MX2011013616A

MX2011013616A - Proteinas biespecificas tetravalentes de union a antigeno.

Info

Publication number: MX2011013616A
Application number: MX2011013616A
Authority: MX
Inventors: Wolfgang Schaefer; Joerg Thomas Regula; Christian Klein; Sabine Imhof-Jung; Juergen Michael Schanzer
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2009-06-18
Filing date: 2010-06-14
Publication date: 2012-01-19
Also published as: BRPI1010109A2; SG177272A1; WO2010145793A1; KR20120028382A; PE20120414A1; CA2764393A1; JP5689118B2; US8703132B2; RU2604189C2; HK1174645A1; US20150044214A1; AR077111A1; CN102803295A; EP2443153B1; US20100322934A1; AU2010262130A1; ES2442917T3; JP2012530089A; ZA201108922B; CA2764393C

Abstract

La presente invención se refiere a proteínas biespecíficas tetravalente de unión a antígeno, a métodos para la producción de las mismas, a composiciones farmacéuticas que contienen dichos anticuerpos y a usos de las mismas.

Description

Proteínas biespecíficas tetravalentes de unión a antígeno La presente invención se refiere a proteínas biespecíficas tetravalentes de unión a antígeno, a métodos para su producción, a composiciones farmacéuticas que contienen dichos anticuerpos y a usos de las mismas.

- Antecedentes de la invención Las proteínas manipuladas, tales como anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos capaces de unirse a dos o más antígenos, son conocidas de la técnica. Estas proteínas de unión multiespecíficas pueden generarse mediante fusión celular, conjugado químico o técnicas de ADN recombinante.

- Recientemente se ha desarrollado una amplia diversidad de formatos de anticuerpo multiespecífico recombinante, por ejemplo anticuerpos biespecíficos tetravalentes mediante fusión de, por ejemplo, un formato de anticuerpo IgG y dominios de una cadena (ver, por ejemplo, Coloma M.J. et ai, Nature Biotech. 15: 159-163, 1997; patente WO n° 2001/077342, y Morrison S.L., Nature Biotech. 25 (2007) 1233-1234.

- También se han desarrollado varios otros formatos nuevos en los que la estructura nuclear del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) ya no se encuentra retenida, tal como diacuerpos, triacuerpos o tetracuerpos, minicuerpos, varios formatos de una sola cadena (scFv, Bis-scFv), que son capaces de unirse a dos o más antígenos (Holliger P. et al, Nature Biotech. 23: 1 126-1 136, 2005; Fischer N. y Léger O., Pathobiology 74:3-14, 2007; - Shen J. et ai, J. Immunol. Methods 318:65-74, 2007; Wu C. et al, Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297).

La totalidad de dichos formatos utiliza línkers, para fusionar el núcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) a una proteína adicional de unión (por ejemplo scFv) o para fusionar, por ejemplo, dos fragmentos Fab o scFv (Fischer N. y Léger O., Pathobiology 74:3-14, 2007). Aunque resulta evidente que los línkers presentan ventajas para la manipulación de los anticuerpos biespecíficos, también pueden provocar problemas en contextos terapéuticos. En efecto, estos péptidos foráneos podrían inducir una respuesta inmunológica contra el línker mismo o contra la unión entre la proteína y el línker. Además, la naturaleza flexible de estos péptidos provoca que presenten una mayor tendencia al corte proteolítico, potencialmente conduciendo a una pobre estabilidad del anticuerpo, a agregación y a una inmunogenicidad incrementada. Además, puede desearse retener funciones efectoras, tales como, por ejemplo, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), que se encuentran mediadas por la parte Fe mediante el mantenimiento de un elevado grado de similitud a anticuerpos naturales.

De esta manera, idealmente, el objetivo debe ser el desarrollo de anticuerpos biespecíficos que presentan una estructura general muy similar a los anticuerpos naturales (por ejemplo IgA, IgD, IgE, IgG o IgM), con diferencias mínimas respecto a las secuencias humanas.

En un enfoque, se han producido anticuerpos biespecíficos que son muy similares a anticuerpos naturales utilizando la tecnología del cuadroma (ver Milstein C: y Cuello A.C., Nature 305:537-540, 1983), basada en la fusión somática de dos líneas celulares de hibridoma diferentes que expresan anticuerpos monoclonales murinos con las especificidades deseadas del anticuerpo biespecífico. Debido al apareamiento aleatorio de las cadenas pesada y ligera de dos anticuerpos diferentes dentro de la línea celular de hibridoma (o cuadroma) híbrido resultante, se generan hasta diez especies diferentes de anticuerpo de entre las que únicamente una es el anticuerpo biespecífico funcional deseado. Debido a la presencia de productos secundarios mal apareados, y rendimientos de producción significativamente reducidos, resultan necesarios procedimientos de purificación sofisticados (ver, por ejemplo, Morrison S.L., Nature Biotech. 25 (2007) 1233-1234). En general, se mantiene el mismo problema de productos secundarios mal apareados en el caso de que se utilicen técnicas de expresión recombinante.

Un enfoque para evitar el problema de los productos secundarios mal apareados, que se conoce como "botón en ojal", pretende forzar el apareamiento de dos cadenas pesadas de anticuerpos diferentes mediante la introducción de mutaciones en los dominios CH3 para modificar la interfaz de contacto. En una cadena se sustituyen aminoácidos voluminosos por aminoácidos con cadenas laterales cortas, para crear un "ojal". A la inversa, se introducen aminoácidos con cadenas laterales grandes en el otro dominio CH3, para crear un "botón". Mediante la coexpresión de estas dos cadenas pesadas (y de dos cadenas ligeras idénticas, que deben ser apropiadas para ambas cadenas pesadas), se han observado rendimientos elevados de formación de heterodímeros ("botón-ojal") frente a la formación de homodímeros ("ojal-ojal" o "botón-botón") (Ridgway J.B. et al., Protein Eng. 9:617-621, 1996, y la patente WO n° 96/02701 1). El porcentaje de heterodímeros podría incrementarse adicionalmente mediante el remodelaje de las superficies de interacción de los dos dominios CH3 utilizando un enfoque de expresión fágica y la introducción de un puente disulfuro para estabilizar los heterodímeros (Merchant A.M. et al., Nature Biotech. 16:677-681, 1998; Atwell S. et al, J. Mol. Biol. 270:26-35, 1997). Se describen nuevos enfoques para la tecnología de botones-en-ojales en, por ejemplo, el documento EP n° 1 870 459 Al . Aunque este formato aparentemente resulta muy atractivo, en la actualidad no se dispone de datos que describan la progresión hacia el uso clínico. Una importante limitación de esta estrategia es que las cadenas ligeras de los dos anticuerpos parentales deben ser idénticas para evitar el apareamiento incorrecto y la formación de moléculas inactivas. De esta manera, esta técnica no resulta apropiada para el desarrollo sencillo de anticuerpos biespecíficos recombinantes contra dos antígenos partiendo de dos anticuerpos contra el primer y segundo antígenos, debido a que las cadenas pesadas de estos anticuerpos y/o las cadenas ligeras idénticas deben optimizarse. Sigue existiendo el mismo problema de desapareamiento en el caso de que, en lugar de anticuerpos biespecíficos bivalentes, se expresen anticuerpos biespecíficos tetravalentes, por ejemplo mediante fusión de fragmentos Fab adicionales (cada uno idéntico al fragmento Fab del anticuerpo respectivo que se une al primer o segundo antígeno) a cada extremo C-terminal de cadena pesada del heterodímero. (ver la fig. 2) La patente WO n° 2006/093794 se refiere a composiciones de proteínas heterodiméricas de unión. La patente WO n° 99/37791 describe derivados de anticuerpos con múltiples fines. Morrison S.L. et al, J. Immunolog. 160:2802-2808, 1998, se refieren a la influencia del intercambio de la región variable sobre las propiedades funcionales de la IgG.

Descripción resumida de ta invención La invención comprende una proteína biespecífíca tetravalente de unión a antígeno, que comprende: a) una cadena pesada modificada de un primer anticuerpo,que se une específicamente a un primer antígeno,y al que el extremo C-terminal de dicha cadena pesada, adicionalmente los dominios CH1 de VH de dicho primer anticuerpo, se encuentra fusionado a través de su extremo N-terminal, b) dos cadenas ligeras de dicho primer anticuerpo de a), c) una cadena pesada modificada de un segundo anticuerpo, que se une específicamente a un segundo antígeno, en el que el dominio CH1 se sustituye por el dominio CL de dicho segundo anticuerpo y al que el extremo C-terminal de dicha cadena pesada, adicionalmente los dominios CL de VH de dicho segundo anticuerpo, se encuentra fusionado a través de su extremo N-terminal, y d) dos cadenas ligeras modificadas de dicho segundo anticuerpo de c), en las que el dominio CL se sustituye por el dominio CH1 de dicho segundo anticuerpo.

Una realización adicional de la invención es un método para la preparación de una proteína de unión a antígeno según la invención, que comprende las etapas siguientes: a) transformar una célula huésped con: - vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de una proteína biespecífíca de unión a antígeno según la invención, b) cultivar la célula huésped bajo condiciones que permitan la síntesis de dicha molécula de anticuerpo, y c) recuperar dicha molécula de anticuerpo a partir de dicho cultivo.

Una realización adicional de la invención es una célula huésped que comprende: - vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de una proteína de unión a antígeno según la invención.

Una realización adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión a antígeno según la invención y por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Una realización adicional de la invención es un método destinado al tratamiento de un paciente que necesita terapia, caracterizado por la administración en el paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de unión a antígeno según la invención.

Según la invención, puede mejorarse la proporción de una proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno deseada en comparación con productos secundarios no deseados mediante la sustitución de CHl por el dominio CL en la cadena pesada modificada en c) y las dos cadenas ligeras modificadas correspondientes en d). De esta manera, puede reducirse el desapareamiento no deseado de las cadenas ligeras del anticuerpo que se une específicamente a un primer antígeno (de b) con los dominios CHl de VH incorrectos de las cadenas pesadas modificadas de anticuerpo (de c) del anticuerpo que se une específicamente a un segundo antígeno. Análogamente, el desapareamiento de las cadenas ligeras modificadas en d) con las cadenas pesadas en a), (ver la fig. 2 sin dichas modificaciones y desapareamiento, y la fig. 3 con dichas sustituciones (o intercambios) CH1-CL y sin desapareamiento).

Descripción detallada de la invención La invención comprende una proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno, que comprende: a) una cadena pesada modificada de un primer anticuerpo, que se une específicamente a un primer antígeno, y al que se encuentra fusionado el extremo C-terminal de dicha cadena pesada, adicionalmente los dominios CH1 de VH de dicho primer anticuerpo, mediante un péptido conectar a su extremo N-terminal, b) dos cadenas ligeras de dicho primer anticuerpo en a), c) una cadena pesada modificada de un segundo anticuerpo, que se une específicamente a un segundo antígeno, en el que el dominio CH1 se sustituye por el dominio CL de dicho segundo anticuerpo y al que se encuentra fusionado el extremo C-terminal de dicha cadea pesada, adicionalmente los dominios C de VH de dicho segundo anticuerpo, mediante un péptido conector a su extremo N-terminal, y d) dos cadenas ligeras modificadas de dicho segundo anticuerpo de c), en las que el dominio CL se sustituye por el dominio CH1 de dicho segundo anticuerpo.

Según la invención, la proporción entre una proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno deseada y productos secundarios no deseados (debido al apareamiento incorrecto de las cadenas ligeras del anticuerpo con las cadenas pesadas de anticuerpo correspondientes en d). El apareamiento incorrecto en el presente contexto se refiere a la asociación de: i) las cadenas ligeras de un anticuerpo que se une específicamente a un primer antígeno b) con cadena pesada modificada de un anticuerpo que se une específicamente a un segundo antígeno, o ii) las cadenas ligeras de un anticuerpo que se une específicamente a un segundo antígeno b) con cadena pesada modificada de un anticuerpo que se une específicamente a un primer antígeno (ver la fig. 2), conduciendo a productos secundarios no deseados inactivos o no totalmente funcionales .

En un aspecto adicional de la invención, dicha proporción mejorada entre un anticuerpo biespecífíco tetravalente deseado y productos secundarios no deseados puede mejorarse adicionalmente mediante modificaciones de los dominios CH3 de dichos anticuerpos que se unen específicamente a un primer y segundo antígenos.

