CN117295757A - ActRII-ALK4拮抗剂和治疗心力衰竭的方法 - Google Patents

ActRII-ALK4拮抗剂和治疗心力衰竭的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117295757A
CN117295757A CN202280034549.5A CN202280034549A CN117295757A CN 117295757 A CN117295757 A CN 117295757A CN 202280034549 A CN202280034549 A CN 202280034549A CN 117295757 A CN117295757 A CN 117295757A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
seq
acid sequence
actriib
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280034549.5A
Other languages
English (en)
Inventor
R·N·V·S·苏拉加尼
J·李
P·安德烈
R·库马尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Acceleron Pharma Inc
Original Assignee
Acceleron Pharma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Acceleron Pharma Inc filed Critical Acceleron Pharma Inc
Priority claimed from PCT/US2022/019570 external-priority patent/WO2022192411A1/en
Publication of CN117295757A publication Critical patent/CN117295757A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Abstract

在一些方面，本公开涉及ActRII‑ALK4拮抗剂和使用ActRII‑ALK4拮抗剂来治疗、预防或降低心力衰竭(HF)的进展速率和/或严重程度，特别是治疗、预防或降低一种或多种HF相关并存病的进展速率和/或严重程度的方法。本公开还提供了使用ActRII‑ALK4拮抗剂来治疗、预防或降低与各种状况相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，所述状况包括但不限于与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭。

Description

ActRII-ALK4拮抗剂和治疗心力衰竭的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年3月10日提交的美国临时申请号63/159,051，以及于2021年7月29日提交的美国临时申请号63/227,149的优先权利益。前述申请的说明书通过引用以其整体并入本文。
背景技术
超重(例如肥胖)是世界范围的一个日益严重的问题，并且是心血管疾病的主要危险因素。相比之下，糖尿病影响全世界超过1.8亿人，并且患者数目预料到2025年将增加到3亿(Mozaffarian，D.等人，Circulation，2015，131:e29-322)。在这个不断升级的医疗保健问题内，肥胖相关的2型糖尿病占所有诊断出的成人糖尿病的90-95％(Mozaffarian，D.等人，Circulation，2015，131:e29-322)。
来自过去20年的流行病学和临床数据已导致以下认知：除心肌梗塞和其它动脉粥样硬化相关的心血管事件之外，心力衰竭也是糖尿病患者中的心血管发病率和死亡率的一个主要贡献因素。2型糖尿病(diabetes mellitus)(即，糖尿病(diabetes))的患病率在过去十年内在全球增加了30％，其中受累数目从2005年的3.33亿增加到2015年的4.35亿。截至2015年，3030万美国人(美国人口的9.4％)患有糖尿病。心力衰竭(HF)影响全世界至少2600万人，并且患病率日益增加。仅在美国，估计有650万成人患有HF。
糖尿病和心力衰竭经常同时发生，并且每种疾病独立地增加另一种疾病的风险。在HF队列包括射血分数降低型HF(HFrEF)和射血分数保留型HF(HFpEF)两者中，糖尿病的患病率范围为10％至47％。糖尿病的患病率在因HF住院治疗的患者中较高，具有>40％的一些报告。在糖尿病患者中，HF的患病率为9％至22％，这是一般人群的4倍，并且患病率在≥60岁的糖尿病患者中甚至更高。
因此，存在关于用于治疗与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的有效疗法的高度的、未满足的需要。相应地，本公开的一个目的是提供用于治疗、预防或降低心力衰竭的进展速率和/或严重程度，特别是治疗、预防或降低一种或多种心力衰竭相关并存病的进展速率和/或严重程度的方法。
发明内容
如本文证实的，ActRII-ALK4拮抗剂有效治疗心力衰竭。特别地，ActRIIB-ALK4异二聚体蛋白证实了在糖尿病性心肌病的鼠模型中的心脏保护效应，所述鼠模型是一种转基因瘦素受体缺陷小鼠模型，称为db/db。除了典型的糖尿病表型例如高血糖之外，db/db小鼠还呈现肥厚性心肌病的独特表型(例如，射血分数保留型心力衰竭(HFpEF)的表型)，包括独特的LV舒张功能障碍。例如，本文呈现的数据显示了，用ActRIIB-ALK4异二聚体的治疗对与这种心力衰竭模型相关的并发症包括但不限于舒张功能具有积极作用。虽然不希望受任何特定机制束缚，但预计ActRIIB-ALK4异二聚体对心力衰竭的作用主要通过拮抗性配体信号传导引起，如通过与ActRIIB-ALK4异二聚体蛋白结合的一种或多种配体介导的，所述配体包括但不限于激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6和/或BMP10(在本文中被称为“ActRII-ALK4配体(ActRII-ALK4 ligands)”或“ActRII-ALK4配体(ActRII-ALK4 ligand)”)。无论机制如何，根据本文呈现的数据显而易见的是，ActRIIB-ALK4异二聚体在改善与心力衰竭相关的各种并发症方面具有显著的积极作用，并且进一步提示了其它ActRII-ALK4拮抗剂也可能可用于治疗与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭。
如本文公开的，术语“ActRII-ALK4拮抗剂”指可以用于抑制通过一种或多种ActRII-ALK4配体的信号传导的各种药剂，包括例如抑制一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6和/或BMP10)的拮抗剂；抑制一种或多种ActRII-ALK4配体相关受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4和ALK7)的拮抗剂；以及抑制一种或多种下游信号传导组分(例如Smad蛋白，如Smads 2和3)的拮抗剂。待按照本公开的方法和用途使用的ActRII-ALK4拮抗剂包括各种形式，例如ActRII-ALK4配体陷阱(例如，可溶性ActRIIA多肽或ActRIIB多肽，包括其变体以及异多聚体和同多聚体)、ActRII-ALK4抗体拮抗剂(例如，抑制激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10、ActRIIB、ActRIIA、ALK4和/或ALK7中的一种或多种的抗体)、小分子拮抗剂(例如，抑制激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10、ActRIIB、ActRIIA、ALK4和/或ALK7中的一种或多种的小分子)和核苷酸拮抗剂(例如，抑制激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10、ActRIIB、ActRIIA、ALK4和/或ALK7中的一种或多种的核苷酸序列)。
在某些方面，本公开提供了包含可溶性ActRIIB、ActRIIA、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽的ActRII-ALK4拮抗剂，以在与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭相关的任何过程中，拮抗一般的ActRII-ALK4配体的信号传导。本公开的ActRII-ALK4拮抗剂可以拮抗ActRII-ALK4的一种或多种配体，例如激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6或BMP10，并且因此可能可用于治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭、或者心力衰竭的一种或多种并存病(例如，贫血、心绞痛、动脉高血压、关节炎、心房颤动、恶病质、癌症、认知功能障碍、冠状动脉疾病(CAD)、勃起功能障碍、痛风、高胆固醇血症、高钾血症、高钾血症、高脂血症、高血压、铁缺乏症、肾功能障碍、代谢综合征、身体失能(physical deconditioning)、钾紊乱、肺疾病(例如，哮喘、COPD)、肌少症、睡眠呼吸暂停、睡眠障碍和心脏瓣膜病(例如，主动脉狭窄、主动脉瓣反流、二尖瓣反流、三尖瓣反流))的进展速率和/或严重程度。
在某些方面，待按照本文公开的方法和用途(例如，治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭、或者心力衰竭的一种或多种并发症的进展速率和/或严重程度)使用的ActRII-ALK4拮抗剂是ActRII-ALK4配体捕获多肽拮抗剂，包括其变体以及其异二聚体和异多聚体，ActRII-ALK4抗体拮抗剂，ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂。ActRII-ALK4配体捕获多肽包括TGF-β超家族相关蛋白，包括其变体，其能够结合一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)。因此，ActRII-ALK4配体陷阱一般包括能够拮抗一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)的多肽。如本文所用，术语“ActRII”指II型激活素受体家族。该家族包括激活素受体IIA型(ActRIIA)和激活素受体IIB型(ActRIIB)。在一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂包含ActRII-ALK4配体陷阱。在一些实施方案中，ActRII-ALK4配体陷阱包含ActRIIB多肽，包括其变体，以及同多聚体(例如，ActRIIB同二聚体)和异多聚体(例如，ActRIIB-ALK4或ActRIIB-ALK7异二聚体)。在一些实施方案中，ActRII-ALK4配体陷阱包含ActRIIA多肽，包括其变体，以及同多聚体(例如，ActRIIA同二聚体)和异多聚体(例如，ActRIIA-ALK4或ActRIIA-ALK7异二聚体)。在其它实施方案中，ActRII-ALK配体陷阱包含可溶性配体捕获蛋白，包括但不限于卵泡抑素多肽以及其变体。在一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂包含ActRII-ALK4抗体拮抗剂。在一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂包含ActRII-ALK4小分子拮抗剂。在一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂包含ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂。
部分地，本公开提供了治疗与糖尿病性心肌病相关的心力衰竭的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂。本公开还提供了治疗、预防或降低与糖尿病性心肌病相关的心力衰竭的一种或多种并存病的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂。
部分地，本公开提供了治疗与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂。本公开还提供了治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的一种或多种并存病的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂。
在本公开的一些实施方案中，患者是肥胖的。在一些实施方案中，患者患有糖尿病。在一些实施方案中，患者患有1型糖尿病。在一些实施方案中，患者患有2型糖尿病。在一些实施方案中，患者患有由心力衰竭引起的糖尿病。在一些实施方案中，患者患有由糖尿病引起的心力衰竭。在一些实施方案中，患者患有糖尿病性心肌病。在一些实施方案中，患者患有高血糖。在一些实施方案中，患者具有胰岛素抵抗。在一些实施方案中，患者患有高胰岛素血症。在一些实施方案中，患者患有高血糖、胰岛素抵抗和高胰岛素血症中的一种或多种。在一些实施方案中，患者具有心脏胰岛素抵抗。
在本公开的一些实施方案中，患者患有代谢病症，其增加线粒体功能障碍、氧化性应激、晚期糖基化终产物(AGE)、线粒体Ca2+处理受损、炎症、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的激活、自主神经病变、内质网应激、心肌细胞死亡和微血管功能障碍中的一种或多种。
在一些实施方案中，本公开的方法改善患者的高血糖、胰岛素抵抗和高胰岛素血症中的一种或多种。在一些实施方案中，方法改善患者的心脏胰岛素抵抗
在一些实施方案中，本公开的方法改善患者的线粒体功能障碍、氧化性应激、晚期糖基化终产物(AGE)、线粒体Ca2+处理受损、炎症、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的激活、自主神经病变、内质网应激、心肌细胞死亡和微血管功能障碍中的一种或多种。
在本公开的一些实施方案中，患者患有选自以下的代谢并发症：心肌甘油三酯沉积、细胞外体积增加、由于胰岛素抵抗的高胰岛素血症、微循环损伤、AGE沉积、减少葡萄糖转运蛋白4型(GLUT4)募集到质膜和葡萄糖摄取的胰岛素代谢信号传导受损、降低肌质网Ca2+泵活性、增加心肌细胞细胞内Ca2+、异常胰岛素代谢信号传导、减少胰岛素刺激的冠状内皮一氧化氮(NO)合酶(eNOS)活性和NO产生、增加心肌细胞细胞内Ca2+/Ca2+致敏、降低肌浆Ca2+摄取、NO生物利用度的降低、高血糖、胰岛素抵抗和氧化性应激。
在一些实施方案中，本公开的方法改善选自以下的促成心血管结构重塑的一种或多种代谢并发症：改善心肌甘油三酯沉积、减少细胞外体积、减少由于胰岛素抵抗的高胰岛素血症、减少微循环损伤、减少AGE沉积、改善减少GLUT4募集到质膜和葡萄糖摄取的胰岛素代谢信号传导的受损、增加肌质网Ca2+泵活性、减少心肌细胞细胞内Ca2+、改善异常胰岛素代谢信号传导、增加胰岛素刺激的冠状内皮NO合酶(eNOS)活性和NO产生、减少心肌细胞细胞内Ca2+/Ca2+致敏、增加肌浆Ca2+摄取、NO生物利用度的增加、改善高血糖、改善胰岛素抵抗和改善氧化性应激。
在本公开的一些实施方案中，心力衰竭是射血分数保留型心力衰竭(HFpEF)。在一些实施方案中，患者具有≥50％的左心室射血分数(LVEF)。在一些实施方案中，患者具有正常的收缩功能。
在本公开的一些实施方案中，患者患有呼吸困难。在一些实施方案中，本公开的方法减少呼吸困难。
在本公开的一些实施方案中，患者具有选自血管内膜厚度增加、血管硬度增加、左心室(LV)肥厚增加和左心房扩大增加的心血管结构重塑。在一些实施方案中，本公开的方法改善了患者中选自血管内膜厚度增加、血管硬度增加、LV肥厚增加和左心房扩大增加的心血管结构重塑。
在本公开的一些实施方案中，患者患有LV肥厚。在一些实施方案中，本公开的方法减少患者中的LV肥厚。在一些实施方案中，方法减少患者中的LV肥厚，其中所述患者的左心室肥厚减少了至少1％(例如，1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或至少50％)。
在一些实施方案中，本公开的方法减少患者中的心脏充盈压。在一些实施方案中，方法改善患者中的舒张早期心脏充盈。
在本公开的一些实施方案中，患者患有左心房扩大。在一些实施方案中，本公开的方法减少患者中的心房扩大。在一些实施方案中，方法减少患者中的左心房扩大，其中所述患者的左心房扩大减少了至少1％(例如，1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或至少50％)。
在一些实施方案中，本公开的方法减少患者中的血管内膜厚度。
在一些实施方案中，本公开的方法减少患者中的血管硬度。
在本公开的一些实施方案中，患者具有在心脏中选自LV肥厚、心肌细胞大小增加、心肌细胞损失和LV舒张末期容积减少的心室结构变化。
在一些实施方案中，本公开的方法改善了患者的心脏中选自LV肥厚、心肌细胞大小增加、心肌细胞损失和LV舒张末期容积减少的心室结构变化。在一些实施方案中，方法减少患者中的心肌细胞大小。在一些实施方案中，方法预防患者中的心肌细胞损失恶化。在一些实施方案中，方法增加患者中的LV舒张末期容积。
在本公开的一些实施方案中，患者具有在心脏中选自左心房肥厚、心律失常、心房扩张、主动脉根部扩张和心房颤动的心房结构变化。在一些实施方案中，本公开的方法改善了患者的心脏中选自左心房肥厚、心律失常、心房扩张、主动脉根部扩张和心房颤动的心房结构变化。
在本公开的一些实施方案中，患者具有在心脏中选自心脏舒张功能变化、心脏收缩功能变化和心脏电功能变化的功能变化。在一些实施方案中，本公开的方法改善了患者的心脏中选自心脏舒张功能变化、心脏收缩功能变化和心脏电功能变化的功能变化。
在一些实施方案中，患者具有舒张功能的变化。在一些实施方案中，患者患有舒张功能障碍。在一些实施方案中，本公开的方法改善了患者中的舒张功能障碍。在一些实施方案中，患者具有减少的心室舒张和增加的充盈压。在一些实施方案中，方法增加患者中的心室舒张并减少充盈压。在一些实施方案中，通过舒张早期跨二尖瓣血流速度/二尖瓣环组织舒张早期速度的比值(E/e')来测量患者中的舒张功能障碍。在一些实施方案中，与相似年龄和性别的健康人相比，患者的E/e’比值增加。在一些实施方案中，患者的E/e’比值小于8。在一些实施方案中，患者的E/e’比值为8至15。在一些实施方案中，患者的E/e’比值大于15。在一些实施方案中，本公开的方法减少患者的E/e’比值，其中所述患者的E/e’比值减少了至少5(例如，至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％)。在一些实施方案中，患者的E/e’比值减少了至少1(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、35、40、45或50)。在一些实施方案中，方法将患者的E/e’比值减少到低于8。
在一些实施方案中，患者具有舒张功能障碍等级正常。在一些实施方案中，相对于相似年龄和性别的健康人，患者的正常等级的舒张功能障碍包含1至2的舒张早期跨二尖瓣血流速度/舒张晚期跨二尖瓣血流速度的比值(E/A)、<8的E/e'、正常左心房容积指数(LAVI)和<160ms的减速时间(DT)。在一些实施方案中，患者具有舒张功能障碍等级1。在一些实施方案中，相对于相似年龄和性别的健康人，患者的1级舒张功能障碍包含由于舒张受损而<1的E/A比值、<8的E/e'、正常或增加的LAVI和增加的减速时间。在一些实施方案中，患者具有舒张功能障碍等级2。在一些实施方案中，相对于相似年龄和性别的健康人，患者的2级舒张功能障碍包含1至2的E/A、8至15的E/e’、增加的LAVI和减少的减速时间。在一些实施方案中，患者具有舒张功能障碍等级3。在一些实施方案中，相对于相似年龄和性别的健康人，患者的3级舒张功能障碍包含E/A>2、大于15的E/e'、增加的LAVI、以及由于严重降低的LV顺应性和高LV充盈压而非常短的E减速时间(<140ms)。
在一些实施方案中，本公开的方法改善了患者的舒张功能障碍等级。在一些实施方案中，方法将患者的舒张功能障碍等级从3级改善到2级。在一些实施方案中，方法将患者的舒张功能障碍等级从3级改善到1级。在一些实施方案中，方法将患者的舒张功能障碍等级从3级改善到正常。在一些实施方案中，方法将患者的舒张功能障碍等级从2级改善到1级。在一些实施方案中，方法将患者的舒张功能障碍等级从2级改善到正常。在一些实施方案中，方法将患者的舒张功能障碍等级从1级改善到正常。
在一些实施方案中，本公开的方法增加患者的LV舒张功能(例如，至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％)。
在本公开的一些实施方案中，患者具有至少50％(例如，50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％)的射血分数。
在本公开的一些实施方案中，使用心电图评价患者的电功能变化。在一些实施方案中，患者的心电图测量中的变化选自P波持续时间、P-R间期和Q-T间期、以及T波电压的增加和QRS轴的左移。在一些实施方案中，本公开的方法改善了患者的心电图测量，其选自P波持续时间的减少、P-R间期的减少、Q-T间期的减少、T波电压的增加、以及QRS轴移动到正常位置。
在本公开的一些实施方案中，使用负荷舒张测试评价患者的舒张功能障碍。在一些实施方案中，舒张期负荷测试在固定至导管台的自行车上执行。在一些实施方案中，使用超声心动图执行舒张期负荷测试。在一些实施方案中，患者具有异常舒张期负荷测试，其参数选自静息状态下间隔e'速度<7cm/s或侧壁e'速度<10cm/s，运动状态下平均E/e'>14或间隔E/e’比值>15，运动状态下三尖瓣反流(TR)峰值速度>2.8m/s和>34mL/m2的左心房容积指数(LAVI)。在一些实施方案中，本公开的方法将患者的静息状态下间隔e'速度增加到>7cm/s或将侧壁e'速度增加到>10cm/s，将运动状态下平均E/e'减少到低于14或将间隔E/e’比值减少到低于15，将运动状态下三尖瓣反流(TR)峰值速度减少到<2.8m/s，并且将左心房容积指数(LAVI)减少到<34mL/m2。
在一些实施方案中，本公开的方法减少患者的H2FPEF评分(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9分)。在一些实施方案中，使用右心导管插入术评价患者的心力衰竭。在一些实施方案中，患者具有静息状态下≥15mmHg的肺毛细血管楔压(PCWP)和/或运动状态下≥25mmHg的PCWP。在一些实施方案中，本公开的方法将患者的静息状态下PCWP减少到至少低于15mmHg，和/或将运动状态下PCWP减少到至少低于25mmHg。
在本公开的一些实施方案中，患者具有≥5分的欧洲心力衰竭协会(EuropeanHeart Failure Association)(EHFA)评分。在一些实施方案中，≥5分的EHFA评分指示HFpEF。在一些实施方案中，患者具有2至4分的EHFA评分。在一些实施方案中，2至4分的EHFA评分指示患者患有HFpEF。在一些实施方案中，患者具有1分或更低的EHFA评分。在一些实施方案中，1或更低的EHFA评分指示患者并不患有HFpEF。
在本公开的一些实施方案中，患者具有关于HFpEF的一种或多种主要功能性EHFA标准。在一些实施方案中，主要功能标准选自静息状态下间隔e'速度<7cm/s、侧壁e'速度<10cm/s，运动状态下平均E/e'>14或间隔E/e’比值>15，以及运动状态下TR速度>2.8m/s。在一些实施方案中，本公开的方法改善了选自以下的一种或多种主要功能标准：将间隔e'速度增加到>7cm/s、将静息状态下侧壁e'速度增加到>10cm/s、将运动状态下E/e'减少到<14或将间隔E/e’比值减少到<15，并且将运动状态下TR速度减少到<2.8m/s。
在本公开的一些实施方案中，患者具有关于HFpEF的一种或多种主要形态学EHFA标准。在一些实施方案中，主要形态学标准选自LAVI>34mL/m2、以及对于男性LVMI≥149g/m2和对于女性≥122g/m2、以及RWT>0.42。在一些实施方案中，本公开的方法改善了选自以下的一种或多种主要形态学标准：将LAVI减少到<34mL/m2，并且将LVMI对于男性减少到<149g/m2且对于女性减少到<122g/m2，并且将RWT减少到<0.42。
在本公开的一些实施方案中，患者具有关于HFpEF的一种或多种主要生物标记物EHFA标准。在一些实施方案中，主要生物标记物标准是窦性心律，具有NT-proBNP>220pg/mL和/或BNP>80pg/mL。在一些实施方案中，主要生物标记物标准是心房颤动，具有NT-proBNP>660pg/mL和/或BNP>240pg/mL。在一些实施方案中，方法改善窦性心律，其包括将NT-proBNP减少到<220pg/mL和/或将BNP减少到<80pg/mL。在一些实施方案中，本公开的方法改善了心房颤动，其包括将NT-proBNP减少到<660pg/mL和/或将BNP减少到<240pg/mL。
在本公开的一些实施方案中，患者具有关于HFpEF的一种或多种次要EHFA标准。在一些实施方案中，患者具有关于HFpEF的一种或多种次要功能性EHFA标准。在一些实施方案中，次要功能标准选自平均E/e'9-14和GLS<16％。在一些实施方案中，本公开的方法改善了次要功能标准，其包括将E/e'减少到8或更低并且将GLS增加到>16％。
在本公开的一些实施方案中，患者具有关于HFpEF的一种或多种次要形态学EHFA标准。在一些实施方案中，次要形态学标准选自LAVI 29-34mL/m2、关于男性的LVMI>115g/m2、关于女性95g/m2的LVMI、RWT>0.42和LV壁厚度≥12mm。在一些实施方案中，本公开的方法改善了选自以下的一种或多种次要形态学标准：将LAVI减少到<34mL/m2，将关于男性的LVMI减少到<115g/m2，将关于女性的LVMI减少到低于95g/m2，将RWT减少到<0.42，并且将LV壁厚度减少到<12mm。
在本公开的一些实施方案中，患者具有关于HFpEF的一种或多种次要生物标记物EHFA标准。在一些实施方案中，次要生物标记物标准是窦性心律，具有5-NT-proBNP 125-220pg/mL和/或BNP 35-80pg/mL。在一些实施方案中，次要生物标记物标准是心房颤动，具有NT-proBNP 365-660pg/mL和/或BNP 105-240pg/mL。在一些实施方案中，本公开的方法改善了窦性心律，其包括将5-NT-proBNP减少到<220pg/mL和/或将BNP减少到<80pg/mL。在一些实施方案中，本公开的方法改善了心房颤动，其包括将NT-proBNP减少到<660pg/mL和/或将BNP减少到<240pg/mL。
在一些实施方案中，本公开的方法减少患者的EHFA评分(例如，1、2、3、4、5、6、7或8分)。
在本公开的一些实施方案中，心力衰竭是与射血分数降低相关的心力衰竭(HFrEF)。在一些实施方案中，患者具有<40％的左心室射血分数(LVEF)。在一些实施方案中，患者具有小于45％(例如，10、15、20、25、30、35、40或45％)的射血分数。
在一些实施方案中，本公开的方法将患者的射血分数增加了至少1％(例如，1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％)。在一些实施方案中，患者患有收缩功能障碍。在一些实施方案中，患者具有正常的收缩功能，其在疾病的晚期阶段进展为收缩功能障碍。在一些实施方案中，本公开的方法改善收缩功能。在一些实施方案中，方法将患者的心输出量增加了(例如，至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％)。
在本公开的一些实施方案中，患者患有纽约心脏协会(New YorkHeartAssociation)(NYHA)I级HF。在一些实施方案中，患者患有NYHA II级HF或。在一些实施方案中，患者患有NYHAIII级HF。在一些实施方案中，患者患有NYHA IV级HF。
在一些实施方案中，本公开的方法降低患者的NYHA分级。在一些实施方案中，方法将患者的NYHA分级从IV级降低到III级。在一些实施方案中，方法将患者的NYHA分级从IV级降低到II级。在一些实施方案中，方法将患者的NYHA分级从IV级降低到I级。在一些实施方案中，方法将患者的NYHA分级从III级降低到II级。在一些实施方案中，方法将患者的NYHA分级从III级降低到I级。在一些实施方案中，方法将患者的NYHA分级从II级降低到I级。
在本公开的一些实施方案中，患者患有美国心脏病学会基金会(AmericanCollege of Cardiology Foundation)/美国心脏协会(American HeartAssociation)(ACCF/AHA)A期心力衰竭。在一些实施方案中，患者患有ACCF/AHA B期心力衰竭。在一些实施方案中，患者患有ACCF/AHA C期心力衰竭。在一些实施方案中，患者患有ACCF/AHA D期心力衰竭。
在一些实施方案中，本公开的方法降低患者的ACCF/AHA分期。在一些实施方案中，方法将患者的ACCF/AHA分期从D期降低到C期。在一些实施方案中，方法将患者的ACCF/AHA分期从D期降低到B期。在一些实施方案中，方法将患者的ACCF/AHA分期从D期降低到A期。在一些实施方案中，方法将患者的ACCF/AHA分期从C期降低到B期。在一些实施方案中，方法将患者的ACCF/AHA分期从C期降低到A期。在一些实施方案中，方法将患者的ACCF/AHA分期从B期降低到A期。
在本公开的一些实施方案中，患者患有并发AMII级心力衰竭的HF的Killip分级。在一些实施方案中，患者患有并发AMIII级心力衰竭的HF的Killip分级。在一些实施方案中，患者患有并发AMIIII级心力衰竭的HF的Killip分级。在一些实施方案中，患者患有并发AMI IV级心力衰竭的HF的Killip分级。
在一些实施方案中，本公开的方法降低患者的并发AMI分级的HF的Killip分级。在一些实施方案中，方法将患者的Killip分级从IV级降低到III级。在一些实施方案中，方法将患者的Killip分级从IV级降低到II级。在一些实施方案中，方法将患者的Killip分级从IV级降低到I级。在一些实施方案中，方法将患者的Killip分级从III级降低到II级。在一些实施方案中，方法将患者的Killip分级从III级降低到I级。在一些实施方案中，方法将患者的Killip分级从II级降低到I级。
在本公开的一些实施方案中，患者具有用于诊断HF的一种或多种主要Framingham标准。在一些实施方案中，患者具有选自以下的一种或多种状况：阵发性夜间呼吸困难或端坐呼吸、颈静脉怒张、啰音、放射显影心脏肥大、急性肺水肿、S3奔马律、静脉压增加大于16cm水柱、循环时间大于或等于25秒、肝颈反射、以及响应治疗在5天内大于或等于4.5kg的重量减轻。
在本公开的一些实施方案中，患者具有用于诊断HF的一种或多种次要Framingham标准。在一些实施方案中，患者具有选自以下的一种或多种状况：双侧踝部浮肿、夜间咳嗽、普通劳力性呼吸困难、肝肿大、胸腔积液、肺活量比记录的最大值减少了1/3和心动过速(心率大于120/分钟)。
在本公开的一些实施方案中，患者具有至少两个Framingham主要标准。在一些实施方案中，患者具有至少一个主要Framingham标准和至少两个次要Framingham标准。
在一些实施方案中，本公开的方法降低关于患者患有的心力衰竭的Framingham标准数目。在一些实施方案中，方法减少关于患者患有的心力衰竭的主要Framingham标准数目。在一些实施方案中，方法减少关于患者患有的心力衰竭的次要Framingham标准数目。
在本公开的一些实施方案中，患者具有选自HF的典型症状、较不典型症状、特异性体征和较不特异性体征的一种或多种状况。在一些实施方案中，患者具有选自以下的一种或多种症状：呼吸困难、端坐呼吸、阵发性夜间呼吸困难、运动耐量降低、疲劳、疲倦、运动后恢复时间增加和踝部肿胀。在一些实施方案中，患者具有选自以下的一种或多种较不典型症状：夜间咳嗽、哮鸣、饱胀感、食欲不振、意识模糊(尤其是在老年人中)、抑郁、心悸、头晕、晕厥和俯身呼吸困难。
在本公开的一些实施方案中，患者具有一种或多种HF体征。在一些实施方案中，患者具有选自以下的一种或多种HF体征：颈静脉压升高、肝颈反流、第三心音(奔马律)和心尖搏动的侧向移位。在一些实施方案中，患者具有一种或多种较不特异性的HF体征。在一些实施方案中，患者具有一种或多种较不特异性的HF体征。在一些实施方案中，患者具有选自以下的一种或多种较不特异性的HF体征：重量增加(>2kg/周)、重量减轻(在晚期HF中)、组织消耗(恶病质)、心脏杂音、外周性水肿(踝部、骶骨、阴囊)、肺捻发音、进气降低和肺底叩诊呈浊音(胸腔积液)、心动过速、不规则脉搏、呼吸急促、潮式呼吸、肝肿大、腹水、四肢冰冷、少尿和脉压窄。
在一些实施方案中，本公开的方法降低患者具有的心力衰竭的体征和/或症状数目。在一些实施方案中，方法减少患者具有的心力衰竭的体征数目。在一些实施方案中，方法减少患者具有的心力衰竭的症状数目。
在本公开的一些实施方案中，与健康患者相比，患者具有升高的脑利钠肽(BNP)水平。在一些实施方案中，患者具有至少35pg/mL(例如，35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、1000、3000、5000、10,000、15,000或20,000pg/mL)的BNP水平。在一些实施方案中，本公开的方法将患者中的BNP水平减少了至少5％(例如，5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或至少80％)。在一些实施方案中，本公开的方法将患者中的BNP水平减少了至少5pg/mL(例如，5、10、50、100、200、500、1000或5000pg/mL)。在一些实施方案中，本公开的方法将BNP水平减少到正常水平(即，<100pg/ml)。
在本公开的一些实施方案中，与健康患者相比，患者具有升高的N末端BNP前体(NT-proBNP)水平。在一些实施方案中，患者具有至少10pg/mL(例如，10、25、50、100、150、200、300、400、500、1000、3000、5000、10,000、15,000或20,000pg/mL)的NT-proBNP水平。在一些实施方案中，本公开的方法将患者中的NT-proBNP水平减少了至少5％(例如，5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或至少80％)。在一些实施方案中，本公开的方法将患者中的NT-proBNP水平减少了至少10pg/mL(例如，10、25、50、100、200、500、1000、5000、10,000、15,000、20,000或25,000pg/mL)。在一些实施方案中，本公开的方法将NT-proBNP水平减少到正常水平(即，<100pg/ml)。
在本公开的一些实施方案中，与健康患者相比，患者具有升高的肌钙蛋白水平。在一些实施方案中，本公开的方法将患者中的肌钙蛋白水平减少了至少1％(例如，1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或至少80％)。
在一些实施方案中，本公开的方法将患者的住院率降低了至少1％(例如，1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％)。在一些实施方案中，本公开的方法将患者的心力衰竭的恶化率降低了至少1％(例如，1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％)。在一些实施方案中，本公开的方法降低患者留在医院的需要。在一些实施方案中，本公开的方法降低患者医院就诊的总次数。在一些实施方案中，本公开的方法增加患者初次住院治疗的时间。在一些实施方案中，本公开的方法增加患者的生命长度。在一些实施方案中，本公开的方法增加医院就诊之间的时间。在一些实施方案中，本公开的方法减少反复去医院就诊的次数。
在一些实施方案中，本公开的方法增加患者的运动能力。在一些实施方案中，患者具有150至400米的6分钟步行距离。在一些实施方案中，本公开的方法增加患者的6分钟步行距离。在一些实施方案中，本公开的方法将患者的6分钟步行距离增加了至少10米(例如，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300或超过400米)。
在一些实施方案中，本公开的方法降低患者的Borg呼吸困难指数(BDI)。在一些实施方案中，本公开的方法将患者的BDI降低了至少0.5个指数点(例如，至少0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10个指数点)。
在本公开的一些实施方案中，使用超声心动图评价患者的心力衰竭。在一些实施方案中，使用心脏磁共振成像(CMR)评价患者的心力衰竭。在一些实施方案中，使用具有延迟钆增强(LGE)的CMR评价患者的心力衰竭。在一些实施方案中，就选自以下的一种或多种状况评价患者：LV结构和收缩功能(例如，通过在乳头肌水平下的胸骨旁短轴切面中的M模式测量的)，包括但不限于LV壁厚度(LVWT)、LV质量(LVM)、LV舒张末期直径(LVEDD)、LV收缩末期直径(LVESD)、缩短分数(FS)(使用等式FS＝100％×[(EDD-ESD)/EDD]计算)、LV舒张末期容积(LVEDV)、LV收缩末期容积(LVESV)、射血分数(使用等式EF＝100％×[(EDV-ESV)/EDV]计算)、肥厚指数(计算为LVM/LVESV的比率)和相对壁厚度(计算为LVWT/LVESD的比率)。在一些实施方案中，使用选自以下的心脏成像评价患者中的心力衰竭：多门控采集(MUGA)、胸部X线、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)和放射性核苷酸心室造影术、正电子发射断层扫描(PET)、冠状动脉造影术和心脏计算机断层扫描(CT)。
在一些实施方案中，本公开的方法进一步包括向患者施用另外的支持疗法或活性剂。在一些实施方案中，另外的支持疗法或活性剂选自以下：血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、β阻滞剂、血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)、盐皮质激素/醛固酮受体拮抗剂(MRA)、糖皮质激素、他汀类药物、钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)抑制剂、胰高血糖素样肽1(GLP-1)受体激动剂、二肽基肽酶4(DPP-4)抑制剂、植入式心脏复律除颤器(ICD)、血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂(ARNI)和利尿剂。在一些实施方案中，另外的活性剂和/或支持疗法选自以下：贝那普利、卡托普利、依那普利、赖诺普利、培哚普利、雷米普利、群多普利、佐芬普利、醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、卡替洛尔、卡维地洛、拉贝洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、奈必洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔、索他洛尔、噻吗洛尔；氯沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦、坎地沙坦、缬沙坦、非马沙坦、阿齐沙坦、沙普立沙坦、替米沙坦、黄体酮、依普利酮和螺内酯、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、可的松、地夫可特、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、甲基强的松、泼尼松、曲安西龙、非奈利酮、阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、匹伐他汀、辛伐他汀、瑞舒伐他汀、卡格列净、达格列净、恩格列净、埃格列净、艾塞那肽、利拉鲁肽、利司那肽、杜拉鲁肽、索马鲁肽、西格列汀、沙格列汀、利格列汀、阿格列汀、缬沙坦和沙库巴曲(脑啡肽酶抑制剂)、呋塞米、布美他尼、托拉塞米、苄氟噻嗪、氢氯噻嗪、美托拉宗、吲达帕胺、螺内酯/依普利酮、阿米洛利、氨苯蝶啶、肼屈嗪和硝酸异山梨酯、地高辛、洋地黄、N-3多不饱和脂肪酸(PUFA)、If通道抑制剂和哌克昔林。
在本公开的一些实施方案中，患者患有选自以下的并存病：年龄、贫血、心绞痛、动脉高血压、关节炎、心房颤动、恶病质、癌症、认知功能障碍、冠状动脉疾病(CAD)、勃起功能障碍、痛风、高胆固醇血症、高钾血症、高钾血症、高脂血症、高血压、铁缺乏症、肾功能障碍、代谢综合征、身体失能、钾紊乱、肺疾病(例如，哮喘、COPD)、肌少症、睡眠呼吸暂停、睡眠障碍和心脏瓣膜病(例如，主动脉狭窄、主动脉瓣反流、二尖瓣反流、三尖瓣反流)。在一些实施方案中，在HF中考虑的一种或多种并存病选自贫血、心房颤动、冠状动脉疾病(CAD)和睡眠呼吸暂停。
在本公开的一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂包含ActRIIA多肽。在一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂是异多聚体。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIA多肽包含的氨基酸序列与如下的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，所述氨基酸序列在SEQ ID NO:366的氨基酸21、22、23、24、25、26、27、28、29或30中的任何一个处开始，并且在SEQ ID NO:366的氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135中的任何一个处结束。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIA多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:367的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIA多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:368的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIA多肽是包含ActRIIA多肽结构域和一个或多个异源结构域的融合多肽。在一些实施方案中，融合多肽是ActRIIA-Fc融合多肽。在一些实施方案中，融合多肽进一步包含置于ActRIIA多肽结构域和i)一个或多个异源结构域或ii)Fc结构域之间的接头结构域。在一些实施方案中，接头结构域选自以下：TGGG(SEQ ID NO:265)、TGGGG(SEQ ID NO:263)、SGGGG(SEQ ID NO:264)、GGGGS(SEQ ID NO:267)、GGG(SEQID NO:261)、GGGG(SEQ ID NO:262)和SGGG(SEQ ID NO:266)。
在本公开的一些实施方案中，多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:380的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:378的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂是同二聚体多肽。在一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂是异多聚体多肽。在一些实施方案中，异多聚体多肽包含ActRIIA多肽和ALK4多肽。在一些实施方案中，异多聚体多肽包含ActRIIA多肽和ALK7多肽。
在本公开的一些实施方案中，ALK4多肽包含的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、92、93、247、249、421和422的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ALK7多肽包含的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、133和134的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ALK4多肽是包含ALK4多肽结构域和一个或多个异源结构域的融合多肽。在一些实施方案中，ALK7多肽是包含ALK7多肽结构域和一个或多个异源结构域的融合多肽。在一些实施方案中，融合多肽是ALK4-Fc融合多肽。在一些实施方案中，融合多肽是ALK7-Fc融合多肽。在一些实施方案中，ALK4-Fc融合多肽进一步包含置于ALK4多肽结构域和i)一个或多个异源结构域或ii)Fc结构域之间的接头结构域。在一些实施方案中，ALK7-Fc融合多肽进一步包含置于ALK7多肽结构域和i)一个或多个异源结构域或ii)Fc结构域之间的接头结构域。在一些实施方案中，接头结构域选自以下：TGGG(SEQ IDNO:265)、TGGGG(SEQ ID NO:263)、SGGGG(SEQ ID NO:264)、GGGGS(SEQ ID NO:267)、GGG(SEQ ID NO:261)、GGGG(SEQ ID NO:262)和SGGG(SEQ ID NO:266)。
在本公开的一些实施方案中，异多聚体包含选自以下的Fc结构域：a)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％具有，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；b)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQID NO:14的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；c.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ IDNO:15的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；d.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；并且e.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，异多聚体包含选自以下的Fc结构域：a.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；b.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；c.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQID NO:15的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；d.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ IDNO:16的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；并且e.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，异多聚体包含选自以下的Fc结构域：a.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；并且b.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，异多聚体包含选自以下的Fc结构域：a.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；并且b.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，异多聚体包含选自以下的Fc结构域：a.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；并且b.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ IDNO:21的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，异多聚体包含选自以下的Fc结构域：a.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；并且b.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，异多聚体包含选自以下的Fc结构域：a.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；并且b.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，异多聚体包含选自以下的Fc结构域：a.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；并且b.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，异多聚体包含选自以下的Fc结构域：a.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；并且b.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，异多聚体包含选自以下的Fc结构域：a.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；并且b.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，异多聚体包含选自以下的Fc结构域：a.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；并且b.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，异多聚体包含选自以下的Fc结构域：a.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；并且b.)ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIA-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置138处的谷氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置217处的天冬氨酸，并且其中ALK4-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在位置146处的丙氨酸、在氨基酸位置162处的精氨酸、在氨基酸位置179处的精氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIA-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置138处的谷氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置217处的天冬氨酸，并且其中ALK7-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在位置146处的丙氨酸、在氨基酸位置162处的精氨酸、在氨基酸位置179处的精氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。
在本公开的一些实施方案中，ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ALK4-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置138处的谷氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置217处的天冬氨酸，并且其中ActRIIA-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在位置146处的丙氨酸、在氨基酸位置162处的精氨酸、在氨基酸位置179处的精氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。
在本公开的一些实施方案中，ALK7-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置138处的谷氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置217处的天冬氨酸，并且其中ActRIIA-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在位置146处的丙氨酸、在氨基酸位置162处的精氨酸、在氨基酸位置179处的精氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIA-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置435处的精氨酸，并且其中ALK4-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在氨基酸位置146处的丙氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIA-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置435处的精氨酸，并且其中ALK7-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在氨基酸位置146处的丙氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。
在本公开的一些实施方案中，ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ActRIIA-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ALK4-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置435处的精氨酸，并且其中ActRIIA-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在氨基酸位置146处的丙氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。
在本公开的一些实施方案中，ALK7-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置435处的精氨酸，并且其中ActRIIA-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在氨基酸位置146处的丙氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。
在本公开的一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂包含ActRIIB多肽。
在本公开的一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂是异多聚体。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与如下的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，所述氨基酸序列在SEQ ID NO:2的氨基酸20-29中的任何一个(例如，氨基酸残基20、21、22、23、24、25、26、27、28或29)处开始，并且在SEQ ID NO:2的氨基酸109-134中的任何一个(例如，氨基酸残基109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134)处结束。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸29-109具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸25-131具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸20-134具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:388的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:389的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIB多肽是包含ActRIIB多肽结构域和一个或多个异源结构域的融合多肽。在一些实施方案中，融合多肽是ActRIIB-Fc融合多肽。在一些实施方案中，融合多肽进一步包含置于ActRIIB多肽结构域和一个或多个异源结构域或Fc结构域之间的接头结构域。在一些实施方案中，接头结构域选自以下：TGGG(SEQ ID NO:265)、TGGGG(SEQ ID NO:263)、SGGGG(SEQ ID NO:264)、GGGGS(SEQ ID NO:267)、GGG(SEQ ID NO:261)、GGGG(SEQ ID NO:262)和SGGG(SEQ ID NO:266)。在一些实施方案中，多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIB多肽包含相对于SEQ ID NO:2的氨基酸序列的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代选自以下：A24N、S26T、N35E、E37A、E37D、L38N、R40A、R40K、S44T、L46V、L46I、L46F、L46A、E50K、E50P、E50L、E52A、E52D、E52G、E52H、E52K、E52N、E52P、E52R、E52S、E52T、E52Y、Q53R、Q53K、Q53N、Q53H、D54A、K55A、K55D、K55E、K55R、R56A、L57E、L57I、L57R、L57T、L57V、Y60D、Y60F、Y60K、Y60P、R64A、R64H、R64K、R64N、N65A、S67N、S67T、G68R、K74A、K74E、K74F、K74I、K74R、K74Y、W78A、W78Y、L79A、L79D、L79E、L79F、L79H、L79K、L79P、L79R、L79S、L79T、L79W、D80A、D80F、D80G、D80I、D80K、D80M、D80N、D80R、F82A、F82D、F82E、F82I、F82K、F82L、F82S、F82T、F82W、F82Y、N83A、N83R、T93D、T93E、T93G、T93H、T93K、T93P、T93R、T93S、T93Y、E94K、Q98D、Q98E、Q98K、Q98R、V99E、V99G、V99K、E105N、F108I、F108L、F108V、F108Y、E111D、E111H、E111K、111N、E111Q、E111R、R112H、R112K、R112N、R112S、R112T、A119P、A119V、G120N、E123N、P129N、P129S、P130A、P130R和A132N。在一些实施方案中，ActRIIB多肽包含相对于SEQ ID NO:2的氨基酸序列的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代选自以下：L38N、E50L、E52D、E52N、E52Y、L57E、L57I、L57R、L57T、L57V、Y60D、G68R、K74E、W78Y、L79E、L79F、L79H、L79R、L79S、L79T、L79W、F82D、F82E、F82I、F82K、F82L、F82S、F82T、F82Y、N83R、E94K和V99G。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的E50的位置处的L取代。在一些实施方案中，ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的L38的位置处的N取代。在一些实施方案中，ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的V99的位置处的G取代。在一些实施方案中，ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的N83的位置处的R取代。在一些实施方案中，ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的F82的位置处的T取代。在一些实施方案中，ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的L79的位置处的H取代。
在本公开的一些实施方案中，多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:276的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:278的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的F82的位置处的I取代以及在对应于N83的位置处的R取代。
在本公开的一些实施方案中，多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:279的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:332的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的F82的位置处的K取代以及在对应于N83的位置处的R取代。
在本公开的一些实施方案中，多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:333的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:335的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的F82的位置处的T取代以及在对应于N83的位置处的R取代。
在本公开的一些实施方案中，多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:336的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:338的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的F82的位置处的T取代。
在本公开的一些实施方案中，多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:339的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:341的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的L79的位置处的H取代以及在对应于F82的位置处的I取代。
在本公开的一些实施方案中，多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:342的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:344的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的L79的位置处的H取代。
在本公开的一些实施方案中，多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:345的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:347的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的L79的位置处的H取代以及在对应于F82的位置处的K取代。
在本公开的一些实施方案中，多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:348的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:350的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的E50的位置处的L取代。
在本公开的一些实施方案中，多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:351的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:353的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的L38的位置处的N取代以及在对应于L79的位置处的R取代。
在本公开的一些实施方案中，多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:354的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:356的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的V99的位置处的G取代。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIB多肽是同二聚体多肽。在一些实施方案中，ActRIIB多肽是异二聚体多肽。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与如下的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，所述氨基酸序列在SEQ ID NO:2的氨基酸20-29中的任何一个(例如，氨基酸残基20、21、22、23、24、25、26、27、28或29)处开始，并且在SEQ ID NO:2的氨基酸109-134中的任何一个(例如，氨基酸残基109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134)处结束，以及选自以下的在SEQ ID NO:2的位置处的一个或多个氨基酸取代：L38N、E50L、E52N、L57E、L57I、L57R、L57T、L57V、Y60D、G68R、K74E、W78Y、L79F、L79S、L79T、L79W、F82D、F82E、F82L、F82S、F82T、F82Y、N83R、E94K和V99G。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与如下的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，所述氨基酸序列在SEQ ID NO:2的氨基酸20-29中的任何一个(例如，氨基酸残基20、21、22、23、24、25、26、27、28或29)处开始，并且在SEQ ID NO:2的氨基酸109-134中的任何一个(例如，氨基酸残基109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134)处结束，以及选自以下的在SEQ ID NO:2的位置处的一个或多个氨基酸取代：L38N、E50L、E52D、E52N、E52Y、L57E、L57I、L57R、L57T、L57V、Y60D、G68R、K74E、W78Y、L79E、L79F、L79H、L79R、L79S、L79T、L79W、F82D、F82E、F82I、F82K、F82L、F82S、F82T、F82Y、N83R、E94K和V99G。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸29-109具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与SEQ IDNO:2的氨基酸25-131具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与SEQID NO:2的氨基酸20-134具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:388的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:389的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，ActRIIB多肽包含相对于SEQ ID NO:2的氨基酸序列的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代选自以下：L38N、E50L、E52D、E52N、E52Y、L57E、L57I、L57R、L57T、L57V、Y60D、G68R、K74E、W78Y、L79E、L79F、L79H、L79R、L79S、L79T、L79W、F82D、F82E、F82I、F82K、F82L、F82S、F82T、F82Y、N83R、E94K和V99G。
在本公开的一些实施方案中，异多聚体多肽包含ActRIIA多肽和ALK4多肽。在一些实施方案中，异多聚体多肽包含ActRIIA多肽和ALK7多肽。在一些实施方案中，ALK4多肽包含的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、92、93、247、249、421和422的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，ALK7多肽包含的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、133和134的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIB多肽是包含ActRIIB多肽结构域和一个或多个异源结构域的融合多肽。在一些实施方案中，ALK4多肽是包含ALK4多肽结构域和一个或多个异源结构域的融合多肽。在一些实施方案中，ALK7多肽是包含ALK7多肽结构域和一个或多个异源结构域的融合多肽。在一些实施方案中，ActRIIB多肽是ActRIIB-Fc融合多肽。在一些实施方案中，ALK4多肽是ALK4-Fc融合多肽。在一些实施方案中，ALK7多肽是ALK7-Fc融合多肽。在一些实施方案中，ActRIIB-Fc融合多肽进一步包含置于ActRIIB多肽结构域和一个或多个异源结构域或Fc结构域之间的接头结构域。在一些实施方案中，ALK4-Fc融合多肽进一步包含置于ALK4多肽结构域和一个或多个异源结构域或Fc结构域之间的接头结构域。在一些实施方案中，ALK7-Fc融合多肽进一步包含置于ALK7多肽结构域和一个或多个异源结构域或Fc结构域之间的接头结构域。在一些实施方案中，接头结构域选自以下：TGGG(SEQ ID NO:265)、TGGGG(SEQ ID NO:263)、SGGGG(SEQ ID NO:264)、GGGGS(SEQ ID NO:267)、GGG(SEQ ID NO:261)、GGGG(SEQ ID NO:262)和SGGG(SEQ ID NO:266)。
在本公开的一些实施方案中，异多聚体包含选自以下的Fc结构域：a.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；b.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；c.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQID NO:15的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；d.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ IDNO:16的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；并且e.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，异多聚体包含选自以下的Fc结构域：a.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；b.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；c.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQID NO:15的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；d.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ IDNO:16的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；并且e.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，异多聚体包含选自以下的Fc结构域：a.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；并且b)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，异多聚体包含选自以下的Fc结构域：a.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；并且b.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ IDNO:19的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，异多聚体包含选自以下的Fc结构域：a.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；并且b.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，异多聚体包含选自以下的Fc结构域：a.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；并且b.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，异多聚体包含选自以下的Fc结构域：a.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；并且b.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，异多聚体包含选自以下的Fc结构域：a.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；并且b.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，异多聚体包含选自以下的Fc结构域：a.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；并且b.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，异多聚体包含选自以下的Fc结构域：a.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；并且b.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，异多聚体包含选自以下的Fc结构域：a.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；并且b.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，异多聚体包含选自以下的Fc结构域：a.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；并且b.)ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ IDNO:27的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIB-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置138处的谷氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置217处的天冬氨酸，并且其中ALK4-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在位置146处的丙氨酸、在氨基酸位置162处的精氨酸、在氨基酸位置179处的精氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIB-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置138处的谷氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置217处的天冬氨酸，并且其中ALK7-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在位置146处的丙氨酸、在氨基酸位置162处的精氨酸、在氨基酸位置179处的精氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。
在本公开的一些实施方案中，ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ALK4-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置138处的谷氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置217处的天冬氨酸，并且其中ActRIIB-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在位置146处的丙氨酸、在氨基酸位置162处的精氨酸、在氨基酸位置179处的精氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。
在本公开的一些实施方案中，ALK7-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置138处的谷氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置217处的天冬氨酸，并且其中ActRIIB-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在位置146处的丙氨酸、在氨基酸位置162处的精氨酸、在氨基酸位置179处的精氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIB-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置435处的精氨酸，并且其中ALK4-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在氨基酸位置146处的丙氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。
在本公开的一些实施方案中，ActRIIB-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置435处的精氨酸，并且其中ALK7-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在氨基酸位置146处的丙氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。
在本公开的一些实施方案中，ALK4-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ALK7-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且ActRIIB-Fc融合多肽包含的Fc结构域与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ALK4-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置435处的精氨酸，并且其中ActRIIB-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在氨基酸位置146处的丙氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。
在本公开的一些实施方案中，ALK7-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置435处的精氨酸，并且其中ActRIIB-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在氨基酸位置146处的丙氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。
在本公开的一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂是卵泡抑素多肽。在一些实施方案中，卵泡抑素多肽的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:390、391、392、393和394的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在本公开的一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂抑制选自激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10、ALK4、ActRIIA和ActRIIB的一种或多种配体。
在本公开的一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂是抗体或抗体的组合。在一些实施方案中，抗体或抗体的组合结合选自激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10、ALK4、ActRIIA和ActRIIB的一种或多种配体。在一些实施方案中，抗体是多特异性抗体。在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，抗体选自加托索单抗(garetosmab)、曲戈卢单抗(trevogumab)、司他芦单抗(stamulumab)、多玛洛珠单抗(domagrozumab)、兰洛珠单抗(landogrozumab)和比玛卢单抗(bimagrumab)。
在本公开的一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂是小分子或小分子的组合。在一些实施方案中，小分子或小分子的组合抑制选自激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10、ALK4、ActRIIA和ActRIIB的一种或多种配体。
在本公开的一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂是多核苷酸或多核苷酸的组合。在一些实施方案中，多核苷酸或多核苷酸的组合抑制选自激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10、ALK4、ActRIIA和ActRIIB的一种或多种配体。
附图说明
图1显示了人ActRIIB(SEQ ID NO:1)和人ActRIIA(SEQ ID NO:367)的细胞外结构域与用方框指示的残基的比对，所述残基基于多重ActRIIB和ActRIIA晶体结构的综合分析，在本文中推导为直接接触配体。
图2显示了人ActRIIB前体多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)；NCBI参考序列NP_001097.2)。信号肽是加下划线的，细胞外结构域是粗体(也被称为SEQ ID NO:1)，并且潜在的N联糖基化位点是加方框的。SEQ ID NO:2在本公开中用作人ActRIIB的野生型参考序列，并且关于本文描述的变体的编号基于SEQ ID NO:2中的编号
图3显示了人ActRIIB细胞外结构域多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。
