MX2013009661A

MX2013009661A - Proteinas de union a antigeno.

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Publication number: MX2013009661A
Application number: MX2013009661A
Authority: MX
Inventors: Wolfgang Schaefer; Birgit Bossenmaier; Christian Klein; Hubert Kettenberger; Klaus-Peter Kuenkele; Joerg Thomas Regula; Manfred Schwaiger; Claudio Sustmann
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2011-02-28
Filing date: 2012-02-24
Publication date: 2014-02-11
Also published as: EP2681239A1; CA2825081A1; CN103502271A; CN103502271B; BR112013019975A2; US20180312573A1; JP2014509198A; MX341921B; US20120237506A1; JP5764677B2; US10793621B2; WO2012116926A1; KR101638224B1; EP2681239B8; KR20130111638A; RU2013141077A; RU2607038C2; EP2681239B1; AR085404A1; US9982036B2

Abstract

La presente invención se refiere a proteínas de unión a antígeno que comprenden dos partes Fc, a métodos para la producción de las mismas, a composiciones farmacéuticas que contienen dichas proteínas de unión a antígeno y a usos de las mismas.

Description

PROTEÍNAS DE UNIÓN A ANTÍGENO La presente invención se refiere a proteínas de unión a antígeno que comprenden dos partes Fe, a métodos para la producción de las mismas, a composiciones farmacéuticas que contienen dichas proteínas de unión a antígeno y a usos de las mismas.

Antecedentes de la invención En las últimas dos décadas, se han desarrollado y evaluado diversos derivados artificiales de anticuerpos, sea monoespecíficos o multiespecíficos, monovalentes o multivalentes (ver, por ejemplo, Holliger P. et al, Nature Biotech. 23:1126-1136, 2005; Fischer N. y Léger O., Pathobiology 74:3-14, 2007).

La patente US n° 2004/0033561 se refiere al ADN y a la producción de monocuerpos monovalentes mediante coexpresión de una cadena pesada y una cadena pesada modificada. Sin embargo, durante la expresión, se forma una cantidad considerable de homodímero no deseado como producto secundario, que resulta difícil de separar de los monocuerpos heterodiméricos deseados, debido a que el homodímero y el heterodímero presentan pesos moleculares iguales o similares. La patente WO n° 2007/048037 se refiere a IgGs monovalentes que corresponden a los monocuerpos heterodiméricos de la patente US n° 2004/0033561, pero que presentan una fracción de etiquetado unida a la cadena pesada para una purificación más fácil del heterodímero respecto del producto secundario homodimérico, que resulta difícil de separar.

Descripción resumida de la invención La invención comprende una proteína de unión a antígeno, que comprende: a) dos cadenas pesadas modificadas de un anticuerpo que se unen específicamente a un antígeno, en las que la VH de cada cadena pesada se sustituye por la VL de dicho anticuerpo, estando asociadas entre sí dichas cadenas pesadas modificadas mediante sus dominios CH de la parte Fe, b) dos cadenas pesadas modificadas de dicho anticuerpo, en las que la CH1 de cada pesada se sustituye por la CL de dicho anticuerpo, estando asociadas entre sí dichas cadenas pesadas modificadas mediante sus dominios CH de la parte Fe, y en la que los dominios VL de las cadenas pesadas de a) se encuentran asociados con los dominios VH de las cadenas pesadas de b), y los dominios CH1 de las cadenas pesadas de a) se encuentran asociadas a los dominios CL de las cadenas pesadas de b).

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque: los dominios CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de a) y los dominios CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de b) son del mismo isotipo.

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque: los dominios CH2 y CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de a) y los dominios CH2 y CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de b) son del mismo isotipo.

En una realización, la proteína de unión a antigeno según la invención se caracteriza porque: los dominios CH2 y CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de a) y los dominios CH2 y CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de b) son del isotipo IgG.

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque: los dominios CH2 y CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de a) y los dominios CH2 y CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de b) son del isotipo IgGl .

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque comprende: a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 1, y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 2, a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 3, y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 4, o a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 5, y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 6.

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque: las dos cadenas pesadas modificadas de a) o las dos cadenas pesadas modificadas de b), se han modificado adicionalmente con las sustituciones de aminoácidos S364G, L368F, D399K y K409D (en las que las posiciones de los aminoácidos se numeran según el índice EU de Kabat).En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque: a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 1, y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 2, en las que las dos cadenas pesadas modificadas de a), o las dos cadenas pesadas modificadas de b), se han modificado adicionalmente con las sustituciones de aminoácidos S364G, L368F, D399K y K409D (en las que las posiciones de los aminoácidos se numeran según el índice EU de Kabat). a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 3, y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 4, en las que las dos cadenas pesadas modificadas de a), o las dos cadenas pesadas modificadas de b), se han modificado adicionalmente con las sustituciones de aminoácidos S364G, L368F, D399K y K409D (en las que las posiciones de los aminoácidos se numeran según el índice EU de Kabat). o a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 5, y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 6, en las que las dos cadenas pesadas modificadas de a), o las dos cadenas pesadas modificadas de b), se han modificado adicionalmente con las sustituciones de aminoácidos S364G, L368F, D399K y K409D (en las que las posiciones de los aminoácidos se numeran según el índice EU de Kabat).

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque: los dominios CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de a) y los dominios CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de b) son de isotipo diferente.

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque: los dominios CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de a) son del isotipo IgGl, y los dominios CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de b) son del isotipo IgA.

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque comprende: a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 7, y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 4.

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque comprende: a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 3, y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 8.

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque: los dominios CH2 y CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de a) son del isotipo IgGl, y los dominios CH2 y CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de b) son del isotipo IgA.

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque el dominio CH2 de las partes Fe de a) y b) son del isotipo IgGl, y la proteína de unión a antígeno se encuentra afucosilada, siendo una cantidad de fúcosa de 80% o inferior (preferentemente de 65% a 5%) de la cantidad total de oligosacáridos (azúcares) en Asn297 del isotipo IgGl humano.

La invención comprende además un método para la preparación de una proteína de unión a antígeno según la invención, que comprende las etapas siguientes: a) transformar una célula huésped con vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de una proteína de unión a antígeno según la invención, b) cultivar la célula huésped bajo condiciones que permiten la síntesis de dicha molécula de proteína de unión a antígeno, y c) recuperar dicha molécula de proteína de unión a antígeno a partir de dicho cultivo.

La invención comprende además un ácido nucleico codificante de la proteína de unión a antígeno según la invención.

La invención comprende además vectores que comprenden un ácido nucleico codificante de la proteína de unión a antígeno según la invención.

La invención comprende además una célula huésped que comprende dichos vectores.

La invención comprende además una composición, preferentemente una composición farmacéutica o diagnóstica, de una proteína de unión a antígeno según la invención.

La invención comprende además una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión a antígeno según la invención.

La invención comprende además un método para el tratamiento de un paciente que necesita terapia, caracterizado por la administración en el paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a antígeno según la invención.

Ahora se ha encontrado que las proteínas de unión a antígeno según la invención presentan características valiosas, tales como actividades biológicas o farmacológicas (tales como, por ejemplo, ADCC incrementada en comparación con anticuerpos parentales). Pueden utilizarse, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades tales como el cáncer. Las proteínas de unión a antígeno según la invención presentan propiedades farmacocinéticas altamente valiosas (tales como, por ejemplo, AUCO-inf, Cmax o CO).

Descripción de las figuras Figuras 1A y B: A) Estructura esquemática de la proteína de unión a antígeno según la invención (abreviada dímero MoAb) con entrecruzamiento CH1-CL. B) Esquema del producto secundario principal - monómero anticuerpo monovalente (MoAb) con entrecruzamiento CH1-CL (abreviadamente MoAb).

Figura 1C: C) Asociación de dos cadenas pesadas modificadas a y b: La heterodimerización de dos cadenas diferentes (a con b) conduce directamente al anticuerpo monovalente B (ruta 2). La homodimerización de dos cadenas idénticas (a con a y b con b) conduce a los intermediarios putativos aa y bb (mediante la ruta 1) que pueden asociarse formando el "dímero de MoAb" A. La modificación de los contactos CH3-CH3 puede afectar a la distribución de los productos A (dímero de MoAb) y B (MoAb). Las modificaciones que favorecen la heterodimerización (por ejemplo de botón-en-ojal) incrementará la cantidad relativa de compuesto B mediante la ruta 2, mientras que las modificaciones que mantienen las interacciones atractivas entre cadenas idénticas pero que conducen a la repulsión de diferentes cadenas (por ejemplo los dominios CH3 de a y b obtenidos de diferentes isotipos) favorecerá la ruta 1 y de esta manera incrementará la cantidad de A. Blanco: dominios de cadena ligera. Rayado: dominios de cadena pesada.

Caracterización bioquímica del dímero de MoAb c-Met (dímero de MoAb 5D5 ("CH3-wt")) (CH3-wt se refiere al dominio CH3 de tipo salvaje no modificado). (A) Se separó el anticuerpo purificado con proteína A en una columna Superdex 200 26/60. (B) Se agruparon las fracciones de picos (1, 2, 3) y se sometieron a SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras y reductoras. Se riñeron geles de poliacrilamida con pigmento azul de Coomassie. Los picos individuales corresponden a MoAb (3), dímero de MoAb (2) y un agregado de peso molecular más elevado (1).

Caracterización bioquímica del dímero de MoAb IGF- IR (dímero de MoAb IGF-1R AK18 ("CH3-wt")) (CH3-wt se refiere al dominio CH3 de tipo salvaje no modificado). (A) Se separó el anticuerpo purificado con proteína A en una columna Superdex 200 26/60. (B) Se agruparon las fracciones de picos (1, 2) y se sometieron a SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras y reductoras. Se riñeron geles de poliacrilamida con pigmento azul de Coomassie. Los picos individuales corresponden a MoAb (2) y a dímero de MoAb (1). C) La masa molecular de las fracciones de picos 1 y 2 se investigaron mediante SEC-MALLS.

Caracterización bioquímica del dímero de MoAb Her3 205 ("CH3-wt") (CH3-wt se refiere al dominio CH3 de tipo salvaje no modificado). (A) Se separó el anticuerpo purificado con proteína A en una columna Superdex 200 26/60. (B) Se agruparon las f acciones de picos (1, 2) y se sometieron a SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras y reductoras. Se tiñeron geles de poliacrilamida con pigmento azul de Coomassie. Los picos individuales corresponden a MoAb (3), dímero de MoAb (2) y un agregado de peso molecular más elevado (1).

Dibujo esquemático del ensayo de resonancia de plasmón superficial aplicado al análisis de la afinidad de unión de IGF- IR. Se inmovilizó un anticuerpo anti-IgG humana (JIR 109-005-098) sobre la superficie de un chip biosensor CM5, capturando posteriormente anticuerpos MoAb o dímero de MoAb. La inyección adicional de ectodominio de IGF- IR recombinante confirmó la funcionalidad de los sitios de unión a antígeno en las moléculas de MoAb y dímero de MoAb.

Unión celular de dímero de MoAb (dímero de MoAb de IGF- IR AK.18 ("CH3-wt") (B) y anticuerpo parental mAb IGF- IR (A) a células A549 según análisis de citometría de flujo. Se incubaron las células A549 con una serie de dilución de los anticuerpos indicados. Se visualizaron los anticuerpos unidos con un anticuerpo secundario de unión a Fe acoplado a fluoróforo.

Figura 7: Ensayo de ADCC con mAb de IGF IR no glucomanipulado (no-gm) y glucomanipulado (gm) y dímero de MoAb de IGF- IR no glucomanipulado (dímero de MoAb de IGF IR A 18 ("CH3-wt")). Las células sanguíneas periféricas mononucleares (PBMC) derivadas de un donante se incubaron con células de cáncer de próstata (DU145) en presencia de mAb de IGF IR no-gm, mAb de IGF IR gm (2) y dímero de MoAb de IGF IR AK18 no-gm (MCH3-wt") (3).

Figura 8: La internalización de IGF- IR se evaluó en células HT29 tras la incubación con anticuerpo IgGl de IGF- IR (mAb de IGF- IR) y dímero de MoAb de IGF-1R (dímero de MoAb de IGF IR AK18 ("CH3-wt")). El gráfico ilustra los niveles totales de IGF- IR tras la exposición a anticuerpo que se determinaron en un diseño de ensayo basado en un ELISA.

Figura 9: Se evaluó la autofosforilación de IGF- IR tras la incubación de células 3 T3 -IGF- IR con anticuerpo IgGl de IGF- IR y dímero de MoAb de IGF-1R (dímero de MOAb de IGF IR AK18 ("CH3-wt")) en presencia de IGF-1 10 nM. El gráfico ilustra los niveles de fosfo-IGF-lR tras la exposición a anticuerpo que se determinaron en un diseño de ensayo basado en un ELISA.

Figura 10: Análisis de las proporciones de dímero de MoAb obtenido (=proteína de unión a antígeno según la invención) a monómero de MoAb (^producto secundario monovalente) determinadas mediante HPLC. Se expresaron transitoriamente diferentes anticuerpos con dominios CH3 de tipo salvaje (CH3-wt) que con dominios CH3 modificados y se determinaron las proporciones de dímero a monómero.

Figura 11: Espectro de ESI-M2 del dímero de MoAb de IGF- IR (fracción 1 de SEC) bajo condiciones no reductoras y después de la desglucosilación. Figura 12: Espectro de ESI-MS del dímero de MoAb de IGF- IR (fracción 1 de SEC) tras la desglucosilación y reducción.

Descripción detallada de la invención La invención comprende una proteína de unión a antígeno, que comprende: a) dos cadenas pesadas modificadas de un anticuerpo que se unen específicamente a un antígeno, en las que la VH de cada cadena pesada se sustituye por la VL de dicho anticuerpo, estando asociadas entre sí dichas cadenas pesadas modificadas mediante sus dominios CH de la parte Fe, b) b) dos cadenas pesadas modificadas de dicho anticuerpo, en las que la CHl de cada cadena pesada se sustituye por la CL de dicho anticuerpo, estando asociadas entre sí dichas cadenas pesadas modificadas mediante sus dominios CH de la parte Fe, y en la que los dominios VL de las cadenas pesadas de a) se encuentran asociados con los dominios VH de las cadenas pesadas de b), y los dominios CHl de las cadenas pesadas de a) se encuentran asociadas a los dominios CL de las cadenas pesadas de b).

