JP2014504498A - 可変領域の突然変異誘発によって得られる血管内皮増殖因子(vegf)に対する組換え抗体 - Google Patents
可変領域の突然変異誘発によって得られる血管内皮増殖因子(vegf)に対する組換え抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2014504498A JP2014504498A JP2013546584A JP2013546584A JP2014504498A JP 2014504498 A JP2014504498 A JP 2014504498A JP 2013546584 A JP2013546584 A JP 2013546584A JP 2013546584 A JP2013546584 A JP 2013546584A JP 2014504498 A JP2014504498 A JP 2014504498A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- scfv
- recombinant antibody
- vegf
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
- A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
- A61K51/1021—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against cytokines, e.g. growth factors, VEGF, TNF, lymphokines or interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Oncology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
(a)本発明の目的である組換え抗体が、それらの可変領域CDR3中に新規なDNA配列を有するからである。このため本発明の目的である組換え抗体は、ハイブリドーマ由来の抗体(Kim、KJ.et al.1992.Growth Factors 7:53〜64頁;Muller、Y.et al.1997.Proc Natl Acad Sci USA 94:7192〜7197頁;Asano、M.et al.1998.Hybridoma 17:185〜190頁;Schaeppi、JM.et al.1999.J Cancer Res Clin Oncol 125:336〜342頁;Brekken、RA.et al.2000.Cancer Res 60:5117〜5124頁;Brekken、RA.and Thorpe、PE.2001.J Controlled Release 74:173〜181頁)、又は別のウイルスによるヒト細胞の形質転換によって得られた抗体(US5730977)、遺伝子操作による既存の抗体の改変(Jayson、G.et al.2002.JNCI 94:1484〜1493頁;Ferrara、N.et al.2005.Biochem Biophys Res Comun 333:328〜335頁)、及びヒト抗体断片ライブラリー由来の抗体(Vitaliti、A.et al.2000.Cancer Res 60:4311〜4314頁;Fuh、G.et al.2006.J Biol Chem 281:6625〜6631頁)などの、他の著者によって報告されたVEGF−Aに対する他の抗体とは異なるものとなる。
抗原結合部位
この用語は、抗原(又はその一部分)と特異的に相互作用する抗体の一部分を記載する。抗体結合部位は主に、2つの抗体可変領域、軽鎖(VL)及び重鎖(VH)可変領域によって形成される。抗体結合部位は、可変領域の非共有結合性相互作用によって形成される。抗体結合部位は、特異的抗原結合性に干渉しないペプチドと2つの可変領域の連結によって、人為的に安定化させることが可能である。これはscFv型の断片の場合である。本来、抗体結合部位は可変領域の非共有結合性相互作用によって構築され、CH1及びCL(κ又はλ)定常ドメインの非共有結合性相互作用、及びCL中に存在するシステインと抗体重鎖のヒンジ領域中に位置する別のシステインの間で確立したジスルフィド結合によって補強される。完全天然抗体は、2つ以上の同一抗原結合部位を有する。
この用語は、1つ又は複数の抗原結合部位により抗原を特異的に認識する、組換えDNA技術又は人為的遺伝子合成によって合成型で完全又は部分的に生成される免疫グロブリン又はその一部分を記載する(Gavilondo、J.y Larrick.J.W.2000.Biotechniques29:128〜136頁)。組換え抗体の例は、その中で遺伝子操作を使用して、一種から得た可変領域遺伝子(又はその一部分)と別種の免疫グロブリン定常領域を結合させた、いわゆるキメラ及びヒト化抗体である。組換え抗体の中で、本発明者らは、遺伝子操作によって生成する、1つ又は複数の抗原結合部位を包含する抗体断片も見出すことができる。組換え抗体断片の例は、(i)VL、VH、CL及びCH1免疫グロブリンドメインを含むFab断片、(ii)VH及びCH1ドメインからなるFd断片、(iii)単一抗体のVL及びVHからなるFv断片、(iv)所与の抗体のVH及びVLドメインを異なる順序(VH−VL又はVL−VH)で、2つの可変領域の結合を可能にするペプチドリンカーと組み合わせて、抗原結合部位を形成するscFv断片(Bird et al.1988.Science 242:423〜426頁;Huston et al.1988.PNAS USA 85:5879〜5883頁)、(v)scFvと同様の形式で、ただし1つの同一分子のVH及びVLドメインを結合部位に構築できない短鎖ペプチドリンカーを用いて構築される多価又は多重特異性断片である「ダイアボディ」、後者は2つ以上のscFvの結合によって作製され、それによって多価性を与えなければならない(WO94/13804;Holliger P et al.1993.PNAS USA 90:6444〜6448頁)、(vi)dAb(Ward SE et al.1989.Nature 341:544〜546頁)、単離CDR、F(ab’)2断片、ナノボディ、及び二重特異性scFv二量体(PCT/US92/09965;Holliger P y Winter G.1993.Current Opinion Biotechnol.4:446〜449頁;de Haard、H et al.1998.Adv.Drug Delivery Rev.31:5〜31頁)などの他の断片である。scFv及びFabなどの幾つかの型の断片は、抗体ライブラリーから得ることができ、この場合、一種の可変領域の大きな合成又は天然遺伝子レパートリーを、ランダムに組み合わせて可変領域の特定の結合を生成し、次いでそれらは線維状ファージの表面に抗体断片として提示される。
