CN115335406A - 抗体或抗原-结合片段的结晶 - Google Patents

抗体或抗原-结合片段的结晶 Download PDF

Info

Publication number
CN115335406A
CN115335406A CN202180028017.6A CN202180028017A CN115335406A CN 115335406 A CN115335406 A CN 115335406A CN 202180028017 A CN202180028017 A CN 202180028017A CN 115335406 A CN115335406 A CN 115335406A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ser
human
antigen
fab
variant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180028017.6A
Other languages
English (en)
Inventor
S·K·艾特威尔
R·L·刘
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eli Lilly and Co
Original Assignee
Eli Lilly and Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eli Lilly and Co filed Critical Eli Lilly and Co
Publication of CN115335406A publication Critical patent/CN115335406A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本文提供了用于改进抗体、抗原‑结合片段(例如Fab或Fab')或融合蛋白和Fab/Fab'/mAb:抗原复合物的结晶的方法和组合物。

Description

抗体或抗原-结合片段的结晶
发明领域
本公开涉及用于改进单克隆抗体(mAb)或抗原-结合片段(例如Fab或Fab')或融合蛋白和Fab/Fab'/mAb:抗原复合物的结晶的方法和组合物。
背景
抗体治疗剂是最重要的药物类别之一。到2019年底，90种治疗免疫疾病、感染疾病、心血管疾病、癌症等的单克隆抗体药物已在美国和欧洲获批，在2018年销售额为1150亿美元(Kaplon等人, Mabs, 2020. 12(1):1703531；Lu, 等人 J Biomed Sci. 2020; 27:1)。尽管曾经开发啮齿动物抗体供人类使用，这随后是长时段的人源化抗体，在过去的二十年里，其已经转变至完全人类发现平台，如噬菌体和酵母展示(Parmley和Smith, Gene,1988. 73(2):305-18; Boder和Wittrup, Nat. Biotechnol., 1997. 15(6):553-7)或通过用人类种系库免疫啮齿动物来实现(Lonberg, Handb. Exp. Pharmacol., 2008.(181):69-97)。在这些平台中，工程改造对于人源化不是必需的，但被继续用于解决其他问题：亲和力、交叉反应性、翻译后修饰、疏水性、静电、粘度和免疫原性。此外，抗体的表征继续变得更复杂，特别是随着开发新的抗体衍生形式，如抗体药物缀合物和双特异性抗体(Carter和Lazar, Nat. Rev. Drug Disc., 2018. 17(3)197-223)。
抗体结构的建模已成为预测潜在治疗剂行为的组成部分，特别是对于诸如疏水性、稳定性、电荷/偶极矩和脱酰胺倾向等特性(Xu Y等人, Mabs, 2019. 11(2)239-264)。这种建模通常基于公开可用的晶体结构。由于对CDR结构、尤其是重链CDR3建模的困难，对高度相似(或相同)Fab晶体结构的晶体结构进行建模应该提高预测抗体特性的准确性。可用的高分辨率Fab结构将为计算提供最佳基础。
Fab:抗原复合物的结构具有甚至更大的价值。它们可以为上述提供Fab的晶体结构以及表位:互补位信息。获得Fab:抗原复合物结构是将抗原和Fab的相对3-维位置直接确定至单个原子精度的唯一方法。可以看到，而不是推断表位。可以检查氨基酸侧链，并且关于它们在亲和力和交叉反应性中的作用形成假设，并进行计算以预测和工程改造亲和力(向上或向下)和交叉反应性。此外，Fab:抗原复合物的结构可以在考虑其他突变时作为参考，并且可以是确定不同测定形式的有效性中的重要交叉检查。
然而，晶体结构测定有挑战性且成本高昂(Slabinski等人, Protein Sci, 2007.16(11):2472-82)。最困难的步骤往往是从纯化的蛋白产生有序的晶体。存在许多因素可能阻碍蛋白的结晶性：纯度、稳定性、无序(结构域间、环间或末端间)、表面电荷和疏水性等。(McPherson, Crystallization of biological macromolecules, 1999. Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。获得良好的衍射晶体可耗费几天或几年，或者可能在巨大努力后简单地放弃。
尽管相对于许多其他蛋白类别、特别是膜蛋白，Fab的结晶和结构测定是容易的，但结晶方法的广泛筛选和优化仍然是必要的。像其他蛋白一样，一些Fab需要显著的晶体优化，并且存在完全顽固的Fab的实例。Fab:抗原复合物经常比单独的抗原更容易结晶(因此使用Fab作为“结晶伴侣”)(Griffin等人, Clin. Exp. Immunol., 2011. 165(3):285-91)，但仍然会很困难，并且需要进行广泛的筛选和优化。结晶和结构精修中所需的数天到数月的个别关注使得这两个步骤在从序列到最终结构的过程中成本最高。困难情况对整体平均值是尤其且负面影响的。Fab结晶所需的努力可能解释为何已经用于工程改造或计算的结构如此之少。
Edmundson和Borrebaeck检查了人类Fab的轻链恒定结构域(CL)和重链第一恒定结构域(CH1)之间的晶体堆积相互作用和β-折叠形成，并观察了“堆积三联体”(倾向于形成β-折叠的三个交替残基)的重要性。(Edmundson和Borrebaeck, Immunotechnology, 1998.3(4):309-17)。
需要改进包含κ链的人CL结构域的Fab (例如人Fab)和/或人Fab:抗原复合物的结晶。
详述
本文提供了显著改进人抗体、抗原-结合片段(例如人Fab或Fab')或包含人抗体轻链κ恒定结构域(Cκ)的融合蛋白和Fab/Fab'/mAb:抗原复合物的结晶的方法和组合物。本文所述的方法和组合物可普遍应用于大多数人Fab、一些人mAb和包含人Fab或mAb的融合蛋白，其包含人Cκ，并显著改善它们的结晶，包括使它们更可能更快地结晶，至更高的分辨率，以在更低的浓度和/或由异质混合物结晶。
在一个方面，本文提供了包含变体Cκ的抗体、抗原-结合片段(例如，人Fab或Fab')或融合蛋白，其中所述变体Cκ包含人Cκ的位置199至203 (根据Kabat编号法编号的位置，其对应于SEQ ID NO:1的位置92至96)处的氨基酸QGTTS，且人Cκ的位置198和204 (根据Kabat编号法编号的位置，其对应于SEQ ID NO:1的位置91和97)处的氨基酸在所述变体Cκ中缺失。在一些实施方案中，所述变体Cκ进一步包含人Cκ的位置126 (根据Kabat编号法，其对应于SEQ ID NO:1的位置19)处的丙氨酸。在一些实施方案中，所述变体Cκ进一步包含人Cκ的位置214 (根据Kabat编号法，其对应于SEQ ID NO:1的位置107)处的脯氨酸。
除非另有指明，否则本文所述的抗体或抗原-结合片段中的氨基酸残基的编号遵循Kabat编号系统(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Bethesda, MD: U.S. Dept. of Health and Human Services, Public HealthService, National Institutes of Health, 1991)。
