JP4220124B2 - 置換アッセイにおける改良又は置換アッセイに関する改良 - Google Patents
置換アッセイにおける改良又は置換アッセイに関する改良 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、とりわけ、サンプル中の目的物質の存在を検出するアッセイを実施する方法と、その方法を実施する装置に関する。
【０００２】
発明の背景
サンプル中の目的物質の存在および／または量を検出する様々なアッセイ法が知られている。アッセイの一つの特殊な形式は、「置換アッセイ」であり、これは慣習的にサンプル中の目的分析物の存在が既存の結合パートナー／リガンド複合体からの標識物質（標識結合パートナーまたは標識リガンドのどちらか）の置換を引き起こす。一般に、置換された標識物質の量は目的分析物の濃度に比例する。あるいは、「競合」アッセイを利用してもよく、そのアッセイでは、目的分析物と標識競合物（標識分析物またはアナログ等）間に限られた数の結合部位への結合に対する競合が存在する。
【０００３】
一つの特殊なアッセイはＷＯ ９１／０５２６２（ミシガン大学）に開示されており、これは典型的に使い捨てのテストストリップを含むアッセイ装置に関し、テスト装置が接触するテスト溶液中の目的分析物の存在が、装置の別の位置でのシグナル（色等）によって示され、分析物の不在は異なる位置に現れる同様のシグナルによって示される。
【０００４】
ＷＯ９１／０５２６２で開示されるように、第一結合手段（固定化抗体等）はテストスティック上の一位置に提供され、目的分析物に対する結合特異性を有する。「シグナル生成分子」に共有結合した分析物を含む「異種二官能性複合体」は、第一結合手段に可逆的に結合している。サンプル中の遊離の目的分析物の存在下で、異種二機能性複合体は第一結合手段から遊離され、「液体伝導手段」（典型的にキャピラリーテストスティック）を介して、複合体が捕獲されるようなシグナル生成分子に対する結合特異性を有する第二結合手段に輸送される。典型的にシグナル生成分子は、テストスティックを適当な基質溶液に浸した時に、テストサンプル中に分析物が存在しない場合は第一結合手段において、分析産物が存在する場合は第二結合手段において色のついた産物（「シグナル」）を形成するような酵素（例えば西洋わさびペルオキシダーゼ）である。シグナル生成分子は、蛍光分子または紫外線吸収剤でもよい。
【０００５】
この種の装置では、シグナル生成分子と結合手段間に、シグナル生成分子を含む複合体の単純捕獲以外の相互関係は存在しない。このように、シグナル生成分子（酵素）は、第一結合手段から遊離されるか否かに関わらず、固有にシグナル（色のついた産物）を生成することが可能であり、シグナル生成分子の捕獲作用はシグナル生成の過程において役割を果たさない。
【０００６】
アッセイに関した一つの比較的最近の開発は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用する装置の利用である。この現象は現在様々な出版物で記述されており、エバネッセント波（ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ ｗａｖｅ）バイオセンサーの基礎となっている（レビューとして、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ １９９５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３，４７−５４とその中の参考文献を参照のこと）。
【０００７】
要約すると、異なる屈折率の２つの媒体間の界面における光入射は、特異的入射角において共鳴「エバネッセント波」を生じる。共鳴は、媒体の屈折率変化に極端に敏感である。屈折率の変化により、共鳴が新しい入射角で生じる。屈折率の変化は、２つの媒体間の界面における薄（典型的に金）膜への大量結合によって生じ：屈折率の変化は金膜への大量結合に比例する。
【０００８】
エバネッセント波現象を利用するそのような装置の例として、ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ（スウェーデン）の販売するＢＩＡ ｌｉｔｅ（商標）とＢＩＡ ｃｏｒｅ（商標）機、Ｆｉｓｏｎ（イギリス）の販売するＩＡ Ｓｙｓ（商標）装置、およびＡｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｎｓｏｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（スイス、チューリッヒ）の販売するＢＩＯＳ−１装置が含まれる。
【０００９】
ＷＯ ９２／１８８６７は、目的分析物に対するアッセイであり、置換表面に固定化された第一試薬からの第二試薬との置換を含み、前記置換は目的分析物の存在に反応して起こり、置換された第二試薬は次に検出表面上で検出表面に固定化された第三試薬を変化する反応を起こし、第三試薬の変化はＳＰＲ手段によって検出されるアッセイ法を開示している。
【００１０】
ＷＯ９２／１８８６７は主に低分子の分析物（ハプテン等）のアッセイに関わり（１ページ、４〜６行）、先行技術で明らかなそのような分析物のアッセイにおける感度の欠除に取り組んでいる（２ページ、１〜１７行）。
【００１１】
ＷＯ９２／１８８６７では典型的に、第一試薬は目的分析物のアナログで、第二試薬は分析物に対する特異的抗体である。あるいは、第一試薬は分析物に対する抗体であり、第二試薬は（低分子量分析物の）アナログと高分子量タンパク質を含むコンジュゲートである。先行技術では、「分析物のアナログとは、その特異的バインダーへの結合について分析物と競合する物質である。アナログの構造は、しばしば、分析物とできるだけ近く、またはさらに完全に同一となるように整列される」と教示している（３ページ、６〜１０行）。
【００１２】
したがって、ＷＯ ９２／１８８６７ではアナログと分析物は構造的に「できるだけ近づいて」同じであるべきであると教示しており、第一試薬、第二試薬と目的分析物間の結合親和性比に違いが存在するはずであるという開示あるいは示唆はない。
【００１３】
発明の要約
第一態様において、本発明は、サンプル中の目的分析物の存在を検出する方法を提供し、この方法は、上に可逆的に固定化された置換可能な成分を有する第一表面を提供し；第一表面を目的分析物を含むサンプルに曝露して目的分析物は第一表面の置換可能な成分を特異的に置換し；第二表面上で置換可能な成分を捕獲するように、第一表面から置換された置換可能な成分を置換可能な成分に特異的に結合する捕獲成分を有する第二表面と接触させ、前記捕獲によって検出可能なシグナルが生成し；シグナルを検出段階を含み、前記検出は表面プラズモン共鳴以外の方法で実施される。
【００１４】
本発明の方法は、あらゆる目的分析物の存在を検出するために利用される。そのような分析物の例として、抗体（診断法において有効でありうる）、核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）、ホルモン（タンパク質とステロイドの両種類）、成長因子等が含まれる。特に目的とするのは、エストロン−３−グルクロニド（Ｅ３Ｇ）、プロゲストゲン−３−グルクロニド（Ｐ３Ｇ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、および卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）等の性および／または受精ホルモンとそのアナログであり、そのような分析物の検出は妊娠検査に有効でありうる。好都合には分析物は、液体サンプル、特に、血液、血清、尿、および唾液等の哺乳動物の体液に存在する。
【００１５】
本発明の方法は定性的に（例えば、目的分析物の存在を検出するため）、またはさらに好ましくは、存在する分析物の量が測定できるような定量的に利用されうる。
【００１６】
置換可能な成分と捕獲成分は、置換可能な成分が第一表面から置換された時に捕獲成分により第二表面で直ちに特異的に捕獲されるように、特異的結合対のメンバーを有利に含む。多くの特異的結合対が当業者に知られており、例えば、抗原／抗体、相補的な（すなわち特異的塩基対）核酸鎖、酵素／基質、レクチン／糖、ホルモン／レセプター等が含まれる。
【００１７】
一般に、第一表面は複数の置換可能な成分を含む。典型的に、置換可能な成分は第一表面に付着したコーティングまたは層を形成する。置換可能な成分は、第一表面に直接付着されてよい。しかし、さらに一般に、置換可能な成分は介在分子を介して間接的に第一表面に付着され、その組み合わせにより置換可能な成分の望ましい程度の可逆的固定化の達成が促進される。
【００１８】
典型的に、介在分子は数多くの従来の化学的技術のいずれかにより第一表面に固定化される一方、置換可能な成分は介在分子に比較的弱く付着される（そしてこのように第一表面上に可逆的に固定化される）。望ましくは、介在分子は目的分析物のアナログ（以下で考察するミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）等）であり、その配置は、介在分子に対する置換可能な成分の（または他の実施形態では、介在分子の）結合親和性が、置換可能な成分の目的分析物に対する親和性と比較して比較的低い（例えば１〜５０％、さらに典型的には１〜１０％、好ましくは１〜５％）ものである。したがって、目的分析物の存在下で、分析物は第一表面の置換可能な成分と特異的に置換する傾向がある。有利には、本発明の方法は、目的分析物が置換可能な成分の定量的置換を引き起こすような、置換可能な成分の特異的な親和性に関した置換を含む。親和性比は望ましくは、少量の分析物の存在によって適当量の置換可能な成分が十分に置換されるように選択され、そのの結果、本発明のアッセイ法が高い感度のものとなる。
【００１９】
好ましい実施形態において、置換可能な成分は免疫グロブリン分子またはその抗原結合誘導体（Ｆｖ，Ｆａｂ，Ｆａｂ２，ｓｃＦｖ，重鎖可変領域［ラマおよびラクダから入手可能なものであるような「Ｈｃｖ」］等）を含む。特に好都合な例はモノクローナル抗体、二特異性抗体と「Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ」、および免疫グロブリン分子またはその抗原結合誘導体を含む融合（キメラ）ポリペプチドである。融合タンパク質は、酵素（例えば、カタラーゼまたはグルコースオキシダーゼ）、または捕獲成分による特異的捕獲を促進する（例えばミモトープ、すなわち、抗体によって認識されるエピトープの構造的アナログ、またはビオチン、アビジン、あるいは特異的結合対の他のメンバー等のいくつかの他の分子で、捕獲成分は特異的結合対の逆のメンバーを含む）、あるいは第一表面での可逆的固定化を促進する部分等の、一つまたはそれ以上の付加的な機能的ドメインに結合された免疫グロブリン分子（またはその抗原結合誘導体）を含みうる。
【００２０】
一般に、捕獲成分は特異的結合対の逆のメンバーを含み（すなわち逆のメンバーとは、置換可能な成分に通常存在する対のメンバーに結合するものである）、簡便に第二表面に固定化される。当業者には周知である従来の化学的方法が、そのような固定化を達成するのに使用しうる。異なる目的分析物に対する本発明の実施を可能にするために、表面が異なる捕獲成分でコーティングされるように、アッセイ完了時に、厳しい化学的処理（例えば、非常に高いまたは非常に低いｐＨ、あるいはカオトロピック剤の使用）により第二表面から捕獲成分を除去することが可能ではあるが、捕獲成分に関する「固定化」という用語は、捕獲成分が通常のアッセイ条件下で第二表面に結合されたままであることを示すように意図されていることが理解されよう。しかしながら、通常は別の分析物と関した使用には第一表面を適当に修飾できるので、一般にそのような処理は必要でない。
【００２１】
本発明の重要な特徴は、第二表面の性質である。本発明では、第二表面は、表面が単に支持体として受動的様式で作用する従来の先行技術アッセイとは対照をなすシグナル生成において、「活性」部分として記述されるものを受け取る。本発明においてそれは、検出可能なシグナルの生成を間接的または（好ましくは）直接的に導く、第二表面での置換可能な成分の捕獲作用である。一般に置換可能な成分は、第二表面で捕獲されない限りおよび捕獲されるまではアッセイで実際に観察またはモニターされる検出可能なシグナルを生成することはできず、一般にシグナル生成は置換可能な成分の第二表面との相互作用に依存する。
【００２２】
本発明は、先行技術のアッセイ法および装置を超える数多くの利点を提供する。第一に、本発明により、どんな目的分析物の検出への利用に対しても容易に修飾され得る一般的なアッセイ法と装置の利用が可能となる：置換可能な成分が適当な分析物の存在に反応して置換されるためには、同じ第二表面が（生成され検出される同じタイプのシグナルとでは）利用可能であり、比較的安価で単純な第一表面のみが変更される必要がある。第二に、特異的置換段階を組み込むアッセイ法と装置によって、不均一な（例えば、食物粒子、血液細胞、または細菌等の粒子状物質を含む）または粗製であり多くの混入物（例えば、血清、尿等）を含むサンプルのテストが可能となる。さらに、本発明のアッセイは特異的置換段階と特異的捕獲段階の両方を含む。これは、アッセイの全体的な特異性が事実上置換および捕獲段階の特異性の非常に正確な産物であることを意味し、ほとんどの先行技術アッセイによって付与される特異性よりもさらに高い特異性を生み出す。さらに、利用者に関する限り、これは基本的に一段階工程の形式で成し遂げることができる：アッセイを実施する人は単にサンプルを第一表面と接触させる必要があり、それによって検出可能なシグナルの生成へと導く一連の反応が開始する。
【００２３】
ある実施形態では、第二表面は、表面における置換可能な成分の捕獲が第二表面でのシグナルの検出可能な変化を生じる質量の増加を起こすような（すなわち、置換可能な成分の捕獲は、既存のシグナルを検出可能な様式で制御または修飾する）エバネッセント波または音波タイプのバイオセンサー（例えば、ＥＰ ０ ４１６ ７３０；ＥＰ ０ ５１７ ００１；またはＷＯ ９７／０４３１４に開示されているような）の検出表面を形成する。
【００２４】