De esta manera, en una realización preferente de la invención, los dominios CH3 de dicha proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno (en las cadenas pesadas modificadas de a) y c)) según la invención, pueden alterarse mediante la tecnología de "botón en ojal", que se describe en detalle mediante varios ejemplos en, por ejemplo, la patente WO n° 96/02701 1, en Ridgway J.B. et al, Protein Eng. 9:617-621, 1996, y en Merchant A.M. et al, Nat. Biotechnol. 16:677-681, 1998. En este método, las superficies de interacción de los dos dominios CH3 se alteran para incrementar la heterodimerización de ambas cadenas pesadas que contienen dichos dos dominios CH3. Cada uno de los dos dominios CH3 (de las dos cadenas pesadas) puede ser el "botón", mientras que el otro es el "ojal". La introducción de un puente disulfuro estabiliza adicionalmente los heterodímeros (Merchant, A.M. et ai, Nature Biotech. 16:677-681, 1998; Atwell, S. et ai, J. Mol. Biol. 270:26-35, 1997) e incrementa el rendimiento.

De esta manera, en un aspecto de la invención, dicha proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno se caracteriza adicionalmente porque el dominio CH3 de la cadena pesada modificada del anticuerpo de a) y el dominio CH3 de la cadena pesada modificada del anticuerpo de b) se reúnen, cada una, en una interfaz que comprende una interfaz original entre los dominios CH3 de anticuerpo, - en donde dicha interfaz se altera para estimular la formación de la proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno, en la que la alteración se caracteriza porque: i) el dominio CH3 de una cadena pesada se encuentra alterado, de manera que, en la interfaz original, el dominio CH3 de una cadena pesada que se reúne con la interfaz original del dominio CH3 de la otra cadena pesada en la proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno,se sustituye un residuo aminoácido por un residuo aminoácido de volumen de cadena lateral más grande, generando de esta manera una protuberancia en el interior de la interfaz del dominio CH3 de una cadena pesada,, pudiendo situarse dicha protuberancia en una cavidad en el interior de la interfaz del dominio CH3 de la otra cadena pesada, e ii) el dominio CH3 de la otra cadena pesada ha sido alterado, de manera que, en la interfaz original del segundo dominio CH3 que se reúne con la interfaz original del primer dominio CH3 en la proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno se sustituye un residuo aminoácido por un residuo aminoácido de volumen de cadena lateral más pequeño, generando de esta manera una cavidad en el interior de la interfaz del segundo dominio CH3, en el interior de la cual puede situarse una protuberancia dentro de la interfaz del primer dominio CH3.

Preferentemente, dicho residuo aminoácido de volumen de cadena lateral más grande se selecciona de entre el grupo que consiste de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptófano (W).

Preferentemente, dicho residuo aminoácido de volumen de cadena lateral más pequeño se selecciona de entre el grupo que consiste de alanina (A), serina (S), treonina (T) y valina (V).

En un aspecto de la invención, ambos dominios CH3 se alteran adicionalmente mediante la introducción de cisteína (C) como el aminoácido en las posiciones correspondientes de cada dominio CH3, de manera que pueda formarse un puente disulfuro entre ambos dominios CH3.

En una realización preferente, dicha proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno comprende una mutación T366W en el dominio CH3 de la "cadena de botón", y las mutaciones T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la "cadena de ojal". También puede utilizarse un puente disulfuro entre cadenas adicional entre los dominios CH3 (Merchant A.M. et al, Nature Biotech. 16:677-681, 1998, por ejemplo mediante la introducción de una mutación Y349C en el dominio CH3 de la cadena de "botón" o de "ojal", y una mutación E356C o una mutación S354C en el dominio CH3 de la otra cadena. De esta manera, en otra realización preferente, dicha proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno comprende las mutaciones S354C, T366W en uno de los dos dominios CH3, y las mutaciones Y349C, T366S, L368A y Y407V en el otro de los dos dominios CH3, o dicha proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno comprende las mutaciones E356C y T366W en uno de los dos dominios CH3, y las mutaciones Y349C, T366S, L368A y Y407V en el otro de los dos dominios CH3, o dicha proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno comprende las mutaciones Y349C y T366W en uno de los dos dominios CH3, y las mutaciones E356C, T366S, L368A y Y407V en el otro de los dos dominios CH3, o dicha proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno comprende las mutaciones Y349C y T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A y Y407V en el otro de los dos dominios CH3 (la mutación adicional Y349C en un dominio CH3 y la mutación adicional E356C o S354C en el otro dominio CH3 forman un puente disulfuro entre cadenas) (la numeración sigue en todos los casos el índice EU de abat). Aunque también pueden utilizarse alternativa o adicionalmente otras tecnologías de botón-en-ojal, tal como se describe en el documento EP n° 1 870 459 Al . Un ejemplo preferente de dicho anticuerpo triespecífico o tetraespecífico son las mutaciones R409D y K370E en el dominio CH3 de la "cadena del botón" y las mutaciones D399 y E357 en el dominio CH3 de la "cadena del ojal" (en todos los casos la numeración sigue el índice EU de Kabat).

En otra realización preferente, dicho anticuerpo triespecífico o tetraespecífico comprende una mutación T366W en el dominio CH3 de la "cadena de botón", y las mutaciones T366S, L368A y Y407V en el dominio CH3 de la "cadena de ojal", y adicionalmente las mutaciones R409D y K370E en el dominio CH3 de la "cadena de botón", y las mutaciones D399K y E357K en el dominio CH3 de la "cadena de ojal".

En otra realización preferente, dicho anticuerpo triespecífico o tetraespecífico comprende las mutaciones Y349C y T366W en uno de los dos dominios CH3, y las mutaciones S354C, T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3, o dicho anticuerpo triespecífico o tetraespecífico comprende las mutaciones Y349C y T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3, y además las mutaciones R409D y K370E en el dominio CH3 de la "cadena del botón" y las mutaciones D399K y E357K en el dominio CH3 de la "cadena del ojal".

El término "anticuerpo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo de longitud completa que consiste de dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo (ver la fig. 1). Una cadena pesada de un anticuerpo de longitud completa es un polipéptido que consiste en la dirección N-terminal a C-terminal de un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo, un dominio constante 1 de cadena pesada (CH1) de anticuerpo, una región bisagra (HR) de anticuerpo, un dominio constante 2 de cadena pesada (CH2) de anticuerpo, y un dominio constante 3 de cadena pesada (Cri3) de anticuerpo, abreviadamente: VH-CH1-HR-CH2-CH3, y opcionalmente un dominio constante 4 de cadena pesada (CH4) de anticuerpo en el caso de un anticuerpo de la subclase IgE. Preferentemente, la cadena pesada del anticuerpo de longitud completa es un polipéptido que consiste, en la dirección N-terminal a C-terminal, de VH, CH1 , HR, CH2 y CH3. La cadena ligera del anticuerpo de longitud completa es un polipéptido que consiste, en dirección N-terminal a C-terminal, de un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo, y un dominio constante de cadena ligera (CL) de anticuerpo, abreviadamente VL-CL. El dominio constante de cadena ligera (CL) de anticuerpo puede ser K (kappa) or ? (lambda). Las cadenas de anticuerpo se encuentran unidas entre sí mediante enlaces disulfuro entre polipéptidos, entre el dominio C^y el dominio CH1 (es decir, entre la cadena ligera y la pesada y entre las regiones de bisagra de las cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa. Son ejemplos de anticuerpos de longitud completa típicos anticuerpos naturales tales como IgG (por ejemplo IgGl e IgG2), IgM, IgA, IgD e IgE. Los anticuerpos según la invención pueden ser de una única especie, por ejemplo humanos, o pueden ser anticuerpos quimerizados o humanizados. Los anticuerpos de longitud completa según la invención comprenden dos sitios de unión a antígeno, cada uno formado por una pareja de VH y VL, uniéndose ambos específciamente al mismo (primer) antígeno. El extremo C-terminal de las cadenas pesada y ligera de dicho anticuerpo de longitud completa indica el último aminoácido en el extremo C-terminal de dicha cadena pesada o ligera. Dicho anticuerpo comprende dos fragmentos Fab idénticos que consisten de los dominios VH y CHl de la cadena pesada y los dominios VL y CL de la cadena ligera (ver la fig. 1 ).

En una proteína de unión a antígeno según la invención, los dominios CHl y CL del segundo anticuerpo, que se une específicamente a un segundo antígeno, se sustituyen mutuamente, produciendo las cadenas ligeras modificadas en d), y la cadena pesada modificada de anticuerpo en c) a la que se fusiona el extremo C-terminal de dicha cadena pesada, adicionalmente los dominios VH-CL de dicho anticuerpo (que se une específicamente a un segundo antígeno), mediante un péptido conector a su extremo N-terminal.

Los "dominios VH-CH1" de dicho anticuerpo (que se une específicamente a un primer antígeno) se refiere a los dominios VH y CHl de dicho anticuerpo en dirección N-terminal a C-terminal. Los "dominios VH-CL" de dicho anticuerpo (que se une específicamente a un segundo antígeno) se refieren a los dominios VH y CHl de dicho anticuerpo en dirección N-terminal a C-terminal.

La expresión "péptido conector" tal como se utiliza en la invención se refiere a un péptido con secuencias de aminoácidos que preferentemente es de origen sintético. Estos péptidos conectores según la invención se utilizan para fusionar los péptidos de unión a antígeno al extremo C-terminal o N-terminal de las cadenas del anticuerpo de longitud completa y/o de longitud completa modificado, para formar una prbteína biespecífica de unión a antígeno según la invención. Preferentemente, dichos péptidos conectores bajo c) son péptidos con una secuencia de aminoácidos que presenta una longitud de por lo menos 5 aminoácidos, preferentemente con una longitud de entre 5 y 100, más preferentemente de entre 10 y 50 aminoácidos. En una realización, dicho péptido conector es (GxS)n o (GxS)nGm, con G=glicina, S=serina y (x=3, n=3, 4, 5 ó 6, y m=0, 1, 2 ó 3) o (x=4, n=2, 3, 4 ó 5, y m=0, 1 , 2 ó 3), preferentemente x=4 y n=2 ó 3, más preferentemente con x=4 y n=2. En una realización, dicho péptido conector es (G4S)2.

Las expresiones "sitio de unión" o "sitio de unión a antígeno" tal como se utilizan en la presente memoria se refiere a una o más regiones de una proteína de unión a antígeno según la invención a las que se une un ligando (por ejemplo el antígeno o un fragmento del mismo) y que se deriva de una molécula de anticuerpo o de un fragmento del mismo (por ejemplo un fragmento Fab). El sitio de unión a antígeno según la invención comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo y un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo de un anticuerpo o de un fragmento del mismo que se une específicamente al antígeno deseado.

Los sitios de unión a antígeno (es decir, las parejas VH/V[_) que se unen específicamente al antígeno deseado pueden derivarse de: a) anticuerpos conocidos del antígeno, o b) nuevos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo obtenidos mediante métodos de inmunización de novo utilizando, ínter alia, la proteína o ácido nucleico del antígeno, o fragmentos de los mismos, o mediante expresión fágica.

Un sitio de unión a antígeno de una proteína de unión a antígeno de la invención contiene seis regiones determinantes de complementariedad (CDRs) que contribuye en grados variables a la afinidad del sitio de unión para el antígeno. Existen tres CDRs de dominio variable de cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRH3) y tres CDRs de dominio variable de cadena ligera (CDRL1, CDRL2 y CDRL3). La extensión de las regiones CDR y de marco (FRs) se determina mediante comparación con una base de datos compilada a partir de secuencias de aminoácidos en las que dichas regiones se han definido según la variabilidad entre secuencias.

La especificidad del anticuerpo se refiere al reconocimiento selectivo del anticuerpo o proteína de unión a antígeno para un epítopo particular de un antígeno. Los anticuerpos naturales, por ejemplo, son monoespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que presentan dos especificidades de unión a antígeno diferentes. En el caso de que un anticuerpo presente más de una especificidad, los epítopos reconocidos pueden asociarse a un único antígeno o a más de un antígeno.

El término "monoespecífico" referido a un anticuerpo o proteína de unión a antígeno tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo o proteína de unión a antígeno que presenta uno o más sitios de unión, cada uno de los cuales se une al mismo epítopo del mismo antígeno.

El término "valente" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a la presencia de un número específico de sitios de unión en una molécula de anticuerpo. Un anticuerpo natural, por ejemplo, o un anticuerpo de longitud completa según la invención, presenta dos sitios de unión y es bivalente. El término "tetravalente" se refiere a la presencia de cuatro sitios de unión en una proteína de unión a antígeno. La expresión "biespecífico tetravalente" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una proteína de unión a antígeno según la invención que presenta cuatro sitios de unión a antígeno, de los cuales dos se unen a un primer antígeno y dos a un segundo antígeno (o a otro epítopo del antígeno). Las proteínas de unión a antígeno de la presente invención presentan cuatro sitios de unión y son tetravalentes.

