次亜塩素酸ナトリウムのような化学的酸化剤、またはラクトペルオキシダーゼの
ような酵素酸化剤と接触することによりヨウ素化され得る。本発明による抗体は
、リガンド交換プロセスにより、例えば、二価のスズの溶液で過テクネチウム酸
（ｐｅｒｔｅｃｈｎａｔｅ）を還元し、Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム上でその還元さ
れたテクネチウムをキレート化し、そしてこのカラムに抗体を適用することによ
り、テクネチウム99mで標識され得る；かまたは直接的標識技術により、例えば
、過テクネチウム酸、ＳＮＣｌ2のような還元剤、ナトリウム−カリウムフタレ
ート溶液のような緩衝溶液、およびその抗体をインキュベートすることにより、
標識され得る。
【０７３５】 検出可能に標識されたＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３に基づく
抗体の上記の型のいずれも、本発明の画像化の局面または組み合わせた画像化お
よび処置の局面において使用され得る。これらは、インビトロでの診断における
使用に等しく適切である。インビボでの画像化実施形態のための投薬量は、一般
的には、治療用よりも少ないが、また患者の年齢および重量にも依存する。１回
の用量は、十分であるべきである。
【０７３６】 インビボ診断方法または画像化方法は、一般的に、非侵襲的方法により検出可
能であるマーカーに結合されたＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３に
基づく抗体の診断的有効量を患者に投与する工程を含む。この抗体−マーカー結
合体は、腫瘍内のＶＥＧＦに局在化しそして結合するに十分な時間放置される。
次いで、患者は、検出可能なマーカーを同定するために検出デバイスに曝露され
、それにより、腫瘍の画像を形成する。
【０７３７】 （Ｈ３．診断キット） なおさらなる実施形態において、本発明は、免疫検出キットおよび画像化キッ
トの両方を含む、上記の免疫検出法および画像化方法との使用のための、診断キ
ットを提供する。従って、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、２Ｃ３）
が、一般的には適切な容器中に含まれて、キットにて提供される。
【０７３８】 免疫検出のために、この抗体は、固体支持体（例えば、マイクロタイタープレ
ートのウェル）に結合され得るが、抗体溶液または再構成のための粉末が好まし
い。この免疫検出キットは、好ましくは、少なくとも第１の免疫検出試薬を含む
。このキットの免疫検出試薬は、種々の形態（所定の抗体と会合しているかまた
は所定の抗体に結合している、検出可能な標識を含む）のいずれか１つを採り得
る。二次結合リガンドに会合または結合している検出可能な標識もまた、意図さ
れる。例示的二次リガンドは、第１の抗体に結合親和性を有する二次抗体である
。
【０７３９】 本キットにおける使用のためのさらに適切な免疫検出試薬は、第１の抗体につ
いて結合親和性を有する二次抗体を、その第２の抗体についての結合親和性を有
する第３の抗体をともに含む、二成分試薬を含み、その第３の抗体は、検出可能
な標識に連結されている。上記のように、多数の例示的標識が当該分野で公知で
あり、そしてこのような標識すべてが、本発明とともに使用され得る。これらの
キットは、完全に結合した形態で、中間体の形態で、またはそのキットのユーザ
ーにより結合される別個の部分としてのいずれかで、抗体−標識結合体を含み得
る。
【０７４０】 その画像化キットは、好ましくは、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体（例えば
、２Ｃ３）（インビボで検出可能な標識にすでに結合している）を含む。しかし
、その標識および結合手段は、別個に供給され得る。
【０７４１】 いずれのキットも、さらに、ＶＥＧＦの適切にアリコートにされた組成物のよ
うな制御因子（標識されいても標識されていなくても）を、検出アッセイのため
の標準曲線を調製するために使用され得るように、含む。このキットの成分は、
水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかにて、パッケージされ得る。
【０７４２】 そのキットの容器手段は、一般的には、少なくとも１つのバイアル、試験管、
フラスコ、瓶、シリンジ、または他の容器手段を含み、その中に、抗体または抗
原が配置され得、そして好ましくは適切なアリコートにされ得る。第２または第
３の結合リガンドまたはさらなる成分が提供される場合、そのキットはまた、一
般的には、このリガンドまたは成分が配置され得る、第２、第３、または他のさ
らなる容器を含む。このキットはまた、１つ以上の脈管形成疾患のいずれかの診
断における使用のための他の診断試薬を含み得る。好ましくは、ＶＥＧＦ結合に
基づかない第２の診断剤が、使用される。
【０７４３】 本発明のキットはまた、代表的には、その抗体を含むための手段、および市販
のために密封されている他の任意の試薬容器を含む。このような容器は、所望の
バイアルが保持されている射出成形または吹き込み成形したプラスチック容器を
含み得る。
【０７４４】 以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下
の実施例に開示される技術は、本発明者らによって、本発明の実施において良好
に機能することが見出された技術を表し、従って、本発明の実施の好ましい形態
を構成するとみなされ得ることが、当業者によって認識されるべきである。しか
し、当業者は、本開示を考慮して、多くの変更が、開示された特定の実施形態に
おいて行われ得、そして本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様もし
くは類似の結果が依然として入手され得ることを認識すべきである。
【０７４５】 （実施例Ｉ） （抗ＶＥＧＦ抗体２Ｃ３の生成および特有の特徴） （Ａ．材料および方法） （１．免疫原） ヒトＶＥＧＦ（ｈｕＶＥＧＦ；配列番号１０）のＮ末端２６アミノ酸に対応す
るペプチドおよびモルモットＶＥＧＦ（ｇｐＶＥＧＦ；配列番号１１）のＮ末端
２５アミノ酸に対応するペプチドが、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｆａｃｉｌｉｔ
ｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｗａｒｄ Ｈｕｇｈｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉ
ｔｕｔｅ，ＵＴ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，
Ｄａｌｌａｓにより合成された。このペプチドは、以下の配列（ＮからＣへ）
【０７４６】
【化１】
【０７４７】 を有した。
【０７４８】 ペプチドを、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン
−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカー（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｌ
ｄ，ＩＬ）を使用して、Ｃ末端のシステインを介してサイログロブリンに結合し
た。サイログロブリンに結合したＬ−システインからなるコントロール結合体も
また調製した。結合体を、サイズ排除クロマトグラフィーにより、遊離ペプチド
またはリンカーから分離した。
【０７４９】 組換えヒトＶＥＧＦもまた、免疫原として使用した（Ｓ．Ｒａｍａｋｒｉｓｈ
ｎａｎ博士、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、Ｍｉｎｎｅａ
ｐｏｌｉｓ、ＭＮから得た）。
【０７５０】 （２．ハイブリドーマ） 抗ｇｐＶＥＧＦ抗体産生ハイブリドーマの産生のために、Ｃ５７／Ｂ１−６マ
ウスに、ＴｉｔｅｒＭａｘアジュバント（ＣｙｔＲＸ Ｃｏ．、Ｎｏｒｃｒｏｓ
ｓ、ＧＡ）中のｇｐＶＥＧＦ−ペプチド−サイログロブリン結合体で免疫した。
抗ヒトＶＥＧＦ抗体の産生のために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＴｉｔｅｒＭａｘ
中のｈｕＶＥＧＦ−ペプチド−サイログロブリン結合体または組換えヒトＶＥＧ
Ｆのいずれかで免疫した。３日後、最終ブースト脾細胞を、Ｍｏｒｒｏｗら（１
９９０；本明細書中に参考として援用される）により記載されるように、ミエロ
ーマＰ３Ｘ６３ＡＧ８．６５３（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）細胞と融合し、そして培
養した。
【０７５１】 （３．抗体精製） ＩｇＧ抗体（２Ｃ３、１２Ｄ７、３Ｅ７）を、硫酸アンモニウム沈殿およびプ
ロテインＡクロマトグラフィーによって、Ｐｉｅｒｃｅ ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ
Ｂｉｎｄｉｎｇ／Ｅｌｕｔｉｏｎ緩衝系（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、組織培
養上清から精製した。
【０７５２】 ＩｇＭ抗体（ＧＶ３９Ｍ、１１Ｂ５、７Ｇ３）を、５０％飽和硫酸アンモニウ
ム沈殿、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でのペレットの再懸濁およびｄＨ2Ｏに対する
透析により組織培養上清から精製し、真性グロブリンを沈殿させた。このｄＨ2
Ｏ沈殿物をＰＢＳ中に再懸濁し、そしてＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｓ３００カラム（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ）におけるサイズ排除クロマトグラフィーによって分画した
。そのＩｇＭ画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判定した場合、８５〜９０％の純
度であった。
【０７５３】 （４．コントロール抗体） 以下を含む、種々のコントロール抗体を、これらの研究を通して使用した：ｍ
Ａｂ ４．６．１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．製のマウス抗ヒトＶＥＧＦ）
、Ａｂ−３（ＯｎｃｏｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．製のマウス抗ヒトＶＥ
ＧＦ）、Ａ−２０（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎ
ｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ製のウサギ抗ヒトＶＥＧＦ）、ＯＸ７（Ｄｒ
．Ａ．Ｆ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ＭＲＣ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ Ｕｎｉｔ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫからのマウス抗ラットＴｈｙ１．１）、ＭＴ
ＳＡ（Ｄｒ．Ｅ．Ｓ．Ｖｉｔｅｔｔａ，ＵＴ−Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ，Ｄａ
ｌｌａｓ，ＴＸ製の無関係な特異性のマウス骨髄腫ＩｇＭ）、１Ａ８（マウス抗
マウスＦｌｋ−１；Ｐｈｉｌｉｐ Ｅ．Ｔｈｏｒｐｅおよび共同研究者）、ＭＥ
ＣＡ ３２（Ｄｒ．Ｅ．Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ，ＣＡからのラット抗マウス内皮）およびＴＥＣ １１
（、マウス抗ヒトエンドグリン（ｅｎｄｏｇｌｉｎ）；米国特許第５，６６０，
８２７号）。
【０７５４】 （５．最初のスクリーニング） 最初のスクリーニングのために、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｆａｌｃｏ
ｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を、２５０ｎｇのＶＥＧＦペプチド
またはＶＥＧＦ−Ｃｙｓ−サイログロブリン結合体のいずれかでコートし、そし
て５％カゼイン酸加水分解物（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でブロッ
クした。抗ｇｐＶＥＧＦハイブリドーマおよび最初の抗ヒトＶＥＧＦハイブリド
ーマ由来の上清を、二重間接的（ｄｕａｌ ｉｎｄｉｒｅｃｔ）ＥＬＩＳＡ技術
によって、この抗原でコートしたプレート上でスクリーニングした（Ｃｒｏｗｔ
ｈｅｒ，１９９５）。
【０７５５】 ＶＥＧＦペプチド−サイログロブリンとの優先的な反応性を示すが、Ｃｙｓ−
サイログロブリンとの反応性を全く示さないか、弱い反応性を示すハイブリドー
マを、腫瘍組織の凍結切片に対する免疫組織化学（以下に記載される）によって
、さらにスクリーニングした。
【０７５６】 （６．免疫組織化学） モルモット系統１０肝細胞癌腫瘍細胞（Ｄｒ．Ｒｏｎａｌｄ Ｎｅｕｍａｎ，
ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤより得た）を、系統２モルモット（ＮＣＩ，Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）中で増殖させた。ヒト腫瘍ＮＣＩ−Ｈ３５８非小細胞肺
癌（ＮＳＣＬＣ）、ＮＣＩ−Ｈ４６０ ＮＳＣＬＣ（両方とも、Ｄｒ．Ａｄｉ
Ｇａｚｄａｒ，ＵＴ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸより得た
）、ＨＴ２９結腸腺癌（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ）、およびＬ５４０ＣＹホジキンリンパ腫（Ｖ．Ｄｉｅｈｌ教授
、Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙから得た）を、ＣＢ１７ ＳＣＩＤマウス（
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）中に異種移植片と
して増殖させた。
【０７５７】 腫瘍を、液体窒素中で瞬間凍結し、そして−７０℃で保存した。患者由来の腫
瘍標本の凍結サンプルを、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ
ｅ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ（Ｓ
ｏｕｔｈｅｒｎ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から得た。
免疫組織化学を、Ｂｕｒｒｏｗｓら（１９９５）に記載のように行った。
【０７５８】 （７．ＥＬＩＳＡ分析） ＶＥＧＦで免疫した動物由来のハイブリドーマ上清を、以下の３つの異なる抗
原を使用する示差的間接（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｉｎｄｉｒｅｃｔ）ＥＬ
ＩＳＡ技術によってスクリーニングした：ヒトＶＥＧＦ単独、ＶＥＧＦ：Ｆｌｋ
−１／ＳＥＡＰ複合体、およびＦｌｋ−１／ＳＥＡＰ単独。ヒトＶＥＧＦ単独に
ついて、特定のＥＬＩＳＡプレートを、１００ｎｇのＶＥＧＦでコートした。
【０７５９】 Ｆｌｋ−１／ＳＥＡＰ単独について、他のＥＬＩＳＡプレートを、５００ｎｇ
のＦｌｋ−１／ＳＥＡＰ（マウスＶＥＧＦレセプターの可溶性形態（Ｆｌｋ−１
／ＳＥＡＰを分泌する細胞は、Ｄｒ．Ｉｈｏｒ Ｌｅｍｉｓｃｈｋａ，Ｐｒｉｎ
ｃｅｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪから得た））で
コートした。このＦｌｋ−１／ＳＥＡＰタンパク質は、Ｔｅｓｓｌｅｒら（１９
９４）に記載のように産生および精製した。基本的には、Ｆｌｋ−１の細胞外ド
メイン（ｓＦｌｋ−１）を、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓ
ｆ９）において産生し、そして、モノクローナル抗Ｆｌｋ−１抗体（１Ａ８）を
使用する免疫親和性技術によって精製した。次いで、ｓＦｌｋ−１をビオチン化
し、そしてアビジンでコートしたプレート上に結合させた。
【０７６０】 ＶＥＧＦ：Ｆｌｋ−１／ＳＥＡＰ複合体でコートしたプレートを調製するため
に、精製ｓＦｌｋ−１をビオチン化し、そして２，５：１のｓＦｌｋ−１：ＶＥ
ＧＦのモル比で、結合緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、
