KR101410417B1

KR101410417B1 - 혈액내의 엔도칸 측정 방법

Info

Publication number: KR101410417B1
Application number: KR1020130010669A
Authority: KR
Inventors: 배종섭
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2013-01-30
Filing date: 2013-01-30
Publication date: 2014-07-03

Abstract

본 발명은 혈액내의 엔도칸 측정 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 엔도칸 측정방법 및 엔도칸 항체의 패혈증 또는 혈관염증 치료 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, competitive ELISA를 이용하여 엔도칸 농도를 측정 시 항체 간의 상호작용을 방지하여 잘못된 결과해석을 막을 수 있고 두 개의 플레이트를 사용으로 시료의 오염을 막을 수 있다. 또한 비특이적 결합이 생기지 않으며 광범위한 측정범위에서 엔도칸 농도를 측정할 수 있다.

Description

혈액내의 엔도칸 측정 방법{Measurement of Endocan within blood}

본 발명은 혈액내의 엔도칸 측정 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 엔도칸 측정방법 및 엔도칸 항체의 패혈증 또는 혈관염증 치료 용도에 관한 것이다.

엔도칸(Endocan; endothelial cell-specific molecule-1; ESM-1)은 원래 배양세포에서 내피세포성장의 용해성 물질로 발견되었다. 엔도칸은 폐, 신장 및 종양 내피의 혈관내피세포에 의해 분비된다. 또한 엔도칸은 50kDa으로 165 아미노산 펩타이드로 구성된 용해성 데르마탄 황산 프로테오글리칸이다. 엔도칸은 세포부착, 염증장애, 종양진행 그리고 세포 성장 및 증식 촉진을 위한 인슐린과 같은 성장요소의 조절에서 중요한 역할을 한다. 뿐만 아니라, 내피세포에서 엔토칸의 발현은 (TNF)-α 또는 (IL)1-β 의 반응에 의해 과발현 된다. 내피장벽은 주변 조직으로부터 혈관에서 혈액을 분리하는 역할을 하며 또한 혈액과 조직 사이의 유동성을 갖게하고 세포의 교환을 통제한다. 이 장벽은 다양한 생리적인 자극 또는 병의 기원에 의한 조절을 위해 매우 역동적이며 매우 민감하다. 장벽 과투과성은 염증이 생긴 조직에 백혈구가 접근하는 것을 제공하기 위해 필수적이다. 이것은 현재 명백한 내피장애붕괴의 보호 조절균형이며 바뀐 내피장벽투과성은 염증반응의 특징이며 패혈증, 급성 호흡곤란 증후군 및 아나필락시스와 같은 염증질병의 사망에 기여한다.

패혈증쇼크를 갖고있는 환자의 혈청에서의 엔도칸의 급격한 증가는 시사되어 왔다. 이러한 증가는 내피손상이 진행되고 있음을 나타내며 고로 질병의 심각함 또는 결과와 연관되어 있다. 따라서 엔도칸은 패혈증 진단 마커로서 보여진다. 다른 연구에서 엔도칸은 체계적 염증 질병을 위한 마커로 특징적이지 않다는 결과가 있다. 특히, 엔도칸의 높은 수준의 양은 암환자에서 발견되지만 엔도칸 양의 높은 수준은 체계적 염증의 맥락에서 볼 때 관련이 있다. 왜냐하면 엔도칸은 염증부위와 백혈구 부착 및 활성을 위한 순환 림프구의 회복에 중재하기 때문이다.

많은 증거들로 비추어 볼 때 엔도칸 및 혈관염증 반응은 밀접하게 관련되어 있고 본 발명자들은 엔도칸이 아마도 혈관 내피로부터 방출될 때 생체 내에서 몇몇의 혈관 염증 반응을 이끌어 낼 것이라고 추측하였다. 게다가 엔도칸은 과투과성 및 세포골격 단백질의 재배열을 통해 혈관 염증을 조절한다고 추측하였다. 그러므로 본 발명자들은 상기에 설명한 바와 같이 본 발명에서는 몇몇의 설립된 세포-신호 분석방법을 사용하여 인간혈관내피세포(human umbilical vein endothelial cells; HUVECs)에서 엔도칸 조절 영향을 분석했다. 게다가, 생쥐에 정맥주사 후 복강안에 순환하는 밸혈구의 이동 및 감소를 관찰하면서 엔도칸의 염증효과에 접근했다. 그리고 우리는 CLP로 유도된 패혈증 마우스 모델에서 엔도칸의 방출과 엔도칸 방출에 있어서 엔도칸 향체의 효과 및 생존을 관찰하였다.

종래에 이러한 엔도칸을 측정하는 방법은 Direct sandwich ELISA 방법을 통해 측정되어 왔다. 그러나 사용되고 있는 엔도칸 측정방법은 다음과 같은 점들이 문제되어 왔다. 첫 번째, Detecting antibody 및 coating antibody간 상호작용에 의한 문제점이 있다. coating antibody는 처음 넣어주는 시료 내에 포함된 엔도칸과 반응하는 항체이며 Detecting antibody는 coating antibody에 결합된 엔도칸과 결합하는 항체로 이 둘 두 항체간의 상호작용으로 인해 샘플 내의 포함된 엔도칸을 완벽하게 측정할 수 없는 단점이 있다. 두 번째, 교차반응성(cross reactivity) 으로 인한 잘못된 결과 해석의 문제점이 있다. 첫 번째 문제점에서 타나난 잘못된 결과로 인해 잘못 된 결과 해석을 할 수도 있다. 세 번째, 시료 간 오염의 문제점이 있다. Direct sandwich ELISA는 coating antibody에 시료를 직접적으로 넣어주는 방식으로 인해 넣어주기 때문에 시료 간 오염이 생길 가능성이 있다. 네 번째, 비특이적결합(Non-specific binding)의 문제점이 있다. Detecting antibody와 coating antibody는 각각 엔도칸의 다른 부위와 결합을 하는데 이 두 항체가 엔도칸과 적절하게 반응하지 않는 즉, 비특이적 결합 문제가 생긴다. 다섯 번째, Direct sandwich ELISA방법은 엔도칸을 포함하는 샘플내에 불순물이 조금이라도 섞여 있으면 전체반응에 대한 해석 자체를 믿을 수 없는 단점이 있기 때문에 잘못된 결과 해석을 가져올 수도 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, a) 표준단백질인 엔도칸을 준비하는 단계;

