JP2011046720A - Ｖｅｇｆの選択的阻害による癌処置のための組成物および方法 - Google Patents

Ｖｅｇｆの選択的阻害による癌処置のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

【課題】新規の治療組成物、ならびに抗脈管形成および抗腫瘍処置においてそれを使用するための方法を提供すること。
【解決手段】上記組成物は、生物学的有効量の抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗原結合フラグメントを含み、この抗体は、モノクローナル抗体ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５と実質的に同じエピトープに結合し、かつＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害する。
【選択図】図４

Description

（発明の背景）
本願は、同時係属中の米国仮出願番号６０／１３１，４３２（１９９９年４月２８日出願）に対する優先権を主張し、本願の本文および図面の全体が、棄権することなく本明細書中で参考として特に援用される。米国政府は、国立保健研究所の助成金番号１ＲＯ１ ＣＡ７４９５１、５ＲＯ ＣＡ５４１６８およびＴ３２ ＧＭ０７０６２に従って、本発明の権利を所有する。
（１．発明の分野）
本発明は一般に、抗体、脈管形成および腫瘍の処置の分野に関する。より詳細には、本発明は、２つのＶＥＧＦレセプターの一方（ＶＥＧＦＲ２）へのＶＥＧＦの結合のみを特異的に阻害する抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。このような抗体は脈管形成を阻害し、そして腫瘍後退を誘導し、そしてさらにそれらの特異的ブロッキング特性に起因して改良された安全性を有する。本発明の抗体ベースの組成物および方法はまた、免疫結合体および他の治療上の組み合わせ、プロドラッグを含むその結合体を含有するキットおよび方法の使用に及ぶ。
（２．関連技術の説明）
化学治療剤に対する腫瘍細胞耐性は、臨床腫瘍学において有意な問題を示す。実際に、これは、この分野の特定の進歩にもかかわらず、ヒト癌のほとんどの流行形態の多くが、効果的な化学治療に未だ耐性である主な原因の１つである。
別の腫瘍処置ストラテジーは、「イムノトキシン」の使用であり、ここで抗腫瘍細胞抗体は毒素を腫瘍細胞に送達するために使用される。しかし、化学治療アプローチと共通して、イムノトキシン治療はまた、充実性腫瘍に適用した場合、重要な欠点を被る。例えば、抗原陰性または抗原欠損細胞は残存し、腫瘍を再増殖するか、またはさらなる転移を導き得る。
抗体ベースの治療に対する充実性腫瘍の耐性に関するさらなる理由は、腫瘍塊が一般に、抗体およびイムノトキシンのような高分子薬剤に対して不浸透性であることである（Ｂｕｒｒｏｗｓら、１９９２；Ｄｖｏｒａｋら、１９９１ａ；ＢａｘｔｅｒおよびＪａｉｎ，１９９１）。腫瘍内の物理的拡散距離および間隙の圧力の両方は、このタイプの治療に対する有意な制限である。従って、充実性腫瘍（これは全てのヒト癌の９０％より多くを占める）は、抗体および免疫毒性処置に対するさらに証明された耐性を有する。
さらに最近のストラテジーは、充実性腫瘍の脈管構造を標的にしている。腫瘍細胞自体よりむしろ、腫瘍の血管を標的にすることは、耐性腫瘍細胞の発達を導きそうになく、そして標的細胞が容易に接近可能であるという点において特定の利点を有する。さらに、多くの腫瘍細胞は、それらの酸素および栄養素に関して単一の血管に頼っているため、血管の破壊は、抗腫瘍効果の増幅を導く（ＢｕｒｒｏｗｓおよびＴｈｏｒｐｅ、１９９４ａ；１９９４ｂ）。代表的な血管標的ストラテジーは、特許文献１および特許文献２に記載され、これらは特に、抗細胞性薬剤および毒素の腫瘍脈管構造のマーカーへの標的送達を記載する。
血管標的アプローチの別の効果的なバージョンは、腫瘍脈管構造内で発現または吸着されたマーカーに対して凝固因子を標的にすることである（Ｈｕａｎｇら、１９９７；特許文献３、特許文献４、および同第５， 、 号（米国出願番号０８／４８２，３６９（１９９８年１０月２０日特許証発行料金支払））。毒素よりむしろ凝血薬を腫瘍脈管構造に送達することは、減少した免疫原性、および毒素の副作用のさらに低い危険性のさらなる利点を有する。特許文献３に記載されるように、このような腫瘍特異的「凝血薬」における使用に好ましい凝固因子は、短縮形態のヒト凝固誘導タンパク質、組織因子（ＴＦ）、血液凝固の主なイニシエータである。
毒素および凝固因子の腫瘍血管への特異的送達は、腫瘍処置における有意な進歩を示すが、特定の周辺腫瘍細胞はこのような治療によって生じる腫瘍内破壊を生存し得る。従って、抗脈管形成ストラテジーは、特許文献１および特許文献３の腫瘍破壊方法との組み合わせた用途を有する。
抗脈管形成腫瘍処置ストラテジーは、一般に充実性腫瘍の周辺における、出芽血管の増殖を阻害することに基づく。これらの治療は主に、微小転移巣の危険性を減らすため、またはより従来的なインターベンション（例えば、手術または化学治療）の後、充実性腫瘍のさらなる増殖を阻害するために用いられる。
脈管形成は、既存の血管および／または循環内皮幹細胞からの新しい血管の発生である（Ａｓａｈａｒａら、１９９７；Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、１９９８；ＦｏｌｋｍａｎおよびＳｈｉｎｇ、１９９２）。脈管形成は、多くの生理学的プロセス（例えば、胚形成、創傷治癒および月経）において重要な役割をはたす。脈管形成はまた、特定の病理学的現象において重要である。充実性腫瘍増殖および転移における役割に加えて、脈管形成成分を有する他の注目すべき状態は、関節炎、乾癬、および糖尿病網膜症である（ＨａｎａｈａｎおよびＦｏｌｋｍａｎ、１９９６；ＦｉｄｌｅｒおよびＥｌｌｉｓ、１９９４）。
脈管形成は、正常組織および悪性組織において、脈管形成刺激、および標的組織および遠隔部位において産生される脈管形成インヒビターのバランスによって調節される（Ｆｉｄｌｅｒら、１９９８；ＭｃＮａｍａｒａら、１９９８）。血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ、血管浸透性因子、ＶＰＦとしても公知）は、脈管形成の一次刺激薬である。ＶＥＧＦは、低酸素および腫瘍形成変異によって引き起こされ、そして様々な組織によって産生され得る多機能性サイトカインである（Ｋｅｒｂｅｌら、１９９８；Ｍａｚｕｒｅら、１９９６）。
病理状態における脈管形成の一次刺激薬としてのＶＥＧＦの認識は、ＶＥＧＦ活性をブロックする様々な試みに至った。阻害性抗ＶＥＧＦレセプター抗体、可溶性レセプター構築物、アンチセンスストラテジー、ＶＥＧＦに対するＲＮＡアプタマー、および低分子量ＶＥＧＦレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）インヒビターは、全て、ＶＥＧＦシグナル伝達を妨害する際の使用が提案されている（Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒら、１９９８）。実際に、ＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体は、ヒト腫瘍異種移植片の増殖およびマウスにおける腹水形成を阻害することが示されている（Ｋｉｍら、１９９３；Ａｓａｎｏら、１９９８；Ｍｅｓｉａｎｏら、１９９８；Ｌｕｏら、１９９８ａ；１９９８ｂ；Ｂｏｒｇｓｔｒｏｍら、１９９６；１９９８）。
上記の研究は、充実性腫瘍増殖におけるＶＥＧＦの重要性、および腫瘍治療のための標的としてのその可能性を強調しているが、ＶＥＧＦ誘導脈管形成を阻害するさらなる薬剤の同定は、治療的選択肢の数を拡大する際の利点となる。より特異的にＶＥＧＦレセプター結合を阻害する治療剤の開発は、それらの抗腫瘍効果が改良された特異性によって実質的に損なわれない限り、重要な進歩を示す。
米国特許第５，８５５，８６６号明細書 米国特許第５，９６５，１３２号明細書 米国特許第５，８７７，２８９号明細書 米国特許第６，００４，５５５号明細書
（発明の要旨）
本発明は、新規の治療組成物、ならびに抗脈管形成および抗腫瘍処置において使用するための方法を提供することによって、従来技術における特定の欠点を克服する。本発明は、２つの主要なＶＥＧＦレセプターの一方（ＶＥＧＦＲ２）へのＶＥＧＦの結合のみを特異的に阻害する抗体に基づく。このような抗体は脈管形成を阻害し、そして他の抗ＶＥＧＦ抗体（すでに臨床試験されているものを含む）と同じぐらい効果的に腫瘍後退を誘導し、そしてさらに、それらの特異的遮断特性に起因する改良された安全性を有する。本発明の組成物および方法はまた、特定の部類の提供される抗体を使用する、免疫結合体および組み合わせ（プロドラッグを含む）の使用まで拡大する。
本発明の特定の利点は、提供される抗体が、ＶＥＧＦＲ１ではなく、ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合のみを阻害することである。これは、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ１の両方へのＶＥＧＦの結合を阻害する従来技術の主要抗体（Ａ４．６．１を含む）と対照をなす。特にマクロファージ移動および化学走性、ならびに破骨細胞および軟骨吸収細胞の機能において、ＶＥＧＦＲ１は脈管形成と無関係の重要な生物学的役割を有するため、ＶＥＧＦＲ２媒介性脈管形成のみを阻害する現在の能力は別の利点である。マクロファージが宿主抗腫瘍応答を依然として媒介し得るという点において、および、例えば、小児癌の処置における、骨代謝が悪影響を受けないという点において、これは注目すべき臨床的利点に変わる。
さらなる利点は、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ１への結合は本発明の抗体の存在において維持されるため、これらが、腫瘍内皮上でアップレギュレートされるＶＥＧＦＲ１に結合するＶＥＧＦへの結合によって、腫瘍脈管構造へ結合した治療薬を特異的に送達するために使用され得る。従って、免疫結合体の状況において、本発明は、抗脈管形成特性および腫瘍破壊特性の両方を同じ分子内に有する薬剤を提供する。
ＶＥＧＦＲ２により媒介される、ＶＥＧＦの生存シグナルを中和するために提供される組成物の能力において、さらなる利点が存在する。従って、本発明の裸の抗体および結合体化した抗体は、他の治療および／または結合した薬剤、特にそれらの破壊特性を妨げるＶＥＧＦの能力のため、インビボで最大の有効性を達成しない方法および薬剤との相乗的な組み合わせを形成する。
従って、本発明は、ＶＥＧＦＲ２レセプターへのＶＥＧＦの結合を特異的にブロックするか、または本質的にＶＥＧＦＲ２レセプターへのＶＥＧＦの結合のみをブロックする抗体を提供する。このような抗体は、ＶＥＧＦＲ１レセプター（Ｆｌｔ−１）へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦＲ２レセプター（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害する。従って、これらの抗体は、ＶＥＧＦＲ２レセプター（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）へのＶＥＧＦの結合を阻害し、ＶＥＧＦＲ１レセプター（Ｆｌｔ−１）へのＶＥＧＦの結合を実質的に阻害せず、インビボで抗脈管形成効果および抗腫瘍効果を示し、そしてマクロファージ走化性、破骨細胞または軟骨吸収細胞の機能を有意に阻害しない。
従って、本発明の抗体は、簡単に「ＶＥＧＲＦ２−遮断、非ＶＥＧＦＲ１−遮断、抗ＶＥＧＦ抗体」と呼ばれる。さらにより簡単には、これらは「ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体」と呼ばれ、これは本発明の全ての組成物、用途および方法に関する簡潔さのために使用される。「ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体」は、ＶＥＧＦＲ２レセプターへのＶＥＧＦの結合をブロックするＶＥＧＦに対する抗体である。このような抗体はＶＥＧＦＲ２レセプター自体に対する抗体ではないことが明らかである。
本発明以前に、ＶＥＧＦＲ１ではなく、ＶＥＧＦＲ２レセプターへのＶＥＧＦの結合を特異的にブロックする抗ＶＥＧＦ抗体を生成する動機付けはなく、そのような抗体のいずれの利点も想定されなかった。重要なことに、遮断抗体は増殖因子とそのレセプター（単数または複数）の相互作用を物理的に妨げる必要があり、そして増殖因子上のレセプター結合部位はサイズ制限されるため、このような特異的ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体が開発され得るという示唆はなかった。
しかし、本明細書中で開示される本発明者らの驚くべき発見の観点から、この分野はここで、このような特異的阻害抗ＶＥＧＦ抗体が調製され、そして異なる利点を有し得るという知識を提供する。本願はさらに、候補ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体を生成するための方法論、および候補物のプールから実際のＶＥＧＦＲ２遮断特異的抗体を同定するために必要とされるアッセイの慣用技術の局面を記載する。従って、本発明の観点において、ある範囲のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体が、ＶＥＧＦＲ１レセプターを経由するＶＥＧＦのシグナル伝達を阻害することなく、かつ顕著な欠点およびそれに関連する副作用のない、脈管形成の阻害、および脈管形成疾患および腫瘍の処置に関与する様々な実施形態において作製および使用され得る。
本明細書全体にわたって使用される場合、用語「ａ」および［ａｎ」は、上限がその後詳細に記載される場合を除いて、「少なくとも１つ」、「少なくとも第１の」、「１つ以上の」、または「複数の」参照成分または工程を意味する意図で使用される。従って、本明細書中で使用される場合、「抗体」とは、「少なくとも第１の抗体」を意味する。組み合わせの実施可能な制限およびパラメーターは、任意の単一の薬剤の量のように、本開示の観点において当業者に公知である。
「ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）へのＶＥＧＦの結合を特異的に阻害する」抗体は、ここで、競合および／または機能性アッセイにより同定され得る。簡潔さのために好ましいアッセイは、ＥＬＩＳＡに基づく競合アッセイである。競合アッセイにおいて、ＶＥＧＦを可変量の試験抗体（例えば、１００倍〜１０００倍過剰モル）と予備混合または混和し、試験抗体がＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合を減少させる能力を決定する。ＶＥＧＦは、予め標識されそして直接検出され得るか、または（二次）抗ＶＥＧＦ抗体または二次および三次抗体検出システムを使用して検出され得る。このような競合アッセイのＥＬＩＳＡフォーマットが好ましいフォーマットであるが、任意のタイプの免疫競合アッセイが実施され得る。
全く関係のない抗体（非遮断抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体を含む）の存在下でＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合は、このような競合アッセイにおけるコントロールの高値（１００％）である。試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下における、ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合の有意な減少は、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害する試験化合物を示す。
有意な減少は、「再現可能な」、すなわち、一貫して観測される結合の減少である。本明細書の用語における、「有意な減少」は、ＶＥＧＦに対する抗体の約１００倍と約１０００倍過剰モルとの間の任意の量において、少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、または約６５％の（ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合の）再現可能な減少として定義される。
本発明の好ましい特徴は、提供される抗体がＶＥＧＦＲ１へのＶＥＧＦの結合を実質的に阻害しないことであるため、ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合の中程度の有意な減少を示す抗体は、それらがＶＥＧＦＲ１へのＶＥＧＦの結合を実質的に阻害しない限りは、なお有用である。それにもかかわらず、より好ましい抗体は、ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合を阻害するより有意な能力を有する抗体である。これらの抗体は、ＶＥＧＦに対する抗体の約１００倍と約１０００倍過剰モルとの間の任意の量において、少なくとも約７０％、約７５％、または約８０％、ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合を減少する再現可能な能力を示す抗体である。本発明を実施する必要はないが、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％またはさらにそれ以上、ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合を減少する抗体は、決して除外されない。
抗ＶＥＧＦ抗体、またはそれらの抗原結合フラグメント（これらは、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／ｆｌＫ−１）へのＶＥＧＦの結合を阻害する）は、単純だが、ＶＥＧＦＲ１を使用する、上記のような競合アッセイにより容易に確認される。
有意な減少の欠如は、「再現可能な」、すなわち、一貫して観測される「結合の実質的な維持」である。本明細書中の用語における「結合の実質的な維持」は、ＶＥＧＦに対する抗体の約１００倍と約１０００倍過剰モルとの間の任意の量において、少なくとも約６０％、約７５％、約８０％、または約８５％の（ＶＥＧＦＲ１へのＶＥＧＦの結合における）再現可能な維持として定義される。
ＶＥＧＦＲ１へのＶＥＧＦの結合を実質的に阻害しない抗体を使用する意図は、ＶＥＧＦＲ１により媒介される生物学的機能を維持することである。従って、抗体は、生物学的応答がＶＥＧＦにより誘導されるように、ＶＥＧＦＲ１へのＶＥＧＦの十分な結合を維持することのみを必要とする。それでもなお、より好ましい抗体は、ＶＥＧＦＲ１へのＶＥＧＦの結合を維持するより有意な能力を有する抗体である。これらの抗体は、ＶＥＧＦに対する抗体の約１００倍と約１０００倍過剰モルとの間の任意の量において、少なくとも約８８％、約９０％、約９２％、約９５％、または約９８〜９９％のレベルで、ＶＥＧＦＲ１へのＶＥＧＦの結合を維持する再現可能な能力を示す抗体である。
ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合をより実質的に阻害する抗体は、ＶＥＧＦＲ１を結合することにおいてさらなる減少を許容し得るようであることが理解される。同様に、抗体がＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合において中程度の減少を有する場合、ＶＥＧＦＲ１への結合の維持はより厳密に追求されるべきである。
抗体がＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）へのＶＥＧＦの結合を阻害することを同定および／または確認するための別の好ましい結合アッセイは、共沈アッセイである。共沈アッセイは、溶液中の１つ以上のレセプターへのＶＥＧＦの結合をブロックする抗体の能力を試験する。このようなアッセイにおいて、ＶＥＧＦまたは検出可能に標識されたＶＥＧＦは、適切な形態のレセプターと共にインキュベートされる。
免疫沈降アッセイまたは共沈アッセイを実施するための多くの様式がある。本発明の場合において、「適切な形態のレセプター」は、問題のＶＥＧＦＲ２レセプター、またはそのレセプターの細胞外ドメインであり得る。次いで免疫沈降は、標準試薬と同様に、ＶＥＧＦＲ２レセプターに対する抗体、またはＶＥＧＦが結合する部位とは異なるレセプターの細胞外ドメインの上のエピトープに対する抗体の存在を必要とする。本発明は、他の「適切な」形態のＶＥＧＦレセプター、すなわち、Ｆｃ抗体部分に結合したレセプターの細胞外ドメインを提供する。このようなレセプター／Ｆｃ構築物は、プロテインＡベースの組成物のような有用な免疫沈降組成物と共にインキュベートすることによって沈降され得る。
適切なレセプターに関係なく、好ましくは、免疫沈降アッセイまたは共沈アッセイが、コントロールを用いて実施される。ＶＥＧＦのみが選択したレセプターに結合する能力は、抗ＶＥＧＦ抗体の非存在下での沈降により確認されるべきである。好ましくは、並行インキュベーションが、コントロールとして作用する公知の結合特性を有する抗体の存在下または非存在下で行われる。最も好ましくは、遮断コントロールおよび非遮断コントロール抗体の両方を使用するアッセイが、並行して行われる。
次いで、任意の結合免疫学的種は、例えば、効果的な免疫沈降組成物（例えば、プロテインＡ組成物またはプロテインＡセファロースビーズ）とのインキュベートによって免疫沈降される。次いで、この沈降物は、ＶＥＧＦの存在について試験される。最初のインキュベーションにおけるＶＥＧＦが、検出可能に標識されたＶＥＧＦ（例えば、放射能標識したＶＥＧＦ）であった場合、免疫沈降物におけるあらゆるＶＥＧＦは、直接検出され得る。免疫沈降物における任意の未標識ＶＥＧＦは、その他の適切な手段によって（例えば、ゲル分離および抗ＶＥＧＦ抗体での免疫検出によって）検出され得る。
抗体がＶＥＧＦレセプター（例えば、ＶＥＧＦＲ２）へのＶＥＧＦの結合を遮断する能力は、共沈殿アッセイのようなアッセイにおいて容易に定量化され得るが、定量の結果はまた有益である。定量化は、標識化ＶＥＧＦの直接測定によって（すなわち、例えば、免疫検出されたＶＥＧＦのデンシトメトリー分析によって）達成され得る。従って、再現可能な（すなわち、一貫して観察される）ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合を阻害する能力を示す抗体は、検出され得、そして有用な抗体は、上記で概説された定量基準に従って選択され得る。
ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害しない、抗ＶＥＧＦ抗体はまた、ＶＥＧＦＲ２ではなくてＶＥＧＦＲ１を用いて上記のような共沈殿アッセイを行うことによって容易に同定され得る。従って、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害しないが、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）へのＶＥＧＦの結合を阻害する、抗ＶＥＧＦ抗体はまた、このような方法を用いて容易に同定され得る。
本願はまた、抗体が、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害することを同定および／または確認するために種々の機能的アッセイを提供する。これらは、一般的には、特定の規定された生物学的応答を担うレセプターとしてのＶＥＧＦＲ２の同定に関する。無細胞系においておこなわれ、かつ最も再現性があり、確実であり、省力的であり、そして経済的である上記の競合型アッセイよりも好ましくないが、以下のアッセイは、それでもなお、本発明の文脈において有用である。
例えば、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ媒介性内皮細胞増殖を阻害する（ＶＥＧＦのマイトジェン活性を阻害する）能力について試験することによって同定され得る。任意の適切なアッセイは、試験抗体を有するかまたは有しないＶＥＧＦの存在下で種々の内皮細胞のいずれかを用いて使用され得る。好ましくは、２連アッセイは、平行して行われる（例えば、ＶＥＧＦを有しないアッセイおよび規定された特徴（遮断するおよび遮断しないの両方）のコントロール抗体を有するアッセイ）。内皮細胞増殖は決定され、そして好ましくは比色アッセイを含む、細胞数を決定する任意の容認可能な手段によって正確に定量される。
ＶＥＧＦ媒介性内皮細胞増殖を阻害する能力を有する抗体は、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％あるいはその程度のＶＥＧＦ媒介性内皮細胞増殖の一貫して観察された阻害を一般的に示す。このような範囲における阻害は、インビボでの新脈管形成を阻害するのに十分な特徴を有する抗体を示す。より有意な阻害活性を有する抗体は、本発明から除外されない。
本発明に従って抗体を同定するためのさらなる機能的アッセイは、ＶＥＧＦ誘導性リン酸化のブロックを試験するためのアッセイである。任意の適切なアッセイは、ネイティブかまたは組換えのリン酸化可能ＶＥＧＦＲ２のいずれかの形態を発現する、種々の内皮細胞のいずれかを用いて使用され得る。細胞は、適切な時間で試験されるべき抗体の存在または非存在下でＶＥＧＦとインキュベートされる。好ましくは、２連アッセイは、平行して行われる（例えば、ＶＥＧＦを有しないアッセイおよび規定される特徴（遮断するおよび遮断しないの両方）のコントロール抗体を有するアッセイ）。
ＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦ誘導性リン酸化は、決定され、そして好ましくは任意の受容可能な手段によって正確に定量化される。一般的には、ＶＥＧＦＲ２は、さらなる分析のために免疫沈降される。ＶＥＧＦＲ２のリン酸化の程度は、直接決定され得る。例えば、この細胞は、32Ｐ標識ＡＴＰとともにインキュベートされ得、これは、免疫沈降したＶＥＧＦＲ２内の32Ｐの直接の定量化を可能にする。好ましくは、免疫沈降したＶＥＧＦＲ２は、その他の手段によって（例えば、ゲル分離およびリン酸化チロシン残基に結合する抗体との免疫検出によって）分析される。ＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦ誘導性リン酸化を阻害する能力を有する抗体は、一般的には、リン酸化されたＶＥＧＦＲ２のレベルにおいて一貫して観察される減少を示す。
本発明に従ってＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体を同定するためのなおさらなる機能的アッセイは、ＶＥＧＦ誘導性脈管透過性の阻害を試験するためのアッセイである。任意のこのようなアッセイが使用されるが、特定の適切なアッセイは、Ｍｉｌｅｓ透過性アッセイである。ここで動物（例えば、モルモット）は、色素（Ｅｖａｎ青色素）とともに注射され、そしてこの動物の皮膚における色素の外観は、試験抗体の存在または非存在下でＶＥＧＦの供給後に決定される。好ましくは、２連研究は、平行して行われる（例えば、ＶＥＧＦを有しない研究および規定された特徴（遮断するおよび遮断しないの両方）のコントロール抗体を有する研究）。この動物の皮膚における色素の外観は、代表的にはこの動物の背面におけるスポット（例えば、青のスポット）であり、これは撮影および測定され得る。
ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体は、一貫して観察される低濃度（例えば、ＶＥＧＦに対して１００倍または１０００倍のモル濃度過剰で提供される場合）での阻害としてＶＥＧＦ誘導性脈管透過性を阻害する。ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合を遮断しない抗体は、ＶＥＧＦ誘導性脈管透過性の任意の有意な阻害を示さない。一般的には、高濃度（例えば、ＶＥＧＦに対して１０倍過剰なモル濃度）でのみＶＥＧＦ誘導性透過性を遮断する抗体は、本発明に従う特徴を有する抗体ではない。
新脈管形成、従って抗脈管形成剤の広範に受容可能な機能的アッセイは、新生血管形成の角膜のマイクロポケットアッセイおよびニワトリ漿尿膜のアッセイ（ＣＡＭ）アッセイである。米国特許第５，７１２，２９１号は、角膜マイクロポケットアッセイおよびＣＡＭアッセイが、新脈管形成の疾患の極めて広範の処置において使用する因子の同定を十分に予測することを示すことを参考として本明細書中で特に援用される。
米国特許第５，００１，１１６号はまた、ＣＡＭアッセイを記載する目的に関して本明細書中で参考として特に援用される。本質的には、受精したニワトリの胚は、３日目または４日目にそれらの殻から除去し、そして試験化合物を含むメチルセルロースディスクが、漿尿膜上に移植される。この胚は、約４８時間後に試験され、そして鮮明な無血管域が、メチルセルロースディスクの周辺に現れる場合、この区域の直径が測定される。米国特許第５，７１２，２９１号に開示されるように、本発明の文脈においてこの目的に関して本明細書中で参考として特に援用され、任意の無血管域の外観は、抗脈管形成性抗体を証明するのに十分である。この区域が大きければ大きいほど、この抗体がより効果的である。
新生血管形成の角膜マイクロポケットアッセイは、ラットまたはウサギの角膜を使用して実施され得る。このインビボモデルは、米国特許第５，７１２，２９１号および同第５，８７１，７２３号（各々は、証明の目的について本明細書中で参考として特に援用される）によって証明されるように臨床学的な有用性の予測をするのに広範に受容される。本発明に特に関連することは考えられないが、これらは、それ自体が不活性であるが、活性な化合物を生じるように代謝される化合物を一般的に認識するので、この角膜アッセイは、ＣＡＭアッセイよりも望ましい。
本発明において、この角膜マイクロポケットアッセイを使用して、抗脈管形成剤を同定する。これは、一貫して観察され、かつ好ましくは顕著であるこの角膜内の血管の数の減少によって示されるように脈管形成における有意な減少によって証明される。このような応答は、この試験物質と接触される場合、好ましくは、持続性の増殖の証拠を示さない時折の新芽および／またはヘアピンループのみを示す角膜として定義される。
本発明の例示的なＶＥＧＦＲ２遮断抗体、抗ＶＥＧＦ抗体（および抗原結合フラグメント）としては、以下の抗体を含む：
（ａ）ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害する抗体；
（ｂ）ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害しない抗体；
（ｃ）ＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦ誘導性リン酸化を阻害し、そして好ましくは有意に阻害する抗体；
（ｄ）ＶＥＧＦ誘導性脈管透過性を阻害し、そして好ましくは有意に阻害する抗体；
（ｅ）ＶＥＧＦ媒介性内皮細胞増殖を阻害し、そして好ましくは有意に阻害する抗体；
（ｆ）脈管形成を阻害し、そして好ましくは有意に阻害する抗体；
（ｇ）マクロファージ、破骨細胞または軟骨吸収細胞のＶＥＧＦＲ１媒介性の刺激または活性化を有意に阻害しない抗体；および
（ｈ）血管化腫瘍を有する動物への投与の際に腫瘍脈管構造および腫瘍支質に局在する抗体。
本発明の特定の局面は、ＶＥＧＦＲ２レセプターへのＶＥＧＦの結合を特異的に阻害し、インビボで有意な抗腫瘍効果を有し、そしてＶＥＧＦＲ１レセプターへのＶＥＧＦの結合を阻害しなかった抗体の本発明者の最初の驚くべき発見に基づいている。特定の実施形態において、本発明は、従って規定されたエピトープ特異性の抗体を提供し、ここでそのような抗体、またはその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と同一のエピトープに本質的に結合する。
特許請求される本発明は、本明細書に従って可能にされ、そして技術的参考文献、ノウハウ、および出発物質を用意に利用可能にする。それにも関わらず、２Ｃ３モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株のサンプルは、２０００年３月２７日に提出され、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（アメリカ合衆国 バージニア２０１１０−２２０９、マナサス、ユニバーシティー ブールバ−ド１０８０１）に寄託物として２０００年３月２８日に受理され、そしてＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５を２０００年４月１１日に付与された。この寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約およびその規定（ブタペスト条約）の下で作製された。この作製されたハイブリドーマは、関連する特許請求の範囲とともに米国特許の発行に基づいてブタペスト条約の条件の下でＡＴＣＣによって入手可能である。この寄託されたハイブリドーマの利用可能性は、その政府の特許法に従って任意の政府の権力の下で付与された権利に違反して本発明を実施するためのライセンスと解釈するべきではない。
特定の好ましい組成物は、従って、実質的にモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と同一のエピトープに結合する、少なくとも第１の抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗原結合フラグメント、あるいは少なくとも第１の精製された抗ＶＥＧＦ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物；本質的にモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と同一のエピトープでＶＥＧＦに結合する、少なくとも第１のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む組成物；および、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と同一のエピトープに結合する、少なくとも第１の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む組成物である。
それにも関わらず、特定のその他の組成物、抗体、方法、ならびに特に本発明の第１医療用途および第２医療用途は、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）自体ではない、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と同一、または実質的に同一であるエピトープに結合する抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗原結合フラグメントに関する。
用語モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）「とおおよそ、実質的に、または本質的に同一、あるいは同一のエピトープに結合する」は、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と「交差反応」する抗体を意味する。「交差反応抗体」は、ＶＥＧＦへの結合に関して、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と効果的に競合し得るように、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に、または本質的に同一、あるいは同一のエピトープまたは「エピトープ部位」を認識する、それに結合する、またはそれに免疫特異性を有する抗体である。「２Ｃ３交差反応抗体」は、簡潔に「２Ｃ３様抗体」および「２Ｃ３ベース抗体」と呼ばれ、そしてこのような用語は、本明細書中で交互に使用され、そして組成物、使用および方法に適用される。
モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）とおおよそ、実質的に、または本質的に同一、あるいは同一のエピトープに結合する１つ以上の抗体の同定は、その好都合な特徴を有する２Ｃ３が提供される以上は、現在簡単な技術内容である。交差反応抗体の同定は、参照抗体と比較して決定されるので、この参照抗体（２Ｃ３）およびこの試験抗体が結合するエピトープを実際に決定することが、モノクローナル抗体２Ｃ３と同一または実質的に同一のエピトープに結合する抗体を同定するために決して必要ではないことが、理解される。しかし、２Ｃ３によって結合されるこのエピトープに対する多数の情報は、本明細書中に含まれ、そしてエピトープマッピングは、Ｃｈａｍｐｅら（１９９５）（特に本明細書中で参考として援用される）によって記載のようにさらに実施され得る。
交差反応抗体の同定は、抗体の競合が評価され得る、種々の免疫学的スクリーニングアッセイのいずれか１つを使用して容易に決定され得る。全てのこのようなアッセイは、当該分野で慣用的であり、そして本明細書中でさらに詳細に記載される。１９９７年８月２６日に刊行された米国特許第５，６６０，８２７号は、所定の抗体（例えば、２Ｃ３）と同一または実質的に同一のエピトープに結合する抗体を作製する方法に関与する本教示をなおさらに補足することを含む目的に関して特に本明細書中で参考として援用される。
例えば、試験されるべきこの試験抗体が、異なる供給源の動物から得られるか、またはさらには異なるアイソタイプである場合、このコントロール（２Ｃ３）および試験抗体が、混合（または前吸着）され、そしてＶＥＧＦ抗原組成物に加えられる、単純な競合アッセイが使用され得る。「ＶＥＧＦ抗原組成物」によって、本明細書中に記載の２Ｃ３結合ＶＥＧＦ抗原を含む任意の組成物（例えば、遊離のＶＥＧＦ）が意味される。従って、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットに基づくプロトコルは、このような単純な競合研究における使用のために適切である。
特定の実施形態において、抗原組成物に適用する前に、ある期間、このコントロール抗体（２Ｃ３）とこの試験抗体の変化量（例えば、１：１０または１：１００）をプレ混合する。他の実施形態において、このコントロールおよび試験抗体の変化量は、抗原組成物に曝露の間に単に混合され得る。いずれにしても、種またはアイソタイプの２次抗体を使用することによって、結合したコントロール抗体のみを検出し得、コントロール抗体の結合は、実質的に同一のエピトープを認識する試験抗体の存在によって減少される。
コントロール抗体と任意の試験抗体（種またはアイソタイプに関係なく）との間の抗体競合研究を実施することにおいて、まず検出可能な標識（例えば、その後の同定を可能にするビオチンまたは酵素標識（さらに放射能標識））を用いてコントロール（２Ｃ３）を標識し得る。これらの場合において、標識コントロール抗体を試験されるべき試験抗体と種々の比（例えば、１：１０または１：１００）でプレ混合またはインキュベートし、（必要に応じて適切な期間の後）次いで標識コントロール抗体の反応性をアッセイし、そして潜在的に競合する試験抗体が、インキュベーション中に含まれなかったコントロール値を用いてこれと比較する。
このアッセイはまた、抗体ハイブリダイゼーションに基づく一連の免疫学的アッセイのいずれか１つであり得、そしてこのコントロール抗体は、それらの標識を検出する手段によって（例えば、ビオチン化抗体の場合、ストレプトアビジンを用いてか、または酵素標識に関連する発色性基質（例えば、ペルオキシダーゼ酵素とともに３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質）を用いることによってか、あるいは放射能標識を単に検出することによって）検出される。コントロール抗体と同一のエピトープに結合する抗体は、結合に関して効果的に競合し得、従って、結合した標識の減少によって証明されるようにコントロール抗体結合を有意に減少する。
完全に無関係な抗体の非存在下でのこの（標識した）コントロール抗体の反応性は、コントロールの高値である。コントロールの低値は、競合が起こり、そして標識化抗体の結合を減少する場合、標識化（２Ｃ３）抗体を正確に同一の型（２Ｃ３）の未標識の抗体とインキュベートすることによって得られる。試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下での標識化抗体の反応性の有意な減少は、同一のエピトープを認識する試験抗体を示す（すなわち、この標識（２Ｃ３）抗体と「交差反応」する抗体）。
有意な減少は、結合における「再現可能な」、すなわち一貫して観察される減少である。本発明の用語において「有意な減少」は、約１：１０と約１：１００との間の任意の比で少なくとも約７０％、約７５％または約８０％の（ＥＬＩＳＡにおいてＶＥＧＦへの２Ｃ３の結合における）再現可能な減少として定義される。なおよりストリンジェントな交差遮断活性を有する抗体は、約１：１０と約１：１００との間の任意の比で少なくとも約８２％、約８５％、約８８％、約９０％、約９２％、または約９５％あるいはその程度の（ＥＬＩＳＡまたはその他の適切なアッセイにおいてＶＥＧＦへの２Ｃ３の結合における）再現可能な減少を示す。本発明を実施するのに決して必要でないが、約９９％、約９８％、約９７％、または約９６％あるいはその程度のＶＥＧＦへの２Ｃ３の結合における再現可能な減少を示すような完全なまたは完全に近い交差遮断は、確実に除外されない。
本発明は、ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体２Ｃ３またはこのようなモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントによって例示される。モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同一のエピトープと結合する、モノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体を産生するハイブリドーマは、本発明の別の局面である。
本発明は、少なくとも第１の免疫原性ＶＥＧＦ成分を用いて、動物を免疫する工程、および免疫された動物からモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に交差反応する抗体を選択する工程を包含するプロセスによって調製されるモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同一のエピトープと結合する、抗ＶＥＧＦ抗体；ならびに少なくとも第１の免疫原性ＶＥＧＦ成分を用いて、動物を免疫する工程、および免疫された動物からＶＥＧＦに対する２Ｃ３抗体の結合を実質的に減少させる抗体を同定することによって交差反応する抗ＶＥＧＦ抗体を選択する工程を包含するプロセスによって調製されるモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同一のエピトープと結合する、抗ＶＥＧＦ抗体を、さらに提供する。
モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合し、そしてＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）へのＶＥＧＦの結合を特異的に阻害する、抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗原結合フラグメント；ならびにモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合し、そしてＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）へのＶＥＧＦの結合を実質的に阻害することなく、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）へのＶＥＧＦの結合を阻害する、抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗原結合フラグメントが、本発明の他の局面を形成する。
このような特性の組み合わせを有する抗体は、レセプター競合、ＥＬＩＳＡ、共沈、および／または機能的アッセイ、ならびに上記の２Ｃ３交差反応性アッセイの１以上または組み合わせによって容易に同定され得る。ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合を一貫して有意に減少させ、そしてＶＥＧＦＲ１へのＶＥＧＦの結合を一貫して有意に阻害しない、２Ｃ３様抗体の定量評価に関する手引きは、上記の通りである。
２Ｃ３は、ＶＥＧＦＲ２コートＥＬＩＳＡウエルに結合するＶＥＧＦの量を、ＶＥＧＦよりも１００倍および１０００倍過剰なモル濃度で、それぞれ約２６％および１９％まで減少させることが本明細書において示された。これらの数字は、それぞれ約７４％および８１％の、ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合における減少に等しい。２Ｃ３は、ＶＥＧＦＲ２コートＥＬＩＳＡウエルに結合するＶＥＧＦの量を、ＶＥＧＦよりも１００倍および１０００倍過剰なモル濃度で、それぞれ約９２％および１０５％で維持することが本明細書中において示された。
ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合をより実質的に阻害する、２Ｃ３様抗体または交差反応性抗体が、ＶＥＧＦＲ１との結合において、さらなる減少を許容し得ることがさらに理解される。同様に、抗体がＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合において穏やかな減少を有する場合、ＶＥＧＦＲ１への結合の維持は、より厳密に追跡されなければならない。
従って、本発明のさらに例示的な抗ＶＥＧＦ抗体（および抗原結合フラグメント）は、以下：
（ａ）ウエスタンブロットでＶＥＧＦに結合することによってアッセイされるように、非コンフォーメーション依存性のＶＥＧＦエピトープに結合する抗体；
（ｂ）遊離ＶＥＧＦに結合する抗体；
（ｃ）ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害する抗体；
（ｄ）ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害しない抗体；
（ｅ）ＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦ誘導リン酸化を阻害、および好ましくは有意に阻害する抗体；
（ｆ）ＶＥＧＦ誘導血管透過性を阻害、および好ましくは有意に阻害する抗体；
（ｇ）ＶＥＧＦ媒介内皮細胞増殖を阻害、および好ましくは有意に阻害する抗体；
（ｈ）脈管形成を阻害、および好ましくは有意に阻害する抗体；
（ｉ）マクロファージ、破骨細胞または軟骨吸収細胞のＶＥＧＦＲ１媒介刺激または活性化を有意に阻害しない抗体；
（ｊ）血管新生腫瘍を有する動物へ投与する際に、腫瘍血管構造および腫瘍支質に局在化する抗体；ならびに
（ｋ）モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と同一かまたは実質的に同一のエピトープと結合する抗体である。
本発明に関連する、組成物、免疫結合体、医薬品、組み合わせ、カクテル、キット、第１および第２医学的使用ならびに全方法の以下の記載において、用語「抗体」および「免疫結合体」、またはその抗原結合領域は、具体的に記載または科学的な用語から明らかにされない限り、一連のＶＥＧＦＲ２遮断、抗−ＶＥＧＦ抗体および特異的な２Ｃ３交差反応抗体を言及する。
本明細書において使用されるように、用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含む、任意の免疫学的な結合剤を広範に言及する。重鎖における定常ドメインのタイプに依存して、抗体は、５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのｌつに割り当てられる。これらの数種は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのようなサブクラスまたはアイソタイプにさらに分類される。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する、重鎖定常ドメインを、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ぶ。このサブユニット構造および免疫グロブリンの異なるクラスの３次元構造は、周知である。
一般に、抗原結合領域以外の抗体が、本発明において使用される場合、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭが、好ましい。なぜならば、これらは、生理学的状態において最も一般的な抗体であり、そしてこれらは、実験室の設定において最も容易に実施されるからである。
哺乳動物の抗体の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２種の明らかに異なるタイプ：カッパ（κ）およびラムダ（λ）のｌつに割り当てられる。本発明の抗体において、κまたはλ軽鎖の使用は、本質的に好ましくない。
モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）またはその誘導体の使用がより好ましい。ＭＡｂｓは、特定の利点（例えば、再現性および大規模の産生）を有すると認識され、これらは、医療処置に適切である。従って、本発明は、マウス、ヒト、サル、ラット、ハムスター、ウサギおよびさらにカエルまたはトリの起源のモノクローナル抗体を提供する。マウス、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体が、一般に好ましい。
当業者に理解されるように、免疫学的結合剤は、全ての種由来の全ての抗体、およびその抗原結合フラグメントに及ぶ用語「抗体」に含まれ、これには、２量体、３量体および多量体の抗体；二重特異性抗体；キメラ抗体；ヒトおよびヒト化抗体；組換えおよび遺伝子組換え抗体；ならびにそのフラグメントが挙げられる。
従って、用語「抗体」は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を言及するために使用され、そしてこの用語は、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、単一のドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単一鎖Ｆｖ）、直鎖抗体、ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）などのような抗体フラグメントを含む。種々の抗体ベース構築物およびフラグメントを調製および使用するための技術は、当該分野で周知である（Ｋａｂａｔら、１９９１（本明細書においてその参考として特に援用される）を参照のこと）。特にダイアボディーは、ＥＰ４０４，０９７およびＷＯ９３／１１１６１（それぞれ本明細書においてその参考として特に援用される）にさらに記載される。一方、直鎖抗体は、Ｚａｐａｔａら（１９９５）（本明細書においてその参考として特に援用される）にさらに記載される。
特定の実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも第１抗−ＶＥＧＦ抗体を含み、この第１抗−ＶＥＧＦ抗体は、配列番号７または配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％程度のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列領域を含む少なくとも第１可変領域を含む、少なくとも第１可変領域を含む。ここで、上記抗−ＶＥＧＦ抗体は、２Ｃ３抗体によって例示されるような、本発明のＶＥＧＦＲ２−遮断、抗−ＶＥＧＦ抗体の生物学的な特性を少なくとも実質的に保持する。
本発明のこれらおよび他の抗−ＶＥＧＦ抗体配列に関する同一性または相同性は、配列番号７または配列番号９の配列、または、配列同一性の最大の割合を達成するために、必要に応じて、配列を整列し、そしてギャップを導入した後の本発明の別の抗−ＶＥＧＦ抗体の配列と同じ候補配列中のアミノ酸残基の割合として本明細書中において定義される。配列比較のために使用されるＶＥＧＦＲ２−遮断、抗−ＶＥＧＦ抗体の実質的に同一、またはさらにより有効な生物学的特性の維持は、特に重要である。このような比較は、例えば、本明細書において記載される１以上の種々のアッセイを使用して、容易に実施される。
特定の好ましい実施形態において、本発明の抗−ＶＥＧＦ抗体は、配列番号７または配列番号９のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列領域を含む少なくとも第１可変領域を含む。これは、配列番号６または配列番号８の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列領域を含む可変領域によって例示される。このような配列は、重鎖および軽鎖の可変領域のＣＤＲ１−３（相補的決定領域）を含む、２Ｃ３ＳｃＦｖのＶｈおよびＶκの配列である。
他の好ましい実施形態において、オリジナルのＶＥＧＦＲ２−遮断、抗−ＶＥＧＦ抗体（例えば２Ｃ３）と比較して、増強したまたは優れた特性を有する、第２世代の抗体が提供される。例えば、第２世代の抗体は、より強力な結合親和性、ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合のより有効な遮断、ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合のより特異的な遮断、ＶＥＧＦＲ１へのＶＥＧＦの結合のさらに弱い遮断、ＶＥＧＦ誘導された内皮細胞の増殖および／または移動を阻害するための増強した能力、ＶＥＧＦ誘導された血管透過性を阻害するための優れた能力、ならびに好ましくは、血管新生化腫瘍を含む、インビボにおいてＶＥＧＦ誘導脈管形成を阻害および脈管形成疾患を処置するための増加した能力を有し得る。
有効な第２世代抗体を同定するための比較が、例えば、本明細書に詳細に記載される１以上の種々のアッセイを使用して、容易に処理および定量される。２Ｃ３抗体によって例示されるように、本発明のＶＥＧＦＲ２−遮断、抗−ＶＥＧＦ抗体と比較して、少なくとも約１０倍、好ましくは少なくとも２０倍、およびより好ましくは少なくとも約５０倍の増強した生物学的特性または活性を有する第２世代抗体、本発明によって包含される。
特定の実施形態において、使用される抗体は、「ヒト化」、部分的ヒトまたはヒト抗体である。「ヒト化」抗体は、一般にマウス、ラットまたは非ヒト種からのキメラモノクローナル抗体であり、ヒト定常領域および／または可変領域ドメイン（「部分的ヒトキメラ抗体」）を有する。本発明において使用される種々のヒト化モノクローナル抗体は、キメラ抗体であり、ここでマウス、ラットまたは他の非ヒトモノクローナル抗体の、少なくとも第１抗原結合領域、または相補性決定領域（ＣＤＲ）が、ヒト抗体定常領域または「フレームワーク」上に作動可能に結合または「グラフト化」されている。
本明細書中の使用のための「ヒト化」モノクローナル抗体はまた、非ヒト種からのモノクローナル抗体であり得、ここで、１つ以上の選択されたアミノ酸が、ヒト抗体中でより一般に観察されるアミノ酸に交換されている。これは、慣用的な組換え技法、特に部位特異的変異誘発の使用により容易に達成され得る。
「ヒト化」よりむしろ完全にヒトの抗体もまた調製され、そして本発明において用いられ得る。このような抗体はまた、健常被験体から得られ得る。これを達成するために、抗原提示細胞および抗体産生細胞を含む、ヒト被験体からの混合末梢血リンパ球の集団を単に得、そしてこの細胞集団を、免疫学的に有効な量のＶＥＧＦサンプルと混合することによりインビトロで刺激する。このヒト抗ＶＥＧＦ抗体産生細胞が一旦得られると、ハイブリドーマおよび／または組換え抗体産生に用いられる。
ヒトモノクローナル抗体産生のためのさらなる技法は、トランスジェニック動物、好ましくはトランスジェニックマウスを免疫化することを包含し、これは、免疫学的に有効な量のＶＥGＦサンプルをともなうヒト抗体ライブラリーを含む。これはまた、ハイブリドーマおよび／または組換え抗体産生においてさらなる操作のためのヒト抗ＶＥＧＦ抗体産生細胞を生成し、末梢血細胞よりもむしろ脾細胞が、トランスジェニック動物またはマウスから容易に得られ得るという利点を持つ。
本発明に従ってＶＥＧＦＲ２遮断、抗−ＶＥＧＦ抗体は、以下を含むプロセスおよび方法によって容易に調製され得る：
（ａ）候補抗体産生細胞を調製する工程；および
（ｂ）候補抗体産生細胞から抗体を選択する工程であって、この抗体は、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害し、そしてＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害しない、工程。
本発明に従った他の抗体は、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に交差反応する抗体を選択することによって容易に調製され得る。適切な調製プロセスおよび方法は、以下を含む：
（ａ）候補抗体産生細胞を調製する工程；および
（ｂ）モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に交差反応する抗体を、候補抗体産生細胞から選択する工程。
適切な抗体産生細胞を調製し、そしてそれから抗体を得る１つのプロセスは、所与の患者においてインサイチュで実施され得る。すなわち、患者に、免疫原性的に有効な量の免疫原性ＶＥＧＦサンプルを単に提供することで、適切な抗体生成を生じる。従って、この抗体は、抗体産生細胞からなお「得られる」が、宿主から離れて単離され、そして引き続き、患者に提供されなければならないことはなく、自然に腫瘍血管系に局在化し、そしてその生物学的抗腫瘍効果を奏し得る。しかし、このような実施形態は、顕著な特異性の欠如に起因して好ましくない。
適切な抗体産生細胞がまた得られ得、引き続いて、抗体は、末梢血液リンパ球をインビトロにおいてＶＥＧＦで刺激することによって単離および／または精製され得る。
他の方法は、少なくとも第１免疫原性ＶＥＧＦ成分を含む免疫化組成物を動物に投与する工程、ならびにＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害し、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害しない抗体、および必要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に交差反応する抗体を、免疫化した動物から選択する工程を包含する。これらの方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）少なくとも１用量、および必要に応じて１より多い用量の免疫学的に有効量の免疫原性ＶＥＧＦサンプル（例えば、第１ヒトＶＥＧＦ成分、実質的に完全長のＶＥＧＦ成分、または組換えヒトＶＥＧＦ）で動物に投与することにより動物を免疫化する工程；ならびに
（ｂ）適切な抗体産生細胞を免疫化した動物から得る工程であって、例えば、抗体産生細胞は、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害し、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害しない抗体、および必要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に交差反応する抗体を産生する、工程。
免疫的に有効量のＶＥＧＦサンプルを、ＶＥＧＦ結合体としてまたは任意の適切なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバント）と組み合わせて投与し得る。任意の経験的技術または改変は、免疫原性を増加するために使用され得る。インタクトな実質的に完全長のヒトＶＥＧＦが、一般的に免疫原として好ましい。
免疫化プロセスの性質または免疫される動物の種類に関係なく、適切な抗体産生細胞は、その免疫される動物から得られ、そして好ましくは、人の手によってさらに操作される。本明細書中で使用される場合、「免疫された動物」は、他に明確に記載しない限り、非ヒト動物である。任意の抗体産生細胞が使用され得るが、最も好ましくは、抗体産生細胞の供給源として脾臓細胞が得られる。抗体産生細胞は、以下を包含する調製工程において使用され得る：
（ａ）抗ＶＥＧＦ抗体産生細胞を不死細胞と融合して、本発明に従ってモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを調製する工程、ならびに
（ｂ）このハイブリドーマから本発明に従って適切な抗ＶＥＧＦ抗体を得る工程。
「適切な」抗ＶＥＧＦ抗体産生細胞、ハイブリドーマおよび抗体は、ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体を産生するか、ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体として存在する細胞、ハイブリドーマおよび抗体であり、このＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に対するＶＥＧＦ結合を有意に阻害し、そしてＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）に対するＶＥＧＦ結合を有意には阻害せず、そして必要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に交差反応する抗体である。
従って、ハイブリドーマに基づくモノクローナル抗体調製方法は、以下を包含する方法を包含する：
（ａ）少なくとも１用量の（必要に応じて１用量より多くの）免疫学的に有効量の免疫原性ＶＥＧＦサンプル（好ましくは、インタクトなヒトＶＥＧＦサンプル）を動物に投与することによって、この動物を免疫する工程；
（ｂ）免疫された動物からモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのコレクションを調製する工程；
（ｃ）本発明に従って少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体、必要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に交差反応する抗ＶＥＧＦ抗体を産生する少なくとも第１のハイブリドーマをこのコレクションから選択する工程；および
（ｄ）少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体を提供するために少なくとも第１の抗体産生ハイブリドーマを培養する工程；ならびに、好ましくは、
（ｅ）培養された少なくとも第１のハイブリドーマから第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体を得る工程。
モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に交差反応する抗ＶＥＧＦ抗体を同定する際に、この選択工程は、以下を包含し得る：
（ａ）ＶＥＧＦサンプルをモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）および候補抗体の有効量と接触させる工程；および
（ｂ）ＶＥＧＦサンプルに対する２Ｃ３抗体の結合を実質的に減少する、候補抗体の能力を決定する工程であって；ここで、このＶＥＧＦサンプルに対する２Ｃ３抗体の結合を実質的に減少する候補抗体の能力が、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合する抗ＶＥＧＦ抗体の指標である、工程。
選択工程は、さらに以下を包含し得る：
（ａ）第１のＶＥＧＦサンプルを、有効な結合量のモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）を接触させる工程、およびＶＥＧＦに結合する２Ｃ３の量を決定する工程；
（ｂ）第２ＶＥＧＦサンプルを、有効な結合量のモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ
ＰＴＡ １５９５）と、有効競合量の候補抗体と組み合わせて接触させる工程、および候補抗体の存在下でＶＥＧＦに結合する２Ｃ３の量を決定する工程；ならびに
（ｃ）ＶＥＧＦに結合する２Ｃ３の量を、好ましくは少なくとも約８０％減少する候補抗体を選択することによって、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合する抗ＶＥＧＦ抗体を同定する工程。
非ヒト動物が免疫化のために使用される場合、このようなハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体は、しばしば非ヒト構成（ｍａｋｅ ｕｐ）を有する。このような抗体は、必要に応じて、当該分野で公知であるような、そして本明細書中でさらに記載されるような、ヒト化プロセス、グラフト化または変異に供され得る。あるいは、ヒト抗体遺伝子ライブラリーを含むトランスジェニック動物（例えばマウス）が使用され得る。従って、このような動物の免疫化は、直接、適切なヒト抗体の生成を生じる。
適切な抗体産生細胞（最も好ましくはハイブリドーマ）の産生の後に、ヒト抗体または非ヒト抗体を産生するか否かにかかわらず、モノクローナル抗体をコードする核酸は、「組換え」モノクローナル抗体を調製するためにクローン化され得る。任意の組換えクローニング技術（抗体コード核酸配列の合成をプライムするためのＰＣＲTMの使用を含む）が利用され得る。従って、なおさらに適切なモノクローナル抗体調製方法は、以下のように抗体産生細胞を使用する工程を包含する方法を包含する：
（ａ）適切な抗ＶＥＧＦ抗体産生細胞（好ましくは、ハイブリドーマ）から少なくとも第１の適切な抗ＶＥＧＦ抗体をコードする核酸分子またはセグメントを得る工程；および
（ｂ）本発明に従って、組換えＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体を得るために、組換え宿主細胞において、この核酸またはセグメントを発現する工程。
しかし、組換えモノクローナル抗体の調製に理想的に適する他の強力な組換え技術が利用可能である。このような組換え技術は、ファージミドライブラリーに基づくモノクローナル抗体調製方法を包含し、これは、以下を包含する：
（ａ）少なくとも１用量の（必要に応じて１用量より多くの）免疫学的に有効量の免疫原性ＶＥＧＦサンプル（例えば、インタクトなヒトＶＥＧＦサンプル）を動物に投与することによって、この動物を免疫する工程；
（ｂ）免疫された動物の抗体産生細胞（好ましくは脾臓）から単離されたＲＮＡを発現するコンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリーを調製する工程；
（ｃ）少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に交差反応するものを発現する少なくとも第１のクローンをファージミドライブラリーから選択する工程；
（ｄ）少なくとも第１の選択されたクローンからＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体をコードする核酸を得る工程、および少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体を提供するために組換え宿主細胞においてこの核酸を発現する工程；ならびに、好ましくは、
（ｅ）少なくとも第１のクローンから得られた核酸によって発現される少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体を得る工程。
また、このようなファージミドライブラリーに基づく技術において、ヒト抗体遺伝子ライブラリーを保有するトランスジェニック動物が使用され得、組換えヒトモノクローナル抗体を産生する。
第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体核酸セグメントの調製方法に関係なく、さらに適切な抗体核酸セグメントは、標準的な分子生物学技術によって容易に調製され得る。任意の改変体、変異体または第二世代のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体核酸セグメントが本発明の使用に適することを確認するために、核酸セグメントは、本発明に従って、ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体の発現を確認するために試験される。好ましくは、改変体、変異体または第二世代の核酸セグメントはまた、標準的な、より好ましくは、標準的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションを確認するために試験される。例示的に適切なハイブリダイゼーション条件は、約７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、約０．５Ｍ ＮａＰＯ4、約１ｍＭ ＥＤＴＡ中、約５０℃でのハイブリダイゼーション；および約１％ＳＤＳ、約４２℃での洗浄を包含する。
種々の組換えモノクローナル抗体が、ヒト由来または非ヒト由来に関わらず、容易に調製され得るので、本発明の処置方法は、患者において少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体の生物学的有効量を発現する少なくとも第１の核酸セグメントを動物または患者に提供することによって実施され得る。「ＶＥＧＦＲ２−遮断、抗ＶＥＧＦ、２Ｃ３様または２Ｃ３に基づく抗体を発現する核酸セグメント」は、一般的に、少なくとも発現構築物の形態であり、ウイルス内または組換え宿主細胞内で構成される発現構築物の形態であり得る。本発明の好ましい遺伝子治療ベクターは、一般的に、組換えレトロウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）などの中で構成されるようなウイルスベクターである。
本発明は、さらに、少なくとも第１の精製されたＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗原結合フラグメント、必要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と基本的に同じエピトープに結合するものを含む組成物を提供する。このような組成物は、研究所の研究における使用のために薬学的に受容可能な組成物であり得る。薬学的組成物の点で、これらは、好ましくは、静脈内投与のような、非経口的な投与のために処方され得る。
本発明は、ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体（２Ｃ３−交差反応性抗体、２Ｃ３様抗体または２Ｃ３に基づく抗体を含む）についての多くの方法および使用を提供する。全ての方法に関して、記載された方法において、用語「ａ」および「ａｎ」は、「少なくとも１」、「少なくとも第１の」、「１以上」、または「複数」の工程（具体的に記載される場合を除く）を意味するために使用される。これは、特に、処置方法における投与工程に関連する。従って、異なる用量が本発明に使用され得るだけでなく、異なる数の用量（例えば、注射）が、複数注射まで、そして複数注射を含んで使用され得る。組み合わせ治療が、抗ＶＥＧＦ治療抗体の投与の前、後、またはその間に投与されて、使用され得る。
重要な生物学的意味を有する種々の有用なインビトロ方法および使用が提供される。第１に、ＶＥＧＦを結合する方法およびその使用が提供され、これは、一般的に、ＶＥＧＦを含む組成物（好ましくは、遊離（ｆｒｅｅ）（非レセプター結合）ＶＥＧＦ）を含む組成物を、少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗原結合フラグメント、必要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合する抗体と、有効に接触する工程を包含する。
ＶＥＧＦを検出する方法、およびその使用が提供され、これは、一般的に、ＶＥＧＦを含むと疑われる組成物を、少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗原結合フラグメント、必要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するものと、ＶＥＧＦ／抗体複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で接触させる工程、およびそのように形成される複合体を検出する工程を包含する。この検出の方法および使用は、例えば、新脈管形成および腫瘍に対する診断において、生物学的サンプルと関連して使用され得、これに基づく診断キットもまた提供される。
本発明は、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合を優先的または特異的に阻害する方法およびその使用を提供し、これは、一般的に、ＶＥＧＦ存在下で、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）を発現する内皮細胞を含む細胞または組織の集団を、生物学的に有効量の少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するもの、またはその抗原結合フラグメントを含む組成物と、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合を阻害するのに有効な条件下で接触する工程を包含する。
ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１へのＶＥＧＦの結合を実質的に阻害することなく、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合を実質的に阻害する方法、およびその使用が提供される。これらの方法は、ＶＥＧＦの存在下で、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）およびＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）を発現する内皮細胞の集団を含む細胞または組織の集団を、生物学的に有効量の少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合する抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む組成物と、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害しないで、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合を阻害するのに有効な条件下で接触させる工程を包含する。
本発明のさらなる方法およびその使用は、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ１と呼ばれるＶＥＧＦレセプターの生物学的な役割を分析する工程においてであり、これは、以下の工程を包含する：
（ａ）ＶＥＧＦならびにＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）およびＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）レセプターを発現する細胞の集団を含む生物学的組成物または組織を、生物学的に有効量の少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合する抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む組成物と接触する工程；および
（ｂ）ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体の、ＶＥＧＦに対する少なくとも第１の生物学的応答に対する効果を決定する工程であって、ここで：
（ｉ）ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体の存在下での生物学的応答における変化が、ＶＥＧＦＲ２レセプターによって媒介される応答の指標であり；そして
（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体の存在下での生物学的応答の維持が、ＶＥＧＦＲ１レセプターによって媒介される応答の指標である、工程。
ＶＥＧＦ誘導内皮細胞増殖および／または遊走（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を特異的に阻害する方法および使用を含む増殖阻害方法およびその使用が提供され、これは、一般的に、ＶＥＧＦおよび内皮細胞の集団を含む細胞または組織の集団を、生物学的に有効量の少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するもの、またはＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体の抗原結合フラグメントを含む組成物と、ＶＥＧＦ誘導内皮細胞増殖および／または遊走を阻害するのに有効な条件下で接触させる工程を包含する。
ＶＥＧＦ誘導マクロファージ化学走性を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦ誘導内皮細胞増殖および／または遊走を阻害する方法およびその使用が提供され、これは、一般的に、内皮細胞、マクロファージおよびＶＥＧＦを含む細胞または組織の集団を、生物学的に有効量の少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するもの、または抗ＶＥＧＦ抗体の抗原結合フラグメントを含む組成物と、ＶＥＧＦ誘導マクロファージ化学走性を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦ誘導内皮細胞増殖および／または遊走を阻害するのに有効な条件下で接触させる工程を包含する。
マクロファージ、破骨細胞または軟骨吸収細胞のＶＥＧＦ刺激を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦ誘導内皮細胞増殖および／または遊走、ならびに必要に応じて新脈管形成を阻害する方法およびその使用がさらに提供される。この方法は、一般的に、内皮細胞およびマクロファージ、破骨細胞または軟骨吸収細胞の内の少なくとも一つを含む細胞または組織の集団を、生物学的に有効量の少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するもの、または抗体の抗原結合フラグメントを含む組成物と、マクロファージ、破骨細胞または軟骨吸収細胞のＶＥＧＦ刺激を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦ誘導内皮細胞増殖および／または遊走、あるいは新脈管形成を阻害するのに有効な条件下で接触させる工程を包含する。
前述の方法および使用は、インビトロおよびインビボで実行され得る。後者の場合、ここで、組織または細胞は、動物内に配置され、そして抗ＶＥＧＦ抗体が動物に投与される。両方の場合に、方法および使用は、血管形成を阻害する方法および使用になる。これは、潜在的に脈管形成性の血管を含む組織、または潜在的に脈管形成性の血管の集団（すなわち、可能性としてＶＥＧＦに曝露されるもの）を、脈管形成を阻害するのに効果的な条件下で、抗脈管形成組成物（生物学的に効果的な量の少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するもの、またはその抗原結合フラグメントを含む）に接触させる工程を包含する。
潜在的に脈管形成性の血管の集団がエキソビボで維持される場合、本発明は、薬物開発プログラムにおいて有用性を有する。インビトロスクリーニングアッセイにおいては、確実な陽性コントロールおよび陰性コントロールが、新脈管形成を阻害または促進する薬物の開発において、および脈管形成プロセスに対するさらなる情報の描写において、第１の工程として有用である。潜在的に脈管形成性の血管の集団が動物または患者内に発見される場合、抗脈管形成性組成物が、治療の形態として動物に投与される。
従って、前述の阻害方法のそれぞれの立場から、「生物学的に有効な量」とは、ＶＥＧＦ誘導内皮細胞増殖および／または細胞移動を阻害し；ＶＥＧＦ誘導マクロファージ走化性を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦ誘導内皮細胞増殖および／または細胞移動を阻害し；マクロファージ、破骨細胞、または軟骨吸収細胞のＶＥＧＦ刺激を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦ誘導内皮細胞増殖および／または細胞移動もしくは新脈管形成を阻害し；そして全体として、血管増殖もしくは新脈管形成を阻害するのに有効な様式で血管内皮細胞の増殖および／または移動を減弱するのに有効な、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体（必要に応じ２Ｃ３−ベースの抗体）の量である。
従って、本発明は、ＶＥＧＦ誘導性新脈管形成を阻害する方法、およびその阻害における使用、ならびに好ましくは、マクロファージ、破骨細胞、または軟骨吸収細胞のＶＥＧＦ刺激を有意に阻害することなく、脈管形成性疾患を処置する方法およびその処置における用途を提供する。この方法は、一般に、内皮細胞および少なくとも１つのマクロファージ、破骨細胞、または軟骨吸収細胞を含む細胞または組織の集団を、ＶＥＧＦ誘導新脈管形成を阻害するのに有効で、かつマクロファージ、破骨細胞、または軟骨吸収細胞のＶＥＧＦ刺激を有意に阻害することなく、脈管形成性疾患を処置するのに有効な条件下で、生物学的に有効な量の少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するもの、またはこの抗体の抗原結合フラグメントを含む組成物と接触させる工程を包含する。
骨代謝に有意な副作用を生じることなく、ＶＥＧＦ誘導性新脈管形成を阻害する方法およびその阻害における用途、そして好ましくは抗脈管形成疾患を処置する方法およびその処置における用途がさらに提供される。この方法は、一般に、血管内皮細胞および少なくとも１つのマクロファージ、破骨細胞、または軟骨吸収細胞を含む脈管形成性血管の組織または集団を、ＶＥＧＦ誘導新脈管形成を阻害するのに有効で、かつマクロファージ、破骨細胞、または軟骨吸収細胞の活性を有意に障害しないことにより、骨代謝に有意な副作用を生じることなく、脈管形成性疾患を処置するのに有効な条件下で、生物学的に有効な量の少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するもの、またはこの抗体の抗原結合フラグメント）を含む組成物と接触させる工程を包含する。
抗脈管形成性薬物のスクリーニング（インビトロ）および治療（インビボ）は、所望されない、不適切な、異常な、過剰なおよび／または病理的な血管新生により特徴付けられる任意の疾患または障害を有するか、またはそのような疾患を発症する危険性がある、動物および患者の立場から提供される。異常な新脈管形成が広範な疾患および障害において生じるので、任意の受容可能なモデル系において、効果的であることが一旦示された所定の抗脈管形成治療が、新脈管形成に関連する全範囲の疾患および障害を処置するのに用いられ得ることが、当業者に周知である。
本発明の方法および用途は、特に、任意の形態の血管新生された腫瘍；黄斑変性症（加齢性黄斑変性を含む）；関節炎（慢性関節リウマチを含む）；アテローム性動脈硬化症およびアテローム斑；糖尿病性網膜症および他の網膜症；甲状腺過形成（グレーブス病を含む）；血管腫；血管新生緑内障；および乾癬を有するか、またはそのような疾患を発症する危険性がある、動物および患者における使用を意図している。
本発明の方法および用途は、動静脈奇形（ＡＶＭ）、髄膜腫および血管再狭窄（血管形成術後の再狭窄を含む）を有するか、またはそのような疾患を発症する危険性がある、動物および患者の処置をさらに意図している。治療方法および用途の他の意図される標的は、血管線維腫、皮膚炎、子宮内膜症、血友病性関節、過形成性瘢痕、炎症性疾患および障害、化膿性肉芽腫、強皮症、滑膜炎、トラコーマおよび血管癒着、を有するか、またはそのような疾患を発症する危険性がある、動物および患者である。
米国特許第５，７１２，２９１号（本明細書において参考として詳細に援用される）に記載のように、前述のいくらか好ましい処置群の各々は、決して、本発明により処置されるべきである状態の網羅的な型ではない。米国特許第５，７１２，２９１号は、特定の特異的な目的のために本明細書において参考として援用される。この目的は、抗脈管形成治療により効果的に処置され得る多数の他の状態を同定する目的；一旦、新脈管形成阻害化合物の規定されたカテゴリーが開示および請求されば、全ての脈管形成性疾患の処置が統一された概念を示す目的（本発明の場合、ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体（必要に応じ、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するもの））；ならびに全ての脈管形成性疾患の処置が単一のモデル系のみに由来するデータにより可能であることを示す目的、を含む。
なおさらなる局面において、そして本明細書において参考として援用される米国特許第５，７１２，２９１号に記載の様に、本発明の方法および使用は、血管結合組織の異常増殖、赤鼻、後天性免疫不全症候群、動脈閉塞、アトピー性角膜炎、細菌性潰瘍、ベーチエット病、血液産生腫瘍（ｂｌｏｏｄ ｂｏｒｎｅ ｔｕｍｏｒ）、頚動脈閉塞性疾患、化学熱傷、脈絡膜血管新生、慢性炎症、慢性網膜剥離、慢性ブドウ膜炎、慢性硝子体炎、コンタクトレンズ過剰装着、角膜移植片拒絶、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、クローン病、イールズ病、流行性角結膜炎、真菌性潰瘍、単純疱疹感染、帯状疱疹感染、過粘稠度症候群、カポジ肉腫、白血病、脂質変性、ライム病、辺縁角質炎、モーレン潰瘍、癩以外のマイコバクテリア感染、近視、眼の血管新生疾患、視神経乳頭の先天的な構造上の欠損、オスラーウェーバー症候群（オスラー−ウェーバーＲｅｎｄｕ）、骨関節炎、ページエット病、毛様体輪炎（ｐａｒｓ ｐｌａｎｉｔｉｓ）、類天疱瘡、ｐｈｙｌｅｃｔｅｎｕｌｏｓｉｓ、多発性動脈炎、レーザー後合併症、原生動物感染、弾性線維性偽性黄色腫、翼状片角膜炎乾燥症、放射状角膜切開術、網膜血管新生、未熟児網膜症、水晶体後方線維増殖症、サルコイド、強膜炎、鎌状赤血球貧血、シェーグレン症候群、固形腫瘍、シュタルガルト病、スティーブンジョンソン病、上部辺縁角膜炎、梅毒、全身性エリテマトーデス、テリエン辺縁変性、トキソプラズマ症、外傷、ユーイング肉腫の腫瘍、神経芽細胞腫の腫瘍、骨肉腫の腫瘍、網膜芽細胞腫の腫瘍、横紋筋肉腫の腫瘍、潰瘍性大腸炎、静脈閉塞、ビタミンＡ欠失およびヴェーゲナーサルコイドーシスを有するか、またはそのような疾患を発症する危険性がある、動物および患者の処置を意図する。
本発明はさらに、関節炎を有するか、または関節炎を発症する危険性のある、動物および患者の処置のための方法および用途を提供する。これは、本明細書において参考として詳細に援用される、米国特許第５，７５３，２３０号に記載の免疫学的因子を用いた関節炎の処置と同様である。米国特許第５，９７２，９２２号がまた、本明細書において参考として詳細に援用されており、糖尿病、寄生生物病、異常な創傷治癒、手術後過形成、火傷、傷害または外傷、毛髪成長不全、排卵および黄体形成の阻害、子宮での着床阻害および胚発生の阻害に関連する所望されない新脈管形成の処置に対する抗脈管形成ストラテジーの適用をなおさらに例証する。従って、前述の条件の全てが本発明の方法および使用による処置のために意図される。
米国特許第５，６３９，７５７号は、本明細書において参考としてさらに詳細に援用され、移植片拒絶の一般的処置に対する抗脈管形成のストラテジーの使用を例証する。ＶＥＧＦ阻害に基く抗脈管形成ストラテジーを用いた、肺炎症、ネフローゼ症候群、子癇前症、心内膜液浸出（心膜炎に関連するものを含む）および胸水の処置は、ＷＯ ９８／４５３３１（本明細書において参考として詳細に援用されている）に記載されている。従って、前述の任意の状態を有するか、またはそれを発症する危険性のある動物および患者は、本発明の方法および使用による処置を意図される。
ＷＯ ９８／１６５５１（本明細書において参考として詳細に援用される）に記載されるように、ＶＥＧＦ機能を拮抗（アンタゴナイズ）する生物学的分子はまた、所望されない血管透過性により特徴付けられる疾患および障害の処置における使用に適切である。従って、本明細書の方法および用途の、ＶＥＧＦ拮抗抗体は、所望されない血管透過性により特徴付けられる疾患および障害（例えば、脳腫瘍に伴う浮腫、悪性腫瘍に伴う腹水、メグズ（メイグス）症候群、肺炎症、ネフローゼ症候群、心内膜液浸出および胸水など）を有するか、またはそれを発症する危険性のある動物および患者の処置に適用可能である。
前述の疾患全ての処置は、統合された本発明内で可能であるが、本発明の方法および使用の特に好ましい局面は、血管新生した固体腫瘍、転移性腫瘍または原発性腫瘍からの転移を有するか、または発症する危険性のある動物および患者への抗脈管形成療法の適用である。
ＶＥＧＦ誘導脈管形成を阻害する方法およびこの阻害における使用、そして好ましくは、マクロファージ、破骨細胞、または軟骨吸収細胞のＶＥＧＦ刺激を有意に阻害することなく、抗腫瘍効果または改善された抗腫瘍効果をもたらす、方法およびこれにおける使用が、さらに提供される。この方法は、一般に、血管内皮細胞および少なくとも１つのマクロファージ、破骨細胞、または軟骨吸収細胞を含む、組織、腫瘍環境または脈管形成性血管の集団を、マクロファージ、破骨細胞、または軟骨吸収細胞のＶＥＧＦ刺激を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦ誘導新脈管形成を阻害するのに有効で、かつ抗腫瘍効果もしくは改善された抗腫瘍効果を発揮するのに有効な条件下で、生物学的に有効な量の少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するもの、またはこの抗体の抗原結合フラグメントを含む組成物と接触させる工程を包含する。
従って、本発明はさらに、新脈管形成に関連するガンの全ての形態を含む、新脈管形成に関連する疾患を処置する方法およびこの処置における使用を提供する。この方法は、このような疾患またはガンを有する動物または患者に、治療上有効な量の少なくとも第１の薬学的組成物（ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するもの、またはこのようなＶＥＧＦ抗体の抗原結合フラグメントもしくは免疫結合体を含む）を投与する工程を包含する。
本発明は、非結合体化抗体または裸の抗体およびそのフラグメントを用いる抗脈管形成方法、ならびに免疫結合体を用いる血管標的方法（ここで、抗体またはその抗原結合フラグメントは、治療剤に作動可能に結合される）の両方を組み合わせる。従って、他に特に言及するか、または科学用語において明白にされない限り、本明細書において用いる場合、用語「抗体およびそのフラグメント」は、「結合体化されていないかまたは裸の」抗体またはフラグメントを意味する。これは、別の薬剤（特に治療薬または診断薬）には結合されていない。これらの定義は、抗体の改変（例えば、単に例としてであるが、抗体の生物学的半減期、親和性、結合活性、もしくは他の特性を改善するような改変、または抗体と他のエフェクターとの組み合わせ）を除外しない。
