JP2022514362A - 抗ｖｅｇｆ抗体のｖｅｇｆ－ｒ１への結合阻害を改善する方法 - Google Patents

抗ｖｅｇｆ抗体のｖｅｇｆ－ｒ１への結合阻害を改善する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＶＥＧＦ－Ｒ１へのＶＥＧＦ結合の阻害が改善された抗ＶＥＧＦ抗体のバリアントを提供するために、抗ＶＥＧＦ抗体を調整する方法；および、前記方法によって提供される抗体に関する。ＶＥＧＦ－Ａ１２１と複合したＶＥＧＦ－００８９ Ｆａｂ断片の結晶構造が開示され、結合したエピトープを同定した。ＶＥＧＦ－００８９により結合されたエピトープは、ＶＥＧＦ－Ｒ１およびＶＥＧＦ－Ｒ２に結合するＶＥＧＦの領域と重複する。ＶＥＦＧ－Ｒ１への結合阻害は、ラニビズマブよりも弱かった。ＶＥＧＦ－００８９抗体は、ＶＥＧＦ二量体に２つの抗体分子が同時に結合することを容易にするように修飾された。ＶＥＧＦ－００８９抗体のＶＥＧＦ－０１１２およびＶＥＧＦ－Ｐ１ＡＤ８６７４バリアントが生成し、ＶＥＧＦ－０００８９抗体と比較して、ＶＥＧＦ－Ｒ１への結合阻害が増強された。【選択図】図６

Description

本発明は、ＶＥＧＦ－Ｒ１へのＶＥＧＦ結合の阻害が改善された抗ＶＥＧＦ抗体のバリアントを提供するために、抗ＶＥＧＦ抗体を調整する方法；および、当該方法によって提供される抗体に関する。
臨床応用が認められている抗ＶＥＧＦ抗体（例えばAvastin（登録商標）やLucentis（登録商標））は、ＶＥＧＦ－Ｒ１（ＦＬＴ－１、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ）およびＶＥＧＦ－Ｒ２（ＫＤＲ／ＦＬＫ－１、胎児肝キナーゼ）の双方の受容体に、ＶＥＧＦが結合するのを阻害する。ＶＥＧＦ－Ｒ１およびＶＥＧＦ－Ｒ２は、近縁の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である。
所望の特性（例えば、両受容体へのＶＥＧＦの結合阻害）を示すように抗ＶＥＧＦ抗体を調整する方法が求められている。
発明の概要
本発明は、ＶＨドメインとＶＬドメインとの同族対によって形成された抗原結合部位を含むＶＥＧＦに結合する抗体のＶＥＧＦ－Ｒ１へのＶＥＧＦ結合阻害を改善する方法であって、該抗体がＶＥＧＦ分子中のＶＥＧＦ－Ｒ１結合領域およびＶＥＧＦ－Ｒ２結合領域と重複するＶＥＧＦのエピトープに結合することを特徴とする方法に関する。本発明の方法は、
（ａ）ＶＥＧＦに結合する当該抗体の第１の抗原結合部位および第２の抗原結合部位によって結合されたＶＥＧＦ二量体の複合体（ＶＥＧＦ二量体－抗体複合体）の三次構造の分析を提供すること；
（ｂ）当該抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメインに位置する少なくとも１つのアミノ酸残基を同定すること、ここで第１抗原結合部位内の当該アミノ酸残基および第２抗原結合部位内の当該アミノ酸残基が、ＶＥＧＦ二量体－抗原複合体において空間的に近接して配置される；および
（ｃ）工程（ｂ）で同定された当該少なくとも１つのアミノ酸残基を、
ｉ）より小さい側鎖体積を有するアミノ酸で；および／または
ｉｉ）異なる電荷の側鎖を有するアミノで
置換すること
を含むものである。本発明の方法では、特定の抗ＶＥＧＦ抗体によって媒介されるＶＥＧＦ－Ｒ１へのＶＥＧＦ結合の阻害は、特に抗原結合に関与していない領域において、そのアミノ酸配列のわずかな修飾によって改善することができる。
一実施形態では、抗体は、ＶＥＧＦ－Ａ１２１の二量体上の構造的エピトープと同一または重複するエピトープに結合し、ここで、ＶＥＧＦ－Ａ１２１は、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、エピトープは、ＶＥＧＦ二量体内の個々のＶＥＧＦ－Ａ１２１分子のうちの一方において、アミノ酸Ｆ１７、Ｍ１８、Ｄ１９、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｒ２３、Ｙ２５、Ｈ２７、Ｐ２８、Ｉ２９、Ｅ３０、Ｍ５５、Ｎ６２、Ｌ６６、Ｎ１００、Ｋ１０１、Ｃ１０２、Ｅ１０３、Ｃ１０４、Ｒ１０５およびＰ１０６を含み、ＶＥＧＦ二量体内の個々のＶＥＧＦ－Ａ１２１分子のうちのもう一方において、アミノ酸Ｅ３０、Ｋ４８、Ｍ８１およびＱ８７を含む。一実施形態では、エピトープがＸ線結晶学により測定される。
一実施形態では、側鎖の体積が小さいアミノ酸は、工程（ｃ）で置換されるアミノ酸よりも、側鎖における炭素原子の数が少ない。
一実施形態では、側鎖の体積が小さいアミノ酸は、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、およびＬから選択される。
一実施形態では、正の電荷の側鎖を有するアミノ酸が、負の電荷の側鎖を有するアミノ酸で置換されるか、または電荷を持たない側鎖を有するアミノ酸で置換される。
一実施形態では、負の電荷の側鎖を有するアミノ酸が、正の電荷の側鎖を有するアミノ酸で置換されるか、または電荷を持たない側鎖を有するアミノ酸で置換される。
一実施形態では、電荷を持たない側鎖を有するアミノ酸が、正の電荷の側鎖を有するアミノ酸で置換されるか、または負の電荷の側鎖を有するアミノ酸で置換される。
一実施形態では、少なくとも1つの置換されたアミノ酸残基は、当該抗体の重鎖可変ドメインに位置する。
本発明の別の態様は、本発明の1つの方法によって提供されるＶＥＧＦに結合する抗体である。
本発明の別の態様は、本発明の方法によって提供される、ＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦがＶＥＧＦ－Ｒ１に結合するのを阻害する抗体である。
本発明のもう一つの態様は、配列番号１２を含むＶＨドメインと配列番号２を含むＶＬドメインとを有するＶＥＧＦに結合する抗体である。
本発明の別の態様は、配列番号１５を含むＶＨドメインと配列番号２を含むＶＬドメインを有するＶＥＧＦに結合する抗体である。
実施例１に記載の、抗体Ｆａｂ断片の存在下でのＶＥＧＦ－Ｒ１およびＶＥＧＦ－Ｒ２へのＶＥＧＦ結合の阻害（ＶＥＧＦ：ＶＥＧＦ－Ｒ２／Ｒ１阻害ＳＰＲ）。 実施例２に従ったＸ線結晶構造解析によって決定された、抗ＶＥＧＦ抗体（ＶＥＧＦ－００８９）と複合したＶＥＧＦ二量体（紫）の結晶構造。赤丸は、ＶＥＧＦ－００８９のＶＨドメインの中で近接している領域を強調している。 実施例２によるＸ線結晶学によって決定された、ＶＥＧＦ－Ａ１２１（配列番号２１）の二量体においてＶＥＧＦ－００８９ Ｆａｂ断片により結合されるエピトープアミノ酸。ＶＥＧＦ－００８９ Ｆａｂ断片と５Å以内の距離で接触しているＶＥＧＦ－Ａ１２１分子のそれぞれに含まれるアミノ酸の位置は、黒で強調されている。 実施例２で測定した、ＶＥＧＦ－Ｒ１ドメイン２と複合したヒトＶＥＧＦ－Ａ１２１二量体の結晶構造と、ＶＥＧＦ－００８９ Ｆａｂと複合したヒトＶＥＧＦ－Ａ１２１二量体の結晶構造とを重ね合わせたもの。 実施例２で測定した、ＶＥＧＦ－Ｒ２ドメイン２および３と複合したヒトＶＥＧＦ－Ａ１２１二量体と、ＶＥＧＦ－００８９ Ｆａｂと複合したヒトＶＥＧＦ－Ａ１２１二量体の結晶構造とを重ね合わせたもの。 実施例３に記載の抗ＶＥＧＦ抗体の存在下でのＶＥＧＦ－Ｒ１へのＶＥＧＦ結合の阻害（０．３４ｎＭ ＶＥＧＦ）。 実施例３に記載の抗ＶＥＧＦ抗体の存在下でのＶＥＧＦ－Ｒ１へのＶＥＧＦ結合の阻害（０．７ｎＭ ＶＥＧＦ）。 実施例３に記載の抗ＶＥＧＦ抗体の存在下でのＶＥＧＦ－Ｒ２へのＶＥＧＦ結合の阻害（０．３４ｎＭ ＶＥＧＦ）。 実施例３に記載の抗ＶＥＧＦ抗体の存在下でのＶＥＧＦ－Ｒ２へのＶＥＧＦ結合の阻害（０．７ｎＭ ＶＥＧＦ）。