在一些实施方案中，本文提供了包含变体Cκ结构域的抗体、抗原-结合片段(例如，人Fab或Fab')或融合蛋白，所述变体Cκ结构域包含SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，本文提供了包含变体Cκ结构域的抗体、抗原-结合片段(例如，人Fab或Fab')或融合蛋白，所述变体Cκ结构域包含SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，本文提供了包含变体Cκ结构域的抗体、抗原-结合片段(例如，人Fab或Fab')或融合蛋白，所述变体Cκ结构域包含SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，本文提供了包含变体Cκ结构域的抗体、抗原-结合片段(例如，人Fab或Fab')或融合蛋白，所述变体Cκ结构域包含SEQ ID NO:6。
在一些实施方案中，所述抗体、抗原-结合片段(例如，人Fab或Fab')或融合蛋白进一步包含人轻链可变结构域(VL)和人重链可变结构域(VH)。在一些实施方案中，所述抗体、抗原-结合片段(例如，人Fab或Fab')或融合蛋白进一步包含人IgG CH1结构域，例如人IgG1或IgG4 CH1结构域。在一些实施方案中，所述抗体、抗原-结合片段(例如，人Fab或Fab')或融合蛋白进一步包含人IgG铰链区(例如，人IgGl或IgG4铰链区)的一部分。
在另一个方面，本文提供了包含变体Cκ的抗体、抗原-结合片段(例如，人Fab或Fab')或融合蛋白的文库，其中所述变体Cκ包含人Cκ的位置199至203处的氨基酸QGTTS，且人Cκ的位置198和204处的氨基酸在变体Cκ中缺失(所有位置都根据Kabat编号法进行编号)。
在另一个方面，本文提供了生成本文所述的包含变体Cκ的抗体、抗原-结合片段(例如，人Fab或Fab')或融合蛋白的晶体结构的方法。此类方法可以包括使包含变体Cκ的抗体、抗原-结合片段或融合蛋白结晶，其中所述变体Cκ包含人Cκ的位置199至203处的氨基酸QGTTS，且人Cκ的位置198和204处的氨基酸在变体Cκ中缺失(所有位置都根据Kabat编号法进行编号)。在一些实施方案中，所述方法进一步包括构建本文所述的包含变体Cκ的抗体、抗原-结合片段(例如，人Fab或Fab')或融合蛋白的文库。例如，所述变体Cκ可以包含人Cκ的位置199至203处的氨基酸QGTTS，且人Cκ的位置198和204处的氨基酸在变体Cκ中缺失(所有位置都根据Kabat编号法进行编号)。在一些实施方案中，所述变体Cκ包含SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，所述变体Cκ包含SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，所述变体Cκ包含SEQID NO:5。在一些实施方案中，所述变体Cκ包含SEQ ID NO:6。
本文还提供了生成包含人Cκ结构域的抗体、抗原-结合片段(例如，人Fab或Fab')或融合蛋白的晶体结构的方法。此类方法可以包括：生成包含变体Cκ的抗体、抗原-结合片段(例如，人Fab或Fab')或融合蛋白，其中所述变体Cκ包含人Cκ的位置199至203处的氨基酸QGTTS，且人Cκ的位置198和204处的氨基酸在变体Cκ中缺失(所有位置都根据Kabat编号法进行编号)；和使包含变体Cκ的抗体、抗原-结合片段(例如，人Fab或Fab')或融合蛋白结晶。在一些实施方案中，所述变体Cκ进一步包含人Cκ的位置126(根据Kabat编号法)处的丙氨酸。在一些实施方案中，所述变体Cκ进一步包含人Cκ的位置214(根据Kabat编号法)处的脯氨酸。在一些实施方案中，所述变体Cκ包含SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，所述变体Cκ包含SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，所述变体Cκ包含SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，所述变体Cκ包含SEQ ID NO:6。
在另一个方面，本文提供了生成抗原和结合所述抗原的抗体、抗原-结合片段或融合蛋白(例如，人Fab或Fab')的复合物的晶体结构的方法，其中所述抗体、抗原-结合片段(例如，人Fab或Fab')或融合蛋白包含人Cκ，所述方法包括：生成包含变体Cκ的抗体、抗原-结合片段(例如，人Fab或Fab')或融合蛋白，其中所述变体Cκ包含人Cκ的位置199至203处的氨基酸QGTTS，且人Cκ的位置198和204处的氨基酸在变体Cκ中缺失(所有位置都根据Kabat编号法进行编号)；和使抗原和包含变体Cκ的抗体、抗原-结合片段(例如，人Fab或Fab')或融合蛋白共结晶。在一些实施方案中，所述变体Cκ进一步包含人Cκ的位置126(根据Kabat编号法)处的丙氨酸。在一些实施方案中，所述变体Cκ进一步包含人Cκ的位置214(根据Kabat编号法)处的脯氨酸。在一些实施方案中，所述变体Cκ包含SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，所述变体Cκ包含SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，所述变体Cκ包含SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，所述变体Cκ包含SEQ ID NO:6。
如本文所用，在本公开的上下文中(特别是权利要求的上下文中)使用的术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”、“该/所述(the)”和类似术语应被解释为涵盖单数和复数两者，除非本文另有指明或与上下文明显矛盾。
如本文所用的术语“抗体”是指结合抗原的免疫球蛋白分子。抗体的实施方案包括单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。所述抗体可以是任何类别(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA)和任何亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。
示例性抗体是由经由链间二硫键交联的以下四条多肽链构成的免疫球蛋白G(IgG)型抗体：两条重链(HC)和两条轻链(LC)。四条多肽链各自的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100-125个或更多氨基酸的可变区。四条多肽链各自的羧基末端部分都含有恒定区，所述恒定区主要负责效应子功能。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区构成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区构成。IgG同种型可进一步分为亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。
VH和VL区域可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其散布于更保守的区域，称为框架区(FR)。CDR暴露在蛋白的表面上，并且是抗体对于抗原结合特异性重要的区域。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR构成，从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本文中，重链的三个CDR被称为“HCDR1、HCDR2和HCDR3”，且轻链的三个CDR被称为“LCDR1、LCDR2和LCDR3”。所述CDR含有与抗原形成特异性相互作用的大部分残基。可以根据众所周知的方案，包括Kabat (Kabat等人, “Sequencesof Proteins of Immunological Interest,” National Institutes of Health,Bethesda, Md. (1991))、Chothia (Chothia等人, “Canonical structures for thehypervariable regions of immunoglobulins”, Journal of Molecular Biology, 196,901-917 (1987); Al-Lazikani等人, “Standard conformations for the canonicalstructures of immunoglobulins”, Journal of Molecular Biology, 273, 927-948(1997))、North (North等人, “A New Clustering of Antibody CDR LoopConformations”, Journal of Molecular Biology, 406, 228-256 (2011))或IMGT (国际ImMunoGeneTics数据库可在www.imgt.org获得; 参见Lefranc等人, Nucleic AcidsRes. 1999; 27:209-212)中描述的那些，将氨基酸残基分配给CDR。
