JP2009539412A - 汎細胞表面レセプター特異的な治療薬 - Google Patents

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Abstract

汎細胞表面レセプター特異的な治療薬、これらの調製方法およびこれらを用いる処置方法が提供される。とりわけ、汎細胞表面レセプター特異的な治療薬は、少なくとも２つの異なるＨＥＲレセプターリガンドと相互作用するか、そして／または、２以上のＨＥＲ細胞表面レセプターと二量体化もしくは相互作用する、汎ＨＥＲ特異的治療薬である。これらの特性によって、この治療薬は、少なくとも２つの細胞表面レセプターの活性を調節し、そして、治療目的に有用となる。

Description

（関連出願）
本特許出願は、２００６年６月１２日出願の米国仮出願第６０／８１３，２６０号；２００６年９月２９日出願の米国仮出願第６０／８４８，５４２号；および２００７年１月５日出願の米国仮出願第６０／８４８，９４１号に対する優先権を主張する。
上で参照した関連出願およびこれらに付随する配列表の各々の主題は、その全体が参考として援用される。
（発明の分野）
汎ＨＥＲ特異的治療薬を含む汎細胞表面レセプター（ｐａｎ−ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）特異的な治療薬、ならびに、これらの作製方法および使用方法が提供される。
（背景）
細胞のシグナル伝達経路は、相互作用して、細胞外シグナル、細胞間シグナルおよび細胞内シグナルを中継する、ポリペプチドおよび低分子を含む分子のネットワークを伴う。このような経路は、相互作用して、その経路の１つのメンバーから次のメンバーへとシグナルを渡す。経路の１つのメンバーの調節は、シグナル伝達経路全体に中継されて、経路の他のメンバーの活性の調節、および、表現型、および、細胞もしくは生物のシグナルに対する応答への影響のようなシグナル伝達の結果の調節をもたらし得る。疾患および障害は、シグナル伝達経路の誤調節または調節における変化を伴い得る。薬物開発の目標は、シグナル伝達経路におけるより正常な調節を回復させるために、このような誤調節された経路を標的とすることである。
レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、多くのシグナル伝達経路に関与するポリペプチドの中の、細胞のシグナル伝達分子のファミリーである。ＲＴＫは、胚形成、細胞分裂、増殖、分化、遊走および代謝を含む、種々の細胞のプロセスにおいて役割を担う。ＲＴＫは、リガンドによって活性化され得る。このような活性化は、次いで、通常は、シグナル伝達経路のその後の活性化のための要件として、レセプターの二量体化または低重合体化をもたらす。オートクリン性もしくはパラクリン性の細胞のシグナル伝達経路を誘発することなどによるシグナル伝達経路の活性化（例えば、セカンドメッセンジャーの活性化）は、特定の生物学的作用をもたらす。ＲＴＫに対するリガンドは、同系のレセプターに特異的に結合する。
ＲＴＫはまた、多数の疾患の進行（癌、自己免疫疾患および他の慢性疾患を含む）に関与しているか、または、これらにおいて役割を担っている（例えば、非特許文献１を参照のこと）。ＲＴＫが関係している癌としては、乳癌および結腸直腸癌、胃癌、神経膠腫、ならびに、中胚葉に由来する腫瘍が挙げられる。ＲＴＫの非調節は、いくつかの癌において指摘されている。例えば、乳癌は、ｐ１８５−ＨＥＲ２の発現の増加と関連付けられ得る。ＲＴＫはまた、糖尿病性網膜症および黄斑変性症を含む眼の疾患にも関連している。ＲＴＫはまた、生理学的な血管形成および腫瘍性の血管形成を含む新脈管形成に伴う調節経路にも関連している。ＲＴＫはまた、細胞の増殖、遊走および生存の調節にも関連している。
疾患に関連するＲＴＫの中でも、とりわけ重要なのが、レセプターのＨＥＲ（ヒトＥＧＦＲファミリー、また、ＥｒｂＢまたはＥＧＦＲとも呼ばれる）ファミリーである（例えば、その癌における役割の考察について、非特許文献１を参照のこと）。クラスＩのレセプターと呼ばれるこれらのレセプターには、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４が含まれる。呼称は多様である：ＨＥＲ１はまた、ＥＧＦＲおよびＨＲＢＢ１とも称される；ＨＥＲ２はまた、ＥＲＢＢ２およびＮＥＵとも称される；ＨＥＲ３はまた、ＥＲＢＢ３とも称される；そして、ＨＥＲ４はまた、ＥＲＢＢ４とも称される。このファミリーのメンバーは全て、細胞外のリガンド結合領域と、１回膜貫通領域と、細胞質チロシンキナーゼ含有ドメインとを有する。ＨＥＲは、上皮、間葉およびニューロンを起源とする種々の組織において発現される。
通常の生理学的条件下では、ＨＥＲの活性化は、そのリガンドの空間的かつ時間的な発現により制御され、これらのリガンドは、増殖因子のＥＧＦファミリーのメンバーである。リガンド結合は、内在性のキナーゼドメインの活性化につながるレセプターのホモ二量体およびヘテロ二量体の形成を誘導し、細胞質テイルにおける特定のチロシン残基のリン酸化をもたらし、最終的には、細胞内シグナル伝達経路の活性化をもたらす。
これらのレセプターの各々は、癌において役割を担っていることが示されている（例えば、非特許文献２；非特許文献３を参照のこと；）。例えば、ＨＥＲ１（ＥｒｂＢ１）およびＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）は、多くのヒトの癌の発症および病理に関連している；そして、これらのレセプターにおける変化は、より攻撃的な疾患および乏しい臨床上の成果を伴う疾患と関連している。以下の表は、特定の癌におけるＨＥＲレセプターファミリーメンバーおよびその同系リガンドの役割をまとめたものである：
癌および他の疾患におけるその役割に起因して、ＨＥＲレセプターは、治療薬の標的となる。抗ＨＥＲ治療薬には２つのクラスがある：本明細書においてＥＣＤと称される細胞外（または外部ドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ））を標的とする抗体と、低分子のチロシンキナーゼインヒビター。抗ＨＥＲ薬物は、限られた効能と限られた応答期間とを呈する。例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（Ｔｒａｓｔｕｚｉｍａｂ）は、マウスモノクローナル抗体のヒト化バージョンであり、これは、ＨＥＲ２の細胞外ドメインを標的とする。薬が効き目を持つには、ＨＥＲ２の高い発現（少なくとも３〜５倍過剰な発現）を必要とする。結果として、乳癌患者のうち２５％よりも少ない割合が、処置に適格とされる。この集団の中でも、大部分は、処置に対し応答しない（Ｐｉｃｃａｒｔ−Ｇｅｂｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．２００５；Ｒｏｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００５）。さらに、低分子のチロシンキナーゼインヒビターは、しばしば、特異性を欠く。したがって、化学療法と組合せてＨｅｒｃｅｐｔｉｎで処置された予め選択されたＨＥＲ２を多く発現する患者を除いて、単一標的の抗ＨＥＲ剤、抗体または低分子のチロシンキナーゼインヒビターで観察される効能は、１０〜１５％の範囲である。
Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ５：３４１−３５ Ｓｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：７０７−７１２ Ｂａｚｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｌａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｊｕｌ１２ 補遺１：Ｓ１７−Ｓ２７
利用可能な治療の限られた有効性に起因して、これらの標的に対処するための代替的な戦略を開発する必要性が残されている。したがって、とりわけ、抗ＨＥＲ抗体および低分子よりも有効な治療薬の提供を含めて、ＨＥＲレセプターファミリーを標的とするための代替的な戦略を提供することが本明細書における目的である。
（発明の簡単な要旨）
本明細書の一部として、配列表が、本発明の一部として添付されるように扱われる。配列は、本明細書の一部として組み込まれる。
本明細書において、治療薬および候補治療薬、ならびに、候補治療薬を同定または発見するための方法が提供される。このような治療薬を用いた処置方法が提供される。治療薬は、１以上の細胞表面レセプターの活性が調節される限りは、１以上のレセプターに対するリガンドへの結合および／または、１以上の細胞表面レセプターとの相互作用を介してなどで、１以上の細胞表面レセプターを特異的に標的とするという点で、汎細胞表面レセプター治療薬となるように設計される。治療薬としては、１以上のＨＥＲレセプターを標的とするもの、ならびに、１以上のＨＥＲレセプターおよびさらなるレセプター（例えば、抗ＨＥＲ治療に対する耐性の発生に寄与または関与するＨＥＲレセプター）を標的とするものが挙げられる。特定の実施形態において、治療薬および候補治療薬は、抗ＨＥＲ治療薬の有効性に対する制約に関連する問題（限られた効能および耐性の発生）に対処するように設計される。
本明細書において、２つの細胞表面レセプターの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはその一部分の多量体が提供される。多量体の成分としては、第一のＥＣＤポリペプチドおよび第二のＥＣＤポリペプチドが挙げられ、ここで、第一および第二のポリペプチドは、別個に、直接的に、または、リンカーを介して間接的に多量体化ドメインへと連結される。本明細書において提供される多量体において、第一のキメラポリペプチドは、ＨＥＲ１の全長ＥＣＤであり得るか；または、第一のキメラポリペプチドは、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４のＥＣＤの全長より短い部分を含み得、ＥＣＤの全体または一部分がＨＥＲ２に由来する場合（この場合、ＨＥＲ２ ＥＣＤの二量体化を達成するためには、ドメインＩＶの少なくとも一部分（代表的には、ドメインＩＶのモジュール２〜５の十分な部分）が存在しなくてはならない）を除いて、ＥＣＤ部分は、少なくとも、ＨＥＲレセプターのリガンドに結合するために十分なサブドメインＩおよびＩＩＩの部分と、細胞表面レセプターと二量体化するために十分なＥＣＤの部分（サブドメインＩＩの十分な部分を含む）とを含む。ポリペプチドの第二の成分は、少なくとも、リガンドに結合するため、および／または、細胞表面レセプターと二量体化するために十分な細胞表面レセプター（ＣＳＲ）のＥＣＤの部分とを含む、第二のキメラポリペプチドである。第二のキメラポリペプチドのＣＳＲは、任意のＥＣＤもしくはこの一部分、または、ＣＳＲ（これが望ましい）であり得る。しかしながら、短縮型ＨＥＲ２が二量体化を達成するために十分なドメインＩＶの部分を含む限り、全長ＨＥＲ１は短縮型ＨＥＲ２と組み合され得るものの、第一のキメラポリペプチドが全長ＨＥＲ１ ＥＣＤである場合、第二のキメラポリペプチドは、全長ＨＥＲ２ではあり得ない。第一および第二のキメラＥＣＤポリペプチドは、その多量体化ドメインの相互作用により多量体を形成する。本明細書において提供される、結果として生じる多量体は、第一のキメラポリペプチドもしくはそのホモ二量体と比べて追加のリガンドに結合し、そして／または、第一のキメラポリペプチドもしくはそのホモ二量体よりも多くの細胞表面レセプターと二量体化する。
他の多量体において、少なくとも１つのＥＣＤドメインもしくはその一部分は、変異を含み、この変異は、このような変異のない形態と比べてリガンド結合または他の活性を変化させる。このような多量体において、第二のＥＣＤ部分は、同じＥＣＤドメイン、野生型もしくは変異形態、または、任意の他の細胞表面レセプターに由来するＥＣＤであり得る。上述のように、各単量体のＥＣＤもしくはその一部分は、多量体化ドメインに連結されるか、または、第二のＥＣＤもしくはその一部分へと、直接的に、または、リンカーを介して連結される。このような多量体の例は、サブドメインＩＩＩに変異を含む少なくとも１つのＨＥＲ１ ＥＣＤを含む多量体であり、この変異は、そのＥＧＦ以外のリガンドに対する親和性を増加させる。このような親和性の増加は、少なくとも１０倍、代表的には、１００倍、１０００倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍またはそれ以上である。
具体的には、そのリガンド結合親和性が変更された１つのＥＣＤもしくは複数のＥＣＤのような、改変されたＥＣＤを含む多量体もまた提供される。例えば、ＥＧＦにより活性化され、一般には、ＮＲＧ−２βにより刺激されないＥＧＦＲ１が、レセプターの二量体化／レセプターのシグナル伝達を促進するために、両方のリガンドがＥＧＦＲ ＥＣＤと相互作用するように改変されている（Ｇｉｌｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３９６：７９−８８を参照のこと；Ｇｉｌｍｏｒｅらは、ＮＲＧ２βが、野生型よりもＥＧＦＲ変異型に対してより強力な刺激剤となることを示している）。例示的な改変型ＥＧＦＲであるＥＧＦＲ−Ｓ４４２Ｆの配列は、配列番号４１４に示され、ここで、ＥＣＤは、アミノ酸２５から始まる。
ＥＣＤ（配列番号４１４の２５〜６４５；改変の位置は、最初の２５アミノ酸シグナル配列を含むＥＣＤの配列に対して遺伝子座４４２にあり、そして、成熟な形態を参照する場合、遺伝子座４１８にある）もしくはその一部分、または、少なくともＥＧＦＲ１およびＮＲＧ−２βに結合するために十分なドメインＩ〜ＩＩＩの部分（または、少なくとも、ＮＲＧ−２βへの結合に十分な改変されたドメインＩＩＩの部分）を含む、対立遺伝子改変体もしくは種改変体の対応する部分が、本明細書において提供される多量体、ならびに、本明細書において提供されるキメラおよび他の汎細胞表面治療薬において用いられ得る。本明細書において提供されるＥＣＤまたは当業者に公知のＥＣＤは、例示的な改変に対応する改変などにより、リガンド結合の特異性を変化させるように改変され得る。ＥＧＦＲ−Ｓ４４２Ｆに由来するＥＣＤ、ならびに種々のＥＣＤに対して特異的なリガンドと相互作用するように改変された他のＥＣＤは、特に、Ｆｃドメインのような多量体化ドメインに連結されたときに、汎細胞表面治療薬として用いられ得る。これらの改変されたＥＣＤは、本明細書中に記載されるあらゆる実施形態において用いられ得る。したがって、少なくとも２つのリガンド（各リガンドは、異なる野生型ＥＣＤと相互作用する）と相互作用するレセプターの改変されたＥＣＤのホモ多量体が本明細書において提供される。
本明細書において提供される多量体は、第一および第二のキメラポリペプチドの一方もしくは両方のＥＣＤが、少なくとも２つの異なる細胞表面レセプターＥＣＤに由来するサブドメインを含むハイブリッドＥＣＤであるものであり得る。また、本明細書には、第一のキメラポリペプチドが、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４のＥＣＤの全長より短い部分を含み得る多量体が含まれる。より頻繁には、第一のキメラポリペプチドは、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４の全長より短い部分を含む。
さらに、本明細書において提供される多量体中の第二のポリペプチドのＥＣＤ部分には、第二のポリペプチドのＥＣＤ部分がＨＥＲ１ではないが、別のＣＳＲのＥＣＤの全体もしくは一部分を含むものが含まれる。いくつかの場合において、他のＥＣＤ部分には、第二のキメラポリペプチドのＥＣＤドメインがＨＥＲ３またはＨＥＲ４に由来するものが含まれる。
また、本明細書において提供されるＥＣＤ多量体には、とりわけ、第二のキメラポリペプチドが、全長ＥＣＤであるＥＣＤポリペプチドを含むものが含まれる。あるいは、第二のキメラポリペプチドのＥＣＤドメインは短縮型であり、そして、少なくとも、そのリガンドに結合するため、および、細胞表面レセプターと二量体化するために十分なサブドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩの部分を含む。いくつかの場合、第二のキメラポリペプチドの短縮型ＥＣＤドメインは、リガンドに結合するために十分なドメインＩおよびＩＩＩの部分を含む。他の場合において、第二のキメラポリペプチドの短縮型ＥＣＤドメインは、細胞表面レセプターと二量体化するために十分なＥＣＤの部分を含む。
また、ＥＣＤもしくはこのようなＥＣＤを含む全長レセプターのリガンド結合または他の活性を、非改変ＥＣＤもしくは非改変ＥＣＤを含む全長レセプターと比べて変更するように改変されたＥＣＤドメインを含む多量体も含まれる。変更としては、リガンド結合の排除または追加が挙げられる。例えば、ＥＣＤは、非改変ＥＣＤと比べて追加されたリガンドに結合するように改変され得る。このような改変としては、改変Ｓ４４２（例えば、配列番号２）またはＨＥＲレセプターの対応する位置が挙げられ、この改変により、ＥＣＤは、ＮＲＧ−２βのようなＨＥＲ３に対するリガンドにも、ＥＧＦのようなＨＥＲ１に対するリガンドにも結合する。
これらの多量体は、ＨＥＲ１に由来するＥＣＤもしくはその一部分と、ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４に由来するＥＣＤもしくはその一部分とを含み得、それによって、結果として生じる多量体は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個または７個のＨＥＲレセプターと相互作用する。多量体の中には二量体が含まれる。多量体化ドメインとしては、Ｆｃドメインまたはその改変体のような、上記または下記に列挙される任意のものを含め、当業者に公知の任意のものが挙げられる。
本明細書において提供される多量体中の第一および第二のポリペプチドの多量体化ドメインとしては、とりわけ、免疫グロブリン定常ドメイン（Ｆｃ）、ロイシンジッパー、相補的疎水性領域、相補的親水性領域、適合性の（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、２分子間で分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオール、ならびに、安定な多量体を形成する、腔内の隆起部（ｐｒｏｔｕｒｂｅｒａｎｃｅ−ｉｎｔｏ−ｃａｖｉｔｙ）および同一もしくは類似の大きさの代償性の腔（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ ｃａｖｉｔｙ）に由来する任意の多量体化ドメインが挙げられる。いくつかの実施形態では、多量体化ドメインは、Ｆｃドメインまたは多量体化を達成するその改変体である。Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＥに由来するものを含めて、任意の免疫グロブリン分子に由来し得る。
代表的には、本明細書において提供される多量体について、細胞表面タンパク質の細胞表面レセプター（ＣＳＲ）（ここから、第二のキメラポリペプチドが由来するか、そして／または、多量体が二量体化する）は、多量体のＥＣＤまたはその一部分に対し同系のレセプターである。ＣＳＲの例としては、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＩＧＦ１−Ｒ、ＶＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＴＮＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＭＥＴ、Ｔｉｅ（すなわち、Ｔｉｅ−１またはＴＥＫ（Ｔｉｅ−２））、ＲＡＧＥ、ＥｐｈレセプターおよびＴ細胞レセプターが挙げられる。いくつかの実施形態では、第二のキメラポリペプチドのＥＣＤは、ＶＥＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４、ＩＧＦ１−ＲまたはＴｉｅ１に由来する。他の場合において、第二のキメラポリペプチドのＥＣＤまたはその一部分は、多量体化ドメインに対し直接的に、または、リンカーを介して間接的に連結されたイントロン融合タンパク質である。いくつかの場合において、イントロン融合タンパク質はハースタイン（ｈｅｒｓｔａｉｎ）である。他の局面では、本明細書において提供される多量体は、少なくとも７個の異なるリガンドに結合する。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される多量体の第二のキメラポリペプチドは、ＨＥＲ１のＥＣＤの全体でも一部分でもない、別のレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である。
このようなＥＣＤ多量体は、任意のＨＥＲ２リガンドである、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ＨＢ−ＥＧＦ、β−セルリン、エピレグリン、ならびに、ＨＥＲ１以外の細胞表面レセプターのＥＣＤに結合する任意のさらなるリガンドと相互作用し得る。例えば、さらなるリガンドとしては、ニューレグリン−１、ニューレグリン−２、ニューレグリン−３およびニューレグリン−４のいずれかのような、ニューレグリンが挙げられ得る。
いくつかの例において、本明細書において提供される多量体は、第一のキメラポリペプチドとして、ｉ）ＨＥＲ１レセプターに由来する全長ＥＣＤまたはｉｉ）リガンドへの結合および／もしくは二量体化に十分なこれらの部分のいずれかを含むものを、そして、第二のキメラポリペプチドとして、リガンドへの結合および／もしくは二量体化に十分な、ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４のＥＣＤの全体もしくは一部分を、含む。
本明細書において提供される任意の多量体は、多量体化ドメインに連結されたキメラポリペプチド成分を含み、ここで、この多量体化ドメインは、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、ロイシンジッパー、相補的疎水性領域、相補的親水性領域、適合性のタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、２分子間で分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオール、ならびに、安定な多量体を形成する、腔内の隆起部および同一もしくは類似の大きさの代償性の腔のうちのいずれかであり得る。このような多量体は、その多量体化ドメインの相互作用により、背中合わせ（ｂａｃｋ−ｔｏ−ｂａｃｋ）の立体配置で配置され、ここでは、両方のキメラポリペプチドのＥＣＤが、細胞表面レセプターとの二量体化に利用可能である。１つの例において、多量体化ドメインはＦｃドメインである。Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＥに由来するもののように、任意の免疫グロブリン分子に由来し得る。
本明細書において提供される多量体には、少なくとも２つのキメラポリペプチドを有するものが含まれる。１つの例において、多量体は、少なくとも２つのキメラポリペプチドを含み、ここで、第一のキメラポリペプチドは、ＨＥＲ１の全体もしくは一部分を含み、そして、第二のキメラポリペプチドは、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４の全体もしくは一部分を含む。
また、本明細書において提供される多量体には、構成要素であるキメラポリペプチドのうちの一方が、融合ポリペプチドであるものも含まれる。いくつかの実施形態では、第一のキメラポリペプチドおよび第二のキメラポリペプチドの両方が、融合ポリペプチドである。他の例において、構成要素であるキメラポリペプチドは、化学結合により形成される。１つの例において、第一のキメラポリペプチドおよび第二のキメラポリペプチドの両方が、化学結合により形成される。さらなる例において、少なくとも１つのキメラポリペプチドの多量体化ドメインは、ＥＣＤに対して直接的に連結される。あるいは、１つのキメラポリペプチドの多量体化ドメインは、リンカーを介してＥＣＤポリペプチドに連結される。このうちのいくつかの実施形態では、第一のキメラポリペプチドおよび第二のキメラポリペプチドの各々の多量体化ドメインは、リンカーを介して各々のＥＣＤに連結される。リンカーは、化学リンカーであってもポリペプチドリンカーであってもよい。
本明細書において提供される多量体は、ヘテロ二量体であり得る。ヘテロ二量体は、構成要素であるキメラポリペプチドが背中合わせの立体配置であり、その結果、各キメラポリペプチド中のＥＣＤが、細胞表面レセプターとの二量体化に利用可能であるようなものであり得る。
本明細書において、少なくとも１つのＥＣＤがＨＥＲ ＥＣＤであり、かつ、ＥＣＤのサブドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩおよびその一部（少なくともモジュール１を含む）を含むが、サブドメインＩＶの全体は含まないように、１つのＨＥＲレセプター（すなわち、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４）に由来する細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と、第二のレセプターに由来するＥＣＤとを含むヘテロ多量体が提供される。このようなヘテロ多量体において、第一のレセプターおよび第二のレセプターのＥＣＤは異なる。いくつかの場合において、第一のレセプターおよび第二のレセプターのＥＣＤは、両方ともＨＥＲ ＥＣＤである。したがって、本明細書において提供されるヘテロ多量体としては、一方のＨＥＲがＨＥＲ１であり、そして、もう一方のＨＥＲがＨＥＲ３またはＨＥＲ４であるものが挙げられる。他の場合において、第二のレセプターのＥＣＤは、細胞表面レセプターに由来するものである。ヘテロ多量体における第一または第二のレセプターのＥＣＤの二量体化アームが、細胞表面レセプターとの二量体化に利用可能である。
本明細書中に提供されるヘテロ多量体の中には、各ＥＣＤが多量体化ドメインに対し直接的にもしくはリンカーを介して連結され、その結果、少なくとも２つのＥＣＤの多量体化ドメインが相互作用してヘテロ多量体を形成するものが含まれる。ヘテロ多量体における各ＥＣＤの多量体化ドメインとしては、免疫グロブリン定常（Ｆｃ）ドメイン、ロイシンジッパー、相補的疎水性領域、相補的親水性領域、適合性のタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、２分子間で分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオール、ならびに、安定な多量体を形成する、腔内の隆起部および同一もしくは類似の大きさの代償性の腔のいずれかが挙げられる。いくつかの実施形態では、多量体化ドメインはＦｃドメインである。Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＥを含む、任意の免疫グロブリン分子に由来し得る。
本明細書において提供されるヘテロ多量体の第二のレセプターの細胞表面レセプター（ＣＳＲ）は、ヘテロ多量体の構成要素であるＥＣＤまたはその一部分に対して同系のレセプターである。ＣＳＲの例としては、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＩＧＦ１−Ｒ、ＶＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＴＮＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＭＥＴ、Ｔｉｅ（すなわち、Ｔｉｅ−１またはＴｉｅ−２（ＴＥＫ））、ＲＡＧＥおよびＥＰＨレセプター、または、Ｔ細胞レセプターが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＳＲは、ＶＥＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４、ＩＧＦ１−ＲまたはＴｉｅ−１のいずれかである。
また、ＥＣＤからのドメインまたはその一部分がそのドメイン中に変異を含むようなヘテロ多量体もまた企図され、このような変異は、リガンド結合もしくは特異性または他の活性を変化させる。この変異は、非改変型のＥＣＤまたは全長レセプターと比べて、ＥＣＤまたはこのようなＥＣＤを含む全長レセプターのリガンド結合または他の活性を変化させ、それにより、ヘテロ多量体は、変更されたリガンド結合または特異性を示す。このようなヘテロ多量体の例は、２つのリガンド（例えば、ＨＥＲ１リガンドおよびＨＥＲ３リガンド）に結合するように改変されたＨＥＲ１ ＥＣＤを含むものである。例えば、Ｓ４４２の例えばＦでの置き換え、または、ＨＥＲレセプターの対応する位置の置き換えによるＨＥＲ ＥＣＤの改変は、リガンド結合を変化させる。このような改変は、ＮＲＧ−２βと相互作用するＨＥＲ１ ＥＣＤをもたらす。このようなヘテロ多量体は、ＨＥＲ１に由来するＥＣＤもしくはその一部分と、ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４に由来するＥＣＤもしくはその一部分とを含み得、それによって、結果として生じるＥＣＤは、少なくとも２以上（例えば、３、４、５、６および７）のＨＥＲレセプターに対するリガンドと相互作用し得る。
各々が１以上のＣＳＲのＥＣＤの少なくともドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩの全体もしくは一部分を含み、その結果、これらのドメインのうち少なくとも２つが、異なる細胞表面レセプターのＥＣＤに由来し、そして、このハイブリッドＥＣＤが、多量体化ドメインに連結されたときに、細胞表面レセプターと二量体化するのに十分な細胞表面レセプターのＥＣＤの部分（ドメインＩＩの十分な部分を含む）、および／または、そのＥＣＤドメインもしくはその部分が由来するＥＣＤに対するリガンドと相互作用するのに十分なリガンド結合ドメインの部分を含む、ハイブリッドＥＣＤが本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、細胞表面レセプターは、ＨＥＲファミリーのメンバーである。したがって、例えば、ドメインＩがＨＥＲ１に由来し、ドメインＩＩがＨＥＲ２に由来し、そして、ドメインＩＩＩがＨＥＲ３に由来する。別の実施形態では、ドメインＩおよびＩＩＩが、ドメインＩＩＩに変異を含むＥＣＤに由来し、この変異は、ドメインＩＩＩが、ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４に対するリガンドに結合することを可能にするものである。
ハイブリッドＥＣＤとしては、例えば、サブドメイン内に変異を含むＥＣＤに由来するサブドメインもしくはその一部分を含むものが挙げられ、この変異は、リガンド結合もしくは特異性を変化させる。このような変異の例は、上記および下記のようなものであり、例えば、ＨＥＲ１の改変では、この改変により、改変されたＨＥＲ１が、ＥＧＦおよびＮＲＧ−２βのような２以上のリガンドと相互作用する。
また、多量体化ドメインに対し直接的に、またはリンカーを介して連結された、本明細書において提供されるハイブリッドＥＣＤのキメラポリペプチドも、本明細書において提供される。多量体化ドメインとしては、免疫グロブリン定常（Ｆｃ）ドメイン、ロイシンジッパー、相補的疎水性領域、相補的親水性領域、適合性のタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、２分子間で分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオール、ならびに、安定な多量体を形成する、腔内の隆起部および同一もしくは類似の大きさの代償性の腔のいずれかが挙げられる。いくつかの場合、多量体化ドメインはＦｃドメインである。Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＥに由来するものを含め、任意の免疫グロブリン分子に由来し得る。本明細書において提供される少なくとも２つのキメラハイブリッドＥＣＤポリペプチド間で形成された多量体が、本明細書において提供される。
ヘテロ多量体がＨＥＲ１、ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４のＥＣＤの短縮型部分を含む場合に、これらの部分が、少なくともサブドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩを含むように、ＨＥＲ１に由来するＥＣＤの全体もしくは一部分と、ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４に由来するＥＣＤの全体もしくは一部分とを含むヘテロ多量体が本明細書において提供される。
多量体化ドメインに連結された、リガンド結合および／もしくは二量体化に十分なＥＣＤもしくはその一部分を含むキメラポリペプチドが本明細書において提供される。本明細書において提供されるキメラポリペプチドのＥＣＤもしくはその一部分は、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４のＥＣＤのいずれか、またはその改変された形態に由来し得る。このようなものの例は以下である：ＨＥＲ２−５３０（配列番号１４）、ＨＥＲ２−５９５（配列番号１６）、ＨＥＲ２−６５０（配列番号１８）、Ｈｅｒ３−５００（配列番号２０）、ｐ８５Ｈｅｒ３（配列番号２２）、ＨＥＲ３−５１９（配列番号２４）、ＨＥＲ３−６２１（配列番号２６）、ＨＥＲ４−４８５（配列番号２８）、ＨＥＲ４−５２２（配列番号３０）、ＨＥＲ４−６５０（配列番号３２）、配列番号３２、３４、１２７、１４１、１４６、１５９おおよび５４〜１２５のいずれかに示されるポリペプチド、ならびに、上述のＥＣＤのいずれかの対立遺伝子改変体および種改変体とその改変された形態（このような形態は、活性を変化させるように改変されている）（例えば、配列番号４１４の残基４４２Ｆを含む残基２５〜６４５またはその一部分（配列番号４１４は、改変されたＨＥＲ１の配列（ＥＧＦＲ１）を示し、ここで、４４２におけるＳがＦで置き換えられ、ＮＲＧ２βとＥＧＦに結合するＥＣＤをもたらす）を参照のこと）。また、以下のうちのいずれかに由来する２以上のキメラポリペプチドを含むヘテロ多量体も提供される：ＨＥＲ１−５０１（配列番号１０）、ＨＥＲ１−６２１（配列番号１２）、ＨＥＲ１ Ｓ４４２Ｆ（配列番号４１４の残基２５〜６４５）、または、リガンド結合（Ｓ４４２Ｆ変異を含むＨＥＲ１ Ｓ４４２Ｆについて）および／もしくはレセプター二量体化に十分な前記ＨＥＲ１ポリペプチドのいずれかの一部分、ＨＥＲ２−５３０（配列番号１４）、ＨＥＲ２−５９５（配列番号１６）、ＨＥＲ２−６５０（配列番号１８）、Ｈｅｒ３−５００（配列番号２０）、ｐ８５Ｈｅｒ３（配列番号２２）、ＨＥＲ３−５１９（配列番号２４）、ＨＥＲ３−６２１（配列番号２６）、ＨＥＲ４−４８５（配列番号２８）、ＨＥＲ４−５２２（配列番号３０）、ＨＥＲ４−６５０（配列番号３２）、配列番号３２、３４、１２７、１４１、１４６、１５９および５４〜１２５のいずれかに示されるポリペプチド、ならびに、前記ポリペプチドのいずれかの対立遺伝子改変体もしくは種改変体。このヘテロ多量体におけるＥＣＤまたはその一部分は、多量体化ドメインに対して、直接的にまたはリンカーを介して間接的に連結される。
上に列挙したいずれかのような多量体化ドメインに対して連結されたＨＥＲ１レセプターのＥＣＤまたはその一部分を含むキメラポリペプチドが提供され、ここで、ＥＣＤもしくはその一部分は改変を含み、それによって、このＥＣＤが、非改変型のＥＣＤもしくはその一部分と比べて、追加のリガンドに結合する。このようなポリペプチドの例は、多量体化ドメインに対して連結された、配列番号４１４の残基２５〜６４５に由来するアミノ酸の連続した配列の全体もしくは一部分、または、これに対して少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％の配列同一性を有し、かつ、配列番号４１４の４４２に対応する位置にリガンド結合を変化させる変異（例えば、ＳｅｒからＰｈｅへの変異）を含むキメラポリペプチドである。リガンド結合における変化は、ＨＥＲ１のＥＣＤがまた、ＨＥＲ３リガンド（例えば、ＮＲＧ−２β）にも結合するような改変を含む。例えば、キメラポリペプチドは、多量体化ドメインと、ＥＧＦおよびＮＲＧ−２βとの相互作用に十分な、改変型ＨＥＲ１のＥＣＤの部分とを含む。
多量体およびヘテロ多量体におけるキメラポリペプチドには、配列番号４１４のアミノ酸２５〜６４５として示されるポリペプチド、または、少なくとも２つの異なるリガンドに対するリガンド結合を達成するのに十分なその部分に対して、直接的またはリンカーを介して間接的に連結された多量体化ドメインを含むキメラポリペプチドが含まれる。これらのキメラポリペプチドもまた提供される。
いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの多量体化ドメインまたはヘテロ多量体の多量体化ドメインは、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、ロイシンジッパー、相補的疎水性領域、相補的親水性領域、適合性のタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、２分子間で分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオール、ならびに、安定な多量体を形成する、腔内の隆起部および同一もしくは類似の大きさの代償性の腔のいずれかであり得、その結果、ヘテロ多量体におけるキメラポリペプチドは、背中合わせの立体配置で相互作用し、ここで、両方のキメラポリペプチドのＥＣＤは、細胞表面レセプターとの二量体化に利用可能である。いくつかの場合、多量体化ドメインはＦｃドメインである。Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＥを含む、任意の免疫グロブリン分子に由来し得る。
また、配列番号１２７、１４１、１４６、１５３、１５５、１５７、１５９、２９７または２９９のいずれかに示されるアミノ残基の配列を含む単離されたポリペプチドも、本明細書において提供される。このような単離されたポリペプチドは、キメラポリペプチドを提供するために、多量体化ドメインに対して連結され得る。また、配列番号１２７、１４１、１４６、１５３、１５５、１５７、１５９、２９７または２９９のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するキメラポリペプチドと、多量体化ドメインについての配列とを含むヘテロ多量体も提供される。このヘテロ多量体は、第二のポリペプチドとして、ＨＥＲ ＥＣＤ、または、リガンド結合および／もしくはレセプター二量体化に十分なその部分を含み得る。
本明細書において提供されるキメラポリペプチド、または、本明細書において提供される多量体もしくはヘテロ多量体における少なくとも１つのキメラポリペプチド（本明細書において提供されるハイブリッドＥＣＤを含む）をコードする核酸分子が本明細書において提供される。核酸分子を含むベクターが、本明細書において提供される。また、本明細書において記載されるベクターを含む細胞も提供される。
本明細書において提供される多量体、ヘテロ多量体、もしくはキメラポリペプチド、または、コードする核酸分子を含む薬学的組成物が本明細書において提供される。また、本明細書において提供される核酸または本明細書において提供されるベクターを含む単離細胞を含む薬学的組成物も提供される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、単回投薬の投与（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓａｇｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）のために処方される。いくつかの場合、薬学的組成物はまた、局部（ｌｏｃａｌ）投与、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）投与または全身投与のために処方され得る。
本明細書において記載される任意の薬学的組成物を投与することによって疾患もしくは状態を処置する方法が、本明細書において提供される。処置される疾患もしくは状態としては、癌、炎症性疾患、新脈管形成疾患または過増殖性疾患が挙げられる。癌の例としては、膵臓癌、胃癌、頭頚部癌、子宮頸部癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、前立腺癌、食道癌、卵巣癌、子宮癌、神経膠腫、膀胱癌、腎臓癌または乳癌が挙げられる。処置される疾患には、増殖性疾患が含まれる。増殖性疾患の例としては、平滑筋細胞の増殖および／もしくは遊走を伴うもの、または、前眼部の疾患、糖尿病性網膜症または乾癬が挙げられる。他の処置される例示的な疾患としては、再狭窄、眼障害、狭窄、アテローム性動脈硬化症、血管肥厚による高血圧、膀胱疾患および閉塞性気道疾患が挙げられる。他の例示的な疾患としては、１以上のニューレグリン（「ＮＲＧ」）（例えば、ＮＲＧ１（タイプＩ、ＩＩおよびＩＩＩを含む）、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３および／またはＮＲＧ４）に対する曝露に関連する（例えば、ＮＲＧによって引き起こされるか、または、ＮＲＧによって悪化される）疾患または状態が挙げられる。ＮＲＧに関連する疾患の例としては、神経性疾患もしくは神経筋肉性疾患（精神分裂病およびアルツハイマー病を含む）が挙げられる。
本明細書において提供される任意の薬学的組成物を別の抗癌剤と組合せて投与することによって癌を処置する方法が、本明細書において提供される。抗癌剤としては、放射線療法および／または化学療法剤が挙げられる。一例において、抗癌剤としては、チロシンキナーゼインヒビターまたは抗体が挙げられる。抗癌剤の例としては、キナゾリンキナーゼインヒビター、アンチセンス分子またはｓｉＲＮＡ分子または他の二本鎖ＲＮＡ分子、ＨＥＲレセプターと相互作用する抗体、および、放射性核種もしくは細胞毒に結合された抗体が挙げられる。他の例示的な抗癌剤としては、Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、Ｔｙｋｅｒｂ、Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ、Ｅｒｏｌｔｉｎｉｂ、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、Ｔｒａｓｔｕｚｉｍａｂ、Ｉｍａｔｉｎｉｂ、白金錯体またはヌクレオシドアナログが挙げられる。
ＥＲレセプター媒介性の疾患の処置方法が本明細書において提供され、この方法は、この疾患を持つ被験体を検査して、どのＨＥＲレセプターが発現されているか、もしくは、過剰発現されているかを同定する工程と、この結果に基づいて、少なくとも１つ（代表的には、２つ）のＨＥＲレセプターを標的とする多量体を選択する工程とを包含する。一実施形態では、疾患は癌である。癌の例としては、膵臓癌、胃癌、頭頚部癌、子宮頸部癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、前立腺癌、食道癌、卵巣癌、子宮癌、神経膠腫、膀胱癌、腎臓癌または乳癌が挙げられる。
配列番号５４〜１２５または４０５のいずれか１つに示されるアミノ酸の配列を有するポリペプチドが本明細書において提供される。
最初に、試験分子またはその集合を、ドメインＩＩおよびＩＶ、またはドメインＩおよびＩＩＩにおける、二量体化、リガンド結合および／もしくは係留のいずれかに関与する領域に基づいた少なくとも６アミノ酸、または、６アミノ酸〜約５０アミノ酸、または、５０アミノ酸のポリペプチドと接触させ、次いで、１以上のポリペプチドと相互作用する任意の試験分子を同定および選択することによって、ＨＥＲレセプターと相互作用する候補治療分子を同定する方法が本明細書において提供される。一実施形態では、ポリペプチドは、ライブラリー（ＨＥＲレセプターに基づくポリペプチドのコンビナトリアルライブラリーである）内に含まれる。試験分子が接触され得るポリペプチドの例としては、配列番号５４〜１２５のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有する任意のもの、および、配列番号４０５の４、５、６、８、１０、１２もしくはそれより多くのアミノ酸残基を有する任意のポリペプチドの部分、ならびに、その６、８、１０、１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０、またはそれより多くのアミノ酸残基を有する部分が挙げられる。分子のライブラリーは、特に、固体支持体またはウイルスの表面上にあるポリペプチドを含むものである。一例では、ポリペプチドは、ファージディスプレイライブラリー内に含まれる。
一実施形態では、試験分子は分子のライブラリーを含む。したがって、一例では、試験分子は、ファージディスプレイライブラリーにおける分子を含む。別の実施形態では、分子は、小さな有機化合物またはポリペプチドである。
本明細書において提供される方法において、ドメインＩおよび／もしくはＩＩＩ、または、ドメインＩＩ、またはドメインＩＶに結合する試験分子が選択される。この方法の一局面では、２以上のポリペプチドのヘテロ二量体である同定された試験分子が作製され、ここで、ヘテロ二量体のペプチドのうちの一方はドメインＩＩに結合し、そして、もう一方は、ドメインＩＶに結合する。
配列番号５４〜１２５または４０５のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有する任意のポリペプチドと相互作用する単離された抗体が、本明細書において提供される。一実施形態では、抗体は、本明細書において提供される２以上のポリペプチドと相互作用するマルチクローナル抗体である。いくつかの例では、抗体は、各々が多量体化ドメインに連結された少なくとも２つの異なるポリペプチドを含む、レセプター本体の（ｒｅｃｅｐｔａｂｏｄｙ）二量体もしくは多量体である。多量体化ドメインは、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、ロイシンジッパー、相補的疎水性領域、相補的親水性領域、適合性のタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、２分子間で分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオール、ならびに安定な多量体を形成する、腔内の隆起部および同一もしくは類似の大きさの代償性の腔のいずれかである。一例では、多量体化ドメインはＦｃドメインである。Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＥに由来するもののように、任意の免疫グロブリン分子に由来し得る。
ヘテロ多量体は、特に、ＥＣＤのサブドメインもしくはその一部分が、ドメイン内に、リガンド結合もしくは特異性もしくは他の活性を変化させる変異を含むものである。例えば、変異は、ＥＣＤまたはこのようなＥＣＤを含む全長レセプターのリガンド結合または他の活性を、非改変型のＥＣＤもしくは全長レセプターと比べて変化させ、それによって、ヘテロ多量体は、変化されたリガンド結合もしくは特異性を示す。このような改変としては、追加のリガンドへの結合のような活性（例えば、ＨＥＲ１のＥＣＤのＨＥＲ３に対するリガンド（例えば、ＮＲＧ−２βリガンド）との相互作用）を排除するか、追加するか、または、向上させる、任意のものが挙げられる。このような改変の例は、ＨＥＲ１の位置Ｓ４４２における改変（例えば、Ｓ４４２Ｆ）またはＨＥＲレセプターの対応する位置における改変に対応する改変である。結果として生じるＥＣＤは、少なくとも２つのリガンド（ＨＥＲ１に対するものリガンド（例えば、リガンドＥＧＦ）と、ＨＥＲ３に対する第二のリガンド（例えば、ＮＲＧ−２β））に結合するか、または、これと相互作用する。
これらのヘテロ多量体は、ＨＥＲ１に由来するＥＣＤもしくはその一部分と、ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４に由来するＥＣＤもしくはその一部分とを含み得、それによって、結果として生じるハイブリッドは、少なくとも３つのＨＥＲレセプターに対するリガンドと相互作用し得る。これらのヘテロ多量体は、本明細書に記載されるか、または、当業者に公知である任意のもの（例えば、Ｆｃ多量体化ドメインもしくはその改変体（すなわち、そのＴ細胞相互作用が変化された改変体））のような多量体化ドメインを含み得る。
本発明はまた、ヘテロ多量体とホモ多量体との混合物を含む組成物を提供し、ここで、ヘテロ多量体は、ＨＥｒ１に由来するＥＣＤもしくはその一部分と、ＨＥＲ３に由来する別のＥＣＤもしくはその一部分とを含み、そして、ホモ多量体は、ＨＥＲ１に由来するＥＣＤもしくはその一部分、または、ＨＥＲ３に由来するＥＣＤもしくはその一部分を含む。いくつかの局面では、ＨＥＲ１部分は、リガンド結合および／または生物学的活性について向上されている。他の局面では、ＨＥＲ３部分は、リガンド結合および／または生物学的活性について向上されている。なお別の局面では、ＨＥＲ１部分およびＨＥＲ３部分の両方が、リガンド結合および／または生物学的について向上されている。
本発明はまた、局所投与、経口投与、全身投与または局部投与のために処方された上記組成物を含む薬学的組成物を提供する。
別の局面では、本発明は、癌、炎症性疾患、新脈管形成疾患または過増殖性疾患を処置するための方法を提供し、この方法は、上に列挙した組成物の治療上有効な量を投与する工程を包含する。いくつかの局面では、癌は、膵臓癌、胃癌、頭頚部癌、子宮頸部癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、前立腺癌、食道癌、卵巣癌、子宮癌、神経膠腫、膀胱癌、腎臓癌または乳癌である。他の局面では、疾患は、増殖性疾患である。他の局面では、増殖性疾患は、平滑筋細胞の増殖および／もしくは遊走を伴うものであるか、または、前眼部の疾患であるか、または、糖尿病性網膜症もしくは乾癬である。他の局面では、疾患は、再狭窄、眼障害、狭窄、アテローム性動脈硬化症、血管肥厚による高血圧、膀胱疾患および閉塞性気道疾患である。
相互作用は動的であるので、示されるアミノ酸位置は参照および例示のためのものである。示される位置は、２、３、４、５もしくはそれより多くのアミノ酸が変化する遺伝子座の範囲を反映する。この変化はまた、対立遺伝子改変体および種改変体の中に存在する。当業者は、容易に利用可能なアルゴリズムおよびソフトウェアを含む、視覚的な比較または他の比較によって、対応する配列を同定し得る。
図１（ａ）は、ヒトＥＧＦレセプター１（ＨＥＲ１；ＥｒｂＢ１；ＥＧＦＲ）の概略を示し、そして、ＨＥＲ１に関する種々の特徴についての遺伝子座を示すが、このような構造はまた、他のファミリメンバー（すなわち、ＨＥＲ２、３、４）の間で保存されている。ＨＥＲ（ＥｒｂＢ）ファミリーメンバーのＥＣＤは、ドメインＩ（Ｌ１）、ＩＩ（Ｓ１）、ＩＩＩ（Ｌ２）およびＩＶ（Ｓ２）と指定される４つのサブドメインを含む。サブドメインＩおよびＩＩＩはリガンド結合のために協働し；ドメインＩＩは、二量体化に必要な配列（「二量体化アーム」）を含み；そして、ドメインＩＶは、ドメインＩＩ／ＩＶの係留を可能にする配列を含む（係留された立体配置をとらないＨＥＲ２は除く）。ドメインＩＩおよびＩＶ内のジスルフィド結合した小さなモジュールは、個別の四角で表される。ドメインＩＩ内に、β−ヘアピン／ループ（二量体化アームとも呼ばれる）（全長の成熟ＨＥＲ１のアミノ酸２４０〜２６０に対応）が示される。ドメインＩＶ内に、係留を容易にするより短いβ−ヘアピン／ループ（全長の成熟ＨＥＲ１のアミノ酸５６１〜５６９およびアミノ酸５７２〜５８５に対応）が示される。レセプターの二量体化および／または係留に関与するループ領域内のいくつかのアミノ酸残基が特定される。ＨＥＲ全長レセプターはまた、膜貫通ドメイン（影をつけた領域）、膜近傍（ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ）（ＪＭ）ドメイン、キナーゼドメインおよび細胞質テイル（ＣＴ）を含む。 図１（ｂ）は、リガンド誘導性のＨＥＲの二量体化の機構を示す。ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶが示される。ＨＥＲレセプターの多く（約９５％）は、係留された立体配置で存在し、ここで、ドメインＩＩとドメインＩＶとが、分子内相互作用を形成する。細胞表面上の単量体性レセプターの残り５％は、非係留型、すなわち開いた立体配置である。リガンド（Ｅ）は、ＨＥＲファミリーレセプターのドメインＩおよび／またはドメインＩＩＩに結合する。リガンド結合は、ドメインＩＩの二量体化アームが露出される、非係留型の立体配置を安定化させる。ドメインＩＩの二量体化アームは、別のＨＥＲファミリーレセプターのドメインＩＩ内の領域と相互作用して、ホモ二量体およびヘテロ二量体をもたらす。ＨＥＲレセプターのリガンド結合および二量体化は、内在性のキナーゼドメインの活性化を誘導し、細胞質テイル内の特定のチロシン残基におけるリン酸化と、その後の、下流のシグナル伝達とをもたらす。 図２（ａ）は、全長ＥＧＦＲ（ＮＰ＿００５２１９、配列番号２のアミノ酸２５〜１２１０に対応）の成熟形態（シグナルペプチドを欠く）と比較した、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）ＥＣＤアイソフォームのアラインメントとドメイン構成とを示す。整列させたＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）ＥＣＤアイソフォーム（シグナルペプチドを欠く）は、ＨＦ１００（配列番号１２）、ＨＦ１１０（配列番号１０）、ＨＦ１２０（ＥＲＲＰ、配列番号３４）、ＨＥ Ｒ１（ＥＧＦＲ）アイソフォームｂ（ＮＰ＿９５８４３９、配列番号１２のアミノ酸２５〜６２８に対応）、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）アイソフォームｃ（ＮＰ＿９５８４４０、配列番号１３３のアミノ酸２５〜４０５に対応）、およびＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）アイソフォームｄ（ＮＰ＿９５８４４１、配列番号１３１のアミノ酸２５〜７０５に対応）を含む。ドメインＩ（全長の成熟ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）のアミノ酸１〜１６５に対応）およびドメインＩＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）のアミノ酸３１３〜４８１に対応）は、太字で示される。ドメインＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）のアミノ酸１６６〜３１２に対応）およびドメインＩＶ（全長の成熟ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）のアミノ酸４８２〜６２１に対応）は、通常のフォントで示され、システインモジュールが強調される。全長の成熟ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）の非ＥＣＤ部分は、薄いグレーで示される。成熟な全長ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）におけるアミノ酸配列とアラインメントを示さないアミノ酸は、斜体で示す。 図２（ａ）は、全長ＥＧＦＲ（ＮＰ＿００５２１９、配列番号２のアミノ酸２５〜１２１０に対応）の成熟形態（シグナルペプチドを欠く）と比較した、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）ＥＣＤアイソフォームのアラインメントとドメイン構成とを示す。整列させたＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）ＥＣＤアイソフォーム（シグナルペプチドを欠く）は、ＨＦ１００（配列番号１２）、ＨＦ１１０（配列番号１０）、ＨＦ１２０（ＥＲＲＰ、配列番号３４）、ＨＥ Ｒ１（ＥＧＦＲ）アイソフォームｂ（ＮＰ＿９５８４３９、配列番号１２のアミノ酸２５〜６２８に対応）、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）アイソフォームｃ（ＮＰ＿９５８４４０、配列番号１３３のアミノ酸２５〜４０５に対応）、およびＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）アイソフォームｄ（ＮＰ＿９５８４４１、配列番号１３１のアミノ酸２５〜７０５に対応）を含む。ドメインＩ（全長の成熟ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）のアミノ酸１〜１６５に対応）およびドメインＩＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）のアミノ酸３１３〜４８１に対応）は、太字で示される。ドメインＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）のアミノ酸１６６〜３１２に対応）およびドメインＩＶ（全長の成熟ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）のアミノ酸４８２〜６２１に対応）は、通常のフォントで示され、システインモジュールが強調される。全長の成熟ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）の非ＥＣＤ部分は、薄いグレーで示される。成熟な全長ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）におけるアミノ酸配列とアラインメントを示さないアミノ酸は、斜体で示す。 図２（ａ）は、全長ＥＧＦＲ（ＮＰ＿００５２１９、配列番号２のアミノ酸２５〜１２１０に対応）の成熟形態（シグナルペプチドを欠く）と比較した、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）ＥＣＤアイソフォームのアラインメントとドメイン構成とを示す。整列させたＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）ＥＣＤアイソフォーム（シグナルペプチドを欠く）は、ＨＦ１００（配列番号１２）、ＨＦ１１０（配列番号１０）、ＨＦ１２０（ＥＲＲＰ、配列番号３４）、ＨＥ Ｒ１（ＥＧＦＲ）アイソフォームｂ（ＮＰ＿９５８４３９、配列番号１２のアミノ酸２５〜６２８に対応）、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）アイソフォームｃ（ＮＰ＿９５８４４０、配列番号１３３のアミノ酸２５〜４０５に対応）、およびＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）アイソフォームｄ（ＮＰ＿９５８４４１、配列番号１３１のアミノ酸２５〜７０５に対応）を含む。ドメインＩ（全長の成熟ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）のアミノ酸１〜１６５に対応）およびドメインＩＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）のアミノ酸３１３〜４８１に対応）は、太字で示される。ドメインＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）のアミノ酸１６６〜３１２に対応）およびドメインＩＶ（全長の成熟ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）のアミノ酸４８２〜６２１に対応）は、通常のフォントで示され、システインモジュールが強調される。全長の成熟ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）の非ＥＣＤ部分は、薄いグレーで示される。成熟な全長ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）におけるアミノ酸配列とアラインメントを示さないアミノ酸は、斜体で示す。 図２（ａ）は、全長ＥＧＦＲ（ＮＰ＿００５２１９、配列番号２のアミノ酸２５〜１２１０に対応）の成熟形態（シグナルペプチドを欠く）と比較した、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）ＥＣＤアイソフォームのアラインメントとドメイン構成とを示す。整列させたＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）ＥＣＤアイソフォーム（シグナルペプチドを欠く）は、ＨＦ１００（配列番号１２）、ＨＦ１１０（配列番号１０）、ＨＦ１２０（ＥＲＲＰ、配列番号３４）、ＨＥ Ｒ１（ＥＧＦＲ）アイソフォームｂ（ＮＰ＿９５８４３９、配列番号１２のアミノ酸２５〜６２８に対応）、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）アイソフォームｃ（ＮＰ＿９５８４４０、配列番号１３３のアミノ酸２５〜４０５に対応）、およびＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）アイソフォームｄ（ＮＰ＿９５８４４１、配列番号１３１のアミノ酸２５〜７０５に対応）を含む。ドメインＩ（全長の成熟ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）のアミノ酸１〜１６５に対応）およびドメインＩＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）のアミノ酸３１３〜４８１に対応）は、太字で示される。ドメインＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）のアミノ酸１６６〜３１２に対応）およびドメインＩＶ（全長の成熟ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）のアミノ酸４８２〜６２１に対応）は、通常のフォントで示され、システインモジュールが強調される。全長の成熟ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）の非ＥＣＤ部分は、薄いグレーで示される。成熟な全長ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）におけるアミノ酸配列とアラインメントを示さないアミノ酸は、斜体で示す。 図２（ｂ）は、全長ＨＥＲ２（ＡＡＡ７５４９３．１、配列番号４のアミノ酸２３〜１２５５に対応）の成熟形態（シグナルペプチドを欠く）と比較した、ＨＥＲ２ ＥＣＤアイソフォームのアラインメントとドメイン構成とを示す。整列させたＨＥＲ２ ＥＣＤアイソフォーム（シグナルペプチドを欠く）は、ＨＦ２００（配列番号１８）、ＥｒｂＢ２．１ｅ（配列番号１３７のアミノ酸２３〜６３３に対応）、ＨＦ２１０（配列番号１６）、ＨＦ２２０（配列番号１４）、ＥｒｂＢ２．１ｄ（配列番号１３６のアミノ酸２５〜６８０に対応）、ＥｒｂＢ２．１ｆ（配列番号１３８のアミノ酸２３〜５７５に対応）、ＨＥＲ２−ｉｎｔ１１（配列番号１４１のアミノ酸２３〜４３８に対応）、ハースタチン（ｈｅｒｓｔａｔｉｎ）（ＡＡＤ５６００９、配列番号１３５のアミノ酸２３〜４１９に対応）およびＥｒｂＢ２．ａ（配列番号１３９のアミノ酸２３〜９０に対応）を含む。ドメインＩ（全長の成熟ＨＥＲ２のアミノ酸１〜１７２に対応）およびドメインＩＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ２のアミノ酸３２０〜４８８に対応）は、太字で示される。ドメインＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ２のアミノ酸１７３〜３１９に対応）およびドメインＩＶ（全長の成熟ＨＥＲ２のアミノ酸４８９〜６２８に対応）は、通常のフォントで示され、システインモジュールが強調される。全長の成熟ＨＥＲ２の非ＥＣＤ部分は、薄いグレーで示される。成熟な全長ＨＥＲ２におけるアミノ酸配列とアラインメントを示さないアミノ酸は、斜体で示す。 図２（ｂ）は、全長ＨＥＲ２（ＡＡＡ７５４９３．１、配列番号４のアミノ酸２３〜１２５５に対応）の成熟形態（シグナルペプチドを欠く）と比較した、ＨＥＲ２ ＥＣＤアイソフォームのアラインメントとドメイン構成とを示す。整列させたＨＥＲ２ ＥＣＤアイソフォーム（シグナルペプチドを欠く）は、ＨＦ２００（配列番号１８）、ＥｒｂＢ２．１ｅ（配列番号１３７のアミノ酸２３〜６３３に対応）、ＨＦ２１０（配列番号１６）、ＨＦ２２０（配列番号１４）、ＥｒｂＢ２．１ｄ（配列番号１３６のアミノ酸２５〜６８０に対応）、ＥｒｂＢ２．１ｆ（配列番号１３８のアミノ酸２３〜５７５に対応）、ＨＥＲ２−ｉｎｔ１１（配列番号１４１のアミノ酸２３〜４３８に対応）、ハースタチン（ｈｅｒｓｔａｔｉｎ）（ＡＡＤ５６００９、配列番号１３５のアミノ酸２３〜４１９に対応）およびＥｒｂＢ２．ａ（配列番号１３９のアミノ酸２３〜９０に対応）を含む。ドメインＩ（全長の成熟ＨＥＲ２のアミノ酸１〜１７２に対応）およびドメインＩＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ２のアミノ酸３２０〜４８８に対応）は、太字で示される。ドメインＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ２のアミノ酸１７３〜３１９に対応）およびドメインＩＶ（全長の成熟ＨＥＲ２のアミノ酸４８９〜６２８に対応）は、通常のフォントで示され、システインモジュールが強調される。全長の成熟ＨＥＲ２の非ＥＣＤ部分は、薄いグレーで示される。成熟な全長ＨＥＲ２におけるアミノ酸配列とアラインメントを示さないアミノ酸は、斜体で示す。 図２（ｂ）は、全長ＨＥＲ２（ＡＡＡ７５４９３．１、配列番号４のアミノ酸２３〜１２５５に対応）の成熟形態（シグナルペプチドを欠く）と比較した、ＨＥＲ２ ＥＣＤアイソフォームのアラインメントとドメイン構成とを示す。整列させたＨＥＲ２ ＥＣＤアイソフォーム（シグナルペプチドを欠く）は、ＨＦ２００（配列番号１８）、ＥｒｂＢ２．１ｅ（配列番号１３７のアミノ酸２３〜６３３に対応）、ＨＦ２１０（配列番号１６）、ＨＦ２２０（配列番号１４）、ＥｒｂＢ２．１ｄ（配列番号１３６のアミノ酸２５〜６８０に対応）、ＥｒｂＢ２．１ｆ（配列番号１３８のアミノ酸２３〜５７５に対応）、ＨＥＲ２−ｉｎｔ１１（配列番号１４１のアミノ酸２３〜４３８に対応）、ハースタチン（ｈｅｒｓｔａｔｉｎ）（ＡＡＤ５６００９、配列番号１３５のアミノ酸２３〜４１９に対応）およびＥｒｂＢ２．ａ（配列番号１３９のアミノ酸２３〜９０に対応）を含む。ドメインＩ（全長の成熟ＨＥＲ２のアミノ酸１〜１７２に対応）およびドメインＩＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ２のアミノ酸３２０〜４８８に対応）は、太字で示される。ドメインＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ２のアミノ酸１７３〜３１９に対応）およびドメインＩＶ（全長の成熟ＨＥＲ２のアミノ酸４８９〜６２８に対応）は、通常のフォントで示され、システインモジュールが強調される。全長の成熟ＨＥＲ２の非ＥＣＤ部分は、薄いグレーで示される。成熟な全長ＨＥＲ２におけるアミノ酸配列とアラインメントを示さないアミノ酸は、斜体で示す。 図２（ｂ）は、全長ＨＥＲ２（ＡＡＡ７５４９３．１、配列番号４のアミノ酸２３〜１２５５に対応）の成熟形態（シグナルペプチドを欠く）と比較した、ＨＥＲ２ ＥＣＤアイソフォームのアラインメントとドメイン構成とを示す。整列させたＨＥＲ２ ＥＣＤアイソフォーム（シグナルペプチドを欠く）は、ＨＦ２００（配列番号１８）、ＥｒｂＢ２．１ｅ（配列番号１３７のアミノ酸２３〜６３３に対応）、ＨＦ２１０（配列番号１６）、ＨＦ２２０（配列番号１４）、ＥｒｂＢ２．１ｄ（配列番号１３６のアミノ酸２５〜６８０に対応）、ＥｒｂＢ２．１ｆ（配列番号１３８のアミノ酸２３〜５７５に対応）、ＨＥＲ２−ｉｎｔ１１（配列番号１４１のアミノ酸２３〜４３８に対応）、ハースタチン（ｈｅｒｓｔａｔｉｎ）（ＡＡＤ５６００９、配列番号１３５のアミノ酸２３〜４１９に対応）およびＥｒｂＢ２．ａ（配列番号１３９のアミノ酸２３〜９０に対応）を含む。ドメインＩ（全長の成熟ＨＥＲ２のアミノ酸１〜１７２に対応）およびドメインＩＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ２のアミノ酸３２０〜４８８に対応）は、太字で示される。ドメインＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ２のアミノ酸１７３〜３１９に対応）およびドメインＩＶ（全長の成熟ＨＥＲ２のアミノ酸４８９〜６２８に対応）は、通常のフォントで示され、システインモジュールが強調される。全長の成熟ＨＥＲ２の非ＥＣＤ部分は、薄いグレーで示される。成熟な全長ＨＥＲ２におけるアミノ酸配列とアラインメントを示さないアミノ酸は、斜体で示す。 図２（ｂ）は、全長ＨＥＲ２（ＡＡＡ７５４９３．１、配列番号４のアミノ酸２３〜１２５５に対応）の成熟形態（シグナルペプチドを欠く）と比較した、ＨＥＲ２ ＥＣＤアイソフォームのアラインメントとドメイン構成とを示す。整列させたＨＥＲ２ ＥＣＤアイソフォーム（シグナルペプチドを欠く）は、ＨＦ２００（配列番号１８）、ＥｒｂＢ２．１ｅ（配列番号１３７のアミノ酸２３〜６３３に対応）、ＨＦ２１０（配列番号１６）、ＨＦ２２０（配列番号１４）、ＥｒｂＢ２．１ｄ（配列番号１３６のアミノ酸２５〜６８０に対応）、ＥｒｂＢ２．１ｆ（配列番号１３８のアミノ酸２３〜５７５に対応）、ＨＥＲ２−ｉｎｔ１１（配列番号１４１のアミノ酸２３〜４３８に対応）、ハースタチン（ｈｅｒｓｔａｔｉｎ）（ＡＡＤ５６００９、配列番号１３５のアミノ酸２３〜４１９に対応）およびＥｒｂＢ２．ａ（配列番号１３９のアミノ酸２３〜９０に対応）を含む。ドメインＩ（全長の成熟ＨＥＲ２のアミノ酸１〜１７２に対応）およびドメインＩＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ２のアミノ酸３２０〜４８８に対応）は、太字で示される。ドメインＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ２のアミノ酸１７３〜３１９に対応）およびドメインＩＶ（全長の成熟ＨＥＲ２のアミノ酸４８９〜６２８に対応）は、通常のフォントで示され、システインモジュールが強調される。全長の成熟ＨＥＲ２の非ＥＣＤ部分は、薄いグレーで示される。成熟な全長ＨＥＲ２におけるアミノ酸配列とアラインメントを示さないアミノ酸は、斜体で示す。 図２（ｃ）は、全長ＨＥＲ３（ＮＰ＿００１９７３．１、配列番号６のアミノ酸２０〜１３４２に対応）の成熟形態（シグナルペプチドを欠く）と比較した、ＨＥＲ３ ＥＣＤアイソフォームのアラインメントとドメイン構成とを示す。整列させたＨＥＲ３ ＥＣＤアイソフォーム（シグナルペプチドを欠く）は、ＨＦ３００（配列番号２６）、ＨＦ３１０（配列番号２０）、ｐ８５ＨＥＲ３（配列番号２２のアミノ酸２０〜５６２に対応）、ＨＥＲ３−５１９（配列番号２４）、ＨＥＲ３アイソフォーム（ＡＡＨ０２７０６、配列番号１４３のアミノ酸２０〜３３１に対応）、ＨＥＲ３−ｉｎｔ１０（配列番号１４６のアミノ酸２０〜４０３に対応）、ｐ７５ｓＨＥＲ３（配列番号１５０のアミノ酸２０〜５３４に対応）、ＨＥＲ３−ｉｎｔ１１（配列番号１４８のアミノ酸２０〜４２５に対応）、ｐ４５ｓＨＥＲ３（配列番号１４９のアミノ酸２０〜３３１に対応）、ｐ５０ｓＨＥＲ３（配列番号１５１のアミノ酸２０〜４００に対応）およびＨＥＲ３アイソフォーム２（Ｐ２１８６０−２、配列番号１４４のアミノ酸２０〜１８３に対応）を含む。ドメインＩ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸１〜１５９に対応）およびドメインＩＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸３１２〜４８０に対応）は、太字で示される。ドメインＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸１６０〜３１１に対応）およびドメインＩＶ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸４８１〜６２１に対応）は、通常のフォントで示され、システインモジュールが強調される。全長の成熟ＨＥＲ３の非ＥＣＤ部分は、薄いグレーで示される。成熟な全長ＨＥＲ３におけるアミノ酸配列とアラインメントを示さないアミノ酸は、斜体で示す。 図２（ｃ）は、全長ＨＥＲ３（ＮＰ＿００１９７３．１、配列番号６のアミノ酸２０〜１３４２に対応）の成熟形態（シグナルペプチドを欠く）と比較した、ＨＥＲ３ ＥＣＤアイソフォームのアラインメントとドメイン構成とを示す。整列させたＨＥＲ３ ＥＣＤアイソフォーム（シグナルペプチドを欠く）は、ＨＦ３００（配列番号２６）、ＨＦ３１０（配列番号２０）、ｐ８５ＨＥＲ３（配列番号２２のアミノ酸２０〜５６２に対応）、ＨＥＲ３−５１９（配列番号２４）、ＨＥＲ３アイソフォーム（ＡＡＨ０２７０６、配列番号１４３のアミノ酸２０〜３３１に対応）、ＨＥＲ３−ｉｎｔ１０（配列番号１４６のアミノ酸２０〜４０３に対応）、ｐ７５ｓＨＥＲ３（配列番号１５０のアミノ酸２０〜５３４に対応）、ＨＥＲ３−ｉｎｔ１１（配列番号１４８のアミノ酸２０〜４２５に対応）、ｐ４５ｓＨＥＲ３（配列番号１４９のアミノ酸２０〜３３１に対応）、ｐ５０ｓＨＥＲ３（配列番号１５１のアミノ酸２０〜４００に対応）およびＨＥＲ３アイソフォーム２（Ｐ２１８６０−２、配列番号１４４のアミノ酸２０〜１８３に対応）を含む。ドメインＩ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸１〜１５９に対応）およびドメインＩＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸３１２〜４８０に対応）は、太字で示される。ドメインＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸１６０〜３１１に対応）およびドメインＩＶ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸４８１〜６２１に対応）は、通常のフォントで示され、システインモジュールが強調される。全長の成熟ＨＥＲ３の非ＥＣＤ部分は、薄いグレーで示される。成熟な全長ＨＥＲ３におけるアミノ酸配列とアラインメントを示さないアミノ酸は、斜体で示す。 図２（ｃ）は、全長ＨＥＲ３（ＮＰ＿００１９７３．１、配列番号６のアミノ酸２０〜１３４２に対応）の成熟形態（シグナルペプチドを欠く）と比較した、ＨＥＲ３ ＥＣＤアイソフォームのアラインメントとドメイン構成とを示す。整列させたＨＥＲ３ ＥＣＤアイソフォーム（シグナルペプチドを欠く）は、ＨＦ３００（配列番号２６）、ＨＦ３１０（配列番号２０）、ｐ８５ＨＥＲ３（配列番号２２のアミノ酸２０〜５６２に対応）、ＨＥＲ３−５１９（配列番号２４）、ＨＥＲ３アイソフォーム（ＡＡＨ０２７０６、配列番号１４３のアミノ酸２０〜３３１に対応）、ＨＥＲ３−ｉｎｔ１０（配列番号１４６のアミノ酸２０〜４０３に対応）、ｐ７５ｓＨＥＲ３（配列番号１５０のアミノ酸２０〜５３４に対応）、ＨＥＲ３−ｉｎｔ１１（配列番号１４８のアミノ酸２０〜４２５に対応）、ｐ４５ｓＨＥＲ３（配列番号１４９のアミノ酸２０〜３３１に対応）、ｐ５０ｓＨＥＲ３（配列番号１５１のアミノ酸２０〜４００に対応）およびＨＥＲ３アイソフォーム２（Ｐ２１８６０−２、配列番号１４４のアミノ酸２０〜１８３に対応）を含む。ドメインＩ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸１〜１５９に対応）およびドメインＩＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸３１２〜４８０に対応）は、太字で示される。ドメインＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸１６０〜３１１に対応）およびドメインＩＶ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸４８１〜６２１に対応）は、通常のフォントで示され、システインモジュールが強調される。全長の成熟ＨＥＲ３の非ＥＣＤ部分は、薄いグレーで示される。成熟な全長ＨＥＲ３におけるアミノ酸配列とアラインメントを示さないアミノ酸は、斜体で示す。 図２（ｃ）は、全長ＨＥＲ３（ＮＰ＿００１９７３．１、配列番号６のアミノ酸２０〜１３４２に対応）の成熟形態（シグナルペプチドを欠く）と比較した、ＨＥＲ３ ＥＣＤアイソフォームのアラインメントとドメイン構成とを示す。整列させたＨＥＲ３ ＥＣＤアイソフォーム（シグナルペプチドを欠く）は、ＨＦ３００（配列番号２６）、ＨＦ３１０（配列番号２０）、ｐ８５ＨＥＲ３（配列番号２２のアミノ酸２０〜５６２に対応）、ＨＥＲ３−５１９（配列番号２４）、ＨＥＲ３アイソフォーム（ＡＡＨ０２７０６、配列番号１４３のアミノ酸２０〜３３１に対応）、ＨＥＲ３−ｉｎｔ１０（配列番号１４６のアミノ酸２０〜４０３に対応）、ｐ７５ｓＨＥＲ３（配列番号１５０のアミノ酸２０〜５３４に対応）、ＨＥＲ３−ｉｎｔ１１（配列番号１４８のアミノ酸２０〜４２５に対応）、ｐ４５ｓＨＥＲ３（配列番号１４９のアミノ酸２０〜３３１に対応）、ｐ５０ｓＨＥＲ３（配列番号１５１のアミノ酸２０〜４００に対応）およびＨＥＲ３アイソフォーム２（Ｐ２１８６０−２、配列番号１４４のアミノ酸２０〜１８３に対応）を含む。ドメインＩ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸１〜１５９に対応）およびドメインＩＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸３１２〜４８０に対応）は、太字で示される。ドメインＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸１６０〜３１１に対応）およびドメインＩＶ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸４８１〜６２１に対応）は、通常のフォントで示され、システインモジュールが強調される。全長の成熟ＨＥＲ３の非ＥＣＤ部分は、薄いグレーで示される。成熟な全長ＨＥＲ３におけるアミノ酸配列とアラインメントを示さないアミノ酸は、斜体で示す。 図２（ｃ）は、全長ＨＥＲ３（ＮＰ＿００１９７３．１、配列番号６のアミノ酸２０〜１３４２に対応）の成熟形態（シグナルペプチドを欠く）と比較した、ＨＥＲ３ ＥＣＤアイソフォームのアラインメントとドメイン構成とを示す。整列させたＨＥＲ３ ＥＣＤアイソフォーム（シグナルペプチドを欠く）は、ＨＦ３００（配列番号２６）、ＨＦ３１０（配列番号２０）、ｐ８５ＨＥＲ３（配列番号２２のアミノ酸２０〜５６２に対応）、ＨＥＲ３−５１９（配列番号２４）、ＨＥＲ３アイソフォーム（ＡＡＨ０２７０６、配列番号１４３のアミノ酸２０〜３３１に対応）、ＨＥＲ３−ｉｎｔ１０（配列番号１４６のアミノ酸２０〜４０３に対応）、ｐ７５ｓＨＥＲ３（配列番号１５０のアミノ酸２０〜５３４に対応）、ＨＥＲ３−ｉｎｔ１１（配列番号１４８のアミノ酸２０〜４２５に対応）、ｐ４５ｓＨＥＲ３（配列番号１４９のアミノ酸２０〜３３１に対応）、ｐ５０ｓＨＥＲ３（配列番号１５１のアミノ酸２０〜４００に対応）およびＨＥＲ３アイソフォーム２（Ｐ２１８６０−２、配列番号１４４のアミノ酸２０〜１８３に対応）を含む。ドメインＩ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸１〜１５９に対応）およびドメインＩＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸３１２〜４８０に対応）は、太字で示される。ドメインＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸１６０〜３１１に対応）およびドメインＩＶ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸４８１〜６２１に対応）は、通常のフォントで示され、システインモジュールが強調される。全長の成熟ＨＥＲ３の非ＥＣＤ部分は、薄いグレーで示される。成熟な全長ＨＥＲ３におけるアミノ酸配列とアラインメントを示さないアミノ酸は、斜体で示す。 図２（ｃ）は、全長ＨＥＲ３（ＮＰ＿００１９７３．１、配列番号６のアミノ酸２０〜１３４２に対応）の成熟形態（シグナルペプチドを欠く）と比較した、ＨＥＲ３ ＥＣＤアイソフォームのアラインメントとドメイン構成とを示す。整列させたＨＥＲ３ ＥＣＤアイソフォーム（シグナルペプチドを欠く）は、ＨＦ３００（配列番号２６）、ＨＦ３１０（配列番号２０）、ｐ８５ＨＥＲ３（配列番号２２のアミノ酸２０〜５６２に対応）、ＨＥＲ３−５１９（配列番号２４）、ＨＥＲ３アイソフォーム（ＡＡＨ０２７０６、配列番号１４３のアミノ酸２０〜３３１に対応）、ＨＥＲ３−ｉｎｔ１０（配列番号１４６のアミノ酸２０〜４０３に対応）、ｐ７５ｓＨＥＲ３（配列番号１５０のアミノ酸２０〜５３４に対応）、ＨＥＲ３−ｉｎｔ１１（配列番号１４８のアミノ酸２０〜４２５に対応）、ｐ４５ｓＨＥＲ３（配列番号１４９のアミノ酸２０〜３３１に対応）、ｐ５０ｓＨＥＲ３（配列番号１５１のアミノ酸２０〜４００に対応）およびＨＥＲ３アイソフォーム２（Ｐ２１８６０−２、配列番号１４４のアミノ酸２０〜１８３に対応）を含む。ドメインＩ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸１〜１５９に対応）およびドメインＩＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸３１２〜４８０に対応）は、太字で示される。ドメインＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸１６０〜３１１に対応）およびドメインＩＶ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸４８１〜６２１に対応）は、通常のフォントで示され、システインモジュールが強調される。全長の成熟ＨＥＲ３の非ＥＣＤ部分は、薄いグレーで示される。成熟な全長ＨＥＲ３におけるアミノ酸配列とアラインメントを示さないアミノ酸は、斜体で示す。 図２（ｃ）は、全長ＨＥＲ３（ＮＰ＿００１９７３．１、配列番号６のアミノ酸２０〜１３４２に対応）の成熟形態（シグナルペプチドを欠く）と比較した、ＨＥＲ３ ＥＣＤアイソフォームのアラインメントとドメイン構成とを示す。整列させたＨＥＲ３ ＥＣＤアイソフォーム（シグナルペプチドを欠く）は、ＨＦ３００（配列番号２６）、ＨＦ３１０（配列番号２０）、ｐ８５ＨＥＲ３（配列番号２２のアミノ酸２０〜５６２に対応）、ＨＥＲ３−５１９（配列番号２４）、ＨＥＲ３アイソフォーム（ＡＡＨ０２７０６、配列番号１４３のアミノ酸２０〜３３１に対応）、ＨＥＲ３−ｉｎｔ１０（配列番号１４６のアミノ酸２０〜４０３に対応）、ｐ７５ｓＨＥＲ３（配列番号１５０のアミノ酸２０〜５３４に対応）、ＨＥＲ３−ｉｎｔ１１（配列番号１４８のアミノ酸２０〜４２５に対応）、ｐ４５ｓＨＥＲ３（配列番号１４９のアミノ酸２０〜３３１に対応）、ｐ５０ｓＨＥＲ３（配列番号１５１のアミノ酸２０〜４００に対応）およびＨＥＲ３アイソフォーム２（Ｐ２１８６０−２、配列番号１４４のアミノ酸２０〜１８３に対応）を含む。ドメインＩ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸１〜１５９に対応）およびドメインＩＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸３１２〜４８０に対応）は、太字で示される。ドメインＩＩ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸１６０〜３１１に対応）およびドメインＩＶ（全長の成熟ＨＥＲ３のアミノ酸４８１〜６２１に対応）は、通常のフォントで示され、システインモジュールが強調される。全長の成熟ＨＥＲ３の非ＥＣＤ部分は、薄いグレーで示される。成熟な全長ＨＥＲ３におけるアミノ酸配列とアラインメントを示さないアミノ酸は、斜体で示す。 図２（ｄ）は、全長ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）（ＮＰ＿００５２２６、配列番号８のアミノ酸２６〜１３０８に対応）の成熟形態（シグナルペプチドを欠く）と比較した、ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）ＥＣＤアイソフォームのアラインメントとドメイン構成とを示す。整列させたＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）ＥＣＤアイソフォーム（シグナルペプチドを欠く）は、ＥｒｂＢ４−５２２（配列番号３０）、ＨＦ４００（配列番号３２）、ＥｒｂＢ４−ｉｎｔ１１（配列番号１５７のアミノ酸２６〜４３０に対応）、ＥｒｂＢ４−ｉｎｔ１２（配列番号１５９のアミノ酸２６〜５０６に対応）、ＨＦ４１０（配列番号２８）、ＥｒｂＢ４−ｉｎｔ９（配列番号１５３のアミノ酸２６〜３９１に対応）およびＥｒｂＢ４−ｉｎｔ１０（配列番号１５５のアミノ酸２６〜４２１に対応）を含む。ドメインＩ（全長の成熟ＥｒｂＢ４のアミノ酸１〜１６３に対応）およびドメインＩＩＩ（全長の成熟ＥｒｂＢ４のアミノ酸３０９〜４７７に対応）は、太字で示される。ドメインＩＩ（全長の成熟ＥｒｂＢ４のアミノ酸１６４〜３０８に対応）およびドメインＩＶ（全長の成熟ＥｒｂＢ４のアミノ酸４７８〜６２５に対応）は、通常のフォントで示され、システインモジュールが強調される。全長の成熟ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）の非ＥＣＤ部分は、薄いグレーで示される。成熟な全長ＥｒｂＢ４におけるアミノ酸配列とアラインメントを示さないアミノ酸は、斜体で示す。 図２（ｄ）は、全長ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）（ＮＰ＿００５２２６、配列番号８のアミノ酸２６〜１３０８に対応）の成熟形態（シグナルペプチドを欠く）と比較した、ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）ＥＣＤアイソフォームのアラインメントとドメイン構成とを示す。整列させたＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）ＥＣＤアイソフォーム（シグナルペプチドを欠く）は、ＥｒｂＢ４−５２２（配列番号３０）、ＨＦ４００（配列番号３２）、ＥｒｂＢ４−ｉｎｔ１１（配列番号１５７のアミノ酸２６〜４３０に対応）、ＥｒｂＢ４−ｉｎｔ１２（配列番号１５９のアミノ酸２６〜５０６に対応）、ＨＦ４１０（配列番号２８）、ＥｒｂＢ４−ｉｎｔ９（配列番号１５３のアミノ酸２６〜３９１に対応）およびＥｒｂＢ４−ｉｎｔ１０（配列番号１５５のアミノ酸２６〜４２１に対応）を含む。ドメインＩ（全長の成熟ＥｒｂＢ４のアミノ酸１〜１６３に対応）およびドメインＩＩＩ（全長の成熟ＥｒｂＢ４のアミノ酸３０９〜４７７に対応）は、太字で示される。ドメインＩＩ（全長の成熟ＥｒｂＢ４のアミノ酸１６４〜３０８に対応）およびドメインＩＶ（全長の成熟ＥｒｂＢ４のアミノ酸４７８〜６２５に対応）は、通常のフォントで示され、システインモジュールが強調される。全長の成熟ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）の非ＥＣＤ部分は、薄いグレーで示される。成熟な全長ＥｒｂＢ４におけるアミノ酸配列とアラインメントを示さないアミノ酸は、斜体で示す。 図２（ｄ）は、全長ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）（ＮＰ＿００５２２６、配列番号８のアミノ酸２６〜１３０８に対応）の成熟形態（シグナルペプチドを欠く）と比較した、ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）ＥＣＤアイソフォームのアラインメントとドメイン構成とを示す。整列させたＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）ＥＣＤアイソフォーム（シグナルペプチドを欠く）は、ＥｒｂＢ４−５２２（配列番号３０）、ＨＦ４００（配列番号３２）、ＥｒｂＢ４−ｉｎｔ１１（配列番号１５７のアミノ酸２６〜４３０に対応）、ＥｒｂＢ４−ｉｎｔ１２（配列番号１５９のアミノ酸２６〜５０６に対応）、ＨＦ４１０（配列番号２８）、ＥｒｂＢ４−ｉｎｔ９（配列番号１５３のアミノ酸２６〜３９１に対応）およびＥｒｂＢ４−ｉｎｔ１０（配列番号１５５のアミノ酸２６〜４２１に対応）を含む。ドメインＩ（全長の成熟ＥｒｂＢ４のアミノ酸１〜１６３に対応）およびドメインＩＩＩ（全長の成熟ＥｒｂＢ４のアミノ酸３０９〜４７７に対応）は、太字で示される。ドメインＩＩ（全長の成熟ＥｒｂＢ４のアミノ酸１６４〜３０８に対応）およびドメインＩＶ（全長の成熟ＥｒｂＢ４のアミノ酸４７８〜６２５に対応）は、通常のフォントで示され、システインモジュールが強調される。全長の成熟ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）の非ＥＣＤ部分は、薄いグレーで示される。成熟な全長ＥｒｂＢ４におけるアミノ酸配列とアラインメントを示さないアミノ酸は、斜体で示す。 図２（ｄ）は、全長ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）（ＮＰ＿００５２２６、配列番号８のアミノ酸２６〜１３０８に対応）の成熟形態（シグナルペプチドを欠く）と比較した、ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）ＥＣＤアイソフォームのアラインメントとドメイン構成とを示す。整列させたＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）ＥＣＤアイソフォーム（シグナルペプチドを欠く）は、ＥｒｂＢ４−５２２（配列番号３０）、ＨＦ４００（配列番号３２）、ＥｒｂＢ４−ｉｎｔ１１（配列番号１５７のアミノ酸２６〜４３０に対応）、ＥｒｂＢ４−ｉｎｔ１２（配列番号１５９のアミノ酸２６〜５０６に対応）、ＨＦ４１０（配列番号２８）、ＥｒｂＢ４−ｉｎｔ９（配列番号１５３のアミノ酸２６〜３９１に対応）およびＥｒｂＢ４−ｉｎｔ１０（配列番号１５５のアミノ酸２６〜４２１に対応）を含む。ドメインＩ（全長の成熟ＥｒｂＢ４のアミノ酸１〜１６３に対応）およびドメインＩＩＩ（全長の成熟ＥｒｂＢ４のアミノ酸３０９〜４７７に対応）は、太字で示される。ドメインＩＩ（全長の成熟ＥｒｂＢ４のアミノ酸１６４〜３０８に対応）およびドメインＩＶ（全長の成熟ＥｒｂＢ４のアミノ酸４７８〜６２５に対応）は、通常のフォントで示され、システインモジュールが強調される。全長の成熟ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）の非ＥＣＤ部分は、薄いグレーで示される。成熟な全長ＥｒｂＢ４におけるアミノ酸配列とアラインメントを示さないアミノ酸は、斜体で示す。 図２（ｄ）は、全長ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）（ＮＰ＿００５２２６、配列番号８のアミノ酸２６〜１３０８に対応）の成熟形態（シグナルペプチドを欠く）と比較した、ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）ＥＣＤアイソフォームのアラインメントとドメイン構成とを示す。整列させたＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）ＥＣＤアイソフォーム（シグナルペプチドを欠く）は、ＥｒｂＢ４−５２２（配列番号３０）、ＨＦ４００（配列番号３２）、ＥｒｂＢ４−ｉｎｔ１１（配列番号１５７のアミノ酸２６〜４３０に対応）、ＥｒｂＢ４−ｉｎｔ１２（配列番号１５９のアミノ酸２６〜５０６に対応）、ＨＦ４１０（配列番号２８）、ＥｒｂＢ４−ｉｎｔ９（配列番号１５３のアミノ酸２６〜３９１に対応）およびＥｒｂＢ４−ｉｎｔ１０（配列番号１５５のアミノ酸２６〜４２１に対応）を含む。ドメインＩ（全長の成熟ＥｒｂＢ４のアミノ酸１〜１６３に対応）およびドメインＩＩＩ（全長の成熟ＥｒｂＢ４のアミノ酸３０９〜４７７に対応）は、太字で示される。ドメインＩＩ（全長の成熟ＥｒｂＢ４のアミノ酸１６４〜３０８に対応）およびドメインＩＶ（全長の成熟ＥｒｂＢ４のアミノ酸４７８〜６２５に対応）は、通常のフォントで示され、システインモジュールが強調される。全長の成熟ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）の非ＥＣＤ部分は、薄いグレーで示される。成熟な全長ＥｒｂＢ４におけるアミノ酸配列とアラインメントを示さないアミノ酸は、斜体で示す。 図３（ａ）は、ＭＤＡ ＭＢ ４６８細胞を、ＲＢ２００ｈおよびチロシンキナーゼインヒビターＡＧ８２５で処理したときに観察される、相乗作用による増殖阻害作用を示す。図３（ｂ）は、Ａ４３１細胞を、ＲＢ２００ｈおよびＧｅｆｉｔｉｎｉｂ（Ｉｒｅｓｓａ）で処理したときに観察される、相乗作用による増殖阻害作用を示す。 図４は、ＲＢ２００ｈ、Ｐａｎ−Ｈｅｒリガンドトラップの概略を示す。 図５は、逆相ＨＰＬＣにより分析した、ハーモジュリン（ｈｅｒｍｏｄｕｌｉｎ）構築物（ＲＢ６００、ＨＦＤ１００、ＨＤＦ３００およびＲＢ２００ｈ）の純度を示す。 図６ａは、加工した二量体が、１２５Ｉ−ＥＧＦおよび１２５Ｉ−ＨＲＧβに対する特異性を保持することを示す：レーン１：ＨＦＤ１００＝ＨＥＲ１−６２１／Ｆｃ、レーン２：ＨＦＤ２００＝ＨＥＲ２−６２８／Ｆｃ、レーン３：ＨＦＤ３００＝ＨＥＲ３−６２１／Ｆｃおよびレーン４：ＨＦＤ４００＝ＨＥＲ４−６２５／Ｆｃ。図６ｂは、ＲＢ２００ｈの加工した二量体が、１２５Ｉ−ＥＧＦおよび１２５Ｉ−ＨＲＧβに対する特異性を保持することを示す。 図７ａは、ＲＢ２００ｈに結合するＥＵ−ＮＲＧ１β１を示す。図７ｂは、ＲＢ２００ｈへのＥＵ−ＥＧＦの結合を示す。図７ｃは、他のＨＥＲリガンドによる競合的なＥｕ−ＥＧＦ結合を示す。図７ｄは、他のＨＥＲリガンドによるＥｕ−ＮＲＧ１−ｂ１結合の競合を示す。 図８ａ〜ｃは、Ａ４３１類表皮癌細胞における、ＲＢ２００ｈ、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎまたはＥｒｂｉｔｕｘによる、ＥＧＦリガンド刺激によるＨＥＲファミリータンパク質のリン酸化の阻害を示す。図８ｄ〜ｆは、Ａ４３１類表皮癌細胞における、ＲＢ２００ｈ、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎまたはＥｒｂｉｔｕｘによる、ＮＲＧ１β１リガンド刺激によるＨＥＲファミリータンパク質のリン酸化の阻害を示す。 図９ａ〜ｃは、ＺＲ−７５−１乳癌細胞における、ＲＢ２００ｈ、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎまたはＥｒｂｉｔｕｘによる、ＥＧＦリガンド刺激によるＨＥＲファミリータンパク質のリン酸化の阻害を示す。図９ｄ〜ｆは、ＺＲ−７５−１乳癌細胞における、ＲＢ２００ｈ、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎまたはＥｒｂｉｔｕｘによる、ＮＲＧ１β１リガンド刺激によるＨＥＲファミリータンパク質のリン酸化の阻害を示す。 図１０ａは、ＥＧＦにより刺激されるレセプターリン酸化において、ＲＢ６００がＲＢ２００ｈよりも強力であることを示す。図１０ｂは、ＮＲＧ１β１により刺激されるレセプターリン酸化において、ＲＢ６００がＲＢ２００ｈよりも強力であることを示す。 図１１ａは、ＲＢ２００ｈが培養腫瘍細胞であるＡ４３１細胞の増殖を阻害することを示す。図１１ｂは、ＲＢ２００ｈが培養腫瘍細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞の増殖を阻害することを示す。 図１２ａ〜ｂは、ＲＢ２００ｈが、ＺＲ−７５−１腫瘍細胞（図１１ａ）およびＡ５４９腫瘍細胞（図１１ｂ）の、リガンド刺激性および非刺激性の両方の、軟寒天コロニー増殖を阻害することを示す。 図１３ａは、ＲＢ２００ｈが、乳癌細胞のＥＧＦにより誘導されるリガンド誘導性の増殖を阻害することを示す。図１３ｂは、ＲＢ２００ｈが、乳癌細胞のＮＲＧ１β１により誘導されるリガンド誘導性の増殖を阻害することを示す。図１３ｃは、ＲＢ２００ｈが、ＬＰＡにより誘導される、乳癌細胞のリガンド誘導性の増殖を阻害することを示す。 図１４ａは、ＲＢ２００ｈが、ＳＵＭ１４９乳癌細胞のＥＧＦによるリガンド誘導性の増殖を阻害することを示す。図１４ｂは、ＲＢ２００ｈが、ＳＵＭ１４９乳癌細胞のＬＰＡによるリガンド誘導性の増殖を阻害することを示す。 図１５ａ〜ｄは、ＲＢ２００ｈおよびチロシンキナーゼインヒビター：ＡＧ−８２５、ＧｅｆｉｔｉｎｉｂおよびＥｒｌｏｔｉｎｉｂでの相乗作用性の増殖阻害を示す。 図１６は、ＲＢ２００ｈおよびチロシンキナーゼインヒビター：Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂでの相乗作用性の増殖阻害を示す。 図１７は、ＲＢ２００ｈが、ＡＧ８２５チロシンキナーゼインヒビターと相乗作用性の抗増殖作用を有することを示す。 図１８は、ＲＢ２００ｈが、Ａ４３１上皮癌細胞において、Ｉｒｅｓｓａと相乗作用性の抗増殖応答を生じることを示す。 図１９は、ＢＴ４７４乳癌細胞における、ＲＢ２００ｈとＩｒｅｓｓａとの相乗作用を示す。 図２０は、Ａ４３１ ｓ．ｃ．モデルにおけるＲＢ２００ｈの治療評価を示す。ヌードマウスにおけるｓ．ｃ．Ａ４３１腫瘍の平均容積。投薬は、１０日目に開始した。両側ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定。図において、統計的有意差＊は、ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、ｐ＜０．０１を示し、そして、＊＊＊は、ｐ＜０．００１を示す。 図２１は、ＨＦＤ１００からＰＣＲによってＨＦＤ１００変異体を生成するために使用した方法の概略を示す。 図２２は、ＨＦＤ１００−Ｔ３９Ｓが、ＥＧＦ（図２２ａ）、ＨＢ−ＥＧＦ（図２２ｂ）およびＴＧＦ−α（図２２ｃ）に対する親和性が向上していることを示す。 図２３は、ＨＦＤ１００変異体の、ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦおよびＴＧＦ−αに対する結合親和性と、相対的な発現レベルとを示す。 図２４は、試験的毒性研究についての平均体重（パネルＡ）および最終腫瘍容積（パネルＢ）を示す。 図２５は、ヌードマウスにおけるｓ．ｃ．Ａ４３１腫瘍の平均容積を示す。投薬は、１０日目に開始した。統計的有意差＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１は、両側ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定を用いて計算した。 図２５は、ヌードマウスにおけるｓ．ｃ．Ａ４３１腫瘍の平均容積を示す。投薬は、１０日目に開始した。統計的有意差＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１は、両側ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定を用いて計算した。 図２５は、ヌードマウスにおけるｓ．ｃ．Ａ４３１腫瘍の平均容積を示す。投薬は、１０日目に開始した。統計的有意差＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１は、両側ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定を用いて計算した。 図２５は、ヌードマウスにおけるｓ．ｃ．Ａ４３１腫瘍の平均容積を示す。投薬は、１０日目に開始した。統計的有意差＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１は、両側ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定を用いて計算した。 図２６は、ｓ．ｃ．Ａ４３１腫瘍の平均腫瘍重量を示す。統計的有意差は、片側ＡＮＯＶＡを用いて計算した。 図２７は、治療研究の間のマウスの体重を示す。
詳細な説明
Ａ．定義
Ｂ．汎細胞表面レセプター特異的な治療薬
Ｃ．ＨＥＲレセプターおよび他の細胞表面レセプターの構造および活性
１．ＨＥＲ１ ＥＣＤの構造およびドメイン構成
２．ＨＥＲ２ ＥＣＤの構造およびドメイン構成
３．ＨＥＲ３ ＥＣＤの構造およびドメイン構成
４．ＨＥＲ４ ＥＣＤの構造およびドメイン構成
５．ＨＥＲファミリーのリガンド、リガンド特異性およびリガンド媒介性のレセプター活性化
６．二量体化 対 係留ならびに活性なホモ二量体およびヘテロ二量体の作製
７．ＨＥＲファミリーのレセプター活性
ａ．細胞の増殖
ｂ．細胞の生存
ｃ．新脈管形成
ｄ．遊走および浸潤
８．他のＣＳＲのＥＣＤ
ａ．ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）およびＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）
ｂ．ＦＧＦＲ１〜ＦＧＦＲ４
ｃ．ＩＧＦ−１Ｒ
ｄ．ＲＡＧＥおよび他のＣＳＲ
Ｄ．ＥＣＤ多量体の成分とＥＣＤ多量体の形成
１．ＥＣＤポリペプチド
ａ．ＨＥＲファミリーの全長ＥＣＤ
ｉ．ＨＥＲ１ ＥＣＤ
ｉｉ．ＨＥＲ２ ＥＣＤ
ｉｉｉ．ＨＥＲ３ ＥＣＤ
