ES2608803T3 - Estructuras inmunorreguladoras procedentes de proteínas naturales - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo o un fragmento del mismo con especificidad frente a un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 80 para su uso en el tratamiento de un tumor maligno.

Description

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Tabla 1 A. Residuos de los péptidos de la HSA que se unen al AcMc A Columna C: área del pico de los péptidos antes de la adsorción con el AcMc A. Columna D: área del pico de los péptidos después de la adsorción con el AcMc A. Columna E: área del pico de los péptidos cuando la digestión de la dHSA estaba protegida por la unión al AcMc A

A

B C D E

MH+ (m/z)

Residuo Área del pico antes de la incubación del anticuerpo2 espectros Área del pico después de la incubación del anticuerpo 5 espectros Área del pico trips. albúmina + antic. 6 espectros

1149,67

066-075 1970, 4092 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,

1017,59

089-097 1695, 5089 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,

933,56

098-105 1862, 4869 0, 0, 132, 0, 0 0, 0, 0, 0, 0, 0,

1434,65

106-117 809, 1010 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,

927,55

162-168 6036,13066 504, 118, 473, 281, 288 448, 895, 216, 724, 2346, 1.571

1074, 63

206-214 3064, 7917 0, 0, 0, 0, 0 0, 0, 0, 0, 0, 0

1443, 74

287-298 583, 1394 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 53, 0, 0, 0,

1546, 91

299-310 2283, 4675 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,

1311,84

362-372 1036, 1482 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 51, 0, 407 (1312), 226 (1312)

1552, 71

384-396 2186, 3327 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,

1657, 87

414-426 2519, 2978 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,212 (1656,64)

960,62

427-434 15276, 32846 267, 315, 931, 494, 309 591, 1284, 199, 1015, 2963, 1998

1138,56

500-508 1360, 4659 0, 0, 0, 0, 0, 0, 258, 0, 0, 0,204 (1139)

1342, 72

570-581 2720, 3758 0, 0, 0, 0, 0 0, 0, 0, 0, 0, 0

Tabla 1B. Secuencia de aminoácidos de los residuos de los péptidos de la HSA unidos por el AcMc A.

MH+ ( m/z)

Residuo Secuencia

1149,67

066-075 LVNEVTEFAK

1017,59

089-097 SLHTLFGDK

933,56

098-105 LCTVATLR

1434,65

106-117 ETYGEMADCCAK

927,55

162-168 YLYEIAR

1074, 63

206-214 LDELRDEGK

1443, 74

287-298 YICENQDSISSK

1546, 91

299-310 LKECCEKPLLEK

1311,84

362-372 HPDYSVVLLLR

1552, 71

384-396 CCAAADPHECYAK

1657, 87

414-426 QNCELFEQLGEYK

960,62

427-434 FQNALLVR

1138,56

500-508 CCTESLVNR

1342, 72

570-581 AVM D D FAAFVE K

10 Con objeto de confirmar adicionalmente estos resultados, se dejó que el anticuerpo monoclonal AcMc A se uniera a la albúmina desnaturalizada (previamente digerida con tripsina a una concentración de 0,02 ng/ml) con objeto de proteger las secuencias de los péptidos del epítopo. Después, el complejo se trató de nuevo con tripsina. Después se llevaron a cabo las MALDI-TOF ms y se compararon los espectros de masas de los péptidos de la albúmina con los espectros generados a partir de la albúmina desnaturalizada tratada con tripsina en ausencia del anticuerpo. Las

15 mismas catorce masas de las 39 masas de la albúmina desaparecieron completamente o estaban significativamente

reducidas en la muestra en la que estaba presente el AcMc durante el tratamiento con tripsina (Tabla 1 A, Columna E). Se realizaron múltiples lecturas para verificar los resultados.

Los fragmentos de péptidos importantes podrían no ser identificados debido a la posibilidad de que el epítopo de 5 unión del AcMc de la albúmina sea escindido por la tripsina, dando como resultado fragmentos del epítopo con una afinidad de unión demasiado baja como para unirse al AcMc. Por lo tanto, también se usó un método alternativo.

Se repitió el cartografiado de los epítopos del AcMc A con la MALDI basada en la protección del anticuerpo frente a la proteolisis. Esta vez se usó una metodología ligeramente diferente. Se incubó la HSA desnaturalizada con el 10 AcMc A. La albúmina no unida por el anticuerpo se retiró de la muestra mediante una exclusión por tamaños con un ultrafiltro. El resto de AcMc libres y los complejos de AcMc-albúmina se digirieron después con tripsina (las secuencias de la molécula de albúmina a las que está unido el AcMc resisten a la digestión con tripsina). Después, los fragmentos pequeños escindidos del AcMc y de la albúmina no protegida se eliminaron de la muestra mediante una ultrafiltración (30 kD). Los complejos del AcMc y los fragmentos de albúmina unidos se disociaron mediante una 15 reducción del pH hasta 2,7. De nuevo, se llevó a cabo una ultrafiltración a 30 kD para separar el AcMc completo de los fragmentos de albúmina menores de 30 kD. El análisis mediante una MALDI TOF de estos fragmentos no identificó los espectros típicos de la albúmina. Razonablemente, debido a que los fragmentos que contienen el epítopo del AcMc A todavía eran demasiado grandes. Después, éste filtrado (< 30 kD) se digirió adicionalmente con tripsina (para la escisión de los sitios previamente protegidos por el AcMc) con objeto de generar masas de péptidos

20 adecuadas para el análisis con la MALDI TOF ms.

Después de este segundo tratamiento con tripsina, se detectaron ocho de las 32 masas mediante la MALDI TOF ms, que concordaban con la albúmina (Tabla 2). Por lo tanto, estas secuencias de aminoácidos identificadas ahora comprenden una parte del epítopo, que también contiene secuencias del otro lado del punto de escisión de la

25 tripsina.

Tabla 2. Péptidos de la albúmina generados mediante la tripsinización de fragmentos mayores eluídos a partir del AcMc A.

Masa

Residuo de la albúmina Área del pico Secuencia de la base de datos

875,49

243-249 481 LSQRFPK

927,47 *

162-168 1035 YLYEIAR

933,51 *

98-105 744 LCTVATLR

940,41

131-138 534 DDNPNLPR

960,55 *

427-434 1345 FQNALLVR

1074,52 *

206-214 644 LDELRDEGK

1138,47 *

500-508 119 CCTESLVNR

1149,53 (1149,61)*

66-75 1918 LVNEVTEFAK

30 Seis de las ocho masas de péptidos (indicadas con un * en la Tabla 2) eran masas de péptidos que también desaparecieron cuando se analizaron previamente, cuando la albúmina completamente escindida se incubó con el AcMc A antes del análisis de la MALDI-TOF (Tablas 1A y B).

35 Los epítopos de este anticuerpo quedaron así establecidos. Es importante destacar que hay múltiples de dichas estructuras presentes en la molécula de albúmina, que pueden causar después la reticulación de los receptores a los que están unidos. Un estudio previo sobre la antigenicidad de la albúmina, basado en 13 anticuerpos monoclonales diferentes, ha demostrado que existe una reactividad cruzada intramolecular entre diferentes dominios de la albúmina humana (5), por lo tanto pueden esperarse múltiples sitios de epítopo para el AcMc A en la albúmina.

40 Tomando como base estos resultados coherentes, se encontró un patrón común. Se encontró un ácido glutámico a una distancia de 5 o 6 aminoácidos de la lisina, bien en las secuencias de péptidos identificadas por la MALDI-TOF o bien en la secuencia adyacente a la secuencia de péptidos identificada mediante esta técnica (esto es, en el otro lado del punto de escisión de la tripsina, en una K (lisina), (Tabla 3)). Es interesante destacar que en 4 de estas

45 secuencias se encontró un ácido glutámico adicional a una distancia de 2 o 3 aminoácidos del primer residuo de ácido glutámico. Estos residuos de ácido glutámico adicionales podrían tener importancia en la afinidad o en la transducción de señales de estos péptidos. La actividad biológica de estos péptidos también podría verse afectada por la aparición de aminoácidos ácidos tanto a una distancia de 12  1 aminoácidos (en la posición -12) desde el primer residuo de ácido glutámico E (en la estructura E5K) como a una distancia de 3  1 aminoácidos (en la

50 posición +3) del residuo de lisina K (en la estructura E5K. Debido a la longitud de los dos aminoácidos importantes, el ácido glutámico (E) y la lisina (K), en el epítopo del AcMc A, la distancia exacta fijada entre estos aminoácidos no es necesariamente para la actividad inmunorreguladora de estos fragmentos. Por lo tanto, una secuencia de E3-7K puede tener una actividad inmunorreguladora similar a la de la secuencia E5K (Tablas 4 A y B).

