JPH08508713A

JPH08508713A - 動物における特異的標的細胞へのエフェクター基の増幅的な方向づけ

Info

Publication number: JPH08508713A
Application number: JP6517239A
Authority: JP
Inventors: アミンアイ．カスィス、
Original assignee: プレズデントアンドフェロウズオブハーヴァードカレッジ
Priority date: 1993-01-21
Filing date: 1994-01-21
Publication date: 1996-09-17
Also published as: EP0680340A1; IL108388A0; AU6126794A; WO1994016734A1; CA2154471A1

Abstract

(57)【要約】ヒトを含めた動物における癌細胞などの生きている特異的細胞またはその成分を標的とし、一定のエフェクター分子をそれに対して方向づけること。本発明の方法では、特異的な結合対を順次形成して、エフェクター分子を増幅した形で特定の標的細胞に向かわせる。特異的結合対を形成する場合には、最初は標的細胞上の標的分子と第１試薬とで結合対を作る。この特異的結合対は、標的分子および第１試薬上の第１の官能基との間の特異的結合の結果として生じる。連続的な特異的結合対は、次いで第１試薬と第２試薬、第２試薬と第３試薬、等々というように形成される。これらの連続的な特異的結合対は、各試薬に第２の官能基があり、それが一連の順序の中で次にくる試薬に存在する第１の官能基と特異的に結合することによってなされる。各試薬上の第１および第２の官能基は多価なので、増幅が生じる。一般に、一連の順序の一番最後の試薬には第１の官能基はあるが、第２の官能基の位置にエフェクター基がある。エフェクター基は、診断マーカーまたは治療用分子のいずれでもよい。

Description

【発明の詳細な説明】動物における特異的標的細胞へのエフェクター基の増幅的な方向づけ発明の背景発明の分野本発明は、モノクローナル抗体など特異的結合分子の診断および治療への利用を最適化することに関する。より具体的には、本発明は、エフェクター基を増幅する形でヒトを含めた動物における特異的標的細胞に向かわせるのにこのような分子を利用することに関する。関連技術の説明モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、それぞれの抗原に対して高い特異性、ならびに高い親和性または結合活性あるいはその両者を有する。そのために、ゴールデンベルグら（New England J．Med．298巻 1384〜1386頁（1978年））、マッハら（Immunol．Today 2巻 239〜249頁（1981年））、およびエッパネートス（Lan cet 2巻 999〜1006頁（1982年））は、診断薬または毒性のある試薬あるいはその両者を選択的に運ぶものとしてＭＡｂに特に注目している。ゴースおよびブレール（J．Natl．Cancer Inst．61巻 657〜676頁（1978年））、エッケルマンら（Cancer Res．40巻 3036〜3042頁（1980年））、プレスマン（Canc er Res．40巻 2960〜2964頁（1980年））をはじめとする多くの研究が、たとえば^99mＴｃまたは¹¹¹Ｉｎを使ったヒトにおける診断へのＭＡｂの利用、あるいは¹³¹ Ｉ、¹⁸⁶Ｒｅ、⁹⁰Ｙ、¹⁶⁵Ｄｙ、⁶⁷Ｃｕ、または¹⁰⁹Ｐｄなどのβ放射体もしくは²¹¹Ａｔまたは²¹²Ｂｉなどのα放射体を使ったヒトの治療におけるＭＡｂの利用について明らかにしている。ただしごく最近では、標的組織１ｇあたりの最大注入量の比率が小さいこと、クリアランスが遅いこと、腫瘍内での分布が不均一であることなどの問題があることから、フィッシュマンら（J．Nucl．Med．30巻 1911〜1915頁（1989年））をはじめとして、放射免疫診断および放射免疫治療におけるＭＡｂの将来に対して疑問を投げかけている者もいる。さらに、ＭＡｂに直接放射標識するとその構造、電荷の免疫学的機能、生体内分布の動力学、および標的能力に非可逆的な悪い影響を及ぼすことがある。ベイジャーらはCancer Res．45巻 1536〜1544頁（1985年）で、ＭＡｂ１分子あたりに２つ以上のヨウ素原子があると、ＭＡｂの血流中の生物学的滞留時間およびＭＡｂの免疫学的機能に深刻な変化が生じうることを明らかにしている。遠藤らはJ．Immunol．Methods 104巻 243〜248頁（1987年）で、ＭＡｂのアミノ基にごく少数の薬物分子を結合させたときでも、その抗原結合能力が低下しうることを示している。このような限界があることから、ＭＡｂの構造の完全性を保つ、よりよい標識方法、ならびにどのＭＡｂ分子の構造的完全性の維持にもそれほど依存しないような標的に向かわせる方法が必要であることは明かである。これらの要求を満たすために様々な方法がとられてきている。グッドウィンらはJ．Nucl．Med．29巻 226〜234頁（1988年）に、キレート化¹¹¹Ｉｎを標識として使用し、しかも、標的腫瘍関連抗原に向けられたひとつの結合価と、¹¹¹Ｉ−キレートに向けられた他の結合価とを有する２官能性抗体とを結合して使用することを開示している。パガネリらは、Int．J．Cancer 2巻 121空125頁（1988年）で、ビオチニル化した抗体とともに検出可能なマーカーとして放射標識アビジンを利用することを明らかにしている。カウリらは、J．Nucl．