ES2687183T3

ES2687183T3 - Anticuerpos recombinantes contra el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) que se obtienen mediante mutagénesis de regiones variables

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Publication number: ES2687183T3
Application number: ES11820879.2T
Authority: ES
Inventors: Humberto Lamdan Ordas; Jorge Víctor GAVILONDO COWLEY; Marta Ayala Avila; Yasmiana MUÑOZ POZO; Amaury PUPO MERIÑO; Gertrudis Rojas Dorantes; Lincidio PÉREZ SÁNCHEZ
Original assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB; BIOREC SA
Current assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB; BIOREC SA
Priority date: 2010-12-28
Filing date: 2011-12-26
Publication date: 2018-10-24
Anticipated expiration: 2031-12-26
Also published as: CA2823233A1; AU2011352474A1; RU2013134983A; CN103370336B; ZA201305031B; KR101896108B1; EP2662388A1; WO2012089176A1; TW201305203A; US9505830B2; MX2013007645A; CU23895B1; AR084618A1; TWI555757B; CA2823233C; BR112013016684A2; RU2557309C2; CN103370336A; JP2014504498A; AU2011352474B2

Abstract

La presente invención revela anticuerpos recombinantes humanos que reconocen el Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular-A (VEGF-A) humano, bloquean su interacción con el receptor VEGFR2, e interfieren con sus efectos proliferativos in vitro y pro-angiogénicos in vivo. Estos anticuerpos identifican un epitope en el VEGF-A humano diferente a cualquier otro reportado antes y se obtuvieron combinando una misma región variable de cadena ligera de inmunoglobulinas, con otras tres de cadena pesada. Los anticuerpos se obtuvieron mediante mutagénesis de regiones variables de inmunoglobulinas humanas, y pueden emplearse para la inmunoterapia de entidades patológicas cuyo curso esté asociado al aumento de la vasculatura, tales como la degeneración macular asociada a la edad, el cáncer y otras.

Description

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DESCRIPCIÓN

Anticuerpos recombinantes contra el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) que se obtienen mediante mutagénesis de regiones variables

Sector técnico

La presente invención se refiere a los sectores de la biotecnología y la industria farmacéutica, en particular al desarrollo y la aplicación de anticuerpos recombinantes humanos que reconocen específicamente el factor de crecimiento endotelial vascular A humano (abreviado VEGF-A) (Ferrara, N. y otros 2003. Nature Medicine 9: 669-676). Los diferentes tipos de anticuerpos recombinantes contenidos en la presente invención se desarrollaron combinando una misma región variable de cadena ligera (VL) de inmunoglobulina con otras tres regiones variables de cadena pesada (VH), utilizando técnicas de ingeniería genética. Los anticuerpos recombinantes reconocen en VEGF-A un epítopo no descrito anteriormente, bloquean la interacción de VEGF-A y su receptor VEGFR2 y, en consecuencia, interfieren con los efectos estimulantes y proangiogénicos de VEGF-A in vitro e in vivo. Debido a estas propiedades, los nuevos anticuerpos recombinantes humanos se pueden utilizar para la inmunoterapia de entidades patológicas asociadas con un aumento de la vasculatura, tales como la degeneración macular relacionada con la edad, el cáncer, la artritis reumatoide y otras.

Estado de la técnica

El proceso de formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los preexistentes (angiogénesis) está regulado por el equilibrio de factores pro y antiangiogénicos que actúan sobre el endotelio vascular y sus precursores de médula ósea. Los factores de crecimiento del endotelio vascular son una familia de moléculas que inducen de manera directa y específica la formación de nuevos vasos (Leung, D. y otros 1989. Science 246: 1306-1309). Esta familia comprende el factor de permeabilidad vascular (abreviado VPF), que también se conoce como factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A), factor de crecimiento placentario (abreviado PLGF), los factores de crecimiento derivados de plaquetas (abreviados PDGF) A y B, y otras moléculas estructural y bioquímicamente relacionadas con el VEGF-A, que se han denominado VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D y VEGF-E (Olofsson, B. y otros, 1996. Proc Natl Acad Sci USA 93: 2576-2581; Joukov, V. y otros 1996. EMBO J 15: 290-298; Yamada, Y. y otros 1997. Genomics 42: 483-488; Ogawa, S. y otros 1998. J Biol Chem 273: 31273-31282).

El VEGF-A es una glicoproteína homodimérica formada por dos subunidades de 23 kDa (Ferrara, N. y otros, 1989. Biochem Biophys Res Comun 161: 851-858). Existen cinco isoformas, derivadas del corte y empalme diferencial de un mismo ácido ribonucleico (ARN). Entre estas se incluyen dos isoformas unidas a la membrana celular (VEGF 189 y VEGF 206) y tres secretadas como factores solubles (VEGF 121, VEGF 145 y VEGF 165). VEGF 165 es el más abundante en tejidos de mamíferos, con la excepción del corazón y pulmones donde predomina VEGF 189 (Neufeld G y otros 1995. Canc Met Rev 15: 153-158). En la placenta, la expresión de VEGF 121 es mayor (Shibuya, M. 1995. Adv Cancer Res 67: 281-316). Las moléculas de la familia VeGf ejercen sus funciones y efectos al unirse a los receptores celulares de la tirosina quinasa de clase III, que incluyen VEGFR1 (Flt1), VEGFR2 (KDR/Flk1) y VEGFR3 (Flt4) (Kaipainen, A. 1993. J Exp Med 178: 2077-2088).

El VEGF-A es la proteína más estudiada y caracterizada de esta familia y se han descrito varias enfermedades en las que esta proteína está relacionada con el proceso patogénico (Carmeliet, P. y Jain, RK. 2000. Nature 407: 249-257; Kuwano M, y otros 2001. Intern Med 40: 565-572). La sobreexpresión de VEGF-A está relacionada con el crecimiento de tumores de diferente origen y localización, así como con su diseminación (Grunstein, J. y otros, 1999. Cancer Res 59: 1592-1598). En el caso particular de los tumores, las células que expresan las tres isoformas básicas de VEGF-A (121, 165 y 189) son las que tienen un crecimiento in vivo más rápido (Grunstein, J. 2000. Mol Cell Biol 20: 7282-7291).

El VEGF-A también se ha relacionado con procesos inflamatorios crónicos, tales como la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn (Kanazawa, S. y otros, 2001. Am J Gastroenterol 96: 822-828), la psoriasis (Detmar, M. y otros, 1994. J Exp Med 180: 1141-1146), las dificultades respiratorias (Thickett, DR y otros 2001. Am J Respir Crit Care Med 164: 1601-1605), la aterosclerosis (Celletti, FL y otros, 2001. Nat Med 7: 425-429), la endometriosis (McLaren, J. 2000. Hum Reprod Update 6: 45-55), el asma (Hoshino, M. y otros 2001. J Allergy Clin Immunol 107: 295-301), la artritis reumatoide y la osteoartritis (Pufe, T. y otros 2001. J Rheumatol 28: 1482-1485), la tiroiditis (Nagura, S. y otros 2001. Hum Pathol 32: 10-17), las retinopatías diabéticas y neonatales (Murata, T. y otros, 1996. Lab Invest 74: 819-825; Reynolds, JD. 2001. Paediatr Drugs 3: 263-272), la degeneración macular y el glaucoma (Wells, JA y otros, 1996. Br J Ophthalmol 80: 363-366), el edema tisular (Kaner, RJ y otros, 2000. Am J Respir Cell Mol Biol 22: 640-641), la obesidad (Tonello, C. y otros, 1999. FEBS Lett 442: 167-172), el hemangioma (Wizigmann, S. y Plate, KH. 1996. Histol Histopathol 11: 1049-1061), las artropatías inflamatorias (Bottomley, MJ y otros, 2000. Clin Exp Immunol 119: 182-188) y el rechazo de trasplante (Vasir, B. y otros, 2001. Transplantation 71: 924-935).