图4显示了编码人ActRIIB前体多肽的核酸序列。SEQ ID NO:4由NCBI参考序列NM_001106.4的核苷酸434-1972组成。
图5显示了编码人ActRIIB(20-134)细胞外结构域多肽的核酸序列(SEQ ID NO:3)。
图6显示了不含其细胞内结构域的各种脊椎动物ActRIIB前体多肽(SEQ ID NO:358-363)、不含其细胞内结构域的人ActRIIA前体多肽(SEQ ID NO:364)、以及共有ActRII前体多肽(SEQ ID NO:365)的多重序列比对。共有序列中的大写字母指示了保守的位置。共有序列中的小写字母指示了其为占优势形式，但该位置处不普遍的氨基酸残基。
图7显示了使用Clustal 2.1，来自人IgG同种型的Fc结构域的多重序列比对。铰链区通过虚线下划线指示。双下划线指示在IgG1(SEQ ID NO:13)Fc中改造为促进不对称链配对的位置的实例，以及相对于其它同种型IgG4(SEQ ID NO:17)、IgG2(SEQ ID NO:14)和IgG3(SEQ ID NO:15)的相应位置。
图8A和图8B显示了包含变体ActRIIB多肽(指示为“X”)和ALK4多肽(指示为“Y”)或ALK7多肽(指示为“Y”)的异聚多肽复合物的示意性实例。在所示出的实施方案中，变体ActRIIB多肽是包含相互作用对的第一成员(“C1”)的融合多肽的部分，并且ALK4多肽或ALK7多肽是包含相互作用对的第二成员(“C2”)的融合多肽的部分。合适的相互作用对包括例如重链和/或轻链免疫球蛋白相互作用对、其截短和变体，例如本文所述的那些[例如，Spiess等人(2015)MolecularImmunology 67(2A):95-106]。在每种融合多肽中，接头可以置于变体ActRIIB多肽、ALK4多肽或ALK7多肽与相互作用对的相应成员之间。相互作用对的第一成员和第二成员可以是非引导的，这意味着该对的成员可以彼此结合或自结合而无显著偏好，并且它们可以具有相同或不同的氨基酸序列。参见图8A。可替代地，相互作用对可以是引导的(不对称的)对，这意味着该对的成员优先彼此结合而不是自结合。参见图8B。
图9显示了各种脊椎动物ALK4蛋白和人ALK4(SEQ ID NO:414-420)的多重序列比对。
图10显示了各种脊椎动物ActRIIA蛋白和人ActRIIA(SEQ ID NO:367、371-377)的多重序列比对。
图11A和11B显示了包含I型受体和II型受体多肽的异聚蛋白质复合物的两个示意性实例。图11A描绘了包含一种I型受体融合多肽和一种II型受体融合多肽的异二聚体蛋白质复合物，其可以经由在每条多肽链内包含的多聚化结构域共价或非共价地组装。两个组装的多聚化结构域构成相互作用对，其可以是引导的或非引导的。图11B描绘了包含如图11A中描绘的两个异二聚体复合物的异四聚体蛋白质复合物。可以设想更高阶的复合物。
图12显示了包含I型受体多肽(指示为“I”)(例如，与来自人或其它物种例如本文所述的那些物种的ALK4或ALK7蛋白的细胞外结构域具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽)和II型受体多肽(指示为“II”)(例如，与来自人或其它物种如例如本文所述的那些物种的ActRIIB或ActRIIA蛋白的细胞外结构域具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽)的异聚蛋白质复合物的示意性实例。在所示出的实施方案中，I型受体多肽是包含相互作用对的第一成员(“C1”)的融合多肽的部分，并且II型受体多肽是包含相互作用对的第二成员(“C2”)的融合多肽的部分。在每种融合多肽中，接头可以置于I型或II型受体多肽与相互作用对的相应成员之间。相互作用对的第一成员和第二成员可以是引导的(不对称的)对，这意味着该对的成员优先彼此结合而不是自结合，或者相互作用对可以是非引导的，这意味着该对的成员可以彼此结合或自结合而无显著偏好，并且可以具有相同或不同的氨基酸序列。传统的Fc融合蛋白和抗体是非引导的相互作用对的实例，而各种改造的Fc结构域已被设计为引导的(不对称的)相互作用对[例如，Spiess等人(2015)Molecular Immunology 67(2A):95-106]。
图13A-13D显示了包含ALK4多肽(例如，与来自人或其它物种例如本文所述的那些物种的ALK4蛋白的细胞外结构域具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽)和ActRIIB多肽(例如，与来自人或其它物种例如本文所述的那些物种的ActRIIB蛋白的细胞外结构域具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽)的异聚蛋白质复合物的示意性实例。在所示出的实施方案中，ALK4多肽是包含相互作用对的第一成员(“C1”)的融合多肽的部分，并且ActRIIB多肽是包含相互作用对的第二成员(“C2”)的融合多肽的部分。合适的相互作用对包括例如重链和/或轻链免疫球蛋白相互作用对、其截短和变体，例如本文所述的那些[例如，Spiess等人(2015)MolecularImmunology 67(2A):95-106]。在每种融合多肽中，接头可以置于ALK4或ActRIIB多肽与相互作用对的相应成员之间。相互作用对的第一成员和第二成员可以是非引导的，这意味着该对的成员可以彼此结合或自结合而无显著偏好，并且它们可以具有相同或不同的氨基酸序列。参见图13A。可替代地，相互作用对可以是引导的(不对称的)对，这意味着该对的成员优先彼此结合而不是自结合。参见图13B。可以设想更高阶的复合物。参见图13C和13D。
图14显示了在CHO细胞中表达的ActRIIA-hFc的纯化。蛋白质纯化为单一、明确限定的峰，如通过筛分柱(上图)和考马斯染色的SDS-PAGE(下图)(左泳道：分子量标准；右泳道：ActRIIA-hFc)显现的。
图15显示了如通过BiacoreTM测定测量的，ActRIIA-hFc与激活素(上图)和GDF-11(下图)的结合。
图16A和图16B显示了关于包含变体或未修饰的ActRIIB结构域的同二聚体Fc融合多肽的配体结合动力学的值，如在37℃下通过表面等离子体共振确定的。氨基酸编号基于SEQ ID NO:2。ND#指示该值在测试的浓度范围内无法检测到。瞬时*指示由于相互作用的瞬时性质，该值是不确定的。对照样品是ActRIIB-G1Fc(SEQ ID NO:5)。
图17显示了关于包含变体或未修饰的ActRIIB结构域的同二聚体Fc融合多肽的配体结合动力学的值，如在37℃下通过表面等离子体共振确定的。氨基酸编号基于SEQ IDNO:2。ND#指示该值在测试的浓度范围内无法检测到。瞬时结合*指示由于相互作用的瞬时性质，该值是不确定的。对照样品是ActRIIB-G1Fc(SEQ ID NO:5)。
图18显示了关于包含变体或未修饰的ActRIIB结构域的同二聚体Fc融合多肽的配体结合动力学的值，如在25℃下通过表面等离子体共振确定的。ND#指示该值在测试的浓度范围内无法检测到。氨基酸编号基于SEQ ID NO:2。
图19显示了与ActRIIB-Fc同二聚体和ALK4-Fc同二聚体相比，关于ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体蛋白质复合物的比较配体结合数据。对于每种蛋白质复合物，配体按koff进行排序，所述koff是与配体信号传导抑制良好相关联的动力学常数，并且按结合亲和力的降序排列(最紧密结合的配体在顶部上列出)。在左侧上，黄线、红线、绿线和蓝线指示解离速率常数的量级。黑色实线指示与同二聚体相比，其与异二聚体的结合增强或未改变的配体，而红色虚线指示与同二聚体相比基本上降低的结合。如所示的，ActRIIB-Fc:ALK4-Fc异二聚体展示了与任一同二聚体相比，与激活素B增强的结合，保留了如对于ActRIIB-Fc同二聚体观察到的，与激活素A、GDF8和GDF11的强结合，并且显示出与BMP9、BMP10和GDF3基本上降低的结合。如同ActRIIB-Fc同二聚体，异二聚体保留了与BMP6的中等水平结合。
图20显示了如通过如本文所述的A-204报道基因测定所确定的，比较ActRIIB-Fc:ALK4-Fc异二聚体/ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同二聚体IC50数据。与ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同二聚体类似，ActRIIB-Fc:ALK4-Fc异二聚体抑制激活素A、激活素B、GDF8和GDF11信号传导途径。然而，与ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同二聚体相比，BMP9和BMP10信号传导途径的ActRIIB-Fc:ALK4-Fc异二聚体抑制是显著降低的。这些数据证实了，与相应的ActRIIB:ActRIIB同二聚体相比，ActRIIB:ALK4异二聚体是激活素A、激活素B、GDF8和GDF11的更具选择性的拮抗剂。
图21显示了与ActRIIB-Fc同二聚体和ALK7-Fc同二聚体相比，关于ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异二聚体蛋白质复合物的比较配体结合数据。对于每种蛋白质复合物，配体按koff进行排序，所述koff是与配体信号传导抑制良好相关联的动力学常数，并且按结合亲和力的降序排列(最紧密结合的配体在顶部上列出)。在左侧上，黄线、红线、绿线和蓝线指示解离速率常数的量级。黑色实线指示与同二聚体相比，其与异二聚体的结合增强或未改变的配体，而红色虚线指示与同二聚体相比基本上降低的结合。如所示的，与ActRIIB-Fc同二聚体具有强结合的5种配体中的4种(激活素A、BMP10、GDF8和GDF11)显示出与ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异二聚体的降低结合，例外是保留与异二聚体的紧密结合的激活素B。类似地，与ActRIIB-Fc同二聚体具有中等结合的4种配体中的3种(GDF3、BMP6且特别是BMP9)显示出与ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异二聚体的降低结合，而与激活素AC的结合是增加的，以成为与异二聚体整体相互作用的第二强的配体。最后，激活素C和BMP5出乎意料地以中等强度结合ActRIIB-Fc:ALK7异二聚体，尽管与ActRIIB-Fc同二聚体无结合(激活素C)或弱结合(BMP5)。测试的配体无一与ALK7-Fc同二聚体结合。
图22显示了衍生自各种脊椎动物物种的ALK7细胞外结构域(SEQ ID NO:425-430)的多重序列比对。
图23ActRIIB-Fc:ALK4-Fc挽救了较年轻小鼠中的LV重塑过程中的心脏舒张功能障碍。“WT-媒介物”小鼠和“db/db-媒介物”小鼠两者均接受了等体积量的PBS媒介物共8周。“db/db-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc”小鼠接受了ActRIIB-Fc:ALK4-Fc(10mg/kg)共8周。与“WT-媒介物”小鼠(n＝10，p<0.001)相比，E/e'在“db/db-媒介物”(n＝9)小鼠中显著增加。然而，在“db/db-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc”小鼠中，E/e'通过ActRIIB-Fc:ALK4-Fc治疗显著降低(n＝9，p<0.05)。数据呈现为平均值±平均值的标准误。执行了统计检验(使用用于多重比较的Tukey氏检验的伴事后分析的单因素ANOVA)，其中显著性水平设定为p<0.05。特别地，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图24ActRIIB-Fc:ALK4-Fc挽救了较年轻小鼠中的左心重塑过程中的异常ECG。在图A-C中，“WT-媒介物”小鼠和“db/db-媒介物”小鼠两者均接受了等体积量的PBS媒介物共8周。“db/db-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc”小鼠接受了ActRIIB-Fc:ALK4-Fc(10mg/kg)共8周。A.与“WT-媒介物”小鼠(n＝10，p<0.01)相比，正P波的P振幅在“db/db-媒介物”(n＝9)小鼠中显著增加。在“db/db-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc”小鼠(n＝9，p<0.05)中，正P波的P振幅通过ActRIIB-Fc:ALK4-Fc治疗显著降低。B.与“WT-媒介物小鼠”(n＝10，p<0.05)相比，负P波的P振幅在“db/db-媒介物”(n＝9)小鼠中显著增加。在ActRIIB-Fc:ALK4-Fc治疗的小鼠“(db/db-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc”)(n＝9，p>0.05)中，负P波的P振幅显示了降低趋势。数据呈现为平均值±平均值的标准误。执行了统计检验(使用用于多重比较的Tukey氏检验的伴事后分析的单因素ANOVA)，其中显著性水平设定为p<0.05。特别地，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图25ActRIIB-Fc:ALK4-Fc挽救了较年老小鼠中的LV重塑过程中的心脏舒张功能障碍和异常ECG。图A-B，“WT-媒介物”小鼠和“db/db-媒介物”小鼠两者均接受了等体积量的PBS媒介物共8周。“db/db-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc”小鼠接受了ActRIIB-Fc:ALK4-Fc(10mg/kg)共8周。A.与“WT-媒介物”小鼠(n＝10，p<0.0001)相比，E/e'在“db/db-媒介物”(n＝10)小鼠中显著增加。然而，在“db/db-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc”小鼠中，E/e'通过ActRIIB-Fc:ALK4-Fc治疗显著降低(n＝9，p<0.05)。B.与“WT-媒介物”小鼠(n＝10，p<0.05)相比，R振幅在“db/db-媒介物”(n＝10)小鼠中显著增加。在“db/db-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc”小鼠(n＝9，p<0.01)中，R振幅通过ActRIIB-Fc:ALK4-Fc治疗显著降低。数据呈现为平均值±平均值的标准误。执行了统计检验(使用用于多重比较的Tukey氏检验的伴事后分析的单因素ANOVA)，其中显著性水平设定为p<0.05。特别地，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图26ActRIIB-Fc:ALK4-Fc挽救了14周和19周龄db/db小鼠中的LV重塑过程中的心脏舒张功能障碍和异常ECG。在图A-B中，“中年db/db-媒介物”、“老年db/db-媒介物”以及年龄匹配的“中年WT-媒介物”和“老年WT-媒介物”小鼠接受了等体积量的PBS媒介物共8周。“中年db/db-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc”和“老年db/db-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc”小鼠接受了ActRIIB-Fc:ALK4-Fc(10mg/kg)共8周。A.与“中年WT-媒介物”小鼠(n＝10，p<0.001)相比，E/e'在“中年db/db-媒介物”(n＝10)小鼠中显著增加。然而，在“中年db/db-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc”小鼠中，E/e'由于ActRIIB-Fc:ALK4-Fc治疗而显著降低(n＝10，p<0.05)。与“老年WT-媒介物”小鼠(n＝10，p<0.001)相比，E/e'在“老年db/db-媒介物”(n＝10)小鼠中显著增加。然而，在“老年db/db-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc”小鼠中，E/e'由于ActRIIB-Fc:ALK4-Fc治疗而降低(n＝9，p>0.05)。B.与“中年WT-媒介物”小鼠(n＝10，p>0.05)相比，R振幅在“中年db/db-媒介物”(n＝10)小鼠中增加。在“中年db/db-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc”小鼠(n＝10，p<0.01)中，R振幅由于ActRIIB-Fc:ALK4-Fc治疗而显著降低。与“老年WT-媒介物”小鼠(n＝10，p>0.05)相比，R振幅在“老年db/db-媒介物”(n＝10)小鼠中增加。在“老年db/db-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc”小鼠(n＝9，p<0.01)中，R振幅由于ActRIIB-Fc:ALK4-Fc治疗而显著降低。数据呈现为平均值±平均值的标准误。执行了统计检验(使用用于多重比较的Tukey氏检验的伴事后分析的单因素ANOVA)，其中显著性水平设定为p<0.05。特别地，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图27ActRIIB(K55E)-Fc挽救了19周龄db/db小鼠中的LV重塑过程中的心脏舒张功能障碍和异常ECG。图A-B，“老年WT-媒介物”小鼠和“老年db/db-媒介物”小鼠两者均接受了等体积量的PBS媒介物共8周。“老年db/db-ActRIIB(K55E)-Fc”小鼠接受了ActRIIB(K55E)-Fc(10mg/kg)共8周。A.与“老年WT-媒介物”小鼠(n＝10，p<0.0001)相比，E/e'在“老年db/db-媒介物”(n＝10)小鼠中显著增加。然而，在“老年db/db-ActRIIB(K55E)-Fc”小鼠中，E/e'由于ActRIIB(K55E)-Fc治疗而显著降低(n＝10，p<0.0001)。B.与“老年WT-媒介物”小鼠(n＝10，p<0.01)相比，R振幅在“老年db/db-媒介物”(n＝10)小鼠中显著增加。在“老年db/db-ActRIIB(K55E)-Fc”小鼠(n＝10，p<0.05)中，R振幅由于ActRIIB(K55E)-Fc治疗而显著降低。数据呈现为平均值±平均值的标准误。执行了统计检验(使用用于多重比较的Tukey氏检验的伴事后分析的单因素ANOVA)，其中显著性水平设定为p<0.05。特别地，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图28糖尿病中的心力衰竭的病理生理学。经常伴随糖尿病的高血糖、胰岛素抵抗和高胰岛素血症触发一系列有害效应，其促成糖尿病中的心力衰竭发展。AGE是晚期糖基化终产物；CAD是冠状动脉疾病；LVH是左心室肥厚；并且RAAS是肾素-血管紧张素-醛固酮系统。(Dunlay，SM等人，Circulation，2019，140:e294-e324)。
图29ActRIIBL79S-Fc挽救了14周龄db/db小鼠中的LV重塑过程中的心脏舒张功能障碍。图A和B“WT-媒介物”小鼠和“db/db-媒介物”小鼠两者均接受了等体积量的PBS媒介物共8周。“db/db-ActRIIBL79S-Fc”小鼠接受了ActRIIBL79S-Fc(10mg/kg)共8周。图29A。与“WT-媒介物”小鼠(n＝10，p<0.001)相比，E/e'在“db/db-媒介物”(n＝10)小鼠中显著增加。然而，在“db/db-ActRIIBL79S-Fc”小鼠中，E/e'通过ActRIIBL79S-Fc治疗显著降低(n＝8，p<0.01)。图29B。与“WT-媒介物”小鼠(n＝10，p<0.01)相比，R振幅在“db/db-媒介物”(n＝10)小鼠中显著增加。在“db/db-ActRIIBL79S-Fc”小鼠中，R振幅通过ActRIIBL79S-Fc治疗并未改变(n＝8，p>0.05)。数据呈现为平均值±平均值的标准误。执行了统计检验(使用用于多重比较的Tukey氏检验的伴事后分析的单因素ANOVA)，其中显著性水平设定为p<0.05。特别地，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
具体实施方式
1.概述
在某些方面，本公开涉及使用TGF-β超家族配体拮抗剂，特别是ActRII-ALK4拮抗剂来治疗心力衰竭的方法。例如，如本文所述的ActRII-ALK4拮抗剂可以用于治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭、或者与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的一种或多种并发症的进展速率和/或严重程度。
心力衰竭(HF)是一种临床综合征，其特征在于包括呼吸困难、踝部肿胀和疲劳的症状，其可能伴随包括颈静脉压升高、肺部啰音以及通过结构性和/或功能性心脏异常引起的外周性水肿的体征。HF通常导致静息状态下或在负荷过程中的心输出量降低和/或心内压升高。
在临床症状变得明显之前，患者可能呈现无症状的结构性或功能性心脏异常(例如，左心室(LV)收缩或舒张功能障碍)，其为HF的前兆。这些前兆的识别是重要的，因为它们与预后不良相关，并且在前兆阶段起始治疗可能降低具有无症状的LV收缩功能障碍的患者中的死亡率。
潜在的心脏原因的证实对于HF的诊断是至关重要的。这通常包括导致心室收缩和/或舒张功能障碍的心肌异常。然而，瓣膜、心包、心内膜、心律和传导的异常也可以引起HF(并且经常存在多于一种异常)。潜在的心脏问题的鉴定对于治疗原因是至关重要的，因为精确的病理学决定了所使用的具体治疗(例如，用于心瓣膜病的瓣膜修复或置换、用于具有EF降低的HF的特定药理学疗法、心动过速性心肌病中的心率降低等)。
TGF-β超家族配体信号由I型和II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体的异聚复合物介导，其在配体刺激后磷酸化并激活下游Smad蛋白(Massagué，2000，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.1:169-178)。这些I型和II型受体都是跨膜多肽，由具有富含半胱氨酸区域的配体结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸特异性的细胞质结构域构成。I型受体对于信号传导是必要的，并且II型受体对于结合配体是必需的。I型和II型激活素受体在配体结合后形成稳定的复合物，导致I型受体被II型受体磷酸化。
两种有关的II型受体ActRIIA和ActRIIB已被鉴定为激活素的II型受体(Mathews和Vale，1991，Cell 65:973-982；Attisano等人，1992，Cell 68:97-108)。除了激活素之外，ActRIIA和ActRIIB还可以与其它几种TGF-β家族蛋白生物化学相互作用，所述蛋白质包括BMP7、Nodal、GDF8和GDF11(Yamashita等人，1995，J.Cell Biol.130:217-226；Lee和McPherron，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.98:9306-9311；Yeo和Whitman，2001，Mol.Cell 7:949-957；Oh等人，2002，Genes Dev.16:2749-54)。申请人已发现了可溶性ActRIIA-Fc融合多肽和ActRIIB-Fc融合多肽在体内具有基本上不同的效应，其中ActRIIA-Fc对骨骼具有主要作用，而ActRIIB-Fc对骨骼肌具有主要作用。
TGF-β超家族的配体共享相同的二聚体结构，其中一个单体的中央3-1/2转角螺旋靠着由另一个单体的β链形成的凹面包裹。大多数TGF-β家族成员通过分子间二硫键得到进一步稳定。该二硫键穿过由另外两个二硫键形成的环，生成所谓的‘半胱氨酸结’基序[Lin等人(2006)Reproduction 132:179-190；以及Hinck等人(2012)FEBS Letters 586:1860-1870]。
激活素是TGF-β超家族的成员，并且最初作为促卵泡激素分泌的调节剂被发现，但随后已表征了各种生殖和非生殖作用。存在三种主要的激活素形式(A、B和AB)，其为两个密切相关的β亚基的同/异二聚体(分别为βAβA、βBβB和βAβB)。人基因组还编码主要在肝中表达的激活素C和激活素E，并且含有βC或βE的异二聚体形式也是已知的。在TGF-β超家族中，激活素是独特且多功能的因子，其可以刺激卵巢和胎盘细胞中的激素产生，支持神经元细胞存活，取决于细胞类型积极或消极地影响细胞周期进程，并且至少在两栖动物胚胎中诱导中胚层分化[DePaolo等人(1991)Proc Soc Ep Biol Med.198:500-512；Dyson等人(1997)Curr Biol.7:81-84；以及Woodruff(1998)Biochem Pharmacol.55:953-963]。在几种组织中，激活素信号传导被其相关的异二聚体抑制素拮抗。例如，在来自垂体的促卵泡激素(FSH)分泌的调控中，激活素促进FSH合成和分泌，而抑制素降低FSH合成和分泌。可能调控激活素生物活性和/或与激活素结合的其它蛋白质包括卵泡抑素(FS)和α2-巨球蛋白。
如本文所述的，与“激活素A”结合的试剂是与βA亚基特异性地结合的试剂，无论是在分离的βA亚基的背景下还是作为二聚体复合物(例如，βAβA同二聚体或βAβB异二聚体)。在异二聚体复合物(例如，βAβB异二聚体)的情况下，与“激活素A”结合的试剂对于βA亚基内存在的表位是特异性的，但不与复合物的非βA亚基(例如，复合物的βB亚基)内存在的表位结合。类似地，本文公开的拮抗(抑制)“激活素A”的试剂是抑制如由βA亚基介导的一种或多种活性的试剂，无论是在分离的βA亚基的背景下还是作为二聚体复合物(例如，βAβA同二聚体或βAβB异二聚体)。在βAβB异二聚体的情况下，抑制“激活素A”的试剂是特异性地抑制βA亚基的一种或多种活性，但不抑制复合物的非βA亚基(例如，复合物的βB亚基)的活性的试剂。该原理也适用于结合和/或抑制“激活素B”、“激活素C”和“激活素E”的试剂。本文公开的拮抗“激活素AB”的试剂是抑制如由βA亚基介导的一种或多种活性以及如由βB亚基介导的一种或多种活性的试剂。
BMP和GDF一起形成半胱氨酸结细胞因子家族，其共享TGF-β超家族的特征性折叠[Rider等人(2010)BiochemJ.，429(1):1-12]。该家族包括例如BMP2、BMP4、BMP6、BMP7、BMP2a、BMP3、BMP3b(也称为GDF10)、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8、BMP8a、BMP8b、BMP9(也称为GDF2)、BMP10、BMP11(也称为GDF11)、BMP12(也称为GDF7)、BMP13(也称为GDF6)、BMP14(也称为GDF5)、BMP15、GDF1、GDF3(也称为VGR2)、GDF8(也称为肌肉生长抑制素)、GDF9、GDF15和decapentaplegic。除了诱导骨形成的能力(BMP因其而得名)之外，BMP/GDF还在广泛范围的组织的发育中展示形态发生活性。BMP/GDF同二聚体和异二聚体与I型和II型受体二聚体的组合相互作用，以产生多重可能的信号传导复合物，导致两组竞争的SMAD转录因子之一的激活。BMP/GDF具有高度特异性和局限性的功能。这些以多种方式进行调控，所述方式包括BMP/GDF表达的发育限制以及通过分泌以高亲和力与细胞因子结合的几种特异性BMP拮抗剂蛋白。奇怪的是，这些拮抗剂中的许多类似TGF-β超家族配体。
生长和分化因子8(GDF8)也称为肌肉生长抑制素。GDF8是骨骼肌质量的负调节物。GDF8在发育中和成年骨骼肌中是高度表达的。转基因小鼠中的GDF8无效突变的特征在于骨骼肌的明显肥厚和增生(McPherron等人，Nature，1997，387:83-90)。在牛中(Ashmore等人，1974，Growth，38:501-507；Swatland和Kieffer，J.Anim.Sci.，1994，38:752-757；McPherron和Lee，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94:12457-12461；以及Kambadur等人，Genome Res.，1997，7:910-915)，以及引人注目地，在人中(Schuelke等人，NEnglJMed2004；350:2682-8)天然存在的GDF8突变中，骨骼肌质量的类似增加是显而易见的。研究还已显示了，与人中的HIV感染相关的肌肉萎缩伴随GDF8多肽表达的增加(Gonzalez-Cadavid等人，Proc Natl Acad Sci USA，1998，95:14938-43)。另外，GDF8可以调节肌肉特异性酶(例如肌酸激酶)的产生并调节成肌细胞增殖(WO 00/43781)。GDF8前肽可以非共价地结合成熟GDF8结构域二聚体，使其生物活性失活(Miyazono等人(1988)J.Biol.Chem.，263:6407-6415；Wakefield等人(1988)J.Biol.Chem.，263；7646-7654；以及Brown等人(1990)GrowthFactors，3:35-43)。结合GDF8或结构上相关多肽并抑制其生物活性的其它多肽包括卵泡抑素，以及潜在的卵泡抑素相关多肽(Gamer等人(1999)Dev.Biol.，208:222-232)。
生长和分化因子11(GDF11)，也称为BMP11，是一种分泌蛋白(McPherron等人，1999，Nat.Genet.22:260-264)。GDF11在小鼠发育期间在尾芽、肢芽、上颌弓和下颌弓、以及背根神经节中表达(Nakashima等人，1999，Mech.Dev.80：185-189)。GDF11在使中胚层和神经组织两者模式化中发挥独特的作用(Gamer等人，1999，Dev Biol.，208:222-32)。GDF11显示为发育中的鸡肢体中的软骨发生和肌生成的负调节物(Gamer等人，2001，DevBiol.229:407-20)。GDF11在肌肉中的表达也提示了其以与GDF8类似的方式在调控肌肉生长方面的作用。另外，GDF11在脑中的表达提示了GDF11还可能具有与神经系统的功能有关的活性。有趣的是，发现GDF11抑制嗅上皮中的神经发生(Wu等人，2003，Neuron.37:197-207)。
部分地，本公开的实例证实了ActRIIB:ALK4异二聚体有效改善了如通过E/e'测量的舒张功能障碍，而与年龄无关，尽管在较早年龄时的治疗产生更稳固的结果。此外，ActRIIB(K55E)-Fc显示为改善了如通过E/e'测量的舒张功能障碍。与WT小鼠相比，射血分数在“db/db-媒介物”小鼠中并未降低，而BNP水平增加，指示了HFpEF。数据进一步提示了，除ActRIIB:ALK4异多聚体之外，其它ActRII-ALK4拮抗剂以及ActRII多肽和变体也可能可用于治疗与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭。
在某些方面，待按照本文公开的方法和用途(例如，治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭、或者心力衰竭的一种或多种并发症的进展速率和/或严重程度)使用的ActRII-ALK4拮抗剂是ActRII-ALK4配体捕获多肽拮抗剂，包括其变体以及其异二聚体和异多聚体，ActRII-ALK4抗体拮抗剂，ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂。ActRII-ALK4配体捕获多肽包括TGF-β超家族相关蛋白，包括其变体，其能够结合一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6和/或BMP10)。因此，ActRII-ALK4配体陷阱一般包括能够拮抗一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6和/或BMP10)的多肽。在一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂包含ActRII-ALK4配体陷阱。在一些实施方案中，ActRII-ALK4配体陷阱包含ActRIIB多肽，包括其变体，以及同多聚体(例如，ActRIIB同二聚体)和异多聚体(例如，ActRIIB-ALK4或ActRIIB-ALK7异二聚体)。在一些实施方案中，ActRII-ALK4配体陷阱包含ActRIIA多肽，包括其变体，以及同多聚体(例如，ActRIIA同二聚体)和异多聚体(例如，ActRIIA-ALK4或ActRIIA-ALK7异二聚体)。在其它实施方案中，ActRII-ALK配体陷阱包含可溶性配体捕获蛋白，包括但不限于卵泡抑素多肽以及其变体。在一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂包含ActRII-ALK4抗体拮抗剂(抑制激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10、ActRIIB、ActRIIA、ALK4和/或ALK7中的一种或多种的抗体)。在一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂包含ActRII-ALK4小分子拮抗剂(例如，抑制激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10、ActRIIB、ActRIIA、ALK4和/或ALK7中的一种或多种的小分子)。在一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂包含ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂(例如，抑制激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10、ActRIIB、ActRIIA、ALK4和/或ALK7中的一种或多种的核苷酸序列)。
在本说明书中使用的术语一般在本公开的上下文内以及在其中使用每个术语的具体上下文中具有其在本领域中的普通含义。某些术语在下文或说明书中的其它地方进行讨论，以在描述本公开的组合物和方法以及如何制备且使用其方面向从业者提供另外的指导。术语的任何使用的范围或含义根据它在其中使用的具体上下文将是显而易见的。
以其所有语法形式的术语“序列相似性”指可能共享或可能并不共享共同进化起源的核酸序列或氨基酸序列之间的同一性或对应程度。
相对于参考多肽(或核苷酸)序列的“百分比(％)序列同一性”定义为在比对序列并在必要时引入空位以实现最大百分比序列同一性后，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的部分，在候选序列中与参考多肽(核苷酸)序列中的氨基酸残基(或核酸)相同的氨基酸残基(或核酸)的百分比。用于确定百分比氨基酸序列同一性的目的的比对可以以在本领域技术内的各种方式来实现，例如使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在待比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成％氨基酸(核酸)序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.创作，并且源代码已与用户文档一起提交至美国版权局(U.S.Copyright Office)，Washington D.C.，20559，它在其中在美国版权注册号(U.S.Copyright RegistrationNo.)TXU510087下注册。ALIGN-2程序可从Genentech，Inc.，South San Francisco，Calif.公开获得，或者可以从源代码进行编译。ALIGN-2程序应该编译用于在UNIX操作系统包括数字UNIXV 4.0D上使用。所有序列比较参数都由ALIGN-2程序设定，而不改变。
以其所有语法形式的“激动”指激活蛋白质和/或基因(例如，通过激活或放大该蛋白质的基因表达或者通过诱导失活蛋白质进入活性状态)或者增加蛋白质和/或基因的活性的过程。
以其所有语法形式的“拮抗”指抑制蛋白质和/或基因(例如，通过抑制或减少该蛋白质的基因表达或者通过诱导活性蛋白质进入失活状态)或者减少蛋白质和/或基因的活性的过程。
如说明书和权利要求自始至终与数值结合使用的术语“约”和“大约”表示本领域技术人员熟悉和可接受的准确度区间。一般而言，此类准确度区间为±10％。可替代地且特别是在生物系统中，术语“约”和“大约”可以意指在一个数量级内的值，优选给定值的≤5倍且更优选≤2倍。
本文公开的数目范围包括定义该范围的数目在内。
术语“一个”和“一种”包括复数指示物，除非该术语在其中使用的上下文另有明确说明。术语“一个”(或“一种”)以及术语“一个或多个/一种或多种”和“至少一个/种”在本文中可以互换使用。此外，当在本文中使用时，“和/或”应被视为两个或更多个指定特征或组分各自连同或不连同另一个的具体公开。因此，如本文在短语例如“A和/或B”中使用的术语“和/或”预期包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样地，如在短语例如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”预期涵盖下述方面各自：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
在本说明书自始至终，词语“包含(comprise)”或变化例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应理解为暗示包括陈述的整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。
2.ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂及其变体
在某些方面，待按照本文公开的方法和用途(例如，治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭、或者心力衰竭的一种或多种并发症的进展速率和/或严重程度)使用的ActRII-ALK4拮抗剂是ActRII-ALK4配体捕获多肽，包括其变体以及其异二聚体和异多聚体。ActRII-ALK4配体捕获多肽包括TGF-β超家族相关蛋白，包括其变体，其能够结合一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6和BMP10)。因此，ActRII-ALK4配体陷阱一般包括能够拮抗一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6和BMP10)的多肽。例如，在一些实施方案中，ActRII-ALK4配体陷阱包含ActRII多肽，包括其变体，以及其同多聚体和异多聚体(例如，分别为同二聚体和异二聚体)。如本文所用，术语“ActRII”指II型激活素受体家族。该家族包括激活素受体IIA型(ActRIIA)和激活素受体IIB型(ActRIIB)。在一些实施方案中，ActRII-ALK4配体陷阱包含ActRIIB多肽，包括其变体，以及同多聚体(例如，ActRIIB同二聚体)和异多聚体(例如，ActRIIB-ALK4或ActRIIB-ALK7异二聚体)。在一些实施方案中，ActRII-ALK4配体陷阱包含ActRIIA多肽，包括其变体，以及同多聚体(例如，ActRIIA同二聚体)和异多聚体(例如，ActRIIA-ALK4或ActRIIA-ALK7异二聚体)。在其它实施方案中，ActRII-ALK配体陷阱包含可溶性配体捕获蛋白，包括但不限于卵泡抑素多肽以及其变体。
A)ActRIIB多肽
在某些方面，本公开涉及包含ActRIIB多肽(其包括其片段、功能变体和修饰形式)的ActRII-ALK4拮抗剂，以及其用途(例如，治疗、预防或降低心力衰竭(HF)或者HF的一种或多种并发症的进展速率和/或严重程度)。如本文所用，术语“ActRIIB”指来自任何物种的激活素受体IIB型(ActRIIB)蛋白家族，以及保留有用的活性，通过诱变或其它修饰而衍生自此类ActRIIB蛋白的变体多肽(包括例如突变体、片段、融合物和肽模拟物形式)。此类变体ActRIIB多肽的实例在本公开自始至终以及国际专利申请公开号WO 2006/012627、WO2008/097541、WO 2010/151426、WO 2011/020045、WO 2018/009624和WO 2018/067874中提供，所述国际专利申请通过引用以其整体并入本文。本文对ActRIIB的提及应理解为对当前鉴定的形式中的任何一种的提及。ActRIIB家族的成员一般都是跨膜多肽，由具有富含半胱氨酸区域的配体结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶特异性的细胞质结构域构成。人ActRIIB前体多肽的氨基酸序列显示于图2(SEQ ID NO:2)和下文中。优选地，待按照本公开的方法使用的ActRIIB多肽是可溶性的。如本文所用，术语“可溶性ActRIIB多肽”包括ActRIIB多肽的任何天然存在的细胞外结构域以及其保留有用活性的任何变体(包括突变体、片段和肽模拟物形式)。例如，ActRIIB多肽的细胞外结构域与配体结合并且一般是可溶性的。可溶性ActRIIB多肽的实例包括图3中所示的ActRIIB细胞外结构域(SEQ ID NO:1)以及SEQ ID NO:53。该截短的ActRIIB细胞外结构域(SEQ ID NO:53)基于SEQ ID NO:2中的编号表示为ActRIIB(25-131)。可溶性ActRIIB多肽的其它实例包含除ActRIIB多肽的细胞外结构域之外的信号序列(参见实施例4)。信号序列可以是ActRIIB的天然信号序列，或来自另一种多肽的信号序列，例如组织纤溶酶原激活物(TPA)信号序列或蜜蜂蜂毒肽信号序列。在一些实施方案中，ActRIIB多肽抑制一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)的(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，ActRIIB多肽结合一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)。用于确定ActRIIB多肽结合一种或多种ActRII-ALK4配体和/或抑制其活性的能力的方法和测定的各种实例在本文中得到公开或是本领域另外众所周知的，其可以容易地用于确定ActRIIB多肽是否具有所需的结合和/或拮抗活性。除非另有具体说明，否则关于本文描述的所有ActRIIB相关多肽的氨基酸的编号基于下文提供的人ActRIIB前体蛋白序列(SEQ ID NO:2)的编号。
人ActRIIB前体蛋白序列如下：
(SEQ ID NO:2，图2)
信号肽用单下划线指示；细胞外结构域以粗体字体指示；并且潜在的内源性N联糖基化位点用指示。
加工的(成熟的)细胞外ActRIIB多肽序列如下：
(SEQ ID NO:1，图3)。
在一些实施方案中，可以产生在N末端处具有“SGR…”序列的蛋白质。细胞外结构域的C末端“尾部”通过单下划线指示。具有“尾部”缺失的序列(Δ15序列)如下：
文献中还报道了在SEQ ID NO:2的位置64(A64)处具有丙氨酸的ActRIIB形式。参见例如，Hilden等人(1994)Blood，83(8):2163-2170。申请人已确定了包含具有A64取代的ActRIIB的细胞外结构域的ActRIIB-Fc融合蛋白对于激活素和GDF11具有相对低的亲和力。相比之下，在位置64处具有精氨酸(R64)的相同的ActRIIB-Fc融合蛋白对于激活素和GDF11具有在低纳摩尔至高皮摩尔范围内的亲和力。因此，具有R64的序列在本公开中用作人ActRIIB的“野生型”参考序列。
在位置64处具有丙氨酸的ActRIIB前体蛋白序列的形式如下：
信号肽通过单下划线指示，并且细胞外结构域通过粗体字体指示。
替代A64形式的加工的(成熟)细胞外ActRIIB多肽序列如下：
在一些实施方案中，可以产生在N末端处具有“SGR…”序列的蛋白质。细胞外结构域的C末端“尾部”通过单下划线指示。具有“尾部”缺失的替代A64形式的多肽序列(Δ15序列)如下：
编码人ActRIIB前体蛋白的核酸序列显示于下文(SEQ ID NO:4)，代表GenBank参考序列NM_001106.3的核苷酸25-1560，其编码ActRIIB前体的氨基酸1-513。如所示的核苷酸序列编码在位置64处具有精氨酸的多肽，并且可以进行修饰以编码具有代替的丙氨酸的多肽。信号序列是加下划线的。
(SEQ ID NO:4，图4)
编码加工的细胞外人ActRIIB多肽的核酸序列如下(SEQ ID NO:3)。如所示的核苷酸序列编码在位置64处具有精氨酸的多肽，并且可以进行修饰以编码具有代替的丙氨酸的多肽(参见图5，SEQ ID NO:3)。
(SEQ ID NO:3)
B)变体ActRIIB多肽
在某些具体实施方案中，本公开考虑了在ActRIIB多肽的细胞外结构域(也被称为配体结合结构域)中制备突变，使得变体(或突变体)ActRIIB多肽具有改变的配体结合活性(例如，结合亲和力或结合选择性)。在某些情况下，此类变体ActRIIB多肽对于特异性配体具有改变的(升高的或降低的)结合亲和力。在其它情况下，变体ActRIIB多肽对于其配体具有改变的结合选择性。例如，本公开提供了许多变体ActRIIB多肽，与未修饰的ActRIIB多肽相比，其对BMP9具有降低的结合亲和力，但保留对于激活素A、激活素B、GDF8、GDF11和BMP10中的一种或多种的结合亲和力。任选地，变体ActRIIB多肽具有其相应的野生型ActRIIB多肽相似或相同的生物活性。例如，本公开的变体ActRIIB多肽可以结合ActRIIB配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11或BMP10)并抑制其功能。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽治疗、预防或降低心力衰竭或者心力衰竭的一种或多种并发症的进展速率和/或严重程度。ActRIIB多肽的实例包括人ActRIIB前体多肽(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:387)，和可溶性人ActRIIB多肽(例如，SEQ ID NO:1、5、6、12、276、278、279、332、333、335、336、338、339、341、342、344、345、347、348、350、351、353、354、356、357、385、386、387、388、389、396、398、402、403、406、408和409)。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽是同多聚体(例如同二聚体)的成员。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽是异多聚体(例如异二聚体)的成员。在一些实施方案中，任何变体ActRIIB多肽可以与本文公开的任何多肽组合(例如，异多聚化和/或融合)。
ActRIIB跨越几乎所有脊椎动物是非常保守的，具有完全保守的大段的细胞外结构域。参见例如图6。与ActRIIB结合的许多配体也是高度保守的。相应地，来自各种脊椎动物生物的ActRIIB序列的比较提供了对可能改变的残基的了解。因此，活性、人ActRIIB变体可以包括在来自另一种脊椎动物ActRIIB的序列的相应位置处的一个或多个氨基酸，或者可以包括与人或其它脊椎动物序列中的残基相似的残基。
本公开鉴定了ActRIIB的功能活性部分和变体。申请人先前已确定了具有通过Hilden等人(Blood.1994Apr 15；83(8):2163-70)公开的序列的Fc融合多肽(其具有在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸64的位置处的丙氨酸(A64))，对于激活素和GDF11具有相对低的亲和力。相比之下，在位置64处具有精氨酸(R64)的相同Fc融合多肽对于激活素和GDF-11具有在低纳摩尔至高皮摩尔范围内的亲和力。因此，具有R64的序列(SEQ ID NO:2)在本公开中用作人ActRIIB的野生型参考序列，并且关于本文描述的变体的编号基于SEQ ID NO:2中的编号。另外，本领域技术人员可以在A64背景下制备本文描述的任何ActRIIB变体。
加工的细胞外ActRIIB多肽序列显示于SEQ ID NO:1中(参见例如图3)。在一些实施方案中，可以产生在N末端处具有“SGR…”序列的加工的ActRIIB多肽。在一些实施方案中，可以产生在N末端处具有“GRG…”序列的加工的ActRIIB多肽。例如，预计如果伴随TPA前导区表达，则一些构建体将缺少N末端丝氨酸。相应地，本文所述的成熟的ActRIIB序列可以以N末端丝氨酸或N末端甘氨酸开始(缺少N末端丝氨酸)。
Attisano等人(Cell.1992Jan 10；68(1):97-108)显示了在ActRIIB的细胞外结构域的C末端处的脯氨酸结的缺失降低了受体对于激活素的亲和力。WO2008097541中公开的数据显示了，相对于包括脯氨酸结区域和完整的近膜结构域的ActRIIB(20-134)-Fc，含有SEQ ID NO:2的氨基酸20-119的ActRIIB-Fc融合多肽“ActRIIB(20-119)-Fc”与GDF11和激活素具有降低的结合。然而，即使脯氨酸结区域被破坏，ActRIIB(20-129)-Fc多肽也保留了相对于野生型相似但稍微降低的活性。因此，在氨基酸134、133、132、131、130和129处终止的ActRIIB细胞外结构域预计都是活性的，但在134或133处终止的构建体可能是最有活性的。类似地，在残基129-134中的任一个处的突变并不预计大振幅地改变配体结合亲和力。支持了这一点，P129和P130的突变并未基本上减少配体结合。因此，ActRIIB-Fc融合多肽可以早在氨基酸109(最后的半胱氨酸)处结束，然而，在109和119处或其间结束的形式预计具有降低的配体结合。氨基酸119是弱保守的，并且因此很容易改变或截短。在128或更后处结束的形式保留配体结合活性。在119和127处或其间结束的形式将具有中等结合能力。取决于临床或实验环境，可能期望使用这些形式中的任一种。
在ActRIIB的N末端处，预计在氨基酸29处或之前开始的多肽将保留配体结合活性。氨基酸29代表最初的半胱氨酸。在位置24处的丙氨酸至天冬酰胺突变引入了N联糖基化序列，而基本上不影响配体结合。这确认了在信号切割肽和半胱氨酸交联区域之间的区域(对应于氨基酸20-29)中的突变是良好耐受的。特别地，在位置20、21、22、23和24处开始的构建体将保留活性，并且在位置25、26、27、28和29处开始的构建体也预计保留活性。WO2008097541中显示的数据证实了，令人惊讶地，在22、23、24或25处开始的构建体将具有最大的活性。
总的来说，ActRIIB的活性部分包含SEQ ID NO:2的氨基酸29-109，并且构建体可以例如在对应于氨基酸20-29的残基处开始并在对应于氨基酸109-134的位置处结束。其它实例包括在来自20-29或21-29处的位置开始，并且在来自119-134、119-133或129-134、129-133的位置处结束的构建体。其它实例包括在来自20-24(或21-24、或22-25)的位置处开始，并且在来自109-134(或109-133)、119-134(或119-133)或129-134(或129-133)的位置处结束的构建体。还考虑了在这些范围内的变体，特别是与SEQ ID NO:1的相应部分具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的那些变体。
本文描述的变化可以以各种方式进行组合。在一些实施方案中，ActRIIB变体包含在配体结合口袋中的不多于1、2、5、6、7、8、9、10或15个保守氨基酸变化，任选地在配体结合口袋中的位置40、53、55、74、79和/或82处的零个、一个或多个非保守改变。在其处变异性可以是特别良好地耐受的在结合口袋外的位点包括细胞外结构域的氨基末端和羧基末端(如上文指出的)，以及位置42-46和65-73(相对于SEQ ID NO:2)。在位置65处的天冬酰胺至丙氨酸改变(N65A)似乎并不减少在R64背景中的配体结合[美国专利号7,842,663]。这种变化很可能消除了在A64背景中的N65处的糖基化，因此证实了该区域中的显著变化有可能是耐受的。虽然R64A变化是弱耐受的，但R64K是良好耐受的，并且因此另一个碱性残基，例如H在位置64处可能是耐受的[美国专利号7,842,663]。另外，本领域描述的诱变程序的结果指示了在ActRIIB中存在经常有益于保守的氨基酸位置。就SEQ ID NO:2而言，这些包括位置80(酸性或疏水性氨基酸)、位置78(疏水性，且特别是色氨酸)、位置37(酸性，且特别是天冬氨酸或谷氨酸)、位置56(碱性氨基酸)、位置60(疏水性氨基酸，特别是苯丙氨酸或酪氨酸)。因此，本公开提供了在ActRIIB多肽中可能是保守的氨基酸构架。可能期望保守的其它位置如下：位置52(酸性氨基酸)、位置55(碱性氨基酸)、位置81(酸性)、位置98(极性或荷电的，特别是E、D、R或K)，全部相对于SEQ ID NO:2。
先前已证实了，在ActRIIB细胞外结构域内添加进一步的N联糖基化位点(N-X-S/T)是良好耐受的(参见例如美国专利号7,842,663)。因此，N-X-S/T序列一般可以在本公开的ActRIIB多肽中，在图1中限定的配体结合口袋外的位置处引入。用于引入非内源性N-X-S/T序列的特别合适的位点包括氨基酸20-29、20-24、22-25、109-134、120-134或129-134(相对于SEQ ID NO:2)。N-X-S/T序列还可以引入ActRIIB序列和Fc结构域或其它融合组分之间的接头内，以及任选地引入融合组分本身内。通过在相对于预先存在的S或T的正确位置中引入N，或者通过在对应于预先存在的N的位置处引入S或T，此类位点可以伴随最小的努力引入。因此，将产生N联糖基化位点的期望改变是：A24N、R64N、S67N(可能与N65A改变组合)、E105N、R112N、G120N、E123N、P129N、A132N、R112S和R112T(相对于SEQ ID NO:2)。由于通过糖基化提供的保护，预测为糖基化的任何S都可以改变为T，而不产生免疫原性位点。同样地，预测为糖基化的任何T都可以改变为S。因此，考虑了改变S67T和S44T(相对于SEQ IDNO:2)。同样地，在A24N变体中，可以使用S26T改变。相应地，本公开的ActRIIB多肽可以是具有如上文描述的一个或多个另外的、非内源性N联糖基化共有序列的变体。
在某些实施方案中，变体ActRIIB多肽具有的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:1、2和53的氨基酸序列具有至少75％同一性。在某些情况下，变体ActRIIB多肽具有的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:1、2和53的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些情况下，变体ActRIIB多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些情况下，变体ActRIIB多肽具有的氨基酸序列与SEQID NO:2具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些情况下，变体ActRIIB多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:53具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:1、2、5、6、12、31、33、34、36、37、39、40、42、43、45、46、48、49、50、51、52、53、276、278、279、332、333、335、336、338、339、341、342、344、345、347、348、350、351、353、354、356、357、385、386、387、388、389、396、398、402、403、406、408和409中的任何一个的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:1的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:2的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:5的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:6的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:12的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:31的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:33的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:34的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:34的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:36的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:36的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:37的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:37的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:39的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:40的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:40的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:42的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:42的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:43的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:45的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:46的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:48的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:48的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:49的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:50的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:51的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:51的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:52的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:52的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:53的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:276的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:276的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:278的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:278的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:279的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:279的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:332的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:332的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:333的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:333的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:335的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:335的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:336的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:336的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQID NO:338的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:338的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:339的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:339的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:341的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:341的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:342的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:342的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:344的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:344的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:345的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:345的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:347的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:347的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:348的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:348的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:350的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:350的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:351的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:351的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:353的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:353的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQID NO:354的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:354的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:356的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:356的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:357的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:357的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:385的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:385的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:386的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:386的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:387的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:387的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:388的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:388的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:389的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:389的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:396的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:396的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:398的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:398的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:402的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:402的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQID NO:403的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:403的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:406的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:406的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:408的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:408的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。在一些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽或变体ActRIIB-Fc融合多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:409的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。包含SEQ ID NO:409的ActRIIB-Fc融合蛋白可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与如下的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，所述氨基酸序列在SEQ ID NO:2的氨基酸20-29中的任何一个(例如，氨基酸残基20、21、22、23、24、25、26、27、28或29)处开始，并且在SEQ ID NO:2的氨基酸109-134中的任何一个(例如，氨基酸残基109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134)处结束，并且其中所述多肽包含选自以下的在SEQ ID NO:2的位置处的一个或多个氨基酸取代：K55、F82、L79、A24、K74、R64、P129、P130、E37、R40、D54、R56、W78、D80和F82，以及包含一种或多种此类变体ActRIIB多肽的异多聚体复合物。在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与如下的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，所述氨基酸序列在SEQ ID NO:2的氨基酸20-29中的任何一个(例如，氨基酸残基20、21、22、23、24、25、26、27、28或29)处开始，并且在SEQ ID NO:2的氨基酸109-134中的任何一个(例如，氨基酸残基109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134)处结束，并且其中所述多肽包含在SEQ ID NO:2的位置处的一个或多个氨基酸取代，但其中在对应于SEQ ID NO:2的79的位置处的氨基酸是亮氨酸，以及包含一种或多种此类变体ActRIIB多肽的异多聚体复合物。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸29-109具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸25-131具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸20-134具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的A24的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是A24N。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的S26的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是S26T。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的N35的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是N35E。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的E37的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是E37A。在一些实施方案中，取代是E37D。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的L38的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是L38N。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的R40的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是R40A。在一些实施方案中，取代是R40K。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的S44的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是S44T。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的L46的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是L46A。例如，在一些实施方案中，取代是L46I。例如，在一些实施方案中，取代是L46F。例如，在一些实施方案中，取代是L46V。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的E50的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是E50K。在一些实施方案中，取代是E50L。在一些实施方案中，取代是E50P。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的E52的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是E52A。在一些实施方案中，取代是E52D。在一些实施方案中，取代是E52G。在一些实施方案中，取代是E52H。在一些实施方案中，取代是E52K。在一些实施方案中，取代是E52N。在一些实施方案中，取代是E52P。在一些实施方案中，取代是E52R。在一些实施方案中，取代是E52S。在一些实施方案中，取代是E52T。在一些实施方案中，取代是E52Y。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的Q53的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是Q53R。例如，在一些实施方案中，取代是Q53K。例如，在一些实施方案中，取代是Q53N。例如，在一些实施方案中，取代是Q53H。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQID NO:2的D54的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是D54A。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的K55的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是K55A。在一些实施方案中，取代是K55E。在一些实施方案中，取代是K55D。在一些实施方案中，取代是K55R。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ IDNO:2的R56的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是R56A。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的L57的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是L57R。在一些实施方案中，取代是L57E。在一些实施方案中，取代是L57I。在一些实施方案中，取代是L57T。在一些实施方案中，取代是L57V。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的Y60的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是Y60F。在一些实施方案中，取代是Y60D。在一些实施方案中，取代是Y60K。在一些实施方案中，取代是Y60P。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的R64的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是R64K。在一些实施方案中，取代是R64N。在一些实施方案中，取代是R64A。在一些实施方案中，取代是R64H。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的N65的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是N65A。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的S67的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是S67N。在一些实施方案中，取代是S67T。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的G68的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是G68R。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ IDNO:2的K74的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是K74A。在一些实施方案中，取代是K74E。在一些实施方案中，取代是K74F。在一些实施方案中，取代是K74I。在一些实施方案中，取代是K74Y。在一些实施方案中，取代是K74R。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的W78的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是W78A。在一些实施方案中，取代是W78Y。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQID NO:2的L79的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是L79D。在一些实施方案中，取代并不包含在对应于SEQ ID NO:2的L79的位置处的酸性氨基酸。在一些实施方案中，取代并不在SEQ ID NO:2的位置L79处。在一些实施方案中，SEQ ID NO:2的位置L79未被取代。在一些实施方案中，取代并不包含在对应于SEQ ID NO:2的L79的位置处的天冬氨酸(D)。在一些实施方案中，取代是L79A。在一些实施方案中，取代是L79E。在一些实施方案中，取代是L79F。在一些实施方案中，取代是L79H。在一些实施方案中，取代是L79K。在一些实施方案中，取代是L79P。在一些实施方案中，取代是L79R。在一些实施方案中，取代是L79S。在一些实施方案中，取代是L79T。在一些实施方案中，取代是L79W。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的D80的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是D80A。在一些实施方案中，取代是D80F。在一些实施方案中，取代是D80K。在一些实施方案中，取代是D80G。在一些实施方案中，取代是D80M。在一些实施方案中，取代是D80I。在一些实施方案中，取代是D80N。在一些实施方案中，取代是D80R。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的F82的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是F82I。在一些实施方案中，取代是F82K。在一些实施方案中，取代是F82A。在一些实施方案中，取代是F82W。在一些实施方案中，取代是F82D。在一些实施方案中，取代是F82Y。在一些实施方案中，取代是F82E。在一些实施方案中，取代是F82L。在一些实施方案中，取代是F82T。在一些实施方案中，取代是F82S。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的N83的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是N83A。在一些实施方案中，取代是N83R。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的T93的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是T93D。在一些实施方案中，取代是T93E。在一些实施方案中，取代是T93H。在一些实施方案中，取代是T93G。在一些实施方案中，取代是T93K。在一些实施方案中，取代是T93P。在一些实施方案中，取代是T93R。在一些实施方案中，取代是T93S。在一些实施方案中，取代是T93Y。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的E94的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是E94K。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的Q98的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是Q98D。在一些实施方案中，取代是Q98E。在一些实施方案中，取代是Q98K。在一些实施方案中，取代是Q98R。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的V99的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是V99E。在一些实施方案中，取代是V99G。在一些实施方案中，取代是V99K。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的E105的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是E105N。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的E106的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是E106N。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的F108的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是F108I。在一些实施方案中，取代是F108L。在一些实施方案中，取代是F108V。在一些实施方案中，取代是F108Y。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的E111的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是E111K。在一些实施方案中，取代是E111D。在一些实施方案中，取代是E111R。在一些实施方案中，取代是E111H。在一些实施方案中，取代是E111Q。在一些实施方案中，取代是E111N。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的R112的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是R112H。在一些实施方案中，取代是R112K。在一些实施方案中，取代是R112N。在一些实施方案中，取代是R112S。在一些实施方案中，取代是R112T。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的A119的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是A119P。在一些实施方案中，取代是A119V。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ IDNO:2的G120的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是G120N。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的E123的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是E123N。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的P129的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是P129S。在一些实施方案中，取代是P129N。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的P130的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是P130A。在一些实施方案中，取代是P130R。在一些实施方案中，多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的A132的氨基酸位置处的氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，取代是A132N。
