KR20230169123A - Actrii-alk4 길항제 및 심부전을 치료하는 방법 - Google Patents
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Abstract
일부 측면에서, 본 개시내용은 ActRII-ALK4 길항제, 및 심부전 (HF)을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키기 위해, 특히 1종 이상의 HF-연관 동반이환을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키기 위해 ActRII-ALK4 길항제를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 노화와 연관된 심부전을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 상태와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키기 위해 ActRII-ALK4 길항제를 사용하는 방법을 제공한다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 3월 10일에 출원된 미국 가출원 번호 63/159,059로부터의 우선권의 이익을 주장한다. 상기 출원의 명세서는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
심부전 (HF)의 유병률은 적용되는 정의에 좌우되지만, 선진국에서 성인 인구의 대략 1-2%에 영향을 미치며, 70세의 사람에서는 ≥10%로 상승한다. 운동 중 호흡곤란을 갖는, 1차 진료가 제안되는 65세의 사람 중에서, 6명 중 1명은 비인식 HF (주로 HFpEF)를 가질 것이다. 55세에 HF의 평생 위험은 남성의 경우 33%이고 여성의 경우 28%이다. HFpEF를 갖는 환자의 비율은 적용된 정의, 임상 세팅 (1차 진료, 병원 클리닉, 및 병원 입원), 연구된 집단의 연령 및 성별, 이전 심근경색 및 공개 연도에 따라 22 내지 73% 범위이다.
모든 심부전 진단의 50% 및 모든 심부전 사망의 90%가 70세 초과의 성인에서 발생하므로, 심부전은 의심할 바 없이 노화와 결부된다. 프레이밍햄 심장 연구는 50세 내지 59세의 남성에서 HF의 유병률이 1000명당 8명이며, 이는 80세 내지 89세에 1000명당 66명으로 증가한다는 것을 발견하였고; 유사한 값 (1000명당 8명 및 79명)이 여성에서 주목되었다. 아프리카계-미국인 집단에서의 유병률은 백인 집단에서보다 25 퍼센트 더 높은 것으로 보고된다. 노화 자체는 심부전의 원인이 아니지만, 연령은 질환의 징후에 대한 역치를 낮춘다. 허혈성 및 판막성 질환에 대한 치료 옵션의 성공에 따라, 어느 정도의 심장 손상을 갖는 보다 노령의 개체의 수가 증가하고 있으며, 이는 정상 노화와 연관된 감소된 심장 예비력에 의해 점점 위험해진다. 통상적으로, 노화 환자에서의 심부전은 포괄적인 보존된 박출 계수 심부전 (HFpEF)에 속한다. 현재, 특히 HFpEF에 대해 승인된 요법은 존재하지 않는다.
따라서, 노화와 연관된 심부전을 치료하기 위한 효과적인 요법에 대한 높은 미충족 필요가 존재한다. 따라서, 본 개시내용의 목적은 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법, 특히 1종 이상의 심부전-연관 동반이환을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.
본원에 입증된 바와 같이, ActRII-ALK4 길항제는 심부전을 치료하는 데 효과적이다. 특히, ActRIIB-ALK4 이종이량체 단백질은 보존된 박출 계수 연관 심부전 (HFpEF)의 특징을 나타내는 노령의 C57BL6 마우스를 사용한 생리학적 심장 노화의 뮤린 모델에서 심장-보호 효과를 입증하였다. 예를 들어, 본원에 제시된 데이터는 ActRIIB-ALK4 이종이량체로의 처리가 LV 수축성, 비대, LV 벽 두께, 심장 중량, 수축기 기능, 및 심장 손상의 혈청 바이오마커 (예를 들어, cTnI 혈청 수준)를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 이러한 심부전 모델과 연관된 다양한 합병증에 대해 긍정적 효과를 갖는다는 것을 보여준다. 임의의 특정한 메카니즘에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 심부전에 대한 ActRIIB-ALK4 이종이량체의 효과는 주로 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6 및/또는 BMP10 (본원에서 "ActRII-ALK4 리간드들" 또는 "ActRII-ALK4 리간드"로 지칭됨)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 ActRIIB-ALK4 이종이량체 단백질에 결합하는 1종 이상의 리간드에 의해 매개되는 바와 같은 리간드-신호전달을 길항하는 것에 의해 유발되는 것으로 예상된다. 메카니즘에 상관없이, ActRIIB-ALK4 이종이량체가 심부전과 연관된 다양한 합병증을 호전시키는 데 있어서 유의한 긍정적 효과를 갖는다는 것은 본원에 제시된 데이터로부터 명백하며, 이는 추가로 다른 ActRII-ALK4 길항제가 또한 노화와 연관된 심부전을 치료하는 데 유용할 수 있음을 시사한다.
본원에 개시된 용어 "ActRII-ALK4 길항제"는, 예를 들어 1종 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6 및/또는 BMP10)를 억제하는 길항제; 1종 이상의 ActRII-ALK4 리간드 연관 수용체 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4 및 ALK7)를 억제하는 길항제; 및 1종 이상의 하류 신호전달 성분 (예를 들어, Smad 단백질, 예컨대 Smad 2 및 3)을 억제하는 길항제를 비롯한, 1종 이상의 ActRII-ALK4 리간드에 의한 신호전달을 억제하는 데 사용될 수 있는 다양한 작용제를 지칭한다. 본 개시내용의 방법 및 용도에 따라 사용될 ActRII-ALK4 길항제는 다양한 형태, 예를 들어 ActRII-ALK4 리간드 트랩 (예를 들어, 가용성 ActRIIA 폴리펩티드 또는 ActRIIB 폴리펩티드 (그의 변이체뿐만 아니라 이종다량체 및 동종다량체 포함)), ActRII-ALK4 항체 길항제 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10, ActRIIB, ActRIIA, ALK4 및/또는 ALK7 중 1종 이상을 억제하는 항체), 소분자 길항제 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10, ActRIIB, ActRIIA, ALK4 및/또는 ALK7 중 1종 이상을 억제하는 소분자) 및 뉴클레오티드 길항제 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10, ActRIIB, ActRIIA, ALK4 및/또는 ALK7 중 1종 이상을 억제하는 뉴클레오티드 서열)를 포함한다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 일반적으로 노화와 연관된 심부전과 연관된 임의의 과정에서 ActRII-ALK4 리간드의 신호전달을 길항하는 가용성 ActRIIB, ActRIIA, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드를 포함하는 ActRII-ALK4 길항제를 제공한다. 본 개시내용의 ActRII-ALK4 길항제는 ActRII-ALK4의 1종 이상의 리간드, 예컨대 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6 또는 BMP10을 길항할 수 있고, 따라서 노화와 연관된 심부전 또는 심부전의 1종 이상의 동반이환 (예를 들어 빈혈, 협심증, 동맥 고혈압, 관절염, 심방 세동, 악액질, 암, 인지 기능장애, 관상 동맥 질환 (CAD), 당뇨병, 발기 기능장애, 통풍, 고콜레스테롤혈증, 고칼륨혈증, 고칼륨혈증, 고지혈증, 고혈압, 철 결핍, 신장 기능장애, 대사 증후군, 비만, 신체 상태악화, 칼륨 장애, 폐 질환 (예를 들어, 천식, COPD), 근육감소증, 수면 무호흡, 수면 장애, 및 심장 판막 질환 (예를 들어, 대동맥 협착, 대동맥 역류, 승모판 폐쇄부전, 삼첨판 역류)을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 데 유용할 수 있다.
특정 측면에서, 본원에 개시된 방법 및 용도에 따라 (예를 들어, 노화와 연관된 심부전 또는 심부전의 1종 이상의 합병증을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 데) 사용될 ActRII-ALK4 길항제는 ActRII-ALK4 리간드 트랩 폴리펩티드 길항제 (그의 변이체뿐만 아니라 그의 이종이량체 및 이종다량체 포함), ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제이다. ActRII-ALK4 리간드 트랩 폴리펩티드는 1종 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)에 결합할 수 있는 TGF-β 슈퍼패밀리-관련 단백질 (그의 변이체 포함)을 포함한다. 따라서, ActRII-ALK4 리간드 트랩은 일반적으로 1종 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)를 길항할 수 있는 폴리펩티드를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "ActRII"는 유형 II 액티빈 수용체의 패밀리를 지칭한다. 이러한 패밀리는 액티빈 수용체 유형 IIA (ActRIIA) 및 액티빈 수용체 유형 IIB (ActRIIB)를 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제는 ActRII-ALK4 리간드 트랩을 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 리간드 트랩은 ActRIIB 폴리펩티드 (그의 변이체, 뿐만 아니라 동종다량체 (예를 들어, ActRIIB 동종이량체) 및 이종다량체 (예를 들어, ActRIIB-ALK4 또는 ActRIIB-ALK7 이종이량체) 포함)를 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 리간드 트랩은 ActRIIA 폴리펩티드 (그의 변이체, 뿐만 아니라 동종다량체 (예를 들어, ActRIIA 동종이량체) 및 이종다량체 (예를 들어, ActRIIA-ALK4 또는 ActRIIA-ALK7 이종이량체) 포함)를 포함한다. 다른 실시양태에서, ActRII-ALK 리간드 트랩은 폴리스타틴 폴리펩티드를 포함하나 이에 제한되지는 않는 가용성 리간드 트랩 단백질뿐만 아니라 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제는 ActRII-ALK4 항체 길항제를 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제는 ActRII-ALK4 소분자 길항제를 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제는 ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제를 포함한다.
부분적으로, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 노화와 연관된 심부전의 1종 이상의 동반이환의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전의 1종 이상의 동반이환을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 환자는 적어도 40세이다. 일부 실시양태에서, 환자는 약 40 내지 약 100세이다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 심부전은 보존된 박출 계수 심부전 (HFpEF)이다. 일부 실시양태에서, 환자는 ≥50%의 좌심실 박출 계수 (LVEF)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 정상 수축기 기능을 갖는다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 호흡곤란을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 호흡곤란을 감소시킨다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 혈관 내막 두께의 증가, 혈관 강성의 증가, 좌심실 (LV) 비대의 증가, 및 좌심방 팽대의 증가로 이루어진 군으로부터 선택된 심혈관 구조적 재형성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 혈관 내막 두께의 증가, 혈관 강성의 증가, LV 비대의 증가, 및 좌심방 팽대의 증가로 이루어진 군으로부터 선택된, 환자에서의 심혈관 구조적 재형성을 개선시킨다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 LV 비대를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자에서 LV 비대를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자에서 좌심실 비대를 감소시키며, 여기서 환자의 LV 비대는 적어도 1% (예를 들어, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 적어도 50%)만큼 감소된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자에서 심장 충만 압력을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자에서 조기 확장기 심장 충만을 개선시킨다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 좌심방 팽대를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자에서 심방 팽대를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자에서 좌심방 팽대를 감소시키며, 여기서 환자의 좌심방 팽대는 적어도 1% (예를 들어, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 적어도 50%)만큼 감소된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자에서 혈관 내막 두께를 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자에서 혈관 강성을 감소시킨다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 LV 비대, 심근세포 크기의 증가, 심근세포의 손실, 및 LV 확장 말기 부피의 감소로 이루어진 군으로부터 선택된, 심장에서의 심실 구조의 변화를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 LV 비대, 심근세포 크기의 증가, 심근세포의 손실, 및 LV 확장 말기 부피의 감소로 이루어진 군으로부터 선택된, 환자의 심장에서의 심실 구조의 변화를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자에서 심근세포 크기를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자에서 심근세포의 손실이 악화되는 것을 방지한다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자에서 LV 확장 말기 부피를 증가시킨다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 좌심방 비대, 부정맥, 심방 확장, 대동맥 근부 확장 및 심방 세동으로 이루어진 군으로부터 선택된, 심장에서의 심방 구조의 변화를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 좌심방 비대, 부정맥, 심방 확장, 대동맥 근부 확장 및 심방 세동으로 이루어진 군으로부터 선택된 환자의 심장에서의 심방 구조의 변화를 개선시킨다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 확장기 심장 기능의 변화, 수축기 심장 기능의 변화, 및 전기적 심장 기능의 변화로 이루어진 군으로부터 선택된 심장의 기능적 변화를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 확장기 심장 기능의 변화, 수축기 심장 기능의 변화, 및 전기적 심장 기능의 변화로 이루어진 군으로부터 선택된 환자의 심장의 기능적 변화를 개선시킨다.
일부 실시양태에서, 환자는 확장기 기능의 변화를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 확장기 기능장애를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자에서 확장기 기능장애를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 환자는 감소된 심실 이완 및 증가된 충만 압력을 갖는다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자에서 심실 이완을 증가시키고 충만 압력을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 환자에서의 확장기 기능장애는 초기 확장기 경승모판 혈류속도 대 초기 확장기 승모판 환상 조직 속도 (E/e')의 비에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 환자의 E/e' 비는 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람과 비교하여 증가된다. 일부 실시양태에서, 환자의 E/e' 비는 8 미만이다. 일부 실시양태에서, 환자의 E/e' 비는 8 내지 15이다. 일부 실시양태에서, 환자의 E/e' 비는 15 초과이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자의 E/e' 비를 감소시키며, 여기서 환자의 E/e' 비는 적어도 5% (예를 들어, 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%)만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 환자의 E/e' 비는 적어도 1 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 35, 40, 45 또는 50)만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 8 미만으로 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 환자는 정상의 확장기 기능장애 등급을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자의 정상 등급의 확장기 기능장애는 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람에 비해 초기 확장기 경승모판 유속 대 후기 확장기 경승모판 유속의 비 (E/A) 1 내지 2, E/e' < 8, 정상 좌심방 부피 지수 (LAVI), 및 감속 시간 (DT) <1 60 ms를 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자는 확장기 기능장애 등급이 1이다. 일부 실시양태에서, 환자의 등급 1 확장기 기능장애는 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람에 비해 이완 장애로 인한 E/A 비 < 1, E/e' < 8, 정상 또는 증가된 LAVI, 및 증가된 감속 시간을 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자는 확장기 기능장애 등급이 2이다. 일부 실시양태에서, 환자의 등급 2 확장기 기능장애는 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람에 비해 E/A 1 내지 2, E/e' 8 내지 15, 증가된 LAVI, 및 감소된 감속 시간을 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자는 확장기 기능장애 등급이 3이다. 일부 실시양태에서, 환자의 등급 3 확장기 기능장애는 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람에 비해 E/A > 2, E/e' 15 초과, 증가된 LAVI, 및 심하게 감소된 LV 탄성 및 높은 LV 충만 압력으로 인한 매우 짧은 E 감속 시간 (< 140 ms)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자의 확장기 기능장애 등급을 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 확장기 기능장애 등급을 등급 3에서 등급 2로 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 확장기 기능장애 등급을 등급 3에서 등급 1로 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 확장기 기능장애 등급을 등급 3에서 정상으로 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 확장기 기능장애 등급을 등급 2에서 등급 1로 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 확장기 기능장애 등급을 등급 2에서 정상으로 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 확장기 기능장애 등급을 등급 1에서 정상으로 개선시킨다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자의 LV 확장기 기능을 (예를 들어, 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100%) 증가시킨다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 적어도 50% (예를 들어, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%)의 박출 계수를 갖는다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 심전도검사를 사용하여 전기적 기능적 변화에 대해 평가된다. 일부 실시양태에서, 환자의 심전도 측정에서의 변화는 P-파 지속기간, P-R 간격 및 Q-T 간격, 및 T-파 전압의 증가 및 QRS 축의 좌측 이동으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 P-파 지속기간의 감소, P-R 간격의 감소, Q-T 간격의 감소, T-파 전압의 증가, 및 QRS 축의 정상 위치로의 이동으로 이루어진 군으로부터 선택된 환자의 심전도 측정을 개선시킨다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 스트레스 확장기 시험을 사용하여 확장기 기능장애에 대해 평가된다. 일부 실시양태에서, 확장기 스트레스 시험은 카테터삽입 테이블에 고정된 자전거 상에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 확장기 스트레스 시험은 심장초음파검사를 사용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 환자는 휴식 시 중격 e' 속도 < 7 cm/s 또는 외측 e' 속도 < 10 cm/s, 운동 시 평균 E/e' > 14 또는 중격 E/e' 비 > 15, 운동 시 피크 삼첨판 역류 (TR) 속도 > 2.8 m/s, 및 좌심방 부피 지수 (LAVI) > 34 mL/m2로 이루어진 군으로부터 선택된 파라미터로의 비정상적 확장기 스트레스 시험을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 휴식 시 환자의 중격 e' 속도를 > 7 cm/s로 또는 외측 e' 속도를 > 10 cm/s로 증가시키고, 운동 시 평균 E/e'를 14 미만으로 또는 중격 E/e' 비를 15 미만으로 감소시키고, 운동 시 피크 삼첨판 역류 (TR) 속도를 < 2.8 m/s로 감소시키고, 좌심방 부피 지수 (LAVI)를 < 34 mL/m2로 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자의 H2FPEF 점수를 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9포인트만큼) 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 환자는 우심 카테터삽입을 사용하여 심부전에 대해 평가된다. 일부 실시양태에서, 환자는 휴식 시 폐 모세혈관 쐐기압 (PCWP)이 ≥ 15 mmHg이고/거나 운동 동안 PCWP가 ≥25 mmHg이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 휴식 시 환자의 PCWP를 적어도 15 mm Hg 미만으로 감소시키고/거나, 운동 동안 PCWP를 적어도 25 mm Hg 미만으로 감소시킨다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 유럽 심부전 협회 (EHFA) 점수가 ≥ 5포인트이다. 일부 실시양태에서, EHFA 점수 ≥ 5포인트는 HFpEF를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 환자는 EHFA 점수가 2 내지 4포인트이다. 일부 실시양태에서, EHFA 점수 2 내지 4 포인트는 환자가 HFpEF를 갖는다는 것을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 환자는 EHFA 점수가 1 포인트 이하이다. 일부 실시양태에서, EHFA 점수 1 이하는 환자가 HFpEF를 갖지 않는다는 것을 나타낸다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 HFpEF에 대한 1종 이상의 주요 기능적 EHFA 기준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 주요 기능적 기준은 중격 e' 속도 < 7 cm/s, 휴식 시 외측 e' 속도 < 10 cm/s, 운동 시 평균 E/e' > 14 또는 중격 E/e' 비 > 15 및 운동 시 TR 속도 > 2.8 m/s로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 중격 e' 속도를 > 7 cm/s로 증가시키는 것, 휴식 시 외측 e' 속도를 > 10 cm/s로 증가시키는 것, 운동 시 E/e'를 < 14로 또는 중격 E/e' 비를 < 15로 감소시키는 것 및 운동 시 TR 속도를 < 2.8 m/s로 감소시키는 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 주요 기능적 기준을 개선시킨다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 HFpEF에 대한 1종 이상의 주요 형태학적 EHFA 기준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 주요 형태학적 기준은 LAVI > 34 mL/m2 및 LVMI 남성의 경우 ≥ 149 g/m2 및 여성의 경우 ≥ 122 g/m2 및 RWT > 0.42로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 LAVI를 < 34 mL/m2로 감소시키는 것, LVMI를 남성의 경우 < 149 g/m2 및 여성의 경우 < 122 g/m2로 감소시키는 것, 및 RWT를 < 0.42로 감소시키는 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 주요 형태학적 기준을 개선시킨다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 HFpEF에 대한 1종 이상의 주요 바이오마커 EHFA 기준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 주요 바이오마커 기준은 동성 리듬으로, NT-프로BNP > 220 pg/mL 및/또는 BNP > 80 pg/mL이다. 일부 실시양태에서, 주요 바이오마커 기준은 심방 세동으로, NT-프로BNP > 660 pg/mL 및/또는 BNP > 240 pg/mL이다. 일부 실시양태에서, 방법은 NT-프로BNP를 < 220 pg/mL로 감소시키는 것 및/또는 BNP를 < 80 pg/mL로 감소시키는 것을 포함하여, 동성 리듬을 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 NT-프로BNP를 < 660 pg/mL로 감소시키는 것 및/또는 BNP를 < 240 pg/mL로 감소시키는 것을 포함하여, 심방 세동을 개선시킨다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 HFpEF에 대한 1종 이상의 부차적 EHFA 기준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 HFpEF에 대한 1종 이상의 부차적 기능적 EHFA 기준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 부차적 기능적 기준은 평균 E/e' 9-14 및 GLS < 16%로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 E/e'를 8 이하로 감소시키고, GLS를 > 16%로 증가시키는 것을 포함하여, 부차적 기능적 기준을 개선시킨다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 HFpEF에 대한 1종 이상의 부차적 형태학적 EHFA 기준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 부차적 형태학적 기준은 LAVI 29-34 mL/m2, 남성의 경우 LVMI > 115 g/m2, 여성의 경우 LVMI 95 g/m2, RWT > 0.42, 및 LV 벽 두께 ≥ 12 mm로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 LAVI를 <34 mL/m2로 감소시키는 것, LVMI를 남성의 경우 < 115 g/m2로 감소시키는 것, LVMI를 여성의 경우 95 g/m2 미만으로 감소시키는 것, RWT를 < 0.42로 감소시키는 것, 및 LV 벽 두께를 < 12 mm로 감소시키는 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 부차적 형태학적 기준을 개선시킨다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 HFpEF에 대한 1종 이상의 부차적 바이오마커 EHFA 기준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 부차적 바이오마커 기준은 동성 리듬으로, 5-NT-프로BNP 125-220 pg/mL 및/또는 BNP 35-80 pg/mL이다. 일부 실시양태에서, 부차적 바이오마커 기준은 심방 세동으로, NT-프로BNP 365-660 pg/mL 및/또는 BNP 105-240 pg/mL이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 5-NT-프로BNP를 < 220 pg/mL로 감소시키는 것 및/또는 BNP를 < 80 pg/mL로 감소시키는 것을 포함하여, 동성 리듬을 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 NT-프로BNP를 < 660 pg/mL로 감소시키는 것 및/또는 BNP를 < 240 pg/mL로 감소시키는 것을 포함하여, 심방 세동을 개선시킨다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자의 EHFA 점수를 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8포인트만큼) 감소시킨다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 뉴욕 심장 학회 (NYHA) 부류 I HF를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 NYHA 부류 II HF를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 NYHA 부류 III HF를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 NYHA 부류 IV HF를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자의 NYHA 부류를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NYHA 부류를 부류 IV에서 부류 III으로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NYHA 부류를 부류 IV에서 부류 II로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NYHA 부류를 부류 IV에서 부류 I로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NYHA 부류를 부류 III에서 부류 II로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NYHA 부류를 부류 III에서 부류 I로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NYHA 부류를 부류 II에서 부류 I로 감소시킨다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 미국 심장 학회 재단/미국 심장 협회 (ACCF/AHA) A기 심부전을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 ACCF/AHA B기 심부전을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 ACCF/AHA C기 심부전을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 ACCF/AHA D기 심부전을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자의 ACCF/AHA 병기를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 ACCF/AHA 병기를 D기에서 C기로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 ACCF/AHA 병기를 D기에서 B기로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 ACCF/AHA 병기를 D기에서 A기로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 ACCF/AHA 병기를 C기에서 B기로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 ACCF/AHA 병기를 C기에서 A기로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 ACCF/AHA 병기를 B기에서 A기로 감소시킨다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 HF 합병 AMI 부류 I 심부전의 킬립 분류를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 HF 합병 AMI 부류 II 심부전의 킬립 분류를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 HF 합병 AMI 부류 III 심부전의 킬립 분류를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 HF 합병 AMI 부류 IV 심부전의 킬립 분류를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자의 HF 합병 AMI 부류의 킬립 분류를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 킬립 부류를 부류 IV에서 부류 III으로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 킬립 부류를 부류 IV에서 부류 II로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 킬립 부류를 부류 IV에서 부류 I로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 킬립 부류를 부류 III에서 부류 II로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 킬립 부류를 부류 III에서 부류 I로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 킬립 부류를 부류 II에서 부류 I로 감소시킨다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 HF의 진단에 대한 1개 이상의 주요 프레이밍햄 기준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 발작성 야간 호흡곤란 또는 기좌호흡, 경정맥 팽만, 수포음, 방사선촬영상 심장비대, 급성 폐 부종, S3 말발굽심장음, 16 cm 초과의 물의 증가된 정맥압, 25초 이상의 순환 시간, 간경정맥 역류, 및 치료에 반응하여 5일 내 4.5 kg 이상의 체중 감소로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 상태를 갖는다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 HF의 진단에 대한 1개 이상의 부차적 프레이밍햄 기준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 양측 발목 부종, 야간 기침, 통상의 운동 시 호흡곤란, 간비대, 흉막 삼출, 최대 기록으로부터 1/3까지의 폐활량 감소, 및 빈맥 (120회/분 초과의 심박수)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 상태를 갖는다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 적어도 2개의 프레이밍햄 주요 기준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 적어도 1개의 주요 프레이밍햄 기준 및 적어도 2개의 부차적 프레이밍햄 기준을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자가 갖는 심부전에 대한 프레이밍햄 기준의 수를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자가 갖는 심부전에 대한 주요 프레이밍햄 기준의 수를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자가 갖는 심부전에 대한 부차적 프레이밍햄 기준의 수를 감소시킨다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 HF의 전형적 증상, 덜 전형적 증상, 특이적 징후 및 덜 특이적 징후로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 상태를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 호흡곤란, 기좌호흡, 발작성 야간 호흡곤란, 감소된 운동 내성, 피로, 피곤감, 운동 후 회복까지 증가된 시간, 및 발목 종창으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 증상을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 야간 기침, 천명, 팽만감, 식욕 상실, 혼란 (특히 고령에서), 우울증, 심계항진, 어지럼증, 실신, 및 구부림 유발 호흡곤란으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 덜 전형적인 증상을 갖는다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 HF의 1종 이상의 징후를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 상승된 경정맥압, 간경정맥 역류, 제3 심장음 (말발굽 리듬), 및 측방향으로 변위된 심첨 박동으로 이루어진 군으로부터 선택된 HF의 1종 이상의 징후를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 HF의 1종 이상의 덜 특이적인 징후를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 HF의 1종 이상의 덜 특이적인 징후를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 체중 증가 (>2 kg/주), 체중 감소 (진행성 HF에서), 조직 소모 (악액질), 심장 잡음, 말초 부종 (발목, 천골, 음낭), 폐 비빔소리, 폐 기저에서의 감소된 공기 진입 및 타진 둔탁음 (흉막 삼출), 빈맥, 불규칙 맥박, 빈호흡, 체인 스토크스 호흡, 간비대, 복수, 한랭 사지, 핍뇨, 및 좁은 맥압으로 이루어진 군으로부터 선택된 HF의 1종 이상의 덜 특이적인 징후를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자가 갖는 심부전의 징후 및/또는 증상의 수를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자가 갖는 심부전의 징후의 수를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자가 갖는 심부전의 증상의 수를 감소시킨다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 건강한 환자와 비교하여 상승된 뇌 나트륨이뇨 펩티드 (BNP) 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 적어도 35 pg/mL (예를 들어, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 3000, 5000, 10,000, 15,000, 또는 20,000 pg/mL)의 BNP 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자에서 BNP 수준을 적어도 5% (예를 들어, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 적어도 80%) 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자에서 BNP 수준을 적어도 5 pg/mL (예를 들어, 5, 10, 50, 100, 200, 500, 1000, 또는 5000 pg/mL) 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 BNP 수준을 정상 수준 (즉, <100 pg/ml)으로 감소시킨다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 건강한 환자와 비교하여 상승된 N-말단 프로-BNP (NT-프로BNP) 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 적어도 10 pg/mL (예를 들어, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 3000, 5000, 10,000, 15,000, 또는 20,000 pg/mL)의 NT-프로BNP 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자에서 NT-프로BNP 수준을 적어도 5% (예를 들어, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 적어도 80%) 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자에서 NT-프로BNP 수준을 적어도 10 pg/mL (예를 들어, 10, 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 5000, 10,000, 15,000, 20,000 또는 25,000 pg/mL) 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 NT-프로BNP 수준을 정상 수준 (즉, <100 pg/ml)으로 감소시킨다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 건강한 환자와 비교하여 상승된 트로포닌 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자에서 트로포닌 수준을 적어도 1% (예를 들어, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 적어도 80%)만큼 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자의 입원율을 적어도 1% (예를 들어, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%)만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자의 심부전 악화율을 적어도 1% (예를 들어, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%)만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자가 병원에 머무를 필요를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 총 환자 병원 방문 횟수를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자의 초기 입원까지의 시간을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자의 삶의 기간을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 병원 방문 사이의 시간을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 재발성 병원 방문 횟수를 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자의 심장 박출량을 적어도 5% (예를 들어, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 적어도 80%)만큼 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자의 운동 능력을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 환자는 150 내지 400 미터의 6-분 보행 거리를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자의 6-분 보행 거리를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자의 6-분 보행 거리를 적어도 10 미터 (예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 또는 400 미터 초과)만큼 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자의 보르그 호흡곤란 지수 (BDI)를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자의 BDI를 적어도 0.5 지수 포인트 (예를 들어, 적어도 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 또는 10 지수 포인트)만큼 감소시킨다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 심장초음파검사를 사용하여 심부전에 대해 평가된다. 일부 실시양태에서, 환자는 심장 자기 공명 영상화 (CMR)를 사용하여 심부전에 대해 평가된다. 일부 실시양태에서, 환자는 후기 가돌리늄 증진 (LGE)에 의한 CMR을 사용하여 심부전에 대해 평가된다. 일부 실시양태에서, 환자는 LV 벽 두께 (LVWT), LV 질량 (LVM), LV 확장 말기 직경 (LVEDD), LV 수축 말기 직경 (LVESD), 분획 단축 (FS) (식 FS = 100% x [(EDD - ESD)/EDD]를 사용하여 계산됨), LV 확장 말기 부피 (LVEDV), LV 수축 말기 부피 (LVESV), 박출 계수 (식 EF = 100% x [(EDV - ESV)/EDV]를 사용하여 계산됨), 비대 지수 (LVM 대 LVESV의 비로서 계산됨), 및 상대 벽 두께 (LVWT 대 LVESD의 비로서 계산됨)를 포함하나 이에 제한되지는 않는, LV 구조 및 수축기 기능 (예를 들어, 유두근 수준에서 흉골연 단축 단면도에서 M-모드에 의해 측정됨)으로 이루어진 군으로부터 선택된 상태 중 1종 이상에 대해 평가된다. 일부 실시양태에서, 환자에서의 심부전은 멀티게이팅 획득 (MUGA), 흉부 X선, 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT) 및 방사성뉴클레오티드 심실조영, 양전자 방출 단층촬영 (PET), 관상 혈관조영 및 심장 컴퓨팅 단층촬영 (CT)으로 이루어진 군으로부터 선택된 심장 영상화를 사용하여 평가된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 환자에게 추가의 지지 요법 또는 활성제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가의 지지 요법 또는 활성제는 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제, 베타 차단제, 안지오텐신 II 수용체 차단제 (ARB), 미네랄로코르티코이드/알도스테론 수용체 길항제 (MRA), 글루코코르티코이드, 스타틴, 나트륨-글루코스 공동-수송체 2 (SGLT2) 억제제, 이식형 심장율동전환 제세동기 (ICD), 안지오텐신 수용체 네프릴리신 억제제 (ARNI), 및 이뇨제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 추가의 활성제 및/또는 지지 요법은 베나제프릴, 캅토프릴, 에날라프릴, 리시노프릴, 페린도프릴, 라미프릴, 트란돌라프릴, 조페노프릴, 아세부톨롤, 아테놀롤, 베탁솔롤, 비소프롤롤, 카르테올롤, 카르베딜롤, 라베탈롤, 메토프롤롤, 나돌롤, 네비볼롤, 펜부톨롤, 핀돌롤, 프로프라놀롤, 소탈롤, 티몰롤; 로사르탄, 이르베사르탄, 올메사르탄, 칸데사르탄, 발사르탄, 피마사르탄, 아질사르탄, 살프리사르탄, 텔미사르탄, 프로게스테론, 에플레레논 및 스피로노락톤, 베클로메타손, 베타메타손, 부데소니드, 코르티손, 데플라자코르트, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 메틸프레드니손, 프레드니손, 트리암시놀론, 피네레논, 아토르바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 프라바스타틴, 피타바스타틴, 심바스타틴, 로수바스타틴, 카나글리플로진, 다파글리플로진, 엠파글리플로진, 에르투글리플로진, 발사르탄 및 사쿠비트릴 (네프릴리신 억제제), 푸로세미드, 부메타니드, 토라세미드, 벤드로플루메티아지드, 히드로클로로티아지드, 메톨라존, 인다파미드, 스피로노락톤/에플레레논, 아밀로리드 트리암테렌, 히드랄라진 및 이소소르비드 디니트레이트, 디곡신, 디기탈리스, N-3 다중불포화 지방산 (PUFA), 및 If-채널 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 환자는 빈혈, 협심증, 동맥 고혈압, 관절염, 심방 세동, 악액질, 암, 인지 기능장애, 관상 동맥 질환 (CAD), 당뇨병, 발기 기능장애, 통풍, 고콜레스테롤혈증, 고칼륨혈증, 고칼륨혈증, 고지혈증, 고혈압, 철 결핍, 신장 기능장애, 대사 증후군, 비만, 신체 상태악화, 칼륨 장애, 폐 질환 (예를 들어, 천식, COPD), 근육감소증, 수면 무호흡, 수면 장애, 및 심장 판막 질환 (예를 들어, 대동맥 협착, 대동맥 역류, 승모판 폐쇄부전, 삼첨판 역류)으로 이루어진 군으로부터 선택된 동반이환을 갖는다. 일부 실시양태에서, HF에서 고려되는 1종 이상의 동반이환은 빈혈, 심방 세동, 관상 동맥 질환 (CAD) 및 수면 무호흡으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제는 ActRIIA 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제는 이종다량체이다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열식별번호(SEQ ID NO): 366의 아미노산 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 중 어느 하나에서 시작하여 서열식별번호: 366의 아미노산 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 또는 135 중 어느 하나에서 종결되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열식별번호: 367의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열식별번호: 368의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIA 폴리펩티드는 ActRIIA 폴리펩티드 도메인 및 1개 이상의 이종 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 ActRIIA 폴리펩티드 도메인과 i) 1개 이상의 이종 도메인 또는 ii) Fc 도메인 사이에 위치한 링커 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 도메인은 TGGG (서열식별번호: 265), TGGGG (서열식별번호: 263), SGGGG (서열식별번호: 264), GGGGS (서열식별번호: 267), GGG (서열식별번호: 261), GGGG (서열식별번호: 262) 및 SGGG (서열식별번호: 266)로부터 선택된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 380의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 378의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제는 동종이량체 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제는 이종다량체 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 이종다량체 폴리펩티드는 ActRIIA 폴리펩티드 및 ALK4 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종다량체 폴리펩티드는 ActRIIA 폴리펩티드 및 ALK7 폴리펩티드를 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ALK4 폴리펩티드는 서열식별번호: 84, 85, 86, 87, 88, 89, 92, 93, 247, 249, 421 및 422로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ALK7 폴리펩티드는 서열식별번호: 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 133 및 134로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ALK4 폴리펩티드는 ALK4 폴리펩티드 도메인 및 1개 이상의 이종 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, ALK7 폴리펩티드는 ALK7 폴리펩티드 도메인 및 1개 이상의 이종 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 ALK4 폴리펩티드 도메인과 i) 1개 이상의 이종 도메인 또는 ii) Fc 도메인 사이에 위치한 링커 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 ALK7 폴리펩티드 도메인과 i) 1개 이상의 이종 도메인 또는 ii) Fc 도메인 사이에 위치한 링커 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 도메인은 TGGG (서열식별번호: 265), TGGGG (서열식별번호: 263), SGGGG (서열식별번호: 264), GGGGS (서열식별번호: 267), GGG (서열식별번호: 261), GGGG (서열식별번호: 262) 및 SGGG (서열식별번호: 266)로부터 선택된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 이종다량체는 하기로부터 선택된 Fc 도메인을 포함하며: a) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 13의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 13의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; b) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; c.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 15의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 15의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; d.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 16의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 16의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; e.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 이종다량체는 하기로부터 선택된 Fc 도메인을 포함하며: a.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 13의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 13의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; b.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; c.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 15의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 15의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; d.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 16의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 16의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; e.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 이종다량체는 하기로부터 선택된 Fc 도메인을 포함하며: a.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; b.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 이종다량체는 하기로부터 선택된 Fc 도메인을 포함하며: a.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; b.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 이종다량체는 하기로부터 선택된 Fc 도메인을 포함하며: a.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 21의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; b.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 21의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 이종다량체는 하기로부터 선택된 Fc 도메인을 포함하며: a.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 21의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; b.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 21의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 이종다량체는 하기로부터 선택된 Fc 도메인을 포함하며: a.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 22의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; b.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 22의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 이종다량체는 하기로부터 선택된 Fc 도메인을 포함하며: a.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 22의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; b.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 22의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 이종다량체는 하기로부터 선택된 Fc 도메인을 포함하며: a.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 24의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; b.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 24의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 이종다량체는 하기로부터 선택된 Fc 도메인을 포함하며: a.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 24의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; b.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 24의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 이종다량체는 하기로부터 선택된 Fc 도메인을 포함하며: a.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 26의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 27의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; b.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 27의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 26의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 이종다량체는 하기로부터 선택된 Fc 도메인을 포함하며: a.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 26의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 27의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; b.) ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 27의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 26의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 28의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 29의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 28의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 29의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 138에 글루탐산, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 217에 아스파르트산을 포함하고, 여기서 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 위치 146에 알라닌, 아미노산 위치 162에 아르기닌, 아미노산 위치 179에 아르기닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 138에 글루탐산, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 217에 아스파르트산을 포함하고, 여기서 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 위치 146에 알라닌, 아미노산 위치 162에 아르기닌, 아미노산 위치 179에 아르기닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 28의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 29의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 28의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 29의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 138에 글루탐산, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 217에 아스파르트산을 포함하고, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 위치 146에 알라닌, 아미노산 위치 162에 아르기닌, 아미노산 위치 179에 아르기닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 138에 글루탐산, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 217에 아스파르트산을 포함하고, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 위치 146에 알라닌, 아미노산 위치 162에 아르기닌, 아미노산 위치 179에 아르기닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 30의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 30의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 435에 아르기닌을 포함하고, 여기서 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 아미노산 위치 146에 알라닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 435에 아르기닌을 포함하고, 여기서 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 아미노산 위치 146에 알라닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 30의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 30의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 435에 아르기닌을 포함하고, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 아미노산 위치 146에 알라닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 435에 아르기닌을 포함하고, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 아미노산 위치 146에 알라닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제는 ActRIIB 폴리펩티드를 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제는 이종다량체이다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 아미노산 20-29 중 어느 하나 (예를 들어, 아미노산 잔기 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 또는 29)에서 시작하여 서열식별번호: 2의 아미노산 109-134 중 어느 하나 (예를 들어, 아미노산 잔기 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 또는 134)에서 종결되는 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 아미노산 29-109와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 아미노산 25-131과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 아미노산 20-134와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 53의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 388의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 389의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 ActRIIB 폴리펩티드 도메인 및 1개 이상의 이종 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 ActRIIB 폴리펩티드 도메인과 1개 이상의 이종 도메인 또는 Fc 도메인 사이에 위치한 링커 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 도메인은 TGGG (서열식별번호: 265), TGGGG (서열식별번호: 263), SGGGG (서열식별번호: 264), GGGGS (서열식별번호: 267), GGG (서열식별번호: 261), GGGG (서열식별번호: 262) 및 SGGG (서열식별번호: 266)로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 5의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 12의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열과 관련하여 A24N, S26T, N35E, E37A, E37D, L38N, R40A, R40K, S44T, L46V, L46I, L46F, L46A, E50K, E50P, E50L, E52A, E52D, E52G, E52H, E52K, E52N, E52P, E52R, E52S, E52T, E52Y, Q53R, Q53K, Q53N, Q53H, D54A, K55A, K55D, K55E, K55R, R56A, L57E, L57I, L57R, L57T, L57V, Y60D, Y60F, Y60K, Y60P, R64A, R64H, R64K, R64N, N65A, S67N, S67T, G68R, K74A, K74E, K74F, K74I, K74R, K74Y, W78A, W78Y, L79A, L79D, L79E, L79F, L79H, L79K, L79P, L79R, L79S, L79T, L79W, D80A, D80F, D80G, D80I, D80K, D80M, D80N, D80R, F82A, F82D, F82E, F82I, F82K, F82L, F82S, F82T, F82W, F82Y, N83A, N83R, T93D, T93E, T93G, T93H, T93K, T93P, T93R, T93S, T93Y, E94K, Q98D, Q98E, Q98K, Q98R, V99E, V99G, V99K, E105N, F108I, F108L, F108V, F108Y, E111D, E111H, E111K, 111N, E111Q, E111R, R112H, R112K, R112N, R112S, R112T, A119P, A119V, G120N, E123N, P129N, P129S, P130A, P130R, 및 A132N으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열과 관련하여 L38N, E50L, E52D, E52N, E52Y, L57E, L57I, L57R, L57T, L57V, Y60D, G68R, K74E, W78Y, L79E, L79F, L79H, L79R, L79S, L79T, L79W, F82D, F82E, F82I, F82K, F82L, F82S, F82T, F82Y, N83R, E94K, 및 V99G로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 E50에 상응하는 위치에서 L 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L38에 상응하는 위치에서 N 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 V99에 상응하는 위치에서 G 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 N83에 상응하는 위치에서 R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 T 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L79에 상응하는 위치에서 H 치환을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 276의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 278의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 I 치환을 포함하고, N83에 상응하는 위치에서 R 치환을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 279의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 332의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 K 치환을 포함하고, N83에 상응하는 위치에서 R 치환을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 333의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 335의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 T 치환을 포함하고, N83에 상응하는 위치에서 R 치환을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 336의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 338의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 T 치환을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 339의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 341의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L79에 상응하는 위치에서 H 치환을 포함하고, F82에 상응하는 위치에서 I 치환을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 342의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 344의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L79에 상응하는 위치에서 H 치환을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 345의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 347의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L79에 상응하는 위치에서 H 치환을 포함하고, F82에 상응하는 위치에서 K 치환을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 348의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 350의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 E50에 상응하는 위치에서 L 치환을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 351의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 353의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L38에 상응하는 위치에서 N 치환을 포함하고, L79에 상응하는 위치에서 R 치환을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 354의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 356의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 V99에 상응하는 위치에서 G 치환을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 동종이량체 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 이종이량체 폴리펩티드이다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 아미노산 20-29 중 어느 하나 (예를 들어, 아미노산 잔기 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 또는 29)에서 시작하여 서열식별번호: 2의 아미노산 109-134 중 어느 하나 (예를 들어, 아미노산 잔기 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 또는 134)에서 종결되는 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열, 및 L38N, E50L, E52N, L57E, L57I, L57R, L57T, L57V, Y60D, G68R, K74E, W78Y, L79F, L79S, L79T, L79W, F82D, F82E, F82L, F82S, F82T, F82Y, N83R, E94K 및 V99G로 이루어진 군으로부터 선택된 서열식별번호: 2의 위치에서의 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 아미노산 20-29 중 어느 하나 (예를 들어, 아미노산 잔기 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 또는 29)에서 시작하여 서열식별번호: 2의 아미노산 109-134 중 어느 하나 (예를 들어, 아미노산 잔기 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 또는 134)에서 종결되는 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열, 및 L38N, E50L, E52D, E52N, E52Y, L57E, L57I, L57R, L57T, L57V, Y60D, G68R, K74E, W78Y, L79E, L79F, L79H, L79R, L79S, L79T, L79W, F82D, F82E, F82I, F82K, F82L, F82S, F82T, F82Y, N83R, E94K, 및 V99G로 이루어진 군으로부터 선택된 서열식별번호: 2의 위치에서의 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 아미노산 29-109와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 아미노산 25-131과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 아미노산 20-134와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 53의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 388의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 389의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열과 관련하여 L38N, E50L, E52D, E52N, E52Y, L57E, L57I, L57R, L57T, L57V, Y60D, G68R, K74E, W78Y, L79E, L79F, L79H, L79R, L79S, L79T, L79W, F82D, F82E, F82I, F82K, F82L, F82S, F82T, F82Y, N83R, E94K, 및 V99G로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 이종다량체 폴리펩티드는 ActRIIA 폴리펩티드 및 ALK4 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종다량체 폴리펩티드는 ActRIIA 폴리펩티드 및 ALK7 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, ALK4 폴리펩티드는 서열식별번호: 84, 85, 86, 87, 88, 89, 92, 93, 247, 249, 421 및 422로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, ALK7 폴리펩티드는 서열식별번호: 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 133 및 134로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 ActRIIB 폴리펩티드 도메인 및 1개 이상의 이종 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, ALK4 폴리펩티드는 ALK4 폴리펩티드 도메인 및 1개 이상의 이종 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, ALK7 폴리펩티드는 ALK7 폴리펩티드 도메인 및 1개 이상의 이종 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, ALK4 폴리펩티드는 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, ALK7 폴리펩티드는 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 ActRIIB 폴리펩티드 도메인과 1개 이상의 이종 도메인 또는 Fc 도메인 사이에 위치한 링커 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 ALK4 폴리펩티드 도메인과 1개 이상의 이종 도메인 또는 Fc 도메인 사이에 위치한 링커 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 ALK7 폴리펩티드 도메인과 1개 이상의 이종 도메인 또는 Fc 도메인 사이에 위치한 링커 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 도메인은 TGGG (서열식별번호: 265), TGGGG (서열식별번호: 263), SGGGG (서열식별번호: 264), GGGGS (서열식별번호: 267), GGG (서열식별번호: 261), GGGG (서열식별번호: 262) 및 SGGG (서열식별번호: 266)로부터 선택된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 이종다량체는 하기로부터 선택된 Fc 도메인을 포함하며: a.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 13의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 13의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; b.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; c.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 15의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 15의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; d.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 16의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 16의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; e.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 이종다량체는 하기로부터 선택된 Fc 도메인을 포함하며: a.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 13의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 13의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; b.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; c.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 15의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 15의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; d.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 16의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 16의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; e.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 이종다량체는 하기로부터 선택된 Fc 도메인을 포함하며: a.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; b) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 이종다량체는 하기로부터 선택된 Fc 도메인을 포함하며: a.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; b.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 이종다량체는 하기로부터 선택된 Fc 도메인을 포함하며: a.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 21의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; b.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 21의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 이종다량체는 하기로부터 선택된 Fc 도메인을 포함하며: a.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 21의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; b.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 21의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 이종다량체는 하기로부터 선택된 Fc 도메인을 포함하며: a.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 22의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; b.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 22의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 이종다량체는 하기로부터 선택된 Fc 도메인을 포함하며: a.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 22의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; b.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 22의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 이종다량체는 하기로부터 선택된 Fc 도메인을 포함하며: a.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 24의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; b.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 24의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 이종다량체는 하기로부터 선택된 Fc 도메인을 포함하며: a.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 24의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; b.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 24의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 이종다량체는 하기로부터 선택된 Fc 도메인을 포함하며: a.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 26의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 27의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; b.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 27의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 26의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 이종다량체는 하기로부터 선택된 Fc 도메인을 포함하며: a.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 26의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 27의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고; b.) ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 27의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 26의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 28의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 29의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 28의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 29의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 138에 글루탐산, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 217에 아스파르트산을 포함하고, 여기서 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 위치 146에 알라닌, 아미노산 위치 162에 아르기닌, 아미노산 위치 179에 아르기닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 138에 글루탐산, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 217에 아스파르트산을 포함하고, 여기서 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 위치 146에 알라닌, 아미노산 위치 162에 아르기닌, 아미노산 위치 179에 아르기닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 28의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 29의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 28의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 29의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 138에 글루탐산, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 217에 아스파르트산을 포함하고, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 위치 146에 알라닌, 아미노산 위치 162에 아르기닌, 아미노산 위치 179에 아르기닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 138에 글루탐산, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 217에 아스파르트산을 포함하고, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 위치 146에 알라닌, 아미노산 위치 162에 아르기닌, 아미노산 위치 179에 아르기닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 30의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 30의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 435에 아르기닌을 포함하고, 여기서 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 아미노산 위치 146에 알라닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 435에 아르기닌을 포함하고, 여기서 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 아미노산 위치 146에 알라닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 30의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 30의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 435에 아르기닌을 포함하고, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 아미노산 위치 146에 알라닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 435에 아르기닌을 포함하고, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 아미노산 위치 146에 알라닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제는 폴리스타틴 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리스타틴 폴리펩티드는 서열식별번호: 390, 391, 392, 393 및 394로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제는 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10, ALK4, ActRIIA 및 ActRIIB로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 리간드를 억제한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제는 항체 또는 항체의 조합물이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항체의 조합물은 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10, ALK4, ActRIIA 및 ActRIIB로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 리간드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 다중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 가레토스맙, 트레보구맙, 스타물루맙, 도마그로주맙, 란도그로주맙 및 비마그루맙으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제는 소분자 또는 소분자의 조합물이다. 일부 실시양태에서, 소분자 또는 소분자의 조합물은 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10, ALK4, ActRIIA, 및 ActRIIB로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 리간드를 억제한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 조합물이다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 조합물은 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10, ALK4, ActRIIA 및 ActRIIB로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 리간드를 억제한다.
도 1은 다중 ActRIIB 및 ActRIIA 결정 구조의 복합 분석에 기초하여, 박스로 표시된 리간드와 직접 접촉하는 것으로 본원에서 추론되는 잔기와 인간 ActRIIB (서열식별번호: 1) 및 인간 ActRIIA (서열식별번호: 367)의 세포외 도메인의 정렬을 보여준다.
도 2는 인간 ActRIIB 전구체 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열식별번호: 2; NCBI 참조 서열 NP_001097.2)을 보여준다. 신호 펩티드는 밑줄로 표시되고, 세포외 도메인은 볼드체로 표시되고 (또한 서열식별번호: 1로도 지칭됨), 잠재적인 N-연결된 글리코실화 부위는 박스로 표시된다. 서열식별번호: 2는 본 개시내용에서 인간 ActRIIB에 대한 야생형 참조 서열로서 사용되고, 본원에 기재된 변이체에 대한 넘버링은 서열식별번호: 2에서의 넘버링에 기초한다.
도 3은 인간 ActRIIB 세포외 도메인 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열식별번호: 1)을 보여준다.
도 4는 인간 ActRIIB 전구체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 보여준다. 서열식별번호: 4는 NCBI 참조 서열 NM_001106.4의 뉴클레오티드 434-1972로 이루어진다.
도 5는 인간 ActRIIB(20-134) 세포외 도메인 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 (서열식별번호: 3)을 보여준다.
도 6은 그의 세포내 도메인이 없는 다양한 척추동물 ActRIIB 전구체 폴리펩티드 (서열식별번호: 358-363), 그의 세포내 도메인이 없는 인간 ActRIIA 전구체 폴리펩티드 (서열식별번호: 364), 및 컨센서스 ActRII 전구체 폴리펩티드 (서열식별번호: 365)의 다중 서열 정렬을 보여준다. 컨센서스 서열 내의 대문자는 보존된 위치를 나타낸다. 컨센서스 서열 내의 소문자는 우세한 형태이지만 그 위치에서 보편적이지 않은 아미노산 잔기를 나타낸다.
도 7은 클러스탈 2.1을 사용한 인간 IgG 이소형으로부터의 Fc 도메인의 다중 서열 정렬을 보여준다. 힌지 영역은 점선 밑줄로 표시된다. 이중 밑줄은 비대칭 쇄 쌍형성을 촉진하기 위해 IgG1 (서열식별번호: 13) Fc에서 조작된 위치 및 다른 이소형 IgG4 (서열식별번호: 17), IgG2 (서열식별번호: 14) 및 IgG3 (서열식별번호: 15)과 관련한 상응하는 위치의 예를 나타낸다.
도 8a 및 도 8b는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 ("X"로 표시됨) 및 ALK4 폴리펩티드 ("Y"로 표시됨) 또는 ALK7 폴리펩티드 ("Y"로 표시됨)를 포함하는 이형체 폴리펩티드 복합체의 개략적인 예를 보여준다. 예시된 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 제1 구성원 ("C1")을 포함하는 융합 폴리펩티드의 일부이고, ALK4 폴리펩티드 또는 ALK7 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 제2 구성원 ("C2")을 포함하는 융합 폴리펩티드의 일부이다. 적합한 상호작용 쌍은, 예를 들어 중쇄 및/또는 경쇄 이뮤노글로불린 상호작용 쌍, 말단절단, 및 그의 변이체, 예컨대 본원에 기재된 것을 포함한다 [예를 들어, Spiess et al., (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106]. 각각의 융합 폴리펩티드에서, 링커는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드 또는 ALK7 폴리펩티드 및 상호작용 쌍의 상응하는 구성원 사이에 위치할 수 있다. 상호작용 쌍의 제1 및 제2 구성원은 안내되지 않을 수 있으며, 이는 쌍의 구성원이 실질적 선호도 없이 서로 회합할 수 있거나 또는 자기-회합할 수 있고, 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다는 것을 의미한다. 도 8a를 참조한다. 대안적으로, 상호작용 쌍은 안내된 (비대칭) 쌍일 수 있으며, 이는 쌍의 구성원이 자기-회합보다는 서로 우선적으로 회합한다는 것을 의미한다. 도 8b를 참조한다.
도 9는 다양한 척추동물 ALK4 단백질 및 인간 ALK4의 다중 서열 정렬을 보여준다 (서열식별번호: 414-420).
도 10은 다양한 척추동물 ActRIIA 단백질 및 인간 ActRIIA의 다중 서열 정렬을 보여준다 (서열식별번호: 367, 371-377).
도 11a 및 11b는 유형 I 수용체 및 유형 II 수용체 폴리펩티드를 포함하는 이형체 단백질 복합체의 2개의 개략적인 예를 보여준다. 도 11a는 1개의 유형 I 수용체 융합 폴리펩티드 및 1개의 유형 II 수용체 융합 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체 단백질 복합체를 도시하고, 이는 각각의 폴리펩티드 쇄 내에 함유된 다량체화 도메인을 통해 공유 또는 비공유 어셈블리될 수 있다. 2개의 어셈블리된 다량체화 도메인은 안내되거나 또는 안내되지 않을 수 있는 상호작용 쌍을 구성한다. 도 11b는 도 11a에 도시된 바와 같은 2개의 이종이량체 복합체를 포함하는 이종사량체 단백질 복합체를 도시한다. 보다 고차의 복합체가 고려될 수 있다.
도 12는 유형 I 수용체 폴리펩티드 ("I"로 표시됨) (예를 들어, 인간 또는 다른 종, 예컨대 본원에 기재된 것으로부터의 ALK4 단백질의 세포외 도메인과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드) 및 유형 II 수용체 폴리펩티드 ("II"로 표시됨) (예를 들어, 인간 또는 다른 종, 예컨대 본원에 기재된 것으로부터의 ActRIIB 단백질의 세포외 도메인과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드)를 포함하는 이형체 단백질 복합체의 개략적인 예를 보여준다. 예시된 실시양태에서, 유형 I 수용체 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 제1 구성원 ("C1")을 포함하는 융합 폴리펩티드의 일부이고, 유형 II 수용체 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 제2 구성원 ("C2")을 포함하는 융합 폴리펩티드의 일부이다. 각각의 융합 폴리펩티드에서, 링커는 유형 I 또는 유형 II 수용체 폴리펩티드 및 상호작용 쌍의 상응하는 구성원 사이에 위치할 수 있다. 상호작용 쌍의 제1 및 제2 구성원은 안내된 (비대칭) 쌍일 수 있으며, 이는 쌍의 구성원이 자기-회합보다는 서로 우선적으로 회합한다는 것을 의미하거나, 또는 상호작용 쌍은 안내되지 않을 수 있으며, 이는 쌍의 구성원이 실질적 선호도 없이 서로 회합할 수 있거나 또는 자기-회합할 수 있고, 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다는 것을 의미한다. 전통적인 Fc 융합 단백질 및 항체는 안내되지 않은 상호작용 쌍의 예인 반면, 다양한 조작된 Fc 도메인은 안내된 (비대칭) 상호작용 쌍으로서 설계되었다 [예를 들어, Spiess et al., (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106].
도 13a-13d는 ALK4 폴리펩티드 (예를 들어, 인간 또는 다른 종, 예컨대 본원에 기재된 것으로부터의 ALK4 단백질의 세포외 도메인과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드) 및 ActRIIB 폴리펩티드 (예를 들어, 인간 또는 다른 종, 예컨대 본원에 기재된 것으로부터의 ActRIIB 단백질의 세포외 도메인과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드)를 포함하는 이형체 단백질 복합체의 개략적인 예를 보여준다. 예시된 실시양태에서, ALK4 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 제1 구성원 ("C1")을 포함하는 융합 폴리펩티드의 일부이고, ActRIIB 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 제2 구성원 ("C2")을 포함하는 융합 폴리펩티드의 일부이다. 적합한 상호작용 쌍은, 예를 들어 중쇄 및/또는 경쇄 이뮤노글로불린 상호작용 쌍, 말단절단, 및 그의 변이체, 예컨대 본원에 기재된 것을 포함하였다 [예를 들어, Spiess et al., (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106]. 각각의 융합 폴리펩티드에서, 링커는 ALK4 또는 ActRIIB 폴리펩티드 및 상호작용 쌍의 상응하는 구성원 사이에 위치할 수 있다. 상호작용 쌍의 제1 및 제2 구성원은 안내되지 않을 수 있으며, 이는 쌍의 구성원이 실질적 선호도 없이 서로 회합할 수 있거나 또는 자기-회합할 수 있고, 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다는 것을 의미한다. 도 13a를 참조한다. 대안적으로, 상호작용 쌍은 안내된 (비대칭) 쌍일 수 있으며, 이는 쌍의 구성원이 자기-회합보다는 서로 우선적으로 회합한다는 것을 의미한다. 도 13b를 참조한다. 보다 고차의 복합체가 고려될 수 있다. 도 13c 및 13d를 참조한다.
도 14는 CHO 세포에서 발현된 ActRIIA-hFc의 정제를 보여준다. 단백질은 크기결정 칼럼 (상부 패널) 및 쿠마시 염색된 SDS-PAGE (하부 패널)에 의해 가시화된 바와 같이 단일의, 잘 규정된 피크로서 정제된다 (좌측 레인: 분자량 표준물; 우측 레인: ActRIIA-hFc).
도 15는 비아코어(Biacore)™ 검정에 의해 측정된 바와 같은, 액티빈 (상부 패널) 및 GDF-11 (하부 패널)에 대한 ActRIIA-hFc의 결합을 보여준다.
도 16a 및 도 16b는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 바와 같은, 변이체 또는 비변형된 ActRIIB 도메인을 포함하는 동종이량체 Fc-융합 폴리펩티드의 리간드 결합 동역학에 대한 값을 보여준다. 아미노산 넘버링은 서열식별번호: 2에 기초한다. ND#는 값이 시험된 농도 범위에 걸쳐 검출가능하지 않음을 나타낸다. 일시적*은 값이 상호작용의 일시적 성질로 인해 불확실함을 나타낸다. 대조군 샘플은 ActRIIB-G1Fc (서열식별번호: 5)이다.
도 17은 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 바와 같은, 변이체 또는 비변형된 ActRIIB 도메인을 포함하는 동종이량체 Fc-융합 폴리펩티드의 리간드 결합 동역학에 대한 값을 보여준다. 아미노산 넘버링은 서열식별번호: 2에 기초한다. ND#는 값이 시험된 농도 범위에 걸쳐 검출가능하지 않음을 나타낸다. 일시적 결합*은 값이 상호작용의 일시적 성질로 인해 불확실함을 나타낸다. 대조군 샘플은 ActRIIB-G1Fc (서열식별번호: 5)이다.
도 18은 25℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 바와 같은, 변이체 또는 비변형된 ActRIIB 도메인을 포함하는 동종이량체 Fc-융합 폴리펩티드의 리간드 결합 동역학에 대한 값을 보여준다. ND#는 값이 시험된 농도 범위에 걸쳐 검출가능하지 않음을 나타낸다. 아미노산 넘버링은 서열식별번호: 2에 기초한다.
도 19는 ActRIIB-Fc 동종이량체 및 ALK4-Fc 동종이량체와 비교한, ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이종이량체 단백질 복합체에 대한 비교 리간드 결합 데이터를 보여준다. 각각의 단백질 복합체에 대해, 리간드는 리간드 신호전달 억제와 잘 상관되는 동역학 상수인 koff에 의해 순위화되고, 결합 친화도의 내림차순으로 열거된다 (가장 단단하게 결합된 리간드가 상부에 열거됨). 좌측의, 황색, 적색, 녹색 및 청색 선은 오프-레이트 상수의 크기를 나타낸다. 흑색 실선은 이종이량체에 대한 결합이 동종이량체와 비교하여 증진되거나 변하지 않은 리간드를 나타내는 반면, 적색 파선은 동종이량체와 비교하여 실질적으로 감소된 결합을 나타낸다. 제시된 바와 같이, ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이종이량체는 어느 하나의 동종이량체와 비교하여 액티빈 B에 대해 증진된 결합을 나타내고, ActRIIB-Fc 동종이량체에 의해 관찰된 바와 같은 액티빈 A, GDF8, 및 GDF11에 대한 강한 결합을 보유하고, BMP9, BMP10, 및 GDF3에 대한 실질적으로 감소된 결합을 나타낸다. ActRIIB-Fc 동종이량체와 같이, 이종이량체는 BMP6에 대한 중간-수준 결합을 보유한다.
도 20은 본원에 기재된 바와 같은 A-204 리포터 유전자 검정에 의해 결정된 바와 같은 비교 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이종이량체/ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc 동종이량체 IC50 데이터를 보여준다. ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이종이량체는 ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc 동종이량체와 유사하게 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, 및 GDF11 신호전달 경로를 억제한다. 그러나, BMP9 및 BMP10 신호전달 경로의 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이종이량체 억제는 ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc 동종이량체와 비교하여 유의하게 감소된다. 이들 데이터는 ActRIIB:ALK4 이종이량체가 상응하는 ActRIIB:ActRIIB 동종이량체와 비교하여 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, 및 GDF11의 보다 선택적인 길항제임을 입증한다.
도 21은 ActRIIB-Fc 동종이량체 및 ALK7-Fc 동종이량체와 비교한, ActRIIB-Fc:ALK7-Fc 이종이량체 단백질 복합체에 대한 비교 리간드 결합 데이터를 보여준다. 각각의 단백질 복합체에 대해, 리간드는 리간드 신호전달 억제와 잘 상관되는 동역학 상수인 koff에 의해 순위화되고, 결합 친화도의 내림차순으로 열거된다 (가장 단단하게 결합된 리간드가 상부에 열거됨). 좌측의, 황색, 적색, 녹색 및 청색 선은 오프-레이트 상수의 크기를 나타낸다. 흑색 실선은 이종이량체에 대한 결합이 동종이량체와 비교하여 증진되거나 변하지 않은 리간드를 나타내는 반면, 적색 파선은 동종이량체와 비교하여 실질적으로 감소된 결합을 나타낸다. 제시된 바와 같이, ActRIIB-Fc 동종이량체에 대해 강한 결합을 갖는 5종의 리간드 중 4종 (액티빈 A, BMP10, GDF8, 및 GDF11)은 ActRIIB-Fc:ALK7-Fc 이종이량체에 대해 감소된 결합을 나타내며, 예외는 이종이량체에 대해 단단한 결합을 보유하는 액티빈 B이다. 유사하게, ActRIIB-Fc 동종이량체에 대해 중간 결합을 갖는 4종의 리간드 중 3종 (GDF3, BMP6, 및 특히 BMP9)은 ActRIIB-Fc:ALK7-Fc 이종이량체에 대해 감소된 결합을 나타내는 반면, 액티빈 AC에 대한 결합은 전체적으로 이종이량체와의 두번째로 가장 강한 리간드 상호작용이 되도록 증가된다. 마지막으로, 액티빈 C 및 BMP5는 예상외로, ActRIIB-Fc 동종이량체에 대해서는 결합이 없거나 (액티빈 C) 약한 결합 (BMP5)임에도 불구하고, ActRIIB-Fc:ALK7 이종이량체에 중간 강도로 결합한다. 어떠한 시험된 리간드도 ALK7-Fc 동종이량체에는 결합하지 않는다.
도 22는 다양한 척추동물 종으로부터 유래된 ALK7 세포외 도메인의 다중 서열 정렬을 보여준다 (서열식별번호: 425-430).
도 23 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc는 노화된 심장에서 LV 재형성 동안 심장 확장기 기능장애를 구제하였다. 24-개월령의 ("노령") 13마리의 수컷 마우스 및 4-개월령의 ("어린") 10마리의 마우스를 연구하였다. "노령" 및 "어린" 마우스 군에게 포스페이트-완충 염수 (PBS)를 8주 동안 1주에 2회 피하로 제공하였다 ("어린-비히클" 또는 "노령-비히클"). 또 다른 군의 "노령" 마우스에게는 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc (10 mg/kg)를 8주 동안 1주에 2회 피하로 제공하였다 ("노령-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc"). 투여된 비히클의 부피 및 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc의 부피는 동일하였다. 확장기 기능장애의 측정치인 E/e'는 "어린-비히클" 마우스 (n=10, p<0.01)와 비교하여 "노령-비히클" (n=7) 마우스에서 증가되었다. "노령-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc" 마우스에서의 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 처리는 E/e'를 유의하게 감소시켰다 (n=6, p<0.05).
도 2는 인간 ActRIIB 전구체 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열식별번호: 2; NCBI 참조 서열 NP_001097.2)을 보여준다. 신호 펩티드는 밑줄로 표시되고, 세포외 도메인은 볼드체로 표시되고 (또한 서열식별번호: 1로도 지칭됨), 잠재적인 N-연결된 글리코실화 부위는 박스로 표시된다. 서열식별번호: 2는 본 개시내용에서 인간 ActRIIB에 대한 야생형 참조 서열로서 사용되고, 본원에 기재된 변이체에 대한 넘버링은 서열식별번호: 2에서의 넘버링에 기초한다.
도 3은 인간 ActRIIB 세포외 도메인 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열식별번호: 1)을 보여준다.
도 4는 인간 ActRIIB 전구체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 보여준다. 서열식별번호: 4는 NCBI 참조 서열 NM_001106.4의 뉴클레오티드 434-1972로 이루어진다.
도 5는 인간 ActRIIB(20-134) 세포외 도메인 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 (서열식별번호: 3)을 보여준다.
도 6은 그의 세포내 도메인이 없는 다양한 척추동물 ActRIIB 전구체 폴리펩티드 (서열식별번호: 358-363), 그의 세포내 도메인이 없는 인간 ActRIIA 전구체 폴리펩티드 (서열식별번호: 364), 및 컨센서스 ActRII 전구체 폴리펩티드 (서열식별번호: 365)의 다중 서열 정렬을 보여준다. 컨센서스 서열 내의 대문자는 보존된 위치를 나타낸다. 컨센서스 서열 내의 소문자는 우세한 형태이지만 그 위치에서 보편적이지 않은 아미노산 잔기를 나타낸다.
도 7은 클러스탈 2.1을 사용한 인간 IgG 이소형으로부터의 Fc 도메인의 다중 서열 정렬을 보여준다. 힌지 영역은 점선 밑줄로 표시된다. 이중 밑줄은 비대칭 쇄 쌍형성을 촉진하기 위해 IgG1 (서열식별번호: 13) Fc에서 조작된 위치 및 다른 이소형 IgG4 (서열식별번호: 17), IgG2 (서열식별번호: 14) 및 IgG3 (서열식별번호: 15)과 관련한 상응하는 위치의 예를 나타낸다.
도 8a 및 도 8b는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 ("X"로 표시됨) 및 ALK4 폴리펩티드 ("Y"로 표시됨) 또는 ALK7 폴리펩티드 ("Y"로 표시됨)를 포함하는 이형체 폴리펩티드 복합체의 개략적인 예를 보여준다. 예시된 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 제1 구성원 ("C1")을 포함하는 융합 폴리펩티드의 일부이고, ALK4 폴리펩티드 또는 ALK7 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 제2 구성원 ("C2")을 포함하는 융합 폴리펩티드의 일부이다. 적합한 상호작용 쌍은, 예를 들어 중쇄 및/또는 경쇄 이뮤노글로불린 상호작용 쌍, 말단절단, 및 그의 변이체, 예컨대 본원에 기재된 것을 포함한다 [예를 들어, Spiess et al., (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106]. 각각의 융합 폴리펩티드에서, 링커는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드 또는 ALK7 폴리펩티드 및 상호작용 쌍의 상응하는 구성원 사이에 위치할 수 있다. 상호작용 쌍의 제1 및 제2 구성원은 안내되지 않을 수 있으며, 이는 쌍의 구성원이 실질적 선호도 없이 서로 회합할 수 있거나 또는 자기-회합할 수 있고, 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다는 것을 의미한다. 도 8a를 참조한다. 대안적으로, 상호작용 쌍은 안내된 (비대칭) 쌍일 수 있으며, 이는 쌍의 구성원이 자기-회합보다는 서로 우선적으로 회합한다는 것을 의미한다. 도 8b를 참조한다.
도 9는 다양한 척추동물 ALK4 단백질 및 인간 ALK4의 다중 서열 정렬을 보여준다 (서열식별번호: 414-420).
도 10은 다양한 척추동물 ActRIIA 단백질 및 인간 ActRIIA의 다중 서열 정렬을 보여준다 (서열식별번호: 367, 371-377).
도 11a 및 11b는 유형 I 수용체 및 유형 II 수용체 폴리펩티드를 포함하는 이형체 단백질 복합체의 2개의 개략적인 예를 보여준다. 도 11a는 1개의 유형 I 수용체 융합 폴리펩티드 및 1개의 유형 II 수용체 융합 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체 단백질 복합체를 도시하고, 이는 각각의 폴리펩티드 쇄 내에 함유된 다량체화 도메인을 통해 공유 또는 비공유 어셈블리될 수 있다. 2개의 어셈블리된 다량체화 도메인은 안내되거나 또는 안내되지 않을 수 있는 상호작용 쌍을 구성한다. 도 11b는 도 11a에 도시된 바와 같은 2개의 이종이량체 복합체를 포함하는 이종사량체 단백질 복합체를 도시한다. 보다 고차의 복합체가 고려될 수 있다.
도 12는 유형 I 수용체 폴리펩티드 ("I"로 표시됨) (예를 들어, 인간 또는 다른 종, 예컨대 본원에 기재된 것으로부터의 ALK4 단백질의 세포외 도메인과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드) 및 유형 II 수용체 폴리펩티드 ("II"로 표시됨) (예를 들어, 인간 또는 다른 종, 예컨대 본원에 기재된 것으로부터의 ActRIIB 단백질의 세포외 도메인과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드)를 포함하는 이형체 단백질 복합체의 개략적인 예를 보여준다. 예시된 실시양태에서, 유형 I 수용체 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 제1 구성원 ("C1")을 포함하는 융합 폴리펩티드의 일부이고, 유형 II 수용체 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 제2 구성원 ("C2")을 포함하는 융합 폴리펩티드의 일부이다. 각각의 융합 폴리펩티드에서, 링커는 유형 I 또는 유형 II 수용체 폴리펩티드 및 상호작용 쌍의 상응하는 구성원 사이에 위치할 수 있다. 상호작용 쌍의 제1 및 제2 구성원은 안내된 (비대칭) 쌍일 수 있으며, 이는 쌍의 구성원이 자기-회합보다는 서로 우선적으로 회합한다는 것을 의미하거나, 또는 상호작용 쌍은 안내되지 않을 수 있으며, 이는 쌍의 구성원이 실질적 선호도 없이 서로 회합할 수 있거나 또는 자기-회합할 수 있고, 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다는 것을 의미한다. 전통적인 Fc 융합 단백질 및 항체는 안내되지 않은 상호작용 쌍의 예인 반면, 다양한 조작된 Fc 도메인은 안내된 (비대칭) 상호작용 쌍으로서 설계되었다 [예를 들어, Spiess et al., (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106].
도 13a-13d는 ALK4 폴리펩티드 (예를 들어, 인간 또는 다른 종, 예컨대 본원에 기재된 것으로부터의 ALK4 단백질의 세포외 도메인과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드) 및 ActRIIB 폴리펩티드 (예를 들어, 인간 또는 다른 종, 예컨대 본원에 기재된 것으로부터의 ActRIIB 단백질의 세포외 도메인과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드)를 포함하는 이형체 단백질 복합체의 개략적인 예를 보여준다. 예시된 실시양태에서, ALK4 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 제1 구성원 ("C1")을 포함하는 융합 폴리펩티드의 일부이고, ActRIIB 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 제2 구성원 ("C2")을 포함하는 융합 폴리펩티드의 일부이다. 적합한 상호작용 쌍은, 예를 들어 중쇄 및/또는 경쇄 이뮤노글로불린 상호작용 쌍, 말단절단, 및 그의 변이체, 예컨대 본원에 기재된 것을 포함하였다 [예를 들어, Spiess et al., (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106]. 각각의 융합 폴리펩티드에서, 링커는 ALK4 또는 ActRIIB 폴리펩티드 및 상호작용 쌍의 상응하는 구성원 사이에 위치할 수 있다. 상호작용 쌍의 제1 및 제2 구성원은 안내되지 않을 수 있으며, 이는 쌍의 구성원이 실질적 선호도 없이 서로 회합할 수 있거나 또는 자기-회합할 수 있고, 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다는 것을 의미한다. 도 13a를 참조한다. 대안적으로, 상호작용 쌍은 안내된 (비대칭) 쌍일 수 있으며, 이는 쌍의 구성원이 자기-회합보다는 서로 우선적으로 회합한다는 것을 의미한다. 도 13b를 참조한다. 보다 고차의 복합체가 고려될 수 있다. 도 13c 및 13d를 참조한다.
도 14는 CHO 세포에서 발현된 ActRIIA-hFc의 정제를 보여준다. 단백질은 크기결정 칼럼 (상부 패널) 및 쿠마시 염색된 SDS-PAGE (하부 패널)에 의해 가시화된 바와 같이 단일의, 잘 규정된 피크로서 정제된다 (좌측 레인: 분자량 표준물; 우측 레인: ActRIIA-hFc).
도 15는 비아코어(Biacore)™ 검정에 의해 측정된 바와 같은, 액티빈 (상부 패널) 및 GDF-11 (하부 패널)에 대한 ActRIIA-hFc의 결합을 보여준다.
도 16a 및 도 16b는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 바와 같은, 변이체 또는 비변형된 ActRIIB 도메인을 포함하는 동종이량체 Fc-융합 폴리펩티드의 리간드 결합 동역학에 대한 값을 보여준다. 아미노산 넘버링은 서열식별번호: 2에 기초한다. ND#는 값이 시험된 농도 범위에 걸쳐 검출가능하지 않음을 나타낸다. 일시적*은 값이 상호작용의 일시적 성질로 인해 불확실함을 나타낸다. 대조군 샘플은 ActRIIB-G1Fc (서열식별번호: 5)이다.
도 17은 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 바와 같은, 변이체 또는 비변형된 ActRIIB 도메인을 포함하는 동종이량체 Fc-융합 폴리펩티드의 리간드 결합 동역학에 대한 값을 보여준다. 아미노산 넘버링은 서열식별번호: 2에 기초한다. ND#는 값이 시험된 농도 범위에 걸쳐 검출가능하지 않음을 나타낸다. 일시적 결합*은 값이 상호작용의 일시적 성질로 인해 불확실함을 나타낸다. 대조군 샘플은 ActRIIB-G1Fc (서열식별번호: 5)이다.
도 18은 25℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 바와 같은, 변이체 또는 비변형된 ActRIIB 도메인을 포함하는 동종이량체 Fc-융합 폴리펩티드의 리간드 결합 동역학에 대한 값을 보여준다. ND#는 값이 시험된 농도 범위에 걸쳐 검출가능하지 않음을 나타낸다. 아미노산 넘버링은 서열식별번호: 2에 기초한다.
도 19는 ActRIIB-Fc 동종이량체 및 ALK4-Fc 동종이량체와 비교한, ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이종이량체 단백질 복합체에 대한 비교 리간드 결합 데이터를 보여준다. 각각의 단백질 복합체에 대해, 리간드는 리간드 신호전달 억제와 잘 상관되는 동역학 상수인 koff에 의해 순위화되고, 결합 친화도의 내림차순으로 열거된다 (가장 단단하게 결합된 리간드가 상부에 열거됨). 좌측의, 황색, 적색, 녹색 및 청색 선은 오프-레이트 상수의 크기를 나타낸다. 흑색 실선은 이종이량체에 대한 결합이 동종이량체와 비교하여 증진되거나 변하지 않은 리간드를 나타내는 반면, 적색 파선은 동종이량체와 비교하여 실질적으로 감소된 결합을 나타낸다. 제시된 바와 같이, ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이종이량체는 어느 하나의 동종이량체와 비교하여 액티빈 B에 대해 증진된 결합을 나타내고, ActRIIB-Fc 동종이량체에 의해 관찰된 바와 같은 액티빈 A, GDF8, 및 GDF11에 대한 강한 결합을 보유하고, BMP9, BMP10, 및 GDF3에 대한 실질적으로 감소된 결합을 나타낸다. ActRIIB-Fc 동종이량체와 같이, 이종이량체는 BMP6에 대한 중간-수준 결합을 보유한다.
도 20은 본원에 기재된 바와 같은 A-204 리포터 유전자 검정에 의해 결정된 바와 같은 비교 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이종이량체/ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc 동종이량체 IC50 데이터를 보여준다. ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이종이량체는 ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc 동종이량체와 유사하게 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, 및 GDF11 신호전달 경로를 억제한다. 그러나, BMP9 및 BMP10 신호전달 경로의 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이종이량체 억제는 ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc 동종이량체와 비교하여 유의하게 감소된다. 이들 데이터는 ActRIIB:ALK4 이종이량체가 상응하는 ActRIIB:ActRIIB 동종이량체와 비교하여 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, 및 GDF11의 보다 선택적인 길항제임을 입증한다.
도 21은 ActRIIB-Fc 동종이량체 및 ALK7-Fc 동종이량체와 비교한, ActRIIB-Fc:ALK7-Fc 이종이량체 단백질 복합체에 대한 비교 리간드 결합 데이터를 보여준다. 각각의 단백질 복합체에 대해, 리간드는 리간드 신호전달 억제와 잘 상관되는 동역학 상수인 koff에 의해 순위화되고, 결합 친화도의 내림차순으로 열거된다 (가장 단단하게 결합된 리간드가 상부에 열거됨). 좌측의, 황색, 적색, 녹색 및 청색 선은 오프-레이트 상수의 크기를 나타낸다. 흑색 실선은 이종이량체에 대한 결합이 동종이량체와 비교하여 증진되거나 변하지 않은 리간드를 나타내는 반면, 적색 파선은 동종이량체와 비교하여 실질적으로 감소된 결합을 나타낸다. 제시된 바와 같이, ActRIIB-Fc 동종이량체에 대해 강한 결합을 갖는 5종의 리간드 중 4종 (액티빈 A, BMP10, GDF8, 및 GDF11)은 ActRIIB-Fc:ALK7-Fc 이종이량체에 대해 감소된 결합을 나타내며, 예외는 이종이량체에 대해 단단한 결합을 보유하는 액티빈 B이다. 유사하게, ActRIIB-Fc 동종이량체에 대해 중간 결합을 갖는 4종의 리간드 중 3종 (GDF3, BMP6, 및 특히 BMP9)은 ActRIIB-Fc:ALK7-Fc 이종이량체에 대해 감소된 결합을 나타내는 반면, 액티빈 AC에 대한 결합은 전체적으로 이종이량체와의 두번째로 가장 강한 리간드 상호작용이 되도록 증가된다. 마지막으로, 액티빈 C 및 BMP5는 예상외로, ActRIIB-Fc 동종이량체에 대해서는 결합이 없거나 (액티빈 C) 약한 결합 (BMP5)임에도 불구하고, ActRIIB-Fc:ALK7 이종이량체에 중간 강도로 결합한다. 어떠한 시험된 리간드도 ALK7-Fc 동종이량체에는 결합하지 않는다.
도 22는 다양한 척추동물 종으로부터 유래된 ALK7 세포외 도메인의 다중 서열 정렬을 보여준다 (서열식별번호: 425-430).
도 23 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc는 노화된 심장에서 LV 재형성 동안 심장 확장기 기능장애를 구제하였다. 24-개월령의 ("노령") 13마리의 수컷 마우스 및 4-개월령의 ("어린") 10마리의 마우스를 연구하였다. "노령" 및 "어린" 마우스 군에게 포스페이트-완충 염수 (PBS)를 8주 동안 1주에 2회 피하로 제공하였다 ("어린-비히클" 또는 "노령-비히클"). 또 다른 군의 "노령" 마우스에게는 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc (10 mg/kg)를 8주 동안 1주에 2회 피하로 제공하였다 ("노령-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc"). 투여된 비히클의 부피 및 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc의 부피는 동일하였다. 확장기 기능장애의 측정치인 E/e'는 "어린-비히클" 마우스 (n=10, p<0.01)와 비교하여 "노령-비히클" (n=7) 마우스에서 증가되었다. "노령-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc" 마우스에서의 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 처리는 E/e'를 유의하게 감소시켰다 (n=6, p<0.05).
1. 개관
특정 측면에서, 본 개시내용은 심부전을 치료하기 위해 TGF-β 슈퍼패밀리 리간드 길항제, 특히 ActRII-ALK4 길항제를 사용하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ActRII-ALK4 길항제는 노화와 연관된 심부전 또는 노화와 연관된 심부전의 1종 이상의 합병증을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 데 사용될 수 있다.
심부전 (HF)은 구조적 및/또는 기능적 심장 이상에 의해 유발된 상승된 경정맥압, 폐 수포음 및 말초 부종을 포함하는 징후를 동반할 수 있는, 호흡곤란, 발목 종창 및 피로를 포함하는 증상을 특징으로 하는 임상 증후군이다. HF는 전형적으로 휴식 시 또는 스트레스 동안 감소된 심장 박출량 및/또는 상승된 심장내 압력을 유발한다.
임상 증상이 명백해지기 전에, 환자는 HF의 전조인 무증상 구조적 또는 기능적 심장 이상 (예를 들어, 수축기 또는 확장기 좌심실 (LV) 기능장애)을 나타낼 수 있다. 이들 전조의 인식은 이들이 불량한 결과와 관련되기 때문에 중요하고, 전조 단계에서 치료를 시작하는 것은 무증상 수축기 LV 기능장애를 갖는 환자에서 사망률을 감소시킬 수 있다.
기저 심장성 원인의 입증은 HF의 진단에 중요하다. 이는 통상적으로 수축기 및/또는 확장기 심실 기능장애를 유발하는 심근 이상을 포함한다. 그러나, 판막, 심막, 심내막, 심장 리듬 및 전도의 이상이 또한 HF를 유발할 수 있다 (그리고 1종 초과의 이상이 종종 존재함). 정확한 병리상태는 사용되는 특이적 치료를 결정하기 때문에 (예를 들어, 판막성 질환의 경우 판막 복구 또는 대체, 감소된 EF를 갖는 HF의 경우 특이적 약리학적 요법, 빈맥성 심근병증에서 심박수의 감소 등), 기저 심장성 문제를 확인하는 것은 치료 이유로 중요하다.
TGF-β 슈퍼패밀리 리간드 신호는 리간드 자극 시 하류 Smad 단백질을 인산화하고 활성화시키는 유형 I 및 유형 II 세린/트레오닌 키나제 수용체의 이형체 복합체에 의해 매개된다 (Massague, 2000, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1:169-178). 이들 유형 I 및 유형 II 수용체는 시스테인-풍부 영역을 갖는 리간드-결합 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 및 예측된 세린/트레오닌 키나제 특이성을 갖는 세포질 도메인으로 구성된 모든 막횡단 폴리펩티드이다. 유형 I 수용체는 신호전달에 필수적이고, 유형 II 수용체는 리간드 결합에 요구된다. 유형 I 및 유형 II 액티빈 수용체는 리간드 결합 후에 안정한 복합체를 형성하여, 유형 II 수용체에 의한 유형 I 수용체의 인산화를 발생시킨다.
2종의 관련된 유형 II 수용체, ActRIIA 및 ActRIIB는 액티빈에 대한 유형 II 수용체로서 확인되었다 (Mathews and Vale, 1991, Cell 65:973-982; Attisano et al., 1992, Cell 68: 97-108). 액티빈 이외에, ActRIIA 및 ActRIIB는 BMP7, 노달, GDF8, 및 GDF11을 비롯한 여러 다른 TGF-β 패밀리 단백질과 생화학적으로 상호작용할 수 있다 (Yamashita et al., 1995, J. Cell Biol. 130:217-226; Lee and McPherron, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 98:9306-9311; Yeo and Whitman, 2001, Mol. Cell 7: 949-957; Oh et al., 2002, Genes Dev. 16:2749-54). 본 출원인은 가용성 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드가 생체내에서 실질적으로 상이한 효과를 가지며, ActRIIA-Fc는 골에 대한 1차 효과를 갖고 ActRIIB-Fc는 골격근에 대한 1차 효과를 갖는다는 것을 발견하였다.
TGF-베타 슈퍼패밀리의 리간드는 하나의 단량체의 중심 3-1/2 턴 헬릭스가 다른 단량체의 베타-가닥에 의해 형성된 오목한 표면에 대해 패킹된 동일한 이량체 구조를 공유한다. 대부분의 TGF-베타 패밀리 구성원은 분자간 디술피드 결합에 의해 추가로 안정화된다. 이러한 디술피드 결합은 2개의 다른 디술피드 결합에 의해 형성된 고리를 통해 횡단하여 '시스테인 노트' 모티프로 명명된 것을 생성한다 [Lin et al., (2006) Reproduction 132: 179-190; 및 Hinck et al., (2012) FEBS Letters 586: 1860-1870].
액티빈은 TGF-베타 수퍼패밀리의 구성원이고, 처음에는 여포-자극 호르몬의 분비의 조절인자로서 발견되었지만, 후속해서 다양한 생식 및 비-생식 역할이 특징화되었다. 2개의 밀접하게 관련된 β 서브유닛의 동종/이종이량체인 3종의 주요 액티빈 형태 (A, B 및 AB)가 존재한다 (각각 βAβA, βBβB, 및 βAβB). 인간 게놈은 또한 간에서 주로 발현되는 액티빈 C 및 액티빈 E를 코딩하고, βC 또는 βE를 함유하는 이종이량체 형태가 또한 공지되어 있다. TGF-베타 슈퍼패밀리에서, 액티빈은 난소 및 태반 세포에서 호르몬 생산을 자극하고, 뉴런 세포 생존을 지지하고, 세포 유형에 따라 세포-주기 진행에 긍정적으로 또는 부정적으로 영향을 미치고, 적어도 양서류 배아에서 중배엽 분화를 유도할 수 있는 독특하고 다중기능적인 인자이다 [DePaolo et al., (1991) Proc Soc Ep Biol Med. 198:500-512; Dyson et al., (1997) Curr Biol. 7:81-84; 및 Woodruff (1998) Biochem Pharmacol. 55:953-963]. 여러 조직에서, 액티빈 신호전달은 그의 관련 이종이량체인 인히빈에 의해 길항된다. 예를 들어, 뇌하수체로부터의 여포-자극 호르몬 (FSH) 분비의 조절에서, 액티빈은 FSH 합성 및 분비를 촉진하는 한편, 인히빈은 FSH 합성 및 분비를 감소시킨다. 액티빈 생물활성을 조절할 수 있고/거나 액티빈에 결합할 수 있는 다른 단백질은 폴리스타틴 (FS) 및 α2-마크로글로불린을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, "액티빈 A"에 결합하는 작용제는, 단리된 βA 서브유닛의 맥락에서든 또는 이량체 복합체 (예를 들어, βAβA 동종이량체 또는 βAβB 이종이량체)로서든, βA 서브유닛에 특이적으로 결합하는 작용제이다. 이종이량체 복합체 (예를 들어, βAβB 이종이량체)의 경우에, "액티빈 A"에 결합하는 작용제는 βA 서브유닛 내에 존재하는 에피토프에 특이적이지만, 복합체의 비-βA 서브유닛 (예를 들어, 복합체의 βB 서브유닛) 내에 존재하는 에피토프에는 결합하지 않는다. 유사하게, "액티빈 A"를 길항 (억제)하는 본원에 개시된 작용제는, 단리된 βA 서브유닛의 맥락에서든 또는 이량체 복합체 (예를 들어, βAβA 동종이량체 또는 βAβB 이종이량체)로서든, βA 서브유닛에 의해 매개되는 바와 같은 1종 이상의 활성을 억제하는 작용제이다. βAβB 이종이량체의 경우에, "액티빈 A"를 억제하는 작용제는 βA 서브유닛의 1종 이상의 활성을 특이적으로 억제하지만, 복합체의 비-βA 서브유닛 (예를 들어, 복합체의 βB 서브유닛)의 활성은 억제하지 않는 작용제이다. 이러한 원리는 또한 "액티빈 B", "액티빈 C" 및 "액티빈 E"에 결합하고/거나 이를 억제하는 작용제에 적용된다. "액티빈 AB"를 길항하는 본원에 개시된 작용제는 βA 서브유닛에 의해 매개되는 바와 같은 1종 이상의 활성 및 βB 서브유닛에 의해 매개되는 바와 같은 1종 이상의 활성을 억제하는 작용제이다.
BMP 및 GDF는 함께 TGF-베타 슈퍼패밀리의 특징적인 폴드를 공유하는 시스테인-노트 시토카인의 패밀리를 형성한다 [Rider et al., (2010) Biochem J., 429(1):1-12]. 이러한 패밀리는, 예를 들어, BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP2a, BMP3, BMP3b (또한 GDF10으로도 공지됨), BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, BMP8a, BMP8b, BMP9 (또한 GDF2로도 공지됨), BMP10, BMP11 (또한 GDF11로도 공지됨), BMP12 (또한 GDF7로도 공지됨), BMP13 (또한 GDF6으로도 공지됨), BMP14 (또한 GDF5로도 공지됨), BMP15, GDF1, GDF3 (또한 VGR2로도 공지됨), GDF8 (또한 미오스타틴으로도 공지됨), GDF9, GDF15, 및 데카펜타플레직을 포함한다. BMP의 명칭을 제공하는 골 형성을 유도하는 능력 이외에, BMP/GDF는 광범위한 조직의 발생에서 형태발생 활성을 나타낸다. BMP/GDF 동종- 및 이종-이량체는 유형 I 및 유형 II 수용체 이량체의 조합과 상호작용하여 다중의 가능한 신호전달 복합체를 생성하며, 이는 SMAD 전사 인자의 2개의 경쟁 세트 중 1개의 활성화로 이어진다. BMP/GDF는 고도로 특이적이고 국재화된 기능을 갖는다. 이들은 BMP/GDF 발현의 발생 제한, 및 시토카인에 고친화도로 결합하는 몇몇 특이적 BMP 길항제 단백질의 분비를 통하는 것을 포함하여, 다수의 방식으로 조절된다. 흥미롭게도, 다수의 이들 길항제는 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드와 유사하다.
성장 및 분화 인자-8 (GDF8)은 또한 미오스타틴으로 공지되어 있다. GDF8은 골격근 질량의 음성 조절인자이다. GDF8은 발생 중인 골격근 및 성인 골격근에서 고도로 발현된다. 트랜스제닉 마우스에서의 GDF8 널 돌연변이는 골격근의 현저한 비대 및 증식증을 특징으로 한다 (McPherron et al., Nature, 1997, 387:83-90). 골격근 질량의 유사한 증가는 소에서 (Ashmore et al., 1974, Growth, 38:501-507; Swatland and Kieffer, J. Anim. Sci., 1994, 38:752-757; McPherron and Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94:12457-12461; 및 Kambadur et al., Genome Res., 1997, 7:910-915) 및 놀랍게도 인간에서 (Schuelke et al., N Engl J Med 2004;350:2682-8) GDF8의 자연 발생 돌연변이에서 명백하다. 연구는 또한 인간에서 HIV-감염과 연관된 근육 소모가 GDF8 폴리펩티드 발현의 증가를 동반한다는 것을 제시하였다 (Gonzalez-Cadavid et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95:14938-43). 또한, GDF8은 근육-특이적 효소 (예를 들어, 크레아틴 키나제)의 생산을 조정할 수 있고, 근모세포 세포 증식을 조정할 수 있다 (WO 00/43781). GDF8 프로펩티드는 성숙 GDF8 도메인 이량체에 비공유적으로 결합하여, 그의 생물학적 활성을 불활성화시킬 수 있다 (Miyazono et al., (1988) J. Biol. Chem., 263: 6407-6415; Wakefield et al., (1988) J. Biol. Chem., 263; 7646-7654; 및 Brown et al., (1990) Growth Factors, 3: 35-43). GDF8 또는 구조적으로 관련된 폴리펩티드에 결합하고 그의 생물학적 활성을 억제하는 다른 폴리펩티드는 폴리스타틴, 및 잠재적으로 폴리스타틴-관련 폴리펩티드를 포함한다 (Gamer et al., (1999) Dev. Biol., 208: 222-232).
BMP11로도 공지된 성장 및 분화 인자-11 (GDF11)은 분비된 단백질이다 (McPherron et al., 1999, Nat. Genet. 22: 260-264). GDF11은 마우스 발생 동안 미아, 지아, 상악 및 하악궁, 및 후근 신경절에서 발현된다 (Nakashima et al., 1999, Mech. Dev. 80: 185-189). GDF11은 중배엽 및 신경 조직 둘 다를 패턴화하는 데 독특한 역할을 한다 (Gamer et al., 1999, Dev Biol., 208:222-32). GDF11은 발생 중인 병아리 사지에서 연골형성 및 근발생의 음성 조절인자인 것으로 제시되었다 (Gamer et al., 2001, Dev Biol. 229:407-20). 근육에서의 GDF11의 발현은 또한 GDF8과 유사한 방식으로의, 근육 성장을 조절하는 데 있어서의 그의 역할을 시사한다. 또한, 뇌에서의 GDF11의 발현은 GDF11이 또한 신경계의 기능과 관련된 활성을 보유할 수 있다는 것을 시사한다. 흥미롭게도, GDF11은 후각 상피에서 신경발생을 억제하는 것으로 밝혀졌다 (Wu et al., 2003, Neuron. 37:197-207).
부분적으로, 본 개시내용의 예는 ActRIIB:ALK4 이종이량체가 E/e'에 의해 측정된 바와 같이 확장기 기능장애를 개선시키는 데 효과적이라는 것을 입증한다. 박출 계수는 어린 마우스와 비교하여 노령의 마우스에서 감소되지 않았지만, BNP 수준은 증가하였고, 이는 HFpEF를 나타낸다. 데이터는 추가로, ActRIIB:ALK4 이종다량체에 더하여, 다른 ActRII-ALK4 길항제가 노화와 연관된 심부전을 치료하는 데 유용할 수 있음을 시사한다.
특정 측면에서, 본원에 개시된 방법 및 용도에 따라 (예를 들어, 노화와 연관된 심부전 또는 심부전의 1종 이상의 합병증을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 데) 사용될 ActRII-ALK4 길항제는 ActRII-ALK4 리간드 트랩 폴리펩티드 길항제 (그의 변이체뿐만 아니라 그의 이종이량체 및 이종다량체 포함), ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제이다. ActRII-ALK4 리간드 트랩 폴리펩티드는 1종 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, 및/또는 BMP10)에 결합할 수 있는 TGF-β 슈퍼패밀리-관련 단백질 (그의 변이체 포함)을 포함한다. 따라서, ActRII-ALK4 리간드 트랩은 일반적으로 1종 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, 및/또는 BMP10)를 길항할 수 있는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제는 ActRII-ALK4 리간드 트랩을 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 리간드 트랩은 ActRIIB 폴리펩티드 (그의 변이체, 뿐만 아니라 동종다량체 (예를 들어, ActRIIB 동종이량체) 및 이종다량체 (예를 들어, ActRIIB-ALK4 또는 ActRIIB-ALK7 이종이량체) 포함)를 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 리간드 트랩은 ActRIIA 폴리펩티드 (그의 변이체, 뿐만 아니라 동종다량체 (예를 들어, ActRIIA 동종이량체) 및 이종다량체 (예를 들어, ActRIIA-ALK4 또는 ActRIIA-ALK7 이종이량체) 포함)를 포함한다. 다른 실시양태에서, ActRII-ALK 리간드 트랩은 폴리스타틴 폴리펩티드를 포함하나 이에 제한되지는 않는 가용성 리간드 트랩 단백질뿐만 아니라 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제는 ActRII-ALK4 항체 길항제 (액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10, ActRIIB, ActRIIA, ALK4 및/또는 ALK7 중 1종 이상을 억제하는 항체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제는 ActRII-ALK4 소분자 길항제 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10, ActRIIB, ActRIIA, ALK4 및/또는 ALK7 중 1종 이상을 억제하는 소분자)를 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제는 ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10, ActRIIB, ActRIIA, ALK4 및/또는 ALK7 중 1종 이상을 억제하는 뉴클레오티드 서열)를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어는 일반적으로 본 개시내용의 문맥 내에서 및 각각의 용어가 사용되는 구체적인 문맥에서 관련 기술분야에서의 그의 통상의 의미를 갖는다. 본 개시내용의 조성물 및 방법 및 그의 제조 및 사용 방법을 기재하는 데 있어서 진료의에게 추가의 지침을 제공하기 위해 특정 용어가 하기 또는 명세서의 다른 곳에서 논의된다. 임의의 용어 사용의 범주 또는 의미는 이것이 사용되는 구체적인 문맥으로부터 명백할 것이다.
