JP2005501011A - 組織特異的内皮膜タンパク質 - Google Patents
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Abstract
組織特異的内皮膜タンパク質を用いた、医薬または他の治療物質を特異的な組織へ標的化するための方法および組成物が提供される。本組成物はリガンド、リンカー、および治療的部分からなる治療組成物を含み、前記治療的部分は細胞内に入ることができる。リガンドは特定の組織の内皮膜上の組織特異的タンパク質に結合する抗体または他の分子であってよい。リガンドはレセプターを活性化する必要はないが、エンドサイトーシスを活性化することがある。治療的部分は薬剤、遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、造影剤、タンパク質、毒素または特異的組織に作用するどのような型の分子であっても良い。リンカーはリポソームまたは切断可能若しくは非切断性の化学的分子であってよい。あるいは、リンカーは単にリガンドと治療的部分との間の結合であっても良い。あるいは、親油性プロドラッグが切断されて、そのプロドラッグが親油性特性のために細胞内に入っても良い。
Description
【0001】
発明の分野
本発明は一般に、組織特異的内皮膜タンパク質を用いて医薬または他の治療剤を特定の組織へ標的化することに関する。
【0002】
関連技術の記載
従来の医薬が患者にデリバリーされるときは、それらは患者の全身を循環し、全てではないにしろ身体の大部分の組織または細胞に対して作用する。これは治療のために高用量を必要とし、全身毒性および副作用を生じさせる。
医薬または診断試薬の特異的器官、組織または細胞への標的化デリバリーはそのような非特異的治療よりもかなり安全であり、より効果的である。なぜなら、必要とされる薬剤の量はより少なく、副作用または毒性の可能性はかなり低いからである。
医薬の標的化デリバリーのための従前の方法には、インプラント(例えば、Elise(1999) PNAS USA 96:3104-3107)、ステントまたはカテーテル(例えば、Murphy(1992)、Circulation 86:1596-1604)の使用、または器官の血管隔離(vascular isolation)(例えば、Vahrmeijer(1998) Semin. Surg. Oncol. 14:262-268)が含まれる。しかしながら、これらの技術は侵襲的で外傷性であり、広範な炎症性応答および繊維細胞増殖を引き起こし得る。
【0003】
組織特異的デリバリーの従前のほとんどの試みは脈管構造という天然の障壁のせいで化合物がアクセスできない組織内部の部位に依存していた。化合物の標的デリバリーのための別の方法は組織細胞自体というより脈管構造の管腔表面上に露出した器官または組織特異的分子を含む。これらの分子の利用により非常に特異的な反応が可能となるであろう。この特異性は、脈管構造はそれが埋め込まれている組織の必要性に適合するために複雑で動的な系を形成するので、血管はこれらの組織特異的タンパク質を発現しなければならないという事実のためである。
従来、脈管構造の管腔表面上に露出しアクセス可能であるこれらの器官または組織特異的分子を同定するための方法は、利用可能な分子の同定に至っていない。これは内皮膜がどの器官でもその組織量のごく一部分を占めるに過ぎないからである。従来の手段で器官を解析した場合、内皮膜は組織ホモゲネート全体に分散してしまう。このことは内皮膜およびそのタンパク質を分けて解析することを本質的に不可能にしてしまう。さらに、単離して培養したとしても、これらの膜はその組織特異的特性を失う傾向がある。そのような分子が有用な様式で単離されるならば、患者の疾病の治療に関するそれらの分子の利用を可能とする方法が考慮されるに違いない。
【0004】
発明の概要
本発明のいくつかの例示的態様が存在する。そのような態様の一つは、治療薬を特異的組織にデリバリーする方法であって、治療上効果的な量の治療複合体を投与することを含み、前記治療複合体は組織特異的管腔発現タンパク質に結合するリガンド、治療的部分、および前記治療的部分を前記リガンドに連結させるリンカーを含む。
他の態様には、標的内皮細胞と相互作用する肺および/または心臓特異的治療複合体が含まれる。この複合体は、前記治療複合体を特定の組織の脈管内皮細胞膜管腔表面へ付着させるリガンド、リンカー、および治療的部分を含み、前記リガンドは配列番号9若しくは11、またはそれらの類似体に結合するものであり、前記リンカーは前記リガンドを前記治療的部分に連結させる。
別の態様には、組織または細胞中の炭酸脱水素酵素IV(CA-4)の存在又は濃度を決定する方法を含む。この方法は、上記肺および/または心臓特異的治療複合体を前記組織又は細胞にin vitro若しくはin vivoで投与すること、および、結合した治療複合体を同定またはその量を定量することを含む。
別の態様には、上述の肺および/または心臓特異的治療複合体および1以上の製薬的に許容できる担体とを含む医薬組成物が含まれる。
【0005】
別の態様には、標的内皮細胞と相互作用する肺および/または腎臓特異的治療複合体が含まれ、この治療複合体は前記治療複合体を特定の組織の脈管内皮細胞膜の管腔表面へ付着させるリガンド、リンカー、および治療的部分を含み、前記リガンドは配列番号4若しくは6またはそれらの類似体に結合し、前記リンカーは前記リガンドを前記治療的部分に連結させるものである。
別の態様には、組織または細胞のジペプチジルペプチダーゼIV(DPP-4)の存在または濃度を決定する方法が含まれ、その方法は上記肺および/または腎臓特異的治療複合体を前記組織または細胞にin vitro若しくはin vivoで投与すること、および結合する治療複合体を同定、またはその量を定量することを含む。
別の態様には、上記肺および/または腎臓特異的治療複合体および1以上の製薬的に許容できる担体を含む医薬組成物が含まれる。
【0006】
別の態様には、標的内皮細胞と相互作用する膵臓および/または消化管(gut)特異的治療複合体が含まれ、この複合体は、前記治療複合体を特定の組織の脈管内皮細胞膜の管腔表面へ付着させるリガンド、リンカーおよび治療的部分を含み、前記リガンドは配列番号14若しくは16またはそれらの類似体へ結合するものであり、前記リンカーは前記リガンドを前記治療的部分に連結させるものである。
別の態様には、組織または細胞中のZG16-pの存在または濃度を決定する方法であって、上記膵臓および/または消化管特異的治療複合体を前記組織または細胞にin vitro若しくはin vivoで投与すること、および結合した治療複合体を同定またはその量を定量することを含む。
別の態様には前記膵臓および/または消化管特異的治療複合体および1以上の製薬的に許容できる担体を含む医薬組成物が含まれる。
【0007】
別の態様には、標的内皮細胞と相互作用する前立腺特異的治療複合体が含まれ、この複合体は前記治療複合体を、配列番号23またはその類似体を含む特定の組織の脈管内皮細胞膜の管腔表面へ付着させるリガンド、リンカー、および治療的部分を含み、前記リンカーは前記リガンドを前記治療的部分に連結させるものである。
別の態様には、組織または細胞中のアルブミン断片の存在または濃度を決定する方法が含まれ、その方法は上記前立腺特異的治療複合体を前記組織または細胞へin vivo若しくはin vitroで投与すること、および結合した治療複合体を同定またはその量を定量することを含む。
別の態様には、前記前立腺特異的治療複合体および1以上の製薬的に許容できる担体を含む医薬組成物が含まれる。
【0008】
別の態様には標的内皮細胞と相互作用する脳特異的治療複合体が含まれる。この複合体は、前記治療複合体を特定の組織の脈管内皮細胞膜の管腔表面に付着させるリガンド、リンカー、治療的部分を含み、前記リガンドは配列番号26若しくは28またはそれらの類似体に結合するものであり、前記リンカーは前記リガンドを前記治療的部分に連結させるものである。
別の態様には、組織または細胞におけるCD71(トランスフェリンレセプター)の存在または濃度を決定する方法が含まれ、その方法は上記脳特異的治療複合体を前記組織または細胞にin vivoまたはin vitroで投与すること、および結合した治療複合体を同定またはその量を定量することを含む。
別の態様には、前記脳特異的治療複合体および1以上の製薬的に許容できる担体を含む医薬組成物が含まれる。
【0009】
別の態様には、標的内皮細胞と相互作用する膵臓および/または消化管特異的治療複合体が含まれ、この複合体は前記治療的部分を特異的組織の脈管内皮細胞膜の管腔表面に付着させるリガンド、リンカー、および治療的部分を含み、前記リガンドは配列番号18若しくは20またはそれらの類似体に結合し、前記リンカーは前記リガンドを前記治療的部分に連結させるものである。
別の態様には、組織または細胞におけるMAdCAM(MadCam-1)の存在または濃度を決定する方法が含まれ、その方法は上記膵臓および/または消化管特異的治療複合体を前記組織または細胞にin vitroまたはin vivoで投与すること、および結合した治療複合体を同定又はその量を定量することを含む。
別の態様には、上記膵臓および/または消化管特異的治療複合体および1以上の製薬的に許容できる担体を含む医薬組成物が含まれる。
【0010】
別の態様には、標的内皮細胞と相互作用する腎臓特異的治療複合体が含まれ、その複合体は前記治療複合体を特異的組織の脈管内皮細胞膜の管腔表面へ付着させるリガンド、リンカー、および治療的部分を含み、前記リガンドは配列番号30若しくは32またはそれらの類似体へ結合し、前記リンカーは前記リガンドを前記治療的部分に連結するものである。
別の態様には、組織または細胞におけるCD90の存在または濃度を決定する方法が含まれ、その方法は腎臓特異的治療複合体を前記組織または細胞へin vitro若しくはin vivoで投与すること、および結合した治療複合体を同定またはその量を定量することを含む。
別の態様には上記腎臓特異的治療複合体および1以上の製薬的に許容できる担体を含む医薬組成物が含まれる。
別の態様には、上記前立腺特異的治療複合体を癌細胞の数を低下させるために効果的な量で投与することを含む前立腺癌の治療方法が含まれ、前記方法において前記治療的部分は化学療法物質である。
別の態様には、上記脳特異的治療複合体を癌細胞の数を低下させるために効果的な量で投与することを含む脳腫瘍の治療方法が含まれ、前記方法において前記治療的部分は化学療法物質である。
【0011】
別の態様には、1以上の上記膵臓および/または消化管特異的治療複合体を血栓症を低下させために効果的な量で投与することを含む膵臓癌の治療方法が含まれ、前記方法において前記治療的部分は抗血栓症剤である。
別の態様には、腎臓移植拒絶を治療する方法が含まれ、前記方法は上記肺および/または腎臓特異的治療複合体を腎臓移植の拒絶を低下させるために効果的な量で投与することを含み、前記方法において前記治療的部分は免疫抑制剤である。
別の態様には特定の組織へ治療薬剤をデリバリーする方法が含まれ、前記方法は治療複合体の治療的効果量を投与することを含み、前記治療複合体は、組織特異的管腔発現タンパク質に結合するリガンド、治療的部分、および前記治療的部分を前記リガンドに連結するリンカーを含み、前記組織特異的管腔発現タンパク質はCD71、CD90、MAdCAM、アルブミン断片、炭酸脱水素酵素IV、ZG16-p、およびジペプチジルペプチダーゼIVからなる群より選ばれる。
【0012】
別の態様には、in vivoまたはin vitroにおける物質の肺および/または心臓特異的デリバリーのための方法が含まれ、前記方法は、炭酸脱水素酵素IV-結合因子を提供すること、および前記炭酸脱水素酵素IV-結合因子をin vivoまたはin vitroで投与することを含み、前記物質は炭酸脱水素酵素IV-結合因子の投与の結果として肺および/または心臓、または肺および/又は心臓組織へデリバリーされる。
別の態様には肺および/または心臓特異的リガンドを同定する方法が含まれ、前記方法は炭酸脱水素酵素IV-結合因子の同定を含む。
別の態様には、in vivoまたはin vitroにおける物質の脳特異的デリバリーのための方法が含まれ、前記方法は、CD71(トランスフェリンレセプター)結合因子を提供すること、および前記CD71-結合因子をin vivoまたはin vitroで投与することを含み、前記物質はCD71-結合因子の投与の結果として脳または脳組織へデリバリーされる。
別の態様には、CD71-結合因子を同定することを含む、脳特異的リガンドを同定する方法が含まれる。
【0013】
別の態様には、in vivoまたはin vitroにおける物質の腎臓特異的デリバリーのための方法が含まれ、前記方法は、CD90(Thy-1)結合因子を提供すること、および前記CD90結合因子をin vivoまたはin vitroで投与することを含み、前記物質はCD90-結合因子の投与の結果として腎臓または腎臓組織へデリバリーされる。
別の態様には、CD90-結合因子を同定することを含む、腎臓特異的リガンドを同定する方法が含まれる。
別の態様には、in vivoまたはin vitroにおける物質の肺および/または腎臓特異的デリバリーのための方法が含まれ、前記方法はジペプチジルペプチダーゼIV-結合因子を提供すること、および前記ジペプチジルペプチダーゼIV-結合因子をin vivoまたはin vitroで投与することを含み、前記物質はペプチジルペプチダーゼIV-結合因子の投与の結果として肺および/または腎臓、または肺および/または腎臓組織へデリバリーされる。
別の態様には、ジペプチジルペプチダーゼIV-結合因子を同定することを含む、肺および/または腎臓特異的リガンドを同定する方法が含まれる。
【0014】
別の態様には、in vivoまたはin vitroにおける物質の膵臓および/または消化管特異的デリバリーのための方法が含まれ、前記方法は、ZC16-p-結合因子を提供すること、および前記ZG16-p-結合因子をin vivoまたはin vitroで投与することを含み、前記物質はZG16-p-結合因子の投与の結果として膵臓および/または消化管、または膵臓および/または消化管組織へデリバリーされる。
別の態様には、ZG16-p-結合因子を同定することを含む、膵臓および/または消化管特異的リガンドを同定する方法が含まれる。
別の態様には、in vivoまたはin vitroにおける物質の膵臓および/または消化管特異的デリバリーのための方法が含まれ、前記方法はMAdCAM-結合因子を提供すること、および、前記MAdCAM-結合因子をin vivoまたはin vitroで投与することを含み、前記物質はMAdCAM-結合因子の投与の結果として膵臓および/または消化管、または膵臓および/または消化管組織へデリバリーされる。
別の態様には、MAdCAM-結合因子を同定することを含む、膵臓および/または消化管特異的リガンドを同定する方法が含まれる。
別の態様には、in vivoまたはin vitroにおける物質の前立腺特異的デリバリーのための方法が含まれ、前記方法はアルブミン断片-結合因子を提供すること、前記アルブミン断片-結合因子をin vivoまたはin vitroで投与することを含み、前記物質はアルブミン断片-結合因子の投与の結果として前立腺または前立腺組織へデリバリーされる。
別の態様にはアルブミン断片-結合因子を同定することを含む、前立腺特異的リガンドを同定する方法が含まれる。
【0015】
好ましい実施態様の詳細な記載
本明細書において記載される一つの実施態様は特異的な組織(それが疾病状態にあろうがなかろうが)へデリバリーするための治療化合物の組成物または治療化合物の使用方法を提供する。具体的には、本発明は、組織特異的に管腔に露出されている内皮細胞上のタンパク質を使用し、その結果、本明細書に記載する組織特異的治療複合体は、それらの療複合体が管腔露出内皮タンパク質へ結合することのために、特異的組織に局在する。この実施態様は医薬物質を特異的な組織へ局在化および濃縮することを可能とし、従ってその医薬物質の治療インデックスを増加させることができる。この局在性はその薬剤による副作用の可能性を減少させ、同じ効果を得るためにその薬剤を低濃度で使用することが可能になるであろう。管腔露出組織特異的内皮タンパク質への局在化はその組織が関与する種々の疾病の治療に単一のリガンドを使用することができるというさらなる利点を与える。言い換えると、組織の各疾病状態について疾病特異的リガンドを作製する必要がない;なぜなら、その組織または器官の管腔内皮細胞上に通常見られるタンパク質を発現している、影響を受けた組織に1以上の治療複合体の充分な量が結合するであろうから。この特徴により、単一のリガンドを使用してその組織と関連したいずれの疾病をも治療する治療複合体を作製することが可能になる。組織特異的分子は2000年3月20日出願の米国特許出願第09/528,742号の方法によって、または他のどんな同定方法によっても同定することができる。米国特許出願第09/528,742号に開示された方法は、種々の組織の血管の内表面上に露出した全てのタンパク質のin vivo単離を可能にする。組織を形成する全ての他のタンパク質(これが大多数である)はこの方法においては破棄される。次に、得られる管腔露出脈管タンパク質の組を分離して生化学的に解析して各タンパク質を個々に同定することができる。各組織で発現されているタンパク質の組を比較することにより、与えられた組織に特異的であるタンパク質が同定される。注目するタンパク質を次にシーケンシングする。その標的タンパク質に特異的に結合するリガンドが得られる。これらのリガンドはその標的タンパク質、すなわち組織特異的に管腔で発現しているタンパク質に結合すると、好ましくはそれが結合する細胞の特異的シグナル伝達系路は活性化しないが、細胞輸送または飲作用の過程を活性化し得る。
【0016】
内皮細胞組織特異的タンパク質は血液にアクセス可能で、従って、それらは特定の組織へ治療複合体を局在化させるために使用する部位特異的標的において作用することができる。血管はこれらの組織特異的内皮タンパク質を発現している。なぜなら、脈管構造はそれが埋め込まれている組織の必要性に適合した複雑かつ動的な系を形成しているからである。これらのタンパク質の多くは構成的に発現しており、このことはそれらの発現レベルは種々の疾病状態で有意には変化しないことを意味し、その組織またはその組織を含む器官が疾病状態にあるか否かにかかわらず医薬のデリバリーのための理想的な標的となることを意味する。加えて、これらのタンパク質の多くはトランスサイトーシス、すなわち血液内から組織への物質の輸送の過程、に関与している。
【0017】
定義
別に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は本発明の属する分野の当業者が一般的に理解する意味を有する。本明細書において、以下の用語は特に述べない限りそれらに割当てられた意味を有する。
本明細書において、「消化管」とは胃腸(GI)管と同義語である。
本明細書において用語「標的タンパク質」とは、組織特異的、管腔曝露脈管タンパク質である。
本明細書において、用語「リガンド」とは、標的タンパク質に特異的に結合する分子である。これらはペプチドであってもよく、抗体または抗体の一部であってもよく、非タンパク質性部分であってもよい。
本明細書において「リンカー」とは、リガンドおよび治療的部分を同じ領域、組織または細胞へ標的化することを可能とするいっさいの結合、小分子、または他のビヒクルをいう。リンカーは、標的タンパク質への結合のためにリガンドおよび治療的部分を結合させる、またはそうでなくてもこれらを一緒に保持する。
本明細書において、「治療的部分」とは、ある種の結果を生じさせるために使用することのできるどんな種類の物質をもいう。この結果とは正でも負でもありえ、あるいは、結果とは単なる診断でもあり得る。結果とは細胞の分子発現を単に変化させるというようなより些細なものでもあり得る。治療的部分はプロドラッグを対応する医薬物質へ変換することを可能とする酵素であってもよい。
【0018】
用語「治療複合体」とは、標的タンパク質に特異的なリガンドおよび1以上の治療的部分およびリンカーを含むどのような種類の分子をも言う。しかしながら、治療複合体はプロドラッグを対応する医薬物質へ変換することを可能とする酵素または他の何かの切断誘導因子を含み得ることは言うまでもない。
本明細書において「組織特異的」とは、投与後に本治療複合体の相当な割合がその組織へ結合することを可能とする、特異的な組織または細胞型において優先的に発現している分子についていう。この分子は他の組織よりも1またはいくつかの組織においてかなり高濃度で見いだされるかもしれない。例えば、組織特異的分子は他の組織に比較して肺において高度にアップレギュレーションされているかもしれないが、脈管全体にわたる結合の統計的分布に基づいてより特異的に投与することができる。治療複合体の適切な投与(しばしば低用量)は、非標的組織においてランダムに現れる量が副作用をほとんど若しくは全く生じさせないように行われるであろう。
【0019】
一般的技術
本明細書に記載する実施態様は、この分野で知られた、および、学術文献および特許文献に記載された既知のどの方法またはプロトコルによっても実施することができる。本明細書に記載の実施態様で使用する種々の組成物(たとえば、天然または合成化合物、ポリペプチド、ペプチド、核酸、抗体、毒素その他)は、遺伝的に操作され、増幅され、およびまたは組換え的に発現されて、種々の起源から単離することができる。あるいは、これらの組成物はin vitroでよく知られた、例えば、Organic Synthesis, 総集巻、Gilmanら(編集)、John Wiley & Sons, Inc.,NY; Carruthers (1982) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47: 411-418; およびCaruthersら、米国特許第4,458,066号、1984年7月3日に記載されたような化学合成技術によって合成することができる。
【0020】
治療複合体
本発明の治療複合体は標的タンパク質、例えば、膵臓、肺、筋肉、腸、前立腺、腎臓および脳の標的タンパク質に結合し、治療的部分を選択した組織又は器官へ特異的にデリバリーする。治療複合体は少なくとも一つのリガンド、リンカーおよび少なくとも一つの治療的部分からなっている(図1参照)。しかしながら、治療複合体の3種類の構成成分の連結は種々の態様を有することが想像できる。治療的部分は治療または診断方法において使用されるいかなる種類の分子の1以上でもあり得る。例えば、治療的部分は特異的組織によって取り込まれる必要のある抗生物質であり得る。治療複合体は抗生物質をそれを必要とする組織へ濃縮しかつ標的化し、それによりその抗生物質の治療インデックスを上昇させると考えることができる。あるいは、治療的部分はin vivoまたはin vitro診断目的のものでもあり得る。本発明の特定の実施態様における治療複合体の使用のさらなる例は「治療複合体相互作用の型」と題した節中でより詳細に述べる。
【0021】
リガンド
リガンドは標的タンパク質(この場合は管腔発現組織特異的タンパク質)に特異的に結合する分子である。一つの実施態様では、リガンドは管腔発現している、組織特異的分子に特異的に結合するある種の抗体またはその一部分である。通常、リガンドは天然のリガンドの結合に関与しないエピトープを認識する。管腔発現組織特異的内皮タンパク質は当業者によくられた技術、例えば、2-ハイブリッド技術、コンビナトリアルライブラリーを用いてまたは抗体分子の作製によって同定することができる。リガンドはタンパク質であっても、RNA、DNA、小分子または標的タンパク質に特異的に結合する他のどんな種類の分子であっても良い。
【0022】
標的タンパク質は内在性膜タンパク質(例えばレセプター)であってもリガンド自体であってもよい。組織特異的分子が管腔発現タンパク質に結合するリガンドであるならば、内腔および組織特異性を示すリガンドまたはその断片は本発明の治療複合体の構築に使用される。あるいは、管腔露出リガンド分子に対する、または、類似の結合特性を有する抗体、抗体断片、抗体複合体を本発明の治療複合体の構築に使用することができる。
組織特異的管腔露出タンパク質(標的タンパク質)がレセプターであるとすると、天然のリガンドは沢山の種々の方法で当業者によって同定され得る。例えば、2-ハイブリッド技術を使用することができる。あるいは、ハイスループットスクリーニングを用いてリガンドとして作用することのできるペプチドを同定することができる。リガンドを同定するための他の方法は当業者に知られている。
【0023】
一つの実施態様において、治療複合体のリガンドはレセプター標的タンパク質の天然のリガンドと異なるエピトープを利用し、従って結合部位に関する競合は起こらない。
別の実施態様において、リガンドは抗体分子であり、好ましくはこの抗体分子は、組織特異的管腔曝露レセプター標的タンパク質に対してより高い特異性を有するか、または天然のリガンドと競合する必要が無いような様式で結合する。
抗体および断片は標準的な方法(例えば,E.Harlowら、Antibodies, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Latoratory, Cold Spring Hargbor, New York, 1988を参照せよ)によって作製することができる。しかしながら、抗体の単離、同定、および分子構築はその選択がほとんど無尽蔵な程度に開発されている。従って、抗体部分および複合体の例は、何が利用可能であるかという見本を表すことができるに過ぎないという理解の下に提供される。
【0024】
一つの実施態様では、抗体は一本鎖Fv領域である。抗体分子は、重鎖および軽鎖のそれぞれにおいて、一般に認識される2つの領域を有している。これらの領域は、問題としている特異的抗原に結合することに関与するいわゆる「可変」領域、および、補体結合、好中球およびマクロファージ結合その他のような生物学的エフェクター応答に関与するいわゆる「定常」領域である。定常領域は抗原結合には必要ない。定常領域は抗体分子から分離され、可変結合領域が得られている。従って、抗体分子が本治療複合体のリガンド部分として作用する場合には、抗体分子の結合作用には明らかに定常領域は必要ない。
抗体の可変領域は軽鎖と重鎖からなっている。軽鎖および重鎖可変領域はクローン化され外来宿主において発現されており、一方、その結合能は維持されている。従って、多重鎖凝集物(抗体)から一本鎖構造体を作製し、その一本鎖構造が多重鎖凝集物の三次元構造を維持するようにすることが可能である。
【0025】
抗体分子の多重鎖可変領域の結合能特性を有する単一ポリペプチド鎖結合タンパク質であるFv断片は本発明のリガンドとして使用することができる。これらのリガンドは、例えば、Ladnerら、米国特許5,260,203号(1993年11月9日発行)に従って、コンピューターベースのシステムと化学構造を決定するための方法を用いて作製することが出来る。これらの化学構造物は、天然には凝集しているが化学的には別個である、抗体可変領域の軽および重ポリペプチド鎖を、この2つのポリペプチド鎖の元の構造に非常によく似た3次元構造へフォールディングする単一のポリペプチド鎖へ変換するために使用される。この2つの領域はアミノ酸配列を橋として使用して連結することができる。
次に、この方法によって得られる単一鎖ポリペプチドを使用してそれをコードする遺伝子配列を調製することができる。次にその遺伝子配列を、更に制御領域に連結して、適切な宿主で複製し、発現宿主(そこで発現される)へ形質転換することができる。得られた単一ポリペプチド鎖結合性タンパク質は、リフォールディングすると、抗体の可変領域の元の2つの(軽および重鎖)ポリペプチド鎖凝集物の結合特性を有する。
【0026】
更なる実施態様においては、抗体は単一本鎖抗原結合タンパク質の多価形態である。単一鎖抗原結合タンパク質の多価形態は一価の単一鎖抗原結合タンパク質を越える重要な有用性を有している。多価抗原結合タンパク質は1以上の抗原結合部位を有しており、増強された結合アフィニティーを生じさせる。多価抗体はWhitlowら、米国特許第5,869,620号(1999年2月9日発行)に開示された方法を用いて作製することが出来る。この方法は、少なくとも2つの単一鎖分子を結合することによって多価抗原結合タンパク質を作製することを含む。ここで、各単一鎖分子は、単一鎖タンパク質へと連結された抗体重鎖または軽鎖可変領域の2つの結合性部分を有している。このようにして、抗体は抗原の異なる部分に対する結合部位を有することができ、または、複数の抗原に対する結合部位を有することができる。
【0027】
一つの実施態様において、抗体はオリゴマーである。このオリゴマーはPCT/EP97/05897(1997年10月24日)におけるように、初めにファージディスプレイライブラリーから特異的なリガンドを単離することによって作製される。オリゴマーは、低アフィニティーリガンドをオリゴマー化して高アフィニティーオリゴマーを作製することによって、これらのライブラリーからはほとんど低アフィニティーリガンドが単離されるという問題を克服する。オリゴマーは半剛性ヒンジおよび軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質(Cartilage Oligomeric Matrix Protein)(COMP)のコイル化コイル領域に融合したリガンドを有する融合タンパク質を作製することによって構築される。融合タンパク質は宿主細胞内で発現されると、自己アッセンブルしてオリゴマーとなる。
好ましくは、このオリゴマーはペプタボディー(peptabody)(Terskikhら、Biochemistry 94:1663-1668 (1997))である。ペプタボディーは、各結合部位は低結合アフィニティーを有するが複合体としては高アフィニティーをもって結合できる、5量体であるIgMとして例示される。ペプタボディーはファージディスプレイランダムペプチドライブラリーを用いて作製される。ライブラリーからの短いペプチドリガンドはCOMP(軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質)5量体化領域のN-末端において半剛性ヒンジを介して融合している。この融合タンパク質はバクテリアで発現され、バクテリア内でその標的に対して高アフィニティーを示す5量体抗体にアッセンブルされる。リガンドのアフィニティーに依存して、非常に高いアフィニティーを有する抗体が作製される。
【0028】
好ましくは、本発明の抗体、抗体部分または抗体複合体はヒトに由来するか、または組換え技術または他の技術によって「ヒト化」(即ち、ヒトにおいて非免疫原性)されたものである。そのような抗体は本明細書に開示されたモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の等価物であるが、より免疫原性が低く、より良好に患者に寛容される。
ヒト化抗体は、例えば、抗体の免疫原性部分を対応する部分であるが但し非免疫原性部分に置き換える(すなわち、キメラ抗体)ことによって作製される(例えば、Robinsonら、PCT出願No. PCT/US86/02269;Akiraら、 欧州特許出願第184,187号;Taniguchi、欧州特許出願第171,496号;Morrisonら、欧州特許出願第173,494号、Neubergerら、国際公開公報No. WO86/01533;Cabillyら、欧州特許出願第125,023号;Betterら、Science 240:1041-1043 (1988);Liuら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3433(1987);Liuら、J. Immunol. 139:3521-3526(1987);Sunら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218 (1987);Nishimuraら、Canc. Res. 47:999-1005 (1987);Woodら、Nature 314:446-449 (1985));Shawら、J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559 (1988)を参照せよ。)。「ヒト化」キメラ抗体の一般的な総説はMorrison(Science, 229:1202-1207 (1985))およびOiら、BioTechniques 4:214 (1986)によって与えられる。
【0029】
あるいは、適切な「ヒト化」抗体はCDRまたはCEA置換(Jonesら、Nature 321:552-525 (1986);Verhoeyanら、Science 239:1534 (1988);Bsidlerら、J. Immunol. 141:4053-4060 (1988))によっても作製することができる。
小分子とは、一切の非生体高分子性DNA、RNA、マクロ環、アルケンアイソマーのような有機若しくは無機分子、または製薬工業において薬剤として典型的に考えられる多くのものである。これらの分子はしばしばコンビナトリアル法を通じて同定される。特に、リガンドは「ドッキング」と呼ばれる方法を用いて同定することができる。この方法は、遊離のリガンドとレセプターの構造だけが与えられた場合にリガンド−レセプター複合体の構造および結合自由エネルギーを予測しようとする合理的薬剤設計へのアプローチである。典型的にはこれらの小分子は特異的なタンパク質に結合してある効果を生じさせるために使用される。しかしながら、これとの関連において、それらの小分子を単に特定のタンパク質に結合し、接続されている薬剤を要求される器官に局在化するために使用することも考慮される。
【0030】
リンカー
本明細書において「リンカー」とは、リガンドおよび治療的部分を同じ領域、組織または細胞に標的化することを可能とする一切の結合、小分子、または他のビヒクルをいう。好ましくは、リンカーは切断可能である。
一つの実施態様において、リンカーは1以上のリガンドと1以上の治療的部分との間の化学結合である。従って、この結合は共有結合でもイオン結合でもよい。リンカーが化学結合である治療複合体の例は融合タンパク質であろう。一つの実施態様において、この化学結合は酸感受性であり、pH感受性結合は血流(pH7.5)から細胞輸送小胞または細胞内部(pH約6.0)へ移行すると切断される。あるいは、この結合は酸感受性でないかもしれないが、続いて添加される、または標的部位の微小環境中に天然に見出される特異的な酵素または化学物質によって切断することができてもよい。あるいは、この結合は還元条件下で切断される結合、例えば、ジスルフィド結合であってもよい。あるいは、この結合は切断可能でなくてもよい。
酸切断可能または酸感受性のいかなる種類のリンカーも使用できる。酸切断可能結合の例には以下が含まれるがこれらに限定されない:cis-ポリカルボキシルアルケンとして知られる有機酸クラス。このクラスの分子は少なくとも1つの二重結合を含む炭素鎖に結合した少なくとも3つのカルボキシル基(COOH)を含む。これらの分子、および、どのようにそれらを作製し使用するかはShenら、米国特許第4,631,190号に開示されている。あるいは、温和な酸性条件で切断されるアミノ-スルフィドリル架橋試薬のような分子を使用することができる。これらの分子はBlattlerら、米国特許第4,569,789号に開示されている。
【0031】
あるいは、酸切断可能リンカーは、生分解性、加水分解可能結合のような、徐放性結合であってもよい。典型的な生分解性担体結合にはエステル、アミドまたはウレタン結合が含まれ、従って典型的な担体は約5,000〜1,000,000の分子量を有するポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、および他の縮合ポリマーである。これらの担体/結合の例はPetersonら、米国特許第4,356,166号に示されている。他の酸切断可能リンカーは米国特許第4,569,789号および第4,631,190号、またはBlattnerら、Biochemistry 24: 1517-1524 (1984)に見ることができる。リンカーは天然の酸性条件下で切断され、あるいは、Abramsら、米国特許第4,171,563号に説明されるように酸性条件を標的部位において誘導することができる。
切断可能ジスルフィド結合(還元可能結合)を含むリンク試薬の例には、“DPDPB”、1,4-ジ-[3'-(2'-ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ブタン;“SADP”、(N-スクシンイミジル(4-アジドフェニル)1,3'-ジチオプロピオネート);“スルフォ-SADP”、(スルホスクシンイミジル(4-アジドフェニルジチオ)プロピオネート;“DSP”−ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート);“DTSSP”-3,3'-ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート);“DTBP”−ジメチル3,3'-ジチオビスプロピオンイミデート-2HCl(これらは全てPierce Chemicals(Rockford、Illinois)から入手可能)が含まれるが、これらに限定されない。
酸化によって切断可能なリンク試薬の例は、“DST”−ジスクシンイミジルタルタレートおよび“スルホ-DST”−ジスクシンイミジルタルタレートである。これらのリンカーもPierce Chemicals(Rockford、Illinois)から入手可能である。
【0032】
非切断性リンカーの例は、“スルホ-LC-SMPT”−(スルホスクシンイミジル6-[α-メチル-α-(2-ピリジルチオ)トルアミド]ヘキサノエート、“SMPT”;“ABH”−アジドベンゾイルヒドラジド;“NHS-ASA”−N-ヒドロキシスクシンイミジル-4-アジドサリサイクリック酸(N-Hydroxysuccinimidyl-4-azidosalicyclic acid);“SASD”−スルホスクシンイミジル2-(p-アジドサリチルアミド)エチル-1,3-ジチオプロピオネート;“APDP”−N-{4-(p-アジドサリチルアミド)ブチル}-3'(2'-ピリジルジチオ)プロピオンアミド;“BASED”−ビス-[β-(4-アジドサリチルアミド)エチル]ジスルフィド;“HSAB”−N-ヒドロキシスクシンイミジル-4 アジドベンゾエート; “AGP”−p-アジドフェニルグリオキサル一水和物;“SANPAH”−N-スクシンイミジル-6(4'-アジド-2'-ニトロフェニル-アミノ)ヘキサノエート;“スルホ-SANPAH”−スルホスクシンイミジル6-(4'-アジド-2'-ニトロフェニルアミノ)ヘキサノエート;“ANB-NOS”−N-5-アジド-2-ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド;“SAND”−スルホスクシンイミジル-2-(m-アジド-o-ニトロベンズアミド)-エチル-1,3'-ジチオプロピオネート;“PNP-DTP”−p-ニトロフェニル-2-ジアゾ-3,3,3-トリフルオロプロピオネート;“SMCC”−スクシンイミジル4(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート;“スルホ-SMCC”−スルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート;“MBS”−m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル;“スルホ-MBS”−m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル;“SIAB”−N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート;“スルホ-SIAB”−N-スルホスクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート;“SMBP”−スクシンイミジル4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート;“スルホ-SMPB”−スルホスクシンイミジル4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート;“DSS”−ジスクシンイミジルスベレート;“BSSS”−ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート;“BMH”−ビスマレイミドヘキサン;“DFDNB”−1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン;“DMA”−ジメチルアジピミデート2HCl;“DMP”−ジメチルピメリミデート-2HCl;“DMS”−ジメチルスベルイミデート-2-HCl;“SPDP”−N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルチオ)プロピオネート;“スルホ-HSAB”−スルホスクシンイミジル4-(p-アジドフェニル)ブチレート;“スルホ-SAPB”−スルホスクシンイミジル4-(p-アジドフェニルブチレート);“ASBI”−1-9p-アジドサリチルアミド)-4-(ヨードアセトアミド)ブタン;“ASBA”−4-(p-アジドサリチルアミド)ブチルアミン。これらのリンカーは全てPierce Chemicalsから入手可能である。