抗体の同等な変異体は、抗原を特異的に認識し、それ、及びその生物学的特性に対して影響を与える能力を保持する、抗体可変領域の正確な配列の結合及び操作に由来するポリペプチド分子である。これらのポリペプチド分子は、その中でVLドメインがリンカー及びVHscFvドメインの前に位置する、又は現況技術で知られている他のリンカーセグメントが利用される、又はF(ab’)2、Fabc、Facb、二量体、三量体又は四量体scFv断片として生成されるような、他の組換え抗体断片の型をとることができる(Winter G、Milstein C.1991.Nature 349:293〜299頁;WO94/13804;de Haard、H et al.1998.Adv.Drug Delivery Rev.31:5〜31頁)。また、免疫グロブリン由来配列の付加によって多価分子が生成するとき(Bestagno M et al.2001.Biochemistry 40:10686〜10692頁)。その可変領域の正確な配列が二重抗体、又は完全サイズの抗体の型に含有され、ヒト免疫グロブリン又は多種由来の定常ドメインと結合するとき、抗体の同等な変異体がまた生成される。全てのこれらの遺伝子工学的操作は、当技術分野の当業者には知られている。
抗体又はその断片が、その特異的結合対(抗原)と異なる他の分子と有意に結合しない状況を指す。この用語は、抗原結合部位が幾つかの関連又は無関連抗原中に現れる特定エピトープに特異的である場合にも適用可能であり、この場合抗体結合部位は、前述のエピトープを有する幾つかの抗原を同定することができる。
抗原が大きい場合、抗体はエピトープと称される抗原の特定部分に専ら結合することができる。抗原がタンパク質である場合、抗体結合部位によって認識されるエピトープは直鎖状アミノ酸配列により形成されてよく、又は高次構造的、即ち抗体結合部位と相互作用する抗原中のアミノ酸がタンパク質の三次構造において構造上近似していてよいが、その一次構造は必ずしも配列状ではない。タンパク質の場合、所与のエピトープは本来不連続であり、非共有結合により抗体のアミノ酸と相互作用する一群の特異的アミノ酸によって画定する。機能性エピトープは、抗原中の特異的アミノ酸の置換により実験によって決定されるエピトープであり、抗体認識の消失に対する影響(又はその変異体のそれ)は免疫化学的方法によって評価する。
(a)癌、原発性固形腫瘍及びその転移を意味する。これらの治療が見込まれる疾患には、類表皮腫瘍、扁平頭頸部腫瘍、結腸直腸腫瘍、前立腺癌、乳房腫瘍、肺小細胞及び非小細胞癌、膵臓腫瘍、甲状腺癌、卵巣癌、肝臓腫瘍、カポジ肉腫、中枢神経系新生物(神経芽細胞腫、血管芽細胞腫、髄膜腫、及び脳転移)、メラノーマ、腎臓及び胃腸癌、横紋筋肉腫、神経膠芽細胞腫及び平滑筋肉腫があるが、これらだけには限られない。
(c)喘息、呼吸窮迫、子宮内膜症、並びにアテローム性動脈硬化症及び組織浮腫のような慢性及び急性炎症過程。
(d)肝炎及びカポジ肉腫のような感染性疾患。
(e)糖尿病、乾癬、関節リウマチ及び甲状腺炎のような自己免疫疾患。
(f)臓器移植片拒絶、血管腫、及び血管線維腫などの、他の幾つかの疾患及び状態。
突然変異可変領域を含有するscFv抗体断片ファージディスプレイライブラリーの構築
(a)ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による突然変異可変領域の調製
それぞれ2H1scFv抗体断片(WO2008/052489A1)のVH及びVLドメインのCDR3に相当する、配列LVVRDTE及びLLSYSGARを、突然変異誘発の標的として使用した。一組の合成オリゴヌクレオチド(表1)を、Parsimonius突然変異誘発(PM、Balint、R.and Larrick、J.W.1993.Gene、137:109〜118頁)の原理に従い設計した。
2H1−Fベクターと突然変異VH領域から精製したDNA産物のサンプルをSfiI及びApaLI(Fermentas及びNEB)で消化し、QIAQuickカラム(Qiagen)を使用しアガロースゲルから精製し、T4DNAリガーゼ(NEB)を使用してそれぞれ1:1.5で連結させた。連結産物はQIAQuickカラム(Qiagen)を使用して精製し、水に溶出させた。
細菌コロニーをプレートからかき取り、それらの起源に従いプールし、細胞はペレット状にした。高純度DNAは、製造者の説明書に従い、MaxiPrepキット(Qiagen)を使用して細胞ペレットから得た。
突然変異重鎖及び軽鎖可変領域を有し、ヒトVEGFに対する親和性がより高い、ファージ上で提示されるscFv抗体断片の選択。
突然変異可変領域ライブラリーのDNAを使用して、TG1大腸菌細胞を独立にエレクトロポレーション処理し、次いでそれらにヘルパーファージM13K07を感染させてファージを生成した。ファージは精製し、選択実験に使用するまで−20℃でアリコートに保存した。
軽鎖可変領域CDR3の新たな突然変異。
例2の2つの表中に報告した配列及びIC50値を考慮して、VLCDR3において抗原に対する相対親和性をさらに増大するための、考えられる新たな突然変異の分析を行った。4つの最良IC50クローンの3つにおけるその保存、及びこの配列の第5位における突然変異の集中のため、配列RLSY(x)LARが保護されると決定した。この位置における突然変異に関して考えられた新たなアミノ酸は、これら特定残基の特性、及びこれらが他のクローンにおいてこの位置に現れたかどうかを考慮して、P、D又はEであった。
ヒトVEGFに対する親和性が高い突然変異VHとVL可変領域を組み合わせたscFv抗体断片の構築。
制限消化及びクローニング手順を前に記載したように実施し、クローンL3からのVLコード遺伝子(同様にL3と称する、ヌクレオチド配列に関して配列番号7及び推定アミノ酸配列に関して配列番号8)と、例2中で既に述べた重鎖:H6(ヌクレオチド配列に関して配列番号1及び推定アミノ酸配列に関して配列番号4)、H5(ヌクレオチド配列に関して配列番号2及び推定アミノ酸配列に関して配列番号5)、及びH7(ヌクレオチド配列に関して配列番号3及び推定アミノ酸配列に関して配列番号6)をコードする遺伝子を組み合わせた、3個の新たな抗体断片を得た。XL1−Blue MRF’エレクトロコンピテントセルを、これら3つの新たな組換えプラスミドで独立に形質転換し、各々からの5つの独立コロニーを採取し、増殖させてDNAを得た。正確な配列を確認した後、これらのプラスミドを使用してTG1大腸菌細胞を独立にエレクトロポレーション処理し、次いでそれらにヘルパーファージM13K07を感染させてファージを生成した。例2中に記載したように、ファージを精製し、これらを使用してELISAにおいてIC50を評価した。