ｉｖ．ＨＥＲ４ ＥＣＤ
ｂ．ＨＥＲファミリーの短縮型ＥＣＤ
ｉ．短縮型ＨＥＲ１ ＥＣＤ
ｉｉ．短縮型ＨＥＲ２ ＥＣＤ
ｉｉｉ．短縮型ＨＥＲ３ ＥＣＤ
ｉｖ．短縮型ＨＥＲ４ ＥＣＤ
ｃ．ハイブリッドＥＣＤ
ｄ．他のＣＳＲもしくはＲＴＫのＥＣＤ、またはこれらの一部分
ｅ．ポリペプチドの選択的スプライシングを受けたアイソフォーム
２．多量体の形成
ａ．ペプチドリンカー
ｂ．ヘテロ二官能性連結因子
ｃ．ポリペプチド多量体化ドメイン
ｉ．免疫グロブリンドメイン
（ａ）Ｆｃドメイン
（ｂ）腔内の隆起部（すなわち、ノブと穴）
ｉｉ．ロイシンジッパー
（ａ）ｆｏｓおよびｊｕｎ
（ｂ）ＧＣＮ４
ｉｉｉ．他の多量体化ドメイン
（ａ）Ｒ／ＰＫＡ−ＡＤ／ＡＫＡＰ
３．キメラＥＣＤポリペプチド
ａ．例示的なキメラＨＥＲ ＥＣＤポリペプチド
Ｅ．ＥＣＤ多量体
ａ．全長ＨＥＲ１ ＥＣＤおよび別のＣＳＲのＥＣＤの全体もしくは一部分
ｂ．２以上の短縮型ＥＣＤ成分
ｃ．ハイブリッドＥＣＤ多量体
ｄ．同じであるかまたは同じＣＳＲに由来するＥＣＤ成分
Ｆ．キメラＥＣＤポリペプチド融合物をコードする核酸を生成する方法と結果として生じるＥＣＤ多量体の生成
１．合成の遺伝子およびポリペプチド
２．ＥＣＤポリペプチドをクローニングおよび単離する方法
３．ＥＣＤポリペプチドキメラを生成およびクローニングする方法
４．発現系
ａ．原核生物による発現
ｂ．酵母
ｃ．昆虫細胞
ｄ．哺乳動物細胞
ｅ．植物
５．トランスフェクションおよび形質転換の方法
６．ＥＣＤポリペプチド、キメラポリペプチドおよび結果として生じるＥＣＤ多量体の回収および精製
Ｇ．ＥＣＤ多量体の活性を評価または監視するためのアッセイ
１．キナーゼ／リン酸化アッセイ
２．複合体化（ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ）／二量体化
３．リガンド結合
４．細胞増殖アッセイ
５．細胞疾患モデルアッセイ
６．動物モデル
Ｈ．ＥＣＤ多量体およびＥＣＤ多量体組成物の調製、処方および投与
Ｉ．ＥＣＤ多量体を用いた例示的な処置方法
１．ＨＥＲ媒介性の疾患もしくは障害
ａ．癌
ｂ．新脈管形成
ｃ．ニューレグリン関連疾患
ｄ．平滑筋の増殖に関連する疾患および状態
２．ＲＴＫ媒介性の障害または疾患
ａ．新脈管形成に関連する眼の状態
ｂ．新脈管形成に関連するアテローム性動脈硬化症
ｃ．さらなる新脈管形成に関連する処置
ｄ．癌
３．他のＣＳＲ媒介性の疾患または障害
４．ＥＣＤ多量体のＥＣＤポリペプチド成分の選択
５．患者の選択
６．併用療法
Ｊ．汎ＨＥＲ治療薬を同定、スクリーニングおよび作り出すための方法
１．汎ＨＥＲ治療薬の標的
２．汎ＨＥＲ治療薬を同定するためのスクリーニング方法
ａ．ファージディスプレイ
ｉ．ペプチドライブラリー
ｉｉ．多量体ポリペプチド（ヘテロ二量体ペプチド）
ｂ．例示的なスクリーニングアッセイ
Ｋ．実施例
。
Ａ．定義
そうでないと規定されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書における開示全体を通じて参照される全ての特許、特許出願、公開された出願および刊行物、ＧＥＮＢＡＮＫ配列、ウェブサイトおよび他の公開された資料は、そうでないと示されない限り、その全体が参考として援用される。本明細書における用語について複数の定義が存在するような場合には、この節における定義が優先される。ＵＲＬまたは他のこのような識別子もしくはアドレスに対して参照がなされる場合、このような識別子は変化し得、そして、インターネット上の特定の情報は変動し得るが、等価な情報は公知であり、そして、インターネットおよび／または適切なデータベースを検索することなどによって容易にアクセスされ得ることが理解される。これらに対する参照は、このような情報の有用性と公然の普及との証拠となる。
本明細書において使用される場合、「汎細胞表面レセプター治療薬」または「汎細胞表面レセプター特異的な治療薬」は、２以上の細胞表面レセプターの活性を調節し得る分子（ペプチドベースの化合物および低分子を含む）である。
本明細書において使用される場合、「汎ＨＥＲ治療薬」または「汎ＨＥＲ特異的な治療薬」は、２以上のＨＥＲ（ＥｒｂＢ）レセプターの活性を調節し得る汎細胞表面レセプター治療薬（ペプチドベースの化合物および低分子を含む分子）である。一般に、汎ＨＥＲ治療薬は、例えば、リガンド結合および／またはレセプターとの相互作用を介して、少なくとも２つのＨＥＲレセプターを標的とする。
本明細書において使用される場合、抗癌剤は、任意の癌処置とそのための薬物とを包含し、そして、これには、放射線療法、外科手術、抗癌化合物（低分子を含む）、化学療法剤（例えば、シスプラチンおよびゲムシタビン（ｇｅｎｃｙｔｉｎｂｉｎｅ））およびモノクローナル抗体が含まれる。
本明細書において使用される場合、細胞表面レセプターは、細胞の表面上に発現されるタンパク質であり、そして、代表的には、膜貫通ドメインまたは細胞の表面にレセプターを固定させる他の部分を含む。レセプターとしては、細胞表面レセプターは、細胞表面レセプターの活性（例えば、シグナル伝達またはリガンドの内在化）を媒介するか、またはこれに関与するリガンドと結合する。細胞表面レセプターとしては、１回膜貫通型レセプターおよびＧタンパク質共役型レセプターが挙げられるがこれらに限定されない。増殖因子レセプターのようなレセプターチロシンキナーゼもまた、このような細胞表面レセプターに含まれる。
本明細書において使用される場合、ドメインとは、構造的および／または機能的に区別可能であるかまたは特徴付け可能なポリペプチドの部分（３以上（一般には、５以上、もしくは７以上）のアミノ酸の配列）をいう。例えば、ドメインは、１以上の構造的モチーフから構成されるタンパク質内で、個別の折り畳まれた構造を形成し得（例えば、ループ領域でつながれたαヘリックスおよび／またはβストランドの組合せ）、そして／または、キナーゼ活性のような機能的活性によって認識されるものが挙げられる。タンパク質は、１、または２以上の別個のドメインを有し得る。例えば、ドメインは、内部の配列の、関連するファミリーメンバーに対する相同性（例えば、細胞外ドメインを規定するモチーフに対する相同性）によって、同定、規定または区別され得る。別の例では、ドメインは、酵素的活性（例えば、キナーゼ活性）または、生体分子と相互作用する能力（例えば、ＤＮＡ結合、リガンド結合および二量体化）のようなその機能によって、区別され得る。ドメインは、独立して機能または活性を示し得、その結果、ドメインは、独立して、または、別の分子に融合されて、タンパク質分解活性またはリガンド結合のような活性を果たし得る。ドメインは、ポリペプチドに由来するアミノ酸の直鎖状配列またはアミノ酸非直鎖状配列であり得る。多くのポリペプチドが、複数のドメインを含む。例えば、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）のドメイン構造が図１に示される：これは、ＥＣＤと、膜貫通ドメインと、膜近傍ドメインと、キナーゼドメインと、Ｃ末端細胞質ドメインとを含む。ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）について、ＥＣＤは、Ｉ（またはＬ１）、ＩＩ（またはＳ１）、ＩＩＩ（またはＬ２）およびＩＶ（またはＳ２）と呼ばれる４つのサブドメインを含む。「Ｌ」サブドメイン（ＩおよびＩＩＩ）は、リガンドとの相互作用に関与し、そして、ＩＩ（Ｓ１）ドメインおよびＩＶ（Ｓ２）ドメインは、係留領域を介して相互作用する；サブドメインＩＩ（Ｓ１）は、二量体化ループを含む。当業者は、これらのドメインに精通しており、そして、他のこのようなドメインとの構造的および／または機能的な相同性によってこれらを同定することができる。
本明細書において使用される場合、細胞質ドメインは、シグナル伝達に関与するドメインである。
本明細書において使用される場合、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、レセプターの表面上に出現する細胞表面レセプターの部分であり、リガンド結合部位を含む。本明細書における目的では、ＥＣＤに対する参照は、そのＥＣＤポリペプチドが、同系レセプターの別のドメイン（すなわち、膜貫通ドメイン、プロテインキナーゼドメインなど）に関連する任意の連続配列を含まない限りは、任意のＥＣＤ含有分子またはその一部分を含む。したがって、例えば、ＥＣＤポリペプチドは、ＣＳＲの選択的スプライシングを受けたアイソフォームを含み、ここで、このアイソフォームは、ＥＣＤ含有部分を有するが、同系のＣＳＲの任意の他のドメインは欠き、そしてまた、同系ＣＳＲの別のドメイン配列と関連も整列もされないさらなる配列を有する。これらのさらなる配列は、イントロン融合タンパク質アイソフォームにおいて生じるようなイントロンをコードする（ｉｎｔｒｏｎ−ｅｎｃｏｄｅｄ）配列であり得る。代表的には、さらなる配列は、ＣＳＲのＥＣＤポリペプチドのリガンド結合および／またはレセプター二量体化の活性を阻害も干渉もしない。ＥＣＤポリペプチドはまた、ハイブリッドＥＣＤを含む。
本明細書において使用される場合、ハイブリッドＥＣＤは、異なる細胞表面レセプターに由来するＥＣＤの一部分を含むＥＣＤをいう。代表的には、ハイブリッドＥＣＤは、異なる細胞表面レセプターに由来する少なくとも２つのＥＣＤサブドメインを含む。
本明細書において使用される場合、キメラポリペプチドは、少なくとも２つの異なるポリペプチドに由来するか、または、単一のポリペプチドの２つの非連続部分に由来する部分を含むポリペプチドをいう。したがって、キメラポリペプチドは、一般に、１つのポリペプチドの全体もしくは一部分に由来するアミノ酸残基の配列と、別の異なるポリペプチドの全体もしくは一部分に由来するアミノ酸残基の配列とを含む。この２つの部分は、直接的もしくは間接的に連結され得、そして、平衡条件下および生理学的条件下（例えば、等張性のｐＨ７緩衝化生理食塩水中）でキメラポリペプチドの実質部分の一体性を維持するのに十分な強度のペプチド結合、他の共有結合もしくは他の非共有結合を介して連結され得る。本明細書における目的では、キメラポリペプチドは、多量体化ドメインに対して直接的もしくは間接的に連結されたＣＳＲのＥＣＤ部分の全体もしくは一部分を含むものを含む。キメラポリペプチドは、例えばエピトープタグのような、さらなる配列も含み得る。
本明細書において使用される場合、融合構築物は、１つの核酸分子に由来するコード配列と、別の核酸分子に由来するコード配列とを含む核酸分子をいい、ここで、これらのコード配列は、同じ読み取り枠内にあり、その結果、融合構築物が宿主細胞において転写および翻訳されると、２つのタンパク質を含むタンパク質が生成される。２つの分子は、構築物において隣接していても、１、２、３もしくはそれより多く、代表的には、１０、９、８、７、６よりも少ないアミノ酸を含むリンカーポリペプチドによって隔てられていてもよい。融合構築物によりコードされるタンパク質生成物は、融合ポリペプチドと呼ばれる。スペーサーは、ポリペプチドの特性（例えば、溶解度または細胞内輸送）が変化させるポリペプチドをコードし得る。
本明細書において使用される場合、融合タンパク質は、直接的またはペプチド結合を介して間接的に連結された２以上のタンパク質もしくはペプチドに由来する２以上の部分を含むキメラタンパク質をいう。
本明細書において使用される場合、多量体化ドメインは、ポリペプチド分子の、相補的な多量体化ドメインを含む別のポリペプチド分子との安定な相互作用を容易にするアミノ酸の配列をいい、この相補的な多量体化ドメインは、第一のドメインと安定な多量体を形成するために、同じ多量体化ドメインであっても異なる多量体化ドメインであってもよい。一般に、ポリペプチドは、多量体化ドメインに対し直接的に、または間接的に接合される。例示的な多量体化ドメインとしては、免疫グロブリン配列またはその一部分、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域、適合性のタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン（例えば、ＰＫＡのＲサブユニットおよびアンカードメイン（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ：ＡＤ）が挙げられるがこれらに限定されない）、２分子間で分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオール、ならびに安定な多量体を形成する、腔内の隆起部（すなわち、穴内のノブ（ｋｎｏｂ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅ））および同一もしくは類似の大きさの代償性の腔が挙げられる。多量体化ドメインは、例えば、免疫グロブリンの定常領域であり得る。免疫グロブリンの配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＭに由来するＦｃドメインまたはこれらの一部分のような、免疫グロブリンの定常ドメインであり得る。
本明細書において使用される場合、「穴内のノブ」（また、本明細書において腔内の隆起部とも呼ばれる）は、このようなドメイン間および／または中での立体的な相互作用が、安定な相互作用を促進するのみならず、単量体の混合物から、ホモ二量体（またはホモ多量体）よりも多いヘテロ二量体（または多量体）の形成を促進するように設計された特定の多量体化ドメインをいう。これは、例えば、隆起部と腔とを構築することによって達成され得る。隆起部は、第一のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることによって構築され得る。この隆起部に対して同一もしくは類似の大きさの代償性の「腔」が、必要に応じて、大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることによって、第二のペプチドの界面上に作製される。
本明細書において使用される場合、相補的な多量体化ドメインは、相互作用して各々がこのようなドメインに対して連結されたポリペプチドの安定な多量体を形成する２以上の多量体化ドメインをいう。相補的な多量体化ドメインは、例えば、Ｆｃ領域、ロイシンジッパーおよびノブと穴のような、同じドメインのものであっても、ドメインのファミリーメンバーであってもよい。
本明細書において使用される場合、「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」は、最初の定常領域免疫グロブリンドメインを除いて抗体重鎖の定常領域を含むポリペプチドをいう。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥの最後から２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、または、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後から３つの定常領域免疫グロブリンドメインをいう。必要に応じて、Ｆｃドメインは、これらのドメインに対してＮ末端側に柔軟性のあるヒンジ領域の全体もしくは一部分を含み得る。ＩｇＡおよびＩｇＭについては、Ｆｃは、Ｊ鎖を含み得る。ＩｇＧの例示的なＦｃドメインについて、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ２を含み、そして必要に応じて、Ｃγ１とＣγ２との間のヒンジ領域の全体もしくは一部分を含む。Ｆｃ領域の境界は多様であり得るが、代表的には、ヒンジ領域の少なくとも一部分を含み得る。ＩｇＧ Ｆｃドメインの例示的な配列は、配列番号１６７に示される。さらに、Ｆｃはまた、任意の対立遺伝子改変体もしくは種改変体、または、任意の改変体もしくは改変された形態（例えば、ＦｃＲに対する結合を変化させるか、または、Ｆｃ媒介性のエフェクター機能を変化させる任意の改変体または改変された形態）を含む。改変されたＦｃドメインを含む他のＦｃドメインの例示的な配列は、配列番号１６８または１６９に示される。
本明細書において使用される場合、「Ｆｃキメラ」は、１以上のポリペプチドが、Ｆｃ領域もしくはその誘導体に対し、直接的または間接的に連結された、キメラポリペプチドをいう。代表的には、Ｆｃキメラは、免疫グロブリンのＦｃ領域を、例えば、ＥＣＤポリペプチドのような別のポリペプチドと組合せたものである。改変されたＦｃポリペプチドの誘導体は、当業者に公知である。
本明細書において使用される場合、ＥＣＤ部分と多量体化ドメインとを含む少なくとも２つのキメラポリペプチドを含むポリペプチドもまた、「ＥＣＤ多量体」と呼ばれる（また、ホモ多量体、ヘテロ多量体、ホモ二量体またはヘテロ二量体とも呼ばれる）。多量体化ドメインが抗体もしくはその一部分に由来する場合、ポリペプチドは、免疫付着因子またはレセプター本体の二量体または多量体と呼ばれ得る。多量体の構成要素であるポリペプチドはまた、本明細書において、キメラポリペプチドと呼ばれる。多量体化ドメインのＥＣＤへの結合は、直接的であっても間接的であってもよく、そして、融合タンパク質を生成するための組換え核酸法を用いて達成され得る。結合はまた、例えば、ヘテロ二官能化試薬を用いるなどの化学的カップリング法を用いて達成され得る。例示的なカップリング剤としては、以下が挙げられる：Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ミリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアネート）、および、ビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）。
本明細書において使用される場合、抗体は、その標的に対して固有の特定の抗原を認識する特定のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子をいう。免疫グロブリンは、構造的には、２つの同一の重鎖（５クラスの重鎖のいずれかに由来：γ、δ、α、μ、ε）と、ジスルフィド結合で連結された２つの同一の軽鎖とを含む「Ｙ」字型分子のように見える、糖タンパク質である。各重鎖は、同じクラスの全免疫グロブリンについて同一である定常領域（ＣＨ）と、抗原結合部位として機能し、抗原特異性に依存して免疫グロブリン間で異なる可変領域（ＶＨ）とを有する。重鎖γ、δ、αは、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）から構成される定常領域を有し、そして、ヒンジ領域を有するが、一方、重鎖μ、εの定常領域は、４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）から構成される。軽鎖は、１つの定常（ＣＬ）ドメインと１つの可変（ＶＬ）ドメインとを有する。本明細書における目的では、抗体に対する参照は、その１以上のドメインを含む免疫グロブリン分子の全体もしくは一部分を含む分子をいう。例えば、Ｆａｂフラグメントは、重鎖および軽鎖の各々の１つの定常ドメインと１つの可変ドメインとから構成される、抗体分子の一部である。Ｆｃフラグメントは、２〜３の定常ドメインと、必要に応じて、重鎖のヒンジ領域の全体もしくは一部分（抗体のクラスに依存する）とから構成される。したがって、抗体に対する参照は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または、抗体分子の一部分を含む任意の分子（例えば、レセプター本体の二量体または多量体）をいい、ここで、２つのポリペプチド（すなわち、少なくとも２つのＣＳＲのＥＣＤまたはその一部分）を連結する多量体化ドメインは、一緒になって、抗体またはその一部分（例えば、Ｆｃフラグメント）である。
本明細書において使用される場合、モノクローナル抗体は、Ｂ細胞の腫瘍細胞との融合による単一のハイブリッド細胞のクローンにより実験室において作製される高度に特異的な抗体をいう。
本明細書において使用される場合、結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）は、２以上の分子の接合、対形成または会合をいう。例えば、同じかもしくは異なる２以上のポリペプチド（または、そのフラグメント、ドメインもしくは活性部分）が一緒に接合されても、１つのポリペプチド（または、そのフラグメント、ドメインもしくは活性部分）が、合成分子もしくは化学分子または他の部分と接合されてもよい。２以上の分子の会合は、１つのポリペプチドをコードする核酸配列を、別のポリペプチドをコードする核酸配列と接合することなどにより、直接的な結合によってなされてもよいし、１つの分子の別の分子との非共有結合性もしくは共有結合性のカップリングなどにより、間接的になされてもよい。例えば、２以上の分子またはポリペプチドの結合は、化学結合によって達成され得る。
本明細書において使用される場合、「タグ」または「エピトープタグ」は、代表的には、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に加えられるアミノ酸の配列である。ポリペプチドに融合されたタグを含めることで、ポリペプチドの精製および／または検出を促進し得る。代表的には、タグまたはタグポリペプチドは、抗体によって認識されるエピトープを提供するか、または、検出もしくは精製のために働き得るに十分な残基を有するが、このタグまたはタグポリペプチドが連結されるキメラポリペプチドの活性と緩衝しないように十分に短いポリペプチドをいう。タグポリペプチドは、代表的には十分に固有であるので、このタグポリペプチドに特異的に結合する抗体は、このタグポリペプチドが連結されるポリペプチドにおけるエピトープと、実質的に交差反応しない。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも５または６アミノ酸残基を有し、そして、通常は、約８〜５０の間のアミノ酸残基、代表的には９〜３０の間の残基を有する。タグは、多量体における１以上のキメラポリペプチドに対して連結され得、そして、サンプルもしくは混合物からの多量体の検出またはその回収を可能にする。このようなタグは周知であり、そして、容易に合成および設計され得る。例示的なタグポリペプチドとしては、アフィニティ精製のために使用されるものが挙げられ、そして、Ｈｉｓタグ、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグポリペプチドおよびその抗体である１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２１５９−２１６５）；ｃ−ｍｙｃタグおよびこれに対する８Ｆ９抗体、３Ｃ７抗体、６Ｅ１０抗体、Ｇ４抗体、Ｂ７抗体および９Ｅ１０抗体（例えば、Ｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：３６１０−３６１６を参照のこと）；ならびに、単純疱疹ウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３：５４７−５５３（１９９０））が挙げられる。
本明細書において使用される場合、融合タグ化ポリペプチドとは、タグポリペプチドに融合されたＥＣＤポリペプチドを含むキメラポリペプチドをいう。
本明細書において使用される場合、係留（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）とは、単量体レセプターの２つのドメイン間の相互作用をいい、これによって、モノマーを相互作用にあまり利用可能でないようにする立体配座の単量体を生じる。例えば、サブドメインＩＩ（Ｓ１）は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４において、そのサブドメインＩＶ（Ｓ２）ドメインと相互作用して、係留された不活性な構造を形成し得る。係留された状態にあるとき、レセプターまたはそのアイソフォームは、二量体化および／またはレセプター結合にあまり利用可能でないか、または、全く利用可能でない。ＨＥＲ１、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４の単量体形態のＥＣＤは、非係留型の形態よりも低いリガンド親和性を示す係留型形態をとる。サブドメインＩＶにおいて特定の残基を欠くＨＥＲ２は、非係留型の形態をとり、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４との二量体化に有効である。係留型（単量体性）形態とのリガンド結合の際に、係留相互作用が解かれ、そして、ＥＣＤ（またはレセプター）が、２つのＥＣＤのドメインＩＩ間の相互作用を伴う二量体化に利用可能な立体配座となる。
本明細書において使用される場合、本明細書中でのＣＳＲまたはＨＥＲレセプターの活性の調節に対する参照は、このようなレセプターの任意の活性（例えば、リガンド結合または他のシグナル伝達に関連する活性）が変更されることを意味する。
本明細書において使用される場合、背中合わせの立体配置とは、２つのＥＣＤの各々が、細胞表面レセプターとの二量体化に利用可能となるような２つのＥＣＤの立体配置をいう。背中合わせの立体配置をとるとき、多量体化ドメインを含むキメラポリペプチドのＥＣＤ部分の各々は、ＥＣＤ多量体の形成の際に、各ＥＣＤまたはその一部分が細胞表面レセプターとの二量体化に利用可能となるように配向される。
本明細書において使用される場合、２つのキメラポリペプチドに関しての二量体および二量体化とは、２つのキメラポリペプチド間の相互作用をいう。適切に二量体化されるとき、キメラポリペプチドの各々または少なくとも一方におけるＥＣＤは、細胞表面レセプターとの二量体化に利用可能である。
本明細書において使用される場合、「細胞表面レセプターとの二量体化」とは、細胞表面レセプターの、本明細書において提供される多量体中のＥＣＤまたは別の細胞表面レセプターとの相互作用をいう。この言葉が指す「二量体」または「二量体化」は、文脈から明らかである。
本明細書において使用される場合、「ドメインを含むポリペプチド」とは、同系レセプターの対応するドメインを参照して完全なドメインを含むポリペプチドをいう。完全なドメインは、同系のポリペプチド内のその特定のドメインの定義を参照して決定される。例えば、ドメインを含むレセプターアイソフォームは、同系レセプターにおいて見られるような完全なドメインに対応するドメインを含むアイソフォームをいう。例えば、同系レセプターがアミノ酸位置４００〜４２０の間に２１アミノ酸の膜貫通型ドメインを含む場合、このような膜貫通型ドメインを含むレセプターアイソフォームは、同系レセプターの２１アミノ酸のドメインと実質的な同一性を有する２１アミノ酸のドメインを含む。実質的な同一性とは、同系のレセプターのドメインと比較したときに、対立遺伝子のバリエーションおよび保存的置換を含み得るドメインをいう。実質的に同一なドメインは、同系レセプターのドメインと比較して、アミノ酸の欠失も、非保存的置換も、挿入も有さない。
本明細書において使用される場合、対立遺伝子改変体または対立遺伝子のバリエーションとは、遺伝子の参照形態とは異なる遺伝子によってコードされる（すなわち、対立遺伝子によりコードされる）ポリペプチドをいう。代表的には、遺伝子の参照形態は、ある種の集団または単一の参照メンバーに由来するポリペプチドの、野生型形態および／または優性な形態をコードする。代表的には、種間での改変体を含む対立遺伝子改変体は、代表的に、同じ種に由来する野生型形態および／または優性の形態に対して、少なくとも８０％、９０％またはそれより高いアミノ酸同一性を有する；同一性の程度は、遺伝子と、その比較が種間であるかまたは種内であるかに依存する。一般に、種内の対立遺伝子改変体は、野生型形態および／または優性の形態に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％もしくは９５％またはそれより高い同一性を有する（ポリペプチドの野生型形態および／または優性の形態に対する９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い同一性を含む）。
本明細書において使用される場合、種改変体とは、種間での同じポリペプチドの改変体をいう。一般に、種間改変体は、別の種に由来する野生型形態および／または優性の形態に対して、少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％またはそれより高い同一性を有する（ポリペプチドの野生型形態および／または優性の形態に対する９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い同一性を含む）
本明細書において使用される場合、改変とは、ポリペプチドのアミノ酸配列の改変、または、核酸分子におけるヌクレオチド配列の改変をいい、そして、それぞれ、アミノ酸およびヌクレオチドの欠失、挿入および置換を含む。
本明細書において使用される場合、オープンリーディングフレームとは、核酸分子における、機能的なポリペプチドまたはその一部分（代表的には、少なくとも５０アミノ酸）をコードするヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列をいう。オープンリーディングフレームは、全長ポリペプチドまたはその一部分をコードし得る。オープンリーディングフレームは、イントロン内に終止コドンがあり、かつイントロンの全体もしくは一部分が翻訳されたｍＲＮＡである場合、１以上のエキソンまたは１つのエキソンとイントロンとを作動可能に連結することによって作製され得る。
本明細書において使用される場合、ポリペプチドは、共有結合された２以上のアミノ酸をいう。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において交換可能に使用される。
本明細書において使用される場合、核酸分子またはタンパク質の短縮に関して、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）または短縮（ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）とは、タンパク質または核酸分子の野生型形態または優性な形態と比較して、全長よりも短い、核酸分子においてはヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドの配列、または、ポリペプチドにおいてはアミノ酸残基の配列をいう。
本明細書において使用される場合、参照遺伝子とは、遺伝子内のイントロンおよびエキソンをマッピングするために使用され得る遺伝子をいう。参照遺伝子は、例えば、発現された遺伝子配列と比較されて、その遺伝子におけるイントロンおよびエキソンをマッピングし得る、ゲノムＤＮＡまたはその一部分であり得る。参照遺伝子はまた、ポリペプチドの野生型形態または優性な形態をコードする遺伝子であり得る。
本明細書において使用される場合、タンパク質または遺伝子のファミリーまたは関連ファミリーとは、それぞれ、互いに対して相同性および／または構造的類似性および／または機能的類似性を有する、タンパク質または遺伝子のグループをいう。
本明細書において使用される場合、早発の（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ）終止コドンとは、終止コドンがタンパク質の全長形態（例えば、ポリペプチドの野生型形態または優性）を生成するまたは作製するために使用される前に、核酸分子のオープンリーディングフレーム内に生じる終止コドンである。早発の終止コドンの出現は、例えば、選択的スプライシングおよび変異の結果であり得る。
本明細書において使用される場合、キナーゼとは、高分子および低分子を含む分子（代表的には生体分子）のリン酸化を触媒するタンパク質である。例えば、分子は、低分子またはタンパク質であり得る。リン酸化は、自己リン酸化を含む。いくつかのキナーゼは、構成的なキナーゼ活性を有する。他のキナーゼは、活性化を必要とする。例えば、シグナル伝達に関与する多くのキナーゼは、リン酸化を受ける。リン酸化が、経路における別の分子に対するそのキナーゼ活性を活性化する。いくつかのキナーゼは、タンパク質構造の変化および／または別の分子との相互作用によって調節される。例えば、タンパク質の複合体化または分子のキナーゼへの結合が、キナーゼ活性を活性化または阻害し得る。
本明細書において使用される場合、調節するおよび調節とは、タンパク質のような分子の活性の変化をいう。例示的な活性としては、シグナル伝達のような生物学的活性が挙げられるがこれらに限定されない。調節は、活性の増加（すなわち、アップレギュレーションまたはアゴニスト活性、活性の低下（すなわち、ダウンレギュレーションまたは阻害）、または、活性の任意の他の変化（例えば、周期性、頻度、期間、動態または他のパラメーターの変化）を含み得る。調節は、文脈依存性であり得、そして代表的には、調節は、指定される状態（例えば、野生型タンパク質、構成的な状態のタンパク質、または、指定される細胞のタイプもしくは状態において発現されるタンパク質）に対して比較される。
本明細書において使用される場合、阻害するおよび阻害とは、阻害されていない活性と比べた活性の低下をいう。
本明細書において使用される場合、組成物は、あらゆる混合物をいう。組成物は、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはこれらの任意の組合せであり得る。
本明細書において使用される場合、組合せ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）は、２以上のアイテム間の任意の結び付き（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）をいう。組合せは、２以上の別個のアイテム（例えば、２つの組成物または２つの集合物）であり得るか、その混合物（例えば、２以上のアイテムの単一の混合物）であり得るか、または、その任意のバリエーションであり得る。組合せの構成要素は、一般に、機能的に結び付けられているか、または関連している。キットは、必要に応じて、組合せまたはその構成要素の使用のための説明書を備える、包装された組合せである。
本明細書において使用される場合、薬学的な作用または治療的な作用とは、疾患もしくは障害の処置に意図される因子を投与した際に観察される作用、または、これらの症状の改善をいう。
本明細書において使用される場合、新脈管形成（新脈管形成）は、既存の血管からの新血管の形成をいう；新生血管形成（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）は、新生血管の形成をいう。生理学的な新脈管形成は、厳密に調節されており、そして、生殖および胚発生に必須である。出生後および成体の寿命の間、新脈管形成は、創傷修復において、および運動をした筋肉において生じ、そして一般には、数日または数週間に限定される。対照的に、病理学的な新脈管形成（または、異常な新脈管形成）は、数ヶ月または数年にわたって持続し得、例えば、固形腫瘍および白血病の増殖を支える。病理学的な新脈管形成は、炎症性細胞が慢性炎症の部位（例えば、クローン病および慢性膀胱炎）へと進入するための導管を提供する。病理学的な新脈管形成は、盲目の最も一般的な原因である；病理学的な新脈管形成は、慢性関節リウマチにおいて軟骨を破壊し、そして、アテローム性動脈硬化症のプラークの増殖および出血に寄与する。病理学的な新脈管形成は、子宮内膜症における腹腔内出血をもたらす。腫瘍の増殖は、新脈管形成依存的である。腫瘍は、新脈管形成を刺激する因子を放出することによって、その自身への血液供給を補充する。このような因子としては、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、Ｔｅｋ、ＥＰＨＡ２、ＡＧＥなどが挙げられる。ＡＧＥ−ＲＡＧＥは、ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１因子を介してＶＥＧＦ遺伝子の翻訳を活性化することにより新脈管形成を誘発させ得る。ＶＥＧＦは、乳癌、肺癌、結腸直腸癌を含む多数のヒトの癌において過剰産生される。
本明細書において使用される場合、新脈管形成疾患（または新脈管形成関連疾患）は、新脈管形成のバランスが変わっているか、または、新脈管形成のタイミングが変わっている疾患である。新脈管形成疾患は、望ましくない血管新生のような新脈管形成の変化が生じる疾患を含む。このような疾患としては、細胞増殖性障害（癌、糖尿病性網膜症および他の糖尿病の合併症を含む）、炎症性疾患、子宮内膜症、および、上記したものを含めて、過度の血管新生が疾患プロセスの一部となる他の疾患が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書において使用される場合、ＨＥＲ（ＥｒｂＢ）関連疾患またはＨＥＲレセプター媒介性疾患とは、その病因、病理または発症のいくつかの局面にＨＥＲレセプターおよび／またはリガンドが関与しているあらゆる疾患、状態または障害である。具体的には、この関与とは、例えば、ＨＥＲレセプターファミリーメンバーまたはリガンドの発現または過剰発現または活性を含む。疾患としては、癌（例えば、膵臓癌、胃癌、頭頚部癌、子宮頸部癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、前立腺癌、食道癌、卵巣癌、子宮癌、神経膠腫、膀胱癌、腎臓癌または乳癌であるがこれらに限定されない）を含む増殖性疾患が挙げられるがこれらに限定されない。他の状態としては細胞の増殖および／または遊走を伴うものを含み、これには、病理学的な炎症応答、非悪性の過増殖性疾患（例えば、眼の状態、皮膚の状態、平滑筋細胞の増殖および／または遊走から生じる状態、例えば、狭窄（再狭窄を含む）、アテローム性動脈硬化症、膀胱、心臓もしくは他の筋肉の肥厚、子宮内膜症または慢性関節リウマチ）が挙げられる。
本明細書において使用される場合、処置とは、状態、障害もしくは疾患の症状、または他の徴候が、改善されるか、または、他に有益なように変化させられる、任意の様式を意味する。
本明細書において使用される場合、治療的作用とは、疾患もしくは状態の症状を変化させる（代表的には、向上または改善する）か、または、疾患もしくは状態を治癒する、被験体の処置から得られる作用を意味する。治療上有効な量とは、被験体への投与後に治療的作用をもたらす、組成物、分子または化合物の量をいう。
本明細書において使用される場合、用語「被験体」とは、人間のような哺乳動物を含む動物をいう。
本明細書において使用される場合、「患者」とはヒト被験体をいう。
本明細書において使用される場合、「個体」は被験体であり得る。
本明細書において使用される場合、正常レベルまたは正常値は、当業者に公知の種々の方法で規定され得る。代表的には、正常レベルは、健常な集団におけるＣＳＲまたはＣＳＲリガンドの発現レベルをいう。正常レベル（または、参照レベル）は、特定の供給源（すなわち、血液、血清、組織または他の供給源）に由来するもののような、健常な被験体の測定値に基づく。しばしば、正常レベルは、「正常範囲」として特定され、これは、代表的には、健常な集団の中央の９５％の値の範囲を指す。参照値は、本明細書において正常レベルと交換可能に使用されるが、被験体または供給源に依存して、正常レベルとは異なり得る。例えば、ＣＳＲまたはリガンドの正常レベルは、２歳の患者と、５０歳の患者との間では異なり得る。したがって、参照レベルは、代表的には、その集団の特定の階層の正常レベルに依存する。したがって、本明細書における目的では、正常レベルまたは参照レベルは、予め決定された標準またはコントロールであり、これによって、試験患者が比較され得る。
本明細書において使用される場合、上昇したレベルとは、ＣＳＲまたはＣＳＲリガンドの発現の、正常レベルまたは参照レベルについて上昇した任意のレベルをいう。試験被験体におけるＣＳＲまたはＣＳＲリガンドの発現は、ＣＳＲまたはリガンドの正常レベルもしくはコントロールレベルと比較され、そのレベルが上昇しているかどうかを決定し得る。
本明細書において使用される場合、活性とは、生体分子（例えば、ポリペプチド）の機能または機能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ）または相互作用における変化をいう。このような活性の例は、以下であるがこれらに限定されない：複合体化、二量体化、多量体化、レセプターに関連するキナーゼ活性または他の酵素活性もしくは触媒活性、レセプターに関連するプロテアーゼ活性、リン酸化、脱リン酸化、自己リン酸化、他の分子と複合体を形成する能力、リガンド結合、触媒活性もしくは酵素活性、自己活性化および他のポリペプチドの活性化を含む活性化、別の分子の機能の阻害もしくは調節、シグナル伝達および／または細胞応答（例えば、細胞の増殖、遊走、分化および成長）の刺激または阻害、分解、膜局在化、膜結合、ならびに腫瘍形成。活性は、本明細書中に記載されるアッセイおよび当業者に公知の任意の適切なアッセイ（細胞ベースのアッセイを含めたインビトロアッセイ、特定の疾患についての動物モデルにおけるアッセイを含めたインビボアッセイが挙げられるがこれらに限定されない）によって評価され得る。
本明細書において使用される場合、複合体化は、複合体を形成するための、２以上の分子（例えば、２分子のタンパク質）の相互作用をいう。相互作用は、非共有結合および／または共有結合によるものであり得、そして、疎水性相互作用および静電性相互作用、ファンデルワールス力ならびに水素結合が挙げられるがこれらに限定されない。一般に、タンパク質−タンパク質相互作用は、疎水性相互作用と水素結合とを伴う。複合体化は、温度、ｐＨ、イオン強度および圧力、ならびにタンパク質の濃度のような環境条件によって影響され得る。
本明細書において使用される場合、二量体化は、２つの分子（例えば、２分子のレセプター）の相互作用をいう。二量体化は、２つの同一の分子が相互作用するホモ二量体化を含む。二量体化はまた、２つの異なる分子（例えば、２つの異なるレセプター分子）が相互作用するヘテロ二量体化を含む。代表的には、二量体化は、各分子に含まれる二量体化ドメインまたは多量体化ドメインの相互作用により、互いに相互作用する２つの分子を必要とする。同様に、多量体化は、二量体、三量体またはより高次の低重合体を形成する複数の分子の相互作用をいい、これらの分子は、同じタイプのものであるか、または異なるタイプのものである。
２つのキメラポリペプチドに関連する二量体化とは、各々の多量体化ドメイン間の相互作用によって生じる二量体化をいう。レセプターの二量体化は、レセプターの活性化をもたらす２つのレセプター間の二量体化、または、レセプターと二量体化して、次いで、そのレセプターの活性化を調節し得るＥＣＤ部分（例えば、ＥＣＤ多量体）とレセプターとの間の二量体化をいう。
本明細書において使用される場合、インシリコとは、コンピュータを用いて行われる研究および実験をいう。インシリコの方法としては、分子モデリング研究、生体分子ドッキング実験、ならびに、分子の構造および／またはプロセス（例えば、分子の相互作用）のバーチャル表示が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書において使用される場合、生物学的サンプルとは、生きた供給源もしくはウイルス性供給源または高分子および生体分子の他の供給源から得られる任意のサンプルをいい、そして、核酸またはタンパク質または他の高分子が得られ得る被験体の任意の細胞タイプまたは組織を含む。生物学的サンプルは、生物学的供給源から直接得られ得るか、または、サンプルは加工され得る。例えば、単離された核酸を増幅したものが、生物学的サンプルを構成する。生物学的サンプルとしては、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿および汗のような体液、動物および植物に由来する組織および器官のサンプル、ならびに、これらに由来する加工されたサンプルが挙げられるがこれらに限定されない。また、土壌および水のサンプル、ならびに、他の環境的サンプル、ウイルス、細菌、真菌、藻類、原虫およびこれらの成分も含まれる。
本明細書において使用される場合、用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）ならびにＲＮＡもしくはＤＮＡのいずれかのアナログまたは誘導体のような、一本鎖および／または二本鎖のポリヌクレオチドをいう。また、用語「核酸」には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡならびに他のこのようなアナログおよび誘導体またはこれらの組合せのような、核酸のアナログも含まれる。核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドを指し得る。この用語はまた、等価物として、ヌクレオチドアナログ、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドから作製された、ＲＮＡもしくはＤＮＡのいずれかの誘導体、改変体およびアナログも含む。デオキシリボヌクレオチドとしては、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジンが挙げられる。ＲＮＡについては、ウラシル塩基はウリジンである。
本明細書において使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも２つの連結されたヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を含む低重合体または重合体をいい、このヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、および、例えば、ヌクレオチドアナログもしくはホスホジエステル結合以外の「骨格」結合（例えば、ホスホロチオエート結合、チオエステル結合またはペプチド結合（ペプチド核酸）を含むＤＮＡもしくはＲＮＡ誘導体が挙げられる。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、本明細書において、「ポリヌクレオチド」と本質的に同義的に使用されるが、当業者は、オリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＲプライマー）が、一般には、約５０〜１００ヌクレオチドの長さより短いことを認識する。
ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドアナログを含み、例えば、以下のようなものが挙げられる：ポリヌクレオチドの質量による区別を可能にする、質量改変ヌクレオチド；ポリヌクレオチドの検出を可能にする、蛍光標識、放射性標識、発光性標識もしくは化学発光標識のような検出可能な標識を含むヌクレオチド；または、固体支持体へのポリヌクレオチドの固定化を促進する、ビオチンもしくはチオール基のような反応性基を含むヌクレオチド。ポリヌクレオチドはまた、選択的に（例えば、化学的に、酵素的に、または光分解的に）切断可能な１以上の骨格結合を含み得る。例えば、ポリヌクレオチドは、後ろに１以上のリボヌクレオチドが続き、その後ろに１以上のデオキシリボヌクレオチドが続き得る１以上のデオキシリボヌクレオチド（例えば、塩基性加水分解によってリボヌクレオチド配列において切断可能な配列）を含み得る。ポリヌクレオチドはまた、比較的切断に対して抵抗性の１以上の結合を含み得る。例えば、キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、ペプチド核酸結合によって連結されたヌクレオチドと、３’末端にあって、ホスホジエステル結合もしくは他の適切な結合によって連結され、そして、ポリメラーゼによって伸長され得る少なくとも１つのヌクレオチドとを含み得る。ペプチド核酸分子は、周知の方法（例えば、Ｗｅｉｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２７９２−２７９９（１９９７）を参照のこと）を用いて調製され得る。
本明細書において使用される場合、オリゴヌクレオチドとは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸アナログ（例えば、ＰＮＡ）およびこれらの組合せを含む重合体をいう。本明細書における目的では、プライマーおよびプローブは、一本鎖オリゴヌクレオチドであるか、または、部分的に一本鎖のオリゴヌクレオチドである。
本明細書において使用される場合、例えば、合成核酸または合成遺伝子または合成ペプチドに関する、合成とは、組換え法および／または化学合成法によって生成される核酸分子またはポリペプチド分子をいう。
本明細書において使用される場合、組換え技術または組換えＤＮＡ法を用いる方法による生成とは、クローニングされたＤＮＡによってコードされるタンパク質を発現させるための分子生物学の周知の方法を使用することを意味する。
本明細書において使用される場合、用語「ベクター」とは、自身に連結された別の核酸分子を輸送し得る核酸分子をいう。ベクターの１つのタイプは、エピソーム、すなわち、染色体外複製が可能な核酸である。ベクターとしては、自身に連結される核酸を自律的に複製および／または発現させ得るものが挙げられる。自身に作動可能に連結される遺伝子の発現を指向させ得るベクターは、本明細書において、「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、発現ベクターは、しばしば「プラスミド」の形態をとり、このプラスミドは、一般に、そのベクターの形態では染色体に結合しない二本鎖ＤＮＡループである。プラスミドは、ベクターの最も一般に使用される形態であるので、「プラスミド」および「ベクター」は、交換可能に使用される。他のこのような他の発現ベクターの形態も、同等の機能を果たし、そして、本明細書の後に当該分野において公知となる。
本明細書において使用される場合、核酸配列に関連する句「作動可能に連結される」とは、一般に、核酸分子またはそのセグメントが、一本鎖の形態であれ二本鎖の形態であれ、ＤＮＡもしくはＲＮＡのような１片の核酸へと共有結合により連結されることを意味する。セグメントは、必ずしも連続ではなく、むしろ、２以上の成分がその意図される様式で機能することを可能にする関係で並置される。例えば、ＲＮＡのセグメント（エキソン）は、スプライシングなどによって作動可能に連結されて、単一のＲＮＡ分子を形成し得る。別の例では、ＤＮＡセグメントが作動可能に連結され得、それによって、一方のセグメントの制御に関する制御性配列または調節性配列が、他のセグメントの発現または複製または他のこのような制御を可能にする。したがって、調節性領域がレポーターもしくは任意の他のポリヌクレオチドに作動可能に連結される場合、または、レポーターもしくは任意のポリヌクレオチドが調節性領域に作動可能に連結される場合、ポリヌクレオチド／レポーターの発現は、調節性領域によって影響を受けるかまたは制御される（例えば、調節されるかまたは変化させられる（増加または減少など））。遺伝子の発現に関して、ヌクレオチドの配列および調節性配列は、適切な分子シグナル（例えば、転写活性化タンパク質）がその調節性配列に結合されるときに遺伝子の発現を制御するかまたは可能にするような方法で接続される。ヌクレオチドの調節性配列およびエフェクター配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写終止部位および翻訳終止部位、ならびに他のシグナル配列）への異種性の核酸（例えば、ＤＮＡ）の作動可能な連結とは、このようなＤＮＡとこのようなヌクレオチド配列との間の関係性をいう。例えば、プロモーターへの異種性ＤＮＡの作動可能な連結とは、このようなＤＮＡの転写が、読み取り枠内のＤＮＡを特異的に認識、結合および転写するＲＮＡポリメラーゼによってそのプロモーターから開始されるような、そのＤＮＡとそのプロモーターとの間の物理的な関係性をいう。
本明細書において使用される場合、ヌクレオチドの調節性配列およびエフェクター配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写終止部位および翻訳終止部位、ならびに他のシグナル配列）への異種性の核酸の作動可能な連結とは、このような核酸（例えば、ＤＮＡ）とこのようなヌクレオチド配列との間の関係性をいう。例えば、プロモーターへの異種性ＤＮＡの作動可能な連結とは、このようなＤＮＡの転写が、そのＤＮＡを特異的に認識、結合および転写するＲＮＡポリメラーゼによってそのプロモーターから開始されるような、そのＤＮＡとそのプロモーターとの間の物理的な関係性をいう。したがって、作動可能に連結される、または、作動可能に関連付けられる、とは、核酸（例えば、ＤＮＡ）の、ヌクレオチドの調節性配列およびエフェクター配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写終止部位および翻訳終止部位、ならびに他のシグナル配列）との機能的な関係性をいう。発現および／またはインビトロでの転写を最適化するためには、クローンの５’非翻訳部分を除去、追加または変更して、余分な、潜在的には不適切な選択的翻訳開始（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）（すなわち、開始（ｓｔａｒｔ））コドン、あるいは、転写もしくは翻訳のいずれかのレベルで発現と干渉し得るかまたは発現を減少させ得る他の配列を排除することが必要であり得る。あるいは、コンセンサスリボソーム結合部位（例えば、Ｋｏｚａｋ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０（１９９１）を参照のこと）は開始コドンの直ぐ５’側に挿入され得、そして、発現を増強し得る。このような改変の妥当性（または必要性）は、経験的に決定され得る。
本明細書において使用される場合、例えば、句「細胞表面レセプターの少なくとも１つのサブドメインまたはその一部分が、別のサブドメインまたはその一部分に対して作動可能に連結される」という文脈において使用される場合のように、ポリペプチドに関する用語「作動可能に連結される」とは、２つのアミノ酸配列が、各配列における末端アミノ酸残基間のペプチド結合によって接合されて、単一のアミノ酸残基配列を形成することを意味する。
本明細書において使用される場合、アイソフォームおよびイントロン融合タンパク質のようなポリペプチドの生成（ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ）に関する句「核酸から生成される」とは、文字通りのポリペプチド分子の生成と、核酸分子の翻訳によるポリペプチドの生成とを含む。
本明細書において使用される場合、ポリペプチドに関する、産生（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）とは、発現および発現されたタンパク質（または、回収可能もしくは単離可能な発現されたタンパク質）の回収をいう。タンパク質の産生に影響を及ぼし得る因子としては、選択される発現系および宿主細胞、細胞培養の条件、宿主細胞によるタンパク質の分泌、ならびに、精製の目的のためにタンパク質を検出する能力が挙げられる。タンパク質の産生は、例えば、細胞培養培地中などへのタンパク質の分泌を評価することによってモニタリングされ得る。
本明細書において使用される場合、分泌とは、タンパク質が細胞外環境へと輸送されるか、または、グラム陰性細菌の場合には、ペリプラズム空間へと輸送されるプロセスをいう。一般に、分泌は、細胞（例えば、真核生物細胞）における分泌経路を通って起こるが、これは、小胞体およびゴルジ装置を必要とする。
本明細書において使用される場合、異なる種に由来する分子（例えば、核酸分子またはポリペプチド）に関する相同とは、対応する分子（すなわち、種改変体）をいう。このような分子は、代表的に類似しており、そして一般に、約４５％の配列同一性または相同性を共有する。当業者は、種間の相同体を同定し得る。
本明細書において使用される場合、異種性の核酸は、その核酸が発現される細胞によってインビボでは通常は産生されない核酸、または、その細胞によって産生はされるものの、異なる遺伝子座にあったり異なるように発現されたりする核酸、または、転写、翻訳もしくは他の調節可能な生化学プロセスに変化をもたらすことによって、外因性の核酸（例えば、ＤＮＡ）の発現を変化させるメディエーターを媒介もしくはコードする核酸である。異種性の核酸は、一般に、その核酸が導入される細胞に対して内因性ではないが、別の細胞から得られるか、または、合成により調製されたものである。異種性の核酸は、内因性であり得るが、異なる遺伝子座から発現されるか、または、その発現が変化した核酸である。一般に、必ずしもそうではないが、このような核酸は、細胞によって通常は産生されないか、または、その核酸が発現される細胞と同じようには産生されないＲＮＡおよびタンパク質をコードする。異種性の核酸（例えば、ＤＮＡ）はまた、外来性の核酸（例えば、ＤＮＡ）とも呼ばれ得る。したがって、異種性の核酸または外来性の核酸は、対応する核酸分子（例えば、ＤＮＡ）がゲノムにおいて見出されるのとまさに同じ配向または位置では存在しない核酸分子を含む。また、これは、別の生物または種に由来する（すなわち、外来性）の核酸分子も指し得る。単離された核酸分子に関する、異種性の核酸とは、このような分子の別の部分に由来する異なる供給源または遺伝子座から誘導された、このような分子の一部分を指し得る。異種性の分泌シグナルの例としては、コードされる分子の内因性シグナル配列ではない、任意のプレ配列（すなわち、シグナル配列）またはプレプロ配列（例えば、ｔＰＡプレプロ配列、プレプロガストリン配列および当業者に公知の任意の他の配列であるが、これらに限定されない）が挙げられる。
同様に、ポリペプチドの一部分に関する、異種性とは、他の部分と比較したときの、キメラポリペプチドの一部分をいう。したがって、ＨＥＲ１由来のサブドメインＩ、ＨＥＲ２由来のサブドメインＩＩおよびＨＥＲ３由来のサブドメインＩＩＩを含むハイブリッドＥＣＤにおいて、サブドメインの各々は、他のサブドメインの各々に対して異種性である。
異種分子は、異なる遺伝子供給源または種に由来し得る。したがって、特定のＣＳＲ ＥＣＤまたはそのアイソフォームに対して異種性の分子としては、ＣＳＲ ＥＣＤまたはそのアイソフォームに由来しないか、または、これに対して内因性ではない配列を含む任意の分子が挙げられる。異種分子の例としては、同じ種もしくは異なる種の異なるポリペプチドに由来する分泌シグナル、融合タグもしくは標識のようなタグ、または任意の他の分子の全体もしくは一部分が挙げられる。異種分子は、融合分子もしくはキメラ分子の生成のために、関心のある核酸もしくはポリペプチドの配列に対して融合され得るか、または、共有結合もしくは非共有結合によって化学的に連結され得る。
本明細書において使用される場合、異種性の分泌シグナルとは、内因性のシグナル配列とは配列が異なる、同じ種もしくは異なる種に由来するポリペプチドからのシグナル配列をいう。異種性の分泌シグナルは、そのシグナル配列が由来する宿主細胞において使用され得るか、または、シグナル配列が由来する細胞とは異なる宿主細胞において使用され得る。
本明細書において使用される場合、例えば、ＥＣＤの活性な部分に関してなどの、ポリペプチドの活性な部分とは、ポリペプチドの活性を有する部分をいう。
本明細書において使用される場合、タンパク質の精製とは、細胞および組織の構成要素（ＤＮＡ、細胞膜および他のタンパク質を含む）を含み得るホモジネートなどから、タンパク質を単離するプロセスをいう。タンパク質は、当業者に公知の任意の種々の方法（例えば、段階的なｐＨのゲルもしくはイオン交換カラムを通すことによりその等電点に従って、サイズ排除クロマトグラフィーもしくはＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）解析によりそのサイズもしくは分子量に従って、または、その疎水性に従って）で精製され得る。他の精製技術としては、沈降またはアフィニティクロマトグラフィー（免疫アフィニティクロマトグラフィーを含む）ならびに、任意のこれらの方法の組合せを含む他の技術および方法が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、精製は、分子上にタグ（例えば、アフィニティ精製のためのｈｉｓタグ、または、同定のための検出可能なマーカー）を含めることによって促進され得る。
本明細書において使用される場合、分子（例えば、核酸分子、オリゴヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体）に関して、「単離された」とは、分子が、その天然環境において見られる状態から、人の手によって変えられたことを示す。例えば、組換え宿主細胞によって産生される分子、および／または組換え宿主細胞内に含まれる分子は、「単離された」とみなされる。同様に、天然の供給源もしくは組換え宿主細胞から部分的もしくは実質的に精製された分子、または、合成法によって生成された分子は、「単離された」とみなされる。意図される用途に依存して、単離された分子は、動物、細胞もしくはその抽出物中；脱水状態、蒸気、溶液もしくは懸濁液中；または、固体支持体上に固定される、などの任意の形態で存在し得る。
本明細書において使用される場合、実質的に純粋なポリペプチドまたは単離されたポリペプチド（または他の分子）は、交換可能に使用され、そして、クロマトグラフィー技術もしくは他のこのような技術（例えばクーマシーブルーもしくは銀染色を用いる、非還元条件もしくは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥなど）によって検出される場合に、そのポリペプチドが供給源または均質なサンプルから精製されていることを意味する。均質とは、代表的には、他の供給源のタンパク質での汚染が約５％未満または５％未満であることを意味する。
本明細書において使用される場合、検出とは、タンパク質の（眼または機器による）可視化を可能にする方法を含む。タンパク質は、そのタンパク質に対して特異的な抗体を用いて可視化され得る。タンパク質の検出はまた、エピトープタグまたは標識を含むタグとのタンパク質の融合によって容易にされ得る。
本明細書において使用される場合、標識とは、標識されたポリペプチドを生成するようにポリペプチドに対して直接的もしくは間接的に結合される、検出可能な化合物もしくは組成物をいう。標識は、それ自体（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）によって検出され得るか、または、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物の組成物の化学的な変更を触媒し得る。標識の非限定的な例には、蛍光生成部分、緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼを含んだ。
本明細書において使用される場合、発現とは、遺伝子のコードする情報が、細胞中で存在し、機能している構造に変換されるプロセスをいう。発現される遺伝子としては、ｍＲＮＡに転写され、次いで、タンパク質に翻訳されるもの、および、ＲＮＡには転写されるが、タンパク質には翻訳されないもの（例えば、トランスファーＲＮＡおよびリボソームＲＮＡ）が挙げられる。本明細書における目的では、発現されるタンパク質は、細胞の内側（例えば、細胞質内）に保持され得るか、または、細胞から分泌され得る。
本明細書において使用される場合、プロモーター領域とは、その領域が作動可能に連結されるＤＮＡの転写を制御する、遺伝子のＤＮＡの一部分をいう。プロモーター領域としては、ＲＮＡポリペプチドの識別、結合および転写開始に十分な、ＤＮＡの特定の配列が挙げられる。プロモーター領域のこの部分は、プロモーターとも呼ばれる。さらに、プロモーター領域としては、ＲＮＡポリメラーゼのこの識別、結合および転写開始の活性を調節する配列が挙げられる。これらの配列は、シス作用性の因子であっても、トランス作用性の因子に応答性であってもよい。プロモーターは、調節の性質に依存して、構成的であっても、調節性であってもよい。
本明細書において使用される場合、調節性領域は、作動可能に連結された遺伝子の発現を正もしくは負の方向に影響する、シス作用性のヌクレオチド配列を意味する。調節性領域としては、遺伝子の誘導性（すなわち、転写の増加に基質もしくは刺激を必要とする）の発現を与えるヌクレオチドの配列が挙げられる。誘導因子が存在するかまたはその濃度が増大しているとき、遺伝子の発現は増加され得る。調節性領域としてはまた、遺伝子発現の抑制を与える配列が挙げられる（すなわち、基質もしくは刺激が転写を減少させる）。抑制因子が存在するかまたはその濃度が増大しているとき、遺伝子発現は減少させられ得る。調節性領域は、多くのインビボでの生物学的活性（細胞の増殖、細胞の成長および死、細胞の分化ならびに免疫調節を含む）に影響を与えるか、調節するか、または制御することが知られる。調節性領域は、代表的には、１以上のトランス作用性のタンパク質に結合し、遺伝子の転写の増加もしくは減少のいずれかをもたらす。
遺伝子調節性領域の例は、プロモーターおよびエンハンサーである。プロモーターは、転写開始部位もしくは翻訳開始部位付近に位置する（代表的には、翻訳開始部位の５’に位置する）配列である。プロモーターは通常、翻訳開始部位の１Ｋｂ以内に位置するが、さらに遠く離れて（例えば、２Ｋｂ、３Ｋｂ、４Ｋｂ、５ｋＢまたはそれより遠く、最大で１０Ｋｂ離れて）位置し得る。エンハンサーは、遺伝子の５’もしくは３’に位置するとき、あるいは、エキソンもしくはイントロン内、または、これらの部分に位置するとき、遺伝子の発現に影響を与えることが知られる。エンハンサーはまた、遺伝子からかなり離れた距離において（例えば、約３Ｋｂ、５Ｋｂ、７Ｋｂ、１０Ｋｂ、１５Ｋｂまたはそれより離れた距離において）機能し得る。
調節性領域としてはまた、プロモーター領域に加えて、翻訳を促進する配列、イントロンのためのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのインフレームでの翻訳を可能にする遺伝子の正確な読み取り枠の維持、ならびに、終止コドン、リーダー配列および融合パートナー配列、複数の遺伝子の作製のための内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）エレメント、多シストロン性のメッセージ（ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｍｅｓｓａｇｅｓ）、関心のある遺伝子の転写の適切なポリアデニル化を提供するポリアデニル化シグナル、ならびに終止コドンが挙げられ、そして、必要に応じて、発現ベクター内に含められ得る。
本明細書において使用される場合、本明細書中に登場する種々のアミノ酸配列に見出される「アミノ酸」とは、その周知の三文字または一文字の省略形（表２を参照のこと）に従って同定される。種々のＤＮＡフラグメントに見出されるヌクレオチドは、当該分野で慣用的に使用される標準的な一文字表記で示される。
本明細書において使用される場合、「アミノ酸残基」とは、そのペプチド結合におけるポリペプチドの化学的消化（加水分解）の際に形成されるアミノ酸をいう。本明細書において記載されるアミノ酸残基は、一般に、「Ｌ」異性体の形態である。所望の機能的特性がポリペプチドによって保持される限りは、「Ｄ」異性体の形態の残基が任意のＬ−アミノ酸残基を置き換え得る。ＮＨ２はポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基をいう。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基をいう。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５２−５９（１９６９）に記載され、米国特許法施行規則§§１．８２１−１．８２２において採用された、標準的な命名法を遵守して、アミノ酸残基についての省略形を以下の表２に示す：
本明細書において式によって表現されるアミノ酸残基の配列は全て、アミノ末端からカルボキシル末端という従来の方向で、左から右の配向を有する。さらに、句「アミノ酸残基」は、対応表において列挙されるアミノ酸の改変されたもの、非天然のものおよび異常なアミノ酸を含むものと定義される。さらに、アミノ酸残基配列の開始または末端にあるダッシュ（−）は、そのペプチドが、１以上のアミノ酸残基のさらなる配列に、または、ＮＨ２のようなアミノ末端基に、または、ＣＯＯＨのようなカルボキシル末端基に結合されることを示す。
ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の適切な保存的置換は、当業者に公知であり、そして、一般には、結果として生じる分子の活性を変化させることなくなされ得る。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換が生物学的活性を実質的には変化させないことを認識する（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．ｃｏ．，ｐ．２２４を参照のこと）。
このような置換は、例えば、以下のような表３に示されるものに従ってなされ得る：
非保存的な変更を含む他の置換もまた許容され、そして、経験的に、または、他の公知の保存的置換もしくは非保存的置換に従って決定され得る。
本明細書において使用される場合、ペプチド模倣物とは、特定のペプチドの生物学的に活性な形態の立体配座および特定の立体化学的特徴を模倣する化合物である。一般に、ペプチド模倣物は、化合物の特定の所望の特性を模倣するが、生物学的に活性な立体配座の喪失および結合の破壊につながる望ましくない特性（例えば、柔軟性）は模倣しないように設計される。ペプチド模倣物は、望ましくない特性に寄与する特定の基または結合を生物同配体（ｂｉｏｉｓｏｓｔｅｒｅ）で置き換えることによって、生物学的に活性な化合物から調製され得る。生物同配体は、当業者に公知である。例えば、メチレンの生物同配体であるＣＨ２Ｓは、エンケファリンアナログにおけるアミド代替物として使用されている（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ（１９８３）ｐｐ．２６７−３５７ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｅｄ．ｖｏｌｕｍｅ ７，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。経口投与され得るモルヒネは、ペプチドエンドルフィンのペプチド模倣物である化合物である。本明細書における目的では、ペプチド模倣物には、１以上のペプチド結合が模倣物によって置き換えられたポリペプチドとして、環状ペプチドが含まれる。本明細書において提供されるヘテロ多量体および多量体およびハイブリッドＥＣＤおよびキメラポリペプチドは、結合を模倣物で置き換えることによって改変され得、このような分子が本明細書中に提供される。
本明細書において使用される場合、２つのタンパク質または核酸間の「類似性」とは、タンパク質のアミノ酸配列間または核酸のヌクレオチド配列間の関連性をいう。類似性は、配列およびその配列に含まれる残基の同一性および／または相同性の程度に基づき得る。タンパク質または核酸間の類似性の度合いを評価するための方法は当業者に公知である。例えば、配列の類似性を評価する１つの方法において、２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、配列間で最大レベルの同一性を得る様式で整列される。「同一性」とは、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列が不変である程度をいう。アミノ酸配列の、そして、ある程度は、ヌクレオチド配列のアラインメントもまた、アミノ酸（またはヌクレオチド）における保存的な相違および／または頻繁な置換を考慮し得る。保存的な相違とは、関与する残基の物理化学的特性を保存する相違である。アラインメントは、グローバル（配列の全長にわたった、全ての残基を含む比較配列のアラインメント）またはローカル（最も類似的な領域のみを含む配列の一部分のアラインメント）であり得る。
「同一性」は本質的に、当該分野で認識される意味を有し、そして、公開された技術を用いて計算され得る（例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１を参照のこと）。２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列間の同一性を測定するための多数の方法が存在するが、用語「同一性」は、当業者に周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆ Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３（１９８８））。
本明細書において使用される場合、アイソフォームの全長に対して、各配列番号の全長に沿って比較される配列同一性は、特定の配列番号によって指定される参照ポリペプチドのその全長に対する、その全長に沿ったアイソフォームポリペプチドのアミノ酸配列の同一性の割合をいう。例えば、ポリペプチドＡが１００アミノ酸を有し、ポリペプチドＢがポリペプチドＡのアミノ酸１〜９５に対して同一な９５アミノ酸を有する場合、ポリペプチドＢは、配列の同一性が、ポリペプチドＢの全長に対して比較されるポリペプチドＡの全長に沿って比較されるときに９５％の同一性を有する。代表的には、アイソフォームポリペプチドまたは参照ポリペプチドがシグナル配列を欠く成熟ポリペプチドである場合、配列の同一性は、シグナル配列部分を除くポリペプチドの全長に沿って比較される。例えば、アイソフォームはシグナルペプチドを欠くが、参照ポリペプチドはシグナルペプチドを含む場合、配列の同一性を決定するための両方のポリペプチドの全長に沿った比較は、参照ポリペプチドのシグナル配列部分を除外する。以下に考察されるように、そして、当業者に公知であるように、同一性を評価するための種々のプログラムおよび方法が当業者に公知である。例えば、全長を考慮するとき、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈのグローバルアラインメントアルゴリズムなどを用いるグローバルアラインメントが、２つの配列の最適なアラインメントおよび同一性を見出すために使用され得る。９０％または９５％の同一性のような高いレベルの同一性は、ソフトウェアなしで容易に決定され得る。
本明細書において使用される場合、（核酸および／またはアミノ酸配列に関して）相同とは、約２５％以上の配列相同性、代表的には、２５％以上、４０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上の配列相同性を意味する；必要な場合、正確な割合が特定され得る。本明細書における目的について、用語「相同性」および「同一性」は、そうでないと示されない限り、しばしば、交換可能に使用される。一般に、相同性または同一性の割合の決定のために、配列は、最も高い次元のマッチ（ｍａｔｃｈ）が得られるように整列される（例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；Ｃａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３を参照のこと）。配列が相同であることにより、保存されたアミノ酸の数が、標準的なアラインメントアルゴリズムプログラムによって決定され、そして、各供給元によって確立されたデフォルトのギャップペナルティを用いて使用され得る。実質的に相同な核酸分子は、代表的には中程度のストリンジェンシーまたは高いストリンジェンシーにおいて、関心のある核酸の全長に沿ってハイブリダイズする。また、ハイブリダイズしている核酸分子中のコドンの代わりに変質したコドンを含む核酸分子も企図される。
任意の２つの核酸分子が、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％「同一」または「相同」であるヌクレオチド配列を有するかどうかは、以下のような公知のコンピューターアルゴリズムを用いて決定され得る：例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４におけるようなデフォルトパラメーターを用いる「ＦＡＳＴ Ａ」プログラム（他のプログラムとしては、ＧＣＧプログラムパッケージが挙げられる（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（Ｉ）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３（１９９０）；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９４およびＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３）。例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎデータベースのＢＬＡＳＴ機能が、同一性を決定するために使用され得る。他の市販または公的に利用可能なプログラムとしては、ＤＮＡＳｔａｒの「ＭｅｇＡｌｉｇｎ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧ）の「Ｇａｐ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）が挙げられる。タンパク質および／または核酸分子の相同性または同一性の割合は、例えば、ＧＡＰコンピュータプログラム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２）によって改訂されたもの）を用いて配列情報を比較することによって決定され得る。簡単に述べると、ＧＡＰプログラムは、類似性を、整列された（同一である）記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を２つの配列うちの短い方における記号の総数で割ったものとして規定する。ＧＡＰプログラムについてのデフォルトパラメーターとしては以下が挙げられ得る：（１）Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，ＡＴＬＡＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＤ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８（１９７９）によって記載されるような、単項比較マトリクス（同一なものについては１の値、そして、同一でないものについては０の値を含む）と、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５の重み付け比較マトリクス；（２）各ギャップにつき３．０のペナルティと、各ギャップにおける各記号について追加の０．１０のペナルティ；ならびに末端のギャップについてはペナルティなし。
したがって、本明細書において使用される場合、用語「同一性」または「相同性」は、試験ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドと参照ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドとの間の比較を表す。
本明細書において使用される場合、用語「〜に対して少なくとも９０％同一」とは、参照の核酸配列またはアミノ酸配列に対して、９０〜９９．９９の同一性％をいう。９０％異常のレベルの同一性は、例示の目的で、１００アミノ酸の長さの試験ポリペプチドと参照ポリペプチドとを比較すると仮定すると、試験ポリペプチドにおける１０％（すなわち、１００個中１０個）以下のアミノ酸が、参照ポリペプチドのアミノ酸と異なるという事実を示す。同様の比較が、試験ポリヌクレオチドと参照ポリヌクレオチドとの間でなされ得る。このような相違は、アミノ酸配列の全長にわたって不規則に分布する点変異として表され得るか、または、許容される最大までの種々の長さの１以上の場所においてクラスター形成し得る。例えば、１０／１００のアミノ酸の相違（およそ９０％の同一性）。相違は、核酸またはアミノ酸の置換、挿入または欠失として規定される。約８５〜９０％を上回るレベルの相同性または同一性において、結果は、プログラムおよびギャップパラメーターの設定とは無関係であるべきである；このような高いレベルの同一性は、しばしば、ソフトウェアに頼らない手動でのアラインメントにより容易に評価され得る。
本明細書において使用される場合、整列された配列とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列における対応する位置を整列するために相同性（類似性および／または同一性）を使用することをいう。代表的には、５０％以上の同一性により関連付けられる２以上の配列が整列される。配列の整列される組合せ（ｓｅｔ）とは、対応する位置で整列される２以上の配列をいい、そして、ゲノムＤＮＡ配列と整列させた、ＲＮＡに由来する配列（例えば、ＥＳＴおよび他のｃＤＮＡ）の整列を含み得る。
本明細書において使用される場合、特定の割合の参照ポリペプチド中に示されるアミノ酸を含むポリペプチドは、ポリペプチドと参照ポリペプチドとの間で共有される、連続した同一なアミノ酸の部分をいう。例えば、１４７アミノ酸を列挙する配列番号ＸＸに示されるアミノ酸配列を持つ参照ポリペプチド中に示されるアミノ酸の７０％を含むアイソフォームは、参照ポリペプチドが、配列番号ＸＸのアミノ酸配列中に示される少なくとも１０３の連続したアミノ酸を含むことを意味する。
本明細書において使用される場合、「プライマー」とは、２以上の（一般には、３より多い）デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであって、そこからプライマー伸長産物の合成が開始され得るオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは、適切な緩衝液中で、適切な温度において、適切な条件下で（例えば、４種の異なるヌクレオシド三リン酸および重合化剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在下で）、テンプレートにより指向されるＤＮＡ合成の開始点として機能し得る。合成を行う実験条件としては、ヌクレオシド三リン酸と重合および伸長のための因子（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）と適切な緩衝液、温度およびｐＨの存在が挙げられる。
特定の核酸分子は、「プローブ」として、そして「プライマー」として機能し得る。しかし、プライマーは、伸長のための３’ヒドロキシル基としてである。プライマーは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ、ＲＮＡ ＰＣＲ、ＬＣＲ、複合ＰＣＲ、パンハンドル（ｐａｎｈａｎｄｌｅ）ＰＣＲ、捕捉ＰＣＲ、発現ＰＣＲ、３’および５’のＲＡＣＥ、インサイチュＰＣＲ、ライゲーションにより媒介されるＰＣＲ、ならびに他の増幅プロトコールを含む、種々の方法において使用され得る。
本明細書において使用される場合、「プライマーペア」は、増幅されるべき配列の５’末端にハイブリダイズする５’（上流）プライマーと、増幅されるべき配列の３’末端の相補体にハイブリダイズする３’（下流）プライマーとを含むプライマーのセットをいう。
本明細書において使用される場合、「特異的にハイブリダイズする」とは、ある核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）の、標的核酸分子への相補的な塩基対形成によるアニーリングをいう。当業者は、特異的なハイブリダイズに影響するインビトロおよびインビボのパラメーター（例えば、特定の分子の長さおよび組成）に精通している。特にインビトロハイブリダイゼーションに関連するパラメーターとしては、さらに、アニーリングおよび洗浄の温度、緩衝液の組成ならびに塩濃度が挙げられる。非特異的に結合した核酸分子を除くための例示的な洗浄条件は、高ストリンジェンシーにおいては０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳ、６５°Ｃであり、そして、中程度のストリンジェンシーにおいては０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳ、５０°Ｃである。等価なストリンジェンシー条件は当該分野で公知である。当業者は、特定の用途のために適切な、ある核酸分子の標的核酸分子への特異的なハイブリダイゼーションを達成するために、これらのパラメーターを容易に調整し得る。
本明細書において使用される場合、有効量とは、疾患もしくは障害の症状を、予防、治癒、改善、停止または部分的に停止するために必要な治療剤の量である。
本明細書において使用される場合、単位投薬形態とは、ヒトおよび動物の被験体に適切であり、かつ当該分野で公知であるように個別に包装された、物理的に別個の単位をいう。
本明細書において使用される場合、単回投薬用処方物（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）とは、直接的な投与のための処方物をいう。
本明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確にそうでないと指示しない限り、複数への参照を含む。したがって、例えば、「細胞外ドメイン（ａｎ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）」を含む化合物への参照は、１つまたは複数の細胞外ドメインを持つ化合物を含む。
本明細書において使用される場合、範囲および量は、「約」特定の値または範囲として表され得る。約、はまた、正確な量を含む。したがって、「約５塩基」は、「約５塩基」を意味するが、「５塩基」も意味する。
本明細書において使用される場合、「随意の」または「必要に応じて」とは、その後に記載される事象または状況が起こるか、または起こらないことを意味し、そして、この記載は、上記事象または状況が起こる場合と、上記事象または状況が起こらない場合を含む。例えば、必要に応じて置換された基とは、その基が置換されていないか、または、置換されていることを意味する。
Ｂ．汎細胞表面レセプター特異的な治療薬
１以上（代表的には２以上）の細胞表面レセプター（例えば、ＨＥＲファミリーのメンバー、特に、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４、インシュリン様増殖因子−１レセプター（ＩＧＦ−１ＲまたはＩＧＦ１Ｒ）、特に、ＩＧＦ１Ｒ、ならびに、血管内皮細胞増殖因子レセプター（ＶＥＧＦＲ）ファミリーのメンバー）と相互作用する、治療薬または候補治療薬である化合物が、本明細書において提供される。これらの治療薬および候補治療薬は、疾患の経路の活性化において協働する少なくとも１以上のレセプターおよび／またはそのリガンドを特異的に標的とすることによって作用する。このような治療薬は、単一のレセプターに対して標的化された治療薬に付随する問題を克服または対処する。
例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（Ｔｒａｓｔｕｚｉｍａｂ）のような抗ＨＥＲ薬物に関する問題は、ＨＥＲ２の過剰発現が乳癌の一部分のみにおいて生じることに起因して有効性が限られていること、また、薬物に対する耐性が他のレセプターの活性などによって生じ得ることに起因して応答期間が限られていることである。同様の問題は、ＨＥＲファミリーメンバー以外のレセプターを標的とする薬物でも観察される。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（Ｔｒａｓｔｕｚｉｍａｂ）の耐性に関する機構は、さらなるＨＥＲファミリーメンバーの共発現である。耐性の他の機構としては、ＩＧＦ−１Ｒの共発現；メタロプロテアーゼにより媒介されるＨＥＲ２の活性化（細胞外ドメインの「クリッピング」による）；および、しばしば、ＰＴＥＮ（癌において変異しているホスファターゼおよびテンシンの相同体（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄ ｔｅｎｓｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）；例えば、Ｎａｈｔａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．８：１２３−３８；Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ５：３４１−３５４を参照のこと）の欠失によって媒介される、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ（ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ−プロテインキナーゼＢ）経路のアップレギュレーションが挙げられる。ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ治療薬に対する耐性の機構は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（Ｔｒａｓｔｕｚｉｍａｂ）に対する耐性に関する機構と同様である。データは、患者の６０％（１４５人中８８人の患者）が、１または２のＨＥＲファミリーメンバーを発現し；１８．６％（１４５人中２７人）が３つのＨＥＲファミリーメンバーを共発現することを示す。データはまた、レセプターの発現の累積が、かなりより重篤な疾患を予測することを示す（ｐ＜０．０００１）。さらなるデータが、乳癌の約４０％が、２つのＨＥＲファミリーメンバーを共発現することを示す。他の癌におけるＨＥＲファミリーメンバーの共発現の頻度は、乳癌における頻度に匹敵し、約５０％までの患者がＨＥＲを同時に発現すると予測され、したがって、おそらくは、ＡＫＴ（プロテインキナーゼＢ）、および細胞増殖を刺激する他の細胞経路の活性化の累積の結果として、単一の因子を標的とする治療薬に対して抵抗性であり得る（Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ５：３４１−３５４）。ＨＥＲファミリーメンバーの同時の共発現はまた、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）（抗アポトーシス因子；Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２４：６２１３−６２２１）の誘導、ならびに、腫瘍の進行において重要な別の増殖因子（例えば、血管内皮増殖因子；ＶＥＧＦ）の産生の媒介をもたらす。
任意の特定のＨＥＲ指向性治療薬に対する耐性は、しばしば、他のＨＥＲファミリーメンバーの発現によって、または、関連するレセプターチロシンキナーゼ（例えば、ＩＧＦ１Ｒ、ＶＥＧＦＲ、ＦＧＦＲなど）の発現によって媒介されると、本明細書において結論付けられる。例えば、ＩＧＦ−１Ｒは、ＨＥＲ２とのヘテロ二量体化を介して、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（Ｔｒａｓｔｕｚｉｍａｂ）の活性を直接阻害する（Ｎａｈｔａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．８：１２３−３８）。
共過剰発現に加え、任意の特定のＨＥＲファミリーメンバーの過剰発現の頻度は、癌間で多様である。ＨＥＲファミリーのうち最も一般に過剰発現されるのは、ＨＥＲ１およびＨＥＲ３であり、最も一般に過剰発現されないメンバーはＨＥＲ４であることが本明細書において見出される。ＴＧＦ−αは、最も一般に発現されるリガンドである。以下の表は、確立された疾患の徴候と、推定されるＨＥＲファミリーメンバーの過剰発現頻度の寄与（文献の情報源から決定；全てのデータは、免疫組織化学に基づく）とを提供する：
代替のＨＥＲファミリーメンバーの代償性のアップレギュレーションによる応答の欠如または耐性の発現をもたらす、ＨＥＲファミリーメンバーの共発現は、処置のための目標を生み出す。異なるＨＥＲファミリーメンバーが腫瘍の発生と進行に対して、部分的に重なり合う相乗作用性の様式で寄与するという観察が、本明細書において認識され、そして、耐性の問題を回避するように設計され得、かつ、腫瘍におけるレセプター発現に基づいて特定の腫瘍について設計され得る治療薬を提供するために、本明細書において利用される。本明細書において提供される治療薬および候補治療薬は、少なくとも１以上の細胞表面レセプター、代表的には２以上の細胞表面レセプター（例えば、複数のＨＥＲファミリーメンバー、ならびに／または、ＨＥＲファミリーメンバーと、単一の細胞表面レセプターに対して標的化された薬物に対する耐性に関与する任意の他の細胞表面レセプターと）を標的とすることによって、本明細書において同定される問題およびその他の問題を含むこれらの問題に対処する。
ＨＥＲファミリーメンバーならびに他の細胞表面レセプターの構造、機能および相互作用に基づいて、標的化および介入のための多数の治療効果のある遺伝子座が本明細書中に提供される。これらとしては、リガンド結合に関与するレセプターの領域、レセプター二量体化に関与する領域、および、係留に関与する領域が挙げられる。これらの領域は、１つの治療薬が２以上のレセプターのリガンド結合および／またはレセプター二量体化と干渉するように、複数のレセプターにおいて同時に標的化され得る。いくつかのアプローチと候補治療薬分子とが本明細書中に提供される。
二量体化、リガンド結合および／または係留を担うドメインを含むレセプターの領域を標的化するための方法が提供される。特に、レセプター二量体化は、複数のレセプターと相互作用する治療薬によってブロックされる。これらの治療薬としては、本明細書において提供され、そして、以下に詳細に説明されるヘテロ多量体が挙げられる。
また、標的化領域と相互作用する治療薬を産生するための方法が提供される。例えば、サブドメインＩＩおよびＩＶは、レセプター二量体化と干渉するため、そして／または、係留を安定化もしくは促進するために標的化される。これらの方法の第一の工程として、ＤＩＩおよびＤＩＶの相同性領域に対して特異的に結合するペプチドが、ファージディスプレイの選択などによって、それぞれ同定される。その後、ＤＩＩおよびＤＩＶに結合する高親和性の適切なペプチドペアが同定され、そして、ヘテロ二量体が、化学合成またはＰＥＧ化のような利用可能な方法のうちの１つを用いて構築される。ＤＩＩおよびＤＩＶに同時に結合することが同定された高親和性のヘテロ二量体ペプチドは、その自己阻害性の（ａｕｔｏｉｎｈｉｂｉｔｅｄ）立体配置においてレセプターをしっかりと保持し得る。さらに、選択されるペプチド結合因子は、ＨＥＲファミリーレセプターのドメインＩＩおよびドメインＩＶにおける相同な領域を標的とし得る。この方法を用いて標的化されるペプチドは、係留された不活性なＨＥＲファミリーメンバー内のドメイン間領域（例えば、ＤＩＩ／ＩＶの相互作用を安定化させる）を架橋し得るか；または、例えば、単一のレセプターのＤＩＩ上にある別個の部位に結合し、それによって、その二量体化する能力を立体的に阻害し得る。
複数のリガンドに結合する治療薬でリガンドを標的化するための方法もまた提供される。レセプターリガンドは、そのリガンドに結合する分子を同定するためにスクリーニングされ得る。２以上のこのような分子を含むヘテロ多量体が産生され得る。
レセプターの係留された立体配座を安定化させるための方法が提供される。ＨＥＲ１、３および４は、係留された形態および開いた形態で存在する。係留は、サブドメインＩＩおよびＩＶが相互作用するときに形成される。この形態では、（ＤＩＩにおける）重要な二量体化アームは、他のレセプターと相互作用できず、したがって、二量体またはヘテロ二量体を形成できない。細胞表面上のＨＥＲレセプターは、構成的に「二量体化の準備ができている」ものと提唱されているＨＥＲ２を除いて、（リガンドで刺激された場合でさえも）細胞上にある時間の約９５％が係留された形態で生じるものと推定される。レセプターが開いた立体配置を取ることができないような、レセプターの係留された形態の安定化は、レセプターの活性を阻害する。
したがって、上記の考慮すべき事項および問題のうち１つまたは全てに対処する治療薬および方法が、本明細書において提供される。複数のレセプター、特に、ＨＥＲファミリーのメンバーを標的とする治療薬が本明細書において提供される。具体的には、汎ＨＥＲ治療薬を含む汎細胞表面レセプター治療薬、このような治療薬の作製方法、ならびに、レセプターのＨＥＲファミリーおよびそのリガンドが関与する疾患および障害の処置のためのこのような治療薬の使用方法が、本明細書において提供される。また、汎Ｈｅｒ治療薬候補分子を同定するための方法およびそのためのスクリーニングアッセイ方法も提供される。このような方法は、Ｊの節および実施例において、本明細書中に記載される。
いくつかの実施形態では、汎細胞表面レセプター特異的な治療薬は、２以上のレセプターの活性を調節する（一般には、阻害する）ために、１以上のレセプターのリガンドと相互作用するか、そして／または、１以上のレセプターと相互作用するように設計される。これは、少なくとも１つのＨＥＲと、別のＲＴＫもしくは他のＣＳＲ（ＨＥＲファミリーのメンバーであってもそうでなくてもよい）とに由来する２以上のＥＣＤまたはそのフラグメントのヘテロ多量体を形成することによって達成される。特に、ＥＣＤのうち少なくとも一方は、ＨＥＲレセプターに由来し、そして、リガンド結合および細胞表面レセプターとの二量体化を可能にするために、少なくともドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩの一部分を含む。ヘテロ多量体は、代表的には、二量体化ドメインが細胞表面レセプターとの相互作用のために位置決めされるように連結される。代表的には、ＥＣＤは、２以上のＥＣＤＳの二量体化または多量体化を容易にする多量体化ドメインを含み得る。ＥＣＤＳには、２以上の異なるレセプターに由来するドメインを含むハイブリッドＥＣＤが含まれる。
ヘテロ多量体におけるＥＣＤのうち少なくとも１つは、そのヘテロ多量体が、少なくとも２つの細胞表面レセプターの活性を調節するように、ドメインＩ〜ＩＩＩの十分な部分と、必要に応じて、ドメインＩＶの十分な部分とを含む。この少なくとも２つの細胞表面レセプターは、一般に、少なくとも１つのＨＥＲレセプターファミリーメンバーを含む。
２つの異なるＨＥＲファミリーメンバーに由来する少なくとも２つのＥＣＤまたはその一部分を含む汎Ｈｅｒ治療薬は、例えば、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎおよびＥｒｂｉｔｕｘと同様にレセプターの細胞外ドメイン部分を結合させることによって、そして／または、１以上のレセプターを活性化するリガンドを結合させることによって、ＨＥＲファミリーの２以上のメンバーの活性をブロックし得る。汎Ｈｅｒ治療薬は、ＨＥＲレセプターである少なくとも１つの細胞表面レセプターを含む、２以上の細胞表面レセプターの活性を調節する。
また、２以上のＥＣＤＳが同じＨＥＲレセプターに由来するような多量体も提供される。しかし、このような多量体の二量体において、ＥＣＤＳは、異なるＥＣＤ部分を含む。
以下の節は、例示的な治療薬、これらの作製方法、これらのスクリーニング方法およびこれらの使用方法を説明する。
Ｃ．ＨＥＲレセプターおよび他の細胞表面レセプターの構造および活性
レセプターのＨＥＲファミリーのメンバーを含む異なる細胞表面レセプターに由来するＥＣＤを含む多量体が、本明細書において提供される。多量体は、多量体化ドメインに連結された、レセプタードメインとサブドメインとの組合せを含む。本明細書中に提供されるようなＥＣＤ多量体を設計するためには、レセプターの構造および機能の理解が有益である。本節は、このような説明を提供する。
レセプターチロシンキナーゼは、胚形成、細胞の増殖および分化、ならびに、いくつかの疾患（癌、自己免疫障害および他の慢性ヒト疾患のような多様な疾患を含む）の過程に関与する細胞シグナル伝達分子の大きなファミリーである（Ｈｙｎｅｓ ａｎｄ Ｌａｎｅ（２００５）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ５：３４１−５４において概説される）。これらのうち最も特徴付けられたものは、レセプターチロシンキナーゼのヒトＥＧＦレセプターファミリー（ＨＥＲ）である。これらは、クラスＩのレセプターと呼ばれる。レセプターのＨＥＲファミリーは、レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーに属し、そして、タンパク質チロシンキナーゼ活性を有する（ＨＥＲ３を除く；概略については、例えば、Ｊｏｒｉｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｅｘｐｔｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２８４：３１−５３；Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２５：７７３４−７７４２（本明細書において使用される命名法を示す）；およびＢａｚｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒ １２：Ｓ１７−Ｓ２７を参照のこと）。ＨＥＲファミリーメンバーをコードする４つのレセプター遺伝子が存在する：ＨＥＲ１（ＥＧＦＲまたはＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（またはｃ−ｅｒｂＢ−２またはＥｒｂＢ２またはＮＥＵ）、ＨＥＲ３（ｃ−ｅｒｂＢ３またはＥｒｂＢ３）およびＨＥＲ４（ｃ−ｅｒｂＢ４またはＥｒｂＢ４）。コードする遺伝子は選択的スプライシングを受けて、短縮型改変体、およびイントロン融合タンパク質である改変体を含む、多数の改変体を生成し得る。これらのレセプターのいくつかは、必要不可欠な活動である、正常な発生、分化、遊走、創傷治癒およびアポトーシスにおいて役割を担う。異常な機能および活性は、癌を含む種々の疾患状態において役割を果たす。
