MX2011010168A

MX2011010168A - Anticuerpos biespecificos, trivalentes.

Info

Publication number: MX2011010168A
Application number: MX2011010168A
Authority: MX
Inventors: Eike Hoffmann; Ulrich Brinkmann; Pablo Umana; Christian Klein; Rebecca Croasdale; Ekkehard Moessner; Juergen Michael Schanzer; Claudio Sustmann
Original assignee: Roche Glycart Ag
Priority date: 2009-04-07
Filing date: 2010-04-01
Publication date: 2011-10-11
Also published as: CN102369214B; US20100256340A1; IL214884A0; BRPI1010297A2; US20200062826A1; JP2014193181A; PT2417156E; KR101456326B1; CY1116376T1; CN102369214A; CA2757931C; SI2417156T1; SG175077A1; US20130022601A1; KR20110130460A; PL2417156T3; JP2012522527A; WO2010115589A8; JP5616428B2; CA2757931A1

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos biespecíficos trivalentes, a métodos para su producción, a composiciones farmacéuticas que contienen tales anticuerpos y a usos de los mismos. Los anticuerpos biespecíficos trivalentes de la invención comprenden un anticuerpo de longitud completa que se une a un primer antígeno y consiste de dos cadenas pesadas del anticuerpo y dos cadenas ligeras del anticuerpo y un dominio VH fusionado al extremo C-terminal de una de tales cadenas pesadas y un dominio VL fusionado al extremo C-terminal de la otra de tales cadenas pesadas, en donde el dominio VL y el domino VH juntos forman un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a un segundo antígeno.

Description

ANTICUERPOS BIESPECIFICOS, TRIVALENTES Campo de la Invención La presente invención se refiere a anticuerpos biespecificos trivalentes, a métodos para su producción, a composiciones farmacéuticas que contienen tales anticuerpos y a sus usos .

Antecedentes de la Invención Recientemente se ha desarrollado una amplia diversidad de formatos de anticuerpo recombinante multiespecífico, por ejemplo anticuerpos biespecificos tetravalentes mediante la fusión de, por ejemplo, un formato de anticuerpo IgG y dominios de una sola cadena (ver, por ejemplo, Coloma, M.J. et al., Nature Biotech. 15:159-163, 1997, WO 2001/077342, y Morrison, S.L., Nature Biotech. 25 : 1233-1234 , 2007) .

Además, se han desarrollado varios otros formatos nuevos en los que ya no se retiene la estructura nuclear del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o igM) , tales como diacuerpos, triacuerpos o tetracuerpos , minicuerpos, varios formatos de una sola cadena (scFv, Bis-scFv) , que son capaces de unirse a dos o más antígenos (Holliger, P. et al., Nature Biotech. 23:1126-1136, 2005; Fischer, N. y Léger, 0., Pathobiology 74:3-14, 2007; Shen, J. et al., Journal of Immunological Methods 318:65-74, 2007; Wu, C. et al., Nature Biotech. 25 Ref. 223058 (2007) 1290-1297) .

La totalidad de tales formatos utiliza enlazadores para fusionar el núcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) a una proteína ligante adicional (por ejemplo scFv) o para fusionar, por ejemplo, dos fragmentos Fab o scFv (Fischer, N. y Léger, O., Pathobiology 74:3-14, 2007). Puede desearse la conservación de las funciones efectoras, tales como, por ejemplo, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) , las cuales se encuentran mediadas por la unión de un receptor Fe, mediante el mantenimiento de un grado elevado de similitud con los anticuerpos naturales.

En la patente O 2007/024715 se informa de inmunoglobulinas duales de dominio variable en forma de proteínas modificadas ligantes multivalentes y multiespecíficas . Se informa de un procedimiento para la preparación de anticuerpos diméricos biológicamente activos en la patente US 6,897,044. Se informa de un constructo de anticuerpo Fv multivalente que presenta por lo menos cuatro dominios variables que se encuentran unidos entre sí mediante enlazadores peptídicos en la patente US 7,129,330. Se informa de estructuras de unión de antígeno diméricas y multiméricas en el documento US 2005/0079170. En la patentes US 6,511,663 se informa de una proteína ligante de antígeno monoespecífica tri o tetravalente compuesta de tres o cuatro fragmentos Fab unidos entre ellos covalentemente a través de una estructura de conexión, cuya proteína no es una inmunoglobulina natural. En el documento WO 2006/020258 se informa de anticuerpos biespecífieos tetravalentes que pueden expresarse eficientemente en células procarióticas y eucarióticas , y que resultan útiles en métodos terapéuticos y diagnósticos. Se informa en el documento US 2005/0163782 de un método para la separación o la síntesis preferente de dímeros unidos mediante por lo menos un enlace disulfuro entre cadenas, a partir de dímeros que no se encuentran unidos por, como mínimo, un enlace disulfuro entre cadenas, en el que se parte de una mezcla que comprende los dos tipos de polipéptidos diméricos . Se informa de receptores tetravalentes biespecíficos en la patente US 5,959,083. Se informa de anticuerpos modificados con tres o más sitios de unión de antígeno funcionales en el documento WO 2001/077342.

Se informa de polipéptidos de unión a antígeno multiespecíficos y multivalentes en el documento WO 1997/001580. El documento WO 1992/004053 informa de homoconjugados, típicamente preparados a partir de anticuerpos monoclonales de la clase IgG que se unen al mismo determinante antigénico, unidos covalentemente mediante reticulación sintético. Se informa de anticuerpos monoclonales oligoméricos con elevada avidez para antígenos en el documento WO 1991/06305, en donde se secretan oligómeros, típicamente de la clase IgG, que presentan dos o más monómeros de inmunoglobulina asociados entre sí formando moléculas de IgG tetravalentes o hexavalentes . Se informa de anticuerpos derivados de ovejas y constructos de anticuerpo modificados en la patente US 6,350,860, que pueden utilizarse para tratar enfermedades en las que la actividad del interferón gamma resulta patogénica. En el documento US 2005/0100543 se informa de constructos dianizables que son portadores multivalentes de anticuerpos biespecíficos , es decir, cada molécula de un constructo dianizable puede servir como portador de dos o más anticuerpos biespecíficos . Se informa de anticuerpos tetravalentes biespecíficos genéticamente manipulados en el documento WO 1995/009917. En el documento WO 2007/109254 se informa de moléculas de unión estabilizadas que consisten o que comprenden un scFv estabilizado .

Breve Descripción de la Invención Un primer aspecto de la presente ivnención es un anticuerpo biespecífico trivalente que comprende a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consiste de dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo, b) un polipéptido que consiste de: ba) un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo, o bb) un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo y un dominio constante 1 de anticuerpo (CHl) , en donde el polipéptido se encuentra fusionado con el extremo N-terminal del dominio VH mediante un péptido conector con el extremo C-terminal de una de las dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa. c) un polipéptido que consiste de: ca) un dominio variable cadena ligera de anticuerpo (VL) , o cb) un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo y un dominio constante de cadena ligera (CL) de anticuerpo, en donde el polipéptido se encuentra fusionado con el extremo N-terminal del dominio VL mediante un péptido conector al extremo C-terminal de la otra de las dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa, y en el que el dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo del polipéptido de b) y el dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo del polipéptido de a) conjuntamente forman un sitio de unión de antígeno que se une específicamente a un segundo antígeno.

Un aspecto adicional de la invención es una molécula de ácido nucleico codificante de un anticuerpo biespecífico trivalente según la invención.

Los aspectos adicionales de la invención son una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico, trivalente.

Por una parte, los anticuerpos biespecíficos trivalentes según la invención muestran nuevas propiedades debido a su unión a diferentes antígenos, y por otra parte, resultan adecuados para la producción y formulación farmacéutica debido a su estabilidad, agregación reducida y propiedades farmacocinéticas y biológicas. Debido a su núcleo de Ig todavía conservan las propiedades de los anticuerpos naturales tales como ADCC y CDC.

Breve Descripción de las Secuencias de aminoácidos SEC ID NO: 1 dominio variable de cadena pesada <ErbB3> de HER3 clon 29 SEC ID NO: 2 dominio variable de cadena ligera <ErbB3> de HER3 clon 29 SEC ID NO: 3 dominio variable de cadena pesada <c-Met> de Mab 5D5 SEC ID NO: 4 dominio variable de cadena ligera <c-Met> de Mab 5D5 SEC ID NO: 5 cadena pesada <ErbB3> HER3 clon 29 SEC ID NO: 6 cadena ligera <ErbB3> HER3 clon 29 SEC ID NO: 7 cadena pesada <c-Met> de Mab 5D5 SEC ID NO: 8 cadena ligera <c-Met> de Mab 5D5 SEC ID NO: 9 cadena pesada <c-Met> de Fab 5D5 SEC ID NO: 10 cadena ligera <c-Met> de Fab 5D5 SEC ID NO: 11 cadena pesada 1 <ErbB3 -c- et> de Her3/Met_KHSS SEC ID NO: 12 cadena pesada 2 <ErbB3 -c-Me > de Her3/Met_KHSS SEC ID NO: 13 cadena ligera <ErbB3 -c-Met> de Her3/Met_KHSS SEC ID NO: 14 cadena pesada 1 <ErbB3-c-Met> de Her3/Met_SSKH SEC ID NO: 15 cadena pesada 2 <ErbB3-c-Met> de Her3/Met_SSKH SEC ID NO: 16 cadena ligera t <ErbB3 -c-Met> de Her3/Met_SSKH SEC ID NO: 17 cadena pesada 1 <ErbB3-c-Met> de Her3/Met_SSKHSS SEC ID NO: 18 cadena pesada 2 <ErbB3-c-Met> de Her3/Met_SSKHSS SEC ID NO: 19 cadena ligera <ErbB3 -c-Met> de Her3/Met_SSKHSS SEC ID NO: 20 cadena pesada 1 <ErbB3-c-Met> de Her3/Met_lC SEC ID NO: 21 cadena pesada 2 <ErbB3-c-Met> de Her3/Met_lC SEC ID NO: 22 cadena ligera <ErbB3 -c-Met> de Her3/Met 1C SEC ID NO: 23 cadena pesada 1 <ErbB3-c-Met> de Her3/Met_6C SEC ID NO: 24 cadena pesada 2 <ErbB3 -c-Met> de Her3/Met_6C SEC ID NO: 25 cadena ligera <ErbB3 -c-Met> de Her3/Met_6C SEC ID NO: 26 región constante de cadena pesada de la IgGl humana SEC ID NO: 27 región constante de cadena pesada de la IgGl humana SEC ID NO: 28 región constante de la cadena ligera kappa humana SEC ID NO: 29 región constane de la cadena ligera lambda humana Los ejemplos, listado de secuencias y figuras se proporcionan para ayudar a comprender la presente invención, el alcance real de la cual se proporciona en las reivindicaciones adjuntas. Debe entenderse que resulta posible llevar a cabo modificaciones de los procedimientos indicados sin apartarse del espíritu de la invención.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1. Estructura esquemática de un anticuerpo de longitud completa sin unión específica del dominio CH4 a un primer antígeno 1 con dos pares de cadena pesada y cadena ligera que comprenden dominios variables y constantes en un orden típico.

Figuras 2a-2b. Representación esquemática de un anticuerpo biespecífico trivalente según la invención, que comprende un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno 1 al que: a) Figura 2a, se fusionan dos polipéptidos VH y VL (formando conjuntamente ambos dominios VH y VL un sitio de unión de antígeno que se une específicamente a un segundo antígeno 2) , b) Figura 2b, se fusionan dos polipéptidos VH- CH1 y VL-CL (formando conjuntamente los dominios VH y VL un sitio de unión de antígeno que se une específicamente a un segundo antígeno 2) Figura 3. Representación esquemática de un anticuerpo biespecífico trivalente según la invención, que comprende un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno 1 al que se fusionan dos polipéptidos, VH y VL (formando conjuntamente los dominios VH y VL un sitio de unión de antígeno que se une específicamente a un segundo antígeno 2) en "cadena sobreenrollada y cadena en forma de horquilla" .

Figura 4. Representación esquemática de un anticuerpo biespecífico trivalente según la invención, que comprende un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno 1 al que se fusionan dos polipéptidos VH y VL (formando conjuntamente los dominios VH y VL un sitio de unión de antígeno que se une específicamente a un segundo antígeno 2, en el que tales dominios VH y VL comprenden un puente disulfuro intercatenario entre las posiciones VH44 y VL100) de "cadena sobreenrollada y cadena en forma de horquilla" .

