JP2001524674A - 置換アッセイにおける改良又は置換アッセイに関する改良 - Google Patents
置換アッセイにおける改良又は置換アッセイに関する改良Info
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Abstract
Description
する方法と、その方法を実施する装置に関する。
知られている。アッセイの一つの特殊な形式は、「置換アッセイ」であり、これ
は慣習的にサンプル中の目的分析物の存在が既存の結合パートナー/リガンド複
合体からの標識物質(標識結合パートナーまたは標識リガンドのどちらか)の置
換を引き起こす。一般に、置換された標識物質の量は目的分析物の濃度に比例す
る。あるいは、「競合」アッセイを利用してもよく、そのアッセイでは、目的分
析物と標識競合物(標識分析物またはアナログ等)間に限られた数の結合部位へ
の結合に対する競合が存在する。
ており、これは典型的に使い捨てのテストストリップを含むアッセイ装置に関し
、テスト装置が接触するテスト溶液中の目的分析物の存在が、装置の別の位置で
のシグナル(色等)によって示され、分析物の不在は異なる位置に現れる同様の
シグナルによって示される。
テストスティック上の一位置に提供され、目的分析物に対する結合特異性を有す
る。「シグナル生成分子」に共有結合した分析物を含む「異種二官能性複合体」
は、第一結合手段に可逆的に結合している。サンプル中の遊離の目的分析物の存
在下で、異種二機能性複合体は第一結合手段から遊離され、「液体伝導手段」(
典型的にキャピラリーテストスティック)を介して、複合体が捕獲されるような
シグナル生成分子に対する結合特異性を有する第二結合手段に輸送される。典型
的にシグナル生成分子は、テストスティックを適当な基質溶液に浸した時に、テ
ストサンプル中に分析物が存在しない場合は第一結合手段において、分析産物が
存在する場合は第二結合手段において色のついた産物(「シグナル」)を形成す
るような酵素(例えば西洋わさびペルオキシダーゼ)である。シグナル生成分子
は、蛍光分子または紫外線吸収剤でもよい。
む複合体の単純捕獲以外の相互関係は存在しない。このように、シグナル生成分
子(酵素)は、第一結合手段から遊離されるか否かに関わらず、固有にシグナル
(色のついた産物)を生成することが可能であり、シグナル生成分子の捕獲作用
はシグナル生成の過程において役割を果たさない。
を利用する装置の利用である。この現象は現在様々な出版物で記述されており、
エバネッセント波(evanescent wave)バイオセンサーの基礎と
なっている(レビューとして、Hutchinson 1995,Molecu
lar Biotechnology 3,47−54とその中の参考文献を参
照のこと)。
射角において共鳴「エバネッセント波」を生じる。共鳴は、媒体の屈折率変化に
極端に敏感である。屈折率の変化により、共鳴が新しい入射角で生じる。屈折率
の変化は、2つの媒体間の界面における薄(典型的に金)膜への大量結合によっ
て生じ:屈折率の変化は金膜への大量結合に比例する。
AB(スウェーデン)の販売するBIA lite(商標)とBIA cor
e(商標)機、Fison(イギリス)の販売するIA Sys(商標)装置、
およびArtificial Sensor Instruments(スイス
、チューリッヒ)の販売するBIOS−1装置が含まれる。
固定化された第一試薬からの第二試薬との置換を含み、前記置換は目的分析物の
存在に反応して起こり、置換された第二試薬は次に検出表面上で検出表面に固定
化された第三試薬を変化する反応を起こし、第三試薬の変化はSPR手段によっ
て検出されるアッセイ法を開示している。
り(1ページ、4〜6行)、先行技術で明らかなそのような分析物のアッセイに
おける感度の欠除に取り組んでいる(2ページ、1〜17行)。
二試薬は分析物に対する特異的抗体である。あるいは、第一試薬は分析物に対す
る抗体であり、第二試薬は(低分子量分析物の)アナログと高分子量タンパク質
を含むコンジュゲートである。先行技術では、「分析物のアナログとは、その特
異的バインダーへの結合について分析物と競合する物質である。アナログの構造
は、しばしば、分析物とできるだけ近く、またはさらに完全に同一となるように
整列される」と教示している(3ページ、6〜10行)。
るだけ近づいて」同じであるべきであると教示しており、第一試薬、第二試薬と
目的分析物間の結合親和性比に違いが存在するはずであるという開示あるいは示
唆はない。
を提供し、この方法は、上に可逆的に固定化された置換可能な成分を有する第一
表面を提供し;第一表面を目的分析物を含むサンプルに曝露して目的分析物は第
一表面の置換可能な成分を特異的に置換し;第二表面上で置換可能な成分を捕獲
するように、第一表面から置換された置換可能な成分を置換可能な成分に特異的
に結合する捕獲成分を有する第二表面と接触させ、前記捕獲によって検出可能な
シグナルが生成し;シグナルを検出段階を含み、前記検出は表面プラズモン共鳴
以外の方法で実施される。
のような分析物の例として、抗体(診断法において有効でありうる)、核酸(D
NAおよび/またはRNA)、ホルモン(タンパク質とステロイドの両種類)、
成長因子等が含まれる。特に目的とするのは、エストロン−3−グルクロニド(
E3G)、プロゲストゲン−3−グルクロニド(P3G)、ヒト絨毛性ゴナドト
ロピン(hCG)、黄体形成ホルモン(LH)、および卵胞刺激ホルモン(FS
H)等の性および/または受精ホルモンとそのアナログであり、そのような分析
物の検出は妊娠検査に有効でありうる。好都合には分析物は、液体サンプル、特
に、血液、血清、尿、および唾液等の哺乳動物の体液に存在する。
はさらに好ましくは、存在する分析物の量が測定できるような定量的に利用され
うる。
捕獲成分により第二表面で直ちに特異的に捕獲されるように、特異的結合対のメ