２０μｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミンおよび０．１μｇ／ｍｌ ヘパリン）中で
、４℃で一晩、ＶＥＧＦと反応させ、ダイマーを形成させた。次いで、このＶＥ
ＧＦ：ｓＦｌｋ−１複合体を、９６ウェルマイクロタイタープレートのアビジン
でコートしたウェル中でインキュベートし、レセプターに結合したＶＥＧＦでコ
ートしたプレートを生成した。
【０７６１】 次いで、ＶＥＧＦ単独、ビオチン化ｓＦｌｋ−１およびＶＥＧＦ：ｓＦｌｋ−
１複合体との、抗体の反応性を、アビジンでコートしたプレート上のこの３つの
抗原を使用する、制御された研究において決定した。反応性を、最初のスクリー
ニングについて上記したように決定した。
【０７６２】 捕捉ＥＬＩＳＡもまた開発した。捕捉ＥＬＩＳＡにおいて、マイクロタイター
プレートを、１００ｎｇのその示された抗体で、４℃で一晩コートした。ウェル
を、上記のように洗浄およびブロックし、次いで、種々の濃度のビオチン化ＶＥ
ＧＦまたはＶＥＧＦ：ｓＦｌｋ−１−ビオチンと共にインキュベートした。１：
２０００希釈した、ペルオキシダーゼに結合体化されたストレプトアビジン（Ｋ
ｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）
を、第２の層として使用し、そして発色させた。
【０７６３】 競合ＥＬＩＳＡ研究を、製造業者の説明書（ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ａｃｔｉｖａｔ
ｅｄ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，Ｐｉｅｒｃｅ）に従って、抗体をペルオキシダー
ゼで最初に標識することによって行った。１２Ｄ７、３Ｅ７、２Ｃ３および７Ｇ
３との競合研究に使用した抗原は、ＥＬＩＳＡプレート上のアビジンによって捕
捉されるＶＥＧＦ−ビオチンであった。約０．５〜２．０μｇ／ｍｌのペルオキ
シダーゼ標識した試験抗体を、緩衝液単独、無関係なＩｇＧ、または１０〜１０
０倍過剰の他の抗ＶＥＧＦ競合抗体のいずれかの存在下のプレート上でインキュ
ベートした。
【０７６４】 標識した抗体の結合を、３，３’５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ
）基質（ＫｉｒｋｅｇａａｒｄおよびＰｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
Ｉｎｃ）の添加によって評価した。反応を、１５分後に１Ｍ Ｈ3ＰＯ4で停止し
、そして４５０ｎＭで分光光度的に読み取った。このアッセイを、標識した抗体
および競合抗体の各組み合わせについて、少なくとも２回、３連で行った。２つ
抗体が、互いの結合を８０％より大きく交差ブロック（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋ
）した場合に、同じエピトープグループに存在するとみなした。
【０７６５】 ＧＶ３９Ｍおよび１１Ｂ５は、ペルオキシダーゼ標識後、結合活性を保持しな
かったが、ビオチン化に耐性であった。ＧＶ３９Ｍおよび１１Ｂ５をビオチン化
し、そして抗Ｆｌｋ−１抗体（１Ａ８）によって捕捉されたか、またはＥＬＩＳ
Ａプレート上に直接的にコートした、ＶＥＧＦ：ｓＦｌｋ−１に対して試験した
。
【０７６６】 （８．ウエスタンブロット分析） ５％胎仔ウシ血清の存在下の精製組換えＶＥＧＦを、還元条件下および非還元
条件下の１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースに転写し
た。このニトロセルロース膜を、Ｓｅａ−Ｂｌｏｃｋ ＰＰ８２−４１（Ｅａｓ
ｔ Ｃｏａｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｂｅｒｗｉｃｋ，ＭＥ）を使用してブロ
ックし、そしてミニブロッター（ｍｉｎｉ−ｂｌｏｔｔｅｒ）装置（Ｉｍｍｕｎ
ｅｔｉｃｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用して、一次抗体をプローブした
。適切なペルオキシダーゼ結合体化二次抗体とのインキュベーション後、ＥＣＬ
増強化学発光によって、膜を発色させた。
【０７６７】 （Ｂ．結果） （１．２Ｃ３は、固有のエピトープ特異性を有する） 表１は、異なる抗ＶＥＧＦ抗体のクラス／サブクラス、それらが認識するＶＥ
ＧＦ上のエピトープグループ、およびＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ：レセプター（Ｖ
ＥＧＦ：Ｆｌｋ−１）複合体への優先的結合についての情報を要約する。全ての
例において、これらの抗体は、ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１６５に等しくよ
く結合し、本質的に同じ結果を生じた。以下のこれらの結果は、他で明記されな
い限りＶＥＧＦ１６５に対するものである。
【０７６８】
【表６】
【０７６９】 １．エピトープグループを、競合的ＥＬＩＳＡによって決定した。 ２．マウスを、ヒトＶＥＧＦのＮ末端２６アミノ酸（１１Ｂ５、３Ｅ７、７Ｇ３
および１２Ｄ７）、モルモットＶＥＧＦのＮ末端２５アミノ酸（ＧＶ３９Ｍ）ま
たは全長組換えヒトＶＥＧＦ（２Ｃ３）のいずれかに対応する合成ペプチドで免
疫した。 ３．抗体を、ＶＥＧＦ単独との反応性、またはｓＦｌｋ−１と結合したＶＥＧＦ
（ＶＥＧＦ：Ｆｌｋ−１）との反応性について、間接的ＥＬＩＳＡおよび捕捉Ｅ
ＬＩＳＡにおいてスクリーニングした。 ４．Ａ４．６．１は、正確に規定されたエピトープを有し、これは、２Ｃ３によ
って認識されるエピトープグループ４とは異なる。Ａ４．６．１研究は、Ｋｉｍ
ら、１９９２；Ｗｉｅｓｍａｎｎら、１９９７；Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８；お
よびＫｅｙｔ、１９９６（各々は、参考として本明細書中に援用される）に報告
されている。
【０７７０】 ビオチン化試験抗体またはペルオキシダーゼ標識試験抗体、および１０〜１０
０倍過剰の非標識競合抗体を使用する、競合結合研究は、２Ｃ３が、固有のエピ
トープに結合することを示した。これらの研究は、ＧＶ３９Ｍおよび１１Ｂ５が
、ＶＥＧＦ：Ｆｌｋ−１への互いの結合を交差ブロックすること、および３Ｅ７
および７Ｇ３が、アビジン上に捕捉されたＶＥＧＦ−ビオチンへの互いの結合を
交差ブロックすることを、最初に明らかにした。ＧＶ３９Ｍおよび１１Ｂ５を、
エピトープグループ１に任意に割り当て、一方、３Ｅ７および７Ｇ３を、エピト
ープグループ２に割り当てた。
【０７７１】 ２Ｃ３および残りの抗体１２Ｄ７は、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ：レセプターに
対する互いの結合、またはそれらに対する残りの抗体の結合に有意に干渉しなか
った。１２Ｄ７を、エピトープグループ３に割り当て、そして２Ｃ３を、エピト
ープグループ４に割り当てた（表１）。
【０７７２】 上記に作表したように、２Ｃ３は、抗体Ａ４．６．１に対するエピトープとは
異なるエピトープを認識する。本発明者らの競合研究は、２Ｃ３およびＡ４．６
．１が、交差反応性ではないことを示した。Ａ４．６．１によって認識されるエ
ピトープはまた、正確に規定され、そしてアミノ酸８９〜９４の周辺に集中する
連続性のエピトープである（Ｋｉｍら、１９９２；Ｗｉｅｓｍａｎｎら、１９９
７；Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８；Ｋｅｙｔら、１９９６（各々は、参考として本
明細書中に援用される））。２Ｃ３とＡ４．６．１の間には多くの公知の差異も
また、存在する（以下を参照のこと）。
【０７７３】 （２．２Ｃ３は、遊離のＶＥＧＦに結合する） 遊離形態および複合体形態の可溶性ＶＥＧＦに結合する抗体の能力において、
顕著な差異が存在する（表２）。これらの研究は、２Ｃ３の固有の性質の証拠を
さらに提供する。表２は、ＧＶ３９Ｍおよび１１Ｂ５が、ＶＥＧＦ：レセプター
複合体に対する強い選択性を提示し、最大半減結合（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ
ｂｉｎｄｉｎｇ）は、それぞれ、溶液中の遊離ＶＥＧＦについては、４００ｎ
Ｍおよび８００ｎＭであるのに比べて、ＶＥＧＦ：Ｆｌｋ−１については、５．
５ｎＭおよび２ｎＭで到達される。
【０７７４】 対照的に、２Ｃ３および１２Ｄ７は、遊離ＶＥＧＦに対する選択性を提示し、
その最大半減結合は、ＶＥＧＦ：Ｆｌｋ−１複合体について、それぞれ、１５０
ｎＭおよび２５０ｎＭであるのに比べて、それぞれ、１ｎＭおよび２０ｎＭで到
達される。しかし、２Ｃ３は、インビボ注射後に、腫瘍血管系および腫瘍支質に
局在する（以下を参照のこと）。
【０７７５】 ３Ｅ７は、遊離ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ：Ｆｌｋ−１複合体に等しく結合し、
最大半減結合は、両方について１ｎＭで到達される。
【０７７６】
【表７】
【０７７７】 １．最大半減結合値は、ビオチン化ＶＥＧＦ、およびＶＥＧＦと複合体化したビ
オチン化ｓＦｌｋ−１を、その示された抗体でコートしたウェル上に対して３連
で滴定し、次いで、ペルオキシダーゼ標識アビジンで発色させることによって測
定した。 ２．１．０より大きい比は、複合体（ＶＥＧＦ：Ｆｌｋ−１）に対する抗体の選
択性を示し、一方、１．０未満の比は、ＶＥＧＦに対する選択性を示す。 ３．使用したコントロール抗体としては、以下が挙げられる：１Ａ８（マウス抗
Ｆｌｋ−１）、Ｍａｂ４．６．１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ製のマウス抗ヒトＶＥＧ
Ｆ）、およびネガティブコントロールとしての無関係なＩｇＭ。 ４．ＮＲ＝反応が検出されず。
【０７７８】 （３．２Ｃ３は、非コンフォーメーション依存性エピトープを認識する） ウエスタンブロット分析は、１２Ｄ７、２Ｃ３および７Ｇ３が、還元条件下お
よび非還元条件下で、変性ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１６５と反応すること
を示す。従って、これらの抗体は、非コンフォーメーション依存性（ｎｏｎ−ｃ
ｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）のエピトープを認識す
るようである。
【０７７９】 対照的に、ＧＶ３９Ｍ、１１Ｂ５および３Ｅ７は、ウエスタンブロット上でＶ
ＥＧＦと反応しなかった。これはおそらく、それらが、コンフォメーション依存
性であり、そして変性条件下で変形する、ＶＥＧＦのＮ末端上のエピトープを認
識するからである。
【０７８０】 抗ＶＥＧＦ抗体のウエスタンブロット分析を、１２％ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅを使用して、５％ＦＣＳ存在下でＶＥＧＦ１６５を分離して、ＥＣＬ検出を使
用する標準的なウエスタンブロッティングプロトコルによって分析することによ
って行った。一次抗体を、マルチレーンミニブロッター装置を使用して、ニトロ
セルロース膜と共にインキュベートした。コントロール抗体としては、以下を含
んだ：１μｇ／ｍｌのＡｂ−３（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ製のＶＥＧ
Ｆに特異的なモノクローナルＩｇＧ）、５μｇ／ｍｌのＡ−２０（Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．製のウサギ抗ＶＥＧＦ抗体）
、および１０μｇ／ｍｌの無関係な特異性のＩｇＧ。
【０７８１】 ５μｇ／ｍｌの２Ｃ３を含む、異なる抗体についての代表的なウエスタンブロ
ットは、ダイマーのＶＥＧＦを約４２ｋｄの大きいバンドとして示した。約１３
０ｋｄのマルチマーのＶＥＧＦもまた、１２Ｄ７、７Ｇ３およびポジティブコン
トロール抗体で明らかになった。
【０７８２】 （４．腫瘍免疫組織化学） 免疫組織化学によって試験した腫瘍は、癌患者由来の種々の型のヒト腫瘍、マ
ウス中で増殖された種々の型の移植可能なヒト腫瘍異種移植片、モルモット中で
増殖されたモルモット系統１０腫瘍、およびマウス中で増殖されたマウス３ＬＬ
腫瘍であった（詳細については、表３に対する説明を参照のこと）。
【０７８３】 ＮＣＩ−Ｈ３５８ヒトＮＳＣＬＣ異種移植片に対する３Ｅ７、ＧＶ３９Ｍおよ
び１１Ｂ５の免疫組織化学的反応性を測定し、そしてコントロール抗体（無関係
な特異性のＩｇＧ；Ａ２０（ウサギ抗ＶＥＧＦ抗体）；およびＭＥＣＡ ３２（
ラット抗マウス内皮細胞抗体）と比較した。ＳＣＩＤマウス中で増殖されたＮＣ
Ｉ−Ｈ３５８ヒトＮＳＣＬＣの８μｍの凍結切片を、間接的な免疫ペルオキシダ
ーゼ技術を使用して染色し、そしてヘマトキシリンで対比染色した。
【０７８４】 ＧＶ３９Ｍおよび１１Ｂ５（これらは、ＶＥＧＦ上のエピトープグループ１を
認識する）が、試験した全ての腫瘍において、血管内皮細胞を強く染色し、そし
て血管周囲の結合組織を中程度に染色することが決定された。エピトープグルー
プ１抗体は、腫瘍細胞とのそれらの反応性において異なり、ＧＶ３９Ｍは、腫瘍
細胞と弱くしか反応しないが、一方、１１Ｂ５は、より強く反応した。ＭＥＣＡ
３２（マウス）またはＴＥＣ １１（ヒト）によって染色された内皮細胞の約８
０％は、ＧＶ３９Ｍおよび１１Ｂ５によってもまた染色された。
【０７８５】 ３Ｅ７および７Ｇ３（これらは、ＶＥＧＦエピトープグループ２を認識する）
は、試験した全ての腫瘍において、血管内皮細胞、結合組織、および腫瘍細胞と
の反応性を示した（表３）。特に、抗体を低濃度（１〜２μｇ／ｍｌ）で適用し
た場合に、内皮細胞染色の強度は、腫瘍細胞染色または結合組織染色よりも、代
表的にはより強く、血管内皮に対する選択性の顕著な増大が見られた。
【０７８６】
【表８】
【０７８７】 免疫組織化学分析を、標準的な免疫組織化学技術によって、腫瘍組織のアセトン
固定凍結切片に対して行った。これらの切片を、顕微鏡試験し、そして以下のよ
うに反応性についてスコア付けした：−、陰性；＋／−、非常に弱い；１＋、弱
い；２＋、中程度；３＋、強い；４＋、非常に強い。 １．２Ｃ３および１２Ｄ７を、２０μｇ／ｍｌで適用し；全ての他の抗体を、５
〜１０μｇ／ｍｌで適用した。 ２．反応性の定義：ＥＣ＝内皮；ＣＴ＝結合組織；ＴＣ＝腫瘍細胞；ＮＲ＝反応
なし。 ３．試験したヒト腫瘍異種移植片；ＮＣＩ−Ｈ３５８ ＮＳＣＬＣ、ＮＣＩ−Ｈ
４６０ ＮＳＣＬＣ、ＨＴ２９結腸腺癌、Ｌ５４０ホジキンリンパ腫。 ４．試験したヒト腫瘍；軟性組織肉腫、ホジキンリンパ腫、腎臓癌、乳癌、耳下
腺癌、結腸癌、肺癌および内皮癌。 ５．系統１０モルモット腫瘍切片におけるモルモットＶＥＧＦとの反応性。 ６．マウス３ＬＬ Ｌｅｗｉｓ肺癌腫瘍切片におけるマウスＶＥＧＦとの反応性
。
【０７８８】 １２Ｄ７および２Ｃ３は、いずれの腫瘍組織の凍結切片を染色しなかった。こ
れはおそらく、組織のアセトン固定が、抗体結合を破壊したからである。しかし
、２Ｃ３は、インビボ注射後に腫瘍組織に局在化した（以下を参照のこと）。
【０７８９】 ＧＶ３９Ｍ、１１Ｂ５、３Ｅ７および７Ｇ３は、モルモット中で増殖されたモ
ルモット系統１０腫瘍およびマウス中で増殖されたマウス３ＬＬ腫瘍の凍結切片
上の齧歯類血管系と反応した。ＧＶ３９Ｍ、１１Ｂ５および７Ｇ３は、ヒト腫瘍
標本中のヒト血管系と反応したのと同様に、モルモットおよびマウスの腫瘍血管
系と強く反応した。３Ｅ７は、モルモットまたはヒトの腫瘍切片を染色するより
も、低い強度でマウス３ＬＬ腫瘍を染色した。これは、３Ｅ７が、マウスＶＥＧ
Ｆに対するより低い親和性を有することを示唆する。これらの結果は、２Ｃ３を
除く全ての抗体が、マウスＶＥＧＦと反応することを示す、間接的ＥＬＩＳＡに
よる分析と一致する。
【０７９０】 （実施例ＩＩ） （２Ｃ３は、内皮細胞移動を阻害する） （Ａ．材料および方法） （内皮細胞増殖アッセイ） 成体ウシ大動脈内皮（ＡＢＡＥ）細胞を、１５００細胞／ウェルで９６ウェル
組織培養プレート内にプレートし、そして種々のサンプルおよびコントロール抗
体の添加と共に、０．５ｎＭのヒトＶＥＧＦの存在下で増殖させた。コントロー
ルウェルは、ＶＥＧＦを含むか、または含まない培地を含んだ。
【０７９１】 インキュベーション後４日目で、細胞を、ＭＴＣ（３−（４，５−ジメチルチ
アゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−
スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内部塩（ｉｎｎｅｒ ｓａｌｔ））
変換アッセイによって定量化した。ここで、ホルマザンへのＭＴＳ変換は、細胞
数に比例し、そして４９０ｎＭの吸光度によって追跡され得る（Ｃｅｌｌ Ｔｉ
ｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏ
ｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）
。このアッセイは、製造業者の説明書に従って行った。
【０７９２】 細胞増殖を、ＶＥＧＦを添加しなかった培養物中のＭＴＳ変換を差し引くこと
によって推測した。結果を、ＶＥＧＦのみが添加されたコントロール培養物中の
ＭＴＳ変換のパーセンテージとして表した（Ｂｕｔｔｋｅら、１９９３）。
【０７９３】 （Ｂ．結果） （ＶＥＧＦ媒介内皮細胞増殖の阻害） ＶＥＧＦ上のエピトープグループ１〜３を認識する、ＩｇＧ抗体３Ｅ７および
１２Ｄ７は、ＡＢＡＥ細胞のＶＥＧＦ媒介増殖を阻害しなかった（図１）。これ
は、これらの抗体が、そのエピトープがＶＥＧＦ：ＫＤＲ相互作用に関与しない
、非遮断（ｎｏｎ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）抗ＶＥＧＦ抗体であることを示唆する。
ＶＥＧＦ上のエピトープグループ１〜３をまた認識する、ＩｇＧ抗体ＧＶ３９Ｍ
は、同様に、ＡＢＡＥ細胞のＶＥＧＦ媒介増殖を阻害せず、そして非遮断抗ＶＥ
ＧＦ抗体である。
【０７９４】 対照的に、ＶＥＧＦ上のエピトープ４に対する２Ｃ３、および参照の中和抗Ｖ
ＥＧＦ抗体、Ｍａｂ４．６．１は、それぞれ、３ｎＭおよび１ｎＭで、ＶＥＧＦ
媒介ＡＢＡＥ増殖を５０％阻害した（図１）。これは、２Ｃ３が、ＶＥＧＦのマ
イトジェン活性を中和し得ることを示す。
【０７９５】 ２Ｃ３の遮断Ｍａｂとしての規定は、ＧＶ３９Ｍ、３Ｅ７および１２Ｄ７に加
えた、他の抗体の範囲からは、２Ｃ３を区別する。種々の抗ＶＥＧＦ抗体（例え
ば、Ａｂ−３）は、非遮断モノクローナルであることが知られており、これらは
、２Ｃ３から明確に区別される。
【０７９６】 ＩｇＭ抗体の１つである、１１Ｂ５は、８ｎＭより高い濃度でＡＢＡＥ細胞に
対して毒性であった。３０分以内および２４時間以内に脱離された細胞は、トリ
パンブルー色素を取り込んだ。この効果は、細胞型特異的であるようである。な
ぜなら、ＨＵＶＥＣ、ブタ大動脈内皮細胞、およびｂＥＮＤ．３細胞は、４０ｎ
Ｍでさえ、１１Ｂ５によって影響されなかったからである。ＶＥＧＦの添加の不
在下および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の存在下で生じるように、１
１Ｂ５の毒性効果は、増殖因子非依存性であるようである。
【０７９７】 （実施例ＩＩＩ） （２Ｃ３は、インビボで腫瘍に特異的に局在化する） （Ａ．材料および方法） （ヒト腫瘍異種移植片へのインビボ局在化） 腫瘍を、腫瘍体積が約１ｃｍ3になるまで、免疫無防備状態マウスにおいて皮
下増殖させた（ｎｕ／ｎｕマウスにおいてＮＣＩ−Ｈ３５８ ＮＳＣＬＣおよび
ＳＣＩＤマウスにおいてＨＴ２９結腸腺癌）。ＳＣＩＤマウスを使用する研究に
ついての１００μｇの非標識抗体、またはヌードマウスを使用する研究について
の１００μｇのビオチン化抗体を、尾静脈を介して静脈内注射した。２４時間後
、マウスを麻酔し、ＰＢＳを灌流し、そして心臓、肺、肝臓、腎臓、腸および脾
臓を含む腫瘍および器官を収集し、液体窒素中で瞬間凍結させた。
【０７９８】 各マウス由来の腫瘍および器官を、上記のように、低温槽上で切片化し、そし
て免疫組織化学的に抗体について染色した。ただし、ヌードマウス由来の切片は
、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン−ビオチン複合体（Ｄａｋｏ，Ｃａ
ｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を使用して発色させ、そしてＳＣＩＤマウス由来の
切片は、２つのペルオキシダーゼ結合体化二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ＋Ｉｇ
Ｍ、その後のウサギ抗ヤギＩｇＧ）を使用して発色させた。
【０７９９】 （Ｂ．結果） （腫瘍保有マウスにおけるインビボ局在化） ヒト腫瘍異種移植片における２Ｃ３、３Ｅ７およびＧＶ３９Ｍのインビボ局在
化を決定した。１００μｇのビオチン化２Ｃ３またはアイソタイプ適合型コント
ロールＩｇＧを、ＮＣＩ−Ｈ３５８ヒトＮＳＣＬＣを保有するｎｕ／ｎｕマウス
内にｉ．ｖ．注射した。１００μｇのＧＶ３９Ｍおよび３Ｅ７またはアイソタイ
プ適合型コントロールＩｇＧを、ＨＴ２９ヒト結腸腺癌を保有するＳＣＩＤマウ
ス内に注射した。２４時間後、マウスを屠殺し、放血し、そして腫瘍および組織
を取り出した。腫瘍および組織の凍結切片を、免疫組織化学的に分析し、抗体の
結合および分布を決定した（表４）。
【０８００】 （表４．腫瘍を有するマウスにおける抗ＶＥＧＦ抗体の組織分布）
【０８０１】
【表９】
【０８０２】 免疫組織化学分析を、屠殺の２４時間前に静脈内に、１００ｍｇの示された抗体
を受容した、腫瘍を有するマウス由来の、アセトン固定化した組織（腫瘍を含む
）の凍結切片上で実行した。その切片を、顕微鏡的に試験し、そして以下のよう
に特異的反応性について点数付けした：−，ネガティブ；＋／−，非常に弱い；
＋，弱い；２＋，中程度；３＋，強い；４＋，非常に強い。 １．ＧＶ３９Ｍは、腎臓の糸球体中の内皮または血管間膜細胞に特異的に結合し
た。 ２．３Ｅ７およびＧＶ３９Ｍは、腫瘍血管内皮に特異的に結合したが、一方、２
Ｃ３は腫瘍支質に特異的に結合した。 ３．コントロール＝無関係の特異性のＩｇＭ。
【０８０３】 ３Ｅ７は、腫瘍中の血管内皮に特異的に局在した。およそ７０％のＭＥＣＡ
３２ポジティブな血管が、インビボで注射された３Ｅ７によって染色された。微
小脈管構造を与えるより大きな血管は、３Ｅ７ポジティブであった。小さな微小
血管は、支質のトラックおよび腫瘍のネストの両方においてもまた、３Ｅ７につ
いてポジティブであった。３Ｅ７による染色の強度は、病巣の壊死の領域におい
ておよびその領域の周辺で増加した。腫瘍の壊死の領域においては、血管外の抗
体が明白であるが、腫瘍の健常な領域においては、血管外染色の証拠はほとんど
なかった。試験されたすべての正常な組織（腎臓を含む）における血管内皮は、
３Ｅ７によって染色されなかった。
【０８０４】 ＧＶ３９Ｍもまた、腫瘍の血管内皮に特異的に特異的に局在化した。腫瘍中の
およそ８０％のＭＥＣＡ ３２ポジティブ血管がＧＶ３９Ｍによって染色された
。ＧＶ３９Ｍポジティブ血管は、腫瘍全体にわたって等しく分布していた（大き
な血管を含むが、小さな毛細管もまた含む）。３Ｅ７と同様に、ＧＶ３９Ｍポジ
ティブ血管の染色強度は、腫瘍の病巣の壊死領域において増大した。しかし、３
Ｅ７とは異なり、腎臓の糸球体の内皮細胞または血管間膜細胞もまた染色された
。関連性のない特異性のコントロールＩｇＭは糸球体の染色を生じないから、Ｇ
Ｖ３９Ｍによる糸球体の染色は抗原特異的であるようである。腎臓以外の組織中
の血管内皮は、ＧＶ３９Ｍによって染色されなかった。
【０８０５】 ビオチン化された２Ｃ３は、静脈内注射後のＨ３５８ヒトＮＳＣＬＣ腫瘍の脈
管構造を取り囲む接合組織の強力な染色を生じた。腫瘍細胞のネストを結合する
支質組織の大きなトラックは、支質の最大のトラックで最も強い局在化が観察さ
れる、２Ｃ３によって染色された。これらの領域において、周りを取り囲む結合
組織から、血管内皮を区別することは不可能であった。しかし、支質によって取
り囲まれない血管中の内皮細胞（例えば、腫瘍組織それ自体のネストを通して走
る血管中の内皮細胞）が染色された。試験されたいかなる正常組織においても、
２Ｃ３による検出可能な染色は存在しなかった。
【０８０６】 ＨＴ２９ヒト腫瘍モデルにおいて、２Ｃ３もまた強力に結合組織に局在したが
、大部分の強力な染色は、腫瘍の壊死領域中で観察された。
【０８０７】 （実施例ＩＶ） （２Ｃ３は、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２に対する結合を阻害するが、ＶＥＧＦＲ
１に対する結合は阻害しない） （Ａ．材料と方法） （１．細胞株および抗体） ＶＥＧＦＲ１（ＰＡＥ／ＦＬＴ）またはＶＥＧＦＲ２（ＰＡＥ／ＫＤＲ）のい
ずれかでトランスフェクトしたブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞は、Ｄｒ．Ｊｏｈ
ａｎｎｅｓ Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ（Ｕｌｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し
、これは、Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら（１９９４、本明細書中で参考として具
体的に援用される）に記載されるように調製され、そして５％ ＦＣＳ、Ｌ−グ
ルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシン（ＧＰＳ）を含むＦ−１２培
地中で増殖させた。ｂＥＮＤ３細胞は、Ｄｒ．Ｗｅｒｎｅｒ Ｒｉｓａｕ（Ｂａ
ｄ Ｎａｕｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、そして５％ ＦＣＳおよび
ＧＰＳを含むＤＭＥＭ培地中で増殖させた。ＮＣＩ−Ｈ３５８ ＮＳＣＬＣ（Ｄ
ｒ．Ａｄｉ Ｇａｚｄａｒ，ＵＴ−Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ，Ｄａｌｌａｓ，
ＴＸから入手した）、Ａ６７３ヒト横紋筋肉腫、およびＨＴ１０８０ヒト線維肉
腫（両方ともＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎより）は、１０％ ＦＣＳおよびＧＰＳを含有するＤＭＥＭ培地中で増殖さ
せた。
【０８０８】 ２Ｃ３および３Ｅ７（抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体）、および１Ａ８（モノ
クローナル抗Ｆｌｋ−１抗体）、およびＴ０１４（ポリクローナル抗Ｆｌｋ−１
抗体）は、上記のように実施例Ｉに、ならびにＢｒｅｋｋｅｎら（１９９８）お
よびＨｕａｎｇら（１９９８）（各々が具体的に本明細書中に参考として援用さ
れる）に記載される。Ａ４．６．１（マウス抗ヒトＶＥＧＦモノクローナル抗体
）は、Ｄｒ．Ｊｉｎ Ｋｉｍ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，ＣＡ）から入手
し、そして以前に記載されている（Ｋｉｍら、１９９２；具体的に本明細書中に
参考として援用される）。使用したネガティブコントロール抗体は、ＯＸ７、マ
ウス抗ラットＴｈｒ１．１抗体（Ｂｕｋｏｖｓｋｙら、１９８３）（Ｄｒ．Ａ．
Ｆ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ（ＭＲＣ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｕ
ｎｉｔ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）より入手）およびＣ４４、マウス抗コルヒチン抗
体（Ｒｏｕａｎら、１９９０、ＡＴＣＣより入手）。
【０８０９】 （２．ＥＬＩＳＡ分析） ＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメイン（Ｆｌｔ−１／Ｆｃ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ
， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）またはＶＥＧＦＲ２（ｓＦｌｋ−１−ビオチン）
を、それぞれ、マイクロタイタープレートのウェル上で直接コートするか、また
はＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）でコート
されたウェルによって捕捉された。１ｎＭ（４０ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＶＥＧＦ
を、１００〜１０００ｎＭ（１５μｇ−１５０μｇ／ｍｌ）のコントロール抗体
または試験抗体の存在下または非存在下でウェル中でインキュベートした。次い
で、そのウェルを、１μｇ／ｍｌのウサギ抗ＶＥＧＦ抗体（Ａ−２０，Ｓａｎｔ
ａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）と
ともにインキュベートした。
【０８１０】 反応を、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ウサギ抗体（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉ
ｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）の添加によって発色させ、そして３，３’５，５’−テト
ラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒ
ｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の添加によって可視化した。１５分
後、１Ｍ Ｈ3ＰＯ4で反応を停止させ、そして分光測定的に４５０ｎｍで読みと
りを行った。
【０８１１】 アッセイをまた、コントロールＩｇＧおよび試験ＩｇＧのいずれかでマイクロ
タイタープレートのウェルをコートすることによって行った。次いで、ウェルを
ＶＥＧＦ：Ｆｌｔ−ｌ／ＦｃまたはＶＥＧＦ：ｓＦｌｋ−１−ビオチンとともに
インキュベートし、そして、それぞれ、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＦｃ（
Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ．）またはペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンのいずれかを用いて発色
させ、そして上記のように可視化した。
【０８１２】 （３．共沈殿アッセイ） ４０ｎｇのＶＥＧＦを、２Ｃ３（２０μｇ）またはＡ４．６．１（１０および
１μｇ）のいずれかのＦ（ａｂ’）2とともに３０分間、結合緩衝液（１ｍＭ
ＣａＣｌ2，０．１ｍＭ ＣｕＳＯ4，および０．５％ トリプトンを有するＤＭ
ＥＭ）中でプレインキュベートした。２００ｎｇの可溶型ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ
−１／Ｆｃ）またはＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｃ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍ
ｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を５０μｌの総容量で添加し、そして２時間イン
キュベーションした。レセプター／Ｆｃ構築物を、プロテインＡ−ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅビーズを使用して沈殿させ、そして得られた沈殿物を結合緩衝液を用いて
４回洗浄した。
【０８１３】 還元サンプル緩衝液を、各反応のペレットおよび上清に添加し、両方を１２％
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、そしてＰＶＤＦメンブレンに転写した。次い
で、そのメンブレンを、１２Ｄ７（１．０μｇ／ｍｌ）（マウス抗ＶＥＧＦ抗体
）でプロービングし、そしてペルオキシダーゼ標識ヤギマウスＩｇＧ（Ｋｉｒｋ
ｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）とのイ
ンキュベーション後に、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓ
ｃｅｎｃｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に
よって発色させた。可溶性レセプター／Ｆｃ構築物もまた、ペルオキシダーゼ結
合体化ヤギ抗ヒトＦｃ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して検出した。
【０８１４】 （Ｂ．結果） （１．２Ｃ３は、ＥＬＩＳＡにおいてＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２への結合をブロ
ックするが、ＶＥＧＦＲ１への結合はブロックしない） 抗ＶＥＧＦ抗体２Ｃ３は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＶＥＧＦがＶＥＧＦ
Ｒ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に結合することをブロックするが、ＶＥＧＦＲ１（