Tabla 3. Secuencias de los péptidos que rodean las estructuras E5K y E6K seleccionadas para la síntesis de los péptidos para la prueba de actividad inmunológica. Un péptido con la estructura E6K está incluido en latabla (secuencia 2).

imagen5

10 Se sintetizaron cinco de estos péptidos (Tabla 3) y se han investigado sus funciones inmunorreguladoras. Tomando como base estos estudios, se postuló que ambas secuencias de péptidos tanto estimulantes como inhibidoras están presentes en la albúmina sérica.

Conclusión -cartografiado de los epítopos mediante una MALDI-TOF MS

15

Se ha identificado el epítopo del AcMc A como la estructura E5-6K

La estructura biológicamente relevante es por lo tanto la E3-7K, posiblemente con residuos de aminoácidos ácidos adicionales en las posiciones -12 y +3. Tomados conjuntamente, estos resultados indican que el AcMc A puede

20 unirse a múltiples regiones de la molécula de la albúmina. Dado que los experimentos se llevaron a cabo con albúmina desnaturalizada, estos epítopos probablemente no son sitios generados por la combinación de residuos cuando se pliega la molécula.

Actividad de unión de los péptidos E5K -inhibición de la unión del AcMc A a la dHSA

25 Con objeto de probar la especificidad de los péptidos sintetizados, se probaron en un ELISA en el que se ha analizado la inhibición de la unión del AcMc A a placas recubiertas con dHSA. Una elevada afinidad del anticuerpo por la placa es por lo tanto coherente con ninguna actividad inhibidora, y esta unión se reduce cuando se añade una sustancia inhibidora al sistema. Según se muestra en la Fig. 1, cuatro de los cinco péptidos mostraron una inhibición

30 dependiente de la dosis del anticuerpo en las placas recubiertas con dHSA, confirmando que contienen una estructura que reacciona con el anticuerpo.

Expresión del epítopo E5K en células tumorales -correlación con la supervivencia

Previamente se ha demostrado, mediante el uso de una tinción inmunohistoquímica con el AcMc A, que el epítopo / la estructura E5K es expresada por varios tipos de células cancerosas (documento WO 06/043891). Se tiñó una

5 serie de 20 biopsias de pacientes con melanoma mediante el uso de esta técnica, y la intensidad de la tinción se puntuó desde + hasta +++ mediante el uso de un microscopio óptico. Se observó una considerable variación en la intensidad de la tinción. Tomando como base las áreas de las secciones teñidas con más intensidad, los pacientes se clasificaron desde altos hasta bajos expresores de E5K. Después se dividió el número de pacientes en dos grupos iguales, altos y bajos expresores, y se analizó la posible diferencia en la supervivencia entre estos grupos según unos análisis de Kaplan Meyer y de rangos logarítmicos. Según se muestra en la Fig. 2 se ha encontrado una diferencia estadísticamente muy significativa en la supervivencia entre los expresores altos y bajos.

Actividad inmunomoduladora de los péptidos E5K

15 Efecto de los péptidos sobre la proliferación inducida por la PHA de las PBMC

Se probó el efecto de dos péptidos de la albúmina, el 2605 y el 2608, sobre la proliferación inducida por la PHA de las PBMC de un paciente sano de control y de dos pacientes con cáncer. Según se muestra en las Figuras 3 A y B, el patrón de respuesta es bastante diferente entre los individuos, debido probablemente al grado de estimulación inmunitaria de las PBMC in vivo y posiblemente debido también a la aparición de autoanticuerpos contra las neoestructuras representadas por los péptidos. La importancia del grado de estimulación inmunitaria está demostrada por la comparación del efecto de los péptidos cuando las PBMC son estimuladas con 5 o con 10 μg/ml de PHA (compárense las Fig. 3 A y B). Además de las diferencias interindividuales, también se encontró un patrón de respuesta bifásico, por ejemplo, mediante el uso del péptido 2605 con las PBMC de K92, la concentración más baja

25 era inhibidora, la concentración intermedia estimulante, y de nuevo a la mayor concentración, se inhibió la respuesta proliferativa. También es interesante apreciar que se encontró una clara actividad estimuladora con la concentración más baja de ambos péptidos en el paciente P46. También hay algunas diferencias en la actividad de los dos péptidos probados, especialmente cuando las PBMC son estimuladas con PHA a una concentración de μg/ml. Cuando se usa una concentración de PHA de 10 μg/ml, la actividad de los dos péptidos es similar. El modelo de cultivo con el medio grado de estimulación es, por supuesto, más sensible a la variación en la estructura de unión del receptor. Este ejemplo demuestra por lo tanto que, una vez demostrada una secuencia de péptidos biológicamente activa, los cambios en la secuencia de aminoácidos pueden modular su actividad biológica.

Para analizar adicionalmente las diferencias interindividuales en el efecto de estos péptidos, se analizaron las PBMC

35 de 5 controles sanos y de 4 pacientes (Fig. 4). La PHA se usó a una concentración de 5 μg/ml y los péptidos a una concentración de 10 μg/ml. De nuevo se demostró una clara diferencia entre los individuos. El péptido 2605 tenía unos efectos inhibidores o estimuladores en uno de cada control y en uno de cada paciente. El péptido 2608 tenía un efecto estimulador en 1/4 de los controles, mientras que 3/4 de los pacientes eran estimulados.

Efecto de la dHSA sobre la proliferación inducida por la PHA de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)

El efecto de la dHSA sobre la proliferación inducida por la PHA de las PBMC de controles sanos y de pacientes con cáncer es bastante variable (Fig. 5). De nuevo, esto puede ser debido al grado de estimulación de las PBMC in vivo y posiblemente también a la presencia de autoanticuerpos contra la dHSA. La adición de la dHSA a estos cultivos

45 puede dar como resultado tanto una estimulación como una inhibición de la tasa proliferativa, pero frecuentemente dio como resultado la estimulación de la tasa proliferativa. Es apreciable que un control no respondió en absoluto, y esta persona tampoco respondió a una mayor concentración de PHA. En un paciente (P41), la adición de dHSA inhibió la proliferación, especialmente a una concentración de PHA de 10 μg/ml. La variación en la respuesta entre los pacientes demostró la necesidad del diagnóstico del estado inmunitario individual en los pacientes con cáncer.

Efecto de los péptidos sobre la proliferación de las PBMC modulada por la dHSA inducida por la PHA

A continuación se analizó el efecto de los diferentes péptidos, el 2605 o el 2608, sobre la proliferación potenciada por la dHSA inducida por la PHA. Según se muestra en las Figuras 6 A y B, la adición de dHSA a una concentración 55 de 8 μg/ml aumenta significativamente la tasa proliferativa de las PBMC estimuladas con la PHA procedentes de dos controles sanos diferentes. A las concentraciones más bajas de dHSA, el efecto estimulador disminuyó. De forma interesante, la adición de los péptidos a una concentración de 10 μg/ml inhibió significativamente la actividad estimulante de las dos concentraciones más altas de dHSA, mientras que a las concentraciones más bajas, los péptidos, por el contrario, estimularon la tasa proliferativa. Por lo tanto, el efecto estimulador de la dHSA a 8 μg/ml fue inhibido mediante la adición de los péptidos, pero la misma concentración de los péptidos estimuló la tasa proliferativa a una concentración más baja de dHSA. De forma razonable, la reticulación del receptor E5K está implicada en la actividad estimuladora de la dHSA, ya que la unión monomérica de los péptidos a este receptor inhibe el efecto estimulador de la dHSA. La misma concentración de los péptidos tenía entonces una actividad bastante diferente en presencia de diferentes concentraciones de dHSA, a 0,8 μg/ml todavía hay una ligera actividad 65 inhibidora, mientras que a las concentraciones bajas de dHSA la tasa proliferativa está significativamente mejorada. Una explicación razonable para esto es que la actividad estimuladora de los péptidos está bloqueada por una neo