【0033】
別の実施態様において、リンカーはペプチドリンカーのような小分子である。一つの実施態様において、ペプチドリンカーは切断可能ではない。さらなる実施態様において、ペプチドリンカーは塩基によって、または還元条件下で、または特異的酵素によって切断可能である。一つの実施態様において、酵素は自家性である(indigenous)。あるいは、小ペプチドは治療複合体の投与の後、またはそれに加えて投与される非自家性酵素によって切断されても良い。あるいは、小ペプチドは、例えばペプチドがジスルフィド結合を有する場合、還元条件下で切断されてもよい。あるいは、小ペプチドはpH感受性でもよい。ペプチドリンカーの例には以下が含まれる:ポリ(L-Gly)、(ポリL-グリシンリンカー);ポリ(L-Glu)、(ポリL-グルタミンリンカー);ポリ(L-Lys)、(ポリL-リジンリンカー)。一つの実施態様において、ペプチドリンカーは式(アミノ酸)n、(式中、nは2〜100の整数)で表され、好ましくはペプチドは1以上のアミノ酸のポリマーを含む。
【0034】
さらなる実施態様において、ペプチドリンカーは、配列Gly-(D)Phe-Pro-Arg-Gly-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly(配列番号1)(Suzukiら、1998, J. Biomed. Mater. Res. Oct; 42(1):112-6)のような、プロテイナーゼで切断され得るものである。この実施態様は、細菌感染、特にシュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)感染の治療に有利であることが示されている。ゲンタマイシン又は他の抗生物質は傷がPseudomonas aeruginosaに感染した場合にのみ切断される。なぜなら、そこには非感染組織に比べてトロンビン-様プロテイナーゼのかなり高い活性が存在するからである。
更なる実施態様において、リンカーは酵素サーモリシンによって切断され得る、ポリ(エチレングリコール)(PEG)およびジペプチド、L-アラニル-L-バリン(Ala-Val)を含む切断可能リンカーである。サーモリシン-様酵素は多くの腫瘍部位において発現されていると報告されているので、このリンカーは有利である。あるいは、プロテアーゼ、フリンの認識部位(Goyalら、Biochem. J. 2000 Jan 15:335 Pt 2:247-254)を含む12残基スペーサーThr-Arg-His-Arg-Gln-Pro-Arg-Gly-Trp-Glu-Gln-Leu(配列番号2)を使用することができる。
化学リンカーおよびペプチドリンカーは、結合体合成についてこの分野で知られた技術、すなわち遺伝子操作により、または化学的にリガンドと治療的部分の間を結合することができる。結合体合成は、適切な官能基におけるタンパク質の他の部分への古典的カップリング反応によって、適切な抗体を介して化学的に達成することができる。タンパク質中に存在し、通常化学カップリングに使用される官能基の例を以下に概説する。炭水化物構造はアルデヒド基に酸化することができ、次にはH2NNH-R(式中Rは化合物)を含む化合物と反応してC=NH-NH-R基を形成する。チオール基は(タンパク質中のシステイン)、チオール反応性基を含む化合物と反応してチオエーテル基またはジスルフィド基を形成し得る。アミノ酸残基中の遊離のアミノ基(タンパク質のアミノ末端またはリジン上)は活性化カルボキシル基のような親電子基を含む化合物と反応することができ、アミド基を形成することができる。アミノ酸残基中の遊離のカルボキシル基は活性化カルボキシル基に変換されて、次にアミノ基を含む化合物と反応してアミド基を形成することができる。
【0035】
あるいは、リンカーはリポソームであってもよい。リポソームを調製する多数の方法がこの分野で知られている。例えば、逆相エバポレーション法、凍結融解法、押出法、および、脱水-再水和法(Stormら、PSTT 1:19-31 (1998)を参照せよ)。
リポソームは、重合の際に物質が被包化されるように治療的部分を含む溶液中で作製することができる。あるいは、リポソームは最初に重合化し、重合化したリポソームを生物学的に活性な物質の溶液中に再懸濁して音波処理して治療的部分を被包化することによって、生物学的に活性な物質を後で添加することもできる。リポソームはリガンドの存在下で重合化して、リガンドがリン脂質二重層の一部になるようにすることができる。一つの実施態様において、リポソームは治療的部分を内側に、リガンドを外側に含む。
本発明において考慮されるリポソームは種々の構造をとることができる。例えば、リポソームは大多重ラメラベシクル(MLV)、オリゴラメラベシクル(OLV)でも、単層ラメラベシクル(UV)でも、小単層ラメラベシクル(SUV)、中間サイズ単層ラメラベシクル(MUV)、大単層ラメラベシクル(LUV)、巨大単層ラメラベシクル(GUV)または多胞体ベシクル(MVV)でもありえる。これらのリポソーム構造のそれぞれはこの技術分野でよく知られている(Stormら、PSTT 1:19-31 (1998)を参照せよ)。
【0036】
一つの実施態様において、リポソームは、例えば特定の周波数のラジオ派をかけることによって医薬品を引き抜く(evulse)「微小機械」である。別の実施態様では、リポソームは標的細胞内で治療的部分を放出するように分解され得る(例えば、リポソームは酸またはアルカリ感受性であってよく、または低pHまたは高pH存在下で分解され、治療的部分が細胞内で遊離される)。あるいは、リポソームは無荷電にされ、その結果標的細胞に取り込まれるであろう。リポソームはpH感受性であっても還元条件に感受性であってもよい。
本発明において有利なリポソームの一つの型はLangerら、米国特許第6,004,534(1999年12月21日発行)中で明らかにされているものである。この出願では、二重結合および三重結合含有モノマーリン脂質の重合によって調製される改変リポソームの作製方法が開示されている。これらのリポソームは消化管の過酷な環境に対して予想外に増強された安定性を有する。従って、それらは治療的部分の経口および/または粘膜デリバリーのために有用である。リポソームは全身性循環及びリンパ循環へ吸収され得ることが示されている。リポソームは一般に二重結合および三重結合含有モノマーリン脂質の重合(例えばラジカル開始または照射)によって調製される。
【0037】
本発明の別の実施態様において、リンカーは長い血液循環時間を有するリポソームであり得る。そのようなリポソームはこの技術分野でよく知られている(米国特許第5,013,556号、第5,225,212号、第5,213,804号、第5,356,633号、及び第5,843,473号を参照せよ)。長い血液循環時間を有するリポソームは、ポリエチレングリコール(PEG)または他の類似のポリマーで誘導体化されたリン脂質部分を有することによって特徴付けられる。ある実施態様において、リン脂質に遠位のPEG分子末端は化学的に反応性であるように活性化されていてよい。このような反応性PEG分子はリガンドをポリマーに連結するために使用することができる。反応性PEG分子の一つの例は、米国特許第5,527,528号に記載されたPEGのマレイミド誘導体である。
あるいは、リンカーはマイクロカプセル、ナノ粒子、磁性粒子その他であってよく(Kumar, J. Pharm. Sci., May-Aug 3(2) 234-258, 2000;およびGillら、Trends Biotechnol. Nov; 18 (11):469-79, 2000)、親油性治療的部分をコンテナ上または内部に有し、そのコンテナは治療複合体中でリンカーとして機能する。
【0038】
あるいは、リンカーは光切断可能リンカーであってもよい。例えば、1-2-(ニトロフェニル)-エチル部分は300〜360nmの光によって切断することができる(Piereceカタログ番号21332ZZを参照せよ)。光切断可能リンカーがより特異的な領域、例えば器官の特定の部分における薬剤の活性化および作用を許すことも想定される。光は脈管内のカテーテルを用いて局在化させることができる。あるいは、光は消化管の特異的な部分の局所治療に使用することができ、光はその領域に対する天然の開口部を通して操作することもできる。あるいは、その領域へ外科的に光を操作することができる。
あるいは、リンカーは切断可能でないが、治療的部分又はリガンドが切断可能であってもよい。治療的部分がプロドラッグであって、そのプロドラッグを切断する酵素が治療複合体と共に投与される場合がこの例である。あるいは、酵素が治療複合体の一部、または自家性であって、プロドラッグは別個に投与される。好ましくは、別個に投与される酵素またはプロドラッグは最初の投与から約48時間以内に投与する。あるいは、別個に投与されるプロドラッグまたは酵素は約1分〜24時間に投与してよく、あるいは約2分〜8時間に投与してもよい。別個に投与されるプロドラッグまたは酵素はより遅い日に投与してもよく、その薬剤の効果が最早必要でなくなるか、全ての薬剤の酵素切断が行われるまで続けて投与してもよい。
【0039】
治療的部分
「治療的部分」は、所望の結果を生じさせるいかなる化学物質、分子または複合体であってもよい。その例には以下が含まれるが、これらに限定されない:抗生物質、抗腫瘍剤、免疫抑制剤、ホルモンその他の伝統的医薬物質または、1以上の遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、造影物質、タンパク質、毒素、放射活性分子または原子、界面活性タンパク質、凝固タンパク質。治療的部分は親油性であってよく、その性質は標的細胞への進入を助けるであろう。
造影物質はこの分野で当業者に知られたどんな種類の造影物質であってもよい。最も一般的な造影物質は基本的には以下の4つのグループの一つに帰属する:X-線試薬、ラジオグラフィー試薬、磁気共鳴イメージング剤、および超音波試薬。X-線試薬にはイオン性、ヨード含有試薬およびオムニパック(Omnipaque)(Nycomed)およびウルトラヴィスト(Ultravist)(Schering)のような非イオン性試薬が含まれる。ラジオグラフィー試薬は以下に開示する放射性同位体が含まれる。磁気共鳴イメージング剤には、ガドリニウムおよび鉄-酸化物キレートのような磁性物質が含まれる。超音波試薬には、気体の微小気泡およびいくつかの気泡放出配合物が含まれる。
【0040】
放射性核種は診断用でも治療用でもよい。一般に医学的に有用な放射性核種の例には以下が含まれる:90Y、111Ln、67Cu、77Lu、99Tcその他のようなY、Ln、Cu、Lu、Tc、Re、Co、Feその他、好ましくは90Yおよび111Lnのような三価の陽イオン。
診断的γシンチレーション測光による器官及び組織のin vivo画像化に適切な放射性核種には以下が含まれる:γ放射性核種:111Ln、113mLn、67Ga、68Ga、99mTc、51Cr、197Hg、169Yb、85Sr、および87Sr。Fab'断片による結合に適したキレート放射性核種は米国特許第4,658,839号(Nicolettiら)に教示されている。
MRIにおいてイメージング物質として適切な常磁性金属イオンには原子番号57〜70のランタニド元素、または原子番号21〜29、42または44の遷移金属が含まれる。米国特許第4,647,447号(Griesら)はキレート常磁性金属イオンによるMRIイメージングを教示する。
【0041】
治療的放射性核種の例はβ放射体である。適切なβ放射体には67Cu、186Rh、188Rh、189Rh、153Sm、90Yおよび111Lnが含まれる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは正常な遺伝子の過剰発現または異常な遺伝子の発現によって生じたいかなる疾病の治療にも使用できる可能性を有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドはその遺伝子の発現を低下させるまたは停止させるために使用することができる。アンチセンス技術で治療できる癌遺伝子および使用できる特異的なアンチセンス分子を開示した参照文献には以下が含まれる:c-Junおよびc-Fos(米国特許第5,985,558号);HER-2(米国特許第5,968,748号);E2F-1(Popoffら、米国特許第6,187,587号)、SMAD 1-7(米国特許第6,159,697号;第6,013,788号;第6,013,787号;第6,013,522号および第6,037、142号)およびFas(Deanら、米国特許第6,204,055号)。
【0042】
治療剤として使用できるタンパク質にはpRBおよびp53のような、細胞内に存在するとアポトーシスを誘導するアポトーシス誘導物質(Xuら、米国特許第5,912,236号)、および、エリスロポイエチン(Sytkowskiら、米国特許第6,048,971号)のような、疾病において欠損するまたは発現不足となるタンパク質が含まれる。
治療的部分は、アルキル化剤(窒素マスタード、エチレンイミン、アルキルスルホネート、ニトロソウレアおよびトリアゼン)、代謝物拮抗物質(メトトレキセートのような葉酸類似体、ピリミジン類似体、およびプリン類似体)、天然産物およびその誘導体(抗生物質、アルカロイド、酵素)、ホルモンおよびアンタゴニスト(アドレノコルチコステロイド、プロゲスチン、エストロゲン)その他のような、腫瘍性疾患のためのいかなる化学療法物質であってもよいことが考えられる。あるいは、治療的部分は抗腫瘍剤として作用するアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよく、腫瘍細胞のアポトーシスを活性化するタンパク質であってよい。
治療的部分はどんな型の神経エフェクターであってもよく、例えば神経伝達物質または神経伝達物質アンタゴニストを、その使用について一般に経験される種々の副作用を生じさせず、それが必要な領域に標的化することができる。
【0043】
治療的部分はオピオイドのような、痛みの領域に特異的に標的化できる麻酔剤であってもよい。吐き気のような副作用がオピオイド鎮痛剤を使用する患者に一般に経験される。本発明の方法は薬剤を、外科的な傷または関節炎の場合には関節のように、それが必要とされる領域への非常に特異的な局在化を可能とするので、副作用を低減することができる。
治療的部分はヒスタミン、H1-レセプターアンタゴニスト、およびブラジキニンのような抗炎症剤であり得る。あるいは、抗-炎症剤は、サリチル酸誘導体、インドールおよびインデン酢酸およびアルカノンのような非ステロイド抗炎症剤であってよい。あるいは、抗炎症剤は、コルチコステロイド、クロモリンナトリウムおよびネドクロミルのような喘息治療用抗炎症剤であってよい。抗炎症剤はB2-選択的アドレナリン作動薬およびテオフィリンのような気管支拡張剤と共にまたは伴わずに投与することができる。
治療的部分は、特異的に患者の血圧に影響する、利尿剤、バソプレシンアゴニストまたはアンタゴニスト、アンジオテンシンまたはレニンであってよい。
【0044】
治療的部分は心臓疾病の治療に使用されるどんな医薬剤であってもよい。そのような医薬剤には有機ニトライト(亜硝酸アミル、ニトログリセリン、イソソルバイドジニトレート)、カルシウムチャンネル遮断薬、抗血小板剤および抗血栓薬、血管拡張剤、血管抑制薬、抗-ジギタリス抗体、および血栓遮断薬が含まれるが、これらに限定されない。
治療的部分は、テトラサイクリン、クリンダマイシン、キニン、クロロキニン、メフロキン、トリメトプリムスルファメトキサゾール、メトロニダゾール、およびオラミンのような、原生生物感染の治療に使用されるいかなる医薬であってもよい。これらの抗生物医薬で経験される非常に一般的で重篤な副作用故に、原生生物感染領域に医薬または他の治療剤を標的化できることは特に価値がある。
治療的部分は、スルホンアミド、キノロン、ペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、イソニアジドおよびリファンピンのようないかなる抗細菌薬であってもよい。
治療的部分は、アンホテリシン、フルシトシン、ミコナゾールおよびフルコナゾールのような、真菌感染の治療に使用されるいかなる医薬剤であってもよい。
【0045】
治療的部分は、アシクロビル、ビダラビン、インターフェロン、リバビリン、ジドブジン、ザルシタビン、逆転写酵素阻害剤、およびプロテアーゼ阻害剤のような、ウイルス感染の治療に使用されるいかなる医薬剤であってもよい。ウイルス感染した細胞は、毒素、放射活性原子、およびアポトーシス誘導物質のような他の治療的部分を用いて標的化および殺傷することもできることが考慮される。
治療的部分は多様な抗凝集剤、抗血栓溶解薬、および抗血小板薬から選択することができる。
ホルモンの過剰産生または産生不足によって生じる疾病はホルモン(成長ホルモン、アンドロゲン、エストロゲン、ゴナドトロピン-放出ホルモン、甲状腺ホルモン、副腎皮質ステロイド、インスリンおよびグルカゴン)のような治療的部分を用いて治療できることが想像される。あるいは、ホルモンが過剰産生される場合、そのホルモンのアンタゴニストまたは抗体を治療的部分として使用することができる。
他の可能性のある種々の治療的部分には、ビタミン、酵素、および他の産生不足細胞成分、およびジフテリア毒素またはボツリヌス毒素のような毒素が含まれる。
あるいは、治療的部分はin vitro診断に典型的に使用されるものであってよい。従って、リガンドおよびリンカーを慣用される方法によって標識し、シグナル生成系の全体または一部を形成させることができる。リガンドおよびリンカーは、この分野でよく知られた方法により、トリチウム、炭素14、リン32、ヨード125、およびヨード131のような放射性同位体へ共有結合させることができる。
【0046】
例えば、125Iはクロラミン-T法のような方法、ラクトペルオキシダーゼ法によって酵素的に、または前標識ボルトン-ハンター技術によって導入することができる。これらの技術および他の技術がH. Van VunakisおよびJ.J. Langone編集、Methods in Enzymology,第70巻、Part A、1980で論じられている。また、放射活性標識のさらなる例については、それぞれ、米国特許第3,646,346号(1972年2月29日発行)およびEdwardsら、米国特許第4,062,733号(1977年12月13日発行)を参照されたい。
治療的部には、可視、紫外波長の光を吸収する化合物である、発色性標識も含まれる。そのような化合物は通常、染色剤であり、キノリン色素、トリアリールメタン色素、フタレイン、昆虫色素、アゾ色素、アントラキモイド色素、シアニン色素、およびフェナゾキソニウム色素が含まれる。
蛍光原性化合物もこの治療的部分であってよく、それらには光照射に続いて紫外波長または可視波長の光を放射する化合物が含まれる。発蛍光団はそれ自体または消光分子と共に用いることができる。主要な発蛍光団はローダミン、フルオレセインおよびウンベリフェロンファミリーである。これらの発蛍光団及び他の発蛍光団の結合方法および使用についてはこの分野に見ることができる。例えば、J.J. Langone, H.Van Vunakisら、Methods in Enzymology, 第74巻、Part C、1981、特に第3〜105頁を参照されたし。他の適切な発蛍光団の代表的な列挙については、Tomら、米国特許第4,366,241号(1982年、12月28日発行)、特に、第28欄、第29欄を参照されたし。更なる例については、米国特許第3,996,345号を参照せよ。
【0047】
これらの非酵素的シグナル系は本発明のために充分な治療的部分である。しかしながら、当業者は酵素触媒シグナル系は非酵素系よりも一般に感度がより高いことを認識するであろう。従って、本発明において、触媒性標識は、より感度の高い非放射活性標識である。
触媒性標識にはこの技術分野で知られたものが含まれ、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ(リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ)その他のような単一または二成分(「チャネル化」)酵素が含まれる。二成分(「チャネル化」)触媒反応系の例には、初期基質としてグルコース-6-リン酸を用いたアルカリホスファターゼおよびグルコースオキシダーゼの系が含まれる。そのような二成分触媒反応系の第2の例は、グルコースオキシダーゼによるグルコースの過酸化水素への酸化(過酸化水素はロイコ塩基と反応してシグナル発生物質を生成する)によって例示される。触媒反応系に関するさらなる議論は、Tomら、米国特許第4,366,241号(1982年、12月28日発行)(特に第27欄〜第40欄参照)に見られる。また、Wengら、米国特許第4,740,468号(1988年、4月26日発行)(特に、第2欄、第6,7および8欄)を参照されたし。
【0048】
酵素を本治療複合体へ取り込む方法はこの分野でよく知られている。この方法に使用する試薬には、グルタルアルデヒド、p-トルエンジイソシアネート、種々のカルボジイミド試薬、p-ベンゾキノンm-ペリオデート、N,N'-o-フェニレンジマレイミドその他(例えば、J.H.Kennedyら、Clin. Chim. Acta 70, 1 (1976)を参照せよ)が含まれる。本発明の別の特徴として、上述したいずれのデバイスおよび様式も、組織特異的内皮タンパク質のアッセイに使用するための所定の量の試薬と組み合わせて梱包したキットとして供給することができる。
化学発光標識も治療的部分として適用可能である。例えば、C.L. Maier、米国特許第4,104,029号(1978年、8月1日発行)に列挙された標識を参照せよ。
上述した触媒反応系のための基質には、パラニトロフェニルリン酸塩(PNPP)、β-D-グルコース(おそらく適切な酸化還元色素と共に)、ホモバニリン酸、o-ジアニシジン、ブロモクレゾール紫粉末、4-アルキル-ウンベリフェロン、ルミノール、パラ-ジメチルアミノロフィン、パラメトキシロフィン、AMPPDその他のような単純な発色原および発蛍光原が含まれる。
【0049】
標識及び触媒反応シグナル生成系の性質に依存して、光で照射し蛍光のレベルを観察すること;触媒反応系に色素、蛍光または化学発光を生じさせることであって、前記色素は視覚的または分光光度計によって観察できるものであり、前記蛍光は視覚的または蛍光分光計によって観察できるものでること;または化学発光の場合または放射活性標識の場合には、放射能計測器を使用すること、によってシグナルを観察できる。適切な機器が利用できない場合は、目に見える着色を生じさせる発色団を生成させることが通常望ましい。高性能の機器が利用できる場合は、いずれの技法も適用可能である。
あるいは、治療的部分は、化学的環境または酵素のような別個の分子試薬の作用によって対応する医薬物質に変換されるプロドラッグまたはプロ分子(promolecule)であってよい。好ましくは、治療的部分はプロ分子の変換に必要な特異的な分子と共に投与される。あるいは、このプロ分子は標的組織の微小環境に見出される天然の分子によって切断されてもよい。あるいは、プロドラッグはpH感受性で血液から細胞または小胞への環境変化があると変換される(Grecoら、J. Cell. Physiol. 187:22-36, 2001)。
【0050】
治療複合体の使用
本治療複合体は組織特異的または器官特異的治療が効果的であるいかなる疾病の治療または診断にも使用することができる。そのような組織および疾病の例は以下の通りである:
一つの実施態様において、本治療複合体は脳に影響を与える疾病の治療または症状を軽減するために使用することができる。そのような疾病には以下が含まれるが、それらには限定されない:細菌感染、ウイルス感染、真菌および寄生虫感染、てんかん、統合失調症、双極性障害、神経症、うつ病、脳腫瘍、パーキンソン病、アルツハイマー病および他の形態の痴呆疾患、プリオン関連病、卒中、偏頭痛、運動失調、多発性硬化症、髄膜炎、脳膿瘍およびウェルニッケ病または他の代謝疾病。
さらなる実施態様において、本治療複合体は肺に影響を与える疾病の治療に使用することができる。そのような疾病の例には以下が含まれるが、これらに限定されない:細菌感染(すなわち、S.ニューモニアエ(S.pneumoniae)、結核菌(M.tuberculosis))、ウイルス感染(すなわち、ハンタウイルス(Hantavirus))、真菌および寄生虫感染(すなわち、ニューモシスティス-カリニ(Pneumocystis carinii))、喘息、肺癌、肺気腫、肺移植拒絶、嚢胞性繊維症、高血圧症、肺血栓塞栓症および肺浮腫。
【0051】
さらなる実施態様において、本治療複合体は膵臓に影響を与える疾病の治療または症状を軽減するために使用することができる。そのような疾病の例には以下が含まれるが、これらに限定されない:寄生虫感染、膵臓癌、慢性膵臓炎、膵機能不全、内分泌腺腫瘍および糖尿病。
一つの実施態様において、本治療複合体は腎臓に影響を与える疾病の治療または症状を軽減するために使用することができる。そのような疾病の例には以下が含まれるが、これらに限定されない:細菌感染、ウイルス感染、真菌および寄生虫感染、多発性嚢胞腎疾病、腎移植拒絶、浮腫、高血圧症、多血症、膀胱および腎臓癌および尿毒症症候群。
一つの実施態様において、本治療複合体は筋肉に影響を与える疾病の症状を治療または軽減するために使用することができる。そのような疾病の例には以下が含まれるが、これらに限定されない:筋ジストロフィー、多発性筋炎、関節炎、横紋筋肉腫、グリコーゲン貯蔵異常、および軟組織肉腫。
【0052】
一つの実施態様において、本治療複合体は消化管または腸に影響を与える疾病の治療または症状を軽減するために使用することができる。そのような疾病の例には以下が含まれるが、これらに限定されない:赤痢、胃腸炎、過敏性腸症候群、憩室症/憩室炎、消化性潰瘍、クリプトスポリジウム症、ジアルジア症、炎症性腸疾病、結直腸癌、および小腸腫瘍。
一つの実施態様において、本治療複合体は前立腺に影響を与える疾病の治療または症状を軽減するために使用することができる。そのような疾病の例には以下が含まれるが、これらに限定されない:前立腺過形成、前立腺癌、および前立腺感染症。
【0053】
さらなる実施態様において、本治療複合体は疾病または組織型の診断、または組織特異的管腔発現タンパク質を定量または同定するために使用することができる。
標的タンパク質を保持する細胞は2つの一般的な経路、トランスサイトーシス(経細胞輸送)または受動拡散によって治療複合体と相互作用する。これらの相互作用により、治療複合体は標的タンパク質を保持する脈管内皮細胞と直接相互作用することができ、前記内皮細胞を含む内皮マトリックス内に絡みつく、または内皮マトリックスを通過して被包化された組織又は器官内に入ることができる。
内皮細胞上で複合体が標的タンパク質に付着した後、治療複合体が脈管を横断して内皮マトリックス組織または選択した内皮細胞へ経細胞輸送された場合にトランスサイトーシスが起こる。好ましくは、標的タンパク質へのリガンドの結合はトランスサイトーシス小胞内の内皮細胞を横断する治療複合体の輸送を刺激するであろう。トランスサイトーシスの際、ベシクルの微小環境内部の条件はより高度に酸性であり、治療的部分の選択的切断に利用することができる。これが起こるためには、好ましくはリンカーは、血流(pH 7.5)からトランスサイトーシスベシクルまたは細胞内部(pH6.0)へ移行したときのpH変化のせいで切断されるように、開示された酸感受性リンカーのようにpH感受性でなければならない。あるいは、リガンドと治療的部分との間の結合自体が酸感受性である場合は、別個のリンカーは必要でないかも知れない。
【0054】
受動拡散において、複合体中のリガンドは細胞膜の外側に付着することができ、続いて治療的部分が遊離され、内皮細胞または組織へ受動的手段で横断するが、細胞内への治療複合体全体の侵入はない。好ましくは、治療薬は特異的標的組織内の内皮の直ぐ近傍で高濃度に遊離される。そのような高濃度は全身組織に比べてかなり高い濃度の薬剤が標的組織において生じさせることが期待される。
治療複合体は、細胞によって取り込まれ、細胞または細胞マトリックス内に停留し、または器官へと通過し、その器官内部で拡散し得る。
本発明の治療複合体は有利に特異的組織、器官または細胞上の標的タンパク質に結合し、所望の成果のために使用することができる。一つの実施態様において、治療複合体は毒性物質を特定の環境に維持するために使用され、それにより治療的部分の環境への標的化をより特異的なものとし、治療的部分の全身効果を防止することが可能となる。加えて、同じ効果のために必要な物質の量はより低濃度であろう。
さらなる実施態様において、治療複合体は物質が組織へ入らないようにするために使用することができる。治療的部分は、もし活性化されると周辺組織に更に害を与えるであろうレセプターを遮断するために使用することができるかもしれない。
更なる実施態様において、治療複合体は界面活性タンパク質またはホルモンのような、機能不全または特定の組織から欠損している物質を置換するために使用される。
【0055】
プロドラッグ
プロドラッグの概念はこの技術分野でよく知られており、本明細書でも同様な様式で使用する。プロドラッグは、プロドラッグから対応する医薬物質への変換の前後で異なる医薬的特徴を有している。本発明の治療複合体はプロドラッグの使用を2つのやり方で有利に取り込むことができる。本治療複合体は、非自家性酵素の続く注入または選択した組織に見出される酵素によって変換され得る治療的部分として接続されたプロドラッグを有してよい。あるいは、治療的部分はプロドラッグを変換するのに必要な酵素であってもよい。例えば、酵素β-ラクタマーゼは治療複合体の一部であってよく、プロドラッグ(例えばドキソシリン)が続いて添加され、そしてβ-ラクタマーゼは標的組織のみに見出されるので、ドキソシリンはその領域においてのみ正体を現す。残念なことに、腫瘍組織は通常、正常組織と酵素レパートリーを共通にし、そのことは自家性酵素をあまり有望でなくする。しかしながら、疾病組織は、特に病原体による疾病の場合、組織に感染している病原体に特異的な酵素を生成していることがあり、そのことはその感染組織に非常に特異的で効果的なプロドラッグを設計するために利用することができることが分かる。例えば、ウイルス酵素(例えばHBV)によって変換されるプロドラッグは非常に特異的な抗ウイルス効果を得るために肝臓特異的な抗ウイルス治療複合体と共に使用することができる。なぜなら、そのプロドラッグはウイルスを含む微小環境においてのみ変換されるであろうから。
【0056】
従って、一つの実施態様においては、「リガンド-酵素」治療複合体は非接続プロドラッグと組み合わせて使用される。プロドラッグは酵素によって切断され、細胞に入る。好ましくは、プロドラッグは親水性であり、内皮細胞への接近が遮断され、一方(切断された)薬剤は親油性で細胞への侵入能力が増強される。あるいは、「リガンド−プロドラッグ」は、接続されていない非自家性酵素の投与または自家性酵素と組み合わせて治療複合体として使用される。このプロドラッグは酵素によって切断され、治療剤から分離され、その親油性特性は細胞への侵入を可能とする。
プロドラッグアプローチの利点のうちの2つは、傍観者殺作用および増幅である。癌の治療における抗体または免疫複合体の従前の使用の問題点の一つは、それらが細胞によってあまり取り込まれず、あまり局在化されないことである。しかしながら、プロドラッグ治療を利用する場合、単一の酵素分子が1以上のプロドラッグ分子を変換することができるので、取込の機会はかなり増加または増幅される。加えて、活性薬剤は腫瘍全体に拡散するので、傍観者効果を生じさせ、抗原-陰性、異常細胞に対する殺作用またはその他の治療作用を生じさせる。この傍観者効果は正常細胞にも作用するかも知れないが、それらの細胞は腫瘍器官または疾病器官の直接近傍にある細胞のみであろう。
【0057】
いくつかのプロドラッグは癌治療に広範に使用されており、以下に本発明において使用できるプロドラッグの例として提示する(Grecoら、J. Cell. Phys. 187:22-36, 2001;および、Konstantinosら、Anticancer Research 19:605-614, 1999)。しかしながら、それらは本発明の多数の例のいくつかであることは言うまでもない。
最もよく研究された酵素/プロドラッグ組合せはヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ(HSV TK)とヌクレオチド類似体GCVである。GCVおよび関連物質は哺乳動物ヌクレオシド一リン酸キナーゼの不適当な基質であるが、HSV 1のTKによって効率的に(1000倍以上)モノホスフェートに変換され得る。細胞性酵素によって触媒される続く反応によりいくつかの毒性代謝物が生じる。最も活性なのはトリホスフェートである。GCV-トリホスフェートは細胞分裂の際にDNAの伸長取込についてデオキシグアノシン三リン酸と競合し、DNAポリメラーゼの阻害を生じさせ一本鎖中断を生じさせる。
シトシンデアミナーゼと5-フルオロシトシン(それぞれ、CDおよび5-FC)からなるシステムは同様に毒性ヌクレオシド類似体の産生に基づいている。酵素CDはある種のバクテリアおよび真菌に見出されるが哺乳動物細胞には見られず、シトシンからウラシルへの加水分解的脱アミノを触媒する。従って、この酵素は非毒性プロドラッグ5-FCを5-フルオロウラシル(5-FU)に変換し、次に細胞性酵素によって5-FUは強力なピリミジン抗代謝物質(5-FdUMP、5-FdUTP、および5-FUTP)に変換される。誘導細胞死において3つの経路が関与する:チミジレートシンターゼ阻害、(5-FU)RNAおよび(5-FU)DNA複合体の形成。
【0058】
マスタードプロドラッグCB1954[5-(アジリジン-1-イル)-2,4-ジニトロベンズアミド]は弱い一官能性アルキル化剤であるが、げっ歯類DTジアフォラーゼによって効果的に活性化され強力なDNA架橋剤となり得る。しかしながら、ヒトのDTジアフォラーゼ酵素はこのプロドラッグと低い反応性を示し、副作用を生じさせる。この問題は大腸菌ニトロレダクターゼ酵素(NTR)がCB1954プロドラッグをげっ歯類DTジアフォラーゼよりも90倍速く還元することが見出されたときに克服された。このプロドラッグは、修復されにくいDNA架橋を形成するアルキル化剤へ変換された。
オキサザホフホリンプロドラッグであるシクロホスファミド(CP)は肝臓チトクロームP450代謝作用によって4-ヒドロキシル化反応を介して活性化される。4-ヒドロキシ中間体は分解して二官能性アルキル化毒素ホスホルアミドマスタードを形成し、これがDNA架橋を生じさせ、細胞周期依存性様式でG2-M停止およびアポトーシスを生じさせる。
ここまでに記載してきた酵素/プロドラッグ系において、プロドラッグは中間体代謝物に変換され、活性薬剤を形成するために細胞性酵素によって更に触媒されることが要求される。標的細胞におけるこれらの酵素の発現減少または完全に発現を欠くことは腫瘍耐性を生じさせるであろう。バクテリア酵素、カルボキシペプチダーゼG2(CPG2)はヒト類似物が存在せず、プロドラッグ4-[2-クロロエチル-(2-メシルオキシエチル)アミノ]安息香酸のグルタミン酸部分を更なる触媒反応を必要とせずに切断する。
【0059】
植物酵素ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)と非毒性植物ホルモンインドール-3-酢酸(IAA)との反応は詳細に解析されているが、まだ完全には明らかになっていない。中性pHでは、IAAはHRP-化合物Iによってラジカル陽イオンに酸化され、これは環外炭素−炭素結合の切断を受け、炭素-中心スカトリルラジカルを生成する。酸素存在下では、スカトリルラジカルは迅速にペルオキシルラジカルを形成し、次にこれは多数の生成物に分解する(主要なものは、インドール-3-カルビノール、オキシインドール-3-カルビノールおよび3-メチレン-2-オキシインドールである)。無酸素溶液中では、ラジカルカチオンの脱カルボキシルが生じ、炭素−中心ラジカルが優先的に水素供与体と反応する。
容易に分かるように、プロドラッグ/酵素系は特異性を生じさせるためにヒト細胞によっては産生されない酵素を有利に利用する。しかしながら、特定の器官または細胞型において特異的に産生されるヒト酵素もこの特異性を達成するために使用することができ、それが免疫原性でないという利点を有することは当業者には容易に理解されるであろう。
最後に、同じ酵素と種々の器官関連抗原または同じ抗原の種々の抗原決定部位に対する種々の抗体とで構築される複合体の「カクテル」の適用によって不均質性を回避し得る。
【0060】
治療複合体の投与
本発明の治療複合体は、それらを含む調製物がそれらの産物が通常および天然に一緒に見出される物質を実質的に含まない場合、「天然夾雑物を実質的に含まない」と称される。
治療複合体には、組織特異的管腔発現分子に結合し得る抗体(モノクローナルであろうがポリクローナルであろうが)、および生物学的に活性なそれらの断片が含まれる。抗体は動物によって作製してもよく、組織培養、または組換えDNA手段によって作製してもよい。
患者に本治療複合体を与える場合、または、治療複合体を受容患者に与える場合、投与する物質の用量は患者の年齢、体重、身長、性別、一般的な医学的状態、以前の医学的履歴その他のような要因に依存して変動するであろう。加えて、その用量は治療複合体の治療的部分および所望の効果に依存して変動するであろう。以下で論じるように、治療上効果的な用量は、治療複合体が第2の治療または追加的治療複合体と組み合わせて投与されるならば減少させることができる。本明細書において、2つの化合物の投与が近接した時間内に行われ、その結果、両方の化合物が患者の血清中に同時に検出され得る場合に、一つの化合物が第2の化合物と共に追加的に投与されると称される。
【0061】
治療複合体は動脈、静脈、毛細血管、血管洞(sinus)、リンパ管、上皮細胞灌流可能空間その他を通じて注入することができる。注射によって治療複合体を投与する場合は、連続インフュージョンによって投与しても、単一ボーラスまたは複数ボーラスによって投与してもよい。