抗体断片scFvL3H6、scFvL3H5及びscFvL3H7の細菌における発現及び精製。
(a)pACR.1ベクターでの抗体断片scFvL3H6、scFvL3H5及びscFvL3H7のクローニング
ベクターpACR.1は、大腸菌周辺質に対する抗体断片の発現用に設計したプラスミドである(図1)。ベクターpACR.1は、主なエレメントとして、LacZプロモーター、シグナルペプチド、断片コード遺伝子の挿入用のNcoI及びNotI制限部位、c−mycペプチドをコードするドメイン、及び6ヒスチジンをコードする配列を有し、後者はIMAC精製用である。ディスプレイscFv抗体断片L3H6、L3H5及びL3H7をコードするファージミドに対応するDNAは、3つの個別PCR反応用の鋳型として使用した。これらの手順はProofStart(Stratagene)酵素を使用し、製造者の説明書に従い実施した。表6中の合成オリゴヌクレオチドはプライマーとして使用した。
BL21大腸菌コンピテントセルをプラスミドpACR.1−scFvL3H6、pACR.1−scFvL3H5及びpACR.1−scFvL3H7で形質転換した。
scFv2H1と比較した、scFvL3H6、scFvL3H5及びscFvL3H7抗体断片による異なるVEGF変異体の免疫化学的認識の、ELISAによる特徴付け。
Nunc96ウエルMaxisorpイムノプレートを、4℃で16時間PBS中1μg/mlの濃度で、ヒトVEGF−Aのアイソフォーム121及び165(Peprotech)、マウスVEGF(Peprotech)及びP64K−VEGFKDR−(Morera、Y、et al.2008.Angiogenesis 11(4):381〜393頁)でコーティングした。P64K−VEGFKDR−は、VEGFR2受容体(KDR)とのその相互作用を低減するために残基82、84及び86を突然変異させた、ヒトVEGFを表す大腸菌において生成した組換えタンパク質である。PBS−スキムミルク4%でプレートをブロッキングした後、PBS−スキムミルク4%に希釈したscFvL3H6、L3H5、L3H7及び2H1抗体断片を10μg/mLの濃度で加え、22℃で1時間インキュベートした。数回洗浄した後、ペルオキシダーゼとコンジュゲートした9E10モノクローナル抗体を加えて1時間おいた。洗浄後、固相と結合した断片を、基質溶液を加えることにより検出した。吸光度はマイクロプレートリーダーにおいて492nmで読み取った。無関連抗HBsAgscFvは陰性対照として使用した(Ayala、M.et al.1995.Biotechniques 18:832〜842頁)。
抗体断片scFvL3H6、scFvL3H5、scFvL3H7及びscFv2H1によるVEGF受容体相互作用の遮断。
ELISA競合システムを使用して、本発明者らは、ヒトVEGF受容体とVEGF組換え受容体VEGFR2(KDR)とVEGFR1(FLT−1)の間の相互作用を遮断する、精製抗体断片scFvL3H6、scFvL3H5、scFvL3H7及びscFv2H1の能力を評価した。これらのアッセイは、増大させた濃度の断片を加えることによる、固体表面に吸着した可溶性受容体KDR−Fc及びFLT−1−FcとヒトVEGF−Aの結合の阻害に基づいた。
ヒトVEGFに対する抗体断片scFvL3H6、scFvL3H5、scFvL3H7及びscFv2H1の親和性測定。
ヒトVEGFに対する抗体断片scFvL3H6、scFvL3H5、scFvL3H7及びscFv2H1の結合親和性を、BIAcore−X(BIAcore、Sweden)を使用して測定した。CM5センサーチップは、製造者の説明書に従い、N−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を使用して、ヒトVEGFの共有結合を介して活性化した。ヒトVEGFのアイソフォーム165(PeproTech)は10mmol/l酢酸ナトリウムバッファー(pH5.5)中に5μg/mlまで希釈し、5μl/分の流量で注入して約290応答単位の結合タンパク質を得た。
抗体断片FabL3H6、FabL3H5及びFabL3H7の生成及び特徴付け。
(a)pFabHum−1ベクターでのクローニング及び配列決定
図4は、形質転換大腸菌の周辺質及び培養培地における可溶性Fab抗体断片の生成に使用した、プラスミドpFabHum−1の概略図である。このベクターは、LacZプロモーター、RBS、SP配列、軽鎖可変領域に関するクローニング部位(SalI及びAvrII)、及びヒト免疫グロブリンCλドメインをコードする配列、次に別のRBS、SP、及び重鎖可変領域に関するクローニング部位(ApaLI及びBstEII)、次にヒトIgG1Fcヒンジ領域の第一システインを含めるために延長させたヒト免疫グロブリンCH1ドメインをコードする配列を有する。ベクター中に供給される重鎖可変領域−CH1は、いずれもC末端において、IMAC精製用に6ヒスチジンドメイン、及び分析目的でc−mycペプチドに関して発現させる。
BL21大腸菌コンピテントセルをpFabL3H6、pFabL3H5及びpFabL3H7で形質転換した。形質転換体は選択固体培地に播種し、37℃で16時間増殖させた。それぞれの構築物を表すコロニーは液体培地で増殖させ、600nmで、IPTGを培地に加えることにより、1に等しいODをFab発現に関して誘導した。細胞は遠心分離し、培養上清はカップリングバッファーで透析し、アガロース−NTA(QIAGEN)に直接独立に施した。洗浄で汚染物質を除去した後、結合したタンパク質を250mMのイミダゾールで溶出させた。
精製抗体断片FabL3H6、FabL3H5及びFabL3H7を、参照Fab2H1−32(WO2008/052489A1)を使用して、ELISAにおけるヒトVEGF−Aの認識に関して評価した。Nunc96ウエルMaxisorpイムノプレートを、4℃で16時間PBS中1μg/mlの濃度で、ヒトVEGF−Aのアイソフォーム121及び165(Peprotech)、マウスVEGF(Peprotech)及びP64K−VEGFKDR−(Morera、Y、et al.2008.Angiogenesis 11(4):381〜393頁)でコーティングした。PBS−スキムミルク4%でプレートをブロッキングした後、PBS−スキムミルク4%に希釈したFab抗体断片を10μg/mLの濃度で加え、22℃で1時間インキュベートした。数回洗浄した後、ペルオキシダーゼとコンジュゲートした9E10モノクローナル抗体を加えて1時間おいた。洗浄後、固相と結合した断片を、基質溶液を加えることにより検出した。吸光度はマイクロプレートリーダーにおいて492nmで読み取った。抗ヒトEGF受容体抗体ニモツズマブの酵素による消化から誘導した無関連FabもhR3と称した(Boland、W.K y Bebb、G.2009.Expert Opin.Biol.Ther.9(9):1〜8頁)。