b) 상기 엔도칸을 마이크로티터 플레이트에 흡착시킨 후 블록킹 하는 단계;

c) 1차 항체와 시료를 반응시키는 단계;

d) 상기 c) 단계의 반응액을 표준단백질이 흡착된 플레이트에 넣는 단계;

e) 상기 d)단계의 결과물에 효소가 결합 된 2차 항체를 첨가하는 단계;

f) 세척 후 상기 효소 기질액을 넣고 반응시킨 후 반응 중지액을 넣고 반응을 중지시키는 단계; 및

g) 상기 f)단계 후 반응액의 흡광도를 측정하는 단계로 엔도칸을 측정하는 경우, 항체 간의 상호작용을 방지하여 잘못된 결과해석을 막을 수 있고 두 개의 플레이트를 사용으로 시료의 오염을 막을 수 있다. 또한 비특이적 결합이 생기지 않으며 광범위한 측정범위에서 엔도칸 농도를 측정할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 항체 간의 상호작용을 방지하여 잘못된 결과해석을 막을 수 있고 두 개의 플레이트를 사용으로 시료의 오염을 막을 수 있다. 또한 비특이적 결합이 생기지 않으며 광범위한 측정범위를 갖는 혈액내의 엔도칸 측정 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 혈액내의 엔도칸 측정 방법을 이용한 혈액내의 엔도칸 측정 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 엔도칸 측정방법:

a) 표준단백질인 엔도칸을 준비하는 단계;

c) 1차 항체와 시료를 반응시키는 단계;

g) 상기 f)단계 후 반응액의 흡광도를 측정하는 단계를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 엔도칸 측정방법은 엔도칸 농도가 0.1 ~ 900 ng/㎖ 측정범위인 것을 특징으로 하는 엔도칸 측정방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 실시예 2에서 측정한 항체 및 표준단백질 코팅농도를 바탕으로 Robard 공식에 의해 log 변환 시킨 결과 기존 시판중인 두 회사의 Sandwich ELISA Kit 보다 더 넓은 측정범위를 갖는 것을 확인할 수 있었고 이는 사람의 혈액 내에서 엔도칸을 측정하는 데 본 발명이 더 효과적이라는 것을 나타낸다.

여기서 b는 항원이 들어 있지않은 well의 흡광도에 대한 각 농도에서의 퍼센트 값이다.

본 발명에 있어서, 상기 c)단계에서 1차 항체 농도는 1:1000 ~ 1:4000인 것을 특징으로 하는 엔도칸 측정방법을 제공한다. 본 발명에 따르면 도 6에서 나타나는 바와 같이 1:1000 ~ 1:4000 모두 정량적 범위로 적당하였지만 1:1000일 때 가장 적당하였다. 즉, 피어슨의 곱 모멘트 상관 계수(R2) 값이 1에 가까운 농도가 1:1000 으로 가장 적당하였다.

본 발명에 있어서, 상기 e)단계에서 2차 항체 농도는 1:1000 ~ 1:3000인 것을 특징으로 하는 엔도칸 측정방법을 제공한다. 본 발명에 따르면 도 7에서 나타나는 바와 같이 1:1000 ~ 1:3000 모두 정량적 범위로 적당하였지만 1:1000일 때 가장 적당하였다. 즉, 피어슨의 곱 모멘트 상관 계수(R2) 값이 1에 가까운 농도가 1:1000으로 가장 적당하였다.

본 발명에 있어서, 상기 b)단계에서 엔도칸을 흡착시키는 농도는 0.5 ~ 1.0㎍/㎖ 인 것을 특징으로 하는 엔도칸 측정방법을 제공한다. 본 발명에 따르면 도 8에서 나타나는 바와 같이 0.5 ~ 1.0㎍/㎖ 모두 정량적 범위로 적당하였지만 0.5㎍/㎖이 1.0㎍/㎖ 보다 피어슨의 곱 모멘트 상관 계수(R2 )값이 1에 가까운 형태로 나타나 흡착농도는 0.5㎍/㎖일 때 가장 적당하였다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 엔도칸의 항체를 유효성분으로 함유하는 패혈증 또는 혈관염증 치료용 조성물을 제공한다. 엔도칸 (Endocan, also known Endothelial cell specific molecule-1, ESM)은 혈관내피세포에서 분비되는 단백질로서 165개의 아미노산으로 이루어진 dermatan sulfate proteoglycan이다. 엔도칸은 세포부착, 염증 및 종양과 깊은 영향이 있다고 알려져 있다. 특히, 염증인자인 TNF (tumor necrosis factor)-α 또는 IL (interleukin)-1β에 반응하여 그 발현이 증가된다. 현재, 엔도칸을 측정하는 방법은 direct sandwich ELISA 방법이 사용되고 상용화 되어 있으나, 이 방법 자체는 시료 및 시약의 오염에 취약한 단점이 있다. 이런 단점을 극복하고자 Competitive ELISA 방법을 개발하였다.

본 발명에 있어서, 상기 엔도칸은 서열번호 1의 아미노산을 갖는 것을 특징으로 하는 패혈증 또는 혈관염증치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 엔도칸은 혈관내피세포의 투과성 및 백혈구 이동을 증가시키는 것을 특징으로 하는 패혈증 또는 혈관염증치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따르면 도 2A(시험관 내) 및 도 2B(생체 내)에서 나타나는 바와 같이 엔도칸의 농도가 증가할수록 혈관내피세포의 투과성이 증가하는 것을 알 수 있다. 또한 APC 존재 시 APC가 혈관내피세포의 투과성을 줄여준다. 이는 혈관내피세포에서 엔도칸은 내피장벽투과성을 농도-의존적으로 증가시키며 APC는 과투과성으로부터 내피세포를 보호하는 것을 보여준다. 혈관내피의 순환하는 백혈구의 상피세포 넘어로의 이동은 혈관 염증질환의 발명동안 반드시 일어나는 단계이다. 본 발명에 따르면, 도 2C 및 도 2D에서 나타나는 바와 같이 엔도칸의 농도가 증가할수록 백혈구의 이동을 증가시키고 APC 존재 시 APC는 백혈구의 이동을 진압한다.