治療複合体は、所望の治療効果に依存して、単独で投与しても、1以上の追加的免疫抑制剤(特に器官または組織移植の受容者に対して)、抗生物質、化学療法物質、または医薬物質、と組み合わせて投与してもよい。そのような化合物の投与は「予防」目的であっても「治療」目的であってもよい。
化合物の投与が受容患者に寛容される場合に、その化合物を「製薬的に許容できる」と称する。そのような物質は、その物質の投与量が生理的に有意である場合に、「治療上効果的な量」で投与されると称する。典型的には患者の体重あたりの治療複合体は0.1μg/kg〜500mg/kgである。治療複合体の1回投与または複数回投与を、状態が示唆するところにより、数時間、数日、数週間または数ヶ月にわたって行ってよい。薬剤は、その存在が受容患者の生理機能に検出可能な変化を生じさせる場合に、生理的に有意であると称する。用語「製薬上効果的な量」とは患者のIL-1媒介疾病を治療または軽減するために効果的な量を言う。用語「製薬的に許容できる担体、アジュバント、または賦形剤」とは、好ましい態様の化合物と共に患者に投与でき、その生理学的活性を破壊しない、非毒性の担体、アジュバント、または賦形剤をいう。用語「製薬的に許容できる誘導体」とは、好ましい実施態様の化合物若しくは受容者に投与すると好ましい実施態様の化合物を(直接又は間接的に)生じさせることのできる化合物の一切の製薬的に許容できる塩、エステル、またはそのようなエステルの塩をいう。本発明の医薬組成物は、本発明のどの化合物および製薬的に許容できるそれらの塩を、許容できる担体、アジュバント、賦形剤またはビヒクルのいずれと共に含んでいてもよい。
【0062】
本発明の治療複合体は既知の方法に従って製剤化して製薬的に有用な組成物を調製することができ、これらの物質またはそれらの機能的誘導体は製薬的に許容できる担体ビヒクルとの混合物として一緒にされる。適切なビヒクルおよびそれらの製剤は、他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含めて、例えばレミントン製薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)第18版、Gennaro編集、Mack, Easton Pa.(1990)に記載されている。効果的な投与に適した製薬的に許容できる組成物を形成するためには、そのような組成物は治療複合体の効果的な量を適切な量の担体ビヒクルと共に含むであろう。
更なる製薬方法を使用して作用の持続性を制御することができる。徐放性調製物は治療複合体を複合体化または吸収するためにポリマーを使用することによって達成することができる。あるいは、治療複合体を、例えばコアセルベート技術または界面重合化によって調製した微小カプセル中、例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-微小カプセル、およびポリ(メチルメタクリレート)微小カプセル、またはコロイド薬剤デリバリー系、例えばリポソーム、アルブミン微小球、微小エマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセルまたはマクロエマルジョン中に捕捉することができる。そのような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences (1990)に開示されている。
いくつかの実施態様を記載してきた。しかしながら、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく種々の改変を行うことができることは理解されるであろう。例えば、種々の切断可能な化学的部分、表面分子、および治療的部分を本方法に使用することができる。従って、他の実施態様も本発明の範囲内である。
一般的に本発明を記載してきたが、以下の実施例は請求項記載の発明を説明するために提供されるものであり、限定するために提供するものではない。
【0063】
実施例
Robenら、米国特許第09/528,742号(2000年3月20日出願)の方法を用いて以下の組織特異的分子を同定し、単離した。この方法では、化学反応を介して管腔分子に非特異的に結合する細胞膜非透過性試薬を使用した。この試薬は、in vivo条件では切断されないが、所定の条件下で切断され得る切断可能な化学的部分によって連結された、管腔における分子に非特異的に結合する第1の反応領域と第2のビオチン含有領域とを有している。結合試薬を動脈、静脈、毛細血管、脈管洞、リンパ管、上皮列灌流可能空間その他を介して注入した。試薬は管腔特異的分子に結合した。組織または器官をホモゲナイズして、細胞残渣を除去した。試薬に結合した全ての分子をビオチン含有領域に結合するアフィニティークロマトグラフィー(すなわちストレプトアビジンビーズ)を用いて器官から単離した。次に、試薬によって「タグ付け」された管腔露出分子を、試薬を「温和な条件」(温和な還元、非変性条件)下で切断することによって溶出した。このようにして、組織特異的分子を溶出し、PAGE上で精製した。器官特異的分子をそのようにして同定し、PAGEから単離し、その実体を明らかにするために部分シーケンシングした。次に、組織学、ウエスタンブロットおよび/またはin vivo位置特定を行い、単離したポリペプチドの組織特異性を確認した。
実施例1では、内皮特異的タンパク質をそのように同定し、そのタンパク質に特異的な抗体を用いて、ラットの尾静脈に注射したときその抗体が脳に特異的に結合することを明らかにした。実施例1は組織特異的内皮タンパク質に対する抗体は特異的器官を標的化するために使用することができ、その抗体は治療的部分とカップリングさせてその治療的部分を特定の器官に向けて、そこでその効果を生じさせるであろうことを示す。
【0064】
実施例1
脳特異的、管腔発現タンパク質 CD71 を用いた
治療的部分の組織への局在化
CD71すなわちトランスフェリンレセプターはたった一つの組織、脳においてのみ内皮の管腔表面上に露出していることが知られている。この分子は、脳調製物においてのみ見出され、他のいかなる組織にも見出されないことが本方法を用いて分かり、このことにより本方法が組織特異的内皮タンパク質を同定できることが確認された。
薬剤を特定の組織へ選択的にデリバリーするためにタンパク質の組織特異的内皮発現を利用できることを証明するために、ラットCD71に対する抗体を用いた(BD Pharmingen,San Diego, CA, カタログ番号22191)。CD71は、脳に特異的な管腔露出内皮タンパク質である。ラットアミノ酸配列およびヌクレオチド配列はGenBankアクセッション番号AAA42273およびM58040(配列番号26及び27)であり、ヒトアミノ酸配列およびヌクレオチド配列はGenBankアクセッション番号AAH01188およびBC001188である(配列番号28および29)。抗体はラットの尾静脈中に注射した。類似のアイソタイプを有するが異なる特異性を有する別の抗体を別のラットに対照として注射した。アイソタイプ対照として使用した抗体は、Target Protein Technologies社によって作製された抗アルブミン抗体(IgG2)とした。30分後、ラットを犠牲にし、各ラットから組織切片をいくつかの器官から作製した。次に、各組織を免疫組織化学によって抗体の存在について解析した。図2(A)-(D)はCD71または対照抗体を注射されたラットの組織切片の免疫組織化学を示す。図2(A)はCD71を注射されたラットの脳であり、図2(B)は対照抗体を注射されたラットの脳であり、図2(C)はCD71を注射されたラットの肺であり、図2(D)は対照抗体を注射されたラットの肺である。これらの結果は、抗-CD71抗体は脳の毛細管に局在し、他の組織には局在しないことを明らかにしている。このことは、血液−脳障壁を越えることのできる治療剤を発見することはしばしば困難であるという点で特に有利である。
【0065】
追跡実験において、毒素を抗-CD71抗体にカップリングさせた。使用した毒素はリシンA鎖(Sigma, カタログ番号L9514)である。ジスルフィド-含有リンカーを備えたビオチン(Pierece、カタログ番号21331)をリシン及び抗体の両方に添加することによりこの毒素を抗体にカップリングさせた。次に、この2つを、どちらのビオチンにも結合し、リシンと抗体の複合体を形成させるニュートラビジン(Nuetravidin)(Pierce、カタログ番号31000)を添加することによってカップリングさせた。in vivo局在性実験を毒素−抗体複合体を用いて繰り返した。この例では、抗体は毒素の脳の脈管への局在化を容易にしただけでなく、おそらくはトランスサイトーシスによる組織への侵入をも容易にした。組織内にあれば、毒素は脳において、脳に導入されるいかなる毒素についても典型的に見られる反応である炎症性応答を生じさせた。他の組織切片には、炎症性応答は全く見られなかった。
ヒトCD71-特異的抗体はBD Pharmingenから入手可能であり、ヒト治療複合体の作製に使用することができる。
実施例2〜6において、いくつかの他の組織特異的管腔発現タンパク質が同定され、治療複合体を作製するために使用されている。
【0066】
実施例2
ラットジペプチジルペプチダーゼ IV の同定および配列決定
ラット全体の脈管の管腔タンパク質をビオチンで標識した。次に、器官を個別に取り出し、標識タンパク質をRobenら、米国特許第09/528,742(2000年、3月20日出願)に記載されたように単離した。ホモゲナイズした肺から単離した標識タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、肺及び腎臓に特異的であるが(図3)肺において優勢であるタンパク質(DPP-4とラベル付け)を明らかにした。ペプチドをシーケンシングしたところ配列FRPAE(配列番号3)に対応することが分かり、タンパク質はラット肝臓ジペプチジルペプチダーゼIV、GenBankアクセッション番号P147470(ヌクレオチド配列Genbank アクセッション番号NM_012789)として同定された。完全長タンパク質配列は配列番号4に対応し、ヌクレオチド配列は配列番号5である。タンパク質配列はNM_012789のヌクレオチド89-2392によってコードされる。ヒトの配列は配列番号6および7に対応する。Genbankアクセッション番号NM_001935は配列番号6であり、mRNAのコード領域はnt 76〜2376(配列番号7)である。従前の研究により、ラット肝臓ジペプチジルペプチダーゼIVはそのアミノ末端からなる膜繋留領域を有していることが示唆されている(Ogataら、J. Biol Chem 264(6):3596-601 (1989))。ラットジペプチジルペプチダーゼIVに特異的なモノクローナル抗体(BD Pharmingen, San Diego, CA,カタログ番号22811)をラットの尾静脈に注射した(約0.1〜100mg/ml)。種々の器官からの組織を免疫組織化学を利用して処理し、DPP-4に対する抗体は肺及び腎臓に局在することが示された(図4参照)。図4中、パネルa.腎臓、パネルb.肝臓、パネルc.肺、パネルd.心臓、パネルe.膵臓、およびパネルf.結腸。
ヒトDPP-4に対する抗体は本発明の治療複合体作製に使用するために入手することができる(DB Pharmingen, San Diego, CA)。
【0067】
実施例3
炭酸脱水素酵素 IV の同定および配列決定
ラット全体の脈管の管腔タンパク質をビオチンで標識した。次に、器官を個別に取り出し、標識タンパク質をRobenら、米国特許第09/528,742(2000年、3月20日出願)に記載されたように単離した。ホモゲナイズした肺から単離した標識タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、続いて肺及び心臓に特異的であるタンパク質(CA-4とラベル付けしてある)を明らかにした(図5)。ペプチドをシーケンシングしたところ、配列DSHWCYEIQ(配列番号8)に対応し、ラット炭酸脱水素酵素IV、Genbankアクセッション番号NM_019174であることが明らかにされた。完全長タンパク質配列は配列番号9に対応し、ヌクレオチド配列は配列番号10に対応する。ヒトの配列は配列番号11および12、Genbankアクセッション番号NM_000717に対応する。従前の研究により炭酸脱水素酵素IVは発生的制御および血管内皮における細胞特異的発現を示すことが示唆されている(Flemingら、Am J. Physiol, (1993)265(6 Pt 1):L627-35)。
【0068】
実施例4
チモーゲン顆粒 16 タンパク質 (ZG16-p) の同定および配列決定
ラット全体の脈管の管腔タンパク質をビオチンで標識した。次に、器官を個別に取り出し、標識タンパク質をRobenら、米国特許第09/528,742(2000年、3月20日出願)に記載されたように単離した。ホモゲナイズした膵臓から単離した標識タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、その結果膵臓および消化管に特異的であるが、膵臓に優勢であるタンパク質(ZG16pとラベル付けしてある)が明らかにされた(図6参照)。ペプチドをシーケンシングし、配列NSIQSRSSSY、配列番号13が得られ、ラットZG16-p、Genbankアクセッション番号Z30584として同定された。完全長タンパク質配列は配列番号14に対応し、ヌクレオチド配列は配列番号15に対応する。ヒトの配列は配列番号16および17、Genbankアクセッション番号AF264625に対応する。従前の研究により、ZG16-pはラット膵臓および消化管の杯状細胞のチモーゲン顆粒に局在することが示唆されている(CronshagenとKern, Eur J. Cell Biology 65:366-377, 1994)。
【0069】
実施例5
ラット MAdCAM の同定および配列決定
モノクローナル抗体をBD Pharmingen(カタログ番号22861)から購入し、約0.1〜100mg/mlをラットの尾静脈に注射した。種々の器官からの組織を免疫組織化学を利用して処理し、MAdCAM(MadCam-1)に対する抗体は膵臓および結腸に局在することが示された(図7)。図7中、パネルa.腎臓、パネルb.肝臓、パネルc.肺、パネルd.心臓、パネルe.膵臓、およびパネルf.結腸。ラットMadCam-1、Genbankアクセッション番号D87840はタンパク質配列、配列番号18に対応し、ヌクレオチド配列は配列番号19である。ヒトの配列は配列番号20および21、Genbankアクセッション番号U82483に対応する。ヒトに使用する本発明の治療複合体を作製するためのヒトMadCam-1抗体はBD Pharmingen (San Diego, CA)から入手可能である。
【0070】
実施例6
CD90 の同定
ラットCD90に対する抗体を購入し(BD Pharmingen, San Diego, CA,カタログ番号22211D)、約0.1〜100mg/mlをラットの尾静脈に注射した。種々の器官からの組織を免疫組織化学を利用して処理し、Thy-1に対する抗体は腎臓に局在することが示された(図8)。図8中、パネルa.腎臓、パネルb.肝臓、パネルc.肺、パネルd.心臓、パネルe.膵臓、およびパネルf.結腸。ラットThy-1、Genbankアクセッション番号NP036805はタンパク質配列、配列番号30に対応し、Genbankアクセッション番号NM 012673はヌクレオチド配列、配列番号31に対応する。ヒトThy-1、Genbankアクセッション番号XP006076はタンパク質配列、配列番号32に対応し、Genbankアクセッション番号XM 006076はヌクレオチド配列、配列番号33に対応する(Genbankアクセッション番号AF 261093も参照せよ)。マウス抗-ラットThy-1抗体はPharmingen Intl.から入手可能であり、0.5〜5μg/mlの濃度で免疫組織化学に使用し、ヒトに使用するための好ましい実施態様の治療複合体を作製した。
【0071】
実施例7
アルブミン断片の同定および配列決定
ラット全体の脈管の管腔タンパク質をビオチンで標識した。次に、器官を個別に取り出し、標識タンパク質をRobenら、米国特許第09/528,742(2000年、3月20日出願)に記載されたように単離した。ホモゲナイズした前立腺から単離した標識タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、その結果T436-608とラベル付けしてあるタンパク質(図9)が明らかになった。このタンパク質を部分配列決定し、アルブミンの断片、TQKAPQVST(配列番号22)として同定した。加えて、配列決定により、前立腺特異的形態は翻訳が早期に終了した断片であり、完全長アルブミンタンパク質(配列番号23)のアミノ酸436〜608に対応することが示された。アルブミン断片は他者により血管作用性断片であることが示されている(ヒト血清アルブミンのタンパク質分解性消化によって誘導されるヒスタミン放出:ペプシン処理による活性ペプチドの単離及び構造、Sugiyama K, Ogino T, Ogata K, Jpn J Pharmacol, 1989 Feb., 49 (2):165-71)。ラットタンパク質配列は配列番号24(Genbankアクセッション番号P02770)である。ヒト対応物は配列番号25,Genbankアクセッション番号P02768、に示されている。
実施例8において、ここまでの実施例において単離され同定された管腔発現標的タンパク質のin vivo分布が記載される。
【0072】
実施例8
DPP-4 、 MadCam-1 、 CD90 および CA-4 の生体内分布
以下の実施例は、これまでの実施例中で同定されたいくつかの管腔発現タンパク質の生体内分布を視覚化するための特異的標識抗体リガンドの使用を記載したものである。具体的には、DPP-4、MadCam-1、CD90またはCA-4に特異的な抗体(1μg/μl溶液)の50μlをSprauge-Dawleyラットの尾静脈に注射した。抗体を約30分間循環させ、その後動物を犠牲にし、器官を取り出した。脳、心臓、肺、肝臓、膵臓、結腸および腎臓の小さな塊を切り出し、包埋培地中に置き、直ちに凍結した。凍結した塊は切片を作製するまでドライアイス上に保持した。クリオスタットを用いて組織を6μm切片に切り出し、一晩風乾し、アセトン中で2分間固定した。固定した組織切片をCy3-標識二次抗体とインキュベーションし、リンスし、その後の画像取込のためにマウントした。少なくとも3つの独立な実験を各管腔発現標的タンパク質について行った。
上述した方法を用いて、管腔発現標的タンパク質DPP-4に特異的なマウスモノクローナル抗体OX-61(Pharmingen)を用いてDPP-4の生体内分布を確認した。図10(A)は強い蛍光染色を示しており、DPP-4が肺に存在していることを示す。さらに、弱い染色が腎臓の糸球体に観察された(図10(B));しかしながら、DPP-4は調べた他のどの組織においても有意には見出されなかった(図10(C)-(D))。これらの結果はDPP-4は主として肺の内皮に局在することを示す。
【0073】
上述した方法を用いて、MadCam-1の生体内分布も確認した。具体的には、ラットMadCam-1を認識するマウスモノクローナル抗体、OST-2(Pharmingen)を使用した。図11(A)および11(D)は蛍光は膵臓および結腸の両方に観察されたことを示している。さらなる染色が小腸に観察された。対照的に、調べた他の組織においては非常にわずかな蛍光が観察されただけであった(例えば図11(B)-(C))。これらの結果は、MadCam-1は胃腸(GI)管を含むある種の組織に局在することを示す。
ラットCD90を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体OX-7(Pharmingen)を投与することによりCD90の生体内分布を確認した。図12(A)は腎臓に観察された蛍光染色を示したものである。調べた他の組織のいずれにおいても染色は検出されなかった(図12(B)-(F))。これらの結果はCD90が腎臓にのみ局在することを示す。
CA-4の生体内分布を決定するため、ラットCA-4を認識するウサギポリクローナル抗体をこの分野でよく知られた方法を用いて作製した。上述した投与法および組織学的方法を用いて、CA-4の局在性を決定するためにこのポリクローナル抗体を使用した。強い染色が心臓(図13(B))および肺(図13(E))の両方に観察されたが、これはCA-4の存在を示すものである。脳(図13(A))、腎臓(図13(C))、肝臓(図13(D))または膵臓(図13(F))には全く染色が見られなかった。CA-4に特異的なモノクローナル抗体も心臓および肺に特異的に結合するが他の組織には結合しないことが明らかにされた。これらの結果はCA-4が心臓および肺に特異的に局在することを示す。
実施例9〜13において、標的組織における特異的な管腔発現タンパク質へのリガンド結合の特徴を記載した。
【0074】
実施例9
リガンド用量と標的組織への局在性の特異性との関係
以下の実施例において、投与した抗体の量との関係において標的組織への抗体リガンドの局在性の特異性を記載する。具体的には、DPP-4、MadCam-1またはCD90に特異的なマウスモノクローナル抗体をSprague-Dawleyラットへ尾静脈注射により投与した。各ラットに、5μg、20μg、50μgまたは100μgの上記のいずれかの抗体を与えた。注射に続いて、この抗体を30分間循環させ、その後動物を犠牲にし、その器官を取り出した。次にこれらの器官を免疫組織化学のために実施例8に記載したように処理した。
上述した方法を用いて、OX-61モノクローナル抗体を使用して投与した抗体リガンドの量と肺における管腔発現標的タンパク質DPP-4に対する特異性との関係を決定した。5〜50μgの用量でラットに投与した場合、OX-61は肺に対して非常に高い特異性を示した。しかしながら、100μg以上を単一回で投与した場合、OX-61抗体は腎臓にも現れ始めた。これらの結果は実施例8に示したDPP-4に関する生体内分布データと一致する。
【0075】
モノクローナル抗体OST-2を同様な研究に使用して、MadCam-1について膵臓および他のGI器官における特異性に対する用量効果を決定した。5μg、20μg、50μgまたは100μgの用量で投与した場合、OST-2は膵臓およびGI管の他の組織に対して特異性を維持した。これらの結果は、MadCam-1特異性は投与する用量とは関係なくGI管に限定されることを示しているようである。
モノクローナル抗体OX-7を用いて腎臓におけるCD90対するその特異性に対する用量の効果を決定した。5〜50μgの用量において、OX-7は腎臓に対する完全な特異性を示した。しかしながら、100μgにおいては、少量のOX-7が肺及び肝臓に出現し始めた。高濃度の抗体では、ある程度のOX-7が肺および肝臓に検出可能であったが、肺及び肝臓に存在したOX-7の量は腎臓に出現したOX-7の量よりも遙かに少なかった。
【0076】
実施例10
標的組織へのリガンド結合の経時的特徴
以下の実施例に、特異的な標的組織への抗体リガンドの経時的な結合を記載した。具体的には、DPP-4、MadCam-1またはCD90に特異的なマウスモノクローナル抗体をSprague-Dawleyラットに尾静脈注射により投与した。各ラットに50μg用量の単一の抗体を与え、5分間から48時間にわたって循環させた。抗体循環期間の後、動物を犠牲にし、その器官を免疫組織化学のために実施例8に記載したように処理した。
上述した方法を用い、肺の脈管におけるOX-61モノクローナル抗体のDPP-4への結合プロファイルを時間との関係で決定した。図14(A)-(E)は静脈注射後5分間〜24時間にわたる時間の間に肺に局在したOX-61の量を示したものである。特に、OX-61は投与後わずか5分後肺に検出された(図14(A))。同様な量のこの抗体は投与後少なくとも8時間のあいだ肺に検出された(図14(B)-(D))。しかしながら、投与後24時間において、肺に検出できたOX-61の量は顕著に減少した(図14(E))。
【0077】
時間に関連したプロファイルを膵臓の脈管におけるOST-2モノクローナル抗体のMadCam-1への結合について明らかにした。図15(A)-(D)は5分間〜48時間にわたる時間の間に膵臓に検出されたOST-2の量を示したものである。特にOST-2は投与後5分以内に膵臓に検出された(図15(A))。加えて、同様な量のこの抗体は注射後30分、24時間および48時間後においても膵臓に検出された(図15(A)-(D))。
時間に関連したプロファイルを腎臓の脈管におけるOX-7モノクローナル抗体の管腔発現標的タンパク質CD90への結合についても明らかにした。図16(A)-(F)は5分間〜8時間にわたる時間の間に腎臓に局在したOX-7の量を示した図である。特に、OX-7は投与後わずか5分後に腎臓に検出された(図16(A))。同様な量のこの抗体は投与後少なくとも8時間の間腎臓に検出された(図16(B)-(F))。
【0078】
実施例11
時間分解蛍光による、標的組織へ結合した抗体リガンド分子の定量
以下の実施例には、種々の標的組織における管腔発現標的タンパク質に局在した抗体リガンド抗体の定量的解析を記載する。具体的には、DPP-4、MadCam-1またはCA-4に特異的な抗体を、ユーロピウム-DTPAラベリングキット(Perkin Elmer,カタログ番号AD0021)を用いて業者の指示に従って、それぞれ抗体分子あたりおよそ3分子のユーロピウムで標識した。加えて、インフルエンザウイルスに対するモノクローナル抗体(IgG2aおよびIgG1アイソタイプ)もアイソタイプ対照として使用するために標識した。標識後、抗体/ユーロピウム複合体をSprauge-Dawleyラットの尾静脈に5μg、20μgおよび50μgの用量で注射した。各用量レベルにおいて、抗体を30分間、6時間および24時間循環させた。少なくとも3つの独立した実験を各用量および時間の組合せについて行った。
【0079】
各時間の終わりにラットを犠牲にし、その器官を蛍光分析のために取り出した。調べた器官には典型的には、腎臓、肺、肝臓、脳、膵臓、小腸、大腸(結腸)、胃および心臓が含まれる。切り出した器官はまず10倍体積のエンハンス溶液(Perkin Elmer、カタログ番号400-0010)中でホモゲナイズし、次に、一晩4℃にてインキュベーションした。得られた溶液の1%を新鮮なエンハンス溶液中へ1:40に希釈し、室温にて30分間ローテーションし、1500gにて10分間遠心した。得られた溶液を蛍光計に置きシグナル強度を3回測定した。
上述した方法を用いて、特定の時点において各組織型に局在するOX-61(抗-DPP-4)抗体の量を投与した各抗体用量について決定した。IgG2aアイソタイプ抗-インフルエンザモノクローナル抗体をバックグラウンド蛍光の対照として使用した。図17(A)-(C)は各用量レベルについて調べた各時点における各組織に存在したOX-61の質量百分率を示した図である。具体的には、図17Aは30分後に全5μgの投与量のおよそ15%が肺に局在したことを示している。6時間までに、このレベルは約7%にまで落ちたが、その後24時間の時点まで一定に維持された。ほとんどの部分において、他の組織に局在したOX-61の量は投与質量の0.75%に満たない量であり、これは各組織型に局在した抗-インフルエンザ対照抗体の最大レベルに対応する(図18(A)-(C)、および図17(A)点線)。一つの例外は、肝臓への僅かな局在性の増加であった。
【0080】
5μg用量について得られたのと同様な結果が20および50μg用量についても得られた(それぞれ図17(A)-(C))。肺におけるOX-61のレベルについて、初期用量を増加させると経時的な肺へのOX-61局在性のパーセンテージ損失は低下したことに注意すべきである(図17A-C)。これらを合わせると、これらの結果はOX-61の高いレベルが肺に特異的に局在し、長期間にわたって抗体のレベルが高いまま維持されることを示している。このような局在性の高いレベルにより、この抗体リガンドを用いてデリバリーされる肺作用性薬剤の治療インデックスがかなり改善されるであろう。
追加的実験において、各組織型に局在したOST-2(抗MadCam-1)抗体の量を、各抗体投与用量について特定の時点において決定した。IgGアイソタイプ抗-インフルエンザモノクローナル抗体をバックグラウンド蛍光の対照として使用した。図19(A)-(C)は各用量レベルについて調べた各時点における各組織に存在したOST-2の質量百分率を示した図である。特に、図19(A)は、6時間後に全5μg投与量の約3%が膵臓に局在したことを示している。投与量の5%を越える量が同じ時間後に小腸に観察された。非-GI組織に局在したOST-2の量は一般に投与質量の0.75%未満であったが、これは各組織型に局在した抗-インフルエンザ対照抗体の最大レベルに相当する(図19(A)、点線)。肺に比較して、膵臓はあまり脈管化されていないことに注意すべきである。従って、この狭い領域に結合する抗体用量の百分率は肺のようなより高度に脈管化された組織に結合する抗体リガンドよりも低いことが予想される。
【0081】
5μgについて得られたのと同様な結果が20および50μg用量についても得られた(それぞれ、図19(B)および19(C))。加えて、各組織に局在した抗インフルエンザIgG1アイソタイプ対照抗体も5μg用量レベルで局在した量と同様であった。5μg用量と2つの高用量との間で少なくとも一つの注目すべき相違点があった。5μg用量では、GI器官に局在したOST-2の量は6時間後にピークを示し(図19(A))24時間までに低下した。高投与量においては、膵臓および他のGI器官において生じた局在性は24時間にわたって蓄積した(図19(B)-(C))。これらをまとめると、これらの結果はOST-2の高レベルは膵臓のようなGI器官に特異的に局在し、この抗体の濃度は時間と共に増加することを示している。そのような高レベルの局在性はこの抗体リガンドを使用してデリバリーされるどの薬剤の治療インデックスも有意に改善するであろう。
【0082】
同様な実験において、20μgのユーロピウム標識抗-CA-4抗体リガンドをラットに静脈投与し、各組織型に局在したリガンドの量を特定の時点で決定した。アフィニティー精製した、CA-4に対するウサギポリクローナル抗体(抗-CA-4)(これは実施例8に記載したように調製した)を組織特異的リガンドとして用いた。図20は、全注射抗体のおよそ8.5%が最初の30分間以内に肺に局在することを示している。抗体のおよそ2%が同じ時間後に心臓に見出された。心臓および肺における抗体の濃度は両方とも6時間後に僅かに減少し、24時間後に測定したときには低下し続けていた。抗CA-4は24時間の時間経過において他のどの組織においても有意に蓄積しなかった。
【0083】
実施例12
シンチグラフィーによる管腔発現標的タンパク質へ結合した抗体リガンドの定量
以下の実施例には種々の標的組織における管腔発現標的タンパク質に局在した抗体リガンドを定量的に解析するための別の手段を記載した。DPP-4に対して特異的であるOX-61抗体を125Iで放射標識し、1μgまたは5μg用量をSprauge-Dawleyラットの尾静脈に注射し、5分間、2時間または8時間循環させた。種々の組織及び体液をこの分野でよく知られたシンチグラフ法によって解析した。シンチグラフィーの結果は各器官において1グラムの組織あたりの抗体のナノグラム当量として表した。特定の器官に局在した、注射投与量に対する百分率はラット器官の既知の平均質量を用いて計算した。
上述した方法を用いて、OX-61は優先的に肺に局在することが見出された。どちらの用量においてもOX-61は最初の5分間以内に肺に局在した。2時間後、注射した総量である1μgの22%がこの組織に局在することが分かった。8時間後、肺に見られる抗体の量は注射量の30%に増加した。OX-61は肝臓にも見出された。最初、高レベルのOX-61が肝臓に観察された;しかしながら、8時間後、注射量の僅かに7%が残存するのみであった。肝臓における初期の検出とそれに続く迅速な減少は血液中における抗体の循環のせいであったのだろう。
【0084】
5μg用量を投与した場合も結果は同様であった。図21は、組織1グラムあたり0.4μgを越えるOX-61(最初の抗体投与量の20%)が最初の5分間後に肺に局在したことを示している。8時間後、OX-61の量は、肺組織1グラムあたりおよそ0.7μgに増加した。この時間経過の間、他のどの組織においてもOX-61の有意な増強はなかった。これらの結果は、高レベルのOX-61が肺に特異的に局在し、抗体のレベルは長期間高く維持されることを確認するものである。
【0085】
実施例13
管腔発現標的タンパク質による抗体リガンドのトランスサイトーシス
以下の実施例は、トランスサイトーシスを媒介する能力についてのトランスサイトーシス性管腔発現標的タンパク質の特徴を明らかにするために用いた方法を記載したものである。より具体的には、三色組織学を用いて、結合したリガンドを血管の管腔表面から周辺組織空間へ輸送することのできる管腔発現標的タンパク質の特徴を明らかにした。調べた標的タンパク質のうち、DPP-4およびCD90のみが内皮細胞層を通したトランスサイトーシス(細胞輸送)を媒介する能力を有するようであった。
特異的な抗体リガンドおよび細胞構造物に特異的な染色剤を用いて三色組織学を行った。前の実施例のように、DPP-4、MadCam-1、CD90またはCA-4に特異的な抗体を50μgの用量でSprauge-Dawleyラットの尾静脈に注射した。30分後、ラットを犠牲にし、その器官を実施例8に記載したように組織学のために調製した。次に、組織切片をCy3-標識二次抗体とインキュベーションし、結合した一次抗体を検出した。加えて、組織切片を4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、ジヒドロクロリド(DAPI)およびフルオレセイン-標識グリフォニア・シンプリシフォリア(Griffonia simplicifolia)レクチン1-イソレクチンB4(GSL-1)で染色した。DAPIは細胞の核を青く染め、GSL-1は内皮を緑に染める。内皮を横切る抗体のトランスサイトーシスは、抗体は細胞層を通過して輸送されるのでCy-3の赤いシグナルと緑に染色された内皮との混合によって生じる黄色の領域の分布を決定することによって検出した。
【0086】
上述した方法を用いて、DPP-4によるOX-61のトランスサイトーシス輸送を検出した。図22は、OX-61は脈管を囲む肺組織へ浸透したことを示している。予想されるように毛細管の表面は緑に染色され、細胞核は青く染色された。肺の間質は黒い領域として提示された。内皮全体にわたる黄色の分布は抗体が内皮障壁を通して肺組織間腔へ輸送されたことを示す。
同様に、OX-7のCD90によるトランスサイトーシス輸送を検出した。図23はOX-7が腎臓の糸球体へ浸透したことを示している。浸透は結合した抗体と内皮との間に観察されたかなりの量の混合によって示された。抗体の内皮への分布は図23中で管腔表面に結合した赤く染色された抗体と緑に染色される内皮層との間に存在する黄色の拡散した領域として見ることができる。
OST-2は予想されるようにMadCam-1に結合したが、抗体は内皮を横切って膵臓へ輸送されなかった。図24は膵臓の切片を示しているが、内皮への抗体の目に見える浸透は全く見られない。抗体は血管の表面上に局在したが(赤)、内皮(緑)を通して周辺組織へ全く移動しなかった。図24において黄色の着色が全く存在しないことはトランスサイトーシスを欠くことを証明している。
【0087】
同様に、肺の脈管の管腔表面上のCA-4に結合した抗-CA-4抗体についてトランスサイトーシスは見られなかった。図25は肺の切片を示しているが、内皮への抗体の目に見える浸透は全く見られない。言い換えると、内皮表面に結合した抗体の赤い領域は内皮細胞層へ全く移動しなかった。この移動がないことは、図25において内皮細胞層において混合された黄色が存在しないことにより示される。心臓に局在した抗CA-4抗体についても同様な結果が記録された。
まとめると、上記結果は本明細書で同定した管腔発現標的タンパク質は、特定の組織の間質および脈管表面のどちらに薬剤をデリバリーするためにも有用である。
実施例14−16には、ゲンタマイシンおよびドキソルビシンのような治療的部分に連結した標的タンパク質特異的抗体リガンドを含む治療複合体を記載する。
【0088】
実施例14
特異的標的タンパク質を用いた組織への選択的薬剤デリバリー
以下の実施例には、特異的標的組織への治療複合体のデリバリーが記載される。治療複合体は、DPP-4またはMadCam-1に特異的なマウスモノクローナル抗体をゲンタマイシンまたはドキソルビシンのいずれかに非切断性リンカーを介してこの分野でよく知られた方法を用いてカップリングすることによって構築した。平均すると、各抗体に3分子の薬剤が共有結合的に結合した。およそ50μgの各治療複合体を尾静脈注射によりラットに投与し30分間循環させた。次にラットを犠牲にし、実施例8に記載した方法を用いて組織学のためにその器官を切片化した。ゲンタマイシンおよびドキソルビシン治療複合体はゲンタマイシン特異的またはドキソルビシン特異的抗体を必要に応じて添加し、Cy3結合二次抗体でシグナルを増幅することによって検出した。またある実験では、組織切片を4'6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、ジヒドロクロリド(DAPI)およびフルオレセイン-標識グリフォニア・シンプリシフォリアレクチン1-イソレクチンB4(GSL-1)で染色してトランスサイトーシスを明らかにした(実施例13に記載したような三色組織学法)。
【0089】
上述した方法を用いて、OX-61/ゲンタマイシンおよびOX-61ドキソルビシン治療複合体が最初の注射後30分間以内に肺組織へ特異的に局在することが示された。図26(A)-(F)はOX-61/ゲンタマイシン治療複合体の特異的組織への結合を示した図である。特に、この治療複合体は注射後30分間以内に肺に観察された(図26(E))。しかしながら、調べたどの他の組織においてもこの治療複合体は存在しなかった(図26(A)-(D)および26(F))。同様な結果がOX-61/ドキソルビシン治療複合体についても得られた(図27(A)-(D))。
上述した三色組織学法を用いて、OX-61/ゲンタマイシンおよびOX-61/ドキソルビシンの両方のDPP-4媒介トランスサイトーシス輸送も検出された。図28はOX-61/ゲンタマイシン治療複合体は内皮に浸透し、次に肺の間質に局在化されたことを示している。治療複合体は毛細管および内皮細胞層全体を裏打ちしていることが観察された。複合体は肺の間質組織全体にわたっても観察された。図28中の黄色の領域は治療複合体の内皮を横切る移動を示している。同様な結果がOX-61/ドキソルビシン治療複合体についても見られた。図29は特にこの治療複合体の肺の間質における蓄積を示したものである。
OST-2/ゲンタマイシンおよびOST-2/ドキソルビシン結合体の組織特異的局在性も評価した。図30(A)および30(F)はOST-2/ゲンタマイシン結合体は結腸および膵臓のどちらにおいても特異的にMadCAm-1に結合したことを示している。この結合体は調べた他のどの組織にも局在していなかった(図30(B)-(F))。同様な結果がOST-2/ドキソルビシン治療複合体について観察された(図31(A)-(F))。
【0090】
実施例15
DPP-4 特異的抗体 OX-61 を用いたゲンタマイシンの標的化リポソーム製剤