imagen6

Péptidos adsorbidos en la ACS

Péptidos E5K sintetizados

Porcentaje adsorbido

Secuencia Inicio Fin Péptido E5K Secuencia Inicio Fin

0,42

(R)RPCFSALEVDETYVPK (E) 509-524

0,41

(K)FQNALLVR (Y) 427-434

0,36

(K)SLHTLFGDK (L) 89-97

0,36

(K)LKECCEKPLLEK (S) 299-310

0,35

(K)LCTVATLR (E) 98-105

0,34

(K)YLYEIAR ( R ) 162-168 2605 NEETFLKKYLYE 153-168

0,32

(K)CCAAADPH ECYAK (V) 384-396

0,29

(K)AAFTECCQAADK (A) 187198

0,26

(K)CCTESLVNR ( R ) 500-508

0,26

(K)QEPERNECFLQHK (D) 118-130 2607 EMADCCAKQEPE 110-122

0,23

(K)AVMDDFAAFVEK ( C ) 570-581

0,22

(R)NECFLQHK (D) 123-130

0,20

(K)QNCELFEQLGEYK (F) 414-426 2608 ELFEQLGEYKF 417-427

0,18

(K)QEPERNECFLQHK (D) 118-130 2607 EMADCCAKQEPE 110-122

0,13

(K)VHTECCHGDLLECADDR (A) 265-281

0,08

(R)FKDLGEENFK (A) 35-44

0,03

(K)YICENQDSISSK (L) 287-298

0,02

(K)LDELRDEGK (A) 206-214 2606 KLDELRDEGKAS 205-217

0,01

(K)DDNPNLPR (L) 131-138

-0,02

(K)LVN EVTEFAK (T) 66-75 2604 KLVNEVTEFAKT 65-76

-0,08

(R)ETYGEMADCCAK (Q) 106-117

-0,37

(R)YKAAFTECCQAADK (A) 185-198

Tomando como base su grado de unión y su relación espacial con las estructuras E5K de la albúmina, se seleccionaron cuatro nuevos péptidos para ser sintetizados e investigar su actividad inmunorreguladora (Tabla 5 B).

Tabla 5 B.

Péptidos adsorbidos en la ACS

Péptidos de la albúmina sintetizados

Porcentaje

Secuencia Secuencia

Adsorbido

Inicio Fin Péptido Inicio Fin

0,71

(K)KYLYEIAR ( R ) 161 168 3026 NEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP 153-176

0,64

(K)KVPQVSTPTLVEVSR (N) 438 452 3029 KVPQVSTPTLVEVSR 438-452

0,60

(K)VFDEFKPLVEEPQNLIK (Q) 397 413 3028 VFDEFKPLVEEPQNLIK 397-413

0,20

(K)QNCELFEQLGEYK (F) 414 426 3027 ELFEQLGEYKFQNALLVR 417-434

Péptido de E5K relacionado 2605 (3026)

NEETFLKKYLYE 153-168

Péptido de E5K relacionado 2608 (3027)

ELFEQLGEYKF 417-427

Actividad inmunorreguladora de los péptidos generados por la tripsina

10 Efecto de los péptidos sobre la proliferación de las PBMC inducida por la PHA modulada por la dHSA

Se probaron dos de los péptidos de las nuevas series, el 3026 y el 3028, y se compararon con el péptido 2605 en un análisis de su efecto sobre la proliferación estimulada por la PHA modulada por la dHSA (Fig. 9). La proliferación inducida por la PHA de las PBMC de dos controles sanos fue adicionalmente estimulada por la dHSA. Según se

15 muestra en la Figura 9, todos los péptidos eran inhibidores de la actividad estimuladora de la dHSA a las dos concentraciones usadas de PHA. También en este experimento, el grado de estimulación de las PBMC tiene un impacto sobre los resultados.

Efecto de los péptidos sobre la proliferación de las PBMC inducida por la interleucina-2

También se probó el efecto de los péptidos de la nueva serie 3026-3029 sobre la proliferación inducida por la IL-2. Según se muestra en la Figura 10 A, 3/4 de los péptidos, el 3026, el 3027 y el 3029, no tuvo ninguna actividad

5 estadísticamente significativa. Por el contrario, el péptido 3028 era muy inhibidor (p = 0,005). Es interesante apreciar que este efecto inhibidor era completamente revertido por la modulación de la reticulación del receptor Fc (Figura 10 B) de forma similar a la situación descrita previamente para la inmunosupresión relacionada con la IL-2 en el carcinoma de células renales (documento WO 03/099312 A1).

10 Efecto de la nueva serie de péptidos sobre la producción de monocinas por parte de las PBMC

El efecto de la nueva serie de péptidos mostró una diferencia considerable en el efecto incluso entre los individuos sanos de control (Figura 11). El péptido 3026 no tenía ningún efecto en concreto en uno de los controles (PBMC 2), pero tenía un claro efecto bifásico en el otro (PBMC 1). En el último caso, la producción de IL-6 fue estimulada a las 15 tres concentraciones más altas, y fue claramente inhibida a la concentración más baja. El péptido 3027 era ligeramente estimulador en uno de los controles y tenía un efecto inhibidor en el otro. También se encontraron unos resultados similares con el péptido 3028. El péptido 3029 tenía un ligero efecto estimulador únicamente en uno de los controles, a las dos concentraciones más altas. Es interesante apreciar que todos los péptidos excepto el 3029 tenían un efecto inmunomodulador a una concentración tan baja como de 10 ng/ml. Por lo tanto, todos los péptidos

20 tenían un efecto en al menos uno de los controles analizados.

De forma similar al efecto de la nueva serie de péptidos sobre las PBMC de los controles sanos, también las PBMC de los pacientes con cáncer mostraron unas considerables diferencias interindividuales (Figura 12). Ambos péptidos 3026 y 3027 tenían un efecto estimulador en el paciente con carcinoma de células renales, y además el péptido

25 3027 también estimulaba en uno de los pacientes con melanoma. Los otros dos péptidos, el 3028 y el 3029, no tenían esencialmente ningún efecto en estas pruebas. Al contrario que la situación con los controles, no se observaron efectos inhibidores.

Unión de los péptidos generados por la degradación con asparraginasa de la dHSA por parte de los receptores de la 30 superficie celular

La secuencia de péptidos completa de la albúmina no es recuperada mediante el uso de la técnica de MALDI-TOF después de una degradación con tripsina. Además, algunas secuencias con la capacidad de unirse a los receptores de la superficie celular de las células inmunitarias podrían haber sido degradadas por el tratamiento con tripsina. Por

35 lo tanto, se usó el mismo procedimiento experimental al que se ha descrito anteriormente también para una mezcla de péptidos obtenida mediante una degradación mediante el uso de asparraginasa. Los péptidos de unión a la ACS resultante se muestran en las Tablas 6 A y B.

Además de los péptidos generados por la degradación con tripsina, se encontraron otros seis péptidos con un peso

40 molecular de 700 -3.600 Da eficazmente adsorbidos (> 65 %) por las estructuras de la superficie celular de la columna ACS (Tabla 6A)

Tabla 6 A. ASP-DHSA adsorbida en ACS

Porcentaje adsorbido

Secuencia Inicio Fin

1,00

DHVKLVNEVTEFAKTCVA 62-79

1,00

DDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL 586-609

0,87

DRVTKCCTESLVNRRPCFSALEV 495-51710

0,86

DETYVPKEFNAETFTHA 518-535

0,65

DSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVEN 293-319

0,65

DKLCTV ATLRETYGEM 96-112

Se encontró que siete péptidos con un peso molecular de entre 3.200 y 9.000 Da eran completamente adsorbidos por la ACS, y para uno de los péptidos de este grupo, se unió en un 37 %. En este análisis, otros 9 péptidos no eran unidos en absoluto por la ACS.

Tabla 6 B. ASP-DHSA adsorbida en ACS

Porcentaje adsorbido

Secuencia Inicio Fin

1,00

YSVVLL LRLAKTYETT LEKCCAAADP HECYAKVF 364-398

1,00

KLCT VATLRETYGE MA DCCAKQEP ERNECFLQHK 96-130

1,00

ICTLSEKERQIKKQ TALVELVKHK PKATKEQLKA VM 536-572

1,00

LAKYICE NQDSISSKLK ECCEKPLLEK SHCIAEVEN 283-319

1,00

VF LGMFLYEYAR RHPDYSVVLL LRLAKTYETT LEKCCAAA 348-388

1,00

LGE ENFKALVLIA FAQYLQQCPF EDHVKLVNEV TEFAKTCVA 37-79

1,00

RVTKC CTESLVNRRP CFSALEV DET YVPKEFNAET FTFHA 495-535

0,37

YLSWLNQLCVLHEK TPVS DRVTKC CTESLVNRRP CFSALEV 475-517

Dos péptidos de este grupo no se unieron en absoluto, y para un péptido (SISSKLKECCEKPLLEK SHCIAEVEN 5 DEMPA) se obtuvieron unos resultados contradictorios con respecto a la adsorción por parte de la ACS.