본 발명에 있어서, 상기 엔도칸은 혈관세포 장벽을 붕괴하는 것을 특징으로 하는 패혈증 또는 혈관염증 치료용 조성물을 제공한다. 세포에서 내피의 결합 단백질의 중요한 역할은 세포구조유지, 혈관의 투과성 그리고 백혈구 이동에 관여한다. 내피에서 세포부착은 주로 부착연접(adherence junction) 복합체에 의해 이루어진다. 이것은 부착의 견고함에 달려있는데 이것은 밀착연접(tight junctions) 또는 부착연접(adherence junctions)로서 표현된다. 게다가 MLC 인산화반응은 내피세포에서 밀착연접의 조절에 관여하고 occludin 및 zonula occludens은 밀착연접 단백질이다. 이것들은 내피장벽유지에 중요한 역할을 한다. 또한 부착연접은 Rho GTPase(Rac/Rho)에 의해 조절되는데 부착연접붕괴는 Rho 활성과 Rac의 비활성과 연관되어 있고 반대로 부착연접 재집합은 Rho의 비활성과 Rac 활성에 의에 동반된다. 본 발명에 따르면, 도 3A에서 나타나는 바와 같이 LPS 또는 엔도칸 처리 후 p-MLC 증가 및 ZO-1 와 occludin의 감소를 확인할 수 있고 또한 APC 처리 는 이와 반대되는 결과를 확인할 수 있다. 이는 내피장벽유지에 중요한 역할을 하는 p-MLC를 증가시키고 밀착연접 단백질인 occludin과 ZO-1을 감소시켜 혈관세포장벽을 붕괴시키는 것을 의미한다. 또한, 도 3B에서 볼 수 있듯이 LPS 또는 엔도칸 처리 시 부착연접을 조절하는 Rac는 감소(비활성화)하였고 Rho는 증가(활성화)하는 것을 확인할 수 있다. 이는 부착연접의 붕괴로 혈관세포장벽을 붕괴시키는 것을 의미한다.

본 발명의 약학조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학조성물의 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은 허용되는 약전을 기초로 투여경로에 따라 제형화될 수 있다(Fingi 등, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch.1, p.1, 1975; Lemington's Pharmaceutical Sciences, 18 ed., Mack Publishing Co, Easton, PA, 1990). 따라서, 제형은 정제, 환약, 분말, 향낭, 엘릭실제, 현탁제, 유화제, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 및 경질 젤라틴 캡슐, 멸균 주사용액, 멸균 포장 분말 등의 형태가 가능하다. 본 발명에 따른 약학조성물은 환자에게 투여된 후에 활성 성분의 즉효성, 지속성 및 서방성을 달성할 수 있도록 당해 기술 분야에 널리 공지된 방법들을 사용하여 제형화 될 수 있다.

엔도칸은 패혈증쇼크환자의 혈청에서 급격한 증가는 시사되어 왔고, 이러한 엔도칸의 증가는 내피손상의 진행 및 질병의 심각성과 연결되어 있다. 본 발명에서 엔도칸의 증가에 따른 혈관내피세포장벽 붕괴, 혈관세포의 투과성 및 백혈구 이동을 증가시키는 것을 확인하였고 엔도칸 중화-항체를 투여 시 상기의 증상들을 막는 것을 확인하였다. 따라서 이러한 엔도칸 항체를 이용한 엔도칸 분비 억제는 패혈증 또는 패혈증 쇼크 치료를 위해 사용될 수 있음을 확인하였다. 이에 따라 본 발명에서는 기존에 엔도칸 농도를 측정하기 위해 사용되어 온 Snadwich ELISA 방법과는 달리 상기 엔도칸-항체(Human Endocan/ESM-1 Antibody, R&D Systems, USA)를 이용한 competitive ELISA 방법은 항체간의 상호작용 문제점으로 인한 결과해석오류 방지, 시료의 오염 방지 및 광범위한 엔도칸 측정방법의 장점을 갖고있기 때문에 엔도칸을 측정하는데 유용하다.