용어 "서열 유사성"은, 모든 그의 문법적 형태에서, 공통 진화 기원을 공유할 수 있거나 공유하지 않을 수 있는 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 동일성 또는 상응성의 정도를 지칭한다.
참조 폴리펩티드 (또는 뉴클레오티드) 서열과 관련하여 "퍼센트 (%) 서열 동일성"은 서열을 정렬하고 필요한 경우에 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성한 후, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않으면서, 참조 폴리펩티드 (뉴클레오티드) 서열 내의 아미노산 잔기 (또는 핵산)와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기 (또는 핵산)의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 관련 기술분야의 기술 내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어 공중 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈라인(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함한, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, % 아미노산 (핵산) 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) 소유로서, 소스 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱턴 디.씨.)에 사용자 문서로 제출되어 있고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)로부터 공중 이용가능하거나, 또는 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX 운영 시스템에서의 사용을 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있고, 달라지지 않는다.
"효능작용하다"는, 모든 그의 문법적 형태에서, 단백질 및/또는 유전자를 활성화시키거나 (예를 들어, 단백질의 유전자 발현을 활성화시키거나 증폭시킴으로써 또는 불활성 단백질이 활성 상태로 진입하도록 유도함으로써) 또는 단백질의 활성 및/또는 유전자의 활성을 증가시키는 과정을 지칭한다.
"길항하다"는, 모든 그의 문법적 형태에서, 단백질 및/또는 유전자를 억제하거나 (예를 들어, 단백질의 유전자 발현을 억제하거나 감소시킴으로써 또는 활성 단백질이 불활성 상태로 진입하도록 유도함으로써) 또는 단백질의 활성 및/또는 유전자의 활성을 감소시키는 과정을 지칭한다.
명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐 수치와 관련하여 사용된 용어 "약" 및 "대략"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 친숙하고 허용되는 정확도 구간을 나타낸다. 일반적으로, 이러한 정확도 구간은 ± 10%이다. 대안적으로, 및 특히 생물학적 시스템에서, 용어 "약" 및 "대략"은 주어진 값의 한 자릿수 이내, 바람직하게는 ≤ 5-배, 보다 바람직하게는 ≤ 2-배인 값을 의미할 수 있다.
본원에 개시된 수치 범위는 범위를 규정하는 숫자를 포함한다.
단수 용어는 용어가 사용되는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 단수 용어, 뿐만 아니라 용어 "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 또한, 본원에 사용된 "및/또는"은 2개 이상의 명시된 특색 또는 성분 각각을 다른 것과 함께 또는 다른 것 없이 구체적으로 개시하는 것으로서 이해되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독), 및 "B" (단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 각각의 하기 측면: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독)를 포괄하는 것으로 의도된다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 단어 "포함하다" 또는 변형, 예컨대 "포함한다" 또는 "포함하는"은 언급된 정수 또는 정수의 군을 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 정수의 군을 배제하지 않는다는 것을 암시하는 것으로 이해될 것이다.
2. ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제 및 그의 변이체
특정 측면에서, 본원에 개시된 방법 및 용도에 따라 (예를 들어, 노화와 연관된 심부전 또는 심부전의 1종 이상의 합병증을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 데) 사용될 ActRII-ALK4 길항제는 ActRII-ALK4 리간드 트랩 폴리펩티드 (그의 변이체뿐만 아니라 그의 이종이량체 및 이종다량체 포함)이다. ActRII-ALK4 리간드 트랩 폴리펩티드는 1종 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, 및 BMP10)에 결합할 수 있는 TGF-β 슈퍼패밀리-관련 단백질 (그의 변이체 포함)을 포함한다. 따라서, ActRII-ALK4 리간드 트랩은 일반적으로 1종 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, 및 BMP10)를 길항할 수 있는 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 리간드 트랩은 ActRII 폴리펩티드 (그의 변이체, 뿐만 아니라 그의 동종- 및 이종-다량체 (예를 들어, 각각 동종이량체 및 이종이량체) 포함)를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "ActRII"는 유형 II 액티빈 수용체의 패밀리를 지칭한다. 이러한 패밀리는 액티빈 수용체 유형 IIA (ActRIIA) 및 액티빈 수용체 유형 IIB (ActRIIB)를 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 리간드 트랩은 ActRIIB 폴리펩티드 (그의 변이체, 뿐만 아니라 동종다량체 (예를 들어, ActRIIB 동종이량체) 및 이종다량체 (예를 들어, ActRIIB-ALK4 또는 ActRIIB-ALK7 이종이량체) 포함)를 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 리간드 트랩은 ActRIIA 폴리펩티드 (그의 변이체, 뿐만 아니라 동종다량체 (예를 들어, ActRIIA 동종이량체) 및 이종다량체 (예를 들어, ActRIIA-ALK4 또는 ActRIIA-ALK7 이종이량체) 포함)를 포함한다. 다른 실시양태에서, ActRII-ALK 리간드 트랩은 폴리스타틴 폴리펩티드를 포함하나 이에 제한되지는 않는 가용성 리간드 트랩 단백질뿐만 아니라 그의 변이체를 포함한다.
A) ActRIIB 폴리펩티드
특정 측면에서, 본 개시내용은 ActRIIB 폴리펩티드를 포함하며, 그의 단편, 기능적 변이체 및 변형된 형태를 포함하는 ActRII-ALK4 길항제뿐만 아니라 (예를 들어, 심부전 (HF) 또는 HF의 1종 이상의 합병증을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는) 그의 용도에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "ActRIIB"는 임의의 종으로부터의 액티빈 수용체 유형 IIB (ActRIIB) 단백질 패밀리, 및 이러한 ActRIIB 단백질로부터 돌연변이유발 또는 다른 변형에 의해 유래된, 유용한 활성을 보유하는 변이체 폴리펩티드 (예를 들어, 돌연변이체, 단편, 융합체 및 펩티드모방체 형태 포함)를 지칭한다. 이러한 변이체 ActRIIB 폴리펩티드의 예는 본 개시내용 전반에 걸쳐서뿐만 아니라 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2006/012627, WO 2008/097541, WO 2010/151426, WO 2011/020045, WO 2018/009624 및 WO 2018/067874에 제공되며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본원에서 ActRIIB에 대한 언급은 현재 확인된 형태 중 어느 하나에 대한 언급인 것으로 이해된다. ActRIIB 패밀리의 구성원은 일반적으로 시스테인-풍부 영역을 갖는 리간드-결합 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 및 예측된 세린/트레오닌 키나제 특이성을 갖는 세포질 도메인으로 구성된 모든 막횡단 폴리펩티드이다. 인간 ActRIIB 전구체 폴리펩티드의 아미노산 서열은 도 2 (서열식별번호: 2) 및 하기에 제시된다. 바람직하게는, 본 개시내용의 방법에 따라 사용될 ActRIIB 폴리펩티드는 가용성이다. 본원에 사용된 용어 "가용성 ActRIIB 폴리펩티드"는 ActRIIB 폴리펩티드의 임의의 자연 발생 세포외 도메인뿐만 아니라 유용한 활성을 보유하는 그의 임의의 변이체 (돌연변이체, 단편 및 펩티드모방체 형태 포함)를 포함한다. 예를 들어, ActRIIB 폴리펩티드의 세포외 도메인은 리간드에 결합하고, 일반적으로 가용성이다. 가용성 ActRIIB 폴리펩티드의 예는 도 3에 제시된 ActRIIB 세포외 도메인 (서열식별번호: 1)뿐만 아니라 서열식별번호: 53을 포함한다. 이러한 말단절단된 ActRIIB 세포외 도메인 (서열식별번호: 53)은 서열식별번호: 2에서의 넘버링에 기초하여 ActRIIB(25-131)로 표시된다. 가용성 ActRIIB 폴리펩티드의 다른 예는 ActRIIB 폴리펩티드의 세포외 도메인에 더하여 신호 서열을 포함한다 (실시예 4 참조). 신호 서열은 ActRIIB의 천연 신호 서열, 또는 또 다른 폴리펩티드로부터의 신호 서열, 예컨대 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA) 신호 서열 또는 꿀벌 멜리틴 신호 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)의 활성 (예를 들어, Smad 신호전달)을 억제한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)에 결합한다. 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드에 결합하고/거나 그의 활성을 억제하는 ActRIIB 폴리펩티드의 능력을 결정하기 위한 방법 및 검정의 다양한 예는 본원에 개시되어 있거나 또는 달리 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 이는 ActRIIB 폴리펩티드가 목적하는 결합 및/또는 길항 활성을 갖는지 결정하는 데 용이하게 사용될 수 있다. 본원에 기재된 모든 ActRIIB-관련 폴리펩티드에 대한 아미노산의 넘버링은 달리 구체적으로 지정되지 않는 한 하기 제공된 인간 ActRIIB 전구체 단백질 서열 (서열식별번호: 2)의 넘버링에 기초한다.
인간 ActRIIB 전구체 단백질 서열은 하기와 같다:
신호 펩티드는 단일 밑줄로 표시되고; 세포외 도메인은 볼드체로 표시되고; 잠재적인 내인성 N-연결 글리코실화 부위는 이중 밑줄로 표시된다.
프로세싱된 (성숙) 세포외 ActRIIB 폴리펩티드 서열은 하기와 같다:
일부 실시양태에서, 단백질은 N-말단에 "SGR..." 서열을 갖고 생산될 수 있다. 세포외 도메인의 C-말단 "꼬리"는 단일 밑줄로 표시된다. "꼬리"가 결실된 (Δ15 서열) 서열은 하기와 같다:
서열식별번호: 2의 위치 64에서 알라닌을 갖는 (A64) ActRIIB의 형태가 또한 문헌에 보고되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Hilden et al., (1994) Blood, 83(8): 2163-2170]을 참조한다. 본 출원인은 A64 치환을 갖는 ActRIIB의 세포외 도메인을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질이 액티빈 및 GDF11에 대해 상대적으로 낮은 친화도를 갖는다는 것을 확인하였다. 대조적으로, 위치 64에서 아르기닌을 갖는 (R64) 동일한 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 액티빈 및 GDF11에 대해 낮은 나노몰 내지 높은 피코몰 범위의 친화도를 갖는다. 따라서, R64를 갖는 서열은 본 개시내용에서 인간 ActRIIB에 대한 "야생형" 참조 서열로서 사용된다.
위치 64에서 알라닌을 갖는 ActRIIB 전구체 단백질 서열의 형태는 하기와 같다:
신호 펩티드는 단일 밑줄로 표시되고, 세포외 도메인은 볼드체로 표시된다.
대안적 A64 형태의 프로세싱된 (성숙) 세포외 ActRIIB 폴리펩티드 서열은 하기와 같다:
일부 실시양태에서, 단백질은 N-말단에 "SGR..." 서열을 갖고 생산될 수 있다. 세포외 도메인의 C-말단 "꼬리"는 단일 밑줄로 표시된다. "꼬리"가 결실된 (Δ15 서열) 대안적 A64 형태의 폴리펩티드 서열은 하기와 같다:
인간 ActRIIB 전구체 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 하기에 제시하며 (서열식별번호: 4), 이는 ActRIIB 전구체의 아미노산 1-513을 코딩하는 진뱅크 참조 서열 NM_001106.3의 뉴클레오티드 25-1560을 나타낸다. 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열은 위치 64에 아르기닌을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고, 대신 알라닌을 갖는 폴리펩티드를 코딩하도록 변형될 수 있다. 신호 서열은 밑줄로 표시된다.
프로세싱된 세포외 인간 ActRIIB 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 하기와 같다 (서열식별번호: 3). 제시된 뉴클레오티드 서열은 위치 64에 아르기닌을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고, 대신 알라닌을 갖는 폴리펩티드를 코딩하도록 변형될 수 있다 (도 5, 서열식별번호: 3 참조).
B) 변이체 ActRIIB 폴리펩티드
특정의 구체적 실시양태에서, 본 개시내용은 변이체 (또는 돌연변이체) ActRIIB 폴리펩티드가 변경된 리간드-결합 활성 (예를 들어, 결합 친화도 또는 결합 선택성)을 갖도록 ActRIIB 폴리펩티드의 세포외 도메인 (또한 리간드-결합 도메인으로도 지칭됨)에 돌연변이를 만드는 것을 고려한다. 특정 경우에, 이러한 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 특이적 리간드에 대해 변경된 (상승된 또는 감소된) 결합 친화도를 갖는다. 다른 경우에, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 그의 리간드에 대해 변경된 결합 선택성을 갖는다. 예를 들어, 본 개시내용은 비-변형된 ActRIIB 폴리펩티드와 비교하여 BMP9에 대해 감소된 결합 친화도를 갖지만, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11 및 BMP10 중 1개 이상에 대한 결합 친화도는 보유하는 다수의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드를 제공한다. 임의로, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 그의 상응하는 야생형 ActRIIB 폴리펩티드와 유사하거나 동일한 생물학적 활성을 갖는다. 예를 들어, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 ActRIIB 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11 또는 BMP10)에 결합하여 그의 기능을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 심부전 또는 심부전의 1종 이상의 합병증을 치료, 예방하거나, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시킨다. ActRIIB 폴리펩티드의 예는 인간 ActRIIB 전구체 폴리펩티드 (서열식별번호: 2 및 서열식별번호: 387), 및 가용성 인간 ActRIIB 폴리펩티드 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 5, 6, 12, 276, 278, 279, 332, 333, 335, 336, 338, 339, 341, 342, 344, 345, 347, 348, 350, 351, 353, 354, 356, 357, 385, 386, 387, 388, 389, 396, 398, 402, 403, 406, 408 및 409)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 동종다량체 (예를 들어, 동종이량체)의 구성원이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 이종다량체 (예를 들어, 이종이량체)의 구성원이다. 일부 실시양태에서, 임의의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 본원에 개시된 임의의 폴리펩티드와 조합 (예를 들어, 이종다량체화 및/또는 융합)될 수 있다.
ActRIIB는 거의 모든 척추동물에 걸쳐 잘 보존되며, 세포외 도메인의 큰 스트레치는 완전히 보존된다. 예를 들어, 도 6을 참조한다. ActRIIB에 결합하는 많은 리간드는 또한 고도로 보존된다. 따라서, 다양한 척추동물 유기체로부터의 ActRIIB 서열의 비교는 변경될 수 있는 잔기에 대한 통찰력을 제공한다. 따라서, 활성 인간 ActRIIB 변이체는 또 다른 척추동물 ActRIIB의 서열로부터의 상응하는 위치에서 1개 이상의 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 인간 또는 다른 척추동물 서열에서의 잔기와 유사한 잔기를 포함할 수 있다.
본 개시내용은 ActRIIB의 기능적 활성 부분 및 변이체를 확인한다. 출원인은 이전에, 문헌 [Hilden et al., (Blood. 1994 Apr 15;83(8):2163-70]에 개시된 서열을 갖는, 서열식별번호: 2의 아미노산 64에 상응하는 위치에서 알라닌을 갖는 (A64) Fc 융합 폴리펩티드가 액티빈 및 GDF11에 대해 상대적으로 낮은 친화도를 갖는다는 것을 확인하였다. 대조적으로, 위치 64에서 아르기닌을 갖는 (R64) 동일한 Fc 융합 폴리펩티드는 액티빈 및 GDF11에 대해 낮은 나노몰 내지 높은 피코몰 범위의 친화도를 갖는다. 따라서, R64를 갖는 서열 (서열식별번호: 2)은 본 개시내용에서 인간 ActRIIB에 대한 야생형 참조 서열로서 사용되고, 본원에 기재된 변이체에 대한 넘버링은 서열식별번호: 2에서의 넘버링에 기초한다. 추가적으로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 A64 배경에서 본원에 기재된 임의의 ActRIIB 변이체를 제조할 수 있다.
프로세싱된 세포외 ActRIIB 폴리펩티드 서열은 서열식별번호: 1에 제시된다 (예를 들어, 도 3 참조). 일부 실시양태에서, 프로세싱된 ActRIIB 폴리펩티드는 N-말단에 "SGR..." 서열을 갖고 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로세싱된 ActRIIB 폴리펩티드는 N-말단에 "GRG..." 서열을 갖고 생산될 수 있다. 예를 들어, 일부 구축물은, TPA 리더 하에 발현되는 경우에, N-말단 세린이 결여될 것으로 예상된다. 따라서, 본원에 기재된 성숙 ActRIIB 서열은 N-말단 세린 또는 N-말단 글리신 (N-말단 세린이 결여됨)으로 시작할 수 있다.
문헌 [Attisano et al., (Cell. 1992 Jan 10;68(1):97-108)]은 ActRIIB의 세포외 도메인의 C-말단에서의 프롤린 노트의 결실이 액티빈에 대한 수용체의 친화도를 감소시켰음을 보여주었다. WO2008097541에 개시된 데이터는 서열식별번호: 2의 아미노산 20-119를 함유하는 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드인 "ActRIIB(20-119)-Fc"가, 프롤린 노트 영역 및 완전한 막근접 도메인을 포함하는 ActRIIB(20-134)-Fc에 비해 GDF11 및 액티빈에 대해 감소된 결합을 갖는다는 것을 보여준다. 그러나, ActRIIB(20-129)-Fc 폴리펩티드는 프롤린 노트 영역이 파괴되더라도 야생형에 비해 유사하지만 다소 감소된 활성을 보유한다. 따라서, 아미노산 134, 133, 132, 131, 130 및 129에서 정지하는 ActRIIB 세포외 도메인은 모두 활성일 것으로 예상되지만, 134 또는 133에서 정지하는 구축물이 가장 활성일 수 있다. 유사하게, 임의의 잔기 129-134에서의 돌연변이는 리간드 결합 친화도를 큰 차이만큼 변경시킬 것으로 예상되지 않는다. 이를 지지하여, P129 및 P130의 돌연변이는 리간드 결합을 실질적으로 감소시키지 않는다. 따라서, ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 아미노산 109만큼 조기에 종결될 수 있지만 (최종 시스테인), 109 및 119에서 또는 그 사이에서 종결되는 형태는 감소된 리간드 결합을 가질 것으로 예상된다. 아미노산 119는 불량하게 보존되고, 따라서 쉽게 변경되거나 말단절단된다. 128 이후에 종결되는 형태는 리간드 결합 활성을 보유한다. 119 및 127에서 또는 그 사이에서 종결되는 형태는 중간 결합 능력을 가질 것이다. 임의의 이들 형태는 임상 또는 실험 세팅에 따라 사용하기에 바람직할 수 있다.
ActRIIB의 N-말단에서, 아미노산 29에서 또는 그 이전에 시작되는 폴리펩티드는 리간드 결합 활성을 보유할 것으로 예상된다. 아미노산 29는 초기 시스테인을 나타낸다. 위치 24에서의 알라닌-에서-아스파라긴 돌연변이는 리간드 결합에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 N-연결된 글리코실화 서열을 도입한다. 이는 아미노산 20-29에 상응하는, 신호 절단 펩티드와 시스테인 가교된 영역 사이의 영역에서의 돌연변이가 잘 허용된다는 것을 확인시켜 준다. 특히, 위치 20, 21, 22, 23 및 24에서 시작하는 구축물은 활성을 보유할 것이고, 위치 25, 26, 27, 28 및 29에서 시작하는 구축물도 또한 활성을 보유할 것으로 예상된다. WO2008097541에 제시된 데이터는 놀랍게도 22, 23, 24 또는 25에서 시작하는 구축물이 가장 큰 활성을 가질 것임을 입증한다.
종합하면, ActRIIB의 활성 부분은 서열식별번호: 2의 아미노산 29-109를 포함하고, 구축물은 예를 들어 아미노산 20-29에 상응하는 잔기에서 시작하여 아미노산 109-134에 상응하는 위치에서 종결될 수 있다. 다른 예는 20-29 또는 21-29의 위치에서 시작하여 119-134, 119-133 또는 129-134, 129-133의 위치에서 종결되는 구축물을 포함한다. 다른 예는 20-24 (또는 21-24, 또는 22-25)의 위치에서 시작하여 109-134 (또는 109-133), 119-134 (또는 119-133) 또는 129-134 (또는 129-133)의 위치에서 종결되는 구축물을 포함한다. 이들 범위 내의 변이체, 특히 서열식별번호: 1의 상응하는 부분에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 것이 또한 고려된다.
본원에 기재된 변형은 다양한 방식으로 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, ActRIIB 변이체는 리간드-결합 포켓 내에 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 15개 이하의 보존적 아미노산 변화, 임의로 리간드-결합 포켓 내의 위치 40, 53, 55, 74, 79 및/또는 82에서 0개, 1개 또는 그 초과의 비-보존적 변경을 포함한다. 가변성이 특히 잘 허용될 수 있는 결합 포켓 외부의 부위는 세포외 도메인의 아미노 및 카르복시 말단 (상기 언급된 바와 같음), 및 위치 42-46 및 65-73 (서열식별번호: 2에 관함)을 포함한다. 위치 65에서의 아스파라긴-에서-알라닌으로의 변경 (N65A)은 R64 배경에서 리간드 결합을 감소시키는 것으로 보이지 않는다 [미국 특허 번호 7,842,663]. 이러한 변화는 아마도 A64 배경에서 N65에서의 글리코실화를 제거할 것이고, 따라서 이러한 영역에서의 유의한 변화가 허용될 가능성이 있음을 입증한다. R64A 변화는 불량하게 허용되지만, R64K는 잘 허용되고, 따라서 또 다른 염기성 잔기, 예컨대 H가 위치 64에서 허용될 수 있다 [미국 특허 번호 7,842,663]. 추가적으로, 관련 기술분야에 기재된 돌연변이유발 프로그램의 결과는 ActRIIB에서 종종 보존하는 것이 유익한 아미노산 위치가 존재한다는 것을 나타낸다. 서열식별번호: 2와 관련하여, 이는 위치 80 (산성 또는 소수성 아미노산), 위치 78 (소수성, 특히 트립토판), 위치 37 (산성, 특히 아스파르트산 또는 글루탐산), 위치 56 (염기성 아미노산), 위치 60 (소수성 아미노산, 특히 페닐알라닌 또는 티로신)을 포함한다. 따라서, 본 개시내용은 ActRIIB 폴리펩티드에서 보존될 수 있는 아미노산의 프레임워크를 제공한다. 보존하는 것이 바람직할 수 있는 다른 위치는 하기와 같다: 모두 서열식별번호: 2와 관련하여, 위치 52 (산성 아미노산), 위치 55 (염기성 아미노산), 위치 81 (산성), 98 (극성 또는 하전된 것, 특히 E, D, R 또는 K).
ActRIIB 세포외 도메인 내로의 추가의 N-연결된 글리코실화 부위 (N-X-S/T)의 부가는 잘 허용된다는 것이 이전에 입증되었다 (예를 들어, 미국 특허 번호 7,842,663 참조). 따라서, N-X-S/T 서열은 일반적으로 본 개시내용의 ActRIIB 폴리펩티드에서 도 1에 정의된 리간드 결합 포켓 외부의 위치에 도입될 수 있다. 비-내인성 N-X-S/T 서열의 도입에 특히 적합한 부위는 아미노산 20-29, 20-24, 22-25, 109-134, 120-134 또는 129-134를 포함한다 (서열식별번호: 2에 관함). N-X-S/T 서열은 또한 ActRIIB 서열과 Fc 도메인 또는 다른 융합 성분 사이의 링커 내로, 뿐만 아니라 임의로 융합 성분 자체 내로 도입될 수 있다. 이러한 부위는 기존의 S 또는 T와 관련하여 정확한 위치에 N을 도입하는 것에 의해, 또는 기존의 N에 상응하는 위치에 S 또는 T를 도입하는 것에 의해 최소의 노력으로 도입될 수 있다. 따라서, N-연결된 글리코실화 부위를 생성할 바람직한 변경은 A24N, R64N, S67N (가능하게는 N65A 변경과 조합됨), E105N, R112N, G120N, E123N, P129N, A132N, R112S 및 R112T이다 (서열식별번호: 2에 관함). 글리코실화될 것으로 예측되는 임의의 S는, 글리코실화에 의해 제공되는 보호 때문에, 면역원성 부위를 생성하지 않으면서 T로 변경될 수 있다. 마찬가지로, 글리코실화될 것으로 예측되는 임의의 T는 S로 변경될 수 있다. 따라서, 변경 S67T 및 S44T (서열식별번호: 2에 관함)가 고려된다. 마찬가지로, A24N 변이체에서, S26T 변경이 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 ActRIIB 폴리펩티드는 상기 기재된 바와 같은 1개 이상의 추가의, 비-내인성 N-연결된 글리코실화 컨센서스 서열을 갖는 변이체일 수 있다.
특정 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 1, 2 및 53으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 특정 경우에, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 1, 2 및 53으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 특정 경우에, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 특정 경우에, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 특정 경우에, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 53과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 1, 2, 5, 6, 12, 31, 33, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 45, 46, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 276, 278, 279, 332, 333, 335, 336, 338, 339, 341, 342, 344, 345, 347, 348, 350, 351, 353, 354, 356, 357, 385, 386, 387, 388, 389, 396, 398, 402, 403, 406, 408, 및 409 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 1을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 2를 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 5의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 5를 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 6의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 6을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 12의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 12를 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 31의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 31을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 33의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 33을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 34의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 34를 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 36의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 36을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 37의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 37을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 39의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 39를 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 40의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 40을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 42의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 42를 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 43의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 43을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 45의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 45를 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 46의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 46을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 48의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 48을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 49의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 49를 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 50의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 50을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 51의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 51을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 52의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 52를 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 53의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 53을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 276의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 276을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 278의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 278을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 279의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 279를 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 332의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 332를 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 333의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 333을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 335의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 335를 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 336의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 336을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 338의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 338을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 339의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 339를 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 341의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 341을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 342의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 342를 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 344의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 344를 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 345의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 345를 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 347의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 347을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 348의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 348을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 350의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 350을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 351의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 351을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 353의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 353을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 354의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 354를 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 356의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 356을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 357의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 357을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 385의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 385를 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 386의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 386을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 387의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 387을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 388의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 388을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 389의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 389를 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 396의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 396을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 398의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 398을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 402의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 402를 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 403의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 403을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 406의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 406을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 408의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 408을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또는 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 409의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 서열식별번호: 409를 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 2의 아미노산 20-29 중 어느 하나 (예를 들어, 아미노산 잔기 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 또는 29)에서 시작하여 서열식별번호: 2의 아미노산 109-134 중 어느 하나 (예를 들어, 아미노산 잔기 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 또는 134)에서 종결되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, K55, F82, L79, A24, K74, R64, P129, P130, E37, R40, D54, R56, W78, D80, 및 F82로 이루어진 군으로부터 선택된 서열식별번호: 2의 위치에서 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드, 뿐만 아니라 1개 이상의 이러한 변이체 ActRIIB 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체 복합체에 관한 것이다. 특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 2의 아미노산 20-29 중 어느 하나 (예를 들어, 아미노산 잔기 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 또는 29)에서 시작하여 서열식별번호: 2의 아미노산 109-134 중 어느 하나 (예를 들어, 아미노산 잔기 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 또는 134)에서 종결되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 서열식별번호: 2의 위치에서 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하지만, 여기서 서열식별번호: 2의 79에 상응하는 위치의 아미노산이 류신인 변이체 ActRIIB 폴리펩티드, 뿐만 아니라 1개 이상의 이러한 변이체 ActRIIB 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체 복합체에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 아미노산 29-109와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 아미노산 25-131과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 아미노산 20-134와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 53의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 12의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 5의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 A24에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 A24N이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 S26에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 S26T이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 N35에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 N35E이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 E37에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 E37A이다. 일부 실시양태에서, 치환은 E37D이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L38에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 L38N이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 R40에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 R40A이다. 일부 실시양태에서, 치환은 R40K이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 S44에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 S44T이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L46에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 L46A이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 L46I이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 L46F이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 L46V이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 E50에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 E50K이다. 일부 실시양태에서, 치환은 E50L이다. 일부 실시양태에서, 치환은 E50P이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 E52에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 E52A이다. 일부 실시양태에서, 치환은 E52D이다. 일부 실시양태에서, 치환은 E52G이다. 일부 실시양태에서, 치환은 E52H이다. 일부 실시양태에서, 치환은 E52K이다. 일부 실시양태에서, 치환은 E52N이다. 일부 실시양태에서, 치환은 E52P이다. 일부 실시양태에서, 치환은 E52R이다. 일부 실시양태에서, 치환은 E52S이다. 일부 실시양태에서, 치환은 E52T이다. 일부 실시양태에서, 치환은 E52Y이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 Q53에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 Q53R이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 Q53K이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 Q53N이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 Q53H이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 D54에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 D54A이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 K55에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 K55A이다. 일부 실시양태에서, 치환은 K55E이다. 일부 실시양태에서, 치환은 K55D이다. 일부 실시양태에서, 치환은 K55R이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 R56에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 R56A이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L57에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 L57R이다. 일부 실시양태에서, 치환은 L57E이다. 일부 실시양태에서, 치환은 L57I이다. 일부 실시양태에서, 치환은 L57T이다. 일부 실시양태에서, 치환은 L57V이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 Y60에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 Y60F이다. 일부 실시양태에서, 치환은 Y60D이다. 일부 실시양태에서, 치환은 Y60K이다. 일부 실시양태에서, 치환은 Y60P이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 R64에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 R64K이다. 일부 실시양태에서, 치환은 R64N이다. 일부 실시양태에서, 치환은 R64A이다. 일부 실시양태에서, 치환은 R64H이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 N65에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 N65A이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 S67에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 S67N이다. 일부 실시양태에서, 치환은 S67T이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 G68에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 G68R이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 K74에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 K74A이다. 일부 실시양태에서, 치환은 K74E이다. 일부 실시양태에서, 치환은 K74F이다. 일부 실시양태에서, 치환은 K74I이다. 일부 실시양태에서, 치환은 K74Y이다. 일부 실시양태에서, 치환은 K74R이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 W78에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 W78A이다. 일부 실시양태에서, 치환은 W78Y이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L79에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 L79D이다. 일부 실시양태에서, 치환은 서열식별번호: 2의 L79에 상응하는 위치에서 산성 아미노산을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 치환은 서열식별번호: 2의 위치 L79에서 일어나지 않는다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 2의 위치 L79는 치환되지 않는다. 일부 실시양태에서, 치환은 서열식별번호: 2의 L79에 상응하는 위치에서 아스파르트산 (D)을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 치환은 L79A이다. 일부 실시양태에서, 치환은 L79E이다. 일부 실시양태에서, 치환은 L79F이다. 일부 실시양태에서, 치환은 L79H이다. 일부 실시양태에서, 치환은 L79K이다. 일부 실시양태에서, 치환은 L79P이다. 일부 실시양태에서, 치환은 L79R이다. 일부 실시양태에서, 치환은 L79S이다. 일부 실시양태에서, 치환은 L79T이다. 일부 실시양태에서, 치환은 L79W이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 D80에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 D80A이다. 일부 실시양태에서, 치환은 D80F이다. 일부 실시양태에서, 치환은 D80K이다. 일부 실시양태에서, 치환은 D80G이다. 일부 실시양태에서, 치환은 D80M이다. 일부 실시양태에서, 치환은 D80I이다. 일부 실시양태에서, 치환은 D80N이다. 일부 실시양태에서, 치환은 D80R이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 F82I이다. 일부 실시양태에서, 치환은 F82K이다. 일부 실시양태에서, 치환은 F82A이다. 일부 실시양태에서, 치환은 F82W이다. 일부 실시양태에서, 치환은 F82D이다. 일부 실시양태에서, 치환은 F82Y이다. 일부 실시양태에서, 치환은 F82E이다. 일부 실시양태에서, 치환은 F82L이다. 일부 실시양태에서, 치환은 F82T이다. 일부 실시양태에서, 치환은 F82S이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 N83에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 N83A이다. 일부 실시양태에서, 치환은 N83R이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 T93에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 T93D이다. 일부 실시양태에서, 치환은 T93E이다. 일부 실시양태에서, 치환은 T93H이다. 일부 실시양태에서, 치환은 T93G이다. 일부 실시양태에서, 치환은 T93K이다. 일부 실시양태에서, 치환은 T93P이다. 일부 실시양태에서, 치환은 T93R이다. 일부 실시양태에서, 치환은 T93S이다. 일부 실시양태에서, 치환은 T93Y이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 E94에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 E94K이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 Q98에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 Q98D이다. 일부 실시양태에서, 치환은 Q98E이다. 일부 실시양태에서, 치환은 Q98K이다. 일부 실시양태에서, 치환은 Q98R이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 V99에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 V99E이다. 일부 실시양태에서, 치환은 V99G이다. 일부 실시양태에서, 치환은 V99K이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 E105에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 E105N이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 E106에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 E106N이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F108에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 F108I이다. 일부 실시양태에서, 치환은 F108L이다. 일부 실시양태에서, 치환은 F108V이다. 일부 실시양태에서, 치환은 F108Y이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 E111에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 E111K이다. 일부 실시양태에서, 치환은 E111D이다. 일부 실시양태에서, 치환은 E111R이다. 일부 실시양태에서, 치환은 E111H이다. 일부 실시양태에서, 치환은 E111Q이다. 일부 실시양태에서, 치환은 E111N이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 R112에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 R112H이다. 일부 실시양태에서, 치환은 R112K이다. 일부 실시양태에서, 치환은 R112N이다. 일부 실시양태에서, 치환은 R112S이다. 일부 실시양태에서, 치환은 R112T이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 A119에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 A119P이다. 일부 실시양태에서, 치환은 A119V이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 G120에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 G120N이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 E123에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 E123N이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 P129에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 P129S이다. 일부 실시양태에서, 치환은 P129N이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 P130에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 P130A이다. 일부 실시양태에서, 치환은 P130R이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 A132에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치환은 A132N이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 A24, E37, R40, D54, K55, R56, R64, K74, W78, L79, D80, F82, P129 및 P130으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열식별번호: 2의 위치에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2와 관련하여 위치 A24에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2와 관련하여 위치 E37에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2와 관련하여 위치 R40에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2와 관련하여 위치 D54에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2와 관련하여 위치 K55에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2와 관련하여 위치 R56에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2와 관련하여 위치 R64에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2와 관련하여 위치 K74에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2와 관련하여 위치 W78에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2와 관련하여 위치 L79에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2와 관련하여 위치 D80에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2와 관련하여 위치 F82에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2와 관련하여 위치 P129에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2와 관련하여 위치 P130에서 치환을 포함한다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 31의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 K55에 상응하는 위치에서 알라닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 31의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 33의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 K55에 상응하는 위치에서 알라닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 33의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 34의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 K55에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 34의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 36의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 K55에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 36의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 37의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 이소류신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 37의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 39의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 이소류신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 39의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 40의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 리신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 40의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 42의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 리신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 42의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 43의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L79에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 43의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 45의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L79에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 45의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 336의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 336의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 338의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 338의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 342의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L79에 상응하는 위치에서 히스티딘을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 342의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 344의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L79에 상응하는 위치에서 히스티딘을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 344의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 348의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 E50에 상응하는 위치에서 류신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 348의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 350의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 E50에 상응하는 위치에서 류신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 350의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 354의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 V99에 상응하는 위치에서 글리신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 354의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 356의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 V99에 상응하는 위치에서 글리신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 356의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 본원에 개시된 임의의 아미노산 치환 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 본원에 개시된 임의의 아미노산 치환 중 2개를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 본원에 개시된 임의의 아미노산 치환 중 3개를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 본원에 개시된 임의의 아미노산 치환 중 4개를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 본원에 개시된 임의의 아미노산 치환 중 5개를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 본원에 개시된 임의의 아미노산 치환 중 6개를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 본원에 개시된 임의의 아미노산 치환 중 7개를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 본원에 개시된 임의의 아미노산 치환 중 8개를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 본원에 개시된 임의의 아미노산 치환 중 9개를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 본원에 개시된 임의의 아미노산 치환 중 10개를 포함한다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 2의 참조 아미노산 서열과 비교하여 2개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 A24N 치환 및 K74A 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 L79P 치환 및 K74A 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 P129S 치환 및 P130A 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 L38N 치환 및 L79R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 F82I 치환 및 N83R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 F82K 치환 및 N83R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 F82T 치환 및 N83R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 L79H 치환 및 F82K 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 L79H 치환 및 F82I 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 F82D 치환 및 N83R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 F82E 치환 및 N83R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 L79F 치환 및 F82D 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 L79F 치환 및 F82T 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 E52D 치환 및 F82D 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 E52D 치환 및 F82T 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 L57R 치환 및 F82D 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 L57R 치환 및 F82T 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 F82I 치환 및 E94K 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 F82S 치환 및 N83R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 L57R 치환 및 F82S 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 K74A 치환 및 L79P 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 K55A 치환 및 F82I 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 L79K 치환 및 F82K 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 F82W 치환 및 N83A 치환을 포함한다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 276의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 이소류신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 N83에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 이소류신 및 서열식별번호: 2의 N83에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 276의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 278의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 이소류신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 N83에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 이소류신 및 서열식별번호: 2의 N83에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 278의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 279의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 리신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 N83에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 리신 및 서열식별번호: 2의 N83에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 279의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 332의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 리신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 N83에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 리신 및 서열식별번호: 2의 N83에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 332의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 333의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 N83에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 트레오닌 및 서열식별번호: 2의 N83에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 333의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 335의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 N83에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 트레오닌 및 서열식별번호: 2의 N83에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 335의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 339의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L79에 상응하는 위치에서 히스티딘을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 이소류신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L79에 상응하는 위치에서 히스티딘 및 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 이소류신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 339의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 341의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L79에 상응하는 위치에서 히스티딘을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 이소류신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L79에 상응하는 위치에서 히스티딘 및 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 이소류신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 341의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 345의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L79에 상응하는 위치에서 히스티딘을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 리신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L79에 상응하는 위치에서 히스티딘 및 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 리신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 345의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 347의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L79에 상응하는 위치에서 히스티딘을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 리신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L79에 상응하는 위치에서 히스티딘 및 서열식별번호: 2의 F82에 상응하는 위치에서 리신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 347의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 351의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L38에 상응하는 위치에서 아스파라긴을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L79에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L38에 상응하는 위치에서 아스파라긴 및 서열식별번호: 2의 L79에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 351의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 353의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L38에 상응하는 위치에서 아스파라긴을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L79에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L38에 상응하는 위치에서 아스파라긴 및 서열식별번호: 2의 L79에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 353의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 2의 참조 아미노산 서열과 비교하여 3개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 G68R 치환, F82S 치환 및 N83R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 G68R 치환, W78Y 치환 및 F82Y 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 E52D 치환, F82D 치환 및 N83R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 E52Y 치환, F82D 치환 및 N83R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 E52D 치환, F82E 치환 및 N83R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 E52D 치환, F82T 치환 및 N83R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 E52N 치환, F82I 치환 및 N83R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 E52N 치환, F82Y 치환 및 N83R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 E50L 치환, F82D 치환 및 N83R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 L57I 치환, F82D 치환 및 N83R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 L57V 치환, F82D 치환 및 N83R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 L57R 치환, F82D 치환 및 N83R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 L57E 치환, F82E 치환 및 N83R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 L57R 치환, F82E 치환 및 N83R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 L57I 치환, F82E 치환 및 N83R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 L57R 치환, F82L 치환 및 N83R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 L57T 치환, F82Y 치환 및 N83R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 L57V 치환, F82Y 치환 및 N83R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 상기 임의의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 기재된 아미노산 치환 중 적어도 2개를 포함할 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 2의 참조 아미노산 서열과 비교하여 4개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 관한 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 G68R 치환, L79E 치환, F82Y 치환 및 N83R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 G68R 치환, L79E 치환, F82T 치환 및 N83R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 G68R 치환, L79T 치환, F82T 치환 및 N83R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 E52N 치환, G68R 치환, F82Y 치환 및 N83R 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 상기 임의의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 기재된 아미노산 치환 중 적어도 2개를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 상기 임의의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드에 기재된 아미노산 치환 중 적어도 3개를 포함할 수 있다.
C) ActRIIA 폴리펩티드
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA 폴리펩티드를 포함하며, 그의 단편, 기능적 변이체 및 변형된 형태를 포함하는 ActRII-ALK4 길항제뿐만 아니라 (예를 들어, 심부전 (HF) 또는 HF의 1종 이상의 합병증을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는) 그의 용도에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "ActRIIA"는 임의의 종으로부터의 액티빈 수용체 유형 IIA (ActRIIA) 단백질 패밀리, 및 이러한 ActRIIA 단백질로부터 돌연변이유발 또는 다른 변형에 의해 유래된, 유용한 활성을 보유하는 변이체 폴리펩티드 (예를 들어, 돌연변이체, 단편, 융합체 및 펩티드모방체 형태 포함)를 지칭한다. 이러한 변이체 ActRIIA 폴리펩티드의 예는 본 개시내용 전반에 걸쳐서뿐만 아니라 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2006/012627 및 WO 2007/062188에 제공되며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본원에서 ActRIIA에 대한 언급은 현재 확인된 형태 중 어느 하나에 대한 언급인 것으로 이해된다. ActRIIA 패밀리의 구성원은 일반적으로 시스테인-풍부 영역을 갖는 리간드-결합 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 및 예측된 세린/트레오닌 키나제 활성을 갖는 세포질 도메인으로 구성된 막횡단 단백질이다. 바람직하게는, 본 개시내용의 방법에 따라 사용될 ActRIIA 폴리펩티드는 가용성이다 (예를 들어, ActRIIA의 세포외 도메인). 일부 실시양태에서, ActRIIA 폴리펩티드는 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)의 활성 (예를 들어, Smad 신호전달)을 억제한다. 일부 실시양태에서, ActRIIA 폴리펩티드는 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)에 결합한다. 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드에 결합하고/거나 그의 활성을 억제하는 ActRIIA 폴리펩티드의 능력을 결정하기 위한 방법 및 검정의 다양한 예는 본원에 개시되어 있거나 또는 달리 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 이는 ActRIIA 폴리펩티드가 목적하는 결합 및/또는 길항 활성을 갖는지 결정하는 데 용이하게 사용될 수 있다. 본원에 기재된 모든 ActRIIA-관련 폴리펩티드에 대한 아미노산의 넘버링은 달리 구체적으로 지정되지 않는 한 하기 제공된 인간 ActRIIA 전구체 단백질 서열 (서열식별번호: 366)의 넘버링에 기초한다.
정규 인간 ActRIIA 전구체 단백질 서열은 하기와 같다:
신호 펩티드는 단일 밑줄로 표시되고; 세포외 도메인은 볼드체로 표시되고; 잠재적인 내인성 N-연결 글리코실화 부위는 이중 밑줄로 표시된다.
프로세싱된 (성숙) 세포외 인간 ActRIIA 폴리펩티드 서열은 하기와 같다:
세포외 도메인의 C-말단 "꼬리"는 단일 밑줄로 표시된다. "꼬리"가 결실된 (Δ15 서열) 서열은 하기와 같다:
진뱅크 참조 서열 NM_001616.4의 뉴클레오티드 159-1700에 상응하는, 인간 ActRIIA 전구체 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 하기에 제시된다 (서열식별번호: 369). 신호 서열은 밑줄로 표시된다.
프로세싱된 가용성 (세포외) 인간 ActRIIA 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 하기와 같다:
ActRIIA는 척추동물 사이에서 잘 보존되며, 세포외 도메인의 큰 스트레치는 완전히 보존된다. 예를 들어, 도 10은 다양한 ActRIIA 오르토로그 (서열식별번호: 371-377)와 비교하여 인간 ActRIIA 세포외 도메인 (서열식별번호: 367)의 다중-서열 정렬을 도시한다. ActRIIA에 결합하는 많은 리간드는 또한 고도로 보존된다. 따라서, 이들 정렬로부터, 정상 ActRIIA-리간드 결합 활성에 중요한 리간드-결합 도메인 내의 주요 아미노산 위치를 예측하는 것뿐만 아니라 정상 ActRIIA-리간드 결합 활성을 유의하게 변경시키지 않으면서 치환을 허용할 가능성이 있는 아미노산 위치를 예측하는 것이 가능하다. 따라서, 본원에 개시된 방법에 따라 유용한 활성 인간 ActRIIA 변이체 폴리펩티드는 또 다른 척추동물 ActRIIA의 서열로부터의 상응하는 위치에서 1개 이상의 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 인간 또는 다른 척추동물 서열에서의 잔기와 유사한 잔기를 포함할 수 있다.
제한하려는 의도 없이, 하기 예는 활성 ActRIIA 변이체를 정의하기 위한 이러한 접근법을 예시한다. 도 10에 예시된 바와 같이, 인간 세포외 도메인 내의 F13은 오비스 아리에스(Ovis aries) (서열식별번호: 371), 갈루스 갈루스(Gallus gallus) (서열식별번호: 374), 보스 타우루스(Bos Taurus) (서열식별번호: 375), 티토 알바(Tyto alba) (서열식별번호: 376), 및 미오티스 다비디이(Myotis davidii) (서열식별번호: 377) ActRIIA에서 Y이고, 이는 이 위치에서 F, W, 및 Y를 포함한 방향족 잔기가 허용된다는 것을 나타낸다. 인간 세포외 도메인 내의 Q24는 보스 타우루스 ActRIIA에서 R이고, 이는 이 위치에서 D, R, K, H, 및 E를 포함한 하전된 잔기가 허용될 것임을 나타낸다. 인간 세포외 도메인 내의 S95는 갈루스 갈루스 및 티토 알바 ActRIIA에서 F이고, 이는 이 부위가 극성 잔기, 예컨대 E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y, 및 아마도 소수성 잔기, 예컨대 L, I, 또는 F를 포함한 매우 다양한 변화를 허용할 것임을 나타낸다. 인간 세포외 도메인 내의 E52는 오비스 아리에스 ActRIIA에서 D이고, 이는 이 위치에서 D 및 E를 포함한 산성 잔기가 허용된다는 것을 나타낸다. 인간 세포외 도메인 내의 P29는 상대적으로 불량하게 보존되고, 오비스 아리에스 ActRIIA에서는 S 및 미오티스 다비디이 ActRIIA에서는 L로 나타나므로, 본질적으로 임의의 아미노산이 이 위치에서 허용될 것이다.
더욱이, 상기 논의된 바와 같이, ActRII 단백질은 구조적/기능적 특징의 관점에서, 특히 리간드 결합과 관련하여 관련 기술분야에서 특징화되었다 [Attisano et al., (1992) Cell 68(1):97-108; Greenwald et al., (1999) Nature Structural Biology 6(1): 18-22; Allendorph et al., (2006) Proc Natl Acad Sci USA103(20: 7643-7648; Thompson et al., (2003) The EMBO Journal 22(7): 1555-1566; 뿐만 아니라 미국 특허 번호 7,709,605, 7,612,041, 및 7,842,663]. 본원의 교시에 더하여, 이들 참고문헌은 1종 이상의 목적하는 활성 (예를 들어, 리간드-결합 활성)을 보유하는 ActRII 변이체를 생성하는 방법에 대한 충분한 지침을 제공한다.
예를 들어, 3개-핑거 독소 폴드로서 공지된 구조적 모티프를 정의하는 것은 유형 I 및 유형 II 수용체에 의한 리간드 결합에 중요하고, 이는 각각의 단량체 수용체의 세포외 도메인 내의 다양한 위치에 위치하는 보존된 시스테인 잔기에 의해 형성된다 [Greenwald et al., (1999) Nat Struct Biol 6:18-22; 및 Hinck (2012) FEBS Lett 586:1860-1870]. 따라서, 인간 ActRIIA의 코어 리간드-결합 도메인은, 이들 보존된 시스테인의 최외각에 의해 구분되는 바와 같이, 서열식별번호: 366 (ActRIIA 전구체)의 위치 30-110에 상응한다. 따라서, 이들 시스테인-구분되는 코어 서열에 플랭킹된 구조적으로 덜 정렬된 아미노산은, 리간드 결합을 반드시 변경시키지 않으면서 N-말단에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 또는 29개의 잔기만큼 및 C-말단에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 잔기만큼 말단절단될 수 있다. 예시적인 ActRIIA 세포외 도메인 말단절단은 서열식별번호: 367 및 368을 포함한다.
따라서, ActRIIA의 활성 부분 (예를 들어, 리간드 결합)에 대한 일반식은 서열식별번호: 366의 아미노산 30-110을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어진 폴리펩티드이다. 따라서, ActRIIA 폴리펩티드는 예를 들어 서열식별번호: 366의 아미노산 21-30 중 어느 하나에 상응하는 잔기에서 시작하여 (예를 들어, 아미노산 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 중 어느 하나에서 시작하여) 서열식별번호: 366의 아미노산 110-135 중 어느 하나에 상응하는 위치에서 종결되는 (예를 들어, 아미노산 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 또는 135 중 어느 하나에서 종결되는) ActRIIA의 부분과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어질 수 있다. 다른 예는 서열식별번호: 366의 21-30 (예를 들어, 아미노산 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 중 어느 하나에서 시작함), 22-30 (예를 들어, 아미노산 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 중 어느 하나에서 시작함), 23-30 (예를 들어, 아미노산 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 중 어느 하나에서 시작함), 24-30 (예를 들어, 아미노산 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 중 어느 하나에서 시작함)으로부터 선택된 위치에서 시작하여, 서열식별번호: 366의 111-135 (예를 들어, 아미노산 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 또는 135 중 어느 하나에서 종결됨), 112-135 (예를 들어, 아미노산 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 또는 135 중 어느 하나에서 종결됨), 113-135 (예를 들어, 아미노산 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 또는 135 중 어느 하나에서 종결됨), 120-135 (예를 들어, 아미노산 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 또는 135 중 어느 하나에서 종결됨), 130-135 (예를 들어, 아미노산 130, 131, 132, 133, 134 또는 135 중 어느 하나에서 종결됨), 111-134 (예를 들어, 아미노산 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134 중 어느 하나에서 종결됨), 111-133 (예를 들어, 아미노산 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 또는 133 중 어느 하나에서 종결됨), 111-132 (예를 들어, 아미노산 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 또는 132 중 어느 하나에서 종결됨), 또는 111-131 (예를 들어, 아미노산 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 또는 131 중 어느 하나에서 종결됨)로부터 선택된 위치에서 종결되는 구축물을 포함한다. 이들 범위 내의 변이체, 특히 서열식별번호: 366의 상응하는 부분에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어진 변이체가 또한 고려된다. 따라서, 일부 실시양태에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열식별번호: 366의 아미노산 30-110과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어질 수 있다. 임의로, ActRIIA 폴리펩티드는 서열식별번호: 366의 아미노산 30-110과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고, 리간드-결합 포켓에서 1, 2, 5, 10 또는 15개 이하의 보존적 아미노산 변화를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 ActRIIA 폴리펩티드는 서열식별번호: 366의 아미노산 21-30에 상응하는 잔기에서 시작하여 (예를 들어, 아미노산 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 중 어느 하나에서 시작하여) 서열식별번호: 366의 아미노산 110-135 중 어느 하나에 상응하는 위치에서 종결되는 (예를 들어, 아미노산 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 또는 135 중 어느 하나에서 종결되는) ActRIIA의 부분과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열식별번호: 366의 아미노산 30-110과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열식별번호: 366의 아미노산 21-135와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열식별번호: 366의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열식별번호: 367의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열식별번호: 368의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열식별번호: 380의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열식별번호: 381의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열식별번호: 384의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열식별번호: 364의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열식별번호: 378의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다.
D) ALK4 폴리펩티드
특정 측면에서, 본 개시내용은 ALK4 폴리펩티드를 포함하며, 그의 단편, 기능적 변이체 및 변형된 형태를 포함하는 ActRII-ALK4 길항제뿐만 아니라 (예를 들어, 심부전 (HF) 또는 HF의 1종 이상의 합병증을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는) 그의 용도에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "ALK4"는 임의의 종으로부터의 액티빈 수용체-유사 키나제-4 (ALK4) 단백질 패밀리, 및 이러한 ALK4 단백질로부터 돌연변이유발 또는 다른 변형에 의해 유래된, 유용한 활성을 보유하는 변이체 폴리펩티드 (예를 들어, 돌연변이체, 단편, 융합체 및 펩티드모방체 형태 포함)를 지칭한다. 이러한 변이체 ALK4 폴리펩티드의 예는 본 개시내용 전반에 걸쳐서뿐만 아니라 국제 특허 출원 공개 번호 WO/2016/164089, WO/2016/164497 및 WO/2018/067879에 제공되며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본원에서 ALK4에 대한 언급은 현재 확인된 형태 중 어느 하나에 대한 언급인 것으로 이해된다. ALK4 패밀리의 구성원은 일반적으로 시스테인-풍부 영역을 갖는 리간드-결합 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 및 예측된 세린/트레오닌 키나제 활성을 갖는 세포질 도메인으로 구성된 막횡단 단백질이다. 바람직하게는, 본 개시내용의 방법에 따라 사용될 ALK4 폴리펩티드는 가용성이다. 본원에 사용된 용어 "가용성 ALK4 폴리펩티드"는 ALK4 폴리펩티드의 임의의 자연 발생 세포외 도메인뿐만 아니라 유용한 활성을 보유하는 그의 임의의 변이체 (돌연변이체, 단편 및 펩티드모방체 형태 포함)를 포함한다. 예를 들어, ALK4 폴리펩티드의 세포외 도메인은 리간드에 결합하고, 일반적으로 가용성이다. 가용성 ALK4 폴리펩티드의 예는 하기 제시된 ALK4 세포외 도메인 (서열식별번호: 86)을 포함한다. 가용성 ALK4 폴리펩티드의 다른 예는 ALK4 폴리펩티드의 세포외 도메인에 더하여 신호 서열을 포함한다. 신호 서열은 ALK4 폴리펩티드의 천연 신호 서열, 또는 또 다른 폴리펩티드로부터의 신호 서열, 예컨대 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA) 신호 서열 또는 꿀벌 멜리틴 신호 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, ALK4 폴리펩티드는 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)의 (예를 들어, Smad 신호전달) 활성을 억제한다. 일부 실시양태에서, ALK4 폴리펩티드는 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)에 결합한다. 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드에 결합하고/거나 그의 활성을 억제하는 ALK4 폴리펩티드의 능력을 결정하기 위한 방법 및 검정의 다양한 예는 본원에 개시되어 있거나 또는 달리 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 이는 ActRIIB 폴리펩티드가 목적하는 결합 및/또는 길항 활성을 갖는지 결정하는 데 용이하게 사용될 수 있다. 본원에 기재된 모든 ALK4-관련 폴리펩티드에 대한 아미노산의 넘버링은 달리 구체적으로 지정되지 않는 한 하기 제공된 인간 ALK4 전구체 단백질 서열 (서열식별번호: 84)의 넘버링에 기초한다.
인간 ALK4 전구체 폴리펩티드 서열 (NCBI Ref Seq NP_004293)은 하기와 같다:
신호 펩티드는 단일 밑줄로 표시되고, 세포외 도메인은 볼드체로 표시된다.
프로세싱된 세포외 인간 ALK4 폴리펩티드 서열은 하기와 같다:
진뱅크 참조 서열 NM_004302.4의 뉴클레오티드 78-1592에 상응하는, ALK4 전구체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 서열식별번호: 221에 제시된다.
신호 서열은 밑줄로 표시되고, 세포외 도메인은 볼드체로 표시된다.
세포외 ALK4 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 222에 제시된다.
인간 ALK4 전구체 단백질 서열의 대안적 이소형, 이소형 B (NCBI Ref Seq NP_064732.3)는 하기와 같다:
세포외 도메인은 볼드체로 표시된다.
상기 이소형 B에 상응하는 프로세싱된 세포외 ALK4 폴리펩티드 서열은 하기와 같다:
진뱅크 참조 서열 NM_020327.3의 뉴클레오티드 186-1547에 상응하는, ALK4 전구체 단백질 (이소형 B)을 코딩하는 핵산 서열이 하기에 제시된다 (서열식별번호: 423). 세포외 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드는 볼드체로 표시된다.
세포외 ALK4 폴리펩티드 (이소형 B)를 코딩하는 핵산 서열은 하기와 같다:
인간 ALK4 전구체 폴리펩티드 서열의 대안적 이소형, 이소형 C (NCBI Ref Seq NP_064733.3)는 하기와 같다:
신호 펩티드는 단일 밑줄로 표시되고, 세포외 도메인은 볼드체로 표시된다.
프로세싱된 세포외 ALK4 폴리펩티드 서열 (이소형 C)은 하기와 같다:
진뱅크 참조 서열 NM_020328.3의 뉴클레오티드 78-1715에 상응하는, ALK4 전구체 폴리펩티드 (이소형 C)를 코딩하는 핵산 서열이 서열식별번호: 223에 제시된다.
세포외 ALK4 폴리펩티드 (이소형 C)를 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 224에 제시된다.
ALK4는 척추동물 사이에서 잘 보존되며, 세포외 도메인의 큰 스트레치는 완전히 보존된다. 예를 들어, 도 9는 다양한 ALK4 오르토로그와 비교하여 인간 ALK4 세포외 도메인의 다중-서열 정렬을 도시한다. ALK4에 결합하는 많은 리간드는 또한 고도로 보존된다. 따라서, 이들 정렬로부터, 정상 ALK4-리간드 결합 활성에 중요한 리간드-결합 도메인 내의 주요 아미노산 위치를 예측하는 것뿐만 아니라 정상 ALK4-리간드 결합 활성을 유의하게 변경시키지 않으면서 치환을 허용할 가능성이 있는 아미노산 위치를 예측하는 것이 가능하다. 따라서, 본원에 개시된 방법에 따라 유용한 활성 인간 ALK4 변이체 폴리펩티드는 또 다른 척추동물 ALK4의 서열로부터의 상응하는 위치에서 1개 이상의 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 인간 또는 다른 척추동물 서열에서의 잔기와 유사한 잔기를 포함할 수 있다.
제한하려는 의도 없이, 하기 예는 활성 ALK4 변이체를 정의하기 위한 이러한 접근법을 예시한다. 도 9에 예시된 바와 같이, 인간 ALK4 세포외 도메인 (서열식별번호: 414) 내의 V6은 무스 무쿨루스 ALK4 (서열식별번호: 418)에서 이소류신이고, 따라서 위치는 변경될 수 있고, 임의로 갈루스 갈루스 ALK4 (서열식별번호: 417)에서 관찰되는 바와 같은 또 다른 소수성 잔기, 예컨대 L, I, 또는 F, 또는 비-극성 잔기, 예컨대 A로 변경될 수 있다. 인간 세포외 도메인 내의 E40은 갈루스 갈루스 ALK4에서 K이고, 이는 이 부위가 극성 잔기, 예컨대 E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y, 및 아마도 비-극성 잔기, 예컨대 A를 포함한 매우 다양한 변화를 허용할 수 있다는 것을 나타낸다. 인간 세포외 도메인 내의 S15는 갈루스 갈루스 ALK4에서 D이고, 이는 이 위치에서 광범위한 구조적 변이가 허용된다는 것을 나타내며, 극성 잔기 예컨대 S, T, R, E, K, H, G, P, G 및 Y가 선호된다. 인간 세포외 도메인 내의 E40은 갈루스 갈루스 ALK4에서 K이고, 이는 이 위치에서 D, R, K, H, 뿐만 아니라 Q 및 N을 포함한 하전된 잔기가 허용될 것임을 나타낸다. 인간 세포외 도메인 내의 R80은 콘딜루라 크리스타타(Condylura cristata) ALK4 (서열식별번호: 415)에서 K이고, 이는 이 위치에서 R, K, 및 H를 포함한 염기성 잔기가 허용된다는 것을 나타낸다. 인간 세포외 도메인 내의 Y77은 수스 수크로파 ALK4 (서열식별번호: 419)에서 F이고, 이는 이 위치에서 F, W, 및 Y를 포함한 방향족 잔기가 허용된다는 것을 나타낸다. 인간 세포외 도메인 내의 P93은 상대적으로 불량하게 보존되고, 에리나세우스 유로파에우스(Erinaceus europaeus) ALK4 (서열식별번호: 416)에서는 S 및 갈루스 갈루스 ALK4에서는 N으로 나타나므로, 본질적으로 임의의 아미노산이 이 위치에서 허용될 것이다.
또한, ALK4 단백질은 구조적 및 기능적 특징의 관점에서, 특히 리간드 결합과 관련하여 관련 기술분야에서 특징화되었다 [예를 들어, Harrison et al., (2003) J Biol Chem 278(23):21129-21135; Romano et al., (2012) J Mol Model 18(8):3617-3625; 및 Calvanese et al., (2009) 15(3):175-183]. 본원의 교시에 더하여, 이들 참고문헌은 1종 이상의 정상 활성 (예를 들어, 리간드-결합 활성)을 보유하는 ALK4 변이체를 생성하는 방법에 대한 충분한 지침을 제공한다.
예를 들어, 3개-핑거 독소 폴드로서 공지된 구조적 모티프를 정의하는 것은 유형 I 및 유형 II 수용체에 의한 리간드 결합에 중요하고, 이는 각각의 단량체 수용체의 세포외 도메인 내의 다양한 위치에 위치하는 보존된 시스테인 잔기에 의해 형성된다 [Greenwald et al., (1999) Nat Struct Biol 6:18-22; 및 Hinck (2012) FEBS Lett 586:1860-1870]. 따라서, 인간 ALK4의 코어 리간드-결합 도메인은, 이들 보존된 시스테인의 최외각에 의해 구분되는 바와 같이, 서열식별번호: 84 (ALK4 전구체)의 위치 34-101에 상응한다. 이들 시스테인-구분되는 코어 서열에 플랭킹된 구조적으로 덜 정렬된 아미노산은, 리간드 결합을 반드시 변경시키지 않으면서 N-말단에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33개의 잔기만큼 및/또는 C-말단에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 잔기만큼 말단절단될 수 있다. N-말단 및/또는 C-말단 절단에 대한 예시적인 ALK4 세포외 도메인은 서열식별번호: 86, 87 및 422를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 그의 단편, 기능적 변이체 및 변형된 형태를 포함한, 적어도 1개의 ALK4 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체에 관한 것이다. 바람직하게는, 본원에 개시된 바와 같이 사용하기 위한 ALK4 폴리펩티드 (예를 들어, ALK4 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체 및 그의 용도)는 가용성이다 (예를 들어, ALK4의 세포외 도메인). 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같이 사용하기 위한 ALK4 폴리펩티드는 1개 이상의 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드에 결합하고/거나 그의 활성 (예를 들어, Smad 신호전달의 유도)을 억제 (길항)한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이종다량체는 서열식별번호: 84, 85, 86, 87, 88, 89, 92, 93, 421 및 422의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 적어도 1개의 ALK4 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이종다량체는 서열식별번호: 84, 85, 86, 87, 88, 89, 92, 93, 422의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 적어도 1개의 ALK4 폴리펩티드로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어진다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 84, 85, 또는 421의 아미노산 23-34 (예를 들어, 아미노산 잔기 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34) 중 어느 하나에서 시작하여 서열식별번호: 84, 85, 또는 421의 아미노산 101-126 (예를 들어, 아미노산 잔기 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 및 126) 중 어느 하나에서 종결되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 ALK4 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 84, 85 또는 421의 아미노산 34-101과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 ALK4 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 84, 85 또는 421의 아미노산 23-126과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 ALK4 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 84, 85, 86, 87, 88, 89, 92, 93, 247, 249, 421, 422 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 ALK4 도메인을 포함한다.
E) ALK7 폴리펩티드
특정 측면에서, 본 개시내용은 ALK7 폴리펩티드를 포함하며, 그의 단편, 기능적 변이체 및 변형된 형태를 포함하는 ActRII-ALK4 길항제뿐만 아니라 (예를 들어, 심부전 (HF) 또는 HF의 1종 이상의 합병증을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는) 그의 용도에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "ALK7"은 임의의 종으로부터의 액티빈 수용체-유사 키나제-7 (ALK7) 단백질 패밀리, 및 이러한 ALK7 단백질로부터 돌연변이유발 또는 다른 변형에 의해 유래된, 유용한 활성을 보유하는 변이체 폴리펩티드 (예를 들어, 돌연변이체, 단편, 융합체 및 펩티드모방체 형태 포함)를 지칭한다. 이러한 변이체 ALK7 폴리펩티드의 예는 본 개시내용 전반에 걸쳐서뿐만 아니라 국제 특허 출원 공개 번호 WO/2016/164089 및 WO/2016/164503에 제공되며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본원에서 ALK7에 대한 언급은 현재 확인된 형태 중 어느 하나에 대한 언급인 것으로 이해된다. ALK7 패밀리의 구성원은 일반적으로 시스테인-풍부 영역을 갖는 리간드-결합 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 및 예측된 세린/트레오닌 키나제 특이성을 갖는 세포질 도메인으로 구성된 모든 막횡단 폴리펩티드이다. 인간 ALK7 전구체 폴리펩티드의 아미노산 서열은 하기 (서열식별번호: 120)에 제시된다. 바람직하게는, 본 개시내용의 방법에 따라 사용될 ALK7 폴리펩티드는 가용성이다. 본원에 사용된 용어 "가용성 ALK7 폴리펩티드"는 ALK7 폴리펩티드의 임의의 자연 발생 세포외 도메인뿐만 아니라 유용한 활성을 보유하는 그의 임의의 변이체 (돌연변이체, 단편 및 펩티드모방체 형태 포함)를 포함한다. 예를 들어, ALK7 폴리펩티드의 세포외 도메인은 리간드에 결합하고, 일반적으로 가용성이다. 가용성 ALK7 폴리펩티드의 예는 하기 ALK7 세포외 도메인 (서열식별번호: 123)을 포함한다. 가용성 ALK7 폴리펩티드의 다른 예는 ALK7 폴리펩티드의 세포외 도메인에 더하여 신호 서열을 포함한다. 신호 서열은 ALK7의 천연 신호 서열, 또는 또 다른 폴리펩티드로부터의 신호 서열, 예컨대 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA) 신호 서열 또는 꿀벌 멜리틴 신호 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, ALK7 폴리펩티드는 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)의 활성 (예를 들어, Smad 신호전달)을 억제한다. 일부 실시양태에서, ALK7 폴리펩티드는 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)에 결합한다. 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드에 결합하고/거나 그의 활성을 억제하는 ALK7 폴리펩티드의 능력을 결정하기 위한 방법 및 검정의 다양한 예는 본원에 개시되어 있거나 또는 달리 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 이는 ALK7 폴리펩티드가 목적하는 결합 및/또는 길항 활성을 갖는지 결정하는 데 용이하게 사용될 수 있다. 본원에 기재된 모든 ALK7-관련 폴리펩티드에 대한 아미노산의 넘버링은 달리 구체적으로 지정되지 않는 한 하기 제공된 인간 ALK7 전구체 단백질 서열 (서열식별번호: 120)의 넘버링에 기초한다.
인간 ALK7의 4종의 자연 발생 이소형이 기재되어 있다. 인간 ALK7 이소형 1 전구체 폴리펩티드 (NCBI Ref Seq NP_660302.2)의 서열은 하기와 같다:
신호 펩티드는 단일 밑줄로 표시되고, 세포외 도메인은 볼드체로 표시된다.
프로세싱된 세포외 ALK7 이소형 1 폴리펩티드 서열은 하기와 같다:
진뱅크 참조 서열 NM_145259.2의 뉴클레오티드 244-1722에 상응하는, 인간 ALK7 이소형 1 전구체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 하기 서열식별번호: 233에 제시된다.
프로세싱된 세포외 ALK7 폴리펩티드 (이소형 1)를 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 234에 제시된다.
인간 ALK7의 대안적 이소형, 이소형 2의 아미노산 서열 (NCBI Ref Seq NP_001104501.1)은 하기와 같이 그의 프로세싱된 형태로 제시되고 (서열식별번호: 124), 여기서 세포외 도메인은 볼드체로 표시된다.
세포외 ALK7 폴리펩티드 (이소형 2)의 아미노산 서열은 하기와 같다:
NCBI 참조 서열 NM_001111031.1의 뉴클레오티드 279-1607에 상응하는, 프로세싱된 ALK7 폴리펩티드 (이소형 2)를 코딩하는 핵산 서열은 하기 서열식별번호: 235에 제시된다.
세포외 ALK7 폴리펩티드 (이소형 2)를 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 236에 제시된다.
대안적 인간 ALK7 전구체 폴리펩티드, 이소형 3의 아미노산 서열 (NCBI Ref Seq NP_001104502.1)은 하기와 같이 제시되고 (서열식별번호: 121), 여기서 신호 펩티드는 단일 밑줄로 표시된다.
프로세싱된 ALK7 폴리펩티드 (이소형 3)의 아미노산 서열은 하기와 같다 (서열식별번호: 126). 이러한 이소형은 막횡단 도메인이 결여되어 있고, 따라서 그 전체가 가용성인 것으로 제안된다 (Roberts et al., 2003, Biol Reprod 68:1719-1726). 서열식별번호: 126의 N-말단 변이체는 하기 기재된 바와 같이 예측된다.
NCBI 참조 서열 NM_001111032.1의 뉴클레오티드 244-1482에 상응하는, 비프로세싱된 ALK7 폴리펩티드 전구체 폴리펩티드 (이소형 3)를 코딩하는 핵산 서열이 서열식별번호: 237에 제시된다.
프로세싱된 ALK7 폴리펩티드 (이소형 3)를 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 238에 제시된다.
대안적 인간 ALK7 전구체 폴리펩티드, 이소형 4의 아미노산 서열 (NCBI Ref Seq NP_001104503.1)은 하기와 같이 제시되고 (서열식별번호: 122), 여기서 신호 펩티드는 단일 밑줄로 표시된다.
프로세싱된 ALK7 폴리펩티드 (이소형 4)의 아미노산 서열은 하기와 같다 (서열식별번호: 127). ALK7 이소형 3과 같이, 이소형 4는 막횡단 도메인이 결여되어 있고, 따라서 그 전체가 가용성인 것으로 제안된다 (Roberts et al., 2003, Biol Reprod 68:1719-1726). 서열식별번호: 127의 N-말단 변이체는 하기 기재된 바와 같이 예측된다.
NCBI 참조 서열 NM_001111033.1의 뉴클레오티드 244-1244에 상응하는, 비프로세싱된 ALK7 폴리펩티드 전구체 폴리펩티드 (이소형 4)를 코딩하는 핵산 서열이 서열식별번호: 239에 제시된다.
프로세싱된 ALK7 폴리펩티드 (이소형 4)를 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 240에 제시된다.
래트에서의 전장 ALK7 (이소형 1)의 신호 서열 (NCBI 참조 서열 NP_620790.1 참조) 및 인간과 래트 ALK7 사이의 고도의 서열 동일성에 기초하여, 인간 ALK7 이소형 1의 프로세싱된 형태는 하기와 같을 것으로 예측된다 (서열식별번호: 128).
서열식별번호: 123이 N-말단에서 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산만큼 말단절단되고, 서열식별번호: 128이 N-말단에서 1 또는 2개의 아미노산만큼 말단절단된, 프로세싱된 ALK7 이소형 1의 활성 변이체가 예측된다. 서열식별번호: 128과 일치하게, 류신은 인간 ALK7 이소형 3 (서열식별번호: 126) 및 인간 ALK7 이소형 4 (서열식별번호: 127)의 프로세싱된 형태의 N-말단 아미노산일 것으로 추가로 예상된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 그의 단편, 기능적 변이체 및 변형된 형태를 포함한, 적어도 1개의 ALK7 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 개시내용의 발명에 따라 사용하기 위한 ALK7 폴리펩티드 (예를 들어, ALK7 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체 및 그의 용도)는 가용성이다 (예를 들어, ALK7의 세포외 도메인). 다른 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 ALK7 폴리펩티드는 1종 이상의 ActRII-ALK4 리간드에 결합한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 ALK7 폴리펩티드는 1종 이상의 ActRII-ALK4 리간드의 활성 (예를 들어, Smad 신호전달의 유도)을 억제 (길항)한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이종다량체는 서열식별번호: 120, 123, 124, 125, 121, 126, 122, 127, 128, 129, 255, 133 및 134의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 적어도 1개의 ALK7 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이종다량체는 서열식별번호: 120, 123, 124, 125, 121, 126, 122, 127, 128, 129, 255, 133 및 134의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 적어도 1개의 ALK7 폴리펩티드로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어진다.
ALK7은 척추동물 사이에서 잘 보존되며, 세포외 도메인의 큰 스트레치는 완전히 보존된다. 예를 들어, 도 22는 다양한 ALK7 오르토로그와 비교하여 인간 ALK7 세포외 도메인의 다중-서열 정렬을 도시한다. 따라서, 이들 정렬로부터, 정상 ALK7-리간드 결합 활성에 중요한 리간드-결합 도메인 내의 주요 아미노산 위치를 예측하는 것뿐만 아니라 정상 ALK7-리간드 결합 활성을 유의하게 변경시키지 않으면서 치환을 허용할 가능성이 있는 아미노산 위치를 예측하는 것이 가능하다. 따라서, 본원에 개시된 방법에 따라 유용한 활성 인간 ALK7 변이체 폴리펩티드는 또 다른 척추동물 ALK7의 서열로부터의 상응하는 위치에서 1개 이상의 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 인간 또는 다른 척추동물 서열에서의 잔기와 유사한 잔기를 포함할 수 있다. 제한하려는 의도 없이, 하기 예는 활성 ALK7 변이체를 정의하기 위한 이러한 접근법을 예시한다. 인간 ALK7 세포외 도메인 (서열식별번호: 425) 내의 V61은 칼리트릭스 자쿠스(Callithrix jacchus) ALK7 (서열식별번호: 428)에서 이소류신이고, 따라서 위치는 변경될 수 있고, 임의로 또 다른 소수성 잔기 예컨대 L, I, 또는 F, 또는 비-극성 잔기 예컨대 A로 변경될 수 있다. 인간 세포외 도메인 내의 L32는 타르시우스 시리크타(Tarsius syrichta) (서열식별번호: 429) ALK7에서 R이고, 이는 이 부위가 극성 잔기, 예컨대 E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y, 및 아마도 비-극성 잔기 예컨대 A를 포함한 매우 다양한 변화를 허용할 수 있다는 것을 나타낸다. 인간 세포외 도메인 내의 K37은 판 트로글로디테스(Pan troglodytes) ALK7 (서열식별번호: 426)에서 R이고, 이는 이 위치에서 R, K, 및 H를 포함한 염기성 잔기가 허용된다는 것을 나타낸다. 인간 세포외 도메인 내의 P4는 상대적으로 불량하게 보존되고, 판 트로글로디테스 ALK7에서 A로 나타나므로, 이는 매우 다양한 아미노산이 이 위치에서 허용될 것임을 나타낸다.
더욱이, ALK7 단백질은 구조적 및 기능적 특징의 관점에서 관련 기술분야에서 특징화되었다 [예를 들어, Romano et al., (2012) Journal of Molecular Modeling 18(8): 3617-3625]. 예를 들어, 3개-핑거 독소 폴드로서 공지된 구조적 모티프를 정의하는 것은 유형 I 및 유형 II 수용체에 의한 리간드 결합에 중요하고, 이는 각각의 단량체 수용체의 세포외 도메인 내의 다양한 위치에 위치하는 보존된 시스테인 잔기에 의해 형성된다 [Greenwald et al., (1999) Nat Struct Biol 6:18-22; 및 Hinck (2012) FEBS Lett 586:1860-1870]. 따라서, 인간 ALK7의 코어 리간드-결합 도메인은, 이들 보존된 시스테인의 최외각에 의해 구분되는 바와 같이, 서열식별번호: 120의 위치 28-92에 상응한다. 이들 시스테인-구분되는 코어 서열에 플랭킹된 구조적으로 덜 정렬된 아미노산은, 리간드 결합을 반드시 변경시키지 않으면서 N-말단에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27개의 잔기만큼 및/또는 C-말단에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21개의 잔기만큼 말단절단될 수 있다. N-말단 및/또는 C-말단 절단에 대한 예시적인 ALK7 세포외 도메인은 서열식별번호: 123, 125, 126, 및 127을 포함한다.
따라서, ALK7의 활성 부분 (예를 들어, 리간드-결합 부분)에 대한 일반식은 서열식별번호: 120의 아미노산 28-92를 포함한다. 따라서, ALK7 폴리펩티드는 예를 들어 서열식별번호: 120의 아미노산 20-28 중 어느 하나에 상응하는 잔기에서 시작하여 (예를 들어, 아미노산 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28 중 어느 하나에서 시작하여) 서열식별번호: 120의 아미노산 92-113 중 어느 하나에 상응하는 위치에서 종결되는 (예를 들어, 아미노산 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 또는 113 중 어느 하나에서 종결되는) ALK7의 부분과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어질 수 있다.
다른 예는 서열식별번호: 120의 21-28 (예를 들어, 위치 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28 중 어느 하나), 24-28 (예를 들어, 위치 24, 25, 26, 27, 또는 28 중 어느 하나), 또는 25-28 (예를 들어, 위치 25, 26, 27, 또는 28 중 어느 하나)로부터의 위치에서 시작하여 서열식별번호: 120의 93-112 (예를 들어, 위치 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 또는 112 중 어느 하나), 93-110 (예를 들어, 위치 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 또는 110 중 어느 하나), 93-100 (예를 들어, 위치 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100 중 어느 하나), 또는 93-95 (예를 들어, 위치 93, 94, 또는 95 중 어느 하나)로부터의 위치에서 종결되는 구축물을 포함한다. 이들 범위 내의 변이체, 특히 서열식별번호: 120의 상응하는 부분에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 것이 또한 고려된다.
본원에 기재된 변형은 다양한 방식으로 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, ALK7 변이체는 리간드-결합 포켓 내에 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 15개 이하의 보존적 아미노산 변화를 포함한다. 가변성이 특히 잘 허용될 수 있는 결합 포켓 외부의 부위는 세포외 도메인의 아미노 및 카르복시 말단을 포함한다 (상기 언급된 바와 같음).
F) 폴리스타틴 폴리펩티드
다른 측면에서, ActRII-ALK4 길항제는 폴리스타틴 폴리펩티드이다. 본원에 기재된 바와 같이, 폴리스타틴 폴리펩티드는 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 데, 특히 1종 이상의 심부전-연관 합병증을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 데 사용될 수 있다.
용어 "폴리스타틴 폴리펩티드"는 폴리스타틴의 임의의 자연 발생 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드뿐만 아니라 유용한 활성을 보유하는 그의 임의의 변이체 (돌연변이체, 단편, 융합체 및 펩티드모방체 형태 포함)를 포함하고, 폴리스타틴의 임의의 기능적 단량체 또는 다량체를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리스타틴 폴리펩티드는 특히 액티빈 A인 액티빈에 결합하고/거나 액티빈 활성을 억제한다. 액티빈 결합 특성을 보유하는 폴리스타틴 폴리펩티드의 변이체는 폴리스타틴 및 액티빈 상호작용을 수반하는 이전 연구에 기초하여 확인될 수 있다. 예를 들어, WO2008/030367은 액티빈 결합에 중요한 것으로 제시된 특이적 폴리스타틴 도메인 ("FSD")을 개시한다. 하기 서열식별번호: 392-394에 제시된 바와 같은, 폴리스타틴 N-말단 도메인 ("FSND", 서열식별번호: 392), FSD2 (서열식별번호: 394), 및 보다 적은 정도로 FSD1 (서열식별번호: 393)은 액티빈 결합에 중요한 폴리스타틴 내의 예시적인 도메인을 나타낸다. 또한, 폴리펩티드의 라이브러리를 제조하고 이를 시험하는 방법은 ActRII 폴리펩티드와 관련하여 상기 기재되어 있고, 이러한 방법은 또한 폴리스타틴의 변이체를 제조하고 시험하는 것에 관한 것이다. 폴리스타틴 폴리펩티드는 폴리스타틴 폴리펩티드의 서열과 적어도 약 80% 동일한 서열을 갖는, 임의로 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성을 갖는 임의의 공지된 폴리스타틴의 서열로부터 유래된 폴리펩티드를 포함한다. 폴리스타틴 폴리펩티드의 예는 예를 들어 WO2005/025601에 기재된 바와 같은 인간 폴리스타틴 전구체 폴리펩티드 (서열식별번호: 390)의 성숙 폴리스타틴 폴리펩티드 또는 보다 짧은 이소형 또는 다른 변이체를 포함한다.
인간 폴리스타틴 전구체 폴리펩티드 이소형 FST344는 하기와 같다:
신호 펩티드는 밑줄로 표시되고; 또한 상기 밑줄로 표시된 것은 이러한 폴리스타틴 이소형을 하기 제시된 보다 짧은 폴리스타틴 이소형 FST317과 구별시켜주는 C-말단 연장을 나타내는 마지막 27개의 잔기이다.
인간 폴리스타틴 전구체 폴리펩티드 이소형 FST317은 하기와 같다:
신호 펩티드는 밑줄로 표시된다.
폴리스타틴 N-말단 도메인 (FSND) 서열은 하기와 같다:
FSD1 및 FSD2 서열은 하기와 같다:
G) 융합 폴리펩티드
특정 측면에서, 본 개시내용은 융합 폴리펩티드인 ActRII-ALK4 길항제를 제공한다. 융합 폴리펩티드는 본원에 개시되거나 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 따라 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 융합 폴리펩티드는 하기 성분을 포함한다: a) 본원에 개시된 임의의 폴리펩티드 ("A") (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드), b) 본원에 개시된 임의의 링커 ("B"), c) 본원에 개시된 임의의 이종 부분 ("C") (예를 들어, Fc 이뮤노글로불린 도메인), 및 임의로 리더 서열 ("X") (예를 들어, 조직 플라스미노겐 활성화제 리더 서열). 이러한 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 하기와 같은 방식으로 배열될 수 있다 (N-말단에서 C-말단으로): A-B-C 또는 C-B-A. 이러한 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 하기와 같은 방식으로 배열될 수 있다 (N-말단에서 C-말단으로): X-A-B-C 또는 X-C-B-A. 일부 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 각각의 A, B 및 C (및 임의로 리더 서열)를 포함하며, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 추가의 아미노산을 포함한다 (그러나 추가의 번역후 변형, 예컨대 글리코실화를 포함할 수 있음).
일부 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 하기와 같은 방식으로 (N-말단에서 C-말단으로): X-A-B-C로 위치하는 리더 서열을 포함하고, 융합 폴리펩티드는 X와 A 사이에 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 하기와 같은 방식으로 (N-말단에서 C-말단으로): X-C-B-A로 위치하는 리더 서열을 포함하고, 융합 폴리펩티드는 X와 C 사이에 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 하기와 같은 방식으로 (N-말단에서 C-말단으로): X-A-B-C로 위치하는 리더 서열을 포함하고, 융합 폴리펩티드는 X와 A 사이에 알라닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 하기와 같은 방식으로 (N-말단에서 C-말단으로): X-C-B-A로 위치하는 리더 서열을 포함하고, 융합 폴리펩티드는 X와 C 사이에 알라닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 하기와 같은 방식으로 (N-말단에서 C-말단으로): X-A-B-C로 위치하는 리더 서열을 포함하고, 융합 폴리펩티드는 X와 A 사이에 글리신 및 알라닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 하기와 같은 방식으로 (N-말단에서 C-말단으로): X-C-B-A로 위치하는 리더 서열을 포함하고, 융합 폴리펩티드는 X와 C 사이에 글리신 및 알라닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 하기와 같은 방식으로 (N-말단에서 C-말단으로): X-A-B-C로 위치하는 리더 서열을 포함하고, 융합 폴리펩티드는 X와 A 사이에 트레오닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 하기와 같은 방식으로 (N-말단에서 C-말단으로): X-C-B-A로 위치하는 리더 서열을 포함하고, 융합 폴리펩티드는 X와 C 사이에 트레오닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 하기와 같은 방식으로 (N-말단에서 C-말단으로): X-A-B-C로 위치하는 리더 서열을 포함하고, 융합 폴리펩티드는 A와 B 사이에 트레오닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 하기와 같은 방식으로 (N-말단에서 C-말단으로): X-C-B-A로 위치하는 리더 서열을 포함하고, 융합 폴리펩티드는 C와 B 사이에 트레오닌을 포함한다.
특정 측면에서, 본 개시내용의 융합 단백질은 ActRII-ALK4 리간드 트랩 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)의 적어도 한 부분 및 1개 이상의 이종 부분 (예를 들어, 이뮤노글로불린 Fc 도메인)을 포함하며, 임의로 1개 이상의 링커 도메인 서열이 ActRII-ALK4 리간드 트랩 도메인과 1개 이상의 이종 부분 사이에 위치한다. 이러한 이종 부분의 널리 공지된 예는 폴리히스티딘, Glu-Glu, 글루타티온 S 트랜스퍼라제 (GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역 (Fc), 말토스 결합 단백질 (MBP), 또는 인간 혈청 알부민을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
이종 부분은 목적하는 특성을 부여하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 일부 이종 부분은 친화성 크로마토그래피에 의한 융합 단백질의 단리에 특히 유용하다. 친화성 정제의 목적을 위해, 친화성 크로마토그래피를 위한 관련 매트릭스, 예컨대 글루타티온-, 아밀라제-, 및 니켈- 또는 코발트-접합 수지가 사용된다. 많은 이러한 매트릭스는 "키트" 형태, 예컨대 (HIS6) 융합 파트너에 유용한 파마시아(Pharmacia) GST 정제 시스템 및 퀴아익스프레스(QIAexpress)™ 시스템 (퀴아젠(Qiagen))으로 입수가능하다. 또 다른 예로서, 이종 부분은 융합 폴리펩티드의 검출을 용이하게 하도록 선택될 수 있다. 이러한 검출 도메인의 예는 다양한 형광 단백질 (예를 들어, GFP)뿐만 아니라, 특이적 항체가 이용가능한 통상적으로 짧은 펩티드 서열인 "에피토프 태그"를 포함한다. 특이적 모노클로날 항체가 용이하게 이용가능한 널리 공지된 에피토프 태그는 FLAG, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA), 및 c-myc 태그를 포함한다. 일부 경우에, 이종 부분은 예컨대 인자 Xa 또는 트롬빈에 대한 프로테아제 절단 부위를 가지며, 이는 관련 프로테아제가 융합 단백질을 부분적으로 소화시켜 그로부터 재조합 단백질을 유리시키는 것을 가능하게 한다. 이어서, 유리된 단백질은 후속 크로마토그래피 분리에 의해 이종 부분으로부터 단리될 수 있다.
특정 실시양태에서, ActRII-ALK4 리간드 트랩 도메인 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)은 생체내에서 ActRII-ALK4 리간드 트랩 도메인을 안정화시키는 이종 도메인 ("안정화제" 도메인)에, 임의로 개재 링커 도메인에 의해 융합된다. 일반적으로, 용어 "안정화"는, 이것이 감소된 파괴, 신장에 의한 감소된 클리어런스, 또는 작용제의 다른 약동학적 효과로 인한 것인지 여부와 관계없이, 혈청 반감기를 증가시키는 임의의 것을 의미한다. 이뮤노글로불린의 Fc 부분과의 융합 폴리펩티드는 광범위한 단백질에 바람직한 약동학적 특성을 부여하는 것으로 공지되어 있다. 마찬가지로, 인간 혈청 알부민에 대한 융합도 바람직한 특성을 부여할 수 있다. 선택될 수 있는 이종 부분의 다른 유형은 다량체화 (예를 들어, 이량체화, 사량체화) 도메인 및 기능적 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 안정화 도메인은 또한 다량체화 도메인으로서 기능할 수 있다. 이러한 다중기능적 도메인은, 예를 들어 Fc 이뮤노글로불린 도메인을 포함한다. 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드 트랩 도메인을 포함하는 Fc 이뮤노글로불린 도메인 및 Fc-융합 단백질의 다양한 예가 본 개시내용 전반에 걸쳐 기재된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 융합 단백질은 N-말단에 임의의 다양한 리더 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 서열은 펩티드가 진핵 시스템에서 발현되고 분비 경로에 표적화되도록 할 것이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,082,783 (1992) (Ernst et al.)를 참조한다. 대안적으로, 천연 신호 서열을 사용하여 세포로부터 분출을 수행할 수 있다. 가능한 리더 서열은 천연 리더, 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA) 및 꿀벌 멜리틴을 포함한다. TPA 리더 서열을 포함하는 융합 단백질의 예는 서열식별번호: 6, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 51, 88, 92, 129, 133, 247, 276, 279, 333, 336, 339, 342, 345, 348, 351, 354, 381, 396, 402, 및 406을 포함한다. 신호 펩티드의 프로세싱은, 다른 변수 중에서, 선택된 리더 서열, 사용된 세포 유형 및 배양 조건에 따라 달라질 수 있고, 따라서 성숙 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드) 폴리펩티드에 대한 실제 N-말단 출발 부위는 N-말단 또는 C-말단 방향으로 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산만큼 이동할 수 있다.
바람직한 융합 단백질은 서열식별번호: 5, 6, 12, 31, 33, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 45, 46, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 55, 88, 89, 92, 93, 129, 130, 133, 134, 247, 249, 276, 278, 279, 332, 333, 335, 336, 338, 339, 341, 342, 344, 345, 347, 348, 350, 351, 353, 354, 356, 378, 380, 381, 385, 396, 398, 401, 402, 403, 406, 408 및 409 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
I. 다량체화 도메인
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 및 폴리스타틴 폴리펩티드)는 적어도 1개의 다량체화 도메인을 포함한다. 본원에 개시된 용어 "다량체화 도메인"은 적어도 제1 폴리펩티드와 적어도 제2 폴리펩티드 사이의 공유 또는 비-공유 상호작용을 촉진하는 아미노산 또는 아미노산 서열을 지칭한다. 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 및 폴리스타틴 폴리펩티드)는 다량체화 도메인에 공유 또는 비-공유 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다량체화 도메인은 제1 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIB 또는 ActRIIA 폴리펩티드)와 제2 폴리펩티드 (예를 들어, ALK4 폴리펩티드 또는 ALK7 폴리펩티드) 사이의 상호작용을 촉진하여 이종다량체 형성 (예를 들어, 이종이량체 형성)을 촉진하고, 임의로 동종다량체 형성 (예를 들어, 동종이량체 형성)은 방해하거나 또는 달리 회피시켜, 목적하는 이종다량체의 수율을 증가시킨다 (예를 들어, 도 8b 참조). 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 및 폴리스타틴 폴리펩티드)는 공유 상호작용을 통해 이종이량체를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 및 폴리스타틴 폴리펩티드)는 비-공유 상호작용을 통해 이종이량체를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 및 폴리스타틴 폴리펩티드)는 공유 및 비-공유 상호작용 둘 다를 통해 이종이량체를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다량체화 도메인은 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드 사이의 상호작용을 촉진하여 동종다량체 형성을 촉진하고, 임의로 이종다량체 형성은 방해하거나 또는 달리 회피시켜, 목적하는 동종다량체의 수율을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 및 폴리스타틴 폴리펩티드)는 동종이량체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 및 폴리스타틴 폴리펩티드)는 공유 상호작용을 통해 동종이량체를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 및 폴리스타틴 폴리펩티드)는 비-공유 상호작용을 통해 동종이량체를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 및 폴리스타틴 폴리펩티드)는 공유 및 비-공유 상호작용 둘 다를 통해 동종이량체를 형성할 수 있다.
특정 측면에서, 다량체화 도메인은 상호작용 쌍의 1개의 성분을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드와 공유 또는 비-공유 회합된 제1 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 복합체를 형성할 수 있으며, 여기서 제1 폴리펩티드는 제1 ActRII-ALK4 리간드 트랩 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 및 폴리스타틴 폴리펩티드)의 아미노산 서열 및 상호작용 쌍의 제1 구성원 (예를 들어, 제1 이뮤노글로불린 Fc 도메인)의 아미노산 서열을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 제2 ActRII-ALK4 리간드 트랩 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 및 폴리스타틴 폴리펩티드)의 아미노산 서열 및 상호작용 쌍의 제2 구성원 (예를 들어, 제2 이뮤노글로불린 Fc 도메인)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드와 공유 또는 비공유 회합된 제1 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 복합체를 형성할 수 있으며, 여기서 제1 폴리펩티드는 ActRIIA 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 상호작용 쌍의 제1 구성원의 아미노산 서열을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 ALK4 폴리펩티드 또는 ALK7 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 상호작용 쌍의 제2 구성원의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드와 공유 또는 비공유 회합된 제1 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 복합체를 형성할 수 있으며, 여기서 제1 폴리펩티드는 ActRIIB 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 상호작용 쌍의 제1 구성원의 아미노산 서열을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 ALK4 폴리펩티드 또는 ALK7 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 상호작용 쌍의 제2 구성원의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상호작용 쌍은 상호작용하여 이종이량체 또는 동종이량체 복합체인 이량체 복합체를 형성하는 임의의 2개의 폴리펩티드 서열일 수 있다. 상호작용 쌍은 개선된 특성/활성, 예컨대 증가된 혈청 반감기를 부여하도록, 또는 또 다른 모이어티가 부착되어 개선된 특성/활성을 제공하도록 하는 어댑터로서 작용하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 또는 글리코실화 모이어티가 상호작용 쌍의 하나 또는 둘 다의 성분에 부착되어 개선된 특성/활성, 예컨대 개선된 혈청 반감기를 제공할 수 있다.
상호작용 쌍의 제1 및 제2 구성원은 비대칭 쌍일 수 있으며, 이는 쌍의 구성원이 자기-회합보다는 서로 우선적으로 회합한다는 것을 의미한다. 따라서, 비대칭 상호작용 쌍의 제1 및 제2 구성원은 회합하여 이종이량체 복합체를 형성할 수 있다 (예를 들어, 도 8b 참조). 대안적으로, 상호작용 쌍은 안내되지 않을 수 있으며, 이는 쌍의 구성원이 실질적 선호도 없이 서로 회합할 수 있거나 또는 자기-회합할 수 있고, 따라서 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다는 것을 의미한다 (예를 들어, 도 8a 참조). 따라서, 안내되지 않은 상호작용 쌍의 제1 및 제2 구성원은 회합하여 동종이량체 복합체 또는 이종이량체 복합체를 형성할 수 있다. 임의로, 상호작용 쌍 (예를 들어, 비대칭 쌍 또는 안내되지 않은 상호작용 쌍)의 제1 구성원은 상호작용 쌍의 제2 구성원과 공유 회합한다. 임의로, 상호작용 쌍 (예를 들어, 비대칭 쌍 또는 안내되지 않은 상호작용 쌍)의 제1 구성원은 상호작용 쌍의 제2 구성원과 비-공유 회합한다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 폴리펩티드는 이종이량체 또는 동종이량체 복합체를 형성하지만, 보다 고차의 이종다량체 및 동종다량체 복합체, 예컨대 비제한적으로 이종삼량체, 동종삼량체, 이종사량체, 동종사량체, 및 추가의 올리고머 구조가 또한 포함된다 (예를 들어, 도 11-13 참조, 이는 또한 ActRII-ALK4 및 ActRII-ALK7 올리고머 구조 둘 다에 적용될 수 있음).