二量体分子scFv2−FcL3H6、scFv2−FcL3H5及びscFv2−FcL3H7の作製及び認識の特徴付け。
(a)抗体様分子scFv2−FcL3H6、scFv2−FcL3H5及びscFv2−FcL3H7を産生するトランスフェクトーマの作製
抗体様分子scFv2−FcL3H6、scFv2−FcL3H5及びscFv2−FcL3H7を得るために、鋳型としてプラスミドpACR.1−scFvL3H6、pACR.1−scFvL3H5及びpACR.1−scFvL3H7、並びに表10中に示す合成オリゴヌクレオチドを使用してPCRを実施して、これらの抗体断片をコードするDNA配列を改変し、後のクローニングに適合させた。この手順は、製造者の説明書に従いKODDNAポリメラーゼ(Novagen)を用いて実施した。
scFv2−FcL3H6、scFv2−FcL3H5及びscFv2−FcL3H7分子を産生したトランスフェクトーマクローンを、162cm2フラスコ中、0.5%ウシ胎児血清を含有する培地中で培養した。高い細胞密度を得た後、上清を回収し、0.1Mのリン酸ナトリウムバッファー、pH7.0中に1:1希釈し、次いでscFv2−Fc分子を、プロテインAセファロースファストフロー4(Amersham)を使用したアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。異なるscFv2−Fc分子を0.2Mのグリシンバッファー、pH4.0で独立に溶出させ、1Mのトリス、pH10.0ですぐに中和した。PBSで透析した後、280nmでの吸光度測定によりタンパク質濃度を計算した。純度は12%SDS−PAGEにより推定した。精製分子のサンプルは、非精製上清と比較して、(a)中に記載したのと同様にELISAにより試験し、ヒトVEGF−Aに対する適切な認識活性を示した。
scFvL3H6、scFvL3H5及びscFvL3H7抗体断片によって認識されるヒトVEGFにおける機能性エピトープの同定。
ヒトVEGF121を入手し提示するため、突然変異体を最初に選択し、分子の三次元構造分析(PDB:1FLT)、他の抗体による認識が報告された領域の位置、及びヒトVEGFとネズミVEGFの間の差に基づいて残基を突然変異させた。突然変異させた残基は表11中に示す。
ヒトVEGFで刺激したヒト臍帯静脈内皮細胞(HuVEC)のモデルにおける、ヒトVEGFを認識する異なる組換え抗体のin vitro抗増殖効果の評価。
分子scFvL3H6、scFvL3H5、scFvL3H7、scFv2−FcL3H6、scFv2−FcL3H5及びscFv2−FcL3H7のin vitro抗増殖効果を、ヒトVEGFで刺激したヒト臍帯静脈内皮細胞(HuVEC)のモデルにおいて決定した。抗体scFv2H1及びscFv2−Fc2H1−8.2(WO2008/052489A1)は参照として使用し、scFv抗HBsAg(Ayala、M.et al.1995.Biotechniques18:832〜842頁)及びニモツズマブ(Center for Molecular Immunology、Havana)は陰性対照として使用した。阻害対照として、可溶性KDR−Fc a 1μg/mL(Sigma)を利用した。
マウス皮下マトリゲルペレットモデルにおける、ヒトVEGFを認識する異なる組換え抗体のin vivo抗血管新生効果の評価。
二価分子scFv2−FcL3H6、scFv2−FcL3H5及びscFv2−FcL3H7のin vivo抗血管新生効果を、Passaniti et al.によって記載された実験モデルにおいて試験した(Passaniti A et al.1992.Lab Invest.67:519〜28頁)。比較用に、二価抗体型分子scFv2−Fc2H1 8.2(WO2008/052489A1)を使用した。このモデルでは、血管新生が、血管新生促進因子の存在下での、C57Bl/6マウス(CENPALAB、Habana)への細胞外マトリックスタンパク質の抽出物(マトリゲル、Becton Dickinson)の皮下接種によって誘導される。動物は10匹のグループに分け、200ngのヒトVEGF(Peprotech)、無関連抗体(CB−Hep.1、抗HBsAg、Heber Biotec、Havana)、又は阻害対照として10μgのKDR−Fc(Sigma)を含めた100μgの試験分子を含有する500μLのマトリゲルを腹部領域に皮下注射した。6日後に動物を屠殺し、マトリゲルペレットを抽出し、各々のヘモグロビン含有量を、製造者の説明書に従い、Drabkinの試薬キット(Sigma)を使用したDrabkinの方法により決定した。分子scFv2−FcL3H6、scFv2−FcL3H5及びscFv2−FcL3H72は、マトリゲルペレットにおいてヒトVEGFによって誘導される血管新生を有意に阻害し(p<0.001)、これはヘモグロビン含有量の低下と相関がある。図9中で見ることができるように、得られた阻害値は、組換え抗体scFv2−Fc2H1 8.2によって生じた阻害値より3倍高い。
A673ヒト腫瘍横紋筋肉腫細胞を異種移植したヌードマウスにおける、組換え抗体scFv2−FcL3H6、scFv2−FcL3H5及びscFv2−FcL3H7のin vivo抗腫瘍効果の評価。