本発明の抗脈管形成処置の方法および使用はまた、結合体化されていないかまたは裸の抗体および免疫結合体の両方の使用を包含する。免疫結合体ベースの抗脈管形成処置方法においては、抗体またはその抗原結合フラグメントが、好ましくは、第２の抗脈管形成剤（第１の抗脈管形成剤である、抗ＶＥＧＦ抗体自体）に作動可能に連結される。結合された抗脈管形成剤は、直接または間接の抗脈管形成効果を有する因子であり得る。
抗脈管形成処置方法および使用は、新脈管形成に関連する疾患（新脈管形成に関連するガンの全ての形態を含む）を有する動物または患者に、治療的に有効な量の少なくとも第１の薬学的組成物を投与する工程を包含する。この薬学的組成物は、結合体化されていないかもしくは裸のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗原結合フラグメント（必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するもの）を含む。同様に、投与された抗体は、第２の抗脈管形成剤と作動可能に会合され得る。
転移性ガンを処置するための方法、およびその処置における使用は、転移性ガンを有する動物および患者に、治療的に有効な量の少なくとも１つの薬学的組成物を投与する工程を包含する。この薬学的組成物は、少なくとも第１の結合体化されていないかもしくは裸のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗原結合フラグメント（必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するもの）を含む。さらなる方法は、投与された抗体が、第２の抗脈管形成剤と作動可能に会合され得る方法である。
原発性ガンからの転移を減少させるための方法および減少させることにおける使用は、原発性ガンを有するかまたは原発性ガンについて処置された動物および患者に、治療的に有効な量の少なくとも１つの第１の結合体化されていないかもしくは裸のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗原結合フラグメントを投与する工程を包含する；ここでこの結合体化されていないかもしくは裸のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗原結合フラグメントは、必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合する。同様に、投与された抗体は、第２の抗脈管形成剤と作動可能に会合され得る。
新脈管形成に関連する疾患（新脈管形成に関連するガンの全ての形態を含む）を処置するための方法、およびその処置における使用は、このような疾患（例えば、血管新生化腫瘍）を有する動物または患者に、少なくとも第１の結合体化されていないかもしくは裸のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するものまたはその抗原結合フラグメントを、この疾患部位もしくは血管新生腫瘍内の新脈管形成を阻害するのに効果的な量で、投与する工程をさらに含む。同様に、投与された抗体は、第２の抗脈管形成剤と作動可能に会合され得る。
新脈管形成に関連する疾患（新脈管形成に関連するガンの全ての形態を含む）を処置するための方法、およびその処置における使用は、このような疾患またはガンを有する動物または患者に、少なくとも第１の結合体化されていないかもしくは裸のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するもの、またはその抗原結合フラグメントを、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）へのＶＥＧＦの結合を阻害して、これにより、この疾患またはガンの部位内の新脈管形成を阻害するのに効果的な量で、投与する工程をさらに含む。投与された抗体は、あるいは、第２の抗脈管形成剤と作動可能に会合され得る。
新脈管形成に関連する疾患（新脈管形成に関連するガンの全ての形態を含む）を処置するための方法、およびその処置における使用はまた、血管新生腫瘍を有する動物または患者に、治療的に有効な量の少なくとも第１の結合体化されていないかもしくは裸のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するものまたはその抗原結合フラグメントを投与する工程を包含する；ここで、抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１））へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１））へのＶＥＧＦの結合を実質的に阻害する。同様に、投与された抗体は、第２の抗脈管形成剤と作動可能に会合され得る。
新脈管形成に関連する疾患（新脈管形成に関連するガンの全ての形態を含む）を処置するためのなおさらなる方法、およびその処置における使用は、このような疾患、ガンまたは血管新生腫瘍を有する動物または患者に、治療的に有効な量の少なくとも第１の結合体化されていないかもしくは裸のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するものまたはその抗原結合フラグメントを投与する工程を包含する；ここで、抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１））へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１））へのＶＥＧＦの結合を実質的に阻害し、これにより動物におけるマクロファージ走化性を有意に障害することなく、疾患部位、ガンまたは血管新生腫瘍内の新脈管形成を阻害する。投与された抗体は、第２の抗脈管形成剤と作動可能に会合され得る。
新脈管形成に関連する疾患（新脈管形成に関連するガンの全ての形態を含む）を処置するためのなおさらなる方法、および処置における使用は、このような疾患、ガンまたは血管新生腫瘍を有する動物または患者に、治療的に有効な量の少なくとも第１の結合体化されていないかもしくは裸のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するものまたはその抗原結合フラグメントを投与する工程を包含する；ここで、抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１））へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１））へのＶＥＧＦの結合を実質的に阻害し、これにより動物におけるマクロファージ、破骨細胞、および／または軟骨吸収細胞の活性を有意に阻害することなく、疾患部位、ガンまたは血管新生腫瘍内の新脈管形成を阻害する。同様に、投与された抗体は、第２の抗脈管形成剤と作動可能に会合され得る。
新脈管形成に関連した疾患（新脈管形成に関連した癌の全ての形態を含む）を処置するための方法およびその処置の際の使用は、このような疾患（例えば、血管新生化腫瘍）を有する動物または患者に、少なくとも第１の結合体化されていないかまたは裸のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するもの、またはそれらの抗原−結合フラグメントを、骨代謝に有意な悪影響をおよぼすことなく、疾患部位または血管新生化された腫瘍内の新脈管形成を阻害するのに有効な量で投与する工程をさらに包含する。
上記の抗−血管形成処置の方法および使用は、一般に、哺乳動物または患者に、全身的に（例えば、経皮的注射、筋肉内注射、静脈内注射などによって）、薬学的に有効な組成物を投与する工程を包含する。しかし、血管形成部位（単数または複数）（腫瘍または腫瘍内の血管内皮細胞を含む）に治療用薬剤が局在化することが可能である投与の任意の経路は、受容可能である。従って、送達の他の適切な経路として、経口、直腸、経鼻、局所、膣が挙げられる。米国特許第５，７１２，２９１号は、血管形成の疾患または障害の処置と組み合わせて含まれ得る投与の種々の経路のさらなる説明のために参考として本明細書中に特に援用される。
関節炎の処置のための使用および方法について、本明細書中において参考として特に援用される米国特許第５，７５３，２３０号に他の免疫学的薬剤について記載されるように、例えば、滑液包内投与が使用され得る。眼に関連する状態について、眼の処方および投与が考慮される。
本明細書中で使用される「投与」は、抗血管形成効果および／または抗腫瘍効果を発揮するのに有効な量および時間の、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの治療剤の提供または送達を意味する。タンパク様の治療剤の受動的な投与は、一般に、一部、その簡潔さおよび再現性のために好ましい。
しかし、用語「投与」は、本明細書中において、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの治療剤が腫瘍血管系に送達されるかまたは他の方法で提供される任意かつ全ての手段をいうように使用される。従って、「投与」は、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの治療剤を、腫瘍への送達を生じるのに有効な様式で産生する細胞の提供を含む。このような実施形態において、選択的に浸透可能な膜、構造または移植可能なデバイス、概して治療を中断するために除去され得るものに、細胞を処方または包装することが所望され得る。外因性のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３様物投与が、さらに一般的に好ましく、これは、用量が綿密にモニターかつ制御されることを可能にする非侵襲性の方法を表す。
本発明の治療学的方法および使用はまた、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの治療剤を、腫瘍の近傍または腫瘍へのそれらの局在において、それらの発現を生じるのに有効な様式でコードする核酸の提供に拡張する。裸ＤＮＡ送達、組換え遺伝子およびベクター、細胞ベースの送達のような任意の遺伝子治療技術（患者の細胞などのエキソビボ操作を含む）が使用され得る。
なおさらなる実施形態において、本発明は、疾患に関連した血管形成の血管に選択された治療剤または診断学的薬剤を送達するための方法、および送達する際の使用を提供する。このような実施形態は、好ましくは、腫瘍または腫瘍内血管系または間質にも選択された治療剤または診断学的薬剤を送達するために使用され、そして、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体またはそれらの抗原結合フラグメント、必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ１５９５）と実質的に同じエピトープに結合するものに、診断学的薬剤または治療用薬剤が作動可能に結合される少なくとも第１の免疫結合体を含む生物学的に有効な量の組成物を、血管新生化された腫瘍を有する哺乳動物または患者に投与する工程を包含する。
本発明の標的化局面を内在する作用の機構を理解することはこのような実施形態を実施するために必要とされないが、本発明の抗体が、それらの上に発現されたＶＥＧＦＲ１に結合したＶＥＧＦに結合することによって血管形成および腫瘍の血管系に、結合した薬剤を送達すると考えられる。従って、本発明のこれらの方法および使用は、血管形成の血管、腫瘍または腫瘍内血管系に、選択された治療剤または診断学的薬剤を送達することに関し、血管形成の血管、腫瘍または腫瘍内血管系で発現されるか、過剰発現されるか、またはアップレギュレートされるＶＥＧＦＲ１に結合したＶＥＧＦに抗体が結合することを可能にするのに有効な様式で、少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体またはそれらの抗原結合フラグメント、必要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するものに、診断学的薬剤または治療用薬剤が作動可能に結合される免疫結合体を含む、生物学的に有効な量の組成物を、処置が必要な哺乳動物または患者に投与する工程、すなわち、血管形成の血管、腫瘍または腫瘍内血管系のＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ１に診断学的薬剤または治療用薬剤を送達する工程を包含する。
腫瘍または腫瘍内血管系または間質への選択された治療薬剤の送達は、血流を止めるために、または特に腫瘍血管系内の血流を止めるために；破壊するために、または特に腫瘍血管系を破壊するために；および壊死を誘発するために、または腫瘍内の特異的な壊死を誘発するために、作用する。従って、これらの方法および使用は、血管形成された腫瘍を有する哺乳動物または患者を処置するための方法として要約され得、この方法は、作動可能に治療薬剤に結合される、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するもの、またはそれらの抗原結合フラグメントを含む少なくとも第１の免疫結合体を含む、治療学的に有効な量の少なくとも第１の薬学的組成物を、哺乳動物または患者に投与する工程を包含する。
本発明における使用のための「治療学的に有効な量」は、少なくとも一部の腫瘍または腫瘍内の血管内皮細胞を特異的に殺傷するために；少なくとも一部の腫瘍または腫瘍内血管内皮細胞にアポトーシスを特異的に誘発するために；少なくとも一部の腫瘍または腫瘍内血管に特異的に凝固を促進するために；腫瘍の少なくとも一部の血液輸送血管を特異的に閉塞または破壊するために；少なくとも一部の腫瘍内に特異的に壊死を誘発するために；および／または選択された哺乳動物または患者への投与の際に腫瘍の後退または寛解を誘発するために、有効な、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの免疫結合体の量である。このような効果が達成される一方で、正常で健康な組織内の血管内皮細胞への結合がほとんどまたは全くないか、あるいは正常で健康な組織内の血管内皮細胞の殺傷がほとんどまたは全くないことを示し；健康で正常な組織内の血管の閉塞または破壊の際の凝固がほとんどまたは全くないことを示し；そして哺乳動物または患者の正常で健康な組織におよぼす無視できるまたは扱いやすい有害な副作用を示す。
従って、腫瘍血管系内の凝固を促進する状況、または腫瘍血管系を破壊する状況、および／または腫瘍関質に結合する状況、および／または腫瘍壊死をもたらす状況において、本明細書中で使用される用語「好ましくは」および「特に」は、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの免疫結合体が、実質的に腫瘍間質、血管系および腫瘍部位に制限される間質の結合、凝固、破壊および／または腫瘍壊死を達成するように機能することを意味し、そして哺乳動物または被験体の正常で健康な組織内の凝固、破壊および／または組織壊死に実質的に拡張しない。従って、健康な細胞および組織の構造および機能は、本発明の実施によって実質的に弱められずに維持される。
本発明の抗体は、ＶＥＧＦＲ１に関連したＶＥＧＦに結合することによって血管形成および腫瘍の血管系に薬剤を有効に送達するが、他の方法および使用が治療学的薬剤を腫瘍間質に送達することに基づいて作動し、ここでそれは付近の血管への治療学的効果を発揮する。これらの方法および使用は、腫瘍間質内の非レセプター結合ＶＥＧＦに免疫結合体を結合するのに有効な量で、少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体、またはそれらの抗原結合フラグメント、必要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するものに作動可能に結合された治療学的薬剤を含む免疫結合体を、血管形成腫瘍を有する哺乳動物または患者に投与する工程を包含する。
これらの方法および使用は、腫瘍間質内で免疫結合体を局在化するのに有効な量で、少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体、またはそれらの抗原結合フラグメント、必要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するものに作動可能に結合された治療学的薬剤を含む免疫結合体を、血管形成腫瘍を有する哺乳動物または患者に投与し、その結果、結合された治療用薬剤が、周囲の腫瘍血管系および／または腫瘍細胞に抗腫瘍効果を発揮する工程を包含する。
本発明の組成物ならびに方法および使用は、作動可能に少なくとも第１の治療用薬剤または診断用薬剤に結合される、少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体、またはそれらの抗原結合フラグメント、必要に応じてモノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するものを含む、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの免疫結合体を含む組成物に拡張する。ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの治療用結合体は、好ましくは、放射線療法薬剤、抗脈管形成剤、アポトーシス誘導因子、抗チューブリン薬剤、抗細胞性薬剤または細胞障害性薬剤、あるいは凝血薬（凝固因子）に連結される。
従って、本発明は抗体が少なくとも第１の治療用薬剤または診断用薬剤に作動可能に結合される、ある範囲の結合体化された抗体およびそれらのフラグメントを提供する。用語「免疫結合体」は、抗体と別の有効な薬剤との有効な結合を規定するために広く使用され、専ら任意の型の有効な結合をいうことは意図されず、そして特に化学的「結合体化」に限定されない。組換え融合タンパク質が、特に考慮される。送達薬剤または標的化薬剤が標的に結合し得、そして治療用薬剤または診断用薬剤が送達の際に十分に機能的である限り、結合の態様は適切である。
抗体の糖質部分を介する薬剤の結合がまた、考慮される。糖化（Ｏ−結合およびＮ−結合の両方）が、抗体内で天然に起こる。組換え抗体は、所望される場合、追加の糖化部位を再生または生成するために改変され、これは、適切なアミノ酸配列（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ、Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒ）を抗体の一次配列内に操作することによって容易に達成される。
ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの治療用結合体の使用、および関連した方法および使用のための現在好ましい薬剤は、抗体および／または特定の腫瘍の型または患者について選択された抗体の効果を補足するかまたは向上する薬剤である。「抗体の効果を補足するかまたは向上する治療用薬剤」として、放射線療法薬剤、抗脈管形成剤、アポトーシス誘導因子および抗チューブリン薬物、本明細書中における使用のために好ましい任意の１つ以上の薬剤が挙げられる。
好ましい薬剤と、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体との結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）は、「免疫結合体」を与え、ここで、このような免疫結合体は、しばしば、向上された、さらに相乗的な抗腫瘍特性を有する。この様式における使用のための現在好ましい抗脈管形成剤は、アンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、エンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、アンギオポイエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）、バスクロスタチン（ｖａｓｃｕｌｏｓｔａｔｉｎ）、カンスタチン（ｃａｎｓｔａｔｉｎ）およびマスピン（ｍａｓｐｉｎ）のいずれか１つである。現在好ましい抗チューブリン薬物として、コルヒチン、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデスチンおよびコンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）の１つ以上が挙げられる。
抗細胞性薬剤および細胞障害性薬剤の使用は、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの「イムノトキシン」を生じ、一方で、凝固因子の使用は、ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの「コアグリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄ）」を生じる。少なくとも２つの治療用薬剤（例えば、１つ以上の放射線療法薬剤、抗脈管形成剤、アポトーシス誘導因子、抗チューブリン薬物、抗細胞性薬剤および細胞障害性薬剤および凝固因子の組み合わせ）の使用もまた考慮される。
特定の適用において、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの治療剤は、内皮細胞を殺傷する能力または内皮細胞の増殖または細胞分裂を抑制する能力を有する細胞障害性薬剤、細胞増殖抑制性薬剤または他の抗細胞性薬剤に作動可能に結合される。適切な抗細胞性薬剤として、化学療法薬剤、ならびに細胞毒素および細胞増殖抑制性薬剤が挙げられる。細胞増殖抑制性薬剤は、一般に、標的細胞の天然の細胞周期を乱し、好ましくはその結果細胞が細胞周期から取り除かれる、薬剤である。
代表的な化学療法薬剤として、ステロイド；サイトカイン；抗代謝産物（例えば、サイトカインアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキセートまたはアミノプテリン）；アントラサイクリン；ミトマイシンＣ；ビンカアルカロイド；抗生物質；デメコルチン；エトポシド；ミトラマイシン；および抗腫瘍アルキル化剤（例えば、クロランブシルまたはメルファラン）が挙げられる。実際には、本明細書中の表Ｃに開示される薬剤のいずれかが使用され得る。特定の好ましい抗細胞性薬剤は、ＤＮＡ合成インヒビター（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アドリアマイシンなど）である。
特定の治療適用において、他の潜在的な薬剤と比較して、毒素部分は、大部分の毒素が細胞殺傷効果を送達するはるかに大きな能力のために、好ましい。従って、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体構築物のための特定の好ましい抗細胞性薬剤は、植物由来毒素、真菌由来毒素、または細菌由来毒素である。代表的な毒素として、エピポドフィロ毒素（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）；細菌性内毒素または細菌性内毒素の脂質Ａ部分；リボソーム不活性化タンパク質（例えば、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）またはゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ））；α−サルチン（α−ｓａｒｃｉｎ）；アスペルジリン（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｎ）；レストリクトチン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）；リボヌクレアーゼ（例えば、胎盤リボヌクレアーゼ）；ジフテリア毒素およびシュードモナス体外毒素が挙げられる。
好ましい毒素は、Ａ鎖毒素（例えば、リシンＡ鎖）である。最も好ましい毒素部分は、しばしば、糖質残基を改変または除去するように処理されているリシンＡであり、「脱グリコシル化したＡ鎖（ｄｇＡ）」と呼ばれる。脱グリコシル化したリシンＡ鎖は、その極度の効力、長い寿命のため、そしてそれが臨床的な等級および規模で製造することが経済的に容易であるため、好ましい。組換えリシンＡ鎖および／または短縮型リシンＡ鎖がまた、使用され得る。
腫瘍標的化およびイムノトキシンによる処置のために、以下の特許および特許出願が、特に、抗細胞性薬剤および細胞障害性薬剤に関する本教示をさらに補足するために、本明細書中において参考として援用される：米国出願第０７／８４６，３４９号；同第０８／２９５，８６８（米国特許第６，００４，５５４号）；同第０８／２０５，３３０号（米国特許第５，８５５，８６６号）；同第０８／３５０，２１２号（米国特許第５，９６５，１３２号）；同第０８／４５６，４９５号（米国特許第５，７７６，４２７号）；同第０８／４５７，４８７号（米国特許第５，８６３，５３８号）；同第０８／４５７，２２９号および同第０８／４５７，０３１（米国特許第５，６６０，８２７号）および同第０８／４５７，８６９号（米国特許第６，０５１，２３０号）。
本発明の２Ｃ３ベースの抗ＶＥＧＦ抗体または他のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体は、抗チューブリン薬物に連結され得る。本明細書中で使用される「抗チューブリン薬物」は、好ましくは、細胞有糸分裂に必要なチューブリン活性（好ましくは、チューブリン重合またはチューブリン脱重合）を直接的または間接的に阻害することによって、細胞有糸分裂を阻害する任意の薬剤、薬物、プロドラッグまたはそれらの組み合わせを意味する。
本明細書中での使用のための現在好ましい抗チューブリン薬物は、コルヒチン；タキサン（例えば、タキソール）；ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビンデシン）；およびコンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）である。代表的なコンブレタスタチンは、コンブレタスタチンＡ、Ｂおよび／またはＤ（Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３、Ａ−４、Ａ−５、Ａ−６、Ｂ−１、Ｂ−２、Ｂ−３、Ｂ−４、Ｄ−１およびＤ−２を含む）およびそれらのプロドラッグ形態である。
ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの治療剤は、凝固を促進し得る成分（すなわち、凝固剤）を含み得る。ここで、標的化抗体は、凝固を直接的にまたは間接的に刺激する因子に、例えば別の抗体を介して、直接的にまたは間接的に連結され得る。
このような使用のための好ましい凝固因子は、Ｔｉｓｓｕｅ Ｆａｃｔｏｒ（ＴＦ）およびＴＦ誘導体（例えば、短縮型のＴＦ（ｔＴＦ）、二量体のＴＦ、三量体のＴＦ、重合体のＴＦ／多量体のＴＦ、および第ＶＩＩ因子を活性化する能力に欠ける変異体ＴＦ）である。他の適切な凝固因子として、ビタミンＫ依存凝固剤（例えば、第ＩＩ／ＩＩａ因子、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子および第Ｘ／Ｘａ因子）；Ｇｌａ改変を欠くビタミンＫ依存凝固因子；Ｒｕｓｓｅｌｌクサリヘビ毒液第Ｘ因子活性化剤；血小板活性化化合物（例えば、トロンボキサンＡ2およびトロンボキサンＡ2シンターゼ）；およびフィブリン溶解のインヒビター（例えば、α２−抗プラスミン）が挙げられる。
コアグリガンドを用いる腫瘍標的化および処置は、以下の特許および特許出願に記載され、それらの各々は、特にコアグリガンドおよび凝固因子に関する本教示をなおさらに補強するために参考として本明細書中に援用される：米国出願第０７／８４６，３４９号；同第０８／２０５，３３０（米国特許第５，８５５，８６６号）；同第０８／３５０，２１２号（米国特許第５，９６５，１３２号）；同第０８／２７３，５６７号；同第０８／４８２，３６９号（米国特許第５，＿＿，＿＿号；１９９８年１０月２０日に特許証発行料金支払い）；同第０８／４８５，４８２号；同第０８／４８７，４２７号（米国特許第６，００４，５５５号）；同第０８／４７９，７３３号（米国特許第第５，８７７，２８９号）；および同第０８／４７２，６３１；同第０８／４７９，７２７号および同第０８／４８１，９０４号（米国特許第６，０３６，９５５号）。
免疫結合体およびイムノトキシンの調製は、一般的に当該分野において周知である（例えば、本明細書中において参考として援用される米国特許第４，３４０，５３５号を参照のこと）。以下の特許および特許出願は、イムノトキシンの発生、精製および使用に関する本教示をなおさらに補充するために参考として本明細書中にさらに援用される：米国出願第０７／８４６，３４９号；同第０８／２９５，８６８（米国特許第６，００４，５５４号）；同第０８／２０５，３３０号（米国特許第５，８５５，８６６号）；同第０８／３５０，２１２号（米国特許第５，９６５，１３２号）；同第０８／４５６，４９５号（米国特許第５，７７６，４２７号）；同第０８／４５７，４８７号（米国特許第５，８６３，５３８号）；同第０８／４５７，２２９号および同第０８／４５７，０３１（米国特許第５，６６０，８２７号）および同第０８／４５７，８６９号（米国特許第６，０５１，２３０号）。
免疫結合体およびイムノトキシンの調製において、特定のリンカーの使用を通して利点が達成され得る。例えば、立体的に「かさ高い（ｈｉｎｄｅｒｅｄ）」ジスルフィド結合を含むリンカーは、インビボにおけるそれらのより大きな安定性のために、好ましく、従って作用部位での結合の前の、毒素部分の放出を防止する。一般に、作用の意図される部位（この点で、結合体が良好な「放出」特性を有することが所望される）を除く身体のいかなる箇所に見出される条件下でインタクトなままである結合体を有することが所望される。
使用される特定の毒素化合物に依存して、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３−ベースの抗体および毒素化合物を作動可能に結合するペプチドスペーサーを提供することが必要であり得る。ここで、このペプチドスペーサーは、ジスルフィド結合したループ構造に折り畳まれ得る。次いで、ループ内のタンパク質分解性切断が、ヘテロダイマーポリペプチドを産生し、ここで、抗体および毒素化合物は、単一のジスルフィド結合のみによって結合される。
特定の他の毒素化合物が利用される場合、非切断性ペプチドスペーサーが、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３−ベースの抗体および毒素化合物を作動可能に結合するように提供され得る。非切断性ペプチドスペーサーとともに使用され得る毒素は、それ自体がタンパク質分解性切断によって細胞傷害性ジスルフィド結合形態に変換され得る毒素である。このような毒素化合物の例は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素化合物である。
種々の化学療法剤および他の薬物がまた、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３−ベースの治療法に首尾良く結合体化され得る。抗体に結合体化される例示的な抗悪性腫瘍薬としては、ドキソルビシン、ダウノマイシン、メトトレキサートおよびビンブラスチンが挙げられる。さらに、他の薬剤（例えば、ネオカルチノスタチン、マクロマイシン（ｍａｃｒｏｍｙｃｉｎ）、トレニモン（ｔｒｅｎｉｍｏｎ）およびα−アマニチン）の結合が記載されている（米国特許第５，６６０，８２７号；同第５，８５５，８６６号；および同第５，９６５，１３２号を参照のこと；各々は、本明細書中で援用される）。
本発明者らの以前の研究のうちの１つに鑑みて、コアグリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄ）の調製は、ここでまた、容易に行われる。ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３−ベースの抗体との、１つ以上の凝固因子の作動可能な会合は、直接的な連結（イムノトキシンについての上記の連結のような）であり得る。あるいは、作動可能な会合は、間接的な結合（例えば、抗体が、第二の結合領域、好ましくは、凝固因子に結合する、抗体または抗体の抗原結合領域に作動可能に結合する場合）であり得る。凝固因子は、特に、共有結合が使用されて分子を結合する場合に、機能的凝固部位とは異なる部位で、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３−ベースの抗体に結合されるべきである。
間接的に結合したコアグリガンドは、頻繁に、二重特異性抗体に基づく。二重特異性抗体の調製はまた、当該分野で周知である。一つの調製方法は、一方に標的化された腫瘍成分についての特異性を有し、そして他方に凝固剤についての特異性を有する抗体の分離調製を含む。次いで、２つの選択された抗体由来のペプシンＦ（ａｂ’γ）2フラグメントが生成され、その後、分離したＦａｂ’γＳＨフラグメントを提供するように、各々が還元される。次いで、結合されるべき２つのパートナーのうちの１つに対するＳＨ基が、架橋試薬（例えば、ｏ−フェニレンジマレイミド）を用いてアルキル化されて、１つのパートナー上に遊離のマレイミド基を提供する。次いで、このパートナーは、チオエーテル結合によって、他に結合体化されて、所望のＦ（ａｂ’γ）2ヘテロ結合体を与え得る（Ｇｌｅｎｎｉｅら、１９８７；本明細書中に参考として援用される）。他のアプローチ（例えば、ＳＰＤＰまたはプロテインＡを用いた架橋）がまた、実施され得る。
二重特異性抗体を生成するための別の方法は、２つのハイブリドーマを融合させて、クアドローマを形成する。本明細書中で使用されるように、用語「クアドローマ」は、２つのＢ細胞ハイブリドーマの生産的融合を記載するために使用される。この標準的技術を使用して、ハイブリドーマを生成する２つの抗体を融合して娘細胞を与え、次いで、クロノタイプの免疫グロブリン遺伝子の両方のセットの発現を維持する細胞が選択される。
クアドローマを生成する好ましい方法は、親ハイブリドーマのうちの少なくとも１つの酵素欠損変異体の選択を含む。次いで、この第一の変異ハイブリドーマ細胞株を、例えば、その連続的生存を妨げるヨードアセトアミドに、致死的に曝露された第二のハイブリドーマの細胞に融合する。細胞融合は、致死的に処理されたハイブリドーマから、その酵素欠損についての遺伝子を獲得することによって、第一のハイブリドーマのレスキューを可能にし、そして第一のハイブリドーマへの融合を介した第二のハイブリドーマのレスキューを可能にする。同じアイソタイプであるが、異なるサブクラスの免疫グロブリンの融合が好ましいが、必要とはされない。混合されたサブクラスの抗体は、好ましいクアドローマの単離のための代替のアッセイの場合に使用され得る。
マイクロタイター同定実施形態、ＦＡＣＳ、免疫蛍光染色、イディオタイプ特異的抗体、抗原結合競合アッセイおよび抗体の特徴付けの分野で一般的な他の方法が使用されて、好ましいクアドローマを同定し得る。クアドローマの単離後、二重特異性抗体が、他の細胞生成物から離れて精製される。これは、免疫グロブリン精製の分野の当業者に公知の、種々の抗体単離手順によって果たされ得る（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８８を参照のこと；本明細書中で参考として援用される）。プロテインＡセファロースカラムまたはプロテインＧセファロースカラムが好ましい。
免疫結合体、イムノトキシンおよびコアグリガンドの調製において、組換え発現が利用され得る。選択されたＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３−ベースの抗体および治療剤、毒素または凝固薬をコードする核酸配列が、発現ベクターにおいて、インフレームで結合する。従って、組換え発現は、核酸の翻訳を生じ、所望の免疫結合体を産生する。化学的架橋剤およびアビジン：ビオチン架橋がまた、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３−ベースの抗体に治療剤を結合し得る。
以下の特許および特許出願が、コアグリガンド調製、精製および使用（二重特異性抗体コアグリガンドを含む）に関する本教示をいっそうさらに補う目的のために、本明細書中に参考として各々が援用される：米国出願番号０７／８４６，３４９；０８／２０５，３３０（米国特許第５，８５５，８６６号）；０８／３５０，２１２（米国特許第５，９６５，１３２号）；０８／２７３，５６７；０８／４８２，３６９（米国特許第５，＿，＿号；１９９８年１０月２０日に、特許証発行料金を支払い）；０８／４８５，４８２；０８／４８７，４２７（米国特許第６，００４，５５５号）；０８／４７９，７３３（米国特許第５，８７７，２８９号）；０８／４７２，６３１；および０８／４７９，７２７および０８／４８１，９０４（米国特許第６，０３６，９５５号）。
放射線療法剤、抗脈管形成剤、アポトーシス誘導因子、抗チューブリン薬物、毒素および凝固薬との免疫結合体（化学的結合体化によって調製されるにせよまたは組換え発現によって調製されるにせよ）は、生物学的に放出可能な結合および／または選択的切断可能スペーサーもしくはリンカーを利用し得る。このような組成物は、好ましくは、循環の間に適度に安定であり、そして疾患部位または腫瘍部位への送達に際して、優先的または特異的に放出される。
特定の好ましい例は、酸感受性スペーサーであり、ここで、コルヒチンまたはドキソルビシンに結合したＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体が特に意図される。他の好ましい例は、特異的もしくは優先的に存在するか、または疾患部位（例えば、腫瘍環境）内で活性である、ペプチダーゼおよび／またはプロテイナーゼのための切断部位を含むペプチドリンカーである。疾患部位または腫瘍部位への免疫結合体の送達は、凝固因子の切断および凝固因子の比較的特異的な放出を生じる。
ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、プラスミン、プラスミノーゲン、ＴＧＦβ、スタフィロキナーゼ（ｓｔａｐｈｙｌｏｋｉｎａｓｅ）、トロンビン、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子またはメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）（例えば、間質コラゲナーゼ、ゼラチナーゼまたはストロメライシン）についての切断部位を含むペプチドリンカーは、米国特許第５，８７７，２８９号（本明細書中でこのような目的のために参考として援用され、そして本明細書中の表Ｂ２において、さらに例示される）に記載され、そしてこの米国特許第５，８７７，２８９号によって可能にされるように、特に好ましい。
ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体はまた、誘導体化されて、官能基を導入し、生物学的に放出可能な結合を介した治療剤の結合を可能にし得る。従って、標的化抗体が誘導体化されて、側鎖を導入し、ヒドラジド基、ヒドラジン基、一級アミン基または二級アミン基で終端し得る。治療剤は、シッフ塩基結合、ヒドラゾンまたはアシルヒドラゾン結合もしくはヒドラジドリンカーを介して結合体化され得る（米国特許第５，４７４，７６５号および同第５，７６２，９１８号、各々は、本明細書中で参考として具体的に援用される）。
本来抗脈管形成性であろうと脈管標的化ベースであろうと、本発明の組成物および方法は、他の治療法および診断法と組み合わせて使用され得る。本発明に従って、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体と「組み合わせた」使用のための生物学的因子（好ましくは、診断剤または治療剤）（例えば、２Ｃ３ベースの抗体）という点では、用語「組み合わせた」は、簡潔に使用されて、実施形態の範囲にわたる。「組み合わせた」用語は、特に明記しない限り、科学用語から明らかであり、従って、組み合わせた組成物、医薬、カクテル、キット、方法ならびに第一の医療用使用および第二の医療用使用の種々の型に適用する。
従って、本発明の「組み合わせた」実施形態は、例えば、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体が、裸の抗体であり、そしてその抗体に作動可能に結合しない、薬剤または治療剤と組み合わせて使用される場合を含む。このような場合において、薬剤または治療剤は、非標的化形態または標的化形態で使用され得る。「非標的化形態」において、薬剤（特に、治療剤）は、一般的に、当該分野におけるその標準的使用に従って使用される。「標的化形態」において、薬剤は、一般的に、脈管形成疾患部位または腫瘍へ薬剤または治療剤を送達する、異なる抗体または標的化領域に作動可能に結合する。生物学的薬剤のこのような標的化形態の使用（診断法および治療法の両方）がまた、当該分野でかなり標準的である。
本発明の他の「組み合わせた」実施形態において、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体は、免疫結合体であり、ここで、抗体は、それ自体、薬剤または治療剤と作動可能に会合するか、または結合する。特定の好ましい例において、薬剤（診断剤および治療剤を含む）は、「２Ｃ３標的化薬剤」である。作動可能な結合は、本明細書中に記載され、そして当該分野で公知のように、直接的結合および間接的結合のすべての形態を含む。
「組み合わせた」使用（特に、治療剤と組み合わせたＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体という点において）はまた、組み合わせた組成物、医薬、カクテル、キット、方法ならびに第一の医療用使用および第二の医療用使用を含み、ここで、治療剤は、プロドラッグの形態にある。このような実施形態において、薬物の機能的形態へプロドラッグを変換し得る活性化成分は、本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体と、再び作動可能に会合し得る。
特定の好ましい実施形態において、治療組成物、組み合わせ、医薬、カクテル、キット、方法ならびに第一の医療用使用および第二の医療用使用は、「２Ｃ３プロドラッグ組み合わせ」である。当業者によって理解されるように、用語「２Ｃ３プロドラッグ組み合わせ」は、特に明記しない限り、２Ｃ３ベースの抗体が、活性薬物にプロドラッグを変換し得る成分に作動可能に結合することを意味し、２Ｃ３ベースの抗体が、プロドラッグ自体に結合することを意味しない。しかし、本発明のプロドラッグ実施形態が、２Ｃ３プロドラッグ組み合わせとして使用される必要条件は存在しない。従って、プロドラッグは、当該分野において使用される任意の様式（ＡＤＥＰＴおよび他の形態を含む）で使用され得る。
従って、組み合わせた組成物、医薬、カクテル、キット、方法ならびに第一の医療用使用および第二の医療用使用が、好ましくは、診断剤およびより好ましくは、治療剤という点において記載され、組み合わせとしては、裸の抗体および免疫結合体である、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、２Ｃ３ベースの抗体）が挙げられ、ここで、本発明のインビボ実施形態の実施は、裸の抗体または免疫結合体および生物学的因子、診断剤または治療剤の、前投与、同時投与または引き続く投与を含む；いくつかの結合体化形態または非結合体化形態の限りは、抗体のいくつかの形態、および生物学的因子、診断剤または治療剤のいくつかの形態の供給全体が達成される。
本発明の特に好ましい組み合わせた組成物、方法および使用は、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体およびエンドスタチンを含むものである（米国特許第５，８５４，２０５号、特に、本明細書中で参考として援用される）。これらは、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３構築物が、裸の抗体または免疫結合体である場合を含み：そして免疫結合体の場合、ここで、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３は、エンドスタチン（必要に応じて、アンギオテンシンを伴う）と結合し；ここで、組み合わせた治療方法または使用は、エンドスタチン（必要に応じて、アンギオテンシンを伴う）の前投与、同時投与または引き続く投与を含み；いくつかの結合体化形態または非結合体化形態の限りは、２Ｃ３、エンドスタチンおよび必要に応じてアンギオテンシンの供給全体が達成される。コラゲナーゼと作動可能に会合する、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体がまた、コラゲナーゼとして提供され、腫瘍に特異的に送達される場合、インサイチュでエンドスタチンを産生し、類似の利益を達成する。
腫瘍に対する本発明の効果の、上述の説明および他の説明は、単純化のためになされ、操作の組み合わせた様式、結合された因子の型などを説明する。この記述的アプローチは、本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体の有利な性質の、控えめな表現または過剰な単純化のいずれかのように解釈されるべきではない。従って、このような抗体自身が、抗脈管形成性質およびＶＥＧＦ中和性質（例えば、ＶＥＧＦの生存機能を中和する）ことが理解され、そしてこのような抗体の免疫結合体が、これらの性質を維持し、そしてこれらの性質を結合された因子の性質と結合することが理解される；そしてさらに、抗体および任意の結合された因子の組み合わせた効果が、代表的には、増大されそして／または拡大されることが理解される。
従って、本発明は、組成物、薬学的組成物、治療キットおよび医療用カクテルを提供し、これらは、必要に応じて、少なくとも第一の組成物またはコンテナ中に、生物学的に有効量の少なくとも第一のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ１５９５）と実質的に同じエピトープに結合するものを含むか、またはこのような抗ＶＥＧＦ抗体の、抗原結合フラグメントもしくは免疫結合体を含む；そして生物学的に有効量の少なくとも第二の生物学的因子、成分または系を含む。
「少なくとも第二の生物学的因子、成分または系」は、しばしば、治療剤もしくは診断剤、成分または系であるが、しばしば、治療剤もしくは診断剤、成分または系ではない。例えば、少なくとも第二の生物学的因子、成分または系は、抗体の改変のための成分および／または抗体への他の因子の結合のための成分を含み得る。特定の好ましい第二の生物学的因子、成分または系は、プロドラッグ、またはプロドラッグを作製しそして使用するための成分であり、この成分は、プロドラッグ自身を作製するための成分および本発明の抗体を適応させるための成分を含み、このようなプロドラッグまたはＡＤＥＰＴ実施形態において機能する。
治療剤または診断剤が、少なくとも第二の生物学的因子、成分または系として含まれる場合、このような治療法および／または診断法は、代表的には、脈管形成疾患と関係した使用のためのものである。このような因子は、米国特許第５，７１２，２９１号、同第５，７５３，２３０号、同第５，９７２，９２２号、同第５，６３９，７５７号、ＷＯ９８／４５３３１およびＷＯ９８／１６５５１（各々は、本明細書中で参考として具体的に援用される）のいずれか１つに開示されるような、疾患または障害の、処置または診断における使用に適切な因子である。
処置されるべき疾患が癌である場合、「少なくとも第二の抗癌因子」は、治療キットまたはカクテルに含まれる。用語「少なくとも第二の抗癌因子」は、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３構築物（第一の抗癌因子である）を参照して選択される。従って、本発明の抗体は、化学療法剤、放射線療法剤、サイトカイン、抗脈管形成剤、アポトーシス誘導因子または抗癌イムノトキシンもしくはコアグリガンドと組み合わせられ得る。
本明細書中で使用されるように、「化学療法剤」は、悪性腫瘍の処置において使用される、古典的な化学療法剤または薬物をいう。この用語は、他の化合物が、抗癌効果を発揮する点において、化学療法剤として専門的に記載され得るという事実にもかかわらず、単純化のために使用される。しかし、「化学療法」は、当該分野において、異なる意味を有するようになり、そしてこの標準的な意味に従って使用されている。多くの例示的な化学療法剤が、本明細書中で記載される。当業者は、容易に化学療法剤の使用および適切な用量を理解するが、用量は、本発明と組み合わせて使用される場合に減少され得る。
「化学療法剤」とまたよばれ得る新規のクラスの薬物は、アポトーシスを誘導する因子である。このような薬物のうちのいずれか１つ以上（遺伝子、ベクター、アンチセンス構築物およびリボザイムを含む）はまた、適切なように、本発明と組み合わせて使用され得る。現在好ましい第二の因子は、抗脈管形成剤（例えば、アンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、エンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、バスキュロスタチン（ｖａｓｃｕｌｏｓｔａｔｉｎ）、カンスタチン（ｃａｎｓｔａｔｉｎ）およびマスピン（ｍａｓｐｉｎ））である。
他の例示的な抗癌因子としては、例えば、ネオマイシン、ポドフィロトキシン、ＴＮＦ−α、αvβ3アンタゴニスト、カルシウムイオノフォア、カルシウムフラックス誘導因子、およびその任意の誘導体またはプロドラッグが挙げられる。現在好ましい抗チューブリン薬物としては、コルヒチン、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｃｉｎｅ）、コンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）またはその誘導体もしくはプロドラッグが挙げられる。
抗癌イムノトキシンまたはコアグリガンドは、抗癌因子にさらに適切である。「抗癌イムノトキシンまたはコアグリガンド」あるいは標的化因子／治療剤構築物は、標的化因子（腫瘍細胞、腫瘍脈管構造または腫瘍支質の、標的可能成分または接近可能成分に結合し、そして治療剤（細胞傷害性因子（イムノトキシン）および凝固因子（コアグリガンド）を含む）に作動可能に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む）に基づく。腫瘍細胞、腫瘍脈管構造または腫瘍支質の、「標的可能成分または接近可能成分」は、好ましくは、表面発現成分、表面接近可能成分、または表面局在化成分であるが、ネクローシス細胞、またはそうでなければ傷害性腫瘍細胞あるいは血管内皮細胞から放出される成分（サイトゾルおよび／または核の腫瘍細胞抗原を含む）がまた標的化され得る。
抗体標的化剤および非抗体標的化剤の両方が用いられ得、これには以下が挙げられる：ＶＥＧＦおよびＦＧＦのような増殖因子；腫瘍脈管構造に特異的に結合するトリペプチドＲ−Ｇ−Ｄを含有するペプチド；ならびにアネキシンおよび関連するリガンドのような他の標的化成分。
抗腫瘍細胞イムノトキシンまたはコアグリガンドは、Ｂ３（ＡＴＣＣ ＨＢ １０５７３）、２６０Ｆ９（ＡＴＣＣ ＨＢ ８４８８）、Ｄ６１２（ＡＴＣＣ ＨＢ ９７９６）およびＫＳ１／４と称される抗体からなる群により例証される抗体を含み得る。このＫＳ１／４抗体は、ベクターｐＧＫＣ２３１０（ＮＲＲＬ Ｂ−１８３５６）またはベクターｐＧ２Ａ５２（ＮＲＲＬ Ｂ−１８３５７）を含む細胞から得られた。
壊死腫瘍細胞から放出される細胞内成分に結合する抗体またはその抗原結合領域を含む、抗腫瘍細胞標的化剤もまた意図される。好ましくは、このような抗体は、透過性となるように誘導され得る細胞中、または実質的にすべての壊死細胞および正常細胞の細胞ゴースト中に存在するが、哺乳動物の正常な生細胞の外側では存在しないかもしくはアクセス可能でない、不溶性の細胞内抗原に結合する、モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントである。
米国特許第５，０１９，３６８号、同第４，８６１，５８１号、および同第５，８８２，６２６号（各々、Ａｌａｎ Ｅｐｓｔｅｉｎおよび共同研究者らに対して発行）は、インビボにおいて悪性細胞からアクセス可能となる細胞内抗原に特異的な抗体を作製および使用する方法を、よりさらに記載および教示する目的で、各々詳細に、本明細書中で参考として援用される。記載される抗体は、哺乳動物悪性細胞の内部細胞性成分に対して十分に特異的であるが、外部細胞性成分に対しては特異的ではない。例示的な標的としては、ヒストンが挙げられるが、壊死腫瘍細胞から特異的に放出されるすべての細胞内成分が、包含される。
血管新生化腫瘍を有する動物または患者への投与に際して、インビボで生じそして悪性細胞の少なくとも一部分に壊死を引き起こす腫瘍リモデリングのプロセスに起因して、血管新生化腫瘍は天然に壊死腫瘍細胞を含むという事実によって、このような抗体は、悪性細胞に局在化する。さらに、腫瘍壊死を増強する他の治療と組合せたこのような抗体の使用は、標的化療法およびその後の治療の有効性を増強させるために供される。
従って、抗体のこれらの型は、一般的に本明細書中に開示されるように、アンギオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）と直接的または間接的に結合させるように使用され得、そして血管新生化腫瘍内の壊死悪性細胞にアンギオポエチンを投与するように使用され得る。
米国特許第５，０１９，３６８号、同第４，８６１，５８１号、および同第５，８８２，６２６号（各々、本明細書中で参考として援用される）においても開示されるように、これらの抗体は、組合せ診断方法（以下を参照のこと）および抗腫瘍治療の有効性を測定するための方法において使用され得る。このような方法は、一般的に、標識化バージョンの抗体の調製および投与、ならびに壊死組織内に優先的に結合された内部細胞性成分標的への標識化抗体の結合を測定することを包含する。それによって、この方法は、壊死組織を画像化する。ここで、局在化した抗体濃度は、腫瘍の存在の指標であり、そして抗腫瘍治療によって殺傷された細胞のゴーストを示す。
抗腫瘍支質イムノトキシンまたはコアグリガンドは、フィブリン、ＲＩＢＳまたはＬＩＢＳへの結合により例証されるように、一般的に、結合組織成分、基底膜成分、または活性化血小板成分に結合する抗体を含む。
抗腫瘍脈管構造のイムノトキシンまたはコアグリガンドは、血管新生化腫瘍の血液輸送血管（好ましくは腫瘍内血管）の表面発現成分、表面アクセス可能成分、または表面局在化成分に結合するリガンド、抗体またはそれらのフラグメントを含み得る。このような抗体は、血管新生化腫瘍の腫瘍内血管の表面発現成分に結合する抗体を含む。これには、以下が挙げられる：腫瘍内脈管構造細胞表面レセプター（例えば、エンドグリン（ＴＥＣ−４抗体およびＴＥＣ−１１抗体））、ＴＧＦβレセプター、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＰＳＭＡ、ＶＥＧＦ／ＶＰＦレセプター、ＦＧＦレセプター、ＴＩＥ、αvβ3インテグリン、プレイオトロピン、エンドシアリンならびにＭＨＣクラスＩＩタンパク質。この抗体はまた、腫瘍内血管のサイトカイン誘導性成分または凝血剤誘導性成分に結合し得る。特定の好ましい薬剤は、アミノリン脂質（例えば、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルエタノールアミン）に結合する。
他の抗腫瘍脈管構造イムノトキシンまたはコアグリガンドは、腫瘍内脈管構造細胞表面レセプターに結合するリガンドまたは増殖因子に結合する抗体またはそれらのフラグメントを含み得る。このような抗体は、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ（ＧＶ３９およびＧＶ９７抗体）、ＦＧＦ、ＴＧＦβ、ＴＩＥに結合するリガンド、腫瘍関連フィブロネクチンアイソフォーム、散乱因子／肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血小板因子４（ＰＦ４）、ＰＤＧＦおよびＴＩＭＰと結合する抗体を含む。これらの抗体またはそれらのフラグメントはまた、リガンド：レセプター複合体または増殖因子：レセプター複合体に結合し得るが、リガンドもしくは増殖因子またはレセプターがリガンド：レセプター複合体または増殖因子：レセプター複合体中にない場合、リガンドにも増殖因子にもレセプターにも結合し得ない。
抗腫瘍細胞、抗腫瘍支質または抗腫瘍脈管構造抗体−治療剤構築物は、植物由来毒素、真菌由来毒素、または細菌由来毒素のような抗脈管形成剤、アポトーシス誘発剤、抗チューブリン薬、細胞傷害性薬剤を含み得る。リシンＡ鎖および脱グリコシル化リシンＡ鎖が、しばしば好ましい。抗腫瘍細胞、抗腫瘍支質または抗腫瘍脈管構造抗体−治療剤構築物は、凝血剤（直接的または間接的に作用する凝固因子）に結合する凝固因子または第２の抗体結合領域（凝固因子に結合する）を含み得る。組織因子または組織因子誘導体（例えば、短縮された組織因子）との作動可能な結合が、しばしば好ましい。
本発明の組成物、キット、および／または医薬に関して、治療剤の併用有効量は、単一の容器もしくは容器手段内に含まれても、または異なる容器もしくは容器手段内に含まれてもよい。反応混液は、一般的に、併用使用のために共に混合される。静脈内投与のために処方される薬剤が、しばしば好ましい。画像化成分もまた、含まれ得る。キットはまた、少なくとも第１の抗体、および１以上の他に含まれる生物学的薬剤の使用に関する指示書を備え得る。
概して、少なくとも第２の抗癌剤は、ＶＥＧＦＲ２−遮断（ＶＥＧＦＲ２−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）、抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの治療剤と実質的に同時に、動物または患者に投与され得る（例えば、単一の薬学的組成物から、または密接して一緒に投与される２つの薬学的組成物から）。
あるいは、少なくとも第２の抗癌剤は、ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの治療剤の投与に対して逐次的な時間に、動物または患者に投与され得る。「逐次的な時間」は、本明細書中で使用される場合、「時差的（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）」を意味し、その結果、少なくとも第２の抗癌剤は、ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの治療剤の投与と異なる時点で、動物または患者に投与される。一般的に２つの薬剤は、その２つの薬剤が、それらの個々の治療効果を発揮するのを可能にするに有効な時間間隔を隔てた時点で投与される（すなわち、２つの薬剤は、「生物学的に有効な時間間隔」で投与される）。少なくとも第２の抗癌剤は、ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの治療剤の前に、生物学的に有効な時間に動物または患者に投与され得るか、あるいは、それらの治療剤に対して逐次的に、生物学的に有効な時間に動物または患者に投与され得る。
従って、本発明は、血管新生化腫瘍を有する動物または患者を処置するための方法を提供し、この方法は、以下を包含する：
（ａ）腫瘍負荷量を実質的に減少させる第１の処置に、動物または患者を供する工程；および
（ｂ）引き続いて、任意の残存する腫瘍細胞からの転移を阻害するに有効な量で、少なくとも第１の抗脈管形成剤を、この動物または患者に投与する工程であって；ここで、この第１の抗脈管形成剤は、少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体またはその抗原結合フラグメントであるか、必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するものであり；必要に応じて、この抗体またはフラグメントは、第２の抗脈管形成剤と作動可能に連結される、工程。
好ましい第１の処置としては、外科的切除および化学療法介入が挙げられる。併用される抗脈管形成剤（例えば、アンギオポエチン２または腫瘍標的化アンギオポエチン２構築物）もまた使用され得る。
血管新生化腫瘍を有する動物または患者についての他の処置方法は、以下を包含する：
（ａ）実質的に腫瘍壊死を誘導するに有効な量で、第１の抗体−治療剤構築物を、動物または患者に投与する工程であって；ここで、この第１の抗体−治療剤構築物は、腫瘍細胞、腫瘍脈管構造または腫瘍支質の表面発現成分、表面アクセス可能成分、または表面局在化成分に結合する第１の抗体またはその抗原結合フラグメントに作動可能に連結された治療剤を含む、工程；および
（ｂ）引き続いて、任意の残存する腫瘍細胞からの転移を阻害するに有効な量で、第２の抗体を、この動物または患者に投与する工程であって；ここで、この第２の抗体は、少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体またはその抗原結合フラグメントであるか、必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するものであり；そしてさらに必要に応じて、この抗体またはフラグメントは、第２の抗脈管形成剤と作動可能に連結される、工程。
特に好ましい実施形態では、本発明は、プロドラッグおよびＡＤＥＰＴと組合せての使用のための、ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体および２Ｃ３ベースの抗体を提供する。このような組成物、配合物（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）、医薬品、キット、方法および使用において、ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体もしくは２Ｃ３ベースの抗体またはそれらのフラグメントは、変換能力または酵素学的能力を提供するように改変されるか、または少なくとも１つのプロドラッグをその薬物の活性形態に変換し得る少なくとも第１の変換剤または酵素に作動可能に連結（好ましくは、共有結合または結合体化）される。
酵素的または酵素に結合体化された抗体またはフラグメントは、「プロドラッグ」の最初の別個の処方物と組合せられる。プロドラッグは、不活性または弱い活性の形態の薬物であり、これは、ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３抗体に付随した酵素的能力、変換機能または酵素との接触に際して、活性形態の薬物に変換される。
従って、好ましくは別個の組成物および／または容器中に、以下を含むキットが提供される：
（ａ）生物学的有効量の少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体もしくは２Ｃ３ベースの抗体、またはそれらのフラグメントであって、これらは酵素学的機能を有し、好ましくはここで、この抗体またはフラグメントは、少なくとも第１の酵素と作動可能に連結されるか、共有結合されるか、または結合体化される、生物学的有効量の少なくとも第１の第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体もしくは２Ｃ３ベースの抗体、またはそれらのフラグメント；および
（ｂ）生物学的有効量の少なくとも第１の実質的に不活性なプロドラッグであって、ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体もしくは２Ｃ３抗体、またはフラグメントの酵素学的機能、またはそれらに結合されるか、連結されるか、もしくは結合体化された酵素によって、実質的に活性な薬物に変換される、生物学的有効量の少なくとも第１の実質的に不活性なプロドラッグ。
本発明はさらに、以下を包含する、有利な方法および使用を提供する：
（ａ）少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体もしくは２Ｃ３ベースの抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントを含む、生物学的有効量の少なくとも第１の薬学的組成物を、血管新生化腫瘍を有する動物または患者に投与する工程であって、ここで、この抗体またはフラグメントは、酵素学的機能を有し、好ましくはここで、この抗体またはフラグメントは、少なくとも第１の酵素と作動可能に連結されるか、共有結合されるか、または結合体化され；ここで、この抗体またはフラグメントは、投与後に、血管新生化腫瘍の脈管構造、腫瘍内脈管構造、または支質に局在化する、工程；および
（ｂ）引き続いて、有効な期間後に、生物学的有効量の少なくとも１つの実質的に不活性なプロドラッグを含む、生物学的有効量の少なくとも第２の薬学的組成物を、動物または患者に投与する工程であって；ここで、このプロドラッグは、この血管新生化腫瘍の脈管構造、腫瘍内脈管構造、または支質内に局在化されたＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体もしくは２Ｃ３抗体、またはフラグメントの酵素学的機能、またはそれらに連結されるか、結合されるか、または結合体化された酵素によって、実質的に活性な薬物に変換される、工程。
特定の他の実施形態では、本発明の抗体および免疫結合体は、１以上の診断剤、代表的に、脈管形成疾患に関連した使用のための診断剤と組合せられ得る。従って、一定範囲の診断用組成物、キット、および方法が、本発明に包含される。
癌の診断および処置に関して、本発明の診断用および画像化用の組成物、キットおよび方法は、インビボおよびインビトロでの診断を包含する。例えば、血管新生化腫瘍は、診断的に有効な量の腫瘍診断成分（これは、インビボでの診断用画像化剤に作動可能に結合された、腫瘍細胞、腫瘍脈管構造、または腫瘍支質のアクセス可能な成分に結合する少なくとも第１の結合領域を含む）を使用して、画像化され得る。
腫瘍画像化は、好ましくは、腫瘍脈管構造または腫瘍支質のアクセス可能な成分に結合する少なくとも第１の結合領域を含む診断成分を使用して、血管新生化腫瘍の支質および／または脈管構造の画像を提供するように実施される。任意の適切な結合領域または抗体（例えば、治療用構築物に関して上記されたもの）が、使用され得る。検出可能に標識されたＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体もしくは２Ｃ３ベースの抗体構築物を使用することによって、特定の利点が提供され、ここで、形成される画像は、使用される治療剤の結合部位に予言的である。
検出可能に標識されたインビボ腫瘍診断剤（ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体もしくは２Ｃ３ベースの抗体であっても、そうでなくても良い）は、以下を含み得る：Ｘ線検出可能化合物（例えば、ビスマス（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、ランタン（ＩＩＩ）、または鉛（ＩＩ））；放射性イオン（例えば、銅67、ガリウム67、ガリウム68、インジウム111、インジウム113、ヨウ素123、ヨウ素125、ヨウ素131、水銀197、水銀203、レニウム186、レニウム188、ルビジウム97、ルビジウム103、テクネチウム99m、またはイットリウム90）；核磁気スピン共鳴同位体（例えば、コバルト（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、クロム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、エルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、またはイッテルビウム（ＩＩＩ））；あるいはローダミンまたはフルオレセイン。
腫瘍処置の前の前画像化は、以下によって実施され得る：
（ａ）腫瘍細胞、腫瘍脈管構造（好適）または腫瘍支質（好適）のアクセス可能な成分に結合する少なくとも第１の結合領域に作動可能に連結された診断剤（ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体もしくは２Ｃ３ベースの抗体構築物に作動可能に連結された診断剤）を含む、診断的に有効な量の薬学的組成物を、動物または患者に投与する工程；および
（ｂ）引き続いて、腫瘍細胞、腫瘍血管（好適）または腫瘍支質（好適）に結合された、検出可能に標識された第１の結合領域（すなわち、ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体もしくは２Ｃ３ベースの抗体）を検出する工程であって；これによって、腫瘍、腫瘍脈管構造および／または腫瘍支質の画像を得る、工程。
癌の処置はまた、以下によって実施され得る：
（ａ）腫瘍結合剤、またはＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体もしくは２Ｃ３ベースの抗体に作動可能に連結された診断剤を含む、診断的に最少の量の少なくとも第１の検出可能に標識された腫瘍結合剤（好ましくは、ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体もしくは２Ｃ３ベースの抗体構築物）を、血管新生化腫瘍を有する動物または患者に投与し、それによって腫瘍、腫瘍脈管構造（好適）、または腫瘍支質（好適）の検出可能な画像を形成することによって、血管新生化腫瘍の画像を形成する工程；および
（ｂ）引き続いて、少なくとも第１の裸のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体もしくは２Ｃ３抗体または治療剤−抗体構築物の治療的に最適な量を、このような抗体を使用して、同じ動物または患者に投与し、それによって抗腫瘍効果をもたらす工程。
従って、画像化および処置の処方物または医薬が提供され、これは一般的に、以下を含む：
（ａ）診断的に有効な量の検出可能に標識された腫瘍結合剤（好ましくは、ＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体構築物）を含む第１の薬学的組成物であって、腫瘍結合剤またはＶＥＧＦＲ２−遮断、抗ＶＥＧＦ抗体もしくは２Ｃ３ベースの抗体に作動可能に連結された、検出可能な薬剤を含む、第１の薬学的組成物；および
（ｂ）治療的有効量の少なくとも１つの裸のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体もしくは２Ｃ３抗体、またはこのような抗体を用いた治療剤−抗体構築物を含む、第２の薬学的組成物。
本発明はまた、生物学的有効量の少なくとも１つの診断剤を含む、少なくとも１つの第一の組成物または薬学的組成物を含むインビトロの診断キットを提供し、診断剤は、少なくとも第一のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するもの、またはその抗原結合フラグメントと作動可能に連結される。
本発明はなおさらに、診断剤が、好ましくは動物または患者から得られる生物学的サンプルにおいて行われる試験と関連した、身体の外での使用のために意図される、組み合わされたキットを提供する。それとして、本発明は、一般的に少なくとも二つの異なる容器において、少なくとも第一の組成物、薬学的組成物または医薬カクテル（ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｏｃｋｔａｉｌ）を含み、これらは、生物学的有効量の少なくとも第一のＶＥＧＦＲ２遮断、抗ＶＥＧＦ抗体、必要に応じて、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合するもの、またはこのような抗ＶＥＧＦ抗体の抗原結合フラグメントまたは免疫結合体；およびインビトロの使用のために、生物学的有効量の少なくとも一つの診断薬剤、成分または系を含む、キットを提供する。
「インビトロでの使用のための診断剤、成分または系」は、脈管形成の要素を有する１つ以上の疾患の診断を可能にする、任意の診断剤または薬剤の組み合わせである。従って、インビトロでの診断は、以下のいずれか１つで開示されるような疾患または障害に関連した診断または予後の情報の作成において使用するのに適切な診断を含む：米国特許第５，７１２，２９１号、同第５，７５３，２３０号、同第５，９７２，９２２号、同第５，６３９，７５７号、 ＷＯ ９８／４５３３１およびＷＯ ９８／１６５５１（各々が詳細に、参考として本明細書中に援用される）。
癌診断および処置の点で、インビトロでの診断薬は、腫瘍細胞、腫瘍脈管構造（好ましくは）または腫瘍支質（好ましくは）の接近可能な成分に結合する、少なくとも第一の結合領域を含む診断成分（これは、インビトロ診断試験により直接的にまたは間接的に検出可能な「検出可能な因子またはレポーター因子」に作動可能に結合される）を好ましくは含む。インビトロで直接的に検出可能な「検出可能な因子またはレポーター因子」は、免疫蛍光検査により検出可能な、放射性標識およびレポーター薬剤のような因子を含む。
インビトロで間接的に検出可能な「検出可能な因子またはレポーター因子」は、さらなる内因性因子と共に機能する因子（例えば、色素基質と接触して、着色産物を生成する検出可能な酵素）を含む。インビトロでの間接的な検出はまた、検出可能な成分またはレポーター成分あるい系に及ぶ。これらは、第一の結合領域に免疫特異性を有する少なくとも１つの検出抗体と組み合わせて、腫瘍細胞、腫瘍脈管構造（好ましくは）または腫瘍支質（好ましくは）のアクセス可能な成分に結合する第一の結合領域を含む。「検出抗体」は、好ましくは、直接的または間接的に検出可能な因子（例えば、放射性標識または酵素）に結合する「２次抗体」である。あるいは、「２次および３次抗体検出系」が使用され得、この系は、１次検出抗体に対して免疫特異性を有する２次検出抗体と組み合わせて、第一の結合領域に対する免疫特異性を有する１次検出抗体を含み、この２次検出抗体は、直接的または間接的に検出可能な因子に結合される。
したがって、本発明は以下の項目を提供する：
（項目１） 生物学的有効量の抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む組成物であって、この抗体が、モノクローナル抗体ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５と実質的に同じエピトープに結合し、かつＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害する、組成物。
（項目２） 上記抗体が、モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントである、項目１に記載の組成物。
（項目３） 上記抗体が、ＩｇＧ抗体またはＩｇＭ抗体である、項目１または２に記載の組成物。
（項目４） 上記抗体が、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ダイアボディー、直鎖抗体、抗体のＦ（ａｂ’） 2 抗原結合フラグメントである、項目１または２に記載の組成物。
（項目５） 上記抗体が、この抗体またはその抗原結合フラグメントの二量体、三量体または多量体である、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目６） 上記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、または部分的ヒト抗体あるいはその抗原結合フラグメントである、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目７） 上記抗体が、ヒト抗体フレームワークまたは定常領域に作動可能に連結されたこの抗体の抗原結合領域を含む、項目６に記載の組成物。
（項目８） 上記抗体が、キメラ抗体である、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目９） 上記抗体が、組換え抗体である、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目１０） 上記抗体が、配列番号7または配列番号9のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列領域を含む少なくとも第１の可変領域を含む、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目１１） 上記抗体が、モノクローナル抗体ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５である、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目１２） 上記抗体が、少なくとも第１の生物学的薬剤に作動可能に連結される、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目１３） 上記抗体が、少なくとも、実質的に不活性なプロドラッグを切断して実質的に活性な薬物を放出する第１の薬剤に作動可能に連結される、項目１２に記載の組成物。
（項目１４） 上記抗体が、実質的に不活性なホスフェートプロドラッグを切断して実質的に活性な薬物を放出するアルカリホスファターゼに作動可能に連結される、項目１３に記載の組成物。
（項目１５） 上記抗体が、少なくとも第１の治療剤または診断剤に作動可能に連結される、項目１２に記載の組成物。
（項目１６） 上記抗体が、少なくとも第１の治療剤に作動可能に連結される、項目１５に記載の組成物。
（項目１７） 上記抗体が、少なくとも第１の治療剤および第２の治療剤に作動可能に連結される、項目１６に記載の組成物。
（項目１８） 上記抗体が、少なくとも第１の化学療法剤、放射療法剤、抗脈管形成剤、アポトーシス誘発剤、ステロイド、代謝拮抗薬、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、抗チューブリン薬、抗生物質、サイトカイン、アルキル化剤または凝血薬に作動可能に連結される、項目１６または１７に記載の組成物。
（項目１９） 上記抗体が、内皮細胞を殺傷し得るか、または内皮細胞の増殖または細胞分裂を抑制し得る細胞傷害性薬剤、細胞増殖抑制剤または抗細胞性薬剤に作動可能に連結される、項目１８に記載の組成物。
（項目２０） 上記抗体が、植物由来、真菌由来、または細菌由来の毒素に作動可能に連結される、項目１９に記載の組成物。
（項目２１） 上記抗体が、Ａ鎖毒素、リボソーム不活化タンパク質、α−サルシン、ゲロニン、アスペルギリン、レストリクトシン、リボヌクレアーゼ、エピポドフィロトキシン、ジフテリア毒素またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素に作動可能に連結される、項目２０に記載の組成物。
（項目２２） 上記抗体が、リシンＡ鎖または脱グリコシル化リシンＡ鎖に作動可能に連結される、項目２１に記載の組成物。
（項目２３） 上記抗体が、抗脈管形成剤に作動可能に連結される、項目１８に記載の組成物。
（項目２４） 上記抗体が、アンギオポエチンに作動可能に連結される、項目２３に記載の組成物。
（項目２５） 上記抗体が、アンギオポエチン−２に作動可能に連結される、項目２４に記載の組成物。
（項目２６） 上記抗体が、アンギオスタチン、バスキュロスタチン、カンスタチン、またはマスピンに作動可能に連結される、項目２３に記載の組成物。
（項目２７） 上記抗体が、エンドスタチンに作動可能に連結される、項目２３に記載の組成物。
（項目２８） 上記抗体が、抗チューブリン薬に作動可能に連結される、項目１８に記載の組成物。
（項目２９） 上記抗体が、コルヒチン、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびコンブレタスタチンからなる群から選択される、抗チューブリン薬に作動可能に連結される、項目２８に記載の組成物。
（項目３０） 上記抗体が、凝血薬に作動可能に連結される、項目１８に記載の組成物。
（項目３１） 項目３０に記載の組成物であって、ここで上記抗体が、第ＩＩ／ＩＩａ因子、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第Ｘ／Ｘａ因子、Ｇｌａ修飾を欠くビタミンＫ依存凝血因子、ラッセルクサリヘビ蛇毒第Ｘ因子活性化剤、トロンボキサンＡ 2 、トロンボキサンＡ 2 シンターゼおよびα２−抗プラスミンからなる群から選択される凝血薬に作動可能に連結される、組成物。
（項目３２） 上記抗体が、組織因子、ヒト組織因子、第ＶＩＩ因子を活性化する能力に欠ける変異組織因子、切断組織因子または二量体組織因子、三量体組織因子、もしくはポリマー組織因子、または組織因子誘導体に作動可能に連結される、項目３０に記載の組成物。
（項目３３） 上記抗体が、切断組織因子に作動可能に連結される、項目３２に記載の組成物。
（項目３４） 上記抗体が、診断薬、画像化剤または検出可能な薬剤に作動可能に連結される、項目１５に記載の組成物。
（項目３５） 上記抗体が、Ｘ線で検出可能な化合物、放射性イオンまたは核磁気スピン共鳴同位体に作動可能に連結される、項目３４に記載の組成物。
（項目３６） 上記抗体が、ビオチン、アビジン、または色素形成基質と接触する際に着色産物を生成する酵素に作動可能に連結される、項目３４に記載の組成物。
（項目３７） 項目１２〜３３のいずれか１項に記載の組成物であって、ここで上記抗体が、融合タンパク質として上記生物学的薬剤に作動可能に連結され、この融合タンパク質は、組換えベクターを発現させることにより調製され、この組換えベクターは、同じリーディングフレームで、この生物学的薬剤をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結されるこの抗体をコードするＤＮＡセグメントを含む、組成物。
（項目３８） 上記抗体が、生物学的に解離可能な結合または選択的に切断可能なリンカーを介して上記生物学的薬剤に作動可能に連結される、項目１２〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
（項目３９） 項目３８に記載の組成物であって、上記抗体が、ペプチドリンカーを介して上記生物学的薬剤に作動可能に連結され、このペプチドリンカーが、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、プラスミン、プラスミノーゲン、ＴＧＦβ、スタフィロキナーゼ、トロンビン、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、メタロプロテイナーゼ、間質コラゲナーゼ、ゲラチナーゼまたはストロメライシンに対する切断部位を含む、組成物。
（項目４０） 上記抗体が、上記生物学的薬剤に、直接連結される、項目１２〜３６のいずれか１項に記載の組成物。
（項目４１） 上記抗体が、上記治療剤または診断剤に結合する第２の抗体またはその抗原結合領域に作動可能に連結される、項目１５〜３６のいずれか１項に記載の組成物。
（項目４２） 上記組成物が、薬学的に受容可能な組成物である、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目４３） 上記薬学的に受容可能な組成物が、非経口投与または静脈内投与のために処方される、項目４２に記載の組成物。
（項目４４） 上記組成物が、第２の治療剤をさらに含む、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目４５） 上記第２の治療剤が、第２の抗癌剤である、項目４４に記載の組成物。
（項目４６） 上記第２の抗癌剤が、化学療法剤、放射療法剤、抗脈管形成剤、アポトーシス誘発剤、抗チューブリン薬、または化学療法剤のプロドラッグもしくは腫瘍を標的としたバージョン、放射療法剤、抗脈管形成剤、アポトーシス誘発剤もしくは抗チューブリン薬である、項目４５に記載の組成物。
（項目４７） 上記第２の抗癌剤が、アンギオポエチンまたは腫瘍を標的とするアンギオポエチンである、項目４６に記載の組成物。
（項目４８） 上記第２の抗癌剤が、アンギオポエチン−２または腫瘍を標的とするアンギオポエチン−２である、項目４７に記載の組成物。
（項目４９） 上記第２の抗癌剤が、エンドスタチンまたは腫瘍を標的とするエンドスタチンである、項目４６に記載の組成物。
（項目５０） 上記第２の抗癌剤が、抗チューブリン薬または腫瘍を標的とする抗チューブリン薬である、項目４６に記載の組成物。
（項目５１） 項目４６に記載の組成物であって、ここで上記第２の抗癌剤が、第２の抗体またはその抗原結合フラグメントに作動可能に連結される治療剤を含む抗体治療剤構築物であって、この構築物が、腫瘍細胞、腫瘍脈管構造または腫瘍支質の、表面発現成分、表面アクセス可能成分または表面局在化成分に結合する、組成物。
（項目５２） 治療の際に使用するための、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目５３） 診断の際に使用するための、項目１〜１１または３４〜３６のいずれか１項に記載の組成物。
（項目５４） 動物ヘ投与して新脈管形成を阻害する際に使用するための、項目１〜１１または項目２３〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
（項目５５） 血管新生化腫瘍を有する動物に投与して、この血管新生化腫瘍に生物学的薬剤を送達する際に使用するための、項目１２〜４１のいずれか１項に記載の組成物。
（項目５６） 癌を処置する際に使用するための、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目５７） 治療における上記項目のいずれかに記載の組成物の使用。
（項目５８） 新脈管形成を阻害することにより疾患を処置するための医薬の製造における、項目１〜１１または項目２３〜２７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
（項目５９） 生物学的薬剤を血管新生化腫瘍に送達することにより癌を処置するための医薬の製造における、項目１２〜４１のいずれか１項に記載の組成物の使用。
（項目６０） 癌を処置するための医薬の製造における、項目１〜５６のいずれか１項に記載の組成物の使用。
（項目６１） マクロファージ、破骨細胞または軟骨吸収細胞を実質的に阻害することなく新脈管形成を阻害する際の使用のための組成物であって、この組成物は、生物学的有効量の抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗原結合フラグメントを含み、この抗体が、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合する、組成物。
（項目６２） ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）へのＶＥＧＦの結合を阻害することにより癌を処置するための医薬の製造における組成物の使用であって、この組成物が、生物学的有効量の抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗原結合フラグメントを含み、この抗体が、モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に同じエピトープに結合する、使用。
（項目６３） 項目１〜５６のいずれか１項に記載の少なくとも第１の組成物を含むキット。
（項目６４） 項目１３または１４に記載の少なくとも第１の組成物および実質的に不活性なプロドラッグを含む少なくとも第２の組成物を含むキットであって、このプロドラッグが、この第１の組成物中の抗体に連結される生物学的薬剤により切断されて実質的に活性な薬物を放出する、キット。
（項目６５） 項目１４に記載の少なくとも第１の組成物およびリン酸コンブレタスタチンを含む少なくとも第２の組成物を含むキット。
（項目６６） 項目２〜１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
（項目６７） モノクローナル抗体ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５。
（項目６８） モノクローナル抗体ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５と実質的に同じエピトープに結合する抗ＶＥＧＦ抗体を調製するための方法であって、非ヒト動物を、少なくとも第１の免疫原性ＶＥＧＦ成分を含む免疫組成物を用いて免疫する工程、およびこの免疫された動物からこのモノクローナル抗体ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５と実質的に交差反応する抗体を選択する工程を包含する、方法。
（項目６９） 上記非ヒト動物が、ヒト抗体ライブラリーを含むトランスジェニックマウスである、項目６８に記載の方法。
（項目７０） 上記抗ＶＥＧＦ抗体をコードする核酸を得る工程、およびこの核酸を発現させて組換え抗ＶＥＧＦ抗体を得る工程を包含する、項目６８または６９に記載の方法。
（項目７１） 項目６８〜７０のいずれか１項に記載の方法であって、以下：
（ａ）非ヒト動物に、少なくとも第１の免疫原性ＶＥＧＦ成分を含む免疫有効量の組成物を投与する工程；
（ｂ）この免疫された動物の脾臓から単離されたＲＮＡを発現するコンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリーを調製する工程；
（ｃ）モノクローナル抗体２Ｃ３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ １５９５）と実質的に交差反応する抗ＶＥＧＦ抗体を発現するクローンをこのファージミドライブラリーから選択する工程；ならびに
（ｄ）この選択されたクローン由来の、抗ＶＥＧＦ抗体をコードする核酸を発現させて、組換え抗ＶＥＧＦ抗体を産生する工程、
を包含する方法。
（項目７２） ＶＥＧＦを検出する方法であって、ＶＥＧＦ／抗体複合体の形成を可能にするために有効な条件下で、ＶＥＧＦを含有すると推測される組成物を、項目１〜５６のいずれか１項に記載の組成物と接触させる工程、およびこのようにして形成されたこの複合体を検出する工程、を包含する方法。
（項目７３） ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１へのＶＥＧＦの結合を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合を阻害する方法であって、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）およびＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）を発現する細胞の同種集団または異種集団を生物学的有効量の項目１〜５６のいずれかに記載の組成物と接触させる工程を包含する方法。
（項目７４） ＶＥＧＦ誘導内皮細胞増殖を特異的に阻害する方法であって、内皮細胞集団を生物学的有効量の項目１〜５６のいずれか１項に記載の組成物と接触させる工程を包含する、方法。