ある実施形態では、第二表面における置換可能な成分の捕獲は検出可能な様式でシグナルの生成を阻害し、そのような阻害が「検出可能なシグナル」を構成する。例えば、置換可能な成分の捕獲は第二表面で進行中の反応を阻害する：一実施形態では、第二表面は検出可能な（例えば色のついた）産物を生成する反応を触媒する複数の酵素分子を含み、置換可能な成分は酵素に対する特異的結合活性を有する免疫グロブリン分子を含み、置換可能な成分の酵素に対する結合がその触媒活性を阻害し（または、例えばアロステリック部位への結合等により、別の方法でそれを修飾し）、よって酵素の作用に検出可能な変化をもたらす。
【００２５】
代わりの好ましい実施形態では、第二表面で伝播するエバネッセント波または音波は置換可能な成分と相互作用し、既存のシグナルの変調というよりもむしろ全く新しいシグナルを生成する。例えば、置換可能な成分は、第二表面でのエバネッセント波によって刺激されるフルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒ）を含み、蛍光を発する：エバネッセント波の「範囲」が短いため、フルオロフォアは置換可能な成分が第二表面に捕獲されない限り刺激されない。さらに、特異性の程度は、エバネッセント波がフルオロフォアの励起を起こす適当な性質を有するようにフルオロフォアとエバネッセント波の波長が選択される時の相互作用と関連する。
【００２６】
好ましい実施形態では、捕獲成分による置換可能な成分の捕獲は捕獲成分の電気化学的性質を変調し、その変調は検出可能なシグナルを含む。適当な方法と物質は、我々の同時係属中欧州特許出願第９７３０９４２５．３号に開示されている。特に、捕獲成分は典型的に導電性の支持体に固定化された免疫グロブリン分子（好ましくは抗体）またはその抗体結合誘導体を含み、置換可能な成分の捕獲成分への結合が捕獲成分の電気化学的性質を変化させ、例えば電流測定、ボルタメトリック、または電量測定法によって検出可能なシグナルを生成する。好ましくは、捕獲性分と置換可能な成分は、置換可能な成分の捕獲が捕獲成分の電気化学的性質（例えば酸化還元電位）を直接変えるように選択される。
【００２７】
本発明のある実施形態では、第一表面と第二表面間の距離は非常に小さく（例えば、５０μｍから５ｍｍの範囲）、そのように、第一および第二表面間での置換可能な成分（置換された抗体分子等）の単純な拡散は、必要とされる迅速な反応時間を無理なく提供するのに十分である。「ナノテクノロジー」原理を利用する装置では、第一および第二表面間の距離はさらに小さくてよい：そのような装置では、第一および第二表面間の大量輸送の時間を最短にするため、ギャップは単一分子の大きさと同じぐらい小さくてもよい（例えば、典型的な免疫グロブリン分子または二特異性抗体の５〜５０ｎｍ）。
【００２８】
代わりの実施形態では、第一から第二表面への置換可能な成分の拡散が十分でない場合、ある種の「輸送力」を提供して置換可能な成分を第一表面から第二表面に運ぶ必要がある。これは、キャピラリー流動、または大量の液体流動（ポンプ手段を利用）、または例えば置換可能な成分と第二表面間の静電気的誘引によって可能である。
【００２９】
第一および第二表面は別々のそれぞれ第一および第二固相によって提供されてもよく、これにより以下で述べるようなフィルターの封入が容易となる。代わりに、第一および第二表面は単一の固体支持体上に提供されてもよい。固相は、実質的には平面または粒子であり、多孔性または不浸透性である。第一および第二表面が単一支持体上に提供される場合、表面は支持体上の遠い部分として存在するか、あるいは支持体の近接部分として存在してよい（例えば、一つの表面が二次元的にもう一方の表面に囲まれている、または二つの表面が親密に互いに入り組む）。粒子性の支持体の例として、当業者には既知である重合体物質（例えば、デキストラン等の多糖類；またはラテックスや他の物質）を含むビーズが含まれる。実質上の平面支持体の例としては、既知のエバネッセント波または音波タイプのバイオセンサーと関連して使用されるセンサーチップが含まれる。
【００３０】
ある実施形態では、あるサンプル中に存在する粒子物質を除去するようなフィルター手段を第一および第二表面間に置くことが好ましい。これは、そのような物質がアッセイの結果に悪影響を及ぼすような時に（例えば、第二表面での粒子物質の非特異的結合による）望ましい。適当な微小孔フィルター膜は、当業者には周知である。
【００３１】
本発明の第二態様では、先に定義された第一態様の方法を実施するための装置を提供する。一般に、装置は、その上に可逆的に固定化された置換可能な成分を有し、目的分析物の存在下で置換可能な成分が第一表面から置換される第一表面と、置換可能な成分に特異的に結合する捕獲成分を有する第二表面を含む。
【００３２】
先に定義された装置は、「永久」シグナル検出手段のような、他の成分と付随して利用するための比較的安価で、使い捨てまたは交換可能な成分（例えばキットの一部分として）の形態をとる。あるいは、本発明の装置は、以下の一つまたはそれ以上を含む実質的に「一個の」装置として提供されてもよく、これは、液体伝導手段；目的分析物の存在下で生成されるシグナルを検出するためのシグナル検出手段；およびシグナル検出手段から出力されるデータを処理するデータ処理手段を含む。
【００３３】
流体（ｆｌｕｉｄ）（好ましくは液体（ｌｉｑｕｉｄ））伝導手段は、以下の一つまたはそれ以上の機能を行ってもよい：第一表面への液体サンプルの導入；すべての置換可能な成分の第一表面から第二表面への輸送；および液体伝導手段を介しての廃棄液体の除去。液体伝導手段の利用に適した動力手段は、例えば回転式または蠕動式ポンプを含む。
【００３４】
望ましくは、この装置は液体に懸濁されたまたは溶解された目的分析物（特に、血液、血清、唾液等の体液）との使用に適応する。
【００３５】
第三態様では、本発明は、サンプル中の目的分析物の存在を検出する方法を提供し、この方法は、第一表面と置換可能な成分間の介在成分との相互作用によりその上に可逆的に固定化された置換可能な成分を有する第一表面を提供し；第一表面を目的分析物を含むサンプルに曝露して目的分析物が第一表面からの置換可能な成分と特異的に置換し；第二表面上で置換可能な成分を捕獲するように、第一表面から置換された置換可能な成分を置換可能な成分に特異的に結合する捕獲成分を有する第二表面と接触させ、前記捕獲によって検出可能なシグナルが生成し；シグナルを検出する段階を含み、置換可能な成分の目的分析物に対する結合親和性が置換可能な成分の介在成分に対する結合親和性よりも高い。
【００３６】
第四態様では、本発明は、サンプル中の目的分析物の存在を検出する方法を提供し、この方法は、第一表面と置換可能な成分間の介在成分との相互作用によりその上に可逆的に固定化された置換可能な成分を有する第一表面を提供し；第一表面を目的分析物を含むサンプルに曝露して、目的分析物が第一表面からの置換可能な成分と特異的に置換し；第二表面上で置換可能な成分を捕獲するように、第一表面から置換された置換可能な成分を置換可能な成分に特異的に結合する捕獲成分を有する第二表面と接触させ、前記捕獲によって検出可能なシグナルが生成し；シグナルを検出する段階を含み、介在成分の目的分析物に対する結合親和性が置換可能な成分の介在成分に対する結合親和性よりも高い。
【００３７】
本発明の第三と第四の態様に関して、置換可能な成分が第一表面に可逆的に固定化されている相互作用の結合親和性は、置換可能な成分の置換を起こす傾向がある相互作用の僅か１〜１０％（さらに好ましくは１〜５％）であることが好ましい（すなわち、本発明の第三態様の置換可能な成分と目的分析物間の相互作用、または第四態様の介在成分と目的分析物間の相互作用）。本発明の第三および第四態様の方法の好ましい特徴は、方法が適合する限りは、一般に、第一態様の方法のものと同様である。本発明の第三および第四態様では、シグナルを検出する好ましい方法は、ＷＯ９２／１８８６７に開示されているようにＳＰＲの手段による。本発明は、先に定義された第三および第四態様の方法を実施する装置も提供する。
【００３８】
本発明を図解した実施例により、および付随する図に関してさらに説明する。
【００３９】
実施例
実施例１
本発明の基本的な概念を説明する簡単な実施形態を、図１で模式的に説明する。図１において、置換可能な成分は第一表面１２に可逆的に固定化されている。図１で示される実施形態では、置換可能な成分は二特異性抗体１０であり、不可逆的固定化は、二特異性抗体１０と従来の化学的方法により第一表面１２に固定化された介在分子１４間の相互作用により達成される。単純化するため、単一分子１４と単一の特異的二特異性抗体１０のみを示す。実際には、第一表面１２は通常は複数の介在分子１４でコーティングされており、複数の二特異性抗体１０（それぞれ同じ結合特異性を有する）は表面１２に可逆的に固定化されている。置換可能な成分のこの可逆的固定化は、通常のアッセイ条件下で、目的分析物の不在化では置換可能な成分は第一表面に付着されたままであるが、目的分析物の存在下では置換可能な成分はそこから特異的に置換されるというものである。
【００４０】
二特異性抗体の一つの結合部位１６は、目的分析物１８に対する結合特異性を有する。第一表面１２に固定化された介在分子１４は目的分析物１８の構造的アナログであり、二特異性抗体１０の結合部位１６が分子１４に比較的緩く結合し、そのため第一表面１２上に二重機能性抗体１０を可逆的に固定化している。しかし、結合部位１６のアナログ１４に対する結合親和性は、目的分析物１８に対する結合親和性よりかなり低い（典型的に１〜１０％、好ましくは１〜５％）。したがって、第一表面１２を目的分析物１８を含むサンプルと接触させると、分析物１８は結合部位１６に対する結合に対してアナログ１４とうまく競合し、こように、第一表面１２から二特異性抗体１０を特異的に置換する。次に、置換された二特異性抗体１０は、第二表面２０と接触できるようになる。
【００４１】
再度図１を参照すると、第二表面２０は複数の分子でコーティングされており、それぞれは捕獲成分２２を構成する。二特異性抗体１０の結合部位１６は、捕獲成分２２に対する結合特異性を有する。したがって、第一表面から置換された二特異性抗体分子１０は、第二表面２０で捕獲される。この捕獲により検出可能なシグナルが生成され、それがモニターされる。図１で説明する実施形態では、第二表面２０はＳＰＲセンサーの一部を形成する。
【００４２】
一般に、シグナルは、捕獲された置換可能な成分１０と第二（捕獲）表面２０間の相互作用により生成される。例えば、第二表面２０はエバネッセント波検出装置の一部を含む：置換可能な成分１０の捕獲は、検出可能なシグナルが生成されるような方法で、表面２０上で伝播されるエバネッセント波の特徴を修飾する。そのような装置の例には、現在当分野で周知である表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の技術、あるいは音波検出システムを利用するものがあり、シグナルは表面２０に結合した物質の質量の増加により生成される。
【００４３】
しかし、他の検出システムも考えられており、そこでは置換可能な成分（捕獲された時に）と第二表面間に異なる種類の相互作用が生じる。これらには電気活性表面の利用が含まれ、そこでは捕獲成分による置換可能な成分の捕獲が捕獲成分の電気化学的性質を修飾し、その修飾が検出可能なシグナルを含む。適当な方法と物質は、我々の参照Ｃ３１９／Ｕのもとで、この明細書と同一日に出願された我々の同時係属出願に開示されている。
【００４４】
図１で説明する実施形態では、二特異性抗体１０は第二表面上の捕獲分子２２に結合した時、目的分析物１８に付着したままである。質量に基づく検出システムでは（ＳＰＲ装置のような）、これは特に置換可能な成分自身の質量がが非常に小さい場合に有利である。しかし、他の状況では、特に検出可能なシグナルの生成が質量非依存性である場合には、分析物１８の置換可能な成分１０への継続的な付着は不利となりうる。
【００４５】
実施例２
置換可能な成分の性質とその第一表面への可逆的固定化の方法が、図１で説明された実施形態と異なる代わりの実施形態（図２に部分的に模式的に説明する）も考えられる。機能的に匹敵する成分を、図１と同様の参照数字を用いて図２に注釈する。
【００４６】
図２では、表面１２に固定化された介在分子（抗体１４）との相互作用により、第一表面１２に可逆的に固定化された置換可能な成分が提供される。抗体１４は、目的分析物１８に対して特異的結合親和性を有する。置換可能な成分１０は、「ミモトープ」１６−抗体１４によって結合されるエピトープの構造的アナログである低分子（通常はペプチドであるが、あるいは糖、ステロイド、核酸、または免疫グロブリンにコンジュゲート化できる他の化学的成分）に融合または共有結合された抗体分子から成る。ミモトープ１６は、抗体１４のミモトープ３０に対する結合親和性が分析物１８に対する親和性の僅か１〜１０％（好ましくは１〜５％）というようなものである。したがって、目的分析物１８の存在下では、置換可能な成分１０は第一表面１２から特異的に置換される。次に置換可能な成分は、基本的に図２に示されるように、典型的に置換可能な成分１０の抗体部分の結合部位１６’を認識する捕獲分子によって、第二表面（示していない）に捕獲される。好都合には、ミモトープはペプチドであり、融合タンパク質を形成する（免疫グロブリンとペプチドをコードする配列間の遺伝子融合によりコードされる）。あるいは、ミモトープは、従来の化学的技術のいずれかにより（例えば、「バイオコンジュゲート技術」、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６を参照のこと）免疫グロブリン分子（またはその抗原結合部位）に結合されてもよい。
【００４７】
図２で説明される実施形態の利点は、第一表面１２から置換された時、置換可能な成分１０は大部分が通常の抗体分子から成り、目的分析物１８に着していない。第二表面での目的分析物１８の存在は（図１で説明される実施形態のように）、ある実施形態ではシグナルの生成を時々妨ぐこともある。
【００４８】
実施例３
この実施例は、第一表面に位置する固定化抗体フラグメントからのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の解離と、第二表面での抗体による捕獲／検出に関する。図３で、この検出原理を模式的に説明する。この実施例は進歩したキットに適したＢｉａｃｏｒｅ ＡＢ Ｂｉａｌｉｔｅ（商標）を用いて実施し、表面プラズモン共鳴を利用する。
【００４９】
まず、ＣＭ５センサーチップを以下のように据え付ける：