在一些实施方案中，本文公开的任何变体ActRIIB多肽包含选自以下的在SEQ IDNO:2的位置处的取代：A24、E37、R40、D54、K55、R56、R64、K74、W78、L79、D80、F82、P129和P130。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在相对于SEQ ID NO:2的位置A24处的取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在相对于SEQ ID NO:2的位置E37处的取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在相对于SEQ ID NO:2的位置R40处的取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在相对于SEQ ID NO:2的位置D54处的取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在相对于SEQ ID NO:2的位置K55处的取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在相对于SEQ ID NO:2的位置R56处的取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在相对于SEQ ID NO:2的位置R64处的取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在相对于SEQ ID NO:2的位置K74处的取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在相对于SEQ ID NO:2的位置W78处的取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在相对于SEQ ID NO:2的位置L79处的取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在相对于SEQ ID NO:2的位置D80处的取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在相对于SEQ ID NO:2的位置F82处的取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在相对于SEQ ID NO:2的位置P129处的取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在相对于SEQ ID NO:2的位置P130处的取代。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的K55的位置处的丙氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:31的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的K55的位置处的丙氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:33的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:34的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的K55的位置处的谷氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:34的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:36的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的K55的位置处的谷氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:36的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:37的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的F82的位置处的异亮氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:37的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的F82的位置处的异亮氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:39的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:40的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的F82的位置处的赖氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:40的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:42的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的F82的位置处的赖氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:42的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的L79的位置处的谷氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:43的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的L79的位置处的谷氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:45的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:336的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的F82的位置处的苏氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:336的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:338的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的F82的位置处的苏氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:338的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:342的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的L79的位置处的组氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:342的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:344的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的L79的位置处的组氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:344的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:348的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的E50的位置处的亮氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:348的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:350的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的E50的位置处的亮氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:350的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:354的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的V99的位置处的甘氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:354的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:356的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的V99的位置处的甘氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:356的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在一些实施方案中，本文公开的任何变体ActRIIB多肽包含本文公开的任何氨基酸取代中的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在一些实施方案中，本文公开的任何变体ActRIIB多肽包含本文公开的任何氨基酸取代中的2个。在一些实施方案中，本文公开的任何变体ActRIIB多肽包含本文公开的任何氨基酸取代中的3个。在一些实施方案中，本文公开的任何变体ActRIIB多肽包含本文公开的任何氨基酸取代中的4个。在一些实施方案中，本文公开的任何变体ActRIIB多肽包含本文公开的任何氨基酸取代中的5个。在一些实施方案中，本文公开的任何变体ActRIIB多肽包含本文公开的任何氨基酸取代中的6个。在一些实施方案中，本文公开的任何变体ActRIIB多肽包含本文公开的任何氨基酸取代中的7个。在一些实施方案中，本文公开的任何变体ActRIIB多肽包含本文公开的任何氨基酸取代中的8个。在一些实施方案中，本文公开的任何变体ActRIIB多肽包含本文公开的任何氨基酸取代中的9个。在一些实施方案中，本文公开的任何变体ActRIIB多肽包含本文公开的任何氨基酸取代中的10个。
在某些方面，本公开涉及与SEQ ID NO:2的参考氨基酸序列相比，包含两个或更多个氨基酸取代的变体ActRIIB多肽。例如，在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含A24N取代和K74A取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含L79P取代和K74A取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含P129S取代和P130A取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含L38N取代和L79R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含F82I取代和N83R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含F82K取代和N83R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含F82T取代和N83R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含L79H取代和F82K取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含L79H取代和F82I取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含F82D取代和N83R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含F82E取代和N83R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含L79F取代和F82D取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含L79F取代和F82T取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含E52D取代和F82D取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含E52D取代和F82T取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含L57R取代和F82D取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含L57R取代和F82T取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含F82I取代和E94K取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含F82S取代和N83R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含L57R取代和F82S取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含K74A取代和L79P取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含K55A取代和F82I取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含L79K取代和F82K取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含F82W取代和N83A取代。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:276的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的F82的位置处的异亮氨酸。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的N83的位置处的精氨酸。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的F82的位置处的异亮氨酸以及在对应于SEQ ID NO:2的N83的位置处的精氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:276的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:278的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的F82的位置处的异亮氨酸。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的N83的位置处的精氨酸。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的F82的位置处的异亮氨酸以及在对应于SEQ ID NO:2的N83的位置处的精氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:278的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:279的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的F82的位置处的赖氨酸。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的N83的位置处的精氨酸。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的F82的位置处的赖氨酸以及在对应于SEQ ID NO:2的N83的位置处的精氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:279的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:332的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的F82的位置处的赖氨酸。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的N83的位置处的精氨酸。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的F82的位置处的赖氨酸以及在对应于SEQ ID NO:2的N83的位置处的精氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:332的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:333的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的F82的位置处的苏氨酸。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的N83的位置处的精氨酸。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的F82的位置处的苏氨酸以及在对应于SEQ ID NO:2的N83的位置处的精氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:333的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:335的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的F82的位置处的苏氨酸。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的N83的位置处的精氨酸。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的F82的位置处的苏氨酸以及在对应于SEQ ID NO:2的N83的位置处的精氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:335的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:339的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的L79的位置处的组氨酸。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的F82的位置处的异亮氨酸。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的L79的位置处的组氨酸以及在对应于SEQ ID NO:2的F82的位置处的异亮氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:339的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:341的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的L79的位置处的组氨酸。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的F82的位置处的异亮氨酸。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的L79的位置处的组氨酸以及在对应于SEQ ID NO:2的F82的位置处的异亮氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:341的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:345的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的L79的位置处的组氨酸。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的F82的位置处的赖氨酸。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的L79的位置处的组氨酸以及在对应于SEQ ID NO:2的F82的位置处的赖氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:345的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:347的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的L79的位置处的组氨酸。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的F82的位置处的赖氨酸。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的L79的位置处的组氨酸以及在对应于SEQ ID NO:2的F82的位置处的赖氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:347的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:351的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的L38的位置处的天冬酰胺。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的L79的位置处的精氨酸。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的L38的位置处的天冬酰胺以及在对应于SEQ ID NO:2的L79的位置处的精氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:351的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及变体ActRIIB多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:353的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQID NO:2的L38的位置处的天冬酰胺。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的L79的位置处的精氨酸。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的L38的位置处的天冬酰胺以及在对应于SEQ ID NO:2的L79的位置处的精氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:353的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
在某些方面，本公开涉及与SEQ ID NO:2的参考氨基酸序列相比，包含三个或更多个氨基酸取代的变体ActRIIB多肽。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含G68R取代、F82S取代和N83R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含G68R取代、W78Y取代和F82Y取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含E52D取代、F82D取代和N83R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含E52Y取代、F82D取代和N83R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含E52D取代、F82E取代和N83R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含E52D取代、F82T取代和N83R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含E52N取代、F82I取代和N83R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含E52N取代、F82Y取代和N83R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含E50L取代、F82D取代和N83R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含L57I取代、F82D取代和N83R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含L57V取代、F82D取代和N83R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含L57R取代、F82D取代和N83R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含L57E取代、F82E取代和N83R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含L57R取代、F82E取代和N83R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含L57I取代、F82E取代和N83R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含L57R取代、F82L取代和N83R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含L57T取代、F82Y取代和N83R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含L57V取代、F82Y取代和N83R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽可以包含在上文的任何变体ActRIIB多肽中描述的氨基酸取代中的至少两个。
在某些方面，本公开涉及与SEQ ID NO:2的参考氨基酸序列相比，包含四个或更多个氨基酸取代的变体ActRIIB多肽。例如，在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含G68R取代、L79E取代、F82Y取代和N83R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含G68R取代、L79E取代、F82T取代和N83R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含G68R取代、L79T取代、F82T取代和N83R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽包含E52N取代、G68R取代、F82Y取代和N83R取代。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽可以包含在上文的任何变体ActRIIB多肽中描述的氨基酸取代中的至少两个。在一些实施方案中，变体ActRIIB多肽可以包含在上文的任何变体ActRIIB多肽中描述的氨基酸取代中的至少三个。
C)ActRIIA多肽
在某些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA多肽(其包括其片段、功能变体和修饰形式)的ActRII-ALK4拮抗剂，以及其用途(例如，治疗、预防或降低心力衰竭(HF)或者HF的一种或多种并发症的进展速率和/或严重程度)。如本文所用，术语“ActRIIA”指来自任何物种的激活素受体IIA型(ActRIIA)蛋白家族，以及保留有用的活性，通过诱变或其它修饰而衍生自此类ActRIIA蛋白的变体多肽(包括例如突变体、片段、融合物和肽模拟物形式)。此类变体ActRIIA多肽的实例在本公开自始至终以及国际专利申请公开号WO 2006/012627和WO 2007/062188中提供，所述国际专利申请通过引用以其整体并入本文。本文对ActRIIA的提及应理解为对当前鉴定的形式中的任何一种的提及。ActRIIA家族的成员一般都是跨膜蛋白质，由包含富含半胱氨酸区域的配体结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的细胞质结构域构成。优选地，待按照本公开的方法使用的ActRIIA多肽是可溶性的(例如，ActRIIA的细胞外结构域)。在一些实施方案中，ActRIIA多肽抑制一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)的(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，ActRIIA多肽结合一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)。用于确定ActRIIA多肽结合一种或多种ActRII-ALK4配体和/或抑制其活性的能力的方法和测定的各种实例在本文中得到公开或是本领域另外众所周知的，其可以容易地用于确定ActRIIA多肽是否具有所需的结合和/或拮抗活性。除非另有具体说明，否则关于本文描述的所有ActRIIA相关多肽的氨基酸的编号基于下文提供的人ActRIIA前体蛋白序列(SEQ ID NO:366)的编号。
规范的人ActRIIA前体蛋白序列如下：
信号肽通过单下划线指示；细胞外结构域以粗体字体指示；并且潜在的内源性N联糖基化位点通过指示。/>
加工的(成熟的)细胞外人ActRIIA多肽序列如下：
细胞外结构域的C末端“尾部”通过单下划线指示。具有“尾部”缺失的序列(Δ15序列)如下：
编码人ActRIIA前体蛋白的核酸序列显示于下文(SEQ ID NO:369)，其对应于GenBank参考序列NM_001616.4的核苷酸159-1700。信号序列是加下划线的。
/>
编码加工的可溶性(细胞外)人ActRIIA多肽的核酸序列如下：
(SEQ ID NO:370)
ActRIIA在脊椎动物中是非常保守的，具有完全保守的大段的细胞外结构域。例如，图10描绘了人ActRIIA细胞外结构域(SEQ ID NO:367)与各种ActRIIA直向同源物(SEQID NO:371-377)相比的多序列比对。与ActRIIA结合的许多配体也是高度保守的。相应地，根据这些比对，预测在配体结合结构域内对于正常ActRIIA-配体结合活性重要的关键氨基酸位置，以及预测有可能耐受取代而不显著改变正常的ActRIIA-配体结合活性的氨基酸位置是可能的。因此，按照本文公开的方法有用的活性、人ActRIIA变体多肽可以包括在来自另一种脊椎动物ActRIIA的序列的相应位置处的一个或多个氨基酸，或者可以包括与人或其它脊椎动物序列中的残基相似的残基。
不意欲是限制性的，下述实例示出了定义活性ActRIIA变体的这种方法。如图10中所示出的，人细胞外结构域中的F13在绵羊(Ovis aries)(SEQ ID NO:371)、原鸡(Gallusgallus)(SEQ ID NO:374)、牛(Bos Taurus)(SEQ ID NO:375)、仓鸮(Tyto alba)(SEQ ID NO:376)和大卫鼠耳蝠(Myotis davidii)(SEQ ID NO:377)ActRIIA中是Y，指示了芳香族残基在该位置处是耐受的，包括F、W和Y。人细胞外结构域中的Q24在牛ActRIIA中是R，指示了荷电残基在该位置处将是耐受的，包括D、R、K、H和E。人细胞外结构域中的S95在原鸡和仓鸮ActRIIA中是F，指示了该位点可能耐受广泛各种变化，包括极性残基例如E、D、K、R、H、S、T、P、G、Y，以及很可能的疏水性残基例如L、I或F。人细胞外结构域中的E52在绵羊ActRIIA中是D，指示了酸性残基在该位置处是耐受的，包括D和E。人细胞外结构域中的P29是相对弱保守的，在绵羊ActRIIA中显示为S且在大卫鼠耳蝠ActRIIA中显示为L，因此基本上任何氨基酸在该位置处都应该是耐受的。
此外，如上文讨论的，ActRII蛋白已在本领域中在结构/功能特性方面进行表征，特别是关于配体结合[Attisano等人(1992)Cell 68(1):97-108；Greenwald等人(1999)Nature Structural Biology 6(1):18-22；Allendorph等人(2006)Proc Natl Acad SciUSA 103(20:7643-7648；Thompson等人(2003)The EMBO Journal 22(7):1555-1566；以及美国专利号：7,709,605、7,612,041和7,842,663]。除本文的教导之外，这些参考文献还提供了关于如何生成保留一种或多种所需活性(例如，配体结合活性)的ActRII变体的充分指导。
例如，称为三指毒素折叠的定义结构基序对于通过I型和II型受体的配体结合是重要的，并且由定位于每个单体受体的细胞外结构域内的不同位置处的保守半胱氨酸残基形成[Greenwald等人(1999)Nat Struct Biol 6:18-22；以及Hinck(2012)FEBS Lett 586:1860-1870]。相应地，如通过这些保守半胱氨酸的最外层划分的，人ActRIIA的核心配体结合结构域对应于SEQ ID NO:366(ActRIIA前体)的位置30-110。因此，这些半胱氨酸划分的核心序列侧翼的结构上排序较低的氨基酸可以被截短在N末端处的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个残基，以及在C末端处的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个残基，而不一定改变配体结合。示例性的ActRIIA细胞外结构域截短包括SEQ ID NO:367和368。
相应地，关于ActRIIA的活性部分(例如，配体结合)的通式是包含SEQ ID NO:366的氨基酸30-110、基本上由其组成或由其组成的多肽。因此，ActRIIA多肽可以例如包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与ActRIIA的一部分具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，所述ActRIIA的一部分在对应于SEQ ID NO:366的氨基酸21-30中的任何一个的残基处开始(例如，在氨基酸21、22、23、24、25、26、27、28、29或30中的任何一个处开始)，并且在对应于SEQ ID NO:366的氨基酸110-135中的任何一个的位置处结束(例如，在氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135中的任何一个处结束)。其它实例包括这样的构建体，其在选自SEQ ID NO:366的21-30(例如，在氨基酸21、22、23、24、25、26、27、28、29或30中的任何一个处开始)、22-30(例如，在氨基酸22、23、24、25、26、27、28、29或30中的任何一个处开始)、23-30(例如，在氨基酸23、24、25、26、27、28、29或30中的任何一个处开始)、24-30(例如，在氨基酸24、25、26、27、28、29或30中的任何一个处开始)的位置处开始，并且在选自SEQ ID NO:366的111-135(例如，在氨基酸111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135中的任何一个处结束)、112-135(例如，在氨基酸112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135中的任何一个处结束)、113-135(例如，在氨基酸113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135中的任何一个处结束)、120-135(例如，在氨基酸120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135)、130-135(例如，在氨基酸130、131、132、133、134或135中的任何一个处结束)、111-134(例如，在氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中的任何一个处结束)、111-133(例如，在氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132或133中的任何一个处结束)、111-132(例如，在氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131或132中的任何一个处结束)或111-131(例如，在氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130或131中的任何一个处结束)的位置处结束。还考虑了在这些范围内的变体，特别是包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成的那些变体，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:366的相应部分具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。因此，在一些实施方案中，ActRIIA多肽可以包含多肽、基本上由多肽组成或由多肽组成，所述多肽与SEQ ID NO:366的氨基酸30-110具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。任选地，ActRIIA多肽包含这样的多肽，其与SEQ ID NO:366的氨基酸30-110具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，并且包含在配体结合口袋中的不多于1、2、5、10或15个保守氨基酸变化。在一些实施方案中，本公开的ActRIIA多肽包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与ActRIIA的一部分至少具有70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，所述ActRIIA的一部分在对应于SEQ IDNO:366的氨基酸21-30的残基处开始(例如，在氨基酸21、22、23、24、25、26、27、28、29或30中的任何一个处开始)，并且在对应于SEQ ID NO:366的氨基酸110-135中的任何一个的位置处结束(例如，在氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135中的任何一个处结束)。在一些实施方案中，ActRIIA多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:366的氨基酸30-110具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，ActRIIA多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:366的氨基酸21-135具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，ActRIIA多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:366的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，ActRIIA多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:367的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，ActRIIA多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:368的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，ActRIIA多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:380的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，ActRIIA多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:381的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，ActRIIA多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:384的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，ActRIIA多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:364的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，ActRIIA多肽包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQID NO:378的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。
D)ALK4多肽
在某些方面，本公开涉及包含ALK4多肽(其包括其片段、功能变体和修饰形式)的ActRII-ALK4拮抗剂，以及其用途(例如，治疗、预防或降低心力衰竭(HF)或者HF的一种或多种并发症的进展速率和/或严重程度)。如本文所用，术语“ALK4”指来自任何物种的激活素受体样激酶4(ALK4)蛋白家族，以及保留有用的活性，通过诱变或其它修饰而衍生自此类ALK4蛋白的变体多肽(包括例如突变体、片段、融合物和肽模拟物形式)。此类变体ALK4多肽的实例在本公开自始至终以及国际专利申请公开号WO/2016/164089、WO/2016/164497和WO/2018/067879中提供，所述国际专利申请通过引用以其整体并入本文。本文对ALK4的提及应理解为对当前鉴定的形式中的任何一种的提及。ALK4家族的成员一般是跨膜蛋白质，由具有富含半胱氨酸区域的配体结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的细胞质结构域构成。优选地，待按照本公开的方法使用的ALK4多肽是可溶性的。如本文所用，术语“可溶性ALK4多肽”包括ALK4多肽的任何天然存在的细胞外结构域以及其保留有用活性的任何变体(包括突变体、片段和肽模拟物形式)。例如，ALK4多肽的细胞外结构域与配体结合并且一般是可溶性的。可溶性ALK4多肽的实例包括下文显示的ALK4细胞外结构域(SEQ ID NO:86)。可溶性ALK4多肽的其它实例包含除ALK4多肽的细胞外结构域之外的信号序列。信号序列可以是ALK4多肽的天然信号序列，或来自另一种多肽的信号序列，例如组织纤溶酶原激活物(TPA)信号序列或蜜蜂蜂毒肽信号序列。在一些实施方案中，ALK4多肽抑制一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)的(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，ALK4多肽结合一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)。用于确定ALK4多肽结合一种或多种ActRII-ALK4配体和/或抑制其活性的能力的方法和测定的各种实例在本文中得到公开或是本领域另外众所周知的，其可以容易地用于确定ActRIIB多肽是否具有所需的结合和/或拮抗活性。除非另有具体说明，否则关于本文描述的所有ALK4相关多肽的氨基酸的编号基于下文提供的人ALK4前体蛋白序列(SEQ ID NO:84)的编号。
人ALK4前体多肽序列(NCBI RefSeq NP_004293)如下：
信号肽通过单下划线指示，并且细胞外结构域以粗体字体指示。
加工的细胞外人ALK4多肽序列如下：
编码ALK4前体多肽的核酸序列显示于SEQ ID NO:221)中，对应于GenBank参考序列NM_004302.4的核苷酸78-1592。
信号序列是加下划线的，并且细胞外结构域以粗体字体指示。
编码细胞外ALK4多肽的核酸序列显示于SEQ ID NO:222中。
人ALK4前体蛋白序列的替代同种型，同种型B(NCBI Ref Seq NP_064732.3)如下：
细胞外结构域以粗体字体指示。
对应于上文同种型B的加工的细胞外ALK4多肽序列如下：
编码ALK4前体蛋白(同种型B)的核酸序列显示于下文(SEQ ID NO:423)，对应于GenBank参考序列NM_020327.3的核苷酸186-1547。
编码细胞外结构域的核苷酸以粗体字体指示。
/>
编码胞外ALK4多肽(同种型B)的核酸序列如下：
人ALK4前体多肽序列的替代同种型，同种型C(NCBI Ref Seq NP_064733.3)如下：
信号肽通过单下划线指示，并且细胞外结构域以粗体字体指示。
加工的细胞外ALK4多肽序列(同种型C)如下：
编码ALK4前体多肽(同种型C)的核酸序列显示于SEQ ID NO:223中，对应于GenBank参考序列NM_020328.3的核苷酸78-1715。
编码细胞外ALK4多肽(同种型C)的核酸序列显示于SEQ ID NO:224中。
ALK4在脊椎动物中是非常保守的，具有完全保守的大段的细胞外结构域。例如，图9描绘了人ALK4细胞外结构域与各种ALK4直向同源物相比的多序列比对。与ALK4结合的许多配体也是高度保守的。相应地，根据这些比对，预测在配体结合结构域内对于正常ALK4-配体结合活性重要的关键氨基酸位置，以及预测有可能耐受取代而不显著改变正常的ALK4-配体结合活性的氨基酸位置是可能的。因此，按照本文公开的方法有用的活性、人ALK4变体多肽可以包括在来自另一种脊椎动物ALK4的序列的相应位置处的一个或多个氨基酸，或者可以包括与人或其它脊椎动物序列中的残基相似的残基。
不意欲是限制性的，下述实例示出了定义活性ALK4变体的这种方法。如图9中所示出的，人ALK4细胞外结构域(SEQ ID NO:414)中的V6在小家鼠(Mus muculus)ALK4(SEQ IDNO:418)中是异亮氨酸，并且因此该位置可以是改变的，并且任选地可以改变为另一个疏水性残基例如L、I或F，或者非极性残基例如A，如在原鸡ALK4(SEQ ID NO:417)中观察到的。人细胞外结构域中的E40在原鸡ALK4中是K，指示了该位点可能耐受广泛各种变化，包括极性残基例如E、D、K、R、H、S、T、P、G、Y，以及很可能的非极性残基例如A。人细胞外结构域中的S15在原鸡ALK4中是D，指示了广泛结构变异在该位置处是耐受的，其中极性残基是有利的，例如S、T、R、E、K、H、G、P、G和Y。人细胞外结构域中的E40在原鸡ALK4中是K，指示了荷电残基在该位置处将是耐受的，包括D、R、K、H以及Q和N。人细胞外结构域中的R80在星鼻鼹(Condylura cristata)ALK4(SEQ ID NO:415)中是K，指示了碱性残基在该位置处是耐受的，包括R、K和H。人细胞外结构域中的Y77在野猪(Sus scrofa)ALK4(SEQ ID NO:419)中是F，指示了芳香族残基在该位置处是耐受的，包括F、W和Y。人细胞外结构域中的P93是相对弱保守的，在刺猬(Erinaceus europaeus)ALK4(SEQ ID NO:416)中显示为S且在原鸡ALK4中显示为N，因此基本上任何氨基酸在该位置处都应该是耐受的。
此外，ALK4蛋白已在本领域中在结构和功能特性方面进行表征，特别是关于配体结合[例如，Harrison等人(2003)J Biol Chem 278(23):21129-21135；Romano等人(2012)JMol Model 18(8):3617-3625；以及Calvanese等人(2009)15(3):175-183]。除本文的教导之外，这些参考文献还提供了关于如何生成保留一种或多种正常活性(例如，配体结合活性)的ALK4变体的充分指导。
例如，称为三指毒素折叠的定义结构基序对于通过I型和II型受体的配体结合是重要的，并且由定位于每个单体受体的细胞外结构域内的不同位置处的保守半胱氨酸残基形成[Greenwald等人(1999)Nat Struct Biol 6:18-22；以及Hinck(2012)FEBS Lett 586:1860-1870]。相应地，如通过这些保守半胱氨酸的最外层划分的，人ALK4的核心配体结合结构域对应于SEQ ID NO:84(ALK4前体)的位置34-101。这些半胱氨酸划分的核心序列侧翼的结构上排序较低的氨基酸可以被截短在N末端处的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33个残基，和/或在C末端处的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个残基，而不一定改变配体结合。用于N末端和/或C末端截短的示例性的ALK4细胞外结构域包括SEQID NO:86、87和422。
在某些实施方案中，本公开涉及包含至少一种ALK4多肽的异多聚体，所述ALK4多肽包括其片段、功能变体和修饰形式。优选地，用于如本文公开的使用的ALK4多肽(例如，包含ALK4多肽的异多聚体及其用途)是可溶性的(例如，ALK4的细胞外结构域)。在其它优选实施方案中，用于如本文公开的使用的ALK4多肽结合和/或抑制(拮抗)一种或多种TGF-β超家族配体的活性(例如，Smad信号传导的诱导)。在一些实施方案中，本公开的异多聚体包含至少一种ALK4多肽，其与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、92、93、421和422的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，本公开的异多聚体由至少一种ALK4多肽组成或基本上由其组成，所述ALK4多肽与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、92、93、422的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在某些方面，本公开涉及包含ALK4-Fc融合多肽的异多聚体。在一些实施方案中，ALK4-Fc融合多肽包含ALK4结构域，其包含的氨基酸序列与如下的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，所述氨基酸序列在SEQ ID NO:84、85或421的氨基酸23-34中的任何一个(例如，氨基酸残基23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34)处开始，并且在SEQ ID NO:84、85或421的氨基酸101-126中的任何一个(例如，氨基酸残基101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125和126)处结束。在一些实施方案中，ALK4-Fc融合多肽包含ALK4结构域，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:84、85或421的氨基酸34-101具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，ALK4-Fc融合多肽包含ALK4结构域，其包含的氨基酸序列与SEQID NO:84、85或421的氨基酸23-126具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，ALK4-Fc融合多肽包含ALK4结构域，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、92、93、247、249、421、422中的任何一个的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
E)ALK7多肽
在某些方面，本公开涉及包含ALK7多肽(其包括其片段、功能变体和修饰形式)的ActRII-ALK4拮抗剂，以及其用途(例如，治疗、预防或降低心力衰竭(HF)或者HF的一种或多种并发症的进展速率和/或严重程度)。如本文所用，术语“ALK7”指来自任何物种的激活素受体样激酶7(ALK7)蛋白家族，以及保留有用的活性，通过诱变或其它修饰而衍生自此类ALK7蛋白的变体多肽(包括例如突变体、片段、融合物和肽模拟物形式)。此类变体ALK7多肽的实例在本公开自始至终以及国际专利申请公开号WO/2016/164089和WO/2016/164503中提供，所述国际专利申请通过引用以其整体并入本文。本文对ALK7的提及应理解为对当前鉴定的形式中的任何一种的提及。ALK7家族的成员一般都是跨膜多肽，由具有富含半胱氨酸区域的配体结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶特异性的细胞质结构域构成。人ALK7前体多肽的氨基酸序列显示于下文(SEQ ID NO:120)中。优选地，待按照本公开的方法使用的ALK7多肽是可溶性的。如本文所用，术语“可溶性ALK7多肽”包括ALK7多肽的任何天然存在的细胞外结构域以及其保留有用活性的任何变体(包括突变体、片段和肽模拟物形式)。例如，ALK7多肽的细胞外结构域与配体结合并且一般是可溶性的。可溶性ALK7多肽的实例包括下文的ALK7细胞外结构域(SEQ ID NO:123)。可溶性ALK7多肽的其它实例包含除ALK7多肽的细胞外结构域之外的信号序列。信号序列可以是ALK7的天然信号序列，或来自另一种多肽的信号序列，例如组织纤溶酶原激活物(TPA)信号序列或蜜蜂蜂毒肽信号序列。在一些实施方案中，ALK7多肽抑制一种或多种ActRII-ALK7配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)的(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，ALK7多肽结合一种或多种ActRII-ALK7配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)。用于确定ALK7多肽结合一种或多种ActRII-ALK4配体和/或抑制其活性的能力的方法和测定的各种实例在本文中得到公开或是本领域另外众所周知的，其可以容易地用于确定ALK7多肽是否具有所需的结合和/或拮抗活性。除非另有具体说明，否则关于本文描述的所有ALK7相关多肽的氨基酸的编号基于下文提供的人ALK7前体蛋白序列(SEQ ID NO:120)的编号。
四种天然存在的人ALK7的同种型已得到描述。人ALK7同种型1前体多肽的序列(NCBI RefSeq NP_660302.2)如下：
信号肽通过单下划线指示，并且细胞外结构域以粗体字体指示。
加工的细胞外ALK7同种型1多肽序列如下：
编码人ALK7同种型1前体多肽的核酸序列显示于下文SEQ ID NO:233中，对应于GenBank参考序列NM_145259.2的核苷酸244-1722。
编码加工的细胞外ALK7多肽(同种型1)的核酸序列显示于SEQ ID NO:234中。
人ALK7的替代同种型，同种型2(NCBI RefSeqNP_001104501.1)的氨基酸序列以其加工形式如下(SEQ ID NO:124)显示，其中细胞外结构域以粗体字体指示。
细胞外ALK7多肽(同种型2)的氨基酸序列如下：
编码加工的ALK7多肽(同种型2)的核酸序列显示于下文SEQ ID NO:235中，对应于NCBI参考序列NM_001111031.1的核苷酸279-1607。
编码细胞外ALK7多肽(同种型2)的核酸序列显示于SEQ ID NO:236中。
替代的人ALK7前体多肽，同种型3(NCBIRefSeqNP_001104502.1)的氨基酸序列如下显示(SEQ ID NO:121)，其中信号肽通过单下划线指示。
(SEQ ID NO:121)
加工的ALK7多肽(同种型3)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:126)。该同种型缺乏跨膜结构域，并且因此被提议为以其整体是可溶性的(Roberts等人，2003，Biol Reprod 68:1719-1726)。如下所述预测SEQ ID NO:126的N末端变体。
编码未加工的ALK7多肽前体多肽(同种型3)的核酸序列显示于SEQ ID NO:237中，对应于NCBI参考序列NM_001111032.1的核苷酸244-1482。
编码加工的ALK7多肽(同种型3)的核酸序列显示于SEQ ID NO:238中。
替代的人ALK7前体多肽，同种型4(NCBIRefSeqNP_001104503.1)的氨基酸序列如下显示(SEQ ID NO:122)，其中信号肽通过单下划线指示。
加工的ALK7多肽(同种型4)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:127)。如同ALK7同种型3，同种型4缺乏跨膜结构域，并且因此被提议为以其整体是可溶性的(Roberts等人，2003，BiolReprod 68:1719-1726)。如下所述预测SEQ ID NO:127的N末端变体。
编码未加工的ALK7多肽前体多肽(同种型4)的核酸序列显示于SEQ ID NO:239中，对应于NCBI参考序列NM_001111033.1的核苷酸244-1244。
编码加工的ALK7多肽(同种型4)的核酸序列显示于SEQ ID NO:240中。
基于大鼠中的全长ALK7(同种型1)的信号序列(参见NCBI参考序列NP_620790.1)以及人和大鼠ALK7之间的高度序列同一性，预测加工形式的人ALK7的同种型1如下(SEQ IDNO:128)。
预测了加工的ALK7同种型1的活性变体，其中SEQ ID NO:123在N末端处截短了1、2、3、4、5、6或7个氨基酸，并且SEQ ID NO:128在N末端处截短了1或2个氨基酸。与SEQ IDNO:128一致，进一步预计亮氨酸是人ALK7同种型3(SEQ ID NO:126)和人ALK7同种型4(SEQID NO:127)的加工形式中的N末端氨基酸。
在某些实施方案中，本公开涉及包含至少一种ALK7多肽的异多聚体，所述ALK7多肽包括其片段、功能变体和修饰形式。优选地，用于按照本公开的发明使用(例如，包含ALK7多肽的异多聚体及其用途)的ALK7多肽是可溶性的(例如，ALK7的细胞外结构域)。在其它优选实施方案中，用于按照本公开使用的ALK7多肽结合一种或多种ActRII-ALK4配体。因此，在一些优选实施方案中，用于按照本公开使用的ALK7多肽抑制(拮抗)一种或多种ActRII-ALK4配体的活性(例如，Smad信号传导的诱导)。在一些实施方案中，本公开的异多聚体包含至少一种ALK7多肽，其与SEQ ID NO:120、123、124、125、121、126、122、127、128、129、255、133和134的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％或99％同一性。在一些实施方案中，本公开的异多聚体由至少一种ALK7多肽组成或基本上由其组成，所述ALK7多肽与SEQ ID NO:120、123、124、125、121、126、122、127、128、129、255、133和134的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％或99％同一性。
ALK7在脊椎动物中是非常保守的，具有完全保守的大段的细胞外结构域。例如，图22描绘了人ALK7细胞外结构域与各种ALK7直向同源物相比的多序列比对。相应地，根据这些比对，预测在配体结合结构域内对于正常ALK7-配体结合活性重要的关键氨基酸位置，以及预测有可能耐受取代而不显著改变正常的ALK7-配体结合活性的氨基酸位置是可能的。因此，按照本文公开的方法有用的活性、人ALK7变体多肽可以包括在来自另一种脊椎动物ALK7的序列的相应位置处的一个或多个氨基酸，或者可以包括与人或其它脊椎动物序列中的残基相似的残基。不意欲是限制性的，下述实例示出了定义活性ALK7变体的这种方法。人ALK7细胞外结构域(SEQ ID NO:425)中的V61在普通狨(Callithrixjacchus)ALK7(SEQ IDNO:428)中是异亮氨酸，并且因此该位置可以是改变的，并且任选地可以改变为另一个疏水性残基例如L、I或F，或者非极性残基例如A。人细胞外结构域中的L32在菲律宾眼镜猴(Tarsius syrichta)(SEQ ID NO:429)ALK7中是R，指示了该位点可能耐受广泛各种变化，包括极性残基例如E、D、K、R、H、S、T、P、G、Y，以及很可能的非极性残基例如A。人细胞外结构域中的K37在黑猩猩(Pan troglodytes)ALK7(SEQ ID NO:426)中是R，指示了碱性残基在该位置处是耐受的，包括R、K和H。人细胞外结构域中的P4是相对弱保守的，在黑猩猩ALK7中显示为A，因此指示了广泛各种的氨基酸在该位置处都应该是耐受的。
此外，ALK7蛋白已在本领域中在结构和功能特性方面进行表征[例如，Romano等人(2012)Journal ofMolecular Modeling 18(8):3617-3625]。例如，称为三指毒素折叠的定义结构基序对于通过I型和II型受体的配体结合是重要的，并且由定位于每个单体受体的细胞外结构域内的不同位置处的保守半胱氨酸残基形成[Greenwald等人(1999)NatStruct Biol 6:18-22；以及Hinck(2012)FEBS Lett 586:1860-1870]。相应地，如通过这些保守半胱氨酸的最外层划分的，人ALK7的核心配体结合结构域对应于SEQ ID NO:120的位置28-92。这些半胱氨酸划分的核心序列侧翼的结构上排序较低的氨基酸可以被截短在N末端处的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个残基，以及在C末端处的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个残基，而不一定改变配体结合。用于N末端和/或C末端截短的示例性的ALK7细胞外结构域包括SEQ ID NO:123、125、126和127。
相应地，关于ALK7的活性部分(例如，配体结合部分)的通式包含SEQ ID NO:120的氨基酸28-92。因此，ALK7多肽可以例如包含氨基酸序列、基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与ALK7的一部分具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，所述ALK7的一部分在对应于SEQ ID NO:120的氨基酸20-28中的任何一个的残基处开始(例如，在氨基酸20、21、22、23、24、25、26、27或28中的任何一个处开始)，并且在对应于SEQID NO:120的氨基酸92-113中的任何一个的位置处结束(例如，在氨基酸92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112或113中的任何一个处结束)。
其它实例包括这样的构建体，其在来自SEQ ID NO:120的21-28(例如，位置21、22、23、24、25、26、27或28中的任何一个)、24-28(例如，位置24、25、26、27或28中的任何一个)、或25-28(例如，位置25、26、27或28中的任何一个)的位置处开始，并且在来自SEQ ID NO:120的93-112(例如，位置93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111或112中的任何一个)、93-110(例如，位置93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109或110中的任何一个)、93-100(例如，位置93、94、95、96、97、98、99或100中的任何一个)、或93-95(例如，位置93、94或95中的任何一个)的位置处结束。还考虑了在这些范围内的变体，特别是与SEQ ID NO:120的相应部分具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的那些变体。
本文描述的变化可以以各种方式进行组合。在一些实施方案中，ALK7变体包含在配体结合口袋中的不多于1、2、5、6、7、8、9、10或15个保守氨基酸变化。在其处变异性可以是特别良好地耐受的在结合口袋外的位点包括细胞外结构域的氨基末端和羧基末端(如上文指出的)。
F)卵泡抑素多肽
在其它方面，ActRII-ALK4拮抗剂是卵泡抑素多肽。如本文所述，卵泡抑素多肽可以用于治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度，特别是治疗、预防或降低一种或多种心力衰竭相关并发症的进展速率和/或严重程度。
术语“卵泡抑素多肽”包括包含卵泡抑素的任何天然存在的多肽以及其保留有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和肽模拟物形式)的多肽，并且进一步包括卵泡抑素的任何功能性单体或多聚体。在某些优选实施方案中，本公开的卵泡抑素多肽结合和/或抑制激活素活性，特别是激活素A。可以基于涉及卵泡抑素和激活素相互作用的先前研究来鉴定保留激活素结合性质的卵泡抑素多肽的变体。例如，WO2008/030367公开了特异性卵泡抑素结构域(“FSD”)，其显示对于激活素结合是重要的。如下文SEQ ID NO:392-394中所示，卵泡抑素N末端结构域("FSND"SEQ ID NO:392)、FSD2(SEQ ID NO:394)，以及较小程度的FSD1(SEQ ID NO:393)代表卵泡抑素内对于激活素结合重要的示例性结构域。另外，上文在ActRII多肽的上下文中描述了用于制备且测试多肽文库的方法，并且此类方法还涉及制备且测试卵泡抑素的变体。卵泡抑素多肽包括衍生自任何已知卵泡抑素的序列的多肽，其具有的序列与卵泡抑素多肽的序列具有至少约80％同一性，并且任选地至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。卵泡抑素多肽的实例包括成熟卵泡抑素多肽或者人卵泡抑素前体多肽(SEQ ID NO:390)的较短同种型或其它变体，如例如WO2005/025601中所述的。
人卵泡抑素前体多肽同种型FST344如下：
(SEQ ID NO:390；NCBI参考号NP_037541.1)
信号肽是加下划线的；上文还加下划线的是最后27个残基，其代表区分该卵泡抑素同种型与如下所示的较短的卵泡抑素同种型FST317的C末端延伸。
人卵泡抑素前体多肽同种型FST317如下：
(SEQ ID NO:391；NCBI参考号NP_006341.1)
信号肽是加下划线的。
卵泡抑素N末端结构域(FSND)序列如下：
FSD1和FSD2序列如下：
G)融合多肽
在某些方面，本公开提供了其为融合多肽的ActRII-ALK4拮抗剂。融合多肽可以根据本文公开或本领域已知的任何方法来制备。
在一些实施方案中，本文公开的任何融合多肽包含下述组分：a)本文公开的任何多肽(“A”)(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)，b)本文公开的任何接头(“B”)，c)本文公开的任何异源部分(“C”)(例如，Fc免疫球蛋白结构域)，和任选的前导序列(“X”)(例如，组织纤溶酶原激活物前导序列)。在此类实施方案中，融合多肽可以以如下的方式(N末端至C末端)排列：A-B-C或C-B-A。在此类实施方案中，融合多肽可以以如下的方式(N末端至C末端)排列：X-A-B-C或X-C-B-A。在一些实施方案中，融合多肽包含A、B和C(以及任选的前导序列)中的每一个，并且包含不多于100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、5、4、3、2或1个另外的氨基酸(但其可能包括进一步的翻译后修饰，例如糖基化)。
在一些实施方案中，融合多肽包含以如下的方式(N末端至C末端)放置的前导序列：X-A-B-C，并且融合多肽包含在X和A之间的1、2、3、4或5个氨基酸。在一些实施方案中，融合多肽包含以如下的方式(N末端至C末端)放置的前导序列：X-C-B-A，并且融合多肽包含在X和C之间的1、2、3、4或5个氨基酸。在一些实施方案中，融合多肽包含以如下的方式(N末端至C末端)放置的前导序列：X-A-B-C，并且融合多肽包含在X和A之间的丙氨酸。在一些实施方案中，融合多肽包含以如下的方式(N末端至C末端)放置的前导序列：X-C-B-A，并且融合多肽包含在X和C之间的丙氨酸。在一些实施方案中，融合多肽包含以如下的方式(N末端至C末端)放置的前导序列：X-A-B-C，并且融合多肽包含在X和A之间的甘氨酸和丙氨酸。在一些实施方案中，融合多肽包含以如下的方式(N末端至C末端)放置的前导序列：X-C-B-A，并且融合多肽包含在X和C之间的甘氨酸和丙氨酸。在一些实施方案中，融合多肽包含以如下的方式(N末端至C末端)放置的前导序列：X-A-B-C，并且融合多肽包含在X和A之间的苏氨酸。在一些实施方案中，融合多肽包含以如下的方式(N末端至C末端)放置的前导序列：X-C-B-A，并且融合多肽包含在X和C之间的苏氨酸。在一些实施方案中，融合多肽包含以如下的方式(N末端至C末端)放置的前导序列：X-A-B-C，并且融合多肽包含在A和B之间的苏氨酸。在一些实施方案中，融合多肽包含以如下的方式(N末端至C末端)放置的前导序列：X-C-B-A，并且融合多肽包含在C和B之间的苏氨酸。
在某些方面，本公开的融合蛋白包含ActRII-ALK4配体陷阱(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)的至少一部分和一个或多个异源部分(例如，免疫球蛋白Fc结构域)，任选地具有置于ActRII-ALK4配体捕获结构域和一个或多个异源部分之间的一个或多个接头结构域序列。众所周知的此类异源部分的实例包括但不限于多组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或人血清白蛋白。
可以这样选择异源部分，以便赋予所需性质。例如，一些异源部分对于通过亲和层析分离融合蛋白是特别有用的。为了亲和纯化的目的，使用用于亲和层析的有关基质，例如谷胱甘肽、淀粉酶和镍或钴共轭树脂。许多此类基质可以“试剂盒”形式获得，例如对于(HIS6)融合配偶体有用的Pharmacia GST纯化系统以及QIAexpressTM系统(Qiagen)。作为另一个实例，可以这样选择异源部分，以便促进融合多肽的检测。此类检测结构域的实例包括各种荧光蛋白(例如GFP)以及“表位标签”，其通常是对于其可获得特异性抗体的短肽序列。对于其可容易获得特异性单克隆抗体的众所周知的表位标签包括FLAG、流感病毒血凝素(HA)和c-myc标签。在一些情况下，异源部分具有例如用于因子Xa或凝血酶的蛋白酶切割位点，其允许有关蛋白酶部分地消化融合蛋白并且从而由其释放重组蛋白质。然后释放的蛋白质可以通过后续层析分离与异源部分分离。
在某些优选实施方案中，ActRII-ALK4配体捕获结构域(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)任选地用间插接头结构域与异源结构域融合，其在体内稳定ActRII-ALK4配体捕获结构域(“稳定剂”结构域)。一般而言，术语“稳定”意指增加血清半衰期的任何因素，不管这是由于减少的破坏、通过肾的清除率减少还是药剂的其它药代动力学效应。已知具有免疫球蛋白Fc部分的融合多肽对广泛范围的蛋白质赋予期望的药代动力学性质。同样地，与人血清白蛋白的融合可以赋予期望的性质。可以选择的其它类型的异源部分包括多聚化(例如，二聚化、四聚化)结构域和功能结构域。在一些实施方案中，稳定结构域还可以充当多聚化结构域。此类多功能结构域包括例如Fc免疫球蛋白结构域。在公开内容自始至终描述了Fc免疫球蛋白结构域和包含一个或多个ActRII-ALK4配体捕获结构域的Fc融合蛋白的各种实例。
在一些实施方案中，本公开的融合蛋白可以另外包括在N末端处的各种前导序列中的任一种。此类序列将允许肽被表达并靶向真核系统中的分泌途径。参见例如，Ernst等人，美国专利号5,082,783(1992)。可替代地，可以使用天然信号序列来实现从细胞中的挤出。可能的前导序列包括天然前导区、组织纤溶酶原激活物(TPA)和蜜蜂蜂毒肽)。掺入TPA前导序列的融合蛋白的实例包括SEQ ID NO:6、31、34、37、40、43、46、49、51、88、92、129、133、247、276、279、333、336、339、342、345、348、351、354、381、396、402和406。信号肽的处理可能取决于所选择的前导序列、使用的细胞类型和培养条件以及其它变量而变，并且因此关于成熟(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)多肽的实际的N末端起始位点可以在N末端或C末端方向上移动1、2、3、4或5个氨基酸。
优选的融合蛋白包含SEQ ID NO:5、6、12、31、33、34、36、37、39、40、42、43、45、46、48、49、50、51、52、54、55、88、89、92、93、129、130、133、134、247、249、276、278、279、332、333、335、336、338、339、341、342、344、345、347、348、350、351、353、354、356、378、380、381、385、396、398、401、402、403、406、408和409中的任何一个中所示的氨基酸序列。
I.多聚化结构域
在某些实施方案中，本公开的多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7和卵泡抑素多肽)包含至少一个多聚化结构域。如本文公开的，术语“多聚化结构域”指促进至少第一多肽和至少第二多肽之间的共价或非共价相互作用的氨基酸或氨基酸序列。多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7和卵泡抑素多肽)可以共价或非共价连接至多聚化结构域。在一些实施方案中，多聚化结构域促进第一多肽(例如，ActRIIB或ActRIIA多肽)和第二多肽(例如，ALK4多肽或ALK7多肽)之间的相互作用，以促进异多聚体形成(例如，异二聚体形成)，并且任选地阻碍或以其它方式不利于同多聚体形成(例如，同二聚体形成)，从而增加所需异多聚体的产率(参见例如图8B)。在一些实施方案中，多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7和卵泡抑素多肽)可以通过共价相互作用形成异二聚体。在一些实施方案中，多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7和卵泡抑素多肽)可以通过非共价相互作用形成异二聚体。在一些实施方案中，多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7和卵泡抑素多肽)可以通过共价相互作用和非共价相互作用两者形成异二聚体。在一些实施方案中，多聚化结构域促进第一多肽和第二多肽之间的相互作用以促进同多聚体形成，并且任选地阻碍或以其它方式不利于异多聚体形成，从而增加所需同多聚体的产率。在一些实施方案中，多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7和卵泡抑素多肽)形成同二聚体。在一些实施方案中，多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7和卵泡抑素多肽)可以通过共价相互作用形成同二聚体。在一些实施方案中，多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7和卵泡抑素多肽)可以通过非共价相互作用形成同二聚体。在一些实施方案中，多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7和卵泡抑素多肽)可以通过共价相互作用和非共价相互作用两者形成同二聚体。
在某些方面，多聚化结构域可以包含相互作用对的一个组分。在一些实施方案中，本文公开的多肽可以形成包含与第二多肽共价结合或非共价结合的第一多肽的多肽复合物，其中第一多肽包含第一ActRII-ALK4配体捕获多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7和卵泡抑素多肽)的氨基酸序列、以及相互作用对的第一成员(例如，第一免疫球蛋白Fc结构域)的氨基酸序列；并且第二多肽包含第二ActRII-ALK4配体捕获多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7和卵泡抑素多肽)的氨基酸序列、以及相互作用对的第二成员(例如，第二免疫球蛋白Fc结构域)的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的多肽可以形成包含与第二多肽共价结合或非共价结合的第一多肽的多肽复合物，其中第一多肽包含ActRIIA多肽的氨基酸序列和相互作用对的第一成员的氨基酸序列；并且第二多肽包含ALK4多肽或ALK7多肽的氨基酸序列、以及相互作用对的第二成员的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的多肽可以形成包含与第二多肽共价结合或非共价结合的第一多肽的多肽复合物，其中第一多肽包含ActRIIB多肽的氨基酸序列和相互作用对的第一成员的氨基酸序列；并且第二多肽包含ALK4多肽或ALK7多肽的氨基酸序列、以及相互作用对的第二成员的氨基酸序列。在一些实施方案中，相互作用对可以是相互作用以形成二聚体复合物(异二聚体或同二聚体复合物)的任何两个多肽序列。可以选择相互作用对以赋予改善的性质/活性，例如增加的血清半衰期，或者充当在其上附着另一个部分以提供改善的性质/活性的衔接子。例如，聚乙二醇或糖基化部分可以附着至相互作用对的一个或两个组分，以提供改善的性质/活性，例如改善的血清半衰期。
相互作用对的第一成员和第二成员可以是不对称对，这意味着该对的成员优先彼此结合而不是自结合。相应地，不对称相互作用对的第一成员和第二成员可以结合，以形成异二聚体复合物(参见例如图8B)。可替代地，相互作用对可以是非引导的，这意味着该对的成员可以彼此结合或自结合而无显著偏好，并且因此可以具有相同或不同的氨基酸序列(参见例如图8A)。相应地，非引导的相互作用对的第一成员和第二成员可以结合，以形成同二聚体复合物或异二聚体复合物。任选地，相互作用对(例如，不对称对或非引导的相互作用对)的第一成员与相互作用对的第二成员共价结合。任选地，相互作用对(例如，不对称对或非引导的相互作用对)的第一成员与相互作用对的第二成员非共价结合。在某些优选实施方案中，本文公开的多肽形成异二聚体或同二聚体复合物，但也包括更高阶的异多聚体和同多聚体复合物，例如但不限于异三聚体、同三聚体、异四聚体、同四聚体和进一步的寡聚结构(参见例如图11-13，其还可以应用于ActRII-ALK4和ActRII-ALK7寡聚结构两者)。
Ia Fc融合蛋白
作为包含多聚化结构域的融合多肽的具体实例，本公开提供了包含与多肽融合的ActRII-ALK4配体捕获多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7和卵泡抑素多肽)的融合多肽，所述多肽包含免疫球蛋白的恒定结构域，例如免疫球蛋白的CH1、CH2或CH3结构域或者免疫球蛋白Fc结构域。如本文所用，术语“免疫球蛋白Fc结构域”或简单地“Fc”应理解为意指免疫球蛋白链恒定区，优选免疫球蛋白重链恒定区或其一部分的羧基末端部分。例如，免疫球蛋白Fc区可以包含1)CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域，2)CH1结构域和CH2结构域，3)CH1结构域和CH3结构域，4)CH2结构域和CH3结构域，或者5)两个或更多个结构域和免疫球蛋白铰链区的组合。在一个优选实施方案中，免疫球蛋白Fc区至少包含免疫球蛋白铰链区、CH2结构域和CH3结构域，并且优选地缺乏CH1结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白Fc区是人免疫球蛋白Fc区。在一些实施方案中，重链恒定区衍生自其的免疫球蛋白的类别是IgG(Igγ)(γ亚类1、2、3或4)。在某些实施方案中，恒定区衍生自IgG1。可以使用其它类别的免疫球蛋白，IgA(Igα)、IgD(Igδ)、IgE(Igε)和IgM(Igμ)。适当的免疫球蛋白重链恒定区的选择在美国专利号5,541,087和5,726,044中详细讨论，所述美国专利以其整体并入本文。从某些免疫球蛋白类别和亚类中选择特定的免疫球蛋白重链恒定区序列以实现特定的结果被视为在本领域技术人员的水平内。在一些实施方案中，编码免疫球蛋白Fc区的DNA构建体的一部分优选地包含铰链结构域的至少一部分，并且优选地包含Fcγ的CH3结构域的至少一部分或者IgA、IgD、IgE或IgM中的任一种中的同源结构域。此外，考虑在免疫球蛋白重链恒定区内的氨基酸取代或缺失可以用于本文公开的方法和组合物的实践中。一个实例将是在上部CH2区中引入氨基酸取代，以产生对于Fc受体具有降低亲和力的Fc变体(Cole等人(1997)J.Immunol.159:3613)。本文提供了衍生自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc结构域。
可以用于人IgG1的Fc部分(G1Fc)的天然氨基酸序列的实例显示于下文(SEQ IDNO:13)。虚线下划线指示铰链区，并且实线下划线指示具有天然存在的变体的位置。部分地，本公开提供了包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成的多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7和卵泡抑素多肽)，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:13具有70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
根据SEQ ID NO:13(参见Uniprot P01857)中使用的编号系统，G1Fc中天然存在的变体包括E134D和M136L。
在一些实施方案中，本公开提供了Fc融合多肽，其包含与一个或多个Fc多肽结构域融合的ActRII-ALK4配体捕获多肽结构域(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7和卵泡抑素多肽结构域)，包括其变体以及同多聚体(例如，同二聚体)和异多聚体(例如，异二聚体，包括例如ActRIIA:ALK4、ActRIIB:ALK4、ActRIIA:ALK7和ActRIIB:ALK7异二聚体)，所述Fc多肽结构域与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
可以用于人IgG2的Fc部分(G2Fc)的天然氨基酸序列的实例显示于下文(SEQ IDNO:14)。虚线下划线指示铰链区，并且双下划线指示其中在序列(根据UniProt P01859)中存在数据库冲突的位置。部分地，本公开提供了包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成的多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7和卵泡抑素多肽)，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:14具有70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，本公开提供了Fc融合多肽，其包含与一个或多个Fc多肽结构域融合的ActRII-ALK4配体捕获多肽结构域(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7和卵泡抑素多肽结构域)，包括其变体以及同多聚体(例如，同二聚体)和异多聚体(例如，异二聚体，包括例如ActRIIA:ALK4、ActRIIB:ALK4、ActRIIA:ALK7和ActRIIB:ALK7异二聚体)，所述Fc多肽结构域与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