（項目７５） ＶＥＧＦ誘導マクロファージ機能、破骨細胞機能または軟骨吸収細胞機能を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦ誘導内皮細胞増殖を阻害する方法であって、内皮細胞ならびにマクロファージ、破骨細胞および軟骨吸収細胞のうちの少なくとも１つを含む組織を、生物学的有効量の項目１〜５６のいずれか１項に記載の組成物と接触させる工程を包含する方法。
（項目７６） 新脈管形成を阻害する方法であって、潜在的に新脈管形成性の血管の集団を抗脈管形成組成物と接触させる工程を包含し、この抗新脈管形成組成物が、生物学的有効量の項目１〜５６のいずれか１項に記載の組成物を含む、方法。
（項目７７） 新脈管形成疾患を処置する方法であって、新脈管形成疾患を有する動物に、少なくとも第１の薬学的組成物を投与する工程を包含し、この第１の薬学的組成物が、治療的有効量の項目１〜５６のいずれか１項に記載の組成物を含む、方法。
（項目７８） 診断剤または治療剤を血管新生化腫瘍に送達するための方法であって、血管新生化腫瘍を有する動物に、生物学的有効量の項目１２〜４１のいずれか１項に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目７９） 癌を処置するための方法であって、少なくとも第１の薬学的組成物を、血管新生化固形腫瘍、転移性腫瘍または原発性腫瘍からの転移を有するかまたは発生する危険性のある動物に投与する工程を包含し、ここでこの少なくとも第１の薬学的組成物が、治療的有効量の項目１〜５６のいずれか１項に記載の組成物を含む、方法。
（項目８０） 上記動物を放射療法に供する工程をさらに包含する、項目７８または７９に記載の方法。
（項目８１） 癌を処置するための方法であって、以下：
（ａ）項目１３または１４に記載の第１の組成物を、血管新生化固形腫瘍、転移性腫瘍または原発性腫瘍からの転移を有する動物に投与し、それによりこの組成物の抗体を腫瘍脈管構造または支質に局在化させる工程；および
（ｂ）引き続いて、この動物に、この第１の組成物中の抗体に連結される生物学的薬剤により切断される実質的に不活性なプロドラッグを含む第２の組成物を投与し、それにより実質的に活性な薬物をこの腫瘍脈管構造または支質内に特異的に放出する工程、
を包含する方法。
（項目８２） 上記動物がヒト患者である、項目７８〜８１のいずれか１項に記載の方法。
以下の図面は、本明細書の一部分を形成し、そして本発明の特定の局面をさらに示すために含まれる。本発明は、本明細書中に示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つ以上に対して、参考としてより良く理解され得る。
２Ｃ３は、ＡＢＡＥ細胞のＶＥＧＦ媒介増殖を阻害する。ＡＢＡＥ細胞は、種々の示される抗体および０．５ｎＭ ＶＥＧＦの存在下で増殖される。４日後の増殖は、イエローホルマザンに対するＭＴＳ（Ｏｗｅｎ’ｓ試薬）の酵素的変換により、比色定量的に決定された。結果は、ＶＥＧＦ単独で増殖されたコントロールウェルにおけるホルマザン産生の百分率として示される。バックグラウンドを、ＶＥＧＦまたは抗体なしで細胞を増殖することにより決定し、そしてコントロールウェルおよびサンプルウェルから差し引いた。結果は、３つの測定の算術平均を示し、この平均の標準的な偏差は、常に、平均の２０％より少なかった。抗ＶＥＧＦ ＩｇＧ抗体（陽性コントロールとしてｍＡｂ４．６．１および陰性コントロールとして無関係の特異性のＩｇＧ（コントロールＩｇＧ））に対する増殖カーブが示された。 ２Ｃ３は、ＥＬＩＺＡにおいてＶＥＧＦＲ１ではなくＶＥＧＦＲ２に対するＶＥＧＦ結合をブロックした。ウェルが、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１／Ｆｃ）またはＶＥＧＦＲ２（ｓＦｌｋ−１）の細胞外ドメインを用いてコートされ、次いで、１ｎＭの単独ＶＥＧＦか、または１００ｎＭまたは１０００ｎＭのいずれかの、示されたＩｇＧ存在下で、ＶＥＧＦと共にインキュベートされた。次いで、プレートを、１μｇ／ｍｌのウサギ抗ＶＥＧＦ（Ａ−２０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）と共にインキュベートし、そしてペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗ウサギ抗体を用いて発色させた。アッセイを３回実施した。抗体の非存在下で、結合の平均百分率が、標準的な偏差と共に示された。アステリスクは、スチューデント対応Ｔ検定により、抗体の非存在下における値とは統計学的に有意に違う（ｐ＜０．００２）値を示す。 ２Ｃ３は、ヒト腫瘍異種移植片のインビボ増殖を阻害する。図３Ａ：１×１０7ＮＣＩ−Ｈ３５８ ＮＳＣＬＣ細胞が、０日目に、ｎｕ／ｎｕマウス中に皮下注射された。図３Ｂ：５×１０6 Ａ６７３横紋筋肉腫細胞が、０日目に、ｎｕ／ｎｕマウス中に皮下注射された。マウスは、その後、１日目と、週に２回、示されたＩｇＧを腹腔内に注射された。２Ｃ３が、一用量１００、１０、または１μｇ／注射で与えられ、一方、無関係の特異性のコントロールＩｇＧ（図３Ａ）および３Ｅ７（図３Ｂ）がまた、１００μｇ／注射で与えられた。腫瘍を、一週間あたり２〜３回測定した。平均および標準誤差が、図３Ａにおいて、この研究の継続期間に対して示されるが、この研究（２６日目）の最終日についてのデータは、図３Ｂにおいて示される。 ２Ｃ３は、ヒト腫瘍異種移植片のインビボ増殖を阻害する。図３Ａ：１×１０7ＮＣＩ−Ｈ３５８ ＮＳＣＬＣ細胞が、０日目に、ｎｕ／ｎｕマウス中に皮下注射された。図３Ｂ：５×１０6 Ａ６７３横紋筋肉腫細胞が、０日目に、ｎｕ／ｎｕマウス中に皮下注射された。マウスは、その後、１日目と、週に２回、示されたＩｇＧを腹腔内に注射された。２Ｃ３が、一用量１００、１０、または１μｇ／注射で与えられ、一方、無関係の特異性のコントロールＩｇＧ（図３Ａ）および３Ｅ７（図３Ｂ）がまた、１００μｇ／注射で与えられた。腫瘍を、一週間あたり２〜３回測定した。平均および標準誤差が、図３Ａにおいて、この研究の継続期間に対して示されるが、この研究（２６日目）の最終日についてのデータは、図３Ｂにおいて示される。 ２Ｃ３処置は、確立されたヒトＮＣＩ−Ｈ３５８ ＮＳＣＬＣ腫瘍異種移植片の大きさを減少させる。皮下ＮＣＩ−Ｈ３５８腫瘍（大きさがおよそ３００〜４５０ｍｍ3）を保持するマウスは、示された時点で、５０μｇまたは１００μｇの、２Ｃ３（ｎ＝１４）、ｍＡｂ４．６．１（ｎ＝５）、３Ｅ７（ｎ＝１２）またはコントロールＩｇＧ（ｎ＝９）を用いて、腹腔内で処置される。１１６日にわたり、ＳＥＭと共に、平均の腫瘍体積が示される。 確立されたヒト腫瘍異種移植片の２Ｃ３および３Ｅ７処理の比較。図５Ａ：皮下ＮＣＩ−Ｈ３５８腫瘍（大きさがおよそ４５０ｍｍ3）を保持するマウスが、２Ｃ３（ｎ＝６）または３Ｅ７（ｎ＝４）を用いて処置された。処置（Ｔ）は、静脈内に与えられる５００μｇのＩｇＧからなる最初の処置を除き、腹腔内に与えられる１００μｇのＩｇＧである。ＳＥＭと共に、平均腫瘍体積が示される。研究の最後に（１１６日目）、マウスは屠殺され、そして腫瘍が切開され、そして重さが量られる。２Ｃ３の処置されたグループに対する平均腫瘍重量は、０．０５４ｇであるが、３Ｅ７処置群は、０．５４５ｇの平均腫瘍重量を有した。図５Ｂは、皮下ＨＴ１０８０腫瘍（大きさがおよそ２００〜２５０ｍｍ3）を保持するマウスが、１００μｇの２Ｃ３（ｎ＝９）、３Ｅ７（ｎ＝１１）、コントロールＩｇＧ（ｎ＝１１）、または生理的食塩水（ｎ＝１１）を用いて、腹腔内処置された。マウスは、示された（Ｔ）のように、一日おきに処置された。非２Ｃ３処置マウスは、各群の５０％より多くが、大きく、潰瘍化した腫瘍を有することに起因して、２６日目に屠殺された。ＳＥと共に、平均腫瘍体積が示される。
（例示的実施形態の説明）
固形腫瘍および癌腫は、人類における全ての癌の９０％超の割合を占める。モノクローナル抗体およびイムノトキシンの使用はリンパ腫および白血病の治療において検討されてきたが、これらの薬剤は、癌腫および他の固形腫瘍に対する臨床試験では、期待に反して効果がなかった（ＡｂｒａｍおよびＯｌｄｈａｍ、１９８５）。抗体を基礎とする処置が効果が不十分であることの主な理由は、高分子が容易に固形腫瘍に輸送されないことである。腫瘍塊内に一旦はいっても、これらの分子は、腫瘍細胞間の固い結合、線維性支質、間隙の圧勾配、および結合部位障壁の存在に起因して均一に分布され得ない（Ｄｖｏｒａｋら、１９９１ａ）。
固形腫瘍を処置するための新しい戦略の開発において、腫瘍細胞よりもむしろ腫瘍の血管の標的化を含む方法が明白な利点を提供する。腫瘍血管の効果的な破壊またはブロックは、腫瘍を通じる血流を停止させ、そして腫瘍細胞死の殺到を生じる。抗体―トキシンおよび抗体−凝集素構築物は、特異的な標的化および腫瘍血管の破壊にすでに有効に用いられ、腫瘍壊死を生じる（Ｂｕｒｒｏｗｓら、１９９２；ＢｕｒｒｏｗｓおよびＴｈｏｒｐｅ、１９９３；ＷＯ９３／１７７１５；ＷＯ９６／０１６５３；米国特許第５，８５５，８６６号；同第５，８７７，２８９号；同第５，９６５，１３２号；同第６，０５１，２３０号；同第６，００４，５５５号；米国特許出願第０８／４８２，３６９号（１９９８年１０月２０日に発行料金支払い済み）；それぞれ、本明細書において参考として援用される）。
抗体、増殖因子または他の結合リガンドが腫瘍血管へ凝固剤を特異的に送達するために用いられる場合、このような薬剤は、「コアグリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄｓ）」と名付けられる。現在、コアグリガンドに用いるのに好ましい凝固剤は、短縮化組織因子（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｆａｃｔｏｒ（ｔＴＦ）である（Ｈｕａｎｇら、１９９７；ＷＯ ９６／０１６５３；米国特許５，８７７，２８９号）。ＴＦは、血液凝固の主要な開始因子（ｉｎｉｔｉａｔｏｒ：イニシエーター）である。損傷の部位では、血液中の第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子は、脈管周囲組織における細胞の上のＴＦに接触し、そして結合する。ＴＦ：ＶＩＩａ複合体は、リン脂質表面の存在下において、第ＩＸ因子および第Ｘ因子を活性化する。次に、これは、トロンビンおよびフィブリンの形成、そして最終的に血餅の形成を導く。
腫瘍内皮で利用可能である（しかし、正常な内皮には大きく欠乏している）適切な標的分子の範囲は、記載されている。例えば、以下のような、発現された標的が、利用され得る：エンドグリン、Ｅセレクチン、Ｐセレクチン、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＰＳＭＡ、ＴＩＥ、ＬＡＭ−１と反応性のリガンド、ＶＥＧＦ／ＶＰＦレセプター、ＦＧＦレセプター、αVβ3インテグリン、プレイトロピンまたはエンドシアリン（米国特許５，８５５，８６６号、同第５，８７７，２８９号および同第６，００４，５５５号；Ｂｕｒｒｏｗｓら、１９９２；ＢｕｒｒｏｗｓおよびＴｈｏｒｐｅ，１９９３；Ｈｕａｎｇら，１９９７；それぞれは、本明細書において参考として援用される）。
天然の腫瘍環境またはヒトによる以下の介入により誘導可能な他の標的はまた、標的可能な存在である。これは米国特許第５，７７６，４２７号、および同第６，０３６，９５５号；それぞれは本明細書に参考として援用されている）に記載されている。正常組織における事前の抑制および腫瘍血管誘導と組み合わせて用いた場合、ＭＨＣクラスＩＩ抗原はまた、標的として使用され得る（米国特許第５，７７６，４２７号；同第６，００４，５５４号および同第６，０３６，９５５号；それぞれは、本明細書において参考として援用される）。
吸着された標的は、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦβ、ＨＧＦ、ＰＦ４、ＰＤＧＦ、ＴＩＭＰ、ＴＩＥに結合するリガンド、または腫瘍関連フィブロネクチンアイソフォームのような別の適切なグループである（米国特許第５，８７７，２８９号、および同第５，９６５，１３２号；それぞれは、本明細書において参考として援用される）。フィブロネクチンのアイソフォームは、レセプターのインテグリンファミリーに結合するリガンドである。腫瘍関連フィブロネクチンアイソフォームは、腫瘍血管および腫瘍支質の両方の標的化可能な成分である。
このような臨床的標的化適用のための１つの現在好まれるマーカーは、レセプター関連ＶＥＧＦである。実際、ＶＥＧＦ：レセプター複合体の集合体は、現在までに観察される腫瘍脈管構造の最も特異的なマーカーの１つである （米国特許第５，８７７，２８９号；同第５，９６５，１３２号および同第６，０５１，２３０号；Ｌｉｎ−Ｋｅら、１９９６；Ｄｖｏｒａｋら、１９９１ｂ）。
ＶＥＧＦ：レセプター複合体は、腫瘍内皮に対する薬物または他のエフェクターの特異的な送達のための、魅力的な標的を提示する。−−なぜなら、腫瘍は、サイトカインおよび増殖因子で富化され、そしてなぜなら、ＶＥＧＦレセプターは、ほとんどの固形腫瘍において見出される低酸素状態下でアップレギュレートされるからである（Ｍａｚｕｒｅら、１９９６；Ｆｏｒｓｙｔｈｅら、１９９６；Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら、１９９６；Ｇｅｒｂｅｒら、１９９７；Ｋｒｅｍｅｒら、１９９７）。腫瘍の微小環境に特異的なリガンドおよびそのレセプターの両方のアップレギュレートは、正常組織における内皮と比較して、腫瘍血管内皮において高濃度の占められたレセプターを導く（米国特許第５，８７７，２８９号および同第５，９６５，１３２号）。Ｄｖｏｒａｋおよび仲間はまた、ＶＥＧＦのＮ末端に対して指向されたウサギポリクローナル抗体が、同系腫瘍を保持するマウスに注射後、選択的に腫瘍血管を染色する（Ｌｉｎ−Ｋｅら、１９９６）。
臨床的介入に対する標的としてのＶＥＧＦの役割は、イムノトキシンまたはコアグリガンド治療に限られない。実際、ＶＥＧＦは、固形腫瘍の新脈管形成に関与する鍵となる因子の１つであり（Ｆｅｒｒａｒａ、１９９５；Ｐｏｔｇｅｎｓら、１９９５）、強力な透過性因子（Ｓｅｎｇｅｒら、１９８３；Ｓｅｎｇｅｒら、１９９０；Ｓｅｎｇｅｒら、１９８６）および内皮細胞マイトジェン（Ｋｅｃｋら、１９８９；Ｃｏｎｎｏｌｌｙら、１９８９；Ｔｈｏｍａｓ、１９９６）である。ＶＥＧＦと新脈管形成との間の関連は、ＶＥＧＦ介入の目的とされる種々の治療的ストラテジーの提案に導いた（Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒら、１９９８）。
（Ａ．ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦレセプター）
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、低酸素および腫瘍変異によりにより誘導される多機能性サイトカインである。ＶＥＧＦは、胚発生における血管ネットワークの発生および維持の初期の刺激薬である。これは、強力な透過性誘導因子、内皮細胞走化性因子、内皮生存因子、および内皮細胞増殖因子である（Ｔｈｏｍａｓ。１９９６；Ｎｅｕｆｅｌｄら、１９９９）。この活性は、正常胚発生に必要とされる（Ｆｏｎｇら、１９９５；Ｓｈａｌａｂｙら、１９９５）。なぜなら、ＶＥＧＦの１つまたは両方の対立遺伝子の標的化された破壊は、胚性致死を生じるからである（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔら、１９９６；Ｆｅｒｒａｒａら、１９９６）。
ＶＥＧＦは、多数の生理学的および病理学的プロセスにおいて新脈管形成または脈管形成を駆動する重要な因子であり、創傷治癒（Ｆｒａｎｋら、１９９５；Ｂｕｒｋｅら、１９９５）、糖尿病性網膜症（Ａｌｏｎ、１９９５；Ｍａｌｅｃａｚｅ、１９９４）、乾癬（Ｄｅｔｍａｒら、１９９４）、アテローム性動脈硬化症（Ｉｎｏｕｅら、１９９８）、慢性関節リウマチ（Ｈａｒａｄａら、１９９８；Ｎａｇａｓｈｉｍａら、１９９９）、固形腫瘍増殖（Ｐｌａｔｅら、１９９４；Ｃｌａｆｆｅｙら１９９６）を含む。
広範な種々の細胞および組織は、ＶＥＧＦを産生し、ＶＥＧＦは、同じ遺伝子によりコードされるスプライス改変体である、少なくとも５つのアイソフォーム（１２１、１４５、１６５、１８９および２０６アミノ酸）に存在する（Ｈｏｕｃｋら、１９９１；Ｆｅｒｒａｒａら、１９９１；Ｔｉｓｃｈｅｒら、１９９１）。２つのより小さいアイソフォーム（１２１および１６５）は、細胞から分泌される（Ｈｏｕｃｋら、１９９１；Ａｎｔｈｏｎｙら、１９９４）。分泌されるＶＥＧＦは、モノマーが２つのジスルフィド結合により結合される３８〜４６ｋＤａとの間の偏性（ｏｂｌｉｇａｔｅ）ダイマーである。
ＶＥＧＦダイマーは、高い親和性で２つの十分に特徴化されたレセプター（ＶＥＧＦＲ１（ＦＬＴ−１）およびＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１））に結合し、これらのレセプターは内皮細胞で選択的に発現される（Ｆｌｔ−１およびＦｌｋ−１は、マウスの相同体である）。ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２に対するＶＥＧＦ結合のＫdは、それぞれ、１５〜１００ｐＭおよび４００〜８００ｐＭである（Ｔｅｒｍａｎ １９９４）。最近同定された第３細胞表面タンパク質（ニューロピリン−１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１））はまた、高い親和性によりＶＥＧＦに結合する（Ｏｌａｎｄｅｒら、１９９１；ＤｅＶｒｉｅｓら、１９９２；Ｔｅｒｍａｎら、１９９２；Ｓｏｋｅｒら、１９９８）。
ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２は、ＩＩＩ型レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ ＩＩＩ）ファミリーのメンバーであり、このファミリーは、７つの細胞外ＩｇＧ様リピート、単一の架橋（ｓｐａｎｎｉｎｇ）膜貫通ドメイン、および細胞内スプリット（ｓｐｌｉｔ）チロシンキナーゼドメインにより特徴付けられる（ＭｕｓｔｏｎｅｎおよびＡｌｉｔａｌｏ、１９９５）。非常に最近まで、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２が、内皮細胞においてほとんど独占的に発現されていると考えられていた（ＭｕｓｔｏｎｅｎおよびＡｌｉｔａｌｏ、１９９５）。ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２が、内皮細胞増殖、移動、および分化を刺激することに関して異なる機能を有すると報告されているが（Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら、１９９４；Ｇｕｏら、１９９５）、各レセプターがＶＥＧＦ生物学および内皮細胞ホメオスタシスにおいて果たす正確な役割は、本発明の以前には明確に規定されていなかった。
ノックアウトマウスを用いた最近の研究は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２の各々が脈管形成、新脈管形成および胚発生に不可欠であることを示した（Ｆｏｎｇら、１９９５；Ｓｈａｌａｂｙら、１９９５；Ｈｉｒａｔｓｕｋａら、１９９８）。致死ノックアウトの研究において、各レセプターの欠損に関連した表現型は、異なった。ＶＥＧＦＲ２の標的化された破壊は、内皮細胞分化に欠陥があり、そして卵黄嚢の血島を形成できないか、または脈管形成を終えることができない胚を生じる（Ｓｈａｌａｂｙら、１９９５）。ＶＥＧＦＲ１ヌル変異体は、脈管形成障害、内皮細胞の組織化されていない集合、および血管の拡張を示す（Ｆｏｎｇら、１９９５；Ｈｉｒａｔｓｕｋａら、１９９８）。ＶＥＧＦＲ１は、明らかにきわめて重要な生物学的役割を有する。
ＶＥＧＦＲ１は、より低いチロシンキナーゼ活性を有するが、ＶＥＧＦＲ１は、ＶＥＧＦＲ２よりＶＥＧＦに対してより高い親和性を有する。これは、ＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメインが、特に重要であることを示唆する。この仮説は、インタクトなＶＥＧＦ結合ドメインを残す一方、ＶＥＧＦＲ１のチロシンキナーゼドメインが欠失されたノックアウトマウスにおける研究からの結果により強く示唆された（Ｈｉｒａｔｓｕｋａら、１９９８）。ＶＥＧＦＲ１−チロシンキナーゼ欠陥胚は、正常な血管を発生し、そして限定された期間まで生存した（Ｈｉｒａｔｓｕｋａら、１９９８）。
初期ノックアウト（Ｆｏｎｇら、１９９５；Ｓｈａｌａｂｙら、１９９５）に加えて、Ｈｉｒａｔｓｕｋａら（１９９８）の研究は、ＶＥＧＦＲ１が重要な生物学的役割を有することを示す。しかし、チロシンキナーゼシグナル伝達は、決定的な因子ではないようである。ＶＥＧＦＲ１ノックアウトマウス由来のマクロファージは、ＶＥＧＦ誘導走化性を示さず（Ｈｉｒａｔｓｕｋａら、１９９８；参考として本明細書中で援用される）、それにより、ＶＥＧＦに対するこの重要な生物学的応答を媒介するのに関わるレセプターとしてＶＥＧＦＲ１が関係することを示したことは興味深い。
あるグループが、ＶＥＧＦ誘導有糸分裂誘発、および透過性における優性シグナル伝達レセプターである、ＶＥＧＦＲ２を報告した（Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら、１９９４；Ｚａｃｈａｒｙ、１９９８；ＫｏｒｐｅｌａｉｎｅｎおよびＡｌｉｔａｌｏ、１９９８）。マクロファージ移動および走化性における機能が、上記のＨｉｒａｔｓｕｋａら（１９９８）の研究において立証されているが、内皮細胞機能におけるＶＥＧＦＲ１の役割は、ほとんど明らかではない。
Ｃｌａｕｓｓら（１９９６；本明細書中で参考として援用される）はまた、ＶＥＧＦＲ１が、単球活性化および走化性において重要な役割を有することを報告した。実際、マクロファージ／単球系統の細胞は、ＶＥＧＦＲ１のみを発現し、このレセプターは、単球補充およびプロコアギュラント活性を媒介するのに関係するレセプターである（Ｃｌａｕｓｓら、１９９６）。単球およびマクロファージにおけるＶＥＧＦＲ１に対するＶＥＧＦ結合はまた、細胞内カルシウムを惹起し、そしてチロシンリン酸化を誘導することにより作用する（Ｃｌａｕｓｓら、１９９６）。
ＶＥＧＦレセプターに対するＶＥＧＦダイマーの結合は、レセプター二量体化を誘導すると考えられる。次いで、レセプターの二量体化は、それぞれ、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ１の細胞内側における、特異的なチロシン残基（Ｙ８０１およびＹ１１７５、ならびにＹ１２１３およびＹ１３３３）の自己リン酸基転移を引き起こす。これは、シグナルトランスダクションカスケードに導き、このカスケードは、ホスホリパーゼＣγ（ＰＬＣγ）およびホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の活性化ならびに細胞内カルシウムイオンの増大を含む（ＨｏｏｄおよびＭｅｉｎｉｎｇｅｒ、１９９８；Ｈｏｏｄら、１９９８；ＫｒｏｌｌおよびＷａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ、１９９８）。
多くのグループが、一酸化窒素（ＮＯ）がＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦ活性化後に産生されることを示しているが、ＶＥＧＦ誘導シグナル伝達におけるさらに下流の細胞内事象は、あまり明らかではない（ＨｏｏｄおよびＭｅｉｎｉｎｇｅｒ、１９９８；Ｈｏｏｄら、１９９８；ＫｒｏｌｌおよびＷａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ、１９９８）。ＶＥＧＦによる、ＶＥＧＦＲ１ではなくＶＥＧＦＲ２の活性化が、ＳｒｃおよびＲａｓ−ＭＡＰキナーゼカスケード（ＭＡＰキナーゼ、ＥＲＫ １およびＥＲＫ ２を含む）を活性化することもまた示された（Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら、１９９４、１９９６；ＫｒｏｌｌおよびＷａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ、１９９７）。
特に、Ｆｌｔ−１チロシンキナーゼ欠陥マウスが、生存可能であり、そして正常な管を発生するように、内皮細胞機能におけるＶＥＧＦＲ１の役割は、ほとんど明らかではない（Ｈｉｒａｔｓｕｋａら、１９９８）。内皮におけるＶＥＧＦＲ１の主な生物学的役割が、非シグナル伝達リガンド結合分子、またはＶＥＧＦＲ２に対してＶＥＧＦを提示するのに必要とされ得る、「おとり」レセプターとしての役割であることが示唆されている。
ＶＥＧＦと病理学的脈管形成状態との間の関連が、ＶＥＧＦ活性をブロックする種々の試みを促している。これらは、ＶＥＧＦに対する特定の中和抗体の開発を含む（Ｋｉｍら、１９９２；Ｐｒｅｓｔａら、１９９７；Ｓｉｏｕｓｓａｔら、１９９３；Ｋｏｎｄｏら、１９９３；Ａｓａｎｏら、１９９５）。ＶＥＧＦレセプターに対する抗体もまた、記載されている（例えば、米国特許第５，８４０，３０１号および同第５，８７４，５４２号、ならびに、本発明に引き続いて、ＷＯ ９９／４０１１８において記載される）。米国特許第５，８４０，３０１号および同第５，８７４，５４２号が、実際、ＶＥＧＦ自体ではなく、ＶＥＧＦレセプターをブロックすることが、種々の理由のために都合が良いことを示唆している。
可溶性レセプター構築物（ＫｅｎｄａｌｌおよびＴｈｏｍａｓ、１９９３；Ａｉｅｌｌｏら、１９９５；Ｌｉｎら、１９９８；Ｍｉｌｌａｕｅｒら、１９９６）、チロシンキナーゼインヒビター（Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒら、１９９８）、アンチセンスストラテジー、ＲＮＡアプタマーおよびＶＥＧＦまたはＶＥＧＦレセプターに対するリボザイムもまた、報告されている（Ｓａｌｅｈら、１９９６；Ｃｈｅｎｇら、１９９６；Ｋｅら、１９９８；Ｐａｒｒｙら、１９９９；各々が参考として本明細書中に援用される）。
（Ｂ．抗ＶＥＧＦ抗体）
（Ｂ１．抗体特性の範囲）
種々の阻害方法の応用は、ＶＥＧＦシグナル伝達を妨害することにより、新脈管形成のブロッキングおよび／または腫瘍増殖の抑制のいずれかにおいて少なくともいくらか効果的であると示されている。実際に、ＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体は、マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片増殖、および腹水形成を阻害すると示されている（Ｋｉｍら、１９９３；Ａｓａｎｏら、１９９５；１９９８；Ｍｅｓｉａｎｏら、１９９８；Ｌｕｏら、１９９８ａ；１９９８ｂ；Ｂｏｒｇｓｔｒｏｍら、１９９６；１９９８）。
抗体Ａ４．６．１は、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２の両方に対するＶＥＧＦの結合をブロックし得る、高親和性の抗ＶＥＧＦ抗体である（Ｋｉｍら、１９９２；Ｗｉｅｓｍａｎｎら、１９９７；Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８）。Ａ４．６．１のＦａｂフラグメントにより結合されたＶＥＧＦの、アラニン走査突然変異誘発およびＸ線結晶学は、Ａ４．６．１が結合するＶＥＧＦのエピトープがアミノ酸８９〜９４のあたりに中心を有することを示した。この構造的データは、Ａ４．６．１が、最もありそうには立体障害により、ＶＥＧＦがＶＥＧＦＲ２に結合することを競合的に阻害するが、ＶＥＧＦがＶＥＧＦＲ１に結合することを阻害することを実証する（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８；Ｋｅｙｔら、１９９６；各々が、本明細書中に参考として援用される）。
Ａ４．６．１は、現在まで文献において最も広範囲に利用されている、中和抗ＶＥＧＦ抗体である。これは、マウスにおける種々のヒト腫瘍の増殖およびＶＥＧＦ誘導血管透過性を阻害することが示されている（Ｂｒｅｍ、１９９８；Ｂａｃａら、１９９７；Ｐｒｅｓｔａら、１９９７；Ｍｏｒｄｅｎｔｉら、１９９９；Ｂｏｒｇｓｔｒｏｍら、１９９９；Ｒｙａｎら、１９９９；Ｌｉｎら、１９９９；各々が、具体的に本明細書中に参考として援用される）。Ａ４．６．１はまた、十分に特徴付けられたヒト卵巣癌マウスモデルにおける腹水形成、および新規な転移マウスモデルにおける腫瘍播種を阻害する。Ａ４．６．１は、一価ファージディスプレイ技術により最近ヒト化され、そして現在は、抗癌剤としての第Ｉ段階の臨床試行中である（Ｂｒｅｍ、１９９８；Ｂａｃａら、１９９７；Ｐｒｅｓｔａら、１９９７；各々が、本明細書中に参考として援用される）。
ＶＥＧＦに対する中和抗体を用いた当該分野におけるいくつかの成功にもかかわらず、本発明者らは、新たな抗体（特に、ＶＥＧＦＲ１（ＦＴＬ−１）および／またはＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）との相互作用の、より正確に規定された様式を有するもの）が、種々の理由から有利であることを理解した。例えば、２つのＶＥＧＦレセプターのうちの一方のみとのＶＥＧＦの相互作用を選択的にブロックする、抗ＶＥＧＦ抗体の開発は、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２の両方を発現する細胞におけるＶＥＧＦにより活性化される経路の、より正確な分析を、可能にする。
本発明者らは、１つのレセプター（ＶＥＧＦＲ２）へのＶＥＧＦの結合のみをブロックした、規定されたエピトープ特異性の抗体が、同様に、臨床的利点を、もちろん、これらのインビボでの環境内での阻害効果の維持に依存して、有し得ると考えた。Ｈｉｒａｔｓｕｋａら（１９９８）のノックアウトマウスでの試験は、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２の両方が、重要な生物学的役割を有することを示す。本発明の前に、２つのレセプターのうちの一方のみにより、ＶＥＧＦにより媒介される効果を阻害することに関する、治療的調査のための現実的な機会は、効果的なあつらえの阻害的薬剤の欠乏により、妨害された。
本発明者らは、最初に、種々のエピトープ特異性および特性を有する、ある範囲の新たな抗ＶＥＧＦ抗体を開発した。ＶＥＧＦ：レセプター（Ｆｌｋ−１）複合体またはＶＥＧＦ自体に対するモノクローナル抗体を分泌する、６群のハイブリドーマを提供する。抗体群のうちの５つはＶＥＧＦのそのレセプターへの結合を妨害しないが、１つは、この相互作用をブロックし（２Ｃ３群）、そして内皮細胞のＶＥＧＦにより媒介される増殖を、阻害した。
３Ｅ７、ＧＶ３９Ｍ、および２Ｃ３の群の抗体（これらは全て、ヒト腫瘍異種移植片を有するマウスに静脈内注射した後に、腫瘍に選択的に局在化する）は、現在、固形腫瘍の脈管構造または結合組織の標的化、画像化および処置において使用するために、好ましい。
ＶＥＧＦ：レセプター複合体を認識する本発明のモノクローナル抗体は、ヒト腫瘍異種移植片を有するマウスに注射した後に、腫瘍内皮細胞へと選択的に局在化する。２Ｃ３群のモノクローナル抗体は、腫瘍の脈管周囲の結合組織、および周囲の腫瘍脈管にも、著しく局在化する。
Ｎ末端を認識する抗体は、ＥＬＩＳＡにより、レセプター結合ＶＥＧＦと反応する。ＧＶ３９Ｍおよび１１Ｂ５は、非レセプター結合ＶＥＧＦとは対照的に、レセプター結合ＶＥＧＦに対する高い特異性を示す。恐らく、Ｎ末端上のＧＶ３９Ｍおよび１１Ｂ５により認識されるエピトープは、コンフォメーション的であり、そしてＶＥＧＦがそのレセプターに結合する場合に、作製される。これらの抗体は両方ＩｇＭであり、従って大きさが大きいという事実は、これらのＶＥＧＦ：レセプター複合体に対する選択性にとって重要であり得る。
抗Ｎ末端抗体は、ＶＥＧＦにより媒介される内皮細胞増殖を阻害しなかった。このことは、ＶＥＧＦのＮ末端がレセプター相互作用に関与しないこと、およびＶＥＧＦのＮ末端に対する抗体がＶＥＧＦにより媒介されるシグナル伝達を妨害しないことを示唆する。
対照的に、２Ｃ３は、３ｎＭのＩＣ50で、内皮細胞のＶＥＧＦにより媒介される増殖を阻害する。ＫＤＲ発現内皮細胞（ＡＢＡＥ細胞）を用いる125Ｉ−ＶＥＧＦ結合試験は、２Ｃ３が、ＶＥＧＦのＫＤＲへの結合を、濃度依存の様式でブロックすることを実証した。従って、２Ｃ３は、ＶＥＧＦのそのレセプターへの結合を妨害することにより、インビトロで、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２）により媒介されるＶＥＧＦ活性を中和し得る。
免疫組織化学的分析は、ＧＶ３９Ｍ、１１Ｂ５、３Ｅ７、および７Ｇ３が、脈管内皮の切片に直接適用される場合に、脈管内皮と中程度〜強力に反応することを、明らかにした。ＧＶ３９Ｍは、腫瘍細胞または結合組織の染色がかなり少ないことと比較すると、腫瘍内皮細胞に対する最も高い特異性を示す。１１Ｂ５、３Ｅ７、および７Ｇ３は、低濃度で適用される場合に、内皮細胞を優先的に染色するが、より高い濃度において、腫瘍細胞および結合組織を別々に染色する。
１１Ｂ５、３Ｅ７および７Ｇ３で観察される染色パターンは、ＶＥＧＦの特定のコンホメーションについて優先を有さないＶＥＧＦに対するポリクローナル抗体を使用する場合に見られる染色の型に代表的である（Ｌｉｎ−Ｋｅら、１９９６；Ｐｌａｔｅら、１９９４；Ｃｌａｆｆｅｙら、１９９６）。ＧＶ３９Ｍによる内皮の選択的な染色は、これがこれらの細胞上のＶＥＧＦ：レセプター複合体に結合することを示唆し、そしてレセプターの内皮細胞位置、およびＧＶ３９ＭがＥＬＩＳＡにおいてＶＥＧＦ：ｓＦｌｋ−１に選択的に結合するという事実と一致する。
同様に、３Ｅ７および７Ｇ３のより広い染色パターンは、これらが遊離ＶＥＧＦおよびレセプター結合ＶＥＧＦの両方を認識する能力に一致する。しかし、１１Ｂ５は、内皮に対してより制限された染色パターンを有すると予測された。なぜなら、これは、捕捉ＥＬＩＳＡにおいてＶＥＧＦ：Ｆｌｋ−１を強く好むからである（表２を参照のこと）。１１Ｂ５が、間質成分に結合するＶＥＧＦを認識し得、腫瘍切片におけるより広い反応性パターンを与える。
３Ｅ７およびＧＶ３９Ｍは、インビボで、腫瘍組織の脈管内皮細胞に選択的に局在化し、一方で２Ｃ３は、内皮に加えて、腫瘍の脈管周囲の結合組織に局在化する。腫瘍を有するマウスへの静脈内注射の２４時間後に、３Ｅ７は、腫瘍以外のいかなる組織の内皮でも検出可能ではなかった。他方で、ＧＶ３９Ｍもまた、腎臓の糸球内の内皮細胞または血管間膜細胞に結合する。ＧＶ３９Ｍの、マウス腎臓血管間膜細胞との反応性の理由は、明らかではない。抗体が、腎臓の正常な内皮細胞上のＶＥＧＦ：レセプター複合体に結合することが、可能である（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９５）。しかし、同系の株１０腫瘍を有するモルモットにおける局在化試験は、ＧＶ３９Ｍが腫瘍血管に局在化するが、他の正常な組織における糸球または脈管には局在化しないことを示した。
３Ｅ７およびＧＶ３９Ｍが腫瘍内皮に特異的に局在化する能力は、恐らく、少なくとも２つの要因の結果である。第一に、ＶＥＧＦ：レセプター複合体は、腫瘍血管に対して比較的豊富である。なぜなら、低酸素性腫瘍微小環境は、腫瘍細胞によるＶＥＧＦ発現を、そして内皮細胞によるＶＥＧＦレセプター発現を、刺激するからである。第二に、腫瘍血管は、正常な血管より透過性であり（Ｙｕａｎら、１９９６）、このことは、抗体が、脈管の管腔から離れた面に濃縮しているようであるＶＥＧＦ：レセプター複合体に、より多くアクセスすることを可能にし得る（Ｌｉｎ−Ｋｅら、１９９６；Ｈｏｎｇら、１９９５）。
Ｌｉｎ−Ｋｅおよび共同研究者らによる以前の研究（１９９６）において、ラットＶＥＧＦのＮ末端に指向されるウサギポリクローナル抗体は、ＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌またはＭＯＴ卵巣癌を有するマウスへの注射後に、腫瘍内皮細胞に局在化することが見出された。対照的に、全ＶＥＧＦタンパク質に指向するウサギポリクローナル抗体（Ａｂ−６１８）は、これらの腫瘍においても、腫瘍自体の他の位置においても、内皮細胞に特異的に局在化しなかった。
これらの結果に基づいて、Ｌｉｎ−Ｋｅら（１９９６）は、ＶＥＧＦが毛細血管内皮と会合した後にＶＥＧＦのＮ末端が抗体を結合する能力を有すること、および遊離のＶＥＧＦまたは内皮細胞と結合していないＶＥＧＦのプールが、非Ｎ末端エピトープに指向する抗ＶＥＧＦ抗体を濃縮するには十分ではないことを、結論付けた（Ｌｉｎ−Ｋｅら、１９９６）。ＶＥＧＦのＮ末端に指向する３Ｅ７およびＧＶ３９Ｍを用いた本結果は、これらの結論を支持する。
しかし、２Ｃ３群の抗体（これは、ＶＥＧＦの非Ｎ末端エピトープに指向する）がマウスの固形腫瘍の脈管構造および脈管周囲の結合組織の両方に局在化するという、本発明の知見は、Ｌｉｎ−Ｋｅら（１９９６）の研究より顕著に驚くべきことである。本発明は、ＶＥＧＦの「プール」が、腫瘍支質に存在し、そして実際に、腫瘍塊における２Ｃ３の濃縮を可能にすることを、提唱する。このような腫瘍支質の標的化は、以前の刊行物の研究からは予測し得なかった。本発明者らは、ＶＥＧＦが、腫瘍中のヘパリンスルフェートプロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に結合し得ることを考慮するが、作用の機構の理解は、本発明を実施する際に特に必要ではない。
本発明の初期の結論は、ＧＶ３９Ｍ群および３Ｅ７群の抗体はマウスの腫瘍内皮細胞に選択的に局在化するが、２Ｃ３群の抗体は、腫瘍内皮細胞および腫瘍の脈管周囲の結合組織に局在化する、ということである。ＶＥＧＦおよびそのレセプターの分布は、マウスおよびヒトにおいて類似であるので、これらの抗体は、ガン患者において類似のパターンの局在化を示すことが、考慮される。従って、ＧＶ３９Ｍおよび３Ｅ７は、ヒトにおける腫瘍脈管に治療薬または診断薬剤の送達における使用が予測され、一方で２Ｃ３群の抗体は、腫瘍脈管および腫瘍結合組織への、治療剤または診断薬剤の標的化のためのビヒクルとして、考慮される。
（Ｂ２．ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体および抗２Ｃ３抗体）
２Ｃ３群の抗体のさらなる研究は、なおさらなる驚くべき特性を明らかにし、本発明の効果的な組成物および使用を生じた。
ＥＬＩＳＡ、レセプター結合アッセイおよびレセプター活性化アッセイを使用してなされた、本発明の重要な発見は、２Ｃ３群のモノクローナル抗体が、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／ＦＬＫ−１）との相互作用を選択的にブロックするが、ＶＥＧＦＲ１（ＦＬＴ−１）との相互作用をブロックしないことである。２Ｃ３抗体は、ＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦにより誘導されるリン酸化を阻害し、そしてＶＥＧＦにより誘導される透過性をブロックし、このことは、ＶＥＧＦＲ２をＶＥＧＦにより誘導される透過性の原因となるレセプターとして関連させる。２Ｃ３抗体はまた、強力な抗腫瘍活性を有し、当該分野において認証されているヒト癌の動物モデルにおいて、種々の確立されたヒト固形腫瘍の増殖を停止させる。
これらの発見は、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２の両方を発現する細胞において、ＶＥＧＦにより活性化される経路を分析する際に、２Ｃ３の有用性を実証し、腫瘍の増殖および生存のプロセスにおけるＶＥＧＦＲ２活性の重要性を強調している。より重要なことには、これらは、治療的介入の独自の様式を提供し、マクロファージ走化性、破骨細胞および軟骨吸収細胞の機能（ＶＥＧＦＲ１により媒介される）の付随した阻害なしに、ＶＥＧＦＲ２により誘導される新脈管形成の特異的な阻害を可能にする。
従って、２Ｃ３を考慮する発見は、初めて、ＶＥＧＦＲ１ではなく、ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合を阻害する、抗ＶＥＧＦ抗体の作製および使用の動機および手段を提供する。このような抗体は、簡潔に「ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体」と称され、当該分野における利点を示し、そして多数の利点を提供する（いずれも、結合体化していない、すなわち「裸の」形態での使用、および他の治療薬剤と結合体化した、すなわち会合した場合の使用の意味で）。
本発明のインビトロ結合研究（精製レセプタータンパク質を用いてＥＬＩＳＡおよび共沈アッセイを利用する）は、２Ｃ３が、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２への結合をブロックすることを実証した。驚くべきことに、２Ｃ３は、どのアッセイ系においてもＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ１への結合を阻害しなかった。最初の結果を確認するために結合ＥＬＩＳＡを異なる構成において反復した。各々の構成において、その結果は、２Ｃ３はＶＥＧＦ：ＶＥＧＦＲ１相互作用を妨げないことを示した。これらの研究のコントロールとして、モノクローナル抗体３Ｅ７（ＶＥＧＦのＮＨ2−末端に対する抗体）を使用した。これは、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ１に対する結合も、ＶＥＧＦＲ２に対する結合も妨げなかった。
従って、本発明の抗体の２Ｃ３群は、ＶＥＧＦに対する他の遮断抗体（Ａ４．６．１を含む）を超えて有意に改善されている。Ａ４．６．１抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦがＶＥＧＦレセプター両方に結合することをブロックする。結晶学的研究および変異誘発研究により、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ１についての結合エピトープが、ＶＥＧＦダイマーの２つの対称的な極に向かって集中していることが示された（Ｗｉｅｓｍａｎｎら、１９９７；Ｍｕｌｌｅｒら、１９９７）。２つのレセプターと相互作用するＶＥＧＦ上の結合決定基は、部分的に重複し、かつダイマー表面にまたがる異なる４つのセグメント上に分布する（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８）。抗体Ａ４．６．１は、両方のレセプターのレセプター結合領域内にあるＶＥＧＦの領域に結合する（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８）。２Ｃ３がＶＥＧＦＲ２結合部位の近くに存在する領域に結合するが、ＶＥＧＦＲ１結合部位には結合しないことが提唱される。
レセプターのＶＥＧＦ誘導リン酸化に対する２Ｃ３の効果についての研究により、２Ｃ３が、ＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦ誘導リン酸化をブロックすることが示された。これはまた、上記で議論されるデータに対応し、そしてＶＥＧＦ誘導増殖におけるＶＥＧＦＲ２の役割をさらに固める。
他の研究からの結果と同様に、ＶＥＧＦＲ１の一致したＶＥＧＦ誘導リン酸化は、実証できなかった（Ｄｅ Ｖｒｉｅｓら、１９９２；Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら、１９９４；Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈら、１９９６；Ｌａｎｄｇｒｅｎら、１９９８）。従って、２Ｃ３が、ＶＥＧＦＲ１のＶＥＧＦ誘導リン酸化を阻害するか否かを確実には判定することはできなかった。ＶＥＧＦＲ１リン酸化に対するＶＥＧＦの低能力は、ＶＥＧＦＲ１が、内皮細胞上のシグナル伝達レセプターではなく、ＶＥＧＦを捕捉し、かつＶＥＧＦＲ２を介したシグナル伝達を増幅するデコイレセプターとして働き得ることを示唆することを導き得る（Ｈｉｒａｔｓｕｋａら、１９９８）。しかし、ＶＥＧＦ結合によるＶＥＧＦＲ１のチロシンリン酸化は、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）を用いてＫｕｐｐｒｉｏｎら（１９９８）により、そしてＶＥＧＦＲ１を過剰発現するＮＩＨ ３Ｔ３細胞を用いてＳａｗａｎｏら（１９９６）により報告されている。さらに、Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら（１９９４）は、ＶＥＧＦ誘導ＶＥＧＦＲ１活性化がインビトロキナーゼアッセイを用いた結果として起こり得ることを示した。ＶＥＧＦＲ１のＶＥＧＦ誘導リン酸化に対する２Ｃ３の効果、またはその欠如は、前述の細胞型の１つまたはインビトロキナーゼアッセイを用いて決定し得た。
本発明の図２のＥＬＩＳＡデータおよび細胞結合データは、２Ｃ３抗体がＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２両方を発現する細胞への結合からＶＥＧＦを完全にはブロックしないことを示す。２Ｃ３がＶＥＧＦＲ１へのＶＥＧＦ結合をブロックしないという事実は、２Ｃ３抗体が、内皮細胞および他の細胞型の、生物学におけるＶＥＧＦＲ１の役割を表す際に有効なツールであることを意味する。
２Ｃ３がＶＥＧＦをそのレセプターを活性化することからブロックする際に示す選択性の機能的結果を、モルモットにおけるＭｉｌｅｓ透過性アッセイを用いて試験した。２Ｃ３およびＡ４．６．１両方が、ＩｇＧがＶＥＧＦより少なくとも１０倍モル濃度で過剰にある場合に、ＶＥＧＦ誘導透過性を阻害した。３Ｅ７およびコントロール抗体は、１０００倍モル濃度過剰ですら、ＶＥＧＦ誘導透過性を阻害しなかった。これらの結果は、ＶＥＧＦＲ２がＶＥＧＦ誘導透過性に関与することを示す。
ＶＥＧＦ−Ｃの新規の形態および２つのウイルス誘導ＶＥＧＦ−Ｅ改変体がＶＥＧＦＲ２を結合するが、ＶＥＧＦＲ１を結合しないという最近の報告に従うこの知見は、血管透過性を増強する能力をなお維持する。（Ｊｏｕｋｏｖら、１９９８；Ｏｇａｗａら、１９９８；Ｍｅｙｅｒら、１９９９）。おそらく、種々の形態のＶＥＧＦは、ＮＯ生成を引き起こすＶＥＧＦＲ２を介してシグナルを伝達し、このことは、次いで、血管透過性の増加を引き起こす（ＨｏｏｄおよびＧｒａｎｇｅｒ、１９９８；Ｈｏｏｄら、１９９８；ＫｒｏｌｌおよびＷａｌｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ、１９９８；Ｍｕｒｏｈａｒａら、１９９８；Ｋｕｐｐｒｉｏｎら、１９９８；Ｓａｗａｎｏら、１９９６；Ｆｕｊｉｉら、１９９７；Ｐａｒｅｎｔｉら、１９９８）。このことは、ＮＯ生成がＶＥＧＦＲ２活性化の結果に対して示されたので、ＶＥＧＦＲ２関与で間接的に示される。しかし、Ｃｏｕｐｅｒら（１９９７）のように、対照的に、ＶＥＧＦにより誘導された血管透過性の増加とインビボでのＶＥＧＦＲ１発現との間の強い相関を見出したいくつかの証拠もまた存在する。
２Ｃ３は、インビボで複数の異なるヒト腫瘍型の増殖を阻害した。１週間に２回与えた１００μｇの２Ｃ３の効果は、マウスが有する皮下のＮＣＩ−Ｈ３５８ ＮＳＣＬＣおよびＡ６７３横紋筋肉腫腫瘍において同一であり、ここで、約１５０ｍｍ3サイズの小節にまで、腫瘍の増殖を効率的に制限した。同様の応答が他の腫瘍モデルにおいて見られた（例えば、ＨＴ２９およびＬＳ１７４Ｔ（共に結腸のヒト腺腫））。
２Ｃ３による腫瘍増殖抑制の規模は、異なる中和抗ＶＥＧＦ抗体を用いて他の研究者らにより報告されたもの（Ａｓａｎｏら、１９９８；Ｍｅｓｉａｎｏら、１９９８）と同様である。モノクローナルラット抗マウスＶＥＧＦＲ２抗体はまた、抗脈管形成機構（Ｓｋｏｂｅら、１９９７）を介して、マウスにおける悪性ヒトケラチノサイトの増殖を強くブロックした。２Ｃ３の有効性（他の研究者らが異なる抗ＶＥＧＦ抗体を用いて見出したものと類似である）は、腫瘍脈管形成および腫瘍増殖におけるＶＥＧＦの役割をさらに示す。しかし、２Ｃ３は、本明細書中で議論される特異的阻害特性に基づいて、より安全な治療剤を提供する。
ヒトの状態により近い設定においてＶＥＧＦ活性を阻害する効果を分析するために、腫瘍を確立したマウスを、２Ｃ３で処置した。この設定において、２Ｃ３処置は、２つの攻撃的なヒト腫瘍であるＡ６７３横紋筋肉腫およびＬＳ１７４Ｔ結腸腺腫腫瘍の増殖を有意に遅延させた。２Ｃ３抗体は、マウス保有ＮＣＩ−Ｈ３５８ ＮＳＬＣＬ腫瘍において有意な腫瘍後退を引き起こした。
２Ｃ３またはＡ４．６．１で処置された腫瘍は、処置の約１０週間後、それらの元々の大きさの、それぞれ３０％および３５％まで消失した。処置が、１００日後まで延長させた研究において、さらにより有意な後退が観察された。この結果は、ＶＥＧＦが腫瘍内皮に対して単なる有糸分裂シグナル以上のものを提供することを示す。
腫瘍の静止より、むしろ後退という事実が観察されたことは、ＶＥＧＦが腫瘍内皮に対して単なる脈管形成シグナル以上のものを提供することを示唆する。Ｂｅｎｊａｍｉｎら（１９９９）は、腫瘍は、周辺内皮細胞との接触が確立されていた未熟な血管の大きな画分を含むこと、そしてこれらの血管が生存についてＶＥＧＦに依存することを、最近報告した。ＶＥＧＦの中和が、これらの未熟な血管に、アポトーシスを起こし、それによって、腫瘍内に存在する血管ネットワークの減少を引き起こすことが可能である。血管再構築の動態過程が腫瘍を生じることもまた可能であり、血管形成および血管後退の両方に関係し、そしてＶＥＧＦの中和は、血管後退に向うネットシフトにつながる血管形成を予防する。
２Ｃ３が、Ａ４．６．１と同様に完全に腫瘍の増殖を抑制するという発見（よりそうでない場合）は、腫瘍血管形成におけるＶＥＧＦＲ２の主要な役割を示す。多段階の血管形成は、内皮細胞走化性、メタロプロテイナーゼ産生、浸潤、増殖および分化を必要とする。ＶＥＧＦＲ１は、これらのプロセスにおいて役割を有し得ないか、またはＶＥＧＦに結合し、そしてシグナル伝達レセプター、ＶＥＧＦＲ２に提示することによるプロセスにおいて補助し得る。
腫瘍の処置における２Ｃ３とＡ４．６．１についての比較図は、高度に関連する：２Ｃ３は、わずかによりＡ４．６．１より効果的であるが、ＶＥＧＦＲ２に結合するのみであり、ＶＥＧＦＲ１に結合しない。従って、現在の研究は、ＶＥＧＦ媒介性腫瘍血管形成においてＶＥＧＦＲ１が著しい役割を果たさないことを示し、そしてさらにＶＥＧＦＲ１特異的インヒビターが腫瘍血管形成に影響し得ないことを示す。これらの結果はまた、２Ｃ３がＡ４．６．１と同様であるか、またはより効果的であり、一方より少ない副作用を生じることを示す。
ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２への結合およびＶＥＦＧＲ２の活性化を特異的にブロックする能力は、臨床的な関連性の２つの領域における重要性を有する。第１に、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）は、マクロファージおよび単球細胞が、ＶＥＧＦＲ１を発現し、そしてＶＥＧＦＲ１シグナル伝達を介してＶＥＧＦに対して走化的に応答するので、腫瘍におけるマクロファージおよび単球の補充において重要な役割を果たすと考えられる（Ｃｌａｕｓｓら、１９９６；Ｈｉｒａｔｓｕｋａら、１９９８；Ａｋｕｚａｗａら、２０００）。マクロファージの活性化において、ｆｌｔ−１遺伝子の転写は、Ｅｇｒ−１の誘導を通じて刺激される。Ｅｇｒ−１は、ヒトｆｌｔ−１プロモーターにおけるオーバーラップＥｇｒ−１／Ｓｐ１転写因子結合部位に結合し、ｆｌｔ−１遺伝子が直接のＥｇｒ−１の標的であり、転写因子がマクロファージの分化において優性に誘導される証拠を提供する（Ａｋｕｚａｗａら、２０００）。
厳密な抗腫瘍応答を産生するために必要とされるマクロファージの活性化を維持するために、ＶＥＧＦＲ１シグナル伝達の阻害が避けられるべきである。本発明によって提供されるＶＥＧＦＲ１の特異的な遮断は、従って、腫瘍療法においてＡ４．６．１に勝る重要な利点を提供する。なぜなら、マクロファージの浸潤が、障害されず、これらの細胞が、壊死細胞から腫瘍細胞細片を除去し、腫瘍の収縮を促進することを可能にするからである。ＶＥＧＦＲ２遮断を使用して、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、２Ｃ３）はまた、マクロファージが浸潤し、腫瘍細胞への直接の細胞を殺す効果を有することによって全体の抗腫瘍効果に寄与することを可能にする。
確かに、本発明は、抗血管形成治療のすべての形態における使用に有利な因子を独自に提供する。それらの因子は、ＶＥＧＦ血管形成活性をブロックする能力によって有利であるが、ＶＥＧＦＲ１を通じて媒介されるＶＥＧＦの他の有利な作用（例えば、免疫および骨細胞への作用）を阻害しない。臨床的に重要性なの第２の領域は、本発明に従って調製され、インビボで、破骨細胞および軟骨吸収細胞の有益な効果を阻害しないで機能する抗体の能力に関する。これは、存在するＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体療法（２Ｃ３を含む）の使用を意味し、骨および／または軟骨への副作用に関連しない。
インビボでの研究は、ＶＥＧＦが、軟骨内の骨形成の間の肥大性軟骨リモデリング、骨形成および血管形成に共役し、そしてＶＥＧＦが、軟骨リモデリングに必須であることを示した（Ｇｅｒｂｅｒら、１９９９；参考として具体的に本明細書中に援用される）。可溶性ＶＥＧＦＲ１レセプターキメラタンパク質（Ｆｌｔ−（１−３）−ＩｇＧ）の投与によるＶＥＧＲ１を介したＶＥＧＦシグナル伝達の不活性化は、軟骨細胞の補充および／または分化を減少することによって小柱骨形成および肥大性軟骨細胞領域の増大を障害することが示された（Ｇｅｒｂｅｒら、１９９９）。
ＶＥＧＦが、インビボでの破骨細胞機能を支持してマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を置換し得ることがさらに示された（Ｎｉｉｄａら、１９９９；参考として具体的に本明細書中に援用される）。Ｍ−ＣＳＦ遺伝子に変異を生じる破骨細胞に欠失を有する大理石骨病（ｏｐ／ｏｐ）マウスを使用する研究において、組換えヒトＭ−ＣＳＦ（ｒｈＭ−ＣＳＦ）の注射は、破骨細胞補充および生存を可能にする。最近の研究において、組換えヒトＶＥＧＦの一度の注射が、ｏｐ／ｏｐマウスにおいて破骨細胞漸増を同様に誘導することが示された（Ｎｉｉｄａら、１９９９）。
Ｎｉｉｄａら、（１９９９）は、破骨細胞が優性にＶＥＧＦＲ１を発現し、そして破骨細胞補充に対する組換えヒト胎盤増殖因子１の活性がｒｈＶＥＧＦのものに比較できるので、破骨細胞（ｏｐ／ｏｐ）マウスにおけるＶＥＧＦシグナル伝達の有益な効果は、ＶＥＧＦレセプター１（ＶＥＧＦ−１）を介して媒介されることを報告した。これらの著者は、ＶＥＧＦが阻害された後に（ＶＥＧＦＲ１レセプターキメラタンパク質、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｃを使用する）、ｒｈＭ−ＣＳＦ誘導破骨細胞は死ぬが、このような効果は、ｒｈＭ−ＣＳＦの同時注射によって抑制されることをさらに示した。ｒｈＭ−ＣＳＦまたは内因性ＶＥＧＦによって支持される破骨細胞は、インビボでの活性における有意な差を示さなかった（Ｎｉｉｄａら、１９９９）。
大理石骨病の年齢に関連した回復を起こす変異体ｏｐ／ｏｐマウスは、破骨細胞数における増加を伴う。Ｎｉｉｄａら（１９９９）の研究において、ほとんどの破骨細胞は、抗ＶＥＧＦ抗体の注射後に消失し、内因的に産生されたＶＥＧＦが、変異体マウスにおける破骨細胞の出現の原因であることを実証した。さらに、ｒｈＶＥＧＦは、インビトロでの破骨細胞の分化を支持してｒｈＭ−ＣＳＦを置換した。これらの結果は、Ｍ−ＣＳＦおよびＶＥＧＦが、破骨機能を支持して重なる機能を有し、そしてＶＥＧＦが、ＶＥＧＦＲ−１レセプターを介して作用することを実証する（Ｎｉｉｄａら、１９９９）。
従って、２Ｃ３（本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体のうちの第１のもの）が、ＶＥＧＦがＶＥＧＦＲ１を結合し、そして活性化することをブロックしないが、ＶＥＧＦがＶＥＧＦＲ２を結合し、そして活性化することをブロックすることが結論付けられ得る。このようなＶＥＧＦＲ２阻害の抗腫瘍効果は、明白に実証される。これらの結果は、ＶＥＧＦＲ２が、透過性を媒介し、そして腫瘍血管形成におけるその役割をハイライトするＶＥＧＦレセプターであることを示す。従って、本発明はさらに、固体腫瘍の処置のための治療としてのＶＥＧＦ阻害を確証する。より重要には、本発明は、一連の新しいＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、治療介入のための２Ｃ３に基いた抗体）、そして特に腫瘍および他の疾患における血管形成を阻害する安全、かつ有効な薬剤としての使用を提供する。
本発明の利点は、副作用の欠失に限定されない。しかし、これらは、特に骨障害を有する子供および患者の処置において著しい利点を有する重要な特徴であり、本発明の抗体は多数の他の利点を有する。
例えば、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦまたは２Ｃ３抗体に基づく抗体結合体は、腫瘍環境に治療因子を送達するために使用され得る。実際に、２Ｃ３抗体は、インビボでの投与の際に腫瘍脈管構造および腫瘍支質の両方に結合し、正常器官または組織における脈管構造にも結合組織にも結合しないことが本明細書中で示される。本発明の抗体に基づく治療構築物は、従って、１分子内に２つの機能を結合する利点を有する：抗体またはそのフラグメントの抗脈管形成特性および治療因子の特性は、結合について選択される。
ＶＥＧＦＲ２が、内皮上のキーレセプターであるので、ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合を遮断することは、抗脈管形成効果に重要である。この文脈において、ＶＥＧＦＲ１は、内皮上で発現されるが、非シグナル伝達であるか、または受動的である。従って、本発明の抗体がＶＥＧＦＲ１へのＶＥＧＦの結合をブロックできないことは、抗脈管形成および抗腫瘍因子としてのそれらの有効性にとって重大ではない。実際に、先行技術の遮断抗体で生じるＶＥＧＦＲ１へのＶＥＧＦの結合を阻害するよりもむしろ、ＶＥＧＦに結合する本発明の抗体の能力および、さらにＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ１相互作用を実質的に妨害しない能力は、これらの新しい抗体の薬剤送達特性を増強する。
本発明者らは、遮断抗体は、レセプターに結合されていない腫瘍局在化ＶＥＧＦに結合することによって腫瘍環境へ治療因子を送達するために機能するとさらに期待されることを理解した。具体的には、本発明者らは、このような抗体は、腫瘍支質においてＶＥＧＦに結合し、そしてそこに治療因子を送達することを理解した。これは、内皮周辺に薬剤の貯蔵所を提供し、血管内皮細胞に細胞毒性または他の破壊性の効果を引き起こし、そして抗腫瘍効果を発揮する。
支質または結合組織と結合したＶＥＧＦは、伝統的な意味でＶＥＧＦレセプター（すなわち、細胞表面レセプター）に結合していない。むしろ、ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦの基礎的な領域を介して１以上の結合組織成分（プロテオグリカン（例えば、ヘパラン硫酸プロテオグリカン）を含む）に結合している。これらの配列（およびそれらをコードするエキソン）は、ＶＥＧＦ１２１タンパク質（および根底にあるＤＮＡ）内にないので、このアイソフォームは、有意な量で支質に存在するべきではない。腫瘍支質におけるＶＥＧＦは、「遊離した」としばしば呼ばれるが、腫瘍内にまだ局在化しており、「遊離した」は非レセプター結合を基本的に意味する。
本発明者らは、両方のレセプターではなく、１つのレセプターへのＶＥＧＦの結合をブロックする抗体が、脈管構造上のＶＥＧＦに結合したレセプターに結合することによって、治療薬剤を腫瘍環境に送達し得ることをさらに推論する。これは、本発明の最も多くの利点の１つである。すなわち、抗体の提供は、ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合をブロックし、それ故、ＶＥＧＦからの脈管形成シグナルを阻害するが、ＶＥＧＦＲ１へのＶＥＧＦの結合をブロックしない。他の細胞型および組織におけるＶＥＧＦＲ１を介したＶＥＧＦシグナル伝達を維持することによって全身性副作用を減少することに加えて、これらの抗体は、腫瘍脈管構造上のＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ１複合体に局在化し、そして直接そこに、治療因子を送達し得る。
ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２の両方は、正常組織における内皮細胞とは反対に、腫瘍内皮細胞上で上方制御される。ＶＥＧＦＲ１は、腫瘍脈管内皮上で高度に発現され、本発明の標的とする局面を特に有効にする。実際に、ＶＥＧＦＲ１は、内皮において「非シグナル伝達」であるが、より高いレベルでない場合に、少なくともＶＥＧＦＲ２と同じレベルで発現される。この現象の根底にある因子は、低酸素症およびＶＥＧＦの両方に応答してＶＥＧＦＲ１が上方制御され、一方でＶＥＧＦＲ２は、ＶＥＧＦに応答して上方制御されるのみであり、そして低酸素症によって影響されないことである。
内皮に対するＶＥＧＦＲ１の役割は、不確かなままであるが、ＶＥＧＦＲ１は、デコイレセプターとして作用し得、ＶＥＧＦを「捕捉」し、そしてリガンドをシグナル伝達レセプター、ＶＥＧＦＲ２に渡す。これを実現するために、デコイレセプターが、シグナル伝達レセプター（実際の場合である）よりも、より高いＶＥＧＦに対する親和性を有することが期待される。この点において、そしておそらく、増強された発現レベルのためにもまた、本発明のＶＥＦＧＲ２遮断、非ＶＥＧＲＦ１遮断抗体は、腫瘍の処置のために理想的な送達因子である。これらの抗体の治療結合体は、ＶＥＧＦＲ２を通じた新脈管形成の阻害、および存在する脈管構造の破壊を、ＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ１レセプター複合体に治療因子を送達することによって同時に行うことができる。
本発明者らは、本発明の抗体の有益な抗脈管形成および腫瘍局在化特性の説明としての上記の科学推理に決して限定されない。本発明の有用性は、自明であり、そして根底にある理論が実行されることは必要としないが、本発明者らは、代替のメカニズムを考慮し、このメカニズムによってＶＥＧＦＲ２遮断、非ＶＥＧＦＲ１遮断抗体が、腫瘍脈管構造に有効にかつ特異的に局在化し得ると考えた。
このような抗体は、ＶＥＧＦに結合し得、細胞表面上のＮｐｎ−ｄ１または別のまだ特徴付けられていないＶＥＧＦ結合タンパク質に関連するか、または、内非細胞の表面上でヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合したＶＥＧＦに結合し得る。抗体の局在化はまた、血管に関連するタンパク質のＶＥＧＦファミリーの別のメンバー（すなわち、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ）に結合することによっても増強され得るが、これはより可能性が低い。
本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦまたは２Ｃ３抗体の別の有利な特性は、ＶＥＧＦＲ２を介して媒介されるこれらの抗体が生存シグナルまたはＶＥＧＦの「保護効果」を中和することである。自身がより有効な抗体を作製することに加えて、この特性は、ＶＥＧＦの生存機能によって妨害される他の因子と組み合わせることによってそれらを特に有用にする。
例えば、ＶＥＧＦは、内皮を放射線治療から保護する。従って、本発明の裸の抗体および免疫複合体の両方は、放射線治療と組み合わされる使用に理想的である。まださらなる利点は、放射線療法因子に付着した、このような抗体の使用によって提供される。この型の構築物は、以下の３つの利点を有する：（１）抗体部分を通じた抗脈管形成効果を及ぼすこと；（２）放射線治療因子の送達を通じた腫瘍脈管構造破壊効果を及ぼすこと；および（３）ＶＥＧＦの典型的な生存シグナルが、放射線治療因子の効果を相殺することから防ぐこと。
類似の相乗的な効果を有する他の構築物は、抗チューブリン薬剤またはプロドラッグ、抗アポトーシス因子および他の抗脈管形成剤と関連するＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体である。アポトーシスを引き起こす因子または薬剤の作用は、ＶＥＧＦによってアンタゴナイズされる。従って本発明は、このような因子の有効性を、ＶＥＧＦを中和することによって改善する。ＶＥＧＦの生存シグナルはまた、この治療を限定するエンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）に反対する。従って、エンドスタチンと組み合わされた使用において、本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ、または２Ｃ３抗体は、ＶＥＧＦを中和し、そしてエンドスタチンの抗腫瘍効果を増幅する。２Ｃ３または他のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体はまた、腫瘍にコラゲナーゼを特異的に送達するために使用され得、ここでコラゲナーゼは、インサイチュでエンドスタチンを産生し、類似の利点を達成する。
すべてのこのように増強された、または相乗作用の組み合わせにおいて、抗体および他の因子は、別々に投与され得るか、または第２の因子が、特異的な送達のために抗体に連結され得る（すなわち、ＶＥＧＦＲ１への標的化された送達）。エンドスタチンとの組み合わせにおいて、化学結合体または組換え融合タンパク質が好ましい。なぜなら、これらは、エンドスタチンの短い半減期を相殺するからであり、エンドスタチンの短い半減期は現在、潜在的なエンドスタチン療法の限定である。組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）との組み合わせ、または標的化された形態の組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）はまた、使用され得る。
本発明の治療のさらなる利点は、間隙の圧力を下げる能力を含む。ＶＥＧＦ媒介性の増加した浸透性が、間隙の圧力に寄与するので、ＶＥＦＲ２を介する減少されたシグナル伝達は、浸透性および間隙圧力の両方を減少する。順番に、薬剤が全体の腫瘍組織横断する障壁を、これは減少し、その結果、脈管構造から遠い腫瘍細胞は殺され得る。長期の治療はまた、本発明の組成物が無視できるか、またはより低い免疫原性を有さない場合に達成され得る。
（Ｂ３．２Ｃ３抗体ＣＤＲ配列）
用語「可変性」は、本明細書中で抗体に関連して使用される場合、可変性ドメインの特定の部分を意味する。このドメインは、抗体の間の配列において、大規模に異なる。この用語は、特定の抗体に対する各特定の抗体の結合および特異性において使用される。しかし、可変性は、抗体の可変性ドメインに渡って、一様に分配されない。それは、「超可変性領域」と呼ばれる３つのセグメントに集中される。超可変性領域は、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方にある。
可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブな重鎖および軽鎖の可変ドメインの各々は、４つのＦＲ（それぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）を含み、大部分はβシート立体配置を採用し、３つの超可変性領域に結合され、連結するループを形成し、そしていくつかの場合、βシート構造の一部を形成する。
各鎖における超可変領域は、ＦＲに近接して一緒に保持され、そして他の鎖からの超可変領域は、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、１９９１、参考として本明細書中に具体的に援用される）。定常ドメインは、抗原への抗原の結合に直接に関係しないが、種々のエフェクター機能（例えば、抗原依存性細胞性毒性における抗原の関与）を示す。
用語「超可変性領域」は、本明細書中で使用される場合、抗原結合を担う、抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）および重鎖可変ドメインにおける３１〜３５（Ｈ１）、５０〜５６（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら、１９９１、参考として本明細書中に具体的に援用される）および／または「超可変領域ループ」からの残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）および重鎖可変ドメインにおける２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３））を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書中で定義される超可変領域残基よりも可変ドメイン残基である。
２Ｃ３ ＳｃＦｖフラグメントのＶｈおよびＶκ鎖のＤＮＡおよび推定アミノ酸配列は、本明細書中に配列番号６、７、８および９として提供される。これらの配列は、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のＣＤＲ１〜３を含む。
本明細書中に記載されるように（第Ｃ３章）、生物学的分子に関する構造的および機能的情報の規定について、一連の等価な、または改良された分子でさえも産生され得る。これは、２Ｃ３抗体によって例示される本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体を適用する。抗原結合および抗原の他の機能的特性が、保存されなければならないが、相当する、そしてさらに改善された抗体（一旦参考抗体が産生された）を作製する当該分野における非常に高度の技術が存在する。このような技術的熟練は、本明細書中で提供される配列および情報に関して、さらなる抗体の産生に適用される。この抗体は、改善された、または別の望まれる特徴を有する。
等価な抗体については、特定のアミノ酸は、相互作用的結合能力の明らかな損失なしで、抗体定常ドメインフレームワーク領域または抗体可変ドメインフレームワーク領域における他のアミノ酸と置換され得る。このような変化が、この抗体部分をコードするＤＮＡ配列においてなされること、およびこの変化が、天然において保存的であること（セクションＣ３、表Ａにおけるコドン情報、および部位特異的変異原性を支持する技術的詳細を参照のこと）が好ましい。自然には、なされるべき変化の数は限定されるが、これは当業者に公知である。
他の型の改変体は、それらが産生される親抗体に関する改良された生物学的特性を有する抗体である。このような改変体（すなわち、第二世代化合物）は、代表的には、親抗体の１以上の置換された超可変領域残基を含む置換改変体である。このような置換改変体を産生するための便利な方法は、ファージディスプレイを用いる親和性成熟である。
ファージディスプレイを用いる親和性成熟においては、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）は、変異して各部位におけるすべての可能なアミノ酸置換を生じる。このように産生された抗体改変体は、各粒子内に詰め込まれたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として、一価の様式で繊維状ファージ粒子から提示される。次いで、ファージディスプレイされた改変体は、本明細書中に開示されるようなそれらの生物学的活性（例えば、結合親和力）についてスクリーニングされる。改変のための候補超可変領域部位を同定するために、アラニン走査変異誘発を行い、抗原結合に著しく寄与する超可変領域残基を同定し得る。
あるいは、またはさらに、抗原−抗体複合体の結晶構造は、抗体とＶＥＧＦとの間の接点を同定するために描写され、分析されることが意図される。このような接触残基および隣接残基は、置換の候補である。一旦このような改変体が生成すると、改変体のパネルは、本明細書中に記載されるようにスクリーニングに供され、そして１以上の関連するアッセイにおいて類似の特性を有するが、異なる特性または優れた特性さえも有する抗体は、さらなる開発のために選択される。
従って、本発明のさらなる局面は、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖および軽鎖（例えば、２Ｃ３重鎖および軽鎖）のＣＤＲ領域をコードする単離されたＤＮＡセグメントおよび組換えベクター、ならびにＤＮＡ技術の適用を通した組換え宿主細胞の作製および使用に関連し、これらは、このようなＣＤＲ領域を発現する。
従って、本発明は、任意の動物（好ましくは、ヒトまたはマウス）から単離可能なＤＮＡセグメントに関し、これは全ゲノムＤＮＡを含まず、そしてＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖および軽鎖（例えば、２Ｃ３重鎖および軽鎖）のＣＤＲ領域を発現し得る。本明細書中で使用される場合、用語「ＤＮＡセグメント」は、特定の種の全ゲノムＤＮＡを含まずに単離されたＤＮＡ分子をいう。用語「ＤＮＡセグメント」には、ＤＮＡセグメントおよびこのようなセグメントのより小さいフラグメント、ならびに組換えベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどを含む）もまた含まれる。
同様に、コードセグメントまたはＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖および軽鎖（例えば、２Ｃ３重鎖および軽鎖）の精製ＣＤＲ領域をコードする単離された遺伝子部分を含むＤＮＡセグメントは、ＤＮＡセグメントといい、このようなコード配列（特定の局面においては、調節配列）を含み、他の天然に存在する遺伝子またはタンパク質コード配列から実質的に離れて単離される。この局面においては、用語「遺伝子」は、機能的タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドコードユニットをいうために単純さのために使用される。この機能的用語は、ネイティブな抗体コード配列および適切な抗原結合タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを発現するか、または発現するように適応され得るより小さな操作された配列を含む。
「他のコード配列から実質的に離れて単離される」とは、目的のコードセグメントまたは単離された遺伝子部分は、ＤＮＡセグメントのコード領域の重要な部分を形成し、そしてこのＤＮＡセグメントは、天然に存在するコードＤＮＡの大きい部分（例えば、大きな染色体フラグメントまたは他の機能的遺伝子またはｃＤＮＡコード領域）を含まないことを意味する。当然、これは最初に単離されたＤＮＡセグメントをいい、そして人の手によってそのセグメントに後から加えられた遺伝子またはコード領域を排除しない。
特定の実施形態においては、本発明は、単離されたコードセグメントまたは単離された遺伝子部分、およびＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖および軽鎖（例えば、２Ｃ３重鎖および軽鎖）のＣＤＲ領域をコードするＤＮＡ配列を組み込む組換えベクターに関し、これは、配列番号７または配列番号９のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、より好ましくは、少なくとも約８０％、より好ましくは、少なくとも約８５％、より好ましくは、少なくとも約９０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％などのアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列領域を含む少なくとも第一の配列領域を含み；ここでこのＣＤＲ領域は、配列番号７または配列番号９のアミノ酸配列のＣＤＲ領域の生物学的特性を少なくとも実質的に維持する。
本明細書中で開示されるように、これらの配列は、特定の生物学的に機能的に等価なアミノ酸または「保存的置換」を含み得る。他の配列は、当業者に公知でありそして本明細書中でさらに記載されるように、ＣＤＲまたはＣＤＲ含有抗体の特性を改良するために故意に操作された、機能的に非等価なアミノ酸または「非保存的置換」を含み得る。
アミノ酸および核酸配列は、さらなる残基（例えば、さらなるＮ末端もしくはＣ末端アミノ酸または５’もしくは３’配列）を含み得、そしてこの配列が上記の基準（好ましくは、タンパク質発現が関与する生物学的タンパク質活性の維持または改良を含む）に合う限り、さらになお本発明の配列に一致することもまた理解される。末端配列の付加は、コード領域およびまた制御領域の５’部分または３’部分のいずれかに隣接する種々の非コード配列を含む。
従って、本発明の核酸セグメントは、他のＤＮＡ配列（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、付加的制限酵素部位、多重クローニング部位、他のコードセグメントなど）と組み合わされ得、その結果それらの全体の長さはかなり変化し得る。従って、ほとんど任意の長さの核酸フラグメントが利用され得、その全長は、好ましくは、意図される組換えＤＮＡプロトコルにおける調製および使用の容易さによって制限されることが予想される。
従って、組換えベクターは、本発明のさらなる局面を形成する。特に有用なベクターは、ＤＮＡセグメントのコード部分がプロモーターの制御下で配置されるベクターであることが予想される。一般的に、排他的ではないが、組換えまたは異種プロモーターが利用される（すなわち、プロモーターは通常、それらの天然の環境においてはコード配列を伴わない）。プロモーターが、発現のために選択された細胞型、生物体において、または動物においてさえ、ＤＮＡセグメントの発現を効率的に指向する限り、このようなプロモーターは、細菌プロモーター、ウイルスプロモーター、真核生物プロモーターおよび哺乳動物プロモーターを含み得る。
タンパク質発現のためのプロモーターおよび細胞型の組み合わせの使用は、分子生物学分野の当業者に公知である。使用されるプロモーターは、構成的（または誘導性）であり得、そして適切な条件下で使用されて導入ＤＮＡセグメントの高レベルの発現を指向し得、例えば組換えタンパク質またはペプチドのラージスケールでの産生において有利である。
本発明の核酸配列の発現は、当業者に公知であり、かつ本明細書中にさらに記載される１以上の任意の標準的な技術によって、都合よく達成され得る。例えば、融合タンパク質の組換え発現についての後の記載は、核酸レベルで別のコード配列に作動可能に会合していない抗体および抗体フラグメントに、同様によく当てはまる。
（Ｂ４．ポリクローナル抗体）
抗体を調製および特徴付けるための手段は、当該分野において周知である。（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと；本明細書中で参考として援用される）。ポリクローナル抗血清を調製するために、動物を免疫原性ＶＥＧＦ組成物で免疫し、そして抗血清をこの免疫した動物から収集する。広範な動物種が、抗血清の生成のために使用され得る。代表的に、抗抗血清の生成のために使用される動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、またはヤギである。ウサギの比較的大容量の血液が理由で、ウサギは、ポリクローナル抗体の産生のために好ましい選択である。
ポリクローナル抗体の産生において使用されるＶＥＧＦ免疫原組成物の量は、免疫原ならびに免疫に使用される動物の性質に依存して変動する。以下の種々の経路が、本発明のＶＥＧＦ免疫原を投与するために使用され得る；皮下、筋内、皮内、静脈内、腹腔内、および脾臓内。ポリクローナル抗体の産生は、免疫後の種々の時点で免疫された動物の血液をサンプリングすることによって、モニターされ得る。第２の、追加免疫注射もまた与えられ得る。追加免疫する工程および力価測定する工程のプロセスは、適切な力価が達成されるまで反復される。所望の力価レベルが得られた時点で、この免疫した動物を採血し得、そして血清が単離および保存され得る。動物はまた、モノクローナル抗体を産生するために使用され得る。
当該分野において周知のように、特定の組成物の免疫原性は、アジュバントとして公知の免疫応答の非特異的刺激物質の使用によって増強され得る。例示的なアジュバントとしては完全フロイントアジュバント（殺傷されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含有する、免疫応答の非特異的刺激物質）；不完全フロイントアジュバント；および水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。
ＶＥＧＦをキャリアと連結することによってか、またはＶＥＧＦをキャリアにカップリングすることによって達成され得るように、宿主免疫系を追加免疫することもまた所望され得る。例示的なキャリアは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。オボアルブミン、マウス血清アルブミン、またはウサギ血清アルブミンのような他のアルブミンもまた、キャリアとして使用され得る。当該分野においてまた公知であるように、所定の組成は、その免疫原性において変動し得る。しかし、ＶＥＧＦに対する抗体の産生は著しくは困難でない。
（Ｂ５．モノクローナル抗体）
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を産生するための種々の方法がまた、現在当該分野において十分に周知である。最も標準的なモノクローナル抗体の産生技術は、一般的に、ポリクローナル抗体を調製するための技術と同じ系に沿って開始する（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８；本明細書中で参考として援用される）。ポリクローナル抗体応答は、免疫原性ＶＥＧＦ組成物を用いて動物を免疫することによって開始され、そして所望の力価レベルが得られる時点で、その免疫した動物を用いてＭＡｂを産生し得る。
ＭＡｂは、米国特許第４，１９６，２６５号（これは、本明細書中で参考として援用される）に例示される技術のような、周知技術の使用を通して容易に調製され得る。代表的に、この技術は、選択されたＶＥＧＦ免疫原組成物を用いて適切な動物を免疫することを含む。免疫する組成物は、抗体産生細胞を刺激するのに有効な様式で投与される。マウスおよびラットのような齧歯類は好ましい動物であるが、ウサギ、ヒツジ、およびカエルの細胞の使用もまた可能である。ラットの使用は、特定の利点を与え得る（Ｇｏｄｉｎｇ、１９８６、第６０〜６１頁；本明細書中で参考として援用される）が、マウスが好ましい。そして、ＢＡＬＢ／ｃマウスは、最も慣用的に使用され、そして一般により高率で安定な融合物を与えるので最も好ましい。
免疫後に、ＶＥＧＦを産生する潜在能を有する体細胞（詳細には、Ｂリンパ球（Ｂ細胞））が、ＭＡｂ産生プロトコルにおける使用のために選択される。これらの細胞は、生検された脾臓、扁桃、もしくはリンパ節から、または末梢血サンプルから獲得され得る。脾臓細胞および末梢血細胞が好ましい。前者は、脾臓細胞が分裂形質芽球段階にある抗体産生細胞の豊富な供給源であるからであり、後者は、末梢血が容易に利用可能であるからである。しばしば、一団の動物が免疫され、そして最高の抗体力価を有する動物の脾臓が取り出され、そして注射器でこの脾臓をホモジネートすることによって脾臓リンパ球が得られる。代表的に、免疫したマウス由来の脾臓は、約５×１０7〜２×１０8のリンパ球を含む。
次いで、免疫した動物由来の抗ＶＥＧＦ抗体産生Ｂリンパ球は、不死化骨髄腫細胞の細胞（一般的には、免疫された動物と同じ種の細胞）と融合される。ハイブリドーマ産生融合手順における使用に適切な骨髄腫細胞株は、好ましくは非抗体産生であり、高い融合効率を有し、そして、次いで所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する特定の選択培地中で増殖し得なくさせる酵素欠損を有する。
当業者に公知のように、多くの骨髄腫細胞のうちの任意の細胞が使用され得る（Ｇｏｄｉｎｇ、第６５〜６６頁、１９８６；Ｃａｍｐｂｅｌｌ、第７５〜８３頁、１９８４；各々は、本明細書中で参考として援用される）。例えば、免疫した動物がマウスである場合、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳｌ／１．Ａｇ ４ １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７、およびＳ１９４／５ＸＸ０ Ｂｕｌが使用され得；ラットについて、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ、４Ｂ２１０、または上記に列挙されたマウス細胞株のうちの１つが使用され得；そしてＵ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２、およびＵＣ７２９−６はすべて、ヒト細胞融合に関連して有用である。
抗体産生脾臓細胞または抗体産生リンパ節細胞、および骨髄腫細胞のハイブリッドを生成するための方法は、通常、細胞膜の融合を促進する因子（化学的または電気的）の存在下で、４：１の比率で体細胞を骨髄腫細胞と混合する工程を包含するが、この比率はそれぞれ約２０：１〜約１：１まで変動し得る。センダイウイルスを使用する融合方法は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５；１９７６；各々、本明細書中で参考として援用される）によって記載されており、そしてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、３７％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ）を使用する融合方法は、Ｇｅｆｔｅｒら（１９７７；本明細書中で参考として援用される）に記載されている。電気的に誘導された融合方法の使用もまた適切である（Ｇｏｄｉｎｇ、第７１〜７４頁、１９８６；本明細書中で参考として援用される）。
融合手順は通常、低い頻度（約１×１０-6〜１×１０-8）で生存可能なハイブリッドを生成する。しかし、これは問題を提起しない。なぜなら、生存可能な融合ハイブリッドは、選択培地中で培養することによって、親の非融合細胞（特に、通常は無限に分裂しつづける、非融合骨髄腫細胞）から識別されるからである。選択培地は、一般に、組織培養培地中でのヌクレオチドのデノボ合成をブロックする薬剤を含む培地である。例示的かつ好ましい薬剤は、アミノプテリン、メトトレキサート、およびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキサートは、プリンおよびピリミジンの両方のデノボ合成をブロックし、一方、アザセリンは、プリン合成のみをブロックする。アミノプテリンまたはメトトレキサートが使用される場合、ヌクレオチドの供給源としてヒポキサンチンおよびチミジンを倍地に補充する（ＨＡＴ培地）。アザセリンが使用される場合、ヒポキサンチンを培地に補充する。
好ましい選択培地は、ＨＡＴである。ヌクレオチドサルベージ経路を機能し得る細胞のみが、ＨＡＴ培地中で生存し得る。骨髄腫細胞は、サルベージ経路の重要な酵素（例えば、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を欠損し、そしてそれらは生存し得ない。Ｂ細胞はこの経路を機能し得るが、それらは培養中で限られた寿命を有し、そして一般に約２週間以内に死滅する。従って、選択培地中で生存し得る細胞のみが、骨髄腫細胞およびＢ細胞から形成されたそれらのハイブリッドである。
この培養は、特定のハイブリドーマが選択されるハイブリドーマの集団を提供する。代表的に、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレート中での単一クローン希釈によって細胞を培養し、次いで所望の抗ＶＥＧＦ反応性について個々のクローンの上清を試験すること（約２〜３週間後）によって、実施される。このアッセイは、高感度で、単純で、そして迅速であるべきである（例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫検定法、細胞傷害性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイ（ｄｏｔ ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）など）。
次いで、選択されたハイブリドーマを段階希釈し、そして個々のＶＥＧＦ抗体産生細胞株にクローン化する。次いで、このクローンは無限に増殖されて、ＭＡｂを提供する。細胞株は、２つの基本的様式でＭＡｂ産生のために利用され得る。ハイブリドーマのサンプルは、もともとの融合物のために体細胞および骨髄腫細胞を提供するために使用された型の組織適合性動物に注射（しばしば、腹膜腔内へ）され得る。この注射された動物は、融合された細胞ハイブリッドによって産生される特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発症する。次いで、この動物の体液（例えば、血清または腹水）を穿刺して、高濃度でＭＡｂを提供し得る。個々の細胞株はまた、インビトロで培養され得る。ここで、ＭＡｂは培養培地中に自然に分泌され、ここからＭＡｂは高濃度で容易に獲得され得る。
いずれかの手段によって産生されたＭＡｂは、一般に、例えば、濾過、遠心法、および種々のクロマトグラフィー方法（例えば、ＨＰＬＣまたはアフィニティークロマトグラフィー）（これらの精製技術はすべて、当業者に周知である）を使用して、さらに精製される。これらの精製技術は各々、混合物の他の成分から所望の抗体を分離するための分別を含む。抗体の調製に特に適切な分析方法としては、例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーおよび／またはプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーが挙げられる。
（Ｂ６．ファージミドライブラリー由来の抗体）
組換え技術は、今や、一定範囲の抗体をコードする組換え遺伝子に由来する所望の特異性を有する抗体の調製を可能にしている（Ｖａｎ Ｄｉｊｋら、１９８９；本明細書中に参考として援用される）。特定の組換え技術は、免疫した動物の脾臓から単離されたＲＮＡから調製されるコンビナトリアル免疫グロブリンファージ発現ライブラリーの免疫学的スクリーニングによる抗体遺伝子の単離を包含する（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８６；ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９９１；各々が本明細書中に参考として援用される）。
このような方法のために、コンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリーは免疫した動物の脾臓から単離されたＲＮＡから調製され、そして適切な抗体を発現するファージミドは、抗原を発現する細胞およびコントロール細胞を用いてパニングすることにより選択される。従来のハイブリドーマ技術を超えるこのアプローチの利点は、約１０4倍もの多くの抗体が１回で生成およびスクリーニングされ得ること、ならびに新たな特異性がＨ鎖およびＬ鎖の組み合わせにより生成されることである。このことは、生成される適切な抗体の割合をさらに増大させる。