Los anticuerpos de longitud completa de la invención comprenden regiones constantes de inmunoglobulina de una o más clases de inmunoglobulina. Entre las clases de inmunoglobulina se incluyen los isotipos IgG, IgM, IgA, IgD e IgE y, en el caso de IgA e IgA, los subtipos de las mismas. En una realización preferente, un anticuerpo de longitud completa de la invención presenta una estructura de dominio constante de un anticuerpo de tipo IgG.

Las expresiones "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una preparación de anticuerpo o anticuerpos o moléculas de proteína de unión a antígeno de una única composición de aminoácidos.

La expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que comprende una región variable, es decir la región de unión, procedente de una fuente o especie, y por lo menos una parte de una región constante derivada de una fuente o especie diferente, habitualmente preparado mediante técnicas de ADN recombinante. Los anticuerpos, quiméricos que comprenden una región variable murina y una región constante humana resultan preferentes. Otras formas preferentes de "anticuerpos quiméricos" comprendidas en la presente invención son aquéllas en las que la región constante ha sido modificada o cambiada respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades según la invención, especialmente con respecto a la unión de Clq y/o a la unión de receptor Fe (FcR). Este tipo de anticuerpos quiméricos también se denomina "anticuerpos de clase intercambiada". Los anticuerpos quiméricos son el producto de genes de inmunoglobulina expresados que comprenden segmentos de ADN codificantes de regiones variables de inmunoglobulina y segmentos de ADN codificantes de regiones constantes de inmunoglobulina. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos implican técnicas convencionales de ADN recombinante y de transfección génica bien conocidas de la técnica (ver, por ejemplo, Morrison, S.L. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855, 1985, y las patentes US n° 5.202.238 y n° 5.204.244).

La expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos en los que el marco' o las "regiones determinantes de complementariedad" (CDR) han sido modificadas para que comprendan la CDR de una inmunoglobulina de especificidad diferente de la de la inmunoglobulina parental. En una realización preferente, se injerta una CDR murina en la región marco de un anticuerpo humano para preparar un "anticuerpo humanizado". Ver, por ejemplo, Riechmann, L. et al, Nature 332:323-327, 1988, y Neuberger, M.S. et al., Nature 314:268-270, 1985. Las CDRs particularmente preferentes corresponden a aquéllas que representan secuencias que reconocen los anteriormente indicados antígenos de los anticuerpos quiméricos. Otras formas de "anticuerpos humanizados" comprendidas dentro de la presente invención son aquéllas en las que la región constante ha sido adicionalmente modificada o cambiada respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades según la invención, especialmente con respecto a la unión de Clq y/o a la del receptor de Fe (FcR).

La expresión "anticuerpo humano", tal como se utiliza en la presente memoria, pretende incluir anticuerpos que presentan regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos son bien conocidos del estado de la técnica (van Dijk, .A. y van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5:368-374, 2001). También pueden producirse anticuerpos humanos en animales transgénicos (por ejemplo ratones) que sean capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo o una selección de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulinas. La transferencia de la serie de genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana en dichos ratones mutantes de línea germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos tras el reto de antígeno (ver, por ejemplo, Jakobovits A. et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:2551-2555, 1993; Jakobovits A. et al, Nature 362:255-258, 1993; Brueggemann M. et al, Year Immunol. 7 (1993) 33-40). También pueden producirse anticuerpos humanos en bibliotecas de expresión fágica (Hoogenboom, H.R. y Winter, G.J., Mol. Biol. 227:381-388, 1992; Marks, J.D. et al, J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991). Las técnicas de Colé S.P.C. et al, y de Boerner et al, también se encuentran disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Colé S.P.C. et al, Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, página 77, 1985, y Boerner P. et al, J. Immunol. 147:86-95, 1991). Tal, como se ha indicado para los anticuerpos quiméricos y humanizados según la invención, la expresión "anticuerpo humano" tal como se utiliza en la presente memoria también comprende anticuerpos modificados en la región constante para generar las propiedades según la invención, especialmente con respecto a la unión de Clq y/o a la unión de FcR, por ejemplo mediante "intercambio de clase", es decir, el cambio o la mutación de partes de Fe (por ejemplo de IgGl a IgG4 y/o la mutación IgGl/IgG4).

La expresión "anticuerpo recombinante humano", tal como se utiliza en la presente memoria, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan por medios recombinantes, tal como anticuerpos aislados de una célula huésped, tal como una célula NSO o CHO, o de un animal (por ejemplo un ratón) que es transgénico para genes de inmunogloublina humana o para anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped. Dichos anticuerpos recombinantes humanos presentan regiones variables y constantes en una forma reorganizada. Los anticuerpos recombinantes humanos según la invención han sido sometidos a hipermutación somática in vivo. De esta manera, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivadas y relacionadas con secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir naturalmente en el repertorio in vivo de anticuerpos de la línea germinal humana.

La expresión "dominio variable" (dominio variable de una cadena ligera (VL), región variable de una cadena pesada (VH)) tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cada cadena de la pareja de cadenas ligera y pesada implicada directamente en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios de cadenas variables ligera y pesada humanas presentan la misma estructura general y cada dominio comprnede cuatro regiones marco (FR) cuyas secuencias se encuentran ampliamente conservadas, conectadas por tres "regiones hipervariables" (o regiones determinantes de complementariedad, CDRs). Las regiones de marco adoptan una conformación de hoja ß, y las CDRs pueden formar bucles que conectan la estructura de hoja ß. Las CDRs en cada cadena son mantenidas en su estructura tridimensional por las regiones de marco y forman conjuntamente con las CDRs de la otra cadena el sitio de unión de antígeno. Las regiones CDR3 de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo desempeñan un papel particularmente importante en la especificidad/afinidad de unión de los anticuerpos según la invención y, por lo tanto, proporcionan un objetivo adicional de la invención.

Las expresiones "región hipervariable" o "parte de unión de antígeno de un anticuerpo", tal como se utilizan en la presente memoria, se refieren a los residuos aminoácidos de un anticuerpo que · son responsables de la unión de antígeno. La región hipervariable comprende residuos aminoácidos de las "regiones determinantes de complementariedad" o "CDRs". Las regiones "de marco" o "FR" son aquellas regiones de dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable tal como se definen en la presente memoria. Por lo tanto, las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo comprenden, de extremo N-terminal a extremo C-terminal, los dominios FR1 , CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Las CDRs en cada cadena se encuentran separadas por dichos aminoácidos de marco. Especialmente, la CDR3 de la cadena pesada es la región que contribuye más a la unión de antígeno. Las regiones CDR y FR se determinan según la definición estándar de Kabat et ai, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

Tal como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "de unión", "de unión específica" o "que se une específicamente a" se refieren a la unión del anticuerpo/proteína de unión a anticuerpo a un epítopo del antígeno en un ensayo in vitro, preferentemente en un ensayo de resonancia de plasmón (BIAcore, GE-Healthcaré, Uppsala, Suecia) con antígeno de tipo salvaje purificado. La afinidad de la unión se define con los términos ka (constante de tasa para la asociación del anticuerpo (o proteína de unión a anticuerpo o a antígeno) del complejo de anticuerpo/antígeno), ko (constante de disociación) y KD (ko/ka). La unión o la unión específica se refieren a una afinidad de unión (KD) de 10"8 moles/1 o menos, preferentemente de entre 10"9 M y 10"13 moles/1. De esta manera, una proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno según la invención se une específicamente a cada antígeno para el que es específico con una afinidad de unión (KD) de 10~8 moles/1 o menos, preferentemente de entre 10"9 y 10"13 moles/1.

La unión del anticuerpo a FcyRIII puede investigarse mediante un ensayo BIAcore (GE-Healthcare Uppsala, Suecia). La afinidad de unión está definida por los términos ka (constante de velocidad para la asociación del anticuerpo del complejo de anticuerpo/antígeno), kp (constante de disociación) y KD (ko ka).

El término epítopo incluye cualquier determinante polipéptido capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. En determinadas realizaciones, el determinante epítopo incluye grupos superficiales químicamente activos de moléculas, tales como aminoácidos, cadenas laterales sacáridas, fosforilo o sulfonilo y, en determinadas realizaciones, puede presentar características estructurales tridimensionales específicas, o presentar características de carga específica. Un epítopo es una región de un antígeno que se une a un anticuerpo.

En determinadas realizaciones, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno en el caso de que reconozca preferentemente su antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.

En una realización adicional, la proteína biespecífica de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque dicho anticuerpo de longitud completa es de la subclase IgGl humana, o de la subclase IgGl humana con las mutaciones L234A y L235A.

En una realización adicional, la proteína biespecífica de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque dicho anticuerpo de longitud completa es de la subclase IgG2 humana.

En una realización adicional, la proteína biespecífica de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque dicho anticuerpo de longitud completa es de la subclase IgG3 humana.

En una realización adicional, la proteína biespecífica de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque dicho anticuerpo de longitud completa es de la subclase IgG4 humana o de la subclase IgG4 humana con la mutación adicional S228P.

Preferentemente, la proteína biespecífica de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque dicho anticuerpo de longitud completa es de la subclase IgGl humana o de la subclase IgG4 humana con la mutación adicional S228P.

Ahora se ha encontrado que las proteínas biespecíficas de unión a antígeno según la invención presentan características mejoradas, tales como actividad biológica o farmacológica, propiedades farmacocinéticas o toxicidad. Pueden utilizarse, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades tales como el cáncer.

La expresión "región constante" tal como se utiliza en las presentes solicitudes se refiere a la suma de los dominios de un anticuerpo que no son la región variable. La región constante no se encuentra directamente "implicada en la unión de un antígeno, aunque muestra diversas funciones efectoras. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos se dividen en las clases siguientes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas pueden dividirse adicionalmente en subclases, tales como IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, IgAl e IgA2. Las regiones constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se denominan a, d, e, ? y µ, respectivamente. Las regiones constantes de cadena ligera (CL) que pueden encontrarse en la totalidad de las cinco clases de anticuerpo se denominan (kappa) y ? (lambda).

La expresión "región constante derivada de un origen humano" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a una región constante de cadena pesada de un anticuerpo humano de la subclase IgGl, IgG2, IgG3 ó IgG4 y/o una región constante de cadena ligera kappa o lambda. Dichas regiones constantes son bien conocidas del estado de la técnica y se describen en, por ejemplo, Kabat, E.A. (ver, por ejemplo, Johnson, G. y Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28:214-218, 2000; Kabat E.A. et ai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:2785-2788, 1975).

Mientras que los anticuerpos de la subclase IgG4 muestran un nivel reducido de unión al receptor de Fe (FcyRIIIa), los anticuerpos de otras subclases de IgG muestran una unión fuerte. Sin embargo, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (pérdida del carbohidrato de Fe), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln31 1 , Asn434 e His435 son residuos que, en caso de alterarse, también proporcionan un nivel reducido de unión de Fe (Shields, R.L. et al, J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 2001 ; Lund, J. et al, FASEB J. 9: 115-119, 1995; Morgan, A. et al, Immunology 86:319-324, 1995; patente EP n° 0 307 434).

En una realización, una proteína de unión a antígeno según la invención presenta un nivel reducido de unión a FcR en comparación con un anticuerpo IgGl, así como el anticuerpo parental de longitud completa respecto a la unión a FcR de la subclase IgG4 o de la subclase IgGl o IgG2 con una mutación en S228, L234, L235 y/o D265, y/o contiene la mutación PVA236. En una realización, las mutaciones en el anticuerpo parental de longitud completa son S228P, L234A, L235A, L235E y/o PVA236. En otra realización, las mutaciones en el anticuerpo parental de longitud completa son, en IgG4, S228P, y en IgGl, L234A y L235A.

La región constante de un anticuerpo se encuentra directamente implicada en la ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos) y la CDC (citotoxicidad dependiente del complemento). La activación del complemento (CDC) se inicia a partir de la unión del factor del complemento Clq a la región constante de la mayoría de subclases de anticuerpo IgG. La unión de Clq a un anticuerpo está provocada por interacciones proteína-proteína definidas en el denominado sitio de unión. Dichos sitios de unión de la región constante son conocidos del estado de la técnica y son descritos por, por ejemplo, Lukas T.J. et al, J. Immunol. 127:2555-2560, 1981 ; Brunhouse R. y Cebra J.J., Mol. Immunol. 16:907-917, 1979; Burton D.R. et al, Nature 288:338-344, 1980; Thomason J.E. et al, Mol. Immunol. 37:995-1004, 2000; Idusogie E.E. et ai, J. Immunol. 164:4178-4184, 2000; Hezareh M. et al, J. Virol. 75:12161-12168, 2001; Morgan A. et al, Immunology 86:319-324, 1995, y la patente EP n° 0 307 434. Dichos sitios de unión de la región constante se caracterizan, por ejemplo, por los aminoácidos L234, L235, D270, N297, E318, 320, K322, P331 y P329 (numeración según el índice EU de Kabat).