术语“抗原-结合片段”是指保留与抗原的表位特异性相互作用的能力的抗体部分。抗原-结合片段的实例包括但不限于Fab或Fab'。“Fab”片段由包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)的完整抗体轻链以及重链可变区(VH)和重链第一恒定区(CH1)组成。每个Fab片段就抗原结合而言是单价的，即它具有单个抗原-结合位点。Fab'片段与Fab片段的不同在于在CH1结构域的羧基末端具有几个额外的残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个残基。本文所述的Fab或Fab'可以是人Fab或Fab'或包含人CL的嵌合Fab或Fab'。
如本文所用的术语“融合蛋白”是指包含在人抗体或抗体片段的重链或轻链的氨基或羧基末端直接连接至异源肽或多肽的人抗体或抗体片段的重组蛋白。
附图简要说明
图1A-1B显示兔Fab晶体结构中的示例性G-链β折叠堆积。图1A显示4ZTO.pdb中的HC:HC和LC:LC β堆积。重链呈黑色和浅灰色。轻链呈深灰色和白色。图1B显示4JO1.pdb中的HC:LC β堆积。
图2A-2C显示人Cκ FG环与兔样LC:LC堆积的不相容性。图2A显示来自4NZU.pdb的人Fab(深灰色)在来自4ZTO的兔Fab晶体堆积(中等和浅灰色)上的结构比对，其显示，兔CκFG环(中灰色)比更长和凸出的人Cκ FG环更紧凑，并且与β折叠堆积相容，而更长和凸出的人Cκ FG环不会如此。图2B显示人、小鼠和兔Cκ结构域和Cλ结构域的FG环的序列比对。兔FG环短两个残基，其类似于来自Cλ结构域的FG环。图2C显示第二个潜在的干扰位点是人K126侧链。
图3A-3C显示Cκ构建体中的晶体堆积。图3A显示度普利尤单抗(dupilumab)亲本Fab中的晶体堆积。不存在G链β堆积。图3B显示Crystal Kappa版本中的一个晶体堆积平面。每个κ恒定区(浅灰色)与附近的CH1结构域(黑色)形成β折叠。图3C显示在Cκ结构域的G链(白色)和CH1结构域的G链(深灰色)之间形成的β折叠。折叠从Cκ T205延伸至S211和从CH1N216延伸至R222 (在晶体结构中依次编号的残基)，其为伪对称的，并且居中于Cκ V208(根据Kabat编号的位置205)和CH1 V219 (Kabat编号)之间。
图4A-4B显示Crystal Kappa设计的晶体结构。图4A显示与人IL4R细胞外结构域复合的度普利尤单抗Fab的Crystal Kappa版本的晶体结构(右上)。图4B显示与苏金单抗Fab复合的人IL17二聚体的Crystal Kappa版本的晶体结构(上中)。
图5A-5C显示柱级分结晶。来自大小排阻色谱的柱级分直接用于四种条件下的蒸气扩散结晶实验中。图5A显示色谱图。图5B显示在第9天每个结晶滴的图像。图5C显示分配给每个条件的评分，其中任何结晶的评分为90或更高。
图6A-6B显示使用Crystal Kappa设计的全长mAb的结晶和结构测定。图6A是显示全长mAb晶体的图像。图6B是所得结构的带状图，其中抗体重链呈黑色(包括棒中的Fc糖基化)且抗体轻链呈浅灰色。
图7A-7B显示使用Crystal Kappa设计的肽-Fab复合物的结晶。图7A是显示4小时后与Tau肽融合的L14H18的Crystal Kappa轻链的晶体的图像。图7B是与L14H18 Fab结合的Tau肽(白色)的所得的2.3Å结构的带状图，其中大部分有序Gly-Ser接头连接至Fab轻链的N-末端(灰色)。Fab重链以黑色显示。
实施例
实施例1：Fab和Fab:抗原复合物的结晶
兔Fab晶体堆积分析和人可结晶κ的设计
对36种公开和专有的兔Fab晶体结构中的晶体堆积相互作用的目视检查显示，恒定结构域β链与β链的晶体堆积是常见的(表I)。在19种储存的兔Fab结构(包括Fab复合物)的68%中，发生LC与LC β相互作用，在两个Fab分子间形成连续的β折叠(图1A)。这些结构的超过三分之一还具有HC:HC β堆积相互作用。总体而言，所述结构中的84%在恒定结构域的G链中形成某种β折叠堆积相互作用。内部经验是相似的，但具有HC:HC和LC:LC晶体堆积相互作用的Fab的实例更多，且具有HC:LC堆积的实例更少(表I和图1B)。形成HC:HC和LC:LC或形成HC:LC堆积相互作用的Fab的晶体具有连续的恒定结构域列，每个结构域形成典型的FabHC:LC相互作用以及与另一个结构域的β折叠。
表I. 兔Fab和Fab复合物结构的F-链β折叠晶体堆积
PDB* 分辨率 HC:HC LC:LC HC:LC
4HBC 1.54 x
4JO1 2.03 x
4JO2 2.50 x
4JO3 2.60 x x
4JO4 2.27 x x
4ZTO 2.30 x x
4ZTP 1.63 x
5DRN 1.99 x
5DS8 1.95 x
5DSC 2.40 x
5DTF 1.90 x
5DUB 2.00
5M63 2.74 x x
5V6L 2.55 x x
6CEZ 2.40
6CJK 1.80 x
6I9I 1.98 x
6PEH 2.30 x x
6T3F 3.20 x
总PDB 19 37% 68% 16%
HC:HC & LC:LC 6 32%
任何 17 84%
Lilly内部 17 29% 59% 6%
HC:HC & LC:LC 10 59%
任何 14 82%
*具有HC:HC、LC:LC或HC:LC G-链β折叠形成的储存PDB结构的百分比。还指示具有HC:HC和LC:LC堆积的百分比以及具有任何G-链β堆积的结构的百分比。Lilly内部统计信息列在PDB统计信息下方。
对数十种人Fab结构的调查显示没有这种相互作用。人Fab结构向兔Fab上的对齐显示，人Cκ结构域中存在的较长FG环形成弯曲和凸出的构象，其会干扰β折叠堆积相互作用(图2A)。该较长的FG环由小鼠Cκ共享，但不由兔Cκ结构域(也不由λ恒定结构域Cλ)共享(图2B)。对兔堆积相互作用上对齐的人Fab的目视检查还表明，人Cκ赖氨酸126 (K126，Kabat编号)可能是该结构域的对侧上的β折叠堆积的障碍(图2C)。
通过突变Cκ的FG环或K126生成几种六组氨酸(H6)标记的Fab片段的变体，并测试它们对结晶的影响。在FG环的情况下，这包括用五聚体兔序列QGTTS(根据Kabat编号，位置199至203)替换结构上同源的T和V(根据Kabat编号，分别为位置197和205)之间的七聚体人序列HQGLSSP(根据Kabat编号，位置198至204)。所得的突变体短两个残基，其中缺失位置198处的组氨酸和位置205处的脯氨酸，并且在本文中称为ΔQGTTSΔ (根据Kabat编号，位置198至204，参见SEQ ID NO:3)或“Crystal Kappa”设计。在一些变体中，K126被突变为丙氨酸(K126A，Kabat编号，参见SEQ ID NO:2、4、6)。
独立于晶体堆积分析，观察到C-末端链间二硫键很少在Fab结构中有序。这可能是由于构象异质性或由于异质氧化。为了解决这一点，设计了两种变体。一种称为“GEP*”的变体通过经由将C-末端κ链半胱氨酸突变为脯氨酸(根据Kabat编号，C214P，参见SEQ ID NO:5或6)和将IgG4重链半胱氨酸127突变为丙氨酸(根据Kabat编号，C127A)，来除去二硫键而生成。第二种称为“ESKCGGH6”的设计通过将κ半胱氨酸突变为脯氨酸(根据Kabat编号，C214P)并通过将Tyr 229突变为半胱氨酸(根据Kabat编号，Y229C)在重链的C-末端创建新的二硫键配偶体而生成。
Fab的结晶