例示的なヒトＨＥＲファミリーレセプターの配列は、配列番号２（ＨＥＲ１）、配列番号４（ＨＥＲ２）、配列番号６（ＨＥＲ３）および配列番号８（ＨＥＲ４）に示され、そして、それぞれ、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。代表的には、コードされるＨＥＲポリペプチドは、翻訳後プロセシングを受けて、シグナル配列を欠く成熟なポリペプチドを生じる。成熟な全長ポリペプチドのアミノ酸配列を、図２（Ａ）〜（Ｄ）およびそれぞれの図の凡例に描写および記載する。本明細書における目的では、例示的なＨＥＲファミリーレセプター、そのＥＣＤ部分またはＥＣＤアイソフォームを説明する際のアミノ酸の番号付けは、他のやり方で特定されない限り、成熟なポリペプチドの番号付けに関するものである。さらに、ドメイン構成を説明するために使用されるアミノ酸の位置は、例示的な目的のためのものであり、そして、提供される実施形態の範囲を制限することは意図されない。ポリペプチドおよびそのドメインの説明は、同様のレセプターとの相同性解析およびアラインメントに基づき、理論的に導かれたものであることが理解される。したがって、実際の遺伝子座は多様であり得、そして、各レセプターについて同じであるとは限らない。
図１に示されるように、ＨＥＲファミリーの各メンバーは、約６２０アミノ酸の細胞外ドメイン部分（ＥＣＤまたは外部ドメインまたは細胞外ドメイン）と、膜貫通ドメインと、細胞質チロシンキナーゼドメインとを含む共通のドメイン構成を共有する。ＥＣＤ部分は、Ｉ（Ｌ１）、ＩＩ（Ｓ１）、ＩＩＩ（Ｌ２）およびＩＶ（Ｓ２）で指定される４つのサブドメインを示す。全長ＨＥＲファミリー間の配列同一性は、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）とＨＥＲ３についての３７％から、ＨＥＲ１とＨＥＲ２についての４９％まで変化し、各ドメイン間に、種々の程度の配列同一性がある。例えば、チロシンキナーゼドメインは、最も高い配列同一性（約５９〜８１％）を有し、そして、カルボキシ末端ドメインは、最も低い同一性（約１２〜３１％）を有する。ＥＣＤドメイン内では、サブドメインＩおよびＩＩＩが、約３７％の配列同一性を共有し、そして、ドメインＩＩおよびＩＶは相同であり、かつ、約１７％の配列同一性を共有する（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，１１：５０７−５１７）。
サブドメインＩおよびＩＩＩはまた、Ｌドメインとも呼ばれ、二葉の（ｂｉｌｏｂａｌ）リガンド結合部位を構成する。Ｌドメインは各々、両端がαヘリックスでキャップされたバレル様構造を形成する、６つのターンの一本鎖の右回転のβ−ヘリックスを含む。リガンドは、Ｌ１ドメインとＬ２ドメインとの間を結合する。
サブドメインＩＩおよびＩＶはまた、Ｓドメインまたはシステインリッチ（ＣＲ）ドメインとも呼ばれ（また、フリン様リピートドメインとも呼ばれる）、そして、システインリッチな領域を構成する。このＣｙｓリッチな領域は、ロッド形状の構造を形成する小さなジスルフィド結合モジュールの連続から構成される。各ドメインには、２つのタイプのジスルフィド結合した分子が見られる：単一のジスルフィド結合が介在する弓様ループを拘束するＣ１ジスルフィド結合、および、２つのジスルフィド結合が、Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ３およびＣｙｓ２−Ｃｙｓ４のパターンで４つの連続したシステインを連結して、結び目様の構造を与えるＣ２ジスルフィド結合（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ １１：５０７−５１７）。ドメインＩＩは、３つの連続したＣ２モジュールとその後に続く５つのＣ１モジュールを含むが、ドメインＩＶは、７つのモジュール（最初の２つはＣ１モジュールであり、その後、１つのＣ２モジュールと、２つのＣ１モジュールおよびもう１つのＣ２モジュールが続く）を含む。
一般に、ドメインＩＩおよびＩＶは、ＨＥＲ構造の分子内および分子間の両方の接触を媒介する。例えば、分子内相互作用は、「係留」と呼ばれるプロセスにおいて、サブドメインＩとＩＶとの間で生じ、ここで、第５のＣｙｓリッチモジュールからβ−ループが突出している（図１を参照のこと）。このループは、ドメインＩＶにおけるモジュール５およびモジュール６からの等価ではあるがより小さなループと相互作用する。ドメインＩＩおよびＩＶの相互作用はさらに、２つの領域間の水素結合によって、ならびに、糖質の寄与によって安定化される。さらに、ＨＥＲ１のドメインＩＩ内のＹ２４６に対応するアミノ酸残基の側鎖は、ドメインＩＶ内のＤ５６３およびＫ５８５に対応するアミノ酸残基の側鎖と水素結合を形成する。ドメインＩＩ／ＩＶ間の接触を媒介する際に重要な、成熟なＨＥＲファミリーレセプターのＥＣＤにおける対応するアミノ酸残基は、表５に示される。ドメインＩＩとＩＶとの間の相互作用は、ＨＥＲ２においては存在しない。これは、一部分は、他のＨＥＲファミリーメンバーと比較した場合の、保存されていないアミノ酸残基（すなわち、表５における斜体の残基）の存在に起因するものである。
分子間相互作用もまた生じ、そして、活性なＨＥＲレセプターのホモ二量体化およびヘテロ二量体化の特徴に必須の、レセプター−レセプター相互作用を可能にする。実際、係留を媒介する上記ドメインＩＩのモジュール５内の同じループはまた、二量体化も担う。このループはしばしば、「二量体化アーム」と呼ばれる。Ｙ２４６に対応するアミノ酸残基はまた、二量体化のために必要とされる分子間相互作用の促進においても重要である。
ＨＥＲファミリーレセプターはさらに、膜貫通（ＴＭ）ドメイン（残基６２１、６２２もしくは６２６〜６４４もしくは６４７において開始するものとして種々に報告されている）および細胞質ドメインを含む。膜貫通ドメインは、レセプターを固定する原形質膜に跨り、そして、一般には、疎水性残基を含む。代表的には、膜貫通ドメインを構成する残基は、α−へリッスを形成する。
膜貫通ドメインとキナーゼドメインとの間に位置する領域である膜近傍（ＪＭ）ドメインは、例えば、ダウンレギュレーションおよびリガンド依存性の内在化事象のような種々の調節性機能、例えば分極した細胞におけるＥＧＦＲのような側底膜での選別（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）、ならびに、ｅｐｓ８およびカルモジュリンのようなタンパク質との会合の機能を果たす。さらに、ＪＭドメインは、レセプターの細胞内輸送においても役割を担い、そして、ＥＧＦＲを小窩に対して標的化するために（膜貫通ドメインと共に）必要とされる。
チロシンキナーゼドメインは、レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）に共通する保存された触媒性コアであり、そして、カルボキシ末端ドメインに存在するカルボキシ末端チロシン残基のリン酸基転移の媒介を担う。チロシンキナーゼドメインの活性化は、リガンドがレセプターに結合する際に誘導される立体配座の変化の際に生じる。
カルボキシ末端（ＣＴ）ドメインは、チロシン残基を含み、ここで、リン酸化がシグナル伝達を調節する。このチロシン残基と、各ＨＥＲファミリーメンバーのすぐ近くのアミノ酸とは、多様なセカンドメッセンジャーと相互作用して、特定の生物学的応答および生化学的応答を調節する。例えば、例えばＳＨ２（ｓｒｃホモロジー−２）構造またはＰＴＢドメインを含むセカンドメッセンジャーは、リン酸化の「ドッキング部位」を認識し、そして、レセプターと相互作用して、他のシグナル伝達の構成要素との相互作用を介して、レセプターが受け取ったシグナルを細胞質または核のいずれかに伝達する。また、そのリン酸化がレセプターのダウンレギュレーションおよびエンドサイトーシスのプロセスに影響を及ぼす、いくつかのセリン／スレオニン残基が存在する。ＥＧＦＲのＣ末端の残基９８４〜９９６（図１）は、アクチンのための結合部位として機能し、そして、キナーゼドメインのリガンドによる活性化の後に、より高次のレセプター低重合体の形成および／またはレセプターのクラスター化に関与する。
１．ＨＥＲ１ ＥＣＤの構造およびドメイン構成
全長の成熟なＨＥＲ１ ＥＣＤおよび種々のＨＥＲ１ ＥＣＤアイソフォームのドメイン構成は、図２（Ａ）に示される。ＨＥＲ１の細胞外部分は、成熟なＨＥＲ１レセプターの残基１〜６２１を含み、そして、サブドメインＩ（アミノ酸残基１〜１６５）、サブドメインＩＩ（アミノ酸残基１６６〜３１３）、サブドメインＩＩＩ（アミノ酸残基３１４〜４８１）およびサブドメインＩＶ（アミノ酸残基４８２〜６２１）を含む。ＨＥＲ１のドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩは、Ｉ型インシュリン様増殖因子レセプター（ＩＧＦ−１Ｒ、例えば、Ｇａｒｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｃｅｌｌ，１１０：７６３−７７３を参照のこと）の最初の３つのドメインに対して、構造的相同性および配列相同性を有する。ＩＧＦ−１Ｒと同様に、Ｌドメイン（すなわち、ドメインＩおよびＩＩＩ）は、ヘリックスによって両端がキャップされた６つのターンβヘリックスの構造とジスルフィド結合とを有する。ＩＧＦ−１Ｒと比較すると、ＨＥＲ１配列は、ＨＥＲ１によるリガンド結合の媒介に重要な生化学構造に寄与するアミノ酸挿入を含む。これらには、ドメインＩの大きなβシートの上に位置して、リガンド結合界面の主要な部分を形成するＶ字型の可動域（残基８〜１８）が含まれる。ドメインＩＩＩにおいて、対応する領域は、リガンド結合にも関与するループ（残基３１６〜３２６）を形成する。ドメインＩＩＩに存在する第三の挿入領域（残基３５１〜３６９）は、ドメインＩＩＩの第二のターン内の臨時のループである。このループは、リガンド結合を妨害する種々の抗体に対するエピトープである（すなわち、ＬＡ２２、ＬＡ５８およびＬＡ９０、例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２６４：１７４６９−１７４７５を参照のこと）。さらに、βヘリックスソレノイドの第四のターンにおける他のループが、リガンド結合に関与する。
ＨＥＲ１に対するリガンドであるＴＧＦ−αは、１つのレセプター分子のＬドメインＩおよびＩＩＩの両方の大きなβシートと相互作用する。同様に、リガンドＥＧＦもまた、ＨＥＲ１のドメインＩおよびＩＩＩの両方と相互作用するが、ＥＧＦのドメインＩＩＩとの相互作用が、ＥＧＦのための主要な結合部位であると考えられる（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，（２００２）ＦＥＢＳ，２６９：２３２３−２３２９）。架橋の研究により、ＥＧＦリガンドのＮ末端部分およびＣ末端部分が、それぞれ、ＨＥＲ１レセプターのそれぞれドメインＩおよびＩＩＩと相互作用することが決定された。成熟な全長ＨＥＲ１に対応するドメインＩＩＩ内のアミノ酸Ｇｌｙ４４１は、ヒトＥＧＦのＡｒｇ４５との相互作用を介して、ＥＧＦへの結合の媒介に関与する。２０２アミノ酸のＨＥＲ１の４０ｋＤａフラグメント（成熟ＨＥＲ１ポリペプチドのアミノ酸３０２〜５０３に対応）は、ＨＥＲ１のＥＧＦに対する完全なリガンド結合能を保持するのに十分である。この２０２アミノ酸部分は、ドメインＩＩＩの全体と、ドメインＩＩおよびドメインＩＶの各々の数残基のみとを含む（Ｋｏｈｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）ＪＢＣ ２６８：１９７６）。
ＥＧＦＲのドメインＩＩは、８つのジスルフィド結合したモジュールを含む。ドメインＩＩは、ドメインＩおよびＩＩＩの両方と相互作用する。ドメインＩＩＩとの接触は、モジュール６および７を介して生じるが、モジュール７および８は、ある程度の柔軟性を持ち、それによって、ＥＧＦＲ分子のリガンドを含まない形態においてヒンジを生じるように機能する。高次のループが、ドメインＩＩのモジュール５から形成され、そして、リガンド結合部位から離れる方向に突出する。このループは、残基２４０〜２６０（残基２４２〜２５９とも記載される）に対応し、そして、アンチパラレルなβ−リボンを含む。このループ（二量体化アームとも呼ばれる）は、分子内相互作用の媒介ならびにレセプター−レセプター接触の媒介において重要である。ＨＥＲ１の不活性型すなわち「係留型」の立体配座において、ループは、成熟な全長ＥＣＤの、それぞれアミノ酸５６１〜５６９および５７２〜５８５に対応する、モジュール５および６内の類似のループ構造の間に挿入することによって、分子内相互作用に寄与する（図１に参照のこと）。ドメインＩＩ／ＩＶの相互作用に寄与するアミノ酸残基は、上記の表５に示される。
ドメインＩＩのループの欠失は、ＨＥＲ１ ＥＣＤの二量体化の能力を無効にし、したがって、分子間相互作用の促進におけるその重要性を示す。二量体化は、ドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩの間の空間において、第二のＨＥＲ分子のドメインＩＩを横切って外に延びるループの突出によって媒介される。例えば、接触は、二量体化アームの残基２４４〜２５３と、第二のＨＥＲ分子内のドメインＩＩの凹面上にある残基２２９〜２３９、２６２〜２７８および２８２〜２８８とによってなされる。ドメインＩＩ内のＴｙｒ２４６は、第二のＨＥＲ分子内のＧｌｙ２６４およびＣｙｓ２８３と水素結合を形成し、そして、Ｔｙｒ２４６のフェニル環もまた、隣接分子のＳｅｒ２６２およびＳｅｒ２８２と相互作用する。ＥＧＦＲのドメインＩＩと別のＨＥＲ分子との間での他のアミノ酸接触としては、Ｔｙｒ２５１のＰｈｅ２６３、Ｇｌｙ２６４、Ｔｙｒ２７５およびＡｒｇ２８５との接触；Ｐｒｏ２４８のＰｈｅ２３０およびＡｌａ２６５との接触；Ｍｅｔ２５３のＴｈｒ２７８との接触；ならびにＴｙｒ２５１のＡｒｇ２８５との接触が挙げられる。さらに、Ａｓｎ２４７およびＡｓｎ２５６が、ループを適切な立体配座に維持するのに重要である。これらの残基のほぼ全ては、ＨＥＲファミリーメンバー間で保存されており、そして、ＨＥＲファミリーレセプター間で同様に機能する。さらに、プロリン残基が、位置２４３、２４８、２５５および２５７のいずれか１つにおいて、ＨＥＲファミリーレセプターのループ内に存在し、そして、ＨＥＲ３は３つのプロリンを含む。プロリン残基は、ループの立体配座をさらに安定化させる。例えば、ＨＥＲ１は、位置２４８および２５７にプロリンを含む。
不活性なＨＥＲ１分子の係留におけるドメインＩＶ（モジュール５および６）の関与に加えて、ＨＥＲ１のドメインＩＶのモジュール１の少なくとも一部分がまた、活性なＨＥＲ１分子の構造的な完全性を維持するために必要とされるようである。例えば、上述のように、ドメインＩＩＩの全体と、ドメインＩＩおよびＩＶの一部分とを含むＨＥＲ１の４０ｋＤａのタンパク質分解性フラグメントは、完全なリガンド結合能を保持する。この分子中に存在するドメインＩＶの部分は、アミノ酸４８２〜５０３に対応し、モジュール１の全体を含む。成熟なＨＥＲ１分子におけるＴｒｐ４９２に対応するアミノ酸は、ドメインＩＩＩ内の疎水性ポケットと相互作用することによって、ＨＥＲ１分子の安定性の維持において役割を担う。ドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩの全体を含むが、ドメインＩＶの全体を欠くＨＥＲ１の組換え分子（成熟ＨＥＲ１のアミノ酸１〜４７６に対応、例えば、Ｅｌｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０：８９３０−８９３９を参照のこと）は、リガンドに結合できない。したがって、少なくともドメインＩＶのモジュール１の全体もしくは一部分が、ＨＥＲ１のリガンド結合能に必要とされるようである。ドメインＩＶの残りは、リガンド結合およびシグナル伝達には不要である。例えば、ＨＥＲ１の正常なリガンド結合およびシグナル伝達特性が、成熟なＨＥＲ１ポリペプチドの残基５２１〜６０３を欠くＨＥＲ１分子に存在する。
２．ＨＥＲ２ ＥＣＤの構造およびドメイン構成
全長の成熟なＨＥＲ２ ＥＣＤおよび種々のＨＥＲ２ ＥＣＤアイソフォームのドメイン構成は、図２（Ｂ）に示される。ＨＥＲ２の細胞外部分は、成熟なＨＥＲ２レセプターの残基１〜６２８を含み、そして、サブドメインＩ（アミノ酸残基１〜１７２）、サブドメインＩＩ（アミノ酸残基１７３〜３１９）、サブドメインＩＩＩ（アミノ酸残基３２０〜４８８）およびサブドメインＩＶ（アミノ酸残基４８９〜６２８）を含む。同様のドメイン構成を有するにも関わらず、ＨＥＲ２の結晶構造解析は、ＨＥＲ２が、他のＨＥＲファミリーメンバーの「係留型」の不活性な構造の特徴である、同じ分子内相互作用を有さないことを示している。換言すると、ドメインＩＩのモジュール５内のループは、ドメインＩＶの残基と相互作用しない。上の表５は、ＨＥＲファミリーレセプターの中で、ドメインＩＩ／ＩＶ間の接触を媒介するアミノ酸を示しており、そして、ＨＥＲ２において保存されていないアミノ酸を示す。例えば、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４のそれぞれ位置５６４、５６３および５６１において保存されるＧｌｙ残基は、ＨＥＲ２においてプロリンで置き換えられる。このプロリン残基は、他のＨＥＲファミリーレセプターの中で観察される相互作用を立体的に阻害する（すなわち、Ｇｌｙ残基は、対応するＨＥＲ３のアミノ酸Ｐｈｅ２５１と相互作用する）。結果として、配列の相違に起因して、ＨＥＲ２は、「係留型」の不活性な状態では存在しないが、構成的に活性な立体配座で存在し、そして、そのドメインＩＩ内の二量体化アームが露出されている。
ドメインＩＩの二量体化アームは、ＨＥＲファミリーレセプター間で３３〜４４％のみの配列相同性を有するが、機能的には、ＨＥＲ２を含む全ＨＥＲファミリーレセプター間できわめて保存されている。ＨＥＲ２において、この二量体化アームは、成熟なＨＥＲ２のアミノ酸残基２４６〜２６７に対応する。ＨＥＲ２は、常に、活性な非係留型の立体配座で存在し、その二量体化アームが露出されているので、ＨＥＲ２は、他のＨＥＲファミリーメンバーのための好ましいヘテロ二量体化パートナーである。しかし、ＨＥＲ２は、ホモ二量体は形成しない。ホモ二量体を形成できないことは、静電的反発作用に起因するもののようである。なぜならば、ＨＥＲ２の二量体化アームと、ＨＥＲ２においてこの二量体化アームが接触するポケットとは、共に電気陰性だからである。ＨＥＲ２の高い電気陰性度は、他のＨＥＲファミリーメンバーと比較して、ＨＥＲ２における酸性残基および塩基性残基の数が多いことによって説明され得る。しかし、ＨＥＲ２が細胞において過剰発現されているとき、ＨＥｒ２は、ホモ二量体化し得る。過剰発現の際に観察されるホモ二量体化には、特に、レセプターの過剰発現の際に観察されるリガンド非依存性の多量体化について、ＨＥＲ２のカルボキシ末端ドメインにおける疎水性領域が関与している（Ｇａｒｒｅｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，１１；４９５−５０５）。
さらに、他のＨＥＲファミリーレセプターとは異なり、ＨＥＲ２は、リガンドに結合しない。このリガンドに結合できないことについての１つの理由は、リガンド結合ドメインＩおよびＩＩＩの近接性と相対的な配向とである。ＨＥＲ２において、対向するドメインＩおよびＩＩＩは、互いに実質的に直接接触する。この立体配座では、各結合部位が対向するリガンド結合ドメインによって占有されているので、リガンドは、いかなる潜在的な結合部位にも結合できない（Ｇａｒｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，１１：４９５−５０５）。さらに、他のＨＥＲファミリーメンバーと比較して、ＨＥＲ２は、ドメインＩおよびＩＩＩのリガンド結合界面における配列の相違を含み、これがリガンドの相互作用を阻害し得る。例えば、Ａｒｇ１２（ＨＥＲ１におけるＴｈｒ１５、ＨＥＲ３におけるＳｅｒ１８およびＨＥＲ４におけるＳｅｒ１２に対応する）およびＰｒｏ１４（ＨＥＲ１におけるＬｅｕ１７、ＨＥＲ３におけるＴｈｒ２０およびＨＥＲ４におけるＬｅｕ１４に対応する）が、他のＨＥＲファミリーメンバーにおける等価な位置の対応する残基と異なる。これらの残基は、リガンドを含む拡張されたβシートを形成するＶ字型の可動域の一部であり、そして、ＨＥＲ２のリガンドに結合する能力と干渉する。ドメインＩおよびＩＩＩにおける他の配列の相違もまた、ＨＥＲ２がリガンドに結合できないことを説明する。
３．ＨＥＲ３ ＥＣＤの構造およびドメイン構成
全長の成熟なＨＥＲ３ ＥＣＤおよび種々のＨＥＲ３ ＥＣＤアイソフォームのドメイン構成は、図２（Ｃ）に示される。ＨＥＲ３の細胞外部分は、成熟なＨＥＲ３レセプターの残基１〜６２１を含み、そして、サブドメインＩ（アミノ酸残基１〜１６６）、サブドメインＩＩ（アミノ酸残基１６７〜３１１）、サブドメインＩＩＩ（アミノ酸残基３１２〜４８０）およびサブドメインＩＶ（アミノ酸残基４８１〜６２１）を含む。他のＨＥＲファミリーレセプターと同様に、ＨＥＲ３のドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩの構造は、ＩＧＦ−１Ｒと重ね合わせられ得、そして、他のＨＥＲレセプターと同じ構造的特徴の多くを示し得る。例えば、ＨＥＲ３のドメインＩおよびＩＩＩは、ジスルフィドを含むモジュールの張り出したリピートによって割り込まれるβ−ヘリックス構造を示す。ドメインＩＩとＩＩＩとの間には、ＩＧＦ−１Ｒには示されない高い程度のドメイン間の柔軟性が存在する。さらに、ＨＥＲ３は、ドメインＩＩ（ＨＥＲ３のアミノ酸２４２〜２５９に対応）内に特徴的なβ−ヘアピンループすなわち二量体化アームを示す。このβ−ヘアピンループは、ドメインＩＶにおいて保存された残基との分子内接触を提供し、閉じた、すなわち不活性型のＨＥＲ３の構造をもたらす。この係留相互作用において重要な残基は、上の表５に示し、そして、ＹＨ２４６のＤ５６２およびＫ５８３との相互作用、Ｆ２５１のＧ５６３との相互作用、ならびに、Ｑ２５２のＨ５６５との相互作用が含まれる。リガンドが結合すると、立体配座の変化が、ドメインＩおよびＩＩＩを新たに方向付けして、係留型の構造から二量体化アームを露出して、レセプターの二量体化を可能にする。
他のＨＥＲファミリーレセプターとは異なり、ＨＥＲ３は、機能的なキナーゼドメインを有さない。他のプロテインチロシンキナーゼの中では保存されているキナーゼ領域内の４つのアミノ酸残基の変更が、ＨＥＲ３のキナーゼを機能不全にしている。しかし、ＨＥＲ３は、そのカルボキシ末端ドメイン内にチロシン残基を保持し、そして、適切な活性化およびリン酸基転移を受けると、細胞のシグナル伝達を誘導し得る。このように、ＨＥＲ３のホモ二量体は、直線的なシグナル伝達は支援し得ない。ＨＥＲ３の優先的な二量体化パートナーは、ＨＥＲ２である。
４．ＨＥＲ４ ＥＣＤの構造およびドメイン構成
種々のＨＥＲ４ ＥＣＤアイソフォームの全長のＨＥＲ４ ＥＣＤアイソフォームのドメイン構成は、図２（Ｄ）に示される。ＨＥＲ４の細胞外部分は、成熟なＨＥＲ４レセプターの残基１〜６２５を含み、そして、サブドメインＩ（アミノ酸残基１〜１６３）、サブドメインＩＩ（アミノ酸残基１６４〜３０８）、サブドメインＩＩＩ（アミノ酸残基３０９〜４７７）およびサブドメインＩＶ（アミノ酸残基４７８〜６２５）を含む。ＨＥＲ４は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ４が共に、リガンドに結合し、そして、キナーゼ活性を示し得るという点で、最もよくＨＥＲ１に似ている。係留および二量体化の両方に重要な二量体化アームの存在を含めたドメイン構成が、ＨＥＲ４に存在する。上の表５は、ＨＥＲ４を不活性な状態に固定する、ドメインＩＩおよびＩＶ内の保存された残基を略述する。ＨＥＲ１における対応する二量体化アームは、ＨＥＲ４のアミノ酸残基２３７〜２５８に対応する。リガンド結合ドメインＩおよびＩＩＩのうち、ドメインＩが、リガンドニューレグリン（ＮＲＧ）のＨＥＲ４への結合を担う主なドメインである。ＨＥＲ４のドメインＩは、ＮＲＧのＮ末端残基を認識する（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６９：２３２３−２３２９）。
全長ＨＥＲ４レセプターは、４つの選択的スプライシングを受けたアイソフォームとして発現される。選択的スプライシングを受けたアイソフォームのうち２つは、細胞質テイル内が異なり（すなわち、ＣＹＴ−１およびＣＹＴ−２）、そして、別の２つは、膜近傍領域内が異なる（すなわち、ＪＭ−ａおよびＪＭ−ｂ）。選択的スプライシングの結果、異なるシグナル伝達能を持つアイソフォームが生じる。例えば、ＣＹＴ−１アイソフォームは、ＣＹＴ−２アイソフォーム内には存在しないシグナル伝達分子のための追加ドッキング部位（すなわち、ＳＨ２）を含む追加のエキソンを含む。さらに、ＪＭアイソフォームは、例えば、腫瘍壊死因子−α変換酵素（ＴＡＣＥ）などによる、プロテイナーゼ切断に対する感受性が異なる。
５．ＨＥＲファミリーのリガンド、リガンド特異性およびリガンド媒介性のレセプター活性化
レセプターのＥｒｂＢ（ＨＥＲ）ファミリーメンバーの活性は、触媒活性をもたらし、最終的にはシグナル伝達を生じる、二量体化のためのリガンド結合を必要とする。各々がレセプターのＥＧＦファミリーに属する、いくつかのＨＥＲ特異的なリガンドが存在する（例えば、表６を参照のこと）。ＥＧＦリガンドは全て、６つのシステインを持つ４５〜５５アミノ酸のモチーフであるＥＧＦ様ドメインを有し、このシステインが相互作用して、ジスルフィド結合で共有結合された３つのループを形成する。この領域は、ＨＥＲリガンドの結合特異性を与えるのに重要である。ＥＧＦリガンドにおけるさらなる構造モチーフとしては、免疫グロブリン様ドメイン、ヘパリン結合部位、およびグリコシル化部位が挙げられる。一般に、リガンドは最初に、溶液中で活性を獲得するため、そして／または、細胞表面ＨＥＲタンパク質に結合するためにタンパク質分解による切断を必要とする、膜固定型タンパク質として発現される。この切断を必要とすることが、リガンドの利用能およびレセプターの活性化を制御するために機能する。ＥＧＦリガンドの放出に関与するプロテアーゼとしては、例えば、ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭ）ファミリーを含むメタロプロテイナーゼファミリー、ならびに、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）ファミリーからのものが挙げられる。Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）の活性化は、ＥＧＦリガンドの産生を調節する。癌において、ＧＰＣＲのシグナル伝達の調節異常および腫瘍におけるＥＧＦリガンドの普及は、ＨＥＲレセプターの構成的な活性化と関連する。
表６は、これらのリガンドの中でも、最も周知でありかつ特徴付けられているリガンドと、そのレセプター特異性とを列挙する。リガンドは、そのレセプターの選択性に基づいて、３つの群に分けられる（以下の表において群１〜３として略述される）。他のファミリーメンバーの各々とヘテロ二量体化するＨＥＲ２に結合するリガンドはない。以下の表において、サイトカインのニューレグリン（ＮＲＧ）ファミリーの代替名としては、Ｎｅｕ分化因子、ＮＤＦまたはヘレグリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）（ＨＲＧ）が挙げられる。リガンドのニューレグリン／ヘレグリンファミリーは、選択的にスプライシングを受けたＮＲＧ−１、ＮＲＧ−２、ＮＲＧ−３またはＮＲＧ−４遺伝子に由来する、構造的に関連する増殖因子である。例えば、ＮＲＧ−１遺伝子に由来するものには、少なくとも１４の可溶性で膜貫通型タンパク質アイソフォームが存在する。膜貫通型ＮＲＧ−１アイソフォームの細胞外ドメインのタンパク質分解によるプロセシングは、可溶性の増殖因子を放出する。ＨＲＧ−１βは、これらのうちの１つであり、そして、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４に直接結合するために必要なＩｇドメインおよびＥＧＦ様ドメインを含む。ヘレグリンβのＥＧＦのみを含む組換えヒトＨＲＧ−１βは、ＨＥＲレセプターに結合し、ＨＥＲレセプターを活性化するのに十分である。ＮＲＧ−１遺伝子の別のアイソフォームは、ＨＲＧ１−αである。ＨＲＧαの結合親和性は、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４に対するＨＲＧβの結合親和性よりも１００倍弱い（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４４７：２２７−２３１）。ＮＲＧ２−αおよびＮＲＧ２−βと呼ばれる少なくとも２つのＮＲＧ−２のアイソフォームが存在する。ＮＲＧ２αおよびＮＲＧ２βは共に、ＨＥＲ３のアゴニストであり、ＨＥＲ３のシグナル伝達を刺激する。ＮＲＧ２βはまた、ＨＥＲ４のアゴニストでもあるが、ＮＲＧ２αは、ＨＥＲ４のチロシンリン酸化またはシグナル伝達を強力に刺激するものではない。ＮＲＧ−３およびＮＲＧ−４には、他に報告されるアイソフォームはない。
１５を優に超える、ＨＥＲファミリーメンバーに結合し得る異なるＥＧＦリガンドが存在するので、ＨＥＲファミリーのシグナル伝達の制御および調節は複雑である。この複雑なシグナル伝達の系を調節する因子の中には、レセプターリガンドの組織特異的な発現が挙げられる。例えば、ＮＲＧは、実質器官において優先的に発現され、そして、胚の中枢神経系および末梢神経系において発現される。さらに、リガンドは代表的には単量体レセプターに結合し得るが、これらは、単量体レセプターを活性化できない。代わりに、レセプターの二量体形成、そして、最終的にはＨＥＲにより媒介される活性化およびシグナル伝達は、単量体レセプターと比べてより高い、２つのＨＥＲレセプターとリガンドとの複合体の安定性によって駆動される。単量体レセプターへのリガンド結合は、単量体レセプターの立体配座変化を媒介して、レセプターのホモ二量体化またはヘテロ二量体化を可能にする（以下を参照のこと）だけではなく、一旦二量体レセプターが形成されると、リガンドはまた、二量体レセプターを安定化させる。したがって、種々の二量体ペアは活性化のために、レセプターの濃度ならびにリガンドの濃度に依存する。したがって、ＨＥＲの活性化は、そのリガンドの空間的および時間的な発現によって制御される。
６．二量体化 対 係留ならびに活性なホモ二量体およびヘテロ二量体の作製
ＨＥＲファミリーレセプターの活性化を支配する機構は、リガンド結合と、レセプターにおける立体配座の変化の誘導とに頼る。代表的には、ＨＥＲレセプターの不活性形態と活性形態との間には平衡が存在する。少なくともＨＥＲ１の場合、およそ９５％が係留型形態すなわち不活性な形態で細胞表面上に存在し；そして、わずか５％が、活性な形態である。
結合したリガンドがない場合、単量体レセプターにおいて、ドメインＩＩ内の二量体化アームは、同じ分子内のサブドメインＩＶとの相互作用によって、分子内で係留されて隠され、それによって、レセプターを自己阻害する。したがって、通常は、ＨＥＲ２を除く全てのＨＥＲレセプターは、不活性型すなわち「係留型」の立体配座をとる。係留型の立体配座は、レセプターの閉じた構造であり、レセプターの他のＨＥＲファミリーメンバーとの相互作用を妨げる。通常は、この立体配座において、リガンド結合ドメインＩおよびＩＩＩは、間隔を空けて保持される。このことは、ＨＥＲ２を除く全てのＨＥＲファミリーレセプターに当てはまる。ＨＥＲ２については、単量体レセプターとしてであってさえ、ドメインＩおよびＩＩＩは構造的に互いに閉じており、そして、この領域へのリガンドの結合を立体的に阻害する。結果として、ＨＥＲ２は、リガンドに結合できず、そして常に、その二量体化アームが露出され、かつ、別のＨＥＲファミリーレセプターとの二量体化を促進する準備ができた状態である。
リガンドにより誘導される、ＨＥＲレセプター分子の二量体化は、レセプターの活性化を誘導し、そして、レセプターのＨＥＲファミリーの通常の下流のシグナル伝達機構を提供する。活性化されたリガンドは、ドメインＩおよび／またはＩＩＩと相互作用し、ＥＣＤの再配列を促進し、そして、係留型の立体配座の開放と、二量体化アームの露出とをもたらす。結合したリガンドは、ドメインＩおよびＩＩＩの相対的な位置を固定して、これらを強制的に回転させる（ＨＥＲ１の場合、約１３０°）。この再配置は、分子内のドメインＩＩ／ＩＶ連結もしくは係留を崩壊させ、そして、二量体化アームを解放させ、その結果、二量体化アームが分子間相互作用に関与することが可能となる。このことが、レセプターの「開いた」すなわち活性な立体配座をもたらし、そして、この分子を、他のＨＥＲファミリーメンバーとの二量体化能を有するようにする。ＨＥＲ２は、単量体としてでさえ、常に開いた立体配座をとる。したがって、リガンドが存在しない場合でさえも、ＨＥＲ２は、別のＨＥＲファミリーメンバーと二量体化することができるが、ＨＥＲ２は、過剰発現されない限りは、自己と二量体化しない。開いた立体配置において、二量体化アーム（図１を参照のこと）は、ドメインＩＩから外に突出し、そして、非共有結合性の相互作用（例えば、親水性相互作用および疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用および水素結合）を介して、第二のレセプター内のドメインＩＩの二量体化ループの基部にあるポケットと相互作用することが可能である。二量体化ループ内の変異は、構成的な二量体化をもたらし得、これは、ＨＥＲ２の場合には、細胞の形質転換を誘導することが示されている（Ｂａｚｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒ １２：Ｓ１７−Ｓ２７）。サブドメインループＩＩとサブドメインＩおよびＩＩとの間には接触が存在する。ヘテロ四量体のようなより高次の構造もまた形成され得る（例えば、Ｊｏｒｉｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｅｘｐｔｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２８４：３１−５３を参照のこと）。
二量体化アーム単独では、二量体化には不十分である。ドメインＩＩ／ＩＩＩ相互作用を含むさらなる相互作用が、レセプターの二量体化を安定化する（例えば、Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２５：７７３４−７７４２を参照のこと）。上述のように、二量体化アームは、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４の間で高度に保存されているが、ＨＥＲ２は、ホモ二量体を形成できない。ＨＥＲ１に関して、モジュール６が、ホモ二量体化のためのさらなる自己相補的な相互作用（Ｄ２７９およびＨ２８０を含む）を提供する。モジュール７は、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３のヘテロ二量体化に関与する。これらの残基は、４つ全てのＨＥＲレセプター間で保存されている（例えば、Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２５：７７３４−７７４２を参照のこと）。
７．ＨＥＲファミリーのレセプター活性
ＨＥＲは、上皮、間葉およびニューロン起源の種々の組織において発現され、そして、成長、生存、増殖および分化を調節する。通常の生理学的条件下では、ＨＥＲの活性化は、そのリガンドの空間的および時間的な発現によって制御され、これらのリガンドは、増殖因子のＥＧＦファミリーのメンバーである（上記を参照のこと）。ＨＥＲレセプターへのリガンドの結合は、レセプターのホモ二量体およびヘテロ二量体の形成と、内在性キナーゼドメインの活性化とを誘導し、細胞質テイル内の特定のチロシン残基におけるリン酸化をもたらす。これらのリン酸化された残基は、ある範囲のエフェクタータンパク質のためのドッキング部位として機能し、このエフェクタータンパク質の回収は、細胞内シグナル伝達経路の活性化をもたらす。例えば、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）−ＡＫＴ経路は、ＰＩ３Ｋのｐ８５アダプターサブユニットのレセプターへの回収によって刺激される。マイトジェン活性型プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路は、増殖因子−レセプター結合タンパク質２（ＧＲＢ２）またはＳＨＣのレセプターへの回収によって活性化される。
各レセプターの活性化は、いくつかの局面で互いに異なる。例えば、ＨＥＲ２は、対応する増殖因子リガンドを持たず、そして、ＨＥＲ３には、十分に特徴付けられたチロシンキナーゼ活性がない。これらの２つのレセプターは、一般に、そのシグナル伝達の能力について、他のメンバーに共依存する（ｃｏ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）が、ＨＥＲ２は、十分に過剰発現されている場合、共レセプターもしくはリガンドなしで強力なシグナル伝達を行うことができる。対照的に、ＨＥＲ３ホモ二量体は、チロシンキナーゼドメインの不十分なキナーゼ活性に起因して、完全に不活性である。代表的には、ＨＥＲヘテロ二量体は、シグナル伝達において、ＨＥＲホモ二量体よりも強力である。このことは、ヘテロ二量体化が、２つの異なるレセプターに由来する別個の細胞質テイルを提供し、それによって、さらなるリン酸化チロシン残基と、別個のエフェクター分子の回収のための異なるリン酸化パターンとを提供することに起因する。したがって、ＨＥＲヘテロ二量体化は、シグナル伝達が増幅かつ多様化され得る機構である。ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体は、最も強力なレセプターシグナル伝達ペアである。ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体の効力の増大には、いくつかの理由がある。第一に、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３は、細胞増殖において重要なマイトジェン活性型プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路と、細胞の生存および抗アポトーシス性のシグナルを調節するホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ経路とを含む、多様なシグナル伝達経路に結び付けられる。さらに、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体はまた、レセプターの十分な再生利用と、細胞表面レセプター発現の不十分なダウンレギュレーションとに起因して、シグナル伝達が延長される。
ＨＥＲレセプターは各々が、細胞分化、細胞増殖、細胞生存、新脈管形成、ならびに遊走および浸潤を含む、多様な細胞のプロセスにおいて役割を担うことが示されている。ＨＥＲレセプターは、発生中の胚および成体の組織において、細胞の増殖および分化の必須のメディエーターであるが、その不適切な活性化は、多くの癌（例えば、乳癌、結腸癌および前立腺癌を含む）および他の疾患の発生および重篤度と関連している。疾患に関連するＨＥＲレセプターの不適切な活性化に影響を及ぼす多数の機構が存在する。これらには、例えば、レセプターの過剰発現をもたらす遺伝子の増幅または転写の異常、遺伝子の変異、および、ＨＥＲリガンドの過剰産生から生じるオートクリンの刺激が含まれる。従って、例えば、本明細書において提供される汎治療薬などによるＨＥＲレセプターの標的化は、これらのプロセスが不適切なＨＥＲのシグナル伝達に関連する疾患もしくは状態を処置するために調節され得る機構である。以下は、このような活性およびＨＥＲレセプターのシグナル伝達によって媒介される対応の細胞のプロセスである。これらのプロセス、細胞増殖、細胞生存、新脈管形成、ならびに細胞の遊走および浸潤は、腫瘍形成の特徴である。これらのプロセスはまた、Ｇの節において記載されるように、このような治療薬の実現可能性を評価するために、インビトロで監視され得る。
ａ．細胞の増殖
ＨＥＲレセプターのシグナル伝達は、細胞周期チェックポイントの制御によって増殖の調節において役割を担う。例えば、ＨＥＲ２の過剰発現は、Ｇ１からＳへの移行の調節を異常にし、そして、細胞増殖を駆動する。ＨＥＲ２により誘導される活発なシグナル伝達は、タンパク質ｃ−ＭｙｃおよびサイクリンＤのレベルの増加をもたらす。これらのタンパク質は各々が、サイクリンキナーゼインヒビターであるタンパク質ｐ２７を封鎖するように機能する。サイクリンＥ−ＣＤＫ２は、細胞周期への進入を媒介する。ｐ２７の封鎖は、ｐ２７がサイクリンＥ−ＣＤＫ２に結合してその活性を阻害することを妨害し、したがって、細胞増殖が制御されない結果となる。ＨＥＲ２のシグナル伝達の阻害は、ＭＡＰＫ経路およびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路のダウンレギュレーションをもたらし、これは、ｃ−ＭｙｃおよびサイクリンＤのレベルを減少させる。このことにより、錯体形成していないｐ２７がサイクリンＥ−ＣＤＫ２に結合してＥ−ＣＤＫ２を不活性化し、継続的な細胞増殖を妨害することを可能にする。
ｂ．細胞の生存
ＨＥＲファミリーレセプターは、内在性のアポトーシス経路に関与するエフェクタータンパク質を調節することによって、細胞の生存を調節する。例えば、ＨＥＲシグナル伝達による細胞の生存は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路を介して媒介され、このＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路は、アポトーシス促進性のタンパク質ＢＡＤおよびカスパーゼ９を阻害する基質を標的とする。さらに、ＡＫＴによりリン酸化される標的基質としてはまた、例えば、ＦＡＳリガンドのような、いくつかのアポトーシス促進性遺伝子の発現を阻害する転写因子、ならびに、例えば、ＢＣＬ−ＸＬのような生存促進性タンパク質のレベルをアップレギュレートする他の転写因子（すなわち、ＮＦ−κＢ）が挙げられる。
ｃ．新脈管形成
ＨＥＲシグナル伝達は、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のような種々の脈管形成促進因子の発現を誘導する。例えば、ＨＥＲ１の活性化は、ＶＥＧＦ産生を誘導する。さらに、ＨＥＲ２の過剰発現は、結腸癌、膵臓癌、胃癌、乳癌、腎細胞癌および非小細胞肺癌におけるＶＥＧＦ産生の増加に関連する。ＶＥＧＦの脈管形成作用は、その結合と、内皮細胞上に発現される２つの関連するレセプター（すなわち、ＶＥＧＦＲ１−およびＶＥＧＦＲ−２）の活性化とによって、新血管の発生（すなわち、新脈管形成）、および、脈管の維持または未熟な血管の生存におけるその役割と関連している。新脈管形成は、腫瘍形成において役割を担う。
ｄ．遊走および浸潤
ＨＥＲシグナル伝達の刺激はまた、胚発生、創傷治癒の間、ならびに、腫瘍の増殖および転移において重要な役割を果たす、細胞の移動および遊走の種々の局面を媒介する。細胞の運動性応答は、ＨＥＲ活性化の際に誘導される広域スペクトルのシグナル伝達経路によって開始され得る。例えば、ＨＥＲ１によるＰＬＣγ依存性経路の活性化は、ＨＥＲ１により誘導される細胞の遊走と関連付けられる。というのも、この酵素の阻害は、ＥＧＦにより誘導される細胞の動きをブロックするからである（Ｊｏｒｉｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２８４：３１−５３）。ＥＧＦにより媒介される細胞の遊走の機構は、アクチン改変タンパク質（すなわち、ゲルゾリン、プロフィリン（ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）、コフィリンおよびＣａｐＧ）のＰＬＣ−γにより媒介される放出に起因して、アクチン細胞骨格再配置の刺激に関連付けられる。ＭＡＰＫはまた、例えば、インテグリンレベルの調節などによって、ＨＥＲにより媒介される細胞運動性において役割を担う。ＨＥＲにより媒介される細胞の遊走および運動性に関与する他のシグナル伝達経路またはエフェクター分子としては、ＰＩ３−Ｋおよびその下流のエフェクター分子であるＲａｃ（膜の波打ち運動（ｒａｆｆｌｉｎｇ）およびラメリポディウムの形成に関与）、およびＲｈｏ（細胞の円形化（ｒｏｕｎｄｉｎｇ）および皮質アクチンの重合化に関与）が挙げられる。
さらに、ＨＥＲシグナル伝達により誘導される遊走および浸潤はまた、細胞外マトリックスの構成成分を切断するマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の発現の増加と関連付けられている。例えば、ニューレグリンによるＨＥＲ３およびＨＥＲ４の刺激は、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の誘導に起因した、腫瘍細胞による浸潤およびタンパク質分解活性の生成と関連付けられる。
８．他のＣＳＲのＥＣＤ
ＨＥＲファミリーメンバーを標的とすることに加え、本明細書において提供される治療薬はまた、疾患の過程（腫瘍形成、新脈管形成または炎症性疾患が挙げられるがこれらに限定されない）に関与する任意の他の細胞表面レセプター（ＣＳＲ）またはそのリガンドを標的とするように設計され得る。特に、他のＥＣＤは、１つのレセプターを標的とする治療薬に対する耐性の発生に関与するレセプターに由来する。
代表的には、このようなＣＳＲは、レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である。一般に、このような治療薬は、リガンドと相互作用するか、そして／またはレセプターの二量体化を妨害するのに十分な、ＣＳＲのＥＣＤまたはその一部分を含む。ＲＴＫの例としては、上皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプター（上述のようなもの）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）レセプター、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）レセプター、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）レセプター、神経増殖因子（ＮＧＦ）レセプター、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプター、エフリンに対するレセプター（Ｅｐｈと称される）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）レセプター（ＭＥＴと称される）、ＴＩＥ／Ｔｉｅ−１またはＴＥＫ／Ｔｉｅ−２（アンギオポエチン−１に対するレセプター）、ジスコイジン（ｄｉｓｃｏｉｄｉｎ）ドメインレセプター（ＤＤＲ）および他のレセプター（例えば、Ｔｙｒｏ３／Ａｘ１）が挙げられるがこれらに限定されない。ＥＣＤ部分が治療薬として使用され得る他のＣＳＲとしては、ＴＮＦＲ（すなわち、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＣＤ２７、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＨＶＥＭ、ＬｔβＲ、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０など）またはＲＡＧＥが挙げられるがこれらに限定されない。表７は、例示的なＣＳＲを列挙し、そして、代表的なポリペプチドのＥＣＤを構成するアミノ酸を示す。ＲＴＫおよび他のＣＳＲならびにコードされるアミノ酸の例示的な配列は、配列番号１９３〜２６２のいずれかに示される。
増殖因子レセプターを含むＲＴＫの外部ドメインは、多様なグループのモジュラードメイン（フィブロネクチンＩＩＩ型、システインリッチ、上皮増殖因子、および免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインが挙げられるがこれらに限定されない）から構成される。多くのＲＴＫについて、Ｉｇ様ドメインがリガンド結合を担う（Ｗｉｅｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７８：２４７−２６０を参照のこと）。Ｉｇ様ドメインは、代表的には、８０〜１１０残基を含み、３〜５個のβ−ストランドの２つのアンチパラレルなβーシートを形成し、これらのβ−シートは、ある場合には、ジスルフィド結合によって接続されている。Ｉｇ様ドメインは、β−ストランドの数に依存して、以下の４つの分類にグループ分けされる：Ｖ（可変）、Ｉ（中間）およびＣ１およびＣ２（定常）。例えば、Ｃ２の分類のドメインは、第一のβ−シート内に４を含む最小数のβ−ストランドを含み、そして、第二のβ−シート内に４つのβ−ストランドを含む。表８は、Ｉｇ様ドメインを含む例示的なＲＴＫファミリーメンバーと、これらに結合するリガンドとを示す。
以下の考察は、例示のためのものである。リガンド結合および／または二量体化に必要とされるＥＣＤまたはその一部分は、ヘテロ多量体において、特に、ＨＥＲ ＥＣＤまたはその一部分と合わせられ得るものと理解される。
（ａ）ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）およびＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）
ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２は、ＶＥＧＦに結合し、そして、ＶＥＧＦにより誘導される脈管形成応答において役割を担う。ＶＥＧＦＲ１は、内皮細胞の形態形成に必要とされるのに対し、ＶＥＧＦＲ２は、有糸分裂誘発において役割を担う。ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２の両方のＥＣＤ構造は、７つのＩｇ様ドメインを含み、そして、両方のレセプターはＶＥＧＦに対して同様に結合するが、ＶＥＧＦＲ１はまた、リガンドＰＩＧＦにも結合する。したがって、ＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２との間の機能の差は、レセプターの分子内チロシンキナーゼ配列と、その異なるシグナル伝達特性にあるようである。関連するレセプターＶＥＧＦＲ３もまた、７つのＩｇ様ドメインを含むが、ＶＥＧＦには結合しない。配列番号２５４に示されるＶＥＧＦＲ１の配列に関して、第一のＩｇ様ドメインは、アミノ酸３２〜１２３に対応し、第二のＩｇ様ドメインはアミノ酸１５１〜２１４に対応し、第三のＩｇ様ドメインは、アミノ酸２３０〜３２７に対応し、第四のＩｇ様ドメインは、アミノ酸３３５〜４２１に対応し、第五のＩｇ様ドメインは、アミノ酸４２８〜５５３に対応し、第六のＩｇ様ドメインは、アミノ酸５５６〜６５４に対応し、そして、第七のＩｇ様ドメインは、アミノ酸６６１〜７４７に対応する。配列番号２５６に示されるＶＥＧＦＲ２の配列に関して、第一のＩｇ様ドメインは、アミノ酸４６〜１１０に対応し、第二のＩｇ様ドメインはアミノ酸１４１〜２０７に対応し、第三のＩｇ様ドメインは、アミノ酸２２４〜３２０に対応し、第四のＩｇ様ドメインは、アミノ酸３２８〜４１４に対応し、第五のＩｇ様ドメインは、アミノ酸４２１〜５４８に対応し、第六のＩｇ様ドメインは、アミノ酸５５１〜６６０に対応し、そして、第七のＩｇ様ドメインは、アミノ酸６６７〜７５３に対応する。
ＶＥＧＦＲ１に関して、第二のＩｇ様ドメイン（ドメイン２）は、リガンド結合および特異性を決定し、ＶＥＧＦＲ１ ＥＣＤからこのドメインを欠失させると、このレセプターがＶＥＧＦに結合する能力が無効になる（Ｓｍｙｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９９６）ＥＭＢＯ Ｊ．１５：４９１９−４９２７）。他のドメインを欠失させても、ＶＥＧＦに対する結合を減少させるだけであるが、結合を無効にはしない。しかし、ドメイン２単独では、ＶＥＧＦへの結合に不十分である。ドメイン１と２、またはドメイン２と３もまた、ＶＥＧＦに対して結合しないか、または最小限に結合することが示されている。ドメイン１、２および３のみを含むＶＥＧＦＲ１のＥＣＤ部分は、本質的に、全長ＶＥＧＦＲ１と同一のＶＥＧＦに対する親和性を有する。
（ｂ）ＦＧＦＲ１〜ＦＧＦＲ４
ＦＧＦＲのＥＣＤは、３つのＩｇ様ドメインを含む。例えば、配列番号２３６に示されるＦＧＦＲ２の配列に関して、第一のＩｇ様ドメインは、アミノ酸３９〜１２５に対応し、第二のＩｇ様ドメインは、アミノ酸１５４〜２４７に対応し、そして、第三のＩｇ様ドメインは、アミノ酸２５６〜３５８に対応する。選択的スプライシングにより生成される４つのＦＧＦＲが存在する。個々のＦＧＦＲは、（少なくとも１９の関連するＦＧＦリガンドの中の）リガンドの一部分によって活性化され、そして、ＩｇドメインＩＩＩにおける選択的スプライシングは、特定のリガンドに対する特異性を劇的に変化させ得る（Ｃｈｅｌｌａｉａｈ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＪＢＣ，２７４：３４７８５−３４７９４）。したがって、ＦＧＦリガンドに対する主要なリガンド結合部位は、代表的には、別個のＩｇ様ドメイン内に、より一般には、ドメイン２およびドメイン３内に位置する（Ｃｈｅｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＰＮＡＳ，９１：９８９−９９３）。例えば、ＦＧＦＲ２におけるドメイン３の変異は、ＦＧＦ１およびＦＧＦ７の結合に影響を及ぼすことなく、ＦＧＦ２の結合を阻害する。さらに、キメラＦＧＦＲ分子を用いた研究は、ＦＧＦ１がドメイン２またはドメイン３のいずれかに結合すること；ＦＧＦ２が、Ｉｇドメイン２および３を含むＦＧＦＲ１の遠位配列を優先的に認識すること；ＦＧＦ８が、Ｉｇドメイン２またはＦＧＦＲ２に対してＮ末端側およびＣ末端側の両方の配列を認識すること；そして、ＦＧＦ９の結合が、ＦＧＦＲ３内のＩｇドメイン２に対してＮ末端側の配列およびＦＧＦＲ３内のＩｇドメイン２を含む配列に依存し、ドメイン３は必要としないことを決定した（Ｃｈｅｌｌａｉａｈ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＪＢＣ，２７４：３４７８５−３４７９４）。ＦＧＦのＦＧＦＲへの結合については、ヘアピンの存在がリガンド結合の親和性を最適化する。
（ｃ）ＩＧＦ−１Ｒ
ＲＴＫレセプターの例はＩＧＦ−１Ｒである。インシュリンレセプターファミリーは、インシュリンレセプター（ＩＲ）、インシュリン様増殖因子１レセプター（ＩＦＧ１Ｒ）およびインシュリンレセプター関連レセプターを含む、相同なチロシンキナーゼレセプターを含む。ＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒは共に、単一のポリペプチド鎖として合成され、そして、タンパク質分解により切断されて、ジスルフィド結合によって連結されたαおよびβと呼ばれる２つの別個の鎖を生じる。α鎖は、レセプターの細胞外部分であり、そして、リガンドに結合するのに対し、β鎖は、細胞外領域と、一回膜貫通型セグメントと、リガンドが結合した際にシグナル伝達を媒介する分子内チロシンキナーゼドメインとを有する。ＩＧＦ−１Ｒの細胞外部分は、６つの構造的に別個のドメインを有する。最初の３つは、ＨＥＲの細胞外ドメインＩ〜ＩＩＩ、すなわち、Ｌ１（配列番号２６０のアミノ酸５１〜６１に対応）、システインリッチドメイン（配列番号２６０のアミノ酸１７５〜３３３に対応）およびＬ２（配列番号２６０のアミノ酸３５２〜４６７に対応）に対して相同である。これらの３つのドメインは、レセプターの最小限のリガンド結合部分を形成し、そして、インシュリンに対する低親和性の結合を媒介する。Ｌ２ドメインに対するＣ末端は、３つの細胞外フィブロネクチン３型のモジュールであり、１つはα鎖（配列番号２６０のアミノ酸４８９〜５８７に対応）中であり、１つはα−β連結モジュール（配列番号２６０のアミノ酸６１１〜７０３に対応）中であり、そして、３つ目は、β鎖（配列番号２６０のアミノ酸８３１〜９２６に対応）中である。α鎖およびβ鎖は、αβヘテロ二量体を形成し、そして、２つのヘテロ二量体は、ジスルフィド結合を介して会合し、インタクトな（αβ）２レセプターを形成する。ＨＥＲファミリーレセプターと同様に、リガンド結合は、レセプターを活性化し、そして、細胞質ドメインのリン酸基転移を誘導するために必要とされる。ＩＧＦ−１Ｒの活性化は、細胞増殖、形質転換およびアポトーシスに関与する。
（ｄ）ＲＡＧＥおよび他のＣＳＲ
本明細書において企図される他のＣＳＲ ＥＣＤとしては、ＲＡＧＥ ＣＳＲＳに由来するもの（同時係属中の米国出願第１１／４２９，０９０号と、この中で援用されるＲＡＧＥ ＣＳＲの説明に関する参考文献、ならびにまた、例示的なＥＣＤおよびＣＳＲアイソフォームに関する参考文献を参照のこと）が挙げられる。上記表７はまた、全長ＲＡＧＥおよびそのＥＣＤ部分の配列を示す。
Ｄ．ＥＣＤ多量体の成分とＥＣＤ多量体の形成
ＥＣＤヘテロ多量体は、リガンドへの結合および／または二量体化のために、少なくとも２つの異なるＥＣＤまたはその一部分を含む。本明細書における例示的な実施形態では、構成要素のＥＣＤの少なくとも１つは、ＨＥＲ ＥＣＤであり、一般には、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４のうち少なくとも１つ、または、リガンド結合および／もしくは二量体化のためのこれらの一部分である。一般に、ＥＣＤのうち少なくとも２つは、ＨＥＲ、特に、ＨＥＲ１とＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４である。他のＥＣＤとしては、他のＣＳＲ（一般にはＲＴＫ、特に、腫瘍形成もしくは新脈管形成もしくは炎症性疾患に関連するもの、代表的には、単一の細胞表面レセプターに対して標的化された薬物に対する耐性に関連するもの）に由来するＥＣＤが挙げられる。ＥＣＤポリペプチドはまた、２以上のＣＳＲに由来するドメインを含むハイブリッドＥＣＤ分子であり得る。ヘテロ多量体中のＥＣＤは連結され、それによって、多量体、少なくともヘテロ二量体が、形成される。ＥＣＤの相互作用を可能にするかまたはもたらして、ヘテロ多量体を形成する任意の結合が企図され、これにより、得られる多量体分子が、ＥＣＤの同系レセプターのうち１つまたは全体に対するリガンドと相互作用するか、そして／または、同系レセプターもしくは他の相互作用性のレセプターのうち一方もしくは両方と相互作用して、二量体化を阻害する。このような結合は、共有結合性の相互作用および非共有結合性の相互作用に基づく、任意の安定な結合であり得る。
１．ＥＣＤポリペプチド
本明細書において提供されるＥＣＤ多量体の作製において使用するためのＥＣＤポリペプチドは、ＣＳＲ（例えば、任意のＲＴＫまたはその任意のＥＣＤ含有部分）のＥＣＤの全体もしくは一部分であり得る。代表的には、ＥＣＤがＨＥＲの全体もしくは一部分でない限り、得られるＥＣＤは、リガンドに結合するその能力を保持する。さらに、ＨＥＲファミリー（例えば、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４の全体もしくは一部分）のＥＣＤであるＥＣＤはまた、代表的に、ＨＥＲファミリーレセプター（全長のＨＥＲファミリーレセプターを含む）と二量体化するその能力を保持する。したがって、多量体のパートナーがＨＥＲ ＥＣＤである場合、ＨＥＲ ＥＣＤポリペプチド部分は、少なくとも、リガンドへの結合に十分なサブドメインＩおよびサブドメインＩＩＩの部分と、二量体化に十分なサブドメインＩＩの部分とを含む。一般に、ＨＥＲ ＥＣＤはまた、サブドメインＩＶのモジュール１の少なくとも一部分を含む。サブドメインＩＶの残りは任意である。
（ａ）ＨＥＲファミリーの全長ＥＣＤ
本明細書において提供されるＨＥＲ多量体に含まれるＥＣＤポリペプチドは、ＨＥＲポリペプチドの全長ＥＣＤであり得る。ＨＥＲポリペプチドについて、ＨＥＲ ＥＣＤは、リガンドの結合を可能にし、そして、同系レセプターもしくは関連のＨＥＲファミリーレセプターとの二量体化を媒介するのに十分な、ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶを含む。ＨＥＲ ＥＣＤポリペプチドとしてはまた、対立遺伝子改変体もしくは種改変体、または、結果として生じるＨＥＲ ＥＣＤポリペプチドがリガンドに結合するその能力および／または、同系レセプターもしくは関連のＨＥＲファミリーレセプターと二量体化するその能力を保持する限り、ＨＥＲポリペプチドのＥＣＤ部分内の他の公知の改変体が挙げられる。
（ｉ）ＨＥＲ１ ＥＣＤ
全長ＨＥＲ１ ＥＣＤポリペプチドは、本明細書において提供されるＥＣＤ多量体の形成において使用され得る。このような全長のＨＥＲ１ ＥＣＤは、成熟なＨＥＲ１レセプター（ＨＥＲ１−６２１；ＨＦ１００）のアミノ酸残基１〜６２１を含む。ＨＦ１００分子のヌクレオチド配列は、配列番号１１に示され、そして、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を持つ全長ＨＥＲ１ ＥＣＤポリペプチドをコードする。全長ＨＥＲ１ ＥＣＤポリペプチドとしては、配列番号１２に示される例示的なＨＥＲ１ ＥＣＤポリペプチドと比べて、アミノ酸配列において１以上の変化を有する任意のものが挙げられる。ＨＥＲ１ポリペプチドにおける変化の例は、配列番号２６３に示されるような前駆体ＨＥＲ１ポリペプチドにおける任意の対立遺伝子改変体に対応する任意の変化である。ＨＥＲ１の全長ＥＣＤポリペプチドにおける例示的な変化としては、配列番号１２における、Ｒ７４Ｑ、Ｐ２４２Ｒ、Ｒ４９７ＫもしくはＣ６０４Ｓのうち任意の１つ以上に対応する任意の１以上の変化が挙げられる。
（ｉｉ）ＨＥＲ２ ＥＣＤ
本明細書において提供されるＥＣＤ多量体はまた、成熟なＨＥＲ２レセプター（ＨＥＲ２−６５０；ＨＦ２００）のアミノ酸残基１〜６２８を含む全長ＨＥＲ２ ＥＣＤポリペプチドを含み得る。ＨＦ２００分子のヌクレオチド配列は、配列番号１７に示され、そして、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を持つ全長ＨＥＲ２ ＥＣＤポリペプチドをコードする。全長ＨＥＲ２ ＥＣＤポリペプチドとしては、配列番号１８に示される例示的なＨＥＲ２ ＥＣＤポリペプチドと比べて、アミノ酸配列において１以上の変化を有する任意のものが挙げられる。ＨＥＲ２ポリペプチドにおける変化の例は、配列番号２６４に示されるような前駆体ＨＥＲ２ポリペプチドにおける任意の対立遺伝子改変体に対応する任意の変化である。ＨＥＲ２の全長ＥＣＤポリペプチドにおける例示的な変化としては、配列番号１８における、Ｗ４３０Ｃのうち任意の１つ以上に対応する任意の１以上の変化が挙げられる。
（ｉｉｉ）ＨＥＲ３ ＥＣＤ
別の例では、全長ＨＥＲ３ ＥＣＤポリペプチドが、本明細書において提供されるＥＣＤ多量体の形成において使用され得る。このような全長のＨＥＲ３ ＥＣＤは、成熟なＨＥＲ３レセプター（ＨＥＲ３−６２１；ＨＦ３００）のアミノ酸残基１〜６２１を含む。ＨＦ３００分子のヌクレオチド配列は、配列番号２５に示され、そして、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を持つ全長ＨＥＲ３ ＥＣＤポリペプチドをコードする。全長ＨＥＲ３ ＥＣＤポリペプチドとしては、配列番号２６に示される例示的なＨＥＲ３ ＥＣＤポリペプチドと比べて、アミノ酸配列において１以上の変化を有する任意のものが挙げられる。ＨＥＲ３ポリペプチドにおける変化の例は、配列番号２６５に示されるような前駆体ＨＥＲ３ポリペプチドにおける任意の対立遺伝子改変体に対応する任意の変化である。ＨＥＲ１の全長ＥＣＤポリペプチドにおける例示的な変化としては、配列番号２６における、Ｇ５４１Ｅのうち任意の１つ以上に対応する任意の１以上の変化が挙げられる。
（ｉｖ）ＨＥＲ４ ＥＣＤ
本明細書において提供されるＥＣＤ多量体はまた、成熟なＨＥＲ４レセプター（ＨＥＲ４−６５０；ＨＦ４００）のアミノ酸残基１〜６２５を含む全長ＨＥＲ４ ＥＣＤポリペプチドを含み得る。ＨＦ４００分子のヌクレオチド配列は、配列番号３１に示され、そして、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を持つ全長ＨＥＲ４ ＥＣＤポリペプチドをコードする。全長ＨＥＲ４ ＥＣＤポリペプチドとしては、配列番号３２に示される例示的なＨＥＲ４ ＥＣＤポリペプチドと比べて、アミノ酸配列において１以上の変化を有する任意のものが挙げられる。ＨＥＲ４ポリペプチドにおける変化の例は、配列番号２６６に示されるような前駆体ＨＥＲ４ポリペプチドにおける任意の対立遺伝子改変体に対応する任意の変化である。ＨＥＲ４の全長ＥＣＤポリペプチドにおける例示的な変化としては、配列番号３２に示されるアミノ酸配列に対応する任意の１以上のアミノ酸変化が挙げられる。
（ｂ）ＨＥＲファミリーの短縮型ＥＣＤ
本明細書において提供されるＨＥＲ多量体内に含まれるＥＣＤポリペプチドは、ＨＥＲポリペプチドの短縮型ＥＣＤであり得る。短縮型のＨＥＲポリペプチドに関して、ＨＥＲ ＥＣＤは、代表的に、リガンドへの結合に十分なドメインＩおよびＩＩＩの部分と、レセプターの二量体化を媒介するのに十分なドメインＩＩの部分とを含む。一般に、短縮型のＨＥＲ ＥＣＤはまた、例えば、分子を安定化させるために、ドメインＩＶのモジュール１の少なくとも一部分を含む。ドメインＩＶの残りの部分は任意である。さらに、短縮型ＥＣＤポリペプチドはまた、追加の配列が、ＨＥＲ ＥＣＤポリペプチドのリガンド結合および／またはレセプター二量体化を阻害も干渉もしない限りは、ＨＥＲ ＥＣＤの一部ではない追加の配列を含み得る。例えば、短縮型ＥＣＤポリペプチドは、選択的スプライシングによって生成されるポリペプチド（例えば、イントロンによりコードされるアミノ酸を含むポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない）を含み得る。短縮型のＨＥＲ ＥＣＤポリペプチドはまた、対立遺伝子改変体もしくは種改変体、または、結果として生じる短縮型ＨＥＲ ＥＣＤポリペプチドが、リガンドに結合するその能力および／または、同系レセプターもしくは関連のＨＥＲファミリーレセプターと二量体化するその能力を保持する限りは、短縮型ＨＥＲポリペプチドのＥＣＤ部分内の他の公知の改変体を含む。
（ｉ）短縮型ＨＥＲ１ ＥＣＤ
一例では、本明細書において提供されるＥＣＤ多量体において使用され得る短縮型ＨＥＲ１ ＥＣＤポリペプチドは、成熟なＨＥＲ１レセプター（ＨＥＲ１−５０１；ＨＦ１１０）のアミノ酸残基１〜５０１を含む。ＨＦ１１０分子のヌクレオチド配列は、配列番号９に示され、そして、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を持つ短縮型ＨＥＲ１ ＥＣＤポリペプチドをコードする。ＨＦ１１０は、同系のＨＥＲ１ ＥＣＤのドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩの全体と、ドメインＩＶのモジュール１の全体とを含む。
また、ＥＣＤ多量体における使用が企図されるのは、選択的スプライシングから生じる短縮型ＨＥＲ１ ＥＣＤポリペプチドである。このようなアイソフォームとしては、当該分野で公知の任意のもの、または、関連の米国特許出願公開番号ＵＳ２００５−０２３９０８８に記載される任意のもの、または、イントロン融合タンパク質として本明細書において以下に提供される任意のものが挙げられる。他のこのような例示的な短縮型ＨＥＲ１ ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１２８に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＥＧＦＲアイソフォームｂ（ＮＰ＿９５８４３９；配列番号１２９）である。この短縮型ＨＥＲ１ ＥＣＤポリペプチドはアミノ酸残基１〜２４に対応するシグナルペプチドを含む６２８アミノ酸であり、そして、そのＣ末端に、同系のＨＥＲ１ ＥＣＤには存在しない１つの追加アミノ酸を含む。配列番号１２９に示される前駆体の短縮型ＨＥＲ１ ＥＣＤポリペプチドの成熟な形態（シグナル配列を含まない）は、図２（Ａ）に示されるような長さ６０４のアミノ酸であり、そして、同系のＨＥＲ１ ＥＣＤのドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩと、ドメインＩＶのほぼ全体（最大でモジュール７のほとんどを含む）とを含む。さらなる例において、短縮型ＨＥＲ１ ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１３０に示されるヌクレオチド配列によりコードされるＥＧＦＲアイソフォームｄ（ＮＰ＿９５８４４１；配列番号１３１）を含み得る。この短縮型ＨＥＲ１ ＥＣＤポリペプチドは、アミノ酸残基１〜２４に対応するシグナルペプチドを含む７０５アミノ酸であり、そして、そのＣ末端に、同系のＨＥＲ２ ＥＣＤには存在しない７６の追加アミノ酸を含む。配列番号１３１に示される前駆体の短縮型ＨＥＲ１ ＥＣＤポリペプチドの成熟な形態（シグナル配列を含まない）は、図２（Ａ）に示されるような長さ６８１のアミノ酸であり、そして、同系のＨＥＲ１ ＥＣＤのドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩと、ドメインＩＶのほぼ全体（最大でモジュール７のほとんどを含む）とを含む。
短縮型ＨＥＲ１ ＥＣＤポリペプチドとしては、例えば、配列番号１０、１２９または１３１に示される例示的な短縮型ＨＥＲ１ ＥＣＤポリペプチドに比べて、アミノ酸配列において１以上の変化を有する任意のものが挙げられる。ＨＥＲ１ポリペプチドにおける例示的な変化は、配列番号２６３に示されるような前駆体ＨＥＲ１ポリペプチドにおける任意の対立遺伝子改変体に対応する任意の変化である。短縮型ＨＥＲ１ ＥＣＤポリペプチドにおける例示的な変化としては、配列番号１０におけるＲ７４Ｑ、Ｐ２４２ＲもしくはＲ４９７Ｋのうち任意の１つ以上に対応する任意の１以上の変化が挙げられる。例示的な変化としてはまた、配列番号１２９もしくは１３１に示されるアミノ酸配列を有する短縮型ＨＥＲ１ポリペプチドにおけるＲ９８Ｑ、Ｐ２６６Ｒ、Ｒ５２１Ｋ、Ｃ６２８ＳもしくはＶ６７４Ｉに対応する任意の１以上のアミノ酸変化が挙げられ得る。
（ｉｉ）短縮型ＨＥＲ２ ＥＣＤ
ＥＣＤ多量体はまた、短縮型ＨＥＲ２ ＥＣＤポリペプチドを含み得る。例えば、成熟なＨＥＲ２レセプター（ＨＥＲ２−５９５；ＨＦ２１０）のアミノ酸残基１〜５７３を含む短縮型ＨＥＲ２ ＥＣＤポリペプチドは、ＥＣＤ多量体の形成において使用され得る。ＨＦ２１０分子のヌクレオチド配列は、配列番号１５に示され、そして、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を持つ短縮型ＨＥＲ２ ＥＣＤポリペプチドをコードする。ＨＦ２１０は、同系のＨＥＲ２ ＥＣＤのドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩの全体と、ドメインＩＶのモジュール５の一部分とを含む。また、成熟なＨＥＲ２レセプター（ＨＥＲ２−５３０；ＨＦ２２０）のアミノ酸残基１〜５０８を含む短縮型ＨＥＲ２ ＥＣＤポリペプチドが、本明細書において多量体化パートナーとして提供される。Ｈ２２０のヌクレオチド配列は、配列番号１３に示され、そして、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を持つ短縮型ＨＥＲ２ ＥＣＤポリペプチドをコードする。ＨＦ２１２は、同系のＨＥＲ２ ＥＣＤのドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩの全体と、最大でドメインＩＶのモジュール１の全体とを含む。
また、ＥＣＤ多量体における使用が企図されるのは、選択的スプライシングから生じる短縮型ＨＥＲ２ ＥＣＤポリペプチドである。このようなアイソフォームとしては、当該分野で公知の任意のもの、または、関連の米国特許出願公開番号ＵＳ２００５−０２３９０８８に記載される任意のもの、または、イントロン融合タンパク質として本明細書において以下に提供される任意のものが挙げられる。他のこのような例示的な短縮型ＨＥＲ２ ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１３７に示されるアミノ酸配列を持つＥｒｂＢ２．１ｅである。この短縮型ＨＥＲ２ ＥＣＤポリペプチドはアミノ酸残基１〜２２に対応するシグナルペプチドを含む６３３アミノ酸である。配列番号１３７に示される前駆体の短縮型ＨＥＲ２ ＥＣＤポリペプチドの成熟な形態（シグナル配列を含まない）は、図２（Ｂ）に示されるような長さ６１１のアミノ酸であり、そして、同系のＨＥＲ２ ＥＣＤのドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩと、ドメインＩＶのほぼ全体（最大でモジュール７のほとんどを含む）とを含む。さらなる例において、短縮型ＨＥＲ２ ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１３６に示されるアミノ酸配列を持つＥｒｂＢ２．１ｄである。この短縮型ＨＥＲ２ ＥＣＤポリペプチドは、配列番号３に示される同系のＨＥＲ２内のシグナルペプチドと比べて２アミノ酸の挿入を含むアミノ酸残基１〜２４に対応するシグナルペプチドを含む６８０アミノ酸である。ＥｒｂＢ２．１ｄはまた、Ｃ末端に、同系のＨＥＲ２ ＥＣＤには存在しない３０の追加アミノ酸を含む。配列番号１３６に示される前駆体の短縮型ＨＥＲ２ ＥＣＤポリペプチドの成熟な形態（シグナル配列を含まない）は、図２（Ｂ）に示されるような長さ６５６のアミノ酸であり、そして、同系のＨＥＲ２ ＥＣＤのドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩと、ドメインＩＶのほぼ全体（最大でモジュール１〜７の全体を含む）とを含む。
短縮型ＨＥＲ２ ＥＣＤポリペプチドとしては、例えば、配列番号１４、１６、１３６および１３７に示される例示的な短縮型ＨＥＲ２ ＥＣＤポリペプチドに比べて、アミノ酸配列において１以上の変化を有する任意のものが挙げられる。ＨＥＲ２ポリペプチドにおける例示的な変化は、配列番号２６４に示されるような前駆体ＨＥＲ２ポリペプチドにおける任意の対立遺伝子改変体に対応する任意の変化である。短縮型ＨＥＲ２ ＥＣＤポリペプチドにおける例示的な変化としては、配列番号１４もしくは１６におけるＷ４３０Ｃに対応する任意の１以上の変化が挙げられる。例示的な変化としてはまた、それぞれ、配列番号１３７もしくは１３６に示されるアミノ酸配列を有する短縮型ＨＥＲ２ポリペプチドにおけるＷ４５２ＣもしくはＷ４５４Ｃに対応する任意の１以上のアミノ酸変化が挙げられ得る。
（ｉｉｉ）短縮型ＨＥＲ３ ＥＣＤ
ＥＣＤ多量体はまた、成熟なＨＥＲ３レセプター（ＨＥＲ３−５００；ＨＦ３１０）のアミノ酸残基１〜５００を含む短縮型ＨＥＲ３ ＥＣＤポリペプチドを含み得る。Ｈ３１０分子のヌクレオチド配列は、配列番号１９に示され、そして、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を持つ短縮型ＨＥＲ３ ＥＣＤポリペプチドをコードする。ＨＦ３１０は、同系のＨＥＲ３ ＥＣＤのドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩの全体と、最大でドメインＩＶのモジュール１の一部分とを含む。別の例では、ＥＣＤ多量体は、成熟なＨＥＲ３レセプター（ＨＥＲ３−５１９）のアミノ酸残基１〜５１９を含む短縮型ＨＥＲ３ ＥＣＤポリペプチドを含み得る。ＨＥＲ３−５１９のヌクレオチド配列は、配列番号２３に示され、そして、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を持つ短縮型ＨＥＲ３ ＥＣＤポリペプチドをコードする。ＨＥＲ３−５１９は、同系のＨＥＲ３レセプターのドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩの全体と、最大でドメインＩＶのモジュール３の一部分とを含む。
また、ＥＣＤ多量体における使用が企図されるのは、選択的スプライシングから生じる短縮型ＨＥＲ３ ＥＣＤポリペプチドである。このようなアイソフォームとしては、当該分野で公知の任意のもの、または、関連の米国特許出願公開番号ＵＳ２００５−０２３９０８８に記載される任意のもの、または、イントロン融合タンパク質として本明細書において以下に提供される任意のものが挙げられる。他のこのような例示的な短縮型ＨＥＲ３ ＥＣＤポリペプチドは、配列番号２２に示され、そして、配列番号２１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるｐ８５ＨＥＲ３である。この短縮型ＨＥＲ３ ＥＣＤポリペプチドはアミノ酸残基１〜１９に対応するシグナルペプチドを含む５６２アミノ酸であり、そして、そのＣ末端に、同系のＨＥＲ３ ＥＣＤには存在しない２４の追加アミノ酸を含む。配列番号２２に示される前駆体の短縮型ＨＥＲ３ ＥＣＤポリペプチドの成熟な形態（シグナル配列を含まない）は、図２（Ｃ）に示されるような長さ５４３のアミノ酸であり、そして、同系のＨＥＲ３ ＥＣＤのドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩと、最大でドメインＩＶのモジュール３の一部分とを含む。
短縮型ＨＥＲ３ ＥＣＤポリペプチドとしては、例えば、配列番号１４、１６、１３６および１３７に示される例示的な短縮型ＨＥＲ３ ＥＣＤポリペプチドに比べて、アミノ酸において１以上の変化を有する任意のものが挙げられる。ＨＥＲ３ポリペプチドにおける例示的な変化は、配列番号２６５に示されるような前駆体ＨＥＲ３ポリペプチドにおける任意の対立遺伝子改変体に対応する任意の変化である。
（ｉｖ）短縮型ＨＥＲ４ ＥＣＤ
さらに、短縮型ＨＥＲ４ ＥＣＤポリペプチドを含むＥＣＤ多量体が形成され得る。一つの例示的な短縮型ＨＥＲ４ ＥＣＤポリペプチドは、成熟なＨＥＲ４レセプター（ＨＥＲ４−５２２）のアミノ酸残基１〜５２２を含む短縮型ＨＥＲ４ ＥＣＤポリペプチドを含む。ＨＥＲ４−５２２分子のヌクレオチド配列は、配列番号２９に示され、そして、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を持つ短縮型ＨＥＲ４ ＥＣＤポリペプチドをコードする。ＨＥＲ４−５２２は、同系のＨＥＲ４ ＥＣＤのドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩの全体と、最大でドメインＩＶのモジュール１とを含む。別の短縮型ＨＥＲ４ ＥＣＤポリペプチドは、成熟なＨＥＲ４レセプター（ＨＦ４１０；ＨＥＲ４−４８５）のアミノ酸残基１〜４６０を含む。Ｈ４１０のヌクレオチド配列は、配列番号２７に示され、そして、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を持つ短縮型ＨＥＲ４ ＥＣＤポリペプチドをコードする。ＨＦ４１０は、同系のＨＥＲ４ ＥＣＤのドメインＩ、ＩＩの全体と、最大でドメインＩＩＩのほぼ全体とを含む。
また、ＥＣＤ多量体における使用が企図されるのは、選択的スプライシングから生じる短縮型ＨＥＲ４ ＥＣＤポリペプチドである。このようなアイソフォームとしては、当該分野で公知の任意のもの、または、関連の米国特許出願公開番号ＵＳ２００５−０２３９０８８に記載される任意のもの、または、イントロン融合タンパク質として本明細書において以下に提供される任意のものが挙げられる。他のこのような例示的な短縮型ＨＥＲ４ ＥＣＤポリペプチドは、配列番号１５９に示され、配列番号１５８に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＥｒｂＢ４＿ｉｎｔ１２である。この短縮型ＨＥＲ４ ＥＣＤポリペプチドはアミノ酸残基１〜２５に対応するシグナルペプチドを含む５０６アミノ酸であり、そして、そのＣ末端に、同系のＨＥＲ４ ＥＣＤには存在しない１０の追加アミノ酸を含む。この追加アミノ酸は、選択的スプライシングを受けた産物として保持されるＨＥＲ４遺伝子のイントロン１２の一部分によってコードされる。配列番号１５９に示される前駆体の短縮型ＨＥＲ４ ＥＣＤポリペプチドの成熟な形態（シグナル配列を含まない）は、図２（Ｄ）に示されるような長さ４８１のアミノ酸であり、そして、同系のＨＥＲ４ ＥＣＤのドメインＩ、ＩＩと、ドメインＩＩＩのほぼ全体とを含む。
短縮型ＨＥＲ４ ＥＣＤポリペプチドとしては、例えば、配列番号２８、３０または１５９に示される例示的な短縮型ＨＥＲ４ ＥＣＤポリペプチドに比べて、アミノ酸において１以上の変化を有する任意のものが挙げられる。ＨＥＲ４ポリペプチドにおける例示的な変化は、配列番号２６６に示されるような前駆体ＨＥＲ４ポリペプチドにおける任意の対立遺伝子改変体に対応する任意の変化である。
（ｃ）ハイブリッドＥＣＤ
２以上のＨＥＲレセプターに由来するサブドメインを含む、ハイブリッドＥＣＤまたはその一部分が、本明細書において提供される。一般に、ハイブリッドＥＣＤは、１以上のＨＥＲレセプターのドメインＩもしくはＩＩＩの全体またはリガンドへの結合に十分な部分と、ドメインＩＩの全体または同じＨＥＲ ＥＣＤもしくは別のＨＥＲ ＥＣＤからのレセプターの二量体化を媒介するのに十分な部分とを含む。したがって、ハイブリッドＥＣＤ分子は、全てのＨＥＲファミリーのＥＣＤの一部分、一般には、３つのＨＥＲファミリーのＥＣＤの一部分と、２つのＨＥＲファミリーのＥＣＤの少なくとも一部分とを含み得る。代表的には、このようなＥＣＤは、ＨＥＲ２に由来するサブドメインＩＩと、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ３もしくはＥｒｂＢ４に由来するサブドメインＩおよびＩＩＩ（同じレセプターに由来するものであっても異なるレセプターに由来するものであってもよい）とを含む。各サブドメイン部分は、結果として生じるＥＣＤが二量体化し、そして、少なくとも１つのリガンドに結合し、そして、２以上の（異なる）リガンドに結合し得るように選択される。したがって、ドメインの組合せは、これらが、少なくとも１つのリガンドに結合し、そして、２つのリガンドに結合し得、そしてまた、二量体化のために十分なサブドメインＩＩの部分を含むように選択される。このようなハイブリッドの例は、ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４に由来するサブドメインＩと、ＨＥＲ２に由来するサブドメインＩＩと、ＨＥＲ１に由来するサブドメインＩＩＩとを含む単量体性ハイブリッドＥＣＤである。例えば、ＥｒｂＢ３に由来するサブドメインＩと、ＥｒｂＢ２に由来するサブドメインＩＩと、ＥｒｂＢ１に由来するサブドメインＩＩＩとを含むハイブリッドＥＣＤが提供される。ＨＲＧは、ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４（サブドメインＩ）に結合し、そして、ＥＧＦは、主にＨＥＲ１のサブドメインＩＩＩと相互作用する（例えば、Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４４２６６−４４２７４；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：２３２３−２３２９を参照のこと）。したがって、ハイブリッドは、少なくとも２つのリガンドに結合する（例えば、Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４４２６６−４４２７４を参照のこと）。さらに、多量体化ドメインが追加され、キメラ多量体が形成すると、結果として生じるキメラ分子は、少なくとも２つの異なるＨＥＲレセプターおよび少なくとも２つの異なるリガンドと相互作用し得る。
（ｄ）他のＣＳＲもしくはＲＴＫのＥＣＤ、またはこれらの一部分
ＣＳＲまたは他のＲＴＫの、リガンドへの結合に十分な任意のＥＣＤ部分もしくはそのフラグメントを含む他のＥＣＤポリペプチドが、本明細書において提供されるＥＣＤ多量体の形成において使用され得る。代表的には、このようなＣＳＲ ＥＣＤまたはその一部分は、疾患の病因に関与する任意のＣＳＲのＥＣＤ、および／または、単一の細胞表面レセプターに対して標的化された薬物に対する耐性に関与するＣＳＲのＥＣＤである。例示的なＣＳＲまたはＲＴＫレセプターは、表７に示され、この表はまた、それぞれのレセプターのそれぞれのＥＣＤ部分を示す。したがって、表７に示されるような任意の全長ＥＣＤは、本明細書における多量体化パートナーとして使用するために企図される。表７に示される任意のＣＳＲの全長ＥＣＤの一部分またはフラグメントはまた、その一部分またはフラグメントが、リガンドへの結合および／または同系レセプターとの二量体化の能力を保持する限りは、多量体化パートナーとして使用するために企図される。例えば、ＶＥＧＦＲ１のようなＶＥＧＦＲ ＥＣＤの一部分またはフラグメントは、少なくとも、Ｉｇドメイン１、２および３の、リガンドへの結合に十分な部分を含む。別の例では、ＦＧＦＲ１〜４のいずれかのようなＦＧＦＲ ＥＣＤの一部分またはフラグメントは、少なくとも、Ｉｇドメイン２および３の、リガンドへの結合に十分な部分を含む。さらなる例では、ＩＧＦ−１Ｒ ＥＣＤの一部分またはフラグメントは、少なくとも、Ｌ１ドメイン、システインリッチドメインおよびＬ２ドメインの、リガンドへの結合および／またはレセプターの二量体化の媒介に十分な部分を含む。
（ｅ）ポリペプチドの選択的スプライシングを受けたアイソフォーム
本明細書において提供されるＥＣＤ多量体の形成において使用するための他のＥＣＤポリペプチドとしては、ＣＳＲのＥＣＤ部分またはそのフラグメントと、必要に応じて、同系レセプターのドメイン配列とは整列しない追加アミノ酸とを含む任意のアイソフォームが挙げられる。このようなＥＣＤポリペプチドとしては、例えば、選択的スプライシングを受けた、ＣＳＲまたは他のＲＴＫが挙げられる。代表的には、ＥＣＤを含むポリペプチドアイソフォームは、リガンドに結合し、そして／または、細胞表面レセプターと二量体化する。選択的スプライシングを受けたアイソフォームとしては、例えば、エキソン伸長、エキソン挿入、エキソン欠失、エキソン短縮またはイントロン保持によって作製されたものが挙げられる。このような選択的スプライシングを受けたアイソフォームは、当該分野で公知であり（例えば、米国特許第６，４１４，１３０号；米国特許出願公開ＵＳ２００５／０２３９０８８、ＵＳ２００４／００２２７８５Ａ１、ＵＳ２００５０１２３５３８；国際特許出願公開ＷＯ００４４４０３、ＷＯ０１６１３５６およびＷＯ０２１４４７０を参照のこと）、そして、配列番号２２、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号３０１〜３９９、および配列番号４０８〜４１３のいずれか１つに示される。例えば、選択的スプライシングを受けたアイソフォームとしては、ＨＥＲ１のアイソフォーム（配列番号１２９、配列番号１３１もしくは配列番号１３３に示される任意のものが挙げられるがこれらに限定されない）；ＨＥＲ２のアイソフォーム（配列番号１３５もしくは配列番号３８５〜３９９のいずれかに示されるハースタチンまたはその改変体が挙げられるがこれらに限定されない）；または、他の選択的スプライシングを受けたアイソフォーム（配列番号１３６〜１３９もしくは配列番号４０８〜４１３に示される任意のものが挙げられるがこれらに限定されない）；ＨＥＲ３のアイソフォーム（配列番号２２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４９、配列番号１５０もしくは配列番号１５１に示される任意のものが挙げられるがこれらに限定されない）が挙げられる。
選択的スプライシングを受けたアイソフォームはまた、ＨＥＲ１遺伝子の他のアイソフォームを含み得る。ＨＥＲ１遺伝子（配列番号４００）は、２７のイントロンにより中断された２８のエキソンから構成される。配列番号４００として本明細書中に提供されるＨＥＲ１の例示的なゲノム配列において、エキソン１は、５’非翻訳領域を含むヌクレオチド１〜２５４を含む。開始コドンは、ヌクレオチド位置１６７から始まる。イントロン１は、ヌクレオチド２５５〜６１４を含む；エキソン２は、ヌクレオチド６１５〜７６６を含む；イントロン２は、ヌクレオチド７６７〜１１２６を含む；エキソン３は、ヌクレオチド１１２７〜１３１０を含む；イントロン３は、ヌクレオチド１３１１〜１６７０を含む；エキソン４は、ヌクレオチド１６７１〜１８０５を含む；イントロン４は、ヌクレオチド１８０６〜２１６５を含む；エキソン５は、ヌクレオチド２１６６〜２２３４を含む；イントロン５は、ヌクレオチド２２３５〜２５９４を含む；エキソン６は、ヌクレオチド２５９５〜２７１３を含む；イントロン６は、ヌクレオチド２７１４〜３０７３を含む；エキソン７は、ヌクレオチド３０７４〜３２１５を含む；イントロン７は、ヌクレオチド３２１６〜３５７５を含む；エキソン８は、ヌクレオチド３５７６〜３６９２を含む；イントロン８は、ヌクレオチド３６９３〜４０５２を含む；エキソン９は、ヌクレオチド４０４３〜４１７９を含む；イントロン９は、ヌクレオチド４１８０〜４５３９を含む；エキソン１０は、ヌクレオチド４５４０〜４６１３を含む；イントロン１０は、ヌクレオチド４６１４〜４９７３を含む；エキソン１１は、ヌクレオチド４９７４〜５０６３を含む；イントロン１１は、ヌクレオチド５０６４〜５４２３を含む；エキソン１２は、ヌクレオチド５４２４〜５６２３を含む；イントロン１２は、ヌクレオチド５６２４〜５９８３を含む；エキソン１３は、ヌクレオチド５９８４〜６１１６を含む；イントロン１３は、ヌクレオチド６１１７〜６４７６を含む；エキソン１４は、ヌクレオチド６４７７〜６５６７を含む；イントロン１４は、ヌクレオチド６５６８〜６９２７を含む；エキソン１５は、ヌクレオチド６９２８〜７０８５を含む；イントロン１５は、ヌクレオチド７０８６〜７４４５を含む；エキソン１６は、ヌクレオチド７４４６〜７４８４を含む；イントロン１６は、ヌクレオチド７４８５〜７８４４を含む；エキソン１７は、ヌクレオチド７８４５〜７９８８を含む；イントロン１７は、ヌクレオチド７９８７〜８３４６を含む；エキソン１８は、ヌクレオチド８３４７〜８４６９を含む；イントロン１８は、ヌクレオチド８４７０〜８８２９を含む；エキソン１９は、ヌクレオチド８８３０〜８２９５を含む；イントロン１９は、ヌクレオチド８９２９〜９２８８を含む；エキソン２０は、ヌクレオチド９２８９〜９４７４を含む；イントロン２０は、ヌクレオチド９４７５〜９８３４を含む；エキソン２１は、ヌクレオチド９８３５〜９９９０を含む；イントロン２１は、ヌクレオチド９９９１〜１０３５０を含む；エキソン２２は、ヌクレオチド１０３５１〜１０４２６を含む；イントロン２２は、ヌクレオチド１０４２７〜１０７８６を含む；エキソン２３は、ヌクレオチド１０７８７〜１０９３３を含む；イントロン２３は、ヌクレオチド１０９３４〜１１２９３を含む；エキソン２４は、ヌクレオチド１１２９４〜１１３９１を含む；イントロン２４は、ヌクレオチド１１３９２〜１１７５１を含む；エキソン２５は、ヌクレオチド１１７５２〜１１９１９を含む；イントロン２６は、ヌクレオチド１１９２０〜１２２７９を含む；エキソン２６は、ヌクレオチド１２２８０〜１２３２７を含む；イントロン２６は、ヌクレオチド１２３２８〜１２６８７を含む；エキソン２７は、ヌクレオチド１２６８８〜１２７９６を含む；イントロン２７は、ヌクレオチド１２７９７〜１３１５６を含む；そしてエキソン２８は、ヌクレオチド１３１５７〜１５２３３を含む。エキソン２８における終止コドンは、ヌクレオチド位置１３５１６から始まり、そしてエキソン２８の残りは、３’非翻訳領域を含む。ＲＮＡのスプライシングとイントロンの除去の後、ＨＥＲ１の主な転写物は、エキソン１〜２８を含み、そして、１２１０アミノ酸のポリペプチド（配列番号２）をコードする。ＨＥＲ１遺伝子の選択的スプライシングを受けたアイソフォームは、実施例１０に記載され、そして、保持されたイントロン配列を持つアイソフォームが含まれる。このような例示的なＨＥＲ１アイソフォームの配列は、配列番号１２６に示され、そして、配列番号１２７に示されるアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードする。
選択的スプライシングを受けたアイソフォームはまた、ＨＥＲ２遺伝子の他のアイソフォームを含み得る。ＨＥＲ２遺伝子（配列番号４０１）は、２６のイントロンにより中断された２７のエキソンから構成される。配列番号４０１として本明細書中に提供されるＨＥＲ２の例示的なゲノム配列において、エキソン１は、５’非翻訳領域を含むヌクレオチド１８１〜３４９を含む。開始コドンは、ヌクレオチド位置２７７から始まる。イントロン１は、ヌクレオチド３５０〜７０９を含む；エキソン２は、ヌクレオチド７１０〜８６１を含む；イントロン２は、ヌクレオチド８６２〜１２２１を含む；エキソン３は、ヌクレオチド１２２２〜１４３５を含む；イントロン３は、ヌクレオチド１４３６〜１７９５を含む；エキソン４は、ヌクレオチド１７９６〜１９３０を含む；イントロン４は、ヌクレオチド１９３１〜２２９０を含む；エキソン５は、ヌクレオチド２２９１〜２３５９を含む；イントロン５は、ヌクレオチド２３６０〜２７１９を含む；エキソン６は、ヌクレオチド２７２０〜２８３５を含む；イントロン６は、ヌクレオチド２８３６〜３１９５を含む；エキソン７は、ヌクレオチド３１９６〜３３３７を含む；イントロン７は、ヌクレオチド３３３８〜３６９７を含む；エキソン８は、ヌクレオチド３６９８〜３８１７を含む；イントロン８は、ヌクレオチド３８１８〜４１７７を含む；エキソン９は、ヌクレオチド４１７８〜４３０４を含む；イントロン９は、ヌクレオチド４３０５〜４６６４を含む；エキソン１０は、ヌクレオチド４６６５〜４７３８を含む；イントロン１０は、ヌクレオチド４７３９〜５０９８を含む；エキソン１１は、ヌクレオチド５０９９〜５１８９を含む；イントロン１１は、ヌクレオチド５１９０〜５５４９を含む；エキソン１２は、ヌクレオチド５５５０〜５７４９を含む；イントロン１２は、ヌクレオチド５７５０〜６１０９を含む；エキソン１３は、ヌクレオチド６１１０〜６２４２を含む；イントロン１３は、ヌクレオチド６２４３〜６６０２を含む；エキソン１４は、ヌクレオチド６６０３〜６６９６を含む；イントロン１４は、ヌクレオチド６６９４〜７０５３を含む；エキソン１５は、ヌクレオチド７０５４〜７２１４を含む；イントロン１５は、ヌクレオチド７２１５〜７５７４を含む；エキソン１６は、ヌクレオチド７５７５〜７６２２を含む；イントロン１６は、ヌクレオチド７６２３〜７９８２を含む；エキソン１７は、ヌクレオチド７９８３〜８１２１を含む；イントロン１７は、ヌクレオチド８１２２〜８４８１を含む；エキソン１８は、ヌクレオチド８４８２〜８６０４を含む；イントロン１８は、ヌクレオチド８６０５〜８９６４を含む；エキソン１９は、ヌクレオチド８６９５〜９０６７を含む；イントロン１９は、ヌクレオチド９０６８〜９４２７を含む；エキソン２０は、ヌクレオチド９４２８〜９６１０を含む；イントロン２０は、ヌクレオチド９６１１〜９９７０を含む；エキソン２１は、ヌクレオチド９９７１〜１０１２６を含む；イントロン２１は、ヌクレオチド１０１２７〜１０４８６を含む；エキソン２２は、ヌクレオチド１０４８７〜１０５６２を含む；イントロン２２は、ヌクレオチド１０５６３〜１０９２２を含む；エキソン２３は、ヌクレオチド１０９２３〜１１０６９を含む；イントロン２３は、ヌクレオチド１１０７０〜１１４２９を含む；エキソン２４は、ヌクレオチド１１４３０〜１１５２７を含む；イントロン２４は、ヌクレオチド１１５２８〜１１８８７を含む；エキソン２５は、ヌクレオチド１１８８８〜１２０７６を含む；イントロン２６は、ヌクレオチド１２０７７〜１２４３６を含む；エキソン２６は、ヌクレオチド１２４３７〜１２６８９を含む；イントロン２６は、ヌクレオチド１２６９０〜１３０４９を含む；そして、エキソン２７は、ヌクレオチド１３０５０〜１４０１８を含む。エキソンにおける終止コドン２７は、ヌクレオチド位置１３４０３から始まり、そしてエキソン２７の残りは、３’非翻訳領域を含む。ＲＮＡのスプライシングとイントロンの除去の後、ＨＥＲ２の主な転写物は、エキソン１〜２７を含み、そして、１２５５アミノ酸のポリペプチド（配列番号４）をコードする。ＨＥＲ２遺伝子の選択的スプライシングを受けたアイソフォームは、実施例１０に記載され、そして、保持されたイントロン配列を持つアイソフォームが含まれる。このような例示的なＨＥＲ２アイソフォームの配列は、配列番号１４０に示され、そして、配列番号１４１に示されるアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードする。
選択的スプライシングを受けたアイソフォームはまた、ＨＥＲ３遺伝子の他のアイソフォームを含み得る。ＨＥＲ３遺伝子（配列番号４０２）は、２７のイントロンにより中断された２８のエキソンから構成される。配列番号４０２として本明細書中に提供されるＨＥＲ３の例示的なゲノム配列において、エキソン１は、５’非翻訳領域を含むヌクレオチド１８１〜４６０を含む。開始コドンは、ヌクレオチド位置３７９から始まる。イントロン１は、ヌクレオチド４６１〜８２０を含む；エキソン２は、ヌクレオチド８２１〜９７２を含む；イントロン２は、ヌクレオチド９７３〜１３３２を含む；エキソン３は、ヌクレオチド１３３３〜１５１９を含む；イントロン３は、ヌクレオチド１５２０〜１８７９を含む；エキソン４は、ヌクレオチド１８８０〜２００５を含む；イントロン４は、ヌクレオチド２００６〜２３６５を含む；エキソン５は、ヌクレオチド２３６６〜２４３１を含む；イントロン５は、ヌクレオチド２４３２〜２７９１を含む；エキソン６は、ヌクレオチド２７９２〜２９１０を含む；イントロン６は、ヌクレオチド２９１１〜３２７０を含む；エキソン７は、ヌクレオチド３２３７〜３４１２を含む；イントロン７は、ヌクレオチド３４１３〜３７７２を含む；エキソン８は、ヌクレオチド３７７３〜３８８６を含む；イントロン８は、ヌクレオチド３８８７〜４２４６を含む；エキソン９は、ヌクレオチド４２４７〜４３６７を含む；イントロン９は、ヌクレオチド４３６８〜４７２７を含む；エキソン１０は、ヌクレオチド４７２８〜４８０１を含む；イントロン１０は、ヌクレオチド４８０２〜５１６１を含む；エキソン１１は、ヌクレオチド５１６２〜５２５２を含む；イントロン１１は、ヌクレオチド５２５３〜５６１２を含む；エキソン１２は、ヌクレオチド５６１３〜５８１８を含む；イントロン１２は、ヌクレオチド５８１９〜６１７８を含む；エキソン１３は、ヌクレオチド６１７９〜６３１１を含む；イントロン１３は、ヌクレオチド６３１２〜６６７１を含む；エキソン１４は、ヌクレオチド６６７２〜６７６２を含む；イントロン１４は、ヌクレオチド６７６３〜７１２２を含む；エキソン１５は、ヌクレオチド７１２３〜７２７７を含む；イントロン１５は、ヌクレオチド７２７８〜７６３７を含む；エキソン１６は、ヌクレオチド７６３８〜７６９１を含む；イントロン１６は、ヌクレオチド７６９２〜８０５１を含む；エキソン１７は、ヌクレオチド８０５２〜８１９３を含む；イントロン１７は、ヌクレオチド８１９４〜８５５３を含む；エキソン１８は、ヌクレオチド８５５４〜８６７３を含む；イントロン１８は、ヌクレオチド８６７４〜９０３３を含む；エキソン１９は、ヌクレオチド９０３４〜９１３２を含む；イントロン１９は、ヌクレオチド９１３３〜９４９２を含む；エキソン２０は、ヌクレオチド９４９３〜９６７８を含む；イントロン２０は、ヌクレオチド９６７９〜１００３８を含む；エキソン２１は、ヌクレオチド１００３９〜１０１９４を含む；イントロン２１は、ヌクレオチド１０１９５〜１０５５４を含む；エキソン２２は、ヌクレオチド１０５５５〜１０６３０を含む；イントロン２２は、ヌクレオチド１０６３１〜１０９９０を含む；エキソン２３は、ヌクレオチド１０９９１〜１１１３７を含む；イントロン２３は、ヌクレオチド１１１３８〜１１４９７を含む；エキソン２４は、ヌクレオチド１１４９８〜１１５９５を含む；イントロン２４は、ヌクレオチド１１５９６〜１１９５５を含む；エキソン２５は、ヌクレオチド１１９５６〜１２１４７を含む；イントロン２６は、ヌクレオチド１２１４８〜１２５０７を含む；エキソン２６は、ヌクレオチド１２５０８〜１２５７９を含む；イントロン２６は、ヌクレオチド１２５８０〜１２９３９を含む；エキソン２７は、ヌクレオチド１２９４０〜１３２４０を含む；イントロン２７は、ヌクレオチド１３２４１〜１３６００を含む；そして、エキソン２８は、ヌクレオチド１３６０１〜１４８７５を含む。エキソン２８における終止コドンは、ヌクレオチド位置１４１２５から始まり、そしてエキソン２８の残りは、３’非翻訳領域を含む。ＲＮＡのスプライシングとイントロンの除去の後、ＥｒｂＢ３の主な転写物は、エキソン１〜２８を含み、そして、１３４２アミノ酸のポリペプチド（配列番号６）をコードする。ＨＥＲ３遺伝子の選択的スプライシングを受けたアイソフォームは、実施例１０に記載され、そして、保持されたイントロン配列を持つアイソフォームが含まれる。このような例示的なＨＥＲ３アイソフォームの配列は、配列番号１４５および１４７に示され、そして、それぞれ、配列番号１４６および１４８に示されるアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードする。