以下の実施例にはリポソーム治療複合体の特異的な標的組織へのデリバリーが記載される。リポソーム(リンカー)を用いて、DPP-4(リガンド)に特異的なマウスモノクローナル抗体をゲンタマイシン(治療的部分)にカップリングすることによって治療複合体を構築した。卵ホスファチジルコリン(EPC)またはジステロイルホスファチジルコリン(DSPC)を主たるリン脂質成分(50モル%より大きい)として用いてリポソームを構築した。マレイミド-PEG化ジステロイルホスファチジルエタノールアミン(MPDSPE)を副次的脂質成分として約5モル%の濃度で添加した。MPDSPEは分子量約5000kDaのポリエチレングリコール(PEG)をジステロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)にカップリングすることによって合成した。接続したPEG基の遊離末端はこの分野でよく知られた方法を用いて反応性マレイミドに変換した。コレステロールを最初に使用したリン脂質の量に依存して0〜50モル%の濃度で添加することによりリポソーム製剤化を完了させた。
【0091】
ゲンタマイシンおよびOX-61の両方をリポソームリンカーにカップリングさせることによって治療複合体を作製した。硫酸ゲンタマイシンはリポソーム形成の際にリポソーム内部に受動的に閉じこめることによりカップリングさせた。ゲンタマイシンはおよそ150μg/mlの濃度で捕捉された。治療的部分の捕捉に続いて、OX-61抗体をこのリポソームリンカーにカップリングさせた。このカップリングは最初にOX-61をトラウト試薬と反応させて一級アミンをチオールに変換することによって達成した。次に抗体を反応性MPDSPEにカップリングさせた。
DPP-4に標的化したEPCおよびDSPCリポソーム(それぞれ、EPC-DPPおよびDSPC-DPP治療複合体)として投与したゲンタマイシンの生体内分布を遊離のゲンタマイシンおよび非標的化リポソームとして投与したゲンタマイシンの生体内分布と比較した。具体的には、遊離のゲンタマイシンの溶液、または、治療複合体またはその表面に結合したリガンドを持たないリポソームを含む分散液Sprauge-Dawleyラットの尾静脈にラットあたり150μgゲンタマイシンの用量で注射した。30分後または18時間後にラットを犠牲にし、その器官を取り出してホモゲナイズした。各器官ホモゲネート中のゲンタマイシンの量をTDX分析器(Abbott)を用いて測定した。少なくとも3つの独立の実験を各ゲンタマイシン製剤について各時点で行った。
【0092】
上述した方法を用いて、遊離のゲンタマイシンおよびDSPC-DPP治療複合体として投与したゲンタマイシンの両方について、投与後に肺および腎臓に局在したゲンタマイシンの量を決定した。特に、投与後30分以内に遊離のゲンタマイシンは腎臓に蓄積し始めた(図32(A))。18時間後、腎臓に存在するゲンタマイシンの量は2倍以上になった(図32(B))。対照的に、DSPC-DPP治療複合体として投与した場合、18時間後に非常に僅かなゲンタマイシンが腎臓に出現した(図32(A)-(B))。ほとんど反対の効果が肺組織において観察された。図32(A)-(B)は、遊離形態で投与された場合、注射後30分または18時間後に非常にわずかなゲンタマイシンが肺に観察されたことを示している。しかしながら、DSPC-DPP治療複合体として投与された場合、ゲンタマイシンは30分後に肺組織1グラムあたり約20μgで存在した(図32(A))。18時間後、このレベルは約半分に落ちた(図32(B))。これらの結果により、腎臓におけるゲンタマイシンの蓄積、従って、ゲンタマイシン媒介毒性は、この薬剤と適切な標的化リポソーム治療複合体を用いて感染部位に特異的にデリバリーすることによって防止できることが示された。
【0093】
遊離のゲンタマイシンの生体内分布をEPC-DPP治療複合体および非標的化EPCリポソームとしてデリバリーされたゲンタマイシンの生体内分布と比較した。遊離ゲンタマイシンの投与後30分間以内にかなりの量のこの化合物が腎臓に出現した。18時間後、この量は2倍以上となった(図33(A)-(B))。非標的化リポソームとしてデリバリーされたゲンタマイシンは30分後に血清中に優勢に出現したが、18時間後にはかなりの量が腎臓および脾臓の両方に検出された(図33(A)-(B))。対照的に、30分間以内に、EPC-DPP治療複合体としてデリバリーされたゲンタマイシンの大部分は肺、肝臓および脾臓に分布したが、非常に僅しか腎臓または血清中には観察されなかった。もっとも高いゲンタマイシンレベル、注射量の約15%が肺に検出された(図33(A))。同様な分布が18時間後に観察された(図33(B))。
上述の結果は、ゲンタマイシンはEPC-DPP治療複合体を用いて肺に標的化されたことを示している。肝臓および脾臓に出現したゲンタマイシンの量は有意であったが、これらの器官に蓄積する薬剤の量は低下させることができそうである。そのような結果は、抗体全体ではなく抗体断片を標的化リガンドとして使用することによって達成することができる。抗体のFc部分が肝臓および脾臓への取込を媒介することが明らかにされている。従って、抗体のこの部分を除去することによりこれらの器官における蓄積が低下するのはあり得ることである。腎臓におけるゲンタマイシンの蓄積は非標的化リポソームを用いると防止できなかったが、EPC-DPP治療複合体を用いることによりゲンタマイシンは腎臓から効果的に遮蔽することができた。従って、そのような複合体は標的化薬剤デリバリーおよび薬剤毒性の防止の両方に有用である。
【0094】
遊離のゲンタマイシンの生体内分布をDSPC-DPP治療複合体としておよび非標的化DSPCリポソームとしてデリバリーされたゲンタマイシンとも比較した。図34(A)-(B)はDSPC-DPP治療複合体としてデリバリーされたゲンタマイシンの生体内分布は30分後および18時間後のいずれにおいてもEPC-DPP治療複合体としてデリバリーされたゲンタマイシンの生体内分布とは一つの重要な相違点を除いて同様であったことを示している。どちらの時点においても、DSPC-DPP治療複合体は肺においてEPC-DPP複合体の2倍を超えるゲンタマイシン量を局在させた(図34(A)-(B)および33(A)-(B))。非標的化DSPCリポソームとしてデリバリーされたゲンタマイシンの生体内分布も、デリバリーにDSPCリポソームを用いた場合は18時間後に腎臓において遙かに少ないゲンタマイシンが見られたことを除いて非標的化EPCリポソームとしてデリバリーされたゲンタマイシンの生体内分布と同様であった(図34(A)-(B)および33(A)-(B))。
これらをまとめると、上述の結果は、DSPC-DPP治療複合体は高レベルのゲンタマイシンを肺に標的化することができることを示すものである。加えて、そのような治療複合体を使用することにより腎臓におけるゲンタマイシンの蓄積(毒性効果を有することが知られている)が防止できる。
【0095】
実施例16
ゲンタマイシンを含有する治療複合体の効力
以下の実施例はゲンタマイシン含有EPC-DPP治療複合体の肺炎治療における効力を記載したものである。15匹のラットについて、1.5x107の肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)の気管内注入によって感染させることにより各動物に肺炎を起こさせた。次に、ラットをそれぞれ5匹の動物を含む3つの群に分けた。24時間後、一つの群を動物あたり5mg/kgのゲンタマイシンを投与することにより処置した。第2の群にはEPC-DPP治療複合体として製剤化したゲンタマイシンを各動物あたり5mg/kg投与した。最後の群は対照群として未処置のままにした。次にラットを次の15日間の生存について監視した。
EPC-DPP治療複合体としてデリバリーしたゲンタマイシンは肺炎の治療について遊離のゲンタマイシンよりも優れていた。EPC-DPP処置群では5匹の動物のうち1匹が死亡しただけであった。死亡は第6日に起こった。他の4匹の動物は15日間を通して生存し、感染の徴候を示さなかった。さらに、生存した動物の1匹を犠牲にしたが、病原性バクテリアは肺に見られなかった。これらの結果はEPC-DPP治療複合体としてデリバリーされたゲンタマイシンは処置したラットの80%において完全に感染を治癒したことを示す。
対照的に未処置の動物の全てが死亡した。これらの動物のうち4匹は第3日までに死亡した。遊離のゲンタマイシンで処置した5匹の動物のうち4匹は第9日までに死亡した。しかしながら1匹の動物は第15日まで生存した。従って、遊離のゲンタマイシンの効力はEPC-DPP治療複合体として肺にデリバリーされたゲンタマイシンよりもずっと劣っていた(図35)。
実施例17-22において、肺特異的管腔発現分子、ラットジペプチジルペプチダーゼIV(DPP-4)を使用して、種々の肺特異的疾病または欠損症を治療するために使用されるいくつかの治療複合体を作製している。
【0096】
実施例17
肺癌治療のための、酸感受性リンカーを有する DPP-4 ドキソルビシン治療複合体の使用
まず、実施例7におけるようなヒトドキソルビシン/DPP-4複合体の治療レベルを患者に静脈注射する。複合体の効果的な量、好ましくは生理食塩水または静脈に許容されるデリバリービヒクル中の1μg〜100mg/Kg患者体重、をデリバリーする。DPP-4 F(ab')2は肺組織に特異的である。治療複合体が肺組織へトランスサイトーシスされると、酸感受性リンカーが切断されてドキソルビシンが遊離されDNAへインターカレートする。ドキソルビシンはサイクリングしている細胞のDNAへ取り込まれるので、サイクリング過程にある癌細胞に対する効果は顕著であろうし、通常の肺癌細胞に対する効果はかなり低下するであろう。従って、この処置は肺における癌細胞の数の減少をもたらし、副作用は最小限であろう。ドキソルビシンは一般に分裂細胞を標的にするため、かつ、この組織特異性のため、ドキソルビシンは肺の分裂細胞にのみ影響を与え、従って、この処置の副作用のために死ぬ細胞の数は最小限となろうことが想像される。
実施例18では肺癌の治療のためのDPP-4/ドキソシリンプロドラッグの合成とその使用のための方法が記載される。
【0097】
実施例18
プロドラッグを用いた肺癌治療のための DPP-4/ ドキソシリン治療複合体の使用
治療複合体は、ポリペプチドリンカーまたは共有結合によりβ-ラクタマーゼに連結したDPP-4に特異的なF(ab')2を含むDPP-4/β-ラクタマーゼ結合体である。使用したリンカーはSMCCである。化学療法物質ドキソシリンはその構造中の多数の陰電荷のために内皮を通過せず、そのため全ての細胞に対して非毒性であり抗癌剤としては効果的でない。しかしながら、ドキソシリンはβ-ラクタム環が切断されてドキソルビシンを生成すると活性になるプロドラッグとして考慮することができる。ドキソルビシンは内皮を通過しサイクリング細胞のDNAへインターカレーションし、効果的な化学療法剤となる。
初めに、治療的量のDPP-4/β-ラクタマーゼ複合体を患者に静脈投与する。DPP-4 F(ab')2を治療複合体中のβ-ラクタマーゼプロドラッグに切断されないリンカーを用いて連結する。DPP-4 F(ab')2リガンドは肺組織に標的化されている。この治療複合体の治療的レベルを約1μg〜100mg/Kg患者体重にて患者に投与する。治療複合体の投与および局在化後、ドキソシリンの治療的レベルを約1μg〜100mg/Kg患者体重、好ましくは、10μg〜100mg/Kg患者体重で患者に投与する。ドキソシリンは全身的に取り込まれるが、肺の微小環境においてのみドキソシリンはβ-ラクタマーゼによって切断されてドキソルビシンを生成する。従って、このプロドラッグの真核生物細胞傷害性活性はβ-ラクタマーゼの場所、すなわち肺、においてのみ現れる。ドキソルビシンは肺組織によって取り込まれDNAへインターカレーションする。しかしながら、ドキソルビシンはサイクリング細胞のDNAへ取り込まれるので、サイクリング過程にある癌細胞に対する効果は顕著であり正常な肺癌細胞に対する効果はかなり低下する。この治療は肺における癌細胞数の減少を生じさせる。
実施例19において、DPP-4/セファレキシンプロドラッグ治療複合体の合成および肺炎治療のためのその使用方法を記載する。
【0098】
実施例19
肺感染の治療のための DPP-4 治療複合体の使用
最も一般的な細菌性肺炎は肺炎連鎖菌(Streptococcus pneumoniae)によって引き起こされる肺炎球菌性肺炎である。他の細菌性肺炎はインフルエンザ菌(Haemophilus influenza)およびマイコプラズマの種々の株によって引き起こされる。肺炎球菌性肺炎は一般にペニシリンで治療される。しかしながら、ペニシリン耐性株がより一般的になってきている。
本発明は以下のようにヒト(または他の哺乳動物)における肺炎連鎖菌肺炎の治療に使用される:治療複合体はヒトDPP-4抗体のF(ab')2断片をセファレキシンに連結することによって作製する。使用するリンカーはリポソームである。リポソームはF(ab')2断片が膜内に取り込まれ、セファレキシンがリポソーム内部に保持されるように構築する。リポソームは、リガンドがリン脂質二重層の一部となるようにDPP-4/F(ab')2リガンドの存在下でリポソームを重合させて作製し、薄フィルム水和技術およびそれに続く凍結乾燥サイクルを用いて調製する。しかしながら、リポソーム懸濁液は当業者に知られた方法に従って調製することもできる。0.1〜10nmolの治療複合体を静脈注射する。セファレキシンを保持するリポソームはDPP-4特異的(Fab')2断片によって肺に標的化される。内皮に結合すると、リポソームは取り込まれ、セファレキシンが肺組織に取り込まれる。次にセファレキシンは分裂しているS.pneumonia 生物の細胞壁に作用することができる。抗生物質を特異的な領域に標的化することの一つの利点は同じ結果を得るためにより少ない量の抗生物質しか必要とせず、副作用の可能性がより低く、微生物の薬剤耐性への寄与の可能性がかなり低減されることである。
実施例20では、DPP-4/リファンピンプロドラッグ治療複合体の合成および結核の治療におけるその使用を記載する。
【0099】
実施例20
結核の治療のための DPP-4 治療複合体の使用
細菌M.tuberculosis(結核菌)によって引き起こされる結核のような、リファンピンまたはイソニアジドを長期間用いてしばしば治療される疾病は本発明の治療剤を用いてより効果的に治療されるであろうことは容易に想像される。この疾病の発生率の高さおよびこの微生物における薬剤耐性の理由の多くは極度に長い治療期間に対してコンプライアンスがないことである。高濃度の抗生物質によって肺を直接的に標的化する方法を用いると実行の難しい長期治療に対する必要性を低減し、従ってノンコンプライアンスの発生率と薬剤耐性を低下させることが想像される。
ヒト(または他の哺乳動物)の結核治療に使用するための好ましい実施態様は以下の通りである:治療複合体はヒトDPP-4抗体のF(ab')2断片をリファンピンに連結することによって構築する。使用するリンカーはリポソームである。リポソームはF(ab')2断片が膜に取り込まれてリファンピンがリポソーム内部に保持されるように構築する。リポソームは、リガンドがリン脂質二重層の一部となるようにDPP-4/F(ab')2リガンドの存在下でリポソームを重合させて作製し、薄フィルム水和技術およびそれに続く凍結乾燥サイクルを用いて調製する。しかしながら、リポソーム懸濁液は当業者に知られた方法に従って調製することもできる。0.1〜10nmolの治療複合体を静脈注射する。リファンピンを保持するリポソームはDPP-4特異的(Fab')2断片によって肺に標的化される。内皮に結合すると、リポソームは取り込まれ、リファンピンが肺組織に取り込まれる。次に、リファンピンはM.tuberculosis生物に作用することができる。
実施例21において、DPP-4/界面活性タンパク質治療複合体の合成および界面活性タンパク質の生産不足によって生じる肺疾病治療のためのその使用を記載する。
【0100】
実施例21
界面活性欠損の治療のための DPP-4 治療複合体の使用
肺気腫を含むいくつかの肺疾病は疾病の原因の一部または結果の一部として界面活性タンパク質の欠損を含む。本発明は以下のように界面活性欠損の治療に使用される:DPP-4抗体のF(ab')2断片をSP-A(界面活性タンパク質A)のような界面活性タンパク質に連結することによって治療複合体を構築する。使用するリンカーはpH感受性結合である。この治療複合体を患者の静脈に注射し、DPP-4特異的F(ab')2断片により肺を標的化する。内皮に結合すると治療複合体は肺組織によってトランスサイトーシスされ、pH変化が結合を切断し、界面活性タンパク質が遊離される。
実施例22では、DPP-4/コルチコステロイド治療複合体の合成と移植肺組織の拒絶を治療するためのその使用を記載する。
【0101】
実施例22
肺移植拒絶の治療のための DPP-4 治療複合体
本発明は以下のように肺移植拒絶の治療のために使用される:DPP-4抗体のF(ab')2断片をコルチコステロイドまたはシクロスポリンのような免疫抑制物質にpH感受性リンカーを用いて連結することによって治療複合体を構築する。この治療複合体を患者の静脈へ注射し、DPP-4特異的F(ab')2断片により肺を標的化する。内皮に結合すると、この治療複合体は肺組織によってトランスサイトーシスされ、または取り込まれ、pH変化により結合が切断され、肺の領域においてのみ免疫抑制物質が遊離される。そのような治療の利点は、患者は免疫抑制されず外科手術からの回復の間健全な活性免疫系を有することであることが容易にわかる。肺(または他の移植器官)は免疫抑制される唯一の器官であり、注意深く監視される。
【0102】
当業者はこれらの方法および組成物は、本明細書に内在するものと同様に、述べてきた目的を実行し結果および利益を得るために適合させることができることを理解するであろう。本明細書に記載した方法、手順、および組成物は好ましい実施態様を代表的に示した例示であり、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。本発明の精神の範囲内に包含され、開示の範囲によって規定される変更または他の使用は当業者には想像できるであろう。
当業者は記載した本発明の特徴および実施態様はそれぞれ別個に実施することも互いに組み合わせて使用することもできることを認識する。従って、別々の実施態様の組み合わせも開示したように本発明の範囲内である。
本明細書中で言及した全ての特許および刊行物は本発明が属する分野の当業者の水準を示したものである。
ここに例示的に記載した本発明は特に開示しなかった一切の要素または限定なしに適切に実行できるであろう。種々の改変が本発明の範囲内で可能であることが理解される。従って、本発明は好ましい実施態様および任意的な特徴によって具体的に開示してきたが、当業者は改変および開示した概念の変形を行うことができ、そのような改変または変形は開示によって規定される本発明の範囲内と考えられることは言うまでもない。
本発明の他の実施態様は請求の範囲の範囲内で考えることができる。
【図面の簡単な説明】
【0103】
【図1】内皮細胞表面、組織特異的分子と相互作用する典型的な治療複合体を描写したものである。
【図2】図2(A)-(D)はCD71または対照抗体を注射したラットの組織切片の免疫組織化学を示したものである。図2(A)はCD71を注射したラットの脳である。図2(B)は対照抗体を注射したラットの脳である。図2(C)は、CD71を注射したラットの肺である。図2(D)は対照抗体を注射したラットの肺である。
【図3】肺から単離した管腔タンパク質のポリアクリルアミドゲルを示す。ジペプチジルIVはDPP-4とラベル付けしてある。
【図4】図4(A)-(F)は種々の組織の一連の免疫ヒストグラムであり、腎臓および肺における抗-ジペプチジルペプチダーゼ抗体の管腔組織への結合を示したものである。
【図5】肺から単離した管腔タンパク質の別の組のポリアクリルアミドゲルを示す。炭酸脱水素酵素IVはCA-4とラベル付けしてある。
【図6】膵臓から単離した管腔タンパク質のポリアクリルアミドゲルを示したものである。チモーゲン顆粒16タンパク質はZG16Pとラベル付けした。
【図7】図7(A)-(F)は種々の組織の一連の免疫ヒストグラムであり、膵臓および結腸におけるMAdCAM抗体の管腔組織への結合が示されている。
【図8】図8(A)-(F)は種々の組織の一連の免疫ヒストグラムであり、腎臓におけるThy-1(CD90)抗体の管腔組織への結合が示されている。
【図9】前立腺から単離した管腔タンパク質のポリアクリルアミドゲルを示したものである。アルブミン断片はT406-608とラベル付けしてある。
【図10】図10(A)-(D)は種々の組織の一連の免疫ヒストグラムであり、OX-61のジペプチジルペプチダーゼIV(肺の脈管の管腔表面上に発現されている)への結合が示されている。
【図11】図11(A)-(D)は種々の組織の一連の免疫ヒストグラムであり、OST-2のMadCam-1(膵臓および結腸の脈管の管腔表面上で発現している)への結合が示されている。
【図12】図12(A)-(F)は種々の組織の一連の免疫ヒストグラムであり、OX-7のCD90(腎臓の脈管の管腔表面上に発現している)への結合が示されている。
【図13】図13(A)-(F)は種々の組織の一連の免疫ヒストグラムであり、抗炭酸脱水素酵素IV抗体の炭酸脱水素酵素IV(心臓および肺の脈管の管腔表面上に発現している)への結合が示されている。
【図14】図14(A)-(E)は肺の一連の免疫ヒストグラムであり、24時間のOX-61のジペプチジルペプチダーゼIVへの経時的結合プロファイルを示したものである。
【図15】図15(A)-(D)は膵臓の一連の免疫ヒストグラムであり、48時間のOST-2のMadCam-1への結合の経時的プロファイルを示したものである。
【図16】図16(A)-(F)は腎臓の一連の免疫ヒストグラムであり、8時間のOX-7のCD90への結合の経時的プロファイルを示したものである。
【図17】図17(A)-(C)は24時間にわたるユーロピウム標識OX-61(肺に局在した)の注射用量の割合を示したグラフである。点線はいずれかの時間に示した組織のいずれかに結合したアイソタイプ対照抗体の最大レベルを示す。
【図18】図18(A)-(C)は特定の組織に局在したユーロピウム標識抗インフルエンザIgG2Aアイソタイプ対照抗体の24時間にわたる注射用量の割合を示したグラフである。
【図19】膵臓に局在した図19(A)-(C)はユーロピウム標識OST-2の24時間にわたる注射した用量の割合を示したグラフである。点線はいずれかの時間に示した組織のいずれかに結合したアイソタイプ対照抗体の最大レベルを示す。
【図20】心臓および肺に局在するユーロピウム標識抗炭酸脱水素酵素IV抗体の24時間にわたる注射した用量の割合を示したグラフである。
【図21】種々の組織および体液中に局在する、注射した125I-標識OX-61の8時間にわたる量を示したグラフである。
【図22】ジペプチジルペプチダーゼIVによるOX-61のトランスサイトーシス輸送を示す肺の切片の免疫ヒストグラムである。
【図23】CD90によるOX-7のトランスサイトーシス輸送を示す腎臓の切片の免疫ヒストグラムである。
【図24】OST-2が脈管の管腔表面上のMadCam-1に結合するが内皮を横切って輸送はされないことを示した膵臓の切片の免疫ヒストグラムである。
【図25】抗-炭酸脱水素酵素IV抗体は脈管の管腔表面上の炭酸脱水素酵素IVに結合するが内皮を横切って輸送はされないことを示す、肺の切片の免疫ヒストグラムである。
【図26】図26(A)-(F)はOX-61/ゲンタマイシン治療複合体のジペプチジルペプチダーゼIV(肺の脈管の管腔表面上に発現している)への結合を示す種々の組織の一連の免疫ヒストグラムである。
【図27】図27(A)-(D)はOX-61/ドキソルビシン治療複合体のジペプチジルペプチダーゼIV(肺の脈管の管腔表面上に発現している)への結合を示す種々の組織の一連の免疫ヒストグラムである。
【図28】ジペプチジルペプチダーゼIVによるOX-61/ゲンタマイシン治療複合体のトランスサイトーシス輸送を示す肺の切片の免疫ヒストグラムである。
【図29】ジペプチジルペプチダーゼIVによるOX-61/ドキソルビシン治療複合体のトランスサイトーシス輸送を示す肺の切片の免疫ヒストグラムである。
【図30】図30(A)-(F)はMadCam-1(結腸および膵臓の脈管の管腔表面上に発現している)へのOST-2/ゲンタマイシン治療複合体の結合を示す種々の組織の一連の免疫ヒストグラムである。
【図31】図31(A)-(F)はMadCam-1(結腸および膵臓の脈管の管腔表面上に発現している)へのOST-2/ドキソルビシン治療複合体の結合を示す種々の組織の一連の免疫ヒストグラムである。
【図32】図32(A)-(B)は、DSPC-DPP治療複合体として肺および腎臓にデリバリーされたゲンタマイシン量に比較した、肺および腎臓に18時間にわたって蓄積した遊離のゲンタマイシンの量を示したグラフである。
【図33】図33(A)-(B)はEPC-DPP治療複合体中で肺および腎臓にデリバリーされたゲンタマイシンの量に比較した、肺および腎臓に蓄積した遊離のゲンタマイシンの18時間にわたる量を示したグラフである。
【図34】図34(A)-(B)は、DSPC-DPP治療複合体および非標的化リポソームとして種々の組織へデリバリーされたゲンタマイシン量に比較した、種々の組織に18時間にわたって蓄積した遊離のゲンタマイシンの量を示したグラフである。
【図35】遊離のゲンタマイシンおよびEPC-DPP治療複合体中のゲンタマイシンの両方の、肺感染の治療における効力を示したものである。
発明の分野
本発明は一般に、組織特異的内皮膜タンパク質を用いて医薬または他の治療剤を特定の組織へ標的化することに関する。
【0002】
関連技術の記載
従来の医薬が患者にデリバリーされるときは、それらは患者の全身を循環し、全てではないにしろ身体の大部分の組織または細胞に対して作用する。これは治療のために高用量を必要とし、全身毒性および副作用を生じさせる。
医薬または診断試薬の特異的器官、組織または細胞への標的化デリバリーはそのような非特異的治療よりもかなり安全であり、より効果的である。なぜなら、必要とされる薬剤の量はより少なく、副作用または毒性の可能性はかなり低いからである。
医薬の標的化デリバリーのための従前の方法には、インプラント(例えば、Elise(1999) PNAS USA 96:3104-3107)、ステントまたはカテーテル(例えば、Murphy(1992)、Circulation 86:1596-1604)の使用、または器官の血管隔離(vascular isolation)(例えば、Vahrmeijer(1998) Semin. Surg. Oncol. 14:262-268)が含まれる。しかしながら、これらの技術は侵襲的で外傷性であり、広範な炎症性応答および繊維細胞増殖を引き起こし得る。
【0003】
組織特異的デリバリーの従前のほとんどの試みは脈管構造という天然の障壁のせいで化合物がアクセスできない組織内部の部位に依存していた。化合物の標的デリバリーのための別の方法は組織細胞自体というより脈管構造の管腔表面上に露出した器官または組織特異的分子を含む。これらの分子の利用により非常に特異的な反応が可能となるであろう。この特異性は、脈管構造はそれが埋め込まれている組織の必要性に適合するために複雑で動的な系を形成するので、血管はこれらの組織特異的タンパク質を発現しなければならないという事実のためである。
従来、脈管構造の管腔表面上に露出しアクセス可能であるこれらの器官または組織特異的分子を同定するための方法は、利用可能な分子の同定に至っていない。これは内皮膜がどの器官でもその組織量のごく一部分を占めるに過ぎないからである。従来の手段で器官を解析した場合、内皮膜は組織ホモゲネート全体に分散してしまう。このことは内皮膜およびそのタンパク質を分けて解析することを本質的に不可能にしてしまう。さらに、単離して培養したとしても、これらの膜はその組織特異的特性を失う傾向がある。そのような分子が有用な様式で単離されるならば、患者の疾病の治療に関するそれらの分子の利用を可能とする方法が考慮されるに違いない。
【0004】
発明の概要
本発明のいくつかの例示的態様が存在する。そのような態様の一つは、治療薬を特異的組織にデリバリーする方法であって、治療上効果的な量の治療複合体を投与することを含み、前記治療複合体は組織特異的管腔発現タンパク質に結合するリガンド、治療的部分、および前記治療的部分を前記リガンドに連結させるリンカーを含む。
他の態様には、標的内皮細胞と相互作用する肺および/または心臓特異的治療複合体が含まれる。この複合体は、前記治療複合体を特定の組織の脈管内皮細胞膜管腔表面へ付着させるリガンド、リンカー、および治療的部分を含み、前記リガンドは配列番号9若しくは11、またはそれらの類似体に結合するものであり、前記リンカーは前記リガンドを前記治療的部分に連結させる。
別の態様には、組織または細胞中の炭酸脱水素酵素IV(CA-4)の存在又は濃度を決定する方法を含む。この方法は、上記肺および/または心臓特異的治療複合体を前記組織又は細胞にin vitro若しくはin vivoで投与すること、および、結合した治療複合体を同定またはその量を定量することを含む。
別の態様には、上述の肺および/または心臓特異的治療複合体および1以上の製薬的に許容できる担体とを含む医薬組成物が含まれる。
【0005】
別の態様には、標的内皮細胞と相互作用する肺および/または腎臓特異的治療複合体が含まれ、この治療複合体は前記治療複合体を特定の組織の脈管内皮細胞膜の管腔表面へ付着させるリガンド、リンカー、および治療的部分を含み、前記リガンドは配列番号4若しくは6またはそれらの類似体に結合し、前記リンカーは前記リガンドを前記治療的部分に連結させるものである。
別の態様には、組織または細胞のジペプチジルペプチダーゼIV(DPP-4)の存在または濃度を決定する方法が含まれ、その方法は上記肺および/または腎臓特異的治療複合体を前記組織または細胞にin vitro若しくはin vivoで投与すること、および結合する治療複合体を同定、またはその量を定量することを含む。
別の態様には、上記肺および/または腎臓特異的治療複合体および1以上の製薬的に許容できる担体を含む医薬組成物が含まれる。
【0006】
別の態様には、標的内皮細胞と相互作用する膵臓および/または消化管(gut)特異的治療複合体が含まれ、この複合体は、前記治療複合体を特定の組織の脈管内皮細胞膜の管腔表面へ付着させるリガンド、リンカーおよび治療的部分を含み、前記リガンドは配列番号14若しくは16またはそれらの類似体へ結合するものであり、前記リンカーは前記リガンドを前記治療的部分に連結させるものである。
別の態様には、組織または細胞中のZG16-pの存在または濃度を決定する方法であって、上記膵臓および/または消化管特異的治療複合体を前記組織または細胞にin vitro若しくはin vivoで投与すること、および結合した治療複合体を同定またはその量を定量することを含む。
別の態様には前記膵臓および/または消化管特異的治療複合体および1以上の製薬的に許容できる担体を含む医薬組成物が含まれる。
【0007】
別の態様には、標的内皮細胞と相互作用する前立腺特異的治療複合体が含まれ、この複合体は前記治療複合体を、配列番号23またはその類似体を含む特定の組織の脈管内皮細胞膜の管腔表面へ付着させるリガンド、リンカー、および治療的部分を含み、前記リンカーは前記リガンドを前記治療的部分に連結させるものである。
別の態様には、組織または細胞中のアルブミン断片の存在または濃度を決定する方法が含まれ、その方法は上記前立腺特異的治療複合体を前記組織または細胞へin vivo若しくはin vitroで投与すること、および結合した治療複合体を同定またはその量を定量することを含む。
別の態様には、前記前立腺特異的治療複合体および1以上の製薬的に許容できる担体を含む医薬組成物が含まれる。
【0008】
別の態様には標的内皮細胞と相互作用する脳特異的治療複合体が含まれる。この複合体は、前記治療複合体を特定の組織の脈管内皮細胞膜の管腔表面に付着させるリガンド、リンカー、治療的部分を含み、前記リガンドは配列番号26若しくは28またはそれらの類似体に結合するものであり、前記リンカーは前記リガンドを前記治療的部分に連結させるものである。
別の態様には、組織または細胞におけるCD71(トランスフェリンレセプター)の存在または濃度を決定する方法が含まれ、その方法は上記脳特異的治療複合体を前記組織または細胞にin vivoまたはin vitroで投与すること、および結合した治療複合体を同定またはその量を定量することを含む。
別の態様には、前記脳特異的治療複合体および1以上の製薬的に許容できる担体を含む医薬組成物が含まれる。
【0009】
別の態様には、標的内皮細胞と相互作用する膵臓および/または消化管特異的治療複合体が含まれ、この複合体は前記治療的部分を特異的組織の脈管内皮細胞膜の管腔表面に付着させるリガンド、リンカー、および治療的部分を含み、前記リガンドは配列番号18若しくは20またはそれらの類似体に結合し、前記リンカーは前記リガンドを前記治療的部分に連結させるものである。
別の態様には、組織または細胞におけるMAdCAM(MadCam-1)の存在または濃度を決定する方法が含まれ、その方法は上記膵臓および/または消化管特異的治療複合体を前記組織または細胞にin vitroまたはin vivoで投与すること、および結合した治療複合体を同定又はその量を定量することを含む。
別の態様には、上記膵臓および/または消化管特異的治療複合体および1以上の製薬的に許容できる担体を含む医薬組成物が含まれる。
【0010】
別の態様には、標的内皮細胞と相互作用する腎臓特異的治療複合体が含まれ、その複合体は前記治療複合体を特異的組織の脈管内皮細胞膜の管腔表面へ付着させるリガンド、リンカー、および治療的部分を含み、前記リガンドは配列番号30若しくは32またはそれらの類似体へ結合し、前記リンカーは前記リガンドを前記治療的部分に連結するものである。
別の態様には、組織または細胞におけるCD90の存在または濃度を決定する方法が含まれ、その方法は腎臓特異的治療複合体を前記組織または細胞へin vitro若しくはin vivoで投与すること、および結合した治療複合体を同定またはその量を定量することを含む。
別の態様には上記腎臓特異的治療複合体および1以上の製薬的に許容できる担体を含む医薬組成物が含まれる。
別の態様には、上記前立腺特異的治療複合体を癌細胞の数を低下させるために効果的な量で投与することを含む前立腺癌の治療方法が含まれ、前記方法において前記治療的部分は化学療法物質である。
別の態様には、上記脳特異的治療複合体を癌細胞の数を低下させるために効果的な量で投与することを含む脳腫瘍の治療方法が含まれ、前記方法において前記治療的部分は化学療法物質である。
【0011】
別の態様には、1以上の上記膵臓および/または消化管特異的治療複合体を血栓症を低下させために効果的な量で投与することを含む膵臓癌の治療方法が含まれ、前記方法において前記治療的部分は抗血栓症剤である。
別の態様には、腎臓移植拒絶を治療する方法が含まれ、前記方法は上記肺および/または腎臓特異的治療複合体を腎臓移植の拒絶を低下させるために効果的な量で投与することを含み、前記方法において前記治療的部分は免疫抑制剤である。
別の態様には特定の組織へ治療薬剤をデリバリーする方法が含まれ、前記方法は治療複合体の治療的効果量を投与することを含み、前記治療複合体は、組織特異的管腔発現タンパク質に結合するリガンド、治療的部分、および前記治療的部分を前記リガンドに連結するリンカーを含み、前記組織特異的管腔発現タンパク質はCD71、CD90、MAdCAM、アルブミン断片、炭酸脱水素酵素IV、ZG16-p、およびジペプチジルペプチダーゼIVからなる群より選ばれる。
【0012】
別の態様には、in vivoまたはin vitroにおける物質の肺および/または心臓特異的デリバリーのための方法が含まれ、前記方法は、炭酸脱水素酵素IV-結合因子を提供すること、および前記炭酸脱水素酵素IV-結合因子をin vivoまたはin vitroで投与することを含み、前記物質は炭酸脱水素酵素IV-結合因子の投与の結果として肺および/または心臓、または肺および/又は心臓組織へデリバリーされる。
別の態様には肺および/または心臓特異的リガンドを同定する方法が含まれ、前記方法は炭酸脱水素酵素IV-結合因子の同定を含む。
別の態様には、in vivoまたはin vitroにおける物質の脳特異的デリバリーのための方法が含まれ、前記方法は、CD71(トランスフェリンレセプター)結合因子を提供すること、および前記CD71-結合因子をin vivoまたはin vitroで投与することを含み、前記物質はCD71-結合因子の投与の結果として脳または脳組織へデリバリーされる。
別の態様には、CD71-結合因子を同定することを含む、脳特異的リガンドを同定する方法が含まれる。
【0013】
別の態様には、in vivoまたはin vitroにおける物質の腎臓特異的デリバリーのための方法が含まれ、前記方法は、CD90(Thy-1)結合因子を提供すること、および前記CD90結合因子をin vivoまたはin vitroで投与することを含み、前記物質はCD90-結合因子の投与の結果として腎臓または腎臓組織へデリバリーされる。
別の態様には、CD90-結合因子を同定することを含む、腎臓特異的リガンドを同定する方法が含まれる。
別の態様には、in vivoまたはin vitroにおける物質の肺および/または腎臓特異的デリバリーのための方法が含まれ、前記方法はジペプチジルペプチダーゼIV-結合因子を提供すること、および前記ジペプチジルペプチダーゼIV-結合因子をin vivoまたはin vitroで投与することを含み、前記物質はペプチジルペプチダーゼIV-結合因子の投与の結果として肺および/または腎臓、または肺および/または腎臓組織へデリバリーされる。
別の態様には、ジペプチジルペプチダーゼIV-結合因子を同定することを含む、肺および/または腎臓特異的リガンドを同定する方法が含まれる。
【0014】
別の態様には、in vivoまたはin vitroにおける物質の膵臓および/または消化管特異的デリバリーのための方法が含まれ、前記方法は、ZC16-p-結合因子を提供すること、および前記ZG16-p-結合因子をin vivoまたはin vitroで投与することを含み、前記物質はZG16-p-結合因子の投与の結果として膵臓および/または消化管、または膵臓および/または消化管組織へデリバリーされる。
別の態様には、ZG16-p-結合因子を同定することを含む、膵臓および/または消化管特異的リガンドを同定する方法が含まれる。
別の態様には、in vivoまたはin vitroにおける物質の膵臓および/または消化管特異的デリバリーのための方法が含まれ、前記方法はMAdCAM-結合因子を提供すること、および、前記MAdCAM-結合因子をin vivoまたはin vitroで投与することを含み、前記物質はMAdCAM-結合因子の投与の結果として膵臓および/または消化管、または膵臓および/または消化管組織へデリバリーされる。
別の態様には、MAdCAM-結合因子を同定することを含む、膵臓および/または消化管特異的リガンドを同定する方法が含まれる。
別の態様には、in vivoまたはin vitroにおける物質の前立腺特異的デリバリーのための方法が含まれ、前記方法はアルブミン断片-結合因子を提供すること、前記アルブミン断片-結合因子をin vivoまたはin vitroで投与することを含み、前記物質はアルブミン断片-結合因子の投与の結果として前立腺または前立腺組織へデリバリーされる。
別の態様にはアルブミン断片-結合因子を同定することを含む、前立腺特異的リガンドを同定する方法が含まれる。
【0015】
好ましい実施態様の詳細な記載