ｉ．新しいＣＭ５センサーチップをＢｉａｌｉｔｅ（商標）バイオセンサーに合体させ、ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水）ランニング緩衝液で平衡化した。温度を２５℃に維持し、流速を１０μｌ／分に設定した。
【００５０】
ｉｉ．液体の流れを、フローセル１「第一表面」とフローセル２「第二表面」の二つのフローセルを連続して通るように設定した。Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢアミンカップリングキットの１−エチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性化化学薬品を利用し、ＥＤＣ／ＮＨＣ混合液をサンプルループに注入して４０μｌを充填することにより、デキストラン表面を活性化した。活性化を繰り返したが、これは図４の（ａ）で示した部分に見ることができる。第一表面でのＢｉａｌｉｔｅ（商標）反応は細い線で示され、第二表面での反応は太い線で示される。この線の太さの識別が、次のＢｉａｌｉｔｅ（商標）トレースで利用される。
【００５１】
ｉｉｉ．活性化の後、ｈＣＧを認識する５０μｇ／ｍｌの一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ３２９９ＨｉｓＨ２）溶液４０μｌを、フローセル１を通して注入した。次に、ｈＣＧを認識する５０μｇ／ｍｌの全抗体（３２９９）溶液４０μｌを、フローセル２を通して注入し、さらに５０μｇ／ｍｌのｓｃＦｖ３２９９ＨｉｓＨ２溶液４０μｌをフローセル１を通して注入した。このカップリング段階は、図４の（ｂ）で示した部分に見ることができる。
【００５２】
ｉｖ．ＣＭ５センサーチップの未反応部位を、４０μｌの１Ｍエタノールアミン溶液を２回連続して注入することによりブロックした。これらは、図４の（ｃ）で示した部分に見ることができる。
【００５３】
説明として、ＢｓｔＥＩＩ−ＳａｃＩ ＤＮＡリンカーフラグメントが以下の配列を生じる可動性リンカーをコードするＢｓｔＥＩＩ−ＳａｃＩフラグメントと置換された以外は、ｓｃＦｖ３２９９の配列はＷＯ９６／２７６１２（そこではＦｖＫＣ−ＩＩと記述される）で開示されるものと同様である：
ＦＲ−４ ＶＨ リンカー ＦＲ−１ ＶＬ
ＴＶＴＶＳＳｇｇｇｇｓｇｇｇｇｓｇｇｇｇｓＤＩＥＬＴ（配列番号１）
リンカーをコードするＤＮＡ配列は、Ｊａｃｋｓｏｎら（「バクテリオファージｆｄの表面上への表示を利用した抗体の変異体および他のタンパク質分子の選択」ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｓ．Ｒｅｅｓ，ＳｔｅｒｎｂｅｒｇとＷｅｔｚｅｌ，ｐｕｂｌ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９２）に記述されている。多数の他の抗ｈＣＧ抗体も同様に適当であることが理解されよう。利用可能な他のものは、Ｌｉｎｓｃｏｔｔの免疫学的および生物学的試薬の指導書（第９版、１９９６−７）に載っており、例えば、Ｂｉｏｓｔｒｉｄｅ Ｉｎｃ．（ＣＡ，ＵＳＡ）から入手可能な抗α−ｈＣＧモノクローナル、およびＢｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｌｔｄ（Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ）から入手可能な抗β−ｈＣＧモノクローナルが含まれる。
【００５４】
ｈＣＧの捕獲／検出は以下のように起こる：
ｖ．２００μｌのｈＣＧ（１０ＩＵ／ｍｌ）をｈＣＧを認識する二次モノクローナル抗体（３４６８と名付けられ、１００μｇ／ｍｌで）２０μｌとともに、室温で３０分間インキュベーションした（再度、３４６８以外の抗体も適当である）。これは、ｈＣＧの効果的な質量を増加させるために行われ、これにより検出感度が上昇する。
【００５５】
ｖｉ．予め混合した４０μｌのｈＣＧ−３４６８溶液を、フローセル１を通して注入した。これは、図５Ａの（ａ）で示した部分に見ることができる。
【００５６】
ｖｉｉ．注入後直ちに、緩衝液の流れを、第一表面を離れた後に第二表面を通るように変えた。これが起こるポイントは、図５Ｂの（ｂ）で示される。
【００５７】
図５Ａは、第一表面から解離するｈＣＧ−３４６８複合体が、抗ｈＣＧ抗体３２９９での捕獲により第二表面に結合し検出され得ることを示す（図５Ｂ）。実際には第一表面は検出可能なシグナルを生成する必要はなく、これは研究目的のためだけのこの実施例における装置であることが、当業者には理解されよう。通常の装置では、捕獲（第二）表面のみが検出可能なシグナルを生成し、第一表面はどんな適当な固体支持体でもよい。さらに、本発明のアッセイ法では、目的分析物の存在下でのみｈＣＧが表面１から置換されるように条件を調整した。それにもかかわらず、この実施例は本発明の原理を証明する。
【００５８】
実施例４
この実施例は、第一表面の低親和性エストロン ３−グルクロニド（Ｅ３Ｇ）アナログ（エストラジオール ３−グルクロニド［ＥＤ３Ｇ］）からのＥ３Ｇを認識する抗体（４１５５）の特異的置換と、第二表面での免疫グロブリンを認識する抗体による捕獲と検出に関する。図６で、この検出原理を模式的に説明する。
【００５９】
４１５５モノクローナル細胞株は、Ｇａｎｉら（１９９４ Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４８，２７７−２８２）に記述されている方法に従って、調製しスクリーニングした。Ｇａｎｉらの発表は抗プロゲステロン抗体の開発に関するものであるが、基本的にはエストロンとそのアナログに反応する抗体の作製にも同一の技術を利用した。細胞株４１５５から得られるもの以外の抗体も、当業者によって（そのような技術を利用して）容易に作製され得る：そのような抗体は、質的に同様の性質を有する。さらに、市販の抗エストロングルクロニドモノクローナル抗体（Ｗａｌｌａｃｅｖｉｌｌｅ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）については、Ｌｉｎｓｃｏｔｔの免疫学的および生物学的試薬の指導書（第９版、１９９６−７）に記述されている。
【００６０】
まず、ＣＭ５センサーチップを以下のように据え付ける：
ｉ．新しいＣＭ５センサーチップをＢｉａｌｉｔｅ（商標）バイオセンサーに合体させ、ＨＢＳランニング緩衝液で平衡化した。温度を２５℃に維持し、流速を１０μｌ／分に設定した。
【００６１】
ｉｉ．液体の流れを、第一表面（「表面１」）と第二表面（「表面２」）を連続して通るように設定した。Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢアミンカップリングキットのＥＤＣとＮＨＳ活性化化学薬品を利用し、ＥＤＣ／ＮＨＣ混合液をサンプルループに注入して４０μｌを充填することにより、デキストラン表面を活性化した。これは図７の（ａ）で示した部分に見ることができる。
【００６２】
ｉｉｉ．緩衝液の流れが表面２のみを通るように設定し、酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０中のウサギ抗マウスＩｇＧを４０μｌ注入した。これは、図７の（ｂ）で示した部分に見ることができる。
【００６３】
ｉｖ．表面２へのＩｇＧカップリングの後、緩衝液の流れが表面１のみを通るように変更し、４０μｌのエチレンジアミン（ＥＤＡ）（２０％ ｖ／ｖ）を注入した。これは、図７の（ｃ）で示した部分に見ることができる。
【００６４】
ｖ．２０μｌのＥＤ３Ｇ（５ｍｇ／ｍｌ）を８０μｌのＮＨＳ／ＥＤＣ活性化溶液に添加し、混合して室温で７分間インキュベーションした。次に、この予めインキュベーションしたＥＤ３Ｇ溶液４０μｌを表面１を通して注入した（これは図７の（ｄ）で示した部分に見ることができる）。
【００６５】
ｖｉ．緩衝液の流れが表面２のみを通るように設定し、４０μｌの１Ｍエタノールアミン溶液を注入した。これは図７の（ｅ）で示した部分に見ることができる。
【００６６】
４１５５の置換と再捕獲は以下のように行われた：
ｖｉｉ．２０μｌの１００μｇ／ｍｌ ４１５５溶液を注入することにより、４１５５を表面１に充填した。
【００６７】
ｖｉｉｉ．様々な流速で２分間、表面１および２を通して１ｍｇ／ｍｌのＥ３Ｇ溶液を注入することにより、表面１からの特異的置換と表面２における再捕獲／検出を誘導した。この結果は図８に見ることができ、黒四角はＥ３Ｇによる表面１からの４１５５の特異的置換を示し、白四角は表面２における４１５５の捕獲を示す。四角のサイズの上昇は流速の上昇を表し、最も小さい四角は２μｌ／分を表し、次の四角のサイズは５、１０、および２０μｌ／分で収集したデータのものである。
【００６８】
表面２で捕獲され検出される置換４１５５のパーセンテージは、明らかに流速に関連している（図９を参照のこと）。流速の上昇は、置換物質のパーセンテージを減少させる。低い流速（５μｌ／分以下）により、確実にすべての置換物質が捕獲される。
【００６９】
この実施例は、第一表面に可逆的に結合した分子の特異的置換と、例えば置換物質を認識する抗体による第二の別の表面での続く置換物質の再捕獲を誘導することにより、いかに分析物（Ｅ３Ｇ）がアッセイされ得るかを示すものである。
【００７０】
実施例５
この実施例は、第一表面の低親和性エストロン ３−グルクロニド（Ｅ３Ｇ）アナログ（エストラジオール ３−グルクロニド［ＥＤ３Ｇ］）からのＥ３Ｇを認識する抗体（４１０１）の特異的置換と、第二検出表面でのＥ３Ｇによる捕獲に関連する。図１０は、この検出原理を模式的に説明する。
【００７１】
まず、ＣＭ５センサーチップを以下のように据え付ける：
ｉ．新しいＣＭ５センサーチップをＢｉａｌｉｔｅ（商標）バイオセンサーに合体させ、ＨＢＳランニング緩衝液で平衡化した。温度を２５℃に維持し、流速を１０μｌ／分に設定した。
【００７２】
ｉｉ．液体の流れを、第一表面（「表面１」）と第二表面（「表面２」）を連続して通るように設定した。Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢアミンカップリングキットのＥＤＣとＮＨＳ活性化化学薬品を利用し、ＥＤＣ／ＮＨＣ混合液をサンプルループに注入して４０μｌを充填することにより、デキストラン表面を活性化した。これは図１１の（ａ）で示した部分に見ることができる。
【００７３】
ｉｉｉ．４０μｌのＥＤＡ（２０％ ｖ／ｖ）を、表面１および２を通して注入した。これは、図１１の（ｂ）で示した部分に見ることができる。
【００７４】
ｉｖ．２０μｌのＥＤ３Ｇ（５ｍｇ／ｍｌ）を８０μｌのＮＨＳ／ＥＤＣ活性化溶液に添加し、混合して室温で７分間インキュベーションした。次に、この予めインキュベーションしたＥＤ３Ｇ溶液４０μｌを表面１を通して注入した（これは図１１の（ｃ）で示した部分に見ることができる）。
ｖ．２０μｌのＥ３Ｇ（５ｍｇ／ｍｌ）を８０μｌのＮＨＳ／ＥＤＣ活性化溶液に添加し、混合して室温で７分間インキュベーションした。次に、この予めインキュベーションしたＥ３Ｇ溶液４０μｌを表面２を通して注入した（これは図１１の（ｄ）で示した部分に見ることができる）。
【００７５】
４１０１の特異的置換と捕獲は以下のように行われた：
ｖｉ．２０μｌの１００μｇ／ｍｌ ４１０１溶液を表面１を通して注入することにより、４１０１を表面１に充填した。
【００７６】
ｖｉｉ．表面１および２を通して２０μｌの１ｍｇ／ｍｌエストロン ３−硫酸［Ｅ３Ｓ］溶液を注入することにより、表面１からの４１０１の置換と表面２における再捕獲／検出を誘導した。表面１からの置換と表面２における再捕獲／検出は、図１２に見ることができる。
【００７７】
この実施例では、Ｅ３Ｓは分析物を示す。この実施例は、第一表面で分析物の低親和性アナログ（ＥＤ３Ｇ）に可逆的に結合した分子の置換と、分析物の高親和性アナログ（Ｅ３Ｇ）に結合することにより第二の別の表面での続く再捕獲と検出を誘導することにより、いかに分析物がアッセイされ得るかを示すものである。
【００７８】
実施例６
この実施例は、分析物の添加に応答したグルコースオキシダーゼ／抗体コンジュゲートの置換／捕獲によりもたらされる、色変化の生成を示す。置換されたグルコースオキシダーゼ／抗体コンジュゲートは、ＫＩ、西洋わさびペルオキシダーゼ、および捕獲分子のしみ込んだデンプンの薄層に捕獲される。捕獲されたグルコースオキシダーゼ／抗体コンジュゲートはグルコースを利用してＨ２Ｏ２を生成し、ペルオキシダーゼの存在下でこれがヨウ化物を酸化してヨウ素にする。次に生成されたヨウ素はデンプンと反応し、茶色から青への色変化が生じる。
【００７９】
二つの表面は、以下のように設定する：
第一表面（「表面１」）
ｉ．２．６ｍｇのエストラジオール ３−グルクロニド（ＥＤ３Ｇ）を２ｍｌの新たに調製したＥＤＣ（０．１Ｍ）とＮＨＳ（０．０２Ｍ）溶液に再懸濁して、室温で１５分間インキュベーションすることにより、ＥＤ３Ｇ／オボアルブミンコンジュゲートを準備する。
【００８０】
ｉｉ．ＥＤ３Ｇ溶液に２ｍｌのオボアルブミン（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、定常的に混合しながら室温で２．５時間インキュベーションする。
【００８１】
ｉｉｉ．次に、コンジュゲート化したＥＤ３Ｇ／オボアルブミン溶液を、０．１％アジ化ナトリウムを含む１Ｌのリン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳＡ」）に対して１６時間透析する。
【００８２】
ｉｖ．ウェル内で１００μｌのＥＤ３Ｇ−オボアルブミン（ＰＢＳＡで１：１０に希釈）を室温で２時間インキュベーションすることにより、Ｇｒｉｅｎｅｒ ＨＢウェルを透析したＥＤ３Ｇ−オボアルブミンコンジュゲートでコーティングする。
【００８３】
ｖ．１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．５中のグルコースオキシダーゼ１ｍｌとモノクローナル抗体４１５５（これも１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．５中）を、５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度でガラスチューブ中で混合することにより、グルコースオキシダーゼとモノクローナル抗体４１５５のコンジュゲートを調製する。これに２２０μｌの０．０２％グルタルアルデヒドを、定常的に混合しながら１滴ずつ添加する。チューブをアルミホイルで覆い、室温で３０分間、回転させながら混合する。２５０μｌの１Ｍエタノールアミンを添加し、さらに３０分間混合を続ける。次にこの溶液を１００ｍＭ ＰＢＳに対して室温で２４時間透析し、続いて４℃にて１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離する。