選択的スプライシングを受けたアイソフォームはまた、ＨＥＲ４遺伝子の他のアイソフォームを含み得る。ＨＥＲ４遺伝子（配列番号４０３）は、２７のイントロンにより中断された２８のエキソンから構成される。配列番号４０３として本明細書中に提供されるＨＥＲ４の例示的なゲノム配列において、エキソン１は、５’非翻訳領域を含むヌクレオチド１８１〜２９５を含む。開始コドンは、ヌクレオチド位置２１５から始まる。イントロン１は、ヌクレオチド２９６〜６５５を含む；エキソン２は、ヌクレオチド６５６〜８０７を含む；イントロン２は、ヌクレオチド８０８〜１１６７を含む；エキソン３は、ヌクレオチド１１６８〜１３５４を含む；イントロン３は、ヌクレオチド１３５５〜１７１４を含む；エキソン４は、ヌクレオチド１７１５〜１８４９を含む；イントロン４は、ヌクレオチド１８５０〜２２０９を含む；エキソン５は、ヌクレオチド２２１０〜２２７５を含む；イントロン５は、ヌクレオチド２２７６〜２６３５を含む；エキソン６は、ヌクレオチド２６３６〜２７５４を含む；イントロン６は、ヌクレオチド２７５５〜３１１４を含む；エキソン７は、ヌクレオチド３１１５〜３２５６を含む；イントロン７は、ヌクレオチド３２５７〜３６１６を含む；エキソン８は、ヌクレオチド３６１７〜３７３０を含む；イントロン８は、ヌクレオチド３７３１〜４０９０を含む；エキソン９は、ヌクレオチド４０９１〜４２１７を含む；イントロン９は、ヌクレオチド４２１８〜４５７７を含む；エキソン１０は、ヌクレオチド４５７８〜４６５１を含む；イントロン１０は、ヌクレオチド４６５２〜５０１１を含む；エキソン１１は、ヌクレオチド５０１２〜５１０２を含む；イントロン１１は、ヌクレオチド５１０３〜５４６２を含む；エキソン１２は、ヌクレオチド５４６３〜５６６２を含む；イントロン１２は、ヌクレオチド５６６３〜６０２２を含む；エキソン１３は、ヌクレオチド６０２３〜６１５５を含む；イントロン１３は、ヌクレオチド６１５６〜６５１５を含む；エキソン１４は、ヌクレオチド６５１６〜６６０９を含む；イントロン１４は、ヌクレオチド６６１０〜６９６９を含む；エキソン１５は、ヌクレオチド６９７０〜７１２４を含む；イントロン１５は、ヌクレオチド７１２５〜７４８４を含む；エキソン１６は、ヌクレオチド７４８５〜７５５９を含む；イントロン１６は、ヌクレオチド７５６０〜７９１９を含む；エキソン１７は、ヌクレオチド７９２０〜８０５２を含む；イントロン１７は、ヌクレオチド８０５３〜８４１２を含む；エキソン１８は、ヌクレオチド８４１３〜８５３５を含む；イントロン１８は、ヌクレオチド８５３６〜８８９５を含む；エキソン１９は、ヌクレオチド８８９６〜８９９４を含む；イントロン１９は、ヌクレオチド８９９５〜９３５４を含む；エキソン２０は、ヌクレオチド９３５５〜９５４０を含む；イントロン２０は、ヌクレオチド９５４１〜９９００を含む；エキソン２１は、ヌクレオチド９９０１〜１００５６を含む；イントロン２１は、ヌクレオチド１００５７〜１０４１６を含む；エキソン２２は、ヌクレオチド１０４１７〜１０４９２を含む；イントロン２２は、ヌクレオチド１０４９３〜１０８５２を含む；エキソン２３は、ヌクレオチド１０８５３〜１０９９９を含む；イントロン２３は、ヌクレオチド１１０００〜１１３５９を含む；エキソン２４は、ヌクレオチド１１３６０〜１１４５７を含む；イントロン２４は、ヌクレオチド１１４５８〜１１８１７を含む；エキソン２５は、ヌクレオチド１１８１８〜１１９８８を含む；イントロン２６は、ヌクレオチド１１９８９〜１２３４８を含む；エキソン２６は、ヌクレオチド１２３４９〜１２３９６を含む；イントロン２６は、ヌクレオチド１２３９７〜１２７５６を含む；エキソン２７は、ヌクレオチド１２７５７〜１３０５４を含む；イントロン２７は、ヌクレオチド１３０５５〜１３４１４を含む；そして、エキソン２８は、ヌクレオチド１３４１５〜１５３８５を含む。エキソン２８における終止コドンは、ヌクレオチド位置１３８５８から始まり、そしてエキソン２８の残りは、３’非翻訳領域を含む。ＲＮＡのスプライシングとイントロンの除去の後、ＨＥＲ４の主な転写物は、エキソン１〜２８を含み、そして、１３０８アミノ酸のポリペプチド（配列番号８）をコードする。ＨＥＲ４遺伝子の選択的スプライシングを受けたアイソフォームは、実施例１０に記載され、そして、保持されたイントロン配列を持つアイソフォームが含まれる。このような例示的なＨＥＲ４アイソフォームの配列は、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６または配列番号１５８に示され、そして、それぞれ、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７または配列番号１５９に示されるアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードする。
選択的スプライシングを受けたアイソフォームはまた、ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子のアイソフォームを含み得る。ＩＧＦ１−Ｒ遺伝子（配列番号４０４）は、２０のイントロンにより中断された２１のエキソンから構成される。配列番号４０４として本明細書中に提供されるＩＧＦ１−Ｒの例示的なゲノム配列において、エキソン１は、５’非翻訳領域を含むヌクレオチド１８１〜３０６を含む。開始コドンは、ヌクレオチド位置２１３から始まる。イントロン１は、ヌクレオチド３０７〜６６６を含む；エキソン２は、ヌクレオチド６６７〜１２１２を含む；イントロン２は、ヌクレオチド１２１３〜１５７２を含む；エキソン３は、ヌクレオチド１５７３〜１８８４を含む；イントロン３は、ヌクレオチド１８８５〜２２５５を含む；エキソン４は、ヌクレオチド２２５６〜２３９４を含む；イントロン４は、ヌクレオチド２３９５〜２７５４を含む；エキソン５は、ヌクレオチド２７５５〜２８９９を含む；イントロン５は、ヌクレオチド２９９０〜３２５９を含む；エキソン６は、ヌクレオチド３２６０〜３４７４を含む；イントロン６は、ヌクレオチド３４７５〜３８３４を含む；エキソン７は、ヌクレオチド３８３５〜３９６１を含む；イントロン７は、ヌクレオチド３９６２〜４３２１を含む；エキソン８は、ヌクレオチド４３２２〜４５６０を含む；イントロン８は、ヌクレオチド４５６１〜４９２０を含む；エキソン９は、ヌクレオチド４９２１〜５０８８を含む；イントロン９は、ヌクレオチド５０８９〜５４４８を含む；エキソン１０は、ヌクレオチド５４４９〜５６５３を含む；イントロン１０は、ヌクレオチド５６５４〜６０１３を含む；エキソン１１は、ヌクレオチド６０１４〜６２９７を含む；イントロン１１は、ヌクレオチド６２９８〜６６５７を含む；エキソン１２は、ヌクレオチド６６５８〜６７９４を含む；イントロン１２は、ヌクレオチド６７９５〜７１５４を含む；エキソン１３は、ヌクレオチド７１５５〜７３１４を含む；イントロン１３は、ヌクレオチド７３１５〜７６７４を含む；エキソン１４は、ヌクレオチド７６７５〜７７７７を含む；イントロン１４は、ヌクレオチド７７７８〜８１３７を含む；エキソン１５は、ヌクレオチド８１３８〜８２０８を含む；イントロン１５は、ヌクレオチド８２０９〜８５６８を含む；エキソン１６は、ヌクレオチド８５６９〜８７９８を含む；イントロン１６は、ヌクレオチド８７９９〜９１５８を含む；エキソン１７は、ヌクレオチド９１５９〜９２６９を含む；イントロン１７は、ヌクレオチド９２７０〜９６２９を含む；エキソン１８は、ヌクレオチド９６３０〜９７８９を含む；イントロン１８は、ヌクレオチド９７９０〜１０１４９を含む；エキソン１９は、ヌクレオチド１０１５０〜１０２７９を含む；イントロン１９は、ヌクレオチド１０２８０〜１０６３９を含む；エキソン２０は、ヌクレオチド１０６４０〜１０７７４を含む；イントロン２０は、ヌクレオチド１０７７５〜１１１３４を含む、そしてエキソン２１は、ヌクレオチド１１１３５〜１２３５６を含む。エキソン２１における終止コドンは、ヌクレオチド位置１１５１４から始まり、そしてエキソン２１の残りは、３’非翻訳領域を含む。ＲＮＡのスプライシングとイントロンの除去の後、ＩＧＦ１−Ｒの主な転写物は、エキソン１〜２１を含み、そして、１３６７アミノ酸のポリペプチド（配列番号２９０）をコードする。ＩＧＦ１−Ｒ遺伝子の選択的スプライシングを受けたアイソフォームは、実施例１１に記載され、そして、保持されたイントロン配列を持つアイソフォームが含まれる。このような例示的なＩＧＦ１−Ｒアイソフォームの配列は、配列番号２９７または２９９に示され、そして、それぞれ、配列番号２９８または３００に示されるアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードする。
本明細書において提供され、そして、配列番号１２７、配列番号１４１、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号２９８もしくは配列番号３００に示される、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４およびＩＧＦ１−Ｒの選択的スプライシングを受けたアイソフォームは、本明細書において提供されるＥＣＤ多量体の形成において使用され得る。あるいは、これらのアイソフォームは、その同系レセプターによって媒介される任意の疾患の処置のために、単独で、または、任意の他のアイソフォームと組合せて使用され得る。このような疾患の例は、本明細書において記載され、そして、当業者に公知であるような、任意の脈管形成疾患、腫瘍形成疾患または炎症性疾患、特に、癌である。
２．ＥＣＤ多量体の形成
ＨＥＲ ＥＣＤ多量体を含むＥＣＤ多量体は、二量体、三量体またはより高次の多量体を形成するために、共有結合されたか、非共有結合されたか、または、化学的に連結されたＥＣＤのレセプターの多量体であり得る。いくつかの場合、多量体は、２以上のＥＣＤポリペプチドの二量体化により形成され得る。２つのＥＣＤポリペプチド間の多量体化は、自発的であっても、２以上のポリペプチドの強制的な結合に起因して生じてもよい。一例では、多量体は、異なるＥＣＤポリペプチド上のシステイン残基間に形成されるジスルフィド結合によって連結され得る。別の例では、多量体は、可溶性ポリペプチドに融合されたペプチド部分との共有結合性もしくは非共有結合性の相互作用を介して接合されたＥＣＤポリペプチドを含み得る。このようなペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）または多量体化を促進する特性を持つペプチドであり得る。さらなる例では、多量体は、例えば、ヘテロ二官能性リンカーを用いるなどによって、化学結合により、２つのポリペプチド間で形成され得る。
ａ．ペプチドリンカー
ペプチドリンカーは、例えば、１つの多量体化パートナーがＨＥＲファミリーレセプターのＥＣＤの全体もしくは一部分である多量体のような、ポリペプチド多量体を生成するために使用され得る。一例では、ペプチドリンカーは、第一のポリペプチドのＣ末端および第二のポリペプチドのＮ末端に融合され得る。この構造は、少なくとも１つ（好ましくは、２、３、４またはそれより多く）の可溶性ポリペプチドが、そのそれぞれの末端において、ペプチドリンカーを介して互いに連結されるように、複数回繰り返され得る。例えば、多量体ポリペプチドは、配列Ｚ１−Ｘ−Ｚ２を有し得、ここで、Ｚ１およびＺ２は各々が、細胞表面ポリペプチドのＥＣＤの全体もしくは一部分の配列であり、そして、Ｘは、ペプチドリンカーの配列である。いくつかの場合には、Ｚ１および／またはＺ２は、ＨＥＲファミリーレセプターのＥＣＤの全体もしくは一部分である。別の例では、Ｚ１およびＺ２は、同じであるか、または異なる。別の例では、ポリペプチドは、Ｚ１−Ｘ−Ｚ２（−Ｘ−Ｚ）ｎの配列を有し、ここで、「ｎ」は任意の整数であり、すなわち、一般には１または２である。
代表的には、ペプチドリンカーは、可溶性のＥＣＤポリペプチドに、隣接する可溶性ＥＣＤポリペプチドと結合を形成させるのに十分な長さのものである。ペプチドリンカーの例としては、以下が挙げられる：−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、ＧＧＧＧＧ（配列番号２７３）、ＧＧＧＧＳもしくは（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１７４）、ＳＳＳＳＧもしくは（ＳＳＳＳＧ）ｎ（配列番号１８７）、ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ（配列番号１７５）、ＧＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号１７６）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ（配列番号１７７）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１７８）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＥＦ（配列番号１７９）、またはＡｌａＡｌａＰｒｏＡｌａもしくは（ＡｌａＡｌａＰｒｏＡｌａ）ｎ（配列番号１８８）、ここで、ｎは１〜６（例えば、１、２、３または４）である。例示的なリンカーとしては、以下が挙げられる：
（１）ＮｃｏＩ末端有のＧｌｙ４Ｓｅｒ 配列番号１８９
ＣＣＡＴＧＧＧＣＧＧ ＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴ ＧＣＣＡＴＧＧ
（２）ＮｃｏＩ末端有の（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２ 配列番号１９０
ＣＣＡＴＧＧＧＣＧＧ ＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴ ＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧ ＧＣＴＣＴＧＣＣＡＴ ＧＧ
（３）ＮｃｏＩ末端有の（Ｓｅｒ４Ｇｌｙ）４ 配列番号１９１
ＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣ ＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧ ＧＧＣＴＣＧＴＣＧＴ ＣＧＴＣＧＧＧＣＴＣ ＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧ ＧＧＣＴＣＧＴＣＧＴ ＣＧＴＣＧＧＧＣＧＣ ＣＡＴＧＧ
（４）ＮｃｏＩ末端有の（Ｓｅｒ４Ｇｌｙ）２ 配列番号１９２
ＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣ ＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧ ＧＧＣＴＣＧＴＣＧＴ ＣＧＴＣＧＧＧＣＧＣ ＣＡＴＧＧ。
連結部分は、例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＰＮＡＳ ８５：５８７９−５８８３、Ｗｈｉｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６：９８９−９９５およびＮｅｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：５４５−５５３に記載される。他の適切なペプチドリンカーとしては、米国特許第４，７５１，１８０号または同第４，９３５，２３３号（これらは本明細書により参考として援用される）に記載される任意のものが挙げられる。所望のペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドは、任意の適切な従来の技術を用いて、可溶性ＥＣＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチド間に、そして、このポリヌクレオチドと同じ読み取り枠で挿入され得る。一例では、融合ポリペプチドは、ペプチドリンカーによって隔てられた、２〜４の可溶性ＥＣＤポリペプチド（ＨＥＲ ＥＣＤポリペプチドの全体もしくは一部分であるものを含む）を有する。
ｂ．ヘテロ二官能性連結因子
ヘテロ多量体融合ポリペプチドを作製するための、ＥＣＤポリペプチドの別のＥＣＤポリペプチドへの連結は、直接的であっても間接的であってもよい。例えば、２以上のＥＣＤポリペプチドの連結は、化学結合によって達成されても、当該分野で公知であるかまたは本明細書において提供される任意のもののような、ヘテロ二官能性リンカーによって促進されてもよい。
アミノ基とチオール基との間に共有結合を形成し、タンパク質中にチオール基を導入するために使用される多数のヘテロ二官能性架橋剤は、当業者に公知である（例えば、ＰＩＥＲＣＥ ＣＡＴＡＬＯＧ，ＩｍｍｕｎｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔａｌｏｇ ＆ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９２−１９９３を参照のこと、この文献は、このような試薬の調製および使用を記載し、そして、このような試薬の市販の供給源を提供する；また、例えば、Ｃｕｍｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．３：３９７−４０１；Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：５９２４−５９３１；Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．８４：３０８−３１２；Ｗａｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１９１−１９７；Ｃａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３−７３７；Ｍａｈａｎ ｅｔ ａｌ．９１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１６３−１７０；Ｗａｗｒｙｚｎａｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６６：３６１−３６６；Ｆａｔｔｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ＆ Ｉｍｍｕｎ．６０：５８４−５８９も参照のこと）。これらの試薬は、ＥＣＤポリペプチドのＮ末端部分と、別のＥＣＤポリペプチドのＣ末端部分との間、または、これらの部分の各々とリンカーとの間に共有結合を形成するために使用され得る。これらの試薬としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ミリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ；ジスルフィドリンカー）；スルホスクシンイミジル ６−［３−（２−ミリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）；スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチルベンジルチオスルフォート（ＳＭＢＴ、嵩高い二硫酸塩リンカー）；スクシンイミジル ６−［３−（２−ミリジルジチオ）プロピオンアミド］−ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）；スルホスクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）；スクシンイミジル ３−（２−ミリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ；嵩高いジスルフィド結合リンカー）；スルホスクシンイミジル ２−（７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド） エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ＳＡＥＤ）；スルホ−スクシンイミジル ７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセテート（ＳＡＭＣＡ）；スルホスクシンイミジル−６−［α−メチル−α−（２−ミリジルジチオ）トルアミド］−ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）；１，４−ジ−［３’−（２’−ミリジルジチオ）プロピオン−アミド］ブタン（ＤＰＤＰＢ）；４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ミリジルチオ）トルエン（ＳＭＰＴ、嵩高い二硫酸塩リンカー）；スルホスクシンイミジル−６−［α−メチル−α−（２−ピリミジル−チオ）トルアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（ＭＢＳ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）；Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸（ＳＩＡＢ；チオエーテルリンカー）；スルホスクシンイミジル−（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸（スルホ−ＳＩＡＢ）；スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）；スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ−ＳＭＰＢ）；アジドベンゾイルヒドラジド（ＡＢＨ）。これらのリンカーは例えば、柔軟性もしくは溶解性を高めるもの、または、立体障害を提供するかもしくは排除するもののような、ペプチドリンカーと組合せて使用され得る。ポリペプチド分子を別の分子に連結するための当業者に公知の任意の他のリンカーが使用され得る。一般的な特性は、結果として生じる分子が生体適合性（ヒトを含む動物への投与に関して）となり、そして、結果として生じる分子が、ＨＥＲのような細胞表面分子または他の細胞表面分子もしくはレセプターの活性を調節するヘテロ多量体分子となるようなものである。
ｃ．ポリペプチド多量体化ドメイン
２以上のポリペプチドの相互作用は、それ自体が相互作用して安定な構造を形成し得る任意の部分もしくは他のポリペプチドへの直接的もしくは間接的な結合によって促進され得る。例えば、別々にコードされるポリペプチド鎖が、多量体化によって結合され得、それによって、ポリペプチドの多量体化が、多量体化ドメインによって媒介される。代表的には、多量体化ドメインは、第一のキメラポリペプチドと第二のキメラポリペプチドとの間の安定なタンパク質−タンパク質相互作用の形成を提供する。キメラポリペプチドは、例えば、ポリペプチドのＥＣＤ部分をコードする核酸の、多量体化ドメインをコードする核酸との（直接的または間接的な）結合を含む。代表的には、少なくとも１つの多量体化パートナーは、多量体化ドメインに直接的または間接的に連結されたＨＥＲ ＥＣＤの全体もしくは一部分をコードする核酸である。ホモ多量体もしくはヘテロ多量体のポリペプチドは、別々のキメラポリペプチドの共発現から生成され得る。第一および第二のキメラポリペプチドは、同じであっても異なっていてもよい。
一般に、多量体化ドメインは、安定なタンパク質−タンパク質相互作用を形成し得る任意のものを含む。多量体化ドメインは、免疫グロブリン配列、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域、または、ホモ多量体もしくはヘテロ多量体のキメラ分子間で分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオールを介して相互作用し得る。さらに、多量体化ドメインは、例えば、米国特許出願第０８／３９９，１０６号に記載されるような穴（ｈｏｌｅ）を含むアミノ酸配列に対して相補的な隆起部を含むアミノ酸配列を含み得る。このような多量体化領域は、立体的な相互作用が安定な相互作用を促進するだけでなく、さらに、キメラ単量体の混合物から、ホモ二量体よりも多くのヘテロ二量体の形成を促進するように加工され得る。一般に、隆起部は、第一のポリペプチドの界面から、小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることによって構築される。必要に応じて、この隆起部に対し同一もしくは類似のサイズの代償性の腔が、大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることによって、第二のポリペプチドの界面上に作製される。
例えば、本明細書において提供される任意のもののようなＥＣＤキメラポリペプチドの多量体化ドメインのＮ末端もしくはＣ末端への結合は、いずれの場所においてもなされるが、代表的には、そのＮ末端もしくはＣ末端を介してなされて、キメラポリペプチドを形成し得る。この結合は直接的なものであっても、リンカーを介した間接的なものであってもよい。また、キメラポリペプチドは、融合タンパク質であっても、共有結合性もしくは非共有結合性の相互作用などにより、化学結合によって形成されてもよい。例えば、多量体化ドメインを含むキメラポリペプチドを調製するとき、ポリペプチドのＥＣＤの全体もしくは一部分をコードする核酸は、直接的もしくは間接的にまたは必要に応じてリンカードメインを介して、多量体化ドメイン配列をコードする核酸に対して作動可能に連結され得る。代表的には、構築物は、ＥＣＤポリペプチドのＣ末端が多量体化ドメインのＮ末端に結合されたキメラポリペプチドをコードする。いくつかの場合では、構築物は、ＥＣＤポリペプチドのＮ末端が多量体化ドメインのＮ末端もしくはＣ末端に結合されたキメラタンパク質をコードし得る。
ポリペプチドの多量体は、２つの同じかもしくは異なるＥＣＤポリペプチドを、直接的もしくは間接的に多量体化ドメインに連結することによって生成された２つのキメラタンパク質を含む。多量体化ドメインがポリペプチドであるいくつかの例では、ＥＣＤ−多量体化ドメインキメラポリペプチドをコードする遺伝子融合物が、適切な発現ベクター中に挿入される。結果として生じるＥＣＤ−多量体化ドメインキメラタンパク質は、この組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞において発現され、そして、集合して多量体となることを可能にし得、ここで、この多量体化ドメインは、相互作用して多価ポリペプチドを形成する。多量体化ドメインのＥＣＤポリペプチドへの化学結合は、上述のようなヘテロ二官能性リンカーを用いて達成され得る。
結果として生じるキメラポリオペおよびそこから形成される多量体は、以下のＦの節に詳述されるような任意の適切な方法によって、例えば、プロテインＡもしくはプロテインＧのカラムを通すアフィニティクロマトグラフィーなどによって、精製され得る。異なるＥＣＤキメラポリペプチドをコードする２つの核酸分子が細胞内に形質転換される場合、ホモ二量体およびヘテロ二量体の形成が起こる。発現のための条件は、ヘテロ二量体の形成が、ホモ二量体の形成を上回って起こるように調節され得る。
ｉ．免疫グロブリンドメイン
多量体化ドメインとしては、追加アミノ酸配列の多量体化ドメインと反応して分子間ジスルフィド結合を形成し得る遊離チオールを含むものが挙げられる。例えば、多量体化ドメインは、免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭおよびＩｇＥ）の一部分が挙げられ得る。一般に、このような部分は、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）である。抗体由来のポリペプチド（Ｆｃドメインを含む）の種々の部分に融合された可溶性ＥＣＤポリペプチドを含む融合タンパク質の調製が記載されており、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＰＮＡＳ ８８：１０５３５；Ｂｙｒｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４４：６７７；およびＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ ａｎｄ Ａｒｕｆｆｏ，（１９９２）「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐｐ．１０．１９．１−１０．１９．１１を参照のこと。
抗体は、特定の抗原に結合し、そして、ジスルフィド結合で共有結合された２つの同一の重鎖と、２つの同一の軽鎖とを含む。重鎖および軽鎖の両方が、抗原と結合する可変領域と、定常（Ｃ）領域とを含む。各鎖において、一方のドメイン（Ｖ）は、分子の抗体特異性に依存する多様なアミノ酸配列を持つ。もう一方のドメイン（Ｃ）は、同じ分類の分子の中で共通する幾分一定の配列を持つ。これらのドメインは、アミノ末端から配列が番号付けされる。例えば、ＩｇＧ軽鎖は、ＶＬ−ＣＬの順序でＮ末端からＣ末端へと連結された２つの免疫グロブリンドメインから構成され、これらは、それぞれ、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインと呼ばれる。ＩｇＧ重鎖は、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の順序でＮ末端からＣ末端へと連結された４つの免疫グロブリンドメインから構成され、これらは、それぞれ、可変重鎖ドメイン、定常重鎖ドメイン１、定常重鎖ドメイン２および定常重鎖ドメイン３と呼ばれる。結果として生じる抗体分子は、各重鎖がジスルフィド結合によって軽鎖に連結され、そして、２つの重鎖がジスルフィド結合によって互いに連結された、４つの鎖の分子である重鎖の結合は、重鎖のヒンジ領域として知られる柔軟性のある領域によって媒介される。抗体分子のフラグメントは、例えば、酵素的切断などによって生成され得る。例えば、パパインによるプロテアーゼ切断の際に、重鎖定常領域、すなわちＦｃドメインの二量体が、２つのＦａｂ領域（すなわち、可変領域を含む部分）から切断される。
ヒトにおいては、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、ミュー（μ）およびアルファ（α）およびイプシロン（ε）と名付けられたその重鎖に基づいて分類される、５つの抗体アイソタイプが存在し、これらはそれぞれ、抗体の、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥのクラスを生じる。ＩｇＡおよびＩｇＧのクラスは、サブクラスＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む。免疫グロブリン重鎖間の配列相違は、種々のアイソタイプにおいて、例えば、Ｃドメインの数、ヒンジ領域の存在、ならびに、分子間ジスルフィド結合の数および位置の違いをもたらす。例えば、ＩｇＭおよびＩｇＥの重鎖は、ヒンジ領域にとってかわる、余剰のＣドメイン（Ｃ４）を含む。ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＡのＦｃ領域は、そのＣγ３、Ｃδ３およびＣα３ドメインを介して互いに対になるが、ＩｇＭおよびＩＧＥのＦｃ領域は、そのＣμ４およびＣε４ドメインを介して二量体化する。ＩｇＭおよびＩｇＡは、それぞれ、１０および４の抗原結合部位を持つ多量体構造を形成する。
本明細書において提供されるＥＣＤ免疫グロブリンキメラポリペプチドは、全長の免疫グロブリンポリペプチドを含む。あるいは、免疫グロブリンポリペプチドは、全長よりも短く、すなわち、重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、ＦｖまたはＦｃを含む。一例では、ＥＣＤ免疫グロブリンキメラポリペプチドは、単量体またはヘテロ多量体もしくはホモ多量体として、そして、具体的には、二量体もしくは四量体として組み立てられる。種々の構造の鎖または基本単位が、単量体およびヘテロ多量体およびホモ多量体を組み立てるために利用され得る。例えば、ＥＣＤポリペプチドは、免疫グロブリン分子のＣＨドメイン、ＣＬドメイン、ＶＨドメインまたはＶＬドメインの全体もしくは一部分を含む、免疫グロブリン分子の全体もしくは一部分に融合され得る（例えば、米国特許第５，１１６，９６４号を参照のこと）。キメラＥＣＤポリペプチドは、適切な核酸分子で形質転換された哺乳動物細胞によって、容易に産生および分泌され得る。分泌される形態としては、ＥＣＤポリペプチドが重鎖二量体中に存在するもの；軽鎖単量体もしくは二量体；ならびに、ＥＣＤポリペプチドが１以上の軽鎖もしくは重鎖に融合された重鎖および軽鎖のヘテロ二量体であって、最大で４つ全ての可変領域アナログが置換されているもの、が挙げられる。いくつかの場合、１または１より多い核酸融合分子が、多量体を産生するために宿主細胞中に形質転換され得、ここで、この多量体のＥＣＤ部分は同じであるか、または、異なる。いくつかの例では、非ＥＣＤポリペプチド軽鎖−重鎖可変様ドメインが存在し、それによって、ヘテロ二官能性抗体を産生する。いくつかの例では、ヒンジのジスルフィドを欠く免疫グロブリン分子の一部分に対して融合されたキメラポリペプチドが作製され得、ここで、この２つのＥＣＤポリペプチド部分の非共有結合性もしくは共有結合性の相互作用が、この分子をホモ二量体もしくはヘテロ二量体中に会合させる。
（ａ）Ｆｃドメイン
代表的には、ＥＣＤキメラポリペプチドの免疫グロブリン部分は、免疫グロブリンポリペプチドの重鎖、最も通常は、重鎖の定常ドメインを含む。ヒトＩｇＧサブタイプについての重鎖定常領域の例示的な配列は、配列番号１６３（ＩｇＧ１）、配列番号１６４（ＩｇＧ２）、配列番号１６５（ＩｇＧ３）および配列番号１６６（ＩｇＧ４）に示される。例えば、配列番号１６３に示される例示的な重鎖定常領域について、ＣＨ１ドメインはアミノ酸１〜９８に対応し、ヒンジ領域はアミノ酸９９〜１１０に対応し、ＣＨ２ドメインはアミノ酸１１１〜２２３に対応し、そして、ＣＨ３ドメインはアミノ酸２２４〜３３０に対応する。
一例では、免疫グロブリンポリペプチドキメラタンパク質は、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域を含み得る。代表的に、このような融合物は、少なくとも１つの機能的に活性なヒンジと、免疫グロブリン重鎖の定常領域のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインとを保持する。例えば、ＩｇＧ１の全長Ｆｃ配列は、配列番号１６３に示される配列のアミノ酸９９〜３３０を含む。ｈＩｇＧ１についての例示的なＦｃ配列は、配列番号１６７に示され、そして、配列番号１６３のアミノ酸１００〜１１０に対応するヒンジ配列のほぼ全体と、配列番号１６３に示されるＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインについての完全な配列とを含む。別の例示的なＦｃポリペプチドは、ＰＣＴ出願公開ＷＯ ９３／１０１５１に示され、そして、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のＮ末端のヒンジ領域からネイティブなＣ末端へとのびる一本鎖ポリペプチドである（配列番号１６８）。結合が起こる正確な部位は重要ではない：特定の部位が周知であり、そして、ＥＣＤポリペプチドの生物学的活性、分泌または結合特性を最適化するために選択され得る。例えば、他の例示的なＦｃポリペプチド配列は、配列番号１６３に示される配列のアミノ酸Ｃ１０９またはＰ１１３において開始する（例えば、ＵＳ ２００６／００２４２９８を参照のこと）。
ｈＩｇＧ１ Ｆｃに加えて、他のＦｃ領域もまた、本明細書において提供されるＥＣＤキメラポリペプチド内に含まれ得る。例えば、Ｆｃ／ＦｃγＲ相互作用によって媒介されるエフェクター機能が最小限にされるべき場合、補体またはエフェクター細胞の回収（ｒｅｃｒｕｉｔ）が乏しいＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＦｃ）との融合が企図される。さらに、Ｆｃ融合物は、任意の抗体クラス（抗体のＩｇＧ（ヒトのサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ヒトのサブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭクラスを含むがこれらに限定されない）に属する免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる免疫グロブリン配列を含み得る。さらに、Ｆｃを別のポリペプチドに共有結合してＦｃキメラを作製するために、リンカーが使用され得る。
改変されたＦｃドメインもまた、本明細書において、ＥＣＤポリペプチドとのキメラにおいて使用するために企図される。例示的な改変については、例えば、米国特許出願番号ＵＳ ２００６／００２４２９８；および国際特許出願公開ＷＯ ２００５／０６３８１６を参照のこと。いくつかの例では、Ｆｃ領域は、野生型の免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域のエフェクター機能から変更された（すなわち、多いかまたは少ない）エフェクター機能を有するようなものである。抗体のＦｃ領域は、多数のＦｃレセプターおよびリガンドと相互作用し、エフェクター機能と呼ばれる多数の重要な機能的能力を与える。Ｆｃエフェクター機能としては、例えば、Ｆｃレセプター結合、補体結合、およびＴ細胞欠乏活性が挙げられる（例えば、米国特許第６，１３６，３１０を参照のこと）。Ｔ細胞欠乏活性、Ｆｃエフェクター機能および抗体の安定性をアッセイする方法は、当該分野で公知である。例えば、ＩｇＧ分子のＦｃ領域は、ＦｃγＲと相互作用する。これらのレセプターは、種々の免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、脂肪細胞、血小板、Ｂ細胞、大きな顆粒状リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびγδＴ細胞が挙げられる）において発現される。Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成は、これらのエフェクター細胞を、再度、結合部位へと回収し、代表的には、細胞内でのシグナル伝達事象と、その後の重要な免疫応答（例えば、炎症性メディエーターの放出、Ｂ細胞活性化、エンドサイトーシス、食作用および細胞傷害性アタック）をもたらす。細胞傷害性および食作用性のエフェクター機能を媒介する能力は、抗体が標的細胞を破壊する強力な機構である。ＦｃγＲを発現する細胞傷害性の細胞による、標的細胞上に結合した抗体の認識および溶解は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と呼ばれる。種々の抗体アイソタイプについての他のＦｃレセプターとしては、ＦｃεＲ（ＩｇＥ）、ＦｃαＲ（ＩｇＡ）およびＦｃμＲ（ＩｇＭ）が挙げられる。
したがって、改変されたＦｃドメインは、変更された親和性を有し得る（Ｆｃレセプターに対する親和性が増加したもの、低下したもの、親和性がないものが挙げられるがこれらに限定されない）。例えば、異なるＩｇＧサブクラスは、ＦｃγＲに対して異なる親和性を有し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、代表的には、実質的にＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも良好にレセプター結合する。さらに、異なるＦｃγＲは、異なるエフェクター機能を媒介する。ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ／ｃおよびＦｃγＲＩＩＩａは、免疫複合体により誘発される活性化の正の調節因子であり、免疫レセプターチロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を持つ細胞内ドメインを有することによって特徴付けられる。しかし、ＦｃγＲＩＩｂは、免疫レセプターチロシンベースの抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を有し、したがって、抑制性である。したがって、レセプターに対するＦｃ領域の親和性の変更は、Ｆｃドメインにより誘導されるエフェクター機能を調節し得る。
一例では、例えばＡＤＣＣのようなエフェクター機能をより良好に媒介するために特定のＦｃγＲへの結合を最適化するために改変されたＦｃ領域が使用される。このような改変されたＦｃ領域は、配列番号１６７に示される例示的なＦｃ配列のＧ２０Ｓ、Ｇ２０Ａ、Ｓ２３Ｄ、Ｓ２３Ｅ、Ｓ２３Ｎ、Ｓ２３Ｑ、Ｓ２３Ｔ、Ｋ３０Ｈ、Ｋ３０Ｙ、Ｄ３３Ｙ、Ｒ３９Ｙ、Ｅ４２Ｙ、Ｔ４４Ｈ、Ｖ４８Ｉ、Ｓ５１Ｅ、Ｈ５２Ｄ、Ｅ５６Ｙ、Ｅ５６Ｉ、Ｅ５６Ｈ、Ｋ５８Ｅ、Ｇ６５Ｄ、Ｅ６７Ｌ、Ｅ６７Ｈ、Ｓ８２Ａ、Ｓ８２Ｄ、Ｓ８８Ｔ、Ｓ１０８Ｇ、Ｓ１０８Ｉ、Ｋ１１０Ｔ、Ｋ１１０Ｅ、Ｋ１１０Ｄ、Ａ１１１Ｄ、Ａ１１４Ｙ、Ａ１１４Ｌ、Ａ１１４Ｉ、Ｉ１１６Ｄ、Ｉ１１６Ｅ、Ｉ１１６Ｎ、Ｉ１１６Ｑ、Ｅ１１７Ｙ、Ｅ１１７Ａ、Ｋ１１８Ｔ、Ｋ１１８Ｆ、Ｋ１１８ＡおよびＰ１８０Ｌのうちの任意の１以上に対応する特定の改変またはこれらに組合せを含み得る。これらの変異を含む改変されたＦｃは、例えば、活性化レセプターＦｃγＩＩＩａのようなＦｃＲへの結合が増強され得るか、そして／または、抑制性レセプターＦｃγＲＩＩｂへの結合が減少され得る（例えば、ＵＳ ２００６／００２４２９８を参照のこと）。ＦｃＲへの結合が増加するように改変されたＦｃ領域は、ＥＣＤポリペプチドに連結された場合でさえも、患者における癌細胞の破壊を促進するのにより効果的であり得る。抗体が腫瘍細胞を破壊するのには多数の可能性のある機構が存在し、この機構としては、必要な増殖経路の遮断による抗増殖、アポトーシスをもたらす細胞内シグナル伝達、レセプターのダウンレギュレーションおよび／もしくはターンオーバーの増強、ＡＤＣＣ、ならびに、順応性免疫応答の促進を介するものが挙げられる。
別の例では、ＦｃγＲとの結合を減少もしくは除去するための置換を持つ種々のＦｃ変異体もまた公知である。このようなムテインは、Ｆｃにより媒介されるエフェクター機能の減少もしくは排除が必要とされる場合に有用である。これはしばしば、拮抗作用はあるが、標的抗原を持つ細胞を殺傷しないことが望ましい場合に当てはまる。このようなＦｃの例は、米国特許第５，４５７，０３５号に記載され、そして、配列番号１６９に示されるＦｃムテインである。このムテインのアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａへと変化し、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕへと変化し、そして、アミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａへと変化していることを除いて、配列番号１６８に示されるＦｃ配列と同一である。同様の変異が、例えば、配列番号１６７に示される例示的なＦｃ配列のような任意のＦｃ配列においてなされ得る。このムテインは、Ｆｃレセプターに対して減少した親和性を示す。
いくつかの場合、本明細書において提供されるＥＣＤポリペプチドＦｃキメラタンパク質は、補体タンパク質Ｃ１ｑへの結合を増強するように改変され得る。ＦｃＲと相互作用するのに加えて、Ｆｃはまた、補体タンパク質Ｃ１ｑと相互作用して、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介する。Ｃ１ｑは、セリンプロテアーゼＣ１ｒおよびＣ１ｓと複合体を形成して、Ｃ１複合体を形成する。Ｃ１ｑは６つの抗体を結合し得るが、補体カスケードの活性化には、２つのＩｇＧへの結合で十分である。ＦｃＲとのＦｃの相互作用と同様に、異なるＩｇＧサブクラスは、Ｃ１ｑに対して異なる親和性を持ち、そして、代表的に、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも実質的に良好に結合する。したがって、Ｃ１ｑへの結合が増加した、改変されたＦｃは、増強されたＣＤＣを媒介し、これは、抗体が腫瘍細胞の破壊を促進する潜在的な機構である。Ｃ１ｑへの結合を増加させるＦｃ領域における例示的な改変としては、配列番号１６７におけるＫ１１０Ｗ、Ｋ１１０ＹおよびＥ１１７Ｓに対応するアミノ酸の改変が挙げられるがこれらに限定されない。
さらなる例において、そのＦｃＲｎへの結合が改変され、それによって、ＥＣＤ−Ｆｃキメラポリペプチドの薬物動態が改善されたＦｃ領域が利用され得る。ＦｃＲｎは、新生児のＦｃＲであり、この結合は、エンドサイトーシスされた抗体をエンドソームから回収して血流へと戻す。このプロセスは、全長分子の大きなサイズに起因する腎臓での濾過の妨害と組み合わさって、１週間〜３週間の範囲の望ましい抗体の血清中半減期をもたらす。ＦｃのＦｃＲｎへの結合はまた、抗体の輸送においても役割を担う。ＦｃＲｎへの結合の増強についてのＦｃタンパク質における例示的な改変としては、配列番号２６７におけるＴ３４Ｑ、Ｔ３４Ｅ、Ｍ２１２ＬおよびＭ２１２Ｆに対応するアミノ酸の改変が挙げられる。
代表的には、ポリペプチド多量体は、２つの同じかまたは異なるＥＣＤポリペプチドをＦｃポリペプチドに直接的もしくは間接的に連結することによって作製された２つのキメラタンパク質の二量体である。いくつかの例では、ＥＣＤ−Ｆｃキメラタンパク質をコードする遺伝子融合物は、適切な発現ベクター中に挿入される。結果として生じるＥＣＤ−Ｆｃキメラタンパク質は、組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞において発現され、そして、かなり類似した抗体分子を組み立てることを可能にし得、ここで、Ｆｃ分子間で分子間ジスルフィド結合が形成して、二価のＥＣＤポリペプチドが得られる。代表的には、宿主細胞および発現系は、配列番号１６７のＮ８１に対応するアミノ酸のグリコシル化を可能にする哺乳動物の発現系である。この位置におけるグリコシル化は、Ｆｃタンパク質を安定化させるために重要である。他の宿主細胞もまた使用され得るが、この位置におけるグリコシル化は、考慮の対象ではない。
結果として生じるＦ部分を含むキメラポリペプチドと、そこから形成される多量体とは、プロテインＡもしくはプロテインＧのカラムを通すアフィニティクロマトグラフィーによって容易に精製され得る。異なるＥＣＤキメラポリペプチドをコードする２つの核酸が細胞中に形質転換される場合、ヘテロ二量体の形成は、生化学的に達成されなければならない。というのも、Ｆｃドメインを有するＥＣＤキメラ分子は、ジスルフィド結合されたホモ二量体としても発現されるからである。したがって、ホモ二量体は、分子間ジスルフィドの破壊を促進するが、鎖内ジスルフィドには影響を及ぼさない条件下で減少され得る。代表的には、異なる細胞外部分を持つキメラ単量体は、等モル量で混合され、そして、酸化されてホモ二量体およびヘテロ二量体の混合物を形成する。この混合物の成分は、クロマトグラフィー技術によって分離される。あるいは、このタイプのヘテロ二量体の形成は、ＥＣＤポリペプチドと、その後に、ｈＩｇＧのＦｃドメインと、ｊｕｎもしくはｃ−ｆｏｓのロイシンジッパーのいずれかとを含むＥＣＤ融合分子を、遺伝子操作および発現させることによって偏らされ得る（以下を参照のこと）。ロイシンジッパーは、優先的にヘテロ二量体を形成するので、これらは、所望される場合、ヘテロ二量体の形成を駆動するために使用され得る。Ｆｃ領域を含むＥＣＤキメラポリペプチドはまた、金属キレートまたは他のエピトープを持つタグを含むように加工され得る。タグを付けたドメインは、金属−キレートクロマトグラフィーによる迅速な精製のために、および／または、ウェスタンブロットによる検出、免疫沈降もしくはバイオアッセイにおける活性の除去／ブロッキングを可能にするために、抗体によって使用され得る。
（ｂ）腔内の隆起部（すなわち、ノブと穴）
一局面では、ＥＣＤ多量体は、ホモ低重合体化よりもヘテロ低重合体化を促進するために、第一のキメラポリペプチドと第二のキメラポリペプチドとの間に界面を含むように加工される。代表的には、第一のＥＣＤキメラポリペプチドおよび第二のＥＣＤキメラポリペプチドの一方または両方の多量体化ドメインは、抗体分子の界面がヘテロ二量体化を助長および／もしくは促進するように改変された、改変抗体フラグメントである。いくつかの場合では、抗体分子は改変されたＦｃ領域である。したがって、改変は、第一のＦｃポリペプチド内に隆起部を、そして、第二のＦｃポリペプチド内に腔を含み、その結果、この隆起部がこの腔内に位置付けられて、第一および第二のＦｃ含有キメラＥＣＤポリペプチドの複合体化を促進することが可能となる。
代表的には、第一のキメラポリペプチドと第二のキメラポリペプチドとの安定な相互作用は、免疫グロブリン定常ドメインのＣＨ３ドメインの十分な部分を含む同じかまたは異なる多量体化ドメインの界面相互作用を介する。種々の構造的データおよび機能的データが、抗体重鎖の会合は、ＣＨ３ドメインにより導かれることを示唆している。例えば、Ｘ線結晶解析法は、Ｆｃ領域内でのヒトＩｇＧ１重鎖間の分子間会合は、ＣＨ３ドメイン間の広範囲にわたるタンパク質／タンパク質相互作用を含むが、グリコシル化されたＣＨ２ドメインは、その糖質を介して相互作用することを実証している（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０：２３６１）。さらに、重鎖がＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを除くために短縮されていない限りは、哺乳動物細胞における抗体発現の間に効率的に形成される２つの重鎖間ジスルフィド結合が存在する（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８１：３１７）。したがって、ジスルフィド結合の形成が重鎖の組み立てを促進するのではなく、重鎖の組み立てがジスルフィド結合の形成を促進するようである。ＣＨ３ドメインの界面の加工は、異なる重鎖のヘテロ多量体の形成を促進し、そして、対応するホモ多量体の組み立てを妨害する（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号；国際特許出願公開ＷＯ ９８／５０４３１およびＷＯ ２００５／０６３８１６；Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９：６１７−６２１を参照のこと）。
したがって、本明細書において提供されるＥＣＤ多量体は、第一のキメラＥＣＤポリペプチドと第二のキメラＥＣＤポリペプチドとの間の界面の間で形成され得、ここで、第一のポリペプチドの多量体化ドメインは、少なくとも、隆起部を含むように改変されたＦｃドメインのＣＨ３界面の十分な部分を含み、そして、第二のポリペプチドの多量体化ドメインは、少なくとも、腔を含むように改変されたＦｃドメインのＣＨ３界面の十分な部分を含む。改変されたＣＨ３界面の全体もしくは十分な部分は、ＩｇＧ免疫グロブリン、ＩｇＡ免疫グロブリン、ＩｇＤ免疫グロブリン、ＩｇＥ免疫グロブリンおよびＩｇＭ免疫グロブリンに由来するものであり得る。種々の免疫グロブリン分子のＣＨ３ドメインにおける改変の標的とされる界面の残基は、米国特許第５，７３１，１６８号に示される。一般に、多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧ１のようなＩｇＧ抗体に由来するＣＨ３ドメインの全体もしくは十分な部分である。
ポリペプチド内に隆起部または腔を作製するための置換および／または改変の標的とされるアミノ酸は、代表的に、第二のポリペプチドの界面にある１以上のアミノ酸と相互作用または接触する界面のアミノ酸である。隆起部を含むように改変される第一のポリペプチドは、ネイティブすなわち元のアミノ酸の、第一のポリペプチドの界面から突出し、したがって、第二のポリペプチドの隣接する界面における代償性の腔内に位置付けされ得る少なくとも１つの側鎖を持つアミノ酸での置換を含む。より頻繁に、置換アミノ酸は、元のアミノ酸残基よりも大きな側鎖の嵩を持つアミノ酸である。当業者は、アミノ酸残基の特性を決定および／または評価して、隆起部を作製するための理想的な置換アミノ酸であるアミノ酸を同定する方法を知っている。一般に、隆起部の形成のための置換残基は、天然に存在するアミノ酸残基であり、そして、例えば、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）またはトリプトファン（Ｗ）が挙げられる。いくつかの例では、置換のために同定される元の残基は、例えば、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、スレオニンまたはバリンのような小さな側鎖を持つアミノ酸残基である。
腔を含むように改変される第二のポリペプチドは、ネイティブすなわち元のアミノ酸の、第二のポリペプチドの界面から凹んでおり、したがって、第一のポリペプチドの界面からの対応する隆起部を収容し得る少なくとも１つの側鎖を持つアミノ酸での置換を含むものである。より頻繁に、置換アミノ酸は、元のアミノ酸残基よりも小さな側鎖の嵩を持つアミノ酸である。当業者は、アミノ酸残基の特性を決定および／または評価して、腔の形成のための理想的な置換アミノ酸であるアミノ酸を同定する方法を知っている。一般に、腔の形成のための置換残基は、天然に存在するアミノ酸残基であり、そして、例えば、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）およびバリン（Ｖ）が挙げられる。いくつかの例では、置換のために同定される元のアミノ酸は、例えば、チロシン、アルギニン、フェニルアラニンまたはトリプトファンのような大きな側鎖を持つアミノ酸である。
例えば、ヒトＩｇＧ１のＣＨ３界面は、４つのアンチパラレルβ−ストランド上に位置するドメインの各々（各表面から１０９０Å２埋まっている）の上に１６の残基を含む（例えば、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０：２３６１−２３７０；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１６，９６５−９７３；Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎ．，９：６１７−６２１；米国特許第５，７３１，１６８号を参照のこと）。隆起部または腔を作製するためのＣＨ３ドメインの改変は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号；国際特許出願公開ＷＯ９８／５０４３１およびＷＯ ２００５／０６３８１６；ならびにＲｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎ．，９：６１７−６２１に記載される。例えば、隆起部または腔を作製するためのＣＨ３ドメインの改変は、配列番号１６３に示される配列の、界面アミノ酸Ｑ２３０、Ｖ２３１、Ｙ２３２、Ｔ２３３、Ｌ２３４、Ｖ２４６、Ｓ２４７、Ｌ２４８、Ｔ２４９、Ｃ２５０、Ｌ２５１、Ｖ２５２、Ｋ２５３、Ｇ２５４、Ｆ２５５、Ｙ２５６、Ｋ２７５、Ｔ２７６、Ｔ２７７、Ｐ２７８、Ｖ２７９、Ｌ２８０、Ｄ２８１、Ｇ２８５、Ｓ２８６、Ｆ２８７、Ｆ２８８、Ｌ２８９、Ｙ２９０、Ｓ２９１、Ｋ２９２、Ｌ２９３、Ｔ２９４およびＶ２９５に対応する任意のアミノ酸の置換であり得る。いくつかの例では、隆起部または腔を作製するためのＣＨ３ドメインの改変は、代表的には、２つの中央のアンチパラレルβ−ストランド上に位置する残基に対して標的化される。この目的は、作製される隆起部が、パートナーのＣＨ３ドメイン内の代償性の腔によって収容されるのではなく、周囲の溶媒中に突出することによって適合され得るという危険性を最小限にすることである。このような改変の例としては、例えば、界面アミノ酸Ｔ２４９、Ｌ２５１、Ｐ２７８、Ｆ２８８、Ｙ２９０およびＫ２９２に対応する任意のアミノ酸の置換が挙げられる。隆起部／腔相互作用を生じさせるためのＣＨ３ドメインの改変のためのアミノ酸対の例としては、Ｔ２４９とＹ２９０の改変；およびＦ２８８とＴ２７７の改変が挙げられる。例えば、改変は、Ｔ２４９ＹとＹ２９０Ｔ；Ｔ２４９ＷとＹ２９０Ａ；Ｆ２８８ＡとＴ２７７Ｗ；Ｆ２８８ＷとＴ２７７Ｓ；およびＹ２９０ＴとＴ２４９Ｙを含み得る。
いくつかの例では、１以上の界面相互作用が作製され得る。例えば、改変はまた、例えば、第一のポリペプチドにおける隆起部を作製するための２以上の改変と、第二のポリオペにおける腔を作製するための２以上の改変とを含む。このような改変の例としては、例えば、第一のポリペプチドにおけるＴ２４９ＹおよびＦ２８８Ａの改変と、第二のポリペプチドにおけるＴ２７７ＷおよびＹ２９０Ｔの改変；第一のポリペプチドにおけるＴ２７７ＷおよびＦ２８８Ｗの改変と、第二のポリペプチドにおけるＴ２７７ＳおよびＹ２９０Ａの改変；または、第一のポリペプチドにおけるＦ２８８ＡおよびＹ２９０Ａの改変と、第二のポリペプチドにおけるＴ２４９ＷおよびＴ２７７Ｓの改変、が挙げられる。
Ｆｃドメインもしくはその改変体のような、任意の免疫グロブリン分子もしくはその改変体を含めて、本明細書において記載される他の多量体化ドメインと同様に、ＣＨ３隆起部／腔の改変を含むＦｃ改変体のＥＣＤポリペプチドへの結合は、いずれの場所においてもなされるが、代表的には、そのＮ末端もしくはＣ末端を介して、第一および／もしくは第二のＥＣＤポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端へとなされ、キメラポリペプチドを形成し得る。結合は、直接的であっても、リンカーを介して間接的であってもよい。また、キメラポリペプチドは、融合タンパク質であっても、共有結合性もしくは非共有結合性の相互作用などを介して、化学結合によって形成されてもよい。代表的には、ノブと穴の分子は、ＣＨ３の隆起部改変を含むＦｃ改変体に連結された第一のＥＣＤポリペプチドと、ＣＨ３の腔改変を含むＦｃ改変体に連結された第二のＥＣＤポリペプチドとの共発現によって作製される。
ｉｉ．ロイシンジッパー
ＥＣＤポリペプチド多量体の別の調製方法は、ロイシンジッパードメインの使用を含む。ロイシンジッパーは、これらが見られるタンパク質においてタンパク質の多量体化を促進するペプチドである。代表的には、ロイシンジッパーは、数種のタンパク質中で保存されたドメインとして存在する４〜５のロイシン残基を含む、反復性の７個からなるモチーフを指すために用いられる用語である。ロイシンジッパーは、短い、平行らせん状のコイルとして折り畳まれ、そして、このロイシンジッパーがドメインを形成するタンパク質の低重合体化を担うものと考えられる。ロイシンジッパーは元々、数種のＤＮＡ結合タンパク質において同定されたものであり（例えば、Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９を参照のこと）、そして、その後、種々のタンパク質において見出されている。既知のロイシンジッパーには、二量体化もしくは三量体化する、天然に存在するペプチドおよびその誘導体が含まれる。ロイシンジッパーペプチドに直接的または間接的に連結されたＥＣＤポリペプチドを含む組換えキメラタンパク質は、適切な宿主細胞において発現され得、そして、形成するＥＣＤポリペプチド多量体は、培養上清から回収され得る。
ロイシンジッパードメインは、短い、平行らせん状のコイルとして折り畳まれる（Ｏ’Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：５３９）。平行らせん状コイルの一般的な構造は、「穴内のノブ（ｋｎｏｂ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅ）」パッキングを持つものとして特徴付けられ、１９５３年にＣｒｉｃｋによって最初に提唱された（Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，６：６８９）。ロイシンジッパードメインにより形成される二量体は、（ａｂｃｄｅｆｇ）ｎと示される７個からなるリピートによって安定化され（例えば、ＭｃＬａｃｈｌａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｗａｒｔ（１９７８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：２９３を参照のこと）、ここで、残基ａおよびｄは一般に疎水性残基であり、残基ｄはロイシンであり、そして、これらは、らせんの同一面上に整列する。反対の電荷を持つ残基は、一般に、ｇおよびｅの位置にある。したがって、２つのらせん状ロイシンジッパードメインから形成される平行ならせん状コイルにおいて、第一のらせんの疎水性側鎖によって形成される「ノブ」は、第二のらせんの側鎖間に形成される「穴」内に包まれる。
ｄの位置にあるロイシン残基は、大きな疎水性安定化エネルギーを与え、そして、二量体の形成に重要である（Ｋｒｙｓｔｅｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．３８：２２９）。疎水性安定化エネルギーは、らせん状単量体からのらせん状コイルの形成のための主な駆動力を提供する。静電相互作用もまた、らせん状コイルの化学量論および幾何学に寄与する。
（ａ）ｆｏｓおよびｊｕｎ
２つの核癌遺伝子タンパク質、ｆｏｓおよびｊｕｎは、マウスの癌原遺伝子の遺伝子産物であるｃ−ｍｙｃと同様に、ロイシンジッパードメインを示す。ロイシンジッパードメインは、これらのタンパク質における生物学的活性（ＤＮＡ結合）に必須である。核癌遺伝子の産物であるｆｏｓおよびｊｕｎは、優先的にヘテロ二量体を形成するロイシンジッパードメインを含む（Ｏ’Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：６４６；Ｔｕｒｎｅｒ ａｎｄ Ｔｉｊｉａｎ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：１６８９）。例えば、ヒト転写因子ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓのロイシンジッパードメインは、１：１の化学量論で安定なヘテロ二量体を形成することが示されている（例えば、Ｂｕｓｃｈ ａｎｄ Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ（１９９０）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，６：３６−４０；Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：１６９５−１６９９を参照のこと）。ｊｕｎ−ｊｕｎホモ二量体も形成することが示されているが、このホモ二量体は、ｊｕｎ−ｆｏｓヘテロ二量体よりも約１０００倍安定性が低い。
したがって、代表的には、本明細書において提供されるＥＣＤポリペプチド多量体は、ｊｕｎ−ｆｏｓの組合せを用いて作製される。一般に、ｃ−ｊｕｎまたはｃ−ｆｏｓのいずれかのロイシンジッパードメインは、融合遺伝子を遺伝子操作することによって、ポリペプチドのＥＣＤのＣ末端において、インフレームで融合される。ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓのロイシンジッパーの例示的なアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１７０および１７１に示される。いくつかの場合、ロイシンジッパーの配列は、例えば、システイン残基を加えて、ジスルフィド結合の形成を可能にするか、または、Ｃ末端にチロシン残基を加えて、ペプチド濃度の測定を容易にすることより、改変され得る。改変されたｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓのロイシンジッパーのコードされるアミノ酸のこのような例示的な配列は、それぞれ、配列番号１７２および１７３に示される。さらに、ロイシンジッパーとのＥＣＤポリペプチドの結合は、直接的であっても、柔軟性のあるリンカードメイン（例えば、ＩｇＧのヒンジ領域、または、種々の長さおよび組合せのグリシン、セリン、スレオニンもしくはアラニンのような小さなアミノ酸の他のポリペプチドリンカー）を用いてもよい。いくつかの場合では、コードされるポリペプチドのＣ末端からのロイシンジッパーの分離は、プロテアーゼ切断部位（例えば、トロンビン切断部位）をコードする配列との融合によって達成され得る。さらに、キメラタンパク質は、金属キレートクロマトグラフィーによる迅速な精製を可能にするために、例えば、６×Ｈｉｓタグなどによって、および／または、ウェスタンブロットによる検出、免疫沈降もしくはバイオアッセイにおける活性の除去／ブロッキングを可能にするために、抗体が利用可能なエピトープ（例えば、ｍｙｃタグ）によって、タグが付けられ得る。
（ｂ）ＧＣＮ４
ロイシンジッパードメインはまた、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける窒素の全体的な制御（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ）（ＧＣＮ４）代謝に関与する遺伝子ファミリーの転写活性化因子として機能する核タンパク質において見出される。このタンパク質は、ＧＣＮ４についての認識配列を含むプロモーター配列を二量体化および結合し、それによって、窒素欠乏時に転写を活性化することができる。二量体の複合体を形成し得るＧＣＮ４ロイシンジッパーの例示的な配列は、配列番号１８０に示される。
ＧＣＮ４ロイシンジッパードメインを示す合成ペプチドのａ残基およびｄ残基におけるアミノ酸置換（すなわち、配列番号１８０として示される配列におけるアミノ酸置換）は、ロイシンジッパードメインの低重合体化特性を変化させることが見出されている。例えば、ａの位置における全残基がイソロイシンに変更される場合、ロイシンジッパーは、依然として平行な二量体を形成する。この変更に加えて、ｄの位置にある全てのロイシン残基もまた、イソロイシンに変更される場合、結果として生じるペプチドは、自発的に、溶液において三量体の平行ならせん状コイルを形成する。三量体を形成し得るこのようなＧＣＮ４ロイシンジッパードメインの例示的な配列は、配列番号１８１に示される。ｄの位置にある全てのアミノ酸をイソロイシンで、そして、ａの位置にある全てのアミノ酸をロイシンで置換すると、四量体化するペプチドが生じる。四量体を形成し得るＧＣＮ４のロイシンジッパードメインのこのような例示的な配列は、配列番号１８２に示される。これらの置換を含むペプチドは、低重合体形成の機構が、上述されかつ配列番号１８０に示されるＧＣＮ４のような伝統的なロイシンジッパードメインについての機構と同じであると考えられるので、依然としてロイシンジッパードメインと呼ばれる。
ｉｉｉ．他の多量体化ドメイン
他の多量体化ドメインが当業者に公知であり、これは、別々に作製され、そしてＥＣＤ融合物として発現される２以上のポリペプチドのタンパク質−タンパク質相互作用を促進する任意のものである。２つのキメラポリペプチド間にタンパク質−タンパク質相互作用を提供するために使用され得る他の多量体化ドメインの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ｂａｒｎａｓｅ−ｂａｒｓｔａｒモジュール（例えば、Ｄｅｙｅｖ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：１４８６−１４９２を参照のこと）；特定のタンパク質ドメインを選択したもの（例えば、Ｔｅｒｓｋｉｋｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）ＰＮＡＳ ９４：１６６３−１６６８およびＭｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２２：２５９−２６４を参照のこと）；特定のペプチドモチーフを選択したもの（例えば、ｄｅ Ｋｒｕｉｆ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７６３０−７６３４およびＭｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４３２：４５−４９を参照のこと）；および安定性を増強するためのジスルフィド架橋の使用（ｄｅ Ｋｒｕｉｆ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７６３０−７６３４およびＳｃｈｍｉｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１３：７２５−７３４）。別のタイプの多量体化ドメインの例は、多量体化が、ＰＫＡ／ＡＫＡＰ相互作用について以下に記載されるような、異なるサブユニットポリペプチド間のタンパク質−タンパク質相互作用によって促進されるものである。
（ａ）Ｒ／ＰＫＡ−ＡＤ／ＡＫＡＰ
ヘテロ多量体性ＥＣＤポリペプチドはまた、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の調節性（Ｒ）サブユニットと、Ａキナーゼアンカータンパク質のアンカードメイン（ＡＤ）との間のタンパク質−タンパク質相互作用を利用して作製され得る（ＡＫＡＰ、例えば、Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，（２００６）ＰＮＡＳ １０３：６８４１−６８４６を参照のこと）。２つのタイプのＲサブユニット（ＲＩおよびＲＩＩ）がＰＫＡにおいて見られ、この各々が、αアイソフォームとβアイソフォームとを持つ。Ｒサブユニットは、二量体として存在し、そして、ＲＩＩについては、二量体化ドメインは、アミノ末端の４４残基内に存在する（例えば、配列番号１８３を参照のこと）。ＡＫＡＰは、そのＡＤドメインの相互作用により、ＰＫＡのＲサブユニットと相互作用して、その活性を調節する。ＡＫＡＰは、二量体性のＲサブユニットにのみ結合する。例えば、ヒトＲＩＩαについて、ＡＤは、アミノ末端の２３残基から形成される疎水性表面に結合する。ＡＤの例示的な配列は、配列番号１８４に示されるＡＤ１であり、これは、ＡＫＡＰ−ＩＳ（ＲＩＩ選択的な結合に最適化された合成ペプチド）に由来する１７アミノ酸残基の配列である。したがって、ヘテロ多量体性ＥＣＤポリペプチドは、ＨＥＲ ＥＣＤポリペプチドのようなＥＣＤポリペプチドをコードする核酸を、Ｒサブユニット配列をコードする核酸（すなわち、配列番号１８３）と（直接的または間接的に）連結することによって作製され得る。これにより、Ｒサブユニットにより達成される二量体の自発的な形成に起因して、ホモ二量体分子が生じる。前後して、別のＥＣＤポリペプチド融合物が、別のＥＣＤポリペプチドをコードする核酸を、ＡＤ配列をコードする核酸配列に連結することによって作製され得る。宿主細胞におけるＥＣＤキメラ成分の同時トランスフェクションなどの後にこの２つの成分が共発現すると、二量体のＲサブユニットが、ＡＤ配列に結合してヘテロ多量体分子を生じさせるためのドッキング部位を提供する。この結合事象はさらに、例えば、ジスルフィド結合などの共有結合によって安定化され得る。いくつかの例では、柔軟性のあるリンカー残基が、ＥＣＤポリペプチドをコードする核酸と、多量体化ドメインとの間に融合され得る。別の例では、ＥＣＤポリペプチドをコードする核酸の融合は、共有結合を促進するために、Ｒサブユニットのアミノ末端付近に組み込まれたシステイン残基を含むＲサブユニットをコードする核酸に対してなされ得る（例えば、配列番号１８５を参照のこと）。同様に、パートナーのＥＣＤポリペプチドをコードする核酸の融合は、これもまた、ＡＤのアミノ末端およびカルボキシル末端の両方にシステイン残基の組み込みを含むＡＤサブユニットをコードする核酸に対してなされ得る（例えば、配列番号１８６を参照のこと）。
３．キメラＥＣＤポリペプチド
キメラＥＣＤポリペプチドが、ＥＣＤ多量体の形成において使用するために、本明細書中に記載されるように調製される。キメラＥＣＤポリペプチドは、代表的に、多量体化ドメインに対して直接的または間接的に連結された、ＣＳＲのＥＣＤの全体もしくは一部分を含む。例示的な多量体化ドメインは、本明細書中に記載される任意のものであり、以下が挙げられるがこれらに限定されない：免疫グロブリン配列（すなわち、定常領域（Ｆｃ））、ロイシンジッパー、適合性のタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、らせん状コイルモチーフ、ヘリックスループモチーフ、相補的疎水性領域、相補的親水性領域、腔内の隆起部、および同一もしくは類似の大きさの代償性の腔、ならびに、安定な多量体を形成するのに十分な任意の他のもの。多量体分子の形成を可能にするために、多量体化ドメインは、第一のキメラポリペプチドと第二のキメラポリペプチドとの間で同じであるか、または、相補的である。別々のキメラＥＣＤポリペプチドの単量体は、一度発現されると、多量体化ドメインを介して安定に会合され、多量体のＥＣＤポリペプチドを形成する。
ＣＳＲの任意のＥＣＤ部分が、多量体のパートナーとして使用され得る。例えば、上記のＥＣＤのうち任意のもの、または、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号２９８、配列番号２００もしくは配列番号３０１〜３９９のいずれかに示されるもの、または、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＩＧＦ１−Ｒおよびこれらのスプライシング改変体のＥＣＤを含むＣＳＲの任意のＥＣＤ部分（例えば、表７に記載され、そして、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８、配列番号２６０もしくは配列番号２６２のいずれかに示される任意のＣＳＲのＥＣＤ部分）が、キメラＥＣＤポリペプチドを作製するために使用され得、ここで、ＥＣＤポリペプチドの全体もしくは一部分が、多量体化ドメインに連結される。代表的には、多量体化ドメインに連結されたＥＣＤ部分の少なくとも一方（しかし、ときどき両方）は、リガンドへの結合および／または二量体化に十分なＨＥＲファミリーレセプターの全体もしくは一部分（すなわち、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４分子の全体もしくは一部分）である。多量体化パートナーとして使用するための、ＨＥＲファミリーレセプターのＥＣＤもしくはその一部分の例は、本明細書において上に記載され、そして、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３６、配列番号１３７および配列番号１５９のいずれかに示される。いくつかの例において、多量体化パートナーのうち少なくとも一方が、ＨＥＲ１レセプターのＥＣＤの全体もしくは一部分である。例えば、多量体ＨＥＲ ＥＣＤポリペプチドの例は、ＨＥＲ１／ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ１／ＨＥＲ４のＥＣＤまたはその一部分の間に形成される多量体である。さらに、ＥＣＤ多量体の形成に使用するためのキメラＥＣＤポリペプチドは、多量体化ドメインに連結されたハイブリッドＣＤポリペプチドを含み得る。
一例では、ＥＣＤキメラポリペプチドは、免疫グロブリン分子に由来する配列との、ＥＣＤポリペプチドの直接的もしくは間接的な結合を含む。一例では、多量体化成分は、ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＭもしくはＩｇＡに由来する免疫グロブリン由来のドメイン、または、別の動物（マウスを含むがこれに限定されない）に由来の類似する免疫グロブリンドメインである。他の例では、多量体化成分は、ＩｇＧのＦｃドメイン、ＩｇＧの重鎖およびＩｇＧの軽鎖のうちのいずれかから選択される。代表的には、ＩｇＧのＦｃドメインが使用され、そして、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むＩｇＧアイソタイプ、ならびに、各アイソタイプの群内の任意のアロタイプから選択され得る。多くの場合、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１、または、本明細書に記載されるような特に所望される特性について修飾され得るその誘導体である。Ｆｃ部分は、最も頻繁に、免疫グロブリン重鎖の、少なくともヒンジ領域の一部分と、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。多量体化成分として使用するための例示的なＦｃ配列は、配列番号１６７に示されるが、例えば、Ｆｃ配列において使用されるヒンジ部分の長さに依存して、他のものも公知である。代表的には、ＥＣＤポリペプチドの融合は、Ｆｃ配列との直接的な結合によってなされるが、また、ペプチドリンカーまたは化学的リンカー（ヘテロ二官能性の架橋剤を含む）などによる間接的な結合によってもなされ得る。一般に、任意のＨＥＲファミリーレセプターを含むＣＳＲのＮ末端ＥＣＤもしくはその一部分は、Ｃ末端において、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分、そして、必要な場合、リンカーペプチドおよび／またはエピトープタグへと融合される。
ａ．例示的なキメラＨＥＲ ＥＣＤポリペプチド
本明細書において提供されるＥＣＤ多量体の形成に使用するために含められるキメラポリペプチドは、ＨＥＲ１の全長ＥＣＤまたはその短縮された部分と、Ｆｃ多量体化成分とを含み、そして、必要に応じて、ＨＥＲ１ ＥＣＤキメラポリペプチドの精製および／もしくは検出のためのｃ−ｍｙｃタグもしくはＨｉｓタグのようなエピトープタグを含む任意のものを含む。例示的なＨＥＲ１−Ｆｃキメラポリペプチドは、配列番号３８および４０に示され、そして、それぞれ、配列番号３７および３９に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。例えば、配列番号３８として示される例示的なＨＥＲ１−Ｆｃキメラポリペプチド（ＨＦ１１０−Ｆｃ；ＨＥＲ１−５０１／Ｆｃ；ＨＦＤ１１０）は、配列番号１０に示されるＨＥＲ１の短縮型ＥＣＤ配列（配列番号３８のアミノ酸１〜５０１に対応）を含み、この短縮型ＥＣＤ配列は、Ｎ末端において、ＸｈｏＩ制限酵素リンカー（アミノ酸５０２〜５０３に対応）、ペプチドリンカー配列（アミノ酸５０４〜５０８に対応）、およびＦｃ多量体化成分についての配列（アミノ酸５０９〜７３９に対応）を含む配列に対し、作動可能に連結される。別の例では、配列番号４０として示される例示的なＨＥＲ１−Ｆｃキメラポリペプチド（ＨＦ１００−Ｆｃ；ＨＥＲ１−６２１／Ｆｃ；ＨＦＤ１００）は、配列番号１２に示されるＨＥＲ１の全長ＥＣＤ配列（配列番号４０のアミノ酸１〜６２１に対応）、ペプチドリンカー配列（アミノ酸６２２〜６２６に対応）、およびＦｃ多量体化成分についての配列（アミノ酸６２７〜８５７に対応）を含む。さらに、例えば、例示的なＨＦ１１０−ＦｃおよびＨＦ１００−Ｆｃ分子を含むＨＥＲ１−Ｆｃ分子は、必要に応じて、エピトープタグを含み得る。例えば、配列番号３８に示される例示的なＨＦ１１０−Ｆｃ分子はまた、必要に応じて、ｍｙｃエピトープタグセット（配列番号３８のアミノ酸７４０〜７４９に対応）を含み得る。別の例では、配列番号４０に示されるＨＦ１００−Ｆｃ分子はまた、必要に応じて、Ｈｉｓエピトープタグまたは他のタグ（すなわち、ＨＦＤ１００Ｔ）を含み得る。例示的なＨＦＤ１００Ｔ分子は、配列番号４０６に示され、そして、ＨＥＲ１の全長ＥＣＤ配列（配列番号４０６のアミノ酸１〜６２１に対応）を含み、このＥＣＤ配列は、Ｎ末端において、ＸｂａＩリンカー（アミノ酸６２２〜６２３に対応）、ペプチドリンカー配列（アミノ酸６２４〜６２７に対応）、Ｆｃ多量体化成分についての配列（アミノ酸６２８〜８５８に対応）、ＡｇｅＩリンカーを含む配列（アミノ酸８５９〜８６０に対応）および６×Ｈｉｓタグについての配列（配列番号４０６のアミノ酸８６１〜８６６に対応）を含む配列に対して、作動可能に連結される。
本明細書において提供されるＥＣＤ多量体の形成において使用するために含められるキメラポリペプチドは、ＨＥＲ２の全長ＥＣＤまたはその短縮された部分と、Ｆｃ多量体化成分とを含み、そして、必要に応じて、ＨＥＲ２ ＥＣＤキメラポリペプチドの精製および／もしくは検出のためのｃ−ｍｙｃタグもしくはＨｉｓタグのようなエピトープタグを含む任意のものを含む。例示的なＨＥＲ２−Ｆｃキメラポリペプチドは、配列番号４２に示され、そして、配列番号４１に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。配列番号４０として示される例示的なＨＥＲ２−Ｆｃキメラポリペプチド（ＨＦ２００−Ｆｃ；ＨＥＲ２−６５０／Ｆｃ；ＨＦＤ２００）は、配列番号１８に示されるＨＥＲ２の全長ＥＣＤ配列（配列番号４２のアミノ酸１〜６２８に対応）を含み、この全長ＥＣＤ配列は、Ｎ末端において、ペプチドリンカー配列（アミノ酸６２９〜６３３に対応）、およびＦｃ多量体化成分についての配列（アミノ酸６３４〜８６４に対応）を含む配列に対し、作動可能に連結される。さらに、例えば、例示的なＨＦ２００−Ｆｃを含むＨＥＲ２−Ｆｃ分子は、必要に応じて、エピトープタグを含み得る。
本明細書において提供されるＥＣＤ多量体の形成に使用するために含められるキメラポリペプチドは、ＨＥＲ３の全長ＥＣＤまたはその短縮された部分と、Ｆｃ多量体化成分とを含み、そして、必要に応じて、ＨＥＲ３ ＥＣＤキメラポリペプチドの精製および／もしくは検出のためのｃ−ｍｙｃタグもしくはＨｉｓタグのようなエピトープタグを含む任意のものを含む。例示的なＨＥＲ３−Ｆｃキメラポリペプチドは、配列番号４４および４６に示され、そして、それぞれ、配列番号４３および４５に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。例えば、配列番号４４に示される例示的なＨＥＲ３−Ｆｃキメラポリペプチド（ＨＦ３１０−Ｆｃ；ＨＥＲ１−５００／Ｆｃ；ＨＦＤ３１０）は、配列番号２０に示されるＨＥＲ３の短縮型ＥＣＤ配列（配列番号４４のアミノ酸１〜５００に対応）を含み、この短縮型ＥＣＤ配列は、Ｎ末端において、ペプチドリンカー配列（アミノ酸５０１〜５０５に対応）、およびＦｃ多量体化成分についての配列（アミノ酸５０６〜７３６に対応）を含む配列に対し、作動可能に連結される。別の例では、配列番号４６として示される例示的なＨＥＲ３−Ｆｃキメラポリペプチド（ＨＦ３００−Ｆｃ；ＨＥＲ３−６２１／Ｆｃ；ＨＦＤ３００）は、配列番号２６に示されるＨＥＲ３の全長ＥＣＤ配列（配列番号４６のアミノ酸１〜６２１に対応）を含み、この全長ＥＣＤ配列は、Ｎ末端において、ペプチドリンカー配列（アミノ酸６２２〜６２６に対応）、およびＦｃ多量体化成分についての配列（アミノ酸６２７〜８５７に対応）に対して作動可能に連結される。さらに、例えば、例示的なＨＦ３１０−ＦｃおよびＨＦ３００−Ｆｃ分子を含むＨＥＲ３−Ｆｃ分子は、必要に応じて、エピトープタグを含み得る。
本明細書において提供されるＥＣＤ多量体の形成において使用するために含められるキメラポリペプチドは、ＨＥＲ４の全長ＥＣＤまたはその短縮された部分と、Ｆｃ多量体化成分とを含み、そして、必要に応じて、ＨＥＲ２ ＥＣＤキメラポリペプチドの精製および／もしくは検出のためのｃ−ｍｙｃタグもしくはＨｉｓタグのようなエピトープタグを含む任意のものを含む。例示的なＨＥＲ４−Ｆｃキメラポリペプチドは、配列番号４８に示され、そして、配列番号４７に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。配列番号４８として示される例示的なＨＥＲ４−Ｆｃキメラポリペプチド（ＨＦ４００−Ｆｃ；ＨＥＲ４−６５０／Ｆｃ；ＨＦＤ４００）は、配列番号３２に示されるＨＥＲ４の全長ＥＣＤ配列（配列番号４８のアミノ酸１〜６２５に対応）を含み、この全長ＥＣＤ配列は、Ｎ末端において、ペプチドリンカー配列（アミノ酸６２６〜６３０に対応）、およびＦｃ多量体化成分についての配列（アミノ酸６３１〜８６１に対応）を含む配列に対し、作動可能に連結される。さらに、例えば、例示的なＨＦ４００−Ｆｃを含むＨＥＲ４−Ｆｃ分子は、必要に応じて、エピトープタグを含み得る。
Ｅ．ＥＣＤ多量体
本明細書において提供されるＥＣＤ多量体は、そのそれぞれの多量体化ドメインの相互作用を介して安定に会合された、少なくとも２つのＥＣＤポリペプチドを含む。ＥＣＤ多量体は、ホモ多量体であり得るが、最も頻繁には、多量体のＥＣＤポリペプチド成分が異なるヘテロ多量体である。ＥＣＤヘテロ多量体は、汎ＨＥＲ治療薬を含む汎レセプター治療薬である。ＥＣＤ多量体は、ＨＥＲファミリーメンバー上のいくつかのエピトープを標的とする。したがって、結果として生じるＥＣＤ多量体分子は、２以上の同系または相互作用性のＣＳＲの活性を調節（代表的には、阻害）する。調節は、１以上のリガンドとの相互作用、および／または、全長の同系レセプターもしくは他の相互作用性のＣＳＲとの二量体化によってなされ得る。したがって、多量体ＥＣＤポリペプチドは、それぞれのＥＣＤポリペプチドの各々の１以上のリガンド（一般には２以上のリガンド）に結合し、そして／または、同系のレセプターもしくは細胞表面上の相互作用性レセプターと二量体化する。したがって、結果として得られるＥＣＤポリペプチド多量体は、同系のＣＳＲのアンタゴニストとして有用である。このようなアンタゴニストは、リガンド結合および／または同系レセプターの活性化から生じる疾患の処置において有用である。
ＨＥＲファミリーレセプターは、不活性形態であることがもっとも頻繁であり、膜内外のＨＥＲ分子のほんの５％までが活性な立体配置である。通常は、全長ＨＥＲレセプターについて、不活性な形態から活性な形態への移行を支配する機構はリガンド結合である。リガンド結合は、レセプター分子を再配向して、二量体化アームを係留型の立体配座から、別のＨＥＲ分子と二量体する能力を持つ立体配座へと強制的にシフトさせる。ＨＥＲ分子の活性な形態は、ＨＥＲ分子の細胞外ドメインの全体もしくは一部分の、多量体化ドメイン（例えば、Ｆｃフラグメントであるがこれに限定されない）との二量体化を推し進めることによって模倣され得る。したがって、多量体化ドメインとのＨＥＲ ＥＣＤの融合は、構成的に活性化されたＨＥＲ２分子と同様に、ＨＥＲ分子に、リガンド非依存性に活性化される立体配座（すなわち、非係留型）を採らせる。例えば、多量体化ドメインがＦｃ分子である場合、キメラポリペプチドの発現物は、ホモ二量体として生成され得、ここで、Ｆｃドメインの相互作用を介して、２つの発現された単量体性ポリペプチドの間で二量体化が推し進められる。いくつかの場合、このようなホモ二量体は、ＥＣＤの単量体形態と比べて、ＥＣＤポリペプチドの改善された特性をもたらし得る。一例では、ＨＥＲ ＥＣＤの全体もしくは一部分のＦｃ多量体化ドメインとの結合は、高い親和性でのリガンド結合が可能な高親和性レセプター複合体を生成し得、この場合、ＥＣＤの単量体形態は、リガンドに結合できない。例えば、実施例４に記載されるように、成熟なＨＥＲ１レセプターの完全なＥＣＤ（すなわち、アミノ酸１〜６２１）を含む単量体ＥＣＤ分子は、ＥＧＦに対する最小限の結合のみを示す。ＥＣＤポリペプチドがＦｃ多量体化ドメインに連結される場合、ホモ二量体ＨＥＲ１ ＥＣＤ分子のＥＧＦへの結合能は、多いに増大される。
ＣＳＲ分子のヘテロ多量体の安定化のためのこの同じ機構の利用は、広範な高親和性レセプター治療薬としての汎レセプターＥＣＤ多量体（汎ＨＥＲ ＥＣＤ多量体を含む）の作製に提案されている。
したがって、汎レセプター治療薬の活性は、１以上のリガンドに対する親和性を有する高親和性可溶性レセプター複合体としてのものである。したがって、汎レセプター多量体は、リガンド（増殖因子リガンドを含む）を封鎖するためのリガンドトラップとして使用され得る。ＥＣＤ多量体によって封鎖され得るリガンドは、多量体のポリペプチドＥＣＤに結合するかまたはこれと相互作用することが知られるリガンドである。ＥＣＤ多量体の成分が、ＨＥＲ分子の１以上のＥＣＤの全体またはリガンドへの結合に十分な部分を含む場合、ＥＣＤ多量体は、潜在的に、表６に示されるリガンドの組合せの任意の１以上を封鎖し得る。例えば、多量体がＨＥＲ１とＨＥＲ４の組合せである場合、少なくとも１０の異なるリガンドが標的となり得る。あるいは、多量体がＨＥＲ１とＨＥＲ３の組合せである場合、ＥＧＦ、アンフィレグリン、ＴＧＦ−α、ベタセルリン、ヘパリン結合ＥＧＦ、エピレグリン、または、ニューレグリン１もしくは２（ヘレグリン１もしくは２）を含む任意の１以上のリガンドが、多量体分子によって封鎖され得る。したがって、多量体のＥＣＤポリペプチド成分のうちの１つがＨＥＲ分子（例えば、ＨＥＲ１）であり、かつ、その他が別のＣＳＲの全体もしくは一部分であるいくつかの場合において、ＥＣＤ多量体は、少なくとも７つのリガンドと相互作用し得、このリガンドのうち６つは、ＨＥＲ１のＥＣＤによって認識されるリガンドであり、そして、残りの１以上のリガンドは、パートナーのＥＣＤポリペプチドによって認識される。追加のリガンドは、疾患（例えば、増殖性疾患、新脈管形成疾患もしくは炎症性疾患であるが、これらに限定されない）の過程に関与する増殖因子または他のリガンドであり得る。このようなリガンドの例としては、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、インシュリン、ＨＧＦ、アンジオポエチンなどが挙げられる。さらなる例では、１以上のハイブリッドＥＣＤポリペプチドの組合せから作製されるＥＣＤ多量体は、その多量体が、２つ、３つ、または４つまでの異なるＣＳＲについての十分なリガンド結合部分を含み、したがって、そのそれぞれの全長ＣＳＲから、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれより多いリガンドを封鎖する能力を有するように加工され得る。
本明細書において提供されるＥＣＤ多量体によるＣＳＲの調節はまた、同系レセプターまたは相互作用性の膜貫通型レセプターとの直接的な相互作用を介してなされ得る。例えば、ほぼ全てのＲＴＫレセプターの活性化は、補レセプター（ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）との二量体化を介してなされ、全長のホモ二量体レセプターおよびヘテロ二量体レセプターを作製し、そして、エフェクターの回収および下流のシグナル伝達のための触媒作用性のテイルの自己リン酸化を可能にする。例えば、ＨＥＲレセプターは、ＨＥＲのシグナル伝達を増幅および多様化するための１つの機構として、種々の組合せで二量体化する。全長ＨＥＲレセプターの全組合せが観察されており、ＨＥＲ２が最も代表的な二量体化のパートナーである。したがって、ＣＳＲ、特に、ＲＴＫ（ＨＥＲを含む）の二量体化する能力とのあらゆる干渉が、レセプター媒介性のシグナル伝達を損ねる。ＣＳＲの二量体化を損ね得る分子の例は、ＥＣＤ多量体、特に、ＨＥＲ ＥＣＤ多量体である。多量体化ドメインとの融合物（例えば、Ｆｃタンパク質との融合物）を生じる、ＨＥＲ ＥＣＤ多量体の活性化された高親和性の形態は、膜貫通型レセプターとの相互作用のための立体配置において、リガンドによって結合されていてもそうでなくても、ドメインＩＩ内に二量体化アームを呈する、「背中合わせの」立体配座を予測する（ｐｒｅｄｉｃｔ）。このような相互作用は、全長ＨＥＲレセプターが、膜の内外で別の全長ＨＥＲレセプターと対になる能力と干渉し得、それによって、レセプターの活性化を阻害する。同様の相互作用および阻害が、同系レセプターの二量体化と干渉する他のＣＳＲ ＥＣＤ（他のＲＴＫ ＥＣＤ多量体を含む）についても企図される。したがって、リガンドの封鎖に加えて、または、その代わりに、本明細書において提供される汎レセプター多量体は、１以上のレセプターと二量体化して、その活性を阻害し得る。以下に記載されるように、膜貫通型レセプターの活性は、アッセイ（リン酸化または細胞増殖が挙げられるがこれらに限定されない）によって評価され得る。
代表的には、ＥＣＤ多量体は二量体であるが、例えば、多量体化の形成のために選択した多量体化ドメインに依存して、三量体またはより高次の多量体であり得る。例えば、Ｆｃドメインは、二量体分子をもたらす。さらに、一般的には、ロイシンジッパーである多量体化ドメインもまた二量体性のＥＣＤ分子をもたらすが、例えば、改変体ＧＣＮ４のようなロイシンジッパーの改変形態が、三量体、または、より高次の多量体を作製するために使用され得る。より高次の多量体化ドメインが望ましい場合、それに従って多量体化ドメインが選択され得る。当業者は、例えば、本明細書中に提供されるもののような例示的な多量体化ドメインの構造体系を熟知している。
ａ．全長ＨＥＲ１ ＥＣＤおよび別のＣＳＲのＥＣＤの全体もしくは一部分
本明細書では、多量体化ドメインに連結されたＨＥＲ１の全長ＥＣＤを第一のポリペプチドとして、そして、これもまた多量体化ドメインに連結された別のＣＳＲのＥＣＤの全体もしくは一部分を第二のポリペプチドとして含むＥＣＤ多量体が提供される。第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドの多量体化ドメインは、同じであっても異なっていてもよいが、ことなる場合、多量体化ドメインは、多量体の成分間での安定なタンパク質−タンパク質相互作用を可能にするために相補的である。全長ＨＥＲ１ ＥＣＤポリペプチドの例は、ＨＦ１００であり、これは、配列番号１２に示されるもののような成熟なＨＥＲ１レセプターのアミノ酸１〜６２１、またはその対立遺伝子改変体もしくは種改変体を含む。第二のポリペプチドのＥＣＤは、ＥＣＤポリペプチドが全長ＨＥＲ２分子でない限りは、任意のＣＳＲ（特に、増殖、新脈管形成もしくは炎症を伴う疾患の過程に関与する任意のＣＳＲ）のＥＣＤの全体もしくは一部分であり得る。しかし、第二のポリペプチドのＥＣＤは、ＨＥＲ２分子のＥＣＤの他のＨＥＲ分子との二量体化に十分な部分であり得る。短縮型ＨＥＲ２ ＥＣＤポリペプチドの例としては、配列番号１８に示されるＨＦ２２０分子、および配列番号１６に示されるＨＦ２１０分子、ならびにこれらの対立遺伝子改変体が挙げられる。いくつかの場合、全長ＨＥＲ１分子と短縮型ＨＥＲ２分子ＨＦ２１０を含むＥＣＤ多量体が好ましい。というのも、短縮型ＨＥＲ２分子のサブドメインＩＶ内のモジュール２〜５の存在は、実施例５に記載されるように、短縮型ＨＥＲ２分子の二量体化能に影響を及ぼすからである。
全長ＨＥＲ１ ＥＣＤを第一のポリペプチドとして含むＥＣＤ多量体は、その第二のポリペプチド成分として、ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４レセプターのＥＣＤの全体もしくは一部分を有し得る。このような特定のＥＣＤ多量体は、ＥＧＦ、アンフィレグリン、ＴＧＦ−α、ベタセルリン、ヘパリン結合ＥＧＦ、またはエピレグリン、および１以上のニューレグリンの中からの２以上のリガンドと結合する能力を有するものである。このようなポリペプチドはまた、任意の１以上のＨＥＲレセプターと二量体化しうる。例えば、ＨＥＲ４ ＥＣＤポリペプチドの全体もしくは一部分と組み合わされるＥＣＤ多量体は、ニューレグリン１〜４のいずれか（その任意のアイソフォームを含む）と結合する能力を有する。このようなＥＣＤ多量体の例は、多量体の第一のポリペプチドが全長ＨＥＲ１ ＥＣＤ（すなわち、配列番号１２に示されるＨＦ１００またはその対立遺伝子改変体）であり、第二のポリペプチドが、リガンドに結合する能力のある短縮型ＨＥＲポリペプチド（配列番号２８に示されるＨＦ４１０分子またはその対立遺伝子改変体が挙げられるがこれらに限定されない）であるものである。ＥＣＤ多量体のＨＥＲ４部分はまた、配列番号３２に示されるような成熟なＨＥＲ４レセプターの完全なＥＣＤ部分（すなわち、ＨＦ４００）を含む全長ＨＥＲ４分子であり得る。いくつかの例では、ＨＥＲ１ ＥＣＤと、ＨＥＲ４ ＥＣＤの全体もしくは一部分との多量体化は、多量体化ドメインを介して媒介される。例えば、配列番号４０に示される例示的なキメラポリペプチド（ＨＦ１００−Ｆｃ、または、配列番号４０６に示されるようなエピトープタグが付いたバージョン）および、配列番号４８に示される例示的なキメラポリペプチド（ＨＦ４００−Ｆｃ）は、共発現されて、多量体分子を生成し得る。
しかし、代表的には、全長のＨＥＲ１ ＥＣＤポリペプチドは、多量体においてＨＥＲ３ ＥＣＤポリペプチドの全体もしくは一部分と組み合わされ、その結果、結果として生じる多量体は、ニューレグリン１もしくは２（任意のそのアイソフォームを含む）のいずれかと結合し、そして／または、細胞表面上の任意の１以上のＨＥＲレセプターと二量体化する能力を有する。このようなＥＣＤ多量体の例は、第一のポリペプチドが全長ＨＥＲ１ ＥＣＤであり、多量体の第二のポリペプチドが、ＨＥＲ３ポリペプチドの全体もしくは一部分であるものである。ＨＥＲ１およびＨＥＲ３は、最も一般的に過剰発現されているレセプターのうちの２つである。したがって、ＨＥＲ１とＨＥＲ３とのＥＣＤ多量体は、最も一般的に過剰発現されているレセプターのうちの２つに結合するリガンドを捕捉する能力を有する一方で、癌において広い活性を有することが示されていないＨＥＲ４に結合するいくつかのリガンド（すなわち、ニューレグリン３およびニューレグリン４）を節約する（Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １１：２１６３−８；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１８５：２３６−４５）。
一例では、ＨＥＲ１ ＥＣＤおよびＨＥＲ３ ＥＣＤのＥＣＤ多量体は、第一のポリペプチドとしてＨＥＲ１ ＥＣＤの全長を、そして、第二のポリペプチドとして短縮型のＨＥＲ３ ＥＣＤポリペプチドを含み得、ここで、各ポリペプチドが多量体化ドメインに連結される。上述のように、全長ＨＥＲ１分子の例は、ＨＦ１００分子（配列番号１２）またはその対立遺伝子改変体である。そのポリペプチドが、ニューレグリン１もしくはニューレグリン２のアイソフォームの任意の１以上に結合し、そして／または二量体化する能力を保持する限り、任意の短縮型ＨＥＲ３ ＥＣＤポリペプチドが企図される。このような短縮型ＨＥＲ３ ＥＣＤポリペプチドの例としては、配列番号２０に示されるＨＦ３１０、配列番号２２に示されるｐ８５ＨＥＲ３、もしくは、配列番号２４に示されるＥｒｂＢ３−５１９、またはこれらの対立遺伝子改変体が挙げられる。例えば、配列番号４０に示される例示的なキメラポリペプチド（ＨＦ１００−Ｆｃ、または、配列番号４０６に示されるもののようなそのエピトープタグ化バージョン）および配列番号４４に示される例示的なキメラポリペプチド（ＨＦ３１０−Ｆｃ）が共発現されて、多量体分子を生成し得る。
別の例では、ＨＥＲ１ ＥＣＤおよびＨＥＲ３ ＥＣＤのＥＣＤ多量体は、第一のポリペプチドとして、ＨＦ１００分子（配列番号１２）のようなＨＥＲ１ ＥＣＤの全長を、そして、第二のポリペプチドとして、全長ＨＥＲ３ ＥＣＤ分子を含み得、ここで、各ポリペプチドが、多量体化ドメインに連結される。例示的な全長ＨＥＲ３ ＥＣＤ分子としては、配列番号２６（ＨＦ３００）に示されるような、成熟なＨＥＲ３全長レセプターのアミノ酸１〜６２１が挙げられる。ＨＥＲ１／ＨＥＲ３の全長ＥＣＤ多量体は、そのそれぞれの多量体化ドメインの相互作用によって連結され得る。第一の全長ＨＥＲ１ ＥＣＤポリペプチドおよび第二のＨＥＲ３ ＥＣＤポリペプチドの多量体化ドメインは、同じであっても異なっていてよいが、異なる場合には、これらの多量体化ドメインは、多量体の成分間で安定なタンパク質−タンパク質相互作用を可能にするために相補的である。一例では、第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドの各々は、ＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントのような（これに限定されない）Ｆｃフラグメントに連結される。Ｆｃフラグメントに連結される全長のＨＥＲ１およびＨＥＲ３のＥＣＤキメラポリペプチドの例は、それぞれ、配列番号４０または配列番号４６に示される。したがって、ＨＥＲ１／ＨＥＲ３ ＥＣＤ多量体は、配列番号４０（または配列番号４０６に示されるもののようなそのエピトープタグ化バージョン）および配列番号４６（または、配列番号４０７に示されるもののようなそのエピトープタグ化バージョン）に示されるアミノ酸配列、またはこれらの対立遺伝子改変体を持つポリペプチドをコードする核酸配列を共発現させると形成され得る。さらに、必要に応じて、配列番号４０または配列番号４６に示されるキメラポリペプチドの配列のいずれかまたは両方は、ｃ−ｍｙｃタグまたはＨｉｓタグのようなエピトープタグの追加を含み得、したがって、これらのタグは、結果として生じるＨＥＲ１／ＨＥＲ３ ＥＣＤ多量体中に組み込まれ得る。例えば、一方または両方のキメラポリペプチドが配列番号４０６および／または配列番号４０７に示されるアミノ酸配列を持つ多量体が作製され得る。
さらに、ＥＣＤ多量体を形成するために全長ＨＥＲ１ ＥＣＤと組み合され得る第二のポリペプチドは、この第二のポリペプチドが、リガンドへの結合および／または二量体化の能力を保持する限りは、任意の長さのＣＳＲ ＥＣＤポリペプチドであり得る。多量体において全長ＨＥＲ１ ＥＣＤポリペプチドと組み合され得る例示的なＥＣＤポリペプチドとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＶＥＧＦＲ１もしくは２、ＦＧＦＲ１〜４、ＩＧＦ１−Ｒ、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ−２、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲＡもしくはＢ、ＰＤＧＦＲＢ、Ｅｐｈａ１〜８、ＴＮＦＲ、ＲＡＧＥ、または、増殖、脈管形成もしくは炎症性の要素によって特徴付けられる疾患の過程に関与する任意の他のＣＳＲ、の全体もしくは一部分。例示的なＣＳＲの全長ＥＣＤポリペプチドの例示的な配列を表７に示す。リガンドへの結合に十分なその一部分は、いくつかの例示的なＲＴＫについて本明細書中に記載されるように、当該分野で公知である。公知ではない場合、リガンド結合のために必要とされるサブドメインは、関連するレセプターとのアラインメントに基づいて、そして／または、リガンド結合アッセイと同時に組換えＤＮＡ技術を用いることによって、経験的に決定され得る。多量体において全長ＨＥＲ１ ＥＣＤポリペプチドと共に使用することが企図される他のＣＳＲおよびそのＥＣＤ部分は、処置されるべき疾患、および／または、単一の細胞表面レセプターに対して標的化された薬物に対する耐性へのＣＳＲの寄与に基づいて、経験的に決定され得る。さらに、任意のＣＳＲの選択的スプライシングを受けたアイソフォームが、多量体において、全長ＨＥＲ１ ＥＣＤポリペプチドと共に使用され得る。これらの例は、実施例１１に記載され、かつ、配列番号２９８〜３００として示されるようなＩＧＦ−１Ｒのアイソフォームである。ＥＣＤ多量体において使用され得る他のＣＳＲアイソフォームは、配列番号３０１〜３８４のいずれかに示される。
ｂ．２以上の短縮型ＥＣＤ成分
また、任意のＣＳＲ ＥＣＤの２以上の短縮型ＥＣＤ部分の間で形成されるＥＣＤ多量体分子も本明細書において提供され、ここで、少なくともＣＳＲの一方は、短縮型のＨＥＲ分子である。代表的には、短縮型ＥＣＤ部分のうち少なくとも一つは、その短縮型ＥＣＤポリペプチドが、ＨＥＲ２に由来しない限りは、リガンドに結合するか、そして／またはＣＳＲと二量体化する（代表的には、両方）のに十分であり、短縮型ＥＣＤポリペプチドがＨＥＲ２に由来する場合には、このポリペプチド部分は、少なくとも、別の細胞表面レセプターと二量体化する能力を有さなければ成らない。このような分子は、１以上のＨＥＲレセプターおよび／または別のＣＳＲを調節（代表的には阻害）することによって、汎レセプター治療薬として機能し得る。調節は、リガンドを封鎖することによって、そして／または、ＣＳＲと二量体化することによってなされ得る。いくつかの例では、第一のポリペプチド成分および第二のポリペプチド成分の各々は、直接的に、または、多量体化ドメインを介して間接的に連結され得る。第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドの多量体化ドメインは、同じであっても異なっていてもよいが、異なる場合には、これらの多量体化ドメインは、多量体の成分間での安定なタンパク質−タンパク質相互作用を可能にするために相補的である。ＥＣＤ多量体は、そのリガンド結合能および／または二量体化能を保持する２つの短縮型ＨＥＲポリペプチド（代表的には、異なるＨＥＲレセプターの短縮型ＥＣＤポリペプチド）の間で形成され得る。当業者は、短縮型ＨＥＲポリペプチドのうち少なくとも一方（代表的には両方）が、リガンド結合能、そして／または、二量体化能を保持するような、ＥＣＤ多量体を作製する際に使用するためのＨＥＲ分子の部分を決定し得る。例えば、一般に、短縮型のＨＥＲ１分子、ＨＥＲ２分子またはＨＥＲ３分子は、リガンドへの結合に十分なサブドメインＩおよびＩＩＩの部分と、二量体化に十分なサブドメインＩＩの部分と、サブドメインＩＶの少なくともモジュールＩとを含む。短縮型ＨＥＲ２分子は一般に、二量体化のために、サブドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩの少なくとも十分な部分と、サブドメインＩＶの少なくともモジュール２〜５とを含む。
