JP6074071B2 - VEGFR2/Ang2化合物 - Google Patents
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Description
アンジオポエチン−1(Ang1)およびAng2は、血管新生を制御する別の鍵となる経路のメンバーである。Ang1およびAng2は、内皮細胞に特異的な受容体チロシンキナーゼTie2に結合する、分泌される因子である。Ang1は、周細胞によって構成的に分泌され、Tie2受容体を介して血管の完全性を安定なものとする。Ang2は、刺激(例えば、創傷治癒、腫瘍成長)に対する応答のときにのみ内皮細胞から放出され、血管の萌出を助長し、Tie2シグナル伝達を介して周細胞−内皮細胞相互作用を阻害する。ヒトAng2に対する抗体は、VEGFブロッカーであるアフリベルセプトと組み合わせて投薬されると、腫瘍成長を阻害し、マウス異種移植腫瘍モデルにおいて腫瘍血管系を減少させることが示されている(Dalyら、Cancer Res(2013)73(1):108)。複数の研究段階のAng2抗体が、現在臨床試験中である。
2つの一本鎖フラグメント可変(scFv)ポリペプチドに2つのリンカーによって融合した抗体を含み、
(a)この抗体が、2つの同一の重鎖(HC)と2つの同一の軽鎖(LC)とを含み、それぞれのHCが、アミノ酸配列が配列番号1、配列番号2、配列番号3または配列番号4によって与えられる重鎖可変領域(HCVR)を含み、それぞれのLCが、アミノ酸配列が配列番号13、配列番号14または配列番号15によって与えられる軽鎖可変領域(LVCR)を含み、
(b)2つのscFvポリペプチドが同一であり、それぞれが、LCVRに作動可能に連結するHCVRを含み、それぞれのHCVRが、配列番号21または配列番号22に与えられるアミノ酸配列を有し、それぞれのLCVRが、配列番号23または配列番号24に与えられるアミノ酸配列を有し、
(c)2つのリンカーが、scFvポリペプチドの1つのアミノ末端に対し、抗体の1つのHCのカルボキシ末端にそれぞれ作動可能に連結する、同一のグリシンを豊富に含むリンカーである、化合物を提供する。
(a)抗体は、2つの同一の重鎖(HC)と、2つの同一の軽鎖(LC)とを含み、それぞれのHCは、アミノ酸配列が配列番号1、配列番号2、配列番号3または配列番号4によって与えられる重鎖可変領域(HCVR)を含み、それぞれのLCは、アミノ酸配列が配列番号13、配列番号14または配列番号15によって与えられる軽鎖可変領域(LVCR)を含み、
(b)2つのscFvポリペプチドが同一であり、それぞれが、LCVRに作動可能に連結するHCVRを含み、それぞれのHCVRが、配列番号21または配列番号22に与えられるアミノ酸配列を有し、それぞれのLCVRが、配列番号23または配列番号24に与えられるアミノ酸配列を有し、
(c)2つのリンカーは、scFvポリペプチドの1つのアミノ末端に対し、抗体の1つのHCのカルボキシ末端にそれぞれ作動可能に連結する、同一のグリシンを豊富に含むリンカーである、
化合物を提供する。
化合物C、化合物D、化合物Eおよび化合物Fの抗体部分、scFv部分および抗体−リンカー−scFvのポリペプチド、およびこれらをコードするヌクレオチド配列を以下の「アミノ酸およびヌクレオチド配列」という表題の章に列挙する。それに加え、化合物C、化合物D、化合物Eおよび化合物Fの抗体部分、scFv部分および抗体−リンカー−scFvの配列番号を表1に示す。
(アッセイ)
(結合反応速度、アフィニティおよび選択性)
ヒトAng2およびヒトVEGFR2に対する本発明の化合物の結合反応速度、アフィニティおよび選択性を、当該技術分野で公知の方法に従って、表面プラズモン共鳴(SPR)バイオセンサー、例えば、Biacore(登録商標)2000、Biacore(登録商標)3000またはBiacore(登録商標)T100(GE HealthCare)を使用することによって決定してもよい。
このアッセイに本質的に記載されるように行う実験において、化合物Fは、匹敵する高いアフィニティでヒト、カニクイザル、マウスウサギおよびイヌのAng2に結合し、化合物Fは、匹敵する高いアフィニティでヒト、カニクイザル、ウサギおよびイヌのVEGFR2に結合する。
本発明の化合物による、ヒトAng2の受容体ヒトTie2に対するヒトAng2の結合の遮断を、固相in vitro ELISAアッセイによって測定してもよい。上述のin vitro細胞ベースアッセイを使用し、この化合物のscFvポリペプチド部分と同じHCDR配列およびLCDR配列を有するAng2抗体に対し、本発明の化合物の匹敵する遮断活性を確立してもよい。
本発明の化合物による、ヒトAng2のin vitroでの細胞における阻害を、Ang1およびAng2が用量依存的な溶液でヒトTie2に結合し、ヒトTieリン酸化を誘発する細胞ベースアッセイで測定してもよい。in vitro細胞ベースアッセイを使用し、本発明の化合物が、Ang2の効果を選択的になくすが、Ang1が介在するTie−2受容体のリン酸化は効果は選択的になくさない能力について評価してもよい。Ang2抗体、Ang1抗体およびコントロールヒトIgG4 PAAアイソタイプ抗体は、それぞれ、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして含まれていてもよい。
ヒトVEGFR2のin vitroでの細胞における阻害を、VEGFR2を発現する細胞株について、用量依存的な様式で、VEGFR2に対するVEGF165の結合が、VEGFR2リン酸化を誘発する細胞ベースアッセイで測定してもよい。上述のアッセイを使用し、本発明の化合物が、用量依存的な様式で、VEGF165が介在するVEGFR2受容体のリン酸化の効果を選択的になくす能力を評価してもよい。VEGFR2抗体および無関係な抗体ヒトIgG4 PAAアイソタイプは、それぞれ、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして含まれていてもよい。
本発明の化合物による、ヒトVEGFR2のin vitroでの細胞における阻害を、VEGF165が、用量依存的な様式でヒトVEGFR2の増殖を誘発する細胞ベースアッセイで測定してもよい。本発明の化合物が、VEGFR2を介するヒトVEGF165によって誘発される増殖の効果をなくす能力を、ヒトHMVEC−d(皮膚微小血管内皮細胞)で測定してもよい。VEGFR2、Ang2および無関係なヒトIgG4 PAA抗体は、それぞれ、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして含まれていてもよい。