Por lo tanto, el tratamiento con asparraginasa genera secuencias de péptidos distintas a las generadas por la tripsina, que se unen eficazmente a las estructuras de la superficie celular de las células inmunitarias. Tomando como base los resultados descritos anteriormente, es muy probable que estas estructuras tengan una actividad

10 inmunomoduladora.

Aparición de fragmentos de unión a la ACS en la IgG de pacientes con cáncer

Con objeto de identificar adicionalmente la aparición de estructuras de unión a las células inmunitarias in vivo, se

15 preparó plasma sanguíneo y se llevó a cabo una cromatografía de afinidad como se ha descrito anteriormente. Las sustancias unidas por la columna de ACS se eluyeron, se fraccionaron en una electroforesis en gel bidimensional y se identificaron mediante el uso de la técnica de MALDI TOF. Como se esperaba, se identificaron las áreas del gel bidimensional correspondientes a la albúmina y a las inmunoglobulinas. Además, también se identificaron otras sustancias de unión a las células inmunitarias (Fig. 13). La unión de algunas variedades de albúmina,

20 probablemente albúmina dañada portadora de cambios conformacionales, a las células inmunitarias, había sido descrita previamente por varios grupos. Las nuevas estructuras de unión a las células inmunitarias encontradas en esta investigación se resumen en la Tabla 7.

Tabla 7. Proteínas identificadas mediante la MALDI-TOF ms.

25

1.

Región variable de la cadena pesada de la IgA Acc. #: 3004672

2.

Regiones de unión y variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina Acc. #: 2198477

3.

Cadena pesada de la inmunoglobulina Región V de la cadena pesada de la Ig (clon LUNmO3) Acc. #: 1669777 Acc. #: 484974

4.

Proteína que contiene el dominio SERTA 2 (TRIP-Br2) Acc. #: Q14140

5.

Región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina Acc. #: 42632530

Por lo tanto, además de la albúmina sérica, también otras proteínas naturales son sustratos para la generación de fragmentos inmunorreguladores.

30 Por lo tanto, puede concluirse, y se demuestra claramente en la presente solicitud de patente, que las secuencias de las proteínas naturales tales como la albúmina sérica y la IgG, se unen a los receptores de la superficie celular de las células inmunitarias y tienen una actividad inmunorreguladora. Se han identificado ambas secuencias estimuladoras e inhibidoras. Además, se encontró que la reticulación de los receptores de las células inmunitarias era un mecanismo mediante el cual puede modularse la función de estas células.

35

Modelo ex vivo humano para la evaluación de la inmunosupresión en pacientes con cáncer

La IL-2 tiene una importancia fundamental para el inicio y la estimulación de una respuesta inmunitaria, y la actividad de esta citocina está a menudo inhibida en la inmunosupresión relacionada con el cáncer. Por lo tanto, se estableció

40 un modelo ex vivo humano para la inmunosupresión en pacientes con cáncer (Fig. 14 y 15) para la evaluación de posibles péptidos inmunorreguladores inhibidores.

En este modelo se demostró que la respuesta a la IL-2 se correlacionaba con la supervivencia global de los pacientes (Fig. 15). La inmunosupresión en este modelo ex vivo humano está mediada por factores séricos, ya que

la capacidad proliferativa de las PBMC procedentes de controles sanos está significativamente inhibida si estas células se cultivan con sueros de pacientes con cáncer en el medio (Fig.16).

Identificación de péptidos inmunorreguladores adicionales

5 Se usaron columnas de superficie celular artificial (ACS) con objeto de identificar las secuencias de los péptidos de la unión de la albúmina a los receptores de la superficie de las células inmunitarias. Después de la biotinilación, dichos receptores se unieron a microesferas de estreptavidina. Los péptidos que se unían a dichas columnas fueron identificados después de la elución mediante la técnica de MALDI-TOF. Tomando como base estos resultados y su relación con los péptidos de la albúmina identificados previamente, se sintetizaron cinco péptidos. Su actividad inmunorreguladora se probó principalmente en la respuesta a la IL-2.

Se analizó el efecto de diferentes péptidos sobre la proliferación inducida por la IL-2 en el modelo ex vivo humano. El péptido 3028 inhibe de forma regular la proliferación inducida por la IL-2, pero ninguno de los otros péptidos

15 identificados por su unión a la superficie celular artificial tenía ninguna actividad inhibidora (Fig. 17). Dado que la parte C-terminal del péptido 3028 contiene una estructura inmunorreguladora identificada previamente, la E5K, también se probó el efecto de cinco péptidos que contienen esta estructura sobre la proliferación inducida por la IL-2, pero éstos solo mostraron una actividad inhibidora mínima, o ninguna actividad.

La actividad inhibidora del péptido 3028 sobre la proliferación inducida por la IL-2 también puede demostrarse en cultivos con PBMC de pacientes con cáncer, incluso si la respuesta a la IL-2 ya había sido suprimida (Fig. 18). Dado que la inmunosupresión en el cáncer está caracterizada por una baja respuesta a la IL-2, la inhibición de la actividad de esta neo-estructura de la albúmina en pacientes con cáncer tiene una gran capacidad para superar la inmunosupresión relacionada con el cáncer. El péptido inhibe uno de los mecanismos fundamentales de inicio y de

25 regulación por aumento de una respuesta inmunitaria, por lo tanto será más probable que sea de gran valor en la regulación por disminución de la actividad inmunitaria en las enfermedades inflamatorias crónicas y autoinmunes.

Caracterización adicional del efecto del péptido 3028 sobre la proliferación inducida por la IL

Dado que previamente se ha encontrado que ciertas neo-estructuras de la albúmina tienen una actividad inmunorreguladora, y la parte C-terminal del péptido 3028 tiene una estructura similar, se sintetizaron las partes C y N terminales del péptido 3028 y se analizaron por separado y en combinación. Obviamente, la actividad inhibidora de las dos partes del péptido 3028 es mucho más débil (Fig. 19).

35 Caracterización de un antisuero de conejo y de anticuerpos de conejo purificados por afinidad dirigidos contra el péptido 3028

Los antisueros de conejo dirigidos contra el péptido de la albúmina 3028 se unen a la dHSA, y en menor grado a la kHSA. Se probaron dos antisueros, R y L, procedentes de dos conejos diferentes. Estos anticuerpos séricos se unen preferentemente al fragmento 3325 pero no al 3218 de 3028. También se obtuvieron unos resultados similares con los anticuerpos purificados por afinidad (véase la figura 21).

Efecto inmunomodulador de los anticuerpos de conejo purificados por afinidad dirigidos contra el péptido 3028

45 Según se muestra en la Figura 22, la inhibición de la respuesta proliferativa a la IL-2 fue superada en pacientes con cáncer inmunodeprimidos (Fig. 22A) y en los controles normales con la regulación por disminución de la reactividad inmunitaria (Fig. 22 B) que tiene un índice proliferativo menor de 100.000 dpm en el modelo ex vivo humano. Los anticuerpos anti-3028 no tuvieron ningún efecto cuando la tasa proliferativa está en el intervalo normal.

Se añadió IgG policlonal de conejo a cultivos de control con objeto de asegurarse de que el efecto de los anticuerpos purificados por afinidad no era debido a una actividad no específica de la IgG de conejo en este modelo. La IgG de conejo solo tuvo una actividad mínima. La especificidad de los anticuerpos anti-3028 fue demostrada adicionalmente ya que el efecto estimulador de estos anticuerpos fue neutralizado por una pequeña cantidad de péptido 3028 que no tiene ninguna actividad inhibidora per se. Además, la adsorción de los sueros de inhibidores por parte del gel al

55 que se habían unido los anticuerpos anti-3028 redujo la actividad inhibidora de dichos sueros.

De forma similar a los resultados con el modelo ex vivo autólogo, la actividad inmunosupresora de los sueros procedentes de personas con una baja respuesta proliferativa a la IL-2 fue superada mediante la adición a los cultivos de los anticuerpos anti-3028.

Unión de los anticuerpos anti-3028 a / Expresión del epítopo 3028 en / tumores malignos

Las estructuras a las que se unen los anticuerpos anti-3028 son ampliamente expresadas en los tumores malignos humanos, por ejemplo, en el melanoma maligno, en el carcinoma de células renales y en el cáncer colorrectal

65 (véase la figura 23).