発明の詳細な説明
１．定義
本明細書で特に定義されていない限り、本発明に関連して使用される科学技術用語は、当業者に共通して理解される意味を持つものとする。さらに、文脈上特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本開示の方法および技術は、一般に、当技術分野でよく知られている従来の方法に従って行われる。一般に、本明細書に記載されている生化学、酵素学、分子生物学、および細胞生物学、微生物学、遺伝学、およびタンパク質および核酸の化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法ならびに技術は、当技術分野でよく知られ、一般的に使用されているものである。
本明細書で特に定義されていない限り、「～から構成される（comprising of）」という用語には、「～から成る（consisting of）」という用語も含まれるものとする。
本明細書において「抗体」という用語は、最も広い意味で使用されており、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体）、および抗体断片を含む多様な抗体構造を包含するが、これらに限られない。
無傷の抗体をパパイン消化すると、重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ順にＶＨおよびＶＬ）に加えて、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）もそれぞれが含む、２つの同一の抗原結合断片（いわゆる「Ｆａｂ」断片）が得られる。よって「Ｆａｂ断片」とは、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖を有する抗体断片のことである。
「単離された」抗体とは、その自然環境の構成要素から分離されているものである。いくつかの実施形態では、抗体は、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点フォーカシング（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）の方法によって決定される９５％超または９９％超の純度に精製される。抗体の純度を評価する方法のレビューについては、例えばFlatmanら、J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照されたい。
「抗体断片」とは、無傷な抗体が結合する抗原に結合する無傷な抗体の一部を含む、無傷な抗体以外の分子である。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線形抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれるが、これらに限られない。
「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体と抗原との結合に関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインである。天然抗体の重鎖および軽鎖（それぞれ順にＶＨおよびＶＬ）の可変ドメインは、一般的に類似の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む（例えば、Kindtら、Kuby Immunology、第6版、W.H.Freeman and Co.、91ページ（2007年）参照）。
「パラトープ」または「抗原結合部位」とは、抗原を認識して抗原に結合する抗体の一部分を指し、本明細書では互換可能に使用される。抗原結合部位は、Ｆｖ領域の三次構造において空間的に近接して配置された、抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインからの複数の個別のアミノ酸残基によって形成される。一実施形態では、抗原結合部位は、コグネイトなＶＨ／ＶＬペアに含まれる６つのＣＤＲのセットとして定義される。
本明細書において使用する「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、配列が超可変で、抗原に接触する残基を含む、抗体の可変ドメインの各領域を指す。一般的に抗体は、６つのＣＤＲを含む：ＶＨドメインに３つ（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）、ＶＬドメインに３つ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）。特に断りのない限り、本明細書では、ＣＤＲ残基および可変ドメインの他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991）に従っている。
本明細書の目的において「受容体ヒトフレームワーク」とは、以下に定義するように、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。
本明細書で使用する「フレームワーク」または「ＦＲ」は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメインのアミノ酸残基を指す。可変ドメインのフレームワークは一般的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４という４つのフレームワークドメインから成る。したがって、ＣＤＲおよびＦＲのアミノ酸配列は一般に、以下の順序で現れる：（ａ）ＶＨドメインでは、ＦＲ１－ＣＤＲ-Ｈ１－ＦＲ２－ＣＤＲ-Ｈ２－ＦＲ３－ＣＤＲ-Ｈ３－ＦＲ４；（ｂ）ＶＬドメインでは、ＦＲ１－ＣＤＲ-Ｌ１－ＦＲ２－ＣＤＲ-Ｌ２－ＦＲ３－ＣＤＲ-Ｌ３－ＦＲ４。
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、成長因子のシスチン・ノット・ファミリーのホモ二量体メンバーである。本明細書で使用される「ＶＥＧＦ」という用語は、特に示さない限り、霊長類（例えばヒト）およびげっ歯類（例えばマウスおよびラット）などの哺乳類を含む、任意の脊椎動物源からの任意の天然ＶＥＧＦを指す。この用語は、「完全長」の未処理のＶＥＧＦだけでなく、細胞内での処理に起因する任意の形態のＶＥＧＦをも包含する。この用語はまた、ＶＥＧＦの自然発生的なバリアント、例えば、スプライスバリアントまたは対立遺伝子バリアントをも包含する。例示的なヒトＶＥＧＦのアミノ酸配列は、配列番号１８に示されている。本明細書で使用する「ＶＥＧＦ二量体」という用語は、２つの同一のＶＥＧＦ分子のホモ二量体を指す。ＶＥＧＦ二量体に結合している２つの同一の抗体分子によって形成される複合体は、本明細書では「ＶＥＧＦ二量体－抗体複合体」と呼ぶ。
ＶＥＧＦ二量体－抗体複合体に含まれる「第１の抗原結合部位および第２の抗原結合部位」とは、ＶＥＧＦ二量体－抗体複合体に含まれる２つの抗体のうち、いずれか１つの抗体のＶＨ／ＶＬペアに含まれる抗原結合部位のことを指す。例えば、ＶＥＧＦ二量体－抗体複合体における２つの抗ＶＥＧＦ抗体のうち、一方の抗ＶＥＧＦ抗体の抗原結合部位を「第１抗原結合部位」とすると、２つの抗ＶＥＧＦ抗体のうち、もう一方の抗ＶＥＧＦ抗体の抗原結合部位は、自動的に「第２抗原結合部位」となる。