【００８４】
ｖｉ．次に、ウェル当たり１００μｌのグルコースオキシダーゼ−４１５５コンジュゲートを室温で１時間インキュベーションすることにより、Ｇｒｉｅｎｅｒ ＨＢウェルを準備する。続いてウェルをＰＢＳでリンスし、非結合のグルコースオキシダーゼ／４１５５コンジュゲートを除去する。ウェルは、必要時まで、１００μｌのＰＢＳを入れたまま４℃で保存する。
【００８５】
第二表面（「表面２」）
ｉ．ＰＢＳ中に１００μｌのエストロン ３−グルクロニド（Ｅ３Ｇ）−オボアルブミンコンジュゲート（ＥＤ３Ｇ−オボアルブミンコンジュゲートで記述したのと同様に調製）、５％（ｗ／ｖ）デンプン、１０ｍｇ／ｍｌ西洋わさびペルオキシダーゼ、および０．１Ｍ ＫＩを含む２００μｌの溶液を、Ｇｒｅｉｎｅｒ ＨＢウェル内で室温で１６時間インキュベーションする。表面の色は茶色である。
【００８６】
１０ｍＭグルコースのＰＢＳ溶液中の分析物（１ｍｌの０．１Ｍエストロン ３−グルクロニド）を準備した表面１のウェルに０．２ｍｌ／分で送り込み、それと同時にこのウェルからの溶液を表面２を含むウェルに０．２ｍｌ／分で送り込む。表面２を有するウェルがオーバーフローしないように、０．２ｍｌ／分で溶液をまたウェルから送り出す。
【００８７】
表面１から表面２へのテスト溶液の流動を開始すると、グルコースオキシダーゼによるグルコースの酸化によって生成されるＨ２Ｏ２により、ヨウ化物が酸化されてヨウ素になり、表面２の色が茶色から青に変化する。
【００８８】
実施例７
この実施例は、分析物に応答した表面での蛍光強度の変調に関する。分析物が来ると、分子は第一表面から置換される。これらの置換された分子は、第二表面で生成される蛍光強度を変調することができる。
【００８９】
二つの表面は、以下のようにセットアップする：
第一表面（「表面１」）
ｉ．２．６ｍｇのＥＤ３Ｇを２ｍｌの新たに調製したＥＤＣ（０．１Ｍ）とＮＨＳ（０．０２Ｍ）溶液に再懸濁して、室温で１５分間インキュベーションすることにより、ＥＤ３Ｇ／オボアルブミンコンジュゲートを準備する。
【００９０】
ｉｉ．ＥＤ３Ｇ溶液に２ｍｌのオボアルブミン（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、定常的に混合しながら室温で２．５時間インキュベーションする。
【００９１】
ｉｉｉ．次に、コンジュゲート化したＥＤ３Ｇ／オボアルブミン溶液を、１ＬのＰＢＳＡに対して１６時間透析する。
【００９２】
ｉｖ．ウェル内で１００μｌのＥＤ３Ｇ−オボアルブミン（ＰＢＳＡで１：１０に希釈）を室温で２時間インキュベーションすることにより、Ｇｒｉｅｎｅｒ ＨＢウェルを、透析したＥＤ３Ｇ−オボアルブミンコンジュゲートでコーティングする。
【００９３】
ｖ．１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．５中のセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）１ｍｌとモノクローナル抗体４１５５（これも１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．５中）を、５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度でガラスチューブ中で混合することにより、ＣＢＤ／モノクローナル抗体４１５５のコンジュゲートを調製する。これに２２０μｌの０．０２％グルタルアルデヒドを、定常的に混合しながら１滴ずつ添加する。チューブをアルミホイルで覆い、室温で３０分間、回転させながら混合する。２５０μｌの１Ｍエタノールアミンを添加し、さらに３０分間混合を続ける。次にこの溶液を１００ｍＭ ＰＢＳに対して室温で２４時間透析し、続いて４℃にて１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離する。必要時まで、上清を４℃で保存する。
【００９４】
ｖｉ．次に、ウェル当たり１００μｌのＣＢＤ−４１５５コンジュゲートを室温で１時間インキュベーションすることにより、Ｇｒｉｅｎｅｒ ＨＢ表面を準備する。続いてウェルをＰＢＳで濯ぎ、非結合のＣＢＤ／４１５５コンジュゲートを除去する。
【００９５】
第二表面（「表面２」）
ｉ．Ｈ３ＰＯ４膨潤したＡｖｉｃｅｌ（０．２％）溶液１ｍｌをイナゴマメゴム（ｇｕｍ）（ＬＢＧ）−ＦＩＴＣコンジュゲート５０μｌとともに、定常的に混合しながら室温で１時間インキュベーションする。
【００９６】
ｉｉ．粒子を室温で１０分間、１３００ｒｐｍで遠心分離し、ペレットをＰＢＳに再懸濁することにより、ＬＢＧ−ＦＩＴＣ Ａｖｉｃｅｌを洗浄する。この洗浄手順をもう一度繰り返す。
【００９７】
ｉｉｉ．２回目の洗浄後、ＬＢＧ−ＦＩＴＣ充填粒子を５０μｌのＰＢＳに再懸濁し、必要時まで４℃で保存する。
【００９８】
分析物（１００μｌの１ｍｇ／ｍｌＥ３Ｇ）を、準備したＧｒｅｉｎｅｒ ＨＢウェル（表面１）中で室温で１時間インキュベーションする。次にインキュベーションした溶液をウェルから除去し、ＬＢＧ−ＦＩＴＣ充填粒子に添加する。Ａｖｉｃｅｌ粒子上でのＣＤＢ−４１５５によるＬＢＧ−ＦＩＴＣの置換による蛍光強度の減少を、蛍光標示式セルソーターを使用して、またはセルソーター（例えば、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｉｔｅ（商標）セルソーター）によりモニターする。
【００９９】
実施例８
この実施例は、分析物の添加に応答した二特異性抗体フラグメント構築物の置換／捕獲によってもたらされる、電気的変化の生成を示す。それは、第一抗体結合部位（エストロン−３−グルクロニド（Ｅ３Ｇ）を認識し、マウスモノクローナル抗体４１５５から誘導する）の、第一表面からの低親和性Ｅ３Ｇアナログ（エストラジオール ３−グルクロニド（ＥＤ３Ｇ））からの特異的置換と、第二表面に固定化された電気活性分子を認識する第二抗体結合部位を介しての捕獲と検出に関する。第二表面は、単層の電気活性分子でコーティングされた金の電極である。電気活性分子は、ヘキシル付属部分に結合したカルバゾール残基であり、これは次にチオール基によって金表面に結合される。この明細書と同一日に出願された我々の同時係属中欧州特許出願は、いかに選択された抗体の結合が、印加電圧の影響下で電極を流れる電流を変化（変調）することができるのかを説明している。ここでは、電気活性分子への二特異性抗体フラグメントの結合が、もともと導入された分析物の濃度に直接関連する様式で、電流を変調した。
【０１００】
４１５５モノクローナル細胞株は、Ｇａｎｉら（１９９４ Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４８，２７７−２８２）に記述されている方法に従って、調製しスクリーニングした。Ｇａｎｉらの発表は抗プロゲステロン抗体の開発に関するものであるが、基本的にはエストロンとそのアナログに反応する抗体の作製にも同一の技術を利用した。細胞株４１５５から得られるもの以外の抗体も、当業者によって（そのような技術を利用して）容易に作製され得る：そのような抗体は、質的に同様の性質を有する。電気活性カルバゾール分子、別のハプテンに対するモノクローナル抗体も、この方法を使用して作製することができる。二つの抗体結合特異性の遺伝子のクローニングと、二特異性抗体フラグメントの構築でのその使用は、当業者には周知の方法により容易に達成することができる（例えばＷＯ ９７／１４７１９を参照のこと）。
【０１０１】
二つの表面は、以下のように設定する：
第一表面（「表面１」）
ｉ．２．６ｍｇのエストラジオール ３−グルクロニド（ＥＤ３Ｇ）を２ｍｌの新たに調製したＥＤＣ（０．１Ｍ）とＮＨＳ（０．０２Ｍ）溶液に再懸濁して、室温で１５分間インキュベーションすることにより、ＥＤ３Ｇ／オボアルブミンコンジュゲートを準備する。
【０１０２】
ｉｉ．ＥＤ３Ｇ溶液に２ｍｌのオボアルブミン（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、定常的に混合しながら室温で２．５時間インキュベーションする。
【０１０３】
ｉｉｉ．次に、コンジュゲート化したＥＤ３Ｇ／オボアルブミン溶液を、０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳＡ」）１Ｌに対して１６時間透析する。
【０１０４】
ｉｖ．ウェル内で１００μｌのＥＤ３Ｇ−オボアルブミン（ＰＢＳＡで１：１０に希釈）を室温で２時間インキュベーションすることにより、Ｇｒｉｅｎｅｒ ＨＢウェルを透析したＥＤ３Ｇ−オボアルブミンコンジュゲートでコーティングする。
【０１０５】
ｖ．次に、ウェル当たり１００μｌの二特異性抗体フラグメント（ＰＢＳＡ中１００μｇ／ｍｌ）溶液を室温で１時間インキュベーションすることにより、Ｇｒｉｅｎｅｒ ＨＢ−ＥＤ３Ｇ−オボアルブミン表面を準備する。続いてウェルをＰＢＳＡで濯ぎ、非結合の二特異性抗体フラグメントを除去する。ウェルは、必要時まで、１００μｌのＰＢＳＡを入れたまま４℃で保存する。
【０１０６】
第二表面（「表面２」）
ｉ．チオール末端アルキル付属電気活性（カルバゾール）分子を、窒素をパージしたエタノール、またはＤＭＦ溶液に溶解した。
【０１０７】
ｉｉ．清潔で純粋な金の表面を、電気活性成分を含む溶液に暗下で２４時間浸した。
【０１０８】
ｉｉｉ．金表面上の電気活性単層を適当な溶媒（例えば、ジクロロメタン）中で洗浄して非結合の分子をすべて除去し、次いで、窒素をパージした適当な溶媒中で一晩保存した。
【０１０９】
ｉｖ．電極を窒素流で乾燥し、電極表面から溶媒を除去した。
【０１１０】
ｖ．電極を一連の増加希釈アセトニトリル：水混合液に移して単層の分子の向きを改善し、その結果、水性環境下で適当な単層となる。
【０１１１】
アッセイ
電気化学的測定は、Ｂｒｙａｎ ｆｌａｔ ｂｅｄ ｘ−ｙ ｒｅｃｏｒｄｅｒ（ｍｏｄｅｌ Ａ２５０００）とＥＨ＆Ｇ ｍｏｄｅｌ ２７３Ａ Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔ／Ｇａｌｖａｎｏｓｔａｔと一緒にＰｒｉｎｃｅｔｏｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔ（ｍｏｄｅｌ ３６２）でのサイクリックボルタンメトリーまたはクロノアンペロメトリーにより（データの処理にはＥｃｈｅｍとＬｏｔｕｓ１２３を使用して）行う。
【０１１２】
（ａ）安定したスキャンが生成されたら、バックグラウンドの電気化学を読み取って保存する。
【０１１３】
（ｂ）読み取るサンプルを表面１（ウェル）に添加し、室温で１５分間インキュベーションする。
【０１１４】
（ｃ）ウェルからサンプルを除去して表面２（電極表面）に添加し、再度室温で１５分間インキュベーションする。
【０１１５】
（ｄ）ＭｉｌｌｉＱ水で電極表面を洗浄し、上記（ｂ）と同じ条件を用いて電気化学を測定する。システムを標準Ｅ３Ｇサンプルに対してキャリブレーションしてあるならば、電流の変調により、モル濃度単位で表される分析物濃度の測定値が与えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明によるアッセイ法の模式的な説明である。
【図２】 図２は、本発明によるアッセイ法の模式的な説明である。
【図３】 図３は、本発明によるアッセイ法の模式的な説明である。
【図４】 図４は、ＳＰＲシグナル出力を示すトレース（時間に対する任意の応答単位）である。
【図５】 図５は、ＳＰＲシグナル出力を示すトレース（時間に対する任意の応答単位）である。
【図６】 図６は、本発明によるアッセイ法の模式的な説明である。
【図７】 図７は、ＳＰＲシグナル出力を示すトレース（時間に対する任意の応答単位）である。
【図８】 図８は、時間（秒）に対するＳＰＲ応答（任意の応答単位）のグラフである。
【図９】 図９は、本発明の一実施形態で捕獲される置換可能な成分の量に対する流速の影響、および低い流速において第一表面から特異的に置換された置換可能な成分の１００％がいかに第二表面に捕獲され得るかを示すグラフ（毎分μｌの流速に対する、第二表面で捕獲される置換可能な成分の％）である。
【図１０】 図１０は、本発明によるアッセイ法の模式的な説明である。
【図１１】 図１１は、ＳＰＲシグナル出力を示すトレース（時間に対する任意の応答単位）である。
【図１２】 図１２は、時間（秒）に対するＳＰＲ応答（任意の応答単位）のグラフである。
【配列表】
発明の属する技術分野
本発明は、とりわけ、サンプル中の目的物質の存在を検出するアッセイを実施する方法と、その方法を実施する装置に関する。
【０００２】
発明の背景
サンプル中の目的物質の存在および／または量を検出する様々なアッセイ法が知られている。アッセイの一つの特殊な形式は、「置換アッセイ」であり、これは慣習的にサンプル中の目的分析物の存在が既存の結合パートナー／リガンド複合体からの標識物質（標識結合パートナーまたは標識リガンドのどちらか）の置換を引き起こす。一般に、置換された標識物質の量は目的分析物の濃度に比例する。あるいは、「競合」アッセイを利用してもよく、そのアッセイでは、目的分析物と標識競合物（標識分析物またはアナログ等）間に限られた数の結合部位への結合に対する競合が存在する。
【０００３】
一つの特殊なアッセイはＷＯ ９１／０５２６２（ミシガン大学）に開示されており、これは典型的に使い捨てのテストストリップを含むアッセイ装置に関し、テスト装置が接触するテスト溶液中の目的分析物の存在が、装置の別の位置でのシグナル（色等）によって示され、分析物の不在は異なる位置に現れる同様のシグナルによって示される。
【０００４】
ＷＯ９１／０５２６２で開示されるように、第一結合手段（固定化抗体等）はテストスティック上の一位置に提供され、目的分析物に対する結合特異性を有する。「シグナル生成分子」に共有結合した分析物を含む「異種二官能性複合体」は、第一結合手段に可逆的に結合している。サンプル中の遊離の目的分析物の存在下で、異種二機能性複合体は第一結合手段から遊離され、「液体伝導手段」（典型的にキャピラリーテストスティック）を介して、複合体が捕獲されるようなシグナル生成分子に対する結合特異性を有する第二結合手段に輸送される。典型的にシグナル生成分子は、テストスティックを適当な基質溶液に浸した時に、テストサンプル中に分析物が存在しない場合は第一結合手段において、分析産物が存在する場合は第二結合手段において色のついた産物（「シグナル」）を形成するような酵素（例えば西洋わさびペルオキシダーゼ）である。シグナル生成分子は、蛍光分子または紫外線吸収剤でもよい。
