JPH0975096A - ラクトフェリンの測定法 - Google Patents
ラクトフェリンの測定法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 標的抗原をラクトフェリンとする二重特異性
抗体、それを産生するハイブリッドハイブリドーマ及び
この抗体を用いるラクトフェリン濃度の測定法の提供。 【解決手段】 ラクトフェリン及びペルオキシダーゼに
対して抗原特異性を有する二重特異性抗体。抗ラクトフ
ェリン抗体及び抗ペルオキシダーゼ抗体を産生する２種
類のハイブリドーマを細胞配合し、このハイブリドーマ
のみを選択培養して得ることのできる二重特異性抗体を
産生するハイブリドーマ。この二重特異性抗体を用いて
ＥＬＩＳＡ法により試料中のラクトフェリン濃度を迅速
簡便で精度高く測定する方法。
抗体、それを産生するハイブリッドハイブリドーマ及び
この抗体を用いるラクトフェリン濃度の測定法の提供。 【解決手段】 ラクトフェリン及びペルオキシダーゼに
対して抗原特異性を有する二重特異性抗体。抗ラクトフ
ェリン抗体及び抗ペルオキシダーゼ抗体を産生する２種
類のハイブリドーマを細胞配合し、このハイブリドーマ
のみを選択培養して得ることのできる二重特異性抗体を
産生するハイブリドーマ。この二重特異性抗体を用いて
ＥＬＩＳＡ法により試料中のラクトフェリン濃度を迅速
簡便で精度高く測定する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ラクトフェリンと
ペルオキシダーゼに対し抗原特異性を有する二重特異性
抗体、その抗体を産生するハイブリッドハイブリドー
マ、及びその抗体を用いたラクトフェリンの測定法に関
する。詳しくは、ウシラクトフェリンと西洋ワサビペル
オキシダーゼに対し抗原結合性を有する二重特異性抗
体、それを産生するマウスハイブリッドハイブリドー
マ、及びその抗体を用いたウシラクトフェリンの測定法
に関する。本発明により、迅速簡便で精度の高いラクト
フェリンの測定が可能になる。
ペルオキシダーゼに対し抗原特異性を有する二重特異性
抗体、その抗体を産生するハイブリッドハイブリドー
マ、及びその抗体を用いたラクトフェリンの測定法に関
する。詳しくは、ウシラクトフェリンと西洋ワサビペル
オキシダーゼに対し抗原結合性を有する二重特異性抗
体、それを産生するマウスハイブリッドハイブリドー
マ、及びその抗体を用いたウシラクトフェリンの測定法
に関する。本発明により、迅速簡便で精度の高いラクト
フェリンの測定が可能になる。
【０００２】
【従来の技術】ラクトフェリンは乳中に含まれる分子量
約８万の糖タンパク質であり、１分子のラクトフェリン
は２分子の鉄と結合することが知られ、乳中の鉄輸送蛋
白質と考えられている。この蛋白質は、乳あるいは涙液
等に含まれており、非特異的な抗菌活性を有することが
知られている。この活性より敗血症、化学療法や自己免
疫疾患等による免疫低下に伴う炎症及び感染症の予防及
び治療薬、又、点眼薬や創傷の治療剤として従来より用
いられている。さらにこのような活性を期待して、食品
に添加する試みもなされている。しかし、ウシラクトフ
ェリンはヒトに対し抗原性を有する。それゆえ、アレル
ギー疾患等が懸念され、その配合量を考慮しなければな
らない。
約８万の糖タンパク質であり、１分子のラクトフェリン
は２分子の鉄と結合することが知られ、乳中の鉄輸送蛋
白質と考えられている。この蛋白質は、乳あるいは涙液
等に含まれており、非特異的な抗菌活性を有することが
知られている。この活性より敗血症、化学療法や自己免
疫疾患等による免疫低下に伴う炎症及び感染症の予防及
び治療薬、又、点眼薬や創傷の治療剤として従来より用
いられている。さらにこのような活性を期待して、食品
に添加する試みもなされている。しかし、ウシラクトフ
ェリンはヒトに対し抗原性を有する。それゆえ、アレル
ギー疾患等が懸念され、その配合量を考慮しなければな
らない。
【０００３】従来、ラクトフェリン濃度の測定は、ポリ
クローナル抗体を用いたロケット免疫電気泳動のよう
な、非常に繁雑な方法で行なわれることが多かった。し
かし、近年では酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によるラ
クトフェリンの測定が可能になった。この酵素免疫測定
法には、サンドイッチＥＬＩＳＡ法及び競争ＥＬＩＳＡ
法の２種類の方法が知られている。サンドイッチＥＬＩ
ＳＡ法は、目的とする抗原に対する抗体（１次抗体）を
プレートに固定化し、これに抗原を反応させる。さらに
酵素標識した抗体（酵素標識２次抗体、モノクローナル
抗体の場合はプレートに固定化したものとは異なるエピ
トープを認識する抗体）を加え、プレートに結合した酵
素活性によって抗原濃度を決定することができる。この
場合、抗原濃度の増加とともに、抗原濃度の指標となる
酵素活性は増加する。しかし、この方法は反応ステップ
が多い、測定に時間がかかる、又、酵素標識した二次抗
体をあらかじめ用意しておく必要がある等煩雑であり、
簡便性に問題を有する。一方、競争ＥＬＩＳＡ法による
ＥＬＩＳＡは、酵素標識した抗体を抗原と反応させ、抗
原と反応しなかった標識抗体をＥＬＩＳＡプレート上の
抗原に結合させることにより、試料中の抗原濃度を決定
することができる。この場合、抗原濃度増加とともに、
抗原濃度の指標となる酵素活性は減少する。この方法は
反応ステップは少ないが、やはり標識抗体の調製は必須
である。
クローナル抗体を用いたロケット免疫電気泳動のよう
な、非常に繁雑な方法で行なわれることが多かった。し
かし、近年では酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によるラ
クトフェリンの測定が可能になった。この酵素免疫測定