このアッセイのために、5継代でのHMVEC−d細胞を、あらかじめ加温しておいた清澄培地で1回洗浄してもよく、内部の60ウェルの壁が白く、底部が透明の96ウェルプレート(BD 番号35−3377)中、2,000細胞/ウェル(100μlの成長培地中)になるように再懸濁させてもよい。蒸発を低減するために、縁部のウェルに250μlの補助物質を含まない培地を加えてもよい。4倍濃度での化合物およびヒトVEGF165(Lot ALY−BE01241−033)を、ポリプロピレンプレート中、補助物質を含まない培地で1:4に段階希釈してもよい。化合物(または補助物質を含まない培地のみ)を、50μl/ウェルで3個ずつ細胞に加えてもよく、その後、50μl/ウェルの4X VEGF165に加えてもよい。プレートを37℃、95%RH、5%CO2で5日間インキュベートしてもよい。化合物の最終濃度範囲は、0.012〜800nMであってもよく、ヒトVEGF165の最終濃度は、0.5nMであってもよい。
VEGFによって誘発されるコード生成のin vitroでの阻害を、in vitro同時培養系で測定してもよい。上述のアッセイを使用し、本発明の化合物による、VEGFによって誘発されるコード生成の阻害を測定してもよい。VEGFR2抗体は、ポジティブコントロールとして含まれてもよい。
Ang2抗体による生理学的血管新生のin vivoでの抑制を、マウスの網膜の血管成長モデルにおいて測定してもよい。上述のアッセイを使用し、本発明の化合物が、マウス網膜における生理学的な血管新生を抑制する能力を試験してもよい。
凝集度、発現中の均質性、物理安定性および化学安定性を含め、生成物の品質を評価し、課題を特定し、適切さを確認する。
化合物A(配列番号38の2つの第1のポリペプチドおよび配列番号39の2つの第2のポリペプチド)および化合物B(配列番号40の2つの第1のポリペプチドおよび配列番号39の2つの第2のポリペプチド)の精製および分析の間に、化合物の抗体部分からの非共有結合性軽鎖の存在を検出する。ミスフォールディングされた種を除去するための精製によって所望の生成物の最終的な収率が悪くなる。化合物の抗体部分のVHおよびVLと、scFvポリペプチドのドメインの折りたたみとの界面の不安定性は、両方とも、この問題に関与していることがわかっている。この軽鎖ミスペアリングの問題をなくすために、化合物の抗体部分のフレームワーク中の突然変異が使用されるが、この問題は、単に減るだけであり、解決はしていない。scFvポリペプチド中の多くの生殖細胞系フレームワークを試したが、発現プロフィールは向上しない。望ましい許容レベルの軽鎖ミスペアリング結果を得るために、化合物の抗体部分のCDRおよびフレームワークの操作と、scFvポリペプチドの操作を組み合わせることが必要である。
本発明の化合物におけるMab−ダイアボディ/Mab−scFv比率の測定を容易にするために、以下の処理を行う。典型的には、20μgの本発明の化合物を、Amicon Ultra−0.5mL遠心分離濾過デバイスを用い、150mMの塩化ナトリウムを含有する50mMのリン酸ナトリウム(pH6.6)とバッファーを交換する。サンプルを、約30μlになるまで濃縮し、次いで、1μlの新たに調製したFABricator酵素(Genovis、カタログ番号A0−FR1−020;2000Uを30μlのddH2Oに溶解)を加え、37℃で一晩インキュベートする。消化したサンプル(1μl)について、Waters Xevo G2−S質量分析計を取り付けたWaters Acquity UPLCで、LC/UV/MS分析を行う。サンプルをPLRP−S 50×1.0mm、1000Å、5um逆相カラム(Proxeon、カタログ番号PL1312−1502)に流速0.3ml/分、カラム温度80℃で入れる。アセトニトリル中、TEAの勾配を用い、サンプルをカラムから溶出させる。溶出物を、この流れを用いて最初に214nmのUVによって分析し、次いで、高感度モード、正の極性を用い、獲得範囲400〜4000m/zでの分析のために質量分析計に向かわせる。
温度保持ストレスにさらし得るさまざまな配合状態を製造することによって、本発明の化合物の化学安定性を評価してもよい。化学安定性の変化を、確立されたLCMSペプチドマッピング技術によってモニタリングしてもよい。簡単にいうと、試験物を得て、10mM クエン酸塩、pH 5.0、10mM クエン酸塩、pH6.5、1X PBS、pH7.4および10mM Tris、pH8.0の配合バッファーで最終濃度1mg/mlまで希釈し、それぞれのバッファー中、4℃で排他的に透析し、確実に完全にバッファーを交換してもよい。次いで、バッファーを交換したサンプルを、4℃または40℃で4週間インキュベートしてもよく、その後、サンプルを以下のようにLCMSによって分析してもよい。ストレスを受けた材料を、8Mグアニジンにバッファー交換し、DTTを用いた還元前に変性させ、その後のヨードアセトアミドによるアルキル化を行ってもよい。次いで、還元し、アルキル化したタンパク質を、Tris(pH7.5)とバッファー交換し、20:1のモル比で、37℃で4時間、トリプシンで消化してもよい。1μLの氷酢酸を加え、消化を止めてもよい。消化したペプチドフラグメントの分離は、0.2%ギ酸水溶液であらかじめ平衡状態にしたZorbax 1.8μm C18 2.1mm×50mmに捕捉し、その後に、0.3ml/分で操作された0.2%ギ酸アセトニトリル溶液を用いて溶出させることによって達成されてもよい。溶出したペプチドを、1走査/秒で300m/z〜2000m/zの陽イオンモードで走査するように設定されたAgilent ESI−QTOFセットを用い、すぐに分析してもよい。ESI源を、4000Vに設定し、温度を350℃に設定して、ネブライザガスを40psiに、コーンガスを12psiに設定してもよい。Agilent Mass Hunter Bio−confirmソフトウエアを使用し、トリプチンペプチドマススペクトルをタンパク質配列にアラインメントしてもよい。
カニクイザルにおいて、1回の静脈内投薬の後に、本発明の化合物のPKおよびPDを測定してもよい。
アミノ酸およびヌクレオチド配列
配列番号1(抗体のHCVR−化合物C)
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSAISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTEAFDIWGQGTLVTVSS
配列番号2(抗体のHCVR−化合物D)
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMLWVRQAPGKGLEWVSAISSSSSYTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTDAFDIWGQGTLVTVSS
配列番号3(抗体のHCVR−化合物E)
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSAISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTDAFDIWGQGTLVTVSS
配列番号4(抗体のHCVR−化合物F)