ンバーを有利に含む。多くの特異的結合対が当業者に知られており、例えば、抗
原/抗体、相補的な(すなわち特異的塩基対)核酸鎖、酵素/基質、レクチン/
糖、ホルモン/レセプター等が含まれる。
は第一表面に付着したコーティングまたは層を形成する。置換可能な成分は、第
一表面に直接付着されてよい。しかし、さらに一般に、置換可能な成分は介在分
子を介して間接的に第一表面に付着され、その組み合わせにより置換可能な成分
の望ましい程度の可逆的固定化の達成が促進される。
固定化される一方、置換可能な成分は介在分子に比較的弱く付着される(そして
このように第一表面上に可逆的に固定化される)。望ましくは、介在分子は目的
分析物のアナログ(以下で考察するミモトープ(mimotope)等)であり
、その配置は、介在分子に対する置換可能な成分の(または他の実施形態では、
介在分子の)結合親和性が、置換可能な成分の目的分析物に対する親和性と比較
して比較的低い(例えば1〜50%、さらに典型的には1〜10%、好ましくは
1〜5%)ものである。したがって、目的分析物の存在下で、分析物は第一表面
の置換可能な成分と特異的に置換する傾向がある。有利には、本発明の方法は、
目的分析物が置換可能な成分の定量的置換を引き起こすような、置換可能な成分
の特異的な親和性に関した置換を含む。親和性比は望ましくは、少量の分析物の
存在によって適当量の置換可能な成分が十分に置換されるように選択され、その
の結果、本発明のアッセイ法が高い感度のものとなる。
抗原結合誘導体(Fv,Fab,Fab2,scFv,重鎖可変領域[ラマおよ
びラクダから入手可能なものであるような「Hcv」]等)を含む。特に好都合
な例はモノクローナル抗体、二特異性抗体と「Diabodies」、および免
疫グロブリン分子またはその抗原結合誘導体を含む融合(キメラ)ポリペプチド
である。融合タンパク質は、酵素(例えば、カタラーゼまたはグルコースオキシ
ダーゼ)、または捕獲成分による特異的捕獲を促進する(例えばミモトープ、す
なわち、抗体によって認識されるエピトープの構造的アナログ、またはビオチン
、アビジン、あるいは特異的結合対の他のメンバー等のいくつかの他の分子で、
捕獲成分は特異的結合対の逆のメンバーを含む)、あるいは第一表面での可逆的
固定化を促進する部分等の、一つまたはそれ以上の付加的な機能的ドメインに結
合された免疫グロブリン分子(またはその抗原結合誘導体)を含みうる。
ーとは、置換可能な成分に通常存在する対のメンバーに結合するものである)、
簡便に第二表面に固定化される。当業者には周知である従来の化学的方法が、そ
のような固定化を達成するのに使用しうる。異なる目的分析物に対する本発明の
実施を可能にするために、表面が異なる捕獲成分でコーティングされるように、
アッセイ完了時に、厳しい化学的処理(例えば、非常に高いまたは非常に低いp
H、あるいはカオトロピック剤の使用)により第二表面から捕獲成分を除去する
ことが可能ではあるが、捕獲成分に関する「固定化」という用語は、捕獲成分が
通常のアッセイ条件下で第二表面に結合されたままであることを示すように意図
されていることが理解されよう。しかしながら、通常は別の分析物と関した使用
には第一表面を適当に修飾できるので、一般にそのような処理は必要でない。
面が単に支持体として受動的様式で作用する従来の先行技術アッセイとは対照を
なすシグナル生成において、「活性」部分として記述されるものを受け取る。本
発明においてそれは、検出可能なシグナルの生成を間接的または(好ましくは)
直接的に導く、第二表面での置換可能な成分の捕獲作用である。一般に置換可能
な成分は、第二表面で捕獲されない限りおよび捕獲されるまではアッセイで実際
に観察またはモニターされる検出可能なシグナルを生成することはできず、一般
にシグナル生成は置換可能な成分の第二表面との相互作用に依存する。
。第一に、本発明により、どんな目的分析物の検出への利用に対しても容易に修
飾され得る一般的なアッセイ法と装置の利用が可能となる:置換可能な成分が適
当な分析物の存在に反応して置換されるためには、同じ第二表面が(生成され検
出される同じタイプのシグナルとでは)利用可能であり、比較的安価で単純な第
一表面のみが変更される必要がある。第二に、特異的置換段階を組み込むアッセ
イ法と装置によって、不均一な(例えば、食物粒子、血液細胞、または細菌等の
粒子状物質を含む)または粗製であり多くの混入物(例えば、血清、尿等)を含
むサンプルのテストが可能となる。さらに、本発明のアッセイは特異的置換段階
と特異的捕獲段階の両方を含む。これは、アッセイの全体的な特異性が事実上置
換および捕獲段階の特異性の非常に正確な産物であることを意味し、ほとんどの
先行技術アッセイによって付与される特異性よりもさらに高い特異性を生み出す
。さらに、利用者に関する限り、これは基本的に一段階工程の形式で成し遂げる
ことができる:アッセイを実施する人は単にサンプルを第一表面と接触させる必
要があり、それによって検出可能なシグナルの生成へと導く一連の反応が開始す
る。
面でのシグナルの検出可能な変化を生じる質量の増加を起こすような(すなわち
、置換可能な成分の捕獲は、既存のシグナルを検出可能な様式で制御または修飾
する)エバネッセント波または音波タイプのバイオセンサー(例えば、EP 0
416 730;EP 0 517 001;またはWO 97/04314
に開示されているような)の検出表面を形成する。
でシグナルの生成を阻害し、そのような阻害が「検出可能なシグナル」を構成す
る。例えば、置換可能な成分の捕獲は第二表面で進行中の反応を阻害する:一実
施形態では、第二表面は検出可能な(例えば色のついた)産物を生成する反応を
触媒する複数の酵素分子を含み、置換可能な成分は酵素に対する特異的結合活性
を有する免疫グロブリン分子を含み、置換可能な成分の酵素に対する結合がその
触媒活性を阻害し(または、例えばアロステリック部位への結合等により、別の