細菌中で、多様な抗体分子の大きなレパートリーを生成するための１つの方法は、ベクターとしてバクテリオファージλを利用する（Ｈｕｓｅら、１９８９；本明細書中に参考として援用される）。λベクターを使用する抗体の生成は、ＤＮＡ配列の重鎖および軽鎖集団を別々の開始ベクターへクローニングすることを包含する。このベクターは、引き続きランダムに組み合わされて、抗体フラグメントを形成するために重鎖および軽鎖の同時発現を指向する単一のベクターを形成する。重鎖および軽鎖のＤＮＡ配列は、選択された抗原で免疫された動物に由来する脾臓細胞（またはそれらのハイブリドーマ）から単離されたｍＲＮＡの増幅により（好ましくは、ＰＣＲTMまたは関連増幅技術により）得られる。重鎖および軽鎖の配列は、代表的には、開始ベクターへの重鎖および軽鎖セグメントのクローニングを容易にするために、増幅されたＤＮＡセグメントの末端に制限部位を組み込むプライマーを使用して増幅される。
完全にまたは部分的に合成的である抗体結合部位（すなわちパラトープ）の大きなライブラリーを作製およびスクリーニングするための別の方法は、糸状ファージ（例えば、Ｍ１３、ｆｌまたはｆｄ）に由来するディスプレイベクターを利用する。これらの糸状ファージディスプレイベクター（「ファージミド」ともいわれる）は、多様かつ新規な免疫特異性を有するモノクローナル抗体の大きなライブラリーを生じる。この技術は、糸状ファージ複製のアセンブリ段階の間に遺伝子産物および遺伝子を連結するための手段として、糸状ファージコートタンパク質膜アンカードメインを使用し、そしてこれは、コンビナトリアルライブラリーから抗体をクローニングおよび発現するために使用されている（Ｋａｎｇら、１９９１；Ｂａｒｂａｓら、１９９１；各々が本明細書中に参考として援用される）。
糸状ファージディスプレイのためのこの一般的技術は、米国特許第５，６５８，７２７号（本明細書中に参考として援用される）に記載される。大部分の一般的認識において、この方法は、単一のベクター系を使用して、抗体遺伝子レパートリーから予め選択されたリガンド−結合特異性を同時クローニングおよびスクリーニングするための系を提供する。予め選択されたリガンド−結合能力についてライブラリーの単離されたメンバーをスクリーニングすることにより、ライブラリーに由来するメンバーをコードする遺伝子を単離するための簡便な手段を用いて、発現された抗体分子の結合能力の相関づけが可能になる。
発現およびスクリーニングの関連づけは、機能的抗体のアセンブリを可能にするための細菌細胞のペリプラズムへの融合ポリペプチドの標的化と、目的のライブラリーメンバーの簡便なスクリーニングを可能にするためのファージアセンブリの間の糸状ファージ粒子のコートへの融合タンパク質の標的化との組み合わせにより達成される。ペリプラズム標的化は、融合ポリペプチド中の分泌シグナルドメインの存在により提供される。ファージ粒子への標的化は、融合ポリペプチド中の糸状ファージコートタンパク質膜アンカードメイン（すなわち、ｃｐＩＩＩ由来か、またはｃｐＶＩＩＩ由来の膜アンカードメイン）の存在により提供される。
糸状ファージベースのコンビナトリアル抗体ライブラリーの多様性は、重鎖および軽鎖の遺伝子のシャッフリングにより、ライブラリーのクローニングされた重鎖遺伝子の１つ以上の相補性決定領域を改変することにより、または誤りがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ポリメラーゼ連鎖反応によりライブラリーへランダム変異を導入することにより増大され得る。ファージミドライブラリーをスクリーニングするためのさらなる方法は、米国特許第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，４０３，４８４号；および同第５，２２３，４０９号（各々が本明細書中に参考として援用される）に記載される。
大きなコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングするための別の方法が開発され、この方法は、Ｍ１３、ｆｌまたはｆｄのような糸状バクテリオファージの表面での多様な重鎖および軽鎖配列の集団の発現を利用する（米国特許第５，６９８，４２６号；本明細書中に参考として援用される）。多様な重鎖（Ｈｃ）および軽鎖（Ｌｃ）配列の２つの集団は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲTM）により合成される。これらの集団は、発現のために必要なエレメントを含む、別個のＭ１３ベースのベクターにクローニングされる。重鎖ベクターは、重鎖配列の翻訳がｇＶＩＩＩ−Ｈｃ融合タンパク質を生成するように、遺伝子ＶＩＩＩ（ｇＶＩＩＩ）コートタンパク質配列を含む。２つのベクターの集団は、ＨｃおよびＬｃの配列を含むベクター部分のみが単一の環状ベクターに連結されるように、ランダムに組み合わされる。
組み合わされたベクターは、Ｍ１３での２つのポリペプチドのアセンブリおよび表面発現のためにＨｃおよびＬｃの配列の両方の同時発現を指向する（米国特許第５，６９８，４２６号；本明細書中に参考として援用される）。組み合わせ工程は、単一のベクターに２つの多様な集団内の異なるＨｃコ−ド配列およびＬｃコード配列をランダムに結びつける。各々の独立したベクターから与えられたこのベクター配列は、生存ファージの生成のために必要である。さらに、擬ｇＶＩＩＩ配列は２つの開始ベクターのうちの一方のみに含まれるので、Ｌｃ会合ｇＶＩＩＩ−Ｈｃ融合タンパク質としての機能的抗体フラグメントの同時発現は、ベクター配列が単一のベクター内に連結されるまではファージ表面で達成され得ない。
抗体ライブラリーの表面発現は、アンバーサプレッサー株において行われる。Ｈｃ配列とｇＶＩＩＩ配列との間のアンバー停止コドンは、非サプレッサー株において２つの成分を連結しない。非サプレッサー株から生成されたファージを単離し、そしてサプレッサー株を感染させることは、発現の間に、ｇＶＩＩＩ配列にＨｃ配列を連結させる。感染後にサプレッサー株を培養することは、ｇＶＩＩＩ融合タンパク質（ｇＶＩＩＩ−Ｆａｂ融合タンパク質）としてライブラリー内の全ての抗体種をＭ１３ファージの表面で同時発現させることを可能にする。あるいは、このＤＮＡは、非サプレッサー株から単離され得、次いで、同じ効果を達成するようにサプレッサー株に導入され得る。
表面発現ライブラリーは、標準的アフィニティー単離手順により予め選択された分子を結合する特異的Ｆａｂフラグメントについてスクリーニングされる。このような方法としては、例えば、パニング（ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ、１９８８；本明細書中に参考として援用される）、アフィニティークロマトグラフィーおよび固相ブロッティング手順が挙げられる。パニングは、高力価のファージが容易に、迅速かつ少容量でスクリーニングされ得るので好ましい。さらに、この手順は、集団内の微量なＦａｂフラグメント種を選択し得る。この微量のフラグメント種は、他の方法では検出不能であり、そして実質的に均質な集団にまで増殖されない。選択されたＦａｂフラグメントは、このファージ集団の増殖後に、ポリペプチドをコードする核酸を配列決定することにより特徴づけられ得る。
抗体の多様なライブラリーを作製し、所望の結合特異性についてスクリーニングするための別の方法は、米国特許第５，６６７，９８８号および同第５，７５９，８１７号（各々が、本明細書中に参考として援用される）に記載される。この方法は、免疫グロブリン可変重鎖および可変軽鎖の可変ドメインのＣＤＲ領域に縮重、ならびにファージミドの表面での変異誘発したポリペプチドのディスプレイを組み込むために、縮重オリゴヌクレオチドおよびプライマー伸長反応を用いるファージミドライブラリーの形態での、ヘテロダイマーの免疫グロブリン分子のライブラリーの調製を包含する。それ以降、ディスプレイタンパク質は、予め選択された抗原に結合する能力についてスクリーニングされる。
ヘテロダイマー免疫グロブリン分子を生成するための方法は、一般に、（１）目的の重鎖または軽鎖のＶ領域コード遺伝子をファージミドディスプレイベクターに導入すること；（２）無作為化された結合部位をファージミドディスプレイタンパク質ベクターへ、抗体Ｖ領域遺伝子のＣＤＲに対する相同性の領域を含み、そして無作為化したコード配列を生成するための縮重領域を含むオリゴヌクレオチドでのプライマー伸長により導入して、各々がファージミド表面ディスプレイタンパク質上に提示される異なる推定結合部位を発現し得るディスプレイベクターの大きな集団を形成すること；（３）糸状ファージ粒子の表面でディスプレイタンパク質および結合部位を発現させること；ならびに（４）アフィニティー技術（例えば、予め選択された抗原に対するファージ粒子のパニング）を用いて表面発現したファージ粒子を単離（スクリーニング）し、このことによって、予め選択された抗原に結合する結合部位を含むディスプレイタンパク質を含む１種以上のファージミドを単離することを包含する。
抗体の多様なライブラリーを作製し、そして所望の結合特異性についてスクリーニングするためのこの方法のさらなるバリエーションは、米国特許第５，７０２，８９２号（本明細書中に参考として援用される）に記載される。この方法においては、重鎖配列のみが用いられ、この重鎖配列は、ＣＤＲＩ超可変領域またはＣＤＲＩＩＩ超可変領域のいずれかをコードする全てのヌクレオチド位置で無作為化され、そしてＣＤＲにおける遺伝的可変性は、任意の生物学的プロセスとは独立して生成される。
この方法において、２つのライブラリーを操作して、重鎖遺伝子構造の骨格内のオリゴヌクレオチドモチーフを遺伝的にシャッフルする。ＣＤＲＩまたはＣＤＲＩＩＩのいずれかのランダム変異によって、重鎖遺伝子の超可変領域は、高度に多様な配列の収集物を生じるように再構築された。変異した遺伝子配列の収集物によりコードされる重鎖タンパク質は、２つの免疫グロブリン鎖の一方のみを必要とするが、免疫グロブリンの結合特性の全てを有する潜在能力を保有した。
詳細には、この方法は、免疫グロブリン軽鎖タンパク質の非存在下で行われる。改変した重鎖タンパク質を提示するファージライブラリーは、固定化されたリガンドとともにインキュベートされて、固定化されたリガンドに特異的に結合する組換えタンパク質をコードするクローンが選択される。次いで、結合したファージを固定化されたリガンドから解離し、そして細菌宿主細胞中での増殖により増幅させる。個々のウイルスプラーク（各々が異なる組換えタンパク質を発現する）は拡大され、次いで、個々のクローンは結合活性についてスクリーニングされ得る。
（Ｂ７．ヒトリンパ球由来の抗体）
インビトロ免疫、または抗原刺激をまた使用して、ヒト抗ＶＥＧＦ抗体を生成し得る。このような技術を使用して、正常な健全な被験体由来の末梢血リンパ球を単にインビトロにおいてＶＥＧＦで抗体産生細胞を刺激することにより刺激し得る。 このような「インビトロ免疫」は、一般的に、リンパ球の混合集団（混合リンパ球培養物、ＭＬＣ）中での非免疫Ｂリンパ球の抗原特異的活性化を含む。インビトロ免疫はまた、Ｂ細胞増殖因子およびＢ細胞分化因子ならびにリンホカインにより支持され得る。これらの方法により産生される抗体は、しばしば、ＩｇＭ抗体である（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋら、１９８６；本明細書中に参考として援用される）。
別の方法が記載され（米国特許第５，６８１，７２９号、本明細書中に参考として援用される）、ここで、主にＩｇＧ（またはＩｇＡ）抗体を産生するヒトリンパ球が得られ得る。この方法は、一般的な意味において、免疫不全動物へヒトリンパ球を移植し、その結果、ヒトリンパ球が動物の身体内に「取りこまれ」；抗原に特異的な抗体を産生するヒトリンパ球を生成するように所望の抗原を用いて動物を免疫し；そして動物から抗体を産生するヒトリンパ球を回収する工程を包含する。従って、産生されたヒトリンパ球を使用して、抗体を産生するヒトリンパ球を不死化し、抗体を産生する得られた不死化ヒト起源リンパ球をクローニングし、そしてクローニングされた不死化ヒト起源リンパ球から所望の抗原に特異的なモノクローナル抗体を回収することによりモノクローナル抗体を産生し得る。
この技術において使用され得る免疫不全動物は、動物にヒトリンパ球が移植された場合に拒絶を示さない免疫不全動物である。このような動物は、物理的、化学的、または生物学的な処置により人工的に調製され得る。任意の免疫不全動物が使用され得る。ヒトリンパ球は、ヒト末梢血、脾臓、リンパ節、扁桃腺などから得られ得る。
動物における移植されたヒトリンパ球の「取りこみ」は、単に動物にヒトリンパ球を投与することにより達成され得る。投与経路は制限されず、そして例えば、皮下、静脈内、または腹腔内であり得る。ヒトリンパ球の用量は制限されず、そして通常は、動物あたり１０6〜１０8のリンパ球であり得る。次いで、免疫不全動物は、所望のＶＥＧＦ抗原で免疫される。
免疫後、ヒトリンパ球が、任意の慣習的な方法により、血液、脾臓、リンパ節または他のリンパ組織から回収される。例えば、単核細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（比重：１．０７７）遠心法により分離され得、そしてプラスチックディッシュ吸着法により単球が回収され得る。免疫不全動物由来の夾雑細胞は、動物細胞に特異的な抗血清を用いることにより取り除かれ得る。抗血清は、例えば、免疫不全動物の脾臓細胞で第２の異なる動物を免疫し、そして異なる免疫動物から血清を回収することにより得られ得る。抗血清での処置は、任意の段階で実施され得る。ヒトリンパ球はまた、マーカーとして、細胞表面上で発現されるヒト免疫グロブリンを使用する免疫学的方法により回収され得る。
これらの方法により、一つ以上の選択されたＶＥＧＦエピトープに特異的なＩｇＧ抗体およびＩｇＡ抗体を主に産生するヒトリンパ球が得られ得る。次いで、モノクローナル抗体が、不死化、選択、細胞増殖、および抗体産生によりヒトリンパ球から得られる。
（Ｂ８．ヒト抗体ライブラリーを含有するトランスジェニックマウス）
組換え技術は、今や抗体の調製のために利用可能である。上記に開示される組換え免疫グロブリンファージ発現ライブラリーに加えて、別の分子クローニングアプローチは、抗体をヒト抗体ライブラリーを含有するトランスジェニックマウスから調製することである。このような技術は、米国特許第５，５４５，８０７号に記載され、これは、本明細書に参考として援用される。
最も一般的な意味において、これらの方法は、その生殖系統に、ヒト起源の免疫グロブリンの少なくとも一部をコードする遺伝子材料か、または免疫グロブリンのレパートリーをコードするように再編成され得る遺伝子材料を挿入したトランスジェニック動物の産生を包含する。挿入された遺伝子材料は、ヒト供給源から産生され得るか、または合成により産生され得る。その材料は、公知の免疫グロブリンの少なくとも一部をコードし得るか、または改変された免疫グロブリンの少なくとも一部をコードするように改変され得る。
挿入された遺伝子材料は、トランスジェニック動物において発現され、挿入されたヒト免疫グロブリン遺伝子材料に少なくとも部分的に由来する免疫グロブリンを産生する。その遺伝子材料は、たとえ、その挿入された遺伝子材料が、生殖系列の誤った位置に、または誤った相対位置に組み込まれたとしても、その一部が挿入された遺伝子材料に由来する免疫グロブリンのレパートリーが、産生され得るように、トランスジェニック動物において再編成されることが見出される。
その挿入された遺伝子材料は、プラスミドおよび／またはコスミドのような原核生物ベクターにクローン化されたＤＮＡの形態であり得る。より大きなＤＮＡフラグメントは、酵母人工染色体ベクターを使用して（Ｂｕｒｋｅら、１９８７；本明細書中に参考として援用される）、または染色体フラグメントを導入することにより（ＲｉｃｈｅｒおよびＬｏ、１９８９；本明細書中に参考として援用される）挿入される。その挿入された遺伝子材料は、従来の様式で宿主に（例えば、注入によって、または他の手順によって、受精卵または胚性幹細胞に）導入され得る。
好ましい局面において、得られるトランスジェニック動物が、免疫グロブリンを産生するときに、挿入されたヒト遺伝子材料のみを使用するように、免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子材料をはじめから保有しない宿主動物が利用される。これは、関連する遺伝子材料を欠失する天然に存在する変異体宿主を使用して、または人工的に、例えば、細胞株で、関連する遺伝子材料が除去されている宿主を究極的に作製するために、変異体を作製することによってのいずれかで、達成され得る。
宿主動物が免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子材料を保有する場合、トランスジェニック動物は、天然に存在する遺伝子材料および挿入された遺伝子材料を保有し、そして天然に存在する遺伝子材料、挿入された遺伝子材料、および両方のタイプの遺伝子材料の混合物に由来する免疫グロブリンを産生する。この場合、その所望の免疫グロブリンは、トランスジェニック動物に由来するハイブリドーマを、例えば、抗体遺伝子発現の対立遺伝子排除の現象または示差的染色体損失を利用して、スクリーニングすることによって得られ得る。
一旦適切なトランスジェニック動物が調製されると、その動物は、所望の免疫原で単に免疫される。挿入される材料の性質に依存して、その動物は、外来起源のその遺伝子材料が、免疫グロブリンの一部のみをコードする場合、例えば、混合されたマウス／ヒト起源のキメラ免疫グロブリンを産生し得る；または、その動物は、外来起源の遺伝子材料が、免疫グロブリン全体をコードする場合、完全に外来の免疫グロブリン（例えば、完全にヒト起源の）を産生し得る。
ポリクローナル抗血清は、免疫に続いて、トランスジェニック動物から産生され得る。免疫グロブリン産生細胞は、目的の免疫グロブリンを産生する動物から除去され得る。好ましくは、モノクローナル抗体は、トランスジェニック動物から、例えば、その動物由来の脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合し、そして得られるハイブリドーマをスクリーニングして所望の抗体を産生するものを選択することによって、産生される。このようなプロセスのための適切な技術は、本明細書に記載される。
代替のアプローチにおいて、その遺伝子材料は、所望の抗体が、動物の血清のような体液、またはミルク、初乳もしくは唾液のような外部分泌液において産生されるような様式で、動物に組み込まれ得る。例えば、インビトロでヒト免疫グロブリンの少なくとも一部をコードする遺伝子材料を、ミルクタンパク質をコードする哺乳動物の遺伝子に挿入し、次いで、その遺伝子をその哺乳動物の受精卵に、例えば、注入により、導入することによって、その卵は、挿入されたヒト免疫グロブリン遺伝子材料に少なくとも部分的に由来する免疫グロブリンを含有するミルクを産生する成体雌哺乳動物に成長し得る。次いで、所望の抗体は、ミルクから回収され得る。このようなプロセスを行うための適切な技術は、当業者に公知である。
上記のトランスジェニック動物は、通常、単一のアイソタイプの、より詳細にはＢ細胞成熟に必須であるアイソタイプ（例えば、ＩｇＭおよびたぶんＩｇＤ）のヒト抗体を産生するために利用される。ヒト抗ＶＥＧＦ抗体を産生するための別の好ましい方法は、米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６１１，０１６号；および同第５，７７０，４２９号（各々が本明細書に参考として援用される）に記載される技術を使用することである。そこでは、Ｂ細胞発生のために必要とされるアイソタイプから他のアイソタイプへ変換し得るトランスジェニック動物が記載される。
Ｂリンパ球の発生において、その細胞は、まず生産的に再編成されたＶHおよびＶL領域によって決定される結合特異性を有するＩｇＭを産生する。その結果、各Ｂ細胞およびその子孫細胞は、同じＬおよびＨ鎖Ｖ領域を有する抗体を合成するが、これらは、Ｈ鎖のアイソタイプを交換し得る。ミューまたはデルタ定常領域の使用は、交互のスプライシングによって大部分決定され、ＩｇＭおよびＩｇＤが、単一の細胞において同時発現されることを可能にする。他の重鎖アイソタイプ（γ、α、およびε）は、遺伝子再編成事象が、ＣミューエキソンおよびＣデルタエキソンを削除した後に、天然においてのみ発現される。この遺伝子の再編成プロセスは、アイソタイプスイッチングと呼ばれ、代表的には、各重鎖遺伝子のすぐ上流に位置する（デルタを除く）いわゆるスイッチセグメント間の組換えによって生じる。個々のスイッチセグメントは、２ｋｂと１０ｋｂとの間の長さであり、そして主に短い反復した配列からなる。
これらの理由により、導入遺伝子は、転写調節配列を、アイソタイプスイッチングに利用されるべき各スイッチ領域の約１〜２ｋｂ上流内に組み込んでいることが好ましい。これらの転写調節配列は、好ましくは、プロモーターおよびエンハンサーエレメントを含み、そしてより好ましくは、スイッチ領域に天然に結合する（すなわち、生殖系統の構成において生じる）５’隣接（すなわち、上流）領域を含む。１つのスイッチ領域からの５’隣接配列は、導入遺伝子構築のために異なるスイッチ領域に作動可能に連結され得るが、いくつかの実施形態では、導入遺伝子構築物に組み込まれている各スイッチ領域は、天然に存在する生殖系統構成においてすぐ上流に存在する５’隣接領域を有することが好ましい。免疫グロブリンスイッチ領域配列に関連する配列情報は、公知である（Ｍｉｌｌｓら、１９９０；Ｓｉｄｅｒａｓら、１９８９；各々、参考として本明細書に援用される）。
米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号；および第５，７７０，４２９号に記載される方法では、トランスジェニック動物内に含まれるヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、アイソタイプのスイッチングに至るＢ細胞発達の経路を通じて正確に機能する。従って、この方法では、これらの導入遺伝子は、アイソタイプスイッチングおよび以下の１つ以上を生成するように構築される：（１）高レベルおよび細胞型特異的発現、（２）機能的遺伝子再配置、（３）対立遺伝子排除の活性化および対立遺伝子排除に対する応答、（４）十分な一次レパートリーの発現、（５）シグナル伝達、（６）体細胞過剰変異、および（７）免疫応答の間の導入遺伝子抗体遺伝子座の支配。
導入遺伝子機能に対する重要な要件は、広範な範囲の抗原に対する二次免疫応答の引金となるために十分に多様性である一次抗体レパートリーの生成である。再配置された重鎖遺伝子鎖は、各々がいくつかのエキソンによりコードされる、シグナルペプチドエキソン、可変領域エキソンおよび多ドメイン定常領域の領域のタンデムアレイからなる。これらの定常領域遺伝子の各々は、異なるクラスの免疫グロブリンの定常部分をコードする。Ｂ細胞発達の間に、Ｖ領域近位定常領域は欠失し、新たな重鎖クラスの発現に至る。各重鎖クラスについて、ＲＮＡスプライシングの選択的パターンが、膜貫通免疫グロブリンおよび分泌された免疫グロブリンの両方を生じる。
ヒト重鎖遺伝子座は、２Ｍｂにまたがるほぼ２００Ｖ遺伝子セグメント、約４０ｋｂにまたがるほぼ３０Ｄ遺伝子セグメント、３ｋｂ内のクラスターである６つのＪセグメント、およびほぼ３００ｋｂにわたって広がる９つのの定常領域遺伝子セグメントからなる。全長遺伝子座は、第１４染色体の長腕の遠位部分のほぼ２．５Ｍｂにまたがる。６つの公知のＶHファミリーのすべてのメンバー、ＤおよびＪ遺伝子セグメント、ならびにμ、δ、γ３、γ１およびα１定常領域を含む重鎖導入遺伝子フラグメントは公知である（Ｂｅｒｍａｎら、１９８８；参考として本明細書に援用される）。すべての必要な遺伝子セグメントおよびヒト軽鎖遺伝子座からの調節配列を含むゲノムフラグメントもまた同様に構築される。
首尾良く再配置された免疫グロブリン重鎖および軽鎖導入遺伝子の発現は、通常、トランスジェニック非ヒト動物において内因性免疫グロブリン遺伝子の再配置を抑制することによって優性効果を有する。しかし、特定の実施形態では、例えば、導入遺伝子と内因性Ｉｇ配列との間のトランススイッチングにより、ヒト可変領域および非ヒト（例えばマウス）定常領域を含むハイブリッド免疫グロブリン鎖が形成され得ないように、内因性Ｉｇ遺伝子座の完全不活性化を行うことが所望される。胚性幹細胞技術および相同的組換えを用い、内因性免疫グロブリンレパートリーを容易に排除し得る。さらに、内因性Ｉｇ遺伝子の抑制は、アンチセンス技法のような種々の技法を用いて達成され得る。
本発明の他の局面では、トランススイッチされた免疫グロブリンを生成することが所望され得る。このようなキメラトランススイッチ免疫グロブリンを含む抗体は、例えば、宿主細胞においてエフェクター機能の保持のために、非ヒト（例えばマウス）定常領域を有することが所望される種々の適用のために用いられ得る。マウス定常領域の存在は、ヒト定常領域に比べ、例えば、このようなキメラ抗体がマウス疾患モデルにおいて試験され得るように、マウスエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、マウス補体固定化）を提供するという利点を与え得る。動物試験の次に、ヒト可変領域コード配列が、例えば、ＰＣＲTM増幅または供給源（ハイブリドーマクローン）からのｃＤＮＡクローニングにより単離され、そしてヒト治療使用により適切なヒト配列抗体をコードするための所望のヒト定常領域をコードする配列にスプライスされ得る。
（Ｂ９．ヒト化抗体）
一般に、ヒト抗体は、ヒト治療における使用に少なくとも３つの可能な利点を有する。第１に、そのエフェクター部分はヒトであるので、例えば、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）によって標的細胞をより効率的に破壊するために、ヒト免疫系の他の部分とより良好に相互作用し得る。第２に、ヒト免疫系は、異物として抗体を認識しない。第３に、ヒト循環中の半減期は、天然に存在するヒト抗体と類似であり、より少なくかつより少ない用量を与えることを可能にする。
ヒト抗ＶＥＧＦ抗体を調製する種々の方法が本明細書中に提供される。ヒト抗体に加えて、「ヒト化」抗体は多くの利点を有する。「ヒト化」抗体は、一般に、ヒト定常および／または可変領域ドメインまたは特定の変更を保持する、マウス、ラット、ハムスター、ウサギまたはその他の種からのキメラまたは変異体モノクローナル抗体である。いわゆる「ヒト化」抗ＶＥＧＦ抗体を生成するための技法は、当業者に周知である。
ヒト化抗体もまた、先行する利点を共有する。第１に、エフェクター部分はなおヒトである。第２に、ヒト免疫系は、フレームワークまたは定常領域を異物として認識せず、そしてそれ故、このような注入抗体に対する抗体応答は、完全に異物であるマウス抗体に対してより少ない。第３に、注入されたヒト化抗体は、注入されたマウス抗体とは反対に、天然に存在するヒト抗体により類似する半減期を有し、またより少なくかつより少ない頻度の用量を与える。
ヒト化抗体を産生する多くの方法が記載されている。新たな人工タンパク質分子または「キメラ」抗体を形成するための、タンパク質ジスルフィド結合を通じて連結される抗体ドメインの制御された再配置が利用され得る（Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙら、１９８１；本明細書中に参考として援用される）。組換えＤＮＡ技術もまた、マウス抗体可変軽鎖および重鎖ドメインと、ヒト抗体軽鎖および重鎖定常ドメインとをコードするＤＮＡ配列間の遺伝子融合を構築するために用いられ得る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４；本明細書中に参考として援用される）。
マウスモノクローナル抗体の抗原結合部分または相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡ配列を、ヒト抗体重鎖および軽鎖のフレームワークをコードするＤＮＡ配列中に分子手段により挿入し得る（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８）。発現された組換え産物は、「新形態」またはヒト化抗体と呼ばれ、そしてヒト抗体軽鎖または重鎖およびマウスモノクローナル抗体の抗原認識部分であるＣＤＲのフレームワークを含む。
ヒト化抗体を生成する別の方法が、米国特許第５，６３９，６４１号に記載され、本明細書中に参考として援用される。この方法は、再表面化（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）により、可変領域においてヒト表面の提示に起因する改良された治療効力を有するヒト化げっ歯類抗体を提供する。この方法では：（１）抗体重鎖および軽鎖可変領域のプールの位置アラインメントを生成し、重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面曝露位置のセットを与える。ここで、すべての可変領域に対するアラインメント位置は、少なくとも約９８％同一である；（２）重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面曝露アミノ酸残基のセットがげっ歯類抗体（またはそのフラグメント）に対して規定される；（３）このげっ歯類表面曝露アミノ酸残基のセットに最も近接して同一である、重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面曝露アミノ酸残基のセットが同定される；（４）工程（２）で規定された重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面曝露アミノ酸残基のセットが、げっ歯類抗体の相補性決定領域の任意の残基の任意の原子の５Å内にあるようなアミノ酸残基を除いて、工程（３）で同定された重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面曝露アミノ酸残基のセットで置換される；および（５）結合特異性を有するヒト化げっ歯類抗体が産生される。
ヒト化抗体の産生についての類似の方法は、米国特許第５，６９３，７６２号；同第５，６９３，７６１号；同第５，５８５，０８９号；および同第５，５３０，１０１号（各々が本明細書中で参考として援用される）に記載される。これらの方法は、１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびドナー免疫グロブリンに由来するさらなるアミノ酸ならびに受け入れているヒト化免疫グロブリンに由来するフレームワーク領域を有するヒト化免疫グロブリンを産生することを包含する。各々のヒト化免疫グロブリン鎖は、通常、ＣＤＲに加えて、ドナー免疫グロブリン中のＣＤＲに直接隣接する１以上のアミノ酸または分子モデリングにより推定される約３Å以内の１以上のアミノ酸のような、ＣＤＲと相互作用して結合親和性をもたらし得るドナー免疫グロブリンフレームワークに由来するアミノ酸を含む。重鎖および軽鎖は、米国特許第５，６９３，７６２号；同第５，６９３，７６１号；同第５，５８５，０８９号；および同第５，５３０，１０１号（各々が本明細書中で参考として援用される）に記載される種々の位置基準の、いずれか１つ、任意の組合せ、または全てを使用することによって、各々設計され得る。インタクトな抗体に組み合わされる場合、ヒト化免疫グロブリンは、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、そして本来の抗原に対するドナー免疫グロブリンと実質的に同じ親和性を保持する。
ヒト化抗体を産生するためのさらなる方法は、米国特許第５，５６５，３３２号および同第５，７３３，７４３号（各々が本明細書中で参考として援用される）に記載される。この方法は、抗体をヒト化する概念を、本明細書中にもまた詳細に記載されるファージミドライブラリーと組み合わせる。一般的な意味では、この方法は、目的の抗原に対する抗体または抗体の集団の抗原結合部位に由来する配列を利用する。従って、単一のげっ歯類抗体について、抗体の抗原結合部位の部分を含む配列は、組み合せて完全な抗原結合部位を作製し得るヒト抗体の配列の多様なレパートリーと組み合せられ得る。
このプロセスにより作製される抗原結合部位は、本来のげっ歯類抗体の配列の部分のみが同様の様式にて抗原と接触するようであるという点で、ＣＤＲグラフティング（ｇｒａｆｔｉｎｇ）により作製される抗原結合部位とは異なる。選択されたヒト配列は、配列において異なるようであり、そして本来の結合部位のそれらからの抗原と代替的に接触する。しかし、抗原に対する本来の配列の部分の結合ならびに抗原およびその抗原結合部位の形状により課される制約は、抗原の同じ領域またはエピトープに対するヒト配列の新たな接触を駆動するようである。従って、このプロセスは、「エピトープインプリント選択」（ＥＩＳ）と呼ばれている。
動物の抗体で開始して、１つのプロセスは、部分的にヒト抗体である抗体の選択を生じる。このような抗体は、治療において直接的にまたは少数の重要な残基の変更の後に使用されるべきヒト抗体と配列において十分に類似し得る。ヒト配列を有する選択された抗体のげっ歯類成分の間の配列の差異は、例えば、個々の残基の部位特異的変異誘発によってか、またはループ全体のＣＤＲグラフティングによって、ヒト配列の残基で異なる残基を置換することによって最小化され得る。しかし、完全なヒト配列を有する抗体もまた、作製され得る。従って、ＥＩＳは、それぞれ、動物または部分的なヒト抗体と同じエピトープに結合する部分的なヒト抗体またはそれぞれ、動物または部分的なヒト抗体と同じエピトープに結合する完全なヒト抗体を作成するための方法を提供する。ＥＩＳにおいて、抗体フラグメントのレパートリーは、糸状ファージの表面上に提示され得、そして抗原結合活性を有するフラグメントをコードする遺伝子は、抗原へのファージの結合によって選択され得る。
本発明の使用に意図される抗体をヒト化するためのさらなる方法は、米国特許第５，７５０，０７８号；同第５，５０２，１６７号；同第５，７０５，１５４号；同第５，７７０，４０３号；同第５，６９８，４１７号；同第５，６９３，４９３号；同第５，５５８，８６４号；同第４，９３５，４９６号；および同第４，８１６，５６７号（各々は、本明細書中で参考として援用される）に記載される。ＷＯ９８／４５３３１およびＷＯ９８／４５３３２は、特に有益であり、かつ抗ＶＥＧＦ抗体に適用される場合のヒト化の原理をさらに例示するために、本明細書中で参考として援用される。
（Ｂ１０．ＰＣＲTMによる変異誘発）
部位特異的変異誘発は、基礎となるＤＮＡの特異的な変異誘発を通して、個々の抗体の調製において有用な技術である。この技術はさらに、ヒト化しようとしなかろうと、ＤＮＡ内に１以上のヌクレオチド配列の変化を導入することによって、１以上の前述の考慮を援用して、配列改変体を調製および試験するすばやい能力を提供する。
多くの方法が、変異誘発における使用について適切であるが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲTM）の使用は、一般的に現在好ましい。この技術は、所定のＤＮＡ配列中に所望の変異を導入するための迅速かつ効率的な方法を提供する。以下のテキストは、所定の配列によってコードされるアミノ酸を変えるために使用され得るような、配列中に点変異を導入するＰＣＲTMの使用を特に記載する。この方法の適応もまた、ＤＮＡ分子中に制限酵素部位を導入するために適切である。
この方法において、合成オリゴヌクレオチドは、増幅したセグメントの一方の端に点変異を組み込むために設計される。ＰＣＲTMの後に、増幅したフラグメントは、クレノーフラグメントで処理することによって、平滑末端にされ、次いで、この平滑末端フラグメントは、配列分析を容易にするためにベクター中に連結され、そしてサブクローニングされる。
変異誘発することを所望するテンプレートのＤＮＡを調製するために、このＤＮＡは、高コピー数のベクター（例えば、ｐＵＣ１９）中に、変異される領域に隣接する制限部位を使用して、サブクローニングされる。次いで、テンプレートのＤＮＡは、プラスミドのミニプレップを使用して調製される。親配列に基づくが、所望の点変異を含みかつ制限酵素部位によってその５’末端に隣接される、適切なオリゴヌクレオチドプライマーが、自動化合成機を使用して合成される。約１５塩基程度のテンプレートＤＮＡに相同なプライマーが、一般に必要とされる。プライマーは、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製され得るが、これは、ＰＣＲTMの使用について絶対に必要ではない。次いで、このオリゴヌクレオチドの５’末端は、リン酸化されるべきである。
このテンプレートＤＮＡは、所望の点変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲTMによって増幅されるべきである。増幅緩衝液中のＭｇＣｌ2の濃度は、一般に約１５ｍＭである。一般に、約２０〜２５サイクルのＰＣＲTMが、以下の通りに実行されるべきである：９５℃にて３５秒の変性；５０℃にて２分のハイブリダイゼーション；および７２℃にて２分の伸長。ＰＣＲTMは、一般に、７２℃での約１０分間の最後のサイクルの伸長を含む。最後の伸長工程の後に、約５ユニットのクレノーフラグメントが、反応混合物に添加され、約３０℃にてさらに１５分間インキュベートされるべきである。クレノーフラグメントのエキソヌクレアーゼ活性は、末端を平らにし、そして平滑末端クローニングに適切にするために必要とされる。
得られた反応混合物は、一般に、この増幅が推定される産物を生じたことを確認するために、非変性アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動によって分析されるべきである。次いで、大部分のミネラルオイルを除去し、クロロホルムで抽出して残っているオイルを除去し、緩衝化フェノールで抽出し、次いで１００％エタノールを用いる沈澱により濃縮することによって、反応混合物を処理する。次に、このオリゴヌクレオチドに使用された隣接配列で切断する制限酵素を用いて増幅したフラグメントのおよそ半分を消化するべきである。この消化したフラグメントは、低ゲル化／融点アガロースゲル上にて精製される。
このフラグメントをサブクローニングするため、そして点変異を調べるために、平滑末端のライゲーションによって、適切に消化されたベクター中に２つの増幅したフラグメントをサブクローニングする。これは、ミニプレップを使用して、プラスミドＤＮＡが引き続き調製され得るＥ．ｃｏｌｉを形質転換するために使用される。次いで、プラスミドＤＮＡの増幅した部分は、正確な点変異が作製されたことを確認するためにＤＮＡ配列決定によって分析される。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡフラグメント中にさらなる点変異を導入するので、これは、重要である。
点変異の導入はまた、一連のＰＣＲTM工程を使用してもたらされ得る。この手順において、この変異を含む２つのフラグメントは、互いにアニールされ、そして相互に開始する合成によって伸長される。次いで、このフラグメントは、第２のＰＣＲTM工程によって増幅され、それによって上記のプロトコルに必要とされる平滑末端のライゲーションを回避する。この方法において、テンプレートＤＮＡの調製、オリゴヌクレオチドプライマーの作製および第１のＰＣＲTM増幅は、上記のように実行される。しかし、このプロセスにおいて、選択されたオリゴヌクレオチドは、約１５〜約２０個の間の塩基のストレッチについてテンプレートＤＮＡと相同なはずであり、そしてまた約１０塩基以上だけで互いに重複しなければならない。
第２のＰＣＲTM増幅において、上記の条件を使用して、各々の増幅したフラグメントおよび各々の隣接する配列プライマーを使用して、そして約２０〜約２５の間のサイクルについてＰＣＲTMを実行する。再度、このフラグメントをサブクローニングし、そして上記に概説した工程を使用して点変異が正確であったことを調べる。
前述の方法のいずれかを使用して、可能な限り小さなフラグメントを増幅することによって、変異を導入することが、一般に好ましい。もちろん、パラメータ（例えば、ＧＣ含量およびこのオリゴの長さによって一般に影響される、オリゴヌクレオチドの融解温度）はまた、注意深く考慮されるべきである。これらの方法の実行、および必要な場合、それらの最適化は、当業者に公知であり、そして本明細書中に参考として援用される、種々の刊行物（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５）にさらに記載される。
部位特異的変異誘発を実行する場合に、表Ａは、参考として用いられ得る。
Figure 2011046720
（Ｂ１１．抗体フラグメントおよび誘導体）
本来のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体の供給源とは無関係に、インタクトな抗体、抗体マルチマー、または抗体の種々の機能的な抗原結合領域のいずれか１つは、本発明において使用され得る。例示的な機能領域は、抗ＶＥＧＦ抗体のｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2フラグメントを含む。このような構築物を調製するための技術は、当業者に周知であり、そして本明細書中にてさらに例示される。
抗体構築物の選択は、種々の因子によって影響され得る。例えば、延長した半減期は、腎臓内のインタクトな抗体の能動的な再吸収（免疫グロブリンのＦｃ片の特性）から生じ得る。従って、ＩｇＧベースの抗体は、それらのＦａｂ’対応物よりも遅い血中クリアランスを示すことが予測される。しかし、Ｆａｂ’フラグメントベースの組成物は、一般に、より良好な組織浸透能力を示す。
抗体フラグメントは、非特異的チオールプロテアーゼであるパパインによる免疫グロブリン全体のタンパク質分解によって得られ得る。パパイン消化により、２つの同一の抗原結合フラグメント（「Ｆａｂフラグメント」および残りの「Ｆｃフラグメント」と呼ばれ、Ｆａｂフラグメントは、各々が単一の抗原結合部位を有する）が得られる。
パパインはまず、活性部位中のスルフヒドリル基を、システイン、２−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトールで還元することによって活性化されなければならない。ストック酵素中の重金属は、最大の酵素活性を補償するために、ＥＤＴＡ（２ｍＭ）でのキレート化によって除去されるべきである。酵素および基質は、通常、１：１００の重量比で一緒に混合される。インキュベーションの後に、この反応は、ヨードアセトアミドを用いるチオール基の不可逆的なアルキル化によってか、または単純に透析によって停止され得る。この消化の終了は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニターされ、そして種々の画分は、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅまたはイオン交換クロマトグラフィーによって分離されるべきである。
ウサギおよびヒト起源のＩｇＧからのＦ（ａｂ’）2フラグメントの調製のための通常の手順は、酵素のペプシンによる限定されたタンパク質分解である。この条件（１００×抗体過剰ｗ／ｗ酢酸緩衝液中ｐＨ４．５、３７℃）は、抗体が重鎖内のジスルフィド結合のＣ末端側にて切断されることを示唆する。マウスＩｇＧの消化の速度は、サブクラスで変動し得、そして条件は、有意な量の完全に分解されたＩｇＧを避けるように選択されるべきである。特に、ＩｇＧ2bは、完全な分解を受けやすい。他のサブクラスは、最適な結果を生じるために異なるインキュベーション条件（これらの全ては、当該分野で公知である）を必要とする。
インタクトな抗体のペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有するＦ（ａｂ’）2フラグメントが得られ、そしてなお抗原を架橋し得る。ペプシンによるラットＩｇＧの消化は、０．１Ｍ 酢酸緩衝液、ｐＨ４．５、中での透析、次いで１％ ｗ／ｗペプシンを用いる４時間のインキュベーションを含む条件を必要とする；ＩｇＧ1およびＩｇＧ2a消化は、初めに４℃で１６時間の０．１Ｍホルメート緩衝液、ｐＨ２．８、続いて酢酸緩衝液に対して透析される場合に、改善される。ＩｇＧ2bは、０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．８中のｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ｖ８ プロテアーゼ（３％ｗ／ｗ）における３７℃で４時間のインキュベーションでより一貫した結果を生じる。
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端でのいくつかの残基の付加によって、Ｆａｂフラグメントと異なる。Ｆ（ａｂ’）2抗体フラグメントは、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として、本来生成された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングは公知である。
「Ｆｖ」フラグメントは、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、密接した共有結合（ｃｏｎ−ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）した１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとのダイマーから構成される。各可変ドメインの３つの超可変領域が、ＶH−ＶLダイマーの表面上の抗原結合部位を規定するように相互作用することは、この構成内にある。集合的に、６つの超可変領域は、抗体に抗原結合特異性を与える。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に対して特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえ、全結合部位よりも低い親和力であるが、抗原を認識しかつ結合する能力を有する。
「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶHおよびＶLドメインを含み、ここでこれらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、ＶHドメインとＶLドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含み、これはｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。
以下の特許および特許出願は、抗体の機能的な抗原結合領域（抗ＶＥＧＦ抗体のｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2フラグメントを含む）の調製および使用に関する本教示をなおさらに補足する目的のために、本明細書中に参考として具体的に援用される：米国特許第５，８５５，８６６号；同第５，９６５，１３２号；同第６，０５１，２３０号；同第６，００４，５５５号；および同第５，８７７，２８９号；ならびに米国特許出願第０８／４８２，３６９号（１９９８年１０月２０日に特許証発行料金が支払われた）。ＷＯ９８／４５３３１もまた、抗体の可変領域、超可変領域、および相補性決定領域（ＣＤＲ）（ を含む）の調製をなおさらに記載および教示することを含む目的のために、本明細書中に参考として援用される。
「ｄｉａｂｏｄｙ」は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体フラグメントであり、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶH−ＶL）において軽鎖可変ドメイン（ＶL）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶH）を含む。同じ鎖上で２つのドメインの間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることによって、これらのドメインは、別の鎖の相補ドメインと対を形成することを強いられ、そして２つの抗原結合部位を作製する。ｄｉａｂｏｄｙは、ＥＰ４０４，０９７およびＷＯ９３／１１１６１（各々、本明細書中に参考として具体的に援用される）に記載される。「線形抗体（ｌｉｎｅａｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」（これは、二特異的または一特異的であり得る）は、Ｚａｐａｔａら（１９９５）（本明細書中に参考として具体的に援用される）に記載されるように、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデム型Ｆｄセグメント（ＶH−ＣH１−ＶH−ＣH１）を含む。
抗体のＦａｂ’フラグメントまたは抗原結合フラグメントの使用において、組織貫通に対する付帯利益と共に、その半減期を増加するようにフラグメントを改変することにより、さらなる利点を引き出し得る。種々の技術（例えば、抗体分子自身の操作または改変、およびまた不活性なキャリアへの結合）が使用され得る。薬剤を標的に送達するのではなく、半減期を増加させるただ一つの目的のために、任意の結合が注意深くアプローチされるべきであり、その際にＦａｂ’および他のフラグメントは、組織を貫通するように選択される。それでもなお、非タンパク質ポリマー（例えば、ＰＥＧなど）への結合が意図される。
従って、結合ではなく改変は、抗体フラグメントをより安定にし、そして／または身体における異化作用の速度を減少させるように、抗体フラグメントの構造を改変することに基づく。このような改変の１つのメカニズムは、Ｌ−アミノ酸の代わりのＤ−アミノ酸の使用である。このような改変の導入は、得られた分子がなお所望の生物学的特性を保持していることを確実にするために、得られた分子の厳密な試験を次に必要とすることを当業者は理解する。さらなる安定化改変は、Ｎ末端もしくはＣ末端のいずれか、またはその両方への、安定化部分の付加の使用を含み、これは、一般的には生物学的分子の半減期を延ばすために使用される。例示のみの目的で、アシル化またはアミノ化によって末端を改変することを所望し得る。
本発明と共に使用するための適度な結合型改変は、サルベージレセプター結合エピトープを抗体フラグメントに組み込む工程を包含する。これを達成するための技術としては、抗体フラグメントの適切な領域の変異、または抗体フラグメントに付着するペプチドタグとしてのエピトープの組み込みが挙げられる。ＷＯ９６／３２４７８は、このような技術をさらに説明する目的のために、本明細書中に参考として具体的に援用される。サルベージレセプター結合エピトープは、代表的には、抗体フラグメントの類似の位置に移されるＦｃドメインの１つまたは２つのラップ（ｌｏｐ）由来の３つ以上のアミノ酸の領域である。ＷＯ９８／４５３３１のサルベージレセプター結合エピトープは、本発明と共に使用するために、本明細書中に参考として援用される。
（Ｂ１２．結合アッセイおよび機能アッセイ）
本発明は、動物およびヒト処置レジメンにおいて有意な用途を有するが、多くの他の実用的用途（多くのインビトロ用途を含む）もまた有する。特定のこれらの用途は、抗体または免疫複合体の特異的結合特性に関する。本発明のそれらのすべての化合物には、少なくとも１つの抗体要素が含まれ、これらは最初の抗体が使用され得る実質的にすべての結合実施形態において使用され得る。
付着薬剤の存在は、関連する場合、有利な特性を提供するが、任意の結合アッセイにおける第１の抗体領域の利用を否定しない。従って、適切に有用な結合アッセイとしては、本明細書中にさらに記載されるような、当該分野において通常使用される結合アッセイ（例えば、イムノブロット、ウエスタンブロット、ドットブロット、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、免疫組織学、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）、免疫沈降、アフィニティークロマトグラフィーなど）が挙げられる。
特定の標準的な結合アッセイは、抗原が固体支持体マトリックス（例えば、ニトロセルロース、ナイロンまたはそれらの組み合わせ）に固定されている（例えば、イムノブロット、ウエスタンブロットおよび関連するアッセイにおけるような）アッセイである。他の重要なアッセイは、ＥＬＩＳＡである。すべてのこのようなアッセイは、血管形成疾患の診断において適用され得るように、ＶＥＧＦの検出における使用のために容易に適用され得る。本発明の薬剤はまた、免疫組織化学において；蛍光標示式細胞分取、フローサイトメトリーまたはフロー微蛍光測定において；免疫沈降において；抗原精製実施形態（例えば、アフィニティークロマトグラフィー（二特異的抗体の場合をも含む）、１以上の抗原の同時の１工程急速精製）；ならびに本明細書中で示される情報を与えられた当業者に公知の多くの他の結合アッセイにおいて、新しく冷凍したパラフィン包埋組織ブロックおよびホルマリン固定したパラフィン包埋組織ブロックの両方と共に使用され得る。
本抗体のさらなる実用的用途は、機能的アッセイにおけるコントロールとしてである。これらは、多くのインビトロおよびエキソビボアッセイおよび系ならびに動物モデル研究を含む。本発明の抗体の結合特性および機能的特性が特に特異的である場合（すなわち、これらがＶＥＧＦの（ＶＥＧＦＲ１ではなく）ＶＥＧＦＲ２への結合およびＶＥＧＦＲ２を介したシグナル伝達を阻害する）、このような「コントロール」用途は、実際に非常に有用である。本発明のこのような実用的適用から利益を得るアッセイとしては、例えば、ＶＥＧＦ媒介内皮細胞増殖、ＶＥＧＦ誘導リン酸化およびＶＥＧＦ誘導血管浸透性に関連するアッセイ、ならびに新生血管形成の角膜マイクロポケットアッセイおよびニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイが挙げられる。これらのアッセイ系はまた、インビトロまたはエキソビボ薬物スクリーニングアッセイに発展し、ここで十分に規定された特性を有する生物学的材料の本提供は、特に重要である。
（Ｃ．免疫結合体）
本発明は、抗血管形成方法における使用のための非常に効果的な裸の抗体または結合体化されていない抗体を提供するが、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体のまたは２Ｃ３に基づく免疫結合体、イムノトキシンおよびコアグリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄ）もまた本明細書によって提供される。ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体のまたは２Ｃ３に基づく治療的結合体における使用のための現在好ましい薬剤は、放射線療法剤（本明細書中に開示される放射線診断によって例示されるような）、抗脈管形成剤、アポトーシス誘導剤、抗チューブリン剤、抗細胞性剤または細胞傷害性薬剤および凝血剤（凝固因子）である。
免疫結合体、イムノトキシンおよびコアグリガンドを生成するために、当業者に公知であり、かつ本明細書中でさらに開示されるように、組換え発現を使用して融合タンパク質を作製し得る。同様に、免疫結合体、イムノトキシンおよびコアグリガンドは、アビジン：ビオチン架橋または任意の化学的結合および抗体結合体に関して開発された架橋技術を用いて生成され得る。
（Ｃ１．毒素および抗細胞性薬剤）
特定の適用のために、治療剤は、内皮細胞の増殖または細胞分裂を消失または抑制する能力を有する、細胞傷害性薬剤または薬理学的薬剤、特に細胞傷害性薬剤、細胞増殖抑制剤か、そうでなければ抗細胞性薬剤である。一般に、本発明のこれらの局面は、ＶＥＧＦＲ２を遮断、抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３様抗体に結合されて、そして活性な形態で標的化される内皮に送達され得る任意の薬理学的薬剤の使用を意図する。
例示的な抗細胞性薬剤には、化学療法剤および細胞毒が挙げられる。使用され得る化学療法剤には以下が挙げられる：ホルモン（例えば、ステロイド）；代謝拮抗薬（例えば、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキセートまたはアミノプテリン）；アントラサイクリン；マイトマイシンＣ；ビンカアルカロイド類；デメコルチン；エトポシド：ミトラマイシン：抗腫瘍アルキル化剤（例えば、クロラムブシルまたはメルファラン）。他の実施形態は、サイトカインのような薬剤を含み得る。基本的には、標的化された内皮細胞の部位での血液成分への標的化、インターナリゼーション、放出および／または提示を可能にする様式で、抗体に首尾良く結合され得るか、またはそれと会合され得る限り、任意の抗細胞性薬剤が使用され得る。
例えば、標的抗原が、毒性化合物による効率的な中毒と一致する経路によってインターナライズしない場合、化学療法剤（例えば、抗腫瘍薬物、サイトカイン、代謝拮抗薬、アルキル化剤、ホルモンなど）を標的化することが望まれる場合のような状況が存在し得る。種々の化学療法剤および他の薬理学的薬剤（ドキソルビシン、ダウノマイシン、メトトレキセート、ビンブラスチン、ネオカルチノスタチン、マクロマイシン、トレニモン（ｔｒｅｎｉｍｏｎ）およびα−アマニチンを含む）は、現在では、抗体に首尾良く結合され、そして薬理学的に機能することが示されている。
他の状況において、細胞毒に基づく治療由来の任意の潜在的な副作用が、ＤＮＡ合成インヒビター（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アドリアマイシンなど）の使用によって除去され得る。従って、これらの薬剤は、本発明における使用のための抗細胞性薬剤の好ましい例である。
細胞増殖抑制剤に関して、そのような化合物は、一般に、標的細胞の天然の細胞周期を、好ましくはその細胞が細胞周期からはずされるように妨害する。
ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体に結合され得る、広範な種々の細胞傷害性薬剤が公知である。例には、いくつか例を挙げると、例として以下が挙げられる多くの有用な植物由来毒素、真菌由来毒素または細菌由来毒素が挙げられる：種々のＡ鎖毒素、特にリシンＡ鎖；リボソーム不活化タンパク質（例えば、サポリンまたはゲロニン）；α−サルシン；アスペルギリン；レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）；リボヌクレアーゼ（例えば、胎盤リボヌクレアーゼ）；ジフテリア毒素；およびｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素。
毒素のうち、リシンＡ鎖が好ましい。本発明に関する使用のための最も好ましい毒素部分は、炭水化物残基を改変または除去するように処理された毒素Ａ鎖、いわゆる脱グリコシル化Ａ鎖（ｄｇＡ）である。脱グリコシル化リシンＡ鎖は、その極度の有効性、より長い寿命のため、そして臨床等級および規模での製造に経済的に適切であるために好ましい。
最も小さな分子であるが、にもかかわらず適切な生物学的応答を提供することが可能な分子を使用することは、薬理学的見地から望ましくあり得る。例えば、十分な抗細胞応答を提供するより小さなＡ鎖ペプチドを使用することが望まれ得る。この目的のために、リシンＡ鎖は、Ｎａｇａｒａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）による３０のＮ末端アミノ酸の除去によって「切り詰め」され得、そしてなお十分な毒素活性を保持し得ることが発見されている。所望される場合、この切り詰めされたＡ鎖は、本発明に従って結合体において使用され得ることが提案される。
あるいは、毒素Ａ鎖部分への組換えＤＮＡ技術の適用は、本発明によるさらなる利益を提供することが理解され得る。生物学的に活性なリシンＡ鎖のクローニングおよび発現が達成されているという点で、現在では、より小さいまたは他の様式の改変体ペプチドであるが、にもかかわらず適切な毒素活性を示す改変体ペプチドを同定および調製することが可能である。さらに、現在では、リシンＡ鎖がクローニングされているという事実によって、部位特異的変異誘発の適用が可能であり、それを通じて、Ａ鎖由来ペプチドが容易に調製およびスクリーニングされ得、そして本発明と組み合わせての使用のためのさらなる有用な部分が得られる。
（Ｃ２．凝固因子）
本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体は、凝固を直接的または間接的に刺激し得る成分に連結され、コアグリガンドを形成し得る。ここで、この抗体は、凝血薬または凝固因子に直接的に連結され得るか、または凝血薬もしくは凝固因子を結合し、次いでそれらを放出する第２の結合領域に連結され得る。本明細書中で使用される用語「凝血薬」および「凝固因子」を各々使用して、適切な条件下、好ましくは特定のインビボ環境（例えば、腫瘍血管構造）に提供される場合に、凝固を直接的または間接的に刺激し得る成分をいう。
好ましい凝固因子は、組織因子組成物（例えば、切り詰めされたＴＦ（ｔＴＦ）、ダイマーＴＦ分子、マルチマーＴＦ分子および変異体ＴＦ分子）である。「切り詰めされたＴＦ（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ＴＦ）」（ｔＴＦ）は、膜結合欠損に、この特性における変化をもたらすために十分なアミノ酸配列を除去することによってされているＴＦ構造をいう。この状況において「十分な量」とは、ＴＦ分子を膜中に進入させるか、またはＴＦタンパク質の機能的な膜結合を他の様式で媒介するに元々十分な、膜貫通アミノ酸配列の量である。従って、このような「十分な量の膜貫通配列」の除去は、リン脂質膜結合能を欠損した切り詰めされた組織因子タンパク質またはポリペプチドを生じ、その結果、このタンパク質は、実質的に、リン脂質膜に有意に結合しない可溶性タンパク質である。従って、切り詰めされたＴＦは、実質的に、標準的なＴＦアッセイにおいて第ＶＩＩ因子を第ＶＩＩａ因子に変換し得ず、そしてなお第ＶＩＩａ因子の存在下で第Ｘ因子を活性化することを含む、いわゆる触媒活性を保持する。
米国特許第５，５０４，０６７号は、そのような切り詰めされた組織因子タンパク質をさらに記載する目的のために、特に本明細書中において参考として援用される。好ましくは、本発明のこれらの局面における使用のための組織因子は、一般に、タンパク質の膜貫通領域および細胞質領域（アミノ酸２２０〜２６３）を欠く。しかし、切り詰めされたＴＦ分子が、２１９アミノ酸という正確な長さの分子に限定される必要はない。
組織因子組成物はまた、ダイマーとして有用であり得る。任意の切り詰めされた組織因子構築物、変異された組織因子構築物、または他の組織因子構築物は、本発明における使用のためにダイマー形態で調製され得る。当業者に公知のように、このようなＴＦダイマーは、分子生物学および組換え発現の標準的な技術を使用することによって調製され得る。ここで２つのコード領域は、インフレームに調製され、そして発現ベクターから発現される。同様に、種々の化学結合技術が、ＴＦダイマーの調製と組み合わせて使用され得る。個々のＴＦモノマーは、結合の前に誘導体化され得る。すべてのこのような技術は、当業者に容易に公知である。
所望される場合、組織因子ダイマーまたはマルチマーは、生物学的に放出可能な（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ−ｒｅｌｅａｓａｂｌｅ）結合（例えば、選択的に切断可能なリンカーまたはアミノ酸配列）を介して結合され得る。例えば、腫瘍環境内で優先的に配置されるか、または活性である酵素についての切断部位を含むペプチドリンカーが意図される。そのようなペプチドリンカーの例示的な形態は、ウロキナーゼ、プラスミン、トロンビン、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子またはメタロプロテイナーゼ（例えば、コラーゲナーゼ、ゲラチナーゼまたはストロメライシン）によって切断されるペプチドリンカーである。
特定の実施形態において、組織因子ダイマーはさらに、後にリン脂質膜と組織因子の機能的会合を（特定の所定の条件下のみであるが）強化するために、妨げられた疎水性膜挿入部分を含み得る。切り詰めされた組織因子の状況において記載される場合、疎水性膜会合配列は、一般に、それらの疎水性の性質に起因して、リン脂質環境との会合を促進するアミノ酸のストレッチである。同様に、脂肪酸は、潜在的な膜挿入部分を提供するために使用され得る。
このような膜挿入配列は、それらの付着がＴＦ構築物の機能的特性を妨げない限り、ＴＦ分子のＮ末端もしくはＣ末端のいずれかに位置され得るか、または一般に膜の任意の他の点に付加され得る。妨げられた挿入部分の意義は、ＴＦ構築物が腫瘍環境に位置するまで、それは非機能性を保持し、そして疎水性付加が、接近可能になり、そしてなおさらに膜との物理的会合を促進するのを可能にすることである。再度、生物学的に放出可能な結合および選択的に切断可能な配列が、この点において特に有用であり、結合または配列のみが、腫瘍環境内の局在化および特定の酵素または他の生物活性分子への曝露の際に切断または他の様式で改変されることが意図される。
他の実施形態において、ｔＴＦ構築物は、マルチマーまたはポリマーであり得る。この状況において、「ポリマー構築物」は、３以上の組織因子構築物を含む。「マルチマーＴＦ構築物またはポリマーＴＦ構築物」は、少なくとも第２および第３のＴＦ分子または誘導体に作動可能に結合された第１のＴＦ分子または誘導体を含む構築物である。マルチマーは、約３〜約２０のこのようなＴＦ分子を含み得る。マルチマーまたはポリマー内の個々のＴＦ単位はまた、所望される場合、選択的に切断可能なペプチドリンカーまたは他の生物学的に放出可能な結合によって連結され得る。再度、上記に議論されたＴＦダイマーに関して、構築物は、組換え操作および発現を用いるか、または標準的な合成化学を用いるかのいずれかで容易に作製され得る。
本発明の状況において有用ななおさらなるＴＦ構築物は、第ＶＩＩ因子を活性化する能力が欠損している変異体である。そのような「第ＶＩＩ因子活性化変異体」は、一般に、機能的な第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子を結合し、第Ｘ因子をタンパク質分解性に活性化するが、第ＶＩＩ因子をタンパク質分解性に活性化する能力が実質的に存在しないＴＦ変異体として本明細書中において定義されている。従って、そのような構築物は、第ＶＩＩ因子活性化活性を欠くＴＦ変異体である。
そのような第ＶＩＩ因子活性化変異体が、腫瘍特異的凝固を促進する際に機能する能力は、腫瘍血管構造へのそれらの特異的送達、および血漿中における低いレベルでの第ＶＩＩａ因子の存在に基づく。そのような第ＶＩＩ因子活性化変異体標的化剤結合体の投与の際に、変異体は、血管新生化腫瘍の血管構造内に局在化される。局在化の前に、ＴＦ変異体は、一般に、第ＶＩＩ因子を第ＶＩＩａ因子に変換し得ないことに基づいて、任意の他の身体部位における凝固を促進し得ない。しかし、次いで、腫瘍領域内の局在化および蓄積の際に、変異体は、外因性の凝固経路を開始するために血漿から十分な第ＶＩＩａ因子と出会い、腫瘍特異的血栓症を導く。外因性の第ＶＩＩａ因子もまた患者に投与され得る。
種々の第ＶＩＩ因子活性化変異体のうちの任意の１つ以上が調製され、本発明と組み合わせて使用され得る。第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子についてのＴＦ分子上の認識部位に関して、有意な量の科学知識が存在する。従って、第ＶＩＩ活性化領域が、一般にＴＦ分子のおよそアミノ酸１５７〜およそアミノ酸１６７の間に位置することが理解される。しかし、この領域の外側の残基もまた、第ＶＩＩ活性化活性に関連することが判明し得、従ってＴＦ配列のおよそアミノ酸１０６〜およそアミノ酸２０９に一般に位置する残基の任意の１つ以上に変異を導入することが考慮され得る（ＷＯ９４／０７５１５；ＷＯ９４／２８０１７；各々、本明細書中において参考として援用される）。
種々の他の凝固因子は、以下に示される薬剤によって例示されるように、本発明と組み合わせて使用され得る。トロンビン、第Ｖ／Ｖａ因子および誘導体、第ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子および誘導体、第ＩＸ／ＩＸａ因子および誘導体、第Ｘ／Ｘａ因子および誘導体、第ＸＩ／ＸＩａ因子および誘導体、第ＸＩＩ／ＸＩＩａ因子および誘導体、第ＸＩＩＩ／ＸＩＩＩａ因子および誘導体、第Ｘ因子アクチベーターおよび第Ｖ因子アクチベーターが、本発明において使用され得る。
ラッセルクサリヘビ蛇毒第Ｘ因子アクチベーターは、本発明における使用について意図される。ラッセルクサリヘビ蛇毒中に存在する第Ｘ因子アクチベーターについて特異的なモノクローナル抗体もまた産生されており、そして二重特異性結合リガンドの部分として因子を特異的に送達するために使用され得る。
トロンボキサンＡ2は、血小板ミクロソーム中の酵素シクロオキシゲナーゼおよび酵素トロンボキサンシンテターゼの連続的作用によって、エンドペルオキシドから形成される。トロンボキサンＡ2は血小板によって容易に産生され、そして血小板凝集を生成するその能力が理由で強力な血管収縮薬である。トロンボキサンＡ2およびその活性なアナログは、本発明の用途のために意図される。
トロンボキサンシンターゼ、および血小板活性化プロスタグランジンを合成する他の酵素もまた、本発明の状況において「凝固薬」として使用され得る。トロンボキサンシンターゼに対するモノクローナル抗体、およびトロンボキサンシンターゼのイムノアフィニティ精製は公知であり；ヒトトロンボキサンシンターゼについてのｃＤＮＡも同様である。
α２−抗プラスミン、すなわち、α２−プラスミンインヒビターは、プラスミノーゲンアクチベーターによって誘導されるフィブリン血餅の溶解を効率的に阻害するように機能する、ヒト血漿において天然に存在するプロテイナーゼインヒビターである。α２−抗プラスミンは、特に強力なインヒビターであり、そして本発明の用途のために意図される。
α２−抗プラスミンについてのｃＤＮＡ配列が利用可能である場合、組換え発現および／または融合タンパク質が好ましい。α２−抗プラスミンに対するモノクローナル抗体もまた利用可能であり、これは本発明の二重特異性結合リガンドの実施形態において使用され得る。これらの抗体は、標的部位に外因性α２−抗プラスミンを送達するために使用されるか、または内因性α２−抗プラスミンを収集し、そして標的領域内でそれを濃縮するために使用され得る。
（Ｃ３．抗チューブリン薬）
一連の薬物は、チューブリン活性との干渉を介してその効果を行使する。チューブリンの機能は、有糸分裂および細胞の生存能力に不可欠であるので、特定の「抗チューブリン薬」は、強力な化学療法剤である。いくつかの周知であってかつ本発明とともに使用するための現在好ましい抗チューブリン薬は、コルヒチン；タキサン（例えば、タキソール）；ビンカアルカロイド類（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビンデスチン）；およびコンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）である。他の適切な抗チューブリン薬は、サイトカラシン類（Ｂ、Ｊ、Ｅを含む）、ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）、オーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）ＰＥ、パクリタキセル、ウスチロキシン（ｕｓｔｉｌｏｘｉｎ）Ｄ、リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）、１０６９Ｃ８５、コルセミド（ｃｏｌｃｅｍｉｄ）、アルベンダゾール、アザトキシン（ａｚａｔｏｘｉｎ）およびノコダゾールである。
米国特許第５，８９２，０６９号、同第５，５０４，０７４号、および同第５，６６１，１４３号（各々本明細書中に詳細に参考として援用される）に記載されるように、コンブレタスタチン類は、一般に細胞有糸分裂を阻害するエストラジオール誘導体である。本発明と組合せて使用され得る例示的なコンブレタスタチンとしては、コンブレタスタチンＡ、Ｂおよび／またはＤを基本とするコンブレタスタチンならびに米国特許第５，８９２，０６９号、同第５，５０４，０７４号、および同第５，６６１，１４３号に記載されるコンブレタスタチンが挙げられる。コンブレタスタチンＡ−１、Ａ−２、Ａ−３、Ａ−４、Ａ−５、Ａ−６、Ｂ−１、Ｂ−２、Ｂ−３およびＢ−４は、上記の型の例である。
米国特許第５，５６９，７８６号および同第５，４０９，９５３号は、コンブレタスタチンＡ−１、Ａ２、Ａ−３、Ｂ−１、Ｂ−２、Ｂ−３およびＢ−４の各々の単離、構造的特徴付けおよび合成、ならびにこのようなコンブレタスタチンを使用して新生物性増殖を処置するための処方物および方法を記載する目的のために、本明細書中に参考として援用される。任意の１つ以上のこのようなコンブレタスタチンは、本発明と組合せて使用され得る。
米国特許第５，８９２，０６９号、同第５，５０４，０７４号、同第５，６６１，１４３号および同第４，９９６，２３７号（各々詳細に本明細書中で参考として援用される）に記載されるように、コンブレタスタチンＡ−４はまた、本発明と共に使用され得る。米国特許第５，５６１，１１２号は、適切なコンブレタスタチンＡ−４プロドラッグ（これらは、本発明とともに組合せて使用することが意図される）を適切に記載するために、本明細書中に参考として援用される。
米国特許第４，９４０，７２６号（本明細書中に参考として詳細に援用される）は、コンブレタスタチンＤ−１および「コンブレタスタチンＤ−２」と称される大環状ラクトンを詳細に記載し、これらは、本発明の組成物および方法と組み合わせて使用され得る。米国特許第５，４３０，０６２号（本明細書中に参考として詳細に援用される）は、抗癌活性を有するスチルベン誘導体およびコンブレタスタチンアナログに関し、これらは本発明と組合せて使用され得る。
（Ｃ４．抗脈管形成剤）
本発明は、組合せた抗脈管形成を特に提供する。アンギオポエチンは、ＶＥＧＦファミリーのメンバーと同様に、血管内皮に特異的な増殖因子である（ＤａｖｉｓおよびＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ、１９９９：Ｈｏｌａｓｈら、１９９９；本明細書中で参考として援用される）。最初に記載されたアンギオポエチンは、天然に存在するレセプター賦活体またはアゴニストであるアンギオポエチン−１（Ａｎｇ−１；配列番号１および配列番号２）、および天然に存在するレセプターアンタゴニストであるアンギオポエチン−２（Ａｎｇ−２）であった。この両方は、内皮細胞チロシンキナーゼレセプターＴｉｅ２によって作用する。
２つの新しいアンギオポエチンである、アンギオポエチン−３（マウス）およびアンギオポエチン−４（ヒト）もまた同定された（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、１９９９）。アンギオポエチン−３は、（Ａｎｇ−２のような）アンタゴニストとして作用するようであるが、アンギオポエチン−４は、（Ａｎｇ−１のような）アゴニストとして機能するようである（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、１９９９）。アンギオポエチン−３と呼ばれるタンパク質はまた、ヒト心臓からクローニングされ、そして内皮細胞に対してマイトジェン効果を有さないと報告された（Ｋｉｍら、１９９９）。
ＶＥＧＦは、血管発達の早期の段階のために必要であるが、アンギオポエチン−１は、一般に、血管新生のより後期の段階に必要とされる。従って、ＶＥＧＦは、内皮細胞分化、増殖および初期の血管形成を促進するように作用する。アンギオポエチン−１は、Ｔｉｅ２レセプターを介して、成熟管の維持および安定化を促進するように作用する。従って、アンギオポエチン−１は、成熟因子または安定化因子であり、これは、内皮細胞と周囲の支持細胞との間の相互作用を促進することにより未成熟の血管を成熟した血管に変換する（Ｈｏｌａｓｈら、１９９９）。
アンギオポエチン−１は、虚血性組織において血管再生を増強すること（Ｓｈｙｕら、１９９８）、およびＶＥＧＦまたはａＦＧＦの形態のいずれかに曝露された血管網の生存を増加すること（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓら、１９９９）が示されている。これらの著者らはまた、アンギオポエチン−１が、同じ形態のａＦＧＦの撤退によって誘発されるＨＵＶＥＣにおけるアポトーシス死を妨げることを示した（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓら、１９９９）。そのようなデータは、ヒト内皮細胞に対するアンギオポエチン−１の直接的な役割、および分化した内皮細胞の生存を促進することによって血管構造を安定化する他の血管形成分子との相互作用と一致する。
アンギオポエチン−１は、成熟シグナルおよび安定性シグナルを伝達するので、本発明者らは、標的アンギオポエチン−１の送達に関する本発明の局面について注意深く考えた。本発明者らは、アンギオポエチン−１は、成熟因子であるので、腫瘍血管を増殖因子非依存性にすると推論した。従って、発明の１つの局面は、標的管のＶＥＧＦ非応答性特性を固めるための腫瘍標的化アンギオポエチン−１の使用に関する。
腫瘍結合リガンドを使用して、アンギオポエチン−１分子を腫瘍血管に送達することは、５００，０００のオーダーのアンギオポエチン−１分子を管腔に容易に送達すると推論される。これは、Ｔｉｅ２レセプター系を圧倒し、全体としてＴｉｅ２レセプターをアンギオポエチン−１リガンドで飽和させる。従って、アンギオポエチン−２は、結合し得ないので、アンギオポエチン−２およびＶＥＧＦの組合せた効果（以下の考察を参照のこと）は、阻害される。
アンギオポエチン−１の腫瘍ヘの送達、好ましくは腫瘍脈管構造への送達をまた種々の他の抗癌ストラテジーと共に使用して、本明細書中に詳細に記載されるように、組合された治療的効果を達成する。少なくともいくらかの壊死を誘発する治療に対する腫瘍の代表的な応答は、脈管再生を開始することである。アンギオポエチン−１のシグナルは、血管を成熟に向かわせるので、これらを再構築することはできず、そして初期の治療剤により誘発される腫瘍塊の損失を補うことができない。したがってこれらの観測は、アンギオポエチン送達の発明（すなわち、従来の化学療法薬を含む任意の１つ以上の抗癌剤との組み合わせたアンギオポエチン−１標的化の組合された使用）の別の好ましい局面を提供する。
送達に対するアンギオポエチン−１の作用は、基本的に脈管再成形機能（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）を予防することである。これが単独で使用されても、治療剤と組合せて使用されても、アンギオポエチン−１標的化の価値は、この治療的アプローチにおける固有の安全性により特に増強される。アンギオポエチン−１治療に対する有意な欠点は存在しない。ある量の標的化Ａｎｇ−１が非腫瘍組織に誤まって与えられるという起こりそうもない事象においてさえ、その結果起こる全てのことは、標的領域における脈管構造が、より安定になり、かつ／または休止状態になることである。これに関して、Ａｎｇ−１はまた、抗炎症剤として使用され得る。
アンギオポエチン−２は、腫瘍標的治療における使用、特に本発明のＶＥＧＦ阻害と組合せた使用のために、現在では好ましい薬剤である。しかし、異なる条件下、特に変化するＶＥＧＦレベルで、アンギオポエチン２の特異な効果に起因して、本発明者らは、標的化アンギオポエチン−２送達に関する本発明の局面を注意深く再考した。
アンギオポエチン−２はまた、Ｔｉｅ２レセプターのリガンドであるが、一般的にはアンギオポエチン−１により媒介される血管成熟／安定化を中和する。従ってこれはアンギオポエチン−１のアンタゴニストであり、毛細構造を乱すように作用する。適切な条件下では、アンギオポエチン−２は、ネガティブシグナルを標的細胞に伝達し、そしてアンギオポエチン−２により誘発された不安定化は、脈管の後退をもたらす。このことは、腫瘍、好ましくは腫瘍脈管構造へのアンギオポエチン−２の標的化送達において開拓されるアンギオポエチン−２の第１の特徴である。 単に送達する充分なアンギオポエチン−２（これは、２Ｃ３のようなＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体を使用して容易に達成可能である）は、腫瘍環境において存在し得る任意の他のシグナルを圧倒し、そして脈管後退を促進する。天然の環境においてアンギオポエチン間に注意深く制御された相互作用が存在するので、後退に有利な系の異常な偏りは、絶え間ないアンギオポエチン−２シグナル伝達により、アンギオポエチン−１およびＶＥＧＦの両方の効果を消去し得る。
従って、腫瘍標的化アンギオポエチン−２の単独使用は、特に治療的介入の初期の機構として、腫瘍血管後退を誘発するために有利になるように用いられ得る。けれども一般的には、アンギオポエチン−２により誘発される不安定化が、脈管後退または再生のいずれかをもたらし得る。他の脈管形成刺激の非存在下、特にＶＥＧＦの非存在下では、脈管後退に至るのは不安定化であるが；一方、高レベルのＶＥＧＦの存在下での不安定化は、脈管形成応答を促進する（Ｈｏｌａｓｈら、１９９９）。
アンギオポエチン−２に応答して不安定化を受ける脈管は、他の刺激に曝露することにより後退から「救出」され得る。従って、アンギオポエチン−２は、内皮細胞を他の脈管形成刺激に応答性にし、そして規定された条件下で脈管形成応答を促進する。特に、ＶＥＧＦは、ａｎｇ−２不安定化細胞を増殖させ得、そして初期の新脈管を形成させ得る（Ａｓａｈａｒａら、１９９８；Ｈｏｌａｓｈら、１９９９）。実際、腫瘍組織におけるアンギオポエチン−２発現は、報告されており（Ｔａｎａｋａら、１９９９）、ここでＶＥＧＦと組み合わさって作用して、脈管形成を促進するということが推定された（Ｓｔｒａｔｍａｎｎら、１９９８）。アンギオポエチン−２およびＶＥＧＦにより開始される新脈管形成は、これらの分子を「共脈管形成性（ｃｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）」にする。
特定の腫瘍型における血管に対するアンギオポエチン−２のポジティブおよびネガティブの効果を説明するための統合されたモデルは、これまでに報告されている（Ｈｏｌａｓｈら、１９９９）。このモデルにおいて、アンギオポエチン−２誘発不安定化は、周囲の宿主脈管構造から血管を選出する（ｃｏｏｐｔｉｎｇ）ことにより生じる、腫瘍における有意な脈管後退を最初に引き起こす。腫瘍に付随する内皮細胞により産生される高レベルのアンギオポエチン−２は、アンギオポエチン−１の低レベルで構成性の発現により明確に発生される生存シグナルを無効にする。従って、アンギオポエチン−２は、アポトーシス後退について選出された脈管をマークする（Ｈｏｌａｓｈら、１９９９）。しかし、生じた腫瘍壊死にもかかわらず、生存する腫瘍細胞は、その生存を確実にするためにＶＥＧＦをアップレギュレートする。ＶＥＧＦは、アンギオポエチン−２からの後退シグナルを無効にし、そして実際脈管発生を促進するので（Ｈｏｌａｓｈら、１９９９）、次いでＶＥＧＦおよびアンギオポエチン−２の同時発現は、腫瘍末梢において頑健な脈管形成を生じる。
一見したところ矛盾しているように思われるが、アンギオポエチン−２の作用は、他の存在するシグナル、特にＶＥＧＦに基づいて説明され得、そして多くは予測され得る。別の脈管形成シグナルの非存在下においてアンギオポエチン−２は、脈管を不安定化させ、そして未成熟にし、後退に至る。刺激、特にＶＥＧＦの存在下において、脈管が二次的な脈管形成刺激を受容するように「準備される」と、アンギオポエチン−２により引き起こされる不安定化は、実際に脈管形成を生じる。従って、多数の調節因子の脈管形成効果は、少なくとも部分的に、微小血管内皮細胞におけるアンギオポエチン−２活性のオートクラインループの調節により達成されると考えられる（ＭａｎｄｏｒｉｏｔａおよびＰｅｐｐｅｒ，１９９８）。
アンギオポエチン−２の二重の生物学的役割は、本発明者らに、腫瘍環境における他のシグナル、特にＶＥＧＦを説明するさらなる治療的ストラテジーを開発させた。アンギオポエチン−２およびＶＥＧＦは、協調して脈管形成を刺激するので、本発明の好ましい局面は本発明のＶＥＧＦ阻害抗体と組み合わせて、腫瘍標的化アンギオポエチン−２送達を使用する。これにより、アンギオポエチン−２が後退において作用し、脈管形成において作用しないことを確実にする。
上述の説明を考慮して、本発明は、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、２Ｃ３）を提供し、この抗体は、アンギオポエチン−１、アンギオポエチン−２、アンギオポエチン−３および／またはアンギオポエチン−４のいずれか１つ以上に作動可能に連結されるか、そうでなければ機能的に関連するということが理解される。例示的なアンギオポエチン−１組成物は、配列番号１（ＤＮＡ）および配列番号２（タンパク質）であり、一方アンギオポエチン−２組成物は、配列番号３（ＤＮＡ）および配列番号４（タンパク質）により例示される。アンギオポエチン−３は、アンタゴニストであり、一般的にアンギオポエチン−２のように使用され；アゴニストアンギオポエチン−４は、アンギオポエチン−１の様式で使用され得る。Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａらの論文（１９９９）は、アンギオポエチン−３およびアンギオポエチン−４に関する本明細書の教示をさらに補充する目的のために、参考として詳細に援用される。
さらに、アンギオポエチンの融合タンパク質はまた、本発明における使用が想像される。一例は、本明細書中に配列番号５として含まれる安定なＡｎｇ−１−Ａｎｇ−２融合タンパク質である。このタンパク質は、アミノ酸７７で始まるアンギオポエチン−１配列に融合される、アンギオポエチン−２の最初の７３残基、ＤＡＰＬＥＹ配列まで、を含む。これはまた、アンギオポエチン−１配列において位置２６５に変異を有し、ここでＣｙｓは、Ｓｅｒで置換される。
本発明と共に使用するための他の抗脈管形成剤としては、アンギオスタチンおよびエンドスタチンが挙げられる。アンギオスタチンは、米国特許第５，７７６，７０４号；同第５，６３９，７２５号および同第５，７３３，８７６号において開示されている。これらの各々は、本明細書中に参考として援用される。アンギオスタチンは、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定されるように、約３８ｋＤａ〜約４５ｋＤａの分子量を有するタンパク質であり、これは、プラスミノーゲン分子のほぼクリングル領域１〜４を含む。アンギオスタチンは、一般に、インタクトなマウスプラスミノーゲン分子のアミノ酸番号９８から開始するマウスプラスミノーゲンのフラグメントと実質的に類似のアミノ酸配列を有する。
アンギオスタチンのアミノ酸配列は、種の間でわずかに変化する。例えば、ヒトアンギオスタチンにおいて、このアミノ酸配列は、上記のマウスプラスミノーゲンフラグメントの配列と実質的に類似であるが、活性なヒトアンギオスタチン配列は、インタクトなヒトプラスミノーゲンアミノ酸配列のアミノ酸番号９７または９９のいずれかで開始し得る。さらに、ヒトプラスミノーゲンは、類似の抗脈管形成活性を有するので、マウス腫瘍モデルにおいて示されるように使用され得る。
アンギオスタチンおよびエンドスタチンは、マウスにおいて、腫瘍増殖を阻害するだけでなく腫瘍後退もまたもたらす能力が実証された最初の新脈管形成インヒビターであるので、これらは熱心な研究の焦点となる。エラスターゼ、マクロファージメタロエラスターゼ（ＭＭＥ）、マトリリシン（ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ）（ＭＭＰ−７）、および９２ｋＤａゼラチナーゼＢ／ＩＶ型コラゲナーゼ（ＭＭＰ−９）を含む、プラスミノーゲンからアンギオスタチンを生成することが示される複数のプロテアーゼが存在する。
ＭＭＥは、腫瘍においてプラスミノーゲンからアンギオスタチンを生成し得、そして顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）は、アンギオスタチンの生成を誘導するマクロファージによってＭＭＥの発現をアップレギュレートする。アンギオスタチン生成におけるＭＭＥの役割は、ＭＭＥが患者由来の肝細胞癌の臨床サンプルにおいて実際に発現されるという知見によって支持される。アンギオスタチンを生成し得ると考えられる別のプロテアーゼは、ストロメライシン−１（ＭＭＰ−３）である。ＭＭＰ−３は、インビトロにおいてプラスミノーゲンからアンギオスタチン様フラグメントを生成することが示されている。アンギオスタチンについての作用機構は現在のところ明らかではなく、これが、プログラム化された細胞死または有糸分裂の阻止を受けるように内皮細胞を誘導する内皮細胞上の同定されていない細胞表面レセプターに結合すると推定されている。
エンドスタチンは、さらにより強力な抗新脈管形成および抗腫瘍剤であるようであり、そしてＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、２Ｃ３）に連結するために特に好ましい。エンドスタチンは、マウスにおける多くの腫瘍モデルにおいて後退を生じることにおいて有効である。腫瘍は、エンドスタチンに対する耐性を発生させず、そして複数のサイクルの処置後に、腫瘍は、休眠状態に進入し、この間、これらは容量において増加しない。この休眠状態において、アポトーシスを受ける腫瘍細胞の割合は増加し、そして本質的に同じサイズをとどめる集団を生じた。
ＦｏｌｋｍａｎおよびＯ’Ｒｅｉｌｅｙらへの米国特許第５，８５４，２０５号（本明細書中で参考として詳細に援用される）は、内皮細胞増殖および脈管形成のインヒビターとしてのエンドスタチンおよびその使用に関する。エンドスタチンタンパク質は、コラーゲンＸＶＩＩＩ型のＣ末端フラグメントに対応し、そしてこのタンパク質は、種々の供給源から単離され得る。米国特許第５，８５４，２０５号はまた、エンドスタチンが、コラーゲンＸＶＩＩＩ型、コラーゲンＸＶ型、またはＢＯＶＭＰＥ１プロガストリン（ｐｒｅｇａｓｔｒｉｃ）エステラーゼのフラグメントのアミノ酸配列を有し得るということを教示する。エンドスタチンの他の抗脈管形成タンパク質、特にアンギオスタチンとの組み合わせはまた、米国特許第５，８５４，２０５号に記載され、その結果、組合された組成物は、脈管形成依存性腫瘍塊を効果的に後退させ得る。
エンドスタチンおよびアンギオスタチンは、本発明に従う腫瘍送達に好ましい薬剤である。バスキュロスタチン（ｖａｓｃｕｌｏｓｔａｔｉｎ）、カンスタチン（ｃａｎｓｔａｔｉｎ）およびマスピン（ｍａｓｐｉｎ）はまた、好ましい薬剤である。エンドスタチンは、特に最も好ましい薬剤の１つである。エンドスタチン２Ｃ３融合タンパク質は、本明細書中に記載されるように、調製され得る。化学的に結合されたエンドスタチン−２Ｃ３構築物の種々の形態はまた、本出願に記載される。
（Ｃ５．アポトーシス誘発剤）
本発明はまた、腫瘍内の任意の細胞（腫瘍細胞および腫瘍脈管内皮細胞を含む）においてアポトーシスを誘発する。多くの抗癌剤は、その作用機構の一部として、アポトーシス誘発効果を有し得るが、特定の薬剤は、以下に記載されるように、主要な機構としてこのことを用いて、発見されるか、設計されるかまたは選択された。
多くの形態の癌において、腫瘍抑制遺伝子（例えば、ｐ５３）における変異が報告されている。ｐ５３の不活性化は、アポトーシスの促進の不全を生じる。この不全によって、癌細胞は、細胞死へと運命付けられるよりむしろ、腫瘍形成を進行させる。従って、腫瘍抑制因子の送達もまた、細胞死を刺激するために本発明での使用が意図される。例示的な腫瘍抑制因子としては、ｐ５３、網膜芽細胞腫遺伝子（Ｒｂ）、ウィルムス腫瘍（ＷＴ１）、ｂａｘα、インターロイキン−１ｂ−変換酵素およびファミリー、ＭＥＮ−１遺伝子、神経芽細胞腫Ｉ型（ＮＦ１）、ｃｄｋインヒビターｐ１６、結腸直腸癌遺伝子（ＤＣＣ）、家族性腺腫症ポリポーシス遺伝子（ＦＡＰ）、多発性腫瘍抑制遺伝子（ＭＴＳ−１）、ＢＲＣＡ１ならびにＢＲＣＡ２が挙げられるがこれらに限定されない。