在单独或组合并入这些突变之前和之后的两种Fab (G6和度普利尤单抗)的结晶结果显示于表II中。一种Fab源自公开的度普利尤单抗(Dupixent ™)序列(可在https://www.kegg.jp/entry/ D10354获得)。第二种Fab是针对细胞表面受体的内部发现努力的一部分。使用具有相同纯化的Fab的两个96-孔结晶筛选，设置为近似10 mg/ml，用不相关的Fab晶体划线接种(以消除由于成核导致的随机差异)并在同一时间点(9天)进行分析。两种亲本Fab在一些条件下产生结晶命中，并且度普利尤单抗Fab晶体甚至产生2.0Å数据集和结构。K126A突变(表II)和任何二硫键变体(未显示)都没有产生显著更多的晶体条件。最显著的差异在于并入ΔQGTTSΔ FG环(即，Crystal Kappa设计)。具有该设计的Fab在G6 Fab的192种条件中的近似90-114种条件下得到晶体；并且对于度普利尤单抗Fab，在192种条件中的近似113-136种条件下得到晶体。直接从这些筛选中收获(即未在后续筛选中优化)的晶体产生高分辨率数据集(表II)。最好的度普利尤单抗Fab从单独的ΔQGTTSΔ衍射至1.4Å(CK1.0)；并且最好的G6 Fab从ΔQGTTSΔ突变与K126A和链内二硫键的组合衍射至1.15Å(CK1.5)。
表II. 两种Fab及其变体的结晶
HC LC G6 Xtal** G6 Res (Å) Dup Xtal** Dup Res (Å)
亲本* ESKYGH<sub>6</sub> 野生型κ 1 4 2.0
CK0.1 ESKYGH<sub>6</sub> K126A 2 3.4 NA
CK1.0 ESKYGH<sub>6</sub> ∆QGTTS∆ 94 1.5 113 1.4
CK1.1 ESKYGH<sub>6</sub> K126A ∆QGTTS∆ 114 1.3 136 2.1
CK1.2 ESKYGH<sub>6</sub> C127A ∆QGTTS∆ GEP* 93 1.7 123 1.9
CK1.3 ESKCGGH<sub>6</sub> ∆QGTTS∆ GEP* 90 1.2 125 1.7
CK1.4 ESKYGH<sub>6</sub> C127A K126A ∆QGTTS∆ GEP* 104 1.4 NA
CK1.5 ESKCGGH<sub>6</sub> K126A ∆QGTTS∆ GEP* 110 1.15 121 2.2
*亲本轻链是野生型κ。亲本重链终止于序列ESKYG并包括用于纯化目的的H6标签。
**“Xtal”列表示在近似第9天，来自两个96-孔筛选的条件有多少产生任何类型的晶体。从具有可收获晶体的每个构建体发送几种晶体，并指示最佳分辨率数据集。
工程改造的Fab的晶体结构
为G6变体收集59个数据集，涵盖11种晶体形式。为7种晶体形式解析结构并为5种晶体形式进行精修：P212121，具有43x75x165 Å晶胞(5个精修结构)，P43212 77x77x330 (3)，P212121 66x74x91 (1)，P1 53x65x67 85x71x84 (1)，和C2 206x103x70 β=92.7º (1)。为度普利尤单抗Fab变体收集44个数据集，涵盖11种晶体形式。为4个数据集解析结构并为3个数据集进行精修：P21 53x66x135 β=91.6º (1)，P212121 59x73x105 (1)，P43212 74x74x185(1)。
没有ΔQGTTSΔ的Fab变体(包括亲本)的结构没有具有扩展的β折叠相互作用的堆积。例如，亲本度普利尤单抗Fab以各种类型的相互作用堆积，但无一形成连续的β-折叠(图3A)。在另一方面，所有源自具有ΔQGTTSΔ FG环的Fab的结构都堆积，在Cκ结构域的G链和CH1结构域的G链之间形成β折叠(图3B和3C)。这种相互作用与在兔Fab晶体堆积中看到的相似但不相同。它涉及与图1B中所看到的相同的链，但更广泛，涉及两侧的7个残基，如图1A中所看到的H:H或L:L相互作用。该β折叠的伪对称中心在Cκ V208 (根据Kabat编号，位置205)和CH1 V219 (Kabat编号)之间。
K126A突变似乎不影响晶体堆积或衍射质量。G6 Fab的最高分辨率结构并入该突变，但该突变的影响不是系统性的。例如，度普利尤单抗Fab的最高分辨率结构仅并入FG环突变ΔQGTTSΔ。二硫化物除去(C127A+GEP*)或链内二硫键(ESKC+GEP*)似乎也不影响晶体堆积或衍射。结构用有序的链内二硫键获得。该区域中的温度因子高于如在其他具有有序链间二硫键的结构中所看到的平均值。
Fab:抗原复合物的结晶
将结晶突变应用于Fab:抗原复合物。在G6 Fab的情况下，利用Fab的CK1.5变体，因为它作为单独的Fab衍射最好。对于度普利尤单抗Fab和其他四种复合物，利用CK1.0 (即仅ΔQGTTSΔ)。所有CH1结构域都是IgG4，并具有相同的C-末端六组氨酸(H6)标签(SEQ IDNO:7)。在有限的筛选和采用的时间范围内，亲本复合物(即没有任何结晶工程改造应用于Fab的抗原:Fab复合物)无一产生任何晶体(表III)。所有工程改造的复合物都产生晶体，从G6-受体复合物的4种条件(192种条件中的)到H4-受体复合物的87种条件(图4C和表III)。六种复合物中的四种产生结构，大部分分辨率较低。GITR复合物晶体在解析结构后实际上是单独的Fab，并且TIGIT复合物晶体的衍射没有足够好，不足以产生数据集。度普利尤单抗和苏金单抗两者的晶体都需要优化以达到各自的3和3.2Å分辨率(图4A-4B)。在前者的情况下，来自初始筛选的晶体衍射至5Å，而对于后者则完全没有。
表III. Fab:抗原复合物的结晶
Fab 抗原 亲本晶体 CK晶体 分辨率(Å) 注释 参考
G6 受体 0 4 3.6 CK1.5 未公开的分子
度普利尤单抗 IL4Ra 0 34 3.0 优化的 CAS: 1190264-60-8; 序列可得自https://www.kegg.jp/entry/D10354
苏金单抗 IL17a 0 54 3.2 优化的 CAS: 1229022-83-6; 序列可得自https://www.kegg.jp/entry/D09967
h2155 GITR 0 54 2.6 仅Fab US2013108641
h22G2 TIGIT 0 30 9 仅衍射 US2016176963
H4 受体 0 87 2.6 未公开的分子
在9天后在两个结晶筛选中筛选复合物并评分。来自亲本复合物(没有结晶突变)的任何种类的晶体的条件数量在“亲本晶体”列中指示。来自CK1.0 Fab抗原复合物的晶体的条件在标记为“CK晶体”的列中。来自这些筛选或后续优化的最佳衍射或数据集在“分辨率”列中指示。
由于苏金单抗:IL17复合物产生低分辨率但衍射的晶体，因此选择它用于进一步比较CH1结构域同种型和C-末端。创建四种新构建体：短5个残基并以序列DKRVESK结束的IgG4版本(无标签，SEQ ID NO:11)，以DKRVH6结束的IgG4版本(带标签，SEQ ID NO:12)，和以具有H6标签(SEQ ID NO:10)或不具有H6标签(SEQ ID NO:9)的序列KSC结束的IgG1版本。对这些进行纯化且如前以10 mg/ml、但也以5mg/ml进行筛选。较短的IgG4版本比原始版本产生的晶体更少(标记版本为24个，且未标记版本为18个，相比之下，原始标记版本为54个)。IgG1版本给出类似数量的晶体条件(标记版本为88个，且未标记版本为43个，相比之下，原始标记版本为54个)。10 mg/ml IgG4标记的版本衍射到4.2Å，就像最初不衍射但优化后产生3.2Å的亲本版本一样。另一方面，10 mg/ml的IgG1标记版本直接从初始筛选产生2.7Å数据集，并且5 mg/ml的IgG1未标记版本从初始筛选产生2.4Å数据集。
柱级分结晶(CFC)
工程改造的Fab的稳健结晶允许直接从柱级分结晶。当直接从柱级分结晶时，G6Fab的ΔQGTTSΔ变体产生与10 mg/ml的纯化和浓缩样品相同的晶体形式(图5A-5C)。CFC结构具有2.4Å的相当好的分辨率(相比于1.4Å)。
此处描述的设计应用于几个目标，利用相当的同种型和C-末端，使用相同的纯化、结晶和晶体收获程序(尽可能并行)，利用晶体接种来减少成核的可变性，评估相同经过时间的结晶实验，并在所有实验中让相同的科学家进行纯化和结晶。
变体Cκ结构域(ΔQGTTSΔ)将人Fab的结晶频率提高50倍。G6亲本Fab(完全人)仅在一种条件下产生晶体，但含有ΔQGTTSΔ的G6变体在近似90-114种条件下产生晶体。度普利尤单抗亲本Fab在4种条件下产生晶体，但含有ΔQGTTSΔ的度普利尤单抗变体在近似113-136种条件下产生晶体。此外，Cκ结构域的修饰FG环(“可结晶Kappa”或“CrystalKappa”)使得Fab:抗原复合物能够结晶，但无法计算提高倍数，因为在没有Crystal Kappa设计的情况下无一产生晶体。大多数Crystal Kappa版本为复合物产生30至90种结晶条件(注意：统计数据来自在一个相对保守的时间点的两个板)。