Med．29巻 923頁（1988年）に、放射性ビオチン誘導体マーカーとともにアビジン複合抗体を利用することを開示している。しかしながらこれらの方法にも短所があることわかっている。たとえば、ガーリックおよびギースはJ．Biol．Chem．263巻 210〜215頁（1988年）で、ある放射標識ビオチン誘導体ではアビジンに対する親和性が小さくなることを明らかにしている。したがって、使用するあらゆるＭＡｂ分子の構造が厳密に完全であることを要しない方法で、エフェクター分子を特異的標的細胞に向かわせる新しい方法が必要となる。できればこのような方法では、各標的細胞に複数のエフェクター分子が向けられるようにすることが望ましい。発明の簡単な概要本発明は、ヒトを含めた動物における癌細胞などの生きている特異的細胞またはそれらの成分を標的とし、一定のエフェクター分子をそれに対して向かわせることに関する。本発明の方法では、特異的な結合対を順次形成して、エフェクター分子を増幅した形で特定の標的細胞に向かわせる。特異的結合対を形成するには、最初に、標的細胞上の標的分子と第１試薬とで結合対を作る。この特異的結合対は、標的分子および第１試薬上の第１の官能基の間との特異的結合の結果としてできる。ついで、連続的な特異的結合対が、第１試薬と第２試薬との間、第２試薬と第３試薬との間、等々というように形成される。これらの連続的な特異的結合対は、各試薬に第２の官能基があり、それが一連の順序の中で次にくる試薬に存在する第１の官能基と特異的に結合することによって形成される。各試薬上の第１および第２の官能基は多価なので、増幅が生じる。一般に、一連の順序における一番最後の試薬では第１の官能基があり、第２の官能基のかわりにエフェクター基がある。エフェクター基には、診断マーカーまたは治療用分子のいずれでもよい。図面の簡単な説明図１は、本発明に従った方法で、診断用エフェクター基を使って第３試薬の段階まで実行することで形成される結合複合体を示す。この図で、Ｔは標的細胞、Ｃは標的細胞上の化学成分、Ｆ１は第１の官能基、Ｆ２は第２の官能基、Ｎは核種、また円内の番号１、２および３は、それぞれ第１、第２、第３試薬を表す。黒丸は特異的結合を、また試薬から伸びている直線は共有結合型結合を示す。図２は、本発明に従った方法で、治療用エフェクター基を使って第３試薬の段階まで実行することで形成される結合複合体を示す。記号は図１の場合と同じ。ただし、Ｒは放射性核種を示す。図３は、本発明に従った方法の実施例で形成される結合複合体で、治療薬が第３試薬上のエフェクター基であり、また結合複合体形成後に第３試薬から当該薬を放出させることのできる酵素を投与するものを示す。左図は酵素を添加する前の結合複合体、右図はその後の結合複合体およびその近傍。記号は図１の場合と同じ。ただしＤは治療薬、円内のＥは第３試薬から薬を放出させることのできる酵素を示す。図４は、本発明に従った方法の実施例で形成される結合複合体で、特異的な不活性状態のプロドラッグを活性状態の薬に変換するのを触媒する酵素が第３試薬に結合され、また結合複合体の形成後に特異的プロドラッグを添加するものを示す。記号は図１と同じ。ただし、円内のＰは不活性プロドラッグ、Ｄは活性型薬剤を示す。発明の詳細な説明本発明は、様々な疾患にかかった動物において、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）およびその他の特異的結合リガンドを最適な状態で診断的および治療的に利用する方法に関する。より詳細には、本発明はヒトを含めた動物において癌細胞などの生きている細胞またはそれらの成分を標的として特定のエフェクター分子をそれに向かわせる方法に関する。本発明に従った方法には、特異的細胞を標的としてエフェクター分子をそれに向かわせるための方法として現在利用できるものに比べて一定の長所がある。まず第１に、この方法は、どの抗体分子の免疫的完全性が保存されていることにはそれほど大きくは依存しない。それというのも、投与した第１試薬のかなりの部分を消耗してしまえるからである。化学的操作を行っている間にすでにダメージを受けているこの第１試薬は、標的との結合を行いやすくするだけであり、動物の循環血液からは一掃されてしまう。第１試薬は高価なあるいは有毒なエフェクター物質を運ばないので、飽和レベルで投与することができる。こうするとその標的内における分布の均一性がさらに増大するという付加的な利点もある。最後に、第１試薬はそれがマウスＭＡｂである場合には、エフェクター分子を運ばないので、ＨＡＭＡ反応を通じてエフェクター基を含有する免疫複合体の形成を回避できる。様々な実施例において、本発明の方法ではヒトを含む動物における個々の標的細胞または細胞成分を標的として、これにエフェクター分子を増幅した形で向かわせるために、特異的結合対の連続的な形成を利用する。これらの様々な実施例では、最初の特異的結合対は細胞上の標的分子と、当該標的分子に特異的に結合する第１の官能基を有する第１試薬との間で形成される。好ましい実施例では、第１試薬は抗体で、特にモノクローナル抗体が望ましく、これが細胞上の標的分子と特異的に結合し、第１の官能基は抗原結合部位となる。ただし、当業者であれば、リガンドやレセプターなどの特定の標的分子はそれぞれに対応するレセプターまたはリガンドと特異的に結合することができ、したがってそのような各々のレセプターまたはリガンドは、第１の官能基であるリガンドやレセプター結合部位を有する第１試薬として受け入れられることがわかるだろう。