可以用于人IgG3的Fc部分(G3Fc)的氨基酸序列的两个实例显示于下文。G3Fc中的铰链区可以长达其它Fc链中的四倍，并且含有前面为类似的17残基区段的三个相同的15残基区段。下文显示的第一G3Fc序列(SEQ ID NO:15)含有由单个15残基区段组成的短铰链区，而第二G3Fc序列(SEQ ID NO:16)含有全长铰链区。在每种情况下，虚线下划线指示铰链区，并且实线下划线指示具有根据UniProt P01859的天然存在的变体的位置。部分地，本公开提供了包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成的多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7和卵泡抑素多肽)，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:15具有70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。部分地，本公开提供了包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成的多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7和卵泡抑素多肽)，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:16具有70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
当转换成SEQ ID NO:15中使用的编号系统时，G3Fc(例如，参见Uniprot P01860)中天然存在的变体包括E68Q、P76L、E79Q、Y81F、D97N、N100D、T124A、S169N、S169del、F221Y，并且本公开提供了包含含有这些变化中的一种或多种的G3Fc结构域的融合多肽。另外，人免疫球蛋白IgG3基因(IGHG3)显示了特征在于不同铰链长度的结构多态性(参见UniprotP01859)。具体地，变体WIS缺少大部分V区和全部CH1区。除铰链区中通常存在的11之外，它还具有在位置7处的额外的链间二硫键。变体ZUC缺少大部分V区、全部CH1区和部分铰链。变体OMM可能代表等位基因形式或另一个γ链亚类。本公开提供了包含含有这些变体中的一种或多种的G3Fc结构域的另外的融合多肽。
在一些实施方案中，本公开提供了Fc融合多肽，其包含与一个或多个Fc多肽结构域融合的ActRII-ALK4配体捕获多肽结构域(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7和卵泡抑素多肽结构域)，包括其变体以及同多聚体(例如，同二聚体)和异多聚体(例如，异二聚体，包括例如ActRIIA:ALK4、ActRIIB:ALK4、ActRIIA:ALK7和ActRIIB:ALK7异二聚体)，所述Fc多肽结构域与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，本公开提供了Fc融合多肽，其包含与一个或多个Fc多肽结构域融合的ActRII-ALK4配体捕获多肽结构域(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7和卵泡抑素多肽结构域)，包括其变体以及同多聚体(例如，同二聚体)和异多聚体(例如，异二聚体，包括例如ActRIIA:ALK4、ActRIIB:ALK4、ActRIIA:ALK7和ActRIIB:ALK7异二聚体)，所述Fc多肽结构域与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
可以用于人IgG4的Fc部分(G4Fc)的天然氨基酸序列的实例显示于下文(SEQ IDNO:17)。虚线下划线指示铰链区。部分地，本公开提供了包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成的多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7和卵泡抑素多肽)，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:17具有70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，本公开提供了Fc融合多肽，其包含与一个或多个Fc多肽结构域融合的ActRII-ALK4配体捕获多肽结构域(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7和卵泡抑素多肽结构域)，包括其变体以及同多聚体(例如，同二聚体)和异多聚体(例如，异二聚体，包括例如ActRIIA:ALK4、ActRIIB:ALK4、ActRIIA:ALK7和ActRIIB:ALK7异二聚体)，所述Fc多肽结构域与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
本文呈现了关于G1Fc序列(SEQ ID NO:13)在Fc结构域中的各种改造的突变。G2Fc、G3Fc和G4Fc中的类似突变可以衍生自其与图7中的G1Fc的比对。由于铰链长度不等，基于同种型比对(图7)的类似Fc位置在SEQ ID NO:13、14、15和17中具有不同的氨基酸编号。还可以了解，当编号涵盖如Uniprot数据库中的整个IgG1重链恒定结构域(由CH1、铰链、CH2和CH3区组成)时，由铰链区、CH2和CH3区组成的免疫球蛋白序列(例如，SEQ ID NO:13、14、15、16或17)中的给定氨基酸位置将通过与相同位置不同的编号进行鉴定。例如，人G1Fc序列(SEQ ID NO:13)、人IgG1重链恒定结构域(Uniprot P01857)和人IgG1重链中选择的CH3位置之间的对应关系如下。
在一些实施方案中，本公开提供了具有改造的或变体Fc区的抗体和Fc融合蛋白。此类抗体和Fc融合蛋白可以用于例如调节效应子功能，例如抗原依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。另外，修饰可以改善抗体和Fc融合蛋白的稳定性。抗体和Fc融合蛋白的氨基酸序列变体通过将适当的核苷酸变化引入DNA内或通过肽合成进行制备。此类变体包括例如在本文公开的抗体和Fc融合蛋白的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。制备缺失、插入和取代的任何组合以获得最终构建体，条件是最终构建体具有所需特性。氨基酸变化还可能改变抗体和Fc融合蛋白的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数目或位置。
具有效应子功能降低的抗体和Fc融合蛋白可以通过引入氨基酸序列中的变化来产生，包括但不限于通过Bluestone等人(参见WO 94/28027和WO 98/47531；还参见Xu等人2000 Cell Immunol 200；16-26)描述的Ala-Ala突变。因此，在某些实施方案中，具有在恒定区内的突变包括Ala-Ala突变的本公开的Fc融合蛋白可以用于降低或取消效应子功能。根据这些实施方案，抗体和Fc融合蛋白可以包含在位置234处至丙氨酸的突变或在位置235处至丙氨酸的突变或其组合。在一个实施方案中，抗体或Fc融合蛋白包含IgG4构架，其中Ala-Ala突变描述了在位置234处从苯丙氨酸到丙氨酸的突变和/或在位置235处从亮氨酸到丙氨酸的突变。在另一个实施方案中，抗体或Fc融合蛋白包含IgG1构架，其中Ala-Ala突变描述了在位置234处从亮氨酸到丙氨酸的突变和/或在位置235处从亮氨酸到丙氨酸的突变。虽然在这些位点处的丙氨酸取代有效降低人和鼠抗体两者中的ADCC，但这些取代在降低CDC活性方面较不有效。通过映射Fc的Clq结合位点的随机诱变方法鉴定的另一种单一变体P329A在降低CDC活性同时保留ADCC活性方面高度有效。L234A、L235A和P329A(LALA-PG，Kabat位点)取代的组合已显示有效沉默人IgG1抗体的效应子功能。关于LALA、LALA-PG和其它突变的详细讨论，参见Lo等人(2017)1Biol.Chem.292:3900-3908，其内容在此通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，本公开的Fc融合蛋白包含在重链的Fc区中的L234A、L235A和P329G突变(LALA-PG；Kabat位置)。抗体或Fc融合蛋白可以替代地或另外携带其它突变，包括在CH2结构域中的点突变K322A(Hezareh等人2001J Virol.75:12161-8)。
在特定实施方案中，可以修饰抗体或Fc融合蛋白，以增强或抑制补体依赖性细胞毒性(CDC)。调节的CDC活性可以通过在Fc区中引入一个或多个氨基酸取代、插入或缺失来实现(参见例如，美国专利号6,194,551)。可替代地或另外，可以将半胱氨酸残基引入Fc区中，从而允许该区域中的链间二硫键形成。因此生成的同二聚抗体或Fc融合蛋白可以具有改善或降低的内在化能力和/或增加或减少的补体介导的细胞杀伤。参见Caron等人，J.ExpMed.176:1191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.148:2918-2922(1992)，WO99/51642，Duncan&Winter Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及WO94/29351。
Ib异多聚体
本领域已知的许多方法可以用于生成如本文公开的ActRIIB:ALK4异多聚体、ActRIIB:ALK7异多聚体、ActRIIA:ALK4异多聚体和ActRIIA:ALK7异多聚体。例如，非天然存在的二硫键可以通过以下进行构建：用含有游离硫醇的残基例如半胱氨酸替换第一多肽(例如，ActRIIB或ActRIIA多肽)上天然存在的氨基酸，使得游离硫醇与第二多肽(例如，ALK4或ALK7多肽)上的另一个含有游离硫醇的残基相互作用，使得在第一多肽和第二多肽之间形成二硫键。促进异多聚体形成的相互作用的另外实例包括但不限于例如Kjaergaard等人，WO2007147901中描述的离子相互作用；例如Kannan等人，U.S.8,592,562中描述的静电转向效应；例如Christensen等人，U.S.20120302737中描述的卷曲螺旋相互作用；例如Pack&Plueckthun,(1992)Biochemistry 31:1579-1584中描述的亮氨酸拉链；以及例如Pack等人，(1993)Bio/Technology 11:1271-1277中描述的螺旋-转角-螺旋基序。各个区段的键合可以经由例如共价结合例如通过化学交联、肽接头、二硫桥等，或者亲和相互作用例如通过抗生物素蛋白-生物素或亮氨酸拉链技术来获得。
作为具体实例，本公开提供了包含与多肽融合的ActRIIB、ActRIIA、ALK4或ALK7的融合蛋白，所述多肽包含免疫球蛋白的恒定结构域，例如衍生自人IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4的CH1、CH2或CH3结构域，其已进行修饰以促进异多聚体形成。在来自单细胞系的基于不对称免疫球蛋白的蛋白质的大规模生产中出现的问题称为“链结合问题”。如双特异性抗体的生产中显著面临的，链结合问题涉及从多重组合中有效生产所需多链蛋白的挑战，所述多重组合在单细胞系中产生不同的重链和/或轻链时固有地产生[参见例如Klein等人(2012)mAbs4:653-663]。当在同一细胞中产生两条不同的重链和两条不同的轻链时，这个问题是最严重的，在所述情况下，当通常只需要一种时，存在总共16种可能的链组合(尽管其中一些是相同的)。然而，同样的原理解释了仅掺入两条不同(不对称)重链的所需多链融合蛋白的产率缩减。
各种方法是本领域已知的，其增加了单细胞系中含有Fc的融合多肽链的所需配对，以可接受的产率产生优选的不对称融合蛋白[参见例如，Klein等人(2012)mAbs 4:653-663；以及Spiess等人(2015)Molecular Immunology 67(2A):95-106]。获得含有Fc链的所需配对的方法包括但不限于基于电荷的配对(静电转向)、“旋钮入孔(knobs-into-holes)”空间配对、SEEDbody配对和基于亮氨酸拉链的配对。参见例如，Ridgway等人(1996)ProteinEng 9:617-621；Merchant等人(1998)Nat Biotech16:677-681；Davis等人(2010)ProteinEng Des Sel 23:195-202；Gunasekaran等人(2010)；285:19637-19646；Wranik等人(2012)J Biol Chem287:43331-43339；US5932448；WO 1993/011162；WO 2009/089004和WO 2011/034605。如本文所述，这些方法可以用于生成包含以下的异二聚体：ActRIIB多肽和另一种任选不同的ActRIIB多肽、ActRIIA多肽和另一种任选不同的ActRIIA多肽、ActRIIB多肽和ActRIIA多肽、ActRIIB多肽和ALK4多肽、ActRIIB多肽和ALK7多肽、ActRIIA多肽和ALK4多肽、或ActRIIA多肽和ALK7多肽。
例如，通过其可以促进特定多肽之间的相互作用的一种手段是通过改造突起入空腔(protuberance-into-cavity)(旋钮入孔)互补区，例如Arathoon等人，U.S.7,183,076和Carter等人，U.S.5,731,168中所述的。“突起”通过用较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换来自第一多肽(例如，第一相互作用对)的界面的小氨基酸侧链进行构建。通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链，在第二多肽(例如，第二相互作用对)的界面上任选地产生与突起相同或相似大小的互补“空腔”。当在第一多肽或第二多肽的界面处存在适当放置和尺寸的突起或空腔时，仅需要在相邻界面处分别改造相应的空腔或突起。
在中性pH(7.0)下，天冬氨酸和谷氨酸是带负电的，并且赖氨酸、精氨酸和组氨酸是带正电的。这些荷电残基可以用于促进异二聚体形成，并且同时阻碍同二聚体形成。在相反电荷之间发生吸引相互作用，并且在同种电荷之间发生排斥相互作用。部分地，本文公开的多肽复合物利用吸引相互作用用于促进异多聚体形成(例如，异二聚体形成)，并且任选地利用排斥相互作用通过进行荷电界面残基的定点诱变用于阻碍同二聚体形成(例如，同二聚体形成)。
例如，IgG1 CH3结构域界面包含涉及结构域-结构域相互作用的四个独特电荷残基对：Asp356-Lys439’、Glu357-Lys370’、Lys392-Asp399’和Asp399-Lys409’[第二条链中的残基编号通过(’)指示]。应当注意的是，此处用于指定IgG1 CH3结构域中残基的编号方案符合Kabat的EU编号方案。由于CH3-CH3结构域相互作用中存在2重对称性，每个独特的相互作用将在结构中出现两次(例如，Asp-399-Lys409’和Lys409-Asp399’)。在野生型序列中，K409-D399’有利于异二聚体和同二聚体两者形成。转换第一条链中的电荷极性的单个突变(例如，K409E；正电荷至负电荷)导致关于第一条链同二聚体形成的不利相互作用。不利的相互作用由于相同电荷之间发生的排斥相互作用而出现(负-负；K409E-D399’和D399-K409E’)。转换第二条链中的电荷极性的类似突变(D399K'；负至正)导致关于第二条链同二聚体形成的不利相互作用(K409’-D399K’和D399K-K409’)。但是，与此同时，这两个突变(K409E和D399K’)导致关于异二聚体形成的有利相互作用(K409E-D399K’和D399-K409’)。
对异二聚体形成和同二聚体抑制的静电转向效应可以通过另外的电荷残基的突变得到进一步增强，所述另外的电荷残基可以与第二条链中带相反电荷的残基配对或可以不配对，所述残基包括例如Arg355和Lys360。下表列出了可以单独或组合使用的可能的电荷变化突变，以增强本文公开的异多聚体的异多聚体形成。
在一些实施方案中，构成本申请的融合多肽中的CH3-CH3界面的一个或多个残基由荷电氨基酸替换，使得相互作用变得静电不利的。例如，界面中带正电的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)由带负电的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)替换。可替代地或与前述取代组合，界面中带负电的氨基酸由带正电的氨基酸替换。在某些实施方案中，氨基酸由具有所需电荷特性的非天然存在的氨基酸替换。应该注意的是，使带负电的残基(Asp或Glu)突变为His将导致侧链容积的增加，其可能导致空间问题。此外，His质子供体和受体形式取决于局限性环境。设计策略应该考虑这些问题。因为界面残基在人和小鼠IgG亚类中是高度保守的，所以本文公开的静电转向效应可以应用于人和小鼠IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。该策略还可以进行扩展，以将在CH3结构域界面处的非荷电残基修饰为荷电残基。
在某些方面，待按照本文公开的方法使用的ActRII-ALK4配体陷阱是异多聚体复合物，其包含与至少一种ActRII多肽(例如，ActRIIA或ActRIIB多肽)共价结合或非共价结合的至少一种ALK多肽(例如，ALK4或ALK7多肽)。优选地，本文公开的多肽形成异二聚体复合物，尽管也包括更高阶的异多聚体复合物(异多聚体)，例如但不限于异三聚体、异四聚体和进一步的寡聚结构(参见例如图11-13，其也可以适用于ActRII-ALK4和ActRII-ALK7寡聚结构两者)。在一些实施方案中，ALK和/或ActRII多肽包含至少一个多聚化结构域。本文公开的多肽可以共价或非共价连接至多聚化结构域。优选地，多聚化结构域促进第一多肽(例如，ActRIIB或ActRIIA多肽)和第二多肽(例如，ALK4或ALK7多肽)之间的相互作用，以促进异多聚体形成(例如，异二聚体形成)，并且任选地阻碍或以其它方式不利于同多聚体形成(例如，同二聚体形成)，从而增加所需异多聚体的产率(参见例如图12)。
部分地，本公开使用基于电荷配对(静电转向)而改造为互补的Fc序列，提供了不对称的含有Fc的多肽链的所需配对。具有静电互补性的一对Fc序列之一可以与构建体的ActRIIB多肽、ActRIIA多肽、ALK4多肽或ALK7多肽任意融合，具有或不具有任选的接头，以生成ActRIIB-Fc、ActRIIA-Fc、ALK4-Fc或ALK7-Fc融合多肽。该单链可以连同与第一Fc序列互补的Fc序列一起在选择的细胞中共表达，以有利于生成所需的多链构建体(例如，ActRIIB-Fc-ALK4-Fc异多聚体)。在基于静电转向的该实例中，SEQ ID NO:18[人G1Fc(E134K/D177K)]和SEQ ID NO:19[人G1Fc(K170D/K187D)]是互补Fc序列的实例，其中改造的氨基酸取代是加双下划线的，并且构建体的ActRIIB多肽、ActRIIA多肽、ALK4多肽或ALK7多肽可以与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19融合，但并非与两者融合。鉴于天然hG1Fc、天然hG2Fc、天然hG3Fc和天然hG4Fc之间高度的氨基酸序列同一性，可以了解在hG2Fc、hG3Fc或hG4Fc中的相应位置处的氨基酸取代(参见图7)将生成互补Fc，其可以代替下文的互补hG1Fc对(SEQ ID NO:18和19)使用。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIB:ALK4异多聚体多肽，其中ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIB异多聚体多肽，其中ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIB:ALK7异多聚体多肽，其中ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIB:ALK7异多聚体多肽，其中ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIA-ALK4异多聚体多肽，其中ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIA异多聚体多肽，其中ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIA:ALK7异多聚体多肽，其中ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIA:ALK7异多聚体多肽，其中ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
部分地，本公开使用对于空间互补性进行改造的Fc序列，提供了不对称的含有Fc的多肽链的所需配对。部分地，本公开提供了作为空间互补性的实例的旋钮入孔配对。具有空间互补性的一对Fc序列之一可以与构建体的ActRIIB多肽、ActRIIA多肽、ALK4多肽或ALK7多肽任意融合，具有或不具有任选的接头，以生成ActRIIB-Fc、ActRIIA-Fc、ALK4-Fc或ALK7-Fc融合多肽。该单链可以连同与第一Fc序列互补的Fc序列一起在选择的细胞中共表达，以有利于生成所需的多链构建体。在基于旋钮入孔配对的该实例中，SEQ ID NO:20[人G1Fc(T144Y)]和SEQ ID NO:21[人G1Fc(Y185T)]是互补Fc序列的实例，其中改造的氨基酸取代是加双下划线的，并且构建体的ActRIIB多肽、ActRIIA多肽、ALK4多肽或ALK7多肽可以与SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21融合，但并非与两者融合。鉴于天然hG1Fc、天然hG2Fc、天然hG3Fc和天然hG4Fc之间高度的氨基酸序列同一性，可以了解在hG2Fc、hG3Fc或hG4Fc中的相应位置处的氨基酸取代(参见图7)将生成互补Fc，其可以代替下文的互补hG1Fc对(SEQID NO:20和21)使用。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIB:ALK4异多聚体多肽，其中ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIB:ALK4异多聚体多肽，其中ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIB:ALK7异多聚体多肽，其中ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIB:ALK7异多聚体多肽，其中ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIA:ALK4异多聚体多肽，其中ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIA:ALK4异多聚体多肽，其中ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIA:ALK7异多聚体多肽，其中ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIA:ALK7异多聚体多肽，其中ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
与改造的二硫键组合的基于旋钮入孔配对的Fc互补性的实例公开于SEQ ID NO:22[hG1Fc(S132C/T144W)]和SEQ ID NO:23[hG1Fc(Y127C/T144S/L146A/Y185V)]中。这些序列中改造的氨基酸取代是加双下划线的，并且构建体的ActRIIB多肽、ActRIIA多肽、ALK4多肽或ALK7多肽可以与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23融合，但并非与两者融合。鉴于天然hG1Fc、天然hG2Fc、天然hG3Fc和天然hG4Fc之间高度的氨基酸序列同一性，可以了解在hG2Fc、hG3Fc或hG4Fc中的相应位置处的氨基酸取代(参见图7)将生成互补Fc，其可以代替下文的互补hG1Fc对(SEQ ID NO:22和23)使用。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIB:ALK4异多聚体多肽，其中ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIB:ALK4异多聚体多肽，其中ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIB:ALK7异多聚体多肽，其中ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIB:ALK7异多聚体多肽，其中ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIA:ALK4异多聚体多肽，其中ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIA:ALK4异多聚体多肽，其中ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIA:ALK7异多聚体多肽，其中ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIA:ALK7异多聚体多肽，其中ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
部分地，本公开使用改造为生成人IgG和IgA CH3结构域的叉指型β链区段的Fc序列，提供了不对称的含有Fc的多肽链的所需配对。此类方法包括使用链交换改造结构域(SEED)CH3异二聚体，允许形成SEEDbody融合多肽[参见例如，Davis等人(2010)ProteinEng Design Sel23:195-202]。具有SEEDbody互补性的一对Fc序列之一可以与构建体的第一ActRIIB多肽或第二ActRIIB多肽任意融合，具有或不具有任选的接头，以生成ActRIIB-Fc融合多肽。该单链可以连同与第一Fc序列互补的Fc序列一起在选择的细胞中共表达，以有利于生成所需的多链构建体。在基于SEEDbody(Sb)配对的该实例中，SEQ ID NO:24[hG1Fc(SbAG)]和SEQ ID NO:25[hG1Fc(SbGA)]是互补IgG Fc序列的实例，其中来自IgA Fc的改造的氨基酸取代是加双下划线的，并且构建体的第一ActRIIB多肽或第二变体ActRIIB多肽可以与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25融合，但并非与两者融合。鉴于天然hG1Fc、天然hG2Fc、天然hG3Fc和天然hG4Fc之间高度的氨基酸序列同一性，可以了解在hG1Fc、hG2Fc、hG3Fc或hG4Fc中的相应位置处的氨基酸取代(参见图7)将生成Fc单体，其可以在下文的互补IgG-IgA对(SEQ ID NO:24和25)中使用。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIB:ALK4异多聚体多肽，其中ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIB:ALK4异多聚体多肽，其中ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIB:ALK7异多聚体多肽，其中ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIB:ALK7异多聚体多肽，其中ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIA:ALK4异多聚体多肽，其中ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIA:ALK4异多聚体多肽，其中ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIA:ALK7异多聚体多肽，其中ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIA:ALK7异多聚体多肽，其中ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
部分地，本公开提供了不对称的含有Fc的多肽链的所需配对，伴随在Fc CH3结构域的C末端处附着的可切割的亮氨酸拉链结构域。亮氨酸拉链的附着足以导致异二聚体抗体重链的优先组装。参见例如，Wranik等人(2012)J Biol Chem 287:43331-43339。如本文公开的，附着至亮氨酸拉链形成链的一对Fc序列之一可以与构建体的第一ActRIIB多肽或第二ActRIIB多肽任意融合，具有或不具有任选的接头，以生成ActRIIB-Fc融合多肽。该单链可以连同附着至互补亮氨酸拉链形成链的Fc序列一起在选择的细胞中共表达，以有利于生成所需的多链构建体。在纯化后构建体用细菌内蛋白酶Lys-C的蛋白酶解消化可以释放亮氨酸拉链结构域，导致其结构与天然Fc结构相同的Fc构建体。在基于亮氨酸拉链配对的该实例中，SEQ ID NO:26[hG1Fc-Ap1(酸性)]和SEQ ID NO:27[hG1Fc-Bp1(碱性)]是互补IgG Fc序列的实例，其中改造的互补亮氨酸拉链序列是加下划线的，并且构建体的ActRIIB多肽或第二变体ActRIIB多肽可以与SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27融合，但并非与两者融合。鉴于天然hG1Fc、天然hG2Fc、天然hG3Fc和天然hG4Fc之间高度的氨基酸序列同一性，可以了解具有或不具有任选的接头，附着至hG1Fc、hG2Fc、hG3Fc或hG4Fc的亮氨酸拉链形成序列(参见图7)将生成Fc单体，其可以在下文的互补亮氨酸拉链形成对(SEQ ID NO:26和27)中使用。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIB:ALK4异多聚体多肽，其中ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIB:ALK4异多聚体多肽，其中ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIB:ALK7异多聚体多肽，其中ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIB:ALK7异多聚体多肽，其中ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIA:ALK4异多聚体多肽，其中ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIA:ALK4异多聚体多肽，其中ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIA:ALK7异多聚体多肽，其中ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIA:ALK7异多聚体多肽，其中ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
部分地，本公开通过与Fc结构域中的另外突变组合的上述方法，提供了不对称的含有Fc的多肽链的所需配对，所述另外的突变促进所需异聚种类的纯化。一个实例使用与改造的二硫键组合的基于旋钮入孔配对的Fc结构域的互补性，如SEQ ID NO:22和23中公开的，加上一条含有Fc的多肽链中的两个带负电的氨基酸(天冬氨酸或谷氨酸)和互补的含有Fc的多肽链(SEQ ID NO:28-29)中的两个带正电的氨基酸(例如，精氨酸)的另外取代。这四个氨基酸取代促进基于等电点或净分子电荷的差异，从异质多肽混合物中选择性纯化所需的异聚融合多肽。这些序列中的改造的氨基酸取代是下文加双下划线的，并且构建体的ActRIIB多肽、ActRIIA多肽、ALK4多肽或ALK7多肽可以与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29融合，但并非与两者融合。鉴于天然hG1Fc、天然hG2Fc、天然hG3Fc和天然hG4Fc之间高度的氨基酸序列同一性，可以了解在hG2Fc、hG3Fc或hG4Fc中的相应位置处的氨基酸取代(参见图7)将生成互补Fc，其可以代替下文的互补hG1Fc对(SEQ ID NO:28-29)使用。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIB:ALK4异多聚体多肽，其中ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIB:ALK7异多聚体多肽，其中ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，ActRIIB-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置138处的谷氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置217处的天冬氨酸。在一些实施方案中，ALK4-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在氨基酸位置146处的丙氨酸、在氨基酸位置162处的精氨酸、在氨基酸位置179处的精氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。在一些实施方案中，ALK7-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在氨基酸位置146处的丙氨酸、在氨基酸位置162处的精氨酸、在氨基酸位置179处的精氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIA:ALK4异多聚体多肽，其中ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIA:ALK7异多聚体多肽，其中ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
另一个实例涉及与改造的二硫键组合的基于旋钮入孔配对的Fc结构域的互补性，如SEQ ID NO:22-23中公开的，加上一条含有Fc的多肽链(SEQ ID NO:30)中的位置213处的组氨酸至精氨酸取代。这个取代(在Kabat等人的编号系统中表示为H435R)促进基于关于蛋白A的亲和力差异，所需的异二聚体与不期望的同二聚体的分开。改造的氨基酸取代通过双下划线指示，并且构建体的ActRIIB多肽、ActRIIA多肽、ALK4多肽或ALK7多肽可以与SEQ IDNO:30或SEQ ID NO:23融合，但并非与两者融合。鉴于天然hG1Fc、天然hG2Fc、天然hG3Fc和天然hG4Fc之间高度的氨基酸序列同一性，可以了解在hG2Fc、hG3Fc或hG4Fc中的相应位置处的氨基酸取代(参见图7)将生成互补Fc，其可以代替SEQ ID NO:30(下文)和SEQ ID NO:23的互补hG1Fc对使用。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIB:ALK4异多聚体多肽，其中ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIB:ALK7异多聚体多肽，其中ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，ActRIIB-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置435处的精氨酸。在一些实施方案中，ALK4-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在氨基酸位置146处的丙氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。在一些实施方案中，ALK7-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在氨基酸位置146处的丙氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIB:ALK4异多聚体多肽，其中ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIB:ALK7异多聚体多肽，其中ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，ActRIIA-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置138处的谷氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置217处的天冬氨酸。在一些实施方案中，ALK4-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在氨基酸位置146处的丙氨酸、在氨基酸位置162处的精氨酸、在氨基酸位置179处的精氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。在一些实施方案中，ALK7-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在氨基酸位置146处的丙氨酸、在氨基酸位置162处的精氨酸、在氨基酸位置179处的精氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIB:ALK4异多聚体多肽，其中ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIB-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIB:ALK7异多聚体多肽，其中ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ActRIIB-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，ALK4-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置138处的谷氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置217处的天冬氨酸。在一些实施方案中，ActRIIB-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在氨基酸位置146处的丙氨酸、在氨基酸位置162处的精氨酸、在氨基酸位置179处的精氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。在一些实施方案中，ALK7-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置138处的谷氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置217处的天冬氨酸。在一些实施方案中，ActRIIB-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在氨基酸位置146处的丙氨酸、在氨基酸位置162处的精氨酸、在氨基酸位置179处的精氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIA:ALK4异多聚体多肽，其中ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIA:ALK7异多聚体多肽，其中ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，ALK4-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置138处的谷氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置217处的天冬氨酸。在一些实施方案中，ActRIIA-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在氨基酸位置146处的丙氨酸、在氨基酸位置162处的精氨酸、在氨基酸位置179处的精氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。在一些实施方案中，ALK7-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置138处的谷氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置217处的天冬氨酸。在一些实施方案中，ActRIIA-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在氨基酸位置146处的丙氨酸、在氨基酸位置162处的精氨酸、在氨基酸位置179处的精氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。
在一些实施方案中，ALK4-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置435处的精氨酸。在一些实施方案中，ALK7-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置435处的精氨酸。在一些实施方案中，ActRIIB-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在氨基酸位置146处的丙氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIA:ALK4异多聚体多肽，其中ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIA:ALK7异多聚体多肽，其中ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，ActRIIA-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置435处的精氨酸。在一些实施方案中，ALK4-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在氨基酸位置146处的丙氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。在一些实施方案中，ALK7-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在氨基酸位置146处的丙氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽的ActRIIA:ALK4异多聚体多肽，其中ALK4-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，本公开涉及包含ActRIIA-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽的ActRIIA:ALK7异多聚体多肽，其中ALK7-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域，并且ActRIIA-Fc融合多肽包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的Fc结构域。
在一些实施方案中，ALK4-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置435处的精氨酸。在一些实施方案中，ALK7-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置132处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的色氨酸以及在氨基酸位置435处的精氨酸。在一些实施方案中，ActRIIA-Fc融合多肽Fc结构域包含在氨基酸位置127处的半胱氨酸、在氨基酸位置144处的丝氨酸、在氨基酸位置146处的丙氨酸以及在氨基酸位置185处的缬氨酸。
在某些实施方案中，本公开涉及包含第一变体ActRIIB-Fc融合多肽和第二变体ActRIIB-Fc融合多肽的异多聚体，其中所述第一变体ActRIIB多肽并不包含第二变体ActRIIB多肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc异多聚体结合一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)。在一些实施方案中，ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc异多聚体抑制一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)的信号传导。在一些实施方案中，ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc异多聚体是异二聚体。
在一些实施方案中，第一ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的F82、L79、A24、K74、R64、P129、P130、E37、R40、D54、R56、W78、D80和F82中的任何一个的氨基酸位置处的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，第一ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的L38N、E50L、E52N、L57E、L57I、L57R、L57T、L57V、Y60D、G68R、K74E、W78Y、L79F、L79S、L79T、L79W、F82D、F82E、F82L、F82S、F82T、F82Y、N83R、E94K和V99G中的任何一个的氨基酸位置处的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代选自以下：A24N、K74A、R64K、R64N、K74A、L79A、L79D、L79E、L79P、P129S、P130A、P130R、E37A、R40A、D54A、R56A、K74F、K74I、K74Y、W78A、D80A、D80F、D80G、D80I、D80K、D80M、D80M、D80N、D80R和F82A。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代选自以下：L38N、E50L、E52N、L57E、L57I、L57R、L57T、L57V、Y60D、G68R、K74E、W78Y、L79F、L79S、L79T、L79W、F82D、F82E、F82L、F82S、F82T、F82Y、N83R、E94K和V99G。在一些实施方案中，第二ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的F82、L79、A24、K74、R64、P129、P130、E37、R40、D54、R56、W78、D80和F82中的任何一个的氨基酸位置处的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代选自以下：A24N、K74A、R64K、R64N、K74A、L79A、L79D、L79E、L79P、P129S、P130A、P130R、E37A、R40A、D54A、R56A、K74F、K74I、K74Y、W78A、D80A、D80F、D80G、D80I、D80K、D80M、D80M、D80N、D80R和F82A。在一些实施方案中，第二ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的L38N、E50L、E52N、L57E、L57I、L57R、L57T、L57V、Y60D、G68R、K74E、W78Y、L79F、L79S、L79T、L79W、F82D、F82E、F82L、F82S、F82T、F82Y、N83R、E94K和V99G中的任何一个的氨基酸位置处的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代选自以下：L38N、E50L、E52N、L57E、L57I、L57R、L57T、L57V、Y60D、G68R、K74E、W78Y、L79F、L79S、L79T、L79W、F82D、F82E、F82L、F82S、F82T、F82Y、N83R、E94K和V99G。在一些实施方案中，第一ActRIIB多肽和/或第二ActRIIB多肽包含促进异多聚体形成的一种或多种氨基酸修饰。在一些实施方案中，第一ActRIIB多肽和/或第二ActRIIB多肽包含抑制异多聚体形成的一种或多种氨基酸修饰。在一些实施方案中，异多聚体是异二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含第一ActRIIB多肽和第二ActRIIB多肽的异多聚体，所述第一ActRIIB多肽与SEQ ID NO:36的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，所述第二ActRIIB多肽与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，其中所述第一ActRIIB多肽并不包含第二ActRIIB多肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一ActRIIB多肽包含在对应于SEQ IDNO:2的55的氨基酸位置处的谷氨酸。在一些实施方案中，第二ActRIIB多肽并不包含在对应于SEQ ID NO:2的55的氨基酸位置处的谷氨酸。在一些实施方案中，第二ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的55的氨基酸位置处的赖氨酸。在一些实施方案中，第一ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的F82、L79、A24、K74、R64、P129、P130、E37、R40、D54、R56、W78和D80中的任何一个的氨基酸位置处的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代选自以下：A24N、K74A、R64K、R64N、K74A、L79A、L79D、L79E、L79P、P129S、P130A、P130R、E37A、R40A、D54A、R56A、K74F、K74I、K74Y、W78A、D80A、D80F、D80G、D80I、D80K、D80M、D80M、D80N、D80R和F82A。在一些实施方案中，第二ActRIIB多肽包含在对应于SEQ IDNO:2的F82、L79、A24、K74、R64、P129、P130、E37、R40、D54、R56、W78、D80和F82中的任何一个的氨基酸位置处的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代选自以下：A24N、K74A、R64K、R64N、K74A、L79A、L79D、L79E、L79P、P129S、P130A、P130R、E37A、R40A、D54A、R56A、K74F、K74I、K74Y、W78A、D80A、D80F、D80G、D80I、D80K、D80M、D80M、D80N、D80R和F82A。在一些实施方案中，第一ActRIIB多肽和/或第二ActRIIB多肽包含促进异多聚体形成的一种或多种氨基酸修饰。在一些实施方案中，第一ActRIIB多肽和/或第二ActRIIB多肽包含抑制异多聚体形成的一种或多种氨基酸修饰。在一些实施方案中，异多聚体是异二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含第一ActRIIB多肽和第二ActRIIB多肽的异多聚体，所述第一ActRIIB多肽与SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，所述第二ActRIIB多肽与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，其中所述第一ActRIIB多肽并不包含第二ActRIIB多肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一ActRIIB多肽包含在对应于SEQ IDNO:2的82的氨基酸位置处的异亮氨酸。在一些实施方案中，第二ActRIIB多肽并不包含在对应于SEQ ID NO:2的82的氨基酸位置处的异亮氨酸。在一些实施方案中，第二ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的82的氨基酸位置处的苯丙氨酸。在一些实施方案中，第一ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的L79、A24、K74、R64、P129、P130、E37、R40、D54、R56、W78和D80中的任何一个的氨基酸位置处的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代选自以下：A24N、K74A、R64K、R64N、K74A、L79A、L79D、L79E、L79P、P129S、P130A、P130R、E37A、R40A、D54A、R56A、K74F、K74I、K74Y、W78A、D80A、D80F、D80G、D80I、D80K、D80M、D80M、D80N和D80R。在一些实施方案中，第二ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的L79、A24、K74、R64、P129、P130、E37、R40、D54、R56、W78和D80中的任何一个的氨基酸位置处的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代选自以下：A24N、K74A、R64K、R64N、K74A、L79A、L79D、L79E、L79P、P129S、P130A、P130R、E37A、R40A、D54A、R56A、K74F、K74I、K74Y、W78A、D80A、D80F、D80G、D80I、D80K、D80M、D80M、D80N和D80R。在一些实施方案中，第一ActRIIB多肽和/或第二ActRIIB多肽包含促进异多聚体形成的一种或多种氨基酸修饰。在一些实施方案中，第一ActRIIB多肽和/或第二ActRIIB多肽包含抑制异多聚体形成的一种或多种氨基酸修饰。在一些实施方案中，异多聚体是异二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含第一ActRIIB多肽和第二ActRIIB多肽的异多聚体，所述第一ActRIIB多肽与SEQ ID NO:42的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，所述第二ActRIIB多肽与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，其中所述第一ActRIIB多肽并不包含第二ActRIIB多肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一ActRIIB多肽包含在对应于SEQ IDNO:2的82的氨基酸位置处的赖氨酸。在一些实施方案中，第二ActRIIB多肽并不包含在对应于SEQ ID NO:2的82的氨基酸位置处的赖氨酸。在一些实施方案中，第二ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的82的氨基酸位置处的苯丙氨酸。在一些实施方案中，第一ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的L79、A24、K74、R64、P129、P130、E37、R40、D54、R56、W78和D80中的任何一个的氨基酸位置处的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代选自以下：A24N、K74A、R64K、R64N、K74A、L79A、L79D、L79E、L79P、P129S、P130A、P130R、E37A、R40A、D54A、R56A、K74F、K74I、K74Y、W78A、D80A、D80F、D80G、D80I、D80K、D80M、D80M、D80N和D80R。在一些实施方案中，第二ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的L79、A24、K74、R64、P129、P130、E37、R40、D54、R56、W78和D80中的任何一个的氨基酸位置处的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代选自以下：A24N、K74A、R64K、R64N、K74A、L79A、L79D、L79E、L79P、P129S、P130A、P130R、E37A、R40A、D54A、R56A、K74F、K74I、K74Y、W78A、D80A、D80F、D80G、D80I、D80K、D80M、D80M、D80N和D80R。在一些实施方案中，第一ActRIIB多肽和/或第二ActRIIB多肽包含促进异多聚体形成的一种或多种氨基酸修饰。在一些实施方案中，第一ActRIIB多肽和/或第二ActRIIB多肽包含抑制异多聚体形成的一种或多种氨基酸修饰。在一些实施方案中，异多聚体是异二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含第一ActRIIB多肽和第二ActRIIB多肽的异多聚体，所述第一ActRIIB多肽与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，所述第二ActRIIB多肽与SEQ ID NO:48的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，其中所述第一ActRIIB多肽并不包含第二ActRIIB多肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一ActRIIB多肽包含对应于SEQ ID NO:2的79的酸性氨基酸位置。在一些实施方案中，酸性氨基酸是天冬氨酸。在一些实施方案中，酸性氨基酸是谷氨酸。在一些实施方案中，第二ActRIIB多肽并不包含在对应于SEQ ID NO:2的79的氨基酸位置处的酸性酸(例如，天冬氨酸或谷氨酸)。在一些实施方案中，第二ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的79的氨基酸位置处的亮氨酸。在一些实施方案中，第一ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的F82、A24、K74、R64、P129、P130、E37、R40、D54、R56、W78、D80和F82中的任何一个的氨基酸位置处的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代选自以下：A24N、K74A、R64K、R64N、K74A、L79P、P129S、P130A、P130R、E37A、R40A、D54A、R56A、K74F、K74I、K74Y、W78A、D80A、D80F、D80G、D80I、D80K、D80M、D80M、D80N、D80R和F82A。在一些实施方案中，第二ActRIIB多肽包含在对应于SEQ IDNO:2的F82、A24、K74、R64、P129、P130、E37、R40、D54、R56、W78、D80和F82中的任何一个的氨基酸位置处的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代选自以下：A24N、K74A、R64K、R64N、K74A、P129S、P130A、P130R、E37A、R40A、D54A、R56A、K74F、K74I、K74Y、W78A、D80A、D80F、D80G、D80I、D80K、D80M、D80M、D80N、D80R和F82A。在一些实施方案中，第一ActRIIB多肽和/或第二ActRIIB多肽包含促进异多聚体形成的一种或多种氨基酸修饰。在一些实施方案中，第一ActRIIB多肽和/或第二ActRIIB多肽包含抑制异多聚体形成的一种或多种氨基酸修饰。在一些实施方案中，异多聚体是异二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含第一ActRIIB多肽和第二ActRIIB多肽的异多聚体，所述第一ActRIIB多肽与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，所述第二ActRIIB多肽与SEQ ID NO:52的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，其中所述第一ActRIIB多肽并不包含第二ActRIIB多肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一ActRIIB多肽包含对应于SEQ ID NO:2的79的酸性氨基酸位置。在一些实施方案中，酸性氨基酸是天冬氨酸。在一些实施方案中，酸性氨基酸是谷氨酸。在一些实施方案中，第二ActRIIB多肽并不包含在对应于SEQ ID NO:2的79的氨基酸位置处的酸性酸(例如，天冬氨酸或谷氨酸)。在一些实施方案中，第二ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的79的氨基酸位置处的亮氨酸。在一些实施方案中，第一ActRIIB多肽包含在对应于SEQ ID NO:2的F82、A24、K74、R64、P129、P130、E37、R40、D54、R56、W78、D80和F82中的任何一个的氨基酸位置处的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代选自以下：A24N、K74A、R64K、R64N、K74A、L79P、P129S、P130A、P130R、E37A、R40A、D54A、R56A、K74F、K74I、K74Y、W78A、D80A、D80F、D80G、D80I、D80K、D80M、D80M、D80N、D80R和F82A。在一些实施方案中，第二ActRIIB多肽包含在对应于SEQ IDNO:2的F82、A24、K74、R64、P129、P130、E37、R40、D54、R56、W78、D80和F82中的任何一个的氨基酸位置处的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代选自以下：A24N、K74A、R64K、R64N、K74A、P129S、P130A、P130R、E37A、R40A、D54A、R56A、K74F、K74I、K74Y、W78A、D80A、D80F、D80G、D80I、D80K、D80M、D80M、D80N、D80R和F82A。
在某些方面，本公开涉及异多聚体，其包含一种或多种ALK4受体多肽(例如，SEQID No:84、85、86、87、88、89、92、93、247、249、421、422及其变体)和一种或多种ActRIIB受体多肽(例如，SEQ ID NO:1、2、5、6、12、31、33、34、36、37、39、40、42、43、45、46、48、49、50、51、52、53、276、278、279、332、333、335、336、338、339、341、342、344、345、347、348、350、351、353、354、356、357、385、386、387、388、389、396、398、402、403、406、408、409及其变体)，包括其用途(例如，治疗有此需要的患者中的心力衰竭)，其在本文中一般被称为“ActRIIB:ALK4异多聚体”或“ActRIIB-ALK4异多聚体”，包括其用途(例如，治疗有此需要的患者中的心力衰竭)。优选地，ActRIIB:ALK4异多聚体是可溶性的[例如，异多聚体复合物包含ALK4受体的可溶性部分(结构域)和ActRIIB受体的可溶性部分(结构域)]。一般而言，ALK4和ActRIIB的细胞外结构域对应于这些受体的可溶性部分。因此，在一些实施方案中，ActRIIB:ALK4异多聚体包含ALK4受体的细胞外结构域和ActRIIB受体的细胞外结构域。在一些实施方案中，ActRIIB:ALK4异多聚体抑制一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)的(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，ActRIIB:ALK4异多聚体结合一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)。在一些实施方案中，ActRIIB:ALK4异多聚体包含至少一种ALK4多肽，其包含序列、基本上由序列组成或由序列组成，所述序列与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、92、93、247、249、421和422的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，本公开的ActRIIB:ALK4异多聚体复合物包含至少一种ALK4多肽，其包含序列、基本上由序列组成、由序列组成，所述序列与ALK4的一部分具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性，所述ALK4的一部分在对应于SEQ ID NO:84的氨基酸24-34、25-34或26-34中的任何一个的残基处开始，并且在来自SEQ ID NO:84的101-126、102-126、101-125、101-124、101-121、111-126、111-125、111-124、121-126、121-125、121-124或124-126的位置处结束。在一些实施方案中，ActRIIB:ALK4异多聚体包含至少一种ALK4多肽，其包含序列、基本上由序列组成、由序列组成，所述序列与关于SEQ ID NO:84的氨基酸34-101具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，ActRIIB-ALK4异多聚体包含至少一种ActRIIB多肽，其包含序列、基本上由序列组成、由序列组成，所述序列与SEQ ID NO:2、5、6、12、31、33、34、36、37、39、40、42、43、45、46、48、49、50、51、52、53、276、278、279、332、333、335、336、338、339、341、342、344、345、347、348、350、351、353、354、356、357、385、386、387、388、389、396、398、402、403、406、408和409中的任何一个的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，本公开的ActRIIB:ALK4异多聚体复合物包含至少一种ActRIIB多肽，其包含序列、基本上由序列组成、由序列组成，所述序列与ActRIIB的一部分具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性，所述ActRIIB的一部分在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸20-29、20-24、21-24、22-25或21-29中的任何一个的残基处开始，并且在来自109-134、119-134、119-133、129-134或129-133的位置处结束。在一些实施方案中，ActRIIB:ALK4异多聚体包含至少一种ActRIIB多肽，其包含序列、基本上由序列组成、由序列组成，所述序列与SEQ ID NO:2的氨基酸29-109具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，ActRIIB:ALK4异多聚体包含至少一种ActRIIB多肽，其包含序列、基本上由序列组成、由序列组成，所述序列与SEQ ID NO:2的氨基酸25-131具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的ActRIIB:ALK4异多聚体复合物包含至少一种ActRIIB多肽，其中对应于SEQ ID NO:2的L79的位置不是酸性氨基酸(即，并非天然存在的D或E氨基酸残基或者人工酸性氨基酸残基)。本公开的ActRIIB:ALK4异多聚体包括例如异二聚体、异三聚体、异四聚体和进一步更高阶的寡聚结构。参见例如图11-13，其也可以应用于ActRII:ALK7寡聚结构。在某些优选实施方案中，本公开的异二聚体复合物是ActRIIB:ALK7异二聚体。
在某些实施方案中，本公开涉及包含至少一种ALK7-Fc融合多肽和至少一种ActRIIB-Fc融合多肽的异多聚体。在一些实施方案中，ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异多聚体结合一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)。在一些实施方案中，ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异多聚体抑制一种或多种ActRII-ALK4(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)的信号传导。在一些实施方案中，ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异多聚体是异二聚体。
在某些实施方案中，本公开涉及包含至少一种ALK7多肽的异多聚体，所述ALK7多肽包括其片段、功能变体和修饰形式。优选地，用于如本文公开的使用的ALK7多肽(例如，包含ALK7多肽的异多聚体及其用途)是可溶性的(例如，ALK7的细胞外结构域)。在其它优选实施方案中，用于如本文公开的使用的ALK7多肽结合和/或抑制(拮抗)一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)超家族配体的活性(例如，Smad信号传导的诱导)。在一些实施方案中，ALK7-Fc融合多肽包含ALK7结构域，其包含的氨基酸序列与如下的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，所述氨基酸序列在SEQ ID NO:120、121或122的氨基酸21-28中的任何一个(例如，氨基酸残基21、22、23、24、25、26、27和28)处开始，并且在SEQ ID NO:120、121或122的氨基酸92-113中的任何一个(例如，氨基酸残基92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112和113)处结束。在一些实施方案中，ALK7-Fc融合多肽包含ALK7结构域，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:120、121或122的氨基酸28-92具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，ALK7-Fc融合多肽包含ALK7结构域，其包含的氨基酸序列与SEQID NO:120、121或122的氨基酸21-113具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，ALK7-Fc融合多肽包含ALK7结构域，其包含的氨基酸序列与SEQ ID No:120、123、124、125、121、126、122、127、128、129、130、131、132、133或134中的任何一个的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，本公开的异多聚体由至少一种ALK7多肽组成或基本上由其组成，所述ALK7多肽与SEQ ID NO:120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、133或134的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在某些方面，本公开涉及异多聚体复合物，其包含一种或多种ALK7受体多肽(例如，SEQ ID No:120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、133、134及其变体)和一种或多种ActRIIB受体多肽(例如，SEQ ID NO:1、2、5、6、12、31、33、34、36、37、39、40、42、43、45、46、48、49、50、51、52、53、276、278、279、332、333、335、336、338、339、341、342、344、345、347、348、350、351、353、354、356、357、385、386、387、388、389、396、398、402、403、406、408、409及其变体)，其在本文中一般被称为“ActRIIB:ALK7异多聚体”或“ActRIIB-ALK7异多聚体”，包括其用途(例如，治疗有此需要的患者中的心力衰竭)。优选地，ActRIIB-ALK7异多聚体是可溶性的[例如，异多聚体复合物包含ALK7受体的可溶性部分(结构域)和ActRIIB受体的可溶性部分(结构域)]。一般而言，ALK7和ActRIIB的细胞外结构域对应于这些受体的可溶性部分。因此，在一些实施方案中，ActRIIB-ALK7异多聚体包含ALK7受体的细胞外结构域和ActRIIB受体的细胞外结构域。在一些实施方案中，ActRIIB-ALK7异多聚体抑制一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)的(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，ActRIIB-ALK7异多聚体结合一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)。在一些实施方案中，ActRIIB-ALK7异多聚体包含至少一种ALK7多肽，其包含序列、基本上由序列组成或由序列组成，所述序列与SEQID NO:120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、133和134的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，ActRIIB-ALK7异多聚体包含至少一种ActRIIB多肽，其包含序列、基本上由序列组成、由序列组成，所述序列与SEQ ID NO:2、5、6、12、31、33、34、36、37、39、40、42、43、45、46、48、49、50、51、52、53、276、278、279、332、333、335、336、338、339、341、342、344、345、347、348、350、351、353、354、356、357、385、386、387、388、389、396、398、402、403、406、408和409中的任何一个的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，本公开的ActRIIB-ALK7异多聚体复合物包含至少一种ActRIIB多肽，其包含序列、基本上由序列组成、由序列组成，所述序列与ActRIIB的一部分具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性，所述ActRIIB的一部分在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸20-29、20-24、21-24、22-25或21-29中的任何一个的残基处开始，并且在来自109-134、119-134、119-133、129-134或129-133的位置处结束。在一些实施方案中，ActRIIB-ALK7异多聚体包含至少一种ActRIIB多肽，其包含序列、基本上由序列组成、由序列组成，所述序列与SEQ ID NO:2的氨基酸29-109具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，ActRIIB-ALK7异多聚体包含至少一种ActRIIB多肽，其包含序列、基本上由序列组成、由序列组成，所述序列与SEQ ID NO:2的氨基酸25-131具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的ActRIIB-ALK7异多聚体复合物包含至少一种ActRIIB多肽，其中对应于SEQ ID NO:2的L79的位置不是酸性氨基酸(即，并非天然存在的D或E氨基酸残基或者人工酸性氨基酸残基)。本公开的ActRIIB-ALK7异多聚体包括例如异二聚体、异三聚体、异四聚体和进一步更高阶的寡聚结构。参见例如图11-13，其也可以应用于ActRII-ALK4和ActRII-ALK7寡聚结构两者。在某些优选实施方案中，本公开的异二聚体复合物是ActRIIB-ALK7异二聚体。
在某些方面，本公开涉及异多聚体复合物，其包含一种或多种ALK7受体多肽(例如，SEQ ID No:120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、133、134及其变体)和一种或多种ActRIIA受体多肽(例如，SEQ ID NO:364、366、367、368、369、378、380、381、384及其变体)，其在本文中一般被称为“ActRIIA:ALK7异多聚体”或“ActRIIA-ALK7异多聚体”，包括其用途(例如，治疗有此需要的患者中的心力衰竭)。优选地，ActRIIA-ALK7异多聚体是可溶性的[例如，异多聚体复合物包含ALK7受体的可溶性部分(结构域)和ActRIIA受体的可溶性部分(结构域)]。一般而言，ALK7和ActRIIA的细胞外结构域对应于这些受体的可溶性部分。因此，在一些实施方案中，ActRIIA-ALK7异多聚体包含ALK7受体的细胞外结构域和ActRIIA受体的细胞外结构域。在一些实施方案中，ActRIIA-ALK7异多聚体抑制一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)的(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，ActRIIA-ALK7异多聚体结合一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)。在一些实施方案中，ActRIIA-ALK7异多聚体包含至少一种ALK7多肽，其包含序列、基本上由序列组成或由序列组成，所述序列与SEQ IDNO:120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、133和134的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，ActRIIA-ALK7异多聚体包含至少一种ActRIIA多肽，其包含序列、基本上由序列组成、由序列组成，所述序列与SEQ ID NO:364、366、367、368、369、378、380、381、384中的任何一个的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些优选实施方案中，本公开的异多聚体复合物是ActRIIA-ALK7异二聚体。
在某些方面，本公开涉及异多聚体复合物，其包含一种或多种ALK4受体多肽(例如，SEQ ID No:84、85、86、87、88、89、92、93、247、249、421、422及其变体)和一种或多种ActRIIA受体多肽(例如，SEQ ID NO:364、366、367、368、369、378、380、381、384及其变体)，其在本文中一般被称为“ActRIIA:ALK4异多聚体”或“ActRIIA-ALK4异多聚体”，包括其用途(例如，治疗有此需要的患者中的心力衰竭)。优选地，ActRIIA-ALK4异多聚体是可溶性的[例如，异多聚体复合物包含ALK4受体的可溶性部分(结构域)和ActRIIA受体的可溶性部分(结构域)]。一般而言，ALK4和ActRIIA的细胞外结构域对应于这些受体的可溶性部分。因此，在一些实施方案中，ActRIIA-ALK4异多聚体包含ALK4受体的细胞外结构域和ActRIIA受体的细胞外结构域。在一些实施方案中，ActRIIA-ALK4异多聚体抑制一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)的(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，ActRIIA-ALK4异多聚体结合一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)。在一些实施方案中，ActRIIA-ALK4异多聚体包含至少一种ALK4多肽，其包含序列、基本上由序列组成或由序列组成，所述序列与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、92、93、247、249、421和422的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，本公开的ActRIIA-ALK4异多聚体复合物包含至少一种ALK4多肽，其包含序列、基本上由序列组成、由序列组成，所述序列与ALK4的一部分具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性，所述ALK4的一部分在对应于SEQ ID NO:84的氨基酸24-34、25-34或26-34中的任何一个的残基处开始，并且在来自SEQ ID NO:84的101-126、102-126、101-125、101-124、101-121、111-126、111-125、111-124、121-126、121-125、121-124或124-126的位置处结束。在一些实施方案中，ActRIIA-ALK4异多聚体包含至少一种ALK4多肽，其包含序列、基本上由序列组成、由序列组成，所述序列与关于SEQ ID NO:84的氨基酸34-101具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，ActRIIA-ALK4异多聚体包含至少一种ActRIIA多肽，其包含序列、基本上由序列组成、由序列组成，所述序列与SEQ ID NO:364、366、367、368、369、378、380、381、384中的任何一个的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些优选实施方案中，本公开的异多聚体复合物是ActRIIA-ALK4异二聚体。
在某些实施方案中，本公开涉及包含第一ActRIIA-Fc融合多肽和第二ActRIIA-Fc融合多肽的异多聚体，其中所述第二变体ActRIIA-Fc融合多肽不同于第一多肽中存在的。在一些实施方案中，ActRIIA-Fc:ActRIIA-Fc异多聚体结合一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)。在一些实施方案中，ActRIIA-Fc:ActRIIA-Fc异多聚体抑制一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)的信号传导。在一些实施方案中，ActRIIA-Fc:ActRIIA-Fc异多聚体是异二聚体。
II.接头
本公开提供了ActRII-ALK4配体捕获多肽(例如，ActRIIB、ActRIIA、ALK4、ALK7和卵泡抑素多肽，包括其变体)，其可以与本文公开的另外的多肽融合，包括例如与异源部分(例如Fc部分)融合。在这些实施方案中，多肽部分(例如，ActRIIB、ActRIIA、ALK4、ALK7和卵泡抑素多肽，包括其变体)借助于接头连接至另外的多肽(例如，异源部分如Fc结构域)。在一些实施方案中，接头是富含甘氨酸和丝氨酸的接头。在一些实施方案中，接头可以是富含甘氨酸(例如，2-10、2-5、2-4、2-3个甘氨酸残基)或甘氨酸和脯氨酸残基的，并且可以例如含有苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸的单一序列或苏氨酸/丝氨酸和/或甘氨酸的重复序列，例如GGG(SEQ ID NO:261)、GGGG(SEQ ID NO:262)、TGGGG(SEQ ID NO:263)、SGGGG(SEQ ID NO:264)、TGGG(SEQ ID NO:265)或SGGG(SEQ ID NO:266)单峰或重复。其它近中性氨基酸，例如但不限于Thr、Asn、Pro和Ala，也可以用于接头序列中。在一些实施方案中，接头包含含有Gly和Ser的氨基酸序列的各种排列。在一些实施方案中，接头长度大于10个氨基酸。在进一步的实施方案中，接头具有至少12、15、20、21、25、30、35、40、45或50个氨基酸的长度。在一些实施方案中，接头少于40、35、30、25、22或20个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度是10-50、10-40、10-30、10-25、10-21、10-15、10、15-25、17-22、20或21个氨基酸。在优选实施方案中，接头包含氨基酸序列GlyGlyGlyGlySer(GGGGS)(SEQ ID NO:267)或其重复(GGGGS)n，其中n≥2。在特定实施方案中，n≥3或n＝3-10。在一些实施方案中，n≥4或n＝4-10。在一些实施方案中，(GGGGS)n接头中的n不大于4。在一些实施方案中，n＝4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-8、5-7或5-6。在一些实施方案中，n＝3、4、5、6或7。在特定实施方案中，n＝4。在一些实施方案中，包含(GGGGS)n序列的接头还包含N末端苏氨酸。在一些实施方案中，接头是下述中的任何一种：