方法でそれを修飾し)、よって酵素の作用に検出可能な変化をもたらす。
音波は置換可能な成分と相互作用し、既存のシグナルの変調というよりもむしろ
全く新しいシグナルを生成する。例えば、置換可能な成分は、第二表面でのエバ
ネッセント波によって刺激されるフルオロフォア(fluorophor)を含
み、蛍光を発する:エバネッセント波の「範囲」が短いため、フルオロフォアは
置換可能な成分が第二表面に捕獲されない限り刺激されない。さらに、特異性の
程度は、エバネッセント波がフルオロフォアの励起を起こす適当な性質を有する
ようにフルオロフォアとエバネッセント波の波長が選択される時の相互作用と関
連する。
気化学的性質を変調し、その変調は検出可能なシグナルを含む。適当な方法と物
質は、我々の同時係属中欧州特許出願第97309425.3号に開示されてい
る。特に、捕獲成分は典型的に導電性の支持体に固定化された免疫グロブリン分
子(好ましくは抗体)またはその抗体結合誘導体を含み、置換可能な成分の捕獲
成分への結合が捕獲成分の電気化学的性質を変化させ、例えば電流測定、ボルタ
メトリック、または電量測定法によって検出可能なシグナルを生成する。好まし
くは、捕獲性分と置換可能な成分は、置換可能な成分の捕獲が捕獲成分の電気化
学的性質(例えば酸化還元電位)を直接変えるように選択される。
えば、50μmから5mmの範囲)、そのように、第一および第二表面間での置
換可能な成分(置換された抗体分子等)の単純な拡散は、必要とされる迅速な反
応時間を無理なく提供するのに十分である。「ナノテクノロジー」原理を利用す
る装置では、第一および第二表面間の距離はさらに小さくてよい:そのような装
置では、第一および第二表面間の大量輸送の時間を最短にするため、ギャップは
単一分子の大きさと同じぐらい小さくてもよい(例えば、典型的な免疫グロブリ
ン分子または二特異性抗体の5〜50nm)。
ない場合、ある種の「輸送力」を提供して置換可能な成分を第一表面から第二表
面に運ぶ必要がある。これは、キャピラリー流動、または大量の液体流動(ポン
プ手段を利用)、または例えば置換可能な成分と第二表面間の静電気的誘引によ
って可能である。
もよく、これにより以下で述べるようなフィルターの封入が容易となる。代わり
に、第一および第二表面は単一の固体支持体上に提供されてもよい。固相は、実
質的には平面または粒子であり、多孔性または不浸透性である。第一および第二
表面が単一支持体上に提供される場合、表面は支持体上の遠い部分として存在す
るか、あるいは支持体の近接部分として存在してよい(例えば、一つの表面が二
次元的にもう一方の表面に囲まれている、または二つの表面が親密に互いに入り
組む)。粒子性の支持体の例として、当業者には既知である重合体物質(例えば
、デキストラン等の多糖類;またはラテックスや他の物質)を含むビーズが含ま
れる。実質上の平面支持体の例としては、既知のエバネッセント波または音波タ
イプのバイオセンサーと関連して使用されるセンサーチップが含まれる。
ルター手段を第一および第二表面間に置くことが好ましい。これは、そのような
物質がアッセイの結果に悪影響を及ぼすような時に(例えば、第二表面での粒子
物質の非特異的結合による)望ましい。適当な微小孔フィルター膜は、当業者に
は周知である。
を提供する。一般に、装置は、その上に可逆的に固定化された置換可能な成分を
有し、目的分析物の存在下で置換可能な成分が第一表面から置換される第一表面
と、置換可能な成分に特異的に結合する捕獲成分を有する第二表面を含む。
して利用するための比較的安価で、使い捨てまたは交換可能な成分(例えばキッ
トの一部分として)の形態をとる。あるいは、本発明の装置は、以下の一つまた
はそれ以上を含む実質的に「一個の」装置として提供されてもよく、これは、液
体伝導手段;目的分析物の存在下で生成されるシグナルを検出するためのシグナ
ル検出手段;およびシグナル検出手段から出力されるデータを処理するデータ処
理手段を含む。
一つまたはそれ以上の機能を行ってもよい:第一表面への液体サンプルの導入;
すべての置換可能な成分の第一表面から第二表面への輸送;および液体伝導手段
を介しての廃棄液体の除去。液体伝導手段の利用に適した動力手段は、例えば回
転式または蠕動式ポンプを含む。
、血液、血清、唾液等の体液)との使用に適応する。
供し、この方法は、第一表面と置換可能な成分間の介在成分との相互作用により
その上に可逆的に固定化された置換可能な成分を有する第一表面を提供し;第一
表面を目的分析物を含むサンプルに曝露して目的分析物が第一表面からの置換可
能な成分と特異的に置換し;第二表面上で置換可能な成分を捕獲するように、第
一表面から置換された置換可能な成分を置換可能な成分に特異的に結合する捕獲
成分を有する第二表面と接触させ、前記捕獲によって検出可能なシグナルが生成
し;シグナルを検出する段階を含み、置換可能な成分の目的分析物に対する結合
親和性が置換可能な成分の介在成分に対する結合親和性よりも高い。
供し、この方法は、第一表面と置換可能な成分間の介在成分との相互作用により
その上に可逆的に固定化された置換可能な成分を有する第一表面を提供し;第一
表面を目的分析物を含むサンプルに曝露して、目的分析物が第一表面からの置換
可能な成分と特異的に置換し;第二表面上で置換可能な成分を捕獲するように、
第一表面から置換された置換可能な成分を置換可能な成分に特異的に結合する捕
獲成分を有する第二表面と接触させ、前記捕獲によって検出可能なシグナルが生
成し;シグナルを検出する段階を含み、介在成分の目的分析物に対する結合親和
性が置換可能な成分の介在成分に対する結合親和性よりも高い。
定化されている相互作用の結合親和性は、置換可能な成分の置換を起こす傾向が
ある相互作用の僅か1〜10%(さらに好ましくは1〜5%)であることが好ま
しい(すなわち、本発明の第三態様の置換可能な成分と目的分析物間の相互作用