ＶＥＧＦは、細胞表面のチロシンキナーゼ受容体（ＶＥＧＦ－受容体、又は「ＶＥＧＦＲ」）に結合することによって細胞応答を促して、ＶＥＧＦＲを二量体化し、部位や時間、程度は異なるものの、リン酸転移反応を介して活性になる。ＶＥＧＦ－Ｒ１およびＶＥＧＦ－Ｒ２は、近縁の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である。ＶＥＧＦ－Ａは、ＶＥＧＦＲ－１（Ｆｌｔ－１）と結合してＶＥＧＦ－Ｒ１のドメイン２と相互作用し、ＶＥＧＦＲ－２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ－１）と結合してＶＥＧＦ－Ｒ２のドメイン２および３と相互作用する（図４および５参照）。
本明細書で使用されるＶＥＧＦ分子またはＶＥＧＦ二量体の「ＶＥＧＦ－Ｒ１結合領域」および「ＶＥＧＦ－Ｒ２結合領域」とは、それぞれＶＥＧＦ－Ｒ１のドメイン２またはＶＥＧＦ－Ｒ２のドメイン２もしくは３と相互作用するＶＥＧＦ上のアミノ酸を指す。
「抗ＶＥＧＦ抗体」および「ＶＥＧＦに結合する抗体」という用語は、ＶＥＧＦを標的とした診断および／または治療薬として有用であるように、十分な親和性でＶＥＧＦと結合することができる抗体を指す。一実施形態では、無関係な非ＶＥＧＦタンパク質への抗ＶＥＧＦ抗体の結合の程度は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定されたＶＥＧＦへの抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、ＶＥＧＦに結合する抗体は、解離定数（ＫＤ）が１ｎＭ以下、または０．１５ｎＭ以下である。抗体が１μＭ以下のＫＤを有する場合、抗体はＶＥＧＦに「特異的に結合」すると言われる。
ＶＥＧＦへの抗ＶＥＧＦ抗体の結合は、ＶＥＧＦとその受容体であるＶＥＧＦ－Ｒ１もしくはＶＥＧＦ－Ｒ２、またはその両方との結合を阻害することができる。ＶＥＧＦ－Ｒ１またはＶＥＧＦ－Ｒ２へのＶＥＧＦの結合の阻害は、ＥＬＩＳＡやＳＰＲなど、当技術分野で知られている方法で評価することができる。
タンパク質の「三次構造」とは、そのタンパク質の三次元的な形状である。三次構造は、1本のポリペプチド鎖の「骨格」と、1つまたは複数のタンパク質の二次構造である「タンパク質ドメイン」を示す。アミノ酸の側鎖は、様々なやり方で相互作用および結合することがある。特定のタンパク質内の側鎖の相互作用および結合が、その三次構造を決定する。本明細書で用いる「ＶＥＧＦ二量体－抗体複合体の三次構造」とは、当該複合体の三次元形状を意味する。
ＶＥＧＦ二量体－抗体複合体の三次構造内に「近接」して位置するアミノ酸残基とは、当該複合体の三次元形状において、その距離が５Åまでとなるように空間的に配置された両方の抗ＶＥＧＦ抗体に由来するアミノ酸残基である。これには、それぞれの抗ＶＥＧＦ抗体の個々のドメイン、すなわちＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列において、互いに隣接するアミノ酸は含まれない。
「親和性」とは、ある分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合相手（例えば抗原）との間の非共有結合性相互作用の総和の強さを意味する。別段の記載がない限り、本明細書において「結合親和性」とは、結合ペア（例えば、抗体および抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのパートナーＹに対する親和性は、一般に解離定数（ＫＤ）で表すことができる。親和性は、当技術分野で知られている一般的な方法（本明細書に記載されているものを含む）により、測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な説明的、例示的な実施形態は、本明細書に記載されている。
「エピトープ」とは、抗ＶＥＧＦ抗体が結合するタンパク質性または非タンパク質性の抗原上の部位を意味する。エピトープは、連続したアミノ酸ストレッチ部位から形成される場合（線状エピトープ）、または非連続のアミノ酸を含む場合（構造的エピトープ）の両方があり、例えば、抗原の折り畳みに起因して（すなわち、タンパク質性抗原の三次折り畳みによって）空間的に近接して形成される。線状エピトープは、タンパク質性抗原が変性剤にさらされた後もなお、抗ＶＥＧＦ抗体と結合しているのが一般的であるが、一方、構造的エピトープは、変性剤で処理されると破壊されるのが一般的である。エピトープは、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、または８～１０個のアミノ酸を、独特な空間的構造的で含む。
特定のエピトープに結合する抗体（すなわち、同じエピトープに結合する抗体）のスクリーニングは、当技術分野で慣用的に行われている方法を用いて行うことができ、例えばアラニンスキャニング、ペプチドブロット（Meth.Mol.Biol. 248 (2004) 443-463参照）、ペプチド開裂分析、エピトープ切除、エピトープ抽出、抗原の化学修飾（Prot. Sci. 9 (2000) 487-496参照）、およびクロスブロッキング（「Antibodies」、Harlow and Lane（Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY）参照）があるが、これらに限られない。
抗原構造系抗体プロファイリング（Antigen Structure-based Antibody Profiling：ＡＳＡＰ）は、変性促進型プロファイリング（Modification-Assisted Profiling：ＭＡＰ)としても知られ、ＶＥＧＦに特異的に結合する多数のモノクローナル抗体を、化学的または酵素的に修飾された抗原表面に対する多数の抗体のそれぞれの結合プロファイルに基づいて区分けすることができる（例えばUS 2004/0101920参照）。区分けされた各抗体は同じエピトープに結合するが、このエピトープは、他の区分けで表されるエピトープとは明確に異なることがあるか、または部分的に重なっている独特なエピトープであり得る。
競合結合はまた、抗体がＶＥＧＦの同じエピトープに結合しているかどうか、または参照抗ＶＥＧＦ抗体と競合して結合しているかどうかを容易に決定するために、使用することができる。例えば、参照抗ＶＥＧＦ抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて参照抗ＶＥＧＦ抗体の抗原への結合を５０％以上阻害する抗体を指し、逆に参照抗体は、競合アッセイにおいて抗体の抗原への結合を５０％以上阻害する。また例えば、抗体が参照抗ＶＥＧＦ抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照抗体を飽和状態でＶＥＧＦに結合させることができる。過剰な参照抗ＶＥＧＦ抗体を除去した後、当該抗ＶＥＧＦ抗体のＶＥＧＦへの結合能力を評価する。参照抗ＶＥＧＦ抗体の飽和結合後に、抗ＶＥＧＦ抗体がＶＥＧＦに結合できる場合、この抗ＶＥＧＦ抗体は、参照抗ＶＥＧＦ抗体とは異なるエピトープに結合すると結論づけることができる。しかし、参照抗ＶＥＧＦ抗体の飽和結合後に、抗ＶＥＧＦ抗体がＶＥＧＦに結合できない場合、この抗ＶＥＧＦ抗体は、参照抗ＶＥＧＦ抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合している可能性がある。この抗体が同じエピトープに結合しているのか、または立体的な理由で結合が妨害されているだけなのかを確認するためには、慣用的な実験を用いることができる（例えばペプチド変異や、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、または当技術分野で利用可能なその他の定量的または定性的な抗体結合アッセイを用いた結合分析など）。このアッセイは、２つのセットアップ、すなわち、両方の抗体が飽和抗体である状態で実施されるべきである。両方のセットアップにおいて、第１の（飽和）抗体のみがＶＥＧＦに結合可能な場合、この抗ＶＥＧＦ抗体と参照抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦへの結合について競合していると結論づけることができる。