本明細書において記載される一つの実施態様は特異的な組織(それが疾病状態にあろうがなかろうが)へデリバリーするための治療化合物の組成物または治療化合物の使用方法を提供する。具体的には、本発明は、組織特異的に管腔に露出されている内皮細胞上のタンパク質を使用し、その結果、本明細書に記載する組織特異的治療複合体は、それらの療複合体が管腔露出内皮タンパク質へ結合することのために、特異的組織に局在する。この実施態様は医薬物質を特異的な組織へ局在化および濃縮することを可能とし、従ってその医薬物質の治療インデックスを増加させることができる。この局在性はその薬剤による副作用の可能性を減少させ、同じ効果を得るためにその薬剤を低濃度で使用することが可能になるであろう。管腔露出組織特異的内皮タンパク質への局在化はその組織が関与する種々の疾病の治療に単一のリガンドを使用することができるというさらなる利点を与える。言い換えると、組織の各疾病状態について疾病特異的リガンドを作製する必要がない;なぜなら、その組織または器官の管腔内皮細胞上に通常見られるタンパク質を発現している、影響を受けた組織に1以上の治療複合体の充分な量が結合するであろうから。この特徴により、単一のリガンドを使用してその組織と関連したいずれの疾病をも治療する治療複合体を作製することが可能になる。組織特異的分子は2000年3月20日出願の米国特許出願第09/528,742号の方法によって、または他のどんな同定方法によっても同定することができる。米国特許出願第09/528,742号に開示された方法は、種々の組織の血管の内表面上に露出した全てのタンパク質のin vivo単離を可能にする。組織を形成する全ての他のタンパク質(これが大多数である)はこの方法においては破棄される。次に、得られる管腔露出脈管タンパク質の組を分離して生化学的に解析して各タンパク質を個々に同定することができる。各組織で発現されているタンパク質の組を比較することにより、与えられた組織に特異的であるタンパク質が同定される。注目するタンパク質を次にシーケンシングする。その標的タンパク質に特異的に結合するリガンドが得られる。これらのリガンドはその標的タンパク質、すなわち組織特異的に管腔で発現しているタンパク質に結合すると、好ましくはそれが結合する細胞の特異的シグナル伝達系路は活性化しないが、細胞輸送または飲作用の過程を活性化し得る。
【0016】
内皮細胞組織特異的タンパク質は血液にアクセス可能で、従って、それらは特定の組織へ治療複合体を局在化させるために使用する部位特異的標的において作用することができる。血管はこれらの組織特異的内皮タンパク質を発現している。なぜなら、脈管構造はそれが埋め込まれている組織の必要性に適合した複雑かつ動的な系を形成しているからである。これらのタンパク質の多くは構成的に発現しており、このことはそれらの発現レベルは種々の疾病状態で有意には変化しないことを意味し、その組織またはその組織を含む器官が疾病状態にあるか否かにかかわらず医薬のデリバリーのための理想的な標的となることを意味する。加えて、これらのタンパク質の多くはトランスサイトーシス、すなわち血液内から組織への物質の輸送の過程、に関与している。
【0017】
定義
別に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は本発明の属する分野の当業者が一般的に理解する意味を有する。本明細書において、以下の用語は特に述べない限りそれらに割当てられた意味を有する。
本明細書において、「消化管」とは胃腸(GI)管と同義語である。
本明細書において用語「標的タンパク質」とは、組織特異的、管腔曝露脈管タンパク質である。
本明細書において、用語「リガンド」とは、標的タンパク質に特異的に結合する分子である。これらはペプチドであってもよく、抗体または抗体の一部であってもよく、非タンパク質性部分であってもよい。
本明細書において「リンカー」とは、リガンドおよび治療的部分を同じ領域、組織または細胞へ標的化することを可能とするいっさいの結合、小分子、または他のビヒクルをいう。リンカーは、標的タンパク質への結合のためにリガンドおよび治療的部分を結合させる、またはそうでなくてもこれらを一緒に保持する。
本明細書において、「治療的部分」とは、ある種の結果を生じさせるために使用することのできるどんな種類の物質をもいう。この結果とは正でも負でもありえ、あるいは、結果とは単なる診断でもあり得る。結果とは細胞の分子発現を単に変化させるというようなより些細なものでもあり得る。治療的部分はプロドラッグを対応する医薬物質へ変換することを可能とする酵素であってもよい。
【0018】
用語「治療複合体」とは、標的タンパク質に特異的なリガンドおよび1以上の治療的部分およびリンカーを含むどのような種類の分子をも言う。しかしながら、治療複合体はプロドラッグを対応する医薬物質へ変換することを可能とする酵素または他の何かの切断誘導因子を含み得ることは言うまでもない。
本明細書において「組織特異的」とは、投与後に本治療複合体の相当な割合がその組織へ結合することを可能とする、特異的な組織または細胞型において優先的に発現している分子についていう。この分子は他の組織よりも1またはいくつかの組織においてかなり高濃度で見いだされるかもしれない。例えば、組織特異的分子は他の組織に比較して肺において高度にアップレギュレーションされているかもしれないが、脈管全体にわたる結合の統計的分布に基づいてより特異的に投与することができる。治療複合体の適切な投与(しばしば低用量)は、非標的組織においてランダムに現れる量が副作用をほとんど若しくは全く生じさせないように行われるであろう。
【0019】
一般的技術
本明細書に記載する実施態様は、この分野で知られた、および、学術文献および特許文献に記載された既知のどの方法またはプロトコルによっても実施することができる。本明細書に記載の実施態様で使用する種々の組成物(たとえば、天然または合成化合物、ポリペプチド、ペプチド、核酸、抗体、毒素その他)は、遺伝的に操作され、増幅され、およびまたは組換え的に発現されて、種々の起源から単離することができる。あるいは、これらの組成物はin vitroでよく知られた、例えば、Organic Synthesis, 総集巻、Gilmanら(編集)、John Wiley & Sons, Inc.,NY; Carruthers (1982) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47: 411-418; およびCaruthersら、米国特許第4,458,066号、1984年7月3日に記載されたような化学合成技術によって合成することができる。
【0020】
治療複合体
本発明の治療複合体は標的タンパク質、例えば、膵臓、肺、筋肉、腸、前立腺、腎臓および脳の標的タンパク質に結合し、治療的部分を選択した組織又は器官へ特異的にデリバリーする。治療複合体は少なくとも一つのリガンド、リンカーおよび少なくとも一つの治療的部分からなっている(図1参照)。しかしながら、治療複合体の3種類の構成成分の連結は種々の態様を有することが想像できる。治療的部分は治療または診断方法において使用されるいかなる種類の分子の1以上でもあり得る。例えば、治療的部分は特異的組織によって取り込まれる必要のある抗生物質であり得る。治療複合体は抗生物質をそれを必要とする組織へ濃縮しかつ標的化し、それによりその抗生物質の治療インデックスを上昇させると考えることができる。あるいは、治療的部分はin vivoまたはin vitro診断目的のものでもあり得る。本発明の特定の実施態様における治療複合体の使用のさらなる例は「治療複合体相互作用の型」と題した節中でより詳細に述べる。
【0021】
リガンド
リガンドは標的タンパク質(この場合は管腔発現組織特異的タンパク質)に特異的に結合する分子である。一つの実施態様では、リガンドは管腔発現している、組織特異的分子に特異的に結合するある種の抗体またはその一部分である。通常、リガンドは天然のリガンドの結合に関与しないエピトープを認識する。管腔発現組織特異的内皮タンパク質は当業者によくられた技術、例えば、2-ハイブリッド技術、コンビナトリアルライブラリーを用いてまたは抗体分子の作製によって同定することができる。リガンドはタンパク質であっても、RNA、DNA、小分子または標的タンパク質に特異的に結合する他のどんな種類の分子であっても良い。
【0022】
標的タンパク質は内在性膜タンパク質(例えばレセプター)であってもリガンド自体であってもよい。組織特異的分子が管腔発現タンパク質に結合するリガンドであるならば、内腔および組織特異性を示すリガンドまたはその断片は本発明の治療複合体の構築に使用される。あるいは、管腔露出リガンド分子に対する、または、類似の結合特性を有する抗体、抗体断片、抗体複合体を本発明の治療複合体の構築に使用することができる。
組織特異的管腔露出タンパク質(標的タンパク質)がレセプターであるとすると、天然のリガンドは沢山の種々の方法で当業者によって同定され得る。例えば、2-ハイブリッド技術を使用することができる。あるいは、ハイスループットスクリーニングを用いてリガンドとして作用することのできるペプチドを同定することができる。リガンドを同定するための他の方法は当業者に知られている。
【0023】
一つの実施態様において、治療複合体のリガンドはレセプター標的タンパク質の天然のリガンドと異なるエピトープを利用し、従って結合部位に関する競合は起こらない。
別の実施態様において、リガンドは抗体分子であり、好ましくはこの抗体分子は、組織特異的管腔曝露レセプター標的タンパク質に対してより高い特異性を有するか、または天然のリガンドと競合する必要が無いような様式で結合する。
抗体および断片は標準的な方法(例えば,E.Harlowら、Antibodies, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Latoratory, Cold Spring Hargbor, New York, 1988を参照せよ)によって作製することができる。しかしながら、抗体の単離、同定、および分子構築はその選択がほとんど無尽蔵な程度に開発されている。従って、抗体部分および複合体の例は、何が利用可能であるかという見本を表すことができるに過ぎないという理解の下に提供される。
【0024】
一つの実施態様では、抗体は一本鎖Fv領域である。抗体分子は、重鎖および軽鎖のそれぞれにおいて、一般に認識される2つの領域を有している。これらの領域は、問題としている特異的抗原に結合することに関与するいわゆる「可変」領域、および、補体結合、好中球およびマクロファージ結合その他のような生物学的エフェクター応答に関与するいわゆる「定常」領域である。定常領域は抗原結合には必要ない。定常領域は抗体分子から分離され、可変結合領域が得られている。従って、抗体分子が本治療複合体のリガンド部分として作用する場合には、抗体分子の結合作用には明らかに定常領域は必要ない。
抗体の可変領域は軽鎖と重鎖からなっている。軽鎖および重鎖可変領域はクローン化され外来宿主において発現されており、一方、その結合能は維持されている。従って、多重鎖凝集物(抗体)から一本鎖構造体を作製し、その一本鎖構造が多重鎖凝集物の三次元構造を維持するようにすることが可能である。
【0025】
抗体分子の多重鎖可変領域の結合能特性を有する単一ポリペプチド鎖結合タンパク質であるFv断片は本発明のリガンドとして使用することができる。これらのリガンドは、例えば、Ladnerら、米国特許5,260,203号(1993年11月9日発行)に従って、コンピューターベースのシステムと化学構造を決定するための方法を用いて作製することが出来る。これらの化学構造物は、天然には凝集しているが化学的には別個である、抗体可変領域の軽および重ポリペプチド鎖を、この2つのポリペプチド鎖の元の構造に非常によく似た3次元構造へフォールディングする単一のポリペプチド鎖へ変換するために使用される。この2つの領域はアミノ酸配列を橋として使用して連結することができる。
次に、この方法によって得られる単一鎖ポリペプチドを使用してそれをコードする遺伝子配列を調製することができる。次にその遺伝子配列を、更に制御領域に連結して、適切な宿主で複製し、発現宿主(そこで発現される)へ形質転換することができる。得られた単一ポリペプチド鎖結合性タンパク質は、リフォールディングすると、抗体の可変領域の元の2つの(軽および重鎖)ポリペプチド鎖凝集物の結合特性を有する。
【0026】
更なる実施態様においては、抗体は単一本鎖抗原結合タンパク質の多価形態である。単一鎖抗原結合タンパク質の多価形態は一価の単一鎖抗原結合タンパク質を越える重要な有用性を有している。多価抗原結合タンパク質は1以上の抗原結合部位を有しており、増強された結合アフィニティーを生じさせる。多価抗体はWhitlowら、米国特許第5,869,620号(1999年2月9日発行)に開示された方法を用いて作製することが出来る。この方法は、少なくとも2つの単一鎖分子を結合することによって多価抗原結合タンパク質を作製することを含む。ここで、各単一鎖分子は、単一鎖タンパク質へと連結された抗体重鎖または軽鎖可変領域の2つの結合性部分を有している。このようにして、抗体は抗原の異なる部分に対する結合部位を有することができ、または、複数の抗原に対する結合部位を有することができる。
【0027】
一つの実施態様において、抗体はオリゴマーである。このオリゴマーはPCT/EP97/05897(1997年10月24日)におけるように、初めにファージディスプレイライブラリーから特異的なリガンドを単離することによって作製される。オリゴマーは、低アフィニティーリガンドをオリゴマー化して高アフィニティーオリゴマーを作製することによって、これらのライブラリーからはほとんど低アフィニティーリガンドが単離されるという問題を克服する。オリゴマーは半剛性ヒンジおよび軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質(Cartilage Oligomeric Matrix Protein)(COMP)のコイル化コイル領域に融合したリガンドを有する融合タンパク質を作製することによって構築される。融合タンパク質は宿主細胞内で発現されると、自己アッセンブルしてオリゴマーとなる。
好ましくは、このオリゴマーはペプタボディー(peptabody)(Terskikhら、Biochemistry 94:1663-1668 (1997))である。ペプタボディーは、各結合部位は低結合アフィニティーを有するが複合体としては高アフィニティーをもって結合できる、5量体であるIgMとして例示される。ペプタボディーはファージディスプレイランダムペプチドライブラリーを用いて作製される。ライブラリーからの短いペプチドリガンドはCOMP(軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質)5量体化領域のN-末端において半剛性ヒンジを介して融合している。この融合タンパク質はバクテリアで発現され、バクテリア内でその標的に対して高アフィニティーを示す5量体抗体にアッセンブルされる。リガンドのアフィニティーに依存して、非常に高いアフィニティーを有する抗体が作製される。
【0028】
好ましくは、本発明の抗体、抗体部分または抗体複合体はヒトに由来するか、または組換え技術または他の技術によって「ヒト化」(即ち、ヒトにおいて非免疫原性)されたものである。そのような抗体は本明細書に開示されたモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の等価物であるが、より免疫原性が低く、より良好に患者に寛容される。
ヒト化抗体は、例えば、抗体の免疫原性部分を対応する部分であるが但し非免疫原性部分に置き換える(すなわち、キメラ抗体)ことによって作製される(例えば、Robinsonら、PCT出願No. PCT/US86/02269;Akiraら、 欧州特許出願第184,187号;Taniguchi、欧州特許出願第171,496号;Morrisonら、欧州特許出願第173,494号、Neubergerら、国際公開公報No. WO86/01533;Cabillyら、欧州特許出願第125,023号;Betterら、Science 240:1041-1043 (1988);Liuら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3433(1987);Liuら、J. Immunol. 139:3521-3526(1987);Sunら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218 (1987);Nishimuraら、Canc. Res. 47:999-1005 (1987);Woodら、Nature 314:446-449 (1985));Shawら、J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559 (1988)を参照せよ。)。「ヒト化」キメラ抗体の一般的な総説はMorrison(Science, 229:1202-1207 (1985))およびOiら、BioTechniques 4:214 (1986)によって与えられる。
【0029】
あるいは、適切な「ヒト化」抗体はCDRまたはCEA置換(Jonesら、Nature 321:552-525 (1986);Verhoeyanら、Science 239:1534 (1988);Bsidlerら、J. Immunol. 141:4053-4060 (1988))によっても作製することができる。
小分子とは、一切の非生体高分子性DNA、RNA、マクロ環、アルケンアイソマーのような有機若しくは無機分子、または製薬工業において薬剤として典型的に考えられる多くのものである。これらの分子はしばしばコンビナトリアル法を通じて同定される。特に、リガンドは「ドッキング」と呼ばれる方法を用いて同定することができる。この方法は、遊離のリガンドとレセプターの構造だけが与えられた場合にリガンド−レセプター複合体の構造および結合自由エネルギーを予測しようとする合理的薬剤設計へのアプローチである。典型的にはこれらの小分子は特異的なタンパク質に結合してある効果を生じさせるために使用される。しかしながら、これとの関連において、それらの小分子を単に特定のタンパク質に結合し、接続されている薬剤を要求される器官に局在化するために使用することも考慮される。
【0030】
リンカー
本明細書において「リンカー」とは、リガンドおよび治療的部分を同じ領域、組織または細胞に標的化することを可能とする一切の結合、小分子、または他のビヒクルをいう。好ましくは、リンカーは切断可能である。
一つの実施態様において、リンカーは1以上のリガンドと1以上の治療的部分との間の化学結合である。従って、この結合は共有結合でもイオン結合でもよい。リンカーが化学結合である治療複合体の例は融合タンパク質であろう。一つの実施態様において、この化学結合は酸感受性であり、pH感受性結合は血流(pH7.5)から細胞輸送小胞または細胞内部(pH約6.0)へ移行すると切断される。あるいは、この結合は酸感受性でないかもしれないが、続いて添加される、または標的部位の微小環境中に天然に見出される特異的な酵素または化学物質によって切断することができてもよい。あるいは、この結合は還元条件下で切断される結合、例えば、ジスルフィド結合であってもよい。あるいは、この結合は切断可能でなくてもよい。
酸切断可能または酸感受性のいかなる種類のリンカーも使用できる。酸切断可能結合の例には以下が含まれるがこれらに限定されない:cis-ポリカルボキシルアルケンとして知られる有機酸クラス。このクラスの分子は少なくとも1つの二重結合を含む炭素鎖に結合した少なくとも3つのカルボキシル基(COOH)を含む。これらの分子、および、どのようにそれらを作製し使用するかはShenら、米国特許第4,631,190号に開示されている。あるいは、温和な酸性条件で切断されるアミノ-スルフィドリル架橋試薬のような分子を使用することができる。これらの分子はBlattlerら、米国特許第4,569,789号に開示されている。
【0031】
あるいは、酸切断可能リンカーは、生分解性、加水分解可能結合のような、徐放性結合であってもよい。典型的な生分解性担体結合にはエステル、アミドまたはウレタン結合が含まれ、従って典型的な担体は約5,000〜1,000,000の分子量を有するポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、および他の縮合ポリマーである。これらの担体/結合の例はPetersonら、米国特許第4,356,166号に示されている。他の酸切断可能リンカーは米国特許第4,569,789号および第4,631,190号、またはBlattnerら、Biochemistry 24: 1517-1524 (1984)に見ることができる。リンカーは天然の酸性条件下で切断され、あるいは、Abramsら、米国特許第4,171,563号に説明されるように酸性条件を標的部位において誘導することができる。
切断可能ジスルフィド結合(還元可能結合)を含むリンク試薬の例には、“DPDPB”、1,4-ジ-[3'-(2'-ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ブタン;“SADP”、(N-スクシンイミジル(4-アジドフェニル)1,3'-ジチオプロピオネート);“スルフォ-SADP”、(スルホスクシンイミジル(4-アジドフェニルジチオ)プロピオネート;“DSP”−ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート);“DTSSP”-3,3'-ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート);“DTBP”−ジメチル3,3'-ジチオビスプロピオンイミデート-2HCl(これらは全てPierce Chemicals(Rockford、Illinois)から入手可能)が含まれるが、これらに限定されない。
酸化によって切断可能なリンク試薬の例は、“DST”−ジスクシンイミジルタルタレートおよび“スルホ-DST”−ジスクシンイミジルタルタレートである。これらのリンカーもPierce Chemicals(Rockford、Illinois)から入手可能である。
【0032】
非切断性リンカーの例は、“スルホ-LC-SMPT”−(スルホスクシンイミジル6-[α-メチル-α-(2-ピリジルチオ)トルアミド]ヘキサノエート、“SMPT”;“ABH”−アジドベンゾイルヒドラジド;“NHS-ASA”−N-ヒドロキシスクシンイミジル-4-アジドサリサイクリック酸(N-Hydroxysuccinimidyl-4-azidosalicyclic acid);“SASD”−スルホスクシンイミジル2-(p-アジドサリチルアミド)エチル-1,3-ジチオプロピオネート;“APDP”−N-{4-(p-アジドサリチルアミド)ブチル}-3'(2'-ピリジルジチオ)プロピオンアミド;“BASED”−ビス-[β-(4-アジドサリチルアミド)エチル]ジスルフィド;“HSAB”−N-ヒドロキシスクシンイミジル-4 アジドベンゾエート; “AGP”−p-アジドフェニルグリオキサル一水和物;“SANPAH”−N-スクシンイミジル-6(4'-アジド-2'-ニトロフェニル-アミノ)ヘキサノエート;“スルホ-SANPAH”−スルホスクシンイミジル6-(4'-アジド-2'-ニトロフェニルアミノ)ヘキサノエート;“ANB-NOS”−N-5-アジド-2-ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド;“SAND”−スルホスクシンイミジル-2-(m-アジド-o-ニトロベンズアミド)-エチル-1,3'-ジチオプロピオネート;“PNP-DTP”−p-ニトロフェニル-2-ジアゾ-3,3,3-トリフルオロプロピオネート;“SMCC”−スクシンイミジル4(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート;“スルホ-SMCC”−スルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート;“MBS”−m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル;“スルホ-MBS”−m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル;“SIAB”−N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート;“スルホ-SIAB”−N-スルホスクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート;“SMBP”−スクシンイミジル4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート;“スルホ-SMPB”−スルホスクシンイミジル4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート;“DSS”−ジスクシンイミジルスベレート;“BSSS”−ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート;“BMH”−ビスマレイミドヘキサン;“DFDNB”−1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン;“DMA”−ジメチルアジピミデート2HCl;“DMP”−ジメチルピメリミデート-2HCl;“DMS”−ジメチルスベルイミデート-2-HCl;“SPDP”−N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルチオ)プロピオネート;“スルホ-HSAB”−スルホスクシンイミジル4-(p-アジドフェニル)ブチレート;“スルホ-SAPB”−スルホスクシンイミジル4-(p-アジドフェニルブチレート);“ASBI”−1-9p-アジドサリチルアミド)-4-(ヨードアセトアミド)ブタン;“ASBA”−4-(p-アジドサリチルアミド)ブチルアミン。これらのリンカーは全てPierce Chemicalsから入手可能である。
【0033】
別の実施態様において、リンカーはペプチドリンカーのような小分子である。一つの実施態様において、ペプチドリンカーは切断可能ではない。さらなる実施態様において、ペプチドリンカーは塩基によって、または還元条件下で、または特異的酵素によって切断可能である。一つの実施態様において、酵素は自家性である(indigenous)。あるいは、小ペプチドは治療複合体の投与の後、またはそれに加えて投与される非自家性酵素によって切断されても良い。あるいは、小ペプチドは、例えばペプチドがジスルフィド結合を有する場合、還元条件下で切断されてもよい。あるいは、小ペプチドはpH感受性でもよい。ペプチドリンカーの例には以下が含まれる:ポリ(L-Gly)、(ポリL-グリシンリンカー);ポリ(L-Glu)、(ポリL-グルタミンリンカー);ポリ(L-Lys)、(ポリL-リジンリンカー)。一つの実施態様において、ペプチドリンカーは式(アミノ酸)n、(式中、nは2〜100の整数)で表され、好ましくはペプチドは1以上のアミノ酸のポリマーを含む。
【0034】
さらなる実施態様において、ペプチドリンカーは、配列Gly-(D)Phe-Pro-Arg-Gly-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly(配列番号1)(Suzukiら、1998, J. Biomed. Mater. Res. Oct; 42(1):112-6)のような、プロテイナーゼで切断され得るものである。この実施態様は、細菌感染、特にシュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)感染の治療に有利であることが示されている。ゲンタマイシン又は他の抗生物質は傷がPseudomonas aeruginosaに感染した場合にのみ切断される。なぜなら、そこには非感染組織に比べてトロンビン-様プロテイナーゼのかなり高い活性が存在するからである。
更なる実施態様において、リンカーは酵素サーモリシンによって切断され得る、ポリ(エチレングリコール)(PEG)およびジペプチド、L-アラニル-L-バリン(Ala-Val)を含む切断可能リンカーである。サーモリシン-様酵素は多くの腫瘍部位において発現されていると報告されているので、このリンカーは有利である。あるいは、プロテアーゼ、フリンの認識部位(Goyalら、Biochem. J. 2000 Jan 15:335 Pt 2:247-254)を含む12残基スペーサーThr-Arg-His-Arg-Gln-Pro-Arg-Gly-Trp-Glu-Gln-Leu(配列番号2)を使用することができる。
化学リンカーおよびペプチドリンカーは、結合体合成についてこの分野で知られた技術、すなわち遺伝子操作により、または化学的にリガンドと治療的部分の間を結合することができる。結合体合成は、適切な官能基におけるタンパク質の他の部分への古典的カップリング反応によって、適切な抗体を介して化学的に達成することができる。タンパク質中に存在し、通常化学カップリングに使用される官能基の例を以下に概説する。炭水化物構造はアルデヒド基に酸化することができ、次にはH2NNH-R(式中Rは化合物)を含む化合物と反応してC=NH-NH-R基を形成する。チオール基は(タンパク質中のシステイン)、チオール反応性基を含む化合物と反応してチオエーテル基またはジスルフィド基を形成し得る。アミノ酸残基中の遊離のアミノ基(タンパク質のアミノ末端またはリジン上)は活性化カルボキシル基のような親電子基を含む化合物と反応することができ、アミド基を形成することができる。アミノ酸残基中の遊離のカルボキシル基は活性化カルボキシル基に変換されて、次にアミノ基を含む化合物と反応してアミド基を形成することができる。
【0035】
あるいは、リンカーはリポソームであってもよい。リポソームを調製する多数の方法がこの分野で知られている。例えば、逆相エバポレーション法、凍結融解法、押出法、および、脱水-再水和法(Stormら、PSTT 1:19-31 (1998)を参照せよ)。
リポソームは、重合の際に物質が被包化されるように治療的部分を含む溶液中で作製することができる。あるいは、リポソームは最初に重合化し、重合化したリポソームを生物学的に活性な物質の溶液中に再懸濁して音波処理して治療的部分を被包化することによって、生物学的に活性な物質を後で添加することもできる。リポソームはリガンドの存在下で重合化して、リガンドがリン脂質二重層の一部になるようにすることができる。一つの実施態様において、リポソームは治療的部分を内側に、リガンドを外側に含む。
本発明において考慮されるリポソームは種々の構造をとることができる。例えば、リポソームは大多重ラメラベシクル(MLV)、オリゴラメラベシクル(OLV)でも、単層ラメラベシクル(UV)でも、小単層ラメラベシクル(SUV)、中間サイズ単層ラメラベシクル(MUV)、大単層ラメラベシクル(LUV)、巨大単層ラメラベシクル(GUV)または多胞体ベシクル(MVV)でもありえる。これらのリポソーム構造のそれぞれはこの技術分野でよく知られている(Stormら、PSTT 1:19-31 (1998)を参照せよ)。
【0036】
一つの実施態様において、リポソームは、例えば特定の周波数のラジオ派をかけることによって医薬品を引き抜く(evulse)「微小機械」である。別の実施態様では、リポソームは標的細胞内で治療的部分を放出するように分解され得る(例えば、リポソームは酸またはアルカリ感受性であってよく、または低pHまたは高pH存在下で分解され、治療的部分が細胞内で遊離される)。あるいは、リポソームは無荷電にされ、その結果標的細胞に取り込まれるであろう。リポソームはpH感受性であっても還元条件に感受性であってもよい。
本発明において有利なリポソームの一つの型はLangerら、米国特許第6,004,534(1999年12月21日発行)中で明らかにされているものである。この出願では、二重結合および三重結合含有モノマーリン脂質の重合によって調製される改変リポソームの作製方法が開示されている。これらのリポソームは消化管の過酷な環境に対して予想外に増強された安定性を有する。従って、それらは治療的部分の経口および/または粘膜デリバリーのために有用である。リポソームは全身性循環及びリンパ循環へ吸収され得ることが示されている。リポソームは一般に二重結合および三重結合含有モノマーリン脂質の重合(例えばラジカル開始または照射)によって調製される。
【0037】
本発明の別の実施態様において、リンカーは長い血液循環時間を有するリポソームであり得る。そのようなリポソームはこの技術分野でよく知られている(米国特許第5,013,556号、第5,225,212号、第5,213,804号、第5,356,633号、及び第5,843,473号を参照せよ)。長い血液循環時間を有するリポソームは、ポリエチレングリコール(PEG)または他の類似のポリマーで誘導体化されたリン脂質部分を有することによって特徴付けられる。ある実施態様において、リン脂質に遠位のPEG分子末端は化学的に反応性であるように活性化されていてよい。このような反応性PEG分子はリガンドをポリマーに連結するために使用することができる。反応性PEG分子の一つの例は、米国特許第5,527,528号に記載されたPEGのマレイミド誘導体である。
あるいは、リンカーはマイクロカプセル、ナノ粒子、磁性粒子その他であってよく(Kumar, J. Pharm. Sci., May-Aug 3(2) 234-258, 2000;およびGillら、Trends Biotechnol. Nov; 18 (11):469-79, 2000)、親油性治療的部分をコンテナ上または内部に有し、そのコンテナは治療複合体中でリンカーとして機能する。
【0038】
あるいは、リンカーは光切断可能リンカーであってもよい。例えば、1-2-(ニトロフェニル)-エチル部分は300〜360nmの光によって切断することができる(Piereceカタログ番号21332ZZを参照せよ)。光切断可能リンカーがより特異的な領域、例えば器官の特定の部分における薬剤の活性化および作用を許すことも想定される。光は脈管内のカテーテルを用いて局在化させることができる。あるいは、光は消化管の特異的な部分の局所治療に使用することができ、光はその領域に対する天然の開口部を通して操作することもできる。あるいは、その領域へ外科的に光を操作することができる。
あるいは、リンカーは切断可能でないが、治療的部分又はリガンドが切断可能であってもよい。治療的部分がプロドラッグであって、そのプロドラッグを切断する酵素が治療複合体と共に投与される場合がこの例である。あるいは、酵素が治療複合体の一部、または自家性であって、プロドラッグは別個に投与される。好ましくは、別個に投与される酵素またはプロドラッグは最初の投与から約48時間以内に投与する。あるいは、別個に投与されるプロドラッグまたは酵素は約1分〜24時間に投与してよく、あるいは約2分〜8時間に投与してもよい。別個に投与されるプロドラッグまたは酵素はより遅い日に投与してもよく、その薬剤の効果が最早必要でなくなるか、全ての薬剤の酵素切断が行われるまで続けて投与してもよい。
【0039】
治療的部分
「治療的部分」は、所望の結果を生じさせるいかなる化学物質、分子または複合体であってもよい。その例には以下が含まれるが、これらに限定されない:抗生物質、抗腫瘍剤、免疫抑制剤、ホルモンその他の伝統的医薬物質または、1以上の遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、造影物質、タンパク質、毒素、放射活性分子または原子、界面活性タンパク質、凝固タンパク質。治療的部分は親油性であってよく、その性質は標的細胞への進入を助けるであろう。
造影物質はこの分野で当業者に知られたどんな種類の造影物質であってもよい。最も一般的な造影物質は基本的には以下の4つのグループの一つに帰属する:X-線試薬、ラジオグラフィー試薬、磁気共鳴イメージング剤、および超音波試薬。X-線試薬にはイオン性、ヨード含有試薬およびオムニパック(Omnipaque)(Nycomed)およびウルトラヴィスト(Ultravist)(Schering)のような非イオン性試薬が含まれる。ラジオグラフィー試薬は以下に開示する放射性同位体が含まれる。磁気共鳴イメージング剤には、ガドリニウムおよび鉄-酸化物キレートのような磁性物質が含まれる。超音波試薬には、気体の微小気泡およびいくつかの気泡放出配合物が含まれる。
【0040】
放射性核種は診断用でも治療用でもよい。一般に医学的に有用な放射性核種の例には以下が含まれる:90Y、111Ln、67Cu、77Lu、99Tcその他のようなY、Ln、Cu、Lu、Tc、Re、Co、Feその他、好ましくは90Yおよび111Lnのような三価の陽イオン。
診断的γシンチレーション測光による器官及び組織のin vivo画像化に適切な放射性核種には以下が含まれる:γ放射性核種:111Ln、113mLn、67Ga、68Ga、99mTc、51Cr、197Hg、169Yb、85Sr、および87Sr。Fab'断片による結合に適したキレート放射性核種は米国特許第4,658,839号(Nicolettiら)に教示されている。
MRIにおいてイメージング物質として適切な常磁性金属イオンには原子番号57〜70のランタニド元素、または原子番号21〜29、42または44の遷移金属が含まれる。米国特許第4,647,447号(Griesら)はキレート常磁性金属イオンによるMRIイメージングを教示する。
【0041】
治療的放射性核種の例はβ放射体である。適切なβ放射体には67Cu、186Rh、188Rh、189Rh、153Sm、90Yおよび111Lnが含まれる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは正常な遺伝子の過剰発現または異常な遺伝子の発現によって生じたいかなる疾病の治療にも使用できる可能性を有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドはその遺伝子の発現を低下させるまたは停止させるために使用することができる。アンチセンス技術で治療できる癌遺伝子および使用できる特異的なアンチセンス分子を開示した参照文献には以下が含まれる:c-Junおよびc-Fos(米国特許第5,985,558号);HER-2(米国特許第5,968,748号);E2F-1(Popoffら、米国特許第6,187,587号)、SMAD 1-7(米国特許第6,159,697号;第6,013,788号;第6,013,787号;第6,013,522号および第6,037、142号)およびFas(Deanら、米国特許第6,204,055号)。
【0042】
治療剤として使用できるタンパク質にはpRBおよびp53のような、細胞内に存在するとアポトーシスを誘導するアポトーシス誘導物質(Xuら、米国特許第5,912,236号)、および、エリスロポイエチン(Sytkowskiら、米国特許第6,048,971号)のような、疾病において欠損するまたは発現不足となるタンパク質が含まれる。
治療的部分は、アルキル化剤(窒素マスタード、エチレンイミン、アルキルスルホネート、ニトロソウレアおよびトリアゼン)、代謝物拮抗物質(メトトレキセートのような葉酸類似体、ピリミジン類似体、およびプリン類似体)、天然産物およびその誘導体(抗生物質、アルカロイド、酵素)、ホルモンおよびアンタゴニスト(アドレノコルチコステロイド、プロゲスチン、エストロゲン)その他のような、腫瘍性疾患のためのいかなる化学療法物質であってもよいことが考えられる。あるいは、治療的部分は抗腫瘍剤として作用するアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよく、腫瘍細胞のアポトーシスを活性化するタンパク質であってよい。
治療的部分はどんな型の神経エフェクターであってもよく、例えば神経伝達物質または神経伝達物質アンタゴニストを、その使用について一般に経験される種々の副作用を生じさせず、それが必要な領域に標的化することができる。
【0043】
治療的部分はオピオイドのような、痛みの領域に特異的に標的化できる麻酔剤であってもよい。吐き気のような副作用がオピオイド鎮痛剤を使用する患者に一般に経験される。本発明の方法は薬剤を、外科的な傷または関節炎の場合には関節のように、それが必要とされる領域への非常に特異的な局在化を可能とするので、副作用を低減することができる。