、または第四態様の介在成分と目的分析物間の相互作用)。本発明の第三および
第四態様の方法の好ましい特徴は、方法が適合する限りは、一般に、第一態様の
方法のものと同様である。本発明の第三および第四態様では、シグナルを検出す
る好ましい方法は、WO92/18867に開示されているようにSPRの手段
による。本発明は、先に定義された第三および第四態様の方法を実施する装置も
提供する。
。図1において、置換可能な成分は第一表面12に可逆的に固定化されている。
図1で示される実施形態では、置換可能な成分は二特異性抗体10であり、不可
逆的固定化は、二特異性抗体10と従来の化学的方法により第一表面12に固定
化された介在分子14間の相互作用により達成される。単純化するため、単一分
子14と単一の特異的二特異性抗体10のみを示す。実際には、第一表面12は
通常は複数の介在分子14でコーティングされており、複数の二特異性抗体10
(それぞれ同じ結合特異性を有する)は表面12に可逆的に固定化されている。
置換可能な成分のこの可逆的固定化は、通常のアッセイ条件下で、目的分析物の
不在化では置換可能な成分は第一表面に付着されたままであるが、目的分析物の
存在下では置換可能な成分はそこから特異的に置換されるというものである。
有する。第一表面12に固定化された介在分子14は目的分析物18の構造的ア
ナログであり、二特異性抗体10の結合部位16が分子14に比較的緩く結合し
、そのため第一表面12上に二重機能性抗体10を可逆的に固定化している。し
かし、結合部位16のアナログ14に対する結合親和性は、目的分析物18に対
する結合親和性よりかなり低い(典型的に1〜10%、好ましくは1〜5%)。
したがって、第一表面12を目的分析物18を含むサンプルと接触させると、分
析物18は結合部位16に対する結合に対してアナログ14とうまく競合し、こ
ように、第一表面12から二特異性抗体10を特異的に置換する。次に、置換さ
れた二特異性抗体10は、第二表面20と接触できるようになる。
、それぞれは捕獲成分22を構成する。二特異性抗体10の結合部位16は、捕
獲成分22に対する結合特異性を有する。したがって、第一表面から置換された
二特異性抗体分子10は、第二表面20で捕獲される。この捕獲により検出可能
なシグナルが生成され、それがモニターされる。図1で説明する実施形態では、
第二表面20はSPRセンサーの一部を形成する。
間の相互作用により生成される。例えば、第二表面20はエバネッセント波検出
装置の一部を含む:置換可能な成分10の捕獲は、検出可能なシグナルが生成さ
れるような方法で、表面20上で伝播されるエバネッセント波の特徴を修飾する
。そのような装置の例には、現在当分野で周知である表面プラズモン共鳴(SP
R)の技術、あるいは音波検出システムを利用するものがあり、シグナルは表面
20に結合した物質の質量の増加により生成される。
された時に)と第二表面間に異なる種類の相互作用が生じる。これらには電気活
性表面の利用が含まれ、そこでは捕獲成分による置換可能な成分の捕獲が捕獲成
分の電気化学的性質を修飾し、その修飾が検出可能なシグナルを含む。適当な方
法と物質は、我々の参照C319/Uのもとで、この明細書と同一日に出願され
た我々の同時係属出願に開示されている。
に結合した時、目的分析物18に付着したままである。質量に基づく検出システ
ムでは(SPR装置のような)、これは特に置換可能な成分自身の質量がが非常
に小さい場合に有利である。しかし、他の状況では、特に検出可能なシグナルの
生成が質量非依存性である場合には、分析物18の置換可能な成分10への継続
的な付着は不利となりうる。
された実施形態と異なる代わりの実施形態(図2に部分的に模式的に説明する)
も考えられる。機能的に匹敵する成分を、図1と同様の参照数字を用いて図2に
注釈する。
、第一表面12に可逆的に固定化された置換可能な成分が提供される。抗体14
は、目的分析物18に対して特異的結合親和性を有する。置換可能な成分10は
、「ミモトープ」16−抗体14によって結合されるエピトープの構造的アナロ
グである低分子(通常はペプチドであるが、あるいは糖、ステロイド、核酸、ま
たは免疫グロブリンにコンジュゲート化できる他の化学的成分)に融合または共
有結合された抗体分子から成る。ミモトープ16は、抗体14のミモトープ30
に対する結合親和性が分析物18に対する親和性の僅か1〜10%(好ましくは
1〜5%)というようなものである。したがって、目的分析物18の存在下では
、置換可能な成分10は第一表面12から特異的に置換される。次に置換可能な
成分は、基本的に図2に示されるように、典型的に置換可能な成分10の抗体部
分の結合部位16’を認識する捕獲分子によって、第二表面(示していない)に
捕獲される。好都合には、ミモトープはペプチドであり、融合タンパク質を形成
する(免疫グロブリンとペプチドをコードする配列間の遺伝子融合によりコード
される)。あるいは、ミモトープは、従来の化学的技術のいずれかにより(例え
ば、「バイオコンジュゲート技術」、Hermanson,Academic
Press,1996を参照のこと)免疫グロブリン分子(またはその抗原結合
部位)に結合されてもよい。
能な成分10は大部分が通常の抗体分子から成り、目的分析物18に着していな
い。第二表面での目的分析物18の存在は(図1で説明される実施形態のように
)、ある実施形態ではシグナルの生成を時々妨ぐこともある。
ゴナドトロピン(hCG)の解離と、第二表面での抗体による捕獲/検出に関す
る。図3で、この検出原理を模式的に説明する。この実施例は進歩したキットに
適したBiacore AB Bialite(商標)を用いて実施し、表面プ
ラズモン共鳴を利用する。
合体させ、HBS(HEPES緩衝食塩水)ランニング緩衝液で平衡化した。温
度を25℃に維持し、流速を10μl/分に設定した。
の二つのフローセルを連続して通るように設定した。Biacore ABアミ