法には、サンドイッチＥＬＩＳＡ法及び競争ＥＬＩＳＡ
法の２種類の方法が知られている。サンドイッチＥＬＩ
ＳＡ法は、目的とする抗原に対する抗体（１次抗体）を
プレートに固定化し、これに抗原を反応させる。さらに
酵素標識した抗体（酵素標識２次抗体、モノクローナル
抗体の場合はプレートに固定化したものとは異なるエピ
トープを認識する抗体）を加え、プレートに結合した酵
素活性によって抗原濃度を決定することができる。この
場合、抗原濃度の増加とともに、抗原濃度の指標となる
酵素活性は増加する。しかし、この方法は反応ステップ
が多い、測定に時間がかかる、又、酵素標識した二次抗
体をあらかじめ用意しておく必要がある等煩雑であり、
簡便性に問題を有する。一方、競争ＥＬＩＳＡ法による
ＥＬＩＳＡは、酵素標識した抗体を抗原と反応させ、抗
原と反応しなかった標識抗体をＥＬＩＳＡプレート上の
抗原に結合させることにより、試料中の抗原濃度を決定
することができる。この場合、抗原濃度増加とともに、
抗原濃度の指標となる酵素活性は減少する。この方法は
反応ステップは少ないが、やはり標識抗体の調製は必須
である。
【０００４】従来よりモノクローナル抗体を用いた抗原
の免疫学的測定又は治療法が多く考案されているが、さ
らに、その効果を上げるため、二重特異性を有するハイ
ブリッドモノクローナル抗体を用いる方法も示されてい
る。例えば、特開平2-79970号公報には、ヒトリンホト
キシン及び癌細胞表面膜上の腫瘍関連抗原のそれぞれに
対し特異性を有する二重特異性抗体、又、特開平3-4709
0 号公報には、アンサトマイシン類及び標的抗原のそれ
ぞれに対し特異性を有する二重特異性抗体、又、特開平
4-50768 号公報には、標的抗原及びビオチン又はその誘
導体のそれぞれに対し特異性を有する二重特異性抗体、
又、特表平5-506563号公報には、ヒト癌細胞及びプロド
ラッグ活性化酵素のそれぞれに対し特異性を有する二重
特異性抗体等が開示されている。しかし、ラクトフェリ
ンを標的抗原とし、さらにその測定を簡便かつ高精度に
行える二重特異性抗体は存在しなかった。
の免疫学的測定又は治療法が多く考案されているが、さ
らに、その効果を上げるため、二重特異性を有するハイ
ブリッドモノクローナル抗体を用いる方法も示されてい
る。例えば、特開平2-79970号公報には、ヒトリンホト
キシン及び癌細胞表面膜上の腫瘍関連抗原のそれぞれに
対し特異性を有する二重特異性抗体、又、特開平3-4709
0 号公報には、アンサトマイシン類及び標的抗原のそれ
ぞれに対し特異性を有する二重特異性抗体、又、特開平
4-50768 号公報には、標的抗原及びビオチン又はその誘
導体のそれぞれに対し特異性を有する二重特異性抗体、
又、特表平5-506563号公報には、ヒト癌細胞及びプロド
ラッグ活性化酵素のそれぞれに対し特異性を有する二重
特異性抗体等が開示されている。しかし、ラクトフェリ
ンを標的抗原とし、さらにその測定を簡便かつ高精度に
行える二重特異性抗体は存在しなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上述のように、ラクト
フェリンの有用性は非常に高いが、その測定は煩雑であ
り、迅速簡便で精度の高い測定方法が求められていた。
本発明者らは、このような状況に鑑み鋭意研究の結果、
あらかじめ酵素標識抗体を作製することなく、ただ混合
するだけで酵素結合抗体複合体が形成され、目的の抗原
に対する親和性もあわせて持つような二重特異性抗体を
作出することに成功した。従って本発明は、ラクトフェ
リンを標的抗原とする二重特異性抗体、その抗体を産生
するハイブリッドハイブリドーマ、及びその抗体を用い
たラクトフェリン濃度の迅速簡便で精度の高い測定法を
提供することを課題とする。
フェリンの有用性は非常に高いが、その測定は煩雑であ
り、迅速簡便で精度の高い測定方法が求められていた。
本発明者らは、このような状況に鑑み鋭意研究の結果、
あらかじめ酵素標識抗体を作製することなく、ただ混合
するだけで酵素結合抗体複合体が形成され、目的の抗原
に対する親和性もあわせて持つような二重特異性抗体を
作出することに成功した。従って本発明は、ラクトフェ
リンを標的抗原とする二重特異性抗体、その抗体を産生
するハイブリッドハイブリドーマ、及びその抗体を用い
たラクトフェリン濃度の迅速簡便で精度の高い測定法を
提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明の二重特異性抗体
は、ハイブリッドハイブリドーマ法（米国特許第 4,47
4,893号）によって調製される。具体的には、抗ラクト
フェリン抗体及び抗ペルオキシダーゼ抗体を産生する２
種類のハイブリドーマを細胞融合し、そのハイブリッド
ハイブリドーマのみを選択培養することにより得られ
る。この時、抗ラクトフェリン抗体を得るための抗原と
しては、ウシ由来のものが好ましく、又、抗ペルオキシ
ダーゼ抗体を得るための抗原としては、西洋ワサビ由来
のものが好ましいが、それぞれと共通のエピトープを有
するものであれば、その由来は特に限定されない。細胞
融合はポリエチレングリコール法（M.R.Suresh et al.,
Methods in Enzymology, vol.121, pp210-228(198
6)）、電気パルス法（H.Tachibanaet al.,Human Antibo
dies and Hybridomas, vol.4, pp42-46(1993)）などを
用いることができる。細胞融合後、適当な選択培地を用
いて培養し、もとのハイブリドーマを死滅させ、ハイブ
リッドハイブリドーマのみを増殖させる。このハイブリ
ッドハイブリドーマを選択培養を行なうためには、ハイ