El receptor del péptido 3028:

Unión del 3028 al LFA-1

5 De una forma similar a los resultados descritos anteriormente para los sueros de los pacientes con cáncer y los péptidos inmunorreguladores identificados previamente, el péptido 3028 tiene la capacidad de modular la unión del anticuerpo LFA-1 (HI 111) al LFA-1 de las células mononucleares sanguíneas. Tanto la inhibición (Fig. 24) como la potenciación de la unión han sido demostradas, dependiendo razonablemente de la estructura del LFA-1 (forma activada o inactivada) cuando se prepararon las preparaciones de las células con el cytospin. También se ha demostrado que las partes C y N terminales de este péptido tienen una cierta actividad inhibidora (Fig. 24).

De acuerdo con estos resultados y con el efecto del péptido 3028 sobre la proliferación inducida por la IL-2, es de bastante interés apreciar que el anticuerpo anti-LFA-1 usado en estos experimentos es un potente inhibidor de la proliferación inducida por la IL-2. Unos resultados similares han sido publicados previamente por Vyth-Dreese et al.

15 (1993).

Unión del 3028 a la cadena α (CD25) del receptor de la IL-2

Dado que el péptido 3028 inhibe significativamente la respuesta proliferativa a la IL-2, se comparó la secuencia de aminoácidos de este péptido con la de la IL-2 y se encontraron ciertas similitudes en el sitio de unión al receptor de la IL-2 (Tabla 8).

Tabla 8. Homologías entre la secuencia de aminoácidos del péptido de la albúmina 3028 y un segmento de la interleucina humana 2, que participa en la interacción de la interleucina-2 con el receptor alfa de la

25 interleucina-2 (CD25).

Péptido3028: VFDEFKPLVEEPQNL I K

IL-2humana: E L K P L E E

(a.a. 61-72)

Tomando como base esta observación, se estudió el efecto del péptido 3028 en la unión de la IL-2 a los CD25. La proteína de fusión de CD25 y la parte Fc de la IgG se unió a microplacas recubiertas con proteína G / placas de ELISA, y las placas se incubaron IL-2 biotinilada con o sin el péptido 3028 presente. Sorprendentemente, la unión de la IL-2 a los CD25 era potenciada por el péptido 3028, lo que indica una interacción de terceras partes entre la IL-2,

35 los CD25 y el 3028. Incluso si la unión de la IL-2 a los CD25 está potenciada, el ensamblaje apropiado del receptor de alta afinidad y/o la transcripción de señales está bloqueada, ya que el péptido 3028 es un potente inhibidor de la proliferación inducida por la IL-2 (véase más arriba).

Después se demostró, mediante el uso de un modelado molecular asistido por ordenador, que el péptido 3028 se une a los CD25 en el sitio de unión de la IL-2 (Fig. 25). Por lo tanto, puede concluirse que el péptido 3028 tiene una capacidad inmunorreguladora doble mediante la unión tanto al LFA-1 como al receptor de la IL-2.

El péptido 3028, estructura inmunosupresora óptima:

45 El péptido inhibidor fisiológico

Tomando como base los resultados descritos anteriormente (la diferencia en la actividad antiproliferativa de los péptidos 3218 y 3325, la especificidad de la afinidad de los anticuerpos purificados dirigidos contra el 3325 y no contra el péptido 3218, la actividad inmunomoduladora de estos anticuerpos y el efecto de estos péptidos sobre la unión del AcMc anti-LFA-1 a las células inmunitarias), puede concluirse que ninguno de los péptidos menores, el 3218 ni el 3325, son tan eficaces como el péptido completo, el 3028 (Fig. 26). Sin embargo, ambos péptidos inhiben la unión del AcMc HI 111 al LFA-1. Una explicación razonable para esto es que ambos péptidos menores contribuyen a la actividad completa del efecto inhibidor del péptido 3028. Por lo tanto, es lógico extender el péptido 3325 con los aminoácidos N terminales del péptido 3218. Dado que la extensión C terminal del péptido 3325 es una

55 lisina, sería de bastante interés producir péptidos más largos con objeto de probar la posibilidad de que los péptidos más largos sean incluso más eficaces que el péptido 3028.

Con objeto de mantener la naturaleza fisiológica de este péptido inhibidor, la única modificación pertinente de su estructura es cambiar su longitud, como se ha analizado más arriba.

Este programa clarificará la estructura óptima del péptido 3028 que se va a usar como fármaco inmunosupresor para el tratamiento de afecciones patológicas / enfermedades relacionadas / dependientes de la IL-2, tales como neoplasias de los linfocitos T, rechazo de un aloinjerto de trasplantes de órganos, enfermedad del injerto contra el hospedador (GVH), enfermedades inflamatorias crónicas tales como psoriasis, y algunas enfermedades 65 autoinmunes. El fundamento del uso terapéutico del péptido inmunoinhibidor 3028 en estas afecciones está demostrado por la actividad terapéutica de los anticuerpos monoclonales dirigidos contra los CD25 (el receptor Tac).

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Materiales y métodos

Preparación de albúmina sérica humana desnaturalizada (dHSA)

5 Una solución para infusión de albúmina sérica humana (HSA) (Pharmacia, Uppsala, Suecia) se desnaturalizó y se redujo mediante su suspensión a una concentración final de 10 mg/ml en urea 8 M y ditiotreitol 10 mM (ambos de Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) en Tris-HCL 50 mM (a pH 7,9) durante 2 h a 25 ºC. Después, la HSA fue alquilada mediante la adición de yodoacetamida 60 mM (Sigma) y se incubó adicionalmente durante 2 h a 25 ºC en la oscuridad. La solución de HSA se diluyó hasta una concentración de 100 μg/ml con solución salina tamponada con fosfato (PBS, Gibco BRL) y se dializó intensamente frente a PBS mediante el uso de tubos de diálisis Spectrapore 4 con un peso molecular de corte de 12.000 (Spectrum Europe, Breda, Holanda). Se preparó HSA de control en paralelo mediante la incubación de la HSA a 10 mg/m en Tris-HCL (a pH 7,9) seguido de una diálisis. Antes de su uso en los experimentos de cultivo tisular, la dHSA se filtró estéril a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm (Millipore Co, MA, EE.UU.). La DHSA se almacenó a 4 ºC, o se liofilizó y se almacenó a -20 ºC.

15

Escisión enzimática de la dHSA con una baja dosis de tripsina

Se llevó a cabo el intercambio del tampón por NH4HCO3 25 mM, a pH 8, en la HSA desnaturalizada con una filtración en gel en Sephadex-G25 (columnas de desalinización PD-10, Amersham Biosciences Europe, Uppsala, Suecia). El intercambio de proteínas se determinó con un ensayo de proteínas Bio-Rad basado en el procedimiento de unión al colorante de Bradford siguiendo las recomendaciones del fabricante (Bio-Rad Laboratories AB, Sundbyberg, Suecia). Se añadió tripsina modificada de calidad para secuenciación (Promega, Madison, concentración después del tampón Wl) se añadió a una concentración final de 2, de 0,2 o de 0,02 ng/ml a la HSA desnaturalizada (49 μg/ml). Alternativamente, como control, se añadió la cantidad equivalente del tampón de dilución de la tripsina

25 (C2H4O2 50 mM). La mezcla se incubó a 37 ºC durante 18 horas. La actividad de la tripsina se detuvo mediante el paso de la muestra por una columna con inhibidor de tripsina de soja reticulado con agarosa activada por CNBr (Sigma).

Escisión enzimática completa de la dHSA con una dosis alta de tripsina, seguida de una incubación con el AcMc A para el cartografiado del epítopo

Se liofilizaron ocho μg de dHSA tratada con una dosis baja de tripsina y después se disolvieron en 16 μl de tripsina modificada de calidad para secuenciación (a 5 μg/ml) (Promega) y se incubaron a 37 ºC durante 18 horas. Una porción (10 μl) de los péptidos digeridos con tripsina se hizo reaccionar con el anticuerpo monoclonal (AcMc A) a

35 una concentración final de 0,3 mg/ml durante 2 horas a la temperatura ambiente. Las muestras se almacenaron a 4 ºC durante una noche y después se analizaron mediante una MALDI TOF MS (véase a continuación).

Incubación de la dHSA con el AcMc seguida de una escisión enzimática completa con tripsina para el cartografiado del epítopo

Se incubó la HSA desnaturalizada tratada con una dosis baja de tripsina (8 μg) en NH4HCO3 25 mM, a pH 8, con 8 μg del anticuerpo monoclonal (AcMc A) o con un control de PBS durante 2 horas a 4 ºC. También se cultivó en un control paralelo solo por separado que consiste en 8 μg del anticuerpo monoclonal en NH4HCO3 25 mM. Las muestras se agitaron vorticialmente brevemente cada 10 min. Después las muestras se secaron inmediatamente

45 durante una noche en un concentrador a vacío SpeedVac (Savant, Farmingdale, NY). Después las muestras se disolvieron en 16 μl de tripsina modificada de calidad para secuenciación a 5 μg/ml (Promega) y se incubaron a 37 ºC durante 18 horas. Las muestras se almacenaron a 4 ºC durante una noche y después se analizaron mediante una MALDI TOF MS (véase a continuación).