使用のために好ましいのは、ｐ５３（米国特許第５，７４７，４６９号；同第５，６７７，１７８号；および同第５，７５６，４５５号；各々は、参考として本明細書中に援用される）、網膜芽細胞腫、ＢＲＣＡ１（米国特許第５，７５０，４００号；同第５，６５４，１５５号；および同第５，７１０，００１号；同第５，７５６，２９４号；同第５，７０９，９９９号；同第５，６９３，４７３号；同第５，７５３，４４１号；同第５，６２２，８２９号；および同第５，７４７，２８２号；各々は、参考として本明細書中に援用される）、ＭＥＮ−１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ９３２３６号）およびアデノウイルスＥ１Ａ（米国特許第５，７７６，７４３号；参考として本明細書中に援用される）の遺伝子である。
ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、２Ｃ３）により送達され得る他の組成物としては、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬと称される）をコードする遺伝子、およびＴＲＡＩＬポリペプチド（米国特許第５，７６３，２２３号；参考として本明細書中に援用される）；米国特許第５，６０５，８２６号（参考として本明細書中に援用される）２４ｋＤアポトーシス関連プロテアーゼ；Ｆａｓ関連因子１、ＦＡＦ１（米国特許第５，７５０，６５３号；参考として本明細書中に援用される）が挙げられる。インターロイキン−１β−変換酵素およびファミリーのメンバー（これらもまた、アポトーシスを刺激することが報告されている）の提供もまた、本発明のこれらの局面における使用のために意図される。
以下のような化合物もまた使用され得る；カルボスチリル（ｃａｒｂｏｓｔｙｒｉｌ）誘導体（米国特許第５，６７２，６０３号；および同第５，４６４，８３３号；各々は、参考として本明細書中に援用される）；分枝状アポトーシス原性（ａｐｏｇｅｎｉｃ）ペプチド（米国特許第５，５９１，７１７号；参考として本明細書中に援用される）；ホスホチロシンインヒビターおよび非加水分解性ホスホチロシンアナログ（米国特許第５，５６５，４９１号；および同第５，６９３，６２７号；各々は、参考として本明細書中に援用される）；ＲＸＲレチノイドレセプターのアゴニスト（米国特許第５，３９９，５８６号；参考として本明細書中に援用される）；さらには、抗酸化剤（米国特許第５，５７１，５２３号；参考として本明細書中に援用される）。チロシンキナーゼインヒビター（例えば、ゲニステイン）もまた、細胞表面レセプター（ＶＥＧＦＲ１）を標的化する本発明の薬剤に連結され得る（参考として本明細書中に援用される米国特許第５，５８７，４５９号により支持されるように）。
（Ｃ６．生物学的機能性等価物）
２Ｃ３ベースの抗体または任意の他のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体の等価物またはさらなる改良物が、今や、一般には上記に提供される物質を出発点として使用して作製され得る。改変および変化が、このような抗体の構造中になされ得、そしてさらに類似または他の様式の所望の特徴を有する分子を入手し得る。例えば、特定のアミノ酸が、相互作用性結合能のかなり大きな損失なしに、タンパク質構造において他のアミノ酸の代わりに置換され得る。これらの考察もまた、毒素、抗脈管形成剤、アポトーシス誘発剤および凝血薬などにあてはまる。
タンパク質の生物学的機能活性を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質であるので、特定のアミノ酸配列置換がタンパク質配列（または、当然のことながら基礎のＤＮＡ配列）中でなされ得、にもかかわらず類似（アゴニスト）の特性を有するタンパク質を入手し得る。従って、種々の変化が、それらの生物学的有用性または活性のかなり大きな損失なく、抗体または治療剤の配列（または、基礎のＤＮＡ配列）になされ得ることが意図される。基礎のＤＮＡ配列を変異することから作製される生物学的機能性等価物は、本明細書中の表Ａにおいて提供されるコドン情報、および部位特異的変異誘発に関する支持する技術的詳細を用いてなされ得る。
分子の所定の部分内になされ得、なお受容可能なレベルの等価な生物学的活性を有する分子を生じ得る変化の数に対して限界が存在するという概念が、「生物学的機能性等価物」タンパク質またはペプチドの定義に固有であることもまた、当業者に十分に理解される。従って、生物学的機能性等価物タンパク質およびペプチドは、本明細書中において、ほとんどまたはすべてではないが特定のアミノ酸が置換され得るタンパク質およびペプチドとして規定される。当然のことながら、異なる置換を有する複数の異なるタンパク質／ペプチドは、本発明に従って容易に作製および使用され得る。
アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖の置換の相対的類似性（例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなど）に基づく。アミノ酸側鎖置換のサイズ、形状および型の分析によって、アルギニン、リジンおよびヒスチジンはすべて正に荷電した残基であること；アラニン、グリシンおよびセリンはすべて類似のサイズであること；そして、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンはすべて一般的に類似の形状であることが示される。従って、これらの考察に基づいて、アルギニン、リジンおよびヒスチジン；アラニン、グリシンおよびセリン；ならびにフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、本明細書中において、生物学的機能性等価物として規定される。
より定量的な変化を生じさせる際に、アミノ酸の疎水親水指数が考慮され得る。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷特徴に基づいて疎水親水指数を指定されており、これらは以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
タンパク質に相互作用性生物学的機能を付与する際の疎水親水アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野において理解される（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２、本明細書中で参考として援用される）。特定のアミノ酸が、類似の疎水親水指数またはスコアを有する他のアミノ酸の代わりに置換され得、そしてなお類似の生物学的活性を保持することは公知である。疎水親水指数に基づいた変化を生じさせる際に、疎水親水指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内である置換が特に好ましく、そして±０．５以内である置換がさらにより特に好ましい。
従って、アミノ酸が、類似の親水性値を有する別のアミノ酸の代わりに置換され、そしてなお生物学的に等価なタンパク質を入手し得ることが理解される。米国特許第４，５５４，１０１号（本明細書中で参考として援用される）において詳述されるように、以下の親水性値が、アミノ酸残基に指定されている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
親水性値に基づいた変化を生じさせる際に、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内である置換が特に好ましく、そして±０．５以内である置換がさらにより特に好ましい。
（Ｃ７．融合タンパク質および組換え発現）
本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの免疫結合体は、分子生物学技術を使用して、融合タンパク質として容易に調製され得る。任意の融合タンパク質は、本明細書中に記載され、そして当該分野で公知の任意の治療剤を使用して、設計および作製され得る。融合タンパク質技術は、２つの部分が選択的に切断可能なペプチド配列により結合される融合タンパク質を調製するために容易に適合される。現在好ましい融合タンパク質は、エンドスタチンを含む融合タンパク質である。任意の他の治療剤と同様に、エンドスタチンは、抗体の末端またはＣＤＲと別の任意の点に連結され得る。エンドスタチンのような治療剤はまた、「一体化して」調製され得、ここでこれらは、標的化後に薬剤の放出を可能にするために、選択的に切断可能なペプチドに好ましくは付随する。
このような目的を達成するための組換えＤＮＡ技術の使用は、現在、当業者に標準的操作である。これらの方法としては、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ組換え／遺伝的組換えが挙げられる。さらに、ＤＮＡ合成およびＲＮＡ合成は、自動合成装置を使用して実施され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（本明細書中に参考として援用される）に記載される技術を参照のこと）。
このような融合タンパク質の調製は、一般的に、所望の融合タンパク質をコードする単一のコード領域を調製するために、第１および第２のＤＮＡコード領域の調製、およびそのような領域をインフレームで機能的に連結または結合することを伴う。本発明の状況において、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３様抗体のＤＮＡ配列は、治療剤をコードするＤＮＡ配列とインフレームで連結される。構築物のどの部分がＮ末端領域またはＣ末端領域として調製されるかが、特に関連するとは一般に考えられない。
一旦、所望のコード領域が生成されると、発現ベクターが作製される。発現ベクターは、挿入されたＤＮＡ領域の上流に、そのＤＮＡの転写を促進するように作用し、そして従ってコードされる組換えタンパク質の発現を促進するように作用する１つ以上のプロモーターを含む。これが、「組換え発現」の趣意である。
ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの免疫結合体のいわゆる「組換え」バージョンを獲得するために、これは組換え細胞内で発現される。原核生物系または真核生物系における発現のためのＤＮＡセグメントの操作は、組換え発現における当業者に一般的公知の技術によって実施され得る。実質的に任意の発現系が、このＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの免疫結合体構築物の発現において使用され得ると考えられる。
そのようなタンパク質は、真核生物発現系（例えば、ＣＨＯ細胞）において首尾良く発現され得る。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＱＥ−６０のような細菌発現系が、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの免疫結合体の大規模調製および引き続く精製のために特に有用であると考えられる。ｃＤＮＡはまた細菌系において発現され、発現されるそのコードタンパク質はβ−ガラクトシダーゼ、ユビキチン、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍグルタチオンＳ−トランスフェラーゼなどを伴う融合物として発現され得る。細菌発現は、使用の容易さ、およびそれによって得られる物質の品質に関して、真核生物発現を超える利点を有すると考えられる。
微生物発現に関して、組換え宿主細胞における遺伝子の発現と関連して本発明の開示をなおさらに補充する目的のために、米国特許第５，５８３，０１３号；同第５，２２１，６１９号；同第４，７８５，４２０号；同第４，７０４，３６２号；および同第４，３６６，２４６号が、本明細書中で参考として援用される。
組換え的に生成されるＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの免疫結合体物は、ヒト投与のために精製および処方され得る。あるいは、免疫結合体をコードする核酸は、遺伝子治療を通して送達され得る。裸の組換えＤＮＡまたはプラスミドが使用され得るが、リポソームまたはベクターの使用が好ましい。特定ウイルスが、レセプター媒介性エンドサイトーシスを介して細胞に進入する能力、および宿主細胞ゲノムに組込みそして安定的および効率的にウイルス遺伝子を発現する能力は、それらを、哺乳動物細胞内に外来遺伝子を移入させるための魅力的な候補にさせている。本発明における使用のために好ましい遺伝子治療ベクターは、一般的にウイルスベクターである。
レトロウイルスは、それらの遺伝子を宿主ゲノム中に組込むそれらの能力、大量の外来性遺伝物質を移入させるそれらの能力、広範なスペクトルの種および細胞型に感染するそれらの能力、および特定の細胞株にパッケージングされるそれらの能力に起因して、遺伝子送達ベクターとして見こまれている。他のウイルス（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（例えば、米国特許第５，１３９，９４１号（本明細書中で参考として援用される）に記載されるウイルス）もまた、遺伝子移入のためのベクターとして作用されるように操作され得る。
外来性遺伝物質を受容し得るいくつかのウイルスは、それらが適応し得るヌクレオチドの数、およびそれらが感染する細胞の範囲において限定されるが、これらのウイルスは、遺伝子発現を首尾良くもたらすことが実証されている。しかし、アデノウイルスは、それらの遺伝物質を宿主ゲノム中に組込まず、従って遺伝子発現のために宿主の複製を必要としない。これは、迅速な遺伝子発現、効率的な遺伝子発現、異種遺伝子発現についてそれらを理想的に適合させる。複製欠損した感染性ウイルスを調製する技術は、当該分野において周知である。
特定のさらなる実施形態において、遺伝子治療ベクターはＨＳＶである。ＨＳＶを魅力的なベクターにする因子は、ゲノムの大きさおよび組織化である。ＨＳＶは大きいので、複数の遺伝子または発現カセットを組込むことは、より小さな他のウイルス系よりもあまり問題ではない。さらに、変動する性能（例えば、時間的、強度）を有する種々のウイルスコントロール配列の利用能は、他の系におけるよりも高い程度で発現を制御することを可能にする。ウイルスが比較的少数でスプライシングされるメッセージを有し、遺伝子操作をさらに容易にすることもまた有用である。ＨＳＶはまた、操作が比較的容易であり、そして高い力価まで増殖され得る。
もちろん、ウイルス送達系を使用する際には、所望されない夾雑物（例えば、不完全干渉ウイルス粒子または内毒素、および他の発熱物質）を本質的に含まないようにするために十分にビリオンを精製し、その結果、ベクター構築物を受容する細胞、動物、または個体において不都合な反応を全く引き起こさないことが所望される。ベクターを精製する好ましい手段としては、浮遊密度勾配の使用（例えば、塩化セシウム勾配遠心分離）が挙げられる。
（Ｃ８．抗体結合体）
ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体は、「イムノトキシン」を調製するために、抗細胞性薬剤または細胞傷害性薬剤に結合体化され得るか；あるいは凝固を直接的または間接的に刺激して、それによって「コアグリガンド」を形成し得る成分と作動可能に会合され得る。コアグリガンドにおいて、抗体は、直接的または間接的な凝固因子に直接的に連結され得るか、あるいは直接的なまたは間接的な凝固因子を結合し、次いで放出する第２の結合領域に連結され得る。「第２の結合領域」アプローチは、一般に、第２の結合領域として凝血薬結合抗体を使用して、それによって二重特異的な抗体構築物を生じる。二重特異性抗体の調製および使用は、一般に、当該分野において周知であり、そして本明細書中にさらに開示される。
イムノトキシン、コアグリガンドおよび二重特異性抗体の調製において、組換え発現が用いられ得る。この選択された抗体をコードする核酸配列は、選択された毒素、凝血薬、または第２の結合領域をコードする核酸配列に、インフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）で結合され、発現ユニットまたはベクターを作製する。組換え発現は、新しい核酸の翻訳を生じ、所望のタンパク質産物を生じる。タンパク質結合リガンドではなく抗体をコードする核酸が用いられるが、組換えアプローチは、本明細書中上記のアプローチと本質的に同じである。
結合体技術に戻ると、イムノトキシンの調製は、一般に、当該分野において周知である。しかし、特定の利点は、イムノトキシンの調製において、および引き続く臨床での投与のためのそれらの精製においての両方で、特定の好ましい技術の適用を通じて達成され得る。例えば、ＩｇＧベースのイムノトキシンが、代表的には、それらのＦａｂ’対応物よりも良好な結合能力および遅い血中クリアランスを示すが、Ｆａｂ’フラグメントベースのイムノトキシンは、一般に、ＩｇＧベースのイムノトキシンと比較した場合に、より良好な組織浸透能力を示す。
さらに、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体に毒素部分を結合体化するために首尾よく用いられ得る、多くの型のジスルフィド結合含有リンカーが公知であるが、特定のリンカーは、一般に、薬理学的な特徴および能力の差異に基づいて、他のリンカーよりも好ましい。例えば、立体的に「妨害される」ジスルフィド結合を含むリンカーが、インビボでのそれらのより大きな安定性に起因して好まれ、それによって作用部位での結合の前に毒素部分の放出を防ぐ。
ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体に結合体化され得る、広汎な種々の細胞傷害性薬剤（植物由来の毒素、真菌由来の毒素および細菌由来の毒素（例えば、リシンＡ鎖または脱グリコシル化Ａ鎖）が、公知である。標的化剤への毒素Ａ鎖の架橋は、特定の場合において、ジスルフィド機能を示す架橋剤を必要とする。このことに対する理由は、不明であるが、一旦この因子が標的細胞にこの毒素を「送達する」と、標的化剤から容易に放出可能である特定の毒素部分に対する必要性に起因するようである。
各々の型の架橋剤、ならびに架橋が実行される方法は、得られた結合体の薬力学を変動する傾向がある。最終的には、放出可能な毒素が意図される場合には、意図される作用部位を除く身体中のいたるところ（結合体が良好な「放出」特徴を有することが好ましい点）に見出される条件下でインタクトなままである結合体を有することが所望される。従って、特定の架橋スキーム（特に、使用される特定の架橋試薬および架橋される構造を含む）は、いくらか重要である。
融合タンパク質の部分として使用される特定の毒素化合物に依存して、標的化剤に作動可能に結合する抗体および毒素化合物を提供することが必要であり得る。次いで、ループ内のタンパク質分解性切断は、ヘテロダイマーポリペプチドを生じ、ここで抗体および毒素化合物は、１個のジスルフィド結合によってのみ連結されている。このような毒素の例は、リシンＡ鎖毒素である。
特定の他の毒素化合物が利用される場合、非切断性ペプチドスペーサーが、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体および融合タンパク質の毒素化合物を作動可能に連結するために提供される。非切断性ペプチドスペーサーと組み合せて使用され得る毒素は、それ自体、タンパク質分解性切断によって細胞傷害性ジスルフィド結合形態に変換され得る毒素である。このような毒素化合物の例は、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｍａｓ外毒素化合物である。
化学療法剤（例えば、抗腫瘍薬物、他のサイトカイン、代謝拮抗物質、アルキル化剤、ホルモンなど）を標的化することが所望されるような、標的抗原が、イムノトキシンよる効率的な中毒と一致する経路によって内在化しない場合のような状況が存在し得る。種々の化学療法剤および他の薬理学的薬剤は、現在、抗体に首尾よく結合体化されており、そして薬理学的に機能することが示されている。調査されている例示的な抗腫瘍性因子は、ドキソルビシン、ダウノマイシン、メトトレキセート、ビンブラスチン、および種々の他の因子を含む。さらに、他の因子（例えば、ネオカルジノスタチン（ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、マクロマイシン（ｍａｃｒｏｍｙｃｉｎ）、トレニモン（ｔｒｅｎｉｍｏｎ）およびα−アマニチンの部分が、記載されている。
凝固因子が、本発明と組み合せて使用される場合、抗体に対する任意の共有結合は、その機能的に凝固する部位とは別の部位に作製されるべきである。従って、この組成物は、各々の領域が重要な障害なしにその意図された機能を実行するようにする、任意の作動可能な様式にて「連結される」。従って、この抗体は、ＶＥＧＦに結合し、そして凝固因子は、血餅化を促進する。
（Ｃ９．生化学架橋剤）
上記に提供される一般の情報に加えて、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体は、特定の好ましい生化学架橋剤を使用して、抗細胞性薬剤または細胞傷害性薬剤に結合体化され得る。架橋試薬は、２つの異なる分子の官能基を共に結ぶ分子架橋を形成するために使用される。段階的な様式にて２つの異なるタンパク質を連結するために、所望されないホモポリマー形成を排除するヘテロ二官能性架橋剤が、使用され得る。例示的なヘテロ二官能性架橋剤は、表Ｂ１において参照される。
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ヘテロ二官能性架橋剤は、２つの反応基（一方は、一般に、第１級アミン基（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）と反応し、そして他方は、一般にチオール基（例えば、ピリジルジスルフィド、マレイミド、ハロゲンなど）と反応する）を含む。第１級アミン反応基を通じて、この架橋剤は、あるタンパク質（例えば、選択された抗体またはフラグメント）のリジン残基と反応し得、このチオール反応基を通じて、第１のタンパク質と既に結び付けられている架橋剤は、他のタンパク質（例えば、凝血薬）のシステイン残基（遊離のスルフヒドリル基）と反応する。
従って、組成物は、一般に、架橋の目的に利用可能な官能基を有するか、または有するように誘導体化される。この要件は、広汎な種々の基がこの様式において使用され得るという点で限定的であるとは考えられない。例えば、第一級アミン基または第二級アミン基、ヒドラジド基またはヒドラジン基、カルボキシル基、アルコール基、ホスフェート基、あるいはアルキル化基は、結合および架橋のために使用され得る。
架橋剤の２つの反応基の間のスペーサーアームは、種々の長さおよび化学組成を有し得る。より長いスペーサーアームは、結合体成分のより良好な可撓性を可能にし、その一方、架橋におけるいくつかの特定の成分（例えば、ベンゼン基）は、反応基にさらに安定性を、または種々の局面の作用に化学結合の耐性の増大（例えば、還元剤への耐性のジスルフィド結合）を与え得る。ペプチドスペーサー（例えば、Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ａｌａ）の使用もまた、意図される。
血中にて合理的な安定性を有する架橋剤が用いられることが好ましい。標的化剤および毒素因子または凝固因子を結合体化するために首尾よく用いられ得る、多くの型のジスルフィド結合含有リンカーが、公知である。立体的に妨害されるジスルフィド結合を含むリンカーが、インビボでより大きな安定性を生じることを証明し得、このことは、作用部位での結合の前に因子の放出を妨げる。従って、これらのリンカーは、連結剤の１つの好ましい群である。
イムノトキシンにおける使用に最も好ましい架橋試薬のうちの１つは、ＳＭＰＴである。ＳＭＰＴは、隣接するベンゼン環およびメチル基により「立体的に妨害」されているジスルフィド結合を含む、二官能性架橋剤である。ジスルフィド結合の立体障害は、チオレートアニオン（組織および血中に存在し得るグルタチオンのような）による攻撃から結合を保護し、それによって腫瘍部位への結合した薬剤の送達の前に結合体の脱カップリングを防ぐため際に役立つ機能を提供すると考えられる。ＳＭＰＴ剤はまた、本発明の二重特異性リガンドと組み合せて使用され得ることが意図される。
多くの他の公知の架橋試薬のように、ＳＭＰＴ架橋試薬は、官能基（例えば、システインのＳＨまたは第一級アミン（例えば、リジンのε−アミノ基））を架橋する能力を与える。別の可能な型の架橋剤は、切断性ジスルフィド結合（例えば、スルホスクシンイミジル−２−（ｐ−アジドサリチルアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート）を含有する、ヘテロ二官能性感光性フェニルアジドを含む。Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル基は、第一級アミノ基と反応し、そしてフェニルアジド（光分解の際）は、任意のアミノ酸残基と非選択的に反応する。
妨害された（ｈｉｎｄｅｒｅｄ）架橋剤に加えて、妨害されていないリンカーもまた、本明細書に従って用いられ得る。保護されたジスルフィドを含まないかまたは生成しないと考えられる、他の有用な架橋剤には、ＳＡＴＡ、ＳＰＤＰおよび２−イミノチオレンが挙げられる。このような架橋剤の使用は、当該分野において十分に理解されている。
一旦結合体化されると、この結合体は、非結合体化標的化剤および非結合体化治療剤から、ならびに他の夾雑物から分離される。多数の精製技術が、結合体を臨床的に有用にするに十分な程度の純度の結合体を提供する使用に利用可能である。サイズ分離（例えば、ゲル濾過、ゲル浸透、または液体高速クロマトグラフィー）に基づく精製方法は、一般に、最も有用である。他のクロマトグラフィー技術（例えば、Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ分離）もまた、使用され得る。
（Ｃ１０．生物学的に放出可能なリンカー）
任意の結合部分は、血液において合理的な安定性を有し、疾患部位または腫瘍部位に標的化する前に、付着した薬剤の実質的な放出を予防することが、好ましいけれども、特定の局面において、生物学的に放出可能な結合および／または選択的に切断可能なスペーサーまたはリンカーの使用が、意図される。「生物学的に放出可能な結合」および「選択的に切断可能なスペーサーまたはリンカー」は、循環において合理的な安定性をなお有する。
従って、本発明のＶＥＧＦＲ−２遮断抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、２Ｃ３様抗体）は、生物学的に放出可能な結合を介して１以上の治療剤に結合され得る。ＳｃＦｖフラグメントは、特定の実施形態において好ましいけれども、ＶＥＧＦＲ２遮断抗−ＶＥＧＦ抗体、または「標的抗体もしくは薬剤」の任意の形態は、使用され得、これは、インタクトな抗体を含む。
「生物学的に放出可能な結合」または「選択的に加水分解可能な結合」は、唯一または優先的に特定の条件下で、放出可能、切断可能、または加水分解であるすべての結合を含む。これは、米国特許第５，４７４，７６５号および同第５，７６２，９１８号（各々は、本明細書中で特異的に参考文献として援用される）に記載されるように、ジスルフィド結合およびトリスルフィド結合ならびに酸標識結合が挙げられる。
治療剤または治療薬物の本発明の抗体への付着のための酸感応性スペーサーの使用は、特に意図される。このような実施形態において、治療剤または治療薬物は、細胞内の酸区画内で放出される。酸感応性放出は、細胞外で起こり得るが、特定の標識の後、好ましくは腫瘍部位に対して起こることが意図される。特定の現状で好ましい例としては、酸感応性スペーサーを介してコルヒチンまたはドキソルビシンに結合された２Ｃ３様抗体が挙げられる。抗体の糖質部分を介する付着はまた、意図される。このような実施形態において、治療剤または治療薬物は、細胞内の酸性区画内で放出される。
標的抗ＶＥＧＦ抗体はまた、生物学的に放出可能な結合を介して治療剤の付着を可能にする官能基を導入するように誘導され得る。従って、標的抗体は、ヒドラジド基、ヒドラジン基、１級アミン基または２級アミン基で終端する側鎖を導入するように誘導され得る。治療剤は、Ｓｃｈｉｆｆの塩基結合、ヒドラゾンもしくはアシルヒドラゾン結合またはヒドラジドリンカーを介して結合体化され得る（米国特許第５，４７４，７６５号および同第５，７６２，９１８号、各々は、本明細書中で参考として特異的に援用される）。
米国特許第５，４７４，７６５号および同第５，７６２，９１８号（各々は、本明細書中で参考として特異的に援用される）に記載されるように、標的抗ＶＥＧＦ抗体は、酵素感応性の１以上の生物学的に放出可能な結合（ペプチド結合、エステル、アミド、リン酸ジエステルおよびグリコシドが挙げられる）を介して治療剤に操作可能に付着され得る。
本発明の好ましい局面は、優先的に疾患部位、特に、腫瘍環境内に位置する、ペプチターゼおよび／またはプロテイナーゼに対する少なくとも第１切断部位を含むペプチドリンカーの使用に関する。従って、付着された治療剤の抗体媒介送達は、疾患部位または腫瘍環境内で特異的に切断を生じ、活性薬剤の特異的放出を生じる。特定のペプチドリンカーは、再構築に関する１以上の酵素によって認識される切断部位を含む。
ウロキナーゼ、プロ−ウロキナーゼ、プラスミン、プラスミノゲン、ＴＧＦβ、スタフィロキナーゼ、トロンビン、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子またはメタロプロテイナーゼ（例えば、間質性コラゲナーゼ、ゲラチナーゼ、またはストロメライシン）に対する切断部位を含むポリペプチドリンカーは、特に好ましい。米国特許第６、００４、５５５、米国特許第５，８７７，２８９および米国出願番号０８／４８２，３６９（１９９８年、１０月２０日発行、料金支払い済）は、さらなる記載ならびに標的薬剤−治療剤構築（生物学的に放出可能な結合ならびに選択的に切断可能なリンカーおよびペプチドを含む）を作製かつ使用する方法を可能にする目的のために、本明細書中で参考として特異的に援用される。特に、１９９９年３月２日に発行された米国特許第５，８７７，２８９号は、さらなる記載ならびに標的薬剤−治療剤構築（ウロキナーゼ、プラスミン、トロンビン、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子またはメタロプロテイナーゼ（例えば、間質性コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、またはストロメライシン）によって腫瘍環境内で切断される選択的に切断可能なペプチドリンカーを含む）を作製かつ使用する方法を可能にする目的のために、本明細書中で特異的に参考として援用される。
現状で好ましい選択的に切断可能なペプチドリンカーは、プラスミンまたはメタロプロテイナーゼ（「マトリックスメタロプロテアーゼ」または「ＭＭＰ」としても公知である）（例えば、間質性コラゲナーゼ、ゼラチナーゼまたはストロメリシン）に対する切断部位を含むリンカーである。本発明に関して使用され得るさらなるペプチドリンカーとしては、例えば、表Ｂ２中に列挙されるリンカーが挙げられる。
Figure 2011046720
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（Ｃ１１．二重特異性抗体）
二重特異性抗体は、本発明のコアグリガンドおよび組合された抗脈管形成の局面において特に有用である。しかし二重特異性抗体は、一般的に、一本のアームがＶＥＧＦ（必要に応じて２Ｃ３と実質的にに同じエピトープ）に結合し、そして二重特異性抗体が治療剤に（一般に抗原結合部位とは異なる部位で）結合する限り、使用され得る。
一般に、二重特異性抗体の調製はまた、当該分野において周知である。１つの方法は、一方で、標的抗原に対する特異性を有する抗体を、他方で、（本明細書でのように）凝集剤を、別々に調製することを含む。ペプシンのＦ（ａｂ’γ）2フラグメントを、２つの選択した抗体から調製し、続いて各々を還元し、別々のＦａｂ’γSHフラグメントを提供する。次に、カップリングする２つのパートナーの１つにあるＳＨ基を、ｏ−フェニレンジマレイミドのような架橋剤を用いてアルキル化し、遊離のマレイミド基を１つのパートナー上に提供する。次にこのパートナーを、チオエーテル結合の手段によって他方と結合させ、所望のＦ（ａｂ’γ）2ヘテロ結合体を生成し得る。ＳＰＤＰまたはプロテインＡを用いて架橋を行うか、または三重特異性構築物を調製する他の技術が、公知である。
二重特異性抗体を生成する他の方法は、２つのハイブリドーマを融合して、クアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ）を形成することである。本明細書において使用する場合、用語「クアドローマ」は、２つのＢ細胞ハイブリドーマの融合産物を記載するために使用される。ここで、標準的な技術を用いて、２つの抗体産生ハイブリドーマを融合して、娘細胞を産生し、そして免疫グロブリン遺伝子のクローン型の両方のセットの発現を維持する細胞が、次いで選択される。
クアドローマを産生する好ましい方法は、親ハイブリドーマの少なくとも１つの酵素を欠失する変異体の選択を包含する。次に、この第１の変異型ハイブリドーマ細胞株は、その連続する生存を妨げる、例えば、ヨードアセトアミドに致死的に曝露された第２のハイブリドーマの細胞に融合される。細胞融合は、致死的に処理されたハイブリドーマから、その酵素欠失についての遺伝子を獲得することにより、第１のハイブリドーマの救済、および第１のハイブリドーマとの融合を介する第２のハイブリドーマの救済を可能とする。同一のアイソタイプであるが、異なるサブクラスの免疫グロブリンの融合が好ましいが、しかし必要ではない。好ましいクアドローマの単離のための代替的なアッセイが存在すれば、混合されたサブクラスの抗体は、使用可能である。
より詳細には、クアドローマの開発およびスクリーニングの１つの方法は、第１の選択されたＭＡｂを分泌するハイブリドーマ株を得る工程、およびこのハイブリドーマを、必須の代謝酵素（ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ））について欠失させる工程を包含する。ハイブリドーマの欠失変異体を得るために、細胞を、８−アザグアニンの漸増濃度（１×１０-7Ｍ〜１×１０-5Ｍ）の存在下で増殖させる。変異体を、限界希釈によってサブクローニングし、そしてそのヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）感受性について試験する。この培養培地は、例えば、１０％ ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１ｍＭ ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭからなり得る。
第２の所望のＭＡｂを産生する相補的なハイブリドーマ細胞株を使用して、標準的な細胞融合技術によって、クアドローマを生成する。手短には、４．５×１０7のＨＡＴ感受性の第１の細胞を、２．８×１０7ＨＡＴ耐性の第２の細胞（不可逆的生化学的インヒビターであるヨードアセトアミドの致死用量（リン酸緩衝化生理食塩水中に５ｍＭ）で、融合前に３０分間氷上で前処理した）と混合する。細胞融合は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して誘導し、そしてこの細胞を９６ウェルのマイクロ培養プレート中にプレートする。クアドローマを、ＨＡＴ含有培地を使用して選択する。二重特異性抗体含有培養物を、例えば、固相アイソタイプ特異的ＥＬＩＳＡおよびアイソタイプ特異的免疫蛍光染色を使用して、同定する。
二重特異性抗体を同定するための、１つの同定実施形態において、マイクロタイタープレートのウェル（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ）を、親ハイブリドーマ抗体の１つと特異的に相互作用し、そして両方の抗体との交差反応性を有さない試薬で、コートする。プレートを洗浄し、ブロックし、そして試験する上清（ＳＮ）を各ウェルに添加する。プレートを室温で２時間インキュベートし、上清を棄て、プレートを洗浄し、そして希釈したアルカリホスファターゼ−抗−抗体結合体を、室温で２時間添加する。プレートを洗浄し、そしてホスファターゼ基質（例えば、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ））を各ウェルに添加する。プレートをインキュベートし、３Ｎ ＮａＯＨを各ウェルに添加して反応を停止し、そしてＥＬＩＳＡリーダーを使用して、ＯＤ410値を測定する。
別の同定実施形態において、ポリＬ−リジンを用いて前処理したマイクロタイタープレートを使用して、各ウェルに標的細胞の１つを結合し、次にその細胞を固定化し（例えば、１％ グルタルアルデヒドを使用する）、そして二重特異性抗体を、インタクトな細胞に結合するその能力について試験する。さらに、ＦＡＣＳ、免疫蛍光染色、イデオタイプ特異的抗体、抗原結合競合アッセイ、および抗体の特徴付けの分野において一般的な他の方法を、本発明の方法と組み合わせて使用し、好ましいクアドローマを同定し得る。
クアドローマの単離に続いて、二重特異性抗体を他の細胞性産物から精製する。この精製は、免疫グロブリン精製の分野において当業者に公知の、種々のタンパク質単離手順によって達成され得る。抗体を調製する手段、および特徴付ける手段は、当該分野において周知である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１９８８を参照のこと）。
例えば、選択されたクアドローマの上清をプロテインＡセファロースカラムまたはプロテインＧセファロースカラムを通過させて、ＩｇＧを結合させる（アイソタイプに依存する）。次に結合した抗体を、例えば、ｐＨ５．０クエン酸緩衝液を使用して溶出する。ＢｓＡｂを含む溶出画分を、等張緩衝液に対して透析する。あるいは、溶出液をまた、抗−免疫グロブリンセファロースカラムを通過させる。次に、ＢｓＡｂを、３．５Ｍ 塩化マグネシウムを用いて溶出する。次に、この方法において精製されたＢｓＡｂを、例えば、上記の標的細胞のアイソタイプ特異的ＥＬＩＳＡおよび免疫蛍光染色アッセイによって、結合活性について試験する。
精製されたＢｓＡｂおよび親抗体はまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動と、その後の銀染色またはクマシー染色によって、特徴付け、および単離され得る。この手順は、親抗体の一方が、他方の抗体よりも大きな分子量を有し、ＢｓＡｂのバンドが２つの親抗体の中間に移動する場合に、可能である。サンプルの還元は、２つの見掛け上異なる分子量を有する重鎖の存在を確認する。
（Ｄ．薬学的組成物）
本発明の薬学的組成物は、一般に、少なくとも第１のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体（薬学的に受容可能なキャリアまたは水性媒体中に、溶解または分散した）の有効量を含む。組み合わせ治療もまた意図され、そして同じ型の基礎をなす薬学的組成物を、単一医薬および組み合わせ医薬の両方について使用し得る。
句「薬学的に受容可能、または薬理学的に受容可能」とは、必要に応じて、動物またはヒトに投与された場合、有害な、アレルギー性のまたは他の有害な反応を生じない分子全体または組成物をいう。獣医学的使用、本発明に等しく包含され、そして「薬学的に受容可能な」処方物は、臨床的および／または獣医学的使用の両方のための処方物を含む。
本明細書において使用する場合、「薬学的に受容可能なキャリア」としては、任意のおよび全ての、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤および吸着遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質のための、そのような媒体および薬剤の使用は、当該分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性成分と不適合である場合を除いて、治療的組成物中でのその使用が意図される。ヒトへの投与のために、調製物は、ＦＤＡ官庁の生物製剤の基準によって必要とされる、滅菌性、発熱性、一般的安全性および純度の基準を充たすべきである。補助的な活性成分もまた、組成物中に組込まれ得る。
「単位用量」処方物は、特定の時機に合わせられた送達に適合される投与成分の用量または副用量を含む。例えば、例示的な「単位用量」処方物は、日用量もしくは日用量単位もしくは日副用量または週用量もしくは週用量単位もしくは週副用量などを含む処方物である。
（Ｄ１．注射可能処方物）
本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体ベース抗体もしくは２Ｃ３ベース抗体または免疫結合体は、最もしばしば、非経口投与（例えば、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、経皮経路、または、ぜん動投与および腫瘍もしくは疾患部位中への直接滴下（腔内投与）を含むそのような経路を介する注射のために処方され得る）のために処方される。治療剤−標的化剤構築物を活性成分として含有する水性組成物の調製は、本明細書の開示を参照すれば、当業者に公知である。代表的には、そのような組成物は、水溶液または懸濁液のいずれかにおいて、注射可能な薬剤として調製され得る；注射前の液体への添加において、溶液または懸濁液を調製するための使用に適切な固体形態もまた調製され得る；そしてその調製物はまた、乳化され得る。
注射での使用に適切な薬学的形態としては、滅菌水溶液または滅菌懸濁液；ゴマ油、ピーナッツオイル、または水性プロピレングリコールを含む処方物；および滅菌注射可能溶液または滅菌注射可能懸濁液の即時調製のための滅菌粉末、が挙げられる。全ての場合において、その形態は、滅菌であるべきであり、そして注射可能性が存在する程度に流動性であるべきである。それは、製造および保存の条件下において安定であるべきであり、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の混入作用に対して、保護されるべきである。
ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体または免疫結合体組成物は、中性または塩の形態において、滅菌水性組成物中に処方され得る。遊離の塩基、または薬理学的に受容可能な塩としての溶液は、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合された水中で調製され得る。薬学的に受容可能な塩としては、酸添加塩（タンパク質の遊離のアミノ基を用いて形成される）、および無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）または有機酸（例えば、酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸）などを用いて形成される塩などが挙げられる。遊離のカルボキシ基を用いて形成される塩はまた、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化鉄（ＩＩＩ））および有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン）などから誘導され得る。
適切なキャリアとしては、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、ならびに植物油を含む、溶媒および分散媒体が挙げられる。多くの場合において、等張剤（例えば、糖類または塩化ナトリウム）を含むのが好ましい。適切な流動性は、例えば、コーティング剤（例えば、レシチン）の使用によって、分散の場合において必要とされる粒子サイズの維持によって、および／または界面活性剤の使用によって、維持され得る。
貯蔵および使用の通常の条件下において、全てのそのような調製物は、防腐剤を含有し、微生物の増殖を防ぐべきである。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によってもたらされ得る。注射可能な組成物の長期の吸収は、遅延型吸収剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の組成物中での使用によってもたらされ得る。
処方の際、または処方前に、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体または免疫結合体は、広範に透析され、所望されない低分子物質を除去するか、および／または、適切な場合、所望のビヒクル中へのより容易な処方のために凍結乾燥されるべきである。滅菌の注射可能溶液は、必要とされる量の活性薬剤を、適切な溶媒中に、上記に列挙した他の種々の成分とともに取り込まれ、必要に応じて、その後に濾過滅菌されることにより調製される。一般に、分散剤は、種々の滅菌活性成分を、塩基性分散媒体および上記に列挙される必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に取り込まれることにより、調製される。
滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分、および以前に滅菌濾過されたその溶液由来の任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥およびフリーズドライ技術である。
本発明に従う適切な薬学的組成物は、一般に、受容可能な薬学的希釈剤または賦形剤（例えば、滅菌水溶液）と混合されたある量のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体または免疫結合体を含み、意図される使用に依存して、ある範囲の最終濃度を生じる。調製の技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８０（本明細書において参考として援用される）によって例示されるように、一般に当該分野において周知である。エンドトキシンの混入は、安全なレベルに最小限に維持されるべきである（例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満）ことを理解するべきである。さらに、ヒトへの投与について、調製物は、ＦＤＡ官庁の生物製剤基準によって必要とされる、滅菌性、発熱性、一般的安全性および純度の基準を充たすべきである。処方の際に、抗体または免疫結合体溶液は、投薬量処方と適合する様式において、およびそのような治療的有効量において、投与される。
（Ｄ２．徐放性処方物）
ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体または免疫結合体溶液の処方物は、種々の投薬形態（例えば、上記の注射可能な溶液の型）において容易に投与されるが、他の薬学的に受容可能な形態（例えば、錠剤、ピル、カプセルまたは経口投与のための他の固体、座剤、腟坐薬、経鼻溶液またはスプレー、エアロゾル、吸入剤、リポソーム形態など）もまた意図される。投与形態の型は、処置される疾患または障害に適合される。
薬学的「遅放性」カプセルまたは「徐放性」組成物または調製物が、使用され得、そして一般的に適用可能である。徐放性処方物は、一般に、長期間にわたって一定の薬物レベルを生じるように設計され、そして本発明に従うＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体または免疫結合体を送達するために使用され得る。
徐放性調製物の適切な例としては、抗体または免疫結合体を含む固形疎水性ポリマーの半浸透性マトリックスが挙げられ、これらのマトリックスは、成形された物品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。徐放性マトリックスの例としては、以下が挙げられる：ポリエステル；ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））；ポリラクチド（例えば、米国特許第３，７７３，９１９号）；Ｌ−グルタミン酸およびγエチルＬ−グルタメートのコポリマー；非分解性エチレン−酢酸ビニル；分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、Ｌｕｐｒｏｎ ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリドアセテートからなる注射可能なミクロスフェア））；およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸。
エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、分子を１００日間にわたって放出し得、特定のヒドロゲルは、タンパク質をより短期間で放出する。カプセル化抗体が身体内に長時間残留する場合、３７℃で湿気に曝露される結果としてこれらは変性または凝集し得、従って生物学的活性を減少し、かつ／または免疫原性を変化する。合理的なストラテジーは、関与する機構に依存した安定化に利用可能である。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド相互変換を介した分子間Ｓ−Ｓ結合形成に関与する場合、安定化は、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加物の使用、特定のポリマーマトリクス組成物の開発などによって達成される。
（Ｄ３．リポソームおよびナノカプセル）
特定の実施形態において、リポソームおよび／またはナノカプセルもまた、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体または免疫結合体とともに使用され得る。リポソームの処方および使用は、以下に要約されるように、当業者に、一般に公知である。
リポソームは、水性媒体中に分散されるリン脂質から形成され、そして自発的に多層の同心の二重層ビヒクル（多層ビヒクル（ＭＬＶ）とも称する）を形成する。ＭＬＶは、一般に、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、中心に水溶液を含有する、直径２００〜５００Åの範囲の小さな単層のビヒクル（ＳＵＶ）を生じる。
リン脂質は、水中に分散される場合、水に対する脂質のモル比に依存して、リポソーム以外の多様な構造を形成し得る。低い比において、リポソームは、好ましい構造である。リポソームの物理学的特徴は、ｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。リポソームは、イオンおよび極性物質に対する低い透過性を示し得るが、高温において、その透過性を顕著に変化させる相転移を受ける。相転移は、ゲル状態として公知の密接に充填された、規則正しい構造から、流体状態として公知の疎に充填された、より規則正しくない構造への変化を含む。これは、特徴的な相転移温度において生じ、そしてイオン、糖および薬物の透過性を増加する。
リポソームは、４つの異なる機構を通じて、細胞と相互作用する：マクロファージおよび好中球のような細網内皮系の食細胞によるエンドサイトーシス；非特異的な弱い疎水的な力、もしくは静電的な力のいずれかによるか、または細胞表面成分との特異的な相互作用による細胞表面への吸着；リポソーム含有物の細胞質への同時放出をともなう、リポソームの脂質二重層の形質膜への挿入による形質細胞膜との融合；および、リポソームの内容物の会合をいずれもともなわない、リポソーム脂質の、細胞膜または細胞内（オルガネラ）膜への移入、あるいはその逆。１つより多い機構が同時に作動し得るが、リポソームの処方を変化させることは、作動する機構を変更し得る。
ナノカプセルは、一般に、安定にかつ再現性のある方法において、化合物を捕獲し得る。細胞内へのポリマー性の過剰負荷に起因する副作用を避けるために、そのような超微細粒子（約０．１μｍのサイズ）が、インビボで分解され得るポリマーを使用して設計されるべきである。これらの要求を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子は、本発明における使用において意図され、そしてそのような粒子は、容易に作製され得る。
（Ｄ４． 眼性処方物）
脈管形成成分を有する多くの疾患は、眼に関する。例えば、本発明に従って処置され得る、角膜新生血管形成に関する疾患としては、糖尿病網膜症、未熟児網膜症、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障および水晶体後線維増殖症、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズ過剰装着、アトピー性角膜炎、上輪部角膜炎、翼状角膜炎症候群、シェーグレン、酒性挫瘡、フリクテン症（ｐｈｙｌｅｃｔｅｎｕｌｏｓｉｓ）、梅毒、マイコバクテリア感染、脂質変性、化学的焼灼、微生物潰瘍、真菌潰瘍、単純疱疹感染、帯状疱疹感染、カポージ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン辺縁変性、辺縁角質溶解、外傷、リウマチ様動脈炎、全身性狼瘡、多発性動脈炎、ヴェーゲナー類肉腫症、強膜炎、スティーヴンズ−ジョンソン疾患、天疱瘡（ｐｅｒｉｐｈｉｇｏｉｄ）放射状角膜切開、ならびに角膜移植片拒絶が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明に従って処置され得る、網膜／脈絡膜新生血管形成に関する疾患は、糖尿病性網膜症、黄斑変性、鎌状赤血球貧血、類肉腫、梅毒、弾性線維性仮性黄色腫、パジェット病、静脈閉鎖、動脈閉鎖、頸動脈閉塞性疾患、慢性ブドウ膜炎／ビトリティス（ｖｉｔｒｉｔｉｓ）、マイコバクテリア感染、ライム病、全身性エリトマトーデス、未熟児網膜症、イールズ病、べチュット病、網膜炎または脈絡膜炎を引き起こす疾患、推定眼ヒストプラスマン症、ベスト病、近視、視神経乳頭欠損、スターガート疾患、パースプラニティス（ｐａｒｓ ｐｌａｎｉｔｉｓ）、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、トキソプラスマ症、外傷およびレーザー後合併症が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明に従って処置され得る他の疾患としては、皮膚潮紅（角の新生血管形成）および血管結合組織または線維質組織の異常増殖（糖尿病に関係してもしなくても、増殖性硝子体網膜症のすべての形態を含む）によって引き起こされる疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
従って、本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体ベースの抗体および２Ｃ３ベースの抗体ならびに免疫結合体は、眼性溶液として使用するために適切な薬学的組成物の調製において有利に使用され得、この薬学的組成物は、硝子体内および／または房内（ｉｎｔｒａｃａｍｅｒａｌ）投与のための組成物を含む。前述の障害または他の障害の処置のために、本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体組成物または２Ｃ３ベースの抗体組成物のいずれかは、従来の薬学的慣行（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５編、１４８８〜１５０１頁（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）を参照のこと）に従って調製された眼性調製物の形態で処置の必要な非験体の眼に投与される。
眼性調製物は、薬学的に受容可能な溶液、懸濁液または軟膏中に約０．０１〜１重量％、好ましくは約０．０５〜約０．５重量％の濃度でＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体を含む。濃度のいくらかの変更は、使用する特定の化合物、処置される被験体の状態などに依存して必要に生じ、そして処置の担当者は、個々の被験体について最も適切な濃度を決定する。眼性調製物は、好ましくは、滅菌水溶液の形態であり、所望の場合、さらなる成分、例えば、防腐剤、緩衝液、弾力剤、酸化防止剤および安定剤、非イオン性湿潤剤または浄水剤、粘性増加剤などを含む。
このような溶液において使用するための適切な防腐剤としては、塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンズエトニウム、クロロブタノール、チメロサールなどが挙げられる。適切な緩衝液としては、約ｐＨ６とｐＨ８との間、好ましくは、約ｐＨ７とｐＨ７．５との間のｐＨを維持するために十分な量の、ホウ酸、炭酸水素ナトリウムおよびカリウム、ホウ酸ナトリウムおよびカリウム、炭酸ナトリウムおよびカリウム、酢酸ナトリウム、ビリン酸（ｂｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ナトリウムなどが挙げられる。適切な弾力剤は、デキストラン４０、デキストラン７０、デキストロース、グリセリン、塩化カリウム、プロピレングリコール、塩化ナトリウム、などであり、眼性溶液の塩化ナトリウム当量は、０．９±０．２％の範囲である。
適切な酸化防止剤おおび安定剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ亜硫酸ナトリウム、チオ尿素などが挙げられる。適切な湿潤剤および浄水剤としては、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロキサマー２８２およびチロキサポールが挙げられる。適切な粘性増加剤としては、デキストラン４０、デキストラン７０、ゼラチン、グリセリン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ラノリン、メチルセルロース、ペトロラタム、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなどが挙げられる。眼性調製物は、例えばドロップの形態で従来の方法によってか、または眼性溶液中に眼を浸すことによって処置の必要な被験体の眼に局所的に投与される。
（Ｄ５．局所処方物）
広範な意味で、局所投与のための処方物は、口（頬側）を介してかつ皮膚を通して送達するための処方物を含む。「局所送達システム」はまた、投与される成分を含む経皮的パッチを含む。皮膚を通す送達は、所望の場合、イオン注入または電気的運搬によってさらに達成され得る。
口において局所投与するための適切な処方物は、風味のある基礎原料の成分、通常は、ショ糖およびアカシアまたはトラガカントを含むロゼンジ；不活性基礎原料（例えば、ゼラチンおよびグリセリン）の活性成分またはショ糖およびアカシアを含む香錠；ならびに適切な液体キャリアで投与される成分を含むうがい薬が挙げられる。
皮膚に局所投与するための適切な処方物としては、軟膏、クリーム、ゲルおよび泥膏（薬学的に受容可能なキャリアで投与される成分を含む）が挙げられる。局所使用（例えば、クリーム、軟膏およびゲルで）のためのＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦまたは２Ｃ３ベース抗体の処方物としては、当該分野で周知のような、脂肪性基剤または水溶性軟膏基剤の調製物が挙げられる。例えば、これらの組成物は、野菜オイル、動物性脂肪、が挙げられ、そしてより好ましくは、石油から得た半個体炭化水素が挙げられ得る。使用される特定の成分は、白色軟膏、黄色軟膏、セチルエステルワックス、オレイン酸、オリーブオイル、パラフィン、ペトロラタム、白色ペトロラタム、鯨蝋、グリセリンデンプン、白色ワックス、黄色ワックス、ラノリン、無水ラノリンおよびモノステアリン酸グリセリルが挙げられ得る。種々の水溶性軟膏剤が、使用され得、グリコールエーテルおよび誘導体、ポリエチレングリコール、ポリオキシル４０ステアレート、ならびにポリソルベートが挙げられる。
直腸投与のための処方物は、適切な基剤（例えば、ココアバターまたはサリチレートを含む）とともに坐剤として与えられ得る。膣投与のための適切な処方物は、さらなる活性成分（例えば、当該分野で適切であると知られるキャリア）を含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、泥膏、包状物、またはスプレー処方物として与えられ得る。
（Ｄ６．鼻性処方物）
鼻経路および呼吸器経路を介する局所送達は、種々の状態を処置するために意図される。これらの送達経路はまた、薬剤を全身性循環に送達するために適切である。従って、鼻性投与のための適切なキャリアにおける活性成分の処方物は、本発明内に含まれ、例えば、鼻性溶液、スプレー、エアロゾルおよび吸入剤が挙げられる。キャリアが個体である場合、処方物は、例えば、２０〜５００ミクロンの範囲の粒子サイズを有する粗散剤が挙げられ、例えば、鼻に近接して維持される散剤のコンテナから鼻経路を通る急速な吸入によって投与される。
キャリアが液体である適切な処方物は、鼻投与において有用である。鼻溶液は、通常は、ドロップまたはスプレーで鼻経路に投与されるように設計される水溶液であり、そしてそれらが、多くの局面において鼻分泌物と類似であり、通常の線毛作用が維持されるように調製される。従って、鼻水溶液は、通常、等張性であり、そして５．５〜６．５のｐＨを維持するようにわずかに緩衝化される。さらに、必要な場合、眼性調製物において使用される防腐剤と類似の抗菌防腐剤および適切な薬物安定剤は、処方物中に含まれ得る。種々の市販の鼻性調製物は、公知であり、そして例えば、抗生物質および抗ヒスタミン剤が挙げられ、ぜん息予防に使用される。
吸入薬および吸入剤は、薬物または化合物の患者の呼吸樹への送達のために設計される薬学的調製物である。蒸気または霧が、投与され、そして有効領域に到達する。この経路はまた、薬剤を全身性循環に送達するために使用され得る。吸入薬は、鼻または口呼吸性経路によって投与され得る。吸入薬溶液の投与は、この液滴が十分に微細でかつサイズが均一であり、その結果、この霧が、細気管支に到達する場合にのみ、有効である。
製品の別のグループ（吸入薬としても公知であり、そして時には、吸入剤といわれる）は、特異的送達システムの使用によって呼吸経路に運ばれる微細な散剤薬物または液体薬物（例えば、薬学的エアロゾル）を含み、液体ガス噴霧剤中に薬物の溶液または懸濁液を維持する。適切なバルブおよび口アダプターを通して放出される場合、吸入薬の測定用量は、患者の呼吸路に進められる。粒子サイズは、この型の調製物の投与において主に重要である。肺腔への穿通のための最適粒子サイズは、０．５〜７μｍのオーダーであると、報告されてきた。微細な霧は、加圧エアロゾルによって産生され、それによって、それらの使用の利点が、考慮される。
（Ｅ．治療用キット）
本発明はまた、本発明の処置方法における使用のためのＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体または免疫結合体を含む治療用キットを提供する。そのようなキットは、一般に、適切な容器手段において、少なくとも１つのＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体または免疫結合体の薬学的に受容可能な処方物を含有する。このキットはまた、診断／造影または組み合わせ治療のいずれかのための、他の薬学的に受容可能な処方物を含む。例えば、そのようなキットは、化学治療剤または放射線治療剤；抗脈管形成剤；抗腫瘍細胞抗体；および／あるいは抗腫瘍脈管構造性または抗腫瘍支質性のイムノトキシンまたはコアグリガンドのある範囲の任意の１つ以上を含み得る。
このキットは、任意のさらなる成分を含むか、または含まないＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体または免疫結合体を含む１つの容器（容器手段）を有し得るか、あるいは各所望の薬剤のために別々の容器を有し得る。組み合わせ治療剤が提供される場合、単一の溶液が、モル等価の組み合わせにおいてか、または１つの成分が他の成分より過剰においてのいずれかで、予め混合され得る。あるいは、キットの各ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体または免疫結合体および他の抗癌剤成分は、患者への投与前に、異なる容器中で別々に維持され得る。
このキットの成分が、１つ以上の液体中で提供される場合、液体は、好ましくは、水溶液であり、特に滅菌水溶液が好ましい。しかし、このキットの成分は、乾燥粉末において提供され得る。試薬または成分が乾燥粉末として提供される場合、この粉末は、適切な溶媒の添加によって再構成され得る。この溶媒もまた別の容器中で提供され得ることが意図される。
キットの容器は、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器手段を含み、これらの中でＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体または免疫結合体および任意の他の所望の薬剤が、好ましくは適切なアリコートで、配置され得る。別々の成分が含まれる場合、このキットはまた、一般に第２のバイアルまたは他の容器を含み、これらの中にこの成分が配置され、別々に設計された用量での投与を可能にする。このキットは、滅菌の、薬学的に受容可能な緩衝液または他の希釈剤を含むための第２／第３の容器手段もまた、含み得る。
このキットはまた、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体または免疫結合体を動物または患者に投与するための手段（例えば、１つ以上の針またはシリンジ、あるいは点眼剤、ピペット、または他のそのような装置）を含み、その手段によって、この処方物が、動物に注入され得るか、または身体の疾患領域に適用され得る。本発明のキットはまた、代表的に、バイアルなど、および他の成分を、市販のために密接な拘束において含む手段（例えば、射出成形またはブロー成形したプラスチック容器）を含み、これらの手段の中で、所望のバイアルおよび他の装置が配置され、そして保持される。
（Ｆ．抗脈管形成治療）
本発明は、例えば、種々の疾患および障害に寄与する、異常な脈管形成を有する動物および患者を処置するために、使用され得る。これらのうちで最も普及した、および／または臨床的に重要なものは、癌処置の分野以外に、以下を含む：関節変形、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、グレーヴズ病、血管性再狭窄（以下の再狭窄を含む：血管形成術、動静脈機能不全（ＡＶＭ）、髄膜腫、血管腫および血管新生緑内障）。介入についての他の潜在的な標的には、以下が挙げられる：血管線維腫、アテローム性動脈硬化症斑、角膜移植新生血管形成、血友病性関節、肥大性瘢痕、オースラー−ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫水晶体後線維増殖症、強皮症、トラコーマ、脈管接着、滑膜炎、皮膚炎、種々の他の炎症性疾患および障害、ならびに子宮内膜症。本発明によって処置可能なさらなる疾患および障害、ならびにこのような脈管形成障害の統一的な基礎が、以下に記載される。
新脈管形成が関連する１つの疾患は、慢性関節リウマチであり、ここで、関節の滑膜内壁における血管は、新脈管形成を起こす。新しい脈管ネットワークの形成に加えて、内皮細胞は、パンヌス増殖および軟骨破壊に導く、因子および反応性酸素種を放出する。新脈管形成に関連する因子は、慢性関節リウマチの慢性的な炎症状態に能動的に寄与し、そして維持するのを助け得る。新脈管形成に関連する因子はまた、変形性関節症において役割を有し、関節の破壊に寄与する。
Ｈａｒａｄａら（１９９８，本明細書中で参考として具体的に援用される）は、ＶＥＧＦが、慢性関節リウマチの病因に関係し、そしてさらに、ＶＥＧＦの血清濃度の測定が、慢性関節リウマチの疾患活性をモニターするための、非侵襲性の有用な方法であることを示した。このことは、慢性関節リウマチと関連する本発明の治療的用途および診断的用途を支持する。
Ｎａｇａｓｈｉｍａら（１９９９，具体的に、本明細書中で参考として援用される）は、培養されたリウマチ滑膜細胞におけるＶＥＧＦに対する抗リウマチ薬物の阻害効果を記載する。ＶＥＧＦは、慢性関節リウマチの滑膜において恒常的に発現される。公知の抗リウマチ薬物（ブシラミン（ＢＵＣ））は、その作用機構内に、滑膜細胞によるＶＥＧＦ産生の阻害を含むことが示されている。従って、ＢＵＣの抗リウマチ効果は、滑膜細胞によるＶＥＧＦ産生の阻害を介して、リウマチ滑膜における新脈管形成および滑膜増殖の抑制によって媒介される。抗リウマチ治療としての本発明の使用は、この現存する治療薬のＶＥＧＦ阻害作用によって支持される。
新脈管形成によって媒介される疾患の別の例は、眼血管新生疾患である。この疾患は、眼の構造（例えば、網膜または角膜）への新しい血管の侵入によって特徴付けられる。それは、失明に最も一般的な原因であり、そして約２０の眼の疾患に関係する。加齢性黄斑変性において、関連した視覚問題は、網膜色素上皮の真下での維管束組織の増殖を有するブルーフ膜における欠陥を介する脈絡膜毛細管の内殖によって引き起こされる。脈管形成損傷はまた、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒絶、血管新生緑内障および水晶体後線維増殖症と関連する。
角膜新生血管形成に関連する他の疾患には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠損、コンタクトレンズ過剰装着（ｏｖｅｒｗｅａｒ）、萎縮性角膜炎、上輪部角膜炎、翼状角膜炎乾燥症、シェーグレン症（ｓｊｏｇｒｅｎｓ）、しゅさ性挫瘡、フリクテン症（ｐｈｙｌｅｃｔｅｎｕｌｏｓｉｓ）、梅毒、マイコバクテリア感染、脂質変性、化学的やけど、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純疱疹感染、帯状疱疹感染、原虫感染、カポージ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン辺縁変性、辺縁角膜炎、慢性関節リウマチ、全身性狼瘡、多発性動脈炎、外傷、ヴェーゲナー類肉腫症、強膜炎、スティーヴンズ−ジョンソン疾患、脈絡放射状角膜切開、および角膜移植片（ｇｒａｐｈ）拒絶。
網膜／脈絡膜新生血管形成に関連する疾患には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：糖尿病性網膜症、黄斑変性、鎌状赤血球貧血、サルコイド、梅毒、弾性線維性仮性黄色腫、パジェット病、静脈閉鎖、動脈閉鎖、頸動脈閉塞性疾患、慢性ブドウ膜炎／硝子体炎（ｖｉｔｒｉｔｉｓ）、マイコバクテリア感染、ライム病、全身性エリテマトーデス（ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｉｓ）、未熟児網膜症、イールズ病、ベチェット病（Ｂｅｃｈｅｔｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、網膜症または脈絡膜炎を引き起こす感染、推定眼ヒストプラスマ症、ベスト病、近視、視神経乳頭の先天的な構造上の欠損、シュタルガルト病、扁平部炎、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、トキソプラスマ症、外傷およびレーザー処置後の合併症。
他の疾患には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ルベオーシス（角の新生血管形成）に関連する疾患、および増殖性硝子体網膜症の全ての形態を含む維管束組織または線維性組織の異常増殖によって引き起こされる疾患。
慢性炎症はまた、病理学的新脈管形成に関連する。潰瘍性大腸炎およびクローン病のようなこのような疾患状態は、新しい血管の炎症性組織への内殖とともに、組織学的変化を示す。南アメリカに見出されるバルトネラ症（細菌性感染）は、脈管内皮細胞の増殖によって特徴付けられる慢性的な段階を生じ得る。
新脈管形成に関連する別の病理学的役割は、アテローム性動脈硬化症に見出される。血管の管腔内に形成されるプラークは、脈管形成刺激活性を有することが示されている。ヒト冠動脈硬化性病変におけるＶＥＧＦの発現は、Ｉｎｏｕｅら（１９９８、具体的に、本明細書中で参考として援用されている）によって立証されている。このことは、ヒト冠状動脈硬化の進行において、および閉塞性冠疾患における再疎通プロセスにおけるＶＥＧＦの病態生理学的重要性を明らかにする。本発明は、このような状態のための有効な処置を提供する。
小児期の最も頻繁な脈管形成疾患の１つは、血管腫である。ほとんどの場合において、腫瘍は良性であり、そして介入なく退行する。より重篤な場合において、腫瘍は、大きな空洞性かつ浸潤性の組織に進行し、そして臨床的な合併症を作り出す。血管腫の全身的な形態である、血管腫症（ｈｅｍａｎｇｉｏｎｍａｔｏｓｅｓ）は、高い死亡率を有する。現在使用される治療法を用いて処置され得ない治療耐性血管腫が存在する。
新脈管形成はまた、オースラー−ウェーバー−ランデュ病、つまり遺伝性出血性毛細管拡張症のような遺伝性疾患に見出される損傷についての原因である。これは、血管またはリンパ管の複数の小さな血管腫、腫瘍によって特徴付けられる遺伝疾患である。血管腫は、皮膚および粘膜に見出され、しばしば、鼻出血（鼻血）または胃腸出血によって、ならびにときどき肺および肝動静脈瘻を伴って生じる。
新脈管形成はまた、生殖および創傷治癒のような通常の生理学的プロセスに関係する。新脈管形成は、排卵、およびまた、受精後の胞胚の着床において重要な工程である。新脈管形成の阻止により、排卵をブロックするために、または胞胚による着床を防止するために無月経を誘導し得る。
創傷治癒において、過剰修復または線維増殖症は、外科手順の有害な副作用であり得、そして新脈管形成によって引き起こされ得るか、または悪化され得る。接着は、手術の頻繁な合併症であり、そして小腸閉塞症のような問題に導く。
所望でない脈管浸透性によって特徴付けられる疾患および障害はまた、本発明によって処置され得る。これらは、脳腫瘍と関連した水腫、悪性疾患と関連した腹水、メグズ症候群、肺炎症、ネフローゼ症候群、心内膜液浸出および胸水を含み、ＷＯ ９８／１６５５１に開示され、本明細書中で参考として援用される。
以下の節に記載されるように、先の疾患および障害の各々は、全ての型の腫瘍とともに、例えば、米国特許第５，７１２，２９１号（具体的に、本明細書中で参考として援用される）に記載されるように、当該分野の知識にしたがって、本発明によって効果的に処置され、統合された利益が、脈管形成疾患の処置への抗脈管形成ストラテジーの適用から生じる。
本発明の抗体および／または免疫結合体は、最も好ましくは、腫瘍の処置において利用される。新脈管形成が重要である腫瘍は、悪性腫瘍および良性腫瘍を含み、例えば、神経腫、神経線維腫、トラコーマおよび化膿性肉芽腫である。新脈管形成は、固形腫瘍形成および転移において、特に顕著である。しかし、新脈管形成はまた、血液生成腫瘍（ｂｌｏｏｄ−ｂｏｒｎ ｔｕｍｏｒ）（例えば、白血病）、および白血球の非制限増殖が起こる骨髄の種々の急性または慢性の腫瘍性疾患（通常、貧血、障害性血液凝固、およびリンパ節、肝臓および脾臓の膨大を伴う）に関連する。新脈管形成はまた、白血病様の腫瘍を生じる、骨髄における異常において役割を果たす。
新脈管形成は、腫瘍転移の２つの段階において重要である。一次腫瘍の血管新生において、新脈管形成は、細胞が、血液流に入ること、そして身体内を循環することを可能にする。腫瘍が一次部位を離れ、そして二次の転移部位に定着した後、新管脈形成は、新しい腫瘍が増殖し得、そして拡大する前に、生じなくてはならない。従って、新脈管形成の防止は、腫瘍の転移を妨げ得、そして１次部位における腫瘍性増殖を含み得、他の治療法、特に、治療剤−標的化薬剤構築物による処置を可能にする（以下を参照のこと）。
本発明によって提供されるＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体および２Ｃ３ベース抗体法または免疫結合体法は、従って、脈管成分を有する任意の悪性腫瘍の処置に広範囲に適用可能である。腫瘍、特に血管新生化された、悪性腫瘍の処置に、本発明の抗体および／または免疫結合体を使用する際に、薬剤は、単独でか、または例えば、化学療法剤、放射線療法剤、アポトーシス剤、抗脈管形成剤および／あるいはイムノトキシンまたはコアグリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄ）と組み合せて使用され得る。
処置のための代表的な血管新生化腫瘍は、固形腫瘍、特に癌であり、これらは酸素および養分の供給のために、脈管成分を必要とする。本発明を使用して処置され得る例示的な固形腫瘍としては、肺、胸部、卵巣、胃、膵臓、喉頭、食道、精巣、肝臓、耳下腺、胆管、結腸、直腸、頚部、子宮、子宮内膜、腎臓、膀胱、前立腺、甲状腺の腫瘍、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌腫、メラノーマ、グリオーム、神経芽細胞腫などが挙げられるが、これらに限定されない。ＷＯ ９８／４５３３１は、抗ＶＥＧＦ抗体を使用して、効果的に処理され得る種々の腫瘍型をさらに例示するために、本明細書中で参考として援用される。
腫瘍の維持および転移における新脈管形成の役割の知識は、乳癌のような癌に対する予後インディケーターに導く。一次癌に見出される新生血管形成の量は、侵襲性乳癌において最も激しい新生血管形成の範囲における微小血管密度を計測することによって決定された。高レベルの微小血管は、腫瘍再発と相関することが見出された。本発明の治療による新脈管形成の制御は、このような腫瘍の再発を減少するか、または打ち消す。
本発明は、固形腫瘍が存在する任意の患者の処置における使用に対して考慮される。ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体ベースの組成物の特定の特性の観点から、本発明の治療剤は、減少した副作用を有する。特定の利点は、マクロファージによって媒介され、そして骨組織に対する不利な効果を欠く、腫瘍に対する宿主免疫応答の維持または増強を生じる。本発明は、従って、小児癌および骨粗しょう症および他の骨欠損症を有するか、またはこれらが進行する危険性のある患者の処置のための選択の抗脈管形成治療であり得る。
全ての悪性疾患および固形腫瘍は、本発明によって処置され得るが、本発明の非結合体化ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体および２Ｃ３抗体は、より脈管形成的な腫瘍を有する患者、または転移の危険性を有する患者の処置における使用のために、特に考慮される。
本発明はまた、予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）処置または予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｖｅ）処置として意図される。本発明のこれらの局面は、本発明が、転移性腫瘍の播種の早い段階において転移性癌または腫瘍細胞を有し得る、一次腫瘍を提示する患者を処置する能力を含む。抗脈管形成ストラテジーとして、本発明はまた、腫瘍の進行に対して中程度または高度の危険性の被験体の腫瘍進行を防止するために使用され得、予後試験および／または遺伝性癌に苦しむ近親類に基づく。
本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体および２Ｃ３抗体の結合体化形態またはイムノトキシン形態は、固形腫瘍を破壊または脱バルク化（ｄｅ-ｂｕｌｋｉｎｇ）における使用について、特に考慮される。本発明のこれらの局面は、本発明の非結合体化抗脈管形成抗体とともに、または他の抗脈管形成アプローチとともに使用されうる。
本発明の処置方法の免疫結合体およびプロドラッグ形態は、以下の２つの特性を有する単一の治療剤を提供する別の利点を有することが当業者に明らかである：抗体の固有の抗脈管形成特性および取り付けられた薬剤の治療特性（例えば、細胞毒性、凝固性、アポトーシス性など）。従って、本発明の抗体の結合体化およびプロドラッグ処置形態は、癌治療の分野にわたって信じられないほどの広範な有用性を有する。
本発明の異なる局面と関係する使用についてより適切な患者に関して本明細書中に提供されるガイダンスは、特定の患者のプロフィールが、本発明による処置についての患者の選択を補助し得るという教示として意図される。特定の患者の予備選択、または患者のカテゴリーは、血管新生化腫瘍、または上記のような他の脈管形成疾患を有する全ての患者の処置に関係する本発明の有用性を、いかなる方法でも否定しない。さらなる考慮は、本発明によって提供される腫瘍に対する攻撃が、腫瘍をさらなる治療処置を受けやすくさせ、その結果、引き続く処置は全体的な相乗効果を生じるか、完全な寛解または治癒を導きさえする。
任意の特定の型の腫瘍が本発明を使用する処置から除外されることは考えられない。しかし、腫瘍細胞の型は、他の治療剤、特に化学療法剤および抗腫瘍細胞イムノトキシンを組合せた本発明の使用に関連し得る。本発明の治療の非結合体化および結合体化の局面は、腫瘍血管系増殖を阻害する抗脈管形成効果を含む。結合体化およびプロドラッグ処置局面は、さらに、腫瘍血管系を破壊するか、または閉鎖する。その血管系は実質的または全体的に全ての固形腫瘍で同じであるために、本発明の方法論は、腫瘍細胞自体の特定の表現型または遺伝子型に無関係に、全ての固形腫瘍の処置に広範に、または全体的に適用可能であることが理解される。
ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体または免疫結合体構築物の治療的有効用量は、例えば、本明細書中に詳述される研究に示されるように、動物モデルからのデータを使用して容易に決定可能である。固形腫瘍を保持する実験動物は、臨床環境に移行する前に適切な治療用量を最適化するために、しばしば使用される。このようなモデルは、効果的な抗癌ストラテジーを予測する際に非常に信頼性があることが公知である。例えば、固形腫瘍を保持するマウス（例えば、本実施例で使用される）は、前臨床試験において広範に使用される。本発明者らは、このような分野で受容されるマウスモデルを使用して、最小の毒性で有益な抗腫瘍効果を与える治療剤の作用範囲を決定した。
非結合体化ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体を、抗脈管形成治療において使用する際に、当業者はまた、臨床処置のための用量の処方を補助するために、他の公開されたデータを使用し得る。例えば、本発明の抗体は、当該分野の抗体に対して、異なる利点を有するが、他の抗ＶＥＧＦ抗体を用いる処置に関する文献における情報は、なお、処置プロトコルおよび用量を設計または最適化するために、本出願のデータおよび教示と組み合せて使用され得る。
例えば、Ｂｒｏｇｓｔｒｏｍら（１９９９）（具体的に、本明細書中で参考として援用される）は、ＭＡｂ Ａ４．６．１を使用して、インビボでの乳癌新脈管形成におけるＶＥＧＦの重要性を記載した。本発明の２Ｃ３様の抗体は、Ａ４．６．１との比較研究において、等価なまたは改良された抗腫瘍応答を示したが、これらの抗体はまた、乳癌の処置において有意な有用性を有する。本発明者らは、当業者によって理解されるように、乳癌を有する患者が、代表的に、中年または老年の集団の女性であることをさらに認め、ここで、骨粗しょう症に関する関与もまた、明らかである。従って、本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体は、骨代謝に対する不利な効果を引き起こさないさらなる利点を有し、そして骨粗しょう症を有するか、またはその進行の危険性を有する乳癌患者における使用に対して好ましくはない。
同じ型の利点は、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体および２Ｃ３ベースの治療剤を、小児癌の処置のための好ましい薬物にする。癌を有する子供において、健全なかつ実質的な骨成長を維持する必要性は、明らかである。ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、２Ｃ３）は、破骨細胞および軟骨吸収細胞の活性を実質的に損なわせず、これらは、骨の成長において重要であるので、２Ｃ３は、他の抗体（例えば、Ａ４．６．１）に比べて重要な利点を有する。
Ｂｒｏｇｓｔｒｏｍら（１９９９）（具体的に、本明細書中で参考として援用される）は、ＭＡｂ Ａ４．６．１は、ドキソルビシンと組み合せて使用される場合、有意な腫瘍後退を生じることを報告した。このことは、さらに、種々の癌を処置する際に、有意な臨床的な結果を達成するために、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体と従来の細胞毒性剤または化学治療剤とを組み合わせた使用を支持する。非結合体化ドキソルビシンおよびドキソルビシンプロドラッグ配合物の両方が、考慮される。
Ｆｅｒｒａｒａおよび共同研究者らはまた、腫瘍保有マウスにおけるマウス抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体の効力および濃度−応答、ならびにヒト処置への推定について報告した（Ｍｏｒｄｅｎｔｉら、１９９９、具体的に本明細書中で参考として援用される）。これらの研究は、マウス抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体の濃度−応答関係を評価するために設計され、その結果、抗体の組換えヒト化形態の有効血漿濃度が、癌患者において評価され得る。Ｍｏｒｄｅｎｔｉら（１９９９）は、ヌードマウスにおける満足のいく腫瘍抑制が、マウス抗体の用量を使用して達成され、この用量は、必要とされる有効範囲におけるヒト用途に対して治療抗体を維持するのに有効な臨床的な投薬レジメンを規定するために、ヒト系に容易に適用され得ると結論した。従って、本発明の技術を受容するマウスモデルからのデータはまた、本明細書中に記載されるような、当業者に公知の技術に加えて、Ｍｏｒｄｅｎｔｉら（１９９９）に報告された分析のタイプを使用して適切なヒト用量に変換され得る。
サルにおける組換えヒト化形態のＧｅｎｅｎｔｅｃｈの抗ＶＥＧＦ抗体（本明細書中に特に参考として援用されるＲｙａｎら，１９９９）の前臨床安全性評価の結果は、特定の候補治療剤に伴う欠点を例示するために役立つ。この抗体はこの動物において薬理学的活性を有するが、これらの研究においてサルは、過従属栄養軟骨細胞、肋軟骨下骨板形成、および成長板（ｇｒｏｗｔｈ ｐｌａｔｅ）の血管侵襲における用量関連増加により特徴付けられる骨端軟骨形成異常を示す。このような欠点は、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体および２Ｃ３ベースの治療剤の使用においては明らかでない。この使用は、ＶＥＧＦＲ１により媒介される軟骨吸収細胞および軟骨細胞におけるＶＥＧＦ結合およびシグナル伝達を阻害しない。
Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈのヒト化モノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体の前臨床的薬理学、種間比較（ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ ｓｃａｌｉｎｇ）および組織分布に対するさらなる研究によるデータは、Ｌｉｎら（１９９９，本明細書中に参考として援用される）により報告された。これらの研究は、マウス、ラット、サル、およびウサギにおいて行われており、後者（ウサギ）は、125Ｉ標識抗体が使用されている。マウス、ラットおよびサルからの薬理学的データを、ヒトにおける相対成長的（ａｌｌｏｍｅｔｒｉｃ）比較を使用してヒト化対応抗体の薬物動態を推定するために使用した。従って、適切な投薬量情報を、ヒトの病理状態（例えば、慢性関節リウマチ、眼の新生血管形成および癌）の処置のために開発し得る。
抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１のヒト化バージョンを、抗癌剤のような臨床試験において使用した（Ｂｒｅｍ，１９９８；Ｂａｃａら，１９９７；Ｐｒｅｓｔａら，１９９７；各々が本明細書中に参考として援用される）。従って、このような臨床データもまた、本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体および２Ｃ３処置の治療用量を設計する場合の参照供給源として考慮し得る。本発明は、腫瘍保有マウスの研究においてＡ４．６．１と同程度に２Ｃ３が有効であることを示すが、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２媒介作用のみを阻害することに対する特異性は利点である。ＷＯ９８／４５３３１はまた、本明細書中に参考として援用されて、処置において使用され得るヒト化抗ＶＥＧＦ抗体の用量を例示する。
腫瘍治療における結合体化ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの免疫結合体の使用に対して、当業者は、有益な効果を達成するために腫瘍血管系に広範な治療剤を送達するという成功に関する科学文献および特許文献を参照し得る。これらの文献としては、米国特許第５，８５５，８６６号；同第５，８７７，２８９号；同第５，９６５，１３２号；同第６，０５１，２３０号；同第６，００４，５５５号；同第５，７７６，４２７号；同第６，００４，５５４号；および同第６，０３６，９５５号；ならびに米国特許出願第０８／４８２，３６９号（登録費は１９９８年１０月２０日に支払われた）の各々が挙げられ、これらは、このような治療薬剤−標的化薬剤構築物の使用をさらに記載する目的で、本明細書中に参考として援用される。
当該分野で公知のように、臨床処置に進める前に、前臨床試験と関係するガイドラインとして使用され得る、現実的目的が存在する。しかし、臨床への他のＶＥＧＦ抗体の普及、本明細書中で示された受容されるモデルにおいてすでに実証された抗腫瘍効果、および現在のストラテジーの増強された安全性を鑑みて、本発明は、臨床的処置に対する最初の道を治療剤にもたらす。従って、前臨床試験は、最も有利な抗体、用量または組み合わせを選択するために利用され得る。
任意の一貫して検出可能な抗脈管形成効果、転移の阻害、腫瘍血管系破壊、腫瘍血栓症、壊死および／または一般的抗腫瘍効果を生じる、任意のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体または免疫結合体の用量または組合せられた医薬は、有用な発明を規定する。本発明はまた、腫瘍の血管下流に対して効果的であり得る。すなわち、本発明は、排出（ｄｒａｉｎｉｎｇ）血管の少なくともサブセットを標的化し、特に、腫瘍から放出されたサイトカインが、これらの血管に作用する場合に、これらの抗原性プロフィールを変化する。
ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体または免疫結合体の用量または組み合わせ治療の抗脈管形成および／または腫瘍効果が、意図された治療範囲の下端に向かうような状況下でさえ、この治療が、特定の腫瘍標的または患者の状況における他の全ての公知の治療となお等価であるか、またはより効果的でさえあることがあり得ることもまた理解される。特定の腫瘍および状態が中期間または長期間効果的に処置され得ないことは臨床医に不幸にも明らかであるが、特に一般的に提案されている他のストラテジーと少なくともほぼ同様に効果的である場合、それは、本発明の治療の有用性を否定しない。
血管新生化腫瘍の処置のための、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体もしくは免疫結合体構築物または組み合わせの治療薬の適切な用量を設計する際に、当業者は、臨床投与のための適切な用量に到達するために、本明細書中に記載される動物研究および文献における技術的常識から容易に推定し得る。動物からヒトへの用量のコンバージョンを達成するために、当業者は、実験動物の単位質量あたり投与される薬剤の質量を計算し、そして好ましくは、実験動物とヒト患者との間の体表面積（ｍ2）の差異を計算する。全てのこのような計算は、当業者に周知でありそして慣用的である。