在一些实施方案中，接头包含TGGGPKSCDK(SEQ ID NO:275)的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头是缺少N末端苏氨酸的SEQ ID NO:268-275中的任何一个。在一些实施方案中，接头并不包含SEQ ID NO:273或274的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文描述的多肽(例如，ActRIIB、ActRIIA、ALK4、ALK7和卵泡抑素多肽，包括其变体)可以包括通过接头融合至部分的多肽。在一些实施方案中，该部分增加多肽的稳定性。在一些实施方案中，该部分选自Fc结构域单体、野生型Fc结构域、具有氨基酸取代(例如，降低二聚化的一个或多个取代)的Fc结构域、白蛋白结合肽、纤连蛋白结构域和人血清白蛋白。合适的肽接头是本领域已知的，并且包括例如含有柔性氨基酸残基例如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸的肽接头。在一些实施方案中，接头可以含有GA、GS、GG、GGA、GGS、GGG(SEQ ID NO:261)、GGGA(SEQ ID NO:280)、GGGS(SEQ ID NO:281)、GGGG(SEQ IDNO:262)、GGGGA(SEQ ID NO:282)、GGGGS(SEQ ID NO:267)、GGGGG(SEQ ID NO:283)、GGAG(SEQ ID NO:284)、GGSG(SEQ ID NO:285)、AGGG(SEQ ID NO:286)或SGGG(SEQ ID NO:266)的基序，例如多重或重复基序。在一些实施方案中，接头可以含有2至12个氨基酸，包括GA或GS的基序，例如GA、GS、GAGA(SEQ ID NO:287)、GSGS(SEQ ID NO:288)、GAGAGA(SEQ ID NO:289)、GSGSGS(SEQ ID NO:290)、GAGAGAGA(SEQ ID NO:291)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:292)、GAGAGAGAGA(SEQ ID NO:293)、GSGSGSGSGS(SEQ ID NO:294)、GAGAGAGAGAGA(SEQ ID NO:295)和GSGSGSGSGSGS(SEQ ID NO:296)。在一些实施方案中，接头可以含有3至12个氨基酸，包括GGA或GGS的基序，例如GGA、GGS、GGAGGA(SEQ ID NO:297)、GGSGGS(SEQ ID NO:298)、GGAGGAGGA(SEQ ID NO:299)、GGSGGSGGS(SEQ ID NO:300)、GGAGGAGGAGGA(SEQ ID NO:301)和GGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:302)。在一些实施方案中，接头可以含有4至12个氨基酸，包括GGAG(SEQ ID NO:303)、GGSG(SEQ ID NO:304)、GGAGGGAG(SEQ ID NO:305)、GGSGGGSG(SEQID NO:306)、GGAGGGAGGGAG(SEQ ID NO:307)和GGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:308)的基序。在一些实施方案中，接头可以含有GGGGA(SEQ ID NO:309)或GGGGS(SEQ ID NO:267)的基序，例如GGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO:310)和GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:311)。在一些实施方案中，在部分(例如，Fc结构域单体、野生型Fc结构域、具有氨基酸取代(例如，降低二聚化的一个或多个取代)的Fc结构域、白蛋白结合肽、纤连蛋白结构域或人血清白蛋白)和多肽(例如，ActRIIB、ActRIIA、ALK4、ALK7和卵泡抑素多肽，包括其变体)之间的氨基酸接头可以是GGG、GGGA(SEQ ID NO:280)、GGGG(SEQ ID NO:262)、GGGAG(SEQ ID NO:312)、GGGAGG(SEQID NO:313)或GGGAGGG(SEQ ID NO:314)。
在一些实施方案中，接头还可以含有除甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸外的氨基酸，例如AAAL(SEQ ID NO:315)、AAAK(SEQ ID NO:316)、AAAR(SEQ ID NO:317)、EGKSSGSGSESKST(SEQ ID NO:318)、GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO:319)、AEAAAKEAAAKA(SEQ ID NO:320)、KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO:321)、GENLYFQSGG(SEQ ID NO:322)、SACYCELS(SEQ IDNO:323)、RSIAT(SEQ ID NO:324)、RPACKIPNDLKQKVMNH(SEQ ID NO:325)、GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG(SEQ ID NO:326)、AAANSSIDLISVPVDSR(SEQ ID NO:327)或GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS(SEQ ID NO:328)。在一些实施方案中，接头可以含有EAAAK(SEQ ID NO:329)的基序，例如多重或重复基序。在一些实施方案中，接头可以含有富含脯氨酸的序列的基序，例如多重或重复基序，所述富含脯氨酸的序列例如其中X可以是任何氨基酸(例如，A、K或E)且n是1-5的(XP)n、以及PAPAP(SEQ ID NO:330)。
可以取决于所涉及的两种多肽以及最终多肽融合多肽中所需的柔性程度来调整肽接头的长度和所使用的氨基酸。可以调整接头的长度以确保正确的多肽折叠并避免聚集体形成。
H)多肽变体和修饰
部分地，本公开涉及其为变体多肽(例如，变体ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)的ActRII-ALK4拮抗剂。本公开的变体多肽包括例如通过一种或多种氨基酸取代、缺失、添加或其组合产生的变体多肽，以及一种或多种翻译后修饰(例如，包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化)的变体。用于生成包含一种或多种氨基酸修饰的变体多肽的方法，特别是用于生成具有一种或多种所需性质的变体多肽的方法，在本文中进行描述或是本领域另外众所周知的。同样地，用于确定变体多肽是否已保留或发展了一种或多种所需性质(例如，配体结合和/或拮抗活性的改变)的各种方法，在本文中进行描述或是本领域另外众所周知的。这些方法可以用于生成变体多肽(例如，变体ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)，以及如此处所述的验证其活性(或其它性质)。
如上文所述，本公开提供了与天然存在的多肽共享指定程度的序列同一性或相似性的多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)。为了确定两个氨基酸序列的百分比同一性，序列对于最佳比较目的进行比对(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列之一或两者中引入空位用于最佳比对，并且为了比较目的可以忽略非同源序列)。然后比较在相应的氨基酸位置处的氨基酸残基。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基占据时，则分子在该位置处是相同的(如本文所用，氨基酸“同一性”等价于氨基酸“同源性”)。在两个序列之间的百分比同一性是由序列共享的相同位置数目的函数，考虑到空位的数目和每个空位的长度，所述空位需要被引入用于两个序列的最佳比对。
序列的比较以及两个序列之间的百分比同一性和相似性的确定可以使用数学算法(Computational MolecularBiology，Lesk，A.M.，编辑，OxfordUniversity Press，NewYork，1988；Biocomputing:Informatics和Genome Projects，Smith，D.W.，编辑，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part 1，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.，编辑，Humana Press，NewJersey，1994；Sequence Analysisin Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；以及Sequence AnalysisPrimer，Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑，M Stockton Press，New York，1991)来完成。
在一个实施方案中，使用Needleman和Wunsch(J Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法来确定两个氨基酸序列之间的百分比同一性，所述算法已并入GCG软件包(可在http://www.gcg.com处获得)中的GAP程序内。在一个具体实施方案中，下述参数用于GAP程序中：Blosum 62矩阵或PAM250矩阵，以及空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6。在又一个实施方案中，使用GCG软件包(Devereux，J.等人，Nucleic Acids Res.12(1):387(1984))(可在http://www.gcg.com处获得)中的GAP程序，来确定两个核苷酸序列之间的百分比同一性。示例性参数包括使用NWSgapdna.CMP矩阵，以及空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6。除非另有说明，否则两个氨基酸序列之间的百分比同一性待使用GAP程序，使用Blosum 62矩阵、GAP权重10和长度权重3来确定，并且如果此类算法不能计算所需的百分比同一性，则应当选择本文公开的合适的替代方案。
在另一个实施方案中，使用E.Myers和W.Miller(CABIOS，4:11-17(1989))的算法，来确定两个氨基酸序列之间的百分比同一性，所述算法已并入ALIGN程序(版本2.0)内，使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。
用于确定两个氨基酸序列之间的最佳整体比对的另一个实施方案可以使用基于Brutlag等人(Comp.App.Biosci.，6:237-245(1990))的算法的FASTDB计算机程序来确定。在序列比对中，查询序列和主题序列均为氨基酸序列。所述总体序列比对的结果依据同一性百分比呈现。在一个实施方案中，使用基于Brutlag等人(Comp.App.Biosci.，6:237-245(1990))的算法的FASTDB计算机程序，来执行氨基酸序列同一性。在一个具体实施方案中，用于计算氨基酸比对的百分比同一性和相似性的参数包含：矩阵＝PAM 150、k元组＝2、错配罚分＝1、连接罚分＝20、随机化组长度＝0、截断评分＝1、空位罚分＝5和空位大小罚分＝0.05。
在一些实施方案中，本公开考虑了通过修饰多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)的结构来制备功能性变体多肽，用于此类目的如增强治疗功效或稳定性(例如，贮存期限以及对体内蛋白酶解降解的抗性)。变体可以通过氨基酸取代、缺失、添加或其组合来产生。例如，合理的是预计亮氨酸由异亮氨酸或缬氨酸的分开替换、天冬氨酸盐由谷氨酸盐的替换、苏氨酸由丝氨酸的替换、或者氨基酸由结构上有关的氨基酸的相似替换(例如，保守突变)对所得到的分子的生物活性没有重大作用。保守替换是在其侧链方面有关的氨基酸家族内发生的那些替换。通过评价变体多肽以类似于野生型多肽的方式在细胞中产生应答，或者结合一种或多种ActRII-ALK4配体，包括例如激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6和BMP10的能力，可以容易地确定本公开的多肽的氨基酸序列中的变化是否导致功能同源物。
在某些实施方案中，本公开考虑了多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)的特定突变，以便改变多肽的糖基化。可以选择此类突变以便引入或消除一个或多个糖基化位点，例如O联或N联糖基化位点。天冬酰胺连接的糖基化识别位点一般包含三肽序列，天冬酰胺-X-苏氨酸或天冬酰胺-X-丝氨酸(其中“X”是任何氨基酸)，其被适当的细胞糖基化酶特异性地识别。该改变还可以通过向多肽的序列添加或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(对于O联糖基化位点)来进行。在糖基化识别位点的第一个或第三个氨基酸位置之一或两者处的各种氨基酸取代或缺失(和/或在第二个位置处的氨基酸缺失)导致在修饰的三肽序列处的非糖基化。增加多肽上的碳水化合物部分数目的另一种手段是通过糖苷与多肽的化学或酶促偶联。取决于所使用的偶联模式，糖可以附着至(a)精氨酸和组氨酸；(b)游离羧基；(c)游离巯基，例如半胱氨酸的巯基；(d)游离羟基，例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些羟基；(e)芳香族残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些残基；或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。多肽上存在的一个或多个碳水化合物部分的去除可以以化学方法和/或酶促完成。化学去糖基化可以涉及例如使多肽暴露于化合物三氟甲磺酸或等价化合物。这种处理导致除了连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大多数或所有糖的切割，同时使氨基酸序列保持完整。多肽上的碳水化合物部分的酶促切割可以通过使用各种内切糖苷酶和外切糖苷酶来实现，如通过Thotakura等人[Meth.Enzymol.(1987)138:350]所述的。取决于所使用的表达系统的类型，可以适当地调整多肽的序列，因为哺乳动物、酵母、昆虫和植物细胞都可能引入可以受肽的氨基酸序列影响的不同的糖基化模式。一般而言，用于人中的本公开的多肽可以在提供适当糖基化的哺乳动物细胞系，例如HEK293或CHO细胞系中表达，尽管预计其它哺乳动物表达细胞系也是有用的。在一些实施方案中，本公开的多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)是糖基化的，并且具有可从CHO细胞中的多肽获得的糖基化模式。
本公开进一步涵盖了生成突变体，特别是多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)的组合突变体以及截短突变体集合的方法。组合突变体库对于鉴定功能活性(例如，ActRII-ALK4配体结合)序列尤为有用。筛选此类组合文库的目的可以是生成例如具有改变的性质的多肽变体，所述改变的性质例如改变的药代动力学或改变的配体结合。下文提供了各种筛选测定，并且此类测定可以用于评估变体。例如，可以筛选多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)变体、包含其的同多聚体和异多聚体结合一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)的能力，以防止ActRII-ALK4配体与ActRII和/或ALK4多肽以及其同多聚体或异多聚体的结合，和/或干扰由ActRII-ALK4配体引起的信号传导。
多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)，包括其同多聚体和异多聚体，或其变体的活性也可以在基于细胞的测定或体内测定中进行测试。例如，评价了多肽包括其同多聚体和异多聚体或其变体对涉及心力衰竭发病机制的基因表达的作用。需要时，这可以在一种或多种重组配体蛋白(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)的存在下执行，并且可以转染细胞以便产生多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)，以及任选的ActRII-ALK4配体。同样地，可以将多肽包括其同多聚体和异多聚体或其变体施用于小鼠或其它动物，并且可以使用领域公认的方法评价对心力衰竭发病机制的作用。类似地，例如，通过如本文所述的测定和本领域通常已知的那些测定，可以就对这些细胞生长的任何作用在血细胞前体细胞中测试多肽包括其同多聚体和异多聚体或其变体的活性。SMAD响应报道基因可以用于此类细胞系中，以监测对下游信号传导的作用。
在某些方面，本公开的多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)，包括其异多聚体或同多聚体，结合一种或多种ActRII-ALK4配体。在一些实施方案中，本公开的多肽包括其异多聚体或同多聚体以至少1x 10-7M的KD结合一种或多种ActRII-ALK4配体。在一些实施方案中，一种或多种ActRII-ALK4配体选自以下：激活素A、激活素B、GDF8、GDF11和BMP10。
在某些方面，本公开的多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)，包括其异多聚体或同多聚体，抑制一种或多种ActRII-ALK4家族配体。在一些实施方案中，本公开的多肽包括其异多聚体或同多聚体，抑制一种或多种ActRII-ALK4配体的信号传导。在一些实施方案中，本公开的多肽包括其异多聚体或同多聚体，抑制一种或多种ActRII-ALK4配体的Smad信号传导。在一些实施方案中，本公开的多肽包括其异多聚体或同多聚体，在基于细胞的测定中抑制一种或多种ActRII-ALK4配体的信号传导。在一些实施方案中，本公开的多肽包括其异多聚体或同多聚体，抑制选自以下的一种或多种ActRII-ALK4配体：激活素A、激活素B、GDF8、GDF11和BMP10。
可以生成组合衍生的变体，其相对于参考多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)，包括其同多聚体和异多聚体，具有增加的选择性或一般增加的效力。当从重组DNA构建体表达时，此类变体可以用于基因治疗方案中。同样地，诱变可以产生具有与相应的未修饰多肽包括其同多聚体和异多聚体显著不同的细胞内半衰期的变体。例如，可以致使改变的蛋白质对蛋白酶解降解或者导致未修饰多肽的破坏或另外失活的其它细胞过程更稳定或更不稳定。此类变体以及编码其的基因可以用于通过调节多肽的半衰期来改变多肽复合物水平。例如，短半衰期可以产生更瞬时的生物效应，并且当作为诱导表达系统的部分时，可以允许细胞内的重组多肽复合物水平的更严格控制。在Fc融合蛋白中，可以在接头(如果有的话)和/或Fc部分中制备突变，以改变多肽包括其同多聚体和异多聚体的半衰期。
组合文库可以通过编码多肽文库的基因简并文库来产生，所述多肽文库各自包括多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)，包括其同多聚体和异多聚体的至少一部分。例如，可以将合成寡核苷酸的混合物酶促连接到基因序列内，使得潜在的ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素编码核苷酸序列的简并集合可表达为个别的多肽，或者可替代地表达为更大的融合蛋白集合(例如，用于噬菌体展示)。
存在可以通过其从简并寡核苷酸序列生成潜在同源物文库的许多方法。简并基因序列的化学合成可以在自动DNA合成仪中进行，然后可以将合成的基因连接到适当的载体内用于表达。简并寡核苷酸的合成是本领域众所周知的[Narang，SA(1983)Tetrahedron39:3；Itakura等人(1981)Recombinant DNA，Proc.3rd ClevelandSympos.Macromolecules，编辑AG Walton，Amsterdam:Elsevier pp273-289；Itakura等人(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323；Itakura等人(1984)Science 198:1056；以及Ike等人(1983)Nucleic Acid Res.11:477]。此类技术已用于其它蛋白质的定向进化中[Scott等人，(1990)Science249:386-390；Roberts等人(1992)ProcNatl Acad Sci USA 89:2429-2433；Devlin等人(1990)Science 249:404-406；Cwirla等人，(1990)Proc Natl Acad SciUSA 87:6378-6382；以及美国专利号：5,223,409、5,198,346和5,096,815]。
可替代地，可以利用其它形式的诱变来生成组合文库。例如，本公开的多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)，包括其同多聚体和异多聚体，可以通过以下生成并从文库中分离：使用例如丙氨酸扫描诱变[Ruf等人(1994)Biochemistry 33:1565-1572；Wang等人(1994)J.Biol.Chem.269:3095-3099；Balint等人(1993)Gene137:109-118；Grodberg等人(1993)Eur.J.Biochem.218:597-601；Nagashima等人(1993)J.Biol.Chem.268:2888-2892；Lowman等人(1991)Biochemistry 30:10832-10838；以及Cunningham等人(1989)Science244:1081-1085]的筛选，接头扫描诱变[Gustin等人(1993)Virology193:653-660；以及Brown等人(1992)Mol.Cell Biol.12:2644-2652；McKnight等人(1982)Science 232:316]，饱和诱变[Meyers等人，(1986)Science 232:613]；PCR诱变[Leung等人(1989)Method Cell Mol Biol1:11-19]；或随机诱变，包括化学诱变[Miller等人(1992)A Short Course in Bacterial Genetics，CSHL Press，Cold Spring Harbor，NY；以及Greener等人(1994)Strategies in Mol Biol 7:32-34]。特别是在组合背景下的接头扫描诱变是用于鉴定截短(生物活性)形式的多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)，包括其同多聚体和异多聚体的有吸引力的方法。
本领域已知广泛范围的技术用于筛选通过点突变和截短制备的组合文库的基因产物，并且就此而言，用于在cDNA文库中筛选具有某一性质的基因产物。此类技术一般适用于快速筛选通过多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)，包括其同多聚体和异多聚体的组合诱变生成的基因文库。用于筛选大基因文库的最广泛使用的技术通常包括将基因文库克隆到可复制的表达载体内，用所得到的载体文库转化适当的细胞，并且在其中所需活性的检测促进编码其产物被检测的基因的载体的相对容易分离的条件下表达组合基因。优选的测定包括配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)结合测定和/或配体介导的细胞信号传导测定。
如本领域技术人员将认识到的，本文所述的大多数所述突变、变体或修饰可以在核酸水平下进行制备，或者在一些情况下，通过翻译后修饰或化学合成进行制备。此类技术是本领域众所周知的，并且其中一些在本文中进行描述。部分地，本公开鉴定了多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)的功能活性部分(片段)和变体，包括其同多聚体和异多聚体，其可以用作用于生成且使用在本文描述的方法和用途的范围内的其它变体多肽的指导。
在某些实施方案中，本公开的多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)，包括其同多聚体和异多聚体的功能活性片段，可以通过筛选由编码本文公开的多肽的核酸的相应片段重组产生的多肽来获得。另外，可以使用本领域已知的技术例如常规Merrifield固相f-Moc或t-Boc化学来化学合成片段。可以(重组或通过化学合成)产生片段并进行测试，以鉴定可以充当ActRII和/或ALK4受体和/或一种或多种配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)的拮抗剂(抑制剂)的那些肽基片段。
在某些实施方案中，本公开的多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)，包括其同多聚体和异多聚体或其变体，可以进一步包含除天然存在于多肽中的任何之外的翻译后修饰。此类修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。结果，多肽包括其同多聚体和异多聚体可以含有非氨基酸元件，例如聚乙二醇、脂质、多糖或单糖、以及磷酸盐。此类非氨基酸元件对多肽的功能性的作用可以如本文对于其它多肽变体所述的进行测试。当通过切割多肽的新生形式在细胞中产生本发明的多肽时，翻译后加工对于蛋白质的正确折叠和/或功能也可能是重要的。不同的细胞(例如，CHO、HeLa、MDCK、293、WI38、NIH-3T3或HEK293)具有用于此类翻译后活性的特定细胞机制和特性机制，并且可以选择为确保多肽的正确修饰和加工。
I)核酸和制造方法
在某些方面，本公开提供了编码本文公开的任何多肽、以及本文公开的任何变体的分离的和/或重组核酸，所述多肽包括例如ActRIIB、ActRIIA、ALK4或ALK7多肽(例如，可溶性ActRIIB、ActRIIA、ALK4或ALK7多肽)、或卵泡抑素多肽。例如，SEQ ID NO:4编码天然存在的ActRIIB前体多肽，而SEQ ID NO:3编码可溶性ActRIIB多肽。主题核酸可以是单链或双链的。此类核酸可以是DNA或RNA分子。这些核酸可以用于例如制备ActRIIB、ActRIIA、ALK4或ALK7多肽的方法中或者用作直接治疗剂(例如，在基因治疗方法中)。
在某些方面，本公开涉及分离的和/或重组核酸，其包含关于如本文所述的ActRIIB、ActRIIA、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽中的一种或多种的编码序列。例如，在一些实施方案中，本公开涉及分离的和/或重组核酸，其与对应于SEQ ID No:3、4、10、32、35、38、41、44、47、221、222、223、224、233、234、235、236、237、238、239、240、243、248、250、251、252、255、277、331、334、337、340、343、346、349、352、355、369、370、382、397、407、423和424中的任何一个的核酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，本公开的分离的和/或重组多核苷酸序列包含与本文所述的编码序列(例如，与对应于SEQ ID No:3、4、10、32、35、38、41、44、47、221、222、223、224、233、234、235、236、237、238、239、240、243、248、250、251、252、255、277、331、334、337、340、343、346、349、352、355、369、370、382、397、407、423和424中的任何一个的核酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸)可操作地连接的启动子序列。在一些实施方案中，本公开涉及包含本文所述的分离的和/或重组核酸(例如，与对应于SEQ ID No:3、4、10、32、35、38、41、44、47、221、222、223、224、233、234、235、236、237、238、239、240、243、248、250、251、252、255、277、331、334、337、340、343、346、349、352、355、369、370、382、397、407、423和424中的任何一个的核酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸)的载体。在一些实施方案中，本公开涉及包含本文所述的分离的和/或重组多核苷酸序列(例如，与对应于SEQ ID No:3、4、10、32、35、38、41、44、47、221、222、223、224、233、234、235、236、237、238、239、240、243、248、250、251、252、255、277、331、334、337、340、343、346、349、352、355、369、370、382、397、407、423和424中的任何一个的核酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸)的细胞。在一些实施方案中，细胞是CHO细胞。在一些实施方案中，细胞是COS细胞。
在某些实施方案中，编码本公开的变体ActRIIB(或者其同多聚体或异多聚体)、ALK4或ALK7多肽的核酸应理解为包括其为SEQ ID NO:3、4、10、32、35、38、41、44、47、221、222、223、224、233、234、235、236、237、238、239、240、243、248、250、251、252、255、277、331、334、337、340、343、346、349、352、355、369、370、382、397、407、423和424中的任何一个的变体的核酸。变体核苷酸序列包括通过一种或多种核苷酸取代、添加或缺失而不同的序列，包括等位基因变体，并且因此将包括与SEQ ID NO:3、4、10、32、35、38、41、44、47、221、222、223、224、233、234、235、236、237、238、239、240、243、248、250、251、252、255、277、331、334、337、340、343、346、349、352、355、369、370、382、397、407、423和424中的任何一个中指定的核苷酸序列不同的编码序列。
在某些实施方案中，本公开的变体ActRIIB(或者其同多聚体或异多聚体)、ALK4或ALK7多肽由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:3、4、10、32、35、38、41、44、47、221、222、223、224、233、234、235、236、237、238、239、240、243、248、250、251、252、255、277、331、334、337、340、343、346、349、352、355、369、370、382、397、407、423和424中的任何一个具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽(或者其同多聚体或异多聚体)由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:3具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽(或者其同多聚体或异多聚体)由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:4具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽(或者其同多聚体或异多聚体)由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:10具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽(或者其同多聚体或异多聚体)由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:32具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽(或者其同多聚体或异多聚体)由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:35具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽(或者其同多聚体或异多聚体)由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:38具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽(或者其同多聚体或异多聚体)由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:41具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽(或者其同多聚体或异多聚体)由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:44具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽(或者其同多聚体或异多聚体)由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:47具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在某些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽(或者其同多聚体或异多聚体)由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:277具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽(或者其同多聚体或异多聚体)由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:331具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽(或者其同多聚体或异多聚体)由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:334具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽(或者其同多聚体或异多聚体)由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:337具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽(或者其同多聚体或异多聚体)由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:340具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽(或者其同多聚体或异多聚体)由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:343具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽(或者其同多聚体或异多聚体)由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:346具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽(或者其同多聚体或异多聚体)由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:349具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽(或者其同多聚体或异多聚体)由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:352具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽(或者其同多聚体或异多聚体)由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:355具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽(或者其同多聚体或异多聚体)由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:382具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽(或者其同多聚体或异多聚体)由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:397具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的变体ActRIIB多肽(或者其同多聚体或异多聚体)由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:407具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在某些实施方案中，本公开的变体ActRIIA多肽(或者其同多聚体或异多聚体)由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:369具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的变体ActRIIA多肽(或者其同多聚体或异多聚体)由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:370具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在某些实施方案中，本公开的ALK4多肽由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:221具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的ALK4多肽由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ IDNO:222具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的ALK4多肽由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:223具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的ALK4多肽由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:224具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的ALK4多肽由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:423具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的ALK4多肽由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:424具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在某些实施方案中，本公开的ALK7多肽由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:233具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的ALK7多肽由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ IDNO:234具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的ALK7多肽由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:235具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的ALK7多肽由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:236具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的ALK7多肽由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:237具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的ALK7多肽由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:238具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的ALK7多肽由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ IDNO:239具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的ALK7多肽由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:240具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在某些实施方案中，本公开的ALK4-Fc融合多肽由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:243具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的ALK4-Fc融合多肽由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:248具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的ALK4-Fc融合多肽由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:250具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的ALK4-Fc融合多肽由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:251具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的ALK4-Fc融合多肽由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:252具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方案中，本公开的ALK7-Fc融合多肽由分离的和/或重组核酸序列编码，所述分离的和/或重组核酸序列与SEQ ID NO:255具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在某些方面，编码变体ActRIIB多肽的主题核酸进一步理解为包括其为SEQ IDNO:3的变体的核酸。变体核苷酸序列包括通过一种或多种核苷酸取代、添加或缺失而不同的序列，例如等位基因变体；并且因此将包括与SEQ ID NO:4中指定的编码序列的核苷酸序列不同的编码序列。
在某些实施方案中，本公开提供了分离的或重组核酸序列，其与SEQ ID NO:3具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。本领域普通技术人员将了解，与SEQ ID NO:3互补的核酸序列以及SEQ ID NO:3的变体也在本公开的范围内。在进一步的实施方案中，本公开的核酸序列可以是分离的、重组的和/或与异源核苷酸序列融合的，或者在DNA文库中。
在其它实施方案中，本公开的核酸还包括在高度严格条件下与以下杂交的核苷酸序列：编码以同聚或异聚形式的ActRIIB或ActRIIA多肽、本公开的ALK4或ALK7多肽、或本公开的卵泡抑素多肽的核酸，其互补序列或片段。如上文讨论的，本领域普通技术人员将容易理解促进DNA杂交的适当严格条件可以变化。本领域普通技术人员将容易理解促进DNA杂交的适当严格条件可以变化。例如，可以执行在约45℃下在6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)下的杂交，随后为在50℃下2.0x SSC的洗涤。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以从在50℃下约2.0xSSC的低严格性到在50℃下约0.2x SSC的高严格性选择。另外，洗涤步骤中的温度可以从在室温(约22℃)下的低严格性条件增加到在约65℃下的高严格性条件。温度和盐两者均可以变化，或者温度或盐浓度可以保持恒定而另一个变量改变。在一个实施方案中，本公开提供了在室温下在6x SSC的低严格性条件下杂交，随后在室温下在2x SSC下洗涤的核酸。
由于遗传密码的简并性与如本公开中阐述的核酸不同的分离的核酸也在本公开的范围内。例如，多个氨基酸通过多于一个三联体指定。指定相同氨基酸的密码子或同义词(例如，CAU和CAC是组氨酸的同义词)可能导致并不影响多肽的氨基酸序列的“沉默”突变。然而，预计确实导致主题多肽的氨基酸序列改变的DNA序列多态性将存在于哺乳动物细胞中。本领域技术人员将了解，由于天然等位基因变异，编码特定多肽的核酸的一个或多个核苷酸(最多约3-5％的核苷酸)中的这些变异可能存在于给定物种的个体中。任何和所有此类核苷酸变异和所得到的氨基酸多态性都在本公开的范围内。
在某些实施方案中，本公开的重组核酸可以可操作地连接到表达构建体中的一种或多种调控性核苷酸序列。调控性核苷酸序列一般适合于用于表达的宿主细胞。对于各种宿主细胞，众多类型的适当的表达载体和合适的调控序列是本领域已知的。通常，所述一种或多种调控性核苷酸序列可以包括但不限于启动子序列、前导或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、以及增强子或激活子序列。如本领域已知的组成型或诱导型启动子由本公开加以考虑。启动子可以是天然存在的启动子，或者是组合多于一种启动子的元件的杂合启动子。表达构建体可以存在于细胞中的附加体例如质粒上，或者表达构建体可以插入染色体中。在一个优选实施方案中，表达载体含有可选择标记物基因，以允许转化的宿主细胞的选择。可选择标记物基因是本领域众所周知的，并且将随着所使用的宿主细胞而变。
在某些方面，主题核酸在表达载体中提供，所述表达载体包含编码本发明的多肽(例如，变体ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)的核苷酸序列，其可操作地连接到至少一种调控序列。调控序列是领域公认的并且被选择为指导本公开的多肽(例如，变体ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)的表达。相应地，术语调控序列包括启动子、增强子和其它表达控制元件。示例性的调控序列在Goeddel；GeneExpression Technology:Methods inEnzymology，Academic Press，San Diego，CA(1990)中进行描述。例如，当与DNA序列可操作地连接时控制其表达的广泛各种的表达控制序列中的任一种可以用于这些载体中，以表达编码本公开的多肽的DNA序列(例如，变体ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)。此类有用的表达控制序列包括例如SV40的早期和晚期启动子、tet启动子、腺病毒或巨细胞病毒立即早期启动子、RSV启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、其表达由T7 RNA聚合酶指导的T7启动子、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区、用于fd外壳蛋白的控制区、用于3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子例如Pho5、酵母α-交配因子的启动子、杆状病毒系统的多面体启动子和已知控制原核或真核细胞或其病毒的基因表达的其它序列、及其各种组合。应当理解，表达载体的设计可以取决于此类因素如待转化的宿主细胞的选择和/或需要表达的多肽的类型。此外，还应该考虑载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力、以及由载体编码的任何其它多肽例如抗生素标记物的表达。
本公开的重组核酸可以通过将克隆的基因或其一部分连接到载体内来产生，所述载体适合于在原核细胞、真核细胞(酵母、禽类、昆虫或哺乳动物)或两者中表达。用于产生重组变体ActRIIB多肽的表达载体包括质粒和其它载体。例如，合适的载体包括以下类型的质粒：用于在原核细胞例如大肠杆菌(E.coli)中表达的pBR322衍生的质粒、pEMBL衍生的质粒、pEX衍生的质粒、pBTac衍生的质粒和pUC衍生的质粒。
一些哺乳动物表达载体含有促进载体在细菌中增殖的原核序列和在真核细胞中表达的一个或多个真核转录单位。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg衍生的载体是适合于转染真核细胞的哺乳动物表达载体的实例。这些载体中的一些用来自细菌质粒例如pBR322的序列进行修饰，以促进在原核细胞和真核细胞两者中的复制和药物抗性选择。可替代地，病毒的衍生物例如牛乳头状瘤病毒(BPV-1)或EB病毒(pHEBo、pREP衍生的和p205)可以用于多肽在真核细胞中的瞬时表达。其它病毒(包括逆转录病毒)表达系统的实例可以在下文基因治疗递送系统的描述中找到。用于制备质粒和转化宿主生物的各种方法是本领域众所周知的。关于用于原核细胞和真核细胞两者的其它合适的表达系统以及一般的重组程序，参见MolecularCloningA LaboratoryManual，第2版，由Sambrook、Fritsch和Maniatis编辑(Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)，第16章和第17章。在一些情况下，可能期望通过使用杆状病毒表达系统来表达重组多肽。此类杆状病毒表达系统的实例包括pVL衍生的载体(例如pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW衍生的载体(例如pAcUW1)和pBlueBac衍生的载体(例如含有β-gal的pBlueBac III)。
在一个优选实施方案中，载体被设计用于在CHO细胞中产生本公开的多肽(例如，变体ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)，例如Pcmv-Script载体(Stratagene，La Jolla，Calif.)、pcDNA4载体(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)和pCI-neo载体(Promega，Madison，Wisc.)。如显而易见的，主题基因构建体可以用于引起本公开的多肽(例如，变体ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)在培养物中增殖的细胞中的表达，例如以产生多肽包括融合多肽或多肽用于纯化。
在某些实施方案中，本公开涉及制备本公开的多肽(例如，变体ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)以及包含其的同多聚体和异多聚体的方法，如本文所述的。此类方法可以包括在合适的细胞(例如，CHO细胞或COS细胞)中表达本文公开的任何核酸。此类方法可以包括：a)在适合于表达本公开的可溶性多肽(例如，变体ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)的条件下培养细胞，其中所述细胞包含本公开的多肽(例如，变体ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)的表达构建体。在一些实施方案中，方法进一步包括回收所表达的本公开的多肽(例如，变体ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)。本公开的多肽(例如，变体ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)可以使用任何众所周知的用于从细胞培养物中获得蛋白质的技术，作为粗制的、部分纯化的或高度纯化的级分进行回收。
本公开还涉及用重组基因转染的宿主细胞，所述重组基因包括关于本公开的一种或多种多肽(例如，变体ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)的编码序列。宿主细胞可以是任何原核细胞或真核细胞。例如，本公开的多肽(例如，变体ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)可以在细菌细胞例如大肠杆菌、昆虫细胞(例如，使用杆状病毒表达系统)、酵母或哺乳动物细胞中表达。其它合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。
相应地，本公开进一步涉及产生本公开的多肽(例如，变体ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)的方法。例如，用编码本公开的多肽(例如，变体ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)的表达载体转染的宿主细胞可以在适当的条件下进行培养，以允许本公开的多肽(例如，变体ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)的表达发生。本公开的多肽(例如，变体ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)可以从含有该多肽的细胞和培养基的混合物中分泌且分离。可替代地，本公开的多肽(例如，变体ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)可以保留在细胞质或膜级分中，并且将细胞收获，裂解并分离蛋白质。细胞培养物包括宿主细胞、培养基和其它副产物。用于细胞培养的合适培养基是本领域众所周知的。本公开的主题多肽(例如，变体ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)可以使用本领域已知的用于纯化多肽的技术，从细胞培养基、宿主细胞或两者中进行分离，所述技术包括离子交换层析、凝胶过滤层析、超滤、电泳以及用对于本公开的多肽(例如，变体ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)的特定表位特异性的抗体的免疫亲和纯化。在一个优选实施方案中，本公开的多肽(例如，变体ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)是含有促进纯化的结构域的融合多肽。
在优选实施方案中，待按照本文描述的方法使用的ActRII多肽、ALK4多肽、ALK7多肽，以及ActRIIB-ALK4、ActRIIB-ALK7、ActRIIA-ALK4和ActRIIA-ALK7异多聚体是分离的多肽。如本文所用，分离的蛋白质或多肽是已与其天然环境的组分分开的分离的蛋白质或多肽。在一些实施方案中，本公开的多肽纯化至大于95％、96％、97％、98％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。用于评价纯度的方法是本领域众所周知的[参见例如，Flatman等人，(2007)J.Chromatogr.B 848:79-87]。在一些实施方案中，待按照本文描述的方法使用的ActRII多肽、ALK4多肽和ActRIIB-ALK4异多聚体是重组多肽。
在某些实施方案中，本公开的ActRIIB或ActRIIA多肽可以通过各种领域已知的技术来产生。例如，此类ActRIIB或ActRIIA多肽可以使用标准蛋白质化学技术来合成，所述技术例如Bodansky，M.Principles of Peptide Synthesis，Springer Verlag，Berlin(1993)和Grant G.A.(编辑)，Synthetic Peptides:A User's Guide，W.H.Freeman and Company，NewYork(1992)中描述的那些技术。另外，自动化肽合成仪是商购可得的(例如，AdvancedChemTech Model 396；Milligen/Biosearch9600)。可替代地，ActRIIB或ActRIIA多肽、其片段或变体可以使用如本领域众所周知(还参见上文)的各种表达系统(例如，大肠杆菌、中国仓鼠卵巢细胞、COS细胞、杆状病毒)重组产生。在一个进一步的实施方案中，ActRIIB或ActRIIA多肽可以通过使用例如蛋白酶，例如胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶或成对的碱性氨基酸转换酶(PACE)，通过消化天然存在的或重组产生的全长ActRIIB或ActRIIA多肽来产生。计算机分析(使用商购可得的软件，例如MacVector，Omega，PCGene，Molecular Simulation，Inc.)可以用于鉴定蛋白酶解切割位点。可替代地，此类ActRIIB或ActRIIA多肽可以由天然存在的或重组产生的全长ActRIIB或ActRIIA多肽产生，例如本领域已知的标准技术，例如通过化学切割(例如，溴化氰、羟胺)。
在另一个实施方案中，编码纯化前导序列的融合基因，例如在本公开的重组多肽(例如，变体ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)的所需部分的N末端处的聚(His)/肠激酶切割位点序列，可以允许通过使用Ni2+金属树脂的亲和层析纯化所表达的融合多肽。随后可以通过用肠激酶处理去除纯化前导序列，以提供纯化的本公开的多肽(例如，变体ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7或卵泡抑素多肽)(例如，参见Hochuli等人，(1987)J.Chromatography411:177；以及Janknecht等人，Proc Natl Acad Sci USA 88:8972)。
用于制备融合基因的技术是众所周知的。基本上，编码不同多肽序列的各种DNA片段的连接按照常规技术执行，采用平末端或交错末端用于连接，限制性酶消化以提供适当的末端，适当时粘性末端的填入，碱性磷酸酶处理以避免不期望的连接和酶促连接。在另一个实施方案中，可以通过常规技术包括自动化DNA合成仪来合成融合基因。可替代地，可以使用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述锚定引物在两个连续基因片段之间产生互补突出端，其随后可以进行退火以生成嵌合基因序列(参见例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology，编辑，Ausubel等人，John Wiley&Sons:1992)。
3.抗体拮抗剂
在某些方面，待按照本文公开的方法和用途(例如，治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭、或者与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的一种或多种并发症的进展速率和/或严重程度)使用的ActRII-ALK4拮抗剂是抗体(ActRII-ALK4拮抗剂抗体)或抗体的组合。ActRII-ALK4拮抗剂抗体或抗体的组合可以结合例如一种或多种ActRII配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、ActRII受体(ActRIIA和/或ActRIIB)和/或I型受体(例如，ALK4)。如本文所述的，ActRII-ALK4拮抗剂抗体可以单独使用或者与一种或多种支持疗法或活性剂组合使用，以治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度，特别是治疗、预防或降低一种或多种心力衰竭相关并发症的进展速率和/或严重程度。
在某些方面，ActRII-ALK4拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)的抗体。因此，在一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂抗体或抗体的组合至少结合激活素。如本文所用，激活素抗体(或抗激活素抗体)一般指以足够的亲和力结合激活素的抗体，使得该抗体可用作靶向激活素的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施方案中，激活素抗体与无关的非激活素蛋白的结合程度小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％，或小于约1％的抗体与激活素的结合，如例如通过放射性免疫测定(RIA)、Biacore或者其它蛋白质相互作用或结合亲和力测定所测量的。在某些实施方案中，激活素抗体结合在来自不同物种的激活素中保守的激活素表位。在某些优选实施方案中，抗激活素抗体结合人激活素。在一些实施方案中，激活素抗体可以抑制激活素与I型和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB和/或ALK4)的结合，并且因此抑制激活素介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。应当注意，激活素A与激活素B具有相似的序列同源性，并且因此在一些情况下，结合激活素A的抗体也可以结合和/或抑制激活素B，其也适用于抗激活素B抗体。在一些实施方案中，本公开涉及多特异性抗体(例如双特异性抗体)及其用途，其结合激活素并进一步结合例如一种或多种另外的ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB和/或ALK4)。在一些实施方案中，结合激活素的多特异性抗体并不结合或基本上并不结合BMP9(例如，以大于1x 10-7M的KD结合BMP9，或者具有相对适度的结合例如约1x 10-8M或约1x 10-9M)。在一些实施方案中，结合激活素的多特异性抗体并不结合或基本上并不结合激活素A(例如，以大于1x10-7M的KD结合激活素A，或者具有相对适度的结合例如约1x 10-8M或约1x 10-9M)。在一些实施方案中，本公开涉及抗体的组合及其用途，其中所述抗体的组合包含激活素抗体和一种或多种另外的抗体，其结合例如一种或多种另外的ActRII配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、ActRII受体(ActRIIA和/或ActRIIB)、和/或I型受体(例如，ALK4)。在一些实施方案中，包含激活素抗体的抗体的组合并不包含BMP9抗体。
在某些方面，ActRII-ALK4拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制激活素A的抗体。因此，在一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂抗体或抗体的组合至少结合激活素A。如本文所用，激活素A抗体(或抗激活素A抗体)一般指以足够的亲和力结合激活素A的抗体，使得该抗体可用作靶向激活素A的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施方案中，激活素A抗体与无关的非激活素A蛋白的结合程度小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％，或小于约1％的抗体与激活素的结合，如例如通过放射性免疫测定(RIA)、Biacore或者其它蛋白质相互作用或结合亲和力测定所测量的。在某些实施方案中，激活素A抗体结合在来自不同物种的激活素A中保守的激活素A表位。在某些优选实施方案中，抗激活素A抗体结合人激活素A。在一些实施方案中，激活素A抗体可以抑制激活素A与I型和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB和/或ALK4)的结合，并且因此抑制激活素A介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，激活素A抗体可以抑制激活素A结合共受体并因此抑制激活素A介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。应当注意，激活素A与激活素B具有相似的序列同源性，并且因此在一些情况下，结合激活素A的抗体也可以结合和/或抑制激活素B。在一些实施方案中，本公开涉及多特异性抗体(例如双特异性抗体)及其用途，其结合激活素A并进一步结合例如一种或多种另外的ActRII配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、ActRII受体(ActRIIA和/或ActRIIB)、和/或I型受体(例如，ALK4)。在一些实施方案中，结合激活素A的多特异性抗体并不结合或基本上并不结合BMP9(例如，以大于1x 10-7M的KD结合BMP9，或者具有相对适度的结合例如约1x 10-8M或约1x 10-9M)。在一些实施方案中，结合激活素A的多特异性抗体并不结合或基本上并不结合激活素B(例如，以大于1x 10-7M的KD结合激活素B，或者具有相对适度的结合例如约1x 10-8M或约1x 10-9M)。在一些实施方案中，本公开涉及抗体的组合及其用途，其中所述抗体的组合包含激活素A抗体和一种或多种另外的抗体，其结合例如一种或多种另外的ActRII配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、ActRII受体(ActRIIA和/或ActRIIB)、和/或I型受体(例如，ALK4)。在一些实施方案中，包含激活素A抗体的抗体的组合并不包含BMP9抗体。在一些实施方案中，包含激活素A抗体的抗体的组合并不包含激活素B抗体。在一些实施方案中，本公开的激活素A抗体包含REGN-2477。在一些实施方案中，本公开的激活素A抗体包含加托索单抗。
在某些方面，ActRII-ALK4拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制激活素B的抗体。因此，在一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂抗体或抗体的组合至少结合激活素B。如本文所用，激活素B抗体(或抗激活素B抗体)一般指以足够的亲和力结合激活素B的抗体，使得该抗体可用作靶向激活素B的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施方案中，激活素B抗体与无关的非激活素B蛋白的结合程度小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％，或小于约1％的抗体与激活素的结合，如例如通过放射性免疫测定(RIA)、Biacore或者其它蛋白质相互作用或结合亲和力测定所测量的。在某些实施方案中，激活素B抗体结合在来自不同物种的激活素B中保守的激活素B表位。在某些优选实施方案中，抗激活素B抗体结合人激活素B。在一些实施方案中，激活素B抗体可以抑制激活素B与I型和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB和/或ALK4)的结合，并且因此抑制激活素B介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，激活素B抗体可以抑制激活素B结合共受体并因此抑制激活素B介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。应当注意，激活素B与激活素A具有相似的序列同源性，并且因此在一些情况下，结合激活素B的抗体也可以结合和/或抑制激活素A。在一些实施方案中，本公开涉及多特异性抗体(例如双特异性抗体)及其用途，其结合激活素B并进一步结合例如一种或多种另外的ActRII配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、ActRII受体(ActRIIA和/或ActRIIB)、和/或I型受体(例如，ALK4)。在一些实施方案中，结合激活素B的多特异性抗体并不结合或基本上并不结合BMP9(例如，以大于1x 10-7M的KD结合BMP9，或者具有相对适度的结合例如约1x 10-8M或约1x 10-9M)。在一些实施方案中，结合激活素B的多特异性抗体并不结合或基本上并不结合激活素A(例如，以大于1x 10-7M的KD结合激活素A，或者具有相对适度的结合例如约1x 10-8M或约1x 10-9M)。在一些实施方案中，本公开涉及抗体的组合及其用途，其中所述抗体的组合包含激活素B抗体和一种或多种另外的抗体，其结合例如一种或多种另外的ActRII配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、ActRII受体(ActRIIA和/或ActRIIB)、和/或I型受体(例如，ALK4)。在一些实施方案中，包含激活素B抗体的抗体的组合并不包含BMP9抗体。在一些实施方案中，包含激活素B抗体的抗体的组合并不包含激活素A抗体。
在某些方面，ActRII-ALK4拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制GDF8的抗体。因此，在一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂抗体或抗体的组合至少结合GDF8。如本文所用，GDF8抗体(或抗GDF8抗体)一般指以足够的亲和力结合GDF8的抗体，使得该抗体可用作靶向GDF8的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施方案中，GDF8抗体与无关的非GDF8蛋白的结合程度小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％，或小于约1％的抗体与GDF8的结合，如例如通过放射性免疫测定(RIA)、Biacore或者其它蛋白质相互作用或结合亲和力测定所测量的。在某些实施方案中，GDF8抗体结合在来自不同物种的GDF8中保守的GDF8表位。在某些优选实施方案中，抗GDF8抗体结合人GDF8。在一些实施方案中，GDF8抗体可以抑制GDF8与I型和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB和/或ALK4)的结合，并且因此抑制GDF8介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，GDF8抗体可以抑制GDF8结合共受体并因此抑制GDF8介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。应当注意，GDF8与GDF11具有高序列同源性，并且因此在一些情况下，结合GDF8的抗体也可以结合和/或抑制GDF11。在一些实施方案中，本公开涉及多特异性抗体(例如双特异性抗体)及其用途，其结合GDF8并进一步结合例如一种或多种另外的ActRII配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、ActRII受体(ActRIIA和/或ActRIIB)、和/或I型受体(例如，ALK4)。在一些实施方案中，结合GDF8的多特异性抗体并不结合或基本上并不结合BMP9(例如，以大于1x 10-7M的KD结合BMP9，或者具有相对适度的结合例如约1x 10-8M或约1x 10-9M)。在一些实施方案中，结合GDF8的多特异性抗体并不结合或基本上并不结合激活素A(例如，以大于1x 10-7M的KD结合激活素A，或者具有相对适度的结合例如约1x 10-8M或约1x 10-9M)。在一些实施方案中，本公开涉及抗体的组合及其用途，其中所述抗体的组合包含GDF8抗体和一种或多种另外的抗体，其结合例如一种或多种另外的ActRII配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、ActRII受体(ActRIIA和/或ActRIIB)、和/或I型受体(例如，ALK4)。在一些实施方案中，包含GDF8抗体的抗体的组合并不包含BMP9抗体。在一些实施方案中，包含GDF8抗体的抗体的组合并不包含激活素A抗体。在一些实施方案中，本公开的GDF8抗体包含REGN-1033。在一些实施方案中，本公开的GDF8抗体包含曲戈卢单抗。在一些实施方案中，本公开的GDF8抗体包含MYO-029。在一些实施方案中，本公开的GDF8抗体包含司他芦单抗。在一些实施方案中，本公开的GDF8抗体包含PF-06252616。在一些实施方案中，本公开的GDF8抗体包含多玛洛珠单抗。在一些实施方案中，本公开的GDF8抗体包含LY-2495655。在一些实施方案中，本公开的GDF8抗体包含兰洛珠单抗。在一些实施方案中，本公开的GDF8抗体包含SRK-015。
在某些方面，ActRII-ALK4拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制GDF11的抗体。因此，在一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂抗体或抗体的组合至少结合GDF11。如本文所用，GDF11抗体(或抗GDF11抗体)一般指以足够的亲和力结合GDF11的抗体，使得该抗体可用作靶向GDF11的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施方案中，GDF11抗体与无关的非GDF11蛋白的结合程度小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％，或小于约1％的抗体与GDF11的结合，如例如通过放射性免疫测定(RIA)、Biacore或者其它蛋白质相互作用或结合亲和力测定所测量的。在某些实施方案中，GDF11抗体结合在来自不同物种的GDF11中保守的GDF11表位。在某些优选实施方案中，抗GDF11抗体结合人GDF11。在一些实施方案中，GDF11抗体可以抑制GDF11与I型和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB和/或ALK4)的结合，并且因此抑制GDF11介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，GDF11抗体可以抑制GDF11结合共受体并因此抑制GDF11介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。应当注意，GDF11与GDF8具有高序列同源性，并且因此在一些情况下，结合GDF11的抗体也可以结合和/或抑制GDF8。在一些实施方案中，本公开涉及多特异性抗体(例如双特异性抗体)及其用途，其结合GDF11并进一步结合例如一种或多种另外的ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB和/或ALK4)、和/或一种或多种共受体。在一些实施方案中，结合GDF11的多特异性抗体并不结合或基本上并不结合BMP9(例如，以大于1x 10-7M的KD结合BMP9，或者具有相对适度的结合例如约1x 10-8M或约1x 10-9M)。在一些实施方案中，结合GDF11的多特异性抗体并不结合或基本上并不结合激活素A(例如，以大于1x 10-7M的KD结合激活素A，或者具有相对适度的结合例如约1x 10-8M或约1x 10-9M)。在一些实施方案中，本公开涉及抗体的组合及其用途，其中所述抗体的组合包含GDF11抗体和一种或多种另外的抗体，其结合例如一种或多种另外的ActRII配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、ActRII受体(ActRIIA和/或ActRIIB)、和/或I型受体(例如，ALK4)。在一些实施方案中，包含GDF11抗体的抗体的组合并不包含BMP9抗体。在一些实施方案中，包含GDF11抗体的抗体的组合并不包含激活素A抗体。
在某些方面，ActRII-ALK4拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制BMP6的抗体。因此，在一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂抗体或抗体的组合至少结合BMP6。如本文所用，BMP6抗体(或抗BMP6抗体)一般指可以以足够的亲和力结合BMP6的抗体，使得该抗体可用作靶向BMP6的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施方案中，BMP6抗体与无关的非BMP6蛋白的结合程度小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％，或小于约1％的抗体与BMP6的结合，如例如通过放射性免疫测定(RIA)、Biacore或者其它蛋白质相互作用或结合亲和力测定所测量的。在某些实施方案中，BMP6抗体结合在来自不同物种的BMP6中保守的BMP6表位。在某些优选实施方案中，抗BMP6抗体结合人BMP6。在一些实施方案中，BMP6抗体可以抑制BMP6与I型和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB和/或ALK4)的结合，并且因此抑制BMP6介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，BMP6抗体可以抑制BMP6结合共受体并因此抑制BMP6介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，本公开涉及多特异性抗体(例如双特异性抗体)及其用途，其结合BMP6并进一步结合例如一种或多种另外的ActRII配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、ActRII受体(ActRIIA和/或ActRIIB)、和/或I型受体(例如，ALK4)。在一些实施方案中，结合BMP6的多特异性抗体并不结合或基本上并不结合BMP9(例如，以大于1x 10-7M的KD结合BMP9，或者具有相对适度的结合例如约1x 10-8M或约1x10-9M)。在一些实施方案中，结合BMP6的多特异性抗体并不结合或基本上并不结合激活素A(例如，以大于1x 10-7M的KD结合激活素A，或者具有相对适度的结合例如约1x 10-8M或约1x 10-9M)。在一些实施方案中，本公开涉及抗体的组合及其用途，其中所述抗体的组合包含BMP6抗体和一种或多种另外的抗体，其结合例如一种或多种ActRII配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、ActRII受体(ActRIIA和/或ActRIIB)、和/或I型受体(例如，ALK4)。在一些实施方案中，包含BMP6抗体的抗体的组合并不包含BMP9抗体。在一些实施方案中，包含BMP6抗体的抗体的组合并不包含激活素A抗体。
在某些方面，ActRII-ALK4拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制BMP10的抗体。因此，在一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂抗体或抗体的组合至少结合BMP10。如本文所用，BMP10抗体(或抗BMP10抗体)一般指可以以足够的亲和力结合BMP10的抗体，使得该抗体可用作靶向BMP10的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施方案中，BMP10抗体与无关的非BMP10蛋白的结合程度小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％，或小于约1％的抗体与BMP10的结合，如例如通过放射性免疫测定(RIA)、Biacore或者其它蛋白质相互作用或结合亲和力测定所测量的。在某些实施方案中，BMP10抗体结合在来自不同物种的BMP10中保守的BMP10表位。在某些优选实施方案中，抗BMP10抗体结合人BMP10。在一些实施方案中，BMP10抗体可以抑制BMP10与I型和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB和/或ALK4)的结合，并且因此抑制BMP10介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，BMP10抗体可以抑制BMP10结合共受体并因此抑制BMP10介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，本公开涉及多特异性抗体(例如双特异性抗体)及其用途，其结合BMP10并进一步结合例如一种或多种另外的ActRII配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、ActRII受体(ActRIIA和/或ActRIIB)、和/或I型受体(例如，ALK4)。在一些实施方案中，结合BMP10的多特异性抗体并不结合或基本上并不结合BMP9(例如，以大于1x10-7M的KD结合BMP9，或者具有相对适度的结合例如约1x 10-8M或约1x 10-9M)。在一些实施方案中，结合BMP10的多特异性抗体并不结合或基本上并不结合激活素A(例如，以大于1x10-7M的KD结合激活素A，或者具有相对适度的结合例如约1x 10-8M或约1x 10-9M)。在一些实施方案中，本公开涉及抗体的组合及其用途，其中所述抗体的组合包含BMP10抗体和一种或多种另外的抗体，其结合例如一种或多种另外的ActRII配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、ActRII受体(ActRIIA和/或ActRIIB)、和/或I型受体(例如，ALK4)。在一些实施方案中，包含BMP10抗体的抗体的组合并不包含BMP9抗体。在一些实施方案中，包含BMP10抗体的抗体的组合并不包含激活素A抗体。
在某些方面，ActRII-ALK4拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制ActRIIB的抗体。因此，在一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂抗体或抗体的组合至少结合ActRIIB。如本文所用，ActRIIB抗体(或抗ActRIIB抗体)一般指以足够的亲和力结合ActRIIB的抗体，使得该抗体可用作靶向ActRIIB的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗ActRIIB抗体与无关的非ActRIIB蛋白的结合程度小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％，或小于约1％的抗体与ActRIIB的结合，如例如通过放射性免疫测定(RIA)、Biacore或者其它蛋白质-蛋白质相互作用或结合亲和力测定所测量的。在某些实施方案中，抗ActRIIB抗体结合在来自不同物种的ActRIIB中保守的ActRIIB表位。在某些优选实施方案中，抗ActRIIB抗体结合人ActRIIB。在一些实施方案中，抗ActRIIB抗体可以抑制一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)与ActRIIB的结合。在一些实施方案中，抗ActRIIB抗体是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其结合ActRIIB和一种或多种ActRII配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、ActRII受体(例如，ActRIIA)、和/或I型受体(例如，ALK4)。在一些实施方案中，本公开涉及抗体的组合及其用途，其中所述抗体的组合包含抗ActRIIB抗体和一种或多种另外的抗体，其结合例如一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、I型受体(例如，ALK4)和/或另外的II型受体(例如，ActRIIA)。应当注意，ActRIIB与ActRIIA具有序列相似性，并且因此结合ActRIIB的抗体在一些情况下也可以结合和/或抑制ActRIIA。在一些实施方案中，本公开的抗ActRII抗体包含比玛卢单抗(BYM338)。