Incubación del dHSA con el AcMc seguida de una escisión enzimática con tripsina con una ultrafiltración en condiciones ácidas para el cartografiado del epítopo

Se incubó la HSA desnaturalizada (80 μg) con el AcMc A (10 μg) en PBS durante 18 h a la temperatura ambiente. Para eliminar la dHSA libre, la mezcla de reacción de dHSA-AcMc A se centrifugó durante 5 min a 3.000 rpm en un 55 ultrafiltro Amicon Ultra-15 con un peso molecular de corte de 100.000 Da (Millipore Co., Billerica, MA). El retenido se diluyó en NH4HCO3 25 mM y se centrifugó de nuevo como se ha descrito anteriormente. El retenido se transfirió a un tubo de microcentrífuga eppendorf estéril en 0,4 ml de NH4HCO3 25 mM y se añadieron 0,4 μg de tripsina modificada de calidad para secuenciación (Promega). La digestión se llevó a cabo a 37 ºC durante una noche con una agitación suave. Se eliminaron la tripsina y los fragmentos de albúmina libre (no unidos al anticuerpo) mediante una ultrafiltración con un filtro Amicon Ultra-4 (peso molecular de corte de 30.000 Da, Millipore Co.) durante 5 min a

3.000 rpm. Esto se repitió tres veces. Después, el retenido se transfirió a un nuevo ultrafiltro en el que el AcMc A se disoció de la albúmina unida mediante la adición de 600 μl de glicina-HCI 0,1 M, a pH 2,7, durante 30 min a la temperatura ambiente, tras lo cual el ultrafiltro se centrifugó durante 10 min a 3.000 rpm. El filtrado se transfirió a un tubo de microcentrífuga eppendorf estéril y se neutralizó con Tris-HCI, a pH 9. Después, la muestra se secó

65 inmediatamente durante una noche en un concentrador a vacío SpeedVac. Después las muestras se disolvieron en 16 μl de tripsina modificada de calidad para secuenciación (a 5 μg/ml) (Promega) y se incubaron a 37 ºC durante 18

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albúmina sérica humana al 2 % (HSA) (Pharmacia & Upjohn, Estocolmo, Suecia) (RPMI / HSA al 2 %). Para los cultivos con una estimulación con PHA, las PBMC se lavaron con solución salina equilibrada de Hank (HBSS) con un 10 % de plasma autólogo en lugar de con RPMI / HSA al 2 %. La viabilidad celular fue evaluada mediante una exclusión con Trypan Blue al 0,05 %, y fue siempre superior al 95 %. La suspensión celular se tiñó con solución de

5 Türk, y el número de linfocitos y de monocitos en la preparación de PBMC se contó con un hemocitómetro. Las PBMC se suspendieron en RPMI / HSA al 2 % y la concentración de células se ajustó a 5 x 105 linfocitos/ml.

Suero

10 Se recogió suero humano en tubos de recolección de suero sin aditivos (Vacutainer, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) al mismo tiempo que las muestras de sangre para el aislamiento de las PBMC. Los sueros fueron inactivados térmicamente a 56 ºC durante 30 minutos.

Proliferación inducida por PHA de las PBMC en presencia de péptidos de albúmina y/o de dHSA

15 Se resuspendieron PBMC de voluntarios sanos en RPMI1640 con o sin la adición de dHSA y/o de péptidos de albúmina, según se indica, a una concentración celular de 5 x 105 linfocitos/ml. Se sembraron 100 μl de la suspensión celular en placas de microtitulación de fondo redondo (Corning, NY, Estados Unidos) seguido de 100 μl de un medio de cultivo que consiste en RPMI 1640 (Flow Laboratories, Irvine, Escocia) complementado con 200

20 UI/ml de penicilina, 200 μg/ml de estreptomicina (Flow laboratories) y un 20 % de suero autólogo inactivado con calor. Después se añadió la fitohemaglutinina (PHA-P, Sigma Chemical Co, St.Louis, MO) a una concentración final de 5 o de 10 μg/ml. Todas las condiciones de cultivo se establecieron en pocillos por triplicado. Las células se cultivaron durante 3 días en una atmósfera humidificada con un 5 % de CO2 a 37 ºC. La proliferación se ensayó mediante la incorporación de 1,6 μCi/pocillo de [3H]timidina (Amersham International, Reino Unido) durante las

25 últimas 18 h. Para los cálculos se usaron los valores medios de las desintegraciones por minuto (dpm) de los triplicados.

Producción de IL-6 inducida por LPS, efecto de los péptidos

30 Se añadieron 100 μl de un medio de cultivo que consiste en RPMI1640 complementado con 200 UI/ml de penicilina, 200 μg/ml de estreptomicina, L-glutamina 4 mM (Sigma Chemical, MO, Estados Unidos) y un 20 % de suero autólogo reciente inactivado por calor, a placas de microtitulación no recubiertas o recubiertas previamente, seguido de 100 μl de la suspensión de PBMC (5 x 104 linfocitos) en RPMI / HSA al 2 % con los péptidos a las concentraciones indicadas. Se añadió lipopolisacárido (LPS, Sigma Chemical Co, MO, Estados Unidos) a una

35 concentración final de 0,05 ng/ml. Las células se cultivaron en una atmósfera humidificada con un 5 % de CO2 a 37 ºC. Todas las condiciones de cultivo se establecieron en pocillos por triplicado. Los sobrenadantes (SN) se recogieron después de 24 h y las células residuales se eliminaron mediante una centrifugación en una centrífuga refrigerada (Beckman) a 2.600 x g durante 5 minutos. Los SN se congelaron y se almacenaron a -70 ºC. La IL-6 de los SN del cultivo celular se midió mediante un ELISA mediante el uso del kit de desarrollo DuoSet0 ELISA para IL-6

40 humana (R&D Systems Europe, Ltd., Abingdon, Reino Unido) siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante. El límite inferior de detección era de 3,1 pg/ml. Las muestras se analizaron como la media de los pocillos por triplicado.

Proliferación inducida por la interleucina 2 (IL-2) de las PBMC en presencia de péptidos de albúmina en placas de 45 cultivo tisular recubiertas y no recubiertas

Se recubrieron previamente placas de cultivo tisular de 96 pocillos de fondo redondo (Costar, Corning Inc. NY, Estados Unidos) solo con HSA o con HSA e IgG humana agrupada para una inyección intravenosa (Gammagard, Baxter AS, DK) como sigue; la HSA se diluyó en RPMI1640 sin complementos hasta una concentración de 10 50 mg/ml. También se preparó una mezcla de 1 mg/ml de IgG en una solución de 9 mg/ml de HSA en RPMI (HSA/IgG). Después se añadieron 200 μl de la HSA o de HSA/IgG a cada pocillo de la placa. Las placas se incubaron a 4 ºC durante 30 minutos, tras lo cual los pocillos se lavaron dos veces con 200 μl de RPMI1640. Las placas recubiertas se usaron inmediatamente. Se añadieron 100 μl de RPMI1640 complementado con 200 UI/ml de penicilina, 200 μl/ml de estreptomicina, L-glutamina 4 mM (todos de Sigma Chemical Co. MO, Estados Unidos) y un 20 % de suero 55 humano inactivado por calor (autólogo) a los pocillos de microtitulación del cultivo tisular con HSA o con HSA/IgG recubiertos. Las PBMC, aisladas a partir de individuos sanos, se diluyeron en RPMI / HSA al 2 % y se añadieron directamente los péptidos a la suspensión celular a una concentración de 10 μg/ml. Después se añadieron cien μl de esta suspensión celular (5 x 104 linfocitos) por pocillo, proporcionando una concentración final de 5 μg/ml de péptido por pocillo. Se añadió a los pocillos IL-2 (Proleukin, Chiron, NL), a una concentración final de 120 UI/pocillo. Las

60 células se cultivaron durante 7 días en una atmósfera humidificada con un 5 % de CO2 a 37 ºC. La proliferación se ensayó mediante la incorporación de 1,6 μCi/pocillo de [3H]-timidina (Amersham Int., Reino Unido) durante las últimas 18 h. Para los cálculos se usaron los valores medios de las dpm (desintegraciones por minuto) de los triplicados.