Un procedimiento terapéutico atractivo para muchas de estas enfermedades se basa en la inhibición de la actividad de los factores proangiogénicos que estimulan la formación anormal de vasos sanguíneos, mediante la administración de moléculas que los neutralizan. Muchas de las nuevas estrategias terapéuticas basadas en la

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inhibición de la angiogénesis, especialmente para el cáncer, se basan en el bloqueo de VEGF-A y/o sus receptores. Entre los productos aprobados o en ensayo clínico se pueden encontrar: (1) anticuerpos monoclonales que bloquean el receptor de VEGF-A o el receptor de KDR, (2) inhibidores de metaloproteinasas, tales como Neovastat y Prinomastat, (3) inhibidores de VEGF, tales como talidomida, suramina, troponina I, e IFN-a, (4) bloqueadores del receptor VEGF, tales como SU5416, FTK787 y SU6668, (5) inductores de apoptosis del endotelio tumoral, tales como endostatina y CA4-P, y (6) ribozimas que disminuyen la expresión de VeGf o sus receptores (angiozima).

De todo lo mencionado anteriormente, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que neutralizan los efectos proangiogénicos del VEGF-A son los más avanzados, en términos de aplicación y aceptación como productos terapéuticos. En la práctica médica, el anticuerpo recombinante humanizado bevacizumab, conocido comercialmente como Avastin (Ferrara, N. y otros, 2005. Biochem Biophys Res Comun 333: 328-335; Kim, KJ. y otros 1992. Growth Factors 7: 53-64), que reconoce al VEGF-A humano y neutraliza su efecto proangiogénico, ha sido aprobado en varios países para el tratamiento de diferentes cánceres (Allison, M. 2010. Nature Biotechnology, 28 (9): 879-880).

Recientemente, varios países han aprobado la utilización de ranibizumab (Gaudreault, J. y otros 2005. Invest Ophthalmol Visual Sci 46: 726-733), comercialmente conocido como Lucentis, para el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad, en su forma húmeda. El ranibizumab es un fragmento de anticuerpo recombinante del tipo Fab, desarrollado mediante manipulación del bevacizumab mediante ingeniería genética. La inyección intravítrea de ranibizumab neutraliza el VEGF-A producido localmente y afecta a la neoangiogénesis en las capas más profundas de la retina, que es la base de esta enfermedad.

Además de los ejemplos de bevacizumab y ranibizumab, que ya han sido registrados por las autoridades sanitarias, existen informes de otros anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que reconocen y neutralizan el VEGF humano (Muller, Y. y otros, 1997. Proc Natl Acad Sci USA 94: 7192-7197; Asano, M. y otros 1998. Hybridoma 17: 185-190; Vitaliti A. y otros 2000. Cancer Res 60: 4311-4314; Brekken, RA. y Thorpe, PE. 2001. J Controlled Release 74: 173-181; Jayson, G. y otros 2002. JNCI 94: 1484-1493; Brekken, RA. y otros 2000. Cancer Res 60: 5117-5124; Fuh, G. y otros 2006. J Biol Chem 281: 6625-6631; documento US 5730977; documento WO2008/052489 A1).

El 2H1 es un fragmento de anticuerpo humano del tipo Fv monocatenario (o “fragmento variable de cadena única”, abreviado scFv) que reconoce específicamente el VEGF humano (documento WO2008/052489 A1). El 2H1 se obtuvo a partir de una biblioteca de fragmentos de anticuerpo scFv de origen humano expresados en fagos filamentosos. El scFv 2H1 es específico para el VEGF-A humano, pero muestra una baja afinidad por esta molécula. Esto puede explicarse teniendo en cuenta que la biblioteca a partir de la que se originó se construyó con regiones variables no inmunizadas (“naive”) obtenidas de células linfoides humanas de diferentes fuentes (sangre periférica, bazo, amígdalas, médula ósea) y diferentes individuos sanos (Rojas G., y otros, 2005. Biochem Biophys Res Comun 336: 1207-1213). Tal como se conoce en el estado de la técnica, los scFv expresados sobre fago seleccionados a partir de librerías de tamaño medio de regiones variables naive pueden producir anticuerpos de media y baja afinidad a sus antígenos específicos. Esto puede ser más notorio en el caso de los autoantígenos, tal como es este caso (Marks J.D., y otros, 1991. J. Mol. Biol. 222: 581-597). El anticuerpo de afinidad media o baja generalmente se corresponde con la presencia de una baja cantidad de mutaciones en las regiones variables, con respecto a las secuencias de la línea germinal de inmunoglobulina a partir de las que se originaron. Los anticuerpos recombinantes de baja afinidad tienen un rendimiento insuficiente en aplicaciones inmunoquímicas y en procedimientos terapéuticos in vivo, en comparación con moléculas similares que tienen una afinidad más elevada por el mismo antígeno.

En la actualidad, sigue siendo un tema de interés el desarrollo de nuevos anticuerpos que neutralicen los efectos del VEGF humano, y que puedan utilizarse en la terapia de entidades que se desarrollan con una angiogénesis excesiva.

Descripción de la invención

La presente invención resuelve el problema mencionado anteriormente, ya que da a conocer nuevos anticuerpos recombinantes humanos que reconocen específicamente VEGF-A humano.

La presente invención da a conocer un anticuerpo recombinante, según la reivindicación 1.

Los diferentes anticuerpos recombinantes dados a conocer en la presente invención muestran rendimientos inmunoquímicos, biológicos y terapéuticos superiores, cuando se comparan con moléculas similares derivadas del fragmento de anticuerpo scFv 2H1. Para desarrollar estos anticuerpos, se realizaron mutaciones en las regiones determinantes de complementariedad 3 (CDR3) de las regiones variables VL y VH del fragmento de anticuerpo scFv 2H1. Las nuevas regiones variables mutadas, seleccionadas para un mejor reconocimiento de VEGF-A humano debido a la tecnología de expresión sobre fagos filamentosos, se combinaron utilizando técnicas de ingeniería genética para obtener nuevos sitios de unión de anticuerpos con las propiedades inmunoquímicas y biológicas mejoradas y novedosas deseadas. Para este trabajo, se realizó en primer lugar un análisis de las secuencias de los genes que codifican el fragmento de anticuerpo scFv 2H1, que indicaba que las CDR3 de VL y VH tenían muy pocos cambios con respecto a las regiones génicas germinales V, D y/o J humanas de las que se originaron, que es un elemento que explica la baja afinidad de 2H1 por el antígeno.

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Entonces, se diseñó una estrategia de mutagénesis particular, dirigida exclusivamente a las secuencias génicas que codifican los dominios CDR3 de las regiones VL (8 residuos de aminoácidos) y VH (7 residuos de aminoácidos) del fragmento de anticuerpo scFv 2H1. Se utilizó para la mutagénesis la técnica de Parsimonius Mutagenesis, (abreviada PM) (Balint, R. y Larrick J.W. 1993. Gene, 137: 109-118) en la que se realiza un análisis de las secuencias para mutar y se realizan por computadora los cambios mínimos que podrían modificar las características de un sitio de unión de anticuerpo, teniendo en cuenta la información existente sobre secuencias de inmunoglobulinas conocidas disponibles en bases de datos públicas. Utilizando oligonucleótidos sintéticos degenerados y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PM produce millones de nuevos mutantes para la región del gen deseado, en un tiempo muy corto.