ブリドーマへの薬剤選択マーカーの付与が必須であり、
例えば６チオグアニン耐性や５ブロモデオキシウリジン
耐性のようなアミノプテリンによって細胞が死滅するも
の、ウアバイン耐性、ネオマイシン耐性などを利用す
る。又、アクチノマイシンＤのような、細胞増殖を不可
逆的に停止させる薬品処理でも良い。２種類のハイブリ
ドーマから増殖したハイブリッドハイブリドーマが、目
的とする二重特異性抗体を分泌しているかどうかはＥＬ
ＩＳＡ法によって測定する。目的抗原であるラクトフェ
リンを固定化したＥＬＩＳＡプレートにハイブリッドハ
イブリドーマが産生した二重特異性抗体を反応させ、さ
らにマーカーとなるペルオキシダーゼを添加して、プレ
ートに結合した酵素活性を測定する。ハイブリッドハイ
ブリドーマの培養、二重特異性抗体の精製等は常法に従
って行なう。小規模であればペトリディッシュやカルチ
ャーフラスコを用いる。中規模〜大規模培養ではスピナ
ーフラスコ、ホローファイバーあるいはタンクによる培
養を行なう。培地からの抗体の精製は塩析法、イオン交
換法、ヒドロキシアパタイト法、プロテインＡ法、プロ
テインＧ法、抗原固定化カラム法などで行なうことがで
きる。
は、ハイブリッドハイブリドーマ法（米国特許第 4,47
4,893号）によって調製される。具体的には、抗ラクト
フェリン抗体及び抗ペルオキシダーゼ抗体を産生する２
種類のハイブリドーマを細胞融合し、そのハイブリッド
ハイブリドーマのみを選択培養することにより得られ
る。この時、抗ラクトフェリン抗体を得るための抗原と
しては、ウシ由来のものが好ましく、又、抗ペルオキシ
ダーゼ抗体を得るための抗原としては、西洋ワサビ由来
のものが好ましいが、それぞれと共通のエピトープを有
するものであれば、その由来は特に限定されない。細胞
融合はポリエチレングリコール法（M.R.Suresh et al.,
Methods in Enzymology, vol.121, pp210-228(198
6)）、電気パルス法（H.Tachibanaet al.,Human Antibo
dies and Hybridomas, vol.4, pp42-46(1993)）などを
用いることができる。細胞融合後、適当な選択培地を用
いて培養し、もとのハイブリドーマを死滅させ、ハイブ
リッドハイブリドーマのみを増殖させる。このハイブリ
ッドハイブリドーマを選択培養を行なうためには、ハイ
ブリドーマへの薬剤選択マーカーの付与が必須であり、
例えば６チオグアニン耐性や５ブロモデオキシウリジン
耐性のようなアミノプテリンによって細胞が死滅するも
の、ウアバイン耐性、ネオマイシン耐性などを利用す
る。又、アクチノマイシンＤのような、細胞増殖を不可
逆的に停止させる薬品処理でも良い。２種類のハイブリ
ドーマから増殖したハイブリッドハイブリドーマが、目
的とする二重特異性抗体を分泌しているかどうかはＥＬ
ＩＳＡ法によって測定する。目的抗原であるラクトフェ
リンを固定化したＥＬＩＳＡプレートにハイブリッドハ
イブリドーマが産生した二重特異性抗体を反応させ、さ
らにマーカーとなるペルオキシダーゼを添加して、プレ
ートに結合した酵素活性を測定する。ハイブリッドハイ
ブリドーマの培養、二重特異性抗体の精製等は常法に従
って行なう。小規模であればペトリディッシュやカルチ
ャーフラスコを用いる。中規模〜大規模培養ではスピナ
ーフラスコ、ホローファイバーあるいはタンクによる培
養を行なう。培地からの抗体の精製は塩析法、イオン交
換法、ヒドロキシアパタイト法、プロテインＡ法、プロ
テインＧ法、抗原固定化カラム法などで行なうことがで
きる。
【０００７】得られた二重特異性抗体を用いた抗原の測
定は、サンドイッチＥＬＩＳＡ法あるいは競争ＥＬＩＳ
Ａ法によって行なう。サンドイッチＥＬＩＳＡ法の場合
には、他に抗原に対するポリクローナル抗体、あるいは
二重特異性抗体とは異なるエピトープを認識するモノク
ローナル抗体がプレート固定化抗体として必要である。
サンドイッチＥＬＩＳＡでは、上述のような抗体をＥＬ
ＩＳＡプレートに固定化し、抗原、二重特異性抗体、酵
素を反応させて、最終的にプレートに結合した酵素活性
を測定する。又、競争ＥＬＩＳＡ法の場合には、抗原を
ＥＬＩＳＡプレートに結合させ、プレートに結合する酵
素結合二重特異性抗体を、抗原で競争的に阻害すること
により、最終的にプレートに結合した酵素活性を測定す
ればよい。
定は、サンドイッチＥＬＩＳＡ法あるいは競争ＥＬＩＳ
Ａ法によって行なう。サンドイッチＥＬＩＳＡ法の場合
には、他に抗原に対するポリクローナル抗体、あるいは
二重特異性抗体とは異なるエピトープを認識するモノク
ローナル抗体がプレート固定化抗体として必要である。
サンドイッチＥＬＩＳＡでは、上述のような抗体をＥＬ
ＩＳＡプレートに固定化し、抗原、二重特異性抗体、酵
素を反応させて、最終的にプレートに結合した酵素活性
を測定する。又、競争ＥＬＩＳＡ法の場合には、抗原を
ＥＬＩＳＡプレートに結合させ、プレートに結合する酵
素結合二重特異性抗体を、抗原で競争的に阻害すること
により、最終的にプレートに結合した酵素活性を測定す
ればよい。
【０００８】
【発明の実態の形態】以下の実施例により本発明をより
詳細に説明するが、単に例示するのみであり、本発明は
これらにより限定されるものではない。
詳細に説明するが、単に例示するのみであり、本発明は
これらにより限定されるものではない。
【実施例１】抗西洋ワサビペルオキシダーゼモノクローナル抗体の作
製 （１）抗原感作マウス脾臓細胞の調製 Balb/cマウス（雌）を西洋ワサビペルオキシダーゼで免
疫した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（シグマ社）100
μg をフロイント完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ社）と