Ia Fc-융합 단백질
다량체화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드의 구체적 예로서, 본 개시내용은 이뮤노글로불린의 불변 도메인, 예컨대 이뮤노글로불린의 CH1, CH2 또는 CH3 도메인 또는 이뮤노글로불린 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 융합된 ActRII-ALK4 리간드 트랩 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7 및 폴리스타틴 폴리펩티드)를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 본원에 사용된 용어 "이뮤노글로불린 Fc 도메인" 또는 간단히 "Fc"는 이뮤노글로불린 쇄 불변 영역, 바람직하게는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역, 또는 그의 부분의 카르복실-말단 부분을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 이뮤노글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 또는 5) 2개 이상의 도메인 및 이뮤노글로불린 힌지 영역의 조합을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 이뮤노글로불린 Fc 영역은 적어도 이뮤노글로불린 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 바람직하게는 CH1 도메인이 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, 이뮤노글로불린 Fc 영역은 인간 이뮤노글로불린 Fc 영역이다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역이 유래된 이뮤노글로불린의 부류는 IgG (Igγ) (γ 하위부류 1, 2, 3 또는 4)이다. 특정 실시양태에서, 불변 영역은 IgG1로부터 유래된다. 다른 부류의 이뮤노글로불린, IgA (Igα), IgD (Igδ), IgE (Igε) 및 IgM (Igμ)이 사용될 수 있다. 적절한 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역의 선택은 미국 특허 번호 5,541,087 및 5,726,044에 상세하게 논의되어 있고, 이는 그 전문이 본원에 포함된다. 특정한 결과를 달성하기 위한 특정 이뮤노글로불린 부류 및 하위부류로부터의 특정한 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역 서열의 선택은 관련 기술분야의 기술 수준 내에 있는 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 이뮤노글로불린 Fc 영역을 코딩하는 DNA 구축물의 한 부분은 바람직하게는 힌지 도메인의 적어도 한 부분, 바람직하게는 Fc 감마의 CH3 도메인 또는 IgA, IgD, IgE 또는 IgM 중 임의의 것에서의 상동 도메인의 적어도 한 부분을 포함한다. 또한, 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역 내의 아미노산의 치환 또는 결실이 본원에 개시된 방법 및 조성물의 실시에 유용할 수 있는 것으로 고려된다. 한 예는 상부 CH2 영역에 아미노산 치환을 도입하여 Fc 수용체에 대해 감소된 친화도를 갖는 Fc 변이체를 생성하는 것이다 (Cole et al., (1997) J. Immunol. 159:3613). 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로부터 유래된 Fc 도메인이 본원에 제공된다.
인간 IgG1의 Fc 부분 (G1Fc)에 사용될 수 있는 천연 아미노산 서열의 예가 하기에 제시된다 (서열식별번호: 13). 점선 밑줄은 힌지 영역을 나타내고, 실선 밑줄은 자연 발생 변이체를 갖는 위치를 나타낸다. 부분적으로, 본 개시내용은 서열식별번호: 13에 대해 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7 및 폴리스타틴 폴리펩티드)를 제공한다.
G1Fc에서의 자연 발생 변이체는 서열식별번호: 13에 사용된 넘버링 시스템에 따라 E134D 및 M136L을 포함한다 (유니프롯 P01857 참조).
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 13의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 1개 이상의 Fc 폴리펩티드 도메인에 융합된, ActRII-ALK4 리간드 트랩 폴리펩티드 도메인 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 및 폴리스타틴 폴리펩티드 도메인) (그의 변이체뿐만 아니라 동종다량체 (예를 들어, 동종이량체) 및 이종다량체 (예를 들어 ActRIIA:ALK4, ActRIIB:ALK4, ActRIIA:ALK7, 및 ActRIIB:ALK7 이종이량체를 포함한, 예를 들어 이종이량체)를 포함하는 Fc 융합 폴리펩티드를 제공한다.
인간 IgG2의 Fc 부분 (G2Fc)에 사용될 수 있는 천연 아미노산 서열의 예가 하기에 제시된다 (서열식별번호: 14). 점선 밑줄은 힌지 영역을 나타내고, 이중 밑줄은 서열에서 데이터베이스 상충이 존재하는 위치를 나타낸다 (유니프롯 P01859에 따름). 부분적으로, 본 개시내용은 서열식별번호: 14에 대해 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7 및 폴리스타틴 폴리펩티드)를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 1개 이상의 Fc 폴리펩티드 도메인에 융합된, ActRII-ALK4 리간드 트랩 폴리펩티드 도메인 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 및 폴리스타틴 폴리펩티드 도메인) (그의 변이체뿐만 아니라 동종다량체 (예를 들어, 동종이량체) 및 이종다량체 (예를 들어 ActRIIA:ALK4, ActRIIB:ALK4, ActRIIA:ALK7, 및 ActRIIB:ALK7 이종이량체를 포함한, 예를 들어 이종이량체)를 포함하는 Fc 융합 폴리펩티드를 제공한다.
인간 IgG3의 Fc 부분 (G3Fc)에 사용될 수 있는 아미노산 서열의 2가지 예가 하기에 제시된다. G3Fc 내의 힌지 영역은 다른 Fc 쇄에서보다 최대 4배 길 수 있고, 유사한 17-잔기 절편이 선행하는 3개의 동일한 15-잔기 절편을 함유한다. 하기 제시된 제1 G3Fc 서열 (서열식별번호: 15)은 단일 15-잔기 절편으로 이루어진 짧은 힌지 영역을 함유하는 반면, 제2 G3Fc 서열 (서열식별번호: 16)은 전장 힌지 영역을 함유한다. 각각의 경우에, 점선 밑줄은 힌지 영역을 나타내고, 실선 밑줄은 유니프롯 P01859에 따른 자연 발생 변이체를 갖는 위치를 나타낸다. 부분적으로, 본 개시내용은 서열식별번호: 15에 대해 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7 및 폴리스타틴 폴리펩티드)를 제공한다. 부분적으로, 본 개시내용은 서열식별번호: 16에 대해 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7 및 폴리스타틴 폴리펩티드)를 제공한다.
G3Fc 내의 자연 발생 변이체 (예를 들어, 유니프롯 P01860 참조)는 서열식별번호: 15에서 사용된 넘버링 시스템으로 전환될 경우 E68Q, P76L, E79Q, Y81F, D97N, N100D, T124A, S169N, S169del, F221Y를 포함하고, 본 개시내용은 이들 변이 중 1개 이상을 함유하는 G3Fc 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 또한, 인간 이뮤노글로불린 IgG3 유전자 (IGHG3)는 상이한 힌지 길이를 특징으로 하는 구조적 다형성을 나타낸다 [유니프롯 P01859 참조]. 구체적으로, 변이체 WIS는 대부분의 V 영역 및 모든 CH1 영역이 결여되어 있다. 이는 힌지 영역에 정상적으로 존재하는 위치 11에 더하여 위치 7에서 추가의 쇄간 디술피드 결합을 갖는다. 변이체 ZUC는 대부분의 V 영역, 모든 CH1 영역, 및 힌지의 일부가 결여되어 있다. 변이체 OMM은 대립유전자 형태 또는 또 다른 감마 쇄 하위부류를 나타낼 수 있다. 본 개시내용은 이들 변이체 중 1종 이상을 함유하는 G3Fc 도메인을 포함하는 추가의 융합 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 15의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 1개 이상의 Fc 폴리펩티드 도메인에 융합된, ActRII-ALK4 리간드 트랩 폴리펩티드 도메인 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 및 폴리스타틴 폴리펩티드 도메인) (그의 변이체뿐만 아니라 동종다량체 (예를 들어, 동종이량체) 및 이종다량체 (예를 들어 ActRIIA:ALK4, ActRIIB:ALK4, ActRIIA:ALK7, 및 ActRIIB:ALK7 이종이량체를 포함한, 예를 들어 이종이량체)를 포함하는 Fc 융합 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 16의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 1개 이상의 Fc 폴리펩티드 도메인에 융합된, ActRII-ALK4 리간드 트랩 폴리펩티드 도메인 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 및 폴리스타틴 폴리펩티드 도메인) (그의 변이체뿐만 아니라 동종다량체 (예를 들어, 동종이량체) 및 이종다량체 (예를 들어 ActRIIA:ALK4, ActRIIB:ALK4, ActRIIA:ALK7, 및 ActRIIB:ALK7 이종이량체를 포함한, 예를 들어 이종이량체)를 포함하는 Fc 융합 폴리펩티드를 제공한다.
인간 IgG4의 Fc 부분 (G4Fc)에 사용될 수 있는 천연 아미노산 서열의 예가 하기에 제시된다 (서열식별번호: 17). 점선 밑줄은 힌지 영역을 나타낸다. 부분적으로, 본 개시내용은 서열식별번호: 17에 대해 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7 및 폴리스타틴 폴리펩티드)를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 17의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 1개 이상의 Fc 폴리펩티드 도메인에 융합된, ActRII-ALK4 리간드 트랩 폴리펩티드 도메인 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 및 폴리스타틴 폴리펩티드 도메인) (그의 변이체뿐만 아니라 동종다량체 (예를 들어, 동종이량체) 및 이종다량체 (예를 들어 ActRIIA:ALK4, ActRIIB:ALK4, ActRIIA:ALK7, 및 ActRIIB:ALK7 이종이량체를 포함한, 예를 들어 이종이량체)를 포함하는 Fc 융합 폴리펩티드를 제공한다.
Fc 도메인 내의 다양한 조작된 돌연변이가 G1Fc 서열 (서열식별번호: 13)과 관련하여 본원에 제시된다. G2Fc, G3Fc 및 G4Fc에서의 유사한 돌연변이가 도 7에서 G1Fc와의 정렬로부터 유래될 수 있다. 동일하지 않은 힌지 길이로 인해, 이소형 정렬에 기초한 유사한 Fc 위치 (도 7)는 서열식별번호: 13, 14, 15 및 17에서 상이한 아미노산 번호를 갖는다. 또한, 힌지, CH2, 및 CH3 영역으로 이루어진 이뮤노글로불린 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 13, 14, 15, 16, 또는 17) 내의 주어진 아미노산 위치는 넘버링이 유니프롯 데이터베이스에서와 같이 전체 IgG1 중쇄 불변 도메인 (CH1, 힌지, CH2, 및 CH3 영역으로 이루어짐)을 포괄하는 경우에 동일한 위치보다 상이한 번호에 의해 확인될 것임이 인지될 수 있다. 예를 들어, 인간 G1Fc 서열 (서열식별번호: 13), 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 (유니프롯 P01857) 및 인간 IgG1 중쇄에서 선택된 CH3 위치 사이의 상응성은 하기와 같다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 조작된 또는 변이체 Fc 영역을 갖는 항체 및 Fc 융합 단백질을 제공한다. 이러한 항체 및 Fc 융합 단백질은, 예를 들어 이펙터 기능, 예컨대 항원-의존성 세포독성 (ADCC) 및 보체-의존성 세포독성 (CDC)을 조정하는 데 유용할 수 있다. 추가적으로, 변형은 항체 및 Fc 융합 단백질의 안정성을 개선시킬 수 있다. 항체 및 Fc 융합 단백질의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 DNA 내로 도입하는 것에 의해 또는 펩티드 합성에 의해 제조된다. 이러한 변이체는, 예를 들어 본원에 개시된 항체 및 Fc 융합 단백질의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물이 목적하는 특징을 보유하는 것을 조건으로, 최종 구축물에 도달하도록 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어진다. 아미노산 변화는 또한 항체 및 Fc 융합 단백질의 번역후 과정을 변경시킬 수 있으며, 예컨대 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시킬 수 있다.
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체 및 Fc 융합 단백질은 아미노산 서열에 문헌 [Bluestone et al.] (WO 94/28027 및 WO 98/47531 참조; 또한 문헌 [Xu et al., 2000 Cell Immunol 200; 16-26] 참조)에 기재된 Ala-Ala 돌연변이를 포함하나 이에 제한되지는 않는 변화를 도입하는 것에 의해 생산될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 불변 영역 내에 Ala-Ala 돌연변이를 포함한 돌연변이를 갖는 본 개시내용의 Fc 융합 단백질은 이펙터 기능을 감소시키거나 없애는 데 사용될 수 있다. 이들 실시양태에 따르면, 항체 및 Fc 융합 단백질은 위치 234에서 알라닌으로의 돌연변이 또는 위치 235에서 알라닌으로의 돌연변이, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 항체 또는 Fc 융합 단백질은 IgG4 프레임워크를 포함하며, 여기서 Ala-Ala 돌연변이는 위치 234에서 페닐알라닌에서 알라닌으로의 돌연변이(들) 및/또는 위치 235에서 류신에서 알라닌으로의 돌연변이를 기재한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 Fc 융합 단백질은 IgG1 프레임워크를 포함하며, 여기서 Ala-Ala 돌연변이는 위치 234에서 류신에서 알라닌으로의 돌연변이(들) 및/또는 위치 235에서 류신에서 알라닌으로의 돌연변이를 기재한다. 이들 부위에서의 알라닌 치환은 인간 및 뮤린 항체 둘 다에서 ADCC를 감소시키는 데 효과적이지만, 이들 치환은 CDC 활성을 감소시키는 데에는 덜 효과적이다. Fc의 Clq 결합 부위를 맵핑하기 위해 무작위 돌연변이유발 접근법에 의해 확인된 또 다른 단일 변이체 P329A는 ADCC 활성을 유지시키면서 CDC 활성을 감소시키는 데 고도로 효과적이다. L234A, L235A 및 P329A (LALA-PG, 카바트 위치) 치환의 조합은 인간 IgG1 항체의 이펙터 기능을 효과적으로 침묵시키는 것으로 밝혀졌다. LALA, LALA-PG, 및 다른 돌연변이의 상세한 논의에 대해서는, 문헌 [Lo et al., (2017) 1 Biol. Chem. 292:3900-3908]을 참조하며, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 Fc 융합 단백질은 중쇄의 Fc 영역에 L234A, L235A 및 P329G 돌연변이 (LALA-PG; 카바트 위치)를 포함한다. 항체 또는 Fc 융합 단백질은 대안적으로 또는 추가적으로 CH2 도메인에서 점 돌연변이 K322A를 비롯한 다른 돌연변이를 보유할 수 있다 (Hezareh et al., 2001 J Virol. 75: 12161-8).
특정한 실시양태에서, 항체 또는 Fc 융합 단백질은 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 증진시키거나 억제하도록 변형될 수 있다. 조정된 CDC 활성은 Fc 영역에 1개 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 도입하는 것에 의해 달성될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,194,551 참조). 대안적으로 또는 추가적으로, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역에 도입함으로써, 이 영역에서 쇄간 디술피드 결합 형성을 가능하게 할 수 있다. 이렇게 생성된 동종이량체 항체 또는 Fc 융합 단백질은 개선된 또는 감소된 내재화 능력 및/또는 증가된 또는 감소된 보체-매개 세포 사멸을 가질 수 있다. 문헌 [Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) 및 Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992), WO99/51642, Duncan & Winter Nature 322: 738-40 (1988)]; 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO94/29351을 참조한다.
Ib 이종다량체
관련 기술분야에 공지된 많은 방법을 사용하여 본원에 개시된 바와 같은 ActRIIB:ALK4 이종다량체, ActRIIB:ALK7 이종다량체, ActRIIA:ALK4 이종다량체, 및 ActRIIA:ALK7 이종다량체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 제1 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIB 또는 ActRIIA 폴리펩티드) 상에서 자연 발생 아미노산을 유리 티올-함유 잔기, 예컨대 시스테인으로 대체하여, 유리 티올이 제2 폴리펩티드 (예를 들어, ALK4 또는 ALK7 폴리펩티드) 상의 또 다른 유리 티올-함유 잔기와 상호작용하여, 제1 및 제2 폴리펩티드 사이에 디술피드 결합이 형성되도록 함으로써 비-자연 발생 디술피드 결합이 구축될 수 있다. 이종다량체 형성을 촉진하는 상호작용의 추가의 예는 WO2007147901 (Kjaergaard et al.)에 기재된 바와 같은 이온 상호작용; U.S.8,592,562 (Kannan et al.)에 기재된 바와 같은 정전기 스티어링 효과; U.S.20120302737 (Christensen et al.)에 기재된 바와 같은 코일드-코일 상호작용; 문헌 [Pack & Plueckthun,(1992) Biochemistry 31: 1579-1584]에 기재된 바와 같은 류신 지퍼; 및 문헌 [Pack et al., (1993) Bio/Technology 11: 1271-1277]에 기재된 바와 같은 헬릭스-턴-헬릭스 모티프를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다양한 절편의 연결은, 예를 들어 공유 결합을 통해, 예컨대 화학적 가교, 펩티드 링커, 디술피드 가교 등에 의해, 또는 친화성 상호작용을 통해, 예컨대 아비딘-비오틴 또는 류신 지퍼 기술에 의해 수득될 수 있다.
구체적 예로서, 본 개시내용은 이뮤노글로불린의 불변 도메인, 예컨대 이종다량체 형성을 촉진하도록 변형된 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및/또는 IgG4로부터 유래된 CH1, CH2 또는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 융합된 ActRIIB, ActRIIA, ALK4 또는 ALK7을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 단일 세포주로부터의 비대칭 이뮤노글로불린-기반 단백질의 대규모 생산에서 발생하는 문제는 "쇄 회합 문제"로 공지되어 있다. 이중특이적 항체의 생산에서 두드러지게 직면하게 되는 바와 같이, 쇄-회합 문제는 상이한 중쇄 및/또는 경쇄가 단일 세포주에서 생산되는 경우에 본질적으로 이루어지는 다중 조합 사이에서 목적하는 다중쇄 단백질을 효율적으로 생산하는 도전과제에 관한 것이다 [예를 들어, 문헌 [Klein et al., (2012) mAbs 4:653-663] 참조]. 이러한 문제는 2개의 상이한 중쇄 및 2개의 상이한 경쇄가 동일한 세포에서 생산되는 경우에 가장 심각하고, 이 경우에 오직 1개만이 전형적으로 바람직할 때 총 16개의 가능한 쇄 조합이 (이들 중 일부는 동일하더라도) 존재한다. 그럼에도 불구하고, 동일한 원리는 단지 2개의 상이한 (비대칭) 중쇄만을 포함하는 목적하는 다중쇄 융합 단백질의 감소된 수율을 설명한다.
바람직한 비대칭 융합 단백질을 허용되는 수율로 생산하기 위해 단일 세포주에서 Fc-함유 융합 폴리펩티드 쇄의 목적하는 쌍형성을 증가시키는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다 [예를 들어, 문헌 [Klein et al., (2012) mAbs 4:653-663; 및 Spiess et al., (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106] 참조]. Fc-함유 쇄의 목적하는 쌍형성을 수득하는 방법은 전하-기반 쌍형성 (정전기적 스티어링), "노브-인투-홀" 입체 쌍형성, 시드바디 쌍형성, 및 류신 지퍼-기반 쌍형성을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [Ridgway et al., (1996) Protein Eng 9:617-621; Merchant et al., (1998) Nat Biotech 16:677-681; Davis et al., (2010) Protein Eng Des Sel 23:195-202; Gunasekaran et al., (2010); 285:19637-19646; Wranik et al., (2012) J Biol Chem 287:43331-43339]; US5932448; WO 1993/011162; WO 2009/089004, 및 WO 2011/034605를 참조한다. 본원에 기재된 바와 같이, 이들 방법은 ActRIIB 폴리펩티드 및 또 다른, 임의로 상이한, ActRIIB 폴리펩티드, ActRIIA 폴리펩티드 및 또 다른, 임의로 상이한, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드 및 ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드 및 ALK4 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드 및 ALK7 폴리펩티드, ActRIIA 폴리펩티드 및 ALK4 폴리펩티드, 또는 ActRIIA 폴리펩티드 및 ALK7 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체를 생성하는 데 사용될 수 있다.
예를 들어, 특정 폴리펩티드 사이의 상호작용이 촉진될 수 있는 하나의 수단은 U.S.7,183,076 (Arathoon et al.) 및 U.S.5,731,168 (Carter et al.)에 기재된 바와 같은 돌출부-대-함몰부 (노브-인투-홀) 상보적 영역을 조작하는 것이다. "돌출부"는 제1 폴리펩티드의 계면으로부터의 작은 아미노산 측쇄 (예를 들어, 제1 상호작용 쌍)를 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체하는 것에 의해 구축된다. 돌출부와 동일하거나 유사한 크기의 상보적 "함몰부"는 임의로, 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체하는 것에 의해 제2 폴리펩티드의 계면 (예를 들어, 제2 상호작용 쌍) 상에서 생성된다. 적합하게 위치하고 치수화된 돌출부 또는 함몰부가 제1 또는 제2 폴리펩티드의 계면에 존재하는 경우, 인접한 계면에서 각각 상응하는 함몰부 또는 돌출부를 조작하는 것만이 필요하다.
중성 pH (7.0)에서, 아스파르트산 및 글루탐산은 음으로 하전되고, 리신, 아르기닌 및 히스티딘은 양으로 하전된다. 이들 하전된 잔기는 이종이량체 형성을 촉진하고 동시에 동종이량체 형성을 방해하는 데 사용될 수 있다. 인력 상호작용은 반대 전하 사이에서 일어나고, 척력 상호작용은 유사 전하 사이에서 일어난다. 부분적으로, 본원에 개시된 폴리펩티드 복합체는 하전된 계면 잔기의 부위 지정 돌연변이유발을 수행함으로써 이종다량체 형성 (예를 들어, 이종이량체 형성)을 촉진하기 위한 인력 상호작용, 및 임의로 동종이량체 형성 (예를 들어, 동종이량체 형성)을 방해하기 위한 척력 상호작용을 이용한다.
예를 들어, IgG1 CH3 도메인 계면은 도메인-도메인 상호작용에 수반되는 4개의 독특한 전하 잔기 쌍: Asp356-Lys439', Glu357-Lys370', Lys392-Asp399', 및 Asp399-Lys409'를 포함한다 [제2 쇄에서의 잔기 넘버링은 (')로 표시됨]. IgG1 CH3 도메인 내의 잔기를 지정하기 위해 본원에 사용된 넘버링 스킴은 카바트의 EU 넘버링 스킴에 따른다는 것에 주목해야 한다. CH3-CH3 도메인 상호작용에 존재하는 2중 대칭으로 인해, 각각의 독특한 상호작용은 구조에서 2회 나타날 것이다 (예를 들어, Asp-399-Lys409' 및 Lys409-Asp399'). 야생형 서열에서, K409-D399'는 이종이량체 및 동종이량체 형성 둘 다를 선호한다. 제1 쇄에서 전하 극성을 스위칭하는 단일 돌연변이 (예를 들어, K409E; 양전하에서 음전하로)는 제1 쇄 동종이량체의 형성에 불리한 상호작용을 유도한다. 불리한 상호작용은 동일한 전하 (음전하-음전하; K409E-D399' 및 D399-K409E') 사이에 발생하는 척력 상호작용으로 인해 발생한다. 제2 쇄에서 전하 극성을 스위칭하는 유사한 돌연변이 (D399K'; 음전하에서 양전하로)는 제2 쇄 동종이량체 형성에 불리한 상호작용 (K409'-D399K' 및 D399K-K409')을 유도한다. 그러나, 동시에, 이들 2개의 돌연변이 (K409E 및 D399K')는 이종이량체 형성에 유리한 상호작용 (K409E-D399K' 및 D399-K409')을 유도한다.
이종이량체 형성 및 동종이량체 방해에 대한 정전기적 스티어링 효과는, 예를 들어 Arg355 및 Lys360을 포함한, 제2 쇄 내의 반대로 하전된 잔기와 쌍형성될 수 있거나 또는 쌍형성되지 않을 수 있는 추가의 전하 잔기의 돌연변이에 의해 추가로 증진될 수 있다. 하기 표는 본원에 개시된 이종다량체의 이종다량체 형성을 증진시키기 위해 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있는 가능한 전하 변화 돌연변이를 열거한다.
일부 실시양태에서, 본 출원의 융합 폴리펩티드에서 CH3-CH3 계면을 구성하는 1개 이상의 잔기는 상호작용이 정전기적으로 불리해지도록 하전된 아미노산으로 대체된다. 예를 들어, 계면 내의 양으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘)은 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산 또는 글루탐산)으로 대체된다. 대안적으로, 또는 상기 치환과 조합하여, 계면 내의 음으로 하전된 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 대체된다. 특정 실시양태에서, 아미노산은 목적하는 전하 특징을 갖는 비-자연 발생 아미노산으로 대체된다. 음으로 하전된 잔기 (Asp 또는 Glu)를 His로 돌연변이시키는 것은 측쇄 부피의 증가로 이어질 것이며, 이는 입체 문제를 유발할 수 있다는 것에 주목해야 한다. 또한, His 양성자 공여자- 및 수용자-형태는 국재화된 환경에 의존한다. 이들 문제는 설계 전략과 함께 고려되어야 한다. 계면 잔기는 인간 및 마우스 IgG 하위부류에서 고도로 보존되기 때문에, 본원에 개시된 정전기적 스티어링 효과는 인간 및 마우스 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4에 적용될 수 있다. 이러한 전략은 또한 CH3 도메인 계면에서 비하전 잔기를 하전 잔기로 변형시키는 것으로 확장될 수 있다.
특정 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 사용될 ActRII-ALK4 리간드 트랩은 적어도 1개의 ActRII 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA 또는 ActRIIB 폴리펩티드)와 공유 또는 비공유 회합된 적어도 1개의 ALK 폴리펩티드 (예를 들어, ALK4 또는 ALK7 폴리펩티드)를 포함하는 이종다량체 복합체이다. 바람직하게는, 본원에 개시된 폴리펩티드는 이종이량체 복합체를 형성하지만, 보다 고차의 이종다량체 복합체 (이종다량체), 예컨대 비제한적으로 이종삼량체, 이종사량체 및 추가의 올리고머 구조가 또한 포함된다 (예를 들어, 도 11-13 참조, 이는 또한 ActRII-ALK4 및 ActRII-ALK7 올리고머 구조 둘 다에 적용될 수 있음). 일부 실시양태에서, ALK 및/또는 ActRII 폴리펩티드는 적어도 1개의 다량체화 도메인을 포함한다. 본원에 개시된 폴리펩티드는 다량체화 도메인에 공유 또는 비-공유 연결될 수 있다. 바람직하게는, 다량체화 도메인은 제1 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIB 또는 ActRIIA 폴리펩티드)와 제2 폴리펩티드 (예를 들어, ALK4 또는 ALK7 폴리펩티드) 사이의 상호작용을 촉진하여 이종다량체 형성 (예를 들어, 이종이량체 형성)을 촉진하고, 임의로 동종다량체 형성 (예를 들어, 동종이량체 형성)은 방해하거나 또는 달리 회피시켜, 목적하는 이종다량체의 수율을 증가시킨다 (예를 들어, 도 12 참조).
부분적으로, 본 개시내용은 전하 쌍형성 (정전기적 스티어링)에 기초하여 상보적이도록 조작된 Fc 서열을 사용한 비대칭 Fc-함유 폴리펩티드 쇄의 목적하는 쌍형성을 제공한다. 정전기적 상보성을 갖는 한 쌍의 Fc 서열 중 1개는 임의적 링커의 존재 또는 부재 하에 구축물의 ActRIIB 폴리펩티드, ActRIIA 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드 또는 ALK7 폴리펩티드에 임의적으로 융합되어 ActRIIB-Fc, ActRIIA-Fc, ALK4-Fc 또는 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 이러한 단일 쇄는 목적하는 다중쇄 구축물 (예를 들어, ActRIIB-Fc-ALK4-Fc 이종다량체)의 생성을 유리하게 하기 위해 제1 Fc 서열에 상보적인 Fc 서열과 함께 선택된 세포에서 공발현될 수 있다. 정전기적 스티어링에 기초한 이러한 예에서, 서열식별번호: 18 [인간 G1Fc(E134K/D177K)] 및 서열식별번호: 19 [인간 G1Fc(K170D/K187D)]는 상보적 Fc 서열의 예이며, 여기서 조작된 아미노산 치환은 이중 밑줄로 표시되고, 구축물의 ActRIIB 폴리펩티드, ActRIIA 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드 또는 ALK7 폴리펩티드는 서열식별번호: 18 또는 서열식별번호: 19에 융합될 수 있지만, 둘 다에 융합되지는 않는다. 천연 hG1Fc, 천연 hG2Fc, 천연 hG3Fc, 및 천연 hG4Fc 사이의 고도의 아미노산 서열 동일성을 고려하면, hG2Fc, hG3Fc, 또는 hG4Fc 내의 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 (도 7 참조)은 하기 상보적인 hG1Fc 쌍 (서열식별번호: 18 및 19) 대신에 사용될 수 있는 상보적인 Fc 쌍을 생성할 것임을 인지할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB:ALK4 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA-ALK4 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
부분적으로, 본 개시내용은 입체 상보성을 위해 조작된 Fc 서열을 사용한 비대칭 Fc-함유 폴리펩티드 쇄의 목적하는 쌍형성을 제공한다. 부분적으로, 본 개시내용은 입체 상보성의 예로서 노브-인투-홀 쌍형성을 제공한다. 입체 상보성을 갖는 한 쌍의 Fc 서열 중 1개는 임의적 링커의 존재 또는 부재 하에 구축물의 ActRIIB 폴리펩티드, ActRIIA 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드 또는 ALK7 폴리펩티드에 임의적으로 융합되어 ActRIIB-Fc, ActRIIA-Fc, ALK4-Fc 또는 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 이러한 단일 쇄는 목적하는 다중쇄 구축물의 생성을 유리하게 하기 위해 제1 Fc 서열에 상보적인 Fc 서열과 함께 선택된 세포에서 공발현될 수 있다. 노브-인투-홀 쌍형성에 기초한 이러한 예에서, 서열식별번호: 20 [인간 G1Fc(T144Y)] 및 서열식별번호: 21 [인간 G1Fc(Y185T)]은 상보적 Fc 서열의 예이며, 여기서 조작된 아미노산 치환은 이중 밑줄로 표시되고, 구축물의 ActRIIB 폴리펩티드, ActRIIA 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드 또는 ALK7 폴리펩티드는 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 21에 융합될 수 있지만, 둘 다에 융합되지는 않는다. 천연 hG1Fc, 천연 hG2Fc, 천연 hG3Fc, 및 천연 hG4Fc 사이의 고도의 아미노산 서열 동일성을 고려하면, hG2Fc, hG3Fc, 또는 hG4Fc 내의 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 (도 7 참조)은 하기 상보적인 hG1Fc 쌍 (서열식별번호: 20 및 21) 대신에 사용될 수 있는 상보적인 Fc 쌍을 생성할 것임을 인지할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB:ALK4 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 21의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB:ALK4 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 21의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 21의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 21의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA:ALK4 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 21의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA:ALK4 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 21의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 21의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 21의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
조작된 디술피드 결합과 조합된 노브-인투-홀 쌍형성에 기초한 Fc 상보성의 예는 서열식별번호: 22 [hG1Fc(S132C/T144W)] 및 서열식별번호: 23 [hG1Fc(Y127C/T144S/L146A/Y185V)]에 개시되어 있다. 이들 서열에서 조작된 아미노산 치환은 이중 밑줄로 표시되고, 구축물의 ActRIIB 폴리펩티드, ActRIIA 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드 또는 ALK7 폴리펩티드는 서열식별번호: 22 또는 서열식별번호: 23에 융합될 수 있지만, 둘 다에 융합되지는 않는다. 천연 hG1Fc, 천연 hG2Fc, 천연 hG3Fc, 및 천연 hG4Fc 사이의 고도의 아미노산 서열 동일성을 고려하면, hG2Fc, hG3Fc, 또는 hG4Fc 내의 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 (도 7 참조)은 하기 상보적인 hG1Fc 쌍 (서열식별번호: 22 및 23) 대신에 사용될 수 있는 상보적인 Fc 쌍을 생성할 것임을 인지할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB:ALK4 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 22의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB:ALK4 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 22의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 22의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 22의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA:ALK4 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 22의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA:ALK4 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 22의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 22의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 22의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
부분적으로, 본 개시내용은 인간 IgG 및 IgA CH3 도메인의 상호교차 β-가닥 절편을 생성하도록 조작된 Fc 서열을 사용한 비대칭 Fc-함유 폴리펩티드 쇄의 목적하는 쌍형성을 제공한다. 이러한 방법은 시드바디 융합 폴리펩티드의 형성을 가능하게 하는 가닥-교환 조작된 도메인 (시드) CH3 이종이량체의 사용을 포함한다 [예를 들어, 문헌 [Davis et al., (2010) Protein Eng Design Sel 23:195-202] 참조]. 시드바디 상보성을 갖는 한 쌍의 Fc 서열 중 1개는 임의적 링커의 존재 또는 부재 하에 구축물의 제1 ActRIIB 폴리펩티드 또는 제2 ActRIIB 폴리펩티드에 임의적으로 융합되어 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 이러한 단일 쇄는 목적하는 다중쇄 구축물의 생성을 유리하게 하기 위해 제1 Fc 서열에 상보적인 Fc 서열과 함께 선택된 세포에서 공발현될 수 있다. 시드바디 (Sb) 쌍형성에 기초한 이러한 예에서, 서열식별번호: 24 [hG1Fc(SbAG)] 및 서열식별번호: 25 [hG1Fc(SbGA)]는 상보적 IgG Fc 서열의 예이며, 여기서 IgA Fc로부터의 조작된 아미노산 치환은 이중 밑줄로 표시되고, 구축물의 제1 ActRIIB 폴리펩티드 또는 제2 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 24 또는 서열식별번호: 25에 융합될 수 있지만, 둘 다에 융합되지는 않는다. 천연 hG1Fc, 천연 hG2Fc, 천연 hG3Fc, 및 천연 hG4Fc 사이의 고도의 아미노산 서열 동일성을 고려하면, hG1Fc, hG2Fc, hG3Fc, 또는 hG4Fc 내의 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 (도 7 참조)은 하기 상보적인 IgG-IgA 쌍 (서열식별번호: 24 및 25)에서 사용될 수 있는 Fc 단량체를 생성할 것임을 인지할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB:ALK4 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 24의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB:ALK4 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 24의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 24의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 24의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA:ALK4 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 24의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA:ALK4 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 24의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 24의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 24의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
부분적으로, 본 개시내용은 절단가능한 류신 지퍼 도메인이 Fc CH3 도메인의 C-말단에 부착된 비대칭 Fc-함유 폴리펩티드 쇄의 목적하는 쌍형성을 제공한다. 류신 지퍼의 부착은 이종이량체 항체 중쇄의 우선적인 어셈블리를 유발하기에 충분하다. 예를 들어, 문헌 [Wranik et al., (2012) J Biol Chem 287:43331-43339]을 참조한다. 본원에 개시된 바와 같이, 류신 지퍼-형성 가닥에 부착된 한 쌍의 Fc 서열 중 1개는 임의적 링커의 존재 또는 부재 하에 구축물의 제1 ActRIIB 폴리펩티드 또는 제2 ActRIIB 폴리펩티드에 임의적으로 융합되어 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 이러한 단일 쇄는 목적하는 다중쇄 구축물의 생성을 유리하게 하기 위해 상보적 류신 지퍼-형성 가닥에 부착된 Fc 서열과 함께 선택된 세포에서 공발현될 수 있다. 정제후 박테리아 엔도프로테이나제 Lys-C에 의한 구축물의 단백질분해적 소화는 류신 지퍼 도메인을 방출시켜, 그의 구조가 천연 Fc의 구조와 동일한 Fc 구축물을 생성할 수 있다. 류신 지퍼 쌍형성에 기초한 이러한 예에서, 서열식별번호: 26 [hG1Fc-Ap1 (산성)] 및 서열식별번호: 27 [hG1Fc-Bp1 (염기성)]은 상보적 IgG Fc 서열의 예이며, 여기서 조작된 상보적 류신 지퍼 서열은 밑줄로 표시되고, 구축물의 ActRIIB 폴리펩티드 또는 제2 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 26 또는 서열식별번호: 27에 융합될 수 있지만, 둘 다에 융합되지는 않는다. 천연 hG1Fc, 천연 hG2Fc, 천연 hG3Fc, 및 천연 hG4Fc 사이의 고도의 아미노산 서열 동일성을 고려하면, 임의적 링커의 존재 또는 부재 하에 hG1Fc, hG2Fc, hG3Fc, 또는 hG4Fc에 부착된 류신 지퍼-형성 서열 (도 7 참조)은 하기 상보적인 류신 지퍼-형성 쌍 (서열식별번호: 26 및 27)에서 사용될 수 있는 Fc 단량체를 생성할 것임을 인지할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB:ALK4 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 27의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 26의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB:ALK4 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 26의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 27의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 27의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 26의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 26의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 27의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA:ALK4 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 27의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 26의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA:ALK4 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 26의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 27의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 27의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 26의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 26의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 27의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
부분적으로, 본 개시내용은 목적하는 이형체 종의 정제를 용이하게 하는 Fc 도메인 내의 추가의 돌연변이와 조합하여 상기 기재된 방법에 의한 비대칭 Fc-함유 폴리펩티드 쇄의 목적하는 쌍형성을 제공한다. 한 예는 서열식별번호: 22 및 23에 개시된 바와 같은 조작된 디술피드 결합과 조합된 노브-인투-홀 쌍형성에 기초한 Fc 도메인의 상보성, 플러스 1개의 Fc-함유 폴리펩티드 쇄 내의 2개의 음으로 하전된 아미노산 (아스파르트산 또는 글루탐산) 및 상보적 Fc-함유 폴리펩티드 쇄 내의 2개의 양으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 아르기닌)의 추가의 치환 (서열식별번호: 28-29)을 사용한다. 이들 4개의 아미노산 치환은 등전점 또는 알짜 분자 전하의 차이에 기초하여 불균질 폴리펩티드 혼합물로부터 목적하는 이형체 융합 폴리펩티드의 선택적 정제를 용이하게 한다. 이들 서열에서 조작된 아미노산 치환은 하기에 이중 밑줄로 표시되고, 구축물의 ActRIIB 폴리펩티드, ActRIIA 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드 또는 ALK7 폴리펩티드는 서열식별번호: 28 또는 서열식별번호: 29에 융합될 수 있지만, 둘 다에 융합되지는 않는다. 천연 hG1Fc, 천연 hG2Fc, 천연 hG3Fc, 및 천연 hG4Fc 사이의 고도의 아미노산 서열 동일성을 고려하면, hG2Fc, hG3Fc, 또는 hG4Fc 내의 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 (도 7 참조)은 하기 상보적인 hG1Fc 쌍 (서열식별번호: 28-29) 대신에 사용될 수 있는 상보적인 Fc 쌍을 생성할 것임을 인지할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB:ALK4 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 28의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 29의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 28의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 29의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 138에 글루탐산, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 217에 아스파르트산을 포함한다. 일부 실시양태에서, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 아미노산 위치 146에 알라닌, 아미노산 위치 162에 아르기닌, 아미노산 위치 179에 아르기닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다. 일부 실시양태에서, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 아미노산 위치 146에 알라닌, 아미노산 위치 162에 아르기닌, 아미노산 위치 179에 아르기닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA:ALK4 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 28의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 29의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 28의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 29의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
또 다른 예는 서열식별번호: 22-23에 개시된 바와 같은 조작된 디술피드 결합과 조합된 노브-인투-홀 쌍형성에 기초한 Fc 도메인의 상보성, 플러스 1개의 Fc-함유 폴리펩티드 쇄 (서열식별번호: 30) 내의 위치 213에서의 히스티딘에서 아르기닌으로의 치환을 수반한다. 이러한 치환 (카바트 등의 넘버링 시스템에서 H435R로 표시됨)은 단백질 A에 대한 친화도의 차이에 기초하여 바람직하지 않은 동종이량체로부터 목적하는 이종이량체의 분리를 용이하게 한다. 조작된 아미노산 치환은 이중 밑줄로 표시되고, 구축물의 ActRIIB 폴리펩티드, ActRIIA 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드 또는 ALK7 폴리펩티드는 서열식별번호: 30 또는 서열식별번호: 23에 융합될 수 있지만, 둘 다에 융합되지는 않는다. 천연 hG1Fc, 천연 hG2Fc, 천연 hG3Fc, 및 천연 hG4Fc 사이의 고도의 아미노산 서열 동일성을 고려하면, hG2Fc, hG3Fc, 또는 hG4Fc 내의 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 (도 7 참조)은 서열식별번호: 30 (하기) 및 서열식별번호: 23의 상보적인 hG1Fc 쌍 대신에 사용될 수 있는 상보적인 Fc 쌍을 생성할 것임을 인지할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB:ALK4 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 30의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 30의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 435에 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 아미노산 위치 146에 알라닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다. 일부 실시양태에서, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 아미노산 위치 146에 알라닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB:ALK4 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 30의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 30의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 138에 글루탐산, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 217에 아스파르트산을 포함한다. 일부 실시양태에서, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 아미노산 위치 146에 알라닌, 아미노산 위치 162에 아르기닌, 아미노산 위치 179에 아르기닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다. 일부 실시양태에서, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 아미노산 위치 146에 알라닌, 아미노산 위치 162에 아르기닌, 아미노산 위치 179에 아르기닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB:ALK4 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 28의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 29의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 28의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 29의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 138에 글루탐산, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 217에 아스파르트산을 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 아미노산 위치 146에 알라닌, 아미노산 위치 162에 아르기닌, 아미노산 위치 179에 아르기닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다. 일부 실시양태에서, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 138에 글루탐산, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 217에 아스파르트산을 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 아미노산 위치 146에 알라닌, 아미노산 위치 162에 아르기닌, 아미노산 위치 179에 아르기닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA:ALK4 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 28의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 29의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 28의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 29의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 138에 글루탐산, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 217에 아스파르트산을 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 아미노산 위치 146에 알라닌, 아미노산 위치 162에 아르기닌, 아미노산 위치 179에 아르기닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다. 일부 실시양태에서, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 138에 글루탐산, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 217에 아스파르트산을 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 아미노산 위치 146에 알라닌, 아미노산 위치 162에 아르기닌, 아미노산 위치 179에 아르기닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다.
일부 실시양태에서, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 435에 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 435에 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 아미노산 위치 146에 알라닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA:ALK4 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 30의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 30의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 435에 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 아미노산 위치 146에 알라닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다. 일부 실시양태에서, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 아미노산 위치 146에 알라닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA:ALK4 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 30의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA:ALK7 이종다량체 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 30의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함하고, ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 435에 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 132에 시스테인, 아미노산 위치 144에 트립토판, 및 아미노산 위치 435에 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 Fc 도메인은 아미노산 위치 127에 시스테인, 아미노산 위치 144에 세린, 아미노산 위치 146에 알라닌, 및 아미노산 위치 185에 발린을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 제1 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 제2 변이체 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체에 관한 것이며, 여기서 제1 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는 제2 변이체 ActRIIB 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc 이종다량체는 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)에 결합한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc 이종다량체는 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)의 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc 이종다량체는 이종이량체이다.
일부 실시양태에서, 제1 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82, L79, A24, K74, R64, P129, P130, E37, R40, D54, R56, W78, D80, 및 F82 중 어느 하나에 상응하는 아미노산 위치에서 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L38N, E50L, E52N, L57E, L57I, L57R, L57T, L57V, Y60D, G68R, K74E, W78Y, L79F, L79S, L79T, L79W, F82D, F82E, F82L, F82S, F82T, F82Y, N83R, E94K 및 V99G 중 어느 하나에 상응하는 아미노산 위치에서 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 치환은 A24N, K74A, R64K, R64N, K74A, L79A, L79D, L79E, L79P, P129S, P130A, P130R, E37A, R40A, D54A, R56A, K74F, K74I, K74Y, W78A, D80A, D80F, D80G, D80I, D80K, D80M, D80M, D80N, D80R, 및 F82A로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 치환은 L38N, E50L, E52N, L57E, L57I, L57R, L57T, L57V, Y60D, G68R, K74E, W78Y, L79F, L79S, L79T, L79W, F82D, F82E, F82L, F82S, F82T, F82Y, N83R, E94K, 및 V99G로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제2 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82, L79, A24, K74, R64, P129, P130, E37, R40, D54, R56, W78, D80, 및 F82 중 어느 하나에 상응하는 아미노산 위치에서 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 치환은 A24N, K74A, R64K, R64N, K74A, L79A, L79D, L79E, L79P, P129S, P130A, P130R, E37A, R40A, D54A, R56A, K74F, K74I, K74Y, W78A, D80A, D80F, D80G, D80I, D80K, D80M, D80M, D80N, D80R, 및 F82A로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제2 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L38N, E50L, E52N, L57E, L57I, L57R, L57T, L57V, Y60D, G68R, K74E, W78Y, L79F, L79S, L79T, L79W, F82D, F82E, F82L, F82S, F82T, F82Y, N83R, E94K 및 V99G 중 어느 하나에 상응하는 아미노산 위치에서 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 치환은 L38N, E50L, E52N, L57E, L57I, L57R, L57T, L57V, Y60D, G68R, K74E, W78Y, L79F, L79S, L79T, L79W, F82D, F82E, F82L, F82S, F82T, F82Y, N83R, E94K, 및 V99G로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제1 ActRIIB 폴리펩티드 및/또는 제2 ActRIIB 폴리펩티드는 이종다량체 형성을 촉진하는 1개 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 ActRIIB 폴리펩티드 및/또는 제2 ActRIIB 폴리펩티드는 이종다량체 형성을 억제하는 1개 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종다량체는 이종이량체이다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 36의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 제1 ActRIIB 폴리펩티드, 및 서열식별번호: 5의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 제2 ActRIIB 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체에 관한 것이며, 여기서 제1 ActRIIB 폴리펩티드는 제2 ActRIIB 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 제1 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 55에 상응하는 아미노산 위치에서 글루탐산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 55에 상응하는 아미노산 위치에서 글루탐산을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 제2 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 55에 상응하는 아미노산 위치에서 리신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82, L79, A24, K74, R64, P129, P130, E37, R40, D54, R56, W78, 및 D80 중 어느 하나에 상응하는 아미노산 위치에서 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 치환은 A24N, K74A, R64K, R64N, K74A, L79A, L79D, L79E, L79P, P129S, P130A, P130R, E37A, R40A, D54A, R56A, K74F, K74I, K74Y, W78A, D80A, D80F, D80G, D80I, D80K, D80M, D80M, D80N, D80R, 및 F82A로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제2 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82, L79, A24, K74, R64, P129, P130, E37, R40, D54, R56, W78, D80, 및 F82 중 어느 하나에 상응하는 아미노산 위치에서 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 치환은 A24N, K74A, R64K, R64N, K74A, L79A, L79D, L79E, L79P, P129S, P130A, P130R, E37A, R40A, D54A, R56A, K74F, K74I, K74Y, W78A, D80A, D80F, D80G, D80I, D80K, D80M, D80M, D80N, D80R, 및 F82A로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제1 ActRIIB 폴리펩티드 및/또는 제2 ActRIIB 폴리펩티드는 이종다량체 형성을 촉진하는 1개 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 ActRIIB 폴리펩티드 및/또는 제2 ActRIIB 폴리펩티드는 이종다량체 형성을 억제하는 1개 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종다량체는 이종이량체이다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 39의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 제1 ActRIIB 폴리펩티드, 및 서열식별번호: 5의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 제2 ActRIIB 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체에 관한 것이며, 여기서 제1 ActRIIB 폴리펩티드는 제2 ActRIIB 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 제1 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 82에 상응하는 아미노산 위치에서 이소류신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 82에 상응하는 아미노산 위치에서 이소류신을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 제2 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 82에 상응하는 아미노산 위치에서 페닐알라닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L79, A24, K74, R64, P129, P130, E37, R40, D54, R56, W78, 및 D80 중 어느 하나에 상응하는 아미노산 위치에서 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 치환은 A24N, K74A, R64K, R64N, K74A, L79A, L79D, L79E, L79P, P129S, P130A, P130R, E37A, R40A, D54A, R56A, K74F, K74I, K74Y, W78A, D80A, D80F, D80G, D80I, D80K, D80M, D80M, D80N, 및 D80R로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제2 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L79, A24, K74, R64, P129, P130, E37, R40, D54, R56, W78, 및 D80 중 어느 하나에 상응하는 아미노산 위치에서 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 치환은 A24N, K74A, R64K, R64N, K74A, L79A, L79D, L79E, L79P, P129S, P130A, P130R, E37A, R40A, D54A, R56A, K74F, K74I, K74Y, W78A, D80A, D80F, D80G, D80I, D80K, D80M, D80M, D80N, 및 D80R로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제1 ActRIIB 폴리펩티드 및/또는 제2 ActRIIB 폴리펩티드는 이종다량체 형성을 촉진하는 1개 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 ActRIIB 폴리펩티드 및/또는 제2 ActRIIB 폴리펩티드는 이종다량체 형성을 억제하는 1개 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종다량체는 이종이량체이다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 42의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 제1 ActRIIB 폴리펩티드, 및 서열식별번호: 5의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 제2 ActRIIB 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체에 관한 것이며, 여기서 제1 ActRIIB 폴리펩티드는 제2 ActRIIB 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 제1 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 82에 상응하는 아미노산 위치에서 리신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 82에 상응하는 아미노산 위치에서 리신을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 제2 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 82에 상응하는 아미노산 위치에서 페닐알라닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L79, A24, K74, R64, P129, P130, E37, R40, D54, R56, W78, 및 D80 중 어느 하나에 상응하는 아미노산 위치에서 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 치환은 A24N, K74A, R64K, R64N, K74A, L79A, L79D, L79E, L79P, P129S, P130A, P130R, E37A, R40A, D54A, R56A, K74F, K74I, K74Y, W78A, D80A, D80F, D80G, D80I, D80K, D80M, D80M, D80N, 및 D80R로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제2 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 L79, A24, K74, R64, P129, P130, E37, R40, D54, R56, W78, 및 D80 중 어느 하나에 상응하는 아미노산 위치에서 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 치환은 A24N, K74A, R64K, R64N, K74A, L79A, L79D, L79E, L79P, P129S, P130A, P130R, E37A, R40A, D54A, R56A, K74F, K74I, K74Y, W78A, D80A, D80F, D80G, D80I, D80K, D80M, D80M, D80N, 및 D80R로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제1 ActRIIB 폴리펩티드 및/또는 제2 ActRIIB 폴리펩티드는 이종다량체 형성을 촉진하는 1개 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 ActRIIB 폴리펩티드 및/또는 제2 ActRIIB 폴리펩티드는 이종다량체 형성을 억제하는 1개 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종다량체는 이종이량체이다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 45의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 제1 ActRIIB 폴리펩티드, 및 서열식별번호: 48의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 제2 ActRIIB 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체에 관한 것이며, 여기서 제1 ActRIIB 폴리펩티드는 제2 ActRIIB 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 제1 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 79에 상응하는 산성 아미노산 위치를 포함한다. 일부 실시양태에서, 산성 아미노산은 아스파르트산이다. 일부 실시양태에서, 산성 아미노산은 글루탐산이다. 일부 실시양태에서, 제2 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 79에 상응하는 아미노산 위치에서 산성 산 (예를 들어, 아스파르트산 또는 글루탐산)을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 제2 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 79에 상응하는 아미노산 위치에서 류신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82, A24, K74, R64, P129, P130, E37, R40, D54, R56, W78, D80, 및 F82 중 어느 하나에 상응하는 아미노산 위치에서 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 치환은 A24N, K74A, R64K, R64N, K74A, L79P, P129S, P130A, P130R, E37A, R40A, D54A, R56A, K74F, K74I, K74Y, W78A, D80A, D80F, D80G, D80I, D80K, D80M, D80M, D80N, D80R 및 F82A로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제2 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82, A24, K74, R64, P129, P130, E37, R40, D54, R56, W78, D80, 및 F82 중 어느 하나에 상응하는 아미노산 위치에서 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 치환은 A24N, K74A, R64K, R64N, K74A, P129S, P130A, P130R, E37A, R40A, D54A, R56A, K74F, K74I, K74Y, W78A, D80A, D80F, D80G, D80I, D80K, D80M, D80M, D80N, D80R 및 F82A로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제1 ActRIIB 폴리펩티드 및/또는 제2 ActRIIB 폴리펩티드는 이종다량체 형성을 촉진하는 1개 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 ActRIIB 폴리펩티드 및/또는 제2 ActRIIB 폴리펩티드는 이종다량체 형성을 억제하는 1개 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종다량체는 이종이량체이다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 50의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 제1 ActRIIB 폴리펩티드, 및 서열식별번호: 52의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 제2 ActRIIB 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체에 관한 것이며, 여기서 제1 ActRIIB 폴리펩티드는 제2 ActRIIB 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 제1 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 79에 상응하는 산성 아미노산 위치를 포함한다. 일부 실시양태에서, 산성 아미노산은 아스파르트산이다. 일부 실시양태에서, 산성 아미노산은 글루탐산이다. 일부 실시양태에서, 제2 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 79에 상응하는 아미노산 위치에서 산성 산 (예를 들어, 아스파르트산 또는 글루탐산)을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 제2 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 79에 상응하는 아미노산 위치에서 류신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82, A24, K74, R64, P129, P130, E37, R40, D54, R56, W78, D80, 및 F82 중 어느 하나에 상응하는 아미노산 위치에서 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 치환은 A24N, K74A, R64K, R64N, K74A, L79P, P129S, P130A, P130R, E37A, R40A, D54A, R56A, K74F, K74I, K74Y, W78A, D80A, D80F, D80G, D80I, D80K, D80M, D80M, D80N, D80R 및 F82A로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제2 ActRIIB 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 F82, A24, K74, R64, P129, P130, E37, R40, D54, R56, W78, D80, 및 F82 중 어느 하나에 상응하는 아미노산 위치에서 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 치환은 A24N, K74A, R64K, R64N, K74A, P129S, P130A, P130R, E37A, R40A, D54A, R56A, K74F, K74I, K74Y, W78A, D80A, D80F, D80G, D80I, D80K, D80M, D80M, D80N, D80R 및 F82A로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 1개 이상의 ALK4 수용체 폴리펩티드 (예를 들어, 서열식별번호: 84, 85, 86, 87, 88, 89, 92, 93, 247, 249, 421, 422 및 그의 변이체) 및 1개 이상의 ActRIIB 수용체 폴리펩티드 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 2, 5, 6, 12, 31, 33, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 45, 46, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 276, 278, 279, 332, 333, 335, 336, 338, 339, 341, 342, 344, 345, 347, 348, 350, 351, 353, 354, 356, 357, 385, 386, 387, 388, 389, 396, 398, 402, 403, 406, 408, 409 및 그의 변이체)를 포함하는 이종다량체, 및 그의 용도 (예를 들어, 심부전의 치료를 필요로 하는 환자에서 심부전을 치료하는 것), 일반적으로 본원에서 "ActRIIB:ALK4 이종다량체" 또는 "ActRIIB-ALK4 이종다량체"로 지칭되는 것, 및 그의 용도 (예를 들어, 심부전의 치료를 필요로 하는 환자에서 심부전을 치료하는 것)에 관한 것이다. 바람직하게는, ActRIIB:ALK4 이종다량체는 가용성이다 [예를 들어, 이종다량체 복합체는 ALK4 수용체의 가용성 부분 (도메인) 및 ActRIIB 수용체의 가용성 부분 (도메인)을 포함함]. 일반적으로, ALK4 및 ActRIIB의 세포외 도메인은 이들 수용체의 가용성 부분에 상응한다. 따라서, 일부 실시양태에서, ActRIIB:ALK4 이종다량체는 ALK4 수용체의 세포외 도메인 및 ActRIIB 수용체의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB:ALK4 이종다량체는 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)의 활성 (예를 들어, Smad 신호전달)을 억제한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB:ALK4 이종다량체는 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)에 결합한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB:ALK4 이종다량체는 서열식별번호: 84, 85, 86, 87, 88, 89, 92, 93, 247, 249, 421 및 422의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어진 적어도 1개의 ALK4 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 ActRIIB:ALK4 이종다량체 복합체는 서열식별번호: 84의 아미노산 24-34, 25-34 또는 26-34 중 어느 하나에 상응하는 잔기에서 시작하여 서열식별번호: 84의 101-126, 102-126, 101-125, 101-124, 101-121, 111-126, 111-125, 111-124, 121-126, 121-125, 121-124 또는 124-126의 위치에서 종결되는 ALK4의 부분과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 그로 이루어진 적어도 1개의 ALK4 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB:ALK4 이종다량체는 서열식별번호: 84와 관련하여 아미노산 34-101과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 그로 이루어진 적어도 1개의 ALK4 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB-ALK4 이종다량체는 서열식별번호: 2, 5, 6, 12, 31, 33, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 45, 46, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 276, 278, 279, 332, 333, 335, 336, 338, 339, 341, 342, 344, 345, 347, 348, 350, 351, 353, 354, 356, 357, 385, 386, 387, 388, 389, 396, 398, 402, 403, 406, 408 및 409 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 그로 이루어진 적어도 1개의 ActRIIB 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 ActRIIB:ALK4 이종다량체 복합체는 서열식별번호: 2의 아미노산 20-29, 20-24, 21-24, 22-25 또는 21-29 중 어느 하나에 상응하는 잔기에서 시작하여 109-134, 119-134, 119-133, 129-134 또는 129-133의 위치에서 종결되는 ActRIIB의 부분과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 그로 이루어진 적어도 1개의 ActRIIB 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB:ALK4 이종다량체는 서열식별번호: 2의 아미노산 29-109와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 그로 이루어진 적어도 1개의 ActRIIB 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB:ALK4 이종다량체는 서열식별번호: 2의 아미노산 25-131과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 그로 이루어진 적어도 1개의 ActRIIB 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 ActRIIB:ALK4 이종다량체 복합체는 서열식별번호: 2의 L79에 상응하는 위치가 산성 아미노산이 아닌 (즉, 자연 발생 D 또는 E 아미노산 잔기 또는 인공 산성 아미노산 잔기가 아닌) 적어도 1개의 ActRIIB 폴리펩티드를 포함한다. 본 개시내용의 ActRIIB:ALK4 이종다량체는, 예를 들어 이종이량체, 이종삼량체, 이종사량체 및 추가의 고차 올리고머 구조를 포함한다. 예를 들어, 도 11-13을 참조하며, 이는 ActRII:ALK7 올리고머 구조에 또한 적용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 이종다량체 복합체는 ActRIIB:ALK7 이종이량체이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 적어도 1개의 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드 및 적어도 1개의 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, ActRIIB-Fc:ALK7-Fc 이종다량체는 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)에 결합한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB-Fc:ALK7-Fc 이종다량체는 1개 이상의 ActRII-ALK4 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)의 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB-Fc:ALK7-Fc 이종다량체는 이종이량체이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 그의 단편, 기능적 변이체 및 변형된 형태를 포함한, 적어도 1개의 ALK7 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체에 관한 것이다. 바람직하게는, 본원에 개시된 바와 같이 사용하기 위한 ALK7 폴리펩티드 (예를 들어, ALK7 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체 및 그의 용도)는 가용성이다 (예를 들어, ALK7의 세포외 도메인). 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같이 사용하기 위한 ALK7 폴리펩티드는 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10) 슈퍼패밀리 리간드에 결합하고/거나 그의 활성 (예를 들어, Smad 신호전달의 유도)을 억제 (길항)한다. 일부 실시양태에서, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 120, 121 또는 122의 아미노산 21-28 (예를 들어, 아미노산 잔기 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 및 28) 중 어느 하나에서 시작하여 서열식별번호: 120, 121 또는 122의 아미노산 92-113 (예를 들어, 아미노산 잔기 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 및 113) 중 어느 하나에서 종결되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 ALK7 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 120, 121, 또는 122의 아미노산 28-92와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 ALK7 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 120, 121, 또는 122의 아미노산 21-113과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 ALK7 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 120, 123, 124, 125, 121, 126, 122, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 또는 134 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 ALK7 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이종다량체는 서열식별번호: 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 133 또는 134의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 적어도 1개의 ALK7 폴리펩티드로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어진다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 그의 용도 (예를 들어, 심부전의 치료를 필요로 하는 환자에서 심부전을 치료하는 것)를 포함한, 1개 이상의 ALK7 수용체 폴리펩티드 (예를 들어, 서열식별번호: 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 133, 134 및 그의 변이체) 및 1개 이상의 ActRIIB 수용체 폴리펩티드 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 2, 5, 6, 12, 31, 33, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 45, 46, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 276, 278, 279, 332, 333, 335, 336, 338, 339, 341, 342, 344, 345, 347, 348, 350, 351, 353, 354, 356, 357, 385, 386, 387, 388, 389, 396, 398, 402, 403, 406, 408, 409 및 그의 변이체)를 포함하는 이종다량체 복합체에 관한 것이며, 이는 일반적으로 본원에서 "ActRIIB:ALK7 이종다량체" 또는 "ActRIIB-ALK7 이종다량체"로 지칭된다. 바람직하게는, ActRIIB-ALK7 이종다량체는 가용성이다 [예를 들어, 이종다량체 복합체는 ALK7 수용체의 가용성 부분 (도메인) 및 ActRIIB 수용체의 가용성 부분 (도메인)을 포함함]. 일반적으로, ALK7 및 ActRIIB의 세포외 도메인은 이들 수용체의 가용성 부분에 상응한다. 따라서, 일부 실시양태에서, ActRIIB:ALK7 이종다량체는 ALK7 수용체의 세포외 도메인 및 ActRIIB 수용체의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB-ALK7 이종다량체는 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)의 활성 (예를 들어, Smad 신호전달)을 억제한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB-ALK7 이종다량체는 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)에 결합한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB-ALK7 이종다량체는 서열식별번호: 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 133 및 134의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어진 적어도 1개의 ALK7 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB-ALK7 이종다량체는 서열식별번호: 2, 5, 6, 12, 31, 33, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 45, 46, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 276, 278, 279, 332, 333, 335, 336, 338, 339, 341, 342, 344, 345, 347, 348, 350, 351, 353, 354, 356, 357, 385, 386, 387, 388, 389, 396, 398, 402, 403, 406, 408 및 409 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 그로 이루어진 적어도 1개의 ActRIIB 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 ActRIIB:ALK7 이종다량체 복합체는 서열식별번호: 2의 아미노산 20-29, 20-24, 21-24, 22-25 또는 21-29 중 어느 하나에 상응하는 잔기에서 시작하여 109-134, 119-134, 119-133, 129-134 또는 129-133의 위치에서 종결되는 ActRIIB의 부분과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 그로 이루어진 적어도 1개의 ActRIIB 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB:ALK7 이종다량체는 서열식별번호: 2의 아미노산 29-109와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 그로 이루어진 적어도 1개의 ActRIIB 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB:ALK7 이종다량체는 서열식별번호: 2의 아미노산 25-131과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 그로 이루어진 적어도 1개의 ActRIIB 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 ActRIIB:ALK7 이종다량체 복합체는 서열식별번호: 2의 L79에 상응하는 위치가 산성 아미노산이 아닌 (즉, 자연 발생 D 또는 E 아미노산 잔기 또는 인공 산성 아미노산 잔기가 아닌) 적어도 1개의 ActRIIB 폴리펩티드를 포함한다. 본 개시내용의 ActRIIB-ALK7 이종다량체는, 예를 들어 이종이량체, 이종삼량체, 이종사량체 및 추가의 고차 올리고머 구조를 포함한다. 예를 들어, 도 11-13을 참조하며, 이는 ActRII-ALK4 및 ActRII-ALK7 올리고머 구조 둘 다에 또한 적용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 이종다량체 복합체는 ActRIIB-ALK7 이종이량체이다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 그의 용도 (예를 들어, 심부전의 치료를 필요로 하는 환자에서 심부전을 치료하는 것)를 포함한, 1개 이상의 ALK7 수용체 폴리펩티드 (예를 들어, 서열식별번호: 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 133, 134 및 그의 변이체) 및 1개 이상의 ActRIIA 수용체 폴리펩티드 (예를 들어, 서열식별번호: 364, 366, 367, 368, 369, 378, 380, 381, 384 및 그의 변이체)를 포함하는 이종다량체 복합체에 관한 것이며, 이는 일반적으로 본원에서 "ActRIIA:ALK7 이종다량체" 또는 "ActRIIA-ALK7 이종다량체"로 지칭된다. 바람직하게는, ActRIIA-ALK7 이종다량체는 가용성이다 [예를 들어, 이종다량체 복합체는 ALK7 수용체의 가용성 부분 (도메인) 및 ActRIIA 수용체의 가용성 부분 (도메인)을 포함함]. 일반적으로, ALK7 및 ActRIIA의 세포외 도메인은 이들 수용체의 가용성 부분에 상응한다. 따라서, 일부 실시양태에서, ActRIIA-ALK7 이종다량체는 ALK7 수용체의 세포외 도메인 및 ActRIIA 수용체의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIA-ALK7 이종다량체는 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)의 활성 (예를 들어, Smad 신호전달)을 억제한다. 일부 실시양태에서, ActRIIA-ALK7 이종다량체는 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)에 결합한다. 일부 실시양태에서, ActRIIA-ALK7 이종다량체는 서열식별번호: 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 133 및 134의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어진 적어도 1개의 ALK7 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIA-ALK7 이종다량체는 서열식별번호: 364, 366, 367, 368, 369, 378, 380, 381, 384 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 그로 이루어진 적어도 1개의 ActRIIA 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 이종다량체 복합체는 ActRIIA-ALK7 이종이량체이다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 그의 용도 (예를 들어, 심부전의 치료를 필요로 하는 환자에서 심부전을 치료하는 것)를 포함한, 1개 이상의 ALK4 수용체 폴리펩티드 (예를 들어, 서열식별번호: 84, 85, 86, 87, 88, 89, 92, 93, 247, 249, 421, 422 및 그의 변이체) 및 1개 이상의 ActRIIA 수용체 폴리펩티드 (예를 들어, 서열식별번호: 364, 366, 367, 368, 369, 378, 380, 381, 384 및 그의 변이체)를 포함하는 이종다량체 복합체에 관한 것이며, 이는 일반적으로 본원에서 "ActRIIA:ALK4 이종다량체" 또는 "ActRIIA-ALK4 이종다량체"로 지칭된다. 바람직하게는, ActRIIA-ALK4 이종다량체는 가용성이다 [예를 들어, 이종다량체 복합체는 ALK4 수용체의 가용성 부분 (도메인) 및 ActRIIA 수용체의 가용성 부분 (도메인)을 포함함]. 일반적으로, ALK4 및 ActRIIA의 세포외 도메인은 이들 수용체의 가용성 부분에 상응한다. 따라서, 일부 실시양태에서, ActRIIA-ALK4 이종다량체는 ALK4 수용체의 세포외 도메인 및 ActRIIA 수용체의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIA-ALK4 이종다량체는 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)의 활성 (예를 들어, Smad 신호전달)을 억제한다. 일부 실시양태에서, ActRIIA-ALK4 이종다량체는 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)에 결합한다. 일부 실시양태에서, ActRIIA-ALK4 이종다량체는 서열식별번호: 84, 85, 86, 87, 88, 89, 92, 93, 247, 249, 421 및 422의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어진 적어도 1개의 ALK4 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 ActRIIA-ALK4 이종다량체 복합체는 서열식별번호: 84의 아미노산 24-34, 25-34 또는 26-34 중 어느 하나에 상응하는 잔기에서 시작하여 서열식별번호: 84의 101-126, 102-126, 101-125, 101-124, 101-121, 111-126, 111-125, 111-124, 121-126, 121-125, 121-124 또는 124-126의 위치에서 종결되는 ALK4의 부분과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 그로 이루어진 적어도 1개의 ALK4 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIA-ALK4 이종다량체는 서열식별번호: 84와 관련하여 아미노산 34-101과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 그로 이루어진 적어도 1개의 ALK4 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIA-ALK4 이종다량체는 서열식별번호: 364, 366, 367, 368, 369, 378, 380, 381, 384 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 그로 이루어진 적어도 1개의 ActRIIA 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 이종다량체 복합체는 ActRIIA-ALK4 이종이량체이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 제1 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드 및 제2 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체에 관한 것이며, 여기서 제2 변이체 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드에 존재하는 것과 상이하다. 일부 실시양태에서, ActRIIA-Fc:ActRIIA-Fc 이종다량체는 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)에 결합한다. 일부 실시양태에서, ActRIIA-Fc:ActRIIA-Fc 이종다량체는 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)의 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, ActRIIA-Fc:ActRIIA-Fc 이종다량체는 이종이량체이다.
II. 링커
본 개시내용은, 예를 들어 이종 부분 (예를 들어, Fc 부분)에 융합된 것을 비롯한, 본원에 개시된 추가의 폴리펩티드에 융합될 수 있는 ActRII-ALK4 리간드 트랩 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIB, ActRIIA, ALK4, ALK7, 및 폴리스타틴 폴리펩티드 (그의 변이체 포함))를 제공한다. 이들 실시양태에서, 폴리펩티드 부분 (예를 들어, ActRIIB, ActRIIA, ALK4, ALK7, 및 폴리스타틴 폴리펩티드 (그의 변이체 포함))은 링커에 의해 추가의 폴리펩티드 (예를 들어, 이종 부분, 예컨대 Fc 도메인)에 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 글리신 및 세린 풍부 링커이다. 일부 실시양태에서, 링커는 글리신 (예를 들어, 2-10, 2-5, 2-4, 2-3개의 글리신 잔기) 또는 글리신 및 프롤린 잔기가 풍부할 수 있고, 예를 들어, 트레오닌/세린 및 글리신의 단일 서열 또는 트레오닌/세린 및/또는 글리신의 반복 서열, 예를 들어, GGG (서열식별번호: 261), GGGG (서열식별번호: 262), TGGGG (서열식별번호: 263), SGGGG (서열식별번호: 264), TGGG (서열식별번호: 265), 또는 SGGG (서열식별번호: 266) 단일체, 또는 반복체를 함유할 수 있다. 다른 중성에 가까운 아미노산, 예컨대 비제한적으로 Thr, Asn, Pro 및 Ala가 또한 링커 서열에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 Gly 및 Ser을 함유하는 아미노산 서열의 다양한 순열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 10개 초과의 아미노산 길이이다. 추가 실시양태에서, 링커는 적어도 12, 15, 20, 21, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 링커는 40, 35, 30, 25, 22 또는 20개 미만의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 링커는 10-50, 10-40, 10-30, 10-25, 10-21, 10-15, 10, 15-25, 17-22, 20, 또는 21개의 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 GlyGlyGlyGlySer (GGGGS) (서열식별번호: 267) 또는 그의 반복 (GGGGS)n을 포함하며, 여기서 n ≥ 2이다. 특정한 실시양태에서, n ≥ 3 또는 n = 3-10이다. 일부 실시양태에서, n ≥ 4이거나, 또는 n = 4-10이다. 일부 실시양태에서, (GGGGS)n 링커에서 n은 4 이하이다. 일부 실시양태에서, n = 4-10, 4-9, 4-8, 4-7, 4-6, 4-5, 5-8, 5-7, 또는 5-6이다. 일부 실시양태에서, n = 3, 4, 5, 6 또는 7이다. 특정한 실시양태에서, n = 4이다. 일부 실시양태에서, (GGGGS)n 서열을 포함하는 링커는 또한 N-말단 트레오닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 하기 중 어느 하나이다:
일부 실시양태에서, 링커는 TGGGPKSCDK (서열식별번호: 275)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 N-말단 트레오닌이 결여된 서열식별번호: 268-275 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 링커는 서열식별번호: 273 또는 274의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIB, ActRIIA, ALK4, ALK7, 및 폴리스타틴 폴리펩티드 (그의 변이체 포함))는 링커에 의해 모이어티에 융합된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 모이어티는 폴리펩티드의 안정성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 모이어티는 Fc 도메인 단량체, 야생형 Fc 도메인, 아미노산 치환 (예를 들어, 이량체화를 감소시키는 1개 이상의 치환)을 갖는 Fc 도메인, 알부민-결합 펩티드, 피브로넥틴 도메인 및 인간 혈청 알부민으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 적합한 펩티드 링커는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 가요성 아미노산 잔기, 예컨대 글리신, 알라닌 및 세린을 함유하는 펩티드 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 모티프, 예를 들어 GA, GS, GG, GGA, GGS, GGG (서열식별번호: 261), GGGA (서열식별번호: 280), GGGS (서열식별번호: 281), GGGG (서열식별번호: 262), GGGGA (서열식별번호: 282), GGGGS (서열식별번호: 267), GGGGG (서열식별번호: 283), GGAG (서열식별번호: 284), GGSG (서열식별번호: 285), AGGG (서열식별번호: 286) 또는 SGGG (서열식별번호: 266)의 다중 또는 반복 모티프를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 GA 또는 GS의 모티프를 포함하는 2 내지 12개의 아미노산, 예를 들어 GA, GS, GAGA (서열식별번호: 287), GSGS (서열식별번호: 288), GAGAGA (서열식별번호: 289), GSGSGS (서열식별번호: 290), GAGAGAGA (서열식별번호: 291), GSGSGSGS (서열식별번호: 292), GAGAGAGAGA (서열식별번호: 293), GSGSGSGSGS (서열식별번호: 294), GAGAGAGAGAGA (서열식별번호: 295) 및 GSGSGSGSGSGS (서열식별번호: 296)를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 GGA 또는 GGS의 모티프, 예를 들어, GGA, GGS, GGAGGA (서열식별번호: 297), GGSGGS (서열식별번호: 298), GGAGGAGGA (서열식별번호: 299), GGSGGSGGS (서열식별번호: 300), GGAGGAGGAGGA (서열식별번호: 301), 및 GGSGGSGGSGGS (서열식별번호: 302)를 포함하는 3 내지 12개의 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 GGAG (서열식별번호: 303), GGSG (서열식별번호: 304), GGAGGGAG (서열식별번호: 305), GGSGGGSG (서열식별번호: 306), GGAGGGAGGGAG (서열식별번호: 307) 및 GGSGGGSGGGSG (서열식별번호: 308)의 모티프를 비롯한 4 내지 12개의 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 GGGGA (서열식별번호: 309) 또는 GGGGS (서열식별번호: 267)의 모티프, 예를 들어 GGGGAGGGGAGGGGA (서열식별번호: 310) 및 GGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 311)를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 모이어티 (예를 들어, Fc 도메인 단량체, 야생형 Fc 도메인, 아미노산 치환 (예를 들어, 이량체화를 감소시키는 1개 이상의 치환)을 갖는 Fc 도메인, 알부민-결합 펩티드, 피브로넥틴 도메인, 또는 인간 혈청 알부민) 및 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIB, ActRIIA, ALK4, ALK7, 및 폴리스타틴 폴리펩티드 (그의 변이체 포함)) 사이의 아미노산 링커는 GGG, GGGA (서열식별번호: 280), GGGG (서열식별번호: 262), GGGAG (서열식별번호: 312), GGGAGG (서열식별번호: 313), 또는 GGGAGGG (서열식별번호: 314)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 링커는 또한 글리신, 알라닌 및 세린 이외의 아미노산, 예를 들어 AAAL (서열식별번호: 315), AAAK (서열식별번호: 316), AAAR (서열식별번호: 317), EGKSSGSGSESKST (서열식별번호: 318), GSAGSAAGSGEF (서열식별번호: 319), AEAAAKEAAAKA (서열식별번호: 320), KESGSVSSEQLAQFRSLD (서열식별번호: 321), GENLYFQSGG (서열식별번호: 322), SACYCELS (서열식별번호: 323), RSIAT (서열식별번호: 324), RPACKIPNDLKQKVMNH (서열식별번호: 325), GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG (서열식별번호: 326), AAANSSIDLISVPVDSR (서열식별번호: 327), 또는 GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS (서열식별번호: 328)를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 모티프, 예를 들어 EAAAK (서열식별번호: 329)의 다중 또는 반복 모티프를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 모티프, 예를 들어 프랄린-풍부 서열의 다중 또는 반복 모티프, 예컨대 (XP)n (여기서 X는 임의의 아미노산 (예를 들어, A, K 또는 E)일 수 있고, n은 1-5임), 및 PAPAP (서열식별번호: 330)를 함유할 수 있다.
사용되는 펩티드 링커 및 아미노산의 길이는 수반되는 2개의 폴리펩티드 및 최종 폴리펩티드 융합 폴리펩티드에서 요구되는 가요성의 정도에 따라 조정될 수 있다. 링커의 길이는 적절한 폴리펩티드 폴딩을 보장하고 응집체 형성을 피하기 위해 조정될 수 있다.
H) 폴리펩티드 변이체 및 변형
부분적으로, 본 개시내용은 변이체 폴리펩티드 (예를 들어, 변이체 ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)인 ActRII-ALK4 길항제에 관한 것이다. 본 개시내용의 변이체 폴리펩티드는, 예를 들어 1개 이상의 아미노산 치환, 결실, 부가 또는 그의 조합에 의해 생산된 변이체 폴리펩티드뿐만 아니라 1개 이상의 번역후 변형 (예를 들어, 아세틸화, 카르복실화, 글리코실화, 인산화, 지질화 및 아실화를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 변이체를 포함하였다. 1개 이상의 아미노산 변형을 포함하는 변이체 폴리펩티드를 생성하는 방법, 특히 1종 이상의 목적하는 특성을 갖는 변이체 폴리펩티드를 생성하는 방법은 본원에 기재되어 있거나 또는 달리 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 마찬가지로, 변이체 폴리펩티드가 1종 이상의 목적하는 특성 (예를 들어, 리간드 결합 및/또는 길항 활성의 변경)을 보유하는지 또는 그것이 발생하였는지 결정하기 위한 다양한 방법이 본원에 기재되어 있거나 또는 달리 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이들 방법은 본원에 기재된 바와 같이 변이체 폴리펩티드 (예를 들어, 변이체 ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)를 생성할 뿐만 아니라 그의 활성 (또는 다른 특성)을 검증하는 데 사용될 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 본 개시내용은 자연 발생 폴리펩티드와 명시된 정도의 서열 동일성 또는 유사성을 공유하는 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)를 제공한다. 2개의 아미노산 서열의 퍼센트 동일성을 결정하기 위해, 서열을 최적 비교 목적을 위해 정렬한다 (예를 들어, 최적 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 다에 갭을 도입할 수 있고, 비교 목적을 위해 비-상동 서열은 무시할 수 있음). 이어서, 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 잔기를 비교한다. 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기에 의해 점유되는 경우에, 분자는 그 위치에서 동일하다 (본원에 사용된 아미노산 "동일성"은 아미노산 "상동성"과 등가임). 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다.
서열의 비교 및 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성 및 유사성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다 (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991).
한 실시양태에서, 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 이용가능함) 내로 혼입된 문헌 [Needleman and Wunsch (J Mol. Biol. (48):444-453 (1970))] 알고리즘을 사용하여 결정된다. 구체적 실시양태에서, 하기 파라미터가 GAP 프로그램에 사용된다: 블로섬 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4, 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6. 또 다른 실시양태에서, 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 동일성은 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램 (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Res. 12(1):387 (1984)) (http://www.gcg.com에서 이용가능함)을 사용하여 결정된다. 예시적인 파라미터는 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 갭 가중치 40, 50, 60, 70 또는 80 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용하는 것을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 블로섬 62 매트릭스, GAP 가중치 10 및 길이 가중치 3을 사용하는 GAP 프로그램을 사용하여 결정되어야 하고, 이러한 알고리즘이 목적하는 퍼센트 동일성을 계산할 수 없는 경우에, 본원에 개시된 적합한 대안이 선택되어야 한다.
또 다른 실시양태에서, 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하는 ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내로 혼입된 문헌 [E. Myers and W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989))]의 알고리즘을 사용하여 결정된다.
2개의 아미노산 서열 사이의 최상의 전체 정렬을 결정하기 위한 또 다른 실시양태는 문헌 [Brutlag et al., (Comp. App. Biosci., 6:237-245 (1990))]의 알고리즘에 기초한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 서열 정렬에서, 질의 및 대상 서열은 둘 다 아미노산 서열이다. 상기 전반적 서열 정렬의 결과는 퍼센트 동일성의 관점에서 제시된다. 한 실시양태에서, 아미노산 서열 동일성은 문헌 [Brutlag et al., (Comp. App. Biosci., 6:237-245 (1990))]의 알고리즘에 기초한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 수행된다. 구체적 실시양태에서, 아미노산 정렬의 퍼센트 동일성 및 유사성을 계산하는 데 사용된 파라미터는 매트릭스=PAM 150, k-튜플=2, 미스매치 페널티=1, 연결 페널티=20, 무작위화 군 길이=0, 컷오프 점수=1, 갭 페널티=5 및 갭 크기 페널티=0.05를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 치료 효능 또는 안정성 (예를 들어, 보관-수명 및 생체내 단백질분해적 분해에 대한 저항성)을 증진시키는 것과 같은 이러한 목적을 위해 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)의 구조를 변형시킴으로써 기능적 변이체 폴리펩티드를 제조하는 것을 고려한다. 변이체는 아미노산 치환, 결실, 부가, 또는 그의 조합에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 류신의 이소류신 또는 발린으로의, 아스파르테이트의 글루타메이트로의, 트레오닌의 세린으로의 단발적 대체, 또는 아미노산의 구조적으로 관련된 아미노산으로의 유사한 대체 (예를 들어, 보존적 돌연변이)는 생성된 분자의 생물학적 활성에 주요 효과를 갖지 않을 것으로 예상하는 것이 합리적이다. 보존적 대체는 그의 측쇄에서 관련이 있는 아미노산의 패밀리 내에서 일어나는 것이다. 본 개시내용의 폴리펩티드의 아미노산 서열에서의 변화가 기능적 상동체를 생성하는지 여부는 변이체 폴리펩티드가 야생형 폴리펩티드와 유사한 방식으로 세포에서 반응을 생성하는 능력, 또는 예를 들어 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, 및 BMP10을 포함한 1종 이상의 ActRII-ALK4 리간드에 결합하는 능력을 평가하는 것에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 폴리펩티드의 글리코실화를 변경시키도록 하는 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)의 특이적 돌연변이를 고려한다. 이러한 돌연변이는 1개 이상의 글리코실화 부위, 예컨대 O-연결된 또는 N-연결된 글리코실화 부위를 도입하거나 제거하도록 선택될 수 있다. 아스파라긴-연결된 글리코실화 인식 부위는 일반적으로 적절한 세포 글리코실화 효소에 의해 특이적으로 인식되는 트리펩티드 서열, 아스파라긴-X-트레오닌 또는 아스파라긴-X-세린 (여기서, "X"는 임의의 아미노산임)을 포함한다. 변경은 또한 폴리펩티드의 서열에 대한 1개 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 그에 의한 치환에 의해 이루어질 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우). 글리코실화 인식 부위의 제1 또는 제3 아미노산 위치 중 하나 또는 둘 다에서의 다양한 아미노산 치환 또는 결실 (및/또는 제2 위치에서의 아미노산 결실)은 변형된 트리펩티드 서열에서 비-글리코실화를 유발한다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 수를 증가시키는 또 다른 수단은 폴리펩티드에 글리코시드를 화학적 또는 효소적 커플링하는 것에 의한다. 사용된 커플링 방식에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘; (b) 유리 카르복실 기; (c) 유리 술프히드릴 기, 예컨대 시스테인의 것; (d) 유리 히드록실 기, 예컨대 세린, 트레오닌 또는 히드록시프롤린의 것; (e) 방향족 잔기, 예컨대 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 것; 또는 (f) 글루타민의 아미드 기에 부착될 수 있다. 폴리펩티드 상에 존재하는 1개 이상의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 및/또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화는, 예를 들어 폴리펩티드를 화합물 트리플루오로메탄술폰산 또는 등가의 화합물에 노출시키는 것을 수반할 수 있다. 이러한 처리는 아미노산 서열을 무손상으로 유지시키면서 연결 당 (N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분의 또는 모든 당의 절단을 초래한다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 문헌 [Thotakura et al., [Meth. Enzymol. (1987) 138:350]]에 기재된 바와 같이 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제의 사용에 의해 달성될 수 있다. 포유동물, 효모, 곤충 및 식물 세포가 모두 펩티드의 아미노산 서열에 의해 영향을 받을 수 있는 상이한 글리코실화 패턴을 도입할 수 있기 때문에, 폴리펩티드의 서열은 사용되는 발현 시스템의 유형에 따라 적절하게 조정될 수 있다. 일반적으로, 인간에서 사용하기 위한 본 개시내용의 폴리펩티드는 적절한 글리코실화를 제공하는 포유동물 세포주, 예컨대 HEK293 또는 CHO 세포주에서 발현될 수 있지만, 다른 포유동물 발현 세포주가 또한 유용할 것으로 예상된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)는 글리코실화되고, CHO 세포에서 폴리펩티드로부터 수득가능한 글리코실화 패턴을 갖는다.
본 개시내용은 돌연변이체, 특히 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)의 조합 돌연변이체뿐만 아니라 말단절단 돌연변이체의 세트를 생성하는 방법을 추가로 고려한다. 조합 돌연변이체의 풀은 기능적 활성 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 결합) 서열을 확인하는 데 특히 유용하다. 이러한 조합 라이브러리를 스크리닝하는 목적은, 예를 들어 변경된 특성, 예컨대 변경된 약동학적 또는 변경된 리간드 결합을 갖는 폴리펩티드 변이체를 생성하는 것일 수 있다. 다양한 스크리닝 검정이 하기에 제공되고, 이러한 검정은 변이체를 평가하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드) 변이체, 그를 포함하는 동종다량체, 및 이종다량체는 1종 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)에 결합하는 능력, ActRII-ALK4 리간드가 ActRII 및/또는 ALK4 폴리펩티드, 뿐만 아니라 그의 동종다량체 또는 이종다량체에 결합하는 것을 방지하는 능력 및/또는 ActRII-ALK4 리간드에 의해 유발된 신호전달을 방해하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다.
폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드) (그의 동종다량체 및 이종다량체, 또는 그의 변이체 포함)의 활성은 또한 세포-기반 또는 생체내 검정에서 시험될 수 있다. 예를 들어, 심부전 발병기전에 수반되는 유전자의 발현에 대한 폴리펩티드 (그의 동종다량체 및 이종다량체 또는 그의 변이체 포함)의 효과가 평가된다. 이는, 필요에 따라, 1종 이상의 재조합 리간드 단백질 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)의 존재 하에 수행될 수 있고, 세포는 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드), 및 임의로 ActRII-ALK4 리간드를 생산하도록 형질감염될 수 있다. 마찬가지로, 폴리펩티드 (그의 동종다량체 및 이종다량체 또는 그의 변이체 포함)는 마우스 또는 다른 동물에게 투여될 수 있고, 관련 기술분야에 인식된 방법을 사용하여 심부전 발병기전에 대한 효과가 평가될 수 있다. 유사하게, 폴리펩티드 (그의 동종다량체 및 이종다량체 또는 그의 변이체 포함)의 활성은, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 검정 및 관련 기술분야의 통상의 지식의 검정에 의해, 혈액 세포 전구체 세포에서 이들 세포의 성장에 대한 임의의 효과에 대해 시험될 수 있다. SMAD-반응성 리포터 유전자는 하류 신호전달에 대한 효과를 모니터링하기 위해 이러한 세포주에서 사용될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드) (그의 이종다량체 또는 동종다량체 포함)는 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 (그의 이종다량체 또는 동종다량체 포함)는 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드에 적어도 1 x 10-7 M의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드는 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, 및 BMP10으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 측면에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드) (그의 이종다량체 또는 동종다량체 포함)는 1개 이상의 ActRII-ALK4 패밀리 리간드를 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 (그의 이종다량체 또는 동종다량체 포함)는 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드의 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 (그의 이종다량체 또는 동종다량체 포함)는 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드의 Smad 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 (그의 이종다량체 또는 동종다량체 포함)는 세포-기반 검정에서 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드의 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 (그의 이종다량체 또는 동종다량체 포함)는 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11 및 BMP10으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 ActRII-ALK4 리간드를 억제한다.
참조 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드) (그의 동종다량체 및 이종다량체 포함)에 비해 증가된 선택성 또는 일반적으로 증가된 효력을 갖는 조합-유래된 변이체가 생성될 수 있다. 이러한 변이체는, 재조합 DNA 구축물로부터 발현되는 경우에, 유전자 요법 프로토콜에서 사용될 수 있다. 마찬가지로, 돌연변이유발은 상응하는 비변형된 폴리펩티드 (그의 동종다량체 및 이종다량체 포함)와 현저하게 상이한 세포내 반감기를 갖는 변이체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 변경된 단백질은 단백질분해적 분해, 또는 비변형된 폴리펩티드의 파괴 또는 달리 불활성화를 야기하는 다른 세포 과정에 대해 보다 안정하거나 또는 덜 안정하게 될 수 있다. 이러한 변이체, 및 이를 코딩하는 유전자는 폴리펩티드의 반감기를 조정함으로써 폴리펩티드 복합체 수준을 변경시키는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 짧은 반감기는 보다 일시적인 생물학적 효과를 일으킬 수 있고, 유도성 발현 시스템의 일부일 때, 세포 내의 재조합 폴리펩티드 복합체 수준의 보다 엄격한 제어를 가능하게 할 수 있다. Fc 융합 단백질에서, 돌연변이는 폴리펩티드 (그의 동종다량체 및 이종다량체 포함)의 반감기를 변경시키기 위해 링커 (존재하는 경우) 및/또는 Fc 부분에서 이루어질 수 있다.
각각 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드) (그의 동종다량체 및 이종다량체 포함)의 적어도 한 부분을 포함하는 폴리펩티드의 라이브러리를 코딩하는 유전자의 축중성 라이브러리에 의해 조합 라이브러리가 생산될 수 있다. 예를 들어, 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물은 잠재적 ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 코딩 뉴클레오티드 서열의 축중성 세트가 개별 폴리펩티드로서, 또는 대안적으로 보다 큰 융합 단백질의 세트로서 (예를 들어, 파지 디스플레이의 경우) 발현가능하도록 유전자 서열에 효소적으로 라이게이션될 수 있다.
축중성 올리고뉴클레오티드 서열로부터 잠재적 상동체의 라이브러리가 생성될 수 있는 많은 방식이 존재한다. 축중성 유전자 서열의 화학적 합성은 자동 DNA 합성기에서 수행될 수 있고, 이어서 합성 유전자는 발현을 위해 적절한 벡터 내로 라이게이션될 수 있다. 축중성 올리고뉴클레오티드의 합성은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 [Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al., (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura et al., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; 및 Ike et al., (1983) Nucleic Acid Res. 11:477]. 이러한 기술은 다른 단백질의 방향적 진화에 사용되어 왔다 [Scott et al., (1990) Science 249:386-390; Roberts et al., (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:2429-2433; Devlin et al., (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al., (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87: 6378-6382; 뿐만 아니라 미국 특허 번호 5,223,409, 5,198,346, 및 5,096,815].
대안적으로, 다른 형태의 돌연변이유발을 이용하여 조합 라이브러리를 생성할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드) (그의 동종다량체 및 이종다량체 포함)는, 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 [Ruf et al., (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint et al., (1993) Gene 137:109-118; Grodberg et al., (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman et al., (1991) Biochemistry 30:10832-10838; 및 Cunningham et al., (1989) Science 244:1081-1085], 링커 스캐닝 돌연변이유발 [Gustin et al., (1993) Virology 193:653-660; 및 Brown et al., (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight et al., (1982) Science 232:316], 포화 돌연변이유발 [Meyers et al., (1986) Science 232:613]; PCR 돌연변이유발 [Leung et al., (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19]; 또는 화학적 돌연변이유발 [Miller et al., (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; 및 Greener et al., (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34]을 포함한 무작위 돌연변이유발을 사용하여 스크리닝함으로써 라이브러리로부터 생성 및 단리될 수 있다. 링커 스캐닝 돌연변이유발은, 특히 조합 세팅에서, 말단절단된 (생물활성) 형태의 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드) (그의 동종다량체 및 이종다량체 포함)를 확인하기 위한 매력적인 방법이다.
점 돌연변이 및 말단절단에 의해 제조된 조합 라이브러리의 유전자 산물을 스크리닝하기 위한, 및 이와 관련하여 특정 특성을 갖는 유전자 산물에 대해 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 광범위한 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 기술은 일반적으로 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드) (그의 동종다량체 및 이종다량체를 포함)의 조합 돌연변이유발에 의해 생성된 유전자 라이브러리의 신속한 스크리닝을 위해 적합화될 것이다. 대형 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위해 가장 널리 사용되는 기술은 전형적으로 유전자 라이브러리를 복제가능한 발현 벡터 내로 클로닝하고, 생성된 벡터 라이브러리로 적절한 세포를 형질전환시키고, 목적하는 활성의 검출이 산물이 검출된 유전자를 코딩하는 벡터의 상대적으로 용이한 단리를 용이하게 하는 조건 하에 조합 유전자를 발현시키는 것을 포함한다. 바람직한 검정은 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10) 결합 검정 및/또는 리간드-매개 세포 신호전달 검정을 포함한다.
관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식될 바와 같이, 본원에 기재된 대부분의 기재된 돌연변이, 변이체 또는 변형은 핵산 수준에서, 또는 일부 경우에 번역후 변형 또는 화학적 합성에 의해 이루어질 수 있다. 이러한 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 이들 중 일부는 본원에 기재되어 있다. 부분적으로, 본 개시내용은 본원에 기재된 방법 및 용도의 범주 내에서 다른 변이체 폴리펩티드를 생성하고 사용하기 위한 지침으로서 사용될 수 있는 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드) (그의 동종다량체 및 이종다량체 포함)의 기능적 활성 부분 (단편) 및 변이체를 확인한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드) (그의 동종다량체 및 이종다량체 포함)의 기능적 활성 단편은 본원에 개시된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 상응하는 단편으로부터 재조합적으로 생산된 폴리펩티드를 스크리닝함으로써 수득될 수 있다. 또한, 단편은 관련 기술분야에 공지된 기술, 예컨대 통상적인 메리필드 고체 상 f-Moc 또는 t-Boc 화학을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 단편은 (재조합적으로 또는 화학적 합성에 의해) 생산되고, ActRII 및/또는 ALK4 수용체 및/또는 1종 이상의 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)의 길항제 (억제제)로서 기능할 수 있는 펩티딜 단편을 확인하기 위해 시험될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드) (그의 동종다량체 및 이종다량체 또는 그의 변이체 포함)는 폴리펩티드에 자연적으로 존재하는 임의의 것에 더하여 번역후 변형을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 변형은 아세틸화, 카르복실화, 글리코실화, 인산화, 지질화 및 아실화를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 그 결과, 폴리펩티드 (그의 동종다량체 및 이종다량체 포함)는 비-아미노산 요소, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 지질, 폴리사카라이드 또는 모노사카라이드, 및 포스페이트를 함유할 수 있다. 폴리펩티드의 기능성에 대한 이러한 비-아미노산 요소의 효과는 다른 폴리펩티드 변이체에 대해 본원에 기재된 바와 같이 시험될 수 있다. 본 개시내용의 폴리펩티드가 신생 형태의 폴리펩티드를 절단하는 것에 의해 세포에서 생산되는 경우에, 번역후 프로세싱은 또한 단백질의 정확한 폴딩 및/또는 기능에 중요할 수 있다. 상이한 세포 (예컨대, CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 또는 HEK293)는 이러한 번역후 활성을 위한 특수한 세포 기구 및 특징적인 메카니즘을 가지며, 폴리펩티드의 정확한 변형 및 프로세싱이 확실하게 이루어질 수 있도록 선택될 수 있다.