【０００５】
この種の装置では、シグナル生成分子と結合手段間に、シグナル生成分子を含む複合体の単純捕獲以外の相互関係は存在しない。このように、シグナル生成分子（酵素）は、第一結合手段から遊離されるか否かに関わらず、固有にシグナル（色のついた産物）を生成することが可能であり、シグナル生成分子の捕獲作用はシグナル生成の過程において役割を果たさない。
【０００６】
アッセイに関した一つの比較的最近の開発は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用する装置の利用である。この現象は現在様々な出版物で記述されており、エバネッセント波（ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ ｗａｖｅ）バイオセンサーの基礎となっている（レビューとして、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ １９９５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３，４７−５４とその中の参考文献を参照のこと）。
【０００７】
要約すると、異なる屈折率の２つの媒体間の界面における光入射は、特異的入射角において共鳴「エバネッセント波」を生じる。共鳴は、媒体の屈折率変化に極端に敏感である。屈折率の変化により、共鳴が新しい入射角で生じる。屈折率の変化は、２つの媒体間の界面における薄（典型的に金）膜への大量結合によって生じ：屈折率の変化は金膜への大量結合に比例する。
【０００８】
エバネッセント波現象を利用するそのような装置の例として、ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ（スウェーデン）の販売するＢＩＡ ｌｉｔｅ（商標）とＢＩＡ ｃｏｒｅ（商標）機、Ｆｉｓｏｎ（イギリス）の販売するＩＡ Ｓｙｓ（商標）装置、およびＡｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｎｓｏｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（スイス、チューリッヒ）の販売するＢＩＯＳ−１装置が含まれる。
【０００９】
ＷＯ ９２／１８８６７は、目的分析物に対するアッセイであり、置換表面に固定化された第一試薬からの第二試薬との置換を含み、前記置換は目的分析物の存在に反応して起こり、置換された第二試薬は次に検出表面上で検出表面に固定化された第三試薬を変化する反応を起こし、第三試薬の変化はＳＰＲ手段によって検出されるアッセイ法を開示している。
【００１０】
ＷＯ９２／１８８６７は主に低分子の分析物（ハプテン等）のアッセイに関わり（１ページ、４〜６行）、先行技術で明らかなそのような分析物のアッセイにおける感度の欠除に取り組んでいる（２ページ、１〜１７行）。
【００１１】
ＷＯ９２／１８８６７では典型的に、第一試薬は目的分析物のアナログで、第二試薬は分析物に対する特異的抗体である。あるいは、第一試薬は分析物に対する抗体であり、第二試薬は（低分子量分析物の）アナログと高分子量タンパク質を含むコンジュゲートである。先行技術では、「分析物のアナログとは、その特異的バインダーへの結合について分析物と競合する物質である。アナログの構造は、しばしば、分析物とできるだけ近く、またはさらに完全に同一となるように整列される」と教示している（３ページ、６〜１０行）。
【００１２】
したがって、ＷＯ ９２／１８８６７ではアナログと分析物は構造的に「できるだけ近づいて」同じであるべきであると教示しており、第一試薬、第二試薬と目的分析物間の結合親和性比に違いが存在するはずであるという開示あるいは示唆はない。
【００１３】
発明の要約
第一態様において、本発明は、サンプル中の目的分析物の存在を検出する方法を提供し、この方法は、上に可逆的に固定化された置換可能な成分を有する第一表面を提供し；第一表面を目的分析物を含むサンプルに曝露して目的分析物は第一表面の置換可能な成分を特異的に置換し；第二表面上で置換可能な成分を捕獲するように、第一表面から置換された置換可能な成分を置換可能な成分に特異的に結合する捕獲成分を有する第二表面と接触させ、前記捕獲によって検出可能なシグナルが生成し；シグナルを検出段階を含み、前記検出は表面プラズモン共鳴以外の方法で実施される。
【００１４】
本発明の方法は、あらゆる目的分析物の存在を検出するために利用される。そのような分析物の例として、抗体（診断法において有効でありうる）、核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）、ホルモン（タンパク質とステロイドの両種類）、成長因子等が含まれる。特に目的とするのは、エストロン−３−グルクロニド（Ｅ３Ｇ）、プロゲストゲン−３−グルクロニド（Ｐ３Ｇ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、および卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）等の性および／または受精ホルモンとそのアナログであり、そのような分析物の検出は妊娠検査に有効でありうる。好都合には分析物は、液体サンプル、特に、血液、血清、尿、および唾液等の哺乳動物の体液に存在する。
【００１５】
本発明の方法は定性的に（例えば、目的分析物の存在を検出するため）、またはさらに好ましくは、存在する分析物の量が測定できるような定量的に利用されうる。
【００１６】
置換可能な成分と捕獲成分は、置換可能な成分が第一表面から置換された時に捕獲成分により第二表面で直ちに特異的に捕獲されるように、特異的結合対のメンバーを有利に含む。多くの特異的結合対が当業者に知られており、例えば、抗原／抗体、相補的な（すなわち特異的塩基対）核酸鎖、酵素／基質、レクチン／糖、ホルモン／レセプター等が含まれる。
【００１７】
一般に、第一表面は複数の置換可能な成分を含む。典型的に、置換可能な成分は第一表面に付着したコーティングまたは層を形成する。置換可能な成分は、第一表面に直接付着されてよい。しかし、さらに一般に、置換可能な成分は介在分子を介して間接的に第一表面に付着され、その組み合わせにより置換可能な成分の望ましい程度の可逆的固定化の達成が促進される。
【００１８】
典型的に、介在分子は数多くの従来の化学的技術のいずれかにより第一表面に固定化される一方、置換可能な成分は介在分子に比較的弱く付着される（そしてこのように第一表面上に可逆的に固定化される）。望ましくは、介在分子は目的分析物のアナログ（以下で考察するミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）等）であり、その配置は、介在分子に対する置換可能な成分の（または他の実施形態では、介在分子の）結合親和性が、置換可能な成分の目的分析物に対する親和性と比較して比較的低い（例えば１〜５０％、さらに典型的には１〜１０％、好ましくは１〜５％）ものである。したがって、目的分析物の存在下で、分析物は第一表面の置換可能な成分と特異的に置換する傾向がある。有利には、本発明の方法は、目的分析物が置換可能な成分の定量的置換を引き起こすような、置換可能な成分の特異的な親和性に関した置換を含む。親和性比は望ましくは、少量の分析物の存在によって適当量の置換可能な成分が十分に置換されるように選択され、そのの結果、本発明のアッセイ法が高い感度のものとなる。
【００１９】
好ましい実施形態において、置換可能な成分は免疫グロブリン分子またはその抗原結合誘導体（Ｆｖ，Ｆａｂ，Ｆａｂ２，ｓｃＦｖ，重鎖可変領域［ラマおよびラクダから入手可能なものであるような「Ｈｃｖ」］等）を含む。特に好都合な例はモノクローナル抗体、二特異性抗体と「Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ」、および免疫グロブリン分子またはその抗原結合誘導体を含む融合（キメラ）ポリペプチドである。融合タンパク質は、酵素（例えば、カタラーゼまたはグルコースオキシダーゼ）、または捕獲成分による特異的捕獲を促進する（例えばミモトープ、すなわち、抗体によって認識されるエピトープの構造的アナログ、またはビオチン、アビジン、あるいは特異的結合対の他のメンバー等のいくつかの他の分子で、捕獲成分は特異的結合対の逆のメンバーを含む）、あるいは第一表面での可逆的固定化を促進する部分等の、一つまたはそれ以上の付加的な機能的ドメインに結合された免疫グロブリン分子（またはその抗原結合誘導体）を含みうる。
【００２０】
一般に、捕獲成分は特異的結合対の逆のメンバーを含み（すなわち逆のメンバーとは、置換可能な成分に通常存在する対のメンバーに結合するものである）、簡便に第二表面に固定化される。当業者には周知である従来の化学的方法が、そのような固定化を達成するのに使用しうる。異なる目的分析物に対する本発明の実施を可能にするために、表面が異なる捕獲成分でコーティングされるように、アッセイ完了時に、厳しい化学的処理（例えば、非常に高いまたは非常に低いｐＨ、あるいはカオトロピック剤の使用）により第二表面から捕獲成分を除去することが可能ではあるが、捕獲成分に関する「固定化」という用語は、捕獲成分が通常のアッセイ条件下で第二表面に結合されたままであることを示すように意図されていることが理解されよう。しかしながら、通常は別の分析物と関した使用には第一表面を適当に修飾できるので、一般にそのような処理は必要でない。
【００２１】
本発明の重要な特徴は、第二表面の性質である。本発明では、第二表面は、表面が単に支持体として受動的様式で作用する従来の先行技術アッセイとは対照をなすシグナル生成において、「活性」部分として記述されるものを受け取る。本発明においてそれは、検出可能なシグナルの生成を間接的または（好ましくは）直接的に導く、第二表面での置換可能な成分の捕獲作用である。一般に置換可能な成分は、第二表面で捕獲されない限りおよび捕獲されるまではアッセイで実際に観察またはモニターされる検出可能なシグナルを生成することはできず、一般にシグナル生成は置換可能な成分の第二表面との相互作用に依存する。
【００２２】
本発明は、先行技術のアッセイ法および装置を超える数多くの利点を提供する。第一に、本発明により、どんな目的分析物の検出への利用に対しても容易に修飾され得る一般的なアッセイ法と装置の利用が可能となる：置換可能な成分が適当な分析物の存在に反応して置換されるためには、同じ第二表面が（生成され検出される同じタイプのシグナルとでは）利用可能であり、比較的安価で単純な第一表面のみが変更される必要がある。第二に、特異的置換段階を組み込むアッセイ法と装置によって、不均一な（例えば、食物粒子、血液細胞、または細菌等の粒子状物質を含む）または粗製であり多くの混入物（例えば、血清、尿等）を含むサンプルのテストが可能となる。さらに、本発明のアッセイは特異的置換段階と特異的捕獲段階の両方を含む。これは、アッセイの全体的な特異性が事実上置換および捕獲段階の特異性の非常に正確な産物であることを意味し、ほとんどの先行技術アッセイによって付与される特異性よりもさらに高い特異性を生み出す。さらに、利用者に関する限り、これは基本的に一段階工程の形式で成し遂げることができる：アッセイを実施する人は単にサンプルを第一表面と接触させる必要があり、それによって検出可能なシグナルの生成へと導く一連の反応が開始する。
【００２３】
ある実施形態では、第二表面は、表面における置換可能な成分の捕獲が第二表面でのシグナルの検出可能な変化を生じる質量の増加を起こすような（すなわち、置換可能な成分の捕獲は、既存のシグナルを検出可能な様式で制御または修飾する）エバネッセント波または音波タイプのバイオセンサー（例えば、ＥＰ ０ ４１６ ７３０；ＥＰ ０ ５１７ ００１；またはＷＯ ９７／０４３１４に開示されているような）の検出表面を形成する。
【００２４】
ある実施形態では、第二表面における置換可能な成分の捕獲は検出可能な様式でシグナルの生成を阻害し、そのような阻害が「検出可能なシグナル」を構成する。例えば、置換可能な成分の捕獲は第二表面で進行中の反応を阻害する：一実施形態では、第二表面は検出可能な（例えば色のついた）産物を生成する反応を触媒する複数の酵素分子を含み、置換可能な成分は酵素に対する特異的結合活性を有する免疫グロブリン分子を含み、置換可能な成分の酵素に対する結合がその触媒活性を阻害し（または、例えばアロステリック部位への結合等により、別の方法でそれを修飾し）、よって酵素の作用に検出可能な変化をもたらす。
【００２５】
代わりの好ましい実施形態では、第二表面で伝播するエバネッセント波または音波は置換可能な成分と相互作用し、既存のシグナルの変調というよりもむしろ全く新しいシグナルを生成する。例えば、置換可能な成分は、第二表面でのエバネッセント波によって刺激されるフルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒ）を含み、蛍光を発する：エバネッセント波の「範囲」が短いため、フルオロフォアは置換可能な成分が第二表面に捕獲されない限り刺激されない。さらに、特異性の程度は、エバネッセント波がフルオロフォアの励起を起こす適当な性質を有するようにフルオロフォアとエバネッセント波の波長が選択される時の相互作用と関連する。
【００２６】
好ましい実施形態では、捕獲成分による置換可能な成分の捕獲は捕獲成分の電気化学的性質を変調し、その変調は検出可能なシグナルを含む。適当な方法と物質は、我々の同時係属中欧州特許出願第９７３０９４２５．３号に開示されている。特に、捕獲成分は典型的に導電性の支持体に固定化された免疫グロブリン分子（好ましくは抗体）またはその抗体結合誘導体を含み、置換可能な成分の捕獲成分への結合が捕獲成分の電気化学的性質を変化させ、例えば電流測定、ボルタメトリック、または電量測定法によって検出可能なシグナルを生成する。好ましくは、捕獲性分と置換可能な成分は、置換可能な成分の捕獲が捕獲成分の電気化学的性質（例えば酸化還元電位）を直接変えるように選択される。
【００２７】