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque: los dominios CH2 y CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de a) y los dominios CH2 y CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de b) son del isotipo IgG.

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque comprende: a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 1 , y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 2, a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 3, y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 4, o a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 5, y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 6.

Con el fin de mejorar los rendimientos de la proteína de unión a antígeno según la invención (es decir, para mejorar la proporción entre dímero de MoAb y monómero de MoAb (ver el Ejemplo 9)), los dominios CH3 de IgGl de a) pueden modificarse adicionalmente mediante mutaciones de manera que los dominios CH3 de IgGl de a) y los dominios CH3 de IgGl natural (wt) de b) sean diferentes. La modificación/mutación debe llevarse a cabo de manera que se mantengan las interacciones de atracción entre cadenas idénticas, pero que conduzca a la repulsión de diferentes cadenas (ver también la fig. 1C). En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque: las dos cadenas pesadas modificadas de a) o las dos cadenas pesadas modificadas de b), se han modificado adicionalmente con las sustituciones de aminoácidos S364G, L368F, D399K y K409D (en las que las posiciones de los aminoácidos se numeran según el índice EU de Kabat).

El índice EU del sistema numeración de Kabat se describe en Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque: a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 1 , y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 2, en las que las dos cadenas pesadas modificadas de a), o las dos cadenas pesadas modificadas de b), se han modificado adicionalmente con las sustituciones de aminoácidos S364G, L368F, D399K y K409D (en las que las posiciones de los aminoácidos se numeran según el índice EU de Kabat). a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 3, y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 4, en las que las dos cadenas pesadas modificadas de a), o las dos cadenas pesadas modificadas de b), se han modificado adicionalmente con las sustituciones de aminoácidos S364G, L368F, D399K y K409D (en las que las posiciones de los aminoácidos se numeran según el índice EU de Kabat). o a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 5, y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 6, en las que las dos cadenas pesadas modificadas de a), o las dos cadenas pesadas modificadas de b), se han modificado adicionalmente con las sustituciones de aminoácidos S364G, L368F, D399K y K409D (en las que las posiciones de los aminoácidos se numeran según el índice EU de Kabat).

Otra posibilidad para mejorar los rendimientos de la proteína de unión a antígeno según la invención (es decir, para mejorar la proporción de dímero de MoAb a monómero de MoAb (ver el Ejemplo 9)), es que los dominios CH3 de a) y b) utilizados sean de diferente isotipo. De esta manera, las interacciones de atracción entre cadenas idénticas se mantienen aunque cadenas diferentes se repelen (ver también la fig. 1C).

Por lo tanto, en una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque: los dominios CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de a) y los dominios CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de b) son de isotipo diferente.

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque: los dominios CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de a) son del isotipo IgG, y los dominios CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de b) son del isotipo IgA.

En una realización, la proteína de unión a antigeno según la invención se caracteriza porque: los dominios CH2 y CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de a) son del isotipo IgGl, y los dominios CH2 y CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de b) son del isotipo IgAl.

En una realización, la proteina de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque el dominio CH2 de las partes Fe de a) y b) son del isotipo IgGl, y la proteína de unión a antígeno se encuentra afucosilada con una cantidad de fucosa de 80% o inferior de la cantidad total de oligosacáridos (azúcares) en Asn297 del isotipo IgGl humano.

El término "anticuerpo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo de longitud completa que consiste de dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo (ver la fig. 1). Una cadena pesada de un anticuerpo de longitud completa es un polipéptido que consiste, en la dirección N-terminal a C-terminal, de un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo, un dominio constante 1 de cadena pesada (CHl) de anticuerpo, una región bisagra (HR) de anticuerpo, un dominio constante 2 de cadena pesada (CH2) de anticuerpo, y un dominio constante 3 de cadena pesada (CH3) de anticuerpo, abreviadamente: VH-CH1-HR-CH2-CH3, y opcionalmente un dominio constante 4 de cadena pesada (CH4) de anticuerpo en el caso de un anticuerpo de la clase IgE. Preferentemente, la cadena pesada del anticuerpo de longitud completa es un polipéptido que consiste, en la dirección N-terminal a C-terminal, de VH, CHl, HR, CH2 y CH3. La cadena ligera del anticuerpo de longitud completa es un polipéptido que consiste, en dirección N-terminal a C-terminal, de un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo, y un dominio constante de cadena ligera (CL) de anticuerpo, abreviadamente VL-CL. El dominio constante de cadena ligera (CL) de anticuerpo puede ser ? (kappa) or ? (lambda). Las cadenas de anticuerpo se encuentran unidas entre sí mediante enlaces disulfuro entre polipéptidos, entre el dominio CL y el dominio CH1 (es decir, entre la cadena ligera y la pesada y entre las regiones de bisagra de las cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa. Son ejemplos de anticuerpos de longitud completa típicos anticuerpos naturales tales como IgG (por ejemplo IgGl e IgG2), IgM, IgA, IgD e IgE. Los anticuerpos según la invención pueden ser de una única especie, por ejemplo humanos, o pueden ser anticuerpos quimerizados o humanizados. Los anticuerpos de longitud completa según la invención comprenden dos sitios de unión a antígeno, cada uno formado por una pareja de VH y L, uniéndose ambos específicamente al mismo (primer) antígeno.

A partir de dichos anticuerpos de longitud completa, la proteína de unión a antígeno de la invención se deriva mediante: a) la modificación de dos cadenas pesadas de un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno, mediante la sustitución del dominio VH de cada cadena pesada por el dominio VL de dicho anticuerpo, b) la modificación de dos cadenas pesadas de dicho anticuerpo mediante la sustitución del dominio CH1 de cada cadena pesada por el dominio CL de dicho anticuerpo.

La "parte Fe" de un anticuerpo o proteína de unión a antígeno no participa directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, sino que es responsable de a) la asociación de las cadenas de anticuerpo (modificado) entre sí (por ejemplo mediante sus dominios CH3), y b) diversas funciones efectoras. Una "parte Fe de un anticuerpo" es una expresión bien conocida por el experto en la materia y definida basándose en el corte con papaína de los anticuerpos. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos o inmunoglobulinas se dividen en las clases: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y algunas de ellas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, IgAl e IgA2. Según las regiones constantes de cadena pesada, las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, ? y µ, , respectivamente.

Existen cinco tipos de cadenas pesadas de anticuerpo de mamífero, indicadas con las letras griegas a, d, e, ? y µ (Janeway, C.A., Jr. et al, Immunobiology, 5a edición, Garland Publishing, 2001). El tipo de cadena pesada presente define la clase del anticuerpo; estas cadenas se encuentran en los anticuerpos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente (Rhoades R.A. y Pflanzer R.G., Human Physiology, 4a edición, Thomson Learning, 2002).

Las cadenas pesadas diferentes difieren en tamaño y composición; a y ? contienen aproximadamente 450 aminoácidos, mientras que µ y e presentan aproximadamente 550 aminoácidos.

Cada cadena pesada presenta dos regiones: la región constante y la región variable. La región constante es idéntica en todos los anticuerpos del mismo isotipo, pero difiere en anticuerpos de isotipo diferente. Las cadenas pesadas ?, a y d presentan una región constante compuesta de tres dominios constantes, CHl, CH2 y CH3 (en una línea), y una región bisagra para una mayor flexibilidad (Woof J. y Burton D., Nat. Rev. Immunol. 4:89-99, 2004); las cadenas pesadas µ y e presentan una región constante compuesta de cuatro dominios constantes, CHl, CH2, CH3 y CH4 (Janeway C.A. Jr. et al, Immunobiology, 5a edición, Garland Publishing, 2001). La región variable de la cadena pesada difiere en los anticuerpos producidos por diferentes células B, pero es igual para todos los anticuerpos producidos por una célula B o clon de células B determinado. La región variable de cada cadena pesada presenta una longitud de aproximadamente 1 10 aminoácidos y está compuesta de un solo dominio de anticuerpo.

Los "dominios CH de la parte Fe" son el dominio constante 2 de cadena pesada de anticuerpo (CH2) y el dominio constante 3 de cadena pesada de anticuerpo (CH3), y opcionalmente el dominio 4 de cadena pesada de anticuerpo (CH4) en el caso de un anticuerpo de la clase IgE.

La expresión "estando asociadas entre sí dichas cadenas pesadas modificadas mediante sus dominios CH de la parte Fe" se refiere al apareamiento entre sí de los dominios intercadena de los dominios constantes de cadena pesada (CH) de anticuerpo de las dos cadenas pesadas modificadas, por ejemplo los dos dominios CH3 de ambas cadenas entre sí mediante, por ejemplo, interacción iónica intercadena, interacción de van Der Waals o puente de hidrógeno (ver la fíg. 1A). En una realización, dichas cadenas pesadas modificadas se asocian entre sí mediante por lo menos sus dominios CH3 de la parte Fe (y opcionalmente mediante sus dominios CH3 u opcionalmente mediante sus dominios CH2 y CH4 (en caso de existir)).

La expresión "en el que los dominios VL de las cadenas pesadas de a) se asocian con los dominios VH de las cadenas pesadas de b), y los dominios CH1 de las cadenas pesadas de a) se asocian a los dominios CL de las cadenas pesadas de b)" se refiere al apareamiento entre dominios de dichos dominios de anticuerpo (en todo caso uno de a) y uno de b)) tal como se encuentran en, por ejemplo, los anticuerpos naturales (VL VH y CHl/CL), por ejemplo mediante interacción iónica entre cadenas, interacción de van der Waals, enlaces de hidrógeno o interacciones de disulfuros (ver la fig. 1A). La "proteína de unión a antígeno" según la invención comprende dos sitios de unión a antígeno y es bivalente. Las expresiones "sitio de unión" o "sitio de unión a antígeno" tal como se utilizan en la presente memoria se refiere a una o más regiones de una proteína de unión a antígeno según la invención a las que se une realmente un ligando (por ejemplo el antígeno o un fragmento del mismo) y que se deriva de una molécula de anticuerpo o de un fragmento del mismo (por ejemplo un fragmento Fab). El sitio de unión a antígeno según la invención comprende dominios variables de cadena pesada (VH) de anticuerpo y dominios variables de cadena ligera (VL) de anticuerpo.

Los sitios de unión a antígeno (es decir, las parejas VH VL) que se unen específicamente al antígeno deseado pueden derivarse de: a) anticuerpos conocidos del antígeno, o b) nuevos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo obtenidos mediante métodos de inmunización de novo utilizando, inter alia, la proteína o ácido nucleico del antígeno, o fragmentos de los mismos, o mediante expresión fágica.

Un sitio de unión a antígeno de una proteína de unión a antígeno de la invención contiene seis regiones determinantes de complementariedad (CDRs) que contribuye en grados variables a la afinidad del sitio de unión para el antígeno. Existen tres CDRs de dominio variable de cadena pesada (CDRHl, CDRH2 y CDRH3) y tres CDRs de dominio variable de cadena ligera (CDRLl, CDRL2 y CDRL3). La extensión de las regiones CDR y de marco (FRs) se determina mediante comparación con una base de datos compilada a partir de secuencias de aminoácidos en las que dichas regiones se han definido según la variabilidad entre secuencias.

La especificidad del anticuerpo se refiere al reconocimiento específico del anticuerpo para un epítopo particular de un antígeno. Los anticuerpos naturales, por ejemplo, son monoespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que presentan dos especificidades de unión a antígeno diferentes. Las proteínas de unión a antígeno según la invención son por lo menos monoespecíficas y se unen específicamente a un epítopo del antígeno respectivo.

El término "valente" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a la presencia de un número específico de sitios de unión en una molécula de anticuerpo. Un anticuerpo natural, por ejemplo, presenta dos sitios de unión y es bivalente. Además, la proteína de unión a antígeno según la invención es por lo menos bivalente.

Las expresiones "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" tal como se utilizan en la presente memoria se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una única composición de aminoácidos.

La expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que comprende una región variable, es decir la región de unión, procedente de una fuente o especie, y por lo menos una parte de una región constante derivada de una fuente o especie diferente, habitualmente preparado mediante técnicas de ADN recombinante. Los anticuerpos quiméricos que comprenden una región variable murina y una región constante humana resultan preferentes. Otras formas preferentes de "anticuerpos quiméricos" comprendidas en la presente invención son aquéllas en las que la región constante ha sido modificada o cambiada respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades según la invención, especialmente con respecto a la unión de Clq y/o a la unión de receptor Fe (FcR). Dichos anticuerpos quiméricos también se denominan "anticuerpos de clase intercambiada". Los anticuerpos quiméricos son el producto de genes de inmunoglobulina expresados que comprenden segmentos de ADN codificantes de regiones variables de inmunoglobulina y segmentos de ADN codificantes de regiones constantes de inmunoglobulina. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos implican técnicas convencionales de ADN recombinante y de transfección génica bien conocidas de la técnica (ver, por ejemplo, Morrison, S.L. et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855, 1985, y las patentes US n° 5.202.238 y n° 5.204.244).

La expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos en los que el marco o las "regiones determinantes de complementariedad" (CDR) han sido modificadas para que comprendan la CDR de una inmunoglobulina de especificidad diferente de la de la inmunoglobulina parental. En una realización preferente, se injerta una CDR murina en la región marco de un anticuerpo humano para preparar un "anticuerpo humanizado". Ver, por ejemplo, Riechmann, L. et ai, Nature 332:323-327, 1988, y Neuberger, M.S. et al., Nature 314:268-270, 1985. Las CDRs particularmente preferentes corresponden a aquéllas que representan secuencias que reconocen los anteriormente indicados antígenos de los anticuerpos quiméricos. Otras formas de "anticuerpos humanizados" comprendidas dentro de la presente invención son aquéllas en las que la región constante ha sido adicionalmente modificada o cambiada respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades según la invención, especialmente con respecto a la unión de Clq y/o a la del receptor de Fe (FcR).