ともにマウス腹腔に投与し、３週間後に西洋ワサビペル
オキシダーゼ（シグマ社）250 μg をアジュバントなし
で追加免疫した。追加免疫の３日後にマウスを頚椎脱臼
により屠殺し、脾臓を摘出した。脾臓をハサミで細切
し、ＥＲＤＦ培地（極東製薬社）１０mlに浮遊させ、激
しくピペッティングすることにより脾臓細胞を分離し、
全細胞（２〜４×108 個）をＥＲＤＦ培地に浮遊させ
た。
製 （１）抗原感作マウス脾臓細胞の調製 Balb/cマウス（雌）を西洋ワサビペルオキシダーゼで免
疫した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（シグマ社）100
μg をフロイント完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ社）と
ともにマウス腹腔に投与し、３週間後に西洋ワサビペル
オキシダーゼ（シグマ社）250 μg をアジュバントなし
で追加免疫した。追加免疫の３日後にマウスを頚椎脱臼
により屠殺し、脾臓を摘出した。脾臓をハサミで細切
し、ＥＲＤＦ培地（極東製薬社）１０mlに浮遊させ、激
しくピペッティングすることにより脾臓細胞を分離し、
全細胞（２〜４×108 個）をＥＲＤＦ培地に浮遊させ
た。
【０００９】（２）ミエローマ細胞の調製 ミエローマ（骨髄腫）細胞としては、Balb/cマウス由来
で抗体非分泌性の８アザグアニン耐性株SP2/O-Ag14 (SP
2/O)（国立衛生試験所より譲受）を用いた。SP2/O 株は
１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＥＲＤＦ培地で培
養し、細胞培養直前にはＦＣＳを含まないＥＲＤＦ培地
で３回洗浄し、３×107 個の細胞を同培地に浮遊させ
た。
で抗体非分泌性の８アザグアニン耐性株SP2/O-Ag14 (SP
2/O)（国立衛生試験所より譲受）を用いた。SP2/O 株は
１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＥＲＤＦ培地で培
養し、細胞培養直前にはＦＣＳを含まないＥＲＤＦ培地
で３回洗浄し、３×107 個の細胞を同培地に浮遊させ
た。
【００１０】（３）細胞融合 上記（１）及び（２）で調製した細胞浮遊液を50ml遠沈
管中で混合し、1500rpm で１５分間遠心分離した。上清
を除去後、１mlの５０％ポリエチレングリコールを１分
間かけて滴下し、細胞融合を行なった。ポリエチレング
リコールをＥＲＤＦ培地でゆっくり希釈し（３０秒に１
mlずつ添加混合）、ＥＲＤＦ培地を１０ml添加したとこ
ろで細胞を遠心した。細胞ペレットを１５％ＦＣＳを含
むＥＲＤＦ培地８０mlに浮遊させ、これを９６穴マイク
ロカルチャープレート５枚に播種した。プレートは５％
炭酸ガス／９５％空気のインキュベーターにおいて３７
℃で培養した。翌日、１０％ＦＣＳ、0.1mＭヒポキサン
チン、 0.4μＭアミノプテリン、１６μM チミジンを含
むＥＲＤＦ培地培地（ＨＡＴ培地）を各穴に100μｌ添
加した。さらに２〜３日おきに各穴の培地を半量、新し
いＨＡＴ培地と交換した。
管中で混合し、1500rpm で１５分間遠心分離した。上清
を除去後、１mlの５０％ポリエチレングリコールを１分
間かけて滴下し、細胞融合を行なった。ポリエチレング
リコールをＥＲＤＦ培地でゆっくり希釈し（３０秒に１
mlずつ添加混合）、ＥＲＤＦ培地を１０ml添加したとこ
ろで細胞を遠心した。細胞ペレットを１５％ＦＣＳを含
むＥＲＤＦ培地８０mlに浮遊させ、これを９６穴マイク
ロカルチャープレート５枚に播種した。プレートは５％
炭酸ガス／９５％空気のインキュベーターにおいて３７
℃で培養した。翌日、１０％ＦＣＳ、0.1mＭヒポキサン
チン、 0.4μＭアミノプテリン、１６μM チミジンを含
むＥＲＤＦ培地培地（ＨＡＴ培地）を各穴に100μｌ添
加した。さらに２〜３日おきに各穴の培地を半量、新し
いＨＡＴ培地と交換した。
【００１１】（４）ハイブリドーマの選択 培養２週間後に、プレートにハイブリドーマのコロニー
が肉眼でも観察されるようになったところで、培養上清
の抗西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体の存在の有無を、
以下の方法に従って測定した。即ち、抗マウスγ(Fc)
（コスモバイオ社）を0.05Ｍ炭酸水素ナトリウムで1000
倍希釈し、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（住友化学社）に
５０μl ずつ分注した。４℃で１夜静置後、４倍希釈し
たブロックエース（雪印乳業社）でプレートを１時間ブ
ロッキングした。ブロッキングしたプレートを0.02％Ｔ
ｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＴＰＢＳ）
で３回洗浄し、ここにハイブリドーマの培養上清５０μ
l を加えて１時間静置した。培養上清を捨て、プレート
をＴＰＢＳで３回洗浄後、４倍希釈したブロックエース
に溶解した西洋ワサビペルオキシダーゼ（0.5 μg/ml）
５０μl を加え、１時間静置した。西洋ワサビペルオキ
シダーゼ溶液を捨て、ＥＬＩＳＡプレートをＴＰＢＳで
６回洗浄後、プレートに結合したペルオキシダーゼ活性
を２，２’−アジノ−ビス−（３−エチルベンゾチアゾ
リン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ；和光純薬社）を基
質として測定した。３回の細胞融合から３つの抗西洋ワ
サビペルオキシダーゼ抗体陽性のハイブリドーマを得
た。ハイブリドーマは９６穴プレートから２４穴プレー