第１試薬が抗体、レセプター、またはリガンドのいずれであれ、それは第２の官能基を、好ましくは共有結合により結合し、その第２の官能基によって第１試薬は第２試薬と特異的結合対を形成することができる。本発明による様々な第１試薬における好ましい第２の官能基としては、二本鎖オリゴヌクレオチド（ＤＳＯ）、ビオチニル化ＤＳＯ（ＢＮ−ＤＳＯ）、アビジン結合ＤＳＯ（ＡＶ−ＤＳＯ）、一本鎖オリゴヌクレオチド結合ＤＳＯ（ＳＳＯ−ＤＳＯ）、ビオチニル化ＳＳＯ（ＢＮ−ＳＳＯ）、ＤＮＡインターカレーター（ＩＮＴ）、ビオチニル化ＩＮＴ（ＳＳＯ−ＩＮＴ）、ペプチド、蛋白質または炭水化物と結合するかさもなければ多量体となっているビオチン（ＢＮ）、アビジン（ＡＶ）、一本鎖オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）、およびアビジン結合ＳＳＯ（ＡＶ−ＳＳＯ）が挙げられる。これらの官能基びその特異的結合の相手を下記の表Ｉに示す。様々な実施例で、本発明に従った試薬は、一緒に直接結合する第１および第２の官能基またはエフェクター基を有することがあり、それらがヒト血清アルブミンなど別の分子、あるいはその他の非抗原性分子を介して結合することもある。本発明に従った方法の様々な実施例では、第１試薬を動物に、好ましくは非経口的に投与し、細胞上の標的分子と特異的結合対を形成できるようにし、この標的分子と第１試薬の第１の官能基とを特異的に結合させる。標的分子とまだ特異的結合対を形成しておらず、しかも体内からまだ排泄されていない第１試薬は、動物の循環血液中にある。本発明の方法のこうした様々な実施例では、その後に、動物に第２試薬が投与される。第２試薬の投与では、それを投与する時点で循環血液中に残っている第１試薬の量を（モル単位で）超える量の第２試薬を使用するのが好ましい。第２試薬は第１試薬と特異的結合対を形成し、その第１試薬は細胞上の標的分子に結合する。第１試薬および第２試薬が特異的結合対を形成する能力は、次のような形で生じる。第１試薬の第２の官能基は、たとえば表Ｉの左側の欄に挙げられている官能基の中から選択される。第２試薬の第１の官能基は、たとえば表Ｉの右側の欄に挙げられている官能基の中から選ぶが、この官能基には表Ｉに示したように第１試薬の第２の官能基が特異的に結合する。したがって、第１試薬の第２の官能基は第２試薬の第１の官能基と特異的に結合し、その結果として第１試薬と第２試薬との間に特的結合対が形成される。本発明に従った方法の一実施例では、第２試薬に第２の官能基はないが、エフェクター基を有している。エフェクター基は診断機能または治療機能のいずれかを有することができる。たとえば、本発明に従った方法で有用な診断用エフェクター基としては、核種および放射性核種がある。本発明に従った方法で有用な治療用エフェクター基としては、治療用酵素、薬剤、毒素、放射性核種、核種、プロドラッグを活性状態の薬剤に変換するのを触媒する酵素、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドがある。この実施例では、第２試薬に第１試薬と特異的結合対を形成させてから動物に第３試薬を最適状態で投与し、第３試薬の量がその投与時点で動物の循環血液中に残っている第２試薬の量を超えるように投与することができる。第２試薬のエフェクター基が薬剤、治療用酵素、毒素、放射範囲が短い放射性核種、あるいはアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合には、この第３試薬はエフェクター基と第２試薬との間の化学結合を切断することのできる酵素である。第２試薬のエフェクター基が、プロドラッグを活性状態の薬剤に変換するのを触媒することのできる酵素であれば、第３試薬は当該酵素の基質であるプロドラッグである。別の実施例では、第２試薬は、第３試薬と特異的結合対を形成することができるようにする第２の官能基を有している。第２試薬の第２の官能基は、たとえば表Ｉの左側の欄に挙げた官能基から選択される。本発明に従った方法のさらに別の実施例では、上記のような方法で実施されるが、第３試薬と特異的結合対を形成できるようにする第２の官能基が第２試薬にあるような別の実施例で行う。第２試薬が第１試薬と特異的結合対を形成した後に第３試薬を、好ましくは非経口的に動物に投与し、その際、第３試薬の合計量が、その投与時点で動物の循環血液中に残っている第２試薬の合計量を超えるように投与する。第３試薬は、第２試薬の第２の官能基と特異的に結合する第１の官能基があるので、第３試薬は第２試薬と特異的結合対を形成することができる。この第３試薬の第１の官能基は、たとえば表Ｉの右側の欄に挙げた官能基から選択することができ、表Ｉに示すように第２試薬の第２の官能基と特異的に結合するように選択される。本発明に従った方法の一実施例では、第３試薬は第２の官能基はないが、エフェクター基を有している。エフェクター基は診断機能または治療機能のいずれかを有することができる。たとえば、本発明に従った方法で有用な診断用エフェクター基としては、核種および放射性核種がある。本発明に従った方法で有用な治療用エフェクター基としては、治療用酵素、薬剤、毒素、放射性核種、核種、プロドラッグを活性状態の薬剤に変換するのを触媒する酵素、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドがある。この実施例では、第２試薬に第１試薬と特異的結合対を形成させてから任意選択的に動物に第４試薬を投与し、第４試薬の量がその投与時点で動物の循環血液中に残っている第３試薬の量を超えるように投与することができる。