腫瘍及び幾つかの腫瘍間質細胞により誘導される血管新生は、腫瘍増殖及び播種に必要不可欠である。この血管新生促進効果の主なメディエーターは、これらの細胞要素によって生成されるVEGFである。このため、抗血管新生物質のアッセイに使用するモデルは、動物における腫瘍増殖の阻害のモデルである。本特許中に記載する新たな抗体はヒトVEGFを好ましいことに同定するので、ヒト腫瘍細胞を同系無胸腺マウス(ヌードマウス;nu/nu)に接種する腫瘍増殖モデルをマウスにおいて実施する。この実験中、本発明者らは、8〜10週齢の、BALB/c系統(CENPALAB、Havana)の5群の5nu/nu無胸腺マウスを使用した。治療群に、組換え抗体scFv2−FcL3H6、scFv2−FcL3H5及びscFv2−FcL3H7、参照として組換え分子scFv2−Fc2H1−8.2(WO2008/052489A1)、及び陰性対照として抗HBsAgCB−Hep.1ネズミモノクローナル抗体(Heber Biotec、Habana)を、いずれも2.5mg/kg、PBS pH7.2中の用量で分配した。マウスには、右背面領域に1.5×107個のヒトA673腫瘍細胞(ATCC、CRL1598)を皮下注射した。この多量の細胞接種原を、使用治療用量と共に利用して、異なる試験抗体の抗腫瘍効果の差をすぐに実証した。腫瘍が200mm3の体積に達したとき、マウスを5匹の5群にランダムに分けて、各実験群に関して示すように治療を開始した。投与は3週間の間2日毎に、200μLの体積で腹腔内に行った。腫瘍増殖のフォローアップは、デジタルカリパーを使用し最長(長さ)、及び最狭(幅)腫瘍径を測定して行った。腫瘍体積は、腫瘍体積(mm3)=0.52×長さ(mm)×幅2(mm)として計算した。観察期間中の腫瘍体積は、一元配置ANOVA stadigraph及びボンフェローニ事後検定を使用して比較した。一定治療期間後、動物を屠殺し、腫瘍は外科手術によって除去し、ヘマトキシリン及びエオシンを使用して組織学的に分析した。
横紋筋肉腫系A673のヒト腫瘍細胞を接種したヌードマウスにおいて、腫瘍領域中に選択的に存在する131I−放射標識scFvL3H6断片の能力。
A673細胞の腫瘍増殖に対応する領域に存在するscFvL3H6断片の能力を決定するため、この断片、及び陰性対照(ネズミ抗B型肝炎表面抗原scFv;scFv−Hep.1;Ayala、M.et al.1995.Biotechniques 18:832〜842頁)を、それぞれ1.51MBq/5μg及び1.55MBq/5μgの最終比活性でIodogen手順(Fraker PJ、Speck JC Jr.1978.Biochem Biophys Res Comm 80:849〜857頁)を使用して、131I(Amersham、UK)で標識した。
scFvL3H6断片及び二価分子scFv2−FcL3H6を使用した、非ヒト霊長類における実験的脈絡膜血管新生(CNV)の予防。
実験的脈絡膜血管新生(CNV)のモデルとして、本発明者らは、Krzystolik et al.(Krzystolik M.G、et al.2006.Acta Ophthalmol 120:338〜346頁)によって報告されたモデルを利用した。6匹のカニクイザル(Macaca fascicularis、CENPALAB、Havana)を、動物試験実施適正基準に従い維持し操作した。動物には、ケタミン塩酸塩、マレイン酸アセプロマジン、及び硫酸アトロピンの筋肉内注射を用いる全手順のため麻酔をかけた。プロパラカイン塩酸塩を用いた局所麻酔も使用した。除核及び安楽死前の麻酔は静脈内ナトリウムペントバルビタールで行った。アルゴンレーザー照射を使用して黄斑においてCNV膜を誘導し、50μmと100μmの間の適用地点で、水疱及びわずかな出血をもたらす手順を確実にした。写真撮影及び蛍光血管造影法を使用して、病巣の拡大及び特徴を検出し測定した。動物の目は、異なる日時、断片及びプラシーボ及びレーザー照射手順の適用前後、並びに実験の最後で調べ、除核及び動物屠殺で終わらせた。
Claims (21)
- i)配列番号1、配列番号2及び配列番号3の配列により構成される群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、及びヌクレオチド配列の配列番号7によってコードされる軽鎖可変領域、又はii)アミノ酸配列の配列番号4、配列番号5及び配列番号6により構成される群から選択される重鎖可変領域、及びアミノ酸配列の配列番号8を有する軽鎖可変領域を含む組換え抗体。
- アミノ酸残基K101、R103、E105及びY25が抗体−抗原相互作用の基盤であるヒト血管内皮増殖因子A(VEGF−A)における機能性エピトープを同定する組換え抗体。
- i)ヌクレオチド配列の配列番号1によってコードされる重鎖可変領域、及びヌクレオチド配列の配列番号7によってコードされる軽鎖可変領域、又はii)アミノ酸配列の配列番号4からなる重鎖可変領域、及びアミノ酸配列の配列番号8からなる軽鎖可変領域を含む、請求項2に記載の組換え抗体。
- 異なるアイソフォームのヒトVEGF−Aのin vitro刺激効果、及びin vivo血管新生促進効果に干渉する、請求項1〜3に記載の組換え抗体。
- 単鎖Fv(scFv)型の抗体断片である、請求項1〜4に記載の組換え抗体。
- i)配列番号9、配列番号11及び配列番号13により構成されるヌクレオチド配列の群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされ、又はii)配列番号10、配列番号12及び配列番号14により構成される群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項5に記載の組換え抗体。
- Fab型の抗体断片である、請求項1〜4に記載の組換え抗体。
- i)配列番号15と配列番号16、配列番号19と配列番号20、及び配列番号23と配列番号24により構成される群から選択されるヌクレオチド配列の対によりそれらの2本の鎖に関してコードされ、又はii)配列番号17と配列番号18、配列番号21と配列番号22、及び配列番号25と配列番号26により構成される群から選択されるアミノ酸配列の対によりそれらの2本の鎖に関して構成される、請求項7に記載の組換え抗体。
- scFv2−Fc型であり、scFv断片がスペーサーにより、そのタンパク質型で別の同一ポリペプチド鎖と共有結合して二量体分子を形成するヒト免疫グロブリンのヒンジ、CH2及びCH3定常ドメインと連結している、請求項1〜4に記載の組換え抗体。
- ヌクレオチド配列の配列番号27、配列番号29及び配列番号31により構成される群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされ、又はii)配列番号28、配列番号30及び配列番号32により構成される群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項9に記載の組換え抗体。
- ヒト免疫グロブリンのFc定常ドメインがIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4型である、請求項9に記載の組換え抗体。