La expresión "anticuerpo humano", tal como se utiliza en la presente memoria, pretende incluir anticuerpos que presentan regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos son bien conocidos del estado de la técnica (van Dijk, M.A. y van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5:368-374, 2001). También pueden producirse anticuerpos humanos en animales transgénicos (por ejemplo ratones) que sean capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo o una selección de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulinas. La transferencia del conjunto de genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana a dichos ratones mutantes de la línea germinal resulta en la producción de anticuerpos humanos tras el reto con antígeno (ver, por ejemplo, Jakobovits, A. et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:2551-2555, 1993; Jakobovits, A. et al., Nature 362:255-258, 1993; Bruggemann, M. et al, Year Immunol. 7 (1993) 33-40). También pueden producirse anticuerpos humanos en bibliotecas de expresión fágica (Hoogenboom, H.R. y Winter, G., J. Mol. Biol. 227:381-388, 1992; Marks, J.D. et al, J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991). Las técnicas de Colé et al. y de Boerner et al. también se encuentran disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, página 77, 1985; y Boerner, P. et al, J. Immunol. 147:86-95, 1991). Tal como ya se ha indicado para los anticuerpos quiméricos y humanizados según la invención, la expresión "anticuerpo humano" tal como se utiliza en la presente memoria también comprende los anticuerpos que se han modificado en la región constante para generar las propiedades según la invención, especialmente con respecto a la unión de Clq y/o la unión de FcR, por ejemplo mediante "intercambio de clase", es decir, el cambio o mutación de partes Fe (por ejemplo de IgGl a IgG4 y/o la mutación IgGl/IgG4).

La expresión "anticuerpo recombinante humano", tal como se utiliza en la presente memoria, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de una célula huésped, tal como una célula NSO o CHO, o de un animal (por ejemplo un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana o para anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped. Dichos anticuerpos recombinantes humanos presentan regiones variables y constantes en una forma reorganizada. Los anticuerpos recombinantes humanos según la invención han sido sometidos a hipermutación somática in vivo. De esta manera, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivadas y relacionadas con secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir naturalmente en el repertorio in vivo de anticuerpos de la línea germinal humana. La expresión "dominio variable" (dominio variable de una cadena ligera (VL), región variable de una cadena pesada (VH)) tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cada cadena de la pareja de cadenas ligera y pesada implicada directamente en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios de las cadenas variables ligeras y pesadas humanas presentan la misma estructura general y cada dominio comprende cuatro regiones marco (FR) cuyas secuencias se encuentran ampliamente conservadas y conectadas por tres "regiones hipervariables" (o regiones determinantes de complementariedad, CDRs). Las regiones de marco adoptan una conformación de hoja ß y las CDRs pueden formar bucles conectando la estructura de hoja ß. Las CDRs en cada cadena son mantenidas en su estructura tridimensional por las regiones de marco y forman conjuntamente con las CDRs de la otra cadena el sitio de unión de antígeno. Las regiones CDR3 de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo desempeñan un papel particularmente importante en la especificidad/afinidad de unión de los anticuerpos según la invención y, por lo tanto, proporcionan un objetivo adicional de la invención.

Las expresiones "región hipervariable" o "parte de unión de antígeno de un anticuerpo", tal como se utilizan en la presente memoria se refieren a los residuos aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión de antígeno. La región hipervariable comprende residuos aminoácidos de las "regiones determinantes de complementariedad" o "CDRs". Las regiones "de marco" o "FR" son aquellas regiones de dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable tal como se definen en la presente memoria. Por lo tanto, las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo comprenden, de extremo N-terminal a extremo C-terminal, los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Las CDRs en cada cadena se encuentran separadas por dichos aminoácidos de marco. En particular, la CDR3 de la cadena pesada es la región que contribuye más a la unión de antígeno. Las regiones CDR y FR se determinan según la definición estándar de Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "de unión" o "de unión específica" se refieren a la unión de la proteína de unión a antígeno a un epítopo del antígeno en un ensayo in vitro, preferentemente en un ensayo de resonancia de plasmón (BI Acore, GE-Healthcare, Uppsala, Suecia) con antígeno de tipo salvaje purificado. La afinidad de unión está definida por los términos ka (constante de velocidad para la asociación del anticuerpo del complejo de anticuerpo/antígeno), ko (constante de disociación) y D (krj/ka). Las expresiones "unión" o "unión específica" se refieren a una afinidad de unión (KD) de 10" moles/1 o inferior (por ejemplo 10"8 a 10"13 moles/1), preferentemente 10"9 M a 10" 13 moles/1. De esta manera, una proteína de unión a antígeno según la invención se une específicamente a cada antígeno para el que es específica con una afinidad de unión (KD) de 8 13 9 10" moles/1 o inferior (por ejemplo de 10" M a lO" moles/1), preferentemente de 10" M a 10" 13 moles/1.

La unión de la proteína de unión a antígeno a FcyRIII puede investigarse mediante un ensayo BIAcore (GE-Healthcare Uppsala, Suecia). La afinidad de unión está definida por los términos ka (constante de velocidad para la asociación del anticuerpo del complejo de anticuerpo/antígeno), ko (constante de disociación) y KD (ko/ka).

El término epítopo incluye cualquier determinante polipéptido capaz de unirse específicamente a una proteína de unión a antígeno. En determinadas realizaciones, el determinante epítopo incluye grupos superficiales químicamente activos de moléculas, tales como aminoácidos, cadenas laterales sacáridas, fosforilo o sulfonilo y, en determinadas realizaciones, puede presentar características estructurales tridimensionales específicas, o presentar características de carga específica. Un epítopo es una región de un antígeno que se une a una proteína de unión a antígeno.

En determinadas realizaciones, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno en el caso de que reconozca preferentemente su antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.

La expresión "región constante" tal como se utiliza en las presentes solicitudes se refiere a la suma de los dominios de un anticuerpo que no son la región variable. La región constante no se encuentra directamente implicada en la unión de un antígeno, aunque muestra diversas funciones efectoras. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos se dividen en las clases (también denominadas isotipos) siguientes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas pueden dividirse adicionalmente en subclases (también denominadas isotipos), tales como IgGl , IgG2, IgG3 e IgG4, IgAl e IgA2. Las regiones constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se denominan a, d, e, ? y µ, respectivamente. Las regiones constantes de cadena ligera (CL) que pueden encontrarse en la totalidad de las cinco clases de anticuerpo se denominan ? (kappa) y ? (lambda).

La expresión "región constante derivada de origen humano" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a una región constante de cadena pesada de un anticuerpo humano de los isotipos IgGl, IgG2, IgG3 ó IgG4 y/o una región constante de cadena ligera kappa o lambda. Dichas regiones constantes son bien conocidas del estado de la técnica y se describen en, por ejemplo, Kabat, E.A. (ver, por ejemplo, Johnson, G. y Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28:214-218, 2000; Kabat, E.A. et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 72:2785-2788, 1975.

La expresión "citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)" se refiere a un proceso iniciado por la unión del factor del complemento Clq a la parte Fe de la mayoría de subclases de anticuerpo IgG. La unión de Clq a un anticuerpo está provocada por interacciones proteína-proteína definidas en el denominado sitio de unión. Dichos sitios de unión de la parte Fe son conocidos del estado de la técnica (ver anteriormente). Dichos sitios de unión de la parte Fe se caracterizan, por ejemplo, por los aminoácidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numeración según el índice EU de Kabat). Los anticuerpos de las subclases IgGl, IgG2 e IgG3 habitualmente muestran activación del complemento, incluyendo la unión de Clq y C3, mientras que IgG4 no activa el sistema del complemento y no se une a Clq y/o a C3.

Aunque los anticuerpos de la subclase IgG4 muestran un nivel reducido de unión de Fe (FcyRIIIa), los anticuerpos de otras subclases de IgG muestran una unión fuerte. Sin embargo, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (pérdida del carbohidrato de Fe), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 e His435 son residuos que, en caso de alterarse, también proporcionan un nivel reducido de unión de Fe (Shields, R.L. et al, J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 2001 ; Lund, J. et al, FASEB J. 9:115-119, 1995; Morgan, A. et al, Immunology 86:319-324, 1995; patente EP n° 0 307 434).

En una realización, un anticuerpo según la invención presenta un nivel reducido de unión de FcR en comparación con un anticuerpo IgGl y el anticuerpo parental de longitud completa presenta un nivel reducido de unión de FcR en comparación con un anticuerpo de la subclase IgG4 o de la subclase IgGl o IgG2 con una mutación en S228, L234, L235 y/o D265, y/o contiene la mutación PVA236. En una realización, las mutaciones en el anticuerpo parental de longitud completa son S228P, L234A, L235A, L235E y/o PVA236. En otra realización, las mutaciones en el anticuerpo parental de longitud completa son, en IgG4, S228P y L235E, y en IgGl, L234A y L235A.

La región constante de un anticuerpo se encuentra directamente implicada en la ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos) y la CDC (citotoxicidad dependiente del complemento). La activación del complemento (CDC) se inicia a partir de la unión del factor del complemento Clq a la región constante de la mayoría de subclases de anticuerpo IgG. La unión de Clq a un anticuerpo está provocada por interacciones proteína-proteína definidas en el denominado sitio de unión. Dichos sitios de unión de región constante son conocidos del estado de la técnica y se describen en, por ejemplo, Lukas, T.J. et al, J. Immunol. 127:2555-2560, 1981 ; Bunkhouse, R. y Cobra, J.J., Mol. Immunol. 16:907-917, 1979; Burton, D.R. et al, Nature 288:338-344, 1980; Thomason, J.E. et ai, Mol. Immunol. 37:995-1004, 2000; Idiocies, E.E. et al, J. Immunol. 164:4178-4184, 2000; Hearer, M. et al, J. Virol. 75:12161-12168, 2001; Morgan, A. et al, Immunology 86:319-324, 1995, y la patente EP n° 0 307 434. Dichos sitios de unión de región constante se caracterizan, por ejemplo, por los aminoácidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numeración según el índice EU de Kabat, que se describe en Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).

La expresión "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC)" se refiere a la lisis de células diana humanas por parte de un anticuerpo según la invención en presencia de células efectoras. La ADCC se mide preferentemente mediante el tratamiento de una preparación de células expresantes de antígeno con un anticuerpo según la invención en presencia de células efectoras, tales como PBMCs recién aisladas o células efectoras purificadas a partir de capas leucocitarias, por ejemplo monocitos o células asesinas naturales (NK) o una línea celular de NK de crecimiento continuo.

Inesperadamente se ha encontrado que una proteína de unión a antígeno según la invención muestra propiedades de ADCC incrementadas en comparación con su anticuerpo parental de longitud completa, especialmente en el área de las concentraciones más altas de anticuerpo. Dichos efectos de ADCC mejorada se consiguen sin modificación adicional de la parte Fe, tal como la glucomanipulación.

De esta manera, en una realización, las proteína de unión a antígeno según la invención presentan una ADCC incrementada (medida tal como se describe en el Ejemplo 4) en comparación con su anticuerpo parental de longitud completa.

En los mamíferos existen únicamente dos tipos de cadena ligera, que se denominan lambda (?) y kappa (?). Una cadena ligera presenta dos dominios sucesivos: un dominio constante CL y un dominio variable VL. La longitud aproximada de una cadena ligera es de entre 21 1 y 217 aminoácidos. Preferentemente, la cadena ligera es una cadena ligera kappa (?) y el dominio constante CL preferentemente se deriva de una cadena ligera kappa (?) (el dominio constante CK).

Las funciones efectoras mediadas por células de los anticuerpos monoclonales pueden potenciarse, por ejemplo, mediante la manipulación de su componente oligosacárido, tal como se describe en Umana, P. et al, Nature Biotechnol. 17:176-180, 1999, y la patente US n° 6.602.684. Los anticuerpos de tipo IgGl, los anticuerpos terapéuticos utilizados más habitualmente, son glucoproteínas que presentan un sitio N-ligado de glucosilación conservado en Asn297 en cada dominio CH2. Los dos oligosacáridos complejos biantenarios unidos a Asn27 se encuentran enterrados entre los dominios CH2, formando contactos extensivos con el esqueleto polipeptídico, y su presencia resulta esencial para que el anticuerpo medie en funciones efectoras, tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Lifely M. R. et al, Glycobiology 5:813-822, 1995; Jefferis R. et al, Immunol. Rev. 163:59-76, 1998; Wright A. y Morrison S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32). Umana, P. et al Nature Biotechnol. 17:176-180, 1999, y la patente WO n° 99/54342 mostraron la sobreexpresion en células de ovario de hámster chino (CHO) de la (l ,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III ("GnTIII"), una glucosiltransferasa que cataliza la formación de oligosacáridos biantenarios, incrementa significativamente la actividad ADCC in vitro de los anticuerpos. Las alteraciones en la composición del carbohidrato de Asn297 o su eliminación también afecta a la unión a FcyR y a Clq (Umana, P. et al, Nature Biotechnol. 17:176-180, 1999; Davies J. et al., Biotechnol. Bioeng. 74:288-294, 2001 ; Mimura Y. et al, J. Biol. Chem. 276:45539-45547, 2001; Radaev S. et al, J. Biol. Chem. 276:16478-16483, 2001; Shields R.L. et al, J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 2001 ; Shields R.L. et al, J. Biol. Chem. 277:26733-26740, 2002; Simmons L.C. et al, J. Immunol. Methods 263:133-147, 2002).

En un aspecto de la invención, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque los dominios CH2 de las partes Fe de a) y b) son del isotipo IgGl, y la proteína de unión a antígeno se encuentra afucosilada con una cantidad de fucosa de 80% o inferior de la cantidad total de oligosacáridos (azúcares) en Asn297.

En una realización, la proteína de unión a antígeno se encuentra afucosilada; la cantidad de fucosa en Asn297 es de 65% a 5% de la cantidad total de oligosacáridos (azúcares).