Figura 5. Unión de anticuerpos biespecíficos a la superficie celular de células cancerígenas .

Figuras 6a- 6c. Inhibición de la fosforilación del receptor c-Met inducida por HGF por parte de formatos biespecíficos de anticuerpo de Her3/c- et .

Figuras 7a-7b. Inhibición de la fosforilación del receptor Her3 inducida por HRG por parte de formatos biespecíficos de anticuerpo de Her3/c-Met.

Figura 8. Inhibición de la proliferación de HUVEC inducida por HGF por parte de formatos biespecíficos de anticuerpo de Her3/c-Met.

Figura 9. Inhibición de la proliferación de la línea celular cancerígena A431 por parte de formatos biespecíficos de anticuerpo de Her3/c-Met.

Figura 10. Análisis de la inhibición de la diseminación (dispersión) célula-célula inducida por HGF en la línea celular cancerígena A431 por parte de formatos biespecíficos de anticuerpo de Her3/c-Met.

Descripción Detallada de la Invención Un aspecto de la invención es un anticuerpo biespecífico, trivalente que comprende: a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consiste de dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo, b) un polipéptido que consiste de: ba) un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo; o bb) un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo y un dominio constante 1 de anticuerpo (CHl) , en donde el polipéptido se encuentra fusionado con el extremo N-terminal del dominio VH mediante un péptido conector con el extremo C-terminal de una de las dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa. c) un polipéptido que consiste de: ca) un dominio variable cadena ligera de anticuerpo (VL) , o cb) un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo y un dominio constante de cadena ligera (CL) de anticuerpo, en donde el polipéptido se encuentra fusionado con el extremo N-terminal del dominio VL mediante un péptido conector al extremo C-terminal de la otra de las dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa, y en el que el dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo del polipéptido de b) y el dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo del polipéptido de c) conjuntamente forman un sitio de unión de antígeno que se une específicamente a un segundo antígeno.

Opcionalmente el dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo del polipéptido de b) y el dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo del polipéptido de c) se encuentran unidos y estabilizados mediante un puente disulfuro entre cadenas mediante la introducción de un enlace disulfuro entre las posiciones siguientes: i) entre las posición 44 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera, ii) entre la posición 105 del dominio variable de cadena pesada y la posición 43 del dominio variable de cadena ligera, o iii) entre la posición 101 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera (la númeración en todo caso según el índice EU de Kabat) .

Las técnicas para introducir puentes disulfuro no naturales para la estabilización se describen en, por ejemplo, la patente WO 94/029350, Rajagopal, V. et al., Prot. Engin. 1453-59, 1997; Kobayashi, H. et al., Nuclear Medicine & Biology vol. 25:387-393, 1998, o Schmidt, M. et al., Oncogene 18:1711-1721, 1999. En una modalidad, el enlace disulfuro opcional entre los dominios variables de los polipéptidos de b) y e) se encuentra entre la posición 44 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera. En una modalidad, el enlace disulfuro opcional entre dominios variables de los polipéptidos de b) y c) se encuentre entre la posición 105 del dominio variable de cadena pesada y la posición 43 del dominio variable de cadena ligera (la numeración en todo caso según el índice EU de Kabat) . En una modalidad, resulta preferente un anticuerpo biespecífico trivalente sin la estabilización opcional con disulfuro entre los dominios variables VH y VL de los fragmentos Fab de un sola cadena.

La expresión "anticuerpo de longitud completa" se refiere a un anticuerpo que consiste de dos "cadenas pesadas de anticuerpo de longitud completa" y dos "cadenas ligeras de anticuerpo de longitud completa" (ver la Fig. 1) . Una "cadena pesada de anticuerpo de longitud completa" es un polipéptido que consiste, en dirección N-terminal a C-terminal, de un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo, un dominio constante l de cadena pesada de anticuerpo (CH1) , una región bisagra de anticuerpo (HR) , un dominio constante 2 de cadena pesada de anticuerpo (CH2) y un dominio constante 3 de cadena pesada de anticuerpo (CH3) , en forma abreviada: VH-CH1-HR-CH2-CH3 , y opcionalmente un dominio constante 4 de cadena pesada de anticuerpo (CH4) en el caso de un anticuerpo de la subclase IgE. Preferentemente la "cadena pesada de anticuerpo de longitud completa" es un polipéptido que consiste, en dirección N-terminal a C-terminal, de VH, CH1, HR, CH2 y CH3. Una "cadena ligera de anticuerpo de longitud completa" es un polipéptido que consiste, en dirección N-terminal a C-terminal, de un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo y un dominio constante de cadena ligera (CL) de anticuerpo, en forma abreviada: VL-CL. El dominio constante de cadena ligera (CL) de anticuerpo puede ser K ( kappa ) o ? (lambda) . Las dos cadenas de anticuerpo de longitud completa se encuentran unidas entre sí mediante enlaces disulfuro entre polipéptidos, entre el dominio CL y el dominio CH1 y entre las regiones bisagra de las cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa. Son ejemplos de anticuerpos de longitud completa típicos anticuerpos naturales tales como IgG (por ejemplo IgGl e IgG2) , Ig , IgA, IgD e IgE. Los anticuerpos de longitud completa según la invención pueden ser de una única especie, por ejemplo el ser humano, o puede ser anticuerpos quimerizados o humanizados. Los anticuerpos de longitud completa según la invención comprende dos sitios de unión de antígeno formados por una pareja de VH y VL, los cuales se unen específicamente al mismo antígeno. El extremo C-terminal de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo de longitud completa indica el último aminoácido en el extremo C-terminal de tal cadena pesada o ligera .

El extremo N-terminal del dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo del polipéptido de b) y el dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo del polipéptido de c) indica el último aminoácido en el extremo N-terminal del dominio VH o VL.

Los dominios CH3 del anticuerpo de longitud completa según la invención pueden alterarse mediante la tecnología de "introducción de superhélice" que se describe en detalle mediante varios ejemplos en, por ejemplo, el documento WO 96/027011, Ridgway, J.B. et al., Protein Eng. 9:617-621, 1996, y en Merchant, A.M. et al., Nat . Biotechnol. 16:677-681, 1998. En tal método, se alteran las superficies de interacción de los dos dominios CH3 para incrementar la heterodimerización de ambas cadenas pesadas que contienen los dos dominios CH3. Cualquiera de los dos dominios CH3 (de las dos cadenas pesadas) puede ser el "cadena sobreenrollada" , siendo el otro el "cadena en forma de horquilla" . La introducción de un puente disulfuro estabiliza adicionalmente los heterodímeros (Merchant, A.M. et al., Nature Biotech. 16:677-681, 1998; Atwell, S. et al., J. Mol. Biol . 270:26-35, 1997) e incrementa el rendimiento.

De esta manera, en un aspecto de la invención, el anticuerpo biespecífico trivalente se caracteriza adicionalmente porque: el dominio CH3 de una cadena pesada del anticuerpo de longitud completa y el dominio CH3 de la otra cadena pesada del anticuerpo de longitud completa se reúnen en una interface que comprende una interface original entre los dominios CH3 de anticuerpo, en donde se altera tal interface con el fin de estimular la formación de anticuerpo biespecífico bivalente, en el que la alteración se caracteriza porque: a) se altera el dominio CH3 de una cadena pesada, de manera que dentro de la interface original del dominio CH3 de una cadena pesada que se reúne con la interface original del dominio CH3 de la otra cadena pesada del anticuerpo biespecífico bivalente, se sustituye un residuo aminoácido por un residuo aminoácido de volumen de cadena lateral más grande, generando de esta manera una protuberancia en el interior de la interface del dominio CH3 de una cadena pesada, pudiendo situarse la protuberancia en una pocilio en el interior de la interface del dominio CH3 de la otra cadena pesada y b) se altera el dominio CH3 de la otra cadena pesada, de manera que dentro de la interface original del segundo dominio CH3 que se reúne con la interface original del primer dominio CH3 dentro del anticuerpo biespecífico trivalente, se sustituye un residuo aminoácido por un residuo aminoácido de volumen de cadena lateral más pequeño, generando de esta manera una pocilio en el interior de la interface del segundo dominio CH3, en el interior de la cual puede situarse una protuberancia en la interface del primer dominio CH3.

Preferentemente, tal residuo aminoácido de volumen de cadena lateral más grande se selecciona de entre el grupo que consiste de arginina (R) , fenilalanina (F) , tirosina (Y) y triptofano (W) .

Preferentemente, tal residuo aminoácido de volumen de cadena lateral más pequeño se selecciona de entre el grupo que consiste de alanina (A) , serina (S) , treonina (T) y valina (V) .

En un aspecto de la invención, ambos dominios CH3 se alteran adicionalmente mediante la introducción de cisteína (C) como el aminoácido en las posiciones correspondientes de cada dominio CH3 , de manera que pueda formarse un puente disulfuro entre ambos dominios CH3.

En una modalidad preferente, el anticuerpo biespecífico trivalente comprende una mutación T366W en el dominio CH3 de la "cadena sobreenrollada" , y mutaciones T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" . También puede utilizarse un puente disulfuro adicional entre cadenas entre los dominios CH3 (Merchant, A.M. et al., Nature Biotech. 16:677-681, 1998), por ejemplo mediante la introducción de una mutación Y349C en el dominio CH3 de la "cadena sobreenrollada" y una mutación E356C o una mutación S354C en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" . De esta manera, en otra modalidad preferida, el anticuerpo biespecífico trivalente comprende las mutaciones Y349C y T366W en uno de los dos dominios CH3, y las mutaciones E356C, T366S, L368A y Y407V en el otro de los dos dominios CH3, o el anticuerpo biespecífico trivalente comprende las mutaciones Y349C y T366W en uno de los dos dominios CH3, y las mutaciones S354C, T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3 (formando la mutación Y349C adicional en un dominio CH3 y la mutación E356C o S354C adicional en el otro dominio CH3 un puente disulfuro entre cadenas) (la numeración en todo caso según el índice EU de Kabat) . Sin embargo, también pueden utilizarse alternativa o adicionalmente otras tecnologías de superhélices , tal como se describe en el documento EP n° 1 870 459 Al. Un ejemplo preferente del anticuerpo biespecífico trivalente son las mutaciones R409D y K370E en el dominio CH3 de la "cadena sobreenrollada", y las mutaciones D399K y E357K en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" (numeración en todo caso según el índice EU de Kabat) .

En otra modalidad preferida, el anticuerpo biespecífico trivalente comprende una mutación T366W en el dominio CH3 de la "cadena sobreenrollada" y las mutaciones T366S, L368A e Y407V en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" , y además las mutaciones R409D y K370E en el dominio CH3 de la "cadena sobreenrollada" , y las mutaciones D399K y E357K en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" .

En otra modalidad preferida, el anticuerpo biespecífico trivalente comprende las mutaciones Y349C y T366W en uno de los dos dominios CH3 , y las mutaciones S354C, T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3, o el anticuerpo biespecífico trivalente comprende las mutaciones Y349C y T366 en uno de los dos dominios CH3 , y las mutaciones S354C, T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3, y además las mutaciones R409D y K370E en el dominio CH3 de la "cadena sobreenrollada" y D399K y E357K en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" .

El anticuerpo biespecífico de la invención comprende tres sitios de unión de antígeno (A) , el anticuerpo de longitud completa comprende dos sitios idénticos de unión de antígeno que se unen específicamente a un primer antígeno, y B) el dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo y el dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo del polipéptido de c) forman conjuntamente un sitio de unión de antígeno que se une específicamente a un segundo antígeno.

Las expresiones "sitio de unión" o "sitio de unión de antígeno" tal como se utilizan en la presente descripción se refieren a una o más regiones del anticuerpo biespecífico según la invención a las que se une específicamente el antígeno respectivo. Los sitios de unión de antígeno en el anticuerpo de longitud completa o en el dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo del polipéptido de b) y el doinio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) del polipéptido de c) están formados, cada uno, por una pareja que consiste de un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo y un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo .

Los sitios de unión de antígeno que se unen específicamente al antígeno deseado pueden derivarse a) de anticuerpos conocidos contra el antígeno, o b) de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo nuevos obtenidos mediante métodos de inmunización de novo utilizando, inter alia, el antígeno proteína o ácido nucleico o fragmentos de los mismos, o mediante expresión fágica.

Un sitio de unión de antígeno de un anticuerpo de la invención contiene seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) que contribuyen en grados diversos a la afinidad del sitio de unión para el antígeno. Existen tres CDR de dominio variable de cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRH3) y tres CDR de dominio variable de cadena ligera (CDRL1, CDRL2 y CDRL3) . La extensión de las regiones CDR y de marco (FRs) se determina mediante comparación con una base de datos compilada a partir de secuencias de aminoácidos en las que las regiones se han definido según la variabilidad entre secuencias.