La expresión "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC)" se refiere a la lisis de células diana humanas por una proteína de unión a antígeno según la invención en presencia de células efectoras. La ADCC se mide preferentemente mediante el tratamiento de una preparación de células expresantes de antígeno con una proteína de unión a antígeno según la invención en presencia de células efectoras, tales como PBMC recién aisladas o células efectoras purificadas procedentes de capas leucocitarias, por ejemplo monocitos o células asesinas naturales (NK) o una línea celular NK de crecimiento permanente.

La expresión "citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)" se refiere a un proceso iniciado por la unión del factor del complemento Clq a la parte Fe de la mayoría de subclases de anticuerpo IgG. La unión de Clq a un anticuerpo está provocada por interacciones proteína-proteína definidas en el denominado sitio de unión. Dichos sitios de unión de la parte Fe son conocidos del estado de la técnica (ver anteriormente). Dichos sitios de unión de la parte Fe se caracterizan, por ejemplo, por los aminoácidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, 322, P331 y P329 (numeración según el índice EU de Kabat). Los anticuerpos de las subclases IgGl , IgG2 e IgG3 habitualmente muestran activación del complemento, incluyendo la unión de Clq y C3, mientras que IgG4 no activa el sistema del complemento y no se une a Clq y/o a C3.

Las funciones efectoras mediadas por células de los anticuerpos monoclonales pueden potenciarse mediante la manipulación de su componente oligosacárido, tal como se describe en Umana, P. et al, Nature Biotechnol. 17:176-180, 1999, y la patente US n° 6.602.684. Los anticuerpos de tipo IgGl, los anticuerpos terapéuticos utilizados más habitualmente, son glucoproteínas que presentan un sitio N-ligado de glucosilación conservado en Asn297 en cada dominio CH2. Los dos oligosacáridos complejos biantenarios unidos a Asn27 se encuentran enterrados entre los dominios CH2, formando contactos extensivos con el esqueleto polipeptídico, y su presencia resulta esencial para que el anticuerpo medie en funciones efectoras, tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Lifely M. R. et al, Glycobiology 5:813-822, 1995; Jefferis R. et al, Immunol. Rev. 163:59-76, 1998; Wright A. y Morrison S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32). Umana, P. et al Nature Biotechnol. 17: 176-180, 1999, y la patente WO n° 99/54342 mostraron la sobreexpresión en células de ovario de hámster chino (CHO) de la P(l,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III ("GnTIII"), una glucosiltransferasa que cataliza la formación de oligosacáridos biantenarios, incrementa significativamente la actividad ADCC in vitro de los anticuerpos. Las alteraciones en la composición del carbohidrato de Asn297 o su eliminación tambiin afecta a la unión a FcyR y a Clq (Umana, P. et al, Nature Biotechnol. 17: 176-180, 1999; Davies J. et al., Biotechnol. Bioeng. 74:288-294, 2001; Mimura Y. et al., J. Biol. Chem. 276:45539-45547, 2001 ; Radaev S. et al., J. Biol. Chem. 276: 16478-16483, 2001; Shields R.L. et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 2001 ; Shields R.L. et al., J. Biol. Chem. 277:26733-26740, 2002; Simmons L.C. et al, J. Immunol. Methods 263:133-147, 2002).

Los métodos para potenciar las funciones efectoras mediadas por células de los anticuerpos monoclonales se informan en, por ejemplo, los documentos WO n° 2005/018572, n° 2006/116260, n° 2006/114700, n° 2004/065540, n° 2005/011735, n° 2005/027966, n° 1997/028267, US n° 2006/0134709, n° 2005/0054048, n° 2005/0152894, y WO n° 2003/035835 y n° 2000/061739.

En una realización preferente de la invención, la proteína biespecífica de unión a antígeno se encuentra glucosilada (en el caso de que comprenda una parte Fe de la subclase IgGl , IgG2, IgG3 o IgG4, preferentemente de la subclase IgGl o IgG3) con una cadena sacárida en Asn297, de manera que la proporción de fucosa en dicha cadena sacárida es 65% o inferior (numeración según Kabat). En otra realización, la cantidad de fucosa dentro de dicha cadena sacárida se encuentra comprendida entre 5% y 65%, preferentemente entre 20% y 40%. El término "Asn297" según la invención se refiere al aminoácido asparagina situado en aproximadamente la posición 297 en la región de Fe. Basándose en variaciones menores de la secuencia de los anticuerpos, Asn297 también puede localizarse a algunos aminoácidos (habitualmente no más de ±3 aminoácidos) cadena arriba o abajo de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300. En una realización, la proteína de unión a antígeno glucosilada según la invención es de una subclase de IgG, es de la subclase IgGl humana, de la subclase IgGl humana con las mutaciones L234A y L235A o de la subclase IgG3. En una realización adicional, la cantidad de ácido N-glucolilneuramínico (NGNA) es de 1 % o menos, y/o la cantidad de alfa-l,3-galactosa N-terminal es de 1% o menos dentro de dicha cadena sacárida. La cadena sacárida muestra preferentemente las características de los glicanos N-ligados unidos a Asn297 de un anticuerpo expresado recombinantemente en una célula CHO.

La expresión "las cadenas sacáridas muestran características de glicanos N-ligados unidos a Asn297 de un anticuerpo expresado recombinantemente en una célula CHO" se refiere a que la cadena sacárida en Asn297 del anticuerpo parental de longitud completa según la invención presenta la misma estructura y secuencia de residuos sacáridos, excepto por el residuo fucosa, que los del mismo anticuerpo expresado en células CHO no modificadas, por ejemplo que las células de las que se informa en el documento WO n° 2006/103100.

El término "NGNA" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere al residuo sacando del ácido N-glucolilneuramínico.

La glucosilación de IgGl o IgG3 humana se produce en Asn297 en forma de glucosilación de oligosacárido complejo biantenario fucosilado terminado en, como máximo, dos residuos Gal. Las regiones constantes de cadena pesada humana de la subclase IgGl o IgG3 se informan en detalle en Kabat E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), y en Brüggemann M. et al, J. Exp. Med. 166: 1351-1361, 1987; Love T.W. et al, Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527. Estas estructuras se denominn G0, Gl (a- 1,6- oa-1,3-) o residuos glicanos G2, dependiendo de la cantidad de residuos Gal terminales (Raju, T.S., Bioprocess Int. 1 (2003) 44-53). La glucosilación de tipo CHO de partes Fe de anticuerpo se describe en, por ejemplo, Routier, F.H., Glyconjugate J. 14:201-207, 1997. Los anticuerpos que se expresan recombinantemente en células CHO huésped no glucomodificadas habitualmente se encuentran fucosiladas en Asn297 en una proporción de por lo menos 85%. Los oligosacáridos modificados del anticuerpo parental de longitud completa pueden ser híbridos o complejos. Preferentemente, los oligosacáridos bifurcados, reducidos/no fucosilados son híbridos. En otra realización, los oligosacáridos bifurcados reducidos/no fucosilados son complejos.

Según la invención, la expresión "cantidad de fucosa" se refiere á la cantidad de dicho azúcar en la cadena sacárida en Asn297, referida a la suma de todas las glucoestructuras unidas a Asn297 (por ejemplo estructuras complejas, híbridas y de alto contenido en mañosa) según medición realizada mediante espectrometría de masas MALDI-TOF y calculado como valor medio. La cantidad relativa de fucosa es el porcentaje de estructuras que contienen fucosa en relación a la totalidad de las glucoestructuras identificadas en una muestra tratada con N-glucosidasa F (por ejemplo estructuras complejas, híbridas y estructuras de bajo y alto contenido en mañosa, respectivamente) según el MALDI-TOF.

La proteína de unión a antígeno según la invención se produce por medios recombinantes. De esta manera, un aspecto de la presente invención es un ácido nucleico codificante de la proteína de unión a antígeno según la invención, y un aspecto adicional es una célula que comprende dicho ácido nucleico codificante de una proteína de unión a antígeno según la invención. Los métodos para la producción recombinante son ampliamente conocidos del estado de la técnica y comprenden la expresión de proteínas en células procarióticas y eucarióticas con el posterior aislamiento de la proteína de unión a antígeno y habitualmente la purificación hasta una pureza farmacéuticamente aceptable. Para la expresión de los anticuerpos tal como se ha indicado anteriormente en una célula huésped, se insertan ácidos nucleicos codificantes de las cadenas ligeras y pesadas modificadas respectivas en los vectores de expresión mediante métodos estándares. La expresión se lleva a cabo en células huésped procarióticas o eucarióticas apropiadas, por ejemplo células CHO, células NSO, células SP2/0, células HEK293, células COS, células PER.C6, células de levadura o de E. coli, y la proteína de unión a antígeno se recupera a partir de las células (del sobrenadante o de las células tras la lisis). Los métodos generales para la producción recombinante de anticuerpos son bien conocidos del estado de la técnica y se describen, por ejemplo, en los artículos de revisión de Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17: 183-202, 1999; Geisse, S. et al., Protein Expr. Purif. 8:271-282, 1996; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16:151-161, 2000; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880.

Las proteínas biespecíficas de unión a antígeno según la invención convenientemente se separan del medio de cultivo mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, proteína A-sefarosa, cromatografía en hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. El ADN o ARN codificante de los anticuerpos monoclonales se aisla y se secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales. Las células de hibridoma pueden servir como fuente de dicho ADN y ARN. Tras el aislamiento, el ADN puede insertarse en vectores de expresión, que seguidamente se transfectan en células huésped, tales como células HE 293, células CHO o células de mieloma que de otra manera no producirían proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales recombinantes en las células huésped.

Las variantes (o mutantes) de la secuencia de aminoácidos de la proteína biespecífica de unión a antígeno se preparan mediante la introducción de cambios apropiados de nucleótidos en el ADN de la proteína de unión a antígeno, o mediante síntesis de nucleótidos. Sin embargo, estas modificaciones únicamente pueden llevarse a cabo bajo condiciones muy limitadas, por ejemplo tal como se ha indicado anteriormente. Por ejemplo, las modificaciones que no alteran las características anteriormente indicadas del anticuerpo, tal como el isotipo y la unión de antígeno del IgG pero que podrían mejorar el rendimiento de la producción recombinante, la estabilidad de la proteína o facilitar la purificación.

La expresión "célula huésped" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a cualquier tipo de sistema celular que puede manipularse para generar los anticuerpos según la presente invención. En una realización, se utilizan células HEK293 y CHO como células huésped. Tal como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan intercambiablemente y todas dichas denominaciones incluyen la progenie. De esta manera, las expresiones "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula sujeto primaria y los cultivos derivados de la misma, con independencia del número de transferencias. También debe interpretarse que toda la progenie puede no ser exactamente idéntica en su contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o naturales. Se encuentra incluida la progenie variante que presenta la misma función o actividad biológica según el cribado realizado en la célula originalmente transformada.

La expresión en células NSO se describe en, por ejemplo, Barnes, L.M. et al, Cytotechnology 32: 109-123, 2000; Barnes, L.M. et al., Biotech. Bioeng. 73:261-270, 2001. La expresión transitoria se describe en, por ejemplo, Durocher, Y. et al, Nucí. Acids Res. 30:E9, 2002. La clonación de dominios variables se describe en Orlandi, R. et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:3833-3837, 1989; Cárter, P. et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:4285-4289, 1992, y en Norderhaug, L. et al, J. Immunol. Methods 204:77-87, 1997. Un sistema preferente de expresión transitoria (HEK293) se describe en Schlaeger, E.-J. y Christensen, K., Cytotechnology 30:71-83, 1999, y en Schlaeger, E.-J., J. Immunol. Methods 194:191-199, 1996.

Entre las secuencias de control que resultan adecuadas para los procariotas se incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión ribosómica. Es conocido que las células eucarióticas utilizan promotores, intensifícadores y señales de poliadenilación.

Un ácido nucleico se encuentra "operablemente ligado" en el caso de que se encuentre situado en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder secretorio se encuentra operablemente ligado a ADN de un polipéptido en el caso de que se exprese en forma de una preproteína que participe en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión ribosómica se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que se encuentre situado de manera que facilite la traducción. Generalmente, la expresión "operablemente ligado" se refiere a que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de un líder secretorio, contiguas y en el mismo marco de lectura. Sin embargo, los intensificadores no son necesariamente contiguos. La unión se lleva a cabo mediante ligación en sitios de restricción apropiados. En el caso de que dichos sitios no existan, se utilizan adaptadores oligonucleótidos sintéticos o línker según la práctica convencional.