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMLWVRQAPGKGLEWVSAISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTDAFDIWGQGTLVTVSS
配列番号5(抗体のHC−化合物C)
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSAISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTEAFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
配列番号6(抗体のHC−化合物D)
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMLWVRQAPGKGLEWVSAISSSSSYTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTDAFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
配列番号7(抗体のHC−化合物E)
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSAISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTDAFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
配列番号8(抗体のHC−化合物F)
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMLWVRQAPGKGLEWVSAISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTDAFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
配列番号9(抗体のHC/リンカー/scFvポリペプチド−化合物C)
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSAISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTEAFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYNMVWVRQAPGQCLEWMGYIDPYNGGTGYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARTRDRYDVWYFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVYIAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRDTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYSSYPPTFGCGTKVEIK
配列番号10(抗体のHC/リンカー/scFvポリペプチド−化合物D)
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMLWVRQAPGKGLEWVSAISSSSSYTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTDAFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYNMVWVRQAPGQCLEWMGYIDPYNGGTGYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARTRDRYDVWYFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVYIAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRDTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYSSYPPTFGCGTKVEIK
配列番号11(抗体のHC/リンカー/scFvポリペプチド−化合物E)
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSAISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTDAFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYNMVWVRQAPGQCLEWMGYIDPYNGGTGYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARTRDRYDVWYFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVYIAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRDTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYSSYPPTFGCGTKVEIK
配列番号12(抗体のHC/リンカー/scFvポリペプチド−化合物F)
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMLWVRQAPGKGLEWVSAISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTDAFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQDVYIAVAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRDTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCHQYSSYPPTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTDYNMVWVRQAPGQCLEWMGYIDPYNGGTGYNQKFEGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARTRDRYDVWYFDVWGQGTLVTVSS
配列番号13(抗体のLCVR−化合物Cおよび化合物F)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASRGIDNWLTWYQQKPGKAPKLLIYEASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKAFPPTFGGGTKVDIK
配列番号14(抗体のLCVR−化合物D)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIDNWLTWYQQKPGKAPKLLIVEASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKRFPPTFGGGTKVDIK
配列番号15(抗体のLCVR−化合物E)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIDNWLTWYQQKPGKAPKLLIVEASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKAFPPTFGGGTKVDIK
配列番号16(抗体のLC−化合物Cおよび化合物F)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASRGIDNWLTWYQQKPGKAPKLLIYEASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKAFPPTFGGGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号17(抗体のLC−化合物D)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIDNWLTWYQQKPGKAPKLLIVEASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKRFPPTFGGGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号18(抗体のLC−化合物E)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIDNWLTWYQQKPGKAPKLLIVEASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKAFPPTFGGGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号19(scFvポリペプチド−化合物C、化合物D、化合物E)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYNMVWVRQAPGQCLEWMGYIDPYNGGTGYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARTRDRYDVWYFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVYIAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRDTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYSSYPPTFGCGTKVEIK
配列番号20(scFvポリペプチド−化合物F)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQDVYIAVAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRDTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCHQYSSYPPTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTDYNMVWVRQAPGQCLEWMGYIDPYNGGTGYNQKFEGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARTRDRYDVWYFDVWGQGTLVTVSS
配列番号21(ScFvポリペプチドのHCVR−化合物C、化合物D、化合物E)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYNMVWVRQAPGQCLEWMGYIDPYNGGTGYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARTRDRYDVWYFDVWGQGTLVTVSS
配列番号22(ScFvポリペプチドのHCVR−化合物F)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTDYNMVWVRQAPGQCLEWMGYIDPYNGGTGYNQKFEGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARTRDRYDVWYFDVWGQGTLVTVSS
配列番号23(ScFvポリペプチドのLCVR−化合物C、化合物D、化合物E)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVYIAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRDTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYSSYPPTFGCGTKVEIK
配列番号24(ScFvポリペプチドのLCVR−化合物F)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQDVYIAVAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRDTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCHQYSSYPPTFGCGTKVEIK
配列番号25(抗体のHC/リンカー/scFvポリペプチドのDNA−化合物C)
GAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATAGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGTCACAGAGGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACACTGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTGGCGGAGGCTCCGGGGGAGGGGGTAGCGGAGGAGGGGGATCCCAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGACTACAACATGGTGTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAATGCCTTGAGTGGATGGGATATATTGATCCTTACAATGGTGGTACTGGCTACAACCAGAAGTTCGAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAACGAGGGATAGATACGACGTCTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGAGGCGGAGGTTCCGGGGGAGGGGGCAGCGGAGGAGGCGGATCGGGCGGAGGAGGAAGTGGAGGCGGAGGCAGCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTTGGCGACAGAGTCACCATCACTTGTAAGGCCAGTCAGGATGTGTATATTGCTGTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCATCCACCCGGGACACTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCACCAATATAGCAGCTATCCTCCTACGTTCGGCTGCGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
配列番号26(抗体のLCのDNA−化合物Cおよび化合物F)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCTGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCGTGGTATTGACAACTGGTTAACGTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATTTACGAAGCATCCAGTTTGCAATCAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACTATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAAGCTAAGGCTTTTCCTCCCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGACATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC
配列番号27(抗体のHC/リンカー/scFvポリペプチドのDNA−化合物D)
GAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATAGCATGCTTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACACCTACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGTCACAGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACACTGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTGGCGGAGGCTCCGGGGGAGGGGGTAGCGGAGGAGGGGGATCCCAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGACTACAACATGGTGTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAATGCCTTGAGTGGATGGGATATATTGATCCTTACAATGGTGGTACTGGCTACAACCAGAAGTTCGAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAACGAGGGATAGATACGACGTCTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGAGGCGGAGGTTCCGGGGGAGGGGGCAGCGGAGGAGGCGGATCGGGCGGAGGAGGAAGTGGAGGCGGAGGCAGCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTTGGCGACAGAGTCACCATCACTTGTAAGGCCAGTCAGGATGTGTATATTGCTGTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCATCCACCCGGGACACTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCACCAATATAGCAGCTATCCTCCTACGTTCGGCTGCGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
配列番号28(抗体のLCのDNA−化合物D)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCTGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTGACAACTGGTTAACGTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCGTCGAGGCATCCAGTTTGCAATCAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACTATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTAAGAGGTTTCCTCCCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGACATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC
配列番号29(抗体のHC/リンカー/scFvポリペプチドのDNA−化合物E)
GAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATAGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCGATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGTCACAGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACACTGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTGGCGGAGGCTCCGGGGGAGGGGGTAGCGGAGGAGGGGGATCCCAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGACTACAACATGGTGTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAATGCCTTGAGTGGATGGGATATATTGATCCTTACAATGGTGGTACTGGCTACAACCAGAAGTTCGAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAACGAGGGATAGATACGACGTCTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGAGGCGGAGGTTCCGGGGGAGGGGGCAGCGGAGGAGGCGGATCGGGCGGAGGAGGAAGTGGAGGCGGAGGCAGCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTTGGCGACAGAGTCACCATCACTTGTAAGGCCAGTCAGGATGTGTATATTGCTGTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCATCCACCCGGGACACTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCACCAATATAGCAGCTATCCTCCTACGTTCGGCTGCGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
配列番号30(抗体のLCのDNA−化合物E)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCTGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTGACAACTGGTTAACGTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCGTCGAGGCATCCAGTTTGCAATCAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACTATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTAAGGCTTTTCCTCCCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGACATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC
配列番号31(抗体のHC/リンカー/scFvポリペプチドのDNA−化合物F)
GAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATAGCATGCTTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGTCACAGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACACTGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTGGCGGAGGCTCCGGGGGAGGGGGTAGCGGAGGAGGGGGATCCGACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGTATATTGCTGTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCCACCCGGGACACTGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAATATAGCAGCTATCCTCCTACGTTCGGCTGCGGGACCAAGGTGGAGATCAAAGGTGGCGGAGGATCTGGTGGAGGTGGCTCAGGAGGTGGCGGAAGCGGCGGAGGTGGAAGTCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGACTACAACATGGTGTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAATGCCTTGAGTGGATGGGATATATTGATCCTTACAATGGTGGTACTGGCTACAACCAGAAGTTCGAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAACGAGGGATAGGTACGACGTCTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
配列番号32(ヒトVEGFR2 ECD)
ASVGLPSVSLDLPRLSIQKDILTIKANTTLQITCRGQRDLDWLWPNNQSGSEQRVEVTECSDGLFCKTLTIPKVIGNDTGAYKCFYRETDLASVIYVYVQDYRSPFIASVSDQHGVVYITENKNKTVVIPCLGSISNLNVSLCARYPEKRFVPDGNRISWDSKKGFTIPSYMISYAGMVFCEAKINDESYQSIMYIVVVVGYRIYDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKPFVAFGSGMESLVEATVGERVRIPAKYLGYPPPEIKWYKNGIPLESNHTIKAGHVLTIMEVSERDTGNYTVILTNPISKEKQSHVVSLVVYVPPQIGEKSLISPVDSYQYGTTQTLTCTVYAIPPPHHIHWYWQLEEECANEPSQAVSVTNPYPCEEWRSVEDFQGGNKIEVNKNQFALIEGKNKTVSTLVIQAANVSALYKCEAVNKVGRGERVISFHVTRGPEITLQPDMQPTEQESVSLWCTADRSTFENLTWYKLGPQPLPIHVGELPTPVCKNLDTLWKLNATMFSNSTNDILIMELKNASLQDQGDYVCLAQDRKTKKRHCVVRQLTVLERVAPTITGNLENQTTSIGESIEVSCTASGNPPPQIMWFKDNETLVEDSGIVLKDGNRNLTIRRVRKEDEGLYTCQACSVLGCAKVEAFFIIEGAQEKTNLE
配列番号33(ヒトAng2)
YNNFRKSMDSIGKKQYQVQHGSCSYTFLLPEMDNCRSSSSPYVSNAVQRDAPLEYDDSVQRLQVLENIMENNTQWLMKLENYIQDNMKKEMVEIQQNAVQNQTAVMIEIGTNLLNQTAEQTRKLTDVEAQVLNQTTRLELQLLEHSLSTNKLEKQILDQTSEINKLQDKNSFLEKKVLAMEDKHIIQLQSIKEEKDQLQVLVSKQNSIIEELEKKIVTATVNNSVLQKQQHDLMETVNNLLTMMSTSNSAKDPTVAKEEQISFRDCAEVFKSGHTTNGIYTLTFPNSTEEIKAYCDMEAGGGGWTIIQRREDGSVDFQRTWKEYKVGFGNPSGEYWLGNEFVSQLTNQQRYVLKIHLKDWEGNEAYSLYEHFYLSSEELNYRIHLKGLTGTAGKISSISQPGNDFSTKDGDNDKCICKCSQMLTGGWWFDACGPSNLNGMYYPQRQNTNKFNGIKWYYWKGSGYSLKATTMMIRPADF