La expresión "proteína de unión a antígeno afucosilada" se refiere a una proteína de unión a antígeno de isotipo IgGl ó IgG3 (preferentemente de isotipo IgGl) que presenta un patrón alterado de glucosilación en la región Fe en Asn297, presentando un nivel reducido de residuos de fucosa. La glucosilación de la IgGl o IgG3 humana se produce en Asn297 en forma de glucosilación del complejo biantenario fucosilado terminado en hasta 2 residuos Gal. Estas estructuras se denominan residuos glicano G0, Gl (al, 6 o al, 3) o G2, dependiendo de la cantidad de residuos Gal terminales (Raju T.S., BioProcess Int. 1 :44-53, 2003). La glucosilación de tipo CHO de las partes Fe de anticuerpo se describe en, por ejemplo, Routier F.H., Glyconjugate J. 14:201-207, 1997. Los anticuerpos que se expresan recombinantemente en células huésped CHO no glucomodificadas habitualmente se encuentran fucosiladas en Asn297 en una proporción de por lo menos 85%. Debe entenderse que la expresión "proteína de unión a antígeno" tal como se utiliza en la presente memoria incluye una proteína de unión a antígeno que no presenta fucosa en su patrón de glucosilación. Es comúnmente conocido que la posición de residuo glucosilado típica en un anticuerpo es la asparagina en la posición 297 según el sistema de numeración EU ("Asn297").

De esta manera, una proteína de unión a antígeno afucosilada según la invención se refiere a una pro teína de unión a antígeno de isotipo IgGl o IgG3 (preferentemente de isotipo IgGl) en el que la cantidad de fucosa es de 80% o inferior (por ejemplo de 80% a 1%) de la cantidad total de oligosacáridos (azúcares) en Asn297 (lo que implica que por lo menos 20% o más de los oligosacáridos de la región Fe en Asn297 se encuentran afucosilados). En una realización, la cantidad de fucosa es de 65% o inferior (por ejemplo de 65% a 1%); en una realización, de 65% a 5%, en una realización de 40% a 20% de los oligosacáridos de la región Fe en Asn297. Según la invención, la expresión "cantidad de glucosa" se refiere a la cantidad de dicho oligosacárido (fucosa) dentro de la cadena oligosacárida (azúcar) en Asn297, referida a la suma de todos los oligosacáridos (azúcares) unidos a Asn297 (por ejemplo estructuras complejas, híbridas y ricas en mañosa) medida mediante espectrometría de masas MALDI-TOF y calculada como valor promedio (para el procedimiento detallado de determinación de la cantidad de fucosa, ver, por ejemplo, la patente WO n° 2008/077546). Además, en una realización, los oligosacáridos de la región Fe son biantenarios. La proteína de unión a antígeno afucosilada según la invención puede expresarse en una célula huésped glucomodificada que ha sido manipulada para expresar por lo menos un ácido nucleico codificante de un polipéptido que presenta actividad de GnTIII en una cantidad suficiente para fucosilar parcialmente los oligosacáridos en la región Fe. En una realización, el polipéptido que presenta actividad de GnTIII es un polipéptido de fusión. Alternativamente, puede reducirse o eliminarse la actividad de al, 6-fucosiltransferasa de la célula huésped según la patente US n° 6.946.292 para generar células huésped glucomodificadas. La cantidad de fucosilación de la proteína de unión a antígeno puede encontrarse predeterminada, por ejemplo, por las condiciones de la fermentación (por ejemplo el tiempo de fermentación) o por la combinación de por lo menos dos proteínas de unión a antígeno con diferente cantidad de fucosilación. Dichos métodos para generar proteínas de unión a antígeno afucosiladas se describen en las patentes WO n° 2005/044859, n° 2004/065540 y n° 2007/031875, y en Umana P. et al, Nature Biotechnol. 17:176-180, 1999, y en las patentes n° WO 99/154342, n° WO 2005/018572, n° WO 2006/116260, n° WO 2006/114700, n° WO 2005/011735, n° WO 2005/027966, n° WO 97/028267, n° US 2006/0134709, n° US 2005/0054048, n° US 2005/0152894, n° WO 2003/035835 y n° WO 2000/061739. Estas proteínas de unión a antígeno glucomanipuladas presentan una ADCC incrementada (en comparación con las proteínas de unión a antígeno parentales). Otros métodos de glucomanipulación que proporcionan anticuerpos afucosilados según la invención se describen en, por ejemplo, Niwa R. et al, J. Immunol. Methods 306:151-160, 2005; Shinkawa T. et al, J. Biol. Chem. 278:3466-3473, 2003; o en las patentes n° WO 03/055993 ó n° US 2005/0249722.

De esta manera, en un aspecto de la invención es una proteína de unión a antígeno afucosilada según la invención es del isotipo IgGl ó IgG3 (preferentemente del isotipo IgGl) con una cantidad de fucosa de 60% o inferior (por ejemplo de 60% a 1%) de la cantidad total de oligosacáridos (azúcares) en Asn297.

De esta manera, un aspecto de la invención es una proteína de unión a antígeno afucosilada según la invención que es del isotipo IgGl ó IgG3 (preferentemente del isotipo IgGl) con una cantidad de fucosa de 60% o inferior (por ejemplo de 60% a 1%) de la cantidad total de oligosacáridos (azúcares) en Asn297, destinada al tratamiento del cáncer.

Otro aspecto de la invención es la utilización de una proteína de unión a antígeno afucosilada según la invención que es de isotipo IgGl ó IgG3 (preferentemente de isotipo I Gl) con una cantidad de fucosa de 60% o inferior de la cantidad total de oligosacáridos (azúcares) en Asn297, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer.

En una realización, la cantidad de fucosa se encuentra comprendida entre 60% y 20% de la cantidad total de oligosacáridos (azúcares) en Asn297. En una realización, la cantidad de fucosa se encuentra comprendida entre 60% y 40% de la cantidad total de oligosacáridos (azúcares) en Asn297. En una realización, la cantidad de fucosa se encuentra comprendida entre 0% y 20% de la cantidad total de oligosacáridos (azúcares) en Asn297.

El "sistema de numeración EU" o "índice EU" se utiliza de manera general en referencia a un residuo en una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo el índice EU informado en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, incorporado expresamente como referencia en la presente memoria).

La expresión "las cadenas sacáridas muestran características de glicanos N-ligados unidos a Asn297 de un anticuerpo expresado recombinantemente en una célula CHO" se refiere a que la cadena sacárida en Asn297 del anticuerpo parental de longitud completa según la invención presenta la misma estructura y secuencia de residuos sacáridos, excepto por el residuo fucosa, que los del mismo anticuerpo expresado en células CHO no modificadas, por ejemplo que las células de las que se informa en el documento WO n° 2006/103100.

El término "NGNA" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere al residuo sacárido del ácido N-glucolilneuramínico.

La glucosilación de IgGl o IgG3 humana se produce en Asn297^en forma de glucosilación de oligosacárido complejo biantenario fucosilado terminado en, como máximo, dos residuos Gal. Las regiones constantes de cadena pesada humana de la subclase IgGl o IgG3 se informan en detalle en Kabat E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, y en Brueggemann M. et al, J. Exp. Med. 166:1351-1361, 1987; Love T.W. et al, Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527. Estas estructuras se denominan GO, Gl (a- 1,6- o a- 1,3-) o residuos glicanos G2, dependiendo de la cantidad de residuos Gal terminales (Raju, T.S., Bioprocess Int. 1 (2003) 44-53). La glucosilación de tipo CHO de partes Fe de anticuerpo se describe en, por ejemplo, Routier, F.H., Glyconjugate J. 14:201-207, 1997. Los anticuerpos que se expresan recombinantemente en células CHO huésped no glucomodificadas habitualmente se encuentran fucosiladas en Asn297 en una proporción de por lo menos 85%. Los oligosacáridos modificados del anticuerpo parental de longitud completa pueden ser híbridos o complejos. Preferentemente, los oligosacáridos bifurcados, reducidos/no fucosilados son híbridos. En otra realización, los oligosacáridos bifurcados reducidos/no fucosilados son complejos.

Según la invención, la expresión "cantidad de fucosa" se refiere a la cantidad de dicho azúcar en la cadena sacárida en Asn297, referida a la suma de todas las glucoestructuras unidas a Asn297 (por ejemplo estructuras complejas, híbridas y de alto contenido en mañosa) según medición realizada mediante espectrometría de masas MALDI-TOF y calculado como valor medio. La cantidad relativa de fucosa es el porcentaje de estructuras que contienen fucosa en relación a la totalidad de las glucoestructuras identificadas en una muestra tratada con N-glucosidasa F (por ejemplo estructuras complejas, híbridas y estructuras de bajo y alto contenido en mañosa, respectivamente) según el MALDI-TOF. El anticuerpo según la invención se produce por medios recombinantes. De esta manera, un aspecto de la presente invención es un ácido nucleico codificante del anticuerpo según la invención, y un aspecto adicional es una célula que comprende dicho ácido nucleico codificante de un anticuerpo según la invención. Los métodos para la producción recombinante son ampliamente conocidos del estado de la técnica y comprende la expresión de proteínas en células procarióticas y eucarióticas con el aislamiento posterior del anticuerpo y habitualmente la purificación hasta una pureza farmacéuticamente aceptable. Para la expresión de los anticuerpos tal como se ha indicado anteriormente en una célula huésped, se insertan ácidos nucleicos codificantes de las cadenas ligeras y pesadas modificadas respectivas en los vectores de expresión mediante métodos estándares. La expresión se lleva a cabo en células huésped procarióticas o eucarióticas apropiadas, tales como células CHO, células NSO, células SP2/0, células HE 293, células COS, células PER.C6, levaduras o células de E. coli, y el anticuerpo se recupera de las células (del sobrenadante o de la parte celular tras la lisis). Los métodos generales para la producción recombinante de anticuerpos son bien conocidos del estado de la técnica y se describen, por ejemplo, en los artículos de revisión de Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17:183-202, 1999; Geisse, S. et al, Protein Expr. Purif. 8:271-282, 1996; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16:151-161, 2000; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880.

Las proteínas de unión a antígeno según la invención convenientemente se separan del medio de cultivo mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, proteína A-sefarosa, cromatografía en hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. El ADN y ARN codificante de los anticuerpos monoclonales se aisla y secuencia fácilmente mediante procedimientos convencionales. Las células de hibridoma pueden servir como fuente de dicho ADN y ARN. Tras el aislamiento, el ADN puede insertarse en vectores de expresión, que seguidamente se transfectan en células huésped, tales como células HEK 293, células CHO o células de mieloma que de otra manera no producirían proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales recombinantes en las células huésped. Las variantes (o imitantes) de la secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno se preparan mediante la introducción de cambios de nucleótidos apropiados en el ADN del anticuerpo, o mediante síntesis de nucleótidos. Sin embargo, estas modificaciones únicamente pueden llevarse a cabo bajo condiciones muy limitadas, por ejemplo tal como se ha indicado anteriormente. Por ejemplo, las modificaciones que no alteran las características anteriormente indicadas del anticuerpo, tal como el isotipo y la unión de antígeno del IgG pero que podrían mejorar el rendimiento de la producción recombinante, la estabilidad de la proteína o facilitar la purificación.

La expresión "célula huésped" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a cualquier tipo de sistema celular que puede manipularse para generar los anticuerpos según la presente invención. En una realización, se utilizan células HEK293 y CHO como células huésped. Tal como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan intercambiablemente y todas dichas denominaciones incluyen la progenie. De esta manera, las expresiones "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula sujeto primaria y los cultivos derivados de la misma, con independencia del número de transferencias. También debe interpretarse que toda la progenie puede no ser exactamente idéntica en su contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o naturales. Se encuentra incluida la progenie variante que presenta la misma función o actividad biológica según el cribado realizado en la célula originalmente transformada.

La expresión en células NSO se describe en, por ejemplo, Barnes, L.M. et al, Cytotechnology 32:109-123, 2000; Barnes, L.M. et al, Biotech. Bioeng. 73:261-270, 2001. La expresión transitoria se describe en, por ejemplo, Durocher, Y. et al, Nucí. Acids Res. 30:E9, 2002. La clonación de dominios variables se describe en Orlandi, R. et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:3833-3837, 1989; Cárter, P. et ai, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:4285-4289, 1992, y en Norderhaug, L. et al, J. Immunol. Methods 204:77-87, 1997. Un sistema de expresión transitoria preferente (HEK293) se describe en Schlaeger, E.-J. y Christensen, K., Cytotechnology 30:71-83, 1999, y en Schlaeger, E.-J., J. Immunol. Methods 194:191-199, 1996.

Entre las secuencias de control que resultan adecuadas para los procariotas se incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión ribosómica. Es conocido que las células eucarióticas utilizan promotores, intensificadores y señales de poliadenilación.

Un ácido nucleico se encuentra "operablemente ligado" en el caso de que se encuentre situado en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder secretorio se encuentra operablemente ligado a ADN de un polipéptido en el caso de que se exprese en forma de una preproteína que participe en la secreción del polipéptido; un promotor o intensifícador se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión ribosómica se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que se encuentre situado de manera que facilite la traducción. Generalmente, la expresión "operablemente ligado" se refiere a que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de un líder secretorio, contiguas y en el mismo marco de lectura. Sin embargo, los intensificadores no son necesariamente contiguos. La unión se lleva a cabo mediante ligación en sitios de restricción apropiados. En el caso de que dichos sitios no existan, se utilizan adaptadores oligonucleótidos sintéticos o línker según la práctica convencional.

La purificación de las proteínas de unión a antígeno se lleva a cabo con el fin de eliminar los componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo otros ácidos nucleicos o proteínas celulares (por ejemplo los productos secundarios de la fig. IB), mediante técnicas estándares, incluyendo el tratamiento alcalino/de SDS, la formación de bandas en CsCl, la cromatografía de columna, la electroforesis en gel de agarosa, y otras técnicas bien conocidas de la técnica (ver Ausubel, F. et al, editor, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987). Una serie de diferentes métodos se encuentran bien establecidos y son ampliamente utilizados para la purificación de proteínas, tales como la cromatografía de afinidad con proteínas microbianas (por ejemplo la cromatografía de afinidad de proteína A o de proteína G), la cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo de intercambio catiónico (resinas carboximetilo), de intercambio aniónico (resinas aminoetilo) y de intercambio de modo mixto), la adsorción tiofílica (por ejemplo con beta-mercaptoetanol y con otros ligandos de SH), la cromatografía de interacción hidrofóbica o de adsorción aromática (por ejepmlo con fenil-sefarosa, resians aza-arenofílicas o ácido m-aminofenilborónico), la cromatografía de afinidad de quelato metálico (por ejemplo con material de afinidad por el Ni(II) y por el Cu(II)), la cromatografía de exclusión por tamaño, y métodos electroforéticos (tales como la electroforesis en gel y la electroforesis capilar) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75:93-102, 1998). Un ejemplo de una purificación se describe en el Ejemplo 1 y en las figuras correspondientes.