La especificidad del anticuerpo se refiere al reconocimiento específico del anticuerpo para un epítopo particular de un antígeno. Los anticuerpos naturales, por ejemplo, son monoespecíficos . La expresión "anticuerpos biespecíficos" según la invención se refiere a anticuerpos que presentan dos especificidades de unión de antígeno diferentes. En el caso de que un anticuerpo presente más de una especificidad, los epítopos reconocidos pueden asociarse a un único antígeno o a más de un antígeno. El término "monoespecífico" referido a un anticuerpo tal como se utiliza en la presente descripción se refiere a un anticuerpo que presenta uno o más sitios de unión, cada uno de los cuales se une al mismo epítopo del mismo antígeno. El término "valente" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a la presencia de un número específico de sitios de unión en una molécula de anticuerpo. Un anticuerpo natural, por ejemplo, o un anticuerpo de longitud completa según la invención presenta dos sitios de unión y es bivalente. El término "trivalente" se refiere a la presencia de tres sitios de unión en una molécula de anticuerpo. Los anticuerpos biespecíficos según la invención son "trivalentes" . La expresión "anticuerpo biespecífico trivalente" tal como se utiliza en la presente descripción se refiere a un anticuerpo que presenta tres sitios de unión de antígeno de los cuales dos se unen al mismo antígeno (o al mismo epítopo del antígeno) y el tercero se une a un antígeno diferente o á un epítopo diferente del mismo antígeno. Los anticuerpos de la presente invención presentan tres sitios de unión y son biespecíficos .

Otra modalidad de la presente invención es un anticuerpo biespecífico, trivalente, que comprende: a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consiste de: aa) dos cadenas pesadas de anticuerpo que consisten, en dirección N-terminal a C-terminal, de un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo, un dominio constante 1 de cadena pesada de anticuerpo (CH1) , una región bisagra de anticuerpo (HR) , un dominio constante 2 de cadena pesada (CH2) de anticuerpo y un dominio constante 3 de cadena pesada (CH3) de anticuerpo, y ab) dos cadenas ligeras de anticuerpo que consisten de, en dirección N-terminal a C-terminal, un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo y un dominio constante de cadena ligera (CL) de anticuerpo, y b) un polipéptido que consiste de: ba) un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo, o bb) un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo y un dominio constante 1 (CH1) de anticuerpo, en donde el polipéptido se encuentra fusionado con el extremo N-terminal del dominio VH mediante un péptido conector al extremo C-terminal de una de las dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa, en donde el péptido conector es un péptido de por lo menos 5 aminoácidos, preferentemente de entre 25 y 50 aminoácidos, c) un polipéptido que consiste de: ca) un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo, o cb) un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo y un dominio constante de cadena ligera (CL) de anticuerpo, en donde el polipéptido se encuentra fusionado con el extremo N-terminal del dominio VL mediante un péptido conector al extremo C-terminal de la otra de las dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa, en donde el péptido conector es idéntico al péptido conector de b) , y en el que el dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo del polipéptido de b) y el dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo del polipéptido de c) forman conjuntamente un sitio de unión de antígeno que se une específicamente al segundo antígeno.

Dentro de la presente modalidad, preferentemente el anticuerpo biespecífico trivalente comprende una mutación T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3 , y más preferentemente el anticuerpo biespecífico trivalente comprende las mutaciones Y349C y T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones D356C, T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3 (formando la mutación Y349C adicional en un dominio CH3 y la mutación D356C adicional en el otro dominio CH3 un puente disulfuro entre cadenas) .

En una modalidad de la invención, el anticuerpo biespecífico trivalente según la invención se caracteriza porque: a) el anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a ErbB-3 comprende como dominio variable de cadena pesada la secuencia SEC ID NO: 1, y como dominio variable de cadena ligera, la secuencia SEC ID NO: 2 b) tal polipéptido de b) comprende, a modo de dominio variable de cadena pesada, la secuencia SEC ID NO: 3, y c) tal polipéptido de c) comprende, a modo de dominio variable de cadena ligera, la secuencia SEC ID NO: 4.

En otro aspecto de la presente invención, el anticuerpo biespecífico, trivalente según la invención comprende : a) un anticuerpo de longitud completa que se une a un primer antígeno, que consiste de dos cadenas pesadas de anticuerpo VH-CH1-HR-CH2-CH3 y dos cadenas ligeras de anticuerpo VL-CL; (en las que preferentemente uno de los dos dominios CH3 comprende las mutaciones Y349C y T366W y el otro de los dos dominios CH3 comprende las mutaciones S354C, T366S, L368A e Y407V) , b) un polipéptido que consiste de: ba) un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo, o bb) un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo y un dominio constante 1 de anticuerpo (CH1) , en donde el polipéptido se encuentra fusionado con el extremo N-terminal del dominio VH mediante un péptido conector con el extremo C-terminal de una de las dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa. c) un polipéptido que consiste de: ca) un dominio variable cadena ligera de anticuerpo (VL) , o cb) un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo y un dominio constante de cadena ligera (CL) de anticuerpo, en donde el polipéptido se encuentra fusionado al extremo N-terminal del dominio VL mediante un péptido conector al extremo C-terminal de la otra de las dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa, y en el que el dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo del polipéptido de b) y el dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo del polipéptido de c) forman conjuntamente un sitio de unión de antígeno que se une específicamente al segundo antígeno.

Otra modalidad de la presente invención es un anticuerpo biespecífico, trivalente que comprende: a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a ErbB-3 humano y que consiste de: aa) dos cadenas pesadas de anticuerpo que consisten de, en dirección N-terminal a C-terminal, de un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo, un dominio constante 1 de cadena pesada de anticuerpo (CH1) , una región bisagra de anticuerpo (HR) , un dominio constante 2 de cadena pesada de anticuerpo (CH2) y un dominio constante 3 de cadena pesada de anticuerpo (CH3) , y ab) dos cadenas ligeras de anticuerpo que consisten, en dirección N-terminal a C-terminal, de un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo y un dominio constante de cadena ligera (CL) de anticuerpo (VL-CL) , y b) un fragmento Fv de una sola cadena que se une específicamente a c-Met humano. en donde el fragmento Fv de una sola cadena de b) se encuentra fusionado con el anticuerpo de longitud completa de a) mediante un péptido conector en el extremo C-terminal o N-terminal de la cadena pesada o ligera (preferentemente en el extremo C-terminal de la cadena pesada) del anticuerpo de longitud completa, en donde el péptido conector es un péptido de por lo menos 5 aminoácidos, preferentemente de entre 25 y 50 aminoácidos .

Preferentemente el anticuerpo biespecífico trivalente comprende además las mutaciones Y349C y T366W en uno de los dos dominios CH3 del anticuerpo de longitud completa, y las mutaciones S354C (o E356C) , T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3 del anticuerpo de longitud completa.

Otra modalidad de la presente invención es un anticuerpo biespecífico, trivalente que comprende: a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a ErbB-3 humano y que consiste de: aa) dos cadenas pesadas de anticuerpo que consisten, en dirección N-terminal a C-terminal, de un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo, un dominio constante 1 de cadena pesada de anticuerpo (CH1) , una región bisagra de anticuerpo (HR) , un dominio constante 2 de cadena pesada de anticuerpo (CH2) y un dominio constante 3 de cadena pesada de anticuerpo (CH3) , y ab) dos cadenas ligeras de anticuerpo que consisten de, en dirección N-terminal a C-terminal, un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo y un dominio constante de cadena ligera (CL) de anticuerpo, y b) un polipéptido que consiste de: ba) un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo, o bb) un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo y un dominio constante 1 de anticuerpo (CHl),en donde el polipéptido se encuentra fusionado con el extremo N-terminal del dominio VH mediante un péptido conector al extremo C-terminal de una de las dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa, en donde el péptido conector es un péptido de por lo menos 5 aminoácidos, preferentemente de entre 25 y 50 aminoácidos, c) un polipéptido que consiste de: ca) un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo, o cb) un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo y un dominio constante de cadena ligera (CL) de anticuerpo, en donde el polipéptido se encuentra fusionado con el extremo N-terminal del dominio VL mediante un péptido conector al extremo C-terminal de la otra de las dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa, en donde el péptido conector es idéntico al péptido conector de b) , y en el que el dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo del polipéptido de b) y el dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo del polipéptido de c) conjuntamente forman un sitio de unión de antígeno que se une específicamente a c-Met humano.

Los anticuerpos de longitud completa de la invención comprenden regiones constantes de inmunoglobulina de una o más clases de inmunoglobulina . Entre las clases de inmunoglobulina se incluyen los isotipos IgG, IgM, IgA, IgD e IgE y, en el caso de IgA e IgA, los subtipos de las mismas. En una modalidad preferente, un anticuerpo de longitud completa de la invención presenta una estructura de dominio constante de un anticuerpo de tipo IgG.

Las expresiones "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" tal como se utilizan en la presente descripción se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una única composición de aminoácidos .

La expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que comprende una región variable, es decir la región de unión, procedente de una fuente o especie, y por lo menos una parte de una región constante derivada de una fuente o especie diferente, habitualmente preparado mediante técnicas de ADN recombinante . Los anticuerpos quiméricos que comprenden una región variable murina y una región constante humana resultan preferentes. Otras formas preferentes de "anticuerpos quiméricos" comprendidas en la presente invención son aquéllas en las que la región constante ha sido modificada o cambiada respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades según la invención, especialmente con respecto a la unión de Clq y/o a la unión de receptor Fe (FcR) . Este tipo de anticuerpos quiméricos también se denomina "anticuerpos de clase intercambiada" . Los anticuerpos quiméricos son el producto de genes de inmunoglobulina expresados que comprenden segmentos de ADN codificantes de regiones variables de inmunoglobulina y segmentos de ADN codificantes de regiones constantes de inmunoglobulina. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos implican técnicas convencionales de ADN recombinante y de transfección génica bien conocidas de la técnica (ver, por ejemplo, Morrison, S.L. et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1985 y las patentes US 5,202,238 y 5, 204 , 244.

La expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos en los que la estructura o las "regiones determinantes de complementariedad" (CDR) han sido modificadas para que comprenden la CDR de una inmunoglobulina de especificidad diferente comparado con la de la inmunoglobulina parental . En una modalidad preferente, se injerta una CDR murina en la región de estructura de un anticuerpo humano para preparar el "anticuerpo humanizado" . Ver, por ejemplo, Riechmann, L. et al., Nature 332:323-327, 1988, y Neuberger, M.S. et al., Nature 314:268-270, 1985. Las CDR particularmente preferentes corresponden a aquéllas que representan secuencias que reconocen los antígenos indicados anteriormente para los anticuerpos quiméricos. Otras formas de "anticuerpos humanizados" comprendidas dentro de la presente invención son aquéllas en las que la región constante ha sido adicionalmente modificada o cambiada respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades según la invención, especialmente con respecto a la unión de Clq y/o a la del receptor de Fe (FcR) .

La expresión "anticuerpo humano" , tal como se utiliza en la presente descripción, pretende incluir anticuerpos que presentan regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos son bien conocidos del estado de la técnica (van Dijk, M.A. y van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol . 5:368-374, 2001). También pueden producirse anticuerpos humanos en animales transgénicos (por ejemplo ratones) que son capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo o una selección de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulinas . La transferencia de la serie génica de inmunoglobulinas de la línea germinal humana en tales ratones mutantes para la línea germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos tras el reto de antígeno (ver, por ejemplo, Jakobovits, A. et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 90:2551-2555, 1993; Jakobovits, A. et al., Nature 362:255-258, 1993; Brüggemann, M. et al., Year Immunol . 7 (1993) 33-40) . También pueden producirse anticuerpos humanos en bibliotecas de expresión fágica (Hoogenboom, H.R. y Winter, G.J., Mol. Biol . 227:381-388, 1992; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991). Las técnicas de Colé, S.P.C. et al. y de Boerner, P. et al. también se encuentran disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonáles humanos (Colé, S.P.C. et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, páginas 77 a 96, 1985; y Boerner, P. et al., J. Immunol. 147:86-95, 1991). Tal como se ha indicado para los anticuerpos quiméricos y humanizados según la invención, la expresión "anticuerpo humano" tal como se utiliza en la presente descripción también comprende anticuerpos modificados en la región constante para generar las propiedades según la invención, especialmente con respecto a la unión de Clq y/o a la unión de FcR, por ejemplo mediante "intercambio de clase", es decir, el cambio o la mutación de partes de Fe (por ejemplo de IgGl a IgG4 y/o la mutación IgGl/IgG4) .