ＦＬＴ−１）への結合はブロックしなかった。１００倍および１０００倍モル過
剰の２Ｃ３の存在下において、ＶＥＧＦＲ２コートされたウェルに結合するＶＥ
ＧＦの量は、２Ｃ３の非存在下において結合する量の２６％および１９％にそれ
ぞれ減少した（図２）。対照的に、１００倍および１０００倍モル過剰の２Ｃ３
の存在下において、ＶＥＧＦＲ１コートされたウェルに結合するＶＥＧＦの量は
、それぞれ、２Ｃ３の非存在下において結合する量の９２％および１０５％であ
った（図２）。
【０８１５】 ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ２に結合するＶＥＧＦの量は、１００〜１００
０倍過剰の非ブロッキングモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体３Ｅ７または関連性の
ない特異性のコントロールＩｇＧの存在によって影響されなかった（図２）。Ａ
４．６．１は、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）とＶＥＧＦＲ１（ＦＬＴ−
１）の両方へのＶＥＧＦ結合をブロックした。
【０８１６】 （２．２Ｃ３は、溶液中でＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２への結合をブロックするが
ＶＥＧＦＲ１への結合をブロックしない） ２Ｃ３が、溶液中で、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ１／ＦｃまたはＶＥＧＦＲ２／Ｆ
ｃへの結合をブロックする能力を、共沈殿アッセイにおいて評価した。４０ｎｇ
のＶＥＧＦを、Ｆｃ部分（Ｆｌｔ−１／Ｆｃ）に連結したＶＥＧＦＲ１の細胞外
ドメインまたは２Ｃ３または４．６．１ Ｆ（ａｂ’）2の存在下または非存在
下で連結したＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｃ）の２００ｎｇとともにインキュベー
トした。レセプター／Ｆｃ構築物を、プロテインＡ ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ
を伴うインキュベーションによって沈殿させた。沈殿物を洗浄し、還元サンプル
緩衝液中に再懸濁し、そして１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてＰ
ＶＤＦに転写した。メンブレンをＰ８２でブロックし、そして１２Ｄ７（１μｇ
／ｍｌ）マウス抗ＶＥＧＦ抗体でプロービングし、そして標準的な化学発光条件
下で発色させた。Ｆ（ａｂ’）2を伴うＶＥＧＦモノマーおよびダイマーを検出
した。
【０８１７】 ＶＥＧＦＲ１／ＦｃまたはＶＥＧＦＲ２／Ｆｃのいずれかと混合したＶＥＧＦ
を、プロテインＡ ｓｅｐｈａｒｏｓｅによって共沈殿させた。このことは、Ｖ
ＥＧＦが両方のレセプターに結合することを示す。２Ｃ３ Ｆ（ａｂ’）2の付
加は、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２／Ｆｃへの結合をブロックしたが、ＶＥＧＦＲ１
／Ｆｃへの結合はブロックしなかった。対照的に、４．６．１ Ｆ（ａｂ’）2
は、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２／ＦｃとＶＥＧＦＲ１／Ｆｃの両方への結合をブロ
ックした。この結果は、２Ｃ３が、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２への結合を阻害する
が、ＶＥＧＦＲ１への結合を阻害しないこと、それに対して、４．６．１抗体は
、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２とＶＥＧＦＲ１の両方への結合を阻害することを支持
する。
【０８１８】 （実施例Ｖ） （２Ｃ３は、ＶＥＧＦによって誘導されるＶＥＧＦＲ２のリン酸化をブロック
する） （Ａ．材料および方法） （免疫沈殿およびウェスタンブロット分析） ＰＡＥ／ＫＤＲ、ＰＡＥ／ＦＬＴ、およびｂＥＮＤ．３細胞を、５％血清を含
む培地中の１００ｍｍ組織ディッシュにおいて、８０〜９０％コンフルエントま
で増殖させた。次いで、細胞を、０．１％血清を含む培地中で２４時間血清飢餓
にした。ＰＢＳ中の１００ｎＭ オルトバナジン酸ナトリウムでの３０分間の前
処理の後に、さらなる１５分間のコントロール抗体または試験抗体の存在下また
は非存在下において、細胞を５ｎＭ（２００ｎｇ／ｍｌ）のＶＥＧＦ１６５、５
ｎＭ（１００ｎｇ／ｍｌ）ｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐ
ｏｌｉｓ，ＭＮ）、またはＡ６７３腫瘍馴化培地とともにインキュベートした。
【０８１９】 次いで、細胞を、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ フッ化ナトリウムおよび２ｍ
Ｍ オルトバナジン酸ナトリウムを含有する氷冷したＰＢＳで洗浄し、そして溶
解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣＩ、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ
Ｐ−４０、０．２５％ デオキシコール酸、０．１％ ＣＨＡＰＳ、５ｍＭ
ＥＤＴＡ、１．５ｍＭ ＭｇＣ１2、２ｍＭ フッ化ナトリウム、２ｍＭ オル
トバナジン酸ナトリウム、１０％ グリセロール、およびプロテアーゼインヒビ
ター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔ
ａｉｌ ｔａｂｌｅｔｓ，Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中で溶解さ
せた。この溶解物を遠心分離によって清澄化し、そして得られた上清を免疫沈降
のために使用した。
【０８２０】 ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２は、それぞれ、細胞溶解物を５μｇのニワト
リ抗ＦＬＴ−１ Ｎ末端（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａ
ｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）または１０μｇのＴ０１４（アフィニティー精製し
た抗Ｆｌｋ−１）とともに４℃で一晩インキュベートすることによって免疫沈降
させた。ニワトリ抗ＦＬＴ−１抗体を使用する反応は、引き続いて、架橋したヤ
ギ抗ニワトリ抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）とともに４℃で１時間インキュベートした。次いで、
この免疫複合体を、プロテインＡ／Ｇ ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて沈殿させ、
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．２％）中の１０％溶解緩衝液（プロテアーゼインヒビ
ターを添加して）複数回洗浄し、そして１００ｍＭ β−メルカプトエタノール
および８Ｍ 尿素を含有するＳＤＳサンプル緩衝液中で煮沸した。
【０８２１】 次いで、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてＰＶＤＦメンブ
レンに転写した。このメンブレンを、ＰＰ８１（Ｅａｓｔ Ｃｏａｓｔ Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃｓ，Ｂｅｒｗｉｃｋ，ＭＥ）で３０〜６０分間ブロックし、そしてホ
スホチロシン残基について、０．５μｇ／ｍｌの４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）を用いて、４℃で
一晩プロービングした。ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｄａｋｏ
，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）とのインキュベーションの後、Ｓｕｐｅｒ
Ｓｉｇｎａｌ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐ
ｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によってＰＶＤＦメンブレンを発色させ
た。次いで、ＰＶＤＦメンブレンを、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ Ｅｌｕｔｉｏｎ
ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で、５５℃で３０分間
ストリップし、そして０．５μｇ／ｍｌニワトリ抗ＦＬＴ−１または１．０μｇ
／ｍｌ Ｔ０１４のいずれかを用いてレセプターレベルについて再プロービング
し、そして適切なペルオキシダーゼ結合体化二次抗体とのインキュベーション後
に上記のように発色させた。
【０８２２】 （Ｂ．結果） （ＶＥＧＦ誘導されたリン酸化のブロッキング） これらの研究において、ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞を、ＰＢＳ、ｂＦＧＦ（５ｎＭ、
１００ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ１６５（５ｎＭ、２１０ｎｇ／ｍｌ）、Ａ６７
３馴化培地（ＣＭ）、特定の抗体（ＣＮＴＬ、２Ｃ３、３Ｅ７、Ａ４．６．１、
別々に１００ｎＭ、１５ｇ／ｍｌ）を組み合わせたＣＭ、またはＴ０１４単独（
１００ｎＭ、１５μｇ／ｍｌ）で１５分間刺激した。ＰＡＥ／ＦＬＴ細胞をまた
、ＰＢＳ、ＶＥＧＦ１６５（５ｎＭ、２１０ｎｇ／ｍｌ）、Ａ６７３馴化培地（
ＣＭ）、特定の抗体（２Ｃ３、３Ｅ７、Ａ４．６．１、別々に１００ｎＭ、１５
ｇ／ｍｌ）を組み合わせたＣＭ、またはＴ０１４単独（１００ｎＭ、１５μｇ／
ｍｌ）で１５分間刺激した。次いで、この細胞を、溶解緩衝液中でインキュベー
トし、そしてレセプターを免疫沈降し、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって
分離し、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、そして４Ｇ５０（０．５μｇ／ｍｌ）（
マウス抗ホスホチロシン抗体）を用いてプロービングし、そして標準的な化学発
光条件下で発色させた。次いで、メンブレンをストリップし、そして免疫沈降し
ているＩｇＧを用いて再プロービングして、各レーン中のレセプタータンパク質
のレベルを決定した。
【０８２３】 この結果は、２Ｃ３がＡ４．６．１（コントロール中和抗ＶＥＧＦ抗体）とと
もに、ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞中におけるＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦ誘導性のリン酸化
をブロックすることを示す。このことは、２Ｃ３とＡ４．６．１の両方がＶＥＧ
Ｆ媒介性の内皮細胞の増殖をブロックすることを実証した以前の実験と一致した
（実施例ＩＩ；Ｂｒｅｋｋｅｎら、１９９８）。免疫沈降物中のＶＥＧＦＲ２の
ウェスタンブロットを、各レーンにおけるＶＥＧＦＲ２タンパク質の量を実証す
るために行った。３Ｅ７（これは、ＶＥＧＦのＮＨ2−末端エピトープを認識す
る）は、ＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦ誘導されたリン酸化をブロックせず、そして関
連性のない特異性のコントロールＩｇＧもブロックしなかった。
【０８２４】 ＶＥＧＦＲ１のＶＥＧＦ誘導されたリン酸化に対する２Ｃ３の効果は明らかで
はない。他の研究者らが示してきたように、ＰＡＥ／ＦＬＴ細胞中の、ＶＥＧＦ
Ｒ１のＥＧＦ誘導性のリン酸化は、ＶＥＧＦＲ１の低い内因性のキナーゼ活性に
おそらく起因して、実証するのが困難である（Ｄｅ Ｖｒｉｅｓら、１９９２；
Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら、１９９４；Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈら、１９９６
； Ｌａｎｄｇｒｅｎら、１９９８）。
【０８２５】 （実施例 ＶＩ） （２Ｃ３は、ＶＥＧＦ誘導された透過性を阻害する） （Ａ．材料と方法） （Ｍｉｌｅｓ透過性アッセイ） 以下のプロトコルは、Ｍｕｒｏｈａｒａら（１９９８；本明細書中で参考とし
て具体的に援用される）によって記載されたものである。手短に言えば、４００
〜４５０ｇの雄性ＩＡＦ無毛モルモット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌ
ｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を麻酔し、次いで、耳の静脈を通して、滅菌ＰＢＳ中の
０．５ｍｌの０．５％ Ｅｖａｎ’ｓ ｂｌｕｅ色素を静脈内注射した。２０分
後、２０ｎｇのＶＥＧＦを、コントロール抗体または試験抗体の存在下または非
存在下で皮内（ｉ．ｄ．）注射した。皮内注射の３０分後に、モルモットの背面
における得られた青色のスポットを写真撮影し、そしてカリパーを用いて測定し
た。
【０８２６】 （Ｂ．結果） （２Ｃ３は、ＶＥＧＦ誘導された透過性をブロックする） ＶＥＧＦ誘導された透過性に対する２Ｃ３の効果を研究するために、４００〜
４５０ｇのサイズのＩＡＦ無毛モルモット（Ｈａｒｔｌｅｙ ｓｔｒａｉｎ）を
麻酔し、次いで、耳の静脈を通して、滅菌ＰＢＳ中の０．５ｍｌの０．５％ Ｅ
ｖａｎ’ｓ ｂｌｕｅ色素を静脈内注射した。２０分後、２５ｎｇのＶＥＧＦを
、コントロール抗体または試験抗体の存在下または非存在下で皮内（ｉ．ｄ．）
注射した。皮内注射の３０分後に、モルモットの背面における得られた青色のス
ポットを写真撮影し、そしてカリパーを用いて測定した。
【０８２７】 このＭｉｌｅｓ透過性アッセイを用いて、ＶＥＧＦがＶＥＧＦＲ２を活性化す
ることをブロックする２Ｃ３は、モルモットにおけるＶＥＧＦ誘導された透過性
を阻害することが見出された。この効果は、ＶＥＧＦよりも１０倍モル過剰、１
００倍モル過剰、または１０００倍モル過剰で、２Ｃ３を用いて明白であった。
ＶＥＧＦがＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２の両方を活性化することをブロックする
Ａ４．６．１（これは、ＶＥＧＦがＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２の両方を活性化
することをブロックする）は、１０倍モル過剰でＶＥＧＦ誘導された透過性をブ
ロックした（本研究およびＫｉｍら、１９９２）。ＶＥＧＦ：ＶＥＧＦＲ２相互
作用をブロックしない３Ｅ７およびコントロールＩｇＧもまた、モルモットのＭ
ｉｌｅｓ透過性アッセイにおいて、ＶＥＧＦ誘導された透過性をブロックしなか
った。
【０８２８】 これらの結果は、ＶＥＧＦによって媒介される内皮の透過性が、少なくとも部
分的には、ＶＥＧＦＲ２活性化を通して媒介されることを示唆する。これらの結
果は、ＶＥＧＦＲ２のチロシンキナーゼ活性がＶＥＧＦ誘導された透過性のため
に必要であることを示した、他の研究者の結果と一致する（Ｍｕｒｏｈａｒａら
、１９９８；Ｊｏｕｋｏｖら、１９９８；Ｏｇａｗａら、１９９８）。
【０８２９】 （実施例ＶＩＩ） （２Ｃ３の抗腫瘍効果） （Ａ．材料と方法） （１．インビトロ腫瘍増殖阻害） ｎｕ／ｎｕマウスを、０日目に、１×１０7ＮＣＩ−Ｈ３５８ ＮＳＣＬＣ細
胞または５×１０6Ａ６７３横紋筋肉腫細胞のいずれかを皮下注射した。１日目
および引き続いて１週間あたり２回、マウスに２Ｃ３の腹腔内注射（示されるよ
うに、１、１０、もしくは１００μｇまたはコントロール）を与えた。次いで、
腫瘍を、ＮＣＩ−Ｈ３５８保有マウスについては約６週間、およびＡ６７３保有
マウスについては４週間の期間にわたって１週間あたり２回測定した。腫瘍の体
積を、式：体積＝Ｌ×Ｗ×Ｈ（ここで、Ｌ＝長さ、Ｗ＝幅、Ｈ＝高さ）に従って
測定した。
【０８３０】 （２．インビボ腫瘍治療） ２００〜４００ｍｍ3のサイズの皮下ＮＣＩ−Ｈ３５８腫瘍またはＨＴ１０８
０線維肉腫を有する雄性ｎｕ／ｎｕマウスに、試験抗体またはコントロール抗体
を腹腔内注射した。ＮＣＩ−Ｈ３５８を有するマウスを、最初の週の間は１週間
に３回、そして２週目および３週目の間は１週間に２回、注射１回あたり１００
μｇの抗体で処理した。次いで、このマウスに、５日間毎日、注射１回あたり５
０μｇに切り換えた。ＨＴ１０８０保有マウスを、研究の全期間にわたって１日