本発明のある実施形態では、第一表面と第二表面間の距離は非常に小さく（例えば、５０μｍから５ｍｍの範囲）、そのように、第一および第二表面間での置換可能な成分（置換された抗体分子等）の単純な拡散は、必要とされる迅速な反応時間を無理なく提供するのに十分である。「ナノテクノロジー」原理を利用する装置では、第一および第二表面間の距離はさらに小さくてよい：そのような装置では、第一および第二表面間の大量輸送の時間を最短にするため、ギャップは単一分子の大きさと同じぐらい小さくてもよい（例えば、典型的な免疫グロブリン分子または二特異性抗体の５〜５０ｎｍ）。
【００２８】
代わりの実施形態では、第一から第二表面への置換可能な成分の拡散が十分でない場合、ある種の「輸送力」を提供して置換可能な成分を第一表面から第二表面に運ぶ必要がある。これは、キャピラリー流動、または大量の液体流動（ポンプ手段を利用）、または例えば置換可能な成分と第二表面間の静電気的誘引によって可能である。
【００２９】
第一および第二表面は別々のそれぞれ第一および第二固相によって提供されてもよく、これにより以下で述べるようなフィルターの封入が容易となる。代わりに、第一および第二表面は単一の固体支持体上に提供されてもよい。固相は、実質的には平面または粒子であり、多孔性または不浸透性である。第一および第二表面が単一支持体上に提供される場合、表面は支持体上の遠い部分として存在するか、あるいは支持体の近接部分として存在してよい（例えば、一つの表面が二次元的にもう一方の表面に囲まれている、または二つの表面が親密に互いに入り組む）。粒子性の支持体の例として、当業者には既知である重合体物質（例えば、デキストラン等の多糖類；またはラテックスや他の物質）を含むビーズが含まれる。実質上の平面支持体の例としては、既知のエバネッセント波または音波タイプのバイオセンサーと関連して使用されるセンサーチップが含まれる。
【００３０】
ある実施形態では、あるサンプル中に存在する粒子物質を除去するようなフィルター手段を第一および第二表面間に置くことが好ましい。これは、そのような物質がアッセイの結果に悪影響を及ぼすような時に（例えば、第二表面での粒子物質の非特異的結合による）望ましい。適当な微小孔フィルター膜は、当業者には周知である。
【００３１】
本発明の第二態様では、先に定義された第一態様の方法を実施するための装置を提供する。一般に、装置は、その上に可逆的に固定化された置換可能な成分を有し、目的分析物の存在下で置換可能な成分が第一表面から置換される第一表面と、置換可能な成分に特異的に結合する捕獲成分を有する第二表面を含む。
【００３２】
先に定義された装置は、「永久」シグナル検出手段のような、他の成分と付随して利用するための比較的安価で、使い捨てまたは交換可能な成分（例えばキットの一部分として）の形態をとる。あるいは、本発明の装置は、以下の一つまたはそれ以上を含む実質的に「一個の」装置として提供されてもよく、これは、液体伝導手段；目的分析物の存在下で生成されるシグナルを検出するためのシグナル検出手段；およびシグナル検出手段から出力されるデータを処理するデータ処理手段を含む。
【００３３】
流体（ｆｌｕｉｄ）（好ましくは液体（ｌｉｑｕｉｄ））伝導手段は、以下の一つまたはそれ以上の機能を行ってもよい：第一表面への液体サンプルの導入；すべての置換可能な成分の第一表面から第二表面への輸送；および液体伝導手段を介しての廃棄液体の除去。液体伝導手段の利用に適した動力手段は、例えば回転式または蠕動式ポンプを含む。
【００３４】
望ましくは、この装置は液体に懸濁されたまたは溶解された目的分析物（特に、血液、血清、唾液等の体液）との使用に適応する。
【００３５】
第三態様では、本発明は、サンプル中の目的分析物の存在を検出する方法を提供し、この方法は、第一表面と置換可能な成分間の介在成分との相互作用によりその上に可逆的に固定化された置換可能な成分を有する第一表面を提供し；第一表面を目的分析物を含むサンプルに曝露して目的分析物が第一表面からの置換可能な成分と特異的に置換し；第二表面上で置換可能な成分を捕獲するように、第一表面から置換された置換可能な成分を置換可能な成分に特異的に結合する捕獲成分を有する第二表面と接触させ、前記捕獲によって検出可能なシグナルが生成し；シグナルを検出する段階を含み、置換可能な成分の目的分析物に対する結合親和性が置換可能な成分の介在成分に対する結合親和性よりも高い。
【００３６】
第四態様では、本発明は、サンプル中の目的分析物の存在を検出する方法を提供し、この方法は、第一表面と置換可能な成分間の介在成分との相互作用によりその上に可逆的に固定化された置換可能な成分を有する第一表面を提供し；第一表面を目的分析物を含むサンプルに曝露して、目的分析物が第一表面からの置換可能な成分と特異的に置換し；第二表面上で置換可能な成分を捕獲するように、第一表面から置換された置換可能な成分を置換可能な成分に特異的に結合する捕獲成分を有する第二表面と接触させ、前記捕獲によって検出可能なシグナルが生成し；シグナルを検出する段階を含み、介在成分の目的分析物に対する結合親和性が置換可能な成分の介在成分に対する結合親和性よりも高い。
【００３７】
本発明の第三と第四の態様に関して、置換可能な成分が第一表面に可逆的に固定化されている相互作用の結合親和性は、置換可能な成分の置換を起こす傾向がある相互作用の僅か１〜１０％（さらに好ましくは１〜５％）であることが好ましい（すなわち、本発明の第三態様の置換可能な成分と目的分析物間の相互作用、または第四態様の介在成分と目的分析物間の相互作用）。本発明の第三および第四態様の方法の好ましい特徴は、方法が適合する限りは、一般に、第一態様の方法のものと同様である。本発明の第三および第四態様では、シグナルを検出する好ましい方法は、ＷＯ９２／１８８６７に開示されているようにＳＰＲの手段による。本発明は、先に定義された第三および第四態様の方法を実施する装置も提供する。
【００３８】
本発明を図解した実施例により、および付随する図に関してさらに説明する。
【００３９】
実施例
実施例１
本発明の基本的な概念を説明する簡単な実施形態を、図１で模式的に説明する。図１において、置換可能な成分は第一表面１２に可逆的に固定化されている。図１で示される実施形態では、置換可能な成分は二特異性抗体１０であり、不可逆的固定化は、二特異性抗体１０と従来の化学的方法により第一表面１２に固定化された介在分子１４間の相互作用により達成される。単純化するため、単一分子１４と単一の特異的二特異性抗体１０のみを示す。実際には、第一表面１２は通常は複数の介在分子１４でコーティングされており、複数の二特異性抗体１０（それぞれ同じ結合特異性を有する）は表面１２に可逆的に固定化されている。置換可能な成分のこの可逆的固定化は、通常のアッセイ条件下で、目的分析物の不在化では置換可能な成分は第一表面に付着されたままであるが、目的分析物の存在下では置換可能な成分はそこから特異的に置換されるというものである。
【００４０】
二特異性抗体の一つの結合部位１６は、目的分析物１８に対する結合特異性を有する。第一表面１２に固定化された介在分子１４は目的分析物１８の構造的アナログであり、二特異性抗体１０の結合部位１６が分子１４に比較的緩く結合し、そのため第一表面１２上に二重機能性抗体１０を可逆的に固定化している。しかし、結合部位１６のアナログ１４に対する結合親和性は、目的分析物１８に対する結合親和性よりかなり低い（典型的に１〜１０％、好ましくは１〜５％）。したがって、第一表面１２を目的分析物１８を含むサンプルと接触させると、分析物１８は結合部位１６に対する結合に対してアナログ１４とうまく競合し、こように、第一表面１２から二特異性抗体１０を特異的に置換する。次に、置換された二特異性抗体１０は、第二表面２０と接触できるようになる。
【００４１】
再度図１を参照すると、第二表面２０は複数の分子でコーティングされており、それぞれは捕獲成分２２を構成する。二特異性抗体１０の結合部位１６は、捕獲成分２２に対する結合特異性を有する。したがって、第一表面から置換された二特異性抗体分子１０は、第二表面２０で捕獲される。この捕獲により検出可能なシグナルが生成され、それがモニターされる。図１で説明する実施形態では、第二表面２０はＳＰＲセンサーの一部を形成する。
【００４２】
一般に、シグナルは、捕獲された置換可能な成分１０と第二（捕獲）表面２０間の相互作用により生成される。例えば、第二表面２０はエバネッセント波検出装置の一部を含む：置換可能な成分１０の捕獲は、検出可能なシグナルが生成されるような方法で、表面２０上で伝播されるエバネッセント波の特徴を修飾する。そのような装置の例には、現在当分野で周知である表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の技術、あるいは音波検出システムを利用するものがあり、シグナルは表面２０に結合した物質の質量の増加により生成される。
【００４３】
しかし、他の検出システムも考えられており、そこでは置換可能な成分（捕獲された時に）と第二表面間に異なる種類の相互作用が生じる。これらには電気活性表面の利用が含まれ、そこでは捕獲成分による置換可能な成分の捕獲が捕獲成分の電気化学的性質を修飾し、その修飾が検出可能なシグナルを含む。適当な方法と物質は、我々の参照Ｃ３１９／Ｕのもとで、この明細書と同一日に出願された我々の同時係属出願に開示されている。
【００４４】
図１で説明する実施形態では、二特異性抗体１０は第二表面上の捕獲分子２２に結合した時、目的分析物１８に付着したままである。質量に基づく検出システムでは（ＳＰＲ装置のような）、これは特に置換可能な成分自身の質量がが非常に小さい場合に有利である。しかし、他の状況では、特に検出可能なシグナルの生成が質量非依存性である場合には、分析物１８の置換可能な成分１０への継続的な付着は不利となりうる。
【００４５】
実施例２
置換可能な成分の性質とその第一表面への可逆的固定化の方法が、図１で説明された実施形態と異なる代わりの実施形態（図２に部分的に模式的に説明する）も考えられる。機能的に匹敵する成分を、図１と同様の参照数字を用いて図２に注釈する。
【００４６】
図２では、表面１２に固定化された介在分子（抗体１４）との相互作用により、第一表面１２に可逆的に固定化された置換可能な成分が提供される。抗体１４は、目的分析物１８に対して特異的結合親和性を有する。置換可能な成分１０は、「ミモトープ」１６−抗体１４によって結合されるエピトープの構造的アナログである低分子（通常はペプチドであるが、あるいは糖、ステロイド、核酸、または免疫グロブリンにコンジュゲート化できる他の化学的成分）に融合または共有結合された抗体分子から成る。ミモトープ１６は、抗体１４のミモトープ３０に対する結合親和性が分析物１８に対する親和性の僅か１〜１０％（好ましくは１〜５％）というようなものである。したがって、目的分析物１８の存在下では、置換可能な成分１０は第一表面１２から特異的に置換される。次に置換可能な成分は、基本的に図２に示されるように、典型的に置換可能な成分１０の抗体部分の結合部位１６’を認識する捕獲分子によって、第二表面（示していない）に捕獲される。好都合には、ミモトープはペプチドであり、融合タンパク質を形成する（免疫グロブリンとペプチドをコードする配列間の遺伝子融合によりコードされる）。あるいは、ミモトープは、従来の化学的技術のいずれかにより（例えば、「バイオコンジュゲート技術」、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６を参照のこと）免疫グロブリン分子（またはその抗原結合部位）に結合されてもよい。
【００４７】
図２で説明される実施形態の利点は、第一表面１２から置換された時、置換可能な成分１０は大部分が通常の抗体分子から成り、目的分析物１８に着していない。第二表面での目的分析物１８の存在は（図１で説明される実施形態のように）、ある実施形態ではシグナルの生成を時々妨ぐこともある。
【００４８】
実施例３
この実施例は、第一表面に位置する固定化抗体フラグメントからのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の解離と、第二表面での抗体による捕獲／検出に関する。図３で、この検出原理を模式的に説明する。この実施例は進歩したキットに適したＢｉａｃｏｒｅ ＡＢ Ｂｉａｌｉｔｅ（商標）を用いて実施し、表面プラズモン共鳴を利用する。
【００４９】
まず、ＣＭ５センサーチップを以下のように据え付ける：
ｉ．新しいＣＭ５センサーチップをＢｉａｌｉｔｅ（商標）バイオセンサーに合体させ、ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水）ランニング緩衝液で平衡化した。温度を２５℃に維持し、流速を１０μｌ／分に設定した。
【００５０】
ｉｉ．液体の流れを、フローセル１「第一表面」とフローセル２「第二表面」の二つのフローセルを連続して通るように設定した。Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢアミンカップリングキットの１−エチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性化化学薬品を利用し、ＥＤＣ／ＮＨＣ混合液をサンプルループに注入して４０μｌを充填することにより、デキストラン表面を活性化した。活性化を繰り返したが、これは図４の（ａ）で示した部分に見ることができる。第一表面でのＢｉａｌｉｔｅ（商標）反応は細い線で示され、第二表面での反応は太い線で示される。この線の太さの識別が、次のＢｉａｌｉｔｅ（商標）トレースで利用される。
【００５１】
ｉｉｉ．活性化の後、ｈＣＧを認識する５０μｇ／ｍｌの一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ３２９９ＨｉｓＨ２）溶液４０μｌを、フローセル１を通して注入した。次に、ｈＣＧを認識する５０μｇ／ｍｌの全抗体（３２９９）溶液４０μｌを、フローセル２を通して注入し、さらに５０μｇ／ｍｌのｓｃＦｖ３２９９ＨｉｓＨ２溶液４０μｌをフローセル１を通して注入した。このカップリング段階は、図４の（ｂ）で示した部分に見ることができる。
【００５２】
ｉｖ．ＣＭ５センサーチップの未反応部位を、４０μｌの１Ｍエタノールアミン溶液を２回連続して注入することによりブロックした。これらは、図４の（ｃ）で示した部分に見ることができる。
【００５３】
説明として、ＢｓｔＥＩＩ−ＳａｃＩ ＤＮＡリンカーフラグメントが以下の配列を生じる可動性リンカーをコードするＢｓｔＥＩＩ−ＳａｃＩフラグメントと置換された以外は、ｓｃＦｖ３２９９の配列はＷＯ９６／２７６１２（そこではＦｖＫＣ−ＩＩと記述される）で開示されるものと同様である：