Un aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión a antígeno según la invención. Otro aspecto de la invención es la utilización de una proteína de unión a antígeno según la invención para la preparación de una composición farmacéutica. Un aspecto adicional de la invención es un método para la preparación de una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión a antígeno según la invención. En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo una composición farmacéutica, que contiene una proteína de unión a antígeno según la presente invención, formulada conjuntamente con un portador farmacéutico.

Una realización de la invención es la proteína de unión a antígeno según la invención para el tratamiento del cáncer.

Otro aspecto de la invención es dicha composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer.

Una realización de la invención es la proteína de unión a antígeno según la invención para la utilización en el tratamiento del cáncer.

Otro aspecto de la invención es la utilización de una proteína de unión a antígeno según la invención para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer.

Otro aspecto de la invención es un método para el tratamiento de un paciente que sufre de cáncer, mediante la administración de una proteína de unión a antígeno según la invención en un paciente que necesita dicho tratamiento.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "portador farmacéutico" incluye cualquiera y la totalidad de los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotónícos y de retraso de la absorción y similares que son fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el portador resulta adecuado para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo mediante inyección o infusión).

Una composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse mediante una diversidad de métodos conocidos de la técnica. Tal como apreciará el experto en la materia, la vía y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Para administrar un compuesto de la invención mediante determinadas vías de administración, puede resultar necesario recubrir el compuesto con un material, o coadministrar el compuesto con un material, para impedir su inactivación. Por ejemplo, el compuesto puede administrarse en un sujeto en un portador apropiado, por ejemplo liposomas o un diluyente. Entre los diluyentes farmacéuticamente aceptables se incluyen solución salina y soluciones tamponadoras acuosas. Entre los portadores farmacéuticos se incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. La utilización de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocida de la técnica.

Las expresiones "administración parenteral" y "administrado parenteralmente" tal como se utilizan en la presente memoria se refieren a modos de administración diferentes de la administración entérica y tópica, habitualmente mediante inyección, e incluyen, sin limitarse a las mismas, las inyecciones e infusiones intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal El término "cáncer" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a enfermedades proliferativas, tales como linfomas, leucemias linfocíticas, cáncer de pulmón, cáncer de células pulmonares no pequeñas (NSCL), cáncer pulmonar de células bronquioloalveolares, cáncer óseo, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o infraocular, cáncer uterino, cáncer oválico, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de los tubos de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cérvix, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula adrenal, sarcoma del tejido blando, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de riñon o uretra, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, neoplasma del sistema nervioso central (SNC), tumores del eje espinal, glioma del tallo cerebral, glioblastoma multiforme, asfrocitomas, schwanomas, ependinomas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma pituitario y sarcoma de Ewings, incluyendo las versiones refractarias de cualquiera de los cánceres anteriormente indicados, o de una combinación de uno o más de los cánceres anteriormente indicados.

Dichas composiciones también pueden contener adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede garantizarse tanto mediante procedimientos de esterilización, supra, como mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo parabén, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede resultar deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro sódico y similares en las composiciones. Además, puede conseguirse la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Con independencia de la vía de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden utilizarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos por el experto en la materia.

Los niveles reales de las dosis de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden modificarse de manera que se obtenga una cantidad del ingrediente activo que resulte efectiva para conseguir la respuesta terapéutica deseada en un paciente, composición y modo de administración particulares, sin resultar tóxicos para el paciente. El nivel de dosis seleccionado dependerá de una diversidad de factores farmacocinéticos, incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención utilizadas, la vía de admimstracion, el momento de la administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se utiliza, la duración del tratamiento, otros fármacos, los compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares utilizadas, la edad, sexo, peso, condición, estado de salud general e historia médica del paciente bajo tratamiento, y factores similares bien conocidos de la técnica médica.

La composición debe ser estéril y líquida en grado suficiente para que la composición resulte administrable mediante jeringa. Además de agua, el portador preferentemente es una solución salina tamponada isotónica.

Puede mantenerse la fluidez correcta, por ejemplo mediante la utilización de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento de un tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión, y mediante la utilización de surfactantes. En muchos casos, resulta preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes, tales como manitol o sorbitol, y cloruro sódico en la composición.

Tal como se utilizan en la presente memoria, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan intercambiablemente y todas dichas expresiones incluyen la progenie. De esta manera, las expresiones "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula sujeto primario y los cultivos derivados de la misma con independencia del número de transferencias. También debe interpretarse que toda la progenie puede no ser exactamente idéntica en su contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o naturales. Se encuentra incluida la progenie variante que presenta la misma función o actividad biológica según el cribado realizado en la célula originalmente transformada. En donde se pretendan utilizar denominaciones diferentes, éstas resultarán evidentes a partir del contexto.

El término "transformación" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un procedimiento de transferencia de un vector/ácido nucleico al interior de una célula huésped. En el caso de que se utilicen células sin grandes barreras de pared celular a modo de células huésped, la transfección se lleva a cabo mediante, por ejemplo, el método de precipitación con fosfato de calcio, tal como se describe en Graham, F.L. y van der Eb, A.J., Virology 52:546, 1978. Sin embargo, también pueden utilizarse otros métodos para introducir ADN en células, tales como la inyección nuclear o la fusión de protoplasto. En el caso de que se utilicen células procarióticas o células que contengan construcciones sustanciales de pared celular, un método de transfección es, por ejemplo, el tratamiento de calcio utilizando cloruro de calcio tal como se describe en Cohén, S.N. et al, PNAS 69:7110-2114, 1972.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "expresión" se refiere al procedimiento por el que se transcribe un ácido nucleico en ARNm y/o al procedimiento por el que el ARNm transcrito (también denominado "transcrito") se traduce posteriormente en péptidos, polipéptidos o proteínas. Los transcritos y los polipéptidos codificados se denominan colectivamente "producto génico". En el caso de que se derive el polinucleótido de ADN genómico, la expresión en una célula eucariótica puede incluir el procesamiento del ARNm.

Un "vector" es una molécula de ácidos nucleicos, en particular autorreplicativa, que transfiere una molécula de ácidos nucleicos insertada al interior de células huésped o entre las mismas. El término incluye vectores que funcionan principalmente insertando ADN o ARN en una célula (por ejemplo la integración cromosómica), la replicación de vectores que funcionan principalmente replicando ADN o ARN, y los vectores de expresión que funcionan transcribiendo y/o traduciendo ADN o ARN. También se encuentran incluidos los vectores que proporcionan más de una de las funciones anteriormente descritas.

Un "vector de expresión" es un polinucleótido que, al introducirlo en una célula huésped apropiada, puede transcribirse y traducirse en un polipéptido. Un "sistema de expresión" habitualmente se refiere a una célula huésped adecuada que comprende un vector de expresión que puede funcionar rindiendo un producto de expresión deseado.

Los ejemplos, listado de secuencias y figuras siguientes se proporcionan para ayudar a la comprensión de la presente invención, el alcance real de la cual se proporciona en las reivindicaciones adjuntas. Debe entenderse que resulta posible llevar a cabo modificaciones de los procedimientos indicados sin apartarse del espíritu de la invención.

Descripción de las secuencias de aminoácidos SEC ID n° 1 dímero de MoAb 5D5 c-Met ("CH3-wt") - cadena pesada modificada a) VL-CH 1 -CH2-CH3 SEC ID n° 2 dímero de MoAb 5D5 c-Met ("CH3-wt") - cadena pesada modificada b) VH-CL-CH2-CH3 SEC ID n° 3 dímero de MoAb AK18 IGF IR ("CH3-wt") - cadena pesada modificada a) VL-CH1-CH2-CH3 SEC ID n° 4 dímero de MoAb AK18 IGF IR ("CH3-wt") - cadena pesada modificada b) VH-CL-CH2-CH3 SEC ID n° 5 dímero de MoAb 205 Her3 ("CH3-wt") - cadena pesada modificada a) VL-CH 1-CH2-CH3 SEC ID n° 6 dímero de MoAb 205 Her3 ("CH3-wt") - cadena pesada modificada b) VH-CL-CH2-CH3 SEC ID n° 7 dímero de MoAb AK18 IGF1R - cadena pesada modificada a) VL-CH 1- CH2-CH3 con IgA-CH3 SEC ID ?° 8 dímero de MoAb A 18 IGF IR - cadena pesada modificada b) VH-CL- CH2-CH3 con dominio CH3 de IgA Procedimiento experimental A. Materiales v métodos: Técnicas de ADN recombinante Se utilizaron métodos estándares para manipular el ADN, tales como los descritos en Sambrook J. et al, Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Se utilizaron los reactivos biológicos moleculares según las instrucciones del fabricante.

Análisis de secuencias de ADN y de proteínas y gestión de los datos de secuencias Se proporciona información general sobre secuencias de nucleótidos de cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas humanas en: Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, publicación del NIH n° 91-3242, 1991. Los aminoácidos de las cadenas de anticuerpos se han numerado según la numeración EU (Edelman, G.M. et al, PNAS 63:78-85, 1969; Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, publicación del NIH n° 91-3242, 1991). Se utilizó el paquete informático versión 10.2 del GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) y Vector NTI Advance suite versión 8.0 de Infomax para la creación, mapado, análisis, anotación e ilustración de las secuencias.

Secuenciación de ADN Se determinaron las secuencias del ADN mediante secuenciación de doble cadena realizada en SequiServe (Vaterstetten, Alemania) y en Geneart AG (Regensburg, Alemania).

Síntesis génica Los segmentos génicos deseados fueron preparados por Geneart AG (Regensburg, Alemania) a partir de oligonucleótidos sintéticos y productos de PCR mediante síntesis génica automática. Los segmentos génico flanqueados por sitios únicos de corte por endonucleasa de restricción se clonaron en plásmidos pGAl 8 (ampR). El plásmido de ADN se purificó a partir de bacterias transformadas y la concentración se determinó mediante espectroscopia de UV. La secuencia del ADN de los fragmentos génicos subclonados se confirmó mediante secuenciación de ADN. Se prepararon las secuencias de ADN para las dos cadenas de anticuerpo (VH-CL-CH2-CH3 y VL-CH 1 -CH2-CH3) en forma de fragmentos completos mediante síntesis génica con sitios de restricción flanqueantes 5'HpaI y 3'NaeI. Se prepararon mediante síntesis génica los segmentos génicos codificantes de mutaciones puntuales en el dominio CH3 que conducían preferentemente al producto dímero de MoAb, así como a la sustitución de los segmentos génicos codificantes de la parte IgGl con un dominio CH3 de IgA (por ejemplo SEC ID n° 7). Estos segmentos se encontraban flanqueados por sitios de restricción únicos que permitían la sustitución de las secuencias de IgGl de tipo salvaje correspondientes. Todos los constructos se diseñaron con una secuencia 5 '-terminal de ADN codificante de un péptido líder que presentaba como diana proteínas para la secreción en células eucarióticas.

Construcción de los plásmidos de expresión Se utilizó un vector de expresión de Roche para la construcción de todas las cadenas de anticuerpo. El vector estaba compuesto de los elementos siguientes: - un origen de replicación, oriP, procedente del virus Epstein-Barr (EBV), - un origen de replicación procedente del vector pUCl 8 que permite la replicación de este plásmido en E. coli - un gen beta-lactamasa que proporciona resistencia a la ampicilina en E. coli, el intensifícador y promotor tempranos inmediatos procedentes del citomegalovirus humano (HCMV), - la secuencia de señal de poliadenilación ("poli A") de la inmunoglobulina 1 humana, y sitios de restricción únicos Hpal, Bell y Nael.

Se prepararon los genes de inmunoglobulina con el orden de VH-CL-CH2-CH3 y VL-CH1-CH2-CH3, así como constructos modificados en la región 3' codificante del extremo C-terminal de la cadena de anticuerpo (CH3) mediante síntesis génica y se clonaron en los plásmidos pGA18 (ampR) tal como se encuentra descrito. Los plásmidos pG18 (ampR) que portaba los segmentos de ADN sintetizados y el vector de expresión de Roche se digirieron con los enzimas de restricción Hpal y Nael (Roche Molecular Biochemicals) y se sometieron a electroforesis en gel de agarosa. A continuación, se ligaron los segmentos de ADN purificados con el fragmento Hpal/Nael o Bcll/Nael del vector de expresión de Roche aislado, resultando en los vectores de expresión finales. Los vectores de expresión finales se transformaron en células de E.coli, se aisló el plásmido ADN de expresión (Miniprep) y se sometió a análisis de enzimas de restricción y de secuenciación del ADN. Los clones correctos se cultivaron en 150 mi de medio LB-Amp, se aisló nuevamente el plásmido de ADN (Maxiprep) y se confirmó la integridad de la secuencia mediante secuenciación del ADN.

Expresión transitoria de variantes de inmunoglobulina en células HEK293 Se expresaron variantes recombinantes de inmunoglobulina mediante transfección transitoria de células 293-F renales embrionarias humanas utilizando el sistema de expresión FreeStyle™ 293 Expression System siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogen, USA). Brevemente, se cultivaron células 293-F FreeStyle™ en suspensión en medio de expresión FreeStyle™ 293 a 37°C/8% de C02. Las células se sembraron en medio fresco a una densidad de 1-2 106 células viables/ml el día de la transfección. Se prepararon complejos de ADN-293fectin™ en medio Opti-MEM® I (Invitrogen, US) utilizando 325 µ? de 293fectin™ (Invitrogen, Alemania) y 250 µg de cada plásmido de ADN en una proporción molar 1 :1 para un volumen final de transfección de 250 mi. Se recolectaron sobrenadantes de cultivo celular que contenían anticuerpos 7 días después de la transfección mediante centrifugación a 14.000xg durante 30 minutos, y se filtraron a través de un filtro estéril (0,22 µp?). Los sobrenadantes se almacenaron a -20°C hasta la purificación.