第３試薬のエフェクター基が薬剤、毒素、放射範囲が短い放射性核種、治療用酵素、あるいはアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合には、この第４試薬はエフェクター基と第３試薬との間の化学結合を切断することのできる酵素であり、それによってエフェクター基を放出する。第３試薬のエフェクター基が、プロドラッグを活性状態の薬剤に変換するのを触媒することのできる酵素であれば、第４試薬は当該酵素の基質であるプロドラッグである。別の実施例では、第３試薬は、第４試薬と特異的結合対を形成することができるようにする第２の官能基を有している。第３試薬の第２の官能基は、たとえば表Ｉの左側の欄に挙げた官能基から選択される。この実施例では、第３試薬が第２試薬と特異的結合対を形成した後に第４試薬を、好ましくは非経口的に動物に投与し、その際、第４試薬の合計量が、その投与時点で動物の循環血液中に残っている第３試薬の合計量を超えるように投与する。第４試薬は、第３試薬の第２の官能基と特異的に結合する第１の官能基があるので、第４試薬は第３試薬と特異的結合対を形成することができる。この第４試薬の第１の官能基は、たとえば表Ｉの右側の欄に挙げた官能基から選択することができ、表Ｉに示すように第３試薬の第２の官能基と特異的に結合するように選択される。本発明に従った方法の一実施例では、第４試薬は第２の官能基はないが、エフェクター基を有している。この実施例では、第４試薬に第３試薬と特異的結合対を形成させてから任意選択的に動物に第５試薬を投与し、第５試薬の量がその投与時点で動物の循環血液中に残っている第４試薬の量を超えるように投与することができる。第４試薬のエフェクター基が薬剤、毒素、放射性核種、核種、治療用酵素、あるいはアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合には、この第５試薬はエフェクター基と第４試薬との間の化学結合を切断することのできる酵素であり、それによってエフェクター基を放出する。第４試薬のエフェクター基が、プロドラッグを活性状態の薬剤に変換するのを触媒することのできる酵素であれば、第５試薬は当該酵素の基質であるプロドラッグである。別の実施例では、第４試薬は、第５試薬と特異的結合対を形成することができるようにする第２の官能基を有している。第４試薬の第２の官能基は、たとえば表Ｉの左側の欄に挙げた官能基から選択される。この実施例では、第４試薬が第３試薬と特異的結合対を形成した後に第５試薬を、好ましくは非経口的に動物に投与し、その際、第５試薬の合計量が動物の循環血液中に残っている第４試薬の合計量を超えるように投与する。第５試薬は、第４試薬の第２の官能基と特異的に結合する第１の官能基があるので、第５試薬は第４試薬と特異的結合対を形成することができる。この第５試薬の第１の官能基は、たとえば表Ｉの右側の欄に挙げた官能基から選択することができ、表Ｉに示すように第４試薬の第２の官能基と特異的に結合するように選択される。本発明に従った方法の一実施例では、第５試薬は第２の官能基はないが、エフェクター基を有している。別の実施例では、第５試薬は、さらに追加される試薬と特異的結合対を形成することができるようにする第２の官能基を有している。当業者であれば、ここに述べたタイプの官能基およびエフェクター基を使って、この増幅システムを第５試薬よりもさらに拡張して多数の試薬を含めることができることが理解できるだろう。上に挙げた本発明に従った方法のどの実施例でも、方法のポイントとなるのは診断用または治療用のエフェクター分子を標的細胞の近傍に向かわせることである。本発明に従った方法は、標的細胞の近傍に信号を作り出し、かつそれを増幅する。信号は、検出可能な化学成分、またはエフェクター分子などさらに別の化学成分によって特異的に結合されうる化学成分を標的細胞に特異的に結合させることによって作り出される。信号は、本発明の方法で使用する試薬上にこの化学成分のコピーを多数作ることによって増幅される。図１に、診断用エフェクター基を使用したこのような信号の作り出しおよび増幅の例を示す。この図では、標的細胞Ｔには化学成分Ｃがあり、この成分が第１試薬１の第１の官能基Ｆ１と特異的に結合する。それから、第１試薬の第２の官能基Ｆ２の複数のコピーは、第２試薬２の第１の官能基Ｆ１と特異的に結合する。同様に、第２試薬の第２の官能基Ｆ２は第３試薬３の第１の官能基Ｆ１と結合し、この第３試薬には複数の検出可能核種が付着されている。信号Ｃは検出可能信号Ｎにすでに変換されているので、信号が作り出される。その信号はすでに増幅されている。というのも、この場合には信号Ｃの単一コピーが信号Ｎの多数のコピーで置き換えられているからである。図２に示すように、このシステムは治療用エフェクター分子、この場合には治療用放射核種Ｒに対して使っても同等によく機能する。このような利用法では、多くの治療用エフェクター基が標的細胞の近傍にもたらされる。たとえば標的細胞が癌細胞の場合、エフェクター基、すなわちこの場合には放射性核種の濃度がこのように高いと、標的となる癌細胞を殺せる確率が大いに高まる。その他の例では、最終エフェクター基は、標的細胞に付着する結合複合体の一部ではない外部の分子により働きかけられることが望ましい。たとえば図３に示す例では、エフェクター基は化学療法薬Ｄであるが、これは試薬３から放出され、標的細胞Ｔ、この場合には癌細胞によって取り込まれなければならない。最初の癌細胞の近傍に薬剤のコピー多数を送っておくと、試薬から当該薬を放出できる酵素が提供されるので、癌細胞近傍に薬剤が高濃度で集中する。