I) 핵산 및 제조 방법
특정 측면에서, 본 개시내용은 예를 들어 ActRIIB, ActRIIA, ALK4, 또는 ALK7 폴리펩티드 (예를 들어, 가용성 ActRIIB, ActRIIA, ALK4, 또는 ALK7 폴리펩티드), 또는 폴리스타틴 폴리펩티드를 포함한 본원에 개시된 임의의 폴리펩티드, 뿐만 아니라 본원에 개시된 임의의 변이체를 코딩하는 단리된 및/또는 재조합 핵산을 제공한다. 예를 들어, 서열식별번호: 4는 자연 발생 ActRIIB 전구체 폴리펩티드를 코딩하는 한편, 서열식별번호: 3은 가용성 ActRIIB 폴리펩티드를 코딩한다. 대상 핵산은 단일-가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 이러한 핵산은 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 이들 핵산은, 예를 들어 ActRIIB, ActRIIA, ALK4 또는 ALK7 폴리펩티드를 제조하는 방법에서 또는 직접 치료제로서 (예를 들어, 유전자 요법 접근법에서) 사용될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 ActRIIB, ActRIIA, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드(들) 중 1종 이상에 대한 코딩 서열을 포함하는 단리된 및/또는 재조합 핵산에 관한 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 3, 4, 10, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 221, 222, 223, 224, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 243, 248, 250, 251, 252, 255, 277, 331, 334, 337, 340, 343, 346, 349, 352, 355, 369, 370, 382, 397, 407, 423 및 424 중 어느 하나에 상응하는 핵산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단리된 및/또는 재조합 폴리뉴클레오티드 서열은 본원에 기재된 코딩 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 3, 4, 10, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 221, 222, 223, 224, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 243, 248, 250, 251, 252, 255, 277, 331, 334, 337, 340, 343, 346, 349, 352, 355, 369, 370, 382, 397, 407, 423, 및 424 중 어느 하나에 상응하는 핵산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산)에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 단리된 및/또는 재조합 핵산 (예를 들어, 서열식별번호: 3, 4, 10, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 221, 222, 223, 224, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 243, 248, 250, 251, 252, 255, 277, 331, 334, 337, 340, 343, 346, 349, 352, 355, 369, 370, 382, 397, 407, 423 및 424 중 어느 하나에 상응하는 핵산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산)을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 단리된 및/또는 재조합 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 3, 4, 10, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 221, 222, 223, 224, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 243, 248, 250, 251, 252, 255, 277, 331, 334, 337, 340, 343, 346, 349, 352, 355, 369, 370, 382, 397, 407, 423, 및 424 중 어느 하나에 상응하는 핵산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산)을 포함하는 세포에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 세포는 CHO 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 COS 세포이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB (또는 그의 동종다량체 또는 이종다량체), ALK4 또는 ALK7 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 서열식별번호: 3, 4, 10, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 221, 222, 223, 224, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 243, 248, 250, 251, 252, 255, 277, 331, 334, 337, 340, 343, 346, 349, 352, 355, 369, 370, 382, 397, 407, 423 및 424 중 어느 하나의 변이체인 핵산을 포함하는 것으로 이해된다. 변이체 뉴클레오티드 서열은 대립유전자 변이체를 포함하여 1개 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실에 의해 상이한 서열을 포함하고, 따라서 서열식별번호: 3, 4, 10, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 221, 222, 223, 224, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 243, 248, 250, 251, 252, 255, 277, 331, 334, 337, 340, 343, 346, 349, 352, 355, 369, 370, 382, 397, 407, 423 및 424 중 어느 하나에 지정된 뉴클레오티드 서열과 상이한 코딩 서열을 포함할 것이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB (또는 그의 동종다량체 또는 이종다량체), ALK4 또는 ALK7 폴리펩티드는 서열식별번호: 3, 4, 10, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 221, 222, 223, 224, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 243, 248, 250, 251, 252, 255, 277, 331, 334, 337, 340, 343, 346, 349, 352, 355, 369, 370, 382, 397, 407, 423 및 424 중 어느 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 (또는 그의 동종다량체 또는 이종다량체)는 서열식별번호: 3과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 (또는 그의 동종다량체 또는 이종다량체)는 서열식별번호: 4와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 (또는 그의 동종다량체 또는 이종다량체)는 서열식별번호: 10과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 (또는 그의 동종다량체 또는 이종다량체)는 서열식별번호: 32와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 (또는 그의 동종다량체 또는 이종다량체)는 서열식별번호: 35와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 (또는 그의 동종다량체 또는 이종다량체)는 서열식별번호: 38과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 (또는 그의 동종다량체 또는 이종다량체)는 서열식별번호: 41과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 (또는 그의 동종다량체 또는 이종다량체)는 서열식별번호: 44와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 (또는 그의 동종다량체 또는 이종다량체)는 서열식별번호: 47과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 (또는 그의 동종다량체 또는 이종다량체)는 서열식별번호: 277과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 (또는 그의 동종다량체 또는 이종다량체)는 서열식별번호: 331과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 (또는 그의 동종다량체 또는 이종다량체)는 서열식별번호: 334와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 (또는 그의 동종다량체 또는 이종다량체)는 서열식별번호: 337과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 (또는 그의 동종다량체 또는 이종다량체)는 서열식별번호: 340과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 (또는 그의 동종다량체 또는 이종다량체)는 서열식별번호: 343과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 (또는 그의 동종다량체 또는 이종다량체)는 서열식별번호: 346과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 (또는 그의 동종다량체 또는 이종다량체)는 서열식별번호: 349와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 (또는 그의 동종다량체 또는 이종다량체)는 서열식별번호: 352와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 (또는 그의 동종다량체 또는 이종다량체)는 서열식별번호: 355와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 (또는 그의 동종다량체 또는 이종다량체)는 서열식별번호: 382와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 (또는 그의 동종다량체 또는 이종다량체)는 서열식별번호: 397과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 (또는 그의 동종다량체 또는 이종다량체)는 서열식별번호: 407과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIA 폴리펩티드 (또는 그의 동종다량체 또는 이종다량체)는 서열식별번호: 369와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 변이체 ActRIIA 폴리펩티드 (또는 그의 동종다량체 또는 이종다량체)는 서열식별번호: 370과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 ALK4 폴리펩티드는 서열식별번호: 221과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 ALK4 폴리펩티드는 서열식별번호: 222와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 ALK4 폴리펩티드는 서열식별번호: 223과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 ALK4 폴리펩티드는 서열식별번호: 224와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 ALK4 폴리펩티드는 서열식별번호: 423과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 ALK4 폴리펩티드는 서열식별번호: 424와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 ALK7 폴리펩티드는 서열식별번호: 233과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 ALK7 폴리펩티드는 서열식별번호: 234와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 ALK7 폴리펩티드는 서열식별번호: 235와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 ALK7 폴리펩티드는 서열식별번호: 236과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 ALK7 폴리펩티드는 서열식별번호: 237과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 ALK7 폴리펩티드는 서열식별번호: 238과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 ALK7 폴리펩티드는 서열식별번호: 239와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 ALK7 폴리펩티드는 서열식별번호: 240과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 243과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 248과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 250과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 251과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 252와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 255와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다.
특정 측면에서, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드를 코딩하는 대상 핵산은 서열식별번호: 3의 변이체인 핵산을 포함하는 것으로 추가로 이해된다. 변이체 뉴클레오티드 서열은 1개 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실에 의해 상이한 서열, 예컨대 대립유전자 변이체를 포함하고; 따라서, 서열식별번호: 4에 지정된 코딩 서열의 뉴클레오티드 서열과 상이한 코딩 서열을 포함할 것이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 3과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 또는 재조합 핵산 서열을 제공한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 서열식별번호: 3에 상보적인 핵산 서열 및 서열식별번호: 3의 변이체가 또한 본 개시내용의 범주 내에 있음을 인지할 것이다. 추가 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산 서열은 단리되고/거나, 재조합되고/거나, 이종 뉴클레오티드 서열과 또는 DNA 라이브러리에서 융합될 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산은 또한 고도로 엄격한 조건 하에 본 개시내용의 동형체 또는 이형체 형태의 ActRIIB 또는 ActRIIA 폴리펩티드, ALK4 또는 ALK7 폴리펩티드, 또는 본 개시내용의 폴리스타틴 폴리펩티드, 상보체 서열, 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 논의된 바와 같이, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 DNA 혼성화를 촉진하는 적절한 엄격도 조건이 달라질 수 있음을 용이하게 이해할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 DNA 혼성화를 촉진하는 적절한 엄격도 조건이 달라질 수 있음을 용이하게 이해할 것이다. 예를 들어, 약 45℃에서 6.0 x 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC)에서의 혼성화에 이어, 50℃에서 2.0 x SSC로의 세척을 수행할 수 있다. 예를 들어, 세척 단계에서의 염 농도는 50℃에서의 약 2.0 x SSC의 낮은 엄격도로부터 50℃에서의 약 0.2 x SSC의 높은 엄격도까지 선택될 수 있다. 또한, 세척 단계에서의 온도는 실온, 약 22℃에서의 낮은 엄격도 조건으로부터 약 65℃에서의 높은 엄격도 조건까지 증가될 수 있다. 온도 및 염 둘 다는 달라질 수 있거나, 또는 다른 변수는 변화시키면서 온도 또는 염 농도는 일정하게 유지시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 실온에서 6 x SSC의 낮은 엄격도 조건 하에서의 혼성화에 이어 실온에서 2 x SSC로 세척한 핵산을 제공한다.
유전자 코드의 축중성으로 인해 본 개시내용에 제시된 바와 같은 핵산과 상이한 단리된 핵산이 또한 본 개시내용의 범주 내에 있다. 예를 들어, 다수의 아미노산은 1개 초과의 트리플렛에 의해 지정된다. 동일한 아미노산을 명시하는 코돈, 또는 동의어 (예를 들어, CAU 및 CAC는 히스티딘에 대한 동의어임)는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않는 "침묵" 돌연변이를 발생시킬 수 있다. 그러나, 대상 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변화로 이어지는 DNA 서열 다형성이 포유동물 세포 사이에 존재할 것으로 예상된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 특정한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 1개 이상의 뉴클레오티드 (뉴클레오티드의 최대 약 3-5%)에서의 이들 변이가 자연 대립유전자 변이로 인해 주어진 종의 개체 사이에 존재할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 임의의 및 모든 이러한 뉴클레오티드 변이 및 생성된 아미노산 다형성은 본 개시내용의 범주 내에 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 재조합 핵산은 발현 구축물 내의 1개 이상의 조절 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 조절 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 발현에 사용되는 숙주 세포에 적절할 것이다. 다양한 숙주 세포에 대한 수많은 유형의 적절한 발현 벡터 및 적합한 조절 서열이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 상기 1개 이상의 조절 뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열, 리더 또는 신호 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 개시 및 종결 서열, 번역 개시 및 종결 서열, 및 인핸서 또는 활성화제 서열을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 구성적 또는 유도성 프로모터가 본 개시내용에 의해 고려된다. 프로모터는 자연 발생 프로모터, 또는 1개 초과의 프로모터의 요소를 조합한 하이브리드 프로모터일 수 있다. 발현 구축물은 에피솜, 예컨대 플라스미드 상에서 세포에 존재할 수 있거나, 또는 발현 구축물은 염색체에 삽입될 수 있다. 한 실시양태에서, 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포의 선택을 가능하게 하는 선택 마커 유전자를 함유한다. 선택 마커 유전자는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 사용되는 숙주 세포에 따라 달라질 것이다.
특정 측면에서, 대상 핵산은 적어도 1개의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본 개시내용의 폴리펩티드 (예를 들어, 변이체 ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 제공된다. 조절 서열은 관련 기술분야에 인식되어 있고, 본 개시내용의 폴리펩티드 (예를 들어, 변이체 ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)의 발현을 지시하기 위해 선택된다. 따라서, 용어 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 및 다른 발현 제어 요소를 포함한다. 예시적인 조절 서열은 문헌 [Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기재되어 있다. 예를 들어, 작동가능하게 연결된 경우에 DNA 서열의 발현을 제어하는 매우 다양한 발현 제어 서열 중 임의의 것이 본 개시내용의 폴리펩티드 (예를 들어, 변이체 ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)를 코딩하는 DNA 서열을 발현시키기 위해 이들 벡터에서 사용될 수 있다. 이러한 유용한 발현 제어 서열은, 예를 들어 SV40의 초기 및 후기 프로모터, tet 프로모터, 아데노바이러스 또는 시토메갈로바이러스 극초기 프로모터, RSV 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, 그의 발현이 T7 RNA 폴리머라제에 의해 지시되는 T7 프로모터, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코트 단백질에 대한 제어 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소에 대한 프로모터, 산 포스파타제의 프로모터, 예를 들어 Pho5, 효모 α-교배 인자의 프로모터, 바큘로바이러스 시스템의 다면체 프로모터, 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 그의 바이러스의 유전자의 발현을 제어하는 것으로 공지된 다른 서열, 및 그의 다양한 조합을 포함한다. 발현 벡터의 설계는 형질전환시킬 숙주 세포의 선택 및/또는 발현시키고자 하는 폴리펩티드의 유형과 같은 인자에 좌우될 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 벡터의 카피수, 벡터에 의해 코딩되는 임의의 다른 폴리펩티드, 예컨대 항생제 마커의 카피수 및 발현을 제어하는 능력이 또한 고려되어야 한다.
본 개시내용의 재조합 핵산은 클로닝된 유전자 또는 그의 부분을 원핵 세포, 진핵 세포 (효모, 조류, 곤충 또는 포유동물), 또는 둘 다에서의 발현에 적합한 벡터 내로 라이게이션함으로써 생산될 수 있다. 재조합 변이체 ActRIIB 폴리펩티드의 생산을 위한 발현 비히클은 플라스미드 및 다른 벡터를 포함한다. 예를 들어, 적합한 벡터는 원핵 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli)에서의 발현을 위한 유형의 플라스미드: pBR322-유래 플라스미드, pEMBL-유래 플라스미드, pEX-유래 플라스미드, pBTac-유래 플라스미드 및 pUC-유래 플라스미드를 포함한다.
일부 포유동물 발현 벡터는 박테리아에서 벡터의 증식을 용이하게 하는 원핵 서열, 및 진핵 세포에서 발현되는 1종 이상의 진핵 전사 단위 둘 다를 함유한다. pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo 및 pHyg 유래 벡터는 진핵세포의 형질감염에 적합한 포유동물 발현 벡터의 예이다. 이들 벡터 중 일부는 원핵 및 진핵 세포 둘 다에서 복제 및 약물 저항성 선택을 용이하게 하기 위해 박테리아 플라스미드, 예컨대 pBR322로부터의 서열로 변형된다. 대안적으로, 바이러스, 예컨대 소 유두종 바이러스 (BPV-1) 또는 엡스타인-바르 바이러스 (pHEBo, pREP-유래 및 p205)의 유도체가 진핵 세포에서의 폴리펩티드의 일시적 발현을 위해 사용될 수 있다. 다른 바이러스 (레트로바이러스 포함) 발현 시스템의 예는 하기 유전자 요법 전달 시스템의 설명에서 찾아볼 수 있다. 플라스미드의 제조 및 숙주 유기체의 형질전환에 사용되는 다양한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 원핵 및 진핵 세포 둘 다에 대한 다른 적합한 발현 시스템, 뿐만 아니라 일반적 재조합 절차에 대해, 문헌 [Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) Chapters 16 and 17]을 참조한다. 일부 경우에, 바큘로바이러스 발현 시스템의 사용에 의해 재조합 폴리펩티드를 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 바큘로바이러스 발현 시스템의 예는 pVL-유래 벡터 (예컨대 pVL1392, pVL1393 및 pVL941), pAcUW-유래 벡터 (예컨대 pAcUW1), 및 pBlueBac-유래 벡터 (예컨대 β-gal 함유 pBlueBac III)를 포함한다.
한 실시양태에서, 벡터, 예컨대 Pcmv-Script 벡터 (스트라타진(Stratagene), 캘리포니아주 라호야), pcDNA4 벡터 (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드) 및 pCI-neo 벡터 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨)는 CHO 세포에서의 본 개시내용의 폴리펩티드 (예를 들어, 변이체 ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)의 생산을 위해 설계될 것이다. 명백할 바와 같이, 대상 유전자 구축물은 배양물에서 증식된 세포에서 본 개시내용의 폴리펩티드 (예를 들어, 변이체 ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)의 발현을 유발하여, 예를 들어 정제를 위한 융합 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 비롯한 폴리펩티드를 생산하는 데 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 본 개시내용의 폴리펩티드 (예를 들어, 변이체 ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)뿐만 아니라 그를 포함하는 동종다량체 및 이종다량체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 적합한 세포 (예를 들어, CHO 세포 또는 COS 세포)에서 본원에 개시된 임의의 핵산을 발현시키는 것을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 a) 세포를 본 개시내용의 가용성 폴리펩티드 (예를 들어, 변이체 ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 세포는 본 개시내용의 폴리펩티드 (예를 들어, 변이체 ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)의 발현 구축물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 본 개시내용의 발현된 폴리펩티드 (예를 들어, 변이체 ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)를 회수하는 것을 추가로 포함한다. 본 개시내용의 폴리펩티드 (예를 들어, 변이체 ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)는 세포 배양물로부터 단백질을 수득하기 위한 임의의 널리 공지된 기술을 사용하여 조 물질, 부분적으로 정제된 분획 또는 고도로 정제된 분획으로서 회수될 수 있다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 1종 이상의 폴리펩티드 (예를 들어, 변이체 ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)에 대한 코딩 서열을 포함하는 재조합 유전자로 형질감염된 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 폴리펩티드 (예를 들어, 변이체 ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)는 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이, 곤충 세포 (예를 들어, 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용함), 효모, 또는 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
따라서, 본 개시내용은 추가로 본 개시내용의 폴리펩티드 (예를 들어, 변이체 ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)를 생산하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 본 개시내용의 폴리펩티드 (예를 들어, 변이체 ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)를 코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포는 본 개시내용의 폴리펩티드 (예를 들어, 변이체 ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)의 발현이 일어나도록 하는 적절한 조건 하에 배양될 수 있다. 본 개시내용의 폴리펩티드 (예를 들어, 변이체 ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)는 분비되고, 세포 및 폴리펩티드를 함유하는 배지의 혼합물로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, 본 개시내용의 폴리펩티드 (예를 들어, 변이체 ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)는 세포질에서 또는 막 분획에서 보유될 수 있고, 세포는 수거되고, 용해되고, 단백질 단리된다. 세포 배양물은 숙주 세포, 배지 및 다른 부산물을 포함한다. 세포 배양에 적합한 배지는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 본 개시내용의 대상 폴리펩티드 (예를 들어, 변이체 ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)는 이온-교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 한외여과, 전기영동, 및 본 개시내용의 폴리펩티드 (예를 들어, 변이체 ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)의 특정한 에피토프에 특이적인 항체에 의하는 면역친화성 정제를 포함한, 폴리펩티드를 정제하기 위한 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 세포 배양 배지, 숙주 세포, 또는 둘 다로부터 단리될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 (예를 들어, 변이체 ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)는 정제를 용이하게 하는 도메인을 함유하는 융합 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용될 ActRII 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드, ALK7 폴리펩티드, 및 ActRIIB-ALK4, ActRIIB-ALK7, ActRIIA-ALK4, 및 ActRIIA-ALK7 이종다량체는 단리된 폴리펩티드이다. 본원에 사용된 단리된 단백질 또는 폴리펩티드는 그의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드는 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정된 바와 같이 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 순도의 평가 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 [예를 들어, 문헌 [Flatman et al., (2007) J. Chromatogr. B 848:79-87] 참조]. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용될 ActRII 폴리펩티드, ALK4 폴리펩티드 및 ActRIIB-ALK4 이종다량체는 재조합 폴리펩티드이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 ActRIIB 또는 ActRIIA 폴리펩티드는 다양한 관련 기술분야에 공지된 기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 이러한 ActRIIB 또는 ActRIIA 폴리펩티드는 문헌 [Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) and Grant G. A. (ed.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company, New York (1992)]에 기재된 바와 같은 표준 단백질 화학 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 또한, 자동화 펩티드 합성기가 상업적으로 입수가능하다 (예를 들어, 어드밴스드 켐테크(Advanced ChemTech) 모델 396; 밀리겐(Milligen)/바이오서치(Biosearch) 9600). 대안적으로, ActRIIB 또는 ActRIIA 폴리펩티드, 그의 단편 또는 변이체는 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같은 다양한 발현 시스템 (예를 들어, 이. 콜라이, 차이니즈 햄스터 난소 세포, COS 세포, 바큘로바이러스)을 사용하여 재조합적으로 생산될 수 있다 (또한 상기 참조). 추가의 실시양태에서, ActRIIB 또는 ActRIIA 폴리펩티드는 자연 발생의 또는 재조합적으로 생산된 전장 ActRIIB 또는 ActRIIA 폴리펩티드를, 예를 들어 프로테아제, 예를 들어, 트립신, 써모리신, 키모트립신, 펩신, 또는 쌍형성된 염기성 아미노산 전환 효소 (PACE)를 사용하여 소화시키는 것에 의해 생산될 수 있다. 컴퓨터 분석 (상업적으로 입수가능한 소프트웨어, 예를 들어 맥벡터(MacVector), 오메가(Omega), PCGene, 몰레큘라 시뮬레이션, 인크.(Molecular Simulation, Inc.)를 사용함)을 사용하여 단백질분해적 절단 부위를 확인할 수 있다. 대안적으로, 이러한 ActRIIB 또는 ActRIIA 폴리펩티드는 자연 발생의 또는 재조합적으로 생산된 전장 ActRIIB 또는 ActRIIA 폴리펩티드로부터, 예컨대 관련 기술분야에 공지된 표준 기술, 예컨대 화학적 절단 (예를 들어, 브로민화시아노겐, 히드록실아민)에 의해 생산될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 재조합 폴리펩티드 (예를 들어, 변이체 ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)의 목적하는 부분의 N-말단에서 정제 리더 서열, 예컨대 폴리-(His)/엔테로키나제 절단 부위 서열을 코딩하는 융합 유전자는 Ni2+ 금속 수지를 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 발현된 융합 폴리펩티드의 정제를 가능하게 할 수 있다. 이어서, 정제 리더 서열은 엔테로키나제로의 처리에 의해 후속적으로 제거되어 본 개시내용의 정제된 폴리펩티드 (예를 들어, 변이체 ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, 또는 폴리스타틴 폴리펩티드)를 제공할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411:177; 및 Janknecht et al., Proc Natl Acad Sci USA 88:8972] 참조).
융합 유전자를 제조하는 기술은 널리 공지되어 있다. 본질적으로, 상이한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 다양한 DNA 단편을 연결하는 것은 라이게이션을 위한 평활-종결 또는 엇갈림-종결 말단, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 소화, 적절한 경우에 응집성 단부의 충전, 바람직하지 않은 연결을 피하기 위한 알칼리성 포스파타제 처리, 및 효소적 라이게이션을 사용하는 통상적인 기술에 따라 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 융합 유전자는 자동화 DNA 합성기를 포함한 통상적인 기술에 의해 합성될 수 있다. 대안적으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은 2개의 연속 유전자 단편 사이에 상보적 오버행을 발생시키는 앵커 프라이머를 사용하여 수행될 수 있으며, 이는 후속적으로 어닐링되어 키메라 유전자 서열을 생성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992] 참조).
3. 항체 길항제
특정 측면에서, 본원에 개시된 방법 및 용도에 따라 (예를 들어, 노화와 연관된 심부전 또는 노화와 연관된 심부전의 1종 이상의 합병증을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 데) 사용될 ActRII-ALK4 길항제는 항체 (ActRII-ALK4 길항제 항체) 또는 항체의 조합물이다. ActRII-ALK4 길항제 항체 또는 항체의 조합물은, 예를 들어 1종 이상의 ActRII 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), ActRII 수용체 (ActRIIA 및/또는 ActRIIB), 및/또는 유형 I 수용체 (예를 들어, ALK4)에 결합할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, ActRII-ALK4 길항제 항체는 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 데, 특히 1종 이상의 심부전-연관 합병증을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 데 단독으로 또는 1종 이상의 지지 요법 또는 활성제와 조합되어 사용될 수 있다.
특정 측면에서, ActRII-ALK4 길항제 항체 또는 항체의 조합물은 적어도 액티빈 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE, 및/또는 액티빈 BE)을 억제하는 항체이다. 따라서, 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제 항체 또는 항체의 조합물은 적어도 액티빈에 결합한다. 본원에 사용된 액티빈 항체 (또는 항-액티빈 항체)는 일반적으로 항체가 액티빈의 표적화에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 액티빈에 결합하는 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 비관련, 비-액티빈 단백질에 대한 액티빈 항체의 결합의 정도는, 예를 들어 방사성면역검정 (RIA), 비아코어, 또는 다른 단백질 상호작용 또는 결합 친화도 검정에 의해 측정된 바와 같이, 액티빈에 대한 항체의 결합의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 실시양태에서, 액티빈 항체는 상이한 종으로부터의 액티빈 사이에 보존된 액티빈의 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-액티빈 항체는 인간 액티빈에 결합한다. 일부 실시양태에서, 액티빈 항체는 액티빈이 유형 I 및/또는 유형 II 수용체 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, 및/또는 ALK4)에 결합하는 것을 억제할 수 있고, 따라서 액티빈-매개 신호전달 (예를 들어, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. 액티빈 A는 액티빈 B와 유사한 서열 상동성을 갖고, 따라서 액티빈 A에 결합하는 항체는, 일부 경우에, 또한 액티빈 B에 결합할 수 있고/거나 이를 억제할 수 있으며, 이는 또한 항-액티빈 B 항체에 적용된다는 것을 주목하여야 한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 액티빈에 결합하고, 예를 들어 1종 이상의 추가의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), 1종 이상의 유형 I 수용체 및/또는 유형 II 수용체 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, 및/또는 ALK4)에 추가로 결합하는 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 그의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 액티빈에 결합하는 다중특이적 항체는 BMP9에 결합하지 않거나 실질적으로 결합하지 않는다 (예를 들어, BMP9에 1 x 10-7 M 초과의 KD로 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 예를 들어, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 실시양태에서, 액티빈에 결합하는 다중특이적 항체는 액티빈 A에 결합하지 않거나 실질적으로 결합하지 않는다 (예를 들어, 액티빈 A에 1 x 10-7 M 초과의 KD로 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 예를 들어, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 항체의 조합물 및 그의 용도에 관한 것이며, 여기서 항체의 조합물은 액티빈 항체, 및 예를 들어 1종 이상의 추가의 ActRII 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), ActRII 수용체 (ActRIIA 및/또는 ActRIIB) 및/또는 유형 I 수용체 (예를 들어, ALK4)에 결합하는 1종 이상의 추가의 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 액티빈 항체를 포함하는 항체의 조합물은 BMP9 항체를 포함하지 않는다.
특정 측면에서, ActRII-ALK4 길항제 항체 또는 항체의 조합물은 적어도 액티빈 A를 억제하는 항체이다. 따라서, 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제 항체 또는 항체의 조합물은 적어도 액티빈 A에 결합한다. 본원에 사용된 액티빈 A 항체 (또는 항-액티빈 A 항체)는 일반적으로 항체가 액티빈 A의 표적화에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 액티빈 A에 결합하는 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 비관련, 비-액티빈 A 단백질에 대한 액티빈 A 항체의 결합의 정도는, 예를 들어 방사성면역검정 (RIA), 비아코어, 또는 다른 단백질 상호작용 또는 결합 친화도 검정에 의해 측정된 바와 같이, 액티빈에 대한 항체의 결합의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 실시양태에서, 액티빈 A 항체는 상이한 종으로부터의 액티빈 A 사이에 보존된 액티빈 A의 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-액티빈 A 항체는 인간 액티빈 A에 결합한다. 일부 실시양태에서, 액티빈 A 항체는 액티빈 A가 유형 I 및/또는 유형 II 수용체 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, 및/또는 ALK4)에 결합하는 것을 억제할 수 있고, 따라서 액티빈 A-매개 신호전달 (예를 들어, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 액티빈 A 항체는 액티빈 A가 보조-수용체에 결합하는 것을 억제할 수 있고, 따라서 액티빈 A-매개 신호전달 (예를 들어, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. 액티빈 A는 액티빈 B와 유사한 서열 상동성을 갖고, 따라서 액티빈 A에 결합하는 항체는, 일부 경우에, 또한 액티빈 B에 결합할 수 있고/거나 이를 억제할 수 있다는 것을 주목하여야 한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 액티빈 A에 결합하고, 예를 들어 1종 이상의 추가의 ActRII 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), ActRII 수용체 (ActRIIA 및/또는 ActRIIB), 및/또는 유형 I 수용체 (예를 들어, ALK4)에 추가로 결합하는 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 그의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 액티빈 A에 결합하는 다중특이적 항체는 BMP9에 결합하지 않거나 실질적으로 결합하지 않는다 (예를 들어, BMP9에 1 x 10-7 M 초과의 KD로 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 예를 들어, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 실시양태에서, 액티빈 A에 결합하는 다중특이적 항체는 액티빈 B에 결합하지 않거나 실질적으로 결합하지 않는다 (예를 들어, 액티빈 B에 1 x 10-7 M 초과의 KD로 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 예를 들어, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 항체의 조합물 및 그의 용도에 관한 것이며, 여기서 항체의 조합물은 액티빈 A 항체, 및 예를 들어 1종 이상의 추가의 ActRII 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), ActRII 수용체 (ActRIIA 및/또는 ActRIIB) 및/또는 유형 I 수용체 (예를 들어, ALK4)에 결합하는 1종 이상의 추가의 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 액티빈 A 항체를 포함하는 항체의 조합물은 BMP9 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 액티빈 A 항체를 포함하는 항체의 조합물은 액티빈 B 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 액티빈 A 항체는 REGN-2477을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 액티빈 A 항체는 가레토스맙을 포함한다.
특정 측면에서, ActRII-ALK4 길항제 항체 또는 항체의 조합물은 적어도 액티빈 B를 억제하는 항체이다. 따라서, 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제 항체 또는 항체의 조합물은 적어도 액티빈 B에 결합한다. 본원에 사용된 액티빈 B 항체 (또는 항-액티빈 B 항체)는 일반적으로 항체가 액티빈 B의 표적화에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 액티빈 B에 결합하는 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 비관련, 비-액티빈 B 단백질에 대한 액티빈 B 항체의 결합의 정도는, 예를 들어 방사성면역검정 (RIA), 비아코어, 또는 다른 단백질 상호작용 또는 결합 친화도 검정에 의해 측정된 바와 같이, 액티빈에 대한 항체의 결합의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 실시양태에서, 액티빈 B 항체는 상이한 종으로부터의 액티빈 B 사이에 보존된 액티빈 B의 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-액티빈 B 항체는 인간 액티빈 B에 결합한다. 일부 실시양태에서, 액티빈 B 항체는 액티빈 B가 유형 I 및/또는 유형 II 수용체 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, 및/또는 ALK4)에 결합하는 것을 억제할 수 있고, 따라서 액티빈 B-매개 신호전달 (예를 들어, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 액티빈 B 항체는 액티빈 B가 보조-수용체에 결합하는 것을 억제할 수 있고, 따라서 액티빈 B-매개 신호전달 (예를 들어, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. 액티빈 B는 액티빈 A와 유사한 서열 상동성을 갖고, 따라서 액티빈 B에 결합하는 항체는, 일부 경우에, 또한 액티빈 A에 결합할 수 있고/거나 이를 억제할 수 있다는 것을 주목하여야 한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 액티빈 B에 결합하고, 예를 들어 1종 이상의 추가의 ActRII 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), ActRII 수용체 (ActRIIA 및/또는 ActRIIB), 및/또는 유형 I 수용체 (예를 들어, ALK4)에 추가로 결합하는 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 그의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 액티빈 B에 결합하는 다중특이적 항체는 BMP9에 결합하지 않거나 실질적으로 결합하지 않는다 (예를 들어, BMP9에 1 x 10-7 M 초과의 KD로 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 예를 들어, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 실시양태에서, 액티빈 B에 결합하는 다중특이적 항체는 액티빈 A에 결합하지 않거나 실질적으로 결합하지 않는다 (예를 들어, 액티빈 A에 1 x 10-7 M 초과의 KD로 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 예를 들어, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 항체의 조합물 및 그의 용도에 관한 것이며, 여기서 항체의 조합물은 액티빈 B 항체, 및 예를 들어 1종 이상의 추가의 ActRII 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), ActRII 수용체 (ActRIIA 및/또는 ActRIIB) 및/또는 유형 I 수용체 (예를 들어, ALK4)에 결합하는 1종 이상의 추가의 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 액티빈 B 항체를 포함하는 항체의 조합물은 BMP9 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 액티빈 B 항체를 포함하는 항체의 조합물은 액티빈 A 항체를 포함하지 않는다.
특정 측면에서, ActRII-ALK4 길항제 항체 또는 항체의 조합물은 적어도 GDF8을 억제하는 항체이다. 따라서, 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제 항체 또는 항체의 조합물은 적어도 GDF8에 결합한다. 본원에 사용된 GDF8 항체 (또는 항-GDF8 항체)는 일반적으로 항체가 GDF8의 표적화에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 GDF8에 결합하는 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 비관련, 비-GDF8 단백질에 대한 GDF8 항체의 결합의 정도는, 예를 들어 방사성면역검정 (RIA), 비아코어, 또는 다른 단백질 상호작용 또는 결합 친화도 검정에 의해 측정된 바와 같이, GDF8에 대한 항체의 결합의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 실시양태에서, GDF8 항체는 상이한 종으로부터의 GDF8 사이에 보존된 GDF8의 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-GDF8 항체는 인간 GDF8에 결합한다. 일부 실시양태에서, GDF8 항체는 GDF8이 유형 I 및/또는 유형 II 수용체 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, 및/또는 ALK4)에 결합하는 것을 억제할 수 있고, 따라서 GDF8-매개 신호전달 (예를 들어, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, GDF8 항체는 GDF8이 보조-수용체에 결합하는 것을 억제할 수 있고, 따라서 GDF8-매개 신호전달 (예를 들어, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. GDF8은 GDF11과 높은 서열 상동성을 갖고, 따라서 GDF8에 결합하는 항체는, 일부 경우에, 또한 GDF11에 결합할 수 있고/거나 이를 억제할 수 있다는 것을 주목하여야 한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 GDF8에 결합하고, 예를 들어 1종 이상의 추가의 ActRII 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), ActRII 수용체 (ActRIIA 및/또는 ActRIIB), 및/또는 유형 I 수용체 (예를 들어, ALK4)에 추가로 결합하는 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 그의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, GDF8에 결합하는 다중특이적 항체는 BMP9에 결합하지 않거나 실질적으로 결합하지 않는다 (예를 들어, BMP9에 1 x 10-7 M 초과의 KD로 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 예를 들어, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 실시양태에서, GDF8에 결합하는 다중특이적 항체는 액티빈 A에 결합하지 않거나 실질적으로 결합하지 않는다 (예를 들어, 액티빈 A에 1 x 10-7 M 초과의 KD로 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 예를 들어, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 항체의 조합물 및 그의 용도에 관한 것이며, 여기서 항체의 조합물은 GDF8 항체, 및 예를 들어 1종 이상의 추가의 ActRII 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), ActRII 수용체 (ActRIIA 및/또는 ActRIIB) 및/또는 유형 I 수용체 (예를 들어, ALK4)에 결합하는 1종 이상의 추가의 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, GDF8 항체를 포함하는 항체의 조합물은 BMP9 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, GDF8 항체를 포함하는 항체의 조합물은 액티빈 A 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 GDF8 항체는 REGN-1033을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 GDF8 항체는 트레보구맙을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 GDF8 항체는 MYO-029를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 GDF8 항체는 스타물루맙을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 GDF8 항체는 PF-06252616을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 GDF8 항체는 도마그로주맙을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 GDF8 항체는 LY-2495655를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 GDF8 항체는 란도그로주맙을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 GDF8 항체는 SRK-015를 포함한다.
특정 측면에서, ActRII-ALK4 길항제 항체 또는 항체의 조합물은 적어도 GDF11을 억제하는 항체이다. 따라서, 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제 항체 또는 항체의 조합물은 적어도 GDF11에 결합한다. 본원에 사용된 GDF11 항체 (또는 항-GDF11 항체)는 일반적으로 항체가 GDF11의 표적화에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 GDF11에 결합하는 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 비관련, 비-GDF11 단백질에 대한 GDF11 항체의 결합의 정도는, 예를 들어 방사성면역검정 (RIA), 비아코어, 또는 다른 단백질 상호작용 또는 결합 친화도 검정에 의해 측정된 바와 같이, GDF11에 대한 항체의 결합의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 실시양태에서, GDF11 항체는 상이한 종으로부터의 GDF11 사이에 보존된 GDF11의 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-GDF11 항체는 인간 GDF11에 결합한다. 일부 실시양태에서, GDF11 항체는 GDF11이 유형 I 및/또는 유형 II 수용체 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, 및/또는 ALK4)에 결합하는 것을 억제할 수 있고, 따라서 GDF11-매개 신호전달 (예를 들어, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, GDF11 항체는 GDF11이 보조-수용체에 결합하는 것을 억제할 수 있고, 따라서 GDF11-매개 신호전달 (예를 들어, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. GDF11은 GDF8과 높은 서열 상동성을 갖고, 따라서 GDF11에 결합하는 항체는, 일부 경우에, 또한 GDF8에 결합할 수 있고/거나 이를 억제할 수 있다는 것을 주목하여야 한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 GDF11에 결합하고, 예를 들어 1종 이상의 추가의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), 1종 이상의 유형 I 수용체 및/또는 유형 II 수용체 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, 및/또는 ALK4), 및/또는 1종 이상의 보조-수용체에 추가로 결합하는 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 그의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, GDF11에 결합하는 다중특이적 항체는 BMP9에 결합하지 않거나 실질적으로 결합하지 않는다 (예를 들어, BMP9에 1 x 10-7 M 초과의 KD로 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 예를 들어, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 실시양태에서, GDF11에 결합하는 다중특이적 항체는 액티빈 A에 결합하지 않거나 실질적으로 결합하지 않는다 (예를 들어, 액티빈 A에 1 x 10-7 M 초과의 KD로 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 예를 들어, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 항체의 조합물 및 그의 용도에 관한 것이며, 여기서 항체의 조합물은 GDF11 항체, 및 예를 들어 1종 이상의 추가의 ActRII 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), ActRII 수용체 (ActRIIA 및/또는 ActRIIB) 및/또는 유형 I 수용체 (예를 들어, ALK4)에 결합하는 1종 이상의 추가의 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, GDF11 항체를 포함하는 항체의 조합물은 BMP9 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, GDF11 항체를 포함하는 항체의 조합물은 액티빈 A 항체를 포함하지 않는다.
특정 측면에서, ActRII-ALK4 길항제 항체 또는 항체의 조합물은 적어도 BMP6을 억제하는 항체이다. 따라서, 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제 항체 또는 항체의 조합물은 적어도 BMP6에 결합한다. 본원에 사용된 BMP6 항체 (또는 항-BMP6 항체)는 일반적으로 항체가 BMP6의 표적화에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 BMP6에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 비관련, 비-BMP6 단백질에 대한 BMP6 항체의 결합의 정도는, 예를 들어 방사성면역검정 (RIA), 비아코어, 또는 다른 단백질 상호작용 또는 결합 친화도 검정에 의해 측정된 바와 같이, BMP6에 대한 항체의 결합의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 실시양태에서, BMP6 항체는 상이한 종으로부터의 BMP6 사이에 보존된 BMP6의 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-BMP6 항체는 인간 BMP6에 결합한다. 일부 실시양태에서, BMP6 항체는 BMP6이 유형 I 및/또는 유형 II 수용체 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, 및/또는 ALK4)에 결합하는 것을 억제할 수 있고, 따라서 BMP6-매개 신호전달 (예를 들어, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, BMP6 항체는 BMP6이 보조-수용체에 결합하는 것을 억제할 수 있고, 따라서 BMP6-매개 신호전달 (예를 들어, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 BMP6에 결합하고, 예를 들어 1종 이상의 추가의 ActRII 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), ActRII 수용체 (ActRIIA 및/또는 ActRIIB), 및/또는 유형 I 수용체 (예를 들어, ALK4)에 추가로 결합하는 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 그의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, BMP6에 결합하는 다중특이적 항체는 BMP9에 결합하지 않거나 실질적으로 결합하지 않는다 (예를 들어, BMP9에 1 x 10-7 M 초과의 KD로 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 예를 들어, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 실시양태에서, BMP6에 결합하는 다중특이적 항체는 액티빈 A에 결합하지 않거나 실질적으로 결합하지 않는다 (예를 들어, 액티빈 A에 1 x 10-7 M 초과의 KD로 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 예를 들어, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 항체의 조합물 및 그의 용도에 관한 것이며, 여기서 항체의 조합물은 BMP6 항체, 및 예를 들어 1종 이상의 ActRII 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), ActRII 수용체 (ActRIIA 및/또는 ActRIIB) 및/또는 유형 I 수용체 (예를 들어, ALK4)에 결합하는 1종 이상의 추가의 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, BMP6 항체를 포함하는 항체의 조합물은 BMP9 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, BMP6 항체를 포함하는 항체의 조합물은 액티빈 A 항체를 포함하지 않는다.
특정 측면에서, ActRII-ALK4 길항제 항체 또는 항체의 조합물은 적어도 BMP10을 억제하는 항체이다. 따라서, 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제 항체 또는 항체의 조합물은 적어도 BMP10에 결합한다. 본원에 사용된 BMP10 항체 (또는 항-BMP10 항체)는 일반적으로 항체가 BMP10의 표적화에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 BMP10에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 비관련, 비-BMP10 단백질에 대한 BMP10 항체의 결합의 정도는, 예를 들어 방사성면역검정 (RIA), 비아코어, 또는 다른 단백질 상호작용 또는 결합 친화도 검정에 의해 측정된 바와 같이, BMP10에 대한 항체의 결합의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 실시양태에서, BMP10 항체는 상이한 종으로부터의 BMP10 사이에 보존된 BMP10의 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-BMP10 항체는 인간 BMP10에 결합한다. 일부 실시양태에서, BMP10 항체는 BMP10이 유형 I 및/또는 유형 II 수용체 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, 및/또는 ALK4)에 결합하는 것을 억제할 수 있고, 따라서 BMP10-매개 신호전달 (예를 들어, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, BMP10 항체는 BMP10이 보조-수용체에 결합하는 것을 억제할 수 있고, 따라서 BMP10-매개 신호전달 (예를 들어, Smad 신호전달)을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 BMP10에 결합하고, 예를 들어 1종 이상의 추가의 ActRII 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), ActRII 수용체 (ActRIIA 및/또는 ActRIIB), 및/또는 유형 I 수용체 (예를 들어, ALK4)에 추가로 결합하는 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 그의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, BMP10에 결합하는 다중특이적 항체는 BMP9에 결합하지 않거나 실질적으로 결합하지 않는다 (예를 들어, BMP9에 1 x 10-7 M 초과의 KD로 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 예를 들어, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 실시양태에서, BMP10에 결합하는 다중특이적 항체는 액티빈 A에 결합하지 않거나 실질적으로 결합하지 않는다 (예를 들어, 액티빈 A에 1 x 10-7 M 초과의 KD로 결합하거나, 또는 상대적으로 보통의 결합, 예를 들어, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 항체의 조합물 및 그의 용도에 관한 것이며, 여기서 항체의 조합물은 BMP10 항체, 및 예를 들어 1종 이상의 추가의 ActRII 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), ActRII 수용체 (ActRIIA 및/또는 ActRIIB) 및/또는 유형 I 수용체 (예를 들어, ALK4)에 결합하는 1종 이상의 추가의 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, BMP10 항체를 포함하는 항체의 조합물은 BMP9 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, BMP10 항체를 포함하는 항체의 조합물은 액티빈 A 항체를 포함하지 않는다.
특정 측면에서, ActRII-ALK4 길항제 항체 또는 항체의 조합물은 적어도 ActRIIB를 억제하는 항체이다. 따라서, 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제 항체 또는 항체의 조합물은 적어도 ActRIIB에 결합한다. 본원에 사용된 ActRIIB 항체 (항-ActRIIB 항체)는 일반적으로 항체가 ActRIIB의 표적화에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 ActRIIB에 결합하는 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 비관련, 비-ActRIIB 단백질에 대한 항-ActRIIB 항체의 결합의 정도는, 예를 들어 방사성면역검정 (RIA), 비아코어, 또는 다른 단백질-단백질 상호작용 또는 결합 친화도 검정에 의해 측정된 바와 같이, ActRIIB에 대한 항체의 결합의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 실시양태에서, 항-ActRIIB 항체는 상이한 종으로부터의 ActRIIB 사이에 보존된 ActRIIB의 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-ActRIIB 항체는 인간 ActRIIB에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-ActRIIB 항체는 1종 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)가 ActRIIB에 결합하는 것을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-ActRIIB 항체는 ActRIIB 및 1종 이상의 ActRII 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), ActRII 수용체 (예를 들어, ActRIIA) 및/또는 유형 I 수용체 (예를 들어, ALK4)에 결합하는 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체)이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 항체의 조합물 및 그의 용도에 관한 것이며, 여기서 항체의 조합물은 항-ActRIIB 항체, 및 예를 들어 1종 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), 유형 I 수용체 (예를 들어, ALK4) 및/또는 추가의 유형 II 수용체 (예를 들어, ActRIIA)에 결합하는 1종 이상의 추가의 항체를 포함한다. ActRIIB는 ActRIIA와 서열 유사성을 갖고, 따라서 ActRIIB에 결합하는 항체는, 일부 경우에, 또한 ActRIIA에 결합할 수 있고/거나 이를 억제할 수 있다는 것을 주목하여야 한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-ActRII 항체는 비마그루맙 (BYM338)을 포함한다.
특정 측면에서, ActRII-ALK4 길항제 항체 또는 항체의 조합물은 적어도 ActRIIA를 억제하는 항체이다. 따라서, 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제 항체 또는 항체의 조합물은 적어도 ActRIIA에 결합한다. 본원에 사용된 ActRIIA 항체 (항-ActRIIA 항체)는 일반적으로 항체가 ActRIIA의 표적화에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 ActRIIA에 결합하는 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 비관련, 비-ActRIIA 단백질에 대한 항-ActRIIA 항체의 결합의 정도는, 예를 들어 방사성면역검정 (RIA), 비아코어, 또는 다른 단백질-단백질 상호작용 또는 결합 친화도 검정에 의해 측정된 바와 같이, ActRIIA에 대한 항체의 결합의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 실시양태에서, 항-ActRIIA 항체는 상이한 종으로부터의 ActRIIA 사이에 보존된 ActRIIA의 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-ActRIIA 항체는 인간 ActRIIA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-ActRIIA 항체는 1종 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)가 ActRIIA에 결합하는 것을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-ActRIIA 항체는 ActRIIA 및 1종 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), 유형 I 수용체 (예를 들어, ALK4), 및/또는 추가의 유형 II 수용체 (예를 들어, ActRIIB)에 결합하는 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체)이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 항체의 조합물 및 그의 용도에 관한 것이며, 여기서 항체의 조합물은 항-ActRIIA 항체, 및 예를 들어 1종 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), 유형 I 수용체 (예를 들어, ALK4) 및/또는 추가의 유형 II 수용체 (예를 들어, ActRIIB)에 결합하는 1종 이상의 추가의 항체를 포함한다. ActRIIA는 ActRIIB와 서열 유사성을 갖고, 따라서 ActRIIA에 결합하는 항체는, 일부 경우에, 또한 ActRIIB에 결합할 수 있고/거나 이를 억제할 수 있다는 것을 주목하여야 한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-ActRII 항체는 비마그루맙 (BYM338)을 포함한다.
특정 측면에서, ActRII-ALK4 길항제 항체 또는 항체의 조합물은 적어도 ALK4를 억제하는 항체이다. 따라서, 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제 항체 또는 항체의 조합물은 적어도 ALK4에 결합한다. 본원에 사용된 ALK4 항체 (항-ALK4 항체)는 일반적으로 항체가 ALK4의 표적화에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 ALK4에 결합하는 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 비관련, 비-ALK4 단백질에 대한 항-ALK4 항체의 결합의 정도는, 예를 들어 방사성면역검정 (RIA), 비아코어, 또는 다른 단백질-단백질 상호작용 또는 결합 친화도 검정에 의해 측정된 바와 같이, ALK4에 대한 항체의 결합의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 실시양태에서, 항-ALK4 항체는 상이한 종으로부터의 ALK4 사이에 보존된 ALK4의 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-ALK4 항체는 인간 ALK4에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-ALK4 항체는 1종 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)가 ALK4에 결합하는 것을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-ALK4 항체는 ALK4 및 1종 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), 및/또는 유형 II 수용체 (예를 들어, ActRIIA 및/또는 ActRIIB)에 결합하는 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체)이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 항체의 조합물 및 그의 용도에 관한 것이며, 여기서 항체의 조합물은 항-ALK4 항체, 및 예를 들어 1종 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), 및/또는 유형 II 수용체 (예를 들어, ActRIIA 및/또는 ActRIIB)에 결합하는 1종 이상의 추가의 항체를 포함한다.
특정 측면에서, 본원에 개시된 방법 및 용도에 따라 (예를 들어, 노화와 연관된 심부전 또는 노화와 연관된 심부전의 1종 이상의 합병증을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 데) 사용될 ActRII-ALK4 길항제는 항체 (ActRII-ALK4 길항제 항체) 또는 항체의 조합물이다. ActRII-ALK4 길항제 항체 또는 항체의 조합물은, 예를 들어 1종 이상의 ActRII 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), ActRII 수용체 (ActRIIA 및/또는 ActRIIB), 및/또는 유형 I 수용체 (예를 들어, ALK4)에 결합할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, ActRII-ALK4 길항제 항체는 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 데, 특히 1종 이상의 심부전-연관 합병증을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 데 단독으로 또는 1종 이상의 지지 요법 또는 활성제와 조합되어 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제 항체는 REGN-2477, 가레토스맙, REGN-1033, 트레보구맙, MYO-029, 스타물루맙, PF-06252616, 도마그로주맙, LY-2495655, 란도그로주맙, SRK-015, 비마그루맙 및 BYM338로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 길항제 항체는 가레토스맙, 트레보구맙, 스타물루맙, 도마그로주맙, 란도그로주맙 및 비마그루맙으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
용어 항체는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다. 항체 단편은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 부분을 포함하는 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다 [예를 들어, 문헌 [Hudson et al., (2003) Nat. Med. 9:129-134; Plueckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]; WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894; 5,587,458; 및 5,869,046 참조]. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다 [예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., (2003) Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448] 참조]. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌 [Hudson et al., (2003) Nat. Med. 9:129-134]에 기재되어 있다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 [예를 들어, 미국 특허 번호 6,248,516 참조]. 본원에 개시된 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 그에 부착되어 검출될 수 있는 표지를 포함한다 (예를 들어, 표지는 방사성동위원소, 형광 화합물, 효소, 또는 효소 보조인자일 수 있음). 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 단리된 항체이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 재조합 항체이다.
본원의 항체는 임의의 부류의 것일 수 있다. 항체의 부류는 그의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 5가지 주요 부류의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 불린다.
일반적으로, 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 항체는 바람직하게는 높은 결합 친화도로 그의 표적 항원에 특이적으로 결합한다. 친화도는 KD 값으로 표현될 수 있고, 고유 결합 친화도 (예를 들어, 최소화된 결합력 효과를 가짐)를 반영한다. 전형적으로, 결합 친화도는 세포-무함유 세팅에서든 또는 세포-연관 세팅에서든 시험관내에서 측정된다. 본원에 개시된 것을 포함한, 예를 들어 비아코어, 방사성표지된 항원-결합 검정 (RIA), 및 ELISA를 포함한 관련 기술분야에 공지된 수많은 검정 중 임의의 것을 사용하여 결합 친화도 측정치를 수득할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 그의 표적 항원 (예를 들어, ActRIIA, ActRIIB, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10)에 적어도 1x10-7 또는 더 강한, 1x10-8 또는 더 강한, 1x10-9 또는 더 강한, 1x10-10 또는 더 강한, 1x10-11 또는 더 강한, 1x10-12 또는 더 강한, 1x10-13 또는 더 강한, 또는 1x10-14 또는 더 강한 KD로 결합한다.
특정 실시양태에서, KD는 하기 검정에 기재된 바와 같이 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 표적 항원을 사용하여 수행된 RIA에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 비표지된 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 최소 농도의 방사성표지된 항원 (예를 들어, 125I-표지된 것)으로 Fab를 평형화시킨 다음, 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 측정된다 [예를 들어, 문헌 [Chen et al., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881] 참조]. 검정을 위한 조건을 확립하기 위해, 다중-웰 플레이트 (예를 들어, 써모 사이언티픽(Thermo Scientific)으로부터의 마이크로타이터(MICROTITER)®)를 포획 항-Fab 항체 (예를 들어, 카펠 랩스(Cappel Labs)로부터의 것)로 (예를 들어, 밤새) 코팅하고, 후속적으로 바람직하게는 실온 (대략 23℃)에서 소 혈청 알부민으로 차단한다. 비-흡착 플레이트에서, 방사성표지된 항원을 관심 Fab의 연속 희석물과 혼합한다 [예를 들어, 문헌 [Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에서 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함]. 이어서, 관심 Fab를 바람직하게는 밤새 인큐베이션하지만, 평형에 도달하는 것을 보장하기 위해 보다 긴 기간 (예를 들어, 약 65시간) 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 그 후, 혼합물을 바람직하게는 실온에서 약 1시간 동안 인큐베이션을 위해 포획 플레이트로 옮긴다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 바람직하게는 폴리소르베이트 20 및 PBS 혼합물로 수회 세척한다. 플레이트가 건조되면, 섬광제 (예를 들어, 팩커드(Packard)로부터의 마이크로신트(MICROSCINT)®)를 첨가하고, 플레이트를 감마 계수기 (예를 들어, 팩커드로부터의 탑카운트(TOPCOUNT)®) 상에서 계수한다.
또 다른 실시양태에 따르면, KD는, 예를 들어 비아코어® 2000 또는 비아코어® 3000 (비아코어, 인크.(BIAcore, Inc.), 뉴저지주 피스카타웨이)을 약 10 반응 단위 (RU)로 고정된 항원 CM5 칩과 함께 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정한다. 간략하게, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 예를 들어, 항원을 10 mM 아세트산나트륨, pH 4.8로 5 μg/ml (약 0.2 μM)로 희석한 후, 커플링된 단백질의 대략 10 반응 단위 (RU)를 달성하도록 5 μl/분의 유량으로 주입할 수 있다. 항원의 주입 후에, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응 기를 차단한다. 동역학 측정을 위해, Fab의 2-배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 대략 25 μl/분의 유량으로 0.05% 폴리소르베이트 20 (트윈-20®) 계면활성제를 함유하는 PBS (PBST) 중에 주입한다. 회합률 (kon) 및 해리율 (koff)은, 예를 들어 단순 일-대-일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (비아코어® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 회합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 계산한다. 평형 해리 상수 (KD)는 비 koff/kon으로서 계산한다 [예를 들어, 문헌 [Chen et al., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881] 참조]. 온-레이트가 예를 들어 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 106 M-1 s-1을 초과하는 경우에, 온-레이트는 분광계, 예컨대 정지-유동 설비 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳이 장착된 8000-시리즈 SLM-AMINCO® 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정되는 바와 같이, 증가하는 농도의 항원의 존재 하에 PBS 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 형광 방출 강도 (예를 들어, 여기=295 nm; 방출=340 nm, 16 nm 대역-통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같은 무손상 항체의 단백질분해적 소화뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이 또는 파지)에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 인간 ActRIIA, ActRIIB, ALK4, 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C 및 액티빈 E), GDF11, GDF8, BMP10 및 BMP6의 핵산 및 아미노산 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 또한, 항체를 생성하는 수많은 방법이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 이들 중 일부는 본원에 기재되어 있다. 따라서, 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 항체 길항제는 관련 기술분야의 지식 및 본원에 제공된 교시에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 상용적으로 제조될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 키메라 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 한 부분은 특정한 공급원 또는 종으로부터 유래되고, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다. 특정 키메라 항체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855]에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 모 항체의 것으로부터 변화된 "부류 전환된" 항체이다. 일반적으로, 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 키메라 항체는 인간화 항체이다. 인간화 항체는 비-인간 초가변 영역 (HVR)으로부터의 아미노산 잔기 및 인간 프레임워크 영역 (FR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)은 비-인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 한 부분을 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 거친 항체를 지칭한다. 인간화 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어 문헌 [Almagro and Fransson (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633]에서 검토되고, 예를 들어 문헌 [Riechmann et al., (1988) Nature 332:323-329; Queen et al., (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033]; 미국 특허 번호 5,821,337; 7,527,791; 6,982,321; 및 7,087,409; 문헌 [Kashmiri et al., (2005) Methods 36:25-34 [SDR (a-CDR) 그라프팅 기재]; Padlan, Mol. Immunol. (1991) 28:489-498 ("재표면화" 기재); Dall'Acqua et al., (2005) Methods 36:43-60 ("FR 셔플링" 기재); Osbourn et al., (2005) Methods 36:61-68; 및 Klimka et al., Br. J. Cancer (2000) 83:252-260 (FR 셔플링에 대한 "안내된 선택" 접근법 기재)]에 추가로 기재되어 있다. 인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 "최적-피트" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 [예를 들어, 문헌 [Sims et al., (1993) J. Immunol. 151:2296] 참조]; 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 [예를 들어, 문헌 [Carter et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; 및 Presta et al., (1993) J. Immunol., 151:2623] 참조); 인간 성숙 (체세포적으로 성숙된) 프레임워크 영역 또는 인간 배선 프레임워크 영역 [예를 들어, 문헌 [Almagro and Fransson (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633] 참조); 및 FR 라이브러리의 스크리닝으로부터 유래된 프레임워크 영역 [예를 들어, 문헌 [Baca et al., (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; 및 Rosok et al., (1996) J. Biol. Chem. 271:22611-22618] 참조]을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk and van de Winkel (2008) Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459]에 기재되어 있다. 예를 들어, 인간 항체는 항원 챌린지에 반응하여 무손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), ActRII 수용체 (ActRIIA 및/또는 ActRIIB), 및/또는 유형 I 수용체 (예를 들어, ALK4))을 투여하는 것에 의해 제조될 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 이뮤노글로불린 유전자좌를 대체하거나 또는 염색체외에 존재하거나 또는 동물의 염색체 내로 무작위로 통합된 인간 이뮤노글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 트랜스제닉 동물에서, 내인성 이뮤노글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되었다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Lonberg (2005) Nat. Biotech. 23:1117-1125]; 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 (제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술 기재); 미국 특허 번호 5,770,429 (HuMab® 기술 기재); 미국 특허 번호 7,041,870 (K-M 마우스® 기술 기재); 및 미국 특허 출원 공개 번호 2007/0061900 (벨로시마우스(VelociMouse)® 기술 기재)을 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 무손상 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과 조합하는 것에 의해 추가로 변형될 수 있다.
본원에 제공된 인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다 [예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., (1984) 133: 3001; Brodeur et al., (1987) Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York; 및 Boerner et al., (1991) J. Immunol., 147: 86] 참조]. 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체는 또한 문헌 [Li et al., (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562]에 기재되어 있다. 추가의 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터 모노클로날 인간 IgM 항체의 생산을 기재함) 및 문헌 [Ni, Xiandai Mianyixue (2006) 26(4):265-268 (2006)] (인간-인간 하이브리도마를 기재함)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마 기술)이 또한 문헌 [Vollmers and Brandlein (2005) Histol. Histopathol., 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein (2005) Methods Find Exp. Clin. Pharmacol., 27(3):185-91]에 기재되어 있다. 본원에 제공된 인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변-도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 이어서, 이러한 가변-도메인 서열은 목적하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본원에 기재되어 있다.
예를 들어, 본 개시내용의 항체는 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 이러한 라이브러리를 목적하는 결합 특징을 보유하는 항체에 대해 스크리닝하기 위한 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al., (2001) in Methods in Molecular Biology 178:1-37, O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J.]에서 검토되고, 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., (1991) Nature 348:552-554; Clackson et al., (1991) Nature 352: 624-628; Marks et al., (1992) J. Mol. Biol. 222:581-597; Marks and Bradbury (2003) in Methods in Molecular Biology 248:161-175, Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J.; Sidhu et al., (2004) J. Mol. Biol. 338(2):299-310; Lee et al., (2004) J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093; Fellouse (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472; 및 Lee et al., (2004) J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132]에 추가로 기재되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 개별적으로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 클로닝되고, 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되며, 이는 이어서 문헌 [Winter et al., (1994) Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일-쇄 Fv (scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원 (예를 들어, ActRII 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), ActRII 수용체 (ActRIIA 및/또는 ActRIIB), 및/또는 유형 I 수용체 (예를 들어, ALK4))에 대한 고친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브 레퍼토리는 문헌 [Griffiths et al., (1993) EMBO J, 12: 725-734]에 기재된 바와 같이 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기-항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공하도록 (예를 들어, 인간으로부터) 클로닝될 수 있다. 마지막으로, 문헌 [Hoogenboom and Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381-388]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열을 달성하기 위해 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 나이브 라이브러리를 또한 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하는 특허 공개는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과)의 항원 상의 적어도 2개의 상이한 에피토프 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 또는 그 초과)에 대한 결합 특이성을 갖는 다중특이적 항체 (전형적으로 모노클로날 항체).
다중특이적 항체를 제조하는 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 재조합 공동-발현을 포함하나 이에 제한되지는 않는다 [예를 들어, 문헌 [Milstein and Cuello (1983) Nature 305: 537]; 국제 특허 공개 번호 WO 93/08829; 및 문헌 [Traunecker et al., (1991) EMBO J. 10: 3655], 및 미국 특허 번호 5,731,168 ("노브-인-홀" 조작) 참조]. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과의 조작 (예를 들어, WO 2009/089004A1 참조); 2개 이상의 항체 또는 단편의 가교 [예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980; 및 문헌 [Brennan et al., (1985) Science, 229: 81] 참조]; 이중특이적 항체를 생산하기 위한 류신 지퍼의 사용 [예를 들어, 문헌 [Kostelny et al., (1992) J. Immunol., 148(5):1547-1553] 참조]; 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 "디아바디" 기술의 사용 [예를 들어, 문헌 [Hollinger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448] 참조]; 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체의 사용 [예를 들어, 문헌 [Gruber et al., (1994) J. Immunol., 152:5368] 참조]; 및 삼중특이적 항체의 제조 (예를 들어, 문헌 [Tutt et al., (1991) J. Immunol. 147: 60] 참조)에 의해 만들어질 수 있다. 다중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다. "옥토퍼스 항체"를 포함한, 3개 이상의 기능적 항원-결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 [예를 들어, US 2006/0025576A1 참조].
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 항체는 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉 집단을 구성하는 개별 항체는, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 함유하거나 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 발생하는, 일반적으로 소량으로 존재하는 가능한 변이체 항체를 제외하고는 동일하고/거나 같은 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 에피토프에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 에피토프에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 것으로서의 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 방법에 따라 사용될 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 이뮤노글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 이러한 방법 및 모노클로날 항체를 제조하기 위한 다른 예시적인 방법은 본원에 기재되어 있다.
예를 들어, 액티빈으로부터 유래된 면역원을 사용함으로써, 항-단백질/항-펩티드 항혈청 또는 모노클로날 항체가 표준 프로토콜에 의해 제조될 수 있다 [예를 들어, 문헌 [Antibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane (1988) Cold Spring Harbor Press: 1988] 참조]. 포유동물, 예컨대 마우스, 햄스터, 또는 토끼는 면역원성 형태의 액티빈 폴리펩티드, 항체 반응을 유도할 수 있는 항원성 단편, 또는 융합 단백질로 면역화될 수 있다. 단백질 또는 펩티드에 면역원성을 부여하는 기술은 담체에의 접합 또는 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 기술을 포함한다. 액티빈 폴리펩티드의 면역원성 부분은 아주반트의 존재 하에 투여될 수 있다. 면역화의 진행은 혈장 또는 혈청에서 항체 역가의 검출에 의해 모니터링될 수 있다. 항체 생산의 수준 및/또는 결합 친화도의 수준을 평가하기 위해 항원으로서 면역원과 함께 표준 ELISA 또는 다른 면역검정이 사용될 수 있다.
액티빈의 항원성 제제로 동물을 면역화시킨 후, 항혈청을 수득할 수 있고, 원하는 경우, 혈청으로부터 폴리클로날 항체를 단리할 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하기 위해, 항체-생산 세포 (림프구)를 면역화된 동물로부터 수거하고, 표준 체세포 융합 절차에 의해 불멸화 세포, 예컨대 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 생성할 수 있다. 이러한 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 하이브리도마 기술 [예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein (1975) Nature, 256: 495-497] 참조], 인간 B 세포 하이브리도마 기술 [예를 들어, 문헌 [Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4:72] 참조], 및 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위한 EBV-하이브리도마 기술 [Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96]을 포함한다. 하이브리도마 세포는 액티빈 폴리펩티드와 특이적으로 반응성인 항체의 생산에 대해 면역화학적으로 스크리닝될 수 있고, 모노클로날 항체는 이러한 하이브리도마 세포를 포함하는 배양물로부터 단리될 수 있다.
특정 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입되어 Fc 영역 변이체가 생성될 수 있다. Fc 영역 변이체는 1개 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환, 결실, 및/또는 부가)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 개시내용은 모든 이펙터 기능은 아니지만 일부 이펙터 기능을 보유하는 항체 변이체를 고려하며, 이는 생체내 항체의 반감기가 중요하지만 특정 이펙터 기능 [예를 들어, 보체-의존성 세포독성 (CDC) 및 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)]이 불필요하거나 해로운 적용에 대한 바람직한 후보가 되게 한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행하여 항체가 FcγR 결합이 결여되어 있지만 (따라서 ADCC 활성이 결여될 가능성이 있음), FcRn 결합 능력은 보유한다는 것을 확실하게 할 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은, 예를 들어 문헌 [Ravetch and Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9:457-492]에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예는 미국 특허 번호 5,500,362; 문헌 [Hellstrom, I. et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7059-7063; Hellstrom, I et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1499-1502]; 미국 특허 번호 5,821,337; 문헌 [Bruggemann, M. et al., (1987) J. Exp. Med. 166:1351-1361]에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법이 사용될 수 있다 (예를 들어, ACTI™, 유동 세포측정법을 위한 비-방사성 세포독성 검정; 셀테크놀로지, 인크.(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰; 및 시토톡스 96(CytoTox 96)® 비-방사성 세포독성 검정, 프로메가, 위스콘신주 매디슨). 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656]에 개시된 바와 같이 동물 모델에서 평가될 수 있다. 또한, C1q 결합 검정을 수행하여 항체가 C1q에 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 결여되어 있음을 확인할 수 있다 [예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참조]. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정을 수행할 수 있다 [예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., (1996) J. Immunol. Methods 202:163; Cragg, M. S. et al., (2003) Blood 101:1045-1052; 및 Cragg, M. S, and M. J. Glennie (2004) Blood 103:2738-2743] 참조]. FcRn 결합 및 생체내 클리어런스/반감기 결정은 또한 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다 [예를 들어, 문헌 [Petkova, S. B. et al., (2006) Intl. Immunol. 18(12):1759-1769] 참조]. 감소된 이펙터 기능을 갖는 본 개시내용의 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 1개 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체, 예컨대 잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).
특정 실시양태에서, 항체의 1개 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 발생한다. 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 그러한 잔기를 시스테인으로 치환하는 것에 의해 반응성 티올 기가 항체의 접근가능한 부위에 위치하게 되고, 이는 항체를 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜 면역접합체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하기 잔기 중 어느 하나 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카바트 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는 예를 들어 미국 특허 번호 7,521,541에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
또한, 바람직한 항체를 확인하기 위해 항체를 스크리닝하는 데 사용되는 기술은 수득된 항체의 특성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 항체가 용액 중에서 항원에 결합하기 위해 사용되는 경우, 용액 결합을 시험하는 것이 바람직할 수 있다. 특히 바람직한 항체를 확인하기 위해 항체와 항원 사이의 상호작용을 시험하는 데 다양한 상이한 기술이 이용가능하다. 이러한 기술은 ELISA, 표면 플라즈몬 공명 결합 검정 (예를 들어, 비아코어 결합 검정, 비아코어 아베(Biacore AB), 스웨덴 웁살라), 샌드위치 검정 (예를 들어, 매릴랜드주 게이더스버그 소재의 이겐 인터내셔널, 인크.(IGEN International, Inc.)의 상자성 비드 시스템), 웨스턴 블롯, 면역침전 검정, 및 면역조직화학을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 항체 및/또는 결합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변형을 도입하는 것에 의해 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물이 목적하는 특징, 예를 들어, 표적-결합 (예를 들어, 및 액티빈 예컨대 액티빈 E 및/또는 액티빈 C 결합)을 보유하는 것을 조건으로, 최종 구축물에 도달하도록 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다.
변경 (예를 들어, 치환)은 예를 들어 항체 친화도를 개선시키기 위해 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟", 즉 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 거치는 코돈에 의해 코딩된 잔기 [예를 들어, 문헌 [Chowdhury (2008) Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] 참조], 및/또는 SDR (a-CDR)에서 이루어질 수 있으며, 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 친화도 성숙은 관련 기술분야에 기재되어 있다 [예를 들어, 문헌 [Hoogenboom et al., in Methods in Molecular Biology 178:1-37, O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., (2001)] 참조]. 친화도 성숙의 일부 실시양태에서, 다양성은 성숙을 위해 선택된 가변 유전자 내로 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류-유발 PCR, 쇄 셔플링 또는 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발)에 의해 도입된다. 이어서, 2차 라이브러리가 생성된다. 이어서, 라이브러리를 스크리닝하여 목적하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인한다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 HVR-지정 접근법을 수반하며, 여기서 여러 HVR 잔기 (예를 들어, 한 번에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 수반되는 HVR 잔기는, 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 구체적으로 확인될 수 있다. 특히 CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 1개 이상의 HVR 내에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR의 외부일 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 비변경되거나, 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 이러한 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 군 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 Arg, Asp, His, Lys 및 Glu)을 확인하고, 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체하여 항체-항원의 상호작용에 영향을 미치는지 결정한다. 추가의 치환은 초기 치환에 대한 기능적 감수성을 입증하는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 결정하여 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인한다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 목적하는 특성을 함유하는지 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드의 길이 범위의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단의 융합을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 및/또는 결합 폴리펩티드는 관련 기술분야에 공지되어 있고 용이하게 입수가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서의 그의 안정성으로 인해 제조에서 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드에 부착되는 중합체의 수는 다양할 수 있고, 1개 초과의 중합체가 부착되는 경우에, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체 및/또는 결합 폴리펩티드 유도체가 규정된 조건 하에 요법에 사용될 것인지의 여부를 포함하나 이에 제한되지는 않는 고려사항에 기초하여 결정될 수 있다.
4. 소분자 길항제
특정 측면에서, 본원에 개시된 방법 및 용도에 따라 (예를 들어, 노화와 연관된 심부전 또는 노화와 연관된 심부전의 1종 이상의 합병증을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 데) 사용될 ActRII-ALK4 길항제는 소분자 (ActRII-ALK4 소분자 길항제) 또는 소분자 길항제의 조합물이다. ActRII-ALK4 소분자 길항제 또는 소분자 길항제의 조합물은, 예를 들어 1종 이상의 ActRII 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), ActRII 수용체 (ActRIIA 및/또는 ActRIIB), 유형 I 수용체 (예를 들어, ALK4), 유형 II 수용체 (예를 들어, ActRIIB 및/또는 ActRIIA), 및/또는 1종 이상의 신호전달 인자를 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 소분자 길항제 또는 소분자 길항제의 조합물은, 예를 들어 세포-기반 검정, 예컨대 본원에 기재된 검정에서 결정된 바와 같이, 1종 이상의 ActRII-ALK4 리간드에 의해 매개되는 신호전달을 억제한다. 본원에 기재된 바와 같이, ActRII-ALK4 소분자 길항제는 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 데, 특히 1종 이상의 심부전-연관 합병증을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 데 단독으로 또는 1종 이상의 지지 요법 또는 활성제와 조합되어 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 소분자 길항제 또는 소분자 길항제의 조합물은 적어도 GDF11을 억제하고, 임의로 GDF8, 액티빈 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, 및 1종 이상의 Smad 신호전달 인자 중 1종 이상을 추가로 억제한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 소분자 길항제 또는 소분자 길항제의 조합물은 적어도 GDF8을 억제하고, 임의로 GDF11, 액티빈 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, 및 1종 이상의 Smad 신호전달 인자 중 1종 이상을 추가로 억제한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 소분자 길항제 또는 소분자 길항제의 조합물은 적어도 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE)을 억제하고, 임의로 GDF8, GDF11, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, 및 1종 이상의 Smad 신호전달 인자 중 1종 이상을 추가로 억제한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 소분자 길항제 또는 소분자 길항제의 조합물은 적어도 액티빈 B를 억제하고, 임의로 GDF8, GDF11, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, 및 1종 이상의 Smad 신호전달 인자 중 1종 이상을 추가로 억제한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 소분자 길항제 또는 소분자 길항제의 조합물은 적어도 BMP6을 억제하고, 임의로 GDF8, 액티빈 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), GDF11, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, 및 1종 이상의 Smad 단백질 (예를 들어, Smad 2 및 3) 중 1종 이상을 추가로 억제한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 소분자 길항제 또는 소분자 길항제의 조합물은 적어도 BMP10을 억제하고, 임의로 GDF8, 액티빈 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), BMP6, GDF11, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, 및 1종 이상의 Smad 신호전달 인자 중 1종 이상을 추가로 억제한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 소분자 길항제 또는 소분자 길항제의 조합물은 적어도 ActRIIA를 억제하고, 임의로 GDF8, 액티빈 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), BMP6, GDF11, BMP10, ActRIIB, ALK4, 및 1종 이상의 Smad 신호전달 인자 중 1종 이상을 추가로 억제한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 소분자 길항제 또는 소분자 길항제의 조합물은 적어도 ActRIIB를 억제하고, 임의로 GDF8, 액티빈 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), BMP6, GDF11, BMP10, ActRIIA, ALK4, 및 1종 이상의 Smad 신호전달 인자 중 1종 이상을 추가로 억제한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 소분자 길항제 또는 소분자 길항제의 조합물은 적어도 ALK4를 억제하고, 임의로 GDF8, 액티빈 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), BMP6, GDF11, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, 및 1종 이상의 Smad 신호전달 인자 중 1종 이상을 추가로 억제한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 ActRII-ALK4 소분자 길항제 또는 소분자 길항제의 조합물은 BMP9를 억제하지 않거나 또는 실질적으로 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 ActRII-ALK4 소분자 길항제 또는 소분자 길항제의 조합물은 액티빈 A를 억제하지 않거나 또는 실질적으로 억제하지 않는다.
ActRII-ALK4 소분자 길항제는 직접 또는 간접 억제제일 수 있다. 예를 들어, 간접 소분자 길항제 또는 소분자 길항제의 조합물은 적어도 1종 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), 유형 I 수용체 (예를 들어, ALK4), 유형 II 수용체 (예를 들어, ActRIIA 및/또는 ActRIIB), 및/또는 1종 이상의 하류 신호전달 성분 (예를 들어, Smad)의 발현 (예를 들어, 전사, 번역, 세포 분비, 또는 그의 조합)을 억제할 수 있다. 대안적으로, 직접 소분자 길항제 또는 소분자 길항제의 조합물은, 예를 들어 1종 이상의 1종 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), 유형 I 수용체 (예를 들어, ALK4), 유형 II 수용체 (예를 들어, ActRIIA 및/또는 ActRIIB), 및/또는 1종 이상의 하류 신호전달 성분 (예를 들어, Smad)에 직접 결합하여 그를 억제할 수 있다. 1종 이상의 간접 및 1종 이상의 직접 ActRII-ALK4 소분자 길항제의 조합물이 본원에 개시된 방법에 따라 사용될 수 있다.
본 개시내용의 결합 소분자 길항제는 공지된 방법론을 사용하여 확인되고 화학적으로 합성될 수 있다 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO 00/00823 및 WO 00/39585 참조). 일반적으로, 본 개시내용의 소분자 길항제는 통상적으로 크기가 약 2000 달톤 미만, 대안적으로 크기가 약 1500, 750, 500, 250 또는 200 달톤 미만이며, 여기서 이러한 유기 소분자는 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드에 결합, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있다. 이들 소분자 길항제는 널리 공지된 기술을 사용하여 과도한 실험 없이 확인될 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 결합할 수 있는 분자에 대해 유기 소분자 라이브러리를 스크리닝하는 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다는 것에 주목한다 (예를 들어, 국제 특허 공개 번호 WO00/00823 및 WO00/39585 참조).
본 개시내용의 결합 유기 소분자는, 예를 들어 알데히드, 케톤, 옥심, 히드라존, 세미카르바존, 카르바지드, 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민, N-치환된 히드라진, 히드라지드, 알콜, 에테르, 티올, 티오에테르, 디술피드, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 우레아, 카르바메이트, 카르보네이트, 케탈, 티오케탈, 아세탈, 티오아세탈, 아릴 할라이드, 아릴 술포네이트, 알킬 할라이드, 알킬 술포네이트, 방향족 화합물, 헤테로시클릭 화합물, 아닐린, 알켄, 알킨, 디올, 아미노 알콜, 옥사졸리딘, 옥사졸린, 티아졸리딘, 티아졸린, 엔아민, 술폰아미드, 에폭시드, 아지리딘, 이소시아네이트, 술포닐 클로라이드, 디아조 화합물, 및 산 클로라이드일 수 있다.
5. 폴리뉴클레오티드 길항제
특정 측면에서, 본원에 개시된 방법 및 용도에 따라 (예를 들어, 노화와 연관된 심부전 또는 노화와 연관된 심부전의 1종 이상의 합병증을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 데) 사용될 ActRII-ALK4 길항제는 폴리뉴클레오티드 (ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제) 또는 폴리뉴클레오티드의 조합물이다. ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합물은, 예를 들어 1종 이상의 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP6, BMP10), 유형 I 수용체 (예를 들어, ALK4), 유형 II 수용체 (예를 들어, ActRIIA 및/또는 ActRIIB), 및/또는 하류 신호전달 성분 (예를 들어, Smad)을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합물은, 예를 들어 세포-기반 검정, 예컨대 본원에 기재된 검정에서 결정된 바와 같이, 1종 이상의 ActRII-ALK4 리간드에 의해 매개되는 신호전달을 억제한다. 본원에 기재된 바와 같이, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제는 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 데, 특히 1종 이상의 심부전-연관 합병증을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 데 단독으로 또는 1종 이상의 지지 요법 또는 활성제와 조합되어 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합물은 적어도 GDF11을 억제하고, 임의로 GDF8, 액티빈 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), BMP6, BMP10, ActRIIA ActRIIB, ALK4, 및 1종 이상의 Smad 신호전달 인자 중 1종 이상을 추가로 억제한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합물은 적어도 GDF8을 억제하고, 임의로 GDF11, 액티빈 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, 및 1종 이상의 Smad 신호전달 인자 중 1종 이상을 추가로 억제한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합물은 적어도 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE)을 억제하고, 임의로 GDF8, GDF11, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4 및 1종 이상의 Smad 신호전달 인자 중 1종 이상을 추가로 억제한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합물은 적어도 액티빈 B를 억제하고, 임의로 GDF8, GDF11, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4 및 1종 이상의 Smad 신호전달 인자 중 1종 이상을 추가로 억제한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합물은 적어도 BMP6을 억제하고, 임의로 GDF8, 액티빈 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), GDF11, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, 및 1종 이상의 Smad 단백질 신호전달 인자 중 1종 이상을 추가로 억제한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합물은 적어도 BMP10을 억제하고, 임의로 GDF8, 액티빈 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), BMP6, GDF11, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, 및 1종 이상의 Smad 신호전달 인자 중 1종 이상을 추가로 억제한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합물은 적어도 ActRIIA를 억제하고, 임의로 GDF8, 액티빈 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), BMP6, GDF11, BMP10, ActRIIB, ALK4, 및 1종 이상의 Smad 신호전달 인자 중 1종 이상을 추가로 억제한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합물은 적어도 ActRIIB를 억제하고, 임의로 GDF8, 액티빈 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), BMP6, GDF11, ActRIIA, BMP10, ALK4, 및 1종 이상의 Smad 신호전달 인자 중 1종 이상을 추가로 억제한다. 일부 실시양태에서, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합물은 적어도 ALK4를 억제하고, 임의로 GDF8, 액티빈 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 액티빈 BC, 액티빈 AE 및/또는 액티빈 BE), BMP6, GDF11, ActRIIA, ActRIIB, BMP10, 및 1종 이상의 Smad 신호전달 인자 중 1종 이상을 추가로 억제한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합물은 BMP9를 억제하지 않거나 또는 실질적으로 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제 또는 폴리뉴클레오티드 길항제의 조합물은 액티빈 A를 억제하지 않거나 또는 실질적으로 억제하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 길항제는 안티센스 핵산, RNAi 분자 [예를 들어, 소형 간섭 RNA (siRNA), 소형-헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로RNA (miRNA)], 압타머 및/또는 리보자임일 수 있다. 인간 GDF11, GDF8, 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 및 액티빈 E), BMP6, ActRIIA, ActRIIB, BMP10, ALK4, 및 Smad 신호전달 인자의 핵산 및 아미노산 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 길항제를 생성하는 많은 상이한 방법이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드 길항제는 관련 기술분야의 지식 및 본원에 제공된 교시에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 상용적으로 제조될 수 있다.
안티센스 기술을 사용하여 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해, 또는 삼중-나선 형성을 통해 유전자 발현을 제어할 수 있다. 안티센스 기술은, 예를 들어 문헌 [Okano (1991) J. Neurochem. 56:560; Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988)]에 논의되어 있다. 삼중-나선 형성은, 예를 들어 문헌 [Cooney et al., (1988) Science 241:456; 및 Dervan et al., (1991) Science 251:1300]에 논의되어 있다. 방법은 상보적 DNA 또는 RNA에 대한 폴리뉴클레오티드의 결합에 기초한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 핵산은 본원에 개시된 유전자의 RNA 전사체의 적어도 한 부분에 상보적인 단일-가닥 RNA 또는 DNA 서열을 포함한다. 그러나, 절대 상보성이 바람직하긴 하지만, 요구되는 것은 아니다.
본원에 지칭된 "RNA의 적어도 한 부분에 상보적인" 서열은 RNA와 혼성화하여 안정한 듀플렉스를 형성할 수 있기에 충분한 상보성을 갖는 서열을 의미하고; 본원에 개시된 유전자의 이중-가닥 안티센스 핵산의 경우에, 따라서 듀플렉스 DNA의 단일 가닥이 시험될 수 있거나, 또는 트리플렉스 형성이 검정될 수 있다. 혼성화하는 능력은 안티센스 핵산의 상보성 정도 및 길이 둘 다에 좌우될 것이다. 일반적으로, 혼성화 핵산이 클수록, RNA와의 염기 미스매치를 더 많이 함유할 수 있고, 여전히 안정한 듀플렉스 (또는 경우에 따라 트리플렉스)를 형성할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 혼성화된 복합체의 융점을 결정하기 위한 표준 절차의 사용에 의해 허용되는 미스매치 정도를 확인할 수 있다.
메세지의 5' 단부에 상보적인 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 AUG 개시 코돈까지 및 이를 포함하는 5'-비번역 서열은 번역을 억제하는 데 가장 효율적으로 작용할 것이다. 그러나, mRNA의 3'-비번역 서열에 상보적인 서열도 mRNA의 번역을 억제하는 데 또한 효과적인 것으로 밝혀졌다 [예를 들어, 문헌 [Wagner, R., (1994) Nature 372:333-335] 참조]. 따라서, 본 개시내용의 유전자의 5'- 또는 3'-비-번역, 비-코딩 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드는 내인성 mRNA의 번역을 억제하기 위해 안티센스 접근법에 사용될 수 있다. mRNA의 5'-비번역 영역에 상보적인 폴리뉴클레오티드는 AUG 개시 코돈의 상보체를 포함하여야 한다. mRNA 코딩 영역에 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오티드는 덜 효율적인 번역 억제제이지만, 본 개시내용의 방법에 따라 사용될 수 있다. 본 개시내용의 mRNA의 5'-, 3'- 또는 코딩 영역에 혼성화하도록 설계되는지에 관계없이, 안티센스 핵산은 적어도 6개 뉴클레오티드 길이여야 하고, 바람직하게는 6 내지 약 50개 뉴클레오티드 길이 범위의 올리고뉴클레오티드이다. 구체적 측면에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 10개의 뉴클레오티드, 적어도 17개의 뉴클레오티드, 적어도 25개의 뉴클레오티드 또는 적어도 50개의 뉴클레오티드이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 안티센스 핵산은 외인성 서열로부터의 전사에 의해 세포내에서 생산된다. 예를 들어, 벡터 또는 그의 일부가 전사되어, 본 개시내용의 유전자의 안티센스 핵산 (RNA)을 생산한다. 이러한 벡터는 목적하는 안티센스 핵산을 코딩하는 서열을 함유한다. 이러한 벡터는, 이것이 전사되어 목적하는 안티센스 RNA를 생산할 수 있는 한, 에피솜으로 남아있을 수 있거나 또는 염색체적으로 통합될 수 있다. 이러한 벡터는 관련 기술분야에서 표준인 재조합 DNA 기술 방법에 의해 구축될 수 있다. 벡터는 플라스미드, 바이러스, 또는 척추동물 세포에서의 복제 및 발현에 사용되는 관련 기술분야에 공지된 다른 것일 수 있다. 본 개시내용의 목적하는 유전자 또는 그의 단편을 코딩하는 서열의 발현은 척추동물, 바람직하게는 인간 세포에서 작용하는 것으로 관련 기술분야에 공지된 임의의 프로모터에 의한 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 유도성 또는 구성적일 수 있다. 이러한 프로모터는 SV40 초기 프로모터 영역 [예를 들어, 문헌 [Benoist and Chambon (1981) Nature 290:304-310] 참조], 라우스 육종 바이러스의 3' 긴-말단 반복부에 함유된 프로모터 [예를 들어, 문헌 [Yamamoto et al., (1980) Cell 22:787-797] 참조], 헤르페스 티미딘 프로모터 [예를 들어, 문헌 [Wagner et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445] 참조], 및 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열 [예를 들어, 문헌 [Brinster, et al., (1982) Nature 296:39-42] 참조]을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 길항제는 GDF11, GDF8, 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C 및 액티빈 E), BMP6, ActRIIA, ActRIIB, BMP10, ALK4 및 Smad 신호전달 인자 중 1종 이상의 발현을 표적화하는 간섭 RNA (RNAi) 분자이다. RNAi는 표적화된 mRNA의 발현을 방해하는 RNA의 발현을 지칭한다. 구체적으로, RNAi는 siRNA (소형 간섭 RNA)를 통해 특이적 mRNA와 상호작용하는 것을 통해 표적화된 유전자를 침묵시킨다. 이어서, ds RNA 복합체는 세포에 의한 분해를 위해 표적화된다. siRNA 분자는 충분히 상보적인 (예를 들어, 유전자에 대해 적어도 80% 동일성) 표적 유전자의 발현을 방해하는, 10 내지 50개 뉴클레오티드 길이의 이중-가닥 RNA 듀플렉스이다. 일부 실시양태에서, siRNA 분자는 표적 유전자의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
추가의 RNAi 분자는 짧은-헤어핀 RNA (shRNA); 또한 짧은-간섭 헤어핀 및 마이크로RNA (miRNA)를 포함한다. shRNA 분자는 루프에 의해 연결된 표적 유전자로부터의 센스 및 안티센스 서열을 함유한다. shRNA는 핵으로부터 세포질로 수송되고, mRNA와 함께 분해된다. Pol III 또는 U6 프로모터를 사용하여 RNAi에 대한 RNA를 발현시킬 수 있다. 문헌 [Paddison et al., [Genes & Dev. (2002) 16:948-958, 2002]]은 RNAi에 영향을 미치기 위한 수단으로서 헤어핀으로 폴딩된 소형 RNA 분자를 사용하였다. 따라서, 이러한 짧은-헤어핀 RNA (shRNA) 분자는 또한 본원에 기재된 방법에 유리하게 사용된다. 기능적 shRNA의 줄기 및 루프의 길이는 다양하고; 줄기 길이는 약 25 내지 약 30 nt의 임의의 범위일 수 있고, 루프 크기는 침묵 활성에 영향을 미치지 않으면서 4 내지 약 25 nt의 범위일 수 있다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 이들 shRNA는 다이서(DICER) RNase의 이중-가닥 RNA (dsRNA) 산물과 유사하며, 어떠한 경우에도 특정 유전자의 발현을 억제하는 동일한 능력을 갖는 것으로 여겨진다. shRNA는 렌티바이러스 벡터로부터 발현될 수 있다. miRNA는 초기에 "스템-루프" 구조를 특징으로 하는 프리-miRNA로서 전사되는 약 10 내지 70개 뉴클레오티드 길이의 단일-가닥 RNA이며, 이는 후속적으로 RISC를 통한 추가의 프로세싱 후에 성숙 miRNA로 프로세싱된다.
비제한적으로 siRNA를 포함하는, RNAi를 매개하는 분자는 시험관내에서 화학적 합성 (Hohjoh, FEBS Lett 521:195-199, 2002), dsRNA의 가수분해 (Yang et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947, 2002), T7 RNA 폴리머라제를 사용한 시험관내 전사 (Donzeet et al., Nucleic Acids Res 30:e46, 2002; Yu et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:6047-6052, 2002), 및 뉴클레아제, 예컨대 이. 콜라이 RNase III을 사용한 이중-가닥 RNA의 가수분해 (Yang et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947, 2002)에 의해 생산될 수 있다.
또 다른 측면에 따르면, 본 개시내용은 디코이 DNA, 이중-가닥 DNA, 단일-가닥 DNA, 복합체화된 DNA, 캡슐화된 DNA, 바이러스 DNA, 플라스미드 DNA, 네이키드 RNA, 캡슐화된 RNA, 바이러스 RNA, 이중-가닥 RNA, RNA 간섭을 생성할 수 있는 분자, 또는 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 폴리뉴클레오티드 길항제를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 길항제는 압타머이다. 압타머는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 3차 구조에 결합하고 3차 구조를 형성하는, 이중 가닥 DNA 및 단일 가닥 RNA 분자를 비롯한 핵산 분자이다. 압타머의 생성 및 치료 용도는 관련 기술분야에 널리 확립되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,475,096 참조). 압타머에 대한 추가의 정보는 미국 특허 출원 공개 번호 20060148748에서 찾아볼 수 있다. 핵산 압타머는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어 지수적 풍부화에 의한 리간드의 체계적 진화 (SELEX) 과정을 통해 선택된다. SELEX는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,475,096; 5,580,737; 5,567,588; 5,707,796; 5,763,177; 6,011,577; 및 6,699,843에 기재된 바와 같은, 표적 분자에 고도로 특이적으로 결합하는 핵산 분자의 시험관내 진화 방법이다. 압타머를 확인하기 위한 또 다른 스크리닝 방법은 미국 특허 번호 5,270,163에 기재되어 있다. SELEX 과정은 다양한 2- 및 3-차원 구조를 형성하는 핵산의 능력, 뿐만 아니라 다른 핵산 분자 및 폴리펩티드를 포함하여, 단량체성이든 또는 중합체성이든, 실질적으로 임의의 화학적 화합물과 리간드로서 작용하는 (특이적 결합 쌍을 형성하는) 뉴클레오티드 단량체 내에서 이용가능한 화학적 다용도성을 기초로 한다. 임의의 크기 또는 조성의 분자가 표적으로서의 역할을 할 수 있다. SELEX 방법은 목적하는 결합 친화도 및 선택성을 달성하기 위해 동일한 일반적 선택 계획을 사용하여 후보 올리고뉴클레오티드의 혼합물로부터의 선택, 및 결합, 분할 및 증폭의 단계적 반복을 수반한다. 무작위화된 서열의 절편을 포함할 수 있는 핵산의 혼합물로부터 출발하여, SELEX 방법은 결합에 유리한 조건 하에 혼합물을 표적과 접촉시키는 단계; 미결합 핵산을 표적 분자에 특이적으로 결합된 핵산으로부터 분할하는 단계; 핵산-표적 복합체를 해리시키는 단계; 핵산-표적 복합체로부터 해리된 핵산을 증폭시켜 핵산의 리간드 풍부 혼합물을 수득하는 단계를 포함한다. 결합, 분할, 해리 및 증폭 단계는 표적 분자에 높은 친화도 및 특이성으로 결합하는 핵산 리간드를 생성하기 위해 원하는 만큼 많은 사이클을 통해 반복된다.
전형적으로, 이러한 결합 분자는 동물에게 개별적으로 투여되지만 [예를 들어, 문헌 [O'Connor (1991) J. Neurochem. 56:560] 참조], 이러한 결합 분자는 또한 숙주 세포에 의해 흡수되어 생체내 발현된 폴리뉴클레오티드로부터 생체내 발현될 수 있다 [예를 들어, 문헌 [Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988)] 참조].
6. 심부전
부분적으로, 본 개시내용은 심부전의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 심부전을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 1종 이상의 동반이환의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전의 1종 이상의 동반이환을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전을 치료하는 것에 관한 것이며, 여기서 환자는 보존된 박출 계수 심부전 (HFpEF)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HFpEF를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 확장기 기능장애를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 좌심실 박출 계수 (LVEF)의 감소가 없는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 좌심실 벽 두께가 증가된 환자를 치료하는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 좌심방 크기가 증가된 환자를 치료하는 것에 관한 것이다.
이들 방법은 특히 동물, 보다 특히 인간의 치유적 및 예방적 치료를 목표로 한다. 용어 "대상체", "개체" 또는 "환자"는 명세서 전반에 걸쳐 상호교환가능하고, 인간 또는 비-인간 동물을 지칭한다. 이들 용어는 포유동물, 예컨대 인간, 비-인간 영장류, 실험 동물, 가축 동물 (소, 돼지, 낙타 등 포함), 반려 동물 (예를 들어, 개, 고양이, 다른 가축 등) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 환자, 대상체 또는 개체는 인간이다.
용어 "치료", "치료하는", "완화시키는" 등은 일반적으로 목적하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 의미하는 것으로 본원에 사용되고, 또한 치료될 상태 (예를 들어, 심부전)의 1종 이상의 임상 합병증의 중증도를 개선, 완화 및/또는 감소시키는 것을 지칭하는 데 사용될 수 있다. 효과는 질환, 상태 또는 그의 합병증의 발병 또는 재발을 완전히 또는 부분적으로 지연시키는 관점에서 예방적일 수 있고/거나, 질환 또는 상태 및/또는 질환 또는 상태에 기인하는 유해 효과에 대한 부분적 또는 완전한 치유의 관점에서 치료적일 수 있다. 본원에 사용된 "치료"는 포유동물, 특히 인간의 질환 또는 상태의 임의의 치료를 포괄한다. 본원에 사용된, 장애 또는 상태를 "예방하는" 치료제는 통계적 샘플에서, 비처리 대조군 샘플에 비해 처리된 샘플에서 장애 또는 상태의 발생을 감소시키거나, 또는 비처리 대조군 샘플에 비해 질환 또는 상태의 발병을 지연시키는 화합물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRII-ALK4 길항제를 치료를 필요로 하는 환자 (예를 들어, "그를 필요로 하는 환자")에게 투여하는 방법에 관한 것이다. ActRII-ALK4 길항제를 사용한 치료를 필요로 하는 이러한 환자는 노화와 연관된 심부전을 포함하나 이에 제한되지는 않는 본 출원에 개시된 장애 또는 상태를 갖는 환자이다.
일반적으로, 본 개시내용에 기재된 바와 같은 질환 또는 상태의 치료 또는 예방 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)은 본 개시내용의 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제를 "유효량"으로 투여함으로써 달성된다. 작용제의 유효량은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하는 데 효과적인 양을 지칭한다. 본 개시내용의 작용제의 "치료 유효량"은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 도출하는 작용제의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. "예방 유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 목적하는 예방 결과를 달성하는 데 효과적인 양을 지칭한다.
HF를 기재하는 데 사용된 주요 용어는 좌심실 박출 계수 (LVEF)의 측정에 기초한다. HF는 광범위한 환자를 포함한다 (표 1). 일부 환자는 정상 LVEF를 가지며, 이는 전형적으로 ≥50%로 간주되고, 보존된 박출 계수 HF (HFpEF)로 지칭된다. 다른 환자는 감소된 LVEF를 갖는 HF (HFrEF)를 가지며, 이는 전형적으로 <40%인 것으로 간주된다. 약 40% 내지 약 49% 범위의 LVEF를 갖는 환자는 때때로 중간-범위 박출 계수 HF (HFmrEF)로서 정의되는 "중간 영역"을 나타낸다. 때때로 "중간 영역"의 이들 환자는 임상의에 따라 HFrEF를 갖는 것으로 확인된다. LVEF에 기초한 HF를 갖는 환자의 구별은 상이한 기저 병인, 인구통계, 동반이환 및 요법에 대한 반응으로 인해 중요하다. 1990년 후에 공개된 대부분의 임상 시험은 LVEF (통상적으로 심장초음파검사, 방사성핵종 기술 또는 심장 자기 공명 (CMR)을 사용하여 측정됨)에 기초하여 환자를 선택하였고, 본 발명자들이 아는 한, 오직 HFrEF를 갖는 환자에서만 요법이 이환율 및 사망률 둘 다를 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 전형적으로, 노화와 연관된 심부전을 갖는 환자는 정상 LVEF (예를 들어, HFpEF)를 갖는다.
표 1. 좌심실 박출 계수 분석에 의한 심부전의 정의
증상: 예를 들어, 호흡곤란, 발목 종창 및 피로
징후: 예를 들어, 상승된 경정맥압, 폐 수포음 및 말초 부종. 징후는 HF (특히 HFpEF)의 초기 단계 및 이뇨제로 치료된 환자에서 존재하지 않을 수 있다.
증상 및 징후는 구조적 및/또는 기능적 심장 이상에 의해 유발된다.