도 1a은 LPS에 의해 유도되는 엔도칸 분비의 반응속도론 및 LPS로 유도된 엔도칸 분비에서 APC의 영향에 대한 것으로 HUVECs에서 LPS를 포함하는 세포(검은색)와 LPS를 포함하지 않는 세포(하얀색)를 시간에 따른 엔도칸 분비량을 나타낸 것이다.
도 1b는 LPS에 의해 유도되는 엔도칸 분비의 반응속도론 및 LPS로 유도된 엔도칸 분비에서 APC의 영향에 대한 것으로 동물에 LPS를 처리 시 시간에 따른 엔도칸 분비량을 나타낸 것이다.
도 1C는 LPS에 의해 유도되는 엔도칸 분비의 반응속도론 및 LPS로 유도된 엔도칸 분비에서 APC의 영향에 대한 것으로 세포에서 PC(하얀색) 또는 APC(검은색)를 3시간 동안 전처리 후 96시간 동안 LPS를 처리하였을 때 엔도칸의 분비량을 나타 낸 것이다.
도 1D는 LPS에 의해 유도되는 엔도칸 분비의 반응속도론 및 LPS로 유도된 엔도칸 분비에서 APC의 영향에 대한 것으로 도 C에서 PC의 전처리를 제외하고 αPAR-1 및 αEPCR을 APC와 함께 전 처리 했을 때 엔도칸의 분비량을 나타낸 것이다.
도 2A는 백혈구 이동 장벽 투과성에서 엔도칸의 영향에 관한 것으로 HUVEC에서 APC의 부재(하얀색) 및 APC 존재(검은색)하에 엔도칸 농도에 따른 투과성을 나타낸 것이다.
도 2B는 백혈구 이동 장벽 투과성에서 엔도칸의 영향에 관한 것으로 동물에서 엔도칸 또는 엔도칸과 APC를 함께 투여 시 Evans blue의 양을 나타낸 것이다.
도 2C는 백혈구 이동 장벽 투과성에서 엔도칸의 영향에 관한 것으로 HUVEC에서 APC의 부재(하얀색) 및 APC의 존재(검정색)하에 엔도칸 농도에 따른 이동성을 나타낸 것이다.
도 2D는 백혈구 이동 장벽 투과성에서 엔도칸의 영향에 관한 것으로 동물의 복강에서 엔도칸 및 엔도칸과 APC를 함께 주입 시 백혈구 수를 나타낸 것이다.
도 3A는 세포골격 재배열에서 엔도칸의 영향과 Rac 및 Rho의 활성화에 관한 것으로 HUVEC에 APS 전처리 또는 무처리된 상태에서 LPS 및 Endocan을 처리한 세포에서 면역블롯팅을 사용하여 p-MLC, Zo-1 및 occludin의 단백질 정도를 측정한 결과이다.(control:α-Tubulin)
도 3B는 세포골격 재배열에서 엔도칸의 영향과 Rac 및 Rho의 활성화에 관한 것으로 HUVEC에 APS 전처리 또는 무처리된 상태에서 LPS 및 Endocan을 처리한 세포에서 Rac 및 Rho를 측정한 결과이다.
도 3C는 세포골격 재배열에서 엔도칸의 영향과 Rac 및 Rho의 활성화에 관한 것으로 HUVEC에 APS 전처리 또는 무처리 된 상태에서 LPS 및 Endocan을 처리한 세포에서 F-actin를 염색한 결과이다.
도 4A는 엔도칸 처리 후 CLP의 혈청에서 APC 또는 엔도칸 중화-항체의 영향에 관한 것으로 control 항체처리(하얀색) 및 중화항체(검은색) 처리 시 시간에 따른 혈청에서의 엔도칸 양을 측정한 결과이다.
도 4B는 엔도칸 처리 후 CLP의 혈청에서 APC 또는 엔도칸 중화-항체의 영향에 관한 것으로 control PBS(하얀색) 및 APC(검은색) 처리 시 시간에 따른 혈청에서의 엔도칸 양을 측정한 결과이다.
도 5A는 치명적인 CLP에서 APC 또는 엔도칸 중화-항체의 영향에 관한 것으로 엔도칸 중화-항체를 주입하였을 때 생존률을 나타낸 결과이다.
도 5B는 치명적인 CLP에서 APC 또는 엔도칸 중화-항체의 영향에 관한 것으로 APC(검정색 네모) 또는 엔도칸 중화-항체(하얀색 네모)를 주입하였을 때 control CLP 생쥐(검은색 원형) 또는 CLP 생쥐의 생존률을 나타낸 결과이다.
도 6은 일차항체의 정량적 비율의 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 이차항체의 정량적 비율의 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 표준 단백질의 코팅 농도의 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 Lunginnov 사의 Sandwich ELISA 키트에서 엔도칸 측정범위를 나타낸 것이다.
도 10은 USCN LIFE SCIENCE.INC 의 Sandwich ELISA 키트에서 엔도칸 측정범위를 나타낸 것이다.
도 11은 ELISA의 원리를 도면으로 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1 : 세포배양

일차 인간혈액내피세포(HUVECs, Charles City, IA))는 growth supplement(Cambrex Bio Science)가 포함된 EBM-2 basal media에서 배양하여 5% CO2 37°C 상태에서 증식시킨다. HUVECs은 3~4 배양 후 실험에 사용한다. 인간 백혈구는 다섯 명의 건강한 지원자로부터 얻은 전체 혈액(15ml)로부터 바로 분리한다. 그리고 RPMI 1640 + 2 mM Glutamine + 10% FBS의 배양액을 사용하여 37°C 인큐베이터에서 유지한다.

실시예 2 : 동물생육

Orient Bio Co.(Sungnam, KyungKiDo, Republic of Korea)로부터 구입한 Male C57BL/6 mice (6-7-wk old, weighting 18-20 g)는 12일 동안 안정화시킨다. 동물은 온도 20-25°C 습도 40%~45% 상태에서 폴리카보네이트 케이지 하나 당 다섯 마리씩 가두고 12시간씩 반복적으로 명조건과 암조건을 순환시킨다. 그리고 먹이와 음용수를 주기적으로 공급하였다. 모든 동물들은 보살핌을 위해 설명서와 동일하게 처리된다. 그리고 실험동물의 사용은 경북대학교에서 공급된다.

실시예 3 : Competitive - ELISA (C- ELISA )의 항체 및 코팅 농도 측정

1. 일차항체의 정량적 비율의 결정

인간일차항체(human primary Antibody)의 정량적 비율을 구하기 위해 표준단백질(Human Endocan protein, Abnova)을 0.5㎍/㎖로 코팅하고, 2차 항체(peroxidase-conjugated anti-goat IgG항체, R&D System)를 1:2000으로 고정시킨 후, anti-endocan항체(Endocan/ESM-1 Antibody, R&D Systems, USA)의 농도를 1:500, 1:1000, 1:1500, 1:2000, 1:3000 그리고 1:4000으로 측정하였다. 그 결과(도 6) anti-endocan항체의 농도 정량적 비율은 1:1000일 때 적당하였다.

2. 이차항체의 정량적 비율의 결정

2차 항체의 정량적 비율을 구하기 위해 표준 단백질(Human Endocan protein, Abnova)을 0.5㎍/㎖로 코팅하고, anti-endocan항체( Endocan/ESM-1 Antibody, R&D Systems, USA)의 농도를 1:1000으로 고정시킨 후 2차 항체(peroxidase-conjugated anti-goat IgG항체, R&D System)의 농도를 1:1000, 1:2000 그리고 1:3000까지 농도별로 측정하였다. 그 결과(도 7) anti-endocan항체의 농도의 정량적 비율은 1:1000일 때, 그리고 이차항체의 농도는 1:1000일 때 적당하였다.

3. 코팅 농도의 결정

코팅 농도를 정하기 위해 anti-endocan항체(Endocan/ESM-1 Antibody R&D Systems, USA)의 농도를 1:1000, 2차 항체(peroxidase-conjugated anti-goat IgG항체, R&D System)의 농도를 1:1000으로 고정시키고 표준 단백질(Human Endocan protein, Abnova) 의 코팅 농도를 0.5 ㎍/㎖, 1.0 ㎍/㎖일 때 측정하였다. 그 결과(도 8), 1.0 ㎍/㎖과 0.5 ㎍/㎖ 두 가지 경우 모두 정량적 범위로 적당하였지만, 0.5 ㎍/㎖이 1.0 ㎍/㎖보다 피어슨의 곱 모멘트 상관 계수(R2)값이 1에 가까운 형태로 나타나서, 코팅 농도는 0.5 ㎍/㎖일 때 가장 적당하였다.