在某些方面，ActRII-ALK4拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制ActRIIA的抗体。因此，在一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂抗体或抗体的组合至少结合ActRIIA。如本文所用，ActRIIA抗体(或抗ActRIIA抗体)一般指以足够的亲和力结合ActRIIA的抗体，使得该抗体可用作靶向ActRIIA的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗ActRIIA抗体与无关的非ActRIIA蛋白的结合程度小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％，或小于约1％的抗体与ActRIIA的结合，如例如通过放射性免疫测定(RIA)、Biacore或者其它蛋白质-蛋白质相互作用或结合亲和力测定所测量的。在某些实施方案中，抗ActRIIA抗体结合在来自不同物种的ActRIIA中保守的ActRIIA表位。在某些优选实施方案中，抗ActRIIA抗体结合人ActRIIA。在一些实施方案中，抗ActRIIA抗体可以抑制一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)与ActRIIA的结合。在一些实施方案中，抗ActRIIA抗体是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其结合ActRIIA和一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、I型受体(例如，ALK4)和/或另外的II型受体(例如，ActRIIB)。在一些实施方案中，本公开涉及抗体的组合及其用途，其中所述抗体的组合包含抗ActRIIA抗体和一种或多种另外的抗体，其结合例如一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、I型受体(例如，ALK4)和/或另外的II型受体(例如，ActRIIB)。应当注意，ActRIIA与ActRIIB具有序列相似性，并且因此结合ActRIIA的抗体在一些情况下也可以结合和/或抑制ActRIIB。在一些实施方案中，本公开的抗ActRII抗体包含比玛卢单抗(BYM338)。
在某些方面，ActRII-ALK4拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制ALK4的抗体。因此，在一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂抗体或抗体的组合至少结合ALK4。如本文所用，ALK4抗体(或抗ALK4抗体)一般指以足够的亲和力结合ALK4的抗体，使得该抗体可用作靶向ALK4的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗ALK4抗体与无关的非ALK4蛋白的结合程度小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％，或小于约1％的抗体与ALK4的结合，如例如通过放射性免疫测定(RIA)、Biacore或者其它蛋白质-蛋白质相互作用或结合亲和力测定所测量的。在某些实施方案中，抗ALK4抗体结合在来自不同物种的ALK4中保守的ALK4表位。在某些优选实施方案中，抗ALK4抗体结合人ALK4。在一些实施方案中，抗ALK4抗体可以抑制一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)与ALK4的结合。在一些实施方案中，抗ALK4抗体是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其结合ALK4和一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、和/或II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)。在一些实施方案中，本公开涉及抗体的组合及其用途，其中所述抗体的组合包含抗ALK4抗体和一种或多种另外的抗体，其结合例如一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、和/或II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)。
在某些方面，待按照本文公开的方法和用途(例如，治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭、或者与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的一种或多种并发症的进展速率和/或严重程度)使用的ActRII-ALK4拮抗剂是抗体(ActRII-ALK4拮抗剂抗体)或抗体的组合。ActRII-ALK4拮抗剂抗体或抗体的组合可以结合例如一种或多种ActRII配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、ActRII受体(ActRIIA和/或ActRIIB)和/或I型受体(例如，ALK4)。如本文所述的，ActRII-ALK4拮抗剂抗体可以单独使用或者与一种或多种支持疗法或活性剂组合使用，以治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度，特别是治疗、预防或降低一种或多种心力衰竭相关并发症的进展速率和/或严重程度。在一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂抗体选自REGN-2477、加托索单抗、REGN-1033、曲戈卢单抗、MYO-029、司他芦单抗、PF-06252616、多玛洛珠单抗、LY-2495655、兰洛珠单抗、SRK-015、比玛卢单抗和BYM338。在一些实施方案中，ActRII-ALK4拮抗剂抗体选自加托索单抗、曲戈卢单抗、司他芦单抗、多玛洛珠单抗、兰洛珠单抗和比玛卢单抗。
术语抗体在本文中以最广泛的含义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性。抗体片段指除完整抗体外的分子，其包含完整抗体的一部分，所述部分结合完整抗体与之结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体[参见例如，Hudson等人(2003)Nat.Med.9:129-134；Plückthun，in The PharmacologyofMonoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，(Springer-Verlag，NewYork)，第269-315页(1994)；WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894；5,587,458；和5,869,046]。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的[参见例如，EP404,097；WO 1993/01161；Hudson等人(2003)Nat.Med.9:129-134(2003)；以及Hollinger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448]。在Hudson等人(2003)Nat.Med.9:129-134中还描述了三抗体和四抗体。单结构域抗体是包含抗体的重链可变结构域的全部或一部分或者轻链可变结构域的全部或一部分的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体[参见例如，美国专利号6,248,516]。本文公开的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。在某些实施方案中，本公开的抗体包含与其附着并且能够被检测的标记(例如，标记可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。在某些优选实施方案中，本公开的抗体是分离的抗体。在某些优选实施方案中，本公开的抗体是重组抗体。
本文的抗体可以属于任何类别。抗体的类别指由其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在抗体的五个主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几个可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域称为α、δ、ε、γ和μ。
一般而言，用于本文公开的方法中的抗体优选以高结合亲和力特异性地结合其靶抗原。亲和力可以表示为KD值，并且反映固有结合亲和力(例如，具有最低限度的亲合力效应)。通常，结合亲和力在体外进行测量，无论是在无细胞背景下还是在细胞相关背景下。本领域已知的多种测定中的任一种，包括本文公开的那些测定，都可以用于获得结合亲和力测量，包括例如Biacore、放射性标记的抗原结合测定(RIA)和ELISA。在一些实施方案中，本公开的抗体结合其靶抗原(例如，ActRIIA、ActRIIB、激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)，具有至少1x 10-7或更强、1x10-8或更强、1x10-9或更强、1x10-10或更强、1x10-11或更强、1x10-12或更强、1x10-13或更强、或者1x10-14或更强的KD。
在某些实施方案中，KD通过用感兴趣抗体的Fab形式及其靶抗原执行的RIA来测量，如通过下述测定描述的。Fab对于抗原的溶液结合亲和力通过以下进行测量：在未标记抗原的滴定系列的存在下，用最低浓度的放射性标记的抗原(例如125I标记)平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的板捕获结合的抗原[参见例如，Chen等人(1999)J.Mol.Biol.293:865-881]。为了建立关于测定的条件，多孔板(例如，来自Thermo Scientific的)用捕获抗Fab抗体(例如，来自Cappel Labs)进行包被(例如，过夜)，并且随后优选在室温(大约23℃)下用牛血清白蛋白进行封闭。在非吸附板中，放射性标记的抗原与感兴趣的Fab的连续稀释物混合[例如，与在Presta等人，(1997)Cancer Res.57:4593-4599中的抗VEGF抗体，Fab-12的评价一致]。然后使感兴趣的Fab温育，优选过夜，但温育可以持续更长的时期(例如，约65小时)，以确保达到平衡。其后，将混合物转移到捕获板用于温育，优选在室温下约一小时。然后去除溶液，并且优选用聚山梨醇酯20和PBS混合物将板洗涤数次。当板已干燥后，添加闪烁剂(例如，来自Packard的/>)，并且板在伽马计数器(例如，来自Packard的/>)上进行计数。
根据另一个实施方案，使用表面等离子体共振测定，使用例如2000或/>3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，N.J.)，伴随以约10响应单位(RU)的固定化抗原CM5芯片来测量KD。简言之，根据供应商的说明，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)。例如，在以5μl/分钟的流速注射以获得大约10个响应单位(RU)的偶联蛋白之前，抗原可以用10mM乙酸钠pH4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)。在抗原注射之后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，以大约25μl/分钟的流速注入在含有0.05％聚山梨醇酯20/>表面活性剂的PBS(PBST)中的Fab的两倍系列稀释物(0.78nM至500nM)。使用例如简单的一对一Langmuir结合模型(/>EvaluationSoftware版本3.2)，通过同时拟合结合和解离传感图，来计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon[参见例如，Chen等人，(1999)J.Mol.Biol.293:865-881]。如果通过上文的表面等离子体共振测定，结合速率超过例如106M-1s-1，则可以通过使用荧光猝灭技术来确定结合速率，所述荧光猝灭技术测量在渐增浓度的抗原的存在下，在PBS中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(例如，激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少，如在分光计例如配备停流的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌比色皿的8000系列/>分光光度计(ThermoSpectronic)中测量的。
抗体片段可以通过各种技术进行制备，所述技术包括但不限于完整抗体的蛋白酶解消化以及通过重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)的产生，如本文所述的。人ActRIIA、ActRIIB、ALK4、激活素(激活素A、激活素B、激活素C和激活素E)、GDF11、GDF8、BMP10和BMP6的核酸序列和氨基酸序列是本领域已知的。另外，用于生成抗体的众多方法是本领域众所周知的，所述方法中的一些在本文中进行描述。因此，用于按照本公开使用的抗体拮抗剂可以通过本领域技术人员基于本领域的知识和本文提供的教导照常规进行制备。
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。嵌合抗体指其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分衍生自不同来源或物种的抗体。某些嵌合抗体例如在美国专利号4,816,567；以及Morrison等人，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851-6855中进行描述。在一些实施方案中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，衍生自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物例如猴的可变区)和人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中类别或亚类已由亲本抗体的类别或亚类改变。一般而言，嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，本文提供的嵌合抗体是人源化抗体。人源化抗体指包含来自非人高变区(HVR)的氨基酸残基和来自人构架区(FR)的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个，且通常为两个可变结构域的基本上全部，其中HVR(例如，CDR)的全部或基本上全部对应于非人抗体的那些，并且FR的全部或基本上全部对应于人抗体的那些。人源化抗体任选地可以包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体例如非人抗体的“人源化形式”指已经历人源化的抗体。人源化抗体及其制备方法例如在Almagro和Fransson(2008)Front.Biosci.13:1619-1633中进行综述，并且例如在以下中进一步描述：Riechmann等人，(1988)Nature 332:323-329；Queen等人(1989)Proc.Nat'lAcad.Sci.USA 86:10029-10033；美国专利号5,821,337；7,527,791；6,982,321；和7,087,409；Kashmiri等人，(2005)Methods36:25-34[描述SDR(a-CDR)移植]；Padlan，Mol.Immunol.(1991)28:489-498(描述“表面重塑”)；Dall'Acqua等人(2005)Methods 36:43-60(描述“FR改组”)；Osbourn等人(2005)Methods 36:61-68；以及Klimka等人Br.J.Cancer(2000)83:252-260(描述FR改组的“引导选择”方法)。可以用于人源化的人构架区包括但不限于使用“最佳拟合”方法选择的构架区[参见例如，Sims等人(1993)J.Immunol.151:2296]；衍生自轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的构架区[参见例如，Carter等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4285；以及Presta等人(1993)J.Immunol.，151:2623]；人成熟(体细胞突变的)构架区或人种系构架区[参见例如，Almagro和Fransson(2008)Front.Biosci.13:1619-1633]；以及衍生自筛选FR文库的构架区[参见例如，Baca等人，(1997)J.Biol.Chem.272:10678-10684；以及Rosok等人，(1996)J.Biol.Chem.271:22611-22618]。
在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。人抗体可以使用本领域已知的各种技术来产生。人抗体一般在van Dijk和van de Winkel(2008)Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)，以及Lonberg，Curr.Opin.Immunol.20:450-459中进行描述。例如，人抗体可以通过向转基因动物施用免疫原(例如，ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、ActRII受体(ActRIIA和/或ActRIIB)和/或I型受体(例如，ALK4))进行制备，所述转基因动物已进行修饰，以响应抗原攻击产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有人免疫球蛋白基因座的全部或一部分，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者染色体外存在或随机整合到动物的染色体内。在此类转基因动物中，内源性免疫球蛋白基因座一般已失活。关于用于从转基因动物中获得人抗体的方法的综述，参见例如，Lonberg(2005)Nat.Biotech.23:1117-1125；美国专利号6,075,181和6,150,584(描述XENOMOUSETM技术)；美国专利号5,770,429(描述技术)；美国专利号7,041,870(描述/>技术)；以及美国专利申请公开号2007/0061900(描述技术)。来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区可以例如，通过与不同的人恒定区组合进行进一步修饰。
本文提供的人抗体还可以通过基于杂交瘤的方法来制备。已描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系[参见例如，Kozbor J.Immunol.，(1984)133:3001；Brodeur等人(1987)Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，第51-63页，Marcel Dekker，Inc.，NewYork；以及Boerner等人(1991)J.Immunol.，147:86]。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也在Li等人，(2006)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103:3557-3562中进行描述。另外的方法包括例如在以下中描述的那些方法：美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系生产单克隆人IgM抗体)和Ni，Xiandai Mianyixue(2006)26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)。人杂交瘤技术(Triomatechnology)还在Vollmers和Brandlein(2005)Histol.Histopathol.，20(3):927-937(2005)，以及Vollmers和Brandlein(2005)Methods Find Exp.Clin.Pharmacol.，27(3):185-91中进行描述。本文提供的人抗体还可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来生成。然后可以将此类可变结构域序列与所需的人恒定结构域组合。用于从抗体文库中选择人抗体的技术是本领域已知的并且在本文中进行描述。
例如，可以通过在组合文库中筛选具有一种或多种所需活性的抗体来分离本公开的抗体。本领域已知各种方法用于生成噬菌体展示文库并在此类文库中筛选具有所需结合特性的抗体。此类方法例如在以下中进行综述：Hoogenboom等人(2001)inMethodsinMolecularBiology178:1-37，O'Brien等人，编辑，Human Press，Totowa，N.J.，并且例如在以下中进行进一步描述：McCafferty等人(1991)Nature 348:552-554；Clackson等人，(1991)Nature 352:624-628；Marks等人(1992)J.Mol.Biol.222:581-597；Marks和Bradbury(2003)in Methods in Molecular Biology248:161-175，Lo，编辑，HumanPress，Totowa，N.J.；Sidhu等人(2004)J.Mol.Biol.338(2):299-310；Lee等人(2004)J.Mol.Biol.340(5):1073-1093；Fellouse(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472；以及Lee等人(2004)J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132。
在某些噬菌体展示方法中，VH和VL基因的储库通过聚合酶链反应(PCR)分开进行克隆，并且在噬菌体文库中随机重组，所述噬菌体文库然后可以如Winter等人(1994)Ann.Rev.Immunol.，12:433-455中所述筛选抗原结合噬菌体。噬菌体通常展示作为单链Fv(scFv)片段或Fab片段的抗体片段。来自免疫来源的文库提供了针对免疫原(例如，ActRII配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、ActRII受体(ActRIIA和/或ActRIIB)和/或I型受体(例如，ALK4))的高亲和力抗体，而无需构建杂交瘤。可替代地，可以(例如，从人中)克隆首次用于实验的储库，以提供针对广泛范围的非自身抗原以及自身抗原的单一来源的抗体，而无需任何免疫，如通过Griffiths等人(1993)EMBO J，12:725-734所述的。最后，首次用于实验的文库还可以通过以下进行合成制备：从干细胞中克隆未重排的V基因区段，并且使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并在体外完成重排，如通过Hoogenboom和Winter(1992)J.Mol.Biol.，227:381-388所述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括例如：美国专利号5,750,373，以及美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体(通常为单克隆抗体)对于一种或多种(例如，两种、三种、四种、五种、六种或更多种)抗原上的至少两个不同的表位(例如，两个、三个、四个、五个、或六个或更多个)具有结合特异性。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链/轻链对的重组共表达[参见例如，Milstein和Cuello(1983)Nature 305:537；国际专利公开号WO 93/08829；以及Traunecker等人(1991)EMBO J.10:3655和美国专利号5,731,168(“旋钮入孔”改造)]。多特异性抗体还可以通过以下进行制备：改造静电转向效应用于制备抗体Fc-异二聚体分子(参见例如WO 2009/089004A1)；使两个或更多个抗体或片段交联[参见例如，美国专利号4,676,980；以及Brennan等人(1985)Science，229:81]；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体[参见例如，Kostelny等人(1992)J.Immunol.，148(5):1547-1553]；使用“双抗体”技术用于制备双特异性抗体片段[参见例如，Hollinger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448]；使用单链Fv(sFv)二聚体[参见例如，Gruber等人(1994)J.Immunol.，152:5368]；以及制备三特异性抗体(参见例如，Tutt等人(1991)J.Immunol.147:60。多特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。具有三个或更多个功能性抗原结合位点的改造抗体，包括“章鱼抗体”，也包括在本文中[参见例如，US 2006/0025576A1]。
在某些实施方案中，本文公开的抗体是单克隆抗体。单克隆抗体指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即，构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中出现的可能的变体抗体之外，此类变体一般以少量存在。与通常包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制剂形成对比，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单个表位。因此，修饰语“单克隆的”指示抗体的特性是从基本上同质的抗体群体中获得，并且不应被解释为需要通过任何特定方法的抗体产生。例如，待按照本文方法使用的单克隆抗体可以通过各种技术进行制备，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、以及利用含有人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，本文描述了此类方法和用于制备单克隆抗体的其它示例性方法。
例如，通过使用衍生自激活素的免疫原，可以通过标准方案制备抗蛋白/抗肽抗血清或单克隆抗体[参见例如，Antibodies:A Laboratory Manualed.by Harlow和Lane(1988)Cold Spring Harbor Press:1988]。可以用免疫原性形式的激活素多肽、能够引发抗体应答的抗原片段或融合蛋白来免疫哺乳动物，例如小鼠、仓鼠或兔。用于对蛋白质或肽赋予免疫原性的技术包括与载体缀合或本领域众所周知的其它技术。激活素多肽的免疫原性部分可以在佐剂的存在下进行施用。免疫的进展可以通过检测血浆或血清中的抗体滴度进行监测。标准ELISA或其它免疫测定可以与作为抗原的免疫原一起使用，以评价抗体产生的水平和/或结合亲和力的水平。
在用激活素的抗原制剂免疫动物之后，可以获得抗血清，并且需要时，可以从血清中分离多克隆抗体。为了生产单克隆抗体，可以从免疫动物中收获抗体产生细胞(淋巴细胞)，并且通过标准体细胞融合程序与永生化细胞例如骨髓瘤细胞融合，以产生杂交瘤细胞。此类技术是本领域众所周知的，并且包括例如杂交瘤技术[参见例如，Kohler和Milstein(1975)Nature，256:495-497]、人B细胞杂交瘤技术[参见例如，Kozbar等人(1983)Immunology Today，4:72]、以及产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术[Cole等人(1985)Monoclonal Antibodies andCancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.第77-96页]。杂交瘤细胞可以进行免疫化学筛选，用于产生与激活素多肽特异性地反应的抗体，并且从包含此类杂交瘤细胞的培养物中分离单克隆抗体。
在某些实施方案中，可以将一种或多种氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区内，从而生成Fc区变体。Fc区变体可以包含人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其包含在一个或多个氨基酸位置处的氨基酸修饰(例如，取代、缺失和/或添加)。
例如，本公开考虑了具有一些但并非全部效应子功能的抗体变体，这使其成为用于应用的期望候选物，在所述应用中，在体内的抗体半衰期是重要的，但某些效应子功能[例如，补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)]是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定，以确认CDC和/或ADCC活性的降低/耗尽。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定，以确保抗体缺少FcγR结合(因此有可能缺少ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的主要细胞，NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达在例如Ravetch和Kinet(1991)Annu.Rev.Immunol.9:457-492中进行概括。评价感兴趣分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例在以下中进行描述：美国专利号5,500,362；Hellstrom，I.等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:7059-7063]；Hellstrom，I等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:1499-1502；美国专利号5,821,337；Bruggemann，M.等人(1987)J.Exp.Med.166:1351-1361。可替代地，可以采用非放射性测定方法(例如，ACTITM，用于流式细胞术的非放射性细胞毒性测定；CellTechnology，Inc.Mountain View，Calif.；以及CytoTox非放射性细胞毒性测定，Promega，Madison，Wis.)。用于此类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外，可以在体内例如在动物模型中评价感兴趣分子的ADCC活性，所述动物模型例如Clynes等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:652-656中公开的动物模型。还可以进行C1q结合测定，以确认抗体不能结合C1q并因此缺少CDC活性[参见例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA]。为了评价补体激活，可以执行CDC测定[参见例如，Gazzano-Santoro等人(1996)J.Immunol.Methods 202:163；Cragg，M.S.等人(2003)Blood 101:1045-1052；以及Cragg，M.S和M.J.Glennie(2004)Blood103:2738-2743]。FcRn结合和体内清除率/半衰期确定也可以使用本领域已知的方法来执行[参见例如，Petkova，S.B.等人(2006)Intl.Immunol.18(12):1759-1769]。具有降低的效应子功能的本公开的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的取代的那些抗体(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括具有残基265和297取代为丙氨酸的所谓的"DANA"Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
在某些实施方案中，可能期望产生半胱氨酸改造的抗体，例如"thioMAbs"，其中抗体的一个或多个残基由半胱氨酸残基取代。在特定实施方案中，取代的残基在抗体的可及位点处出现。通过用半胱氨酸取代这些残基，反应性硫醇基团由此放置在抗体的可及位点处，并且可以用于将抗体缀合至其它部分，例如药物部分或接头-药物部分，以产生免疫缀合物，如本文进一步描述的。在某些实施方案中，下述残基中的任何一个或多个可以由半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸改造的抗体可以如例如美国专利号7,521,541中所述的生成。
另外，用于筛选抗体以便鉴定期望抗体的技术可能影响所获得的抗体的性质。例如，如果抗体待用于结合溶液中的抗原，则可能期望测试溶液结合。各种不同的技术可用于测试抗体和抗原之间的相互作用，以鉴定特别期望的抗体。此类技术包括ELISA、表面等离子体共振结合测定(例如，Biacore结合测定，Biacore AB，Uppsala，瑞典)、夹心测定(例如，IGEN International，Inc.，Gaithersburg，Maryland的顺磁珠系统)、蛋白质印迹、免疫沉淀测定和免疫组织化学。
在某些实施方案中，考虑了本文提供的抗体和/或结合多肽的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善抗体和/或结合多肽的结合亲和力和/或其它生物学性质。抗体和/或结合多肽的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引入编码抗体和/或结合多肽的核苷酸序列内或通过肽合成进行制备。此类修饰包括例如在抗体和/或结合多肽的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以制备缺失、插入和取代的任何组合以获得最终构建体，条件是最终构建体具有所需特性，例如靶结合(例如，以及激活素如激活素E和/或激活素C结合)。
例如，可以在HVR中进行改变(例如，取代)，以改善抗体亲和力。此类改变可以在以下中进行：HVR“热点”，即由在体细胞成熟过程期间经历以高频率的突变的密码子编码的残基[参见例如，Chowdhury(2008)Methods Mol.Biol.207:179-196(2008)]，和/或SDR(a-CDR)，其中测试所得到的变体VH或VL的结合亲和力。本领域已描述了通过构建二级文库且从其中重新选择的亲和力成熟[参见例如，Hoogenboom等人，in Methods in MolecularBiology 178:1-37，O'Brien等人，编辑，Human Press，Totowa，N.J.，(2001)。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过各种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一种，将多样性引入选择用于成熟的可变基因内。然后产生二级文库。然后筛选文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR指导的方法，其中几个HVR残基(例如一次4-6个残基)被随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性地鉴定涉及抗原结合的HVR残基。特别地经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，取代、插入或缺失可以在一个或多个HVR内发生，只要此类改变基本上并不降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中进行基本上并不降低结合亲和力的保守改变(例如，本文提供的保守取代)。此类改变可能在HVR“热点”或SDR外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR或者是未改变的，或者含有不多于1、2或3个氨基酸取代。
用于鉴定可以靶向用于诱变的抗体和/或结合多肽的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如通过Cunningham和Wells(1989)Science，244:1081-1085所述的。在这种方法中，鉴定了一个残基或一组靶残基(例如荷电残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并且替换为中性或带负电的氨基酸(例如丙氨酸或多聚丙氨酸)，以确定抗体-抗原的相互作用是否受影响。可以在证实对初始取代的功能敏感性的氨基酸定位处引入进一步的取代。可替代地或另外，确定抗原-抗体复合物的晶体结构，以鉴定抗体与抗原之间的接触点。此类接触残基和邻近残基可以作为用于取代的候选物被靶向或消除。可以筛选变体以确定它们是否含有所需性质。
氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合物，以及单个或多重氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N末端或C末端与酶(例如，对于ADEPT)或增加抗体的血清半衰期的多肽的融合物。
在某些实施方案中，本文提供的抗体和/或结合多肽可以进一步进行修饰，以含有本领域已知且容易获得的另外的非蛋白质部分。适合于抗体和/或结合多肽的衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧戊环、聚1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、以及葡聚糖或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而具有在制造方面的优点。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支化的或非支化的。附着至抗体和/或结合多肽的聚合物的数目可以变化，并且如果附着多于一种聚合物，则它们可以是相同或不同的分子。一般而言，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于考虑因素来确定，所述考虑因素包括但不限于待改善的抗体和/或结合多肽的特定性质或功能，无论抗体衍生物和/或结合多肽衍生物是否将用于在限定条件下的治疗中。
4.小分子拮抗剂
在某些方面，待按照本文公开的方法和用途(例如，治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭、或者与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的一种或多种并发症的进展速率和/或严重程度)使用的ActRII-ALK4拮抗剂是小分子(ActRII-ALK4小分子拮抗剂)或小分子拮抗剂的组合。ActRII-ALK4小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合可以抑制例如一种或多种ActRII配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、ActRII受体(ActRIIA和/或ActRIIB)、I型受体(例如，ALK4)、II型受体(例如，ActRIIB和/或ActRIIA)和/或一种或多种信号传导因子。在一些实施方案中，ActRII-ALK4小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合抑制由一种或多种ActRII-ALK4配体介导的信号传导，例如，如在基于细胞的测定例如本文描述的那些测定中确定的。如本文所述，ActRII-ALK4小分子拮抗剂可以单独使用或者与一种或多种支持疗法或活性剂组合使用，以治疗、预防或降低心力衰竭的进展速率和/或严重程度，特别是治疗、预防或降低一种或多种心力衰竭相关并发症的进展速率和/或严重程度。
在一些实施方案中，ActRII-ALK4小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制GDF11，任选地进一步抑制GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、BMP6、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4和一种或多种Smad信号传导因子中的一种或多种。在一些实施方案中，ActRII-ALK4小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制GDF8，任选地进一步抑制GDF11、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、BMP6、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4和一种或多种Smad信号传导因子中的一种或多种。在一些实施方案中，ActRII-ALK4小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制激活素(激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)，任选地进一步抑制GDF8、GDF11、BMP6、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4和一种或多种Smad信号传导因子中的一种或多种。在一些实施方案中，ActRII-ALK4小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制激活素B，任选地进一步抑制GDF8、GDF11、BMP6、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4和一种或多种Smad信号传导因子中的一种或多种。在一些实施方案中，ActRII-ALK4小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制BMP6，任选地进一步抑制GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF11、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4和一种或多种Smad蛋白(例如，Smad2和3)中的一种或多种。在一些实施方案中，ActRII-ALK4小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制BMP10，任选地进一步抑制GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、BMP6、GDF11、ActRIIA、ActRIIB、ALK4和一种或多种Smad信号传导因子中的一种或多种。在一些实施方案中，ActRII-ALK4小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制ActRIIA，任选地进一步抑制GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、BMP6、GDF11、BMP10、ActRIIB、ALK4和一种或多种Smad信号传导因子中的一种或多种。在一些实施方案中，ActRII-ALK4小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制ActRIIB，任选地进一步抑制GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、BMP6、GDF11、BMP10、ActRIIA、ALK4和一种或多种Smad信号传导因子中的一种或多种。在一些实施方案中，ActRII-ALK4小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制ALK4，任选地进一步抑制GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、BMP6、GDF11、BMP10、ActRIIA、ActRIIB和一种或多种Smad信号传导因子中的一种或多种。在一些实施方案中，如本文公开的ActRII-ALK4小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合并不抑制或基本上并不抑制BMP9。在一些实施方案中，如本文公开的ActRII-ALK4小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合并不抑制或基本上并不抑制激活素A。
ActRII-ALK4小分子拮抗剂可以是直接或间接抑制剂。例如，间接小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合可以抑制至少一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、I型受体(例如，ALK4)、II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)、和/或一种或多种下游信号传导组分(例如，Smad)的表达(例如，转录、翻译、细胞分泌或其组合)。可替代地，直接小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合可以直接结合并抑制例如一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、I型受体(例如，ALK4)、II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)、和/或一种或多种下游信号传导组分(例如，Smad)。一种或多种间接和一种或多种直接ActRII-ALK4小分子拮抗剂的组合可以按照本文公开的方法使用。
本公开的结合小分子拮抗剂可以使用已知的方法进行鉴定且化学合成(参见例如，PCT公开号WO 00/00823和WO 00/39585)。一般而言，本公开的小分子拮抗剂的尺寸通常小于约2000道尔顿，可替代地尺寸小于约1500、750、500、250或200道尔顿，其中此类有机小分子能够优选特异性地结合如本文所述的多肽。这些小分子拮抗剂可以使用众所周知的技术进行鉴定，而无需过度实验。在这方面，值得注意的是，用于在有机小分子文库中筛选能够结合多肽靶的分子的技术是本领域众所周知的(参见例如，国际专利公开号WO00/00823和WO00/39585)。
本发明的结合有机小分子可以是例如醛、酮、肟、腙、缩氨基脲、卡巴肼、伯胺、仲胺、叔胺、N-取代的肼、酰肼、醇、醚、硫醇、硫醚、二硫化物、羧酸、酯、酰胺、脲、氨基甲酸酯、碳酸酯、缩酮、缩硫酮、缩醛、硫缩醛、芳基卤化物、芳基磺酸酯、烷基卤化物、烷基磺酸酯、芳香族化合物、杂环化合物、苯胺、烯烃、炔烃、二醇、氨基醇、噁唑烷、噁唑啉、噻唑烷、噻唑啉、烯胺、磺酰胺、环氧化物、氮丙啶、异氰酸酯、磺酰氯、重氮化合物和酰基氯。
5.多核苷酸拮抗剂
在某些方面，待按照本文公开的方法和用途(例如，治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭、或者与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的一种或多种并发症的进展速率和/或严重程度)使用的ActRII-ALK4拮抗剂是多核苷酸(ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂)或多核苷酸的组合。ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合可以抑制例如一种或多种ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10)、I型受体(例如，ALK4)、II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)、和/或下游信号传导组分(例如，Smad)。在一些实施方案中，ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合抑制由一种或多种ActRII-ALK4配体介导的信号传导，例如，如在基于细胞的测定例如本文所述的那些测定中确定的。如本文所述，ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂可以单独使用或者与一种或多种支持疗法或活性剂组合使用，以治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度，特别是治疗、预防或降低一种或多种心力衰竭相关并发症的进展速率和/或严重程度。
在一些实施方案中，ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制GDF11，任选地进一步抑制GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、BMP6、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4和一种或多种Smad信号传导因子中的一种或多种。在一些实施方案中，ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制GDF8，任选地进一步抑制GDF11、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、BMP6、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4和一种或多种Smad信号传导因子中的一种或多种。在一些实施方案中，ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制激活素(激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)，任选地进一步抑制GDF8、GDF11、BMP6、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4和一种或多种Smad信号传导因子中的一种或多种。在一些实施方案中，ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制激活素B，任选地进一步抑制GDF8、GDF11、BMP6、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4和一种或多种Smad信号传导因子中的一种或多种。在一些实施方案中，ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制BMP6，任选地进一步抑制GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF11、BMP10、ActRIIA、ActRIIB、ALK4和一种或多种Smad蛋白信号传导因子中的一种或多种。在一些实施方案中，ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制BMP10，任选地进一步抑制GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、BMP6、GDF11、ActRIIA、ActRIIB、ALK4和一种或多种Smad信号传导因子中的一种或多种。在一些实施方案中，ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制ActRIIA，任选地进一步抑制GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、BMP6、GDF11、BMP10、ActRIIB、ALK4和一种或多种Smad信号传导因子中的一种或多种。在一些实施方案中，ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制ActRIIB，任选地进一步抑制GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、BMP6、GDF11、ActRIIA、BMP10、ALK4和一种或多种Smad信号传导因子中的一种或多种。在一些实施方案中，ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制ALK4，任选地进一步抑制GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、BMP6、GDF11、ActRIIA、ActRIIB、BMP10和一种或多种Smad信号传导因子中的一种或多种。在一些实施方案中，如本文公开的ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合并不抑制或基本上并不抑制BMP9。在一些实施方案中，如本文公开的ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合并不抑制或基本上并不抑制激活素A。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸拮抗剂可以是反义核酸、RNAi分子[例如，小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)]、适体和/或核酶。人GDF11、GDF8、激活素(激活素A、激活素B、激活素C和激活素E)、BMP6、ActRIIA、ActRIIB、BMP10、ALK4和Smad信号传导因子的核酸序列和氨基酸序列是本领域已知的。另外，生成多核苷酸拮抗剂的许多不同方法是本领域众所周知的。因此，用于按照本公开使用的多核苷酸拮抗剂可以通过本领域技术人员基于本领域的知识和本文提供的教导照常规进行制备。
反义技术可以用于通过反义DNA或RNA或者通过三螺旋形成来控制基因表达。反义技术例如在Okano(1991)J.Neurochem.56:560；Oligodeoxynucleotides as AntisenseInhibitors of Gene Expression，CRC Press，BocaRaton，Fla.(1988)中进行讨论。三螺旋形成例如在Cooney等人(1988)Science 241:456；以及Dervan等人，(1991)Science 251:1300中进行讨论。该方法基于多核苷酸与互补DNA或RNA的结合。在一些实施方案中，反义核酸包含与本文公开的基因的RNA转录物的至少一部分互补的单链RNA或DNA序列。然而，绝对互补性虽然是优选的，但不是必需的。
本文提及的“与RNA的至少一部分互补的”序列意指具有足够互补性以能够与RNA杂交，形成稳定双链体的序列；在本文公开的基因的双链反义核酸的情况下，因此可以测试双链体DNA的单链，或者可以测定三链体形成。杂交的能力将取决于互补性的程度和反义核酸的长度两者。一般地，杂交核酸越大，它可能含有的与RNA的碱基错配就越多，但仍形成稳定的双链体(或三链体，视情况而定)。本领域技术人员可以通过使用确定杂交复合物熔点的标准程序来确定可耐受的错配程度。
与信息的5'端互补的多核苷酸，例如，直到并包括AUG起始密码子的5'-非翻译序列，应该在抑制翻译方面最有效地起作用。然而，与mRNA的3'-非翻译序列互补的序列也已显示有效抑制mRNA的翻译[参见例如，Wagner，R.，(1994)Nature 372:333-335]。因此，与本公开的基因的5'-或3'-非翻译、非编码区互补的寡核苷酸可以用于反义方法中，以抑制内源mRNA的翻译。与mRNA的5'-非翻译区互补的多核苷酸应该包括AUG起始密码子的互补体。与mRNA编码区互补的反义多核苷酸是效率较低的翻译抑制剂，但可以按照本公开的方法使用。无论被设计为与本公开的mRNA的5'-还是3'-编码区杂交，反义核酸的长度应该是至少6个核苷酸，并且优选长度范围为6至约50个核苷酸的寡核苷酸。在具体方面，寡核苷酸是至少10个核苷酸、至少17个核苷酸、至少25个核苷酸或至少50个核苷酸。
在一个实施方案中，本公开的反义核酸通过来自外源序列的转录在细胞内产生。例如，载体或其一部分被转录，产生本公开的基因的反义核酸(RNA)。此类载体将含有编码所需反义核酸的序列。此类载体可以保持附加型或变得染色体整合，只要它可以进行转录以产生所需的反义RNA。此类载体可以通过本领域标准的重组DNA技术方法进行构建。载体可以是质粒、病毒或本领域已知的用于在脊椎动物细胞中复制和表达的其它载体。编码本公开的所需基因的序列或其片段的表达可以是通过本领域已知在脊椎动物，优选人细胞中起作用的任何启动子。此类启动子可以是诱导型或组成型的。此类启动子包括但不限于SV40早期启动子区[参见例如，Benoist和Chambon(1981)Nature290:304-310]，劳斯肉瘤病毒的3'长末端重复中包含的启动子[参见例如，Yamamoto等人(1980)Cell 22:787-797]，疱疹胸苷启动子[参见例如，Wagner等人(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1441-1445]，以及金属硫蛋白基因的调控序列[参见例如，Brinster等人(1982)Nature 296:39-42]。
在一些实施方案中，多核苷酸拮抗剂是干扰RNA(RNAi)分子，其靶向以下中的一种或多种的表达：GDF11、GDF8、激活素(激活素A、激活素B、激活素C和激活素E)、BMP6、ActRIIA、ActRIIB、BMP10、ALK4和Smad信号传导因子。RNAi指干扰靶向mRNA的表达的RNA的表达。具体地，RNAi经由通过siRNA(小干扰RNA)与特异性mRNA相互作用而使靶向基因沉默。然后靶向ds RNA复合物用于通过细胞的降解。siRNA分子是长度为10至50个核苷酸的双链RNA双链体，其干扰足够互补(例如与基因的至少80％同一性)的靶基因的表达。在一些实施方案中，siRNA分子包含与靶基因的核苷酸序列具有至少85、90、95、96、97、98、99或100％同一性的核苷酸序列。
另外的RNAi分子包括短发夹RNA(shRNA)；以及短干扰发夹和微小RNA(miRNA)。shRNA分子含有通过环连接的来自靶基因的有义序列和反义序列。shRNA从核转运到细胞质，并且它连同mRNA一起被降解。Pol III或U6启动子可以用于表达关于RNAi的RNA。Paddison等人[Genes&Dev.(2002)16:948-958，2002]已使用折叠成发夹的小RNA分子作为影响RNAi的手段。相应地，此类短发夹RNA(shRNA)分子也有利地用于本文所述的方法中。功能性shRNA的茎和环的长度不同；茎长度的范围可以为约25至约30nt，并且环尺寸的范围可以为4至约25nt，而不影响沉默活性。尽管不希望受任何特定理论的束缚，但认为这些shRNA类似DICERRNA酶的双链RNA(dsRNA)产物，并且在任何情况下，都具有用于抑制特异性基因表达的相同能力。shRNA可以由慢病毒载体表达。miRNA是长度为约10至70个核苷酸的单链RNA，其最初转录为特征在于“茎环”结构的miRNA前体，其随后在通过RISC的进一步加工后加工为成熟的miRNA。
介导RNAi的分子包括但不限于siRNA可以通过以下在体外产生：化学合成(Hohjoh，FEBS Lett 521:195-199，2002)，dsRNA的水解(Yang等人，Proc Natl Acad SciUSA 99:9942-9947，2002)，用T7 RNA聚合酶的体外转录(Donzeet等人，NucleicAcids Res30:e46，2002；Yu等人，Proc Natl Acad Sci USA 99:6047-6052，2002)，以及使用核酸酶例如大肠杆菌RNA酶III的双链RNA水解(Yang等人，Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947，2002)。
根据另一个方面，本公开提供了多核苷酸拮抗剂，包括但不限于诱饵DNA、双链DNA、单链DNA、复合DNA、封装的DNA、病毒DNA、质粒DNA、裸露DNA、封装的RNA、病毒RNA、双链RNA、能够生成RNA干扰的分子或其组合。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸拮抗剂是适体。适体是核酸分子，包括双链DNA和单链RNA分子，其与靶分子结合并形成与靶分子特异性地结合的三级结构。适体的生成和治疗用途在本领域中充分确立(参见例如，美国专利号5,475,096)。关于适体的另外信息可以在美国专利申请公开号20060148748中找到。使用本领域已知的方法，例如经由指数富集的配体系统进化(SELEX)过程，来选择核酸适体。SELEX是用于与靶分子具有高度特异性结合的核酸分子的体外进化的方法，如例如美国专利号5,475,096；5,580,737；5,567,588；5,707,796；5,763,177；6,011,577；和6,699,843中所述的。鉴定适体的另一种筛选方法在美国专利号5,270,163中进行描述。SELEX过程基于核酸形成各种二维结构和三维结构的能力，以及核苷酸单体内可用的化学多功能性，以充当几乎任何化学化合物的配体(形成特异性结合对)，无论是单体的还是聚合的，包括其它核酸分子和多肽。任何大小或组成的分子都可以充当靶。SELEX方法涉及从候选寡核苷酸的混合物中选择，并且使用相同的一般选择方案的结合、分隔和扩增的逐步迭代，以实现所需的结合亲和力和选择性。从可以包含随机化序列的区段的核酸混合物起始，SELEX方法包括以下步骤：在有利于结合的条件下使混合物与靶接触；将未结合的核酸与已特异性地结合靶分子的那些核酸分隔；使核酸-靶复合物解离；扩增从核酸-靶复合物中解离的核酸，以产生富含配体的核酸混合物。结合、分隔、解离和扩增的步骤根据需要重复多个循环，以产生以高亲和力和特异性结合靶分子的核酸配体。
通常，此类结合分子分开施用于动物[参见例如，O'Connor(1991)J.Neurochem.56:560]，但此类结合分子也可以由多核苷酸在体内表达，所述多核苷酸由宿主细胞摄取并在体内表达[参见例如，Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitorsof Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，Fla.(1988)]。
6.心力衰竭
部分地，本公开涉及治疗与代谢并发症(例如，肥胖、糖尿病)相关的心力衰竭的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)。在一些实施方案中，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的一种或多种并存病的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)。在某些方面，本公开涉及治疗糖尿病性心肌病的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)。在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低糖尿病性心肌病的一种或多种并存病的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)。
在一些实施方案中，本公开涉及治疗与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭，其中患者患有射血分数保留型心力衰竭(HFpEF)。在一些实施方案中，本公开涉及治疗射血分数保留型心力衰竭(HFpEF)的方法。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有舒张功能障碍的患者的方法。在一些实施方案中，本公开涉及治疗不具有左心室射血分数(LVEF)降低的患者的方法。在一些实施方案中，本公开涉及治疗具有左心室壁厚度增加的患者。在一些实施方案中，本公开涉及治疗具有左心房尺寸增加的患者。
在一些实施方案中，本公开涉及治疗与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭，其中患者患有射血分数降低型心力衰竭(HFrEF)。在一些实施方案中，本公开涉及治疗射血分数降低型心力衰竭(HFrEF)的方法。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有收缩功能障碍的患者的方法。在一些实施方案中，本公开涉及治疗具有左心室射血分数(LVEF)降低的患者的方法。
术语“糖尿病(diabetes)”和“糖尿病(diabetes mellitus)”在说明书自始至终是可互换的。
这些方法特别针对动物，且更特别是人的治疗性和预防性治疗。术语“受试者”、“个体”或“患者”在说明书自始至终是可互换的，并且指人或非人动物。这些术语包括哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、实验动物、家畜动物(包括牛、猪、骆驼等)、伴侣动物(例如，犬科动物、猫科动物、其它驯养动物等)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在特定实施方案中，患者、受试者或个体是人。
术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“减轻”等等在本文中一般用于意指获得所需的药理学和/或生理学效应，并且还可以用于指改善、减轻和/或减少待治疗状况(例如心力衰竭)的一种或多种临床并发症的严重程度。效应在完全或部分延迟疾病、状况或其并发症的发作或复发方面可以是预防性的，和/或在关于疾病或状况的部分或完全治愈和/或可归于疾病或状况的不良作用方面可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物，特别是人的疾病或状况的任何治疗。如本文所用，“预防”病症或状况的治疗剂指这样的化合物，其在统计样品中，相对于未治疗的对照样品，降低治疗的样品中的病症或状况的发生，或者相对于未治疗的对照样品，延迟疾病或状况的发作。在一些实施方案中，本公开涉及向需要治疗的患者(例如，“有此需要的患者”)施用ActRII-ALK4拮抗剂的方法。需要用ActRII-ALK4拮抗剂治疗的此类患者是患有本申请中公开的病症或状况，包括但不限于与糖尿病性心肌病相关的心力衰竭的患者。
一般而言，如本公开中所述的疾病或状况的治疗或预防(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)通过以“有效量”施用本公开的一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂来实现。药剂的有效量指在必要的剂量和时间段下，有效实现所需的治疗或预防结果的量。本公开的药剂的“治疗有效量”可以根据因素而变，所述因素例如个体的疾病状态、年龄、性别和重量，以及药剂在个体中引发所需应答的能力。“预防有效量”指在必要的剂量和时间段下，有效实现所需的预防结果的量。
用于描述HF的主要术语基于左心室射血分数(LVEF)的测量。HF包含广泛范围的患者(表1)。一些患者具有正常的LVEF，其通常被视为≥50％，并且被称为射血分数保留型HF(HFpEF)。其它患者具有LVEF降低的HF(HFrEF)，其通常被视为<40％。具有在约40％至约49％范围内的LVEF的患者代表“灰色区域”，其有时被定义为射血分数中间值HF(HFmrEF)。有时，取决于临床医生，处于“灰色区域”的这些患者被鉴定为患有HFrEF。由于不同的潜在病因学、人口统计数据、并存病以及对治疗的应答，基于LVEF区分HF患者是重要的。在1990年后发表的大多数临床试验都基于LVEF(通常使用超声心动图、放射性核素技术或心脏磁共振(CMR)测量)来选择患者，并且据我们所知，仅在HFrEF患者中，治疗才显示降低发病率和死亡率两者。
表1.通过左心室射血分数分析的心力衰竭定义
症状：例如呼吸困难、踝部肿胀和疲劳
体征：例如颈静脉压升高、肺啰音和外周性水肿。体征可能不呈现在HF(尤其是HFpEF)的早期阶段和用利尿剂治疗的患者中。
症状和体征由结构性和/或功能性心脏异常引起。
HF＝心力衰竭；HFmrEF＝射血分数中间值心力衰竭；HFpEF＝射血分数保留型心力衰竭；HFrEF＝射血分数降低型心力衰竭；LAE＝左心房扩大；LVEF＝左心室射血分数；LVH＝左心室肥厚；
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低射血分数保留型心力衰竭(HFpEF)的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)。在一些实施方案中，本公开涉及治疗具有正常LVEF的患者的方法。在一些实施方案中，本公开涉及治疗具有正常LVEF的患者的方法。在一些实施方案中，正常LVEF是≥50％的LVEF。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有与射血分数保留相关的HF(HFpEF)的患者的方法。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有HFpEF和利钠肽水平升高的患者的方法。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有HFpEF、利钠肽水平升高和结构性心脏病和/或舒张功能障碍的患者。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者，其中所述患者患有HFpEF。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者，其中所述患者具有正常的LVEF。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者，其中所述患者具有≥50％的LVEF。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者，其中所述患者具有升高水平的利钠肽。在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述患者患有射血分数保留型心力衰竭(HFpEF)。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低射血分数降低型心力衰竭(HFrEF)的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)。在一些实施方案中，本公开涉及治疗具有LVEF降低的患者的方法。在一些实施方案中，本公开涉及治疗具有LVEF降低和LVEF<40％的患者的方法。在一些实施方案中，本公开涉及治疗具有LVEF降低以及与射血分数降低相关的HF(HFrEF)的患者的方法。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者，其中所述患者患有HFrEF。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者，其中所述患者具有降低的LVEF。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者，其中所述患者具有<40％的LVEF。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者，其中所述患者具有升高水平的利钠肽。在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述患者患有射血分数降低型心力衰竭(HFrEF)。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低射血分数中间值心力衰竭(HFmrEF)的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)。在一些实施方案中，本公开涉及治疗具有中间值LVEF的患者的方法。在一些实施方案中，本公开涉及治疗具有中间值LVEF和约40％至约49％的LVEF的患者的方法。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有中间值LVEF和中间值射血分数HF(HFmrEF)的患者。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有HFmrEF和利钠肽水平升高的患者的方法。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有HFmrEF和利钠肽水平升高、以及结构性心脏病和/或舒张功能障碍的患者的方法。
HFpEF的诊断可能比HFrEF的诊断更具挑战性。HFpEF患者一般没有扩张的LV，而是经常具有LV壁厚度增加和/或左心房(LA)大小增加作为充盈压增加的体征。大多数具有LV充盈或抽吸能力受损的另外‘证据’，也分类为舒张功能障碍，其一般公认为这些患者中的HF的可能原因(因此称为‘舒张性HF’)。然而，大多数HFrEF(以前被称为‘收缩性HF’)患者也患有舒张功能障碍，并且在HFpEF患者中已显示了收缩功能的细微异常。因此，与‘收缩功能’保留或降低相比，更倾向于陈述LVEF保留或降低。
在先前的指南中，公认的是在HFrEF和HFpEF之间存在灰色区域。这些患者具有范围为40％至49％的LVEF，因此称为HFmrEF。HFmrEF患者最有可能主要患有轻度收缩功能障碍，但具有舒张功能障碍的特征。
未检测到LV心肌病的患者可能具有关于HF的其它心血管原因(例如，肺动脉高压、心脏瓣膜病等)。患有非心血管病理状况(例如，贫血、肺病、肾病或肝病)的患者可能具有与HF相似或相同的症状，并且各自可能使HF综合征复杂化或加剧。
NYHA功能分级(表2)已用于描述症状的严重程度和运动不耐受。然而，症状严重程度与LV功能的许多量度弱相关；尽管在症状的严重程度和存活之间存在明确的关系，但具有轻度症状的患者可能仍具有住院治疗和死亡的增加风险。有时，术语‘晚期HF’用于表征患有重度症状、反复失代偿和严重心功能不全的患者。
表2.基于症状的严重程度和体力活动的纽约心脏协会(NYHA)HF功能分级
在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有NYHA I级HF的患者的方法。在一些实施方案中，患有NYHA I级HF的患者没有体力活动的限制。在一些实施方案中，患有NYHA I级HF的患者经历并不引起过度的呼吸困难、疲劳和/或心悸的体力活动。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有NYHA II级HF的患者的方法。在一些实施方案中，患有NYHA II级HF的患者具有体力活动的轻微限制。在一些实施方案中，患有NYHA II级HF的患者经历普通的体力活动，导致过度的呼吸困难、疲劳或心悸。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有NYHAIII级HF的患者的方法。在一些实施方案中，患有NYHA III级HF的患者具有体力活动的明显限制。在一些实施方案中，患有NYHA III级HF的患者经历低于普通的体力活动，导致过度的呼吸困难、疲劳或心悸。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有NYHA IV级HF的患者的方法。在一些实施方案中，患有NYHA IV级HF的患者无法进行任何体力活动而无不适。在一些实施方案中，患有NYHA IV级HF的患者经历在休息时的症状，并且当从事任何体力活动时，不适增加。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法改善患者的NYHA功能性心力衰竭分级。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NYHA分级从IV级降低到III级。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NYHA分级从IV级降低到II级。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NYHA分级从IV级降低到I级。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NYHA分级从III级降低到II级。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NYHA分级从III级降低到I级。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NYHA分级从II级降低到I级。
美国心脏病学会基金会/美国心脏协会(ACCF/AHA)分级描述了基于结构变化和症状的HF发展阶段(表3)。ACC/AHA分级系统强调疾病的分期和发展，类似于肿瘤学中常用的方法。这些HF阶段从先前的危险因素(A期)进展到亚临床心功能不全的发展(B期)，然后是有症状的HF(C期)，以及最后的终末期难治性疾病(D期)。ACC/AHA分期从A期进展到D期。
表3.美国心脏病学会基金会/美国心脏协会(ACCF/AHA)心力衰竭分期
A 处于HF的高风险中，但没有结构性心脏病或HF的症状。
B 结构性心脏病，但没有HF的体征或症状。
C 结构性心脏病，具有以前或当前的HF症状。
D 需要专门干预的难治性HF。
在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有ACCF/AHA A期HF的患者的方法。在一些实施方案中，患有ACCF/AHA A期HF的患者处于HF的高风险中，但没有结构性心脏病或HF的症状。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有ACCF/AHA B期HF的患者的方法。在一些实施方案中，患有B期HF的患者患有结构性心脏病，但没有已知的HF体征或症状。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有ACCF/AHA C期HF的患者的方法。在一些实施方案中，患有ACCF/AHA C期HF的患者患有结构性心脏病，具有以前或当前的HF症状。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有ACCF/AHA D期HF的患者的方法。在一些实施方案中，患有ACCF/AHA D期HF的患者患有需要专门干预的难治性HF。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法改善患者的心力衰竭的ACCF/AHA分期。在一些实施方案中，方法涉及将患者的ACCF/AHA分期从D期降低到C期。在一些实施方案中，方法涉及将患者的ACCF/AHA分期从D期降低到B期。在一些实施方案中，方法涉及将患者的ACCF/AHA分期从D期降低到A期。在一些实施方案中，方法涉及将患者的ACCF/AHA分期从C期降低到B期。在一些实施方案中，方法涉及将患者的ACCF/AHA分期从C期降低到A期。在一些实施方案中，方法涉及将患者的ACCF/AHA分期从B期降低到A期。
Killip分级可以用于描述在心肌梗塞后的急性背景下的患者状况的严重程度。患有并发急性心肌梗塞(AMI)的HF的患者可以根据Killip和Kimball分类成表4中所示的分级。
表4.并发AMI的HF的Killip分级
在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有Killip I级并发AMI的HF的患者的方法。在一些实施方案中，患有Killip I级并发AMI的HF的患者没有HF的临床体征。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有Killip II级并发AMI的HF的患者的方法。在一些实施方案中，患有Killip II级并发AMI的HF的患者患有具有啰音和S3奔马律的HF。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有Killip III级并发AMI的HF的患者的方法。在一些实施方案中，患有Killip III级并发AMI的HF的患者患有明显的急性肺水肿。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有Killip IV级并发AMI的HF的患者的方法。在一些实施方案中，患有Killip IV级并发AMI的HF的患者具有心源性休克、低血压(例如，SBP，90mmHg)以及外周血管收缩的证据例如少尿、发绀和发汗。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法改善患者的Killip HF分级。在一些实施方案中，方法涉及将患者的Killip分级从IV级降低到III级。在一些实施方案中，方法涉及将患者的Killip分级从IV级降低到II级。在一些实施方案中，方法涉及将患者的Killip分级从IV级降低到I级。在一些实施方案中，方法涉及将患者的Killip分级从III级降低到II级。在一些实施方案中，方法涉及将患者的Killip分级从III级降低到I级。在一些实施方案中，方法涉及将患者的Killip分级从II级降低到I级。
用于诊断心力衰竭的Framingham标准(表5)要求存在至少两个主要标准，或至少一个主要标准和两个次要标准。尽管这些标准已充当黄金参考标准几十年，但它们在很大程度上基于在休息时存在充血。重要的是，这种临床特征经常不存在于具有良好代偿的HF的非卧床患者或仅运动状态下发展异常血流动力学的HF患者中。因此，尽管是高度特异性的，但Framingham标准趋于具有用于诊断HF的弱灵敏度。
表5.用于诊断心力衰竭的Framingham标准
在一些实施方案中，本公开涉及治疗具有用于诊断HF的一个或多个主要Framingham标准的患者的方法。在一些实施方案中，患者具有以下中的一种或多种：阵发性夜间呼吸困难或端坐呼吸、颈静脉怒张、啰音、放射显影心脏肥大、急性肺水肿、S3奔马律、静脉压增加大于16cm水柱、循环时间大于或等于25秒、肝颈反射、以及响应治疗在5天内大于或等于4.5kg的重量减轻。在一些实施方案中，本公开涉及治疗具有用于诊断HF的一个或多个次要Framingham标准的患者的方法。在一些实施方案中，患者具有以下中的一种或多种：双侧踝部浮肿、夜间咳嗽、普通劳力性呼吸困难、肝肿大、胸腔积液、肺活量比记录的最大值减少了1/3和心动过速(心率大于120/分钟)。在一些实施方案中，患者具有至少两个Framingham主要标准。在一些实施方案中，患者具有至少一个主要Framingham标准和至少两个次要Framingham标准。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法降低患者具有的关于心力衰竭的Framingham标准数目。在一些实施方案中，方法涉及减少患者具有的关于心力衰竭的主要Framingham标准数目。在一些实施方案中，方法涉及减少患者具有的关于心力衰竭的次要Framingham标准数目。
存在医学专业人员可能寻找关于心力衰竭诊断的许多已知的心力衰竭症状和体征。一些症状可能是非特异性的，并且因此无法帮助区别HF和其它问题。由于液体潴留的HF症状和体征可能用利尿疗法快速消退。体征例如颈静脉压升高和心尖搏动移位可能是更特异性的，但更难以检测且具有弱可重复性。HF在没有有关病史(例如，心脏损伤的潜在原因)的个体中是不常见的，而某些特征，特别是以前的心肌梗塞，极大地增加了具有适当症状和体征的患者中HF的可能性。症状和体征在监测患者对治疗的应答以及在一段时间内的稳定性是重要的。尽管治疗但症状的持续存在通常指示需要另外的疗法，并且症状恶化是严重的发展(将患者置于紧急入院和死亡的风险中)，并且需要立即的医学关注。
表6.心力衰竭的体征和症状