相对于Fab结果，复合物的结果不太令人鼓舞。尽管使用Crystal Kappa的复合物都产生晶体，这是相对于任何努力的显著优势，但6种中只有4种产生好得足以分辨和精修的复杂数据集，并且这些往往分辨率较低。一种(h2155 + GITR)产生仅Fab的晶体。
与人IL4R复合的度普利尤单抗Fab的3.0Å结构显示与IL4和IL13结合基本上重叠的表位，解释了其阻断活性(图4A)。表位的中心部分是CD环(Ul-Haq2016)，解释了为什么度普利尤单抗与在该区域中具有非常不同序列(L67L68 vs. Q67S68)的食蟹猴IL4R没有交叉反应性。3.0Å苏金单抗IL17复合物(及其2.4Å改进结构)显示两个Fab与具有不连续表位的IL17二聚体结合，每个Fab结合两条IL17链的部分(图4B)。H4复合物产生与不对称单元中的3个Fab的晶体堆积排列(未显示)。Fab之一形成对于CK设计典型的两个HC:LC β堆积相互作用。另一个Fab在LC侧形成一个，而在HC侧则没有。并且第三个Fab与第二个Fab形成HC:LC相互作用，并且其LC形成LC:LC β堆积相互作用，这是已经见到的唯一的这种相互作用。
苏金单抗构建体的额外精修缩短IgG4构建体的C-末端，并首次包括IgG1版本，并比较H6标记版本与未标记版本。将10 mg/ml与5 mg/ml进行比较，以使晶体对于收获目的不那么拥挤。在本系列中，IgG1版本比IgG4表现更好，并且直接为标记(10 mg/ml)版本产生2.7Å数据集且为未标记Fab (5mg/ml)版本产生2.4Å数据集，而来自CK1.0构建体的3.0Å数据集在优化和筛选大量晶体后获得。有趣的是，G1、G4(两个版本)、有标签的和无标签的，都产生同形晶体。
关于结晶速度，所有描述的晶体都在一周内生长，并且对于更频繁检查的那些，晶体在数小时内出现。关于浓度，柱级分结晶实验显示，可以从稀释至0.1mg/ml的样品获得晶体，至少对于单独的Fab是这样。除了对所需浓度的影响外，CFC还具有其他潜在优势。例如，柱峰前缘的蛋白的特征可能与后缘不同，并且一个或另一个可能在确定结构中更多产。CFC实验和Fab在超过一半的高浓度结晶条件下结晶的事实表明，对于Fab，Crystal Kappa设计应允许显著简化的筛选条件集合。
总之，本文提供了人恒定κ结构域(变体Cκ)的可结晶变体，其显著提高Fab和Fab:抗原复合物的晶体形成的频率，产生Fab (和Fab:肽复合物)的高分辨率结构，并且在大多数情况下，可以产生Fab:蛋白复合物的至少低分辨率数据集和结构。Crystal Kappa设计似乎允许在少数条件的筛选中从稀释样品过夜结晶。Crystal Kappa设计应使得甚至使用更小的筛选和更少的蛋白，Fab结构确定也是稳健的，并加快复合物结构确定，包括具有困难目标的Fab伴侣复合物。
材料和方法
工程改造和分子生物学
利用蛋白数据库和Eli Lilly的专有结构数据库中可用的结构，在Pymol中对兔Fab晶体堆积进行分析。来自不同物种的LC恒定结构域的比对利用BLAST。度普利尤单抗和苏金单抗的可变结构域的氨基酸序列获得自京都基因和基因组百科全书(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes)网站(www.kegg.jp; Kanehisa2000)，条目D10354和D09967。h2155和h22G2的序列获得自专利US2013108641和US2016176963。通过将相应的DNA片段合成为gblocks (IDT, CoralvilleIA)并使用标准技术克隆至哺乳动物表达载体中来创建表达载体。
表达和纯化
Fab和抗原ECD在哺乳动物细胞培养CHO细胞中表达。收获含有蛋白的细胞培养上清液，并使用His Trap™ Excel (GE Healthcare)，使用PBS缓冲液加15mM咪唑，pH 7.5作为结合缓冲液，通过固定化金属亲和色谱(IMAC)纯化澄清的培养基。然后将蛋白在PBS加0.3M咪唑，pH7.4中在10柱体积梯度洗脱上洗脱。收集洗脱液并使用Millipore 10KDa旋转浓缩器进行浓缩。将浓缩IMAC合并物加载于Superdex75或Superdex200 (GEHealthcare)柱上。对于结晶托盘，将蛋白再次浓缩至10mg/ml。
通过分析型大小排阻色谱法(Waters)和SDS-PAGE凝胶表征蛋白(数据未显示)。
结晶和结构测定
将所有样品浓缩至5-10 mg/ml，并在室温下使用Qiagen Classics II和PEGs结晶筛选以1:1的比率置设置于蒸汽扩散坐滴中。液滴立即用相关Fab晶种交叉接种以用于Fab结晶，并且用复合物-晶种交叉接种以用于复合物结晶。在第1天、第4天和第9天拍摄结晶托盘的图像。在液氮中冷冻之前，将晶体转移至冷冻保护剂溶液中，所述冷冻保护剂溶液由补充有额外10%用于该结晶孔中的沉淀剂和25%的甘油的孔溶液或来自母液的孔溶液组成，如果母液包含浓度足以进行冷冻保护的具有冷冻保护特性的沉淀剂(诸如PEG 400、PEG MME550、PEG MME 2K等)的话。
结构测定衍射数据集在以下来源收集：Lilly Research Collaborative AccessTeam (LRL-CAT) Beamline 31-ID at Advanced Proton Source (Argonne, IL);Beamline ALS-502 at Advanced Light Source (Berkley, CA); Beamline I04-1 atDiamond Light Source (Oxfordshire, UK)。使用MOSFLM (Leslie AGW & Powell HR.In: Read RJ, & Sussman JL (编), Evolving methods for macromolecularcrystallography: the structural path to the understanding of the mechanism ofaction of CBRN Agents. Dordrecht: Springer Netherlands. 2007)和CCP4程序套件(Winn, 等人, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2011. 67(Pt 4):235-42)将数据整合和简化。使用Phaser (CCP4套件) (McCoy, 等人, J. Appl. Crystallogr., 2007.40(Pt 4):658-674)获得初始分子置换解决方案。该模型使用COOT (Emsley, 等人, ActaCrystallogr D Biol Crystallogr, 2010. 66(Pt 4):486-501)构建，并使用Refmac(Murshudov, 等人, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2011. 67(Pt 4):355-67)或Buster (Bricogne, 等人 BUSTER version 2.11.5. Cambridge, United Kingdom:Global Phasing Ltd. 2011)精修并使用内部开发的方案进行验证。
实施例2：全长单克隆抗体(mAb)的结晶和X-射线结构测定
除了Fab片段以外，Crystal Kappa设计还可用于结晶全长IgG抗体，如下所示。使用标准分子生物学技术，在标准表达载体中用Crystal Kappa设计修饰抗体的轻链。然后，轻链与相应的重链在适合用于分泌抗体的表达系统(诸如，HEK293或中国仓鼠卵巢细胞)中表达。然后，使用诸如用MabSelect柱(GE Healthcare)的柱纯化的技术，从培养基纯化抗体并浓缩至例如5 mg/ml。利用蒸气扩散方法，然后筛选条件以从纯化的抗体生长蛋白晶体。然后分离、转移和冷冻晶体，然后收集X-射线数据。使用标准技术，然后可以通过分子置换(例如，使用软件Phaser，且然后使用精修的原子模型)，从该数据确定结构。
一种抗体结构是通过将Crystal Kappa设计并入IgG4-P (具有S241P (根据Kabat编号)或S228P (根据EU索引编号)的IgG4)同种型抗体的κ轻链产生。从21℃的96-孔筛选(ComPAS, Qiagen)，几种条件产生晶体，包括18%乙醇+100mM Tris HCl(pH 8.5)。通过优化这些条件，从20%乙醇、21℃获得衍射晶体和4Å数据集。该数据集的分子置换解决方案产生全长抗体的结构(两条重链、两条轻链和糖基化)，其构象与两种已知的人IgG4结构的构象(5DK3.pdb和6GFE.pdb)显著不同并且更类似于已知的人IgG1结构(1HZH.pdb)。CrystalKappa设计有助于晶体堆积，抗体中的其他接触点也是如此。