HF = 심부전; HFmrEF = 중간-범위 박출 계수 심부전; HFpEF = 보존된 박출 계수 심부전; HFrEF = 감소된 박출 계수 심부전; LAE = 좌심방 팽대; LVEF = 좌심실 박출 계수; LVH = 좌심실 비대;
특정 측면에서, 본 개시내용은 HFpEF의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, HFpEF를 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 정상 LVEF를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 정상 LVEF를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 정상 LVEF는 ≥50%의 LVEF이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HFpEF를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HFpEF 및 상승된 수준의 나트륨이뇨 펩티드를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HFpEF, 상승된 수준의 나트륨이뇨 펩티드, 및 구조적 심장 질환 및/또는 확장기 기능장애를 갖는 환자를 치료하는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전을 갖는 환자를 치료하는 것에 관한 것이며, 여기서 환자는 HFpEF를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전을 갖는 환자를 치료하는 것에 관한 것이며, 여기서 환자는 정상 LVEF를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전을 갖는 환자를 치료하는 것에 관한 것이며, 여기서 환자는 ≥50%의 LVEF를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전을 갖는 환자를 치료하는 것에 관한 것이며, 여기서 환자는 상승된 수준의 나트륨이뇨 펩티드를 갖는다. 특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 환자는 HFpEF를 갖는다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 감소된 박출 계수 심부전 (HFrEF)의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, HFrEF를 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 감소된 LVEF를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 감소된 LVEF 및 <40%의 LVEF를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 감소된 LVEF 및 감소된 박출 계수 연관 HF (HFrEF)를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 중간-범위 박출 계수 심부전 (HFmrEF)의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, HFmrEF를 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 중간-범위 LVEF를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 중간-범위 LVEF 및 약 40% 내지 약 49%의 LVEF를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 중간-범위 LVEF 및 중간-범위 박출 계수 연관 HF (HFmrEF)를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HFmrEF 및 상승된 수준의 나트륨이뇨 펩티드를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HFmrEF 및 상승된 수준의 나트륨이뇨 펩티드, 및 구조적 심장 질환 및/또는 확장기 기능장애를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
HFpEF의 진단은 HFrEF의 진단보다 더 도전적일 수 있다. HFpEF를 갖는 환자는 일반적으로 확장된 LV를 갖지 않지만, 대신에 종종 증가된 충만 압력의 징후로서 LV 벽 두께의 증가 및/또는 증가된 좌심방 (LA) 크기를 갖는다. 대부분은 또한 확장기 기능장애로 분류되는 손상된 LV 충만 또는 흡인 능력의 추가의 '증거'를 가지며, 이는 일반적으로 이들 환자에서 HF의 가능한 원인으로서 받아들여진다 (따라서 용어 '확장기 HF'). 그러나, HFrEF (이전에 '수축기 HF'로 지칭됨)를 갖는 대부분의 환자는 또한 확장기 기능장애를 갖고, HFpEF를 갖는 환자에서 수축기 기능의 미묘한 이상이 나타났다. 따라서, 보존된 또는 감소된 '수축기 기능'보다 보존된 또는 감소된 LVEF를 언급하는 것이 바람직하다.
이전의 가이드라인에서는, 중간 영역이 HFrEF와 HFpEF 사이에 존재하는 것으로 인정되었다. 이들 환자는 40 내지 49% 범위의 LVEF, 따라서 용어 HFmrEF를 갖는다. HFmrEF를 갖는 환자는 주로 경도 수축기 기능장애를 가질 가능성이 가장 크지만, 확장기 기능장애의 특색을 갖는다.
검출가능한 LV 심근 질환이 없는 환자는 HF에 대한 다른 심혈관 원인 (예를 들어, 폐고혈압, 심장 판막 질환 등)을 가질 수 있다. 비-심혈관 병리상태 (예를 들어, 빈혈, 폐, 신장 또는 간 질환)를 갖는 환자는 HF의 증상과 유사하거나 동일한 증상을 가질 수 있고, 각각은 HF 증후군을 복합적이게하거나 악화시킬 수 있다.
NYHA 기능적 분류 (표 2)는 증상의 중증도 및 운동 불내성을 기재하는 데 사용되었다. 그러나, 증상 중증도는 LV 기능의 많은 척도와 불량하게 상관되며; 증상의 중증도와 생존 사이에는 명확한 관계가 존재하지만, 경도 증상을 갖는 환자도 여전히 입원 및 사망의 증가된 위험을 가질 수 있다. 때때로 용어 '진행성 HF'는 중증 증상, 재발성 대상부전 및 중증 심장 기능장애를 갖는 환자를 특징화하는 데 사용된다.
표 2. 증상의 중증도 및 신체 활동에 기초한 HF의 뉴욕 심장 협회 (NYHA) 기능적 분류
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 NYHA 부류 I HF를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, NYHA 부류 I HF를 갖는 환자는 신체 활동의 제한을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, NYHA 부류 I HF를 갖는 환자는 과도한 호흡곤란, 피로 및/또는 심계항진을 유발하지 않는 신체 활동을 경험한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 NYHA 부류 II HF를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, NYHA 부류 II HF를 갖는 환자는 신체 활동의 약간의 제한을 갖는다. 일부 실시양태에서, NYHA 부류 II HF를 갖는 환자는 과도한 호흡곤란, 피로 또는 심계항진을 유발하는 통상의 신체 활동을 경험한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 NYHA 부류 III HF를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, NYHA 부류 III HF를 갖는 환자는 신체 활동의 현저한 제한을 갖는다. 일부 실시양태에서, NYHA 부류 III HF를 갖는 환자는 과도한 호흡곤란, 피로 또는 심계항진을 유발하는 통상보다 적은 신체 활동을 경험한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 NYHA 부류 IV HF를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, NYHA 부류 IV HF를 갖는 환자는 불편함 없이 어떠한 신체 활동도 수행할 수 없다. 일부 실시양태에서, NYHA 부류 IV HF를 갖는 환자는 휴식 시에 증상을 경험할 뿐만 아니라, 임의의 신체 활동이 착수될 때, 불편함이 증가된다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 환자의 NYHA 기능적 심부전 부류를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NYHA 부류를 부류 IV에서 부류 III으로 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NYHA 부류를 부류 IV에서 부류 II로 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NYHA 부류를 부류 IV에서 부류 I로 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NYHA 부류를 부류 III에서 부류 II로 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NYHA 부류를 부류 III에서 부류 I로 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NYHA 부류를 부류 II에서 부류 I로 감소시키는 것에 관한 것이다.
미국 심장 학회 재단/미국 심장 협회 (ACCF/AHA) 분류는 구조적 변화 및 증상에 기초한 HF 발달의 병기를 기재한다 (표 3). ACC/AHA 분류 시스템은 종양학에서 통상적으로 사용되는 접근법과 유사하게 질환의 병기결정 및 발달에 중점을 둔다. 이들 HF 병기는 선행 위험 인자 (병기 A)로부터 준임상 심장 기능장애의 발달 (병기 B), 이어서 증후성 HF (병기 C), 및 최종적으로 말기 불응성 질환 (병기 D)으로 진행된다. ACC/AHA 병기는 병기 A에서 병기 D로 진행된다.
표 3. 심부전의 미국 심장 학회 재단/미국 심장 협회 (ACCF/AHA) 병기
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ACCF/AHA A기 HF를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, ACCF/AHA A기 HF를 갖는 환자는 HF에 대한 높은 위험이 있지만 HF의 구조적 심장 질환 또는 증상은 없다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ACCF/AHA B기 HF를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, B기 HF를 갖는 환자는 구조적 심장 질환을 갖지만, HF의 공지된 징후 또는 증상은 없다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ACCF/AHA C기 HF를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, ACCF/AHA C기 HF를 갖는 환자는 HF의 이전 또는 현재 증상과 함께 구조적 심장 질환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ACCF/AHA D기 HF를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, ACCF/AHA D기 HF를 갖는 환자는 전문화된 개입을 요구하는 불응성 HF를 갖는다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 환자의 심부전의 ACCF/AHA 병기를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 ACCF/AHA 병기를 D기에서 C기로 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 ACCF/AHA 병기를 D기에서 B기로 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 ACCF/AHA 병기를 D기에서 A기로 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 ACCF/AHA 병기를 C기에서 B기로 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 ACCF/AHA 병기를 C기에서 A기로 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 ACCF/AHA 병기를 B기에서 A기로 감소시키는 것에 관한 것이다.
킬립 분류는 심근경색 후 급성 세팅에서 환자의 상태의 중증도를 기재하는 데 사용될 수 있다. HF 합병 급성 심근경색 (AMI)을 갖는 환자는 킬립 및 킴볼에 따라 표 4에 제시된 부류로 분류될 수 있다.
표 4. HF 합병 AMI의 킬립 분류
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 킬립 부류 I HF 합병 AMI를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 킬립 부류 I HF 합병 AMI를 갖는 환자는 HF의 임상 징후를 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 킬립 부류 II HF 합병 AMI를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 킬립 부류 II HF 합병 AMI를 갖는 환자는 수포음 및 S3 말발굽심장음을 갖는 HF를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 킬립 부류 III HF 합병 AMI를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 킬립 부류 III HF 합병 AMI를 갖는 환자는 두드러진 급성 폐 부종을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 킬립 부류 IV HF 합병 AMI를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 킬립 부류 IV HF 합병 AMI를 갖는 환자는 심인성 쇼크, 저혈압 (예를 들어, SBP, 90 mmHg) 및 말초 혈관수축의 증거, 예컨대 핍교, 청색증 및 발한을 갖는다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 환자의 킬립 HF 분류를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 킬립 부류를 부류 IV에서 부류 III으로 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 킬립 부류를 부류 IV에서 부류 II로 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 킬립 부류를 부류 IV에서 부류 I로 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 킬립 부류를 부류 III에서 부류 II로 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 킬립 부류를 부류 III에서 부류 I로 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 킬립 부류를 부류 II에서 부류 I로 감소시키는 것에 관한 것이다.
심부전의 진단에 대한 프레이밍햄 기준 (표 5)은 적어도 2개의 주요 기준, 또는 적어도 1개의 주요 및 2개의 부차적 기준의 존재를 필요로 한다. 이들 기준이 수십년 동안 황금 참조 표준으로서 역할을 하였지만, 이는 주로 휴식 시 울혈이 존재한다는 것을 근거로 한다. 중요한 것으로, 이러한 임상 양상은 종종 잘 보상된 HF를 갖는 외래 환자, 또는 전적으로 운동 동안 비정상적 혈류역학이 발생하는 HF를 갖는 환자에서는 부재한다. 따라서, 고도로 특이적임에도 불구하고, 프레이밍햄 기준은 HF의 진단에 대해 불량한 감수성을 갖는 경향이 있다.
표 5. 심부전 진단에 대한 프레이밍햄 기준
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HF의 진단에 대한 1개 이상의 주요 프레이밍햄 기준을 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 환자는 발작성 야간 호흡곤란 또는 기좌호흡, 경정맥 팽만, 수포음, 방사선촬영상 심장비대, 급성 폐 부종, S3 말발굽심장음, 16 cm 초과의 물의 증가된 정맥압, 25초 이상의 순환 시간, 간경정맥 역류, 및 치료에 반응하여 5일 내 4.5 kg 이상의 체중 감소 중 1종 이상을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HF의 진단에 대한 1개 이상의 부차적 프레이밍햄 기준을 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 환자는 양측 발목 부종, 야간 기침, 통상의 운동 시 호흡곤란, 간비대, 흉막 삼출, 최대 기록으로부터 1/3까지의 폐활량 감소, 및 빈맥 (120회/분 초과의 심박수) 중 1종 이상을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 적어도 2개의 프레이밍햄 주요 기준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 적어도 1개의 주요 프레이밍햄 기준 및 적어도 2개의 부차적 프레이밍햄 기준을 갖는다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 환자가 갖는 심부전에 대한 프레이밍햄 기준의 수를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자가 갖는 심부전에 대한 주요 프레이밍햄 기준의 수를 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자가 갖는 심부전에 대한 부차적 프레이밍햄 기준의 수를 감소시키는 것에 관한 것이다.
의료 전문가가 심부전의 진단과 관련하여 찾을 수 있는 심부전의 많은 공지된 증상 및 징후가 존재한다. 일부 증상은 비-특이적일 수 있고, 따라서 HF와 다른 문제 사이를 구별하는 데 도움이 되지 않는다. 체액 저류로 인한 HF의 증상 및 징후는 이뇨 요법으로 신속하게 해소될 수 있다. 상승된 경정맥압 및 심첨 박동의 변위와 같은 징후는 보다 특이적일 수 있지만, 검출하기가 더 어렵고 불량한 재현성을 갖는다. HF는 관련 병력 (예를 들어, 심장 손상의 잠재적 원인)을 갖지 않는 개체에서 비통상적인 반면, 특정 특색, 특히 이전의 심근경색은 적절한 증상 및 징후를 갖는 환자에서 HF의 가능성을 크게 증가시킨다. 증상 및 징후는 치료에 대한 환자의 반응 및 시간 경과에 따른 안정성을 모니터링하는 데 중요하다. 치료에도 불구하고 지속되는 증상은 통상적으로 추가의 요법에 대한 필요를 나타내고, 증상의 악화는 심각한 전개 (환자를 응급 병원 입원 및 사망의 위험에 처하게 함)이며, 즉각적인 의학적 주의가 요구된다.
표 6. 심부전의 징후 및 증상
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HF의 1종 이상의 전형적 및/또는 덜 전형적 증상을 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HF의 1종 이상의 특이적 및/또는 덜 특이적 징후를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HF의 1종 이상의 전형적 증상, 덜 전형적 증상, 특이적 징후, 및/또는 덜 특이적 징후를 갖는 환자를 치료하는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HF의 1종 이상의 전형적 증상을 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 환자는 호흡곤란, 기좌호흡, 발작성 야간 호흡곤란, 감소된 운동 내성, 피로, 피곤감, 운동 후 회복까지 증가된 시간, 및 발목 종창으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 증상을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 HF의 1종 이상의 덜 전형적인 증상을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 야간 기침, 천명, 팽만감, 식욕 상실, 혼란 (특히 고령에서), 우울증, 심계항진, 어지럼증, 실신, 및 구부림 유발 호흡곤란으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 덜 전형적인 증상을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 HF의 1종 이상의 징후를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 상승된 경정맥압, 간경정맥 역류, 제3 심장음 (말발굽 리듬), 및 측방향으로 변위된 심첨 박동으로 이루어진 군으로부터 선택된 HF의 1종 이상의 징후를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 HF의 1종 이상의 덜 특이적인 징후를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 체중 증가 (>2 kg/주), 체중 감소 (진행성 HF에서), 조직 소모 (악액질), 심장 잡음, 말초 부종 (발목, 천골, 음낭), 폐 비빔소리, 폐 기저에서의 감소된 공기 진입 및 타진 둔탁음 (흉막 삼출), 빈맥, 불규칙 맥박, 빈호흡, 체인 스토크스 호흡, 간비대, 복수, 한랭 사지, 핍뇨, 및 좁은 맥압으로 이루어진 군으로부터 선택된 HF의 1종 이상의 덜 특이적인 징후를 갖는다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 환자가 갖는 심부전의 징후 및/또는 증상의 수를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자가 갖는 심부전의 징후의 수를 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자가 갖는 심부전의 증상의 수를 감소시키는 것에 관한 것이다.
노화와 연관된 심부전
연령이 심혈관 질환의 발생에 대한 우세한 위험 인자 중 하나이므로, 유병률은 환자의 연령이 증가함에 따라 현저하게 증가한다. 선진국의 성인 인구에서 심부전의 유병률은 1-2%이며, 이는 70세 이상의 사람에서는 >10%로 상승한다 (McMurray et al., Eur. J. Heart Fail, 2012, 14:803-869). 프레이밍햄 연구는 심부전의 발생률이 각각의 연속 10년의 생애에 걸쳐 대략 2배가 되었고, 남성에서보다 여성에서 연령에 따라 보다 가파르게 상승함을 나타내었다. 남성의 연간 발생률은 35세 내지 64세에 1000명당 2명에서 65세 내지 94세에 1000명당 12명으로 상승하였다. 연령에 따른 위험의 증가가 노령에 따른 기대 수명의 감소와 균형을 이루기 때문에, 평생 HF의 발생 가능성은 40세 초과의 모든 연령에서 대략 20 퍼센트이다. 이러한 집단은 보존된 박출 계수 (HFpEF)를 갖는 환자 및 감소된 박출 계수 (HFrEF)를 갖는 환자로 나뉠 수 있다. 이들 심부전 환자의 거의 절반은 HFpEF를 갖는다. 심장이 노화됨에 따라, 변화는 많은 상이한 수준: 구조적, 기능적, 세포적, 및 분자적으로 발생할 수 있으며, 이들 모두는 심부전으로 이어질 수 있다. 통상적으로, 노화와 연관된 심부전은 좌심실 박출 계수 (LVEF)의 감소 없이 (즉, HFpEF), 증가된 좌심실 (LV) 벽 두께 (즉, LV 비대) 및 확장기 기능장애를 특징으로 한다. HFpEF 환자에서의 정의에 의한 박출 계수는 정상이지만, LV 수축성은 손상된다. HFpEF를 진단할 때 낮은 특이성을 피하기 위해, 운동성 호흡곤란 및 정상 LVEF는 확장기 LV 기능장애, LV 비대, 좌심방 (LA) 팽대, 및/또는 나트륨이뇨 펩티드 (NP)의 혈장 수준의 객관적 척도와 커플링될 수 있다.
HFpEF의 진단은 도전과제로 남아있다. HFpEF 환자에서, LVEF는 정상이고, HF에 대한 징후 및 증상은 종종 비-특이적이며, HF와 다른 임상 상태 사이가 잘 구별되지 않는다. 특히 동반이환을 갖고 중앙 유체 과부하의 명백한 징후가 없는 전형적인 고령 환자에서의 만성 HFpEF의 진단은 어렵고, 검증된 황금 표준은 파악하기 어렵다. HFpEF를 진단하는 특이성을 개선시키기 위해, 임상 진단은 휴식 시 또는 운동 동안 심장 기능장애의 객관적 척도에 의해 지지되어야 한다. HFpEF의 진단은 전형적으로 하기: HF의 증상 및/또는 징후의 존재; '보존된' EF (LVEF ≥50% 또는 HFmrEF의 경우 때때로 40-49%로서 정의됨); 상승된 수준의 NP (BNP > 35 pg/mL 및/또는 NT-프로BNP >125 pg/mL); HF 기저의 다른 심장 기능적 및 구조적 변경의 객관적 증거를 필요로 하며; 불확실한 경우에, HFpEF의 진단을 확인하기 위해 스트레스 시험 또는 침습적으로 측정된 상승된 LV 충만 압력이 필요할 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 환자는 적어도 40세이다. 일부 실시양태에서, 환자는 적어도 45세이다. 일부 실시양태에서, 환자는 적어도 50세이다. 일부 실시양태에서, 환자는 적어도 55세이다. 일부 실시양태에서, 환자는 적어도 60세이다. 일부 실시양태에서, 환자는 적어도 65세이다. 일부 실시양태에서, 환자는 적어도 70세이다. 일부 실시양태에서, 환자는 적어도 75세이다. 일부 실시양태에서, 환자는 적어도 80세이다. 일부 실시양태에서, 환자는 적어도 85세이다. 일부 실시양태에서, 환자는 적어도 90세이다. 일부 실시양태에서, 환자는 적어도 95세이다. 일부 실시양태에서, 환자는 적어도 100세이다. 일부 실시양태에서, 환자는 약 40 내지 약 100세이다. 일부 실시양태에서, 환자는 보존된 박출 계수 심부전 (HFpEF)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 심부전은 보존된 박출 계수 연관 심부전 (HFpEF)이다. 일부 실시양태에서, 환자는 호흡곤란을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 운동성 호흡곤란을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 증가된 좌심실 벽 두께를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 LV 비대를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 확장기 기능장애를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 LV 확장기 기능장애를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 좌심방 팽대를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 좌심실 박출 계수의 감소가 없다. 일부 실시양태에서, 환자는 ≥50%의 좌심실 박출 계수를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 증가된 수준의 나트륨이뇨 펩티드를 갖는다.
구조적 변화
환자가 나이가 들수록, 심장 및 혈관계에서 유의한 구조적 변화가 발생한다. 이의 일부 예는 증가된 혈관 내막 두께, 증가된 혈관 강직, 증가된 좌심실 벽 두께 (정상 한계 내) 및 증가된 좌심방 크기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다 (표 7). 심장의 두께 및 형상의 전반적인 변화는 심장 벽 스트레스 및 전반적인 수축 효율에 중요한 영향을 미친다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전 또는 노화와 연관된 심부전의 1종 이상의 합병증의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전 또는 노화와 연관된 심부전의 1종 이상의 합병증을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 환자는 심혈관 구조적 재형성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 혈관 내막 두께의 증가, 혈관 강성의 증가, LV 비대의 증가 (예를 들어, LV 벽 두께의 증가), 및 좌심방 팽대의 증가 (예를 들어, 좌심방 벽 크기의 증가)로 이루어진 군으로부터 선택된 심혈관 구조적 재형성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 혈관 내막 두께의 증가를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 혈관 강성의 증가를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 LV 비대의 증가를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 LV 벽 두께의 증가를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 수축기 고혈압을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 지연된 조기 확장기 심장 충만을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 증가된 심장 충만 압력을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 호흡곤란에 대한 보다 낮은 역치를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 상대적으로 정상 수축기 기능을 갖는 심부전의 증가된 가능성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 좌심방 팽대를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 좌심방 크기의 증가를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 고립성 심방세동 및/또는 다른 심방성 부정맥의 증가된 유병률을 갖는다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전 또는 노화와 연관된 심부전의 1종 이상의 합병증의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전 또는 노화와 연관된 심부전의 1종 이상의 합병증을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 환자에서 심혈관 구조적 재형성을 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 혈관 내막 두께의 증가, 혈관 강성의 증가, LV 비대의 증가 (예를 들어, LV 벽 두께의 증가), 및 좌심방 팽대의 증가 (예를 들어, 좌심방 벽 크기의 증가)로 이루어진 군으로부터 선택된 심혈관 구조적 재형성을 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자에서 혈관 내막 두께를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자에서 혈관 강성을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자에서 LV 비대를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 환자에서 LV 벽 두께를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자에서 수축기 고혈압을 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자에서 조기 확장기 심장 충만을 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자에서 심장 충만 압력을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자에서 좌심방 팽대를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자에서 좌심방 크기를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자에서 고립성 심방세동 및/또는 다른 심방성 부정맥의 유병률을 감소시킨다.
표 7. 심혈관 질환에 대한 심혈관 인간 구조적 변화의 관계
약어: VSMC = 혈관 평활근 세포; LV = 좌심실; PUFA = 다중불포화 지방산 (Strait and Lakatta, Heart Fail Clin, 2012, 8:143-164).
심실 구조
구조적 수준에서, 연령에 따라 관찰되는 가장 두드러진 현상 중 하나는 증가된 심근세포 크기의 결과로서 LV 벽의 두께의 증가이다 (즉, LV 비대). LV 비대는 노화와 함께 발생하는 심근세포의 손실 후 신체에 의한 보상 반응으로서 대부분 관찰되며, 이는 좌심실이 더 힘들게 작업하도록 한다. 작업부하가 증가함에 따라, 심방실 벽 내의 근육 조직이 두꺼워지고, 때때로 심방실 자체의 크기가 또한 증가한다. 팽대된 심장근은 탄성을 잃고, 결국 필요한 만큼의 힘으로 펌핑하지 못할 수 있다. 연령에 따른 LV 질량의 진화에 관한 상충하는 데이터가 존재했고, 최근의 분석은 질량에 대한 효과가 거의 내지 전혀 없는 경향이거나 (Akasheva et al., PLoS One, 2015, 10:e0135883), 또는 남성에서만 약간의 성별-특이적 감소가 존재할 수 있다 (Strait and Lakatta, Heart Fail Clin, 2012, 8:143-164). LV 치수는 연령에 따라 감소하며, 이는 질량/부피 비의 증가 및 LV 확장 말기 부피의 감소에 의해 반영된다. 따라서, 노화는 전형적으로 LV 비대와 연관된다. 이러한 비대는 비대칭 방식으로 LV에 영향을 미치며, 대부분 심실중격에 영향을 미치고, 심장근의 재분포를 야기하여, 이는 총 심장 질량에 대한 효과의 가능한 결여를 설명한다. LV 비대 및 감소된 LV 공동 부피는 HFpEF의 특징 중 일부이며, 이는 심부전을 갖는 노화 환자에서 통상적이다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 환자는 심장에서 심실 구조의 변화를 갖는다. 일부 실시양태에서, 심장에서의 심실 구조의 변화는 LV 비대, 심근세포 크기의 증가, 심근세포의 손실, LV 질량의 작은 변화 내지 무변화, 및 LV 확장 말기 부피의 감소로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 환자는 LV 비대를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 LV 벽 두께의 증가를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 증가된 심근세포 크기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 심근세포의 손실을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 LV 확장 말기 부피의 감소를 갖는다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 심장의 심실 구조에서 1종 이상의 변화를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 LV 비대, 심근세포 크기의 증가, 심근세포의 손실, LV 질량의 작은 변화 내지 무변화, 및 LV 확장 말기 부피의 감소로 이루어진 군으로부터 선택된 심장에서의 심실 구조의 변화를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 LV 비대를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 LV 비대가 악화되는 것을 방지한다. 일부 실시양태에서, 방법은 LV 비대를 복구한다. 일부 실시양태에서, 방법은 LV 벽의 두께를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 심근세포 크기를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 심근세포의 손실을 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 심근세포의 손실이 악화되는 것을 방지한다. 일부 실시양태에서, 방법은 LV 확장 말기 부피를 증가시킨다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 환자는 좌심실 비대를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 심부전 환자의 1종 이상의 파라미터의 보다 정상 수준 (예를 들어, 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람과 비교하여 정상)으로의 조정을 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 심부전 환자의 1종 이상의 파라미터를 보다 정상 수준 (예를 들어, 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람과 비교하여 정상)으로 조정하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심실 비대를 적어도 1% (예를 들어, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%)만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심실 비대를 적어도 1%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심실 비대를 적어도 5%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심실 비대를 적어도 10%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심실 비대를 적어도 15%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심실 비대를 적어도 20%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심실 비대를 적어도 25%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심실 비대를 적어도 30%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심실 비대를 적어도 35%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심실 비대를 적어도 40%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심실 비대를 적어도 45%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심실 비대를 적어도 50%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심실 비대를 적어도 55%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심실 비대를 적어도 60%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심실 비대를 적어도 65%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심실 비대를 적어도 70%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심실 비대를 적어도 75%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심실 비대를 적어도 80%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심실 비대를 적어도 85%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심실 비대를 적어도 90%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심실 비대를 적어도 95%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심실 비대를 100%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다.
심방 구조
고령에서, 심방 수축은 어린 집단에서보다 확장기 동안 LV 충만에 훨씬 더 큰 역할을 한다. 이러한 기능 변화는 심방 비대 (비후) 및 확장의 발생과 연관된다. 좌심방 크기는 심방 세동의 존재와 연관되었다. 따라서, 심장-LV 비대 및 심방 확장의 연령-관련 구조적 재형성의 2가지 중요한 측면은 노령의 2가지 주요 심장 병리상태: HFpEF 및 심방 세동과 연관된다. 이들 2가지 병리상태는 종종 함께 발생하며, 일부 시점에 HFpEF 환자의 2/3은 심방 세동을 나타내고, 대부분의 환자는 먼저 심방 세동에 이어서 심부전이 발생한다. 심장초음파 연구는 대동맥 근부가 연령에 따라 약간 확장되어, 40대와 80대 사이에 대략 6%임을 보여준다. 그러나, 정상 노화에서, 이러한 대동맥 근부 확장은 LV 비대에 대한 추가의 자극을 제공하는 데, 이는 근위 대동맥에서의 보다 큰 부피의 혈액이 노쇠한 심장이 펌핑해야 하는 보다 큰 관성 부하를 유발하기 때문이다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 환자는 심장에서 심방 구조의 변화를 갖는다. 일부 실시양태에서, 심장에서의 심방 구조의 변화는 좌심방 비대, 부정맥, 심방 확장, 대동맥 근부 확장 및 심방 세동으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 환자는 심방 비대를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 좌심방 비대를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 좌심방 팽대를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 부정맥을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 심방 확장을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 대동맥 근부 확장을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 심방 세동을 갖는다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 심장의 심방 구조에서의 변화를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 좌심방 비대, 부정맥, 심방 확장, 대동맥 근부 확장 및 심방 세동으로 이루어진 군으로부터 선택된 심장에서의 심방 구조의 변화를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 심방 비대를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 좌심방 비대를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 좌심방 팽대를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자에서 부정맥을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 심방 확장을 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 대동맥 근부 확장을 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 심방 세동을 개선시킨다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 환자는 좌심방 팽대를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 심부전 환자의 1종 이상의 파라미터의 보다 정상 수준 (예를 들어, 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람과 비교하여 정상)으로의 조정을 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 심부전 환자의 1종 이상의 파라미터를 보다 정상 수준 (예를 들어, 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람과 비교하여 정상)으로 조정하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심방 팽대를 적어도 1% (예를 들어, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%)만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심방 팽대를 적어도 1%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심방 팽대를 적어도 5%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심방 팽대를 적어도 10%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심방 팽대를 적어도 15%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심방 팽대를 적어도 20%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심방 팽대를 적어도 25%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심방 팽대를 적어도 30%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심방 팽대를 적어도 35%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심방 팽대를 적어도 40%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심방 팽대를 적어도 45%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심방 팽대를 적어도 50%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심방 팽대를 적어도 55%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심방 팽대를 적어도 60%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심방 팽대를 적어도 65%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심방 팽대를 적어도 70%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심방 팽대를 적어도 75%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심방 팽대를 적어도 80%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심방 팽대를 적어도 85%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심방 팽대를 적어도 90%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심방 팽대를 적어도 95%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심방 팽대를 100%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다.
기능적 변화
노화된 심장이 겪는 다수의 기능적 변화 및 보상 반응이 존재하며, 이는 증가된 작업부하에 반응하는 그의 능력을 저하시키고, 또한 그의 예비 용량을 감소시킨다. 노화는 심장의 확장기, 수축기, 뿐만 아니라 전기적 기능에도 영향을 미친다. 최대 심박수, 수축-말기 부피 (ESV), 확장-말기 부피 (EDV), 수축성, 지속적 수축기 수축, 지속적 확장기 이완, 및 교감신경 신호전달에서의 변화는 대상체 연령에 따른 기능적 변화의 예이다. 노화 환자는 혈관 긴장도의 변경된 조절, 세포 Ca2+ 과부하에 대한 감소된 역치, 증가된 심혈관 예비력, 및 감소된 신체 활동을 가질 수 있다. 이러한 기능적 변화는 혈관 강직, 고혈압, 조기 아테롬성동맥경화증, 심방 및 심실 부정맥에 대한 보다 낮은 역치, 증가된 근세포 사멸, 증가된 섬유증, 및 심부전에 대한 보다 낮은 역치 및 그의 증가된 중증도로 이어질 수 있다 (표 8).
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 환자는 심장에서 기능적 변화를 갖는다. 일부 실시양태에서, 심장에서의 기능적 변화는 확장기 심장 기능의 변화, 수축기 심장 기능의 변화, 및 전기적 심장 기능의 변화로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 환자는 확장기 심장 기능의 변화를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 수축기 심장 기능의 변화를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 전기적 심장 기능의 변화를 갖는다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 심장에서 기능적 변화를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 확장기 심장 기능의 변화, 수축기 심장 기능의 변화, 및 전기적 심장 기능의 변화로 이루어진 군으로부터 선택된 심장에서의 기능적 변화를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 확장기 심장 기능의 변화를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 수축기 심장 기능의 변화를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 전기적 심장 기능의 변화를 개선시킨다.
표 8. 심혈관 질환에 대한 심혈관 인간 기능적 변화의 관계
약어: VSMC = 혈관 평활근 세포; LV = 좌심실; PUFA = 다중불포화 지방산 (Strait and Lakatta, Heart Fail Clin, 2012, 8:143-164).
확장기 기능
확장기 기능은 좌심실 (LV)이 폐 울혈을 방지하기에 충분히 낮은 압력에서 신체의 현재의 필요에 충분한 혈액으로 충만되도록 하는 여러 상이한 생리학적 과정을 지칭한다. 정상 LV는 흡인 펌프로서 기능하며, 초기 확장기 흡인의 정도는 LV 이완에 더하여 이전 박동의 단축의 정도 및 승모판 시점에서 좌심방 내 압력과 관련된다. 심장 노화의 특징은 심장이 심실 이완 장애 및 충만 압력 증가를 경험하는 LV 확장기 기능의 감소 (예를 들어, 확장기 기능장애)이다. 정상 확장기 충만은 2개의 단계로 나뉠 수 있다: 초기 확장기 경승모판 유속으로 공지된, 확장기 동안의 초기 수동 충만 ('E'), 및 후기 확장기 경승모판 유속으로 공지된, 심방 수축에 의한 확장기 동안의 후기 능동 충만 ('A'). 확장기 기능 장애의 초기 단계에서, 혈액으로의 심장 충만 속도는 감소하고 (예를 들어, E가 작아짐), 심실 충만의 대부분이 확장기 후기로 이동하고, 유의한 심방 팽대 및 수축 동안 심방이 분출하기 위한 보다 큰 혈액 부피가 존재한다 (예를 들어, A가 커짐). 따라서, 심방은 총 확장 말기 부피의 보다 큰 부분을 차지하고, E/A 비가 감소하며, 이는 HFpEF의 초기 단계에서의 확장기 기능장애의 특징이다. 건강한 청소년에서의 E/A 비는 전형적으로 >1이다. 확장기 기능장애는 HFpEF (보존된 박출 계수 심부전)와 연관된다. 확장기 기능장애는 손상된 좌심실 (LV) 이완, 회복력, 근세포 연장 부하, 및 심방 기능의 조합을 나타내며, 모두 증가된 LV 충만 압력으로 귀결된다. 초기 대 후기 확장기 경승모판 유속의 비 (E/A)는 확장기 기능을 평가하는 데 사용될 수 있다.
측정 (E/A) 이외에 확장기 기능장애를 추정하기 위한 다른 방식이 존재한다. 사용하기 위한 하나의 측정치는 초기 확장기 경승모판 혈류속도 대 초기 확장기 승모판 환상 조직 속도의 비 (E/e')이며, 이는 LV 충만 압력을 추정한다. 정상 (E/e')은 전형적으로 <15이고, 15 초과의 값은 상승된 LV 충만 압력 및 HFpEF를 시사한다. 따라서, 비 (E/e')는 또한 확장기 기능을 평가하는 데 사용될 수 있고, 확장기 기능장애가 심실 이완 장애로 인해 보다 큰 E/e' 비 및 이에 따라 보다 작은 e' 측정치 및 보다 큰 E 측정치를 야기하기 때문에 임상적으로 바람직하다. 초기 확장기 승모판 환상 조직 속도 대 후기 확장기 승모판 환상 조직 속도의 비 (e'/a')가 또한 측정될 수 있다.
마지막으로, 감속 시간 (DT, 또한 E 감속 시간으로 지칭됨)이 확장기 기능장애를 추정하는 데 사용될 수 있다. DT는 심장초음파상에서의 E-파의 피크로부터 그의 투영 기준선까지의 시간의 간격이다. 정상 환자에서의 E-파 감속 시간은 전형적으로 150 ms 내지 240 ms이다. DT는 좌심방과 좌심실 사이의 압력차를 평형화하기 위한 기간을 나타낸다.
확장기 기능장애의 이들 측정치는 중요한 진단 및 예후 의미를 갖지만, 이는 환자의 연령 및 나머지 심장초음파와 관련하여 확장기 기능을 기재하고 환자 관리를 안내하는 것으로 해석되어야 한다. 건강한 심장에서, 유의한 양의 LV 박출 및 LA 충만은 승모판륜의 심첨을 향한 하강으로부터 발생한다. 이러한 종축 운동은 보통 충만에 선행한다. 이러한 운동은 전반적 기능장애의 세팅에서 (모든 운동이 감소됨) 또는 LV 비대와 연관된 다양한 세팅에서 (수축은 종축 단축에서 방사상 비후로 이동함) 감소될 뿐만 아니라 지연될 수 있다.
심내막 또는 심막 질환의 부재 하에, 확장기 LV 기능장애는 증가된 심근 강성으로부터 발생한다. 심근 내의 2개의 구획은 그의 확장기 강성을 조절한다. 이들 구획은 세포외 매트릭스 및 심근세포이다. 하나의 구획 내의 강성 변화는 또한 기질세포 단백질을 통해 다른 구획으로 전달된다. 세포외 매트릭스의 강성은 대부분 콜라겐에 의해 그의 총량, 콜라겐 유형 I의 상대 존재비, 및 콜라겐 가교의 정도의 조절을 통해 결정되며, 이들은 모두 HFpEF에서 역할을 하는 것으로 생각된다. 콜라겐 침착에 더하여, 고유 심근세포 강성은 또한 HFpEF에서 확장기 LV 기능장애에 기여한다.
표 9. LV 확장기 기능을 평가하는 데 사용되는 변수
약어: A= 후기 (심방) 경승모판 펄스-파 도플러 유동; AF = 심방 세동; DT= 감속 시간; E = 초기 경승모판 펄스-파 도플러 유동; e' = 초기 승모판 환상 조직 도플러 속도; LA = 좌심방; LAP= 좌심방압; LV = 좌심실; LAVI = 체표면적에 대해 지수화된 좌심방 부피. TR= 삼첨판 역류 (Nagueh, S.F. et al., J Am Soc Echocardiogr., 2016, 29:277-314).
확장기 기능장애를 진단하기 위해 공개된 다중 세트의 가이드라인이 존재한다. 파라미터는 상이할 수 있지만, 모든 가이드라인은 HF의 징후 또는 증상의 존재, 정상 수축기 LV 기능의 증거, 및 확장기 기능장애의 증거 또는 LV 비대, LA 팽대, 심방 세동 또는 상승된 BNP 수준을 포함하는 대용물 마커를 필요로 한다. 미국 심장초음파검사 학회 및 유럽 심혈관 영상화 협회에 따르면, 확장기 기능장애는 특히 상기 측정에 기초하여 4가지 등급 또는 병기로 나뉠 수 있다. 표 10은 확장기 기능장애의 상이한 등급에 대한 예상된 발견의 요약을 제시한다. (Nagueh, S.F. et al., J Am Soc Echocardiogr., 2016, 29:277-314). 중요하게는, E/e' 비는 HFpEF로 의심되는 환자에서 확장기 기능장애의 등급을 결정하기 위해 측정될 수 있다. 등급 1 확장기 기능장애를 갖는 환자에서의 E/e' 값은 8 미만이다. 등급 2 확장기 기능장애를 갖는 환자에서의 E/e' 값은 8 내지 15이다. 등급 3 확장기 기능장애를 갖는 환자에서의 E/e' 값은 15 초과이다.
표 10. 확장기 기능장애의 병기/등급
약어: A= 후기 (심방) 경승모판 펄스-파 도플러 유동; AF = 심방 세동; DT= 감속 시간; E = 초기 경승모판 펄스-파 도플러 유동; e' = 초기 승모판 환상 조직 도플러 속도; LA = 좌심방; LAP= 좌심방압; LV = 좌심실; LAVI = 체표면적에 대해 지수화된 좌심방 부피; TR 속도 = 삼첨판 역류 속도. (Nagueh, S.F. et al., J Am Soc Echocardiogr., 2016, 29:277-314) 및 (Lekavich C. L. et al., Heart Fail Rev, 2015, 20:643-653).
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 환자는 확장기 기능장애를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람과 비교하여 좌심실 확장기 기능의 감소를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람과 비교하여 감소된 좌심실 이완을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자의 E/A 비가 측정된다. 일부 실시양태에서, 환자의 초기 확장기 경승모판 유속 대 후기 확장기 경승모판 유속의 비 (E/A)가 측정된다. 일부 실시양태에서, 환자의 심장 내 혈액 충만 속도는 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람과 비교하여 감소된다. 일부 실시양태에서, 환자는 수축 동안 심장의 심방이 박출하기 위한 증가된 양의 혈액 부피를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 심방 팽대를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람과 비교하여 E/A 비의 감소를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 유사한 연령 및 성별의 사람과 비교하여 증가된 좌심방압을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람과 비교하여 감소된 LV 충만 압력을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자의 초기 확장기 경승모판 혈류속도 대 초기 확장기 승모판 환상 조직 속도의 비 (E/e')가 측정된다. 일부 실시양태에서, 환자의 E/e' 비는 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람과 비교하여 증가된다. 일부 실시양태에서, 환자의 E/e' 비는 8 미만이다. 일부 실시양태에서, 환자의 E/e' 비는 8 내지 15이다. 일부 실시양태에서, 환자의 E/e' 비는 15 초과이다. 일부 실시양태에서, 환자의 초기 확장기 승모판 환상 조직 속도 대 후기 확장기 승모판 환상 조직 속도의 비 (e'/a')가 측정된다. 일부 실시양태에서, 환자의 감속 시간 (DT)이 측정된다. 일부 실시양태에서, 환자의 감속 시간은 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람과 비교하여 감소된다. 일부 실시양태에서, 환자의 감속 시간은 160 ms 미만이다. 일부 실시양태에서, 환자의 삼첨판 역류 속도 (TR 속도)가 측정된다. 일부 실시양태에서, 환자의 TR 속도는 일반적으로 증가된다. 일부 실시양태에서, 환자의 TR 속도는 일반적으로 2.8 m/sec 초과이다. 일부 실시양태에서, 환자의 좌심방 부피 지수 (LAVI)가 측정된다. 일부 실시양태에서, 환자의 LAVI는 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람과 비교하여 증가된다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 확장기 기능장애를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 좌심실 확장기 기능을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 좌심실 이완을 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 초기 확장기 경승모판 유속 대 후기 확장기 경승모판 유속의 비 (E/A)를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 일반적으로 환자의 E/A 비를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 초기 확장기 승모판 환상 조직 속도 대 후기 확장기 승모판 환상 조직 속도의 비 (e'/a')를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 일반적으로 환자의 e'/a' 비를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 심장에서 환자의 감속 시간 (DT)을 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 일반적으로 심장에서 환자의 감속 시간 (DT)을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 일반적으로 환자의 DT를 160 ms 미만으로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심장 내 혈액 충만 속도를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 수축 동안 심장의 심방이 박출하는 환자의 혈액 부피의 양을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 좌심실 이완을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 좌심방압을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 심방 팽대를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 LV 충만 압력을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 일반적으로 환자의 TR 속도를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 일반적으로 환자의 TR 속도를 2.8 m/sec 미만으로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 좌심방 부피 지수 (LAVI) 측정치를 감소시킨다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 환자의 초기 확장기 경승모판 혈류속도 대 초기 확장기 승모판 환상 조직 속도 (E/e')의 비를 (예를 들어, 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100%만큼) 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 5%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 10%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 15%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 20%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 25%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 30%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 35%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 40%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 45%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 50%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 55%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 60%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 65%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 70%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 75%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 80%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 85%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 90%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 95%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 100%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 환자의 초기 확장기 경승모판 혈류속도 대 초기 확장기 승모판 환상 조직 속도 (E/e')의 비를 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 35, 40, 45, 또는 50만큼) 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 1만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 2만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 3만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 4만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 5만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 6만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 7만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 8만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 9만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 10만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 11만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 12만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 13만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 14만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 15만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 16만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 17만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 18만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 19만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 20만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 25만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 30만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 35만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 40만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 45만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 E/e' 비를 적어도 50만큼 감소시키는 것에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 환자의 확장기 기능장애 등급은 정상이다. 일부 실시양태에서, 확장기 기능장애의 정상 등급은 E/A 1 내지 2, E/e' <8, 정상 좌심방 부피 지수 (LAVI), 및 감속 시간 (DT) <160 ms를 포함하며, 여기서 정상은 환자와 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 환자의 확장기 기능장애 병기는 등급 1이다. 일부 실시양태에서, 등급 1 확장기 기능장애는 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람에 비해 이완 장애로 인한 E/A < 1, E/e' <8, 정상 또는 증가된 LAVI, 및 증가된 감속 시간을 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자의 확장기 기능장애 병기는 등급 2이다. 일부 실시양태에서, 등급 2 확장기 기능장애는 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람에 비해 E/A 1 내지 2, E/e' 8 내지 15, 증가된 LAVI, 및 감소된 감속 시간을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증가된 E/e' 및/또는 증가된 LA 크기는 등급 1로부터 등급 2의 진단을 확증한다. 일부 실시양태에서, 환자의 확장기 기능장애 병기는 등급 3이다. 일부 실시양태에서, 등급 3 확장기 기능장애는 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람에 비해 E/A > 2, E/e' 15 초과, 증가된 LAVI, 및 심하게 감소된 LV 탄성 및 높은 LV 충만 압력으로 인한 매우 짧은 E 감속 시간 (< 140 ms)을 포함한다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 환자의 확장기 기능장애 등급을 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 확장기 기능장애 등급을 등급 3에서 등급 2로 개선시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 확장기 기능장애 등급을 등급 3에서 등급 1로 개선시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 확장기 기능장애 등급을 등급 3에서 정상으로 개선시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 확장기 기능장애 등급을 등급 2에서 등급 1로 개선시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 확장기 기능장애 등급을 등급 2에서 정상으로 개선시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 확장기 기능장애 등급을 등급 1에서 정상으로 개선시키는 것에 관한 것이다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 환자의 LV 확장기 기능을 (예를 들어, 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%만큼) 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 LV 확장기 기능을 적어도 5%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 LV 확장기 기능을 적어도 10%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 LV 확장기 기능을 적어도 15%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 LV 확장기 기능을 적어도 20%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 LV 확장기 기능을 적어도 25%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 LV 확장기 기능을 적어도 30%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 LV 확장기 기능을 적어도 35%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 LV 확장기 기능을 적어도 40%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 LV 확장기 기능을 적어도 45%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 LV 확장기 기능을 적어도 50%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 LV 확장기 기능을 적어도 55%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 LV 확장기 기능을 적어도 60%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 LV 확장기 기능을 적어도 65%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 LV 확장기 기능을 적어도 70%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 LV 확장기 기능을 적어도 75%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 LV 확장기 기능을 적어도 80%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 LV 확장기 기능을 적어도 85%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 LV 확장기 기능을 적어도 90%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 LV 확장기 기능을 적어도 95%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 LV 확장기 기능을 100%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다.
수축기 기능
심장근의 전반적 휴식기 수축기 기능은 전형적으로 건강한 노화로 인해 변하지 않는다. 일반적으로 가장 흔히 사용되는 LV 수축기 성능의 척도인 LV 박출 계수는 전형적으로 노화 동안 보존된다 (즉, HFpEF). 수축기 기능에 대한 효과는 통상적으로 운동 동안 관찰가능한 심장 예비력의 연령-연관 감소에 의해 반영된다. 연구는 HFpEF에서 기저 수축성의 경미한 제한조차도 운동 스트레스 세팅에서 보다 문제가 될 수 있으며, 여기서 수축성을 증진시키는 것의 불능은 심장 박출 예비력 장애, 운동 불내성의 보다 중증 증상, 및 감소된 유산소 능력과 연관될 수 있음을 제시하였다. 이러한 감소에 수반되는 인자는 심근 수축성의 감소, 및 운동 동안 달성되는 최대 심박수 및 최대 박출 계수의 감소를 포함한다. 감소된 심장 기능 예비력은 일반적으로 심부전과 연관된다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 환자는 정상 수축기 기능을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 수축기 기능에 변화가 없다. 일부 실시양태에서, 환자는 운동 동안 관찰가능한 심장 예비력에서의 연령-연관 감소를 갖는다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 수축기 기능을 개선시킨다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 환자는 적어도 50% (예를 들어, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100%)의 박출 계수를 갖는다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 50%의 박출 계수를 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 55%의 박출 계수를 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 60%의 박출 계수를 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 65%의 박출 계수를 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 70%의 박출 계수를 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 75%의 박출 계수를 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 80%의 박출 계수를 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 85%의 박출 계수를 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 90%의 박출 계수를 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 95%의 박출 계수를 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 100%의 박출 계수를 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 박출 계수는 우심실 박출 계수이다. 일부 실시양태에서, 박출 계수는 좌심실 박출 계수이다. 일부 실시양태에서, 박출 계수는 심장초음파상을 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, 환자는 보존된 좌심실 박출 계수를 갖는다.
심장 박출량
일반적으로, 휴식 시 정상 심장 박출량은 약 2.5-4.2 L/분/m2이고, 심장 박출량은 정상 한계로부터 벗어나지 않으면서 거의 40%만큼 저하될 수 있다. 약 2.5 L/분/m2 미만의 낮은 심장 지수는 통상적으로 심혈관 성능의 장애를 나타낸다. 특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 환자의 심장 박출량을 (예를 들어, 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%만큼) 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심장 박출량을 적어도 5%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심장 박출량을 적어도 10%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심장 박출량을 적어도 15%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심장 박출량을 적어도 20%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심장 박출량을 적어도 25%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심장 박출량을 적어도 30%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심장 박출량을 적어도 35%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심장 박출량을 적어도 40%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심장 박출량을 적어도 45%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심장 박출량을 적어도 50%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심장 박출량을 적어도 55%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심장 박출량을 적어도 60%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심장 박출량을 적어도 65%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심장 박출량을 적어도 70%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심장 박출량을 적어도 75%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심장 박출량을 적어도 80%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심장 박출량을 적어도 85%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심장 박출량을 적어도 90%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심장 박출량을 적어도 95%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심장 박출량을 100%만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심장 박출량을 적어도 4.2 L/분/m2로 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 심장 박출량은 휴식 시에 측정된다. 일부 실시양태에서, 심장 박출량은 우심 카테터를 사용하여 측정된다.
전기적 기능
심장 전도 시스템에서, 노화는 동심방 결절에서 박동조율 세포의 활력 감소와 연관된다. 박동조율 세포의 수의 현저한 감소는 60세 이후에 발생한다. 75세에는, 청소년에서 관찰되는 박동조율 세포의 수의 10% 미만이 남아있다. 심장 골격의 좌측 상의 가변적 정도의 석회화가 또한 노화에 따라 발생한다. 이들 전도 시스템 변화는 고령에서의 동 기능장애의 증가된 발생률에 의해 반영되고, 심계항진, 어지럼증, 지속적인 피로 및 혼란을 동반한 실신에 의해 그 자체로 나타난다. 또한, 조직 재형성은 방실 결절, His 다발 및 다발 가지의 기능에 영향을 미친다. 심방 및 심실의 탈분극 및 재분극에서 생성된 변화는 심전도 (ECG) 측정에서 연령-연관 변화에 의해 반영된다. 심장초음파상 측정에서의 변화는 P-파 지속기간, P-R 간격 및 Q-T 간격, 및 T-파 전압의 증가 및 QRS 축의 좌측 이동을 포함한다. 방실 전도를 나타내는 P-R 간격은 일반적으로 20-35세에 159 ms에서 60세 초과에 172 ms로 증가한다. QRS 축은, 가능하게는 LV 벽 두께의 증가로 인해 좌측으로 이동하고, 건강한 대상체의 20%는 100세까지 좌측 축 치우침을 갖는다. 흥미롭게도, 증가된 LV 두께에도 불구하고, 40세까지 명백한 노화에 따른 R- 및 S-파 진폭의 감소가 존재한다. 또한, 심방 및 심실 이소성 박동 둘 다의 유병률이 증가한다.
표 11. 휴식기 ECG 측정에서의 정상 연령-연관 변화
(Strait and Lakatta, Heart Fail Clin, 2012, 8:143-164).
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 환자는 심전도검사를 사용하여 심부전에 대해 평가된다. 일부 실시양태에서, 환자는 박동조율 세포의 수의 감소를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 심전도 상 P-파 지속기간의 증가를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 심전도 상 P-R 간격의 증가를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 심전도 상 Q-T 간격의 증가를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 심전도 상 T-파 전압의 감소를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 심전도 상 QRS 축의 좌측 이동을 갖는다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 심전도검사 측정치를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자에 존재하는 박동조율 세포의 수를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 심전도 상 P-파 지속기간을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 심전도 상 P-R 간격을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 심전도 상 Q-T 간격을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 심전도 상 T-파 전압을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 심전도 상 QRS 축을 정상 위치로 이동시킨다.
나트륨이뇨 펩티드
나트륨이뇨 펩티드 (NP), 예컨대 BNP 및 NT-프로BNP의 혈장 농도는, 특히 심장초음파검사가 즉시 이용가능하지 않은 비-급성 세팅에서 초기 진단 시험으로서 사용될 수 있다. 상승된 NP는 추가의 심장 조사를 필요로 하는 자를 확인하는 초기 작업 진단을 확립하는 것을 돕는다. 중요한 심장 기능장애의 배제에 대한 컷오프 포인트 미만의 값을 갖는 환자는 전형적으로 심장초음파검사를 필요로 하지 않는다. 특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 환자는 1종 이상의 나트륨이뇨 펩티드의 상승된 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 방법은 심부전을 갖는 환자를 치료하는 것에 관한 것이며, 여기서 환자는 상승된 수준의 BNP를 갖는다. 일부 실시양태에서, 방법은 심부전을 갖는 환자를 치료하는 것에 관한 것이며, 여기서 환자는 상승된 수준의 NT-프로BNP를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자 NP (예를 들어, BNP 및/또는 NT-프로BNP)는 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람과 비교하여 상승된다.
BNP 및 NT-프로BNP 둘 다는 증가된 심장내 압력으로 인한 심방 및 심실 팽만의 마커이다. 뉴욕 심장 협회 (NYHA)는 증상의 중증도에 기초하여 울혈성 심부전 (CHF)에 대한 4-병기 기능적 분류 시스템을 개발하였다. 연구는 순환 BNP 및 NT-프로BNP의 측정된 농도가 NYHA 분류에 기초한 CHF의 중증도에 따라 증가한다는 것을 입증하였다.
정상 혈장 NP 농도를 갖는 환자는 HF를 가질 가능성이 없다. B-유형 나트륨이뇨 펩티드 (BNP)에 대한 비-급성 세팅에서 정상의 상한은 35 pg/mL이고, N-말단 프로-BNP (NT-프로BNP)에 대해서는 125 pg/mL이며; 급성 세팅에서는 보다 높은 값이 사용되어야 한다 [예를 들어, BNP , 100 pg/mL; NT-프로BNP, 300 pg/mL; 및 중간-영역 프로 A-유형 나트륨이뇨 펩티드 (MR-프로ANP), 120 pmol/L]. 진단 값은 HFrEF 및 HFpEF에 유사하게 적용된다. 평균적으로, 값은 전형적으로 HFrEF보다 HFpEF에 대해 더 낮다.
HF에서 그의 진단 유용성을 약화시킬 수 있는 상승된 NP의 수많은 심혈관 및 비-심혈관 원인이 존재한다. 이들 중에서, AF, 연령 및 신부전은 NP 측정의 해석을 방해하는 가장 중요한 인자이다. 다른 한편으로는, NP 수준은 비만 환자에서 불균등하게 낮을 수 있다.
BNP
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 환자는 상승된 수준의 BNP를 갖는다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 35 pg/mL의 BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 40 pg/mL의 BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 50 pg/mL의 BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 60 pg/mL의 BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 70 pg/mL의 BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 80 pg/mL의 BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 90 pg/mL의 BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 100 pg/mL의 BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 150 pg/mL의 BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 200 pg/mL의 BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 300 pg/mL의 BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 400 pg/mL의 BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 500 pg/mL의 BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1000 pg/mL의 BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 5000 pg/mL의 BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 10,000 pg/mL의 BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 15,000 pg/mL의 BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 20,000 pg/mL의 BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 심부전 환자의 1종 이상의 나트륨이뇨 펩티드의 보다 정상 수준 (예를 들어, 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람과 비교하여 정상)으로의 조정을 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 심부전 환자의 1종 이상의 나트륨이뇨 펩티드를 보다 정상 수준 (예를 들어, 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람과 비교하여 정상)으로 조정하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 5 pg/mL만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 10 pg/mL만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 50 pg/mL만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 100 pg/mL만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 200 pg/mL만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 500 pg/mL만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 1000 pg/mL만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 5000 pg/mL만큼 감소시키는 것에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 5% (예를 들어, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100%)만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 5%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 10%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 15%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 20%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 25%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 30%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 35%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 40%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 45%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 50%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 55%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 60%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 65%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 70%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 75%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 80%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 85%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 90%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 적어도 95%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 BNP를 100%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다.
NT-프로BNP
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 환자는 적어도 100 pg/mL (예를 들어, 100, 125, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 3000, 5000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000, 또는 30,000 pg/mL)의 NT-프로BNP 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 100 pg/mL의 NT-프로BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 125 pg/mL의 NT-프로BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 150 pg/mL의 NT-프로BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 200 pg/mL의 NT-프로BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 300 pg/mL의 NT-프로BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 400 pg/mL의 NT-프로BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 500 pg/mL의 NT-프로BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 1000 pg/mL의 NT-프로BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 5000 pg/mL의 NT-프로BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 10,000 pg/mL의 NT-프로BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 15,000 pg/mL의 NT-프로BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 20,000 pg/mL의 NT-프로BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 25,000 pg/mL의 NT-프로BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 30,000 pg/mL의 NT-프로BNP 수준을 갖는 환자에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 심부전 환자의 1종 이상의 나트륨이뇨 펩티드의 보다 정상 수준 (예를 들어, 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람과 비교하여 정상)으로의 조정을 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 심부전 환자의 1종 이상의 나트륨이뇨 펩티드를 보다 정상 수준 (예를 들어, 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람과 비교하여 정상)으로 조정하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 10 pg/mL만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 25 pg/mL만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 50 pg/mL만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 100 pg/mL만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 200 pg/mL만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 500 pg/mL만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 1000 pg/mL만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 5000 pg/mL만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 10,000 pg/mL만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 15,000 pg/mL만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 20,000 pg/mL만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 25,000 pg/mL만큼 감소시키는 것에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 5% (예를 들어, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100%)만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 5%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 10%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 15%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 20%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 25%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 30%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 35%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 40%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 45%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 50%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 55%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 60%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 65%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 70%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 75%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 80%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 85%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 90%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 적어도 95%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 NT-프로BNP를 100%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다.
트로포닌 수준
트로포닌 또는 트로포닌 복합체는 골격근 및 심장근에서 근육 수축에 필수적이지만 평활근에서는 그렇지 않은, 3종의 조절 단백질 (트로포닌 C, 트로포닌 I, 및 트로포닌 T)의 복합체이다. 혈액 트로포닌 수준은 졸중에 대한 진단 마커로서 사용될 수 있지만, 이러한 측정의 민감도는 낮다. 심장-특이적 트로포닌 I 및 T의 측정은 심근경색 및 급성 관상동맥 증후군의 관리에서 진단 및 예후 지표로서 광범위하게 사용된다.
트로포닌의 특정 하위유형 (심장 I 및 T)은 심장근 (심근)에 대한 손상의 민감하고 특이적인 지표이다. 이는 흉통 또는 급성 관상동맥 증후군을 갖는 사람에서 불안정형 협심증과 심근경색 (심장 발작)을 구별하기 위해 혈액에서 측정된다. 최근 심근경색을 앓았던 사람은 손상된 심장근 영역 및 혈중 상승된 심장 트로포닌 수준을 가질 것이다. 이는 또한 심장 혈관의 중증 수축을 수반하는 심근경색의 유형인 관상동맥 혈관연축을 갖는 사람에서도 발생할 수 있다. 심근경색 후, 트로포닌은 최대 2주 동안 높게 유지될 수 있다.
심장 트로포닌은 심장근 손상의 마커이다. 심근경색을 나타내는 상승된 트로포닌에 대한 진단 기준은 현재 WHO에 의해 2 μg 이상의 역치로 설정되어 있다. 다른 심장 바이오마커, 예컨대 크레아틴 키나제의 임계 수준이 또한 관련된다. 심장근 손상 및 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 유발하는 다른 상태, 예컨대 신부전도 또한 트로포닌 수준을 증가시킬 수 있다. 또한 예를 들어 정상 관상 동맥을 갖는 개체에서의 중증 빈맥 (예를 들어 심실상성 빈맥으로 인함)도 증가된 트로포닌으로 이어질 수 있고, 이는 증가된 산소 요구량 및 심장근으로의 불충분한 공급으로 인한 것으로 가정된다.
트로포닌은 심부전을 갖는 환자에서 증가되며, 여기서 이는 또한 사망률 및 심실 리듬 이상을 예측한다. 이는 염증성 상태, 예컨대 심장근 침범을 갖는 심근염 및 심막염 (이에 이는 심근심막염으로 지칭됨)에서 발생할 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 환자는 상승된 수준의 트로포닌을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 심부전 환자의 1종 이상의 파라미터의 보다 정상 수준 (예를 들어, 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람과 비교하여 정상)으로의 조정을 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 심부전 환자의 1종 이상의 파라미터를 보다 정상 수준 (예를 들어, 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람과 비교하여 정상)으로 조정하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 트로포닌 수준을 적어도 1% (예를 들어, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100%)만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 트로포닌 수준을 적어도 1%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 트로포닌 수준을 적어도 5%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 트로포닌 수준을 적어도 10%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 트로포닌 수준을 적어도 15%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 트로포닌 수준을 적어도 20%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 트로포닌 수준을 적어도 25%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 트로포닌 수준을 적어도 30%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 트로포닌 수준을 적어도 35%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 트로포닌 수준을 적어도 40%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 트로포닌 수준을 적어도 45%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 트로포닌 수준을 적어도 50%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 트로포닌 수준을 적어도 55%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 트로포닌 수준을 적어도 60%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 트로포닌 수준을 적어도 65%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 트로포닌 수준을 적어도 70%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 트로포닌 수준을 적어도 75%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 트로포닌 수준을 적어도 80%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 트로포닌 수준을 적어도 85%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 트로포닌 수준을 적어도 90%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 트로포닌 수준을 적어도 95%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 트로포닌 수준을 100%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다.
운동 능력 (6MWD 및 BDI)
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이다. 운동 능력의 임의의 적합한 척도가 사용될 수 있다. 예를 들어, 환자가 6분 내에 얼마나 멀리 걸을 수 있는지를 측정하는 6-분 보행 시험 (6MWT)에서의 운동 능력, 즉 6-분 보행 거리 (6MWD)가 심부전 중증도 및 질환 진행을 평가하는 데 빈번하게 사용된다. 보르그 호흡곤란 지수 (BDI)는 지각되는 호흡곤란 (호흡 불편)을 평가하기 위한 수치 척도이다. 이는, 예를 들어 6MWT의 완료 후에 호흡곤란의 정도를 측정하며, 여기서 BDI 0은 호흡곤란이 없음을 나타내고 10은 최대 호흡곤란을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 방법은 심부전 (예를 들어, 노화와 연관된 심부전)을 갖는 환자에서 6MWD를 적어도 10 미터만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 심부전 (예를 들어, 노화와 연관된 심부전)을 갖는 환자에서 6MWD를 적어도 30 미터만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 심부전 (예를 들어, 노화와 연관된 심부전)을 갖는 환자에서 6MWD를 적어도 40 미터만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 심부전 (예를 들어, 노화와 연관된 심부전)을 갖는 환자에서 6MWD를 적어도 60 미터만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 심부전 (예를 들어, 노화와 연관된 심부전)을 갖는 환자에서 6MWD를 적어도 70 미터만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 심부전 (예를 들어, 노화와 연관된 심부전)을 갖는 환자에서 6MWD를 적어도 80 미터만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 심부전 (예를 들어, 노화와 연관된 심부전)을 갖는 환자에서 6MWD를 적어도 90 미터만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 심부전 (예를 들어, 노화와 연관된 심부전)을 갖는 환자에서 6MWD를 적어도 100 미터만큼 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 6MWD는 환자가 본원에 개시된 것을 이용한 4주 치료를 받은 후에 시험된다. 일부 실시양태에서, 6MWD는 환자가 본원에 개시된 것을 이용한 8주 치료를 받은 후에 시험된다. 일부 실시양태에서, 6MWD는 환자가 본원에 개시된 것을 이용한 12주 치료를 받은 후에 시험된다. 일부 실시양태에서, 6MWD는 환자가 본원에 개시된 것을 이용한 16주 치료를 받은 후에 시험된다. 일부 실시양태에서, 6MWD는 환자가 본원에 개시된 것을 이용한 20주 치료를 받은 후에 시험된다. 일부 실시양태에서, 6MWD는 환자가 본원에 개시된 것을 이용한 22주 치료를 받은 후에 시험된다. 일부 실시양태에서, 6MWD는 환자가 본원에 개시된 것을 이용한 24주 치료를 받은 후에 시험된다. 일부 실시양태에서, 6MWD는 환자가 본원에 개시된 것을 이용한 26주 치료를 받은 후에 시험된다. 일부 실시양태에서, 6MWD는 환자가 본원에 개시된 것을 이용한 28주 치료를 받은 후에 시험된다.
일부 실시양태에서, 방법은 노화와 연관된 심부전을 갖는 환자에서 BDI를 적어도 0.5 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 노화와 연관된 심부전을 갖는 환자에서 BDI를 적어도 1 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 노화와 연관된 심부전을 갖는 환자에서 BDI를 적어도 1.5 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 노화와 연관된 심부전을 갖는 환자에서 BDI를 적어도 2 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 노화와 연관된 심부전을 갖는 환자에서 BDI를 적어도 2.5 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 노화와 연관된 심부전을 갖는 환자에서 BDI를 적어도 3 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 노화와 연관된 심부전을 갖는 환자에서 BDI를 적어도 3.5 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 노화와 연관된 심부전을 갖는 환자에서 BDI를 적어도 4 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 노화와 연관된 심부전을 갖는 환자에서 BDI를 적어도 4.5 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 노화와 연관된 심부전을 갖는 환자에서 BDI를 적어도 5 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 노화와 연관된 심부전을 갖는 환자에서 BDI를 적어도 5.5 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 노화와 연관된 심부전을 갖는 환자에서 BDI를 적어도 6 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 노화와 연관된 심부전을 갖는 환자에서 BDI를 적어도 6.5 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 노화와 연관된 심부전을 갖는 환자에서 BDI를 적어도 7 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 노화와 연관된 심부전을 갖는 환자에서 BDI를 적어도 7.5 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 노화와 연관된 심부전을 갖는 환자에서 BDI를 적어도 8 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 노화와 연관된 심부전을 갖는 환자에서 BDI를 적어도 8.5 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 노화와 연관된 심부전을 갖는 환자에서 BDI를 적어도 9 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 노화와 연관된 심부전을 갖는 환자에서 BDI를 적어도 9.5 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 노화와 연관된 심부전을 갖는 환자에서 BDI를 적어도 3 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 노화와 연관된 심부전을 갖는 환자에서 BDI를 10 지수 포인트만큼 저하시키는 것에 관한 것이다.
스트레스 확장기 시험
운동성 호흡곤란을 갖는 환자에서, 운동 혈류역학 반응은 휴식 시 LV 확장기 기능의 평가보다 더 많은 생리학적 및 진단적 정보를 제공한다. 따라서, 호흡곤란이 좌심실 확장기 기능장애의 결과임을 확인하기 위해 운동에 대한 혈류역학 반응을 평가하는 것은 도움이 된다. 2가지 유형의 확장기 스트레스 시험-침습적 및 심장초음파 시험이 존재한다. 침습적 확장기 스트레스 시험은 환자가 카테터삽입 테이블에 고정된 자전거 상에서 운동을 하는 동안 수행된다. 운동 동안, LV 충만 압력의 간접 파라미터인 폐 모세혈관 쐐기압의 변화를 우측 내경 정맥을 통한 우심 카테터삽입에 의해 평가하거나 또는 요골 동맥 접근 부위로부터 LV 내로 돼지꼬리형 카테터를 도입하는 것에 의해 평가한다. LV 수축기압, 최소 LV 압력, LV 확장 말기압, 및 평균 LV 확장기압을 측정한다. 비-침습적 측정은 펄스형 및 조직 도플러 파라미터 E/e'의 조합을 포함하며, 이는 전형적으로 LV 충만 압력을 결정하기 위해 측정된다. 미국 심장초음파검사 학회는, 특히, 확장기 스트레스 시험이 이들 파라미터: (i) 휴식 시 중격 e' 속도 < 7 cm/s 또는 외측 e' 속도 < 10 cm/s; (ii) 운동 시 평균 E/e' > 14 또는 중격 E/e' 비 > 15; (iii) 운동 시 피크 삼첨판 역류 (TR) 속도 > 2.8 m/s, 및 (iv) 좌심방 부피 지수 (LAVI) > 34 mL/m2의 존재 하에서는 비정상적인 것으로 간주되어야 함을 제안하였다. 운동 동안 E/e' 및 TR > 2.8 m/s의 조합은 HFpEF의 검출에 감수성인 것으로 나타났다. 또한, E/e'의 상승은 감소된 산소 소모와 관련이 있는 반면, 증가된 E/e' 및 TR 속도의 조합은 운동 동안의 상승된 NT-프로BNP 값과 연관되는 것으로 나타났다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 환자는 스트레스 확장기 시험을 사용하여 확장기 기능장애에 대해 평가된다. 일부 실시양태에서, 확장기 스트레스 시험은 카테터삽입 테이블에 고정된 자전거 상에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 확장기 스트레스 시험은 심장초음파검사를 사용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 비정상적 확장기 스트레스 시험을 받은 환자는 휴식 시 중격 e' 속도 < 7 cm/s 또는 외측 e' 속도 < 10 cm/s, 운동 시 평균 E/e' > 14 또는 중격 E/e' 비 > 15, 운동 시 피크 삼첨판 역류 (TR) 속도 > 2.8 m/s, 및 좌심방 부피 지수 (LAVI) > 34 mL/m2를 포함하는 파라미터를 갖는다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 환자의 스트레스 확장기 시험 결과를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 확장기 스트레스 시험에 의해 보고된 바와 같이 환자의 확장기 기능을 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 휴식 시 중격 e' 속도를 > 7 cm/s로 또는 외측 e' 속도를 > 10 cm/s로 증가시키고, 운동 시 평균 E/e'를 14 미만으로 또는 중격 E/e' 비를 15 미만으로 감소시키고, 운동 시 피크 삼첨판 역류 (TR) 속도를 < 2.8 m/s로 감소시키고, 좌심방 부피 지수 (LAVI)를 < 34 mL/m2로 감소시킨다.
H2FPEF 점수
노화와 연관된 심부전을 비롯한 의심되는 HFpEF를 갖는 환자에서, H2FPEF 점수는 호흡곤란의 비심장 원인 대비 HFpEF의 확률을 추정하는 데 사용될 수 있다. 호흡곤란은 고령 심부전 환자에서 심부전의 흔한 징후이다. 메이요 클리닉(Mayo Clinic)의 그룹은 하기 임상 변수에 할당된 포인트의 합계인 H2FPEF 점수를 개발하고 임상적으로 검증하였다: 무거움 (예를 들어, 체질량 지수 >30 kg/m2 = 2포인트); 고혈압 (예를 들어, 환자가 2종 이상의 항고혈압 의약을 복용하고 있음 = 1포인트); 동맥 세동 (AF) (예를 들어, 발작성 또는 지속성 = 3포인트); 폐고혈압 (PH) (예를 들어, 심장초음파검사에 의한 폐동맥 수축기압 >35 mm Hg = 1포인트); 노인 (예를 들어, 환자의 연령이 >60세 = 1포인트); 및 충만 압력 (예를 들어, 심장초음파검사 측정 E/e' >9 = 1포인트). HFpEF가 환자에서의 증상의 원인일 확률은 총 H2FPEF 점수 (최저 0 내지 최고 9의 범위)가 증가함에 따라 증가한다. 고령 (예를 들어, 환자가 60세 이상임) 인자 단독은 H2FPEF 점수를 구성하는 총 9포인트 중 1포인트이다. 0 또는 1의 낮은 H2FPEF 점수는 환자에서의 낮은 (예를 들어, <25 퍼센트) HFpEF 확률과 연관된다. 낮은 점수는 증상이 비심장 원인으로 인한 것일 가능성이 가장 크다는 것을 시사한다. 그러나, 증상의 원인이 비심장 원인에 대한 평가 후에 불확실하게 남아있는 경우에, HFpEF가 존재하는지를 결정하기 위해 심장학 상담 및 우심 카테터삽입이 제안된다. 2 내지 5의 중간 H2FPEF 점수는 중간 (예를 들어, 40 내지 80 퍼센트) HFpEF 확률과 연관된다. 중간 점수 환자에서, 나트륨이뇨 펩티드 수준이 높은지 (예를 들어, 뇌 나트륨이뇨 펩티드 (BNP) >100 pg/mL 또는 N-말단 프로BNP (NT-프로BNP) >300 pg/mL), 및 유의한 폐 질환이 부재하는지 결정하기 위해 평가를 수행한다. 둘 다의 기준이 만족되면, 임상 소견은 HFpEF 진단이다. 기준 중 하나 또는 둘 다가 충족되지 않는 경우에, 전형적으로 더 많은 정보를 수집하기 위해 심장학 상담 및 우심 카테터삽입이 수행된다. 우심 카테터삽입에서, 휴식 시 ≥15 mmHg 또는 운동 동안 ≥25 mmHg의 폐 모세혈관 쐐기압 (PCWP)으로 HFpEF를 진단한다. 6 이상의 H2FPEF 점수는 90 퍼센트 초과의 HFpEF 확률과 연관되고, 따라서 HFpEF에 대한 진단으로 간주된다. H2FPEF 점수의 2가지 성분은 도플러 심장초음파검사로부터 유래된다: 추정 폐동맥 수축기압 (PASP) 및 E/e' 비. 심장초음파검사에 의한 추정 PASP의 상승은 HFpEF를 갖는 환자에서 매우 흔하고, 호흡곤란을 갖는 노인 환자에서 상승된 PASP의 확인은 HFpEF의 진단에 대한 고려를 촉발할 것이다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 환자는 H2FPEF 점수를 사용하여 HFpEF에 대해 평가된다. 일부 실시양태에서, 환자의 H2FPEF 점수는 0이다. 일부 실시양태에서, 환자의 H2FPEF 점수는 1이다. 일부 실시양태에서, 환자의 H2FPEF 점수는 2이다. 일부 실시양태에서, 환자의 H2FPEF 점수는 3이다. 일부 실시양태에서, 환자의 H2FPEF 점수는 4이다. 일부 실시양태에서, 환자의 H2FPEF 점수는 5이다. 일부 실시양태에서, 환자의 H2FPEF 점수는 6이다. 일부 실시양태에서, 환자의 H2FPEF 점수는 7이다. 일부 실시양태에서, 환자의 H2FPEF 점수는 8이다. 일부 실시양태에서, 환자의 H2FPEF 점수는 9이다. 일부 실시양태에서, 환자의 H2FPEF 점수는 약 0 내지 약 1이다. 일부 실시양태에서, 환자의 H2FPEF 점수는 약 2 내지 약 5이다. 일부 실시양태에서, 환자의 H2FPEF 점수는 약 6 내지 약 9이다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 환자의 H2FPEF 점수를 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9포인트만큼) 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 H2FPEF 점수를 적어도 1포인트만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 H2FPEF 점수를 적어도 2포인트만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 H2FPEF 점수를 적어도 3포인트만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 H2FPEF 점수를 적어도 4포인트만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 H2FPEF 점수를 적어도 5포인트만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 H2FPEF 점수를 적어도 6포인트만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 H2FPEF 점수를 적어도 7포인트만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 H2FPEF 점수를 적어도 8포인트만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 H2FPEF 점수를 적어도 9포인트만큼 감소시키는 것에 관한 것이다.
우심 카테터삽입
우심 카테터삽입 (때때로 폐 카테터삽입으로 불림)은 HFpEF의 진단 및 평가를 위해 보편적으로 요구되지는 않는다. 그러나, 중간 H2FPEF 점수를 갖는 선택된 환자 (및 증상의 원인이 결정되지 않은 낮은 H2FPEF 점수를 갖는 선택된 환자)에서, 우심 카테터삽입은 HFpEF의 진단을 행하거나 배제하는 것을 돕기 위해 휴식 시 및 운동 동안 심장 충만 압력을 평가하는 데 유용하다. 우심 카테터삽입은 심장이 얼마나 잘 펌핑하는지 (예를 들어, 분당 얼마나 많이 펌핑하는지)를 관찰하고 심장 및 폐의 주요 혈관에서 혈압을 측정하는 데 사용되는 시험이다. 우심 카테터삽입은 동맥에서 차단을 체크하는 데 사용되는 좌심 카테터삽입 (관상 혈관조영)과 상이하다. 우심 카테터삽입에서, 폐동맥 (PA) 카테터는 심장의 우측으로, 및 폐로 혈액을 운반하는 주요 동맥인 폐동맥 내로 안내된다. 심장을 통한 혈류를 관찰하고, 심장 및 폐 내부의 압력을 측정할 수 있다. 카테터가 폐동맥을 향해 전진함에 따라, 압력은 우심방 및 우심실을 포함한 심장의 우측 심방실 내부에서, 길을 따라 측정된다. 심장의 좌측의 압력의 간접 측정이 또한 측정될 수 있다. 심장 박출량 (예를 들어, 분당 심장이 펌핑하는 혈액의 양)이 또한 결정된다. 휴식 시 ≥15 mmHg 또는 운동 동안 ≥25 mmHg의 폐 모세혈관 쐐기압 (PCWP)으로 HFpEF를 진단한다. 일부 실시양태에서, 환자는 우심 카테터삽입을 사용하여 심부전에 대해 평가된다. 일부 실시양태에서, 환자는 우심 카테터삽입을 사용하여 HFpEF로 진단된다. 일부 실시양태에서, 우심 카테터삽입에 의해 측정된, 휴식 시 PCWP가 ≥15 mmHg인 대상체는 HFpEF를 갖는다. 일부 실시양태에서, 우심 카테터삽입에 의해 측정된, 운동 동안 PCWP가 ≥25 mmHg인 대상체는 HFpEF를 갖는다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 폐 모세혈관 쐐기압 (PCWP)을 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 휴식 시 PCWP를 적어도 15 mm Hg 미만으로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 운동 동안 PCWP를 적어도 25 mm Hg 미만으로 감소시킨다.
HFpEF 진단을 위한 유럽 심장 학회 (ESC) 심부전 협회 (HFA) 기준
유럽 심부전 협회는 최근에 HFpEF의 진단에 대한 합의 및 제안된 기준을 공개하였다 (표 12). 이러한 합의는 임상 평가로부터 보다 구체적인 시험까지 단계적 진단 접근법을 제공하는 것을 목표로 하였다. 기준을 3개의 군으로 분리하였다: 기능적, 형태학적, 및 바이오마커. 주요 기능 기준은 LV 확장기 기능장애의 평가를 위한 가이드라인에서 제안된 심장초음파 파라미터를 포함하였다 (감소된 중격 e', 증가된 E/e', 및 증가된 TR) (또한 표 10 참조). 부차적 기능 기준은 중간 값의 E/e' 및 감소된 LV 전반적 종축 변형 (< - 16%)을 포함하였다. 주요 형태학적 기준은 확장된 좌심방 부피 지수 (LAVI 동성 리듬에서 ≥ 34 ml/m2 및 심방 세동에서 ≥ 40 ml/m2) 또는 증가된 상대 벽 두께 ≥ 0.42와 함께 LV 질량 지수 (LVMI) 남성에서 ≥ 149 g/m2 또는 여성에서 ≥ 122 g/m2로 정의되는 좌심실 비대를 포함한다. 흥미롭게도, 부차적 형태학적 기준은 LA 부피 지수의 높은 정상 값 (동성 리듬에서 29-34 ml/m2 및 심방 세동에서 ≥ 34-40 ml/m2), 현행 심장초음파 가이드라인에 의해 정의된 증가된 LV 질량 지수 (남성에서 ≥ 115 g/m2 또는 여성에서 ≥ 95 g/m2), 또는 상대 벽 두께 ≥ 0.42 또는 LV 벽 두께 ≥ 12 mm였다. 주요 및 부차적 바이오마커 기준은 동성 리듬 및 심방 세동을 갖는 환자에 대한 다양한 컷오프 값을 갖는 상이한 수준의 BNP 및 프로-BNP를 지칭한다 (값은 심방 세동 군에서 3배 더 높음). 각각의 군으로부터의 단지 1가지의 기준이 점수에 포함될 수 있다. ≥ 5포인트의 점수는 HFpEF를 나타낸다. 2-4포인트의 점수는 확장기 스트레스 시험 또는 침습적 혈류역학 측정이 추진되어야 함을 나타낸다. 1포인트 이하의 점수는 HFpEF의 진단 가능성이 없음을 나타낸다. (Pieske B., et al., Eur Heart J, 2019, 40:3297-3317) 및 (Tadic M. et al., Heart Failure Reviews, 2020, 10.1007/s10741-020-09966-4).
표 12. HFpEF를 진단하기 위한 유럽 심부전 협회 기준의 요약
약어: BNP 뇌 나트륨이뇨 펩티드, HFpEF 보존된 박출 계수 심부전, E 및 e' 펄스형 및 조직 도플러에 의해 측정된 초기 확장기 승모판 유속, GLS 좌심실 전반적 종축 변형, LAVI 좌심방 부피 지수, LVMI 좌심실 질량 지수, RWT 상대 벽 두께. (Pieske B., et al., Eur Heart J, 2019, 40:3297-3317) 및 (Tadic M. et al., Heart Failure Reviews, 2020, 10.1007/s10741-020-09966-4).
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 환자는 유럽 심부전 협회 (EHFA) 기준을 사용하여 HFpEF에 대해 평가된다.
일부 실시양태에서, 환자는 유럽 심부전 협회 (EHFA) 점수가 0이다. 일부 실시양태에서, 환자는 EHFA 점수가 1이다. 일부 실시양태에서, 환자는 EHFA 점수가 2이다. 일부 실시양태에서, 환자는 EHFA 점수가 3이다. 일부 실시양태에서, 환자는 EHFA 점수가 4이다. 일부 실시양태에서, 환자는 EHFA 점수가 5이다. 일부 실시양태에서, 환자는 EHFA 점수가 6이다. 일부 실시양태에서, 환자는 EHFA 점수가 7이다. 일부 실시양태에서, 환자는 EHFA 점수가 8이다. 일부 실시양태에서, EHFA 점수가 ≥ 5포인트인 환자는 HFpEF로 진단된다. 일부 실시양태에서, EHFA 점수가 2 내지 4포인트인 환자는 HFpEF를 가질 수 있고, 확인을 위해 확장기 스트레스 시험 또는 침습적 혈류역학 측정을 필요로 한다. 일부 실시양태에서, EHFA 점수가 1포인트 이하인 환자는 HFpEF를 가질 가능성이 없다.
일부 실시양태에서, 환자는 HFpEF에 대한 1종 이상의 주요 EHFA 기준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 HFpEF에 대한 1종 이상의 주요 기능적 EHFA 기준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 주요 기능적 기준은 중격 e' 속도 < 7 cm/s, 휴식 시 외측 e' 속도 < 10 cm/s, 운동 시 평균 E/e' > 14 또는 중격 E/e' 비 > 15 및 운동 시 TR 속도 > 2.8 m/s로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 환자는 중격 e' 속도 < 7 cm/s를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 휴식 시 < 10 cm/s의 외측 e' 속도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 운동 시 평균 E/e' > 14 또는 중격 E/e' 비 > 15를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 운동 시 TR 속도 > 2.8 m/s를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 HFpEF에 대한 1종 이상의 주요 형태학적 EHFA 기준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 주요 형태학적 기준은 LAVI > 34 mL/m2 및 LVMI 남성의 경우 ≥ 149 g/m2 및 여성의 경우 ≥ 122 g/m2 및 RWT > 0.42로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 환자는 LAVI > 34 mL/m2를 갖는다. 일부 실시양태에서, 남성 환자는 LVMI ≥ 149 g/m2를 갖는다. 일부 실시양태에서, 여성 환자는 LAVI ≥ 122 g/m2를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 RWT > 0.42를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 HFpEF에 대한 1종 이상의 주요 바이오마커 EHFA 기준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 주요 바이오마커 기준은 동성 리듬으로, NT-프로BNP > 220 pg/mL 및/또는 BNP > 80 pg/mL이다. 일부 실시양태에서, 환자는 NT-프로BNP > 220 pg/mL 및/또는 BNP > 80 pg/mL를 갖는다. 일부 실시양태에서, 주요 바이오마커 기준은 심방 세동으로, NT-프로BNP > 660 pg/mL 및/또는 BNP > 240 pg/mL이다. 일부 실시양태에서, 환자는 NT-프로BNP > 660 pg/mL 또는 BNP > 240 pg/mL를 갖는다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 1종 이상의 주요 기능적 EHFA 기준을 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 중격 e' 속도를 > 7 cm/s로 증가시키는 것, 휴식 시 외측 e' 속도를 > 10 cm/s로 증가시키는 것, 운동 시 E/e'를 < 14로 또는 중격 E/e' 비를 < 15로 감소시키는 것 및 운동 시 TR 속도를 < 2.8 m/s로 감소시키는 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 주요 기능적 기준을 개선시킨다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 1종 이상의 주요 형태학적 EHFA 기준을 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 LAVI를 < 34 mL/m2로 감소시키는 것, LVMI를 남성의 경우 < 149 g/m2 및 여성의 경우 < 122 g/m2로 감소시키는 것, 및 RWT를 < 0.42로 감소시키는 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 주요 형태학적 기준을 개선시킨다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 1종 이상의 주요 바이오마커 EHFA 기준을 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 NT-프로BNP를 < 220 pg/mL로 감소시키는 것 및/또는 BNP를 < 80 pg/mL로 감소시키는 것을 포함하여, 동성 리듬을 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 NT-프로BNP를 < 660 pg/mL로 감소시키는 것 및/또는 BNP를 < 240 pg/mL로 감소시키는 것을 포함하여, 심방 세동을 개선시킨다.
일부 실시양태에서, 환자는 HFpEF에 대한 1종 이상의 부차적 EHFA 기준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 HFpEF에 대한 1종 이상의 부차적 기능적 EHFA 기준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 부차적 기능적 기준은 평균 E/e' 9-14 및 GLS < 16%로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 환자는 평균 E/e' 9-14를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 GLS < 16%를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 HFpEF에 대한 1종 이상의 부차적 형태학적 EHFA 기준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 부차적 형태학적 기준은 LAVI 29-34 mL/m2, 남성의 경우 LVMI > 115 g/m2, 여성의 경우 LVMI 95 g/m2, RWT > 0.42, 및 LV 벽 두께 ≥ 12 mm로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 환자는 LAVI 29-34 mL/m2를 갖는다. 일부 실시양태에서, 남성 환자는 LVMI > 115 g/m2를 갖는다. 일부 실시양태에서, 여성 환자는 LVMI 95 g/m2를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 RWT > 0.42를 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 HFpEF에 대한 1종 이상의 부차적 바이오마커 EHFA 기준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 LV 벽 두께 ≥ 12 mm를 갖는다. 일부 실시양태에서, 부차적 바이오마커 기준은 동성 리듬으로, 5-NT-프로BNP 125-220 pg/mL 및/또는 BNP 35-80 pg/mL이다. 일부 실시양태에서, 환자는 5-NT-프로BNP 125-220 pg/mL 및/또는 BNP 35-80 pg/mL를 갖는다. 일부 실시양태에서, 부차적 바이오마커 기준은 심방 세동으로, NT-프로BNP 365-660 pg/mL 및/또는 BNP 105-240 pg/mL이다. 일부 실시양태에서, 환자는 NT-프로BNP 365-660 pg/mL 및/또는 BNP 105-240 pg/mL를 갖는다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 1종 이상의 부차적 기능적 EHFA 기준을 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 E/e'를 8 이하로 감소시키고, GLS를 > 16%로 증가시키는 것을 포함하여, 부차적 기능적 기준을 개선시킨다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 1종 이상의 부차적 형태학적 EHFA 기준을 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 LAVI를 <34 mL/m2로 감소시키는 것, LVMI를 남성의 경우 < 115 g/m2로 감소시키는 것, LVMI를 여성의 경우 95 g/m2 미만으로 감소시키는 것, RWT를 < 0.42로 감소시키는 것, 및 LV 벽 두께를 < 12 mm로 감소시키는 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 부차적 형태학적 기준을 개선시킨다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 1종 이상의 부차적 바이오마커 EHFA 기준을 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 5-NT-프로BNP를 < 220 pg/mL로 감소시키는 것 및/또는 BNP를 < 80 pg/mL로 감소시키는 것을 포함하여, 동성 리듬을 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 NT-프로BNP를 < 660 pg/mL로 감소시키는 것 및/또는 BNP를 < 240 pg/mL로 감소시키는 것을 포함하여, 심방 세동을 개선시킨다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 환자의 EHFA 점수를 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8포인트만큼) 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 EHFA 점수를 적어도 1포인트만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 EHFA 점수를 적어도 2포인트만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 EHFA 점수를 적어도 3포인트만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 EHFA 점수를 적어도 4포인트만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 EHFA 점수를 적어도 5포인트만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 EHFA 점수를 적어도 6포인트만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 EHFA 점수를 적어도 7포인트만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 EHFA 점수를 적어도 8포인트만큼 감소시키는 것에 관한 것이다.
입원율
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 환자의 입원율을 (예를 들어, 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%만큼) 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 입원율을 적어도 1%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 입원율을 적어도 2%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 입원율을 적어도 3%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 입원율을 적어도 4%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 입원율을 적어도 5%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 입원율을 적어도 10%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 입원율을 적어도 15%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 입원율을 적어도 20%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 입원율을 적어도 25%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 입원율을 적어도 30%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 입원율을 적어도 35%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 입원율을 적어도 40%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 입원율을 적어도 45%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 입원율을 적어도 50%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 입원율을 적어도 55%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 입원율을 적어도 60%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 입원율을 적어도 65%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 입원율을 적어도 70%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 입원율을 적어도 75%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 입원율을 적어도 80%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 입원율을 적어도 85%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 입원율을 적어도 90%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 입원율을 적어도 95%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 입원율을 100%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 환자의 입원율을 감소시키는 것은 환자가 병원에 머무를 필요를 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자의 입원율을 감소시키는 것은 총 환자 병원 방문 횟수를 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자의 입원율을 감소시키는 것은 환자의 초기 입원까지의 시간을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자의 입원율을 감소시키는 것은 환자의 삶의 기간을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자의 입원율을 감소시키는 것은 환자 병원 방문 사이의 시간을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자의 입원율을 감소시키는 것은 재발성 환자 병원 방문 횟수를 감소시키는 것을 포함한다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 환자의 입원율을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자가 병원에 머무를 필요를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 총 환자 병원 방문 횟수를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 초기 입원까지의 시간을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 삶의 기간을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 병원 방문 사이의 시간을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 재발성 병원 방문 횟수를 감소시킨다.
심부전 악화율
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 환자의 심부전 악화율을 (예를 들어, 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%만큼) 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심부전 악화율을 적어도 1%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심부전 악화율을 적어도 2%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심부전 악화율을 적어도 3%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심부전 악화율을 적어도 4%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심부전 악화율을 적어도 5%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심부전 악화율을 적어도 10%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심부전 악화율을 적어도 15%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심부전 악화율을 적어도 20%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심부전 악화율을 적어도 25%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심부전 악화율을 적어도 30%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심부전 악화율을 적어도 35%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심부전 악화율을 적어도 40%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심부전 악화율을 적어도 45%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심부전 악화율을 적어도 50%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심부전 악화율을 적어도 55%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심부전 악화율을 적어도 60%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심부전 악화율을 적어도 65%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심부전 악화율을 적어도 70%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심부전 악화율을 적어도 75%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심부전 악화율을 적어도 80%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심부전 악화율을 적어도 85%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심부전 악화율을 적어도 90%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심부전 악화율을 적어도 95%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자의 심부전 악화율을 100%만큼 감소시키는 것에 관한 것이다.
심장 영상화
심장초음파상
본원에 사용된 용어 "심장초음파검사"는 2차원/3차원 심장초음파검사, 펄스파 및 연속파 도플러, 색 유동 도플러, 조직 도플러 영상화 (TDI) 조영 심장초음파검사, 이형 영상화 (변형 및 변형 속도), 및 경흉부 심장초음파검사 (TTE, 또는 2차원 심장초음파검사)를 지칭한다. TTE는 전형적으로 좌심실 및 우심실 둘 다의 심근 수축기 및 확장기 기능의 평가를 위해 선택되는 방법이다. 일부 실시양태에서, 환자는 심장초음파검사를 사용하여 심부전에 대해 평가된다. 일부 실시양태에서, 환자는 2차원 심장초음파검사를 사용하여 심부전에 대해 평가된다. 일부 실시양태에서, 환자는 3차원 심장초음파검사를 사용하여 심부전에 대해 평가된다. 일부 실시양태에서, 환자는 펄스파 및 연속파 도플러 심장초음파검사를 사용하여 심부전에 대해 평가된다. 일부 실시양태에서, 환자는 심장초음파검사를 사용하여 심부전에 대해 평가된다. 일부 실시양태에서, 환자는 색 유동 도플러 심장초음파검사를 사용하여 심부전에 대해 평가된다. 일부 실시양태에서, 환자는 조직 도플러 영상화 (TDI) 조영 심장초음파검사를 사용하여 심부전에 대해 평가된다. 일부 실시양태에서, 환자는 이형 영상화 (변형 및 변형 속도) 심장초음파검사를 사용하여 심부전에 대해 평가된다. 일부 실시양태에서, 환자는 경흉부 심장초음파검사 (TTE)를 사용하여 심부전에 대해 평가된다.
심장초음파검사는 진단을 확립하기 위해 HF가 의심되는 환자에서 유용하고 널리 이용가능한 시험이다. 이는 LV 벽 두께 (LVWT), LV 질량 (LVM), LV 확장 말기 직경 (LVEDD), LV 수축 말기 직경 (LVESD), 분획 단축 (FS) (식 FS = 100% x [(EDD - ESD)/EDD]를 사용하여 계산됨), LV 확장 말기 부피 (LVEDV), LV 수축 말기 부피 (LVESV), 박출 계수 (식 EF = 100% x [(EDV - ESV)/EDV]를 사용하여 계산됨), 비대 지수 (LVM 대 LVESV의 비로서 계산됨), 및 상대 벽 두께 (LVWT 대 LVESD의 비로서 계산됨)를 포함하나 이에 제한되지는 않는, LV 구조 및 수축기 기능 (예를 들어, 유두근 수준에서 흉골연 단축 단면도에서 M-모드에 의해 측정됨)에 대한 정보를 제공한다. 이러한 정보는 진단을 확립하고 적절한 치료를 결정하는 데 중요하다. 일부 실시양태에서, 환자의 LV 벽 두께 (LVWT)는 심장초음파검사를 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, 환자의 LV 질량 (LVM)은 심장초음파검사를 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, 환자의 LV 확장 말기 직경 (LVEDD)은 심장초음파검사를 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, 환자의 LV 수축 말기 직경 (LVESD)은 심장초음파검사를 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, 환자의 분획 단축 (FS)은 심장초음파검사를 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, 환자의 LV 확장 말기 부피 (LVEDV)는 심장초음파검사를 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, 환자의 LV 수축 말기 부피 (LVESV)는 심장초음파검사를 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, 환자의 박출 계수는 심장초음파검사를 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, 환자의 비대 지수는 심장초음파검사를 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, 환자의 상대 벽 두께는 심장초음파검사를 사용하여 측정된다. 노화와 연관된 심부전을 나타낼 수 있는 수많은 임상 제시 인자, 심장초음파검사 특색, 및 다른 특색이 존재한다. 일부 실시양태에서, 환자에 대해 수행된 심장초음파상은 구조적 좌심장 이상을 보여준다. 일부 실시양태에서, 구조적 좌심장 이상은 좌심장 판막의 질환이다. 일부 실시양태에서, 구조적 좌심장 이상은 좌심방 팽대 (예를 들어, >4.2 cm)이다.
좌심부전의 증상을 갖는 환자에서, 심장초음파상을 수행하여 다양한 파라미터를 평가할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 환자에 대해 수행된 도플러를 사용한 심장초음파상은 증가된 충만 압력 및/또는 확장기 기능장애의 지표 (예를 들어, 증가된 E/e' 또는 >유형 2-3 승모판 혈류속도 이상, 표 9, 10, 12 참조)를 보여줄 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자에 대해 수행된 영상화 (예를 들어, 심장초음파상, CT 스캔, 흉부 X선 또는 심장 MRI)는 컬리 B선을 보여준다. 일부 실시양태에서, 환자에 대해 수행된 영상화 (예를 들어, 심장초음파상, CT 스캔, 흉부 X선 또는 심장 MRI)는 흉막 삼출을 보여준다. 일부 실시양태에서, 환자에 대해 수행된 영상화 (예를 들어, 심장초음파상, CT 스캔, 흉부 X선 또는 심장 MRI)는 폐 부종을 보여준다. 일부 실시양태에서, 환자에 대해 수행된 영상화 (예를 들어, 심장초음파상, CT 스캔, 흉부 X선 또는 심장 MRI)는 좌심방 팽대를 보여준다. Id.