在一些实施方案中，本公开涉及治疗具有HF的一种或多种典型和/或较不典型症状的患者的方法。在一些实施方案中，本公开涉及治疗具有HF的一种或多种特异性和/或较不特异性体征的患者的方法。在一些实施方案中，本公开涉及治疗具有HF的一种或多种典型症状、较不典型症状、特异性体征和/或较不特异性体征的患者。在一些实施方案中，本公开涉及治疗具有HF的一种或多种典型症状的患者的方法。在一些实施方案中，患者具有选自以下的一种或多种症状：呼吸困难、端坐呼吸、阵发性夜间呼吸困难、运动耐量降低、疲劳、疲倦、运动后恢复时间增加和踝部肿胀。在一些实施方案中，患者具有HF的一种或多种较不典型症状。在一些实施方案中，患者具有选自以下的一种或多种较不典型症状：夜间咳嗽、哮鸣、饱胀感、食欲不振、意识模糊(尤其是在老年人中)、抑郁、心悸、头晕、晕厥和俯身呼吸困难。在一些实施方案中，患者具有一种或多种HF体征。在一些实施方案中，患者具有选自以下的一种或多种HF体征：颈静脉压升高、肝颈反流、第三心音(奔马律)和心尖搏动的侧向移位。在一些实施方案中，患者具有一种或多种较不特异性的HF体征。在一些实施方案中，患者具有选自以下的一种或多种较不特异性的HF体征：重量增加(>2kg/周)、重量减轻(在晚期HF中)、组织消耗(恶病质)、心脏杂音、外周性水肿(踝部、骶骨、阴囊)、肺捻发音、进气降低和肺底叩诊呈浊音(胸腔积液)、心动过速、不规则脉搏、呼吸急促、潮式呼吸、肝肿大、腹水、四肢冰冷、少尿和脉压窄。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法降低患者具有的心力衰竭的体征和/或症状数目。在一些实施方案中，方法涉及减少患者具有的心力衰竭的体征数目。在一些实施方案中，方法涉及减少患者具有的心力衰竭的症状数目。
与代谢并发症相关的心力衰竭
代谢并发症例如糖尿病(Diabetes Mellitus)(即，糖尿病(diabetes))和肥胖广泛公认为心力衰竭发展的主要危险因素。糖尿病和胰岛素抵抗可以是心血管发病率和死亡率的有力预测因素，并且各自是心力衰竭患者中的死亡的独立危险因素。肥胖患者和糖尿病患者中的心力衰竭的特征可以在于左心室舒张功能障碍的早期发展、左心室壁厚度增加和动脉硬度，所有这些都是HFpEF的标志。患者还可能患有左心室收缩功能障碍和射血分数降低(例如HFrEF)。即使在调整独立心脏因素包括冠状动脉疾病和高血压后，在肥胖个体和/或患有糖尿病的个体中发展心力衰竭的这种增加的风险仍可以持续。随着时间过去，对心脏持续不断的代谢性应激可以导致心肌结构和功能的逐渐恶化，其典型的最终结果是心力衰竭(例如，糖尿病性心肌病)。
在Framingham心脏研究(Framingham Heart Study)中，即使在调整了其它心血管危险因素后，糖尿病与男性中的HF事件风险的近2倍增加以及女性中的4倍增加相关(Kannel等人，JAMA，1979，241:2035-2038)。在心脏与灵魂研究(Heart and Soul Study)中已知患有冠状动脉疾病(CAD)的患者中，糖尿病也与较高的调整后HF事件风险相关(风险比[HR]，3.34[95％CI，1.65–6.76])(van Melle JP等人，Diabetes Care，2010，33:2084-2089)。
糖尿病本身也是无症状左心室(LV)收缩功能障碍患者中的有症状的HF发展的重要预测因素。此外，血糖控制不佳与HF发展的更大风险相关；对于血红蛋白A1c(HbA1c)的每1％增加，HF事件的风险增加了8％至36％(Dunlay，SM等人，Circulation，2019，140:e294-e324)。在糖尿病患者中的HF事件的风险随着年龄的增长，冠状动脉疾病(CAD)，外周动脉疾病，肾病变，视网膜病变，更长的糖尿病持续时间，肥胖，高血压和更高的NT-proBNP(N末端B型利钠肽前体)水平而增加。即使具有血糖调控中的较轻微异常，HF的风险也是增加的。在处于心血管疾病的高风险中、没有糖尿病的18,084人中的前瞻性队列研究中，比平均空腹血糖水平高1-mmol/L与1.23倍增加的HF住院治疗风险相关(95％CI，1.03–1.47)(Held C.等人，Circulation，2007，115:1371-1375)。其它研究已进一步将胰岛素抵抗与HF事件的风险增加以及LV收缩和舒张功能障碍的发展相联系。
经常伴随糖尿病的高血糖、胰岛素抵抗和高胰岛素血症触发一系列有害效应，其促成糖尿病患者中的心力衰竭发展。高血糖、胰岛素抵抗和高胰岛素血症诱发心脏胰岛素抵抗和代谢病症，其增加线粒体功能障碍、氧化性应激、晚期糖基化终产物(AGE)、线粒体Ca2+处理受损、炎症、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的激活、自主神经病变、内质网应激、心肌细胞死亡和微血管功能障碍中的一种或多种。这些病理生理学异常促进心脏硬度、肥厚和纤维化，导致心脏舒张功能障碍、收缩功能障碍和心力衰竭(图28)。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)。在一些实施方案中，患者是肥胖的。在一些实施方案中，患者患有糖尿病(diabetes mellitus)。在一些实施方案中，患者患有糖尿病(diabetes)。在一些实施方案中，患者患有1型糖尿病。在一些实施方案中，患者患有2型糖尿病。在一些实施方案中，患者的糖尿病引起心力衰竭。在一些实施方案中，患者的心力衰竭引起糖尿病。在一些实施方案中，患者患有糖尿病性心肌病。在一些实施方案中，患者患有高血糖。在一些实施方案中，患者具有胰岛素抵抗。在一些实施方案中，患者患有高胰岛素血症。在一些实施方案中，患者患有高血糖、胰岛素抵抗和高胰岛素血症中的一种或多种。在一些实施方案中，患者具有心脏胰岛素抵抗。在一些实施方案中，患者患有代谢病症，其增加线粒体功能障碍、氧化性应激、晚期糖基化终产物(AGE)、线粒体Ca2+处理受损、炎症、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的激活、自主神经病变、内质网应激、心肌细胞死亡和微血管功能障碍中的一种或多种。在一些实施方案中，患者患有射血分数保留型心力衰竭(HFpEF)。在一些实施方案中，心力衰竭是HFpEF。在一些实施方案中，患者具有增加的左心室壁厚度。在一些实施方案中，患者患有LV肥厚。在一些实施方案中，患者患有舒张功能障碍。在一些实施方案中，患者患有LV舒张功能障碍。在一些实施方案中，患者患有左心房扩大。在一些实施方案中，患者不具有左心室射血分数的降低。在一些实施方案中，患者具有≥50％的左心室射血分数。在一些实施方案中，患者具有增加水平的利钠肽。在一些实施方案中，患者的HFpEF进展为HFrEF。在一些实施方案中，患者患有射血分数降低型心力衰竭(HFrEF)。在一些实施方案中，心力衰竭是HFrEF。在一些实施方案中，患者患有收缩功能障碍。在一些实施方案中，患者具有左心室射血分数的降低。在一些实施方案中，患者具有<40％的左心室射血分数。
在某些方面，本公开涉及改善与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)。在一些实施方案中，方法改善患者的肥胖。在一些实施方案中，方法改善患者的糖尿病。在一些实施方案中，方法改善患者的1型糖尿病。在一些实施方案中，方法改善患者的2型糖尿病。在一些实施方案中，方法改善患者的高血糖。在一些实施方案中，方法改善患者的胰岛素抵抗。在一些实施方案中，方法改善患者的高胰岛素血症。在一些实施方案中，方法改善患者的高血糖、胰岛素抵抗和高胰岛素血症中的一种或多种。在一些实施方案中，方法改善患者的心脏胰岛素抵抗。在一些实施方案中，方法改善患者的线粒体功能障碍、氧化性应激、晚期糖基化终产物(AGE)、线粒体Ca2+处理受损、炎症、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的激活、自主神经病变、内质网应激、心肌细胞死亡和微血管功能障碍中的一种或多种。
糖尿病性心肌病
“糖尿病性心肌病”是由Rubler等人于1972年首次使用的术语，其描述了在冠状动脉疾病、肥厚或心脏瓣膜病的不存在下，患有心力衰竭和糖尿病的患者中的心肌功能障碍。在2013年，美国心脏病学会基金会、美国心脏协会和欧洲心脏病学会(European SocietyofCardiology)与欧洲糖尿病研究协会(European Association for the Study ofDiabetes)合作，将糖尿病性心肌病定义为在糖尿病患者中、在冠状动脉粥样硬化和高血压的不存在下发生的心室功能障碍的临床状况。
在其早期阶段，糖尿病性心肌病包括特征在于结构和功能性心脏异常的亚临床期，包括左心室(LV)肥厚、纤维化和细胞信号传导异常。心脏纤维化和硬度的这些变化以及相关的亚临床舒张功能障碍经常可以演变为射血分数保留型心力衰竭(HFpEF)，以及最终的伴有射血分数降低型心力衰竭(HFrEF)的收缩功能障碍。或者，在一些情况下，患者可能呈现HFrEF而无需首先呈现HFpEF。
糖尿病性心肌病在其演变的早期阶段通常是无症状的。最早的表现之一是LV肥厚和LV顺应性减少，其特征在于舒张早期充盈受损、心房充盈增加和等容舒张延长。LV扩张和有症状的心力衰竭通常在收缩功能障碍发展后发生。心肌细胞硬度和肥大以及心肌纤维化都促成糖尿病性心肌病中的心脏异常。心血管健康研究(Cardiovascular Health Study)发现了，在5201个男性和女性的队列中，心室间隔和左后心肌壁厚度在糖尿病患者中大于非糖尿病个体中，并且这与收缩或舒张功能受损相关(Lee M.等人，Am Heart J，1997，133:36-43)。与糖尿病性心肌病相关的心力衰竭的特征可以在于左心室(LV)壁厚度增加(即LV肥厚)和舒张功能障碍，不伴随左心室射血分数(LVEF)的降低(即HFpEF)。虽然通过定义在HFpEF患者中的射血分数是正常的，但LV收缩力是受损的。为了避免在诊断HFpEF时的低特异性，劳力性呼吸困难和正常LVEF可以加上舒张期LV功能障碍、LV肥厚、左心房(LA)扩大和/或利钠肽(NP)的血浆水平的客观测量。在疾病的后期阶段，或者有时甚至从早期阶段开始，与糖尿病性心肌病相关的心力衰竭的特征可以在于射血分数降低和收缩功能障碍，伴随扩大的LV腔室。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与糖尿病性心肌病相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)。在一些实施方案中，患者是肥胖的。在一些实施方案中，患者患有糖尿病(diabetesmellitus)。在一些实施方案中，患者患有糖尿病(diabetes)。在一些实施方案中，患者患有1型糖尿病。在一些实施方案中，患者患有2型糖尿病。在一些实施方案中，患者的糖尿病引起心力衰竭。在一些实施方案中，患者的心力衰竭引起糖尿病。在一些实施方案中，患者患有射血分数保留型心力衰竭(HFpEF)。在一些实施方案中，心力衰竭是与射血分数保留相关的心力衰竭(HFpEF)。在一些实施方案中，患者具有增加的左心室壁厚度。在一些实施方案中，患者患有LV肥厚。在一些实施方案中，患者患有舒张功能障碍。在一些实施方案中，患者患有LV舒张功能障碍。在一些实施方案中，患者患有左心房扩大。在一些实施方案中，患者不具有左心室射血分数的降低。在一些实施方案中，患者具有≥50％的左心室射血分数。在一些实施方案中，患者具有增加水平的利钠肽。在一些实施方案中，患者的HFpEF进展为HFrEF。在一些实施方案中，患者患有射血分数降低型心力衰竭(HFrEF)。在一些实施方案中，心力衰竭是与射血分数降低相关的心力衰竭(HFrEF)。在一些实施方案中，患者患有收缩功能障碍。在一些实施方案中，患者具有左心室射血分数的降低。在一些实施方案中，患者具有<40％的左心室射血分数。
在某些方面，本公开涉及改善糖尿病性心肌病的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)。在一些实施方案中，方法改善患者的肥胖。在一些实施方案中，方法改善患者的糖尿病。在一些实施方案中，方法改善患者的1型糖尿病。在一些实施方案中，方法改善患者的2型糖尿病。在一些实施方案中，方法改善患者的高血糖。在一些实施方案中，方法改善患者的胰岛素抵抗。在一些实施方案中，方法改善患者的高胰岛素血症。在一些实施方案中，方法改善患者的高血糖、胰岛素抵抗和高胰岛素血症中的一种或多种。在一些实施方案中，方法改善患者的心脏胰岛素抵抗。在一些实施方案中，方法改善患者的线粒体功能障碍、氧化性应激、晚期糖基化终产物(AGE)、线粒体Ca2+处理受损、炎症、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的激活、自主神经病变、内质网应激、心肌细胞死亡和微血管功能障碍中的一种或多种。
结构变化
成像研究已揭示了左心室向心性重塑作为糖尿病心肌的特性。糖尿病心脏的肥厚一般被视为心肌甘油三酯沉积和/或作为胶原沉积和纤维化指标的细胞外体积增加的后果。在一些情况下，细胞外体积增加预示着糖尿病患者中的死亡率和心力衰竭。另外，由于胰岛素抵抗的高胰岛素血症也被视为直接促进心肌肥厚。在糖尿病患者中的心肌组织灌注、氧供应和能量底物可用性与心肌功能之间存在相关，提示了微循环损伤作为糖尿病性心肌病的促成原因。
晚期糖基化终产物(AGE)的沉积构成糖尿病中的微血管损伤的驱动因素，并且已与心肌细胞硬度和心肌胶原沉积连同心脏舒张受损相关。晚期糖基化终产物由葡萄糖和其它糖基化化合物与脂质和蛋白质部分的非酶促反应产生，导致结构和功能修饰。AGE与其受体(RAGE)相互作用，从而激活NFκB信号传导途径和次级促炎细胞因子、趋化因子和粘附分子。心肌硬度增加的后果转变为舒张功能障碍、心肌应变降低和心房扩大，HFpEF的标志。
糖尿病心脏中促进心肌细胞硬度的机制包括胰岛素代谢信号传导受损，其减少葡萄糖转运蛋白4型(GLUT4)募集到质膜和葡萄糖摄取，从而降低肌质网Ca2+泵活性并增加心肌细胞细胞内Ca2+。异常的胰岛素代谢信号传导还减少胰岛素刺激的冠状动脉内皮一氧化氮(NO)合酶(eNOS)活性和NO产生，增加心肌细胞细胞内Ca2+/Ca2+致敏并降低肌浆Ca2+摄取。NO生物利用度的降低还可能导致肌联蛋白的磷酸化，增加刚性肌联蛋白同种型N2B/N2BA(顺应性)表达的比率。这些病理生理学异常促成心脏硬度增加和舒张受损，这两者均为糖尿病性心肌病的表现。
与代谢并发症(例如，肥胖、糖尿病)相关的心力衰竭中的其它相关异常包括高血糖、胰岛素抵抗和氧化性应激，其促进几种心肌细胞肥大基因，例如β-肌球蛋白重链、胰岛素样生长因子1受体和B型利钠肽的表达。高胰岛素水平通过与胰岛素样生长因子1受体结合来诱导心肌细胞肥大。由心肌细胞产生的胰岛素样生长因子1还可以经由胰岛素受体、细胞外信号调控激酶1/2(Erk1/2)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号传导途径来刺激心肌细胞肥大。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭、或者与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的一种或多种并发症的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述患者患有促成心血管结构重塑的一种或多种代谢并发症。在一些实施方案中，患者患有选自以下的代谢并发症：心肌甘油三酯沉积、细胞外体积增加、由于胰岛素抵抗的高胰岛素血症、微循环损伤、晚期糖基化终产物(AGE)沉积、减少葡萄糖转运蛋白4型(GLUT4)募集到质膜和葡萄糖摄取的胰岛素代谢信号传导受损、降低肌质网Ca2+泵活性、增加心肌细胞细胞内Ca2+、异常胰岛素代谢信号传导、减少胰岛素刺激的冠状内皮一氧化氮(NO)合酶(eNOS)活性和NO产生、增加心肌细胞细胞内Ca2+/Ca2+致敏、降低肌浆Ca2+摄取、NO生物利用度的降低、高血糖、胰岛素抵抗和氧化性应激。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭、或者与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的一种或多种并发症的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法改善促成心血管结构重塑的一种或多种代谢并发症。在一些实施方案中，方法改善选自以下的代谢并发症：改善心肌甘油三酯沉积、减少细胞外体积、减少由于胰岛素抵抗的高胰岛素血症、减少微循环损伤、减少晚期糖基化终产物(AGE)沉积、改善减少葡萄糖转运蛋白4型(GLUT4)募集到质膜和葡萄糖摄取的胰岛素代谢信号传导的受损、增加肌质网Ca2+泵活性、减少心肌细胞细胞内Ca2+、改善异常胰岛素代谢信号传导、增加胰岛素刺激的冠状内皮一氧化氮(NO)合酶(eNOS)活性和NO产生、减少心肌细胞细胞内Ca2+/Ca2+致敏、增加肌浆Ca2+摄取、NO生物利用度的增加、改善高血糖、改善胰岛素抵抗和改善氧化性应激。
心脏和血管系统中的显著结构变化可以在与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的开始阶段发生。这点的一些实例包括但不限于增加的血管内膜厚度、增加的血管硬度、增加的左心室壁厚度(在正常限度内)和增加的左心房尺寸(表7)。心脏厚度和形状的整体变化对于心脏壁应力和整体收缩效率具有重要牵涉。在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭、或者与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的一种或多种并发症的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述患者具有心血管结构重塑。在一些实施方案中，患者具有选自以下的心血管结构重塑：血管内膜厚度增加、血管硬度增加、LV肥厚增加(例如，LV壁厚度增加)和左心房扩大增加(例如，左心房壁尺寸增加)。在一些实施方案中，患者具有血管内膜厚度的增加。在一些实施方案中，患者具有血管硬度的增加。在一些实施方案中，患者具有LV肥厚的增加。在一些实施方案中，患者具有LV壁厚度的增加。在一些实施方案中，患者患有收缩期高血压。在一些实施方案中，患者具有舒张早期心脏充盈延迟。在一些实施方案中，患者具有增加的心脏充盈压。在一些实施方案中，患者具有较低的呼吸困难阈值。在一些实施方案中，患者患有心力衰竭的可能性增加，伴随相对正常的收缩功能。在一些实施方案中，患者患有左心房扩大。在一些实施方案中，患者具有左心房尺寸的增加。在一些实施方案中，患者具有孤立性心房颤动和/或其它房性心律失常的患病率增加。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭、或者与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的一种或多种并发症的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法改善患者中的心血管结构重塑。在一些实施方案中，方法改善选自以下的心血管结构重塑：血管内膜厚度增加、血管硬度增加、LV肥厚增加(例如，LV壁厚度增加)和左心房扩大增加(例如，左心房壁尺寸增加)。在一些实施方案中，方法减少患者中的血管内膜厚度。在一些实施方案中，方法减少患者中的血管硬度。在一些实施方案中，方法减少患者中的LV肥厚。在一些实施方案中，减少患者中的LV壁厚度。在一些实施方案中，方法改善患者中的收缩期高血压。在一些实施方案中，方法改善患者中的舒张早期心脏充盈。在一些实施方案中，方法减少患者中的心脏充盈压。在一些实施方案中，方法改善患者中的左心房扩大。在一些实施方案中，方法减少患者中的左心房尺寸。在一些实施方案中，方法减少患者中的孤立性心房颤动和/或其它房性心律失常的患病率。
表7.心血管人体结构变化与心血管疾病的关系
缩写：VSMC＝血管平滑肌细胞；LV＝左心室；PUFA＝多不饱和脂肪酸(Strait和Lakatta，Heart Fail Clin，2012，8:143-164)。
心室结构
在结构水平下，可以发生由于心肌细胞大小增加的LV壁厚度增加(即，LV肥厚)。LV肥厚主要被视为在心肌细胞损失后通过身体的代偿性应答，促使左心室更努力地工作。随着工作量增加，腔室壁中的肌肉组织增厚，并且有时腔室本身的尺寸也增加。扩大的心肌失去弹性，并且最终可能未能以所需的力量泵血。此类肥厚以不对称的方式影响LV，主要影响室间隔并导致心肌重新分布，这解释了对心脏总质量的作用的可能缺少。LV肥厚和LV腔容积减少是HFpEF的一些标志，其可以在与代谢并发症(例如，肥胖、糖尿病)相关的心力衰竭中发生。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述患者具有心脏中的心室结构变化。在一些实施方案中，心脏中的心室结构变化选自LV肥厚、心肌细胞大小增加、心肌细胞损失、LV质量的很少变化至无变化、以及LV舒张末期容积减少。在一些实施方案中，患者患有LV肥厚。在一些实施方案中，患者具有LV壁厚度的增加。在一些实施方案中，患者具有心肌细胞大小的增加。在一些实施方案中，患者具有心肌细胞的损失。在一些实施方案中，患者具有LV舒张末期容积的减少。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法改善心脏中的心室结构的一种或多种变化。在一些实施方案中，方法改善心脏中选自以下的心室结构：LV肥厚、心肌细胞大小增加、心肌细胞损失、LV质量的很少变化至无变化、以及LV舒张末期容积减少。在一些实施方案中，方法减少LV肥厚。在一些实施方案中，方法预防LV肥厚恶化。在一些实施方案中，方法修复LV肥厚。在一些实施方案中，方法减少LV壁的厚度。在一些实施方案中，方法减少心肌细胞大小。在一些实施方案中，方法改善心肌细胞的损失。在一些实施方案中，方法预防心肌细胞损失恶化。在一些实施方案中，方法增加LV舒张末期容积。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述患者患有左心室肥厚。在一些实施方案中，本公开涉及将心力衰竭患者中的一种或多种参数朝向更正常水平(例如，与相似年龄和性别的健康人相比正常)调整的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心室肥厚减少了至少1％(例如，1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％)。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心室肥厚减少了至少1％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心室肥厚减少了至少5％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心室肥厚减少了至少10％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心室肥厚减少了至少15％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心室肥厚减少了至少20％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心室肥厚减少了至少25％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心室肥厚减少了至少30％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心室肥厚减少了至少35％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心室肥厚减少了至少40％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心室肥厚减少了至少45％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心室肥厚减少了至少50％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心室肥厚减少了至少55％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心室肥厚减少了至少60％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心室肥厚减少了至少65％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心室肥厚减少了至少70％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心室肥厚减少了至少75％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心室肥厚减少了至少80％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心室肥厚减少了至少85％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心室肥厚减少了至少90％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心室肥厚减少了至少95％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心室肥厚减少了100％。
心房结构
糖尿病性心肌病的第一阶段之一可以是临床上无症状的，并且典型特征在于增加的纤维化和硬度。此外，存在舒张早期充盈的降低以及心房充盈和扩大的增加，以及升高的LV舒张末压。潜在的代谢因素包括高血糖、全身和心脏胰岛素抵抗、增加的游离脂肪酸(FFA)水平、全身和组织炎症、氧化性应激以及肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)和交感神经系统(SNS)的激活。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述患者具有心脏中的心房结构变化。在一些实施方案中，心脏中的心房结构变化选自左心房肥厚、心律失常、心房扩张、主动脉根部扩张和心房颤动。在一些实施方案中，患者患有心房肥厚。在一些实施方案中，患者患有左心房肥厚。在一些实施方案中，患者患有左心房扩大。在一些实施方案中，患者患有心律失常。在一些实施方案中，患者患有心房扩张。在一些实施方案中，患者患有主动脉根部扩张。在一些实施方案中，患者患有心房颤动。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法改善心脏中的心房结构变化。在一些实施方案中，方法改善心脏中选自以下的心房结构变化：左心房肥厚、心律失常、心房扩张、主动脉根部扩张和心房颤动。在一些实施方案中，方法改善心房肥厚。在一些实施方案中，方法改善左心房肥厚。在一些实施方案中，方法改善左心房扩大。在一些实施方案中，方法减少患者中的心律失常。在一些实施方案中，方法改善心房扩张。在一些实施方案中，改善主动脉根部扩张。在一些实施方案中，方法改善心房颤动
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述患者患有左心房扩大。在一些实施方案中，本公开涉及将心力衰竭患者中的一种或多种参数朝向更正常水平(例如，与相似年龄和性别的健康人相比正常)调整的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心房扩大减少了至少1％(例如，1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％)。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心房扩大减少了至少1％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心房扩大减少了至少5％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心房扩大减少了至少10％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心房扩大减少了至少15％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心房扩大减少了至少20％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心房扩大减少了至少25％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心房扩大减少了至少30％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心房扩大减少了至少35％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心房扩大减少了至少40％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心房扩大减少了至少45％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心房扩大减少了至少50％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心房扩大减少了至少55％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心房扩大减少了至少60％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心房扩大减少了至少65％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心房扩大减少了至少70％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心房扩大减少了至少75％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心房扩大减少了至少80％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心房扩大减少了至少85％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心房扩大减少了至少90％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心房扩大减少了至少95％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的左心房扩大减少了100％。
功能变化
糖尿病性心肌病的第一阶段之一可以是临床上无症状的，并且典型特征在于结构变化例如增加的纤维化和硬度、舒张早期充盈的降低、心房充盈和扩大的增加、以及升高的LV舒张末压。降低的钙(Ca2+)泵活性诱导的肌质网Ca2+的低效隔离被视为心脏中的功能变化(其为舒张功能障碍)发展的重要贡献者。
糖尿病性心肌病第二阶段的典型特征在于结构变化例如LV肥厚、心脏重塑和心脏舒张功能障碍进展，以及射血分数保留型心力衰竭(HFpEF)的临床指征的随后出现。随着糖尿病性心肌病的进展，功能变化例如舒张功能障碍和心脏顺应性降低可能与收缩功能障碍共存，导致射血分数降低、射血前期性能延长、LV腔室扩大、射血期缩短，而后者是通过对充盈抗性的增加，伴随充盈阻力的增加。
自主神经病变或遍及全身的神经损伤可能在左心室(LV)功能障碍的发展中发挥作用。交感神经刺激增加LV收缩并且还增加LV舒张率，后者可能是通过促进经由肌质网的钙摄取。
减少的胰岛素可用性或响应性可以损害葡萄糖跨细胞膜的能量不依赖性转运。由于缺血性心肌依赖葡萄糖的无氧代谢，因此增加的葡萄糖摄取和代谢对于心肌功能的维持是必要的。缩减的胰岛素活性限制了葡萄糖的可用性，导致朝向脂肪酸代谢的转变。这些变化增加了心肌的氧利用率，并且可以降低非梗塞心肌的代偿能力。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述患者具有心脏中的功能变化。在一些实施方案中，心脏中的功能变化选自心脏舒张功能的变化、心脏收缩功能的变化和心脏电功能的变化。在一些实施方案中，患者具有心脏舒张功能的变化。在一些实施方案中，患者具有心脏收缩功能的变化。在一些实施方案中，患者具有心脏电功能的变化。在一些实施方案中，患者具有降低的钙(Ca2+)泵活性诱导的肌质网Ca2+的低效隔离。在一些实施方案中，患者具有舒张早期充盈的降低。在一些实施方案中，患者具有心房充盈和扩大的增加。在一些实施方案中，患者具有升高的LV舒张末压。在一些实施方案中，患者患有舒张功能障碍。在一些实施方案中，患者患有收缩功能障碍。在一些实施方案中，患者患有自主神经病变。在一些实施方案中，患者具有减少的胰岛素可用性，其损害了葡萄糖跨细胞膜的能量依赖性转运。在一些实施方案中，患者具有朝向脂肪酸代谢的转变。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法改善心脏中的功能变化。在一些实施方案中，方法改善心脏中选自心脏舒张功能变化、心脏收缩功能变化和心脏电功能变化的功能变化。在一些实施方案中，改善心脏舒张功能的变化。在一些实施方案中，方法改善心脏收缩功能的变化。在一些实施方案中，方法改善心脏电功能的变化。在一些实施方案中，方法增加钙(Ca2+)泵活性诱导的肌质网Ca2+的低效隔离。在一些实施方案中，方法增加舒张早期充盈。在一些实施方案中，方法减少心房充盈和扩大。在一些实施方案中，方法减少LV舒张末压。在一些实施方案中，方法改善舒张功能障碍。在一些实施方案中，方法改善收缩功能障碍。在一些实施方案中，方法改善自主神经病变。在一些实施方案中，方法增加胰岛素可用性。在一些实施方案中，方法诱导远离脂肪酸代谢的转变。
表8.心血管人体功能变化与心血管疾病的关系
缩写：VSMC＝血管平滑肌细胞；LV＝左心室；PUFA＝多不饱和脂肪酸(Strait和Lakatta，Heart Fail Clin，2012，8:143-164)。
舒张功能
舒张功能指几种不同的生理过程，其允许左心室(LV)在足够低的压力下充满足够的血液用于身体的当前需要，以预防肺充血。正常LV充当吸泵，其中舒张早期抽吸的程度涉及前一次搏动的缩短程度以及在二尖瓣时的左心房中的压力加上LV舒张。在与代谢并发症(例如，肥胖、糖尿病)相关的心力衰竭中，患者可能具有LV舒张功能减少(例如，舒张功能障碍)，其中心脏经历心室舒张受损和充盈压增加。胰岛素抵抗和/或高胰岛素血症可能促成LV肥厚和相关的舒张功能障碍。正常舒张期充盈可以分成两个阶段：在舒张过程中早期的被动充盈(‘E’)，称为舒张早期跨二尖瓣血流速度，以及在舒张过程中晚期通过心房收缩的主动充盈(‘A’)，称为舒张晚期跨二尖瓣血流速度。在舒张功能受损的早期阶段，心脏的血液充盈率下降(例如，较小的E)，心室充盈的大部分转变为舒张后期，并且存在显著的心房扩大以及关于心房的更大血容量，以在收缩期间射出(例如，较大的A)。因此，心房占舒张末期总容积的更大部分，并且E/A比值减少，其是在HFpEF早期阶段的舒张功能障碍的标志。健康年轻人中的E/A比值通常>1。舒张功能障碍与HFpEF(射血分数保留型心力衰竭)相联系。舒张功能障碍代表受损的左心室(LV)舒张、恢复力、肌细胞延长负荷和心房功能的组合，所有这些最终导致LV充盈压增加。舒张早期/晚期跨二尖瓣血流速度(E/A)的比值可以用于评价舒张功能。
存在除了测量(E/A)之外的估计舒张功能障碍的其它方式。使用的一种测量是舒张早期跨二尖瓣血流速度/二尖瓣环组织舒张早期速度的比值(E/e')，其估计LV充盈压。正常(E/e')通常<15，并且大于15的值指示LV充盈压升高和HFpEF。因此，比值(E/e')也可以用于评价舒张功能，并且是临床上优选的，因为舒张功能障碍导致由于心室舒张受损较大的E/e’比值、以及因此较小的e'测量和较大的E测量。还可以测量二尖瓣环组织舒张早期速度/二尖瓣环组织舒张晚期速度的比值(e'/a')。
最后，减速时间(DT，也被称为E减速时间)可以用于估计舒张功能障碍。DT从超声心动图中的E波峰值到其预计基线的时间间隔。正常患者中的E波减速时间通常为150ms至240ms。DT指示用于平衡在左心房和左心室之间的压力差的持续时间。
尽管舒张功能障碍的这些测量具有重要的诊断和预后牵涉，但它们应该在患者的年龄和超声心动图的剩余部分的背景下加以解释，以描述舒张功能并指导患者管理。在健康的心脏中，显著量的LV射血和LV充盈起因于二尖瓣环朝向心尖的下降。这种纵向运动通常在充盈之前。在总体功能障碍(所有运动都降低)的背景下或在与LV肥厚(收缩从纵向缩短转变为径向增厚)相关的各种背景下，这种运动可能是既减少又延迟的。
在心内膜或心包疾病的不存在下，LV舒张功能障碍起因于心肌硬度增加。心肌内的两个区室调控其舒张硬度。这些区室是细胞外基质和心肌细胞。一个区室内的硬度变化也经由基质细胞蛋白传递到另一个区室。细胞外基质的硬度在很大程度上由胶原通过调控其总量、I型胶原的相对丰度和胶原交联程度来决定，其都被认为在HFpEF中发挥作用。除胶原沉积之外，固有的心肌细胞硬度也促成HFpEF中的LV舒张功能障碍。
表9.用于评价LV舒张功能的变量
/>
/>
缩写：A＝晚期(心房)跨二尖瓣脉搏波多普勒血流；AF＝心房颤动；DT＝减速时间；E＝早期跨二尖瓣脉搏波多普勒血流；e’＝早期二尖瓣环组织多普勒速度；LA＝左心房；LAP＝左心房压；LV＝左心室；LAVI＝左心房容积与体表面积指数。TR＝三尖瓣反流(Nagueh，S.F.等人，J Am Soc Echocardiogr.，2016，29:277-314)。
存在对于诊断舒张功能障碍发表的多组指南。虽然参数可能不同，但所有指南都要求存在HF的体征或症状、LV收缩功能正常的证据、以及舒张功能障碍的证据或替代标记物，其包括LV肥厚、LV扩大、心房颤动或BNP水平升高。根据美国超声心动图学会(AmericanSociety of Echocardiography)和欧洲心血管影像协会(European Association ofCardiovascularImaging)，尤其基于上文测量，舒张功能障碍可以分成四个等级或阶段。表10呈现了关于不同等级的舒张功能障碍的预计发现的概括。(Nagueh，S.F.等人，J Am SocEchocardiogr.，2016，29:277-314)。重要的是，可以测量E/e’比值，以确定疑似HFpEF患者中的舒张功能障碍等级。1级舒张功能障碍患者中的E/e'值小于8。2级舒张功能障碍患者中的E/e'值为8至15。3级舒张功能障碍患者中的E/e'值高于15。
表10.舒张功能障碍的阶段/等级
缩写：A＝晚期(心房)跨二尖瓣脉搏波多普勒血流；AF＝心房颤动；DT＝减速时间；E＝早期跨二尖瓣脉搏波多普勒血流；e’＝早期二尖瓣环组织多普勒速度；LA＝左心房；LAP＝左心房压；LV＝左心室；LAVI＝左心房容积与体表面积指数；TR速度＝三尖瓣反流速度。(Nagueh，S.F.等人，JAm Soc Echocardiogr.，2016，29:277-314)和(Lekavich C.L.等人，Heart Fail Rev，2015，20:643-653)。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，肥胖、糖尿病)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述患者患有舒张功能障碍。在一些实施方案中，与相似年龄和性别的健康人相比，患者具有减少的左心室舒张功能。在一些实施方案中，与相似年龄和性别的健康人相比，患者具有减少的左心室舒张。在一些实施方案中，测量患者的E/A比值。在一些实施方案中，测量患者的舒张早期跨二尖瓣血流速度/舒张晚期跨二尖瓣血流速度的比值(E/A)。在一些实施方案中，与相似年龄和性别的健康人相比，患者的心脏中的血液充盈速率减少。在一些实施方案中，患者具有关于心脏的心房在收缩期间射出的血容量的增加量。在一些实施方案中，患者患有心房扩大。在一些实施方案中，与相似年龄和性别的健康人相比，患者具有E/A比值的减少。在一些实施方案中，与相似年龄和性别的人相比，患者具有增加的左心房压。在一些实施方案中，与相似年龄和性别的健康人相比，患者具有减少的LV充盈压。在一些实施方案中，测量患者的舒张早期跨二尖瓣血流速度/二尖瓣环组织舒张早期速度的比值(E/e')。在一些实施方案中，与相似年龄和性别的健康人相比，患者的E/e’比值增加。在一些实施方案中，患者的E/e’比值小于8。在一些实施方案中，患者的E/e’比值为8至15。在一些实施方案中，患者的E/e’比值大于15。在一些实施方案中，测量患者的二尖瓣环组织舒张早期速度/二尖瓣环组织舒张晚期速度的比值(e'/a')。在一些实施方案中，测量患者的减速时间(DT)。在一些实施方案中，与相似年龄和性别的健康人相比，患者的减速时间降低。在一些实施方案中，患者的减速时间小于160ms。在一些实施方案中，测量患者的三尖瓣反流速度(TR速度)。在一些实施方案中，患者的TR速度一般是增加的。在一些实施方案中，患者的TR速度一般大于2.8m/秒。在一些实施方案中，测量患者的左心房容积指数(LAVI)。在一些实施方案中，与相似年龄和性别的健康人相比，患者的LAVI增加。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，肥胖、糖尿病)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法改善舒张功能障碍。在一些实施方案中，方法增加左心室舒张功能。在一些实施方案中，方法改善左心室舒张。在一些实施方案中，方法改善患者的舒张早期跨二尖瓣血流速度/舒张晚期跨二尖瓣血流速度的比值(E/A)。在一些实施方案中，方法一般减少患者的E/A比值。在一些实施方案中，方法改善患者的二尖瓣环组织舒张早期速度/二尖瓣环组织舒张晚期速度的比值(e'/a')。在一些实施方案中，方法一般减少患者的e'/a'比值。在一些实施方案中，方法改善患者的心脏中的减速时间(DT)。在一些实施方案中，方法一般增加患者的心脏中的减速时间(DT)。在一些实施方案中，方法一般将患者的DT减少到低于160ms。在一些实施方案中，方法增加患者的心脏中的血液充盈速率。在一些实施方案中，方法减少关于患者的心脏的心房在收缩期间射出的血容量的量。在一些实施方案中，方法增加左心室舒张。在一些实施方案中，方法减少左心房压。在一些实施方案中，方法改善心房扩大。在一些实施方案中，方法增加LV充盈压。在一些实施方案中，方法一般减少患者的TR速度。在一些实施方案中，方法一般将患者的TR速度减少到低于2.8m/秒。在一些实施方案中，方法减少患者的左心房容积指数(LAVI)测量。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法减少患者的舒张早期跨二尖瓣血流速度/二尖瓣环组织舒张早期速度的比值(E/e')(例如，至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％)。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少5％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少10％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少15％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少20％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少25％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少30％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少35％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少40％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少45％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少50％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少55％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少60％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少65％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少70％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少75％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少80％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少85％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少90％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少95％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了100％。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法减少患者的舒张早期跨二尖瓣血流速度/二尖瓣环组织舒张早期速度的比值(E/e')(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、35、40、45或50)。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少1。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少2。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少3。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少4。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少5。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少6。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少7。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少8。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少9。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少10。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少11。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少12。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少13。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少14。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少15。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少16。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少17。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少18。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少19。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少20。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少25。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少30。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少35。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少40。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少45。在一些实施方案中，方法涉及将患者的E/e’比值减少了至少50。
在一些实施方案中，患者的舒张功能障碍等级是正常。在一些实施方案中，正常等级的舒张功能障碍包含1至2的E/A、<8的E/e'、正常左心房容积指数(LAVI)和<160ms的减速时间(DT)，其中正常参考与患者相似年龄和性别的健康人。在一些实施方案中，患者的舒张功能障碍阶段是1级。在一些实施方案中，1级舒张功能障碍包含由于舒张受损的E/A<1、<8的E/e'、正常或增加的LAVI、以及相对于相似年龄和性别的健康人增加的减速时间。在一些实施方案中，患者的舒张功能障碍阶段是2级。在一些实施方案中，2级舒张功能障碍包含1至2的E/A、8至15的E/e'、增加的LAVI、以及相对于相似年龄和性别的健康人减少的减速时间。在一些实施方案中，增加的E/e'和/或增加的LA大小确证了从1级到2级的诊断。在一些实施方案中，患者的舒张功能障碍阶段是3级。在一些实施方案中，3级舒张功能障碍包含E/A>2、大于15的E/e'、增加的LAVI、以及相对于相似年龄和性别的健康人，由于严重降低的LV顺应性和高LV充盈压而非常短的E减速时间(<140ms)。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法改善患者的舒张功能障碍等级。在一些实施方案中，方法涉及将患者的舒张功能障碍等级从3级改善到2级。在一些实施方案中，方法涉及将患者的舒张功能障碍等级从3级改善到1级。在一些实施方案中，方法涉及将患者的舒张功能障碍等级从3级改善到正常。在一些实施方案中，方法涉及将患者的舒张功能障碍等级从2级改善到1级。在一些实施方案中，方法涉及将患者的舒张功能障碍等级从2级改善到正常。在一些实施方案中，方法涉及将患者的舒张功能障碍等级从1级改善到正常。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法增加患者的LV舒张功能(例如，至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％)。在一些实施方案中，方法涉及将患者的LV舒张功能增加了至少5％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的LV舒张功能增加了至少10％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的LV舒张功能增加了至少15％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的LV舒张功能增加了至少20％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的LV舒张功能增加了至少25％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的LV舒张功能增加了至少30％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的LV舒张功能增加了至少35％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的LV舒张功能增加了至少40％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的LV舒张功能增加了至少45％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的LV舒张功能增加了至少50％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的LV舒张功能增加了至少55％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的LV舒张功能增加了至少60％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的LV舒张功能增加了至少65％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的LV舒张功能增加了至少70％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的LV舒张功能增加了至少75％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的LV舒张功能增加了至少80％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的LV舒张功能增加了至少85％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的LV舒张功能增加了至少90％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的LV舒张功能增加了至少95％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的LV舒张功能增加了100％。
收缩功能
在与代谢并发症(例如，肥胖、糖尿病)相关的心力衰竭患者中，心肌的整体静息收缩功能可以随着疾病的进展在一段时间内改变。一般是最常用的LV收缩性能测量的LV射血分数通常在糖尿病性心肌病的开始和中期阶段保留(即，HFpEF)。随着时间过去，由于在疾病的晚期阶段衰弱的心脏肌肉，心脏可能无法有效地收缩，并且因此更少的富氧血液从心脏泵出到身体。当这种情况发生时，射血分数降低且LV腔室扩大，并且患者现在呈现通常与射血分数降低(HFrEF)相关的收缩功能障碍。有时，与代谢并发症(例如，肥胖、糖尿病)相关的心力衰竭患者还可以在疾病的早期阶段呈现收缩功能障碍。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中测量患者的收缩功能。在一些实施方案中，患者具有正常的收缩功能。在一些实施方案中，正常的收缩功能与射血分数保留型心力衰竭(HFpEF)相关。在一些实施方案中，患者具有正常的收缩功能，其在疾病的晚期阶段进展为收缩功能障碍。在一些实施方案中，患者患有收缩功能障碍。在一些实施方案中，收缩功能障碍与射血分数降低型心力衰竭(HFrEF)相关。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，肥胖、糖尿病)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法改善收缩功能。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述患者具有至少50％(例如，50，55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％)的射血分数。在一些实施方案中，方法涉及具有至少50％的射血分数的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少55％的射血分数的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少60％的射血分数的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少65％的射血分数的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少70％的射血分数的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少75％的射血分数的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少80％的射血分数的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少85％的射血分数的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少90％的射血分数的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少950％的射血分数的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有100％的射血分数的患者。在一些实施方案中，射血分数是右心室射血分数。在一些实施方案中，射血分数是左心室射血分数。在一些实施方案中，使用超声心动图测量射血分数。在一些实施方案中，患者具有保留的左心室射血分数。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述患者具有小于45％(例如，10、15、20、25、30、35、40或45％)的射血分数。在一些实施方案中，方法涉及具有小于10％的射血分数的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有小于15％的射血分数的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有小于20％的射血分数的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有小于25％的射血分数的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有小于30％的射血分数的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有小于35％的射血分数的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有小于40％的射血分数的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有小于45％的射血分数的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有小于50％的射血分数的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有小于55％的射血分数的患者。在一些实施方案中，射血分数是右心室射血分数。在一些实施方案中，射血分数是左心室射血分数。在一些实施方案中，使用超声心动图测量射血分数。在一些实施方案中，患者具有保留的左心室射血分数。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法改善收缩功能。
在一些实施方案中，本公开涉及将心力衰竭患者中的射血分数朝向更正常水平(例如，与相似年龄和性别的健康人相比正常)增加的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法将患者的射血分数增加了至少1％(例如，1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％)。在一些实施方案中，方法涉及将患者的射血分数增加了至少1％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的射血分数增加了至少5％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的射血分数增加了至少10％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的射血分数增加了至少15％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的射血分数增加了至少20％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的射血分数增加了至少25％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的射血分数增加了至少30％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的射血分数增加了至少35％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的射血分数增加了至少40％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的射血分数增加了至少45％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的射血分数增加了至少50％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的射血分数增加了至少55％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的射血分数增加了至少60％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的射血分数增加了至少65％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的射血分数增加了至少70％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的射血分数增加了至少75％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的射血分数增加了至少80％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的射血分数增加了至少85％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的射血分数增加了至少90％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的射血分数增加了至少95％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的射血分数增加了100％。
心输出量
一般而言，静息状态下的正常心输出量为约2.5-4.2L/分钟/m2，并且心输出量可以下降几乎40％，而不偏离正常限度。小于约2.5L/分钟/m2的低心脏指数通常指示心血管性能的扰乱。在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法增加患者的心输出量(例如，至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％)。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心输出量增加了至少5％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心输出量增加了至少10％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心输出量增加了至少15％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心输出量增加了至少20％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心输出量增加了至少25％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心输出量增加了至少30％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心输出量增加了至少35％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心输出量增加了至少40％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心输出量增加了至少45％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心输出量增加了至少50％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心输出量增加了至少55％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心输出量增加了至少60％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心输出量增加了至少65％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心输出量增加了至少70％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心输出量增加了至少75％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心输出量增加了至少80％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心输出量增加了至少85％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心输出量增加了至少90％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心输出量增加了至少95％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心输出量增加了100％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心输出量增加到至少4.2L/分钟/m2。在一些实施方案中，心输出量在休息状态下进行测量。在一些实施方案中，心输出量使用右心导管进行测量。
电功能
组织重塑影响房室结、希氏束和束支的功能化。所得到的心房和心室的去极化和复极化变化通过心电图(ECG)测量中的变化来反映。超声心动图测量的变化包括P波持续时间、P-R间期和Q-T间期、以及T波电压的增加和QRS轴的左移。代表房室传导的P-R间期一般从20-35岁时的159ms增加到60岁以后的172ms。QRS轴向左移动，很可能是由于LV壁厚度的增加，其中20％的健康受试者到100岁时具有左轴偏差。有趣的是，尽管LV厚度增加，但到40岁时，存在显而易见的R波和S波振幅随着年龄的增长的下降。另外，心房和心室异位搏动两者的患病率增加。
表11.静息ECG测量中的变化
测量 对死亡率的作用
R-R间期 N/A
P波持续时间 无
P-R间期 无
QRS持续时间 N/A
QRS轴 无
Q-T间期 很可能增加
T波电压 无
(Strait和Lakatta，Heart Fail Clin，2012，8:143-164).
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中使用心电图评估患者的心力衰竭。在一些实施方案中，患者具有起搏细胞数目的降低。在一些实施方案中，患者具有心电图上的P波持续时间增加。在一些实施方案中，患者具有心电图上的P-R间期增加。在一些实施方案中，患者具有心电图上的Q-T间期增加。在一些实施方案中，患者具有心电图上的T波电压减少。在一些实施方案中，患者具有心电图上的QRS轴左移。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法改善心电图测量。在一些实施方案中，方法增加患者中存在的起搏细胞数目。在一些实施方案中，方法减少心电图上的P波持续时间。在一些实施方案中，方法减少心电图上的P-R间期。在一些实施方案中，方法减少心电图上的Q-T间期。在一些实施方案中，方法增加心电图上的T波电压。在一些实施方案中，方法将心电图上的QRS轴移动到正常位置。
利钠肽
利钠肽(NP)包括BNP和NT-proBNP的血浆浓度可以用作初始诊断测试，尤其是在超声心动图无法立即获得时的非急性背景下。NP升高帮助建立初步工作诊断，鉴定需要进一步心脏检查的那些患者。其值低于用于排除重要心功能障碍的截断点的患者通常并不需要超声心动图。在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述患者具有升高水平的一种或多种利钠肽。在一些实施方案中，方法涉及治疗患有心力衰竭的患者，其中所述患者具有升高水平的BNP。在一些实施方案中，方法涉及治疗患有心力衰竭的患者，其中所述患者具有升高水平的NT-proBNP。在一些实施方案中，与相似年龄和性别的健康人相比，患者NP(例如，BNP和/或NT-proBNP)是升高的。
BNP和NT-proBNP两者均为由于心内压增加的心房和心室扩张的标记物。纽约心脏协会(NYHA)开发了基于症状的严重程度用于充血性心力衰竭(CHF)的4阶段功能分级系统。研究已证实了，基于NYHA分级，测量的循环BNP和NT-proBNP浓度随着CHF的严重程度增加。
具有正常血浆NP浓度的患者不太可能患有HF。在非急性背景下关于B型利钠肽(BNP)的正常上限为35pg/mL，并且关于N末端BNP前体(NT-proBNP)，正常上限为125pg/mL；在急性背景下，应该使用更高的值[例如，BNP，100pg/mL；NT-proBNP，300pg/mL；以及中段A型利钠肽原(MR-proANP)，120pmol/L]。诊断值类似地适用于HFrEF和HFpEF。平均而言，值对于HFpEF通常低于HFrEF。
存在NP升高的众多心血管和非心血管原因，这可能削弱其在HF中的诊断效用。在其中，AF、年龄和肾衰竭是阻碍NP测量解释的最重要因素。另一方面，NP水平在肥胖患者中可能是不相称地低的。
BNP
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述患者具有升高水平的BNP。在一些实施方案中，方法涉及具有至少35pg/mL的BNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少40pg/mL的BNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少50pg/mL的BNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少60pg/mL的BNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少70pg/mL的BNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少80pg/mL的BNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少90pg/mL的BNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少100pg/mL的BNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少150pg/mL的BNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少200pg/mL的BNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少300pg/mL的BNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少400pg/mL的BNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少500pg/mL的BNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少1000pg/mL的BNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少5000pg/mL的BNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少10,000pg/mL的BNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少15,000pg/mL的BNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少20,000pg/mL的BNP水平的患者。
在一些实施方案中，本公开涉及将心力衰竭患者中的一种或多种利钠肽朝向更正常水平(例如，与相似年龄和性别的健康人相比正常)调整的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少5pg/mL。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少10pg/mL。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少50pg/mL。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少100pg/mL。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少200pg/mL。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少500pg/mL。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少1000pg/mL。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少5000pg/mL。
在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少5％(例如，5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％)。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少5％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少10％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少15％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少20％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少25％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少30％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少35％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少40％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少45％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少50％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少55％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少60％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少65％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少70％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少75％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少80％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少85％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少90％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了至少95％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的BNP降低了100％。
NT-proBNP
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述患者具有至少100pg/mL(例如，100、125、150、200、300、400、500、1000、3000、5000、10,000、15,000、20,000、25,000或30,000pg/mL)的NT-proBNP水平。在一些实施方案中，方法涉及具有至少100pg/mL的NT-proBNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少125pg/mL的NT-proBNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少150pg/mL的NT-proBNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少200pg/mL的NT-proBNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少300pg/mL的NT-proBNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少400pg/mL的NT-proBNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少500pg/mL的NT-proBNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少1000pg/mL的NT-proBNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少5000pg/mL的NT-proBNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少10,000pg/mL的NT-proBNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少15,000pg/mL的NT-proBNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少20,000pg/mL的NT-proBNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少25,000pg/mL的NT-proBNP水平的患者。在一些实施方案中，方法涉及具有至少30,000pg/mL的NT-proBNP水平的患者。
在一些实施方案中，本公开涉及将心力衰竭患者中的一种或多种利钠肽朝向更正常水平(例如，与相似年龄和性别的健康人相比正常)调整的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少10pg/mL。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少25pg/mL。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少50pg/mL。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少100pg/mL。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少200pg/mL。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少500pg/mL。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少1000pg/mL。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少5000pg/mL。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少10,000pg/mL。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少15,000pg/mL。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少20,000pg/mL。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少25,000pg/mL。
在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少5％(例如，5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％)。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少5％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少10％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少15％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少20％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少25％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少30％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少35％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少40％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少45％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少50％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少55％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少60％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少65％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少70％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少75％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少80％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少85％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少90％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了至少95％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的NT-proBNP降低了100％。
肌钙蛋白水平
肌钙蛋白或肌钙蛋白复合物是三种调控蛋白(肌钙蛋白C、肌钙蛋白I和肌钙蛋白T)的复合物，其对于骨骼肌和心肌(但不是平滑肌)中的肌肉收缩是不可或缺的。血液肌钙蛋白水平可以用作中风的诊断标记物，尽管该测量的灵敏度较低。心脏特异性肌钙蛋白I和T的测量广泛用作心肌梗塞和急性冠脉综合征的管理中的诊断和预后指标。
肌钙蛋白的某些亚型(心脏I和T)是心脏肌肉(心肌)损伤的灵敏和特异性的指标。它们在血液中进行测量，以区分具有胸痛或急性冠脉综合征的患者中的不稳定型心绞痛和心肌梗塞(心脏病发作)。最近患有心肌梗塞的人将具有心脏肌肉受损的区域，以及血液中升高的心肌肌钙蛋白水平。这也可以在患有冠状血管痉挛的人中发生，所述冠状血管痉挛是涉及心脏血管的严重收缩的一类心肌梗塞。在心肌梗塞后，肌钙蛋白可能保持较高长达2周。心肌肌钙蛋白是心脏肌肉损伤的标记物。关于指示心肌梗塞的肌钙蛋白升高的诊断标准当前通过WHO设定为2μg或更高的阈值。其它心脏生物标记物的临界水平也是有关的，例如肌酸激酶。直接或间接导致心脏肌肉损伤和死亡的其它状况也可以增加肌钙蛋白水平，例如肾衰竭。在具有正常冠状动脉的个体中的严重心动过速(例如由于室上性心动过速)也可以导致肌钙蛋白增加，例如，推测是由于需氧量增加和心脏肌肉的供应不足。