いくつかの実施形態では、２つの抗体は、競合結合アッセイで測定して、一方の抗体の１倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍の過剰量が、他方の抗体の結合を少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、またはさらに９９％以上阻害する場合、同じまたは重複するエピトープに結合するとみなされる（例えば、Junghansら、Cancer Res 50（1990）1495-1502を参照）。
いくつかの実施形態では、一方の抗体の結合を低下または排除する抗原のアミノ酸変異のうち、実質的にすべてのアミノ酸変異が他方の抗体の結合も低下または排除する場合、２つの抗体は同じエピトープに結合するとみなされる。２つの抗体は、一方の抗体の結合を減少または排除するアミノ酸変異のサブセットのみが、他方の抗体の結合を減少または排除する場合、「重複エピトープ」を有するとみなされる。
「単離された」核酸とは、自然環境の構成要素から切り離されている核酸分子のことである。単離された核酸には、通常は核酸分子を含む細胞に含まれる核酸分子が含まれるが、この核酸分子は染色体外に存在するか、または自然の染色体の位置とは異なる染色体の位置に存在する。
抗体を「コードする単離された核酸」とは、抗体の重鎖および軽鎖（またはその断片）をコードする１つまたは複数の核酸分子を指し、そのような核酸分子を単一のベクターまたは別個のベクターに含み、そのような核酸分子が宿主細胞の１つまたは複数の位置に存在する。
「ベクター」という用語は、本明細書では、連結している別の核酸を増殖可能な核酸分子を指す。この用語には、自己複製する核酸構造としてのベクターだけでなく、ベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターも含まれる。ある種のベクターは、それらが作動的に連結された核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターを本明細書では、「発現ベクター」と呼ぶ。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養」という用語は、互換可能に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫も含まれる。宿主細胞には、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、これらは、継代数によらず、一次形質転換細胞およびそれに由来する子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸の含有量が完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。本明細書では、最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体の子孫が、含まれる。
アミノ酸は、共通する側鎖特性によってグループ分けされる：
（１）疎水性の側鎖：ノルロイシン、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）；
電荷を持たない親水性側鎖（当技術分野では「中性」の親水性側鎖とも呼ばれる）：Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；
負に帯電した側鎖（当技術分野では「酸性」側鎖とも呼ばれる）：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；
正に帯電した側鎖（当技術分野では「塩基性」側鎖とも呼ばれる）：Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）；
芳香族側鎖：Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、および鎖の配向に影響を与える残基を含む側鎖：Ｇｌｙ（Ｇ），Ｐｒｏ（Ｐ）。
アミノ酸の修飾について言及する場合、「より小さい側鎖体積を有する」アミノ酸とは、修飾される位置にある元のアミノ酸よりも小さい側鎖体積を有するアミノ酸を指す。ある実施形態では、小さい側鎖体積を有するアミノ酸は、修飾されるべき位置にある元のアミノ酸よりも、側鎖中の炭素原子の数が少ない。
２．発明の実施形態の詳細な説明
本発明は、ＶＨドメインとＶＬドメインとの同族対によって形成された抗原結合部位を含むＶＥＧＦに結合する抗体のＶＥＧＦ－Ｒ１へのＶＥＧＦ結合の阻害を改善する方法であって、該抗体がＶＥＧＦ分子中のＶＥＧＦ－Ｒ１結合領域およびＶＥＧＦ－Ｒ２結合領域と重複するＶＥＧＦのエピトープに結合する方法に関する。本発明の方法は、
（ａ）ＶＥＧＦに結合する当該抗体の第１の抗原結合部位および第２の抗原結合部位によって結合されたＶＥＧＦ二量体の複合体（ＶＥＧＦ二量体－抗体複合体）の三次構造の分析を提供すること、
（ｂ）当該抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメインに位置する少なくとも１つのアミノ酸残基を同定すること、ここで第１抗原結合部位内の当該アミノ酸残基および第２抗原結合部位内の当該アミノ酸残基が、ＶＥＧＦ二量体－抗原複合体において空間的に近接して配置される；および
（ｃ）工程（ｂ）で同定された当該少なくとも１つのアミノ酸残基を、
ｉ）より小さい側鎖体積を有するアミノ酸で、および／または
ｉｉ）異なる電荷の側鎖を有するアミノ酸で
置換すること、
を含む。