La PM se aplicó independientemente en los dominios CDR3 de las regiones VL y VH del fragmento de anticuerpo scFv 2H1 y, utilizando la clonación de las nuevas regiones variables en un vector de fagémido apropiado, se produjeron dos bibliotecas grandes de fragmentos de anticuerpos scFv (aproximadamente 5 x 108 individuos), en los que los sitios de unión se habían mutado en las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente (ejemplo 1). En la biblioteca denominada No. 1, se conservó la región VL del fragmento de anticuerpo scFv 2H1 original, pero estaba asociada con millones de nuevas regiones VH con diferentes mutaciones en el dominio CDR3. En la biblioteca denominada No. 2, se conservó la región VH del fragmento de anticuerpo scFv 2H1 original, y en este caso estaba asociada con millones de nuevas regiones VL con diferentes mutaciones en el dominio CDR3.

Los fagos que expresaron los nuevos fragmentos de anticuerpo scFv que representan la diversidad de cada una de las dos bibliotecas se seleccionaron utilizando VEGF-A humano como antígeno, utilizando simultáneamente concentraciones crecientes de scFv 2H1 soluble, para favorecer el aislamiento de nuevos fragmentos de anticuerpo scFv con mayor afinidad por VEGF-A (ejemplo 2).

Comenzando con los nuevos clones de fragmentos scFv seleccionados de cada una de las dos bibliotecas, se realizó una estimación experimental de su reconocimiento relativo de VEGF-A mediante ELISA, con respecto a scFv 2H1 expresado también en fagos (ejemplo 2). Estos experimentos indicaron cuáles de las regiones variables de VL y VH mutadas proporcionaron características de reconocimiento antigénico y afinidad superiores a los nuevos fragmentos.

Las nuevas regiones variables identificadas se secuenciaron para determinar la composición de nucleótidos de los nuevos dominios CDR3. En el caso de los nuevos dominios CDR3 de la región VH, de los mejores fragmentos de anticuerpo scFv seleccionados de la biblioteca No. 1, todos estos dominios tenían diferentes secuencias de aminoácidos, tanto entre ellas, como con respecto a la VH original del fragmento de anticuerpo scFv 2H1 (ejemplo 2, tabla 2). Los fragmentos de anticuerpo scFv con el mejor reconocimiento de antígeno se denominaron 3F3, 3E3 y 4D8, y contenían las nuevas regiones VH. El scFv 3F3 contiene la VH denominada por los inventores de la presente invención H6 (SEQ ID No. 1 para la secuencia de bases y SEQ ID No. 4 para la secuencia deducida de aminoácidos). El scFv 3E3 contiene la VH denominada por los inventores de la presente invención H5 (SEQ ID No. 2 para la secuencia de bases y SEQ ID No. 5 para la secuencia deducida de aminoácidos). El scFv 4D8 contiene la VH denominada por los inventores de la presente invención H7 (SEQ ID No. 3 para la secuencia de bases y SEQ ID No. 6 para la secuencia de aminoácidos deducida).

En el caso de los nuevos dominios CDR3 de la región VL, presente en los fragmentos seleccionados de la biblioteca No. 2 (ejemplo 2, tabla 3), se identificó que las mutaciones en los nuevos fragmentos de anticuerpo scFv se agruparon en varias posiciones con respecto al dominio original, y en 3 de los 4 fragmentos de scFv con reconocimiento mejorado de VEGF humano, se conservaron 7 de los 8 nuevos residuos de CDR3, variando principalmente el aminoácido en la quinta posición. Los resultados de este análisis indicaron que la posibilidad de aumentar los contactos entre el sitio de unión y el antígeno podría explorarse adicionalmente mediante la producción de sustituciones adicionales en esta quinta posición, para lo que se construyeron nuevos scFv expresados en fagos tomando como base un CDR3 de VL típico de este grupo, en los que el nucleótido de la CDR3 que codifica el quinto aminoácido se sustituyó para producir los aminoácidos P, E o D. Los nuevos clones de la región VL que se produjeron de esta manera se denominaron L1, L2 y L3, respectivamente.

A partir de estas sustituciones, la que incluía el aminoácido D fue la que dio como resultado un fragmento de anticuerpo scFv expresado por el fago con el mejor reconocimiento de antígeno, con respecto a los otros dos nuevos mutantes, a todos los mutantes de VL anteriores y, por supuesto, al scFv 2H1 original (ejemplo 3, tabla 4).

Para continuar aumentando las características de reconocimiento de antígenos, se combinaron las regiones VH H6, H5 y H7, identificadas como las mejores de la biblioteca No. 1, con la nueva región VL L3 (SEQ ID No. 7 para las bases y SEQ ID No. 8 para la secuencia de aminoácidos deducida). Una vez que se expresaron sobre los fagos estos tres nuevos fragmentos de anticuerpos scFv, denominados L3H6, L3H5 y L3H7, se realizó una comparación de afinidad por VEGF-A, con respecto al fragmento de anticuerpo scFv 2H1, y otros scFv expresados en fagos seleccionados de las bibliotecas No. 1 y No. 2 (ejemplo 4, tabla 5). Este estudio mostró que los tres nuevos fragmentos de anticuerpo scFv L3H6, L3H5 y L3H7 expresados sobre fago son superiores a todos los demás scFv. Entre estos tres, L3H6 es el que muestra una mejor CI50 en el ensayo de inhibición, lo que indica que es necesario añadir más cantidad de fragmento de scFv 2H1 soluble en el ensayo para inhibir la unión promedio de L3H6 al VEGF humano.

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En diferentes realizaciones de presente invención, los genes que codifican las regiones variables H6 (SEQ ID No. 1), H5 (SEQ ID No. 2), H7 (SEQ ID No. 3) y L3 (SEQ ID No. 7) fueron utilizados para producir diferentes tipos de anticuerpos recombinantes: (a) los fragmentos scFv solubles denominados scFv L3H6, scFv L3H5 y scFv L3H7, (b) los fragmentos Fab solubles denominados Fab L3H6, Fab L3H5 y Fab L3H7 y (c) las moléculas bivalentes de tipo anticuerpo scFv2-Fc L3H6, scFv2-Fc L3H5 y scFv2-Fc L3H7.

Para producir los fragmentos de anticuerpos recombinantes scFv L3H6, scFv L3H5 y scFv L3H7, se combinaron los genes que codifican las regiones VH H6 (SEQ ID No. 1), H5 (SEQ ID No. 2) y H7 (sEq ID No. 3) con la región VL L3 (SEQ ID No. 7), intercalada por un segmento espaciador (denominado de forma habitual espaciador), y en el orden VH-espac/ador-VL, utilizando el vector pACR.1 (ejemplo 5). El vector pACR.1 está diseñado para la expresión de proteínas recombinantes en el periplasma bacteriano, y se añadió en el extremo C-terminal de las moléculas un dominio c-myc, que sirve como marcador para fines analíticos, seguido de un dominio de seis histidinas para facilitar la purificación utilizando cromatografía de afinidad de iones metálicos (abreviada IMAC) (Porath J. 1992. Prot. Expr. Purif. 3: 263-281). Los fragmentos de anticuerpo scFv L3H6 (SEQ ID No. 9 para la secuencia de bases y SEQ ID No. 10 para la secuencia de aminoácidos), scFv L3H5 (SEQ ID No. 11 para la secuencia de bases y SEQ ID No. 12 para la secuencia de aminoácidos) y scFv L3H7 (SEQ ID No. 13 para la secuencia de bases y SEQ ID No. 14 para la secuencia de aminoácidos), con un peso molecular aparente de, aproximadamente, 29 kDa en electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (abreviada SDS-PAGE), se recuperan del medio de cultivo de bacterias transformadas y se purifican fácilmente utilizando IMAC.