治療的部分はヒスタミン、H1-レセプターアンタゴニスト、およびブラジキニンのような抗炎症剤であり得る。あるいは、抗-炎症剤は、サリチル酸誘導体、インドールおよびインデン酢酸およびアルカノンのような非ステロイド抗炎症剤であってよい。あるいは、抗炎症剤は、コルチコステロイド、クロモリンナトリウムおよびネドクロミルのような喘息治療用抗炎症剤であってよい。抗炎症剤はB2-選択的アドレナリン作動薬およびテオフィリンのような気管支拡張剤と共にまたは伴わずに投与することができる。
治療的部分は、特異的に患者の血圧に影響する、利尿剤、バソプレシンアゴニストまたはアンタゴニスト、アンジオテンシンまたはレニンであってよい。
【0044】
治療的部分は心臓疾病の治療に使用されるどんな医薬剤であってもよい。そのような医薬剤には有機ニトライト(亜硝酸アミル、ニトログリセリン、イソソルバイドジニトレート)、カルシウムチャンネル遮断薬、抗血小板剤および抗血栓薬、血管拡張剤、血管抑制薬、抗-ジギタリス抗体、および血栓遮断薬が含まれるが、これらに限定されない。
治療的部分は、テトラサイクリン、クリンダマイシン、キニン、クロロキニン、メフロキン、トリメトプリムスルファメトキサゾール、メトロニダゾール、およびオラミンのような、原生生物感染の治療に使用されるいかなる医薬であってもよい。これらの抗生物医薬で経験される非常に一般的で重篤な副作用故に、原生生物感染領域に医薬または他の治療剤を標的化できることは特に価値がある。
治療的部分は、スルホンアミド、キノロン、ペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、イソニアジドおよびリファンピンのようないかなる抗細菌薬であってもよい。
治療的部分は、アンホテリシン、フルシトシン、ミコナゾールおよびフルコナゾールのような、真菌感染の治療に使用されるいかなる医薬剤であってもよい。
【0045】
治療的部分は、アシクロビル、ビダラビン、インターフェロン、リバビリン、ジドブジン、ザルシタビン、逆転写酵素阻害剤、およびプロテアーゼ阻害剤のような、ウイルス感染の治療に使用されるいかなる医薬剤であってもよい。ウイルス感染した細胞は、毒素、放射活性原子、およびアポトーシス誘導物質のような他の治療的部分を用いて標的化および殺傷することもできることが考慮される。
治療的部分は多様な抗凝集剤、抗血栓溶解薬、および抗血小板薬から選択することができる。
ホルモンの過剰産生または産生不足によって生じる疾病はホルモン(成長ホルモン、アンドロゲン、エストロゲン、ゴナドトロピン-放出ホルモン、甲状腺ホルモン、副腎皮質ステロイド、インスリンおよびグルカゴン)のような治療的部分を用いて治療できることが想像される。あるいは、ホルモンが過剰産生される場合、そのホルモンのアンタゴニストまたは抗体を治療的部分として使用することができる。
他の可能性のある種々の治療的部分には、ビタミン、酵素、および他の産生不足細胞成分、およびジフテリア毒素またはボツリヌス毒素のような毒素が含まれる。
あるいは、治療的部分はin vitro診断に典型的に使用されるものであってよい。従って、リガンドおよびリンカーを慣用される方法によって標識し、シグナル生成系の全体または一部を形成させることができる。リガンドおよびリンカーは、この分野でよく知られた方法により、トリチウム、炭素14、リン32、ヨード125、およびヨード131のような放射性同位体へ共有結合させることができる。
【0046】
例えば、125Iはクロラミン-T法のような方法、ラクトペルオキシダーゼ法によって酵素的に、または前標識ボルトン-ハンター技術によって導入することができる。これらの技術および他の技術がH. Van VunakisおよびJ.J. Langone編集、Methods in Enzymology,第70巻、Part A、1980で論じられている。また、放射活性標識のさらなる例については、それぞれ、米国特許第3,646,346号(1972年2月29日発行)およびEdwardsら、米国特許第4,062,733号(1977年12月13日発行)を参照されたい。
治療的部には、可視、紫外波長の光を吸収する化合物である、発色性標識も含まれる。そのような化合物は通常、染色剤であり、キノリン色素、トリアリールメタン色素、フタレイン、昆虫色素、アゾ色素、アントラキモイド色素、シアニン色素、およびフェナゾキソニウム色素が含まれる。
蛍光原性化合物もこの治療的部分であってよく、それらには光照射に続いて紫外波長または可視波長の光を放射する化合物が含まれる。発蛍光団はそれ自体または消光分子と共に用いることができる。主要な発蛍光団はローダミン、フルオレセインおよびウンベリフェロンファミリーである。これらの発蛍光団及び他の発蛍光団の結合方法および使用についてはこの分野に見ることができる。例えば、J.J. Langone, H.Van Vunakisら、Methods in Enzymology, 第74巻、Part C、1981、特に第3〜105頁を参照されたし。他の適切な発蛍光団の代表的な列挙については、Tomら、米国特許第4,366,241号(1982年、12月28日発行)、特に、第28欄、第29欄を参照されたし。更なる例については、米国特許第3,996,345号を参照せよ。
【0047】
これらの非酵素的シグナル系は本発明のために充分な治療的部分である。しかしながら、当業者は酵素触媒シグナル系は非酵素系よりも一般に感度がより高いことを認識するであろう。従って、本発明において、触媒性標識は、より感度の高い非放射活性標識である。
触媒性標識にはこの技術分野で知られたものが含まれ、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ(リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ)その他のような単一または二成分(「チャネル化」)酵素が含まれる。二成分(「チャネル化」)触媒反応系の例には、初期基質としてグルコース-6-リン酸を用いたアルカリホスファターゼおよびグルコースオキシダーゼの系が含まれる。そのような二成分触媒反応系の第2の例は、グルコースオキシダーゼによるグルコースの過酸化水素への酸化(過酸化水素はロイコ塩基と反応してシグナル発生物質を生成する)によって例示される。触媒反応系に関するさらなる議論は、Tomら、米国特許第4,366,241号(1982年、12月28日発行)(特に第27欄〜第40欄参照)に見られる。また、Wengら、米国特許第4,740,468号(1988年、4月26日発行)(特に、第2欄、第6,7および8欄)を参照されたし。
【0048】
酵素を本治療複合体へ取り込む方法はこの分野でよく知られている。この方法に使用する試薬には、グルタルアルデヒド、p-トルエンジイソシアネート、種々のカルボジイミド試薬、p-ベンゾキノンm-ペリオデート、N,N'-o-フェニレンジマレイミドその他(例えば、J.H.Kennedyら、Clin. Chim. Acta 70, 1 (1976)を参照せよ)が含まれる。本発明の別の特徴として、上述したいずれのデバイスおよび様式も、組織特異的内皮タンパク質のアッセイに使用するための所定の量の試薬と組み合わせて梱包したキットとして供給することができる。
化学発光標識も治療的部分として適用可能である。例えば、C.L. Maier、米国特許第4,104,029号(1978年、8月1日発行)に列挙された標識を参照せよ。
上述した触媒反応系のための基質には、パラニトロフェニルリン酸塩(PNPP)、β-D-グルコース(おそらく適切な酸化還元色素と共に)、ホモバニリン酸、o-ジアニシジン、ブロモクレゾール紫粉末、4-アルキル-ウンベリフェロン、ルミノール、パラ-ジメチルアミノロフィン、パラメトキシロフィン、AMPPDその他のような単純な発色原および発蛍光原が含まれる。
【0049】
標識及び触媒反応シグナル生成系の性質に依存して、光で照射し蛍光のレベルを観察すること;触媒反応系に色素、蛍光または化学発光を生じさせることであって、前記色素は視覚的または分光光度計によって観察できるものであり、前記蛍光は視覚的または蛍光分光計によって観察できるものでること;または化学発光の場合または放射活性標識の場合には、放射能計測器を使用すること、によってシグナルを観察できる。適切な機器が利用できない場合は、目に見える着色を生じさせる発色団を生成させることが通常望ましい。高性能の機器が利用できる場合は、いずれの技法も適用可能である。
あるいは、治療的部分は、化学的環境または酵素のような別個の分子試薬の作用によって対応する医薬物質に変換されるプロドラッグまたはプロ分子(promolecule)であってよい。好ましくは、治療的部分はプロ分子の変換に必要な特異的な分子と共に投与される。あるいは、このプロ分子は標的組織の微小環境に見出される天然の分子によって切断されてもよい。あるいは、プロドラッグはpH感受性で血液から細胞または小胞への環境変化があると変換される(Grecoら、J. Cell. Physiol. 187:22-36, 2001)。
【0050】
治療複合体の使用
本治療複合体は組織特異的または器官特異的治療が効果的であるいかなる疾病の治療または診断にも使用することができる。そのような組織および疾病の例は以下の通りである:
一つの実施態様において、本治療複合体は脳に影響を与える疾病の治療または症状を軽減するために使用することができる。そのような疾病には以下が含まれるが、それらには限定されない:細菌感染、ウイルス感染、真菌および寄生虫感染、てんかん、統合失調症、双極性障害、神経症、うつ病、脳腫瘍、パーキンソン病、アルツハイマー病および他の形態の痴呆疾患、プリオン関連病、卒中、偏頭痛、運動失調、多発性硬化症、髄膜炎、脳膿瘍およびウェルニッケ病または他の代謝疾病。
さらなる実施態様において、本治療複合体は肺に影響を与える疾病の治療に使用することができる。そのような疾病の例には以下が含まれるが、これらに限定されない:細菌感染(すなわち、S.ニューモニアエ(S.pneumoniae)、結核菌(M.tuberculosis))、ウイルス感染(すなわち、ハンタウイルス(Hantavirus))、真菌および寄生虫感染(すなわち、ニューモシスティス-カリニ(Pneumocystis carinii))、喘息、肺癌、肺気腫、肺移植拒絶、嚢胞性繊維症、高血圧症、肺血栓塞栓症および肺浮腫。
【0051】
さらなる実施態様において、本治療複合体は膵臓に影響を与える疾病の治療または症状を軽減するために使用することができる。そのような疾病の例には以下が含まれるが、これらに限定されない:寄生虫感染、膵臓癌、慢性膵臓炎、膵機能不全、内分泌腺腫瘍および糖尿病。
一つの実施態様において、本治療複合体は腎臓に影響を与える疾病の治療または症状を軽減するために使用することができる。そのような疾病の例には以下が含まれるが、これらに限定されない:細菌感染、ウイルス感染、真菌および寄生虫感染、多発性嚢胞腎疾病、腎移植拒絶、浮腫、高血圧症、多血症、膀胱および腎臓癌および尿毒症症候群。
一つの実施態様において、本治療複合体は筋肉に影響を与える疾病の症状を治療または軽減するために使用することができる。そのような疾病の例には以下が含まれるが、これらに限定されない:筋ジストロフィー、多発性筋炎、関節炎、横紋筋肉腫、グリコーゲン貯蔵異常、および軟組織肉腫。
【0052】
一つの実施態様において、本治療複合体は消化管または腸に影響を与える疾病の治療または症状を軽減するために使用することができる。そのような疾病の例には以下が含まれるが、これらに限定されない:赤痢、胃腸炎、過敏性腸症候群、憩室症/憩室炎、消化性潰瘍、クリプトスポリジウム症、ジアルジア症、炎症性腸疾病、結直腸癌、および小腸腫瘍。
一つの実施態様において、本治療複合体は前立腺に影響を与える疾病の治療または症状を軽減するために使用することができる。そのような疾病の例には以下が含まれるが、これらに限定されない:前立腺過形成、前立腺癌、および前立腺感染症。
【0053】
さらなる実施態様において、本治療複合体は疾病または組織型の診断、または組織特異的管腔発現タンパク質を定量または同定するために使用することができる。
標的タンパク質を保持する細胞は2つの一般的な経路、トランスサイトーシス(経細胞輸送)または受動拡散によって治療複合体と相互作用する。これらの相互作用により、治療複合体は標的タンパク質を保持する脈管内皮細胞と直接相互作用することができ、前記内皮細胞を含む内皮マトリックス内に絡みつく、または内皮マトリックスを通過して被包化された組織又は器官内に入ることができる。
内皮細胞上で複合体が標的タンパク質に付着した後、治療複合体が脈管を横断して内皮マトリックス組織または選択した内皮細胞へ経細胞輸送された場合にトランスサイトーシスが起こる。好ましくは、標的タンパク質へのリガンドの結合はトランスサイトーシス小胞内の内皮細胞を横断する治療複合体の輸送を刺激するであろう。トランスサイトーシスの際、ベシクルの微小環境内部の条件はより高度に酸性であり、治療的部分の選択的切断に利用することができる。これが起こるためには、好ましくはリンカーは、血流(pH 7.5)からトランスサイトーシスベシクルまたは細胞内部(pH6.0)へ移行したときのpH変化のせいで切断されるように、開示された酸感受性リンカーのようにpH感受性でなければならない。あるいは、リガンドと治療的部分との間の結合自体が酸感受性である場合は、別個のリンカーは必要でないかも知れない。
【0054】
受動拡散において、複合体中のリガンドは細胞膜の外側に付着することができ、続いて治療的部分が遊離され、内皮細胞または組織へ受動的手段で横断するが、細胞内への治療複合体全体の侵入はない。好ましくは、治療薬は特異的標的組織内の内皮の直ぐ近傍で高濃度に遊離される。そのような高濃度は全身組織に比べてかなり高い濃度の薬剤が標的組織において生じさせることが期待される。
治療複合体は、細胞によって取り込まれ、細胞または細胞マトリックス内に停留し、または器官へと通過し、その器官内部で拡散し得る。
本発明の治療複合体は有利に特異的組織、器官または細胞上の標的タンパク質に結合し、所望の成果のために使用することができる。一つの実施態様において、治療複合体は毒性物質を特定の環境に維持するために使用され、それにより治療的部分の環境への標的化をより特異的なものとし、治療的部分の全身効果を防止することが可能となる。加えて、同じ効果のために必要な物質の量はより低濃度であろう。
さらなる実施態様において、治療複合体は物質が組織へ入らないようにするために使用することができる。治療的部分は、もし活性化されると周辺組織に更に害を与えるであろうレセプターを遮断するために使用することができるかもしれない。
更なる実施態様において、治療複合体は界面活性タンパク質またはホルモンのような、機能不全または特定の組織から欠損している物質を置換するために使用される。
【0055】
プロドラッグ
プロドラッグの概念はこの技術分野でよく知られており、本明細書でも同様な様式で使用する。プロドラッグは、プロドラッグから対応する医薬物質への変換の前後で異なる医薬的特徴を有している。本発明の治療複合体はプロドラッグの使用を2つのやり方で有利に取り込むことができる。本治療複合体は、非自家性酵素の続く注入または選択した組織に見出される酵素によって変換され得る治療的部分として接続されたプロドラッグを有してよい。あるいは、治療的部分はプロドラッグを変換するのに必要な酵素であってもよい。例えば、酵素β-ラクタマーゼは治療複合体の一部であってよく、プロドラッグ(例えばドキソシリン)が続いて添加され、そしてβ-ラクタマーゼは標的組織のみに見出されるので、ドキソシリンはその領域においてのみ正体を現す。残念なことに、腫瘍組織は通常、正常組織と酵素レパートリーを共通にし、そのことは自家性酵素をあまり有望でなくする。しかしながら、疾病組織は、特に病原体による疾病の場合、組織に感染している病原体に特異的な酵素を生成していることがあり、そのことはその感染組織に非常に特異的で効果的なプロドラッグを設計するために利用することができることが分かる。例えば、ウイルス酵素(例えばHBV)によって変換されるプロドラッグは非常に特異的な抗ウイルス効果を得るために肝臓特異的な抗ウイルス治療複合体と共に使用することができる。なぜなら、そのプロドラッグはウイルスを含む微小環境においてのみ変換されるであろうから。
【0056】
従って、一つの実施態様においては、「リガンド-酵素」治療複合体は非接続プロドラッグと組み合わせて使用される。プロドラッグは酵素によって切断され、細胞に入る。好ましくは、プロドラッグは親水性であり、内皮細胞への接近が遮断され、一方(切断された)薬剤は親油性で細胞への侵入能力が増強される。あるいは、「リガンド−プロドラッグ」は、接続されていない非自家性酵素の投与または自家性酵素と組み合わせて治療複合体として使用される。このプロドラッグは酵素によって切断され、治療剤から分離され、その親油性特性は細胞への侵入を可能とする。
プロドラッグアプローチの利点のうちの2つは、傍観者殺作用および増幅である。癌の治療における抗体または免疫複合体の従前の使用の問題点の一つは、それらが細胞によってあまり取り込まれず、あまり局在化されないことである。しかしながら、プロドラッグ治療を利用する場合、単一の酵素分子が1以上のプロドラッグ分子を変換することができるので、取込の機会はかなり増加または増幅される。加えて、活性薬剤は腫瘍全体に拡散するので、傍観者効果を生じさせ、抗原-陰性、異常細胞に対する殺作用またはその他の治療作用を生じさせる。この傍観者効果は正常細胞にも作用するかも知れないが、それらの細胞は腫瘍器官または疾病器官の直接近傍にある細胞のみであろう。
【0057】
いくつかのプロドラッグは癌治療に広範に使用されており、以下に本発明において使用できるプロドラッグの例として提示する(Grecoら、J. Cell. Phys. 187:22-36, 2001;および、Konstantinosら、Anticancer Research 19:605-614, 1999)。しかしながら、それらは本発明の多数の例のいくつかであることは言うまでもない。
最もよく研究された酵素/プロドラッグ組合せはヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ(HSV TK)とヌクレオチド類似体GCVである。GCVおよび関連物質は哺乳動物ヌクレオシド一リン酸キナーゼの不適当な基質であるが、HSV 1のTKによって効率的に(1000倍以上)モノホスフェートに変換され得る。細胞性酵素によって触媒される続く反応によりいくつかの毒性代謝物が生じる。最も活性なのはトリホスフェートである。GCV-トリホスフェートは細胞分裂の際にDNAの伸長取込についてデオキシグアノシン三リン酸と競合し、DNAポリメラーゼの阻害を生じさせ一本鎖中断を生じさせる。
シトシンデアミナーゼと5-フルオロシトシン(それぞれ、CDおよび5-FC)からなるシステムは同様に毒性ヌクレオシド類似体の産生に基づいている。酵素CDはある種のバクテリアおよび真菌に見出されるが哺乳動物細胞には見られず、シトシンからウラシルへの加水分解的脱アミノを触媒する。従って、この酵素は非毒性プロドラッグ5-FCを5-フルオロウラシル(5-FU)に変換し、次に細胞性酵素によって5-FUは強力なピリミジン抗代謝物質(5-FdUMP、5-FdUTP、および5-FUTP)に変換される。誘導細胞死において3つの経路が関与する:チミジレートシンターゼ阻害、(5-FU)RNAおよび(5-FU)DNA複合体の形成。
【0058】
マスタードプロドラッグCB1954[5-(アジリジン-1-イル)-2,4-ジニトロベンズアミド]は弱い一官能性アルキル化剤であるが、げっ歯類DTジアフォラーゼによって効果的に活性化され強力なDNA架橋剤となり得る。しかしながら、ヒトのDTジアフォラーゼ酵素はこのプロドラッグと低い反応性を示し、副作用を生じさせる。この問題は大腸菌ニトロレダクターゼ酵素(NTR)がCB1954プロドラッグをげっ歯類DTジアフォラーゼよりも90倍速く還元することが見出されたときに克服された。このプロドラッグは、修復されにくいDNA架橋を形成するアルキル化剤へ変換された。
オキサザホフホリンプロドラッグであるシクロホスファミド(CP)は肝臓チトクロームP450代謝作用によって4-ヒドロキシル化反応を介して活性化される。4-ヒドロキシ中間体は分解して二官能性アルキル化毒素ホスホルアミドマスタードを形成し、これがDNA架橋を生じさせ、細胞周期依存性様式でG2-M停止およびアポトーシスを生じさせる。
ここまでに記載してきた酵素/プロドラッグ系において、プロドラッグは中間体代謝物に変換され、活性薬剤を形成するために細胞性酵素によって更に触媒されることが要求される。標的細胞におけるこれらの酵素の発現減少または完全に発現を欠くことは腫瘍耐性を生じさせるであろう。バクテリア酵素、カルボキシペプチダーゼG2(CPG2)はヒト類似物が存在せず、プロドラッグ4-[2-クロロエチル-(2-メシルオキシエチル)アミノ]安息香酸のグルタミン酸部分を更なる触媒反応を必要とせずに切断する。
【0059】
植物酵素ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)と非毒性植物ホルモンインドール-3-酢酸(IAA)との反応は詳細に解析されているが、まだ完全には明らかになっていない。中性pHでは、IAAはHRP-化合物Iによってラジカル陽イオンに酸化され、これは環外炭素−炭素結合の切断を受け、炭素-中心スカトリルラジカルを生成する。酸素存在下では、スカトリルラジカルは迅速にペルオキシルラジカルを形成し、次にこれは多数の生成物に分解する(主要なものは、インドール-3-カルビノール、オキシインドール-3-カルビノールおよび3-メチレン-2-オキシインドールである)。無酸素溶液中では、ラジカルカチオンの脱カルボキシルが生じ、炭素−中心ラジカルが優先的に水素供与体と反応する。
容易に分かるように、プロドラッグ/酵素系は特異性を生じさせるためにヒト細胞によっては産生されない酵素を有利に利用する。しかしながら、特定の器官または細胞型において特異的に産生されるヒト酵素もこの特異性を達成するために使用することができ、それが免疫原性でないという利点を有することは当業者には容易に理解されるであろう。
最後に、同じ酵素と種々の器官関連抗原または同じ抗原の種々の抗原決定部位に対する種々の抗体とで構築される複合体の「カクテル」の適用によって不均質性を回避し得る。
【0060】
治療複合体の投与
本発明の治療複合体は、それらを含む調製物がそれらの産物が通常および天然に一緒に見出される物質を実質的に含まない場合、「天然夾雑物を実質的に含まない」と称される。
治療複合体には、組織特異的管腔発現分子に結合し得る抗体(モノクローナルであろうがポリクローナルであろうが)、および生物学的に活性なそれらの断片が含まれる。抗体は動物によって作製してもよく、組織培養、または組換えDNA手段によって作製してもよい。
患者に本治療複合体を与える場合、または、治療複合体を受容患者に与える場合、投与する物質の用量は患者の年齢、体重、身長、性別、一般的な医学的状態、以前の医学的履歴その他のような要因に依存して変動するであろう。加えて、その用量は治療複合体の治療的部分および所望の効果に依存して変動するであろう。以下で論じるように、治療上効果的な用量は、治療複合体が第2の治療または追加的治療複合体と組み合わせて投与されるならば減少させることができる。本明細書において、2つの化合物の投与が近接した時間内に行われ、その結果、両方の化合物が患者の血清中に同時に検出され得る場合に、一つの化合物が第2の化合物と共に追加的に投与されると称される。
【0061】
治療複合体は動脈、静脈、毛細血管、血管洞(sinus)、リンパ管、上皮細胞灌流可能空間その他を通じて注入することができる。注射によって治療複合体を投与する場合は、連続インフュージョンによって投与しても、単一ボーラスまたは複数ボーラスによって投与してもよい。
治療複合体は、所望の治療効果に依存して、単独で投与しても、1以上の追加的免疫抑制剤(特に器官または組織移植の受容者に対して)、抗生物質、化学療法物質、または医薬物質、と組み合わせて投与してもよい。そのような化合物の投与は「予防」目的であっても「治療」目的であってもよい。
化合物の投与が受容患者に寛容される場合に、その化合物を「製薬的に許容できる」と称する。そのような物質は、その物質の投与量が生理的に有意である場合に、「治療上効果的な量」で投与されると称する。典型的には患者の体重あたりの治療複合体は0.1μg/kg〜500mg/kgである。治療複合体の1回投与または複数回投与を、状態が示唆するところにより、数時間、数日、数週間または数ヶ月にわたって行ってよい。薬剤は、その存在が受容患者の生理機能に検出可能な変化を生じさせる場合に、生理的に有意であると称する。用語「製薬上効果的な量」とは患者のIL-1媒介疾病を治療または軽減するために効果的な量を言う。用語「製薬的に許容できる担体、アジュバント、または賦形剤」とは、好ましい態様の化合物と共に患者に投与でき、その生理学的活性を破壊しない、非毒性の担体、アジュバント、または賦形剤をいう。用語「製薬的に許容できる誘導体」とは、好ましい実施態様の化合物若しくは受容者に投与すると好ましい実施態様の化合物を(直接又は間接的に)生じさせることのできる化合物の一切の製薬的に許容できる塩、エステル、またはそのようなエステルの塩をいう。本発明の医薬組成物は、本発明のどの化合物および製薬的に許容できるそれらの塩を、許容できる担体、アジュバント、賦形剤またはビヒクルのいずれと共に含んでいてもよい。
【0062】
本発明の治療複合体は既知の方法に従って製剤化して製薬的に有用な組成物を調製することができ、これらの物質またはそれらの機能的誘導体は製薬的に許容できる担体ビヒクルとの混合物として一緒にされる。適切なビヒクルおよびそれらの製剤は、他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含めて、例えばレミントン製薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)第18版、Gennaro編集、Mack, Easton Pa.(1990)に記載されている。効果的な投与に適した製薬的に許容できる組成物を形成するためには、そのような組成物は治療複合体の効果的な量を適切な量の担体ビヒクルと共に含むであろう。
更なる製薬方法を使用して作用の持続性を制御することができる。徐放性調製物は治療複合体を複合体化または吸収するためにポリマーを使用することによって達成することができる。あるいは、治療複合体を、例えばコアセルベート技術または界面重合化によって調製した微小カプセル中、例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-微小カプセル、およびポリ(メチルメタクリレート)微小カプセル、またはコロイド薬剤デリバリー系、例えばリポソーム、アルブミン微小球、微小エマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセルまたはマクロエマルジョン中に捕捉することができる。そのような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences (1990)に開示されている。
いくつかの実施態様を記載してきた。しかしながら、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく種々の改変を行うことができることは理解されるであろう。例えば、種々の切断可能な化学的部分、表面分子、および治療的部分を本方法に使用することができる。従って、他の実施態様も本発明の範囲内である。
一般的に本発明を記載してきたが、以下の実施例は請求項記載の発明を説明するために提供されるものであり、限定するために提供するものではない。
【0063】
実施例
Robenら、米国特許第09/528,742号(2000年3月20日出願)の方法を用いて以下の組織特異的分子を同定し、単離した。この方法では、化学反応を介して管腔分子に非特異的に結合する細胞膜非透過性試薬を使用した。この試薬は、in vivo条件では切断されないが、所定の条件下で切断され得る切断可能な化学的部分によって連結された、管腔における分子に非特異的に結合する第1の反応領域と第2のビオチン含有領域とを有している。結合試薬を動脈、静脈、毛細血管、脈管洞、リンパ管、上皮列灌流可能空間その他を介して注入した。試薬は管腔特異的分子に結合した。組織または器官をホモゲナイズして、細胞残渣を除去した。試薬に結合した全ての分子をビオチン含有領域に結合するアフィニティークロマトグラフィー(すなわちストレプトアビジンビーズ)を用いて器官から単離した。次に、試薬によって「タグ付け」された管腔露出分子を、試薬を「温和な条件」(温和な還元、非変性条件)下で切断することによって溶出した。このようにして、組織特異的分子を溶出し、PAGE上で精製した。器官特異的分子をそのようにして同定し、PAGEから単離し、その実体を明らかにするために部分シーケンシングした。次に、組織学、ウエスタンブロットおよび/またはin vivo位置特定を行い、単離したポリペプチドの組織特異性を確認した。
実施例1では、内皮特異的タンパク質をそのように同定し、そのタンパク質に特異的な抗体を用いて、ラットの尾静脈に注射したときその抗体が脳に特異的に結合することを明らかにした。実施例1は組織特異的内皮タンパク質に対する抗体は特異的器官を標的化するために使用することができ、その抗体は治療的部分とカップリングさせてその治療的部分を特定の器官に向けて、そこでその効果を生じさせるであろうことを示す。
【0064】
実施例1
脳特異的、管腔発現タンパク質 CD71 を用いた
治療的部分の組織への局在化
CD71すなわちトランスフェリンレセプターはたった一つの組織、脳においてのみ内皮の管腔表面上に露出していることが知られている。この分子は、脳調製物においてのみ見出され、他のいかなる組織にも見出されないことが本方法を用いて分かり、このことにより本方法が組織特異的内皮タンパク質を同定できることが確認された。
薬剤を特定の組織へ選択的にデリバリーするためにタンパク質の組織特異的内皮発現を利用できることを証明するために、ラットCD71に対する抗体を用いた(BD Pharmingen,San Diego, CA, カタログ番号22191)。CD71は、脳に特異的な管腔露出内皮タンパク質である。ラットアミノ酸配列およびヌクレオチド配列はGenBankアクセッション番号AAA42273およびM58040(配列番号26及び27)であり、ヒトアミノ酸配列およびヌクレオチド配列はGenBankアクセッション番号AAH01188およびBC001188である(配列番号28および29)。抗体はラットの尾静脈中に注射した。類似のアイソタイプを有するが異なる特異性を有する別の抗体を別のラットに対照として注射した。アイソタイプ対照として使用した抗体は、Target Protein Technologies社によって作製された抗アルブミン抗体(IgG2)とした。30分後、ラットを犠牲にし、各ラットから組織切片をいくつかの器官から作製した。次に、各組織を免疫組織化学によって抗体の存在について解析した。図2(A)-(D)はCD71または対照抗体を注射されたラットの組織切片の免疫組織化学を示す。図2(A)はCD71を注射されたラットの脳であり、図2(B)は対照抗体を注射されたラットの脳であり、図2(C)はCD71を注射されたラットの肺であり、図2(D)は対照抗体を注射されたラットの肺である。これらの結果は、抗-CD71抗体は脳の毛細管に局在し、他の組織には局在しないことを明らかにしている。このことは、血液−脳障壁を越えることのできる治療剤を発見することはしばしば困難であるという点で特に有利である。
【0065】
追跡実験において、毒素を抗-CD71抗体にカップリングさせた。使用した毒素はリシンA鎖(Sigma, カタログ番号L9514)である。ジスルフィド-含有リンカーを備えたビオチン(Pierece、カタログ番号21331)をリシン及び抗体の両方に添加することによりこの毒素を抗体にカップリングさせた。次に、この2つを、どちらのビオチンにも結合し、リシンと抗体の複合体を形成させるニュートラビジン(Nuetravidin)(Pierce、カタログ番号31000)を添加することによってカップリングさせた。in vivo局在性実験を毒素−抗体複合体を用いて繰り返した。この例では、抗体は毒素の脳の脈管への局在化を容易にしただけでなく、おそらくはトランスサイトーシスによる組織への侵入をも容易にした。組織内にあれば、毒素は脳において、脳に導入されるいかなる毒素についても典型的に見られる反応である炎症性応答を生じさせた。他の組織切片には、炎症性応答は全く見られなかった。
ヒトCD71-特異的抗体はBD Pharmingenから入手可能であり、ヒト治療複合体の作製に使用することができる。
実施例2〜6において、いくつかの他の組織特異的管腔発現タンパク質が同定され、治療複合体を作製するために使用されている。
【0066】
実施例2
ラットジペプチジルペプチダーゼ IV の同定および配列決定
ラット全体の脈管の管腔タンパク質をビオチンで標識した。次に、器官を個別に取り出し、標識タンパク質をRobenら、米国特許第09/528,742(2000年、3月20日出願)に記載されたように単離した。ホモゲナイズした肺から単離した標識タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、肺及び腎臓に特異的であるが(図3)肺において優勢であるタンパク質(DPP-4とラベル付け)を明らかにした。ペプチドをシーケンシングしたところ配列FRPAE(配列番号3)に対応することが分かり、タンパク質はラット肝臓ジペプチジルペプチダーゼIV、GenBankアクセッション番号P147470(ヌクレオチド配列Genbank アクセッション番号NM_012789)として同定された。完全長タンパク質配列は配列番号4に対応し、ヌクレオチド配列は配列番号5である。タンパク質配列はNM_012789のヌクレオチド89-2392によってコードされる。ヒトの配列は配列番号6および7に対応する。Genbankアクセッション番号NM_001935は配列番号6であり、mRNAのコード領域はnt 76〜2376(配列番号7)である。従前の研究により、ラット肝臓ジペプチジルペプチダーゼIVはそのアミノ末端からなる膜繋留領域を有していることが示唆されている(Ogataら、J. Biol Chem 264(6):3596-601 (1989))。ラットジペプチジルペプチダーゼIVに特異的なモノクローナル抗体(BD Pharmingen, San Diego, CA,カタログ番号22811)をラットの尾静脈に注射した(約0.1〜100mg/ml)。種々の器官からの組織を免疫組織化学を利用して処理し、DPP-4に対する抗体は肺及び腎臓に局在することが示された(図4参照)。図4中、パネルa.腎臓、パネルb.肝臓、パネルc.肺、パネルd.心臓、パネルe.膵臓、およびパネルf.結腸。
ヒトDPP-4に対する抗体は本発明の治療複合体作製に使用するために入手することができる(DB Pharmingen, San Diego, CA)。
【0067】
実施例3
炭酸脱水素酵素 IV の同定および配列決定
ラット全体の脈管の管腔タンパク質をビオチンで標識した。次に、器官を個別に取り出し、標識タンパク質をRobenら、米国特許第09/528,742(2000年、3月20日出願)に記載されたように単離した。ホモゲナイズした肺から単離した標識タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、続いて肺及び心臓に特異的であるタンパク質(CA-4とラベル付けしてある)を明らかにした(図5)。ペプチドをシーケンシングしたところ、配列DSHWCYEIQ(配列番号8)に対応し、ラット炭酸脱水素酵素IV、Genbankアクセッション番号NM_019174であることが明らかにされた。完全長タンパク質配列は配列番号9に対応し、ヌクレオチド配列は配列番号10に対応する。ヒトの配列は配列番号11および12、Genbankアクセッション番号NM_000717に対応する。従前の研究により炭酸脱水素酵素IVは発生的制御および血管内皮における細胞特異的発現を示すことが示唆されている(Flemingら、Am J. Physiol, (1993)265(6 Pt 1):L627-35)。
【0068】
実施例4
チモーゲン顆粒 16 タンパク質 (ZG16-p) の同定および配列決定
ラット全体の脈管の管腔タンパク質をビオチンで標識した。次に、器官を個別に取り出し、標識タンパク質をRobenら、米国特許第09/528,742(2000年、3月20日出願)に記載されたように単離した。ホモゲナイズした膵臓から単離した標識タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、その結果膵臓および消化管に特異的であるが、膵臓に優勢であるタンパク質(ZG16pとラベル付けしてある)が明らかにされた(図6参照)。ペプチドをシーケンシングし、配列NSIQSRSSSY、配列番号13が得られ、ラットZG16-p、Genbankアクセッション番号Z30584として同定された。完全長タンパク質配列は配列番号14に対応し、ヌクレオチド配列は配列番号15に対応する。ヒトの配列は配列番号16および17、Genbankアクセッション番号AF264625に対応する。従前の研究により、ZG16-pはラット膵臓および消化管の杯状細胞のチモーゲン顆粒に局在することが示唆されている(CronshagenとKern, Eur J. Cell Biology 65:366-377, 1994)。
【0069】
実施例5
ラット MAdCAM の同定および配列決定
モノクローナル抗体をBD Pharmingen(カタログ番号22861)から購入し、約0.1〜100mg/mlをラットの尾静脈に注射した。種々の器官からの組織を免疫組織化学を利用して処理し、MAdCAM(MadCam-1)に対する抗体は膵臓および結腸に局在することが示された(図7)。図7中、パネルa.腎臓、パネルb.肝臓、パネルc.肺、パネルd.心臓、パネルe.膵臓、およびパネルf.結腸。ラットMadCam-1、Genbankアクセッション番号D87840はタンパク質配列、配列番号18に対応し、ヌクレオチド配列は配列番号19である。ヒトの配列は配列番号20および21、Genbankアクセッション番号U82483に対応する。ヒトに使用する本発明の治療複合体を作製するためのヒトMadCam-1抗体はBD Pharmingen (San Diego, CA)から入手可能である。
【0070】
実施例6
CD90 の同定
ラットCD90に対する抗体を購入し(BD Pharmingen, San Diego, CA,カタログ番号22211D)、約0.1〜100mg/mlをラットの尾静脈に注射した。種々の器官からの組織を免疫組織化学を利用して処理し、Thy-1に対する抗体は腎臓に局在することが示された(図8)。図8中、パネルa.腎臓、パネルb.肝臓、パネルc.肺、パネルd.心臓、パネルe.膵臓、およびパネルf.結腸。ラットThy-1、Genbankアクセッション番号NP036805はタンパク質配列、配列番号30に対応し、Genbankアクセッション番号NM 012673はヌクレオチド配列、配列番号31に対応する。ヒトThy-1、Genbankアクセッション番号XP006076はタンパク質配列、配列番号32に対応し、Genbankアクセッション番号XM 006076はヌクレオチド配列、配列番号33に対応する(Genbankアクセッション番号AF 261093も参照せよ)。マウス抗-ラットThy-1抗体はPharmingen Intl.から入手可能であり、0.5〜5μg/mlの濃度で免疫組織化学に使用し、ヒトに使用するための好ましい実施態様の治療複合体を作製した。
【0071】
実施例7
アルブミン断片の同定および配列決定