图6A-6B显示全长mAb的结晶和结构测定。图6A是显示全长mAb的晶体的图像。图6B是所得结构的带状图，其中抗体重链呈黑色(包括呈棒的Fc糖基化)且抗体轻链呈浅灰色。
实施例3：通过生成融合蛋白结晶Fab:抗原肽复合物
Fab与其抗原肽的复合物的晶体结构测定可以通过两种方式实现。首先且更典型地，抗原肽可以购买或使用各种技术(Chandrudu S, Simerska P, Toth I. Chemicalmethods for peptide and protein production. Molecules. 2013 Apr 12;18(4):4373-88)制备。然后，可以将该肽溶解并以等于或超过以摩尔计的Fab浓度的最终浓度添加至Fab中。然后，如同单独的Crystal Kappa Fab一样，实现复合物的结晶和结构测定。无需购买肽的第二种技术是将肽的编码序列直接插入Fd或κ轻链的开放阅读框中，以便在构建Fab表达载体期间生成在肽和Fd/κ轻链之间具有适当接头的融合蛋白。然后，在融合蛋白中，该肽将通过接头以精确的一对一化学计量栓系至Fab。该栓系还具有增加肽的有效浓度和避免低亲和力肽不出现在晶体或所得结构中的情况的益处。栓系保证了晶体中抗原肽的存在。
如下获得抗Tau抗体L14H18 (WO 2017/005734)与其同源Tau肽抗原的Fab:抗原肽复合物。通过在开放阅读框的信号序列和Fab链的成熟开始之间并入DNA序列(翻译成如下那27个氨基酸)，将包含已知表位TPPKSPSSAKSRLQTAPVPM (SEQ ID NO:18)的tau肽(氨基酸231-250)用GS接头(SEQ ID NO:19)融合至Fd-His6或L14H18 Fab的Crystal Kappa轻链的N-末端。Tau肽-接头-Fd-His/Crystal Kappa轻链和Fd-His/Tau肽-接头-Crystal Kappa轻链版本均在CHO细胞中表达，通过固定化金属亲和色谱法和凝胶过滤纯化，浓缩至4.5 mg/ml并在市售筛选中结晶。在Classics和PEG筛选(Qiagen)中，数十种条件对两种版本产生晶体。对于Crystal Kappa融合体解析并精修两种复合物结构：来自20% PEG 3350/200mM酒石酸钠钾的1.22Å结构和来自100mM醋酸钠pH4.6/25% PEG 4000/200mM硫酸铵的2.3Å结构。两种结构都显示大部分延伸的肽，其中一个螺旋转角与Fab的CDR结合，并且仅在接头部分的顺序程度上不同。
图7A-7B显示Tau肽-Fab复合物的结晶。图7A是显示4小时后与Tau肽融合的L14H18的Crystal Kappa轻链的晶体的图像。图7B是与L14H18 Fab结合的Tau肽(白色)的所得2.3Å结构的带状图，其中大部分有序的GS接头连接至Fab轻链(灰色)的N-末端。Fab重链以黑色显示。
序列表
野生型人κ轻链恒定结构域
Figure 144759DEST_PATH_IMAGE001
氨基酸序列(SEQ ID NO:1)
Figure 789367DEST_PATH_IMAGE002
人
Figure 245756DEST_PATH_IMAGE003
变体氨基酸序列(SEQ ID NO:2)
Figure 751955DEST_PATH_IMAGE004
人
Figure 344610DEST_PATH_IMAGE005
变体氨基酸序列(SEQ ID NO:3)
Figure 160120DEST_PATH_IMAGE006
人
Figure 838226DEST_PATH_IMAGE007
变体氨基酸序列(SEQ ID NO:4)
Figure 397383DEST_PATH_IMAGE006
人
Figure 875505DEST_PATH_IMAGE008
变体氨基酸序列(SEQ ID NO:5)
Figure 596336DEST_PATH_IMAGE009
人
Figure 761738DEST_PATH_IMAGE010
变体氨基酸序列(SEQ ID NO:6)
Figure 859007DEST_PATH_IMAGE011
人IgG4 CH1结构域ESKYGH6变体氨基酸序列(SEQ ID NO:7)
Figure 442567DEST_PATH_IMAGE012
人IgG4 CH1结构域ESKYGH6 C127A变体氨基酸序列(SEQ ID NO:8)
Figure 68720DEST_PATH_IMAGE013
野生型人IgG1无标签CH1结构域氨基酸序列(SEQ ID NO:9)
Figure 986997DEST_PATH_IMAGE014
人IgG1有标签CH1结构域氨基酸序列(SEQ ID NO:10)
Figure 887957DEST_PATH_IMAGE015
人IgG4无标签CH1结构域(SEQ ID NO:11)
Figure 44132DEST_PATH_IMAGE016
人IgG4有标签CH1结构域(SEQ ID NO:12)
Figure 123078DEST_PATH_IMAGE017
野生型小鼠
Figure 263072DEST_PATH_IMAGE018
氨基酸序列(SEQ ID NO:13)
Figure 967723DEST_PATH_IMAGE019
野生型兔
Figure 588191DEST_PATH_IMAGE018
氨基酸序列(SEQ ID NO:14)
Figure 631846DEST_PATH_IMAGE020
野生型人λ轻链恒定结构域
Figure 259136DEST_PATH_IMAGE021
氨基酸序列(SEQ ID NO:15)
Figure 236320DEST_PATH_IMAGE022
野生型小鼠
Figure 632666DEST_PATH_IMAGE023
氨基酸序列(SEQ ID NO:16)
Figure 584573DEST_PATH_IMAGE024
野生型兔
Figure 433580DEST_PATH_IMAGE023
氨基酸序列(SEQ ID NO:17)
Figure 214454DEST_PATH_IMAGE025
Tau肽(SEQ ID NO:18)
Figure 730886DEST_PATH_IMAGE026
GS接头(SEQ ID NO:19)
Figure 322536DEST_PATH_IMAGE027
序列表
<110> Eli Lilly and Company
<120> 抗体或抗原-结合片段的结晶
<130> X22176
<150> 62/975,269
<151> 2020-02-12
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Ala Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 3
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val
85 90 95
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 4
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Ala Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val
85 90 95
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 5
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val
85 90 95
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Pro
100 105
<210> 6
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Ala Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val
85 90 95
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Pro
100 105
<210> 7
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly His His His His His His