この代わりに、図４に示すように、プロドラッグを活性状態の薬剤に変換するのを触媒することのできる酵素を最終試薬に結合させることによって、標的細胞近傍に集中して薬剤を高濃度で与えることもできる。この図では、酵素Ｅは第３試薬３に結合されており、標的細胞Ｔの近傍においてのみ不活性状態のプロドラッグＰは活性状態の薬剤Ｄに変換される。本発明の説明にあたっては、以下の用語を次に示す意味で用いる。特異的結合対とは、少なくとも互いに１０⁶/モル以上の結合親和力を有する化学成分の対のことで、約１０¹⁵/モルを超える親和力のものも含む。この範囲に該当する例としては、結合親和力が約１０⁶/モルである特異的結合対ＤＳＯ−ＩＮＴ、および結合親和力が少なくとも１０¹⁵/モル以上であるＡＶ−ＢＩＯがある。この範囲内の特異的結合対は、前出の表Ｉに示したとおりである。本発明における特異的結合とは、親和力が少なくとも約１０⁶/モル以上の２つの化学成分間の結合のことで、親和力が約１０¹⁰/モルを超えるものも含む。本発明における第１試薬とは、標的細胞上の化学成分に特異的に結合する分子のことである。このような第１試薬の例としては、細胞表面の抗原と特異的に結合する抗体、細胞表面のレセプターと特異的に結合するリガンド、および細胞表面のリガンドと特異的に結合するレセプターがある。「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、あるいはそれらのフラグメントのことを言い、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）₂’およびＦ（ｖ）フラグメントも含む。このような第１試薬には、標的細胞の化学成分と特異的に結合する第１の官能基、および第２試薬と特異的に結合する第２の官能基がある。官能基とは、標的細胞上の化学成分と第１試薬との間、あるいは第１試薬と第２試薬との間、第２試薬と第３試薬もしくはエフェクター細胞との間などにおける特異的結合を媒介する化学成分のことである。ここで述べるように、第１試薬の第２の官能基は第２試薬の第１の官能基と特異的に結合し、第２試薬に第２の官能基があれば、それは第３試薬の第１の官能基もしくはエフェクター細胞と特異的に結合し、また第３試薬に第２の官能基があれば、それは第４試薬の第１の官能基またはエフェクター細胞と特異的に結合するというように続いていく。すべての試薬が多価であることが望ましい。すなわち、第１および第２の官能基のコピーを複数有していることが望ましく、ただし一定の好ましい第１試薬は１ないし２個の第１の官能基を持つものでよい。好ましい官能基を、表Ｉの左側の欄に示す。第２、第３、第４、第５、等々の試薬は、第１の官能基だけで、第２の官能基の代わりにエフェクター基を有していてもよい。エフェクター基とは、標的細胞部位もしくはその近くで試薬に治療機能もしくは診断機能をもたらす化学成分である。診断機能をもたらすエフェクター基としては、ＭＲＩで検出可能なガドリニウムおよびフッ素などの核種、ＰＥＴで検出可能な陽電子放射体などの放射性核種（たとえば炭素-11、酸素-15、フッ素-18）、および断層撮影で検出可能な γ放射体（たとえば、テクネチウム-99、ヨウ素-123、ヨウ素-131、ガリウム-67、インジウム-111）がある。治療機能をもたらすエフェクター基としては、薬剤、毒素、放射性核種、治療用酵素および蛋白、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびプロドラッグを活性状態の薬剤に変換するのを触媒できる酵素がある。薬剤としては一般に使われている化学療法剤および抗生物質があるが、これらに限定されない。治療用酵素および蛋白質としては、組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼおよびヒト・デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）があるが、これらに限定されない。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、すでに公知の結合や修飾体であるヌクレアーゼ抵抗性のヌクレオチド間結合、中でもホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、ホスホルアミデート、およびホスホトリエステルの結合を有するオリゴヌクレオチドがある。プロドラッグを活性状態の薬剤に変換するのを触媒できる酵素としては、フェニルアラニンに結合したメトトレキセートの結合を切断して活性状態のメトトレキセートをもたらすカルボキシペプチダーゼ−１９、グルタミン酸に結合したビス・クロロ安息香酸マスタードの結合を切断して活性化状態のマスタードをもたらすカルボキシペプチダーゼＧ２、デスアセチルビンブラスチンヒドラジドに結合したセファロスポリン２０の結合を切断するＢ−ラクタマーゼ、およびマイトマイシンおよびエトポシドなどリン酸化された抗癌剤を脱リン酸化する（そのようにして活性化する）アルカリホスファターゼがある。以下に挙げる実施例は、本発明の一定の好ましい実施態様を詳しく示したものであり、これらに限定しようとするものではない。実施例１第２の官能基としてビオチンを有する第１試薬の調製糖蛋白質ＴＡＧ７２と盛んに反応するＩｇＧ₁抗体である抗ヒト乳癌ＭＡｂＢ７２．３は、それを産生するハイブリドーマ細胞系（ＡＴＣＣＭＢ８１０８）をＭｉｎｉＦｌｏ−Ｐａｔｈ^TMバイオリアクター（Amicon，Danvers，MA）においてインビトロで培養して得られる。このＭＡｂを０．１ＭＮａＨＣＯ₃ 、０．２ＭＮａＣｌ（ｐＨ８．