本発明の方法は、ＶＥＧＦ分子内のＶＥＧＦ－Ｒ１結合領域およびＶＥＧＦ－Ｒ２結合領域と重複するＶＥＧＦのエピトープに結合する抗ＶＥＧＦ抗体を調整するためのものである。一実施形態では、当該エピトープは、ＶＥＧＦがＶＥＧＦ－Ｒ１に結合している場合に、ＶＥＧＦ－Ｒ１のドメイン２と相互作用するアミノ酸を含む。一実施形態では、当該エピトープは、ＶＥＧＦがＶＥＧＦ－Ｒ１に結合している場合に、ＶＥＧＦ－Ｒ２のドメイン２および３と相互作用するアミノ酸を含む。一実施形態では、当該抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号０１のＶＨおよび配列番号：０２のＶＬによって特徴付けられる抗体（本明細書に記載の抗体ＶＥＧＦ－００８９）が結合するエピトープと重複するエピトープに結合する。一実施形態では、当該抗ＶＥＧＦ抗体は、Ｘ線結晶学によって測定されるように、本明細書に記載の抗体ＶＥＧＦ－００８９と同じエピトープに結合する。一実施形態では、当該抗ＶＥＧＦ抗体は、実施例３に記載されているようにＸ線結晶学によって測定された、本明細書に記載されているような抗体ＶＥＧＦ－００８９と同じエピトープに結合する。一実施形態では、当該エピトープは、ＶＥＧＦ－Ａ１２１の二量体内の構造的エピトープであり、ここでＶＥＧＦ－Ａ１２１は、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、エピトープは、ＶＥＧＦ二量体内の個々のＶＥＧＦ－Ａ１２１分子の一方に、アミノ酸Ｆ１７、Ｍ１８、Ｄ１９、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｒ２３、Ｙ２５、Ｈ２７、Ｐ２８、Ｉ２９、Ｅ３０、Ｍ５５、Ｎ６２、Ｌ６６、Ｎ１００、Ｋ１０１、Ｃ１０２、Ｅ１０３、Ｃ１０４、Ｒ１０５およびＰ１０６を含み；ＶＥＧＦ二量体内の個々のＶＥＧＦ－Ａ１２１分子のもう一方に、アミノ酸Ｅ３０、Ｋ４８、Ｍ８１およびＱ８７を含む。番号付けは、配列番号２１に示されるＶＥＧＦ－Ａ１２１のアミノ酸配列におけるアミノ酸の位置に従っている（図６も参照）。
本発明の方法では、ＶＥＧＦ二量体－抗体複合体の三次構造の分析が提供される。三次構造は、当技術分野で既知の方法によって提供されてもよい。一実施形態では、三次構造が、Ｘ線結晶学によって提供される（例えば、本明細書の実施例３に記載されているように）。
本発明の方法では、当該抗体のＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインのアミノ酸残基のうち、ＶＥＧＦ二量体－抗体複合体内で近接しているアミノ酸残基が特定される。一実施形態では、「近接」とは、１０Å以下の距離を指す。一実施形態において「近接」とは、５Å以下の距離を指す。この少なくとも１つのアミノ酸残基は、修飾に適していると考えられる。
一実施形態では、工程（ｂ）で同定されたそのような少なくとも1つのアミノ酸残基は、当該抗体の重鎖可変ドメイン内に位置する。一実施形態では、工程（ｂ）で同定されたそのような少なくとも１つのアミノ酸残基は、当該抗体の重鎖ＣＤＲ内に位置する。一実施形態では、工程（ｂ）で同定された少なくとも１つのアミノ酸残基は、当該抗体のＨ－ＣＤＲ２内に位置する。一実施形態では、工程（ｂ）において同定された少なくとも１つのアミノ酸残基は、当該抗体の重鎖ＦＲ内に位置する。一実施形態では、工程（ｂ）で同定された少なくとも１つのアミノ酸残基は、当該抗体のＨ－ＦＲ３内に位置する。
本発明の方法では、そのようなアミノ酸残基は、改良すべき抗ＶＥＧＦ抗体に含まれるアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有するアミノ酸によって置換される。あるいは、そのようなアミノ酸残基は、異なる電荷の側鎖を有するアミノ酸によって置換される。特定の実施形態では、本発明の方法の工程（ｃ）において、１つより多いアミノ酸残基が置換される。この場合、そのような少なくとも２つのアミノ酸残基は互いに独立して、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸によって、または異なる電荷の側鎖を有するアミノ酸によって、置換されてもよい。
一実施形態では、より小さい側鎖体積を有する当該アミノ酸は、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、およびＬから選択される。
一実施形態では、アミノ酸が、異なる電荷の側鎖を有するアミノ酸で置換されている。一実施形態では、Ｒ、ＫおよびＨから選択されるアミノ酸が、ＤおよびＥから選択されるアミノ酸で置換されている。一実施形態では、Ｒ、ＫおよびＨから選択されるアミノ酸が、Ｃ、Ｓ、Ｔ、ＮおよびＱから選択されるアミノ酸で置換されている。一実施形態では、ＥおよびＤから選択されるアミノ酸が、Ｋ、ＲおよびＨから選択されるアミノ酸で置換されている。一実施形態では、ＥおよびＤから選択されるアミノ酸は、Ｃ、Ｓ、Ｔ、ＮおよびＱから選択されるアミノ酸によって置換されている。一実施形態では、Ｃ、Ｓ、Ｔ、ＮおよびＱから選択されるアミノ酸は、ＥおよびＤから選択されるアミノ酸によって置換されている。
一実施形態では、工程ａ）の当該抗ＶＥＧＦ抗体は、ヒトＶＥＧＦＡに結合する。一実施形態では、工程ａ）の当該抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号１８のヒトＶＥＧＦに結合する。
一態様では、本発明の方法によって改良された抗ＶＥＧＦ抗体は、
（ａ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；
（ｂ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；
（ｃ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；
（ｄ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；
（ｅ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および
（ｆ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含む。このセットのＣＤＲアミノ酸配列を含む１つの例示的な抗体は、本明細書で「ＶＥＧＦ－００８９」と呼ばれる抗体である。一実施形態では、当該抗体は、配列番号０１を含むＶＨと、配列番号０２を含むＶＬとを特徴とする。
この態様の一実施形態では、工程（ｂ）で同定された少なくとも１つのアミノ酸残基は、当該抗体のＨ－ＣＤＲ２内に位置する。一実施形態では、当該少なくとも１つのアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ位置５２ａである。一実施形態では、Ｋａｂａｔ位置５２ａからのアミノ酸残基は、Ｃ、Ｓ、Ｔ、ＮまたはＱでの置換によって修飾される。一実施形態では、工程（ｃ）は、Ｎ５２ａＳ置換を含む。
この態様の一実施形態では、工程（ｂ）で同定された少なくとも１つのアミノ酸残基は、当該抗体のＨ－ＦＲ３内に位置する。一実施形態では、当該少なくとも１つのアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ位置７２、７４、および７５から選択される。一実施形態では、Ｋａｂａｔ位置７２、７４、および７５の１つ、２つ、または３つのアミノ酸が修飾される。一実施形態では、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、ＮまたはＱとの置換によってＫａｂａｔ位置７２が修飾される。一実施形態では、Ｎとの置換によってＫａｂａｔ位置７２が修飾される。一実施形態では、Ａとの置換によってＫａｂａｔ位置７４が修飾される。一実施形態では、Ｄ、Ｅ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、ＮまたはＱとの置換によってＫａｂａｔ位置７５が修飾される。一実施形態では、ＤまたはＥとの置換によってＫａｂａｔ位置７５が修飾される。
本発明の一実施形態では、工程（ｃ）に続いて、本方法は、工程（ｃ）で導入された置換を含む抗ＶＥＧＦ抗体のＶＥＧＦ－Ｒ１に対するＶＥＧＦ結合と、当該置換を含まない抗ＶＥＧＦ抗体（すなわち、親抗ＶＥＧＦ抗体）のＶＥＧＦ－Ｒ１に対するＶＥＧＦ結合とを比較する工程（ｄ）を含む。