ＦＲ−４ ＶＨ リンカー ＦＲ−１ ＶＬ
ＴＶＴＶＳＳｇｇｇｇｓｇｇｇｇｓｇｇｇｇｓＤＩＥＬＴ（配列番号１）
リンカーをコードするＤＮＡ配列は、Ｊａｃｋｓｏｎら（「バクテリオファージｆｄの表面上への表示を利用した抗体の変異体および他のタンパク質分子の選択」ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｓ．Ｒｅｅｓ，ＳｔｅｒｎｂｅｒｇとＷｅｔｚｅｌ，ｐｕｂｌ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９２）に記述されている。多数の他の抗ｈＣＧ抗体も同様に適当であることが理解されよう。利用可能な他のものは、Ｌｉｎｓｃｏｔｔの免疫学的および生物学的試薬の指導書（第９版、１９９６−７）に載っており、例えば、Ｂｉｏｓｔｒｉｄｅ Ｉｎｃ．（ＣＡ，ＵＳＡ）から入手可能な抗α−ｈＣＧモノクローナル、およびＢｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｌｔｄ（Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ）から入手可能な抗β−ｈＣＧモノクローナルが含まれる。
【００５４】
ｈＣＧの捕獲／検出は以下のように起こる：
ｖ．２００μｌのｈＣＧ（１０ＩＵ／ｍｌ）をｈＣＧを認識する二次モノクローナル抗体（３４６８と名付けられ、１００μｇ／ｍｌで）２０μｌとともに、室温で３０分間インキュベーションした（再度、３４６８以外の抗体も適当である）。これは、ｈＣＧの効果的な質量を増加させるために行われ、これにより検出感度が上昇する。
【００５５】
ｖｉ．予め混合した４０μｌのｈＣＧ−３４６８溶液を、フローセル１を通して注入した。これは、図５Ａの（ａ）で示した部分に見ることができる。
【００５６】
ｖｉｉ．注入後直ちに、緩衝液の流れを、第一表面を離れた後に第二表面を通るように変えた。これが起こるポイントは、図５Ｂの（ｂ）で示される。
【００５７】
図５Ａは、第一表面から解離するｈＣＧ−３４６８複合体が、抗ｈＣＧ抗体３２９９での捕獲により第二表面に結合し検出され得ることを示す（図５Ｂ）。実際には第一表面は検出可能なシグナルを生成する必要はなく、これは研究目的のためだけのこの実施例における装置であることが、当業者には理解されよう。通常の装置では、捕獲（第二）表面のみが検出可能なシグナルを生成し、第一表面はどんな適当な固体支持体でもよい。さらに、本発明のアッセイ法では、目的分析物の存在下でのみｈＣＧが表面１から置換されるように条件を調整した。それにもかかわらず、この実施例は本発明の原理を証明する。
【００５８】
実施例４
この実施例は、第一表面の低親和性エストロン ３−グルクロニド（Ｅ３Ｇ）アナログ（エストラジオール ３−グルクロニド［ＥＤ３Ｇ］）からのＥ３Ｇを認識する抗体（４１５５）の特異的置換と、第二表面での免疫グロブリンを認識する抗体による捕獲と検出に関する。図６で、この検出原理を模式的に説明する。
【００５９】
４１５５モノクローナル細胞株は、Ｇａｎｉら（１９９４ Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４８，２７７−２８２）に記述されている方法に従って、調製しスクリーニングした。Ｇａｎｉらの発表は抗プロゲステロン抗体の開発に関するものであるが、基本的にはエストロンとそのアナログに反応する抗体の作製にも同一の技術を利用した。細胞株４１５５から得られるもの以外の抗体も、当業者によって（そのような技術を利用して）容易に作製され得る：そのような抗体は、質的に同様の性質を有する。さらに、市販の抗エストロングルクロニドモノクローナル抗体（Ｗａｌｌａｃｅｖｉｌｌｅ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）については、Ｌｉｎｓｃｏｔｔの免疫学的および生物学的試薬の指導書（第９版、１９９６−７）に記述されている。
【００６０】
まず、ＣＭ５センサーチップを以下のように据え付ける：
ｉ．新しいＣＭ５センサーチップをＢｉａｌｉｔｅ（商標）バイオセンサーに合体させ、ＨＢＳランニング緩衝液で平衡化した。温度を２５℃に維持し、流速を１０μｌ／分に設定した。
【００６１】
ｉｉ．液体の流れを、第一表面（「表面１」）と第二表面（「表面２」）を連続して通るように設定した。Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢアミンカップリングキットのＥＤＣとＮＨＳ活性化化学薬品を利用し、ＥＤＣ／ＮＨＣ混合液をサンプルループに注入して４０μｌを充填することにより、デキストラン表面を活性化した。これは図７の（ａ）で示した部分に見ることができる。
【００６２】
ｉｉｉ．緩衝液の流れが表面２のみを通るように設定し、酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０中のウサギ抗マウスＩｇＧを４０μｌ注入した。これは、図７の（ｂ）で示した部分に見ることができる。
【００６３】
ｉｖ．表面２へのＩｇＧカップリングの後、緩衝液の流れが表面１のみを通るように変更し、４０μｌのエチレンジアミン（ＥＤＡ）（２０％ ｖ／ｖ）を注入した。これは、図７の（ｃ）で示した部分に見ることができる。
【００６４】
ｖ．２０μｌのＥＤ３Ｇ（５ｍｇ／ｍｌ）を８０μｌのＮＨＳ／ＥＤＣ活性化溶液に添加し、混合して室温で７分間インキュベーションした。次に、この予めインキュベーションしたＥＤ３Ｇ溶液４０μｌを表面１を通して注入した（これは図７の（ｄ）で示した部分に見ることができる）。
【００６５】
ｖｉ．緩衝液の流れが表面２のみを通るように設定し、４０μｌの１Ｍエタノールアミン溶液を注入した。これは図７の（ｅ）で示した部分に見ることができる。
【００６６】
４１５５の置換と再捕獲は以下のように行われた：
ｖｉｉ．２０μｌの１００μｇ／ｍｌ ４１５５溶液を注入することにより、４１５５を表面１に充填した。
【００６７】
ｖｉｉｉ．様々な流速で２分間、表面１および２を通して１ｍｇ／ｍｌのＥ３Ｇ溶液を注入することにより、表面１からの特異的置換と表面２における再捕獲／検出を誘導した。この結果は図８に見ることができ、黒四角はＥ３Ｇによる表面１からの４１５５の特異的置換を示し、白四角は表面２における４１５５の捕獲を示す。四角のサイズの上昇は流速の上昇を表し、最も小さい四角は２μｌ／分を表し、次の四角のサイズは５、１０、および２０μｌ／分で収集したデータのものである。
【００６８】
表面２で捕獲され検出される置換４１５５のパーセンテージは、明らかに流速に関連している（図９を参照のこと）。流速の上昇は、置換物質のパーセンテージを減少させる。低い流速（５μｌ／分以下）により、確実にすべての置換物質が捕獲される。
【００６９】
この実施例は、第一表面に可逆的に結合した分子の特異的置換と、例えば置換物質を認識する抗体による第二の別の表面での続く置換物質の再捕獲を誘導することにより、いかに分析物（Ｅ３Ｇ）がアッセイされ得るかを示すものである。
【００７０】
実施例５
この実施例は、第一表面の低親和性エストロン ３−グルクロニド（Ｅ３Ｇ）アナログ（エストラジオール ３−グルクロニド［ＥＤ３Ｇ］）からのＥ３Ｇを認識する抗体（４１０１）の特異的置換と、第二検出表面でのＥ３Ｇによる捕獲に関連する。図１０は、この検出原理を模式的に説明する。
【００７１】
まず、ＣＭ５センサーチップを以下のように据え付ける：
ｉ．新しいＣＭ５センサーチップをＢｉａｌｉｔｅ（商標）バイオセンサーに合体させ、ＨＢＳランニング緩衝液で平衡化した。温度を２５℃に維持し、流速を１０μｌ／分に設定した。
【００７２】
ｉｉ．液体の流れを、第一表面（「表面１」）と第二表面（「表面２」）を連続して通るように設定した。Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢアミンカップリングキットのＥＤＣとＮＨＳ活性化化学薬品を利用し、ＥＤＣ／ＮＨＣ混合液をサンプルループに注入して４０μｌを充填することにより、デキストラン表面を活性化した。これは図１１の（ａ）で示した部分に見ることができる。
【００７３】
ｉｉｉ．４０μｌのＥＤＡ（２０％ ｖ／ｖ）を、表面１および２を通して注入した。これは、図１１の（ｂ）で示した部分に見ることができる。
【００７４】
ｉｖ．２０μｌのＥＤ３Ｇ（５ｍｇ／ｍｌ）を８０μｌのＮＨＳ／ＥＤＣ活性化溶液に添加し、混合して室温で７分間インキュベーションした。次に、この予めインキュベーションしたＥＤ３Ｇ溶液４０μｌを表面１を通して注入した（これは図１１の（ｃ）で示した部分に見ることができる）。
ｖ．２０μｌのＥ３Ｇ（５ｍｇ／ｍｌ）を８０μｌのＮＨＳ／ＥＤＣ活性化溶液に添加し、混合して室温で７分間インキュベーションした。次に、この予めインキュベーションしたＥ３Ｇ溶液４０μｌを表面２を通して注入した（これは図１１の（ｄ）で示した部分に見ることができる）。
【００７５】
４１０１の特異的置換と捕獲は以下のように行われた：
ｖｉ．２０μｌの１００μｇ／ｍｌ ４１０１溶液を表面１を通して注入することにより、４１０１を表面１に充填した。
【００７６】
ｖｉｉ．表面１および２を通して２０μｌの１ｍｇ／ｍｌエストロン ３−硫酸［Ｅ３Ｓ］溶液を注入することにより、表面１からの４１０１の置換と表面２における再捕獲／検出を誘導した。表面１からの置換と表面２における再捕獲／検出は、図１２に見ることができる。
【００７７】
この実施例では、Ｅ３Ｓは分析物を示す。この実施例は、第一表面で分析物の低親和性アナログ（ＥＤ３Ｇ）に可逆的に結合した分子の置換と、分析物の高親和性アナログ（Ｅ３Ｇ）に結合することにより第二の別の表面での続く再捕獲と検出を誘導することにより、いかに分析物がアッセイされ得るかを示すものである。
【００７８】
実施例６
この実施例は、分析物の添加に応答したグルコースオキシダーゼ／抗体コンジュゲートの置換／捕獲によりもたらされる、色変化の生成を示す。置換されたグルコースオキシダーゼ／抗体コンジュゲートは、ＫＩ、西洋わさびペルオキシダーゼ、および捕獲分子のしみ込んだデンプンの薄層に捕獲される。捕獲されたグルコースオキシダーゼ／抗体コンジュゲートはグルコースを利用してＨ２Ｏ２を生成し、ペルオキシダーゼの存在下でこれがヨウ化物を酸化してヨウ素にする。次に生成されたヨウ素はデンプンと反応し、茶色から青への色変化が生じる。
【００７９】
二つの表面は、以下のように設定する：
第一表面（「表面１」）
ｉ．２．６ｍｇのエストラジオール ３−グルクロニド（ＥＤ３Ｇ）を２ｍｌの新たに調製したＥＤＣ（０．１Ｍ）とＮＨＳ（０．０２Ｍ）溶液に再懸濁して、室温で１５分間インキュベーションすることにより、ＥＤ３Ｇ／オボアルブミンコンジュゲートを準備する。
【００８０】
ｉｉ．ＥＤ３Ｇ溶液に２ｍｌのオボアルブミン（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、定常的に混合しながら室温で２．５時間インキュベーションする。
【００８１】
ｉｉｉ．次に、コンジュゲート化したＥＤ３Ｇ／オボアルブミン溶液を、０．１％アジ化ナトリウムを含む１Ｌのリン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳＡ」）に対して１６時間透析する。
【００８２】
ｉｖ．ウェル内で１００μｌのＥＤ３Ｇ−オボアルブミン（ＰＢＳＡで１：１０に希釈）を室温で２時間インキュベーションすることにより、Ｇｒｉｅｎｅｒ ＨＢウェルを透析したＥＤ３Ｇ−オボアルブミンコンジュゲートでコーティングする。
【００８３】
ｖ．１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．５中のグルコースオキシダーゼ１ｍｌとモノクローナル抗体４１５５（これも１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．５中）を、５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度でガラスチューブ中で混合することにより、グルコースオキシダーゼとモノクローナル抗体４１５５のコンジュゲートを調製する。これに２２０μｌの０．０２％グルタルアルデヒドを、定常的に混合しながら１滴ずつ添加する。チューブをアルミホイルで覆い、室温で３０分間、回転させながら混合する。２５０μｌの１Ｍエタノールアミンを添加し、さらに３０分間混合を続ける。次にこの溶液を１００ｍＭ ＰＢＳに対して室温で２４時間透析し、続いて４℃にて１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離する。
【００８４】
ｖｉ．次に、ウェル当たり１００μｌのグルコースオキシダーゼ−４１５５コンジュゲートを室温で１時間インキュベーションすることにより、Ｇｒｉｅｎｅｒ ＨＢウェルを準備する。続いてウェルをＰＢＳでリンスし、非結合のグルコースオキシダーゼ／４１５５コンジュゲートを除去する。ウェルは、必要時まで、１００μｌのＰＢＳを入れたまま４℃で保存する。
【００８５】
第二表面（「表面２」）
ｉ．ＰＢＳ中に１００μｌのエストロン ３−グルクロニド（Ｅ３Ｇ）−オボアルブミンコンジュゲート（ＥＤ３Ｇ−オボアルブミンコンジュゲートで記述したのと同様に調製）、５％（ｗ／ｖ）デンプン、１０ｍｇ／ｍｌ西洋わさびペルオキシダーゼ、および０．１Ｍ ＫＩを含む２００μｌの溶液を、Ｇｒｅｉｎｅｒ ＨＢウェル内で室温で１６時間インキュベーションする。表面の色は茶色である。
【００８６】
１０ｍＭグルコースのＰＢＳ溶液中の分析物（１ｍｌの０．１Ｍエストロン ３−グルクロニド）を準備した表面１のウェルに０．２ｍｌ／分で送り込み、それと同時にこのウェルからの溶液を表面２を含むウェルに０．２ｍｌ／分で送り込む。表面２を有するウェルがオーバーフローしないように、０．２ｍｌ／分で溶液をまたウェルから送り出す。
【００８７】
表面１から表面２へのテスト溶液の流動を開始すると、グルコースオキシダーゼによるグルコースの酸化によって生成されるＨ２Ｏ２により、ヨウ化物が酸化されてヨウ素になり、表面２の色が茶色から青に変化する。
【００８８】
実施例７
この実施例は、分析物に応答した表面での蛍光強度の変調に関する。分析物が来ると、分子は第一表面から置換される。これらの置換された分子は、第二表面で生成される蛍光強度を変調することができる。