例えば、マウス研究において２Ｃ３の成功用量を採用して、そして質量および表面積に基づく標準的計算を適用すると、ヒト患者における使用に効果的な用量は、約１ｍｇ／ｍ2〜約１０００ｍｇ／ｍ2、好ましくは、約５０ｍｇ／ｍ2〜約５００ｍｇ／ｍ2、そして最も好ましくは、約１０ｍｇ／ｍ2〜約１００ｍｇ／ｍ2である。これら用量は、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの裸の抗体およびＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの免疫結合体について適切であるが、この用量は、抗脈管形成剤として使用するための、裸のまたは非結合体化抗体に関連した使用に好ましい。
従って、この情報を使用して、本発明者らは、ヒト投与のための有用な低用量のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体または免疫結合体は、約１ｍｇ／ｍ2、２ｍｇ／ｍ2、３ｍｇ／ｍ2、４ｍｇ／ｍ2、５ｍｇ／ｍ2、６ｍｇ／ｍ2、７ｍｇ／ｍ2、８ｍｇ／ｍ2、９ｍｇ／ｍ2、１０ｍｇ／ｍ2、１２ｍｇ／ｍ2、１５ｍｇ／ｍ2、２０ｍｇ／ｍ2、２５ｍｇ／ｍ2、約３０ｍｇ／ｍ2、３５ｍｇ／ｍ2、４０ｍｇ／ｍ2、４５ｍｇ／ｍ2または約５０ｍｇ／ｍ2であり；そしてヒト投与のための有用な高用量のこのような抗体または免疫結合体は、約６００ｍｇ／ｍ2、６５０ｍｇ／ｍ2、７００ｍｇ／ｍ2、７５０ｍｇ／ｍ2、８００ｍｇ／ｍ2、８５０ｍｇ／ｍ2、９００ｍｇ／ｍ2、９２５ｍｇ／ｍ2、９５０ｍｇ／ｍ2、９７５ｍｇ／ｍ2または約１０００ｍｇ／ｍ2である。ヒト投与のための有用な中程度の用量のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベース抗体または免疫結合体は、約５５ｍｇ／ｍ2、６０ｍｇ／ｍ2、７０ｍｇ／ｍ2、８０ｍｇ／ｍ2、９０ｍｇ／ｍ2、１００ｍｇ／ｍ2、１２５ｍｇ／ｍ2、１５０ｍｇ／ｍ2、１７５ｍｇ／ｍ2、２００ｍｇ／ｍ2、２５０ｍｇ／ｍ2、３００ｍｇ／ｍ2、３５０ｍｇ／ｍ2、４００ｍｇ／ｍ2、４５０ｍｇ／ｍ2、５００ｍｇ／ｍ2、５２５ｍｇ／ｍ2、５５０ｍｇ／ｍ2または約５７５ｍｇ／ｍ2などの低用量と高用量との間の任意の用量であることが意図される。
上記に引用されたいずれかの例示的用量を用いる任意の特定の範囲または特定の記載された範囲の間の任意の中間の値が意図される。ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの免疫結合体が使用される場合、凝固薬免疫複合体が一般的に毒素免疫結合体より高用量で使用され得ることがまた理解される。
一般に、約１０〜１００ｍｇ／ｍ2、約１０〜９０ｍｇ／ｍ2、約１０〜８０ｍｇ／ｍ2、約２０〜１００ｍｇ／ｍ2、約２０〜９０ｍｇ／ｍ2、約２０〜８０ｍｇ／ｍ2、約３０〜１００ｍｇ／ｍ2、約３０〜９０ｍｇ／ｍ2、約３０〜８０ｍｇ／ｍ2、約１５〜１００ｍｇ／ｍ2、約２５〜１００ｍｇ／ｍ2、約３５〜１００ｍｇ／ｍ2、約１５〜９０ｍｇ／ｍ2、約２５〜９０ｍｇ／ｍ2、約３５〜９０ｍｇ／ｍ2の間の投薬量範囲、あるいはＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体もしくは免疫結合体のそのような投薬量範囲が好ましい。これらの記載の範囲にかかわらず、本明細書中に提示されたパラメーターおよび詳細なガイダンスを考慮して、活性または最適な範囲でのさらなる変更は、本発明の範囲内であることが理解される。
従って、他の薬剤と組合わせにおいて、低用量がより適切であり得、そして特に、ＶＥＧＦＲ２にのみ結合するＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体および２Ｃ３ベースの抗体の増強された安全性、ならびにＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体および２Ｃ３ベースの抗凝固薬および抗脈管形成免疫結合体のなおさらに増強された安全性を考慮すると、高用量がなお許容され得ることは理解されるべきである。ヒトまたはヒト化抗体（および必要に応じて、ヒト抗凝固薬または抗脈管形成タンパク質）の使用は、健常組織における有意な毒性または副作用の機会をさらに減少して、本発明を臨床使用のためにさらに安全にする。
本発明の治療レジメの意図は、一般的に、受け入れられない毒性に関連するレベル未満の用量をなお維持しながら、有意な抗腫瘍効果を生成することである。用量自体の変化に加えて、投与レジメはまた、処置ストラテジーを最適化するために採用され得る。１つの処置プロトコルは、約１ｍｇ／ｍ2〜１０００ｍｇ／ｍ2、好ましくは、約５０ｍｇ／ｍ2〜５００ｍｇ／ｍ2、そして最も好ましくは、約１０ｍｇ／ｍ2〜約１００ｍｇ／ｍ2のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体もしくは免疫結合体、あるいはこれらを含む治療カクテル（ｔｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃｏｃｋｔａｉｌ）を、１週間に１〜３回、好ましくは、静脈内または筋肉内投与により、最も好ましくは、静脈内投与により投与することである。
特定の用量の投与において、当業者は、好ましくは薬学的受容可能な組成物（無菌性、発熱性、純度および一般的な安定性のＦＤＡ基準に従う）を患者に全身的に提供する。静脈内注射が、一般的に好ましい。約１時間または２時間などの期間にわたって連続注入を使用することもまた意図される。
当然、広範な使用の前に、臨床試験が実施される。臨床試験の実行の種々のエレメント（患者の処置およびモニタリングを含む）は、本発明の開示に照らして当業者に公知である。以下の情報は、このような治験を確立する際の使用のための一般的なガイドラインとして提示されている。
第１のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの処置研究について選択される患者は、従来の治療の少なくとも１つの過程に応答せず、そして身体検査、実験技術、および／またはＸ線撮影手段によって決定されるような客観的に測定可能な疾患を有する。いずれの化学療法も、本研究に入る少なくとも２週間前に停止する。マウスモノクローナル抗体または抗体部分を使用する場合、患者はマウス免疫グロブリンに対するアレルギーの病歴を有さない。
特定の利点は、三管腔ポート（ｔｒｉｐｌｅ ｌｕｍｅｎ ｐｏｒｔ）を有する中心静脈カテーテルの留置を使用する際に見出される。ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの薬剤は、例えば、０．２２μフィルターを使用して濾過され、そして適切に（例えば、生理食塩水で）１００ｍｌの最終用量に希釈される。使用の前に、この試験サンプルはまた、同様の様式で濾過され、そしてＡ280を測定することによって濾過の前後でその濃度を評価される。予想される回収率は、８７％〜９９％の範囲内であり、次いで、タンパク質の損失についての調整が補正される。
ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体もしくは結合体は、約４〜２４時間の期間にわたって投与され、各患者は、２〜７日間の間隔で２〜４回の注入を受ける。投与はまた、７日間にわたって一定速度の注入によって実施され得る。任意の用量レベルで与えられる注入は、観察される任意の毒性に依存する。従って、グレードＩＩの毒性が、任意の単回注入後または一定速度注入の間の特定の期間で達した場合、毒性が改善されない限り、さらなる用量を中止するか、またはその一定速度注入を停止する。漸増用量のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの治療剤は、約６０％の患者が、任意のカテゴリーにおいて、受け入れられないグレードＩＩＩまたはＩＶの毒性を示すまで、患者群に投与される。この値の２／３である用量が、安全用量として定義される。
身体検査、腫瘍測定、および実験室試験は、もちろん、処置前および１ヶ月後までの間隔で実施される。実験室試験としては、全血球計数、血清クレアチニン、クレアチニンキナーゼ、電解質、尿素、ＳＧＯＴ、窒素、ビリルビン、アルブミン、および全血清タンパク質が挙げられる。処置後６０日までに採取された血清サンプルは、投与された治療剤、およびそのいずれかの部分に対する抗体の存在について放射免疫アッセイによって評価される。任意の標準的アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡのような）を使用する、血清の免疫学的分析は、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの治療剤の薬物動態およびクリアランスの評価を可能にする。
抗腫瘍応答を評価するために、患者を、最後の注入の、４８時間後〜１週間後に、そして再び３０日後に試験するべきである。触知可能な疾患が存在した場合、全ての塊の二つの垂直直径（ｐｅｒｐｅｎｄｉｃｕｌａｒ ｄｉａｍｅｔｅｒ）を、処置の間毎日、治療完了後１週間以内、および３０日で測定すべきである。触知可能でない疾患を測定するために、連続ＣＴスキャンが、胸部、腹部、および骨盤の全体を通して、１ｃｍ間隔で、４８時間〜１週間で、そして３０日で再び実施され得る。組織サンプルはまた、組織学的におよび／あるいはフローサイトメトリーにより、疾患部位から、または適切であれば血液もしくは体液サンプルからの生検を用いて評価されるべきである。
臨床応答は、受容可能な基準により規定され得る。例えば、完全な応答は、処置の１カ月後、全ての測定可能な腫瘍がみられないことにより規定され得る。これに対し、部分的な応答は、処置の１カ月後に、増大を示す腫瘍部位なしでの、全ての評価可能な腫瘍小節の垂直直径の積の和の５０％またはそれ以上の減少により規定され得る。同様に、混合応答は、処置の１カ月後に、一つ以上の部位での進行を伴った、全ての測定可能な病巣の垂直直径の積の５０％以上の減少により規定され得る。
上記のような臨床試験の結果を鑑みて、さらにより正確な処置レジメが処方され得る。そうであったとしても、投与量におけるいくらかのバリエーションは、処置される被験体の状態に依存して、後で必要であり得る。投与に責任をもつ医者は、本開示に鑑みて、個々の被験体に適切な用量を決定し得る。このような最適化および調節は、当該分野において慣用的に実施され、そして過剰な実験量をけっして反映しない。
（Ｇ．組合わせ治療）
脈管形成疾患（例えば、関節炎、乾癬、アテローム硬化症、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、グレーブス病、血管再狭窄、血管腫および血管新生緑内障（あまたは上記の他の疾患））または固形腫瘍を処置するために使用される場合、本発明は、他の治療と組合わされ得る。
本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの処置方法は、患者が示す特定の腫瘍、疾患または障害の処置において、一般的に使用される他の任意の方法と組み合わせられ得る。特定の治療的アプローチが、患者の状態に、それ自体で有害であることが公知でなく、そしてＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの処置を有意に相殺しない限り、本発明とのその組み合わせが意図される。
固形腫瘍処置と関連して、本発明は、古典的なアプローチ（例えば、手術、放射線治療、化学療法など）との組み合わせにおいて使用され得る。それゆえ、本発明は、組み合わせ治療を提供し、そこでは、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの構築物が、手術、または放射線処置と、同時に、その前に、またはその後に使用される；または従来の化学療法剤、放射線療法剤、または抗脈管形成剤、あるいは標的化イムノトキシンまたはコアグリガンドとともに、その前に、またはその後に、患者に投与される。
本発明と放射線療法、放射線療法薬剤、抗脈管形成薬剤、アポトーシス誘導薬剤および抗チューブリン薬物とを組合わせた使用は、特に好ましい。このような薬剤の多くの例は、本発明の免疫結合体とともに、上記で記載される。治療結合体の一部として使用するために最初に記載された任意の薬剤はまた、別々に使用され得るが、本発明と実施可能に組合わせても使用され得る。
１つ以上の薬剤がＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの治療との組み合わせにおいて使用される場合、組み合わされた結果が、各処置が別々に実施されるときに観察される効果の相加である必要性はない。少なくとも相加的効果が、一般的に、望ましいが、単一の治療の１つを超える増加した抗腫瘍効果が有益である。また、組み合わせ処置が相乗効果を示す特定の要件は存在しないが、これは、もちろん可能であり、かつ有利である。
組み合わせられた抗腫瘍治療を実施するために、動物内でそれらの組み合わされた抗腫瘍作用を生じるに効果的な様式で別の抗癌剤と組み合わせて、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの構築物を動物に単に投与する。従って、その薬剤は、腫瘍血管系内にそれらを組み合わせて存在させ、かつ腫瘍環境においてそれらの組み合わされた作用が生じるに、有効な量および有効な時間で提供される。この目的を達成するために、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの治療剤および抗癌剤が、同時に、単一の組成物または異なる投与経路を用いる２つの異なる組成物のいずれかにおいて、動物に投与され得る。
あるいは、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの処置は、抗癌剤処置の前に、または続いて、例えば、数分から数週間および数ヶ月にわたる間隔でなされ得る。当業者は、抗癌剤およびＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの薬剤は、腫瘍に対して有利な組合わせ効果を発揮することを確認する。
大部分の抗癌剤は、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗脈管形成治療の前に与えられ得る。しかし、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの免疫結合体が使用される場合、種々の抗癌剤が同時に、または続いて投与され得る。
癌の処置における物質の組み合わせの一般的な使用は、周知である。例えば、米国特許第５、７１０、１３４号（本明細書中に参考として援用される）は、非毒性物質または「プロドラッグ」との組み合わせにおいて腫瘍において壊死を誘導する成分を開示する。壊死プロセスにより放出された酵素は、非毒性の「プロドラッグ」を切断して、毒性の「薬物」にし、これは、腫瘍細胞死を導く。また、米国特許第５，７４７，４６９号（本明細書中に参考として援用される）は、ｐ５３およびＤＮＡ損傷因子（ＤＮＡ ｄａｍａｇｉｎｇ ａｇｅｎｔ）をコードするウイルスベクターの組み合わされた使用を開示する。任意のこのような類似のアプローチが、本発明とともに使用され得る。
いくつかの状況において、有意に処置期間を延長（それぞれの投与間に数日（２、３、４、５、６または７）、数週間（１、２、３、４、５、６、７または８）あるいはさらに数ヶ月（１、２、３、４、５、６、７または８）の経過）することは、望ましくさえあり得る。これは、１つの処置が、実質的に腫瘍を破壊することを意図し（例えば、手術及び化学療法）、そして別の処置が、微小転移巣または腫瘍の再増殖を予防することを意図する（例えば、抗脈管形成ベースの治療）状況において、有利である。抗脈管形成剤は、手術後に慎重に投与されて、効率的な創傷治癒を可能にすべきである。
ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの薬剤または抗癌剤のいずれかの一つを超える投与が利用されることがまた、想定される。これらの薬剤は、１日おきまたは１週間おきに、交換可能に投与され得る；または一連のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの処置が行われ、次いで、一連の抗癌剤治療が行なわれ得る。いずれにせよ、組み合わせ治療を用いて腫瘍の後退を達成するために、必要とされる全ては、投与時間にかかわらず、抗腫瘍効果を発揮するに有効な組み合わされた量で両方の薬剤を送達することである。
手術に関して、任意の外科的介入が、本発明との組み合わせにおいて実施され得る。放射線療法と関連して、腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡ損傷を誘導する任意の機構（例えば、γ照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、およびさらに電子発光（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｅｍｉｓｓｉｏｎ）など）が意図される。腫瘍細胞への指向されたラジオアイソトープの送達がまた意図され、そしてこれは、標的化抗体または他の標的化手段、および好ましくは、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、２Ｃ３）との関連において使用され得る。
サイトカイン治療はまた、組み合わされた治療レジメの有効なパートナーであることが実証された。種々のサイトカインは、そのような組み合わせアプローチにおいて使用され得る。サイトカインの例には、以下が挙げられる：ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＴＧＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＬＡＦ、ＴＣＧＦ、ＢＣＧＦ、ＴＲＦ、ＢＡＦ、ＢＤＧ、ＭＰ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＴＭＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ。サイトカインは、臨床的な指標（例えば、患者の状態、およびサイトカインの相対的な毒性）と一致する標準的なレジメに従って投与される。ウテログロビン（ｕｔｅｒｏｇｌｏｂｉｎ）をまた使用して、転移を予防または阻害し得る（米国特許第５，６９６，０９２号；本明細書中に参考として援用される）。
（Ｇ１．化学療法剤）
特定の実施形態において、本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの治療薬剤は、化学療法剤と組み合わせて投与され得る。種々の化学療法剤は、本明細書中に開示される組合わせ処置方法において使用され得る。例示として意図される化学療法剤としては、以下が挙げられる：例えば、アドリアマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、カルミノマイシン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、タモキシフェン、タキソール、タキソテール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｕｂｉｎｅ）、エトポシド（ＶＰ−１６）、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、チオテパ、メトトレキセート、カンプトセシン、アクチノマイシン−Ｄ、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、アミノプテリン、コンブレタスタチン（ｃｏｎｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）、ならびにそれらの誘導体およびプロドラッグ。
当業者に理解されるように、適切な用量の化学療法剤は、一般に、臨床治療においてすでに利用されてきており、ここで、この化学療法剤は、単独で、または他の化学療法剤と組み合わせて投与される。例示のみのために、シスプラチンのような薬剤、および他のＤＮＡアルキル化剤が使用され得る。シスプラチンは、癌を処置するために広範に使用され得、臨床適用において使用される有効な用量は、総計３つの経路について３週間毎に５日間２０ｍｇ／ｍ2である。シスプラチンは、経口で吸収されず、従って、注射を介して、静脈内で、皮下で、腫瘍内で、または腹腔内で送達されねばならない。
さらに有用な薬剤は、ＤＮＡ複製、有糸分裂、および染色体分離に干渉する化合物を含む。このような化学療法剤化合物には、アドリアマイシン（ドキソルビシンとしてもまた公知である）、エトポシド、ベラパミル、ポドフィロトキシンなどが挙げられる。新形成の処置のための臨床設定において広範に使用されるので、これらの化合物は、静脈内では、アドリアマイシンについて２１日間隔で２５〜７５ｍｇ／ｍ2からエトポシドについては３５〜５０ｍｇ／ｍ2までの範囲の用量で、静脈内にボーラス注射を通じて、または経口的に静脈内用量の２倍で、投与される。
ポリヌクレオチド前駆体の合成および忠実度を崩壊させる薬剤もまた使用され得る。特に有用なものは、広範な試験を受け、そして容易に利用可能な薬剤である。そのようなものとして、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような薬剤は，新形成組織によって優先的に使用され、新形成細胞に対する標的化のためにこの薬剤を特に有用にさせる。非常に毒性の５−ＦＵは、広範囲のキャリア（局所を含む）において適用可能であるが、３〜１５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量を有する静脈内投与が一般に使用される。
組合せ治療に関する例示的な化学療法剤は、表Ｃにおいて列挙される。そこで列挙される各薬剤は、例示的であり、そして限定することを意味しない。当業者は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、第３３章（特に６２４頁〜６５２頁）に指向される。投薬量における改変は、おそらく、処置されるべき被験体の状態に依存して生じる。処置を施す医師は、個々の被験体について適切な用量を決定し得る。
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（Ｇ２．抗新脈管形成）
正常な生理学的条件下では、ヒトまたは動物は、非常に特異的な制限された状況においてのみ新脈管形成を受ける。例えば、新脈管形成は、通常、創傷治癒、胎児および胚発生、ならびに黄体、子宮内膜および胎盤の形成において観察される。制御されていない（持続性のおよび／または調節されていない）新脈管形成は、種々の疾患状態に関連し、ならびに腫瘍転移の間に生じる。
制御された新脈管形成および制御されていない新脈管形成はともに、類似の様式において進行すると考えられている。内皮細胞および周皮細胞（基底膜によって囲まれる）は、毛細血管を形成する。新脈管形成は、内皮細胞および白血球により放出される酵素によって基底膜の侵食で開始する。次いで、内皮細胞（これは、血管の内腔に沿う）は、基底膜を通って突出する。新脈管形成刺激因子は、内皮細胞を、腐食された基底膜を通じて遊走するように誘導する。遊走する細胞は、親血管から「新芽」を形成し、ここで、この内皮細胞は有糸分裂を受け、そして増殖する。内皮新芽は、互いに合わせられて、新たな血管を作製する毛細血管のループを形成する。
ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３に基づく本発明は、任意の１つ以上の抗脈管形成治療と組み合わせて使用され得る。ＶＥＧＦを阻害する他の因子との組み合わせもまた含まれ、他の因子としては、例えば、他の中和抗体（Ｋｉｍら、１９９２；Ｐｒｅｓｔａら、１９９７；Ｓｉｏｕｓｓａｔら、１９９３；Ｋｏｎｄｏら、１９９３；Ａｓａｎｏら、１９９５）、可溶性レセプター構築物（ＫｅｎｄａｌｌおよびＴｈｏｍａｓ、１９９３；Ａｉｅｌｌｏら、１９９５；Ｌｉｎら、１９９８；Ｍｉｌｌａｕｅｒら、１９９６）、チロシンキナーゼインヒビター（Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒら、１９９８）、アンチセンスストラテジー、ＲＮＡアプタマーおよびＶＥＧＦに対するリボザイムまたはＶＥＧＦレセプター（Ｓａｌｅｈら、１９９６；Ｃｈｅｎｇら、１９９６；Ｋｅら、１９９８；Ｐａｒｒｙら、１９９９；各々は、参考として本明細書中で援用される）が挙げられる。アンタゴニスト特性を有するＶＥＧＦの改変体もまた、ＷＯ９８／１６５５１（具体的に参考として本明細書中で援用される）に記載されるように、使用され得る。
抗脈管形成治療は、抗脈管形成剤の供給または脈管形成因子の阻害に基づき得る。脈管形成因子の阻害は、ＶＥＧＦを阻害について記載される１以上の方法により達成され得る。ここで、中和抗体、可溶性レセプター構築物、小分子インヒビター、アンチセンス、ＲＮＡアプタマーおよびリボザイムを含む方法が全て使用され得る。例えば、脈管形成に対する抗体は、米国特許第５，５２０，９１４号（具体的に、参考として本明細書中で援用される）に記載されるように使用され得る。ＦＧＦが新脈管形成と関連する場合、ＦＧＦインヒビターもまた使用され得る。ある例は、グリコサミノグリカン（例えば、アルカラン硫酸（ａｒｃｈａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ）を含む、それらの反復単位として２−Ｏ−硫化ウロン酸で配列において変更しているＮ−アセチルグルコサミンを有する化合物である。このような化合物は、米国特許第６，０２８，０６１号（具体的に、参考として本明細書中で援用される）に記載され、そして本明細書と共に使用され得る。
種々の疾患状態で顕著であるように、新脈管形成の処置に有用である多数のチロシンキナーゼインヒビターが、現在公知である。これらとしては、例えば、米国特許第５，６３９，７５７号（具体的に、参考として本明細書中で援用される）の４−アミノピロール［２，３−ｄ］ピリミジンが挙げられる。これはまた、本発明と組み合わせて使用され得る。ＶＥＧＤＲ２レセプターを介するチロシンキナーゼシグナル伝達を媒介し得る有機分子のさらなる例は、キナゾリン化合物および米国特許第５，７９２，７７１号（具体的に、脈管形成疾患の処置における本発明と共に使用するためのさらなる組み合わせを記載する目的で、参考として本明細書中で援用される）の組成物である。
他の化学クラスの化合物はまた、新脈管形成を阻害することが示されており、そして本発明と組み合わせて使用され得る。例えば、米国特許第５，９７２，９２２号（具体的に、参考として本明細書中で援用される）に記載されるステロイド（例えば、新脈管形成の４，９（１１）−ステロイドおよびＣ２１−酸化ステロイド）は、併用治療において使用され得る。米国特許第５，７１２，２９１号および同第５，５９３，９９０号（各々、参考として本明細書中で援用される）は、サリドマイドならびに関連する化合物、前駆体、アナログ、代謝物および加水分解産物を記載する。これらもまた、新脈管形成を阻害するために本発明と組み合わせて使用され得る。米国特許第５，７１２，２９１号および同第５，５９３，９９０号における化合物は、経口的に投与され得る。組合せ治療に関して有用である、さらなる例示的な抗新脈管形成剤は、表Ｄに列挙される。ここで列挙される各薬剤は、例示であって、限定することを意味しない。
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新脈管形成の阻害における使用のための特定の好ましい化合物は、アンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、エンドステイン、バスキュロスタチン（ｖａｓｃｕｌｏｓｔａｔｉｎ）、カンスタチン（ｃａｎｓｔａｔｉｎ）およびマスピン（ｍａｓｐｉｎ）である。このような薬剤は、本発明の免疫結合体と組み合わせて上記される。しかし、これらは、組み合わせてはあるが、結合体化されていない形態で使用され得る。結合体形態で上記される他の好ましい薬剤はまた、アンギオポイエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｓｔｉｎ）（具体的に、アンギオポイエチン−２）であり、これは、本発明との組み合わせ使用のために意図される。
特定の抗脈管形成治療は、腫瘍の後退を引き起こすことが既に示されており、細菌性多糖 ＣＭ１０１および抗体ＬＭ６０９が含まれる。ＣＭ１０１は、細菌性ポリサッカリドであり、これは、腫瘍において新血管炎症を誘導する能力において十分に特徴付けられている。ＣＭ１０１は、補体系の活性化を刺激する脱分化した内皮上で発現されるレセプターに結合し、そして架橋する。それはまた、腫瘍を選択的に標的化するサイトカイン駆動化炎症応答を開始する。これは、発現ＶＥＧＦおよびそのレセプターをダウンレギュレートする固有の抗病理新脈管形成剤である。ＣＭ１０１は、現在、抗癌剤として臨床試験中であり、そしてこれと組み合わせて使用され得る。
トロンボスポンジン（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）（ＴＳＰ−１）および血小板因子４（ＰＦ４）もまた、本発明と合わせて使用され得る。これらはともに、へパリンと会合する新脈管形成インヒビターであり、そしてまた血小板α−顆粒において見出される。ＴＳＰ−１は、細胞外マトリクスの構成成分である、大きな４５０ｋＤａのマルチドメイン糖タンパク質である。ＴＳＰ−１は、ＨＳＰＧ、フィブロネクチン、ラミニン、および種々の型のコラーゲンを含む、細胞外マトリクスにおいて見出される多くのプロテオグリカン分子に結合する。ＴＳＰ−１は、インビトロにおいて内皮細胞遊走および増殖、ならびにインビボにおいて新脈管形成を阻害する。ＴＳＰ−１はまた、形質転換された内皮細胞の悪性表現型および腫瘍形成を抑制し得る。腫瘍抑制遺伝子ｐ５３は、ＴＳＰ−１の発現を直接的に調節することが示されており、その結果、ｐ５３活性の損失は、ＴＳＰ−１生成における劇的な減少、および腫瘍が開始する新脈管形成を付随する増大を生じる。
ＰＦ４は、ケモカインのＣＸＣ ＥＬＲファミリーのメンバーである７０ａａタンパク質であり、これは、インビトロにおける内皮細胞の増殖およびインビボにおける新脈管形成を強力に阻害し得る。腫瘍内に投与された、またはアデノウイルスベクターによって送達されたＰＦ４は、腫瘍増殖の阻害を生じ得る。
インターフェロンおよびメタロプロテイナーゼインヒビターは、本発明と併用され得る、２つの他のクラスの天然に存在する脈管形成インヒビターである。インターフェロンの抗内皮活性は、１９８０年代初期から公知であるが、阻害の機構は、未だ明確でない。これらが内皮細胞の移動を阻害し得ること、およびこれらが、腫瘍細胞による新脈管形成プロモーターの産生を阻害する能力によっておそらく媒介される、インビボでのいくつかの抗新脈管形成活性を有することは公知である。血管腫瘍は具体的に、インターフェロンに感受性であり、例えば、増殖中の血管腫はＩＦＮαで首尾よく処置され得る。
メタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ）は、天然に存在するマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のインヒビターのファミリーであり、これもまた、新脈管形成を阻害し得、そして併用処置プロトコルにおいて使用され得る。ＭＭＰは、新脈管形成プロセスにおいて重要な役割を果たす。なぜなら、これらは、血管網を拡大または再構築する場合、内皮細胞および線維芽細胞が移動するマトリックスを分解するからである。実際、ＭＭＰの１つのメンバーであるＭＭＰ−２は、おそらくこの目的のためにインテグリンαｖβ３を介して活性化された内皮と会合することが示されている。この相互作用がＭＭＰ−２のフラグメントによって崩壊されられる場合、次いで新脈管形成はダウンレギュレートされ、そして腫瘍増殖において阻害される。
新脈管形成を阻害する多くの薬理学的物質が存在し、これらの任意の１以上が本発明と組合せて使用され得る。これらの物質としては、ＡＧＭ−１４７０／ＴＮＰ−４７０、サリドマイド、およびカルボキシアミドトリアゾール（ＣＡＩ）が挙げられる。フマギリンは、１９９０年に新脈管形成の強力なインヒビターであることが見出されており、そしてそれ以来、フマギリンの合成アナログである、ＡＧＭ−１４７０およびＴＮＰ−４７０が開発されてきた。これら両方の薬物は、インビトロでの内皮細胞増殖およびインビボでの新脈管形成を阻害する。ＴＮＰ−４７０は、ヒトの臨床試験で広範に研究され、そのデータは長期の投与が最適であることを示唆する。
サリドマイドは、元来鎮静薬として使用されていたが、強力な催奇形物質であることが見出され、そして中止された。１９９４年に、サリドマイドは新脈管形成インヒビターであることが見出された。サリドマイドは現在、抗癌剤および血管性の眼疾患の処置として臨床試験されている。
ＣＡＩは新脈管形成の低分子量の合成インヒビターであり、これは、アクチンの再組織化、内皮細胞の移動およびコラーゲンＩＶ上での延展を妨げる、カルシウムチャネルブロッカーとして作用する。ＣＡＩは生理学的に達成可能な濃度で新生血管形成を阻害し、そして癌患者によって経口的に十分許容される。ＣＡＩを用いた臨床試験によって、処置前に進行性の疾患を有する癌患者の４９％において疾患の安定化を生じた。
ヘパリンまたはヘパリンフラグメントの存在下のコルチゾンは、内皮細胞増殖をブロックすることによってマウスにおいて腫瘍増殖を阻害することが示された。ステロイドおよびヘパリンの相加的な阻害効果に関与する機構は明らかでないが、ヘパリンが内皮細胞によるステロイドの取り込みを増加させ得ると考えられる。この混合物は、新しく形成された毛細血管の下の基底膜の溶解を増加させることが示されており、そしてこれはまた、相加的な血管抑制（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ）効果についての可能性のある説明である。ヘパリン−コルチゾール結合体はまた、インビボでの強力な血管抑制効果活性および抗腫瘍効果活性を有する。
さらに特定の新脈管形成インヒビター（抗侵襲性因子（Ａｎｔｉ−Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｆａｃｔｏｒ）、レチノイン酸およびパクリタキセル（米国特許第５，７１６，９８１号；参考として本明細書中に援用される）；ＡＧＭ−１４７０（Ｉｎｇｂｅｒら、１９９０；参考として本明細書中に援用される）；サメ軟骨抽出物（米国特許第５，６１８，９２５号；参考として本明細書中に援用される）；アニオン性ポリアミドオリゴマーまたはアニオン性ポリ尿素オリゴマー（米国特許第５，５９３，６６４号；参考として本明細書中に援用される）；オキシンドール（ｏｘｉｎｄｏｌｅ）誘導体（米国特許第５，５７６，３３０号；参考として本明細書中に援用される））；エストラジオール誘導体（米国特許第５，５０４，０７４号；参考として本明細書中に援用される）；およびチアゾールピリミジン誘導体（米国特許第５，５９９，８１３号；参考として本明細書中に援用される）を含むが、これらに限定されない）はまた、本発明の併用使用のための、抗新脈管形成組成物としての使用が意図される。
αvβ3インテグリンのアンタゴニストを含む組成物はまた、本発明と組合せて新脈管形成を阻害するために使用され得る。米国特許第５，７６６，５９１号（参考として本明細書中に援用される）に開示されるように、ＲＧＤ含有ポリペプチドおよびその塩（環状ポリペプチドを含む）は、αvβ3インテグリンアンタゴニストの適切な例である。
αvβ3インテグリンに対する抗体ＬＭ６０９もまた、腫瘍後退を誘導する。インテグリンαvβ3アンタゴニスト（例えば、ＬＭ６０９）は、新脈管形成性内皮細胞のアポトーシスを誘導して、静止状態の血管を影響を受けないままにする。ＬＭ６０９または他のαvβ3アンタゴニストはまた、αvβ3とＭＭＰ−２（ＭＭＰ−２は、内皮細胞および線維芽細胞の移動に重要な役割を果たすと考えられるタンパク質分解性の酵素である）との相互作用を阻害することによって作用し得る。米国特許第５，７５３，２３０号は、新脈管形成を阻害するために本発明と組み合わせるためのαvβ3（ビトロネクチンαvβ3）に対する抗体を記載するために参考として本明細書中で具体的に援用される。
この場合の新脈管形成性内皮のアポトーシスは、残りの血管網に対するカスケード効果を有し得る。腫瘍の拡大しようとするシグナルに対して腫瘍血管網が完全に応答するのを阻害することは、実際には、その血管網の部分的または完全な崩壊を開始して、腫瘍細胞の死および腫瘍容積の減少を生じる。エンドスタチンおよびアンギオスタチンが類似の様式で機能することが可能である。ＬＭ６０９が静止状態の血管に影響を与えないが腫瘍後退を引き起こし得るという事実は、腫瘍中の全ての血管が、抗腫瘍効果を得るために処置の標的とされる必要があるわけではないということを強く示唆する。
Ｔｉｅ２レセプターを介するシグナル伝達を変更することに基づく治療処置の他の方法もまた、例えば、Ｔｉｅ２活性化を遮断し得る可溶性Ｔｉｅ２レセプター（Ｌｉｎら、１９９８）を使用して、本発明と組み合わせて使用され得る。組換えアデノウイルス遺伝子治療を使用するこのような構築物の送達は、癌を治療する際および転移を減少する際に効果的であることが示されている（Ｌｉｎら、１９９８）。
（Ｇ３．アポトーシス誘発因子）
ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの治療剤はまた、アポトーシスを誘発するための方法と有利に組合され得る。種々のアポトーシス誘発因子は、本発明の免疫結合体と組み合わされて上記されている。任意のこのようなアポトーシス誘発因子は、本発明の抗体に連結されることなく、本発明と組み合わされて使用され得る。
免疫結合体として上記されるアポトーシス誘発因子の他に、アポトーシス、すなわちプログラムされた細胞死を阻害する多くの癌遺伝子が記載されている。この範疇における例示的な癌遺伝子としては、ｂｃｒ−ａｂｌ、ｂｃｌ−２（ｂｃｌ−１、サイクリンＤ１と異なる；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１４７４５，Ｘ０６４８７；米国特許第５，６５０，４９１号；および同第５，５３９，０９４号；各々は、参考として本明細書中に援用される）およびＢｃｌ−ｘ１、Ｍｃｌ−１、Ｂａｋ、Ａ１、Ａ２０を含むファミリーのメンバーが挙げられるがこれらに限定されない。ｂｃｌ−２の過剰発現は、Ｔ細胞リンパ腫において最初に発見された。ｂｃｌ−２は、Ｂａｘ（アポトーシス経路中のタンパク質）に結合し、そしてＢａｘを不活性化することによって癌遺伝子として機能する。ｂｃｌ−２機能の阻害は、Ｂａｘの不活性化を妨げ、そしてアポトーシス経路を進行させる。
このクラスの癌遺伝子の阻害（例えば、アンチセンスヌクレオチド配列を使用する）は、アポトーシスの増強が所望される局面において、本発明での使用が意図される（米国特許第５，６５０，４９１号；同第５，５３９，０９４号および同第５，５８３，０３４号；各々は、参考として本明細書中に援用される）。
（Ｇ４．イムノトキシンおよびコアグリガンド）
本発明の抗アミノリン脂質結合体に基づく処置方法は、他のイムノトキシンおよび／またはコアグリガンドと組合せて使用され得、ここで、その標的化をする部分（例えば、抗体またはリガンド）は、腫瘍細胞、腫瘍脈管構造または腫瘍支質の比較的特異的なマーカーに指向される。上記に議論した化学療法剤および抗新脈管形成剤に共通して、他の標的化された毒素または凝固剤の併用した使用は、一般に、相加的であり、相加的よりも顕著に大きく、またはさらには相乗的な、抗腫瘍の結果を生じる。
一般的に言えば、本発明のこれらのさらなる局面での使用のための抗体またはリガンドは、好ましくは、接近可能な腫瘍抗原を認識し、これらは、優先的に、または具体的には腫瘍部位で発現される。抗体またはリガンドはまた、好ましくは高い親和性の特性を示し；そして抗体、リガンド、またはそれらの結合体は、生存を持続させる正常細胞（例えば、心臓、腎臓、脳、肝臓、骨髄、結腸、乳房、前立腺、甲状腺、胆嚢、肺、副腎、筋肉、神経線維、膵臓、皮膚、またはヒト体内の他の生存を維持させる器官もしくは組織）から選択される１以上の組織に対するインビボでの有意な副作用を発揮しない。本明細書中で使用される場合、用語「有意な副作用」は、インビボで投与される場合に、無視可能なまたは臨床的に管理し得る副作用（例えば、化学療法の間に通常遭遇する副作用）のみを生じる、抗体、リガンドまたは抗体結合体をいう。
本発明と組合せて使用されるこれらの第二の抗癌剤の少なくとも１つの結合領域は、腫瘍領域への毒素または凝固因子を送達し得る（すなわち、腫瘍部位内へ局在し得る）成分である。このような標的化する薬剤は、腫瘍細胞、腫瘍脈管構造または腫瘍支質の成分に対して指向され得る。この標的化する薬剤は、一般に、腫瘍細胞、腫瘍脈管構造または腫瘍支質の、表面に発現されるか、表面に接近可能か、または表面に局在される成分に結合する。しかし、一旦、腫瘍脈管構造および腫瘍細胞の破壊が始まると、内部成分は放出され、実質的に任意の腫瘍成分のさらなる標的化を可能にする。
多くの腫瘍細胞抗原が記載されており、そのいずれの抗原も、本発明の併用される局面と関連して標的として使用され得る。さらなるイムノトキシンおよびコアグリガンドの標的化のための適切な腫瘍細胞抗原は、抗体Ｂ３（米国特許第５，２４２，８１３号；参考として本明細書中に援用される；ＡＴＣＣ ＨＢ １０５７３）；ＫＳＩ／４（米国特許第４，９７５，３６９号；参考として本明細書中に援用される；ベクターＮＲＲＬ Ｂ−１８３５６および／またはＮＲＲＬ Ｂ−１８３５７を含む細胞から得られる）；２６０Ｆ９（ＡＴＣＣ ＨＢ ８４８８）；およびＤ６１２（米国特許第５，１８３，７５６号；参考として本明細書中に援用される；ＡＴＣＣ ＨＢ ９７９６）によって認識される抗原を含む。当業者は、抗腫瘍細胞抗体を産生する他の適切な細胞株を同定するために、任意の後年のＡＴＣＣカタログもまた調べ得る。
腫瘍脈管構造標的化のために、標的化する抗体またはリガンドは、しばしば、血管形成された腫瘍の腫瘍内血管によって発現されるか、それに吸着されるか、その上に誘導されるか、またはさもなければそこに局在されるマーカーに結合する。適切に発現される標的分子としては、例えば、エンドグリン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＰＳＭＡ（Ｌｉｕら、１９９７）、ＴＩＥ、ＬＡＭ−１に反応性のリガンド、ＶＥＧＦ／ＶＰＦレセプター、ＦＧＦレセプター、αvβ3インテグリン、プレイオトロピン（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｎ）、およびエンドシアリン（ｅｎｄｏｓｉａｌｉｎ）が挙げられる。吸着される適切な標的は、例えば、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦβ、ＨＧＦ、ＰＦ４、ＰＤＧＦ、ＴＩＭＰ、ＴＩＥに結合するリガンド、および腫瘍関連フィブロネクチンアイソフォームのような標的である。例えば、以下のような、サイトカインおよび凝固剤によって自然におよび人工的に誘導され得る抗原もまた標的化され得る；ＥＬＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＬＡＭ−１に反応性のリガンド、エンドグリン、さらにＭＨＣクラスＩＩ（例えば、ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４および／またはＴＮＦ−βによって、サイトカイン誘導性）；ならびにＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＰＤＧＦおよびＩＣＡＭ−１（例えば、トロンビン、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第Ｘ／Ｘａ因子および／またはプラスミンによって、凝固剤誘導性）。
以下の特許および特許出願は、腫瘍脈管構造の発現された、吸着された、誘導された、または局在されたマーカーに対して指向されるイムノトキシンの調製および使用に関する本発明の教示をなおさらに補完する目的のために、参考として本明細書中に具体的に援用される：米国出願第０８／４８２，３６９号（１９９８年１０月２０日に登録料支払済）米国特許第５，８５５，８６６号、同第５，９６５，１３２号、同第６，０５１，２３０号、同第６，００４，５５５号、同第５，８７７，２８９号、同第６，００４，５５４号、同第５，７７６，４２７号、同第５，８６３，５３８号、同第５，６６０，８２７号および同第５，０３６，９５５号。
さらなる腫瘍血管標的組成物および方法は、これらの標的アミノリン脂質（例えば、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミン（近年、腫瘍血管のアクセス可能かつ特異的なマーカーであることが発見された））を含む。抗アミノリン脂質抗体のみの投与は、血栓症および腫瘍の後退を誘発するに十分である。従って、本発明は、結合体化されていない抗ホスファチジルセリンおよび／またはホスファチジルエタノールアミン抗体と有効に組み合わせられ得るか；またはこのような抗体の免疫結合体が使用され得る。
以下の仮出願は、抗アミノリン脂質抗体およびイムノトキシンの調製および使用に関する本発明の教示をなおさらに補完する目的のために、参考として本明細書中に具体的に援用される：仮出願第６０／０９２，６７２号（１９９８年７月１３日出願）および同第６０／０９２，５８９号（１９９８年７月１３日出願）。出願番号６０／０９２，５８９号はさらに、腫瘍血管に対する毒物および凝血薬を送達する際の使用のため、ならびに血栓症および腫瘍の後退を増加するために、アミノリン酸脂質結合タンパク質結合体（例えば、アネキシン結合体）の使用に関する本発明の教示をなおさらに補完する目的のために、参考として本明細書中に具体的に援用される。
適切な腫瘍支質標的としては、腫瘍細胞外マトリックスもしくは支質の成分、またはその中に結合される以下を含む成分が挙げられる；基底膜マーカー、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸、プロテオグリカン、フィブロネクチン、活性化血小板、ＬＩＢＳおよびテネイシン。このような使用に好ましい標的は、ＲＩＢＳである。
以下の特許および特許出願は、腫瘍支質を標的化する薬剤の調製および使用に関する本発明の教示をなおさらに補完する目的のために、参考として本明細書中に具体的に援用される：米国特許出願第０８／４８２，３６９号（米国特許第５， ， 号；１９９８年１０月２０日に登録料支払済）；同第０８／４８５，４８２号；同第０８／４８７，４２７号（米国特許第６，００４，５５５号）；同第０８／４７９，７３３号（米国特許第５，８７７，２８９号）；同第０８／４７２，６３１号および同第０８／４７９，７２７号および同第０８／４８１，９０４号（米国特許第６，０３６，９５５号）。
第２の抗癌治療剤は、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースのイムノトキシンにおける使用について本明細書中に記載される任意の細胞傷害性薬剤またはさもなければ抗細胞性薬剤に作動可能に結合され得る。しかし、適切な抗細胞性薬剤はまた、放射性同位体を含む。リシンＡ鎖および脱グリコシル化Ａ鎖（ｄｇＡ）のような毒素部分が好ましい。
本発明での任意の使用のための第２の標的化された因子は、凝固を促進し得る標的化された成分（すなわち、コアグリガンド）を含み得る。ここで、この標的化する抗体またはリガンドは、直接的または間接的に（例えば、別の抗体を介して）、直接的または間接的に凝固を刺激する任意の因子（ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースのコアグリガンドにおける使用について本明細書中に記載された因子のいずれかを含む）に連結され得る。このような使用のために好ましい凝固因子は、組織因子（ＴＦ）およびＴＦ誘導体（例えば、短縮型ＴＦ（ｔＴＦ）、二量体および多量体ＴＦ、ならびに第ＶＩＩ因子活性化能が欠損した変異ＴＦ）である。
癌の処置における併用使用のためのイムノトキシンおよびコアグリガンドの有効用量は、１週間あたり約１回の頻度でＩＶ経路を介して投与する場合、約０．１ｍｇ／ｋｇと約２ｍｇ／ｋｇとの間、そして好ましくは約０．８ｍｇ／ｋｇと約１．２ｍｇ／ｋｇとの間である。用量決定におけるいくらかの変動が、処置される被験体の状態に依存して必ず生じる。投与の責任を負う医師は、個々の被験体について適切な用量を決定する。
（Ｇ５．ＡＤＥＰＴおよびプロドラッグ治療）
本発明のＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体は、プロドラッグと組み合わせて使用され得、ここでＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３ベースの抗体は、プロドラッグ活性化成分（例えば、抗体に接触した際にのみ、プロドラッグをより活性な形態へ変換するプロドラッグ活性化酵素）と作動可能に付随される。この技術は、一般に「ＡＤＥＰＴ」と称され、そして例えば、ＷＯ９５／１３０９５；ＷＯ９７／２６９１８、ＷＯ９７／２４１４３および米国特許第４，９７５，２７８号および同第５，５６８，５６８号（これらは、各々具体的に本明細書中に参考として援用される）において記載される。
本明細書中で使用される場合、用語「プロドラッグ」は、プロドラッグが基づく親の薬物と比較して（腫瘍血管内皮細胞を含む）標的細胞に対する減少した細胞傷害性または他の抗細胞性効果を及ぼす生物学的にかまたは薬学的に活性な物質の前駆体または誘導体形態をいう。好ましくは、プロドラッグまたは前駆体形態は、有意な減少を及ぼすか、またはより好ましくは、「ネイティブ」または親の形態と比較して、無視できる細胞傷害性または抗細胞性効果を及ぼす。「プロドラッグ」は、活性化されているかまたは変換されて、その薬物のより活性な親の形態を生じ得る。
薬物を作製しそして使用する技術的能力は、当業者の範囲内である。Ｗｉｌｌｍａｎら（１９８６）およびＳｔｅｌｌａら（１９８５）は、種々のプロドラッグの作製方法および使用方法に関する記載および技術をさらに供給する目的のために参考として本明細書中に各々具体的に援用される。本発明の文脈で使用され得る例示的なプロドラッグ構築物としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ホスフェート含有プロドラッグ（米国特許第４，９７５，２７８号）、チオホスフェート含有プロドラッグ、サルフェート含有プロドラッグ、ペプチドベースのプロドラッグ（米国特許第５，６６０，８２９号；同第５，５８７，１６１号；同第５，４０５，９９０号；ＷＯ９７／０７１１８）、Ｄ−アミノ酸改変プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ（米国特許第５，５６１，１１９号；同第５，６４６，２９８号；同第４，９０４，７６８号、同第５，０４１，４２４号）、βラクタム含有プロドラッグ、必要に応じて置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ（米国特許第４，９７５，２７８号）、必要に応じて置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグおよびさらには５−フルオロシトシン（米国特許第４，９７５，２７８号）および５−フルオロウリジンプロドラッグなど（これらの特許の各々は、本明細書中に参考として具体的に援用される）。
プロドラッグの形態で使用され得る治療剤または細胞傷害性薬物の型は、実質的には限られる。より細胞傷害性薬剤は、このような送達の形態には好ましく、たとえば、コアグラント（プロドラッグとしての使用にあまり好ましくない）の送達より好ましい。プロドラッグが実質的に不活性であり、そして「放出された」かまたは活性化された薬物が、実質的にかまたは意図される目的のための活性を有するように構築物を設計することが、プロドラッグの形成において必要とされる全てである。
もとのプロドラッグに関する種々の改良もまた、ＷＯ ９５／０３８３８０；ＥＰ ７５１，１４４（アントラサイクリン）；ＷＯ ９７／０７０９７（シクロプロピルインドール）；およびＷＯ ９６／２０１６９に開示されるように、公知でありかつ本明細書との使用について意図される。例えば、Ｋｍが減少したプロドラッグは、米国特許第５，６２１，００２号（本明細書中に参考として特に援用される）に記載され、これは本発明の状況において使用され得る。細胞内にて実行されるプロドラッグ治療もまた、ＷＯ ９６／０３１５１（本明細書中に参考として特に援用される）に例示されるように公知であり、そして本明細書を用いて実施され得る。
ＡＤＥＰＴにおける使用のために、そのプロドラッグをより活性な薬物へと活性化または変換する因子が、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３に基づく抗体に作動可能に結合される。従って、このＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３様抗体は、脈管形成部位内、好ましくは腫瘍血管系および支質内で、プロドラッグ変換能力を局在化し、活性薬物がそのような領域のみで産生され、そして循環中または健常組織においては産生されないようにする。
ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３様抗体に結合してプロドラッグ活性化にて機能し得る酵素としては、ホスフェート含有プロドラッグと組み合わせた使用のためのアルカリホスファターゼ（米国特許第４，９７５，２７８号）；スルフェート含有プロドラッグと組み合わせた使用のためのアリールスルファターゼ（米国特許第５，２７０，１９６号）；ペプチドに基づくプロドラッグと組み合わせた使用のためのペプチダーゼおよびプロテアーゼ（例えば、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ（米国特許第５，６６０，８２９号；同第５，５８７，１６１号；同第５，４０５，９９０号）およびカテプシン（カテプシンＢおよびＬを含む））；Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグと組み合わせた使用のためのＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグと組み合わせた使用のための炭水化物切断酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼ）（米国特許第５，５６１，１１９号；同第５，６４６，２９８号）；β−ラクタム含有プロドラッグと組み合わせた使用のためのβ−ラクタマーゼ；アミノ窒素にてフェノキシアセトアミド基またはフェニルアセトアミド基で誘導体化された薬物と組み合わせた使用のためのペニシリンアミダーゼ（例えば、ペニシリンＶアミダーゼ（米国特許第４，９７５，２７８号）またはペニシリンＧアミダーゼ）；ならびに５−フルオロシトシンに基づくプロドラッグ（米国特許第４，９７５，２７８号）と組み合わせた使用のためのシトシンデアミナーゼ（米国特許第５，３３８，６７８号；同第５，５４５，５４８号）が、挙げられるがこれらに限定されず、これらの特許各々は、本明細書中に参考として特に援用される。
酵素活性を有する抗体（触媒抗体または「アブザイム」として公知）もまた、プロドラッグを活性な薬物へと変換するために使用され得る。従って、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３様抗体に基づくアブザイムは、本発明の別の局面を形成する。アブザイムを生成する技術的能力もまた、Ｍａｓｓｅｙら（１９８７）（このアブザイムの教示を補足する目的で、本明細書中に参考として特に援用される）に例示されるように、当業者の範囲内に存在する。カルバメート位置（例えば、窒素マスタードアリールカルバメート）でプロドラッグの分解を触媒し得る触媒抗体が、ＥＰ ７４５，６７３（本明細書中に参考として特に援用される）に記載されるように、さらに意図される。
（Ｈ．診断法および画像化）
本発明はさらに、インビトロおよびインビボでの診断法および画像化法を提供する。このような方法は、いかなる脈管形成疾患についても（関節炎、乾癬および固形腫瘍により例証されるが、本明細書中に開示される脈管形成疾患すべてを含む）診断情報、予後情報または画像情報を生成する際の使用に適用可能である。腫瘍診断および画像化の分野の外側で、本発明のこれらの局面は、インビトロでの診断試験（好ましくは、サンプルが非侵襲的に得られかつ高スループットアッセイにて試験され得るか、そして／または曖昧および確認における臨床診断が望まれるかのいずれか）における使用に最も好ましい。
（Ｈ１．免疫検出法およびキット）
なおさらなる実施形態において、本発明は、ＶＥＧＦを結合、精製、除去、定量さもなければ一般には検出するため、そして脈管形成疾患を診断するための、免疫検出法に関する。本発明のＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、２Ｃ３）が、インビボ（下記）にて、単離された組織サンプル、生検またはスワブにおいて、そして／またはホモジナイズされた組織サンプルにおいて、ＶＥＧＦを検出するために使用され得る。このような免疫検出法は、明らかな診断的有用性を有するが、また、非臨床サンプルに（例えば、抗原サンプルの力価測定などにおいて）も適用を有する。
種々の有用な免疫検出法の工程は、科学文献（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａら、（１９８７、本明細書中に参考として援用される））に記載されている。一般には、免疫結合法は、ＶＥＧＦを含むと疑われるサンプルを得る工程、およびそのサンプルをＶＥＧＦＲ２−遮断抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、２Ｃ３）と、免疫複合体の形成を可能にするに有効な条件下で接触させる工程を包含する。このような方法において、その抗体は、固体支持体に、例えば、カラムマトリックスの形態で結合され得、そしてＶＥＧＦを含むと疑われるサンプルが、その固定された抗体に適用される。
より好ましくは、その免疫結合法は、サンプル中のＶＥＧＦの量を検出または定量するための方法を含み、この方法は、結合プロセスの間に形成されたすべての免疫複合体の検出または定量を必要とする。ここで、ＶＥＧＦを含むと疑われるサンプルを得、そしてそのサンプルを、本明細書に従う抗体と接触させ、次いで、特定の条件下で形成された免疫複合体の量を検出または定量する。
分析される生物学的サンプルは、ＶＥＧＦを含むと疑われる任意のサンプルであり得、一般的には、脈管形成疾患を有すると疑われる動物または患者由来である。そのサンプルは、組織切片または標本、生検、スワブまたはスミア試験サンプル、ホモジナイズされた組織抽出物、あるいはそのようなものの分離形態または精製形態であり得る。
免疫複合体（一次免疫複合体）の形成を可能にするに有効な条件下でかつそれを可能にするに十分な時間の間、選択した生物学的サンプルをその抗体と接触させることは、一般には、そのサンプルに抗体組成物を単に添加し、そして存在するすべてのＶＥＧＦとその抗体が免疫複合体を形成する（すなわち、結合する）に十分に長い時間その混合物をインキュベートすることである。この時点の後、そのサンプル−抗体組成物（例えば、組織切片、ＥＬＩＳＡプレート、ドットブロット、またはウェスタンブロット）が、一般には洗浄されて、非特異的結合したすべての抗体種が除去されて、一次免疫複合体中の特異的に結合した抗体のみ検出することが可能になる。
免疫複合体の検出は、当該分野で周知であり、そして多数のアプローチの適用を介して達成され得る。これらの方法は、一般的には、標識またはマーカー（例えば、当該分野で公知の任意の放射性、蛍光性、生物学的または酵素的な、タグもしくは標識）の検出に基づく。このような標識の使用に関する米国特許としては、第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号および同第４，３６６，２４１号（各々が、本明細書中で参考として援用される）が挙げられる。色素形成基質との接触に際して有色生成物を生成する酵素の使用が、一般的に好ましい。二次結合リガンド（例えば、第２の抗体またはビオチン／アビジンリガンド結合配置）もまた、当該分野で公知であるように、使用され得る。
検出において使用されるＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、２Ｃ３）自体は、検出可能な標識に連結され得、次いでこの標識が簡単に検出され、それにより組成物中の一次免疫複合体の量を決定することが可能になる。
好ましくは、この一次免疫複合体は、本発明の抗体について結合親和性を有する第２の結合リガンドによって検出される。この場合において、その第２の結合リガンドは、検出可能な標識に連結され得る。この第２の結合リガンド自体は、しばしば抗体であり、従って、「二次」抗体と呼ばれ得る。この一次免疫複合体は、この標識された二次結合リガンドまたは抗体と、二次免疫複合体の形成を可能にするに有効な条件下かつそれを可能にするに十分な時間の間、接触される。次いで、この二次免疫複合体は、一般的には、非特異的に結合したすべての標識二次抗体またはリガンドを除去するために洗浄され、次いでその二次免疫複合体中の残りの標識が検出される。
さらなる方法は、２工程アプローチによる一次免疫複合体の検出を含む。第１の抗体に結合親和性を有する第２の結合リガンド（例えば、抗体）が、上記のように二次免疫複合体を形成するために使用される。洗浄の後、その二次免疫複合体は、その第２の抗体に結合親和性を有する第３の結合リガンドまたは抗体と、免疫複合体（三次免疫複合体）の形成を可能にするに有効な条件下かつそれを可能にするに十分な時間、接触させられる。この第３のリガンドまたは抗体は、そのようにして形成された三次免疫複合体の検出を可能にする、検出可能な標識に連結される。この系は、所望ならば、シグナル増幅を提供し得る。
脈管形成疾患を有する患者の臨床診断またはモニタリングにおいて、ＶＥＧＦの検出、または正常な被検体由来の対応する生物学的サンプルにおけるレベルと比較したＶＥＧＦのレベルの増加が、脈管形成疾患を有する患者の指標である。
しかし、当該分野で公知であるように、このような臨床診断は、この方法に基礎基づいて孤立しては行われないだろう。当業者は、バイオマーカーの有意な発現（ポジティブな同定を示す）とバイオマーカーの低レベル発現またはバックグラウンド発現との間を識別することに非常に精通している。実際、バックグラウンド発現レベルは、しばしば、「カットオフ」を形成するために使用され、このカットオフを超える染色の増加が、有意またはポジティブと記録される。
（Ｈ２．画像化）
本発明のこれらの局面は、腫瘍画像化方法ならびに組み合わせた腫瘍処置および画像化方法における使用に好ましい。一つ以上の検出可能な因子に結合させたＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３に基づく抗体は、それ自体が腫瘍の画像化においてか、または腫瘍のプレ画像化に使用して、処置の前に信頼性のある画像を形成することが構想される。このよな組成物および方法はまた、他の任意の脈管形成疾患または状態（特に、非悪性腫瘍、アテローム性動脈硬化症、そして内部画像化が診断目的または予後目的について望まれる状態または処置を設計するために望まれる状態）の画像化および診断に適用され得る。
ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３に基づく画像化抗体は、一般的に、検出可能な標識に作動可能に付着したかもしくは結合したＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３に基づく抗体を含む。「検出可能な標識」は、それらの特異的な機能特性、または化学的特徴に起因して検出され得る化合物あるいはエレメントであり、その使用により、それらが付着する成分が検出可能になり、そして所望であれば、さらに定量可能になる。インビボでの診断プロトコルまたは「画像化方法」のための抗体結合体において、非侵襲的方法を用いて検出され得る標識が必要である。
抗体および結合リガンドにそれらを付着させる方法のような多くの適切な画像化剤が、当該分野において公知である（例えば、米国特許第５，０２１，２３６号および同第４，４７２，５０９号を参照のこと。両方とも本明細書中に参考として援用される）。特定の付着方法は、例えば、抗体に付着されたＤＴＰＡのような有機キレート剤を使用する金属キレート複合体の使用を含む（米国特許第４，４７２，５０９号）。モノクローナル抗体はまた、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩のような結合剤の存在下で酵素と反応され得る。フルオレセインマーカーとの結合体は、これらの結合剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応により、調製される。
検出可能な標識の例は、常磁性イオンである。この場合、適切なイオンとしては、以下が挙げられる：クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、およびエルビウム（ＩＩＩ）（ガドリニウムが特に好ましい）。
他の状況（例えば、Ｘ線画像化）において有用なイオンは、以下を含むがそれらに限定されない：ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）および特にビスマス（ＩＩＩ）。蛍光標識には、ローダミン、フルオレセイン、およびレノグラフィンが挙げられる。ローダミンおよびフルオレセインは、しばしば、イソチオシアネート中間体を介して結合される。
診断的適用のための放射性同位体の場合、適切な例としては、以下が挙げられる：14炭素、51クロム、36塩素、57コバルト、58コバルト、銅67、152Ｅｕ、ガリウム67、3水素、ヨウ素123、ヨウ素125、ヨウ素131、インジウム111、59鉄、32リン、レニウム186、レニウム188、75セレニウム、35硫黄、テクネチウム99m、およびイットリウム90。125Ｉは、しばしば、特定の実施形態において使用するために好ましく、そしてテクネチウム99mおよびインジウム111はまた、しばしば、それらが低エネルギーでありかつ広範囲での検出に適しているために好ましい。
本発明における使用のための放射性標識されたＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３に基づく抗体が、当該分野で周知の方法により生成され得る。例えば、放射性同位体金属イオンを抗体に結合するために、しばしば使用される中間体官能基は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）およびエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）である。
モノクローナル抗体はまた、ヨウ化ナトリウムまたはヨウ化カリウム、および次亜塩素酸ナトリウムのような化学的酸化剤、またはラクトペルオキシダーゼのような酵素酸化剤と接触することによりヨウ素化され得る。本発明による抗体は、リガンド交換プロセスにより、例えば、二価のスズの溶液で過テクネチウム酸（ｐｅｒｔｅｃｈｎａｔｅ）を還元し、Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム上でその還元されたテクネチウムをキレート化し、そしてこのカラムに抗体を適用することにより、テクネチウム99mで標識され得る；かまたは直接的標識技術により、例えば、過テクネチウム酸、ＳＮＣｌ2のような還元剤、ナトリウム−カリウムフタレート溶液のような緩衝溶液、およびその抗体をインキュベートすることにより、標識され得る。
検出可能に標識されたＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３に基づく抗体の上記の型のいずれも、本発明の画像化の局面または組み合わせた画像化および処置の局面において使用され得る。これらは、インビトロでの診断における使用に等しく適切である。インビボでの画像化実施形態のための投薬量は、一般的には、治療用よりも少ないが、また患者の年齢および重量にも依存する。１回の用量は、十分であるべきである。
インビボ診断方法または画像化方法は、一般的に、非侵襲的方法により検出可能であるマーカーに結合されたＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体または２Ｃ３に基づく抗体の診断的有効量を患者に投与する工程を含む。この抗体−マーカー結合体は、腫瘍内のＶＥＧＦに局在化しそして結合するに十分な時間放置される。次いで、患者は、検出可能なマーカーを同定するために検出デバイスに曝露され、それにより、腫瘍の画像を形成する。
（Ｈ３．診断キット）
なおさらなる実施形態において、本発明は、免疫検出キットおよび画像化キットの両方を含む、上記の免疫検出法および画像化方法との使用のための、診断キットを提供する。従って、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、２Ｃ３）が、一般的には適切な容器中に含まれて、キットにて提供される。
免疫検出のために、この抗体は、固体支持体（例えば、マイクロタイタープレートのウェル）に結合され得るが、抗体溶液または再構成のための粉末が好ましい。この免疫検出キットは、好ましくは、少なくとも第１の免疫検出試薬を含む。このキットの免疫検出試薬は、種々の形態（所定の抗体と会合しているかまたは所定の抗体に結合している、検出可能な標識を含む）のいずれか１つを採り得る。二次結合リガンドに会合または結合している検出可能な標識もまた、意図される。例示的二次リガンドは、第１の抗体に結合親和性を有する二次抗体である。
本キットにおける使用のためのさらに適切な免疫検出試薬は、第１の抗体について結合親和性を有する二次抗体を、その第２の抗体についての結合親和性を有する第３の抗体をともに含む、二成分試薬を含み、その第３の抗体は、検出可能な標識に連結されている。上記のように、多数の例示的標識が当該分野で公知であり、そしてこのような標識すべてが、本発明とともに使用され得る。これらのキットは、完全に結合した形態で、中間体の形態で、またはそのキットのユーザーにより結合される別個の部分としてのいずれかで、抗体−標識結合体を含み得る。
その画像化キットは、好ましくは、ＶＥＧＦＲ２遮断抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、２Ｃ３）（インビボで検出可能な標識にすでに結合している）を含む。しかし、その標識および結合手段は、別個に供給され得る。
いずれのキットも、さらに、ＶＥＧＦの適切にアリコートにされた組成物のような制御因子（標識されいても標識されていなくても）を、検出アッセイのための標準曲線を調製するために使用され得るように、含む。このキットの成分は、水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかにて、パッケージされ得る。
そのキットの容器手段は、一般的には、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジ、または他の容器手段を含み、その中に、抗体または抗原が配置され得、そして好ましくは適切なアリコートにされ得る。第２または第３の結合リガンドまたはさらなる成分が提供される場合、そのキットはまた、一般的には、このリガンドまたは成分が配置され得る、第２、第３、または他のさらなる容器を含む。このキットはまた、１つ以上の脈管形成疾患のいずれかの診断における使用のための他の診断試薬を含み得る。好ましくは、ＶＥＧＦ結合に基づかない第２の診断剤が、使用される。
本発明のキットはまた、代表的には、その抗体を含むための手段、および市販のために密封されている他の任意の試薬容器を含む。このような容器は、所望のバイアルが保持されている射出成形または吹き込み成形したプラスチック容器を含み得る。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明者らによって、本発明の実施において良好に機能することが見出された技術を表し、従って、本発明の実施の好ましい形態を構成するとみなされ得ることが、当業者によって認識されるべきである。しかし、当業者は、本開示を考慮して、多くの変更が、開示された特定の実施形態において行われ得、そして本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様もしくは類似の結果が依然として入手され得ることを認識すべきである。
（実施例Ｉ）
（抗ＶＥＧＦ抗体２Ｃ３の生成および特有の特徴）
（Ａ．材料および方法）
（１．免疫原）
ヒトＶＥＧＦ（ｈｕＶＥＧＦ；配列番号１０）のＮ末端２６アミノ酸に対応するペプチドおよびモルモットＶＥＧＦ（ｇｐＶＥＧＦ；配列番号１１）のＮ末端２５アミノ酸に対応するペプチドが、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｗａｒｄ Ｈｕｇｈｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＵＴ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄａｌｌａｓにより合成された。このペプチドは、以下の配列（ＮからＣへ）
Figure 2011046720
を有した。
ペプチドを、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカー（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｌｄ，ＩＬ）を使用して、Ｃ末端のシステインを介してサイログロブリンに結合した。サイログロブリンに結合したＬ−システインからなるコントロール結合体もまた調製した。結合体を、サイズ排除クロマトグラフィーにより、遊離ペプチドまたはリンカーから分離した。
組換えヒトＶＥＧＦもまた、免疫原として使用した（Ｓ．Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ博士、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮから得た）。
（２．ハイブリドーマ）
抗ｇｐＶＥＧＦ抗体産生ハイブリドーマの産生のために、Ｃ５７／Ｂ１−６マウスに、ＴｉｔｅｒＭａｘアジュバント（ＣｙｔＲＸ Ｃｏ．、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）中のｇｐＶＥＧＦ−ペプチド−サイログロブリン結合体で免疫した。抗ヒトＶＥＧＦ抗体の産生のために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＴｉｔｅｒＭａｘ中のｈｕＶＥＧＦ−ペプチド−サイログロブリン結合体または組換えヒトＶＥＧＦのいずれかで免疫した。最終ブーストの３日後、脾細胞を、Ｍｏｒｒｏｗら（１９９０；本明細書中に参考として援用される）により記載されるように、ミエローマＰ３Ｘ６３ＡＧ８．６５３（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）細胞と融合し、そして培養した。
（３．抗体精製）
ＩｇＧ抗体（２Ｃ３、１２Ｄ７、３Ｅ７）を、硫酸アンモニウム沈殿およびプロテインＡクロマトグラフィーによって、Ｐｉｅｒｃｅ ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ／Ｅｌｕｔｉｏｎ緩衝系（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、組織培養上清から精製した。
ＩｇＭ抗体（ＧＶ３９Ｍ、１１Ｂ５、７Ｇ３）を、５０％飽和硫酸アンモニウム沈殿、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でのペレットの再懸濁およびｄＨ2Ｏに対する透析により組織培養上清から精製し、真性グロブリンを沈殿させた。このｄＨ2Ｏ沈殿物をＰＢＳ中に再懸濁し、そしてＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｓ３００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）におけるサイズ排除クロマトグラフィーによって分画した。そのＩｇＭ画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判定した場合、８５〜９０％の純度であった。
（４．コントロール抗体）
以下を含む、種々のコントロール抗体を、これらの研究を通して使用した：ｍＡｂ ４．６．１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．製のマウス抗ヒトＶＥＧＦ）、Ａｂ−３（ＯｎｃｏｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．製のマウス抗ヒトＶＥＧＦ）、Ａ−２０（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ製のウサギ抗ヒトＶＥＧＦ）、ＯＸ７（Ｄｒ．Ａ．Ｆ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ＭＲＣ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｔ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫからのマウス抗ラットＴｈｙ１．１）、ＭＴＳＡ（Ｄｒ．Ｅ．Ｓ．Ｖｉｔｅｔｔａ，ＵＴ−Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ製の無関係な特異性のマウス骨髄腫ＩｇＭ）、１Ａ８（マウス抗マウスＦｌｋ−１；Ｐｈｉｌｉｐ Ｅ．Ｔｈｏｒｐｅおよび共同研究者）、ＭＥＣＡ ３２（Ｄｒ．Ｅ．Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ，ＣＡからのラット抗マウス内皮）およびＴＥＣ １１（、マウス抗ヒトエンドグリン（ｅｎｄｏｇｌｉｎ）；米国特許第５，６６０，８２７号）。
（５．最初のスクリーニング）
最初のスクリーニングのために、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｆａｌｃｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を、２５０ｎｇのＶＥＧＦペプチドまたはＶＥＧＦ−Ｃｙｓ−サイログロブリン結合体のいずれかでコートし、そして５％カゼイン酸加水分解物（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でブロックした。抗ｇｐＶＥＧＦハイブリドーマおよび最初の抗ヒトＶＥＧＦハイブリドーマ由来の上清を、二重間接的（ｄｕａｌ ｉｎｄｉｒｅｃｔ）ＥＬＩＳＡ技術によって、この抗原でコートしたプレート上でスクリーニングした（Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，１９９５）。
ＶＥＧＦペプチド−サイログロブリンとの優先的な反応性を示すが、Ｃｙｓ−サイログロブリンとの反応性を全く示さないか、弱い反応性を示すハイブリドーマを、腫瘍組織の凍結切片に対する免疫組織化学（以下に記載される）によって、さらにスクリーニングした。
（６．免疫組織化学）
モルモット系統１０肝細胞癌腫瘍細胞（Ｄｒ．Ｒｏｎａｌｄ Ｎｅｕｍａｎ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤより得た）を、系統２モルモット（ＮＣＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）中で増殖させた。ヒト腫瘍ＮＣＩ−Ｈ３５８非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、ＮＣＩ−Ｈ４６０ ＮＳＣＬＣ（両方とも、Ｄｒ．Ａｄｉ Ｇａｚｄａｒ，ＵＴ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸより得た）、ＨＴ２９結腸腺癌（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、およびＬ５４０ＣＹホジキンリンパ腫（Ｖ．Ｄｉｅｈｌ教授、Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙから得た）を、ＣＢ１７ ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）中に異種移植片として増殖させた。
腫瘍を、液体窒素中で瞬間凍結し、そして−７０℃で保存した。患者由来の腫瘍標本の凍結サンプルを、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から得た。免疫組織化学を、Ｂｕｒｒｏｗｓら（１９９５）に記載のように行った。
（７．ＥＬＩＳＡ分析）
ＶＥＧＦで免疫した動物由来のハイブリドーマ上清を、以下の３つの異なる抗原を使用する示差的間接（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｉｎｄｉｒｅｃｔ）ＥＬＩＳＡ技術によってスクリーニングした：ヒトＶＥＧＦ単独、ＶＥＧＦ：Ｆｌｋ−１／ＳＥＡＰ複合体、およびＦｌｋ−１／ＳＥＡＰ単独。ヒトＶＥＧＦ単独について、特定のＥＬＩＳＡプレートを、１００ｎｇのＶＥＧＦでコートした。
Ｆｌｋ−１／ＳＥＡＰ単独について、他のＥＬＩＳＡプレートを、５００ｎｇのＦｌｋ−１／ＳＥＡＰ（マウスＶＥＧＦレセプターの可溶性形態（Ｆｌｋ−１／ＳＥＡＰを分泌する細胞は、Ｄｒ．Ｉｈｏｒ Ｌｅｍｉｓｃｈｋａ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪから得た））でコートした。このＦｌｋ−１／ＳＥＡＰタンパク質は、Ｔｅｓｓｌｅｒら（１９９４）に記載のように産生および精製した。基本的には、Ｆｌｋ−１の細胞外ドメイン（ｓＦｌｋ−１）を、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）において産生し、そして、モノクローナル抗Ｆｌｋ−１抗体（１Ａ８）を使用する免疫親和性技術によって精製した。次いで、ｓＦｌｋ−１をビオチン化し、そしてアビジンでコートしたプレート上に結合させた。
ＶＥＧＦ：Ｆｌｋ−１／ＳＥＡＰ複合体でコートしたプレートを調製するために、精製ｓＦｌｋ−１をビオチン化し、そして２，５：１のｓＦｌｋ−１：ＶＥＧＦのモル比で、結合緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０μｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミンおよび０．１μｇ／ｍｌ ヘパリン）中で、４℃で一晩、ＶＥＧＦと反応させ、ダイマーを形成させた。次いで、このＶＥＧＦ：ｓＦｌｋ−１複合体を、９６ウェルマイクロタイタープレートのアビジンでコートしたウェル中でインキュベートし、レセプターに結合したＶＥＧＦでコートしたプレートを生成した。
次いで、ＶＥＧＦ単独、ビオチン化ｓＦｌｋ−１およびＶＥＧＦ：ｓＦｌｋ−１複合体との、抗体の反応性を、アビジンでコートしたプレート上のこの３つの抗原を使用する、制御された研究において決定した。反応性を、最初のスクリーニングについて上記したように決定した。
捕捉ＥＬＩＳＡもまた開発した。捕捉ＥＬＩＳＡにおいて、マイクロタイタープレートを、１００ｎｇのその示された抗体で、４℃で一晩コートした。ウェルを、上記のように洗浄およびブロックし、次いで、種々の濃度のビオチン化ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ：ｓＦｌｋ−１−ビオチンと共にインキュベートした。１：２０００希釈した、ペルオキシダーゼに結合体化されたストレプトアビジン（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を、第２の層として使用し、そして発色させた。
競合ＥＬＩＳＡ研究を、製造業者の説明書（ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，Ｐｉｅｒｃｅ）に従って、抗体をペルオキシダーゼで最初に標識することによって行った。１２Ｄ７、３Ｅ７、２Ｃ３および７Ｇ３との競合研究に使用した抗原は、ＥＬＩＳＡプレート上のアビジンによって捕捉されるＶＥＧＦ−ビオチンであった。約０．５〜２．０μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識した試験抗体を、緩衝液単独、無関係なＩｇＧ、または１０〜１００倍過剰の他の抗ＶＥＧＦ競合抗体のいずれかの存在下のプレート上でインキュベートした。
標識した抗体の結合を、３，３’５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（ＫｉｒｋｅｇａａｒｄおよびＰｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）の添加によって評価した。反応を、１５分後に１Ｍ Ｈ3ＰＯ4で停止し、そして４５０ｎＭで分光光度的に読み取った。このアッセイを、標識した抗体および競合抗体の各組み合わせについて、少なくとも２回、３連で行った。２つ抗体が、互いの結合を８０％より大きく交差ブロック（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋ）した場合に、同じエピトープグループに存在するとみなした。
ＧＶ３９Ｍおよび１１Ｂ５は、ペルオキシダーゼ標識後、結合活性を保持しなかったが、ビオチン化に耐性であった。ＧＶ３９Ｍおよび１１Ｂ５をビオチン化し、そして抗Ｆｌｋ−１抗体（１Ａ８）によって捕捉されたか、またはＥＬＩＳＡプレート上に直接的にコートした、ＶＥＧＦ：ｓＦｌｋ−１に対して試験した。
（８．ウエスタンブロット分析）
５％胎仔ウシ血清の存在下の精製組換えＶＥＧＦを、還元条件下および非還元条件下の１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースに転写した。このニトロセルロース膜を、Ｓｅａ−Ｂｌｏｃｋ ＰＰ８２−４１（Ｅａｓｔ Ｃｏａｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｂｅｒｗｉｃｋ，ＭＥ）を使用してブロックし、そしてミニブロッター（ｍｉｎｉ−ｂｌｏｔｔｅｒ）装置（Ｉｍｍｕｎｅｔｉｃｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用して、一次抗体をプローブした。適切なペルオキシダーゼ結合体化二次抗体とのインキュベーション後、ＥＣＬ増強化学発光によって、膜を発色させた。
（Ｂ．結果）
（１．２Ｃ３は、固有のエピトープ特異性を有する）
表１は、異なる抗ＶＥＧＦ抗体のクラス／サブクラス、それらが認識するＶＥＧＦ上のエピトープグループ、およびＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ：レセプター（ＶＥＧＦ：Ｆｌｋ−１）複合体への優先的結合についての情報を要約する。全ての例において、これらの抗体は、ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１６５に等しくよく結合し、本質的に同じ結果を生じた。以下のこれらの結果は、他で明記されない限りＶＥＧＦ１６５に対するものである。
Figure 2011046720
１．エピトープグループを、競合的ＥＬＩＳＡによって決定した。
２．マウスを、ヒトＶＥＧＦのＮ末端２６アミノ酸（１１Ｂ５、３Ｅ７、７Ｇ３および１２Ｄ７）、モルモットＶＥＧＦのＮ末端２５アミノ酸（ＧＶ３９Ｍ）または全長組換えヒトＶＥＧＦ（２Ｃ３）のいずれかに対応する合成ペプチドで免疫した。
３．抗体を、ＶＥＧＦ単独との反応性、またはｓＦｌｋ−１と結合したＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ：Ｆｌｋ−１）との反応性について、間接的ＥＬＩＳＡおよび捕捉ＥＬＩＳＡにおいてスクリーニングした。
４．Ａ４．６．１は、正確に規定されたエピトープを有し、これは、２Ｃ３によって認識されるエピトープグループ４とは異なる。Ａ４．６．１研究は、Ｋｉｍら、１９９２；Ｗｉｅｓｍａｎｎら、１９９７；Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８；およびＫｅｙｔ、１９９６（各々は、参考として本明細書中に援用される）に報告されている。
ビオチン化試験抗体またはペルオキシダーゼ標識試験抗体、および１０〜１００倍過剰の非標識競合抗体を使用する、競合結合研究は、２Ｃ３が、固有のエピトープに結合することを示した。これらの研究は、ＧＶ３９Ｍおよび１１Ｂ５が、ＶＥＧＦ：Ｆｌｋ−１への互いの結合を交差ブロックすること、および３Ｅ７および７Ｇ３が、アビジン上に捕捉されたＶＥＧＦ−ビオチンへの互いの結合を交差ブロックすることを、最初に明らかにした。ＧＶ３９Ｍおよび１１Ｂ５を、エピトープグループ１に任意に割り当て、一方、３Ｅ７および７Ｇ３を、エピトープグループ２に割り当てた。
２Ｃ３および残りの抗体１２Ｄ７は、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ：レセプターに対する互いの結合、またはそれらに対する残りの抗体の結合に有意に干渉しなかった。１２Ｄ７を、エピトープグループ３に割り当て、そして２Ｃ３を、エピトープグループ４に割り当てた（表１）。
上記に作表したように、２Ｃ３は、抗体Ａ４．６．１に対するエピトープとは異なるエピトープを認識する。本発明者らの競合研究は、２Ｃ３およびＡ４．６．１が、交差反応性ではないことを示した。Ａ４．６．１によって認識されるエピトープはまた、正確に規定され、そしてアミノ酸８９〜９４の周辺に集中する連続性のエピトープである（Ｋｉｍら、１９９２；Ｗｉｅｓｍａｎｎら、１９９７；Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８；Ｋｅｙｔら、１９９６（各々は、参考として本明細書中に援用される））。２Ｃ３とＡ４．６．１の間には多くの公知の差異もまた、存在する（以下を参照のこと）。
（２．２Ｃ３は、遊離のＶＥＧＦに結合する）
遊離形態および複合体形態の可溶性ＶＥＧＦに結合する抗体の能力において、顕著な差異が存在する（表２）。これらの研究は、２Ｃ３の固有の性質の証拠をさらに提供する。表２は、ＧＶ３９Ｍおよび１１Ｂ５が、ＶＥＧＦ：レセプター複合体に対する強い選択性を提示し、最大半減結合（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ
ｂｉｎｄｉｎｇ）は、それぞれ、溶液中の遊離ＶＥＧＦについては、４００ｎＭおよび８００ｎＭであるのに比べて、ＶＥＧＦ：Ｆｌｋ−１については、５．５ｎＭおよび２ｎＭで到達される。
対照的に、２Ｃ３および１２Ｄ７は、遊離ＶＥＧＦに対する選択性を提示し、その最大半減結合は、ＶＥＧＦ：Ｆｌｋ−１複合体について、それぞれ、１５０ｎＭおよび２５０ｎＭであるのに比べて、それぞれ、１ｎＭおよび２０ｎＭで到達される。しかし、２Ｃ３は、インビボ注射後に、腫瘍血管系および腫瘍支質に局在する（以下を参照のこと）。
３Ｅ７は、遊離ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ：Ｆｌｋ−１複合体に等しく結合し、最大半減結合は、両方について１ｎＭで到達される。
Figure 2011046720
１．最大半減結合値は、ビオチン化ＶＥＧＦ、およびＶＥＧＦと複合体化したビオチン化ｓＦｌｋ−１を、その示された抗体でコートしたウェル上に対して３連で滴定し、次いで、ペルオキシダーゼ標識アビジンで発色させることによって測定した。