Para producir los fragmentos de anticuerpo Fab recombinantes Fab L3H6, Fab L3H5 y Fab L3H7, los genes que codifican las secuencias contenidas en las regiones variables H6 (SEQ ID No. 1), H5 (SEQ ID No. 2), H7 (SEQ ID No. 3) y L3 (SEQ ID No. 7) se clonaron en el vector pFabHum-1 (ejemplo 9). El plásmido pFabHum-1 es un vector bicistrónico construido para la expresión de los fragmentos Fab con inmunoglobulina humana y regiones constantes CH1 y C Lambda, en el periplasma bacteriano. El vector añade 6 histidinas y un dominio c-myc al extremo C terminal de la molécula clonada. En este plásmido, las regiones H6, H5 o H7 se asociaron genéticamente a la región constante CH1, mientras que la L3 se asoció a la región constante C Lambda, dando como resultado los fragmentos de anticuerpo Fab L3H6 (que corresponden a las secuencias de nucleótidos SEQ ID No. 15 y SEQ ID No. 16, que codifican las secuencias de aminoácidos SEQ ID No. 17 y SEQ ID No. 18), Fab L3H5 (que corresponden a las secuencias de nucleótidos SEQ ID No. 19 y SEQ ID No. 20, que codifican las secuencias de aminoácidos SEQ ID No. 21 y SEQ ID No. 22), y Fab L3H7 (que corresponden a las secuencias de nucleótidos SEQ ID No. 23 y SEQ ID No. 24, que codifican las secuencias de aminoácidos SEQ ID No. 25 y SEQ ID No. 26). Los fragmentos de anticuerpo Fab L3H6, Fab L3H5 y Fab L3H7 se expresan en Escherichia coliy se purifican mediante IMAC de los sobrenadantes del medio de cultivo de bacterias transformadas con estas construcciones y tienen un peso molecular aparente de, aproximadamente, 50 kDa en SDS-PAGE, en condiciones no desnaturalizantes.

Los anticuerpos recombinantes bivalentes scFv2-Fc L3H6, scFv2-Fc L3H5 y scFv2-Fc L3H7 comprenden las secuencias de los fragmentos de anticuerpo scFv L3H6, L3H5 y L3H7, asociadas en cada caso con una secuencia 3' que codifica un separador de 10 aminoácidos, seguida de una secuencia de nucleótidos que codifica los dominios bisagra, CH2 y cH3 de una inmunoglobulina IgG1 humana. Los anticuerpos mencionados se obtuvieron clonando los productos de PCR de los genes que codifican para los fragmentos scFv mencionados anteriormente, en el vector pVSJG-HucFc (ejemplo 10). El vector pVSJG-HucFc se ha diseñado para la expresión de moléculas de tipo “anticuerpo completo” que comprenden dos scFv idénticos, asociados a una inmunoglobulina Fc de tipo IgG 1 humana, en células de mamífero. Las moléculas scFv2-Fc L3H6 (SEQ ID No. 27 para la secuencia de nucleótidos y SEQ ID No. 28 para la secuencia de aminoácidos), scFv2-Fc L3H5 (SEQ ID No. 29 para la secuencia de nucleótidos y SEQ ID No. 30 para la secuencia de aminoácidos), y scFv2-Fc L3H7 (SEQ ID No. 31 para la secuencia de nucleótidos y SEQ ID No. 32 para la secuencia de aminoácidos), se produjeron en el sobrenadante de los medios de cultivo de las células CHO transfectadas con los plásmidos correspondientes. Después de la purificación mediante cromatografía de afinidad utilizando proteína A o proteína G, se observó que las moléculas de scFv2-Fc mostraban pesos moleculares aparentes entre 100 y 120 kDa.

Los anticuerpos recombinantes objeto de la presente invención son nuevos con respecto a otros anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que reconocen o neutralizan VEGF-A humano, incluidos los derivados de las regiones variables originales del fragmento de anticuerpo scFv 2H1. Esto se debe a que los anticuerpos recombinantes objeto de la presente invención:

(a) tienen nuevas secuencias de ADN en su región variable CDR3. Esto los hace diferentes de los anticuerpos contra VEGF-A divulgados por otros autores que los han obtenido, tales como los derivados de hibridomas (Kim, KJ y otros, 1992. Growth Factors 7: 53-64; Muller, Y. y otros 1997. Proc Natl Acad Sci USA 94: 7192-7197; Asano, M. y otros 1998. Hybridoma 17: 185-190; Schaeppi, jM. y otros 1999. J Cancer Res Clin Oncol 125: 336-342; Brekken, RA. y otros 2000. Cancer Res 60: 5117-5124; Brekken, RA. y Thorpe, PE. 2001. J Controlled Release 74: 173-181), los obtenidos mediante una transformación viral alternativa de células humanas (documento US 5730977), los obtenidos mediante la modificación de anticuerpos preexistentes mediante ingeniería genética (Jayson, G. y otros 2002. JNCI 94: 1484-1493; Ferrara, N. y otros 2005. Biochem Biophys Res Comun 333: 328-335), y los derivados de bibliotecas de fragmentos de anticuerpos humanos (Vitaliti, A. y otros 2000. Cancer Res 60: 4311-4314; Fuh, G. y

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otros 2006. J Biol Chem 281: 6625-6631). Con respecto a las regiones VL y VH del fragmento de anticuerpo scFv 2H1 (documento WO2008/052489 A1), los anticuerpos descritos en la presente invención también son diferentes. Las regiones VH H6 (SEQ ID No. 4), H5 (SEQ ID No. 5) y H7 (SEQ ID No. 6) son diferentes en los 7 aminoácidos que corresponden al dominio CDR3, con respecto a la vH de 2H1 y la región VL L3 (SEQ ID No. 8) es diferente en 3 de los 8 aminoácidos del dominio CDR3.

(b) Tienen especificidad inmunoquímica para VEGF-A humano diferente a los fragmentos de anticuerpos Fab humanos obtenidos a partir de otras bibliotecas (Fuh G. y otros, 2006. J. Biol Chem 281: 6625-6631), y con respecto al bevacizumab, que no es capaz de reconocer VEGF de ratón e identifica una cantidad reducida de VEGF-A, mientras que este último aspecto no lo muestran los anticuerpos novedosos descritos en la presente invención. En los ejemplos 6, 7 y 9 de la presente invención, se describe cómo los nuevos anticuerpos recombinantes tienen también un reconocimiento inmunoquímico de VEGF-A humano que diferente y superior al del fragmento de anticuerpo scFv 2H1, y los anticuerpos recombinantes derivados del mismo (documento WO2008/052489 A1).

(c) El fragmento de anticuerpo scFv L3H6 y los anticuerpos recombinantes derivados del mismo (Fab L3H6 y scFv2-Fc-L3H6) reconocen un epítopo funcional en VEGF-A humano que es diferente a todos los demás identificados por otros anticuerpos que neutralizan los efectos de VEGF-A humano (Muller, Y. y otros, 1997. PNAS USA 94: 7192-7197; Muller, aY. y otros 1998. Estructura 6: 1153-1167; Schaeppi, JM. y otros 1999. J Cancer Res Clin Oncol 125: 336-342; Brekken, RA. y otros 2000. Cancer Res 60: 5117-5124; Fuh, G. y otros 2006. J Biol Chem 281: 6625-6631; WO2005012359; WO2008/052489 A1). El nuevo epítopo funcional definido en VEGF-A humano por los nuevos anticuerpos recombinantes scFv L3H6, Fab L3H6 y scFv2-Fc-L3H6, descrito en la presente invención, tiene como aminoácidos críticos los residuos K101, E103, R105 e Y25 (ejemplo 11). Si estos aminoácidos están sustituidos, el reconocimiento de los anticuerpos descritos en la presente invención se ve gravemente afectado.