ンカップリングキットの1−エチル(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
(EDC)とN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)活性化化学薬品を利用し
、EDC/NHC混合液をサンプルループに注入して40μlを充填することに
より、デキストラン表面を活性化した。活性化を繰り返したが、これは図4の(
a)で示した部分に見ることができる。第一表面でのBialite(商標)反
応は細い線で示され、第二表面での反応は太い線で示される。この線の太さの識
別が、次のBialite(商標)トレースで利用される。
ント(scFv3299HisH2)溶液40μlを、フローセル1を通して注
入した。次に、hCGを認識する50μg/mlの全抗体(3299)溶液40
μlを、フローセル2を通して注入し、さらに50μg/mlのscFv329
9HisH2溶液40μlをフローセル1を通して注入した。このカップリング
段階は、図4の(b)で示した部分に見ることができる。
ン溶液を2回連続して注入することによりブロックした。これらは、図4の(c
)で示した部分に見ることができる。
配列を生じる可動性リンカーをコードするBstEII−SacIフラグメント
と置換された以外は、scFv3299の配列はWO96/27612(そこで
はFvKC−IIと記述される)で開示されるものと同様である: FR−4 VH リンカー FR−1 VL TVTVSSggggsggggsggggsDIELT(配列番号1) リンカーをコードするDNA配列は、Jacksonら(「バクテリオファージ
fdの表面上への表示を利用した抗体の変異体および他のタンパク質分子の選択
」in Protein Engineering:A Practical
Approach,eds.Rees,SternbergとWetzel,p
ubl.IRL Press,Oxford,1992)に記述されている。多
数の他の抗hCG抗体も同様に適当であることが理解されよう。利用可能な他の
ものは、Linscottの免疫学的および生物学的試薬の指導書(第9版、1
996−7)に載っており、例えば、Biostride Inc.(CA,U
SA)から入手可能な抗α−hCGモノクローナル、およびBiogenesi
s Ltd(Poole,Dorset,UK)から入手可能な抗β−hCGモ
ノクローナルが含まれる。
ーナル抗体(3468と名付けられ、100μg/mlで)20μlとともに、
室温で30分間インキュベーションした(再度、3468以外の抗体も適当であ
る)。これは、hCGの効果的な質量を増加させるために行われ、これにより検
出感度が上昇する。
て注入した。これは、図5Aの(a)で示した部分に見ることができる。
るように変えた。これが起こるポイントは、図5Bの(b)で示される。
299での捕獲により第二表面に結合し検出され得ることを示す(図5B)。実
際には第一表面は検出可能なシグナルを生成する必要はなく、これは研究目的の
ためだけのこの実施例における装置であることが、当業者には理解されよう。通
常の装置では、捕獲(第二)表面のみが検出可能なシグナルを生成し、第一表面
はどんな適当な固体支持体でもよい。さらに、本発明のアッセイ法では、目的分
析物の存在下でのみhCGが表面1から置換されるように条件を調整した。それ
にもかかわらず、この実施例は本発明の原理を証明する。
アナログ(エストラジオール 3−グルクロニド[ED3G])からのE3Gを
認識する抗体(4155)の特異的置換と、第二表面での免疫グロブリンを認識
する抗体による捕獲と検出に関する。図6で、この検出原理を模式的に説明する
。
d Biochem.Molec.Biol.48,277−282)に記述さ
れている方法に従って、調製しスクリーニングした。Ganiらの発表は抗プロ
ゲステロン抗体の開発に関するものであるが、基本的にはエストロンとそのアナ
ログに反応する抗体の作製にも同一の技術を利用した。細胞株4155から得ら
れるもの以外の抗体も、当業者によって(そのような技術を利用して)容易に作
製され得る:そのような抗体は、質的に同様の性質を有する。さらに、市販の抗
エストロングルクロニドモノクローナル抗体(Wallaceville An
imal Research Centre,New Zealand)につい
ては、Linscottの免疫学的および生物学的試薬の指導書(第9版、19
96−7)に記述されている。
合体させ、HBSランニング緩衝液で平衡化した。温度を25℃に維持し、流速
を10μl/分に設定した。
続して通るように設定した。Biacore ABアミンカップリングキットの
EDCとNHS活性化化学薬品を利用し、EDC/NHC混合液をサンプルルー
プに注入して40μlを充填することにより、デキストラン表面を活性化した。
これは図7の(a)で示した部分に見ることができる。
液、pH5.0中のウサギ抗マウスIgGを40μl注入した。これは、図7の
(b)で示した部分に見ることができる。
ように変更し、40μlのエチレンジアミン(EDA)(20% v/v)を注
入した。これは、図7の(c)で示した部分に見ることができる。
溶液に添加し、混合して室温で7分間インキュベーションした。次に、この予め
インキュベーションしたED3G溶液40μlを表面1を通して注入した(これ
は図7の(d)で示した部分に見ることができる)。
ールアミン溶液を注入した。これは図7の(e)で示した部分に見ることができ
る。
4155を表面1に充填した。
G溶液を注入することにより、表面1からの特異的置換と表面2における再捕獲
/検出を誘導した。この結果は図8に見ることができ、黒四角はE3Gによる表
面1からの4155の特異的置換を示し、白四角は表面2における4155の捕