La purificación de los anticuerpos se lleva a cabo con el fin de eliminar los componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas estándares, incluyendo el tratamiento alcalino/de SDS, la formación de bandas en CsCl, la cromatografía de columna, la electroforesis en gel de agarosa, y otras técnicas bien conocidas de la técnica (ver Ausubel, F. et al, editor, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987). Una serie de diferentes métodos se encuentran bien establecidos y son ampliamente utilizados para la purificación de proteínas, tales como la cromatografía de afinidad con proteínas microbianas (por ejemplo la cromatografía de afinidad de proteína A o de proteína G), la cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo de intercambio catiónico (resinas carboximetilo), de intercambio aniónico (resinas aminoetilo) y de intercambio de modo mixto), la adsorción tiofílica (por ejemplo con beta-mercaptoetanol y con otros ligandos de SH), la cromatografía de interacción hidrofóbica o de adsorción aromática (por ejepmlo con fenil-sefarosa, resians aza-arenofílicas o ácido m-aminofenilborónico), la cromatografía de afinidad de quelato metálico (por ejemplo con material de afinidad por el Ni(II) y por el Cu(II)), la cromatografía de exclusión por tamaño, y métodos electroforéticos (tales como la electroforesis en gel y la electroforesis capilar) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75:93-102, 1998).

Un aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión a antígeno según la invención. Otro aspecto de la invención es la utilización de una proteína de unión a antígeno según la invención para la preparación de una composición farmacéutica. Un aspecto adicional de la invención es un método para la preparación de una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión a antígeno según la invención. En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo una composición farmacéutica, que contiene una proteína de unión a antígeno según la presente invención, formulada conjuntamente con un portador farmacéutico.

Otro aspecto de la invención es dicha composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer.

Otro aspecto de la invención es la proteína biespecífcia de unión a antígeno según la invención destinada al tratamiento del cáncer.

I; Otro aspecto de la invención es la utilización de una proteína de unión a antígeno según la invención para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer.

Otro aspecto de la invención es un método de tratamiento de un paciente, que sufre de cáncer, mediante la administración de una proteína de unión a antígeno según la ivnención en dicho paciente que necesita dicho tratamiento.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "portador farmacéutico" incluye cualquiera y la totalidad de los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicps, agentes isotónicos y de retraso de la absorción y similares que son fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el portador resulta adecuado para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo mediante inyección o infusión).

Una composición de la presente invención puede administrarse mediante una diversidad de métodos conocidos de la técnica. Tal como apreciará el experto en la materia, la vía y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Para administrar un compuesto de la invención mediante determinadas vías de administración, puede resultar necesario recubrir el compuesto con un material, o coadministrar el compuesto con un material, para impedir su inactivación. Por ejemplo, el compuesto puede administrarse en un sujeto en un portador apropiado, por ejemplo liposomas o un diluyente. Entre los diluyentes farmacéuticamente aceptables se incluyen solución salina y soluciones tamponadoras acuosas. Entre los portadores farmacéuticos se incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. La utilización de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocida de la técnica.

Las expresiones "administración parenteral" y "administrado parenteralmente" tal como se. utilizan en la presente memoria se refieren a modos de administración diferentes de la administración entérica y tópica, habitualmente mediante inyección, e incluyen, sin limitarse a las mismas, las inyecciones e infusiones intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal-, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal El término "cáncer" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a enfermedades proliferativas, tales como linfomas, leucemias linfocíticas, cáncer de pulmón, cáncer de células pulmonares no pequeñas (NSCL), cáncer pulmonar de células bronquioloalveolares, cáncer óseo, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer ovárico, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de los tubos de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cérvix, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula adrenal, sarcoma del tejido blando, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de tiñón o uretra, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, neoplasma del sistema nervioso central (SNC), tumores del eje espinal, glioma del tallo cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwanomas, ependinomas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma pituitario y sarcoma de Ewings, incluyendo las versiones refractarias de cualquiera de los cánceres anteriormente indicados, o de una combinación de uno o más de los cánceres anteriormente indicados.

Dichas composiciones también pueden contener adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede garantizarse tanto mediante procedimientos de esterilización, supra, como mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo parabén, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede resultar deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro sódico y similares en las composiciones. Además, puede conseguirse la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Con independencia de la vía de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden utilizarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos por el experto en la materia.

Los niveles reales de las dosis de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden modificarse de manera que se obtenga una cantidad del ingrediente activo que resulte efectiva para conseguir la respuesta terapéutica deseada en un paciente, composición y modo de administración particulares, sin resultar tóxicos para el paciente. El nivel de dosis seleccionado dependerá de una diversidad de factores farmacocinéticos, incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención utilizadas, la vía de administración, el momento de la administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se utiliza, la duración del tratamiento, otros fármacos, los compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares utilizadas, la edad, sexo, peso, condición, estado de salud general e historia médica del paciente bajo tratamiento, y factores similares bien conocidos de la técnica médica.

La composición debe ser estéril y líquida en grado suficiente para que la composición resulte administrable mediante jeringa. Además de agua, el portador preferentemente es una solución salina tamponada isotónica.

Puede mantenerse la fluidez correcta, por ejemplo mediante la utilización de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento de un tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión, y mediante la utilización de surfactantes. En muchos casos, resulta preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes, tales como manitol o sorbitol, y cloruro sódico en la composición.

Tal como se utilizan en la presente memoria, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan intercambiablemente y todas dichas expresiones incluyen la progenie. De esta manera, las expresiones "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula sujeto primario y los cultivos derivados de la misma con independencia del número de transferencias. También debe interpretarse que toda la progenie puede no ser exactamente idéntica en su contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o naturales. Se encuentra incluida la progenie variante que presenta la misma función o actividad biológica según el cribado realizado en la célula originalmente transformada. En donde se pretendan utilizar denominaciones diferentes, éstas resultarán evidentes a partir del contexto.

El término "transformación" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un procedimiento de transferencia de un vector/ácido nucleico al interior de una célula huésped. En el caso de que se utilicen células sin grandes barreras de pared celular como células huésped, la transfección se lleva a cabo mediante, por ejemplo, el método de precipitación con fosfato de calcio, tal como describen Graham y Van der Eb, Virology 52:456ff, 1978. Sin embargo, también pueden utilizarse otros métodos para introducir ADN en células, tales como la inyección nuclear o la fusión de protoplasto. En el caso de que se utilicen células procarióticas o células que contenga construcciones sustanciales de pared celular, un método de transfección es, por ejemplo, el tratamiento de calcio utilizando cloruro de calcio tal como se describe en Cohén, S.N. et al, PNAS 69:2110-2114, 1972.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "expresión" se refiere al procedimiento por el que se transcribe un ácido nucleico en ARNm y/o al procedimiento por el que el ARNm transcrito (también denominado "transcrito") se traduce posteriormente en péptidos, polipéptidos o proteínas. Los transcritos y los polipéptidos codificados se denominan colectivamente "producto génico". En el caso de que se derive el polinucleótido de ADN genómico, la expresión en una célula eucariótica puede incluir el procesamiento del ARNm.

Un "vector" es una molécula de ácidos nucleicos, en particular autorreplicativa, que transfiere una molécula de ácidos nucleicos insertada al interior de células huésped o entre las mismas. El término incluye vectores que funcionan principalmente insertando ADN o ARN en una célula (por ejemplo la integración cromosómica), la replicación de vectores que funcionan principalmente replicando ADN o ARN, y los vectores de expresión que funcionan transcribiendo y/o traduciendo ADN o ARN. También se encuentran incluidos los vectores que proporcionan más de una de las funciones anteriormente descritas.

Un "vector de expresión" es un polinucleótido que, al introducirlo en una célula huésped apropiada, puede transribirse y traducirse en un polipéptido. Un "sistema de expresión" habitualmente se refiere a una célula huésped adecuada que comprende un vector de expresión que puede funcionar rindiendo un producto de expresión deseado.

Los ejemplos, listado de secuencias y figuras siguientes se proporcionan para ayudar a comprender la presente invención, el alcance real de la cual se proporciona en las reivindicaciones adjuntas. Debe entenderse que resulta posible llevar a cabo modificaciones de los procedimientos indicados sin apartarse del espíritu de la invención.

Descripción del listado de secuencias SEC ID n° 1 cadena pesada modificada del anticuerpo de <Ang-2> con dominios VH- CH1 del anticuerpo de <Ang-2> fusionados en el extremo C-terminal SEC ID n° 2 cadena ligera no modificada del anticuerpo de <Ang-2> SEC ID n° 3 cadena pesada modificada del anticuerpo de <VEGF> con intercambio CH I-CL y con dominios VH-CL del anticuerpo de <VEGF> fusionados con el extremo C-terminal SEC ID n° 4 cadena ligera modificada del anticuerpo de <VEGF> con intercambio CHI -CL (dominios VL-CH 1 del anticuerpo de <VEGF>) Descripción de las figuras Figura 1 Estructura esquemática de un anticuerpo de longitud completa sin unión específica del dominio CH4 a un primer antígeno 1 con dos parejas de cadena pesada y cadena ligera que comprenden dominios variables y constantes en un orden típico.

Figura 2 Estructura esquemática de dos posibilidades de apareamiento incorrecto (de entre cuatro), que conducen a un producto secundario no deseado ejemplar, reduciendo el rendimiento de un anticuerpo biespecífico tetravalente, que se une a un priemr antígeno 1 y a un segundo antígeno 2, y en el que no se intercambia ningún dominio.

Figura 3 Estructura esquemática de una proteína de unión a antígeno biespecífica tetravalente según la ivnención; el apareamiento incorrecto resulta afectado negativamente por la sustitución de los dominios CH1 y CL en las cadenas pesada y ligera del anticuerpo que se une específicamente al segundo antígeno.

Figura 4 Estructura esquemática de una proteína de unión a antígeno biespecífica tetravalente según la invención con botón Ejemplos Materiales y métodos generales Se proporciona información general sobre secuencias de nucleótidos de cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas humanas en: Kabat E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Los aminoácidos de las cadenas de ariti cuerpo se numeran y se hace referencia a las mismas según la numeración EU (Edelman G.M. et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 63:78-85, 1969; Kabat E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).

Técnicas de ADN recombinante Se utilizan métodos estándares para manipular el ADN, tal como se describe en Sambrook J. et al, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Los reactivos biológicos moleculares se utilizaron siguiendo las instrucciones del fabricante.

Síntesis génica Se prepararon los segmentos génicos deseados a partir de oligonucleótidos construidos mediante síntesis química. Los segmentos génicos, que se encuentran flanqueados por sitios de restricción de corte por endonucleasa únicos, se ensamblan mediante hibridación y ligación de oligonucleótidos, incluyendo la amplificación por PCR, y posteriormente se clonan utilizando los. sitios de restricción indicados, por ejemplo Kpnl/SacI o AscI/PacI en un vector de cloanción pGA4 basado en pPCRScript (Stratagene). Las secuencias de ADN de los fragmentos génicos subclonados se confirman mediante secuenciación del ADN. Los fragmentos de síntesis génica se ordenan según las especificaciones proporcionadas por Geneart (Regensburg, Alemania).

Determinación de la secuencia de ADN Se determinaron las secuencias de ADN mediante secuenciación de doble cadena realizada en MediGenomix GmbH (Martinsried, Alemania) o en Sequiserve GmbH (Vaterstetten, Alemania).

Análisis de secuencias de ADN y de proteínas y gestión de los datos de secuencias El paquete informático del GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin), versión 10.2, y el programa informático Vector NTl Advance suite versión 8.0 de Infomax, se utilizaron para la creación de secuencias, mapeado, análisis, anotación e ilustración.

Vectores de expresión Para la expresión de los anticuerpos biespecíficos tetravalentes indicados se utilizan variantes de plásmidos de expresión para células de expresión transitoria (por ejemplo en células HEK293 EBNA o HEK293-F) basadas en una organización de ADNc con o sin un promotor intrón A de CMV o en una organización genómica con un promotor de CMV.

Aparte del cásete de expresión de anticuerpo, los vectores contenían: - un origen de replicación que permite la replicación de dicho plásmido en E. coli, y un gen ß-lactamasa que proporciona resistencia a la ampicilina a E. coli.