Los nuevos anticuerpos recombinantes descritos en la presente invención pueden unirse a VEGF-A humano soluble, VEGF-A humano adsorbido a superficies sólidas, o VEGF-A humano asociado o cerca de células humanas que producen este factor, entre estas últimas, células presentes en tumores humanos que crecen en ratones desnudos (atímicos).

Los nuevos anticuerpos recombinantes descritos en la presente invención reconocen específicamente las isoformas VEGF-A humanas 121 y 165, reconocen VEGF de ratón y bloquean la interacción de VEGF-A con el receptor VEGFR2, pero no con el receptor 1 (VEGFR1). Las dos últimas propiedades distinguen los nuevos anticuerpos recombinantes descritos en la presente invención del bevacizumab y el ranibizumab.

Los nuevos anticuerpos recombinantes descritos en la presente invención tienen mayor afinidad por VEGF-A humano que aquellos derivados del fragmento de anticuerpo scFv 2H1, tal como se muestra en el ejemplo 8. En consecuencia, estos nuevos anticuerpos tienen un rendimiento superior, con respecto a scFv 2H1 y los anticuerpos derivados de 2H1, en pruebas que miden: (a) el bloqueo de la asociación de VEGF y VEGFR2 (ejemplo 7), (b) la inhibición de la proliferación de células endoteliales en cultivo, bajo la estimulación de VEGF-A humano (ejemplo 12), (c) la inhibición de la angiogénesis subcutánea en ratones, inducida por gránulos de Matrigel que contienen VEGF (ejemplo 13), y la inhibición de la crecimiento de tumores humanos trasplantados a ratones desnudos (ejemplo 14).

Definición de terminologías utilizadas en la presente invención

Sitio de unión al antígeno

El término describe la parte de un anticuerpo que interactúa específicamente con un antígeno (o parte del mismo). Un sitio de unión de anticuerpo está formado principalmente por dos regiones variables de anticuerpo, la región variable de cadena ligera (VL) y la de cadena pesada (VH). El sitio de unión del anticuerpo está formado por interacciones no covalentes de las regiones variables. El sitio de unión del anticuerpo se puede estabilizar artificialmente a través del enlace de las dos regiones variables con un péptido que no interferirá con las propiedades específicas de unión al antígeno. Este es el caso de un fragmento del tipo scFv. En la naturaleza, los sitios de unión del anticuerpo se ensamblan mediante la interacción no covalente de las regiones variables, reforzada por la interacción no covalente de los dominios constantes CH1 y CL (kappa o lambda) y mediante un enlace disulfuro establecido entre una cisteína presente en CL y otra localizada en la región bisagra de la cadena pesada del anticuerpo. Los anticuerpos nativos completos tienen dos o más sitios de unión a antígeno idénticos.

Anticuerpos recombinantes

El término describe una inmunoglobulina o partes de la misma producidas total o parcialmente en forma sintética, a través de técnicas de ADN recombinante o síntesis genética artificial, con reconocimiento específico de un antígeno por medio de uno o más sitios de unión a antígeno (Gavilondo, J. y Larrick. J.W. 2000. Biotechniques 29: 128-136). Los ejemplos de anticuerpos recombinantes son los denominados anticuerpos quiméricos y humanizados, en los que se utiliza la ingeniería genética para asociar los genes de la región variable (o partes de los mismos) obtenidos de una especie con regiones constantes de inmunoglobulina de otra especie. Entre los anticuerpos recombinantes también se pueden encontrar los fragmentos de anticuerpos producidos por ingeniería genética que comprenden uno o más sitios de unión a antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos recombinantes son: (i) el fragmento

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Fab, que incluye los dominios de inmunoglobulina VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd, que comprende los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv, que comprende VL y VH de un solo anticuerpo; (iv) el fragmento scFv, en el que los dominios VH y VL de un anticuerpo dado se combinan en diferente orden (VH-VL o VL-VH) con un espaciador peptídico que permite que las dos regiones variables se asocien y formen un sitio de unión al antígeno (Bird y otros 1988. Science 242: 423-426; Huston y otros 1988. PNAS USA 85: 5879-5883); (v) "diacuerpos", que son fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos de manera similar a scFv, pero con un espaciador peptídico corto que no permite que los dominios VH y VL de una misma molécula se unan en un sitio de unión, y éste tiene que ser creado por la asociación de dos o más scFv, proporcionando de este modo la multivalencia (documento WO94/13804; Holliger P y otros, 1993. PNAS USA 90: 6444-6448); (vi) otros fragmentos tales como el dAb (Ward SE y otros 1989). Nature 341: 544-546), CDR aisladas, fragmentos F(ab')2, nanoanticuerpos y dímeros de scFv biespecíficos (documento PCT/US92/09965; Holliger P y Winter G. 1993. Current Opinion Biotechnol. 4: 446-449, de Haard, H y otros 1998. Adv. Drug Delivery Rev. 31:5-31). Algunos tipos de fragmentos, tales como scFv y Fab, se pueden obtener de bibliotecas de anticuerpos, en las que un repertorio genético natural o sintético grande de las regiones variables de una especie se combina aleatoriamente para producir asociaciones particulares de regiones variables, que posteriormente se expresan como fragmentos de anticuerpos en la superficie del fago filamentoso.

También se consideran anticuerpos recombinantes las moléculas "de tipo anticuerpo" producidas por ingeniería genética en las que los fragmentos de anticuerpos se ensamblan en regiones constantes de anticuerpos. Por ejemplo, es posible construir una molécula bivalente de "tipo anticuerpo" (denominada en el presente documento scFv2-Fc) uniendo un scFv a una región formada por los dominios bisagra, CH2, CH3 y en ocasiones CH4 de una inmunoglobulina Fc. Dependiendo de las partes implicadas en su construcción, y la presencia de glucosilación, dicha molécula puede expresar todas las funciones efectoras asociadas a la inmunoglobulina Fc. Una vez que se expresa en un huésped adecuado, la molécula de scFv2-Fc tiene dos sitios de unión, representados por dos scFv idénticos.

Finalmente, los anticuerpos recombinantes también son moléculas en las que las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas obtenidas de una fuente (es decir, scFv o Fab) se ensamblan a las regiones constantes de una inmunoglobulina humana, por ejemplo, CH1, bisagra, CH2, CH3 y en ocasiones CH4, para la región variable de cadena pesada, y C Kappa o C Lambda para la región variable de cadena ligera.

Variantes equivalentes de un anticuerpo

Las variantes equivalentes de un anticuerpo son moléculas polipeptídicas derivadas de asociaciones y manipulaciones de las secuencias exactas de sus regiones variables que conservan la capacidad de reconocer específicamente al antígeno y desarrollar efectos sobre él y sobre sus propiedades biológicas. Estas moléculas polipeptídicas pueden tomar la forma de otros fragmentos de anticuerpos recombinantes, tales como aquellos en los que el dominio VL está ubicado antes de los dominios del espaciador y VH de scFv, o se utilizan otros segmentos espaciadores conocidos en el estado de la técnica, o se producen como fragmentos scFv F(ab')2, Fabc, Facb, diméricos, triméricos o tetraméricos (Winter G, Milstein C. 1991. Nature 349: 293-299; documento WO94/13804; de Haard, H y otros 1998. Adv. Drug Delivery Rev. 31:5-31). Además, cuando se producen moléculas multivalentes mediante la adición de secuencias derivadas de inmunoglobulinas (Bestagno M y otros 2001. Biochemistry 40: 10686-10692). Las variantes equivalentes de un anticuerpo también se producen cuando las secuencias exactas de sus regiones variables están contenidas en anticuerpos biespecíficos, o en forma de anticuerpos de tamaño completo, asociados a los dominios constantes de una inmunoglobulina humana o de otra especie. Todas estas manipulaciones de ingeniería genética son conocidas por los expertos en la técnica en este sector técnico.