ト、１０cmディッシュに培養を拡大し、一部を凍結保存
した。
が肉眼でも観察されるようになったところで、培養上清
の抗西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体の存在の有無を、
以下の方法に従って測定した。即ち、抗マウスγ(Fc)
（コスモバイオ社）を0.05Ｍ炭酸水素ナトリウムで1000
倍希釈し、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（住友化学社）に
５０μl ずつ分注した。４℃で１夜静置後、４倍希釈し
たブロックエース（雪印乳業社）でプレートを１時間ブ
ロッキングした。ブロッキングしたプレートを0.02％Ｔ
ｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＴＰＢＳ）
で３回洗浄し、ここにハイブリドーマの培養上清５０μ
l を加えて１時間静置した。培養上清を捨て、プレート
をＴＰＢＳで３回洗浄後、４倍希釈したブロックエース
に溶解した西洋ワサビペルオキシダーゼ（0.5 μg/ml）
５０μl を加え、１時間静置した。西洋ワサビペルオキ
シダーゼ溶液を捨て、ＥＬＩＳＡプレートをＴＰＢＳで
６回洗浄後、プレートに結合したペルオキシダーゼ活性
を２，２’−アジノ−ビス−（３−エチルベンゾチアゾ
リン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ；和光純薬社）を基
質として測定した。３回の細胞融合から３つの抗西洋ワ
サビペルオキシダーゼ抗体陽性のハイブリドーマを得
た。ハイブリドーマは９６穴プレートから２４穴プレー
ト、１０cmディッシュに培養を拡大し、一部を凍結保存
した。
【００１２】（５）クローニング 増殖が良好なハイブリドーマ２株を１０％ＦＣＳを含む
ＥＲＤＦ培地に浮遊させ、丸底96穴プレート５枚に、プ
レートあたり３０個の細胞となるように播種し培養し
た。合計109 個のクローンが増殖し、このうち４個のク
ローンが強い抗西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体を分泌
していた。最も増殖のよいクローンを選択し、ＨＳ＠０
３と名付けた。ハイブリドーマＨＳ＠０３が分泌するモ
ノクローナル抗体のクラスはＩｇＧ１であった。
ＥＲＤＦ培地に浮遊させ、丸底96穴プレート５枚に、プ
レートあたり３０個の細胞となるように播種し培養し
た。合計109 個のクローンが増殖し、このうち４個のク
ローンが強い抗西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体を分泌
していた。最も増殖のよいクローンを選択し、ＨＳ＠０
３と名付けた。ハイブリドーマＨＳ＠０３が分泌するモ
ノクローナル抗体のクラスはＩｇＧ１であった。
【００１３】
【実施例２】二重特異性抗体の作製 （１）ハイブリドーマＨＳ＠０３からの６チオグアニン
耐性株の取得 ハイブリドーマＨＳ＠０３を１０％ＦＣＳおよび２０μ
g/mlの６チオグアニンを含むＥＲＤＦ培地に浮遊させ、
９６穴プレート５枚に穴あたり２×104 個を播種し培養
した。このうち、４２穴に６チオグアニン耐性ハイブリ
ドーマが増殖した。最も増殖の早い６チオグアニン耐性
ハイブリドーマをクローニングし、クローン０３ＡＲ１
０−２を得た。６チオグアニン耐性株はヒポキサンチン
グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損して
いるため、ＨＡＴ培地で増殖することができない。クロ
ーン０３ＡＲ１０−２はＨＡＴ培地中で全く増殖できな
かった。
耐性株の取得 ハイブリドーマＨＳ＠０３を１０％ＦＣＳおよび２０μ
g/mlの６チオグアニンを含むＥＲＤＦ培地に浮遊させ、
９６穴プレート５枚に穴あたり２×104 個を播種し培養
した。このうち、４２穴に６チオグアニン耐性ハイブリ
ドーマが増殖した。最も増殖の早い６チオグアニン耐性
ハイブリドーマをクローニングし、クローン０３ＡＲ１
０−２を得た。６チオグアニン耐性株はヒポキサンチン
グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損して
いるため、ＨＡＴ培地で増殖することができない。クロ
ーン０３ＡＲ１０−２はＨＡＴ培地中で全く増殖できな
かった。
【００１４】（２）ＨＢ８８５２細胞からの５ブロモデ
オキシウリジン耐性株の取得 ウシラクトフェリンに対するモノクローナル抗体（Ｉｇ
Ｇ１）を分泌するハイブリドーマは川上ら（J. Dairy S
ci. Vol.70, No.4, pp752-759 (1987)）の作製したＡＴ
ＣＣ寄託ＨＢ８８５２細胞を用いた。ＨＢ８８５２細胞
を１０％ＦＣＳ及び２５μg/mlの５ブロモデオキシウリ
ジンを含むＥＲＤＦ培地に浮遊させ、９６穴プレート２
枚に穴あたり１×104 個播種し培養した。このうち５９
穴に５ブロモデオキシウリジン耐性ハイブリドーマが増
殖した。最も増殖の早い５ブロモデオキシウリジン耐性
ハイブリドーマをクローニングし、クローンＨＢ８８５
２ＴＫ−３−１を得た。５ブロモデオキシウリジン耐性
株はチミジンキナーゼを欠損しているため、ＨＡＴ培地
で増殖することができない。クローンＨＢ８８５２ＴＫ
−３−１はＨＡＴ培地中で全く増殖できなかった。
オキシウリジン耐性株の取得 ウシラクトフェリンに対するモノクローナル抗体（Ｉｇ
Ｇ１）を分泌するハイブリドーマは川上ら（J. Dairy S
ci. Vol.70, No.4, pp752-759 (1987)）の作製したＡＴ
ＣＣ寄託ＨＢ８８５２細胞を用いた。ＨＢ８８５２細胞
を１０％ＦＣＳ及び２５μg/mlの５ブロモデオキシウリ
ジンを含むＥＲＤＦ培地に浮遊させ、９６穴プレート２