本発明はまた、本発明の方法によって提供される抗ＶＥＧＦ抗体に関する。本発明はさらに、本発明の方法によって提供される抗ＶＥＧＦ抗体であって、ＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦがＶＥＧＦ－Ｒ１に結合するのを阻害する抗ＶＥＧＦ抗体に関する。一実施形態では、本発明の方法によって提供される抗体は、単離された抗体である。
そのような抗ＶＥＧＦ抗体は、当技術分野で知られている組換え方法、例えば、ＵＳ ４，８１６，５６７に記載されているような方法、例えば、実施例１に記載されているようなＨＥＫ２９３細胞などの真核細胞における組換え発現を用いて製造することができる。これらの方法のために、抗体をコードする１つまたは複数の単離された核酸が提供される。
特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。一実施形態では、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、またはＦ（ａｂ’）２断片、特にＦａｂ断片である。
特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、完全長抗体である。
ある実施形態では、抗体はＩｇＧ１抗体である。
本発明は、さらに、本発明の方法によって提供される抗ＶＥＧＦ抗体をコードする核酸に関する。本発明は、さらに、本発明の核酸を含む宿主細胞に関する。
Figure 2022514362000002
Figure 2022514362000003
Figure 2022514362000004
以下の実施例は、本発明の理解を助けるために提供されるものであり、実際の範囲は添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の思想から逸脱することなく、定められた手順に変更を加えることができると理解される。
実施例１：
生成されたヒト抗ＶＥＧＦ抗体（抗体ＶＥＧＦ－００８９）の特性決定
本明細書で使用される抗体「ＶＥＧＦ－００８９」は、ＥＰ １７２１１０３２．２に概説されているように、Ｒｏｃｈｅが知的財産権を有するトランスジェニックウサギに由来する。ＶＥＧＦ－００８９は、配列番号０１のＶＨドメインと配列番号０２のＶＬドメインを含む。その後の分析のために、抗体ＶＥＧＦ－００８９は、ヒトのＶＨドメインおよびＶＬドメインと、ウサギ由来の軽鎖（ＣＬκ）および重鎖（ＣＨ１）の定常ドメインとを有するＦａｂ断片（本明細書では「ＶＥＧＦ－００８９ Ｆａｂ断片」または単に「ＶＥＧＦ－００８９ Ｆａｂ」と呼ぶ）として生成された。ＶＥＧＦ－００８９ Ｆａｂ断片の重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１０である。ＶＥＧＦ－００８９ Ｆａｂ断片の軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号１１である。
抗体の組換え発現のために、ＶＨまたはＶＬをコードするＰＣＲ産物をｃＤＮＡとして発現ベクターにクローニングし、ＨＥＫ－２９３細胞に一過性に形質転換した。
抗体ＶＥＧＦ－００８９ Ｆａｂｓ断片のＶＥＧＦ結合は、以下のように表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で評価した。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による抗体結合親和性の測定
抗Ｈｉｓ捕捉抗体（anti-His capturing antibody :GE Healthcare 28995056）を、標準的なアミンカップリング化学を用いてSeries S Sensor Chip C1（GE Healthcare 29104990）に固定化し、５００～１０００共鳴単位（ＲＵ）の表面密度を得た。ランニングバッファーおよび希釈バッファーとして、ＨＢＳ－Ｐ＋（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ７．４、０．０５％の界面活性剤Ｐ２０）を使用し、測定温度はそれぞれ２５℃と３７℃に設定した。ｈＶＥＧＦ－Ａ１２１を表面に捕捉した結果、捕捉レベルの範囲は５～３５ＲＵとなった。抗ＶＥＧＦ抗体の希釈シリーズ（０．３７～３０ｎＭ）を１２０秒間注入し、３０μｌ／ｍｉｎの流速で少なくとも６００秒間解離をモニターした。１０ｍＭのグリシン ｐＨ１．５を６０秒間注入して表面を再生した。バルク屈折率の差は、ブランク注入を差し引くことで補正し、ｈＶＥＧＦ－Ａ１２１を捕捉していない対照フローセルから得られた応答を差し引くことで補正した。速度定数はBiacore EvaluationソフトウェアのLangmuir 1:1結合モデルを用いて算出した。
その結果、ＶＥＧＦ－００８９ Ｆａｂ断片のＫＤは、１３４ｐＭ（温度２５℃）となった。
抗体をさらに特性評価するために、ＶＥＧＦ－００８９ Ｆａｂ断片の存在下で、ＶＥＧＦがその受容体であるＶＥＧＦ－Ｒ１およびＶＥＧＦ－Ｒ２に結合するのを阻害することを、以下のように評価した。
抗体Ｆａｂ断片の存在下でのＶＥＧＦ－Ｒ１およびＶＥＧＦ－Ｒ２へのＶＥＧＦ結合の阻害（ＶＥＧＦ：ＶＥＧＦ－Ｒ２／Ｒ１阻害ＥＬＩＳＡ）
３８４ウェルのストレプトアビジンプレート（Nunc/Microcoat # 11974998001）に、０．２５μｇ／ｍｌのビオチン化ＶＥＧＦ－Ｒ１または０．５μｇ／ｍｌのビオチン化ＶＥＧＦ－Ｒ２（自社製造、ＤＰＢＳ（１×）中、各２５μｌ／ウェル（ＰＡＮ，#P04-36500））をコーティングした。プレートを室温で１時間インキュベートした。並行して、０．７ｎＭの濃度のＶＥＧＦ－１２１－Ｈｉｓ（自社製造）を異なる希釈率の抗体とインキュベートした（１２×１：２希釈ステップ、５００ｎＭの濃度から開始）。このプレインキュベーションステップは、３８４ウェルのＰＰプレート（Weidmann medical technology, # 23490-101）を用い、１×ＯＳＥＰバッファ（ビデストウォーター、１０×、Ｒｏｃｈｅ， # 11 666 789 001＋０．５％のウシ結成アルブミンフラクションV、脂肪酸不含、Roche, # 10 735 086 001 + 0,05% Tween 20）中で行った。プレートを室温で１時間インキュベートした。ＶＥＧＦ－Ｒ１／ＶＥＧＦ－Ｒ２をコートしたストレプトアビジンプレートを９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファー（ビデストウォーター、１０×ＰＢＳ Ｒｏｃｈｅ#11666789001 + 0.1% Tween 20）で３回洗浄した後、ＶＥＧＦ－抗体プレインキュベーションプレートから２５μｌのサンプルを、コートしたストレプトアビジンプレートに移し、その後、室温で１時間インキュベートした。９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴバッファーで３回洗浄した後、１ｘＯＳＥＰに２５μｌ／ウェルの検出抗体（抗Ｈｉｓ ＰＯＤ， Bethyl, # A190-114P, 1:12000）を加えた。室温で１時間インキュベートした後、プレートを９０μｌのＰＢＳＴバッファーで３回洗浄した。２５μｌのＴＭＢ（Ｒｏｃｈｅ， #11 835 033 001）をすべてのウェルに同時に加えた。室温で１０分間インキュベートした後、Tecan Safire 2 Readerで３７０ｎｍ／４９２ｎｍの波長でシグナルを検出した。