También se consideran variantes equivalentes de un anticuerpo aquellas moléculas o variantes producidas por el llamado trasplante de CDR, en el que las secuencias de CDR de las regiones variables se colocan artificialmente en un marco de inmunoglobulina foránea, y esta manipulación no afecta la capacidad de reconocer el antígeno original y provocar efectos biológicos y bioquímicos.

Especificidad de un anticuerpo o su variante

Se refiere a una situación en la que un anticuerpo o fragmento del mismo no se unirá significativamente a otras moléculas diferentes de su par de unión específico (antígeno). Este término también es aplicable al caso en el que un sitio de unión a antígeno sea específico para un epítopo particular que aparece en varios antígenos relacionados o no relacionados, en cuyo caso el sitio de unión del anticuerpo podrá identificar los diversos antígenos que portan el epítopo mencionado.

Epítopo. Epítopo funcional

Cuando el antígeno es grande, un anticuerpo se puede unir exclusivamente a una parte particular del antígeno que se denomina epítopo. El epítopo reconocido por un sitio de unión de anticuerpo, en el caso de que el antígeno sea una proteína, puede estar formado por una secuencia lineal de aminoácidos, o puede ser conformacional, es decir, que los aminoácidos en el antígeno que interactúan con el sitio de unión del anticuerpo son estructuralmente cercanos en la estructura terciaria de la proteína, pero no son necesariamente secuenciales en su estructura

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primaria. En el caso de las proteínas, un epítopo dado es por naturaleza discreto, definido por un grupo de aminoácidos específicos que interactúan con los del anticuerpo mediante enlaces no covalentes.

El epítopo funcional es aquel que se determina experimentalmente mediante la sustitución de aminoácidos específicos en el antígeno, y se evalúa mediante métodos inmunoquímicos el efecto o no sobre el reconocimiento del anticuerpo (o el de sus variantes equivalentes).

Los nuevos anticuerpos descritos en la presente invención son útiles para la prevención de neovascularización coroidea en un modelo experimental de primates no humanos, en el que el daño ocular está causado por fotocoagulación con láser (ejemplo 16).

Debido a que bloquean la interacción entre VEGF y el receptor VEGFR2, los nuevos anticuerpos descritos en la presente invención afectan a la capacidad de proliferación de las células endoteliales activadas y sus precursores de médula ósea, así como al mantenimiento de la estabilidad fisiológica de los nuevos vasos sanguíneos que son formados patológicamente en diferentes enfermedades. Este bloqueo también puede afectar a otras funciones biológicas descritas para VEGF humano, tales como por ejemplo su papel como regulador negativo de la respuesta inmune (Chouaib S y otros 1997. Immunology Today 18: 493-497).

Dado todo lo anterior, los nuevos anticuerpos recombinantes descritos en la presente invención son útiles para el desarrollo de nuevos tratamientos para enfermedades que están asociadas con angiogénesis anormal o excesiva, entre las cuales se pueden encontrar:

(a) Cáncer, es decir tumores sólidos primarios y sus metástasis; entre estas posibilidades terapéuticas se incluyen, sin que constituyan limitación: tumores epidermoides, tumores escamosos de cabeza y cuello, tumores colorrectales, cáncer de próstata, tumores de mama, cánceres de células pequeñas y no pequeñas de pulmón, tumores pancreáticos, cáncer de tiroides, cáncer de ovario, tumores hepáticos, sarcoma de Kaposi, neoplasia del sistema nervioso central (neuroblastoma, hemangioblastoma, meningioma y metástasis cerebral), melanoma, carcinoma renal y gastrointestinal, rabdomiosarcoma, glioblastoma y leiomiosarcoma.

Los anticuerpos recombinantes scFv2-Fc L3H6, scFv2-Fc L3H5 y scFv2-Fc L3H7, descritos en presente invención, mostraron un efecto sobre el crecimiento de tumores humanos trasplantados a ratones desnudos (ejemplo 14). Debido a que los anticuerpos recombinantes descritos en la presente invención poseen un reconocimiento de epítopos novedoso de VEGF-A humano, estos son diferentes de otros anticuerpos y moléculas antiangiogénicas en sus formas de interferir en la unión de VEGF-A humano y su receptor VEGFR2, que podrían conducir a diferentes efectos terapéuticos in vivo. Está bien documentado que es posible producir diferentes efectos terapéuticos in vivo, incluida una disminución de los efectos colaterales en un ser humano con cáncer, con anticuerpos producidos contra el mismo antígeno, pero que reconocen diferentes epítopos o tienen afinidad diferente (Allan D.G.P. 2005. The Oncologist 10: 760-761; Boland, W. K y Bebb, G. 2009. Expert Opin. Biol. Ther. 9(9): 1-8).

(b) Enfermedades oculares, tales como la degeneración macular relacionada con la edad en su forma húmeda, el glaucoma neovascular y las retinopatías diabéticas y neonatales. Las moléculas scFv L3H6 y scFv2-Fc L3H6 descritas en la presente invención mostraron un efecto preventivo y terapéutico (ejemplo 16) sobre la neovascularización coroidea inducida por quemaduras con láser en un modelo experimental de primates no humanos, indicando la utilidad de estos anticuerpos para el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad (AMD) (Gaudreault, J. y otros 2005. Invest Ophthalmol Visual Sci 46: 726-733; Costa, RA y otros 2006. Investig Ophthalmol Visual Sci 47: 4569-4578) y otras enfermedades oculares que comparten una base patológica similar.

(c) Procesos inflamatorios crónicos y agudos, tales como el asma, la dificultad respiratoria, la endometriosis y la aterosclerosis y el edema tisular.

(d) Enfermedades infecciosas, tales como la hepatitis y el sarcoma de Kaposi.

(e) Enfermedades autoinmunes, tales como la diabetes, la psoriasis, la artritis reumatoide y la tiroiditis.

(f) Otras enfermedades y estados diversos, tales como rechazo de trasplante de órganos, hemangioma y angiofibroma.

Los anticuerpos recombinantes descritos en la presente invención se pueden acoplar o conjugar a una enzima o sus fragmentos, a un modificador de respuesta biológica (BRM), a una toxina o fármaco, o a isótopos radiactivos, que añadirían a la molécula original unas características funcionales diferentes de su unión al VEGF-A humano. La molécula scFv L3H6 descrita en la presente invención se radiomarcó y se inyectó a ratones atímicos desnudos que portan tumores humanos (ejemplo 15). Se demostró que la molécula se aloja en el tumor y permanece en el área anatómica incluso tres días después de la inyección. De esta manera, los anticuerpos recombinantes descritos en la presente invención, acoplados a otros agentes terapéuticos, pueden ser la base de métodos de tratamiento que comprenden su administración como medicamentos o composiciones farmacéuticas. Los anticuerpos acoplados química o genéticamente a radionucleidos, toxinas, fármacos o BRM terapéuticos, pueden dirigir el efecto terapéutico del elemento acoplado a las áreas anatómicas con una concentración anómala de VEGF-A humana, tal

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como puede ser un tumor y su vecindad inmediata, y ejercer un efecto terapéutico. La cantidad a administrar, la frecuencia y los intervalos de tratamiento dependen de la naturaleza y gravedad de la enfermedad y estas decisiones son responsabilidad de especialistas y médicos que se basan en lo que ya se conoce en el sector.