100 105
<210> 8
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly His His His His His His
100 105
<210> 9
<211> 103
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
100
<210> 10
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys His His His His His His
100 105
<210> 11
<211> 101
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys
100
<210> 12
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val His His His His His His
100
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 13
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 14
<211> 104
<212> PRT
<213> 穴兔
<400> 14
Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp
1 5 10 15
Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr
20 25 30
Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr
35 40 45
Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr
50 55 60
Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser
65 70 75 80
His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Val
85 90 95
Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
100
<210> 15
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 16
<211> 105
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 16
Gln Pro Lys Ser Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Glu Thr Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Thr Ile Thr Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Val Val Thr Val Asp Trp Lys Val Asp Gly Thr Pro Val
35 40 45
Thr Gln Gly Met Glu Thr Thr Gln Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Met Ala Ser Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Ala Arg Ala Trp Glu Arg
65 70 75 80
His Ser Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr Val Glu
85 90 95
Lys Ser Leu Ser Arg Ala Asp Cys Ser
100 105
<210> 17
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Gln Pro Ala Val Thr Pro Ser Val Ile Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Lys Asp Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Thr Val Lys Val Asn Trp Lys Ala Asp Gly Asn Ser Val
35 40 45
Thr Gln Gly Val Asp Thr Thr Gln Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Phe Leu His Leu Thr Ala Asn Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
Tyr Gln Ser Val Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr Val Glu
85 90 95
Lys Ser Leu Ala Pro Ala Glu Cys Ser
100 105
<210> 18
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala
1 5 10 15
Pro Val Pro Met
20
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5

Claims (22)

1.包含变体Cκ的抗体、抗原-结合片段或融合蛋白，其中所述变体Cκ包含人Cκ(人κ轻链恒定结构域)的位置199至203处的氨基酸QGTTS，且人Cκ的位置198和204处的氨基酸在变体Cκ中缺失(所有位置都根据Kabat编号法进行编号)。
2.权利要求1的抗体、抗原-结合片段或融合蛋白，其中所述变体Cκ包含SEQ ID NO:3。
3.权利要求1的抗体、抗原-结合片段或融合蛋白，其中所述变体Cκ进一步包含人Cκ的位置126 (根据Kabat编号法)处的丙氨酸。
4.权利要求3的抗体、抗原-结合片段或融合蛋白，其中所述变体Cκ包含SEQ ID NO:4。
5.权利要求1或3的抗体、抗原-结合片段或融合蛋白，其中所述变体Cκ进一步包含人Cκ的位置214 (根据Kabat编号法)处的脯氨酸。
6.权利要求5的抗体、抗原-结合片段或融合蛋白，其中所述变体Cκ包含SEQ ID NO:5或6。
7.权利要求1-6中任一项的抗体、抗原-结合片段或融合蛋白，其中所述抗体、抗原-结合片段或融合蛋白进一步包含人轻链可变结构域(VL)和人重链可变结构域(VH)。
8.权利要求1-7中任一项的抗体、抗原-结合片段或融合蛋白，其中所述抗体、抗原-结合片段或融合蛋白进一步包含人IgG CH1结构域。
9.权利要求8的抗体、抗原-结合片段或融合蛋白，其中所述人IgG CH1结构域是人IgG1或IgG4 CH1结构域。
10.权利要求1-9中任一项的抗原-结合片段，其中所述抗原-结合片段是人Fab或Fab'。
11.生成包含变体Cκ的抗体、抗原-结合片段或融合蛋白的晶体结构的方法，所述方法包括使包含变体Cκ的抗体、抗原-结合片段或融合蛋白结晶，其中所述变体Cκ包含人Cκ的位置199至203处的氨基酸QGTTS，且人Cκ的位置198和204处的氨基酸在变体Cκ中缺失(所有位置都根据Kabat编号法进行编号)。
12.生成包含人Cκ的抗体、抗原-结合片段或融合蛋白的晶体结构的方法，所述方法包括：
生成包含变体Cκ的抗体、抗原-结合片段或融合蛋白，其中所述变体Cκ包含人Cκ的位置199至203处的氨基酸QGTTS，且人Cκ的位置198和204处的氨基酸在变体Cκ中缺失(所有位置都根据Kabat编号法进行编号)；和
使包含变体Cκ的抗体、抗原-结合片段或融合蛋白结晶。
13.生成抗原和结合所述抗原的抗体、抗原-结合片段或融合蛋白的复合物的晶体结构的方法，其中所述抗体、抗原-结合片段或融合蛋白包含人Cκ，所述方法包括：
生成包含变体Cκ的抗体、抗原-结合片段或融合蛋白，其中所述变体Cκ包含人Cκ的位置199至203处的氨基酸QGTTS，且人Cκ的位置198和204处的氨基酸在变体Cκ中缺失(所有位置都根据Kabat编号法进行编号)；和
使所述抗原和所述包含变体Cκ的抗体、抗原-结合片段或融合蛋白共结晶。