- 重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列の配列番号1、配列番号2又は配列番号3、及び軽鎖可変領域をコードする配列番号7が、1つは重鎖可変領域、次にヒトIgG1免疫グロブリンの定常ドメインCH1、ヒンジ、CH2及びCH3として、もう1つは軽鎖可変領域、次にヒトCκ又はCλ定常ドメインとして、2本のポリペプチド鎖をコードする配列中に含まれる、請求項1から4までのいずれか一項に記載の組換え抗体。
- ヒト免疫グロブリンの定常ドメインがIgG2、IgG3又はIgG4型である、請求項12に記載の組換え抗体。
- 請求項1〜4に記載の組換え抗体の同等な変異体である組換え抗体。
- 放射性同位体、化学的作用物質、又は生物的作用物質とさらにコンジュゲートしている、前出請求項のいずれか一項に記載の組換え抗体。
- 組換え細菌又は哺乳動物細胞において産生される、請求項1〜14に記載の組換え抗体。
- 請求項1〜14に記載の組換え抗体をコードするベクターであって、組換えDNA遺伝子操作によって得られ、宿主細胞中に組み込むことができるプラスミド又は配列である、上記ベクター。
- 請求項1〜14に記載の組換え抗体を含む医薬組成物。
- 徐放可能であることで特徴付けられる、請求項18に記載の医薬組成物。
- 悪性腫瘍及びその転移、急性及び慢性炎症過程、自己免疫過程、並びに加齢黄斑変性などの目の疾患などの、血管新生の増大を伴う実体の免疫療法用の医薬品を製造するための、請求項1〜14に記載の組換え抗体の使用。
- イメージング技術による悪性腫瘍及びその転移のin vivo診断用の放射性医薬品を製造するための、請求項1〜14に記載の組換え抗体の使用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CU20100264A CU23895B1 (es) | 2010-12-28 | 2010-12-28 | Anticuerpos recombinantes contra el factor de crecimiento del endotelio vascular (vegf) obtenidos mediante mutagénesis de regiones variables |
CU2010-0264 | 2010-12-28 | ||
PCT/CU2011/000009 WO2012089176A1 (es) | 2010-12-28 | 2011-12-26 | Anticuerpos recombinantes contra el factor de crecimiento del endotelio vascular (vegf) obtenidos mediante mutagenesis de regiones variables |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014504498A true JP2014504498A (ja) | 2014-02-24 |
JP6082698B2 JP6082698B2 (ja) | 2017-02-15 |
Family
ID=45768110
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013546584A Expired - Fee Related JP6082698B2 (ja) | 2010-12-28 | 2011-12-26 | 可変領域の突然変異誘発によって得られる血管内皮増殖因子(vegf)に対する組換え抗体 |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9505830B2 (ja) |
EP (1) | EP2662388B1 (ja) |
JP (1) | JP6082698B2 (ja) |
KR (1) | KR101896108B1 (ja) |
CN (1) | CN103370336B (ja) |
AR (1) | AR084618A1 (ja) |
AU (1) | AU2011352474B2 (ja) |
BR (1) | BR112013016684A2 (ja) |
CA (1) | CA2823233C (ja) |
CU (1) | CU23895B1 (ja) |
ES (1) | ES2687183T3 (ja) |
MX (1) | MX344915B (ja) |
MY (1) | MY166550A (ja) |
RU (1) | RU2557309C2 (ja) |
TW (1) | TWI555757B (ja) |
UY (1) | UY33844A (ja) |
WO (1) | WO2012089176A1 (ja) |
ZA (1) | ZA201305031B (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2021508472A (ja) * | 2017-12-29 | 2021-03-11 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | 抗vegf抗体及び使用の方法 |
JP2022514362A (ja) * | 2018-12-21 | 2022-02-10 | エフ.ホフマン-ラ ロシュ アーゲー | 抗vegf抗体のvegf-r1への結合阻害を改善する方法 |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9840553B2 (en) | 2014-06-28 | 2017-12-12 | Kodiak Sciences Inc. | Dual PDGF/VEGF antagonists |
CL2014002941A1 (es) * | 2014-10-30 | 2015-04-06 | Univ Concepcion | Moléculas polipeptídicas contra el factor de crecimiento del endotelio vascular (vegf) |
AU2016381964B2 (en) | 2015-12-30 | 2024-02-15 | Kodiak Sciences Inc. | Antibodies and conjugates thereof |
WO2021072265A1 (en) | 2019-10-10 | 2021-04-15 | Kodiak Sciences Inc. | Methods of treating an eye disorder |