ラット全体の脈管の管腔タンパク質をビオチンで標識した。次に、器官を個別に取り出し、標識タンパク質をRobenら、米国特許第09/528,742(2000年、3月20日出願)に記載されたように単離した。ホモゲナイズした前立腺から単離した標識タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、その結果T436-608とラベル付けしてあるタンパク質(図9)が明らかになった。このタンパク質を部分配列決定し、アルブミンの断片、TQKAPQVST(配列番号22)として同定した。加えて、配列決定により、前立腺特異的形態は翻訳が早期に終了した断片であり、完全長アルブミンタンパク質(配列番号23)のアミノ酸436〜608に対応することが示された。アルブミン断片は他者により血管作用性断片であることが示されている(ヒト血清アルブミンのタンパク質分解性消化によって誘導されるヒスタミン放出:ペプシン処理による活性ペプチドの単離及び構造、Sugiyama K, Ogino T, Ogata K, Jpn J Pharmacol, 1989 Feb., 49 (2):165-71)。ラットタンパク質配列は配列番号24(Genbankアクセッション番号P02770)である。ヒト対応物は配列番号25,Genbankアクセッション番号P02768、に示されている。
実施例8において、ここまでの実施例において単離され同定された管腔発現標的タンパク質のin vivo分布が記載される。
【0072】
実施例8
DPP-4 、 MadCam-1 、 CD90 および CA-4 の生体内分布
以下の実施例は、これまでの実施例中で同定されたいくつかの管腔発現タンパク質の生体内分布を視覚化するための特異的標識抗体リガンドの使用を記載したものである。具体的には、DPP-4、MadCam-1、CD90またはCA-4に特異的な抗体(1μg/μl溶液)の50μlをSprauge-Dawleyラットの尾静脈に注射した。抗体を約30分間循環させ、その後動物を犠牲にし、器官を取り出した。脳、心臓、肺、肝臓、膵臓、結腸および腎臓の小さな塊を切り出し、包埋培地中に置き、直ちに凍結した。凍結した塊は切片を作製するまでドライアイス上に保持した。クリオスタットを用いて組織を6μm切片に切り出し、一晩風乾し、アセトン中で2分間固定した。固定した組織切片をCy3-標識二次抗体とインキュベーションし、リンスし、その後の画像取込のためにマウントした。少なくとも3つの独立な実験を各管腔発現標的タンパク質について行った。
上述した方法を用いて、管腔発現標的タンパク質DPP-4に特異的なマウスモノクローナル抗体OX-61(Pharmingen)を用いてDPP-4の生体内分布を確認した。図10(A)は強い蛍光染色を示しており、DPP-4が肺に存在していることを示す。さらに、弱い染色が腎臓の糸球体に観察された(図10(B));しかしながら、DPP-4は調べた他のどの組織においても有意には見出されなかった(図10(C)-(D))。これらの結果はDPP-4は主として肺の内皮に局在することを示す。
【0073】
上述した方法を用いて、MadCam-1の生体内分布も確認した。具体的には、ラットMadCam-1を認識するマウスモノクローナル抗体、OST-2(Pharmingen)を使用した。図11(A)および11(D)は蛍光は膵臓および結腸の両方に観察されたことを示している。さらなる染色が小腸に観察された。対照的に、調べた他の組織においては非常にわずかな蛍光が観察されただけであった(例えば図11(B)-(C))。これらの結果は、MadCam-1は胃腸(GI)管を含むある種の組織に局在することを示す。
ラットCD90を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体OX-7(Pharmingen)を投与することによりCD90の生体内分布を確認した。図12(A)は腎臓に観察された蛍光染色を示したものである。調べた他の組織のいずれにおいても染色は検出されなかった(図12(B)-(F))。これらの結果はCD90が腎臓にのみ局在することを示す。
CA-4の生体内分布を決定するため、ラットCA-4を認識するウサギポリクローナル抗体をこの分野でよく知られた方法を用いて作製した。上述した投与法および組織学的方法を用いて、CA-4の局在性を決定するためにこのポリクローナル抗体を使用した。強い染色が心臓(図13(B))および肺(図13(E))の両方に観察されたが、これはCA-4の存在を示すものである。脳(図13(A))、腎臓(図13(C))、肝臓(図13(D))または膵臓(図13(F))には全く染色が見られなかった。CA-4に特異的なモノクローナル抗体も心臓および肺に特異的に結合するが他の組織には結合しないことが明らかにされた。これらの結果はCA-4が心臓および肺に特異的に局在することを示す。
実施例9〜13において、標的組織における特異的な管腔発現タンパク質へのリガンド結合の特徴を記載した。
【0074】
実施例9
リガンド用量と標的組織への局在性の特異性との関係
以下の実施例において、投与した抗体の量との関係において標的組織への抗体リガンドの局在性の特異性を記載する。具体的には、DPP-4、MadCam-1またはCD90に特異的なマウスモノクローナル抗体をSprague-Dawleyラットへ尾静脈注射により投与した。各ラットに、5μg、20μg、50μgまたは100μgの上記のいずれかの抗体を与えた。注射に続いて、この抗体を30分間循環させ、その後動物を犠牲にし、その器官を取り出した。次にこれらの器官を免疫組織化学のために実施例8に記載したように処理した。
上述した方法を用いて、OX-61モノクローナル抗体を使用して投与した抗体リガンドの量と肺における管腔発現標的タンパク質DPP-4に対する特異性との関係を決定した。5〜50μgの用量でラットに投与した場合、OX-61は肺に対して非常に高い特異性を示した。しかしながら、100μg以上を単一回で投与した場合、OX-61抗体は腎臓にも現れ始めた。これらの結果は実施例8に示したDPP-4に関する生体内分布データと一致する。
【0075】
モノクローナル抗体OST-2を同様な研究に使用して、MadCam-1について膵臓および他のGI器官における特異性に対する用量効果を決定した。5μg、20μg、50μgまたは100μgの用量で投与した場合、OST-2は膵臓およびGI管の他の組織に対して特異性を維持した。これらの結果は、MadCam-1特異性は投与する用量とは関係なくGI管に限定されることを示しているようである。
モノクローナル抗体OX-7を用いて腎臓におけるCD90対するその特異性に対する用量の効果を決定した。5〜50μgの用量において、OX-7は腎臓に対する完全な特異性を示した。しかしながら、100μgにおいては、少量のOX-7が肺及び肝臓に出現し始めた。高濃度の抗体では、ある程度のOX-7が肺および肝臓に検出可能であったが、肺及び肝臓に存在したOX-7の量は腎臓に出現したOX-7の量よりも遙かに少なかった。
【0076】
実施例10
標的組織へのリガンド結合の経時的特徴
以下の実施例に、特異的な標的組織への抗体リガンドの経時的な結合を記載した。具体的には、DPP-4、MadCam-1またはCD90に特異的なマウスモノクローナル抗体をSprague-Dawleyラットに尾静脈注射により投与した。各ラットに50μg用量の単一の抗体を与え、5分間から48時間にわたって循環させた。抗体循環期間の後、動物を犠牲にし、その器官を免疫組織化学のために実施例8に記載したように処理した。
上述した方法を用い、肺の脈管におけるOX-61モノクローナル抗体のDPP-4への結合プロファイルを時間との関係で決定した。図14(A)-(E)は静脈注射後5分間〜24時間にわたる時間の間に肺に局在したOX-61の量を示したものである。特に、OX-61は投与後わずか5分後肺に検出された(図14(A))。同様な量のこの抗体は投与後少なくとも8時間のあいだ肺に検出された(図14(B)-(D))。しかしながら、投与後24時間において、肺に検出できたOX-61の量は顕著に減少した(図14(E))。
【0077】
時間に関連したプロファイルを膵臓の脈管におけるOST-2モノクローナル抗体のMadCam-1への結合について明らかにした。図15(A)-(D)は5分間〜48時間にわたる時間の間に膵臓に検出されたOST-2の量を示したものである。特にOST-2は投与後5分以内に膵臓に検出された(図15(A))。加えて、同様な量のこの抗体は注射後30分、24時間および48時間後においても膵臓に検出された(図15(A)-(D))。
時間に関連したプロファイルを腎臓の脈管におけるOX-7モノクローナル抗体の管腔発現標的タンパク質CD90への結合についても明らかにした。図16(A)-(F)は5分間〜8時間にわたる時間の間に腎臓に局在したOX-7の量を示した図である。特に、OX-7は投与後わずか5分後に腎臓に検出された(図16(A))。同様な量のこの抗体は投与後少なくとも8時間の間腎臓に検出された(図16(B)-(F))。
【0078】
実施例11
時間分解蛍光による、標的組織へ結合した抗体リガンド分子の定量
以下の実施例には、種々の標的組織における管腔発現標的タンパク質に局在した抗体リガンド抗体の定量的解析を記載する。具体的には、DPP-4、MadCam-1またはCA-4に特異的な抗体を、ユーロピウム-DTPAラベリングキット(Perkin Elmer,カタログ番号AD0021)を用いて業者の指示に従って、それぞれ抗体分子あたりおよそ3分子のユーロピウムで標識した。加えて、インフルエンザウイルスに対するモノクローナル抗体(IgG2aおよびIgG1アイソタイプ)もアイソタイプ対照として使用するために標識した。標識後、抗体/ユーロピウム複合体をSprauge-Dawleyラットの尾静脈に5μg、20μgおよび50μgの用量で注射した。各用量レベルにおいて、抗体を30分間、6時間および24時間循環させた。少なくとも3つの独立した実験を各用量および時間の組合せについて行った。
【0079】
各時間の終わりにラットを犠牲にし、その器官を蛍光分析のために取り出した。調べた器官には典型的には、腎臓、肺、肝臓、脳、膵臓、小腸、大腸(結腸)、胃および心臓が含まれる。切り出した器官はまず10倍体積のエンハンス溶液(Perkin Elmer、カタログ番号400-0010)中でホモゲナイズし、次に、一晩4℃にてインキュベーションした。得られた溶液の1%を新鮮なエンハンス溶液中へ1:40に希釈し、室温にて30分間ローテーションし、1500gにて10分間遠心した。得られた溶液を蛍光計に置きシグナル強度を3回測定した。
上述した方法を用いて、特定の時点において各組織型に局在するOX-61(抗-DPP-4)抗体の量を投与した各抗体用量について決定した。IgG2aアイソタイプ抗-インフルエンザモノクローナル抗体をバックグラウンド蛍光の対照として使用した。図17(A)-(C)は各用量レベルについて調べた各時点における各組織に存在したOX-61の質量百分率を示した図である。具体的には、図17Aは30分後に全5μgの投与量のおよそ15%が肺に局在したことを示している。6時間までに、このレベルは約7%にまで落ちたが、その後24時間の時点まで一定に維持された。ほとんどの部分において、他の組織に局在したOX-61の量は投与質量の0.75%に満たない量であり、これは各組織型に局在した抗-インフルエンザ対照抗体の最大レベルに対応する(図18(A)-(C)、および図17(A)点線)。一つの例外は、肝臓への僅かな局在性の増加であった。
【0080】
5μg用量について得られたのと同様な結果が20および50μg用量についても得られた(それぞれ図17(A)-(C))。肺におけるOX-61のレベルについて、初期用量を増加させると経時的な肺へのOX-61局在性のパーセンテージ損失は低下したことに注意すべきである(図17A-C)。これらを合わせると、これらの結果はOX-61の高いレベルが肺に特異的に局在し、長期間にわたって抗体のレベルが高いまま維持されることを示している。このような局在性の高いレベルにより、この抗体リガンドを用いてデリバリーされる肺作用性薬剤の治療インデックスがかなり改善されるであろう。
追加的実験において、各組織型に局在したOST-2(抗MadCam-1)抗体の量を、各抗体投与用量について特定の時点において決定した。IgGアイソタイプ抗-インフルエンザモノクローナル抗体をバックグラウンド蛍光の対照として使用した。図19(A)-(C)は各用量レベルについて調べた各時点における各組織に存在したOST-2の質量百分率を示した図である。特に、図19(A)は、6時間後に全5μg投与量の約3%が膵臓に局在したことを示している。投与量の5%を越える量が同じ時間後に小腸に観察された。非-GI組織に局在したOST-2の量は一般に投与質量の0.75%未満であったが、これは各組織型に局在した抗-インフルエンザ対照抗体の最大レベルに相当する(図19(A)、点線)。肺に比較して、膵臓はあまり脈管化されていないことに注意すべきである。従って、この狭い領域に結合する抗体用量の百分率は肺のようなより高度に脈管化された組織に結合する抗体リガンドよりも低いことが予想される。
【0081】
5μgについて得られたのと同様な結果が20および50μg用量についても得られた(それぞれ、図19(B)および19(C))。加えて、各組織に局在した抗インフルエンザIgG1アイソタイプ対照抗体も5μg用量レベルで局在した量と同様であった。5μg用量と2つの高用量との間で少なくとも一つの注目すべき相違点があった。5μg用量では、GI器官に局在したOST-2の量は6時間後にピークを示し(図19(A))24時間までに低下した。高投与量においては、膵臓および他のGI器官において生じた局在性は24時間にわたって蓄積した(図19(B)-(C))。これらをまとめると、これらの結果はOST-2の高レベルは膵臓のようなGI器官に特異的に局在し、この抗体の濃度は時間と共に増加することを示している。そのような高レベルの局在性はこの抗体リガンドを使用してデリバリーされるどの薬剤の治療インデックスも有意に改善するであろう。
【0082】
同様な実験において、20μgのユーロピウム標識抗-CA-4抗体リガンドをラットに静脈投与し、各組織型に局在したリガンドの量を特定の時点で決定した。アフィニティー精製した、CA-4に対するウサギポリクローナル抗体(抗-CA-4)(これは実施例8に記載したように調製した)を組織特異的リガンドとして用いた。図20は、全注射抗体のおよそ8.5%が最初の30分間以内に肺に局在することを示している。抗体のおよそ2%が同じ時間後に心臓に見出された。心臓および肺における抗体の濃度は両方とも6時間後に僅かに減少し、24時間後に測定したときには低下し続けていた。抗CA-4は24時間の時間経過において他のどの組織においても有意に蓄積しなかった。
【0083】
実施例12
シンチグラフィーによる管腔発現標的タンパク質へ結合した抗体リガンドの定量
以下の実施例には種々の標的組織における管腔発現標的タンパク質に局在した抗体リガンドを定量的に解析するための別の手段を記載した。DPP-4に対して特異的であるOX-61抗体を125Iで放射標識し、1μgまたは5μg用量をSprauge-Dawleyラットの尾静脈に注射し、5分間、2時間または8時間循環させた。種々の組織及び体液をこの分野でよく知られたシンチグラフ法によって解析した。シンチグラフィーの結果は各器官において1グラムの組織あたりの抗体のナノグラム当量として表した。特定の器官に局在した、注射投与量に対する百分率はラット器官の既知の平均質量を用いて計算した。
上述した方法を用いて、OX-61は優先的に肺に局在することが見出された。どちらの用量においてもOX-61は最初の5分間以内に肺に局在した。2時間後、注射した総量である1μgの22%がこの組織に局在することが分かった。8時間後、肺に見られる抗体の量は注射量の30%に増加した。OX-61は肝臓にも見出された。最初、高レベルのOX-61が肝臓に観察された;しかしながら、8時間後、注射量の僅かに7%が残存するのみであった。肝臓における初期の検出とそれに続く迅速な減少は血液中における抗体の循環のせいであったのだろう。
【0084】
5μg用量を投与した場合も結果は同様であった。図21は、組織1グラムあたり0.4μgを越えるOX-61(最初の抗体投与量の20%)が最初の5分間後に肺に局在したことを示している。8時間後、OX-61の量は、肺組織1グラムあたりおよそ0.7μgに増加した。この時間経過の間、他のどの組織においてもOX-61の有意な増強はなかった。これらの結果は、高レベルのOX-61が肺に特異的に局在し、抗体のレベルは長期間高く維持されることを確認するものである。
【0085】
実施例13
管腔発現標的タンパク質による抗体リガンドのトランスサイトーシス
以下の実施例は、トランスサイトーシスを媒介する能力についてのトランスサイトーシス性管腔発現標的タンパク質の特徴を明らかにするために用いた方法を記載したものである。より具体的には、三色組織学を用いて、結合したリガンドを血管の管腔表面から周辺組織空間へ輸送することのできる管腔発現標的タンパク質の特徴を明らかにした。調べた標的タンパク質のうち、DPP-4およびCD90のみが内皮細胞層を通したトランスサイトーシス(細胞輸送)を媒介する能力を有するようであった。
特異的な抗体リガンドおよび細胞構造物に特異的な染色剤を用いて三色組織学を行った。前の実施例のように、DPP-4、MadCam-1、CD90またはCA-4に特異的な抗体を50μgの用量でSprauge-Dawleyラットの尾静脈に注射した。30分後、ラットを犠牲にし、その器官を実施例8に記載したように組織学のために調製した。次に、組織切片をCy3-標識二次抗体とインキュベーションし、結合した一次抗体を検出した。加えて、組織切片を4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、ジヒドロクロリド(DAPI)およびフルオレセイン-標識グリフォニア・シンプリシフォリア(Griffonia simplicifolia)レクチン1-イソレクチンB4(GSL-1)で染色した。DAPIは細胞の核を青く染め、GSL-1は内皮を緑に染める。内皮を横切る抗体のトランスサイトーシスは、抗体は細胞層を通過して輸送されるのでCy-3の赤いシグナルと緑に染色された内皮との混合によって生じる黄色の領域の分布を決定することによって検出した。
【0086】
上述した方法を用いて、DPP-4によるOX-61のトランスサイトーシス輸送を検出した。図22は、OX-61は脈管を囲む肺組織へ浸透したことを示している。予想されるように毛細管の表面は緑に染色され、細胞核は青く染色された。肺の間質は黒い領域として提示された。内皮全体にわたる黄色の分布は抗体が内皮障壁を通して肺組織間腔へ輸送されたことを示す。
同様に、OX-7のCD90によるトランスサイトーシス輸送を検出した。図23はOX-7が腎臓の糸球体へ浸透したことを示している。浸透は結合した抗体と内皮との間に観察されたかなりの量の混合によって示された。抗体の内皮への分布は図23中で管腔表面に結合した赤く染色された抗体と緑に染色される内皮層との間に存在する黄色の拡散した領域として見ることができる。
OST-2は予想されるようにMadCam-1に結合したが、抗体は内皮を横切って膵臓へ輸送されなかった。図24は膵臓の切片を示しているが、内皮への抗体の目に見える浸透は全く見られない。抗体は血管の表面上に局在したが(赤)、内皮(緑)を通して周辺組織へ全く移動しなかった。図24において黄色の着色が全く存在しないことはトランスサイトーシスを欠くことを証明している。
【0087】
同様に、肺の脈管の管腔表面上のCA-4に結合した抗-CA-4抗体についてトランスサイトーシスは見られなかった。図25は肺の切片を示しているが、内皮への抗体の目に見える浸透は全く見られない。言い換えると、内皮表面に結合した抗体の赤い領域は内皮細胞層へ全く移動しなかった。この移動がないことは、図25において内皮細胞層において混合された黄色が存在しないことにより示される。心臓に局在した抗CA-4抗体についても同様な結果が記録された。
まとめると、上記結果は本明細書で同定した管腔発現標的タンパク質は、特定の組織の間質および脈管表面のどちらに薬剤をデリバリーするためにも有用である。
実施例14−16には、ゲンタマイシンおよびドキソルビシンのような治療的部分に連結した標的タンパク質特異的抗体リガンドを含む治療複合体を記載する。
【0088】
実施例14
特異的標的タンパク質を用いた組織への選択的薬剤デリバリー
以下の実施例には、特異的標的組織への治療複合体のデリバリーが記載される。治療複合体は、DPP-4またはMadCam-1に特異的なマウスモノクローナル抗体をゲンタマイシンまたはドキソルビシンのいずれかに非切断性リンカーを介してこの分野でよく知られた方法を用いてカップリングすることによって構築した。平均すると、各抗体に3分子の薬剤が共有結合的に結合した。およそ50μgの各治療複合体を尾静脈注射によりラットに投与し30分間循環させた。次にラットを犠牲にし、実施例8に記載した方法を用いて組織学のためにその器官を切片化した。ゲンタマイシンおよびドキソルビシン治療複合体はゲンタマイシン特異的またはドキソルビシン特異的抗体を必要に応じて添加し、Cy3結合二次抗体でシグナルを増幅することによって検出した。またある実験では、組織切片を4'6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、ジヒドロクロリド(DAPI)およびフルオレセイン-標識グリフォニア・シンプリシフォリアレクチン1-イソレクチンB4(GSL-1)で染色してトランスサイトーシスを明らかにした(実施例13に記載したような三色組織学法)。
【0089】
上述した方法を用いて、OX-61/ゲンタマイシンおよびOX-61ドキソルビシン治療複合体が最初の注射後30分間以内に肺組織へ特異的に局在することが示された。図26(A)-(F)はOX-61/ゲンタマイシン治療複合体の特異的組織への結合を示した図である。特に、この治療複合体は注射後30分間以内に肺に観察された(図26(E))。しかしながら、調べたどの他の組織においてもこの治療複合体は存在しなかった(図26(A)-(D)および26(F))。同様な結果がOX-61/ドキソルビシン治療複合体についても得られた(図27(A)-(D))。
上述した三色組織学法を用いて、OX-61/ゲンタマイシンおよびOX-61/ドキソルビシンの両方のDPP-4媒介トランスサイトーシス輸送も検出された。図28はOX-61/ゲンタマイシン治療複合体は内皮に浸透し、次に肺の間質に局在化されたことを示している。治療複合体は毛細管および内皮細胞層全体を裏打ちしていることが観察された。複合体は肺の間質組織全体にわたっても観察された。図28中の黄色の領域は治療複合体の内皮を横切る移動を示している。同様な結果がOX-61/ドキソルビシン治療複合体についても見られた。図29は特にこの治療複合体の肺の間質における蓄積を示したものである。
OST-2/ゲンタマイシンおよびOST-2/ドキソルビシン結合体の組織特異的局在性も評価した。図30(A)および30(F)はOST-2/ゲンタマイシン結合体は結腸および膵臓のどちらにおいても特異的にMadCAm-1に結合したことを示している。この結合体は調べた他のどの組織にも局在していなかった(図30(B)-(F))。同様な結果がOST-2/ドキソルビシン治療複合体について観察された(図31(A)-(F))。
【0090】
実施例15
DPP-4 特異的抗体 OX-61 を用いたゲンタマイシンの標的化リポソーム製剤
以下の実施例にはリポソーム治療複合体の特異的な標的組織へのデリバリーが記載される。リポソーム(リンカー)を用いて、DPP-4(リガンド)に特異的なマウスモノクローナル抗体をゲンタマイシン(治療的部分)にカップリングすることによって治療複合体を構築した。卵ホスファチジルコリン(EPC)またはジステロイルホスファチジルコリン(DSPC)を主たるリン脂質成分(50モル%より大きい)として用いてリポソームを構築した。マレイミド-PEG化ジステロイルホスファチジルエタノールアミン(MPDSPE)を副次的脂質成分として約5モル%の濃度で添加した。MPDSPEは分子量約5000kDaのポリエチレングリコール(PEG)をジステロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)にカップリングすることによって合成した。接続したPEG基の遊離末端はこの分野でよく知られた方法を用いて反応性マレイミドに変換した。コレステロールを最初に使用したリン脂質の量に依存して0〜50モル%の濃度で添加することによりリポソーム製剤化を完了させた。
【0091】
ゲンタマイシンおよびOX-61の両方をリポソームリンカーにカップリングさせることによって治療複合体を作製した。硫酸ゲンタマイシンはリポソーム形成の際にリポソーム内部に受動的に閉じこめることによりカップリングさせた。ゲンタマイシンはおよそ150μg/mlの濃度で捕捉された。治療的部分の捕捉に続いて、OX-61抗体をこのリポソームリンカーにカップリングさせた。このカップリングは最初にOX-61をトラウト試薬と反応させて一級アミンをチオールに変換することによって達成した。次に抗体を反応性MPDSPEにカップリングさせた。
DPP-4に標的化したEPCおよびDSPCリポソーム(それぞれ、EPC-DPPおよびDSPC-DPP治療複合体)として投与したゲンタマイシンの生体内分布を遊離のゲンタマイシンおよび非標的化リポソームとして投与したゲンタマイシンの生体内分布と比較した。具体的には、遊離のゲンタマイシンの溶液、または、治療複合体またはその表面に結合したリガンドを持たないリポソームを含む分散液Sprauge-Dawleyラットの尾静脈にラットあたり150μgゲンタマイシンの用量で注射した。30分後または18時間後にラットを犠牲にし、その器官を取り出してホモゲナイズした。各器官ホモゲネート中のゲンタマイシンの量をTDX分析器(Abbott)を用いて測定した。少なくとも3つの独立の実験を各ゲンタマイシン製剤について各時点で行った。
【0092】
上述した方法を用いて、遊離のゲンタマイシンおよびDSPC-DPP治療複合体として投与したゲンタマイシンの両方について、投与後に肺および腎臓に局在したゲンタマイシンの量を決定した。特に、投与後30分以内に遊離のゲンタマイシンは腎臓に蓄積し始めた(図32(A))。18時間後、腎臓に存在するゲンタマイシンの量は2倍以上になった(図32(B))。対照的に、DSPC-DPP治療複合体として投与した場合、18時間後に非常に僅かなゲンタマイシンが腎臓に出現した(図32(A)-(B))。ほとんど反対の効果が肺組織において観察された。図32(A)-(B)は、遊離形態で投与された場合、注射後30分または18時間後に非常にわずかなゲンタマイシンが肺に観察されたことを示している。しかしながら、DSPC-DPP治療複合体として投与された場合、ゲンタマイシンは30分後に肺組織1グラムあたり約20μgで存在した(図32(A))。18時間後、このレベルは約半分に落ちた(図32(B))。これらの結果により、腎臓におけるゲンタマイシンの蓄積、従って、ゲンタマイシン媒介毒性は、この薬剤と適切な標的化リポソーム治療複合体を用いて感染部位に特異的にデリバリーすることによって防止できることが示された。
【0093】
遊離のゲンタマイシンの生体内分布をEPC-DPP治療複合体および非標的化EPCリポソームとしてデリバリーされたゲンタマイシンの生体内分布と比較した。遊離ゲンタマイシンの投与後30分間以内にかなりの量のこの化合物が腎臓に出現した。18時間後、この量は2倍以上となった(図33(A)-(B))。非標的化リポソームとしてデリバリーされたゲンタマイシンは30分後に血清中に優勢に出現したが、18時間後にはかなりの量が腎臓および脾臓の両方に検出された(図33(A)-(B))。対照的に、30分間以内に、EPC-DPP治療複合体としてデリバリーされたゲンタマイシンの大部分は肺、肝臓および脾臓に分布したが、非常に僅しか腎臓または血清中には観察されなかった。もっとも高いゲンタマイシンレベル、注射量の約15%が肺に検出された(図33(A))。同様な分布が18時間後に観察された(図33(B))。
上述の結果は、ゲンタマイシンはEPC-DPP治療複合体を用いて肺に標的化されたことを示している。肝臓および脾臓に出現したゲンタマイシンの量は有意であったが、これらの器官に蓄積する薬剤の量は低下させることができそうである。そのような結果は、抗体全体ではなく抗体断片を標的化リガンドとして使用することによって達成することができる。抗体のFc部分が肝臓および脾臓への取込を媒介することが明らかにされている。従って、抗体のこの部分を除去することによりこれらの器官における蓄積が低下するのはあり得ることである。腎臓におけるゲンタマイシンの蓄積は非標的化リポソームを用いると防止できなかったが、EPC-DPP治療複合体を用いることによりゲンタマイシンは腎臓から効果的に遮蔽することができた。従って、そのような複合体は標的化薬剤デリバリーおよび薬剤毒性の防止の両方に有用である。
【0094】
遊離のゲンタマイシンの生体内分布をDSPC-DPP治療複合体としておよび非標的化DSPCリポソームとしてデリバリーされたゲンタマイシンとも比較した。図34(A)-(B)はDSPC-DPP治療複合体としてデリバリーされたゲンタマイシンの生体内分布は30分後および18時間後のいずれにおいてもEPC-DPP治療複合体としてデリバリーされたゲンタマイシンの生体内分布とは一つの重要な相違点を除いて同様であったことを示している。どちらの時点においても、DSPC-DPP治療複合体は肺においてEPC-DPP複合体の2倍を超えるゲンタマイシン量を局在させた(図34(A)-(B)および33(A)-(B))。非標的化DSPCリポソームとしてデリバリーされたゲンタマイシンの生体内分布も、デリバリーにDSPCリポソームを用いた場合は18時間後に腎臓において遙かに少ないゲンタマイシンが見られたことを除いて非標的化EPCリポソームとしてデリバリーされたゲンタマイシンの生体内分布と同様であった(図34(A)-(B)および33(A)-(B))。
これらをまとめると、上述の結果は、DSPC-DPP治療複合体は高レベルのゲンタマイシンを肺に標的化することができることを示すものである。加えて、そのような治療複合体を使用することにより腎臓におけるゲンタマイシンの蓄積(毒性効果を有することが知られている)が防止できる。
【0095】
実施例16
ゲンタマイシンを含有する治療複合体の効力
以下の実施例はゲンタマイシン含有EPC-DPP治療複合体の肺炎治療における効力を記載したものである。15匹のラットについて、1.5x107の肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)の気管内注入によって感染させることにより各動物に肺炎を起こさせた。次に、ラットをそれぞれ5匹の動物を含む3つの群に分けた。24時間後、一つの群を動物あたり5mg/kgのゲンタマイシンを投与することにより処置した。第2の群にはEPC-DPP治療複合体として製剤化したゲンタマイシンを各動物あたり5mg/kg投与した。最後の群は対照群として未処置のままにした。次にラットを次の15日間の生存について監視した。
EPC-DPP治療複合体としてデリバリーしたゲンタマイシンは肺炎の治療について遊離のゲンタマイシンよりも優れていた。EPC-DPP処置群では5匹の動物のうち1匹が死亡しただけであった。死亡は第6日に起こった。他の4匹の動物は15日間を通して生存し、感染の徴候を示さなかった。さらに、生存した動物の1匹を犠牲にしたが、病原性バクテリアは肺に見られなかった。これらの結果はEPC-DPP治療複合体としてデリバリーされたゲンタマイシンは処置したラットの80%において完全に感染を治癒したことを示す。
対照的に未処置の動物の全てが死亡した。これらの動物のうち4匹は第3日までに死亡した。遊離のゲンタマイシンで処置した5匹の動物のうち4匹は第9日までに死亡した。しかしながら1匹の動物は第15日まで生存した。従って、遊離のゲンタマイシンの効力はEPC-DPP治療複合体として肺にデリバリーされたゲンタマイシンよりもずっと劣っていた(図35)。
実施例17-22において、肺特異的管腔発現分子、ラットジペプチジルペプチダーゼIV(DPP-4)を使用して、種々の肺特異的疾病または欠損症を治療するために使用されるいくつかの治療複合体を作製している。
【0096】
実施例17
肺癌治療のための、酸感受性リンカーを有する DPP-4 ドキソルビシン治療複合体の使用
まず、実施例7におけるようなヒトドキソルビシン/DPP-4複合体の治療レベルを患者に静脈注射する。複合体の効果的な量、好ましくは生理食塩水または静脈に許容されるデリバリービヒクル中の1μg〜100mg/Kg患者体重、をデリバリーする。DPP-4 F(ab')2は肺組織に特異的である。治療複合体が肺組織へトランスサイトーシスされると、酸感受性リンカーが切断されてドキソルビシンが遊離されDNAへインターカレートする。ドキソルビシンはサイクリングしている細胞のDNAへ取り込まれるので、サイクリング過程にある癌細胞に対する効果は顕著であろうし、通常の肺癌細胞に対する効果はかなり低下するであろう。従って、この処置は肺における癌細胞の数の減少をもたらし、副作用は最小限であろう。ドキソルビシンは一般に分裂細胞を標的にするため、かつ、この組織特異性のため、ドキソルビシンは肺の分裂細胞にのみ影響を与え、従って、この処置の副作用のために死ぬ細胞の数は最小限となろうことが想像される。
実施例18では肺癌の治療のためのDPP-4/ドキソシリンプロドラッグの合成とその使用のための方法が記載される。
【0097】
実施例18
プロドラッグを用いた肺癌治療のための DPP-4/ ドキソシリン治療複合体の使用
治療複合体は、ポリペプチドリンカーまたは共有結合によりβ-ラクタマーゼに連結したDPP-4に特異的なF(ab')2を含むDPP-4/β-ラクタマーゼ結合体である。使用したリンカーはSMCCである。化学療法物質ドキソシリンはその構造中の多数の陰電荷のために内皮を通過せず、そのため全ての細胞に対して非毒性であり抗癌剤としては効果的でない。しかしながら、ドキソシリンはβ-ラクタム環が切断されてドキソルビシンを生成すると活性になるプロドラッグとして考慮することができる。ドキソルビシンは内皮を通過しサイクリング細胞のDNAへインターカレーションし、効果的な化学療法剤となる。
初めに、治療的量のDPP-4/β-ラクタマーゼ複合体を患者に静脈投与する。DPP-4 F(ab')2を治療複合体中のβ-ラクタマーゼプロドラッグに切断されないリンカーを用いて連結する。DPP-4 F(ab')2リガンドは肺組織に標的化されている。この治療複合体の治療的レベルを約1μg〜100mg/Kg患者体重にて患者に投与する。治療複合体の投与および局在化後、ドキソシリンの治療的レベルを約1μg〜100mg/Kg患者体重、好ましくは、10μg〜100mg/Kg患者体重で患者に投与する。ドキソシリンは全身的に取り込まれるが、肺の微小環境においてのみドキソシリンはβ-ラクタマーゼによって切断されてドキソルビシンを生成する。従って、このプロドラッグの真核生物細胞傷害性活性はβ-ラクタマーゼの場所、すなわち肺、においてのみ現れる。ドキソルビシンは肺組織によって取り込まれDNAへインターカレーションする。しかしながら、ドキソルビシンはサイクリング細胞のDNAへ取り込まれるので、サイクリング過程にある癌細胞に対する効果は顕著であり正常な肺癌細胞に対する効果はかなり低下する。この治療は肺における癌細胞数の減少を生じさせる。
実施例19において、DPP-4/セファレキシンプロドラッグ治療複合体の合成および肺炎治療のためのその使用方法を記載する。
【0098】
実施例19
肺感染の治療のための DPP-4 治療複合体の使用
最も一般的な細菌性肺炎は肺炎連鎖菌(Streptococcus pneumoniae)によって引き起こされる肺炎球菌性肺炎である。他の細菌性肺炎はインフルエンザ菌(Haemophilus influenza)およびマイコプラズマの種々の株によって引き起こされる。肺炎球菌性肺炎は一般にペニシリンで治療される。しかしながら、ペニシリン耐性株がより一般的になってきている。
本発明は以下のようにヒト(または他の哺乳動物)における肺炎連鎖菌肺炎の治療に使用される:治療複合体はヒトDPP-4抗体のF(ab')2断片をセファレキシンに連結することによって作製する。使用するリンカーはリポソームである。リポソームはF(ab')2断片が膜内に取り込まれ、セファレキシンがリポソーム内部に保持されるように構築する。リポソームは、リガンドがリン脂質二重層の一部となるようにDPP-4/F(ab')2リガンドの存在下でリポソームを重合させて作製し、薄フィルム水和技術およびそれに続く凍結乾燥サイクルを用いて調製する。しかしながら、リポソーム懸濁液は当業者に知られた方法に従って調製することもできる。0.1〜10nmolの治療複合体を静脈注射する。セファレキシンを保持するリポソームはDPP-4特異的(Fab')2断片によって肺に標的化される。内皮に結合すると、リポソームは取り込まれ、セファレキシンが肺組織に取り込まれる。次にセファレキシンは分裂しているS.pneumonia 生物の細胞壁に作用することができる。抗生物質を特異的な領域に標的化することの一つの利点は同じ結果を得るためにより少ない量の抗生物質しか必要とせず、副作用の可能性がより低く、微生物の薬剤耐性への寄与の可能性がかなり低減されることである。
実施例20では、DPP-4/リファンピンプロドラッグ治療複合体の合成および結核の治療におけるその使用を記載する。
【0099】
実施例20
結核の治療のための DPP-4 治療複合体の使用
細菌M.tuberculosis(結核菌)によって引き起こされる結核のような、リファンピンまたはイソニアジドを長期間用いてしばしば治療される疾病は本発明の治療剤を用いてより効果的に治療されるであろうことは容易に想像される。この疾病の発生率の高さおよびこの微生物における薬剤耐性の理由の多くは極度に長い治療期間に対してコンプライアンスがないことである。高濃度の抗生物質によって肺を直接的に標的化する方法を用いると実行の難しい長期治療に対する必要性を低減し、従ってノンコンプライアンスの発生率と薬剤耐性を低下させることが想像される。
ヒト(または他の哺乳動物)の結核治療に使用するための好ましい実施態様は以下の通りである:治療複合体はヒトDPP-4抗体のF(ab')2断片をリファンピンに連結することによって構築する。使用するリンカーはリポソームである。リポソームはF(ab')2断片が膜に取り込まれてリファンピンがリポソーム内部に保持されるように構築する。リポソームは、リガンドがリン脂質二重層の一部となるようにDPP-4/F(ab')2リガンドの存在下でリポソームを重合させて作製し、薄フィルム水和技術およびそれに続く凍結乾燥サイクルを用いて調製する。しかしながら、リポソーム懸濁液は当業者に知られた方法に従って調製することもできる。0.1〜10nmolの治療複合体を静脈注射する。リファンピンを保持するリポソームはDPP-4特異的(Fab')2断片によって肺に標的化される。内皮に結合すると、リポソームは取り込まれ、リファンピンが肺組織に取り込まれる。次に、リファンピンはM.tuberculosis生物に作用することができる。
実施例21において、DPP-4/界面活性タンパク質治療複合体の合成および界面活性タンパク質の生産不足によって生じる肺疾病治療のためのその使用を記載する。
【0100】
実施例21
界面活性欠損の治療のための DPP-4 治療複合体の使用
肺気腫を含むいくつかの肺疾病は疾病の原因の一部または結果の一部として界面活性タンパク質の欠損を含む。本発明は以下のように界面活性欠損の治療に使用される:DPP-4抗体のF(ab')2断片をSP-A(界面活性タンパク質A)のような界面活性タンパク質に連結することによって治療複合体を構築する。使用するリンカーはpH感受性結合である。この治療複合体を患者の静脈に注射し、DPP-4特異的F(ab')2断片により肺を標的化する。内皮に結合すると治療複合体は肺組織によってトランスサイトーシスされ、pH変化が結合を切断し、界面活性タンパク質が遊離される。