65

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Biosciences). Para bloquear posibles restos de biotina libre, se añadieron 25 ml de glicina 0,1 M (Sigma) a la Streptavidin Sepharose. Después se hizo reaccionar la estreptavidina no saturada con 225 μg de biotina (Sigma) en tampón de unión. La Streptavidin Sepharose se lavó cuidadosamente con PBS. Después se empaquetó un ml del lisado de células biotiniladas acopladas a la Streptavidin Sepharose en una columna vacía (Tricorn Empty High

5 Performance Column, Amersham Bioscience) y se lavó con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene Ca y Mg (GIBCO).

Adsorción de la dHSA fragmentada con la enzima mediante el uso de una columna de afinidad con proteínas de la superficie celular biotiniladas (ACS)

Se hicieron pasar dos ml de la dHSA fragmentada con la enzima en PBS, que se corresponden con un total de 0,2 mg de proteína, por la columna de ACS, preparada como se ha descrito anteriormente. El flujo pasante se recogió teniendo en consideración el volumen vacío y la dilución de la muestra adsorbida mediante la recolección en pequeñas porciones de 0,2 ml. Se secaron treinta μl de cada muestra, incluyendo una muestra de control que no

15 había sido adsorbida, en una centrífuga Speed-Vac.

Espectrometría de masas

Las muestras secas fueron reconstituidas en 10 ul de TFA al 0,1 %. Se usaron puntas de pipeta Zip Tip (Millipore, Estados Unidos) que contienen medio de fase inversa Ci8 para la desalinización de las muestras reconstituidas.

Para el análisis de las muestras en el intervalo de masas de 700 -3.600 Da, se mezcló un μl de cada muestra eluida con Zip Tip con 1 μl de una solución saturada de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (0,02 mg/ml) en acetonitrilo al 70 % / ácido trifluoroacético al 0,3 %. Para el análisis de las muestras en el intervalo de masas de 1.500 -9.000 Da, se

25 mezcló un μl de cada muestra eluida con Zip Tip con 1 μl de ácido sinapínico (ácido 3-metoxi-4-hidroxicinámico). Se punteó 1 μl de la mezcla en la placa de MALDI y se analizó mediante el uso de una MALDI-TOF MS (Voyager-DE PRO, Applied Biosystems, CA, Estados Unidos). La búsqueda de la identidad de masa de los espectros resultantes se llevó a cabo en las bases de datos SwissProt o NCBI mediante el uso de MS-Fit.

Identificación de las proteínas del plasma humano que se unen a la ACS

Cromatografía de afinidad del plasma con la ACS

El plasma se obtuvo mediante una plasmaféresis a partir de un paciente con un diagnóstico de melanoma maligno.

35 El plasma se congeló a -20 ºC. Tras la descongelación, el plasma se coágulo inmediatamente mediante la adición de CaCI2 a una concentración final de 13 mM. El coágulo de plasma gelificado se eliminó mediante una centrifugación a

3.500 RPM durante 7 min a 4 ºC. Después el plasma se dializó intensivamente frente a PBS mediante el uso de tubos de diálisis Spectrapore 4 (Spectrum Europe, Breda, Países Bajos). Se preparó una columna de afinidad con proteínas de la superficie celular biotiniladas a partir de células mononucleares acopladas a estreptavidinasepharose (ACS-sepharose) como se ha descrito anteriormente.

Se incubaron 45 ml del plasma con la ACS-sepharose durante una noche a 4 ºC con una agitación suave. El plasma-ACS sepharose se lavó ampliamente con PBS. El ACS-sepharose lavado se almacenó durante cinco días a 4 ºC en PBS con un 0,1 % de NaN3. El ACS-sepharose se empaquetó en una columna vacía (Tricorn Empty High

45 Performance Column, Amersham Bioscience) y las proteínas unidas se eluyeron con 2 ml de Glicina-HCI 0,1 M, a pH 2,7. La fracción eluida se neutralizó inmediatamente con tampón Tris 1 M a pH 9 y se liofilizó.

Electroforesis en gel bidimensional

Las muestras liofilizadas se desalinizaron mediante su reconstitución en H2O y ácido tricloroacético al 10 % (TCA) con DTT 20 mM en acetona. Las muestras se centrifugaron a 13.000 RPM durante 5 min. El sedimento resultante se lavó dos veces con DTT 20 mM en acetona para retirar el TCA y finalmente se disolvió en un tampón de rehidratación (tampón de urea 8 M, CHAPS al 4 %, DTT 10 mM, IPG al 0,5 % y una cantidad mínima de naranja G). La electroforesis en gel bidimensional se llevó a cabo en un conjunto horizontal 2-DE (Multiphore/IPGphore,

55 Pharmacia Biotech, SE) basado en isoeletroenfoque (IEF) en la primera dimensión y en masa molecular en la segunda dimensión. En resumen, las muestras se aplicaron a geles de IPG (tira de lmmobiline ™ Dry, pH 3-10 NL, (GE Healthcare)) y se isoeletroenfocaron durante una noche a 38060 Vh. Después se llevó a cabo una SDS-PAGE con geles planos premoldeados de poliacrilamida Exelgel XL SDS 12-14 (Amersham Biosciences). En cada análisis se incluyeron patrones de peso molecular. Las proteínas separadas fueron detectadas mediante una tinción de plata según el método de Shevenco. Los digeridos con tripsina de los puntos de proteínas se recortaron del gel y se analizaron con una MALDI-TOF ms como se ha descrito anteriormente.

Pacientes oncológicos

65 A los pacientes, incluidos en los análisis de la supervivencia global según la respuesta proliferativa de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a la interleucina-2, se les diagnosticó un carcinoma de células renales

con metástasis sistémicas. Previamente estaban sin tratar y se les programó para un tratamiento con interleucina-2 (Proleukin, Chiron, NL). Se tomaron muestras sanguíneas antes de iniciar el tratamiento. Los pacientes incluidos en otros estudios de esta solicitud de patente se describen brevemente según sea apropiado en la sección de resultados.

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Modelo ex vivo de inmunosupresión relacionada con la lL-2; proliferación de las PBMC inducida por la interleucina-2 (IL-2)

Las PBMC se aislaron a partir de muestras de sangre venosa de donantes de sangre sanos (controles) o de pacientes con cáncer. Se añadieron cien μl de medio de cultivo (RPMI 1640 con la modificación de Dutch (Gibco, InVitrogen AB, Estocolmo, Suecia) complementado con 200 UI/ml de penicilina, 200 μl/ml de estreptomicina, Lglutamina 4 mM (todos de Sigma Chemical Co. MO, Estados Unidos) y un 20 % de suero humano inactivado con calor) a placas de cultivo tisular de 96 pocillos de fondo redondo (Costar, Corning Inc. NY, Estados Unidos). Después se añadieron cien μl de las PBMC en RPMI / HSA al 2 % (5 x 104 linfocitos) por pocillo, seguido de IL-2

15 (Proleukin, Chiron, NL) a una concentración final de 120 UI/pocillo. En paralelo se establecieron pocillos de control sin IL-2. Las células se cultivaron durante 7 días en una atmósfera humidificada con un 5 % de CO2 a 37 ºC. La proliferación celular se ensayó mediante la incorporación de 1,6 μCi/pocillo de [3H]-timidina (Amersham Int., Reino Unido) durante las últimas 18-24 h. Se usaron los valores medios de las dpm (desintegraciones por minuto) de los pocillos por triplicado para los cálculos. En los cultivos en los que se usó un suero recogido de los pacientes con cáncer en lugar del suero autólogo, las PBMC eran de donantes con un grupo sanguíneo compatible.

Proliferación de las PBMC inducida por la interleucina-2 (IL-2) en presencia de péptidos de albúmina

Se establecieron cultivos para la proliferación inducida por IL-2 con PBMC procedentes de donantes sanos y de

25 suero autólogo como se ha descrito anteriormente, con la excepción de que las PBMC eran incubadas previamente en primer lugar durante 30 min a la temperatura ambiente con los péptidos de albúmina indicados a una concentración de 10 μg/ml.

Generación de un antisuero de conejo específico para el péptido de la albúmina 3028

El péptido 3028 se sintetizó con una cisteína añadida en el extremo N terminal y después se conjugó con hemocianina de lapa californiana (KLH) como proteína portadora. Se generaron antisueros policlonales mediante inmunizaciones repetidas de conejos con el péptido 3028 conjugado con la KLH y adyuvantes de Freund. Para algunos experimentos, los antisueros fueron purificados por afinidad mediante una cromatografía de geles de

35 yodoacetilo Ultralink conjugados con el péptido 3028 (Pierce Biotechnology Inc.). Para los experimentos de cultivo celular se llevó a cabo un intercambio del tampón por RPMI 1640 con modificación de Dutch (Gibco, InVitrogen AB, Estocolmo, Suecia) mediante el paso a través de columnas PD-10 sephadex (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) seguido de una filtración estéril con filtros de jeringa de 0,22 μm Millex (Millipore Co., MA, Estados Unidos). Las inmunizaciones de los conejos y la purificación de los antisueros fueron llevadas a cabo por Agrisera AB, Suecia.