短縮型ＨＥＲ ＥＣＤの任意の組合せが、ハイブリッドＥＣＤ多量体における使用のために企図される。例えば、短縮型ＨＥＲ１ ＥＣＤポリペプチドは、短縮型ＨＥＲ２ポリペプチド、短縮型ＨＥＲ３ポリペプチドまたは短縮型ＨＥＲ４ポリペプチドと組み合され得る；短縮型ＨＥＲ２ ＥＣＤポリペプチドは、短縮型ＨＥＲ ＥＣＤポリペプチドまたは短縮型ＨＥＲ４ ＥＣＤポリペプチドと組み合され得る；そして、短縮型ＨＥＲ３ポリペプチドは、短縮型ＨＥＲ４ ＥＣＤポリペプチドと組み合され得る。短縮型ＨＥＲポリペプチドの例としては、例えば、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３４に示されるもの、例えば、配列番号２２、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７もしくは配列番号１５９のいずれかに示されるＨＥＲレセプターの選択的スプライシング改変体、または、これらの任意の対立遺伝子改変体もしくは種改変体のような、本明細書中に記載される任意のものが挙げられる。一例では、ハースタチン分子またはその改変体（例えば、配列番号１３５または３８５〜３９９のいずれかに示されるもの）は、任意の他の短縮型ＥＣＤ ＨＥＲポリペプチドと組み合され得る。一例では、ＥＣＤ多量体は、第一のポリペプチドとしてＨＥＲ１ ＥＣＤの一部分を、そして、第二のポリペプチドとして、ＨＥＲ３ ＥＣＤポリペプチドの一部分を含み得、ここで、各ポリペプチドは、多量体化ドメインに連結される。短縮型ＨＥＲ１分子の例は、ＨＦ１１０（配列番号１０）またはその対立遺伝子改変体である。短縮型ＨＥＲ３分子の例は、ＨＦ３１０（配列番号２０）、ｐ８５−ＨＥＲ３（配列番号２２）もしくはＥｒｂＢ３−５１９（配列番号２４）、または、これらの対立遺伝子改変体である。例えば、配列番号３８に示される例示的なキメラポリペプチド（ＨＥＲ１−５０１／Ｆｃ；ＨＦＤ１１０、ｃ−ｍｙｃタグ有またはなし）および配列番号４４に示されるキメラポリペプチド（ＨＥＲ３−５００／Ｆｃ；ＨＦＤ３１０）は、短縮型ＨＥＲ１／ＨＥＲ３ ＥＣＤヘテロ多量体である多量体分子を生成するために共発現され得る。
他の例では、本明細書において提供されるＥＣＤ多量体は、第一のポリペプチドとして短縮型ＨＥＲ ＥＣＤポリペプチドを、そして、第二のポリペプチドとして、レセプターのＨＥＲファミリーのものではない別の短縮型ＣＳＲ ＥＣＤポリペプチドを含み得る。上述のように、多量体のポリペプチド成分の少なくとも一方（代表的には、両方）が、リガンドと結合し、そして／または、膜貫通型レセプターと二量体化する限りは、短縮型のＨＥＲ ＥＣＤポリペプチドは、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４のＥＣＤの一部分であり得る。例示的な短縮型ＨＥＲファミリーレセプターとしては、配列番号 １０、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３４、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９もしくは配列番号３８５〜３９９のいずれかに示される任意のもの、または、これらの任意の対立遺伝子改変体もしくは種改変体が挙げられる。キメラＥＣＤポリペプチドは、多量体化ドメインに連結された別の細胞表面レセプターのＥＣＤポリペプチドの全体もしくは一部分を含み得る。短縮型ＨＥＲ ＥＣＤポリペプチドとのＥＣＤ多量体を形成するために、任意の短縮型ＥＣＤ ＣＳＲの組合せが企図され、そして、このような組合せは、処置されるべき疾患、それぞれのＣＳＲのその疾患に対する寄与、ＣＳＲに対する公知のリガンド、単一の細胞表面レセプターに対して標的化された薬物に対する耐性に対するＣＳＲの寄与、および他の要因に基づいて、経験的に決定され得る。ＣＳＲの例は、本明細書において上記され、そして、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＩＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦＲ（すなわち、ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ２）、ＦＧＦＲ（すなわち、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ４）、ＴＮＦＲ、ＰＤＧＦＲＡもしくはＰＤＧＦＲＢ、ＭＥＴ、Ｔｉｅ（Ｔｉｅ−１またはＴｉｅ−２）、Ｅｐｈレセプター、またはＲＡＧＥ。例示的なＣＳＲの全長ＥＣＤポリペプチドの例示的な配列を表７に示す。リガンドへの結合に十分なその部分は、いくつかの例示的なＲＴＫについて本明細書中に記載されるように、当該分野で公知である。公知でない場合、リガンド結合に必要とされるサブドメインは、関連するレセプターとのアラインメントに基づいて、そして／または、リガンド結合アッセイと同時に組換えＤＮＡ技術を用いることによって、経験的に決定され得る。さらに、任意のＣＳＲの選択的スプライシングを受けたアイソフォームが、多量体において使用され得る。これらの例は、実施例１１に記載され、かつ、配列番号２９８〜３００として示されるようなＩＧＦ−１Ｒのアイソフォームである。ＥＣＤ多量体において使用され得る他のＣＳＲアイソフォームは、配列番号３０１〜３８４のいずれかに示される。
ｃ．ハイブリッドＥＣＤ多量体
多量体のキメラＥＣＤポリペプチドの少なくとも一方または両方が、多量体化ドメインに連結された任意の２以上のＣＳＲのＥＣＤ部分の一部分に由来するリガンド結合ドメインおよび／または二量体化ドメインを含むハイブリッドＥＣＤ部分である、ＥＣＤ多量体が本明細書において提供される。このようなハイブリッドＥＣＤ分子は、本明細書において上記される。例えば、１つのこのようなハイブリッドＥＣＤポリペプチドは、ＨＥＲ２に由来するサブドメインＩＩと、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４に由来する、サブドメインＩおよびＩＩＩ（これらは、同じレセプターに由来しても異なるレセプターに由来してもよい）を含む。ハイブリッドＥＣＤの他の組合せは、関連するＣＳＲの公知のサブドメイン活性に基づいて、経験的に決定され得る。代表的には、ＥＣＤハイブリッドのうちの一つのサブドメインの少なくとも一つは、結果として生じるＥＣＤ多量体に、二量体化能を与える。２以上の同じかまたは異なるハイブリッドＥＣＤ分子は、直接的もしくは間接的に一緒に連結され得る。一例では、ハイブリッドＥＣＤ分子は、第一のハイブリッドＥＣＤポリペプチドの多量体化ドメインとの融合、および、第二のハイブリッドＥＣＤポリペプチドの同じかもしくは相補的な多量体化ドメインとの融合によって連結され得る。ハイブリッドＥＣＤ多量体の形成は、第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドについてのそれぞれのコード核酸を共発現させた後に達成される。
さらに、多量体のポリペプチドのうちの一方のみがハイブリッドＥＣＤであり、第二のポリペプチドが、任意の他のＣＳＲ分子（例えば、上述のような任意の全長ＥＣＤポリペプチド、または、上述のような任意の短縮型ＥＣＤポリペプチド）の全体もしくは一部分であるＥＣＤ多量体が形成され得る。代表的には、他のＣＳＲ ＥＣＤポリペプチドは、ＨＥＲファミリーレセプター、ＨＥＲファミリーレセプターの選択的スプライシングを受けたアイソフォーム、または、これらの対立遺伝子改変体の全体もしくは一部分である。ＨＥＲファミリーレセプター以外の他のＣＳＲが、ハイブリッドＥＣＤと組合され得、そして、処置されるべき疾患、および／または、単一の細胞表面レセプターに対して標的化された薬物に対する耐性に対するＣＳＲの関連性に依存して、適切なように選択され得る。
ｄ．同じであるかまたは同じＣＳＲに由来するＥＣＤ成分
また、リガンドを封鎖することによってか、そして／または、同系ＣＳＲもしくは他の相互作用性のＣＳＲとの直接的な相互作用によって、少なくとも１つ（ときどき、２以上）のＣＳＲを調節するホモ多量体またはヘテロ多量体もまた、本明細書において提供される。このようなＥＣＤ多量体は、多量体化ドメインに連結された第一のＥＣＤポリペプチドと、多量体化ドメインに連結された第二のＥＣＤポリペプチドとのホモ多量体（代表的には、ホモ二量体）であり得、ここで、第一のポリペプチドと第二のポリペプチドとは同じである。あるいは、このようなＥＣＤ多量体は、ヘテロ多量体（第一のＥＣＤポリペプチドおよび第二のＥＣＤポリペプチドの各々が、同じ同系ＣＳＲに由来するが、異なるものである）であり得る。代表的には、常にではないが、ＥＣＤ成分が同じであるか、または同じレセプターに由来する場合、単一のレセプターのみの活性が標的とされる。例えば、いくつかの場合には、第一のポリペプチドとして全長ＩＧＦ１−Ｒ ＥＣＤ（すなわち、配列２６０のアミノ酸３１〜９３５に対応）を、そして、第二のポリペプチドとして、第一のポリペプチドと同じポリペプチドまたはその短縮型もしくはアイソフォームを有するＥＣＤ多量体が、少なくとも全長ＩＧＦ１−Ｒの活性を調節するための候補治療薬である。別の例では、ハースタチン、および／または、別のＨＥＲ２ ＥＣＤの成分を含むホモ多量体もしくはヘテロ多量体が、少なくとも１つ（であるが、代表的には、２つ以上）のＣＳＲを、細胞表面上の全長ＨＥＲ１、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４レセプターと直接的に相互作用するなどによって、調節するための候補である。
Ｆ．キメラＥＣＤポリペプチド融合物をコードする核酸を生成する方法と結果として生じるＥＣＤ多量体の生成
ＥＣＤ、その一部分、特に、リガンド結合および／もしくはレセプターの二量体化に十分な部分、そしてまた、選択的スプライシングを受けた部分と、多量体化ドメインとの間でキメラポリペプチドを作製するために、任意の適切な方法が使用され得る。同様に、キメラポリペプチドからの多量体の形成は、当業者に公知の任意の方法によって達成され得る。上述のように、多量体は、代表的には、少なくとも１つのＨＥＲファミリーメンバー（代表的には、ＨＥＲ１またはＨＥＲ３またはＨＥＲ４）に由来するＥＣＤ、および第二のＨＥＲファミリーメンバーに由来するＥＣＤ、および／または、ＣＳＲ（例えば、ＩＧＦ１−Ｒ、ＶＥＧＦＲおよびＦＧＦＲ、または、腫瘍形成もしくは炎症もしくは他の疾患の過程に関与する他のレセプター）に由来するＥＣＤを含む。
本明細書に記載される多量体化ドメインに対して直接的もしくは間接的に連結されたＥＣＤポリペプチドを含む、ＥＣＤキメラポリペプチドをコードする核酸分子を作製するための例示的な方法が提供される。このような方法としては、ＰＣＲ、合成遺伝子構築、ならびに、単離および／または合成した核酸フラグメントのインビトロライゲーションのような、核酸分子についてのインビトロ合成法が挙げられる。ＨＥＲファミリーレセプターもしくは他のＲＴＫを含むＣＳＲについての核酸分子は、細胞から単離したＲＮＡおよびＤＮＡのＰＣＲ、ならびに、ハイブリダイゼーションおよび／もしくは発現のスクリーニング法による核酸分子ライブラリーのスクリーニングを含む、クローニング法によって単離され得る。
ＥＣＤポリペプチドまたはその一部分は、インビトロおよびインビボの合成法を用いて、ＥＣＤポリペプチドをコードする核酸分子から作製され得る。１以上のキメラＥＣＤポリペプチド（例えば、ＥＣＤ−Ｆｃタンパク質融合物またはＥＣＤの任意の他の多量体化ドメインとの結合など）を含むＥＣＤ多量体は、投与および処置に必要とされるＥＣＤポリペプチド多量体の必要とされる量および形態を生じるのに適切な任意の生物において発現させた後に生成され得る。発現の宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、植物、昆虫細胞、哺乳動物細胞（ヒト細胞株およびトランスジェニック動物を含む）のような原核生物および真核生物が挙げられる。ＥＣＤポリペプチドまたはＥＣＤポリペプチド多量体はまた、これらが発現される細胞および生物（ＥＣＤポリペプチドを組換え的に産生する細胞および生物、ならびに、選択的スプライシング事象によって産生される遺伝的にコードされるアイソフォームのように、アイソフォームを組換え手段なしで合成するような細胞および生物を含む）から単離され得る。
１．合成の遺伝子およびポリペプチド
ＥＣＤポリペプチドをコードする核酸分子は、合成による遺伝子合成を用いて、当業者に公知の方法により合成され得る。このような方法において、ＥＣＤのポリペプチド配列は、ＥＣＤもしくはその一部分をコードする１以上の核酸分子を作製するように「逆翻訳（ｂａｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）」される。逆翻訳された核酸分子は、次いで、自動ＤＮＡ合成技術を用いるなどによって、１以上のＤＮＡフラグメントとして合成される。このフラグメントが、次いで、ＥＣＤポリペプチドをコードする核酸分子を形成するように作動可能に連結される。キメラＥＣＤポリペプチドは、ＥＣＤポリペプチドをコードする核酸分子を、多量体化ドメインをコードする任意のもののような追加の核酸分子、または、エピトープタグ、もしくは融合タグ、転写および翻訳を調節するための調節性配列、ベクターをコードする他の核酸、ならびに、他のポリペプチドをコードする核酸分子と接合することによって作製され得る。ＥＣＤをコードする核酸分子はまた、追跡などのために他の融合タグもしくは標識（放射標識および蛍光部分を含む）と作動可能に連結され得る。
逆翻訳のプロセスは、ＥＣＤポリペプチドのような任意の関心のあるポリペプチドについての核酸遺伝子を得るために遺伝子コードを使用する。遺伝子コードは、縮重しており、６４のコドンが、２０のアミノ酸と３の停止コドンとを特定する。このような縮重は、核酸の設計および作製における柔軟性を許容し、そして、例えば、核酸フラグメントの連結および／または、各合成フラグメント内への固有の識別配列の配置を容易にするために、制限酵素部位を組み込むことを可能にする。遺伝子コードの縮重はまた、望ましくないヌクレオチド配列（望ましくない制限酵素部位、スプライシングのドナー部位もしくはアクセプター部位、または、効率的な翻訳にとって潜在的に有害な他のヌクレオチド配列を含む）を回避するための核酸分子の設計を可能にする。さらに、生物は、ときおり、特定のコドンの使用法（ｕｓａｇｅ）、および／または、ＧＣヌクレオチドのＡＴヌクレオチドに対する規定された比を好む。したがって、遺伝コードの縮重は、特定の生物または生物の群における発現について適応させた核酸分子の設計を可能にする。さらに、核酸分子は、配列の最適化（または、非最適化）に基づいて、異なるレベルの発現のために設計され得る。逆翻訳は、ポリペプチドをコードするコドンを選択することによってなされる。このようなプロセスは、遺伝子コードの表とポリペプチド配列とを用いて手動で行われ得る。あるいは、公的に利用可能なソフトウェアを含むコンピュータプログラムが、逆翻訳された核酸配列を作製するために使用され得る。
逆翻訳された核酸分子を合成するために、核酸合成について当該分野において利用可能なあらゆる方法が使用され得る。例えば、ヌクレオチドのＥＣＤコード配列のフラグメントに対応する個々のオリゴヌクレオチドは、標準的な自動化された方法によって合成され、そして、アニーリングまたはハイブリダイゼーション反応において一緒に混合される。このようなオリゴヌクレオチドは、相補的な配列の二重鎖化の際に形成される、一般に長さ約１００ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングの重なりを用いて、アニーリングにより、オリゴヌクレオチドから遺伝子の自己集合を生じるように合成される。二重鎖ＤＮＡにおける単一ヌクレオチドの「ニック」は、例えば、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーションを用いてシールされる。次いで、制限エンドヌクレアーゼリンカー配列が、例えば、タンパク質の発現に適した種々の組換えＤＮＡベクターのうちいずれか１つに、合成遺伝子を挿入するために使用され得る。別の類似の方法において、一連のオリゴヌクレオチドの重なりが、化学的なオリゴヌクレオチド合成法によって調製される。これらのオリゴヌクレオチドのアニーリングは、ギャップを持つＤＮＡ構造をもたらす。ＤＮＡポリメラーゼＩのような酵素により触媒されるＤＮＡ合成は、これらのギャップを満たすために使用され得、そして、ライゲーションは、二重鎖構造におけるあらゆるニックをシールするために使用される。ＰＣＲおよび／または他のＤＮＡ増幅技術が、形成された線形のＤＮＡ二重鎖を増幅するために応用され得る。
ベクター（例えば、タンパク質発現ベクター、または、コアタンパク質をコードするＤＮＡ配列の増幅のために設計されたベクター）中に合成遺伝子をクローニングする目的で、制限エンドヌクレアーゼ部位を含むリンカー配列を含む、追加のヌクレオチド配列が、ＥＣＤをコードする核酸分子に接合され、それによって、ＥＣＤ融合物を作製し得る。さらに、機能的なＤＮＡエレメントの特性を持たせる追加のヌクレオチド配列は、ＥＣＤをコードする核酸分子に対して作動可能に連結され得る。このような配列の例としては、細胞内タンパク質発現を促進するように設計されたプロモーター配列、または、タンパク質分泌を促進するように設計された前駆体配列が挙げられるがこれらに限定されない。ＥＣＤをコードする核酸分子に対し作動可能に連結され得るヌクレオチド配列の他の例としては、ポリペプチドの精製および／または検出を容易にする配列が挙げられる。例えば、エピトープタグまたは蛍光部分のような融合タグが、アイソフォームに対して融合もしくは連結され得る。タンパク質の結合領域を特性する配列のような追加のヌクレオチド配列もまた、ＥＣＤをコードする核酸分子に対して連結され得る。このような領域としては、ＥＣＤポリペプチドの特定の標的細胞内への取り込みを促進するための配列、または、合成遺伝子の薬物動態を他の方法で増強するための配列が挙げられるがこれらに限定されない。
ＥＣＤポリペプチドはまた、自動化された合成のポリペプチド合成を用いて合成され得る。クローニングされたか、そして／または、インシリコで作製されたポリペプチド配列が、フラグメントで合成され得、次いで、化学的に連結され得る。あるいは、化学分子が、単一のポリペプチドとして合成され得る。このようなポリペプチドは、次いで、本明細書中に記載されるアッセイおよび処置の投与において使用され得る。
２．ＥＣＤポリペプチドをクローニングおよび単離する方法
ＥＣＤ融合物をコードする核酸分子を含めて、ＥＣＤをコードする核酸分子は、核酸分子のクローニングおよび単離について、当該分野で公知の任意の利用可能な方法を用いてクローニングまたは単離され得る。このような方法としては、核酸のＰＣＲ増幅、ならびに、核酸のハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体ベースのスクリーニングおよび活性ベースのスクリーニングを含むライブラリーのスクリーニングが挙げられる。
ＥＣＤポリペプチドをコードする核酸分子はまた、ライブラリーのスクリーニングを用いて単離され得る。例えば、ｃＤＮＡとして発現されたＲＮＡ転写物を示す核酸ライブラリーは、ＥＣＤポリペプチドまたはその一部分をコードする核酸分子とのハイブリダイゼーションによってスクリーニングされ得る。例えば、ＥＣＤポリペプチドの一部分（例えば、ＨＥＲファミリーＥＣＤのドメインＩＶのモジュール１の一部分）をコードする核酸配列は、相同な配列に対するハイブリダイゼーションに基づいて、ドメインＩＶを含む分子についてのスクリーニングに使用され得る。
発現ライブラリーのスクリーニングは、ＥＣＤポリペプチドをコードする核酸分子を単離するために使用され得る。例えば、発現ライブラリーは、特定のＥＣＤもしくはＥＣＤの一部分を認識する抗体を用いてスクリーニングされ得る。ＥＣＤポリペプチドまたは、ＥＣＤ内に含まれる領域もしくはペプチドに特異的に結合する抗体が、得られ得るか、そして／または、調製され得る。ＥＣＤに特異的に結合する抗体は、ＥＣＤ（例えば、ＨＥＲファミリーレセプターのＥＣＤ）をコードする核酸分子を含む発現ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。ポリクローナルおよびモノクローナルの抗体およびフラグメントを含む、抗体を調製および単離する方法は、当該分野で周知である。組換えおよび合成の抗体を調製および単離する方法もまた、当該分野で周知である。例えば、このような抗体は、固相ペプチド合成を用いて行われ得るか、または、候補ポリペプチドに特異的に結合する抗体の抗原結合部位のヌクレオチド配列情報およびアミノ酸配列情報を用いて、組換えにより産生され得る。抗体はまた、可変重鎖および可変軽鎖、または、これらの抗原結合部分を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および非天然抗体を調製、単離および使用する方法は、例えば、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ，ｅｄｓ．（２００１）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ；Ｈｏｗａｒｄ ａｎｄ Ｂｅｔｈｅｌｌ，ｅｄｓ．（２００１）「Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ」ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；ａｎｄ Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ａｎｄ Ａｉｔｋｉｎ，ｅｄｓ．（２００１）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ」Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓにおいて概説される。このような抗体はまた、例えば、細胞、組織もしくは抽出物におけるＥＣＤポリペプチドの発現を検出するために、ＥＣＤポリペプチドの存在についてスクリーニングするために使用され得る。
核酸の増幅のための方法は、ＥＣＤポリペプチドをコードする核酸分子を単離するために使用され得、このような方法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖（ＰＣＲ）反応が挙げられる。核酸を含む物質は、出発物質として使用され得、このような物質から、ＥＣＤをコードする核酸分子が単離され得る。例えば、ＤＮＡおよびｍＲＮＡの調製物、細胞抽出物、組織抽出物、体液サンプル（例えば、血液、血清、唾液）、健常な被験体および／または罹患した被験体からのサンプルが、増幅法において使用され得る。核酸ライブラリーもまた、出発物質の供給源として使用され得る。プライマーは、ＥＣＤ分子を増幅するように設計され得る。例えば、プライマーは、発現される配列に基づいて設計され得、その発現される配列からＥＣＤ分子が生成される。プライマーは、ＥＣＤアミノ酸配列の逆翻訳に基づいて設計され得る。増幅により生成された核酸分子は配列決定され、そして、ＥＣＤをコードすることが確認され得る。
３．ＥＣＤポリペプチドキメラを生成およびクローニングする方法
キメラタンパク質は、異なる、または、異種のタンパク質もしくはペプチドに由来する２以上の領域を含むポリペプチドである。キメラタンパク質は、シグナルペプチド配列と、ＣＳＲ（例えば、ＨＥＲファミリーレセプター）のＥＣＤまたはその一部分についての１以上の配列と、リンカー配列、多量体化ドメイン配列（すなわち、Ｆｃドメイン、ロイシンジッパー、他の多量体形成配列）、および／または、タンパク質の精製を促進するエピトープタグもしくは他の部分についての配列のような、任意の他の異種の配列とを含むいくつかの配列を含み得る。例えば、ＥＣＤポリペプチドは、融合タンパク質を形成するために、別のポリペプチド（すなわち、別のＥＣＤポリペプチドもしくはその一部分、および／または、多量体化ドメイン）に対して直接的に連結され得る。あるいは、タンパク質は、そのタンパク質が、適切な二次構造および三次構造を形成することを確実にするのに十分な距離だけ間隔を空けられ得る。適切なリンカー配列は、（１）柔軟性のある長い立体配座を採り、（２）融合ポリペプチドの機能的ドメインと相互作用し得る規則正しい二次構造を発生させる傾向を示さず、そして（３）機能的なタンパク質ドメインとの相互作用を促進し得る、最小限の疎水性もしくは電荷の特性を有する。例示的なリンカー配列は、上述され、一般には、Ｇｌｙ、ＡｓｎもしくはＳｅｒを含むもの、または、ＴｈｒもしくはＡｌａを含む他の天然アミノ酸が挙げられる。一般に、ＥＣＤ部分の異種配列との結合は、上記のような組換えＤＮＡ技術によってなされる。あるいは、異種配列は、本明細書中に記載される任意のもののような、ヘテロ二官能性架橋剤によってＥＣＤ部分へと共有結合性に連結され得る。
一般に、ＥＣＤ融合分子は、多量体の形成を促進する異種ポリペプチド（例えば、多量体化ドメイン）に連結されたリガンドへの結合に十分な、ＣＳＲのＥＣＤの全体もしくは一部分を有するキメラポリペプチドをコードする。
さらに、ＥＣＤポリペプチドはまた、１以上の他の異種配列に対して、直接的もしくは間接的に連結され得る。例えば、ＥＣＤキメラポリペプチドはまた、タグポリペプチドとの融合物を含み得、このタグポリペプチドは、抗タグ抗体が選択的に結合し得るエピトープを提供する。このようなＥＣＤポリペプチド融合物のエピトープがタグ化した形態は有用である。というのも、その存在が、タグポリペプチドに対する標識化抗体を用いて検出され得るからである。また、エピトープタグを提供することは、ＥＣＤ融合ポリペプチドが、抗タグ抗体を用いたアフィニティ精製によって容易に精製されることを可能にする。
キメラタンパク質は、所望の配列からのフラグメントの酵素により切断およびライゲーションの従来の技術を用いて調製され得る。例えば、所望の配列は、オリゴヌクレオチド合成装置を用いて合成され得るか、適切な制限酵素消化によってタンパク質を産生する親細胞のＤＮＡから単離され得るか、または、適切なプライマーを用いたゲノムＤＮＡのＰＣＲによって、細胞、組織、ベクターもしくは他の標的供給源のような標的供給源から得られ得る。一例では、ＥＣＤキメラ配列は、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ標的配列を、ベクター中の加工した組換え部位内にライゲーションする連続ラウンドによって作製され得る。例えば、１以上のＥＣＤポリペプチド、融合タグおよび／または多量体化ドメイン配列についての核酸配列が、対向鎖にハイブリダイズし、そして、標的ＤＮＡ内の関心領域を挟むプライマーを用いてＰＣＲ増幅され得る。標的ＤＮＡ分子を発現することが知られる細胞もしくは組織もしくは他の供給源、または標的ＤＮＡ分子についての配列を含むベクターが、ＰＣＲ増幅事象のための出発産物として使用され得る。ＰＣＲの増幅産物は、ベクター内に既に含まれる別の核酸配列との融合物を作製するため、または、標的分子の発現のためなどの、配列のさらなる組換え操作のために、ベクター中にサブクローニングされ得る。
ＰＣＲ増幅において使用されるＰＣＲプライマーはまた、核酸配列の作動可能な連結を容易にするように加工され得る。例えば、鋳型に相補的でない５’伸長が、増幅事態に有意な影響を与えることなく、ＰＣＲ産物の種々の増幅後操作を可能にするためにプライマーに追加され得る。例えば、これらの５’伸長は、制限酵素部位、プロモーター配列、制限酵素リンカー配列、プライマー切断部位配列、またはエピトープタグについての配列を含み得る。一例では、融合物の配列を作製する目的で、プライマー中に組み込まれ得る配列としては、例えば、ｍｙｃエピトープタグ、または、他の小さなエピトープタグをコードする配列が挙げられ、その結果、増幅されたＰＣＲ産物は、関心のある核酸配列のエピトープタグとの融合物を効率的に含む。
別の例では、制限酵素部位のプライマー中への組み込みは、核酸配列のライゲーションのための突出末端を提供するなどによって、適合性の制限酵素部位を含むベクター中への増幅産物のサブクローニングを容易にし得る。単一のベクター中への複数のＰＣＲ増幅産物のサブクローニングは、異なる核酸配列を作動可能に連結または融合するための戦略として使用され得る。プライマー配列中に組み込まれ得る制限酵素部位の例としては、以下が挙げられ得るがこれらに限定されない：Ｘｈｏ Ｉ制限酵素部位（ＣＴＣＧＡＧ、配列番号２６７）、ＮｈｅＩ制限酵素部位（ＧＣＴＡＧＣ、配列番号２６８）、Ｎｏｔ Ｉ制限酵素部位（ＧＣＧＧＣＣＧＣ、配列番号２６９）、ＥｃｏＲＩ制限酵素部位（ＧＡＡＴＴＣ、配列番号２７０）、ＡｇｅＩ部位（ＡＣＣＧＧＴ、配列番号２７１）またはＸｂａ Ｉ制限酵素部位（ＴＣＴＡＧＡ、配列番号２７２）。ベクター中へのＰＣＲ産物のサブクローニングのための他の方法としては、平滑末端クローニング、ＴＡクローニング、ライゲーション非依存性のクローニング、およびインビボクローニングが挙げられる。
プライマー中への有効な制限酵素部位の作製は、その後のサブクローニングのために、突出末端、または、いくつかの制限酵素部位については平滑末端を露出するために、適合性の制限酵素を用いたＰＣＲフラグメントの消化を必要とする。プライマーが、制限酵素に対する適合性を保持するような、プライマー中への制限酵素部位の加工には、いくつかの考慮しなければならない要因が存在する。第一に、ＰＣＲプライマーにおける加工された制限酵素部位の上流２〜６個の余分な塩基の追加は、一般に、増幅産物の消化効率を高め得る。制限酵素による制限酵素部位の消化の改善のために使用され得る他の方法としては、ＤＮＡをブロックし得るあらゆる耐熱性ポリメラーゼを除くためのプロテイナーゼＫ処理、ＫｌｅｎｏｗもしくはＴ４ ＤＮＡポリメラーゼによる末端研磨（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）、および／または、スペルミジンの追加が挙げられる。ＰＣＲ産物の消化効率を改善するための代替法としてはまた、増幅後のフラグメントのコンカテマー化が挙げられ得る。これは、まず、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いたＰＣＲ産物の清浄（プライマーが既にリン酸化されていない場合）の処理を行うことによって達成される。Ｐｆｕのようなプルーフリーディングの耐熱性ポリメラーゼが使用される場合には、末端は既に平坦であり得るか、または、Ｔａｑのような非プルーフリーディングの酵素が使用される場合には、末端を研磨するために増幅したＰＣＲ産物がＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理され得る。ＰＣＲ産物は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションされ得る。これにより、制限酵素部位を、フラグメントの末端から離れるように効率的に移動され、効率的な消化が可能となる。
関心のある配列との融合物の作製などのために、露出された制限酵素部位を含むＰＣＲ産物のベクター中へのサブクローニングの前に、ときどき、消化されたＰＣＲ産物を、切断されないままのものから区別することが必要となる。このような例において、プライマーの５’末端への蛍光タグの追加は、ＰＣＲの前に追加され得る。これにより、首尾よく消化された産物は、消化の際に蛍光標識を失っているので、消化された生成物の同定が可能となる。
いくつかの場合、融合配列の作製のための、その後のベクター中へのサブクローニングのために制限酵素部位を含むＰＣＲ増幅産物の使用は、融合タンパク質生成物における制限酵素リンカー配列の組み込みをもたらし得る。一般に、このようなリンカー配列は、短く、これらの配列が作動可能に連結される限りは、ポリペプチドの機能を損ねない。
ＥＣＤキメラポリペプチドをコードする核酸分子は、核酸分子を含むベクターの形態で提供され得る。このようなベクターの一例は、プラスミドである。多くの発現ベクターが利用可能であり、かつ、当業者に公知であり、そして、キメラＥＣＤポリペプチドを含むＥＣＤポリペプチドの発現のために使用され得る。発現ベクターの選択は、宿主の発現系の選択によって影響を受け得る。一般に、発現ベクターは、転写プロモーター、必要に応じてエンハンサー、翻訳シグナル、ならびに、転写終結シグナルおよび翻訳終結シグナルを含み得る。安定な形質転換に使用される発現ベクターは、代表的に、形質転換された細胞の選択および維持を可能にする選択可能なマーカーを有する。いくつかの場合、多コピーのベクターを増幅するために、複製起点が使用され得る。さらに、ベクターから発現される任意の結果として生じたタンパク質が、ポリペプチドの配列とインフレームで挿入されたエピトープタグを有するように、多くの発現ベクターは、マルチプルクローニング部位に隣接して、Ｎ末端もしくはＣ末端のいずれかのエピトープタグを与える。エピトープタグが挿入された例示的な発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ／ｍｙｃ−Ｈｉｓ哺乳動物発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、配列番号１６１）である。したがって、例えば、このベクターからのＥＣＤポリペプチドの発現は、Ｃ末端にｍｙｃ−Ｈｉｓタグを含むポリペプチドの発現をもたらし、ここで、ｍｙｃ−Ｈｉｓタグは、配列番号１６２に示されるアミノ酸配列を有する。従って、任意のＥＣＤポリペプチドまたはその一部分は、ｍｙｃ−Ｈｉｓタグと共に発現され得る。タグを含むこのような例示的なポリペプチドは、実施例に記載されており、そして、「Ｔ」で指定される。例えば、ＨＥＲ１−６２１（Ｔ）分子は、ＨＥＲ１ ＥＣＤの全長と、その後にＣ末端のｍｙｃ−Ｈｉｓタグとを含むポリペプチドである。エピトープタグ配列を含む、本明細書に提供されるＥＣＤポリペプチドの例示的な配列は、配列番号２７４および２７５に示される。エピトープタグ（例えば、ｃ−ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグまたは配列番号１６２に示されるようなｃ−ｍｙｃ／Ｈｉｓタグの組合せであるが、これらに限定されない）を含む任意のＥＣＤポリペプチドまたはその短縮型部分は、当業者に公知の任意の方法によって作製され得る。
４．発現系
本明細書において提供される任意のもののようなキメラポリペプチドをコードするＤＮＡは、発現のために宿主細胞中へとトランスフェクトされる。ＥＣＤ多量体ポリペプチドが所望され、それゆえに、多量体化が、多量体化ドメインによって媒介されるいくつかの場合、宿主細胞は、多量体を形成する別個のキメラＥＣＤ分子をコードするＤＮＡを用いて形質転換され、そして、宿主細胞は、この多量体の別個の鎖を所望の様式で組み立て得るように最適に選択される。別個の単量体ポリペプチドの組み立ては、それぞれの多量体化ドメインの各々の相互作用によって促進され、これらの多量体化ドメインの各々は、キメラＥＣＤポリペプチド間で同じであるか、または相補的である。ＨＥＲファミリーレセプターＥＣＤまたはその一部分が、多量体ポリペプチドの一方または両方のＥＣＤ部分である場合、多量体化ドメインは、単量体の組み立てが、ＨＥＲ分子の二量体化アームを、パートナーの多量体分子から離して方向付けるように選択される。この方向付けは、「背中合わせ」と呼ばれ、二量体化アームが、細胞表面上の同系ＨＥＲとの二量体化に利用可能となることを確実にする。
キメラＥＣＤポリペプチドを含むＥＣＤポリペプチドは、投与および処置に必要とされるポリペプチドの必要とされる量および形態を生成するのに適切な任意の生物において発現され得る。一般に、異種ＤＮＡを発現するように加工され得、そして、分泌経路を有するあらゆる細胞のタイプが適切である。発現宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、植物、昆虫細胞、哺乳動物細胞（ヒト細胞株およびトランスジェニック動物を含む）のような原核生物および真核生物を含む。発現宿主は、そのタンパク質産生レベル、ならびに、発現されたタンパク質上に存在する翻訳後修飾のタイプにおいて異なり得る。発現宿主の選択は、これらおよび他の因子（例えば、調節および安全性の考慮、生産コスト、ならびに、精製の必要性およびその方法）に基づいてなされ得る。
ａ．原核生物による発現
原核生物、特に、Ｅ．ｃｏｌｉは、本明細書中に提供されるＥＣＤポリペプチドおよびＥＣＤポリペプチド融合物のような多量のタンパク質を産生するための系を提供する。桿菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、種々の種のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）または他の細菌株のような他の微生物株もまた使用され得る。Ｅ．ｃｏｌｉを含む細菌の形質転換は、当業者に周知の、単純でかつ迅速な技術である。このような原核生物の系において、しばしば、宿主と適合性の種に由来する複製部位および制御配列を含むプラスミドベクターが使用される。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉについて一般的なベクターとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢＡＤおよびこれらの派生物が挙げられる。転写開始のためのプロモーター、必要に応じてオペレーターを、リボソーム結合部位配列と共に含む、一般に使用される原核生物制御配列としては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（ｌａｃ）プロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、アラビノースプロモーター、ならびに、λ由来ＰｌプロモーターおよびＮ遺伝子リボソーム結合部位のような一般に使用されるプロモーターが挙げられる。しかし、原核生物と適合性である任意の利用可能なプロモーター系が使用され得る。Ｅ．ｃｏｌｉのための発現ベクターは、誘導性のプロモーターを含み得、このようなプロモーターは、高いレベルのタンパク質発現を誘導するため、そして、宿主細胞におい対していくらか毒性を示すタンパク質を発現させるために有用である。誘導性プロモーターの例としては、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７およびＳＰ ＲＮＡプロモーター、ならびに、温度調節性のλＰＬプロモーターが挙げられる。
ＥＣＤポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質環境において発現され得る。細胞質は、還元性の環境であり、そして、いくつかの分子にとっては、このことは、不溶性の封入体の形成をもたらし得る。ジチオスレイトールおよびβ−メルカプトエタノールのような還元剤と、グアニジン−ＨＣｌおよび尿素のような変性剤とが、タンパク質を溶解するために使用され得る。代替的アプローチは、酸化性の環境と、シャペロン様かつジスルフィドのイソメラーゼを提供し、そして、可溶性タンパク質の産生をもたらし得る、細菌のペリプラズム空間におけるＥＣＤポリペプチド融合物を含むＥＣＤポリペプチドの発現である。いくつかの例において、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＦ、ＰｅｌＢまたは他の前駆体配列を含む、細菌において使用するための前駆体配列またはシグナル配列が、タンパク質をペリプラズムへと指向させる内因性の前駆体配列を置き換えることなどによって、発現されるべきタンパク質へと融合される。次いで、リーダーペプチドが、ペリプラズム内部のシグナルペプチダーゼによって除去される。ペリプラズムを標的とする前駆体配列またはリーダー配列の例としては、ペクチン酸リアーゼ遺伝子に由来するｐｅｌＢリーダー配列、および、アルカリホスファターゼ遺伝子に由来するリーダー配列が挙げられる。いくつかの場合、ペリプラズムでの発現は、発現された細胞の培養培地中への漏出を可能にする。タンパク質の分泌は、培養上清からの迅速かつ単純な精製を可能にする。分泌されないタンパク質は、浸透性溶解によってペリプラズムから得られ得る。細胞質での発現と同様に、いくつかの場合、タンパク質は、不溶性となり得、そして、可溶化およびリフォールディングを促進するために変性剤および還元剤が使用され得る。誘導および増殖の温度もまた、発現レベルおよび溶解度に影響を及ぼし得、代表的には、２５℃と３７℃との間の温度が使用される。代表的には、細菌は、グリコシル化タンパク質を生成する。したがって、タンパク質が機能するためにグリコシル化を必要とする場合、宿主細胞から精製した後に、グリコシル化が加えられ得る。
ｂ．酵母
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのような酵母は、ＥＣＤポリペプチドの産生のために使用され得る周知の酵母発現宿主である。酵母は、エピソームの複製ベクターを用いて、または、相同組換えによる安定な染色体組み込みによって、形質転換され得る。代表的には、遺伝子発現を調節するために、誘導性のプロモーターが使用される。このようなプロモーターの例としては、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７およびＧＡＬ５、ならびにメタロチオネインプロモーター（例えば、ＣＵＰ１）、ＡＯＸ１、もしくは、他のＰｉｃｈｉａ、または、他の酵母プロモーターが挙げられる。他の酵母プロモーターとしては、解糖系の酵素の合成のためのプロモーター（例えば、３−ホスホグリセレートキナーゼの合成のためのプロモーター）、または、Ｙｅｐ１３から得られるエノラーゼ遺伝子もしくはＬｅｕ２遺伝子に由来するプロモーターが挙げられる。発現ベクターは、しばしば、形質転換したＤＮＡの選択および維持のために、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３およびＵＲＡ３のような選択可能なマーカーを含む。酵母において使用するための例示的な発現ベクター系は、ＰＯＴ１ベクター系（例えば、米国特許第４，９３１，３７３号を参照のこと）であり、これは、グルコース含有培地における増殖により、形質転換された細胞を選択することを可能にする。酵母において発現されるタンパク質は、しばしば、可溶性である。Ｂｉｐのようなシャペロニンおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの共発現は、発現レベルおよび溶解度を改善させ得る。さらに、酵母において発現されるタンパク質は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅに由来する酵母接合型α因子分泌シグナル（ｍａｔｉｎｇ ｔｙｐｅ α−ｆａｃｔｏｒ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）のような分泌シグナルペプチド融合物、および、Ａｇａ２ｐ接合接着レセプター（ｍａｔｉｎｇ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）もしくはＡｒｘｕｌａアデニニボラングルコアミラーゼ（ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ）のような酵母細胞表面タンパク質との融合物、または、酵母におけるポリペプチドの分泌を促進する任意の他の異種もしくは同種の前駆体配列を用いて、分泌を指向され得る。例えばＫｅｘ−２プロテアーゼのようなプロテアーゼ切断部位が、これらが分泌経路を出るときに、発現されるポリペプチドから融合配列を除去するように加工され得る。酵母はまた、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフにおいてグリコシル化し得る。
ｃ．昆虫細胞
昆虫細胞は、特に、バキュロウイルスの発現を用いて、ＥＣＤポリペプチド融合物を含むＥＣＤポリペプチドのようなポリペプチドを発現させるために有用である。昆虫細胞は、高レベルのタンパク質を発現し、そして、より高次の真核生物によって使用されるほとんどの翻訳後修飾を行い得る。バキュロウイルスは限定的な宿主範囲を持ち、安全性を改善しそして、真核生物発現に関する調節性の問題を減少させる。代表的な発現ベクターは、バキュロウイルスのポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）プロモーターのような高レベルの発現のためのプロモーターを使用する。一般に使用されるバキュロウイルス系としては、バキュロウイルス（例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）およびｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ核多角体ウイルス（ＢｍＮＰＶ））ならびに、昆虫細胞株（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａに由来するＳｆ９、Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａ（Ａ７Ｓ）およびＤａｎａｕｓ ｐｌｅｘｉｐｐｕｓ（ＤｐＮ１））が挙げられる。高レベルの発現のために、発現されるべき分子のヌクレオチド配列は、ウイルスのポリヘドリン開始コドンの直ぐ下流に融合される。哺乳動物の分泌シグナルは、昆虫細胞において正確にプロセシングを受け、発現されたタンパク質を培養培地中へと分泌するために使用され得る。例えば、哺乳動物の組織プラスミノーゲンアクチベーター前駆体配列は、昆虫細胞によるタンパク質の発現および分泌を促進する。さらに、細胞株Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａ（Ａ７Ｓ）およびＤａｎａｕｓ ｐｌｅｘｉｐｐｕｓ（ＤｐＮ１）は、哺乳動物細胞系に類似するグリコシル化パターンを持つタンパク質を生成する。
昆虫細胞における代替的な発現系は、安定に形質転換された細胞の使用である。Ｓｃｈｎｉｅｄｅｒ ２（Ｓ２）細胞およびＫｃ細胞（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）およびＣ７細胞（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）のような細胞株が、発現のために使用され得る。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのメタロチオネインプロモーターは、カドミウムもしくは銅による重金属誘導の存在下で、高レベルの発現を誘導するために使用され得る。発現ベクターは、代表的には、ネオマイシンおよびハイグロマイシンのような選択可能なマーカーの使用によって維持される。
ｄ．哺乳動物細胞
哺乳動物発現系は、本明細書中に提供されるＥＣＤポリペプチド融合物を含むＥＣＤポリペプチドを発現させるために使用され得る。発現構築物は、アデノウイルスベクターを用いるなどによるウイルス感染によって、または、リポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランを含む従来のトランスフェクション法、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションのような物理的な手段などによる直接的なＤＮＡの移入によって、哺乳動物細胞へと移入され得る。例示的な発現ベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、配列番号１６１）が挙げられる。哺乳動物細胞のための発現ベクターは、代表的には、ｍＲＮＡのキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列（Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）およびポリアデニル化エレメントを含む。このようなベクターは、しばしば、高レベルの発現のための転写プロモーター−エンハンサー（例えば、ＳＶ４０プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えば、ｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター−エンハンサー）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長い末端反復、または、ポリオーマ、アデノウイルスＩＩ、ウシパピローマウイルス、もしくはサル肉腫ウイルスに由来するもののような他のウイルスプロモーター）を含む。さらなる適切な哺乳動物プロモーターとしては、β−アクチンプロモーター−エンハンサー、およびヒトメタロチオネインＩＩプロモーターが挙げられる。これらのプロモーター−エンハンサーは、多くの細胞タイプにおいて活性である。組織および細胞のタイプのプロモーターおよびエンハンサーの領域もまた、発現のために使用され得る。例示的なプロモーター／エンハンサー領域としては、エラスターゼＩ、インシュリン、免疫グロブリン、マウス乳腺癌ウイルス、アルブミン、αフェトプロテイン、α１アンチトリプシン、βグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖２およびゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御配列のような遺伝子に由来するものが挙げられるがこれらに限定されない。発現構築物を持つ細胞の選択および維持のために、選択可能なマーカーが使用され得る。選択可能なマーカー遺伝子の例としては、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、およびチミジンキナーゼが挙げられるがこれらに限定されない。ＴＣＲ−ζおよびＦｃεＲＩ−γのような細胞表面シグナル伝達分子との融合物は、細胞表面上での活性な状態のタンパク質の発現を指向し得る。
多くの細胞株が哺乳動物の発現に利用可能であり、これらとしては、マウス、ラット、ヒト、サル、トリおよびハムスターの細胞が挙げられる。例示的な細胞株としては、ＣＨＯ、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳ０（非分泌型）、および他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、繊維芽細胞、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３Ｔ、２９３Ｓ、２Ｂ８およびＨＫＢ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。細胞培養培地からの分泌されたタンパク質の精製を容易にする無血清培地に適合させた細胞株もまた利用可能である。一つのこのような例は、無血清のＥＢＮＡ−１細胞株（Ｐｈａｍ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８４：３３２−４２）である。
ｅ．植物
トランスジェニックの植物細胞および植物が、ＥＣＤポリペプチドを発現させるために使用され得る。発現構築物は、代表的には、微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）およびＰＥＧ媒介性のプロトプラスト内への移入のような直接的なＤＮＡの移入、ならびに、アグロバクテリウムにより媒介される形質転換を用いて、植物へと移入される。発現ベクターは、プロモーター配列およびエンハンサー配列、転写開始エレメント、ならびに、翻訳制御エレメントを含み得る。発現ベクターおよび形質転換技術は、通常、双子葉植物宿主（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓおよびタバコ）と、単子葉植物宿主（例えば、トウモロコシおよびコメ）との間で分けられる。発現に使用される植物プロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリン（ｎｏｐａｌｉｎｅ）シンターゼプロモーター、リボースビスホスフェートカルボキシレートプロモーター、ならびに、ユビキチンおよびＵＢＱ３プロモーターが挙げられる。ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼのような選択可能なマーカーが、しばしば、形質転換された細胞の選択および維持を容易にするために使用される。形質転換された植物細胞は、細胞、凝集物（カルス組織）として培養中に維持され得るか、または、完全な植物へと再生され得る。トランスジェニック植物細胞はまた、ＣＳＲアイソフォームを生成するように加工された藻類を含み得る（例えば、Ｍａｙｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００３）ＰＮＡＳ １００：４３８−４４２を参照のこと）。植物は、哺乳動物細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するので、このことは、これらの宿主において生成されるＣＳＲアイソフォームの選択に影響を及ぼし得る。
５．トランスフェクションおよび形質転換の方法
宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションは、選択した宿主細胞に適切な標準的な方法を用いて達成される。トランスフェクションの方法は当業者に公知であり、例えば、リン酸カルシウム法およびエレクトロポレーション、ならびに、トランスフェクションを促進する市販のカチオン性リポソーム試薬（例えば、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００またはＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ））の使用である。使用する宿主細胞に依存して、形質転換は、このような細胞に適切な標準的な技術を用いて行われる。例えば、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理、または、エレクトロポレーションは、一般に、実質的な細胞壁障壁を持つ原核生物細胞または他の細胞に使用される。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用いた感染は、特定の植物細胞の形質転換に使用される。このような細胞壁のない哺乳動物細胞については、リン酸カルシウム沈降が用いられ得る。形質転換の一般的な局面は、植物細胞について（例えば、Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｇｅｎｅ，２３：３１５、ＷＯ８９／０５８５９を参照のこと）、哺乳動物細胞について（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、Ｋｅｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ．，（１９９０）１８５：５２７；Ｍａｎｓｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３６：３４８を参照のこと）、または酵母細胞について（例えば、Ｖａｌ Ｓｏｌｉｎｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｊ Ｂａｃｔ（１９７７）１３０：９４６，Ｈｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７６：３８２９を参照のこと）記載されている。宿主細胞中のＤＮＡを導入するための他の方法としては、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、インタクトな細胞との細菌のプロトプラスト融合、または、ポリブレンもしくはポリオルニチンのようなポリカチオンの使用が挙げられるがこれらに限定されない。
６．ＥＣＤポリペプチド、キメラポリペプチド、および結果として生じるＥＣＤ多量体の回収および精製
ＥＣＤポリペプチドおよびキメラＥＣＤポリペプチド（ＥＣＤポリペプチド多量体を含む）は、当該分野で周知の種々の技術を用いて単離され得る。当業者は、本明細書において提供される単離されたポリペプチドまたはタンパク質のうちの１つを得るために、ポリペプチドおよびタンパク質を単離するための公知の方法に容易に従い得る。これらとしては、イムノクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられるがこれらに限定されない。イオン交換クロマトグラフィーの例としては、アニオン交換クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーが挙げられ、ＤＥＡＥセファロース、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ＣＭセファロース、ＳＰセファロースまたは当業者に公知の任意の他の類似のカラムの使用が挙げられる。細胞培養培地から、または、溶解細胞からの、ＥＣＤポリペプチドまたはＥＣＤ多量体ポリペプチドの単離は、キメラＥＣＤポリペプチド中のエピトープタグまたはＥＣＤポリペプチドのいずれかに対して指向される抗体を用いて促進され得、次いで、免疫沈降法により単離され得、そして、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離され得る。あるいは、ＥＣＤポリペプチドまたはキメラＥＣＤポリペプチド（ＥＣＤ多量体を含む）は、ポリペプチド特異的な抗体のＥＣＤポリペプチドへの結合、そして／または、その後の、プロテインＡもしくはプロテインＧセファロースカラムへのこの抗体の結合、そして、このカラムからのタンパク質の溶出によって単離され得る。ＥＣＤポリペプチドの精製はまた、タンパク質に結合する試薬を固定したアフィニティカラムまたはビーズと、その後の、結合剤からタンパク質を溶出するための１以上のカラムの工程とを含み得る。アフィニティ因子の例としては、コンカナバリンＡ−アガロース、ヘパリン−トーヨーパール（ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）またはＣｉｂａｃｒｏｍブルー３Ｇａセファロースが挙げられる。タンパク質はまた、フェニルエーテル、ブチルエーテルまたはプロピルエーテルのような樹脂を用いた、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製され得る。
いくつかの例では、キメラＥＣＤポリペプチドは、イムノアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製され得る。このような例において、ＥＣＤポリペプチドは、本明細書中に記載されるもののようなエピトープタグを持つ融合タンパク質として発現され得、これらのタグとしては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはチオレドキシン（ＴＲＸ）、ｍｙｃタグおよび／またはＨｉｓタグが挙げられるがこれらに限定されない。このような融合タンパク質の発現および精製のためのキットは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどから市販されている。タンパク質はまた、タグに融合され得、その後、このようなエピトープに対して指向された特異的な抗体を用いることによって精製され得る。いくつかの例において、エピトープタグ結合剤を固定したアフィニティカラムまたはビーズが、ＥＣＤポリペプチド融合物を精製するために使用され得る。例えば、結合剤は、ＧＳＴエピトープタグとの相互作用のためにグルタチオンを、ポリＨｉｓタグとの相互作用のためにＣｕ２＋またはＮｉ２＋のような固定金属−アフィニティ因子を、キメラＥＣＤタンパク質の精製のために、抗ｍｙｃ抗体のような抗エピトープ抗体、および／または、カラムに固定され得る任意の他の因子を含み得る。
Ｆｃドメインもしくはその混合物を含む精製したホモ多量体分子もしくはヘテロ多量体分子が所望される場合、分子は、当業者に公知でありかつ実施例において詳述される方法を用いて回収または精製され得る。宿主細胞が、Ｆｃドメインを含む第一のポリペプチドをコードする核酸、および、これもまたＦｃドメインを含む第二のポリペプチドをコードする核酸と共に共発現される場合、結果として発現される分子は、第一のポリペプチドのホモ二量体として、第二のポリペプチドのホモ二量体として、そして、第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドのヘテロ二量体として形成され、ここで、各二量体は、Ｆｃ多量体化ドメインの相互作用を介して連結される。ホモ二量体およびヘテロ二量体の組合せは、分泌されるポリペプチドとして培養培地から回収され得るが、これはまた、シグナル配列なしで直接生成される場合、宿主細胞の溶解物からも回収され得る。ホモ多量体もしくはヘテロ多量体が膜に結合している場合、これは、適切な界面活性剤溶液（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００）を用いて膜から放出され得る。
抗体の定常ドメインを含むホモ二量体もしくはヘテロ二量体またはこれらの混合物は、種々の方法（ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない）によって、他の粒子状細胞片または不純なタンパク質から離して、馴化培地から簡便に精製され得る。多量体がＣＨ３ドメインを有する場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。回収されるポリペプチドによっては、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース上のクロマトグラフィー、アニオン交換樹脂もしくはカチオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング（ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓｉｎｇ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿のような、タンパク質精製のための他の技術もまた利用可能である。
さらに、プロテインＡまたはプロテインＧが使用され得る。プロテインＡのアフィニティリガンドとしての適合性は、キメラにおいて使用される免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２もしくはγ４の重鎖に基づいて免疫付着因子を精製するために使用され得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプおよびヒトγ３について推奨される（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７−１５７５）。プロテインＡもしくはプロテインＧのようなアフィニティリガンド、または多量体分子と相互作用し得る他のリガンドに対するマトリクスは、アガロースであることが最も多いが、他のマトリクスもまた利用可能である。制御された孔を持つガラスもしくはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような機械的に安定なマトリクスは、アガロースを用いた場合に達成され得るよりも、より速い流速とより短い処理時間とを可能にする。プロテインＡもしくはプロテインＧアフィニティカラムへと免疫付着因子を結合させるための条件は、完全にＦｃドメインの特徴によって指示される；特徴とは、すなわち、種およびアイソタイプである。一般に、適切なリガンドが選択される場合、効率的な結合が、非馴化培養流体から直接生じる。結合したＥＣＤ−Ｆｃ含有分子は、酸性ｐＨ（ｐＨ３．０以下）において、または、中程度のカオトロピズム塩を含む中性ｐＨの緩衝液中で溶出され得る。あるいは、またはさらに、結合した分子は、過剰のＩｇＧを用いて溶出され得る。必要に応じて、溶出された分子は、塩基性ｐＨにおいて中和され得る。得られた精製分子は、精製された（代表的には、９５％より高い）ホモ多量体およびヘテロ多量体を含む。
ホモ二量体から離してヘテロ多量体を富化するために、いくつかの因子が使用され得、これらの因子としては、抗エピトープタグもしくは多量体分子のただ１つのみのキメラポリペプチド成分を認識するレセプター特異的な抗体の使用が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、１つのキメラポリペプチドが、エピトープタグ（すなわち、ｃ−ｍｙｃタグまたはＨｉｓタグ）へと融合され得る。したがって、例えば、プロテインＡカラムもしくは使用される多量体化ドメインに応じた他の初期精製法を用いるなどの精製の後に、精製した分子は、さらに、第二のアフィニティカラムもしくは他のマトリックスを用いて富化され得る。例えば、ＥＣＤ多量体のさらなる精製のたえに、任意の結合剤がアフィニティカラムもしくはビーズに固定され得る。この例は、ニッケルアフィニティ金属クロマトグラフィーカラムへのＮｉ２＋のような金属アフィニティ因子の固定である。第一のキメラポリペプチドのみが第二のアフィニティカラムによって認識される場合、第二のキメラポリペプチドを含むホモ二量体は、第一のポリペプチドのホモ二量体と、第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドのヘテロ二量体のみを残して洗い流され得る。さらに続くアフィニティ工程は、ヘテロ多量体を精製するために使用され得る。このようなさらなるアフィニティ工程としては、ヘテロ多量体中に存在する第二のキメラポリペプチドのみを認識するが、残りのホモ多量体は認識しない抗レセプター抗体もしくはリガンドのアフィニティカラムもしくは他のマトリックスへの固定が挙げられる。例えば、実施例３は、ＥＧＦアフィニティカラムを第一の精製工程として用い、その後に、あらゆる過剰なリガンドを除くために分取ＳＥＣカラムを用いる、ＨＥＲ１／ＨＥＲ３ ＥＣＤ多量体の精製を記載する。最終的な富化方法として、同様のアフィニティカラムが、例えば、ＥＣＤ多量体の１つの成分を認識する任意の結合剤、リガンド、または、抗レセプター抗体を用いて、ＥＣＤ多量体の成分に依存して、経験的に設計され得る。
さらに、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体（例えば、ペンダントのメチル基もしくは他の脂肪族基を持つシリカゲル）を用いる１以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程が、タンパク質をさらに精製するために用いられ得る。上述の精製工程のいくつかまたは全てはまた、種々の組合せにおいて、実質的に均質な単離組換えタンパク質を提供するために用いられ得る。
精製の前に、分泌されたＥＣＤポリペプチド（キメラＥＣＤポリペプチドおよび／またはＥＣＤ多量体を含む）を含む馴化培地は、清澄化および／または濃縮され得る。清澄化は、遠心分離後に濾過することによってなされ得る。濃縮は、例えば、接線流れメンブラン（接線流 ｍｅｍｂｒａｎｅ）を用いるか、または撹拌細胞系フィルタを用いるなどの当業者に公知の任意の方法によってなされ得る。濃縮プロセスには、種々の分子量（ＭＷ）の分離カットオフが使用され得る。例えば、１０，０００ＭＷの分離カットオフが使用され得る。実施例は、ＨＥＲ１／ＨＥＲ３のヘテロ多量体（例えば、Ｒｂ２００およびＲｂ２００ｈ）の種々の精製方法、ならびに、ホモ多量体（ＨＥＲ１／ＨＥＲ１およびＨＥＲ３／ＨＥＲ３）とヘテロ多量体（ＨＥＲ１／ＨＥＲ３）の混合物の種々の精製方法を詳述する。したがって、いくつかの局面では、本発明は、ヘテロ多量体とホモ多量体の混合物を含む組成物を提供し、ここで、ヘテロ多量体は、ＨＥＲ１に由来するＥＣＤまたはその一部分と、ＨＥＲ３に由来する別のＥＣＤまたはその一部分とを含み、そして、ホモ多量体は、ＨＥＲ１に由来するＥＣＤもしくはその一部分、または、ＨＥＲ３に由来するＥＣＤもしくはその一部分を含む。混合物は、任意の比の３つの多量体成分の比を有し得る。いくつかの場合、３つの多量体成分の比は、使用される発現系のタイプに依存する。一実施形態では、３つの多量体成分の比は、互いにほぼ等しい。
Ｇ．ＥＣＤ多量体の活性を評価または監視するためのアッセイ
一般に、ＥＣＤ多量体は、１以上（代表的には２以上）の同系のＣＳＲまたは他の相互作用性のＣＳＲの１以上の生物学的活性を調節する。ＥＣＤ多量体の生物学的活性を監視するために、インビトロおよびインビボのアッセイが使用され得る。ＲＴＫ ＥＣＤ多量体、特に、ＨＥＲ ＥＣＤ多量体の生物学的活性を評価するための例示的なインビトロおよびインビボのアッセイが、本明細書中に提供される。多くのアッセイが、他のＣＳＲ ＥＣＤ多量体に適用可能である。さらに、ＣＳＲの生物学的活性のための多数のアッセイが当業者に公知であり、そして、特定のＣＳＲの活性を評価することが公知の任意のアッセイが、試験されるＥＣＤ多量体に依存して選択され得る。ＲＴＫ活性に対するＥＣＤ多量体の作用について試験するためのアッセイとしては、キナーゼアッセイ、ホモ二量体化およびヘテロ二量体化アッセイ、タンパク質：タンパク質相互作用アッセイ、構造アッセイ、細胞シグナル伝達アッセイ、ならびに、インビボ表現型決定アッセイが挙げられるがこれらに限定されない。アッセイはまた、疾患モデルを含む動物モデルの使用を含み、ここで、この疾患モデルにおいて、生物学的活性が観察および／または測定され得る。このようなアッセイにおけるＥＣＤ多量体の用量応答曲線は、生物学的活性の調節を評価するため、ならびに、投与のためのＥＣＤ多量体の治療上有効な量を決定するために使用され得る。例示的なアッセイは、以下に記載される。
１．キナーゼ／リン酸化アッセイ
キナーゼ活性は、直接的および間接的に検出および／または測定され得る。例えば、ホスホチロシンに対する抗体は、ＲＴＫのリン酸化を検出するために使用され得る。例えば、ＲＴＫのチロシンキナーゼ活性の活性化は、ＲＴＫに対するリガンドの存在下で測定され得る。リン酸基転移は、抗ホスホチロシン抗体によって検出され得る。リン酸基転移は、ＥＣＤ多量対の存在下および非存在下で測定および／または検出され得、したがって、ＲＴＫのリン酸基転移を調節するＥＣＤ多量体の能力を測定し得る。簡単に述べると、ＲＴＫを発現する細胞は、ＥＣＤ多量体に対して曝露され得、そして、リガンドで処理され得る。細胞は、溶解され、そして、タンパク質抽出物（全細胞抽出物または分画された抽出物）が、ポリアクリルアミドゲル上にロードされ、電気泳動により分離され、そして、ウェスタンブロッティングに使用するなどのために、メンブランに移される。抗ＲＴＫ抗体を用いた免疫沈降はまた、ゲル電気泳動およびウェスタンブロッティングを行う前に、ＲＴＫタンパク質を分画および単離するために使用され得る。メンブレンは、リン酸化を検出するために抗ホスホチロシン抗体でプローブされ得、同時に、総ＲＴＫタンパク質を検出するための抗ＲＴＫ抗体でプローブされ得る。ＲＴＫアイソフォームを発現しない細胞およびリガンドに対して曝露されない細胞のようなコントロール細胞が、比較のために同じ手順に供され得る。
チロシンリン酸化はまた、質量分析法などによって直接測定され得る。例えば、ＲＴＫのリン酸化状態に対するＥＣＤ多量体の影響は、種々の濃度のＥＣＤ多量体を用いてインタクトな細胞を処理し、そして、ＲＴＫの活性化に対する影響を測定することなどによって測定され得る。ＲＴＫは、質量分析法による解析のためのペプチドフラグメントを生成するために、免疫沈降により単離され得、そしてトリプシン処理され得る。ペプチドの質量分析法は、タンパク質のチロシンリン酸化の程度を定量的に決定するための十分に確立された方法である；チロシンのリン酸化は、ホスホチロシンを含むペプチドイオンの質量を増加させ、そして、このペプチドは、質量分析法によって、リン酸化されていないペプチドから容易に分離される。
例えば、チロシン−１１３９およびチロシン−１２４８は、ＨＥＲ２ ＲＴＫにおいて自己リン酸化されることが知られる。トリプシン処理されたペプチドは、例えば、ＥｘＰＡＳｙ−ＰｅｐｔｉｄｅＭａｓｓプログラムを用いることによって、ポリペプチド配列に基づいて経験的に決定または推定され得る。チロシン−１１３９およびチロシン−１２４８のリン酸化の程度は、これらのチロシンを含むペプチドの質量分析データから決定され得る。このようなアッセイは、ＲＴＫの自己リン酸化の程度と、ＲＴＫのリン酸基転移を調節するＥＣＤ多量体の能力とを評価するために使用され得る。
２．複合体化／二量体化
ＲＴＫとＥＣＤ多量体との二量体化のような複合体化が、検出および／または測定され得る。例えば、単離されたポリペプチドが、一緒に混合され、ゲル電気泳動およびウェスタンブロッティングに供され得る。ＲＴＫおよび／またはＥＣＤ多量体はまた、細胞および細胞抽出物（例えば、全細胞抽出物または分画された抽出物）に加えられ得、そして、ゲル電気泳動およびウェスタンブロッティングに供され得る。ポリペプチドを認識する抗体は、単量体、二量体および他の複合体化形態の存在を検出するために使用され得る。あるいは、標識されたＲＴＫおよび／または標識されたＥＣＤ多量体がアッセイにおいて検出され得る。このようなアッセイは、ＥＣＤ多量体の存在下および非存在下で、ＲＴＫのホモ二量体化または２以上のＲＴＫのヘテロ二量体化を比較するために使用され得る。アッセイはまた、ＲＴＫと二量体化するＥＣＤ多量体の能力を評価するために行われ得る。例えば、ＨＥＲ ＥＣＤ多量体は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４とヘテロ二量体化するその能力について評価され得る。さらに、ＥＣＤ多量体は、ホモ二量体化またはヘテロ二量体化するＲＴＫの能力を調節するその能力について評価され得る。例えば、ＨＥＲ ＥＣＤ多量体は、他の組合せの中でも、ＨＥＲ２と、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４とのヘテロ二量体化を調節するその能力について評価され得る。
別の例では、分子サイズ排除解析が行われ得る。分子サイズ排除は、特定のサイズ排除カラムを用いて行われ、そして、溶出された分子と固定された参照標準とを比較する。分子は、単独で与えられても、別の分子と組み合わされてもよい。例えば、任意のＲＴＫポリペプチド、キメラポリペプチドまたはＥＣＤ多量体が、サイズ排除カラムに与えられ得る。溶出容積が決定され得、そして、実施例４に記載されるように、分子の各々について分子量が計算される。あるいは、２以上のポリペプチドが、同時に与えられて、その２以上のポリペプチドまたは分子が、低重合体分子を形成し得るかどうかを決定するために溶出プロフィールが評価され得る。
３．リガンド結合
一般に、ＲＴＫは、１以上のリガンドに結合する。リガンド結合は、レセプターの活性を調節し、したがって、例えば、シグナル伝達経路内のシグナル伝達を調節する。ＥＣＤ多量体へのリガンド結合およびＲＴＫのリガンド結合が、ＥＣＤ多量体の存在下で測定され得る。例えば、放射標識リガンドのような標識されたリガンドが、ＥＣＤ多量体の存在下および非存在下（コントロール）で、精製されたかもしくは部分的に精製されたＲＴＫに加えられ得る。ＥＣＤ多量体の存在下および非存在下で、ＲＴＫに結合したリガンドの量を定量するために、免疫沈降および放射活性の測定が使用され得る。ＥＣＤ多量体はまた、標識されたリガンドと共にＥＣＤ多量体をインキュベートし、そして、例えば、対応するｒＴＫの野生型もしくは優性な形態により結合された量と比較して、ＥＣＤ多量体により結合された標識リガンドの量を決定することなどによって、リガンド結合について評価され得る。
４．細胞増殖アッセイ
多数のＲＴＫ（例えば、ＶＥＧＦＲ、ＨＥＲファミリーレセプター、および他の増殖因子レセプター）が、細胞増殖に関与している。細胞増殖に対するＥＣＤ多量体の影響が測定され得る。試験される細胞は、代表的には、標的のＲＴＫレセプターを発現する。例えば、ＲＴＫを発現する細胞にリガンドが加えられ得る。ＥＣＤ多量体は、リガンドを加える前、同時または後にこのような細胞に加えられ得、そして、細胞増殖に対する影響が測定され得る。細胞増殖のレベルは、アラマーブルーもしくはクリスタルバイオレットのような色素または他の同様の色素で細胞を標識し、その後、最適な密度を測定することによって評価され得る。ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］もまた、細胞の増殖を評価するために使用され得る。増殖試薬としてのＭＴＴの使用は、生存細胞に由来するミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ酵素が、淡黄色のＭＴＴのテトラゾリウム環を切断し、暗青色のホルマザン結晶を形成する能力に基づくものであり、この暗青色の結晶は、細胞膜に不透過性であるので、健常な細胞内に蓄積される。界面活性剤を加えることによる細胞の可溶化は、結晶の放出および可溶化をもたらす。生存している増殖細胞の数に直接比例する色は、分光測光手段によって定量され得る。したがって、選択した細胞を、リガンドの存在下または非存在下でＥＣＤ多量体と共にインキュベートした後、ＭＴＴがこれらの細胞に加えられ得、細胞が、界面活性剤を用いて可溶化され得、そして、吸光度が５７０ｎｍにおいて読まれ得る。あるいは、細胞は、増殖実験の前に、３Ｈ−トリチウムのような放射性標識、または、ＣＦＳＥのような他の蛍光標識で予め標識され得る。
５．細胞疾患モデルアッセイ
疾患もしくは状態に由来する細胞、または、疾患もしくは状態を模倣するように調節され得る細胞が、ＥＣＤ多量体の影響を測定および／または検出するために使用され得る。ＥＣＤ多量体は、細胞に加えられるか、または細胞において発現され、そして、ＥＣＤ多量体に対して曝露されていない細胞またはＥＣＤ多量体を発現しない細胞と比較して、表現型が測定または検出される。このようなアッセイは、細胞増殖、転移、炎症、新脈管形成、病原体の感染、および骨再吸収に対する影響を含む影響を測定するために使用され得る。
例えば、新脈管形成において、ＥＣＤ多量体の影響が測定され得る。例えば、インビトロでのヒト臍帯静脈内比細胞（ＨＵＶＥＣ）のような内皮細胞による細管の形成が、新脈管形成、および新脈管形成に対する影響を測定するためのアッセイとして使用され得る。種々の量のＥＣＤ多量体をインビトロ新脈管形成アッセイに加えることは、新脈管形成のモジュレーターとしてのＥＣＤ多量体の有効性をスクリーニングするために適切な方法である。
６．動物モデル
動物モデルが、ＥＣＤ多量体の影響を評価するために使用され得る。例えば、癌細胞の増殖、遊走および侵襲性に対するＥＣＤ多量体の影響が測定され得る。１つのこのようなアッセイにおいて、卵巣癌のような癌細胞は、インビトロで培養した後に、トリプシン処理され、適切な緩衝液中に懸濁され、そして、マウス（例えば、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスのようなモデルマウスの側腹部および肩部）に注射される。マウスには、マウスへの癌細胞の投与の前、同時または後のいずれかに、任意の適切な投与経路（すなわち、皮下、静脈内、腹腔内および他の経路）によって、同時に投与される。腫瘍の増殖が経時的に監視される。同様のアッセイが、他の細胞のタイプおよび動物モデル（例えば、マウス肺癌（ＬＬＣ）細胞ならびにＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＳＣＩＤマウス）についても行われ得る。腫瘍の増殖は、ＥＣＤ多量体を投与されていないマウス、または、それぞれの同系レセプターもしくはＥＣＤ多量体の相互作用性レセプターが欠失したマウスに対して比較され得る。
別の例では、眼の障害に対するＥＣＤ多量体の影響が、角膜マイクロポケットアッセイのようなアッセイを用いて評価され得る。簡単に述べると、マウスは、アッセイの２〜３日前に注射によってＥＣＤ多量体（またはコントロール）を投与される。その後、マウスは麻酔をかけられ、そして、ＶＥＧＦもしくは他の増殖因子リガンドのようなリガンドのペレットが、眼の角膜マイクロポケット内へと移植される。次いで、例えば、移植から５日後に新生血管形成が測定される。次いで、コントロールと比較した、新脈管形成に対するＥＣＤ多量体の影響が評価される。
当該分野で公知の任意の動物モデルが、ＨＥＲ多量体のようなＥＣＤ多量体の影響を評価するために使用され得、この動物モデルとしては、以下のようなトランスジェニックマウスが挙げられる：例えば、ＤＲおよびＤＱの主要組織適合複合体ＩＩ分子を発現するアテローム性動脈硬化症マウスのようなヒト化トランスジェニックマウスモデル（これは、例えば、慢性関節リウマチ、セリアック病、多発性硬化症およびインシュリン依存性糖尿病を含む自己免疫疾患のためのモデルとして使用され得る）（Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ６３（５）：３８３−９４）、アポリポタンパク質Ｅ欠損マウス（ＡｐｏＥ−／−）（これは、アテローム性動脈硬化症のためのモデルとして使用され得る）、ＩＬ−１０ノックアウトマウス（これは、例えば、炎症性腸疾患およびクローン病のためのモデルとして使用され得る）（Ｓｃｈｅｉｎｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３（１）：３８−４３）、ならびに、変異アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウスおよび家族性常染色体優性連鎖ＰＳ１を発現するマウスのようなアルツハイマー病のモデル。動物モデルはまた、多発性硬化症のためのモデルとして使用されるＥＡＥ誘導性動物のように、疾患を呈するように誘導もしくは処理された動物を含む。
Ｈ．ＥＣＤ多量体およびＥＣＤ多量体組成物の調製、処方および投与
ＥＣＤ多量体およびＥＣＤ多量体組成物（ＨＥＲ ＥＣＤ多量体およびＨＥＲ ＥＣＤ多量体組成物を含む）は、当業者に公知の任意の経路（筋肉内、静脈内、皮内、腹腔内注射、皮下、硬膜外、鼻腔、経口、直腸、局所、吸入、バッカル（例えば、舌下）および経皮投与または任意の経路を含む）による投与のために処方され得る。ＥＣＤ多量体は、例えば、注入もしくは大量注射により、上皮もしくは粘膜皮膚の内層を通した吸収（例えば、経口粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）により、任意の簡便な経路によって投与され得、そして、他の生物学的に活性な薬剤と共に、連続的に、断続的に、または、同じ組成物中で、のいずれかで投与され得る。投与は、処置の場所に依存して、局部、局所または全身性であり得る。処置を必要とする領域への局部投与は、例えば、外科手術の間の局部注入によって、例えば、外科手術後の創傷包帯と組合せた局部適用によって、注射によって、カテーテルによって、坐剤によって、または、移植によって達成され得るがこれらに限定されない。投与はまた、制御放出処方物および制御放出デバイス（例えば、ポンプによるもの）を含む、制御放出システムを含み得る。任意の所定の場合における最も適切な経路は、処置される疾患もしくは状態の性質および重篤度、ならびに、使用される特定の組成物の性質に依存する。
種々の送達システムが公知であり、そして、ＥＣＤ多量体を投与するために使用され得、これらは、例えば、リポソーム中へのカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現し得る組換え細胞、レセプターにより媒介されるエンドサイトーシス、および、ＥＣＤ多量体をコードする核酸分子の送達（例えば、レトロウイルス送達システム）であるが、これらに限定されない。
ＥＣＤ多量体を含む薬学的組成物が調製され得る。一般に、薬学的に受容可能な組成物は、監督官庁の認可の観点で調製されるか、または、他には、動物およびヒトにおける使用のための一般に認識される薬局方に従って調製される。薬学的組成物は、ＥＣＤ多量体と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルのようなキャリアを含み得る。このような薬学的キャリアは、水および油（石油、動物起源のもの、植物起源のものまたは合成起源のもの（例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油およびゴマ油））のような滅菌された液体であり得る。薬学的組成物が静脈内投与される場合、水が代表的なキャリアである。生理食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、液体キャリア、特に、注射用溶液として使用され得る。組成物は、活性成分と共に以下を含み得る：乳糖、リン酸二カルシウム、またはカルボキシメチルセルロースのような希釈剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムおよび滑石のような滑沢剤；およびデンプン、天然ゴム（例えば、アカシアゴム）、ゼラチン、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリドン、セルロースおよびその誘導体、ポビドン、クロスポビドンのような結合剤、ならびに、当業者に公知の他の結合剤。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、乳糖、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦、粉乳、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水およびエタノールが挙げられる。組成物はまた、必要に応じて、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、または、ｐＨ緩衝化剤（例えば、酢酸、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、モノラウリル酸ソルビタン、酢酸トリエタノールアミンナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン）および他のこのような因子を含み得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、散剤、および持続放出処方物の形態をとり得る。組成物は、伝統的な結合剤およびキャリア（例えば、トリグリセリド）と共に、坐剤として処方され得る。経口用処方物は、医薬等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムおよび他のこのような因子のような標準的なキャリアを含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎにより「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」において記載される。このような組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するように、化合物（一般に精製された形態のもの）の治療上有効な量を、適切な量のキャリアと共に含む。処方物は、投与様式に適したものであるべきである。
処方物は、適切な量の化合物またはその薬学的に受容可能な誘導体を含む、錠剤、カプセル、丸剤、散剤、顆粒剤、滅菌の非経口用の溶液もしくは懸濁液、または、経口用の溶液もしくは懸濁液、および油：水エマルジョンのような単位投薬形態で、ヒトおよび動物への投与のために提供される。薬学的、治療的に活性な化合物およびその誘導体は、代表的には、単位投薬形態または複数投薬形態で処方および投与される。本明細書において使用される場合、単位用量形態とは、ヒト被験体および動物被験体に適切な物理的に区別された単位をいい、そして、当該分野で公知であるように、個別に包装されている。各単位用量は、所望の治療作用を生じるのに十分な所定の量の治療上活性な化合物を、必要とされる薬学的キャリア、ビヒクルもしくは希釈剤と共に含む。単位用量形態の例としては、アンプルおよびシリンジ、ならびに、個別に包装された錠剤もしくはカプセル剤が挙げられる。単位用量形態は、画分、または複数の画分で投与され得る。複数用量形態は、単一の容器内に包装された、複数の同一の単位投薬形態であり、これは、区分された単位用量形態で投与される。複数用量形態の例としては、バイアル、錠剤もしくはカプセル剤の瓶、または、数パイントもしくは数ガロンの瓶が挙げられる。したがって、複数用量形態は、包装においては区分されていない、複数の単位用量である。
０．００５％〜１００％の範囲の活性成分を、非毒性キャリアから構成されるバランスを伴って含む投薬形態または組成物が調製され得る。経口投与については、薬学的組成物は、例えば、結合剤（例えば、予めゼラチン状にしたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、乳糖、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、滑石またはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコール酸ナトリウムデンプン）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）のような薬学的に受容可能な賦形剤を用いて従来の手段によって調製された錠剤またはカプセル剤の形態をとり得る。錠剤は、当該分野で周知の方法によってコーティングされ得る。
薬学的調製物はまた、液体形態（例えば、溶液、シロップまたは懸濁液）の形態であっても、使用前に水もしくは他の適切なビヒクルを用いて再構成するための薬物製品として提供されてもよい。このような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素添加された食用脂質）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、または、分画された植物油）；および保存料（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸）のような薬学的に受容可能な添加物を用いて、従来の手段によって調製され得る。
直腸投与に適切な処方物は、単位用量の坐剤として提供され得る。これらは、活性な化合物を１以上の従来の固体キャリア（例えば、カカオ脂）と混合し、次いで、この得られた混合物を成形することによって調製され得る。
皮膚または眼への局所適用に適切な処方物としては、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾルおよびオイルが挙げられる。例示的なキャリアとしては、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、およびこれらの２以上の組合せが挙げられる。局所用処方物はまた、０．０５重量％〜１５重量％、２０重量％、２５重量％の、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（アルキレングリコール）、ポリヒドロキシアルキル、（メタ）アクリレートまたはポリ（メタ）アクリルアミドの中から選択される増粘剤を含み得る。局所用処方物は、しばしば、結膜嚢内に、点眼により、もしくは軟膏として適用される。局所用処方物はまた、眼、顔面の洞、および外耳道の洗浄または潤滑のためにも使用され得る。局所用処方物はまた、前眼房および他の場所へも注射され得る。液体状態の局所用処方物はまた、ストリップまたはコンタクトレンズの形状の親水性の三次元ポリマーマトリックスとして提供され得、ここから、活性な組成物が放出される。
吸入による投与について、本明細書において使用するための組成物は、適切な圧縮不活性ガス（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガス）の使用によって、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレーの形態で送達され得る。加圧されたエアロゾルの場合には、投薬単位は、一定量を送達するための弁を提供することによって決定され得る。吸入器または噴霧器において使用するための、化合物の粉末混合物と、乳糖もしくはデンプンのような適切な粉末基材とを含む、例えば、ゼラチンのカプセルおよびそのカートリッジが処方され得る。
バッカル（舌下）投与のために適切な処方物としては、例えば、風味付けした基材（通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガント）中に活性な化合物を含むロゼンジ；および、不活性な基材（例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシア）中に化合物を含むトローチが挙げられる。
ＥＣＤ多量体の薬学的組成物は、例えば、大量注射もしくは連続注入による、注射による非経口投与のために処方され得る。注射のための処方物は、例えば、アンプルまたは複数用量の容器中に、保存料を加えて、単位投薬形態として提供され得る。組成物は、懸濁液、溶液、または、油性もしくは水性ビヒクル中のエマルジョンであり得、そして、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤のような処方用の因子を含み得る。あるいは、活性な成分は、使用前に、適切なビヒクル（例えば、滅菌した発熱物質を含まない水もしくは他の溶剤）を用いて再構成するための粉末形状であり得る。
経皮投与に適した処方物は、長期間にわたってレシピエントの表皮と直接接した状態で残るように適合された不連続のパッチとして提供され得る。このようなパッチは、活性化合物を、適切に、例えば、活性化合物に関して０．１〜０．２Ｍ濃度の必要に応じて緩衝化された水溶液として含む。経皮投与に適した処方物はまた、イオン浸透療法（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３（６）、３１８（１９８６）を参照のこと）によって送達され得、そして、代表的には、活性化合物の必要に応じて緩衝化された水溶液の形態をとる。
薬学的組成物はまた、制御放出の手段および／または送達デバイスによって投与され得る（例えば、米国特許第３，５３６，８０９号；同第３，５９８，１２３号；同第３，６３０，２００号；同第３，８４５，７７０号；同第３，８４７，７７０号；同第３，９１６，８９９号；同第４，００８，７１９号；同第４，６８７，６１０号；同第４，７６９，０２７号；同第５，０５９，５９５号；同第５，０７３，５４３号；同第５，１２０，５４８号；同第５，３５４，５６６号；同第５，５９１，７６７号；同第５，６３９，４７６号；同第５，６７４，５３３号および同第５，７３３，５６６号を参照のこと）。
特定の実施形態では、リポソームおよび／またはナノ粒子もまた、ＥＣＤ多量体の投与に用いられ得る。リポソームはリン脂質から形成され、水性媒体中に分散され、そして、自発的に、多層構造の同心性二重層小胞（多層小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を形成する。ＭＬＶは一般に、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、２００Å〜５００Åの範囲の直径を有し、コア中に水溶液を含む小さな単層小胞（ＳＵＶ）の形成を生じる。
リン脂質は、その脂質の水に対するモル比に依存して、水中に分散されたときに、リポソーム以外の種々の構造を形成し得る。割合が低いと、リポソームが形成される。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度および二価カチオンの存在に依存する。リポソームは、イオン性物質および極性物質に対して低い透過性を示すが、温度が上昇すると、相転移を受けて、その透過性が劇的に変わる。相転移は、ゲル状態として知られる、ぎっしりと詰め込まれた規則正しい構造から、流体状態として知られる、ゆるく詰められたあまり規則正しくない構造への変化を伴う。これは、特有の相転移温度において生じ、そして、イオン、糖および薬物に対する透過性の増加をもたらす。
リポソームは、以下のような種々の機構を介して細胞と相互作用する：マクロファージおよび好中球のような網内系の食作用細胞によるエンドサイトーシス；非特異的な弱い疎水性もしくは静電的な力、または、細胞表面成分との特異的な相互作用のいずれかによる、細胞表面への吸着；形質膜中へのリポソームの脂質二重膜の挿入による形質細胞膜との融合と、細胞質中へのリポソーム内容物の自発的な放出；および、リポソーム内容物の任意の関与を伴わない、細胞もしくは非細胞膜へのリポソームの脂質の移送（またはその逆）。リポソームの処方を変えることで、作動する機構が変わり得るが、１以上の機構が同時に作動し得る。
ナノカプセルは、一般に、安定かつ再現可能な方法で化合物を捕捉し得る。細胞内の重合体の過負荷に起因する副作用を回避するために、このような超微細粒子（直径約０．１μｍの大きさ）は、インビボで分解され得る重合体を用いて設計され得る。これらの要件を満たす生分解性のポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が、本明細書における使用に企図され、そして、このような粒子は、容易に作製され得る。
投与法は、タンパク質分解による分解、ならびに、抗原性応答および免疫原性応答を介した免疫学的介入などの、分解プロセスへのＥＣＤ多量体の曝露を減らすために用いられ得る。このような方法の例は、処置部位における局部投与が挙げられる。ＥＣＤ多量体はまた、血清中の安定性および半減期を調節し、同時に、免疫原性を減らすように改変され得る。このような改変は、当該分野で公知の任意の手段によって達成され得、そして、ペグ化、および、血清アルブミンのようなキャリアタンパク質の追加、およびグリコシル化のような、ＥＣＤ多量体への分子の追加が挙げられる（Ｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０（３）：８８６８−７６；ｖａｎ Ｄｅｒ Ａｕｗｅｒａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｍ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ．６６（４）：２４５−５１）。さらに、Ｆｃの多量体化ドメイン間で形成されたこれらのＥＣＤ多量体のＦｃ部分は、血清中の安定性および半減期を調節する。
治療薬のペグ化は、タンパク質分解に対する抵抗性を増加させること；血漿中半減期を増加させること、そして、抗原性および免疫原性を減少させることが報告されている。ペグ化の方法の例は、当該分野で公知である（例えば、Ｌｕ ａｎｄ Ｆｅｌｉｘ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，４３：１２７−１３８，１９９４；Ｌｕ ａｎｄ Ｆｅｌｉｘ，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．，６：１４２−６，１９９３；Ｆｅｌｉｘ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．，４６ ：２５３−６４，１９９５；Ｂｅｎｈａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１３３９８−４０４，１９９４；Ｂｒｕｍｅａｎｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４：３０８８−９５，１９９５；ｓｅｅ ａｌｓｏ，Ｃａｌｉｃｅｔｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５（１０）：１２６１−７７ ａｎｄ Ｍｏｌｉｎｅｕｘ（２００３）Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ ２３（８ Ｐｔ ２）：３Ｓ−８Ｓを参照のこと）。ペグ化はまた、核酸分子のインビボでの送達においても使用され得る。例えば、アデノウイルスのペグ化は、安定性および遺伝子の転移を増加させ得る（例えば、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０（９）：１４４４−５１を参照のこと）。
所望される血中レベルは、血漿中レベルによって確認される、活性因子の継続的な注入によって維持され得る。主治医は、毒性、または、骨髄、肝臓もしくは腎臓の機能不全に起因して投薬量を低下させるために治療を終了、中断または調節する方法およびタイミングを認識することに注意すべきである。逆に、主治医はまた、臨床応答が不適切（毒性の副作用を除く）である場合に、例えば、経口、肺、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）または皮下注射）、吸入（微粉末処方物による）、経皮、鼻腔、膣、直腸、または、舌下の塘路経路によって、より高いレベルが投与されるように処置を調節する方法およびタイミングを認識し、そして、各投与経路に適切な投薬形態で処方し得る（例えば、国際ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ ９３／２５２２１およびＷＯ ９４／１７７８４；ならびに欧州特許出願第６１３，６８３号を参照のこと）。
ＥＣＤ多量体は、処置される患者に対して所望されない副作用を生じさせることなく、治療上有用な作用を与えるのに十分な量で、薬学的に受容可能なキャリア中に含められる。治療上有効な濃度は、公知のインビトロおよびインビボの系（例えば、本明細書において提供されるアッセイ）において化合物を検査することにより、経験的に決定され得る。