HFpEF/HFmrEF 심부전의 주요 기능적 변경은 E/e' ≥13 및 평균 e' 중격 및 외측 벽 <9 cm/s를 포함한다. 다른 (간접적) 심장초음파 유래 측정치는 종축 변형 또는 삼첨판 역류 속도 (TRV)이다. HFpEF가 의심되는 환자를 확인하는 데 있어서, 심장초음파검사는 LVEF가 보존되고 (예를 들어, ≥ 50 퍼센트) LV 부피가 정상임을 입증하는 데 도움이 된다. 심장초음파검사는 또한 판막성 질환 및 심막 질환을 비롯한 HFpEF 이외의 LVEF ≥50 퍼센트를 갖는 HF의 원인을 확인하는 데 도움이 된다. 심장초음파검사에 의해 측정된 HFpEF에 정의된 파라미터에 대해, 표 9, 10, 및 11을 참조한다. 심장초음파검사의 조사는 또한 우심실 (RV) 및 우심방 (RA) 치수를 포함하나 이에 제한되지는 않는 RV 구조 및 기능의 평가, 및 RV 수축기 기능 및/또는 폐동맥압의 추정을 포함할 수 있다. RV 수축기 기능을 반영하는 파라미터 중에서, 하기 척도가 특히 중요하다: 삼첨판 환상 평면 수축기 변동 (TAPSE; 비정상 TAPSE <17 mm은 RV 수축기 기능장애를 나타냄) 및 조직 도플러-유래 삼첨판 외측 환상 수축기 속도 (s') (s' 속도 <9.5 cm/s는 RV 수축기 기능장애를 나타냄). 수축기 폐동맥 압력은 하대 정맥 (IVC) 크기 및 그의 호흡-관련 허탈에 기초한 RA 압력의 추정치와 함께, 최대 삼첨판 역류 제트 및 삼첨판 수축기 구배의 최적 기록으로부터 유도된다. 운동 또는 약리학적 스트레스 심장초음파검사는 유도성 허혈 및/또는 심근 생존율의 평가, 및 판막 질환 (예를 들어 동적 승모판 역류, 저-혈류속도-저-구배 대동맥 협착)을 갖는 환자의 일부 임상 시나리오에서 사용될 수 있다. 스트레스 심장초음파검사가 운동성 호흡곤란, 보존된 LVEF, 및 휴식 시 결정적이지 않은 확장기 파라미터를 갖는 환자에서 운동 노출과 관련된 확장기 기능장애의 검출을 가능하게 할 수 있다는 제안이 또한 존재한다.
HFrEF, HFmrEF 또는 HFpEF의 진단을 확립하기 위해 HF가 의심되는 환자에서 심근 구조 및 기능의 평가를 위해 경흉부 심장초음파검사 (TTE)가 권장된다. 또한, TTE는 HFrEF에 대해 권장되는 증거-기반 약리학적 및 장치 (ICD, CRT) 치료에 적합할 HF를 갖는 환자를 확인하기 위해 LVEF를 평가하는 데; 판막 질환의 교정에 적합한 환자를 확인하기 위해 HFrEF, HFmrEF 또는 HFpEF의 이미 확립된 진단을 갖는 환자에서 판막 질환, 우심실 기능 및 폐 동맥압을 평가하는 데; 및/또는 잠재적으로 심근을 손상시킬 수 있는 치료 (예를 들어 화학요법)에 노출될 환자에서 심근 구조 및 기능을 평가하는 데 권장된다. 다른 기술 (수축기 조직 도플러 속도 및 이형 지수, 즉 변형 및 변형 속도를 포함함)이 전임상 단계에서 심근 기능장애를 확인하기 위해 HF가 발생할 위험이 있는 환자에서의 TTE 프로토콜에서 고려되어야 한다.
HFpEF에서, EF는 정상이고, 주요 혈류역학 이상은 충만 압력의 상승이다. 압력이 높고 울혈이 휴식 시에 존재하는 경우에, HFpEF는 병력, 신체 검사, 방사선촬영, NP 수준 및 심장초음파검사에 기초하여 용이하게 진단된다. 그러나, 초기 단계 HFpEF를 갖는 많은 환자는 겉보기 부피 과부하의 부재 하에 운동 불내성의 유의한 증상을 갖는다. 일부 환자에서의 침습적 평가는 이전에 의심되지 않았던 충만 압력에서의 병리학적 상승을 밝혀낼 수 있고, 최근 연구는 정상 검사, 심장초음파검사, NP, 및 정상 휴식기 혈류역학을 갖는 환자 중에서도, 많은 환자에서 운동 스트레스 동안 HFpEF에 특징적인 충만 압력의 병리학적 상승이 여전히 발생할 수 있다는 것을 발견하였다. 폐동맥압은 초기 HFpEF에서 좌심장 충만 압력과 매우 밀접하게 추적되고, 이는 전자가 운동 동안 심장초음파검사에 의해 정확하게 추정될 수 있다면, 이는 정상 EF 및 운동성 호흡곤란을 갖는 환자에서 유용한 비-침습적 스크린으로서의 역할을 할 수 있음을 시사한다. 일부 실시양태에서, 환자는 운동 동안 심장초음파검사를 사용하여 심부전에 대해 검사된다. 일부 실시양태에서, 환자는 운동 동안 심장초음파검사를 사용하여 HFpEF에 대해 검사된다.
심장 자기 공명 (CMR)
CMR은 좌심실 및 우심실 둘 다의 부피, 질량 및 EF의 측정을 위한 황금 표준으로서 인정된다. 이는 비진단적 심장초음파검사 연구 (특히 우심장의 영상화) 하의 환자에 대한 최상의 대안적 심장 영상화 양식이고, 복합 선천성 심장 질환을 갖는 환자에서 선택되는 방법이다. 심장 자기 공명 (CMR)은 심장 해부학적 및 기능적 정량화 둘 다를 측정하고, 비-침습적 조직 특징화의 고유한 능력을 가지며, 심장초음파검사와 잘 보완된다. 정점에서 기저부까지 단축에서 좌심실 (LV)를 커버하는 CMR 영상화를 사용하여 LV 부피, 박출 계수 (EF) 및 영역 기능을 측정한다. 3D 데이터세트는 기하학적 가정에 의해 영향을 받지 않고, 따라서 특히 재형성된 심실에서 2차원 (2D) 심장초음파검사와 비교하여 오류 유발이 덜하다. 신규 CMR 조직 특징화 기술은 CMR 이완측정법 (T1 및 T2 맵핑 및 세포외 부피 분율 (ECV))으로 불리며, 이는 공동내 유동에 대한 정량적 정보를 제공하는 조직 특징화 및 4D-유동에 대한 보다 상세하고 정량적인 접근법을 가능하게 한다. 현행 적용은 임상 실시에서의 적용가능성을 확인하기 위해 전통적인 도플러 및 조직 도플러 (예를 들어, 심장초음파검사) 분석과 구체적인 비교를 받을 만하지만, 확장기 기능장애 검출에 특히 유용한 것으로 보인다. 비-침습적 스트레스 영상화 (CMR, 스트레스 심장초음파검사, SPECT, PET)는 재혈관화에 대한 결정 전에 HF 및 CAD를 갖는 환자에서 심근 허혈 및 생존율의 평가를 위해 고려될 수 있다 (관상동맥 재혈관화에 적합한 것으로 간주됨). 일부 실시양태에서, 환자는 CMR을 사용하여 심부전에 대해 평가된다. 일부 실시양태에서, 환자는 CMR 이완측정법 (T1 및 T2 맵핑 및 세포외 부피 분율 (ECV))을 사용하여 심부전에 대해 평가된다. 일부 실시양태에서, 환자는 CMR 및 4D-유동을 사용하여 심부전에 대해 평가된다.
CMR은 LV 벽 두께 (LVWT), LV 질량 (LVM), LV 확장 말기 직경 (LVEDD), LV 수축 말기 직경 (LVESD), 분획 단축 (FS) (식 FS = 100% x [(EDD - ESD)/EDD]를 사용하여 계산됨), LV 확장 말기 부피 (LVEDV), LV 수축 말기 부피 (LVESV), 박출 계수 (식 EF = 100% x [(EDV - ESV)/EDV]를 사용하여 계산됨), 비대 지수 (LVM 대 LVESV의 비로서 계산됨), 및 상대 벽 두께 (LVWT 대 LVESD의 비로서 계산됨)를 포함하나 이에 제한되지는 않는, LV 구조 및 수축기 기능에 대한 정보를 제공할 수 있다. 이러한 정보는 진단을 확립하고 적절한 치료를 결정하는 데 중요하다. 일부 실시양태에서, 환자의 LV 벽 두께 (LVWT)는 CMR을 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, 환자의 LV 질량 (LVM)은 CMR을 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, 환자의 LV 확장 말기 직경 (LVEDD)은 CMR을 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, 환자의 LV 수축 말기 직경 (LVESD)은 CMR을 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, 환자의 분획 단축 (FS)은 CMR을 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, 환자의 LV 확장 말기 부피 (LVEDV)는 CMR을 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, 환자의 LV 수축 말기 부피 (LVESV)는 CMR을 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, 환자의 박출 계수는 CMR을 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, 환자의 비대 지수는 CMR을 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, 환자의 상대 벽 두께는 CMR을 사용하여 측정된다.
CMR은 T1 맵핑과 함께 후기 가돌리늄 조영증강 (LGE)을 사용하여 심근 섬유증을 평가하는 바람직한 영상화 방법이며, HF 병인을 확립하는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, LGE에 의한 CMR은 HF의 허혈성 및 비-허혈성 기원 사이의 구별을 가능하게 하고, 심근 섬유증/반흔이 가시화될 수 있다. 또한, CMR은 심근염, 아밀로이드증, 사르코이드증, 샤가스병, 파브리병 비-치밀 심근병증 및 혈색소증의 심근 조직의 특징화를 가능하게 한다. CMR은 또한 HF 및 관상 동맥 질환 (CAD)을 갖는 환자에서 심근 허혈 및 생존율의 평가에 사용될 수 있다 (관상동맥 재혈관화에 적합한 것으로 간주됨). 일부 실시양태에서, 환자는 후기 가돌리늄 증진 (LGE) 및/또는 T1 맵핑에 의한 CMR을 사용하여 심부전에 대해 평가된다. 일부 실시양태에서, 환자의 심장에서의 섬유증 및/또는 반흔은 CMR을 사용하여 측정된다.
CMR의 임상적 제한은 심장초음파검사와 비교하여 현지 전문성, 보다 낮은 이용가능성 및 보다 높은 비용, 금속성 이식물 (심장 장치 포함)을 갖는 환자에서의 안전성에 대한 불확실성 및 빈맥부정맥을 갖는 환자에서의 덜 신뢰성 있는 측정을 포함한다. 폐소공포증은 CMR에 대한 중요한 한계이다. 선형 가돌리늄-기반 조영제는 사구체 여과율 (GFR)이 <30 mL/분/1.73m2인 개체에서 금기되는 데, 이는 이것이 신원성 전신 섬유증을 촉발할 수 있기 때문이다 (이는 보다 새로운 시클릭 가돌리늄-기반 조영제에 의하면 우려가 덜할 수 있음).
CMR은 (CMR에 대한 주의/금기를 고려하여) 불량한 음향 창을 갖는 환자 및 복합 선천성 심장 질환을 갖는 환자에서 심근 구조 및 기능 (우심 포함)의 평가를 위해 권장된다. CMR은 (CMR에 대한 주의/금기를 고려하여) 의심되는 심근염, 아밀로이드증, 사르코이드증, 샤가스병, 파브리병 비-치밀 심근병증, 및 혈색소증의 경우에 심근 조직의 특징화를 위해 권장된다.
멀티게이팅 획득 (MUGA)
방사성핵종 혈관조영은 심장의 우심실 및 좌심실의 기능성을 보여주어 심부전에서 사전 진단적 개입을 가능하게 하기 위해 영상화를 전문화하는 핵 의학의 영역이다. 이는 환자에게 주사되는 방사성약제, 및 획득을 위한 감마 카메라의 사용을 수반한다. MUGA 스캔 (멀티게이팅 획득)은 심장 주기의 상이한 지점에서 촉발된 (게이팅된) 획득을 수반한다. MUGA 스캐닝은 또한 때때로 평형 방사성핵종 심혈관조영, 방사성핵종 심실조영 (RNVG), 또는 게이팅된 혈액 풀 영상화, 뿐만 아니라 SYMA 스캐닝 (동기화된 멀티게이팅 획득 스캐닝)으로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 환자는 MUGA를 사용하여 심부전에 대해 평가된다. 일부 실시양태에서, 환자는 평형 방사성핵종 심혈관조영을 사용하여 심부전에 대해 평가된다. 일부 실시양태에서, 환자는 방사성핵종 심실조영 (RNVG)을 사용하여 심부전에 대해 평가된다. 일부 실시양태에서, 환자는 게이팅된 혈액 풀 영상화를 사용하여 심부전에 대해 평가된다. 일부 실시양태에서, 환자는 SYMA 스캐닝 (동기화된 멀티게이팅 획득 스캐닝)을 사용하여 심부전에 대해 평가된다.
MUGA는 박동하는 심장의 시네 유형의 영상 (예를 들어, 심장 주기 전반에 걸쳐 심장 운동을 보여줄 수 있는 짧은 영화)을 독특하게 제공하고, 해석기가 개별 심장 판막 및 심방실의 효율을 결정하게 한다. MUGA/시네 스캐닝은 심장초음파상에 대한 강건한 보조를 나타낸다. 심장 박출량 (Q)의 획득에 관한 수학은 이들 방법뿐만 아니라 수축기에서 심장/심근의 산물로서 박출 계수를 지지하는 다른 저렴한 모델 둘 다에 의해 널리 제공된다. 심장초음파상 또는 혈관조영상에 비해 MUGA 스캔의 하나의 주요 이점은 그의 정확도이다. 심장초음파상은 심실의 단축 분획을 측정하고, 이는 사용자의 능력에 의해 제한된다. 또한, 혈관조영상은 침습적이고, 종종 보다 고가이다. MUGA 스캔은 심장 박출 계수의 보다 정확한 표현을 제공한다.
흉부 X선
흉부 X선은 HF가 의심되는 환자의 진단 정밀검사에서 제한된 용도를 갖는다. 이는 환자의 증상 및 징후 (예를 들어, 폐 악성종양 및/또는 간질성 폐 질환)에 대한 대안적인 폐 설명을 확인하는 데 가장 유용하지만, 흉부의 컴퓨터 단층촬영 (CT)이 현재 이들 유형의 폐 질환에 대한 표준 관리이다. 천식 또는 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)의 진단을 위해, 폐활량측정을 이용한 폐 기능 검사가 필요하다. 그러나, 흉부 X선은 HF를 갖는 환자에서 폐 정맥성 울혈 또는 부종을 나타낼 수 있고, 비-급성 세팅에서보다 급성 세팅에서 더 도움이 된다. 일부 실시양태에서, 환자는 흉부 X선을 사용하여 심부전에 대해 평가된다.
흉부 X선은 통상적으로 폐 부종의 징후를 평가하고 호흡곤란의 다른 원인을 확인하기 위해 HF를 갖는 환자에서 수득된다. 흉부 X선은 심장비대 및/또는 폐 부종의 방사선촬영상 증거를 나타낼 수 있다. HFpEF를 갖는 대부분의 환자는 정상 흉부 X선을 가질 것이다. 일부 실시양태에서, HFpEF를 갖는 환자는 정상 흉부 X선을 갖는다.
단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT) 및 방사성뉴클레오티드 심실조영
단일-광자 방출 CT (SPECT)는 허혈 및 심근 생존율을 평가하는 데 유용할 수 있다. 게이팅 SPECT는 또한 심실 부피 및 기능에 대한 정보를 생성할 수 있지만, 환자를 이온화 방사선에 노출시킨다. 3,3-디포스포노-1,2-프로판디카르복실산 (DPD) 섬광조영은 트랜스티레틴 심장 아밀로이드증의 검출에 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자는 SPECT를 사용하여 심부전에 대해 평가된다.
양전자 방출 단층촬영 (PET)
양전자 방출 단층촬영 (PET)은 (단독으로 또는 CT와 함께) 허혈 및 생존율을 평가하는 데 사용될 수 있지만, 유동 추적자 (N-13 암모니아 또는 O-15 물)는 현장 사이클로트론을 필요로 한다. 루비듐은 PET를 사용한 허혈 시험을 위한 대안적 추적자이며, 이는 상대적으로 낮은 비용으로 국부적으로 생산될 수 있다. 제한된 이용가능성, 방사선 노출 및 비용이 주요 한계이다. 일부 실시양태에서, 환자는 PET를 사용하여 심부전에 대해 평가된다.
관상 혈관조영
관상 혈관조영은, 환자가 관상 재혈관화에 달리 적합한 경우에 한하여, 의료 요법에 대해 난치성인 협심증을 앓고 있는 HF 환자에서 권장된다. 관상 혈관조영은 또한 증후성 심실성 부정맥 또는 중단된 심장 정지 병력을 갖는 환자에서 권장된다. 관상 혈관조영은 허혈 병인 및 CAD 중증도를 확립하기 위해 비-침습적 스트레스 시험에서 HF 및 중간 내지 높은 사전-시험 확률의 관상 동맥 질환 (CAD) 및 허혈의 존재를 갖는 환자에서 고려되어야 한다. 일부 실시양태에서, 환자는 관상 혈관조영을 사용하여 심부전에 대해 평가된다.
침습적 관상 혈관조영은 CAD의 진단 및 그의 중증도를 확립하기 위해 약리학적 요법에 대해 난치성인 HF 및 협심증 또는 증후성 심실성 부정맥 또는 중단된 심장 정지를 갖는 환자에서 권장된다 (잠재적 관상 재혈관화에 적합한 것으로 간주됨). 침습성 관상 혈관조영은 CAD의 진단 및 그의 중증도를 확립하기 위해 비-침습적 스트레스 시험에서 HF 및 중간 내지 높은 사전-시험 확률의 CAD 및 허혈의 존재를 갖는 환자에서 고려되어야 한다 (잠재적 관상 재혈관화에 적합한 것으로 간주됨).
심장 컴퓨터 단층촬영 (CT)
HF를 갖는 환자에서 심장 CT의 주요 용도는, 상대적 금기의 부재 하에, 관상 동맥 질환 (CAD)의 진단을 배제하기 위해 HF 및 낮은 중간 사전-시험 확률의 CAD를 갖는 환자에서 또는 애매한 비-침습적 스트레스 시험을 갖는 환자에서 관상 해부학을 시각화하기 위한 비-침습적 수단으로서의 것이다. 그러나, 시험은 그의 결과가 치료 결정에 영향을 미칠 수 있는 경우에만 요구된다. 심장 CT는 관상 동맥 협착을 배제하기 위해 HF 및 낮은 내지 중간 사전-시험 확률의 CAD를 갖는 환자 또는 애매한 비-침습적 스트레스 시험을 갖는 환자에서 고려될 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자는 심장 컴퓨터 단층촬영을 사용하여 심부전에 대해 평가된다.
심전도 (ECG 또는 EKG)
심전도 (ECG 또는 EKG)는 심장에서의 전기적 신호를 기록한다. 각각의 박동에서, 전기적 박동 (또는 "파")은 심장을 통해 이동한다. 이러한 파는 근육이 심장으로부터 혈액을 압착하고 펌핑하게 한다. ECG 상의 정상 심박동은 상부 및 하부 심방실의 타이밍을 보여줄 것이다. 우심방 및 좌심방 또는 상부 심방실은 전기적 박동이 하부 심방실로 갈 때 편평한 선을 따라 "P파"로 불리는 제1 파를 만든다. 우측 및 좌측 하부 심방실 또는 심실은 "QRS 복합체"로 불리는 다음 파를 만든다. 최종 파 또는 "T 파"는 심실에 대한 전기적 회복 또는 휴식기 상태로의 복귀를 나타낸다. ECG는 2가지 주요 종류의 정보를 제공한다. 먼저, ECG 상의 시간 간격을 측정함으로써, 의사는 전기파가 심장을 통과하는 데 얼마나 오래 걸리는지를 결정할 수 있다. 파가 심장의 한 부분에서 다음 부분으로 이동하는 데 얼마나 오래 걸리는지를 발견하는 것은 전기적 활동이 정상인지 또는 느린지, 빠른지 또는 불규칙한지를 보여준다. 제2로, 심장근을 통과하는 전기적 활성의 양을 측정함으로써, 심장전문의는 심장의 일부가 너무 큰지 또는 과다작업하였는지를 확인할 수 있다. 표 11은 HFpEF 환자의 심전도검사에서의 전형적인 경향을 보여준다. 일부 실시양태에서, 환자는 심전도를 사용하여 심부전에 대해 평가된다.
심내막심근 생검
심내막심근 생검 (EMB)은 진단, 치료 및 연구 목적을 위해 소량의 심근 조직을 경피로 수득하는 절차이다. 이는 주로 (1) 이식된 심장을 심근 거부에 대해 추적하고; (2) 특정 염증성, 침윤성 또는 가족성 심근 장애를 진단하고; (3) 미지의 심근 덩이를 샘플링하는 데 사용된다. EMB는 심근을 검사하기 위한 확정적인 절차이지만, 그의 침습성, 샘플링 오류 및 그의 수행에서의 일반화된 전문 지식의 결여에 의해 제한된다. 일부 실시양태에서, 환자는 심내막심근 생검을 사용하여 심부전에 대해 평가된다.
환자에서의 혈액학적 파라미터의 측정
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 1종 이상의 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)로 치료받았거나 또는 치료될 후보인 환자에서 1종 이상의 혈액학적 파라미터를 측정함으로써 상기 환자를 관리하는 방법을 제공한다. 혈액학적 파라미터는 본 개시내용의 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제로 치료될 후보인 환자에 대한 적절한 투여를 평가하고/거나, 치료 동안 혈액학적 파라미터를 모니터링하고/거나, 본 개시내용의 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제를 사용한 치료 동안 투여량을 조정할지를 평가하고/거나, 본 개시내용의 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제의 적절한 유지 용량을 평가하는 데 사용될 수 있다. 혈액학적 파라미터 중 1종 이상이 정상 수준 밖에 있는 경우, 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제의 투여는 감소, 지연 또는 종결될 수 있다.
본원에 제공된 방법에 따라 측정될 수 있는 혈액학적 파라미터는, 예를 들어 적혈구 수준, 혈압, 철 저장, 및 관련 기술분야에서 인식되는 방법을 사용하여 증가된 적혈구 수준과 상관관계가 있는 체액에서 발견되는 다른 작용제를 포함한다. 이러한 파라미터는 환자로부터의 혈액 샘플을 사용하여 결정될 수 있다. 적혈구 수준, 헤모글로빈 수준 및/또는 적혈구용적률 수준의 증가는 혈압의 증가를 유발할 수 있다.
한 실시양태에서, 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제로 치료될 후보인 환자에서 1종 이상의 혈액학적 파라미터가 정상 범위 밖에 있거나 또는 정상의 높은 쪽에 있는 경우, 본 개시내용의 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제의 투여의 개시는 혈액학적 파라미터가 자연적으로 또는 치료적 개입을 통해 정상 또는 허용되는 수준으로 복귀될 때까지 지연될 수 있다. 예를 들어, 후보 환자가 고혈압 또는 고혈압전인 경우, 환자는 환자의 혈압을 감소시키기 위해 혈압 저하제로 치료될 수 있다. 예를 들어, 이뇨제, 아드레날린성 억제제 (알파 차단제 및 베타 차단제 포함), 혈관확장제, 칼슘 채널 차단제, 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제, 또는 안지오텐신 II 수용체 차단제를 비롯한, 개별 환자의 상태에 적절한 임의의 혈압 저하제가 사용될 수 있다. 혈압은 대안적으로 식이 및 운동 요법을 사용하여 치료될 수 있다. 유사하게, 후보 환자가 정상보다 낮거나 또는 정상의 낮은 쪽인 철 저장을 갖는 경우, 환자는 환자의 철 저장이 정상 또는 허용되는 수준으로 복귀될 때까지 식이 및/또는 철 보충제의 적절한 요법으로 치료될 수 있다. 정상보다 높은 적혈구 수준 및/또는 헤모글로빈 수준을 갖는 환자의 경우, 본 개시내용의 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제의 투여는 수준이 정상 또는 허용되는 수준으로 복귀될 때까지 지연될 수 있다.
특정 실시양태에서, 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제로 치료될 후보인 환자에서 1종 이상의 혈액학적 파라미터가 정상 범위 밖에 있거나 또는 정상의 높은 쪽에 있는 경우, 투여의 개시는 지연되지 않을 수 있다. 그러나, 본 개시내용의 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제의 투여량 또는 투여 빈도는 본 개시내용의 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제의 투여 시 발생하는 혈액학적 파라미터의 허용되지 않는 증가의 위험을 감소시킬 양으로 설정될 수 있다. 대안적으로, 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제를 혈액학적 파라미터의 바람직하지 않은 수준을 다루는 치료제와 조합하는 치료 요법이 환자에 대해 개발될 수 있다. 예를 들어, 환자가 상승된 혈압을 갖는 경우에, 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제 및 혈압 저하제의 투여를 수반하는 치료 요법이 설계될 수 있다. 목적하는 것보다 낮은 철 저장을 갖는 환자의 경우, 본 개시내용의 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제 및 철 보충을 수반하는 치료 요법이 개발될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제로 치료될 후보인 환자에 대해 1종 이상의 혈액학적 파라미터에 대한 기준선 파라미터(들)가 확립될 수 있고, 기준선 값(들)에 기초하여 그러한 환자에 대해 적절한 투여 요법이 확립될 수 있다. 대안적으로, 환자의 병력에 기초하여 확립된 기준선 파라미터를 사용하여 환자에 대한 적절한 ActRII-ALK4 길항제 투여 요법을 통지할 수 있다. 예를 들어, 건강한 환자가 정의된 정상 범위를 초과하는 확립된 기준선 혈압 판독치를 갖는 경우에, 본 개시내용의 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제를 사용한 치료 전에 환자의 혈압을 일반 집단에 대해 정상으로 간주되는 범위로 만드는 것은 필요하지 않을 수 있다. 본 개시내용의 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제를 사용한 치료 전의 1종 이상의 혈액학적 파라미터에 대한 환자의 기준선 값은 또한 본 개시내용의 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제를 사용한 치료 동안 혈액학적 파라미터에 대한 임의의 변화를 모니터링하기 위한 관련 비교 값으로서 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 1종 이상의 혈액학적 파라미터는 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제로 치료받고 있는 환자에서 측정된다. 혈액학적 파라미터는 치료 동안 환자를 모니터링하고, 본 개시내용의 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제를 사용한 투여 또는 또 다른 치료제를 사용한 추가의 투여의 조정 또는 종결을 허용하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제의 투여가 혈압, 적혈구 수준 또는 헤모글로빈 수준의 증가, 또는 철 저장의 감소를 유발하는 경우, 1종 이상의 혈액학적 파라미터에 대한 본 개시내용의 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제의 효과를 감소시키기 위해 본 개시내용의 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제의 용량을 양 또는 빈도의 면에서 감소시킬 수 있다. 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제의 투여가 환자에게 유해한 1종 이상의 혈액학적 파라미터의 변화를 유발하는 경우에, 본 개시내용의 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제의 투여는 혈액학적 파라미터(들)가 허용되는 수준으로 복귀할 때까지 일시적으로, 또는 영구적으로 종결될 수 있다. 유사하게, 본 개시내용의 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제의 투여 용량 또는 빈도를 감소시킨 후에 1종 이상의 혈액학적 파라미터가 허용되는 범위 내에 있지 않은 경우에, 투여는 종결될 수 있다. 본 개시내용의 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제를 사용한 투여를 감소 또는 종결시키는 것에 대안적으로 또는 그에 더하여, 혈액학적 파라미터(들)의 바람직하지 않은 수준을 다루는 추가의 치료제, 예컨대 예를 들어 혈압 저하제 또는 철 보충제를 환자에게 투여할 수 있다. 예를 들어, 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제로 치료되는 환자가 상승된 혈압을 갖는 경우에, 본 개시내용의 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제의 투여는 동일한 수준에서 계속될 수 있고, 혈압-저하제가 치료 요법에 부가되거나, 본 개시내용의 1종 이상의 길항제의 투여가 (예를 들어, 양 및/또는 빈도의 면에서) 감소될 수 있고, 혈압-저하제가 치료 요법에 부가되거나, 또는 본 개시내용의 1종 이상의 길항제의 투여가 종결될 수 있고, 환자가 혈압-저하제로 치료될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 1종 이상의 혈액학적 파라미터를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람과 비교하여 1종 이상의 혈액학적 파라미터를 정상 수준으로 개선시킨다.
7. 심부전을 위한 추가의 치료 및 공동-요법
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키기 위한, 1종 이상의 추가의 활성제 또는 다른 지지 요법과 조합된 ActRII-ALK4 길항제의 용도를 고려한다. 본원에 사용된 "와 조합하여", "의 조합", "와 조합된" 또는 "합동" 투여는 추가의 활성제 또는 지지 요법 (예를 들어, 제2, 제3, 제4 등)이 신체에서 여전히 효과적이도록 하는 (예를 들어, 다중 화합물이 환자에서 일부 기간 동안 동시에 효과적이도록 하는 (그러한 화합물의 상승작용적 효과를 포함할 수 있음)) 임의의 투여 형태를 지칭한다. 유효성은 혈액, 혈청 또는 혈장 중 작용제의 측정가능한 농도와 상관관계가 없을 수 있다. 예를 들어, 상이한 치료 화합물은 동일한 제제로 또는 개별 제제로, 병용으로 또는 순차적으로, 및 상이한 스케줄로 투여될 수 있다. 따라서, 이러한 치료를 받는 대상체는 상이한 활성제 또는 요법의 조합 효과로부터 이익을 얻을 수 있다. 본 개시내용의 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제는 1종 이상의 다른 추가의 작용제 또는 지지 요법, 예컨대 본원에 개시된 것들과 공동으로, 그 전에 또는 그 후에 투여될 수 있다. 일반적으로, 각각의 활성제 또는 요법은 그러한 특정한 작용제에 대해 결정된 용량 및/또는 시간 스케줄로 투여될 것이다. 요법에 사용하기 위한 특정한 조합은 추가의 활성제 또는 요법 및/또는 목적하는 효과와 본 개시내용의 ActRII-ALK4 길항제의 상용성을 고려할 것이다.
HF를 갖는 환자에서의 치료의 일부 목표는 그의 임상 상태, 기능적 능력 및 삶의 질을 개선시키고/거나 병원 입원을 예방하고 사망률을 감소시키는 것이다. 신경-호르몬 길항제 (예를 들어, ACEI, MRA 및 베타-차단제)는 HFrEF를 갖는 환자에서 생존을 개선시키는 것으로 제시되었고, 금기되거나 허용되지 않는 한 HFrEF를 갖는 환자의 치료를 위해 권장되었다. 특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 환자는 또한 안지오텐신-전환 효소 억제제 (ACE 억제제), 베타-차단제, 안지오텐신 II 수용체 차단제 (ARB), 미네랄로코르티코이드/알도스테론 수용체 길항제 (MRA) 또는 이식형 심장율동전환 제세동기 (ICD) 중 1종 이상을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 방법은 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제) 및 안지오텐신-전환 효소 억제제 (ACEI)를 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제) 및 베타-차단제를 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제) 및 안지오텐신 II 수용체 차단제 (ARB)를 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제) 및 미네랄로코르티코이드/알도스테론 수용체 길항제 (MRA)를 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제) 및 이식형 심장율동전환 제세동기 (ICD)를 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제) 및 안지오텐신 수용체 네프릴리신 억제제 (ARNI)를 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제) 및 이뇨제를 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제), 및 히드랄라진 및 이소소르비드 디니트레이트, 디곡신, 디기탈리스, N-3 다중불포화 지방산 (PUFA), 및 If-채널 억제제 (예를 들어, 이바브라딘) 중 1종 이상을 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것에 관한 것이다.
임의로, 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키기 위한, 특히 심부전의 1종 이상의 동반이환을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키기 위한 본원에 개시된 방법은 환자에게 심부전을 치료하기 위한 1종 이상의 지지 요법 또는 추가의 활성제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 환자는 또한 ACE 억제제 (예를 들어, 베나제프릴, 캅토프릴, 에날라프릴, 리시노프릴, 페린도프릴, 라미프릴 (예를 들어, 라미펜), 트란돌라프릴, 및 조페노프릴); 베타 차단제 (예를 들어, 아세부톨롤, 아테놀롤, 베탁솔롤, 비소프롤롤, 카르테올롤, 카르베딜롤, 라베탈롤, 메토프롤롤, 나돌롤, 네비볼롤, 펜부톨롤, 핀돌롤, 프로프라놀롤, 소탈롤, 및 티몰롤); ARB (예를 들어, 로사르탄, 이르베사르탄, 올메사르탄, 칸데사르탄, 발사르탄, 피마사르탄, 아질사르탄, 살프리사르탄, 및 텔미사르탄); 미네랄로코르티코이드/알도스테론 수용체 길항제 (MRA) (예를 들어, 프로게스테론, 에플레레논 및 스피로노락톤); 글루코코르티코이드 (예를 들어, 베클로메타손, 베타메타손, 부데소니드, 코르티손, 데플라자코르트, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 메틸프레드니손, 프레드니손, 트리암시놀론, 및 피네레논); 스타틴 (예를 들어, 아토르바스타틴 (리피토르), 플루바스타틴 (레스콜), 로바스타틴 (메바코르, 알토코르), 프라바스타틴 (프라바콜), 피타바스타틴 (리발로), 심바스타틴 (조코르), 및 로수바스타틴 (크레스토르)); 나트륨-글루코스 공동-수송체 2 (SGLT2) 억제제 (예를 들어, 카나글리플로진, 다파글리플로진 (예를 들어, 파르시가), 및 엠파글리플로진); 이식형 심장율동전환 제세동기 (ICD); 안지오텐신 수용체 네프릴리신 억제제 (ARNI) (예를 들어, 발사르탄 및 사쿠비트릴 (네프릴리신 억제제)); 이뇨제 (예를 들어, 푸로세미드, 부메타니드, 토라세미드, 벤드로플루메티아지드, 히드로클로로티아지드, 메톨라존, 인다파미드, 스피로노락톤/에플레레논, 아밀로리드 및 트리암테렌); 및 히드랄라진 및 이소소르비드 디니트레이트, 디곡신, 디기탈리스, N-3 다중불포화 지방산 (PUFA), 및 If-채널 억제제 (예를 들어, 이바브라딘)를 포함한 다른 요법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 지지 요법 또는 활성제를 투여받을 수 있다.
안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제
ACE 억제제는 HF의 발병을 예방 또는 지연시키고 생명을 연장시키기 위해 무증상 LV 수축기 기능장애 및 심근경색의 병력을 갖는 환자에서, 또는 HF의 발병을 예방 또는 지연시키기 위해 심근경색의 병력 없이 무증상 LV 수축기 기능장애를 갖는 환자에서 권장된다. ACE 억제제는 HF의 발병을 예방 또는 지연시키기 위해 LV 수축기 기능장애를 갖지 않더라도 안정한 CAD를 갖는 환자에서 고려되어야 한다. ACE 억제제는 HFrEF를 갖는 환자에서 사망률 및 이환율을 감소시키는 것으로 나타났고, 모든 증후성 환자에서 금기되거나 허용되지 않는 한 권장된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ACE 억제제를 투여함으로써 심부전을 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, ACE 억제제는 베나제프릴, 캅토프릴, 에날라프릴, 리시노프릴, 페린도프릴, 라미프릴 (예를 들어, 라미펜), 트란돌라프릴, 및 조페노프릴로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 환자는 베나제프릴을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 캅토프릴을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 에날라프릴을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 리시노프릴을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 페린도프릴을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 라미프릴을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 트란돌라프릴을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 조페노프릴을 투여받는다. 일부 실시양태에서, ACE 억제제의 투여
일부 실시양태에서, ACE 억제제의 투여는 환자에서 심부전의 발병을 지연시킨다. 일부 실시양태에서, ACE 억제제의 투여는 환자에서 심부전의 발병을 예방한다. 일부 실시양태에서, ACE 억제제의 투여는 환자의 삶의 기간을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, ACE 억제제의 투여는 환자의 병원 체류 기간을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, ACE 억제제의 투여는 환자의 입원을 예방한다.
베타 차단제
베타-차단제는 HF의 발병을 예방 또는 지연시키거나 생명을 연장시키기 위해 무증상 LV 수축기 기능장애 및 심근경색의 병력을 갖는 환자에서 권장된다. 베타-차단제는 ACEI 및 대부분의 경우에 이뇨제로의 치료에도 불구하고 HFrEF를 갖는 증후성 환자에서 사망률 및 이환율을 감소시킬 수 있지만, 울혈 또는 대상부전 환자에서는 시험되지 않았다. 베타-차단제 및 ACEI는 상보적이고, HFrEF의 진단이 이루어지자마자 함께 시작될 수 있다는 합의가 존재한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 1종 이상의 베타 차단제를 투여함으로써 심부전을 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 베타 차단제는 아세부톨롤, 아테놀롤, 베탁솔롤, 비소프롤롤, 카르테올롤, 카르베딜롤, 라베탈롤, 메토프롤롤, 나돌롤, 네비볼롤, 펜부톨롤, 핀돌롤, 프로프라놀롤, 소탈롤, 및 티몰롤로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서 환자는 아세부톨롤을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 아테놀롤을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 베탁솔롤을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 비소프롤롤을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 카르테올롤을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 카르베딜롤을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 라베탈롤을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 메토프롤롤을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 나돌롤을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 네비볼롤을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 펜부톨롤을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 핀돌롤을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 프로프라놀롤을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 소탈롤을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 티몰롤을 투여받는다.
일부 실시양태에서, 환자는 환자가 심부전의 징후를 나타내는 경우에 베타 차단제를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 환자가 ACE 억제제에 불내성인 경우에 베타 차단제를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 베타 차단제는 환자에서 심부전의 발병을 지연시킨다. 일부 실시양태에서, 베타 차단제는 환자에서 심부전의 발병을 예방한다. 일부 실시양태에서, 베타 차단제의 투여는 환자의 삶의 기간을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 베타 차단제의 투여는 환자의 병원 체류 기간을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 베타 차단제의 투여는 환자의 입원을 예방한다.
안지오텐신 II 수용체 차단제 (ARB)
안지오텐신 II 수용체 차단제 (ARB)는 ACE 억제제에 불내성일 수 있는 환자에서의 대안이다. 칸데사르탄은 심혈관성 사망률을 감소시키는 것으로 제시되었다. 발사르탄은 배경 ACEI를 제공받고 있는 HFrEF를 갖는 환자에서 HF로 인한 입원 (그러나 모든 원인의 입원은 아님)에서 효과를 제시하였다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 1종 이상의 ARB를 투여함으로써 심부전을 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 ARB는 로사르탄, 이르베사르탄, 올메사르탄, 칸데사르탄, 발사르탄, 피마사르탄, 아질사르탄, 살프리사르탄, 및 텔미사르탄으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 환자는 로사르탄을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 이르베사르탄을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 올메사르탄을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 칸데사르탄을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 발사르탄을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 피마사르탄을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 아질사르탄을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 살프리사르탄을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 텔미사르탄을 투여받는다.
일부 실시양태에서, 환자는 환자가 심부전의 징후를 나타내는 경우에 안지오텐신 길항제 (예를 들어, 안지오텐신 수용체 차단제, ARB)를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 환자가 ACE 억제제에 불내성인 경우에 ARB를 투여받는다. 일부 실시양태에서, ARB는 환자에서 심부전의 발병을 지연시킨다. 일부 실시양태에서, ARB는 환자에서 심부전의 발병을 예방한다. 일부 실시양태에서, ARB의 투여는 환자의 삶의 기간을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, ARB의 투여는 환자의 병원 체류 기간을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, ARB의 투여는 환자의 입원을 예방한다.
코르티코스테로이드
미네랄로코르티코이드/알도스테론 수용체 길항제 (MRA)는 알도스테론에 결합하는 수용체를 차단하고, 다른 스테로이드 호르몬 수용체 (예를 들어, 코르티코스테로이드, 안드로겐)를 상이한 정도의 친화도로 차단한다. 스피로노락톤 또는 에플레레논은 (ACE 억제제 및/또는 베타-차단제로의 치료에도 불구하고) HFrEF 및 LVEF가 ≤35%인 증후성 심부전 환자에서 사망률 및 HF 입원을 감소시키기 위해 권장된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 코르티코스테로이드를 투여함으로써 심부전을 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 환자는 미네랄로코르티코이드/알도스테론 수용체 길항제 (MRA)를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 글루코코르티코이드를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 프로게스테론, 에플레레논 및 스피로노락톤으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 미네랄로코르티코이드/알도스테론 수용체 길항제 (MRA)를 투여받는다. 일부 실시양태에서 환자는 에플레레논을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 스피로노락톤을 투여받는다.
일부 실시양태에서, 환자는 환자가 심부전의 징후를 나타내는 경우에 MRA를 투여받는다. 일부 실시양태에서, MRA는 환자에서 심부전의 발병을 지연시킨다. 일부 실시양태에서, MRA는 환자에서 심부전의 발병을 예방한다. 일부 실시양태에서, MRA의 투여는 환자의 삶의 기간을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, MRA 투여는 환자의 병원 체류 기간을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, MRA의 투여는 환자의 입원을 예방한다.
일부 실시양태에서, 심부전을 갖는 환자는 1종 이상의 글루코코르티코이드를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 글루코코르티코이드의 투여는 초기 요법이다. 일부 실시양태에서, 글루코코르티코이드는 베클로메타손, 베타메타손, 부데소니드, 코르티손, 데플라자코르트, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 메틸프레드니손, 프레드니손, 트리암시놀론, 및 피네레논으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 심부전을 갖는 환자는 프레드니손을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 심부전을 갖는 환자는 프레드니솔론을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 심부전을 갖는 환자는 피네레논을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 심부전을 갖는 환자는 데플라자코르트를 투여받는다.
일부 실시양태에서, 환자는 환자가 심부전의 징후를 나타내는 경우에 글루코코르티코이드를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 글루코코르티코이드는 환자에서 심부전의 발병을 지연시킨다. 일부 실시양태에서, 글루코코르티코이드는 환자에서 심부전의 발병을 예방한다. 일부 실시양태에서, 글루코코르티코이드의 투여는 환자의 삶의 기간을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 글루코코르티코이드의 투여는 환자의 병원 체류 기간을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 글루코코르티코이드의 투여는 환자의 입원을 예방한다.
스타틴
스타틴으로의 치료는, HF의 발병을 예방하거나 지연시키고 생명을 연장시키기 위해, LV 수축기 기능장애를 갖는지 여부에 관계없이, CAD를 갖거나 또는 그의 위험이 높은 환자에서 권장된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 1종 이상의 스타틴를 투여함으로써 심부전을 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 스타틴은 아토르바스타틴 (리피토르), 플루바스타틴 (레스콜), 로바스타틴 (메바코르, 알토코르), 프라바스타틴 (프라바콜), 피타바스타틴 (리발로), 심바스타틴 (조코르), 및 로수바스타틴 (크레스토르)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서 환자는 아토르바스타틴을 투여받는다. 일부 실시양태에서 환자는 플루바스타틴을 투여받는다. 일부 실시양태에서 환자는 로바스타틴을 투여받는다. 일부 실시양태에서 환자는 프라바스타틴을 투여받는다. 일부 실시양태에서 환자는 피타바스타틴을 투여받는다. 일부 실시양태에서 환자는 심바스타틴을 투여받는다. 일부 실시양태에서 환자는 로수바스타틴을 투여받는다.
일부 실시양태에서, 환자는 환자가 심부전의 징후를 나타내는 경우에 스타틴을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 환자가 관상 동맥 질환 (CAD)의 높은 위험이 있을 때 스타틴을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 환자가 관상 동맥 질환 (CAD)을 갖는 경우에 스타틴을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 스타틴은 환자에서 심부전의 발병을 지연시킨다. 일부 실시양태에서, 스타틴은 환자에서 심부전의 발병을 예방한다. 일부 실시양태에서, 스타틴의 투여는 환자의 삶의 기간을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 스타틴의 투여는 환자의 병원 체류 기간을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 스타틴의 투여는 환자의 입원을 예방한다.
나트륨-글루코스 공동-수송체 2 (SGLT2) 억제제
나트륨-글루코스 공동-수송체 2 (SGLT2) 억제제는 전형적으로 제2형 당뇨병을 갖는 성인에서 혈당을 낮추기 위해 식이 및 운동과 함께 투여된다. SGLT2 억제제는 신장이 소변을 통해 신체로부터 당을 제거하도록 함으로써 혈당을 낮춘다. SGCT2 억제제로의 치료는 심혈관성 사망 및 심부전으로 인한 입원의 위험을 감소시키기 위해 감소된 박출 계수 심부전 (HFrEF)을 갖는 환자에서 권장된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 1종 이상의 SGLT2 억제제를 투여함으로써 심부전을 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, SGLT2 억제제는 글리플로진이다. 일부 실시양태에서, 환자는 카나글리플로진, 다파글리플로진 (예를 들어, 파르시가) 및 엠파글리플로진으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 SGLT2 억제제를 투여받는다. 일부 실시양태에서 환자는 카나글리플로진을 투여받는다. 일부 실시양태에서 환자는 다파글리플로진 (예를 들어, 파르시가)을 투여받는다. 일부 실시양태에서 환자는 엠파글리플로진을 투여받는다.
일부 실시양태에서, 환자는 환자가 심부전의 징후를 나타내는 경우에 SGLT2 억제제를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 환자가 제2형 당뇨병을 갖지 않는 경우에 SGLT2 억제제를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 환자가 제2형 당뇨병을 갖는 경우에 SGLT2 억제제를 투여받는다. 일부 실시양태에서, SGLT2 억제제는 환자에서 심부전의 발병을 지연시킨다. 일부 실시양태에서, SGLT2 억제제는 환자에서 심부전의 발병을 예방한다. 일부 실시양태에서, SGLT2 억제제의 투여는 환자의 삶의 기간을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, SGLT2 억제제의 투여는 환자의 병원 체류 기간을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, SGLT2 억제제의 투여는 환자의 입원을 예방한다. 일부 실시양태에서, SGLT2 억제제는 환자의 사망 위험을 감소시킨다.
이식형 심장율동전환 제세동기 (ICD)
이식형 심장율동전환 제세동기 (ICD)는 a) 급성 심근경색 후 적어도 40일째인, 허혈성 기원의 무증상 LV 수축기 기능장애 (예를 들어, LVEF ≤30%), 및 b) 골병증성 조작 치료 (OMT)를 받은, 무증상 비-허혈성 확장성 심근병증 (예를 들어, LVEF ≤30%) 중 1종 이상을 갖는 환자에서 돌연사를 예방하고 생명을 연장시키기 위해 권장된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 이식형 심장율동전환 제세동기 (ICD)를 투여함으로써 심부전을 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 환자는 환자가 심부전의 징후를 나타내는 경우에 ICD를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 급성 심근경색 후 적어도 40일째인, 허혈성 기원의 무증상 LV 수축기 기능장애 (예를 들어, LVEF ≤30%)를 갖는 환자는 ICD를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 허혈성 기원의 무증상 LV 수축기 기능장애 (예를 들어, LVEF ≤30%)를 갖는 환자는 ICD를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 급성 심근경색 후 적어도 40일째인 환자는 ICD를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 최적 의료 요법 (OMT)을 받는 무증상 비-허혈성 확장성 심근병증 (예를 들어, LVEF ≤30%)을 갖는 환자는 ICD를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 무증상 비-허혈성 확장성 심근병증 (예를 들어, LVEF ≤30%)을 갖는 환자는 ICD를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 최적 의료 요법을 받는 환자는 ICD를 투여받는다. 일부 실시양태에서, ICD는 환자에서 심부전의 발병을 지연시킨다. 일부 실시양태에서, ICD는 환자에서 심부전의 발병을 예방한다. 일부 실시양태에서, ICD의 투여는 환자의 삶의 기간을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, ICD의 투여는 환자의 병원 체류 기간을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, ICD의 투여는 환자의 입원을 예방한다.
안지오텐신 수용체 네프릴리신 억제제
안지오텐신 수용체 네프릴리신 억제제 (ARNI)로 불리는, 레닌-안지오텐신-알도스테론 시스템 (RAAS) 및 중성 엔도펩티다제 시스템에 작용하는 작용제의 비교적 새로운 치료 부류가 개발되었다. 제1 부류는 발사르탄 및 사쿠비트릴 (네프릴리신 억제제)의 모이어티를 단일 물질로 조합한 분자인 LCZ696이다. 네프릴리신을 억제함으로써, 나트륨이뇨 펩티드 (NP), 브라디키닌 및 다른 펩티드의 분해가 느려진다.
고 순환 A형 나트륨이뇨 펩티드 (ANP) 및 BNP는 NP 수용체에 대한 결합 및 cGMP의 증대된 생성을 통해 생리학적 효과를 발휘하여, 이뇨, 나트륨이뇨 및 심근 이완 및 항-재형성을 증진시킨다. ANP 및 BNP는 또한 레닌 및 알도스테론 분비를 억제한다. 선택적 AT1-수용체 차단은 혈관수축, 나트륨 및 수분 저류 및 심근 비대를 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 안지오텐신-수용체 네프릴리신 억제제를 투여함으로써 심부전을 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 환자는 사쿠비트릴/발사르탄 (예를 들어 LCZ696, 엔트레스토)을 투여받는다. 일부 실시양태에서, LVEF ≤35%인 외래, 증후성 HFrEF를 갖는 환자는 사쿠비트릴/발사르탄을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 상승된 혈장 NP 수준 (BNP ≥150 pg/mL 및/또는 NT-프로BNP ≥600 pg/mL) (또는, 이전 12개월 내에 HF로 인해 입원한 경우, BNP ≥100 pg/mL 및/또는 NT-프로BNP ≥400 pg/mL)을 갖는 환자는 사쿠비트릴/발사르탄을 투여받는다. 일부 실시양태에서, LVEF ≤35%인 외래, 증후성 HFrEF를 갖는 환자는 사쿠비트릴/발사르탄을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 추정 GFR (eGFR) ≥30 mL/분/1.73 m2의 체표면적을 갖는 환자는 사쿠비트릴/발사르탄을 투여받는다.
일부 실시양태에서, 환자는 환자가 심부전의 징후를 나타내는 경우에 사쿠비트릴/발사르탄을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 환자가 ACE 억제제에 불내성인 경우에 사쿠비트릴/발사르탄을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 환자가 베타 차단제에 불내성인 경우에 사쿠비트릴/발사르탄을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 환자가 MRA에 불내성인 경우에 사쿠비트릴/발사르탄을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 환자가 HFrEF를 갖고 ACE 억제제, 베타-차단제 및 MRA 중 1종 이상을 사용한 치료에도 불구하고 증후성을 유지하는 경우에 사쿠비트릴/발사르탄을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 사쿠비트릴/발사르탄은 환자에서 심부전의 발병을 지연시킨다. 일부 실시양태에서, 사쿠비트릴/발사르탄은 환자에서 심부전의 발병을 예방한다. 일부 실시양태에서, 사쿠비트릴/발사르탄의 투여는 환자의 삶의 기간을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 사쿠비트릴/발사르탄의 투여는 환자의 병원 체류 기간을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 사쿠비트릴/발사르탄의 투여는 환자의 입원을 예방한다.
일부 실시양태에서, 환자는 환자가 심부전의 징후를 나타내는 경우에 ARNI를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 환자가 ACE 억제제에 불내성인 경우에 ARNI를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 환자가 베타 차단제에 불내성인 경우에 ARNI를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 환자가 MRA에 불내성인 경우에 ARNI를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 환자가 HFrEF를 갖고 ACE 억제제, 베타-차단제 및 MRA 중 1종 이상을 사용한 치료에도 불구하고 증후성을 유지하는 경우에 ARNI를 투여받는다. 일부 실시양태에서, ARNI는 환자에서 심부전의 발병을 지연시킨다. 일부 실시양태에서, ARNI는 환자에서 심부전의 발병을 예방한다. 일부 실시양태에서, ARNI의 투여는 환자의 삶의 기간을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, ARNI의 투여는 환자의 병원 체류 기간을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, ARNI의 투여는 환자의 입원을 예방한다.
이뇨제
이뇨제는 HFrEF를 갖는 환자에서 울혈의 징후 및 증상을 감소시키기 위해 권장된다. 만성 HF를 갖는 환자에서, 루프 및 티아지드 이뇨제는 사망 및 HF의 악화의 위험을 감소시킬 수 있고, 또한 아마도 운동 능력을 개선시킬 수 있다. 전형적으로, 루프 이뇨제는 티아지드보다 더 강하고 더 짧은 이뇨를 발생시키지만, 이들은 상승작용적으로 작용하고, 조합물은 저항성 부종을 치료하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 1종 이상의 이뇨제를 투여함으로써 심부전을 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 환자는 푸로세미드, 부메타니드, 토라세미드, 벤드로플루메티아지드, 히드로클로로티아지드, 메톨라존, 인다파미드, 스피로노락톤/에플레레논, 아밀로리드 및 트리암테렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 이뇨제를 투여받는다.
일부 실시양태에서, 환자는 푸로세미드, 부메타니드 및 토라세미드로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 루프 이뇨제를 투여받는다. 일부 실시양태에서 환자는 푸로세미드를 투여받는다. 일부 실시양태에서 환자는 부메타니드를 투여받는다. 일부 실시양태에서 환자는 토라세미드를 투여받는다.
일부 실시양태에서, 환자는 벤드로플루메티아지드, 히드로클로로티아지드, 메톨라존 및 인다파미드로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 티아지드 이뇨제를 투여받는다. 일부 실시양태에서 환자는 벤드로플루메티아지드를 투여받는다. 일부 실시양태에서 환자는 히드로클로로티아지드를 투여받는다. 일부 실시양태에서 환자는 메톨라존을 투여받는다. 일부 실시양태에서 환자는 인다파미드를 투여받는다.
일부 실시양태에서, 환자는 스피로노락톤/에플레레논, 아밀로리드 및 트리암테렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 칼륨-보존성 이뇨제를 투여받는다. 일부 실시양태에서 환자는 스피로노락톤/에플레레논을 투여받는다. 일부 실시양태에서 환자는 아밀로리드를 투여받는다. 일부 실시양태에서 환자는 트리암테렌을 투여받는다.
일부 실시양태에서, 환자는 환자가 심부전의 징후를 나타내는 경우에 이뇨제를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 환자가 울혈 징후를 나타내는 경우에 이뇨제를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 환자가 관상 동맥 질환 (CAD)의 높은 위험이 있을 때 이뇨제를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 환자가 관상 동맥 질환 (CAD)을 갖는 경우에 이뇨제를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 이뇨제는 환자에서 심부전의 발병을 지연시킨다. 일부 실시양태에서, 이뇨제는 환자에서 심부전의 발병을 예방한다. 일부 실시양태에서, 이뇨제의 투여는 환자의 삶의 기간을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 이뇨제의 투여는 환자의 병원 체류 기간을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 이뇨제의 투여는 환자의 입원을 예방한다. 일부 실시양태에서, 이뇨제의 투여는 환자의 6분 보행 시험을 개선시킨다.
기타
일부 실시양태에서, 환자는 히드랄라진 및 이소소르비드 디니트레이트, 디곡신, 디기탈리스, N-3 다중불포화 지방산 (PUFA), 및 If-채널 억제제 (예를 들어, 이바브라딘)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 치료를 투여받는다. 일부 실시양태에서 환자는 히드랄라진 및 이소소르비드 디니트레이트를 투여받는다. 일부 실시양태에서 환자는 디곡신을 투여받는다. 일부 실시양태에서 환자는 디기탈리스를 투여받는다. 일부 실시양태에서 환자는 N-3 다중불포화 지방산 (PUFA)을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 환자는 If-채널 억제제 (예를 들어, 이바브라딘)를 투여받는다.
일부 실시양태에서, 환자는 환자가 심부전의 징후를 나타내는 경우에 히드랄라진 및 이소소르비드 디니트레이트, 디곡신, 디기탈리스, N-3 다중불포화 지방산 (PUFA), If-채널 억제제 (예를 들어, 이바브라딘) 중 1종 이상을 투여받는다. 일부 실시양태에서, 히드랄라진 및 이소소르비드 디니트레이트, 디곡신, 디기탈리스, N-3 다중불포화 지방산 (PUFA), If-채널 억제제 (예를 들어, 이바브라딘) 중 1종 이상은 환자에서 심부전의 발병을 지연시킨다. 일부 실시양태에서, 히드랄라진 및 이소소르비드 디니트레이트, 디곡신, 디기탈리스, N-3 다중불포화 지방산 (PUFA), If-채널 억제제 (예를 들어, 이바브라딘) 중 1종 이상은 환자에서 심부전의 발병을 예방한다. 일부 실시양태에서, 히드랄라진 및 이소소르비드 디니트레이트, 디곡신, 디기탈리스, N-3 다중불포화 지방산 (PUFA), If-채널 억제제 (예를 들어, 이바브라딘) 중 1종 이상의 투여는 환자의 삶의 기간을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 히드랄라진 및 이소소르비드 디니트레이트, 디곡신, 디기탈리스, N-3 다중불포화 지방산 (PUFA), If-채널 억제제 (예를 들어, 이바브라딘) 중 1종 이상의 투여는 환자의 병원 체류 기간을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 히드랄라진 및 이소소르비드 디니트레이트, 디곡신, 디기탈리스, N-3 다중불포화 지방산 (PUFA), If-채널 억제제 (예를 들어, 이바브라딘) 중 1종 이상의 투여는 환자의 입원을 예방한다. 일부 실시양태에서, 히드랄라진 및 이소소르비드 디니트레이트, 디곡신, 디기탈리스, N-3 다중불포화 지방산 (PUFA), If-채널 억제제 (예를 들어, 이바브라딘) 중 1종 이상의 투여는 환자의 6분 보행 시험을 개선시킨다.
8. 동반이환
동반이환은 HF에서 중요하고, HF에 대한 치료의 사용에 영향을 미칠 수 있다 (예를 들어, 중증 신장 기능장애를 갖는 일부 환자에서 레닌-안지오텐신 시스템 억제제를 사용하는 것은 가능하지 않을 수 있음). 또한, 동반이환을 치료하는 데 사용되는 약물은 HF의 악화를 유발할 수 있다 (예를 들어, 관절염에 대해 제공된 NSAID, 일부 항암 약물 등). 따라서, 동반이환의 관리는 HF를 갖는 환자의 전체적 관리의 핵심 사항이다. 일부 실시양태에서, HF에서 고려되는 1종 이상의 동반이환은 빈혈, 협심증, 동맥 고혈압, 관절염, 심방 세동, 악액질, 암, 인지 기능장애, 및 관상 동맥 질환 (CAD), 당뇨병, 발기 기능장애, 통풍, 고콜레스테롤혈증, 고칼륨혈증, 고칼륨혈증, 고지혈증, 고혈압, 철 결핍, 신장 기능장애, 대사 증후군, 비만, 신체 상태악화, 칼륨 장애, 폐 질환 (예를 들어, 천식, COPD), 근육감소증, 수면 무호흡, 수면 장애, 및 심장 판막 질환 (예를 들어, 대동맥 협착, 대동맥 역류, 승모판 폐쇄부전, 삼첨판 역류)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, HF에서 고려되는 1종 이상의 동반이환은 빈혈, 심방 세동, 관상 동맥 질환 (CAD) 및 수면 무호흡으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 1종 이상의 동반이환의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전의 1종 이상의 동반이환을 치료하는 방법을 고려한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 심부전의 1종 이상의 동반이환 (예를 들어, 동맥 고혈압, 심방 세동, 인지 기능장애, 당뇨병, 고콜레스테롤혈증, 철 결핍, 신장 기능장애, 대사 증후군, 비만, 신체 상태악화, 칼륨 장애, 폐 질환 (예를 들어, COPD), 및 수면 무호흡)의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 심부전의 1종 이상의 동반이환 (예를 들어, 동맥 고혈압, 심방 세동, 인지 기능장애, 당뇨병, 고콜레스테롤혈증, 철 결핍, 신장 기능장애, 대사 증후군, 비만, 신체 상태악화, 칼륨 장애, 폐 질환 (예를 들어, COPD), 및 수면 무호흡)을 치료하는 방법을 고려한다. 일부 실시양태에서, 노화와 연관된 심부전 심부전의 1종 이상의 동반이환은 간접적으로 개선된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전 심부전의 1종 이상의 동반이환의 예방을 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전 심부전의 1종 이상의 동반이환을 예방하는 방법을 고려한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 진행 속도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전의 진행 속도를 감소시키는 방법을 고려한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 1종 이상의 동반이환의 진행 속도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전의 1종 이상의 동반이환의 진행 속도를 감소시키는 방법을 고려한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전의 중증도를 감소시키는 방법을 고려한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전의 1종 이상의 동반이환의 중증도의 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전의 1종 이상의 동반이환의 중증도를 감소시키는 방법을 고려한다.
9. 스크리닝 검정
특정 측면에서, 본 개시내용은 노화와 연관된 심부전을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 데, 특히 1종 이상의 심부전-연관 동반이환을 치료, 예방, 또는 그의 진행 속도 및/또는 중증도를 감소시키는 데 사용될 수 있는 화합물 (작용제)을 확인하기 위한 ActRII-ALK4 길항제 (예를 들어, ActRII-ALK4 리간드 트랩 길항제, ActRII-ALK4 항체 길항제, ActRII-ALK4 폴리뉴클레오티드 길항제, 및/또는 ActRII-ALK4 소분자 길항제)의 용도에 관한 것이다.
1종 이상의 ActRII-ALK4 리간드의 신호전달 (예를 들어, Smad 신호전달)을 표적화하는 것에 의해 심부전을 치료하기 위한 치료제를 스크리닝하는 수많은 접근법이 존재한다. 특정 실시양태에서, 화합물의 고처리량 스크리닝을 수행하여 선택된 세포주에 대한 ActRII-ALK4 리간드-매개 효과를 교란시키는 작용제를 확인할 수 있다. 특정 실시양태에서, 검정은 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, GDF3, BMP6, GDF8, GDF15, GDF11 또는 BMP10)의 그의 결합 파트너, 예컨대 유형 II 수용체 (예를 들어, ActRIIA 및/또는 ActRIIB)에 대한 결합을 특이적으로 억제하거나 감소시키는 화합물을 스크리닝하고 확인하기 위해 수행된다. 대안적으로, 검정은 ActRII-ALK4 리간드의 그의 결합 파트너, 예컨대 유형 II 수용체에 대한 결합을 증진시키는 화합물을 확인하는 데 사용될 수 있다. 추가 실시양태에서, 화합물은 유형 II 수용체와 상호작용하는 그의 능력에 의해 확인될 수 있다.
다양한 검정 포맷은 충분할 것이고, 본 개시내용에 비추어, 본원에 명백하게 기재되지 않은 것은 그럼에도 불구하고 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 시험 화합물 (작용제)은 임의의 조합 화학적 방법에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 대상 화합물은 생체내 또는 시험관내 합성된 자연 발생 생체분자일 수 있다. 조직 성장의 조정제로서 작용하는 능력에 대해 시험될 화합물 (작용제)은, 예를 들어 박테리아, 효모, 식물 또는 다른 유기체 (예를 들어, 천연 생성물)에 의해 생산될 수 있거나, 화학적으로 생산될 수 있거나 (예를 들어, 펩티드모방체를 포함한 소분자), 또는 재조합적으로 생산될 수 있다. 본 발명에 의해 고려되는 시험 화합물은 비-펩티딜 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티드모방체, 당, 호르몬 및 핵산 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 시험 작용제는 약 2,000 달톤 미만의 분자량을 갖는 유기 소분자이다.
본 개시내용의 시험 화합물은 단일의 별개의 실체로서 제공될 수 있거나, 또는 조합 화학에 의해 제조된 바와 같은 보다 큰 복잡성의 라이브러리로 제공될 수 있다. 이들 라이브러리는, 예를 들어 알콜, 알킬 할라이드, 아민, 아미드, 에스테르, 알데히드, 에테르 및 다른 부류의 유기 화합물을 포함할 수 있다. 시험 시스템에 대한 시험 화합물의 제시는 특히 초기 스크리닝 단계에서 단리된 형태로 또는 화합물의 혼합물로서 이루어질 수 있다. 임의로, 화합물은 다른 화합물로 임의로 유도체화될 수 있고, 화합물의 단리를 용이하게 하는 유도체화 기를 가질 수 있다. 유도체화 기의 비제한적 예는 비오틴, 플루오레세인, 디곡시게닌, 녹색 형광 단백질, 동위원소, 폴리히스티딘, 자기 비드, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST), 광활성화가능한 가교제 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
화합물 및 천연 추출물의 라이브러리를 시험하는 많은 약물-스크리닝 프로그램에서, 주어진 기간 내에 조사되는 화합물의 수를 최대화하기 위해 고처리량 검정이 바람직하다. 예컨대 정제된 또는 반-정제된 단백질로 유래될 수 있는, 무세포 시스템에서 수행되는 검정은, 이들이 시험 화합물에 의해 매개되는 분자 표적에서의 변경의 신속한 개발 및 비교적 용이한 검출을 허용하도록 생성될 수 있다는 점에서 종종 "1차" 스크린으로서 바람직하다. 더욱이, 시험 화합물의 세포 독성 또는 생체이용률의 효과는 일반적으로 시험관내 시스템에서 무시될 수 있으며, 그 대신 검정은 ActRII-ALK4 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, GDF8, GDF15, GDF11, GDF3, BMP6, 또는 BMP10)와 그의 결합 파트너, 예컨대 유형 II 수용체 (예를 들어, ActRIIA 및/또는 ActRIIB) 사이의 결합 친화도의 변경에서 나타날 수 있는 바와 같은 분자 표적에 대한 약물의 효과에 주로 초점을 맞춘다.
단지 예시를 위해, 본 개시내용의 예시적인 스크리닝 검정에서, 관심 화합물을 검정의 의도에 적절한 바와 같이 통상적으로 ActRIIB 리간드에 결합할 수 있는 단리되고 정제된 ActRIIB 폴리펩티드와 접촉시킨다. 이어서, 화합물 및 ActRIIB 폴리펩티드의 혼합물에 ActRIIB 리간드 (예를 들어, GDF11)를 함유하는 조성물을 첨가한다. ActRIIB/ActRIIB-리간드 복합체의 검출 및 정량화는 ActRIIB 폴리펩티드와 그의 결합 단백질 사이의 복합체 형성을 억제 (또는 강화)하는 화합물의 효능을 결정하는 수단을 제공한다. 화합물의 효능은 다양한 농도의 시험 화합물을 사용하여 수득된 데이터로부터 용량-반응 곡선을 생성함으로써 평가될 수 있다. 또한, 비교를 위한 기준선을 제공하기 위해 대조군 검정이 또한 수행될 수 있다. 예를 들어, 대조군 검정에서, 단리되고 정제된 ActRIIB 리간드를 ActRIIB 폴리펩티드를 함유하는 조성물에 첨가하고, ActRIIB/ActRIIB 리간드 복합체의 형성을 시험 화합물의 부재 하에 정량화한다. 일반적으로, 반응물이 혼합될 수 있는 순서는 달라질 수 있고, 동시에 혼합될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 또한, 정제된 단백질 대신, 세포 추출물 및 용해물을 사용하여 적합한 무세포 검정 시스템을 만들 수 있다.
ActRII-ALK4 리간드와 그의 결합 단백질 사이의 복합체 형성은 다양한 기술에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 복합체의 형성의 조정은, 예를 들어 검출가능하게 표지된 단백질, 예컨대 방사성표지된 (예를 들어, 32P, 35S, 14C 또는 3H), 형광 표지된 (예를 들어, FITC), 또는 효소적으로 표지된 ActRIIB 폴리펩티드 및/또는 그의 결합 단백질을 사용하여, 면역검정에 의해 또는 크로마토그래피 검출에 의해 정량화될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 GDF/BMP 리간드와 그의 결합 단백질 사이의 상호작용의 정도를 직접적으로 또는 간접적으로 측정하는 데 있어서 형광 편광 검정 및 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 검정의 사용을 고려한다. 추가로, 광학 도파관 (예를 들어, PCT 공개 WO 96/26432 및 미국 특허 번호 5,677,196 참조), 표면 플라즈몬 공명 (SPR), 표면 전하 센서, 및 표면 힘 센서에 기초한 것과 같은 다른 검출 모드가 본 개시내용의 많은 실시양태와 상용성이다.
또한, 본 개시내용은 ActRII-ALK4 리간드와 그의 결합 파트너 사이의 상호작용을 방해하거나 강화시키는 작용제를 확인하기 위해, "2-하이브리드 검정"으로도 공지된 상호작용 트랩 검정의 사용을 고려한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,283,317; 문헌 [Zervos et al., (1993) Cell 72:223-232; Madura et al., (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel et al., (1993) Biotechniques 14:920-924; 및 Iwabuchi et al., (1993) Oncogene 8:1693-1696)]을 참조한다. 구체적 실시양태에서, 본 개시내용은 ActRII-ALK4 리간드와 그의 결합 단백질 사이의 상호작용을 해리시키는 화합물 (예를 들어, 소분자 또는 펩티드)을 확인하기 위한 역 2-하이브리드 시스템의 사용을 고려한다 [예를 들어, 문헌 [Vidal and Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal and Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81]; 및 미국 특허 번호 5,525,490; 5,955,280; 및 5,965,368 참조].
특정 실시양태에서, 대상 화합물은 ActRII-ALK4 리간드와 상호작용하는 그의 능력에 의해 확인된다. 화합물과 ActRII-ALK4 리간드 사이의 상호작용은 공유 또는 비-공유일 수 있다. 예를 들어, 이러한 상호작용은 광-가교, 방사성표지된 리간드 결합 및 친화성 크로마토그래피를 포함한 시험관내 생화학적 방법을 사용하여 단백질 수준에서 확인될 수 있다 [예를 들어, 문헌 [Jakoby WB et al., (1974) Methods in Enzymology 46:1] 참조]. 특정 경우에, 화합물은 메카니즘-기반 검정, 예컨대 ActRII-ALK4 리간드에 결합하는 화합물을 검출하기 위한 검정에서 스크리닝될 수 있다. 이는 고체-상 또는 유체-상 결합 사건을 포함할 수 있다. 대안적으로, ActRII-ALK4 리간드를 코딩하는 유전자를 리포터 시스템 (예를 들어, β-갈락토시다제, 루시페라제 또는 녹색 형광 단백질)과 함께 세포 내로 형질감염시키고, 라이브러리에 대해 바람직하게는 고처리량 스크리닝에 의해 또는 라이브러리의 개별 구성원으로 스크리닝할 수 있다. 다른 메카니즘-기반 결합 검정; 예를 들어, 자유 에너지의 변화를 검출하는 결합 검정이 사용될 수 있다. 결합 검정은 표적을 웰, 비드 또는 칩에 고정시키거나 또는 고정된 항체에 의해 포획하거나 또는 모세관 전기영동에 의해 분해하여 수행할 수 있다. 결합된 화합물은 통상적으로 비색 종점 또는 형광 또는 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 검출될 수 있다.
10. 제약 조성물
본원에 기재된 치료제 (예를 들어, ActRII-ALK4 길항제)는 제약 조성물로 제제화될 수 있다. 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 제약 조성물은 1종 이상의 생리학상 허용되는 담체 또는 부형제를 사용하여 통상적인 방식으로 제제화될 수 있다. 이러한 제제는 일반적으로 대부분의 규제 요건에 따라 실질적으로 발열원-무함유일 것이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 치료 방법은 조성물을 전신으로, 또는 이식물 또는 장치로서 국부로 투여하는 것을 포함한다. 투여되는 경우, 본 개시내용에 사용하기 위한 치료 조성물은 실질적으로 발열원-무함유 또는 발열원-무함유 생리학상 허용되는 형태이다. 상기 기재된 바와 같은 조성물에 또한 임의로 포함될 수 있는 ActRII-ALK4 길항제 이외의 치료상 유용한 작용제는 본원에 개시된 방법에서 대상 화합물과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
전형적으로, 본원에 개시된 단백질 치료제는 비경구로, 특히 정맥내로 또는 피하로 투여될 것이다. 비경구 투여에 적합한 제약 조성물은 1종 이상의 ActRII-ALK4 길항제를 1종 이상의 제약상 허용되는 멸균 등장성 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 또는 사용 직전에 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 멸균 분말과 조합하여 포함할 수 있으며, 이는 항산화제, 완충제, 정박테리아제, 제제를 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되게 하는 용질, 또는 현탁화제 또는 증점제를 함유할 수 있다. 본 개시내용의 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어 코팅 물질, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비경구 투여 경로는 근육내, 복강내, 피내, 유리체내, 경막외, 뇌내, 동맥내, 관절내, 해면내, 병변내, 골내, 안내, 척수강내, 정맥내, 경피, 경점막, 양막외 투여, 피하, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 비경구 투여 경로는 피하이다. 일부 실시양태에서, 비경구 투여 경로는 피하 주사이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 피하 주사에 의해 투여된다.
조성물 및 제제는, 원하는 경우에, 활성 성분을 함유하는 1종 이상의 단위 투여 형태를 함유할 수 있는 팩 또는 분배기 장치로 제공될 수 있다. 팩은 예를 들어 금속 또는 플라스틱 호일, 예컨대 블리스터 팩을 포함할 수 있다. 팩 또는 분배기 장치는 투여에 대한 지침서를 동반할 수 있다.
추가로, 조성물은 표적 조직 부위로의 전달을 위한 형태로 캡슐화되거나 주사될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 1종 이상의 치료 화합물 (예를 들어, ActRII-ALK4 길항제)을 표적 조직 부위로 전달할 수 있는 매트릭스를 포함하여, 발생 중인 조직을 위한 구조를 제공하고, 최적으로는 신체 내로 재흡수될 수 있다. 예를 들어, 매트릭스는 ActRII-ALK4 길항제의 느린 방출을 제공할 수 있다. 이러한 매트릭스는 현재 다른 이식 의학적 적용에 사용되는 물질로 형성될 수 있다.
매트릭스 물질의 선택은 생체적합성, 생분해성, 기계적 특성, 미용 외관 및 계면 특성에 기초한다. 대상 조성물의 특정한 적용은 적절한 제제를 규정할 것이다. 조성물에 대한 잠재적 매트릭스는 생분해성이고 화학적으로 규정된 황산칼슘, 인산삼칼슘, 히드록시아파타이트, 폴리락트산 및 폴리무수물일 수 있다. 다른 잠재적 물질은 생분해성이고 생물학적으로 잘 규정된, 예컨대 골 또는 피부 콜라겐이다. 추가의 매트릭스는 순수한 단백질 또는 세포외 매트릭스 성분으로 구성된다. 다른 잠재적 매트릭스는 비-생분해성이고 화학적으로 규정된, 예컨대 소결 히드록시아파타이트, 바이오글래스, 알루미네이트, 또는 다른 세라믹이다. 매트릭스는 임의의 상기 언급된 유형의 물질의 조합물, 예컨대 폴리락트산 및 히드록시아파타이트 또는 콜라겐 및 인산삼칼슘으로 구성될 수 있다. 바이오세라믹은 조성, 예컨대 칼슘-알루미네이트-포스페이트에서 변경될 수 있고, 세공 크기, 입자 크기, 입자 형상 및 생분해성을 변경시키기 위한 프로세싱에서 변경될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 경구로, 예를 들어 캡슐, 카쉐, 환제, 정제, 로젠지 (향미 베이스, 통상적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트를 사용함), 분말, 과립의 형태로, 또는 수성 또는 비-수성 액체 중 용액 또는 현탁액으로서, 또는 수중유 또는 유중수 액체 에멀젼으로서, 또는 엘릭시르 또는 시럽으로서, 또는 파스틸 (불활성 베이스, 예컨대 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아를 사용함)로서 및/또는 구강 세정제 등으로서 투여될 수 있으며, 각각은 활성 성분으로서 미리 결정된 양의 작용제를 함유한다. 작용제는 또한 볼루스, 연약 또는 페이스트로서 투여될 수 있다.
경구 투여를 위한 고체 투여 형태 (캡슐, 정제, 환제, 당의정, 분말, 과립 등)에서, 본 발명의 1종 이상의 치료 화합물은 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 예컨대 시트르산나트륨 또는 인산이칼슘, 및/또는 하기 중 임의의 것과 혼합될 수 있다: (1) 충전제 또는 증량제, 예컨대 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨, 및/또는 규산; (2) 결합제, 예컨대, 예를 들어, 카르복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로스, 및/또는 아카시아; (3) 함습제, 예컨대 글리세롤; (4) 붕해제, 예컨대 한천-한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 규산염, 및 탄산나트륨; (5) 용해 지연제, 예컨대 파라핀; (6) 흡수 촉진제, 예컨대 4급 암모늄 화합물; (7) 습윤제, 예컨대, 예를 들어, 세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트; (8) 흡수제, 예컨대 카올린 및 벤토나이트 점토; (9) 윤활제, 예컨대 활석, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 술페이트, 및 그의 혼합물; 및 (10) 착색제. 캡슐, 정제 및 환제의 경우에, 제약 조성물은 또한 완충제를 포함할 수 있다. 유사한 유형의 고체 조성물은 또한 부형제, 예컨대 락토스 또는 유당, 뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등을 사용하여 연질 및 경질-충전 젤라틴 캡슐 내의 충전제로서 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 액체 투여 형태는 제약상 허용되는 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 활성 성분에 더하여, 액체 투여 형태는 관련 기술분야에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제, 예컨대 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일 (특히, 목화씨, 땅콩, 옥수수, 배아, 올리브, 피마자, 및 참깨 오일), 글리세롤, 테트라히드로푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 그의 혼합물을 함유할 수 있다. 불활성 희석제 이외에, 경구 조성물은 또한 아주반트, 예컨대 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 감미제, 향미제, 착색제, 퍼퓸제 및 보존제를 포함할 수 있다.
현탁액은 활성 화합물에 더하여 현탁화제 예컨대 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨, 및 소르비탄 에스테르, 미세결정질 셀룰로스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 한천-한천 및 트라가칸트, 및 그의 혼합물을 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 아주반트, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 포함시킴으로써 보장될 수 있다. 등장화제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 조성물에 포함시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 또한, 주사가능한 제약 형태의 지속 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 이루어질 수 있다.
투여 요법은 본 개시내용의 대상 화합물 (예를 들어, ActRII-ALK4 길항제)의 작용을 변형시키는 다양한 인자를 고려하여 담당 의사에 의해 결정될 것으로 이해된다. 다양한 인자는 환자의 연령, 성별 및 식이, 중증도 질환, 투여 시간 및 다른 임상 인자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 임의로, 투여량은 재구성에 사용되는 매트릭스의 유형 및 조성물 중 화합물의 유형에 따라 달라질 수 있다. 다른 공지된 성장 인자를 최종 조성물에 첨가하는 것이 또한 투여량에 영향을 미칠 수 있다. 진행은 골 성장 및/또는 복구, 예를 들어 X선 (DEXA 포함), 조직형태측정 결정, 및 테트라시클린 표지의 주기적 평가에 의해 모니터링될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 또한 ActRII-ALK4 길항제의 생체내 생산을 위한 유전자 요법을 제공한다. 이러한 요법은 ActRII-ALK4 길항제 폴리뉴클레오티드 서열을 상기 열거된 바와 같은 장애를 갖는 세포 또는 조직 내로 도입함으로써 그의 치료 효과를 달성할 것이다. ActRII-ALK4 길항제 폴리뉴클레오티드 서열의 전달은 재조합 발현 벡터, 예컨대 키메라 바이러스 또는 콜로이드성 분산 시스템을 사용하여 달성될 수 있다. ActRII-ALK4 길항제 폴리뉴클레오티드 서열의 치료적 전달에 바람직한 것은 표적화된 리포솜의 사용이다.
본원에 교시된 바와 같은 유전자 요법에 이용될 수 있는 다양한 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아, 또는 바람직하게는 RNA 바이러스, 예컨대 레트로바이러스를 포함한다. 바람직하게는, 레트로바이러스 벡터는 뮤린 또는 조류 레트로바이러스의 유도체이다. 단일 외래 유전자가 삽입될 수 있는 레트로바이러스 벡터의 예는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MoMuLV), 하비 뮤린 육종 바이러스 (HaMuSV), 뮤린 유방 종양 바이러스 (MuMTV), 및 라우스 육종 바이러스 (RSV)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다수의 추가의 레트로바이러스 벡터가 다중 유전자를 혼입할 수 있다. 모든 이들 벡터는 형질도입된 세포가 확인되고 생성될 수 있도록 선택 마커에 대한 유전자를 전달하거나 혼입할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 예를 들어, 당, 당지질, 또는 단백질을 부착시킴으로써 표적-특이적으로 제조될 수 있다. 바람직한 표적화는 항체를 사용함으로써 달성된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 ActRII-ALK4 길항제를 함유하는 레트로바이러스 벡터의 표적 특이적 전달을 가능하게 하기 위해 특정 폴리뉴클레오티드 서열이 레트로바이러스 게놈 내로 삽입될 수 있거나 또는 바이러스 외피에 부착될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 한 실시양태에서, 벡터는 골 또는 연골에 대해 표적화된다.
대안적으로, 조직 배양 세포는 레트로바이러스 구조 유전자 gag, pol 및 env를 코딩하는 플라스미드로 통상적인 인산칼슘 형질감염에 의해 직접 형질감염될 수 있다. 이어서, 이들 세포를 관심 유전자를 함유하는 벡터 플라스미드로 형질감염시킨다. 생성된 세포는 레트로바이러스 벡터를 배양 배지 내로 방출한다.
ActRII-ALK4 길항제 폴리뉴클레오티드에 대한 또 다른 표적화된 전달 시스템은 콜로이드 분산액 시스템이다. 콜로이드 분산액 시스템은 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로구체, 비드, 및 지질-기반 시스템, 예컨대 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀, 및 리포솜을 포함한다. 본 발명의 바람직한 콜로이드성 시스템은 리포솜이다. 리포솜은 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 유용한 인공 막 소포이다. RNA, DNA 및 무손상 비리온은 수성 내부 내에 캡슐화될 수 있고, 생물학적 활성 형태로 세포에 전달될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981] 참조). 리포솜 비히클을 사용하는 효율적인 유전자 전달 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988]을 참조한다. 리포솜의 조성은 통상적으로 스테로이드, 특히 콜레스테롤과 조합된, 통상적으로 인지질의 조합이다. 다른 인지질 또는 다른 지질이 또한 사용될 수 있다. 리포솜의 물리적 특징은 pH, 이온 강도, 및 2가 양이온의 존재에 좌우된다.
리포솜 생산에 유용한 지질의 예는 포스파티딜 화합물, 예컨대 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고지질, 세레브로시드 및 강글리오시드를 포함한다. 예시적인 인지질은 난 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 및 디스테아로일포스파티딜콜린을 포함한다. 리포솜의 표적화는 또한, 예를 들어 기관-특이성, 세포-특이성 및 소기관-특이성에 기초하여 가능하고, 이는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
본 개시내용은 pH를 조정하기 위한 산 및 염기; 및 pH를 좁은 범위 내로 유지시키기 위한 완충제를 포함하도록 달라질 수 있는 제제를 제공한다.
예시
본 발명은 이제 일반적으로 기재되며, 이는 하기 실시예를 참조하여 보다 용이하게 이해될 것이고, 이는 단지 본 발명의 특정 실시양태의 예시 목적을 위해 포함되는 것으로 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1: ActRIIA-Fc 융합 단백질
사이에 최소 링커를 갖는, 인간 또는 마우스 Fc 도메인에 융합된 인간 ActRIIA의 세포외 도메인을 갖는 가용성 ActRIIA 융합 단백질을 구축하였다. 구축물은 각각 ActRIIA-hFc 및 ActRIIA-mFc로 지칭된다.
CHO 세포주로부터 정제된 바와 같은 ActRIIA-hFc가 하기에 제시된다 (서열식별번호: 380):
CHO 세포주로부터 정제된 바와 같은 C-말단 리신이 결여된 추가의 ActRIIA-hFc가 하기에 제시된다 (서열식별번호: 378):
ActRIIA-hFc 및 ActRIIA-mFc 단백질을 CHO 세포주에서 발현시켰다. 3개의 상이한 리더 서열을 고려하였다:
(i) 꿀벌 멜리틴 (HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (서열식별번호: 7)
(ii) 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (서열식별번호: 8)
(iii) 천연: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (서열식별번호: 379).
선택된 형태는 TPA 리더를 사용하고, 하기 비프로세싱된 아미노산 서열을 갖는다:
이러한 폴리펩티드는 하기 핵산 서열에 의해 코딩된다:
ActRIIA-hFc 및 ActRIIA-mFc 둘 다는 재조합 발현이 현저히 적용가능하였다. 도 14에 제시된 바와 같이, 단백질을 단백질의 잘 규정된 단일 피크로서 정제하였다. N-말단 서열분석은 -ILGRSETQE (서열식별번호: 383)의 단일 서열을 밝혀내었다. 정제는, 예를 들어 하기 중 3개 이상을 임의의 순서로 포함하는 일련의 칼럼 크로마토그래피 단계에 의해 달성될 수 있다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로스 크로마토그래피, 페닐세파로스 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피. 정제는 바이러스 여과 및 완충제 교환에 의해 완료될 수 있었다. ActRIIA-hFc 단백질을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정된 바와 같이 >98% 및 SDS PAGE에 의해 결정된 바와 같이 >95%의 순도로 정제하였다.
ActRIIA-hFc 및 ActRIIA-mFc는 리간드에 대해 높은 친화도를 나타내었다. GDF11 또는 액티빈 A를 표준 아민-커플링 절차를 사용하여 비아코어™ CM5 칩 상에 고정시켰다. ActRIIA-hFc 및 ActRIIA-mFc 단백질을 시스템 상에 로딩하고, 결합을 측정하였다. ActRIIA-hFc는 액티빈에 5 x 10-12의 해리 상수 (KD)로 결합하였고, GDF11에 9.96 x 10-9의 KD로 결합하였다. 도 15a-b를 참조한다. 유사한 결합 검정을 사용하여, ActRIIA-hFc는 예를 들어 액티빈 B, GDF8, BMP6 및 BMP10을 비롯한 다른 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드에 대해 높은 내지 중간 정도의 친화도를 갖는 것으로 결정되었다. ActRIIA-mFc는 유사하게 거동하였다.
ActRIIA-hFc는 약동학적 연구에서 매우 안정하였다. 래트에게 1 mg/kg, 3 mg/kg 또는 10 mg/kg의 ActRIIA-hFc 단백질을 투여하고, 24, 48, 72, 144 및 168시간째에 단백질의 혈장 수준을 측정하였다. 별개의 연구에서, 래트에게 1 mg/kg, 10 mg/kg, 또는 30 mg/kg을 투여하였다. 래트에서, ActRIIA-hFc는 11-14일의 혈청 반감기를 가졌고, 약물의 순환 수준은 2주 후에 상당히 높았다 (1 mg/kg, 10 mg/kg 또는 30 mg/kg의 초기 투여에 대해 각각 11 μg/ml, 110 μg/ml 또는 304 μg/ml). 시노몰구스 원숭이에서, 혈장 반감기는 실질적으로 14일 초과였고, 약물의 순환 수준은 1 mg/kg, 10 mg/kg 또는 30 mg/kg의 초기 투여에 대해 각각 25 μg/ml, 304 μg/ml 또는 1440 μg/ml였다.
실시예 2: ActRIIA-hFc 단백질의 특징화
ActRIIA-hFc 융합 단백질을 안정하게 형질감염된 CHO-DUKX B11 세포에서 pAID4 벡터 (SV40 ori/인핸서, CMV 프로모터)로부터 서열식별번호: 8의 조직 플라스미노겐 리더 서열을 사용하여 발현시켰다. 상기 실시예 1에 기재된 바와 같은 정제된 단백질은 서열식별번호: 380의 서열을 가졌다. Fc 부분은 서열식별번호: 380에 제시된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 서열이다. 단백질 분석은 ActRIIA-hFc 융합 단백질이 디술피드 결합을 갖는 동종이량체로서 형성되었음을 나타낸다.
CHO-세포-발현된 물질은 인간 293 세포에서 발현된 ActRIIA-hFc 융합 단백질에 대해 보고된 것보다 액티빈 B 리간드에 대해 더 높은 친화도를 갖는다 [문헌 [del Re et al., (2004) J Biol Chem. 279(51):53126-53135] 참조]. 추가적으로, TPA 리더 서열의 사용은 다른 리더 서열보다 더 큰 생산을 제공하였고, 천연 리더 하에 발현된 ActRIIA-Fc와 달리, 고도로 순수한 N-말단 서열을 제공하였다. 천연 리더 서열의 사용은 각각 상이한 N-말단 서열을 갖는 ActRIIA-Fc의 2종의 주요 종을 생성하였다.
실시예 3: 대안적 ActRIIA-Fc 단백질
본원에 기재된 방법에 따라 사용될 수 있는 다양한 ActRIIA 변이체는 WO2006/012627 (예를 들어, pp. 55-58 참조)로서 공개된 국제 특허 출원에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 대안적 구축물은 C-말단 꼬리 (ActRIIA의 세포외 도메인의 최종 15개 아미노산)의 결실을 가질 수 있다. 이러한 구축물에 대한 서열을 하기에 제시한다 (Fc 부분은 밑줄로 표시함) (서열식별번호: 384):
실시예 4. ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드의 생성
본 출원인은, 사이에 링커 (3개의 글리신 아미노산)를 갖는, 인간 G1Fc 도메인에 융합된 인간 ActRIIB의 세포외 도메인을 갖는 가용성 ActRIIB 융합 폴리펩티드를 구축하였다. 구축물은 ActRIIB(20-134)-G1Fc로 지칭된다.
CHO 세포주로부터 정제된 바와 같은 ActRIIB(20-134)-G1Fc가 하기에 서열식별번호: 5로 제시된다 (링커는 밑줄로 표시됨):
CHO 세포주로부터 정제된 바와 같은 C-말단 리신이 결여된 추가의 ActRIIB(20-134)-G1Fc가 하기에 제시된다 (서열식별번호: 385):
ActRIIB(20-134)-G1Fc 폴리펩티드를 CHO 세포주에서 발현시켰다. 3개의 상이한 리더 서열을 고려하였다:
(i) 꿀벌 멜리틴 (HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (서열식별번호: 7)
(ii) 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (서열식별번호: 8)
(iii) 천연: MTAPWVALALLWGSLCAG (서열식별번호: 9).
선택된 형태는 TPA 리더를 사용하고, 하기 비프로세싱된 아미노산 서열을 갖는다:
이 폴리펩티드는 하기 핵산 서열 (서열식별번호: 10)에 의해 코딩된다:
CHO-세포 생산된 물질의 N-말단 서열분석은 -GRGEAE (서열식별번호: 11)의 주요 서열을 밝혀내었다. 명백히, 문헌에 보고된 다른 구축물은 -SGR... 서열로 시작한다.
정제는, 예를 들어 하기 중 3개 이상을 임의의 순서로 포함하는 일련의 칼럼 크로마토그래피 단계에 의해 달성될 수 있다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로스 크로마토그래피, 페닐세파로스 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피. 정제는 바이러스 여과 및 완충제 교환에 의해 완료될 수 있었다.
ActRIIB(20-134)-Fc 융합 폴리펩티드를 또한 HEK293 세포 및 COS 세포에서 발현시켰다. 모든 세포주 및 합리적인 배양 조건으로부터의 물질이 생체내 근육-구축 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공하였지만, 아마도 세포주 선택 및/또는 배양 조건과 관련이 있을, 효력의 가변성이 관찰되었다.
실시예 5. 컴퓨터 방법
액티빈 IIB 수용체 (ActRIIB)는 Smad2/3 활성화를 자극하는 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, 및 GDF11, 뿐만 아니라 Smad1/5/8 활성화를 자극하는 골 형태발생 단백질 (BMP), 예컨대 BMP9 및 BMP10을 포함한 다중 TGFβ 슈퍼패밀리 리간드에 결합한다. ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 가용성 리간드에 결합하고, 리간드가 세포 표면 수용체에 결합하는 것을 방지함으로써 Smad 활성화를 차단하는 리간드 트랩으로서 기능할 수 있다. BMP9-매개된 Smad1/5/8 활성화의 ActRIIB-Fc 길항작용은 비혈 및 모세혈관확장증을 비롯한 바람직하지 않은 부작용을 유발하는 것으로 공지되어 있다 (Campbell, C. et al., Muscle Nerve 55: 458-464, 2017). Smad2/3 활성화를 자극하는 리간드에 대한 결합은 유지시키면서 BMP9 결합을 감소시키는 ActRIIB에서의 돌연변이를 설계하기 위해, 본 발명자들은 3종의 ActRIIB 리간드 복합체의 결정 구조를 비교하였다: (1) BMP9:ActRIIB:Alk1, PDB ID=4fao, (2) ActRIIB:액티빈 A, PDB ID:1s4y, 및 (3) GDF11:ActRIIB:Alk5, PDB ID: 6mac (단백질 데이터 뱅크 (PDB) https://www.rcsb.org/로부터 입수가능함). 결정 구조에 기초한 ActRIIB와 3종의 리간드 사이의 접촉의 비교는 동일한 상응하는 ActRIIB 잔기에 의해 접촉된 리간드 잔기의 전하, 극성 및 소수성 차이에 기초하여 돌연변이 포커스를 위한 잔기를 밝혀내었다. 돌연변이를 표적화하기 위해 잔기를 확인한 후, 슈뢰딩거 바이오루미네이트 생물제제 모델링 소프트웨어 플랫폼 (버전 2017-4: 바이오루미네이트, 슈뢰딩거, 엘엘씨(Schroedinger, LLC), 뉴욕주 뉴욕)을 사용하여 다른 리간드-결합 활성은 유지시키면서 BMP9에 대한 결합을 감소시킬 ActRIIB에서의 돌연변이를 컴퓨터적으로 예측하였다.
결정 구조의 비교로부터 확인된 모든 잔기를 돌연변이에 대해 고려하였다. 구조적 복합체 내의 분자의 안정성 및 친화도 둘 다를 고려하여 잔기 스캐닝 계산을 수행하여, 각각의 분자 (리간드 및 수용체) 및 복합체 구조에 대한 잠재적 돌연변이 및 에너지, 뿐만 아니라 야생형 및 돌연변이체 형태 둘 다에 대한 에너지 차이의 명시된 목록을 생성하였다. 친화도/안정성/프라임 에너지 등 파라미터를 분석한 후, 상위 5%-10%의 단일 돌연변이를 확인하였다. 이러한 분석에 이어서 이들 돌연변이의 잠재적 조합을 분석하였다. 선택된 단일 돌연변이 및 돌연변이 조합을 구조적 차이 및 형성된/상실된 접촉을 이해하기 위해 구조적으로 분석하였다. 궁극적으로, 817개의 단일 돌연변이를 각각의 복합체 (ActRIIB:리간드)에 대해 스크리닝하고, Δ친화도에 기초하여, 및 또한 Δ안정성 (용매화) 및 Δ프라임 에너지를 선택적으로 고려하여 상위 히트를 선택하였다. 두드러지는 이상치와 관련하여 또한 다른 특성을 고려하였다.
실시예 6. 변이체 ActRIIB-Fc 폴리펩티드의 생성
실시예 4에 기재된 발견에 기초하여, 본 출원인은 ActRIIB의 세포외 도메인에 일련의 돌연변이 (서열 변이)를 생성하고, 이들 변이체 폴리펩티드를 변이체 ActRIIB 세포외 도메인 및 임의적인 링커에 의해 연결된 Fc 도메인을 포함하는 가용성 동종이량체 융합 폴리펩티드로서 생산하였다. 변이체 ActRIIB-Fc 폴리펩티드의 생성에 사용된 배경 ActRIIB-Fc 융합체는 ActRIIB-G1Fc이고, 서열식별번호: 5로서 상기 실시예 4에 제시된다.