이상의 결과를 바탕으로 anti-endocan항체 그리고 2차 항체의 비율과 표준 단백질의 코팅 농도를 다음과 같이 결정하였다. 즉, 표준 단백질의 코팅 농도를 0.5㎍/㎖, anti-endocan항체의 농도는 1:1000 그리고 이차항체는 1:1000을 택하여 정량적 실험을 하였다. 이것을 Robard(1971)의 공식에 의해 log transformation시켰다.

여기서 b는 항원이 들어 있지않은 웰의 흡광도에 대한 각 농도에서의 퍼센트 값이다. 그 결과, 11 ng/ml에서 900 ng/ml까지 직선을 형성하여 그 측정가능 범위를 알았으며 0.1 ng/ml에서 900 ng/ml까지 측정할 수 있는 감도를 가진 것으로 나타났다.

실시예 4 : 엔도칸을 위한 효소면역측정법(C- ELISA )

96웰 플라스틱 플렛 마이크로디터 플레이트(Ninety-six well plastic flat microtiter plates, Corning, NY, USA)에 0.02% 아지드화 나트륨(sodium azide)를 포함하는 20mM 탄산염/중탄산염 용액(pH 9.6)과 함께 엔도칸 단백질을 코팅시킨 후 4°C에서 하루 동안 둔다. 플레이트는 PBS-0.05% Tween 20(PBS?-T)으로 세 번 세척하고 4°C에서 계속 둔다. 배양 배지나 생쥐 혈청에서 유지된 표준 단백질 엔도칸은 96웰 플라스틱 원형 마이크로티터 플레이터(96-well plastic round microtiter plates)에 37°C에서 90분 동안 항-HMGB1 항체(PBS-T, 1:500 희석)와 함께 미리 배양하여 둔다. 미리 배양된 시료는 미리 코팅된 플레이트로 옮긴 후 실온에서 30분 동안 배양한다. 플레이트는 PBS-T로 세 번 세척 후 과산화효소가 결합 된 anti-goat IgG 항체(PBS-T,1:2000 희석. R&D Systems)와 함께 실온에서 90분 동안 배양시킨다. 플레이트는 PBS-T로 세 번 세척 후 200μl 기질용액(100μg/ml ophenylenediamine and 0.003% H2O2)과 함께 암 조건하에 실온에서 60분 동안 배양시킨다. 8N H²SO⁴ 50μl 을 첨가하여 반응을 종료시킨 후, 490nm에서 흡광도를 측정한다.

LPS가 HUVECs와 생쥐에서 엔도칸을 유도하는지 아닌지 확인하기 위해서 ELISA를 사용한 결과, 시간 의존적 방식에 따라 HUVECs에서 엔도칸의 전체적 분비량을 확인하였고(도 1A), 100ng/ml LPS로 자극 후 24시간 후부터 96시간까지 지속적으로 엔도칸이 분비되었다. 엔도칸이 생쥐에서 내독소혈증이 일어나는 동안 체계적으로 분비되는지 확인하기 위해, 우리는 LPS 투여 후 혈청에서의 엔도칸 분비량을 측정하였다. 혈청의 엔도칸은 LPS의 반수치사량(LD50, 10 mg/kg) 투여 8시간 후에 급격히 나타났고, 48시간에서 72시간의 최고 발현양은 유지되었다(도 1B). 이러한 결과는 패혈증 매개자인 염증은 1차 배양된 인간내피세포와 생쥐에서 엔도칸의 지속적 분비를 유도한다는 것을 시사한다. 우리는 또한 HUVECs에서 APC(FDA에서 승인한 몇몇 패혈증의 치료제)가 LPS가 유도한 엔도칸 분비를 막는지 실험하였다. 도 1C에서 볼 수 있듯이 APC는 엔도칸 분비를 막았으나 지모겐(전구효소)PC는 그렇지 못했고, LPS 유도에 의한 엔도칸 분비를 양-의존적으로 막았다. 게다가 엔도칸 분비에서 APC의 저해효과는 그것의 기능적 수용체 PAR-1 및 EPCR에 의존적이다(도 1D).

실시예 5 : 시험관 내에서 투과성 분석

엔도칸 농도 증가에 따른 반응에서 내피세포투과성은 개조된 2-compartment chamber model을 사용하여 기능성 세포 단일층 쪽으로 Evans blue-bound albumin의 유동성을 측정함으로써 분광측정방법으로 측정한다. HUVECs은 3일 동안 3-μm 구멍크기와 12-mm 지름의 트렌스 웰에 웰당 5 × 10⁴으로 배양한다. 세포가 단일층으로 꽉 차면 여섯 시간 동안 엔도칸(0 ~ 10 nM) 농도를 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10 nM의 농도로 6시간 동안 1번씩 증가시켜 배양시킨다. 앞서 엔도칸을 처리하기 전 세포는 3시간 동안 50nM APC를 전처리한다. APC 전처리 후, Insert는 4% BSA를 함유하는 성장배지에 희석된 0.5 ml의 Evans blue (0.67 mg/ml)를 넣기 전에 PBS(pH 7.4)로 세척한다. 깨끗한 성장배지는 lower chamber에 추가되고, upper chamber의 배지는 Evans blue/BSA와 함께 교체된다. 10분 후, lower chamber에서 광학밀도는 650nm에서 측정한다. 실험은 3배수로 적어도 세 번 수행한다.

그 결과, 도 2A에 나타나는 바와 같이 엔도칸은 내피장벽투과성을 강화하는데 농도-의존적 이라는 것을 보여준다. 붕괴의 중요한 영향은 엔도칸의 농도가 1nM 일 때 관찰되어 진다. APC가 LPS에 의해 유도 된 과투과성으로부터 내피세포를 보호하는 것은 알려져 있다. 도 2A에서 보는 바와 같이 APC 존재 하에 HUVECs의 장벽 투과성을 줄여준다.