La presente invención da a conocer además un vector, según la reivindicación 9.

La presente invención da a conocer además una composición farmacéutica, según la reivindicación 10.

Se da a conocer además en el presente documento la utilización de los anticuerpos recombinantes descritos para producir una composición farmacéutica que pueda inhibir la angiogénesis y se pueda utilizar para el tratamiento de estados patológicos asociados a ella. Este tratamiento comprende la administración de una cantidad efectiva de las moléculas descritas a un ser humano.

Las composiciones producidas con los anticuerpos recombinantes descritos en la presente invención pueden administrarse individualmente o en combinación con otros tratamientos, siendo esto simultáneo o secuencial, todo lo cual depende de la enfermedad a tratar. Las composiciones farmacéuticas comprenden, además del ingrediente activo, un excipiente, tampón, agente de estabilización o vehículo farmacéutico aceptado, y otros materiales bien conocidos por los expertos en este sector técnico. Estos materiales no son tóxicos, no interfieren con la eficacia del ingrediente activo y su naturaleza depende de la vía de administración, ya sea oral, mucosal o parenteral, por ejemplo, mediante inyección intravenosa. Las composiciones descritas en la presente invención son composiciones para la liberación controlada de los anticuerpos recombinantes de la presente invención y de los otros ingredientes activos en la composición.

Los anticuerpos recombinantes descritos en la presente invención, o sus variantes equivalentes, se producen mediante expresión del ácido nucleico codificante. De manera preferente, pero no exclusiva, el ácido nucleico codifica las secuencias de bases ejemplificadas en la SEQ ID No. 9, la SEQ ID No. 11, la SEQ ID No. 13 (scFv L3H6, scFv L3H5 y scFv L3H7, respectivamente); la SEQ ID. No. 15, la SEQ ID No. 16, la SEQ ID. No. 19, la SEQ ID. No. 20, la SEQ ID. No. 23, la SEQ ID. No. 24 (Fab L3H6, Fab L3H5 y Fab L3H7, cadenas individuales, respectivamente); la SEQ ID. No. 27, la SEQ ID. No. 29, la SEQ ID. No. 31 (scFv2-Fc L3H6, scFv2-Fc L3H5 y scFv2-Fc L3H7, respectivamente).

Para la expresión recombinante de las moléculas descritas en la presente invención, o sus variantes equivalentes, pueden construirse o elegirse vectores apropiados, que contienen las secuencias reguladoras necesarias, que incluyen promotor, terminador, potenciador, secuencias de poliadenilación, genes marcadores y otras consideradas pertinentes. Los vectores pueden ser plásmidos.

La presente invención da a conocer además un anticuerpo recombinante para su utilización, según la reivindicación 12 ó 13.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS

Figura 1. Representación esquemática del plásmido pACR.1 utilizado para la producción de fragmentos scFv solubles en el periplasma de E. coli y sobrenadante de cultivo. El vector tiene un promotor LacZ, un sitio de unión ribosomal (RBS) y el péptido señal pe/B (SP).

Figura 2. (A) Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS al 12% con resultados de la purificación del fragmento de anticuerpo scFv L3H6 utilizando iMaC, comenzando a partir del sobrenadante de células E. coli BL-21 transformadas con el plásmido pACR.1 scFv L3H6; muestras preparadas en tampón de carga con beta-mercaptoetanol. Carril 1: marcadores de peso molecular; Carril 2: elución con imidazol 250 mM que muestra la banda que corresponde al fragmento, con aproximadamente 29 kDa. (B) Transferencia Western de una réplica de la electroforesis, revelada utilizando el anticuerpo anti c-myc 9E10.

Figura 3. ELISA competitivo para evaluar la capacidad de diferentes concentraciones de fragmentos de anticuerpos scFv L3H6, scFv L3H5 y scFv L3H7 para bloquear el acceso de formas solubles de los receptores VEGFR2 (KDR-Fc) y VEGFR1 (FLT-1-Fc) a VGF-A humano adsorbido a una fase sólida. La detección de receptores solubles unidos se realizó utilizando anticuerpos IgG antihumanos conjugados con HRPO. (A) Bloqueo de KDR-Fc. El fragmento scFv 2H1 se utilizó como referencia y un scFv anti-HBsAg no relacionado como control negativo. (B) Bloqueo de FLT-1-Fc. El scFv no relacionado anti-HBsAg se utilizó como control negativo y el fragmento Fab Lucentis® (Ranibizumab) como control de inhibición.

Figura 4. Representación esquemática del plásmido pFabHum-1, utilizado para la producción de fragmentos Fab solubles en el periplasma de E. coli y sobrenadante de cultivo. El vector tiene un promotor LacZ, un sitio de unión ribosomal (RBS), y los péptidos señal (p) pPE/B y p3M13 en cada casete de expresión, junto con los dominios de inmunoglobulina humana constante CH1 y C Lambda.

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Figura 5. (A) Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS al 12% con resultados de la purificación del fragmento de anticuerpo Fab L3H6 utilizando IMAC, comenzando a partir del sobrenadante de células de E. coli BL-21 transformadas con el plásmido pFabHum-1 Fab scFv L3H6; muestras preparadas en tampón de carga con beta-mercaptoetanol. Carril 1: marcadores de peso molecular. Carril 2: Las dos cadenas del Fab son visibles, con aproximadamente 28-30 KDa. Carril 3: Transferencia de Western de una réplica de la electroforesis, desarrollada utilizando el anticuerpo anti c-myc 9E10. Solo se reconoce la cadena pesada del Fab, que contiene el dominio c-myc. (B) Muestras preparadas en tampón de carga sin beta-mercaptoetanol (sin reducción) Carril 1: La banda Fab es evidente, con aproximadamente 50 kDa. Carril 2: transferencia de Western de una réplica de la electroforesis, desarrollada utilizando el anticuerpo anti c-myc 9E10.

Figura 6. (A) Representación esquemática del plásmido pVSJG-HucFc, utilizado para la producción de moléculas bivalentes "de tipo anticuerpo" clonando el gen del fragmento scFv entre los sitios de restricción Afl II y Xba. (B) Representación esquemática del tipo de molécula producida por células de mamífero después de la transfección con este plásmido, una vez que el gen scFv ha sido clonado en el vector.

Figura 7. Representación de los residuos expuestos al disolvente (superficie) del VEGF-A humano, utilizando el programa PyMol. Las dos cadenas homodiméricas están representadas en blanco y gris claro. En la cadena blanca, los aminoácidos críticos K101, E103, R105 e Y25 relacionados con el epítopo reconocido por los anticuerpos recombinantes descritos en la presente invención se han resaltado en gris oscuro. Se puede ver que estos definen un "clúster" o agrupamiento conformacional en una zona de la molécula que muestra una buena exposición al disolvente.

Figura 8. Capacidad de los fragmentos de anticuerpos (A) scFv L3H6, scFv L3H5 y scFv L3H7, y anticuerpos recombinantes bivalentes (B) scFv2-Fc L3H6, scFv2-Fc L3H5 y scFv2-Fc L3H7 para bloquear el efecto estimulante del VEGF-A humano en la proliferación de células endoteliales de la vena del cordón umbilical humano (HuVEC). El fragmento de anticuerpo scFv 2H1 y el anticuerpo recombinante bivalente scFv2-Fc 2H1 8.2 se utilizaron como referencias. El gráfico muestra los valores relativos de proliferación, con respecto a la adición de VEGF y sin anticuerpos (100%), cuando se añaden muestras de: fragmentos de anticuerpos a 40 pg/ml (A) o moléculas bivalentes a 10 pg/ml (B) a las células. Los controles negativos fueron un scFv anti-HBsAg no relacionado y el anticuerpo humanizado del receptor anti-EGF nimotuzumab. Como control de la inhibición, se utilizó KDR-Fc soluble. Cada barra representa el valor promedio de las tres réplicas hechas por grupo, con su desviación estándar correspondiente.