おきに、１００μｇの示された抗体、または生理食塩水で処理した。両方の研究
において、マウスを、その腫瘍が２５００ｍｍ3のサイズに達した場合に、また
は腫瘍が潰瘍を作り始めた場合にはより初期に、屠殺した。
【０８３１】 （Ｂ．結果） （１．新規の移植したヒト腫瘍異種移植片の２Ｃ３増殖阻害） ２Ｃ３は、用量依存様式でｎｕ／ｎｕマウスにおけるＮＣＩ−Ｈ３５８ ＮＳ
ＣＬＣおよびＡ６７３横紋筋肉腫の両方のインビボ増殖を阻害する（図３Ａおよ
び図３Ｂ）。腫瘍細胞を皮下に注入したマウスに１週あたり２回ｉ．ｐ．で与え
られた１００μｇの２Ｃ３は、両方のヒト腫瘍型の増殖を１日早く阻害した。２
Ｃ３レシピエントのおける最終腫瘍容積は、コントロールのレシピエントにおけ
る約１０００ｍｍ3と比較すると両方の腫瘍系において約１５０ｍｍ3だった。
【０８３２】 １週間あたり２度の１０μｇまたは１μｇのいずれかの２Ｃ３での処置は、腫
瘍増殖を防止するのにあまり有効ではなかった。しかし、両方のより低い用量の
２Ｃ３は、未処置マウスと比較して、類似する程度でＡ６７３腫瘍の増殖を遅ら
せた。１０μｇの用量の２Ｃ３により引き起こされる腫瘍増殖遅延は、ＮＣＩ−
Ｈ３５８腫瘍モデルにおいてあまり顕著ではなかった。これらの２つの腫瘍モデ
ルの間の差異および２Ｃ３によるＶＥＧＦＲ２活性の阻害に対するこれらの応答
は、インビボでの２つの型の腫瘍の攻撃性と関係する。ＮＣＩ−Ｈ３５８は、Ａ
６７３が増殖するよりもさらにより遅くインビボで増殖し、そして低用量の２Ｃ
３に対してあまり敏感ではないようであり、一方、Ａ６７３腫瘍は、低用量の２
Ｃ３に対して、より速くかつ攻撃的に増殖しであり、そしてより敏感であるよう
である。
【０８３３】 ３Ｅ７（これは、ＶＥＧＦに結合するが、その活性をブロックしない）は、Ｎ
ＣＩ−Ｈ３５８腫瘍の増殖に影響しなかった。しかし、１週間あたり２回、１０
０μｇの用量で与えた３Ｅ７は、Ａ６７３腫瘍の増殖を刺激した（図３Ｂ）。こ
のことは、それが腫瘍におけるＶＥＧＦシグナル伝達の効果を増大させることを
示唆する。
【０８３４】 （２．２Ｃ３を用いる確立したヒト腫瘍異種移植片の処置） 約３００〜４５０ｍｍ3の大きさまで増殖した皮下ＮＣＩ−Ｈ３５８ ＮＳＣ
ＬＣ腫瘍を有するマウスに、無関係の特異性の２Ｃ３、Ａ４．６．１、３Ｅ７、
またはＩｇＧをｉ．ｐ．注射した（図４）。用量は、３〜５日ごとに５０〜１０
０μｇであった。Ａ６．４．１を陽性コントロールとして用いた。なぜならば、
それは腫瘍増殖の阻害をインビトロで生じるＶＥＧＦ活性をブロックすることが
、他の研究者により示されているからである（Ｋｉｍら、１９９３；Ｍｅｓｉａ
ｎｏら、１９９８）。平均腫瘍容積を測定すること（図４）に加えて、各処置群
からのマウスの写真をまた、研究の終了時の腫瘍の大きさにおける差異および外
見を示すために撮影した。
【０８３５】 ２Ｃ３またはＡ４．６．１のいずれかでの処置は、研究の期間にわたり腫瘍の
緩徐な後退を導いた。研究の終了時での平均腫瘍容積は、開始平均腫瘍容積の３
０％（２Ｃ３）および３５％（４．６．１）だった（図４）。しかし、これらの
結果は、腫瘍増殖における自発的な後退が腫瘍細胞の注射の後の４０日〜６０日
の間にマウスのコントロール群において観察されたという事実により複雑化され
る。４０日までの結果は、増殖における自発的な後退の前に、２Ｃ３およびＡ４
．６．１での処置が腫瘍増殖を防ぐことを示す。
【０８３６】 図５Ａは、ＮＣＩ Ｈ３５８を保有するマウスを、１００μｇの２Ｃ３または
３Ｅ７のいずれかで長期間処置したさらなる研究を示す。この研究では、自発的
な後退は、あまり明白ではなかった。処置の開始時点での２Ｃ３処置したマウス
の平均腫瘍容積は、４８０ｍｍ3であり、そして処置のおよそ１４週間後の平均
腫瘍容積は８４ｍｍ3まで低下した（容積で約８０％の低下）。３Ｅ７処置した
マウスは、４２８ｍｍ3の平均腫瘍容積で処置開始し、そしておよそ１４週間後
に１３２６ｍｍ3の容積まで増大した（容積で３００％の増加）。
【０８３７】 図５Ｂは、ヒト線維肉腫であるＨＴ１０８０を有するマウスの腫瘍増殖曲線を
示す。このマウスを、２日ごとに１００μｇの２Ｃ３、３Ｅ７、またはコントロ
ールＩｇＧ、あるいは生理食塩水でいずれも処置した。処置と同じくらい長い間
、腫瘍の増殖を妨害した２Ｃ３を続けた。３Ｅ７、コントロールＩｇＧ、または
生理食塩水で処置したマウスは、進行的にかつ腫瘍細胞注射後の４週間未満で屠
殺されるべきマウスに必要とされる大きさまで増殖した腫瘍を有した。
【０８３８】 （実施例ＶＩＩＩ） （２Ｃ３はＡ４．６．１と区別される） ２Ｃ３とＡ４．６．１との間に多数の差異が存在する（例えば、表５）。抗体
は、ＥＬＩＳＡ交叉ブロック（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋ）研究（実施例Ｉ）に基
づいて、ＶＥＧＦ上の別々のエピトープを認識する。変異研究およびＸ線結晶研
究は、Ａ４．６．１が、アミノ酸８９〜９４の周囲に集中するＶＥＧＦ上のエピ
トープに結合することを早い時期に示した（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８）。
【０８３９】 とくに興味深いことは、Ａ４．６．１が、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２の
両方への結合からＶＥＧＦをブロックする（Ｋｉｍら、１９９２；Ｗｉｅｓｍａ
ｎｎら、１９９７；Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８；Ｋｅｙら、１９８６）が、２Ｃ
３はＶＥＧＦＲ２への結合からのみ、ＶＥＧＦをブロックする（実施例ＩＶ）と
いう事実である。Ａ４．６．１がＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ１へのＶＥＧＦ
結合を阻害するという強力な公開された証拠は、詳細な結晶研究および構造研究
から得た（Ｋｉｍら、１９９２；Ｗｉｅｓｍａｎｎら、１９９７；Ｍｕｌｌｅｒ
ら、１９９８；Ｋｅｙｔら、１９９６；各々が本明細書中で参考として援用され
る）。公開されたデータは、Ａ４．６．１が、ＶＥＧＦＲ２への結合のために重
要であるＶＥＧＦＲ上のエピトープと競合させることにより、ＶＥＧＦＲ２への
ＶＥＧＦ結合を阻害し、そしてＶＥＧＦＲ１へのＶＥＧＦの結合を最も好ましく
は立体障害によりブロックする（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８；Ｋｅｙｔら、１９
９６）。
【０８４０】 Ａ４．６．１のヒト化バージョンは、現在臨床試験中である（Ｂｒｅｍ，１９
９８；Ｂａｃａら、１９９７；Ｐｒｅｓｔａら、１９９７；各々が本明細書中で
参考として援用される）。マクロファージ／単球の走化性、およびＶＥＧＦＲ１
を介して媒介されるＶＥＧＦの他の内因性機能は、Ａ４．６．１トライアルにお
いて最も損なわれるようである。対照的に、２Ｃ３は、ＶＥＧＦＲ２媒介効果を
特異的にブロックするその能力に起因して、より優れていると予見される。従っ
て、２Ｃ３は、特にヒトに対する長期の投与について潜在的により安全な抗体で
ある。２Ｃ３を用いる処置の利益は、それがＶＥＧＦ誘導腫瘍脈管構造拡大をブ
ロックするのと同時に、腫瘍へのマクロファージの移動を可能にすることによっ
て、より大きな抗腫瘍応答を開始する宿主の能力を含む。また、マクロファージ
走化性およびＶＥＧＦＲ１により媒介される他の効果を維持する多くの全身性の
利益を、見逃すべきではない。
【０８４１】
【表１０】
【０８４２】 用いられる略号：ＩＨＣ、免疫組織化学；ＮＲ、無反応性；ＢＶ、血管；ＣＴ、
結合組織。 １．Ａ４．６．１データに関する参考文献としては、以下が挙げられる：Ｋｉｍ
ら、１９９２；Ｗｉｅｓｍａｎｎら、１９９７；Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８；お
よびＫｅｙｔら、１９９６、各々が本明細書中で参考として援用される ２．２Ｃ３がＶＥＧＦ上で認識するエピトープは未決定だが、Ａ４．６．１がＥ
ＬＩＳＡ交叉ブロック研究を介して認識するエピトープと区別されることが示さ
れている ３．ＶＥＧＦについての２Ｃ３のアフィニティーは、ＥＬＩＳＡおよび表面プラ
スモン共鳴分析により評価されている ４．Ａ４．６．１は、わずかに固定した（ｌｉｇｈｔｌｙ ｆｉｘｅｄ）アセト
ン固定凍結切片とのみ反応する （実施例ＩＸ） （関節組織におけるＶＥＧＦ染色） 新脈管形成と疾患との間の関係は、血管新生腫瘍において観察される関係を越
える範囲におよぶ。例えば、異常な新脈管形成の関与は、関節炎において十分に
記載されている。チミジンホスホリラーゼに対する異なる抗ＶＥＧＦ抗体のパネ
ルは、関節炎組織を染色する、および一致するコントロールからのこれを分化さ
せるために用いられている。ＶＥＧＦに対する抗体を用いる研究は、慢性関節リ
ウマチのパンヌスにおいて著しい発現を示した。
【０８４３】 （実施例Ｘ） （２Ｃ３−エンドスタチン結合体） （Ａ．エンドスタチンのクローニングおよび発現） ＲＮＡをマウス肝臓から単離し、そして以下のプライマーを用いるＲＴ−ＰＣ
ＲTMについてのテンプレートとして用いられる：
【０８４４】
【化２】
【０８４５】 得られたｃＤＮＡフラグメントは、配列番号１２のＤＮＡ配列を有し、そして
配列番号１３のアミノ酸配列を有する。参考のため、ヒトエンドスタチンアミノ
酸配列は、配列１４である。マウスｃＤＮＡフラグメントを発現ベクターＨ６ｐ
ＱＥ６０（Ｑｉａｇｅｎ）（これは、Ｎ末端６×ヒスチジンタグをコードする）
へとクローニングし、次いでＥ．ｃｏｌｉ Ｍ１５細胞中で発現させた。Ｅ．ｃ
ｏｌｉ細胞密度が５６０ｎＭで０．６の光学密度に達した時に、０．１ｍＭのイ
ソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加え、４時間、６−Ｈｉｓエンドス
タチンの発現を誘導した。細胞を遠心分離により収集し、そして溶解緩衝液（Ｂ
−ＰＥＲ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅ
ａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））において溶解した。
【０８４６】 封入体（６−Ｈｉｓタグエンドスタチンを含む）を、遠心分離により沈降させ
、そして緩衝液Ａ（ｐＨ８．０、６ＭグアニジンＨＣｌ（ＧｕＨＣＬ）、１００
ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ イミダゾール、１０ｍＭ
βー２メルカプトエタノール）に溶解させた。還元した６−Ｈｉｓエンドスタ
チンを含む溶液を過剰の５，５’−ジチオービス−２−ニトロ安息香酸（Ｅｌｌ
ｍａｎ’ｓ試薬）（２０ｍＭ）で処理し、そしてＮｉ−ＮＴＡカラムにロードし
た。このカラムを洗浄緩衝液（６Ｍ ＧｕＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）で洗浄し、そして６
−Ｈｉｓエンドスタチンを洗浄緩衝液中の０．２Ｍイミダゾールを用いて、カラ
ムから溶出させた。
【０８４７】 溶出しかつ不溶性の６−Ｈｉｓエンドスタチンを、等量の再折畳み緩衝液（ｒ
ｅｆｏｌｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（３Ｍ尿素、１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．３、
０．５Ｍ Ｌ−アルギニン、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4、１
ｍＭ 還元グルタチオン（ＧＳＨ））で希釈し、そして室温で一晩インキュベー
トした。再折畳みした６−Ｈｉｓエンドスタチンを、ＰＢＳ、ｐＨ７．４に対し
て室温で十分に透析した。得られたタンパク質である６−Ｈｉｓエンドスタチン
は、可溶性であり、かつ非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（ここで、６−
Ｈｉｓエンドスタチンは単一の２０ｋＤａのバンドとして泳動される）に基づい
て非常に純粋であった。
【０８４８】 （Ｂ．エンドスタチンの機能的活性） 発現されたタンパク質が完全に溶解性であるという事実に加えて、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ発現した６−Ｈｉｓエンドスタチンが生物学的に活性であるという他の証拠と
しては、内皮細胞に対して実証された結合が挙げられる。ビオチニル化６−Ｈｉ
ｓエンドスタチンを調製し、そしてインビトロで３つの異なる内皮細胞型（Ｂｅ
ｎｄ３マウス内皮細胞；ＡＢＡＥ、ウシ大動脈内皮細胞；およびＨＵＶＥＣ、ヒ
ト臍帯内皮細胞）とインキュベートした。結合をＯ−フェニレンジアミン（ＯＰ
Ｄ）と組み合わせたストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ、および４９０ｎｍ
で読んだ吸光度を用いて検出した。
【０８４９】 直接的結合研究は、（ビオチニル化６−Ｈｉｓ）エンドスタチンが、インビト
ロで３つの異なる型の内皮細胞に対して、過飽和な様式で、結合することを示し
た。また、発現したエンドスタチン（標識なし）は、Ｂｅｎｄ３内皮細胞に対す
る結合について、ビオチニル化エンドスタチンと競合することが示された。
【０８５０】 （Ｃ．ＳＭＰＴおよび２−ＩＴを介する２Ｃ３に対するエンドスタチンの結合
） Ｎ’Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）における４−スクシンイミジルオキ
シカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ
）を、２Ｃ３ ＩｇＧへ、５：１（ＳＭＰＴ：２Ｃ３）のモル比で添加し、そし
て５ｍＭ ＥＤＴＡを有するＰＢＳ（ＰＢＳＥ）中で、室温（ＲＴ）にて１時間
インキュベートした。遊離のＳＭＰＴを、ＰＢＳＥで行うＧ２５サイズ排除クロ
マトグラフィーにより取り除いた。同時に、マウス６−Ｈｉｓエンドスタチンを
、２−イミノチオラン（２−ＩＴ、Ｔｒａｕｔ’ｓ試薬）と、１：５（エンドス
タチン：２−ＩＴ）のモル比で、ＲＴにて１時間インキュベートした。遊離の２
−ＩＴを、ＰＢＳＥで行うサイズ排除クロマトグラフィーにより取り除いた。
【０８５１】 ＳＭＰＴ修飾２Ｃ３を、２−ＩＴ−修飾６−Ｈｉｓエンドスタチンと混合し、
３〜５ｍｌまで濃縮し、そして穏やかな振盪でＲＴにて２４時間インキュベート
した。反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。非結合体化２Ｃ３−ＳＭＰＴを、
ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーにより結合体から取り除き、２Ｃ３
−エンドスタチンを得る。
【０８５２】 （Ｄ．ＳＭＣＣおよびＳＡＴＡを介する２Ｃ３へのエンドスタチンの結合） Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）を、６−Ｈｉ
ｓ−エンドスタチンと、６：１（ＳＡＴＡ：エンドスタチン）のモル比で室温に
て３０分間インキュベートした。遊離のＳＡＴＡを、ＰＢＳＥで行うＧ２５サイ
ズ排除クロマトグラフィーにより取り除いた。ＰＢＳＥ中のＳＡＴＡ修飾６−Ｈ
ｉｓエンドスタチンを、４．０ｍｌまで濃縮し、そして０．４ｍｌ脱アセチル化
溶液（０．１Ｍヒドロキシルアミン）を添加した。混合物を室温にて２時間イン
キュベートした。同時に、ＰＢＳＥ中の２Ｃ３ ＩｇＧを、スクシンイミジル
４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣ
Ｃ）と共に、１：５（２Ｃ３：ＳＭＣＣ）のモル比にてインキュベートした。遊
離のＳＭＣＣを、ＰＢＳＥで行うＧ２５サイズ排除クロマトグラフィーにより取
り除いた。
【０８５３】 次いで、脱アセチル化ＳＡＴＡ修飾エンドスタチンを、ＳＭＣＣ修飾２Ｃ３と
インキュベートし、約５ｍｇ／ｍｌの総タンパク質まで窒素気流下で濃縮し、そ
して穏やかな攪拌でＲＴにて一晩インキュベートした。反応物をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで分析した。非結合体化２Ｃ３−ＭＣＣを、２Ｃ３−エンドスタチン結合体か
ら、ＰＢＳＥ中のヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより取り
除き、２Ｃ３−エンドスタチンを得る。首尾良い結合体化はまた、チオール化剤
として、ＳＡＴＡよりはむしろ２−イミノチオランを用いて達成された。
【０８５４】 （Ｅ．２Ｃ３およびエンドスタチンの融合タンパク質） マウスおよびヒトのエンドスタチン、ならびに２Ｃ３についてのＤＮＡ配列が
利用可な（および本明細書中で提供される）場合、２Ｃ３−エンドスタチン融合