対照として、また、臨床で使用されている先行技術の抗ＶＥＧＦ抗体の代表として、Lucentis（登録商標）（ラニビズマブ、配列番号１９の重鎖アミノ酸配列、配列番号２０の軽鎖アミノ酸配列）を同じ条件で評価した。その結果を図１に示す。
この結果から、ＶＥＧＦ－００８９ Ｆａｂ断片はＶＥＧＦ－Ｒ２へのＶＥＧＦ結合を完全にブロックすることができることがわかった。ＶＥＧＦ－００８９ Ｆａｂ断片は、ＶＥＧＦ－Ｒ１へのＶＥＧＦ結合を完全にブロックしなかった。図２に示すように、先行技術の抗体Lucentis（登録商標）は、ＶＥＧＦ－Ｒ２とＶＥＧＦ－Ｒ１の両方の受容体へのＶＥＧＦの結合を完全に阻害することができる。
実施例２
抗体ＶＥＧＦ－００８９とＶＥＧＦ二量体との複合体のＸ線結晶構造解析およびエピトープ決定
上述のＶＥＧＦ－００８９ Ｆａｂ断片の結晶構造を、当技術分野で知られている標準的な方法に従って解析した。
ＶＥＧＦ－００８９ Ｆａｂ断片とＶＥＧＦ－Ａ１２１の複合体のＸ線結晶構造解析を以下のように行った。
ＶＥＧＦ－Ａ１２１－ＶＥＧＦ－００８９ Ｆａｂの二量体複合体の形成と精製。複合体形成のために、ＶＥＧＦ－００８９ Ｆａｂ断片とヒトＶＥＧＦ－Ａ１２１（Peprotech）を１．１：１のモル比で混合した。４℃で一晩１６時間インキュベートした後、２０ｍＭ ＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（１６／６００）カラムを用いたゲル透過クロマトグラフィーで複合体を精製した。二量体の複合体を含む画分をプールし、１．４４ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。
ＶＥＧＦ－Ａ１２１－ＶＥＧＦ－００８９ Ｆａｂ複合体の二量体の結晶化を行った。最初の結晶化試験は、２１℃のシッティングドロップ型蒸気拡散装置を用いて、タンパク質濃度１１．５ｍｇ／ｍｌで行った。０．１ＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．５、０．２ＭのＬｉＳＯ４、１．２６Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４を用いて１日で結晶が現れた。プレート状の結晶は１週間で成長し、最終的なサイズは１５０×１００×３０μｍになった。この結晶は、さらなる最適化の手順を踏むことなく、スクリーニングプレートから直接採取した。
データ収集と構造決定。データ収集のために、結晶は凍結保護剤として１５％のエチレングリコールを加えた沈殿剤溶液中で１００Ｋで瞬間冷却された。回折データは、Swiss Light Source（スイス・ビリゲン）のビームラインX10SAにおいて、PILATUS 6M検出器を用いて波長１．００００Åで収集した。データはＸＤＳ（Kabsch, W. Acta Cryst. D66, 133-144 (2010))で処理されており、SADABS (BRUKER)でスケーリングした。結晶は空間群Ｃ２に属し、セル軸はａ＝２２７．６１Å、ｂ＝６６．９７Å、ｃ＝２１８．３１Å、β＝１０４．５４°で、２．１７Åの分解能で回折している。この構造は、ＰＨＡＳＥＲを用いた分子置換によって決定された（McCoy, A.J, Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Storoni, L.C., and Read, R.J. J. Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007))では、検索モデルとして、関連するインハウス構造のＦａｂ断片とＶＥＧＦの座標を用いる。ＣＣＰ４スイートのプログラム（Collaborative Computational Project, Number 4 Acta Cryst. D50, 760-763 (1994))とBuster (Bricogne, G., Blanc, E., Brandl, M., Flensburg, C., Keller, P., Paciorek, W., Roversi, P., Sharff, A., Smart, O.S., Vonrhein, C., Womack, T.O . (2011). Buster version 2.9.5 Cambridge, United Kingdom : Global Phasing Ltd）を使用して、その後のデータの精査を行った。差動電子密度を用いたタンパク質の手動による再構築はＣＯＯＴを用いて行った（Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W.G. and Cowtan, K. Acta Cryst D66, 486-501 (2010)）。両構造体のデータ収集と精密化の統計を表Ｂにまとめた。グラフィック表示はすべて、ＰＹＭＯＬ（DeLano Scientific, Palo Alto, CA, 2002）で作成した。
Figure 2022514362000005
図２に、２つのＶＥＧＦ－００８９ Ｆａｂ断片とヒトＶＥＧＦ－Ａ１２１二量体との複合体の結晶構造を模式的に示す。抗体ＶＥＧＦ－００８９ Ｆａｂｖと５Å以内の距離で接触しているＶＥＧＦ－Ａ１２１二量体のアミノ酸残基が、ＶＥＧＦ－Ａ１２１二量体上のＶＥＧＦ－００８９ Ｆａｂが結合する構造的エピトープを形成している。ＶＥＧＦ－Ａ１２１のアミノ酸配列は、配列番号２１である。ＶＥＧＦ二量体の両方のＶＥＧＦ－Ａ１２１分子上のエピトープを構成するアミノ酸を図３に示した。
抗体ＶＥＧＦ－００８９ Ｆａｂは、ＶＥＧＦ－Ａ１２１二量体の以下のエピトープに結合する：
・ＶＥＧＦ二量体内の個々のＶＥＧＦ－Ａ１２１分子の１つでは、アミノ酸Ｆ１７、Ｍ１８、Ｄ１９、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｒ２３、Ｙ２５、Ｈ２７、Ｐ２８、Ｉ２９、Ｅ３０、Ｍ５５、Ｎ６２、Ｌ６６、Ｎ１００、Ｋ１０１、Ｃ１０２、Ｅ１０３、Ｃ１０４、Ｒ１０５およびＰ１０６；ならびに
・ＶＥＧＦ二量体内の個々のＶＥＧＦ－Ａ１２１分子のうちのもう１つでは、アミノ酸Ｅ３０、Ｋ４８、Ｍ８１およびＱ８７。
ＶＥＧＦ－Ｒ１のドメイン２と複合したヒトＶＥＧＦ二量体と、ＶＥＧＦ－００８９ Ｆａｂ断片との複合体の結晶構造とを重ねたものが、図４に描かれている。この重ね合わせは、本発明のＶＥＧＦ－００８９抗体の軽鎖が、ＶＥＧＦ－Ｒ１のドメイン２と重なり合っていることを示している。ＶＥＧＦ－Ｒ２ドメイン２および３との複合体、およびＶＥＧＦ－００８９ Ｆａｂ断片との複合体におけるヒトＶＥＧＦ二量体の結晶構造とを重ねたものが、図５に描かれている。この重ね合わせは、本発明のＶＥＧＦ－００８９抗体の軽鎖が、ＶＥＧＦ－Ｒ２のドメイン２と重なり合っていることを示している。
従ってＸ線データは、ＶＥＧＦ－００８９抗体が結合するエピトープが、ＶＥＧＦ－Ｒ１およびＶＥＧＦ－Ｒ２と結合するＶＥＧＦの領域と重複することを示している。
図２に示したＶＥＧＦ二量体と抗体との複合体の三次構造から、抗体のＶＨドメイン内の２つの領域、すなわちＨ－ＣＤＲ２とＨ－ＦＲ３が空間的に近接していることがわかる。