Alternativamente, se generaron anticuerpos mediante transfección transitoria en células HEK293-EBNA. Los anticuerpos se expresaron mediante cotransfección transitoria de los plásmidos de expresión respectivos en células HEK293-EBNA en crecimiento adherente (línea celular renal embrionaria humana 293 que expresaba antígeno nuclear de virus de Epstein-Barr; número de depósito en la American Type Culture Collection ATCC n° CRL-10852, lote n° 959 218) cultivadas en DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco, Gibco) suplementado con FCS al 10% ultrabajo en IgG (suero de feto bovino, Gibco), L-glutamina 2 mM (Gibco) y geneticina 250 pg/ml (Gibco). Para la transfección, se utilizó reactivo de transfección FuGENE™ 6 (Roche Molecular Biochemicals) en una proporción de reactivo FuGENE (µ?) a ADN ^g) de 4:1 (comprendida entre 3:1 y 6:1). Las proteínas se expresaron a partir de los plásmidos respectivos utilizando una proporción equimolar de plásmidos. Las células se alimentaron el día 3 con L-glutamina 4 mM, glucosa [Sigma] y NAA [Gibco]. Los sobrenadantes de cultivo celular que contenían variantes de inmunoglobulina se recolectaron entre los días 5 y 11 después de la transfección mediante centrifugación y se almacenaron a -80°C. Se proporciona información general sobre la expresión recombinante de inmunoglobulinas humanas en, por ejemplo, células HEK293, en: Meissner P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75:197-203, 2001. Purificación de anticuerpos Se purificaron anticuerpos biespecíficos a partir de sobrenadantes de cultivo celular mediante cromatografía de afinidad utilizando proteína A-Sepharose™ (GE Healthcare, Suecia) y cromatografía de exclusión por tamaño Superdex200. Brevemente, se pasaron sobrenadantes de cultivo celular filtrados a esterilidad por una columna HiTrap HP de proteína A (5 mi) equilibrada con tampón PBS (Na2HP04 10 mM, KH2P04 1 mM, NaCl 137 mM y KC1 2,7 mM, pH 7,4). Las proteínas no unidas se lavaron con tampón de equilibración. Los anticuerpos y variantes de anticuerpo se eluyeron con tampón citrato 0,1 M, pH 2,8, y las fracciones que contenían proteínas se neutralizaron con 0,1 mi de Tris 1 M, pH 8,5. A continuación, las fracciones de proteínas eluidas se agruparon, se concentraron con un dispositivo de filtración centrífuga de Amicon Ultra (valor de corte de PM: 30 K, Millipore) hasta un volumen de 3 mi y se cargaron en una columna de filtración en gel 16/60 ó 26/60 Superdex200 HiLoad de 120 mi (GE Healthcare, Suecia) equilibrada con histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0. Las fracciones que contenían anticuerpos purifícados con menos de 5% de agregados de elevado peso molecular se agruparon y se almacenaron en forma de alícuotas de 1,0 mg/ml a -80°C.

Análisis de las proteínas purificadas La concentración de proteínas de las muestras de proteínas purificadas se determinó mediante la medición de la densidad óptica (DO) a 280 nm, utilizando el coeficiente de extinción molar calculado basándose en la secuencia de aminoácidos. Se analizó mediante SDS-PAGE la pureza y el peso molecular de los anticuerpos en presencia y en ausencia de un agente reductor (1,4-ditiotreitol 5 mM) y tinción con azul brillante de Coomassie. Se utilizó el sistema de gel premoldeado NuPAGE® (Invitrogen, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante (geles de Tris-glicina al 4-12%). Se analizó el contenido de agregados de muestras de anticuerpos mediante SEC de alto rendimiento utilizando una columna analítica de exclusión por tamaños Superdex 200 (GE Healthcare, Suecia) en tampón de migración de KH2P04 200 mM, KC1 250 mM, pH 7,0 a 25°C. Se inyectaron 25 µg de proteínas en la columna a un caudal de 0,5 ml/minuto y se eluyeron isocráticamente durante 50 minutos. Para el análisis de la estabilidad, se incubaron concentaciones de 1 mg/ml de proteínas purificadas a 4°C y 40°C durante 7 días y después se evaluaron mediante SEC de alto rendimiento (por ejemplo análisis SEC HP (proteína purificada)). La integridad del esqueleto de aminoácidos de cadenas de variante de inmunoglobulina reducida se verificó mediante espectrometría de masas Q-TOF por nanoelectropulverización tras la eliminación de los N-glucanos mediante tratamiento enzimático con péptido-N-glucosidasa F (Roche Molecular Biochemicals).

Espectrometría de masas Se determió la masa desglucosilada total de los anticuerpos y se confirmó mediante espectrometría de masas de ionización por electropulverización (ESI-MS). Brevemente, se desglucosilaron 100 µg de anticuerpos purificados con 50 mU de N-glucosidasa F (PNGasaF, ProZyme) en KH2P04/K2HP04 100 mM, pH 7, a 37°C durante 12 a 24 horas a una concentración de proteínas de hasta 2 mg/ml y posteriormente se desalaron mediante HPLC en una columna Sephadex G25 (GE Healthcare). Las masas de las cadenas respectivas de anticuerpo se determinaron mediante ESI-MS tras la desglucosilación y reducción. Brevemente, se incubaron 50 µg de anticuerpo en 115 µ? con 60 µ? de TCEP 1 M y 50 µ? de hidrocloruro de guanidina 8 M posteriormente desalado. Se determinó la masa total y la masa de las cadenas de anticuerpo reducidas mediante ESI-MS en un sistema de MS Q-Star Elite dotado de una fuente NanoMate. El intervalo de masas registrado depende del peso molecular de las muestras. En general, para los anticuerpos reducidos, el intervalo de masas se fijó entre 600 y 2.000 m/z, y para los anticuerpos no reducidos, entre 1.000 y 3.600 m/z.

SEC-MALLS Se utilizó la SEC-MALLS (cromatografía de exclusión por tamaño con detector multiángulo de dispersión de luz láser) para determinar el peso molecular aproximado de las proteínas en solución. Según la teoría de la dispersión lumínica, la MALLS permite la estimación del peso molecular de las macromoléculas con independencia de su forma molecular u otros supuestos. La SEC-MALLS se basa en una separación de las proteínas según su tamaño (radio hidrodinámico) mediante cromatografía SEC, seguido de la utilización de detectores sensibles a la concentración y a la luz dispersada. La SEC-MALLS típicamente proporciona estimaciones del peso molecular con una precisión que permite una discriminación clara entre monómeros, dímeros, trímeros, etc., con la condición de que la separación en la SEC sea suficiente.

En el presente trabajo se utilizó la instrumentación siguiente: HPLC Dionex Ultímate 3000; columna: Superosa 6 10/300 (GE Healthcare); eluyente: 1 x PBS; caudal: 0,25 ml/min; detectores: OptiLab REX (Wyatt Inc., Dernbach), MiniDawn Treos (Wyatt Inc., Dernbach). Los pesos moleculares se calcularon con el software Astra, versión 5.3.2.13. Se cargaron cantidades de proteína de entre 50 y 150 µg en la columna y se utilizó BSA (Sigma Aldrich) a modo de proteína de referencia.

Curso temporal de dispersión de luz dinámica (DLS) Se filtraron muestras (30 µ?) a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml en His/HisCl 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0, mediante una placa de filtros de 384 pocilios (tamaño de poro: 0,45 µ??) en una placa óptica de 384 pocilios (Corning) y se cubrieron con 20 µ? de aceite de parafina (Sigma). Se recogieron repetidamente los datos de dispersión lumínica dinámica durante un periodo de 5 días con un lector de placas DynaPro DLS (Wyatt) a una temperatura constante de 40°C. Los datos se procesaron con Dynamics V6.10 (Wyatt).

Resonancia de plasmón superficial Las propiedades de unión de las proteínas de unión a antígeno y anticuerpos anti-IGF-l se analizaron mediante tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR) utilizando un instrumento Biacore (Biacore, GE-Healthcare, Uppsala). Este sistema se encuentra bien establecido para el estudio de las interacciones moleculares. Permite un seguimiento continuo en tiempo real de la unión de ligando/analito y, de esta manera, permite determinar las constantes de tasa de asociación (ka), las constantes de tasa de disociación (k<j) y las constantes de equilibrio (Kp) bajo diversas condiciones de ensayo. La tecnología de SPR se basa en la medición del índice refractivo en proximidad a la superficie de un chip biosensor recubierto de oro. Los cambios del índice refractivo indican los cambios de masa sobre la superficie causados por la interacción del ligando inmovilizado con el analito inyectado en solución. En el caso de que se unan moléculas al ligando inmovilizado sobre la superficie, se incrementa la masa; en el caso de disociación, la masa se reduce. Para capturar anti-IgG humana se inmovilizó el anticuerpo sobre la superficie de un chip biosensor CM5 utilizando la reacción de acoplamiento de amina. Se activaron las células de flujo con una mezcla 1 :1 de N-hidroxisuccinimida 0,1 M y 3-(N,N-dimetilamino)propil-N-etilcarbodiimida 0, 1 M a un caudal de 5 µ?/min. Se inyectó anticuerpo anti-IgG humana en acetato sódico, pH 5,0 a una concentración de 10 g/ml. Se trató una célula de flujo de control de referencia de la misma manera, aunque con únicamente tampones de vehículo en lugar del anticuerpo de captura. Las superficies se bloquearon con una inyección de etanolamina 1 M/HC1, pH 8,5. Los anticuerpos de IGF-1R se diluyeron en HBS-P y se inyectaron. Todas las interacciones se llevaron a cabo a 25°C (temperatura estándar). Se inyectó la solución de regeneración de cloruro de magnesio 3 M durante 60 segundos a un caudal de 5 µ?/min para eliminar cualquier proteína unida no covalentemente tras cada ciclo de unión. Se detectaron las señales a una tasa de una señal por segundo. Las muestras se inyectaron a concentraciones crecientes. La fig. 17 ilustra el formato de ensayo aplicado. Se seleccionó una densidad de carga con anticuerpo de captura y anticuerpo de IGF- IR baja para forzar la unión.

Para las mediciones de afinidad, se inmovilizó FcglIIa humana en un chip sensor CM-5 mediante la captura del receptor etiquetado con His con un anticuerpo anti-His (Penta-His, Qiagen) que se encontraba acoplado a la superficie mediante reacciones estándares de acoplamiento y bloqueo de amina en un instrumento de SPR (Biacore T100). Tras la captura de FcgRIIIa, se inyectaron 50 nM de anticuerpos de IGF- IR a 25°C a un caudal de 5 µ?/minuto. A continuación, se regeneró el chip con un pulso de 60 segundos de una solución de HC1 de glicina 10 mM, pH 2,0.

Ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) Determinación de las funciones efectoras mediadas por anticuerpos de anticuerpos anti-IGF-1R Con el fin de determinar la capacidad de los anticuerpos generados para inducir mecanismos efectores inmunológicos, se llevaron a cabo estudios de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Con el fin de estudiar los efectos de los anticuerpos en la ADCC, se marcaron células expresantes de IGF- IR DU145 (l l O6 células/ml) con 1 µ? por mi de solución BATDA (Perkin Elmer) durante 25 minutos a 37°C en un incubador celular. A continuación, las células se lavaron cuatro veces con 10 mi de RPMI-FM/PenStrep y se peletizaron durante 10 minutos a 200xg. Antes de la última etapa de centrifugación, se determinó el número de células y seguidamente éstas se diluyeron a lxlO5 células/ml en medio RP I-FM/PenStrep del pellet. Se sembraron placas con 5.000 células en cada pocilio, en una placa de fondo redondo en un volumen de 50 µ?. Se añadieron anticuerpos HuMAb a una concentración final comprendida entre 25 y 0,1 µg/ml en un volumen de 50 µ? de medio de cultivo celular a 50 µ? de suspensión celular. A continuación, se añadieron 50 µ? de células efectoras, PBMCs recién aisladas, a una proporción E:T de 25:1. Las placas se centrifugaron durante 1 minuto a 200xg, seguido de una etapa de incubación de 2 horas a 37°C. Tras la incubación, las células se peletizaron durante 10 minutos a 200xg y se recolectaron 20 µg de sobrenadante y se transfirieron a una placa Optiplate 96-F. Se añadieron 200 µ? de solución de europio (Perkin Elmer, a temperatura ambiente) y las placas se incubaron durante 15 minutos en un oscilador. Se cuantificó la fluorescencia en un fluorómetro con resolución temporal (Víctor 3, Perkin Elmer) utilizando el protocolo Eu-TDA de Perkin Elmer. La magnitud de la lisis celular mediante ADCC se expresa como % de la liberación máxima de potenciador de fluorescencia de TDA de las células diana Usadas con detergente, corregida para la liberación espontánea de TDA de las células diana respectivas.

Ensayo de internalización de IGF-1R La unión de anticuerpos y proteínas de unión a antígeno según la invención a IGF- IR resulta en la internalización y degradación del receptor. Este proceso puede seguirse mediante incubación de células HT29 CRC que expresan IGF- IR con anticuerpos que presentan como diana IGF- IR, seguido de la cuantificación de los niveles remanentes de proteína IGF- 1 R en Usados celulares mediante ELISA.

Con este fin, se incubaron células HT29 a razón de l,5xl04 células/pocilio en una MTP de 96 pocilios en RPMI con FCS al 10% durante la noche a 37°C con 5% de C02 con el fin de permitir la unión de las células. A la mañana siguiente, se aspiró el medio y se añadieron 100 µ? de anticuerpo anti-IGF-lR diluido en RPMI + FCS al 10% a concentraciones de entre 10 nM y 2 pM en etapa de dilución de 1 :3. Las células se incubaron con anticuerpo durante 18 horas a 37°C. A continuación, se eliminó nuevamente el medio y se añadieron 120 µ? de tampón de lisis MES (MES 25 mM, pH 6,5 + Complete).