다양한 치환 돌연변이를 배경 ActRIIB-G1Fc 폴리펩티드에 도입하였다. 실시예 4에 제시된 데이터에 기초하여, 이들 구축물은 TPA 리더 하에 발현되는 경우에 N-말단 세린이 결여될 것으로 예상된다. 따라서, 대다수의 성숙 서열은 글리신으로 시작할 수 있지만 (N-말단 세린이 결여됨), 일부 종은 N-말단 세린이 존재할 수 있다. PCR 돌연변이유발에 의해 ActRIIB 세포외 도메인에 돌연변이를 생성하였다. PCR 후, 단편을 퀴아젠 칼럼을 통해 정제하고, SfoI 및 AgeI로 소화시키고, 겔 정제하였다. 이들 단편을 발현 벡터 pAID4 (WO2006/012627 참조) 내로 라이게이션하였고, 라이게이션 시 인간 IgG1과 융합 키메라를 생성하였다. 이. 콜라이 DH5 알파 내로 형질전환되면, 콜로니를 골라내고, DNA를 단리하였다. 뮤린 구축물 (mFc)의 경우, 인간 IgG1을 뮤린 IgG2a로 대체하였다. 모든 돌연변이체를 서열 검증하였다.
비프로세싱된 ActRIIB(F82I-N83R)-G1Fc의 아미노산 서열이 하기에 제시된다 (서열식별번호: 276). 신호 서열 및 링커 서열은 실선 밑줄로 표시되고, F82I 및 N83R 치환은 이중 밑줄로 표시된다. 서열식별번호: 276의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
이러한 ActRIIB(F82I-N83R)-G1Fc 융합 폴리펩티드는 하기 핵산 서열 (서열식별번호: 277)에 의해 코딩된다:
성숙 ActRIIB(F82I-N83R)-G1Fc 융합 폴리펩티드 (서열식별번호: 278)는 하기와 같고, 임의로 C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
비프로세싱된 ActRIIB(F82K-N83R)-G1Fc의 아미노산 서열이 하기에 제시된다 (서열식별번호: 279). 신호 서열 및 링커 서열은 실선 밑줄로 표시되고, F82K 및 N83R 치환은 이중 밑줄로 표시된다. 서열식별번호: 279의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
이러한 ActRIIB(F82K-N83R)-G1Fc 융합 폴리펩티드는 하기 핵산 서열 (서열식별번호: 331)에 의해 코딩된다:
성숙 ActRIIB(F82K-N83R)-G1Fc 융합 폴리펩티드 (서열식별번호: 332)는 하기와 같고, 임의로 C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
비프로세싱된 ActRIIB(F82T-N83R)-G1Fc의 아미노산 서열이 하기에 제시된다 (서열식별번호: 333). 신호 서열 및 링커 서열은 실선 밑줄로 표시되고, F82T 및 N83R 치환은 이중 밑줄로 표시된다. 서열식별번호: 333의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
이러한 ActRIIB(F82T-N83R)-G1Fc 융합 폴리펩티드는 하기 핵산 서열 (서열식별번호: 334)에 의해 코딩된다:
성숙 ActRIIB(F82T-N83R)-G1Fc 융합 폴리펩티드 (서열식별번호: 335)는 하기와 같고, 임의로 C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
비프로세싱된 ActRIIB(F82T)-G1Fc의 아미노산 서열이 하기에 제시된다 (서열식별번호: 336). 신호 서열 및 링커 서열은 실선 밑줄로 표시되고, F82T 치환은 이중 밑줄로 표시된다. 서열식별번호: 336의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
이러한 ActRIIB(F82T)-G1Fc 융합 폴리펩티드는 하기 핵산 서열 (서열식별번호: 337)에 의해 코딩된다:
성숙 ActRIIB(F82T)-G1Fc 융합 폴리펩티드 (서열식별번호: 338)는 하기와 같고, 임의로 C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
비프로세싱된 ActRIIB(L79H-F82I)-G1Fc의 아미노산 서열이 하기에 제시된다 (서열식별번호: 339). 신호 서열 및 링커 서열은 실선 밑줄로 표시되고, L79H 및 F82I 치환은 이중 밑줄로 표시된다. 서열식별번호: 339의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
이러한 ActRIIB(L79H-F82I)-G1Fc 융합 폴리펩티드는 하기 핵산 서열 (서열식별번호: 340)에 의해 코딩된다:
성숙 ActRIIB(L79H-F82I)-G1Fc 융합 폴리펩티드 (서열식별번호: 341)는 하기와 같고, 임의로 C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
비프로세싱된 ActRIIB(L79H)-G1Fc의 아미노산 서열이 하기에 제시된다 (서열식별번호: 342). 신호 서열 및 링커 서열은 실선 밑줄로 표시되고, L79H 치환은 이중 밑줄로 표시된다. 서열식별번호: 342의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
이러한 ActRIIB(L79H)-G1Fc 융합 폴리펩티드는 하기 핵산 서열 (서열식별번호: 343)에 의해 코딩된다:
성숙 ActRIIB(L79H)-G1Fc 융합 폴리펩티드 (서열식별번호: 344)는 하기와 같고, 임의로 C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
비프로세싱된 ActRIIB(L79H-F82K)-G1Fc의 아미노산 서열이 하기에 제시된다 (서열식별번호: 345). 신호 서열 및 링커 서열은 실선 밑줄로 표시되고, L79H 및 F82K 치환은 이중 밑줄로 표시된다. 서열식별번호: 345의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
이러한 ActRIIB(L79H-F82K)-G1Fc 융합 폴리펩티드는 하기 핵산 서열 (서열식별번호: 346)에 의해 코딩된다:
성숙 ActRIIB(L79H-F82K)-G1Fc 융합 폴리펩티드 (서열식별번호: 347)는 하기와 같고, 임의로 C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
비프로세싱된 ActRIIB(E50L)-G1Fc의 아미노산 서열이 하기에 제시된다 (서열식별번호: 348). 신호 서열 및 링커 서열은 실선 밑줄로 표시되고, E50L 치환은 이중 밑줄로 표시된다. 서열식별번호: 348의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
이러한 ActRIIB(E50L)-G1Fc 융합 폴리펩티드는 하기 핵산 서열 (코돈 최적화됨) (서열식별번호: 349)에 의해 코딩된다:
성숙 ActRIIB(E50L)-G1Fc 융합 폴리펩티드 (서열식별번호: 350)는 하기와 같고, 임의로 C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
비프로세싱된 ActRIIB(L38N-L79R)-G1Fc의 아미노산 서열이 하기에 제시된다 (서열식별번호: 351). 신호 서열 및 링커 서열은 실선 밑줄로 표시되고, L38N 및 L79R 치환은 이중 밑줄로 표시된다. 서열식별번호: 351의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
이러한 ActRIIB(L38N-L79R)-G1Fc 융합 폴리펩티드는 하기 핵산 서열 (서열식별번호: 352)에 의해 코딩된다:
성숙 ActRIIB(L38N-L79R)-G1Fc 융합 폴리펩티드 (서열식별번호: 353)는 하기와 같고, 임의로 C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
비프로세싱된 ActRIIB(V99G)-G1Fc의 아미노산 서열이 하기에 제시된다 (서열식별번호: 354). 신호 서열 및 링커 서열은 실선 밑줄로 표시되고, V99G 치환은 이중 밑줄로 표시된다. 서열식별번호: 354의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
이러한 ActRIIB(V99G)-G1Fc 융합 폴리펩티드는 하기 핵산 서열 (코돈 최적화됨) (서열식별번호: 355)에 의해 코딩된다:
성숙 ActRIIB(V99G)-G1Fc 융합 폴리펩티드 (서열식별번호: 356)는 하기와 같고, 임의로 C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
구축물을 일시적 감염에 의해 COS 또는 CHO 세포에서 발현시키고, 여과 및 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 일부 예에서, 정제된 폴리펩티드보다는 조건화 배지를 사용하여 검정을 수행하였다. 리포터 유전자 검정을 위한 샘플의 순도를 SDS-PAGE 및 분석용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 평가하였다.
돌연변이체를 하기 기재된 결합 검정 및/또는 생물검정에서 시험하였다.
대안적으로, 유사한 돌연변이를 하기 제시된 바와 같은 5개 아미노산의 N-말단 절단 및 3개 아미노산의 C-말단 절단을 보유하는 ActRIIB 세포외 도메인 내로 도입할 수 있다 (서열식별번호: 357). 이러한 말단절단된 ActRIIB 세포외 도메인은 서열식별번호: 2에서의 넘버링에 기초하여 ActRIIB(25-131)로 표시된다.
상응하는 배경 융합 폴리펩티드, ActRIIB(25-131)-G1Fc가 하기 제시된다 (서열식별번호: 12).
실시예 7. 변이체 ActRIIB-Fc 폴리펩티드의 활성 및 리간드 결합 프로파일
변이체 ActRIIB-Fc 동종이량체의 리간드 결합 프로파일을 결정하기 위해, 비아코어™-기반 결합 검정을 사용하여 특정 변이체 ActRIIB-Fc 폴리펩티드의 리간드 결합 동역학을 비교하였다. 시험될 ActRIIB-Fc 폴리펩티드를 항-Fc 항체를 사용하여 시스템 상에 독립적으로 포획하였다. 이어서, 리간드를 주입하고, 포획된 수용체 단백질 상에서 유동시켰다. 37℃에서 분석된 변이체 ActRIIB-Fc 폴리펩티드의 결과를 도 16a 및 16b에 제시한다. ActRIIB-G1Fc를 대조군 폴리펩티드로서 사용하였다.
변이체 ActRIIB-Fc 폴리펩티드의 활성을 결정하기 위해, A204 세포-기반 검정을 사용하여 ActRIIB-G1Fc와 비교하여 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP9, 및 BMP10에 의한 신호전달에 대한 변이체 ActRIIB-Fc 폴리펩티드 사이의 효과를 비교하였다. 간략하게, 본 검정은 근육으로부터 유래된 인간 A204 횡문근육종 세포주 (ATCC®: HTB-82™) 및 리포터 벡터 pGL3(CAGA)12 (Dennler et al., 1998, EMBO 17: 3091-3100)뿐만 아니라 레닐라 리포터 플라스미드 (pRLCMV)를 사용하여 형질감염 효율을 제어한다. CAGA12 모티프는 TGF-β 반응성 유전자 (예컨대 PAI-1 유전자)에 존재하며, 따라서 이러한 벡터는 액티빈 A, GDF11 및 BMP9를 포함한 Smad2/3을 통해 신호전달할 수 있는 리간드에 일반적으로 사용된다.
제1일에, A204 세포를 1개 이상의 48-웰 플레이트로 옮겼다. 제2일에, 이들 세포를 10 μg pGL3(CAGA)12 또는 pGL3(CAGA)12(10 μg) + pRLCMV (1 μg) 및 퓨진으로 형질감염시켰다. 제3일에, 0.1% BSA를 함유하는 배지 중에 희석된 리간드를 ActRIIB-Fc 폴리펩티드와 함께 1시간 동안 사전인큐베이션한 후 세포에 첨가하였다. 대략 6시간 후에, 세포를 PBS로 헹구고 용해시켰다. 세포 용해물을 루시페라제 검정에서 분석하여 Smad 활성화의 정도를 결정하였다.
본 검정을 사용하여 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP9 및 BMP10에 의한 세포 신호전달에 대한 억제 효과에 대해 변이체 ActRIIB-Fc 폴리펩티드를 스크리닝하였다. 인간 ActRIIB 세포외 도메인에 아미노산 치환을 혼입시킨 동종이량체 Fc 융합 폴리펩티드의 효력을 비변형된 인간 ActRIIB 세포외 도메인을 포함하는 Fc 융합 폴리펩티드, ActRIIB-G1Fc의 효력과 비교하였다. 시험된 일부 변이체에 대해, 정확한 IC50을 계산하는 것은 가능하지 않았지만, 곡선의 기울기에서 억제의 징후는 검출가능하였다. 이들 변이체에 대해서는, 명확한 숫자 대신 한 자릿수의 상대 IC50, 즉 >10 nM 또는 > 100 nM의 추정치가 포함되었다. 이러한 데이터 포인트는 하기 표 13에서 (*)로 표시된다. 시험된 일부 변이체에 대해, 시험된 농도 범위에 걸쳐 곡선의 기울기에서 검출가능한 억제는 존재하지 않았고, 이는 표 13에서 "ND"로 표시된다.
표 13. 동종이량체 ActRIIB-Fc 구축물의 억제 효력.
상기 표 13뿐만 아니라 도 16a 및 16b에 제시된 바와 같이, ActRIIB 세포외 도메인에서의 아미노산 치환은 다양한 시험관내 검정에서 ActRIIB:리간드 결합과 하류 신호전달 활성 사이의 균형을 변경시킬 수 있다. 일반적으로, 본 출원인은 다른 리간드 결합 특성을 보유하면서, 비변형된 ActRIIB 세포외 도메인을 함유하는 융합 폴리펩티드 (ActRIIB-G1Fc)와 비교하여, BMP9에 대한 감소된 또는 비-검출가능한 결합을 나타내는 ActRIIB 세포외 도메인에서 변이체를 생성하는 목적을 달성하였다.
추가적으로, 변이체 ActRIIB (L79H-F82I), ActRIIB (L79H), 및 ActRIIB (L79H-F82K)는, BMP9에 대한 결합의 감소를 입증하면서, 또한 ActRIIB-G1Fc와 비교하여 액티빈 B에 대해서는 상대적으로 높은 친화도를 유지하면서 액티빈 A 결합의 유의한 감소를 나타내었다. 표 13에서 억제 효력을 나타내는 IC50 값은 이러한 리간드 결합 경향과 일치한다. 유사하게, 변이체 ActRIIB (F82K-N83R), ActRIIB (F82I-N83R), 및 ActRIIB (F82T-N83R)는 유사한 경향을 입증한다.
또한, 변이체 ActRIIB (F82K-N83R), ActRIIB (F82I-N83R), ActRIIB (F82T-N83R), 및 ActRIIB (L79H-F82K)는, BMP9에 대한 결합의 감소를 입증하고 액티빈 B에 대한 상대적으로 높은 친화도를 유지하면서, 또한 ActRIIB-G1Fc와 비교하여 GDF8 및 GDF11 결합의 유의한 감소를 나타내었다. 표 13에서 억제 효력을 나타내는 IC50 값은 이러한 리간드 결합 경향과 일치한다.
추가로, 변이체 ActRIIB (L79H-F82I), ActRIIB (L79H), 및 ActRIIB (L79H-F82K)는, BMP9에 대한 결합의 감소를 입증하고 액티빈 B에 대한 상대적으로 높은 친화도를 유지하면서, 또한 ActRIIB-G1Fc와 비교하여 BMP10 결합의 감소를 나타내었음이 주목되었다. 표 13에서 억제 효력을 나타내는 IC50 값은 이러한 리간드 결합 경향과 일치한다.
따라서, BMP9에 대해 감소된 내지 비-검출가능한 결합을 나타내는 ActRIIB 변이체를 생산하는 목적을 달성하는 것에 더하여, 본 출원인은 신규 변이체 폴리펩티드의 다양한 어레이를 생성하였으며, 이들 중 다수는 부분적으로 고유한 리간드 결합/억제 프로파일을 특징으로 한다. 따라서, 이들 변이체는 이러한 선택적 길항작용이 유리한 특정 용도에서 ActRIIB-G1Fc보다 더 유용할 수 있다. 예는 BMP9, 및 임의로 액티빈 A, GDF8, GDF11 및 BMP10 중 1종 이상의 길항작용을 감소시키면서 액티빈 B의 길항작용은 유지시키는 것이 바람직한 치료 용도를 포함한다.
실시예 8. 변이체 ActRIIB-Fc 폴리펩티드의 생성
본 출원인은 ActRIIB의 세포외 도메인에 일련의 돌연변이 (서열 변이)를 생성하고, 이들 변이체 폴리펩티드를 변이체 ActRIIB 세포외 도메인 및 임의적인 링커에 의해 연결된 Fc 도메인을 포함하는 가용성 동종이량체 융합 폴리펩티드로서 생산하였다. 배경 ActRIIB-Fc 융합체는 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 ActRIIB-G1Fc였다.
다양한 치환 돌연변이를 배경 ActRIIB-Fc 폴리펩티드에 도입하였다. 실시예 4에 제시된 데이터에 기초하여, 이들 구축물은 TPA 리더 하에 발현되는 경우에 N-말단 세린이 결여될 것으로 예상된다. PCR 돌연변이유발에 의해 ActRIIB 세포외 도메인에 돌연변이를 생성하였다. PCR 후, 단편을 퀴아젠 칼럼을 통해 정제하고, SfoI 및 AgeI로 소화시키고, 겔 정제하였다. 이들 단편을 발현 벡터 pAID4 (WO2006/012627 참조) 내로 라이게이션하였고, 라이게이션 시 인간 IgG1과 융합 키메라를 생성하였다. 이. 콜라이 DH5 알파 내로 형질전환되면, 콜로니를 골라내고, DNA를 단리하였다. 뮤린 구축물 (mFc)의 경우, 인간 IgG1을 뮤린 IgG2a로 대체하였다. 모든 돌연변이체를 서열 검증하였다.
비프로세싱된 ActRIIB(K55A)-G1Fc의 아미노산 서열이 하기에 제시된다 (서열식별번호: 31). 신호 서열 및 링커 서열은 실선 밑줄로 표시되고, K55A 치환은 이중 밑줄로 표시된다. 서열식별번호: 31의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
이러한 ActRIIB(K55A)-G1Fc 융합 폴리펩티드는 하기 핵산 서열 (서열식별번호: 32)에 의해 코딩된다:
성숙 ActRIIB(K55A)-G1Fc 융합 폴리펩티드 (서열식별번호: 33)는 하기와 같고, 임의로 C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
비프로세싱된 ActRIIB(K55E)-G1Fc의 아미노산 서열이 하기에 제시된다 (서열식별번호: 34). 신호 서열 및 링커 서열은 실선 밑줄로 표시되고, K55E 치환은 이중 밑줄로 표시된다. 서열식별번호: 34의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
이러한 ActRIIB(K55E)-G1Fc 융합 폴리펩티드는 하기 핵산 서열 (서열식별번호: 35)에 의해 코딩된다:
성숙 ActRIIB(K55E)-G1Fc 융합 폴리펩티드 (서열식별번호: 36)는 하기와 같고, 임의로 C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
비프로세싱된 ActRIIB(F82I)-G1Fc의 아미노산 서열이 하기에 제시된다 (서열식별번호: 37). 신호 서열 및 링커 서열은 실선 밑줄로 표시되고, F82I 치환은 이중 밑줄로 표시된다. 서열식별번호: 37의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
이러한 ActRIIB(F82I)-G1Fc 융합 폴리펩티드는 하기 핵산 서열 (서열식별번호: 38)에 의해 코딩된다:
성숙 ActRIIB(F82I)-G1Fc 융합 폴리펩티드 (서열식별번호: 39)는 하기와 같고, 임의로 C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
비프로세싱된 ActRIIB(F82K)-G1Fc의 아미노산 서열이 하기에 제시된다 (서열식별번호: 40). 신호 서열 및 링커 서열은 실선 밑줄로 표시되고, F82K 치환은 이중 밑줄로 표시된다. 서열식별번호: 40의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
이러한 ActRIIB(F82K)-G1Fc 융합 폴리펩티드는 하기 핵산 서열 (서열식별번호: 41)에 의해 코딩된다:
성숙 ActRIIB(F82K)-G1Fc 융합 폴리펩티드 (서열식별번호: 42)는 하기와 같고, 임의로 C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
구축물을 COS 또는 CHO 세포에서 발현시키고, 여과 및 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 일부 예에서, 정제된 단백질보다는 조건화 배지를 사용하여 검정을 수행하였다. 리포터 유전자 검정을 위한 샘플의 순도를 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가하였다.
돌연변이체를 하기 기재된 결합 검정 및/또는 생물검정에서 시험하였다.
대안적으로, 유사한 돌연변이를 하기 제시된 바와 같은 5개 아미노산의 N-말단 절단 및 3개 아미노산의 C-말단 절단을 보유하는 ActRIIB 세포외 도메인 내로 도입할 수 있다 (서열식별번호: 53). 이러한 말단절단된 ActRIIB 세포외 도메인은 서열식별번호: 2에서의 넘버링에 기초하여 ActRIIB(25-131)로 표시된다.
상응하는 배경 융합 폴리펩티드, ActRIIB(25-131)-G1Fc가 하기 제시된다 (서열식별번호: 12).
실시예 9. 세포-기반 검정에서 변이체 ActRIIB-Fc 동종이량체의 리간드 결합 프로파일 및 변이체 ActRIIB-Fc 폴리펩티드의 활성
변이체 ActRIIB-Fc 동종이량체의 리간드 결합 프로파일을 결정하기 위해, 비아코어™-기반 결합 검정을 사용하여 특정 변이체 ActRIIB-Fc 폴리펩티드의 리간드 결합 동역학을 비교하였다. 시험될 ActRIIB-Fc 폴리펩티드를 항-Fc 항체를 사용하여 시스템 상에 독립적으로 포획하였다. 이어서, 리간드를 주입하고, 포획된 수용체 단백질 상에서 유동시켰다. 37℃에서 분석된 변이체 ActRIIB-Fc 폴리펩티드의 결과를 도 17에 제시한다. 비변형된 ActRIIB 세포외 도메인을 포함하는 Fc-융합 폴리펩티드와 비교하여, 변이체 폴리펩티드 ActRIIB(K55A)-Fc, ActRIIB(K55E)-Fc, ActRIIB(F82I)-Fc, 및 ActRIIB(F82K)-Fc는 GDF11에 대해서보다 BMP9에 대해 그의 친화도에서 더 큰 감소를 나타내었다. 25℃에서 분석된 추가의 변이체 ActRIIB-Fc 폴리펩티드의 결과를 도 18에 제시한다.
이들 결과는 K55A, K55E, F82I, 및 F82K가 액티빈 A 또는 GDF11에 대한 ActRIIB 친화도를 감소시키는 것보다 BMP9에 대한 ActRIIB 결합 친화도를 더 감소시키는 치환으로서 확인시켜 준다. 따라서, 이들 변이체 ActRIIB-Fc 폴리펩티드는 이러한 선택적 길항작용이 유리한 특정 용도에서 비변형된 ActRIIB-Fc 폴리펩티드보다 더 유용할 수 있다. 예는 BMP9의 길항작용을 감소시키면서 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, 및 GDF11 중 1종 이상의 길항작용은 유지시키는 것이 바람직한 치료 용도를 포함한다.
변이체 ActRIIB-Fc 폴리펩티드의 활성을 결정하기 위해, A204 세포-기반 검정을 사용하여 액티빈 A, GDF11, 및 BMP9에 의한 신호전달에 대한 변이체 ActRIIB-Fc 폴리펩티드 사이의 효과를 비교하였다. 간략하게, 본 검정은 근육으로부터 유래된 인간 A204 횡문근육종 세포주 (ATCC®: HTB-82™) 및 리포터 벡터 pGL3(CAGA)12 (Dennler et al., 1998, EMBO 17: 3091-3100)뿐만 아니라 레닐라 리포터 플라스미드 (pRLCMV)를 사용하여 형질감염 효율을 제어한다. CAGA12 모티프는 TGF-β 반응성 유전자 (예컨대 PAI-1 유전자)에 존재하며, 따라서 이러한 벡터는 액티빈 A, GDF11 및 BMP9를 포함한 Smad2/3을 통해 신호전달할 수 있는 리간드에 일반적으로 사용된다.
제1일에, A-204 세포를 1개 이상의 48-웰 플레이트로 옮겼다. 제2일에, 이들 세포를 10 μg pGL3(CAGA)12 또는 pGL3(CAGA)12(10 μg) + pRLCMV (1 μg) 및 퓨진으로 형질감염시켰다. 제3일에, 0.1% BSA를 함유하는 배지 중에 희석된 리간드를 ActRIIB-Fc 폴리펩티드와 함께 1시간 동안 사전인큐베이션한 후 세포에 첨가하였다. 대략 6시간 후에, 세포를 PBS로 헹구고 용해시켰다. 세포 용해물을 루시페라제 검정에서 분석하여 Smad 활성화의 정도를 결정하였다.
본 검정을 사용하여 액티빈 A, GDF11, 및 BMP9에 의한 세포 신호전달에 대한 억제 효과에 대해 변이체 ActRIIB-Fc 폴리펩티드를 스크리닝하였다. 인간 ActRIIB 세포외 도메인에 아미노산 치환을 혼입시킨 동종이량체 Fc 융합 폴리펩티드의 효력을 비변형된 인간 ActRIIB 세포외 도메인을 포함하는 Fc 융합 폴리펩티드의 효력과 비교하였다.
상기 표에 제시된 바와 같이, ActRIIB 세포외 도메인에서의 단일 아미노산 치환은 세포-기반 리포터 유전자 검정에서 액티빈 A 또는 GDF11 억제와 BMP9 억제 사이의 균형을 변경시킬 수 있다. 비변형된 ActRIIB 세포외 도메인을 함유하는 융합 폴리펩티드와 비교하여, 변이체 ActRIIB(K55A)-Fc, ActRIIB(K55E)-Fc, ActRIIB(F82I)-Fc, 및 ActRIIB(F82K)-Fc는 액티빈 A 및 GDF11의 본질적으로 감소되지 않은 억제를 유지하면서 BMP9의 덜 강력한 억제 (증가된 IC50 값)를 나타내었다.
이들 결과는 변이체 ActRIIB-Fc 폴리펩티드, 예컨대 ActRIIB(K55A)-Fc, ActRIIB(K55E)-Fc, ActRIIB(F82I)-Fc, 및 ActRIIB(F82K)-Fc가 비변형된 ActRIIB 세포외 도메인을 포함하는 Fc 융합 폴리펩티드와 비교하여 액티빈 A 및 GDF11의 보다 선택적인 길항제임을 나타낸다. 따라서, 이들 변이체는 이러한 선택적 길항작용이 유리한 특정 용도에서 ActRIIB-Fc보다 더 유용할 수 있다. 예는 BMP9 및 잠재적으로 BMP10의 길항작용을 감소시키면서 액티빈 A, GDF8, 및 GDF11 중 1종 이상의 길항작용은 유지시키는 것이 바람직한 치료 용도를 포함한다.
실시예 10. ActRIIB-Fc:ActRIIB(L79E)-Fc 이종이량체의 생성
본 출원인은 비변형된 인간 ActRIIB 및 위치 79에서 류신에서-글루타메이트로의 치환을 갖는 인간 ActRIIB의 세포외 도메인을 포함하는 가용성 ActRIIB-Fc:ActRIIB(L79E)-Fc 이형체 복합체의 생성을 고려하며, 이들은 각각 개별적으로 세포외 도메인과 G1Fc 도메인 사이에 위치한 링커에 의해 G1Fc 도메인에 융합된다. 개별 구축물은 각각 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ActRIIB(L79E)-Fc 융합 폴리펩티드로 지칭되고, 각각에 대한 서열은 하기에 제공된다.
ActRIIB-Fc 또는 ActRIIB(L79E)-Fc 동종이량체 복합체와는 대조적으로, ActRIIB-Fc:ActRIIB(L79E)-Fc 이종이량체 복합체의 형성을 촉진하는 방법론은 Fc 도메인의 아미노산 서열에 변경을 도입하여 비대칭 이종이량체 복합체의 형성을 안내하는 것이다. Fc 도메인을 사용하여 비대칭 상호작용 쌍을 만드는 많은 상이한 접근법이 본 개시내용에 기재되어 있다.
각각 서열식별번호: 43-45 및 46-48의 ActRIIB(L79E)-Fc 및 ActRIIB-Fc 폴리펩티드 서열에 예시된 하나의 접근법에서, 하나의 Fc 도메인은 상호작용 면에서 양이온성 아미노산을 도입하도록 변경될 수 있는 한편, 다른 Fc 도메인은 상호작용 면에서 음이온성 아미노산을 도입하도록 변경될 수 있다. ActRIIB(L79E)-Fc 융합 폴리펩티드 및 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 각각 TPA 리더 (서열식별번호: 8)를 사용할 수 있다.
ActRIIB(L79E)-Fc 폴리펩티드 서열 (서열식별번호: 43)은 하기에 제시된다:
리더 (신호) 서열 및 링커는 밑줄로 표시되고, L79E 치환은 이중 밑줄로 표시된다. 가능한 동종이량체 복합체 중 어느 하나보다는 ActRIIB-Fc:ActRIIB(L79E)-Fc 이종이량체의 형성을 촉진하기 위해, 상기 이중 밑줄에 의해 표시된 바와 같은 2개의 아미노산 치환 (리신을 산성 아미노산으로 대체함)을 ActRIIB 융합 폴리펩티드의 Fc 도메인 내로 도입할 수 있다. 서열식별번호: 43의 아미노산 서열은 임의로, C-말단에 리신이 부가된 상태로 제공될 수 있다.
이러한 ActRIIB(L79E)-Fc 융합 폴리펩티드는 하기 핵산 서열 (서열식별번호: 44)에 의해 코딩될 수 있다:
성숙 ActRIIB(L79E)-Fc 융합 폴리펩티드 (서열식별번호: 45)는 하기와 같고, 임의로 C-말단에 리신이 부가된 상태로 제공될 수 있다.
ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드의 상보적 형태 (서열식별번호: 46)는 하기와 같다:
리더 서열 및 링커 서열은 밑줄로 표시된다. 상기 서열식별번호: 43 및 45의 ActRIIB(L79E)-Fc 융합 폴리펩티드와의 이종이량체 형성을 안내하기 위해, 상기 이중 밑줄에 의해 표시된 바와 같은 2개의 아미노산 치환 (글루타메이트 및 아스파르테이트를 리신으로 대체함)을 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드의 Fc 도메인 내로 도입할 수 있다. 서열식별번호: 46의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
이러한 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 하기 핵산 (서열식별번호: 47)에 의해 코딩될 수 있다:
성숙 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 서열 (서열식별번호: 48)은 하기와 같고, 임의로 C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다:
각각 서열식별번호: 45 및 서열식별번호: 48의 ActRIIB(L79E)-Fc 및 ActRIIB-Fc 폴리펩티드는 CHO 세포주로부터 공동-발현 및 정제되어, ActRIIB-Fc:ActRIIB(L79E)-Fc를 포함하는 이형체 폴리펩티드 복합체를 생성할 수 있다.
비대칭 Fc 융합 폴리펩티드를 사용하여 이종다량체 복합체의 형성을 촉진하는 또 다른 접근법에서, Fc 도메인은 각각 서열식별번호: 49-50 및 51-52의 ActRIIB(L79E)-Fc 및 ActRIIB-Fc 폴리펩티드 서열에 예시된 바와 같이 상보적 소수성 상호작용 및 추가의 분자간 디술피드 결합을 도입하도록 변경될 수 있다. ActRIIB(L79E)-Fc 융합 폴리펩티드 및 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 각각 TPA 리더 (서열식별번호: 8)를 사용할 수 있다. ActRIIB(L79E)-Fc 폴리펩티드 서열 (서열식별번호: 49)은 하기에 제시된다:
신호 서열 및 링커 서열은 밑줄로 표시되고, L79E 치환은 이중 밑줄로 표시된다. 가능한 동종이량체 복합체 중 어느 하나보다는 ActRIIB-Fc:ActRIIB(L79E)-Fc 이종이량체의 형성을 촉진하기 위해, 상기 이중 밑줄에 의해 표시된 바와 같은 2개의 아미노산 치환 (세린을 시스테인으로 및 트레오닌을 트립토판으로 대체함)을 융합 폴리펩티드의 Fc 도메인 내로 도입할 수 있다. 서열식별번호: 49의 아미노산 서열은 임의로, C-말단에 리신이 부가된 상태로 제공될 수 있다. 성숙 ActRIIB(L79E)-Fc 융합 폴리펩티드 (서열식별번호: 50)는 하기와 같다:
ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드의 상보적 형태 (서열식별번호: 51)는 하기와 같고, 임의로 C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
리더 서열 및 링커는 밑줄로 표시된다. 상기 서열식별번호: 49-50의 ActRIIB(L79E)-Fc 융합 폴리펩티드와의 이종이량체 형성을 안내하기 위해, 상기 이중 밑줄에 의해 표시된 바와 같은 4개의 아미노산 치환 (티로신을 시스테인으로, 트레오닌을 세린으로, 류신을 알라닌으로, 및 티로신을 발린으로 대체함)을 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드의 Fc 도메인 내로 도입할 수 있다. 서열식별번호: 51의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
성숙 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 서열은 하기와 같고, 임의로 C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
각각 서열식별번호: 50 및 서열식별번호: 52의 ActRIIB(L79E)-Fc 및 ActRIIB-Fc 폴리펩티드는 CHO 세포주로부터 공동-발현 및 정제되어, ActRIIB-Fc:ActRIIB(L79E)-Fc를 포함하는 이형체 폴리펩티드 복합체를 생성할 수 있다.
다양한 ActRIIB-Fc:ActRIIB(L79E)-Fc 복합체의 정제는 예를 들어 하기 중 3개 이상을 임의의 순서로 포함하는 일련의 칼럼 크로마토그래피 단계에 의해 달성될 수 있다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로스 크로마토그래피, 페닐세파로스 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 다중모드 크로마토그래피 (예를 들어, 정전기적 및 소수성 리간드 둘 다를 함유하는 수지에 의함), 및 에피토프-기반 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, ActRIIB의 에피토프에 대해 지시된 항체 또는 기능적으로 등가인 리간드에 의함). 정제는 바이러스 여과 및 완충제 교환에 의해 완료될 수 있다.
실시예 11. ActRIIB-Fc:ActRIIB(L79E)-Fc 이형체의 리간드 결합 프로파일
비아코어™-기반 결합 검정을 사용하여 ActRIIB-Fc:ActRIIB(L79E)-Fc 이종이량체의 리간드 결합 동역학을 비변형된 ActRIIB-Fc 동종이량체의 것과 비교하였다. 융합 단백질을 항-Fc 항체를 사용하여 시스템 상에 포획하였다. 이어서, 리간드를 주입하고, 37℃에서 포획된 수용체 단백질 상에서 유동시켰다. 결과를 하기 표에 요약하며, 여기서 유효한 리간드 트랩을 가장 잘 나타내는 리간드 오프-레이트 (kd)는 볼드체로 표시한다.
본 실시예에서, 2개의 ActRIIB 폴리펩티드 쇄 중 1개에서의 단일 아미노산 치환은 비변형된 ActRIIB-Fc 동종이량체에 비해 Fc-융합 폴리펩티드의 리간드 결합 선택성을 변경시켰다. ActRIIB-Fc 동종이량체와 비교하여, ActRIIB(L79E)-Fc 이종이량체는 액티빈 B, GDF8, GDF11 및 BMP6에 대해 고-친화도 결합을 대부분 보유하였지만, 액티빈 A 및 BMP10에 대해서는 대략 10-배 더 빠른 오프-레이트 및 BMP9에 대해서는 결합 강도의 훨씬 더 큰 감소를 나타내었다. 따라서, 변이체 ActRIIB-Fc 이종이량체는 이러한 선택적 길항작용이 유리한 특정 용도에서 비변형된 ActRIIB-Fc 동종이량체보다 더 유용할 수 있다. 예는 액티빈 A, BMP9, 또는 BMP10.9의 길항작용을 감소시키면서 액티빈 B, GDF8, GDF11, 및 BMP6 중 1종 이상의 길항작용은 유지시키는 것이 바람직한 치료 용도를 포함한다. ActRIIB 돌연변이체의 생성:
ActRIIB의 세포외 도메인에 일련의 돌연변이를 생성하고, 이들 돌연변이체 폴리펩티드를 세포외 ActRIIB와 Fc 도메인 사이의 가용성 융합 폴리펩티드로서 생산하였다. 액티빈 및 세포외 ActRIIB의 공-결정 구조는 리간드 결합에서 세포외 도메인의 최종 (C-말단) 15개 아미노산 (본원에서 "꼬리"로 지칭됨)에 대한 어떠한 역할도 보여주지 않았다. 이러한 서열은 결정 구조 상에서 해상되지 않았고, 이는 이들 잔기가 결정에서 균일하게 패킹되지 않는 가요성 루프에 존재한다는 것을 시사한다. [Thompson EMBO J. 2003 Apr 1;22(7):1555-66]. 이러한 서열은 또한 ActRIIB와 ActRIIA 사이에서 불량하게 보존된다. 따라서, 이들 잔기는 기본 또는 배경 ActRIIB-Fc 융합 구축물에서 생략되었다. 추가적으로, 이러한 예에서 배경 형태의 위치 64는 알라닌에 의해 점유된다. 따라서, 이러한 예에서 배경 ActRIIB-Fc 융합체는 하기 서열 (Fc 부분은 밑줄로 표시됨) (서열식별번호: 54)을 갖는다:
놀랍게도, 하기 논의된 바와 같이, C-말단 꼬리는 액티빈 및 GDF-11 결합을 증진시키는 것으로 밝혀졌고, 따라서 ActRIIB-Fc의 바람직한 버전은 하기 서열 (Fc 부분은 밑줄로 표시됨)(서열식별번호: 55)을 갖는다:
다양한 돌연변이를 배경 ActRIIB-Fc 폴리펩티드에 도입하였다. PCR 돌연변이유발에 의해 ActRIIB 세포외 도메인에 돌연변이를 생성하였다. PCR 후, 단편을 퀴아젠 칼럼을 통해 정제하고, SfoI 및 AgeI로 소화시키고, 겔 정제하였다. 이들 단편을 발현 벡터 pAID4 내로 라이게이션하였고, 라이게이션 시 인간 IgG1과 융합 키메라를 생성하였다. DNA를 단리하였다. 모든 돌연변이체는 HEK293T 세포에서 일시적 형질감염에 의해 생산하였다. 요약하면, 500ml 스피너에서, HEK293T 세포를 250ml 부피의 프리스타일 (인비트로젠) 배지 중 6x105개 세포/ml로 설정하고, 밤새 성장시켰다. 다음날, 이들 세포를 DNA:PEI (1:1) 복합체로 0.5 ug/ml 최종 DNA 농도로 처리하였다. 4시간 후, 250 ml 배지를 첨가하고, 세포를 7일 동안 성장시켰다. 세포를 회전시켜 조건화 배지를 수거하고, 농축시켰다.
모든 돌연변이체를 단백질 A 칼럼 상에서 정제하고, 낮은 pH (3.0) 글리신 완충제로 용리시켰다. 중화 후, 이들을 PBS에 대해 투석하였다.
돌연변이체를 또한 유사한 방법론에 의해 CHO 세포에서 생산하였다.
돌연변이체를 하기 기재된 결합 검정 및 생물검정에서 시험하였다. CHO 세포 및 HEK293 세포에서 발현된 단백질은 결합 검정 및 생물검정에서 구별할 수 없었다.
실시예 12: ActRIIB-ALK4 이종이량체의 생성
인간 ActRIIB 및 인간 ALK4의 세포외 도메인을 포함하는 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이형체 복합체를 구축하였으며, 이들은 각각 개별적으로 세포외 도메인과 Fc 도메인 사이에 위치한 링커에 의해 Fc 도메인에 융합된다. 개별 구축물은 각각 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드로 지칭되고, 각각에 대한 서열은 하기에 제공된다.
ActRIIB-Fc 또는 ALK4-Fc 동종이량체 복합체와는 대조적으로, ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이종이량체 복합체의 형성을 촉진하는 방법론은 Fc 도메인의 아미노산 서열에 변경을 도입하여 비대칭 이종이량체 복합체의 형성을 안내하는 것이다. Fc 도메인을 사용하여 비대칭 상호작용 쌍을 만드는 많은 상이한 접근법이 본 개시내용에 기재되어 있다.
각각 서열식별번호: 396 및 398 및 서열식별번호: 88 및 89의 ActRIIB-Fc 및 ALK4-Fc 폴리펩티드 서열에 예시된 하나의 접근법에서, 하나의 Fc 도메인은 상호작용 면에서 양이온성 아미노산을 도입하도록 변경되는 한편, 다른 Fc 도메인은 상호작용 면에서 음이온성 아미노산을 도입하도록 변경된다. ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 각각 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA) 리더를 사용한다.
ActRIIB-Fc 폴리펩티드 서열 (서열식별번호: 396)은 하기에 제시된다:
리더 (신호) 서열 및 링커는 밑줄로 표시된다. 가능한 동종이량체 복합체 중 어느 하나보다는 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이종이량체의 형성을 촉진하기 위해, 상기 이중 밑줄에 의해 표시된 바와 같은 2개의 아미노산 치환 (산성 아미노산을 리신으로 대체함)을 ActRIIB 융합 단백질의 Fc 도메인 내로 도입할 수 있다. 서열식별번호: 396의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신 (K)이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
이러한 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 하기 핵산 서열 (서열식별번호: 397)에 의해 코딩된다:
성숙 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 (서열식별번호: 398)은 하기와 같고, 임의로 C-말단으로부터 리신 (K)이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
ALK4-Fc 융합 폴리펩티드의 상보적 형태 (서열식별번호: 88)는 하기와 같다:
리더 서열 및 링커는 밑줄로 표시된다. 상기 서열식별번호: 396 및 398의 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드와의 이종이량체 형성을 안내하기 위해, 상기 이중 밑줄에 의해 표시된 바와 같은 2개의 아미노산 치환 (리신을 아스파르트산으로 대체함)을 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드의 Fc 도메인 내로 도입할 수 있다. 서열식별번호: 88의 아미노산 서열은 임의로, C-말단에 리신 (K)이 부가된 상태로 제공될 수 있다.
이러한 ALK4-Fc 융합 단백질은 하기 핵산 (서열식별번호: 243)에 의해 코딩된다:
성숙 ALK4-Fc 융합 단백질 서열 (서열식별번호: 89)은 하기와 같고, 임의로 C-말단에 리신 (K)이 부가된 상태로 제공될 수 있다.
각각 서열식별번호: 398 및 서열식별번호: 89의 ActRIIB-Fc 및 ALK4-Fc 단백질은 CHO 세포주로부터 공동-발현 및 정제되어, ActRIIB-Fc:ALK4-Fc를 포함하는 이형체 복합체를 생성할 수 있다.
비대칭 Fc 융합 단백질을 사용하여 이종다량체 복합체의 형성을 촉진하는 또 다른 접근법에서, Fc 도메인은 각각 서열식별번호: 402 및 403 및 서열식별번호: 92 및 93의 ActRIIB-Fc 및 ALK4-Fc 폴리펩티드 서열에 예시된 바와 같이 상보적 소수성 상호작용 및 추가의 분자간 디술피드 결합을 도입하도록 변경된다. ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 각각 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA) 리더: MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (서열식별번호: 8)를 사용한다.
ActRIIB-Fc 폴리펩티드 서열 (서열식별번호: 402)은 하기에 제시된다:
리더 (신호) 서열 및 링커는 밑줄로 표시된다. 가능한 동종이량체 복합체 중 어느 하나보다는 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이종이량체의 형성을 촉진하기 위해, 상기 이중 밑줄에 의해 표시된 바와 같은 2개의 아미노산 치환 (세린을 시스테인으로 및 트레오닌을 트립토판으로 대체함)을 융합 단백질의 Fc 도메인 내로 도입할 수 있다. 서열식별번호: 402의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신 (K)이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
성숙 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 하기와 같다:
ALK4-Fc 융합 폴리펩티드의 상보적 형태 (서열식별번호: 92)는 하기와 같고, 임의로 C-말단으로부터 리신 (K)이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
리더 서열 및 링커는 밑줄로 표시된다. 상기 서열식별번호: 402 및 403의 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드와의 이종이량체 형성을 안내하기 위해, 상기 이중 밑줄에 의해 표시된 바와 같은 4개의 아미노산 치환을 ALK4 융합 폴리펩티드의 Fc 도메인 내로 도입할 수 있다. 서열식별번호: 92의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신 (K)이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
성숙 ALK4-Fc 융합 단백질 서열은 하기와 같고, 임의로 C-말단으로부터 리신 (K)이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
각각 서열식별번호: 403 및 서열식별번호: 93의 ActRIIB-Fc 및 ALK4-Fc 단백질은 CHO 세포주로부터 공동-발현 및 정제되어, ActRIIB-Fc:ALK4-Fc를 포함하는 이형체 복합체를 생성할 수 있다.
다양한 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 복합체의 정제는, 예를 들어 하기 중 3개 이상을 임의의 순서로 포함하는 일련의 칼럼 크로마토그래피 단계에 의해 달성될 수 있다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로스 크로마토그래피, 페닐세파로스 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피. 정제는 바이러스 여과 및 완충제 교환에 의해 완료될 수 있었다.
비대칭 Fc 융합 단백질을 사용하여 이종다량체 복합체의 형성을 촉진하는 또 다른 접근법에서, Fc 도메인은 각각 서열식별번호: 118-121 및 122-125의 ActRIIB-Fc 및 ALK4-Fc 폴리펩티드 서열에 예시된 바와 같이 상보적 소수성 상호작용, 추가의 분자간 디술피드 결합, 및 알짜 분자 전하에 기초한 정제를 용이하게 하기 위한 2개의 Fc 도메인 사이의 정전기적 차이를 도입하도록 변경된다. ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 각각 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA) 리더를 사용한다.
ActRIIB-Fc 폴리펩티드 서열 (서열식별번호: 406)은 하기에 제시된다:
리더 서열 및 링커는 밑줄로 표시된다. 가능한 동종이량체 복합체 중 어느 하나보다는 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이종이량체의 형성을 촉진하기 위해, 상기 이중 밑줄에 의해 표시된 바와 같은 2개의 아미노산 치환 (세린을 시스테인으로 및 트레오닌을 트립토판으로 대체함)을 융합 단백질의 Fc 도메인 내로 도입할 수 있다. ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이종이량체의 정제를 용이하게 하기 위해, 상기 이중 밑줄에 의해 표시된 바와 같은 2개의 아미노산 치환 (리신을 산성 아미노산으로 대체함)을 또한 융합 단백질의 Fc 도메인 내로 도입할 수 있다. 서열식별번호: 118의 아미노산 서열은 임의로, C-말단에 리신이 부가된 상태로 제공될 수 있다.
이러한 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 하기 핵산 (서열식별번호: 407)에 의해 코딩된다:
성숙 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 하기와 같고 (서열식별번호: 408), 임의로 C-말단에 리신이 부가된 상태로 제공될 수 있다.
이러한 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드는 하기 핵산 (서열식별번호: 409)에 의해 코딩된다:
ALK4-Fc 융합 폴리펩티드의 상보적 형태 (서열식별번호: 247)는 하기와 같고, 임의로 C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
리더 서열 및 링커는 밑줄로 표시된다. 상기 서열식별번호: 406 및 408의 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드와의 이종이량체 형성을 안내하기 위해, 상기 이중 밑줄에 의해 표시된 바와 같은 4개의 아미노산 치환 (티로신을 시스테인으로, 트레오닌을 세린으로, 류신을 알라닌으로, 및 티로신을 발린으로 대체함)을 ALK4 융합 폴리펩티드의 Fc 도메인 내로 도입할 수 있다. ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이종이량체의 정제를 용이하게 하기 위해, 상기 이중 밑줄에 의해 표시된 바와 같은 2개의 아미노산 치환 (아스파라긴을 아르기닌으로, 아스파르테이트를 아르기닌으로 대체함)을 또한 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드의 Fc 도메인 내로 도입할 수 있다. 서열식별번호: 247의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
이러한 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 하기 핵산 (서열식별번호: 248)에 의해 코딩된다:
성숙 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드 서열은 하기와 같고 (서열식별번호: 249), 임의로 C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
이러한 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 하기 핵산 (서열식별번호: 250)에 의해 코딩된다:
각각 서열식별번호: 120 및 서열식별번호: 249의 ActRIIB-Fc 및 ALK4-Fc 단백질은 CHO 세포주로부터 공동-발현 및 정제되어, ALK4-Fc:ActRIIB-Fc를 포함하는 이형체 복합체를 생성할 수 있다.
특정 실시양태에서, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 92 (상기 제시됨)이고, 이는 본원에 개시된 특정 Fc 융합 폴리펩티드의 이종이량체 형성을 안내하는 4개의 아미노산 치환을 함유하며, 임의로 C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
이러한 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 하기 핵산 (서열식별번호: 251)에 의해 코딩된다:
성숙 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드 서열은 서열식별번호: 93 (상기 제시됨)이고, 임의로 C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
이러한 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드는 하기 핵산 (서열식별번호: 252)에 의해 코딩된다:
다양한 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 복합체의 정제는 예를 들어 하기 중 3개 이상을 임의의 순서로 포함하는 일련의 칼럼 크로마토그래피 단계에 의해 달성될 수 있다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로스 크로마토그래피, 페닐세파로스 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 에피토프-기반 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, ALK4 또는 ActRIIB 상의 에피토프에 대해 지시된 항체 또는 기능적으로 등가인 리간드에 의함), 및 다중모드 크로마토그래피 (예를 들어, 정전기적 및 소수성 리간드 둘 다를 함유하는 수지에 의함). 정제는 바이러스 여과 및 완충제 교환에 의해 완료될 수 있었다.
실시예 13. ActRIIB-Fc 동종이량체 및 ALK4-Fc 동종이량체와 비교한 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이종이량체의 리간드 결합 프로파일
비아코어™-기반 결합 검정을 사용하여 상기 기재된 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이종이량체 복합체의 리간드 결합 선택성을 ActRIIB-Fc 및 ALK4-Fc 동종이량체 복합체의 것과 비교하였다. ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이종이량체, ActRIIB-Fc 동종이량체, 및 ALK4-Fc 동종이량체를 항-Fc 항체를 사용하여 시스템 상에 독립적으로 포획하였다. 리간드를 주입하고, 포획된 수용체 단백질 상에서 유동시켰다. 결과를 하기 표에 요약하며, 여기서 유효한 리간드 트랩을 가장 잘 나타내는 리간드 오프-레이트 (kd)는 볼드체 회색 음영으로 표시한다.
이들 비교 결합 데이터는 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이종이량체가 ActRIIB-Fc 또는 ALK4-Fc 동종이량체에 비해 변경된 결합 프로파일/선택성을 갖는다는 것을 입증한다. ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이종이량체는 어느 하나의 동종이량체와 비교하여 액티빈 B에 대해 증진된 결합을 나타내고, ActRIIB-Fc 동종이량체에 의해 관찰된 바와 같은 액티빈 A, GDF8, 및 GDF11에 대한 강한 결합을 보유하고, BMP9, BMP10, 및 GDF3에 대한 실질적으로 감소된 결합을 나타낸다. 특히, BMP9는 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이종이량체에 대해 낮은 관찰가능한 친화도를 나타내거나 전혀 나타내지 않은 반면, 이러한 리간드는 ActRIIB-Fc 동종이량체에 강하게 결합한다. ActRIIB-Fc 동종이량체와 같이, 이종이량체는 BMP6에 대한 중간-수준 결합을 보유한다. 도 19를 참조한다.
또한, A-204 리포터 유전자 검정을 사용하여 액티빈 A, 액티빈 B, GDF11, GDF8, BMP10, 및 BMP9에 의한 신호전달에 대한 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이종이량체 및 ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc 동종이량체의 효과를 평가하였다. 세포주: 인간 횡문근육종 (근육으로부터 유래됨). 리포터 벡터: pGL3(CAGA)12 (문헌 [Dennler et al., 1998, EMBO 17: 3091-3100]에 기재된 바와 같음). CAGA12 모티프는 TGFβ 반응성 유전자 (PAI-1 유전자)에 존재하며, 따라서 이러한 벡터는 Smad2 및 3을 통해 신호전달하는 인자에 일반적으로 사용된다. 예시적인 A-204 리포터 유전자 검정이 하기에 요약된다.
제1일: A-204 세포를 48-웰 플레이트로 분할하였다.
제2일: A-204 세포를 10 ug pGL3(CAGA)12 또는 pGL3(CAGA)12(10 ug)+pRLCMV (1 ug) 및 퓨젠으로 형질감염시켰다.
제3일: 인자 (배지+0.1% BSA 내로 희석됨)를 첨가하였다. 억제제는 세포에 첨가하기 전에 약 1시간 동안 인자와 함께 사전-인큐베이션할 필요가 있다. 약 6시간 후에, 세포를 PBS로 헹군 다음 용해시켰다.
상기 단계 후에, 루시페라제 검정을 수행하였다.
ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이종이량체 및 ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc 동종이량체 둘 다는 본 검정에서 액티빈 A, 액티빈 B, GDF11, 및 GDF8의 강력한 억제제인 것으로 결정되었다. 특히, 도 20에 예시된 비교 동종이량체/이종이량체 IC50 데이터에서 볼 수 있는 바와 같이, ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이종이량체는 ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc 동종이량체와 유사하게 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, 및 GDF11 신호전달 경로를 억제한다. 그러나, BMP9 및 BMP10 신호전달 경로의 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이종이량체 억제는 ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc 동종이량체와 비교하여 유의하게 감소된다. 이러한 데이터는 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이종이량체 및 ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc 동종이량체 둘 다가 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, 및 GDF11에 대해 강한 결합을 나타내지만, BMP10 및 BMP9는 ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc 동종이량체와 비교하여 ALK4-Fc:ActRIIB-Fc 이종이량체에 대해 유의하게 감소된 친화도를 갖는 것으로 관찰된 상기 논의된 결합 데이터와 일치한다.
이와 함께, 이들 데이터는 따라서 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이종이량체가 ActRIIB-Fc 동종이량체와 비교하여 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8, 및 GDF11의 보다 선택적인 길항제임을 입증한다. 따라서, ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 이종이량체는 이러한 선택적 길항작용이 유리한 특정 용도에서 ActRIIB-Fc 동종이량체보다 더 유용할 것이다. 예는 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AC, GDF8, 및 GDF11 중 1종 이상의 길항작용은 유지시키지만 BMP9, BMP10, GDF3, 및 BMP6 중 1종 이상의 길항작용은 최소화하는 것이 바람직한 치료 용도를 포함한다.
실시예 14. ActRIIB-Fc:ALK7-Fc 이종이량체의 생성
본 출원인은 인간 ActRIIB 및 인간 ALK7의 세포외 도메인을 포함하는 가용성 ActRIIB-Fc:ALK7-Fc 이형체 복합체를 구축하였으며, 이들은 각각 세포외 도메인과 Fc 도메인 사이에 위치한 링커에 의해 Fc 도메인에 융합된다. 개별 구축물은 각각 ActRIIB-Fc 및 ALK7-Fc로 지칭된다.
ActRIIB-Fc 또는 ALK7-Fc 동종이량체 복합체와는 대조적으로, ActRIIB-Fc:ALK7-Fc 이종이량체 복합체의 형성을 촉진하는 방법론은 Fc 도메인의 아미노산 서열에 변경을 도입하여 비대칭 이종이량체 복합체의 형성을 안내하는 것이다. Fc 도메인을 사용하여 비대칭 상호작용 쌍을 만드는 많은 상이한 접근법이 본 개시내용에 기재되어 있다.
각각 하기 개시된 ActRIIB-Fc 및 ALK7-Fc 폴리펩티드 서열에 예시된 하나의 접근법에서, 하나의 Fc 도메인은 상호작용 면에서 양이온성 아미노산을 도입하도록 변경되는 한편, 다른 Fc 도메인은 상호작용 면에서 음이온성 아미노산을 도입하도록 변경된다. ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 및 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드는 각각 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA) 리더: MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (서열식별번호: 8)를 사용한다.
ActRIIB-Fc 폴리펩티드 서열 (서열식별번호: 396)은 하기에 제시된다:
리더 (신호) 서열 및 링커는 밑줄로 표시된다. 가능한 동종이량체 복합체 중 어느 하나보다는 ActRIIB-Fc:ALK7-Fc 이종이량체의 형성을 촉진하기 위해, 상기 이중 밑줄에 의해 표시된 바와 같은 2개의 아미노산 치환 (산성 아미노산을 리신으로 대체함)을 ActRIIB 융합 단백질의 Fc 도메인 내로 도입할 수 있다. 서열식별번호: 396의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신 (K)이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
이러한 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 하기 핵산 서열 (서열식별번호: 397)에 의해 코딩된다:
성숙 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 (서열식별번호: 398)는 하기와 같고, 임의로 C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
ALK7-Fc 융합 단백질의 상보적 형태 (서열식별번호: 129)는 하기와 같다:
신호 서열 및 링커 서열은 밑줄로 표시된다. 가능한 동종이량체 복합체 중 어느 하나보다는 ActRIIB-Fc:ALK7-Fc 이종이량체의 형성을 촉진하기 위해, 상기 이중 밑줄에 의해 표시된 바와 같은 2개의 아미노산 치환 (리신을 아스파르트산으로 대체함)을 융합 단백질의 Fc 도메인 내로 도입할 수 있다. 서열식별번호: 129의 아미노산 서열은 임의로, C-말단에 리신이 부가된 상태로 제공될 수 있다.
이러한 ALK7-Fc 융합 단백질은 하기 핵산 (서열식별번호: 255)에 의해 코딩된다:
성숙 ALK7-Fc 융합 단백질 서열 (서열식별번호: 130)은 하기와 같을 것으로 예상되고, 임의로 C-말단에 리신이 부가된 상태로 제공될 수 있다.
각각 서열식별번호: 396 및 서열식별번호: 129의 ActRIIB-Fc 및 ALK7-Fc 융합 단백질은 CHO 세포주로부터 공동-발현 및 정제되어, ActRIIB-Fc:ALK7-Fc를 포함하는 이형체 복합체를 생성할 수 있다.
비대칭 Fc 융합 단백질을 사용하여 이종다량체 복합체의 형성을 촉진하는 또 다른 접근법에서, Fc 도메인은 하기 개시된 ActRIIB-Fc 및 ALK7-Fc 폴리펩티드 서열에 예시된 바와 같이 상보적 소수성 상호작용 및 추가의 분자간 디술피드 결합을 도입하도록 변경된다.
ActRIIB-Fc 폴리펩티드 서열 (서열식별번호: 402)은 하기에 제시된다:
리더 서열 및 링커는 밑줄로 표시된다. 가능한 동종이량체 복합체 중 어느 하나보다는 ActRIIB-Fc:ALK7-Fc 이종이량체의 형성을 촉진하기 위해, 상기 이중 밑줄에 의해 표시된 바와 같은 2개의 아미노산 치환 (세린을 시스테인으로 및 트레오닌을 트립토판으로 대체함)을 융합 단백질의 Fc 도메인 내로 도입할 수 있다. 서열식별번호: 402의 아미노산 서열은 임의로, C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
성숙 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드 (서열식별번호: 403)는 하기와 같고, 임의로 C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
ALK7-Fc 융합 폴리펩티드의 상보적 형태 (서열식별번호: 133)는 하기와 같다:
리더 서열 및 링커 서열은 밑줄로 표시된다. 상기 서열식별번호: 130 및 403의 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드와의 이종이량체 형성을 안내하기 위해, 상기 이중 밑줄에 의해 표시된 바와 같은 4개의 아미노산 치환을 ALK7 융합 폴리펩티드의 Fc 도메인 내로 도입할 수 있다. 서열식별번호: 133의 아미노산 서열은 임의로 C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
성숙 ALK7-Fc 융합 단백질 서열 (서열식별번호: 134)은 하기와 같을 것으로 예상되고, 임의로 C-말단으로부터 리신이 제거된 상태로 제공될 수 있다.
각각 서열식별번호: 402 및 서열식별번호: 133의 ActRIIB-Fc 및 ALK7-Fc 단백질은 CHO 세포주로부터 공동-발현 및 정제되어, ActRIIB-Fc:ALK7-Fc를 포함하는 이형체 복합체를 생성할 수 있다.
다양한 ActRIIB-Fc:ALK7-Fc 복합체의 정제는, 예를 들어 하기 중 3개 이상을 임의의 순서로 포함하는 일련의 칼럼 크로마토그래피 단계에 의해 달성될 수 있다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로스 크로마토그래피, 페닐세파로스 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피. 정제는 바이러스 여과 및 완충제 교환에 의해 완료될 수 있었다.
실시예 15. ActRIIB-Fc 동종이량체 및 ALK7-Fc 동종이량체와 비교한 ActRIIB-Fc:ALK7-Fc 이종이량체의 리간드 결합 프로파일
비아코어™-기반 결합 검정을 사용하여 상기 기재된 ActRIIB-Fc:ALK7-Fc 이종이량체 복합체의 리간드 결합 선택성을 ActRIIB-Fc 및 ALK7-Fc 동종이량체 복합체의 것과 비교하였다. ActRIIB-Fc:ALK7-Fc 이종이량체, ActRIIB-Fc 동종이량체, 및 ALK7-Fc 동종이량체를 항-Fc 항체를 사용하여 시스템 상에 독립적으로 포획하였다. 리간드를 주입하고, 포획된 수용체 단백질 상에서 유동시켰다. 결과를 하기 표에 요약하며, 여기서 유효한 리간드 트랩을 가장 잘 나타내는 리간드 오프-레이트 (kd)는 볼드체로 표시한다.
이들 비교 결합 데이터는 ActRIIB-Fc:ALK7-Fc 이종이량체가 ActRIIB-Fc 동종이량체 또는 ALK7-Fc 동종이량체에 비해 변경된 결합 프로파일/선택성을 갖는다는 것을 입증한다. 흥미롭게도, ActRIIB-Fc 동종이량체에 대해 가장 강한 결합을 갖는 5종의 리간드 중 4종 (액티빈 A, BMP10, GDF8, 및 GDF11)은 ActRIIB-Fc:ALK7-Fc 이종이량체에 대해 감소된 결합을 나타내며, 예외는 이종이량체에 대해 단단한 결합을 보유하는 액티빈 B이다. 유사하게, ActRIIB-Fc 동종이량체에 대해 중간 결합을 갖는 4종의 리간드 중 3종 (GDF3, BMP6, 및 특히 BMP9)은 ActRIIB-Fc:ALK7-Fc 이종이량체에 대해 감소된 결합을 나타내는 반면, 액티빈 AC에 대한 결합은 전체적으로 이종이량체와의 두번째로 가장 강한 리간드 상호작용이 되도록 증가된다. 마지막으로, 액티빈 C 및 BMP5는 예상외로, ActRIIB-Fc 동종이량체에 대해서는 결합이 없거나 (액티빈 C) 약한 결합 (BMP5)임에도 불구하고, ActRIIB-Fc:ALK7 이종이량체에 중간 강도로 결합한다. 순 결과는 ActRIIB-Fc:ALK7-Fc 이종이량체가 ActRIIB-Fc 동종이량체, 또는 상기 리간드 중 어느 것도 결합하지 않는 ALK7-Fc 동종이량체의 것과 뚜렷하게 상이한 리간드-결합 프로파일을 보유한다는 것이다. 도 21을 참조한다.
따라서, 이들 결과는 ActRIIB-Fc:ALK7-Fc 이종이량체가 ActRIIB-Fc 동종이량체와 비교하여 액티빈 B 및 액티빈 AC의 보다 선택적인 길항제임을 입증한다. 또한, ActRIIB-Fc:ALK7-Fc 이종이량체는 액티빈 C에 대한 강건한 결합의 비통상적인 특성을 나타낸다. 따라서, ActRIIB-Fc:ALK7-Fc 이종이량체는 이러한 선택적 길항작용이 유리한 특정 용도에서 ActRIIB-Fc 동종이량체보다 더 유용할 것이다. 예는 액티빈 B 또는 액티빈 AC의 길항작용은 유지시키지만 액티빈 A, GDF3, GDF8, GDF11, BMP9, 또는 BMP10 중 1종 이상의 길항작용은 감소시키는 것이 바람직한 치료 용도를 포함한다. 또한, 액티빈 C를 길항하거나, 또는 액티빈 C와 액티빈 E 사이의 유사성에 기초하여 액티빈 E를 길항하는 것이 바람직한 치료, 진단 또는 분석 용도가 포함된다.
실시예 16. 노화 마우스에서 보존된 박출 계수 심부전 (HFpEF)에서의 심장-보호에 대한 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc의 역할
심장-보호에 대한 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc의 효과를 노령의 C57BL6 마우스 ("노령")를 사용하여 생리학적 심장 노화의 뮤린 모델에서 검사하였다. "노령" 마우스는 LV 확장기 기능장애를 포함한, 노화 인간 심장에서 관찰되는 것과 유사한 구조적 및 기능적 변화 (예를 들어, HFpEF의 표현형)를 나타내고, 박출 계수의 감소는 나타내지 않는다 (문헌 [Merentie et al., 2015; Lucia et al., 2018; Roh et al., 2019; Mesquita et al., 2020] 참조). ActRIIB-Fc:ALK4-Fc가 재형성 하에 심장 기능적 변경을 회복시킬 수 있는지 평가하기 위해 노령의 C57BL6 마우스를 사용한 연구를 수행하였다.
24-개월령의 ("노령") 13마리의 수컷 마우스 및 4-개월령의 ("어린") 10마리의 마우스를 연구하였다. "노령" 및 "어린" 마우스 군에게 포스페이트-완충 염수 (PBS)를 8주 동안 1주에 2회 피하로 제공하였다 (각각 "어린-비히클" 또는 "노령-비히클"). 또 다른 군의 "노령" 마우스에게는 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc (10 mg/kg)를 8주 동안 1주에 2회 피하로 제공하였다 ("노령-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc"). 투여된 비히클의 부피 및 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc의 부피는 동일하였다.
연구 말미에, 동물을 안락사시키기 전에, 생체내 심장 구조 및 기능을 경흉부 심장초음파검사 (비주얼소닉스 베보3100(VisualSonics Vevo3100), 30 MHz 트랜스듀서; 후지필름(Fujifilm))에 의해 마우스가 마취 하에 있는 동안 평가하였다. 확장기 기능을 심첨 4방도에서 최대 초기 (E) 확장기 경승모판 유속의 펄스파 도플러 기록 및 피크 초기 (e') 경승모판 판막륜 속도의 도플러 조직 영상화 기록에 의해 평가하였다. 피크 경승모판 유속 대 피크 경승모판 판막륜 속도의 비 (E/e')에서의 변화를 사용하여 확장기 기능을 추정하였다. (도 23). 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차로서 제시된다. 통계적 검정 (다중 비교를 위해 터키 검정을 사용한 일원 ANOVA 및 사후 분석)을 수행하였으며, 유의성 수준은 p<0.05로 설정하였다. 특히, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
연구 말미에, "노령-비히클" 마우스는 "어린-비히클" 마우스와 비교하여 HFpEF의 특징적인 특색, 예컨대 박출 계수 (EF)의 무 감소 및 BNP 수준의 증가를 나타내었다. ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 처리는 EF의 무 감소 경향, 및 또한 BNP 발현의 감소 경향을 나타내었다 ("노령-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc"). "노령-비히클" 마우스는 "어린-비히클" 마우스와 비교하여 노령의 마우스에서의 울혈성 폐의 지표인 증가된 폐 중량의 경향을 나타내었다. "노령-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc" 마우스에서의 폐 중량은 "노령-비히클" 마우스와 비교하여 폐 중량의 감소 경향을 나타내었다.
노령의 마우스에서의 심장 재형성 (즉, LV 비대)은 E/e'에 의해 측정된 바와 같이 심장 기능, 구체적으로 확장기 기능을 변경시켰다 (도 23). "노령-비히클" 마우스는 "어린-비히클" 마우스와 비교하여 임상 실시에서 충만 압력 및 확장기 기능장애의 지표인 증가된 E/e'를 나타내었다 (도 23). 놀랍게도, 특징적인 확장기 기능 측정치인 E/e' 비는 "노령-비히클" 마우스와 비교하여 "노령-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc" 마우스에서 유의하게 감소되었다.
이들 데이터는 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc가 생리학적 심장 노화 모델에서 박출 계수를 또한 감소시키지 않으면서 확장기 기능장애의 경향을 역전시키는 데 효과적이라는 것을 입증한다. 특히, E/e'는 비처리된 노령의 마우스와 비교하여 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc 처리된 마우스에서 유의하게 감소되었으며, 이는 ActRIIB-Fc:ALK4-Fc가 확장기 기능장애의 징후인 LV 이완을 개선시키는 데 도움이 된다는 것을 나타낸다. 데이터는 추가로, ActRIIB:ALK4 이종다량체에 더하여, 다른 ActRII-ALK4 길항제가 심부전을 치료하는 데 유용할 수 있음을 시사한다.
참조로 포함
본원에 언급된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개별 간행물 또는 특허가 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시된 것과 같이 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
대상의 구체적 실시양태가 논의되었지만, 상기 명세서는 예시적이며 제한적이지 않다. 본 명세서 및 하기 청구범위의 검토 시 많은 변형이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이다. 본 발명의 전체 범주는 청구범위를 그의 전체 등가물 범주와 함께, 및 명세서를 이러한 변형과 함께 참조하여 결정되어야 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> ACCELERON PHARMA INC.