獲を示す。四角のサイズの上昇は流速の上昇を表し、最も小さい四角は2μl/
分を表し、次の四角のサイズは5、10、および20μl/分で収集したデータ
のものである。
に関連している(図9を参照のこと)。流速の上昇は、置換物質のパーセンテー
ジを減少させる。低い流速(5μl/分以下)により、確実にすべての置換物質
が捕獲される。
物質を認識する抗体による第二の別の表面での続く置換物質の再捕獲を誘導する
ことにより、いかに分析物(E3G)がアッセイされ得るかを示すものである。
アナログ(エストラジオール 3−グルクロニド[ED3G])からのE3Gを
認識する抗体(4101)の特異的置換と、第二検出表面でのE3Gによる捕獲
に関連する。図10は、この検出原理を模式的に説明する。
合体させ、HBSランニング緩衝液で平衡化した。温度を25℃に維持し、流速
を10μl/分に設定した。
続して通るように設定した。Biacore ABアミンカップリングキットの
EDCとNHS活性化化学薬品を利用し、EDC/NHC混合液をサンプルルー
プに注入して40μlを充填することにより、デキストラン表面を活性化した。
これは図11の(a)で示した部分に見ることができる。
入した。これは、図11の(b)で示した部分に見ることができる。
化溶液に添加し、混合して室温で7分間インキュベーションした。次に、この予
めインキュベーションしたED3G溶液40μlを表面1を通して注入した(こ
れは図11の(c)で示した部分に見ることができる)。 v.20μlのE3G(5mg/ml)を80μlのNHS/EDC活性化溶液
に添加し、混合して室温で7分間インキュベーションした。次に、この予めイン
キュベーションしたE3G溶液40μlを表面2を通して注入した(これは図1
1の(d)で示した部分に見ることができる)。
ことにより、4101を表面1に充填した。
酸[E3S]溶液を注入することにより、表面1からの4101の置換と表面2
における再捕獲/検出を誘導した。表面1からの置換と表面2における再捕獲/
検出は、図12に見ることができる。
低親和性アナログ(ED3G)に可逆的に結合した分子の置換と、分析物の高親
和性アナログ(E3G)に結合することにより第二の別の表面での続く再捕獲と
検出を誘導することにより、いかに分析物がアッセイされ得るかを示すものであ
る。
ュゲートの置換/捕獲によりもたらされる、色変化の生成を示す。置換されたグ
ルコースオキシダーゼ/抗体コンジュゲートは、KI、西洋わさびペルオキシダ
ーゼ、および捕獲分子のしみ込んだデンプンの薄層に捕獲される。捕獲されたグ
ルコースオキシダーゼ/抗体コンジュゲートはグルコースを利用してH2O2を
生成し、ペルオキシダーゼの存在下でこれがヨウ化物を酸化してヨウ素にする。
次に生成されたヨウ素はデンプンと反応し、茶色から青への色変化が生じる。
の新たに調製したEDC(0.1M)とNHS(0.02M)溶液に再懸濁して
、室温で15分間インキュベーションすることにより、ED3G/オボアルブミ
ンコンジュゲートを準備する。
定常的に混合しながら室温で2.5時間インキュベーションする。
1%アジ化ナトリウムを含む1Lのリン酸緩衝食塩水(「PBSA」)に対して
16時間透析する。
0に希釈)を室温で2時間インキュベーションすることにより、Griener
HBウェルを透析したED3G−オボアルブミンコンジュゲートでコーティン
グする。
とモノクローナル抗体4155(これも100mMリン酸緩衝液、pH6.5中
)を、5mg/mlのタンパク質濃度でガラスチューブ中で混合することにより
、グルコースオキシダーゼとモノクローナル抗体4155のコンジュゲートを調
製する。これに220μlの0.02%グルタルアルデヒドを、定常的に混合し
ながら1滴ずつ添加する。チューブをアルミホイルで覆い、室温で30分間、回
転させながら混合する。250μlの1Mエタノールアミンを添加し、さらに3
0分間混合を続ける。次にこの溶液を100mM PBSに対して室温で24時
間透析し、続いて4℃にて10,000rpmで30分間遠心分離する。
ンジュゲートを室温で1時間インキュベーションすることにより、Griene
r HBウェルを準備する。続いてウェルをPBSでリンスし、非結合のグルコ
ースオキシダーゼ/4155コンジュゲートを除去する。ウェルは、必要時まで
、100μlのPBSを入れたまま4℃で保存する。
アルブミンコンジュゲート(ED3G−オボアルブミンコンジュゲートで記述し
たのと同様に調製)、5%(w/v)デンプン、10mg/ml西洋わさびペル
オキシダーゼ、および0.1M KIを含む200μlの溶液を、Greine
r HBウェル内で室温で16時間インキュベーションする。表面の色は茶色で
ある。
3−グルクロニド)を準備した表面1のウェルに0.2ml/分で送り込み、そ
れと同時にこのウェルからの溶液を表面2を含むウェルに0.2ml/分で送り
込む。表面2を有するウェルがオーバーフローしないように、0.2ml/分で
溶液をまたウェルから送り出す。
ゼによるグルコースの酸化によって生成されるH2O2により、ヨウ化物が酸化
されてヨウ素になり、表面2の色が茶色から青に変化する。
来ると、分子は第一表面から置換される。これらの置換された分子は、第二表面
で生成される蛍光強度を変調することができる。
HS(0.02M)溶液に再懸濁して、室温で15分間インキュベーションする
ことにより、ED3G/オボアルブミンコンジュゲートを準備する。
定常的に混合しながら室温で2.5時間インキュベーションする。
のPBSAに対して16時間透析する。
0に希釈)を室温で2時間インキュベーションすることにより、Griener
HBウェルを、透析したED3G−オボアルブミンコンジュゲートでコーティ
ングする。
D)1mlとモノクローナル抗体4155(これも100mMリン酸緩衝液、p
H6.5中)を、5mg/mlのタンパク質濃度でガラスチューブ中で混合する
ことにより、CBD/モノクローナル抗体4155のコンジュゲートを調製する