Figura 9. Capacidad de los anticuerpos recombinantes bivalentes scFv2-Fc L3H6, scFv2-Fc L3H5 y scFv2-Fc L3H7 para interferir con el efecto estimulante de la angiogénesis del VEGF-A humano contenido en los gránulos subcutáneos de Matrigel, en ratones C57BI/6. Se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-HBsAg no relacionado como control negativo. Como control de la inhibición, se utilizó KDR-Fc soluble. La molécula bivalente scFv2-Fc 2H1 8.2 se utilizó como referencia. Al final del experimento, el contenido de la hemoglobina del sedimento de Matrigel se procesa a fin de evaluar la cantidad relativa de vasos sanguíneos nuevos. El gráfico presenta los valores relativos de concentración de hemoglobina (100%), con respecto a la adición de VEGF y sin anticuerpos. Cada barra representa el valor promedio para los animales incluidos en cada grupo, con su desviación estándar correspondiente.

Figura 10. Efecto de la inyección intraperitoneal de las moléculas bivalentes scFv2-Fc L3H6, scFv2-Fc L3H5, scFv2-Fc L3H7 y scFv2 -Fc 2H1 8.2 en la dosis de 2,5 mg/kg de peso, sobre el crecimiento de tumores subcutáneos derivados de la inoculación de la línea celular de tumor humano A673 a ratones desnudos. Los puntos en las curvas son los valores promedio de los tumores estimados para los 5 animales por grupo. Como control negativo, se utilizó el anticuerpo monoclonal CB-Hep.1 no relacionado, a la misma dosis.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Construcción de bibliotecas de fragmentos de anticuerpos scFv expresados en fagos que contienen regiones variables mutadas

(a) Preparación de regiones variables mutadas mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Las secuencias LVVRDTE y LLSYSGAR, correspondientes a la CDR3 de los dominios VH y VL del fragmento de anticuerpo scFv 2H1 (documento WO2008/052489 A1), respectivamente, se utilizaron como diana para la mutagénesis. Se diseñó un conjunto de oligonucleótidos sintéticos (tabla 1) siguiendo el principio de la Parsimonius mutagénesis (PM, Balint, R. y Larrick, J.W. 1993. Gene, I37: 109-118).

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REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo recombinante que reconoce específicamente el factor de crecimiento endotelial vascular humano A (VEGF-A), anticuerpo que comprende:

i) una región variable de cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo compuesto por las secuencias SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 y SEQ ID No. 3, y una región variable de cadena ligera codificada por la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 7, o

ii) una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo compuesto por las secuencias de aminoácidos

SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 y SEQ ID No. 6, y una región variable de cadena ligera con la secuencia de

aminoácidos SEQ ID No. 8.
2. Anticuerpo recombinante, según la reivindicación 1, que interfiere con los efectos estimuladores in vitro, y los efectos proangiogénicos in vivo de las diferentes isoformas de VEGF-A humano.
3. Anticuerpo recombinante, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que es un fragmento de anticuerpo del

tipo Fv de cadena única (scFv), preferentemente en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo que: i) está codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de secuencias de nucleótidos compuestas por la SEQ ID No. 9, la SEQ ID No. 11 y la SEQ ID No. 13, o ii) tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo

compuesto por la SEQ ID No. 10, la SEQ ID No. 12 y la SEQ ID No. 14.
4. Anticuerpo recombinante, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que es un fragmento de anticuerpo del tipo Fab, preferentemente en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo que: i) está codificado por pares de secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo compuesto por la SEQ ID No. 15 y la SEQ ID No. 16, la SEQ ID No. 19 y la SEQ ID No. 20, y la SEQ ID No. 23 y la SEQ ID No. 24, por sus dos cadenas, o ii) está compuesto por los pares de secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo compuesto por la SEQ ID No. 17 y la SEQ ID No. 18, la SEQ ID No. 21 y la SEQ ID No. 22 y la SEQ ID No. 25 y la SEQ ID No. 26, por su dos cadenas.
5. Anticuerpo recombinante, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que es del tipo scFv2-Fc, en el que un fragmento scFv está unido mediante un separador a los dominios constantes de bisagra, CH2 y CH3 de una inmunoglobulina humana, que en su forma proteica se asocia covalentemente a otra cadena polipeptídica idéntica para formar una molécula dimérica, preferentemente en la que dicho anticuerpo es un anticuerpo que: i) está codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo compuesto por las secuencias de nucleótidos SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29 y SEQ ID No. 31; o ii) tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por la SEQ ID No. 28, la SEQ ID No. 30 y la SEQ ID No. 32, o preferentemente en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo en el que los dominios constantes Fc de las inmunoglobulinas humanas son de tipo IgG 1, IgG2, IgG3 o IgG4.
6. Anticuerpo recombinante, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que las secuencias de nucleótidos SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 3, que codifican la región variable de la cadena pesada, y la SEQ ID No.
7. que codifica la región variable de la cadena ligera, están comprendidos en la secuencia que codifica las dos cadenas polipeptídicas, una como la región variable de la cadena pesada seguida por los dominios constantes CH1, bisagra, CH2 y CH3 de una inmunoglobulina IgG 1 humana, y la segunda como la región variable de cadena ligera, seguida por los dominios constantes C kappa o C lambda humanos, preferentemente en el que los dominios constantes de inmunoglobulina humana son del tipo IgG2, IgG3 o IgG4.
7. Anticuerpo recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que está adicionalmente conjugado con un isótopo radioactivo, un agente químico o un agente biológico.
8. Anticuerpo recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que se produce en bacterias recombinantes o en células de mamífero.
9. Vector que codifica el anticuerpo recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, obtenido por manipulación genética de ADN recombinante, en el que dicho vector es un plásmido o secuencia capaz de integrarse en células huésped.
10. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
11. Composición farmacéutica, según la reivindicación 10, caracterizada por permitir una liberación controlada.
12. Anticuerpo recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su utilización en el tratamiento por inmunoterapia de enfermedades que evolucionan con un incremento en la angiogénesis, tales como tumores malignos y sus metástasis, procesos inflamatorios agudos y crónicos, procesos autoinmunes y enfermedades oculares, tales como la degeneración macular relacionada con la edad.
13. Anticuerpo recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en forma de un radiofármaco para su utilización en el diagnóstico in vivo de tumores malignos y sus metástasis, mediante técnicas de formación de imágenes.

imagen1

imagen2

S—scFu 2H1

scFu L3H6

A- - - scFu L3H5

•—se Fu L3H7

scFu erra-MBsftg

100

Conc. (¿ig/ml)

scFv L3H6 —A—scFv L3H5 —«—s=Fv L3H7

scFv anti-HBsAg ■ Ranibizumab

luu

Conc. (Lig/ml)

imagen3

imagen4

Figura 7

imagen5

% de células proliferantes

imagen6

Muestras

<n

C

i

SJ

00

% de células proliferantes

imagen7

01

o

Volumen tumoral (mm3)

imagen8

Muestras

VEGF scF\£-Fc scF\£-Fc scFV2-Fc scFu£-F( L3H6 L3H5 L3H7 2H1-82

(2

c

t©

Niveles de hemoglobina (%)

hJ

o o o ______|_____|_

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00 <Ü O

O o o

_l____I____I

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