タンパク質を容易に調製可能であり得る。エンドスタチンの発現および再折畳み
は、上述されるように、この分子の首尾良い組換え発現が実際に可能であること
を示す。
【０８５５】 ２Ｃ３−エンドスタチン融合タンパク質の調製は、エンドスタチンが２Ｃ３の
重鎖のＣ末端に存在するか、または２Ｃ３ＳｃＦｖフラグメントに連結される形
態であり得る。これらの場合において、組換え技術は、直接的に、連結を変化さ
せ、そして２つの機能的部分を結合するための選択的に切断可能な配列の使用が
特に考えられる。プラスミン切断可能配列またはＭＭＰ切断可能配列が、現在好
ましい。
【０８５６】 選択的に切断可能な配列の有効性および組換え技術の適応性もまた、２Ｃ３−
エンドスタチン融合タンパク質（ここで、エンドスタチンが２Ｃ３構築物の別の
部分で置換される）に提供する。エンドスタチンを、選択的に切断可能な配列（
この部位で、機能的エンドスタチンが融合タンパク質から放出される）に作用す
る酵素と接触させるまで、２Ｃ３内に包埋する。
【０８５７】 （実施例ＸＩ） （２Ｃ３−Ａｎｇ-２結合体） （Ａ．Ａｎｇ-２の発現） ２Ｃ３-Ａｎｇ-２結合体を構築するため、Ａｎｇ-２を、バキュロウイルス発
現系を用いて昆虫細胞で産生し得る場合、好ましくは、組換え形態で使用する。
Ａｎｇ-２発現および精製のために現在好ましいプロトコルは、Ａｎｇ-２ ｃＤ
ＮＡをマウス胎盤ＲＮＡからＲＴ-ＰＣＲTMによりクローニングし、そしてＡｎ
ｇ-２ ｃＤＮＡをｐＦａｓｔＢａｃ１発現ベクターへとクローニングすること
に関する。コンピテントＤＨ１０Ｂａｃ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、組換えプラスミ
ドを用いて形質転換する。
【０８５８】 抗生物質選択後、組換えＢａｃｍｉｄを含むＥ．ｃｏｌｉコロニーを選び、増
殖させ、そして組換えＢａｃｍｉｄ ＤＮＡを精製する。昆虫細胞ＳＦ９をＣｅ
ｌｌｆｅｃｔ試薬を用い、組換えＢａｃｍｉｄ ＤＮＡを用いてトランスフェク
トさせる。組換えバキュロウイルスを、トランスフェクトしたＳＦ９細胞の上清
から収集する。組換えバキュロウイルスを増幅し、これを用いてＳＦ９細胞を感
染させ、そして感染したＳＦ９細胞はＡｎｇ-２を発現する。Ａｎｇ-２を、この
ような感染したＳＦ９細胞の上清からアフィニティー精製により精製した。
【０８５９】 （Ｂ．２Ｃ３へのＡｎｇ−２の結合） 精製した２Ｃ３を、一般的に上記されるように、化学リンカーＳＭＰＴを用い
て組換えＡｎｇ−２へ結合させた。Ｎ’Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中
のＳＭＰＴを２Ｃ３ ＩｇＧへ、５：１（ＳＭＰＴ：２Ｃ３）のモル比で添加し
、そして５ｍＭ ＥＤＴＡを有するＰＢＳ中で室温（ＲＴ）にて１時間インキュ
ベートする。遊離のＳＭＰＴを、ＰＢＳＥで行うＧ２５サイズ排除クロマトグラ
フィーにより取り除いた。同時に、組換えＡｎｇ−２を２−ＩＴと室温にてイン
キュベートする。遊離の２−ＩＴを、ＰＢＳＥで行うＧ２５サイズ排除クロマト
グラフィーにより取り除いた。
【０８６０】 ＳＭＰＴ修飾２Ｃ３を、２−ＩＴ修飾組換えＡｎｇ−２と混合し、濃縮し、穏
やかな振盪で２４時間インキュベートする。反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析す
る。非結合体化２Ｃ３−ＳＭＰＴを、結合体からゲル濾過クロマトグラフィーに
より取り除き、２Ｃ３エンドスタチンを得る。
【０８６１】 （実施例ＸＩＩ） （２Ｃ３−組織因子結合体） ２Ｃ３を、上記の実施例に記載のようにＳＭＴＰで修飾した。遊離のＳＭＰＴ
ＳＭＰＴを、ピーク（２Ｃ３−ＳＭＰＴ）を窒素気流下で収集したことを除いて
、上記に概説するように、Ｇ２５クロマトグラフィーにより取り除いた。６００
μｌの２Ｃ３−ＳＭＰＴを、５０ｍＭまでのジチオスレイトール（ＤＴＴ）の添
加の後に、チオピリジン基を定量するために取り除いた。平均３つのＭＰＴ基を
、１つのＩｇＧあたり導入した。Ｎ末端に導入したシステイン残基を有するヒト
短縮型組織因子（ｔＴＦ）を、５ｍＭのβ２−ＭＥで還元した。β２−ＭＥを、
Ｇ２５クロマトグラフィーにより取り除いた。
【０８６２】 還元したＮ−Ｃｙｓ−ｔＴＦを、２Ｃ３−ＳＭＰＴと共にプールし、そして２
．５：１（ｔＴＦ：ＩｇＧ）のモル比でＲＴにて２４時間インキュベートした。
反応物を５０，０００の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）メンブランを有するＡｍ
ｉｃｏｎを用いて１〜２ｍｌまで濃縮した。非結合体化ｔＴＦおよびＩｇＧを、
結合体から、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００サイズ排除クロマトグラフィーを用いて取
り除き、２Ｃ３−ｔＴＦを得た。
【０８６３】 （実施例ＸＩＩＩ） （２Ｃ３−ＣＲＭ１０７結合体） ２Ｃ３をＳＭＰＴで修飾した。細胞傷害性薬剤ＣＲＭ１０７（Ｊｅｒｒｙ Ｆ
ｕｌｔｏｎ博士、Ｉｎｌａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＤｅＳｏｔｏ，Ｔ
Ｘ）を、上記の実施例に記載のように、２−ＩＴで修飾した。ＳＭＰＴ修飾２Ｃ
３を、２−ＩＴ修飾ＣＲＭ１０７と、１：５（ＩｇＧ：ＣＲＭ１０７）のモル比
で、穏やかな振盪でＲＴにて２４時間インキュベートした。結合体化２Ｃ３を、
遊離の反応物から、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００サイズ排除クロマトグラフィーを用
いて取り除き、２Ｃ３−ＣＲＭ１０７を得た。
【０８６４】 （実施例ＸＩＶ） （２Ｃ３プロドラック研究） （Ａ．β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）のクローニングおよび発現） Ｅ．ｃｏｌｉＧＵＳ遺伝子を含むプラスミド（ｐＢａｃｇｕｓ−１）をＮｏｖ
ａｇｅｎ，Ｉｎｃ．から得た。プラスミドをＨ６ｐＱＥ６０発現ベクターへＧＵ
Ｓ遺伝子（これは、Ｎ末端６×ヒスチジンタグをコードする）をクローニングす
るためのＰＣＲのテンプレートとして用いた。プラスミドを保有するＥ．ｃｏｌ
ｉ Ｍ１５細胞を、細胞密度が５６０ｎＭにて０．６の光学密度に達するまで増
殖させた。０．１ｍＭのイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加して
、６ｈｉｓ ＧＵＳの発現を誘導した。４時間後、細胞を遠心分離により収集し
た。
【０８６５】 Ｅ．ｃｏｌｉペレットを、細胞溶解緩衝液（Ｂ−ＰＥＲ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒ
ｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））中で溶解した。溶液を、Ｎｉ−ＮＴＡカラムにロード
し、このカラムを洗浄緩衝液（６Ｍ ＧｕＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）で洗浄し、そして結
合した６−Ｈｉｓ ＧＵＳを同じ緩衝液中の０．２Ｍイミダゾールを用いて、カ
ラムから溶出させた。
【０８６６】 ６−Ｈｉｓ ＧＵＳは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいて純粋であり、６−Ｈｉｓ
ＧＵＳは、７５ｋＤａのバンドの単一バンドとして泳動した。ゲル濾過カラム
において、６−Ｈｉｓ ＧＵＳは、約３００ｋＤａのテトラマーとして泳動する
。６−Ｈｉｓ ＧＵＳは、基質であるｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニ
ド（ＰＮＰＧ）を切断するその能力により判断される場合、酵素学的に活性であ
る。
【０８６７】 （Ｂ．β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）への２Ｃ３の結合） Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）を、ＧＵＳと
、６：１（ＳＡＴＡ：ＧＵＳ）のモル比で室温にて３０分間インキュベートした
。遊離のＳＡＴＡを、ＰＢＳＥで行うＧ２５サイズ排除クロマトグラフィーによ
り取り除いた。ＰＢＳＥ中のＳＡＴＡ修飾ＧＵＳを、４．０ｍｌまで濃縮し、そ
して０．４ｍｌ脱アセチル化溶液（０．１Ｍヒドロキシルアミン）を添加した。
混合物をＲＴにて２時間インキュベートした。同時に、ＰＢＳＥ中の２Ｃ３ Ｉ
ｇＧを、スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１
−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）と共に、１：５（２Ｃ３：ＳＭＣＣ）のモル比
にてインキュベートした。遊離のＳＭＣＣを、ＰＢＳＥで行うＧ２５サイズ排除
クロマトグラフィーにより取り除いた。
【０８６８】 次いで、脱アセチル化ＳＡＴＡ修飾ＧＵＳを、ＳＭＣＣ修飾２Ｃ３と、穏やか
な攪拌でＲＴにて一晩インキュベートした。遊離のＧＵＳを、遊離の２Ｃ３と共
にＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのイオン交換クロマトグラフィーにより取り除き、そ
して２Ｃ３−ＧＵＳ結合体を、ＰＢＳ中の０．５Ｍ ＮａＣｌにより溶出した。
得られた溶液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００サイズ排除クロマトグラフィーにより
分離し、２Ｃ３−ＧＵＳを９０％の純度で得た。
【０８６９】 （Ｃ．２Ｃ３−ＧＵＳ結合体の生物学的活性） ２Ｃ３−ＧＵＳ結合体の各成分の生物学的活性を確認した。２Ｃ３−ＧＵＳは
、２次ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧおよびＯＰＤにより検出されるように、適切に
制御されたＥＬＩＳＡにおけるＶＥＧＦ被覆ウェルに特異的に結合する。最大半
減の結合を０．１ｎＭで観察した。従って、２Ｃ３結合部分は正確に機能する。
ＧＵＳ部分はまた酵素活性を保持した。
【０８７０】 ２Ｃ３−ＧＵＳを、５×１０6ｃｐｍ／μｇの比活性まで、125Ｉで放射ヨウ素
標識した。マウスへの静脈内注射後、放射性ヨウ素標識した２Ｃ３−ＧＵＳは、
６時間のｔ１／２αおよび２５時間のｔ１／２βで血液から一掃した。
【０８７１】 （Ｄ．ＧＵＳ切断プロドラッグ） β−グルクロニドプロドラッグ（例えば、ドクソルビシン−β−グルクロニド
およびカルシミシン−β−グルクロニド）を、米国特許第５，５６１，１１９号
（本明細書中で参考として援用される）に記載のように、基本的に調製した。こ
のようなプロドラッグを、グルコシド酵素（例えば、ＧＵＳ）により消化される
場合のみに、細胞傷害性成分（例えば、ドクソルビシンまたはカルシミシン）を
放出するように設計する。２Ｃ３にＧＵＳを付着させることにより、ＧＵＳは、
腫瘍脈管構造および支質を特異的に標的化し、プロドラッグの特異的切断、およ
び腫瘍部位内の特定の細胞毒性成分の放出を提供する。
【０８７２】 （Ｅ．２Ｃ３−ＧＵＳ結合体の生物学的活性） ２Ｃ３−ＧＵＳは、皮下部位にヒトＮＣＩ−Ｈ３５８ ＮＳＣＬＣ腫瘍を保有
するＳＣＩＤマウスへのｉ．ｖ．注射の後、腫瘍脈管構造および腫瘍支質の周辺
に特異的に局在化する。２Ｃ３−ＧＵＳの存在を、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧま
たはＨＲＰ標識抗ＧＵＳを用いて、腫瘍の凍結切片において免疫組織化学的に検
出した。最大局在を、２Ｃ３−ＧＵＳの注射の２４〜４８時間後に観察した。正
常な組織は染色されなかった。腫瘍脈管構造および腫瘍支質周辺への２Ｃ３−Ｇ
ＵＳの特異的な局在は、全身投与されるプロドラッグ（例えば、ドクソルビシン
グルクロニドまたはカルシミシン−グルクロニド）を腫瘍内でのみ活性化させる
。
【０８７３】 本明細書中に記載されるようなハイブリドーマ細胞株を、ブタペスト条約の規
定の下に、アメリカン タイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａ
ｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡに寄託し；そして受託番号ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ １５９
５を割り当てられた。本明細書中記載されかつ特許請求される本発明は、寄託さ
れたＰＴＡ １５９５細胞株により範囲を限定されない。なぜならば、寄託され
た実施形態は、本発明の１つの局面を例示し、等価なモノクローナル抗体を機能
的に産生する等価なハイブリドーマ細胞株は、本発明の範囲内に含まれるからで
ある。実際に、本明細書中に記載されかつ特許請求される全ての組成物および方
法は、本開示を考慮して、過度の実験なしになされかつ完成され得る。
【０８７４】 本発明の組成物および方法は、好ましい実施態様の項で記載されているが、本
明細書中に記載される組成物および方法ならびに本発明の方法の工程または一連
の工程に、本発明の概念、思想および範囲を逸脱せずに、改変が適用され得るこ
とは当業者には明らかである。より詳細には、化学的および生理学的の両方に関
連する特定の試薬が本明細書中に記載される薬剤と置き換えられ得るが、同じま
たは類似の結果が達成されることが明らかである。当業者には明らかである全て
のこのような類似の置き換えおよび改変は、添付の特許請求の範囲によって規定
される本発明の思想、範囲および概念内にあるとみなされる。
【０８７５】 （参考文献） 以下の参考文献は、本明細書中の記載を補充する例示的な手順またはほかの詳
細を提供する程度まで、本明細書中に参考として詳細に援用される。
【０８７６】
【表１１】 以下の図面は、本明細書の一部分を形成し、そして本発明の特定の局面をさら
に示すために含まれる。本発明は、本明細書中に示される特定の実施形態の詳細
な説明と組み合わせて、これらの図面の１つ以上に対して、参考としてより良く
理解され得る。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ２Ｃ３は、ＡＢＡＥ細胞のＶＥＧＦ媒介増殖を阻害する。ＡＢＡＥ細胞は、種
々の示される抗体および０．５ｎＭ ＶＥＧＦの存在下で増殖される。４日後の
増殖は、イエローホルマザンに対するＭＴＳ（Ｏｗｅｎ’ｓ試薬）の酵素的変換
により、比色定量的に決定された。結果は、ＶＥＧＦ単独で増殖されたコントロ
ールウェルにおけるホルマザン産生の百分率として示される。背景は、ＶＥＧＦ
または抗体なしで細胞を増殖することにより決定され、そしてコントロールウェ
ルおよびサンプルウェルからサブトラクトされた。結果は、３つの測定の算術平
均を示し、この平均の標準的な偏差は、常に、平均の２０％より少なかった。抗
ＶＥＧＦ ＩｇＧ抗体（正の制御としてｍＡｂ４．６．１および負の制御として
無関係の特異性のＩｇＧ（コントロールＩｇＧ））に対する増殖カーブが示され
た。
【図２】 ２Ｃ３は、ＥＬＩＺＡにおいてＶＥＧＦＲ１ではなくＶＥＧＦＲ２に対するＶ
ＥＧＦ結合をブロックした。ウェルが、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１／Ｆｃ）また
はＶＥＧＦＲ２（ｓＦｌｋ−１）の細胞外ドメインを用いてコートされ、次いで
、１ｎＭの単独ＶＥＧＦか、または１００ｎＭまたは１０００ｎＭのいずれかの
、示されたＩｇＧ存在下で、ＶＥＧＦと共にインキュベートされた。次いで、プ
レートを、１μｇ／ｍｌのウサギ抗ＶＥＧＦ（Ａ−２０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）と共にインキュベートし、そしてペ
ルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗ウサギ抗体を用いて発生させた。アッセイを３回
実施した。抗体の非存在下で、結合の平均百分率が、標準的な偏差と共に示され
た。アステリスクは、スチューデント対応Ｔ検定により、抗体の非存在下におけ
る値とは統計学的に有意に違う（ｐ＜０．００２）値を示す。
【図３Ａ】 ２Ｃ３は、ヒト腫瘍異種移植片のインビボ増殖を阻害する。図３Ａ：１×１０ 7 ＮＣＩ−Ｈ３５８ ＮＳＣＬＣ細胞が、０日目に、ｎｕ／ｎｕマウス中に皮下
注射された。図３Ｂ：５×１０6 Ａ６７３横紋筋肉腫細胞が、０日目に、ｎｕ
／ｎｕマウス中に皮下注射された。マウスは、その後、１日１回、週に２回、示
されたＩｇＧを腹腔内に注射された。２Ｃ３が、一用量１００、１０、または１
μｇ／注射で与えられ、一方、無関係の特異性のコントロールＩｇＧ（図３Ａ）
および３Ｅ７（図３Ｂ）がまた、１００μｇ／注射で与えられた。腫瘍を、一週
間あたり２〜３回測定した。平均および標準誤差が、図３Ａにおいて、この研究
の継続期間に対して示されるが、この研究（２６日目）の最終日についてのデー