組成物中のＥＣＤ多量体の濃度は、複合体の吸収、不活性化および排泄速度、複合体の物理化学的特徴、投薬計画、ならびに、投与される量、そして、当業者に公知の他の要因に依存する。
疾患または状態（例えば、癌、自己免疫疾患および感染）の処置のために投与されるＥＣＤ多量体の量は、標準的な臨床技術によって決定され得る。さらに、最適な投薬範囲の同定を補助するために、インビトロアッセイおよび動物モデルが用いられ得る。経験的に決定され得る正確な投薬量は、投与経路および疾患の重篤度に依存し得る。投与のための適切な投薬範囲は、約０．０１ｐｇ／体重１ｋｇ〜１ｍｇ／体重１ｋｇの範囲であり得、より代表的には、患者の体重１ｋｇあたり０．０５ｍｇ〜２００ｍｇのＥＣＤ多量体である。
ＥＣＤ多量体は、一度で投与されても、数回分のより小さな用量に分けられて時間間隔を空けて投与されてもよい。ＥＣＤ多量体は、処置時間の過程（例えば、数時間、数日間、数週間または数ヶ月間）にわたり１以上の用量で投与され得る。いくつかの場合、連続投与が有用である。正確な投薬量と処置期間とは、処置される疾患の関数であり、そして、公知の検査プロトコールを用いて、または、インビボもしくはインビトロの検査データからの外挿によって経験的に決定され得ることが理解される。濃度および投薬量の値はまた、状態の重篤度が軽減されるにつれ変化し得ることにも注意すべきである。任意の特定の被験体について、個人の必要性と、組成物の投与を行うかもしくは管理する人物の専門的な判断によって、特定の投薬レジメンが、経時的に調節されるべきであり、そして、本明細書において示される濃度範囲は、単なる例示に過ぎず、組成物および組成物を含む組合せの範囲もしくは使用を制限することは意図されないことがさらに理解されるべきである。
Ｉ．ＥＣＤ多量体を用いた例示的な処置方法
疾患および状態のためのＥＣＤ多量体およびＥＣＤ多量体の混合物を用いて処置する方法が本明細書中に提供される。ＨＥＲ ＥＣＤ多量体を含むＥＣＤ多量体は、ＣＳＲ（ＲＴＫ、および特に、本明細書中に記載されるものを含めてタンパク質のＨＥＲファミリーを含む）を伴う種々の疾患および状態の処置において使用され得る。ＣＳＲのシグナル伝達は、種々の疾患および障害の病因に関与しており、そして、任意のこのような疾患または障害は、本明細書において提供されるＥＣＤ多量体による処置が企図される。本明細書において提供されるＥＣＤ多量体を用いた処置としては、新脈管形成に関連する疾患および状態（眼の疾患、アテローム性動脈硬化症、癌および血管損傷、神経変性性疾患（アルツハイマー病を含む））、炎症性の疾患および状態（アテローム性動脈硬化症を含む）、細胞増殖に関連する疾患および状態（癌を含む）、および、平滑筋細胞に関連する状態、ならびに、種々の自己免疫疾患の処置が挙げられるがこれらに限定されない。例示的な処置および前臨床研究は、ＲＴＫ媒介性（特に、ＨＥＲ媒介性）の疾患および障害のＥＣＤ多量体による処置および治療について記載されている。他のＣＳＲ媒介性の疾患および障害（例えば、ＲＡＧＥ媒介性の疾患および障害が挙げられるがこれらに限定されない）の例示的な処置もまた記載される。このような記載は、例示のみを意図し、特定のＥＣＤ多量体に限定されることは意図されない。処置は、分子処方物に適切な経路によって投与することによって達成され得、この分子処方物は、組成物中にポリペプチドとして提供され得、そして、標的化された送達のために標的化因子に連結されても、リポソームのような送達ビヒクル中に被包されても、裸の核酸として送達されても、またはベクター中で送達されてもよい。特定の処置および投薬量は、当業者によって決定され得る。処置を評価する際に考慮すべき点としては、処置される疾患、疾患の重篤度および経過、分子が予防目的で投与されるのか治療目的で投与されるのか、以前の治療、患者の臨床上の病歴、および、治療に対する応答、ならびに、主治医の判断が挙げられる。
１．ＨＥＲ媒介性の疾患もしくは障害
ＨＥＲ（ＥｒｂＢ）に関連する疾患またはＨＥＲレセプター媒介性の疾患は、ＨＥＲレセプターおよび／またはリガンドが、病因、病理もしくはその発症のある局面において関与している、あらゆる疾患、状態もしくは障害である。具体的には、関与としては、例えば、ＨＥＲレセプターファミリーメンバーまたはリガンドの発現、過剰発現または活性が挙げられる。疾患としては、癌（例えば、膵臓癌、胃癌、頭頚部癌、子宮頸部癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、前立腺癌、食道癌、卵巣癌、子宮癌、神経膠腫、膀胱癌または乳癌であるが、これらに限定されない）を含む増殖性疾患が挙げられるがこれらに限定されない。他の状態としては、細胞の増殖および／または遊走を伴う状態（病理学的な炎症応答を伴う状態、非悪性の過増殖性疾患（眼の状態、皮膚の状態など）、平滑筋細胞の増殖および／または遊走から生じる状態（再狭窄を含めた狭窄、アテローム性動脈硬化症、膀胱、心臓もしくは他の筋肉の筋肥厚など）を含む）が挙げられる。本明細書において提供されるＨＥＲ ＥＣＤ多量体を用いて処置され得る他の疾患としては、ＨＥＲファミリーレセプターまたはそのリガンドによって媒介されるあらゆる疾患または障害が挙げられ、これには、攻撃性（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅｎｅｓｓ）、成長遅延（ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ）、精神分裂病、ショック、パーキンソン病、アルツハイマー病、うっ血性心筋症、子癇前症、神経系疾患および心不全が挙げられるがこれらに限定されない。このような疾患もしくは処置の例は、以下に示される。

ａ．癌
上述のように、ＨＥＲファミリーレセプターは、種々のヒトの癌において頻繁に発現されており、その発現は、多くの癌の病理と関連している。例えば、ＨＥＲシグナル伝達の過活性化または調節異常は、異常な細胞の活性化（細胞の増殖、新脈管形成、および遊走、ならびに、腫瘍形成に関連する浸潤を含む）をもたらし得る。いくつかの機構が、ＨＥＲファミリーレセプターのシグナル伝達の調節異常を説明し得、これらの機構としては、リガンドの過剰産生、レセプターの過剰産生、または、レセプターの構成的な活性化が挙げられるがこれらに限定されない。癌および他の疾患におけるその役割に起因して、ＨＥＲレセプターは、治療薬の標的となる。しかしながら、ＨＥＲファミリーメンバーの共発現は、しばしば、このような治療薬の応答の欠如、または、代替的なＨＥＲファミリーメンバーの代償性のアップレギュレーションによる耐性の発生をもたらす。したがって、本明細書中に提供されるＨＥＲ ＥＣＤ多量体は、癌、特に、２以上の細胞表面レセプターの共発現によって特徴付けられるかまたは関連付けられる癌に対する代替的な処置として使用され得る。
ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４のＥＣＤの全体もしくは一部分を含むＥＣＤ多量体は、癌の処置において使用され得る。一局面では、本発明は、ヘテロ多量体とホモ多量体との混合物を含む薬学的組成物の治療上有効な量を投与することによって種々のタイプの癌、炎症性疾患、新脈管形成疾患を処置するための方法を提供し、ここで、ヘテロ多量体は、ＨＥＲ１に由来するＥＣＤもしくはその一部分と、ＨＥＲ３に由来する別のＥＣＤもしくはその一部分とを含み、ホモ多量体は、ＨＥＲ１に由来するＥＣＤもしくはその一部分、またはＨＥＲ３に由来するＥＣＤもしくはその一部分を含む。いくつかの場合、癌は、膵臓癌、胃癌、頭頚部癌、子宮頸部癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、前立腺癌、食道癌、卵巣癌、子宮癌、神経膠腫、膀胱癌、腎臓癌または乳癌である。他の場合には、処置される疾患は、増殖性疾患である。このような増殖性疾患の非限定的な例としては、平滑筋細胞の増殖および／もしくは遊走が挙げられるか、または、眼前部の疾患であるか、または、糖尿病性網膜症もしくは乾癬である。他の場合には、処置される疾患は、再狭窄、眼障害、狭窄、アテローム性動脈硬化症、血管肥厚による高血圧、膀胱疾患および閉塞性気道疾患である。
本明細書において処置される癌の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫および白血病または悪性リンパ球。このような癌のさらなる例としては、以下が挙げられる：扁平上皮細胞癌（例えば、上皮有棘細胞癌）、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、および肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌（胃腸癌を含む）、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、食道癌、神経膠腫、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌、陰茎癌、ならびに、頭頚部癌。ＨＥＲ ＥＣＤ多量体と共に、併用治療薬が使用され得、これらの治療薬としては、抗ホルモン化合物、心保護剤（ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ）、抗癌剤（例えば、化学療法剤および増殖阻害剤）、および本明細書中に記載されるような任意の他のものが挙げられる。
ＨＥＲ ＥＣＤ多量体で処置可能な癌は、一般に、少なくとも１つのＨＥＲレセプター、代表的には、１以上のＨＥＲレセプターを発現する癌である。このような癌は、ＨＥＲの発現を検出するための当該分野で公知の任意の手段によって同定され得る。例えば、ＨＥＲ２の発現は、利用可能な診断／予後アッセイ（ＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴ．ＲＴＭ．（Ｄａｋｏ）を含む）を用いて評価され得る。腫瘍生検からのパラフィン包埋組織切片を、ＩＨＣアッセイに供し、そして、ＨＥＲ２タンパク質染色の強度基準と適合させる。閾値スコア未満と適合される腫瘍は、ＨＥＲ２を過剰発現しないものとして特徴付けられ得るのに対して、閾値以上のスコアを持つ腫瘍は、ＨＥＲ２を過剰発現するものとして特徴付けられ得る。処置の一例において、ＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍は、ＨＥＲ ＥＣＤ多量体（例えば、本明細書中に提供される任意のＨＥＲ ＥＣＤ多量体）を用いた処置の候補として評価される。
ｂ．新脈管形成
新脈管形成は、既存の血管からの新規血管の調節された形成を伴うプロセスであり、この新規血管は、しばしば、腫瘍に栄養を与え、癌の転移を促進するものである。ＶＥＧＦの産生は、新脈管形成と癌細胞の遊走に必須の因子である。ＨＥＲファミリーレセプターによるＥＧＦおよびＴＧＦ−αのシグナル伝達を含む多数の因子が、ＶＥＧＦの発現を誘導する。実際、ＨＥＲ１およびＨＥＲ２の両方が、新脈管形成に関与する癌関連遺伝子である（Ｙａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｉｎｔ．Ｃａｎ．Ｔｈｅｒ．，５：９−２９）。ＨＥＲファミリーレセプターはまた、内皮細胞において差次的に発現される。例えば、正常な内皮細胞においては、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４が発現されるが、腫瘍由来の内皮細胞においては、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２およびＨＥＲ４が発現される（Ａｍｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６：２１７３−８０）。したがって、正常細胞と比較すると、腫瘍由来の内皮細胞は、ＨＥＲ３の発現の喪失と、ＨＥＲ１の発現の獲得とを有し、これは、ＶＥＧＦの産生および新脈管形成の促進におけるＥＧＦに対する内皮細胞の反応性と一致している。
本明細書において提供されるＥＣＤ多量体などによるＨＥＲファミリーレセプターの標的化は、新脈管形成の処置として使用され得る。インビトロもしくはインビボのアッセイが、新脈管形成に対するＥＣＤ多量体の影響を評価するために使用され得る。例えば、脈管形成因子ＶＥＧＦを分泌するヒト乳癌由来のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が、ＥＣＤ多量体が脈管形成因子の産生と拮抗し得るかどうかを決定するために調べられ得る。さらに、これらの細胞の上清において産生される脈管形成因子の活性、または、ＥＣＤ多量体の存在下もしくは非存在下における組換え脈管形成因子の存在下での脈管形成因子の活性は、ヒト臍帯静脈内非細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖についてアッセイすることによって調べられ得る。増殖性のＨＵＶＥＣ中に［３Ｈ］−チミジンを組み込んだＨＵＶＥＣは、ＥＣＤ多量体の存在下で増殖が軽減されるかどうかを決定するために比較され得る。
ｃ．ニューレグリン関連疾患
ニューレグリン（ＮＲＧ）は、４つの異なる遺伝子によってコードされるリガンド（ＮＲＧ１〜４）の複雑な組である。これらの分子のうちいくつかは、遊離リガンド（ＮＲＧ細胞外ドメインから構成される）のような膜貫通型の前駆体形態において活性であると考えられる。ＮＲＧの膜貫通型形態および遊離形態は、ＨＥＲ１〜４レセプターを介してその生物学的作用を発揮する。これらのリガンドは、神経筋シナプスの発生、ニューロン−グリア相互作用、ならびに、心臓の発生および機能を調節する細胞の相互作用において役割を担う。ＨＥＲ１〜４の細胞外ドメインに由来する治療薬（例えば、ＨＥＲファミリーのリガンド結合ドメインを含む単量体分子、ホモ二量体分子およびヘテロ二量体分子）は、疾患（例えば、少なくとも１つのＮＲＧに対する曝露に関連する（例えば、この曝露によって引き起こされるかまたは増大される）神経学的疾患または神経筋疾患）の処置のために使用され得る。一実施形態では、疾患は、ＮＲＧ１（ＮＲＧ１のタイプＩ、ＩＩおよびＩＩＩを含む、これらは全てＨＥＲ３およびＨＥＲ４に結合する）と関連する。本明細書中に記載されるようなＨＥＲ ＥＣＤ治療薬によって処置され得るＮＲＧに関連する疾患の例としては、アルツハイマー病および精神分裂病が挙げられるがこれらに限定されない。
ＮＲＧが調節異常になっている神経学的疾患の例は、アルツハイマー病であり得る。Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ６２：４２−５４。Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．は、認知的には正常な老齢のヒト、アルツハイマー病患者、および、アルツハイマー病の表現型を発現するダブルトランスジェニックマウスからの海馬において、ＮＲＧ１およびｅｒｂＢキナーゼの発現および分泌を調べた。ＮＲＧ−１およびｅｒｂＢ４の両方の発現が、神経炎症局面内の反応性の細胞要素と特異的に関連しており、オートクリンおよび／またはパラクリンの相互作用が示唆された。本明細書中に記載されるようなＨＥＲ ＥＣＤ多量体は、アルツハイマー病および関連の状態を処置するために使用され得る。ヒトアルツハイマー病について、種々のマウスモデルが利用可能であり、これらのモデルとしては、変異アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウス、および、家族性常染色体優性連鎖ＰＳ１を発現するマウス、および、これらの両方のタンパク質を発現するマウス（ＰＳ１ Ｍ１４６Ｌ／ＡＰＰＫ６７０Ｎ：Ｍ６７１Ｌ）が挙げられる。アルツハイマー病のモデルは、ＨＥＲ ＥＣＤ多量体の注射などによって処置される。プラークの発生は、染色および抗体免疫反応性アッセイを用いた、海馬、内側嗅皮質および大脳皮質における神経炎性局面の観察などによって評価され得る。
精神分裂病は、神経系の深刻でありかつ大部分が解決されていない疾患のままである。全世界の人口のうち推定１％が、この疾患の特徴である重篤な挙動、情動および認知障害に苦しんでいる。現在、この疾患は、診断を補助するための分子マーカーが足りない症候群と考えられている。ＮＲＧと精神分裂病との間の関連性についての証拠は、Ｓｔｅｆａｎｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ７１：８７７−８９２によって最初に示された。より最近のデータは、精神分裂病患者の前頭葉前部の皮質および周縁の白血球に、増加したレベルのＮＲＧ１転写物が存在することを示唆している。Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ９：２９９−３０７；Ｐｅｔｒｙｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １０：３６６−７４。ＮＲＧ１と精神分裂病との間の関係は、特定の神経のシナプスの長期にわたる相乗作用のＮＲＧ１による逆転に関連付けられ得る。Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２５：９３７８−８３。本明細書中に記載されるようなＨＥＲ ＥＣＤ多量体は、精神分裂病を処置するために使用され得る。
ｄ．平滑筋の増殖に関連する疾患および状態
ＨＥＲ ＥＣＤ多量体は、ヒトのような哺乳動物における平滑筋細胞の増殖を伴う種々の疾患および状態の処置に利用され得る。例は、脈管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の増殖を伴い、心内膜の過形成（例えば、脈管狭窄）、血管形成術もしくは外科手術もしくはステント移植物から生じる再狭窄、アテローム性動脈硬化症および高血圧へとつながる、心疾患の処置である。このような状態において、放出された種々の細胞およびサイトカインの相互作用は、オートクライン、パラクリンまたはジャクスタクリンの様式で機能し、その正常な位置から、損傷を受けた内膜へのＶＳＭＣの遊走をもたらす。遊走したＶＳＭＣは、過度に増殖し、そして、内膜の肥厚をもたらし、これが、結果として血管の狭窄または閉塞を生じる。この問題は、病巣部位における血小板の凝集と堆積によって構成される。多機能性セリンプロテアーゼであるα−トロンビンは、脈管の損傷部位において濃縮され、ＶＳＭＣの増殖を刺激する。このレセプターの活性化の後に、ＶＳＭＣは、種々のオートクリン増殖因子（ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＨＢ−ＥＧＦおよびＴＧＦを含む）を産生および分泌する。ＥＧＦＲは、シグナル伝達カスケードに関与し、最終的には、繊維芽細胞とＶＳＭＣの遊走および増殖をもたらし、ならびに、ＶＳＭＣを刺激して、内皮細胞に対して有糸分裂促進性である種々の因子を分泌させ、そして、内皮細胞における化学走性応答を誘導する。ＨＥＲ ＥＣＤ多量体を用いた処置は、このようなシグナル伝達および応答を調節するために使用され得る。
ＨＥＲ２およびＨＥＲ３の一方もしくは両方のＥＣＤの全体もしくは一部分を含むＨＥＲ ＥＣＤヘテロ多量体のようなＨＥＲ ＥＣＤ多量体は、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３のようなＨＥＲが、膀胱ＳＭＣを調節する状態（例えば、下位尿路に影響を及ぼす閉塞性の症候群に応答して生じる膀胱壁の肥厚）を処置するために使用され得る。ＨＥＲ ＥＣＤ多量体は、膀胱平滑筋細胞の増殖の制御、そして、結果として、尿路の閉塞性症候群の予防もしくは処置においても使用され得る。
ＨＥＲ ＥＣＤ多量体は、平滑筋細胞の増殖を伴う基本的な病理を持つ閉塞性気道疾患を処置するために使用され得る。一例は、気道の炎症および気管支収縮において現れる喘息である。ＥＧＦは、ヒトの気道ＳＭＣの増殖を刺激することが示されており、そして、閉塞性気道疾患における気道ＳＭＣの病理学的な増殖に関与する因子であり得る。ＨＥＲ ＥＣＤ多量体は、ＨＥＲ１によるＥＧＦに対する影響および応答を調節するために使用され得る。
２．ＲＴＫ媒介性の障害または疾患
ａ．新脈管形成に関連する眼の状態
ＥＣＤ多量体（ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＴＩＥ／ＴＥＫ、ＦＧＦ、ＥＧＦＲおよびＥｐｈＡのＥＣＤもしくはその一部分の１以上を含むものが挙げられるがこれらに限定されない）は、新脈管形成に関連する眼の疾患および状態（新生血管形成を伴う眼の疾患を含む）の処置において使用され得る。眼の血管新生疾患は、網膜または角膜のような眼の構造中への新しい血管の浸潤によって特徴付けられる。これは、失明の最も一般的な原因であり、そして、約２０の眼の疾患に関与している。加齢性黄斑変性において、付随する視覚上の問題は、ブルーフ膜における傷を通る脈絡膜毛細血管の内殖と、網膜色素上皮下にある線維性の管状組織の増殖によって引き起こされる。脈管形成による損傷はまた、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障および水晶体後線維増殖症にも付随する。角膜の新生血管形成を伴う他の疾患としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズの使い過ぎ、アトピー性角膜炎、上辺縁角膜炎、翼状乾性角結膜炎、シェーグレン病、酒さ性ざ瘡、フィレクテヌローシス（ｐｈｙｌｅｃｔｅｎｕｌｏｓｉｓ）、梅毒、マイコバクテリア感染、脂質変性、化学物質による熱傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純疱疹感染、帯状疱疹感染、原虫感染、カポジ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン辺縁変性、辺縁角質溶解、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性動脈炎、外傷、ウェゲナー類肉腫症、強膜炎、スティーブンズ−ジョンソン病、類天疱瘡外側角膜切開術および角膜移植片拒絶。網膜／脈絡膜の新生血管形成を伴う疾患としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：糖尿病性網膜症、黄斑変性、鎌状赤血球貧血、類肉腫、梅毒、弾性線維性仮性黄色腫、パジェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、頚動脈閉塞性疾患、慢性ブドウ膜炎／硝子体炎、マイコバクテリア感染、ライム病、全身性エリテマトーデス、未熟児網膜症、イールズ病、ベーチェット病、網膜炎もしくは脈絡膜炎を引き起こす感染、推定眼ヒトプラスマ症、ベスト病、近視、視神経乳頭外側部の限局性陥没、シュタルガルト病、周縁部ブドウ膜炎（ｐａｒｓ ｐｌａｎｉｔｉｓ）、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、トキソプラスマ症、外傷およびレーザ照射後の合併症。他の疾患としては、皮膚潮紅（角の新生血管形成）を伴う疾患、および、線維性血管もしくは線維性組織の異常な増殖により引き起こされる疾患（増殖性硝子体網膜症のあらゆる形態を含む）が挙げられるがこれらに限定されない。
眼の疾患の処置などにおける新脈管形成に対するＥＣＤ多量体治療薬の作用は、本明細書中に記載されるような、動物モデルにおいて（例えば、角膜移植物において）評価され得る。例えば、ＲＴＫにより媒介されるような新脈管形成の調節は、ヌードマウスにおける類表皮Ａ３４１腫瘍、およびヌードマウスに移植したＶＥＧＦもしくはＰＩＧＦ形質導入ラットＣ６神経膠腫のようなヌードマウスモデルにおいて評価され得る。ＥＣＤ多量体は、タンパク質として局所的もしくは全身性に注射され得る。腫瘍は、腫瘍阻害の表現型（血管分布が乏しく白色に近い腫瘍、壊死、増殖の低下、および、腫瘍細胞のアポトーシスの増加を含む）を観察するために、コントロール処置モデルとＥＣＤ多量体処置モデルとの間で比較され得る。
ＴＩＥ／ＴＥＫ ＥＣＤの全体もしくは一部分を含むＥＣＤヘテロ多量体で処置され得る眼の障害の例は、眼の新生血管形成によって特徴付けられる眼の疾患であり、この疾患としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：糖尿病性網膜症（糖尿病の主要な合併症）、未熟児網膜症（しばしば慢性の視覚上の問題につながり、高いリスクの失明をもたらすこの破壊的な眼の状態は、早産の乳児の看護中の重篤な合併症である）、血管新生緑内障、網膜芽腫、水晶体後線維増殖症、皮膚潮紅、ブドウ膜炎、黄斑変性および角膜移植片新生血管形成。他の眼の炎症性疾患、眼の腫瘍、および脈絡もしくは虹彩の新生血管形成を伴う疾患もまた、ＴＩＥ／ＴＥＫ ＥＣＤ多量体で処置され得る。
ＰＤＧＦＲ ＥＣＤの全体もしくは一部分を含むＥＣＤヘテロ多量体はまた、増殖性硝子体網膜症の処置において使用され得る。ウサギの結膜線維芽細胞（ＲＣＦ）が、眼の硝子体部分に注射され得る。例えば、ウサギ動物モデルにおいて、約１×１０５個のＲＣＦが、ガスによる硝子体切除術（ｇａｓ ｖｉｔｒｅｏｍｙ）によって注射される。ＥＣＤ多量体の局所性もしくは全身性の投与が、同じ日に注射され得る。増殖性硝子体網膜症に対する作用（例えば、疾患の症状の減少）は、例えば、外科手術後２〜４週間にわたって観察され得る。
ＥｐｈＡ ＥＣＤの全体もしくは一部分を含むＥＣＤヘテロ多量体は、（例えば、眼の疾患における）誤って調節されたか、そして／もしくは、不適切な新脈管形成を伴う疾患または状態を処置するために使用され得る。例えば、ＥｐｈＡ ＥＣＤ多量体は、エフリンＡ−１誘導性の新脈管形成に対する作用について、マウス角膜モデルのような動物モデルにおいて評価され得る。エフリンＡ−１を単独でまたはＥＣＤ多量体と共に含むヒドロン（ｈｙｄｒｏｎ）ペレットが、マウスの角膜内に移植される。新脈管形成のＥＣＤ多量体による阻害もしくは減少を観察するために、移植後の数日にわたり視覚的な観察が行われる。
ｂ．新脈管形成に関連するアテローム性動脈硬化症
ＲＴＫ ＥＣＤ多量体（例えば、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）ＥＣＤの全体もしくは一部分、またはＴＩＥ／ＴＥＫ ＥＣＤの全体もしくは一部分の一方または両方を含むＥＣＤヘテロ多量体）は、アテローム性動脈硬化症プラークの新生血管形成のような、アテローム性動脈硬化症に関連する新脈管形成状態を処置するために使用され得る。血管管腔内に形成されるプラークは、脈管形成の刺激活性を有することが示されている。ヒトの冠状動脈アテローム性動脈硬化症病巣におけるＶＥＧＦの発現は、ヒト冠状動脈アテローム性動脈硬化症の進行と関連している。
動物モデルは、アテローム性動脈硬化症の処置においてＥＣＤ多量体を評価するために使用され得る。アポリポタンパク質−Ｅ欠損マウス（ＡｐｏＥ−／−）は、アテローム性動脈硬化症になる傾向がある。このようなマウスは、５週齢、１０週齢および２０週齢から開始して例えば５週間にわたる期間にわたって、ＥＣＤ多量体（例えば、ＶＥＧＦＲ ＥＣＤ多量体）を注射することによって処置される。大動脈根における病巣は、アイソフォームで処置したマウスにおけるアテローム性動脈硬化症病巣の減少を観察するために、コントロールのＡｐｏＥ−／−マウスと、アイソフォームで処置したＡｐｏＥ−／−マウスとの間で評価される。
ｃ．さらなる新脈管形成に関連する処置
ＲＴＫ ＥＣＤ多量体（例えば、ＶＥＧＦＲ ＥＣＤの全体もしくは一部分、または、ＥｐｈＡ ＥＣＤの全体もしくは一部分を含むＥＣＤヘテロ多量体）はまた、慢性関節リウマチ（ＲＡ）において存在するような滑膜細胞の増殖、炎症性細胞の浸潤、軟骨の破壊、および、パンヌスの形成のような脈管形成および炎症に関連する状態を処置するために使用され得る。ＩＩ型コラーゲン誘導性関節炎の自己免疫モデル（例えば、マウスにおいて誘導した多関節関節炎）は、ヒトＲＡについてのモデルとして使用され得る。タンパク質の局部注入などによりＥＣＤ多量体で処置されたマウスは、関節炎の症状の減少（脚の腫れ、紅斑、および関節強直を含む）について観察され得る。滑膜新脈管形成および滑膜炎症の減少もまた観察され得る。新脈管形成は、ＲＡにおけるパンヌスの形成および維持において重要な役割を担う。ＥＣＤ多量体は、新脈管形成を調節するために、単独で、そして、他のアイソフォームおよび他の処置と組み合わせて使用され得る。例えば、新脈管形成インヒビターが、ＲＡを処置するために、ＥＣＤ多量体と組み合わせて使用され得る。例示的な新脈管形成インヒビターとしては、アンジオスタチン、抗脈管形成性アンチトロンビンＩＩＩ、カンスタチン（ｃａｎｓｔａｔｉｎ）、軟骨由来インヒビター、フィブロネクチンフラグメント、ＩＬ−１２、バスキュロスタチン（ｖａｓｃｕｌｏｓｔａｔｉｎ）および当該分野で公知の他のものが挙げられるがこれらに限定されない（例えば、Ｐａｌｅｏｌｏｇ（２００２）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｈｅｒａｐｙ ４（補遺３）Ｓ８１−Ｓ９０を参照のこと）。
ＥＣＤ多量体（例えば、ＶＥＧＦＲ ＥＣＤ多量体を含む）での処置に馴染む他の新脈管形成に関連する状態としては、血管腫が挙げられる。小児の最も頻繁に起こる新脈管形成疾患の一つが、血管腫である。多くの場合、腫瘍は良性であり、そして、介入なしで退行する。より重篤な症例においては、腫瘍は、大きく、海綿状でかつ浸潤性の形態へと進行し、そして、臨床上の合併症を生じる。血管腫の全身的な形態である、血管腫症は、高い死亡率を有する。処置できないか、または、現在使用中の治療薬では処置困難な血管腫の多くの症例が存在する。
ＥＣＤ多量体（例えば、ＶＥＧＦＲ ＥＣＤ多量体）は、Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ−Ｒｅｎｄｕ病または遺伝性出血性毛細管拡張症のような、新脈管形成が損傷を担うような疾患および状態の処置において使用され得る。これは、多発性の小さな血管腫、血管もしくはリンパ管の腫瘍によって特徴付けられる遺伝性の疾患である。血管腫は、皮膚および粘膜において見られ、しばしば、鼻出血（鼻血）または胃腸出血を、そして、ときどき、肺もしくは肝臓の動静脈フィステルを伴う。所望されない血管透過性によって特徴付けられる疾患および障害はまた、ＥＣＤ多量体によって処置され得る。これらとしては、脳腫瘍に伴う浮腫、悪性疾患に伴う腹水、メージュ症候群、肺の炎症、ネフローゼ症候群、心膜滲出および胸膜滲出が挙げられる。
新脈管形成はまた、生殖および創傷治癒のような正常な生理学的プロセスにおいても関与している。新脈管形成は、排卵において、そしてまた、授精後の胞胚の着床においても重要な段階である。ＥＣＤ多量体（例えば、ＶＥＧＦＲ ＥＣＤの全体もしくは一部分を含むＥＣＤヘテロ多量体）による新脈管形成の調節は、無月経を誘導するか、排卵をブロックするか、または、胞胚による着床を防止するために使用され得る。ＥＣＤ多量体はまた、外科処置において使用され得る。例えば、創傷治癒において、過剰な修復または線維増殖は、外科処置の有害な副作用であり得、そして、これは、新脈管形成によって引き起こされ得るか、または、悪化され得る。癒着は、外科手術の頻繁に起こる合併症であり、そして、小腸閉塞のような問題をもたらす。
新脈管形成に関連する疾患および状態の処置において有用なＲＴＫ ＥＣＤ多量体はまた、例えば、ＲＴＫ関連経路における他のシグナル伝達分子と相互作用する（ＶＥＧＦＲリガンドまたは他の増殖因子リガンドの調節を含む）抗新脈管形成性の薬物、分子と共に、併用療法において使用され得る。例えば、公知の抗リウマチ薬であるブシラミン（ＢＵＣ）は、その作用機構内に、滑膜細胞によるＶＥＧＦ産生の阻害を含むことが示された。ＢＵＣの抗リウマチ作用は、滑膜細胞によるＶＥＧＦ産生の阻害を通じて、関節炎の滑膜における新脈管形成および滑膜細胞の増殖を抑制することによって媒介される。ＥＧＦ多量体とこのような薬物との併用療法は、処置のための複数の作用機構と作用部位とを可能にし得る。
ｄ．癌
ＴＩＥ／ＴＥＫ、ＶＥＧＦＲ、ＭＥＴおよびＦＧＦＲのアイソフォームのようなＲＴＫアイソフォームは、癌の処置において使用され得る。ＲＴＫアイソフォーム（ＶＥＧＦＲアイソフォーム（例えば、Ｆｌｔ１アイソフォーム）、ＦＧＦＲアイソフォーム（例えば、ＦＧＦＲ４アイソフォーム）およびＥｐｈＡ１アイソフォームが挙げられるがこれらに限定されない）は、癌を処置するために使用され得る。本明細書において処置される予定の癌の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫および白血病または悪性リンパ球。このような癌のさらなる例としては、以下が挙げられる：扁平上皮細胞癌（例えば、上皮有棘細胞癌）、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、および肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌（胃腸癌を含む）、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、食道癌、神経膠腫、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌、陰茎癌、ならびに、頭頚部癌。
例えば、ＴＩＥ／ＴＥＫ ＥＣＤの全体もしくは一部分を含むＥＣＤヘテロ多量体は、腫瘍に関連する新脈管形成を調節するなどによって、癌の処置において使用され得る。血管新生は、癌の増殖および拡大の調節に関与する。例えば、新脈管形成および新生血管形成の阻害は、腫瘍の増殖および拡大を阻害する。Ｔｉｅ２のようなＴｉｅ／Ｔｅｋレセプターは、正常組織および癌組織における血管の発生に影響を及ぼすことが示されている。ＴＩＥ／ＴＥＫ ＥＣＤ多量体は、腫瘍の新脈管形成のインヒビターとして使用され得る。新脈管形成に対する作用は、例えば、ラット角膜のマイクロポケット内に外科的に移植されるヒドロンペレット中の馴化培地として、または、ウィンドウチャンバ（ｗｉｎｄｏｗ ｃｈａｍｂｅｒ）に投与される精製タンパク質（例えば、１００μｇ／投薬）として処方されるＴＩＥ／ＴＥＫ ＥＣＤ多量体を用いて、ラット角膜を処置するなどによって、動物モデルにおいて監視され得る。例えば、無血管の角膜を持つＦ３４４ラットのようなラットモデルは、新脈管形成を誘導するために、腫瘍細胞の馴化培地と組み合わせて、または、眼のウィンドウチャンバ内に腫瘍のフラグメントを移植することによって使用され得る。角膜は、腫瘍細胞の馴化培地によって誘導される新脈管形成の阻害を検出するために、組織学的に検査され得る。ＴＩＥ／ＴＥＫ ＥＣＤ多量体はまた、固形腫瘍（原発性および転移性の肉腫および癌腫を含む）のような、悪性かつ転移性の状態を処置するために使用され得る。
ＦＧＦＲ４ ＥＣＤの全体もしくは一部分を含むＥＣＤヘテロ多量体は、癌、例えば、下垂体腫瘍を処置するために使用され得る。動物モデルは、ヒト下垂体腫瘍の進行を模倣するために使用され得る。例えば、トランスジェニックマウスにおいて発現されるＦＧＦＲのＮ末端短縮形態であるｐｔｄ−ＦＧＦＲ４は、下垂体の腫瘍形成（持続的かつ充実の過形成がない、下垂体腺腫の形成を含む）を再現する（Ｅｚｚａｔ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：６９−７８）。ＦＧＦＲ４ ＥＣＤ多量体は、ｐｔｄ−ＦＧＦＲ４マウスに投与され得、そして、下垂体の構造および腫瘍進行の過程が、コントロールマウスと比較され得る。
３．他のＣＳＲ媒介性の疾患または障害
また、非ＲＴＫ ＣＳＲ（例えば、ＴＮＦＲまたはＲＡＧＥであるが、これらに限定されない）の成分のうち少なくとも１つを含むＥＣＤヘテロ多量体を用いた疾患の処置が本明細書中に提供される。例えば、ＲＡＧＥの少なくともＥＣＤの全体もしくは一部分を含むＥＣＤ多量体は、糖尿病に関連する疾患および状態（歯周疾患、自己免疫疾患、血管疾患および尿細管間質性疾患を含む）を処置するために使用され得る。ＲＡＧＥ ＥＣＤ多量体を用いた処置としてはまた、眼の疾患（黄斑変性を含む）、心血管疾患、神経変性疾患（アルツハイマー病を含む）、炎症性の疾患および状態（慢性関節リウマチを含む）、ならびに、細胞増殖を伴う疾患および状態（癌を含む）の処置が挙げられる。別の例では、レセプターのＴＮＦＲファミリーの少なくともＥＣＤの全体もしくは一部分を含むＥＣＤ多量体は、慢性関節リウマチ、クローン病、自己免疫疾患、リウマチ性疾患、炎症性腸疾患、アルツハイマー病および他の疾患（特に、炎症性疾患）を処置するために使用され得る。
４．ＥＣＤ多量体のＥＣＤポリペプチド成分の選択
ＥＣＤ多量体の成分の決定は、選択された疾患の処置の際にどのＥＣＤ多量体分子を使用するかを決定するときの考慮点である。疾患もしくは障害の処置のためのＥＣＤヘテロ多量体を合理的に設計するために、いくつかの要因が、経験的に決定され得る。第一に、処置されるべき疾患が同定されるべきである。代表的には、このような疾患は、例えば、疾患の病因に寄与する複数のＣＳＲ（ＲＴＫおよび特にＨＥＲを含む）の過剰発現に起因して、単一のレセプターを標的とする治療に対して抵抗性を示す疾患である。第二に、疾患の病因に関与する１以上のＣＳＲまたはＣＳＲのリガンドが同定され得る。このようなＣＳＲまたはリガンドは、ＥＣＤ多量体が、ＣＳＲまたはそのリガンドの活性を調節する（代表的には、阻害する）ように設計されるように設計されたＥＣＤ多量体の標的であり得る。したがって、ＥＣＤ多量体は、成分として、ＣＳＲとの二量体化に十分な標的ＣＳＲのＥＣＤの全体もしくは一部分、および／または、標的ＣＳＲリガンドへの結合に十分なＥＣＤの全体もしくは一部分を含む。当業者は、選択された疾患の病因に関与するＣＳＲ（ＲＴＫまたはＨＥＲファミリーレセプターを含む）および／またはそのリガンドを知っているか、または、同定することが可能である。例えば、いくつかの例示的な疾患および障害に対するＣＳＲの寄与は上述される。第三に、リガンドへの結合および／または同系もしくは相互作用性のＣＳＲとの二量体化に十分なＥＣＤの成分が決定され得る。例示的なＥＣＤ分子のこのような部分は、本明細書中に記載されるか、あるいは、当業者に公知であるか、または、例えば、関連するレセプターとのアラインメントに基づいて、および／もしくは、リガンド結合アッセイと組み合わせて組換えＤＮＡ技術を用いることなどによって、当業者によって合理的に決定され得る。少なくとも２以上の同定された標的ＣＳＲのＥＣＤの全体もしくは一部分が、例えば、その個別の多量体化ドメインへの連結などによって多量体を形成するために、直接的もしくは間接的に連結され得る。いくつかの場合、多量体は、個別の成分を連結するために使用される方法に依存して、二量体またはより高次の多量体であり得る。したがって、結果として生じるＥＣＤ多量体は、選択された疾患を処置するための候補治療薬となる。
例えば、ＨＥＲ１のようなＨＥＲレセプターは、種々の癌（ＨＥＲ１が過剰発現される癌（すなわち、結腸直腸癌、頭頚部癌、前立腺癌、膵臓癌、肝臓癌、肺癌、腎細胞癌、乳癌、食道癌、卵巣癌、子宮頸部／子宮癌、神経膠腫、膀胱癌など）が挙げられるがこれらに限定されない）に関与している。したがって、癌を処置する機構としてＨＥＲ１のシグナル伝達を標的とするために、成分としてＨＥＲ１ ＥＣＤの全体もしくは一部分を有するＥＣＤ多量体が設計され得る。ヘテロ多量体の設計において、別のＣＳＲ分子（これもまた選択された疾患に関与している）が同定され得、そして、ヘテロ多量体の第二のポリペプチド成分として使用され得る。例えば、他のＨＥＲレセプターおよびそのリガンドが、種々の癌において過剰発現されるか、または、種々の癌に関与している。例えば、ＨＥＲ１と同様に、ＨＥＲ３は、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝臓癌および食道癌において過剰発現される。したがって、種々の癌の処置のための候補ＥＣＤ治療薬は、ＨＥＲ１のＥＣＤの全体もしくは一部分と、ＨＥＲ２のＥＣＤの全体もしくは一部分とのヘテロ多量体であるものである。第二の例では、選択される疾患は新脈管形成であり得る。当業者は、ＶＥＧＦＲ１およびＲＡＧＥが共に、血管形成の病因に関与することを知っている。したがって、ヘテロ多量体は、ＶＥＧＦＲ１のＥＣＤの全体もしくは一部分とＲＡＧＥのＥＣＤの全体もしくは一部分とを含む候補治療薬として設計され得る。
５．患者の選択
先に述べたように、種々の疾患および障害が、例えば、リガンドの過剰産生、レセプターの過剰産生、または、レセプターの構成的な活性化に起因した、ＣＳＲ（特に、ＨＥＲファミリーレセプター）の不適切な活性化により引き起こされる。しばしば、本明細書において提供されるＥＣＤ多量体のような薬物または分子に対する患者の応答は、その薬物または分子が標的とするＣＳＲまたはリガンドの相対的な発現に根拠を置かれ得る。したがって、所望される場合、疾患もしくは障害の処置の前に、患者は、本明細書において提供されるＥＣＤ多量体による処置に対し増加した応答性を有すると予測される患者を選択するために、リガンドまたはＣＳＲの発現についてアッセイされ得る。例えば、ＥＣＤ多慮付帯が、少なくとも１つのＨＥＲ１レセプターを標的とする場合、患者は、ＨＥＲ１の発現について検査され得る。別の例において、処置されるべき疾患が特定のリガンドによって媒介されることが知られている場合、患者は、そのリガンドを標的とするＥＣＤ多量体を用いた処置の前に、リガンドの発現についてアッセイされ得る。患者サンプル（すなわち、血液、血清、腫瘍、組織、細胞または他の供給源）中のリガンドまたはＣＳＲの発現は、ＣＳＲもしくはリガンドのレベルが上昇した患者を選択するために、コントロールまたは正常なサンプルと比較され得る。このような患者の選択は、患者のほとんどが所与の治療に対して応答すると予測された集団の部分集団の処置を確実なものとし得る。
一局面では、ＣＳＲの発現は、患者において評価され得る。一例では、発現は、（例えば、免疫組織化学アッセイ；ＩＨＣによって）組織または細胞の表面に存在するＣＳＲタンパク質のレベルの増加を評価することによって、診断アッセイまたは予後アッセイにおいて決定され得る。あるいは、もしくはさらに、細胞におけるＣＳＲをコードする核酸のレベルは、例えば、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；ＷＯ ９８／４５４７９を参照のこと）、サザンブロッティング、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ））によって評価され得る。さらに、ＣＳＲの過剰発現は、血清のような生物学的流体中に流れる（ｓｈｅｄ）抗原（例えば、可溶性ＣＳＲ）を測定することによって評価され得る（例えば、米国特許第４，９３３，２９４号；ＷＯ９１／０５２６４；米国特許第５，４０１，６３８号；Ｓｉａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１３２：７３−８０を参照のこと）。別のアッセイでは、細胞は、患者から単離され、そして、必要に応じて検出可能な標識（例えば、放射性同位体または蛍光標識）で標識されたＣＳＲ特異的抗体に対して曝露され、そして、細胞への抗体の結合がアッセイされ得る。別の例では、患者の細胞は、インビボで抗体に対して曝露され得、そして、抗体の結合が、例えば、放射能の外部からの走査によって、または、以前に抗体に対して曝露された患者から採取した生検を解析することによって、評価され得る。当業者に公知の任意の他のアッセイが、患者におけるＣＳＲのレベルを決定するために使用され得、このようなアッセイは、イムノブロット、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）などであるが、これらに限定されない。いくつかの場合、レセプターのリン酸化形態の発現が増加した患者の選択は、活性型レセプターのレベルが上昇した患者の部分集団を具体的に同定するために使用され得る。ＣＳＲのリン酸化を検出するための種々のアッセイが当該分野で公知であり、このようなアッセイとしては、例えば、抗ホスホチロシン抗体または抗リン特異的ＣＳＲ抗体を用いるイムノブロットまたはＥＬＩＳＡが挙げられるがこれらに限定されない。
いくつかの場合、ＣＳＲリガンドのレベルは、患者の選択の指標として決定され得る。例えば、患者の組織または腫瘍におけるリガンドのレベルは、免疫組織化学（ＩＨＣ，例えば、Ｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１：５４５−５５０を参照のこと）を用いて決定され得る。あるいは、またはされない、サンプル、組織、腫瘍もしくは他の供給源におけるリガンドのレベルは、タンパク質またはこれをコードする核酸を検出するための任意の公知の手順にしたがって決定され得る。この例は、ＥＬＩＳＡ、ＲＴ−ＰＣＲを含むＰＣＲ、フローサイトメトリー、ＦＩＳＨ、サザンブロッティングなどである。さらに、上述のように、ＣＳＲリガンドは、例えば、検出されるべき分子に結合し、検出可能な標識（すなわち、放射性標識）でタグが付けられた分子（例えば、抗体）を投与し、そして、標識の局在について患者を外部から走査することによって、インビボ診断アッセイを用いて評価され得る。例えば、ＴＧＦ−α、ＥＧＦまたはアンフィレグリンのようなＨＥＲファミリーレセプターリガンドが、患者のサンプルにおいて（例えば、血清において）、標準的なＥＬＩＳＡ法（すなわち、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ製などの市販のＥＬＩＳＡ）を用いて、または、ホルマリン固定した原発性腫瘍の切片において免疫組織化学および組織マイクロアレイによってアッセイされ得る（例えば、Ｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５：９１７６を参照のこと）。別の例では、ＲＴ−ＰＣＲは、患者の細胞サンプルにおいて（例えば、腫瘍細胞において）（Ｍａｈｔｏｕｋ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２４：３５１２−３５２４）、または、患者の血液、骨髄もしくはリンパ節において（例えば、これらから単離した単核細胞において）、リガンドの発現を評価するために使用され得る。
６．併用療法
ＲＴＫ ＥＣＤ多量体（ＨＥＲ ＥＣＤ多量体を含む）のようなＥＣＤ多量体は、疾患および状態を処置するために、互いに組み合わせて、そして、他の既存の薬物および治療薬との混合物として用いられ得、相加作用もしくは相乗作用のいずれかである治療効果をもたらす。例えば、本明細書中に記載されるように、多数のＥＣＤ多量体が、新脈管形成に関連する状態および疾患を処置するため、そして／または、腫瘍の増殖を制御するために使用され得る。このような処置は、抗脈管形成性および／または抗腫瘍形成性の薬物および／または治療と組み合わせて行われ得る。併用療法に有用な抗脈管形成性および抗腫瘍形成性の薬物および治療の例としては、チロシンキナーゼインヒビターが挙げられ、そして、チロシンキナーゼシグナル伝達を調節し得る分子（４−アミノピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（例えば、米国特許第５，６３９，７５７号を参照のこと）、ならびにキナゾリンの化合物および組成物（例えば、米国特許第５，７９２，７７１号））は、併用療法において使用され得る。併用療法において有用な他の化合物としては、以下が挙げられる：ステロイド（例えば、血管安定性の（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ）４，９（１１）−ステロイドおよびＣ２１−酸化ステロイド）、アンジオスタチン、エンドスタチン、バスキュロスタチン、カンスタチンおよびマスピン（ｍａｓｐｉｎ）、アンジオポエチン、細菌性多糖類ＣＭ１０１および抗体ＬＭ６０９（米国特許第５，７５３，２３０号）、トロンボスポンジン（ＴＳＰ−１）、血小板因子４（ＰＦ４）、インターフェロン、メタロプロテイナーゼインヒビター、薬理学的因子、例えば、ＡＧＭ−１４７０／ＴＮＰ−４７０、サリドマイドおよびカルボキシミドトリアゾール（ＣＡＩ）、コルチゾン（例えば、ヘパリンもしくはヘパリンフラグメントの存在下）、抗浸潤因子、レチン酸およびパクリタキセル（米国特許第５，７１６，９８１号；本明細書中に参考として援用される）、サメ軟骨抽出物、アニオン性ポリアミドもしくはポリ尿素低重合体、オキシインドール誘導体、エストラジオール誘導体およびチアゾロピリミジン誘導体。
癌の処置（ＨＥＲを過剰発現する癌の処置を含む）は、抗ＨＥＲ抗体、低分子チロシンキナーゼインヒビター、アンチセンス、オリゴヌクレオチド、ＨＥＲ／リガンド指向性ワクチン、または免疫結合体（すなわち、放射性同位体もしくは細胞毒に結合させた抗体）のような抗癌剤との併用療法を含み得る。このような抗癌剤の例としては、Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、Ｔｙｋｅｒｂ、Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ、Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、Ｔｒａｓｔｕｚｉｍａｂ、Ｉｍａｔｉｎｉｂ、白金錯体またはヌクレオシドアナログが挙げられる。他の抗癌剤としては、放射線療法もしくは化学療法剤、および／または、増殖阻害剤（異なる化学療法剤のカクテルの同時投与を含む）が挙げられる。細胞傷害剤または化学療法剤の例としては、例えば、以下が挙げられる：タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）、およびアントラサイクリン抗生物質、ドキソルビシン／アドリアマイシン、カルミノマイシン、ダウノルビシン、アミノプテリン、メトトレキセート、メトプテリン、ジクロロメトトレキセート、マイトマイシンＣ、ポルフィロマイシン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、ポドフィロトキシンまたはポドフィロトキシン誘導体（例えば、エトポシドまたはリン酸エトポシド）、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイロシジン（ｌｅｕｒｏｓｉｄｉｎｅ）、ビンデシン、ロイロシドン（ｌｅｕｒｏｓｉｄｎｅ）、メイタンシノール（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｌ）、エポシロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）ＡまたはＢ、タキソテール、タキソールなど。他のこのような治療剤としては、エクストラムスチン、シスプラチン、コンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）およびアナログ、ならびにシクロホスファミドが挙げられる。このような化学療法剤についての調製および投薬計画は、製造業者の説明書に従って、または、当業者によって経験的に決定されるように使用され得る。このような化学療法についての調製および投薬計画はまた、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｅｄ．，Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９９２）に記載される。
さらなる化合物が、ＥＣＤ多量体との併用療法において使用され得る。抗ホルモン化合物が、ＥＣＤ多量体などと共に併用療法において使用され得る。このような化合物の例としては、このような分子について公知の投薬量の、抗エストロゲン化合物（例えば、タモキシフェン）；抗プロゲステロン化合物（例えば、オナプリストン）および抗アンドロゲン化合物（例えば、フルタミド）が挙げられる。また、心保護剤（治療に関連し得る心筋の機能不全を防止または減少させるためのもの）または１以上のサイトカインを同時に投与することがまた有益であり得る。上の治療レジメンに加えて、患者は、癌細胞の外科的除去および／または放射線療法に供され得る。
併用療法は、処置の有効性を増加させ得、そして、いくつかの場合においては、併用が、別々に行った処置の相加作用よりも有効となるような相乗作用をもたらし得る。例えば、化学療法剤（例えば、チロシンキナーゼインヒビター）および本明細書に記載されるＥＣＤ多量体を用いた併用療法は、腫瘍細胞の増殖の相乗的な阻害、すなわち、２つの因子を別々に投与した場合の相加作用の組合せよりも大きな増殖の阻害作用を示し得る。
アジュバントおよび他の免疫調節因子が、例えば、腫瘍細胞に対する免疫応答を高めるために、癌の処置においてＥＣＤ多量体と組み合わせて使用され得る。アジュバントの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：細菌のＤＮＡ、弱毒化マイコバクテリア細胞の核酸画分（ＢＣＧ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）、ＢＣＧゲノムに由来する合成オリゴヌクレオチド、およびＣｐＧモチーフを含む合成オリゴヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ；Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｂｌｏｏｄ ８９：２９９４−２９９８）、レバミゾール、水酸化アルミニウム（ａｌｕｍ）、ＢＣＧ、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、ＱＳ−２１（植物由来の免疫刺激因子）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）ならびにジニトロフェニル（ＤＮＰ）。免疫調節因子の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１ ＲＡ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、オンコスタチンＭ、エリスロポエチン、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、インターフェロン、Ｂ７．１（ＣＤ８０としても公知）、Ｂ７．２（Ｂ７０、ＣＤ８６としても公知）、ＴＮＦファミリーメンバー（ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＴ−β、ＣＤ４０リガンド、Ｆａｓリガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、４−１ＢＢＬ、Ｔｒａｉｌ）、およびＭＩＦ、インターフェロン、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２およびＩＬ−１２））；および、化学療法剤（例えば、メトトレキセートおよびクロラムブシル）。
実施例は、既存の治療薬に加えて、ヘテロ多量体、ヘテロ多量体とホモ多量体との混合物の種々の形態を使用することで、相乗的な結果を提供することを示す。
Ｊ．汎ＨＥＲ治療薬を同定、スクリーニングおよび作り出すための方法
本明細書中に提供されるＥＣＤ多量体に加えて、他の候補汎ＨＥＲ治療薬が同定され得る。本明細書中には、汎ＨＥＲ治療薬を同定する方法およびそのためのスクリーニングアッセイが提供される。この方法は、リガンド結合および／またはレセプター二量体化および／または係留に関与する１以上のＨＥＲレセプターファミリーメンバー上の領域と相互作用する分子（例えば、低分子およびポリペプチド）を同定することによって、リガンド結合および／またはレセプター二量体化および／または係留と干渉するＥＣＤサブドメインを標的とする分子を同定するように設計される。このような治療薬は、ＨＥＲレセプターの同時発現を有さないＨＥＲファミリーのいくつかのメンバーを同時に標的とし得る。
１．汎ＨＥＲ治療薬の標的
このような汎ＨＥＲ治療分子を設計するために、特定の活性に関与するものとして同定される類似のエピトープまたは保存された領域が同定される。例えば、係留に関与する領域は、係留を安定化または促進する候補分子をスクリーニングするために同定され；リガンド結合に関与する領域は、２以上のＨＥＲファミリーメンバーとのリガンドの相互作用と干渉する候補薬をスクリーニングするために同定され、そして、二量体化に関与する領域が同定される。
これらの領域は、レセプターファミリーについての結晶構造データに基づいて同定された（同定される）。例えば、アンタゴニスト治療薬の設計は、細胞表面上のＨＥＲファミリーレセプターの約５％までを構成する活性型レセプターを優先的に標的とするために、レセプターが不活性な立体配座であるか活性な立体配座であるかを決定するレセプターの性質を標的とする。結晶構造によって予測されるこのような構造成分の例としては、例えば、レセプターを係留型または不活性状態に保つ構造成分、二量体化を促進する構造成分、および／または、リガンド結合を促進する構造成分が挙げられる。これらの各々は、汎ＨＥＲ治療薬の設計のための強力な標的として、以下に記載される。
例えば、サブドメインＩＩ（Ｄ ＩＩ）およびＩＶ（Ｄ ＩＶ）内の領域は、係留およびレセプターの二量体化に関与する。保存された領域は、１以上のＨＥＲファミリーメンバーの二量体化を阻害し、そして／または、係留ドメインもしくは架橋ドメインを安定化させて、係留型の立体配座を安定化させる、候補化合物についてスクリーニングするために同定され得る。いくつかのＨＥＲファミリーメンバーからこのように同定されたポリペプチドは、実施例において例示される。
このアプローチのために、標的とされる構造領域の各々の内部にある相同なポリペプチド配列が、各ＨＥＲレセプター（ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４）間で同定された。いくつかの例では、ＩＧＦ１−Ｒおよび他の細胞表面レセプターにおいて相同な領域もまた、潜在的な標的配列を同定するために整列され得る。代表的には、標的とされる配列は、１以上のＨＥＲレセプター（代表的には、ＨＥＲ１および／またはＨＥＲ３）におけるアミノ酸配列を用い、そして、結晶構造からモデリングし、その後、この同定された配列の他のＨＥＲファミリーレセプターとのアラインメントを行い、そして、最も保存されている配列をピックアップすることによって導かれる。他のＨＥＲレセプターにおける対応する配列もまた同定される。これらの標的配列に結合するタンパク質は、例えば、ファージディスプレイなどを用いて同定され得る。結合したタンパク質は、１以上のこれらの領域に結合し、そして１）リガンド結合を阻害し、２）二量体もしくはヘテロ二量体としてのレセプターの会合を阻害し、そして／または、３）脱係留反応（すなわち、ＨＥＲ分子の活性化）を阻害するタンパク質を同定するために富化され得る。いくつかの場合、同定されるペプチドの親和性は、２以上のペプチドの架橋によって（すなわち、ペプチドヘテロ二量体を形成することによって）増加され得、その結果、架橋したペプチドが、同じレセプター分子の２つの領域に結合し、そして、そのレセプターが開くことを防止する。架橋したペプチドは、同じドメイン内の別個のエピトープを認識するものであり得るか、または、これらは、異なるドメイン内の別個のエピトープを認識するものであり得る。例えば、係留型の立体配座の脱係留を阻害するために、ＨＥＲレセプターの係留型の立体配座において、ドメインＩＩおよびドメインＩＶが接近していることに起因して、ドメインＩＩ内のエピトープを認識するペプチドが、ドメインＩＶの係留領域内のエピトープを認識するペプチドに架橋され得る。
一例では、汎ＨＥＲ治療用アンタゴニストは、二量体化を防止することによって、レセプターを自己阻害性の立体配置に固定するように設計される。したがって、ドメインＩＩ内の領域および／またはドメインＩＶ内の領域が標的とされ得る。例えば、ＨＥＲファミリーレセプターの二量体化および会合を防止するために、二量体化アーム内にあるドメインＩＩ内の領域、または、二量体化アームを囲む領域が標的とされ得る。別の例では、レセプターが係留型の立体配座にあるときに起こるドメインＩＶ内の相同な領域との二量体化アームの会合を防止するために、ドメインＩＶ内の領域が標的とされ得る。したがって、例えば、単一のレセプターのドメインＩＩ上の別個の部位に結合し、それによって、その二量体化能を立体的に阻害する、ファージディスプレイによって同定されるペプチドのようなアンタゴニスト、または、抗体もしくは他の低分子治療薬のような他の分子が同定され得る。ドメインＩＩもしくはドメインＩＶのいずれか内にある標的とされるエピトープ領域（ＨＥＲ３とのアラインメントに基づいてＨＥＲファミリーメンバー間で保存されている）は、これらの領域に対する抗体を作製するための免疫原として使用され得るか、または、例えば、ファージディスプレイ技術を用いてこれらの部位へのペプチド結合剤を富化するための標的物質として使用され得る。実施例８は、例示的な相同の標的エピトープの同定を記載し、これはまた、配列番号６３〜９３のいずれか（ドメインＩＩのエピトープ）または、配列番号９４〜１２５のいずれか（ドメインＩＶのエピトープ）に示される。さらに、実施例５は、二量体化に関与するＨＥＲ２内の例示的領域（配列番号４０５に示される）を記載する。したがって、例えば、ファージディスプレイは、ドメインＩＩおよび／またはドメインＩＶの相同な領域内にある別個の部位に結合するペプチドを同定するために使用され得、これらのペプチドは、ドメインＩＩおよび／またはドメインＩＶ内の領域に別々に結合し、二量体化を阻害することによって、レセプターを自動阻害性の立体配置に保持し得る。より高い親和性のペプチド結合剤が、本明細書中で以下に記載されるように、ペプチドヘテロ二量体を生成することによって作製され得る。このアプローチの利点は、細胞表面上のＨＥＲレセプターのほんの約５％だけを占める、レセプターの非係留型形態を標的とすることである。したがって、結果として生じる治療薬は、細胞表面上の係留されかつ不活性な９５％のレセプターの代わりに、これらのレセプターのうち、活発にシグナル伝達を行う部分集団のみを標的とする。標的の総数が約１５〜２０倍減少するので、このことは、レセプターの有効な標的化を増加させ、そして、必要とされる薬物の用量を減少させる。
別の例では、ドメインＩＩおよびドメインＩＶ上の同様な相同性領域が、ＨＥＲレセプターの係留型の立体配座を安定化させる汎ＨＥＲ治療用アンタゴニストを作製するための標的とされ得る。このような治療薬は、ＨＥＲレセプターの不活性な形態（すなわち、ＨＥＲ細胞表面レセプターの約９５％）を標的とし、そして、その活性な立体配座を採る能力を妨害する。このアプローチの実現可能性は、ＨＥＲレセプターの非係留型もしくは不活性な形態におけるドメインＩＩとドメインＩＶとの間の密接な相互作用を実証する結晶構造データによって支持される。ＨＥＲ１およびＨＥＲ３のＥＣＤの結晶構造は、リガンドによる刺激の前に、レセプターが、自己阻害性または係留型の立体配置で細胞表面上に保持されることを示唆する。この立体配置では、ドメインＩＩ内の二量体化アームとドメインＩＶ内の相同性領域との間の分子内の特異的な接触が、リガンド結合を担う２つの領域（すなわち、ドメインＩおよびＩＩＩ）の相対的な配向を拘束し、したがって、これらが共に、同時にリガンドと接触することはできない。これらの構造上の特徴は、レセプターが自己阻害性の係留型立体配置に固定され得る場合、リガンド依存性のＨＥＲレセプター活性化が妨害され得ることを示唆する。ドメインＩＩおよびドメインＩＶの配列の接近性は、その密接な接近性に起因して、これらの配列が架橋され得ることを予測する。したがって、上記および実施例８に記載され、そして、配列番号６２〜９３のいずれか（ドメインＩＩのエピトープ）および配列番号９４〜１２５のいずれか（ドメインＩＶのエピトープ）に示されるようなドメインＩＩおよびドメインＩＶ内の同じエピトープ領域が標的とされ得る。このアプローチのために、例えば、ファージディスプレイ法などによって同定される、ＨＥＲファミリーレセプターのドメインＩＩおよびドメインＩＶの両方における相同な領域を標的とするペプチド結合剤が選択される。２つのペプチド（一方はドメインＩＩに結合し、そしてもう一方がドメインＩＶに結合する）が、本明細書中に記載される方法などを用いてヘテロ二量体化される場合、これらのペプチドは、係留型の不活性なＨＥＲファミリーメンバーにおいて、ドメイン間領域を架橋し得る（例えば、ドメインＩＩとドメインＩＶとの相互作用を安定化する）。したがって、結果として生じるアンタゴニスト分子は、レセプターの係留型の形態に結合し、そして、その係留型の形態をその場に「固定」し、それによって、レセプターの高親和性の非係留型の形態の形成を妨害する。
さらなる例では、ドメインＩおよびＩＩＩ内のリガンド結合領域は、本明細書中に記載される方法によって同定される汎ＨＥＲ治療薬によって標的とされ得る。上述のように、リガンド結合に参加する相同な標的領域が、ＨＥＲファミリーレセプター間で同定され得る。例えば、リガンド結合に参加するＨＥＲ１の領域は、ＴＧＦ−αとの複合体におけるＨＥＲ１の結晶構造によって決定され得る（Ｇａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ，１１０：７６３−７７３）。この結晶構造は、一次元のＰＤＢタンパク質データバンクである１ＭＯＸから検索され得る。他のＨＥＲファミリーレセプターにおける相同な領域は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４の並列アラインメントによって決定され得る。実施例７は、このようなアラインメントによって同定される領域を記載し、そして、整列された配列は、配列番号５４〜６１のいずれかに示される。これらの配列は、例えば、コンビナトリアルペプチドライブラリー、ファージディスプレイ技術によって、または、多クローン性のアプローチ（例えば、Ｈａｕｒｕｍ ａｎｄ Ｂｒｅｇｅｎｈｏｌｔ（２００５）ＩＤｒｕｇｓ，８：４０４−４０９を参照のこと）によって標的とされ得る。このようなアプローチにより同定される汎ＨＥＲ治療薬は、ドメインＩおよび／またはＩＩＩにおける部位をブロックすることによって、立体阻害などにより、複数のＨＥＲレセプターへの多様なリガンドの結合を阻害することが期待される。このような治療薬は、不活性なＨＥＲレセプターを標的とし、そして、リガンドの結合後にのみ生じる活性な立体配座を採る能力を阻害する。
２．汎ＨＥＲ治療薬を同定するためのスクリーニング方法
本明細書中には、１以上のＨＥＲファミリーレセプターを標的とする汎ＨＥＲ治療薬を同定するための方法が提供される。分子のコレクションがスクリーニングされる。このようなコレクションは、例えば、低分子化合物および他の生体分子（ペプチド、多糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造アナログまたはこれらの組合せを含む）を含む。一例では、コレクションは、レセプターファミリー間で保存されており、特定の活性に関与するものと同定されたポリペプチドに対してスクリーニングされる。
同定されたポリペプチドはまた、同定されたポリペプチドと相互作用する分子を同定するために、分子ライブラリーをスクリーニングするための種々の方法のいずれかによってスクリーニングされ得る。例えば、候補汎ＨＥＲ治療薬は、ファージディスプレイ由来のペプチドによって同定され得る。このようなペプチドは、上述のようなＨＥＲレセプターファミリーの間で保存されている配列エレメント（すなわち、配列番号５４〜１２５または４０５のいずれかに示される１以上のペプチドエピトープのいずれか）に結合するものを同定するために富化される。
ａ．ファージディスプレイ
ファージディスプレイ技術は、十分に確立された技術であり、ファージ上にディスプレイされるペプチドのライブラリーを生成することを伴う。これらは、例えば、１０１０個ほどの異なるペプチドを含み得、したがって、多くの低分子コンビナトリアルライブラリーを超越している。ペプチド（しばしば、７〜２０アミノ酸またはそれより長い）とタンパク質標的との相互作用は、非常に特異的であり得、ときおり、低分子よりも特異的であり得る。ペプチドは、その治療上の効能を高めるように修飾され得る。例えば、短い血清中滞留時間と、迅速な腎濾過は、ＰＥＧ化またはアルブミンのような他の血清タンパク質との融合によって減少され得る。ＰＥＧ化は、血清中滞留時間を増やすだけでなく、免疫原性も低下させ得る。さらに、タンパク質標的に対するペプチドの親和性は、２以上の相乗作用性かつ非重複性のペプチドを連結して、高親和性のヘテロ二量体結合剤を形成することによって改善され得る。
ファージディスプレイおよび他のこのような方法は、異なる方法で使用され得る。第一に、本明細書において同定されたポリペプチドは、ライブラリーにおいて、候補汎ＨＥＲ治療薬となり得るポリペプチドを同定するために、ディスプレイされたポリペプチドのライブラリーに対してスクリーニングされ得る。あるいは、本明細書において同定されたポリペプチドは、汎ＨＥＲ治療薬候補を同定するために、低分子および他のポリペプチドのライブラリーに対してディスプレイおよびスクリーニングされ得る。
ｉ．ペプチドライブラリー
本明細書において提供される方法において産生およびスクリーニングされるペプチドライブラリーは、ＨＥＲファミリーレセプターについての新規リガンドを提供すること、そして、汎ＨＥＲ治療薬を産生することにおいて有用である。ペプチドライブラリーは、本明細書において詳細に記載される方法および当業者に一般に利用可能な方法に従って、設計およびパニングされ得る（例えば、米国特許第５，７２３，２８６号および米国特許出願番号ＵＳ２００４００２３８８７を参照のこと）。一局面では、市販のファージディスプレイライブラリー（例えば、ＲＡＰＩＤＬＩＢ（登録商標）またはＧＲＡＢＬＩＢ（登録商標）、ＤＧＩ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｄｉｓｏｎ，Ｎ．Ｊ．；Ｃ７Ｃ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙまたは７−ａａおよび１２−ａａの線形ライブラリー、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）が使用され得る。別の局面では、オリゴヌクレオチドライブラリーは、当該分野で公知の方法にしたがって調製され得、そして、ペプチド発現のための適切なベクター中に挿入され得る。例えば、バクテリオファージの構造タンパク質（好ましくは、バクテリオファージのコートタンパク質のようなアクセス可能なファージのタンパク質）をコードするベクターが使用され得る。当業者は、種々のバクテリオファージが使用され得ることを理解するが、代表的には、ベクターは、例えば、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ１、Ｍ１３などのような糸状バクテリオファージに由来するものである。特に、ｆｄ−ｔｅｔベクターは、文献において包括的に記載されている（例えば、Ｚａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｇｅｎｅ ９：１２７−１４０；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５−１３１７；Ｐａｒｍｌｅｙ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９８８）Ｇｅｎｅ，７３：３０５−３１８を参照のこと）。
ファージベクターは、バクテリオファージの構造タンパク質をコードする遺伝子の５’領域に位置するクローニング部位を含むように選択されるか、またはこのクローニング部位を含むように構築され、その結果、ペプチドは、本明細書において以下に記載されるようなアフィニティ富化手順においてレセプターにアクセス可能となる。ファージの構造タンパク質は、一般にコートタンパク質である。適切なコートタンパク質の例は、ピル（ｐｉｌｌ）である。適切なベクターは、ペプチドが、成熟なコートタンパク質のＮ末端から約１００アミノ酸残基の距離またはその内側に発現されるように、ペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列の方向を定めたクローニングを可能にし得る。コートタンパク質は、代表的には、リーダー配列を有するプレタンパク質として発現される。
代表的には、オリゴヌクレオチドライブラリーは、プロセシングを受けたバクテリオファージの外殻タンパク質のＮ末端がペプチドの第一の残基となるように、すなわち、リーダータンパク質をコードする配列の３’末端と、成熟なタンパク質をコードする配列の５’末端またはその５’末端の一部分との間に挿入される。ライブラリーは、ライブラリーメンバーの多様な領域（および以下に考察されるような任意のスペーサー）を含むオリゴヌクレオチドを、選択したクローニング部位へとクローニングすることによって構築される。１）望ましくない制限酵素部位を除いて望ましい制限酵素部位を加える；２）除かれた任意の配列の正しい部分（例えば、正しいシグナルペプチダーゼ部位）を再構築する；３）必要な場合、スペーサー残基を挿入する；そして／または、４）必要に応じて、翻訳フレームを正しくして、活性かつ感染性のファージを産生する、公知の組換えＤＮＡ技術（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）を用いると、オリゴヌクレオチドが構築され得る。
オリゴヌクレオチドの中央部分は、一般に、１以上のＨＥＲファミリーレセプターエピトープ結合配列と、必要に応じて、スペーサー配列とを含む。配列は、最終的には、組み立てられたバクテリオファージ粒子の外側のアクセス可能な表面上の成熟なコートタンパク質のＮ末端に融合されたか、もしくは、この中にあるペプチド（スペーサーはあってもなくてもよい）として発現される。ライブラリーのサイズは、多様なコドンの数によって、したがって、所望されるペプチドのサイズによって変化する。一般に、ライブラリーは、少なくとも約１０６のメンバー、通常は少なくとも１０７のメンバー、そして代表的には１０８以上のメンバーである。アミノ酸のランダムなコレクションをコードする一連のコドンを形成し、そして、最終的にはベクター中にクローニングされるオリゴヌクレオチドのコレクションを作製するために、（ＮＮＫ）ｘのようなコドンモチーフが使用される。ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ（名目上は等モル量）であり得、ＫはＧまたはＴ（名目上は等モル量）であり、そして、ｘは、代表的には、約５、６、７、８、またはそれ以上であり、それによって、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチドおよびオクタペプチドまたはこれより長いペプチドのライブラリーを生成する。第三位はまた、「Ｓ」と指定される、ＧまたはＣでもあり得る。したがって、ＮＮＫまたはＮＮＳは、１）全てのアミノ酸をコードし；２）ただ１つの停止コドンをコードし；そして、３）コドンの偏りの範囲を６：１から３：１へと減らす。
ペプチドが長くなると、作製されるライブラリーのサイズが、クローニングのプロセスにおける制約となり得ることが理解されるべきである。適切な組換えベクターにおいてランダムに作製されたオリゴヌクレオチドの混合物からのペプチドの発現は、当該分野で公知である（例えば、Ｏｌｉｐｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ４４：１７７−１８３を参照のこと）。例えば、コドンモチーフ（ＮＮＫ）６は、１２アミノ酸の各々について１つ、５アミノ酸の各々について２つ、３アミノ酸の各々について３つ、そして、１つの（アンバー）終止コドンの、３２のコドンを生成する。このモチーフは、オリゴヌクレオチド合成の標準的な方法を用いて利用可能なものと同等に公平なコドンの分布を生じるが、これは、１つのコドンの残基を持つペプチドに対する偏りをもたらす。具体的には、ヘキサコドンの完全なコレクションは、１つのコドンのアミノ酸のみから構成されるペプチドの各々をコードする１つの配列を含むが、３つのコドンのアミノ酸のみを持つペプチドの各々をコードする７２９（２６）の配列を含む。
１コドンの残基に対する偏りを最小限にするための代替的なアプローチは、２０の活性型トリヌクレオチド（各々が２０の遺伝子によりコードされるアミノ酸のうちの１つに対するコドンを表す）の合成を伴う。これらは、従来の手段によって合成され、塩基および５−ＯＨ−保護基を維持したまま支持体から取り外され、そして、モノヌクレオシドの活性化のために使用される方法によって、３’Ｏ−ホスホラミダイト（およびｂ−シアノエチル基でのリン酸基保護）を加えることによって活性化される（一般的には、ＭｃＢｒｉｄｅ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，１９８３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：２４５を参照のこと）。変質オリゴコドンは、これらの三量体を建築ブロックとして用いて調製される。三量体は、所望のモル比で混合され、そして、合成装置に入れられる。この比は、通常は、ほぼ等モルであるが、変質オリゴヌクレオチドコレクションによりコードされる特定のアミノ酸の過剰〜過小な出現を得るために、制御された一様でない比であり得る。オリゴコドンを形成するための三量体の濃縮は、本質的には、活性化したモノヌクレオシドを建築ブロックとして用いて、従来の合成について記載されたようにして行われる（例えば、Ａｔｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，１９８４，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，Ｅｄ．，ｐ．３５−８２を参照のこと）。この手順は、潜在的なペプチド配列の一様な分布（または、制御された一様でない分布）をコードし得る、クローニング用のオリゴヌクレオチド集団を生成する。有利なことに、このアプローチは、（ＮＮＫ）６モチーフにより生成される偏りの範囲が、アミノ酸残基を追加するごとに３倍増加するので、より長いペプチド配列を作製する際に用いられ得る。
コドンモチーフが、上に規定されるような（ＮＮＫ）ｘであり、かつ、ｘが８である場合、２．６×１０１０の潜在的なオクタペプチドが存在する。オクタペプチドのモチーフを含むライブラリーは、生成するのが困難であり得る。したがって、オクタペプチドのサンプリングは、潜在的な配列の約１０％までを用いて、部分集合ライブラリーを構築することによって達成され得、次いで、この組換えバクテリオファージ粒子の部分集合がスクリーニングされる。所望される場合、部分集合ライブラリーの多様性を拡げるために、回収したファージの部分集合が、突然変異誘発に供され、次いで、その後のスクリーニングのラウンドに供され得る。この突然変異誘発の工程は、２つの一般的な方法で達成され得る：回収したファージの多様な領域が突然変異を生成され得るか、または、追加の多様なアミノ酸が、最初の多様な配列に隣接する領域に加えられ得る。
パニングの早いラウンドで見出される活性なペプチド（すなわち、結合剤）に関して多様化するために、ポジティブなファージを配列決定して、活性なペプチドの素性を決定し得る。次いで、オリゴヌクレオチドが、これらのペプチド配列に基づいて合成され得る。合成は、一次のオリゴヌクレオチド配列にわずかなバリエーションを生じるように、各工程において、低いレベルの全塩基が組み込まれるようにしてなされる。この（わずかに）変質したオリゴヌクレオチドの混合物は、次いで、当業者に公知の方法によって、アフィニティファージへとクローニングされ得る。この方法は、二次ライブラリーの一部として、出発ペプチド配列の系統だった制御されたバリエーションを生じる。しかし、この方法は、個々のポジティブファージが突然変異誘発の前に配列決定されることを必要とし、したがって、少数の回収したファージの多様性を拡げるのに有用である。
選択したファージを多様化するための代替的なアプローチは、回収したファージのプールまたは部分集合の突然変異誘発を可能にする。このアプローチによれば、パニングから回収したファージがプールされ、そして、一本鎖ＤＮＡが単離される。ＤＮＡは、例えば、亜硝酸、ギ酸またはヒドラジンでの処理によって突然変異を生成される。これらの処理はＤＮＡに種々の損傷を与える。損傷を受けたＤＮＡは、次いで、逆転写酵素によってコピーされ、この逆転写酵素は、損傷部位に遭遇すると、塩基の組み込みを誤る。次いで、ペプチドをコードする配列を挟む部位に特異的な制限酵素での切断によって、レセプター結合ペプチドをコードする配列を含むセグメントが単離される。次いで、この突然変異を生成されたセグメントは、損傷を受けていないベクターＤＮＡ内に再度クローニングされ、ＤＮＡが細胞中に形質転換され、そして、公知の方法に従って二次ライブラリーが作製される。一般的な突然変異誘発の方法は当該分野で公知である（例えば、Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１３１−３１４５；Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：２４２−２４６；Ｍｙｅｒｓ，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．Ｉ，８．３．１−８．３．６，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。
別の一般的なアプローチにおいて、活性であることが分かったペプチドへのアミノ酸の追加は、種々の方法を用いて行われ得る。一つの方法において、早期のパニングにおいて選択されたペプチドの配列が個々に決定されそして、この決定した配列と、隣接する変質配列とを組み込んだ新しいオリゴヌクレオチドが合成される。これらは、次いで、二次ライブラリーを生成するためにクローニングされる。あるいは、ペプチドを有するファージのプールに、第二のＨＥＲ結合配列を加えるための方法が使用され得る。１つの方法によれば、制限酵素部位が、第一のＨＥＲ結合配列の隣に入れられる。好ましくは、酵素は、その認識配列の外側を切断すべきである。この認識部位は、第一の結合配列から数塩基の場所に位置し得る。第二のＨＥＲ結合配列を挿入するために、ファージＤＮＡのプールが消化され、そして、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントを用いてオーバーハングを埋めることによって平滑末端処理される。二重鎖でかつ平滑末端でかつ変質するように合成されたオリゴヌクレオチドが、次いで、この部位にライゲーションで導入され、第一の結合配列に並置する第二の結合配列を生じる。次いで、この二次ライブラリーが、先に述べたように、増幅およびスクリーニングされる。
いくつかの場合では、特定のレセプターに結合するより長いペプチドを合成することが適切であるが、他の場合では、スペーサー（例えば、リンカー）残基によって隔てられた２以上のＨＥＲ結合配列を有するペプチドを提供することが望ましい。例えば、結合配列は、ペプチドの領域がレセプターに対して種々の方法で提示されることを可能にするスペーサーによって隔てられ得る。結合領域間の距離は、わずか１残基ほど、または、少なくとも２〜２０残基、または、少なくとも１００残基までであり得る。好ましいスペーサーは、長さ３残基、６残基、９残基、１２残基、１５残基または１８残基である。大きな結合部位またはタンデムな結合部位（例えば、ドメインＩＩ上のエピトープとドメインＩＶ上のエピトープ）を追跡するために、結合領域は、２０〜３０アミノ酸までの残基のスペーサーによって隔てられ得る。存在する場合、スペーサー残基の数は、代表的には、少なくとも２残基であり、そしてしばしば、２０残基未満である。
オリゴヌクレオチドライブラリーは、スペーサー（例えば、リンカー）によって隔てられた結合配列を有し得、そして、したがって、以下の式によって表され得る：（ＮＮＫ）ｙ−（ａｂｃ）ｎ−（ＮＮＫ）ｚ、ここで、ＮおよびＫは、先に規定したとおりであり（先に規定されたようなＳが、Ｋを置き換え得ることに留意）、そして、ｙ＋ｚは、約５、６、７、８もしくはそれ以上であり、ａ、ｂおよびｃは、スペーサーアミノ酸をコードするコドンを含む同じかもしくは異なるヌクレオチドを表し、ｎは、約３、６、９もしくは１２アミノ酸まで、またはそれ以上である。スペーサー残基は、ファージタンパク質への付着によって比較的束縛されていない大きな結合部位内の部位と相互作用する能力を持つライブラリーの多様なドメインを提供するために、幾分柔軟性があり得、例えば、オリゴ−グリシンまたはオリゴ−グリシン−グリシン−セリンを含む。例えば、オリゴ−プロリンのような柔軟性のないスペーサーもまた、グリシンスペーサーを含む他のスペーサーとは別に、または、他のスペーサーと組み合わせて挿入され得る。例えば、配列グリシン−プロリン−グリシンのスペーサーによって提供され得るような、２つの配列間にターンを用いることによって、ＨＥＲ結合配列を互いに近接させ、そして、スペーサーを用いて、互いに関してこれらの結合配列を方向付けることが望ましくあり得る。このようなターンに安定性を加えるために、各可変領域の一端もしくは両端にシステイン残基を加えることが所望され得るか、または必須であり得る。次いで、このシステイン残基は、ジスルフィド架橋を形成して、可変領域を一緒にループ内に保持し、そして、この様式において、また、環状ペプチドを模倣するように機能し得る。当然のことながら、当業者は、環化のための種々の他のタイプの共有結合もまた使用され得ることを理解する。
上述のようなスペーサー残基はまた、ＨＥＲ結合配列の一端または両端に据えられ得る。例えば、環状ペプチドは、ペプチドの両端にシステイン残基を持つことで、介在性のスペーサーなしで設計され得る。上述のように、柔軟性のあるスペーサー（例えば、オリゴ−グリシン）は、選択されたレセプターとのペプチドの相互作用を容易にし得る。あるいは、柔軟性のないスペーサーは、ペプチドが、柔軟性のないアームの末端にあるかのように提示されることを可能にし得、ここで、残基（例えば、プロリン残基）の数は、アームの長さを決定するだけでなく、ペプチドが方向付けられるアームの方向もまた決定する。荷電および／または非荷電の親水性アミノ酸（例えば、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ）から構成される親水性スペーサー、または、疎水性アミノ酸（例えば、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ａｌａ）から構成される疎水性スペーサーが、種々の局所的環境を持つレセプター結合部位に対してペプチドを提示するために使用され得る。
特筆すべきは、いくつかのペプチドは、そのサイズおよび／または配列に起因して、そのキャリアファージの感染性に重篤な欠陥をもたらし得る。これは、パニングの各サイクルの後の再感染および増幅の間に、集団からのファージの減損をもたらす。感染性の欠陥に関連する問題を最小限にするために、溶出したファージから調製したＤＮＡは、好ましくは、エレクトロポレーション（例えば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７−６１４５を参照のこと）または周知の化学的手段によって、適切な宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）中に形質転換され得る。これらの細胞は、マーカーの発現に十分な期間にわたり培養され、そして、代表的にはＤＮＡの形質転換についてなされる選択が適用される。コロニーが増幅され、そして、確立された方法にしたがって、アフィニティ富化のためにファージが回収される。アフィニティ富化において同定されたファージは、宿主細胞中への感染によって再度増幅され得る。上手くいった形質転換体が、適切な抗生物質（例えば、テトラサイクリンまたはアンピシリン）中での増殖によって選択される。これは、固体増殖培地上、または液体増殖培地中で行われ得る。
固体培地上での増殖について、細胞は、例えば、選択用の抗生物質を含むＬ−寒天の広い表面上に高い密度（約１０８〜１０９の形質転換体／ｍ２）で増殖され、コンフルエントなローン（ｌａｗｎ）を形成する。細胞と成形されたファージとが表面からはがされ、そして、ファージが、第一ラウンドのパニングのために調製される（例えば、Ｐａｒｍｌｅｙ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，１９８８，Ｇｅｎｅ ７３：３０５−３１８を参照のこと）。液体培地中での増殖について、細胞は、約１０倍以上の倍加速度でＬ−ブロスおよび抗生物質中で増殖され得る。ファージは、標準的な手順によって回収される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄ．を参照のこと）。液体培地中での増殖は、ライブラリーのサイズに起因してより簡便であり得るが、固体培地上での増殖は、増幅プロセスの間に偏りを提供する機会が少なくなり得る。
所望のクローンのアフィニティ富化について、一般には、約１０３〜１０４のライブラリー等価物（ライブラリー等価物とは、各組換え体のうちの１つである；１０９メンバーのライブラリーの１０４の等価物は、１０９×１０４＝１０１３のファージである）であるが、代表的には、少なくとも１０２のライブラリー等価物、約１０５〜１０６までのライブラリー等価物が、レセプター（またはその一部分）と共にインキュベートされ、このレセプターに対して所望のペプチドが探索される。レセプターは、アフィニティ富化スキームに適切ないくつかの形態のうちの１つである。一例では、レセプターは、表面または粒子上に固定され、そして、ペプチドを有するファージのライブラリーが、次いで、一般には当該分野で公知の手順に従って、この固定されたレセプター上でパニングされる。例えば、レセプターは、（トランスフェクションに起因して、または、適切なレセプターを天然に発現する細胞を利用するなどで）単層細胞の細胞表面上に発現され得る。さらに、ＨＥＲ分子のＥＣＤ部分がＦｃドメインに連結され得、そして、プロテインＡアガロースに固定されたＨＥＲ−Ｆｃ複合体に対して選択が行われ得る。このような例において、ファージディスプレイライブラリーは、無関係なＦｃ融合タンパク質−プロテインＡ（またはＧ）アガロース複合体に対して消耗（ｄｅｐｌｅｔｅ）され得る。代替的なスキームにおいて、レセプターは、認識可能なリガンドに固定される（テザーを介して固定され得る）。このようなリガンドの特定の例は、ビオチンである。このように修飾されたレセプターは、ファージのライブラリーと共にインキュベートされ、そして、溶液中の両方の反応物質との結合が生じる。次いで、結果として生じる複合体が、ビオチン部分を介して、ストレプトアビジンまたはアビジンに結合される。ストレプトアビジンは、プラスチックプレートのような表面上または粒子上に固定され得、この場合には、複合体（ファージ／ペプチド／レセプター／ビオチン／ストレプトアビジン）が物理的に保持されるか；または、ストレプトアビジンは、例えば、蛍光細胞分析分離装置上での分離手順による検出および／または単離のために、例えば、活性なファージ／ペプチドにタグを付すためにフルオロフォアで標識され得る。
結合したファージの富化は、より特異的な標的（例えば、サブドメインＩ〜ＩＶのいずれかにおいて同定されたエピトープ領域）に対するその後のパニングによって促進され得る。したがって、例えば、ポジティブファージクローンが、ＨＥＲ分子の標的とされるサブドメイン（例えば、配列番号５４〜６１のいずれか（サブドドメインＩおよびＩＩＩ）、配列番号６２〜９３のいずれか（サブドメインＩＩ）および／または、配列番号９４〜１２５もしくは４０５（サブドメインＩＶ）に示される任意の１以上のもの）に依存して、個々の合成ペプチドに対してさらにスクリーニングされ得る。ファージは、配列番号５４〜１２５もしくは４０５のいずれかに示される個々のペプチドに対して富化され得る。このような富化は、ＨＥＲファミリーレセプター上のファージ結合部位の決定を可能にする。汎ＨＥＲ治療薬である分子を同定するために、その後、他のＨＥＲファミリーレセプター、すなわち、ＨＥＲ−Ｆｃ−プロテインＡアガロース複合体または他のＨＥＲレセプターを発現する単層細胞に対してスクリーニングが行われ得、１以上のＨＥＲファミリーレセプターに結合する分子を同定し得る。
各工程において、非特異的な相互作用によってＨＥＲファミリーレセプターと会合するファージが、洗浄によって除かれる。必要とされる洗浄の程度およびストリンジェンシーは、関心のあるレセプター／ペプチドの各々について決定される。結合インキュベーションおよびその後の洗浄の条件を調整することによって、ある程度の制御が、回収されるペプチドの結合特性について及ぼされ得る。洗浄の温度、ｐＨ、イオン強度、二価カチオン濃度、ならびに、容量および時間が、レセプターに対する親和性の特定の範囲内のペプチドを選択する。遅い解離速度（通常は、高い親和性を予測する）に基づいた選択が、最も実用的な経路である。これは、飽和量の遊離リガンドの存在下でインキュベーションを継続するか、または、洗浄の容量、回数および長さを増やすかのいずれかによって行われ得る。各場合において、解離したペプチド−ファージの再結合が防止され、そして、時間を長くすることで、よりいっそう高い親和性のペプチド−ファージが回収される。特別な条件下でレセプターに結合するペプチドを見出すために、結合および洗浄の手順のさらなる修正が適用され得る。一度、レセプター分子に対していくらかの親和性と特異性とを与えるペプチド配列が分かると、この結合モチーフに関する多様性が装飾（ｅｍｂｅｌｌｉｓｈ）され得る。例えば、可変ペプチド領域が、同定された配列の一端または両端に置かれ得る。公知の配列は、文献から同定されても、パニングの早期ラウンドから導かれてもよい。
ｉｉ．多量体ポリペプチド（ヘテロ二量体ペプチド）
多量体ポリペプチド（リガンド）は、２以上の同定された結合ペプチド（例えば、ファージディスプレイ技術を用いて同定されたもの）のアミノ酸配列を共有結合により連結することによって調製され得る。多価リガンドについて意図される目的に依存して、ＨＥＲ分子上の同じかまたは異なるドメイン部位に結合するポリペプチドが、単一の分子を形成するように合わされ得る。多価リガンドが、異なるレセプター上、または、レセプターの異なるサブドメイン上の同じかまたは対応する部位に結合するように構築される場合、これらのレセプターに結合するためのペプチドリガンドのアミノ酸配列は、同じであっても異なっていてもよく、ただし、異なるアミノ酸配列が使用される場合は、これらは両方とも、同じ部位に結合する。他の細胞表面特異的なポリペプチドも同様に調製され得る。
多価ポリペプチドは、個々の部位に結合するアミノ酸配列を別々に発現させ、次いで、これらを一緒に共有結合により連結するか、または、多価リガンドを、結合のための特定のアミノ酸配列の組合せを内部に含む単一のアミノ酸配列として発現させるかのいずれかによって調製され得る。サブドメイン内またはサブドメイン間の別個の部位に結合するアミノ酸ポリペプチドの組合せは、より高い親和性のペプチドリガンドであるか、または、ＨＥＲレセプター上の異なるサブドメイン上で一緒に架橋し得る分子を生成するために使用され得る。
組換え遺伝子発現によって産生されようと、従来の連結技術によって産生されようと、種々のポリペプチドは、種々の長さのリンカーを介して連結され得る。連結された配列が組換え的に発現される場合、そして、約４Åの平均アミノ酸長さに基づくと、２つのアミノ酸配列を接続するためのリンカーは、代表的には、約３アミノ酸〜約１２アミノ酸の範囲である。アミノ酸配列間でのリンカーの柔軟性の程度は、リンカーを構築するために使用されるアミノ酸の選択によって調節され得る。グリシンとセリンの組合せは、柔軟性があり比較的制限のないリンカーを生成するのに有用である。より柔軟性の低いリンカーは、結合配列内により複雑な側鎖を持つアミノ酸を用いて構築され得る。
一例では、多量体構築物の調製は、１以上の結合ペプチドを含む。例えば、ファージディスプレイによって、標的に結合するものと同定されたペプチドは、ビオチン化され、そして、アビジン、ストレプトアビジン、またはノイトラアビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）と複合体化されて、四量体構築物を形成する。これらの四量体構築物は、次いで、標的またはその一部分（例えば、所望されるＨＥＲ標的を発現する細胞、および、所望されるＨＥＲ標的を発現しない細胞）と共にインキュベートされ、そして、四量体構築物の結合が検出される。結合は、当該分野で公知の任意の検出法を用いて検出され得る。例えば、結合を検出するために、アビジン、ストレプトアビジンまたはノイトラアビジンが、検出可能なマーカー（例えば、放射性標識、蛍光標識、または、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）もしくはアルカリホスファターゼのような、色の変化を受ける酵素標識）に結合され得る。多量体複合体は、必要に応じて、血清の存在下でスクリーニングされ得る。したがって、このアッセイはまた、標的へのペプチドの結合に対する血清の影響を迅速に評価するために使用され得る。
ビオチン化ペプチドは、好ましくは、ノイトラアビジン−ＨＲＰと複合体化される。ノイトラアビジンは、ノイトラアビジン中にレクチンに結合する炭水化物部分と細胞接着レセプターに結合するＲＹＤドメインが存在しないことに起因して、他の代替物よりも少ない分子に対する非特異的な結合を示す（例えば、Ｈｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２４８：１６７−１７１；Ａｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．，１７０：２３６−４１を参照のこと）。
ビオチン／アビジン複合体の使用は、１〜４の異なる結合ペプチドを含む四量体構築物の比較的簡単な調製を可能にする。さらに、標的化構築物の親和性およびアビディティは、同じ標的上の異なるエピトープに結合する２以上の標的化部分を含めることによって増大され得る。本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイは、このような多量体構築物に含めた場合に、親和性が増大し、そして／または、別個のサブドメインを架橋させる（すなわち、係留型の立体配座を安定化させる）結合ポリペプチドの組合せを同定する際に有用であり得る。
ｂ．コンピュータ支援による最適化
薬理学的に活性な汎ＨＥＲ治療用分子を同定するために使用され得る別の方法は、リガンドへの高い親和性の結合をもたらす潜在的な変異を通じて選別するために、コンピュータ支援による最適化技術を用いることである。実施例は、このようなコンピュータ支援による最適化技術がいかにして使用され得るかについての手引きを提供する。例えば、リガンドへの結合が増強されたＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４がこの方法で作製され得、そして、ヘテロ多量体、ホモ多量体およびこれら両方の混合物を作製するための構成要素として使用され得る。
ｃ．例示的なスクリーニングアッセイ
また、薬理学的に活性な汎ＨＥＲ治療用分子を同定するためのスクリーニングアッセイが本明細書中に提供される。汎細胞表面特異的分子は、特定の細胞表面レセプター活性についての公知のアッセイを用いて、同様に同定され得る。
汎治療用分子としては、例えば、以下が挙げられる：１）可溶性ペプチドのようなペプチド（ランダムペプチドライブラリーのＩｇ−テイル融合ペプチド（例えば、Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６を参照のこと）、ならびに、Ｄ−立体配置アミノ酸および／または、Ｌ−立体配置アミノ酸から構成される、コンビナトリアル化学由来の分子ライブラリーを含む）；２）ホスホペプチド（例えば、ランダムホスホペプチドライブラリーおよび部分的に変質した指向型のホスホペプチドライブラリーのメンバー、例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８を参照のこと）；３）抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体および短鎖抗体、ならびに、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂを発現するライブラリーフラグメント、ならびに、抗体のエピトープ結合フラグメント）；ならびに４）有機低分子および無機低分子。例示的な分子は、本明細書において上に記載されたような、ファージディスプレイ方法から同定されたペプチドリガンドである。
試験分子はまた、多数の化学物質の分類を包含し得るが、代表的には、これらは、有機分子、好ましくは、５０より大きく約２，５００ダルトンより小さい分子量を有する低分子有機化合物である。このような分子は、タンパク質との構造的な相互作用、特に、水素結合に必要な官能基を含み得、そして、代表的には、少なくとも、アミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を含み得、好ましくは、これらの官能性化学基のうち少なくとも２つを含み得る。分子はしばしば、上記官能基の１以上で置換された、環状炭素、または、複素環式構造および／または、芳香族もしくは多価芳香族の構造を含む。分子は、合成もしくは天然の化合物のライブラリーを含む、広範な種々の供給源から得られ得る。合成化合物ライブラリーは、例えば、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ，Ｃｏｒｎｗａｌｌ，ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、Ｂｒａｎｄｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ，Ｎ．Ｈ．）およびＭｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（Ｎｅｗ Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．）から市販されている。レアケミカルライブラリーは、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）から入手可能である。細菌、真菌、植物または動物の抽出物を含む天然化合物のライブラリーは、例えば、Ｐａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈ．）から入手可能である。さらに、広範な種々の有機化合物および生体分子（ランダム化されたオリゴヌクレオチドの発現を含む）のランダム合成および指向型合成に、多数の手段が利用可能である。