실시예 6 : 시험관 내에서 이동 분석

이동성 분석은 8μm 구멍 크기의 여과장치를 사용하고 6.5mm 지름의 transwell plates에서 수행된다. HUVECs(6 x 10⁴)은 융합된 내피 단일층 존재하에 3일 동안 배양된다. upper compartment에 백혈구를 처리하기 전에, 세포 단일층은 6시간 동안 엔도칸(0 - 10 nM) 농도를 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10 nM의 농도로 6시간 동안 1번씩 증가시켜 처리한다. 그리고 세포는 앞서 엔도칸을 처리하기 전에 3시간 동안 50 nM APC와 함께 전처리한다. Transwell plates는 5% CO₂에서 2시간 동안 37°C에서 배양한다. upper chamber에서 세포는 여과장치 아래쪽으로 빨아들여지고, 여과장치 위에서 움직이지 않은 세포는 면봉으로 제거한다. 여과장치의 아래쪽에 있는 백혈구는 8% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)로 고정하고 20% methanol(w/v)에 0.25% crystal violet로 염색한다. 각 실험은 각 웰 당 두 개의 웰 에서 반복하고, 현미경 측정(HPF, 200×)을 통해 가장 높은 웰에서 무작위로 아홉 개를 선택하여 개수한다. 그리고 이것은 이동 지수를 나타낸다.

그 결과, 혈관 내피의 순환하는 백혈구의 상피세포 넘어로의 이동은 혈관 염증질환의 발병 동안 반드시 일어나는 단계이다. 도 2C에서 볼 수 있듯이 엔도칸은 HUVECs에서 상피세포 넘어로의 이동을 강화시키고 APC는 엔도칸이 매개로 인한 상피세포로의 이동을 진압한다.

실시예 7 : 생체 내에서 투과성 분석 및 백혈구 이동 분석

Evans blue dye solution(1%)를 포함하는 생리 식염수는 각각의 생쥐에 정맥주사로 주입한다. 그리고 여기에 엔도칸(200 - 900 μg/mouse, i.p.)을 즉시 주입한 후 바로 APC (5 or 10 μg/mouse, i.v.)를 즉시 주입한다. 30분 후 생쥐를 희생시키고 복막의 분비물은 식염수 5ml을 빈 부분에 세척함으로써 수득한다. 그리고 10분 동안 200xg로 원심분리 한다. 상층액의 흡광도는 Sunrise ELISA Analyzer (Tecan Company, Austria)를 사용하여 650nm에서 측정한다. 혈관의 투과성은 생쥐 한 마리당 염색시료(μg)로 나타난다. Evans blue 정도는 표준곡선을 사용하여 결정한다.

그 결과, 생체 내에서 엔도칸의 전염증 기능의 중요성은 생쥐에 엔도칸을 주입함으로써 평가되어 진다. 그 후 복막강의 혈장으로부터 BSA가 결합 된 Evans blue dye의 분비를 이용하여 혈관의 투과성을 측정한다. 도 2B에 나타나는 결과는 엔토칸은 명확하게 내피의 투과성을 증가시킨다. 게다가, APC는 엔도칸에 의한 혈관 붕괴를 막아준다.

실시예 8 : 생체 내에서 백혈구 이동 분석

생체 내에서 백혈구 이동을 측정하기 위해서, 생쥐에 엔도칸(200 ~ 900μg/mouse, i.p.)을 포함하는 생리식염수를 처리하고, 그 후에 APC(5 or 10μg/mouse, i.v.)를 포함하는 생리식염수를 처리한다. 4시간 후, 생쥐를 희생시키고 복막의 빈 부분은 생리식염수 5ml로 세척한다. 복막 투석액(20μl)은 Turk's 용액(0.01% crystal violet in 3% acetic acid) 0.38ml과 함께 혼합한다. 그리고 백혈구 수는 광학현미경으로 개수한다.

그 결과, 세포에서의 결과와 생쥐에서도 동일하게 나타났다. 엔도칸은 복막강의 백혈구의 이동을 특히 강화시키고 APC는 이러한 엔도칸의 영향을 제압한다.

실시예 9 : Rho 및 Rac 의 활성

HUVECs은 6웰 배양 디시에 꽉 찰 때까지 성장시키고 무혈청 배지에서 하루 밤 동안 성장억제(starved)시킨다. RhoA 그리고 Rac1활성(RhoA-GTP or Rac1-GTP)은 일반적으로 사용가능한 키트(Cytoskeleton, Denver, CO, USA)를 사용하여 확인한다. 간단히, 무혈청 배지에서 하루 밤 동안 성장억제시킨 세포는 제조사에 의해 제공되는 세포 용해 버퍼를 사용하여 용해된다. Bio-Rad assay를 사용하여 단백질 농도를 결정 한 후 용해물의 50μg는 총 RhoA 측정을 위하여 웨스턴에 사용을 위해 저장해 둔다. 남은 샘플은 1시간 동안 번갈아 가며 4°C에서 glutathione-Sepharose beads에 GST fusion protein RBD (rhotekin Rho-binding domain) 20μg를 붙게 하여 함께 배양시킨다. RBD 단백질은 RhoA 활성화된 GTP-결합 형태에 특정하게 결합한다. 비드는 세척하고 로딩 버퍼에 재부유(resuspend)시키고, 단백질들은 10% SDS-PAGE(Sigma)에서 분리한다. PVDF membranes에 옮기고 항-RhoA 단클론 항체를 사용하여 웨스턴 블롯한다. 이러한 과정은 Rac1 활성을 확인하는 것은 제외하고 사용된다. Rac1활성을 확인하기 위해서는 적절한 세포 용해물은 GST-PAK PBD (Rac1 effector protein, p21 activated kinase 1) beads와 함께 배양되고 이것은 Rac1 의 활성 GRP-결합 형태에 특정하게 결합한다. 활성화된 Rac1과 전체적 양은 키트에서 제공되는 항-Rac1 단클론 항체를 사용하여 웨스턴 블럿을 통해 측정한다.