Para el ELISA, se cargaron placas de poliestireno de 96 pocilios recubiertas con estreptavidina (Nunc) con 100 µ? de MAK<IGF-lRa-hu>IgG-la-hu-Bi (Ch.10) diluidos 1 :200 en BSA/PBST al 3% (concentración final: 2,4 µg/ml) y se incubaron bajo agitación constante durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, se extrajo el contenido de los pocilios y se lavó cada pocilio tres veces con 200 µ? de PBST. Se añadieron 100 µ? de la solución de Usado celular en cada pocilio, se incubaron nuevamente durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador de placas y se lavaron tres veces con 200 µ? de PBST. Tras extraer el sobrenadante, se añadieron 100 µ?/pocillo de PAK<IGF-lRa humana>Ra-C20-IgG (Santa Cruza n° sc-713) diluidos 1 :750 en BSA/PBST al 3%, seguido de los mismos intervalos de incubación y lavado indicados anteriormente. Con el fin de detectar el anticuerpo específico unido a IGF- IR, se añadieron 100 µ? pocillo de un anticuerpo policlonal de conejo acoplado a peroxidasa de rábano picante (Cell Signaling n° 7074) diluido 1 :4.000 en BSA/PBST al 3%. Tras una hora más, nuevamente se eliminó el anticuerpo no unido mediante lavado intenso 6 veces tal como se ha indicado anteriormente. Para la cuantificación del anticuerpo unido, se añadieron 100 µ?/pocillo de 3,3'-5,5'-tetrametilbencidina (Roche, BM-Blue ID n° 11484281) y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción colorigénica se detuvo finalmente mediante la adición de 25 µ?/pocillo de H2S04 1 M y la absorción lumínica se midió a una longitud de onda de 450 nm. Las células no tratadas con anticuerpo se utilizaron a modo de control para 0% de regulación negativa; el tampón de lisis actuó de control del fondo.

Ensayo de autofosforilación de IGF-1R (estimulación de IGF-1R) La dianización de IGF- IR por anticuerpos IGF-1R resulta en la inhibición de la autofosforilación inducida por IGF-1. Los presentes inventores investigaron la inhibición de la auto fosforilación del dímero de MoAb de IGF- IR de tipo salvaje en comparación con el anticuerpo IgGl de IGF-1R parental. Con este fin, se trataron células 3T3-IGF-1R, una línea celular de fibroblastos murinos que sobreexpresa IGF- IR humana, durante 10 minutos con IGF-1 humana recombinante 10 nM en presencia de diferentes concentraciones de anticuerpo de IGF- IR o proteína de unión a antígeno de IGF- IR. Tras la lisis de las células, se determinaron los niveles de proteína IGF- IR fosforilada mediante una ELISA específica de fosfo-IGF-lR, combinando un anticuerpo de captura específica de IGF- IR humana y un anticuerpo de detección específico fosfo-tirosina.

Determinación de las propiedades PK: cinética de dosis individuales en ratones Métodos Animales: Ratones NMRI, hembra, alimentados, de entre 23 y 32 gramos de peso corporal en el momento de la administración de compuesto.

Protocolo del estudio: Para una sola dosis i.v. de 10 mg/kg, los ratones se asignaron a 3 grupos con 2-3 animales cada uno. Se extrajeron muestras de sangre del grupo 1 a las 0,5, 168 y 672 horas; del grupo 2, a las 24 y 336 hora, y del grupo 3, a las 48 y 504 horas después de la dosificación. Se obtuvieron muestras de 100 µ? de sangre mediante punción retrobulbar. Las muestras de suero de por lo menos 40 µ? de obtuvieron de la sangre tras 1 hora a temperatura ambiente mediante centrifugación (9.300xg) a temperatura ambiente durante 2,5 minutos. Las muestras de suero se congelaron directamente tras la centrifugación y se almacenaron congeladas a -20°C hasta el análisis.

Analítica: Las concentraciones de los anticuerpos humanos en suero de ratón se determinaron con un ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA) utilizando suero de ratón al 1 %. En la primera etapa, se unió anticuerpo monoclonal biotinilado contra Fcy humana (mAb<hFcypAN>IgG-Bi) a placas de microtitulación recubiertas de estreptavidina. En la siguiente etapa, se añadieron muestras de suero (en varias diluciones) y estándares de referencia, respectivamente, y se unieron a mAb<hFcypAN>IgG-Bi inmovilizado. A continuación, se añadió anticuerpo monoclonal digoxigenilado contra Fcy humano (mAb<hFcypAN>IgG-Dig). Los anticuerpos humanos se detectaron mediante conjugado de anti-Dig-peroxidasa de rábano picante. Se utilizó solución de ABTS como el sustrato para la peroxidasa de rábano picante. La especificidad del anticuerpo de captura y detección utilizado, que no reacciona cruzadamente con la IgG de ratón, permite la determinación cuantitativa de los anticuerpos humanos en muestras de suero de ratón.

Cálculos: Se calcularon los parámetros farmacocinéticos mediante análisis no compartimental, utilizando el programa de evaluación farmacocinética WinNonlin , versión 5.2.1.

Tabla 1: Parámetros farmacocinéticos calculados: Se utilizaron los parámetros farmacocinéticos siguientes para evaluar los anticuerpos humanos: • concentración inicial estimada para modelos de bolo IV (CO). • concentración observada máxima (Cmax), en (Tmax). • tiempo de concentración observada máxima (Tmax). • área bajo la curva de concentración/tiempo AUC(O-inf) se calculó aplicando la regla trapezoidal lineal (con interpolación lineal) entre el tiempo 0 y el infinito.

• Se derivó la vida media terminal aparente (T1/2) a partir de la ecuación: T1 2 = ln2 / ??.

· Se calculó la eliminación corporal total (CL) como dosis/ AUC(O-inf).

• Volumen de distribución en el equilibrio (Vss), calculado como MRT(O-inf) x CL (MRT(O-inf), definido como AUMC(0-inf)/AUC/(0-inf).

P, Ejemplos; Ejemplo 1; Generación de proteínas de unión a antígeno dímeros de MoAb Los presentes inventores diseñaron proteínas de unión a antígeno según la invención contra c-Met (SEC ID n° 1 y n° 2), IGF- IR (SEC ID n° 3 y n° 4) y HER3 (SEC ID n° 5 y n° 6) basadas en el principio de diseño mostrado en la fig. 1A. Los constructos respectivos se expresaron transitoriamente en células HEK293 tal como se ha indicado anteriormente, y posteriormente se purificaron mediante cromatografía de afinidad a proteína A seguido de la exclusión por tamaño. Las figs. 2 a 4 ilustran los cromatogramas de la cromatografía de exclusión por tamaño de las tres diferentes producciones de proteínas de unión a antígeno, así como la SDS-PAGE correspondiente bajo condiciones no reductoras y reductoras. Además del pico en la fig. 2, el pico 2 en la fig. 3, el pico 3 en la fig. 4, se observaron proteínas que eluyeron en puntos temporales anteriores de la columna: pico 2 en la fig. 2, pico 1 en la fig. 3 y pico 4 en la fig. 7. Basándose en el tiempo de retención se calculó que mostraban el doble de peso molecular que el anticuerpo monovalente (fig. IB, MoAb), correspondiente a la proteína de unión a antígeno según la figura 1 A (dímero de MoAb). El tamaño de los dos picos, 1 y 2, para los anticuerpos de IGF- IR se confirmó mediante SEC-MALLS (fig. 3C) y demostró que en efecto la proteína correspondiente al pico 1 mostraba un peso molecular aproximadamente el doble del del anticuerpo monovalente (pico 2). La existencia de un dímero de MoAb y la identidad de las proteínas aisladas se confirmó posteriormente mediante espectrometría de masas. Basándose en dichos resultados, los presentes inventores derivaron un modelo para la estructura del dímero de MoAb, que se ilustra en la fig. 1 A.

Los presentes inventores llevaron a cabo experimentos, tal como espectrometría de masas, y reducción y digestión con proteasa, con el fin de confirmar la estructura putativa mostrada en la fig. 1 A.

La estabilidad del dímero de MoAb IGF-1R AK18 ("CH3-wt") se estudió mediante dispersión lumínica dinámica tal como se ha indicado anteriormente. Brevemente, se evaluó la tendencia a la agregación del dímero de MoAb IGF1R AK18 ("CH3-wt") mediante un experimento de curso temporal de DLS a 40°C.

Ejem l 3? Afinidad de unión a IGF-1R Se comparó la unión al dominio extracelular de IGF- IR del dímero de MoAb IGF- IR AK18 ("CH3-wt") con la unión del anticuerpo IgGl <IGF-1R> parental mediante resonancia de plasmón superficial (SPR). La fig.5 ilustra el esquema del ensayo SPR para determinar la afinidad. El análisis (doble determinación) demostró que la afinidad de unión de IGF-1R se conservaba en el dímero de MoAb IGF-1R AK18 ("CH3-wt"). k(on) k(off) KD Mab (IGF- IR) 1.74E+06 6,63E-03 3.80E-09 Dímero de MoAb (IGF-lR)(l,deter,) l,5E+06 3,0E-03 2,01E-09 Dímero de MoAb (IGF-lR)(2,deter,) l,5E+06 3.0E-03 2,05E-09 Ejemplo 3: Unión celular a líneas celulares que expresan IGF-1R Se demostró la unión celular de dímero de MoAb IGF- IR sobre células A549. Se desengancharon las células A549 en la fase de crecimiento logarítmico con acutasa (Sigma) y se utilizaron 2x105 células para cada incubación individual de anticuerpo. Se añadieron anticuerpo de IGF- IR y dímero de MoAb en una serie de dilución de tres veces (100 a 0,0003 µg/ml). Los anticuerpos unidos se visualizaron con un anticuerpo secundario acoplado a Alexa488 (5 µg/ml) unido a la región constante de inmunoglobulina humana. Las células muertas se tifieron con 7-AAD (BD) y se excluyeron del análisis. Se midió la intensidad de fluorescencia de células individuales en un citómetro de flujo FACS Canto (BD Biosciences). Los datos demuestran que el dímero de MoAb mostraba una unión semimáxima a las células muy similar a la del anticuerpo IgGl de IGF- IR parental. Lo anterior implica que el dímero de MoAb puede unirse con dos brazos a IGF- IR sobre las células y que muestra un efecto de avidez. Sin embargo, la mfi (intensidad de fluorescencia media) total era más alta para el dímero de MoAb que para el mAb de IGF- IR. Ello se debe probablemente al mayor número de partes Fe por molécula de IGF- IR situadas sobre la superficie celular. Se muestran los resultados en la figura 6 y posteriormente. union semimáxima IGF-1R (150kDa): 0,76 nM dímero de MoAb de IGF-1R (200 kDa): 1,13 nM Ejemplo 4: Inducción de ADCC Pueden utilizarse células mononucleares sanguíneas (PBMCs) derivadas de donantes para medir el reclutamiento de células efectoras por parte de anticuerpos no glucomanipulados y glucomanipulados contra células de cáncer. La lisis de las células de cáncer se correlaciona con la citotoxicidad mediada por células NK y es proporcional a la capacidad de los anticuerpos de reclutar células NK. En este contexto particular, se incubaron células de cáncer de próstata DU145 en una proporción 1 :25 (DU145:PBMC) con PBMC en ausencia o en presencia de los anticuerpos respectivos. Tras 2 horas, se determinó la lisis celular utilizando el sistema BATD A/europio tal como se ha indicado anteriormente. La magnitud de la lisis celular mediante ADCC se expresa como % de la liberación máxima de potenciador de fluorescencia de TDA de las células diana Usadas con detergente, corregida para la liberación espontánea de TDA de las células diana respectivas. Los datos demuestran que el dímero de MoAb de IGF- IR bivalente no glucomanipulado es superior en la inducción de la ADCC comparado con el anticuierpo de IGF- IR no glucomanipulado. Inesperadamente, el dímero de MoAb de IGF- IR no glucomanipulado era incluso superior en la inducción de ADCC a concentraciones elevadas que el anticuerpo de IGF- IR glucomanipulado, que mostraba una caída en el ensayo de ADCC a concentraciones altas. La superior inducción de ADCC por el dímero de MoAb en ausencia de glucomanipulación puede explicarse por la mayor afinidad del constructo para FcgRIIIa en células NK debido a la bivalencia para FcgRIIIa (efecto de avidez).

Los resultados de la mAb de IGF1R no glucomanipulado (1), mAb de IGF1R afucosilado glucomanipulado (2) y dimero de MoAb de IGF1R AK18 ("CH3-wt") (3) se presentan en la figura 7, mostrando que el dimero de MoAb de IGF1R AK18 ("CH3-wt") mejora la ADCC en comparación con el mAb IGF IR no glucomanipulado y que, a concentraciones más alta, era incluso comparable al mAb de IGF IR afucosilado glucomanipulado (2).

Ejemplo 5: Ensayo de intemalización de IGF- IR La dianización de IGF-1R sobre células tumorales por parte de los anticuerpos bivalentes de IGF-1R resulta en la intemalización y degradación lisosómica de IGF-1R. Los presentes inventores investigaron las propiedades de intemalización del dimero de MoAb de IGF- IR en comparación con el anticuerpo parental de IGF- IR. Con este fin, se trataron células de cáncer de colon HT29 durante 18 horas con diferentes concentraciones de dimero de MoAb y anticuerpo de IGF- IR parental. Tras la lisis de las células, se determinaron los niveles remanentes de proteína IGF- IR mediante ELISA específica de IGF- IR.

Los datos en la fig. 8 demuestran que la intemalización de IGF- IR por parte del dimero de MoAb era virtualmente idéntica con el anticuerpo parental bivalente de IGF- IR. La intemalización máxima era de 82,99% (IgGl) frente a 83,7% (dimero de MoAb); la concentración requerida para una inhibición semimáxima era de 0,027 nM (IgGl) frente a 0,027 nM (dimero de MoAb).

Ejemplo 6: Ensayo de autofosforilación de IGF- IR (estimulación de IGF-1) La dianización de IGF- IR por anticuerpos IGF- IR resulta en la inhibición de la autofosforilación inducida por IGF-1. Los presentes inventores investigaron la inhibición de la autofosforilación del dimero de MoAb de IGF- IR en comparación con el anticuerpo IgGl de IGF-1R parental. Con este fin, se trataron células 3T3-IGF-1R, una línea celular de fibroblastos murinos que sobreexpresa IGF- IR humana, durante 10 minutos con IGF-1 humana recombinante 10 nM en presencia de diferentes concentraciones de anticuerpo de IGF- IR o proteína de unión a antígeno de IGF- IR. Tras la lisis de las células, se determinaron los niveles de proteína IGF- IR fosforilada mediante una ELISA específica de fosfo-IGF-lR, combinando un anticuerpo de captura específica de IGF- IR humana y un anticuerpo de detección específico fosfo-tirosina.