CU20210101A7 (es) | 2021-12-15 | 2023-07-12 | Ct Ingenieria Genetica Biotecnologia | Polipéptidos que se unen a factores de crecimiento proangiogénicos |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010508033A (ja) * | 2006-11-01 | 2010-03-18 | セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア | 血管内皮増殖因子(vegf)に対する組換え抗体 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK0672142T3 (da) | 1992-12-04 | 2001-06-18 | Medical Res Council | Multivalente og multispecifikke bindingsproteiner samt fremstilling og anvendelse af disse |
US5730977A (en) | 1995-08-21 | 1998-03-24 | Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. | Anti-VEGF human monoclonal antibody |
US20050106667A1 (en) | 2003-08-01 | 2005-05-19 | Genentech, Inc | Binding polypeptides with restricted diversity sequences |
WO2008105248A1 (ja) | 2007-02-27 | 2008-09-04 | Nikon Corporation | ズームレンズと、これを有する光学装置 |
US9209965B2 (en) | 2014-01-14 | 2015-12-08 | Microsemi Semiconductor Ulc | Network interface with clock recovery module on line card |
-
2010
- 2010-12-28 CU CU20100264A patent/CU23895B1/es active IP Right Grant
-
2011
- 2011-12-26 ES ES11820879.2T patent/ES2687183T3/es active Active
- 2011-12-26 EP EP11820879.2A patent/EP2662388B1/en active Active
- 2011-12-26 MX MX2013007645A patent/MX344915B/es active IP Right Grant
- 2011-12-26 KR KR1020137019847A patent/KR101896108B1/ko active IP Right Grant
- 2011-12-26 JP JP2013546584A patent/JP6082698B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2011-12-26 US US13/976,060 patent/US9505830B2/en active Active
- 2011-12-26 CA CA2823233A patent/CA2823233C/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-12-26 MY MYPI2013701133A patent/MY166550A/en unknown
- 2011-12-26 BR BR112013016684A patent/BR112013016684A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2011-12-26 WO PCT/CU2011/000009 patent/WO2012089176A1/es active Application Filing
- 2011-12-26 RU RU2013134983/10A patent/RU2557309C2/ru active
- 2011-12-26 AU AU2011352474A patent/AU2011352474B2/en not_active Ceased
- 2011-12-26 CN CN201180066879.4A patent/CN103370336B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2011-12-27 TW TW100148878A patent/TWI555757B/zh not_active IP Right Cessation
- 2011-12-27 AR ARP110104967A patent/AR084618A1/es unknown
- 2011-12-28 UY UY0001033844A patent/UY33844A/es not_active Application Discontinuation
-
2013
- 2013-07-04 ZA ZA2013/05031A patent/ZA201305031B/en unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010508033A (ja) * | 2006-11-01 | 2010-03-18 | セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア | 血管内皮増殖因子(vegf)に対する組換え抗体 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6015033976; J Biotechnol.,2011 Jan 20,151(2),p.166-74,Epub 2010 Dec 15 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2021508472A (ja) * | 2017-12-29 | 2021-03-11 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | 抗vegf抗体及び使用の方法 |
JP7436365B2 (ja) | 2017-12-29 | 2024-02-21 | エフ. ホフマン-ラ ロシュ アーゲー | 抗vegf抗体及び使用の方法 |