配列番号34
GGGGSGGGGS
配列番号35
GGGGSGGGGSGGGGS
配列番号36
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号37
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号38(抗体のHC/リンカー/scFvポリペプチド−化合物A)
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTDAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYNMVWVRQAPGQCLEWMGYIDPYNGGTGYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARTRDRYDVWYFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVYIAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRDTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYSSYPPTFGCGTKVEIK
配列番号39(抗体のLC−化合物Aおよび化合物B)
DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRASQGIDNWLGWYQQKPGKAPKLLIYDASNLDTGVPSRFSGSGSGTYFTLTISSLQAEDFAVYFCQQAKAFPPTFGGGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号40(抗体のHC/リンカー/scFvポリペプチド−化合物B)
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTDAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYNMVWVRQAPGQCLEWMGYIDPYNGGTGYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARTRDRYDVWYFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKASQDVYIAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRDTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYSSYPPTFGCGTKVEIK
[1]
化合物であって、
2つの一本鎖フラグメント可変(scFv)ポリペプチドに2つのリンカーによって融合した抗体を含み、
(a)この抗体が、2つの同一の重鎖(HC)と2つの同一の軽鎖(LC)とを含み、それぞれのHCが、アミノ酸配列が配列番号1、配列番号2、配列番号3または配列番号4によって与えられる重鎖可変領域(HCVR)を含み、それぞれのLCが、アミノ酸配列が配列番号13、配列番号14または配列番号15によって与えられる軽鎖可変領域(LVCR)を含み、
(b)2つのscFvポリペプチドが同一であり、それぞれが、LCVRに作動可能に連結するHCVRを含み、それぞれのHCVRが、配列番号21または配列番号22に与えられるアミノ酸配列を有し、それぞれのLCVRが、配列番号23または配列番号24に与えられるアミノ酸配列を有し、
(c)2つのリンカーが、scFvポリペプチドの1つのアミノ末端に対し、抗体の1つのHCのカルボキシ末端にそれぞれ作動可能に連結する、同一のグリシンを豊富に含むリンカーである、化合物。
[2]
2つのscFvポリペプチドが、それぞれ、1つのscFvポリペプチドのHCVRのアミノ末端に作動可能に連結する1つのscFvポリペプチドのLCVRのカルボキシ末端を含む、請求項1に記載の化合物。
[3]
抗体のそれぞれのHCVRは、配列番号1に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのLCVRは、配列番号13に与えられるアミノ酸配列を有し、scFvポリペプチドのそれぞれのHCVRは、配列番号21に与えられるアミノ酸配列を有し、scFvポリペプチドのそれぞれのLCVRは、配列番号23に与えられるアミノ酸配列を有する、請求項1または2に記載の化合物。
[4]
抗体のそれぞれのHCVRは、配列番号2に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのLCVRは、配列番号14に与えられるアミノ酸配列を有し、scFvポリペプチドのそれぞれのHCVRは、配列番号21に与えられるアミノ酸配列を有し、scFvポリペプチドのそれぞれのLCVRは、配列番号23に与えられるアミノ酸配列を有する、請求項1または2に記載の化合物。
[5]
抗体のそれぞれのHCVRは、配列番号3に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのLCVRは、配列番号15に与えられるアミノ酸配列を有し、scFvポリペプチドのそれぞれのHCVRは、配列番号21に与えられるアミノ酸配列を有し、scFvポリペプチドのそれぞれのLCVRは、配列番号23に与えられるアミノ酸配列を有する、請求項1または2に記載の化合物。
[6]
抗体のそれぞれのHCVRは、配列番号4に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのLCVRは、配列番号13に与えられるアミノ酸配列を有し、scFvポリペプチドのそれぞれのHCVRは、配列番号22に与えられるアミノ酸配列を有し、scFvポリペプチドのそれぞれのLCVRは、配列番号24に与えられるアミノ酸配列を有する、請求項1または2に記載の化合物。
[7]
抗体は、2つの重鎖(HC)と2つの軽鎖(LC)とを含み、それぞれのHCが、配列番号5、配列番号6、配列番号7または配列番号8のいずれかに与えられるアミノ酸配列を有し、それぞれのLCが、配列番号16、配列番号17または配列番号18のいずれかに与えられるアミノ酸配列を有する、請求項1または2に記載の化合物。
[8]
抗体のそれぞれのHCは、配列番号5に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのLCは、配列番号16に与えられるアミノ酸配列を有する、請求項7に記載の化合物。
[9]