２．１．０より大きい比は、複合体（ＶＥＧＦ：Ｆｌｋ−１）に対する抗体の選択性を示し、一方、１．０未満の比は、ＶＥＧＦに対する選択性を示す。
３．使用したコントロール抗体としては、以下が挙げられる：１Ａ８（マウス抗Ｆｌｋ−１）、Ｍａｂ４．６．１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ製のマウス抗ヒトＶＥＧＦ）、およびネガティブコントロールとしての無関係なＩｇＭ。
４．ＮＲ＝反応が検出されず。
（３．２Ｃ３は、非コンフォーメーション依存性エピトープを認識する）
ウエスタンブロット分析は、１２Ｄ７、２Ｃ３および７Ｇ３が、還元条件下および非還元条件下で、変性ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１６５と反応することを示す。従って、これらの抗体は、非コンフォーメーション依存性（ｎｏｎ−ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）のエピトープを認識するようである。
対照的に、ＧＶ３９Ｍ、１１Ｂ５および３Ｅ７は、ウエスタンブロット上でＶＥＧＦと反応しなかった。これはおそらく、それらが、コンフォメーション依存性であり、そして変性条件下で変形する、ＶＥＧＦのＮ末端上のエピトープを認識するからである。
抗ＶＥＧＦ抗体のウエスタンブロット分析を、１２％ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、５％ＦＣＳ存在下でＶＥＧＦ１６５を分離して、ＥＣＬ検出を使用する標準的なウエスタンブロッティングプロトコルによって分析することによって行った。一次抗体を、マルチレーンミニブロッター装置を使用して、ニトロセルロース膜と共にインキュベートした。コントロール抗体としては、以下を含んだ：１μｇ／ｍｌのＡｂ−３（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ製のＶＥＧＦに特異的なモノクローナルＩｇＧ）、５μｇ／ｍｌのＡ−２０（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．製のウサギ抗ＶＥＧＦ抗体）、および１０μｇ／ｍｌの無関係な特異性のＩｇＧ。
５μｇ／ｍｌの２Ｃ３を含む、異なる抗体についての代表的なウエスタンブロットは、ダイマーのＶＥＧＦを約４２ｋｄの大きいバンドとして示した。約１３０ｋｄのマルチマーのＶＥＧＦもまた、１２Ｄ７、７Ｇ３およびポジティブコントロール抗体で明らかになった。
（４．腫瘍免疫組織化学）
免疫組織化学によって試験した腫瘍は、癌患者由来の種々の型のヒト腫瘍、マウス中で増殖された種々の型の移植可能なヒト腫瘍異種移植片、モルモット中で増殖されたモルモット系統１０腫瘍、およびマウス中で増殖されたマウス３ＬＬ腫瘍であった（詳細については、表３に対する説明を参照のこと）。
ＮＣＩ−Ｈ３５８ヒトＮＳＣＬＣ異種移植片に対する３Ｅ７、ＧＶ３９Ｍおよび１１Ｂ５の免疫組織化学的反応性を測定し、そしてコントロール抗体（無関係な特異性のＩｇＧ；Ａ２０（ウサギ抗ＶＥＧＦ抗体）；およびＭＥＣＡ ３２（ラット抗マウス内皮細胞抗体）と比較した。ＳＣＩＤマウス中で増殖されたＮＣＩ−Ｈ３５８ヒトＮＳＣＬＣの８μｍの凍結切片を、間接的な免疫ペルオキシダーゼ技術を使用して染色し、そしてヘマトキシリンで対比染色した。
ＧＶ３９Ｍおよび１１Ｂ５（これらは、ＶＥＧＦ上のエピトープグループ１を認識する）が、試験した全ての腫瘍において、血管内皮細胞を強く染色し、そして血管周囲の結合組織を中程度に染色することが決定された。エピトープグループ１抗体は、腫瘍細胞とのそれらの反応性において異なり、ＧＶ３９Ｍは、腫瘍細胞と弱くしか反応しないが、一方、１１Ｂ５は、より強く反応した。ＭＥＣＡ３２（マウス）またはＴＥＣ １１（ヒト）によって染色された内皮細胞の約８０％は、ＧＶ３９Ｍおよび１１Ｂ５によってもまた染色された。
３Ｅ７および７Ｇ３（これらは、ＶＥＧＦエピトープグループ２を認識する）は、試験した全ての腫瘍において、血管内皮細胞、結合組織、および腫瘍細胞との反応性を示した（表３）。特に、抗体を低濃度（１〜２μｇ／ｍｌ）で適用した場合に、内皮細胞染色の強度は、腫瘍細胞染色または結合組織染色よりも、代表的にはより強く、血管内皮に対する選択性の顕著な増大が見られた。
Figure 2011046720
免疫組織化学分析を、標準的な免疫組織化学技術によって、腫瘍組織のアセトン固定凍結切片に対して行った。これらの切片を、顕微鏡試験し、そして以下のように反応性についてスコア付けした：−、陰性；＋／−、非常に弱い；１＋、弱い；２＋、中程度；３＋、強い；４＋、非常に強い。
１．２Ｃ３および１２Ｄ７を、２０μｇ／ｍｌで適用し；全ての他の抗体を、５〜１０μｇ／ｍｌで適用した。
２．反応性の定義：ＥＣ＝内皮；ＣＴ＝結合組織；ＴＣ＝腫瘍細胞；ＮＲ＝反応なし。
３．試験したヒト腫瘍異種移植片；ＮＣＩ−Ｈ３５８ ＮＳＣＬＣ、ＮＣＩ−Ｈ４６０ ＮＳＣＬＣ、ＨＴ２９結腸腺癌、Ｌ５４０ホジキンリンパ腫。
４．試験したヒト腫瘍；軟性組織肉腫、ホジキンリンパ腫、腎臓癌、乳癌、耳下腺癌、結腸癌、肺癌および内皮癌。
５．系統１０モルモット腫瘍切片におけるモルモットＶＥＧＦとの反応性。
６．マウス３ＬＬ Ｌｅｗｉｓ肺癌腫瘍切片におけるマウスＶＥＧＦとの反応性。
１２Ｄ７および２Ｃ３は、いずれの腫瘍組織の凍結切片を染色しなかった。これはおそらく、組織のアセトン固定が、抗体結合を破壊したからである。しかし、２Ｃ３は、インビボ注射後に腫瘍組織に局在化した（以下を参照のこと）。
ＧＶ３９Ｍ、１１Ｂ５、３Ｅ７および７Ｇ３は、モルモット中で増殖されたモルモット系統１０腫瘍およびマウス中で増殖されたマウス３ＬＬ腫瘍の凍結切片上の齧歯類血管系と反応した。ＧＶ３９Ｍ、１１Ｂ５および７Ｇ３は、ヒト腫瘍標本中のヒト血管系と反応したのと同様に、モルモットおよびマウスの腫瘍血管系と強く反応した。３Ｅ７は、モルモットまたはヒトの腫瘍切片を染色するよりも、低い強度でマウス３ＬＬ腫瘍を染色した。これは、３Ｅ７が、マウスＶＥＧＦに対するより低い親和性を有することを示唆する。これらの結果は、２Ｃ３を除く全ての抗体が、マウスＶＥＧＦと反応することを示す、間接的ＥＬＩＳＡによる分析と一致する。
（実施例ＩＩ）
（２Ｃ３は、内皮細胞移動を阻害する）
（Ａ．材料および方法）
（内皮細胞増殖アッセイ）
成体ウシ大動脈内皮（ＡＢＡＥ）細胞を、１５００細胞／ウェルで９６ウェル組織培養プレート内にプレートし、そして種々のサンプルおよびコントロール抗体の添加と共に、０．５ｎＭのヒトＶＥＧＦの存在下で増殖させた。コントロールウェルは、ＶＥＧＦを含むか、または含まない培地を受容した。
インキュベーション後４日目で、細胞を、ＭＴＣ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内部塩（ｉｎｎｅｒ ｓａｌｔ））変換アッセイによって定量化した。ここで、ホルマザンへのＭＴＳ変換は、細胞数に比例し、そして４９０ｎＭの吸光度によって追跡され得る（Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。このアッセイは、製造業者の説明書に従って行った。
細胞増殖を、ＶＥＧＦを添加しなかった培養物中のＭＴＳ変換を差し引くことによって推測した。結果を、ＶＥＧＦのみが添加されたコントロール培養物中のＭＴＳ変換のパーセンテージとして表した（Ｂｕｔｔｋｅら、１９９３）。
（Ｂ．結果）
（ＶＥＧＦ媒介内皮細胞増殖の阻害）
ＶＥＧＦ上のエピトープグループ１〜３を認識する、ＩｇＧ抗体３Ｅ７および１２Ｄ７は、ＡＢＡＥ細胞のＶＥＧＦ媒介増殖を阻害しなかった（図１）。これは、これらの抗体が、そのエピトープがＶＥＧＦ：ＫＤＲ相互作用に関与しない、非遮断（ｎｏｎ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）抗ＶＥＧＦ抗体であることを示唆する。ＶＥＧＦ上のエピトープグループ１〜３をまた認識する、ＩｇＭ抗体ＧＶ３９Ｍは、同様に、ＡＢＡＥ細胞のＶＥＧＦ媒介増殖を阻害せず、そして非遮断抗ＶＥＧＦ抗体である。
対照的に、ＶＥＧＦ上のエピトープ４に対する２Ｃ３、および参照の中和抗ＶＥＧＦ抗体、Ｍａｂ４．６．１は、それぞれ、３ｎＭおよび１ｎＭで、ＶＥＧＦ媒介ＡＢＡＥ増殖を５０％阻害した（図１）。これは、２Ｃ３が、ＶＥＧＦのマイトジェン活性を中和し得ることを示す。
２Ｃ３の遮断Ｍａｂとしての規定は、ＧＶ３９Ｍ、３Ｅ７および１２Ｄ７に加えた、他の抗体の範囲からは、２Ｃ３を区別する。種々の抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、Ａｂ−３）は、非遮断モノクローナルであることが知られており、これらは、２Ｃ３から明確に区別される。
ＩｇＭ抗体の１つである、１１Ｂ５は、８ｎＭ以上の濃度でＡＢＡＥ細胞に対して毒性であった。３０分以内および２４時間以内に脱離された細胞は、トリパンブルー色素を取り込んだ。この効果は、細胞型特異的であるようである。なぜなら、ＨＵＶＥＣ、ブタ大動脈内皮細胞、およびｂＥＮＤ．３細胞は、４０ｎＭでさえ、１１Ｂ５によって影響されなかったからである。ＶＥＧＦの添加の不在下および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の存在下で生じるように、１１Ｂ５の毒性効果は、増殖因子非依存性であるようである。
（実施例ＩＩＩ）
（２Ｃ３は、インビボで腫瘍に特異的に局在化する）
（Ａ．材料および方法）
（ヒト腫瘍異種移植片へのインビボ局在化）
腫瘍を、腫瘍体積が約１ｃｍ3になるまで、免疫無防備状態マウスにおいて皮下増殖させた（ｎｕ／ｎｕマウスにおいてＮＣＩ−Ｈ３５８ ＮＳＣＬＣおよびＳＣＩＤマウスにおいてＨＴ２９結腸腺癌）。ＳＣＩＤマウスを使用する研究についての１００μｇの非標識抗体、またはヌードマウスを使用する研究についての１００μｇのビオチン化抗体を、尾静脈を介して静脈内注射した。２４時間後、マウスを麻酔し、ＰＢＳを灌流し、そして心臓、肺、肝臓、腎臓、腸および脾臓を含む腫瘍および器官を収集し、液体窒素中で瞬間凍結させた。
各マウス由来の腫瘍および器官を、上記のように、低温槽上で切片化し、そして免疫組織化学的に抗体について染色した。ただし、ヌードマウス由来の切片は、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン−ビオチン複合体（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を使用して発色させ、そしてＳＣＩＤマウス由来の切片は、２つのペルオキシダーゼ結合体化二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ、その後のウサギ抗ヤギＩｇＧ）を使用して発色させた。
（Ｂ．結果）
（腫瘍保有マウスにおけるインビボ局在化）
ヒト腫瘍異種移植片における２Ｃ３、３Ｅ７およびＧＶ３９Ｍのインビボ局在化を決定した。１００μｇのビオチン化２Ｃ３またはアイソタイプ適合型コントロールＩｇＧを、ＮＣＩ−Ｈ３５８ヒトＮＳＣＬＣを保有するｎｕ／ｎｕマウス内にｉ．ｖ．注射した。１００μｇのＧＶ３９Ｍおよび３Ｅ７またはアイソタイプ適合型コントロールＩｇＧを、ＨＴ２９ヒト結腸腺癌を保有するＳＣＩＤマウス内に注射した。２４時間後、マウスを屠殺し、放血し、そして腫瘍および組織を取り出した。腫瘍および組織の凍結切片を、免疫組織化学的に分析し、抗体の結合および分布を決定した（表４）。
（表４．腫瘍を有するマウスにおける抗ＶＥＧＦ抗体の組織分布）
Figure 2011046720
免疫組織化学分析を、屠殺の２４時間前に静脈内に、１００ｍｇの示された抗体を受容した、腫瘍を有するマウス由来の、アセトン固定化した組織（腫瘍を含む）の凍結切片上で実行した。その切片を、顕微鏡的に試験し、そして以下のように特異的反応性について点数付けした：−，ネガティブ；＋／−，非常に弱い；＋，弱い；２＋，中程度；３＋，強い；４＋，非常に強い。
１．ＧＶ３９Ｍは、腎臓の糸球体中の内皮または血管間膜細胞に特異的に結合した。
２．３Ｅ７およびＧＶ３９Ｍは、腫瘍血管内皮に特異的に結合したが、一方、２Ｃ３は腫瘍支質に特異的に結合した。
３．コントロール＝無関係の特異性のＩｇＭ。
３Ｅ７は、腫瘍中の血管内皮に特異的に局在した。およそ７０％のＭＥＣＡ ３２ポジティブな血管が、インビボで注射された３Ｅ７によって染色された。微小脈管構造を与えるより大きな血管は、３Ｅ７ポジティブであった。小さな微小血管は、支質のトラックおよび腫瘍のネストの両方においてもまた、３Ｅ７についてポジティブであった。３Ｅ７による染色の強度は、病巣の壊死の領域においておよびその領域の周辺で増加した。腫瘍の壊死の領域においては、血管外の抗体が明白であるが、腫瘍の健常な領域においては、血管外染色の証拠はほとんどなかった。試験されたすべての正常な組織（腎臓を含む）における血管内皮は、３Ｅ７によって染色されなかった。
ＧＶ３９Ｍもまた、腫瘍の血管内皮に特異的に特異的に局在化した。腫瘍中のおよそ８０％のＭＥＣＡ ３２ポジティブ血管がＧＶ３９Ｍによって染色された。ＧＶ３９Ｍポジティブ血管は、腫瘍全体にわたって等しく分布していた（大きな血管を含むが、小さな毛細管もまた含む）。３Ｅ７と同様に、ＧＶ３９Ｍポジティブ血管の染色強度は、腫瘍の病巣の壊死領域において増大した。しかし、３Ｅ７とは異なり、腎臓の糸球体の内皮細胞または血管間膜細胞もまた染色された。関連性のない特異性のコントロールＩｇＭは糸球体の染色を生じないから、ＧＶ３９Ｍによる糸球体の染色は抗原特異的であるようである。腎臓以外の組織中の血管内皮は、ＧＶ３９Ｍによって染色されなかった。
ビオチン化された２Ｃ３は、静脈内注射後のＨ３５８ヒトＮＳＣＬＣ腫瘍の脈管構造を取り囲む接合組織の強力な染色を生じた。腫瘍細胞のネストを結合する支質組織の大きなトラックは、支質の最大のトラックで最も強い局在化が観察される、２Ｃ３によって染色された。これらの領域において、周りを取り囲む結合組織から、血管内皮を区別することは不可能であった。しかし、支質によって取り囲まれない血管中の内皮細胞（例えば、腫瘍組織それ自体のネストを通して走る血管中の内皮細胞）が染色された。試験されたいかなる正常組織においても、２Ｃ３による検出可能な染色は存在しなかった。
ＨＴ２９ヒト腫瘍モデルにおいて、２Ｃ３もまた強力に結合組織に局在したが、大部分の強力な染色は、腫瘍の壊死領域中で観察された。
（実施例ＩＶ）
（２Ｃ３は、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２に対する結合を阻害するが、ＶＥＧＦＲ１に対する結合は阻害しない）
（Ａ．材料と方法）
（１．細胞株および抗体）
ＶＥＧＦＲ１（ＰＡＥ／ＦＬＴ）またはＶＥＧＦＲ２（ＰＡＥ／ＫＤＲ）のいずれかでトランスフェクトしたブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞は、Ｄｒ．Ｊｏｈａｎｎｅｓ Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ（Ｕｌｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、これは、Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら（１９９４、本明細書中で参考として具体的に援用される）に記載されるように調製され、そして５％ ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシン（ＧＰＳ）を含むＦ−１２培地中で増殖させた。ｂＥＮＤ３細胞は、Ｄｒ．Ｗｅｒｎｅｒ Ｒｉｓａｕ（Ｂａｄ Ｎａｕｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、そして５％ ＦＣＳおよびＧＰＳを含むＤＭＥＭ培地中で増殖させた。ＮＣＩ−Ｈ３５８ ＮＳＣＬＣ（Ｄｒ．Ａｄｉ Ｇａｚｄａｒ，ＵＴ−Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸから入手した）、Ａ６７３ヒト横紋筋肉腫、およびＨＴ１０８０ヒト線維肉腫（両方ともＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより）は、１０％ ＦＣＳおよびＧＰＳを含有するＤＭＥＭ培地中で増殖させた。
２Ｃ３および３Ｅ７（抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体）、および１Ａ８（モノクローナル抗Ｆｌｋ−１抗体）、およびＴ０１４（ポリクローナル抗Ｆｌｋ−１抗体）は、上記のように実施例Ｉに、ならびにＢｒｅｋｋｅｎら（１９９８）およびＨｕａｎｇら（１９９８）（各々が具体的に本明細書中に参考として援用される）に記載される。Ａ４．６．１（マウス抗ヒトＶＥＧＦモノクローナル抗体）は、Ｄｒ．Ｊｉｎ Ｋｉｍ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，ＣＡ）から入手し、そして以前に記載されている（Ｋｉｍら、１９９２；具体的に本明細書中に参考として援用される）。使用したネガティブコントロール抗体は、ＯＸ７、マウス抗ラットＴｈｒ１．１抗体（Ｂｕｋｏｖｓｋｙら、１９８３）（Ｄｒ．Ａ．Ｆ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ（ＭＲＣ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｔ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）より入手）およびＣ４４、マウス抗コルヒチン抗体（Ｒｏｕａｎら、１９９０、ＡＴＣＣより入手）。
（２．ＥＬＩＳＡ分析）
ＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメイン（Ｆｌｔ−１／Ｆｃ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）またはＶＥＧＦＲ２（ｓＦｌｋ−１−ビオチン）を、それぞれ、マイクロタイタープレートのウェル上で直接コートするか、またはＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）でコートされたウェルによって捕捉された。１ｎＭ（４０ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＶＥＧＦを、１００〜１０００ｎＭ（１５μｇ−１５０μｇ／ｍｌ）のコントロール抗体または試験抗体の存在下または非存在下でウェル中でインキュベートした。次いで、そのウェルを、１μｇ／ｍｌのウサギ抗ＶＥＧＦ抗体（Ａ−２０，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）とともにインキュベートした。
反応を、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ウサギ抗体（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）の添加によって発色させ、そして３，３’５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の添加によって可視化した。１５分後、１Ｍ Ｈ3ＰＯ4で反応を停止させ、そして分光測定的に４５０ｎｍで読みとりを行った。
アッセイをまた、コントロールＩｇＧおよび試験ＩｇＧのいずれかでマイクロタイタープレートのウェルをコートすることによって行った。次いで、ウェルをＶＥＧＦ：Ｆｌｔ−ｌ／ＦｃまたはＶＥＧＦ：ｓＦｌｋ−１−ビオチンとともにインキュベートし、そして、それぞれ、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＦｃ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）またはペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンのいずれかを用いて発色させ、そして上記のように可視化した。
（３．共沈殿アッセイ）
４０ｎｇのＶＥＧＦを、２Ｃ３（２０μｇ）またはＡ４．６．１（１０および１μｇ）のいずれかのＦ（ａｂ’）2とともに３０分間、結合緩衝液（１ｍＭ ＣａＣｌ2，０．１ｍＭ ＣｕＳＯ4，および０．５％ トリプトンを有するＤＭＥＭ）中でプレインキュベートした。２００ｎｇの可溶型ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１／Ｆｃ）またはＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｃ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を５０μｌの総容量で添加し、そして２時間インキュベーションした。レセプター／Ｆｃ構築物を、プロテインＡ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを使用して沈殿させ、そして得られた沈殿物を結合緩衝液を用いて４回洗浄した。
還元サンプル緩衝液を、各反応のペレットおよび上清に添加し、両方を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、そしてＰＶＤＦメンブレンに転写した。次いで、そのメンブレンを、１２Ｄ７（１．０μｇ／ｍｌ）（マウス抗ＶＥＧＦ抗体）でプロービングし、そしてペルオキシダーゼ標識ヤギマウスＩｇＧ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）とのインキュベーション後に、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって発色させた。可溶性レセプター／Ｆｃ構築物もまた、ペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗ヒトＦｃ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して検出した。
（Ｂ．結果）
（１．２Ｃ３は、ＥＬＩＳＡにおいてＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２への結合をブロックするが、ＶＥＧＦＲ１への結合はブロックしない）
抗ＶＥＧＦ抗体２Ｃ３は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＶＥＧＦがＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に結合することをブロックするが、ＶＥＧＦＲ１（ＦＬＴ−１）への結合はブロックしなかった。１００倍および１０００倍モル過剰の２Ｃ３の存在下において、ＶＥＧＦＲ２コートされたウェルに結合するＶＥＧＦの量は、２Ｃ３の非存在下において結合する量の２６％および１９％にそれぞれ減少した（図２）。対照的に、１００倍および１０００倍モル過剰の２Ｃ３の存在下において、ＶＥＧＦＲ１コートされたウェルに結合するＶＥＧＦの量は、それぞれ、２Ｃ３の非存在下において結合する量の９２％および１０５％であった（図２）。
ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ２に結合するＶＥＧＦの量は、１００〜１０００倍過剰の非ブロッキングモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体３Ｅ７または関連性のない特異性のコントロールＩｇＧの存在によって影響されなかった（図２）。Ａ４．６．１は、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）とＶＥＧＦＲ１（ＦＬＴ−１）の両方へのＶＥＧＦ結合をブロックした。
（２．２Ｃ３は、溶液中でＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２への結合をブロックするがＶＥＧＦＲ１への結合をブロックしない）
２Ｃ３が、溶液中で、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ１／ＦｃまたはＶＥＧＦＲ２／Ｆｃへの結合をブロックする能力を、共沈殿アッセイにおいて評価した。４０ｎｇのＶＥＧＦを、２Ｃ３または４．６．１ Ｆ（ａｂ’）2の存在下または非存在下で、Ｆｃ部分に連結したＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１／Ｆｃ）またはＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｃ）の細胞外ドメインの２００ｎｇとともにインキュベートした。レセプター／Ｆｃ構築物を、プロテインＡ ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを伴うインキュベーションによって沈殿させた。沈殿物を洗浄し、還元サンプル緩衝液中に再懸濁し、そして１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてＰＶＤＦに転写した。メンブレンをＰＰ８２でブロックし、そして１２Ｄ７（１μｇ／ｍｌ）マウス抗ＶＥＧＦ抗体でプロービングし、そして標準的な化学発光条件下で発色させた。Ｆ（ａｂ’）2を伴うＶＥＧＦモノマーおよびダイマーを検出した。
ＶＥＧＦＲ１／ＦｃまたはＶＥＧＦＲ２／Ｆｃのいずれかと混合したＶＥＧＦを、プロテインＡ ｓｅｐｈａｒｏｓｅによって共沈殿させた。このことは、ＶＥＧＦが両方のレセプターに結合することを示す。２Ｃ３ Ｆ（ａｂ’）2の付加は、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２／Ｆｃへの結合をブロックしたが、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｃへの結合はブロックしなかった。対照的に、４．６．１ Ｆ（ａｂ’）2は、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２／ＦｃとＶＥＧＦＲ１／Ｆｃの両方への結合をブロックした。この結果は、２Ｃ３が、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２への結合を阻害するが、ＶＥＧＦＲ１への結合を阻害しないこと、それに対して、４．６．１抗体は、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２とＶＥＧＦＲ１の両方への結合を阻害することを支持する。
（実施例Ｖ）
（２Ｃ３は、ＶＥＧＦによって誘導されるＶＥＧＦＲ２のリン酸化をブロックする）
（Ａ．材料および方法）
（免疫沈殿およびウェスタンブロット分析）
ＰＡＥ／ＫＤＲ、ＰＡＥ／ＦＬＴ、およびｂＥＮＤ．３細胞を、５％血清を含む培地中の１００ｍｍ組織ディッシュにおいて、８０〜９０％コンフルエントまで増殖させた。次いで、細胞を、０．１％血清を含む培地中で２４時間血清飢餓にした。ＰＢＳ中の１００ｎＭ オルトバナジン酸ナトリウムでの３０分間の前処理の後に、さらなる１５分間のコントロール抗体または試験抗体の存在下または非存在下において、細胞を５ｎＭ（２００ｎｇ／ｍｌ）のＶＥＧＦ１６５、５ｎＭ（１００ｎｇ／ｍｌ）ｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、またはＡ６７３腫瘍馴化培地とともにインキュベートした。
次いで、細胞を、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ フッ化ナトリウムおよび２ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウムを含有する氷冷したＰＢＳで洗浄し、そして溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣＩ、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、０．２５％ デオキシコール酸、０．１％ ＣＨＡＰＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１．５ｍＭ ＭｇＣ１2、２ｍＭ フッ化ナトリウム、２ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム、１０％ グリセロール、およびプロテアーゼインヒビター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ ｔａｂｌｅｔｓ，Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中で溶解させた。この溶解物を遠心分離によって清澄化し、そして得られた上清を免疫沈降のために使用した。
ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２は、それぞれ、細胞溶解物を５μｇのニワトリ抗ＦＬＴ−１ Ｎ末端（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）または１０μｇのＴ０１４（アフィニティー精製した抗Ｆｌｋ−１）とともに４℃で一晩インキュベートすることによって免疫沈降させた。ニワトリ抗ＦＬＴ−１抗体を使用する反応は、引き続いて、架橋したヤギ抗ニワトリ抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）とともに４℃で１時間インキュベートした。次いで、この免疫複合体を、プロテインＡ／Ｇ ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて沈殿させ、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．２％）中の１０％溶解緩衝液（プロテアーゼインヒビターを添加して）複数回洗浄し、そして１００ｍＭ β−メルカプトエタノールおよび８Ｍ 尿素を含有するＳＤＳサンプル緩衝液中で煮沸した。
次いで、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてＰＶＤＦメンブレンに転写した。このメンブレンを、ＰＰ８１（Ｅａｓｔ Ｃｏａｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｂｅｒｗｉｃｋ，ＭＥ）で３０〜６０分間ブロックし、そしてホスホチロシン残基について、０．５μｇ／ｍｌの４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）を用いて、４℃で一晩プロービングした。ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）とのインキュベーションの後、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によってＰＶＤＦメンブレンを発色させた。次いで、ＰＶＤＦメンブレンを、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ Ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で、５５℃で３０分間ストリップし、そして０．５μｇ／ｍｌニワトリ抗ＦＬＴ−１または１．０μｇ／ｍｌ Ｔ０１４のいずれかを用いてレセプターレベルについて再プロービングし、そして適切なペルオキシダーゼ結合体化二次抗体とのインキュベーション後に上記のように発色させた。
（Ｂ．結果）
（ＶＥＧＦ誘導されたリン酸化のブロッキング）
これらの研究において、ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞を、ＰＢＳ、ｂＦＧＦ（５ｎＭ、 １００ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ１６５（５ｎＭ、２１０ｎｇ／ｍｌ）、Ａ６７３馴化培地（ＣＭ）、特定の抗体（ＣＮＴＬ、２Ｃ３、３Ｅ７、Ａ４．６．１、別々に１００ｎＭ、１５μｇ／ｍｌ）を組み合わせたＣＭ、またはＴ０１４単独（１００ｎＭ、１５μｇ／ｍｌ）で１５分間刺激した。ＰＡＥ／ＦＬＴ細胞をまた、ＰＢＳ、ＶＥＧＦ１６５（５ｎＭ、２１０ｎｇ／ｍｌ）、Ａ６７３馴化培地（ＣＭ）、特定の抗体（２Ｃ３、３Ｅ７、Ａ４．６．１、別々に１００ｎＭ、１５μｇ／ｍｌ）を組み合わせたＣＭ、またはＴ０１４単独（１００ｎＭ、１５μｇ／ｍｌ）で１５分間刺激した。次いで、この細胞を、溶解緩衝液中でインキュベートし、そしてレセプターを免疫沈降し、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、そして４Ｇ１０（０．５μｇ／ｍｌ）（マウス抗ホスホチロシン抗体）を用いてプロービングし、そして標準的な化学発光条件下で発色させた。次いで、メンブレンをストリップし、そして免疫沈降しているＩｇＧを用いて再プロービングして、各レーン中のレセプタータンパク質のレベルを決定した。
この結果は、２Ｃ３がＡ４．６．１（コントロール中和抗ＶＥＧＦ抗体）とともに、ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞中におけるＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦ誘導性のリン酸化をブロックすることを示す。このことは、２Ｃ３とＡ４．６．１の両方がＶＥＧＦ媒介性の内皮細胞の増殖をブロックすることを実証した以前の実験と一致した（実施例ＩＩ；Ｂｒｅｋｋｅｎら、１９９８）。免疫沈降物中のＶＥＧＦＲ２のウェスタンブロットを、各レーンにおけるＶＥＧＦＲ２タンパク質の量を実証するために行った。３Ｅ７（これは、ＶＥＧＦのＮＨ2−末端エピトープを認識する）は、ＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦ誘導されたリン酸化をブロックせず、そして関連性のない特異性のコントロールＩｇＧもブロックしなかった。
ＶＥＧＦＲ１のＶＥＧＦ誘導されたリン酸化に対する２Ｃ３の効果は明らかではない。他の研究者らが示してきたように、ＰＡＥ／ＦＬＴ細胞中の、ＶＥＧＦＲ１のＶＥＧＦ誘導性のリン酸化は、ＶＥＧＦＲ１の低い内因性のキナーゼ活性におそらく起因して、実証するのが困難である（Ｄｅ Ｖｒｉｅｓら、１９９２；Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら、１９９４；Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈら、１９９６； Ｌａｎｄｇｒｅｎら、１９９８）。
（実施例 ＶＩ）
（２Ｃ３は、ＶＥＧＦ誘導された透過性を阻害する）
（Ａ．材料と方法）
（Ｍｉｌｅｓ透過性アッセイ）
以下のプロトコルは、Ｍｕｒｏｈａｒａら（１９９８；本明細書中で参考として具体的に援用される）によって記載されたものである。手短に言えば、４００〜４５０ｇの雄性ＩＡＦ無毛モルモット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を麻酔し、次いで、耳の静脈を通して、滅菌ＰＢＳ中の０．５ｍｌの０．５％ Ｅｖａｎ’ｓ ｂｌｕｅ色素を静脈内注射した。２０分後、２０ｎｇのＶＥＧＦを、コントロール抗体または試験抗体の存在下または非存在下で皮内（ｉ．ｄ．）注射した。皮内注射の３０分後に、モルモットの背面における得られた青色のスポットを写真撮影し、そしてカリパーを用いて測定した。
（Ｂ．結果）
（２Ｃ３は、ＶＥＧＦ誘導された透過性をブロックする）
ＶＥＧＦ誘導された透過性に対する２Ｃ３の効果を研究するために、４００〜４５０ｇのサイズのＩＡＦ無毛モルモット（Ｈａｒｔｌｅｙ ｓｔｒａｉｎ）を麻酔し、次いで、耳の静脈を通して、滅菌ＰＢＳ中の０．５ｍｌの０．５％ Ｅｖａｎ’ｓ ｂｌｕｅ色素を静脈内注射した。２０分後、２５ｎｇのＶＥＧＦを、コントロール抗体または試験抗体の存在下または非存在下で皮内（ｉ．ｄ．）注射した。皮内注射の３０分後に、モルモットの背面における得られた青色のスポットを写真撮影し、そしてカリパーを用いて測定した。
このＭｉｌｅｓ透過性アッセイを用いて、ＶＥＧＦがＶＥＧＦＲ２を活性化することをブロックする２Ｃ３は、モルモットにおけるＶＥＧＦ誘導された透過性を阻害することが見出された。この効果は、ＶＥＧＦよりも１０倍モル過剰、１００倍モル過剰、または１０００倍モル過剰で、２Ｃ３を用いて明白であった。ＶＥＧＦがＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２の両方を活性化することをブロックするＡ４．６．１（これは、ＶＥＧＦがＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２の両方を活性化することをブロックする）は、１０倍モル過剰でＶＥＧＦ誘導された透過性をブロックした（本研究およびＫｉｍら、１９９２）。ＶＥＧＦ：ＶＥＧＦＲ２相互作用をブロックしない３Ｅ７およびコントロールＩｇＧもまた、モルモットのＭｉｌｅｓ透過性アッセイにおいて、ＶＥＧＦ誘導された透過性をブロックしなかった。
これらの結果は、ＶＥＧＦによって媒介される内皮の透過性が、少なくとも部分的には、ＶＥＧＦＲ２活性化を通して媒介されることを示唆する。これらの結果は、ＶＥＧＦＲ２のチロシンキナーゼ活性がＶＥＧＦ誘導された透過性のために必要であることを示した、他の研究者の結果と一致する（Ｍｕｒｏｈａｒａら、１９９８；Ｊｏｕｋｏｖら、１９９８；Ｏｇａｗａら、１９９８）。
（実施例ＶＩＩ）
（２Ｃ３の抗腫瘍効果）
（Ａ．材料と方法）
（１．インビトロ腫瘍増殖阻害）
ｎｕ／ｎｕマウスを、０日目に、１×１０7ＮＣＩ−Ｈ３５８ ＮＳＣＬＣ細胞または５×１０6Ａ６７３横紋筋肉腫細胞のいずれかを皮下注射した。１日目および引き続いて１週間あたり２回、マウスに２Ｃ３の腹腔内注射（示されるように、１、１０、もしくは１００μｇまたはコントロール）を与えた。次いで、腫瘍を、ＮＣＩ−Ｈ３５８保有マウスについては約６週間、およびＡ６７３保有マウスについては４週間の期間にわたって１週間あたり２回測定した。腫瘍の体積を、式：体積＝Ｌ×Ｗ×Ｈ（ここで、Ｌ＝長さ、Ｗ＝幅、Ｈ＝高さ）に従って測定した。
（２．インビボ腫瘍治療）
２００〜４００ｍｍ3のサイズの皮下ＮＣＩ−Ｈ３５８腫瘍またはＨＴ１０８０線維肉腫を有する雄性ｎｕ／ｎｕマウスに、試験抗体またはコントロール抗体を腹腔内注射した。ＮＣＩ−Ｈ３５８を有するマウスを、最初の週の間は１週間に３回、そして２週目および３週目の間は１週間に２回、注射１回あたり１００μｇの抗体で処理した。次いで、このマウスに、５日毎に、注射１回あたり５０μｇに切り換えた。ＨＴ１０８０保有マウスを、研究の全期間にわたって１日おきに、１００μｇの示された抗体、または生理食塩水で処理した。両方の研究において、マウスを、その腫瘍が２５００ｍｍ3のサイズに達した場合に、または腫瘍が潰瘍を作り始めた場合にはより初期に、屠殺した。
（Ｂ．結果）
（１．新規の移植したヒト腫瘍異種移植片の２Ｃ３増殖阻害）
２Ｃ３は、用量依存様式でｎｕ／ｎｕマウスにおけるＮＣＩ−Ｈ３５８ ＮＳＣＬＣおよびＡ６７３横紋筋肉腫の両方のインビボ増殖を阻害する（図３Ａおよび図３Ｂ）。１日前に腫瘍細胞を皮下に注入したマウスに１週あたり２回ｉ．ｐ．で与えられた１００μｇの２Ｃ３は、両方のヒト腫瘍型の増殖を阻害した。２Ｃ３レシピエントのおける最終腫瘍容積は、コントロールのレシピエントにおける約１０００ｍｍ3と比較すると両方の腫瘍系において約１５０ｍｍ3だった。
１週間あたり２度の１０μｇまたは１μｇのいずれかの２Ｃ３での処置は、腫瘍増殖を防止するのにあまり有効ではなかった。しかし、両方のより低い用量の２Ｃ３は、未処置マウスと比較して、類似する程度でＡ６７３腫瘍の増殖を遅らせた。１０μｇの用量の２Ｃ３により引き起こされる腫瘍増殖遅延は、ＮＣＩ−Ｈ３５８腫瘍モデルにおいてあまり顕著ではなかった。これらの２つの腫瘍モデルの間の差異および２Ｃ３によるＶＥＧＦＲ２活性の阻害に対するこれらの応答は、インビボでの２つの型の腫瘍の攻撃性と関係する。ＮＣＩ−Ｈ３５８は、Ａ６７３が増殖するよりもさらにより遅くインビボで増殖し、そして低用量の２Ｃ３に対してあまり敏感ではないようであり、一方、Ａ６７３腫瘍は、より速くかつ攻撃的に増殖し、そして低用量の２Ｃ３に対してより敏感であるようである。
３Ｅ７（これは、ＶＥＧＦに結合するが、その活性をブロックしない）は、ＮＣＩ−Ｈ３５８腫瘍の増殖に影響しなかった。しかし、１週間あたり２回、１００μｇの用量で与えた３Ｅ７は、Ａ６７３腫瘍の増殖を刺激した（図３Ｂ）。このことは、それが腫瘍におけるＶＥＧＦシグナル伝達の効果を増大させることを示唆する。
（２．２Ｃ３を用いる確立したヒト腫瘍異種移植片の処置）
約３００〜４５０ｍｍ3の大きさまで増殖した皮下ＮＣＩ−Ｈ３５８ ＮＳＣＬＣ腫瘍を有するマウスに、無関係の特異性の２Ｃ３、Ａ４．６．１、３Ｅ７、またはＩｇＧをｉ．ｐ．注射した（図４）。用量は、３〜５日ごとに５０〜１００μｇであった。Ａ４．６．１を陽性コントロールとして用いた。なぜならば、それはインビボでＶＥＧＦ活性をブロックし、腫瘍増殖の阻害をもたらすことが、他の研究者により示されているからである（Ｋｉｍら、１９９３；Ｍｅｓｉａｎｏら、１９９８）。平均腫瘍容積を測定すること（図４）に加えて、各処置群からのマウスの写真をまた、研究の終了時の腫瘍の大きさにおける差異および外見を示すために撮影した。
２Ｃ３またはＡ４．６．１のいずれかでの処置は、研究の期間にわたり腫瘍の緩徐な後退を導いた。研究の終了時での平均腫瘍容積は、開始平均腫瘍容積の３０％（２Ｃ３）および３５％（４．６．１）だった（図４）。しかし、これらの結果は、腫瘍増殖における自発的な後退が腫瘍細胞の注射の後の４０日〜６０日の間にマウスのコントロール群において観察されたという事実により複雑化される。４０日までの結果は、増殖における自発的な後退の前に、２Ｃ３およびＡ４．６．１での処置が腫瘍増殖を防ぐことを示す。
図５Ａは、ＮＣＩ Ｈ３５８を保有するマウスを、１００μｇの２Ｃ３または３Ｅ７のいずれかで長期間処置したさらなる研究を示す。この研究では、自発的な後退は、あまり明白ではなかった。処置の開始時点での２Ｃ３処置したマウスの平均腫瘍容積は、４８０ｍｍ3であり、そして処置のおよそ１４週間後の平均腫瘍容積は８４ｍｍ3まで低下した（容積で約８０％の低下）。３Ｅ７処置したマウスは、４２８ｍｍ3の平均腫瘍容積で処置開始し、そしておよそ１４週間後に１３２６ｍｍ3の容積まで増大した（容積で３００％の増加）。
図５Ｂは、ヒト線維肉腫であるＨＴ１０８０を有するマウスの腫瘍増殖曲線を示す。このマウスを、２日ごとに１００μｇの２Ｃ３、３Ｅ７、またはコントロールＩｇＧ、あるいは生理食塩水でいずれも処置した。処置が継続する限り、腫瘍の増殖を妨害した２Ｃ３を続けた。３Ｅ７、コントロールＩｇＧ、または生理食塩水で処置したマウスは、進行的にかつ腫瘍細胞注射後の４週間未満で屠殺されるべきマウスに必要とされる大きさまで増殖した腫瘍を有した。
（実施例ＶＩＩＩ）
（２Ｃ３はＡ４．６．１と区別される）
２Ｃ３とＡ４．６．１との間に多数の差異が存在する（例えば、表５）。抗体は、ＥＬＩＳＡ交叉ブロック（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋ）研究（実施例Ｉ）に基づいて、ＶＥＧＦ上の別々のエピトープを認識する。変異研究およびＸ線結晶研究は、Ａ４．６．１が、アミノ酸８９〜９４の周囲に集中するＶＥＧＦ上のエピトープに結合することを早い時期に示した（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８）。
とくに興味深いことは、Ａ４．６．１が、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２の両方への結合からＶＥＧＦをブロックする（Ｋｉｍら、１９９２；Ｗｉｅｓｍａｎｎら、１９９７；Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８；Ｋｅｙら、１９８６）が、２Ｃ３はＶＥＧＦＲ２への結合からのみ、ＶＥＧＦをブロックする（実施例ＩＶ）という事実である。Ａ４．６．１がＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ１へのＶＥＧＦ結合を阻害するという強力な公開された証拠は、詳細な結晶研究および構造研究から得た（Ｋｉｍら、１９９２；Ｗｉｅｓｍａｎｎら、１９９７；Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８；Ｋｅｙｔら、１９９６；各々が本明細書中で参考として援用される）。公開されたデータは、Ａ４．６．１が、ＶＥＧＦＲ２への結合のために重要であるＶＥＧＦ上のエピトープと競合させることにより、ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦ結合を阻害し、そしてＶＥＧＦＲ１へのＶＥＧＦの結合を最も好ましくは立体障害によりブロックする（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８；Ｋｅｙｔら、１９９６）。
Ａ４．６．１のヒト化バージョンは、現在臨床試験中である（Ｂｒｅｍ，１９９８；Ｂａｃａら、１９９７；Ｐｒｅｓｔａら、１９９７；各々が本明細書中で参考として援用される）。マクロファージ／単球の走化性、およびＶＥＧＦＲ１を介して媒介されるＶＥＧＦの他の内因性機能は、Ａ４．６．１トライアルにおいて最も損なわれるようである。対照的に、２Ｃ３は、ＶＥＧＦＲ２媒介効果を特異的にブロックするその能力に起因して、より優れていると予見される。従って、２Ｃ３は、特にヒトに対する長期の投与について潜在的により安全な抗体である。２Ｃ３を用いる処置の利益は、それがＶＥＧＦ誘導腫瘍脈管構造拡大をブロックするのと同時に、腫瘍へのマクロファージの移動を可能にすることによって、より大きな抗腫瘍応答を開始する宿主の能力を含む。また、マクロファージ走化性およびＶＥＧＦＲ１により媒介される他の効果を維持する多くの全身性の利益を、見逃すべきではない。
Figure 2011046720
用いられる略号：ＩＨＣ、免疫組織化学；ＮＲ、無反応性；ＢＶ、血管；ＣＴ、結合組織。
１．Ａ４．６．１データに関する参考文献としては、以下が挙げられる：Ｋｉｍら、１９９２；Ｗｉｅｓｍａｎｎら、１９９７；Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８；およびＫｅｙｔら、１９９６、各々が本明細書中で参考として援用される
２．２Ｃ３がＶＥＧＦ上で認識するエピトープは未決定だが、Ａ４．６．１がＥＬＩＳＡ交叉ブロック研究を介して認識するエピトープと区別されることが示されている
３．ＶＥＧＦについての２Ｃ３のアフィニティーは、ＥＬＩＳＡおよび表面プラスモン共鳴分析により評価されている
４．Ａ４．６．１は、わずかに固定した（ｌｉｇｈｔｌｙ ｆｉｘｅｄ）アセトン固定凍結切片とのみ反応する
（実施例ＩＸ）
（関節組織におけるＶＥＧＦ染色）
新脈管形成と疾患との間の関係は、血管新生腫瘍において観察される関係を越える範囲におよぶ。例えば、異常な新脈管形成の関与は、関節炎において十分に記載されている。異なる抗ＶＥＧＦ抗体およびチミジンホスホリラーゼに対する抗体のパネルは、関節炎組織を染色し、そして一致するコントロールからこれを区別するために用いられている。ＶＥＧＦに対する抗体を用いる研究は、慢性関節リウマチのパンヌスにおいて著しい発現を示した。
（実施例Ｘ）
（２Ｃ３−エンドスタチン結合体）
（Ａ．エンドスタチンのクローニングおよび発現）
ＲＮＡをマウス肝臓から単離し、そして以下のプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲTMについてのテンプレートとして用いられる：
Figure 2011046720
得られたｃＤＮＡフラグメントは、配列番号１２のＤＮＡ配列を有し、そして配列番号１３のアミノ酸配列を有する。参考のため、ヒトエンドスタチンアミノ酸配列は、配列１４である。マウスｃＤＮＡフラグメントを発現ベクターＨ６ｐＱＥ６０（Ｑｉａｇｅｎ）（これは、Ｎ末端６×ヒスチジンタグをコードする）へとクローニングし、次いでＥ．ｃｏｌｉ Ｍ１５細胞中で発現させた。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞密度が５６０ｎＭで０．６の光学密度に達した時に、０．１ｍＭのイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加え、４時間、６−Ｈｉｓエンドスタチンの発現を誘導した。細胞を遠心分離により収集し、そして溶解緩衝液（Ｂ−ＰＥＲ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））において溶解した。
封入体（６−Ｈｉｓタグエンドスタチンを含む）を、遠心分離により沈降させ、そして緩衝液Ａ（ｐＨ８．０、６ＭグアニジンＨＣｌ（ＧｕＨＣＬ）、１００ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ イミダゾール、１０ｍＭ βー２メルカプトエタノール）に溶解させた。還元した６−Ｈｉｓエンドスタチンを含む溶液を過剰の５，５’−ジチオービス−２−ニトロ安息香酸（Ｅｌｌｍａｎ’ｓ試薬）（２０ｍＭ）で処理し、そしてＮｉ−ＮＴＡカラムにロードした。このカラムを洗浄緩衝液（６Ｍ ＧｕＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）で洗浄し、そして６−Ｈｉｓエンドスタチンを洗浄緩衝液中の０．２Ｍイミダゾールを用いて、カラムから溶出させた。
溶出しかつ不溶性の６−Ｈｉｓエンドスタチンを、等量の再折畳み緩衝液（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（３Ｍ尿素、１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．３、０．５Ｍ Ｌ−アルギニン、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4、１ｍＭ 還元グルタチオン（ＧＳＨ））で希釈し、そして室温で一晩インキュベートした。再折畳みした６−Ｈｉｓエンドスタチンを、ＰＢＳ、ｐＨ７．４に対して室温で十分に透析した。得られたタンパク質である６−Ｈｉｓエンドスタチンは、可溶性であり、かつ非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（ここで、６−Ｈｉｓエンドスタチンは単一の２０ｋＤａのバンドとして泳動される）に基づいて非常に純粋であった。
（Ｂ．エンドスタチンの機能的活性）
発現されたタンパク質が完全に溶解性であるという事実に加えて、Ｅ．ｃｏｌｉ発現した６−Ｈｉｓエンドスタチンが生物学的に活性であるという他の証拠としては、内皮細胞に対して実証された結合が挙げられる。ビオチン化６−Ｈｉｓエンドスタチンを調製し、そしてインビトロで３つの異なる内皮細胞型（Ｂｅｎｄ３マウス内皮細胞；ＡＢＡＥ、ウシ大動脈内皮細胞；およびＨＵＶＥＣ、ヒト臍帯内皮細胞）とインキュベートした。結合をＯ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）と組み合わせたストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ、および４９０ｎｍで読んだ吸光度を用いて検出した。
直接的結合研究は、（ビオチン化６−Ｈｉｓ）エンドスタチンが、インビトロで３つの異なる型の内皮細胞に対して、飽和可能な様式で、結合することを示した。また、発現したエンドスタチン（標識なし）は、Ｂｅｎｄ３内皮細胞に対する結合について、ビオチン化エンドスタチンと競合することが示された。
（Ｃ．ＳＭＰＴおよび２−ＩＴを介する２Ｃ３に対するエンドスタチンの結合）
Ｎ’Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）における４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）を、２Ｃ３ ＩｇＧへ、５：１（ＳＭＰＴ：２Ｃ３）のモル比で添加し、そして５ｍＭ ＥＤＴＡを有するＰＢＳ（ＰＢＳＥ）中で、室温（ＲＴ）にて１時間インキュベートした。遊離のＳＭＰＴを、ＰＢＳＥで行うＧ２５サイズ排除クロマトグラフィーにより取り除いた。同時に、マウス６−Ｈｉｓエンドスタチンを、２−イミノチオラン（２−ＩＴ、Ｔｒａｕｔ’ｓ試薬）と、１：５（エンドスタチン：２−ＩＴ）のモル比で、ＲＴにて１時間インキュベートした。遊離の２−ＩＴを、ＰＢＳＥで行うＧ２５サイズ排除クロマトグラフィーにより取り除いた。
ＳＭＰＴ修飾２Ｃ３を、２−ＩＴ−修飾６−Ｈｉｓエンドスタチンと混合し、３〜５ｍｌまで濃縮し、そして穏やかな振盪でＲＴにて２４時間インキュベートした。反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。非結合体化２Ｃ３−ＳＭＰＴを、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーにより結合体から取り除き、２Ｃ３−エンドスタチンを得る。
（Ｄ．ＳＭＣＣおよびＳＡＴＡを介する２Ｃ３へのエンドスタチンの結合）
Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）を、６−Ｈｉｓ−エンドスタチンと、６：１（ＳＡＴＡ：エンドスタチン）のモル比で室温にて３０分間インキュベートした。遊離のＳＡＴＡを、ＰＢＳＥで行うＧ２５サイズ排除クロマトグラフィーにより取り除いた。ＰＢＳＥ中のＳＡＴＡ修飾６−Ｈｉｓエンドスタチンを、４．０ｍｌまで濃縮し、そして０．４ｍｌ脱アセチル化溶液（０．１Ｍヒドロキシルアミン）を添加した。混合物を室温にて２時間インキュベートした。同時に、ＰＢＳＥ中の２Ｃ３ ＩｇＧを、スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）と共に、１：５（２Ｃ３：ＳＭＣＣ）のモル比にてインキュベートした。遊離のＳＭＣＣを、ＰＢＳＥで行うＧ２５サイズ排除クロマトグラフィーにより取り除いた。
次いで、脱アセチル化ＳＡＴＡ修飾エンドスタチンを、ＳＭＣＣ修飾２Ｃ３とインキュベートし、約５ｍｇ／ｍｌの総タンパク質まで窒素下で濃縮し、そして穏やかな攪拌でＲＴにて一晩インキュベートした。反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。非結合体化２Ｃ３−ＭＣＣを、２Ｃ３−エンドスタチン結合体から、ＰＢＳＥ中のヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより取り除き、２Ｃ３−エンドスタチンを得る。首尾良い結合体化はまた、チオール化剤として、ＳＡＴＡよりはむしろ２−イミノチオランを用いて達成された。
（Ｅ．２Ｃ３およびエンドスタチンの融合タンパク質）
マウスおよびヒトのエンドスタチン、ならびに２Ｃ３についてのＤＮＡ配列が利用可能な（および本明細書中で提供される）場合、２Ｃ３−エンドスタチン融合タンパク質を容易に調製可能であり得る。エンドスタチンの発現および再折畳みは、上述されるように、この分子の首尾良い組換え発現が実際に可能であることを示す。
２Ｃ３−エンドスタチン融合タンパク質の調製は、エンドスタチンが２Ｃ３の重鎖のＣ末端に存在するか、または２Ｃ３ＳｃＦｖフラグメントに連結される形態であり得る。これらの場合において、組換え技術は、直接的に、連結を変化させ、そして２つの機能的部分を結合するための選択的に切断可能な配列の使用が特に考えられる。プラスミン切断可能配列またはＭＭＰ切断可能配列が、現在好ましい。
選択的に切断可能な配列の有効性および組換え技術の適応性もまた、２Ｃ３−エンドスタチン融合タンパク質（ここで、エンドスタチンが２Ｃ３構築物の別の部分で置換される）に提供する。エンドスタチンを、選択的に切断可能な配列（この部位で、機能的エンドスタチンが融合タンパク質から放出される）に作用する酵素と接触させるまで、２Ｃ３内に包埋する。
（実施例ＸＩ）
（２Ｃ３−Ａｎｇ-２結合体）
（Ａ．Ａｎｇ-２の発現）
２Ｃ３-Ａｎｇ-２結合体を構築するため、Ａｎｇ-２を、バキュロウイルス発現系を用いて昆虫細胞で産生し得る場合、好ましくは、組換え形態で使用する。Ａｎｇ-２発現および精製のために現在好ましいプロトコルは、Ａｎｇ-２ ｃＤＮＡをマウス胎盤ＲＮＡからＲＴ-ＰＣＲTMによりクローニングし、そしてＡｎｇ-２ ｃＤＮＡをｐＦａｓｔＢａｃ１発現ベクターへとクローニングすることに関する。コンピテントＤＨ１０Ｂａｃ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、組換えプラスミドを用いて形質転換する。
抗生物質選択後、組換えＢａｃｍｉｄを含むＥ．ｃｏｌｉコロニーを選び、増殖させ、そして組換えＢａｃｍｉｄ ＤＮＡを精製する。昆虫細胞ＳＦ９をＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎ試薬を用い、組換えＢａｃｍｉｄ ＤＮＡを用いてトランスフェクトさせる。組換えバキュロウイルスを、トランスフェクトしたＳＦ９細胞の上清から収集する。組換えバキュロウイルスを増幅し、これを用いてＳＦ９細胞を感染させ、そして感染したＳＦ９細胞はＡｎｇ-２を発現する。Ａｎｇ-２を、このような感染したＳＦ９細胞の上清からアフィニティー精製により精製した。
（Ｂ．２Ｃ３へのＡｎｇ−２の結合）
精製した２Ｃ３を、一般的に上記されるように、化学リンカーＳＭＰＴを用いて組換えＡｎｇ−２へ結合させた。Ｎ’Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のＳＭＰＴを２Ｃ３ ＩｇＧへ、５：１（ＳＭＰＴ：２Ｃ３）のモル比で添加し、そして５ｍＭ ＥＤＴＡを有するＰＢＳ中で室温（ＲＴ）にて１時間インキュベートする。遊離のＳＭＰＴを、ＰＢＳＥで行うＧ２５サイズ排除クロマトグラフィーにより取り除いた。同時に、組換えＡｎｇ−２を２−ＩＴと室温にてインキュベートする。遊離の２−ＩＴを、ＰＢＳＥで行うＧ２５サイズ排除クロマトグラフィーにより取り除いた。
ＳＭＰＴ修飾２Ｃ３を、２−ＩＴ修飾組換えＡｎｇ−２と混合し、濃縮し、穏やかな振盪で２４時間インキュベートする。反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。非結合体化２Ｃ３−ＳＭＰＴを、結合体からゲル濾過クロマトグラフィーにより取り除き、２Ｃ３エンドスタチンを得る。
（実施例ＸＩＩ）
（２Ｃ３−組織因子結合体）
２Ｃ３を、上記の実施例に記載のようにＳＭＰＴで修飾した。遊離のＳＭＰＴを、ピーク（２Ｃ３−ＳＭＰＴ）を窒素下で収集したことを除いて、上記に概説するように、Ｇ２５クロマトグラフィーにより取り除いた。６００μｌの２Ｃ３−ＳＭＰＴを、５０ｍＭまでのジチオスレイトール（ＤＴＴ）の添加の後に、チオピリジン基を定量するために取り除いた。平均３つのＭＰＴ基を、１つのＩｇＧあたり導入した。Ｎ末端に導入したシステイン残基を有するヒト短縮型組織因子（ｔＴＦ）を、５ｍＭのβ２−ＭＥで還元した。β２−ＭＥを、Ｇ２５クロマトグラフィーにより取り除いた。
還元したＮ−Ｃｙｓ−ｔＴＦを、２Ｃ３−ＳＭＰＴと共にプールし、そして２．５：１（ｔＴＦ：ＩｇＧ）のモル比でＲＴにて２４時間インキュベートした。反応物を５０，０００の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）メンブランを有するＡｍｉｃｏｎを用いて１〜２ｍｌまで濃縮した。非結合体化ｔＴＦおよびＩｇＧを、結合体から、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００サイズ排除クロマトグラフィーを用いて取り除き、２Ｃ３−ｔＴＦを得た。
（実施例ＸＩＩＩ）
（２Ｃ３−ＣＲＭ１０７結合体）
２Ｃ３をＳＭＰＴで修飾した。細胞傷害性薬剤ＣＲＭ１０７（Ｊｅｒｒｙ Ｆｕｌｔｏｎ博士、Ｉｎｌａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＤｅＳｏｔｏ，ＴＸ）を、上記の実施例に記載のように、２−ＩＴで修飾した。ＳＭＰＴ修飾２Ｃ３を、２−ＩＴ修飾ＣＲＭ１０７と、１：５（ＩｇＧ：ＣＲＭ１０７）のモル比で、穏やかな振盪でＲＴにて２４時間インキュベートした。結合体化２Ｃ３を、遊離の反応物から、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００サイズ排除クロマトグラフィーを用いて取り除き、２Ｃ３−ＣＲＭ１０７を得た。
（実施例ＸＩＶ）
（２Ｃ３プロドラック研究）
（Ａ．β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）のクローニングおよび発現）
Ｅ．ｃｏｌｉＧＵＳ遺伝子を含むプラスミド（ｐＢａｃｇｕｓ−１）をＮｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．から得た。プラスミドをＨ６ｐＱＥ６０発現ベクターへＧＵＳ遺伝子（これは、Ｎ末端６×ヒスチジンタグをコードする）をクローニングするためのＰＣＲのテンプレートとして用いた。プラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉ Ｍ１５細胞を、細胞密度が５６０ｎＭにて０．６の光学密度に達するまで増殖させた。０．１ｍＭのイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加して、６ｈｉｓ ＧＵＳの発現を誘導した。４時間後、細胞を遠心分離により収集した。
Ｅ．ｃｏｌｉペレットを、細胞溶解緩衝液（Ｂ−ＰＥＲ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））中で溶解した。溶液を、Ｎｉ−ＮＴＡカラムにロードし、このカラムを洗浄緩衝液（６Ｍ ＧｕＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）で洗浄し、そして結合した６−Ｈｉｓ ＧＵＳを同じ緩衝液中の０．２Ｍイミダゾールを用いて、カラムから溶出させた。
６−Ｈｉｓ ＧＵＳは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいて純粋であり、６−Ｈｉｓ
ＧＵＳは、７５ｋＤａのバンドの単一バンドとして泳動した。ゲル濾過カラムにおいて、６−Ｈｉｓ ＧＵＳは、約３００ｋＤａのテトラマーとして泳動する。６−Ｈｉｓ ＧＵＳは、基質であるｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド（ＰＮＰＧ）を切断するその能力により判断される場合、酵素学的に活性である。
（Ｂ．β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）への２Ｃ３の結合）
Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）を、ＧＵＳと、６：１（ＳＡＴＡ：ＧＵＳ）のモル比で室温にて３０分間インキュベートした。遊離のＳＡＴＡを、ＰＢＳＥで行うＧ２５サイズ排除クロマトグラフィーにより取り除いた。ＰＢＳＥ中のＳＡＴＡ修飾ＧＵＳを、４．０ｍｌまで濃縮し、そして０．４ｍｌ脱アセチル化溶液（０．１Ｍヒドロキシルアミン）を添加した。混合物をＲＴにて２時間インキュベートした。同時に、ＰＢＳＥ中の２Ｃ３ ＩｇＧを、スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）と共に、１：５（２Ｃ３：ＳＭＣＣ）のモル比にてインキュベートした。遊離のＳＭＣＣを、ＰＢＳＥで行うＧ２５サイズ排除クロマトグラフィーにより取り除いた。
次いで、脱アセチル化ＳＡＴＡ修飾ＧＵＳを、ＳＭＣＣ修飾２Ｃ３と、穏やかな攪拌でＲＴにて一晩インキュベートした。遊離のＧＵＳをＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのイオン交換クロマトグラフィーにより取り除き、そして遊離の２Ｃ３および２Ｃ３−ＧＵＳ結合体を、ＰＢＳ中の０．５Ｍ ＮａＣｌにより溶出した。得られた溶液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００サイズ排除クロマトグラフィーにより分離し、２Ｃ３−ＧＵＳを９０％の純度で得た。
（Ｃ．２Ｃ３−ＧＵＳ結合体の生物学的活性）
２Ｃ３−ＧＵＳ結合体の各成分の生物学的活性を確認した。２Ｃ３−ＧＵＳは、２次ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧおよびＯＰＤにより検出されるように、適切に制御されたＥＬＩＳＡにおけるＶＥＧＦ被覆ウェルに特異的に結合する。最大半減の結合を０．１ｎＭで観察した。従って、２Ｃ３結合部分は正確に機能する。ＧＵＳ部分はまた酵素活性を保持した。
２Ｃ３−ＧＵＳを、５×１０6ｃｐｍ／μｇの比活性まで、125Ｉで放射ヨウ素標識した。マウスへの静脈内注射後、放射性ヨウ素標識した２Ｃ３−ＧＵＳは、６時間のｔ１／２αおよび２５時間のｔ１／２βで血液から一掃した。
（Ｄ．ＧＵＳ切断プロドラッグ）
β−グルクロニドプロドラッグ（例えば、ドクソルビシン−β−グルクロニドおよびカルシミシン−β−グルクロニド）を、米国特許第５，５６１，１１９号（本明細書中で参考として援用される）に記載のように、基本的に調製した。このようなプロドラッグを、グルコシド酵素（例えば、ＧＵＳ）により消化される場合のみに、細胞傷害性成分（例えば、ドクソルビシンまたはカルシミシン）を放出するように設計する。２Ｃ３にＧＵＳを付着させることにより、ＧＵＳは、腫瘍脈管構造および支質を特異的に標的化し、プロドラッグの特異的切断、および腫瘍部位内の特定の細胞毒性成分の放出を提供する。
（Ｅ．２Ｃ３−ＧＵＳ結合体の生物学的活性）
２Ｃ３−ＧＵＳは、皮下部位にヒトＮＣＩ−Ｈ３５８ ＮＳＣＬＣ腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスへのｉ．ｖ．注射の後、腫瘍脈管構造および腫瘍支質の周辺に特異的に局在化する。２Ｃ３−ＧＵＳの存在を、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧまたはＨＲＰ標識抗ＧＵＳを用いて、腫瘍の凍結切片において免疫組織化学的に検出した。最大局在を、２Ｃ３−ＧＵＳの注射の２４〜４８時間後に観察した。正常な組織は染色されなかった。腫瘍脈管構造および腫瘍支質周辺への２Ｃ３−ＧＵＳの特異的な局在は、全身投与されるプロドラッグ（例えば、ドクソルビシングルクロニドまたはカルシミシン−グルクロニド）を腫瘍内でのみ活性化させる。
本明細書中に記載されるようなハイブリドーマ細胞株を、ブタペスト条約の規定の下に、アメリカン タイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡに寄託し；そして受託番号ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ １５９５を割り当てられた。本明細書中記載されかつ特許請求される本発明は、寄託されたＰＴＡ １５９５細胞株により範囲を限定されない。なぜならば、寄託された実施形態は、本発明の１つの局面を例示し、等価なモノクローナル抗体を機能的に産生する等価なハイブリドーマ細胞株は、本発明の範囲内に含まれるからである。実際に、本明細書中に記載されかつ特許請求される全ての組成物および方法は、本開示を考慮して、過度の実験なしになされかつ完成され得る。
本発明の組成物および方法は、好ましい実施態様の項で記載されているが、本明細書中に記載される組成物および方法ならびに本発明の方法の工程または一連の工程に、本発明の概念、思想および範囲を逸脱せずに、改変が適用され得ることは当業者には明らかである。より詳細には、化学的および生理学的の両方に関連する特定の試薬が本明細書中に記載される薬剤と置き換えられ得るが、同じまたは類似の結果が達成されることが明らかである。当業者には明らかである全てのこのような類似の置き換えおよび改変は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の思想、範囲および概念内にあるとみなされる。
（参考文献）
以下の参考文献は、本明細書中の記載を補充する例示的な手順またはほかの詳細を提供する程度まで、本明細書中に参考として詳細に援用される。
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  1. 本明細書に記載の組成物。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018024678A (ja) * 2011-12-13 2018-02-15 エンジーンアイシー モレキュラー デリバリー ピーティーワイ リミテッド 治療薬を脳腫瘍に送達するための細菌由来のインタクトなミニセル

Families Citing this family (520)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5367057A (en) * 1991-04-02 1994-11-22 The Trustees Of Princeton University Tyrosine kinase receptor flk-2 and fragments thereof
US20030108545A1 (en) * 1994-02-10 2003-06-12 Patricia Rockwell Combination methods of inhibiting tumor growth with a vascular endothelial growth factor receptor antagonist
US6448077B1 (en) * 1994-02-10 2002-09-10 Imclone Systems, Inc. Chimeric and humanized monoclonal antibodies specific to VEGF receptors
US6136311A (en) 1996-05-06 2000-10-24 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
JP2002500879A (ja) * 1998-01-23 2002-01-15 イムクローン システムズ インコーポレーテッド 幹細胞の精製ポピュレーション
AU770896C (en) * 1998-09-29 2006-09-07 Gamida Cell Ltd. Methods of controlling proliferation and differentiation of stem and progenitor cells
US6537520B1 (en) * 1998-03-31 2003-03-25 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Pharmaceuticals for the imaging of angiogenic disorders
US20030176663A1 (en) * 1998-05-11 2003-09-18 Eidgenossische Technische Hochscule Specific binding molecules for scintigraphy
AU757698C (en) * 1998-06-01 2004-04-08 Agensys, Inc. Novel serpentine transmembrane antigens expressed in human cancers and uses thereof
US6962702B2 (en) 1998-06-22 2005-11-08 Immunomedics Inc. Production and use of novel peptide-based agents for use with bi-specific antibodies
WO2000037025A2 (en) * 1998-12-21 2000-06-29 Ludwig Institute For Cancer Research Antibodies to truncated vegf-d and uses thereof
IT1312077B1 (it) * 1999-04-15 2002-04-04 Univ Degli Studi Milano Polipeptidi ad attivita' antiangiogenica.
US6342221B1 (en) 1999-04-28 2002-01-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody conjugate compositions for selectively inhibiting VEGF
US6703020B1 (en) 1999-04-28 2004-03-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody conjugate methods for selectively inhibiting VEGF
US6924359B1 (en) 1999-07-01 2005-08-02 Yale University Neovascular-targeted immunoconjugates
US7303749B1 (en) 1999-10-01 2007-12-04 Immunogen Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
CA2385528C (en) 1999-10-01 2013-12-10 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
WO2001024828A2 (en) * 1999-10-06 2001-04-12 Basf Aktiengesellschaft MODULATORS OF CYTOKINE MEDIATED SIGNALLING PATHWAYS AND INTEGRIN αVβ3 RECEPTOR ANTAGONISTS FOR COMBINATION THERAPY
US7740841B1 (en) * 2000-01-28 2010-06-22 Sunnybrook Health Science Center Therapeutic method for reducing angiogenesis
CA2714081C (en) * 2000-02-10 2013-08-06 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Methods and compositions for treating conditions of the eye
EP1259548A1 (en) * 2000-02-24 2002-11-27 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich Antibody specific for the ed-b domain of fibronectin, conjugates comprising said antibody, and their use for the detection and treatment of angiogenesis
US7097840B2 (en) 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
US20040191260A1 (en) * 2003-03-26 2004-09-30 Technion Research & Development Foundation Ltd. Compositions capable of specifically binding particular human antigen presenting molecule/pathogen-derived antigen complexes and uses thereof
EP1268544A2 (en) 2000-03-31 2003-01-02 Institut Pasteur Peptides blocking vascular endothelial growth factor (vegf)-mediated angiogenesis, polynucleotides encoding said peptides and methods of use thereof
US7355019B2 (en) * 2000-06-06 2008-04-08 Sibtech, Inc. Cysteine-containing peptide tag for site-specific conjugation of proteins
US7288390B2 (en) * 2000-08-07 2007-10-30 Centocor, Inc. Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
US7163681B2 (en) * 2000-08-07 2007-01-16 Centocor, Inc. Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses
FR2813606B1 (fr) * 2000-09-01 2004-04-30 Inst Nat Sante Rech Med Proteine bard1 tronquee, et ses applications diagnostiques et therapeutiques
AU2001288025A1 (en) * 2000-09-05 2002-03-22 Biosight Ltd. Peptide conjugated anti-cancer prodrugs
US8314060B2 (en) * 2000-09-05 2012-11-20 Biosight Ltd. Peptide conjugated anti-cancer prodrugs
AU1218202A (en) * 2000-09-07 2002-03-22 Schering Ag Receptor in the ED<sub>b</sub> fibronectin domain
US20020091082A1 (en) * 2000-09-13 2002-07-11 Aiello Lloyd P. Methods of modulating symptoms of hypertension
ATE355275T1 (de) * 2000-10-20 2006-03-15 Eisai R&D Man Co Ltd Stickstoff-enthaltende aromatische ringverbindungen zur behandlung von tumorerkrankungen
US7273722B2 (en) 2000-11-29 2007-09-25 Allergan, Inc. Neurotoxins with enhanced target specificity
US20050209310A1 (en) * 2000-12-22 2005-09-22 Chaplin David J Methods for modulating tumor growth and metastasis
US7037906B1 (en) * 2000-12-22 2006-05-02 Oxigene, Inc. Methods for modulating tumor growth and metastasis
WO2002096948A2 (en) * 2001-01-29 2002-12-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
CA2436092A1 (en) * 2001-01-29 2002-08-08 Idec Pharmaceutical Corporation Modified antibodies and methods of use
US20030077826A1 (en) * 2001-02-02 2003-04-24 Lena Edelman Chimeric molecules containing a module able to target specific cells and a module regulating the apoptogenic function of the permeability transition pore complex (PTPC)
US7601825B2 (en) * 2001-03-05 2009-10-13 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 121P1F1 useful in treatment and detection of cancer
US6924358B2 (en) 2001-03-05 2005-08-02 Agensys, Inc. 121P1F1: a tissue specific protein highly expressed in various cancers
WO2002069907A2 (en) * 2001-03-07 2002-09-12 Mannkind Corporation Anti-neovasculature preparations for cancer
CA2441953A1 (en) * 2001-03-23 2002-10-03 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods for inhibition of angiogenesis, tumor growth and metastasis by fully human anti-il8 and anti-muc18 in diverse types of tumors
US20040198960A1 (en) * 2001-03-29 2004-10-07 Janoff Edward N Human monoclonal antibodies against capsular polysaccharides of streptococcus pneumoniae
AU2002257132A1 (en) * 2001-04-06 2002-10-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Erbb interface peptidomimetics and methods of use thereof
US20030191073A1 (en) * 2001-11-07 2003-10-09 Challita-Eid Pia M. Nucleic acid and corresponding protein entitled 161P2F10B useful in treatment and detection of cancer
ATE470676T1 (de) * 2001-04-13 2010-06-15 Human Genome Sciences Inc Anti-vegf-2 antikörper
US20030170786A1 (en) * 2001-04-13 2003-09-11 Rosen Craig A. Vascular endothelial growth factor 2
US6884869B2 (en) * 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US7256257B2 (en) 2001-04-30 2007-08-14 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US20040234497A1 (en) * 2001-05-04 2004-11-25 Yi Luo Hyaluronic acid containing bioconjugates:targeted delivery of anti-cancer drugs to cancer cells
US7456146B2 (en) * 2001-05-09 2008-11-25 Ghc Research Development Corporation Lytic peptide prodrugs
US20090226429A1 (en) * 2001-05-25 2009-09-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies That Immunospecifically Bind to TRAIL Receptors
US7361341B2 (en) * 2001-05-25 2008-04-22 Human Genome Sciences, Inc. Methods of treating cancer using antibodies that immunospecifically bind to trail receptors
US20030007974A1 (en) * 2001-05-30 2003-01-09 Nanus David M. Endopeptidase/anti-PSMA antibody fusion proteins for treatment of cancer
US7514078B2 (en) * 2001-06-01 2009-04-07 Cornell Research Foundation, Inc. Methods of treating prostate cancer with anti-prostate specific membrane antigen antibodies
US7045605B2 (en) * 2001-06-01 2006-05-16 Cornell Research Foundation, Inc. Modified antibodies to prostate-specific membrane antigen and uses thereof
US7666414B2 (en) * 2001-06-01 2010-02-23 Cornell Research Foundation, Inc. Methods for treating prostate cancer using modified antibodies to prostate-specific membrane antigen
JP2005501011A (ja) * 2001-06-08 2005-01-13 ユタ ベンチャー ザ セカンド リミテッド パートナーシップ 組織特異的内皮膜タンパク質
WO2002102973A2 (en) 2001-06-20 2002-12-27 Prochon Biotech Ltd. Antibodies that block receptor protein tyrosine kinase activation, methods of screening for and uses thereof
AU2002316305A1 (en) * 2001-06-20 2003-01-08 Vlaams Interuniversitair Institut Voor Biotechnologie Method of treating atherosclerosis and other inflammatory diseases
US20050271663A1 (en) * 2001-06-28 2005-12-08 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
US20060073141A1 (en) * 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
AU2002319402B2 (en) * 2001-06-28 2008-09-11 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
CA2453474A1 (en) * 2001-07-13 2003-01-23 Imclone Systems Incorporated Vegfr-1 antibodies to treat breast cancer
WO2003012072A2 (en) * 2001-08-03 2003-02-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Monoclonal antibodies to activated erbb family members and methods of use thereof
EP1423012B1 (en) * 2001-08-10 2007-11-14 Imclone Systems, Inc. Medical use of stem cells expressing vegfr-1
US7494646B2 (en) * 2001-09-06 2009-02-24 Agensys, Inc. Antibodies and molecules derived therefrom that bind to STEAP-1 proteins
ES2537074T3 (es) * 2001-09-06 2015-06-02 Agensys, Inc. Ácido nucleico y proteína correspondiente denominados STEAP-1 útiles en el tratamiento y la detección de cáncer
AU2002305767B2 (en) * 2001-09-20 2008-04-10 Cornell Research Foundation, Inc. Methods and compositions for treating and preventing skin disorders using binding agents specific for PSMA
US20030124132A1 (en) * 2001-09-27 2003-07-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Combined compositions for tumor vasculature coaguligand treatment
PL374495A1 (en) * 2001-10-15 2005-10-31 Immunomedics, Inc. Direct targeting binding proteins
US7226594B2 (en) * 2001-11-07 2007-06-05 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 161P2F10B useful in treatment and detection of cancer
GB0126879D0 (en) * 2001-11-08 2002-01-02 Astrazeneca Ab Combination therapy
EP1453546A2 (en) * 2001-12-04 2004-09-08 Nanospectra Biosciences, Inc. Treatment of angiogenesis disorders using targeted nanoparticles
EP1467756A4 (en) * 2001-12-28 2007-03-21 Abgenix Inc METHODS OF USING ANTI-MUC18 ANTIBODIES
US20030194421A1 (en) * 2001-12-28 2003-10-16 Angiotech Pharmaceuticals, Inc. Treatment of uveitis
CA2472154A1 (en) * 2001-12-28 2003-07-17 Abgenix, Inc. Use of antibodies against the muc18 antigen
MXPA04006554A (es) * 2002-01-02 2005-03-31 Genentech Inc Composiciones y metodos para diagnostico y tratamiento de tumor.