ELISA con antisuero de conejo anti 3028

Se recubrieron pocillos por duplicado en placas de microtitulación Hi-binding (Costar 2592, Corning Inc, NY, Estados

45 Unidos) con 100 μl del péptido 3028 (10 μg/ml), HSA desnaturalizada (denHSA, 4,5 μg/ml) o HSA de control (4,5 μg/ml). Todos los reactivos de recubrimiento se diluyeron con PBS y se incubaron a la temperatura ambiente durante una noche. Después los pocillos se lavaron con un tampón de lavado que consiste en Tween-20 al 0,05 % en PBS (Sigma) seguido de un bloqueo durante 1 h a 25 ºC con 200 μl de gelatina al 0,5 % preparada a partir de piel bovina (Sigma) en PBS, seguido de un lavado con tampón de lavado. Se añadieron los sueros de conejo preinmunes o los sueros anti-3028, diluidos a 1/1.000.000 en diluyente de reactivo de ELISA (gelatina al 0,01 % y Tween-20 al 0,05 % en PBS), y se incubaron durante 1 h a 25 ºC seguido de un lavado. Después se añadió IgG biotinilada de caballo anti-conejo/ratón (Vectastain ELITE, Vetor Laboratories Inc, CA, Estados Unidos) diluida a 1/5 en diluyente de reactivo de ELISA, y las placas se incubaron durante 1 h a 25 ºC, seguido de un lavado. Después, se añadió estreptavidina conjugada con HRP (R&Dsystems Europe, Ltd, Reino Unido). Finalmente, después de un lavado con

55 tampón de lavado, se añadió una solución de sustrato que consiste en H2O2 y tetrametilbenzidina (R&D Systems). La reacción se detuvo con H2SO4 1 M y la densidad óptica se midió en forma de absorbancia (A) a dos longitudes de onda, a 450 nm y a 570 nm, con un lector de microplacas Multiscan EX (Labsystems).

Inhibición del ELISA del anti-3028 de conejo por parte de los péptidos de albúmina

Para probar si los péptidos de la albúmina inhibían la unión del anti-3028 de conejo a los pocillos recubiertos con 3028, se incubaron previamente los antisueros de conejo diluidos a 1/1.000.000 en diluyente de reactivo de ELISA durante 1 h a la temperatura ambiente con las concentraciones indicadas de los péptidos. Después se añadieron 100 μl del anticuerpo monoclonal solo, o, como alternativa, el anticuerpo monoclonal mezclado con péptidos, a los

65 pocillos recubiertos con 3028, y se llevó a cabo el ELISA según se ha descrito.

Proliferación de las PBMC inducida por la interleucina-2 (IL-2) en presencia de anti-3028 de conejo purificado por afinidad

Los cultivos para probar el efecto inmunomodulador de los anticuerpos de conejo purificados por afinidad específicos

5 para el 3028 se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente para la proliferación inducida por la IL-2 con las siguientes excepciones; se omitió la SA al 2 % del medio de lavado y del medio de suspensión de las PBMC. El medio de cultivo que contiene el suero (100 μl/pocillo) se incubó previamente con 20 μg/ml de anticuerpos de conejo durante 30 min a la temperatura ambiente antes de la adición de 100 μl de la suspensión de PBMC a los pocillos del cultivo.

Tinción inmunohistoquímica de las biopsias de tumores con anti-3028 de conejo

Se prepararon secciones tisulares a partir de biopsias fijadas con formalina procedentes de pacientes con cáncer. Las secciones se desparafinizaron y se bloquearon con suero AB humano normal al 10 % en solución salina

15 equilibrada de Hank complementada con Hepes 0,01 M (BSS, GIBCO BRL) durante una hora antes de la tinción. Después, las secciones se tiñeron con 10 μg/ml de anti-3028 de conejo purificado por afinidad diluido en BSS con un 2 % de suero AB y 0,1 g/ml de saponina durante 30 min. Después del lavado con BSS con 0,1 g/ml de saponina, se añadió un polímero de fosfatasa alcalina Ultravison One específico para la Ig de ratón y de conejo (Lab Vision Co., CA, Estados Unidos). Después se lavó el exceso de polímero de las secciones con BSS con 0,1 g/ml de saponina. Después se detectó el complejo polimérico unido mediante sustrato de fosfato de naftol y cromógeno líquido Fast Red (Lab Vision Corp.) Las secciones se contratiñeron con hematoxilina de Mayer y se montaron en Glycergel.

Efecto de los péptidos de la albúmina sobre la actividad citotóxica de las células citolíticas naturales (NK) procedentes de donantes de sangre sanos

25 Las células mononucleares se separaron mediante una centrifugación en un gradiente de densidad Ficoll-paque Plus estándar (Pharmacia AB, Suecia) a partir de sangre heparinizada obtenida de donantes sanos. La actividad citotóxica de las células NK de las células mononucleares se probó después mediante el uso de un kit comercial (NKTEST, Orpegen Pharma GmbH, Heidelberg, Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante. En resumen, el kit contiene células objetivo sensibles a las NK criopreservadas (K562) marcadas con un colorante de membrana fluorescente verde lipófilo, que permite la discriminación entre las células efectoras y las objetivo. Después de una incubación con las células efectoras, las células objetivo destruidas son identificadas mediante una tinción del ADN, que penetra y tiñe específicamente los núcleos de las células objetivo muertas. De esta forma, puede determinarse el porcentaje de objetivos destruidos mediante una citometría de flujo. Las células mononucleares se incubaron

35 previamente durante 30 min a 37 ºC con los péptidos indicados (los péptidos han sido descritos previamente) a 10 μg/ml. Después se añadieron las células objetivo, dando una proporción de efectoras:objetivo de 40:1, y la mezcla de células se incubó a 37 ºC durante 3-4 horas. Las muestras se analizaron con un FACSCaIibur (BD Biosciences, San José, CA).

Leyendas de las figuras

Figura 1. Este diagrama muestra que algunos péptidos que contienen la secuencia E5K inhiben la unión del AcMc A a las placas de ELISA recubiertas con la dHSA. Obviamente, existen algunas diferencias en la actividad inhibidora de los péptidos probados.

45 Figura 2. Efecto de la expresión de la E5K detectada por el AcMc A sobre la supervivencia de los pacientes con melanoma maligno metastásico (p = 0,009). Expresión baja

imagen10x --x Expresión alta

o --o Figura 3 A. Se probó el efecto de dos péptidos de la albúmina, el 2605 y el 2608, sobre la proliferación de las PBMC inducida por la PHA (5 μg/ml) de un control sano y de dos pacientes con cáncer. Las tres diferentes concentraciones de los péptidos (μg/ml) están indicadas en la figura. Los pacientes P45 y 46 padecían un carcinoma de células renales y un melanoma maligno. Figura 3 B. Se probó el efecto de dos péptidos de la albúmina, el 2605 y el 2608, sobre la proliferación de las PBMC inducida por la PHA (10 μg/ml) de un control sano y de dos pacientes con cáncer. Las tres

55 concentraciones de péptido usadas (μg/ml) están indicadas en la figura. Figura 4. Variación interindividual en el efecto de los péptidos de la albúmina sobre la proliferación inducida por la PHA por parte de las PBMC procedentes de controles sanos y de pacientes con cáncer. La PHA se usó a una concentración de 5 μg/ml, y los péptidos a una concentración de 10 μg/ml. Los pacientes tenían los siguientes diagnósticos: melanoma maligno (P46) y carcinoma de células renales (P39, P41 y P45). Figura 5. Efecto de la dHSA, a 8 μg/ml, sobre la proliferación inducida por la PHA de las PBMC procedentes de 5 controles y de 4 pacientes con cáncer. Figura 6 A. Efecto del péptido 2605 sobre la proliferación inducida por la PHA potenciada por la dHSA. Los detalles se describen en el texto. Figura 6 B. Efecto del péptido 2608 sobre la proliferación inducida por la PHA potenciada por la dHSA. Los

65 detalles se describen en el texto. Figura 7. Efecto de los péptidos de la albúmina sobre la producción de IL-6 inducida por LPS por parte de las

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Claims (1)

1. imagen1