あるいは、細菌、真菌、植物または動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーは、容易に生成され得る。分子ライブラリーの合成のための方法は、容易に利用可能である（例えば、ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３ ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６９０９；Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３；Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３を参照のこと）。さらに、天然または合成の化合物ライブラリーまたは化合物は、従来の科学的、物理的および生化学的な手段によって容易に改変され得（例えば、Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：６０を参照のこと）、そして、コンビナトリアルライブラリーを生成するために使用され得る。別のアプローチでは、先に同定された薬理学的因子が、指向型またはランダムな化学修飾（例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化）に供され得、そして、アナログが、ＨＥＲ調節活性についてスクリーニングされ得る。
コンビナトリアルライブラリーを生成するための多数の方法が当該分野で公知であり、これらとしては、生物学的ライブラリーを必要とするもの；空間的にアドレス可能な（ｓｐａｔｉａｌｌｙ ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）パラレル固相または液相ライブラリー；逆重畳を必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ １化合物」ライブラリー法；およびアフィニティクロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法が挙げられる。生物学的ライブラリーアプローチは、ポリペプチドまたはペプチドのライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ポリペプチド、ペプチド、非ペプチド低重合体または化合物の低分子ライブラリーに適用可能である（Ｋ．Ｓ．Ｌａｍ，１９９７，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５）。
ライブラリーは、リガンドが共通の結合部位において競合的に結合するかどうかを決定するための、当該分野で一般に知られる方法によって、溶液中でスクリーニングされ得る。このような方法としては、以下が挙げられ得る：溶液中でのライブラリーのスクリーニング（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１）、またはビーズ上でのライブラリーのスクリーニング（Ｌａｍ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４）、チップ上でのライブラリーのスクリーニング（Ｆｏｄｏｒ，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６）、細菌もしくは芽胞におけるライブラリーのスクリーニング（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミドにおけるライブラリーのスクリーニング（Ｃｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９）、または、ファージ上でのライブラリーのスクリーニング（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：６３７８−６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０；Ｌａｄｎｅｒ，上掲）。これらのライブラリーのうちのいずれか１つ（そのあらゆる試験分子を含む）が、ＨＥＲ分子の全体もしくは一部分（例えば、サブドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩもしくはＩＶにおいて同定され、そして、配列番号５４〜１２５のいずれかに示されるＨＥＲエピトープの任意の部分）と接触され、そして、ＨＥＲ ＥＣＤまたはその一部分との試験分子の相互作用が評価され得る。少なくとも１以上のエピトープ領域との相互作用を示す候補汎ＨＥＲ治療薬が同定され得る。このような汎ＨＥＲ治療薬はまた、少なくとも１以上の全長ＨＥＲ分子、またはそのＥＣＤ部分（代表的には、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＨＥＲ分子）との相互作用を示す。
スクリーニングアッセイが結合アッセイである場合、ＨＥＲの全体もしくは一部分、または、そのＨＥＲ ＥＣＤの全体もしくは一部分（例えば、配列番号５４〜１２５および４０５に示されるペプチドエピトープのうちの任意の１つ）、または試験分子は、標識に接合され得、この標識は、直接的もしくは間接的に検出可能な信号を提供し得る。種々の標識としては、放射性同位体、蛍光分子、化学発光分子、酵素、特異的結合分子、粒子（例えば、磁気粒子）などが挙げられる。特異的結合分子としては、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンとアンチジゴキシンなどのような対が挙げられる。特異的結合分子について、相補的なメンバーは、通常、公知の手順にしたがって検出をもたらす分子で標識される。種々の他の試薬がスクリーニングアッセイに含められ得る。これらとしては、最適なタンパク質−タンパク質結合を促進し、そして／または、非特異的もしくは背景の相互作用を減少させるために使用される、塩、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、界面活性剤などのような試薬が挙げられる。アッセイ効率を改善する試薬（例えば、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビターまたは抗微生物剤）が使用され得る。成分は、任意の順序で加えられ、必須の結合を生じる。インキュベーションは、最適な活性を促進するあらゆる温度、代表的には４℃〜４０℃の間の温度で行われる。インキュベーション時間は、最適な活性について選択されるが、迅速なハイスループットスクリーニングを促進するために最適化もされ得る。通常、０．１時間〜１時間の間で十分である。一般に、複数のアッセイ混合物が、異なる試験因子の濃度で平行して処理されて、これらの濃度に対する差次的な応答が得られる。代表的には、これらの濃度のうちの１つは、ネガティブコントロールとして機能する、すなわち、ゼロ濃度または検出レベル以下の濃度である。
一例では、ファージディスプレイライブラリーは、上述のように、ＨＥＲレセプター分子またはその一部分に結合するリガンドについてスクリーニングされ得る。これらのライブラリーの構築および解析、ならびに、結合剤の生体パニングおよび選択の関する基本的な手順の詳細は、公開されている（例えば、ＷＯ ９６／０４５５７；Ｍａｎｄｅｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｄｉｓｐｌａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−−Ｎｏｖｅｌ Ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｐ．Ｇｕｔｔｒｙ（ｅｄ）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｇｈ，Ｍａｓｓ．，ｐｐ．２３１−２５４；Ｒａｖｅｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １６：１９９３−１９９９；Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０）；Ｇｒｉｈａｌｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅ １６６：１８７−１９５；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１９９７−２００１；Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｇｅｎｅ １２８：５９−６５；Ｃａｒｃａｍｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１１１４６−１１１５１；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，１９９７，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６２−７０；Ｒａｄｅｒ ａｎｄ Ｂａｒｂａｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：５０３−５０８を参照のこと；これらは全て、本明細書中に参考として援用される）。
公知の薬学的に活性な化合物に対する模倣物の設計は、「リード」化合物を元にした薬物の開発のための公知のアプローチである。これは、活性化合物の合成が困難であるか、もしくは合成が高コストである場合、または、活性化合物が特定の投与方法に不適切である場合（例えば、ペプチドは、消化管においてプロテアーゼにより迅速に分解される傾向があるので、一般に、経口用組成物としては不適切な活性因子である）に望ましくあり得る。模倣物の設計、合成および試験は、一般に、標的特性についての分子の大規模スクリーニングを回避するために使用される。
所与の標的特性を持つ化合物からの模倣物の設計において一般に採用されるいくつかの工程がある。第一に、標的特性の決定に重大および／または重要な化合物の特定の部分が決定される。ペプチドの場合には、これは、ペプチド中のアミノ酸残基を体系的に変化させることによって（例えば、ターンにおける各残基を置換することによって）なされ得る。化合物の活性な領域を構成するこれらに部分または残基は、「ファルマコフォア」として知られる。
一度ファルマコフォアが見出されると、様々な供給源からのデータ（例えば、分光技術、Ｘ線回折データおよびＮＭＲ）を用いて、その物理的特性（例えば、立体化学、結合、サイズおよび／または電荷）にしたがって、その構造がモデリングされる。コンピュータ解析、類似性マッピング（原子間の結合ではなく、ファルマコフォアの電荷および／または容量をモデリングする）および他の技術が、このモデリングプロセスにおいて使用され得る。このアプローチの別法において、リガンドおよびその結合パートナーの三次元構造がモデリングされる。これは、リガンドおよび／または結合パートナーが結合の際に立体配座を変化させる場合に特に有用であり得、そのモデルが、模倣物の設計においてこのことを考慮に入れることを可能にする。次いで、鋳型分子が選択され、そして、ファルマコフォアを模倣する化学基が、鋳型上にグラフトされ得る。鋳型分子およびこの鋳型分子上にグラフトされる化学基は、模倣物が、合成が容易となり、薬理学的に受容可能であり、インビボで分解されず、そして、リード化合物の生物学的活性を保持するように、好都合に選択され得る。次いで、見出された模倣物が、標的特性を示す程度、または、それをどの程度阻害するかを確認するためにスクリーニングされる。次いで、さらなる最適化または修飾が行われ、インビボもしくは臨床試験のための１以上の最終的な模倣物にたどり着き得る。
上記の方法において同定された汎ＨＥＲ治療薬は、１以上のＨＥＲ活性を機能的に調節するその能力について試験され得る。このような活性は、当業者に公知であり、そして、本明細書においてもＧの節に記載されている。このようなアッセイの例としては、リガンド結合、細胞増殖、細胞リン酸化および複合体化／二量体化が挙げられる。したがって、
ＨＥＲ分子またはその一部分への高い親和性の結合に基づいて本明細書において候補として同定されたあらゆる候補汎ＨＥＲ治療薬は、その候補治療薬が、汎ＨＥＲ治療特性、すなわち、ＨＥＲ活性に対する阻害特性を有するかどうかを決定するためのさらなるスクリーニングアッセイにおいて試験され得る。例えば、ドメインＩＩ内の二量体化アームを標的とする汎ＨＥＲ治療薬は、ＨＥＲ分子がその分子自体と、または、他のＨＥＲファミリー分子と二量体化する能力を阻害することが最も望ましい。同様に、二量体化がない場合、このような候補治療薬はまた、適切なリガンドで刺激されたときに、細胞のリン酸化または細胞の増殖を誘導するＨＥＲ分子の能力を阻害することが期待される。別の例では、例えば、ドメインＩＩとドメインＩＶを架橋することによって係留型を安定させるように機能する汎ＨＥＲ治療薬は、ＨＥＲ分子が活性な状態に遷移する能力を阻害する。したがって、このような候補汎ＨＥＲ治療薬は、リガンドの存在下で刺激された細胞の増殖または細胞のリン酸化によって評価される、二量体化または細胞の活性化を調節する（代表的には、阻害する）その能力について試験され得る。さらなる例では、候補の汎ＨＥＲ治療薬は、任意の１以上のＨＥＲファミリーへのリガンド（ＥＧＦ、アンフィレグリン、ＴＧＦ−α、またはニューレグリンのうち任意の１つ（すなわち、ＨＲＧβ）が挙げられるがこれらに限定されない）の結合についてアッセイすることによって、リガンド結合を阻害するその能力について試験され得る。同定された汎ＨＥＲ治療薬は、少なくとも２つのＨＥＲレセプターに対する上記ＨＥＲ媒介性の活性のうち１以上を調節（代表的には阻害）する。
Ｋ．実施例
以下の実施例は、例示の目的のみのために含まれ、そして、本発明の範囲を制限することは意図されない。
（実施例１ ＨＥＲ細胞外ドメインのクローニング）
ＨＥＲ分子の細胞外ドメインの全体もしくは一部分を含む種々のＨＥＲ誘導体をクローニングし、そして、発現させた。
Ａ．ＨＥＲ ＥＣＤ誘導体のクローニング
ＨＥＲ１−６２１（配列番号１２）を、以下のようにしてクローニングした：細胞外ドメイン（全長のＨＥＲ１レセプターのアミノ酸配列のアミノ酸１〜６２１；Ｇａｉｌ Ｃｌｉｎｔｏｎから入手；配列番号２）を、ＰＣＲ増幅し、そして、ＫｐｎＩ−Ｘｈｏ１制限酵素部位を介してｐｃＤＮＡ３．１ Ｍｙｃ−Ｈｉｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；また、ｐｃＤＮＡ３．１ Ｍｙｃ−Ｈｉｓの配列については、配列番号１６１もまた参照のこと）中にサブクローニングし、ｐｃＤＮＡ／ＨＥＲ１−６２１−ｍｙｃ−Ｈｉｓベクターを作製した。
ＨＥＲ３−６２１（配列番号２６）を、以下のようにしてクローニングした：細胞外ドメイン（全長のＨＥＲ３レセプターのアミノ酸配列のアミノ酸１〜６２１；配列番号６を参照のこと）を、ＰＣＲ増幅し、そして、ＫｐｎＩ−ＸｂａＩ制限酵素部位を介してｐｃＤＮＡ３．１ Ｍｙｃ−Ｈｉｓベクター中にサブクローニングし、ｐｃＤＮＡ／ＨＥＲ３−６２１−ｍｙｃ−Ｈｉｓベクターを作製した。
さらなるＥＣＤ誘導体をクローニングした。この名称と、それぞれをコードする核酸およびそのコードされるアミノ酸の識別番号を、以下の表に示す：
図２（Ａ）〜２（Ｄ）は、これらのクローニングしたアイソフォームの各々と、そのそれぞれの同系レセプターとのアラインメントを示す。
Ｂ．タンパク質の発現と分泌
ヒト細胞においてＨＥＲ ＥＣＤ誘導体を発現させるために、ヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞を、６ウェルプレート中に２×１０６細胞／ウェルで撒き、そして、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）および１０％胎仔ウシ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に維持した。ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って用いて、細胞のトランスフェクションを行った。トランスフェクションの日に、５μｇのプラスミドＤＮＡを、０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ中で、１５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００と混合した。この混合物を室温で２０分間インキュベートし、その後、これを細胞に加えた。細胞を、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃にて４８時間インキュベートした。ＨＥＲ ＥＣＤ誘導体のタンパク質分泌を研究するために、馴化培地を、４８時間後に回収した。馴化培地を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、その後、抗Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたイムノブロッティングによって解析した。抗体は、１：５０００に希釈した。
培養ヒト細胞からの培養培地を、ＨＥＲ ＥＣＤ誘導体の各々の分泌について評価した。ＨＥＲ ＥＣＤ誘導体の分泌の比較を、以下の表１０に示す。
。
（実施例２ ＨＥＲ−Ｆｃ融合調製物およびタンパク質の発現）
Ａ．ヒトＩｇＧ１のＦｃフラグメントのクローニング
ヒトＩｇＧ１のＦｃフラグメント（配列番号１６７に示され、そして、配列番号１６３に示されるアミノ酸配列のアミノ酸Ｐｒｏ１００〜Ｌｙｓ３３０に対応する）を、以下のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのペアを用いて、一本鎖ｃＤＮＡプールからＰＣＲ増幅した：
５’ ＣＣＣ ＡＡＡ ＴＣＴ ＴＧＴ ＧＡＣ ＡＡＡ ＡＣＴ ＡＣＴ Ｃ ３’（配列番号４９）
５’ ＴＴＴ ＡＣＣ ＣＧＧ ＧＧＡ ＣＡＧ ＧＧＡ Ｇ ３’（配列番号５０）。
ＰＣＲフラグメントをゲル精製し、ｐＤｒｉｖｅクローニングベクター（Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲクローニングキット、Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃａｉ ＣＡ、配列番号１６０）中にサブクローニングし、ｐＤｒｉｖｅ／ＩｇＧ１Ｆｃを作製した。
Ｂ．ＦｃのＨＥＲ細胞外ドメインへの融合
ＨＥＲ１−６２１／Ｆｃ（配列番号４０）を、以下のようにしてクローニングした：ｐｃＤＮＡ／ＨＥＲ１−６２１−ｍｙｃ−Ｈｉｓベクターを、ＸｈｏＩおよびＡｇｅＩで制限酵素消化した。切断したプラスミドを、Ｑｉａｇｅｎゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントを、以下のプライマーを用いて、ｐＤｒｉｖｅ／ＩｇＧ１ＦｃベクターからＰＣＲ増幅した：
５’ＡＴＴＡ ＣＴＣＧＡＧ ＧＧＡ ＣＧＡ ＡＴＧ ＧＡＣ ＣＣＣ ＡＡＡ ＴＣＴ ＴＧＴ ＧＡＣ ＡＡＡ ＡＣＴ Ｃ ３’（ＸｈｏＩ部位を含む、配列番号５１）
５’ ＡＣＴＴ ＡＣＣＧＧＴ ＴＴＴ ＡＣＣ ＣＧＧ ＧＧＡ ＣＡＧ ＧＧＡ Ｇ ３’（ＡｇｅＩ部位を含む、配列番号５２）。
ＰＣＲ増幅したＦｃフラグメントを、ＸｈｏＩおよびＡｇｅＩで消化し、そして、消化したｐｃＤＮＡ／ＨＥＲ１−６２１−ｍｙｃ−Ｈｉｓベクター中にライゲーションした。
ＨＥＲ３−６２１／Ｆｃ（配列番号４６）を、以下のようにしてクローニングした：ｐｃＤＮＡ／ＨＥＲ３−６２１−ｍｙｃ−Ｈｉｓベクターを、ＸｂａＩおよびＡｇｅ１で制限酵素消化した。切断したプラスミドを、Ｑｉａｇｅｎゲル精製キットを用いて精製した。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントを、以下のプライマーによって、ｐＤｒｉｖｅ／ＩｇＧ１からＰＣＲ増幅した：
５’ ＡＴＴＡ ＴＣＴＡＧＡ ＧＧＡ ＣＧＡ ＡＴＧ ＧＡＣ ＣＣＣ ＡＡＡ ＴＣＴ ＴＧＴ ＧＡＣ ＡＡＡ ＡＣＴ Ｃ（ＸｂａＩ部位を含む、配列番号５３）
５’ ＡＣＴＴ ＡＣＣＧＧＴ ＴＴＴ ＡＣＣ ＣＧＧ ＧＧＡ ＣＡＧ ＧＧＡ Ｇ ３’（ＡｇｅＩ部位を含む、配列番号５２）。
ＰＣＲ増幅したＦｃフラグメントを、ＸｂａＩおよびＡｇｅＩで消化し、そして、消化したｐｃＤＮＡ／ＨＥＲ３−６２１−ｍｙｃ−Ｈｉｓベクター中にライゲーションした。
他の融合構築物を同様に調製した。結果として生じた融合構築物を全て、ＤＮＡ配列決定により確認した。例示的なＦｃ融合タンパク質構築物を、以下の表に示す：
Ｃ．タンパク質の発現と分泌
ＨＥＲ−Ｆｃキメラタンパク質を作製するために、ＨＥＲ ＥＣＤ Ｆｃ融合構築物（ＨＥＲ１−６２１／Ｆｃ；ＨＥＲ３−６２１／Ｆｃ；ＨＥＲ２−６５０／Ｆｃ；ＨＥＲ４−６５０／Ｆｃ）を、個々に、実施例１に記載したように、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後に馴化培地を回収した。等量の馴化培地（２０μｌ）を、変性タンパク質ゲル上で分離させた。ウェスタンブロットを抗Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）または抗Ｆｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）でプローブして、タンパク質の発現と分布を確認した。ＨＥＲ ＥＣＤ誘導体の分泌の比較を、以下の表１２に示す。
ＨＥＲ１およびＨＥＲ３の多量体を作製するために、ＨＥＲ Ｆｃ融合構築物（ＨＥＲ１−６２１／ＦｃおよびＨＥＲ３−６２１／Ｆｃ）の各々を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って用いて、２９３Ｔ細胞中に同時にトランスフェクトした。各トランスフェクションからの馴化培地を、トランスフェクションから４８時間後に回収した。等量の馴化培地（２０μｌ）を変性タンパク質ゲル上で分離させた。ウェスタンブロットを抗Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）または抗Ｆｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）でプローブして、タンパク質の発現と分布を確認した。
ＲＢ２００ｈ（ＨＦＤ １００／３００Ｈとも呼ばれる（Ｆｃドメインを介して全長ＨＥＲ３ ＥＣＤに連結された全長ＨＥＲ１ ＥＣＤ））を発現させるために、Ｈｅｒ１およびＨｅｒ３の構築物を、１：３（Ｈｅｒ１：Ｈｅｒ３）の比で同時にトランスフェクトした。ＴＴから５時間後に、培地を、ＤＭＥＭ＋１％ ＦＢＳ（低ＩｇＧ）で置き換える。最初の馴化培地を、ＴＴから４日後に回収し、その後、補給し、二回目の回収を行った。
前もって無血清培地（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３）に適合させたＣＨＯ細胞およびＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を用いて、懸濁細胞タンパク質の発現（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）もまた行った。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、１×１０６細胞／ｍｌでＷａｖｅＢｉｏＲｅａｃｔｏｒｓに撒いた。次の日、ＨＥＲ ＥＣＤ構築物（ＨＥＲ１−６２１／ＦｃおよびＨＥＲ３−６２１／Ｆｃ）を、２５ｋＤの直鎖状ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）：ＤＮＡを１：２の比で用いて、２９３Ｔ細胞中にＴＴ処理した。ＲＢ２００ｈのヘテロ二量体を発現させるために、Ｈｅｒ１およびＨｅｒ３の構築物を、１：３（Ｈｅｒ１：Ｈｅｒ３）の比で同時にトランスフェクトした。ＴＴから５時間後に、培地の容量を倍にした。生存細胞とタンパク質の産生を毎日監視した。ＴＴから６日後に馴化培地を回収した。
（実施例３ ＨＥＲ（ＨＦ）誘導体およびＨＥＲ−Ｆｃ（ＨＦＤ）分子の精製）
末尾に「Ｔ」を沿えたＨＦ分子は全て、金属アフィニティ精製のために、Ｃ末端に６−ヒスチジンテイルを含む。これらの分子を全て、Ｎｉ−アフィニティ金属クロマトグラフィーを用いて精製し、その後、分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。第一に、分泌されたＨＦ分子を含む馴化培地（ＣＭ）を、遠心分離（３０分、１０，０００ｒｐｍ）によって清澄にし、その後、フィルタ処理した（０．３ミクロン）。清澄にしたＣＭを、次いで、Ｐａｌｌ接線流濃縮機（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を用いて４倍に濃縮し、最終的なＣＭの容量を約４００ｍｌとした。
１０×Ｎｉ−ＮＴＡローディング緩衝液を加えて、ＣＭを５０ｍＭ ＮａＰＯ４（ｐＨ８．０）および３５０ｍＭ ＮａＣｌにした。次いで、この溶液を、予め緩衝液Ａ（緩衝液Ａ：５０ｍＭ ＮａＰＯ４（ｐＨ８）、３５０ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化した１．５ｍｌのニッケルアフィニティ金属クロマトグラフィーカラム（Ｎｉ−ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上に、０．６ｍｌ／分の流速でロードした。ローディング後に、２８０ｎｍにおける吸光度が非結合のタンパク質が残っていないことを示すようになるまで、カラムを緩衝液Ａで洗浄した。次いで、ＨＦ分子を、無勾配の緩衝液Ａ＋１５０ｍＭイミダゾールによって溶出した。ＨＦ分子を含むピーク画分をプールして１ｍｌまで濃縮し、次いで、分取ＳＥＣカラム（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２ １０／３００ ＧＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）上にロードした。ＨＦ単量体を含むピーク画分を、ホースラディッシュペルオキシダーゼを結合した抗Ｈｉｓ６−Ｔａｇ抗体（ＨｙＴｅｓｔ Ｌｔｄ．，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いたイムノブロッティングによって同定した。ＨＦ分子のアミノ酸配列決定を行って、各分子を確認した。
ＨＦＤ１００／ＨＦＤ３００Ｔヘテロ二量体は、ＨＦＤ１００およびＨＦＤ３００ＴのＦｃ融合物である。この分子を生成するための一過的なトランスフェクションはまた、ＨＦＤ１００およびＨＦＤ３００Ｔと指定されるホモ二量体も生成する。ＨＦＤ３００Ｔホモ二量体およびＨＦＤ１００／ＨＦＤ３００Ｔヘテロ二量体を、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって精製した。というのも、ＨＦ３００Ｔは、Ｃ末端に６−ヒスチジンタグを含むからである。馴化培地（ＣＭ）を、清澄にし、そして、上述のように濃縮した。得られたＣＭを、１．５ｍｌのプロテインＡカラム（ｎＰｒｏｔｅｉｎＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）上にロードし、そして、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ ＩｇＧ溶出緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で溶出した。溶出の際に、５０μｌの１Ｍ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて、画分を中和した。タンパク質を含む画分をプールし、そして、溶液を、５０ｍＭ ＮａＰＯ４（ｐＨ８．０）および３５０ｍＭ ＮａＣｌにした。このプールを、予め緩衝液Ａで平衡化した１．５ｍｌのニッケルアフィニティ金属クロマトグラフィーカラム（Ｎｉ−ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上にロードした。ＨＦＤ１００ホモ二量体を含むフロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を回収した。緩衝液Ａで洗浄した後、ＨＦＤ３００Ｔホモ二量体およびＨＦＤ１００／ＨＦＤ３００Ｔヘテロ二量体タンパク質を、無勾配の緩衝液Ａ＋１５０ｍＭイミダゾールを用いて溶出した。
３ｍｌのＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて、１０ｍｇのＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）をセファロース固体支持体に共有結合することによって、１０ｍｌのＥＧＦアフィニティカラムを生成した。Ｎｉ−ＮＴＡ溶出物からのピーク画分をプールし、そして、直ちに、ＥＧＦアフィニティカラム上でクロマトグラフィーにより分離した。ＨＦＤ３００Ｔに対応するピークを、フロースルーに回収した。ＨＦＤ１００／ＨＦＤ３００Ｔヘテロ二量体をＩｇＧ溶出緩衝液で溶出し、そして、タンパク質を含む画分をプールし、分取ＳＥＣカラム（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２ １０／３００ ＧＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてクロマトグラフィーにより分離した。この工程は、ＥＧＦアフィニティカラムの工程の間に溶出されるあらゆるＥＧＦを排除する。精製ＨＦＤ１００／３００Ｔを含む画分を、５０μｌ １Ｍ ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）で中和し、緩衝液をＰＢＳに交換し、そして、３０ｋＤカットオフＡｍｉｃｏｎスピン濾過カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で濃縮した。
実施例２のトランスフェクトした細胞から馴化培地をとり、１２，０００×ｇにて４℃で１５分間遠心分離して清澄にし、その後、３μｍのＶｅｒｓａｐｏｒｅ ３０００Ｔフィルタ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ）を通して濾過することによって、ＲＢ６００を精製した。清澄にした馴化培地を、３０ ｋＤａカットオフＵｌｔｒａｓｅｔｔｅ Ｓｃｒｅｅｎ Ｃｈａｎｎｅｌ接線流濾過デバイス（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ）による限外濾過により１０倍に濃縮し、そして、これをＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅアフィニティカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）にアプライした。このカラムを、０．１％（ｖ／ｖ） ＴＸ−１１４を含むＰＢＳで徹底的に洗浄し、そして、ＩｇＧ溶出緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＩＬ）で溶出した。溶出した画分を、直ちに、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬでｐＨ８．０に中和した。
この段階で、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅアフィニティカラムから溶出したＦｃを含むタンパク質は、ＲＢ２００ｈヘテロ二量体、および、ＨＦＤ１００とＨＦＤ３００ｈとのホモ二量体から構成される。このＲＢ２００ｈヘテロ二量体、および、ＨＦＤ１００とＨＦＤ３００ｈとのホモ二量体の混合物は、ＲＢ６００と呼ばれる。このホモ二量体／へテロ二量体混合物を、ＰＢＳに対して透析した後の混合物（ＲＢ６００）として直接使用するか、または、ＲＢ２００ｈ（Ｆｃドメインを介して全長ＨＥＲ３ ＥＣＤに連結された全長ＨＥＲ１ ＥＣＤ；ＨＦＤ１０００／ＨＦＤ３００Ｈとも呼ばれる）のさらなる精製のための出発物質として使用した。ＲＢ２００ｈの構造は図４に示す。
純度解析
分析用逆相ＨＰＬＣを用いて、タンパク質の純度を決定した。タンパク質の逆相ＨＰＬＣを、ＡＫＴＡ：Ｐｕｒｉｆｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に取り付けたＫｒｏｍａｓｉｌ製の分析用Ｃ４カラム（１５０×４６ｍｍ；５ｍｍ；１００ Ａ）を用いて行った。緩衝液Ａは、水中０．１％（ｖ／ｖ）のＴＦＡから構成され、そして、緩衝液Ｂは、２５％の２−プロパノール；７５％のアセトニトリル；０．１％（ｖ／ｖ）のＴＦＡを含んだ。代表的には、５０〜１００ｍｇのタンパク質をロードし、そして、５〜９５％の緩衝液Ｂの線形勾配を用いてサンプルを溶出した（流速＝０．５ｍＬ／分；勾配＝６％／分）。
この系における条件下では、２つのｅｒｂＢ３鎖を含むホモ二量体がまず溶出し、その後、ヘテロ二量体（ＲＢ２００ｈ）が、次いで、ｅｒｂＢ１ホモ二量体が溶出する。ピークの割り当ては、以下の２つのアプローチを用いて行った。第一に、単独のトランスフェクションを行った細胞から精製した鎖（１つのみのポリペプチド鎖をコードするもの）を用いて、ホモ二量体のピークを同定した（図５を参照のこと）。第二に、各ピークからの画分をＮ末端配列決定（Ｓｔａｎｆｏｒｄ：ＰＡＮ施設）に付託し、最初の割り当てを確認した（データ示さず）。
精製スキームは、プロテインＡカラム、Ｎｉ−セファロースカラムおよびＥＧＦＲ−Ａｆｆｙｂｏｄｙカラムの組合せを用いた。ＳＤＳ ＰＡＧＥおよび逆相ＨＰＬＣにより＞９０％の純度であったものとして、精製ＲＢ２００ｈを判断した。分析用の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムにより示されるように、ＲＢ２００ｈ（Ｆｃドメインを介して全長ＨＥＲ３ ＥＣＤに連結された全長ＨＥＲ１ ＥＣＤ）は純粋であり、そして、ＨＦＤ １００およびＨＦＤ ３００の汚染は、１０％以下であった（図５）。
（実施例４ ＨＥＲ ＥＣＤまたはＨＥＲ−Ｆｃのリガンドへの結合）
Ａ．ＨＥＲ ＥＣＤ誘導体の上皮増殖因子（ＥＧＦ）への結合
ＨＥＲ１（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４の細胞外ドメインを、ヒトＦｃ（実施例１および２を参照のこと）に融合して、キメラポリペプチドを生成した。ＨＥＲ ＥＣＤ（ＨＥＲ−Ｔ）またはＨＥＲ−Ｆｃは、対応するベクター（上記の実施例１および２を参照のこと）でトランスフェクトした細胞からの馴化培地から得た。対応するｃＤＮＡ構築物で一過的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞から上清を回収した。ＨＥＲ１−６２１／Ｆｃ、ＨＥＲ２−６５０／Ｆｃ、ＨＥＲ３−６２１／Ｆｃ、ＨＥＲ４−６５０／Ｆｃ、ＨＥＲ１−５０１／Ｆｃ、ＨＥＲ１−６２１（Ｔ）、ＨＥＲ１−５０１（Ｔ）を含む上清への、放射標識ＥＧＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の結合を、以下のようにして決定した：結合は、ｐＨ７．５のＨｅｐｅｓ緩衝液中、室温にて２時間、１０００倍過剰の冷ＥＧＦを伴ってか、または伴わずに、２０μｌの上清と５ｎＭの１２５Ｉ−ＥＧＦとを混合することによって行った。結合アッセイの終わりにＢＳ３（化学的な架橋剤（Ｐｉｅｒｃｅ））を加えて、結合した分子を架橋させた。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、そして、検出のためにフィルムに感光させた。推定されるＨＥＲ分子への１２５Ｉの結合を、等モル濃度に対して基準化した。結果は、１２５Ｉ−ＥＧＦがＨＥＲ１誘導体にのみ結合し、そして、ＨＥＲ２−６５０／Ｆｃ（ＨＦＤ２００）、ＨＥＲ３−６５０／Ｆｃ（ＨＦＤ３００）またはＨＥＲ４−６５０／Ｆｃ（ＨＤＤ４００）に結合した１２５Ｉ−ＥＧＦは検出されなかったことを示す。１２５Ｉ−ＥＧＦのＨＥＲ１−６２１／Ｆｃ（ＨＦＤ１００）への結合は、過剰量の冷ＥＧＦにより完全に競合された。
抗ＨＥＲ１抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたウェスタンブロッティングと、その後のデンシトメトリーを用いて、相対的なＨＥＲ１誘導体レベルを推定し、次いで、各タンパク質に対するリガンド結合を基準化した。結果は、ＨＥＲ１−６２１／Ｆｃ（ＨＦＤ１００）が、ＨＥＲ１−５０１／Ｆｃ（ＨＦＤ１１０）およびＨＥＲ１−５０１（ＨＦ１１０）よりも高く、そして、非Ｆｃ全長ＨＥＲ１ ＥＣＤ（ＨＥＲ１−６２１；ＨＦ１００）よりもかなり高い１２５Ｉ−ＥＧＦに対する結合親和性を有することを示す。Ｆｃ融合物が、発現の際に二量体を形成することが、以下に示される。したがって、これらのリガンド結合は、Ｆｃ部分により媒介される融合／二量体化が、ＨＥＲ１の全長ＥＣＤの高い親和性の結合を回復し、これは、ＨＥＲ１−５０１単量体分子の親和性を上回ることを示す。
さらなる実験が、ＨＦＤ１００（ＨＥＲ−６２１／Ｆｃ）およびＨＦＤ１１０（ＨＥＲ１−５０１／Ｆｃ）が、ＨＦ１００と比較して１２５Ｉ−ＥＧＦリガンドへの結合の実質的な増加を示す一方で、ＨＦ１１０は、１２５Ｉ−ＥＧＦに対して検出可能な結合を示さなかったことを実証する。さらに、データは、予想通り、ＨＥＲ１／ＨＥＲ３（ＨＦＤ１００／ＨＦＤ３００）ヘテロ二量体が、実質的にＨＦ１００およびＨＦ１１０よりも多いが、ＨＦＤ１００ホモ二量体もしくはＨＦＤ１１０ホモ二量体よりも少なく１２５Ｉ−ＥＧＦに結合したことを実証する。
Ｂ．ＨＥＲ ＥＣＤ誘導体のヘレグリン（ＨＲＧ）への結合
ＨＥＲ ＥＣＤ誘導体のヘレグリンへの結合は、上記Ａパートに記載したＥＧＦへの結合について記載されたものと同様のアッセイを用いて行った。簡単に述べると、ＨＦ３００（ＨＥＲ３−６２１）、ＨＦ３１０（ＨＥＲ３−５０１）、ＨＦＤ３００（ＨＥＲ３−６２１／Ｆｃ）、ＨＦＤ３１０（ＨＥＲ３−５０１／Ｆｃ）；および精製ＨＦＤ１１０／ＨＦＤ３１０ヘテロ多量体（ＩｇＧ１のＦｃフラグメントを介して連結されたＨＦ１１０およびＨＦ３１０の構築物）をコードするｃＤＮＡ構築物で一過的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞から上清を回収した。結合は、２０μｌのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．５）中、室温にて２時間、増加する量の上清（２．５μｌ〜２０μｌの上清）と５ｎＭの１２５Ｉ−ＨＲＧとを混合することによって行った。結合アッセイの終わりに１ｍＭのＢＳ３架橋剤を加えて、結合した分子を架橋させた。結合反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離させた。タンパク質ゲルを乾燥させ、そして、２時間および６時間、フィルムに感光させた。
結果は、試験した全ての誘導体がある程度ＨＲＧに結合したが、その程度は多様なレベルであったことを示す。試験した全ての誘導体について、結合は、用量依存的であり、２０μｌの上清において最大の結合が観察された。並行して行った、抗ＨＥＲ３抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたウェスタンブロットと、その後のデンシトメトリーを用いて、相対的なＨＥＲ３誘導体レベルを推定し、次いで、結合部位の平均数（これは、抗ＨＥＲ３結合部位と等価である）に基づいて各タンパク質に対するリガンド結合を基準化した。このような基準化の後、結果は、ＨＲＧが、ＨＦ３００分子に対して最低の結合を示し、これは、試験した他の誘導体と比較して、わずか約１０％の結合であったことを示した。ＨＦ３１０、ＨＦＤ３００、ＨＦＤ３１０およびＨＦＤ１１０／ＨＦＤ３１０の各々は、基準化の後、ＨＲＧに対して等価な結合を示した。
Ｃ．ＨＥＲ誘導体の上皮増殖因子（ＥＧＦ）およびヘレグリン（ＨＲＧ）への結合の競合的解析
１２５Ｉ−ＥＧＦ（ＨＥＲ１に対する天然のリガンド）および１２５Ｉ−ＨＲＧ（ＨＥＲ３およびＨＥＲ４に対する天然のリガンド）へのその結合について、種々のＨＥＲ誘導体を試験することによって、種々のＨＥＲ誘導体の特異性を比較した。放射標識したＥＧＦのＨＥＲ１−６２１／Ｆｃ、ＨＥＲ２−６５０／Ｆｃ、ＨＥＲ３−６２１／Ｆｃ、ＨＥＲ４−６５０／Ｆｃへの結合を、上述のようにして決定した。１２５Ｉで放射標識したＨＲＧのＨＥＲ１−６２１／Ｆｃ、ＨＥＲ２−６５０／Ｆｃ、ＨＥＲ３−６２１／Ｆｃ、ＨＥＲ４−６５０／Ｆｃへの結合は、１２５Ｉ−ＥＧＦへの結合について記載したものと同じ条件を用いて決定した。ウェスタンブロットを、抗Ｈｉｓ抗体でプローブして、タンパク質のレベルを比較した。結果は、放射標識したＥＧＦが、ＨＥＲ１−６２１／Ｆｃにのみ結合し、そして、試験した他の分子には結合しないことを示す。放射標識したＨＲＧは、ＨＥＲ３−６２１／Ｆｃ分子およびＨＥＲ４−６５０／Ｆｃ分子にのみ結合する。
ＨＥＲ１−６２１／ＦｃおよびＨＥＲ３−６２１／Ｆｃ（実施例２を参照のこと）、またはＨＥＲ１−５０１／ＦｃおよびＨＥＲ３−５０１／Ｆｃを用いて同時トランスフェクションを行った細胞からの馴化培地を、１２５Ｉ−ＥＧＦおよび１２５Ｉ−ＨＲＧへの結合について試験した。データは、ＨＥＲ１−６２１／Ｆｃ：ＨＥＲ３−６２１／Ｆｃを用いて同時トランスフェクションを行った細胞は、放射標識したＥＧＦと、ＨＲＧに結合するタンパク質を生成することを示す。
ウェスタンブロットを、抗ＨＥＲ１抗体および抗ＨＥＲ３抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でプローブして、タンパク質のレベルを比較した。放射標識したリガンドの結合は、同時トランスフェクションを行った細胞によって発現されるタンパク質（ＨＥＲ１／ＨＥＲ１ホモ二量体、ＨＥＲ１／ＨＥＲ３ヘテロ二量体およびＨＥＲ３／ＨＥＲ３ホモ二量体を含む）の量に比例していた。
ＨＥＲ１−６２１／Ｆｃホモ二量体（ＨＦＤ１００と呼ばれる）が１２５Ｉ−ＥＧＦに結合する一方で、ＨＥＲ３−６２１／Ｆｃホモ二量体（ＨＦＤ３００）およびＨＥＲ４−６２５／Ｆｃ（ＨＦＤ４００）は、１２５Ｉ−ＨＲＧ１β１に結合する（図６ａ）。ＨＥＲ２−６２８／Ｆｃ（ＨＦＤ２００）は、いかなる検出可能な１２５Ｉ−ＥＧＦもしくは１２５Ｉ−ＨＲＧ１β１への結合も示さなかった（図６ａ）。データは、ＨＦＤ１００、ＨＦＤ２００、ＨＦＤ３００およびＨＦＤ４００が、ＥＧＦおよびＨＲＧ１β１に対するその特異性を保持することを示す（図６ａ）：レーン１：ＨＦＤ１００＝ＨＥＲ１−６２１／Ｆｃ、レーン２：ＨＦＤ２００＝ＨＥＲ２−６２８／Ｆｃ、レーン３：ＨＦＤ３００＝ＨＥＲ３−６２１／Ｆｃ、そしてレーン４：ＨＦＤ４００＝ＨＥＲ４−６２５／Ｆｃ。並行して行った研究において、これらのリガンドの架橋は、そのそれぞれの非標識のリガンドによって競合され得、これらの結合が特異的であることが示唆された。
汎ＨＥＲリガンド結合するハーモジュリンを作製するために、ＨＥＲ１−６２１／ＦｃとＨＥＲ３−６２１／Ｆｃのキメラ構築物（ＲＢ２００ｈと称される）を作製した。この分子（ＲＢ２００ｈ）を、１２５Ｉ−ＥＧＦもしくは１２５Ｉ−ＨＲＧ１β１を用いた架橋研究によって、ＨＥＲ１またはＨＥＲ３リガンドに結合するその能力について試験した。データは、ＲＢ２００ｈが、ＥＧＦおよびＨＲＧ１β１の両方に結合することを示す（図６ｂ）。これらの知見は、キメラハーモジュリン（ＲＢ２００ｈ）におけるＨＥＲ１およびＨＥＲ３が、そのそれぞれのリガンドに結合する能力を保持することを明らかにし、そして、ＲＢ２００ｈを汎ＨＥＲリガンド結合剤の候補として示唆した。
（実施例５ ＨＥＲ細胞外ドメインおよびＨＥＲ／Ｆｃ分子の二量体構造および低重合体構造の形成）
活性型の形態において、ＨＥＲ分子は、その二量体化アームを、他の細胞表面レセプターとの二量体の形成を促進するような方向で呈する。ＨＥＲ誘導体のＦｃドメインへの結合は、活性型レセプターを模倣する「背中合わせの」立体配座をとるものと予測される。ＨＥＲ誘導体および／またはＨＥＲ／Ｆｃキメラポリペプチドが多量体を形成することを示すために、ＨＥＲファミリーの細胞外ドメインポリペプチドに対して分子サイズ排除解析を行った。この方法論は、レセプターの外部ドメインがホモ二量体もしくはヘテロ二量体のいずれかとして会合する能力の簡略化された解析を可能にする。分子サイズ排除解析を行うために、溶出した分子を参照標準に対して比較した。以下の表１３は、使用した分子量標準とその溶出容量とを示す。より少ない容量が、カラムの保持容量内で溶出するが、分子が大きくなるにつれ、その増加する分子量に従って、溶出する容量はより少なくなる。
分子サイズ排除解析は、ＰＢＳで平衡化したＡ ＴＳＫ３０００サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）を、０．７ｍｌ／分の流速で用いて行った。カラムを校正するために、ゲル濾過標準（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いた。その溶出容量と分子量とをプロットした。ＰＢＳ中の３０μｇの各未知分子を注射することによって、各未知分子について溶出容量を決定し、その見かけの分子量を計算した。注射間でカラム全体の流れを維持した。分子量標準に関する標準曲線を用いて分子量を決定した。表１４は、この結果を要約する：
データは、ＨＥＲファミリーの細胞外ドメインのいくつかが多量体構造を形成することを示す。化合物は、リガンドを捕捉し、そして、「モック」二量体を形成して、膜貫通型レセプターの二量体化を妨害し、そして、それによって、膜貫通型タンパク質に結合して、膜貫通型タンパク質の活性と干渉し得る。
ＨＥＲ１−５０１は、１１２，１７０ダルトンの見かけ上の分子量を示し、これは、その６０，０００ダルトンという予測される分子量よりも大きい；ＨＥＲ２−５９５は、１６２，０００ダルトンの見かけ上の分子量を示すのに対し、その予測される分子量は、６７，０００ダルトンであった。ＨＥＲ２−５９５（ＨＦ２１０Ｔ）と比較して、ドメインＩＶ内のモジュール２〜５に跨るＨＥＲ２の細胞外ドメインの一セグメント（ＣＳＱＦＬＲＧＱＥＣＶＥＥＣＲＶＬＱＧＬＰＲＥＹＶＮＡＲＨＣＬＰＣＨＰＥＣＱＰＱＮＧＳＶＴＣＦＧＰＥＡＤＱＣＶＡＣＡＨＹＫＤＰＰＦ、配列番号１６のアミノ酸５０８〜５７３に対応）を欠くＨＥＲ２−５３０（ＨＦ２２０Ｔ）は、二量体構造を形成しない。この後者の結果は、この欠いたセグメント（またはこのセグメントの一部分）が二量体化に重要であることを示す。この２つのポリペプチド配列中の相違は、以下に下線が付され、そして太字にされている。影を付けた配列は使用したタグであり、そして、これは、両方の分子について同じものである。タグは、両方の分子に共通であるので、これらは、観察される二量体化に対する影響において役割は担わない。
データはまた、ＨＥＲ−Ｆｃタンパク質がまた高次の低重合体を形成することを示す。ＨＥＲ１−６２１／ＦｃおよびＨＥＲ３−６２１／Ｆｃの各々が、１８０，０００ダルトンの予測分子量を有し、そして、サイズ排除クロマトグラフィーによって観察された分子量は、それぞれ、９７０，０００ダルトンおよび８４３，０００ダルトンより大きかった。これらのアッセイは、リガンドの非存在下で行ったので、この結果はさらに、二量体化（またはより高次の）構造を生成するためにリガンドが必要とされないことを実証する。
（実施例６ ＨＥＲレセプターの増殖およびリン酸化：ＨＥＲ誘導体による阻害）
Ａ．細胞株におけるＨＥＲの発現プロフィール
ＨＥＲの発現レベルを、蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）によって解析して、種々の細胞株の表面上のレセプターおよびその相対量を同定した。選択した細胞を、レセプター特異的な抗体と接触させ、そして、細胞がレセプター特異的な抗体と結合した際の蛍光強度を評価した。
細胞を５ｎＭ ＥＤＴＡを用いて組織培養プレートから浮かせ、そして、１％のＢＳＡを含むＰＢＳ（ＰＢＳ．ＢＳＡ）中に再懸濁した。懸濁物中の細胞を、それぞれのチューブ内で、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４の各々に対するモノクローナル抗体と共に、４℃にて１時間インキュベートした。一次抗体とのインキュベーションの後、細胞を冷ＰＢＳ．ＢＳＡで一度洗浄した。次いで、蛍光色素ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ）でタグを付けたマウスまたはヒトのＩｇＧ（一次抗体の起源に依存）に対する二次抗体を追加した。細胞を４℃にて３０分間インキュベートし、そして、ＰＢＳ．ＢＳＡで２回洗浄した。Ｃｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ−５５４６５５）を加えて細胞を固定し、そして、暗所にて４℃に維持した。Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ装置（ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いてＦＡＣＳを行った。１０，０００細胞の各細胞株を解析した。各細胞株における各ＨＥＲレセプターの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＢＤ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェアを用いてＭＦＩによって測定した。スコア付け：＋＋＋＋ ＞１０００のＭＦＩ、＋＋＋ １００〜１０００のＭＦＩ、＋＋ ５０〜１００のＭＦＩ、＋ ＜５０のＭＦＩであるが、バックグラウンドよりも高いシグナルを有するもの。
表１５は、種々の細胞株におけるレセプターのＨＥＲファミリーの発現プロフィールの結果を示す。
Ｂ．細胞増殖アッセイ
細胞株ＭＣＦ７、ＺＲ７５−１、ＭＥ１８０を、ＡＴＣＣから購入し、そして、１０％のＦＢＳ ＤＭＥＭ中に維持した。細胞を、１％ ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中、９６ウェルプレートに１ウェルあたり２０００細胞で撒いた。撒いてから２〜３時間後に、増加する濃度の候補ＨＥＲ ＥＣＤ誘導体を、リガンド（ＥＧＦまたはＨＲＧβ）の存在下で、この培養物に加えた。細胞を、３７℃にて約７２時間インキュベートした。細胞の相対密度を、アラマーブルー法により測定した。アラマーブルー（Ｓｉｇｍａ）は、４μＭの濃度でＰＢＳ中に調製し、これを、培養培地の１／１０容量（最終濃度０．４μＭ）でマイクロプレートに加え、そして、プレートをインキュベーターに戻した。３７℃にて２〜４時間後、蛍光を、Ｅｘ．＝５３０ｎｍ／Ｅｍ．＝５９０ｎｍにて読み取った。
結果
細胞増殖のデータ：ＨＦＤ１００／３００調製物は、未知の割合のＨＦＤ１００／１００分子、ＨＦＤ３００／３００分子およびＨＦＤ１００／３００分子のプールであった。それにも関わらず、データは、ハイブリッド物質が阻害を行う能力を実証した。ＨＦＤ１００／３００は、ＨＲＧβにより刺激されたＭＥ１８０の増殖を阻害した（５ｎＭ）。データは、約３ｎＭのＨＦＤ１００／３００において８０％を上回る阻害を示し、ＥＧＦにより刺激されたＨＥＲ１に対しても同様であった。ＨＦ３１０Ｔは、ＨＲＧβによって刺激されたＭＣＦ７の増殖を阻害した（１μＭで約９５％）。
Ｃ．ＥＬＩＳＡベースのＨＥＲレセプターのリン酸化アッセイ
ＨＥＲレセプターのリン酸化を、ＥＬＩＳＡベースのＨＥＲレセプターリン酸化アッセイにおいて評価した。種々の細胞（Ａ４３１、ＭＣＦ７、ＳＫ−ＢＲ３、ＳＫ−ＯＶ３、ＭＣＦ７／ＨＥＲ２）を、無血清培地において約２４時間、血清欠乏状態にさせた。次いで、細胞を、増加する濃度の候補ＨＥＲ ＥＣＤ誘導体（以下を参照のこと）で、３７℃にて３０分間処理し、次いで、リガンド（ＥＧＦ、３ｎＭおよび／またはＨＲＧβ、５ｎＭ）を加えて、１０分間インキュベーションした。処理後、細胞をＰＢＳで一度洗浄し、そして、１００μｌの１×Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）と、プロテアーゼインヒビターおよびホスファターゼインヒビター（Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ ＳｅｔおよびＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｓｅｔ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を加えて、細胞を溶解した。
細胞は、氷上で１５分間溶解し、そして、細胞溶解物を、製造業者によって推奨される濃度（０．４〜４μｇ／ｍｌ）かつ条件（ＰＢＳ中、室温で一晩）によって、それぞれのレセプター特異的捕捉抗体（抗体は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍより購入した）で予めコーティングした９６ウェルプレートにアプライした。細胞溶解物を、室温で３時間、捕捉Ａｂと共にインキュベートした。プレートを、ＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄した。ＨＲＰを結合した抗ホスホチロシン抗体クローン４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ）を１％のＢＳＡ．ＰＢＳ中１：１０００に希釈して、このプレートに１００μｌ／ウェルで１時間加えて、チロシンがリン酸化されたＨＥＲレセプターを特異的に検出した。ＰＢＳＴで３回洗浄した後に、１００μｌの基質溶液（ＴＭＢ，Ｓｉｇｍａ）を加えてプレートを発色させ、そして、５０μｌのＳＤＳ停止溶液によって発色を停止させた。６５０ｎｍのマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＶＥＲＳＡｍａｘ）によって光学密度を決定した。
ｉ．ＨＥＲ１−５０１
ＨＥＲ１−５０１の、ＨＥＲ１およびＨＥＲ２のリン酸化を阻害する能力を、Ａ４３１細胞およびＭＣＦ７細胞において試験した。ＨＥＲ１−５０１の増加する濃度（最大濃度６００ｎＭまで）を、ＥＧＦの存在下で細胞に加えた。予想通りに、ＭＣＦ７細胞においてはＨＥＲ１のリン酸化を観察されなかった。対照的に、ＨＥＲ１は、Ａ４３１細胞においてＨＥＲ１のリン酸化を用量依存的に阻害し、ＩＣ５０は９８ｎＭであった。６００ｎＭのＨＥＲ１−５０１で達成されたＨＥＲ１リン酸化の最大の阻害は、このタンパク質が存在しない場合と比較して、約６０％であった。ＨＥＲ１−５０１はまた、ＭＣＦ７細胞およびＡ４３１細胞においてＨＥＲ２のリン酸化を用量依存的に阻害し、ＩＣ５０はそれぞれ、１８ｎＭおよび４２ｎＭであった。試験した両方の細胞株において、６００ｎＭのＨＥＲ１−５０１において達成されたＨＥＲ２リン酸化の最大の阻害は、このタンパク質が存在しない場合と比較して、約５０％であった。
ｉｉ．ＨＥＲ２−５９５およびＨＥＲ２−５３０
ＨＥＲ２−５９５およびＨＥＲ２−５３０の、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３のリン酸化を阻害する能力を、ＭＣＦ７／ＨＥＲ２細胞において試験した。ＨＥＲ２−５９５またはＨＥＲ２−５３０の増加する濃度（０ｎＭ、７．４ｎＭ、２２．２ｎＭ、６６．７ｎＭ、２００ｎＭおよび６００ｎＭ）を、ＨＲＧの存在下で細胞に加えた。データは、ＨＥＲ２−５９５およびＨＥＲ２−５３０が、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３のリン酸化を用量依存的に阻害し；ＨＥＲ２−５９５がより強力であったことを示す。ＭＣＦ７／ＨＥＲ２細胞において６００ｎＭのＨＥＲ２−５９５で達成されたＨＥＲ２およびＨＥＲ３のリン酸化の最大の阻害は、このタンパク質が存在しない場合と比較して、約５５％であったのに対し、６００ｎＭのＨＥＲ２−５３０で達成された最大の阻害は、このタンパク質が存在しない場合と比較して、約３５％であった。
ｉｉｉ．ＨＥＲ３−６２１およびＨＥＲ３−５００
ＨＥＲ３−６２１およびＨＥＲ３−５００の、ＨＥＲ３のリン酸化を阻害する能力を、ＭＣＦ７細胞において試験した。ＨＥＲ３−６２１およびＨＥＲ３−５００の増加する濃度（最大濃度６００ｎＭまで）を、ＨＲＧの存在下で細胞に加えた。データは、ＨＥＲ３−６２１およびＨＥＲ３−５００が、ＨＥＲ３のリン酸化を用量依存的に阻害したが；ＨＥＲ３−５００がより強力であったことを示す。ＨＥＲ３−５００のＩＣ５０は３９ｎＭであり、ＨＥＲ３−６２１のＩＣ５０は４８ｎＭであった。ＭＣＦ７細胞において６００ｎＭのＨＥＲ３−５００で達成されたＨＥＲ３のリン酸化の最大の阻害は、このタンパク質が存在しない場合と比較して、約７８％であったのに対し、６００ｎＭのＨＥＲ３−６２１で達成された最大の阻害は、このタンパク質が存在しない場合と比較して、約３８％であった。
ＨＥＲ３−６２１およびＨＥＲ３−５００の、ＨＥＲ１およびＨＥＲ３のリン酸化を阻害する能力を、ＳＫ−ＢＲ３細胞において試験した。ＨＥＲ３−６２１およびＨＥＲ３−５００の増加する濃度（最大濃度６００ｎＭまで）を、ＨＲＧの存在下で細胞に加えた。ＨＥＲ１のリン酸化は、ＨＥＲ３−５００によって刺激されたＳＫ−ＢＲ３細胞において観察されなかった。ＭＣＦ７細胞と同様に、ＨＥＲ３−６２１およびＨＥＲ３−５００が、ＳＫ−ＢＲ３細胞において、ＨＥＲ３のリン酸化を用量依存的に阻害したが；ＨＥＲ３−５００がより強力であった。６００ｎＭのＨＥＲ３−５００で達成されたＳＫ−ＢＲ３細胞におけるＨＥＲ３のリン酸化の最大の阻害は、このタンパク質が存在しない場合と比較して、約７５％であったのに対し、６００ｎＭのＨＥＲ３−６２１で達成された最大の阻害は、このタンパク質が存在しない場合と比較して、約５５％であった。
ｉｖ．ＨＥＲ１−６２１／Ｆｃ
ＨＥＲ１−６２１／Ｆｃの、ＨＥＲ１のリン酸化を阻害する能力を、Ａ４３１細胞において試験した。ＨＥＲ１−６２１／Ｆｃの増加する濃度（０．８ｎＭ〜６００ｎＭ）を、ＥＧＦの存在下で細胞に加えた。ＨＥＲ１−６２１／Ｆｃは、Ａ４３１細胞においてＨＥＲ１のリン酸化を用量依存的に阻害し、ＩＣ５０は８．８ｎＭであった。６００ｎＭにおいて、ＨＥＲ１−６２１／Ｆｃは、ＨＥＲ１リン酸化のほぼ完全な阻害を示し、このタンパク質が存在しない場合と比較して、約９９％のリン酸化を阻害した。
ｖ．ＨＥＲ３−６２１／Ｆｃ
ＨＥＲ３−６２１／Ｆｃの、ＨＥＲ３のリン酸化を阻害する能力を、ＭＣＦ７細胞において試験した。ＨＥＲ３−６２１／Ｆｃの増加する濃度（０．８ｎＭ〜６００ｎＭ）を、ＨＲＧの存在下で細胞に加えた。ＨＥＲ３−６２１／Ｆｃは、ＭＣＦ７細胞においてＨＥＲ３のリン酸化を用量依存的に阻害した。６００ｎＭのＨＥＲ３−６２１／Ｆｃで達成されたＭＣＦ７細胞におけるＨＥＲ３リン酸化の最大の阻害は、このタンパク質が存在しない場合と比較して、約７０％であった。
ｖｉ．ＨＥＲ１−６２１／Ｆｃ：ＨＥＲ３−６２１／Ｆｃキメラ
ＨＥＲ１−６２１／Ｆｃ：ＨＥＲ３−６２１／Ｆｃキメラの、ＨＥＲ１のリン酸化を阻害する能力を、Ａ４３１細胞において試験した。ＨＥＲ１−６２１／ＦｃおよびＨｅｒ３−６２１／Ｆｃを用いて同時トランスフェクションを行った細胞からの馴化培地上清を、段階的に２倍に希釈し、そして、ＥＧＦの存在下で細胞に加えた。希釈していない上清中の組換えタンパク質は、約２μｇ／ｍｌ（約１０ｎＭ）である。ＨＥＲ ＥＣＤ／Ｆｃタンパク質でトランスフェクトしていない細胞からの上清をコントロールとして用いた。結果は、コントロールの上清が、ＨＥＲ１リン酸化の阻害をほとんど〜全く示さず、希釈していない上清では、わずかな阻害（１０％未満）のみが観察されたことを示す。対照的に、ＨＥＲ１−６２１／Ｆｃ：ＨＥＲ３−６２１／Ｆｃキメラを含む上清は、ＥＧＦにより刺激されたＡ４３１細胞においてＨＥＲ１のリン酸化を用量依存的に阻害した。ＨＥＲ１−６２１／Ｆｃ：ＨＥＲ３−６２１／Ｆｃキメラを含む希釈していない上清によって達成されたＡ４３１細胞におけるＨＥＲリン酸化の最大の阻害は、このタンパク質が存在しない場合と比較して、約５５％であった。
Ｄ．精製ＨＦＤ１００／３００ ＥＣＤ多量体によるＨＥＲレセプターの増殖およびリン酸化の阻害
１．リン酸化
ＨＥＲレセプターのリン酸化を、上記Ｃの節に記載されるようにして、精製ＨＦＤ１００／３００Ｈにより評価した。精製ＨＦＤ１００／３００Ｈ（Ｈｉｓエピトープタグを持つ、ＨＥＲ１−６２１／ＦｃおよびＨＥＲ３−６２１／Ｆｃを含むＥＣＤ分子）の、ＨＥＲ１およびＨＥＲ３のリン酸化を阻害する能力を、ＳＫ−ＢＲ３細胞において試験した。ＥＧＦによって誘導されるＨＥＲ１リン酸化の影響を評価するために、増加する濃度のＨＦＤ１００／３００Ｈ（０．３ｎＭ〜６００ｎＭ）を、ＥＧＦの存在下で細胞に加えた。結果は、ＨＦＤ１００／３００Ｈ分子が、ＥＧＦによって刺激されたＳＫ−ＢＲ３細胞のＨＥＲ１リン酸化を用量依存的に阻害したことを示した。６００ｎＭのＨＦＤ１００／３００Ｈで達成されたＳＫ−ＢＲ３細胞におけるＨＥＲ１リン酸化の最大の阻害は、このタンパク質が存在しない場合と比較して、約６０％であった。ＨＲＧβによって誘導されるＨＥＲ３リン酸化の影響を評価するために、増加する濃度のＨＦＤ１００／３００Ｈ（０．３ｎＭ〜６００ｎＭ）を、ＨＲＧβの存在下で細胞に加えた。結果は、ＨＦＤ１００／３００Ｈ分子が、約６７ｎＭまでの濃度のＨＲＧβによって刺激されたＳＫ−ＢＲ３細胞のＨＥＲ３リン酸化を用量依存的に阻害し、阻害のレベルは、約６７ｎＭの濃度においてプラトーに達したことを示した。６７ｎＭ〜６００ｎＭの範囲の濃度のＨＦＤ１００／３００Ｈで達成されたＳＫ−ＢＲ３細胞におけるＨＥＲ３リン酸化の最大の阻害は、このタンパク質が存在しない場合と比較して、約６５％であった。
ＥＧＦまたはＨＲＧβのいずれかによって刺激されたＳＫ−ＢＲ３細胞におけるＨＥＲ１、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３のリン酸化に対するＨＦＤ１００／３００Ｈの影響を、ＨＥＲ２の二量体化ドメインを標的とするモノクローナル抗体である２Ｃ４（ｐｅｔｕｚｕｍａｂとも呼ばれる）と比較した。結果は、ＨＦＤ１００／３００Ｈ（６００ｎＭ）が、リガンドによって刺激されたＳＫ−ＢＲ３細胞におけるＨＥＲ１（約６０％）、ＨＥＲ２（約６５％）およびＨＥＲ３（約５５％）のリン酸化を阻害したこをと示す。２Ｃ４モノクローナル抗体は、ＨＥＲ２（約３５％）、ＨＥＲ３（約６５％）のリン酸化を阻害したが、ＨＥＲ１リン酸化の検出可能な阻害を示さなかった。したがって、２Ｃ４抗体と比べて、ＨＦＤ１００／３００Ｈは、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３のリン酸化を阻害し得る汎ＨＥＲインヒビターとなる。
２．増殖
ＨＥＲリガンドにより刺激された細胞の増殖に対する精製ＨＦＤ１００／３００Ｈの影響を、上記Ｂの節に記載したようにして評価した。結果は、精製ＨＦＤ１００／３００（プロテインＡで精製）が、ＥＧＦ（３ｎＭ）またはＨＲＧ（５ｎＭ）のいずれかによって刺激されたＨＴ−２９細胞の増殖を用量依存性の様式で阻害したことを示す。約２００ｎＭのＨＦＤ１００／３００で達成された増殖の最大の阻害は、試験した両方のリガンドの存在下で、このタンパク質が存在しない場合と比較して、約５５％であった。リガンドにより刺激されたＺＲ−７５−１細胞の増殖に対する精製ＨＦＤ１００／３００Ｈ（Ｈｉｓタグを含む）の影響もまた試験した。結果は、精製ＨＦＤ１００／３００Ｈは、ＨＲＧにより刺激されたＺＲ−７５−１細胞の増殖を用量依存性の様式で阻害し、約８０％の最大の阻害は、約６００ｎＭにおいて観察されたことを示す。ＨＦＤ１００／３００Ｈがまた、約１ｎＭまでのＥＧＦによって刺激されたＺＲ−７５−１細胞の増殖を用量依存的に阻害し、この観察される阻害は、約６００ｎＭまでの濃度のＨＦＤ１００／３００Ｈでプラトーに達した。約１ｎＭの精製ＨＦＤ１００／３００Ｈで観察された最大の阻害は、このタンパク質が存在しない場合と比較して、約８０％であった。
Ｅ．ＨＥＲのリン酸化に対するＨＥＲ ＥＣＤ誘導体の阻害作用のまとめ
種々の例示的なＨＥＲ ＥＣＤ分子を、ＨＥＲのリン酸化を阻害するその能力について試験した。結果のまとめを表１６に示す。阻害作用の結果が示されない場合、実験は行わなかった。結果は、ＨＥＲ１−６２１／Ｆｃ：ＨＥＲ３−６２１／Ｆｃキメラが、汎ＨＥＲ候補分子であることを示す。
。
（実施例７ ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４のリガンド結合表面とＨＥＲ２の類似配列の同定）
ＨＥＲファミリーの４つ全てのメンバーについてのおおよそのリガンド結合領域の同定を決定した。これらの領域は、ＴＧＦ−α（一次元のＰＤＢタンパク質データバンクである１ＭＯＸ；例えば、Ｇａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ，１１０：７６３−７７３を参照のこと）と複合体化したヒトＥＧＦＲ（残基１〜５０１）の結晶構造と、ＨＥＲ１（配列番号２）、ＨＥＲ２（配列番号４）、ＨＥＲ３（配列番号６）およびＨＥＲ４（配列番号８）の成熟な形態（すなわち、参照の配列番号と比較して、シグナルペプチドを欠くもの）での並列アラインメントとによって決定した。リガンド結合に重要なドメインＩ（ＤＩ）およびドメインＩＩＩ（ＤＩＩＩ）におけるアミノ酸の同定を表１７に示す。番号付けは、ＨＥＲタンパク質の成熟な形態に従う。これらのアミノ酸配列は、それぞれのＨＥＲタンパク質に対するリガンドの結合と干渉するように標的化され得る。
。
（実施例８ ＨＥＲファミリー分子のサブドメインＩＩ（ＤＩＩ）およびサブドメインＩＶ（ＤＩＶ）中の標的ポリペプチドの同定）
この実施例において、ＨＥＲ３およびＨＥＲ１、ＨＥＲ２およびＨＥＲ４からの連続した領域を、（例えば、ファージディスプレイにおいて使用するための）ペプチド結合のための基質として、または、多クローン性抗体を作製するための免疫源として使用するために同定し、ＨＥＲファミリーのサブドメインＩＩ（ＤＩＩ）またはサブドメインＩＶ（ＤＩＶ）を標的とし得る分子を同定した。このような分子は、二量体化ドメインを標的とし、そして／または、係留に関与するＤＩＩおよびＤＩＶの配列と相互作用することによって、係留を標的化および安定化する、候補汎ＨＥＲ治療薬として機能し得る。
ＨＥＲファミリーレセプター間でＤＩＩまたはＤＩＶの配列を整列させた。ＨＥＲ３は、相同性解析のためのプロトタイプであり、そして、配列によって保存されるペプチドを、ＤＩＩまたはＤＩＶの標的として同定した。以下の表１８は、ＤＩＩにおける同定された標的ペプチドを示し、配列番号（＃）を横の欄に示す。以下の表１９は、ＤＩＶにおける同定された標的ペプチドを示し、配列番号（＃）を横の欄に示す。
。
（実施例９ ＨＥＲファミリー中の露出され、かつ保存された残基を結合するペプチドのファージディスプレイによる同定）
ファージディスプレイは、実施例７〜８において同定されたもの、および、配列番号５４〜１２５のいずれかに示される同定された標的ペプチドのような、標的ポリペプチドと相互作用する候補治療薬をスクリーニングするために使用され得る方法の例である。
Ａ．ファージライブラリーの選択
ファージディスプレイペプチドライブラリー（束縛されたループのＣ７Ｃライブラリー、ならびに、７−ａａおよび１２−ａａの線形ライブラリー）を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓから入手した。ファージディスプレイライブラリーを、無関係のＦｃ融合タンパク質−プロテインＡ（またはプロテインＧ）アガロース複合体に対して消耗させた。この消耗されたファージライブラリーを、ヒトＨＥＲ３−６２１／Ｆｃ−プロテインＡアガロース複合体に対して選択した。ＩｇＧ１ Ｆｃ領域に融合されたＨＥＲ３の細胞外ドメインであるＨＥＲ３−６２１／Ｆｃは、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、実施例２に記載したように調製した。ファージを、低ｐＨの緩衝液（または、ＨＥＲ３ドメイン内で保存される配列エレメントから選択した合成ペプチドプール（上記実施例６および７を参照のこと））で溶出した。４ラウンドの選択を行い、この後、個々のプラークを無作為にピックアップして、ファージ酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）および、Ｅ．ｃｏｌｉにおける増幅後のＤＮＡ配列決定による解析に供した。
Ｂ．ファージＥＬＩＳＡ
ファージＥＬＩＳＡを行うために、９６ウェルプレートをＨＥＲ３−６２１／Ｆｃでコーティングし；洗浄し、そして、ＢＳＡ／スクロース緩衝液でブロッキングした。ブロッキングした後、個々のファージ培養培地をウェルに加え、そして、室温で２時間インキュベートした。繰り返し洗浄して、結合していないファージを除いた。結合したファージを、ＨＲＰを結合したＭ１３抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて検出する。ポジティブなファージクローンを、ＨＥＲレセプターファミリーメンバーの間で保存されているＨＥＲ３細胞外ドメインから選択された個々の合成ペプチド（上記実施例６および７を参照のこと）に対してさらにスクリーニングし、ＨＥＲ３上の潜在的なファージ結合部位を決定した。同様のファージ結合が、ＨＥＲ３を発現する単層細胞を用いて行われ得る。
Ｃ．ヘテロ二量体化のためのペプチドの同定
一度、ポジティブなファージが同定され、結合ペプチドが決定されると、ヘテロ二量体化に適切な相乗作用性ペプチドペアを同定するためにアビジン−ビオチン相互作用を使用した。このアッセイは、４つの異なるビオチン分子に高い親和性および特異性で結合する、単一のアビジン分子の能力を利用する。簡単に述べると、ビオチン化したペプチドとノイトラアビジン−ＨＲＰを４：１の比で混合した。この混合物を、ローテータ上で４℃にて６０分間インキュベートし、その後、低放出性（ｓｏｆｔ ｒｅｌｅａｓｅ）のアビジン−セファロースを加えて、過剰なペプチドを除去した。この低放出性のアビジン−セファロースを遠心分離してペレット状にした。得られた上清を、ＨＥＲ３結合アッセイのために所望される濃度まで希釈した。
（実施例１０ 他のＨＥＲアイソフォームをクローニングするための方法）
Ａ．メッセンジャーＲＮＡの調製
健常もしくは疾患状態の組織または細胞株からの主要なヒト組織タイプから単離したｍＲＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から購入した。等量のｍＲＮＡをプールし、そして、逆転写酵素ベースのＰＣＲ増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）のための鋳型として用いた。
Ｂ．ｃＤＮＡの合成
ｍＲＮＡを、４０％のＤＭＳＯの存在下で、７０℃にて１０分間変性させ、氷上でクエンチした。第一鎖ｃＤＮＡは、１０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、各２ｍＭのｄＮＴＰ、５μｇのｍＲＮＡおよび２００単位のＳｔｒａｔａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）逆転写酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を含む２０μｌの反応中、２００ｎｇのオリゴ（ｄＴ）または２０ｎｇのランダムヘキサマーのいずれかを用いて合成した。３７℃にて１時間インキュベーションした後、両方の反応からのｃＤＮＡをプールし、そして、１０単位のＲＮａｓｅＨ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で処理した。
Ｃ．ＰＣＲ増幅
ＲＴ−ＰＣＲクローニングのためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、ＨＥＲファミリーメンバーのスプライシング改変体をクローニングするように設計した。遺伝子特異的なＰＣＲプライマーは、Ｏｌｉｇｏ ６．６ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｓｃａｄｅ，ＣＯ）を用いて選択し、そして、Ｑｉａｇｅｎ−Ｏｐｅｒｏｎ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）により合成した。フォワードプライマー（Ｆ１、Ｆ２）は、開始コドンを挟むように選択した。リバースプライマー（Ｒ１）は、Ｈｉｌｌｅｒら（Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００５）、６：Ｒ５８）により記載された方法を用いて、ＨＥＲ遺伝子（表２０を参照のこと）のイントロン配列から選択した（表２１を参照のこと）。各ＰＣＲ反応は、合計７０μｌの容量中に、１０ｎｇの逆転写ｃＤＮＡ、０．２μＭのＦ１／Ｒ１プライマーミックス、１ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２、０．２ｍＭのｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、１×ＸＬ−Ｂｕｆｆｅｒ、および０．０４Ｕ／μｌのｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含んだ。ＰＣＲの条件は、９４℃で４５秒間、６０℃で１分間および６８℃で２分間の３６サイクルであった。反応は、６８℃で２０分間の伸長ステップで終了させた。
Ｄ．ＰＣＲ産物のクローニングおよび配列決定
ＰＣＲ産物を、０．８％アガロースゲル上で電気泳動し、そして、検出可能なバンドからのＤＮＡをＧｅｌｓｔａｒ（ＢｉｏＷｈｉｔａｋｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で染色した。ＤＮＡのバンドをＱｉａＱｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で抽出し、ｐＤｒｉｖｅ ＵＡクローニングベクター（Ｑｉａｇｅｎ）中にライゲーションし、そして、ＤＨ１０Ｂ細胞中に形質転換した。組換えプラスミドを、２５μｇ／ｍｌのカナマイシン、０．１ｍＭのＩＰＴＧおよび６０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天プレート上で選別した。各トランスフェクションについて、１２のコロニーを無作為にピックアップし、ＵＡベクタープライマーを用いたＰＣＲによりそのｃＤＮＡ挿入物のサイズを決定した。次いで、これらのクローンを、Ｍ１３フォワードプライマーおよびリバースベクタープライマーを用いて両方向から配列決定した。全てのクローンを、隙間のある領域にわたる指向型の配列決定完了（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ ａｃｒｏｓｓ ｇａｐｐｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ）のためのカスタムプライマーを用いて完全に配列決定した。
Ｅ．配列解析
ＳＩＭ４（スプライシング改変体の解析のためのコンピュータプログラム）を用いて、各ｃＤＮＡ配列のそのそれぞれのゲノム配列に対するアラインメントにより、選択的スプライシングのコンピュータによる解析を行った。正規の（例えば、ＧＴ−ＡＧ）ドナー−アクセプタースプライシング部位を持つ転写体のみを解析に考慮した。ＨＥＲアイソフォームをコードするクローンをさらに研究した（以下の表２２を参照のこと）。
Ｆ．例示的なＨＥＲアイソフォーム
本明細書において記載される方法を用いて調製した例示的なＨＥＲアイソフォームは、以下の表２２に示される。ＨＥＲアイソフォームをコードする核酸分子が提供され、その配列は、表中に示される配列番号の下で示される。例示的なＨＥＲアイソフォームポリペプチドのアミノ酸配列は、示される配列番号の下で示される。
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（実施例１１ ＩＧＦ１Ｒアイソフォームをクローニングするための方法）
Ａ．メッセンジャーＲＮＡの調製
健常もしくは疾患状態の組織または細胞株からの主要なヒト組織タイプから単離したｍＲＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から購入した。等量のｍＲＮＡをプールし、そして、逆転写酵素ベースのＰＣＲ増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）のための鋳型として用いた。
Ｂ．ｃＤＮＡの合成
ｍＲＮＡを、４０％のＤＭＳＯの存在下で、７０℃にて１０分間変性させ、氷上でクエンチした。第一鎖ｃＤＮＡは、１０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、各２ｍＭのｄＮＴＰ、５μｇのｍＲＮＡおよび２００単位のＳｔｒａｔａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）逆転写酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を含む２０μｌの反応中、２００ｎｇのオリゴ（ｄＴ）または２０ｎｇのランダムヘキサマーのいずれかを用いて合成した。ａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）。３７℃にて１時間インキュベーションした後、両方の反応からのｃＤＮＡをプールし、そして、１０単位のＲＮａｓｅＨ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で処理した。
Ｃ．ＰＣＲ増幅
ＲＴ−ＰＣＲクローニングのためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、ＩＧＦ１Ｒのスプライシング改変体をクローニングするように設計した。遺伝子特異的なＰＣＲプライマーは、Ｏｌｉｇｏ ６．６ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｓｃａｄｅ，ＣＯ）を用いて選択し、そして、Ｑｉａｇｅｎ−Ｏｐｅｒｏｎ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）により合成した。フォワードプライマー（Ｆ１、Ｆ２）は、開始コドンを挟むように選択した。リバースプライマー（Ｒ１）は、Ｈｉｌｌｅｒら（Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００５）、６：Ｒ５８）により記載された方法を用いて、ＩＧＦＲ１遺伝子（配列番号４０４、表２３）のイントロン配列から選択した（表２４を参照のこと）。各ＰＣＲ反応は、合計７０μｌの容量中に、１０ｎｇの逆転写ｃＤＮＡ、０．２μＭのＦ１／Ｒ１プライマーミックス、１ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２、０．２ｍＭのｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、１×ＸＬ−Ｂｕｆｆｅｒ、および０．０４Ｕ／μｌのｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含んだ。ＰＣＲの条件は、９４℃で４５秒間、６０℃で１分間および６８℃で２分間の３６サイクルであった。反応は、６８℃で２０分間の伸長ステップで終了させた。
Ｄ．ＰＣＲ産物のクローニングおよび配列決定
ＰＣＲ産物を、０．８％アガロースゲル上で電気泳動し、そして、検出可能なバンドからのＤＮＡをＧｅｌｓｔａｒ（ＢｉｏＷｈｉｔａｋｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で染色した。ＤＮＡのバンドをＱｉａＱｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で抽出し、ｐＤｒｉｖｅ ＵＡクローニングベクター（Ｑｉａｇｅｎ）中にライゲーションし、そして、ＤＨ１０Ｂ細胞中に形質転換した。組換えプラスミドを、２５μｇ／ｍｌのカナマイシン、０．１ｍＭのＩＰＴＧおよび６０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天プレート上で選別した。各トランスフェクションについて、１２のコロニーを無作為にピックアップし、ＵＡベクタープライマーを用いたＰＣＲによりそのｃＤＮＡ挿入物のサイズを決定した。次いで、これらのクローンを、Ｍ１３フォワードプライマーおよびリバースベクタープライマーを用いて両方向から配列決定した。全てのクローンを、隙間のある領域にわたる指向型の配列決定完了のためのカスタムプライマーを用いて完全に配列決定した。
Ｅ．配列解析
ＳＩＭ４（スプライシング改変体の解析のためのコンピュータプログラム）を用いて、各ｃＤＮＡ配列のそのそれぞれのゲノム配列に対するアラインメントにより、選択的スプライシングのコンピュータによる解析を行った。正規の（例えば、ＧＴ−ＡＧ）ドナー−アクセプタースプライシング部位を持つ転写体のみを解析に考慮した。ＩＧＦ１Ｒアイソフォームをコードするクローンをさらに研究した（以下の表２５を参照のこと）。
Ｆ．例示的なＩＧＦ１Ｒアイソフォーム
本明細書において記載される方法を用いて調製した例示的なＩＧＦ１Ｒアイソフォームは、以下の表２５に示される。ＩＧＦ１Ｒアイソフォームをコードする核酸分子が提供され、その配列は、配列番号２９７および２９９のいずれかに示される。例示的なＨＥＲアイソフォームポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２９８および３００のいずれかに示される。
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（実施例１２ ＨＥＲ１ ＥＣＤ／ＨＥＲ３ ＥＣＤヘテロ多量体およびチロシンキナーゼインヒビター（ＴＫＩ）を用いた腫瘍細胞増殖の相乗作用性の阻害）
急激に増殖する腫瘍細胞（ＡＴＣＣから購入）を、９６ウェルのマイクロ希釈プレートに１ウェルあたり１０００細胞の密度で移した。（ＭＤＡ ＭＢ ４６８乳癌細胞は、図３ａに示す実験に使用し、そして、Ａ４３１扁平上皮細胞癌細胞は、図３ｂに示す実験に使用した）。細胞を２４時間接着させ、そして、１×の最終希釈倍率で試験化合物を加えた：ＲＢ２００ｈ（Ｆｃドメインを介して全長ＨＥＲ３ ＥＣＤに連結させた全長ＨＥＲ１ ＥＣＤ）については１μＭと、５０μＭのＡＧ−８２５（ＨＥＲ２に関連するチロシンキナーゼのインヒビター；Ｏｓｈｅｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９３；図３Ａ）または５０μＭのＧｅｆｉｔｉｎｉｂ／Ｉｒｅｓｓａ（ＥＧＦＲに関連するキナーゼのインヒビター；Ｈｅｒｂｓｔ，２００２；図３ｂ）のいずれか。次いで、化合物を二連で同時に加え、そして、段階的な２倍希釈を行った。
７２時間のインキュベーションの後、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、そして、メタノール中０．５％のクリスタルバイオレットで染色した。次いで、プレートを水中で穏やかに洗浄し、そして、一晩乾燥させた。付着細胞のタンパク質に結合したクリスタルバイオレットをＳｏｒｅｎｓｏｎ緩衝液（５０％のエタノール中、０．０２５Ｍのクエン酸ナトリウム、０．０２５Ｍのクエン酸）中に、０．１ｍｌ／ウェルで溶解させた。プレートを、５４０ｎＭの波長で、ＥＬＩＳＡプレートリーダーにて解析した。コントロールに対する生存細胞の割合をプロットし、そして解析した（ＣａｌｃｕＳｙｎ；Ｂｉｏｓｏｆｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）。
試験した最低濃度からの結果を図３Ａおよび３Ｂに示す。「組み合わせ」とラベルを付けた欄を横切る破線は、試験した薬物（ＲＢ２００ｈ＋ＡＧ ８２５，図３Ａ；ＲＢ２００ｈ＋Ｉｒｅｓｓａ，図３Ｂ）の相加的な作用から予測される結果である。図３Ａおよび３Ｂに示されるように、ＨＥＲ１ ＥＣＤ／ＨＥＲ３ ＥＣＤヘテロ多量体（ＲＢ２００ｈ）の、試験したチロシンキナーゼインヒビターのいずれかとの組み合わせは、増殖に対する組み合わせの相加作用よりもかなり大きい、相乗作用性の増殖阻害作用を示した。
この結果は有意である。というのも、この結果は、化学療法剤に伴う毒性が、ＲＢ２００ｈとの組み合わせによって回避され得ることを意味するからである。具体的には、非小細胞肺癌の処置について認可されたＩｒｅｓｓａの生命を脅かす毒性（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｃｏｍ／ｖｉｅｗａｒｔｉｃｌｅ／４５６２２３を参照のこと）が回避され得る。さらに、アジア人の約３０％、そして、白色人種の１０％のみが、Ｉｒｅｓｓａ／Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂの効能に必要とされるＥＧＦＲ／ＨＥＲ１の変異を発現しており、そして、同様の状況が、他のＴＫＩについても存在し得る（ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）。耐性の機構（ＥＧＦＲチロシンキナーゼに関連する腫瘍による野生型アミノ酸配列の保持以外）もまた記載されている。これらの中でも、特筆すべきは、「第二部位」の変異の獲得（Ｐａｏ ｅｔ ａｌ．，２００５）および増殖因子の過剰発現（Ｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００５）である。したがって、感受性が増加し得、そして、ＴＫＩに伴う毒性がＲＢ２００ｈまたは他のレセプター多量体との組み合わせによって回避され得る場合、これは、効能の相乗作用性の増強 対 毒性によるものである。この結果、癌または他のチロシンキナーゼに関する疾患について首尾よく処置され得る患者の数が劇的に増加する。
（実施例１３ Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴による、ＥＧＦおよびＮＲＧ１β１のＲＢ２００ｈへの結合）
ＲＢ２００ｈ（１００／３００ｈとも呼ばれる（ＨＩＳエピトープタグを持つ、ＨＥＲ１−６２１／ＦｃおよびＨＥＲ３−６２１／Ｆｃを含むＥＣＤ分子））に対する増殖因子リガンドの親和性を決定するために、Ｂｉａｃｏｒｅによる結合研究を行った。結合実験は、２５℃にて表面プラズモン共鳴をベースとしたバイオセンサー機器であるＢＩＡｃｏｒｅ ３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて行った。リガンドの固定について、凍結乾燥したヒトのキャリアなしのＥＧＦおよびＨＲＧ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＨＢＰ−ＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５，ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ）中に溶解し、そして、０．２ｍｇ／ｍｌに希釈した。ＰＢＳ中のＲＢ２００ｈを同じ緩衝液中で０．２ｍｇ／ｍｌに希釈した。これらの分子のＢＩＡｃｏｒｅ ＣＭ５チップへの固定は、ＮＨＳ／ＥＤＣカップリングを用いて行った。ＥＧＦまたはＮＲＧ１β１のいずれかをＢｉａｃｏｒｅチップ上に固定し、その後、ＲＢ２００ｈ溶液を流した。一度標的表面共鳴が１００００応答単位に到達したら、表面をエタノールアミンでクエンチした。全ての実験にブランクのフローセルを準備した。
種々の流速および種々の分析物濃度での注入を行い、物質移動作用が存在しないことを確認した。表２６に示す最終測定は、二連または三連のいずれかで行った。データの評価は、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ（ＢｉｏＬｏｇｉｃソフトウェア）を用いてグローバルフィッティングにより行った。リガンド解離速度のリガンド結合速度に対する比から、リガンドの解離定数（Ｋｄ）を決定した。これらの研究からのデータは、ハーモジュリンＲＢ２００ｈが２４ｎＭのＫｄでＥＧＦに結合したのに対し、ハーモジュリンＲＢ２００ｈは、ＮＲＧ１β１には５６ｎＭのＫｄで結合したことを明らかにした（表２６）。
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（実施例１４ ユーロピウム標識したＥＧＦまたはＮＲＧ１β１とのＲＢ２００ｈの飽和結合研究）
Ｂｉａｃｏｒｅ法では、ＨＥＲ３リガンド（ＮＲＧ１β１）のＲＢ２００ｈに対する結合は、ＮＲＧ１β１が固定されたときにのみ決定され得るので、ＲＢ２００ｈの結合研究は、別の方法、時間分解蛍光アッセイ（ＤＥＬＦＩＡ）によって行った。ハーモジュリンのリガンド結合活性を、抗ＩｇＧ Ｆｃでコーティングしたマイクロタイタープレート上で、ユーロピウムタグ化したリガンド（ＨＥＲ１リガンド活性についてはＥｕ−ＥＧＦ、または、ＨＥＲ３リガンド活性についてはＥｕ−ＮＲＧ１β１）を用いて、ＤＥＬＦＩＡ法によって決定した。ＲＢ２００ｈを、抗Ｆｃコーティングした９６ウェルプレートに固定し、そして、ＥＧＦまたはＮＲＧ１β１の結合親和性を、図７ａおよびｂに示されるような広範囲な濃度にわたって、ランタニド（ユーロピウム）タグ化リガンド（Ｅｕ−ＥＧＦまたはＥｕ−ＮＲＧ１β１）を用いて決定した。ＤＥＬＦＩＡ ９６ウェル黄色プレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を、０．５μｇ／ウェル（１００μｌ／ウェル容量）の抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体を用いて、４℃にて一晩コーティングした。このプレートを、ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０で２回洗浄し、次いで、１％ＢＳＡ、５％スクロースおよび０．０１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ緩衝液を用いて、室温（およそ２２℃、ＲＴ）にて２時間ブロッキングした。ブロッキングの後、緩衝液を吸引し、そして、プレートをＲＴにて一晩風乾させ、シールし、次いで、４℃にて１ヶ月まで乾燥させ状態で保存した。アッセイの日に、抗ＩｇＧ Ｆｃでコーティングしたプレートを、ＤＥＬＦＩＡ Ｌ＊Ｒ洗浄緩衝液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で３回洗浄し、そして、ハーモジュリンを、ＤＥＬＦＩＡ結合緩衝液中、５０μｌ／ウェルの容量にて１０もしくは２０ｎｇ／ウェルで加えた。３０℃にて２時間穏やかに振盪させながらインキュベーションした後、５０μｌのユーロピウム（Ｅｕ）標識したリガンドを、図および以下に示される種々の濃度でこれらのウェルに加えた。
飽和結合研究について、非特異的な結合を決定するために、Ｅｕタグ化したリガンドと一緒に、１００倍過剰の非標識リガンドを追試ウェルに含めた。３０ｎＭのＥｕ−ＥＧＦ単独の固定した飽和濃度（総結合について）または５μＭの非標識ＥＧＦの存在下（非特異的な結合について）を、ＨＥＲ１リガンド結合能を定量するために使用したことを除いて、ハーモジュリンのリガンド結合活性の慣用的なアッセイについて、上述のようにして研究を行った。同様に、ＨＥＲ３リガンド結合能を定量するために、ハーモジュリンを、１００ｎＭのＥｕ−ＮＲＧ１β１単独（総結合について）または１０μＭの非標識ＮＲＧ１β１の存在下（非特異的な結合について）を用いてアッセイした。リガンドを加えた後、穏やかに振盪させながら３０℃にて２時間インキュベーションを行った。ついで、プレートを氷上に置き、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含む氷冷ＤＥＬＦＩＡ洗浄緩衝液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で迅速に３回洗浄して、非結合のリガンドを除いた。結合したＥｕタグ化リガンドを定量するために、１３０μｌ／ウェルのＤＥＬＦＩＡ増強溶液を加え、プレートをＲＴにて１５分間インキュベートし、次いで、Ｅｕ時間分解フィルタ設定の下で、蛍光プレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ，モデル２１００，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）にて読み取った。データは、一面もしくは両面の結合曲線フィッティングソフトウェアにＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて解析して、ＫｄおよびＢｍａｘを生成した。慣用的なアッセイについて、ハーモジュリンの特異的結合活性を、タンパク質１ｍｇもしくはハーモジュリン１ｆｍｏｌあたりの結合リガンドのｆｍｏｌ数として表した。
ハーモジュリンＲＢ２００ｈは、飽和可能な様式でＥｕ−ＥＧＦまたはＥｕ−ＮＲＧ１βのいずれかに結合した。Ｅｕタグ化リガンドの結合は、そのそれぞれの非標識リガンドＥＧＦまたはＮＲＧ１β１によって置き換えられ得、結合が特異的であることが示唆された（図７ａおよびｂ）。Ｅｕ−ＥＧＦまたはＥｕ−ＮＲＧ１β１についてのＫｄは、約１０ｎＭであった。さらに、ＮＲＧ１β１は、Ｂｉａｃｏｒｅで観察されたよりも高い親和性（Ｋｄ約１０ｎＭ）で固定されたＲＢ２００ｈに結合する。併せて考えると、データは、ＲＢ２００ｈが、高い親和性でＨＥＲ１およびＨＥＲ３のリガンドに結合することを示す。
（実施例１５ ハーモジュリンＲＢ２００ｈは、ＥＧＦおよびニューレグリン−１βにより刺激されたＨＥＲファミリータンパク質のチロシンリン酸化を阻害する）
上記実施例は、ハーモジュリンＲＢ２００ｈが、ＥＧＦ（ＨＥＲ１リガンド）およびＮＲＧ１β１（ＨＥＲ３リガンド）の両方に結合することを実証した。次いで、ＲＢ２００ｈが、ＨＥＲファミリータンパク質のチロシンリン酸化のリガンド誘導性の刺激をブロックするかどうかを決定するための研究を行った（リガンドは、ＥＧＦまたはＮＲＧ１β１のいずれかである）。
方法
細胞株および組織培養
ヒト結腸直腸腺癌細胞株ＨＴ−２９、ヒト肺癌Ａ５４９、胃癌ＮＣＩ−Ｎ８７、乳腺管癌ＺＲ−７５−１、類表皮癌Ａ４３１および乳腺癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３、ＡＣＨＮ腎癌細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａ，ＶＡ）から購入したが、ＳＵＭ１４９細胞は、Ａｓｔｅｒａｎｄから購入した。ＨＴ−２９細胞およびＳＫ−ＢＲ−３細胞は、１０％胎仔ウシ血清を補充したＭｃＣｏｙｓ ５ａ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）中で培養し、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞およびＺＲ−７５−１細胞は、１０％胎仔ウシ血清を補充したＲＰＭＩ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）中で培養し、そして、Ａ５４９細胞およびＡ４３１細胞は、１０％胎仔ウシ血清を補充したＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）中で培養した。ＳＵＭ１４９細胞は、インシュリン（５μｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（１μｇ／ｍｌ）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ）および５％胎仔ウシ血清を補充したＨａｍのＦ−１２培地中で培養した。全ての細胞は、３７℃のインキュベーター内、５％ＣＯ２および９５％空気の加湿雰囲気中で増殖させた。細胞は、１週間に２度継代した。
ＨＥＲファミリータンパク質についてのホスホチロシンＥＬＩＳＡ
細胞株のうち、Ａ４３１細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ−２９細胞、Ｎ８７細胞、ＳＫ−ＢＲ−３細胞およびＺＲ−７５−１細胞を調べた。Ａ４３１細胞は、高いレベルのＨＥＲ１と、低いレベルのＨＥＲ２およびＨＥＲ３とを有する。細胞を、９６ウェルプレートにおいて、そのそれぞれの増殖速度に適切な密度（代表的には、１ウェルあたり５，０００〜２０，０００細胞）で増殖培地中に撒き、そして、一晩インキュベートし、その後、２４時間血清欠乏状態にした。静止期の細胞を、５０μｌ／ウェルの０．１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むＤＭＥＭで前処理し、そして、段階希釈したインヒビター（ハーモジュリンまたはＨｅｒｃｅｐｔｉｎまたはＥｒｂｉｔｕｘ）を加え、そして、細胞を、３７℃、５％ ＣＯ２にて３０分間インキュベートした。ＨＥＲファミリータンパク質のリン酸化を、３７℃、５％ ＣＯ２にて１０分間、増殖因子（３ｎＭのＥＧＦまたは１ｎＭのＮＲＧ−β１）で刺激した。刺激後、細胞を含むプレートを氷上に置き、２００μｌ／ウェルの氷冷ＰＢＳで一度洗浄し、そして、１００μｌ／ウェルの氷冷１×Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）（ホスファターゼインヒビターカクテルセットＩおよびセットＩＩ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ならびに一般的な用途のためのプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ）を含有）を用いて、氷上にて約３０分間溶解させた。
最初の研究において、このハーモジュリンで処理した細胞に由来する溶解物中にＲＢ２００ｈの持ち越しが存在し、そして、このレベルのＲＢ２００ｈがその捕捉抗体へのＨＥＲ１の結合と競合したが、以下に記載されるようなそのそれぞれの捕捉抗体へのＨＥＲ３またはＨＥＲ２の結合については、ＲＢ２００ｈによる有意な競合は観察されなかったことが分かった。ＨＥＲ１捕捉抗体に対するＲＢ２００ｈによるＨＥＲ１とのこの競合は、以下に記載されるようにＲＢ２００ｈのＦｃドメインに結合するプロテインＡ−セファロースビーズを用いた溶解物の清浄化によって排除された。このことは、研究において用いた最高濃度のＲＢ２００ｈが、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３を含む細胞溶解物中に加えられ、次いで、プロテインＡビーズで処理し、その後、ＨＥＲ１もしくはＨＥＲ２もしくはＨＥＲ３の捕捉抗体に対しＥＬＩＳＡを行った実験から証明された。
上述のように、ＲＢ２００ｈで処理した細胞からの細胞溶解物を、溶解緩衝液中に平衡化した、２０μｌ／ウェルの５０％プロテインＡ−セファロースビーズのスラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と共に、プレート振盪機上で４℃にて一晩インキュベートして、ＲＢ２００ｈを清澄にした。次いで、遠心分離によりビーズを溶解物から除き、そして、ＲＢ２００ｈ汚染物を含まない上清を、ホスホチロシンＥＬＩＳＡに使用した。ＥＬＩＳＡのためのＨＥＲ１もしくはＨＥＲ２もしくはＨＥＲ３の捕捉抗体プレートを、以下のようにして調製した。９６ウェルのＩｍｍｕｌｏｎ ４ＨＸＢマイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を、１００μ／ウェルのＰＢＳ中の以下に記載される捕捉抗体を用いて、室温にて２時間または４℃にて一晩コーティングした。以下の抗ＨＥＲ細胞外ドメイン捕捉抗体を用いた。ＨＥＲ１の検出については、抗ヒトＥＧＦＲ抗体（＃ＡＦ２３１，０．４μｇ／ｍｌ）を捕捉抗体とした；ＨＥＲ２の検出については、ヒト抗ＥｒｂＢ２捕捉抗体（＃ＤＹＣ１７６８，４μｇ／ｍｌ）をＲＢ２００ｈを用いた研究のみに用いた（以下を参照のこと）；ＨＥＲ３の検出については、ヒトＥｒｂ３ ＤｕｏＳｅｔ ＩＣ（＃ＤＹＣ１７６９，４μｇ／ｍｌ）を捕捉抗体とした。本発明者らは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎが、上述したＨＥＲ２捕捉抗体（ＤＹＣ１７６８）に対するＨＥＲ２の結合とは競合したが、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎは、ＡＦ１１２９と呼ばれる抗ＥｒｂＢ２捕捉抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）に対する細胞のＨＥＲ２の結合とは競合しなかったことを発見した。したがって、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎまたはＣ２２５を用いた場合、ＨＥＲ２の検出は、抗ヒトＥｒｂＢ２抗体（＃ＡＦ１１２９，２μｇ／ｍｌ）上に捕捉された細胞溶解物において行った。全ての捕捉抗体はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）製であり、これらをＰＢＳ中に希釈し、そして、ＰＢＳ中２％ウシ血清アルブミン（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ，Ｋｅｒｒｖｉｌｌｅ，ＴＸ）および０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）でブロッキングした。上述のように処理した細胞溶解物（７５μｌ）を、コーティングしたプレートの各ウェルに移し、混合しながら４℃にて一晩インキュベートし、次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で４回洗浄した。ＨＥＲタンパク質上のチロシンリン酸化を、製造業者の説明書に従って、２％ ＢＳＡを含むＰＢＳ中に希釈した１００μｌ／ウェルの抗ホスホチロシン−ＨＲＰ結合体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて検出し、そして、室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄し、次いで、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質で発色させ、その後、１００μｌ／ウェルのＴＭＢの停止試薬（ともにＳｉｇｍａ製）を加えた。発色は多様であったので、発色したプレートの光学密度は、０．５と１．０の間であった。光学密度は、６５０ｎｍにてＶＥＲＳＡｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）により決定した。
結果