실시예 10 : Western blotting

인산화 된 MLC의 형태인 p-MLC, ZO-1 및 occludin은 APC의 함유 또는 비함유된 HUVECs에서 LPS 및 엔도칸을 처리하여 면역블롯팅을 이용하여 확인할 수 있다. 단백질들은 15% 겔에서 SDS-폴리아크릴아미드겔전기영동에 의해 분리되어진다. 그리고 분리된 단백질은 25mM 트리스(Tris, pH8.3), 192mM 글라이신(glycine) 및 20% 메탄올(methanol)을 포함하는 버퍼에서 나이트로셀룰로스(nitrocellulose)막에 전기적 이동에 의해 옮겨진다. 면역블롯은 다클론성 goat anti-human p-MLC, rabbit anti-rat ZO-1, rabbit anti-rat occludin 항체를 사용하여 수행된다. 면역블롯 밴드는 간접촬영방법(fluorography)을 통해 나타나는데, 이것은 ECL(enhanced chemiluminescence)시약(Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA)을 사용한다. α- Tubulin은 컨트롤로 사용된다.

그 결과, 도 3에서 나타나는 바와 같이 HUVECs의 면역블롯(Immunoblot)은 LPS 또는 엔도칸의 처리 후에 미오신의 p-MLC이 증가하는 것을 보여준다. 그리고 APC의 전처리는 엔도칸 처리 후 p-MLC levels를 뚜렷하게 줄여준다(도 3A). 게다가, LPS 또는 엔도칸은 ZO-1 and occludin 레벨을 감소시키고 APC의 전처리는 이러한 감소를 약화시킨다. 특히, 부착연접붕괴는 Rho 활성과 Rac의 비활성과 연관되어 있고 반대로 부착연접 재집합은 Rho의 비활성과 Rac 활성에 의에 동반된다. 도 3B에서 나타나는 바와 같이 LPS 또는 엔도칸의 투여는 Rac를 비활성 시키고, Rho를 활성화시킨다. 또한 APC는 Rac 및 Rho에서 이러한 엔도칸 영향에 대응되어 진다.

실시예 11 : 면역형광염색

HUVEC은 10% FBS를 포함하는 완전 배지에서 0.05% Poly-L-Lysine로 코팅된 glass cover slips에 꽉 찰 때까지 배양한다. 그리고 48시간 동안 유지시킨다. 세포는 1시간 동안 APC(50nM for 1 h)의 전처리 또는 무처리 상태에서 LPS (100ng/ml) 또는 엔도칸(10nM)로 자극한다. 세포골격 염색을 위해 세포는 4% 포름알데하이드(formaldehyde)가 포함 된 PBS(v/v)로 실온에서 15분 동안 고정시킨다. 그리고 면역염색을 위해 세포는 0.05% Triton X-100을 포함하는 PBS로 15분 동안 투과시키고, blocking buffer(5% BSA in PBS)로 4°C에서 하루 동안 저지(blocking)시킨다. 세포는 1차 mouse 단클론 항체(1:400, diluted in 5% BSA in PBS)와 함께 배양시킨다. 세포골격을 이루는 단백질인 이 F-actin은 플루오레세인(fluorescein) 팔로이딘(phalloidin)(F 432; Molecular Probes, Invitrogen)로 4°C에서 하루 동안 표지시킨다.

fluorescein phalloidin가 표지된 F-actin과 함께 HUVEC 단일층을 면역형광법 염색에 의해 HUVEC 엑틴 세포골격 재배열에서의 엔도칸 영향을 실험한 결과, HUVECs는 세포 분계선에서 엑틴필라멘트 묶음의 몇몇의 위치와 함께 세포를 제외하고 무작위적으로 F-actin이 붕괴되는 것을 보여준다. 엔도칸에 의한 장벽붕괴는 HUVECs에서 세포 사이의 공간 (그림에서 화살표로 나타남)형성에 의해 나타나진다. 비슷한 세포골격 재배열은 LPS에 의해 유도된다(도 3C). 또한 APC의 전처리(50nM)는 엔도칸의 유도로 생성된 밀접한 F-actin 원의 형성과 함께 세포 사이의 공간을 막는다.

실시예 12 : Cecal ligation and puncture ( CLP )

패혈증을 유도하기 위해서, 수컷생쥐는 졸레틸(zoletil) 50와 rompun로 흡입기를 사용하여 마취시킨다. CLP로 유도된 패혈증 모델은 2cm 정중선 절개하는데 이는 옆 창자 부분과 함께 막창자를 노출시킨다. 막창자는 맹장 끝 부분으로부터 5.0mm 정도 3.0 견봉합사(3.0-silk suture)로 단단히 묶는다. 그리고 22-gauge needle로 구멍 하나를 뚫는다. 막창자는 적은 배설물 전체를 빼내기 위해 절취선 위치로부터 부드럽게 짜낸다. 그리고 복강으로 다시 넣는다. 개복 부분은 4.0-silk로 꿰맨다. 임의적 컨트롤 동물에서는 묶거나 구멍이 뚫리지 않은 상태로 노출된다. 그리고 복강으로 다시 넣는다. 이 방법은 경북대의 동물보호위원회에 의해 이전에 승진되었다. 패혈증 생쥐 CLP모델은 패혈증에서 혈장 엔도칸 존재의 농도를 확인하기 위해서 사용하였다. LPS로 유도한 내독소혈증보다 CLP 모델이 인간패혈증과 더 비슷하다.

그 결과, 수술 24시간 후 동물은 오한, 곤두선 털 및 약해짐과 같은 패혈증 증상을 나타내기 시작한다. 혈청에서 엔도칸 양은 CLP로 유도된 패혈증 마우스에서 증가한다(도 4A). 그리고 엔도칸 중화-항체(Endocan/ESM-1 Antibody, R&D Systems, USA)를 투여하였을 때 혈청의 엔도칸 양이 감소한다. 그러나 엔도칸 중화-항체 양을(9 μg/mouse, 2시간 후) 일회량 투여 시, CLP-유도된 모델의 사망을 막을 수 없었다. CLP 후의 혈청에서의 엔도칸 축적(도 4, 하얀색 상자)및 상대적으로 짧은 항체의 생물학적 반감기는 반응속도론을 기초로 하였다. 우리는 늦게 나타나는 매개체의 완전한 중화는 반복적 복용이 요구될 것이라고 추론하였다. 따라서 엔도칸 항체들은 CLP 후에 2시간 그리고 50시간에서 9μg/mouse을 투여하였고, 이러한 투여는 엔도칸 분비를 억제하였다. 게다가, APC는 또한 CLP로 유도된 패혈증 마우스에서 혈청에서 엔도칸 양의 분비를 감소시켰다(도 4B).