実施例22では、DPP-4/コルチコステロイド治療複合体の合成と移植肺組織の拒絶を治療するためのその使用を記載する。
【0101】
実施例22
肺移植拒絶の治療のための DPP-4 治療複合体
本発明は以下のように肺移植拒絶の治療のために使用される:DPP-4抗体のF(ab')2断片をコルチコステロイドまたはシクロスポリンのような免疫抑制物質にpH感受性リンカーを用いて連結することによって治療複合体を構築する。この治療複合体を患者の静脈へ注射し、DPP-4特異的F(ab')2断片により肺を標的化する。内皮に結合すると、この治療複合体は肺組織によってトランスサイトーシスされ、または取り込まれ、pH変化により結合が切断され、肺の領域においてのみ免疫抑制物質が遊離される。そのような治療の利点は、患者は免疫抑制されず外科手術からの回復の間健全な活性免疫系を有することであることが容易にわかる。肺(または他の移植器官)は免疫抑制される唯一の器官であり、注意深く監視される。
【0102】
当業者はこれらの方法および組成物は、本明細書に内在するものと同様に、述べてきた目的を実行し結果および利益を得るために適合させることができることを理解するであろう。本明細書に記載した方法、手順、および組成物は好ましい実施態様を代表的に示した例示であり、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。本発明の精神の範囲内に包含され、開示の範囲によって規定される変更または他の使用は当業者には想像できるであろう。
当業者は記載した本発明の特徴および実施態様はそれぞれ別個に実施することも互いに組み合わせて使用することもできることを認識する。従って、別々の実施態様の組み合わせも開示したように本発明の範囲内である。
本明細書中で言及した全ての特許および刊行物は本発明が属する分野の当業者の水準を示したものである。
ここに例示的に記載した本発明は特に開示しなかった一切の要素または限定なしに適切に実行できるであろう。種々の改変が本発明の範囲内で可能であることが理解される。従って、本発明は好ましい実施態様および任意的な特徴によって具体的に開示してきたが、当業者は改変および開示した概念の変形を行うことができ、そのような改変または変形は開示によって規定される本発明の範囲内と考えられることは言うまでもない。
本発明の他の実施態様は請求の範囲の範囲内で考えることができる。
【図面の簡単な説明】
【0103】
【図1】内皮細胞表面、組織特異的分子と相互作用する典型的な治療複合体を描写したものである。
【図2】図2(A)-(D)はCD71または対照抗体を注射したラットの組織切片の免疫組織化学を示したものである。図2(A)はCD71を注射したラットの脳である。図2(B)は対照抗体を注射したラットの脳である。図2(C)は、CD71を注射したラットの肺である。図2(D)は対照抗体を注射したラットの肺である。
【図3】肺から単離した管腔タンパク質のポリアクリルアミドゲルを示す。ジペプチジルIVはDPP-4とラベル付けしてある。
【図4】図4(A)-(F)は種々の組織の一連の免疫ヒストグラムであり、腎臓および肺における抗-ジペプチジルペプチダーゼ抗体の管腔組織への結合を示したものである。
【図5】肺から単離した管腔タンパク質の別の組のポリアクリルアミドゲルを示す。炭酸脱水素酵素IVはCA-4とラベル付けしてある。
【図6】膵臓から単離した管腔タンパク質のポリアクリルアミドゲルを示したものである。チモーゲン顆粒16タンパク質はZG16Pとラベル付けした。
【図7】図7(A)-(F)は種々の組織の一連の免疫ヒストグラムであり、膵臓および結腸におけるMAdCAM抗体の管腔組織への結合が示されている。
【図8】図8(A)-(F)は種々の組織の一連の免疫ヒストグラムであり、腎臓におけるThy-1(CD90)抗体の管腔組織への結合が示されている。
【図9】前立腺から単離した管腔タンパク質のポリアクリルアミドゲルを示したものである。アルブミン断片はT406-608とラベル付けしてある。
【図10】図10(A)-(D)は種々の組織の一連の免疫ヒストグラムであり、OX-61のジペプチジルペプチダーゼIV(肺の脈管の管腔表面上に発現されている)への結合が示されている。
【図11】図11(A)-(D)は種々の組織の一連の免疫ヒストグラムであり、OST-2のMadCam-1(膵臓および結腸の脈管の管腔表面上で発現している)への結合が示されている。
【図12】図12(A)-(F)は種々の組織の一連の免疫ヒストグラムであり、OX-7のCD90(腎臓の脈管の管腔表面上に発現している)への結合が示されている。
【図13】図13(A)-(F)は種々の組織の一連の免疫ヒストグラムであり、抗炭酸脱水素酵素IV抗体の炭酸脱水素酵素IV(心臓および肺の脈管の管腔表面上に発現している)への結合が示されている。
【図14】図14(A)-(E)は肺の一連の免疫ヒストグラムであり、24時間のOX-61のジペプチジルペプチダーゼIVへの経時的結合プロファイルを示したものである。
【図15】図15(A)-(D)は膵臓の一連の免疫ヒストグラムであり、48時間のOST-2のMadCam-1への結合の経時的プロファイルを示したものである。
【図16】図16(A)-(F)は腎臓の一連の免疫ヒストグラムであり、8時間のOX-7のCD90への結合の経時的プロファイルを示したものである。
【図17】図17(A)-(C)は24時間にわたるユーロピウム標識OX-61(肺に局在した)の注射用量の割合を示したグラフである。点線はいずれかの時間に示した組織のいずれかに結合したアイソタイプ対照抗体の最大レベルを示す。
【図18】図18(A)-(C)は特定の組織に局在したユーロピウム標識抗インフルエンザIgG2Aアイソタイプ対照抗体の24時間にわたる注射用量の割合を示したグラフである。
【図19】膵臓に局在した図19(A)-(C)はユーロピウム標識OST-2の24時間にわたる注射した用量の割合を示したグラフである。点線はいずれかの時間に示した組織のいずれかに結合したアイソタイプ対照抗体の最大レベルを示す。
【図20】心臓および肺に局在するユーロピウム標識抗炭酸脱水素酵素IV抗体の24時間にわたる注射した用量の割合を示したグラフである。
【図21】種々の組織および体液中に局在する、注射した125I-標識OX-61の8時間にわたる量を示したグラフである。
【図22】ジペプチジルペプチダーゼIVによるOX-61のトランスサイトーシス輸送を示す肺の切片の免疫ヒストグラムである。
【図23】CD90によるOX-7のトランスサイトーシス輸送を示す腎臓の切片の免疫ヒストグラムである。
【図24】OST-2が脈管の管腔表面上のMadCam-1に結合するが内皮を横切って輸送はされないことを示した膵臓の切片の免疫ヒストグラムである。
【図25】抗-炭酸脱水素酵素IV抗体は脈管の管腔表面上の炭酸脱水素酵素IVに結合するが内皮を横切って輸送はされないことを示す、肺の切片の免疫ヒストグラムである。
【図26】図26(A)-(F)はOX-61/ゲンタマイシン治療複合体のジペプチジルペプチダーゼIV(肺の脈管の管腔表面上に発現している)への結合を示す種々の組織の一連の免疫ヒストグラムである。
【図27】図27(A)-(D)はOX-61/ドキソルビシン治療複合体のジペプチジルペプチダーゼIV(肺の脈管の管腔表面上に発現している)への結合を示す種々の組織の一連の免疫ヒストグラムである。
【図28】ジペプチジルペプチダーゼIVによるOX-61/ゲンタマイシン治療複合体のトランスサイトーシス輸送を示す肺の切片の免疫ヒストグラムである。
【図29】ジペプチジルペプチダーゼIVによるOX-61/ドキソルビシン治療複合体のトランスサイトーシス輸送を示す肺の切片の免疫ヒストグラムである。
【図30】図30(A)-(F)はMadCam-1(結腸および膵臓の脈管の管腔表面上に発現している)へのOST-2/ゲンタマイシン治療複合体の結合を示す種々の組織の一連の免疫ヒストグラムである。
【図31】図31(A)-(F)はMadCam-1(結腸および膵臓の脈管の管腔表面上に発現している)へのOST-2/ドキソルビシン治療複合体の結合を示す種々の組織の一連の免疫ヒストグラムである。
【図32】図32(A)-(B)は、DSPC-DPP治療複合体として肺および腎臓にデリバリーされたゲンタマイシン量に比較した、肺および腎臓に18時間にわたって蓄積した遊離のゲンタマイシンの量を示したグラフである。
【図33】図33(A)-(B)はEPC-DPP治療複合体中で肺および腎臓にデリバリーされたゲンタマイシンの量に比較した、肺および腎臓に蓄積した遊離のゲンタマイシンの18時間にわたる量を示したグラフである。
【図34】図34(A)-(B)は、DSPC-DPP治療複合体および非標的化リポソームとして種々の組織へデリバリーされたゲンタマイシン量に比較した、種々の組織に18時間にわたって蓄積した遊離のゲンタマイシンの量を示したグラフである。
【図35】遊離のゲンタマイシンおよびEPC-DPP治療複合体中のゲンタマイシンの両方の、肺感染の治療における効力を示したものである。
Claims (185)
- 組織特異的な管腔発現タンパク質に結合するリガンド、治療的部分、および、前記治療的部分を前記リガンドに連結するリンカーを含む治療複合体の治療上有効な量を投与することを含む、治療物質を特異的な組織にデリバリーする方法。
- リガンドがタンパク質、ペプチドおよび小分子からなる群より選ばれる、請求項1記載の方法。
- タンパク質が抗体、抗体複合体、抗体断片および酵素からなる群より選ばれる請求項2記載の方法。
- 治療的部分が酵素、抗生物質、免疫調節物質、化学療法物質、抗ウイルス物質、抗真菌物質、造影物質、プロドラッグおよびホルモンからなる群より選ばれる請求項1記載の方法。
- 酵素が特異的にプロドラッグを切断して対応する医薬を生成する請求項4記載の方法。
- リンカーが結合、ペプチド、リポソームおよび微小カプセルからなる群より選ばれる請求項1記載の方法。
- 結合が酸または還元条件に感受性である請求項6記載の方法。
- 治療複合体の投与後約20分〜約12時間の間に酵素が投与される請求項1記載の方法。
- 治療複合体の投与後約48時間以内にプロドラッグが投与される請求項1記載の方法。
- 肺および/または心臓特異的な治療複合体を特異的組織の脈管内皮細胞膜の管腔表面へ付着させるリガンドであって、配列番号9または11またはそれらの類似物に結合する前記リガンド;
リンカー;および、
治療的部分、
を含み、前記リンカーが前記リガンドを前記治療的部分に連結させている、標的化された内細胞と相互作用する肺および/または心臓特異的な治療複合体。 - リガンドが抗体または抗体の結合性部分である、請求項10記載の肺および/または心臓特異的な治療複合体。
- リガンドがレセプターを活性化しない、請求項10記載の肺および/または心臓特異的な治療複合体。
- 治療的部分が少なくとも一つの医薬、少なくとも一つの遺伝子、少なくとも一つのアンチセンスオリゴヌクレオチド、少なくとも一つの化学療法物質、少なくとも一つの造影物質、少なくとも一つのタンパク質、少なくとも一つの毒性物質、少なくとも一つの放射性原子、およびそれらの混合物からなる群より選ばれる請求項10記載の肺および/または心臓特異的な治療複合体。
- リンカーがpH感受性である、請求項10記載の肺および/または心臓特異的治療複合体。
- pH感受性リンカーがリガンドと治療的部分の間の酸感受性結合である、請求項14記載の肺および/または心臓特異的治療複合体。
- リンカーがリポソームである、請求項10記載の肺および/または心臓特異的な治療複合体。
- リガンドがリポソームの外側にあり、治療的部分が前記リポソームの内側にある、請求項16記載の肺および/または心臓特異的な治療複合体。
- 治療的部分がプロドラッグを切断する酵素である、請求項10記載の肺および/または心臓特異的な治療複合体。
- リンカーが酵素によって切断可能である、請求項10記載の肺および/または心臓特異的な治療複合体。
- 治療的部分が抗生物質である、請求項10記載の肺および/または心臓特異的な治療複合体。
- 治療的部分が化学療法物資である、請求項10記載の肺および/または心臓特異的な治療複合体。
- 請求項10記載の治療複合体を組織又は細胞にin vitroまたはin vivoで投与すること、および結合した前記治療複合体を同定またはその量を定量することを含む、組織又は細胞における炭酸脱水素酵素IVの存在または濃度を決定する方法。
- 請求項10記載の肺および/または心臓特異的な治療複合体および1以上の製薬的に許容できる担体を含む医薬組成物。
- 肺および/または腎臓特異的な治療複合体を特異的組織の脈管内皮細胞膜の管腔表面へ付着させるリガンドであって、配列番号4若しくは6またはそれらの類似物に結合する前記リガンド;
リンカー;および、
治療的部分、
を含む、標的化された内皮細胞と相互作用する肺および/または腎臓特異的な治療複合体であって、前記リンカーが前記リガンドを前記治療的部分に連結させている、前記治療複合体。 - リガンドが抗体または抗体の結合性部分である、請求項24記載の肺および/または腎臓特異的な治療複合体。
- リガンドがレセプターを活性化しない、請求項24記載の肺および/または腎臓特異的な治療複合体。
- 治療的部分が、少なくとも一つの医薬、少なくとも一つの遺伝子、少なくとも一つのアンチセンスオリゴヌクレオチド、少なくとも一つの化学療法物質、少なくとも一つの造影物質、少なくとも一つのタンパク質、少なくとも一つの毒性物質、少なくとも一つの放射性原子、およびそれらの混合物からなる群より選ばれる請求項24記載の肺および/または腎臓特異的な治療複合体。
- リンカーがpH感受性である、請求項24記載の肺および/または腎臓特異的な治療複合体。
- pH感受性リンカーがリガンドと治療的部分との間の酸感受性結合である、請求項28記載の肺および/または腎臓特異的な治療複合体。
- リンカーがリポソームである、請求項24記載の肺および/または腎臓特異的な治療複合体。
- リガンドがリポソームの外側にあり、治療的部分が前記リポソームの内側にある請求項30記載の肺および/または腎臓特異的な治療複合体。
- 治療的部分がプロドラッグを切断する酵素である、請求項24記載の肺および/または腎臓特異的な治療複合体。
- リンカーが酵素によって切断可能である、請求項24記載の肺および/または腎臓特異的な治療複合体。
- 少なくとも一つの医薬が免疫抑制物質である、請求項27記載の肺および/または腎臓特異的な治療複合体。
- 少なくとも一つの医薬が抗血栓物質である、請求項27記載の肺および/または腎臓特異的な治療複合体。
- 請求湖24記載の治療複合体を組織又は細胞にin vitroまたはin vivoで投与すること、および、結合した前記治療複合体を同定またはその量を定量すること、を含む、組織又は細胞におけるジペプチジルペプチダーゼIVの存在または濃度を決定する方法。
- 請求項24記載の肺および/または腎臓特異的な治療複合体および1以上の製薬的に許容できる担体を含む、医薬組成物。
- 膵臓および/または消化管特異的な治療複合体を特異的な組織の脈管内皮細胞膜の管腔表面へ付着させるリガンドであって、配列番号14若しくは16またはそれらの類似体に結合する前記リガンド;
リンカー;および、
治療的部分、
を含み、前記リンカーが前記リガンドを前記治療的部分に連結させている、標的化された内皮細胞と相互作用する膵臓および/または消化管特異的な治療複合体。 - リガンドが抗体または抗体の結合性部分である、請求項38記載の膵臓および/または消化管特異的な治療複合体。
- リガンドがレセプターを活性化しない、請求項38記載の膵臓および/または消化管特異的な治療複合体。
- 治療的部分が、少なくとも一つの医薬、少なくとも一つの遺伝子、少なくとも一つのアンチセンスオリゴヌクレオチド、少なくとも一つの化学療法物質、少なくとも一つの造影物質、少なくとも一つのタンパク質、少なくとも一つの毒性物質、少なくとも一つの放射性原子、およびそれらの混合物からなる群より選ばれる請求項38記載の膵臓および/または消化管特異的な治療複合体。
- リンカーがpH感受性である、請求項38記載の膵臓および/または消化管特異的な治療複合体。
- pH感受性リンカーがリガンドと治療的部分との間の酸感受性結合である、請求項42記載の膵臓および/または消化管特異的な治療複合体。
- リンカーがリポソームである、請求項38記載の膵臓および/または消化管特異的な治療複合体。
- リガンドがリポソームの外側にあり、治療的部分が前記リポソームの内側にある、請求項44記載の膵臓および/または消化管特異的な治療複合体。
- 治療的部分がプロドラッグを切断する酵素である、請求項38記載の膵臓および/または消化管特異的な治療複合体。
- リンカーが酵素によって切断可能である、請求項38記載の膵臓および/または消化管特異的な治療複合体。
- 少なくとも一つの医薬が抗生物質又は抗ウイルス物質である、請求項41記載の膵臓および/または消化管特異的な治療複合体。
- 少なくとも一つの医薬が抗血栓物質である、請求項41記載の膵臓および/または消化管特異的な治療複合体。
- 請求項38記載の治療複合体を組織又は細胞にin vivoまたはin vitroで投与すること、および、結合した前記複合体を同定またはその量を定量すること、を含む組織又は細胞におけるZG16-pの存在又は濃度を決定する方法。
- 請求項38記載の膵臓および/または消化管特異的な治療複合体および1以上の製薬的に許容できる担体を含む医薬組成物。
- 前立腺特異的な治療複合体を特異的な組織の脈管内皮細胞膜の管腔表面へ付着させるリガンドであって、配列番号23またはそれらの類似体に結合する前記リガンド;
リンカー;および、
治療的部分、
を含み、前記リンカーが前記リガンドを前記治療的部分に連結させている、標的化された内皮細胞と相互作用する前立腺特異的な治療複合体。 - リガンドが抗体または抗体の結合性部分である、請求項52記載の前立腺特異的な治療複合体。
- リガンドがレセプターを活性化しない請求項52記載の前立腺特異的な治療複合体。
- 治療的部分が、少なくとも一つの医薬、少なくとも一つの遺伝子、少なくとも一つのアンチセンスオリゴヌクレオチド、少なくとも一つの化学療法物質、少なくとも一つの造影物質、少なくとも一つのタンパク質、少なくとも一つの毒性物質、少なくとも一つの放射性原子、およびそれらの混合物からなる群より選ばれる請求項52記載の前立腺特異的な治療複合体。
- リンカーがpH感受性である、請求項52記載の前立腺特異的な治療複合体。
- pH感受性リンカーがリガンドと治療的部分との間の酸感受性結合である、請求項56記載の前立腺特異的な治療複合体。
- リンカーがリポソームである、請求項52記載の前立腺特異的な治療複合体。
- リガンドがリポソームの外側にあり、治療的部分が前記リポソームの内側にある請求項58記載の前立腺特異的な治療複合体。
- 治療的部分がプロドラッグを切断する酵素である、請求項52記載の前立腺特異的な治療複合体。
- リンカーが酵素によって切断可能である請求項52記載の前立腺特異的な治療複合体。
- 少なくとも一つの医薬が免疫抑制物質である、請求項55記載の前立腺特異的な治療複合体。
- 治療的部分が化学療法物質である、請求項52記載の前立腺特異的な治療複合体。
- 請求項52記載の治療複合体を組織又は細胞にin vitroまたはin vivoで投与すること、および、結合した前記治療複合体を同定またはその量を定量することを含む、組織又は細胞におけるアルブミン断片の存在又はその濃度を決定する方法。
- 請求項52記載の前立腺特異的な治療複合体および1以上の製薬的に許容できる担体を含む医薬組成物。
- 脳特異的な治療複合体を特異的な組織の脈管内皮細胞膜の管腔表面へ付着させるリガンドであって、配列番号26若しくは28またはそれらの類似体に結合する前記リガンド;
リンカー;および、
治療的部分、
を含み、前記リンカーが前記リガンドを前記治療的部分に連結させている、標的化された内皮細胞と相互作用する脳特異的な治療複合体。 - リガンドが抗体または抗体の結合性部分である、請求項66記載の脳特異的な治療複合体。
- リガンドがレセプターを活性化しない、請求項66記載の脳特異的な治療複合体。
- 治療的部分が、少なくとも一つの医薬、少なくとも一つの遺伝子、少なくとも一つのアンチセンスオリゴヌクレオチド、少なくとも一つの化学療法物質、少なくとも一つの造影物質、少なくとも一つのタンパク質、少なくとも一つの毒性物質、少なくとも一つの放射性原子、およびそれらの混合物からなる群より選ばれる請求項66記載の脳特異的な治療複合体。
- リンカーがpH感受性である、請求項66記載の脳特異的な治療複合体。
- pH感受性リンカーがリガンドと治療的部分との間の酸感受性結合である、請求項70記載の脳特異的な治療複合体。。
- リンカーがリポソームである、請求項66記載の脳特異的な治療複合体。
- リガンドがリポソームの外側にあり、治療的部分が前記リポソームの内側にある請求項72記載の脳特異的な治療複合体。
- 治療的部分がプロドラッグを切断する酵素である、請求項66記載の脳特異的な治療複合体。
- リンカーが酵素によって切断可能である、請求項66記載の脳特異的な治療複合体。
- 少なくとも一つの医薬が免疫抑制物質である、請求項69記載の脳特異的な治療複合体。
- 少なくとも一つの医薬が抗血栓物質である、請求項69記載の脳特異的な治療複合体。
- 請求項66記載の治療複合体を組織または細胞にin vitroまたはin vivoで投与すること、および、結合した前記治療複合体を同定またはその量を決定することを含む、組織または細胞におけるCD71(トランスフェリンレセプター)の存在又は濃度を決定する方法。
- 請求項66記載の脳特異的な治療複合体および1以上の製薬的に許容できる担体を含む医薬組成物。
- 膵臓および/または消化管特異的な治療複合体を特異的な組織の脈管内皮細胞膜の管腔表面へ付着させるリガンドであって、配列番号18若しくは20またはそれらの類似体に結合する前記リガンド;
リンカー;および、
治療的部分、
を含み、前記リンカーが前記リガンドを前記治療的部分に連結させている、標的化された内皮細胞と相互作用する膵臓および/または消化管特異的な治療複合体。 - リガンドが抗体または抗体の結合性部分である、請求項80記載の膵臓および/または消化管特異的な治療複合体。
- リガンドがレセプターを活性化しない、請求項80記載の膵臓および/または消化管特異的な治療複合体。
- 治療的部分が、少なくとも一つの医薬、少なくとも一つの遺伝子、少なくとも一つのアンチセンスオリゴヌクレオチド、少なくとも一つの化学療法物質、少なくとも一つの造影物質、少なくとも一つのタンパク質、少なくとも一つの毒性物質、少なくとも一つの放射性原子、およびそれらの混合物からなる群より選ばれる請求項80記載の膵臓および/または消化管特異的な治療複合体。
- リンカーがpH感受性である、請求項80記載の膵臓および/または消化管特異的な治療複合体。
- pH感受性リンカーがリガンドと治療的部分との間の酸感受性結合である、請求項84記載の膵臓および/または消化管特異的な治療複合体。
- リンカーがリポソームである、請求項80記載の膵臓および/または消化管特異的な治療複合体。
- リガンドがリポソームの外側にあり、治療的部分が前記リポソームの外側にある請求項86記載の膵臓および/または消化管特異的な治療複合体。
- 治療的部分がプロドラッグを切断する酵素である請求項80記載の膵臓および/または消化管特異的な治療複合体。
- リンカーが酵素によって切断可能である請求項80記載の膵臓および/または消化管特異的な治療複合体。
- 少なくとも一つの医薬が免疫抑制物質である請求項83記載の膵臓および/または消化管特異的な治療複合体。
- 少なくとも一つの医薬が抗血栓物質である請求項83記載の膵臓および/または消化管特異的な治療複合体。
- 請求項80記載の治療複合体を組織又は細胞にin vitroまたはin vivoで投与すること、および結合した前記治療複合体を同定またはその量を定量することを含む、組織または細胞におけるMAdCAMの存在または濃度を決定する方法。
- 請求項80記載の膵臓および/または消化管特異的な治療複合体および1以上の製薬的に許容できる担体を含む医薬組成物。
- 腎臓特異的な治療複合体を特異的な組織の脈管内皮細胞膜の管腔表面へ付着させるリガンドであって、配列番号30若しくは32またはそれらの類似体に結合する前記リガンド;
リンカー;および、
治療的部分、
を含み、前記リンカーが前記リガンドを前記治療的部分に連結させている、標的化された内皮細胞と相互作用する腎臓特異的な治療複合体。 - リガンドが抗体または抗体の結合性部分である、請求項94記載の腎臓特異的な治療複合体。
- リガンドがレセプターを活性化しない、請求項94記載の腎臓特異的な治療複合体。
- 治療的部分が、少なくとも一つの医薬、少なくとも一つの遺伝子、少なくとも一つのアンチセンスオリゴヌクレオチド、少なくとも一つの化学療法物質、少なくとも一つの造影物質、少なくとも一つのタンパク質、少なくとも一つの毒性物質、少なくとも一つの放射性原子、およびそれらの混合物からなる群より選ばれる請求項94記載の腎臓特異的な治療複合体。
- リンカーがpH感受性である、請求項94記載の腎臓特異的な治療複合体。
- pH感受性リンカーがリガンドと治療的部分との間の酸感受性結合である、請求項98記載の腎臓特異的な治療複合体。
- リンカーがリポソームである、請求項94記載の腎臓特異的な治療複合体。
- リガンドがリポソームの外側にあり、治療的部分が前記リポソームの内側にある請求項100記載の腎臓特異的な治療複合体。
- 治療的部分がプロドラッグを切断する酵素である、請求項94記載の腎臓特異的な治療複合体。
- リンカーが酵素によって切断可能である、請求項94記載の腎臓特異的な治療複合体。
- 少なくとも一つの医薬が化学療法物質である請求項97記載の腎臓特異的な治療複合体。
- 請求項94記載の腎臓特異的な治療複合体を組織又は細胞にin vitroまたはin vivoで投与すること、および結合した前記治療複合体を同定またはその量を定量することを含む、組織または細胞におけるCD90(Thy-1)の存在または濃度を決定する方法。
- 請求項94記載の腎臓特異的な治療複合体および1以上の製薬的に許容できる担体を含む医薬組成物。
- 治療的部分が化学療法物質である請求項52記載の前立腺特異的複合体を、癌細胞の数を低下させるために効果的な量で投与することを含む、前立腺癌を治療する方法。
- 化学療法物質がアンチセンスRNA、アポトーシス誘導タンパク質、ヌクレオチド類似物、放射活性分子、毒性物質、および他のいずれかの化学療法物質である請求項107記載の方法。
- 治療的部分が化学療法物質である請求項66記載の脳特異的治療複合体を癌細胞の数を低下させるために効果的な量で投与することを含む、脳腫瘍を治療する方法。
- 化学療法物質がアンチセンスRNA、アポトーシス誘導タンパク質、ヌクレオチド類似物、放射活性分子、毒性物質、および他のいずれかの化学療法物質である請求項109記載の方法。
- 治療的部分が抗血栓物質である請求項38記載の膵臓および/または消化管特異的治療複合体を血栓の量を低下させるために充分な量で投与することを含む、膵臓癌を治療する方法。
- 治療的部分が抗血栓物質である請求項80記載の膵臓および/または消化管特異的治療複合体を血栓の量を低下させるために充分な量で投与することを含む、膵臓癌を治療する方法。
- 治療的部分が免疫抑制物質である請求項94記載の腎臓および/または肺特異的な治療複合体を腎臓移植の拒絶を低減するに充分な量で投与することを含む、腎臓移植拒絶を治療する方法。
- 免疫抑制物質がコルチコステロイドまたはシクロスポリンである、請求項113記載の方法。
- 治療複合体の治療上効果的な量を投与することを含む、特異的な組織へ治療剤をデリバリーする方法であって、前記治療複合体が組織特異的管腔発現タンパク質に結合するリガンド、治療的部分、および前記治療的部分を前記リガンドに連結するリンカーを含み、前記組織特異的管腔発現タンパク質がCD71、CD90、MAdCAM、アルブミン断片、炭酸脱水素酵素IV、ZG16-pおよびジペプチジルペプチダーゼIVからなる群より選ばれる、前記方法。
- 物質を肺および/または心臓特異的にin vivoまたはin vitroデリバリーする方法であって、炭酸脱水素酵素IV結合因子を提供すること、および、前記炭酸脱水素酵素IV結合因子をin vivoまたはin vitroで投与することを含み、前記物質が前記炭酸脱水素酵素IV結合因子の投与の結果として肺および/または心臓にデリバリーされる、前記方法。
- 炭酸脱水素酵素IV結合因子が抗体、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、小分子および多糖からなる群より選ばれる、請求項116記載の方法。
- 物質が共有結合的にまたは非共有結合的に炭酸脱水素酵素IV結合因子に結合している、請求項116記載の方法。
- 物質が炭酸脱水素酵素IV結合因子とは別個に投与される、請求項116記載の方法。
- 物質が治療薬、造影物質、診断物質および毒性物質からなる群より選ばれる、請求項116記載の方法。
- 物質が炭酸脱水素酵素IV結合因子である、請求項116記載の方法。
- in vivo投与が注射、経口投与、エーロゾル投与、移植可能なポンプ、パッチおよびステントからなる群より選ばれる方法によって行われる、請求項116記載の方法。
- in vitro投与が移植される肺および/または心臓、または、肺および/または心臓組織への投与である、請求項116記載の方法。
- 炭酸脱水素酵素IV結合因子を同定することを含む、肺および/または心臓特異的リガンドを同定する方法。
- 同定が、抗体産生、コンビナトリアルライブラリースクリーニング、1−ハイブリッド技術、分子モデリング、および2-ハイブリッド技術からなる群より選ばれる方法によって行われる、請求項124記載の方法。
- CD71(トランスフェリンレセプター)結合因子を提供すること、および、前記CD71結合因子をin vivoまたはin vitroで投与することを含む、物質を脳特異的にin vivoまたはin vitroデリバリーする方法であって、前記物質が前記CD71結合因子の投与の結果として脳または脳組織へデリバリーされる、前記方法。
- CD71結合因子が抗体、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、小分子および多糖からなる群より選ばれる請求項126記載の方法。
- 物質が共有結合的または非共有結合的にCD71結合因子に結合している請求項126記載の方法。
- 物質がCD71結合因子と別個に投与される、請求項126記載の方法。
- 物質が治療薬、造影物質、診断物質および毒性物質からなる群より選ばれる請求項126記載の方法。
- 物質がCD71結合因子である請求項126記載の方法。
- in vivo投与が注射、経口投与、エーロゾル投与、移植可能なポンプ、パッチおよびステントからなる群より選ばれる方法によって行われる、請求項126記載の方法。
- in vitro投与が移植される脳または脳組織への投与である、請求項126記載の方法。
- CD71結合因子を同定することを含む、脳特異的リガンドを同定する方法。
- 同定が、抗体産生、コンビナトリアルライブラリースクリーニング、1−ハイブリッド技術、分子モデリング、および2-ハイブリッド技術からなる群より選ばれる方法によって行われる、請求項134記載の方法。
- CD90(Thy-1)結合因子を提供すること、および、前記CD90結合因子をin vivoまたはin vitroで投与することを含む、物質を腎臓特異的にin vivoまたはin vitroデリバリーする方法であって、前記物質が前記CD90結合因子の投与の結果腎臓または腎臓組織へデリバリーされる、前記方法。
- CD90結合因子が抗体、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、小分子および多糖からなる群より選ばれる請求項136記載の方法。
- 物質が共有結合的にまたは非共有結合的にCD90結合因子に結合している請求項136記載の方法。
- 物質がCD90結合因子とは別個に投与される、請求項136記載の方法。
- 物質が治療薬、造影物質、診断物質および毒性物質からなる群より選ばれる請求項136記載の方法。
- 物質がCD90結合因子である請求項136記載の方法。
- in vivo投与が注射、経口投与、エーロゾル投与、移植可能なポンプ、パッチおよびステントからなる群より選ばれる方法によって行われる、請求項136記載の方法。
- in vitro投与が移植される腎臓または腎臓組織への投与である、請求項136記載の方法。
- CD90結合因子を同定することを含む、腎臓特異的リガンドを同定する方法。
- 同定が、抗体産生、コンビナトリアルライブラリースクリーニング、1−ハイブリッド技術、分子モデリング、および2-ハイブリッド技術からなる群より選ばれる方法によって行われる、請求項144記載の方法。
- ジペプチジルペプチダーゼIV結合因子を提供すること、および前記ジペプチジルペプチダーゼ結合因子をin vivoまたはin vitroで投与することを含む、物質を肺および/または腎臓特異的にin vivoまたはin vitroデリバリーする用法であって、前記物質は前記ジペプチジルペプチダーゼIV結合因子の投与の結果として肺および/または腎臓へデリバリーされる、前記方法。
- ジペプチジルペプチダーゼIV結合因子が抗体、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、小分子および多糖からなる群より選ばれる請求項146記載の方法。
- 物質が共有結合的にまたは非共有結合的にジペプチジルペプチダーゼIV結合因子に結合している請求項146記載の方法。
- 物質がジペプチジルペプチダーゼIV結合因子と別個に投与される、請求項146記載の方法。
- 物質が治療薬、造影物質、診断物質および毒性物質からなる群より選ばれる請求項146記載の方法。
- 物質がジペプチジルペプチダーゼIV結合因子である、請求項146記載の方法。
- in vivo投与が注射、経口投与、エーロゾル投与、移植可能なポンプ、パッチおよびステントからなる群より選ばれる方法によって行われる、請求項146記載の方法。
- in vitro投与が移植される肺および/または腎臓、または、肺および/または腎臓組織への投与である、請求項146記載の方法。
- ジペプチジルペプチダーゼIV結合因子を同定することを含む、肺および/または腎臓特異的リガンドを同定する方法。
- 同定が抗体産生、コンビナトリアルライブラリースクリーニング、1−ハイブリッド技術、分子モデリング、および2-ハイブリッド技術からなる群より選ばれる方法によって行われる、請求項154記載の方法。
- ZG16-p結合因子を提供すること、および、前記ZG16-p結合因子をin vivoまたはin vitroで投与することを含む、物質を膵臓および/または消化管特異的にin vivoまたはin vitroデリバリーする方法であって、前記物質が前記ZG16-p結合因子の投与の結果として膵臓および/または消化管、または膵臓および/または消化管組織へデリバリーされる、前記方法。
- ZG16-p結合因子が抗体、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、小分子および多糖からなる群より選ばれる請求項156記載の方法。
- 物質が共有結合的にまたは非共有結合的にZG16-p合因子に結合している請求項156記載の方法。
- 物質がZG16-p結合因子と別個に投与される、請求項156記載の方法。
- 物質が治療薬、造影物質、診断物質および毒性物質からなる群より選ばれる請求項156記載の方法。
- 物質がZG16-p結合因子である請求項161記載の方法。
- in vivo投与が注射、経口投与、エーロゾル投与、移植可能なポンプ、パッチおよびステントからなる群より選ばれる方法によって行われる、請求項156記載の方法。
- in vitro投与が移植される膵臓および/または消化管、または、膵臓および/または消化管組織への投与である、請求項156記載の方法。
- ZG16-p結合因子を同定することを含む、膵臓および/または消化管特異的離岸度を同定する方法。
- 同定が、抗体産生、コンビナトリアルライブラリースクリーニング、1−ハイブリッド技術、分子モデリング、および2-ハイブリッド技術からなる群より選ばれる方法によって行われる、請求項164記載の方法。
- MAdCAM結合因子を提供すること、および、in vivoまたはin vitroで前記MAdCAM結合因子を投与することを含む、物質を膵臓および/消化管特異的にin vivoまたはin vitroデリバリーする方法であって、前記物質が前記MAdCAM結合因子の投与の結果として膵臓および/または消化管へデリバリーされる、前記方法。
- MAdCAM結合因子が、抗体、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、小分子および多糖からなる群より選ばれる、請求項166記載の方法。
- 物質が共有結合的にまたは非共有結合的にMAdCAM結合因子に結合している、請求項166記載の方法。
- 物質がMAdCAM結合因子と別個に投与される、請求項166記載の方法。
- 物質が治療薬、造影物質、診断物質および毒性物質からなる群より選ばれる請求項166記載の方法。
- 物質がMAdCAM結合因子である、請求項166記載の方法。
- in vivo投与が注射、経口投与、エーロゾル投与、移植可能なポンプ、パッチおよびステントからなる群より選ばれる方法によって行われる、請求項166記載の方法。
- in vitro投与が移植される膵臓および/または消化管または膵臓および/または消化管組織への投与である、請求項166記載の方法。
- MAdCAM結合因子を同定することを含む、膵臓および/または消化管特異的リガンドを同定する方法。
- 同定が、抗体産生、コンビナトリアルライブラリースクリーニング、1−ハイブリッド技術、分子モデリング、および2-ハイブリッド技術からなる群より選ばれる方法によって行われる、請求項174記載の方法。
- アルブミン断片結合因子を提供すること、および、前記アルブミン断片結合因子をin vivoまたはin vitroで投与することを含む、物質を前立腺特異的にin vivoまたはin vitroデリバリーする方法であって、前記物質が前記アルブミン断片結合因子の投与の結果前立腺または前立腺組織へデリバリーされる、前記方法。
- アルブミン断片結合因子が、抗体、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、小分子および多糖からなる群より選ばれる請求項176記載の方法。
- 物質が共有結合的または非共有結合的にアルブミン断片結合因子に結合している、請求項176記載の方法。
- 物質がアルブミン断片結合因子と別個に投与される、請求項178記載の方法。
- 物質が、治療薬、造影物質、診断物質および毒性物質からなる群より選ばれる請求項176記載の方法。
- 物質がアルブミン断片結合因子である、請求項176記載の方法。
- in vivo投与が注射、経口投与、エーロゾル投与、移植可能なポンプ、パッチおよびステントからなる群より選ばれる方法によって行われる、請求項176記載の方法。
- in vitro投与が移植される前立腺または前立腺組織への投与である、請求項176記載の方法。
- アルブミン断片結合因子を同定することを含む、前立腺特異的リガンドを同定する方法。
- 同定が、抗体産生、コンビナトリアルライブラリースクリーニング、1−ハイブリッド技術、分子モデリング、および2-ハイブリッド技術からなる群より選ばれる方法によって行われる、請求項184記載の方法。
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