抗体のそれぞれのHCは、配列番号6に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのLCは、配列番号17に与えられるアミノ酸配列を有する、請求項7に記載の化合物。
[10]
抗体のそれぞれのHCは、配列番号7に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのLCは、配列番号18に与えられるアミノ酸配列を有する、請求項7に記載の化合物。
[11]
抗体のそれぞれのHCは、配列番号8に与えられるアミノ酸配列を有し、抗体のそれぞれのLCは、配列番号16に与えられるアミノ酸配列を有する、請求項7に記載の化合物。
[12]
それぞれのscFvポリペプチドは、配列番号19または配列番号20のいずれかに与えられる同一のアミノ酸配列を有する、請求項1または7に記載の化合物。
[13]
それぞれのscFvポリペプチドは、配列番号19に与えられるアミノ酸配列を有する、請求項12に記載の化合物。
[14]
それぞれのscFvポリペプチドは、配列番号20に与えられるアミノ酸配列を有する、請求項12に記載の化合物。
[15]
化合物であって、2つの第1のポリペプチドと2つの第2のポリペプチドとを含み、それぞれの第1のポリペプチドは、配列番号9、配列番号10、配列番号11または配列番号12のアミノ酸配列を有し、それぞれの第2のポリペプチドは、配列番号16、配列番号17または配列番号18のアミノ酸配列を有する、化合物。
[16]
それぞれの第1のポリペプチドは、配列番号9のアミノ酸配列を有し、それぞれの第2のポリペプチドは、配列番号16のアミノ酸配列を有する、請求項15に記載の化合物。
[17]
それぞれの第1のポリペプチドは、配列番号10のアミノ酸配列を有し、それぞれの第2のポリペプチドは、配列番号17のアミノ酸配列を有する、請求項15に記載の化合物。
[18]
それぞれの第1のポリペプチドは、配列番号11のアミノ酸配列を有し、それぞれの第2のポリペプチドは、配列番号18のアミノ酸配列を有する、請求項15に記載の化合物。
[19]
それぞれの第1のポリペプチドは、配列番号12のアミノ酸配列を有し、それぞれの第2のポリペプチドは、配列番号16のアミノ酸配列を有する、請求項15に記載の化合物。
[20]
それぞれの第1のポリペプチドは、それぞれの第2のポリペプチドとともに鎖間ジスルフィド結合を形成し、第1のポリペプチドは、他の第1のポリペプチドとともに鎖間ジスルフィド結合を形成し、それぞれの第1のポリペプチドは、鎖内ジスルフィド結合を形成する、請求項15〜19のいずれか一項に記載の化合物。
[21]
哺乳動物細胞であって、配列番号9、配列番号10、配列番号11および配列番号12からなるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、配列番号16、配列番号17および配列番号18からなるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列とを含むDNA分子を含み、この細胞は、配列番号9、配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第1のポリペプチドと、配列番号16、配列番号17および配列番号18からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第2のポリペプチドとを含む化合物を発現する能力を有する、哺乳動物細胞。
[22]
配列番号9、配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群から選択される2つの第1のポリペプチドと、配列番号16、配列番号17および配列番号18からなる群から選択される2つの第2のポリペプチドとを含む化合物を製造するためのプロセスであって、化合物が発現する条件で請求項21に記載の哺乳動物細胞を培養することと、発現した化合物を回収することとを含む、プロセス。
[23]
請求項22に記載のプロセスによって得ることができる化合物。
[24]
請求項1〜20のいずれか一項に記載の化合物と、許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む、医薬組成物。
[25]
有効な量の請求項1〜20のいずれか一項に記載の化合物を、がんを処置することが必要な患者に投与することを含む、がんを処置する方法。
[26]
がんが、乳がん、卵巣がん、胃がん、直腸結腸がん、非小細胞肺がん、胆管がんまたは肝細胞癌である、請求項25に記載の方法。
[27]
がんが、乳がん、卵巣がん、胃がん、直腸結腸がんまたは肝細胞癌である、請求項25に記載の方法。
[28]
治療に使用するための請求項1〜20のいずれか一項に記載の化合物。
[29]
がんの処置に使用するための請求項1〜20のいずれか一項に記載の化合物。
[30]
がんが、乳がん、卵巣がん、胃がん、直腸結腸がん、非小細胞肺がん、胆管がんまたは肝細胞癌である、請求項29に記載の使用のための化合物。
[31]
がんが、乳がん、卵巣がん、胃がん、直腸結腸がんまたは肝細胞癌である、請求項29に記載の使用のための化合物。
Claims (5)
- 化合物であって、
2つの第1のポリペプチドと2つの第2のポリペプチドとを含み、
この化合物が、
(a)それぞれの第1のポリペプチドが、配列番号9のアミノ酸配列を有し、それぞれの第2のポリペプチドが、配列番号16のアミノ酸配列を有し;
(b)それぞれの第1のポリペプチドが、配列番号10のアミノ酸配列を有し、それぞれの第2のポリペプチドが、配列番号17のアミノ酸配列を有し;
(c)それぞれの第1のポリペプチドが、配列番号11のアミノ酸配列を有し、それぞれの第2のポリペプチドが、配列番号18のアミノ酸配列を有し;
(d)それぞれの第1のポリペプチドが、配列番号12のアミノ酸配列を有し、それぞれの第2のポリペプチドが、配列番号16のアミノ酸配列を有する
ことからなる群から選択され、
ここで、それぞれの第1のポリペプチドは、それぞれの第2のポリペプチドとともに鎖間ジスルフィド結合を形成し、第1のポリペプチドは、他の第1のポリペプチドとともに鎖間ジスルフィド結合を形成し、それぞれの第1のポリペプチドは、鎖内ジスルフィド結合を形成する、化合物。 - それぞれの第1のポリペプチドが、配列番号12のアミノ酸配列を有し、それぞれの第2のポリペプチドが、配列番号16のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の化合物。
- 請求項1又は2に記載の化合物と、許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む、医薬組成物。
- がんの処置に使用するための請求項1又は2に記載の化合物。
- がんが、乳がん、卵巣がん、胃がん、直腸結腸がん、非小細胞肺がん、胆管がんまたは肝細胞癌である、請求項4に記載の使用のための化合物。
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