Los datos en la fig. 9 demuestran que el dimero de MoAb de IGF- IR puede inhibir la autofosforilación inducida por IGF-1 de manera similar o incluso ligeramente mejor que la molécula parental de IgGl de IGF- IR. La concentración necesaria para una inhibición semimáxima era de 1,44 nM (IgGl de IGF- IR parental) frente a 3,52 nM (dimero de MoAb); la inhibición máxima observada era de 80,3% (IgGl de IGF-1R parental) frente a 89,1% (dimero de MoAb).

Ejemplo 7: Determinación de las propiedades PK Se determinaron las propiedades farmacocinéticas de las proteínas de unión a antígeno según la invención en ratones NMRI, hembra, alimentadas, de entre 23 y 32 gramos de peso corporal en el momento de la administración de compuesto en un estudio PK de una dosis, tal como se ha indicado anteriormente (en la sección de métodos).

Se proporcionan las propiedades PK en la tabla a continuación, e indican que la proteína de unión a antígeno dímero de MoAb de IGF- IR AK18 ("CH3-wt") presentaba propiedades PK altamente valiosas en comparación con el anticuerpo IgGl <IGF-1R> parental (tales como, por ejemplo, AUCO-inf, Cmax o CO); Tabla 2: propiedades PK Ejemplo 8: Experimento de ESI-MS de dímero de MoAb de IGF-1R El dímero de MoAb de IGF-1R (MoAb de IGF IR AK18 ("CH3-wt")) (SEC ID n° 3 y n° 4) se expresó transitoriamente y se purificó mediante cromatografía de afinidad a proteína A y de exclusión por tamaño. Tras la SEC preparativa (ver la figura 3 A), el anticuerpo eluyó en dos picos separados, que se recogieron. La SEC analítica del primer pico (fracción 1) mostró un peso molecular aparente de aproximadamente 200 kDa, mientras que el segundo pico (fracción 2) correspondía a un peso molecular de 100 kDa. Los diferentes pesos moleculares pudieron asignarse a un monómero definido como producto secundario (fracción 2) y el dímero deseado (fracción 1), respectivamente. SEC-MALLS confirmó el resultado inicial de la SEC y demuestra para la fracción 2 (monómero) un PM de 99,5 kDa y para la fracción 1 (dímero), un PM de 193,8 kDa.

El análisis de SDS-PAGE (ver la figura 3B) de las dos fracciones bajo condiciones desnaturalizantes y reductoras muestra una banda principal con un peso molecular aparente de 50 a 60 kDa. Bajo condiciones no reductoras, la fracción 2 muestra una banda principal en torno a un PM de 100 kDa, y la tracción 1 muestra una banda muy ancha comprendida entre aproximadamente 100 y 200 kDa.

Fracción 1 = 165 mi Fracción 2 = 190 mi Estos datos iniciales muestran la formación de dímero.

Los espectros de ESI-MS (muestras incubadas con 60 µ? de TCEP 1 M y 50 µ? de hidrocloruro de guanidina 8 M) del dímero de MoAb desglucosilado de la fracción 1 y el monómero de MoAb de la fracción 2 muestran diferencias. La fracción 2 muestra únicamente una serie de un pico correspondiente a un monómero con una masa de 98.151 Da, mientras que la fracción 1 muestra dos capas diferentes que contienen dos series de picos mayores, correspondientes a una masa de 98.155 Da (monómero) y a una segunda serie con una masa de 196.319 Da (dímero).

Tabla 3: Resumen de los datos de MS de mediciones de ESI-MS no reductor de las fracciones 1 y 2.

La presencia de un monómero en la fracción 1 podría explicarse a partir de las condiciones de incubación (incubado con 60 µ? de TCEP 1 M y 50 µ? de hidrocloruro de guanidina 8 M) y un puente S-S abierto potencial entre CH1 y Ck. En este caso, la transferencia de un solvente acuoso a un solvente orgánico ácido durante la preparación de muestras para la MS podría provocar la disociación del dímero en 2 monómeros.

Lo anterior concuerda con los resultados del análisis de CE-SDS (BioAnalyzer). La fracción 1 contenía 71% de dímero y 16% de monómero bajo condiciones no reductoras.

La utilización de SDS separó las cadenas unidas no covalentemente. La fracción 2 mostraba únicamente una señal de monómero (98%) bajo condiciones no reductoras.

Las mediciones de MS bajo condiciones reductoras de las fracciones 1 y 2 demostraron que la secuencia y expresión de los constructos eran correctas. Los datos de MS de la fracción 1 muestran dos cadenas pesadas diferentes, con pesos moleculares de 47.960 Da y 50.208 Da en cantidades aproximadamente iguales. Estas dos cadenas pesadas también se encontraron en la fracción 2 con intensidades similares.

Tabla 4: Resumen de los datos de MS de mediciones de ESI-MS bajo condiciones reductores de las fracciones 1 y 2.

Ejemplo 9: Análisis de proporciones de monómeros en dímero frente a MoAb monovalente en proteínas de unión a antígeno dímero de MoAb de IGF1R AK18 CH3 wt y con CH3 modificado Las modificaciones de los dominios CH3 de las cadenas de anticuerpo pueden cambiar las proporciones de dímero de MoAb y monómero de MoAb. Se expresaron transitoriamente en células HEK293F modificaciones diferentes ejemplares de cadena pesada conjuntamente o en combinación con la cadena pesada no modificada. A título comparativo, se transfectaron en paralelo anticuerpos que comprendían cadenas pesadas no modificadas. El sobrenadante que contenía los anticuerpos se recogió siete días después de la transfección. Se precipitaron los anticuerpos utilizando proteína A-sefarosa y se eluyeron de las perlas con un protocolo estándar de choque de pH. Los eluidos obtenidos se sometieron a un análisis de HPLC utilizando una columna G3000SW (gel TS ). Se cuantificaron las proporciones de anticuerpos mediante el cálculo del área bajo los picos respectivos. El término "CH3-wt" se refiere a un dominio CH3 de IgGl con la secuencia natural (tipo salvaje=wt).

Tabla 5: Proporciones de dímero de MoAb obtenido (=proteína de unión a antígeno bivalente según la invención) frente a monómero de MoAb (=producto secundario monovalente) determinadas mediante HPLC. El producto dimérico deseado como el producto secundario monomérico pueden separarse fácilmente. Los valores se derivaron de los cromatogramas mostrados en la figura 10. h = mutante con las mutaciones S364W y L368G en el dominio CH3 de IgGl i = mutante con las mutaciones S364G, L368W, D399 y K409D en el dominio CH3 de 1 = mutante con las mutaciones S364F y L368G en el dominio CH3 de IgGl m = mutante con las mutaciones S364G, L368F, D399K y K409D en el dominio CH3 de IgGl.

CH3-wt = dominio CH3 de IgGl wt CH3- IgA = quimera con un dominio CH2 de IgGl y un dominio CH3 de IgA Ejemplo 10: Preparación de anticuerpos glucomanipulados Para la producción de proteína de unión a antígeno MoAb glucomanipulada, se transfectaron células HEK-EBNA utilizando el método del fosfato cálcico con cuatro plásmidos. Dos codificaban las cadenas de anticuerpo, uno para la expresión de un polipéptido GnTIII de fusión (un vector de expresión de GnTIII) y uno para la expresión de manosidasa II (un vector de expresión de manosidasa II de Golgi) en una proporción de 4:4:1:1, respectivamente. Las células se cultivan en cultivos monocapa adherentes en matraces T utilizando medio de cultivo DMEM suplementado con FCS al 10%, y se transfectan al alcanzar una confluencia de entre 50% y 80%. Para la transfección de un matraz TI 50, se siembran 15 millones de células 24 horas antes de la transfección en 25 mi de medio de cultivo DMEM suplementado con FCS (al 10% v/v final) y las células se introducen en un incubador a 37°C con una atmósfera con 5% de C02 durante la noche. Para la transfección de cada matraz TI 50, se prepara una solución de ADN, CaCl2 y agua mediante la mezcla de 94 µg de ADN total de vector plásmido dividido igualmente entre los vectores de expresión de cadena ligera y cadena pesada, agua hasta un volumen final de 469 µ? y 469 µ? de una solución 1 M de CaCl2. A dicha solución, se añadieron 938 µ? de una solución de HEPES 50 mM, NaCl 280 mM, Na2HP04 1,5 mM a pH 7,05, se mezcló inmediatamente durante 10 segundos y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 20 segundos. La suspensión se diluyó con 10 mi de DMEM suplementado con FCS al 2% y se añadió al matraz TI 50 en lugar del medio existente. A continuación, se añadieron 13 mi adicionales de medio de transfección. Las células se incubaron a 37°C, con 5% de C02, durante aproximadamente 17 a 20 horas, y después se sustituyó el medio por 25 mi de DMEM, FCS al 10%. El medio de cultivo condicionado se recolectó aproximadamente 7 días después del intercambio de medios mediante centrifugación durante 15 minutos a 210xg, se esterilizó la solución mediante filtración (filtro de 0,22 µp?) y se añadió azida sódica a una concentración final de 0,01% p/v, y se mantuvo a 4°C.

Claims

REIVINDICACIONES Proteína de unión a antígeno que comprende: a) dos cadenas pesadas modificadas de un anticuerpo que se unen específicamente a un antígeno, en las que la VH de cada cadena pesada se sustituye por la VL de dicho anticuerpo, estando asociadas entre sí dichas cadenas pesadas modificadas mediante sus dominios CH3 de la parte Fe, b) dos cadenas pesadas modificadas de dicho anticuerpo, en las que la CH1 de cada cadena pesada se sustituye por la CL de dicho anticuerpo, estando asociadas entre sí dichas cadenas pesadas modificadas mediante sus dominios CH3 de la parte Fe, y en la que los dominios VL de las cadenas pesadas de a) se encuentran asociados con los dominios VH de las cadenas pesadas de b), y los dominios CH1 de las cadenas pesadas de a) se encuentran asociadas a los dominios CL de las cadenas pesadas de b). Proteína de unión a antígeno según la reivindicación 1, caracterizada porque: los dominios CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de a) y los dominios CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de b) son del mismo isotipo. Proteína de unión a antígeno según la reivindicación 2, caracterizada porque los dominios CH2 y CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de a) y los dominios CH2 y CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de b) son del mismo isotipo. Proteína de unión a antígeno según la reivindicación 3, caracterizada porque los dominios CH2 y CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de a) y los dominios CH2 y CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de b) son del isotipo IgG. Proteína de unión a antígeno según la reivindicación 4, caracterizada porque los dominios CH2 y CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de a) y los dominios CH2 y CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de b) son del isotipo IgGl . Proteína de unión a antígeno según la reivindicación 1, caracterizada porque comprende: a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 1 , y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 2, a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 3, y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 4, o a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 5, y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 6. Proteína de unión a antígeno según la reivindicación 5, caracterizada porque las dos cadenas pesadas modificadas de a) o las dos cadenas pesadas modificadas de b), se han modificado adicionalmente con las sustituciones de aminoácidos S364G, L368F, D399K y K409D (en las que las posiciones de los aminoácidos se numeran según el índice EU de Kabat). Proteína de unión a antígeno según la reivindicación 1, caracterizada porque comprende: a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 1, y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 2, en las que las dos cadenas pesadas modificadas de a), o las dos cadenas pesadas modificadas de b), se han modificado adicionalmente con las sustituciones de aminoácidos S364G, L368F, D399K y K409D (en las que las posiciones de los aminoácidos se numeran según el índice EU de Kabat). a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 3, y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 4, en las que las dos cadenas pesadas modificadas de a), o las dos cadenas pesadas modificadas de b), se han modificado adicionalmente con las sustituciones de aminoácidos S364G, L368F, D399 y K409D (en las que las posiciones de los aminoácidos se numeran según el índice EU de Kabat). o a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 5, y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 6, en las que las dos cadenas pesadas modificadas de a), o las dos cadenas pesadas modificadas de b), se han modificado adicionalmente con las sustituciones de aminoácidos S364G, L368F, D399K y K409D (en las que las posiciones de los aminoácidos se numeran según el índice EU de Kabat). Proteína de unión a antígeno según la reivindicación 1, caracterizada porque los dominios CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de a) y los dominios CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de b) son de isotipo diferente. Proteína de unión a antígeno según la reivindicación 9, caracterizada porque los dominios CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de a) son del isotipo IgGl, y los dominios CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de b) son del isotipo IgA. 11. Proteína de unión a antígeno según la reivindicación 10, caracterizada porque comprende: a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 7, y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 4. 12. Proteína de unión a antígeno según la reivindicación 10, caracterizada porque los dominios CH2 y CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de a) son del isotipo IgGl, y los dominios CH2 y CH3 de la parte Fe de las cadenas pesadas modificadas de b) son del isotipo IgA. 13. Proteína de unión a antígeno monovalente según las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque el dominio CH2 de las partes Fe de a) y b) son del isotipo IgGl, y la proteína de unión a antígeno se encuentra afucosilada, con una cantidad de fucosa de 80% o inferior de la cantidad total de oligosacáridos (azúcares) en Asn297 del isotipo IgGl humano. 14. Composición farmacéutica que comprende una proteína de unión a antígeno según las reivindicaciones 1 a 13. 15. Proteína de unión a antígeno según las reivindicaciones 1 a 13, para la utilización en el tratamiento del cáncer. 16. Utilización de la proteína de unión a antígeno según las reivindicaciones 1 a 13, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer. Método para el tratamiento de un paciente que necesita terapia, caracterizado por la administración en el paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de unión a antígeno según las reivindicaciones 1 a 13. Método para la preparación de una proteína de unión de antígeno según las reivindicaciones 1 a 13, que comprende las etapas siguientes: a) transformar una célula huésped con vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de una proteína de unión a antígeno según las reivindicaciones 1 a 13, b) cultivar la célula huésped bajo condiciones que permiten la síntesis de dicha molécula de proteína de unión a antígeno, y c) recuperar dicha molécula de proteína de unión a antígeno a partir de dicho cultivo. Ácido nucleico codificante de una proteína de unión a antígeno según las reivindicaciones 1 a 13. Vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 19. Célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 20.