枚に穴あたり１×104 個播種し培養した。このうち５９
穴に５ブロモデオキシウリジン耐性ハイブリドーマが増
殖した。最も増殖の早い５ブロモデオキシウリジン耐性
ハイブリドーマをクローニングし、クローンＨＢ８８５
２ＴＫ−３−１を得た。５ブロモデオキシウリジン耐性
株はチミジンキナーゼを欠損しているため、ＨＡＴ培地
で増殖することができない。クローンＨＢ８８５２ＴＫ
−３−１はＨＡＴ培地中で全く増殖できなかった。
【００１５】（３）細胞融合 クローン０３ＡＲ１０−２とクローンＨＢ８８５２ＴＫ
−３−１量をそれぞれ１×107 個ずつ５０ml遠沈管中で
混合し、1500rpm で１５分間遠心分離した。上清を除去
後、１mlの５０％ポリエチレングリコールを１分間かけ
て滴下し、細胞融合を行なった。ポリエチレングリコー
ルをＥＲＤＦ培地でゆっくり希釈し、遠心後細胞ペレッ
トを１５％ＦＣＳを含むＥＲＤＦ培地３０mlに浮遊さ
せ、これを９６穴マイクロカルチャープレート２枚に播
種し培養した。翌日、ＨＡＴ培地を各穴に100 μｌ添加
し、さらに２〜３日おきに各穴の培地を半量、新しいＨ
ＡＴ培地と交換した。
−３−１量をそれぞれ１×107 個ずつ５０ml遠沈管中で
混合し、1500rpm で１５分間遠心分離した。上清を除去
後、１mlの５０％ポリエチレングリコールを１分間かけ
て滴下し、細胞融合を行なった。ポリエチレングリコー
ルをＥＲＤＦ培地でゆっくり希釈し、遠心後細胞ペレッ
トを１５％ＦＣＳを含むＥＲＤＦ培地３０mlに浮遊さ
せ、これを９６穴マイクロカルチャープレート２枚に播
種し培養した。翌日、ＨＡＴ培地を各穴に100 μｌ添加
し、さらに２〜３日おきに各穴の培地を半量、新しいＨ
ＡＴ培地と交換した。
【００１６】（４）ハイブリドーマの選択およびクロー
ニング 培養２週間後にプレートにハイブリドーマのコロニーが
肉眼でも観察されるようになったところで、培養上清の
二重特異性抗体存在の有無を測定した。即ち、ウシラク
トフェリンを0.05Ｍ炭酸水素ナトリウムに１μg/mlに溶
解し、９６穴ＥＬＩＳＡプレートに50μｌずつ分注し
た。４℃で一夜静置後、プレートをブロックエースで１
時間ブロッキングした。ブロッキングしたプレートをＴ
ＰＢＳで３回洗浄し、ここにハイブリドーマの培養上清
５０μl を加えて１時間静置した。培養上清を捨て、プ
レートをＴＰＢＳで３回洗浄後、ブロックエースに溶解
した0.5μg/ml西洋ワサビペルオキシダーゼ５０μl を
加え、１時間静置した。西洋ワサビペルオキシダーゼ溶
液を捨て、ＥＬＩＳＡプレートをＴＰＢＳで６回洗浄
後、プレートに結合したペルオキシダーゼ活性をＡＢＴ
Ｓを基質として測定した。 この結果、一回の細胞融合
から４２個の抗体陽性のハイブリドーマが得られた。得
られたハイブリドーマのうち増殖の速いものを、９６穴
プレートから２４穴プレート、１０cmディッシュに培養
を拡大し、クローニングしてハイブリッドハイブリドー
マＨＨ−１−４−３を得た。このハイブリドーマＨＨ１
−４−３を無血清培地（ＩＴＥＳ−ＥＲＤＦ培地、極東
製薬社）で培養した培養上清を、還元条件下でＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動した結果を図１に示
す。この図に示されるように、ハイブリドーマＨＨ１−
４−３の培養上清の電気泳動パターンに、２本のＨ鎖と
１本のＬ鎖が観察された。この時、培養上清中の二重特
異性抗体に含まれる２種類のＬ鎖は同じ分子量であると
考えられる。
ニング 培養２週間後にプレートにハイブリドーマのコロニーが
肉眼でも観察されるようになったところで、培養上清の
二重特異性抗体存在の有無を測定した。即ち、ウシラク
トフェリンを0.05Ｍ炭酸水素ナトリウムに１μg/mlに溶
解し、９６穴ＥＬＩＳＡプレートに50μｌずつ分注し
た。４℃で一夜静置後、プレートをブロックエースで１
時間ブロッキングした。ブロッキングしたプレートをＴ
ＰＢＳで３回洗浄し、ここにハイブリドーマの培養上清
５０μl を加えて１時間静置した。培養上清を捨て、プ
レートをＴＰＢＳで３回洗浄後、ブロックエースに溶解
した0.5μg/ml西洋ワサビペルオキシダーゼ５０μl を
加え、１時間静置した。西洋ワサビペルオキシダーゼ溶
液を捨て、ＥＬＩＳＡプレートをＴＰＢＳで６回洗浄
後、プレートに結合したペルオキシダーゼ活性をＡＢＴ
Ｓを基質として測定した。 この結果、一回の細胞融合
から４２個の抗体陽性のハイブリドーマが得られた。得
られたハイブリドーマのうち増殖の速いものを、９６穴
プレートから２４穴プレート、１０cmディッシュに培養
を拡大し、クローニングしてハイブリッドハイブリドー
マＨＨ−１−４−３を得た。このハイブリドーマＨＨ１
−４−３を無血清培地（ＩＴＥＳ−ＥＲＤＦ培地、極東
製薬社）で培養した培養上清を、還元条件下でＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動した結果を図１に示
す。この図に示されるように、ハイブリドーマＨＨ１−
４−３の培養上清の電気泳動パターンに、２本のＨ鎖と
１本のＬ鎖が観察された。この時、培養上清中の二重特
異性抗体に含まれる２種類のＬ鎖は同じ分子量であると
考えられる。
【００１７】
【実施例３】二重特異性抗体を用いたウシラクトフェリンの測定 （１）ウシラクトフェリン固定化プレートの作製 実施例２の（４）に記載した方法により、ウシラクトフ
ェリンをＥＬＩＳＡプレートに固定化し、ブロックエー
スでブロッキングした。
ェリンをＥＬＩＳＡプレートに固定化し、ブロックエー
スでブロッキングした。
【００１８】（２）競争ＥＬＩＳＡ法によるウシラクト
フェリンの測定 本発明抗体（実施例２で得られた二重特異性抗体）、西
洋ワサビペルオキシダーゼ、ウシラクトフェリンの希釈