Ａ４３１細胞のＥＧＦ処理は、３つ全てのＨＥＲタンパク質のチロシンリン酸化の刺激をもたらした：ＨＥＲ１が最も刺激が強く（約１０倍）、次にＨＥＲ２の刺激が強く（４倍）、最後がＨＥＲ３（２倍）であった。ＥＧＦは、調べた全ての細胞株においてＨＥＲ１のリン酸化を２倍〜１０倍刺激したが、ＥＧＦは、表２７に列挙される調べて細胞株のうち、Ａ４３１細胞、ＨＴ−２９細胞、ＳＫ−ＢＲ−３細胞およびＺＲ−７５−１細胞においてのみ、ＨＥＲ２のリン酸化を１．６倍〜４倍刺激した。ＥＧＦは、調べた細胞株のうち、Ａ４３１細胞およびＳＫ−ＢＲ−３細胞においてのみ、ＨＥＲ３のリン酸化の２倍〜３倍の刺激を誘導した（表２７）。Ａ４３１細胞を増加する用量のＲＢ２００ｈで処理し、その後、ＥＧＦで刺激した場合、ＥＧＦで刺激しただけの細胞と比較すると、抗ホスホチロシンＥＬＩＳＡにより測定するとき、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３の３つ全てのタンパク質のチロシンリン酸化には用量依存性の阻害が存在した（図８ａ）。ＲＢ２００ｈの最大の応答（１６０ｎＭのＥＣ５０で約７５％の阻害）は、ＨＥＲ１リン酸化について観察された（図８ａ、ならびに表２７および２８）。ＥＧＦにより刺激されたリン酸化に対するＲＢ２００ｈのこの阻害作用は、表ＩＩに列挙される調べた全細胞株において観察された。しかし、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎおよびＣ２２５（Ｅｒｂｉｔｕｘ）のような他のＨＥＲファミリー指向型の生物製剤の中でも、ＨＥＲ１へのＥＧＦの結合を阻害するＣ２２５のみが、ＲＢ２００ｈと同程度に有効であった（表２７および２８）。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎは、ＨＥＲタンパク質のＥＧＦ刺激によるリン酸化をいかなる有意なレベルまでも阻害しなかった。これらの研究は、以下でさらに考察する。
ＨＥＲ１リン酸化を刺激したにも関わらず、ＥＧＦは、ＨＥＲ２（４倍）およびＨＥＲ３（３倍）のリン酸化の刺激を引き起こし、ＥＧＦが、ＨＥＲ１のＨＥＲ２もしくはＨＥＲ３とのヘテロ二量体化を誘導したことが示唆された。このＥＧＦにより刺激されたＨＥＲ２もしくはＨＥＲ３のリン酸化はまた、ＲＢ２００ｈにより約６０％まで阻害された（図８ａ）。ＥＧＦのような増殖因子は、ＨＥＲファミリーレセプタータンパク質のヘテロ二量体化を誘導し、そして、そのそれぞれのパートナーのリン酸基転移を誘導するので、リガンドにより刺激された３つ全てのＨＥＲタンパク質に対する分子の阻害作用を評価することが重要である。これは、リン酸化の阻害のデータを「汎ＨＥＲ指数」として表すことによって行った。
これは、ＨＥＲファミリータンパク質の平均％阻害を測定し、そして以下のように導く：ハーモジュリンまたは別の因子による汎ＨＥＲ指数＝（［ＨＥＲ１＋ＨＥＲ２＋ＨＥＲ３］のリガンドにより刺激されたリン酸化の％阻害／３）。ＥＧＦにより刺激されたＡ４３１細胞におけるＲＢ２００ｈに対する汎ＨＥＲ指数は７０％であり、ＥＧＦの有効な封鎖が、ＨＥＲタンパク質のシグナル伝達を誘導したことを示唆する（表２７）。別の腫瘍細胞株であるＺＲ−７５−１乳癌細胞（低いレベルのＨＥＲ１を有するが、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３のレベルは中程度である）においては、ＲＢ２００ｈは、ＥＧＦにより刺激されたＨＥＲ１およびＨＥＲ２のリン酸化を、それぞれ、４０％および２０％阻害し、汎ＨＥＲ指数は約２０％、そして、ＥＣ５０は５０〜１００ｎＭであった（図９ａ、表２７および２８）。ＺＲ−７５−１細胞においては、ＥＧＦ刺激後にＨＥＲ３リン酸化の有意な増加はなく、結果として、ＥＧＦ処理した細胞においては、ＨＥＲ３リン酸化に対し、ＲＢ２００ｈによる影響はなかった。
Ａ４３１細胞のＮＲＧ１β１（ＨＥＲ３リガンド）処理は、ＨＥＲ３リン酸化の約２倍〜４倍の刺激をもたらした。ＮＲＧ１β１によるＨＥＲ３リン酸化の刺激のこのレベルは、ＺＲ−７５−１を除く他の細胞において見られ、ＺＲ−７５−１においては、ＮＲＧ１β１は、ＨＥＲ３リン酸化の約７倍の刺激をもたらした。研究したほとんどの腫瘍細胞では、ＮＲＧ１β１は、ＨＥＲ２のリン酸化を刺激したが、ＨＥＲ１のリン酸化は、試験した腫瘍細胞株のいくつかにおいてのみ観察された。ＮＥＲＧ１β１で刺激したＡ４３１細胞またはＺＲ−７５−１細胞において、ＲＢ２００ｈは、ＨＥＲ３リン酸化の最大の、６０〜８０％の最大阻害までの、用量依存性の阻害をもたらし、そして、ＥＣ５０は、約１２０ｎＭであり、そして、汎ＨＥＲ指数は、４５〜６０％であった（図８ｄおよび９ｄ、表２７および２８）。Ａ４３１細胞のＮＲＧ１β１による刺激は、ＨＥＲ１リン酸化にいかなる有意な変化をももたらさず、したがって、ＲＢ２００ｈのＨＥＲ１に対する作用は観察されなかった。一方で、ＺＲ−７５−１細胞のＮＲＧ１β１による処理は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３の３つ全てのリン酸化の刺激をもたらし、そして、これらのリン酸化は、ＲＢ２００ｈによって４０〜６０％阻害され、汎ＨＥＲ指数は約５０％であり、そして、ＥＣ５０は、ＨＥＲタンパク質に依存して２４〜９０ｎＭであった（図９ｄ、表２７および２８）。ＲＢ２００ｈを用いた同様の研究を、他の腫瘍細胞株を用いて行い、そして、ＲＢ２００ｈは、多様な範囲の腫瘍細胞株においても同様に、ＥＧＦもしくはＮＲＧ１β１により刺激されたリン酸化を阻害した（表２７および２８）。
ＥＧＦもしくはＮＲＧ１β１により刺激されたリン酸化に対する、ＨＥＲファミリータンパク質のリン酸化を調節することが知られる、ＨＥＲファミリータンパク質に指向された他の生物製剤（すなわち、Ｃ２２５すなわちＥｒｂｉｔｕｘ（ＨＥＲ１指向性）およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（ＨＥＲ２指向性））の作用を調べた。Ａ４３１細胞およびＺＲ−７５−１細胞において、Ｃ２２５は、ＥＧＦにより刺激されたＨＥＲ１リン酸化の最大の用量依存性の阻害を引き起こし、ＥＣ５０は約８ｎＭであり、最大作用は４０〜８０％の阻害であった（図８ｃおよび９ｃ、表２７および２８）。同様に、Ｃ２２５は、試験した他の細胞株においても、ＲＢ２００ｈに匹敵する効能で、ＥＧＦにより刺激されたＨＥＲ１のリン酸化を阻害した（表２７および２８）。ＥＧＦにより刺激されたＡ４３１細胞またはＺＲ−７５−１細胞において、Ｃ２２５はまた、ＨＥＲ２のリン酸化も阻害したが、ＲＢ２００ｈの作用と同様に、Ａ４３１細胞においてのみＨＥＲ３のリン酸化を阻害したものの、ＨＥＲ３に対する効能は、ＲＢ２００ｈと比較して低いものであった（図８ｃ、表２７および２８）。しかし、ＲＢ２００ｈの作用とは異なり、ＨＥＲ１に結合するＣ２２５は、試験した細胞株のいずれにおいても、ＮＲＧ１β１により刺激されたＨＥＲファミリータンパク質のリン酸化は阻害しなかった（図８ｃおよび９ｃ、ならびに表２７および２８）。
ＨＥＲ２指向性のＨｅｒｃｅｐｔｉｎを、ＨＥＲファミリータンパク質のチロシンリン酸化を調節するその能力について試験した。ＥＧＦにより刺激されたＡ４３１において、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎは、ＨＥＲ２もしくはＨＥＲ３リン酸化の低レベル（約２０％）の阻害のみを引き起こした一方で、ＮＲＧ１β１により刺激された細胞においては、ＨＥＲ３のリン酸化のみが、低い（約３０％）阻害まで阻害された（図８ｂおよびｅ、表２７および２８）。しかし、ＥＧＦより刺激されたＺＲ−７５−１細胞において、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎは、ＨＥＲファミリータンパク質のリン酸化は阻害しなかったが、代わりに、ＨＥＲ２のリン酸化の約６０％の刺激をもたらした（図９ｂ）。しかし、ＨＥＲ２に対するその作用とは対照的に、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎは、ＺＲ−７５−１細胞のＮＲＧ１β１による刺激の後に、ＨＥＲ３のリン酸化を５０％阻害した。特に、ＮＲＧ１β１により刺激された細胞における、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎによるＨＥＲ３チロシンリン酸化の低レベル（２０〜３０％）の阻害は、試験した全ての細胞株（Ａ４３１細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ２９細胞、Ｎ８７細胞、ＳＫ−ＢＲ−３細胞およびＺＲ−７５−１細胞）において一貫して観察された。上述の試験した細胞株のうち、Ａ４３１細胞においてのみ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎでの処理が、ＨＥＲ２リン酸化のわずかな阻害（約２０％）をもたらした。全ての他の細胞株において、上述したように、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎでの処理は、処理していない細胞と比較して、１０〜６０％の範囲のＨＥＲ２チロシンリン酸化の刺激をもたらした。
リガンドにより刺激されたリン酸化のＲＢ２００ｈ、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎおよびＣ２２５による阻害に関する同様の研究を、他の細胞株においても行った。データを表２７および２８にまとめる。いくつかの細胞株についての、ＲＢ２００ｈ、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎおよびＣ２２５のＨＥＲファミリータンパク質のリン酸化の平均％阻害（汎ＨＥＲ指数）を比較すると、ハーモジュリンＲＢ２００ｈが、リガンドにより誘導されるＨＥＲファミリータンパク質のリン酸化の阻害において最も有効であった。Ｃ２２５は、ＥＧＦにより刺激されたＨＥＲファミリータンパク質のリン酸化の阻害においてＲＢ２００ｈと同程度に有効であるが、Ｃ２２５は、ＮＲＧ１β１により刺激されたＨＥＲタンパク質のリン酸化の阻害においては有効ではなかった。ＮＲＧ１β１により刺激された細胞では、汎ＨＥＲ指数により判断すると、ＲＢ２００ｈのみが全ＨＥＲファミリータンパク質のリン酸化の抑制において有効であり、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎもＣ２２５も有効ではなかった（表２７および２８）。データは、ハーモジュリンＲＢ２００ｈは、３つ全てのＨＥＲファミリー、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３のＥＧＦ（ＨＥＲ１リガンド）またはＮＲＧ１β１（ＨＥＲ３リガンド）の両方により刺激されたチロシンリン酸化をブロックするが、Ｃ２２５またはＨｅｒｃｅｐｔｉｎはブロックしないことを示す。併せて考慮すると、データは、ＲＢ２００ｈが、ＨＥＲ１およびＨＥＲ３タンパク質にためのリガンドトラップであり、そして、広い抗ＨＥＲ活性を有することを示す。
（実施例１６ 多様な範囲のＨＥＲ１およびＨＥＲ３のリガンドがＲＢ２００ｈに結合する）
ＥＧＦ以外の他のＨＥＲ１リガンドまたはＮＲＧ１β１以外のＨＥＲ３リガンドがＲＢ２００ｈに結合するかどうかを決定するための研究を行った。この研究において、リガンドの結合能は、ＲＢ２００ｈに結合したＥｕ−ＥＧＦまたはＥｕ−ＮＲＧ１β１のいずれかを置き換える能力により試験した。実験は、実施例１４に記載したように行った。
図７ｃおよびｄに示す ように、非標識のＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＴＧＦ−αは、Ｅｕ−ＥＧＦの結合を阻害し、これらのＨＥＲ１リガンドがＲＢ２００ｈに結合することが示唆された。同様の研究において、ＮＲＧ１−α、ＮＲＧ１β３ａおよびＮＲＧ１β１は、ＲＢ２００ｈへのＥｕ−ＮＲＧ１β１の結合を阻害したが、ＥＧＦはこれを阻害せず、これらのニューレグリンがＲＢ２００ｈに結合することが示唆された（図７ｄ）。さらに、ＨＥＲファミリーリガンドと関連のないインシュリンまたはインシュリン様増殖因子−１のような増殖因子は、Ｅｕ−ＥＧＦまたはＥｕ−ＮＲＧ１β１の結合のいずれかとも競合せず（図７ｃおよびｄ）、ＲＢ２００ｈが、ＨＥＲ１またはＨＥＲ３のリガンドとの結合に特異的であることが示唆された。このことは、ＲＢ２００ｈが、増殖因子に非特異的には結合しないが、ＨＥＲ１またはＨＥＲ３のリガンドへの結合には非常に特異的であることを示唆する。このデータは、併せて考えると、ＲＢ２００ｈにおけるＨＥＲ１ ＥＣＤおよびＨＥＲ３ ＥＣＤは、その本来の対応物として、リガンド結合能において機能的であることを示す。
（実施例１７ ＲＢ２００ｈにおけるＨＥＲ１およびＨＥＲ３のリガンド結合能は互いに独立している）
ＲＢ２００ｈにおけるＨＥＲ１およびＨＥＲ３上のリガンド結合部位が互いに独立しているかどうかを調べるために、ＲＢ２００ｈに対するＥｕ−ＥＧＦ結合の競合研究を、ＨＥＲ３リガンド（ＮＲＧ１β１）の存在下で行った。また、逆の実験（非標識のＥＧＦによるＥｕ−ＮＲＧ１β１の競合）も行った。実験は、実施例１４に記載したように行った。
データは、Ｅｕ−ＥＧＦ結合の場合には、非標識のＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦまたはＴＧＦ−αのみが、ＲＢ２００ｈに対するＥｕ−ＥＧＦ結合と競合したが、ＮＲＧ１β１は競合しなかったことを示す。同様に、非標識のＮＲＧ１β１のみが、Ｅｕ−ＮＲＧ−１β１の結合と競合したが、ＥＧＦは競合しなかった。併せて考えると、データは、ＨＥＲ１のリガンド結合部位は、ＨＥＲ３のリガンド結合部位とは無関係にそのリガンドと結合することを示す。逆のこともまた言え、すなわち、ＨＥＲ３のリガンド結合部位は、ＨＥＲ１のリガンド結合部位とは無関係にそのリガンドに結合し得る。
（実施例１８ ハーモジュリンは単層培養および軟寒天における細胞増殖を阻害する）
ＲＢ２００ｈはＥＧＦ（ＨＥＲ１リガンド）およびＮＲＧ１β１（ＨＥＲ３リガンド）の両方に結合し、そして、増殖因子により刺激されたＨＥＲファミリータンパク質のチロシンリン酸化を阻害するので、ＲＢ２００ｈはまた、細胞増殖も阻害する可能性がある。このことを、ＲＢ２００ｈを伴ってかもしくは伴わずに単層細胞増殖研究を行うことによって試験した。
軟寒天コロニー増殖アッセイを、アッセイを、基底層として１０％胎仔ウシ血清を含む培養培地中０．５％アガロース（１．５ｍｌ）を備える２４ウェルプレート中で行い、そして、細胞を含む上部層には、１０％胎仔ウシ血清中０．２５％のアガロース（０．５ｍｌ）であったことを除いて、Ｈｕｄｚｉａｋ ｅｔ ａｌ（１９８７）によって記載された方法に基づいて行った。化合物を、上部層に加えた。コロニーを、５％ ＣＯ２および９５％空気の加湿したインキュベーター中３７℃にて増殖させた。約３日ごとに、５０μｌ／ウェルの滅菌水を加えて乾燥を防いだ。細胞のコロニーを、１．０ｍｌ／ウェルの水中０．００１％のクリスタルバイオレットで４℃にて一晩染色した。細胞のコロニーを、顕微鏡を用いてカウントした。
ハーモジュリンＲＢ２００ｈは、Ａ４３１類表皮癌およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞の増殖を用量依存性の様式で阻害し、ＥＣ５０は、それぞれ、７１ｎＭおよび１．４ｎＭであった（図１１）。単層培養において、いくつかの他の腫瘍細胞株を、ＲＢ２００ｈに対する感受性についてスクリーニングした。この研究を、他の無作為に選択した腫瘍細胞を含めて拡大した。多様な範囲の腫瘍細胞（皮膚癌、乳癌および肺細胞癌を含む）の増殖が、ＲＢ２００ｈによって阻害される（表２９）。しかし、乳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞および胃癌細胞を含むいくつかの腫瘍細胞株は、ＲＢ２００ｈによる増殖阻害に感受性ではない（表２９）。
ＲＢ２００ｈをまた、軟寒天コロニー増殖アッセイにより、固定に非依存性の増殖を阻害する能力について試験した。２つの腫瘍細胞株、単層増殖においてＲＢ２００ｈによる増殖阻害に感受性であったＺＲ−７５−１乳癌細胞およびＡ５４９肺癌細胞を、軟寒天アッセイにおいて試験した。ＺＲ−７５−１細胞は、軟寒天中でほとんど増殖しなかったが、ＥＧＦ（ＨＥＲ１リガンド）またはＮＲＧ１β１（ＨＥＲ３リガンド）のいずれかにより刺激を受けてコロニーを形成した。後者の増殖因子がより有効であり、９倍の刺激を生成したのに対し、ＥＧＦは、コロニー増殖の３倍の刺激を引き起こした（図１２ａ）。ＲＢ２００ｈは、ＥＧＦまたはＮＲＧ１β１の両方により刺激されたＺＲ−７５−１細胞の軟寒天コロニー増殖を阻害し、ＲＢ２００ｈが、これらの増殖因子に対するリガンドトラップのように挙動することが示唆された（図１２ａ）。Ａ５４９肺癌細胞株は軟寒天中で容易にコロニーを形成したが、ＮＲＧ１β１またはＥＧＦによって、増殖因子処理なしの場合と比較して、それぞれ、１．３倍および１．４倍刺激され得た（図１２ｂ）。このコロニー増殖刺激のレベルは、ＺＲ−７５−１細胞について観察されたものよりもかなり少ない。Ａ５４９細胞のＲＢ２００ｈでの処理は、増殖因子の非存在下でのコロニー増殖の約６５％の阻害をもたらした（図１２ｂ）。しかし、ＲＢ２００ｈは、ＥＧＦまたはＮＲＧ１β１により処理されたコロニー増殖の統計的に有意な阻害をもたらさなかった（図１２ｂ）。この後者の知見は、Ａ５４９細胞が、増殖因子を加えることなく軟寒天において容易にコロニーを形成したこと、そして、ＥＧＦもしくはＮＲＧ１β１の添加が、コロニー増殖において瑣末な（約１．３倍）刺激のみを引き起こし、したがって、これらが、コロニー増殖に対するこれらのリガンドに対し非依存性であったという事実に起因するものであり得る。併せて考えると、データは、ＲＢ２００ｈが、増殖因子リガンドトラップとしての機能と、そして、非リガンドトラップ機構との両方によって、細胞増殖を阻害することを示す。
（実施例１９ 無血清培地におけるＥＧＦもしくはＮＲＧ１β１誘導性の細胞増殖のＲＢ２００ｈによるブロッキングに関する研究）
ＲＢ２００ｈがＨＥＲ１もしくはＨＥＲ３のリガンドトラップであるという仮説をさらに試験するために、ＲＢ２００ｈがＥＧＦもしくはＮＲＧ１β１により刺激された細胞増殖を阻害するかどうかを決定するための研究を行った。
細胞増殖研究を、示されるような無血清培地中で行った。細胞を、９６ウェル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ ＃３５−３０７５，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＮＪ）中に、細胞株に適切であるように、１ウェルあたり２０００〜６０００細胞で撒き、その後、一晩（１５〜１８時間）増殖させた。血清含有培地において行った細胞増殖研究では、細胞を、その後、化合物あり、または化合物なしで処理し、そして、３〜５日間増殖させた。増殖因子（ＥＧＦまたはＮＲＧ１β１）により刺激された増殖に対するＲＢ２００ｈの作用を、以下のような無血清増殖条件下で研究した。血清中で細胞を撒いた後、細胞を一晩（１５〜２０時間）増殖させ、次いで、これらの細胞を、無血清培地に切替え、そして、２４〜４８時間増殖させた（血清欠乏状態）。これらを、次いで、増殖因子またはＬＰＡで、ＲＢ２００ｈを伴ってもしくは伴わずに処理し、３〜５日間増殖させた。細胞の増殖を、先に記載されたクリスタルバイオレット色素法（Ｓｕｇａｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７）によって定量した。簡単に述べると、培養培地をデカンテーションにより捨て、細胞を、一度ＰＢＳで洗浄し、その後、５０μ／ウェルのメタノール中０．５％（ｗ／ｖ）のクリスタルバイオレット色素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｉｕｓ，ＭＯ）を加え、２０分間インキュベートした。プレートを水で３回洗浄し、その後、一晩風乾させた。細胞に結合した色素を、１００μｌ／ウェルのＳｏｒｅｎｓｏｎ緩衝液（５０％エタノール中２５ｍＭのクエン酸ナトリウム）を用いて、プレート振盪機上で１５分間溶出した。次いで、プレートを、５４０ｎｍの波長にてプレートリーダー上で吸光度を読み取り、この吸光度は、ウェル内の細胞の量に直接比例していた。
ＥＧＦは、ＳＵＭ１４９細胞の増殖を刺激した。このＥＧＦにより刺激された増殖は、ＲＢ２００ｈによって完全にブロックされた（図１３ａおよび１４ａ）。ＮＲＧ１β１に対して応答することが報告されているＭＣＦ−７細胞（Ｌｅｗｉｓ，ＧＤ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９６，５６：１４５７−６５）を、ＮＲＧ１β１で処理した（図１３ｂ）。この増殖因子は、無血清条件において、用量依存性のＭＣ７細胞増殖の刺激を生成した。このＮＲＧ１β１により刺激された細胞増殖は、ＲＢ２００ｈによって完全にブロックされた。
併せて考えると、リガンドにより刺激された増殖の拮抗作用のデータは、ＲＢ２００ｈが、ＨＥＲ１およびＨＥＲ３のリガンドの両方に対するリガンドトラップであることを示唆する。
（実施例２０ ハーモジュリンは、ＧＰＣＲリガンドにより刺激された細胞増殖を阻害する）
腫瘍細胞に対する増殖因子の重要な供給源は、膜貫通結合したアンフィレグリン、ＨＢ−ＥＧＦまたはＴＧＦ−αのような増殖因子を切断し、結果としてこれらの増殖因子を放出するＡＤＡＭメタロプロテイナーゼ（Ｈｕｏｖｉｌａ，ＡＪ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＳ ２００５，３０：４１３−４２２）のＧＰＣＲリガンド活性化を介して得られる。こうして生成した増殖因子は、次いで、パラクリンもしくはオートクリンのいずれかの様式で腫瘍細胞の増殖を刺激するために利用可能となる。ＲＢ２００ｈはＨＥＲ１およびＨＥＲ３の両方のリガンドに結合するので、ＲＢ２００ｈは、腫瘍細胞に対するこの供給源をブロックし、そして、腫瘍細胞の増殖阻害をもたらし得る。この仮説を、アンフィレグリン（ＡＲ）をオートクリン様式で産生することが報告されているＳＵＭ１４９乳癌細胞およびＡＲ依存性細胞（Ｗｉｌｌｍａｒｔｈ，ＮＥ ａｎｄ Ｅｔｈｉｅｒ，ＳＰ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００６，２８１：３７７２８−３７７３７）を用いて試験した。
実施例１９に記載されるように、細胞増殖を行った。ＧＰＣＲリガンドであるＬＰＡにより刺激された増殖の作用を、無血清増殖下で研究した。
リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）を用いたＳＵＭ１４９細胞の処理は、細胞増殖の用量依存性の増加をもたらした（図１３ｂおよび１４ｂ）。このＬＰＡにより刺激された増殖は、ＲＢ２００ｈによって完全にブロックされ（図１３ｂおよび１４ｂ）、これは、ハーモジュリンが、増殖因子のＧＰＣＲにより活性化された放出に対する増殖因子のリガンドトラップとして機能するという考えと一致している。
（実施例２１ ハーモジュリンは、チロシンキナーゼインヒビターと相乗作用性である）
ＨＥＲファミリータンパク質に対して指向される生物製剤は、ＨＥＲ１もしくはＨＥＲ２キナーゼに対して指向されるチロシンキナーゼインヒビターと組み合わされたときに、細胞増殖の阻害において相乗作用性の応答を示している（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ，Ｊ ａｎｄ Ｂａｓｅｌｇａ，Ｊ．Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００６，３３：３６９−３８５）。したがって、本発明者らは、単層細胞増殖アッセイにおいて、ＲＢ２００ｈおよびチロシンキナーゼインヒビターであるＧｅｆｉｔｉｎｉｂ（Ｉｒｅｓｓａ）、Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ（Ｔａｒｃｅｖａ）（共に、ＦＤＡにより認可されたＥＧＦＲキナーゼインヒビターである）と、チロホスチンＡＧ８２５（ＨＥＲ２キナーゼインヒビター）とを用いた組合せ研究を行った。
細胞増殖研究は、示されるような血清含有培地または無血清培地のいずれかにおいて行った。細胞を、９６ウェル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ ＃３５−３０７５，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＮＪ）中に、細胞株に適切であるように、１ウェルあたり２０００〜６０００細胞で撒き、その後、一晩（１５〜１８時間）増殖させた。血清含有培地において行った細胞増殖研究では、細胞を、その後、化合物あり、または化合物なしで処理し、そして、３〜５日間増殖させた。細胞増殖について、無血清培地条件において研究を行った。血清中で細胞を撒いた後、細胞を一晩（１５〜２０時間）増殖させ、次いで、これらの細胞を、無血清培地に切替え、そして、２４〜４８時間増殖させた（血清欠乏状態）。次いで、化合物（例えば、ＲＢ２００ｈ、ＩＲＳ、Ｉｒｒｅｓｓａ、Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、ＥｒｌｏｔｉｎｉｂおよびＡＧ−８２５）を二連で同時に加え、そして、段階２倍希釈を行った。細胞の増殖を、先に記載されたクリスタルバイオレット色素法（Ｓｕｇａｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７）によって定量した。簡単に述べると、培養培地をデカンテーションにより捨て、細胞を、一度ＰＢＳで洗浄し、その後、５０μ／ウェルのメタノール中０．５％（ｗ／ｖ）のクリスタルバイオレット色素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｉｕｓ，ＭＯ）を加え、２０分間インキュベートした。プレートを水で３回洗浄し、その後、一晩風乾させた。細胞に結合した色素を、１００μｌ／ウェルのＳｏｒｅｎｓｏｎ緩衝液（５０％エタノール中２５ｍＭのクエン酸ナトリウム）を用いて、プレート振盪機上で１５分間溶出した。次いで、プレートを、５４０ｎｍの波長にてプレートリーダー上で吸光度を読み取り、この吸光度は、ウェル内の細胞の量に直接比例していた。
ＮＳＣＬＣ（Ｈ１４３７）細胞において、ＲＢ２００ｈまたはＡＧ ８２５は単独で、細胞増殖を低いレベルまで阻害した。これらの腫瘍細胞は、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２キナーゼインヒビターに対して抵抗性である。ＲＢ２００ｈおよびＡＧ ８２５の組合せは、顕著な相乗作用を生成した（図１５ａ）。この相乗作用データは、薬物の組合せ研究における相乗作用の客観的な決定のために特別に設計されたプログラムである、ＣａｌｃｕＳｙｎ（Ｂｉｏｓｏｆｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵＫ）（Ｔ−Ｃ Ｃｈｏｕ ａｎｄ Ｐ．Ｔａｌａｌａｙ；Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ ４，４５０−４５４）によって解析した。アッセイデータを用いて、ＣａｌｃｕＳｙｎプログラムは、組合せ指数（ＣＩ）と呼ばれるパラメーターを生成する。ＣＩが１．０未満である場合、２つの化合物の間には相乗作用が存在し、ＣＩが１である場合は、相加性の応答が存在することを意味し、そして、１よりも大きいＣＩは、化合物の間には拮抗作用が存在することを示す。ＡＧ−８２５のＲＢ２００ｈとの組合せでは、ＮＳＣＬＣ Ｈ１４３７細胞において、試験した全ての濃度においてＣＩが０．２０であり、相乗作用性であった。
別のチロシンキナーゼインヒビターである、ＥＧＦＲに対して指向されるＧｅｆｉｔｉｎｉｂもまた、ＲＢ２００ｈと高度に相乗作用性であり、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８において、ＣＩは、０．２０であった（図１５ｂ）。このＲＢ２００ｈとの相乗作用性はまた、別のＦＤＡにより認可されたＥＧＦＲキナーゼインヒビターであるＥｒｌｏｔｉｎｉｂでも観察された（図１５ｃ）。Ｒｂ２００ｈはまた、ＮＳＣＬＣ細胞Ｈ２１２２において、Ｅｒｌｏｔｉｎｂと相乗作用性に作用することが分かった（図１６）。対照的に、Ｈｓ５７８ Ｂｓｔのような正常細胞において、ＲＢ２００ｈは、細胞増殖の有意な阻害を示さず、そしてまた、ＲＢ２００ｈとＧｅｆｉｔｉｎｉｂとの間には相乗作用が存在しなかった（図１５ｄ）。ＲＢ２００ｈとＡＧ−８２５もしくはＩｒｅｓｓａのいずれかとの間の相乗作用は、いくつかの他の腫瘍細胞株において見られる。
図１７〜２０は、Ａ４３１細胞におけるＲＢ２００ｈおよびＡＧ８２５の段階希釈を示し、Ａ４３１細胞においてＲＢ２００ｈとＩｒｒｅｓｓａが、そして、ＢＴ４７４においてＲＢ２００ｈとＩＲＳが、ＲＢ２００ｈまたはチロシンキナーゼインヒビターと比較して、細胞増殖を相乗作用性に阻害するように作用する。いくつかの細胞においては相乗作用が強いが、他の細胞においては、弱い相乗作用が存在する（表３０）。
併せて考えると、データは、ＲＢ２００ｈが、非常に低い用量で、ＨＥＲ１もしくはＨＥＲ２キナーゼに対して指向されるチロシンキナーゼインヒビターの増殖阻害活性の相乗作用を示すことを示す。このことは、ＲＢ２００ｈが、ＨＥＲ１もしくはＨＥＲ２キナーゼに対して指向されるチロシンキナーゼインヒビターとの組合せで、これらのキナーゼインヒビターに対して抵抗性の患者を含めて、治療薬として最大の有用性を有し得ることを示す。
（実施例２２ ハーモジュリンＲＢ２００ｈは、Ａ４３１ヒト腫瘍異種移植モデルにおいてインビボ抗腫瘍性の効能をを有する）
ＲＢ２００ｈのインビボ効能を、ヌードマウスを用いて、Ａ４３１ヒト腫瘍異種移植モデルにおいて試験した。使用した一般的なプロトコールは、使用した一般的なプロトコールからのいくらかの逸脱と共に、この実施例に記載する。
動物
マウスを、市場の供給元（Ｈａｒｌａｎ，ＵＫ）より入手した。マウスは、この研究の開始時に４〜６週齢であった。マウスを、ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ） Ａｃｔ １９８６において推奨されるように、１２時間の明暗周期（０７．００に点灯、１９．００に消灯）を与えるように設定された蛍光灯で照射される障壁付きのユニット内で、無菌アイソレーター中に維持した。部屋は、２３±２℃の気温範囲を維持するように設計されたシステムによって空調管理した。マウスは、処置の間、２または５の群に分けて、放射線滅菌した藁床を備え、ネスティング材料（ｎｅｓｔｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ）および環境富化（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）の両方を提供されたプラスチックケージ（Ｔｅｃｈｎｉｐｌａｓｔ ＵＫ）内で飼育した。滅菌照射された２０１９げっ歯類の食餌（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｃｋｌａｎｄ ＵＫ，製品コードＱ２１９ＤＪ１Ｒ２）と、オートクレーブ処理した水を、自由に与えた。
予備毒性研究
以下のような各群２匹のマウスの３群を用いた：第１群：（ｎ＝２）３０ｍｇ／ｋｇのＲＢ２００ｈを週に３回ｉ．ｐ．、第２群：（ｎ＝２）７５ｍｇ／ｋｇのＩＲＥＳＳＡを週に１〜５日目のサイクルでｉ．ｐ．、および、第３群：（ｎ＝２）１０ｍｇ／ｋｇのＲＢ２００ｈを週に３回ｉ．ｐ．、そして、３８ｍｇ／ｋｇのＩＲＥＳＳＡを週に１〜５日目のサイクルでｉ．ｐ．。
治療の評価
以下の８群を用いた：
第１群:（ｎ＝１０）ＲＢ２００ｈのためのビヒクルを週に３回ｉ．ｐ．、第２群：（ｎ＝１０）１０ｍｇ／ｋｇのＲＢ２００ｈを週に３回ｉ．ｐ．、第３群：（ｎ＝１０）３０ｍｇ／ｋｇのＲＢ２００ｈを週に３回ｉ．ｐ．、第４群：（ｎ＝１０）ＩＲＥＳＳＡのためのビヒクルを週に１〜５日目のサイクルでｉ．ｐ．、第５群：（ｎ＝１０）３８ｍｇ／ｋｇのＩＲＥＳＳＡを週に１〜５日目のサイクルでｉ．ｐ．、第６群：（ｎ＝１０）７５ｍｇ／ｋｇのＩＲＥＳＳＡを週に１〜５日目のサイクルでｉ．ｐ．、第７群：（ｎ＝１０）ＲＢ２００ｈおよびＩＲＥＳＳＡのためのビヒクル、および、第８群：（ｎ＝１０）１０ｍｇ／ｋｇのＲＢ２００ｈを週に３回ｉ．ｐ．そして、３８ｍｇ／ｋｇのＩＲＥＳＳＡを週に１〜５日目のサイクルでｉ．ｐ．。
腫瘍のイニシエーション
Ａ４３１細胞は、ＰＲＥＣＯＳから供給され、そして、これを、１０％（ｖ／ｖ）の熱不活性化胎仔ウシ血清（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）を含むＲＰＭＩ １６４０培養培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）中で、５％ ＣＯ２および加湿条件にて３７℃にインビトロで維持した。コンフルエント未満の単層からの細胞を、０．０２５％ＥＤＴＡで回収し、上記培養培地中で２回洗浄し、そして、インビボ投与のために、滅菌したリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４；ＰＢＳ）中に再懸濁した。細胞を、１００μｌの用量で１×１０７細胞にて、マウスに皮下注射した。
腫瘍の監視
予備毒性研究のために、マウスを、それぞれの処置群に割り当て、そして、５日目に、注射１回あたり１５０μｌの投薬容量で２週間の処置を開始した。治療研究のために、マウスを、そのそれぞれの処置群に割り当て、平均腫瘍容積が５０〜１００ｍｍ３に達したときに処置を開始し、そして、注射１回あたり１５０μｌの投薬容量で３週間にわたり投薬した。腫瘍の寸法を週に３回記録し（長さおよび幅のキャリパによる測定、腫瘍の断面積と容積を計算した）、そして、毎週体重を計測した。
終了
各マウスは、終了とされるまでか、または、そのマウスを研究から除く必要が生じるまで、研究に留めた。動物は、腫瘍サイズが大き過ぎになるか、または、任意の有害な影響が認められる場合に終了とした。終了時に、マウスに麻酔をかけ（Ｈｙｐｎｏｒｍ／Ｈｙｎｏｖｅｌ）、そして、約１ｍｌの血液を心臓穿刺により除去し、血漿へと処理し、予備研究および治療研究の両方のために凍結した。次いで、マウスを、認可されたＳ１法によって終了とした。治療研究については、腫瘍を切開し、秤量し、測定し、そして、ホルマリン中に固定した。
データおよび統計的解析
体重のデータ、腫瘍の増殖および最終的な腫瘍の重量を記録し、そして、スプレッドシートおよび図式的なフォーマットで報告した。適切な場合、Ｍｉｎｉｔａｂを用いて統計的解析を行った。
予備研究からの逸脱（ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）
投薬から３時間後に血漿サンプルを回収するために、予備毒性研究を、投薬から１２日後に終了させた。治療研究のための追加の群が、以下のようにＰＲＥＣＯＳによって加えられた。第９群：３０ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧを週に３回ｉ．ｐ．。Ｉｒｅｓｓａは、ＰＢＳ中の１０％ ＤＭＳＯおよび５％ＣｒｅｍａｐｈｏｒでＰＲＥＣＯＳによって調製された。治療研究のために、腫瘍を、マウス１匹あたり２×１０６細胞でイニシエーションした。責任者によって要求されたとおりに、治療研究のためにＲＢ２００ｈおよびＩｇＧを静脈内投薬した。第２群、第３群および第８群における初回投薬後に認められる有害な影響に起因して、投薬は、この研究の残りについて、ｉ．ｐ．投与に戻した。研究は、多数のマウスにおける腫瘍の潰瘍化に起因して、２６日目に終了させた。
結果
予備毒性研究のために、皮下腫瘍を、プロトコールに詳述されるようにＡ４３１細胞でイニシエーションし、そして、Ｒｂ２００ｈおよび／またはＩｒｅｓｓａの投薬を５日目に開始した。Ａ４３１腫瘍担持マウスにおいては有害な影響は認められなかった。マウスの体重は、毒性研究の全体を通じて、許容可能な範囲内に留まった（図２４Ａ）。腫瘍の容積をまた終了前にも測定し、第１群についての平均腫瘍サイズは、極めて大きかった。Ｉｒｅｓｓａ処置群における腫瘍サイズの抑制が見られた（第２群および第３群）（図２４Ｂ）。
１×１０７細胞を注射してから２週間後に存在する腫瘍の大きなサイズに起因して、研究の時間フレームを増やすために、腫瘍をイニシエーションするために使用した細胞数を２×１０６に減らした。この研究を、２バッチの細胞およびマウス（バッチＡおよびバッチＢ）を用いて２日にわたってイニシエーションした。１０日目に、平均腫瘍サイズは、５０〜１００ｍｍ３に到達し、そして、投薬を開始した、ＲＢ２００ｈ、ＩｇＧおよびＲＢ２００ｈビヒクルの投薬は、腹腔内ではなく静脈内投与に変更した。最初のバッチを投薬し、そして、第２群、第３群および第８群のＲＢ２００ｈ処置マウスにおいて有害な反応を観察した。第３群（３０ｍｇ／ｋｇのＲＢ２００ｈ、この研究に使用した最高濃度）において、マウスのうちの１匹は回復しなかった。残りのマウスについて観察し、そして１時間後に回復した。ＲＢ２００ｈは前もってｉ．ｖ．投与していたが、ＲＢ２００ｈのバッチおよび腫瘍モデルは、この研究において使用したものとは異なった。エンドトキシンレベルもまた、先に使用したものよりもこのバッチの方が低かった。ＲＢ２００ｈを、ｉ．ｖ．投薬前に３７℃まで温め、そして、第３群の２匹のマウスに投薬して観察した。以前と同様に、マウスは、１０分後に赤／紫の血色を呈し、そして１時間後には回復した。したがって、投薬は、残りのマウスについてｉ．ｐ．に戻し、さらなる反応は認められなかった。
研究の全体を通じて腫瘍のサイズを監視し、そして、群ごとの平均を経時的にプロットしたものを図２５Ａ〜Ｄに示す。データはまた、以下の表４０に要約する。最終的な腫瘍の重量もまた測定し、群ごとの平均を図２６に示す。データはまた、表４０に要約する。
高い方の用量のＲＢ２００ｈ単独（３０ｍｇ／ｋｇ、第３群）が、ビヒクル群と比較して、腫瘍の増殖速度を有意に低下させた（ｐ＜０．０５，両側Ａｎｏｖａ）。最終的な腫瘍の重量もまた、５０％有意に減少した（ｐ＝０．０１６，片側ＡＮＯＶＡ，図２６）。比較すると、１０ｍｇ／ｋｇのＲＢ２００ｈは、Ａ４３１腫瘍の増殖を有意には弱めなかったが、腫瘍サイズは、約１５〜２０％減少する傾向があった。ＲＢ２００ｈの用量（３０ｍｇ／ｋｇ、第９群）に対して等用量のヒトＩｇＧもまた、タンパク質コントロールとして、ＰＲＥＣＯＳによって含められた。ＩｇＧでは、腫瘍増殖に対する影響は見られなかった。
高い方の用量のＩｒｅｓｓａ（７５ｍｇ／ｋｇ、第６群）が、腫瘍の増殖速度を有意に低下させた（図２，ｐ＜０．００１，両側ＡＮＯＶＡ）一方で、３８ｍｇ／ｋｇのＩｒｅｓｓａは、ビヒクル群と匹敵しなかった（第４群）。最終的な腫瘍の重量もまた、７５ｍｇ／ｋｇのＩｒｅｓｓａで処置したときに６９％減少した（ｐ＝０．０１６，片側Ａｎｏｖａ，図２６）。Ｉｒｅｓｓａｎためのビヒクル（第４群）もまた、経時的に、ビヒクル群からの阻害の影響を有し（図２５Ｄ，ｐ＜０．０５，両側ＡＮＯＶＡ）、そして、最終的な腫瘍のサイズを４３％減少させた（図２６）が、これは有意ではなかった。組合せでは、１０ｍｇ／ｋｇのＲＢ２００ｈおよび３８ｍｇ／ｋｇのＩｒｅｓｓａ（第８群）は、Ａ４３１腫瘍の増殖に影響を及ぼさなかった（図２５Ｃおよび２６）。ビヒクル群（第７群）は、腫瘍サイズを３０％減少させることが分かったが、これは、有意ではなかった。
マウスの体重もまた、研究の期間にわたり監視し、そして、マウスの年齢について予測されるように、次第に増加した（図２７）。
考察
この実施例におけるこれらの実験の目的は、Ａ４３１皮下異種移植モデルにおける、ＲＢ２００ｈの単独の影響、およびＩｒｅｓｓａとの組合せの影響を評価することであった。Ａ４３１類表皮癌は、高いレベルのＥＧＦＲおよびＨｅｒ２を発現することが報告されており（Ｏｎｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，２００６．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１２（２４）：７２４２−５１）、そして、現在ＮＳＣＬＣの処置についてＵＳで臨床上利用可能なＥＧＦＲチロシンキナーゼドメインの選択的インヒビターであるＩｒｅｓｓａの前臨床評価において使用されている（Ｗａｋｅｌｉｎｇ ＡＥ，ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２（２０）：５７４９−５４）。ＲＢ２００ｈは、汎Ｈｅｒ発現腫瘍について特異的に設計されたリガンドトラップ分子であり、したがって、ＲＢ２００ｈを評価するためにＡ４３１異種移植モデルを選択した。
最初の予備毒性研究は、この腫瘍を担持するマウスにおいて、ｉ．ｐ．投与が十分に耐え得ることを示したが、経路をｉ．ｖ．に変更すると、有害な反応が観察された。これは、ＲＢ２００ｈをｉ．ｖ．投薬したＺＲ７５−１担持マウスにおいては観察されなかった（Ｐ１３０：ＺＲ７５−１皮下腫瘍を担持するヌードマウスにおけるＲＢ２００ｈの予備毒性研究）。エンドトキシンレベルもまた、現在の研究に使用したバッチよりも低いと報告された。結果として生じる影響は、したがって、ＲＢ２００ｈ調製のバッチおよび／または腫瘍のタイプにおける選択的なパラメーターにおける変化に起因するものであり得る。
３０ｍｇ／ｋｇの用量のＲＢ２００ｈは、Ａ４３１腫瘍の増殖を有意に減少させたことが分かったが、１０ｍｇ／ｋｇは減少させなかった。同様に、７５ｍｇ／ｋｇの最高用量のＩｒｅｓｓａは、腫瘍増殖を有意に減少させたが、３８ｍｇ／ｋｇは減少させなかった。より低い用量のＲＢ２００ｈおよびＩｒｅｓｓａを組み合わせたとき、腫瘍増殖の減少は観察されなかった。この研究では、より高い用量は組み合わせなかった。Ｉｒｅｓｓａは、ＲＢ２００ｈよりも高い治療効果を有したが、この研究において使用したＩｒｅｓｓａの用量はＭＴＤに近かった一方で、ＲＢ２００ｈのＭＴＤは、まだ決定されていない。
ＲＢ２００ｈのＭＴＤを最大の治療応答を決定するための臨床上達成可能な用量との境界内で決定するために、さらなる用量増大研究を行った。皮下ＺＲ７５−１（高いＨｅｒ２を発現する乳癌細胞株）およびＭＤＡ−ＭＢ２３１（高いＥＧＦＲを発現する乳癌細胞株）の骨転移モデルのような他のモデルにおける、ＲＢ２００ｈの影響について別の組の実験試験。ＢＴ２０乳癌細胞株は、ＥＧＦＲおよびＨｅｒ２の両方を高いレベルで発現し、したがって、ＲｂＢ２００ｈの評価に有用である。
（実施例２３ より高いリガンド結合親和性および能力の汎ＨＥＲリガンドトラップについての加工：ＨＥＲ１ ＥＣＤの構造に基づいた突然変異誘発）
ＲＢ２００ｈは、約１０ｎＭにおいて、ＨＥＲ１またはＨＥＲ３のリガンドに対して比較的高い結合親和性を示したが、細胞は、約０．３〜３ｎＭのＫｄにおいて、ＥＧＦまたはＴＧＦ−αのようなＨＥＲ１リガンドに結合し、そして、ＨＥＲ３リガンドであるＮＲＧ１β１についてのＫｄは約０．１ｎＭ〜７．０ｎＭである（Ｈｏｌｍｅｓ ｅｔ ａｌ；Ｓｌｉｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ；Ｐｉｎｋａｓ−Ｋｒａｍａｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ，１９９６）。これは、腫瘍細胞が、約１０ｎＭのＥＧＦもしくはＮＲＧ１−β１結合に対するＫｄを有するＲＢ２００ｈよりも、ＨＥＲ１もしくはＨＥＲ３のリガンドに対してより高い親和性を有することを示唆する。したがって、ＲＢ２００ｈで観察されるよりも高い汎ＨＥＲリガンドトラップを設計することを試みた。これは、まず、そのリガンドに対する高い親和性のＨＥＲ１／Ｆｃを最適化するために、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）に結合したＥＧＦの公開された共結晶構造を用いるコンピュータモデリングによって行った。ヒト上皮増殖因子およびレセプター細胞外ドメインの複合体の結晶構造（Ｏｇｉｓｏ Ｈ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ（２００２）７７５−７８７）を、リガンド−レセプター相互作用のコンピュータベースの最適化に使用した。三次元タンパク質構造は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＲＣＳＢ）のＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ）に由来するものであった。リガンド−レセプター相互作用の設計された最適化は、アミノ酸の物理化学特性および分類（例えば、荷電、極性、芳香族など）に基づくものであった。また、残基の嵩、表面積、溶媒の接近性なども考慮した。ＰＡＭ２５０マトリクスを用いてアミノ酸置換の予測を補助した（Ｗ．Ａ Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ＦＡＳＴＰ ａｎｄ ＦＡＳＴＡ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｒ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（ＩＳＢＮ ０−１２−１８２０８４−Ｘ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）１８３（１９９０）６３−９８；そしてまた、Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄ．，１９７８，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５）。
Ａ．ハイスループットの突然変異誘発
この後に、突然変異誘発による単一アミノ酸置換を行い、その後発現させ、ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＴＧＦ−αおよびアンフィレグリン（ＡＲ）に対するリガンド結合活性についてクローンをスクリーニングした。ＨＥＲ１の位置３９にあるスレオニンのセリンへの置換を持つ変異（Ｔ３９Ｓ呼ばれる）は、モデリング研究によって高い親和性を生じると予測され、これを、スクリーニングして、ＥＧＦ、ＴＧＦ−αおよびＨＢ−ＥＧＦに結合することを見出した。このＨＥＲ１／Ｆｃ Ｔ３９Ｓ変異体はＨＦＤ１２０と呼ばれる。ＨＦＤ１２０に加え、いくつかの他の変異体を作製した。
Ｅｌｏｎｇａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてオーバーラッピングＰＣＲを行い、設計した点変異を、ＨＦＤ１００（鋳型）に導入した（図２１および表３１）。
使用したフォワードプライマーは、ＥＧＦＲ−Ｆ１：５’−ＡＡＴＴＣＧＴＡＣＧ ＡＣＣＧＣＣＡＣＣ ＡＴＧ ＧＧＡ ＣＣＣＴＣＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣ−３’であり、使用したリバースプライマーは、ＥＧＦＲ６５０−Ｒ１：ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴ ＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴ ＣＴＡ ＧＧＡ ＣＧＧ ＧＡＴ ＣＴＴ ＡＧＧ ＣＣＣ Ａであった。
第１ラウンドのＰＣＲ：ＨＦＤ１００をＰＣＲ鋳型として用いた。ＰＣＲは、Ｅｌｏｎｇａｓｅおよびｐｆｕポリメラーゼを、プライマーＥＧＦＲ−Ｆ１およびＥＧＦＲｍｕ＿Ｒ２と共に用いて行った。ＰＣＲの条件は、９４℃で２分間と、９４℃で４５秒間、６０℃で４５秒間および６８℃で３分間の２６サイクルであった。プライマーＥＧＦＲｍｕ＿Ｆ２およびＥＧＦＲ−Ｒ１については、条件は、９４℃で２分間と、９４℃で４５秒間、６０℃で４５秒間および６８℃で３分間の２６サイクルであった。増幅の後、ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル上で分離し、そして、Ｑｉａｇｅｎゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。
第２ラウンドのＰＣＲ：第一ラウンドのＰＣＲ産物を、１：１のモル比で混合した。ＰＣＲは、Ｅｌｏｎｇａｓｅおよびｐｆｕポリメラーゼと、９℃で２分間、９４℃で４５秒間、５７℃で４５秒間、６８℃で３０分間の８サイクルの条件とを用いて行った。
第３ラウンドのＰＣＲ：第二ラウンドのＰＣＲ産物を鋳型として用いた。ＰＣＲは、Ｅｌｏｎｇａｓｅおよびｐｆｕポリメラーゼを、プライマーＥＧＦＲ−Ｆ１およびＥＧＦＲ−Ｒ１と共に用いて行った。ＰＣＲの条件は、９４℃で２分間と、９４℃で４５秒間、６０℃で４５秒間および６８℃で３分間の２６サイクルであった。ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル上で分離し、そして、Ｑｉａｇｅｎゲル精製キットを用いて精製した。精製したＰＣＲ産物を、ｐ２２１ＤＯＮＲベクター中にサブクローニングした。
確認されたｐＤＯＮＲ２２１中のＨＦＤ１００の変異体を、ＬＲ反応によってｐｃＤＮＡ３．２−ＤＥＳＴ発現ベクター中にサブクローニングした。
Ｂ．タンパク質の発現と分泌
ｐｃＤＮＡ３．２−ＤＥＳＴ発現ベクター中のＨＦＤ１００変異体を、製造業者の説明書に従ったＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ２０００により媒介される一過的な遺伝子発現（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、２９３Ｔ細胞中に発現させた。トランスフェクションの４８時間後に馴化培地を回収した。１５μｌの用量の馴化培地を、ウェスタンブロッティングにより解析した。ウェスタンブロットを抗Ｆｃ抗体でプローブして、タンパク質の発現と分泌を確認した。Ｄｕｏｓｅｔ Ｈｕｍａｎ ＥＧＦＲ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、馴化培地中の組換えＨＦＤ１００変異体を決定した。ＥＬＩＳＡプレートを、０．４μｇ／ｍｌの抗ＥＧＦＲ抗体を用いて、室温で一晩コーティングする。コーティングしたプレートを、ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０中で３回洗浄し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡでＲＴにて２時間ブロッキングし、そして、再度、ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０中で３回洗浄した。馴化培地を、まず１：１０００に希釈し、そして、さらに、１：２の比に希釈した。この希釈した馴化培地（ＣＭ）を、製造業者の説明書に従ったＥＬＩＳＡ検出のためにプレートにアプライした。
Ｃ．リガンド結合のスクリーニング
Ｅｕ標識したＥＧＦの結合：プレートを、５μｇ／ｍｌの抗Ｆｃ抗体を用いて、ＲＴにて一晩コーティングした。コーティングの後、プレートをＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０中で３回洗浄し、そして、ＰＢＳ／１％ＢＳＡでＲＴにて２時間ブロッキングした。ブロッキングの後、プレートを、ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０中で３回洗浄した。馴化培地中の組換えタンパク質（２０ｎｇ）を、１×ＤＥＬＦＩＡ結合緩衝液で希釈し、そして、プレートに加えた（１００μｌ／ウェル）。プレートをＲＴにて２時間インキュベートした。この後、１２０μｌ／ウェルの氷冷ＤＥＬＦＩＡ洗浄緩衝液で３回洗浄した。その後、ＤＥＬＦＩＡ結合緩衝液中のＥｕ−ＥＧＦ（０．５ｎＭ）を各ウェルに加え（１００μｌ／ウェル）、そして、プレートをＲＴにて２時間インキュベートした。プレートを、氷冷ＤＥＬＦＩＡ洗浄緩衝液（１２０μｌ／ウェル）で３回洗浄した。
ＤＥＬＦＩＡ増強溶液（１１０μｌ／ウェル）を各ウェルに加え、そして、プレートをさらにＲＴにて２０分間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって読み取り、時間分解蛍光を検出した。
Ｄ．ＴＧＦ＿またはＨＢ−ＥＧＦの結合
ＴＧＦ＿またはＨＢ−ＥＧＦのＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を、リガンド結合アッセイのために改変した。プレートを、１μｇ／ｍｌの抗Ｆｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いてＲＴにて一晩コーティングし、そして、ＰＢＳ／１％ ＢＳＡを用いてＲＴにて２時間ブロッキングした。ブロッキングしたプレートを、２０ｎｇのＨＦＤ１００変異体タンパク質と共にＲＴにて２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、そしてさらに、１００μｌ／ウェルの結合緩衝液（ＰＢＳ／１％ ＢＳＡ）中、それぞれ、５〜５０ｎＭのＴＧＦ＿または５ｎＭのＨＢ−ＥＧＦと共にＲＴにて２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、そしてさらに、３００ｎｇ／ｍｌのビオチン化ヤギ抗ヒトＴＧＦ＿抗体またはビオチン化ヤギ抗ヒトＨＢ−ＥＧＦ抗体と共にＲＴにて２時間インキュベートした。その後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（１：２００希釈）をプレートに加え、そして、２０分後に、発色のために基質溶液をアプライした。プレートをマイクロプレートリーダーにより読み取り、ＯＤ６５０ｎｍにおける値を決定した。
Ｅ．結果
詳細なリガンド結合研究は、ＨＲＦ１２０が野生型（ＨＦ１００）よりも高い親和性でＨＥＲ１リガンドに結合することを明らかにした。野生型（ＨＦ１００）と比較すると、ＨＦＤ１２０変異体は、ＥＧＦに対して２倍高い親和性を、ＨＢ−ＥＧＦに対して７倍改善された親和性を、そして、ＴＧＦ−αに対して３０倍より大きく改善された親和性を与えた（図２２ａ〜ｃおよび表３２）。
Ｔ４３Ｋ／Ｓ１９３Ｎ／Ｅ３３０Ｄ／Ｇ５８８Ｓと呼ばれる１つの変異体は、Ｔ４３Ｋと指定される変異の他にも、ランダムなＰＣＲにより導入された変異を有した。この４つの変異は、ＨＥＲ１のリガンド結合活性を実質的に増加させた（図２３）。この変異体を、Ｓ１９３Ｎ／Ｅ３３０Ｄ／Ｇ５８８ＳおよびＥ３３０Ｄ／Ｇ５８８Ｓと呼ばれる２つの他のＨＥＲ１変異体を生じるために体系的に変更した。これらの変異体は、両方ともに、ＨＥＲ１のリガンドであるＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦおよびＴＧＦ−αに結合して、野生型（ＨＦＤ１００）と比較して、実質的に増加したレベルのタンパク質分泌を与えるが；Ｓ１９３Ｎ／Ｅ３３０Ｄ／Ｇ５８８Ｓが、Ｅ３３０Ｄ／Ｇ５８８Ｓよりも高いタンパク質の分泌レベルを与えた（図２３）。
（実施例２４ より高いリガンド結合親和性および能力の汎ＨＥＲリガンドトラップについての加工：リガンド結合能が増加したハーモジュリン）
ＨＥＲ１リガンドに対して高い親和性を有するＨＦＤ１２０（実施例１８において上述される）の他に、ＨＥＲ１アームにＴ３９Ｓ変異を持つＲＢ２２０ｈと呼ばれるヘテロ二量体ＨＥＲ１／Ｆｃ：ＨＥＲ３／Ｆｃ構築物を作製した。このＴ３９Ｓ変異は、ＨＤＦ１２０におけるものと同じである。ＨＦＤ１２０を発現させ、そして、実施例２および３におけるＨＦＤ１００と同様に発現および精製させた。ハーモジュリンはまた、ホモ二量体およびヘテロ二量体を含む混合物（ＲＢ６２０と呼ばれる）としても発現され、この混合細胞発現系は、ＨＦＤ１２０、ＨＦＤ３００およびＲＢ２２０ｈとして構成される。表３３を参照のこと。ＲＢ６２０を実施例２に記載したように発現させ、そして、実施例３においてＲＢ６００について記載したようにして精製した。
変異体のＨＥＲ１またはＨＥＲ３のリガンド結合活性（結合能）を、野生型の構築物と比較した。ホモ二量体ＨＦＤ１００ 対 ＨＦＤ１２０（変異体構築物）、または、ＲＢ２００ｈ 対 ＲＢ２２０ｈ（変異体構築物）のいずれかを比較すると、ＨＥＲ１にＴ３９Ｓ変異を含む変異体は、その野生型の対応物の約２．５倍のＥＧＦ結合能を有する（表３４、３５、３８、３９）。また、データは、ＲＢ６００またはＲＢ６２０のいずれかとしての混合物が、良好な、３倍〜１０倍高いＨＥＲ１リガンドＥＧＦ結合能を有することを示す（表３５、３８および３９）。
野生型および変異体のハーモジュリンのＨＥＲ３リガンド（ＮＲＧ１β１）結合能に関して、差異は、ＥＧＦ結合について観察されたものより顕著ではなかった。第一に、ヘテロ二量体ＲＢ２００ｈは、混合物ＲＢ６００より約１．６倍高いＮＲＧ１β１結合能を有する。変異体ヘテロ二量体（ＲＢ２２０ｈ）または変異体混合物ＲＢ６２０のＮＲＧ１β１結合能は、ほぼ同じである（表３８および３９を参照のこと）。しかし、興味深い知見は、野生型ＲＢ２００ｈもしくは変異体（ＲＢ２２０ｈ）のいずれかのヘテロ二量体のＮＲＧ１β１結合活性をＨＥＲ３ホモ二量体（ＨＦＤ３００）と比較する場合、このＨＥＲ３ホモ二量体ＨＦＤ３００は、ヘテロ二量体のわずか３０％の結合活性しか有さないことである（表３６および３７を参照のこと）。

Claims (159)

  1. 多量体であって、以下：
    ａ）以下：
    ｉ）多量体化ドメインに対し直接的もしくはリンカーを介して間接的に連結された、ＨＥＲ１レセプターに由来する全長細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含むキメラポリペプチド、または
    ｉｉ）多量体化ドメインに対し直接的もしくはリンカーを介して間接的に連結された、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４レセプターに由来する細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の全長より短い部分を含むキメラポリペプチドであって、該ＥＣＤは、少なくとも、該レセプターのリガンドに結合するために十分なサブドメインＩおよび／もしくはＩＩＩの部分と、細胞表面レセプターと二量体化するのに十分なサブドメインＩＩの部分を含めたＥＣＤの十分な部分とを含み、該キメラポリペプチドにおける該ＥＣＤがＨＥＲ２レセプターに由来するものではない場合には、該ＥＣＤはまた、細胞表面レセプターとの二量体化を達成するために十分なサブドメインＩＶのモジュール２〜５の部分もしくは全体を含めたドメインＩＶの全体もしくは一部分も含む、キメラポリペプチド
    のいずれかから選択される第一のキメラポリペプチドと；
    ｂ）多量体化ドメインに対して直接的もしくはリンカーを介して間接的に連結され、かつ、少なくとも、リガンドに結合するため、および／もしくは、細胞表面レセプターと二量体化するために十分な細胞表面タンパク質のＥＣＤの部分を含む、第二のキメラポリペプチドと
    を含み、該第一のキメラポリペプチドおよび該第二のキメラポリペプチドにおける該多量体化ドメインは、相補的であるかまたは同じであり、ただし、該第一のキメラポリペプチドが全長ＨＥＲ１ ＥＣＤである場合、該第二のキメラポリペプチドは、ＨＥＲ２に由来するＥＣＤを含まないか、または、含む場合には、該ＨＥＲ２ ＥＣＤが全長より短くかつ、該レセプターの二量体化に十分な部分が、二量体化を達成するために十分なドメインＩＶの部分を含み、それにより：
    該キメラポリペプチドが多量体を形成し；そして
    結果として生じる該多量体が、該第一のキメラポリペプチドもしくはそのホモ二量体と比べて追加されたリガンドに対して結合するか、そして／または、該第一のキメラポリペプチドもしくはそのホモ二量体よりも多くの細胞表面レセプターと二量体化する、
    多量体。
  2. 前記第一のキメラポリペプチドおよび前記第二のキメラポリペプチドの一方もしくは両方のＥＣＤが、ハイブリッドＥＣＤであり、該ハイブリッドＥＣＤが、少なくとも２つの異なる細胞表面レセプターのＥＣＤに由来するサブドメインを含む、請求項１に記載の多量体。
  3. 前記第一のキメラポリペプチドが、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４の全長より短いＥＣＤを含む、請求項１に記載の多量体。
  4. 前記第一のキメラポリペプチドが、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４の全長より短いＥＣＤを含む、請求項１に記載の多量体。
  5. ヘテロ多量体である請求項１に記載の多量体であって、前記第二のキメラポリペプチドのＥＣＤ部分が、ＨＥＲ１に由来する異なる細胞表面レセプターに由来する、多量体。
  6. 前記第二のキメラポリペプチドにおけるＥＣＤが、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４に由来するものである、請求項５に記載の多量体。
  7. 前記第二のキメラポリペプチドにおけるＥＣＤドメインが、全長ＥＣＤを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の多量体。
  8. 前記第二のキメラポリペプチドのＥＣＤドメインが、少なくとも、そのリガンドに結合するため、および、細胞表面レセプターと二量体化するために十分な、サブドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩの部分を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の多量体。
  9. 前記第二のキメラポリペプチドが、全長より短いＥＣＤを含み、かつ、そのリガンドに結合するために十分なドメインＩおよびＩＩＩの部分を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の多量体。
  10. 前記第二のキメラポリペプチドが、全長より短いＥＣＤを含み、かつ、細胞表面レセプターと二量体化するために十分なＥＣＤの部分を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の多量体。
  11. 前記多量体化ドメインが、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、ロイシンジッパー、相補的疎水性領域、相補的親水性領域、適合性のタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、２分子間で分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオール、ならびに安定な多量体を形成する、腔内の隆起部および同一もしくは類似の大きさの代償性の腔、の中から選択される、請求項１〜１０のいずれかに記載の多量体。
  12. 前記多量体化ドメインが、Ｆｃドメイン、または、多量体化を達成するその改変体である、請求項１〜１０のいずれかに記載の多量体。
  13. 前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＥに由来する、請求項１２に記載の多量体。
  14. 前記細胞表面レセプターが、前記多量体のＥＣＤまたは該ＥＣＤのサブドメインに対して同系のレセプターである、請求項１〜１３のいずれかに記載の多量体。
  15. 前記第二のキメラポリペプチドのＥＣＤが、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＩＧＦ１−Ｒ、ＶＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＴＮＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＭＥＴ、Ｔｉｅ、ＲＡＧＥ、ＥＰＨレセプターおよびＴ細胞レセプターの中から選択される、請求項１〜１３および１１７〜１２６のいずれかに記載の多量体。
  16. 前記第二のキメラポリペプチドのＥＣＤが、ＶＥＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４、ＩＧＦ１−ＲおよびＴｉｅ１の中から選択される、請求項１５に記載の多量体。
  17. 前記第二のキメラポリペプチドのＥＣＤが、前記多量体化ドメインに連結されたイントロン融合タンパク質である、請求項２〜１６のいずれかに記載の多量体。
  18. 前記第二のＥＣＤが、全長のＨＥＲ２、ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４、または、細胞表面レセプターとのレセプターの二量体化および／もしくは、細胞表面レセプターに対するリガンドとの結合に十分なその一部分である、請求項２〜１６のいずれかに記載の多量体。
  19. 前記第二のＥＣＤが、ＨＥＲ１以外のレセプターチロシンキナーゼに由来するものである、請求項２〜１７のいずれかに記載の多量体。
  20. 少なくとも３個、４個、５個、６個または７個の異なるリガンドに結合する、請求項２〜１９、１０５、１０６および１１７〜１２６のいずれかに記載の多量体。
  21. 前記リガンドが、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、ＨＢ−ＥＧＦ、β−セルリン、エピレグリン、および、ＨＥＲ１以外の細胞表面レセプターのＥＣＤに結合するさらなるリガンドの中から選択される、請求項２０に記載の多量体。
  22. 前記さらなるリガンドが、ニューレグリン−１、ニューレグリン−２、ニューレグリン−３およびニューレグリン−４の中から選択される、請求項２１に記載の多量体。
  23. 請求項１に記載の多量体であって、以下：
    前記第一のキメラポリペプチドが、ｉ）ＨＥＲ１に由来する全長ＥＣＤ、または、ｉｉ）リガンドへの結合および／もしくは二量体化に十分な該ＥＣＤの部分のいずれかを含み；そして、
    前記第二のキメラポリペプチドが、リガンドへの結合および／もしくは二量体化に十分な、ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４のＥＣＤの全体もしくは一部分を含む、
    多量体。
  24. 請求項１〜２３、１０５、１０６および１１７〜１２６のいずれかに記載の多量体であって、前記キメラポリペプチドの各々における多量体化ドメインが、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、ロイシンジッパー、相補的疎水性領域、相補的親水性領域、適合性のタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、２分子間で分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオール、ならびに、安定な多量体を形成する、腔内の隆起部および同一もしくは類似の大きさの代償性の腔の中から選択され、それによって、該キメラポリペプチドが、背中合わせの立体配置で相互作用し、それによって、該キメラポリペプチドの両方のＥＣＤが、細胞表面レセプターとの二量体化に利用可能である、多量体。
  25. 前記多量体化ドメインがＦｃドメインである、請求項２３または２４に記載の多量体。
  26. 前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＥに由来する、請求項２５に記載の多量体。
  27. 少なくとも２つのキメラポリペプチドを含む、請求項１、７〜１４、１０６および１１７〜１２２のいずれかに記載の多量体であって、以下：
    前記第一のキメラポリペプチドが、ＨＥＲ１のＥＣＤの全体または一部分を含み；そして
    前記第二のキメラポリペプチドが、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４のＥＣＤの全体または一部分を含む、
    多量体。
  28. 構成要素であるキメラポリペプチドが、融合ポリペプチドである、請求項１〜２７、１０６および１１７〜１２６のいずれかに記載の多量体。
  29. キメラポリペプチドａ）およびｂ）は融合ポリペプチドである、請求項１〜２７、１０６および１１７〜１２６のいずれかに記載の多量体。
  30. 構成要素であるキメラポリペプチドが、化学結合により形成される、請求項１〜２７、１０６および１１６〜１２６のいずれかに記載の多量体。
  31. キメラポリペプチドａ）およびｂ）が、化学結合により形成される、請求項１〜２７、１０６および１１７〜１２６のいずれかに記載の多量体。
  32. 少なくとも１つのキメラポリペプチドの前記多量体化ドメインが、ＥＣＤに直接連結される、請求項１〜３１、１０６および１１７〜１２６のいずれかに記載の多量体。
  33. 少なくとも１つのキメラポリペプチドの多量体化ドメインが、リンカーを介してＥＣＤに連結される、請求項１〜３１、１０６および１１７〜１２６のいずれかに記載の多量体。
  34. 前記構成要素であるキメラポリペプチド全ての多量体化ドメインが、それぞれのＥＣＤに直接連結される、請求項３２に記載の多量体。
  35. 前記構成要素であるキメラポリペプチド全ての多量体化ドメインが、リンカーを介してそれぞれのＥＣＤに連結される、請求項３３に記載の多量体。
  36. 前記リンカーが、化学リンカーまたはポリペプチドリンカーである、請求項３３または３５に記載の多量体。
  37. ヘテロ二量体である、請求項１〜３６、１０５、１０６および１１７〜１２６のいずれかに記載の多量体。
  38. ヘテロ二量体である請求項１〜３７、１０５、１０６および１１７〜１２６のいずれかに記載の多量体であって、該ヘテロ二量体は、前記構成要素であるキメラポリペプチドを背中合わせの立体配置で含み、それによって、各キメラポリペプチドにおけるＥＣＤが、細胞表面レセプターとの二量体化に利用可能である、多量体。
  39. ヘテロ多量体であって、以下：
    １つのＨＥＲレセプターに由来する細胞外ドメイン（ＥＣＤ）；および
    第二のレセプターに由来するＥＣＤ
    を含み、ここで：
    該ＥＣＤの少なくとも１つが、ＨＥＲ ＥＣＤであり、かつ、サブドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩ、ならびに、サブドメインＩＶの一部分を含むが、サブドメインＩＶの全体は含まず；
    サブドメインＩＶは少なくともモジュール１を含み；そして
    該ＥＣＤは各々異なる、
    ヘテロ多量体。
  40. 前記第二のＥＣＤが細胞表面レセプターに由来する、請求項３９および１２７〜１３４のいずれかに記載のヘテロ多量体。
  41. 一方のＨＥＲがＨＥＲ１であり、かつ、もう一方のＨＥＲがＨＥＲ３またはＨＥＲ４である、請求項３９および１２７〜１３４のいずれかに記載のヘテロ多量体。
  42. 請求項３９、１０４および１２７〜１３４のいずれかに記載のヘテロ多量体であって、該ヘテロ多量体における少なくとも１つのＥＣＤの二量体化ドメインが、細胞表面レセプターとの二量体化に利用可能である、ヘテロ多量体。
  43. 請求項３９〜４２および１２７〜１３４のいずれかに記載のヘテロ多量体であって、各ＥＣＤが、多量体化ドメインに対し直接的もしくはリンカーを介して連結され、それにより、少なくとも２つのＥＣＤの多量体化ドメインが相互作用して該ヘテロ多量体を形成する、ヘテロ多量体。
  44. 前記多量体化ドメインが、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、ロイシンジッパー、相補的疎水性領域、相補的親水性領域、適合性のタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、２分子間で分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオール、ならびに安定な多量体を形成する、腔内の隆起部および同一もしくは類似の大きさの代償性の腔の中から選択される、請求項４３に記載のヘテロ多量体。
  45. 前記多量体化ドメインがＦｃドメインである、請求項４３または４４に記載のヘテロ多量体。
  46. 前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＥに由来する、請求項４５に記載の多量体。
  47. 請求項４０および４２〜４６のいずれかに記載のヘテロ多量体であって、前記細胞表面レセプターが、該ヘテロ多量体のＥＣＤまたは該ＥＣＤのサブドメインに対して同系のレセプターである、ヘテロ多量体。
  48. 前記第二のＥＣＤは、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＩＧＦ１−Ｒ、ＶＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＴＮＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＭＥＴ、Ｔｉｅ、ＲＡＧＥ、ＥＰＨレセプターおよびＴ細胞レセプターの中から選択されるレセプターに由来する、請求項３８〜４７のいずれかに記載のヘテロ多量体。
  49. 前記ＥＣＤが、ＶＥＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４、ＩＧＦＲ１およびＴｉｅ１の中から選択される、請求項４８に記載のヘテロ多量体。
  50. ハイブリッド細胞外ドメイン（ＥＣＤ）であって、
    １つ以上の細胞表面レセプターのＥＣＤの少なくともドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩの全体もしくは一部分
    を含み、
    該ドメインのうち少なくとも２つは、異なる細胞表面レセプターのＥＣＤに由来し；
    該ハイブリッドＥＣＤは、該ハイブリッドＥＣＤが多量体化ドメインに対して連結されるときに、細胞表面レセプターの１以上のＥＣＤに由来するドメインＩもしくはＩＩＩの、リガンドへの結合に十分な部分と、ドメインＩＩの十分な部分を含む、細胞表面レセプターのＥＣＤの、細胞表面レセプターとの二量体化に十分な部分と、を含む、
    ハイブリッドＥＣＤ。
  51. 前記細胞表面レセプターが、ＨＥＲファミリーのメンバーである、請求項５０に記載のハイブリッドＥＣＤ。
  52. ドメインＩがＨＥＲ１に由来し、ドメインＩＩがＨＥＲ２に由来し、そして、ドメインＩＩＩがＨＥＲ３に由来する、請求項５０に記載のハイブリッドＥＣＤ。
  53. 多量体化ドメインに対し、直接的またはリンカーを介して連結された、請求項５０〜５２および１３５〜１４２のいずれかに記載のハイブリッドＥＣＤを含む、キメラポリペプチド。
  54. 請求項５３に記載のキメラポリペプチドであって、前記多量体化ドメインが、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、ロイシンジッパー、相補的疎水性領域、相補的親水性領域、適合性のタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、２分子間で分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオール、ならびに安定な多量体を形成する、腔内の隆起部および同一もしくは類似の大きさの代償性の腔の中から選択される、キメラポリペプチド。
  55. 前記多量体化ドメインがＦｃドメインである、請求項５３または５４に記載のキメラポリペプチド。
  56. 前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＥに由来する、請求項５５に記載のキメラポリペプチド。
  57. 請求項５０〜５６および１４７〜１４２のいずれかに記載のキメラポリペプチドを少なくとも２つ含む、多量体。
  58. 以下：
    ＨＥＲ１レセプターに由来する細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の全体もしくは一部分；および
    ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４レセプターに由来するＥＣＤの全体もしくは一部分
    を含むヘテロ多量体であって、該一部分は、少なくともサブドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩを含む、ヘテロ多量体。
  59. 請求項１〜４９、５０〜５３、５８、９６、１０２〜１０６および１４３〜１５０のいずれかに記載のヘテロ多量体における少なくとも１つのキメラポリペプチドをコードする核酸配列、請求項９５、９７、９８、９９、１０１、１２７〜１３４、１５１および１５２のいずれかに記載のキメラポリペプチドをコードする核酸配列、または、このようなキメラポリペプチドを含むヘテロ多量体をコードする核酸配列、あるいは、請求項５０〜５２および１３７〜１４２のいずれかに記載のハイブリッドＥＣＤをコードする核酸配列、を含む、核酸分子。
  60. 請求項５９に記載の核酸を含む、ベクター。
  61. 請求項５９に記載の核酸分子、または、請求項６０に記載のベクターを含む、単離細胞。
  62. 請求項１〜５８、９５〜９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０６および１１７〜１５２のいずれかに記載の多量体、ヘテロ多量体キメラポリペプチド、もしくはポリペプチド、または、請求項５９に記載の核酸分子、または、請求項６１に記載の細胞を含む、薬学的組成物。
  63. 単回投薬の投与のために処方された、請求項５９に記載の薬学的組成物。
  64. 局部投与、局所投与または全身投与のために処方された、薬学的組成物。
  65. 癌、炎症性疾患、新脈管形成疾患または過増殖性疾患を処置する方法であって、請求項６２〜６４のいずれかに記載の薬学的組成物の治療上有効な量を投与する工程を包含する、方法。
  66. 前記癌が、膵臓癌、胃癌、頭頚部癌、子宮頸部癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、前立腺癌、食道癌、卵巣癌、子宮癌、神経膠腫、膀胱癌、腎臓癌または乳癌である、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記疾患が増殖性疾患である、請求項６５に記載の方法。
  68. 前記増殖性疾患が、平滑筋細胞の増殖および／もしくは遊走を伴うか、または、前眼部の疾患であるか、または、糖尿病性網膜症もしくは乾癬である、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記疾患が、再狭窄、眼障害、狭窄、アテローム性動脈硬化症、血管肥厚による高血圧、膀胱疾患および閉塞性気道疾患である、請求項６５に記載の方法。
  70. 癌を処置する方法であって、請求項６２〜６４のいずれかに記載の薬学的組成物と、別の抗癌剤とを投与する工程を包含する、方法。
  71. 前記抗癌剤が、放射線療法および／または化学療法剤である、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記抗癌剤が、チロシンキナーゼインヒビターまたは抗体である、請求項７０に記載の方法。
  73. 前記抗癌剤が、キナゾリンキナーゼインヒビター、アンチセンスＲＮＡ分子もしくはｓｉＲＮＡ分子もしくは他の二本鎖ＲＮＡ分子、または、ＨＥＲレセプターと相互作用する抗体、または、放射性核種もしくは細胞毒に結合された抗体である、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記抗癌剤が、Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、Ｔｙｋｅｒｂ、Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ、Ｅｒｏｌｔｉｎｉｂ、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、Ｔｒａｓｔｕｚｉｍａｂ、Ｉｍａｔｉｎｉｂ、白金錯体、またはヌクレオシドアナログである、請求項７３に記載の方法。
  75. ＨＥＲレセプター媒介性の疾患の処置方法であって、以下：
    該疾患を持つ被験体を検査して、どのＨＥＲレセプターが発現されているか、もしくは、過剰発現されているかを同定する工程；および
    この結果に基づいて、少なくとも２つのＨＥＲレセプターを標的とする多量体を選択する工程
    を包含する、方法。
  76. 前記疾患が癌である、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記癌が、膵臓癌、胃癌、頭頚部癌、子宮頸部癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、前立腺癌、食道癌、卵巣癌、子宮癌、神経膠腫、膀胱癌、腎臓癌または乳癌である、請求項７６に記載の方法。
  78. リガンド結合のための標的ポリペプチドである、以下：
    ＣＳＱＦＬＲＧＱＥＣＶＥＥＣＲＶＬＱＧＬＰＲＥＹＶＮＡＲＨＣＬＰＣＨＰＥＣＱＰＱＮＧＳＶＴＣＦＧＰＥＡＤＱＣＶＡＣＡＨＹＫＤＰＰＦ（配列番号４０５）；
    および
    ならびに、配列番号５４〜６１の中から選択される、ポリペプチド。
  79. ＨＥＲレセプターと相互作用する候補分子を同定するための方法であって、
    ａ）二量体化、リガンド結合および／または係留のいずれかに関与するドメインＩＩとＩＶまたはドメインＩとＩＩＩにおける領域に基づいて、少なくとも約６アミノ酸、または６アミノ酸〜約５０アミノ酸、または５０アミノ酸のポリペプチドに、試験分子またはその集合物を接触させる工程；ならびに
    ｂ）該ポリペプチドの１つ以上と相互作用する任意の試験分子を同定および選択する工程
    を包含する、方法。
  80. 前記ポリペプチドが、ＨＥＲレセプターに基づいたポリペプチドのコンビナトリアルライブラリーであるライブラリーを含む、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記ポリペプチドが、以下：
    ＣＳＱＦＬＲＧＱＥＣＶＥＥＣＲＶＬＱＧＬＰＲＥＹＶＮＡＲＨＣ ＬＰＣＨＰＥＣＱＰＱ ＮＧＳＶＴＣＦＧＰＥ ＡＤＱＣＶＡＣＡＨＹ ＫＤＰＰＦ（配列番号４０５）、および、その６、８、１０、１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０またはそれ以上のアミノ酸残基を含む部分；
    配列番号５４〜６１に示されるポリペプチド；および、その４、５、６、８、１０、１２またはそれ以上のアミノ酸残基を含む該ポリペプチドの任意の部分
    の中から選択される１以上のポリペプチドを含む、請求項７９に記載の方法。
  82. 前記試験分子が分子のライブラリーを含む、請求項７９に記載の方法。
  83. 前記分子が、小さな有機化合物またはポリペプチドである、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記ライブラリーが、固体支持体またはウイルスの表面上にディスプレイされるポリペプチドを含む、請求項８０に記載の方法。
  85. 前記ポリペプチドが、ファージディスプレイライブラリーを含む、請求項８４に記載の方法。
  86. ドメインＩおよび／もしくはＩＩＩ、または、ドメインＩＩ、または、ドメインＩＶに結合する試験分子が選択される、請求項７９〜８５のいずれかに記載の方法。
  87. 請求項８６に記載の方法であって、２以上のポリペプチドを含むヘテロ二量体を形成する工程をさらに包含し、該ポリペプチドの一方はドメインＩＩに結合し、そして、該ポリペプチドのもう一方は、ドメインＩＶに結合する、方法。
  88. 前記試験分子はファージディスプレイライブラリーを含む、請求項７９に記載の方法。
  89. 請求項７８に記載のポリペプチドと特異的に相互作用する、単離された抗体。
  90. 請求項７８に記載の２以上のポリペプチドと特異的に相互作用する、単離されたマルチクローナル抗体。
  91. 各々が多量体化ドメインに連結された２つの異なるポリペプチドを含む合成抗体である、請求項８９または９０に記載の単離された抗体。
  92. 請求項９１に記載の抗体であって、前記多量体化ドメインが、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、ロイシンジッパー、相補的疎水性領域、相補的親水性領域、適合性のタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、２分子間で分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオール、ならびに安定な多量体を形成する、腔内の隆起部および同一もしくは類似の大きさの代償性の腔の中から選択されるポリペプチドである、抗体。
  93. 前記多量体化ドメインがＦｃドメインである、請求項９１に記載の抗体。
  94. 前記ＦｃドメインがＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＥに由来する、請求項９３に記載の抗体。
  95. キメラポリペプチドであって、以下：
    ＥＣＤまたはリガンド結合および／もしくはレセプター二量体化に十分なその部分と；
    多量体化ドメインと
    を含み、該ＥＣＤまたはその部分は、ＨＥＲ２−５３０（配列番号１４）、ＨＥＲ２−５９５（配列番号１６）、ＨＥＲ２−６５０（配列番号１８）、ＨＥＲ３−５００（配列番号２０）、Ｐ８５ＨＥＲ３（配列番号２２）、ＨＥＲ３−５１９（配列番号２４）、ＨＥＲ３−６２１（配列番号２６）、ＨＥＲ４−４８５（配列番号２８）、ＨＥＲ４−５２２（配列番号３０）、ＨＥＲ４−６５０（配列番号３２）、配列番号４１４のアミノ酸２５〜６４５として示されるＨＥＲ１ ＥＣＤ、配列番号３２、３４、１２７、１４１、１４６、１４８、１５９および５４〜１２５のいずれかに示されるポリペプチド、ならびに、上記ＥＣＤのいずれかの対立遺伝子改変体および種改変体の中から選択される、キメラポリペプチド。
  96. ２以上のキメラポリペプチドを含むヘテロ多量体であって、ここで：
    ＥＣＤは、配列番号１０に示されるＨＥＲ１−５０１および配列番号１２に示されるＨＥＲ１−６２１、または、リガンド結合および／もしくはレセプター二量体化に十分な部分、請求項９５に記載のキメラポリペプチド、ならびに、上記ポリペプチドのいずれかの対立遺伝子改変体および種改変体の中から選択され；そして
    該キメラポリペプチドの各々が、多量体化ドメインに対して、直接的またはリンカーを介して間接的に連結される、ヘテロ多量体。
  97. 請求項９５に記載のキメラポリペプチドまたは請求項９６に記載のヘテロ多量体であって、前記多量体化ドメインは、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、ロイシンジッパー、相補的疎水性領域、相補的親水性領域、適合性のタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、２分子間で分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオール、ならびに安定な多量体を形成する、腔内の隆起部および同一もしくは類似の大きさの代償性の腔の中から選択されるポリペプチドであり、それによって、該キメラポリペプチドは、背中合わせの立体配置で相互作用し、それにより、両方のキメラポリペプチドのＥＣＤが、細胞表面レセプターとの二量体化に利用可能である、キメラポリペプチドまたはヘテロ多量体。
  98. 前記多量体化ドメインがＦｃドメインである、請求項９７に記載のキメラポリペプチドまたはヘテロ多量体。
  99. 前記ＦｃドメインがＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＥに由来する、請求項９８に記載のキメラポリペプチドまたはヘテロ多量体。
  100. 配列番号１２７、１４１、１４６、１４８、１５３、１５５、１５７、１５９、２９７および２９９のいずれかに示されるアミノ酸残基を含む、単離ポリペプチド。
  101. 請求項１００に記載のペプチドと、請求項１５１または１５２に記載の多量体化ドメインまたはポリペプチドとを含む、キメラポリペプチド。
  102. 請求項１０１に記載のキメラポリペプチドを含む、ヘテロ多量体。
  103. ＨＥＲ ＥＣＤ、または、リガンド結合および／もしくはレセプター二量体化に十分な該ＥＣＤの部分である第二のポリペプチドを含む、請求項１０２に記載のヘテロ多量体。
  104. 両方のＥＣＤがＨＥＲ ＥＣＤである、請求項３９に記載のヘテロ多量体。
  105. 前記イントロン融合タンパク質がハースタチンまたはその改変体である、請求項１７に記載の多量体。
  106. 少なくとも２つのキメラポリペプチドを含む、請求項１〜２５のいずれかに記載の多量体。
  107. 多量体化ドメインに連結されたＨＥＲ１レセプターのＥＣＤまたはその部分を含むキメラポリペプチドであって、
    該ＥＣＤまたはその部分が改変を含み、それによって、該ＥＣＤが、非改変のＥＣＤもしくはその部分と比べて追加されたリガンドに結合する、
    キメラポリペプチド。
  108. 多量体化ドメインに連結されたキメラポリペプチドであって、配列番号１１４のアミノ酸２５〜６４５の全体もしくはその一部分、または、該全体もしくは一部分に対し少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％の配列同一性を有するが、配列番号１１４の４４２に対応する位置にＳｅｒからＰｈｅへの変異を含む配列、を含む、キメラポリペプチド。
  109. 前記多量体化ドメインが、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、ロイシンジッパー、相補的疎水性領域、相補的親水性領域、適合性のタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、２分子間で分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオール、ならびに安定な多量体を形成する、腔内の隆起部および同一もしくは類似の大きさの代償性の腔の中から選択される、請求項１０７または１０８に記載のキメラポリペプチド。
  110. 前記多量体化ドメインが、Ｆｃドメイン、または、多量体化を達成するその改変体である、請求項１０７〜１０９のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  111. 前記ＦｃドメインはＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＥに由来する、請求項１１０に記載のキメラポリペプチド。
  112. 前記ＥＣＤがＨＥＲ１レセプターに由来する、請求項１０７〜１１１のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  113. 前記改変が、位置Ｓ４４２、または、ＨＥＲレセプターの対応する位置における改変に対応する、請求項１０７〜１１２のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  114. 前記改変が、ＨＥＲ１レセプターのＥＣＤ内にあり、それによって、前記ＨＥＲ１ ＥＣＤがＮＲＧ−２βと相互作用する、請求項１１３に記載のキメラポリペプチド。
  115. 前記改変が、配列番号２におけるＳ４４２Ｆであるか、またはこれに対応するものである、請求項１１４に記載の多量体。
  116. 前記改変されたＨＥＲ１のＥＣＤの、ＥＧＦおよびＮＲＧ−２βと相互作用するのに十分な部分を含む、請求項１０７〜１１５のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
  117. 請求項１〜１４のいずれかに記載の多量体であって、以下：
    前記ＥＣＤが改変されたＥＣＤであり；
    該改変が、非改変ＥＣＤもしくは該非改変ＥＣＤを含む全長レセプターと比べて、該ＥＣＤもしくは該ＥＣＤを含む全長レセプターのリガンド結合もしくは他の活性を変化させる、
    多量体。
  118. 請求項１〜１４のいずれかに記載の多量体であって、前記ＥＣＤが、リガンド結合または他の活性を変化させるように改変されていない、多量体。
  119. 前記改変がリガンド結合を変化させる、請求項１５に記載の多量体。
  120. 前記改変が、位置Ｓ４４２またはＨＥＲレセプターの対応する位置における改変に対応する、請求項１１９に記載の多量体。
  121. 前記改変が、ＨＥＲ１レセプターのＥＣＤ内にあり、それによって、前記ＨＥＲ１ ＥＣＤがＮＲＧ−２βと相互作用する、請求項１２０に記載の多量体。
  122. 前記改変が、配列番号２におけるＳ４４２Ｆであるか、またはこれに対応するものである、請求項１２１に記載の多量体。
  123. 請求項１１７〜１２２のいずれかに記載の多量体であって、該多量体は、ＨＥＲ１に由来するＥＣＤもしくはその部分と、ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４に由来するＥＣＤもしくはその部分とを含み、それによって、結果として生じる多量体は、少なくとも２つのＨＥＲレセプターに対するリガンドと相互作用する、多量体。
  124. 請求項１１７〜１２２のいずれかに記載の多量体であって、該多量体は、ＨＥＲ１に由来するＥＣＤもしくはその部分と、ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４に由来するＥＣＤもしくはその部分とを含み、それによって、結果として生じる多量体は、少なくとも３つのＨＥＲレセプターに対するリガンドと相互作用する、多量体。
  125. 二量体である、請求項１１７〜１２４のいずれかに記載の多量体。
  126. Ｆｃ多量体化ドメインを含む、請求項１１７〜１２５のいずれかに記載の多量体。
  127. 請求項３９に記載のヘテロ多量体であって、ＥＣＤに由来するドメインもしくはその一部分は、該ドメイン中にリガンド結合もしくは特異性を変化させる変異を含み；該変異は、非改変ＥＣＤもしくは該非改変ＥＣＤを含む全長レセプターと比べて、該ＥＣＤもしくは該ＥＣＤを含む全長レセプターのリガンド結合もしくは他の活性を変化させ、それによって、該ヘテロ多量体は、変更されたリガンド結合もしくは特異性を示す、ヘテロ多量体。
  128. 前記改変が、リガンド結合を変化させる、請求項１２７に記載のヘテロ多量体。
  129. 前記改変が、位置Ｓ４４２、または、ＨＥＲレセプターの対応する位置における改変に対応する、請求項１２８に記載のヘテロ多量体。
  130. 前記改変が、ＨＥＲ１レセプターのＥＣＤ内にあり、それによって、前記ＨＥＲ１ ＥＣＤがＮＲＧ−２βと相互作用する、請求項１２９に記載のヘテロ多量体。
  131. 前記改変が、Ｓ４４２Ｆであるか、またはこれに対応するものである、請求項１３０に記載のヘテロ多量体。
  132. 請求項１２７〜１３１のいずれかに記載のヘテロ多量体であって、該ヘテロ多量体は、ＨＥＲ１に由来するＥＣＤもしくはその部分と、ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４に由来するＥＣＤもしくはその部分とを含み、それによって、結果として生じるＥＣＤは、少なくとも２つのＨＥＲレセプターに対するリガンドと相互作用し得る、ヘテロ多量体。
  133. 請求項１２７〜１３２のいずれかに記載のヘテロ多量体であって、該ヘテロ多量体は、ＨＥＲ１に由来するＥＣＤもしくはその部分と、ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４に由来するＥＣＤもしくはその部分とを含み、それによって、結果として生じるハイブリッドは、少なくとも３つのＨＥＲレセプターに対するリガンドと相互作用し得る、ヘテロ多量体。
  134. Ｆｃ多量体化ドメインを含む、請求項１２７〜１３３のいずれかに記載のヘテロ多量体。
  135. 請求項５０に記載のハイブリッドＥＣＤであって、該ハイブリッドＥＣＤは、ＥＣＤに由来するドメインもしくはその一部分を含み、該ＥＣＤは、該ドメイン中に、リガンド結合もしくは特異性を変化させる変異を含み；
    該変異は、非改変のＥＣＤもしくは該非改変ＥＣＤを含む全長レセプターと比べて、該ＥＣＤもしくは該ＥＣＤを含む全長レセプターのリガンド結合もしくは他の活性を変化させ、
    該ハイブリッドＥＣＤは、変更されたリガンド結合または特異性を示す、
    ハイブリッドＥＣＤ。
  136. 前記改変がリガンド結合を変化させる、請求項１３５に記載のハイブリッドＥＣＤ。
  137. 前記改変が、位置Ｓ４４２、またはＨＥＲレセプターの対応する位置における改変に対応する、請求項１３６に記載のハイブリッドＥＣＤ。
  138. 前記改変がＨＥＲ１レセプターのＥＣＤ内にあり、それによって、前記ＨＥＲ１ ＥＣＤがＮＲＧ−２βと相互作用する、請求項１３７に記載のハイブリッドＥＣＤ。
  139. 前記改変が、Ｓ４４２Ｆであるか、または、これに対応するものである、請求項１３８に記載のハイブリッドＥＣＤ。
  140. 請求項１３５〜１３９のいずれかに記載のハイブリッドＥＣＤであって、該ハイブリッドＥＣＤは、ＨＥＲ１に由来するＥＣＤもしくはその部分と、ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４に由来するＥＣＤもしくはその部分とを含み、それによって、結果として生じるＥＣＤは、少なくとも２つのＨＥＲレセプターに対するリガンドと相互作用し得る、ハイブリッドＥＣＤ。
  141. 請求項１３５〜１３９のいずれかに記載のハイブリッドＥＣＤであって、該ハイブリッドＥＣＤは、ＨＥＲ１に由来するＥＣＤもしくはその部分と、ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４に由来するＥＣＤもしくはその部分とを含み、それによって、結果として生じるハイブリッドは、少なくとも３つのＨＥＲレセプターに対するリガンドと相互作用し得る、ハイブリッドＥＣＤ。
  142. Ｆｃ多量体化ドメインを含む、請求項１３５〜１４１のいずれかに記載のハイブリッドＥＣＤ。
  143. 請求項５８に記載のヘテロ多量体であって、該ヘテロ多量体は、ＥＣＤに由来するドメインもしくはその一部分を含み、該ＥＣＤは、該ドメイン中に、リガンド結合もしくは特異性を変化させる変異を含み；
    該変異は、非改変のＥＣＤもしくは該非改変ＥＣＤを含む全長レセプターと比べて、該ＥＣＤもしくは該ＥＣＤを含む全長レセプターのリガンド結合もしくは他の活性を変化させ、
    該ヘテロ多量体は、変更されたリガンド結合または特異性を示す、
    ヘテロ多量体。
  144. 前記改変がリガンド結合を変化させる、請求項１４３に記載のヘテロ多量体。
  145. 前記改変が、位置Ｓ４４２、または、ＨＥＲレセプターの対応する位置における改変に対応する、請求項１４４に記載のヘテロ多量体。
  146. 前記改変がＨＥＲ１レセプターのＥＣＤ内にあり、それによって、前記ＨＥＲ１ ＥＣＤがＮＲＧ−２βと相互作用する、請求項１４５に記載のヘテロ多量体。
  147. 前記改変がＳ４４２Ｆであるか、またはこれに対応するものである、請求項１４６に記載のヘテロ多量体。
  148. 請求項１４３〜１４７のいずれかに記載のヘテロ多量体であって、該ヘテロ多量体は、ＨＥＲ１に由来するＥＣＤもしくはその部分と、ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４に由来するＥＣＤもしくはその部分とを含み、それによって、結果として生じるＥＣＤは、少なくとも２つのＨＥＲレセプターに対するリガンドと相互作用し得る、ヘテロ多量体。
  149. 請求項１４３〜１４８のいずれかに記載のヘテロ多量体であって、該ヘテロ多量体は、ＨＥＲ１に由来するＥＣＤもしくはその部分と、ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４に由来するＥＣＤもしくはその部分とを含み、それによって、結果として生じるＥＣＤは、少なくとも３つのＨＥＲレセプターに対するリガンドと相互作用し得る、ヘテロ多量体。
  150. Ｆｃ多量体化ドメインを含む、請求項１４３〜１４９のいずれかに記載のヘテロ多量体。
  151. 配列番号４１４のアミノ酸２５〜６４５に示されるポリペプチド、または、少なくとも２つの異なるリガンドに対するリガンド結合を達成するのに十分なその部分に対して、直接的またはリンカーを介して間接的に連結された多量体化ドメインを含む、キメラポリペプチド。
  152. 請求項１５１に記載のポリペプチドであって、前記多量体化ドメインは、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、ロイシンジッパー、相補的疎水性領域、相補的親水性領域、適合性のタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、２分子間で分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオール、ならびに安定な多量体を形成する、腔内の隆起部および同一もしくは類似の大きさの代償性の腔の中から選択され、それによって、前記キメラポリペプチドは、背中合わせの立体配置で相互作用し、それによって、両方のキメラポリペプチドのＥＣＤが、細胞表面レセプターとの二量体化に利用可能である、ポリペプチド。
  153. ヘテロ多量体とホモ多量体との混合物を含む組成物であって、該ヘテロ多量体は、ＨＥＲ１に由来するＥＣＤもしくはその部分と、ＨＥＲ３に由来する別のＥＣＤもしくはその部分とを含み、該ホモ多量体は、ＨＥＲ１に由来するＥＣＤもしくはその部分、または、ＨＥＲ３に由来するＥＣＤもしくはその部分を含む、組成物。
  154. 局所投与、経口投与、全身投与、もしくは局部投与のために処方された、請求項１５３に記載の組成物を含む、薬学的組成物。
  155. 癌、炎症性疾患、新脈管形成疾患または過増殖性疾患を処置する方法であって、請求項１５３または１５４に記載の組成物の治療上有効な量を投与する工程を包含する、方法。
  156. 前記癌が、膵臓癌、胃癌、頭頚部癌、子宮頸部癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、前立腺癌、食道癌、卵巣癌、子宮癌、神経膠腫、膀胱癌、腎臓癌または乳癌である、請求項１５５に記載の方法。
  157. 前記疾患が増殖性疾患である、請求項１５５に記載の方法。
  158. 前記増殖性疾患が、平滑筋細胞の増殖および／もしくは遊走を伴うか、または、前眼部の疾患であるか、または、糖尿病性網膜症もしくは乾癬である、請求項１５７に記載の方法。
  159. 前記疾患が、再狭窄、眼障害、狭窄、アテローム性動脈硬化症、血管肥厚による高血圧、膀胱疾患および閉塞性気道疾患である、請求項１５５に記載の方法。
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