La expresión "anticuerpo recombinante humano" , tal como se utiliza en la presente descripción, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan por medios recombinantes, tal como anticuerpos aislados de una célula hospedera, tal como una célula NSO o CHO, o de un animal (por ejemplo un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglou lina humana o para anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedera. Los anticuerpos recombinantes humanos presentan regiones variables y constantes en una forma reorganizada. Los anticuerpos recombinantes humanos según la invención han sido sometidos a hipermutación somática in vivo. De esta manera, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivadas y relacionadas con secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir naturalmente en el repertorio in vivo de anticuerpos de la línea germinal humana .

La expresión "dominio variable" (dominio variable de una cadena ligera (VL) , región variable de una cadena pesada (VH) ) tal como se utiliza en la presente descripción se refiere a cada cadena de la pareja de cadenas ligera y pesada implicada directamente en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios de cadenas variables ligera y pesada humanas presentan la misma estructura general y cada dominio comprende cuatro regiones de estructura (FR) cuyas secuencias se encuentran ampliamente conservadas, conectadas por tres "regiones hipervariables" (o regiones determinantes de complementariedad, CDR) . Las regiones de estructura adoptan una conformación de hoja ß y las CDR pueden formar bucles conectando la estructura de hoja ß. Las CDR en cada cadena son mantenidas en su estructura tridimensional por las regiones de estructura y forman conjuntamente con las CDR de la otra cadena el sitio de unión de antígeno. Las regiones CDR3 de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo desempeñan un papel particularmente importante en la especificidad/afinidad de unión de los anticuerpos según la invención y, por lo tanto, proporcionan un objetivo adicional de la invención.

Las expresiones "región hipervariable" o "parte de unión de antígeno de un anticuerpo" , tal como se utilizan en la presente descripción, se refieren a los residuos aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión de antígeno. La región hipervariable comprende residuos aminoácidos de las "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR" . Las regiones "de estructura" o "FR" son aquellas regiones de dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable tal como se definen en la presente descripción. Por lo tanto, las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo comprenden, de extremo N-terminal a extremo C-terminal, los dominios FR1 , CDR1, FR2 , CDR2, FR3 , CDR3 y FR4. Las CDR en cada cadena se encuentran separadas por tales aminoácidos de marco. Especialmente, la CDR3 de la cadena pesada es la región que contribuye más a la unión de antígeno. Las regiones CDR y FR se determinan según la definición estándar de Kabat, E .A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) .

Tal como se utiliza en la presente descripción, la expresión "de unión" o "de unión específica" se refieren a la unión del anticuerpo a un epítopo del antígeno en un ensayo in vitro, preferentemente en un ensayo de resonancia de plasmón (BIAcore, GE-Healthcare, Uppsala, Suecia) con antígeno de tipo silvestre purificado. La afinidad de unión está definida por los términos ka (constante de velocidad para la asociación del anticuerpo del complejo de anticuerpo/antígeno) , kD (constante de disociación) y KD (kD/ka) . La unión o unión específica se refiere a una afinidad de unión (KD) de 10"8 moles/1 o inferior, preferentemente de entre 10"9 y 10"13 moles/1. De esta manera, un anticuerpo biespecífico trivalente según la invención se une específicamente a cada antígeno para el que es específico con una afinidad de unión (KD) de 10 moles/1 o inferior, preferentemente de entre 10"9 M y 10"13 moles/1.

La unión del anticuerpo a FCYRIII puede investigarse mediante un ensayo BIAcore (GE-Healthcare Uppsala, Suecia) . La afinidad de unión está definida por los términos ka (constante de velocidad para la asociación del anticuerpo del complejo de anticuerpo/antígeno) , kD (constante de disociación) y KD (kD/ka) .

El término "epítopo" incluye cualquier determinante polipéptido capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. En determinadas modalidades, el determinante epítopo incluye grupos superficiales químicamente activos de moléculas, tales como aminoácidos, cadenas laterales sacáridas, fosfórilo o sulfonilo y, en determinadas modalidades, puede presentar características estructurales tridimensionales específicas, o presentar características de carga específica. Un epítopo es una región de un antígeno que se une a un anticuerpo.

En determinadas modalidades, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno en el casó de que reconozca preferentemente su antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas .

La expresión "péptido conector" tal como se utiliza en la invención se refiere a un péptido con secuencias de aminoácidos que preferentemente es de origen sintético. Estos péptidos conectores según la invención se utilizan para fusionar los polipéptidos en b) y c) a los extremos C-temrinal de cadena pesada del anticuerpo de longitud completa para formar el anticuerpo biespecífico trivalente según la invención. Preferentemente tales péptidos conectores son péptidos con una secuencia de aminoácidos de una longitud de por lo menos 5 aminoácidos, preferentemente de una longitud de entre 10 y 100 aminoácidos, más preferentemente de una longitud de entre 25 y 50 aminoácidos. Preferentemente, tal péptido conector en b) y e) son péptidos idénticos de una longitud de por lo menos 25 aminoácidos, preferentemente de una longitud de entre 25 y 50 aminoácidos, y más preferentemente tal péptido conector es (GxS)n o (GxS)nGm, en donde G=glicina, S=serina y (x=3, n=6, 7 ó 8, y m=0, 1, 2 ó 3) o (x=4, n=3, 4, 5, 6 ó 7, y m=0, 1, 2 ó 3), preferentemente x=4 y n=5, 6 ó 7.

En una modalidad adicional, el anticuerpo biespecífico trivalente según la invención se caracteriza por que el anticuerpo de longitud completa es de la subclase IgGl humana, o de la subclase IgGl humana con las mutaciones L234A y L235A.

En una modalidad adicional, el anticuerpo biespecífico trivalente según la invención se caracteriza porque el anticuerpo de longitud completa es de la subclase IgG2 humana.

En una modalidad adicional, el anticuerpo biespecífico trivalente según la invención se caracteriza porque el anticuerpo de longitud completa es de la subclase IgG3 humana .

En una modalidad adicional, el anticuerpo biespecífico trivalente según la invención se caracteriza porque el anticuerpo de longitud completa es de la subclase IgG4 humana o de la subclase IgG4 humana con la mutación adicional S228P.

Preferentemente, el anticuerpo biespecífico trivalente según la invención se caracteriza porque el anticuerpo de longitud completa es de la subclase IgGl humana, de la subclase IgG4 humana con la mutación adicional S228P.

Ahora se ha encontrado que los anticuerpos biespecíficos trivalentes según la invención presentan características mejoradas, tales como la actividad biológica o farmacológica, las propiedades f rmacocinéticas o la toxicidad. Pueden utilizarse, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades tales como el cáncer.

En una modalidad adicional, el anticuerpo biespecífico trivalente según la invención se caracteriza porque se une específicamente a ErbB3 y a c-Met. La expresión "región constante" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a la suma de los dominios de un anticuerpo que no son la región variable. La región constante no se encuentra directamente implicada en la unión de un antígeno, aunque muestra diversas funciones efectoras . Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos se dividen en las clases siguientes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas pueden dividirse adicionalmente en subclases, tales como IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, IgAl e IgA2. Las regiones constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se denominan a, d, e, ?, y µ, respectivamente. Las regiones constantes de cadena ligera (CL) que pueden encontrarse en la totalidad de las cinco clases de anticuerpo se denominan (kappa) y ? (lambda) .

La expresión "región constante derivada de un origen humano" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a una región constante de cadena pesada de un anticuerpo humano de la subclase IgGl, IgG2, lgG3 ó lgG4 y/o una región constante de cadena ligera kappa o lambda. Las regiones constantes son bien conocidas del estado de la técnica y son descritas por, por ejemplo, Kabat, E.A. (ver, por ejemplo, Johnson, G. y Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218; Kabat, E.A., et al., Proc. Nati. Acad. sci.

USA 72 (1975) 2785-2788) .

Aunque los anticuerpos de la subclase IgG4 muestran un nivel reducido de unión de receptor Fe (FcYRIIIa) , los anticuerpos de otras subclases de IgG muestran una unión fuerte. Sin embargo, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (pérdida del carbohidrato de Fe), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 e His435 son residuos que, en caso de alterarse, también proporcionan un nivel reducido de unión de Fe (Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 2001; Lund, J. et al., FASEB J. 9:115-119, 1995; Morgan, A. et al., Immunology 86:319-324, 1995; patente EP 0 307 434) .

En una modalidad, un anticuerpo según la invención presenta un nivel reducido de unión de FcR en comparación con un anticuerpo IgGl y el anticuerpo parental de longitud completa presenta un nivel reducido de unión de FcR en comparación con un anticuerpo de la subclase IgG4 o de la subclase IgGl o IgG2 con una mutación en S228, L234, L235 y/o D265, y/o contiene la mutación PVA236. En una modalidad, las mutaciones en el anticuerpo parental de longitud completa son S228P, L234A, L235A, L235E y/o PVA236. En otra modalidad, las mutaciones en el anticuerpo parental de longitud completa son, en IgG4 , S228P, y en IgGl, L234A y L235A.

La región constante de un anticuerpo se encuentra directamente implicada en la ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos) y la CDC (citotoxicidad dependiente del complemento) . La activación del complemento (CDC) se inicia a partir de la unión del factor del complemento Clq a la región constante de la mayoría de subclases de anticuerpo IgG. La unión de Clq a un anticuerpo está provocada por interacciones proteina-proteína definidas en el denominado sitio de unión. Los sitios de unión de región constante son conocidos de la técnica y han sido descritos, por ejemplo, por Lukas, T.J. et al., J. Immunol. 127:2555-2560, 1981; Brunhouse, R. y Cebra, J.J., Mol. immunol. 16:907-917, 1979; Burton, D.R. et al., Nature 288:338-344, 1980; Thommesen, J.E. et al., Mol. Immunol. 37:995-1004, 2000; Idusogie, E.E. et al., J. Immunol . 164:4178-4184, 2000; Hezareh, M. et al., J. Virol. 75:12161-12168, 2001; Morgan, A. et al., Immunology 86:319-324, 1995, y la patente EP 0 307 434. Los sitios de unión de región constante se caracterizan, por ejemplo, por los aminoácidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numeración según el índice EU de Kabat) .

La expresión "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) " se refiere a la lisis de células diana humanas por parte de un anticuerpo según la invención en presencia de células efectoras. La ADCC se mide preferentemente mediante el tratamiento de una preparación de células expresantes de antígeno con un anticuerpo según la invención en presencia de células efectoras, tales como PBMCs recién aisladas o células efectoras purificadas a partir de capas leucocitarias , por ejemplo monocitos o células asesinas naturales (NK) o una línea celular de NK de crecimiento continuo .

La expresión "citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)" se refiere a un proceso iniciado por la unión del factor del complemento Clq a la parte Fe de la mayoría de subclases de anticuerpo IgG. La unión de Clq a un anticuerpo es provocada por interacciones proteína-proteína definidas en el denominado sitio de unión. Los sitios de unión de la parte Fe son conocidos en el estado de la técnica (ver anteriormente) . Los sitios de unión de la parte Fe se caracterizan, por ejemplo, por los aminoácidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numeración según el índice EU de Kabat) . Los anticuerpos de las subclases IgGl, IgG2 e IgG3 habitualmente muestran activación del complemento, incluyendo la unión de Clq y C3 , mientras que IgG4 no activa el sistema del complemento y no se une a Clq y/o a C3.

Las funciones efectoras mediadas por células de los anticuerpos monoclonales pueden potenciarse mediante la manipulación de su componente oligosacárido, tal como se describe en Umana, P. et al., Nature Biotechnol . 17:176-180, 1999, y la patente de US 6,602,684. Los anticuerpos de tipo IgGl, los anticuerpos terapéuticos utilizados más habitualmente, son glucoproteínas que presentan un sitio N-ligado de glucosilación conservado en Asn297 en cada dominio CH2. Los dos oligosacáridos biantenarios complejos unidos a Asn297 se encuentran enterrados entre los dominios CH2, formando contactos extensivos con el esqueleto polipeptídico, y su presencia resulta esencial para que el anticuerpo medie en funciones efectoras, tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Lifely, M.R. et al., Glycobiology 5:813-822, 1995; Jefferis, R. et al., Immunol. Rev. 163:59-76, 1998; Wright, A. y Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32) . Umana, P. et al. Nature Biotechnol. 17:176-180, 1999, y la patente WO 99/54342 mostraron la sobreexpresión en células de ovario de hámster chino (CHO) de la ß ( 1 , 4 ) -N-acetilglucosaminiltransferasa III ("GnTIII")/ una glucosiltransferasa que cataliza la formación de oligosacáridos bifurcados, incrementa significativamente la actividad ADCC in vitro de los anticuerpos. Las alteraciones en la composición del carbohidrato de Asn297 o su eliminación también afecta a la unión a FcyR y a Clq (Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17:176-180, 1999; Davies, J. et al., Biotechnol. Bioeng. 74:288-294, 74; Mimura, Y. et al., J. Biol . Chem. 276:45539-45547, 2001; Radaev, S. et al., J. Biol. Chem. 276:16478-16483, 2001; Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 2001; Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 277:26733-26740, 2002; Simmons, L.C. et al., J. Immunol. Methods 263:133-147, 2002.