５）に溶解して濃度を２ｍｇ／ｍｌにする。ビオチニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Sigma，St．Louis，MA）を２〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度でジメチルホルムアミドに溶解し、５〜２５μｌをとってＭＡｂ溶液に加え、撹拌せずに室温で１時間静置する。それから混合物を１晩かけて０．１５ＭＮａＣｌを時々取り替えながら透析し、最後にリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で透析してから分割し、−２０℃で凍結保存する。ＭＡｂは１分子あたりおよそ１〜２０のビオチン基と結合している。実施例２第２の官能基としてＤＮＡインターカレーターを有する第１試薬の調製ＩｇＧ試料（１〜１０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０）上の炭水化物成分に、過ヨウ素酸ソーダ（１００〜２００μｇを水１００〜２００μｇに溶解）をＡｂ：過ヨウ素酸の分子比が１：１５となるように加えて酸化した。混合液を氷上に９０分間静置し、酸化したＩｇＧをＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラムで移動させた。空隙容量内の内容物に対して臭化エチジウム（１ｍｇ／ｍｌ水溶液４００μｌ）を加え、混合液を室温で暗所に４日間静置する。この間、ソディウムシアノボロハイドライド（Ｉｍｇ／ｍｌ水溶液）を４時間おいて２回に分けて加えた（シアノボロハイドライドとエチジウムのモル比は１：１）。それから試料をＧ−２５で濾過する（溶出緩衝液２５ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．３）。ＢＣＡ試薬（Pierce）を使って蛋白質を測定し、同時に４８０ｎｍで吸光度を測定して結合エチジウムを分析する。最後に、１５μｇの仔ウシ胸腺ＤＮＡ存在下で試料の蛍光強度を測定して、結合エチジウムのＤＮＡ挿入能を明らかにした（発光波長５２０ｎｍ、励起波長５９０ｎｍ）。このデータから、ＩｇＧにエチジウムを（１００：１のモル比で）加えると、ＩｇＧ１モルあたりエチジウム３０モルが結合することがわかる。さらに、エチジウム−ＩｇＧ結合体の蛍光信号は、仔ウシ胸腺ＤＮＡ存在下では３〜４倍に増大し、結合エチジウムのＤＡＮ挿入能がわかる。実施例３第１および第２の官能基としてＤＳＯを有する試薬の調製ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Sigma，St．Louis，MO）を、以下のようにして消化し、７ＣＮＢｒフラグメントを生成すた。まずＨＳＡ１００ｍｇを、６Ｍグアニジン−ＨＣｌおよび０．１％ＥＤＴＡを含有する０．５Ｍトリエタノールアミン酢酸緩衝液（ｐＨ８．１）１０ｍｌ中で、５０℃で３０分間変性させ、それからジチオトレイトール（ＤＴＴ）２００ｍｇを加えて還元し、５０℃で４時間インキュベートする。次いでヨードアセトアミドを加えて最終濃度を２６０ｍＭにし、蛋白質をアルキル化し、混合ジスルフィドの生成を防ぐ。その後、暗所で室温で２０分間反応を進めてから、過剰のＤＴＴを加えて反応を停止させる。反応混合液を蒸留水で透析し、窒素で飽和した７０％ギ酸および１００ｍｇの臭化シアン（ＣＮＢｒ）存在下で１晩、４℃でインキュベートし、ＨＳＡ−ｆ（７フラグメント）を生成させ、それを事前に平衡化したＴＳＫＧ３００ＳＷカラム（0.75×60ｃｍ）を使ったＨＰＬＣで分離し、３５％ＣＨ₃ＣＮの０．１％トリフルオロ酢酸溶液で流速１ｍｌ／分で溶出する。相補的４０量体オリゴヌクレオチド・ホスホロチオエート鎖２本を、Ｍｏｄｅｌ８７００自動合成装置（Mi lligen-Biosearch，Burlington，MA）で、一定細孔ガラス（ＣＰＧ）上のＨ−ホスホネート化学を利用して調製してから、二硫化炭素／ピリジン／トリエチルアミン（９：９：１、ｖ／ｖ）中で０．２Ｍ硫黄で酸化する。合成は、５×１０マイクロモルのスケールで実施した。オリゴヌクレオシド・ホスホロチオエートは、低圧イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−セルロース、ＤＥ−５０Ｗｈａｔｍａｎ）で精製してから、逆相クロマトグラフィー（Ｃ₁₈）を実施し、透析した。オリゴヌクレオシド・ホスホロチオエート合成のＨ−ホスホネート法の詳細については、アグラワルおよびタンがTetrahedron Letters 31巻 7541〜7544 頁（1990年）で述べている。１本の鎖を５’末端または３’末端でＡｍｉｎｏ− Ｌｉｎｋ^TM（Clontech，Palo Alto，CA）を用いて調製した。それからオリゴを１：１モル比で混合し、水槽中で９０℃で加熱してからゆっくりと冷却して室温にし、二本鎖を生成する。それから二本鎖を０．１Ｍリン酸緩衝液、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中でスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸と反応させる。マレイミドと結合したブチルアミド・オリゴをＨＳＡ−ｆに加え、２−メルカプトエタノール中で穏やかに還元する。混合液を０〜４℃で１晩インキュベートしてから、ＨＳＡ−ｆについてさきに述べたようにしたＨＰＬＣで分離する。