EP1461360B1 (en) * 2002-01-03 2010-08-18 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Conjugates comprising an antibody specific for the ed-b domain of fibronectin and their use for the detection and treatment of tumours
JP4242590B2 (ja) * 2002-01-11 2009-03-25 俊一 塩澤 慢性関節リウマチの疾患感受性遺伝子、及びその利用
EP2075256A2 (en) 2002-01-14 2009-07-01 William Herman Multispecific binding molecules
US7241444B2 (en) * 2002-01-18 2007-07-10 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
US20080063639A1 (en) * 2002-01-18 2008-03-13 Pierre Fabre Medicament Method for the treatment of psoriasis comprising novel anti-IGF-IR antibodies
US20080193445A1 (en) * 2002-01-18 2008-08-14 Liliane Goetsch Novel anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
CA2472578A1 (en) * 2002-01-24 2003-07-31 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Anti-cancer combination and use thereof
IL152904A0 (en) * 2002-01-24 2003-06-24 Gamida Cell Ltd Utilization of retinoid and vitamin d receptor antagonists for expansion of renewable stem cell populations
WO2003062404A1 (en) * 2002-01-25 2003-07-31 Gamida-Cell Ltd. Methods of expanding stem and progenitor cells and expanded cell populations obtained thereby
US6992176B2 (en) * 2002-02-13 2006-01-31 Technion Research & Development Foundation Ltd. Antibody having a T-cell receptor-like specificity, yet higher affinity, and the use of same in the detection and treatment of cancer, viral infection and autoimmune disease
US7071311B2 (en) * 2002-02-13 2006-07-04 Sirna Therapeutics, Inc. Antibodies having specificity for 2′-C-allyl nucleic acids
US20050042632A1 (en) * 2002-02-13 2005-02-24 Sirna Therapeutics, Inc. Antibodies having specificity for nucleic acids
EP1485075A4 (en) * 2002-02-20 2006-04-26 Dyax Corp MHC-PEPTIDE COMPLEX BINDING LIGANDS
US8435529B2 (en) 2002-06-14 2013-05-07 Immunomedics, Inc. Combining radioimmunotherapy and antibody-drug conjugates for improved cancer therapy
US8491896B2 (en) * 2002-06-14 2013-07-23 Immunomedics, Inc. Anti-pancreatic cancer antibodies
CA2478169C (en) * 2002-03-04 2013-04-16 Imclone Systems Incorporated Human antibodies specific to kdr and uses thereof
SG108837A1 (en) * 2002-03-11 2005-02-28 Pi Eta Consulting Co Pte Ltd An enterprise knowledge and information acquisition, management and communications system with intelligent user interfaces
US20050124794A1 (en) * 2002-03-15 2005-06-09 Mccrae Keith Cell surface tropomyosin as a target of angiogenesis inhibition
US20060002940A1 (en) * 2002-03-15 2006-01-05 Jennifer Stevenson Method of immunotherapy
US20070178065A1 (en) * 2002-05-03 2007-08-02 Lattime Edmund C Neutralizing factors as vaccine adjuvants
US20050169883A1 (en) * 2002-05-06 2005-08-04 Prestwich Glenn D. Preblocking with non-ha gags increases effectiveness of ha conjugated anticancer agents
CN100396670C (zh) * 2002-05-15 2008-06-25 詹森药业有限公司 作为pdfg受体抑制剂的n-取代的3-氨基苯并环戊二烯并吡唑及药用组合物和用途
AU2003233662B2 (en) 2002-05-23 2010-04-01 Trustees Of The University Of Pennsylvania Fas peptide mimetics and uses thereof
WO2003101495A1 (en) * 2002-05-29 2003-12-11 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for radioimmunotherapy of brain and cns tumors
JP4511108B2 (ja) * 2002-05-31 2010-07-28 オンコリクス インコーポレイテッド ヒトプロラクチン拮抗剤−血管新生阻害剤融合蛋白質
US20040022726A1 (en) * 2002-06-03 2004-02-05 Goldenberg David M. Methods and compositions for intravesical therapy of bladder cancer
US9599619B2 (en) 2002-06-14 2017-03-21 Immunomedics, Inc. Anti-pancreatic cancer antibodies
US8821868B2 (en) 2002-06-14 2014-09-02 Immunomedics, Inc. Anti-pancreatic cancer antibodies
RU2005100777A (ru) * 2002-06-14 2005-08-27 Иммуномедикс, Инк. (Us) Моноклональное антитело рам4 и его применение для диагностики и лечения рака поджелудочной железы
EP2301968A3 (en) * 2002-06-14 2011-06-29 Immunomedics, Inc. Humanized monoclonal antibody HPAM4
US9238081B2 (en) * 2002-06-14 2016-01-19 Immunomedics, Inc. Detection of early-stage pancreatic adenocarcinoma
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
US9321832B2 (en) * 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
JP2006512895A (ja) * 2002-06-28 2006-04-20 ドマンティス リミテッド リガンド
ATE491725T1 (de) 2002-07-15 2011-01-15 Univ Texas Antikörper mit bindung an anionische phospholipide und aminophospholipide und ihre verwendung bei der behandlung von virusinfektionen
US7205298B2 (en) 2002-07-18 2007-04-17 Janssen Pharmaceutica N.V. Substituted triazine kinase inhibitors
NZ520321A (en) * 2002-07-19 2005-03-24 Auckland Uniservices Ltd Use of an agent adapted to inhibit HIF in use together with an antiangiogenic agent for treating tumours in a non- human animal
ES2544527T3 (es) * 2002-07-31 2015-09-01 Seattle Genetics, Inc. Conjugados de fármacos y su uso para tratar el cáncer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa
US20040224986A1 (en) 2002-08-16 2004-11-11 Bart De Corte Piperidinyl targeting compounds that selectively bind integrins
BR0313534A (pt) * 2002-08-16 2005-07-12 Janssen Pharmaceutica Nv Antagonistas de integrinade ácido carboxìlico de piperidinoìla
US7226755B1 (en) * 2002-09-25 2007-06-05 The Procter & Gamble Company HPTPbeta as a target in treatment of angiogenesis mediated disorders
US7507568B2 (en) * 2002-09-25 2009-03-24 The Proctor & Gamble Company Three dimensional coordinates of HPTPbeta
EP1549344B1 (en) * 2002-10-10 2015-01-07 Merck Patent GmbH Pharmaceutical compositions directed to erb-b1 receptors
US9701754B1 (en) 2002-10-23 2017-07-11 City Of Hope Covalent disulfide-linked diabodies and uses thereof
JP4494977B2 (ja) * 2002-12-17 2010-06-30 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｇｄ２に結合するマウス１４．１８抗体のヒト化抗体（ｈ１４．１８）およびそのｉｌ−２融合タンパク質
AU2003290330A1 (en) * 2002-12-27 2004-07-22 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
US20050026826A1 (en) * 2003-01-17 2005-02-03 Margarethe Hoenig Feline proinsulin, insulin and constituent peptides
US7402385B2 (en) * 2003-02-11 2008-07-22 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Radiolabeled antibodies for treatment of tumors
US20060039858A1 (en) * 2003-02-11 2006-02-23 Ekaterina Dadachova Radiolabeled antibodies and peptides for treatment of tumors
ES2347959T3 (es) * 2003-02-20 2010-11-26 Seattle Genetics, Inc. Conjugados de anticuerpos anti-cd70-farmaco y su uso para el tratamiento del cancer.
US20080025989A1 (en) * 2003-02-20 2008-01-31 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd70 antibody-drug conjugates and their use for the treatment of cancer and immune disorders
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7759468B1 (en) * 2003-03-05 2010-07-20 University Of Kentucky Research Foundation Bioactive peptide-based probes
ATE442861T1 (de) * 2003-03-07 2009-10-15 Univ Texas Gegen antikörper gerichtete photodynamische therapie
EP1604665B1 (en) * 2003-03-10 2011-05-11 Eisai R&D Management Co., Ltd. C-kit kinase inhibitor
DK1608685T3 (da) * 2003-03-28 2007-06-11 Regeneron Pharma VEGF antagonister til behandlingen af diabetes
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
MXPA05012613A (es) * 2003-05-23 2006-05-25 Genentech Inc Composiciones y metodos para el diagnostico y tratamiento de tumores de origen glial.
RS20181002A1 (sr) * 2003-05-30 2018-12-31 Genentech Inc Tretman sa anti-vegf antitelima
US9708410B2 (en) 2003-05-30 2017-07-18 Janssen Biotech, Inc. Anti-tissue factor antibodies and compositions
US7605235B2 (en) * 2003-05-30 2009-10-20 Centocor, Inc. Anti-tissue factor antibodies and compositions
WO2005021710A2 (en) * 2003-06-02 2005-03-10 University Of Miami Chimeric molecules and methods of use
WO2005000223A2 (en) * 2003-06-04 2005-01-06 Children's Medical Center Corporation Method of treating retinopathies and disorders associated with blood vessel loss
US7178491B2 (en) * 2003-06-05 2007-02-20 Caterpillar Inc Control system and method for engine valve actuator
US9005613B2 (en) 2003-06-16 2015-04-14 Immunomedics, Inc. Anti-mucin antibodies for early detection and treatment of pancreatic cancer
CA2529056C (en) * 2003-06-17 2013-09-10 Mannkind Corporation Combinations of tumor-associated antigens in compositions for various types of cancers
CA2527054C (en) 2003-06-25 2013-01-08 Peregrine Pharmaceuticals, Inc. Methods and apparatus for continuous large-scale radiolabeling of proteins
CN1930187B (zh) * 2003-06-27 2015-08-19 艾默根佛蒙特有限公司 针对表皮生长因子受体的缺失突变体的抗体及其使用
EP2457586A1 (en) * 2003-06-27 2012-05-30 Amgen Fremont Inc. Antibodies directed to the deletion mutants of epidermal growth factor receptor and uses thereof
US7825085B2 (en) * 2003-06-30 2010-11-02 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Fragments of NKp44 and NKp46 for targeting viral-infected and tumor cells
DE602004030464D1 (de) * 2003-07-02 2011-01-20 Innate Pharma Methode zur produktion und evaluierung der zytotoxizität von kir2dl nk-rezeptor antikörpern
US20090191213A9 (en) * 2003-07-02 2009-07-30 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for regulating NK cell activity
AR046510A1 (es) 2003-07-25 2005-12-14 Regeneron Pharma Composicion de un antagonista de vegf y un agente anti-proliferativo
CA2533878A1 (en) * 2003-07-29 2005-09-22 Immunomedics, Inc. Fluorinated carbohydrate conjugates
US7902338B2 (en) 2003-07-31 2011-03-08 Immunomedics, Inc. Anti-CD19 antibodies
WO2005044853A2 (en) * 2003-11-01 2005-05-19 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
AP2012006644A0 (en) * 2003-08-01 2012-12-31 Genentech Inc Anti-VEGF antibodies
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
AU2012201667B2 (en) * 2003-08-01 2014-11-27 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
US7758859B2 (en) * 2003-08-01 2010-07-20 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
CA2534197A1 (en) * 2003-08-06 2005-02-24 Thomas Jefferson University Use of a vegf antagonist in combination with radiation therapy
CA2534898A1 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Immunomedics, Inc. Bispecific antibodies for inducing apoptosis of tumor and diseased cells
US7547518B2 (en) 2003-08-19 2009-06-16 Becton, Dickinson And Company Method of screening endothelial cells for angiogenic capability
AU2004268614C1 (en) * 2003-08-27 2010-10-28 Ophthotech Corporation Combination therapy for the treatment of ocular neovascular disorders
WO2005074417A2 (en) * 2003-09-03 2005-08-18 Salk Institute For Biological Studies Multiple antigen detection assays and reagents
SG149815A1 (en) 2003-11-06 2009-02-27 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
WO2005044788A1 (ja) * 2003-11-11 2005-05-19 Eisai Co., Ltd. ウレア誘導体およびその製造方法
WO2005047319A2 (en) * 2003-11-12 2005-05-26 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Dna sequence and expressed recombinant glycoproteins related to feline thyrotropin
JP2007511514A (ja) * 2003-11-13 2007-05-10 ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ 生体分子標的同定用の固定化ｎ置換三環状３−アミノピラゾール
WO2005048938A2 (en) * 2003-11-13 2005-06-02 California Pacific Medical Center Anti-pecam therapy for metastasis suppression
US20080220049A1 (en) * 2003-12-05 2008-09-11 Adnexus, A Bristol-Myers Squibb R&D Company Compositions and methods for intraocular delivery of fibronectin scaffold domain proteins
CN1946417A (zh) 2003-12-05 2007-04-11 阿德内克休斯治疗公司 2型血管内皮生长因子受体的抑制剂
US7799327B2 (en) * 2003-12-24 2010-09-21 Henry John Smith Autoantibodies utilized as carrier agents for pharmaceutical compounds used in cancer treatment
US20090155266A1 (en) * 2004-01-16 2009-06-18 Yale University Methods and Compositions Relating to Vascular Endothelial Growth Factor and TH2 Mediated Inflammatory Diseases
WO2005072340A2 (en) * 2004-01-27 2005-08-11 Compugen Ltd. Novel polynucleotides encoding polypeptides and methods using same
US20110020273A1 (en) * 2005-04-06 2011-01-27 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Bispecific Immunocytokine Dock-and-Lock (DNL) Complexes and Therapeutic Use Thereof
WO2005084710A2 (en) * 2004-03-02 2005-09-15 Massachusetts Institute Of Technology Nanocell drug delivery system
US20050214280A1 (en) * 2004-03-02 2005-09-29 Ludwig Institute For Cancer Research Method for inhibiting tumor formation and growth
WO2005094882A1 (en) * 2004-03-03 2005-10-13 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Modified antibodies to prostate-specific membrane antigen and uses thereof
ATE507240T1 (de) * 2004-03-05 2011-05-15 Vegenics Pty Ltd Materialien und verfahren für wachstumsfaktorbindende konstrukte
JP2007527539A (ja) * 2004-03-05 2007-09-27 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート ハイスループットグリカンマイクロアレイ
WO2005087811A2 (en) * 2004-03-10 2005-09-22 Creighton University Estrogen receptors and methods of use
AU2012265582B2 (en) * 2004-03-26 2015-04-16 Ophthotech Corporation Combination therapy for the treatment of ocular neovascular disorders
US8470315B2 (en) 2004-04-13 2013-06-25 Quintessence Biosciences, Inc. Non-natural ribonuclease conjugates as cytotoxic agents
CA2563735C (en) 2004-04-22 2020-07-14 Agensys, Inc. Antibodies and molecules derived therefrom that bind to steap-1 proteins
US20060182783A1 (en) * 2004-04-30 2006-08-17 Allergan, Inc. Sustained release intraocular drug delivery systems
CN1304427C (zh) * 2004-06-08 2007-03-14 成都康弘生物科技有限公司 抑制血管新生的融合蛋白质及其用途
US20060008468A1 (en) * 2004-06-17 2006-01-12 Chih-Sheng Chiang Combinations of tumor-associated antigens in diagnostics for various types of cancers
US20060159689A1 (en) * 2004-06-17 2006-07-20 Chih-Sheng Chiang Combinations of tumor-associated antigens in diagnostics for various types of cancers
US8029766B2 (en) * 2004-06-18 2011-10-04 Elmaleh David R Intravascular imaging device and uses thereof
US20060008415A1 (en) * 2004-06-25 2006-01-12 Protein Design Labs, Inc. Stable liquid and lyophilized formulation of proteins
WO2006003179A2 (en) 2004-07-01 2006-01-12 Novo Nordisk A/S Antibodies binding to receptors kir2dl1, -2, 3 but not kir2ds4 and their therapeutic use
WO2006002474A1 (en) * 2004-07-02 2006-01-12 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Alpha-helical mimetics
JP2008514900A (ja) 2004-07-30 2008-05-08 アデザ・バイオメデイカル・コーポレイシヨン 疾病および他の状態のマーカーとしての癌胎児性フィブロネクチンならびに癌胎児性フィブロネクチンの検出のための方法
JP4807802B2 (ja) * 2004-07-30 2011-11-02 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｖｅｇｆ媒介性活性をブロックすることによるｉ型糖尿病を処置する方法
WO2006016276A2 (en) 2004-08-03 2006-02-16 Innate Pharma S.A. Therapeutic and diagnostic methods and compositions targeting 4ig-b7-h3 and its counterpart nk cell receptor
US20070003943A1 (en) * 2004-08-09 2007-01-04 Northwestern University Tumor angiogenesis inhibitor alpha 1-antitrypsin
CN1316249C (zh) * 2004-08-25 2007-05-16 北京健平九星生物医药科技有限公司 一种酶联检测试剂盒及制备方法
WO2006024092A1 (en) * 2004-08-31 2006-03-09 Newsouth Innovations Pty Limited Vegf inhibition
AR050642A1 (es) * 2004-09-10 2006-11-08 Wyeth Corp Anticuerpos anti-5t4 humanizados y conjugados anticuerpo anti-5t4/ calicheamicina
US8772269B2 (en) * 2004-09-13 2014-07-08 Eisai R&D Management Co., Ltd. Use of sulfonamide-including compounds in combination with angiogenesis inhibitors
EP2364699A1 (en) 2004-09-13 2011-09-14 Eisai R&D Management Co., Ltd. Joint use of sulfonamide based compound with angiogenesis inhibitor
EP1799812A4 (en) * 2004-09-16 2009-09-09 Gamida Cell Ltd EX VIVO CULTIVATION METHODS OF STEM CELLS AND PRECURSOR BY CO-CULTURE WITH MESENCHYMAL CELLS
AU2005283422C1 (en) * 2004-09-17 2017-02-02 Eisai R & D Management Co., Ltd. Medicinal composition
US8697139B2 (en) 2004-09-21 2014-04-15 Frank M. Phillips Method of intervertebral disc treatment using articular chondrocyte cells
JP2008515800A (ja) * 2004-10-04 2008-05-15 セルゲイト， インコーポレイテッド 眼科疾患の処置剤としてのポリアミン類似化合物
US20090010887A1 (en) * 2004-10-06 2009-01-08 Ben-Sasson Shmuel A Method and composition for enhancing anti-angiogenic therapy
US8337838B2 (en) * 2004-10-15 2012-12-25 Seattle Genetics, Inc. Anti-CD70 antibody and its use for the treatment and prevention of cancer and immune disorders
US7641903B2 (en) * 2004-10-15 2010-01-05 Seattle Genetics, Inc. Anti-CD70 antibody and its use for the treatment and prevention of cancer and immune disorders
EP1799262A4 (en) * 2004-10-15 2009-10-21 Seattle Genetics Inc ANTI-CD70 ANTIBODIES AND ITS USE FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF CANCER DISORDERS AND IMMUNE DISORDERS
ES2390676T3 (es) * 2004-10-21 2012-11-15 Genentech, Inc. Método para el tratamiento de enfermedades neovasculares intraoculares
ES2325344B1 (es) * 2004-11-02 2010-06-09 Univ Madrid Autonoma Inhibidores de angiogenesis multifuncionales y multivalentes.
US7595149B1 (en) 2004-11-08 2009-09-29 University Of Kentucky Research Foundation Methods for cancer detection
EP2377555A3 (en) 2004-11-18 2011-11-23 Imclone LLC Antibodies against vascular endothelial growth factor receptor-1
WO2006068758A2 (en) * 2004-11-19 2006-06-29 The Scripps Research Institute Detection, prevention and treatment of breast cancer
NZ555286A (en) * 2004-12-17 2010-04-30 Genentech Inc Antiangiogenesis therapy of autoimmune disease in patients who have failed prior therapy
NZ556029A (en) 2004-12-21 2010-04-30 Astrazeneca Ab Antibodies directed to angiopoietin-2 and uses thereof
US20120269886A1 (en) 2004-12-22 2012-10-25 Nitto Denko Corporation Therapeutic agent for pulmonary fibrosis
HUE048419T2 (hu) 2004-12-22 2020-08-28 Nitto Denko Corp Gyógyszerhordozó és kit gyógyszerhordozó kit fibrózis gátlására
EP3026063A1 (en) 2004-12-28 2016-06-01 Innate Pharma S.A. Monoclonal antibodies against nkg2a
EP1835932A2 (en) * 2004-12-29 2007-09-26 Mannkind Corporation Methods to elicit, enhance and sustain immune responses against mhc class i-restricted epitopes, for prophylactic or therapeutic purposes
PL1833506T3 (pl) * 2004-12-29 2016-01-29 Mannkind Corp Zastosowanie kompozycji zawierających różne antygeny związane z nowotworem jako szczepionek przeciwnowotworowych
ATE531733T1 (de) * 2005-01-06 2011-11-15 Novo Nordisk As Kir-bindende wirkstoffe und verfahren zu ihrer verwendung
EP2446897A1 (en) 2005-01-06 2012-05-02 Novo Nordisk A/S Anti-KIR combination treatments and methods
DK1835937T3 (da) 2005-01-06 2012-07-23 Novo Nordisk As Sammensætninger og fremgangsmåder til behandling af virusinfektion
WO2006084054A2 (en) * 2005-02-02 2006-08-10 Children's Medical Center Corporation Method of treating angiogenic diseases
US20080213399A1 (en) * 2005-02-03 2008-09-04 Topotarget Uk Limited Combination Therapies Using Hdac Inhibitors
US7722867B2 (en) * 2005-02-07 2010-05-25 Glycart Biotechnology Ag Antigen binding molecules that bind EGFR, vectors encoding same, and uses thereof
US8691780B2 (en) * 2005-02-17 2014-04-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Txr1 and enhanced taxane sensitivity based on the modulation of a pathway mediated thereby
AU2006218653A1 (en) * 2005-03-02 2006-09-08 Barnett, Gene Ph.D. Pharmaceutically acceptable carrier for ophthalmic compositions
CA2598452A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treating anemia by inhibition of vegf
PL1861116T3 (pl) 2005-03-25 2016-02-29 Regeneron Pharma Formulacje antagonistów VEGF
US20060222595A1 (en) * 2005-03-31 2006-10-05 Priyabrata Mukherjee Nanoparticles for therapeutic and diagnostic applications
EP2444099A1 (en) 2005-03-31 2012-04-25 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to 161P2F10B proteins
US8350009B2 (en) * 2005-03-31 2013-01-08 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to 161P2F10B proteins
EP1712241A1 (en) * 2005-04-15 2006-10-18 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Composition for treating cancer adapted for intra-tumoral administration and uses thereof
DK1871418T3 (da) 2005-04-19 2014-06-10 Seattle Genetics Inc Humaniserede anti-cd70-bindende midler og anvendelser deraf
KR101329437B1 (ko) 2005-05-13 2013-11-14 토포타겟 유케이 리미티드 Ｈｄａｃ 억제제의 약학 제형
US7767710B2 (en) * 2005-05-25 2010-08-03 Calosyn Pharma, Inc. Method for treating osteoarthritis
US20060269579A1 (en) * 2005-05-25 2006-11-30 Musculoskeletal Research Llc Compositions for treating osteoarthritis
WO2006130673A1 (en) * 2005-05-31 2006-12-07 Janssen Pharmaceutica, N.V. 3-benzoimidazolyl-pyrazolopyridines useful in treating kinase disorders
US8071768B2 (en) * 2005-06-10 2011-12-06 Janssen Pharmaceutica, N.V. Alkylquinoline and alkylquinazoline kinase modulators
US7825244B2 (en) * 2005-06-10 2010-11-02 Janssen Pharmaceutica Nv Intermediates useful in the synthesis of alkylquinoline and alkylquinazoline kinase modulators, and related methods of synthesis
US20060281768A1 (en) * 2005-06-10 2006-12-14 Gaul Michael D Thienopyrimidine and thienopyridine kinase modulators
US20060281788A1 (en) * 2005-06-10 2006-12-14 Baumann Christian A Synergistic modulation of flt3 kinase using a flt3 inhibitor and a farnesyl transferase inhibitor
WO2006138567A2 (en) 2005-06-17 2006-12-28 Mannkind Corporation Methods and compositions to elicit multivalent immune responses against dominant and subdominant epitopes, expressed on cancer cells and tumor stroma
EP1748050A1 (en) * 2005-07-28 2007-01-31 Rijksuniversiteit Groningen Targeting-enhanced activation of galectins
EP1925941B1 (en) * 2005-08-01 2012-11-28 Eisai R&D Management Co., Ltd. Method for prediction of the efficacy of vascularization inhibitor
EP1925676A4 (en) 2005-08-02 2010-11-10 Eisai R&D Man Co Ltd TEST METHOD FOR THE EFFECT OF A VASCULARIZATION INHIBITOR
ES2363758T3 (es) 2005-08-15 2011-08-16 Vegenics Pty Ltd Vegf y pdgf modificados con propiedades angiogénicas mejoradas.
WO2007026864A1 (ja) * 2005-09-01 2007-03-08 Eisai R & D Management Co., Ltd. 崩壊性の改善された医薬組成物の製造方法
US8044179B2 (en) * 2005-09-13 2011-10-25 National Research Council Of Canada Methods and compositions for modulating tumor cell activity
GB0519398D0 (en) * 2005-09-23 2005-11-02 Antisoma Plc Biological materials and uses thereof
CA2623236A1 (en) * 2005-09-26 2007-04-05 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to cd70
US20070071756A1 (en) * 2005-09-26 2007-03-29 Peyman Gholam A Delivery of an agent to ameliorate inflammation
CN101300272B (zh) 2005-10-14 2013-09-18 依奈特制药公司 用于治疗增生性病症的组合物和方法
AU2006304897B2 (en) 2005-10-18 2012-07-12 Janssen Pharmaceutica N.V. Method of inhibiting FLT3 kinase
CN101534865A (zh) * 2005-10-19 2009-09-16 Ibc药品公司 生物活性装配体的制备方法及其用途
JP2009516757A (ja) * 2005-10-21 2009-04-23 メディバス エルエルシー ポリ（エステルウレア）ポリマーおよび使用法
US20090291437A1 (en) * 2005-11-02 2009-11-26 O'brien Sean Methods for targeting quadruplex sequences
CA2627598C (en) 2005-11-07 2013-06-25 Eisai R & D Management Co., Ltd. Use of combination of anti-angiogenic substance and c-kit kinase inhibitor
US8812112B2 (en) * 2005-11-10 2014-08-19 ElectroCore, LLC Electrical treatment of bronchial constriction
US9037247B2 (en) 2005-11-10 2015-05-19 ElectroCore, LLC Non-invasive treatment of bronchial constriction
US20110125203A1 (en) * 2009-03-20 2011-05-26 ElectroCore, LLC. Magnetic Stimulation Devices and Methods of Therapy
US8041428B2 (en) 2006-02-10 2011-10-18 Electrocore Llc Electrical stimulation treatment of hypotension
CN101674862A (zh) * 2005-11-10 2010-03-17 电子核心公司 支气管收缩的电刺激治疗
EP2361619A1 (en) 2005-11-10 2011-08-31 TopoTarget UK Limited Histone deacetylase (hdac) inhibitors (pxd-101) alone for the treatment of hematological cancer
EP1964837A4 (en) * 2005-11-22 2010-12-22 Eisai R&D Man Co Ltd Antitumor agent against multiple myeloma
US8846393B2 (en) 2005-11-29 2014-09-30 Gamida-Cell Ltd. Methods of improving stem cell homing and engraftment
AU2006321364B2 (en) * 2005-12-01 2011-11-10 Domantis Limited Noncompetitive domain antibody formats that bind Interleukin 1 Receptor type 1
PT1962895E (pt) † 2005-12-16 2013-03-28 Regeneron Pharma Utilização terapêutica de um antagonista dll4 e de um inibidor fcev para inibição de crescimento de tumores
AP3433A (en) * 2005-12-21 2015-10-31 Janssen Pharmaceutica Nv Triazolopyridazines as tyrosine kinase modultors
US9572886B2 (en) 2005-12-22 2017-02-21 Nitto Denko Corporation Agent for treating myelofibrosis
AU2006350220A1 (en) * 2005-12-23 2008-05-08 Board Of Regents Of The University Of Texas System Anti-hyperproliferative therapies targeting HDGF
US20090317475A1 (en) * 2006-01-03 2009-12-24 Beardsley Robert A Combination antitumor therapies
WO2007129223A2 (en) * 2006-01-23 2007-11-15 Ad Group Systems and methods for distributing emergency messages
US20070175313A1 (en) * 2006-01-31 2007-08-02 Kevin Vandervliet MP3 player holder assembly
AU2006338184B2 (en) * 2006-02-10 2011-11-24 ElectroCore, LLC. Electrical stimulation treatment of hypotension
EP1984064A4 (en) * 2006-02-10 2009-11-11 Electrocore Inc METHODS AND APPARATUS USED TO TREAT ANAPHYLAXIS USING ELECTRICAL MODULATION
WO2007101202A1 (en) * 2006-02-27 2007-09-07 Research Development Foundation Cell-targeted ikb and methods for the use thereof
ES2363891T3 (es) 2006-03-20 2011-08-18 The Regents Of The University Of California Anticuerpos contra el antígeno de células troncales de la próstata (psca) modificados genéticamente para el direccionamiento al cáncer.
TW200812615A (en) * 2006-03-22 2008-03-16 Hoffmann La Roche Tumor therapy with an antibody for vascular endothelial growth factor and an antibody for human epithelial growth factor receptor type 2
TWI390034B (zh) 2006-04-06 2013-03-21 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Novel anti-CD98 antibody
EP2004697A2 (en) 2006-04-07 2008-12-24 The Procter & Gamble Company Antibodies that bind human protein tyrosine phosphatase beta (hptpbeta) and uses thereof
US20100241188A1 (en) * 2009-03-20 2010-09-23 Electrocore, Inc. Percutaneous Electrical Treatment Of Tissue
NZ572200A (en) 2006-04-20 2011-09-30 Janssen Pharmaceutica Nv Method of inhibiting c-kit kinase
SI2021335T1 (sl) 2006-04-20 2011-09-30 Janssen Pharmaceutica Nv Heterocikliäśne spojine kot zaviralci c-fms kinaze
EP2016070B1 (en) 2006-04-20 2016-01-13 Janssen Pharmaceutica N.V. Inhibitors of c-fms kinase
US8697716B2 (en) 2006-04-20 2014-04-15 Janssen Pharmaceutica Nv Method of inhibiting C-KIT kinase
US20070253960A1 (en) * 2006-04-28 2007-11-01 Josee Roy Pharmaceutical removal of vascular extensions from a degenerating disc
US20070258976A1 (en) * 2006-05-04 2007-11-08 Ward Keith W Combination Therapy for Diseases Involving Angiogenesis
CN101437543A (zh) * 2006-05-04 2009-05-20 佛维雅制药股份有限公司 用于治疗新生血管病的包含vegf抑制剂和丝氨酸蛋白酶的组合
US20070265170A1 (en) * 2006-05-15 2007-11-15 Ola Blixt Detection, prevention and treatment of ovarian cancer
CN101443009A (zh) * 2006-05-18 2009-05-27 卫材R&D管理有限公司 针对甲状腺癌的抗肿瘤剂
MX2008014722A (es) * 2006-05-19 2011-04-15 Teva Pharma Proteinas de fusion, usos de las mismas y procesos para producir las mismas.
US20100196336A1 (en) 2006-05-23 2010-08-05 Dongsu Park Modified dendritic cells having enhanced survival and immunogenicity and related compositions and methods
US8101721B2 (en) * 2006-06-15 2012-01-24 Fibron Ltd. Antibodies blocking fibroblast growth factor receptor activation and methods of use thereof
CA2655411A1 (en) * 2006-06-15 2007-12-21 Biogen Idec Ma Inc. Combination therapy employing lymphotoxin beta receptor binding molecules in combination with second agents
EP2944306B1 (en) 2006-06-16 2021-01-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vegf antagonist formulations suitable for intravitreal administration
JP2009541333A (ja) * 2006-06-23 2009-11-26 クインテセンス バイオサイエンシーズ インコーポレーティッド 修飾リボヌクレアーゼ
US7795444B2 (en) * 2006-06-27 2010-09-14 Warner Chilcott Company Human protein tyrosine phosphatase inhibitors and methods of use
US7589212B2 (en) 2006-06-27 2009-09-15 Procter & Gamble Company Human protein tyrosine phosphatase inhibitors and methods of use
US7622593B2 (en) * 2006-06-27 2009-11-24 The Procter & Gamble Company Human protein tyrosine phosphatase inhibitors and methods of use
US8846685B2 (en) 2006-06-27 2014-09-30 Aerpio Therapeutics Inc. Human protein tyrosine phosphatase inhibitors and methods of use
JPWO2008001956A1 (ja) * 2006-06-29 2009-12-03 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 肝線維症治療剤
US20100021379A1 (en) * 2006-06-29 2010-01-28 The Regents Of The University Of California Chemical Antibodies for Immunotherapy and Imaging
JP2009543868A (ja) 2006-07-17 2009-12-10 クインテセンス バイオサイエンシーズ インコーポレーティッド 癌治療に関する方法および組成物
EP2049666A2 (en) * 2006-07-28 2009-04-22 Sanofi-Aventis Composition and method for treatment of tumors
AR062223A1 (es) 2006-08-09 2008-10-22 Glycart Biotechnology Ag Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas
EP2065372B1 (en) * 2006-08-28 2012-11-28 Eisai R&D Management Co., Ltd. Antitumor agent for undifferentiated gastric cancer
US20080070855A1 (en) * 2006-09-20 2008-03-20 James Pitzer Gills Treatment with anti-VEGF agents to prevent postoperative inflammation and angiogenesis in normal and diseased eyes
PL2066694T3 (pl) 2006-09-29 2016-04-29 Oncomed Pharm Inc Kompozycje i sposoby diagnozowania i leczenia nowotworu
KR20090067214A (ko) * 2006-10-17 2009-06-24 다이액스 코포레이션 순차적 병용 요법
CA2666809A1 (en) 2006-10-20 2008-04-24 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Anti-cancer agent comprising anti-hb-egf antibody as active ingredient
US8975374B2 (en) * 2006-10-20 2015-03-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition comprising anti-HB-EGF antibody as active ingredient
EP2078731A4 (en) * 2006-10-20 2012-08-01 Forerunner Pharma Res Co Ltd PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING ANTI-HB-EGF ANTIBODY AS ACTIVE INGREDIENT
JP5795833B2 (ja) * 2006-10-27 2015-10-14 エルパス・インコーポレイテッドＬｐａｔｈ， Ｉｎｃ． スフィンゴシン−１−リン酸と結合させるための組成物および方法
PT2845866T (pt) 2006-10-27 2017-08-09 Genentech Inc Anticorpos e imunoconjugados e utilizações dos mesmos
CN101687031B (zh) * 2006-10-27 2014-05-14 勒帕斯公司 用于治疗眼疾和眼病的组合物及方法
WO2008059052A1 (en) 2006-11-17 2008-05-22 Innate Pharma Improved methods of using phosphoantigen for the treatment of cancer
EP3156415A1 (en) 2006-11-22 2017-04-19 Bristol-Myers Squibb Company Targeted therapeutics based on engineered proteins for tyrosine kinases receptors, including igf-ir
WO2008064336A2 (en) 2006-11-22 2008-05-29 Inivitrogen Corporation Autoimmune disease biomarkers
NZ578354A (en) * 2006-12-14 2012-01-12 Medarex Inc Antibody-partner molecule conjugates that bind cd70 and uses thereof
MX2009006779A (es) * 2006-12-19 2009-08-27 Genentech Inc Antagonistas especificos para terapia con adyuvantes y neo-adyuvantes y el tratamiento de tumores en etapa temprana.
WO2008074853A1 (en) * 2006-12-21 2008-06-26 Novartis Ag Ophthalmic rebamipide solution
WO2008081942A1 (ja) * 2007-01-05 2008-07-10 The University Of Tokyo 抗prg-3抗体を用いる癌の診断および治療
US20080213253A1 (en) * 2007-01-12 2008-09-04 Dyax Corp. Combination therapy for the treatment of cancer
WO2008093855A1 (ja) * 2007-01-29 2008-08-07 Eisai R & D Management Co., Ltd. 未分化型胃癌治療用組成物
US7816390B2 (en) * 2007-01-31 2010-10-19 Janssen Pharmaceutica Nv N-substituted tricyclic 3-aminopyrazoles as anti-mitotic tubulin polymerization inhibitors
ATE516814T1 (de) * 2007-02-02 2011-08-15 Bristol Myers Squibb Co 10fn3 domain zur behandlung von krankheiten begleitet von unerwünschter angiogenese
WO2008093246A2 (en) 2007-02-02 2008-08-07 Vegenics Limited Vegf receptor antagonist for treating organ transplant alloimmunity and arteriosclerosis
TWI407971B (zh) 2007-03-30 2013-09-11 Nitto Denko Corp Cancer cells and tumor-related fibroblasts
US20080286337A1 (en) * 2007-05-15 2008-11-20 Boston Foundation For Sight Method of treating a disease in an eye using a scleral lens
WO2008149147A2 (en) * 2007-06-06 2008-12-11 Domantis Limited Polypeptides, antibody variable domains and antagonists
KR100883430B1 (ko) * 2007-06-13 2009-02-12 한국생명공학연구원 혈관내피성장인자 수용체를 중화하는 인간 단클론항체 및그 용도
PE20090368A1 (es) * 2007-06-19 2009-04-28 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-igf
US8097422B2 (en) 2007-06-20 2012-01-17 Salk Institute For Biological Studies Kir channel modulators
US20090047689A1 (en) * 2007-06-20 2009-02-19 John Kolman Autoantigen biomarkers for early diagnosis of lung adenocarcinoma
US8629144B2 (en) * 2007-06-21 2014-01-14 Janssen Pharmaceutica Nv Polymorphic and hydrate forms, salts and process for preparing 6-{difluoro[6-(1-methyl-1H-pyrazol-4-yl)[1,2,4]triazolo[4,3-b]pyridazin-3-yl]methyl}quinoline
US8334239B2 (en) 2007-07-10 2012-12-18 The Board Of Regents Of The University Of Texas System High affinity VEGF-receptor antagonists
EP2641618A3 (en) 2007-07-16 2013-10-23 Genentech, Inc. Humanized anti-CD79B antibodies and immunoconjugates and methods of use
SG183023A1 (en) 2007-07-16 2012-08-30 Genentech Inc Anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
WO2009025806A2 (en) * 2007-08-20 2009-02-26 Adnexus, A Bristol-Myers Squibb R & D Company Use of vegfr-2 inhibitors for treating metastatic cancer
JP6035009B2 (ja) 2007-08-22 2016-11-30 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 活性化可能な結合ポリペプチドおよびその同定方法ならびに使用
US8940298B2 (en) 2007-09-04 2015-01-27 The Regents Of The University Of California High affinity anti-prostate stem cell antigen (PSCA) antibodies for cancer targeting and detection
EP2207570A2 (en) * 2007-09-14 2010-07-21 Nitto Denko Corporation Drug carriers
CN101868446A (zh) * 2007-09-25 2010-10-20 托波塔吉特英国有限公司 某些异羟肟酸化合物的合成方法
WO2009042854A1 (en) * 2007-09-26 2009-04-02 Musculoskeletal Research Llc Ion-channel regulator compositions and methods of using same
EP3714906A1 (en) * 2007-10-03 2020-09-30 Cornell University Treatment of proliferative disorders using radiolabelled antibodies to psma
EP2205271B1 (en) * 2007-10-08 2014-05-21 Quintessence Biosciences, Inc. Compositions and methods for ribonuclease-based therapies
JO3240B1 (ar) * 2007-10-17 2018-03-08 Janssen Pharmaceutica Nv c-fms مثبطات كيناز
US8361465B2 (en) * 2007-10-26 2013-01-29 Lpath, Inc. Use of anti-sphingosine-1-phosphate antibodies in combination with chemotherapeutic agents
US20090170770A1 (en) * 2007-11-06 2009-07-02 Ali Hafezi-Moghadam Methods and compositions for treating conditions associated with angiogenesis using a vascular adhesion protein-1 (vap 1) inhibitor
WO2009062174A1 (en) * 2007-11-08 2009-05-14 University Of Utah Research Foundation Use of angiogenesis antagonists in conditions of abnormal venous proliferation
NZ586053A (en) 2007-11-09 2012-09-28 Peregrine Pharmaceuticals Inc Anti-vegf antibody compositions and methods
CA2704000C (en) 2007-11-09 2016-12-13 Eisai R&D Management Co., Ltd. Combination of anti-angiogenic substance and anti-tumor platinum complex
AU2013205269B2 (en) * 2007-11-09 2016-05-19 Affitech Research As Anti-VEGF antibody compositions and methods
ES2369717T3 (es) * 2007-11-30 2011-12-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Estabilización de conjugados que comprenden una molécula conectora de tiourea.
TWI468417B (zh) * 2007-11-30 2015-01-11 Genentech Inc 抗－ｖｅｇｆ抗體
WO2009083225A2 (en) * 2007-12-28 2009-07-09 Biolnvent International Ab Formulation
US8253725B2 (en) * 2007-12-28 2012-08-28 St. Jude Medical, Atrial Fibrillation Division, Inc. Method and system for generating surface models of geometric structures
CA2713137C (en) * 2008-01-25 2017-10-24 Hadasit Medical Research Services And Development Ltd. Targeting of innate immune response to tumor site
CA2713930A1 (en) * 2008-01-29 2009-08-06 Eisai R & D Management Co., Ltd. Combined use of angiogenesis inhibitor and taxane
IL295449A (en) 2008-01-31 2022-10-01 Genentech Inc and fusion antibody-drug-cd79b engineered antibodies cysteine-
CN102007145A (zh) 2008-02-14 2011-04-06 百时美施贵宝公司 基于结合egfr的工程化蛋白质的靶向治疗剂
SI2262493T1 (sl) * 2008-03-07 2015-07-31 Onxeo Dk Branch Of Onxeo S.A. France Postopki zdravljenja z uporabo podaljšane kontinuirane infuzije belinostata
EP2644204B1 (en) 2008-03-18 2017-04-19 Genentech, Inc. Combinations of an Anti-HER2 antibody-drug conjugate and pertuzumab
CN103992405B (zh) * 2008-03-26 2016-08-17 宜康公司 抗-vegf抗体
AU2014202474B2 (en) * 2008-03-26 2016-07-28 Epitomics, Inc. Anti-VEGF antibody
KR100998569B1 (ko) * 2008-03-31 2010-12-07 한국원자력연구원 암 또는 전이암 진단 및 치료용 방사면역접합체，및 이를이용한 암 또는 전이암 억제제 개발
WO2009125394A1 (en) * 2008-04-09 2009-10-15 Technion Research & Development Foundation Ltd. Anti human immunodeficiency antibodies and uses thereof
EP2636513B1 (en) * 2008-04-10 2014-08-27 Stratasys Ltd. System and method for three dimensional model printing
ES2620285T3 (es) 2008-05-02 2017-06-28 Novartis Ag Moléculas de unión con base en fibronectina mejorada y usos de las mismas
CA2723197C (en) 2008-05-02 2017-09-19 Seattle Genetics, Inc. Methods and compositions for making antibodies and antibody derivatives with reduced core fucosylation
ES2338400B1 (es) * 2008-05-06 2011-09-14 David Benet Ferrus Conjunto de moleculas antiangiogenicas y su uso.
US8082730B2 (en) * 2008-05-20 2011-12-27 Caterpillar Inc. Engine system having particulate reduction device and method
JP2011520961A (ja) * 2008-05-22 2011-07-21 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー 多価フィブロネクチンをベースとする足場ドメインタンパク質
US20090298088A1 (en) * 2008-05-30 2009-12-03 Belyaev Alexander S Cleavable catalytic binding and detection system
HUE032894T2 (hu) 2008-06-25 2017-11-28 Esbatech Alcon Biomed Res Unit VEGF-gátló, stabilis és oldható antitestek
US20100069616A1 (en) * 2008-08-06 2010-03-18 The Regents Of The University Of California Engineered antibody-nanoparticle conjugates
EP2334695B1 (en) 2008-10-01 2015-12-23 Quintessence Biosciences, Inc. Therapeutic ribonucleases
US9434610B2 (en) * 2008-10-07 2016-09-06 Rexahn Pharmaceuticals, Inc. HPMA—docetaxel conjugates and uses therefore
US8871202B2 (en) 2008-10-24 2014-10-28 Lpath, Inc. Prevention and treatment of pain using antibodies to sphingosine-1-phosphate
PT2365828E (pt) 2008-11-07 2014-12-12 Galaxy Biotech Llc Anticorpos monoclonais para o receptor 2 do factor de crescimento de fibroblastos
PA8849001A1 (es) 2008-11-21 2010-06-28 Lilly Co Eli Anticuerpos de c-met
TWI496582B (zh) 2008-11-24 2015-08-21 必治妥美雅史谷比公司 雙重專一性之ｅｇｆｒ／ｉｇｆｉｒ結合分子
KR101093717B1 (ko) 2008-11-26 2011-12-19 한국생명공학연구원 Ｖｅｇｆ―특이적인 인간항체
UA105198C2 (ru) 2008-12-12 2014-04-25 Берингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх Антитело против инсулиноподобных факторов роста
JP5851842B2 (ja) * 2009-01-12 2016-02-03 サイトムエックス セラピューティクス, インク.CytomX Therapeutics, Inc. 改変した抗体組成物、それを作製および使用する方法
GB0900555D0 (en) * 2009-01-14 2009-02-11 Topotarget As New methods
US8940501B2 (en) 2009-01-30 2015-01-27 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods for ligation and uses thereof
WO2010091234A2 (en) 2009-02-06 2010-08-12 The General Hospital Corporation Methods of treating vascular lesions
DK3912643T3 (da) 2009-02-13 2022-10-17 Immunomedics Inc Immunokonjugater med en intracellulært-spaltelig binding
US20160095939A1 (en) 2014-10-07 2016-04-07 Immunomedics, Inc. Neoadjuvant use of antibody-drug conjugates
CA2752510C (en) * 2009-02-17 2024-01-23 Neil Bander Methods and kits for diagnosis of cancer and prediction of therapeutic value
WO2010096838A2 (en) 2009-02-23 2010-08-26 Cytomx Therapeutics, Llc Proproteins and methods of use thereof
KR101224468B1 (ko) 2009-05-20 2013-01-23 주식회사 파멥신 신규한 형태의 이중표적항체 및 그 용도
US20120135064A1 (en) * 2009-05-27 2012-05-31 Northeastern University Conjugated nanodelivery vehicles
GB0909906D0 (en) 2009-06-09 2009-07-22 Affitech As Antibodies
US8883832B2 (en) 2009-07-06 2014-11-11 Aerpio Therapeutics Inc. Compounds, compositions, and methods for preventing metastasis of cancer cells
DK2451279T3 (da) 2009-07-06 2019-05-20 Aerpio Therapeutics Inc Benzosulfonamid derivater forbindelser deraf og deres brug til at forhindre metastaser af cancerceller
US8956600B2 (en) * 2009-08-10 2015-02-17 Taiwan Liposome Co. Ltd. Ophthalmic drug delivery system containing phospholipid and cholesterol
CN102002104A (zh) 2009-08-28 2011-04-06 江苏先声药物研究有限公司 一种抗vegf的单克隆抗体及含有该抗体的药物组合物
US8178307B2 (en) * 2009-09-02 2012-05-15 National Tsing Hua University Methods and compositions for detection of lethal cell and uses thereof
US8642515B2 (en) 2009-09-04 2014-02-04 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Genetic determinants of prostate cancer risk
EP2293071A1 (en) * 2009-09-07 2011-03-09 Universität Zu Köln Biomarker for colorectal cancer
EP2478110B1 (en) 2009-09-16 2016-01-06 Immunomedics, Inc. Class i anti-cea antibodies and uses thereof
MX2012004416A (es) 2009-10-13 2012-05-08 Rexahn Pharmaceuticals Inc Sistemas polimericos para el suministro de agentes anticancer.
ES2895226T3 (es) 2009-10-16 2022-02-18 Mereo Biopharma 5 Inc Combinación terapéutica y uso de anticuerpos antagonistas de DLL4 y agentes antihipertensivos
AU2010324506B2 (en) 2009-11-24 2015-02-26 Alethia Biotherapeutics Inc. Anti-clusterin antibodies and antigen binding fragments and their use to reduce tumor volume
WO2011068845A1 (en) 2009-12-02 2011-06-09 Immunomedics, Inc. Combining radioimmunotherapy and antibody-drug conjugates for improved cancer therapy
EP3511023A1 (en) 2009-12-02 2019-07-17 Imaginab, Inc. J591 minibodies and cys-diabodies for targeting human prostate specific membrane antigen (psma) and methods for their use
JP6046494B2 (ja) * 2010-02-08 2016-12-14 アジェンシス，インコーポレイテッド １６１ｐ２ｆ１０ｂタンパク質に結合する抗体薬物コンジュゲート（ａｄｃ）
GB201002238D0 (en) 2010-02-10 2010-03-31 Affitech As Antibodies
WO2011119871A1 (en) 2010-03-24 2011-09-29 Rxi Phrmaceuticals Corporation Rna interference in ocular indications
US9080171B2 (en) 2010-03-24 2015-07-14 RXi Parmaceuticals Corporation Reduced size self-delivering RNAi compounds
TW201138808A (en) 2010-05-03 2011-11-16 Bristol Myers Squibb Co Serum albumin binding molecules
WO2011140182A2 (en) 2010-05-04 2011-11-10 Medimmune, Llc Optimized degenerative muscle disease diagnostics and treatments
CN103180339B (zh) 2010-05-26 2016-04-27 百时美施贵宝公司 具有改善的稳定性的基于纤连蛋白的支架蛋白质
ES2573515T3 (es) 2010-06-25 2016-06-08 Eisai R&D Management Co., Ltd. Agente antitumoral que emplea compuestos con efecto inhibitorio de cinasas combinados
EP2591002A2 (en) * 2010-07-07 2013-05-15 Tubitak Recombinant antibody structures binding to and blocking the activity of vascular endothelial growth factor 2 (vegfr- 2 /kdr)
CN101942022B (zh) * 2010-07-29 2013-07-24 华东理工大学 抗人表皮生长因子受体单链抗体-铁蛋白重链亚基蛋白、构建方法及其用途
US8551479B2 (en) 2010-09-10 2013-10-08 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating melanoma
EP2675485A4 (en) 2011-02-15 2014-10-15 Immunomedics Inc ANTI-MUCIN ANTIBODY FOR THE EARLY RECOGNITION AND TREATMENT OF PANCREATIC CANCER
US8722044B2 (en) 2011-03-15 2014-05-13 Janssen Biotech, Inc. Human tissue factor antibody and uses thereof
WO2012142174A1 (en) 2011-04-12 2012-10-18 Electronic Biosciences Inc. Site specific chemically modified nanopore devices
RU2580609C2 (ru) 2011-04-18 2016-04-10 Эйсай Ар Энд Ди Менеджмент Ко., Лтд. Противоопухолевое терапевтическое средство
JO3283B1 (ar) 2011-04-26 2018-09-16 Sanofi Sa تركيب يتضمن أفليبيرسيبت, حمض فولينيك, 5- فلورويوراسيل (5- Fu) وإرينوسيتان (FOLFIRI)
EP2704751B1 (en) 2011-05-02 2019-04-17 Immunomedics, Inc. Ultrafiltration concentration of allotype selected antibodies for small-volume administration
ES2841809T3 (es) 2011-06-03 2021-07-09 Eisai R&D Man Co Ltd Biomarcadores para pronosticar y evaluar el grado de respuesta de sujetos con cáncer de tiroides y de riñón a compuestos de lenvatinib
CN103764830A (zh) * 2011-06-30 2014-04-30 基因信号国际公司 含有irs-1抑制剂和vegf抑制剂的组合物
US9682144B2 (en) 2011-06-30 2017-06-20 Gene Signal International, Sa Composition comprising inhibitors of IRS-1 and of VEGF
EP2540828A1 (en) * 2011-06-30 2013-01-02 Gene Signal International SA Composition comprising inhibitors of IRS-1 and of VEGF
US8921533B2 (en) 2011-07-25 2014-12-30 Chromatin Technologies Glycosylated valproic acid analogs and uses thereof
PE20141537A1 (es) 2011-09-23 2014-11-17 Oncomed Pharm Inc Agentes de ligacion al factor de crecimiento endotelial vascular/ligando 4 similar a delta (vegf/dll4) y usos de los mismos
CN102492038B (zh) * 2011-12-09 2014-05-28 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 抗人Tim-3的中和性单克隆抗体L3D及其用途
SG11201404608WA (en) 2012-02-13 2014-09-26 Gamida Cell Ltd Mesenchymal stem cells conditioned medium and methods of generating and using the same
AU2013224591A1 (en) 2012-02-22 2014-07-24 Alethia Biotherapeutics Inc. Co-use of a clusterin inhibitor with an EGFR inhibitor to treat cancer
WO2013134431A1 (en) 2012-03-06 2013-09-12 Life Technologies Corporation Biomarkers for systemic lupus erythematosus
WO2013149219A2 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Sorrento Therapeutics Inc. Fully human antibodies that bind to vegfr2
US20150204873A1 (en) 2012-06-18 2015-07-23 Electonic Biosciences, Inc. Cell-free assay device and methods of use
US9175266B2 (en) 2012-07-23 2015-11-03 Gamida Cell Ltd. Enhancement of natural killer (NK) cell proliferation and activity
US9567569B2 (en) 2012-07-23 2017-02-14 Gamida Cell Ltd. Methods of culturing and expanding mesenchymal stem cells
JOP20180012A1 (ar) 2012-08-07 2019-01-30 Janssen Pharmaceutica Nv عملية السلفنة باستخدام نونافلوروبوتانيسولفونيل فلوريد
WO2014025675A1 (en) 2012-08-07 2014-02-13 Janssen Pharmaceutica Nv Process for the preparation of heterocyclic ester derivatives
US9315567B2 (en) 2012-08-14 2016-04-19 Ibc Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
US9382329B2 (en) 2012-08-14 2016-07-05 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Disease therapy by inducing immune response to Trop-2 expressing cells
EP2914961A4 (en) 2012-10-31 2016-04-20 Oncomed Pharm Inc METHODS AND MONITORING A TREATMENT BY AN ANTAGONIST OF DLL4
CA2891280C (en) 2012-11-24 2018-03-20 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Hydrophilic linkers and their uses for conjugation of drugs to cell binding molecules
PT2900277T (pt) 2012-12-13 2022-05-25 Immunomedics Inc Doses de imunoconjugados de anticorpos e sn-38 para melhorar a eficácia e diminuir a toxicidade
AU2013364953A1 (en) 2012-12-21 2015-04-30 Eisai R&D Management Co., Ltd. Amorphous form of quinoline derivative, and method for producing same
US9770426B2 (en) 2013-01-11 2017-09-26 Massachusetts Eye And Ear Infirmary CYP450 lipid metabolites reduce inflammation and angiogenesis
US9745558B2 (en) 2013-02-18 2017-08-29 Vegenics Pty Limited VEGFR-3 ligand binding molecules and uses thereof
US20140255413A1 (en) 2013-03-07 2014-09-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination therapy for neoplasia treatment
KR102049990B1 (ko) 2013-03-28 2019-12-03 삼성전자주식회사 c-Met 항체 및 VEGF 결합 단편이 연결된 융합 단백질
US9452228B2 (en) 2013-04-01 2016-09-27 Immunomedics, Inc. Antibodies reactive with an epitope located in the N-terminal region of MUC5AC comprising cysteine-rich subdomain 2 (Cys2)
WO2014182635A1 (en) 2013-05-08 2014-11-13 Baldwin Megan E Biomarkers for age-related macular degeneration (amd)
US10517861B2 (en) 2013-05-14 2019-12-31 Eisai R&D Management Co., Ltd. Biomarkers for predicting and assessing responsiveness of endometrial cancer subjects to lenvatinib compounds
KR101541478B1 (ko) 2013-05-31 2015-08-05 동아쏘시오홀딩스 주식회사 항-vegf 항체 및 이를 포함하는 암 또는 신생혈관형성관련 질환의 예방, 진단 또는 치료용 약학 조성물
WO2015006734A1 (en) 2013-07-12 2015-01-15 Ophthotech Corporation Methods for treating or preventing ophthalmological conditions
RS58719B1 (sr) 2013-08-01 2019-06-28 Five Prime Therapeutics Inc Nefukozilisana anti-fgfr2iiib antitela
US10934550B2 (en) 2013-12-02 2021-03-02 Phio Pharmaceuticals Corp. Immunotherapy of cancer
US9914769B2 (en) * 2014-07-15 2018-03-13 Kymab Limited Precision medicine for cholesterol treatment
AU2015219495B2 (en) 2014-02-21 2019-11-21 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Disease therapy by inducing immune response to Trop-2 expressing cells
US9139649B2 (en) 2014-02-25 2015-09-22 Immunomedics, Inc. Humanized anti-CD22 antibody
EP3122757B1 (en) 2014-02-28 2023-09-06 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd Charged linkers and their uses for conjugation
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
KR20220162886A (ko) 2014-03-20 2022-12-08 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 혈청 알부민-결합 피브로넥틴 유형 iii 도메인
WO2015164541A1 (en) * 2014-04-22 2015-10-29 Presage Biosciences, Inc. Methods and devices for evaluating drug candidates
EP3160504B1 (en) 2014-06-24 2020-09-16 Immunomedics, Inc. Anti-histone therapy for vascular necrosis in severe glomerulonephritis
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
RS58957B1 (sr) 2014-07-18 2019-08-30 Sanofi Sa Postupak za predviđanje ishoda tretmana sa afliberceptom kod pacijenta za kog se sumnja da boluje od raka
HRP20221047T1 (hr) 2014-08-28 2022-11-11 Eisai R&D Management Co., Ltd. Derivat kinolina visoke čistoće i postupak za njegovu proizvodnju
ES2796903T3 (es) 2014-09-23 2020-11-30 Hoffmann La Roche Procedimiento de uso de inmunoconjugados anti-CD79b
ES2808153T3 (es) 2014-10-31 2021-02-25 Mereo Biopharma 5 Inc Terapia de combinación para tratamiento de enfermedad
TWI695837B (zh) 2014-12-04 2020-06-11 比利時商健生藥品公司 作為激酶調節劑之三唑並嗒
WO2016109943A1 (zh) * 2015-01-06 2016-07-14 珠海亿胜生物制药有限公司 抗vegf抗体
AR103477A1 (es) 2015-01-28 2017-05-10 Lilly Co Eli Compuestos de vegfa / ang2
FI3263106T3 (fi) 2015-02-25 2024-01-03 Eisai R&D Man Co Ltd Menetelmä kinoliinijohdannaisen kitkeryyden tukahduttamiseksi
EP3265059A4 (en) 2015-03-03 2018-08-29 Cureport Inc. Combination liposomal pharmaceutical formulations
EP3265063A4 (en) 2015-03-03 2018-11-07 Cureport, Inc. Dual loaded liposomal pharmaceutical formulations
CA2978226A1 (en) 2015-03-04 2016-09-09 Merck Sharpe & Dohme Corp. Combination of a pd-1 antagonist and a vegfr/fgfr/ret tyrosine kinase inhibitor for treating cancer
CA2981543A1 (en) 2015-04-22 2016-10-27 Immunomedics, Inc. Isolation, detection, diagnosis and/or characterization of circulating trop-2-positive cancer cells
CA2988707C (en) 2015-06-16 2023-10-10 Eisai R&D Management Co., Ltd. Combination of cbp/catenin inhibitor and immune checkpoint inhibitor for treating cancer
PT3313443T (pt) 2015-06-25 2023-08-30 Immunomedics Inc Combinação de anticorpos anti-hla-dr ou anti-trop-2 com inibidores de microtúbulos, inibidores de parp, inibidores de bruton quinase ou inibidores de fosfoinositídeo 3-quinase melhora significativamente o resultado terapêutico no cancro
EP3316885B1 (en) 2015-07-01 2021-06-23 Immunomedics, Inc. Antibody-sn-38 immunoconjugates with a cl2a linker
CN113350518A (zh) 2015-07-12 2021-09-07 杭州多禧生物科技有限公司 与细胞结合分子的共轭偶联的桥连接体
US9839687B2 (en) 2015-07-15 2017-12-12 Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd. Acetylenedicarboxyl linkers and their uses in specific conjugation of a cell-binding molecule
KR20180050321A (ko) 2015-08-07 2018-05-14 이미지냅 인코포레이티드 분자를 표적화하기 위한 항원 결합 구조체
RU2763916C2 (ru) 2015-09-23 2022-01-11 Дженентек, Инк. Оптимизированные варианты анти-vegf антител
JP6893504B2 (ja) 2015-09-23 2021-06-23 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 速い解離速度を有する血清アルブミン結合フィブロネクチンタイプｉｉｉドメイン
EP3353204B1 (en) 2015-09-23 2023-10-18 Mereo BioPharma 5, Inc. Bi-specific anti-vegf/dll4 antibody for use in treating platinum-resistant ovarian cancer
CA3003157A1 (en) * 2015-10-30 2017-05-04 The Jackson Laboratory Compositions and methods relating to tumor analysis
SG11201804134YA (en) 2015-11-23 2018-06-28 Five Prime Therapeutics Inc Fgfr2 inhibitors alone or in combination with immune stimulating agents in cancer treatment
HUE063335T2 (hu) 2015-12-03 2024-01-28 Regeneron Pharma Módszerek genetikai variánsok és klinikai eredmény közötti összefüggés megállapítására idõskori makuladegenerációban szenvedõ, anti-VEGF-fel kezelt betegeknél
BR112018013407A2 (pt) 2015-12-30 2018-12-18 Kodiak Sciences Inc anticorpos e conjugados dos mesmos
US11008387B2 (en) 2016-01-06 2021-05-18 Order-Made Medical Research Inc. Antibody inhibiting binding of VEGF to NRP1
EP3401331B1 (en) 2016-01-06 2022-04-06 Order-Made Medical Research Inc. High-affinity anti-vegf antibody
JP7181091B2 (ja) * 2016-05-10 2022-11-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド ポリペプチドの組み換え産生中にトリスルフィド結合を減少させる方法
AU2017275081B2 (en) 2016-05-30 2023-12-07 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Anti-human hemoglobin monoclonal antibody or antibody kit, insoluble carrier particle to which anti-human hemoglobin monoclonal antibody is immobilized, and measurement reagent and measurement method using same
GB2551979A (en) 2016-06-30 2018-01-10 Rs Arastirma Egitim Danismanlik Llac Sanayi Ticaret Ltd Cleavable polymer drug conjugates
AU2017334224A1 (en) * 2016-09-27 2019-03-21 The University Of The Highlands And Islands Antigen biomarkers
US10537563B2 (en) * 2016-10-14 2020-01-21 Novartis Ag Methods for treating ocular disease using inhibitors of CSF-1R
US11779604B2 (en) 2016-11-03 2023-10-10 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses and methods
JP7138350B2 (ja) 2016-11-14 2022-09-16 ハンジョウ ディーエーシー バイオテック シーオー．，エルティディ． 共役連結体、該連結体を含有する細胞結合分子－薬物共役体、並びに該共役体及び連結体の使用及び製造方法
GB2556055B (en) 2016-11-16 2022-03-23 Rs Arastirma Egitim Danismanlik Ilac Sanayi Ticaret Ltd Sti Self-assembled diblock copolymers composed of pegmema and drug bearing polymeric segments
WO2018147960A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
SG11201909218RA (en) 2017-04-03 2019-11-28 Hoffmann La Roche Antibodies binding to steap-1
US11311626B2 (en) 2017-05-02 2022-04-26 National Cancer Center Japan Plasmin-cleavable anti-insoluble fibrin antibody-drug conjugate
KR20200006538A (ko) 2017-05-16 2020-01-20 파이브 프라임 테라퓨틱스, 인크. 암 치료에서 화학요법제와 병용되는 항-fgfr2 항체
US10543231B2 (en) 2017-05-19 2020-01-28 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for treating cancer
US10894019B2 (en) 2017-08-15 2021-01-19 University Of South Carolina Drug delivery system and method for targeting cancer stem cells
JP7436365B2 (ja) * 2017-12-29 2024-02-21 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 抗ｖｅｇｆ抗体及び使用の方法
KR102644938B1 (ko) * 2018-03-19 2024-03-07 주식회사 파멥신 항-vegfr-2 항체
JP2021522308A (ja) 2018-05-04 2021-08-30 トゥリーズ 上皮細胞及び骨髄細胞の両方を活性化するｔｌｒ３リガンド
US11672767B2 (en) 2019-05-13 2023-06-13 University Of South Carolina Enzymatically cleavable self-assembled nanoparticles for morphogen delivery
JP2022545181A (ja) 2019-08-30 2022-10-26 ユニバーシティ オブ ロチェスター がん治療のためのセプチン阻害剤
EP4041312A4 (en) 2019-10-10 2023-12-20 Kodiak Sciences Inc. METHOD FOR TREATING AN EYE DISORDER
TW202138388A (zh) 2019-12-30 2021-10-16 美商西根公司 以非海藻糖苷化抗－ｃｄ７０抗體治療癌症之方法
US11883432B2 (en) 2020-12-18 2024-01-30 Century Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor system with adaptable receptor specificity
JPWO2022239720A1 (ja) 2021-05-10 2022-11-17

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4456550A (en) 1982-11-22 1984-06-26 President And Fellows Of Harvard College Vascular permeability factor
US4925922A (en) * 1983-02-22 1990-05-15 Xoma Corporation Potentiation of cytotoxic conjugates
FR2566271B1 (fr) 1984-06-20 1986-11-07 Sanofi Sa Nouveaux conjugues cytotoxiques utilisables en therapeutique et procede d'obtention
CA1289880C (en) 1985-12-06 1991-10-01 Jeffrey L. Winkelhake Anti-human ovarian cancer immunotoxins and methods of use thereof
FR2601679B1 (fr) 1986-07-15 1990-05-25 Sanofi Sa Immunotoxines, procede de preparation et compositions pharmaceutiques en contenant
CA1338645C (en) 1987-01-06 1996-10-15 George R. Pettit Isolation, structural elucidation and synthesis of novel antineoplastic substances denominated "combretastatins"
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5008196A (en) 1987-08-21 1991-04-16 Monsanto Company Stimulation of endothelial cell growth
US5036003A (en) 1987-08-21 1991-07-30 Monsanto Company Antibodies to VPF
US5720937A (en) 1988-01-12 1998-02-24 Genentech, Inc. In vivo tumor detection assay
US5024834A (en) 1988-07-12 1991-06-18 Cetus Corporation Thioether linked immunotoxin conjugates
US6007817A (en) 1988-10-11 1999-12-28 University Of Southern California Vasopermeability enhancing immunoconjugates
US5240848A (en) 1988-11-21 1993-08-31 Monsanto Company Dna sequences encoding human vascular permeability factor having 189 amino acids
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US4940726A (en) 1989-04-26 1990-07-10 Arizona Board Of Regents Cell growth inhibitory macrocyclic lactones denominated Combretastatin D-1 and Combretastatin D-2
US5332671A (en) 1989-05-12 1994-07-26 Genetech, Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor and DNA encoding same
US6020145A (en) * 1989-06-30 2000-02-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96
US5194596A (en) 1989-07-27 1993-03-16 California Biotechnology Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor
US5165923A (en) 1989-11-20 1992-11-24 Imperial Cancer Research Technology Methods and compositions for the treatment of hodgkin's disease
DK0536350T3 (da) 1991-02-22 2002-09-02 American Cyanamid Co Identifikation af et nyt humant receptor-tyrosinkinase-gen
US6582959B2 (en) * 1991-03-29 2003-06-24 Genentech, Inc. Antibodies to vascular endothelial cell growth factor
US20030206899A1 (en) * 1991-03-29 2003-11-06 Genentech, Inc. Vascular endothelial cell growth factor antagonists
US20020032313A1 (en) * 1991-03-29 2002-03-14 Genentech, Inc. Vascular endothelial cell growth factor antagonists
US6022541A (en) 1991-10-18 2000-02-08 Beth Israel Deaconess Medical Center Immunological preparation for concurrent specific binding to spatially exposed regions of vascular permeability factor bound in-vivo to a tumor associated blood vessel
AU2861692A (en) 1991-10-18 1993-05-21 Beth Israel Hospital Association, The Vascular permeability factor targeted compounds
US5234955A (en) 1991-12-20 1993-08-10 Eli Lilly And Company Antitumor compositions and methods of treatment
US6093399A (en) 1992-03-05 2000-07-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the specific coagulation of vasculature
US5877289A (en) 1992-03-05 1999-03-02 The Scripps Research Institute Tissue factor compositions and ligands for the specific coagulation of vasculature
US5776427A (en) 1992-03-05 1998-07-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for targeting the vasculature of solid tumors
US6036955A (en) 1992-03-05 2000-03-14 The Scripps Research Institute Kits and methods for the specific coagulation of vasculature
DK0627940T3 (da) 1992-03-05 2003-09-01 Univ Texas Anvendelse af immunokonjugater til diagnose og/eller terapi af vaskulariserede tumorer
US6004555A (en) 1992-03-05 1999-12-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for the specific coagulation of vasculature
US5965132A (en) 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
US5281700A (en) 1992-08-11 1994-01-25 The Regents Of The University Of California Method of recovering endothelial membrane from tissue and applications thereof
BR9207175A (pt) 1992-10-28 1995-12-12 Genentech Inc Composição contendo antagonista de fator de crescimento de célula endotelial vascular sequência aminoácida de anticorpo monoclonal polipeptídeo e método de tratamento de tumor em mamífero
EP0669988B2 (en) 1992-10-29 2009-07-08 The Australian National University Angiogenesis inhibitory antibodies
CN1173991C (zh) 1992-11-13 2004-11-03 马克斯普朗克科学促进协会 作为血管内皮生长因子受体的f1k-1
US5879672A (en) 1994-10-07 1999-03-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tie-2 ligand 1
US5643755A (en) 1994-10-07 1997-07-01 Regeneron Pharmaceuticals Inc. Nucleic acid encoding tie-2 ligand
US5840301A (en) 1994-02-10 1998-11-24 Imclone Systems Incorporated Methods of use of chimerized, humanized, and single chain antibodies specific to VEGF receptors
GB9410533D0 (en) 1994-05-26 1994-07-13 Lynxvale Ltd In situ hybridisation and immuno-Chemical localisation of a growth factor
US5786344A (en) * 1994-07-05 1998-07-28 Arch Development Corporation Camptothecin drug combinations and methods with reduced side effects
CA2194369C (en) 1994-07-11 2004-08-31 Philip E. Thorpe Methods and compositions for the specific coagulation of vasculature
US5650490A (en) 1994-10-07 1997-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tie-2 ligand 2
US5814464A (en) 1994-10-07 1998-09-29 Regeneron Pharma Nucleic acids encoding TIE-2 ligand-2
US5561122A (en) 1994-12-22 1996-10-01 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Combretastatin A-4 prodrug
US5730977A (en) 1995-08-21 1998-03-24 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Anti-VEGF human monoclonal antibody
US6020473A (en) 1995-08-25 2000-02-01 Genentech, Inc. Nucleic acids encoding variants of vascular endothelial cell growth factor
US5854205A (en) 1995-10-23 1998-12-29 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic compositions and methods
JPH09124697A (ja) 1995-11-01 1997-05-13 Toagosei Co Ltd ペプチド及びモノクローナル抗体
US5942385A (en) 1996-03-21 1999-08-24 Sugen, Inc. Method for molecular diagnosis of tumor angiogenesis and metastasis
US5851797A (en) 1996-06-19 1998-12-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tie ligand-3, methods of making and uses thereof
US6008319A (en) 1996-12-23 1999-12-28 University Of Southern California Vasopermeability enhancing peptide of human interleukin-2 and immunoconjugates thereof
US6291667B1 (en) 1997-01-31 2001-09-18 Parkash S. Gill Method and composition for treatment of kaposi's sarcoma
ES2361267T3 (es) 1997-04-07 2011-06-15 Genentech Inc. Procedimiento para la produccion de anticuerpos humanizados mediante mutagénesis aleatoria.
US20020032315A1 (en) 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
JP3957765B2 (ja) 1997-04-07 2007-08-15 ジェネンテク・インコーポレイテッド 抗ｖｅｇｆ抗体
ATE312935T1 (de) * 1997-06-03 2005-12-15 Regulatorische sequenzen für die in-vivo- expression einer heterologen dns-sequenz in endothelzellen und ihre verwendungen.
US5972338A (en) 1997-09-19 1999-10-26 Genentech, Inc. Tie ligands homologues
US6057435A (en) 1997-09-19 2000-05-02 Genentech, Inc. Tie ligand homologues
US6030831A (en) 1997-09-19 2000-02-29 Genetech, Inc. Tie ligand homologues
AU2299099A (en) 1998-02-04 1999-08-23 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Antibodies against human vegf receptor kdr
WO2000034337A1 (en) 1998-12-10 2000-06-15 Tsukuba Research Laboratory, Toagosei Co., Ltd. Humanized monoclonal antibodies against vascular endothelial cell growth factor
EP2016953A3 (en) 1998-12-22 2009-04-15 Genentech, Inc. Vascular endothelial cell growth factor antagonists and uses thereof
US6342221B1 (en) 1999-04-28 2002-01-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody conjugate compositions for selectively inhibiting VEGF
US6703020B1 (en) * 1999-04-28 2004-03-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody conjugate methods for selectively inhibiting VEGF
US7740841B1 (en) 2000-01-28 2010-06-22 Sunnybrook Health Science Center Therapeutic method for reducing angiogenesis
AU2002327310B2 (en) * 2001-07-17 2006-09-28 Research Development Foundation Therapeutic agents comprising pro-apoptotic proteins

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018024678A (ja) * 2011-12-13 2018-02-15 エンジーンアイシー モレキュラー デリバリー ピーティーワイ リミテッド 治療薬を脳腫瘍に送達するための細菌由来のインタクトなミニセル
US10994014B2 (en) 2011-12-13 2021-05-04 Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd Bacterially derived, intact minicells for delivery of therapeutic agents to brain tumors
US11964021B2 (en) 2011-12-13 2024-04-23 Engenelc Molecular Delivery Pty Ltd Bacterially derived, intact minicells for delivery of therapeutic agents to brain tumors

Also Published As

Publication number Publication date
ATE269357T1 (de) 2004-07-15
US6416758B1 (en) 2002-07-09
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CA2372053A1 (en) 2000-11-02
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US6342219B1 (en) 2002-01-29
ZA200108612B (en) 2002-06-07
KR100816572B1 (ko) 2008-03-24
EP1185559A2 (en) 2002-03-13
AU4804900A (en) 2000-11-10
CN101073668A (zh) 2007-11-21
DE60011612D1 (de) 2004-07-22
US7056509B2 (en) 2006-06-06
WO2000064946A2 (en) 2000-11-02
US6676941B2 (en) 2004-01-13
MXPA01010891A (es) 2002-11-07
JP4926320B2 (ja) 2012-05-09
BR0010017A (pt) 2002-06-11
EP1179541B1 (en) 2004-06-16
US6887468B1 (en) 2005-05-03
US20030175276A1 (en) 2003-09-18
NZ514918A (en) 2003-11-28
US20020119153A1 (en) 2002-08-29
IL145941A0 (en) 2002-07-25
ZA200108285B (en) 2002-08-28
US6524583B1 (en) 2003-02-25
CA2372053C (en) 2008-09-02
KR20020019905A (ko) 2002-03-13
CN1358197A (zh) 2002-07-10

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Thorpe Antibody conjugate compositions for selectively inhibiting VEGF

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