には、いずれも４倍希釈したブロックエース（雪印乳業
社）を用いた。 1.6μg/mlの二重特異性抗体溶液（ハイ
ブリドーマーＨＨ１−４−３の培養上清を希釈）、２〜
100 μg/mlのウシラクトフェリン溶液および 0.5μg/ml
の西洋ワサビペルオキシダーゼそれぞれ５０μｌずつを
混和し、室温で６０分間反応させた。上記（１）で用意
したウシラクトフェリン固定化ＥＬＩＳＡプレートに反
応液を加え、室温で６０分間静置後反応液を捨て、ＴＰ
ＢＳで６回洗浄した。ＥＬＩＳＡプレートに結合したペ
ルオキシダーゼ活性は、ＡＢＴＳを基質として測定し
た。酵素活性は405nm の吸光度で表わした。測定結果を
図２に示す。 図２に示されるように、反応液に添加し
たウシラクトフェリンの濃度とともに、ＥＬＩＳＡプレ
ートに結合するペルオキシダーゼ活性は減少した。この
ラクトフェリン−酵素活性の関係から、２〜100 μg/ml
の濃度のウシラクトフェリンを測定することが可能であ
るとの結果が得られた。
フェリンの測定 本発明抗体（実施例２で得られた二重特異性抗体）、西
洋ワサビペルオキシダーゼ、ウシラクトフェリンの希釈
には、いずれも４倍希釈したブロックエース（雪印乳業
社）を用いた。 1.6μg/mlの二重特異性抗体溶液（ハイ
ブリドーマーＨＨ１−４−３の培養上清を希釈）、２〜
100 μg/mlのウシラクトフェリン溶液および 0.5μg/ml
の西洋ワサビペルオキシダーゼそれぞれ５０μｌずつを
混和し、室温で６０分間反応させた。上記（１）で用意
したウシラクトフェリン固定化ＥＬＩＳＡプレートに反
応液を加え、室温で６０分間静置後反応液を捨て、ＴＰ
ＢＳで６回洗浄した。ＥＬＩＳＡプレートに結合したペ
ルオキシダーゼ活性は、ＡＢＴＳを基質として測定し
た。酵素活性は405nm の吸光度で表わした。測定結果を
図２に示す。 図２に示されるように、反応液に添加し
たウシラクトフェリンの濃度とともに、ＥＬＩＳＡプレ
ートに結合するペルオキシダーゼ活性は減少した。この
ラクトフェリン−酵素活性の関係から、２〜100 μg/ml
の濃度のウシラクトフェリンを測定することが可能であ
るとの結果が得られた。
【００１９】
【実施例４】二重特異性抗体を用いた乳中のラクトフェリン量の測定 非加熱牛乳試料３種、市販の高温殺菌乳、及び出産後２
ヵ月後の人乳を試料とし、これらの試料に含まれるラク
トフェリンを、本発明の抗体を用いた競争ＥＬＩＳＡ、
及び従来法としてサンドイッチＥＬＩＳＡ法によって測
定した。本発明の抗体を用いた競争ＥＬＩＳＡ法は、実
施例３の方法に従って行った。従来法としてのサンドイ
ッチＥＬＩＳＡ法は、以下の方法に従って行った。即
ち、ウサギ抗ラクトフェリンポリクローナル抗体ＩｇＧ
画分（ヤガイ社）を0.05Ｍ炭酸水素ナトリウムで５μg/
mlに希釈し、この５０mlを９６穴ＥＬＩＳＡプレートに
分注し、実施例２−（４）記載の方法に従って抗体を吸
着させ、ブロッキングを行った。試料５０μｌをプレー
トに分注して１時間静置後ＴＰＢＳで洗浄し、ＨＢ８８
５２抗体（１０μg/ml）５０μｌを加え、さらに１時間
静置した。プレートをＴＰＢＳで洗浄後、1000倍希釈し
たペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（ＴＡＧＯ社）
５０μｌを加え、１時間静置後、プレートに結合したペ
ルオキシダーゼ活性を実施例３−（４）に従って測定し
た。標準試料から作成した検量線より、試料中のラクト
フェリン濃度を算出した。結果を表１に示す。
ヵ月後の人乳を試料とし、これらの試料に含まれるラク
トフェリンを、本発明の抗体を用いた競争ＥＬＩＳＡ、
及び従来法としてサンドイッチＥＬＩＳＡ法によって測
定した。本発明の抗体を用いた競争ＥＬＩＳＡ法は、実
施例３の方法に従って行った。従来法としてのサンドイ
ッチＥＬＩＳＡ法は、以下の方法に従って行った。即
ち、ウサギ抗ラクトフェリンポリクローナル抗体ＩｇＧ
画分（ヤガイ社）を0.05Ｍ炭酸水素ナトリウムで５μg/
mlに希釈し、この５０mlを９６穴ＥＬＩＳＡプレートに
分注し、実施例２−（４）記載の方法に従って抗体を吸
着させ、ブロッキングを行った。試料５０μｌをプレー
トに分注して１時間静置後ＴＰＢＳで洗浄し、ＨＢ８８
５２抗体（１０μg/ml）５０μｌを加え、さらに１時間
静置した。プレートをＴＰＢＳで洗浄後、1000倍希釈し
たペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（ＴＡＧＯ社）
５０μｌを加え、１時間静置後、プレートに結合したペ
ルオキシダーゼ活性を実施例３−（４）に従って測定し
た。標準試料から作成した検量線より、試料中のラクト
フェリン濃度を算出した。結果を表１に示す。
【００２０】
【表１】 ────────────────────────────── ウシラクトフェリン濃度（μg／ml） ───────────────────── 試 料 本発明方法 従来法 ────────────────────────────── 非加熱牛乳１ ７６ ８１ ２ １２５ １２２ ３ １０５ １１０ 高温殺菌乳 ０ ０ 人乳 ０ ０ ──────────────────────────────
【００２１】以上の結果より、本発明の抗体による競争
ＥＬＩＳＡ法及び従来法であるサンドイッチＥＬＩＳＡ
法において、ほぼ同等の測定値が得られた。本発明の抗
体を用いた競争ＥＬＩＳＡは、ブロッキング以降に要す
る測定時間が約 2.5時間、従来法では約４時間であっ
た。又、いずれの方法においても加熱殺菌乳及び人乳と
は反応しなかった。
ＥＬＩＳＡ法及び従来法であるサンドイッチＥＬＩＳＡ
法において、ほぼ同等の測定値が得られた。本発明の抗
体を用いた競争ＥＬＩＳＡは、ブロッキング以降に要す