14.权利要求11-13中任一项的方法，其中所述变体Cκ包含SEQ ID NO:3。
15.权利要求11-13中任一项的方法，其中所述变体Cκ进一步包含人Cκ的位置126 (根据Kabat编号法)处的丙氨酸。
16.权利要求15的方法，其中所述变体Cκ包含SEQ ID NO:4。
17.权利要求11-13或15中任一项的方法，其中所述变体Cκ进一步包含人Cκ的位置214(根据Kabat编号法)处的脯氨酸。
18.权利要求17的方法，其中所述变体Cκ包含SEQ ID NO:5或6。
19.权利要求11-18中任一项的方法，其中所述抗体、抗原-结合片段或融合蛋白进一步包含人VL和人VH。
20.权利要求11-19中任一项的方法，其中所述抗体、抗原-结合片段或融合蛋白进一步包含人IgG CH1结构域。
21.权利要求20的方法，其中所述人IgG CH1结构域是人IgG1或IgG4 CH1结构域。
22.权利要求11-21中任一项的方法，其中所述抗原-结合片段是人Fab或Fab'。
CN202180028017.6A 2020-02-12 2021-02-09 抗体或抗原-结合片段的结晶 Pending CN115335406A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202062975269P 2020-02-12 2020-02-12
US62/975269 2020-02-12
PCT/US2021/017212 WO2021163031A1 (en) 2020-02-12 2021-02-09 Crystallization of antibodies or antigen-binding fragments

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115335406A true CN115335406A (zh) 2022-11-11

Family

ID=74856928

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180028017.6A Pending CN115335406A (zh) 2020-02-12 2021-02-09 抗体或抗原-结合片段的结晶

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20230137966A1 (zh)
EP (1) EP4103615A1 (zh)
JP (1) JP7399305B2 (zh)
CN (1) CN115335406A (zh)
CA (1) CA3167317A1 (zh)
WO (1) WO2021163031A1 (zh)

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130108641A1 (en) 2011-09-14 2013-05-02 Sanofi Anti-gitr antibodies
EP2970435B1 (en) * 2013-03-15 2020-08-12 Eli Lilly and Company Methods for producing fabs and bi-specific antibodies
TWI612059B (zh) 2013-03-15 2018-01-21 美國禮來大藥廠 泛－ＥＬＲ<sup>＋</sup>ＣＸＣ趨化因子抗體
JP6180663B2 (ja) 2014-12-23 2017-08-16 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｔｉｇｉｔに対する抗体
WO2016205618A1 (en) 2015-06-19 2016-12-22 Morphotek, Inc. Cys80 conjugated immunoglobulins
JP6630426B2 (ja) 2015-07-06 2020-01-15 ユーシービー バイオファルマ エスピーアールエル Ｔａｕ結合抗体
EP3341415B1 (en) 2015-08-28 2021-03-24 H. Hoffnabb-La Roche Ag Anti-hypusine antibodies and uses thereof
WO2017102920A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 Intervet International B.V. Caninized human antibodies to human and canine il-4r alpha
AU2016381605A1 (en) 2015-12-28 2018-07-12 Massachusetts Institute Of Technology Bispecific antibodies having constant region mutations and uses therefor
US11820828B2 (en) * 2016-12-22 2023-11-21 Eli Lilly And Company Methods for producing fabs and IgG bispecific antibodies
AU2018292438A1 (en) * 2017-06-30 2019-12-12 Zymeworks Bc Inc. Stabilized chimeric fabs
WO2019148412A1 (en) 2018-02-01 2019-08-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-pd-1/lag3 bispecific antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021163031A1 (en) 2021-08-19
EP4103615A1 (en) 2022-12-21
JP2023513900A (ja) 2023-04-04
US20230137966A1 (en) 2023-05-04
CA3167317A1 (en) 2021-08-19
JP7399305B2 (ja) 2023-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10808027B2 (en) DNA molecules encoding antibodies to tau and methods of making thereof
EP3337812B1 (en) Method for the reduction of host cell proteins in affinity chromatography
JP2021520825A (ja) ガレクチン−１０抗体
JP6738814B2 (ja) 抗ＥｐｈＡ４抗体
JP2019525925A (ja) アフィニティークロマトグラフィー洗浄バッファー
US9193787B2 (en) Human antibodies that bind human TNF-alpha and methods of preparing the same
JP2017538656A (ja) 可変ドメインｖｌおよびｖｈｈ誘導体に基づく高アフィニティおよび凝集耐性抗体
JP7060906B2 (ja) 抗ｉｌ－５抗体
WO2021002312A1 (ja) 抗ＥｐｈＡ４抗体
JP2022115961A (ja) 親和性を操作した血清タンパク質担体結合ドメイン
WO2021201202A1 (ja) 多重特異性抗原結合分子を含む組成物における不純物分子の分析方法
CN113677701A (zh) 产生亲合结合多特异性抗体的方法
JP7399305B2 (ja) 抗体または抗原結合フラグメントの結晶化
US20220002397A1 (en) Method for improving inhibition of vegf-binding to vegf-r1 of an anti-vegf antibody
TW202003555A (zh) 用於純化重組多肽之方法
EA042576B1 (ru) Анти-il-5 антитела
Almagro et al. Humanization of antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40080128

Country of ref document: HK