<120> ACTRII-ALK4 ANTAGONISTS AND METHODS OF TREATING HEART FAILURE
<130> 1848179-0002-154-WO1
<140> PCT/US2022/019557
<141> 2022-03-09
<150> 63/159,059
<151> 2021-03-10
<160> 437
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 115
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser
35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr
100 105 110
Ala Pro Thr
115
<210> 2
<211> 512
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Thr Ala Pro Trp Val Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr
20 25 30
Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg
35 40 45
Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg
50 55 60
Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp
65 70 75 80
Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn
85 90 95
Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg
100 105 110
Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu
130 135 140
Pro Ile Gly Gly Leu Ser Leu Ile Val Leu Leu Ala Phe Trp Met Tyr
145 150 155 160
Arg His Arg Lys Pro Pro Tyr Gly His Val Asp Ile His Glu Asp Pro
165 170 175
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Val Gly Leu Lys Pro Leu Gln Leu
180 185 190
Leu Glu Ile Lys Ala Arg Gly Arg Phe Gly Cys Val Trp Lys Ala Gln
195 200 205
Leu Met Asn Asp Phe Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Leu Gln Asp Lys
210 215 220
Gln Ser Trp Gln Ser Glu Arg Glu Ile Phe Ser Thr Pro Gly Met Lys
225 230 235 240
His Glu Asn Leu Leu Gln Phe Ile Ala Ala Glu Lys Arg Gly Ser Asn
245 250 255
Leu Glu Val Glu Leu Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Asp Lys Gly Ser
260 265 270
Leu Thr Asp Tyr Leu Lys Gly Asn Ile Ile Thr Trp Asn Glu Leu Cys
275 280 285
His Val Ala Glu Thr Met Ser Arg Gly Leu Ser Tyr Leu His Glu Asp
290 295 300
Val Pro Trp Cys Arg Gly Glu Gly His Lys Pro Ser Ile Ala His Arg
305 310 315 320
Asp Phe Lys Ser Lys Asn Val Leu Leu Lys Ser Asp Leu Thr Ala Val
325 330 335
Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala Val Arg Phe Glu Pro Gly Lys Pro Pro
340 345 350
Gly Asp Thr His Gly Gln Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro Glu
355 360 365
Val Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg Ile
370 375 380
Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu Val Leu Trp Glu Leu Val Ser Arg Cys
385 390 395 400
Lys Ala Ala Asp Gly Pro Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu Glu
405 410 415
Glu Ile Gly Gln His Pro Ser Leu Glu Glu Leu Gln Glu Val Val Val
420 425 430
His Lys Lys Met Arg Pro Thr Ile Lys Asp His Trp Leu Lys His Pro
435 440 445
Gly Leu Ala Gln Leu Cys Val Thr Ile Glu Glu Cys Trp Asp His Asp
450 455 460
Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala Gly Cys Val Glu Glu Arg Val Ser Leu
465 470 475 480
Ile Arg Arg Ser Val Asn Gly Thr Thr Ser Asp Cys Leu Val Ser Leu
485 490 495
Val Thr Ser Val Thr Asn Val Asp Leu Pro Pro Lys Glu Ser Ser Ile
500 505 510
<210> 3
<211> 345
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
gggcgtgggg aggctgagac acgggagtgc atctactaca acgccaactg ggagctggag 60
cgcaccaacc agagcggcct ggagcgctgc gaaggcgagc aggacaagcg gctgcactgc 120
tacgcctcct ggcgcaacag ctctggcacc atcgagctcg tgaagaaggg ctgctggcta 180
gatgacttca actgctacga taggcaggag tgtgtggcca ctgaggagaa cccccaggtg 240
tacttctgct gctgtgaagg caacttctgc aacgaacgct tcactcattt gccagaggct 300
gggggcccgg aagtcacgta cgagccaccc ccgacagccc ccacc 345
<210> 4
<211> 1536
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
atgacggcgc cctgggtggc cctcgccctc ctctggggat cgctgtgcgc cggctctggg 60
cgtggggagg ctgagacacg ggagtgcatc tactacaacg ccaactggga gctggagcgc 120
accaaccaga gcggcctgga gcgctgcgaa ggcgagcagg acaagcggct gcactgctac 180
gcctcctggc gcaacagctc tggcaccatc gagctcgtga agaagggctg ctggctagat 240
gacttcaact gctacgatag gcaggagtgt gtggccactg aggagaaccc ccaggtgtac 300
ttctgctgct gtgaaggcaa cttctgcaac gaacgcttca ctcatttgcc agaggctggg 360
ggcccggaag tcacgtacga gccacccccg acagccccca ccctgctcac ggtgctggcc 420
tactcactgc tgcccatcgg gggcctttcc ctcatcgtcc tgctggcctt ttggatgtac 480
cggcatcgca agccccccta cggtcatgtg gacatccatg aggaccctgg gcctccacca 540
ccatcccctc tggtgggcct gaagccactg cagctgctgg agatcaaggc tcgggggcgc 600
tttggctgtg tctggaaggc ccagctcatg aatgactttg tagctgtcaa gatcttccca 660
ctccaggaca agcagtcgtg gcagagtgaa cgggagatct tcagcacacc tggcatgaag 720
cacgagaacc tgctacagtt cattgctgcc gagaagcgag gctccaacct cgaagtagag 780
ctgtggctca tcacggcctt ccatgacaag ggctccctca cggattacct caaggggaac 840
atcatcacat ggaacgaact gtgtcatgta gcagagacga tgtcacgagg cctctcatac 900
ctgcatgagg atgtgccctg gtgccgtggc gagggccaca agccgtctat tgcccacagg 960
gactttaaaa gtaagaatgt attgctgaag agcgacctca cagccgtgct ggctgacttt 1020
ggcttggctg ttcgatttga gccagggaaa cctccagggg acacccacgg acaggtaggc 1080
acgagacggt acatggctcc tgaggtgctc gagggagcca tcaacttcca gagagatgcc 1140
ttcctgcgca ttgacatgta tgccatgggg ttggtgctgt gggagcttgt gtctcgctgc 1200
aaggctgcag acggacccgt ggatgagtac atgctgccct ttgaggaaga gattggccag 1260
cacccttcgt tggaggagct gcaggaggtg gtggtgcaca agaagatgag gcccaccatt 1320
aaagatcact ggttgaaaca cccgggcctg gcccagcttt gtgtgaccat cgaggagtgc 1380
tgggaccatg atgcagaggc tcgcttgtcc gcgggctgtg tggaggagcg ggtgtccctg 1440
attcggaggt cggtcaacgg cactacctcg gactgtctcg tttccctggt gacctctgtc 1500
accaatgtgg acctgccccc taaagagtca agcatc 1536
<210> 5
<211> 343
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 5
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser
35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr
100 105 110
Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
115 120 125
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
130 135 140
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
145 150 155 160
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
165 170 175
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
180 185 190
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
195 200 205
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
210 215 220
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
225 230 235 240
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
245 250 255
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
260 265 270
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
275 280 285
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
290 295 300
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
305 310 315 320
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
325 330 335
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340
<210> 6
<211> 368
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 6
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr
20 25 30
Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn
35 40 45
Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His
50 55 60
Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys
65 70 75 80
Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys
85 90 95
Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly
100 105 110
Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro
115 120 125
Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr
130 135 140
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
145 150 155 160
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
165 170 175
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
180 185 190
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
195 200 205
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
210 215 220
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
225 230 235 240
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
245 250 255
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
260 265 270
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
275 280 285
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
290 295 300
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
305 310 315 320
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
325 330 335
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
340 345 350
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 7
Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile
1 5 10 15
Ser Tyr Ile Tyr Ala
20
<210> 8
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 8
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro
20
<210> 9
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 9
Met Thr Ala Pro Trp Val Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Ala Gly
<210> 10
<211> 1107
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 10
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccggcg cctctgggcg tggggaggct gagacacggg agtgcatcta ctacaacgcc 120
aactgggagc tggagcgcac caaccagagc ggcctggagc gctgcgaagg cgagcaggac 180
aagcggctgc actgctacgc ctcctggcgc aacagctctg gcaccatcga gctcgtgaag 240
aagggctgct ggctagatga cttcaactgc tacgataggc aggagtgtgt ggccactgag 300
gagaaccccc aggtgtactt ctgctgctgt gaaggcaact tctgcaacga gcgcttcact 360
catttgccag aggctggggg cccggaagtc acgtacgagc cacccccgac agcccccacc 420
ggtggtggaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 480
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 540
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 600
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 660
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 720
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 780
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 840
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 900
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 960
tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1020
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1080
agcctctccc tgtctccggg taaatga 1107
<210> 11
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 11
Gly Arg Gly Glu Ala Glu
1 5
<210> 12
<211> 335
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 12
Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg
1 5 10 15
Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg
20 25 30
Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu
35 40 45
Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln
50 55 60
Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys
65 70 75 80
Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly
85 90 95
Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr Gly Gly Gly Thr His
100 105 110
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
130 135 140
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
145 150 155 160
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
165 170 175
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
180 185 190
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
195 200 205
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
210 215 220
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
225 230 235 240
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
245 250 255
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
260 265 270
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
275 280 285
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
290 295 300
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
305 310 315 320
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210> 13
<211> 225
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
1 5 10 15
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
20 25 30
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
35 40 45
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
50 55 60
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
65 70 75 80
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
85 90 95
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
100 105 110
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
115 120 125
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
145 150 155 160
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
165 170 175
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
180 185 190
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
195 200 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
Lys
225
<210> 14
<211> 223
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
1 5 10 15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
50 55 60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
85 90 95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
180 185 190
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
195 200 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 15
<211> 232
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 16
<211> 279
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys
1 5 10 15
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
20 25 30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
35 40 45
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro
50 55 60
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
65 70 75 80
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
85 90 95
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp
100 105 110
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
115 120 125
Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
130 135 140
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
145 150 155 160
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg
165 170 175
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
180 185 190
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
195 200 205
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn
210 215 220
Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
225 230 235 240
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser
245 250 255
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser
260 265 270
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
275
<210> 17
<211> 229
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 18
<211> 225
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 18
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
1 5 10 15
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
20 25 30
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
35 40 45
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
50 55 60
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
65 70 75 80
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
85 90 95
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
100 105 110
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
115 120 125
Leu Pro Pro Ser Arg Lys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
145 150 155 160
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
165 170 175
Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
180 185 190
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
195 200 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
Lys
225
<210> 19
<211> 225
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 19
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
1 5 10 15
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
20 25 30
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
35 40 45
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
50 55 60
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
65 70 75 80
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
85 90 95
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
100 105 110
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
115 120 125
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
145 150 155 160
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asp Thr Thr Pro Pro Val Leu
165 170 175
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys
180 185 190
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
195 200 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
Lys
225
<210> 20
<211> 225
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 20
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
1 5 10 15
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
20 25 30
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
35 40 45
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
50 55 60
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
65 70 75 80
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
85 90 95
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
100 105 110
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
115 120 125
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Tyr
130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
145 150 155 160
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
165 170 175
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
180 185 190
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
195 200 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
Lys
225
<210> 21
<211> 225
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 21
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
1 5 10 15
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
20 25 30
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
35 40 45
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
50 55 60
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
65 70 75 80
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
85 90 95
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
100 105 110
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
115 120 125
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
145 150 155 160
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
165 170 175
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Thr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
180 185 190
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
195 200 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
Lys
225
<210> 22
<211> 225
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 22
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
1 5 10 15
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
20 25 30
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
35 40 45
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
50 55 60
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
65 70 75 80
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
85 90 95
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
100 105 110
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
115 120 125
Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
145 150 155 160
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
165 170 175
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
180 185 190
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
195 200 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
Lys
225
<210> 23
<211> 225
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 23
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
1 5 10 15
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
20 25 30
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
35 40 45
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
50 55 60
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65 70 75 80
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
85 90 95
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
100 105 110
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr
115 120 125
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
130 135 140
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
145 150 155 160
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
165 170 175
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
180 185 190
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
195 200 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
Lys
225
<210> 24
<211> 228
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 24
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
1 5 10 15
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Thr Ile Ser Leu
210 215 220
Ser Pro Gly Lys
225
<210> 25
<211> 228
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 25
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
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20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
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100 105 110
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115 120 125
Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu
130 135 140
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
145 150 155 160
Glu Ser Asn Gly Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Ile Leu Arg
180 185 190
Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Asp Arg
210 215 220
Ser Pro Gly Lys
225
<210> 26
<211> 261
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 26
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
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50 55 60
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65 70 75 80
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
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195 200 205
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Glu Asn Ala Gln Leu Glu Trp Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Leu
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Ala Gln Gly Ala Thr
260
<210> 27
<211> 261
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 27
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
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50 55 60
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130 135 140
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
180 185 190
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
195 200 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
Lys Gly Gly Ser Ala Gln Leu Lys Lys Lys Leu Gln Ala Leu Lys Lys
225 230 235 240
Lys Asn Ala Gln Leu Lys Trp Lys Leu Gln Ala Leu Lys Lys Lys Leu
245 250 255
Ala Gln Gly Ala Thr
260
<210> 28
<211> 225
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 28
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
1 5 10 15
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
20 25 30
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
35 40 45
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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165 170 175
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180 185 190
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
195 200 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Asp Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
Lys
225
<210> 29
<211> 225
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 29
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
1 5 10 15
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
20 25 30
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
35 40 45
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50 55 60
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
65 70 75 80
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
195 200 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
Lys
225
<210> 30
<211> 225
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 30
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
1 5 10 15
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
20 25 30
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
35 40 45
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
50 55 60
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
65 70 75 80
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
85 90 95
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
100 105 110
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
115 120 125
Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
195 200 205
Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
Lys
225
<210> 31
<211> 368
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 31
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys
85 90 95
Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly
100 105 110
Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro
115 120 125
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130 135 140
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
145 150 155 160
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
165 170 175
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
180 185 190
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
195 200 205
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
210 215 220
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
225 230 235 240
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
245 250 255
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
260 265 270
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
275 280 285
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
290 295 300
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305 310 315 320
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
325 330 335
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
340 345 350
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 32
<211> 1104
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 32
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccggcg cctctgggcg tggggaggct gagacacggg agtgcatcta ctacaacgcc 120
aactgggagc tggagcgcac caaccagagc ggcctggagc gctgcgaagg cgagcaggac 180
gcccggctgc actgctacgc ctcctggcgc aacagctctg gcaccatcga gctcgtgaag 240
aagggctgct ggctagatga cttcaactgc tacgataggc aggagtgtgt ggccactgag 300
gagaaccccc aggtgtactt ctgctgctgt gaaggcaact tctgcaacga gcgcttcact 360
catttgccag aggctggggg cccggaagtc acgtacgagc cacccccgac agcccccacc 420
ggtggtggaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 480
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 540
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 600
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 660
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aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 780
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 840
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 900
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 960
tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1020
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1080
agcctctccc tgtccccggg taaa 1104
<210> 33
<211> 343
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 33
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
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35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
115 120 125
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
130 135 140
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
145 150 155 160
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
165 170 175
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
180 185 190
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
195 200 205
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
210 215 220
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
225 230 235 240
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
245 250 255
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
260 265 270
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
275 280 285
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290 295 300
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
305 310 315 320
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
325 330 335
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340
<210> 34
<211> 368
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 34
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr
20 25 30
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35 40 45
Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Glu Arg Leu His
50 55 60
Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys
65 70 75 80
Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys
85 90 95
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100 105 110
Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
165 170 175
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
180 185 190
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
195 200 205
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
210 215 220
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
225 230 235 240
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
245 250 255
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
260 265 270
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
275 280 285
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
290 295 300
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
305 310 315 320
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
325 330 335
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
340 345 350
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 35
<211> 1104
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 35
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccggcg cctctgggcg tggggaggct gagacacggg agtgcatcta ctacaacgcc 120
aactgggagc tggagcgcac caaccagagc ggcctggagc gctgcgaagg cgagcaggac 180
gagcggctgc actgctacgc ctcctggcgc aacagctctg gcaccatcga gctcgtgaag 240
aagggctgct ggctagatga cttcaactgc tacgataggc aggagtgtgt ggccactgag 300
gagaaccccc aggtgtactt ctgctgctgt gaaggcaact tctgcaacga gcgcttcact 360
catttgccag aggctggggg cccggaagtc acgtacgagc cacccccgac agcccccacc 420
ggtggtggaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 480
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 540
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 600
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<211> 343
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 36
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 37
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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115 120 125
Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr
130 135 140
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
145 150 155 160
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
165 170 175
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
180 185 190
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
195 200 205
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
210 215 220
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
225 230 235 240
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
245 250 255
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
260 265 270
Pro Pro Ser Arg Lys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
275 280 285
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
290 295 300
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys
305 310 315 320
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
325 330 335
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
340 345 350
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 47
<211> 1104
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 47
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccggcg cctctgggcg tggggaggct gagacacggg agtgcatcta ctacaacgcc 120
aactgggagc tggagcgcac caaccagagc ggcctggagc gctgcgaagg cgagcaggac 180
aagcggctgc actgctacgc ctcctggcgc aacagctctg gcaccatcga gctcgtgaag 240
aagggctgct ggctagatga cttcaactgc tacgataggc aggagtgtgt ggccactgag 300
gagaaccccc aggtgtactt ctgctgctgt gaaggcaact tctgcaacga gcgcttcact 360
catttgccag aggctggggg cccggaagtc acgtacgagc cacccccgac agcccccacc 420
ggtggtggaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 480
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 540
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 600
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 660
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 720
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 780
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggaa ggagatgacc 840
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 900
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctgaag 960
tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1020
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1080
agcctctccc tgtctccggg taaa 1104
<210> 48
<211> 343
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 48
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser
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Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
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100 105 110
Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
115 120 125
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
130 135 140
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
145 150 155 160
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
165 170 175
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
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Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
225 230 235 240
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Lys Glu Met Thr Lys
245 250 255
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260 265 270
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
275 280 285
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305 310 315 320
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
325 330 335
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340
<210> 49
<211> 367
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 49
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr
20 25 30
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65 70 75 80
Lys Gly Cys Trp Glu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
225 230 235 240
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
290 295 300
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305 310 315 320
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
325 330 335
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
340 345 350
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
355 360 365
<210> 50
<211> 342
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 50
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser
35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Glu Asp Asp Phe Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr
100 105 110
Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
115 120 125
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
130 135 140
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
145 150 155 160
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
165 170 175
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
180 185 190
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
195 200 205
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
210 215 220
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
225 230 235 240
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys
245 250 255
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
260 265 270
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
275 280 285
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
290 295 300
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
305 310 315 320
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
325 330 335
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
340
<210> 51
<211> 368
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 51
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys
65 70 75 80
Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys
85 90 95
Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly
100 105 110
Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro
115 120 125
Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr
130 135 140
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
145 150 155 160
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
165 170 175
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
180 185 190
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
195 200 205
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
210 215 220
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
225 230 235 240
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
245 250 255
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
260 265 270
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
275 280 285
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
290 295 300
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
305 310 315 320
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
325 330 335
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
340 345 350
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 52
<211> 343
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 52
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser
35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
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Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr
100 105 110
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115 120 125
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
130 135 140
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145 150 155 160
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
165 170 175
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
180 185 190
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
195 200 205
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
210 215 220
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
225 230 235 240
Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
245 250 255
Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
260 265 270
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
275 280 285
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser
290 295 300
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
305 310 315 320
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
325 330 335
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340
<210> 53
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 53
Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg
1 5 10 15
Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg
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65 70 75 80
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100 105
<210> 54
<211> 329
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 54
Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala
1 5 10 15
Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu
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35 40 45
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65 70 75 80
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130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
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Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
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210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 55
<211> 344
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 55
Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala
1 5 10 15
Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu
20 25 30
Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Ala Asn Ser
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Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe
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Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln
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His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro
100 105 110
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130 135 140
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
145 150 155 160
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
165 170 175
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
180 185 190
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
195 200 205
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
210 215 220
Leu Pro Val Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
225 230 235 240
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
245 250 255
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
325 330 335
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<400> 56
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<400> 57
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<400> 60
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<400> 61
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<400> 62
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<400> 65
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<400> 66
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<400> 67
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<400> 68
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<400> 69
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<400> 71
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<400> 76
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<400> 78
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<400> 79
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<400> 80
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<400> 81
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<400> 82
000
<210> 83
<400> 83
000
<210> 84
<211> 505
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 84
Met Ala Glu Ser Ala Gly Ala Ser Ser Phe Phe Pro Leu Val Val Leu
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Pro Arg Gly Val Gln Ala Leu
20 25 30
Leu Cys Ala Cys Thr Ser Cys Leu Gln Ala Asn Tyr Thr Cys Glu Thr
35 40 45
Asp Gly Ala Cys Met Val Ser Ile Phe Asn Leu Asp Gly Met Glu His
50 55 60
His Val Arg Thr Cys Ile Pro Lys Val Glu Leu Val Pro Ala Gly Lys
65 70 75 80
Pro Phe Tyr Cys Leu Ser Ser Glu Asp Leu Arg Asn Thr His Cys Cys
85 90 95
Tyr Thr Asp Tyr Cys Asn Arg Ile Asp Leu Arg Val Pro Ser Gly His
100 105 110
Leu Lys Glu Pro Glu His Pro Ser Met Trp Gly Pro Val Glu Leu Val
115 120 125
Gly Ile Ile Ala Gly Pro Val Phe Leu Leu Phe Leu Ile Ile Ile Ile
130 135 140
Val Phe Leu Val Ile Asn Tyr His Gln Arg Val Tyr His Asn Arg Gln
145 150 155 160
Arg Leu Asp Met Glu Asp Pro Ser Cys Glu Met Cys Leu Ser Lys Asp
165 170 175
Lys Thr Leu Gln Asp Leu Val Tyr Asp Leu Ser Thr Ser Gly Ser Gly
180 185 190
Ser Gly Leu Pro Leu Phe Val Gln Arg Thr Val Ala Arg Thr Ile Val
195 200 205
Leu Gln Glu Ile Ile Gly Lys Gly Arg Phe Gly Glu Val Trp Arg Gly
210 215 220
Arg Trp Arg Gly Gly Asp Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser Arg Glu
225 230 235 240
Glu Arg Ser Trp Phe Arg Glu Ala Glu Ile Tyr Gln Thr Val Met Leu
245 250 255
Arg His Glu Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Asn Lys Asp Asn
260 265 270
Gly Thr Trp Thr Gln Leu Trp Leu Val Ser Asp Tyr His Glu His Gly
275 280 285
Ser Leu Phe Asp Tyr Leu Asn Arg Tyr Thr Val Thr Ile Glu Gly Met
290 295 300
Ile Lys Leu Ala Leu Ser Ala Ala Ser Gly Leu Ala His Leu His Met
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Glu Ile Val Gly Thr Gln Gly Lys Pro Gly Ile Ala His Arg Asp Leu
325 330 335
Lys Ser Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Met Cys Ala Ile Ala
340 345 350
Asp Leu Gly Leu Ala Val Arg His Asp Ala Val Thr Asp Thr Ile Asp
355 360 365
Ile Ala Pro Asn Gln Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu
370 375 380
Val Leu Asp Glu Thr Ile Asn Met Lys His Phe Asp Ser Phe Lys Cys
385 390 395 400
Ala Asp Ile Tyr Ala Leu Gly Leu Val Tyr Trp Glu Ile Ala Arg Arg
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Leu Val Pro Ser Asp Pro Ser Ile Glu Glu Met Arg Lys Val Val Cys
435 440 445
Asp Gln Lys Leu Arg Pro Asn Ile Pro Asn Trp Trp Gln Ser Tyr Glu
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Ala Leu Arg Val Met Gly Lys Met Met Arg Glu Cys Trp Tyr Ala Asn
465 470 475 480
Gly Ala Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Ser Gln
485 490 495
Leu Ser Val Gln Glu Asp Val Lys Ile
500 505
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 85
Met Ala Glu Ser Ala Gly Ala Ser Ser Phe Phe Pro Leu Val Val Leu
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Leu Leu Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Pro Arg Gly Val Gln Ala Leu
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Arg Leu Asp Met Glu Asp Pro Ser Cys Glu Met Cys Leu Ser Lys Asp
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Glu Arg Ser Trp Phe Arg Glu Ala Glu Ile Tyr Gln Thr Val Met Leu
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Arg His Glu Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Asn Lys Ala Asp
260 265 270
Cys Ser Phe Leu Thr Leu Pro Trp Glu Val Val Met Val Ser Ala Ala
275 280 285
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Leu Val Ser Asp Tyr His Glu His Gly Ser Leu Phe Asp Tyr Leu Asn
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Arg Tyr Thr Val Thr Ile Glu Gly Met Ile Lys Leu Ala Leu Ser Ala
340 345 350
Ala Ser Gly Leu Ala His Leu His Met Glu Ile Val Gly Thr Gln Gly
355 360 365
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370 375 380
Lys Lys Asn Gly Met Cys Ala Ile Ala Asp Leu Gly Leu Ala Val Arg
385 390 395 400
His Asp Ala Val Thr Asp Thr Ile Asp Ile Ala Pro Asn Gln Arg Val
405 410 415
Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Asp Glu Thr Ile Asn
420 425 430
Met Lys His Phe Asp Ser Phe Lys Cys Ala Asp Ile Tyr Ala Leu Gly
435 440 445
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450 455 460
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Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Ser Gln Leu Ser Val Gln Glu Asp Val
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Lys Ile
545
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 86
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1 5 10 15
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 88
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 89
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<400> 91
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 92
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 93
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245 250 255
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260 265 270
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
275 280 285
Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
290 295 300
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
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Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<400> 94
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<400> 95
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<400> 101
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<400> 103
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<400> 104
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<400> 105
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<400> 106
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<400> 109
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<400> 110
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<400> 119
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<210> 120
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 120
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Ser Ser Arg Asp Glu Arg Ser Trp Phe Arg Glu Ala Glu Ile Tyr Gln
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<211> 413
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<211> 336
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Ile Val Thr Val Ala Gly Met Ile Lys Leu Ala Leu Ser Ile Ala Ser
130 135 140
Gly Leu Ala His Leu His Met Glu Ile Val Gly Thr Gln Gly Lys Pro
145 150 155 160
Ala Ile Ala His Arg Asp Ile Lys Ser Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys
165 170 175
Cys Glu Thr Cys Ala Ile Ala Asp Leu Gly Leu Ala Val Lys His Asp
180 185 190
Ser Ile Leu Asn Thr Ile Asp Ile Pro Gln Asn Pro Lys Val Gly Thr
195 200 205
Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Met Leu Asp Asp Thr Met Asn Val Asn
210 215 220
Ile Phe Glu Ser Phe Lys Arg Ala Asp Ile Tyr Ser Val Gly Leu Val
225 230 235 240
Tyr Trp Glu Ile Ala Arg Arg Cys Ser Val Gly Gly Ile Val Glu Glu
245 250 255
Tyr Gln Leu Pro Tyr Tyr Asp Met Val Pro Ser Asp Pro Ser Ile Glu
260 265 270
Glu Met Arg Lys Val Val Cys Asp Gln Lys Phe Arg Pro Ser Ile Pro
275 280 285
Asn Gln Trp Gln Ser Cys Glu Ala Leu Arg Val Met Gly Arg Ile Met
290 295 300
Arg Glu Cys Trp Tyr Ala Asn Gly Ala Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg
305 310 315 320
Ile Lys Lys Thr Ile Ser Gln Leu Cys Val Lys Glu Asp Cys Lys Ala
325 330 335
<210> 123
<211> 93
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 123
Glu Leu Ser Pro Gly Leu Lys Cys Val Cys Leu Leu Cys Asp Ser Ser
1 5 10 15
Asn Phe Thr Cys Gln Thr Glu Gly Ala Cys Trp Ala Ser Val Met Leu
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Thr Asn Gly Lys Glu Gln Val Ile Lys Ser Cys Val Ser Leu Pro Glu
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Leu Asn Ala Gln Val Phe Cys His Ser Ser Asn Asn Val Thr Lys Thr
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Thr Ala Ser Pro Asn Ala Pro Lys Leu Gly Pro Met Glu
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 124
Met Leu Thr Asn Gly Lys Glu Gln Val Ile Lys Ser Cys Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Glu Leu Asn Ala Gln Val Phe Cys His Ser Ser Asn Asn Val Thr
20 25 30
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35 40 45
Leu Pro Thr Ala Ser Pro Asn Ala Pro Lys Leu Gly Pro Met Glu Leu
50 55 60
Ala Ile Ile Ile Thr Val Pro Val Cys Leu Leu Ser Ile Ala Ala Met
65 70 75 80
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Ser Gly Ser Gly Leu Pro Leu Leu Val Gln Arg Thr Ile Ala Arg Thr
130 135 140
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His Gly Arg Trp Cys Gly Glu Asp Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser
165 170 175
Arg Asp Glu Arg Ser Trp Phe Arg Glu Ala Glu Ile Tyr Gln Thr Val
180 185 190
Met Leu Arg His Glu Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Asn Lys
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Gly Met Ile Lys Leu Ala Leu Ser Ile Ala Ser Gly Leu Ala His Leu
245 250 255
His Met Glu Ile Val Gly Thr Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg
260 265 270
Asp Ile Lys Ser Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys Cys Glu Thr Cys Ala
275 280 285
Ile Ala Asp Leu Gly Leu Ala Val Lys His Asp Ser Ile Leu Asn Thr
290 295 300
Ile Asp Ile Pro Gln Asn Pro Lys Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala
305 310 315 320
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325 330 335
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Arg Arg Cys Ser Val Gly Gly Ile Val Glu Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
355 360 365
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Cys Glu Ala Leu Arg Val Met Gly Arg Ile Met Arg Glu Cys Trp Tyr
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<211> 63
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 125
Met Leu Thr Asn Gly Lys Glu Gln Val Ile Lys Ser Cys Val Ser Leu
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 126
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Thr Asn Gly Lys Glu Gln Val Ile Lys Ser Cys Val Ser Leu Pro Glu
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Met Leu Asp Asp Thr Met Asn Val Asn Ile Phe Glu Ser Phe Lys Arg
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370 375 380
Leu Cys Val Lys Glu Asp Cys Lys Ala
385 390
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 127
Glu Leu Ser Pro Gly Leu Lys Cys Val Cys Leu Leu Cys Asp Ser Ser
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Tyr Ala Asn Gly Ala Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 128
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 129
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Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
325 330 335
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 130
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<400> 132
000
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 133
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Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<211> 318
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 134
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
275 280 285
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
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<210> 220
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000
<210> 221
<211> 1515
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 221
atggcggagt cggccggagc ctcctccttc ttcccccttg ttgtcctcct gctcgccggc 60
agcggcgggt ccgggccccg gggggtccag gctctgctgt gtgcgtgcac cagctgcctc 120
caggccaact acacgtgtga gacagatggg gcctgcatgg tttccatttt caatctggat 180
gggatggagc accatgtgcg cacctgcatc cccaaagtgg agctggtccc tgccgggaag 240
cccttctact gcctgagctc ggaggacctg cgcaacaccc actgctgcta cactgactac 300
tgcaacagga tcgacttgag ggtgcccagt ggtcacctca aggagcctga gcacccgtcc 360
atgtggggcc cggtggagct ggtaggcatc atcgccggcc cggtgttcct cctgttcctc 420
atcatcatca ttgttttcct tgtcattaac tatcatcagc gtgtctatca caaccgccag 480
agactggaca tggaagatcc ctcatgtgag atgtgtctct ccaaagacaa gacgctccag 540
gatcttgtct acgatctctc cacctcaggg tctggctcag ggttacccct ctttgtccag 600
cgcacagtgg cccgaaccat cgttttacaa gagattattg gcaagggtcg gtttggggaa 660
gtatggcggg gccgctggag gggtggtgat gtggctgtga aaatattctc ttctcgtgaa 720
gaacggtctt ggttcaggga agcagagata taccagacgg tcatgctgcg ccatgaaaac 780
atccttggat ttattgctgc tgacaataaa gataatggca cctggacaca gctgtggctt 840
gtttctgact atcatgagca cgggtccctg tttgattatc tgaaccggta cacagtgaca 900
attgagggga tgattaagct ggccttgtct gctgctagtg ggctggcaca cctgcacatg 960
gagatcgtgg gcacccaagg gaagcctgga attgctcatc gagacttaaa gtcaaagaac 1020
attctggtga agaaaaatgg catgtgtgcc atagcagacc tgggcctggc tgtccgtcat 1080
gatgcagtca ctgacaccat tgacattgcc ccgaatcaga gggtggggac caaacgatac 1140
atggcccctg aagtacttga tgaaaccatt aatatgaaac actttgactc ctttaaatgt 1200
gctgatattt atgccctcgg gcttgtatat tgggagattg ctcgaagatg caattctgga 1260
ggagtccatg aagaatatca gctgccatat tacgacttag tgccctctga cccttccatt 1320
gaggaaatgc gaaaggttgt atgtgatcag aagctgcgtc ccaacatccc caactggtgg 1380
cagagttatg aggcactgcg ggtgatgggg aagatgatgc gagagtgttg gtatgccaac 1440
ggcgcagccc gcctgacggc cctgcgcatc aagaagaccc tctcccagct cagcgtgcag 1500
gaagacgtga agatc 1515
<210> 222
<211> 309
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 222
tccgggcccc ggggggtcca ggctctgctg tgtgcgtgca ccagctgcct ccaggccaac 60
tacacgtgtg agacagatgg ggcctgcatg gtttccattt tcaatctgga tgggatggag 120
caccatgtgc gcacctgcat ccccaaagtg gagctggtcc ctgccgggaa gcccttctac 180
tgcctgagct cggaggacct gcgcaacacc cactgctgct acactgacta ctgcaacagg 240
atcgacttga gggtgcccag tggtcacctc aaggagcctg agcacccgtc catgtggggc 300
ccggtggag 309
<210> 223
<211> 1638
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 223
atggcggagt cggccggagc ctcctccttc ttcccccttg ttgtcctcct gctcgccggc 60
agcggcgggt ccgggccccg gggggtccag gctctgctgt gtgcgtgcac cagctgcctc 120
caggccaact acacgtgtga gacagatggg gcctgcatgg tttccatttt caatctggat 180
gggatggagc accatgtgcg cacctgcatc cccaaagtgg agctggtccc tgccgggaag 240
cccttctact gcctgagctc ggaggacctg cgcaacaccc actgctgcta cactgactac 300
tgcaacagga tcgacttgag ggtgcccagt ggtcacctca aggagcctga gcacccgtcc 360
atgtggggcc cggtggagct ggtaggcatc atcgccggcc cggtgttcct cctgttcctc 420
atcatcatca ttgttttcct tgtcattaac tatcatcagc gtgtctatca caaccgccag 480
agactggaca tggaagatcc ctcatgtgag atgtgtctct ccaaagacaa gacgctccag 540
gatcttgtct acgatctctc cacctcaggg tctggctcag ggttacccct ctttgtccag 600
cgcacagtgg cccgaaccat cgttttacaa gagattattg gcaagggtcg gtttggggaa 660
gtatggcggg gccgctggag gggtggtgat gtggctgtga aaatattctc ttctcgtgaa 720
gaacggtctt ggttcaggga agcagagata taccagacgg tcatgctgcg ccatgaaaac 780
atccttggat ttattgctgc tgacaataaa gcagactgct cattcctcac attgccatgg 840
gaagttgtaa tggtctctgc tgcccccaag ctgaggagcc ttagactcca atacaaggga 900
ggaaggggaa gagcaagatt tttattccca ctgaataatg gcacctggac acagctgtgg 960
cttgtttctg actatcatga gcacgggtcc ctgtttgatt atctgaaccg gtacacagtg 1020
acaattgagg ggatgattaa gctggccttg tctgctgcta gtgggctggc acacctgcac 1080
atggagatcg tgggcaccca agggaagcct ggaattgctc atcgagactt aaagtcaaag 1140
aacattctgg tgaagaaaaa tggcatgtgt gccatagcag acctgggcct ggctgtccgt 1200
catgatgcag tcactgacac cattgacatt gccccgaatc agagggtggg gaccaaacga 1260
tacatggccc ctgaagtact tgatgaaacc attaatatga aacactttga ctcctttaaa 1320
tgtgctgata tttatgccct cgggcttgta tattgggaga ttgctcgaag atgcaattct 1380
ggaggagtcc atgaagaata tcagctgcca tattacgact tagtgccctc tgacccttcc 1440
attgaggaaa tgcgaaaggt tgtatgtgat cagaagctgc gtcccaacat ccccaactgg 1500
tggcagagtt atgaggcact gcgggtgatg gggaagatga tgcgagagtg ttggtatgcc 1560
aacggcgcag cccgcctgac ggccctgcgc atcaagaaga ccctctccca gctcagcgtg 1620
caggaagacg tgaagatc 1638
<210> 224
<211> 309
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 224
tccgggcccc ggggggtcca ggctctgctg tgtgcgtgca ccagctgcct ccaggccaac 60
tacacgtgtg agacagatgg ggcctgcatg gtttccattt tcaatctgga tgggatggag 120
caccatgtgc gcacctgcat ccccaaagtg gagctggtcc ctgccgggaa gcccttctac 180
tgcctgagct cggaggacct gcgcaacacc cactgctgct acactgacta ctgcaacagg 240
atcgacttga gggtgcccag tggtcacctc aaggagcctg agcacccgtc catgtggggc 300
ccggtggag 309
<210> 225
<400> 225
000
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<400> 226
000
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<400> 227
000
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<400> 228
000
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<400> 229
000
<210> 230
<400> 230
000
<210> 231
<400> 231
000
<210> 232
<400> 232
000
<210> 233
<211> 1479
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 233
atgacccggg cgctctgctc agcgctccgc caggctctcc tgctgctcgc agcggccgcc 60
gagctctcgc caggactgaa gtgtgtatgt cttttgtgtg attcttcaaa ctttacctgc 120
caaacagaag gagcatgttg ggcatcagtc atgctaacca atggaaaaga gcaggtgatc 180
aaatcctgtg tctcccttcc agaactgaat gctcaagtct tctgtcatag ttccaacaat 240
gttaccaaaa ccgaatgctg cttcacagat ttttgcaaca acataacact gcaccttcca 300
acagcatcac caaatgcccc aaaacttgga cccatggagc tggccatcat tattactgtg 360
cctgtttgcc tcctgtccat agctgcgatg ctgacagtat gggcatgcca gggtcgacag 420
tgctcctaca ggaagaaaaa gagaccaaat gtggaggaac cactctctga gtgcaatctg 480
gtaaatgctg gaaaaactct gaaagatctg atttatgatg tgaccgcctc tggatctggc 540
tctggtctac ctctgttggt tcaaaggaca attgcaagga cgattgtgct tcaggaaata 600
gtaggaaaag gtagatttgg tgaggtgtgg catggaagat ggtgtgggga agatgtggct 660
gtgaaaatat tctcctccag agatgaaaga tcttggtttc gtgaggcaga aatttaccag 720
acggtcatgc tgcgacatga aaacatcctt ggtttcattg ctgctgacaa caaagataat 780
ggaacttgga ctcaactttg gctggtatct gaatatcatg aacagggctc cttatatgac 840
tatttgaata gaaatatagt gaccgtggct ggaatgatca agctggcgct ctcaattgct 900
agtggtctgg cacaccttca tatggagatt gttggtacac aaggtaaacc tgctattgct 960
catcgagaca taaaatcaaa gaatatctta gtgaaaaagt gtgaaacttg tgccatagcg 1020
gacttagggt tggctgtgaa gcatgattca atactgaaca ctatcgacat acctcagaat 1080
cctaaagtgg gaaccaagag gtatatggct cctgaaatgc ttgatgatac aatgaatgtg 1140
aatatctttg agtccttcaa acgagctgac atctattctg ttggtctggt ttactgggaa 1200
atagcccgga ggtgttcagt cggaggaatt gttgaggagt accaattgcc ttattatgac 1260
atggtgcctt cagatccctc gatagaggaa atgagaaagg ttgtttgtga ccagaagttt 1320
cgaccaagta tcccaaacca gtggcaaagt tgtgaagcac tccgagtcat ggggagaata 1380
atgcgtgagt gttggtatgc caacggagcg gcccgcctaa ctgctcttcg tattaagaag 1440
actatatctc aactttgtgt caaagaagac tgcaaagcc 1479
<210> 234
<211> 279
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 234
gagctctcgc caggactgaa gtgtgtatgt cttttgtgtg attcttcaaa ctttacctgc 60
caaacagaag gagcatgttg ggcatcagtc atgctaacca atggaaaaga gcaggtgatc 120
aaatcctgtg tctcccttcc agaactgaat gctcaagtct tctgtcatag ttccaacaat 180
gttaccaaaa ccgaatgctg cttcacagat ttttgcaaca acataacact gcaccttcca 240
acagcatcac caaatgcccc aaaacttgga cccatggag 279
<210> 235
<211> 1329
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 235
atgctaacca atggaaaaga gcaggtgatc aaatcctgtg tctcccttcc agaactgaat 60
gctcaagtct tctgtcatag ttccaacaat gttaccaaaa ccgaatgctg cttcacagat 120
ttttgcaaca acataacact gcaccttcca acagcatcac caaatgcccc aaaacttgga 180
cccatggagc tggccatcat tattactgtg cctgtttgcc tcctgtccat agctgcgatg 240
ctgacagtat gggcatgcca gggtcgacag tgctcctaca ggaagaaaaa gagaccaaat 300
gtggaggaac cactctctga gtgcaatctg gtaaatgctg gaaaaactct gaaagatctg 360
atttatgatg tgaccgcctc tggatctggc tctggtctac ctctgttggt tcaaaggaca 420
attgcaagga cgattgtgct tcaggaaata gtaggaaaag gtagatttgg tgaggtgtgg 480
catggaagat ggtgtgggga agatgtggct gtgaaaatat tctcctccag agatgaaaga 540
tcttggtttc gtgaggcaga aatttaccag acggtcatgc tgcgacatga aaacatcctt 600
ggtttcattg ctgctgacaa caaagataat ggaacttgga ctcaactttg gctggtatct 660
gaatatcatg aacagggctc cttatatgac tatttgaata gaaatatagt gaccgtggct 720
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gtgaaaaagt gtgaaacttg tgccatagcg gacttagggt tggctgtgaa gcatgattca 900
atactgaaca ctatcgacat acctcagaat cctaaagtgg gaaccaagag gtatatggct 960
cctgaaatgc ttgatgatac aatgaatgtg aatatctttg agtccttcaa acgagctgac 1020
atctattctg ttggtctggt ttactgggaa atagcccgga ggtgttcagt cggaggaatt 1080
gttgaggagt accaattgcc ttattatgac atggtgcctt cagatccctc gatagaggaa 1140
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gcccgcctaa ctgctcttcg tattaagaag actatatctc aactttgtgt caaagaagac 1320
tgcaaagcc 1329
<210> 236
<211> 189
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 236
atgctaacca atggaaaaga gcaggtgatc aaatcctgtg tctcccttcc agaactgaat 60
gctcaagtct tctgtcatag ttccaacaat gttaccaaaa ccgaatgctg cttcacagat 120
ttttgcaaca acataacact gcaccttcca acagcatcac caaatgcccc aaaacttgga 180
cccatggag 189
<210> 237
<211> 1239
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 237
atgacccggg cgctctgctc agcgctccgc caggctctcc tgctgctcgc agcggccgcc 60
gagctctcgc caggactgaa gtgtgtatgt cttttgtgtg attcttcaaa ctttacctgc 120
caaacagaag gagcatgttg ggcatcagtc atgctaacca atggaaaaga gcaggtgatc 180
aaatcctgtg tctcccttcc agaactgaat gctcaagtct tctgtcatag ttccaacaat 240
gttaccaaaa ccgaatgctg cttcacagat ttttgcaaca acataacact gcaccttcca 300
acaggtctac ctctgttggt tcaaaggaca attgcaagga cgattgtgct tcaggaaata 360
gtaggaaaag gtagatttgg tgaggtgtgg catggaagat ggtgtgggga agatgtggct 420
gtgaaaatat tctcctccag agatgaaaga tcttggtttc gtgaggcaga aatttaccag 480
acggtcatgc tgcgacatga aaacatcctt ggtttcattg ctgctgacaa caaagataat 540
ggaacttgga ctcaactttg gctggtatct gaatatcatg aacagggctc cttatatgac 600
tatttgaata gaaatatagt gaccgtggct ggaatgatca agctggcgct ctcaattgct 660
agtggtctgg cacaccttca tatggagatt gttggtacac aaggtaaacc tgctattgct 720
catcgagaca taaaatcaaa gaatatctta gtgaaaaagt gtgaaacttg tgccatagcg 780
gacttagggt tggctgtgaa gcatgattca atactgaaca ctatcgacat acctcagaat 840
cctaaagtgg gaaccaagag gtatatggct cctgaaatgc ttgatgatac aatgaatgtg 900
aatatctttg agtccttcaa acgagctgac atctattctg ttggtctggt ttactgggaa 960
atagcccgga ggtgttcagt cggaggaatt gttgaggagt accaattgcc ttattatgac 1020
atggtgcctt cagatccctc gatagaggaa atgagaaagg ttgtttgtga ccagaagttt 1080
cgaccaagta tcccaaacca gtggcaaagt tgtgaagcac tccgagtcat ggggagaata 1140
atgcgtgagt gttggtatgc caacggagcg gcccgcctaa ctgctcttcg tattaagaag 1200
actatatctc aactttgtgt caaagaagac tgcaaagcc 1239
<210> 238
<211> 1179
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 238
gagctctcgc caggactgaa gtgtgtatgt cttttgtgtg attcttcaaa ctttacctgc 60
caaacagaag gagcatgttg ggcatcagtc atgctaacca atggaaaaga gcaggtgatc 120
aaatcctgtg tctcccttcc agaactgaat gctcaagtct tctgtcatag ttccaacaat 180
gttaccaaaa ccgaatgctg cttcacagat ttttgcaaca acataacact gcaccttcca 240
acaggtctac ctctgttggt tcaaaggaca attgcaagga cgattgtgct tcaggaaata 300
gtaggaaaag gtagatttgg tgaggtgtgg catggaagat ggtgtgggga agatgtggct 360
gtgaaaatat tctcctccag agatgaaaga tcttggtttc gtgaggcaga aatttaccag 420
acggtcatgc tgcgacatga aaacatcctt ggtttcattg ctgctgacaa caaagataat 480
ggaacttgga ctcaactttg gctggtatct gaatatcatg aacagggctc cttatatgac 540
tatttgaata gaaatatagt gaccgtggct ggaatgatca agctggcgct ctcaattgct 600
agtggtctgg cacaccttca tatggagatt gttggtacac aaggtaaacc tgctattgct 660
catcgagaca taaaatcaaa gaatatctta gtgaaaaagt gtgaaacttg tgccatagcg 720
gacttagggt tggctgtgaa gcatgattca atactgaaca ctatcgacat acctcagaat 780
cctaaagtgg gaaccaagag gtatatggct cctgaaatgc ttgatgatac aatgaatgtg 840
aatatctttg agtccttcaa acgagctgac atctattctg ttggtctggt ttactgggaa 900
atagcccgga ggtgttcagt cggaggaatt gttgaggagt accaattgcc ttattatgac 960
atggtgcctt cagatccctc gatagaggaa atgagaaagg ttgtttgtga ccagaagttt 1020
cgaccaagta tcccaaacca gtggcaaagt tgtgaagcac tccgagtcat ggggagaata 1080
atgcgtgagt gttggtatgc caacggagcg gcccgcctaa ctgctcttcg tattaagaag 1140
actatatctc aactttgtgt caaagaagac tgcaaagcc 1179
<210> 239
<211> 1011
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 239
atgacccggg cgctctgctc agcgctccgc caggctctcc tgctgctcgc agcggccgcc 60
gagctctcgc caggactgaa gtgtgtatgt cttttgtgtg attcttcaaa ctttacctgc 120
caaacagaag gagcatgttg ggcatcagtc atgctaacca atggaaaaga gcaggtgatc 180
aaatcctgtg tctcccttcc agaactgaat gctcaagtct tctgtcatag ttccaacaat 240
gttaccaaaa ccgaatgctg cttcacagat ttttgcaaca acataacact gcaccttcca 300
acagataatg gaacttggac tcaactttgg ctggtatctg aatatcatga acagggctcc 360
ttatatgact atttgaatag aaatatagtg accgtggctg gaatgatcaa gctggcgctc 420
tcaattgcta gtggtctggc acaccttcat atggagattg ttggtacaca aggtaaacct 480
gctattgctc atcgagacat aaaatcaaag aatatcttag tgaaaaagtg tgaaacttgt 540
gccatagcgg acttagggtt ggctgtgaag catgattcaa tactgaacac tatcgacata 600
cctcagaatc ctaaagtggg aaccaagagg tatatggctc ctgaaatgct tgatgataca 660
atgaatgtga atatctttga gtccttcaaa cgagctgaca tctattctgt tggtctggtt 720
tactgggaaa tagcccggag gtgttcagtc ggaggaattg ttgaggagta ccaattgcct 780
tattatgaca tggtgccttc agatccctcg atagaggaaa tgagaaaggt tgtttgtgac 840
cagaagtttc gaccaagtat cccaaaccag tggcaaagtt gtgaagcact ccgagtcatg 900
gggagaataa tgcgtgagtg ttggtatgcc aacggagcgg cccgcctaac tgctcttcgt 960
attaagaaga ctatatctca actttgtgtc aaagaagact gcaaagccta a 1011
<210> 240
<211> 951
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 240
gagctctcgc caggactgaa gtgtgtatgt cttttgtgtg attcttcaaa ctttacctgc 60
caaacagaag gagcatgttg ggcatcagtc atgctaacca atggaaaaga gcaggtgatc 120
aaatcctgtg tctcccttcc agaactgaat gctcaagtct tctgtcatag ttccaacaat 180
gttaccaaaa ccgaatgctg cttcacagat ttttgcaaca acataacact gcaccttcca 240
acagataatg gaacttggac tcaactttgg ctggtatctg aatatcatga acagggctcc 300
ttatatgact atttgaatag aaatatagtg accgtggctg gaatgatcaa gctggcgctc 360
tcaattgcta gtggtctggc acaccttcat atggagattg ttggtacaca aggtaaacct 420
gctattgctc atcgagacat aaaatcaaag aatatcttag tgaaaaagtg tgaaacttgt 480
gccatagcgg acttagggtt ggctgtgaag catgattcaa tactgaacac tatcgacata 540
cctcagaatc ctaaagtggg aaccaagagg tatatggctc ctgaaatgct tgatgataca 600
atgaatgtga atatctttga gtccttcaaa cgagctgaca tctattctgt tggtctggtt 660
tactgggaaa tagcccggag gtgttcagtc ggaggaattg ttgaggagta ccaattgcct 720
tattatgaca tggtgccttc agatccctcg atagaggaaa tgagaaaggt tgtttgtgac 780
cagaagtttc gaccaagtat cccaaaccag tggcaaagtt gtgaagcact ccgagtcatg 840
gggagaataa tgcgtgagtg ttggtatgcc aacggagcgg cccgcctaac tgctcttcgt 900
attaagaaga ctatatctca actttgtgtc aaagaagact gcaaagccta a 951
<210> 241
<400> 241
000
<210> 242
<400> 242
000
<210> 243
<211> 1065
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 243
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccggcg cctccgggcc ccggggggtc caggctctgc tgtgtgcgtg caccagctgc 120
ctccaggcca actacacgtg tgagacagat ggggcctgca tggtttccat tttcaatctg 180
gatgggatgg agcaccatgt gcgcacctgc atccccaaag tggagctggt ccctgccggg 240
aagcccttct actgcctgag ctcggaggac ctgcgcaaca cccactgctg ctacactgac 300
tactgcaaca ggatcgactt gagggtgccc agtggtcacc tcaaggagcc tgagcacccg 360
tccatgtggg gcccggtgga gaccggtggt ggaactcaca catgcccacc gtgcccagca 420
cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 480
atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 540
gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 600
cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 660
gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 720
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 780
cccccatccc gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 840
ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 900
gacaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctatag cgacctcacc 960
gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1020
ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggt 1065
<210> 244
<400> 244
000
<210> 245
<400> 245
000
<210> 246
<400> 246
000
<210> 247
<211> 356
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 247
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ser Gly Pro Arg Gly Val Gln Ala
20 25 30
Leu Leu Cys Ala Cys Thr Ser Cys Leu Gln Ala Asn Tyr Thr Cys Glu
35 40 45
Thr Asp Gly Ala Cys Met Val Ser Ile Phe Asn Leu Asp Gly Met Glu
50 55 60
His His Val Arg Thr Cys Ile Pro Lys Val Glu Leu Val Pro Ala Gly
65 70 75 80
Lys Pro Phe Tyr Cys Leu Ser Ser Glu Asp Leu Arg Asn Thr His Cys
85 90 95
Cys Tyr Thr Asp Tyr Cys Asn Arg Ile Asp Leu Arg Val Pro Ser Gly
100 105 110
His Leu Lys Glu Pro Glu His Pro Ser Met Trp Gly Pro Val Glu Thr
115 120 125
Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
130 135 140
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
145 150 155 160
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
165 170 175
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
180 185 190
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
195 200 205
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
210 215 220
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
225 230 235 240
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
245 250 255
Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
260 265 270
Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
275 280 285
Glu Trp Glu Ser Arg Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
290 295 300
Pro Val Leu Asp Ser Arg Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr
305 310 315 320
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
325 330 335
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
340 345 350
Ser Pro Gly Lys
355
<210> 248
<211> 1068
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 248
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccggcg cctccgggcc ccggggggtc caggctctgc tgtgtgcgtg caccagctgc 120
ctccaggcca actacacgtg tgagacagat ggggcctgca tggtttccat tttcaatctg 180
gatgggatgg agcaccatgt gcgcacctgc atccccaaag tggagctggt ccctgccggg 240
aagcccttct actgcctgag ctcggaggac ctgcgcaaca cccactgctg ctacactgac 300
tactgcaaca ggatcgactt gagggtgccc agtggtcacc tcaaggagcc tgagcacccg 360
tccatgtggg gcccggtgga gaccggtggt ggaactcaca catgcccacc gtgcccagca 420
cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 480
atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 540
gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 600
cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 660
gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 720
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtgcaccctg 780
cccccatccc gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgtcctgcgc cgtcaaaggc 840
ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagccgcg ggcagccgga gaacaactac 900
aagaccacgc ctcccgtgct ggactcccgc ggctccttct tcctcgtgag caagctcacc 960
gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1020
ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa 1068
<210> 249
<211> 332
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 249
Ser Gly Pro Arg Gly Val Gln Ala Leu Leu Cys Ala Cys Thr Ser Cys
1 5 10 15
Leu Gln Ala Asn Tyr Thr Cys Glu Thr Asp Gly Ala Cys Met Val Ser
20 25 30
Ile Phe Asn Leu Asp Gly Met Glu His His Val Arg Thr Cys Ile Pro
35 40 45
Lys Val Glu Leu Val Pro Ala Gly Lys Pro Phe Tyr Cys Leu Ser Ser
50 55 60
Glu Asp Leu Arg Asn Thr His Cys Cys Tyr Thr Asp Tyr Cys Asn Arg
65 70 75 80
Ile Asp Leu Arg Val Pro Ser Gly His Leu Lys Glu Pro Glu His Pro
85 90 95
Ser Met Trp Gly Pro Val Glu Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
115 120 125
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
130 135 140
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
145 150 155 160
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
165 170 175
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
180 185 190
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
195 200 205
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
210 215 220
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg
225 230 235 240
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly
245 250 255
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Arg Gly Gln Pro
260 265 270
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Arg Gly Ser
275 280 285
Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
290 295 300
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
305 310 315 320
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 250
<211> 996
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 250
tccgggcccc ggggggtcca ggctctgctg tgtgcgtgca ccagctgcct ccaggccaac 60
tacacgtgtg agacagatgg ggcctgcatg gtttccattt tcaatctgga tgggatggag 120
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tgcctgagct cggaggacct gcgcaacacc cactgctgct acactgacta ctgcaacagg 240
atcgacttga gggtgcccag tggtcacctc aaggagcctg agcacccgtc catgtggggc 300
ccggtggaga ccggtggtgg aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 360
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 420
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 480
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 540
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 600
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 660
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt gcaccctgcc cccatcccgg 720
gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg tcctgcgccg tcaaaggctt ctatcccagc 780
gacatcgccg tggagtggga gagccgcggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 840
cccgtgctgg actcccgcgg ctccttcttc ctcgtgagca agctcaccgt ggacaagagc 900
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 960
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 996
<210> 251
<211> 1068
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 251
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccggcg cctccgggcc ccggggggtc caggctctgc tgtgtgcgtg caccagctgc 120
ctccaggcca actacacgtg tgagacagat ggggcctgca tggtttccat tttcaatctg 180
gatgggatgg agcaccatgt gcgcacctgc atccccaaag tggagctggt ccctgccggg 240
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tactgcaaca ggatcgactt gagggtgccc agtggtcacc tcaaggagcc tgagcacccg 360
tccatgtggg gcccggtgga gaccggtggt ggaactcaca catgcccacc gtgcccagca 420
cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 480
atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 540
gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 600
cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 660
gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 720
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtgcaccctg 780
cccccatccc gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgtcctgcgc cgtcaaaggc 840
ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 900
aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctcgtgag caagctcacc 960
gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1020
ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa 1068
<210> 252
<211> 996
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 252
tccgggcccc ggggggtcca ggctctgctg tgtgcgtgca ccagctgcct ccaggccaac 60
tacacgtgtg agacagatgg ggcctgcatg gtttccattt tcaatctgga tgggatggag 120
caccatgtgc gcacctgcat ccccaaagtg gagctggtcc ctgccgggaa gcccttctac 180
tgcctgagct cggaggacct gcgcaacacc cactgctgct acactgacta ctgcaacagg 240
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tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 996
<210> 253
<400> 253
000
<210> 254
<400> 254
000
<210> 255
<211> 1023
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 255
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccggcg ccggactgaa gtgtgtatgt cttttgtgtg attcttcaaa ctttacctgc 120
caaacagaag gagcatgttg ggcatcagtc atgctaacca atggaaaaga gcaggtgatc 180
aaatcctgtg tctcccttcc agaactgaat gctcaagtct tctgtcatag ttccaacaat 240
gttaccaaaa ccgaatgctg cttcacagat ttttgcaaca acataacact gcaccttcca 300
acagcatcac caaatgcccc aaaacttgga cccatggaga ccggtggtgg aactcacaca 360
tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca 420
aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 480
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aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 600
ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 660
aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 720
ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg 780
acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 840
cagccggaga acaactacga caccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 900
ctctatagcg acctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 960
tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1020
ggt 1023
<210> 256
<400> 256
000
<210> 257
<400> 257
000
<210> 258
<400> 258
000
<210> 259
<400> 259
000
<210> 260
<400> 260
000
<210> 261
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 261
Gly Gly Gly
1
<210> 262
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 262
Gly Gly Gly Gly
1
<210> 263
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 263
Thr Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 264
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 264
Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 265
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 265
Thr Gly Gly Gly
1
<210> 266
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 266
Ser Gly Gly Gly
1
<210> 267
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 267
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 268
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 268
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 269
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 269
Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 270
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 270
Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 271
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 271
Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 272
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 272
Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 273
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 273
Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 274
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 274
Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser
35
<210> 275
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 275
Thr Gly Gly Gly Pro Lys Ser Cys Asp Lys
1 5 10
<210> 276
<211> 368
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 276
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr
20 25 30
Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn
35 40 45
Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His
50 55 60
Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys
65 70 75 80
Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Arg Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys
85 90 95
Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly
100 105 110
Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro
115 120 125
Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr
130 135 140
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
145 150 155 160
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
165 170 175
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
180 185 190
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
195 200 205
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
210 215 220
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
225 230 235 240
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
245 250 255
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
260 265 270
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
275 280 285
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
290 295 300
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
305 310 315 320
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
325 330 335
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
340 345 350
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 277
<211> 1107
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 277
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccggcg cctctgggcg tggggaggct gagacacggg agtgcatcta ctacaacgcc 120
aactgggagc tggagcgcac caaccagagc ggcctggagc gctgcgaagg cgagcaggac 180
aagcggctgc actgctacgc ctcctggcgc aacagctctg gcaccatcga gctcgtgaag 240
aagggctgct ggctagatga catccgttgc tacgataggc aggagtgtgt ggccactgag 300
gagaaccccc aggtgtactt ctgctgctgt gaaggcaact tctgcaacga gcgcttcact 360
catttgccag aggctggggg cccggaagtc acgtacgagc cacccccgac agcccccacc 420
ggtggtggaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 480
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 540
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 600
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 660
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 720
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 780
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 840
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 900
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 960
tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1020
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1080
agcctctccc tgtctccggg taaatga 1107
<210> 278
<211> 343
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 278
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser
35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Arg
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr
100 105 110
Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
115 120 125
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
130 135 140
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
145 150 155 160
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
165 170 175
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
180 185 190
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
195 200 205
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
210 215 220
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
225 230 235 240
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
245 250 255
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
260 265 270
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
275 280 285
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
290 295 300
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
305 310 315 320
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
325 330 335
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340
<210> 279
<211> 368
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 279
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr
20 25 30
Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn
35 40 45
Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His
50 55 60
Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys
65 70 75 80
Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Lys Arg Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys
85 90 95
Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly
100 105 110
Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro
115 120 125
Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr
130 135 140
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
145 150 155 160
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
165 170 175
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
180 185 190
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
195 200 205
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
210 215 220
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
225 230 235 240
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
245 250 255
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
260 265 270
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
275 280 285
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
290 295 300
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
305 310 315 320
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
325 330 335
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
340 345 350
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 280
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 280
Gly Gly Gly Ala
1
<210> 281
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 281
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 282
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 282
Gly Gly Gly Gly Ala
1 5
<210> 283
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 283
Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 284
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 284
Gly Gly Ala Gly
1
<210> 285
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 285
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 286
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 286
Ala Gly Gly Gly
1
<210> 287
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 287
Gly Ala Gly Ala
1
<210> 288
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 288
Gly Ser Gly Ser
1
<210> 289
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 289
Gly Ala Gly Ala Gly Ala
1 5
<210> 290
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 290
Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 291
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 291
Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala
1 5
<210> 292
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 292
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 293
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 293
Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala
1 5 10
<210> 294
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 294
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 295
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 295
Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala
1 5 10
<210> 296
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 296
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 297
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 297
Gly Gly Ala Gly Gly Ala
1 5
<210> 298
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 298
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 299
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 299
Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala
1 5
<210> 300
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 300
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 301
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 301
Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala
1 5 10
<210> 302
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 302
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 303
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 303
Gly Gly Ala Gly
1
<210> 304
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 304
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 305
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 305
Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly
1 5
<210> 306
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 306
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 307
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 307
Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly
1 5 10
<210> 308
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 308
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 309
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 309
Gly Gly Gly Gly Ala
1 5
<210> 310
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 310
Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala
1 5 10 15
<210> 311
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 311
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 312
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 312
Gly Gly Gly Ala Gly
1 5
<210> 313
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 313
Gly Gly Gly Ala Gly Gly
1 5
<210> 314
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 314
Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly
1 5
<210> 315
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 315
Ala Ala Ala Leu
1
<210> 316
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 316
Ala Ala Ala Lys
1
<210> 317
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 317
Ala Ala Ala Arg
1
<210> 318
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 318
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr
1 5 10
<210> 319
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 319
Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe
1 5 10
<210> 320
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 320
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala
1 5 10
<210> 321
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 321
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 322
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 322
Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Gly
1 5 10
<210> 323
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 323
Ser Ala Cys Tyr Cys Glu Leu Ser
1 5
<210> 324
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 324
Arg Ser Ile Ala Thr
1 5
<210> 325
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 325
Arg Pro Ala Cys Lys Ile Pro Asn Asp Leu Lys Gln Lys Val Met Asn
1 5 10 15
His
<210> 326
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 326
Gly Gly Ser Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser
1 5 10 15
Gly Ala Ser Gly Thr Gly Thr Ala Gly Gly Thr Gly Ser Gly Ser Gly
20 25 30
Thr Gly Ser Gly
35
<210> 327
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 327
Ala Ala Ala Asn Ser Ser Ile Asp Leu Ile Ser Val Pro Val Asp Ser
1 5 10 15
Arg
<210> 328
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 328
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Ser
35
<210> 329
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 329
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 330
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 330
Pro Ala Pro Ala Pro
1 5
<210> 331
<211> 1107
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 331
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccggcg cctctgggcg tggggaggct gagacacggg agtgcatcta ctacaacgcc 120
aactgggagc tggagcgcac caaccagagc ggcctggagc gctgcgaagg cgagcaggac 180
aagcggctgc actgctacgc ctcctggcgc aacagctctg gcaccatcga gctcgtgaag 240
aagggctgct ggctagatga caagcgttgc tacgataggc aggagtgtgt ggccactgag 300
gagaaccccc aggtgtactt ctgctgctgt gaaggcaact tctgcaacga gcgcttcact 360
catttgccag aggctggggg cccggaagtc acgtacgagc cacccccgac agcccccacc 420
ggtggtggaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 480
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 540
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 600
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 660
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 720
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 780
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 840
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 900
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 960
tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1020
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1080
agcctctccc tgtctccggg taaatga 1107
<210> 332
<211> 343
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 332
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser
35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Lys Arg
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr
100 105 110
Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
115 120 125
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
130 135 140
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
145 150 155 160
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
165 170 175
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
180 185 190
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
195 200 205
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
210 215 220
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
225 230 235 240
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
245 250 255
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
260 265 270
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
275 280 285
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
290 295 300
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
305 310 315 320
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
325 330 335
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340
<210> 333
<211> 368
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 333
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 334
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 336
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<211> 343
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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180 185 190
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
195 200 205
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
210 215 220
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
225 230 235 240
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
245 250 255
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
260 265 270
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
275 280 285
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
290 295 300
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
305 310 315 320
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
325 330 335
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
340 345 350
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 355
<211> 1107
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 355
atggatgcga tgaaacgcgg cctgtgctgc gtgctgctgc tgtgcggcgc ggtgtttgtg 60
agcccgggcg ccagcggccg cggcgaagcg gaaacccgcg aatgcattta ttataacgcg 120
aactgggaac tggaacgcac caaccagagc ggcctggaac gctgcgaagg cgaacaggat 180
aaacgcctgc attgctatgc gagctggcgc aacagcagcg gcaccattga actggtgaaa 240
aaaggctgct ggctggatga ttttaactgc tatgatcgcc aggaatgcgt ggcgaccgaa 300
gaaaacccgc agggctattt ttgctgctgc gaaggcaact tttgcaacga acgctttacc 360
catctgccgg aagcgggcgg cccggaagtg acctatgaac cgccgccgac cgcgccgacc 420
ggtggtggaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 480
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 540
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 600
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 660
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 720
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 780
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 840
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 900
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 960
tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1020
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1080
agcctctccc tgtctccggg taaatga 1107
<210> 356
<211> 343
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 356
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser
35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Gly
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr
100 105 110
Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
115 120 125
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
130 135 140
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
145 150 155 160
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
165 170 175
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
180 185 190
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
195 200 205
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
210 215 220
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
225 230 235 240
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
245 250 255
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
260 265 270
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
275 280 285
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
290 295 300
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
305 310 315 320
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
325 330 335
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340
<210> 357
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 357
Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg
1 5 10 15
Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg
20 25 30
Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu
35 40 45
Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln
50 55 60
Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys
65 70 75 80
Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly
85 90 95
Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr
100 105
<210> 358
<211> 150
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 358
Met Thr Ala Pro Trp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr
20 25 30
Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg
35 40 45
Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Pro
50 55 60
Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp
65 70 75 80
Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn
85 90 95
Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg
100 105 110
Phe Thr His Leu Pro Glu Pro Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu
130 135 140
Pro Ile Gly Gly Leu Ser
145 150
<210> 359
<211> 150
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 359
Met Thr Ala Pro Trp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Val Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr
20 25 30
Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg
35 40 45
Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg
50 55 60
Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp
65 70 75 80
Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn
85 90 95
Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg
100 105 110
Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu
130 135 140
Pro Ile Gly Gly Leu Ser
145 150
<210> 360
<211> 150
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 360
Met Thr Ala Pro Trp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr
20 25 30
Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg
35 40 45
Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg
50 55 60
Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp
65 70 75 80
Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn
85 90 95
Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg
100 105 110
Phe Thr His Leu Pro Glu Pro Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu
130 135 140
Pro Ile Gly Gly Leu Ser
145 150
<210> 361
<211> 150
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 361
Met Thr Ala Pro Trp Val Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr
20 25 30
Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg
35 40 45
Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg
50 55 60
Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp
65 70 75 80
Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn
85 90 95
Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg
100 105 110
Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu
130 135 140
Pro Ile Gly Gly Leu Ser
145 150
<210> 362
<211> 150
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 362
Met Thr Ala Pro Trp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr
20 25 30
Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg
35 40 45
Cys Glu Gly Glu Arg Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg
50 55 60
Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp
65 70 75 80
Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn
85 90 95
Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg
100 105 110
Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu
130 135 140
Pro Val Gly Gly Leu Ser
145 150
<210> 363
<211> 150
<212> PRT
<213> Xenopus sp.
<400> 363
Met Gly Ala Ser Val Ala Leu Thr Phe Leu Leu Leu Leu Ala Thr Phe
1 5 10 15
Arg Ala Gly Ser Gly His Asp Glu Val Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr
20 25 30
Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Lys Thr Asn Gln Ser Gly Val Glu
35 40 45
Arg Leu Val Glu Gly Lys Lys Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Arg Asn Asn Ser Gly Phe Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp
65 70 75 80
Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Ile Ala Lys Glu
85 90 95
Glu Asn Pro Gln Val Phe Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Tyr Cys Asn
100 105 110
Lys Lys Phe Thr His Leu Pro Glu Val Glu Thr Phe Asp Pro Lys Pro
115 120 125
Gln Pro Ser Ala Ser Val Leu Asn Ile Leu Ile Tyr Ser Leu Leu Pro
130 135 140
Ile Val Gly Leu Ser Met
145 150
<210> 364
<211> 150
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 364
Met Gly Ala Ala Ala Lys Leu Ala Phe Ala Val Phe Leu Ile Ser Cys
1 5 10 15
Ser Ser Gly Ala Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe
20 25 30
Phe Asn Ala Asn Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu
35 40 45
Pro Cys Tyr Gly Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp
50 55 60
Lys Asn Ile Ser Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu
65 70 75 80
Asp Asp Ile Asn Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp
85 90 95
Ser Pro Glu Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu
100 105 110
Lys Phe Ser Tyr Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn
115 120 125
Pro Val Thr Pro Lys Pro Pro Tyr Tyr Asn Ile Leu Leu Tyr Ser Leu
130 135 140
Val Pro Leu Met Leu Ile
145 150
<210> 365
<211> 154
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> T, A, or absent
<220>
<221> MOD_RES
<222> (121)..(121)
<223> P, A, V, or M
<400> 365
Met Thr Ala Pro Trp Ala Ala Xaa Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu
1 5 10 15
Cys Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Arg Tyr
20 25 30
Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu
35 40 45
Arg Leu Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Ile His Cys Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Ile Val Lys Lys Gly Cys Trp
65 70 75 80
Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu
85 90 95
Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn
100 105 110
Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Xaa Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr
115 120 125
Glu Pro Lys Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr
130 135 140
Ser Leu Leu Pro Ile Gly Gly Leu Ser Met
145 150
<210> 366
<211> 513
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 366
Met Gly Ala Ala Ala Lys Leu Ala Phe Ala Val Phe Leu Ile Ser Cys
1 5 10 15
Ser Ser Gly Ala Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe
20 25 30
Phe Asn Ala Asn Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu
35 40 45
Pro Cys Tyr Gly Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp
50 55 60
Lys Asn Ile Ser Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu
65 70 75 80
Asp Asp Ile Asn Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp
85 90 95
Ser Pro Glu Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu
100 105 110
Lys Phe Ser Tyr Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn
115 120 125
Pro Val Thr Pro Lys Pro Pro Tyr Tyr Asn Ile Leu Leu Tyr Ser Leu
130 135 140
Val Pro Leu Met Leu Ile Ala Gly Ile Val Ile Cys Ala Phe Trp Val
145 150 155 160
Tyr Arg His His Lys Met Ala Tyr Pro Pro Val Leu Val Pro Thr Gln
165 170 175
Asp Pro Gly Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Leu Gly Leu Lys Pro Leu
180 185 190
Gln Leu Leu Glu Val Lys Ala Arg Gly Arg Phe Gly Cys Val Trp Lys
195 200 205
Ala Gln Leu Leu Asn Glu Tyr Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Ile Gln
210 215 220
Asp Lys Gln Ser Trp Gln Asn Glu Tyr Glu Val Tyr Ser Leu Pro Gly
225 230 235 240
Met Lys His Glu Asn Ile Leu Gln Phe Ile Gly Ala Glu Lys Arg Gly
245 250 255
Thr Ser Val Asp Val Asp Leu Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Glu Lys
260 265 270
Gly Ser Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ala Asn Val Val Ser Trp Asn Glu
275 280 285
Leu Cys His Ile Ala Glu Thr Met Ala Arg Gly Leu Ala Tyr Leu His
290 295 300
Glu Asp Ile Pro Gly Leu Lys Asp Gly His Lys Pro Ala Ile Ser His
305 310 315 320
Arg Asp Ile Lys Ser Lys Asn Val Leu Leu Lys Asn Asn Leu Thr Ala
325 330 335
Cys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Leu Lys Phe Glu Ala Gly Lys Ser
340 345 350
Ala Gly Asp Thr His Gly Gln Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro
355 360 365
Glu Val Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg
370 375 380
Ile Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu Val Leu Trp Glu Leu Ala Ser Arg
385 390 395 400
Cys Thr Ala Ala Asp Gly Pro Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu
405 410 415
Glu Glu Ile Gly Gln His Pro Ser Leu Glu Asp Met Gln Glu Val Val
420 425 430
Val His Lys Lys Lys Arg Pro Val Leu Arg Asp Tyr Trp Gln Lys His
435 440 445
Ala Gly Met Ala Met Leu Cys Glu Thr Ile Glu Glu Cys Trp Asp His
450 455 460
Asp Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala Gly Cys Val Gly Glu Arg Ile Thr
465 470 475 480
Gln Met Gln Arg Leu Thr Asn Ile Ile Thr Thr Glu Asp Ile Val Thr
485 490 495
Val Val Thr Met Val Thr Asn Val Asp Phe Pro Pro Lys Glu Ser Ser
500 505 510
Leu
<210> 367
<211> 115
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 367
Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly
20 25 30
Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser
35 40 45
Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr
85 90 95
Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn Pro Val Thr Pro
100 105 110
Lys Pro Pro
115
<210> 368
<211> 100
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 368
Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly
20 25 30
Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser
35 40 45
Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr
85 90 95
Phe Pro Glu Met
100
<210> 369
<211> 1539
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 369
atgggagctg ctgcaaagtt ggcgtttgcc gtctttctta tctcctgttc ttcaggtgct 60
atacttggta gatcagaaac tcaggagtgt cttttcttta atgctaattg ggaaaaagac 120
agaaccaatc aaactggtgt tgaaccgtgt tatggtgaca aagataaacg gcggcattgt 180
tttgctacct ggaagaatat ttctggttcc attgaaatag tgaaacaagg ttgttggctg 240
gatgatatca actgctatga caggactgat tgtgtagaaa aaaaagacag ccctgaagta 300
tatttttgtt gctgtgaggg caatatgtgt aatgaaaagt tttcttattt tccggagatg 360
gaagtcacac agcccacttc aaatccagtt acacctaagc caccctatta caacatcctg 420
ctctattcct tggtgccact tatgttaatt gcggggattg tcatttgtgc attttgggtg 480
tacaggcatc acaagatggc ctaccctcct gtacttgttc caactcaaga cccaggacca 540
cccccacctt ctccattact aggtttgaaa ccactgcagt tattagaagt gaaagcaagg 600
ggaagatttg gttgtgtctg gaaagcccag ttgcttaacg aatatgtggc tgtcaaaata 660
tttccaatac aggacaaaca gtcatggcaa aatgaatacg aagtctacag tttgcctgga 720
atgaagcatg agaacatatt acagttcatt ggtgcagaaa aacgaggcac cagtgttgat 780
gtggatcttt ggctgatcac agcatttcat gaaaagggtt cactatcaga ctttcttaag 840
gctaatgtgg tctcttggaa tgaactgtgt catattgcag aaaccatggc tagaggattg 900
gcatatttac atgaggatat acctggccta aaagatggcc acaaacctgc catatctcac 960
agggacatca aaagtaaaaa tgtgctgttg aaaaacaacc tgacagcttg cattgctgac 1020
tttgggttgg ccttaaaatt tgaggctggc aagtctgcag gcgataccca tggacaggtt 1080
ggtacccgga ggtacatggc tccagaggta ttagagggtg ctataaactt ccaaagggat 1140
gcatttttga ggatagatat gtatgccatg ggattagtcc tatgggaact ggcttctcgc 1200
tgtactgctg cagatggacc tgtagatgaa tacatgttgc catttgagga ggaaattggc 1260
cagcatccat ctcttgaaga catgcaggaa gttgttgtgc ataaaaaaaa gaggcctgtt 1320
ttaagagatt attggcagaa acatgctgga atggcaatgc tctgtgaaac cattgaagaa 1380
tgttgggatc acgacgcaga agccaggtta tcagctggat gtgtaggtga aagaattacc 1440
cagatgcaga gactaacaaa tattattacc acagaggaca ttgtaacagt ggtcacaatg 1500
gtgacaaatg ttgactttcc tcccaaagaa tctagtcta 1539
<210> 370
<211> 345
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 370
atacttggta gatcagaaac tcaggagtgt cttttcttta atgctaattg ggaaaaagac 60
agaaccaatc aaactggtgt tgaaccgtgt tatggtgaca aagataaacg gcggcattgt 120
tttgctacct ggaagaatat ttctggttcc attgaaatag tgaaacaagg ttgttggctg 180
gatgatatca actgctatga caggactgat tgtgtagaaa aaaaagacag ccctgaagta 240
tatttttgtt gctgtgaggg caatatgtgt aatgaaaagt tttcttattt tccggagatg 300
gaagtcacac agcccacttc aaatccagtt acacctaagc caccc 345
<210> 371
<211> 115
<212> PRT
<213> Ovis aries
<220>
<221> MOD_RES
<222> (45)..(45)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (114)..(114)
<223> Any amino acid
<400> 371
Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Arg Asp Arg Thr Asn Arg Thr Gly Val Glu Ser Cys Tyr Gly
20 25 30
Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Xaa Asn Ile Ser
35 40 45
Gly Ser Ile Asp Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Ile Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Arg Phe Ser Thr
85 90 95
Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn Pro Val Thr Pro
100 105 110
Lys Xaa Pro
115
<210> 372
<211> 115
<212> PRT
<213> Condylura cristata
<220>
<221> MOD_RES
<222> (45)..(45)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (113)..(113)
<223> Any amino acid
<400> 372
Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Arg Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly
20 25 30
Asp Lys Asp Lys His Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Xaa Asn Ile Ser
35 40 45
Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Ile Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Thr
85 90 95
Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn Pro Val Thr Pro
100 105 110
Xaa Ala Pro
115
<210> 373
<211> 115
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MOD_RES
<222> (45)..(45)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (68)..(68)
<223> Any amino acid
<400> 373
Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Arg Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly
20 25 30
Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Xaa Asn Ile Ser
35 40 45
Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Xaa Thr Asp Cys Ile Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Thr
85 90 95
Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn Pro Val Thr Pro
100 105 110
Lys Pro Pro
115
<210> 374
<211> 115
<212> PRT
<213> Gallus gallus
<220>
<221> MOD_RES
<222> (45)..(45)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (113)..(113)
<223> Any amino acid
<400> 374
Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Tyr Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Lys Asp Lys Thr Asn Arg Ser Gly Ile Glu Pro Cys Tyr Gly
20 25 30
Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Xaa Asn Ile Ser
35 40 45
Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Asn Asp Cys Ile Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val
65 70 75 80
Phe Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Arg Phe Phe Thr
85 90 95
Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn Pro Val Thr Pro
100 105 110
Xaa Pro Pro
115
<210> 375
<211> 115
<212> PRT
<213> Bos taurus
<220>
<221> MOD_RES
<222> (45)..(45)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (113)..(113)
<223> Any amino acid
<400> 375
Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Arg Asp Arg Thr Asn Arg Thr Gly Val Glu Ser Cys Tyr Gly
20 25 30
Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Xaa Asn Ile Ser
35 40 45
Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Ile Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Arg Phe Ser Thr
85 90 95
Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn Pro Val Thr Pro
100 105 110
Xaa Pro Pro
115
<210> 376
<211> 115
<212> PRT
<213> Tyto alba
<220>
<221> MOD_RES
<222> (45)..(45)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (113)..(113)
<223> Any amino acid
<400> 376
Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Tyr Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Lys Asp Lys Thr Asn Arg Ser Gly Ile Glu Pro Cys Tyr Gly
20 25 30
Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Xaa Asn Ile Ser
35 40 45
Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Asn Asp Cys Ile Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val
65 70 75 80
Phe Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Arg Phe Phe Thr
85 90 95
Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn Pro Val Thr Pro
100 105 110
Xaa Pro Pro
115
<210> 377
<211> 115
<212> PRT
<213> Myotis davidii
<220>
<221> MOD_RES
<222> (45)..(45)
<223> Any amino acid
<400> 377
Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Arg Asp Lys Thr Asn Arg Thr Gly Val Glu Leu Cys Tyr Gly
20 25 30
Asp Lys Asp Lys His Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Xaa Asn Ile Ser
35 40 45
Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Lys Thr Asp Cys Ile Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Arg Phe Ser Thr
85 90 95
Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn Pro Val Thr Pro
100 105 110
Lys Pro Pro
115
<210> 378
<211> 343
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 378
Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly
20 25 30
Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser
35 40 45
Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr
85 90 95
Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn Pro Val Thr Pro
100 105 110
Lys Pro Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
115 120 125
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
130 135 140
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
145 150 155 160
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
165 170 175
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
180 185 190
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
195 200 205
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
210 215 220
Leu Pro Val Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
225 230 235 240
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
245 250 255
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
260 265 270
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
275 280 285
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
290 295 300
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
305 310 315 320
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
325 330 335
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
340
<210> 379
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 379
Met Gly Ala Ala Ala Lys Leu Ala Phe Ala Val Phe Leu Ile Ser Cys
1 5 10 15
Ser Ser Gly Ala
20
<210> 380
<211> 344
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 380
Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly
20 25 30
Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser
35 40 45
Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr
85 90 95
Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn Pro Val Thr Pro
100 105 110
Lys Pro Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
115 120 125
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
130 135 140
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
145 150 155 160
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
165 170 175
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
180 185 190
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
195 200 205
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
210 215 220
Leu Pro Val Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
225 230 235 240
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
245 250 255
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
260 265 270
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
275 280 285
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
290 295 300
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
305 310 315 320
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
325 330 335
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340
<210> 381
<211> 369
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 381
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ala Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr
20 25 30
Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn
35 40 45
Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly Asp Lys Asp Lys Arg Arg His
50 55 60
Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys
65 70 75 80
Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys
85 90 95
Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly
100 105 110
Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr Phe Pro Glu Met Glu Val Thr
115 120 125
Gln Pro Thr Ser Asn Pro Val Thr Pro Lys Pro Pro Thr Gly Gly Gly
130 135 140
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
145 150 155 160
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
165 170 175
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
180 185 190
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
195 200 205
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
210 215 220
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
225 230 235 240
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile Glu Lys
245 250 255
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
260 265 270
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
275 280 285
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
290 295 300
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
305 310 315 320
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
325 330 335
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
340 345 350
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
355 360 365
Lys
<210> 382
<211> 1114
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 382
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccggcg ccgctatact tggtagatca gaaactcagg agtgtctttt tttaatgcta 120
attgggaaaa agacagaacc aatcaaactg gtgttgaacc gtgttatggt gacaaagata 180
aacggcggca ttgttttgct acctggaaga atatttctgg ttccattgaa tagtgaaaca 240
aggttgttgg ctggatgata tcaactgcta tgacaggact gattgtgtag aaaaaaaaga 300
cagccctgaa gtatatttct gttgctgtga gggcaatatg tgtaatgaaa agttttctta 360
ttttccggag atggaagtca cacagcccac ttcaaatcca gttacaccta agccacccac 420
cggtggtgga actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc 480
agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt 540
cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt 600
ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac 660
gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta 720
caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agtccccatc gagaaaacca tctccaaagc 780
caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac 840
caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt 900
ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga 960
ctccgacggc tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca 1020
ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa 1080
gagcctctcc ctgtctccgg gtaaatgaga attc 1114
<210> 383
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 383
Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu
1 5
<210> 384
<211> 329
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 384
Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly
20 25 30
Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser
35 40 45
Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr
85 90 95
Phe Pro Glu Met Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Val Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 385
<211> 342
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 385
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser
35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr
100 105 110
Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
115 120 125
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
130 135 140
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
145 150 155 160
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
165 170 175
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
180 185 190
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
195 200 205
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
210 215 220
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
225 230 235 240
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
245 250 255
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
260 265 270
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
275 280 285
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
290 295 300
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
305 310 315 320
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
325 330 335
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
340
<210> 386
<211> 100
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 386
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser
35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala
100
<210> 387
<211> 512
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 387
Met Thr Ala Pro Trp Val Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr
20 25 30
Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg
35 40 45
Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Ala
50 55 60
Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp
65 70 75 80
Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn
85 90 95
Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg
100 105 110
Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu
130 135 140
Pro Ile Gly Gly Leu Ser Leu Ile Val Leu Leu Ala Phe Trp Met Tyr
145 150 155 160
Arg His Arg Lys Pro Pro Tyr Gly His Val Asp Ile His Glu Asp Pro
165 170 175
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Val Gly Leu Lys Pro Leu Gln Leu
180 185 190
Leu Glu Ile Lys Ala Arg Gly Arg Phe Gly Cys Val Trp Lys Ala Gln
195 200 205
Leu Met Asn Asp Phe Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Leu Gln Asp Lys
210 215 220
Gln Ser Trp Gln Ser Glu Arg Glu Ile Phe Ser Thr Pro Gly Met Lys
225 230 235 240
His Glu Asn Leu Leu Gln Phe Ile Ala Ala Glu Lys Arg Gly Ser Asn
245 250 255
Leu Glu Val Glu Leu Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Asp Lys Gly Ser
260 265 270
Leu Thr Asp Tyr Leu Lys Gly Asn Ile Ile Thr Trp Asn Glu Leu Cys
275 280 285
His Val Ala Glu Thr Met Ser Arg Gly Leu Ser Tyr Leu His Glu Asp
290 295 300
Val Pro Trp Cys Arg Gly Glu Gly His Lys Pro Ser Ile Ala His Arg
305 310 315 320
Asp Phe Lys Ser Lys Asn Val Leu Leu Lys Ser Asp Leu Thr Ala Val
325 330 335
Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala Val Arg Phe Glu Pro Gly Lys Pro Pro
340 345 350
Gly Asp Thr His Gly Gln Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro Glu
355 360 365
Val Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg Ile
370 375 380
Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu Val Leu Trp Glu Leu Val Ser Arg Cys
385 390 395 400
Lys Ala Ala Asp Gly Pro Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu Glu
405 410 415
Glu Ile Gly Gln His Pro Ser Leu Glu Glu Leu Gln Glu Val Val Val
420 425 430
His Lys Lys Met Arg Pro Thr Ile Lys Asp His Trp Leu Lys His Pro
435 440 445
Gly Leu Ala Gln Leu Cys Val Thr Ile Glu Glu Cys Trp Asp His Asp
450 455 460
Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala Gly Cys Val Glu Glu Arg Val Ser Leu
465 470 475 480
Ile Arg Arg Ser Val Asn Gly Thr Thr Ser Asp Cys Leu Val Ser Leu
485 490 495
Val Thr Ser Val Thr Asn Val Asp Leu Pro Pro Lys Glu Ser Ser Ile
500 505 510
<210> 388
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 388
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Ala Asn Ser Ser
35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr
100 105 110
Ala Pro Thr
115
<210> 389
<211> 100
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 389
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Ala Asn Ser Ser
35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala
100
<210> 390
<211> 344
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 390
Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys
20 25 30
Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr
35 40 45
Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser
50 55 60
Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile
65 70 75 80
Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu
85 90 95
Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn
100 105 110
Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys
115 120 125
Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala
130 135 140
Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr
145 150 155 160
Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser
165 170 175
Ser Thr Cys Val Val Asp Gln Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys
180 185 190
Asn Arg Ile Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gln Tyr Leu Cys Gly
195 200 205
Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr
210 215 220
Cys Leu Leu Gly Arg Ser Ile Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys Ile
225 230 235 240
Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys
245 250 255
Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu
260 265 270
Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn
275 280 285
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290 295 300
Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser Ile Ser
305 310 315 320
Glu Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gln Asp Tyr Ser Phe
325 330 335
Pro Ile Ser Ser Ile Leu Glu Trp
340
<210> 391
<211> 317
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 391
Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys
20 25 30
Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr
35 40 45
Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser
50 55 60
Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile
65 70 75 80
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Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn
100 105 110
Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys
115 120 125
Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala
130 135 140
Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr
145 150 155 160
Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser
165 170 175
Ser Thr Cys Val Val Asp Gln Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys
180 185 190
Asn Arg Ile Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gln Tyr Leu Cys Gly
195 200 205
Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr
210 215 220
Cys Leu Leu Gly Arg Ser Ile Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys Ile
225 230 235 240
Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys
245 250 255
Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu
260 265 270
Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn
275 280 285
Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser
290 295 300
Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn
305 310 315
<210> 392
<211> 63
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 392
Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu
1 5 10 15
Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu
20 25 30
Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys
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<211> 25
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 393
Glu Thr Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met
1 5 10 15
Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val
20 25
<210> 394
<211> 26
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 394
Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser Ser Thr Cys Val Val
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20 25
<210> 395
<400> 395
000
<210> 396
<211> 368
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 396
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr
20 25 30
Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn
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Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys
65 70 75 80
Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys
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Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly
100 105 110
Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro
115 120 125
Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr
130 135 140
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
145 150 155 160
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
165 170 175
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
180 185 190
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
195 200 205
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
210 215 220
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
225 230 235 240
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
245 250 255
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
260 265 270
Pro Pro Ser Arg Lys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
275 280 285
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
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Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys
305 310 315 320
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Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
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Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 397
<211> 1104
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 397
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccggcg cctctgggcg tggggaggct gagacacggg agtgcatcta ctacaacgcc 120
aactgggagc tggagcgcac caaccagagc ggcctggagc gctgcgaagg cgagcaggac 180
aagcggctgc actgctacgc ctcctggcgc aacagctctg gcaccatcga gctcgtgaag 240
aagggctgct ggctagatga cttcaactgc tacgataggc aggagtgtgt ggccactgag 300
gagaaccccc aggtgtactt ctgctgctgt gaaggcaact tctgcaacga gcgcttcact 360
catttgccag aggctggggg cccggaagtc acgtacgagc cacccccgac agcccccacc 420
ggtggtggaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 480
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 540
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 600
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 660
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 720
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 780
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggaa ggagatgacc 840
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 900
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctgaag 960
tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1020
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1080
agcctctccc tgtctccggg taaa 1104
<210> 398
<211> 343
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 398
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser
35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr
100 105 110
Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
115 120 125
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
130 135 140
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
145 150 155 160
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
165 170 175
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
180 185 190
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
195 200 205
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
210 215 220
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
225 230 235 240
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Lys Glu Met Thr Lys
245 250 255
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
260 265 270
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
275 280 285
Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
290 295 300
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
305 310 315 320
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
325 330 335
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340
<210> 399
<400> 399
000
<210> 400
<400> 400
000
<210> 401
<400> 401
000
<210> 402
<211> 368
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 402
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr
20 25 30
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35 40 45
Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His
50 55 60
Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys
65 70 75 80
Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys
85 90 95
Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly
100 105 110
Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro
115 120 125
Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr
130 135 140
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
145 150 155 160
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
165 170 175
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
180 185 190
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
195 200 205
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
210 215 220
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
225 230 235 240
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
245 250 255
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
260 265 270
Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
275 280 285
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
290 295 300
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
305 310 315 320
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
325 330 335
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
340 345 350
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 403
<211> 343
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 403
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser
35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
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100 105 110
Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
115 120 125
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
130 135 140
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
145 150 155 160
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
165 170 175
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
180 185 190
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
195 200 205
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
210 215 220
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
305 310 315 320
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
325 330 335
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340
<210> 404
<400> 404
000
<210> 405
<400> 405
000
<210> 406
<211> 367
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 406
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr
130 135 140
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
145 150 155 160
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
165 170 175
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
180 185 190
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
195 200 205
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
210 215 220
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
225 230 235 240
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
245 250 255
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
260 265 270
Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Glu Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
275 280 285
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
290 295 300
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
305 310 315 320
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
325 330 335
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
340 345 350
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Asp Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
355 360 365
<210> 407
<211> 1101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 407
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccggcg cctctgggcg tggggaggct gagacacggg agtgcatcta ctacaacgcc 120
aactgggagc tggagcgcac caaccagagc ggcctggagc gctgcgaagg cgagcaggac 180
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gagaaccccc aggtgtactt ctgctgctgt gaaggcaact tctgcaacga gcgcttcact 360
catttgccag aggctggggg cccggaagtc acgtacgagc cacccccgac agcccccacc 420
ggtggtggaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 480
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 540
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 600
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 660
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 720
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 780
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catgccggga ggagatgacc 840
gagaaccagg tcagcctgtg gtgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 900
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tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1020
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcaggac 1080
agcctctccc tgtctccggg t 1101
<210> 408
<211> 342
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 408
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
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Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser
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130 135 140
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
145 150 155 160
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
165 170 175
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
180 185 190
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
195 200 205
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
210 215 220
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
225 230 235 240
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Glu
245 250 255
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
260 265 270
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
275 280 285
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
290 295 300
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
305 310 315 320
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Asp Ser
325 330 335
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
340
<210> 409
<211> 1026
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 409
gggcgtgggg aggctgagac acgggagtgc atctactaca acgccaactg ggagctggag 60
cgcaccaacc agagcggcct ggagcgctgc gaaggcgagc aggacaagcg gctgcactgc 120
tacgcctcct ggcgcaacag ctctggcacc atcgagctcg tgaagaaggg ctgctggcta 180
gatgacttca actgctacga taggcaggag tgtgtggcca ctgaggagaa cccccaggtg 240
tacttctgct gctgtgaagg caacttctgc aacgagcgct tcactcattt gccagaggct 300
gggggcccgg aagtcacgta cgagccaccc ccgacagccc ccaccggtgg tggaactcac 360
acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 420
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 480
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 540
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 600
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 660
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 720
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatgc cgggaggaga tgaccgagaa ccaggtcagc 780
ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 840
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 900
ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 960
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc aggacagcct ctccctgtct 1020
ccgggt 1026
<210> 410
<400> 410
000
<210> 411
<400> 411
000
<210> 412
<400> 412
000
<210> 413
<400> 413
000
<210> 414
<211> 103
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 414
Ser Gly Pro Arg Gly Val Gln Ala Leu Leu Cys Ala Cys Thr Ser Cys
1 5 10 15
Leu Gln Ala Asn Tyr Thr Cys Glu Thr Asp Gly Ala Cys Met Val Ser
20 25 30
Ile Phe Asn Leu Asp Gly Met Glu His His Val Arg Thr Cys Ile Pro
35 40 45
Lys Val Glu Leu Val Pro Ala Gly Lys Pro Phe Tyr Cys Leu Ser Ser
50 55 60
Glu Asp Leu Arg Asn Thr His Cys Cys Tyr Thr Asp Tyr Cys Asn Arg
65 70 75 80
Ile Asp Leu Arg Val Pro Ser Gly His Leu Lys Glu Pro Glu His Pro
85 90 95
Ser Met Trp Gly Pro Val Glu
100
<210> 415
<211> 103
<212> PRT
<213> Condylura cristata
<400> 415
Ser Gly Pro Arg Gly Ile Gln Ala Leu Leu Cys Ala Cys Thr Ser Cys
1 5 10 15
Leu Gln Ala Asn Leu Thr Cys Glu Thr Asp Gly Ala Cys Met Val Ser
20 25 30
Ile Phe Asn Leu Asp Gly Leu Glu His His Val Arg Thr Cys Ile Pro
35 40 45
Lys Val Glu Leu Val Pro Ala Gly Lys Pro Phe Tyr Cys Leu Ser Ser
50 55 60
Glu Asp Leu Arg Asn Thr His Cys Cys Tyr Thr Asp Phe Cys Asn Lys
65 70 75 80
Ile Asp Leu Arg Val Pro Ser Gly His Val Lys Glu Pro Glu Arg Pro
85 90 95
Ser Val Trp Gly Pro Val Glu
100
<210> 416
<211> 103
<212> PRT
<213> Erinaceus europaeus
<400> 416
Ser Gly Pro Arg Gly Ile Gln Ala Leu Leu Cys Ala Cys Thr Ser Cys
1 5 10 15
Leu Gln Thr Asn Tyr Thr Cys Glu Thr Asp Gly Ala Cys Met Val Ser
20 25 30
Ile Phe Asn Leu Asp Gly Met Glu His His Val Arg Thr Cys Ile Pro
35 40 45
Lys Val Glu Leu Val Pro Ala Gly Lys Pro Phe Tyr Cys Leu Ser Ser
50 55 60
Glu Asp Leu Arg Asn Thr His Cys Cys Tyr Thr Asp Phe Cys Asn Lys
65 70 75 80
Ile Asp Leu Arg Val Pro Ser Gly His Pro Lys Glu Ser Glu Gln Ala
85 90 95
Ser Met Trp Gly Pro Val Glu
100
<210> 417
<211> 102
<212> PRT
<213> Gallus gallus
<400> 417
Ala Pro Gly Gly Ala Arg Ala Leu Thr Cys Leu Cys Ser Asp Cys Lys
1 5 10 15
Gln Ala Asn Ser Thr Cys Glu Thr Asp Gly Ala Cys Met Val Ser Val
20 25 30
Phe Asn Leu Asp Gly Val Lys His His Val Arg Thr Cys Ile Pro Glu
35 40 45
Ala Lys Leu Ile Pro Ala Gly Lys Pro Phe Tyr Cys Leu Ser Ser Glu
50 55 60
Asp Leu Arg Asn Thr His Cys Cys Tyr Ser Asp Phe Cys Asn Lys Ile
65 70 75 80
Asp Leu Met Val Pro Ser Gly His Leu Lys Asp Asn Glu Pro Pro Ser
85 90 95
Ser Trp Gly Pro Val Glu
100
<210> 418
<211> 103
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 418
Ser Gly Pro Arg Gly Ile Gln Ala Leu Leu Cys Ala Cys Thr Ser Cys
1 5 10 15
Leu Gln Thr Asn Tyr Thr Cys Glu Thr Asp Gly Ala Cys Met Val Ser
20 25 30
Ile Phe Asn Leu Asp Gly Val Glu His His Val Arg Thr Cys Ile Pro
35 40 45
Lys Val Glu Leu Val Pro Ala Gly Lys Pro Phe Tyr Cys Leu Ser Ser
50 55 60
Glu Asp Leu Arg Asn Thr His Cys Cys Tyr Ile Asp Phe Cys Asn Lys
65 70 75 80
Ile Asp Leu Arg Val Pro Ser Gly His Leu Lys Glu Pro Ala His Pro
85 90 95
Ser Met Trp Gly Pro Val Glu
100
<210> 419
<211> 103
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 419
Ser Gly Pro Arg Gly Ile Gln Ala Leu Leu Cys Ala Cys Thr Ser Cys
1 5 10 15
Leu Gln Ala Asn Tyr Thr Cys Glu Thr Asp Gly Ala Cys Met Val Ser
20 25 30
Ile Phe Asn Leu Asp Gly Met Glu His His Val Arg Thr Cys Ile Pro
35 40 45
Lys Val Glu Leu Val Pro Ala Gly Lys Pro Phe Tyr Cys Leu Ser Ser
50 55 60
Glu Asp Leu Arg Asn Thr His Cys Cys Tyr Thr Asp Phe Cys Asn Lys
65 70 75 80
Ile Asp Leu Arg Val Pro Ser Gly His Leu Lys Glu Pro Glu His Pro
85 90 95
Ser Met Trp Gly Pro Val Glu
100
<210> 420
<211> 103
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
Vertebrate ALK4 protein sequence
<400> 420
Ser Gly Pro Arg Gly Ile Gln Ala Leu Leu Cys Ala Cys Thr Ser Cys
1 5 10 15
Leu Gln Thr Asn Tyr Thr Cys Glu Thr Asp Gly Ala Cys Met Val Ser
20 25 30
Ile Phe Asn Leu Asp Gly Met Glu His His Val Arg Thr Cys Ile Pro
35 40 45
Lys Val Glu Leu Val Pro Ala Gly Lys Pro Phe Tyr Cys Leu Ser Ser
50 55 60
Glu Asp Leu Arg Asn Thr His Cys Cys Tyr Ile Asp Phe Cys Asn Lys
65 70 75 80
Ile Asp Leu Arg Val Pro Ser Gly His Leu Lys Glu Pro Glu His Pro
85 90 95
Ser Met Trp Gly Pro Val Glu
100
<210> 421
<211> 453
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 421
Met Val Ser Ile Phe Asn Leu Asp Gly Met Glu His His Val Arg Thr
1 5 10 15
Cys Ile Pro Lys Val Glu Leu Val Pro Ala Gly Lys Pro Phe Tyr Cys
20 25 30
Leu Ser Ser Glu Asp Leu Arg Asn Thr His Cys Cys Tyr Thr Asp Tyr
35 40 45
Cys Asn Arg Ile Asp Leu Arg Val Pro Ser Gly His Leu Lys Glu Pro
50 55 60
Glu His Pro Ser Met Trp Gly Pro Val Glu Leu Val Gly Ile Ile Ala
65 70 75 80
Gly Pro Val Phe Leu Leu Phe Leu Ile Ile Ile Ile Val Phe Leu Val
85 90 95
Ile Asn Tyr His Gln Arg Val Tyr His Asn Arg Gln Arg Leu Asp Met
100 105 110
Glu Asp Pro Ser Cys Glu Met Cys Leu Ser Lys Asp Lys Thr Leu Gln
115 120 125
Asp Leu Val Tyr Asp Leu Ser Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu Pro
130 135 140
Leu Phe Val Gln Arg Thr Val Ala Arg Thr Ile Val Leu Gln Glu Ile
145 150 155 160
Ile Gly Lys Gly Arg Phe Gly Glu Val Trp Arg Gly Arg Trp Arg Gly
165 170 175
Gly Asp Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser Arg Glu Glu Arg Ser Trp
180 185 190
Phe Arg Glu Ala Glu Ile Tyr Gln Thr Val Met Leu Arg His Glu Asn
195 200 205
Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Asn Lys Asp Asn Gly Thr Trp Thr
210 215 220
Gln Leu Trp Leu Val Ser Asp Tyr His Glu His Gly Ser Leu Phe Asp
225 230 235 240
Tyr Leu Asn Arg Tyr Thr Val Thr Ile Glu Gly Met Ile Lys Leu Ala
245 250 255
Leu Ser Ala Ala Ser Gly Leu Ala His Leu His Met Glu Ile Val Gly
260 265 270
Thr Gln Gly Lys Pro Gly Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Ser Lys Asn
275 280 285
Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Met Cys Ala Ile Ala Asp Leu Gly Leu
290 295 300
Ala Val Arg His Asp Ala Val Thr Asp Thr Ile Asp Ile Ala Pro Asn
305 310 315 320
Gln Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Asp Glu
325 330 335
Thr Ile Asn Met Lys His Phe Asp Ser Phe Lys Cys Ala Asp Ile Tyr
340 345 350
Ala Leu Gly Leu Val Tyr Trp Glu Ile Ala Arg Arg Cys Asn Ser Gly
355 360 365
Gly Val His Glu Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Tyr Asp Leu Val Pro Ser
370 375 380
Asp Pro Ser Ile Glu Glu Met Arg Lys Val Val Cys Asp Gln Lys Leu
385 390 395 400
Arg Pro Asn Ile Pro Asn Trp Trp Gln Ser Tyr Glu Ala Leu Arg Val
405 410 415
Met Gly Lys Met Met Arg Glu Cys Trp Tyr Ala Asn Gly Ala Ala Arg
420 425 430
Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Ser Gln Leu Ser Val Gln
435 440 445
Glu Asp Val Lys Ile
450
<210> 422
<211> 74
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 422
Met Val Ser Ile Phe Asn Leu Asp Gly Met Glu His His Val Arg Thr
1 5 10 15
Cys Ile Pro Lys Val Glu Leu Val Pro Ala Gly Lys Pro Phe Tyr Cys
20 25 30
Leu Ser Ser Glu Asp Leu Arg Asn Thr His Cys Cys Tyr Thr Asp Tyr
35 40 45
Cys Asn Arg Ile Asp Leu Arg Val Pro Ser Gly His Leu Lys Glu Pro
50 55 60
Glu His Pro Ser Met Trp Gly Pro Val Glu
65 70
<210> 423
<211> 1362
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 423
atggtttcca ttttcaatct ggatgggatg gagcaccatg tgcgcacctg catccccaaa 60
gtggagctgg tccctgccgg gaagcccttc tactgcctga gctcggagga cctgcgcaac 120
acccactgct gctacactga ctactgcaac aggatcgact tgagggtgcc cagtggtcac 180
ctcaaggagc ctgagcaccc gtccatgtgg ggcccggtgg agctggtagg catcatcgcc 240
ggcccggtgt tcctcctgtt cctcatcatc atcattgttt tccttgtcat taactatcat 300
cagcgtgtct atcacaaccg ccagagactg gacatggaag atccctcatg tgagatgtgt 360
ctctccaaag acaagacgct ccaggatctt gtctacgatc tctccacctc agggtctggc 420
tcagggttac ccctctttgt ccagcgcaca gtggcccgaa ccatcgtttt acaagagatt 480
attggcaagg gtcggtttgg ggaagtatgg cggggccgct ggaggggtgg tgatgtggct 540
gtgaaaatat tctcttctcg tgaagaacgg tcttggttca gggaagcaga gatataccag 600
acggtcatgc tgcgccatga aaacatcctt ggatttattg ctgctgacaa taaagataat 660
ggcacctgga cacagctgtg gcttgtttct gactatcatg agcacgggtc cctgtttgat 720
tatctgaacc ggtacacagt gacaattgag gggatgatta agctggcctt gtctgctgct 780
agtgggctgg cacacctgca catggagatc gtgggcaccc aagggaagcc tggaattgct 840
catcgagact taaagtcaaa gaacattctg gtgaagaaaa atggcatgtg tgccatagca 900
gacctgggcc tggctgtccg tcatgatgca gtcactgaca ccattgacat tgccccgaat 960
cagagggtgg ggaccaaacg atacatggcc cctgaagtac ttgatgaaac cattaatatg 1020
aaacactttg actcctttaa atgtgctgat atttatgccc tcgggcttgt atattgggag 1080
attgctcgaa gatgcaattc tggaggagtc catgaagaat atcagctgcc atattacgac 1140
ttagtgccct ctgacccttc cattgaggaa atgcgaaagg ttgtatgtga tcagaagctg 1200
cgtcccaaca tccccaactg gtggcagagt tatgaggcac tgcgggtgat ggggaagatg 1260
atgcgagagt gttggtatgc caacggcgca gcccgcctga cggccctgcg catcaagaag 1320
accctctccc agctcagcgt gcaggaagac gtgaagatct aa 1362
<210> 424
<211> 230
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 424
atggtttcca ttttcaatct ggatgggatg gagcaccatg tgcgcacctg catccccaaa 60
gtggagctgg tccctgccgg gaagcccttc tactgcctga gctcggagga cctgcgcaac 120
acccactgct gctacactga ctactgcaac aggatcgact tgagggtgcc cagtggtcac 180
ctcaaggagc ctgagcaccc gtccatgtgg ggcccggtgg agctggtagg 230
<210> 425
<211> 93
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 425
Glu Leu Ser Pro Gly Leu Lys Cys Val Cys Leu Leu Cys Asp Ser Ser
1 5 10 15
Asn Phe Thr Cys Gln Thr Glu Gly Ala Cys Trp Ala Ser Val Met Leu
20 25 30
Thr Asn Gly Lys Glu Gln Val Ile Lys Ser Cys Val Ser Leu Pro Glu
35 40 45
Leu Asn Ala Gln Val Phe Cys His Ser Ser Asn Asn Val Thr Lys Thr
50 55 60
Glu Cys Cys Phe Thr Asp Phe Cys Asn Asn Ile Thr Leu His Leu Pro
65 70 75 80
Thr Ala Ser Pro Asn Ala Pro Lys Leu Gly Pro Met Glu
85 90
<210> 426
<211> 93
<212> PRT
<213> Pan troglodytes
<400> 426
Glu Leu Ser Ala Gly Leu Lys Cys Val Cys Leu Leu Cys Asp Ser Ser
1 5 10 15
Asn Phe Thr Cys Gln Thr Glu Gly Ala Cys Trp Ala Ser Val Met Leu
20 25 30
Thr Asn Gly Lys Glu Gln Val Ile Lys Ser Cys Val Ser Leu Pro Glu
35 40 45
Leu Asn Ala Gln Val Phe Cys His Ser Ser Asn Asn Val Thr Lys Thr
50 55 60
Glu Cys Cys Phe Thr Asp Phe Cys Asn Asn Ile Thr Leu His Leu Pro
65 70 75 80
Thr Ala Ser Pro Asn Ala Pro Lys Leu Gly Pro Met Glu
85 90
<210> 427
<211> 93
<212> PRT
<213> Carlito sp.
<400> 427
Glu Leu Ser Ala Gly Leu Lys Cys Val Cys Leu Leu Cys Asp Ser Ser
1 5 10 15
Asn Phe Thr Cys Gln Thr Glu Gly Ala Cys Trp Ala Ser Val Met Arg
20 25 30
Thr Asn Gly Lys Glu Gln Val Ile Lys Ser Cys Val Ser Leu Pro Glu
35 40 45
Leu Asn Ala Gln Val Phe Cys His Ser Ser Asn Asn Val Thr Lys Thr
50 55 60
Glu Cys Cys Phe Thr Asp Phe Cys Asn Asn Ile Thr Leu His Leu Pro
65 70 75 80
Thr Ala Ser Pro Asn Ala Pro Lys Leu Gly Pro Met Glu
85 90
<210> 428
<211> 93
<212> PRT
<213> Callithrix jacchus
<400> 428
Glu Leu Ser Ala Gly Leu Lys Cys Val Cys Leu Leu Cys Asp Ser Ser
1 5 10 15
Asn Phe Thr Cys Gln Thr Glu Gly Ala Cys Trp Ala Ser Val Met Leu
20 25 30
Thr Asn Gly Lys Glu Gln Val Ile Lys Ser Cys Val Ser Leu Pro Glu
35 40 45
Leu Asn Ala Gln Val Phe Cys His Ser Ser Asn Asn Ile Thr Lys Thr
50 55 60
Glu Cys Cys Phe Thr Asp Phe Cys Asn Asn Ile Thr Leu His Leu Pro
65 70 75 80
Thr Ala Ser Pro Asn Ala Pro Lys Leu Gly Pro Met Glu
85 90
<210> 429
<211> 93
<212> PRT
<213> Tarsius syrichta
<400> 429
Glu Leu Thr Ala Gly Leu Lys Cys Val Cys Leu Leu Cys Asp Ser Ser
1 5 10 15
Asn Phe Thr Cys Gln Thr Glu Gly Ala Cys Trp Ala Ser Val Met Leu
20 25 30
Thr Asn Gly Lys Glu Gln Val Ile Lys Ser Cys Val Ser Leu Pro Glu
35 40 45
Leu Asn Ala Gln Val Phe Cys His Ser Ser Asn Asn Val Thr Lys Thr
50 55 60
Glu Cys Cys Phe Thr Asp Phe Cys Asn Asn Ile Thr Leu His Leu Pro
65 70 75 80
Thr Val Ser Pro Ser Ala Pro Arg Leu Gly Pro Met Glu
85 90
<210> 430
<211> 93
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
Squirrel sequence
<400> 430
Glu Leu Ser Ala Gly Leu Lys Cys Val Cys Leu Leu Cys Asp Ser Ser
1 5 10 15
Asn Phe Thr Cys Gln Thr Glu Gly Ala Cys Trp Ala Ser Val Met Leu
20 25 30
Thr Asn Gly Lys Glu Gln Val Ile Lys Ser Cys Val Ser Leu Pro Glu
35 40 45
Leu Asn Ala Gln Val Phe Cys His Ser Ser Asn Asn Val Thr Lys Thr
50 55 60
Glu Cys Cys Phe Thr Asp Phe Cys Asn Asn Ile Thr Leu His Leu Pro
65 70 75 80
Thr Val Ser Pro Asn Ala Pro Arg Leu Gly Pro Met Glu
85 90
<210> 431
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
6xHis tag
<400> 431
His His His His His His
1 5
<210> 432
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments
<400> 432
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 433
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments
<400> 433
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 434
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments
<400> 434
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 435
<211> 1539
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 435
atgacggcgc cctgggtggc cctcgccctc ctctggggat cgctgtgcgc cggctctggg 60
cgtggggagg ctgagacacg ggagtgcatc tactacaacg ccaactggga gctggagcgc 120
accaaccaga gcggcctgga gcgctgcgaa ggcgagcagg acaagcggct gcactgctac 180
gcctcctggc gcaacagctc tggcaccatc gagctcgtga agaagggctg ctggctagat 240
gacttcaact gctacgatag gcaggagtgt gtggccactg aggagaaccc ccaggtgtac 300
ttctgctgct gtgaaggcaa cttctgcaac gaacgcttca ctcatttgcc agaggctggg 360
ggcccggaag tcacgtacga gccacccccg acagccccca ccctgctcac ggtgctggcc 420
tactcactgc tgcccatcgg gggcctttcc ctcatcgtcc tgctggcctt ttggatgtac 480
cggcatcgca agccccccta cggtcatgtg gacatccatg aggaccctgg gcctccacca 540
ccatcccctc tggtgggcct gaagccactg cagctgctgg agatcaaggc tcgggggcgc 600
tttggctgtg tctggaaggc ccagctcatg aatgactttg tagctgtcaa gatcttccca 660
ctccaggaca agcagtcgtg gcagagtgaa cgggagatct tcagcacacc tggcatgaag 720
cacgagaacc tgctacagtt cattgctgcc gagaagcgag gctccaacct cgaagtagag 780
ctgtggctca tcacggcctt ccatgacaag ggctccctca cggattacct caaggggaac 840
atcatcacat ggaacgaact gtgtcatgta gcagagacga tgtcacgagg cctctcatac 900
ctgcatgagg atgtgccctg gtgccgtggc gagggccaca agccgtctat tgcccacagg 960
gactttaaaa gtaagaatgt attgctgaag agcgacctca cagccgtgct ggctgacttt 1020
ggcttggctg ttcgatttga gccagggaaa cctccagggg acacccacgg acaggtaggc 1080
acgagacggt acatggctcc tgaggtgctc gagggagcca tcaacttcca gagagatgcc 1140
ttcctgcgca ttgacatgta tgccatgggg ttggtgctgt gggagcttgt gtctcgctgc 1200
aaggctgcag acggacccgt ggatgagtac atgctgccct ttgaggaaga gattggccag 1260
cacccttcgt tggaggagct gcaggaggtg gtggtgcaca agaagatgag gcccaccatt 1320
aaagatcact ggttgaaaca cccgggcctg gcccagcttt gtgtgaccat cgaggagtgc 1380
tgggaccatg atgcagaggc tcgcttgtcc gcgggctgtg tggaggagcg ggtgtccctg 1440
attcggaggt cggtcaacgg cactacctcg gactgtctcg tttccctggt gacctctgtc 1500
accaatgtgg acctgccccc taaagagtca agcatctaa 1539
<210> 436
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Any amino acid
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(10)
<223> This sequence may encompass 1-5 "Xaa Pro"
repeating units
<400> 436
Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro
1 5 10
<210> 437
<211> 115
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MOD_RES
<222> (45)..(45)
<223> Any amino acid
<400> 437
Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gln Val Glu Pro Cys Tyr Gly
20 25 30
Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Xaa Asn Ile Ser
35 40 45
Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Thr
85 90 95
Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn Pro Val Thr Pro
100 105 110
Lys Pro Pro
115
Claims (51)
- 노화와 연관된 심부전의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII-ALK4 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 노화와 연관된 심부전을 치료하는 방법.
- 제1항에 있어서, 심부전이 보존된 박출 계수 연관 심부전 (HFpEF)인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 환자가 좌심실 (LV) 비대를 갖는 것인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에서 LV 비대를 감소시키는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에서 심실 이완을 증가시키고 충만 압력을 감소시키는 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 환자의 초기 확장기 경승모판 혈류속도 대 초기 확장기 승모판 환상 조직 속도의 비 (E/e' 비)가 유사한 연령 및 성별의 건강한 사람과 비교하여 증가된 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 확장기 기능장애를 갖는 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 환자의 확장기 기능장애를 개선시키는 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 건강한 환자와 비교하여 상승된 뇌 나트륨이뇨 펩티드 (BNP) 수준을 갖는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 환자에서 BNP 수준을 감소시키는 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, ActRII-ALK4 길항제가 ActRIIA 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
- 제11항에 있어서, ActRIIA 폴리펩티드가 서열식별번호: 366의 아미노산 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 중 어느 하나에서 시작하여 서열식별번호: 366의 아미노산 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 또는 135 중 어느 하나에서 종결되는 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제11항에 있어서, ActRIIA 폴리펩티드가 서열식별번호: 367의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제11항에 있어서, ActRIIA 폴리펩티드가 서열식별번호: 368의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, ActRIIA 폴리펩티드가 ActRIIA 폴리펩티드 도메인 및 1개 이상의 이종 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드인 방법.
- 제15항에 있어서, 융합 폴리펩티드가 ActRIIA-Fc 융합 폴리펩티드인 방법.
- 제15항 또는 제16항에 있어서, 융합 폴리펩티드가 ActRIIA 폴리펩티드 도메인과 i) 1개 이상의 이종 도메인 또는 ii) Fc 도메인 사이에 위치한 링커 도메인을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제17항에 있어서, 링커 도메인이 TGGG (서열식별번호: 265), TGGGG (서열식별번호: 263), SGGGG (서열식별번호: 264), GGGGS (서열식별번호: 267), GGG (서열식별번호: 261), GGGG (서열식별번호: 262) 및 SGGG (서열식별번호: 266)로부터 선택된 것인 방법.
- 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 서열식별번호: 380의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 서열식별번호: 380의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 서열식별번호: 378의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제16항 내지 제18항 및 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 서열식별번호: 378의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, ActRII-ALK4 길항제가 이종다량체 폴리펩티드인 방법.
- 제23항에 있어서, 이종다량체 폴리펩티드가 ActRIIB 폴리펩티드 및 ALK4 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
- 제23항에 있어서, 이종다량체 폴리펩티드가 ActRIIB 폴리펩티드 및 ALK7 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
- 제24항에 있어서, ALK4 폴리펩티드가 서열식별번호: 84, 85, 86, 87, 88, 89, 92, 93, 247, 249, 421 및 422로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제25항에 있어서, ALK7 폴리펩티드가 서열식별번호: 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 133 및 134로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제24항 또는 제26항에 있어서, ALK4 폴리펩티드가 ALK4 폴리펩티드 도메인 및 1개 이상의 이종 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드인 방법.
- 제25항 또는 제27항에 있어서, ALK7 폴리펩티드가 ALK7 폴리펩티드 도메인 및 1개 이상의 이종 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드인 방법.
- 제28항에 있어서, 융합 폴리펩티드가 ALK4-Fc 융합 폴리펩티드인 방법.
- 제29항에 있어서, 융합 폴리펩티드가 ALK7-Fc 융합 폴리펩티드인 방법.
- 제30항에 있어서, ALK4-Fc 융합 폴리펩티드가 ALK4 폴리펩티드 도메인과 i) 1개 이상의 이종 도메인 또는 ii) Fc 도메인 사이에 위치한 링커 도메인을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제31항에 있어서, ALK7-Fc 융합 폴리펩티드가 ALK7 폴리펩티드 도메인과 i) 1개 이상의 이종 도메인 또는 ii) Fc 도메인 사이에 위치한 링커 도메인을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제32항 또는 제33항에 있어서, 링커 도메인이 TGGG (서열식별번호: 265), TGGGG (서열식별번호: 263), SGGGG (서열식별번호: 264), GGGGS (서열식별번호: 267), GGG (서열식별번호: 261), GGGG (서열식별번호: 262) 및 SGGG (서열식별번호: 266)로부터 선택된 것인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, ActRII-ALK4 길항제가 ActRIIB 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
- 제23항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, ActRII-ALK4 이종다량체가 ActRIIB 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
- 제35항 또는 제36항에 있어서, ActRIIB 폴리펩티드가 서열식별번호: 2의 아미노산 잔기 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 또는 29 중 어느 하나에서 시작하여 서열식별번호: 2의 아미노산 잔기 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 또는 134 중 어느 하나에서 종결되는 아미노산 서열과 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제35항 또는 제36항에 있어서, ActRIIB 폴리펩티드가 서열식별번호: 2의 아미노산 29-109와 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제35항 또는 제36항에 있어서, ActRIIB 폴리펩티드가 서열식별번호: 2의 아미노산 25-131과 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제35항 또는 제36항에 있어서, ActRIIB 폴리펩티드가 서열식별번호: 2의 아미노산 20-134와 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제35항 또는 제36항에 있어서, ActRIIB 폴리펩티드가 서열식별번호: 53의 아미노산 서열과 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제35항 또는 제36항에 있어서, ActRIIB 폴리펩티드가 서열식별번호: 388의 아미노산 서열과 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제35항 또는 제36항에 있어서, ActRIIB 폴리펩티드가 서열식별번호: 389의 아미노산 서열과 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제35항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, ActRIIB 폴리펩티드가 ActRIIB 폴리펩티드 도메인 및 1개 이상의 이종 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드인 방법.
- 제44항에 있어서, 융합 폴리펩티드가 ActRIIB-Fc 융합 폴리펩티드인 방법.
- 제44항 또는 제45항에 있어서, 융합 폴리펩티드가 ActRIIB 폴리펩티드 도메인과 1개 이상의 이종 도메인 또는 Fc 도메인 사이에 위치한 링커 도메인을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제46항에 있어서, 링커 도메인이 TGGG (서열식별번호: 265), TGGGG (서열식별번호: 263), SGGGG (서열식별번호: 264), GGGGS (서열식별번호: 267), GGG (서열식별번호: 261), GGGG (서열식별번호: 262) 및 SGGG (서열식별번호: 266)로부터 선택된 것인 방법.
- 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 폴리펩티드가 서열식별번호: 5의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 폴리펩티드가 서열식별번호: 12의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제35항 및 제37항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, ActRIIB 폴리펩티드가 서열식별번호: 2의 아미노산 서열과 관련하여 A24N, S26T, N35E, E37A, E37D, L38N, R40A, R40K, S44T, L46V, L46I, L46F, L46A, E50K, E50P, E50L, E52A, E52D, E52G, E52H, E52K, E52N, E52P, E52R, E52S, E52T, E52Y, Q53R, Q53K, Q53N, Q53H, D54A, K55A, K55D, K55E, K55R, R56A, L57E, L57I, L57R, L57T, L57V, Y60D, Y60F, Y60K, Y60P, R64A, R64H, R64K, R64N, N65A, S67N, S67T, G68R, K74A, K74E, K74F, K74I, K74R, K74Y, W78A, W78Y, L79A, L79D, L79E, L79F, L79H, L79K, L79P, L79R, L79S, L79T, L79W, D80A, D80F, D80G, D80I, D80K, D80M, D80N, D80R, F82A, F82D, F82E, F82I, F82K, F82L, F82S, F82T, F82W, F82Y, N83A, N83R, T93D, T93E, T93G, T93H, T93K, T93P, T93R, T93S, T93Y, E94K, Q98D, Q98E, Q98K, Q98R, V99E, V99G, V99K, E105N, F108I, F108L, F108V, F108Y, E111D, E111H, E111K, 111N, E111Q, E111R, R112H, R112K, R112N, R112S, R112T, A119P, A119V, G120N, E123N, P129N, P129S, P130A, P130R, 및 A132N으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
- 제35항 및 제37항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, ActRIIB 폴리펩티드가 서열식별번호: 2의 아미노산 서열과 관련하여 L38N, E50L, E52D, E52N, E52Y, L57E, L57I, L57R, L57T, L57V, Y60D, G68R, K74E, W78Y, L79E, L79F, L79H, L79R, L79S, L79T, L79W, F82D, F82E, F82I, F82K, F82L, F82S, F82T, F82Y, N83R, E94K, 및 V99G로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
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