La unidad de transcripción del gen de anticuerpo está compuesta de los elementos siguientes: - uno o más sitios de restricción únicos en el extremo 5' el intensificador y promotor tempranos inmediatos del citomegalovirus humano, - seguido de la secuencia del intrón A en el caso de la organización de ADNc, - una región 5' no traducida de un gen de anticuerpo humano, - una secuencia de señal de cadena pesada de inmunoglobulina, - la cadena de anticuerpo biespecífico tetravalente humano (de tipo salvaje o con intercambio de dominios) en forma de ADNc o de organización genómica con la organización de exón-intrón de inmunoglobulina - una región 3' no traducida con una secuencia de señal de poliadenilación, y - uno o más sitios de restricción únicos en el extremo 3'.

Los genes de fusión que comprenden las cadenas de anticuerpo indicadas, tal como se indica posteriormente, se generan mediante PCR y/o síntesis génica, y se ensamblan utilizando métodos y técnicas recombinantes conocidos mediante conexión de los segmentos de ácidos nucleicos correspondientes, por ejemplo utilizando sitios de restricción únicos en los vectores respectivos. Las secuencias subclonadas de ácidos nucleicos se verificaron mediante secuenciación del ADN. Para las transfecciones transitarías, se prepararon cantidades mayores de los plásmidos a partir de cultivos de E. coli transformados (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).

Técnicas de cultivo celular Se utilizaron técnicas estándares de cultivo celular tal como se describe en Current Protocols in Cell Biology, Bonifacino J.S., Dasso M., Harford J.B., Lippincott-Schwartz J. y Yamada Y.M. (editores), John Wiley & Sons, Inc., 2000.

Se expresaron anticuerpos biespecíficos tetravalentes mediante cotransfección transitoria de los tres plásmidos de expresión respectivos en células HEK293-EBNA en crecimiento adherente o en células HEK29-F que crecían en suspensión, tal como se describe posteriormente. Se expresaron anticuerpos biespecíficos tetravalentes mediante cotransfección transitoria de los tres plásmidos de expresión .respectivos en células HEK293-EBNA en crecimiento adherente o en células HE 29-F que crecían en suspensión, tal como se describe posteriormente.

Transfecciones transitorias en el sistema HEK293-EBNA Se expresaron anticuerpos biespecífícos tetravalentes mediante cotransfección transitoria de los tres plásmidos de expresión respectivos (por ejemplo codificantes de la cadena pesada modificada, así como la cadenas correspondientes ligera y ligera modificada) en células HEK293-EBNA en crecimiento adherente (línea celular 293 renal embrionaria humana que expresa antígeno nuclear de virus de Epstein-Barr, número de depósito de la American Type Culture Collection (ATCC) n° CRL-1852, lote n° 959 218) cultivadas en DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco, Gibco) suplementado con FCS al 10% ultrabajo en IgG (suero de feto bovino, Gibco), L-glutamina 2 mM (Gibco) y geneticina 250 µg/ml (Gibco). Para la transfección, se utilizó reactivo de transfección FuGENE™ 6 (Roche Molecular Biochemicals) en una proporción de reactivo FuGENE™ (µ?) a ADN ^g) de 4: 1 (comprendida entre 3:1 y 6:1). Se expresaron proteínas a partir de los plásmidos respectivos utilizando una proporción molar de plásmidos codificantes de cadena ligera (modificada y de tipo salvaje) y pesada de 1 : 1 : 1 (equimolar) comprendida entre 1 : 1 :2 y 2:2: 1, respectivamente. Las células se alimentan el día 3 con L-glutamina 4 mM, glucosa [Sigma] y NAA [Gibco]. Los sobrenadantes de cultivo celular que contienen anticuerpo biespecífico ' tetravalente se recoelctaron entre los días 5 y 11 tras la transfección mediante centrifugaicón y se almacenaron a -20°C. Se proporciona información general sobre la expresión recombinante de inmunoglobulinas humanas en, por ejemplo, células HE 293, en: Meissner P. et al, Biotechnol. Bioeng. 75:197-203, 2001.

Transfecciones transitorias en el sistema HEK293-F Alternativamente, se generaron anticuerpos biespecífícos tetravalentes mediante transfección transitoria de los plásmidos respectivos (por ejemplo codificantes de la cadena pesada modificada, así como las cadenas ligera y ligera modificada correspondientes) utilizando el sistema HEK293-F (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se transfectaron células HE 293-F (Invitrogen) cultivadas en suspensión en un matraz de agitación o en un fermentador bajo agitación en medio de expresión FreeStyle 293 sin suero (Invitrogen) se transfectaron con una mezcla de los tres plásmidos de expresión tal como se ha indicado anteriormente y 293fectina o fectina (Invitrogen). En un matraz oscilante de 2 litros (Corning) se sembraron células HEK293-F a una densidad de 106 células/ml en 600 mi y se incubaron a 120 rpm en 8% de C02. El día después se transfectaron las células a una densidad celular de aproximadamente 1,5x106 células/ml con aproximadamente 42 mi de una mezcla formada por: A) 20 mi de Opti-MEM (Invitrogen) y 600 µg de ADN total de plásmido (1 µg/ml) codificante de las cadenas pesada modificada, ligera y ligera modificada correspondientes, en proporciones equimolares, y B) 20 mi de Opti-MEM + 1 ,2 mi de 293fectina o fectina (2 µ?/ml). Según el consumo de glucosa, se añadió solución de glucosa durante el curso de la fermentación. Tras 5 a 10 días se recolectó el sobrenadante que contenía el anticuerpo secretado, y los anticuerpos se purificaron directamente del sobrenadante o el sobrenadante se congeló y se almacenó.

Determinación de proteínas Se determinó la concentración de proteínas de anticuerpos biespecíficos tetravalentes purificados y derivados, mediante la determinación de la densidad óptica (DO) a 280 nm, utilizando el coeficiente de extinción molar calculado basándose en la secuencia de aminoácidos según Pace C.N. et al, Protein Science 4:2411-2423, 1995.

Determinación de la concentración de anticuerpos en sobrenadantes Se estimó la concentración de anticuerpos biespecíficos tetravalentes en sobrenadantes de cultivo celular mediante inmunoprecipitación con perlas de proteína A-agarosa (Roche). Se lavaron 60 µ? de perlas de agarosa-proteína A tres veces en TBS-NP40 (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Nonidet-P40 al 1%). Posteriormente, se aplicaron 1 a 15 mi de sobrenadante de cultivo celular a las perlas de agarosa-proteína A preequilibradas en TBS-NP40. Tras la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, las perlas se lavaron en una columna de filtro Ultrafree-MC (Amicon) una vez con 0,5 mi de TBS-NP40, dos veces con 0,5 mi de 2x de solución salina tamponada con fosfato (2xPBS, Roche) y brevemente cuatro veces con 0,5 mi de citrato sódi 100 mM, pH 5,0. El anticuerpo ligado se eluyó mediante la adición de 35 µ? de tampón para muestras NuPAGE® LDS (Invitrogen). Se combinó la mitad de la muestra con agente reductor de muestras NuPAGE® o se dejó sin reducir, respectivamente, y se calentó durante 10 minutos a 70°C. Después, se aplicaron 5 a 30 µ? a un SDS-PAGE Bis-Tris NuPAGE® al 4-12% (Invitrogen) (con tampón MOPS para SDS-PAGE no reducido y tampón MES con aditivo antioxidante de tampón de corrido NuPAGE® (Invitrogen) para un SDS-PAGE reducido) y se tiñó con azul de Coomassie.

Se midió cuantitativamente la concentración de anticuerpos biespecíficos tetravalentes en sobrenadantes de cultivo celular mediante cromatografía HPLC de afinidad. Brevemente, se aplicaron sobrenadantes de cultivo celular que contenían anticuerpos y derivados que se unen a la proteína A a una columna Poros A/20 de Applied Biosystems en KH2P04 200 mM, citrato sódico 100 mM, pH 7,4, y se eluyeron de la matriz con NaCl 200 mM, ácido cítrico 100 mM, pH 2,5 en un sistema HPLC 1 100 de Agilent. Las proteínas eluídas se cuantificaron mediante absorbancia de UV e integración de las áreas de los picos. Un anticuerpo IgGl estándar purificado sirvió como estándar.

Alternativamente, se midió la concentración de anticuerpos biespecíficos tetravalentes en sobrenadantes de cultivo celular mediante ELISA sándwich de IgG. Brevemente, se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocilios recubiertas con estreptavidina StreptaWell High Bind (Roche) con 100 µ?/pocillo de molécula de captura biotinilada anti-IgG humana F(ab')2<h-Fcy> BI (Dianova) a una concentración de 0,1 µg/ml durante 1 hora a temperatura ambiente, o alternativamente durante la noche a 4°C y posteriormente se lavaron tres veces con 200 µ?/pocillo de PBS, Tween al 0,05% (PBST, Sigma). Se añadieron 100 µ?/pocillo de una serie de dilución en PBS (Sigma) de sobrenadantes de cultivo celular que contenían el anticuerpo respectivo, a los pocilios y se incubaron durante 1 a 2 horas en un agitador de placas de microtitulación a temperatura ambiente. Los pocilios se lavaron tres veces con 200 µ?/pocillo de PBST y el anticuerpo ligado se detectó con 100 µ? de F(ab')2<hFcy>POD (Dianova) a una concentración de 0,1 µg/ml como anticuerpo de detección durante 1 a 2 horas en un agitador para placas de microtitulación a temperatura ambiente. Se lavó el anticuerpo de detección no ligado tres veces con 200 µ?/pocillo de PBST y el anticuerpo de detección ligado se detectó mediante adición de 100 µ? de ABTS/pocillo. La determinación de la absorbancia se llevó a cabo en un espectrómetro Tecan Fluor a una longitud de onda de medición de 405 nm (longitud de onda de referencia: 492 nm).

Purificación de proteínas Se purificaron proteínas a partir de sobrenadantes de cultivo celular filtrados siguiendo protocolos estándares. Brevemente, se aplicaron anticuerpos biespecíficos tetravalentes a una columna de proteína A-sefarosa (GE Healthcare) y se lavaron con PBS. La elución de los anticuerpos biespecíficos tetravalentes se consiguió a pH 2,8, seguido de la neutralización inmediata de la muestra. Se separaron las proteínas agregadas de los anticuerpos monoméricos mediante cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 200, GE Healthcare) en PBS o en histidina 20 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0. Se agruparon las fracciones monoméricas, se concentraron en caso necesario utilizando, por ejemplo, un concentrador de centrífuga Amicon Ultra (valor de corte: 30 MWCO) de Millipore, se congelaron y se almacenaron a -20°C o a -80°C. Se reservó parte de las muestras para la analítica posterior de las proteínas y para la caracterización analítica, por ejemplo mediante SDS-PAGE, cromatografía de exclusión por tamaños o espectrometría de masas.

SDS-PAGE Se utilizó el sistema de gel NuP AGE® Pre-Cast (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. En particular, se utilizaron geles NuP AGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast (pH 6,4) y un tampón de corrido NuPage MES (geles reducidos con aditivo antioxidante NuPAGE® para tampón de corrido) o MOPS (geles no reducidos).

Cromatografía analítica de exclusión por tamaño La cromatografía de exclusión por tamaños para la determinación de la agregación y del estado oligomérico de los anticuerpos biespecíficos tetravalentes se llevó a cabo mediante cromatografía HPLC. Brevemente, se aplicaron anticuerpo purificados con proteína A en una columna Tosoh TSKgel G3000SW en NaCl 300 mM, KH2P04/K2HP04 50 mM, pH 7,5 en un sistema HPLC 1100 de Agilent o en una columna Superdex 200 (GE Healthcare) en 2xPBS en un sistema de HPLC de Dionex. Las proteínas eluídas se cuantificaron mediante absorbancia de UV e integración de las áreas de los picos. El estándar de filtración en gel 151-1901 de BioRad sirvió de estándar.

Espectrometría de masas Se determinó y se confirmó la masa desglucosilada total de los anticuerpos biespecíficos tetravalentes mediante espectrometría de masas de ionización por electropulverización (ESI-MS). Brevemente, se desglucosilaron 100 pg de anticuerpos purificados con N-glucosidasa F (PNGasaF, ProZyme) 50 mM en KH2P04/K2HP04 100 mM, pH 7, a 37°C durante 12 a 24 horas a una concentración de proteínas de hasta 2 mg/ml y posteriormente se desalaron mediante HPLC en una columna Sephadex G25 (GE Healthcare). Se determinó la masa de las cadenas pesada modificada, ligera y ligera modificada respectivas mediante ESI-MS tras la desglucosilación y reducción. Brevemente, se incubaron 50 pg de anticuerpo biespecífico tetravalente en 115 µ?, con 60 µ? de TCEP 1 M y 50 µ? de hidrocloruro de guanidina 8 M posteriormente desalado. Se determinó la masa total y la masa de las cadenas pesada y ligera reducidas mediante ESI-MS en un sistema Q-Star Elite MS dotado de una fuente NanoMate.

ELISA de unión a VEGF Se evaluaron las propiedades de unión de los anticuerpos biespecíficos tetravalentes en un ensayo ELISA con proteína VEGF165-His de longitud completa (R&D Systems). Para ello, se recubrieron placas de microtitulación de poliestireno transparente Falcon potenciadas, con 100 µ? de VEGF 165 humana recombinante 2 µ§/??1 (R&D Systems) en PBS durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4°C. Se lavaron los pocilios tres veces con 300 µ? de PBST (Tween-2 al 0,2%) y se bloquearon con 200 µ? de BSA al 2%-Tween-20 al 0,1% durante 30 minutos a temperatura ambiente y posteriormente se lavaron tres veces con 300 µ? de PBST. Se añadieron 100 µ?/pocillo de una serie de dilución de los anticuerpos biespecíficos tetravalentes purificados en PBS (Sigma) a los pocilios y se incubaron durante 1 hora en un agitador de placas de microtitulación a temperatura ambiente. Se lavaron los pocilios tres veces con 300 µ? de PBST (Tween-20 al 0,2%) y se detectó anticuerpo unido con 100 µ?/pocillo de F(ab') 0,1 µg/ml <hFcgamma>POD (Immunoresearch) en BSA al 2%-Tween-20 al 0,1% como anticuerpo de detección durante 1 hora en un agitador de placas de microtitulación a temperatura ambiente. Se lavó el anticuerpo de detección no ligado tres veces con 300 µ?/pocillo de PBST y el anticuerpo de detección ligado se detectó mediante adición de 100 µ? de ABTS/pocillo. La determinación de la absorbancia se llevó a cabo en un espectrómetro Tecan Fluor a una longitud de onda de medición de 405 nm (longitud de onda de referencia: 492 nm).

Unión de VEGF: Caracterización cinética de la unión de VEGF a 37°C mediante resonancia de plasmón superficial (Biacore) Con el fin de corroborar adicionalmente los resultados de la ELISA, se analizó cuantitativamente la unión de los anticuerpos biespecíficos tetravalentes a VEGF utilizando tecnología de resonancia de plasmón superficial en un instrumento Biacore TI 00 según el protocolo siguiente y utilizando el paquete de programas informáticos del TI 00. Brevemente, se capturaron anticuerpos biespecíficos tetravalentes en un chip CM5 mediante la unión a IgG de cabra antihumana (JIR 109-005-098). El anticuerpo de captura se inmovilizó mediante acoplamiento de grupos amino utilizando acoplamiento estándar de aminos, de la manera siguiente: El tampón HBS-N sirvió como tampón de corrido, la activación se llevó a cabo con la mezcla EDC/NHS con el objetivo de una densidad de ligando de 700 RU. Se diluyó el anticuerpo de captura en tampón de acoplamiento NaAc, pH 5,0, c=2 µ§/t??, finalmente se bloquearon los grupos carboxilo todavía activados mediante inyección de etanolamina 1 M La captura de los anticuerpos de <VEGF> biespecíficos tetravalentes se realizó a un caudal de 5 µ?/minuto y c=10 nM, se diluyó con tampón de corrido + BSA 1 mg/ml; debía alcanzarse un nivel de captura de aproximadamente 30 RU. Se utilizó VEGFrh (VEGFrh, R&D Systems n° de cat. 293-Ve) como analito. La caracterización cinética de la unión de VEGF a los anticuerpos de <VEGF> biespecíficos tetravalentes se llevó a cabo a 25°C o a 37°C en PBS + Tween-20 al 0,005% (v/v) como tampón de corrido. Se inyectó la muestra a un caudal de 50 µ?/minuto y un tiempo de asociación de 80 segundos y un tiempo de disociación de 1.200 segundos, con una serie de concentraciones de VEGFrh de 300 a 0,29 nM. La regeneración de la superficie de anticuerpo de captura libre se llevó a cabo con glicina 10 mM, pH 1,5, y un tiempo de contacto de 60 segundos tras cada ciclo de analito. Se calcularon las constantes cinéticas mediante la utilización del método habitual de doble referenciado (referencia de control: unión de VEGFrh a molécula de captura de IgG de cabra antihumana, blancos en la celda de flujo de medición, concentración de VEGFrh "0", modelo: de Langmuir unión 1 :1 (se fijó la Rmax a local debido a la unión de moléculas de captura).

ELISA de unión de Ang-2 Se evaluaron las propiedades de unión de los anticuerpos biespecíficos tetravalentes en un ensayo ELISA con proteína Ang-2-His de longitud completa (R&D Systems). Para ello, se recubrieron placas de microtitulación Falcon de poliestireno transparente potenciadas, con 100 µ? de Ang-2 recombinante humana 1 µg/ml (R&D Systems, sin portador) en PBS durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4°C. Se lavaron los pocilios tres veces con 300 µ? de PBST (Tween-20 al 0,2%) y se bloquearon con 200 µ? de BSA al 2%-Tween-20 al 0,1% durante 30 minutos a temperatura ambiente y posteriormente se lavaron tres veces con 300 µ? de PBST. Se añadieron 100 µ?/pocillo de una serie de dilución de los anticuerpos biespecíficos tetravalentes purificados en PBS (Sigma) a los pocilios y se incubaron durante 1 hora en un agitador de placas de microtitulación a temperatura ambiente. Se lavaron los pocilios tres veces con 300 µ? de PBST (Tween-20 al 0,2%) y el anticuerpo unido se detectó con 100 µ?/pocillo de F(ab') de <hk>POD (Biozol n° de cat. 206005) 0,1 µg/ml en BSA al 2%-Tween-20 al 0,1% como anticuerpo de detección, durante 1 hora en un agitador de placas de microtitulación a temperatura ambiente. Se lavó el anticuerpo de detección no ligado tres veces con 300 µ?/pocillo de PBST y el anticuerpo de detección ligado se detectó mediante adición de 100 µ? de ABTS/pocillo. La determinación de la absorbancia se llevó a cabo en un espectrómetro Tecan Fluor a una longitud de onda de medición de 405 nm (longitud de onda de referencia: 492 nm).

BIACORE de unión de Ang-2 Se investigó la unión de los anticuerpos biespecíficos tetravalentes a Ang-2 humana mediante resonancia de plasmón superficial utilizando un instrumento BIACORE TI 00 (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suecia). Brevemente, para las mediciones de afinidad, se inmovilizaron anticuerpos policlonales de cabra <hIgG-Fcy> en un chip CM5 mediante acoplamiento de grupos amina para la presentación de los anticuerpos biespecíficos tetravalentes contra Ang-2 humano. La unión se midió en tampón HBS (HBS-P (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0,005%, pH 7,4), 25°C. Se añadió Ang-2-His purificado (R&S Systems o purificado en el propio laboratorio) en diversas concentraciones en solución. Se midió la asociación mediante una inyección de Ang-2 de 3 minutos; se midió la disociación mediante lavado de la superficie del chip con tampón HBS durante 3 minutos y se estimó un valor de KD utilizando un modelo de unión de Lagmuir 1 : 1. Debido a la heterogeneidad de la preparación de Ang-2, no pudo observarse unión 1 :1 ; de esta manera, los valores de KD sólo son estimaciones relativas. Se restaron los datos de control negativo (por ejemplo las curvas de tampón) de las curvas de muestras para la corrección de la deriva intrínseca de la línea base del sistema y para la reducción de la señal de ruido. Se utilizó el programa Biacore TI 00 Evaluation versión 1.1.1, para el análisis de los sensorgramas y para el cálculo de los datos de afinidad. Alternativamente, pudo capturarse Ang-2 a un nivel de captura de entre 2.000 y 1.700 RU mediante un anticuerpo pentaHis (PentaHis-Ab sin BSA, Qiagen n° 34660) inmovilizado sobre un chip CM5 mediante acoplamiento de grupos amina (sin BSA) (ver posteriormente).

ELISA de formación de puentes de Ang-2-VEGF Se evaluaron las propiedades de unión de los anticuerpos biespecíficos tetravalentes en un ensayo ELISA con proteína VEGF165-His de longitud completa inmovilizada (R&D Systems) y proteína Ang-2-His humana (R&D Systems) para la detección de anticuerpo biespecífico unido. Únicamente un anticuerpo biespecífico tetravalente de <VEGF-Ang-2> es capaz de unirse simultáneamente a VEGF y a Ang-2, y de esta manera establecer un puente entre los dos antígénos, mientras que los anticuerpos IgGl monoespecí fieos "estándares" no son capaces de unirse simultáneamente a VEGF y Ang-2 (figura 7).

Para ello, se recubrieron placas de microtitulación de poliestireno transparente Falcon potenciadas, con 100 µ? de VEGF 165 humana recombinante 2 \ig/m\ (R&D Systems) en PBS durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4°C. Se lavaron los pocilios tres veces con 300 µ? de PBST (Tween-2 al 0,2%) y se bloquearon con 200 µ? de BSA al 2%-Tween-20 al 0,1% durante 30 minutos a temperatura ambiente y posteriormente se lavaron tres veces con 300 µ? de PBST. Se añadieron 100 µ?/pocillo de una serie de dilución de anticuerpos biespecíficos tetravalentes purificados en PBS (Sigma) a los pocilios y se incubaron durante 1 hora en un agitador de placas de microtitulación a temperatura ambiente. Se lavaron los pocilios tres veces con 300 µ? de PBST (Tween-20 al 0,2%) y los anticuerpos unidos se detectaron mediante la adición de 100 µ? de Ang-2-His humana 0,5 µg/ml (R&D Systems) en PBS. Se lavaron los pocilios tres veces con 300 µ? de PBST (Tween-20 al 0,2%) y el Ang-2 unido se detectó con 100 µ? de anticuerpo de <Ang-2>mIgGl-biotina 0,5 g/ml (BAM0981, R&D Systems) durante 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo de detección no unido se lavó tres veces con 300 µ? de PBST (Tween-20 al 0,2%) y los anticuerpos unidos se detectaron mediante la adición de 100 µ? de conjugado de estreptavidina-POD 1 :2.000 (Roche Diagnostics GmbH, n° de cat. 11089153) diluido 1 :4 en tampón de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. El conjugado de estreptavidina-POD no unido se lavó tres-seis veces con 300 µ? de PBST (Tween-20 al 0,2%) y el conjugado de estreptavidina-POD unido se detectó mediante la adición de 100 µ? de ABTS/pocillo. La determinación de la absorbancia se llevó a cabo en un espectrómetro Tecan Fluor a una longitud de onda de medición de 405 nm (longitud de onda de referencia: 492 nm).

Demostración de la unión simultánea de anticuerpo biespecífico tetravalente de <VEGF-Ang-2> a VEGF-A y a Ang-2 mediante Biacore Con el fin de corroborar adicionalmente los datos de la ELISA de formación de puentes, se estableció un ensayo adicional para confirmar la unión simultánea a VEGF y a Ang-2 utilizando tecnología de resonancia de plasmón superficial en un instrumento Biacore T100 siguiendo el protocolo siguiente, y se realizando el análisis con el paquete de programas informáticos del T100 (T100 Control, versión 2.01, T100 Evaluation, versión 2.01, T100 Kinetics Summary, versión 1.01): Se capturó Ang-2 con un nivel de captura de entre 2.000 y 1.700 RU en PBS, tampón de corrido Tween-20 al 0,005%) (v/v), utilizando un anticuerpo PentaHis (PentaHis-Ab sin BSA, Qiagen n° 34660) inmovilizado sobre un chip CM5 mediante acoplamiento de grupos amina (sin BSA). El tampón HBS-N sirvió como tampón de corrido durante el acoplamiento; la activación se llevó a cabo coñ una mezcla de EDC NHS. El anticuerpo de captura sin BSA PentaHis-Ab se diluyó en tampón de acoplamiento NaAc, pH 4,5, c=30 µ§/??1, finalmente los grupos carboxilo todavía activados se bloquearon mediante la inyección de etanolamina 1 M; se sometieron a ensayo densidades de ligando de entre 5.000 y 17.000 RU. Se capturó Ang-2 a una concentración de 500 nM con el anticuerpo PentaHis-Ab a un caudal de 5 µ?/minuto diluido con tampón de corrido + BSA 1 mg/ml. A continuación, se demostró la unión a Ang-2 y a VEGF del anticuerpo biespecífico tetravalente <Ang-2, VEGF> mediante incubación con VEGFrh y la formación de un complejo sandwich. Para ello, se unió el anticuerpo biespecífico tetravalente <VEGF-Ang-2> a Ang-2 a un caudal de 50 µ?/minuto y a una concentración de 100 nM, se diluyó con tampón de corrido + BSA 1 mg/ml y se detectó la unión simultánea mediante incubación con VEGF (VEGFrh, R&D-Systems, n° de cat. 293-VE) en PBS + . tampón de corrido Tween-20 al 0,005% (v/v) a un caudal de 50 µ?/minuto y una concentración de VEGF de 150 nM. Tiempo de asociación: 120 segundo; tiempo de disociación: 1.200 segundos. La regeneración se llevó a cabo tras cada ciclo a un caudal de 50 µ?/minuto con 2x10 mM de glicina, pH 2,0, y un tiempo de contacto de 60 segundos. Se corrigieron los sensorgramas utilizando el método habitual de doble referenciado (referencia de control: unión de anticuerpo biespecífico y VEGFrh a la molécula de captura PentaHisAb). Se midieron los blancos para cada Ab con VEGFrh concentración "0".