Los métodos para potenciar las funciones efectoras mediadas por células de los anticuerpos monoclonales se informan en, por ejemplo, los documentos WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2004/065540, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 1997/028267, US 2006/0134709, WO 2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/035835 y WO 2000/061739.

Inesperadamente, los anticuerpos biespecífieos <ErbB3 -c-Met> quec son una modalidad de la invención muestran una regulación negativa e internalización reducidas del antígeno diana en comparación con sus anticuerpos parentales <ErbB3> y/o <c-Met>. Por lo tanto, en una modalidad preferida de la invención, el anticuerpo biespecífico se encuentra glucosilado (en el caso de que comprende una parte Fe de subclase IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4, preferentemente de subclase IgGl o IgG3) con una cadena sacárida en Asn297 en donde la cantidad de fucosa en tal cadena sacárida es de 65% o inferior (numeración según Kabat) . En otra modalidad, la cantidad de fucosa dentro de tal cadena sacárida se encuentra comprendida entre 5% y 65%, preferentemente entre 20% y 40%. El término "Asn297" según la invención se refiere al aminoácido asparagina situado en aproximadamente la posición 297 en la región de Fe. Basado en variaciones de secuencia menores de los anticuerpos, Asn297 también puede encontrarse situado a algunos aminoácidos (habitualmente no más de ±3 aminoácidos) cadena arriba o abajo de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300. En una modalidad, el anticuerpo glucosilado según la invención es de la subclase IgGl humana, de la subclase IgGl humana con las mutaciones L234A y L235A o de la subclase IgG3. En una modalidad adicional, la cantidad de ácido N-glucolilneuramínico (NGNA) es de 1% o menos, y/o la cantidad de alfa- 1, 3 -galactosa N-terminal es de 1% o menos dentro de tal cadena sacárida. La cadena sacárida muestra preferentemente las características de los glicanos N-ligados unidos a Asn297 de un anticuerpo expresado recombinantemente en una célula CHO.

La expresión "las cadenas sacáridas muestran características de glicanos N-ligados unidos a Asn297 de un anticuerpo expresado recombinantemente en una célula CHO" se refiere a que la cadena sacárida en Asn297 del anticuerpo parental de longitud completa según la invención presenta la misma estructura y secuencia de residuos sacáridos, excepto por el residuo fucosa, que los del mismo anticuerpo expresado en células CHO no modificadas, por ejemplo que las células de las que se informa en el documento O 2006/103100.

El término "NGNA" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere al residuo sacárido del ácido N-glucolilneuramínico .

La glicosilación de IgGl o IgG3 humana se produce en Asn297 en forma de glicosilación de oligosacárido complejo biantenario fucosilado terminado en, como máximo, dos residuos Gal . Se informa en detalle de regiones constantes de cadena pesada humana de la subclase IgGl o IgG3 en Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, y en Brüggermann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361, 1987; Love , T.W. et al., Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527. Estas estructuras se denominan GO, Gl ( -1,6- o a-1,3-) o residuos glicanos G2 , dependiendo de la cantidad de residuos Gal terminales (Raju, T.S., Bioprocess Int. 1 (2003) 44-53) . La glucosilacion de tipo CHO de partes Fe de anticuerpo se describe en, por ejemplo, Routier, F.H., Glyconjugate J. 14:201-207, 1997. Los anticuerpos que se expresan recombinantemente en células CHO huésped no glucomodificadas habitualmente se encuentran fucosiladas en Asn297 en una proporción de por lo menos 85%. Los oligosacáridos modificados del anticuerpo parental de longitud completa pueden ser híbridos o complejos. Preferentemente, los oligosacáridos bifurcados, reducidos/no fucosilados son híbridos. En otra modalidad, los oligosacáridos bifurcados reducidos/no fucosilados son complejos.

Según la invención, la expresión "cantidad de fucosa" se refiere a la cantidad de tal azúcar en la cadena sacárida en Asn297, referida a la suma de todas las glucoestructuras unidas a Asn297 (por ejemplo estructuras complejas, híbridas y de alto contenido en mañosa) según medición realizada mediante espectrometría de masas MALDI-TOF y calculado como valor medio. La cantidad relativa de fucosa es el porcentaje de estructuras que contienen fucosa en relación a la totalidad de las glucoestructuras identificadas en una muestra tratada con N-glucosidasa F (por ejemplo estructuras complejas, híbridas y estructuras de bajo y alto contenido en mañosa, respectivamente) según el MALDI-TOF.

El anticuerpo según la invención se produce por medios recombinantes . De esta manera, un aspecto de la presente invención es un ácido nucleico codificante del anticuerpo según la invención, y un aspecto adicional es una célula que comprende tal ácido nucleico codificante de un anticuerpo según la invención. Los métodos para la producción recombinante son ampliamente conocidos en el estado de la técnica y comprenden la expresión de proteínas en células procarióticas y eucarióticas con el aislamiento posterior del anticuerpo y habitualmente la purificación hasta una pureza farmacéuticamente aceptable. Para la expresión de los anticuerpos tal como se ha indicado anteriormente en una célula hospedera, se insertan ácidos nucleicos codificantes de las cadenas ligeras y pesadas modificadas respectivas en los vectores de expresión mediante métodos estándares. La expresión se lleva a cabo en células hospederas procarióticas o eucarióticas apropiadas, tales como células CHO, células NSO, células SP2/0, células HEK293, células COS, células PER.C6, levaduras o células de E. coli, y el anticuerpo se recupera de las células (del sobrenadante o de la parte celular tras la lisis) . Los métodos generales para la producción recombinante de anticuerpos son bien conocidos del estado de la técnica y se describen, por ejemplo, en los artículos de revisión de Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17:183-202, 1999; Geisse, S. et al., Protein Expr. Purif. 8:271-282, 1996; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol . 16:151-160, 2000; erner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880.

Los anticuerpos biespecíficos trivalentes según la invención se preparan convenientemente a partir del medio de cultivo mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales, tales como, por ejemplo, proteína A-sefarosa, cromatografía en hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. El ADN y ARN codificante de los anticuerpos monoclonales se aisla y secuencia fácilmente mediante procedimientos convencionales. Las células de hibridoma pueden servir como fuente de tal ADN y ARN. Tras el aislamiento, el ADN puede insertarse en vectores de expresión, que seguidamente se transfectan en células hospederas, tales como células HEK 293, células CHO o células de mieloma que de otra manera no producirían proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales recombinantes en las células hospederas .

Las variantes (o mutantes) de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo biespecífico trivalente se preparan mediante la introducción de cambios nucleótidos apropiados en el ADN del anticuerpo, o mediante síntesis de nucleótidos. Sin embargo, estas modificaciones únicamente pueden llevarse a cabo bajo condiciones muy limitadas, por ejemplo tal como se ha indicado anteriormente. Por ejemplo, las modificaciones que no alteran las características anteriormente indicadas del anticuerpo, tal como el isotipo y la unión de antígeno del IgG pero que podrían mejorar el rendimiento de la producción recombinante , la estabilidad de la proteína o facilitar la purificación.

La expresión "célula hospedera" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a cualquier tipo de sistema celular que puede manipularse para generar los anticuerpos según la presente invención. En una modalidad, se utilizan células HEK293 y CHO como células hospederas. Tal como se utiliza en la presente descripción, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan intercambiablemente y todas estas denominaciones incluyen la progenie. De esta manera, las expresiones "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula sujeto primaria y los cultivos derivados de la misma, con independencia del número de transferencias. También debe interpretarse que toda la progenie puede no ser exactamente idéntica en su contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o naturales. Se encuentra incluida la progenie variante que presenta la misma función o actividad biológica según el cribado realizado en la célula originalmente transformada.

La expresión en células NSO se describe en, por ejemplo, Barnes, L.M. et al., Cytotechnology 32:109-123, 2000; Barnes, L.M. et al., Biotech. Bioeng. 73:261-270, 2001. La expresión transitoria se describe en, por ejemplo, Durocher, Y. et al., Nucí. Acids Res. 30:E9, 2002. La clonación de dominios variables se describe en Orlandi, R. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:3833-3837, 1989; Cárter, P. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:4285-4289, 1992, y en Norderhaug, L. et al., J. Immunol. Methods 204:77-87, 1997. Un sistema de expresión transitoria preferente (HEK293) se describe en Schlaeger, E.-J. y Christensen, K. , Cytotechnology 30:71-83, 1999, y en Schlaeger, E.-J., J. Immunol. Methods 194:191-199, 1996.

Entre las secuencias de control que resultan adecuadas para los procariotas se incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión ribosómica. Es conocido que las células eucarióticas utilizan promotores, intensificadores y señales de poliadenilación .

Un ácido nucleico se encuentra "operablemente ligado" en el caso de que se encuentre situado en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder secretorio se encuentra operablemente ligado a ADN de un polipéptido en el caso de que se exprese en forma de una preproteína que participe en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión ribosómica se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que se encuentre situado de manera que facilite la traducción. Generalmente, la expresión "operablemente ligado" se refiere a que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y en el caso de un líder secretorio, contiguas y en el mismo marco de lectura. Sin embargo, los intensificadores no son necesariamente contiguos. La unión se lleva a cabo mediante ligación en sitios de restricción apropiados. En el caso de que tales sitios no existan, se utilizan adaptadores oligonucleótidos sintéticos o enlazador según la práctica convencional.

La purificación de los anticuerpos se lleva a cabo con el fin de eliminar los componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas estándares, incluyendo el tratamiento alcalino/de SDS, la formación de bandas en CsCl, la cromatografía de columna, la electroforesis en gel de agarosa, y otras técnicas bien conocidas de la técnica (ver Ausubel, F. et al., editor, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987) . Una serie de diferentes métodos se encuentran bien establecidos y son ampliamente utilizados para la purificación de proteínas, tales como la cromatografía de afinidad con proteínas microbianas (por ejemplo la cromatografía de afinidad de proteína A o de proteína G) , la cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo de intercambio catiónico (resinas carboximetilo) , de intercambio aniónico (resinas aminoetilo) y de .intercambio de modo mixto), la adsorción tiofílica (por ejemplo con beta-mercaptoetanol y con otros ligandos de SH) , la cromatografía de interacción hidrofóbica o de adsorción aromática (por ejepmlo con fenil-sefarosa, resians aza-arenofílicas o ácido m-aminofenilborónico) , la cromatografía de afinidad de quelato metálico (por ejemplo con material de afinidad por el Ni(II) y por el Cu(II)), la cromatografía de exclusión por tamaño, y métodos electroforéticos (tales como la electroforesis en gel y la electroforesis capilar) (Vijayalakshmi, M.A., Ap l . Biochem. Biotech. 75:93-102, 1998) .

Un aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la invención. Otro aspecto de la invención es la utilización de un anticuerpo según la invención para la preparación de una composición farmacéutica. Un aspecto adicional de la invención es un método para la preparación de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la invención. En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo una composición farmacéutica, que contiene un anticuerpo según la presente invención, formulado conjuntamente con un portador farmacéutico.

Una modalidad de la invención es el anticuerpo biespecífico trivalente según la invención para el tratamiento del cáncer.

Otro aspecto de la invención es la composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer.

Otro aspecto de la invención es la utilización de un anticuerpo según la invención para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer.

Otro aspecto de la invención es un método para el tratamiento de un paciente que sufre de cáncer mediante la administración de un anticuerpo según la invención en un paciente que necesita tal tratamiento.

Tal como se utiliza en la presente descripción, la expresión "portador farmacéutico" incluye cualquiera y la totalidad de los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes isotónicos y de retraso de la absorción y similares que son fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el portador resulta adecuado para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo mediante inyección o infusión) .