JP2022514362A (ja) * | 2018-12-21 | 2022-02-10 | エフ.ホフマン-ラ ロシュ アーゲー | 抗vegf抗体のvegf-r1への結合阻害を改善する方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP6082698B2 (ja) | 2017-02-15 |
KR20140019316A (ko) | 2014-02-14 |
KR101896108B1 (ko) | 2018-09-10 |
UY33844A (es) | 2012-07-31 |
US20140086829A1 (en) | 2014-03-27 |
MX2013007645A (es) | 2013-12-02 |
ZA201305031B (en) | 2014-03-26 |
US9505830B2 (en) | 2016-11-29 |
AU2011352474A1 (en) | 2013-08-15 |
AU2011352474B2 (en) | 2017-02-16 |
CN103370336A (zh) | 2013-10-23 |
CA2823233C (en) | 2020-06-09 |
TW201305203A (zh) | 2013-02-01 |
RU2557309C2 (ru) | 2015-07-20 |
WO2012089176A1 (es) | 2012-07-05 |
EP2662388A1 (en) | 2013-11-13 |
EP2662388B1 (en) | 2018-08-22 |
AR084618A1 (es) | 2013-05-29 |
TWI555757B (zh) | 2016-11-01 |
CN103370336B (zh) | 2015-11-25 |
CU20100264A7 (es) | 2012-07-31 |
RU2013134983A (ru) | 2015-02-10 |
MX344915B (es) | 2017-01-10 |
CU23895B1 (es) | 2013-05-31 |
MY166550A (en) | 2018-07-16 |
CA2823233A1 (en) | 2012-07-05 |
ES2687183T3 (es) | 2018-10-24 |
BR112013016684A2 (pt) | 2017-06-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6082698B2 (ja) | 可変領域の突然変異誘発によって得られる血管内皮増殖因子(vegf)に対する組換え抗体 | |
JP5476404B2 (ja) | Kdrに特異的なヒト抗体及びその利用 | |
WO2021042694A1 (zh) | 抗vegf单域抗体及其应用 | |
JP2012507299A (ja) | Light標的分子およびその使用 | |
JPH08500962A (ja) | 癌マーカー用生物合成結合蛋白質 | |
EP1411983A1 (en) | Bispecific antibodies that bind to vegf receptors | |
US20100151566A1 (en) | Recombinant antibodies against the vascular endothelial growth factor (vegf) | |
KR20100021577A (ko) | 에스.아우레우스 ORF0657n을 표적화하는 항원 결합 단백질 | |
JP7212391B2 (ja) | a-syn/IGF1Rに対する二重特異抗体およびその用途 | |
EP4238989A1 (en) | Anti-il5 nanoantibody and use thereof | |
JP2013540420A (ja) | 血管内皮増殖因子2(vegfr−2/kdr)に結合し、その活性を遮断する組換え抗体構造 | |
KR20230125042A (ko) | 항-tslp 나노항체 및 이의 응용 | |
JP6074071B2 (ja) | VEGFR2/Ang2化合物 | |
KR101854529B1 (ko) | 인간 및 마우스 Sema3A에 교차결합하는 항체 및 그의 용도 | |
Weber | Novel phage display libraries and selection technologies for the isolation of fully human antibodies for pharmaceutical applications |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140912 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150821 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20151118 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20151218 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160121 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20160517 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160909 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20160912 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20161005 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20161129 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161213 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170117 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170123 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6082698 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |