JP2015507193A - 多重特異性結合物の結合パートナーを検出するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
抗体を用いた標準的な固相イムノアッセイ法は、固相に吸着させた/固定した抗体(捕捉抗体)と、抗原と、酵素または検出可能な標識と連結させた、抗原の別のエピトープに対する抗体(トレーサー抗体)との間での複合体形成を伴う。このアッセイ法において、固相/捕捉抗体/抗原/トレーサー抗体というサンドイッチが形成される。サンドイッチによって触媒される反応において、特に、抗体と連結された酵素の活性は、インキュベーション媒体中の抗原濃度に比例する。抗イディオタイプ抗体アッセイ法は、例えば、US5,219,730(特許文献1);WO87/002778(特許文献2);EP0139389(特許文献3);およびEP0170302(特許文献4)において言及されている。Wadhwa, M., et al. (J. Immunol. Methods 278 (2003) 1-17)(非特許文献1)では、治療用の生物由来物質によって誘発される望まれない抗体の検出、測定、および特徴付けのための戦略が報告されている。抗イディオタイプ抗体を作製するための方法は、EP1917854(特許文献5)において報告されている。
‐該抗原および該二重特異性抗体を含む試料を、該二重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体と共にインキュベートする段階であって、該抗イディオタイプ抗体が固相に結合されている、段階。
‐抗原および二重特異性抗体を含む試料を、該二重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体と共にインキュベートする段階であって、該抗イディオタイプ抗体が固相に結合されている、段階、ならびに
-抗原と二重特異性抗体と抗イディオタイプ抗体との複合体を検出し、それによって、二重特異性抗体の抗原の存在および/または量を測定する段階。
-抗原および二重特異性抗体を含む試料を、該二重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体と共にインキュベートする段階であって、該抗イディオタイプ抗体が固相に結合されている、段階、ならびに
-第1の段階で形成された複合体を、該二重特異性抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープにおいて該抗原に特異的に結合する抗体と共にインキュベートし、かつそれによって、試料中の二重特異性抗体の該抗原の存在および/または量を測定する段階。
-抗原および二重特異性抗体を含む試料を提供する段階であって、少なくとも90%の該抗原が該二重特異性抗体と複合体形成する、段階、
-該抗原および該二重特異性抗体を含む試料を、該二重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体と共にインキュベートする段階であって、該抗イディオタイプ抗体が固相に結合されている、段階、ならびに
-第1の段階で形成された複合体を、該二重特異性抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープにおいて該抗原に特異的に結合する抗体と共にインキュベートし、かつそれによって、試料中の二重特異性抗体の該抗原の存在および/または量を測定する段階。
-抗原および二重特異性抗体を含む試料をインキュベートする段階であって、該二重特異性抗体が、少なくとも90%の該抗原が該二重特異性抗体と複合体形成する試料を提供する量である、段階、
-該二重特異性抗体と複合体形成した該抗原を含む試料を、該二重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体と共にインキュベートする段階であって、該抗イディオタイプ抗体が固相に結合されている、段階、ならびに
-前の段階で形成された複合体を、該二重特異性抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープにおいて該抗原に特異的に結合する抗体と共にインキュベートし、かつそれによって、試料中の二重特異性抗体の該抗原の存在および/または量を測定する段階。
-抗原および二重特異性抗体を含む試料の第1のアリコートをインキュベートする段階であって、該二重特異性抗体が、少なくとも90%の該抗原が該二重特異性抗体と複合体形成する試料を提供する量である、段階、
-該二重特異性抗体と複合体形成した該抗原を含む試料を、該二重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体と共にインキュベートする段階であって、該抗イディオタイプ抗体が固相に結合されている、段階、ならびに
-前の段階で形成された複合体を、該二重特異性抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープにおいて該抗原に特異的に結合する抗体と共にインキュベートし、かつそれによって、試料中の二重特異性抗体の該抗原の存在および/または量を測定し、かつそれによって、該試料中に存在する該抗原の総量を測定する段階、
-該抗原および該二重特異性抗体を含む該試料の第2のアリコートを、該二重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体と共にインキュベートする段階であって、該抗イディオタイプ抗体が固相に結合されている、段階、ならびに
-形成された複合体を、該二重特異性抗体が結合している該エピトープとは異なるエピトープにおいて該抗原に特異的に結合する抗体と共にインキュベートし、かつそれによって、試料中に存在する二重特異性抗体の遊離型抗原の量を測定する段階、ならびに
-試料中に存在する該抗原の総量と試料中に存在する遊離型抗原の量の差によって、二重特異性抗体の抗体結合型抗原の量を測定する段階。
-(第1の)結合パートナーおよび多重特異性結合物を含む試料を、多重特異性結合物の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性によって特異的に結合され得る第2の結合パートナーと共にインキュベートする段階。
-(第1の)結合パートナーおよび多重特異性結合物を含む試料を、多重特異性結合物の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性に特異的に結合する単一特異性結合物と共にインキュベートする段階、ならびに
-多重特異性結合物を枯渇させた試料中の(遊離型の第1の)結合パートナーの量を測定する段階。
-(第1の)結合パートナーおよび多重特異性結合物を含む試料を、多重特異性結合物の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性に特異的に結合する単一特異性結合物と共にインキュベートする段階、
-単一特異性結合物と多重特異性結合物との複合体を試料から枯渇させた後に、遊離型の結合パートナーの存在または量を測定する段階、ならびに
-多重特異性結合物を枯渇させた試料中の(遊離型の第1の)結合パートナーの量を測定する段階。
-多重特異性抗体、多重特異性抗体結合型の(第1の)抗原、および遊離型の(第1の)抗原を含む試料を、該多重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性によって特異的に結合され得る第2の抗原と共にインキュベートする段階。
-多重特異性抗体、多重特異性抗体結合型の(第1の)抗原、および遊離型の(第1の)抗原を含む試料を、該多重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性によって特異的に結合され得る第2の抗原と共にインキュベートする段階、ならびに
-多重特異性抗体を枯渇させた試料中の(第1の)抗原の量を測定する段階。
-(第1の)抗原および多重特異性抗体を含む試料を、該多重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性によって特異的に結合され得る第2の抗原と共にインキュベートする段階、
-第2の抗原と多重特異性抗体との複合体を試料から枯渇させた後に、遊離型抗原の存在または量を測定する段階、ならびに
-多重特異性抗体を枯渇させた試料中の(第1の)抗原の量を測定する段階。
-多重特異性抗体、多重特異性抗体結合型の(第1の)抗原、および遊離型の(第1の)抗原を含む試料を、該多重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性によって特異的に結合され得る第2の抗原と共にインキュベートして、第2の抗原と多重特異性抗体との複合体形成させる段階、ならびに
-第2の抗原と多重特異性抗体との複合体を該試料から除去する段階。
-(第1の)抗原および多重特異性抗体を含む試料を、該多重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性によって特異的に結合され得る第2の抗原と共にインキュベートして、第2の抗原と多重特異性抗体との複合体形成させる段階、
-第2の抗原と多重特異性抗体との複合体を該試料から除去する段階、ならびに
-多重特異性抗体を枯渇させた試料中の(第1の)抗原の量を測定する段階。
-多重特異性抗体を枯渇させた試料を、(第1の)抗原に特異的に結合する捕捉抗体と共にインキュベートして、捕捉抗体と(第1の)抗原との複合体形成させる段階、および
-形成された捕捉抗体と(第1の)抗原との複合体を、試料中の(第1の)抗原の量と関連付ける段階。
-多重特異性抗体を枯渇させた試料を、(第1の)抗原に特異的に結合する捕捉抗体と共にインキュベートして、捕捉抗体と(第1の)抗原との複合体形成させる段階、
-捕捉抗体と(第1の)抗原との複合体をトレーサー抗体と共にインキュベートする段階であって、捕捉抗体およびトレーサー抗体が(第1の)抗原上の重複しないエピトープに結合する、段階、ならびに
-形成された捕捉抗体と(第1の)抗原とトレーサー抗体との複合体を、該試料中の該抗原の量と関連付ける段階。
-多重特異性抗体を枯渇させた試料を、(第1の)抗原に特異的に結合する捕捉抗体と共にインキュベートして、捕捉抗体と(第1の)抗原との複合体形成させる段階、
-捕捉抗体と(第1の)抗原との複合体をトレーサー抗体と共にインキュベートする段階であって、捕捉抗体およびトレーサー抗体が(第1の)抗原上の重複しないエピトープに結合する、段階、
-捕捉抗体と(第1の)抗原とトレーサー抗体との複合体を、検出可能な標識を含む検出抗体と共にインキュベートする段階であって、該検出抗体が、該トレーサー抗体の可変ドメインの外側のエピトープにおいて該トレーサー抗体に特異的に結合する、段階、ならびに
-形成された捕捉抗体と(第1の)抗原とトレーサー抗体との複合体を、試料中の(第1の)抗原の量と関連付ける段階。
-形成された複合体を試料から枯渇させた後に、(第1の)抗原の存在または量を測定する段階。
-(第1の)抗原を含む試料を、二重特異性抗体と第2の抗原との複合体、または二重特異性抗体と、二重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体との複合体と共にインキュベートする段階。
-第1の段階で形成された複合体を、二重特異性抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープにおいて第1の抗原に特異的に結合する抗体と共にインキュベートする段階。
-(第1の)抗原を含む試料を、二重特異性抗体および第2の抗原、または二重特異性抗体および二重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体と共にインキュベートする段階であって、第2の抗原または抗イディオタイプ抗体が固相に結合されている、段階。
-第1の段階で形成された複合体を、二重特異性抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープにおいて第1の抗原に特異的に結合する抗体と共にインキュベートし、かつそれによって、試料中の二重特異性抗体の(第1の)抗原の量を測定する段階。
-(第1の)抗原および該二重特異性抗体を含む試料を、該二重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体と共にインキュベートする段階であって、該抗イディオタイプ抗体が固相に結合されている、段階。
-第1の段階で形成された複合体を、二重特異性抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープにおいて第1の抗原に特異的に結合する抗体と共にインキュベートし、かつそれによって、試料中の二重特異性抗体と複合体形成している(第1の抗原と二重特異性抗体との複合体)、二重特異性抗体の(第1の)抗原の量を測定する段階。
-形成された複合体を試料から枯渇させた後に、(第1の)抗原の存在または量を測定する段階。
前臨床試料および臨床試料において二重特異性抗体/薬物のような多重特異性結合物の「遊離型結合パートナーおよび/またはすべての結合パートナー(total binding partner)」を検出するために試料を前処理するためのインビトロの方法が、本明細書において報告される。
-(第1の)抗原および多重特異性抗体を含む試料を、該多重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性によって特異的に結合され得る第2の抗原と共にインキュベートし、それによって多重特異性抗体を試料から除去する段階。
-(第1の)抗原および多重特異性抗体を含む試料を、該多重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性によって特異的に結合され得る第2の抗原と共にインキュベートして、第2の抗原と多重特異性抗体との複合体形成させる段階、ならびに
-第2の抗原と多重特異性抗体との複合体を該試料から除去する段階。
-(第1の)抗原および多重特異性抗体を含む試料を、該多重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性によって特異的に結合され得る第2の抗原と共にインキュベートして、第2の抗体(antibody)と多重特異性抗体との複合体形成させる段階、
-第2の抗原と多重特異性抗体との複合体を該試料から除去する段階、ならびに
-多重特異性抗体を枯渇させた試料中の(第1の)抗原の量を測定する段階。
-第2の抗原と多重特異性抗体との複合体を試料から枯渇させた後に、遊離型の(第1の)抗原の存在または量を測定する段階。
-(第1の)抗原および多重特異性抗体を含む試料を、該多重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性によって特異的に結合され得る第2の抗原と共にインキュベートする段階、
-第2の抗原と多重特異性抗体との複合体を試料から枯渇させた後に、遊離型の(第1の)抗原の存在または量を測定する段階、ならびに
-多重特異性抗体を枯渇させた試料中の(第1の)抗原の量を測定する段階。
-多重特異性抗体を枯渇させた試料を、(第1の)抗原に特異的に結合する捕捉抗体と共にインキュベートして、捕捉抗体と抗原との複合体形成させる段階、および
-形成された捕捉抗体と(第1の)抗原との複合体の量を、該試料中の該抗原の量と関連付ける段階。
-多重特異性抗体を枯渇させた試料を、(第1の)抗原に特異的に結合する捕捉抗体と共にインキュベートして、捕捉抗体と(第1の)抗原との複合体形成させる段階、
-捕捉抗体と(第1の)抗原との複合体をトレーサー抗体と共にインキュベートする段階であって、捕捉抗体およびトレーサー抗体が(第1の)抗原上の重複しないエピトープに結合する、段階、ならびに
-形成された捕捉抗体と(第1の)抗原とトレーサー抗体との複合体を、試料中の(第1の)抗原の量と関連付ける段階。
-多重特異性抗体を枯渇させた試料を、(第1の)抗原に特異的に結合する捕捉抗体と共にインキュベートして、捕捉抗体と(第1の)抗原との複合体形成させる段階、
-捕捉抗体と(第1の)抗原との複合体をトレーサー抗体と共にインキュベートする段階であって、捕捉抗体およびトレーサー抗体が(第1の)抗原上の重複しないエピトープに結合する、段階、
-捕捉抗体と(第1の)抗原とトレーサー抗体との複合体を、検出可能な標識を含む検出抗体と共にインキュベートする段階であって、該検出抗体が、該トレーサー抗体の可変ドメインの外側のエピトープにおいて該トレーサー抗体に特異的に結合する、段階、ならびに
-形成された捕捉抗体と(第1の)抗原とトレーサー抗体との複合体を、試料中の(第1の)抗原の量と関連付ける段階。
-抗原Xおよび抗原Yに特異的に結合する二重特異性抗体(抗X/Y抗体)との複合体を構築する段階:
一定濃度の抗原Xを、第1の結合特異性によって抗原Xに特異的に結合し、第2の結合特異性によって抗原Yに特異的に結合する漸増量の二重特異性モノクローナル抗体(抗X/Y抗体)と共に室温で1時間インキュベートする。その後、この試料を枯渇段階の陽性対照として使用する。
-枯渇段階:
抗X/Y抗体に結合した抗原Xを枯渇させる場合、ビオチン標識抗原(Y-BI)をストレプトアビジンでコーティングされた約10μg/mlの磁性ビーズ(SA-ビーズ)に結合させる。各試料について、600μlのSA-ビーズを洗浄し、磁気分離器を用いて上清から分離させる。ビオチン標識抗原Yを含む溶液600μlをSA-ビーズと混合し、室温で約1時間インキュベートする。磁気分離器を用いてビーズを3回洗浄することによって、過剰の未結合抗原を除去する。その後、抗原Yでコーティングされたビーズを、抗X/Y抗体と抗原Xとの複合体を含む約250μlの試料と共にインキュベートする。室温で約1時間、振盪しながら、混合物をインキュベートする。インキュベーション後、磁気分離器を用いてビーズを試料から分離させる。ELISAによって「遊離型」抗原Xの分析をするために、上清を採取する(例えば、実施例2を参照されたい)。残存しているビーズをELECSYS容器に移した。ユーザーガイドの標準的な操作手順に従ってELECSYS 2010分析器を用いて、ビーズに結合した抗原X(二重特異性抗体結合型抗原X)を分析する。
-(第1の)抗原および二重特異性抗体を含む試料を、二重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体と共にインキュベートする段階。
-(第1の)抗原および二重特異性抗体を含む試料を、二重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体と共にインキュベートする段階、
-抗イディオタイプ抗体と二重特異性抗体との複合体を該試料から除去する段階、ならびに
-二重特異性抗体を枯渇させた試料中の該抗原の量を測定する段階。
-(第1の)抗原および該二重特異性抗体を含む試料を、該二重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体と共にインキュベートする段階であって、該抗イディオタイプ抗体が固相に結合されている、段階。
-第1の段階で形成された複合体を、二重特異性抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープにおいて(第1の)抗原に特異的に結合する抗体と共にインキュベートし、かつそれによって、試料中の二重特異性抗体と複合体形成している((第1の)抗原と二重特異性抗体との複合体)、二重特異性抗体の(第1の)抗原の存在および/または量を測定する段階。
二重特異性薬物分子の場合の、薬物に結合された標的(抗体結合型抗原)の枯渇
A)抗c-MET/HER3二重特異性抗体とc-METとの複合体の構築
一定濃度のc-METを、第1の結合特異性によってc-METに特異的に結合し、第2の結合特異性によってHER3に特異的に結合する漸増量の二重特異性抗体(抗c-MET/HER3二重特異性抗体)と共に室温で1時間インキュベートした。その後、これらの試料を枯渇段階の陽性対照として使用した。
抗c-MET/HER3二重特異性抗体に結合したc-METを枯渇させる場合、ビオチン標識HER3(HER3-BI)を、ストレプトアビジンでコーティングされた10μg/mlの磁性ビーズ(SAビーズ)に結合させた。各試料について、600μlのSA-ビーズを洗浄し、磁気分離器を用いて上清から分離させた。HER3-BIを含む溶液約600μlをSA-ビーズと混合し、室温で1時間インキュベートした。磁気分離器を用いてビーズを3回洗浄することによって、過剰の未結合HER3-BIを除去した。その後、抗原でコーティングされたビーズを、抗c-MET/HER3二重特異性抗体とc-METとの複合体を含む試料250μlと共にインキュベートした。試料を振盪しながら室温で1時間インキュベートした。インキュベーション後、磁気分離器を用いてビーズを試料から分離させた。ELISAによって「遊離型」c-METの分析をするために、上清を採取した(実施例2を参照されたい)。
c-METを検出するためのELISA
第1の段階において、c-METに対するビオチン標識モノクローナル抗体をストレプトアビジンマイクロタイタープレートにコーティングした。枯渇段階から得た上清試料(実施例1を参照されたい)を10倍希釈し、抗c-MET抗体でコーティングしたマイクロプレートのウェルに添加した。マイクロプレートのウェルにコーティングされた抗c-MET抗体が、試料中に含まれる遊離型c-METに結合した。室温で1時間のインキュベーション期間の後、プレートを3回洗浄することによって試料を除去した。その後、コーティングしている抗体とは特異性、すなわちエピトープが異なるDIG標識モノクローナル抗c-MET抗体をウェルに添加し、室温でさらに1時間インキュベートした。洗浄段階をもう1度行った後、HRP標識ポリクローナル抗DIG抗体をプレートに添加し、さらに1時間インキュベートした。ABTS基質溶液を用いて、呈色反応を開始させた(図3を参照されたい)。
ヒト血清および緩衝液中の薬物結合型c-METの枯渇。
実施例1に従って、抗c-MET/HER3二重特異性抗体を濃度20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.1μg/ml、および0μg/mlにそれぞれ希釈し、一定濃度100ng/mlのc-METと共にインキュベートした。希釈物は以下の2種の異なるマトリックス中で作製した:
・PBS/BSA緩衝液
・ヒト血清プール(Trina、NHSベースのマトリックス(NHS Base matrix))
他の抗原の助けを借りて二重特異性抗体の抗原を検出するためのELISA
a)試料中の(全)c-METの量の検出
第1の段階において、ビオチン標識HER3をストレプトアビジンマイクロタイタープレートに結合させた。並行して、試料/標準物質と共に抗c-MET/HER3二重特異性抗体を1時間プレインキュベートした。プレインキュベーションの間、試料中のc-METを抗c-MET/HER3二機能性抗体に結合させた。ストレプトアビジンでコーティングされたプレートを洗浄した後、プレインキュベートしたc-METおよび抗c-MET/HER3抗体の混合物をプレートに添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄段階をもう1度行って、未結合成分を試料から除去した後、ジゴキシゲニン標識抗c-MET抗体(抗c-MET/HER3二機能性抗体として異なるc-METエピトープに結合する)を添加し、1時間インキュベートした。洗浄段階をもう1度行った後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識ポリクローナル抗DIG抗体をプレートに添加し、1時間インキュベートした。ABTS基質溶液を用いて、呈色反応を開始させた(図5aを参照されたい)。
第1の段階において、ビオチン標識HER3をストレプトアビジンマイクロタイタープレートに結合させた。プレートを洗浄した後、試料および標準物質をプレートに添加し、室温で1時間インキュベートした。抗c-MET/HER3二重特異性抗体とc-METとの複合体を、固定したHER3-BIに結合させた。洗浄段階をもう1度行った後、抗c-MET/HER3二機能性抗体として異なるc-METエピトープに特異的に結合するジゴキシゲニン標識抗c-MET抗体を添加し、1時間インキュベートした。洗浄段階をもう1度行った後、HRP標識ポリクローナル抗DIG抗体をプレートに添加し、1時間インキュベートした。ABTS基質溶液を用いて、呈色反応を開始させた(図5(A)を参照されたい)。
二重特異性抗体の第1の抗原を、この二重特異性抗体の第2の結合特異性に対する抗イディオタイプ抗体の助けを借りて検出するためのELISA
a)試料中の(全)c-METの量の検出
HER3に特異的に結合する結合特異性に対するビオチン標識抗イディオタイプ抗体(抗HER3抗体に対する抗イディオタイプ抗体-BI)を、第1の段階で、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレートに結合させる。並行して、試料または標準物質と共に抗c-MET/HER3二重特異性抗体を1時間プレインキュベートする。プレインキュベーション段階で、試料中のc-METに抗c-MET/HER3二重特異性抗体を特異的に結合させる。ストレプトアビジンでコーティングされたプレートを洗浄した後、プレインキュベートしたc-METおよび抗c-MET/HER3二重特異性抗体の混合物をプレートに添加し、室温で1時間インキュベートする。洗浄段階をもう1度行って未結合成分を除去した後、(抗c-MET/HER3二重特異性抗体として異なるc-METエピトープに特異的に結合する)ジゴキシゲニン標識抗c-MET抗体を添加し、1時間インキュベートする。洗浄段階をもう1度行った後、HRP標識ポリクローナル抗DIG抗体をプレートに添加し、さらに1時間インキュベートする。ABTS基質溶液を用いて、呈色反応を開始させる(図5(B)を参照されたい)。
HER3に特異的に結合する結合特異性に対するビオチン標識抗イディオタイプ抗体(抗HER3抗体に対する抗イディオタイプ抗体-BI)を、第1の段階で、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレートに結合させる。プレートを洗浄した後、試料および標準物質を室温で1時間、プレートに添加する。抗c-MET/HER3抗体とc-METとの複合体を、固定した抗イディオタイプ抗体によって捕捉する。洗浄段階をもう1度行った後、抗c-MET/HER3二重特異性抗体として異なるc-METエピトープに特異的に結合するジゴキシゲニン標識抗c-MET抗体を添加し、1時間インキュベートする。洗浄段階をもう1度行った後、HRP標識ポリクローナル抗DIG抗体をプレートに添加し、1時間インキュベートする。ABTS基質溶液を用いて、呈色反応を開始させる(図5(B)を参照されたい)。
VEGFと抗ANG2/VEGF二重特異性抗体との複合体を検出するためのELISA
抗ANG2/VEGF抗体のANG2結合特異性に特異的に結合する、抗ANG2抗体に対するビオチン標識モノクローナル抗イディオタイプ抗体を、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレート(MTP)にコーティングした。未知の量のVEGFと抗ANG2/VEGF抗体との複合体を含む試料を10倍希釈し、抗ANG2抗体に対する抗イディオタイプ抗体でコーティングしたMTPのウェルに添加した。ANG2およびVEGFに特異的に結合する二重特異性抗体は、二重特異性抗体のANG2結合特異性を有するCDRに対する固定された抗イディオタイプ抗体と複合体形成した。二重特異性抗体とVEGFとの複合体もまた、結合された。室温で1時間のインキュベーション期間の後、試料/上清を除去し、次いで、プレートを3回洗浄した。その後、(検出されるべき抗ANG2/VEGF二重特異性抗体とは異なるVEGFエピトープに結合する)ジゴキシゲニン標識モノクローナル抗VEGF抗体をウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄段階の後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識ポリクローナル抗ジゴキシゲニン抗体(抗DIG抗体)をプレートに添加し、1時間インキュベートした。上清を除去し洗浄した後、呈色反応のためにABTS基質溶液を添加した(図7を参照されたい)。
ANG2と抗ANG2/VEGF二重特異性抗体との複合体を検出するためのELISA
抗ANG2/VEGF抗体のVEGF結合特異性に特異的に結合するビオチン標識モノクローナル抗イディオタイプ抗体を、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレート(MTP)にコーティングした。未知の量のANG2と抗ANG2/VEGF抗体との複合体を含む試料を10倍希釈し、抗VEGF抗体に対する抗イディオタイプ抗体でコーティングしたMTPのウェルに添加した。ANG2およびVEGFに特異的に結合する二重特異性抗体は、抗ANG2/VEGF二重特異性抗体のVEGF結合特異性を有するCDRに対する固定された抗イディオタイプ抗体と複合体形成した。二重特異性抗体とANG2との複合体もまた、結合された。室温で1時間のインキュベーションの後、試料/上清を除去し、次いで、プレートを3回洗浄した。その後、(抗ANG2/VEGF二重特異性抗体のANG2結合特異性とは異なるエピトープに特異的に結合する)ジゴキシゲニン標識モノクローナル抗ANG2抗体をウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄段階の後、HRP標識ポリクローナル抗ジゴキシゲニン抗体をプレートに添加し、1時間インキュベートした。上清を除去し洗浄した後、呈色反応のためにABTS基質溶液を添加した(図9を参照されたい)。
VEGFと抗ANG2/VEGF二重特異性抗体との複合体を検出するためのELISA
VEGFに対するビオチン標識モノクローナル抗体を、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレート(MTP)にコーティングした。洗浄後、未知の量のVEGFと抗ANG2/VEGF抗体との複合体を含む試料を10倍希釈し、抗VEGF抗体でコーティングしたMTPのウェルに添加した。VEGFに対する固定された抗体は、抗ANG2/VEGF二重特異性抗体と比べて異なる結合部位においてVEGFに結合する。VEGFと抗ANG2/VEGF抗体との複合体は、固定された抗VEGF抗体に結合する。室温で1時間のインキュベーションの後、試料/上清を除去し、次いで、プレートを3回洗浄した。その後、抗ANG2/VEGF抗体のANG2結合特異性に特異的に結合するジゴキシゲニン標識モノクローナル抗イディオタイプ抗体をウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄段階の後、HRP標識ポリクローナル抗ジゴキシゲニン抗体をプレートに添加し、1時間インキュベートした。上清を除去し洗浄した後、呈色反応のためにABTS基質溶液を添加した(図11を参照されたい)。対応する検量線を図12に示す。
遊離型ANG2の抗体結合型ANG2への変換および抗ANG2/VEGF二重特異性抗体とのインキュベーションによる、全ANG2を検出するためのELISA
抗ANG2/VEGF抗体のVEGF結合特異性に特異的に結合するビオチン標識モノクローナル抗イディオタイプ抗体を、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレート(MTP)に結合させた。遊離型ANG2を抗ANG2/VEGF抗体結合型ANG2に変換するために、未知の量のANG2を含む試料の第1のアリコートを1.5μg/mLの抗ANG2/VEGF二重特異性抗体と共に1時間インキュベートした。第2の(すなわち、インキュベートしていない)試料アリコートおよび抗体と共にインキュベートした(antibody incubated)試料アリコートを10倍希釈し、二重特異性抗体のVEGF結合特異性に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体でコーティングしたMTPのウェルに添加した。二重特異性抗体は、固定された抗イディオタイプ抗体によって結合された。同様に、複合体形成したANG2が、二重特異性抗体を介して結合された。室温で1時間のインキュベーション期間の後、上清(=試料)を除去し、次いで、プレートを3回洗浄した。その後、(抗ANG2/VEGF二重特異性抗体のANG2結合特異性とは異なるエピトープに特異的に結合する)ジゴキシゲニン標識モノクローナル抗ANG2抗体をウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄段階の後、HRP標識ポリクローナル抗ジゴキシゲニン抗体をプレートに添加し、1時間インキュベートした。上清を除去し洗浄した後、呈色反応のためにABTS基質溶液を添加した(図13を参照されたい)。第1のアリコートから得られた結果と第2のアリコートから得られた結果の差から、遊離型ANG2の量を算出した。このようにして、このアッセイ法によって、抗体結合型ANG2および遊離型ANG2の量を決定した。
Claims (21)
- 以下の段階を含む、試料中の二重特異性抗体の抗原の存在および/または量を測定するための方法であって、検出されるべき抗原が、該二重特異性抗体の第1の結合特異性によって特異的に結合され得、かつ該抗原が二重特異性抗体と複合体形成する(抗原と二重特異性抗体との複合体)、方法:
-該抗原および該二重特異性抗体を含む試料を、該二重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体と共にインキュベートする段階であって、該抗イディオタイプ抗体が固相に結合されている、段階。 - 以下の段階を含むことを特徴とする、請求項1記載の方法:
-抗原および二重特異性抗体を含む試料を、該二重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体と共にインキュベートする段階であって、該抗イディオタイプ抗体が固相に結合されている、段階、ならびに
-抗原と二重特異性抗体と抗イディオタイプ抗体との複合体を検出し、それによって、二重特異性抗体の抗原の存在および/または量を測定する段階。 - 以下の段階を含むことを特徴とする、請求項1または2記載の方法:
-抗原および二重特異性抗体を含む試料を、該二重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体と共にインキュベートする段階であって、該抗イディオタイプ抗体が固相に結合されている、段階、ならびに
-第1の段階で形成された複合体を、該二重特異性抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープにおいて該抗原に特異的に結合する抗体と共にインキュベートし、かつそれによって、試料中の二重特異性抗体の該抗原の存在および/または量を測定する段階。 - 二重特異性抗体と複合体形成する該二重特異性抗体の抗原の存在および/または量を測定するためのものであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 以下の段階を含むことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法:
-抗原および二重特異性抗体を含む試料を提供する段階であって、少なくとも90%の該抗原が該二重特異性抗体と複合体形成する、段階
-抗原および二重特異性抗体を含む試料を、該二重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体と共にインキュベートする段階であって、該抗イディオタイプ抗体が固相に結合されている、段階、ならびに
-第1の段階で形成された複合体を、該二重特異性抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープにおいて該抗原に特異的に結合する抗体と共にインキュベートし、かつそれによって、試料中の二重特異性抗体の該抗原の存在および/または量を測定する段階。 - 以下の段階を含むことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法:
-抗原および二重特異性抗体を含む試料をインキュベートする段階であって、該二重特異性抗体が、少なくとも90%の該抗原が該二重特異性抗体と複合体形成する試料を提供する量である、段階、
-該二重特異性抗体と複合体形成した該抗原を含む試料を、該二重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体と共にインキュベートする段階であって、該抗イディオタイプ抗体が固相に結合されている、段階、ならびに
-前の段階で形成された複合体を、該二重特異性抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープにおいて該抗原に特異的に結合する抗体と共にインキュベートし、かつそれによって、試料中の二重特異性抗体の該抗原の存在および/または量を測定する段階。 - 二重特異性抗体の量が、1μg/ml試料〜10μg/ml試料の間であることを特徴とする、請求項6記載の方法。
- 少なくとも95%の抗原が二重特異性抗体と複合体形成することを特徴とする、請求項6または7記載の方法。
- 少なくとも98%の抗原が二重特異性抗体と複合体形成することを特徴とする、請求項8記載の方法。
- 以下の段階を含む、試料中の、二重特異性抗体の抗体結合型抗原の量を測定するための方法であって、該抗原が、該二重特異性抗体の第1の結合特異性によって特異的に結合され得る、方法:
-抗原および二重特異性抗体を含む試料の第1のアリコートをインキュベートする段階であって、該二重特異性抗体が、少なくとも90%の該抗原が該二重特異性抗体と複合体形成する試料を提供する量である、段階、
-該二重特異性抗体と複合体形成した該抗原を含む試料を、該二重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体と共にインキュベートする段階であって、該抗イディオタイプ抗体が固相に結合されている、段階、ならびに
-前の段階で形成された複合体を、該二重特異性抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープにおいて該抗原に特異的に結合する抗体と共にインキュベートし、かつそれによって、試料中の二重特異性抗体の該抗原の存在および/または量を測定し、かつそれによって、該試料中に存在する該抗原の総量を測定する、段階、
-該抗原および該二重特異性抗体を含む該試料の第2のアリコートを、該二重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体と共にインキュベートする段階であって、該抗イディオタイプ抗体が固相に結合されている、段階、ならびに
-形成された複合体を、該二重特異性抗体が結合している該エピトープとは異なるエピトープにおいて該抗原に特異的に結合する抗体と共にインキュベートし、かつそれによって、試料中に存在する二重特異性抗体の遊離型抗原の量を測定する段階、ならびに
-試料中に存在する該抗原の総量と試料中に存在する遊離型抗原の量の差によって、二重特異性抗体の抗体結合型抗原の量を測定する段階。 - 以下の段階を含む、試料中の多重特異性抗体の抗原の存在および/または量を測定するための方法であって、該抗原が、該多重特異性抗体の第1の結合特異性によって特異的に結合され得る、方法:
-抗原および多重特異性抗体を含む試料を、該多重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性によって特異的に結合され得る第2の抗原と共にインキュベートする段階、ならびに
-第2の抗原と多重特異性抗体との複合体を試料から除去した後に、抗原の存在および/または量を測定する段階。 - 第2の抗原が固相に連結されていることを特徴とする、請求項11記載の方法。
- 第2の抗原が常磁性ビーズに連結されていることを特徴とする、請求項11または12記載の方法。
- 以下の段階を含むことを特徴とする、請求項11〜13のいずれか一項記載の方法:
-抗原および多重特異性抗体を含む試料を、該多重特異性抗体の第1の結合特異性とは異なる第2の結合特異性によって特異的に結合され得る第2の抗原と共にインキュベートして、第2の抗原と多重特異性抗体との複合体形成させる段階、
-第2の抗原と多重特異性抗体との複合体を該試料から除去する段階、ならびに
-多重特異性抗体を枯渇させた試料中の該抗原を測定する段階。 - 抗原を測定する段階が以下の段階を含むことを特徴とする、請求項11〜14のいずれか一項記載の方法:
-多重特異性抗体を枯渇させた試料を、該抗原に特異的に結合する捕捉抗体と共にインキュベートして、捕捉抗体と抗原との複合体形成させる段階、および
-形成された捕捉抗体と抗原との複合体を、該試料中の該抗原の量と関連付ける段階。 - 抗原を測定する段階が以下の段階を含むことを特徴とする、請求項11〜15のいずれか一項記載の方法:
-多重特異性抗体を枯渇させた試料を、該抗原に特異的に結合する捕捉抗体と共にインキュベートして、捕捉抗体と抗原との複合体形成させる段階、
-該捕捉抗体と抗原との複合体をトレーサー抗体と共にインキュベートする段階であって、該捕捉抗体および該トレーサー抗体が該抗原上の重複しないエピトープに結合する、段階、ならびに
-形成された捕捉抗体と抗原とトレーサー抗体との複合体を、該試料中の該抗原の量と関連付ける段階。 - 抗原を測定する段階が以下の段階を含むことを特徴とする、請求項11〜16のいずれか一項記載の方法:
-多重特異性抗体を枯渇させた試料を、該抗原に特異的に結合する捕捉抗体と共にインキュベートして、捕捉抗体と抗原との複合体形成させる段階、
-該捕捉抗体と抗原との複合体をトレーサー抗体と共にインキュベートする段階であって、該捕捉抗体および該トレーサー抗体が該抗原上の重複しないエピトープに結合する、段階、
-捕捉抗体と抗原とトレーサー抗体との複合体を、検出可能な標識を含む検出抗体と共にインキュベートする段階であって、該検出抗体が、該トレーサー抗体の可変ドメインの外側のエピトープにおいて該トレーサー抗体に特異的に結合する、段階、ならびに
-形成された捕捉抗体と抗原とトレーサー抗体との複合体を、該試料中の該抗原の量と関連付ける段階。 - 多重特異性抗体が、第1の抗原にまたは抗原上の第1のエピトープに特異的に結合する第1の結合特異性を有しかつ第2の抗原にまたは該抗原上の第2のエピトープに特異的に結合する第2の結合特異性を有する、二重特異性抗体であることを特徴とする、請求項11〜17のいずれか一項記載の方法。
- 測定が、多重特異性抗体の遊離型抗原についてであることを特徴とする、請求項11〜18のいずれか一項記載の方法。
- 以下の段階を含む、試料中の二重特異性抗体と複合体形成している該二重特異性抗体の抗原の量を測定するための方法:
-該抗原および該二重特異性抗体を含む試料を、該抗原が結合されている結合特異性とは異なる該二重特異性抗体の結合特異性に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体と共にインキュベートする段階であって、該抗イディオタイプ抗体が固相に結合されている、段階。 - 第2の段階として以下の段階を含むことを特徴とする、請求項20記載の方法:
-第1の段階で形成された複合体を、該二重特異性抗体が結合している該エピトープとは異なるエピトープにおいて該抗原に特異的に結合する抗体と共にインキュベートし、かつそれによって、試料中の二重特異性抗体と複合体形成している二重特異性抗体の抗原の量を測定する、段階。
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