実施例４第１の官能基としてビオチンを、第２の官能基として放射性同位体キレート化剤を有する試薬の調製ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン５酢酸、Aldrich；７．１ｍｇ／ｍｌ）およびＮＨＳ−ビオチン（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチンエステル、Sigma ；６．８ｍｇ／ｍｌ）を、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド、無水、Al drich）中に同時溶解した。一部（１０〜６０μｌ）を取ってＨＳＡ（ヒト血清アルブミン、Sigma；１．３２ｍｇ／ｍｌの０．１ＭＮａＨＣＯ₃、０．２ＭＮａＣｌ（ｐＨ８．５）溶液）に加え、モル比が５〜４０になるようにした。６ＮＨＮＯ₃で洗浄したガラス管内で反応をさせ、緩衝水溶液をキレート樹脂（イミノ２酢酸、Sigma）上で保存した。どの程度ビオチニル化したかを調べるために、反応試験管それぞれにトリチル化したビオチン（ｄ−［８，９−³Ｈ］ビオチンスクシンイミジルエステル、Amersham；100,000ｃｐｍ）を加えた。室温で１時間静置した後、各溶液のアリコートを計数し、０．１５ＭＮａＣｌに透析して結合していないビオチンを取り除いた。透析液の一部について計数し、透析液中に回収されたカウント率に最初のビオチン：ＨＳＡ比をかけて最終的なビオチン／ＨＳＡ比を求めた。ＨＳＡ１モルに結合するＤＴＰＡのモル数を求めるために、各反応混合液１０μｌにｌｕＣｉ¹¹¹ＩｎＣｌ₃（Dupont-NEN）を含有するｐＨ６．０の０．１Ｍクエン酸ナトリウム１２０μｌを加えた。室温で１時間静置した後、５μｌをとってシリカストライプ上に滴下し、ｐＨ８．０のクエン酸ナトリウム中で移動させた。このストライプを起始部と前橋部の分けて計数した。起始部でのカウント率に最初のＤＴＰＡ：ＨＳＡ比をかけてＨＳＡ１モルあたりのＤＴＰＡモル数を算出した。各反応混合液の蛋白質濃度は、ＰｉｅｒｃｅＢＣＡ法により求めた。加えたモル数と、ＤＴＰＡおよびビオチンの双方に結合するモル数との間には、モル比が５〜４０の範囲で明らかに線形の関係があった。実施例５ ¹¹¹Inエフェクター基を有する第３試薬の調製ビオチンまたはＤＡＯと結合したＨＳＡ−ｆを、例３および４のようにして調製する。ジエチレントリアミン５酢酸二無水物（ＤＴＰＡ）（Aldrich，Milwauk ee，WI）をＤＭＳＯに溶解し、モル比５：１でビオチンまたはＤＳＯと結合したＨＳＡ−ｆ（２ｍｇ／ｍｌの０．１ＭＮａＨＣＯ₃溶液、ｐＨ８．２）と結合させる。室温で１時間静置した後、例３で述べたような条件下でＨＰＬＣによりＤＴＰＡおよびビオチンまたはＤＡＯと結合したＨＳＡ−ｆから結合していないＤＴＰＡを分離する。次いで、１Ｍ酢酸ナトリウムを等容積の¹¹¹Ｉｎ放射性核種溶液に加えて最終酢酸濃度が０．５Ｍになるようにして¹¹¹Ｉｎ酢酸を調製し、２ＭＮａＯＨを使ってｐＨを５．５〜６．０に調整する。¹¹¹Ｉｎ酢酸を０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中の結合したＨＳＡ−ｆと１：１で混ぜ、室温で３０分間静置。生成された第３試薬を、例３で述べた条件下でＨＰＬＣにより遊離¹¹¹Ｉｎから分離する。実施例６ ^99mＴｃエフェクター基を有する試薬の調製例３および例４に従ってビオチンまたはＤＳＯに結合したＨＳＡ−ｆを調製する。１ｍｇ／ｍｌ結合ＨＳＡ−ｆ溶液１ｍｌを、５ｍＭＳｎＣｌ₂、４０ｍＭカリウムフハレート（potassium phhalate）および１３．４ｍＭ酒石酸ナトリウムカリウムを含有する溶液（ｐＨ５．６）０．６７ｍｌに加える。混合液を室温で２４時間インキュベートしてから、１ｍＣｉ過テクネチウム酸塩を加え、室温でさらに１時間インキュベートする。実施例７放射性ヨウ素エフェクター基を有する試薬の調製放射性ヨウ素（０．１〜１．０ｍＣｉＮａ¹²³ＩまたはＮａ¹²⁵Ｉ）をＰＢＳ中でＤＳＯ結合ＨＳＡ−ｆ（１〜１０ｍｇ）と５：１の比で混ぜ、１ｍｇのロードゲン（lodogen）で被覆した試験管に移す。室温で５分間静置した後、生成された試薬を例３に述べた条件下でＨＰＬＣにより遊離ヨウ素から分離する。実施例８ ²¹¹Ａｔエフェクター基を有する試薬の調製例３および例４に従って、ビオチンまたはＤＳＯに結合したＨＳＡ−ｆを調製する。それからカウリおよびカッシスがNucl．Med．Bio l．16巻727〜733頁（1989年）で述べているようにＮ−スクシンイミジル−ｐ− ｐ［²¹¹Ａｔ］−アスタートベンゾエート（Astatobenzoate）を使うか、あるいはカウリらが癌のためのモノクローナル抗体免疫接合に関する第３回国際会議講演集26頁（1988年）に明らかにしているようにＮ−（ｍ−［²¹¹Ａｔ］−アスタートマレイミド（astatomaleimide））を使うかのいずれかにより、放射性アスタート（radioastato）基を加える。Ｇ２５Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムで遊離²¹¹ Ａｔから［²¹¹Ａｔ］−標識したＨＳＡ−ｆを分離する。実施例９マウスにおける腫瘍細胞に ^99mＴｃエフェクター基を向けるＴＡＧ７２を発現するＬＳ１７４Ｔヒト腺癌（結腸）細胞系を５〜８週齢の雄スイス-ｎｕ／ｎｕヌードマウスの側腹部に１０⁷細胞を皮下注入して、ヌードマウスに同細胞系を充実性皮下腫瘍として増殖させる。腫瘍は大きさが３〜５ｍｍになるまで増殖させた。それからそのマウスにＴＡＧ７２結合部位となる第１の官能基、ならびに第２の官能基としてビオチンを有する第１試薬を静注する。