Generación de la línea celular HEK293-Tie2 Con el fin de determinar la interferencia de los anticuerpos biespecíficos tetravalentes <Ang-2, VEGF> con la fosforilación de Tie2 estimulada por Ang-2 y la unión de Ang-2 a Tie2 sobre las células, se generó una línea celular recombinante HEK293-Tie. Brevemente, se transfectó un plásmido basado en pcDNA3 (RB22-pcDNA3 Topo hTie2) codificante de Tie2 humano de longitud completa bajo el control de un promotor de CMV y un marcador de resistencia a la neomicina, utilizando Fugene (Roche Applied Science) como reactivo de transfección en células HEK293 (ATCC) y las células resistentes se seleccionaron en DMEM+FCS al 10%, G418 500 µg/ml. Se aislaron clones individuales mediante un aro de clonación, y se analizaron posteriormente para la expresión de Tie2 mediante FACS. Se identificó el clon 22 como clon con elevada expresión estable de Tie2, incluso en ausencia de G418 (HEK293-Tie2 clon 22). Seguidamente se utilizó HEK293-Tie2 clon 22 para los ensayos celulares siguientes: ensayo de fosforilación de Tie2 inducida por Ang-2 y ensayo de unión de ligando celular Ang-2.

Ensayo de fosforilación de Tic2 inducida por Ang-2 Se midió la inhibición de la fosforilación de Tie2 inducida por Ang-2 por parte de los anticuerpos biespecíficos tetravalentes <Ang-2, VEGF> según el principio de ensayo siguiente. Se estimuló HEK293-Tie2 clon 22 con Ang-2 durante 5 minutos en ausencia o en presencia de anticuerpo de Ang-2 y se cuantificó P-Tie2 mediante un ELISA sandwich. Brevemente, se cultivaron 2x105 células de HEK293-Tie2 clon 22 por pocilio durante la noche en una placa de microtitulación de 96 pocilios recubiertos con poli-D-lisina en 100 µ? de DMEM, FCS al 10%, geneticina 500 µg/ml. Al día siguiente, se preparó una fila de titulación de anticuerpos biespecíficos tetravalentes <Ang-2, VEGF> en una placa de microtitulación (concentrada 4 veces, volumen final de 75 µ?/pocillo, por duplicado) y se mezcló con 75 µ? de una dilución de Ang-2 (R&D Systems, n° 623-AN) (3,2 µg/ml en forma de solución concentrada 4 veces). Se preincubaron anticuerpos y Ang-2 durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 100 µ? de la mezcla a las células HEK293-Tie2 clon 22 (preincubadas durante 5 minutos con NaV304 1 mM, Sigma n° S6508) y se incubaron durante 5 minutos a 37°C. A continuación, las células se lavaron con 200 µ? de PBS helado + NaV304 1 mM por pocilio y se lisaron mediante la adición de 120 µ? de tampón de lisis (Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 137 mM, NP-40 al 1%, glicerol al 10%, EDTA 2 mM, NaV304 1 mM, PMSF 1 mM y aprotinina 10 µg/ml) por pocilio sobre hielo. Se lisaron las células durante 30 minutos a 4°C en un agitador de placas de microtitulación y se transfirieron directamente 100 µ? de Usado a una placa de microtitulación ELISA de p-Tie2 (R&D Systems, R&D n° DY990) sin centrifugación previa y sin determinación de las proteínas totales. Se cuantificaron las cantidades de P-Tie2 siguiendo las instrucciones del fabricante y se determinaron los valores de IC50 para la inhibición utilizando el plug-in de análisis XLfit4 para Excel (respuesta de dosis de un sitio, modelo 205). Los valores de IC50 pueden compararse dentro de un experimento dado, pero pueden variar entre experimentos.

Ensayo de proliferación de HUVEC inducida por VEGF La proliferación de HUVEC (células endoteliales de la vena umbilical humana, Promocell n° C- 12200) inducida por VEGF se seleccionó para medir la funicón celular de los anticuerpos biespecíficos tetravalentes <Ang-2, VEGF>. Brevemente, se incubaron 5.000 células HUVEC (número de pases reducido, <5 pases) por cada pocilio de placa de 96 pocilios, en 100 µ? de medio de ayuno (EMB-2, medio endotelial basal 2, Promocell n° C-22211, FCS al 0,5%, penicilina/estreptomicina) en una placa de microtitulación de 96 pocilios recubierta con colágeno I (BD Biocoat Collagen I) (BD n° 354407/35640) durante la noche. Se mezclaron diversas concentraciones de anticuerpo biespecífico tetravalente <Ang-2, VEGF> con VEGFrh (concentración final: 30 ng/ml, BD n° 354107) y se preincubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añadió la mezcla a las células HUVEC y se incubaron durante 72 horas a 37°C, 5% de C02. El día del análisis, la placa se equilibró a la temperatura ambiente durante 30 minutos y se determinó la viabilidad/proliferación celular utilizando el kit de ensayo luminiscente de viabilidad celular CellTiter-Glo™ según el manual (Promega, n° G7571/2/3). Se determinó la luminiscencia con un espectrofotómetro.

Ejemplo 1 Producción, expresión, purificación y caracterización de una proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno que reconoce Ang-2 y VEGF-A En un primer ejemplo se preparó una proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno que reconocía Ang-2 y VEGF-A mediante la fusión mediante un conector (G4S)4 de una fusión de dominio VH-CH1 de un anticuerpo que reconoce Ang-2, con el extremo C-terminal de la cadena pesada de dicho anticuerpo que reconoce Ang-2 (SECl), y mediante la fusión mediante un conector (G4S)4 de una fusión de dominio VH-CL de un anticuerpo que reconoce VEGF-A, con el extremo C-terminal de la cadena pesada de un anticuerpo de intercambio CH1-CL que reconoce VEGF (SEC3). Con el fin de inducir la heterodimerización de las dos cadenas pesadas respectivas, SECl contiene, por ejemplo, la secuencia de botón (T366W), y SEC2 contiene, por ejemplo, las secuencias de ojal T366S, L368A y Y407V, así como dos residuos de cisteína introducidos S354C/Y349C, respectivamente, para formar un puente disulfuro estabilizador tras la heterodimerización. Con el fin de obtener la proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno según la invención, dichos constructos de cadena pesada se coexprearon con plásmidos codificantes de la cadena ligera respectiva del anticuerpo de Ang-2 (SEC2) y una fusión de dominio VL- CH1 que reconoce VEGF-A (SEC4). En la fig. 4 se proporciona un esquema general de la proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno con modificación de botón-en-ojal.

Se generó la proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno tal como se describe en la sección de métodos generales mediante técnicas clásicas de biología molecular y se expresó transitoriamente en células HEK293F tal como se ha indicado anteriormente. A continuación, se purificó a partir del sobrenadante mediante una combinación de cromatografía de afinidad de proteína A y cromatografía de exclusión por tamaño. El producto obtenido se caracterizó para la identidad mediante espectrometría de masas y propiedades analíticas, tales como la pureza, mediante SDS-PAGE, contenido de monómeros y estabilidad. expresión purificación Título rendimiento de producto homogeneidad (producto final) Og/ml] final 9,8 16,7 mg/1 29 % Estos datos muestran que la proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno puede producirse con un buen rendimiento y es estable.

A continuación, se estudió la unión a Ang-2 y a VEGF-A, así como la unión simultánea, mediante los ensayos ELISA y Biacore indicados anteriormente, y se analizaron las propiedades funcionales, tales como la inhibición de la fosforilación de Tie2 y la inhibición de la proliferación de HUVEC inducida por VEGF, mostrando que el anticuerpo biespecífico tetravalente generado era capaz de unirse a Ang-2 y a VEGF-A y de bloquear su actividad simultáneamente.

Claims

Reivindicaciones Proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno, que comprende: a) cadena pesada modificada de un primer anticuerpo, que se une específicamente a un primer antígeno, y al que se fusiona el extremo C-terminal de dicha cadena pesada, adicionalmente los dominios VH-CH 1 de dicho primer anticuerpo, mediante su extremo N-terminal, b) dos cadenas ligeras de dicho primer anticuerpo en a), c) una cadena pesada modificada de un segundo anticuerpo, que se une específicamente a un segundo antígeno, • en el que el dominio CH 1 se sustituye por el dominio CL de dicho segundo anticuerpo y al que se fusiona el extremo C -terminal de dicha cadena pesada, adicionalmente los dominios VH-CL de dicho segundo anticuerpo, mediante su extremo N-terminal, y d) dos cadenas ligeras modificadas de dicho segundo anticuerpo en c), en el que el dominio CL se sustituye por el dominio CH 1 de dicho segundo anticuerpo, Proteína de unión a antígeno según la reivindicación 1 , caracterizada porque el dominio CH3 de la cadena pesada modificada del anticuerpo en a) y el dominio CH3 de la cadena pesada modificada del anticuerpo en c) se reúnen, cada uno, en una interfaz que comprende una interfaz original entre los dominios CH3 de anticuerpo, en donde dicha interfaz se altera para estimular la formación de la proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno, en la que la alteración se caracteriza porque: i) el dominio CH3 de una cadena pesada se encuentra alterado, de manera que, en la interfaz original, el dominio CH3 de una cadena pesada que se reúne con la interfaz original del dominio CH3 de la otra cadena psada en la proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno, se sustituye un residuo aminoácido por un residuo aminoácido de volumen de cadena lateral más grande, generando de esta manera una protuberancia en el interior de la interfaz del dominio CH3 de una cadena pesada, pudiendo situarse dicha protuberancia en una cavidad en el interior de la interfaz del dominio CH3 de la otra cadena pesada, e ii) el dominio CH3 de la otra cadena pesada ha sido alterado, de manera que, dentro de la interfaz original del segundo dominio CH3 que se reúne con la interfaz original del primer dominio CH3 en la proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno, se sustituye un residuo aminoácido por un residuo aminoácido de volumen de cadena lateral más pequeño, generando de esta manera una cavidad en el interior de la interfaz del segundo dominio CH3, en el interior de la cual puede situarse una protuberancia dentro de la interfaz del primer dominio CH3. Proteína de unión a antígeno según la reivindicación 2, caracterizada porque dicho residuo aminoácido que presenta un volumen mayor de cadena lateral se selecciona de entre el grupo que consiste de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W) y dicho residuo aminoácido que presenta un volumen menor de cadena lateral se selecciona de entre el grupo que consiste de alanina (A), serina (S), treonina (T) y valina (V). Pro teína de unión a antígeno según las reivindicaciones 2 ó 3, caracterizada porque ambos dominios CH3 se han alterado adicionalmente mediante la introducción de cisteína (C) como aminoácido en las posiciones correspondientes de cada dominio CH3, de manera que puede formarse un puente disulfuro entre ambos dominios CH3. Método para la preparación de una proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno según las reivindicaciones 1 a 4, que comprende las etapas siguientes: a) transformar una célula huésped con vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de una proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno según las reivindicaciones 1 a 4 b) cultivar la célula huésped bajo condiciones que permiten la síntesis de dicha molécula de proteína de unión a antígeno, y c) recuperar dicha molécula de proteína de unión a antígeno a partir de dicho cultivo. Célula huésped que comprende los vectores según la reivindicación 5. Composición farmacéutica que comprende la proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno según las reivindicaciones 1 a 4 y por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno según las reivindicaciones 1 a 4 para el tratamiento del cáncer. Utilización de la proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno según las reivindicaciones 1 a 4, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer. Método para el tratamiento de un paciente que necesita terapia, caracterizado por la administración en el paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína biespecífica tetravalente de unión a antígeno según las reivindicaciones 1 a