タは、図３Ｂにおいて示される。
【図３Ｂ】 ２Ｃ３は、ヒト腫瘍異種移植片のインビボ増殖を阻害する。図３Ａ：１×１０ 7 ＮＣＩ−Ｈ３５８ ＮＳＣＬＣ細胞が、０日目に、ｎｕ／ｎｕマウス中に皮下
注射された。図３Ｂ：５×１０6 Ａ６７３横紋筋肉腫細胞が、０日目に、ｎｕ
／ｎｕマウス中に皮下注射された。マウスは、その後、１日１回、週に２回、示
されたＩｇＧを腹腔内に注射された。２Ｃ３が、一用量１００、１０、または１
μｇ／注射で与えられ、一方、無関係の特異性のコントロールＩｇＧ（図３Ａ）
および３Ｅ７（図３Ｂ）がまた、１００μｇ／注射で与えられた。腫瘍を、一週
間あたり２〜３回測定した。平均および標準誤差が、図３Ａにおいて、この研究
の継続期間に対して示されるが、この研究（２６日目）の最終日についてのデー
タは、図３Ｂにおいて示される。
【図４】 ２Ｃ３処置は、確立されたヒトＮＣＩ−Ｈ３５８ ＮＳＣＬＣ腫瘍異種移植片
の大きさを減少させる。マウス保有皮下ＮＣＩ−Ｈ３５８腫瘍（大きさがおよそ
３００〜４５０ｍｍ3）は、示された時点で、５０μｇまたは１００μｇの、２
Ｃ３（ｎ＝１４）、ｍＡｂ４．６．１（ｎ＝５）、３Ｅ７（ｎ＝１２）またはコ
ントロールＩｇＧ（ｎ＝９）を用いて、腹腔内で処置される。１１６日にわたり
、ＳＥＭと共に、平均の腫瘍体積が示される。
【図５】 確立されたヒト腫瘍異種移植片の２Ｃ３および２Ｅ３処理の比較。図５Ａ：マ
ウス保有皮下ＮＣＩ−Ｈ３５８腫瘍（大きさがおよそ４５０ｍｍ3）が、２Ｃ３
（ｎ＝６）または３Ｅ７（ｎ＝４）を用いて処置された。処置（Ｔ）は、静脈内
に与えられる５００μｇのＩｇＧからなる最初の処置を除き、腹腔内に与えられ
る１００μｇのＩｇＧである。ＳＥＭと共に、平均腫瘍体積が示される。研究の
最後に（１１６日目）、マウスは屠殺され、そして腫瘍が分析され、そして重さ
が量られる。２Ｃ３の処置されたグループに対する平均腫瘍重量は、０．０５４
ｇであるが、３Ｅ７処置群は、０．５４５ｇの平均腫瘍重量を有した。図５Ｂは
、のマウス保有皮下ＨＴ１０８０腫瘍（大きさがおよそ２００〜２５０ｍｍ3）
が、１００μｇの２Ｃ３（ｎ＝９）、３Ｅ７（ｎ＝１１）、コントロールＩｇＧ
（ｎ＝１１）、または生理的食塩水（ｎ＝１１）を用いて、静脈内に処置された
。マウスは、示された（Ｔ）のように、一日おきに処置された。非２Ｃ３処置マ
ウスは、各群の５０％より多くが、大きく、潰瘍化した腫瘍を有することに起因
して、２６日目に屠殺された。ＳＥと共に、平均腫瘍体積が示される。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１月１１日（２００１．１．１１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６６】 コアグリガンドを用いる腫瘍標的化および処置は、以下の特許および特許出願
に記載され、それらの各々は、特にコアグリガンドおよび凝固因子に関する本教
示をなおさらに補強するために参考として本明細書中に援用される：米国出願第
０７／８４６，３４９号；同第０８／２０５，３３０（米国特許第５，８５５，
８６６号）；同第０８／３５０，２１２号（米国特許第５，９６５，１３２号）
；同第０８／２７３，５６７号；同第０８／４８２，３６９号（米国特許第６， ０９３，３９９号； 同第０８／４８５，４８２号；同第０８／４８７，４２７号
（米国特許第６，００４，５５５号）；同第０８／４７９，７３３号（米国特許
第第５，８７７，２８９号）；および同第０８／４７２，６３１；同第０８／４
７９，７２７号および同第０８／４８１，９０４号（米国特許第６，０３６，９
５５号）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７８】 以下の特許および特許出願が、コアグリガンド調製、精製および使用（二重特
異性抗体コアグリガンドを含む）に関する本教示をいっそうさらに補う目的のた
めに、本明細書中に参考として各々が援用される：米国出願番号０７／８４６，
３４９；０８／２０５，３３０（米国特許第５，８５５，８６６号）；０８／３
５０，２１２（米国特許第５，９６５，１３２号）；０８／２７３，５６７；０
８／４８２，３６９（米国特許第６，０９３，３９９号；０８／４８５，４８２
；０８／４８７，４２７（米国特許第６，００４，５５５号）；０８／４７９，
７３３（米国特許第５，８７７，２８９号）；０８／４７２，６３１；および０
８／４７９，７２７および０８／４８１，９０４（米国特許第６，０３６，９５
５号）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４２３】 以下の特許および特許出願は、抗体の機能的な抗原結合領域（抗ＶＥＧＦ抗体
のｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2フラグメントを含む
）の調製および使用に関する本教示をなおさらに補足する目的のために、本明細
書中に参考として具体的に援用される：米国特許第５，８５５，８６６号；同第
５，９６５，１３２号；同第６，０５１，２３０号；同第６，００４，５５５号
；および同第５，８７７，２８９号；ならびに米国特許出願第０８／４８２，３
６９号（１９９８年１０月２０日に特許証発行料金が支払われた）。ＷＯ９８／
４５３３１もまた、抗体の可変領域、超可変領域、および相補性決定領域（ＣＤ
Ｒ）の調製をなおさらに記載および教示することを含む目的のために、本明細書
中に参考として援用される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４２７】 本発明と共に使用するための適度な結合型改変は、サルベージレセプター結合
エピトープを抗体フラグメントに組み込む工程を包含する。これを達成するため
の技術としては、抗体フラグメントの適切な領域の変異、または抗体フラグメン
トに付着するペプチドタグとしてのエピトープの組み込みが挙げられる。ＷＯ９
６／３２４７８は、このような技術をさらに説明する目的のために、本明細書中
に参考として具体的に援用される。サルベージレセプター結合エピトープは、代
表的には、抗体フラグメントの類似の位置に移されるＦｃドメインの１つまたは
２つのループ（ｌｏｏｐ）由来の３つ以上のアミノ酸の領域である。ＷＯ９８／
４５３３１のサルベージレセプター結合エピトープは、本発明と共に使用するた
めに、本明細書中に参考として援用される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０７０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０７０３】 以下の特許および特許出願は、腫瘍支質を標的する薬剤の調製および使用に関
する本発明の教示をなおさらに補完する目的のために、参考として本明細書中に
具体的に援用される：米国特許第５，８７７，２８９号ならびに米国特許出願第
０８／４８２，３６９号（米国特許第６，０９３，３９９号；同第０８／４８５
，４８２号；同第０８／４８７，４２７号（米国特許第６，００４，５５５号）
；同第０８／４７９，７３３号（米国特許第５，８７７，２８９号）；同第０８
／４７２，６３１号および同第０８／４７９，７２７号および同第０８／４８１
，９０４号（米国特許第６，０３６，９５５号）。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年５月９日（２００１．５．９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】 血管標的アプローチの別の効果的なバージョンは、細胞血管内で発現または吸
着されたマーカーに対して凝固因子を標的にすることである（Ｈｕａｎｇら、１
９９７；米国特許第５，８７７，２８９、同第６，００４，５５５号、および同 第６，０９３，３９９号。 毒素よりむしろ凝血薬を腫瘍血管に送達することは、
減少した免疫原性のさらなる利点、および毒素の副作用のさらに低い危険性を有
する。米国特許第５，８７７，２８９号に記載されるように、このような腫瘍特
異的「凝血薬」における使用に好ましい凝固因子は、短縮形態のヒト凝固誘導タ
ンパク質、組織因子（ＴＦ）、血液凝固の主なイニシエータである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/48 Ａ６１Ｋ 47/48 ４Ｃ０８５ Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｐ 9/10 ４Ｈ０４５ 27/02 27/02 35/00 35/00 43/00 １０５ 43/00 １０５ １１１ １１１ １２３ １２３ Ｃ０７Ｋ 16/30 Ｃ０７Ｋ 16/30 Ｃ１２Ｎ 5/02 Ｃ１２Ｎ 5/02 5/10 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 15/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＺＮＡＢ Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ブレッケン， ロルフ エイ． アメリカ合衆国 ワシントン 98125， シアトル， 25ティーエイチ アベニュー エヌイー 14304 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA45 BA61 CA04 CA07 GA01 GA04 GA11 GA18 HA08 HA11 4B064 AG26 AG27 DA01 DA14 4B065 AA90X AA90Y AA93Y AA95X AB02 AB04 CA24 CA25 CA44 4C076 AA95 CC41 CC42 EE59 FF68 4C084 AA17 NA13 NA15 ZA331 ZB212 ZB262 4C085 AA14 AA21 AA25 AA26 AA27 CC02 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA09 BA42 BA54 CA40 DA75 DA76 DA86 EA20 EA50 EA51

Claims (85)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生物学的有効量の抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗原結合フラ
    グメントを含む組成物であって、該抗体が、モノクローナル抗体ＡＴＣＣ ＰＴ
    Ａ １５９５と実質的に同じエピトープに結合し、かつＶＥＧＦレセプターＶＥ
    ＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害することなく、ＶＥＧ
    ＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）へのＶＥＧＦの結合を有意に
    阻害する、組成物。
  2. 【請求項２】 前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、部分的ヒト抗体、キメ
    ラ抗体もしくは組換え抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１に
    記載の組成物。
  3. 【請求項３】 前記抗体が、ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５として寄託された
    ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である、請求項１または２
    に記載の組成物。
  4. 【請求項４】 前記抗体が、少なくとも第１の生物学的薬剤に作動可能に連
    結される、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
  5. 【請求項５】 前記抗体が、少なくとも第１の治療剤または実質的に不活性
    なプロドラッグを切断して実質的に活性な薬物を放出する薬剤に作動可能に連結
    される、請求項４に記載の組成物。
  6. 【請求項６】 前記抗体が、少なくとも第１の化学療法剤、放射療法剤、抗
    脈管形成剤、アポトーシス誘発剤、抗チューブリン薬、凝血薬、細胞傷害性薬剤
    、細胞増殖抑制剤または抗細胞性薬剤に作動可能に連結される、請求項５に記載
    の組成物。
  7. 【請求項７】 治療の際に使用するための、請求項１〜６のいずれかに記載
    の組成物。
  8. 【請求項８】 眼性血管新生疾患、黄斑変性または血管新生化腫瘍を有する
    動物において新脈管形成を阻害する際に使用するための、請求項１〜７のいずれ
    かに記載の組成物。
  9. 【請求項９】 請求項１〜８に記載の組成物の治療における使用。
  10. 【請求項１０】 新脈管形成を阻害することによる、眼性血管新生疾患、黄
    斑変性または癌の処置のための医薬の製造における、請求項１〜８のいずれか１
    項に記載の組成物の使用。
  11. 【請求項１１】 前記抗体が、モノクローナル抗体ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５
    ９５である、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
  12. 【請求項１２】 前記抗体が、少なくとも第１の生物学的薬剤に作動可能に
    連結される、請求項１〜８または１１のいずれかに記載の組成物。
  13. 【請求項１３】 前記抗体が、少なくとも、実質的に不活性なプロドラッグ
    を切断して実質的に活性な薬物を放出する第１の薬剤に作動可能に連結される、
    請求項１２に記載の組成物。
  14. 【請求項１４】 前記抗体が、実質的に不活性なホスフェートプロドラッグ
    を切断して実質的に活性な薬物を放出するアルカリホスファターゼに作動可能に
    連結される、請求項１３に記載の組成物。
  15. 【請求項１５】 前記抗体が、少なくとも第１の治療剤または診断剤に作動
    可能に連結される、請求項１２に記載の組成物。
  16. 【請求項１６】 前記抗体が、少なくとも第１の治療剤に作動可能に連結さ
    れる、請求項１５に記載の組成物。
  17. 【請求項１７】 前記抗体が、少なくとも第１の治療剤および第２の治療剤
    に作動可能に連結される、請求項１６に記載の組成物。
  18. 【請求項１８】 前記抗体が、少なくとも第１の化学療法剤、放射療法剤、
    抗脈管形成剤、アポトーシス誘発剤、ステロイド、代謝拮抗薬、アントラサイク
    リン、ビンカアルカロイド、抗チューブリン薬、抗生物質、サイトカイン、アル
    キル化剤または凝血薬に作動可能に連結される、請求項１６または１７に記載の
    組成物。
  19. 【請求項１９】 前記抗体が、内皮細胞を殺傷し得るか、または内皮細胞の
    増殖または細胞分裂を抑制し得る細胞傷害性薬剤、細胞増殖抑制剤または抗細胞
    性薬剤に作動可能に連結される、請求項１８に記載の組成物。
  20. 【請求項２０】 前記抗体が、植物由来、真菌由来、または細菌由来の毒素
    に作動可能に連結される、請求項１９に記載の組成物。
  21. 【請求項２１】 前記抗体が、Ａ鎖毒素、リボソーム不活化タンパク質、α
    −サルシン、ゲロニン、アスペルギリン、レストリクトシン、リボヌクレアーゼ
    、エピポドフィロトキシン、ジフテリア毒素またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外
    毒素に作動可能に連結される、請求項２０に記載の組成物。
  22. 【請求項２２】 前記抗体が、リシンＡ鎖または脱グリコシル化リシンＡ鎖
    に作動可能に連結される、請求項２１に記載の組成物。
  23. 【請求項２３】 前記抗体が、抗脈管形成剤に作動可能に連結される、請求
    項１８に記載の組成物。
  24. 【請求項２４】 前記抗体が、アンギオポエチンに作動可能に連結される、
    請求項２３に記載の組成物。
  25. 【請求項２５】 前記抗体が、アンギオポエチン−２およびアンギオポエチ
    ン−１に作動可能に連結される、請求項２４に記載の組成物。
  26. 【請求項２６】 前記抗体が、アンギオスタチン、バスキュロスタチン、カ
    ンスタチン、またはマスピンに作動可能に連結される、請求項２３に記載の組成
    物。
  27. 【請求項２７】 前記抗体が、エンドスタチンに作動可能に連結される、請
    求項２３に記載の組成物。
  28. 【請求項２８】 前記抗体が、抗チューブリン薬に作動可能に連結される、
    請求項１８に記載の組成物。
  29. 【請求項２９】 前記抗体が、コルヒチン、タキソール、ビンブラスチン、