。これに220μlの0.02%グルタルアルデヒドを、定常的に混合しながら
1滴ずつ添加する。チューブをアルミホイルで覆い、室温で30分間、回転させ
ながら混合する。250μlの1Mエタノールアミンを添加し、さらに30分間
混合を続ける。次にこの溶液を100mM PBSに対して室温で24時間透析
し、続いて4℃にて10,000rpmで30分間遠心分離する。必要時まで、
上清を4℃で保存する。
温で1時間インキュベーションすることにより、Griener HB表面を準
備する。続いてウェルをPBSで濯ぎ、非結合のCBD/4155コンジュゲー
トを除去する。
ム(gum)(LBG)−FITCコンジュゲート50μlとともに、定常的に
混合しながら室温で1時間インキュベーションする。
Sに再懸濁することにより、LBG−FITC Avicelを洗浄する。この
洗浄手順をもう一度繰り返す。
懸濁し、必要時まで4℃で保存する。
Bウェル(表面1)中で室温で1時間インキュベーションする。次にインキュベ
ーションした溶液をウェルから除去し、LBG−FITC充填粒子に添加する。
Avicel粒子上でのCDB−4155によるLBG−FITCの置換による
蛍光強度の減少を、蛍光標示式セルソーターを使用して、またはセルソーター(
例えば、Coulter Elite(商標)セルソーター)によりモニターす
る。
換/捕獲によってもたらされる、電気的変化の生成を示す。それは、第一抗体結
合部位(エストロン−3−グルクロニド(E3G)を認識し、マウスモノクロー
ナル抗体4155から誘導する)の、第一表面からの低親和性E3Gアナログ(
エストラジオール 3−グルクロニド(ED3G))からの特異的置換と、第二
表面に固定化された電気活性分子を認識する第二抗体結合部位を介しての捕獲と
検出に関する。第二表面は、単層の電気活性分子でコーティングされた金の電極
である。電気活性分子は、ヘキシル付属部分に結合したカルバゾール残基であり
、これは次にチオール基によって金表面に結合される。この明細書と同一日に出
願された我々の同時係属中欧州特許出願は、いかに選択された抗体の結合が、印
加電圧の影響下で電極を流れる電流を変化(変調)することができるのかを説明
している。ここでは、電気活性分子への二特異性抗体フラグメントの結合が、も
ともと導入された分析物の濃度に直接関連する様式で、電流を変調した。
d Biochem.Molec.Biol.48,277−282)に記述さ
れている方法に従って、調製しスクリーニングした。Ganiらの発表は抗プロ
ゲステロン抗体の開発に関するものであるが、基本的にはエストロンとそのアナ
ログに反応する抗体の作製にも同一の技術を利用した。細胞株4155から得ら
れるもの以外の抗体も、当業者によって(そのような技術を利用して)容易に作
製され得る:そのような抗体は、質的に同様の性質を有する。電気活性カルバゾ
ール分子、別のハプテンに対するモノクローナル抗体も、この方法を使用して作
製することができる。二つの抗体結合特異性の遺伝子のクローニングと、二特異
性抗体フラグメントの構築でのその使用は、当業者には周知の方法により容易に
達成することができる(例えばWO 97/14719を参照のこと)。
の新たに調製したEDC(0.1M)とNHS(0.02M)溶液に再懸濁して
、室温で15分間インキュベーションすることにより、ED3G/オボアルブミ
ンコンジュゲートを準備する。
定常的に混合しながら室温で2.5時間インキュベーションする。
1%アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝食塩水(「PBSA」)1Lに対して1
6時間透析する。
0に希釈)を室温で2時間インキュベーションすることにより、Griener
HBウェルを透析したED3G−オボアルブミンコンジュゲートでコーティン
グする。
100μg/ml)溶液を室温で1時間インキュベーションすることにより、G
riener HB−ED3G−オボアルブミン表面を準備する。続いてウェル
をPBSAで濯ぎ、非結合の二特異性抗体フラグメントを除去する。ウェルは、
必要時まで、100μlのPBSAを入れたまま4℃で保存する。
ジしたエタノール、またはDMF溶液に溶解した。
した。
で洗浄して非結合の分子をすべて除去し、次いで、窒素をパージした適当な溶媒
中で一晩保存した。
きを改善し、その結果、水性環境下で適当な単層となる。
r(model A25000)とEH&G model 273A Prin
ceton Applied Research Potentiostat/
Galvanostatと一緒にPrinceton Applied Res
earch Corporation Scanning Potentios
tat(model 362)でのサイクリックボルタンメトリーまたはクロノ
アンペロメトリーにより(データの処理にはEchemとLotus123を使
用して)行う。
取って保存する。
ュベーションする。
で15分間インキュベーションする。
気化学を測定する。システムを標準E3Gサンプルに対してキャリブレーション
してあるならば、電流の変調により、モル濃度単位で表される分析物濃度の測定
値が与えられる。
である。
である。
である。
影響、および低い流速において第一表面から特異的に置換された置換可能な成分
の100%がいかに第二表面に捕獲され得るかを示すグラフ(毎分μlの流速に
対する、第二表面で捕獲される置換可能な成分の%)である。
)である。
。
Claims (24)
- 【請求項1】 サンプル中の目的分析物の存在を検出する方法であって、上
に可逆的に固定化された置換可能な成分を有する第一表面を提供し;第一表面を
目的分析物を含むサンプルに曝露して、目的分析物は第一表面の置換可能な成分
を特異的に置換し;第二表面上で置換可能な成分を捕獲するように、第一表面か