る測定時間が約 2.5時間、従来法では約４時間であっ
た。又、いずれの方法においても加熱殺菌乳及び人乳と
は反応しなかった。
【００２２】
【発明の効果】以上の結果から、本発明によりラクトフ
ェリン及びペルオキシダーゼに対する二重特異性抗体を
用いて、試料中のラクトフェリン濃度を迅速簡便に、且
つ高精度に測定することができる。
ェリン及びペルオキシダーゼに対する二重特異性抗体を
用いて、試料中のラクトフェリン濃度を迅速簡便に、且
つ高精度に測定することができる。
【図１】実施例２で作製したハイブリッドハイブリドー
マが分泌する二重特異性抗体の、還元条件下でのＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。レー
ン１は、分子量マーカー（タンパク質分子量マーカーII
I ；第一化学薬品社）を表す。レーン２は、本発明の抗
体を表す。
マが分泌する二重特異性抗体の、還元条件下でのＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。レー
ン１は、分子量マーカー（タンパク質分子量マーカーII
I ；第一化学薬品社）を表す。レーン２は、本発明の抗
体を表す。
【図２】実施例３で測定したウシラクトフェリン濃度と
405 nmの吸光度（ペルオキシダーゼ活性）の関係を示
す。
405 nmの吸光度（ペルオキシダーゼ活性）の関係を示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ０７Ｋ 14/415 Ｃ１２Ｑ 1/28 14/79 // Ｃ０７Ｋ 14/415 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 14/79 9162−4Ｂ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (7)
- 【請求項１】 ラクトフェリン及びペルオキダーゼに対
し抗原特異性を有する二重特異性抗体。 - 【請求項２】 ラクトフェリンがウシラクトフェリンで
ある、請求項１記載の二重特異性抗体。 - 【請求項３】 ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキ
シダーゼである、請求項１記載の二重特異性抗体。 - 【請求項４】 請求項１〜３記載の二重特異性抗体を産
生する、ハイブリッドハイブリドーマ。 - 【請求項５】 ハイブリッドハイブリドーマがマウスハ
イブリッドハイブリドーマである請求項４記載のハイブ
リッドハイブリドーマ。 - 【請求項６】 ハイブリッドハイブリドーマがＨＨ１−
４−３（ＦＥＲＭＰ−１５１２２）である、請求項５記
載のハイブリッドハイブリドーマ。 - 【請求項７】 請求項１〜３記載の二重特異性抗体を、
試料及びペルオキシダーゼと反応させ、この混合液をさ
らにラクトフェリンを固定化したプレートと接触させた
後、プレートに結合したペルオキシダーゼ酵素活性を測
定することによりラクトフェリン濃度を測定することを
特徴とする、ラクトフェリンの測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7262199A JPH0975096A (ja) | 1995-09-14 | 1995-09-14 | ラクトフェリンの測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7262199A JPH0975096A (ja) | 1995-09-14 | 1995-09-14 | ラクトフェリンの測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0975096A true JPH0975096A (ja) | 1997-03-25 |
Family
ID=17372466
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7262199A Pending JPH0975096A (ja) | 1995-09-14 | 1995-09-14 | ラクトフェリンの測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0975096A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015507193A (ja) * | 2012-02-01 | 2015-03-05 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | 多重特異性結合物の結合パートナーを検出するための方法 |
-
1995
- 1995-09-14 JP JP7262199A patent/JPH0975096A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015507193A (ja) * | 2012-02-01 | 2015-03-05 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | 多重特異性結合物の結合パートナーを検出するための方法 |
| US10761097B2 (en) | 2012-02-01 | 2020-09-01 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method for the detection of a binding partner of a multispecific binder |
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