    ビンクリスチン、ビンデシンおよびコンブレタスタチンからなる群から選択され
    る、抗チューブリン薬に作動可能に連結される、請求項２８に記載の組成物。
  30. 【請求項３０】 前記抗体が、凝血薬に作動可能に連結される、請求項１８
    に記載の組成物。
  31. 【請求項３１】 請求項３０に記載の組成物であって、ここで前記抗体が、
    第ＩＩ／ＩＩａ因子、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第Ｘ／Ｘ
    ａ因子、Ｇｌａ修飾を欠くビタミンＫ依存凝血因子、ラッセルクサリヘビ蛇毒第
    Ｘ因子活性化剤、トロンボキサンＡ2、トロンボキサンＡ2シンターゼおよびα２
    −抗プラスミンからなる群から選択される凝血薬に作動可能に連結される、組成
    物。
  32. 【請求項３２】 前記抗体が、組織因子、ヒト組織因子、第ＶＩＩ因子を活
    性化する能力に欠ける変異組織因子、切断組織因子または二量体組織因子、三量
    体組織因子、もしくはポリマー組織因子、または組織因子誘導体に作動可能に連
    結される、請求項３０に記載の組成物。
  33. 【請求項３３】 前記抗体が、切断組織因子に作動可能に連結される、請求
    項３２に記載の組成物。
  34. 【請求項３４】 前記抗体が、診断薬、画像化剤または検出可能な薬剤に作
    動可能に連結される、請求項１５に記載の組成物。
  35. 【請求項３５】 前記抗体が、Ｘ線で検出可能な化合物、放射性イオンまた
    は核磁気スピン共鳴同位体に作動可能に連結される、請求項３４に記載の組成物
    。
  36. 【請求項３６】 前記抗体が、ビオチン、アビジン、または色素生産性物質
    と接触する際に着色産物を生成する酵素に作動可能に連結される、請求項３４に
    記載の組成物。
  37. 【請求項３７】 請求項１２〜３３のいずれか１項に記載の組成物であって
    、ここで前記抗体が、融合タンパク質として前記生物学的薬剤に作動可能に連結
    され、該融合タンパク質は、組換えベクターを発現させることにより調製され、
    該組換えベクターは、同じリーディングフレームで、該生物学的薬剤をコードす
    るＤＮＡセグメントに作動可能に連結される該抗体をコードするＤＮＡセグメン
    トを含む、組成物。
  38. 【請求項３８】 前記抗体が、生物学的に解離可能な結合または選択的に切
    断可能なリンカーを介して前記生物学的薬剤に作動可能に連結される、請求項１
    ２〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
  39. 【請求項３９】 請求項３８に記載の組成物であって、前記抗体が、ペプチ
    ドリンカーを介して前記生物学的薬剤に作動可能に連結され、該ペプチドリンカ
    ーが、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、プラスミン、プラスミノーゲン、ＴＧ
    Ｆβ、スタフィロキナーゼ、トロンビン、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、メタロプ
    ロテイナーゼ、間質コラゲナーゼ、ゲラチナーゼまたはストロメライシンに対す
    る切断部位を含む、組成物。
  40. 【請求項４０】 前記抗体が、前記生物学的薬剤に、直接連結される、請求
    項１２〜３６のいずれか１項に記載の組成物。
  41. 【請求項４１】 前記抗体が、前記治療剤または診断剤に結合する第２の抗
    体またはその抗原結合領域に作動可能に連結される、請求項１５〜３６のいずれ
    か１項に記載の組成物。
  42. 【請求項４２】 前記組成物が、薬学的に受容可能な組成物である、請求項
    １〜８または１１〜４１のいずれかに記載の組成物。
  43. 【請求項４３】 前記薬学的に受容可能な組成物が、非経口投与のために処
    方される、請求項４２に記載の組成物。
  44. 【請求項４４】 前記組成物が、第２の治療剤をさらに含む、請求項１〜８
    または１１〜４３のいずれかに記載の組成物。
  45. 【請求項４５】 前記第２の治療剤が、第２の抗癌剤である、請求項４４に
    記載の組成物。
  46. 【請求項４６】 前記第２の抗癌剤が、化学療法剤、放射療法剤、抗脈管形
    成剤、アポトーシス誘発剤、抗チューブリン薬または腫瘍を標的とした化学療法
    剤、放射療法剤、抗脈管形成剤、アポトーシス誘発剤もしくは抗チューブリン薬
    である、請求項４５に記載の組成物。
  47. 【請求項４７】 前記第２の抗癌剤が、アンギオポエチンまたは腫瘍を標的
    とするアンギオポエチンである、請求項４６に記載の組成物。
  48. 【請求項４８】 前記第２の抗癌剤が、腫瘍を標的とするアンギオポエチン
    −１である、請求項４７に記載の組成物。
  49. 【請求項４９】 前記第２の抗癌剤が、エンドスタチンまたは腫瘍を標的と
    するエンドスタチンである、請求項４６に記載の組成物。
  50. 【請求項５０】 前記第２の抗癌剤が、抗チューブリン薬または腫瘍を標的
    とする抗チューブリン薬である、請求項４６に記載の組成物。
  51. 【請求項５１】 請求項４６に記載の組成物であって、ここで前記第２の抗
    癌剤が、第２の抗体またはその抗原結合フラグメントに作動可能に連結される治
    療剤を含む抗体治療剤構築物であって、該構築物が、腫瘍細胞、腫瘍脈管構造ま
    たは腫瘍支質の、表面発現成分、表面アクセス可能成分または表面局在化成分に
    結合する、組成物。
  52. 【請求項５２】 治療の際に使用するための、請求項１〜８または１１〜５
    １のいずれかに記載の組成物。
  53. 【請求項５３】 診断の際に使用するための、請求項１〜８、１１または３
    ４〜３６のいずれか１項に記載の組成物。
  54. 【請求項５４】 動物ヘ投与して新脈管形成を阻害する際に使用するための
    、請求項１〜８、１１または請求項２３〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
  55. 【請求項５５】 動物に投与して新脈管形成を阻害する際に使用するための
    、請求項５４に記載の組成物であって、該動物は、眼性血管新生疾患または黄斑
    変性を有する、組成物。
  56. 【請求項５６】 血管新生化腫瘍を有する動物に投与して、該血管新生化腫
    瘍に生物学的薬剤を送達する際に使用するための、請求項１２〜４１のいずれか
    １項に記載の組成物。
  57. 【請求項５７】 癌を処置する際に使用するための、請求項１〜８または１
    １〜５６に記載の組成物。
  58. 【請求項５８】 治療における請求項１〜８または請求項１１〜５７に記載
    の組成物の使用。
  59. 【請求項５９】 新脈管形成を阻害することにより疾患を処置するための医
    薬の製造における、請求項１〜８、１１または請求項２３〜２９のいずれか１項
    に記載の組成物の使用。
  60. 【請求項６０】 前記医薬が、新脈管形成を阻害することにより、眼性血管
    新生疾患または黄斑変性を処置することを意図される、請求項５９に記載の使用
    。
  61. 【請求項６１】 生物学的薬剤を血管新生化腫瘍に送達することにより癌を
    処置するための医薬の製造における、請求項１２〜４１のいずれか１項に記載の
    組成物の使用。
  62. 【請求項６２】 癌を処置するための医薬の製造における、請求項１〜８ま
    たは１１〜５７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
  63. 【請求項６３】 マクロファージ、破骨細胞または軟骨吸収細胞を実質的に
    阻害することなく新脈管形成を阻害する際の使用のための組成物であって、該組
    成物は、生物学的有効量の抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗原結合フラグメントを
    含み、該抗体が、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と
    実質的に同じエピトープに結合する、組成物。
  64. 【請求項６４】 ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）へのＶＥ
    ＧＦの結合を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤ
    Ｒ／Ｆｌｋ−１）へのＶＥＧＦの結合を阻害することにより癌を処置するための
    医薬の製造における組成物の使用であって、該組成物が、生物学的有効量の抗Ｖ
    ＥＧＦ抗体、またはその抗原結合フラグメントを含み、該抗体が、モノクローナ
    ル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合
    する、使用。
  65. 【請求項６５】 請求項１〜８または１１〜５７のいずれか１項に記載の少
    なくとも第１の組成物を含むキット。
  66. 【請求項６６】 請求項１３または１４に記載の少なくとも第１の組成物お
    よび実質的に不活性なプロドラッグを含む少なくとも第２の組成物を含むキット
    であって、該プロドラッグが、該第１の組成物中の前記抗体に連結される前記生
    物学的薬剤により切断されて実質的に活性な薬物を放出する、キット。
  67. 【請求項６７】 請求項１４に記載の少なくとも第１の組成物およびリン酸
    コンブレタスタチンを含む少なくとも第２の組成物を含むキット。
  68. 【請求項６８】 抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
    であって、該抗体は、モノクローナル抗体ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５と実質的
    に同じエピトープに結合し、かつＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１
    ）へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦ
    Ｒ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害する、ハイブリド
    ーマ。
  69. 【請求項６９】 モノクローナル抗体ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５。
  70. 【請求項７０】 モノクローナル抗体ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５と実質的
    に同じエピトープに結合する抗ＶＥＧＦ抗体を調製するための方法であって、非
    ヒト動物を、少なくとも第１の免疫原性ＶＥＧＦ成分を含む免疫組成物を用いて
    免疫する工程、および該免疫された動物から該モノクローナル抗体ＡＴＣＣ Ｐ
    ＴＡ １５９５と実質的に交差反応する抗体を選択する工程を包含する、方法。
  71. 【請求項７１】 前記非ヒト動物が、ヒト抗体ライブラリーを含むトランス
    ジェニックマウスである、請求項７０に記載の方法。
  72. 【請求項７２】 前記抗ＶＥＧＦ抗体をコードする核酸を得る工程、および
    該核酸を発現させて組換え抗ＶＥＧＦ抗体を得る工程を包含する、請求項７０ま
    たは７１に記載の方法。
  73. 【請求項７３】 請求項７０〜７２のいずれか１項に記載の方法であって、
    以下： （ａ）非ヒト動物に、少なくとも第１の免疫原性ＶＥＧＦ成分を含む免疫有効
    量の組成物を投与する工程； （ｂ）前記免疫された動物の脾臓から単離されたＲＮＡを発現するコンビナト
    リアル免疫グロブリンファージミドライブラリーを調製する工程； （ｃ）モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に
    交差反応する抗ＶＥＧＦ抗体を発現するクローンを該ファージミドライブラリー
    から選択する工程；ならびに （ｄ）該選択されたクローン由来の、抗ＶＥＧＦ抗体をコードする核酸を発現
    させて、組換え抗ＶＥＧＦ抗体を産生する工程、 を包含する方法。
  74. 【請求項７４】 ＶＥＧＦを検出する方法であって、ＶＥＧＦ／抗体複合体
    の形成を可能にするために有効な条件下で、ＶＥＧＦを含有すると推測される組
    成物を、請求項１〜８または１１〜５７のいずれか１項に記載の組成物と接触さ
    せる工程、およびこのようにして形成された該複合体を検出する工程、を包含す
    る方法。
  75. 【請求項７５】 ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１へのＶＥＧＦの結合を有
    意に阻害することなく、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合を
    阻害する方法であって、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）およびＶＥＧＦＲ
    １（Ｆｌｔ−１）を発現する細胞の同種集団または異種集団を生物学的有効量の
    請求項１〜８または１１〜５７に記載の組成物と接触させる工程を包含する方法
    。
  76. 【請求項７６】 ＶＥＧＦ誘導内皮細胞増殖を特異的に阻害する方法であっ
    て、内皮細胞集団を生物学的有効量の請求項１〜８または１１〜５７のいずれか
    １項に記載の組成物と接触させる工程を包含する、方法。
  77. 【請求項７７】 ＶＥＧＦ誘導マクロファージ機能、破骨細胞機能または軟
    骨吸収細胞機能を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦ誘導内皮細胞増殖を阻害す
    る方法であって、内皮細胞ならびにマクロファージ、破骨細胞および軟骨吸収細
    胞のうちの少なくとも１つを含む組織を、生物学的有効量の請求項１〜８または
    １１〜５７のいずれか１項に記載の組成物と接触させる工程を包含する方法。
  78. 【請求項７８】 新脈管形成を阻害する方法であって、血管の集団を抗脈管
    形成組成物と接触させる工程を包含し、該新脈管形成組成物が、生物学的有効量
    の請求項１〜８または１１〜５７のいずれか１項に記載の組成物を含む、方法。
  79. 【請求項７９】 新脈管形成疾患を処置する方法であって、新脈管形成疾患
    を有する動物に、少なくとも第１の薬学的組成物を投与する工程を包含し、該第
    １の薬学的組成物が、治療的有効量の請求項１〜８または１１〜５７のいずれか
    １項に記載の組成物を含む、方法。
  80. 【請求項８０】 前記動物が、眼性血管新生疾患または黄斑変性を有する、
    請求項７９に記載の方法。
  81. 【請求項８１】 診断剤または治療剤を血管新生化腫瘍に送達するための方
    法であって、血管新生化腫瘍を有する動物に、生物学的有効量の請求項１２〜４
    １のいずれか１項に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
  82. 【請求項８２】 癌を処置するための方法であって、少なくとも第１の薬学
    的組成物を、血管新生化固形腫瘍、転移性腫瘍または原発性腫瘍からの転移を有
    するかまたは発生する危険性のある動物に投与する工程を包含し、ここで該少な
    くとも第１の薬学的組成物が、治療的有効量の請求項１〜８または１１〜５７の
    いずれか１項に記載の組成物を含む、方法。
  83. 【請求項８３】 前記動物を放射療法に供する工程をさらに包含する、請求
    項８１または８２に記載の方法。
  84. 【請求項８４】 癌を処置するための方法であって、以下： （ａ）請求項１３または１４に記載の第１の組成物を、血管新生化固形腫瘍、
    転移性腫瘍または原発性腫瘍からの転移を有する動物に投与し、それにより該組
    成物の前記抗体を腫瘍脈管構造または支質に局在化させる工程；および （ｂ）引き続いて、該動物に、該第１の組成物中の抗体に連結される前記生物
    学的薬剤により切断される実質的に不活性なプロドラッグを含む第２の組成物を
    投与し、それにより実質的に活性な薬物を該腫瘍脈管構造または支質内に特異的
    に放出する工程、 を包含する方法。
  85. 【請求項８５】 前記動物がヒト患者である、請求項７９〜８４のいずれか
    １項に記載の方法。
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