CLP로 유도된 패혈증으로부터 중화항체가 보호하는지 아닌지 조사하기 위해 엔도칸 항체를 CLP 후의 생쥐에 투여하였다. 엔도칸 항체를 일회량(9μg/mouse, 2 h after CLP)투여 시 CLP로 유도된 사망을 막을 수 없었다. 그러나, CLP 후의 중성 엔도칸 항체에 의한 혈청에서 엔도칸 축척의 반응속도론을 기초로 하였다.(도 4), 우리는 엔도칸 항체를(9μg/mouse, one 2 h after CLP and one 50 h after CLP) 두 번 투여하였고, 생존율은 30% 까지 증가 되었다. 그러나 엔도칸 안티바디의 보호효과는 APC 보다는 약했다(도 B). 게다가 엔도칸의 항체 처리(9μg/mouse, 2 h and 50 h after CLP)는 생존을 매우 강화시켰다. 그러나 그보다 낮은 항체 양(3 μg/mouse, 도 5A)에서는 효과가 나타나지 않는 것을 관찰할 수 있다.

실시예 13 : 시판중인 Sandwich ELISA Kit 와 비교

ELISA Kit를 만드는 회사 중 세계적으로 가장 유명한 회사인 R&D System, Inc. (MN, USA)에서는 현재 mouse endocan을 측정하는 Kit은 판매하고 있지만, human endocan을 특정하는 Kit은 없는 실정이다. 현재 Human endocan을 측정하기 위한 시판중인 Sandwich ELISA Kit와 본 발명의 Competitive ELISA(C-ELISA)와 비교를 했을 때 Lunginnov의 경우 엔도칸의 측정범위는 2.5ng/ml 에서 10ng/ml 이며(도 9), USCN LIFE SCIENCE, INC에서 시판중인 Sandwich ELISA Kit의 측정 범위는 0.156ng/ml 에서 10 ng/ml이다(도 10).

따라서 0.1ng/ml에서 900ng/ml까지 측정할 수 있는 본 발명의 C-ELISA와 비교할 때 기존의 엔도칸 측정 키트 보다 더 효과적이라는 것을 확인할 수 있다.

<110> NOH, Eun Bee <120> Measurement of Endocan within blood <130> PN120319 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 226 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Lys Ser Val Leu Leu Leu Thr Thr Leu Ala Leu Val Pro Ala His 1 5 10 15 Leu Val Ala Ala Trp Ala Ser Asn Asn Tyr Ala Val Asp Cys Pro Gln 20 25 30 Ala His Cys Asp Ser Ser Glu Cys Lys Ser Ser Ala Pro Arg Cys Lys 35 40 45 Arg Thr Val Leu Asp Asp Ala Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Ala 50 55 60 Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg Gly Glu Thr Cys Tyr 65 70 75 80 Arg Thr Val Ser Ala Gly Met Asp Gly Met Lys Cys Gly Pro Gly Ala 85 90 95 Leu Arg Cys Gln Pro Ser Asn Gly Glu Asp Ala Pro Phe Gly Glu Glu 100 105 110 Phe Gly Ile Cys Lys Ala Asp Cys Pro Tyr Gly Thr Phe Gly Met Asp 115 120 125 Ala Cys Arg Glu Thr Cys Asn Cys Gln Ser Gly Ala Ala Ala Ala Ala 130 135 140 Ala Ala Ala Ala Ile Cys Asp Arg Gly Thr Gly Lys Cys Leu Ala Lys 145 150 155 160 Phe Pro Phe Phe Gln Tyr Ser Val Thr Ala Lys Ser Ser Asn Arg Phe 165 170 175 Val Ser Leu Thr Ala Glu His Asp Met Ala Ser Gly Asp Gly Asn Ala 180 185 190 Ile Val Arg Glu Glu Val Val Lys Glu Asn Ala Ala Ala Gly Ser Pro 195 200 205 Val Met Arg Lys Trp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Asn 210 215 220 Pro Arg 225

Claims

하기 단계를 포함하는 엔도칸 측정방법:
a) 표준단백질인 엔도칸을 준비하는 단계;
b) 상기 엔도칸을 마이크로티터 플레이트에 흡착시킨 후 블록킹 하는 단계;
c) 1차 항체와 시료를 반응시키는 단계;
d) 상기 c) 단계의 반응액을 표준단백질이 흡착 된 플레이트에 넣는 단계;
e) 상기 d)단계의 결과물에 효소가 결합된 2차 항체를 첨가하는 단계;
f) 세척 후 상기 효소 기질액을 넣고 반응시킨 후 반응 중지액을 넣고 반응을 중지시키는 단계; 및
g) 상기 f)단계 후 반응액의 흡광도를 측정하는 단계.
제 1항에 있어서, 상기 엔도칸 측정방법은 엔도칸 농도가 0.1 ~ 900ng/㎖ 측정범위인 것을 특징으로 하는 엔도칸 측정방법.
제 1항에 있어서, 상기 c)단계에서 1차 항체 농도는 1:1000 ~ 1:4000 (항체:버퍼의 부피비)인 것을 특징으로 하는 엔도칸 측정방법.
제 1항에 있어서, 상기 e)단계에서 2차 항체 농도는 1:1000 ~ 1:3000 (항체:버퍼의 부피비)인 것을 특징으로 하는 엔도칸 측정방법.
제 1항에 있어서, 상기 b)단계에서 엔도칸을 흡착시키는 농도는 0.5 ~ 1.0㎍/㎖ 인 것을 특징으로 하는 엔토칸 측정방법.
엔도칸의 항체를 유효성분으로 함유하고, 상기 엔도칸은 서열번호 1의 아미노산을 갖는 것을 특징으로 하는 패혈증 또는 혈관염증 치료용 조성물.
삭제
제 6항에 있어서, 상기 엔도칸은 혈관내피세포의 투과성 및 백혈구 이동을 증가시키는 것을 특징으로 하는 패혈증 또는 혈관염증치료용 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 엔도칸은 세포 장벽을 붕괴하는 것을 특징으로 하는 패혈증 또는 혈관염증 치료용 조성물.