Una composición de la presente invención puede administrarse mediante una diversidad de métodos conocidos en la técnica. Tal como apreciará el experto en la materia, la vía y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Para administrar un compuesto de la invención mediante determinadas vías de administración, puede resultar necesario recubrir el compuesto con un material, o coadministrar el compuesto con un material, para impedir su inactivación. Por ejemplo, el compuesto puede administrarse en un sujeto en un portador apropiado, por ejemplo liposomas o un diluyente. Entre los diluyentes farmacéuticamente aceptables se incluyen solución salina y soluciones amortiguadoras acuosas. Entre los portadores farmacéuticos se incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. La utilización de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocida en la técnica.

Las expresiones "administración parenteral" y "administrado parenteralmente" tal como se utilizan en la presente descripción se refieren a modos de administración diferentes de la administración entérica y tópica, habitualmente mediante inyección, e incluyen, sin limitarse a las mismas, las inyecciones e infusiones intravenosa, intramuscular, intraarterial , intratecal, intracapsular, intraorbital , intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal , subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal , epidural e intraesternal .

El término "cáncer" tal como se utiliza en la presente descripción se refiere a enfermedades proliferativas , tales como linfornas, leucemias linfocíticas, cáncer de pulmón, cáncer pulmonar de células no pequeñas (NSCL) , cáncer pulmonar de células bronquioloalveolares, cáncer óseo, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabe2a o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer ovárico, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de los tubos de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cérvix, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides , cáncer de la glándula adrenal, sarcoma del tejido blando, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de riñon o uretra, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular , cáncer biliar, neoplasma del sistema nervioso central (SNC) , tumores del eje espinal, glioma del tallo cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwanomas, ependinomas, meduloblastomas , meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma pituitario y sarcoma de Ewings, incluyendo las versiones refractarias de cualquiera de los cánceres anteriormente indicados, o de una combinación de uno o más de los cánceres anteriormente indicados.

Las composiciones también pueden contener adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede garantizarse tanto mediante procedimientos de esterilización, supra, como mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos , por ejemplo parabén, clorobutanol , fenol, ácido sórbico y similares. También puede resultar deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro sódico y similares en las composiciones. Además, puede conseguirse la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Con independencia de la vía de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden utilizarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones f rmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos por el experto en la materia.

Los niveles reales de las dosis de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden modificarse de manera que se obtenga una cantidad del ingrediente activo que resulte efectiva para conseguir la respuesta terapéutica deseada en un paciente, composición y modo de administración particulares, sin resultar tóxicos para el paciente. El nivel de dosis seleccionado dependerá de una diversidad de factores farmacocinéticos , incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención utilizadas, la vía de administración, el momento de la administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se utiliza, la duración del tratamiento, otros fármacos, los compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares utilizadas, la edad, sexo, peso, condición, estado de salud general e historia médica del paciente bajo tratamiento, y factores similares bien conocidos en la técnica médica.

La composición debe ser estéril y líquida en grado suficiente para que la composición resulte administrable mediante jeringa. Además de agua, el portador preferentemente es una solución salina regulada en pH isotónica.

Puede mantenerse la fluidez correcta, por ejemplo mediante la utilización de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento de un tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión, y mediante la utilización de tensioactivos . En muchos casos, resulta preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes , tales como manitol o sorbitol, y cloruro sódico en la composición.

Tal como se utilizan en la presente descripción, las expresiones "célula" , "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan intercambiablemente y todas tales expresiones incluyen la progenie. De esta manera, las expresiones "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula sujeto primario y los cultivos derivados de la misma con independencia del número de transferencias. También debe interpretarse que toda la progenie puede no ser exactamente idéntica en su contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o naturales. Se encuentra incluida la progenie variante que presenta la misma función o actividad biológica según el cribado realizado en la célula originalmente transformada. En donde se pretendan utilizar denominaciones diferentes, éstas resultarán evidentes a partir del contexto.

El término "transformación" tal como se utiliza en la presente descripción se refiere a un procedimiento de transferencia de un vector/ácido nucleico al interior de una célula hospedera. En el caso de que se utilicen células sin grandes barreras de pared celular a modo de células hospederas, la transfección se lleva a cabo mediante, por ejemplo, el método de precipitación con fosfato de calcio, tal como se describe en Graham, F.L. y van der Eb, A.J., Virology 52:456-467, 1973. Sin embargo, también pueden utilizarse otros métodos para introducir ADN en células, tales como la inyección nuclear o la fusión de protoplasto. En el caso de que se utilicen células procarióticas o células que contenga construcciones sustanciales de pared celular, un método de transfección es, por ejemplo, el tratamiento de calcio utilizando cloruro de calcio tal como se describe en Cohén, S.N. et al., PNAS 69:2110-2114, 1972.

Tal como se utiliza en la presente descripción, el término "expresión" se refiere al procedimiento por el que se transcribe un ácido nucleico en ARNm y/o al procedimiento por el que el transcrito de ARNm (también denominado "transcrito") se traduce posteriormente en péptidos, polipéptidos o proteínas. Los transcritos y los polipéptidos codificados se denominan colectivamente "producto génico" . En el caso de que se derive el polinucleótido de ADN genómico, la expresión en una célula eucariótica puede incluir el procesamiento del ARNm.

Un "vector" es una molécula de ácido nucleico, en particular autorreplicativa, que transfiere una molécula de ácido nucleico insertada al interior de células hospederas o entre las mismas . El término incluye vectores que funcionan principalmente insertando ADN o ARN en una célula (por ejemplo la integración cromosómica) , la replicación de vectores que funcionan principalmente replicando ADN o ARN, y los vectores de expresión que funcionan transcribiendo y/o traduciendo ADN o ARN. También se encuentran incluidos los vectores que proporcionan más de una de las funciones anteriormente descritas.

Un "vector de expresión" es un polinucleótido que, al introducirlo en una célula hospedera apropiada, puede transcribirse y traducirse en un polipéptido. Un "sistema de expresión" habitualmente se refiere a una célula hospedera adecuada que comprende un vector de expresión que puede funcionar rindiendo un producto de expresión deseado.

Procedimiento experimental Ej emplos Materiales y métodos Técnicas de ADN recombinante Se utilizaron métodos estándares para manipular el ADN, tales como los descritos en Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Los reactivos biológicos moleculares se utilizaron siguiendo las instrucciones del fabricante.

Análisis de secuencias de ADN y de proteínas y gestión de los datos de secuencias Se proporciona información general sobre secuencias de nucleótidos de cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas humanas en: Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, publicación del NIH No. 91-3242, 1991. Los aminoácidos de las cadenas de anticuerpos se han numerado según la numeración EU (Edelman, G.M. et al., PNAS 63:78-85, 1969; Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, publicación del NIH No. 91-3242, 1991) . Se utilizó el paquete informático versión 10.2 del GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) y Vector NTI Advance suite versión 8.0 de Infomax para la creación, mapeado, análisis, anotación e ilustración de las secuencias.

Secuenciación de ADN Se determinaron las secuencias del ADN mediante secuenciación de doble cadena realizada en SequiServe (Vaterstetten, Alemania) y en Geneart AG (Regensburg, Alemania) .

Síntesis génica Los segmentos génicos deseados fueron preparados por Geneart AG (Regensburg, Alemania) a partir de oligonucleótidos sintéticos y productos de PCR mediante síntesis génica automática. Los segmentos génico flanqueados por sitios únicos de corte por endonucleasa de restricción se clonaron en plásmidos pGA18 (ampR) . El plásmido de ADN se purificó a partir de bacterias transformadas y la concentración se determinó mediante espectroscopia de UV. La secuencia del ADN de los fragmentos génicos subclonados se confirmó mediante secuenciación de ADN. Se sintetizaron con los sitios de restricción 5'-BamHI y 3'-XbaI, segmentos génicos codificantes de la cadena pesada del anticuerpo de Her3 (clon 29) de "superhélice" que portaba una mutación T366 en el dominio CH3 con una región C-terminal VH de 5D5 unida mediante un péptido conector (G4S)n, así como cadena pesada de anticuerpo de Her3 de "superhélice" (clon 29) que portaba las mutaciones T366S, L368A e Y407V con una región VL de 5D5 C-terminal unida por un péptido conector (G4S)n. De manera similar, se prepararon mediante síntesis génica con los sitios de restricción flanqueantes Bamhl y Xbal, secuencias de ADN codificantes de Her3 (clon 29) de "superhélice" que portaban las mutaciones S354C y T366 en el dominio CH3 con una región VH C-terminal de 5D5 unida por un péptido conector (GS)n, así como cadena pesada de Her3 (clon 29) de "superhélice" que lleva las mutaciones Y349C, T366S, L368A e Y407V con una región VL C-terminal de 5D5 unida por un péptido conector (G4S)n. Finalmente, se sintetizaron secuencias de ADN codificantes de cadenas pesada y ligera no modificadas de los anticuerpos Her3 (clon 29) y 5D5, con los sitios de restricción flanqueantes BamHI y Xb l . Todos los constructos se diseñaron con una secuencia 5' -terminal de ADN codificante de un péptido líder (MGWSCIILFLVATATGVHS) , que presenta como diana proteínas para la secreción en células eucarióticas .

Construcción de los plásmidos de expresión Se utilizó un vector de expresión de Roche para la construcción de todos los plásmidos de expresión codificantes de proteínas de fusión de cadena pesada VH o cadena ligera VL y de proteína de cadena ligera. El vector estaba compuesto de los elementos siguientes: un gen de resistencia a la higromicina como marcador de selección, - un origen de replicación, oriP, procedente del virus Epstein-Barr (EBV) , un origen de replicación procedente del vector pUC18 que permite la replicación de este plásmido en E. coli un gen beta-lactamasa que proporciona resistencia a la ampicilina en E. coli, el intensificador y promotor tempranos inmediatos procedentes del citomegalovirus humano (HCMV) , la secuencia de señal de poliadenilación ("poli A") de la inmunoglobulina 1 humana, y - sitios de restricción únicos BamHI y Xbal.

Los genes de fusión de inmunoglobulina que comprendían los constructos de cadena pesada o ligera, así como constructos de "superhélice" con dominios VH y VL C-terminal se prepararon mediante síntesis génica y se clonaron en plásmidos pGA18 (ampR) tal como se ha descrito anteriormente. Los plásmidos pG18 (ampR) que portaba los segmentos de ADN sintetizados y el vector de expresión de Roche se digirieron con los enzimas de restricción BamHI y Xbal (Roche Molecular Biochemicals) y se sometieron a electroforesis en gel de agarosa. A continuación, se ligaron segmentos de ADN purificados codificantes de cadenas pesada y ligera en el fragmento BamHI/Xbal aislado del vector de expresión de Roche, resultando en los vectores de expresión finales. Los vectores de expresión finales se transformaron en células de E.coli, se aisló el plásmido ADN de expresión (Miniprep) y se sometió a análisis de enzimas de restricción y de secuenciación del ADN. Los clones correctos se cultivaron en 150 mi de medio LB-Amp, se aisló nuevamente el plásmido de ADN (Maxiprep) y se confirmó la integridad de la secuencia mediante secuenciación del ADN.

Expresión transitoria de variantes de inmunoglobulina en células HEK293 Se expresaron variantes recombinantes de inmunoglobulina mediante transfección transitoria de células 293-F renales embrionarias humanas utilizando el sistema de expresión FreeStyle 293 Expression System siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogen, USA) . Brevemente, se cultivó una suspensión de células 293 -F FreeStyle™ en medio de expresión FreeStyle™ 293 Expression médium, a 37°C/8% de C02, y las células se sembraron en medio fresco a una densidad de entre lxlO6 y 2xl06 células viables/ml el día de la transíección. Se prepararon complejos de ADN-293fectin™ en medio Opti-MEM® I (Invitrogen, USA) utilizando 325 µ? de 293fectin™ (Invitrogen, Alemania) y 250 g de plásmido de ADN de cadenas pesada y ligera en una proporción molar 1:1, obteniendo un volumen final de transfección de 250 mi. Se prepararon complejos de ADN-293Íectin de "superhélice" en medio Opti- EM* I (Invitrogen, US) utilizando 325 µ? de 293fectin™ (Invitrogen, Alemania) y 250 g de plásmido de ADN superhélice" de cadenas pesadas 1 y 2 y cadena ligera en una proporción molar de 1:1:2, obteniendo un volumen final de transfección de 250 mi. Se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular que contenían anticuerpos 7 días después de la transfección, mediante centrifugación a 14000 g durante 30 minutos, y se filtraron a través de un filtro estéril (0.22 µ??) . Los sobrenadantes se almacenaron a -20 °C hasta la purificación.