この試薬は例１に述べるようにして調製し、体重１ｋｇあたり１０〜１００ｍｇの濃度で投与する。１〜２日後に、マウスにアビジン（Sigma，St．Louis，MO）を注入する。アビジンは、第１および第２の官能基としてビオチン結合部位を有する第２試薬である。さらに２４〜２８時間たってから、第１の官能基としてビオチンを、またエフェクター基として^99mＴｃを有する第３試薬をマウスに１０〜１００ｍｇ／ｋｇ注入する。この第３試薬は、例６に述べるようにして調製する。２４時間以内に^99mＴｃ腫瘍の限局化を断層撮影で確認する。実施例１０マウスにおける腫瘍細胞に ¹¹¹Ｉｎエフェクター基を向かわせる３〜５ｍｍのＬＳ１７４Ｔ腫瘍を有するヌードマウスを、例９に述べるように作製する。そのマウスにＴＡＧ７２結合部位となる第１の官能基、ならびに第２の官能基としてアビジンを有する第１試薬１０〜１００ｍｇ／ｋｇを注入する。２４〜４８時間後に、第１の官能基がビオチン、第２エフェクター基がＤＴＰＡである第２試薬１．５ｍｇ／ｋｇを注入する。この試薬は例３に従って調製する。さらに１〜６時間たってから、マウスに¹¹¹ＩｎＣｌ₃を注入する。さらに１〜４８時間後に、¹¹¹Ｉｎエフェクター基が腫瘍部位に局在することを断層撮影で確認する。

Claims

【特許請求の範囲】１．動物の体内のあらかじめ選択した化学成分を標的とし、増幅的な形でエフェクター基をそれに向かわせる方法であって、（a）第１の官能基および第２の官能基から成る第１試薬を動物に投与し、その第１試薬の第１の官能基はあらかじめ選択した化学成分に特異的に結合し、（b）第１試薬があらかじめ選択した化学成分と特異的結合対を形成できるようにし、（c）第１の官能基および第２の官能基から成る１つ以上のサイクリング試薬を動物に連続的に投与し、その投与した第１サイクリング試薬の第１の官能基が第１試薬の第２の官能基と増幅的な形で特異的に結合し、（d）第１サイクリング試薬が第１試薬と特異的な結合対を形成できるようにしてから、連続的に投与したサイクリング試薬が増幅的な形で特異的な連続的な結合対を形成できるようにし、（e）その後に、第１の官能基およびエフェクター基から成るエフェクター試薬を動物に投与し、そのエフェクター試薬の第１の官能基は１つ以上のサイクリング試薬の第２の官能基と特異的に結合し、（f）エフェクター試薬が１つ以上のサイクリング試薬と特異的結合対を形成できるようにするという段階から成る方法で、特異的結合対それぞれは１０⁶／Ｍより大きい結合親和力を有している、増幅的な形でエフェクター基を標的に向かわせる方法。２．各官能基が、抗体、抗原、抗体フラグメント、細胞レセプター、細胞レセプターへのリガンド、ＤＸＯ、ＢＮ−ＤＳＯ、ＡＶ−ＤＳＯ、ＳＳＯ−ＤＳＯ、ＢＮ−ＳＳＯ、ＩＮＴ、ＢＮ−ＩＮＴ、ＡＶ−ＩＮＴ、ＳＳＯ−ＩＮＴ、ＢＮ、ＡＶ、ＳＳＯ、ＡＡＶ−ＳＳＯおよびＣＳＳＯからなる群から選択された官能基である請求項１に記載の方法。３．サイクリング試薬がさらに、少なくとも１つ以上の官能基と化学的に結合する担体分子を含んでいる請求項１に記載の方法。４．エフェクター試薬がさらに、少なくとも１つ以上の官能基および少なくとも１つ以上のエフェクター基と化学的に結合する担体分子を含んでいる請求項３に記載の方法。５．担体分子が蛋白質、ペプチド、糖蛋白質、糖、または脂質である請求項４に記載の方法。６．エフェクター基が、核種、放射性核種、薬剤、プロドラッグを活性状態の薬剤に変換するのを触媒する酵素、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択されたエフェクター基である請求項１に記載の方法。７．さらに、エフェクター試薬からエフェクター基を放出するのを触媒する酵素的な試薬を動物に投与する段階を備え、そのエフェクター基が薬剤またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである請求項１に記載の方法。８．さらに、プロドラッグ試薬を動物に投与する段階を備え、エフェクター基がプロドラッグ試薬を活性状態の薬剤に変換するのを触媒する酵素である請求項１に記載の方法。９．第１の官能基および第２の官能基を備え、当該第１の官能基は抗体抗原結合部位、アビジンおよびビオチンからなる群から選択された官能基であり、また当該第２の官能基は二本鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、およびインターカレーターからなる群から選択された官能基である試薬。１０．前記第１の官能基が抗体抗原結合部位であり、前記第２の官能基が二本鎖オリゴヌクレオチドである請求項９に記載の試薬。１１．前記第１の官能基が抗体抗原結合部位であり、前記第２の官能基が一本鎖オリゴヌクレオチドである請求項９に記載の試薬。１２．前記第１の官能基がアビジンであり、前記第２の官能基が二本鎖オリゴヌクレオチドである請求項９に記載の試薬。１３．前記第１の官能基がアビジンであり、当該第２の官能基が一本鎖オリゴヌクレオチドである請求項９に記載の試薬。１４．前記第１の官能基がアビジンであり、前記第２の官能基がインターカレーターである請求項９に記載の試薬。１５．前記第１の官能基がビオチンであり、前記第２の官能基が二本鎖オリゴヌクレオチドである請求項９に記載の試薬。１６．前記第１の官能基がビオチンであり、前記第２の官能基が一本鎖オリゴヌクレオチドである請求項９に記載の試薬。１７．前記第１の官能基がビオチンであり、前記第２の官能基がインターカレーターである請求項９に記載の試薬。