【００８９】
二つの表面は、以下のようにセットアップする：
第一表面（「表面１」）
ｉ．２．６ｍｇのＥＤ３Ｇを２ｍｌの新たに調製したＥＤＣ（０．１Ｍ）とＮＨＳ（０．０２Ｍ）溶液に再懸濁して、室温で１５分間インキュベーションすることにより、ＥＤ３Ｇ／オボアルブミンコンジュゲートを準備する。
【００９０】
ｉｉ．ＥＤ３Ｇ溶液に２ｍｌのオボアルブミン（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、定常的に混合しながら室温で２．５時間インキュベーションする。
【００９１】
ｉｉｉ．次に、コンジュゲート化したＥＤ３Ｇ／オボアルブミン溶液を、１ＬのＰＢＳＡに対して１６時間透析する。
【００９２】
ｉｖ．ウェル内で１００μｌのＥＤ３Ｇ−オボアルブミン（ＰＢＳＡで１：１０に希釈）を室温で２時間インキュベーションすることにより、Ｇｒｉｅｎｅｒ ＨＢウェルを、透析したＥＤ３Ｇ−オボアルブミンコンジュゲートでコーティングする。
【００９３】
ｖ．１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．５中のセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）１ｍｌとモノクローナル抗体４１５５（これも１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．５中）を、５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度でガラスチューブ中で混合することにより、ＣＢＤ／モノクローナル抗体４１５５のコンジュゲートを調製する。これに２２０μｌの０．０２％グルタルアルデヒドを、定常的に混合しながら１滴ずつ添加する。チューブをアルミホイルで覆い、室温で３０分間、回転させながら混合する。２５０μｌの１Ｍエタノールアミンを添加し、さらに３０分間混合を続ける。次にこの溶液を１００ｍＭ ＰＢＳに対して室温で２４時間透析し、続いて４℃にて１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離する。必要時まで、上清を４℃で保存する。
【００９４】
ｖｉ．次に、ウェル当たり１００μｌのＣＢＤ−４１５５コンジュゲートを室温で１時間インキュベーションすることにより、Ｇｒｉｅｎｅｒ ＨＢ表面を準備する。続いてウェルをＰＢＳで濯ぎ、非結合のＣＢＤ／４１５５コンジュゲートを除去する。
【００９５】
第二表面（「表面２」）
ｉ．Ｈ３ＰＯ４膨潤したＡｖｉｃｅｌ（０．２％）溶液１ｍｌをイナゴマメゴム（ｇｕｍ）（ＬＢＧ）−ＦＩＴＣコンジュゲート５０μｌとともに、定常的に混合しながら室温で１時間インキュベーションする。
【００９６】
ｉｉ．粒子を室温で１０分間、１３００ｒｐｍで遠心分離し、ペレットをＰＢＳに再懸濁することにより、ＬＢＧ−ＦＩＴＣ Ａｖｉｃｅｌを洗浄する。この洗浄手順をもう一度繰り返す。
【００９７】
ｉｉｉ．２回目の洗浄後、ＬＢＧ−ＦＩＴＣ充填粒子を５０μｌのＰＢＳに再懸濁し、必要時まで４℃で保存する。
【００９８】
分析物（１００μｌの１ｍｇ／ｍｌＥ３Ｇ）を、準備したＧｒｅｉｎｅｒ ＨＢウェル（表面１）中で室温で１時間インキュベーションする。次にインキュベーションした溶液をウェルから除去し、ＬＢＧ−ＦＩＴＣ充填粒子に添加する。Ａｖｉｃｅｌ粒子上でのＣＤＢ−４１５５によるＬＢＧ−ＦＩＴＣの置換による蛍光強度の減少を、蛍光標示式セルソーターを使用して、またはセルソーター（例えば、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｉｔｅ（商標）セルソーター）によりモニターする。
【００９９】
実施例８
この実施例は、分析物の添加に応答した二特異性抗体フラグメント構築物の置換／捕獲によってもたらされる、電気的変化の生成を示す。それは、第一抗体結合部位（エストロン−３−グルクロニド（Ｅ３Ｇ）を認識し、マウスモノクローナル抗体４１５５から誘導する）の、第一表面からの低親和性Ｅ３Ｇアナログ（エストラジオール ３−グルクロニド（ＥＤ３Ｇ））からの特異的置換と、第二表面に固定化された電気活性分子を認識する第二抗体結合部位を介しての捕獲と検出に関する。第二表面は、単層の電気活性分子でコーティングされた金の電極である。電気活性分子は、ヘキシル付属部分に結合したカルバゾール残基であり、これは次にチオール基によって金表面に結合される。この明細書と同一日に出願された我々の同時係属中欧州特許出願は、いかに選択された抗体の結合が、印加電圧の影響下で電極を流れる電流を変化（変調）することができるのかを説明している。ここでは、電気活性分子への二特異性抗体フラグメントの結合が、もともと導入された分析物の濃度に直接関連する様式で、電流を変調した。
【０１００】
４１５５モノクローナル細胞株は、Ｇａｎｉら（１９９４ Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４８，２７７−２８２）に記述されている方法に従って、調製しスクリーニングした。Ｇａｎｉらの発表は抗プロゲステロン抗体の開発に関するものであるが、基本的にはエストロンとそのアナログに反応する抗体の作製にも同一の技術を利用した。細胞株４１５５から得られるもの以外の抗体も、当業者によって（そのような技術を利用して）容易に作製され得る：そのような抗体は、質的に同様の性質を有する。電気活性カルバゾール分子、別のハプテンに対するモノクローナル抗体も、この方法を使用して作製することができる。二つの抗体結合特異性の遺伝子のクローニングと、二特異性抗体フラグメントの構築でのその使用は、当業者には周知の方法により容易に達成することができる（例えばＷＯ ９７／１４７１９を参照のこと）。
【０１０１】
二つの表面は、以下のように設定する：
第一表面（「表面１」）
ｉ．２．６ｍｇのエストラジオール ３−グルクロニド（ＥＤ３Ｇ）を２ｍｌの新たに調製したＥＤＣ（０．１Ｍ）とＮＨＳ（０．０２Ｍ）溶液に再懸濁して、室温で１５分間インキュベーションすることにより、ＥＤ３Ｇ／オボアルブミンコンジュゲートを準備する。
【０１０２】
ｉｉ．ＥＤ３Ｇ溶液に２ｍｌのオボアルブミン（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、定常的に混合しながら室温で２．５時間インキュベーションする。
【０１０３】
ｉｉｉ．次に、コンジュゲート化したＥＤ３Ｇ／オボアルブミン溶液を、０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳＡ」）１Ｌに対して１６時間透析する。
【０１０４】
ｉｖ．ウェル内で１００μｌのＥＤ３Ｇ−オボアルブミン（ＰＢＳＡで１：１０に希釈）を室温で２時間インキュベーションすることにより、Ｇｒｉｅｎｅｒ ＨＢウェルを透析したＥＤ３Ｇ−オボアルブミンコンジュゲートでコーティングする。
【０１０５】
ｖ．次に、ウェル当たり１００μｌの二特異性抗体フラグメント（ＰＢＳＡ中１００μｇ／ｍｌ）溶液を室温で１時間インキュベーションすることにより、Ｇｒｉｅｎｅｒ ＨＢ−ＥＤ３Ｇ−オボアルブミン表面を準備する。続いてウェルをＰＢＳＡで濯ぎ、非結合の二特異性抗体フラグメントを除去する。ウェルは、必要時まで、１００μｌのＰＢＳＡを入れたまま４℃で保存する。
【０１０６】
第二表面（「表面２」）
ｉ．チオール末端アルキル付属電気活性（カルバゾール）分子を、窒素をパージしたエタノール、またはＤＭＦ溶液に溶解した。
【０１０７】
ｉｉ．清潔で純粋な金の表面を、電気活性成分を含む溶液に暗下で２４時間浸した。
【０１０８】
ｉｉｉ．金表面上の電気活性単層を適当な溶媒（例えば、ジクロロメタン）中で洗浄して非結合の分子をすべて除去し、次いで、窒素をパージした適当な溶媒中で一晩保存した。
【０１０９】
ｉｖ．電極を窒素流で乾燥し、電極表面から溶媒を除去した。
【０１１０】
ｖ．電極を一連の増加希釈アセトニトリル：水混合液に移して単層の分子の向きを改善し、その結果、水性環境下で適当な単層となる。
【０１１１】
アッセイ
電気化学的測定は、Ｂｒｙａｎ ｆｌａｔ ｂｅｄ ｘ−ｙ ｒｅｃｏｒｄｅｒ（ｍｏｄｅｌ Ａ２５０００）とＥＨ＆Ｇ ｍｏｄｅｌ ２７３Ａ Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔ／Ｇａｌｖａｎｏｓｔａｔと一緒にＰｒｉｎｃｅｔｏｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔ（ｍｏｄｅｌ ３６２）でのサイクリックボルタンメトリーまたはクロノアンペロメトリーにより（データの処理にはＥｃｈｅｍとＬｏｔｕｓ１２３を使用して）行う。
【０１１２】
（ａ）安定したスキャンが生成されたら、バックグラウンドの電気化学を読み取って保存する。
【０１１３】
（ｂ）読み取るサンプルを表面１（ウェル）に添加し、室温で１５分間インキュベーションする。
【０１１４】
（ｃ）ウェルからサンプルを除去して表面２（電極表面）に添加し、再度室温で１５分間インキュベーションする。
【０１１５】
（ｄ）ＭｉｌｌｉＱ水で電極表面を洗浄し、上記（ｂ）と同じ条件を用いて電気化学を測定する。システムを標準Ｅ３Ｇサンプルに対してキャリブレーションしてあるならば、電流の変調により、モル濃度単位で表される分析物濃度の測定値が与えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明によるアッセイ法の模式的な説明である。
【図２】 図２は、本発明によるアッセイ法の模式的な説明である。
【図３】 図３は、本発明によるアッセイ法の模式的な説明である。
【図４】 図４は、ＳＰＲシグナル出力を示すトレース（時間に対する任意の応答単位）である。
【図５】 図５は、ＳＰＲシグナル出力を示すトレース（時間に対する任意の応答単位）である。
【図６】 図６は、本発明によるアッセイ法の模式的な説明である。
【図７】 図７は、ＳＰＲシグナル出力を示すトレース（時間に対する任意の応答単位）である。
【図８】 図８は、時間（秒）に対するＳＰＲ応答（任意の応答単位）のグラフである。
【図９】 図９は、本発明の一実施形態で捕獲される置換可能な成分の量に対する流速の影響、および低い流速において第一表面から特異的に置換された置換可能な成分の１００％がいかに第二表面に捕獲され得るかを示すグラフ（毎分μｌの流速に対する、第二表面で捕獲される置換可能な成分の％）である。
【図１０】 図１０は、本発明によるアッセイ法の模式的な説明である。
【図１１】 図１１は、ＳＰＲシグナル出力を示すトレース（時間に対する任意の応答単位）である。
【図１２】 図１２は、時間（秒）に対するＳＰＲ応答（任意の応答単位）のグラフである。
【配列表】
Claims (17)
- サンプル中の目的分析物の存在を検出する方法であって、可逆的に固定化された置換可能な成分を有する第一表面を提供し；第一表面を目的分析物を含むサンプルに曝露して目的分析物により親和性に関連した様式で第一表面の置換可能な成分を特異的に置換し；第一表面から置換された置換可能な成分をこの置換可能な成分に特異的に結合する捕獲成分を有する第二表面と接触させて第二表面上に置換可能な成分を捕獲し、前記捕獲によって生成した検出可能なシグナルを検出する段階を含み、前記検出はＳＰＲ以外の手段で実施され、置換可能な成分が第二表面で捕獲されない限りおよび捕獲されるまでは置換可能な成分はアッセイで検出されるシグナルを生成することができない方法。
- 置換可能な成分が免疫グロブリン分子またはその抗原結合性誘導体からなる、請求項１に記載の方法。
- 置換可能な成分が二特異性抗体または二特異性抗原結合性抗体誘導体からなる、請求項１または２に記載の方法。
- 置換可能な成分が第一表面での可逆的固定化を容易にする部分を含む、請求項１、２、または３に記載の方法。
- 置換可能な成分が融合タンパク質からなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
- 置換可能な成分が目的分析物のアナログであるミモトープからなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
- 第一表面が置換可能な成分に比較的緩く結合する複数の介在分子を含み、介在成分の目的分析物に対する結合親和性が置換可能な成分の介在成分に対する結合親和性よりも高い、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
- 介在分子が目的分析物のアナログである、請求項７に記載の方法。
- 介在分子がミモトープである、請求項７に記載の方法。
- 捕獲成分が免疫グロブリン分子またはその抗原結合性変異体からなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
- 置換可能な成分と捕獲成分が特異的結合対のメンバーからなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
- 検出可能なシグナルがエバネッセント波または音波の生成または変調からなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
- 捕獲成分による置換可能な成分の捕獲が捕獲成分の電気化学的性質を直接変調し、その変調が検出可能なシグナルを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
- 第一および第二表面が別々のそれぞれ第一および第二支持体上に提供される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
- 第一および第二表面が単一の支持体上に提供される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
- 第一および／または第二表面が平面、粒子、多孔性である固体支持体上に提供される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
- 目的分析物が、ステロイドホルモン、タンパク質ホルモン、核酸、ペプチド、細菌性またはウイルス性抗原、および免疫グロブリンから成る群より選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
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