Purificación de anticuerpos biespecífieos trivalentes y de control Se purificaron anticuerpos biespecíficos trivalentes y de control a partir de sobrenadantes de cultivo celular mediante cromatografía de afinidad utilizando proteína A-Sepharose™ (GE Healthcare, Suecia) y cromatografía de exclusión por tamaño Superdex200. Brevemente, se pasaron sobrenadantes de cultivo celular filtrados a esterilidad por una columna HiTrap HP de proteína A (5 mi) equilibrada con regulador de pH PBS (Na2HP04 10 mM, KH2P04 1 mM, NaCl 137 mM y KC1 2.7 mM, pH 7.4). Las proteínas no unidas se lavaron con regulador de pH de equilibración. Los anticuerpos y variantes de anticuerpo se eluyeron con regulador de pH citrato 0.1 M, pH 2.8, y las fracciones que contenían proteínas se neutralizaron con 0.1 mi de Tris 1 M, pH 8.5. A continuación, las fracciones de proteínas eluidas se agruparon, se concentraron con un dispositivo de filtración centrífuga de Amicon Ultra (valor de corte de PM: 30 K, Millipore) hasta un volumen de 3 mi y se cargaron en una columna de filtración en gel 16/60 Superdex200 HiLoad de 120 mi (GE Healthcare, Suecia) equilibrada con histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6.0. Las fracciones que contenían anticuerpos biespecífieos y de control purificados con menos de 5% de agregados de alto peso molecular se agruparon y se almacenaron en forma de alícuotas de 1.0 mg/ml a -80°C. Se generaron fragmentos Fab mediante una digestión con papaína del anticuerpo monoclonal 5D5 purificado y la posterior eliminación de los dominios Fe contaminantes mediante cromatografía de proteína A. Los fragmentos Fab no unidos se purificaron adicionalmente en una columna de filtración en gel 16/60 Superdex200 HiLoad de 120 mi (GE Healthcare, Suecia) equilibrada con histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6.0, se agruparon y se almacenaron en forma de alícuotas de 1.0 mg/ml a -80°C.

Análisis de las proteínas purificadas La concentración de proteínas de las muestras de proteínas purificadas se determinó mediante la medición de la densidad óptica (DO) a 280 nm, utilizando el coeficiente de extinción molar calculado basándose en la secuencia de aminoácidos. Se analizó mediante SDS-PAGE la pureza y el peso molecular de los anticuerpos biespecíficos y de control en presencia y en ausencia de un agente reductor (1,4-ditiotreitol 5 mM) y tinción con azul brillante de Coomassie. Se utilizó el sistema de gel premoldeado NuPAGEe (Invitrogen, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante (geles de Tris-glicina al 4-20%) . Se analizó el contenido de agregados de muestras de anticuerpos biespecíficos y de control mediante SEC de alto rendimiento utilizando una columna analítica de exclusión por tamaños Superdex200 (GE Healthcare, Suecia) en regulador de pH de desplazamiento de KH2P0 200 mM, KC1 250 mM, pH 7.0 a 25°C. Se inyectaron 25 pg de proteínas en la columna a un caudal de 0.5 ml/minuto y se eluyeron isocráticamente durante 50 minutos. Para el análisis de la estabilidad, se incubaron concentraciones de 1 mg/ml de proteínas purificadas a 4°C y a 40°C durante 7 días y después se evaluaron mediante SEC de alto rendimiento. La integridad del esqueleto de aminoácidos de las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos biespecíficos reducidos se verificó mediante espectrometría de masas NanoElectrospray Q-TOF tras la eliminación de los N-glicanos mediante tratamiento enzimático con péptido-N-glucosidasa F (Roche Molecular Biochemicals) .

Ensayo de fosforilación de c-Met Se sembraron 5xl05 células A549 en cada pocilio de una placa de 6 pocilios el día antes de la estimulación con HGF en RPMI con FCS al 0.5% (suero de feto bovino). Al día siguiente, se sustituyó el medio de crecimiento durante una hora con RPMI que contenía BSA al 0.2% (albúmina de suero bovino) . A continuación, se añadieron 5 g/ml del anticuerpo biespecífico al medio y las células se incubaron durante 10 minutos, añadiendo seguidamente HGF durante 10 minutos adicionales a una concentración final de 50 ng/ml. Las células se lavaron una vez con PBS helado que contenía vanadato sódico i mM, colocándolas después sobre hielo y lisándolas en la placa de cultivo celular con 100 µ? de regulador de pH de lisis (Tris-Cl 50 mM, pH 7.5, NaCl 150 mM, NP40 al 1%, DOC al 0.5%, aprotinina, PMSF 0.5 mM, vanadato sódico 1 mM) . Los lisados celulares se transfirieron a tubos Eppendorf y se dejó que se produjese la lisis durante 30 minutos sobre hielo. Se determinó la concentración de proteínas utilizando el método BCA (Pierce) . Se separaron 30 a 50 pg del lisado en un gel NuPage Bis-Tris al 4-12% (Invitrogen) y las proteínas en el gel se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon durante una hora con TBS-T que contenía BSA al 5% y se revelaron con un anticuerpo de c-Met fosfoespecífico dirigido contra Y1230, 1234, 1235 (44-888, Biosource) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las membranas de transferencia inmunológica se sondearon nuevamente con un anticuerpo que se unía a c-Met no fosforilado (AF276, R&D) .

Ensayo de fosforilación de Her3 (ErbB3) Se sembraron 2x10s células MCF7 en cada pocilio de una placa de 12 pocilios en medio de crecimiento completo (RPMI 1640, FCS al 10%) . Se dejó que las células creciesen hasta una confluencia de 90% dentro de los dos días posteriores. A continuación, se sustituyó el medio por medio de ayuno que contenía FCS al 0.5%. Al día siguiente, se suplementaron los anticuerpos respectivos a las concentraciones indicadas 1 hora antes de la adición de heregulina 500 ng/ml (R&D) . Tras la adición de la heregulina, las células se cultivaron durante 10 minutos adicionales antes de recolectar y lisar las células. Se determinó la concentración de proteínas utilizando el método BCA (Pierce) . Se separaron 30 a 50 g del lisado en un gel NuPage Bis-Tris al 4-12% (Invitrogen) y las proteínas en el gel se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon durante una hora con TBS-T que contenía BSA al 5% y se revelaron con un anticuerpo de Her3/ErbB3 fosfoespecífico que reconocía específicamente Tyrl289 (4791, Cell Signaling) .

Ensayo de dispersión Se sembraron células A549 (4.000 células en cada pocilio) o A431 (8,000 células en cada pocilio) el día antes del tratamiento con compuesto en un volumen total de 200 µ? en placas especiales (E-plates) de 96 pocilios (Roche, 05232368001) en RPMI con FCS al 0.5%. Se realizó un seguimiento de la adhesión y crecimiento celular durante la noche con el aparato analizador de células en tiempo real, que realiza un barrido cada 15 minutos monitorizando la impedancia. Al día siguiente, las células se preincubaron con 5 µ? de las diluciones de anticuerpos respectivas en PBS, con barridos cada cinco minutos. Tras 30 minutos, se añadieron 2.5 µ? de una solución de HGF, rindiendo una concentración final de 30 ng/ml, y se dejó que transcurriese el experimento durante 72 horas adicionales. Se realizó un seguimiento de los cambios inmediatos con barridos cada minuto durante 180 minutos, seguido de barridos cada 15 minutos durante el resto del tiempo.

FACS a) Ensayo de unión Se separaron y contaron las células A431. Se sembraron 1.5xl05 células en cada pocilio de una placa cónica de 96 pocilios. Las células se granularon (1.500 rpm, 4°C, 5 minutos) y se incubaron durante 30 minutos sobre hielo en 50 µ? de una serie de dilución del anticuerpo biespecífico respectivo en PBS con FCS al 2% (suero de feto bovino) . Las células se granularon nuevamente y se lavaron una vez con 200 µ? de PBS que contenía FCS al 2% seguido de una segunda incubación de 30 minutos con un anticuerpo acoplado a ficoeritrina dirigido contra Fe humano que se había diluido en PBS que contenía FCS al 2% (Jackson Immunoresearch, 109116098) . Las células se granularon, se lavaron dos veces con 200 µ? de PBS que contenía FCS al 2%, se resuspendieron en solución BD CellFix (BD Biosciences) y se incubaron durante por lo menos 10 minutos sobre hielo. Se determinó la intensidad de fluorescencia media (mfi) de las células mediante citometría de flujo (FACS Canto, BD) . Se determinó la mfi por lo menos por duplicado en dos tinciones independientes . Se procesaron adicionalmente los espectros de citometría de flujo utilizando el programa informático FlowJo (TreeStar) . Se determinó la unión semimáxima utilizando XLFit 4.0 (IDBS) y el modelo 205 de respuesta de dosis en un sitio, b) Ensayo de internalización Se separaron y contaron las células. Se introdujeron 5xl05 células en 50 µ? de medio completo en un tubo Eppendorf y se incubaron con 5 µ9/p?1 del anticuerpo biespecífico respectivo a 37 °C. Tras los puntos temporales indicados, las células se almacenaron en hielo hasta completar el curso temporal. Después, las células se transfirieron a tubos de FACS, se granularon (1.500 rpm, 4°C, 5 minutos), se lavaron con PBS + FCS al 2% y se incubaron durante 30 minutos en 50 µ? de anticuerpo secundario acoplado a ficoeritrina dirigido contra Fe humano que se diluyó en PBS que contenía FCS al 2% (Jackson Immunoresearch, 109116098) . Se granularon nuevamente las células, se lavaron con PBS + FCS al 2% y se determinó la intensidad de fluorescencia mediante citometría de flujo (FACS Canto, BD) . c) Experimento de reticulación Se desengancharon y contaron las células HT29 y se dividieron en dos poblaciones que se tiñeron individualmente con PKH26 y PKH67 (Sigma) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se obtuvieron de cada una de las poblaciones teñidas, 5xl05 células, se agruparon y se incubaron durante 30 y 60 minutos con 10 g/ml del anticuerpo biespecífico respecto en medio completo. Tras los tiempos indicados, las células se almacenaron en hielo hasta completar el curso temporal. Las células se granularon (1500 rpm, 4°C, 5 minutos) , se lavaron con PBS + FCS al 2% y se determinó la intensidad de fluorescecia mediante citometría de flujo (FACS Canto, BD) .

Ensayo de luminiscencia del título celular Se cuantificó la viabilidad y proliferación celulares utilizando el ensayo de luminiscencia del título celular (Promega) . El ensayo se llevó a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se cultivaron las células en placas de 96 pocilios en un volumen total de 100 µ? durante el periodo de tiempo deseado. Para el ensayo de proliferación, se extrajeron las células del incubador y se dejaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadieron 100 µ? de reactivo de luminiscencia de título celular y las placas multipocillo se introdujeron en un agitador orbital durante 2 minutos. Se cuantificó la luminiscencia tras 15 minutos en un lector de ?microplacas (Tecan) .

Ensayo de Wst-1 Se llevó a cabo un ensayo de Wst-1 de viabilidad y proliferación celulares a modo de análisis de parámetros de valoración, detectando el número de células metabólicamente activas. Brevemente, se añadieron 20 µ? de reactivo Wst-1 (Roche, 11644807001) a 200 µ? de medio de cultivo. Se incubaron adicionalmente placas de 96 pocilios durante 30 minutos a 1 hora hasta el desarrollo robusto del pigmento. Se cuantificó la intensidad de tinción en un lector de microplacas (Tecan) a una longitud de onda de 450 nm.

Diseño de anticuerpos <ErbB3-c-Met> biespecífieos trivalentes expresados y purificados En la Tabla 1 : Se expresaron y se purificaron anticuerpos <ErbB3 -c-Met> biespecíficos trivalentes basados en un anticuerpo ErbB-3 de longitud completa (HER3 clon 29) y el dominio VH y VL de un anticuerpo de C-met (5D5 de c-Met) con las características respectivas mostradas en la Tabla 1, siguiendo los métodos generales descritos anteriormente. Los VH y VL correspondientes de HER3 clon 29 y de 5D5 de c-Met se proporcionan en el listado de secuencias.

Tabla 1: Se expresaron y se purificaron los anticuerpos biespecíficos trivalentes de <ErbB3-c-Met> con la nomenclatura indicada en la Tabla 1 (ver también los Ejemplos, posteriormente, y la Figura 3c) .