ら置換された置換可能な成分を置換可能な成分に特異的に結合する捕獲成分を有
する第二表面と接触させ、前記捕獲によって検出可能なシグナルが生成し;シグ
ナルを検出する段階を含み;前記検出はSPR以外の手段により実施される方法
。 - 【請求項2】 置換可能な成分が第二表面で捕獲成分により捕獲された時に
のみ、検出可能なシグナルが生成される、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 置換可能な成分が免疫グロブリン分子またはその抗原結合誘
導体を含む、請求項1または2に記載の方法。 - 【請求項4】 置換可能な成分が二特異性抗体または二特異性抗原結合抗体
誘導体を含む、請求項1、2、または3のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項5】 置換可能な成分が第一表面での可逆的固定化を促進する部分
を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項6】 置換可能な成分が融合タンパク質を含む、先行する請求項の
いずれか一項に記載の方法。 - 【請求項7】 置換可能な成分が目的分析物のアナログであるミモトープを
含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項8】 第一表面が置換可能な成分に比較的緩く結合する複数の介在
分子を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項9】 介在分子が目的分析物のアナログ(例えばミモトープ)であ
る、請求項8に記載の方法。 - 【請求項10】 捕獲成分が免疫グロブリン分子またはその抗原結合変異体
を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項11】 置換可能な成分と捕獲成分が特異的結合対のメンバーを含
む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項12】 検出可能なシグナルがエバネッセント波または音波の生成
または変調を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項13】 捕獲成分による置換可能な成分の捕獲が捕獲成分の電気化
学的性質を直接変調し、その変調が検出可能なシグナルを含む、請求項1〜11
のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項14】 第一および第二表面が別々のそれぞれ第一および第二支持
体上に備わる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項15】 第一および第二表面が単一の支持体上に提供される、請求
項1〜13のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項16】 第一および/または第二表面が、平面、粒子、多孔性であ
る固体支持体上に提供される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項17】 目的分析物が、ステロイドホルモン、タンパク質ホルモン
、核酸、ペプチド、細菌性またはウイルス性抗原、および免疫グロブリンから成
る群より選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項18】 上に可逆的に固定化された置換可能な成分を有し、目的分
析物の存在下で置換可能な成分が第一表面から置換される第一表面と;及び置換
可能な成分に特異的に結合する捕獲成分を有する第二表面を含む、先行する請求
項のいずれか一項に記載の方法を実施するための装置。 - 【請求項19】 さらに、液体伝導手段;捕獲成分による置換可能な成分の
捕獲により生成されるシグナルを検出するシグナル検出手段;およびデータ処理
手段の一つまたはそれ以上を含む、請求項18に記載の方法。 - 【請求項20】 第一および第二表面間に提供されるフィルター手段を含む
、請求項18または19に記載の装置。 - 【請求項21】 サンプル中の目的分析物の存在を検出する方法であって、
第一表面と置換可能な成分間の介在成分との相互作用によりその上に可逆的に固
定化された置換可能な成分を有する第一表面を提供し;第一表面を目的分析物を
含むサンプルに曝露して、目的分析物が第一表面からの置換可能な成分と特異的
に置換し;第二表面上で置換可能な成分を捕獲するように、第一表面から置換さ
れた置換可能な成分を置換可能な成分に特異的に結合する捕獲成分を有する第二
表面と接触させ、前記捕獲によって検出可能なシグナルが生成し;シグナルを検
出する段階を含み、置換可能な成分の目的分析物に対する結合親和性が置換可能
な成分の介在成分に対する結合親和性よりも高い方法。 - 【請求項22】 サンプル中の目的分析物の存在を検出する方法であって、
第一表面と置換可能な成分間の介在成分との相互作用によりその上に可逆的に固
定化された置換可能な成分を有する第一表面を提供し;第一表面を目的分析物を
含むサンプルに曝露して、目的分析物が第一表面からの置換可能な成分と特異的
に置換し;第二表面上で置換可能な成分を捕獲するように、第一表面から置換さ
れた置換可能な成分を置換可能な成分に特異的に結合する捕獲成分を有する第二
表面と接触させ、前記捕獲によって検出可能なシグナルが生成し;シグナルを検
出する段階を含み、介在成分の目的分析物に対する結合親和性が置換可能な成分
の介在成分に対する結合親和性よりも高い方法。 - 【請求項23】 実質的に先に記述されたような、および付随する図に関す
る方法。 - 【請求項24】 実質的に先に記述されたような、および付随する図に関す
る装置。
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