これは、１つのＦａｂ断片がすでに結合している場合に、２つ目の抗体がＶＥＧＦ二量体に結合することを立体的に妨げているのかもしれない。この理論に縛られることなく、抗体がＶＥＧＦ－Ｒ１へのＶＥＧＦ結合を（完全には）ブロックできないという観察結果は、この立体障害の疑いに起因しているのかもしれない。ＶＥＧＦ－Ｒ１はＶＥＧＦと強い親和性で結合することが知られているので、２つではなく１つのＦａｂ断片しか結合していないＶＥＧＦ二量体は、まだＶＥＧＦ－Ｒ１に結合できると予想される。なお、ＶＥＧＦ－Ｒ２はＶＥＧＦと弱い親和性で結合することが知られており、ＶＥＧＦ－Ｒ２へのＶＥＧＦの結合がＶＥＧＦ－００８９によって阻害されるという観察結果を支持している。
実施例３
ＶＥＧＦ－００８９のバリアントの提供
上述の理論に基づき、ＶＥＧＦ－００８９抗体を、ＶＥＧＦ二量体に２つの抗体分子が同時に結合しやすくなるように改良した。
この理論に基づいて、抗体ＶＥＧＦ－００８９の以下のような抗体バリアントが生成された。
Figure 2022514362000006
抗体のＦａｂ断片は、実施例１に記載されているようにクローニングし、発現させた。重鎖と軽鎖のアミノ酸配列を表２に示す。
Figure 2022514362000007
改良された抗体Ｆａｂ断片の存在下でのＶＥＧＦ－Ｒ１およびＶＥＧＦ－Ｒ２へのＶＥＧＦの結合を、実施例１に記載したように試験した。表２に記載のすべての抗体Ｆａｂ断片を試験した。結果を図６および７に示す。
実施例４：
ＶＥＧＦ－００８９の改良バリアントのＶＥＧＦ結合親和性
抗体の親和性は、実施例１に記載したのと同じ方法でＳＰＲにより測定した。示された抗体の結果を表３に示す。
Figure 2022514362000008

Claims (16)

  1. ＶＨドメインおよびＶＬドメインの同族対によって形成された抗原結合部位を含むＶＥＧＦに結合する抗体の、ＶＥＧＦ－Ｒ１へのＶＥＧＦ結合阻害を改善する方法であって、ここで抗体は、ＶＥＧＦ分子中のＶＥＧＦ－Ｒ１結合領域およびＶＥＧＦ－Ｒ２結合領域と重複するＶＥＧＦのエピトープに結合するものであり、以下の工程：
    ａ）ＶＥＧＦに結合する前記抗体の第１の抗原結合部位および第２の抗原結合部位によって結合されたＶＥＧＦ二量体の複合体（ＶＥＧＦ二量体－抗体複合体）の三次構造の分析を提供する工程；
    ｂ）前記抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメインに位置する少なくとも１つのアミノ酸残基を同定する工程であって、第１抗原結合部位内の前記アミノ酸残基および第２抗原結合部位内の前記アミノ酸残基が、ＶＥＧＦ二量体－抗原複合体において空間的に近接して配置される工程；および
    ｃ）工程ｂ）で同定された前記少なくとも１つのアミノ酸残基を、
    ｉ）より小さい側鎖体積を有するアミノ酸で；および／または
    ｉｉ）異なる電荷の側鎖を有するアミノ酸で；
    置換する工程、
    を含む、方法。
  2. 抗体が、配列番号０１のＶＨおよび配列番号０２のＶＬにより特徴付けられる抗体と同一または重複するエピトープに結合する、請求項１に記載の方法。
  3. 抗体が、ＶＥＧＦ－Ａ１２１の二量体上の構造的エピトープと同一または重複するエピトープに結合し、ＶＥＧＦ－Ａ１２１が、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、エピトープが、
    ・ＶＥＧＦ二量体内の個々のＶＥＧＦ－Ａ１２１分子の一方において、アミノ酸Ｆ１７、Ｍ１８、Ｄ１９、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｒ２３、Ｙ２５、Ｈ２７、Ｐ２８、Ｉ２９、Ｅ３０、Ｍ５５、Ｎ６２、Ｌ６６、Ｎ１００、Ｋ１０１、Ｃ１０２、Ｅ１０３、Ｃ１０４、Ｒ１０５およびＰ１０６；ならびに
    ・ＶＥＧＦ二量体内の個々のＶＥＧＦ－Ａ１２１分子のうちのもう一方において、アミノ酸Ｅ３０、Ｋ４８、Ｍ８１およびＱ８７、
    を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. より小さい側鎖体積を有するアミノ酸が、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｖ、ＩおよびＬから選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 正の電荷の側鎖を有するアミノ酸が、負の電荷の側鎖を有するアミノ酸で置換されるか、または電荷を持たない側鎖を有するアミノ酸で置換される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 負の電荷の側鎖を有するアミノ酸が、正の電荷の側鎖を有するアミノ酸で置換されるか、または電荷を持たない側鎖を有するアミノ酸で置換される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 少なくとも１つの置換されたアミノ酸残基が、前記抗体の重鎖可変ドメインに位置する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 少なくとも１つの置換されたアミノ酸残基が、前記抗体の重鎖ＣＤＲ内に位置する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 少なくとも１つの置換されたアミノ酸残基が、前記抗体のＨ－ＣＤＲ２内に位置する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 少なくとも１つの置き換えられたアミノ酸残基が、前記抗体の重鎖ＦＲ内に位置する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 少なくとも１つの置き換えられたアミノ酸残基が、前記抗体のＨ－ＦＲ３内に位置する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 抗体が、
    （ａ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；
    （ｂ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；
    （ｃ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；
    （ｄ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；
    （ｅ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および
    （ｆ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
    を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 抗体が、配列番号０１を含むＶＨおよび配列番号０２を含むＶＬを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法により提供される抗体。
  15. 配列番号１２を含むＶＨドメインと、配列番号２を含むＶＬドメインとを有するＶＥＧＦに結合する抗体。
  16. 配列番号１５を含むＶＨドメインと、配列番号２を含むＶＬドメインとを有するＶＥＧＦに結合する抗体。
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