Ncnbre de la Her3 et_HSS Her3/M=t_SSKH Her3Met_SSKHSS Her3/Met_lC Her3/Uet_6C molécula ttanenclatura VHVL-Ab para anticuerpos biespecífieos Características Mutaciones de S354C:T366W/ T366W/ S354C:T366W/ S354C:T366W/ S3S4C:T366W/ superhélice Y349'C:I366'S: T36G'S:L368'A:Y4 Y349'C:T366'S: Y349'C:T366'S Y349'C:T366'S L368'A;Y407'V 07'V I3S8'A:Y407'V 1-368'A:Y407'V L368,A:Y407IV Esqueleto del Her3 Her3 Her3 Her3 Her3 anticuerpo de clctl 29 cien 29 cien 29 Cien 29 Clon 29 longitud (quinérico) (quinérico) (quinérico) (quimérico) (quinérico) crtpleta derivad? de fragmento VVL cMet 5D5 cMet 5E6 cMet 5DS cMet 55 CMet SE5 derivado de (humanizado) (humanizado) (hunariizado) (h ranizado) (humanizado) Posición de VH Extremo C- Extremo C- Extremo C- Extremo C- Extremo C- unida a termiral cadera terminal cadena termLnal cadena termiral terminal anticuerpo pesada cadena pesada cadena pesada cadena cadena pesada cadena pesada scbreenrnllada cadena cadena scbreenrollad scbreei ul.lad a a Posición da VL Extremo C- Extreno C- Extremo C- Extremo C- Extremo C- unida a termirial cadena terminal cadena terrrdnal cadena terminal terminal anticuerpo pasada cadena psada cadena en pesada cadena en cadena pesada cadena pesada en forma de fcn i-i de fatua de cadena en cadena en horquilla horquilla horquilla farma de fonra de rranguilla horquilla Péptido (¾S>3 (¾S)j (¾Sh (G£)e conectar Estabilizado + + por disulfuro VVL VH44/ VIAOO Ejemplo 1 (Figura 5) : Unión de anticuerpos biespecí fieos a la superficie celular de las células cancerígenas Las propiedades de unión de los anticuerpos biespecí fieos a su receptor respectivo sobre la superficie celular se analizaron en células cancerígenas A431 en un ensayo basado en citometríá de flujo. Las células se incubaron con los anticuerpos primarios monoespecí fieos o biespecífieos y la unión de estos anticuerpos con sus receptores afines se detectó con un anticuerpo secundario acoplado a un fluoróforo que se unía específicamente a Fe del anticuerpo primario. Se gráfico la intensidad de fluorescencia media de una serie de dilución de los anticuerpos primarios frente a la concentración del anticuerpo con el fin de obtener una curva sigmoidea de la unión. La expresión en superficie celular de c-Met y Her3 se validó mediante la incubación con únicamente el anticuerpo bivalente 5D5 y anticuerpo de Her3 clon 29.

El anticuerpo de Her3 /c -Met_KHSS se une fácilmente a la superficie celular de A431. Bajo estas condiciones experimentales, el anticuerpo puede unirse únicamente mediante su parte Her3 y en consecuencia la intensidad de fluorescencia media no excede la tinción para Her3 clon 29 solo.

Ejemplo 2 (Figura 6) : Inhibición de la fosforilación de c-Met inducida por HGF por parte de formatos biespecífieos de anticuerpo de Her3/c-Met Para confirmar la funcionalidad de la parte c-Met en los anticuerpos biespecífieos, se llevó a cabo un ensayo de fosforilación de c-Met. En este experimento, se trataron células cancerígenas pulmonares A549 o células cancerígenas colorrectales HT29 con los anticuerpos biespecífieos o con anticuerpos de control previamente a la exposición a HGF. A continuación, se lisaron las células y se examinó la fosforilación del receptor c-Met. Ambas líneas celulares pueden estimularse con HGF, tal como se observa a partir de la existencia de una banda específica de fosfo-c-Met en la membrana de transferencia inmunológica .

Ejemplo 3 (Figura 6) : Inhibición de la fosforilación del receptor Her3 inducida por HRG por parte de formatos biespecíficos de anticuerpo de Her3/c-Met Para confirmar la funcionalidad de la parte Her3 en los anticuerpos biespecíficos , se llevó a cabo un ensayo de fosforilación de Her3. En este experimento, se trataron células MCF7 con los anticuerpos biespecíficos o con anticuerpos de control previamente a la exposición a HRG (heregulina) . A continuación, se lisaron las células y se examinó la fosforilación del receptor Her3. Her3/c-Met_KHSS inhibió la fosforilación del receptor Her3 en el mismo grado que el Her3 clon 29 parental, indicando que la unión de Her3 y la funcionalidad del anticuerpo no resultan comprometidos por el formato trivalente del anticuerpo .

Ejemplo 4 (Figura 8) : Inhibición de la proliferación de HUVEC inducida por HGF por parte de formatos biespecíficos de anticuerpo de Her3/c-Met Se llevaron a cabo ensayos de proliferación de HUVEC para demostrar el efecto mitogénico de HGF . La adición de HGF a HUVEC condujo a un incremento de dos veces de la proliferación. La adición de anticuerpo IgG humano de control en el mismo intervalo de concentraciones que los anticuerpos biespecíficos no presentó ningún impacto sobre la proliferación celular, mientras que el fragmento Fab de 5D5 inhibición la proliferación inducida por HGF. La titulación de Her3 /c-Met_KHSS demostró un efecto de inhibición débil del anticuerpo (fig. 8) . El efecto fue más pronunciado para el anticuerpo de Her3/Met-6C, indicando que un conecto más largo incrementa la eficacia del anticuerpo. Esto demuestra la funcionalidad del componente c-Met en el formato trivalente de anticuerpo.

Ejemplo 5 (Figura 9) : Inhibición de la proliferación en la línea celular cancerígena A431 por parte de formatos biespecíficos de anticuerpo de Her3/c-Met En el caso de que se sembrase A431 en medio de suero reducido, la adición de HGF indujo, aparte de la dispersión, un efecto mitogénico débil. Esto se explotó para analizar el impacto de Her3/c-Met_KHSS sobre la proliferación de A431 tratadas con HGF. En efecto, los anticuerpos biespecíficos pueden inhibir en gran medida el incremento inducido por HGF de la proliferación (15%) . Un anticuerpo IgGl humano de control no presentó ninguna influencia sobre el crecimiento de las células A431 estimulado por HGF.

Ejemplo 6 (Figura 10) : Análisis de la inhibición de la diseminación de célula a célula (dispersión) inducida por HGF en la línea celular cancerígena A431 por parte de formatos biespecíficos de anticuerpo de Her3/c-Met La dispersión inducida por HGF comprende cambios morfológicos de la célula, resultando en el redondeo de las células, protrusiones similares a filopodios, estructuras ahusadas y una cierta motilidad de las células. El analizador celular en tiempo real (Roche) mide la impedancia de un pocilio determinado de cultivo celular y puede, por lo tanto, monitorizar indirectamente los cambios de la morfología y proliferación celulares. La adición de HGF a células A431 y A549 resultó en cambios de la impedancia que se monitorizaron como función del tiempo. Her3/c- et_KHSS y Her3/Met-6C inhibieron la dispersión inducida por HGF, siendo Her3/Met-6C más eficaz (inhibición de la dispersión de 20.7% y 43.7%) (Figura 10) .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1.- Anticuerpo biespecífico trivalente, caracterizado porque comprende : a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consiste de dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo, b) un polipéptido que consiste de: ba) un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo, o bb) un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo y un dominio constante 1 de anticuerpo (CHl),en donde el polipéptido se encuentra fusionado con el extremo N-terminal del dominio VH mediante un péptido conector al extremo C-terminal de una de las dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa. c) . un polipéptido que consiste de: ca) un dominio variable cadena ligera de anticuerpo (VL) , o cb) un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo y un dominio constante de cadena ligera (CL) de anticuerpo, en donde el polipéptido se encuentra fusionado con el extremo N-terminal del dominio VL mediante un péptido conector al extremo C-terminal de la otra de las dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa, y en el que el dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo del polipéptido de b) y el dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo del polipéptido de c) conjuntamente forman un sitio de unión de antígeno que se une específicamente a un segundo antígeno. 2. - Anticuerpo biespecífico trivalente de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque: el dominio CH3 de una cadena pesada y el dominio CH3 de la otra cadena pesada se reúnen en una interface que comprende una interface original entre los dominios CH3 del anticuerpo, en donde se altera tal interface con el fin de estimular la formación del anticuerpo biespecífico bivalente, en el que la alteración se distingue porque: i) el dominio CH3 de una cadena pesada ha sido alterado, de manera que dentro de la interface original del dominio CH3 de una cadena pesada que se reúne con la interface original del dominio CH3 de la otra cadena pesada del anticuerpo biespecífico bivalente, se sustituye un residuo aminoácido por un residuo aminoácido de volumen de cadena lateral más grande, generando de esta manera una protuberancia en el interior de la interface del dominio CH3 de una cadena pesada, pudiendo situarse la protuberancia en una pocilio en el interior de la interface del dominio CH3 de la otra cadena pesada y ii) el dominio CH3 de la otra cadena pesada ha sido alterado, de manera que dentro de la interface original del segundo dominio CH3 que se reúne con la interface original del primer dominio CH3 dentro del anticuerpo biespecífico trivalente, se sustituye un residuo aminoácido por un residuo aminoácido de volumen de cadena lateral más pequeño, generando de esta manera una pocilio en el interior de la interface del segundo dominio CH3 , en el interior de la cual puede situarse una protuberancia dentro de la interface del primer dominio CH3. 3.- Anticuerpo biespecífico trivalente de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque: i) tal residuo aminoácido que presenta un volumen más grande de cadena lateral se selecciona de entre el grupo que consiste de arginina (R) , fenilalanina (F) , tirosina (Y) , triptófano (W) , y ii) tal residuo aminoácido que presenta un volumen más pequeño de cadena lateral se selecciona de entre el grupo que consiste de alanina (A) , serina (S) , treonina (T) y valina (V) . 4. - Anticuerpo biespecífico trivalente de conformidad con las reivindicaciones 2 ó 3, caracterizado porque ambos dominios CH3 se han alterado adicionalmente mediante la introducción de cisteína (C) como aminoácido en las posiciones correspondientes de cada dominio CH3, de manera que puede formarse un puente disulfuro entre ambos dominios CH3. 5.- Anticuerpo biespecífico trivalente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque el dominio CH3 en i) comprende una mutación T366W, y el dominio CH3 en ii) comprende las mutaciones T366S, L368A e Y407V. 6. Anticuerpo biespecífico trivalente según la reivindicación 4, caracterizado porque el dominio CH3 en i) comprende las mutaciones Y349C y T366 , y el dominio CH3 en ii) comprende las mutaciones S354C, T366S, L368A e Y407V. 7. Anticuerpo biespecífico trivalente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque: el dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo del polipéptido en b) y el dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo del polipéptido en c) se unen y estabilizan mediante un puente disulfuro entre cadenas mediante la introducción de un enlace disulfuro entre las posiciones siguientes: i) entre la posición 44 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera, ii) entre la posición 105 del dominio variable de cadena pesada y la posición 43 del dominio variable de cadena ligera, o iii) entre la posición 101 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera. 8. - Anticuerpo biespecífico trivalente de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo del polipéptido en b) y el dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo del polipéptido en c) se unen y estabilizan mediante un puente disulfuro entre cadenas mediante la introducción de un enlace disulfuro entre las posiciones siguientes: i) la posición 44 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera . 9.- Anticuerpo biespecífico trivalente de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque los péptidos conectores en b) y e) son péptidos idénticos de longitud comprendida entre 25 y 50 aminoácidos. 10. - Composición farmacéutica caracterizada porque comprende un anticuerpo biespecífico trivalente de conformidad con las reivindicaciones 1 a 9. 11. - Acido nucleico caracterizado porque codifica un anticuerpo biespecífico trivalente de conformidad las reivindicaciones 1 a 9. 12.- Anticuerpo biespecífico trivalente de conformidad con las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque está destinado al tratamiento del cáncer. 13. - El uso del anticuerpo biespecífico trivalente de conformidad con las reivindicaciones 1 a 9, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer.

1 . - Método de tratamiento de pacientes que sufren cáncer, caracterizado porque es a través de la administración del anticuerpo biespecífico trivalente, de conformidad con las reivindicaciones 1 a 9 en un paciente que necesita tal tratamiento.