肌钙蛋白在心力衰竭患者中是增加的，在其中它们也预测死亡率和室性节律异常。它们可以在炎症性状况中上升，所述炎症性状况例如心肌炎和具有心脏肌肉牵涉的心包炎(其随后称为心肌心包炎)。收缩和调控蛋白表达的异常负责导致心脏收缩中的机械缺陷。连同减少的Ca2+敏感性、心肌肌球蛋白重链从V1同种型转变为V3同种型、肌钙蛋白的磷酸化也促成心肌收缩力下降，因为肌球蛋白轻链2和肌钙蛋白I涉及调控与代谢并发症(例如，肥胖、糖尿病)相关的心力衰竭患者中的心肌细胞收缩。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述患者具有升高水平的肌钙蛋白。在一些实施方案中，本公开涉及将心力衰竭患者中的一种或多种参数朝向更正常水平(例如，与相似年龄和性别的健康人相比正常)调整的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)。在一些实施方案中，方法涉及将患者的肌钙蛋白水平减少了至少1％(例如，1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％)。在一些实施方案中，方法涉及将患者的肌钙蛋白水平减少了至少1％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的肌钙蛋白水平减少了至少5％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的肌钙蛋白水平减少了至少10％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的肌钙蛋白水平减少了至少15％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的肌钙蛋白水平减少了至少20％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的肌钙蛋白水平减少了至少25％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的肌钙蛋白水平减少了至少30％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的肌钙蛋白水平减少了至少35％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的肌钙蛋白水平减少了至少40％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的肌钙蛋白水平减少了至少45％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的肌钙蛋白水平减少了至少50％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的肌钙蛋白水平减少了至少55％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的肌钙蛋白水平减少了至少60％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的肌钙蛋白水平减少了至少65％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的肌钙蛋白水平减少了至少70％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的肌钙蛋白水平减少了至少75％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的肌钙蛋白水平减少了至少80％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的肌钙蛋白水平减少了至少85％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的肌钙蛋白水平减少了至少90％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的肌钙蛋白水平减少了至少95％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的肌钙蛋白水平减少了100％。
运动能力(6MWD和BDI)
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)。可以使用运动能力的任何合适的测量。例如，测量患者在6分钟内可以步行多远，即6分钟步行距离(6MWD)的6分钟步行测试(6MWT)中的运动能力，频繁用于评价心力衰竭的严重程度和疾病进展。Borg呼吸困难指数(BDI)是用于评价感知到的呼吸困难(呼吸不适)的数值量表。它测量例如在6MWT完成后的呼吸困难程度，其中BDI 0指示没有呼吸困难，并且10指示最大呼吸困难。在一些实施方案中，方法涉及使患有心力衰竭(例如，与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭)的患者的6MWD增加了至少10米。在一些实施方案中，方法涉及使患有心力衰竭(例如，与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭)的患者的6MWD增加了至少30米。在一些实施方案中，方法涉及使患有心力衰竭(例如，与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭)的患者的6MWD增加了至少40米。在一些实施方案中，方法涉及使患有心力衰竭(例如，与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭)的患者的6MWD增加了至少60米。在一些实施方案中，方法涉及使患有心力衰竭(例如，与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭)的患者的6MWD增加了至少70米。在一些实施方案中，方法涉及使患有心力衰竭(例如，与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭)的患者的6MWD增加了至少80米。在一些实施方案中，方法涉及使患有心力衰竭(例如，与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭)的患者的6MWD增加了至少90米。在一些实施方案中，方法涉及使患有心力衰竭(例如，与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭)的患者的6MWD增加了至少100米。在一些实施方案中，在患者已接受利用本文公开的治疗4周后测试6MWD。在一些实施方案中，在患者已接受利用本文公开的治疗8周后测试6MWD。在一些实施方案中，在患者已接受利用本文公开的治疗12周后测试6MWD。在一些实施方案中，在患者已接受利用本文公开的治疗16周后测试6MWD。在一些实施方案中，在患者已接受利用本文公开的治疗20周后测试6MWD。在一些实施方案中，在患者已接受利用本文公开的治疗22周后测试6MWD。在一些实施方案中，在患者已接受利用本文公开的治疗24周后测试6MWD。在一些实施方案中，在患者已接受利用本文公开的治疗26周后测试6MWD。在一些实施方案中，在患者已接受利用本文公开的治疗28周后测试6MWD。
在一些实施方案中，方法涉及将患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者的BDI降低了至少0.5个指数点。在一些实施方案中，方法涉及将患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者的BDI降低了至少1个指数点。在一些实施方案中，方法涉及将患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者的BDI降低了至少1.5个指数点。在一些实施方案中，方法涉及将患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者的BDI降低了至少2个指数点。在一些实施方案中，方法涉及将患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者的BDI降低了至少2.5个指数点。在一些实施方案中，方法涉及将患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者的BDI降低了至少3个指数点。在一些实施方案中，方法涉及将患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者的BDI降低了至少3.5个指数点。在一些实施方案中，方法涉及将患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者的BDI降低了至少4个指数点。在一些实施方案中，方法涉及将患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者的BDI降低了至少4.5个指数点。在一些实施方案中，方法涉及将患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者的BDI降低了至少5个指数点。在一些实施方案中，方法涉及将患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者的BDI降低了至少5.5个指数点。在一些实施方案中，方法涉及将患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者的BDI降低了至少6个指数点。在一些实施方案中，方法涉及将患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者的BDI降低了至少6.5个指数点。在一些实施方案中，方法涉及将患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者的BDI降低了至少7个指数点。在一些实施方案中，方法涉及将患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者的BDI降低了至少7.5个指数点。在一些实施方案中，方法涉及将患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者的BDI降低了至少8个指数点。在一些实施方案中，方法涉及将患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者的BDI降低了至少8.5个指数点。在一些实施方案中，方法涉及将患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者的BDI降低了至少9个指数点。在一些实施方案中，方法涉及将患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者的BDI降低了至少9.5个指数点。在一些实施方案中，方法涉及将患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者的BDI降低了至少3个指数点。在一些实施方案中，方法涉及将患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的患者的BDI降低了10个指数点。
负荷舒张测试
在劳力性呼吸困难患者中，运动血流动力学应答提供了比静息状态下的LV舒张功能评价更多的生理学和诊断信息。因此，评价对运动的血流动力学应答有助于确认呼吸困难是左心室舒张功能障碍的后果。存在两种类型的舒张期负荷测试—侵入性和超声心动图。当患者在固定在导管台处的自行车上锻炼时，执行侵入性舒张期负荷测试。运动状态下的肺毛细血管楔压(LV充盈压的间接参数)变化通过经由右颈内静脉的右心导管插入术或通过将猪尾导管从桡动脉进入部位引入LV内进行评估。测量LV收缩压、最小LV压、LV舒张末期压和平均LV舒张压。非侵入性测量包括脉冲和组织多普勒参数的组合E/e'，其通常进行测量以确定LV充盈压。美国超声心动图学会尤其已提议，舒张期负荷测试在这些参数的存在下应该被视为异常的：(i)静息状态下间隔e'速度<7cm/s或侧壁e'速度<10cm/s；(ii)运动状态下平均E/e'>14或间隔E/e’比值>15；(iii)运动状态下三尖瓣反流(TR)峰值速度>2.8m/s，以及(iv)>34mL/m2的左心房容积指数(LAVI)。运动状态下E/e'和TR>2.8m/s的组合已显示对于检测HFpEF是灵敏的。还已显示了，E/e'的升高与耗氧量降低有关，而E/e'增加和TR速度的组合与运动状态下升高的NT-proBNP值相关。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中使用负荷舒张测试来评价患者的舒张功能障碍。在一些实施方案中，在固定至导管台的自行车上执行舒张期负荷测试。在一些实施方案中，使用超声心动图执行舒张期负荷测试。在一些实施方案中，具有异常舒张期负荷测试的患者具有包含以下的参数：静息状态下间隔e'速度<7cm/s或侧壁e'速度<10cm/s、运动状态下平均E/e'>14或间隔E/e’比值>15、运动状态下三尖瓣反流(TR)峰值速度>2.8m/s以及>34mL/m2的左心房容积指数(LAVI)。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法改善患者的负荷舒张测试结果。在一些实施方案中，方法改善患者的舒张功能，如通过舒张期负荷测试所报道的。在一些实施方案中，方法将静息状态下间隔e'速度增加到>7cm/s或将侧壁e'速度增加到>10cm/s，将运动状态下平均E/e'减少到低于14或将间隔E/e’比值减少到低于15，将运动状态下三尖瓣反流(TR)峰值速度减少到<2.8m/s，并且将左心房容积指数(LAVI)减少到<34mL/m2。
H2FPEF评分
在患有疑似HFpEF的患者，包括患有与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的那些患者中，H2FPEF评分可以用于评估HFpEF相对于呼吸困难的非心源性原因的概率。呼吸困难是老年心力衰竭患者中的心力衰竭的常见体征。在Mayo Clinic的一个小组开发了并在临床上验证了H2FPEF评分，其是分配给下述临床变量的分总和：重(例如，>30kg/m2的体重指数＝两分)；高血压(例如，患者正在服用两种或更多种抗高血压药＝一分)；心房颤动(Arterial Fibrillation)(AF)(例如，阵发性或持续性＝三分)；肺动脉高压(PH)(例如，通过超声心动图>35mmHg的肺动脉收缩压＝一分)；年长(例如，患者的年龄>60岁＝一分)；以及充盈压(例如，超声心动图测量>9的E/e'＝一分)。HFpEF是患者中的症状原因的概率随着H2FPEF总评分(范围从最低0到最高9)的增加而增加。0或1的低H2FPEF评分与患者中的HFpEF的低(例如，<25％)概率相关。低评分提示了症状最有可能是由于非心源性原因。然而，如果症状的原因在评估非心源性原因后仍不确定，则建议心脏病学咨询和右心导管插入术，以确定是否存在HFpEF。2至5的中间H2FPEF评分与HFpEF的中间(例如40至80％)概率相关。在中间评分的患者中，完成评价以确定利钠肽水平是否很高(例如，脑利钠肽(BNP)>100pg/mL或N末端BNP前体(NT-proBNP)>300pg/mL)，以及是否存在缺少的明显肺病。如果符合这两个标准，则临床发现是HFpEF的诊断。如果并未满足标准之一或两者，则通常执行心脏病学咨询和右心导管插入术，以收集更多的信息。在右心导管插入术中，静息状态下≥15mmHg或运动状态下≥25mmHg的肺毛细血管楔压(PCWP)是HFpEF的诊断。6或更高的H2FPEF评分与大于90％的HFpEF概率相关，并且因此被视为HFpEF的诊断。H2FPEF评分的两个组分衍生自多普勒超声心动图：估计肺动脉收缩压(PASP)和E/e’比值。通过超声心动图估计的PASP的升高在HFpEF患者中是非常常见的，并且在患有呼吸困难的较年老患者中PASP升高的鉴定应该触发关于HFpEF诊断的考虑。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中使用H2FPEF评分来评估患者的HFpEF。在一些实施方案中，患者具有H2FPEF评分0。在一些实施方案中，患者具有H2FPEF评分1。在一些实施方案中，患者具有H2FPEF评分2。在一些实施方案中，患者具有H2FPEF评分3。在一些实施方案中，患者具有H2FPEF评分4。在一些实施方案中，患者具有H2FPEF评分5。在一些实施方案中，患者具有H2FPEF评分6。在一些实施方案中，患者具有H2FPEF评分7。在一些实施方案中，患者具有H2FPEF评分8。在一些实施方案中，患者具有H2FPEF评分9。在一些实施方案中，患者具有约0至约1的H2FPEF评分。在一些实施方案中，患者具有约2至约5的H2FPEF评分。在一些实施方案中，患者具有约6至约9的H2FPEF评分。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法减少患者的H2FPEF评分(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9分)。在一些实施方案中，方法涉及将患者的H2FPEF评分减少了至少1分。在一些实施方案中，方法涉及将患者的H2FPEF评分减少了至少2分。在一些实施方案中，方法涉及将患者的H2FPEF评分减少了至少3分。在一些实施方案中，方法涉及将患者的H2FPEF评分减少了至少4分。在一些实施方案中，方法涉及将患者的H2FPEF评分减少了至少5分。在一些实施方案中，方法涉及将患者的H2FPEF评分减少了至少6分。在一些实施方案中，方法涉及将患者的H2FPEF评分减少了至少7分。在一些实施方案中，方法涉及将患者的H2FPEF评分减少了至少8分。在一些实施方案中，方法涉及将患者的H2FPEF评分减少了至少9分。
右心导管插入术
右心导管插入术(有时称为肺导管插入术)对于HFpEF的诊断和评估并非普遍需要的。然而，在具有中间H2FPEF评分的所选患者(以及具有不确定的症状原因，具有低H2FPEF评分的所选患者)中，右心导管插入术可用于评价静息状态下和运动状态下的心脏充盈压，以帮助做出或排除HFpEF的诊断。右心导管插入术是用于查看心脏如何良好地泵血(例如它的每分钟泵血量)，并且测量心脏和肺中的主要血管的血压的测试。右心导管插入术不同于左心导管插入术(冠状动脉造影术)，所述左心导管插入术用于检查动脉中的阻塞。在右心导管插入术中，肺动脉(PA)导管被引导至心脏的右侧并进入肺动脉内，所述肺动脉是将血液运送到肺的主要动脉。可以观察通过心脏的血流量，并且测量在心脏和肺内部的压力。当导管向肺动脉前进时，沿途测量在心脏的右侧上的腔室内部，包括在右心房和右心室中的压力。还可以测量在心脏的左侧上的压力的间接测量。还确定了心输出量(例如心脏每分钟泵出的血液量)。静息状态下≥15mmHg或运动状态下≥25mmHg的肺毛细血管楔压(PCWP)是HFpEF的诊断。在一些实施方案中，使用右心导管插入术评价患者的心力衰竭。在一些实施方案中，使用右心导管插入术诊断患者患有HFpEF。在一些实施方案中，用右心导管插入术测量的具有静息状态下≥15mmHg的PCWP的受试者患有HFpEF。在一些实施方案中，用右心导管插入术测量的具有运动状态下≥25mmHg的PCWP的受试者患有HFpEF。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法改善肺毛细血管楔压(PCWP)。在一些实施方案中，方法将静息状态下PCWP减少到至少低于15mmHg。在一些实施方案中，方法将运动状态下PCWP减少到至少低于25mm Hg。
欧洲心脏病学会(ESC)的心力衰竭协会(HFA)的HFpEF诊断标准
欧洲心力衰竭协会最近发表了共识，并且提议了用于HFpEF的诊断标准(表12)。该共识旨在提供从临床评价到更特异性的测试的逐步诊断方法。标准分成3组：功能、形态学和生物标记物。主要功能标准包括在用于评价LV舒张功能障碍的指南中提议的超声心动图参数(间隔e'降低、E/e'增加和TR增加)(还参见表10)。次要功能标准包括E/e'的中间值和LV总体纵向应变降低(<-16％)。主要形态学标准包括扩张左心房容积指数(LAVI在窦性心律时≥34ml/m2以及在心房颤动时≥40ml/m2)，或者定义为LV质量指数(LVMI)的左心室肥厚在男性中≥149g/m2或在女性中≥122g/m2，连同增加的相对壁厚度≥0.42。有趣的是，次要形态学标准是LV容积指数的高正常值(在窦性心律时29–34ml/m2和在心房颤动时≥34–40ml/m2)，通过当前超声心动图指南定义的LV质量指数增加(在男性中≥115g/m2或在女性中≥95g/m2)，或相对壁厚度≥0.42或LV壁厚度≥12mm。主要和次要生物标记物标准指对于窦性心律和心房颤动患者，具有各种截断值的不同水平的BNP和pro-BNP(值在心房颤动组中是3倍)。关于每组的仅一个标准可以包括在评分中。≥5分的评分指示HFpEF。2-4分的评分指示应该进行舒张期负荷测试或侵入性血流动力学测量。1分或更低的评分指示HFpEF的诊断不太可能。(Pieske B.等人，EurHeart J，2019，40:3297-3317)和(Tadic M.等人，HeartFailure Reviews，2020，10.1007/s10741-020-09966-4)。
表12.用于诊断HFpEF的欧洲心力衰竭协会标准概括
缩写：BNP脑利钠肽、HFpEF射血分数保留型心力衰竭、E和e'通过脉冲和组织多普勒测量的舒张早期二尖瓣血流速度、GLS左心室总体纵向应变、LAVI左心房容积指数、LVMI左心室质量指数、RWT相对壁厚度。(Pieske B.等人，EurHeart J，2019，40:3297-3317)和(Tadic M.等人，Heart Failure Reviews，2020，10.1007/s10741-020-09966-4)。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中使用欧洲心力衰竭协会(EHFA)标准评估患者的HFpEF。
在一些实施方案中，患者具有欧洲心力衰竭协会(EHFA)评分0。在一些实施方案中，患者具有EHFA评分1。在一些实施方案中，患者具有EHFA评分2。在一些实施方案中，患者具有EHFA评分3。在一些实施方案中，患者具有EHFA评分4。在一些实施方案中，患者具有EHFA评分5。在一些实施方案中，患者具有EHFA评分6。在一些实施方案中，患者具有EHFA评分7。在一些实施方案中，患者具有EHFA评分8。在一些实施方案中，具有≥5分的EHFA评分的患者诊断有HFpEF。在一些实施方案中，具有2至4分的EHFA评分的患者可能患有HFpEF，并且需要舒张期负荷测试或侵入性血液动力学测量来确认。在一些实施方案中，具有1分或更低的EHFA评分的患者不太可能患有HFpEF。
在一些实施方案中，患者具有关于HFpEF的一种或多种主要EHFA标准。在一些实施方案中，患者具有关于HFpEF的一种或多种主要功能性EHFA标准。在一些实施方案中，主要功能标准选自间隔e'速度<7cm/s、静息状态下侧壁e'速度<10cm/s、运动状态下平均E/e'>14或间隔E/e’比值>15和运动状态下TR速度>2.8m/s。在一些实施方案中，患者具有间隔e'速度<7cm/s。在一些实施方案中，患者具有静息状态下侧壁e’速度<10cm/s。在一些实施方案中，患者具有运动状态下平均E/e'>14或间隔E/e’比值>15。在一些实施方案中，患者具有运动状态下TR速度>2.8m/s。在一些实施方案中，患者具有关于HFpEF的一种或多种主要形态学EHFA标准。在一些实施方案中，主要形态学标准选自LAVI>34mL/m2以及LVMI对于男性≥149g/m2且对于女性≥122g/m2以及RWT>0.42。在一些实施方案中，患者具有LAVI>34mL/m2。在一些实施方案中，男性患者具有LVMI≥149g/m2。在一些实施方案中，女性患者具有LAVI≥122g/m2。在一些实施方案中，患者具有RWT>0.42。在一些实施方案中，患者具有关于HFpEF的一种或多种主要生物标记物EHFA标准。在一些实施方案中，主要生物标记物标准是窦性心律，具有NT-proBNP>220pg/mL和/或BNP>80pg/mL。在一些实施方案中，患者具有NT-proBNP>220pg/mL和/或BNP>80pg/mL。在一些实施方案中，主要生物标记物标准是心房颤动，具有NT-proBNP>660pg/mL和/或BNP>240pg/mL。在一些实施方案中，患者具有NT-proBNP>660pg/mL或BNP>240pg/mL。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法改善一种或多种主要功能性EHFA标准。在一些实施方案中，方法改善选自以下的一种或多种主要功能标准：将间隔e'速度增加到>7cm/s、将静息状态下侧壁e'速度增加到>10cm/s、将运动状态下E/e'减少到<14或将间隔E/e’比值减少到<15，并且将运动状态下TR速度减少到<2.8m/s。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法改善一种或多种主要形态学EHFA标准。在一些实施方案中，方法改善选自以下的一种或多种主要形态学标准：将LAVI减少到<34mL/m2，并且将LVMI对于男性减少到<149g/m2且对于女性减少到<122g/m2，并且将RWT减少到<0.42。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法改善一种或多种主要生物标记物EHFA标准。在一些实施方案中，方法改善窦性心律，其包括将NT-proBNP减少到<220pg/mL和/或将BNP减少到<80pg/mL。在一些实施方案中，方法改善心房颤动，其包括将NT-proBNP减少到<660pg/mL和/或将BNP减少到<240pg/mL。
在一些实施方案中，患者具有关于HFpEF的一种或多种次要EHFA标准。在一些实施方案中，患者具有关于HFpEF的一种或多种次要功能性EHFA标准。在一些实施方案中，次要功能标准选自平均E/e'9-14和GLS<16％。在一些实施方案中，患者具有平均E/e'9-14。在一些实施方案中，患者具有GLS<16％。在一些实施方案中，患者具有关于HFpEF的一种或多种次要形态学EHFA标准。在一些实施方案中，次要形态学标准选自LAVI 29-34mL/m2、对于男性LVMI>115g/m2、对于女性95g/m2的LVMI、RWT>0.42、以及LV壁厚度≥12mm。在一些实施方案中，患者具有LAVI 29-34mL/m2。在一些实施方案中，男性患者具有LVMI>115g/m2。在一些实施方案中，女性患者具有95g/m2的LVMI。在一些实施方案中，患者具有RWT>0.42。在一些实施方案中，患者具有关于HFpEF的一种或多种次要生物标记物EHFA标准。在一些实施方案中，患者具有LV壁厚度≥12mm。在一些实施方案中，次要生物标记物标准是窦性心律，具有5-NT-proBNP 125-220pg/mL和/或BNP 35-80pg/mL。在一些实施方案中，患者具有5-NT-proBNP 125-220pg/mL和/或BNP 35-80pg/mL。在一些实施方案中，次要生物标记物标准是心房颤动，具有NT-proBNP 365-660pg/mL和/或BNP 105-240pg/mL。在一些实施方案中，患者具有NT-proBNP 365-660pg/mL和/或BNP 105-240pg/mL。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法改善一种或多种次要功能性EHFA标准。在一些实施方案中，方法改善次要功能标准，其包括将E/e'减少到8或更低并且将GLS增加到>16％。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法改善一种或多种次要形态学EHFA标准。在一些实施方案中，方法改善选自以下的一种或多种次要形态学标准：将LAVI减少到<34mL/m2，将LVMI对于男性减少到<115g/m2，将LVMI对于女性减少到低于95g/m2，将RWT减少到<0.42，并且将LV壁厚度减少到<12mm。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法改善一种或多种次要生物标记物EHFA标准。在一些实施方案中，方法改善窦性心律，其包括将5-NT-proBNP减少到<220pg/mL和/或将BNP减少到<80pg/mL。在一些实施方案中，方法改善心房颤动，其包括将NT-proBNP减少到<660pg/mL和/或将BNP减少到<240pg/mL。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法减少患者的EHFA评分(例如，1、2、3、4、5、6、7或8分)。在一些实施方案中，方法涉及将患者的EHFA评分减少了至少1分。在一些实施方案中，方法涉及将患者的EHFA评分减少了至少2分。在一些实施方案中，方法涉及将患者的EHFA评分减少了至少3分。在一些实施方案中，方法涉及将患者的EHFA评分减少了至少4分。在一些实施方案中，方法涉及将患者的EHFA评分减少了至少5分。在一些实施方案中，方法涉及将患者的EHFA评分减少了至少6分。在一些实施方案中，方法涉及将患者的EHFA评分减少了至少7分。在一些实施方案中，方法涉及将患者的EHFA评分减少了至少8分。
住院率
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法降低患者的住院率(例如，至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的住院率降低了至少1％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的住院率降低了至少2％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的住院率降低了至少3％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的住院率降低了至少4％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的住院率降低了至少5％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的住院率降低了至少10％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的住院率降低了至少15％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的住院率降低了至少20％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的住院率降低了至少25％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的住院率降低了至少30％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的住院率降低了至少35％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的住院率降低了至少40％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的住院率降低了至少45％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的住院率降低了至少50％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的住院率降低了至少55％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的住院率降低了至少60％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的住院率降低了至少65％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的住院率降低了至少70％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的住院率降低了至少75％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的住院率降低了至少80％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的住院率降低了至少85％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的住院率降低了至少90％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的住院率降低了至少95％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的住院率降低了100％。
在一些实施方案中，降低患者的住院率包括降低患者留在医院的需要。在一些实施方案中，降低患者的住院率包括降低患者医院就诊的总次数。在一些实施方案中，降低患者的住院率包括增加患者初次住院治疗的时间。在一些实施方案中，降低患者的住院率包括增加患者的生命长度。在一些实施方案中，降低患者的住院率包括增加患者医院就诊之间的时间。在一些实施方案中，降低患者的住院率包括减少患者反复去医院就诊的次数。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法降低患者的住院率。在一些实施方案中，方法降低患者留在医院的需要。在一些实施方案中，方法降低患者医院就诊的总次数。在一些实施方案中，方法增加患者初次住院治疗的时间。在一些实施方案中，方法增加患者的生命长度。在一些实施方案中，方法增加医院就诊之间的时间。在一些实施方案中，方法减少反复去医院就诊的次数。
心力衰竭的恶化率
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法降低患者的心力衰竭的恶化率(例如，至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％)。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心力衰竭的恶化率降低了至少1％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心力衰竭的恶化率降低了至少2％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心力衰竭的恶化率降低了至少3％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心力衰竭的恶化率降低了至少4％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心力衰竭的恶化率降低了至少5％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心力衰竭的恶化率降低了至少10％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心力衰竭的恶化率降低了至少15％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心力衰竭的恶化率降低了至少20％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心力衰竭的恶化率降低了至少25％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心力衰竭的恶化率降低了至少30％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心力衰竭的恶化率降低了至少35％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心力衰竭的恶化率降低了至少40％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心力衰竭的恶化率降低了至少45％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心力衰竭的恶化率降低了至少50％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心力衰竭的恶化率降低了至少55％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心力衰竭的恶化率降低了至少60％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心力衰竭的恶化率降低了至少65％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心力衰竭的恶化率降低了至少70％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心力衰竭的恶化率降低了至少75％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心力衰竭的恶化率降低了至少80％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心力衰竭的恶化率降低了至少85％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心力衰竭的恶化率降低了至少90％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心力衰竭的恶化率降低了至少95％。在一些实施方案中，方法涉及将患者的心力衰竭的恶化率降低了100％。
心脏成像
超声心动图
如本文所用，术语“超声心动图”指二维/三维超声心动图、脉搏波和连续波多普勒、彩色血流多普勒、组织多普勒成像(TDI)造影超声心动图、变形成像(应变和应变率)和经胸超声心动图(TTE或二维超声心动图)。TTE通常是用于评价左心室和右心室两者的心肌收缩和舒张功能的选择方法。在一些实施方案中，使用超声心动图评价患者的心力衰竭。在一些实施方案中，使用二维超声心动图评价患者的心力衰竭。在一些实施方案中，使用三维超声心动图评价患者的心力衰竭。在一些实施方案中，使用脉搏波和连续波多普勒超声心动图评价患者的心力衰竭。在一些实施方案中，使用超声心动图评价患者的心力衰竭。在一些实施方案中，使用彩色血流多普勒超声心动图评价患者的心力衰竭。在一些实施方案中，使用组织多普勒成像(TDI)造影超声心动图评价患者的心力衰竭。在一些实施方案中，使用变形成像(应变和应变率)超声心动图评价患者的心力衰竭。在一些实施方案中，使用经胸超声心动图(TTE)评价患者的心力衰竭。
超声心动图是患有疑似HF的患者中有用且可广泛获得的测试，以建立诊断。它提供了关于LV结构和收缩功能(例如，通过在乳头肌水平下的胸骨旁短轴切面中的M模式测量的)的信息，包括但不限于LV壁厚度(LVWT)、LV质量(LVM)、LV舒张末期直径(LVEDD)、LV收缩末期直径(LVESD)、缩短分数(FS)(使用等式FS＝100％×[(EDD-ESD)/EDD]计算)、LV舒张末期容积(LVEDV)、LV收缩末期容积(LVESV)、射血分数(使用等式EF＝100％×[(EDV-ESV)/EDV]计算)、肥厚指数(计算为LVM/LVESV的比率)和相对壁厚度(计算为LVWT/LVESD的比率)。该信息在建立诊断且确定适当的治疗方面是关键的。在一些实施方案中，使用超声心动图测量患者的LV壁厚度(LVWT)。在一些实施方案中，使用超声心动图测量患者的LV质量(LVM)。在一些实施方案中，使用超声心动图测量患者的LV舒张末期直径(LVEDD)。在一些实施方案中，使用超声心动图测量患者的LV收缩末期直径(LVESD)。在一些实施方案中，使用超声心动图测量患者的缩短分数(FS)。在一些实施方案中，使用超声心动图测量患者的LV舒张末期容积(LVEDV)。在一些实施方案中，使用超声心动图测量患者的LV收缩末期容积(LVESV)。在一些实施方案中，使用超声心动图测量患者的射血分数。在一些实施方案中，使用超声心动图测量患者的肥厚指数。在一些实施方案中，使用超声心动图测量患者的相对壁厚度。存在众多临床呈现因素、超声心动图特征以及可以指示与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的其它特征。在一些实施方案中，对患者执行的超声心动图显示结构性左心异常。在一些实施方案中，结构性左心异常是左心脏瓣膜疾病。在一些实施方案中，结构性左心异常是左心房扩大(例如，>4.2cm)。
在具有左心衰竭症状的患者中，可以执行超声心动图以评估各种参数。例如，在一些实施方案中，使用对患者执行的多普勒的超声心动图可以显示充盈压增加和/或舒张功能障碍的指数(例如，E/e'增加或>2-3型二尖瓣血流异常，参见表9、10、12)。在一些实施方案中，对患者执行的成像(例如超声心动图、CT扫描、胸部X线或心脏MRI)显示Kerley B线。在一些实施方案中，对患者执行的成像(例如超声心动图、CT扫描、胸部X线或心脏MRI)显示胸腔积液。在一些实施方案中，对患者执行的成像(例如超声心动图、CT扫描、胸部X线或心脏MRI)显示肺水肿。在一些实施方案中，对患者执行的成像(例如超声心动图、CT扫描、胸部X线或心脏MRI)显示左心房扩大。同上。
HFpEF/HFmrEF心力衰竭的关键功能改变包括E/e'≥13以及平均e'间隔和侧壁<9cm/s。其它(间接)超声心动图衍生的测量是纵向应变或三尖瓣反流速度(TRV)。在鉴定患有疑似HFpEF的患者时，超声心动图有助于证实LVEF得到保留(例如，≥50百分比)且LV容积是正常的。超声心动图也有助于鉴定除HFpEF外的LVEF≥50百分比的HF原因，包括瓣膜疾病和心包疾病。对于通过超声心动图测量的HFpEF中定义的参数，参见表9、10和11。超声心动图检查还可能包括右心室(RV)结构和功能的评价，包括但不限于RV和右心房(RA)尺寸、以及RV收缩功能和/或肺动脉压的估计。在反映RV收缩功能的参数中，下述测量特别重要：三尖瓣环收缩期位移(TAPSE；异常TAPSE<17mm指示RV收缩功能障碍)和组织多普勒衍生的三尖瓣侧壁环收缩期速度(s')(s'速度<9.5cm/s指示RV收缩功能障碍)。肺动脉收缩压衍生自最大三尖瓣反流射流和三尖瓣收缩梯度的最佳记录，连同基于下腔静脉(IVC)大小及其呼吸相关塌陷的RA压力估计。运动或药理学负荷超声心动图可以用于评价诱导性缺血和/或心肌活力以及瓣膜疾病患者的一些临床情形(例如动态二尖瓣反流、低流量低梯度主动脉瓣狭窄)。还存在以下建议：在具有劳力性呼吸困难、保留型LVEF和静息状态下不确定的舒张参数的患者中，负荷超声心动图可能允许检测与运动暴露有关的舒张功能障碍。
推荐经胸超声心动图(TTE)用于评价患有疑似HF的患者中的心肌结构和功能，以便建立HFrEF、HFmrEF或HFpEF的诊断。此外，推荐TTE来评价LVEF，以便鉴定适合于对于HFrEF推荐的基于证据的药理学和装置(ICD、CRT)治疗的HF患者；用于评价已经建立HFrEF、HFmrEF或HFpEF诊断的患者中的瓣膜疾病、右心室功能和肺动脉压，以便鉴定适合于校正瓣膜疾病的那些患者；和/或用于评价暴露于潜在地可以损害心肌的治疗(例如化学治疗)的患者中的心肌结构和功能。在处于发展HF的风险中的患者中，在TTE方案中应该考虑其它技术(包括收缩组织多普勒速度和变形指数，即应变和应变率)，以便鉴定在临床前阶段的心肌功能障碍。
在HFpEF中，EF是正常的，并且主要的血流动力学紊乱是充盈压升高。当静息状态下压力较高且存在充血时，HFpEF基于病史、体格检查、放射显影、NP水平和超声心动图很容易诊断。然而，许多早期阶段HFpEF患者在明显容量超负荷的不存在下，具有运动不耐受的显著症状。一些患者中的侵入性评价可能揭示以前未怀疑的充盈压的病理性升高，并且最近的研究发现，即使在具有正常检查、超声心动图、NP和正常静息血流动力学的患者中，许多患者仍可能在运动负荷期间发展HFpEF特有的充盈压的病理性升高。在早期阶段HFpEF中，肺动脉压与左心充盈压非常密切地相关，提示了如果肺动脉压可以在运动过程中通过超声心动图准确地估计，则这可能充当具有正常EF和劳力性呼吸困难的患者中有用的非侵入性筛查。在一些实施方案中，在运动过程中使用超声心动图检查患者的心力衰竭。在一些实施方案中，在运动过程中使用超声心动图检查患者的HFpEF。
心脏磁共振(CMR)
CMR被公认为用于测量左心室和右心室两者的容积、质量和EF的黄金标准。它是用于具有非诊断性超声心动图研究(特别是用于右心的成像)的患者的最佳替代心脏成像模式，并且是复杂先天性心脏病患者中的选择方法。心脏磁共振(CMR)测量心脏解剖和功能定量两者，具有与超声心动图良好互补的非侵入性组织表征的独特能力。在从心尖到基底的短轴上覆盖LV的CMR成像用于测量左心室(LV)容积、射血分数(EF)和区域功能。3D数据集不受几何假设的影响，并且因此与二维(2D)超声心动图相比更不容易出错，特别是在重塑的心室中。新型CMR组织表征技术称为CMR弛豫法(T1和T2映射以及细胞外容积分数(ECV))，其允许更详细和定量的组织表征方法，以及提供关于腔内流量的定量信息的4D-Flow。当前的应用似乎对于舒张功能障碍检测特别有用，尽管它们值得与传统多普勒和组织多普勒(例如超声心动图)分析的具体比较，以便确认在临床实践中的适用性。在决定血运重建之前，可以考虑非侵入性负荷成像(CMR、负荷超声心动图、SPECT、PET)用于评价HF和CAD患者(被视为适合于冠状动脉血运重建)中的心肌缺血和活力。在一些实施方案中，使用CMR评价患者的心力衰竭。在一些实施方案中，使用CMR弛豫法(T1和T2映射以及细胞外容积分数(ECV))评价患者的心力衰竭。在一些实施方案中，使用CMR和4D-Flow评价患者的心力衰竭。
CMR可以提供关于LV结构和收缩功能的信息，包括但不限于LV壁厚度(LVWT)、LV质量(LVM)、LV舒张末期直径(LVEDD)、LV收缩末期直径(LVESD)、缩短分数(FS)(使用等式FS＝100％×[(EDD-ESD)/EDD]计算)、LV舒张末期容积(LVEDV)、LV收缩末期容积(LVESV)、射血分数(使用等式EF＝100％×[(EDV-ESV)/EDV]计算)、肥厚指数(计算为LVM/LVESV的比率)和相对壁厚度(计算为LVWT/LVESD的比率)。该信息在建立诊断且确定适当的治疗方面是关键的。在一些实施方案中，使用CMR测量患者的LV壁厚度(LVWT)。在一些实施方案中，使用CMR测量患者的LV质量(LVM)。在一些实施方案中，使用CMR测量患者的LV舒张末期直径(LVEDD)。在一些实施方案中，使用CMR测量患者的LV收缩末期直径(LVESD)。在一些实施方案中，使用CMR测量患者的缩短分数(FS)。在一些实施方案中，使用CMR测量患者的LV舒张末期容积(LVEDV)。在一些实施方案中，使用CMR测量患者的LV收缩末期容积(LVESV)。在一些实施方案中，使用CMR测量患者的射血分数。在一些实施方案中，使用CMR测量患者的肥厚指数。在一些实施方案中，使用CMR测量患者的相对壁厚度。
CMR是使用延迟钆增强(LGE)连同T1映射来评价心肌纤维化的优选成像方法，并且可以用于确定HF病因。例如，CMR与LGE一起允许区分HF的缺血性和非缺血性起源，并且可以显现心肌纤维化/疤痕。另外，CMR允许表征心肌炎、淀粉样变性、结节病、恰加斯病、法布里病、致密化不全心肌病和血色素沉着症的心肌组织。CMR还可以用于评价HF和冠状动脉疾病(CAD)患者(被视为适合于冠状动脉血运重建)中的心肌缺血和活力。在一些实施方案中，使用具有延迟钆增强(LGE)和/或T1映射的CMR评价患者的心力衰竭。在一些实施方案中，使用CMR测量患者的心脏中的纤维化和/或疤痕。
CMR的临床局限性包括局部专业知识、与超声心动图相比更低的可用性和更高的成本、在具有金属植入物(包括心脏装置)的患者中关于安全性的不确定性以及在快速性心律失常患者中不太可靠的测量。幽闭恐惧症是CMR的一个重要局限性。基于线性钆的造影剂在具有肾小球滤过率(GFR)<30mL/分钟/1.73m2的个体中是禁忌的，因为它们可能触发肾源性系统性纤维化(对于较新的基于环状钆的造影剂，这可能不是问题)。
推荐CMR用于评价在具有弱声窗的患者和复杂先天性心脏病患者中的心肌结构和功能(包括右心)(考虑CMR的注意事项/禁忌症)。推荐CMR用于在疑似心肌炎、淀粉样变性、结节病、恰加斯病、法布里病、致密化不全心肌病和血色素沉着症的情况下表征心肌组织(考虑CMR的注意事项/禁忌症)。
多门控采集(MUGA)
放射性核素血管造影术是核医学领域，其擅长于成像来显示心脏的右心室和左心室的功能性，因此允许告知心力衰竭的诊断干预。它涉及使用注射到患者内的放射性药物以及用于采集的伽玛相机。MUGA扫描(多门控采集)涉及在心动周期的不同点触发(门控)的采集。MUGA扫描有时也被称为平衡放射性核素心血管造影术、放射性核素心室造影术(RNVG)或门控血池成像以及SYMA扫描(同步多门控采集扫描)。在一些实施方案中，使用MUGA评价患者的心力衰竭。在一些实施方案中，使用平衡放射性核素心血管造影术评价患者的心力衰竭。在一些实施方案中，使用放射性核素心室造影术(RNVG)评价患者的心力衰竭。在一些实施方案中，使用门控血池成像评价患者的心力衰竭。在一些实施方案中，使用SYMA扫描(同步多门控采集扫描)评价患者的心力衰竭。
MUGA独特地提供了跳动心脏的电影类型的图像(例如，能够显示在心动周期自始至终的心脏运动的短片)，并且允许解释器确定各个心脏瓣膜和腔室的效率。MUGA/Cine扫描代表超声心动图的稳固辅助。关于心输出量(Q)采集的数学通过这两种方法以及支持射血分数作为收缩期心脏/心肌产物的其它廉价模型充分发挥作用。MUGA扫描超过超声心动图或血管造影的一个主要优点是其准确性。超声心动图测量心室的缩短分数，并且受到用户能力的限制。此外，血管造影是侵入性且经常更昂贵的。MUGA扫描提供了心射血分数的更准确表示。
胸部X线
胸部X线在疑似HF患者的诊断检查中具有有限的用途。尽管胸部计算机断层扫描(CT)当前是用于这些类型的肺疾病的护理标准，但它在鉴定关于患者的症状和体征(例如肺部恶性肿瘤和/或间质性肺疾病)的替代肺部解释方面最有用。为了诊断哮喘或慢性阻塞性肺疾病(COPD)，需要用肺活量测定法的肺功能测试。然而，胸部X线可能显示HF患者中的肺静脉充血或水肿，并且在急性背景下比在非急性背景下更有帮助。在一些实施方案中，使用胸部X线评价患者的心力衰竭。
胸部X线通常在HF患者中获得，以评价肺水肿的体征并鉴定呼吸困难的其它原因。胸部X线可能显示心脏扩大和/或肺水肿的放射显影证据。大多数HFpEF患者将具有正常的胸部X线。在一些实施方案中，HFpEF患者具有正常的胸部X线。
单光子发射计算机断层扫描(SPECT)和放射性核苷酸心室造影术
单光子发射CT(SPECT)可以用于评价缺血和心肌活力。门控SPECT还可以产生关于心室容积和功能的信息，但使患者暴露于电离辐射。3,3-二膦酰基-1,2-丙二羧酸(DPD)闪烁扫描法可以用于检测转甲状腺素蛋白心脏淀粉样变性。在一些实施方案中，使用SPECT评价患者的心力衰竭。
正电子发射断层扫描(PET)
正电子发射断层扫描(PET)(单独或与CT一起)可以用于评价缺血和活力，但流量示踪剂(N-13氨或O-15水)需要现场回旋加速器。铷是用于由PET的缺血测试的替代示踪剂，其可以以相对低的成本在当地生产。有限的可用性、辐射暴露和成本是主要局限性。在一些实施方案中，使用PET评价患者的心力衰竭。
冠状动脉造影术
在患有抗拒药物治疗的心绞痛的HF患者中，推荐冠状动脉造影术，条件是患者在其它方面适合于冠状动脉血运重建。在有症状的室性心律失常或心脏骤停中止病史的患者中，也推荐冠状动脉造影术。在具有HF以及冠状动脉疾病(CAD)的中等至高验前概率以及在非侵入性负荷测试中存在缺血的患者中，应该考虑冠状动脉造影术，以便确定缺血的病因和CAD的严重程度。在一些实施方案中，使用冠状血管造影术评价患者的心力衰竭。
在具有HF和抗拒药理学治疗的心绞痛或者有症状的室性心律失常或心脏骤停中止的患者(其被视为适合于潜在的冠状动脉血运重建)中，推荐侵入性冠状动脉造影术，以便确定CAD的诊断及其严重程度。在具有HF以及CAD的中等至高验前概率以及在非侵入性负荷测试中存在缺血的患者(其被视为适合于潜在的冠状动脉血运重建)中，应该考虑侵入性冠状动脉造影术，以便确定CAD及其严重程度。
心脏计算机断层扫描(CT)
心脏CT在HF患者中的主要用途是作为非侵入性手段，以在具有冠状动脉疾病(CAD)的低中等验前概率的HF患者或具有模棱两可的非侵入性负荷测试的那些患者中显现冠状动脉解剖结构，以便在相对禁忌症的不存在下，排除CAD的诊断。然而，仅当其结果可能影响治疗决定时才需要该测试。在具有HF以及CAD的低至中等验前概率的患者或具有模棱两可的非侵入性负荷测试的那些患者中考虑心脏CT，以便排除冠状动脉狭窄。在一些实施方案中，使用心脏计算机断层扫描评价患者的心力衰竭
心电图(ECG或EKG)
心电图(ECG或EKG)记录心脏中的电信号。伴随每次心跳，电脉冲(或“波”)穿过心脏。这种波促使肌肉挤压心脏并从心脏中泵出血液。ECG上的正常心跳将显示上部腔室和下部腔室的时机。当电脉冲到达底部腔室时，右和左心房或上部腔室产生接着一条平线的第一个波，称为“P波”。右和左底部腔室或心室产生下一个波，称为“QRS波群”。最后一个波或“T波”代表关于心室的电恢复或返回到静息状态。ECG给出两种主要信息。首先，通过测量ECG上的时间间隔，医生可以确定电波穿过心脏需要多长时间。找出波从心脏的一个部分传播到下一个部分需要多长时间，显示电活动性是正常还是缓慢、快速还是不规则。其次，通过测量通过心脏肌肉的电活动性的量，心脏病学家可能能够找出心脏的某些部分是太大还是过度劳累。表11显示了HFpEF患者中的心电图的典型趋势。在一些实施方案中，使用心电图评价患者的心力衰竭。
心内膜心肌活检
心内膜心肌活检(EMB)是经皮获得少量心肌组织用于诊断、治疗和研究目的的程序。它主要用于(1)跟踪移植心脏的心肌排斥；(2)诊断特异性炎症性、浸润性或家族性心肌病症；以及(3)对未知的心肌团块进行取样。EMB是用于检查心肌的决定性程序，但因其侵入性、取样误差以及在其操作中缺少通用专业知识而受限制。在一些实施方案中，使用心内膜心肌活检评价患者的心力衰竭。
测量患者中的血液学参数
在某些实施方案中，本公开提供了通过测量患者中的一种或多种血液学参数用于管理患者的方法，所述患者已用本公开的一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)进行治疗或是待用其治疗的候选者。血液学参数可以用于评估用于患者的适当给药，所述患者是待用本公开的一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂治疗的候选者，以监测在治疗期间的血液学参数，以评估在用本公开的一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂的治疗期间是否调整剂量，和/或评估本公开的一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂的适当维持剂量。如果一种或多种血液学参数超出正常水平，则可以降低、延迟或终止用一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂的给药。
使用领域公认的方法，可以按照本文提供的方法测量的血液学参数包括例如红血细胞水平、血压、铁储存量和体液中发现的与增加的红血细胞水平相关联的其它试剂。此类参数可以使用来自患者的血液样品进行确定。红血细胞水平、血红蛋白水平和/或血细胞比容水平的增加可能引起血压的增加。
在一个实施方案中，如果在其为待用一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂治疗的候选者的患者中，一种或多种血液学参数在正常范围外或处于正常偏高，则可以延迟本公开的一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂的施用开始，直到血液学参数已自然地或经由治疗干预恢复到正常或可接受的水平。例如，如果候选患者是高血压或高血压前期，则患者可以用降血压剂进行治疗以便降低患者的血压。可以使用对于个别患者的状况适当的任何降血压剂，包括例如利尿剂、肾上腺素能抑制剂(包括α阻滞剂和β阻滞剂)、血管扩张剂、钙通道阻滞剂、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂或血管紧张素II受体阻滞剂。可替代地可以使用饮食和运动方案来治疗血压。类似地，如果候选患者具有低于正常或处于正常偏低的铁储存量，则患者可以用适当的饮食方案和/或铁补充剂进行治疗，直到患者的铁储存量已恢复到正常或可接受的水平。对于具有高于正常红血细胞水平和/或血红蛋白水平的患者，则可以延迟本公开的一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂的施用，直到水平已恢复到正常或可接受的水平。
在某些实施方案中，如果在其为待用一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂治疗的候选者的患者中，一种或多种血液学参数在正常范围外或处于正常偏高，则可以并不延迟施用的开始。然而，本公开的一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂的剂量量或给药频率可以设定为这样的量，其将降低在本公开的一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂施用后出现的不可接受的血液学参数增加的风险。可替代地，可以对于患者开发这样的治疗方案，其将一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂与解决不期望水平的血液学参数的治疗剂组合。例如，如果患者具有升高的血压，则可以设计这样的治疗方案，其涉及一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂和降血压剂的施用。对于具有低于所需铁储存量的患者，可以开发这样的治疗方案，其涉及本公开的一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂和铁补充剂。
在一个实施方案中，可以对于其为待用本公开的一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂治疗的候选者的患者建立关于一种或多种血液学参数的基线参数，并且基于基线值对于该患者建立适当的给药方案。可替代地，基于患者的病史建立的基线参数可以用于告知对于患者适当的ActRII-ALK4拮抗剂给药方案。例如，如果健康患者具有高于限定的正常范围的既定基线血压读数，则在用本公开的一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂治疗之前，可能不需要将患者的血压调整到对于一般群体视为正常的范围内。在用本公开的一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂治疗之前，患者关于一种或多种血液学参数的基线值也可以用作有关比较值，用于监测在用本公开的一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂的治疗期间血液学参数的任何变化。
在某些实施方案中，在用一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂治疗的患者中，测量一种或多种血液学参数。血液学参数可以用于在治疗期间监测患者，并且允许调整或终止用本公开的一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂的给药或者用另一种治疗剂的另外给药。例如，如果一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂的施用导致血压、红血细胞水平或血红蛋白水平的增加，或者铁储存量的降低，则本公开的一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂的剂量可以在量或频率方面降低，以便减少本公开的一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂对一种或多种血液学参数的作用。如果一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂的施用导致对患者不利的一种或多种血液学参数的变化，则可以暂时终止本公开的一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂的给药，直到血液学参数恢复到可接受的水平，或永久终止给药。类似地，如果在降低本公开的一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂的施用剂量或频率后，一种或多种血液学参数并未达到可接受的范围内，则可以终止给药。作为降低或终止用本公开的一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂的给药的替代方案或者补充，患者可以用解决不期望水平的血液学参数的另外治疗剂，例如降血压剂或铁补充剂进行给药。例如，如果用一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂治疗的患者具有升高的血压，则用本公开的一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂的给药可以以相同的水平继续，并且将降血压剂加入治疗方案中，用本公开的一种或多种拮抗剂的给药可以降低(例如，在量和/或频率方面)，并且将降血压剂加入治疗方案中，或者用本公开的一种或多种拮抗剂的给药可以终止，并且患者可以用降血压剂进行治疗。
在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中所述方法改善一种或多种血液学参数。在一些实施方案中，与相似年龄和性别的健康人相比，方法将一种或多种血液学参数改善到正常水平。
7.用于心力衰竭的另外治疗和协同疗法
在某些方面，本公开考虑了与一种或多种另外的活性剂或其它支持疗法组合的ActRII-ALK4拮抗剂的使用，用于治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度。如本文所用，“与……组合(incombinationwith)”、“组合”、“与……组合(combined with)”或“联合”施用指任何形式的施用，使得另外的活性剂或支持疗法(例如，第二、第三、第四等)在体内仍是有效的(例如，多重化合物在一段时间内在患者中是同时有效的，其可能包括这些化合物的协同效应)。有效性可能与血液、血清或血浆中药剂的可测量浓度不相关。例如，不同的治疗化合物可以在相同的制剂中或在分开的制剂中、伴随地或序贯地、以及在不同的时间表上进行施用。因此，接受此类治疗的受试者可以受益于不同活性剂或疗法的组合效应。本公开的一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂可以与一种或多种其它另外的药剂或支持疗法例如本文公开的那些同时、在其之前或之后进行施用。一般而言，每种活性剂或疗法将以对于该特定试剂确定的剂量和/或时间表进行施用。在方案中采用的特定组合将考虑到本公开的ActRII-ALK4拮抗剂与另外的活性剂或疗法的相容性和/或所需效应。
HF患者中的一些治疗目标是改善其临床状态、功能能力和生活质量，和/或预防入院并降低死亡率。神经激素拮抗剂(例如ACEI、MRA和β阻滞剂)已显示改善HFrEF患者的存活，并且已推荐用于治疗HFrEF患者，除非禁忌或不耐受。在某些方面，本公开涉及治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，其中还向患者施用以下中的一种或多种：血管紧张素转换酶抑制剂(ACE抑制剂)、β阻滞剂、血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)、盐皮质激素/醛固酮受体拮抗剂(MRA)或植入式心脏复律除颤器(ICD)。在一些实施方案中，方法涉及向有此需要的患者施用ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)、以及血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)。在一些实施方案中，方法涉及向有此需要的患者施用ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)、以及β-阻滞剂。在一些实施方案中，方法涉及向有此需要的患者施用ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)、以及血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)。在一些实施方案中，方法涉及向有此需要的患者施用ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)、以及盐皮质激素/醛固酮受体拮抗剂(MRA)。在一些实施方案中，方法涉及向有此需要的患者施用ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)、以及植入式心脏复律除颤器(ICD)。在一些实施方案中，方法涉及向有此需要的患者施用ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)、以及钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)。在一些实施方案中，方法涉及向有此需要的患者施用ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)、以及胰高血糖素样肽1(GLP-1)受体激动剂。在一些实施方案中，方法涉及向有此需要的患者施用ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)、以及二肽基肽酶4(DPP-4)抑制剂。在一些实施方案中，方法涉及向有此需要的患者施用ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)、以及血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂(ARNI)。在一些实施方案中，方法涉及向有此需要的患者施用ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)、以及利尿剂。在一些实施方案中，方法涉及向有此需要的患者施用ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)，以及肼屈嗪和硝酸异山梨酯、地高辛、洋地黄、N-3多不饱和脂肪酸(PUFA)、If通道抑制剂(例如伊伐布雷定)和哌克昔林中的一种或多种。
任选地，本文公开的用于治疗、预防或降低心力衰竭的进展速率和/或严重程度，特别是治疗、预防或降低心力衰竭的一种或多种并存病的进展速率和/或严重程度的方法，可以进一步包括向患者施用用于治疗心力衰竭的一种或多种支持疗法或者另外的活性剂。例如，还可以向患者施用选自以下的一种或多种支持疗法或活性剂：ACE抑制剂(例如，贝那普利、卡托普利、依那普利、赖诺普利、培哚普利、雷米普利(例如ramipen)、群多普利和佐芬普利)；β阻滞剂(例如，醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、卡替洛尔、卡维地洛、拉贝洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、奈必洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔、索他洛尔和噻吗洛尔)；ARB(例如，氯沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦、坎地沙坦、缬沙坦、非马沙坦、阿齐沙坦、沙普立沙坦和替米沙坦)；盐皮质激素/醛固酮受体拮抗剂(MRA)(例如，黄体酮、依普利酮和螺内酯)；糖皮质激素(例如，倍氯米松、倍他米松、布地奈德、可的松、地夫可特、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、甲基强的松、泼尼松、曲安西龙和非奈利酮)；他汀类药物(例如，阿托伐他汀(Lipitor)、氟伐他汀(Lescol)、洛伐他汀(Mevacor、Altocor)、普伐他汀(Pravachol)、匹伐他汀(Livalo)、辛伐他汀(Zocor)和瑞舒伐他汀(Crestor))；钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)抑制剂(例如，卡格列净、达格列净(例如Farxiga)和恩格列净)；GLP-1受体激动剂(例如，艾塞那肽(例如，Byetta、Byureon)、利拉鲁肽(例如，Victoza、Saxenda)、利司那肽(例如，Adlyxin)、杜拉鲁肽(例如，Trulicity)和索马鲁肽(例如，Ozempic、Rynelsus)；DPP-4抑制剂(例如，西格列汀、沙格列汀、利格列汀和阿格列汀)；植入式心脏复律除颤器(ICD)；血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂(ARNI)(例如，缬沙坦和沙库巴曲(脑啡肽酶抑制剂))；利尿剂(例如，呋塞米、布美他尼、托拉塞米、苄氟噻嗪、氢氯噻嗪、美托拉宗、吲达帕胺、螺内酯/依普利酮、阿米洛利和氨苯蝶啶)；以及其它疗法包括肼屈嗪和硝酸异山梨酯、地高辛、洋地黄、N-3多不饱和脂肪酸(PUFA)、If通道抑制剂(例如伊伐布雷定)和哌克昔林。
血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂
在具有无症状LV收缩功能障碍和心肌梗塞病史的患者中，推荐ACE抑制剂，以便预防或延迟HF的发作并延长生命，或者在具有无症状LV收缩功能障碍而无心肌梗塞病史的患者中，以便预防或延迟HF的发作。在稳定型CAD患者中，即使他们没有LV收缩功能障碍，也应该考虑ACE抑制剂，以便预防或延迟HF的发作。ACE抑制剂已显示降低HFrEF患者中的死亡率和发病率，并且除非在所有有症状的患者中禁忌或不耐受，否则推荐ACE抑制剂。
在一些实施方案中，本公开涉及通过施用ACE抑制剂来治疗患有心力衰竭的患者的方法。在一些实施方案中，ACE抑制剂选自贝那普利、卡托普利、依那普利、赖诺普利、培哚普利、雷米普利(例如ramipen)、群多普利和佐芬普利。在一些实施方案中，向患者施用贝那普利。在一些实施方案中，向患者施用卡托普利。在一些实施方案中，向患者施用依那普利。在一些实施方案中，向患者施用赖诺普利。在一些实施方案中，向患者施用培哚普利。在一些实施方案中，向患者施用雷米普利。在一些实施方案中，向患者施用群多普利。在一些实施方案中，向患者施用佐芬普利。在一些实施方案中，ACE抑制剂的施用
在一些实施方案中，ACE抑制剂的施用延迟患者中的心力衰竭发作。在一些实施方案中，ACE抑制剂的施用预防患者中的心力衰竭发作。在一些实施方案中，ACE抑制剂的施用增加患者的生命长度。在一些实施方案中，ACE抑制剂的施用减少患者的住院时长。在一些实施方案中，ACE抑制剂的施用预防患者的住院治疗。
β阻滞剂
在具有无症状LV收缩功能障碍和心肌梗塞病史的患者中，推荐β阻滞剂，以便预防或延迟HF的发作或者延长生命。尽管用ACEI和(在大多数情况下)利尿剂的治疗，β阻滞剂仍可以降低有症状的HFrEF患者中的死亡率和发病率，但尚未在充血或失代偿患者中进行测试。一致认为，β阻滞剂和ACEI是互补的，并且一旦做出HFrEF的诊断，就可以一起起始。
在一些实施方案中，本公开涉及通过施用一种或多种β阻滞剂来治疗患有心力衰竭的患者的方法。在一些实施方案中，一种或多种β阻滞剂选自以下：醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、卡替洛尔、卡维地洛、拉贝洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、奈必洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔、索他洛尔和噻吗洛尔。在一些实施方案中，向患者施用醋丁洛尔。在一些实施方案中，向患者施用阿替洛尔。在一些实施方案中，向患者施用倍他洛尔。在一些实施方案中，向患者施用比索洛尔。在一些实施方案中，向患者施用卡替洛尔。在一些实施方案中，向患者施用卡维地洛。在一些实施方案中，向患者施用拉贝洛尔。在一些实施方案中，向患者施用美托洛尔。在一些实施方案中，向患者施用纳多洛尔。在一些实施方案中，向患者施用奈必洛尔。在一些实施方案中，向患者施用喷布洛尔。在一些实施方案中，向患者施用吲哚洛尔。在一些实施方案中，向患者施用普萘洛尔。在一些实施方案中，向患者施用索他洛尔。在一些实施方案中，向患者施用噻吗洛尔。
在一些实施方案中，当患者显示心力衰竭的体征时，向患者施用β阻滞剂。在一些实施方案中，当患者不耐受ACE抑制剂时，向患者施用β阻滞剂。在一些实施方案中，β阻滞剂延迟患者中的心力衰竭发作。在一些实施方案中，β阻滞剂预防患者中的心力衰竭发作。在一些实施方案中，β阻滞剂的施用增加患者的生命长度。在一些实施方案中，β阻滞剂的施用减少患者的住院时长。在一些实施方案中，β阻滞剂的施用预防患者的住院治疗。
血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)
血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)是可能不耐受ACE抑制剂的患者中的替代方案。坎地沙坦已显示降低心血管死亡率。缬沙坦已在接受背景ACEI的HFrEF患者中显示了对因HF住院治疗(但不是全因住院治疗)的作用。
在一些实施方案中，本公开涉及通过施用一种或多种ARB来治疗患有心力衰竭的患者的方法。在一些实施方案中，一种或多种ARB选自以下：氯沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦、坎地沙坦、缬沙坦、非马沙坦、阿齐沙坦、沙普立沙坦和替米沙坦。在一些实施方案中，向患者施用氯沙坦。在一些实施方案中，向患者施用厄贝沙坦。在一些实施方案中，向患者施用奥美沙坦。在一些实施方案中，向患者施用坎地沙坦。在一些实施方案中，向患者施用缬沙坦。在一些实施方案中，向患者施用非马沙坦。在一些实施方案中，向患者施用阿齐沙坦。在一些实施方案中，向患者施用沙普立沙坦。在一些实施方案中，向患者施用替米沙坦。
在一些实施方案中，当患者显示心力衰竭的体征时，向患者施用血管紧张素拮抗剂(例如，血管紧张素受体阻滞剂，ARB)。在一些实施方案中，当患者不耐受ACE抑制剂时，向患者施用ARB。在一些实施方案中，ARB延迟患者中的心力衰竭发作。在一些实施方案中，ARB预防患者中的心力衰竭发作。在一些实施方案中，ARB的施用增加患者的生命长度。在一些实施方案中，ARB的施用减少患者的住院时长。在一些实施方案中，ARB的施用预防患者的住院治疗。
皮质类固醇
盐皮质激素/醛固酮受体拮抗剂(MRA)阻断这样的受体，其结合醛固酮并且以不同程度的亲和力结合其它类固醇激素受体(例如皮质类固醇、雄激素)。在具有HFrEF和LVEF≤35％的有症状的心力衰竭患者(尽管用ACE抑制剂和/或β阻滞剂的治疗)中，推荐螺内酯或依普利酮，以降低死亡率和HF住院治疗。
在一些实施方案中，本公开涉及通过施用皮质类固醇来治疗患有心力衰竭的患者的方法。在一些实施方案中，向患者施用盐皮质激素/醛固酮受体拮抗剂(MRA)。在一些实施方案中，向患者施用糖皮质激素。在一些实施方案中，向患者施用选自黄体酮、依普利酮和螺内酯的一种或多种盐皮质激素/醛固酮受体拮抗剂(MRA)。在一些实施方案中，向患者施用依普利酮。在一些实施方案中，向患者施用螺内酯。
在一些实施方案中，当患者显示心力衰竭的体征时，向患者施用MRA。在一些实施方案中，MRA延迟患者中的心力衰竭发作。在一些实施方案中，MRA预防患者中的心力衰竭发作。在一些实施方案中，MRA的施用增加患者的生命长度。在一些实施方案中，MRA的施用减少患者的住院时长。在一些实施方案中，MRA的施用预防患者的住院治疗。
在一些实施方案中，向心力衰竭患者施用一种或多种糖皮质激素。在一些实施方案中，糖皮质激素的施用是初始疗法。在一些实施方案中，糖皮质激素选自倍氯米松、倍他米松、布地奈德、可的松、地夫可特、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、甲基强的松、泼尼松、曲安西龙和非奈利酮。在一些实施方案中，向心力衰竭患者施用泼尼松。在一些实施方案中，向心力衰竭患者施用泼尼松龙。在一些实施方案中，向心力衰竭患者施用非奈利酮。在一些实施方案中，向心力衰竭患者施用地夫可特。
在一些实施方案中，当患者显示心力衰竭的体征时，向患者施用糖皮质激素。在一些实施方案中，糖皮质激素延迟患者中的心力衰竭发作。在一些实施方案中，糖皮质激素预防患者中的心力衰竭发作。在一些实施方案中，糖皮质激素的施用增加患者的生命长度。在一些实施方案中，糖皮质激素的施用减少患者的住院时长。在一些实施方案中，糖皮质激素的施用预防患者的住院治疗。
他汀类药物
在患有CAD或处于CAD的高度风险中的患者(无论他们是否患有LV收缩功能障碍)中，推荐用他汀类药物的治疗，以便预防或延迟HF的发作并延长生命。
在一些实施方案中，本公开涉及通过施用一种或多种他汀类药物来治疗患有心力衰竭的患者的方法。在一些实施方案中，一种或多种他汀类药物选自以下：阿托伐他汀(Lipitor)、氟伐他汀(Lescol)、洛伐他汀(Mevacor、Altocor)、普伐他汀(Pravachol)、匹伐他汀(Livalo)、辛伐他汀(Zocor)和瑞舒伐他汀(Crestor)。在一些实施方案中，向患者施用阿托伐他汀。在一些实施方案中，向患者施用氟伐他汀。在一些实施方案中，向患者施用洛伐他汀。在一些实施方案中，向患者施用普伐他汀。在一些实施方案中，向患者施用匹伐他汀。在一些实施方案中，向患者施用辛伐他汀。在一些实施方案中，向患者施用瑞舒伐他汀。
在一些实施方案中，当患者显示心力衰竭的体征时，向患者施用他汀类药物。在一些实施方案中，当患者处于冠状动脉疾病(CAD)的高风险中时，向患者施用他汀类药物。在一些实施方案中，当患者患有冠状动脉疾病(CAD)时，向患者施用他汀类药物。在一些实施方案中，他汀类药物延迟患者中的心力衰竭发作。在一些实施方案中，他汀类药物预防患者中的心力衰竭发作。在一些实施方案中，他汀类药物的施用增加患者的生命长度。在一些实施方案中，他汀类药物的施用减少患者的住院时长。在一些实施方案中，他汀类药物的施用预防患者的住院治疗。
钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)抑制剂
钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)抑制剂通常连同饮食和运动一起施用，以降低患有2型糖尿病的成人中的血糖。SGLT2抑制剂通过促使肾经由尿从体内去除糖来降低血糖。在射血分数降低型心力衰竭(HFrEF)患者中，推荐用SGCT2抑制剂的治疗，以降低心血管死亡和因心力衰竭住院治疗的风险。
在一些实施方案中，本公开涉及通过施用一种或多种SGLT2抑制剂来治疗患有心力衰竭的患者的方法。在一些实施方案中，SGLT2抑制剂是格列净。在一些实施方案中，向患者施用选自以下的一种或多种SGLT2抑制剂：卡格列净、达格列净(例如Farxiga)和恩格列净。在一些实施方案中，向患者施用卡格列净。在一些实施方案中，向患者施用达格列净(例如Farxiga)。在一些实施方案中，向患者施用恩格列净。
在一些实施方案中，当患者显示心力衰竭的体征时，向患者施用SGLT2抑制剂。在一些实施方案中，当患者并未患有2型糖尿病时，向患者施用SGLT2抑制剂。在一些实施方案中，当患者患有2型糖尿病时，向患者施用SGLT2抑制剂。在一些实施方案中，SGLT2抑制剂延迟患者中的心力衰竭发作。在一些实施方案中，SGLT2抑制剂预防患者中的心力衰竭发作。在一些实施方案中，SGLT2抑制剂的施用增加患者的生命长度。在一些实施方案中，SGLT2抑制剂的施用减少患者的住院时长。在一些实施方案中，SGLT2抑制剂的施用预防患者的住院治疗。在一些实施方案中，SGLT2抑制剂降低患者的死亡风险。
胰高血糖素样肽1(GLP-1)受体激动剂
胰高血糖素样肽1(GLP-1)受体激动剂是一类非胰岛素用药，其与饮食和运动组合使用，以帮助治疗2型糖尿病。这些药物的具体作用是帮助降低血糖水平，特别是血红蛋白A1C，并且有助于重量减轻。研究已显示了，GLP-1受体激动剂可以具有其它健康益处，包括对血压、胆固醇水平和β细胞功能的积极作用。
在一些实施方案中，向患者施用GLP-1受体激动剂。在一些实施方案中，向患者施用选自以下的GLP-1受体激动剂：艾塞那肽(例如，Byetta、Byureon)、利拉鲁肽(例如，Victoza、Saxenda)、利司那肽(例如，Adlyxin)、杜拉鲁肽(例如，Trulicity)和索马鲁肽(例如，Ozempic、Rynelsus)。在一些实施方案中，向患者施用艾塞那肽。在一些实施方案中，向患者施用利拉鲁肽。在一些实施方案中，向患者施用利司那肽。在一些实施方案中，向患者施用杜拉鲁肽。在一些实施方案中，向患者施用索马鲁肽。
二肽基肽酶4(DPP-4)抑制剂
二肽基肽酶4(DPP-4)抑制剂是与饮食和运动一起使用，以控制患有2型糖尿病的成人中的高血糖的一类用药。DPP-4(二肽基肽酶4)是涉及GLP-1的快速降解的酶，并且因此，肠促胰素系统的效应可以通过DPP-4抑制得到增强。
在一些实施方案中，向患者施用选自西格列汀、沙格列汀、利格列汀和阿格列汀的DPP-4抑制剂。在一些实施方案中，向患者施用西格列汀。在一些实施方案中，向患者施用沙格列汀。在一些实施方案中，向患者施用利格列汀。在一些实施方案中，向患者施用阿格列汀。
植入式心脏复律除颤器(ICD)
在患有以下中的一种或多种的患者中推荐植入式心律转复除颤器(ICD)：a)缺血性起源的无症状LV收缩功能障碍(例如，LVEF≤30％)，其在急性心肌梗塞后至少40天；以及b)无症状的非缺血性扩张型心肌病(例如，LVEF≤30％)，其接受整骨手法治疗(OMT)，以便预防猝死并延长生命。在一些实施方案中，本公开涉及通过施用植入式心律转复除颤器(ICD)来治疗患有心力衰竭的患者的方法。
在一些实施方案中，当患者显示心力衰竭的体征时，向患者施用ICD。在一些实施方案中，向患有缺血性起源的无症状LV收缩功能障碍(例如，LVEF≤30％)的患者施用ICD，所述患者在急性心肌梗塞后至少40天。在一些实施方案中，向患有缺血性起源的无症状LV收缩功能障碍(例如，LVEF≤30％)的患者施用ICD。在一些实施方案中，向急性心肌梗塞后至少40天的患者施用ICD。在一些实施方案中，向接受最佳药物治疗(OMT)、患有无症状的非缺血性扩张型心肌病(例如，LVEF≤30％)的患者施用ICD。在一些实施方案中，向患有无症状的非缺血性扩张型心肌病(例如，LVEF≤30％)的患者施用ICD。在一些实施方案中，向接受最佳药物治疗的患者施用ICD。在一些实施方案中，ICD延迟患者中的心力衰竭发作。在一些实施方案中，ICD预防患者中的心力衰竭发作。在一些实施方案中，ICD的施用增加患者的生命长度。在一些实施方案中，ICD的施用减少患者的住院时长。在一些实施方案中，ICD的施用预防患者的住院治疗。
血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂
已开发了一类相对较新的作用于肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)和中性内肽酶系统的药剂，称为血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂(ARNI)。该类别中的第一个是LCZ696，其是将缬沙坦和沙库巴曲(脑啡肽酶抑制剂)的部分组合在单一物质中的分子。通过抑制脑啡肽酶，减缓利钠肽(NP)、缓激肽和其它肽的降解。
高循环的A型利钠肽(ANP)和BNP通过与NP受体结合和cGMP的加强生成而发挥生理效应，从而增强利尿、尿钠排泄和心肌舒张和抗重塑。ANP和BNP还抑制肾素和醛固酮分泌。选择性AT1受体阻断降低血管收缩、钠和水潴留以及心肌肥厚。
在一些实施方案中，本公开涉及通过施用血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂来治疗患有心力衰竭的患者的方法。在一些实施方案中，向患者施用沙库巴曲/缬沙坦(例如LCZ696、Entresto)。在一些实施方案中，向具有LVEF≤35％的不卧床、有症状的HFrEF的患者施用沙库巴曲/缬沙坦。在一些实施方案中，向具有血浆NP水平升高(BNP≥150pg/mL和/或NT-proBNP≥600pg/mL(或者，如果他们在先前12个月内已因HF住院治疗，则BNP≥100pg/mL和/或NT-proBNP≥400pg/mL)的患者施用沙库巴曲/缬沙坦。在一些实施方案中，向具有LVEF≤35％的不卧床、有症状的HFrEF的患者施用沙库巴曲/缬沙坦。在一些实施方案中，向具有估计GFR(eGFR)≥30mL/分钟/1.73m2体表面积的患者施用沙库巴曲/缬沙坦。
在一些实施方案中，当患者显示心力衰竭的体征时，向患者施用沙库巴曲/缬沙坦。在一些实施方案中，当患者不耐受ACE抑制剂时，向患者施用沙库巴曲/缬沙坦。在一些实施方案中，当患者不耐受β阻滞剂时，向患者施用沙库巴曲/缬沙坦。在一些实施方案中，当患者不耐受MRA时，向患者施用沙库巴曲/缬沙坦。在一些实施方案中，当患者患有HFrEF并且尽管用ACE抑制剂、β-阻滞剂和MRA中的一种或多种的治疗仍是有症状的时，向患者施用沙库巴曲/缬沙坦。在一些实施方案中，沙库巴曲/缬沙坦延迟患者中的心力衰竭发作。在一些实施方案中，沙库巴曲/缬沙坦预防患者中的心力衰竭发作。在一些实施方案中，沙库巴曲/缬沙坦的施用增加患者的生命长度。在一些实施方案中，沙库巴曲/缬沙坦的施用减少患者的住院时长。在一些实施方案中，沙库巴曲/缬沙坦的施用预防患者的住院治疗。
在一些实施方案中，当患者显示心力衰竭的体征时，向患者施用ARNI。在一些实施方案中，当患者不耐受ACE抑制剂时，向患者施用ARNI。在一些实施方案中，当患者不耐受β阻滞剂时，向患者施用ARNI。在一些实施方案中，当患者不耐受MRA时，向患者施用ARNI。在一些实施方案中，当患者患有HFrEF并且尽管用ACE抑制剂、β-阻滞剂和MRA中的一种或多种的治疗仍是有症状的时，向患者施用ARNI。在一些实施方案中，ARNI延迟患者中的心力衰竭发作。在一些实施方案中，ARNI预防患者中的心力衰竭发作。在一些实施方案中，ARNI的施用增加患者的生命长度。在一些实施方案中，ARNI的施用减少患者的住院时长。在一些实施方案中，ARNI的施用预防患者的住院治疗。
利尿剂
推荐利尿剂以降低HFrEF患者中的充血体征和症状。在慢性HF患者中，袢利尿剂和噻嗪类利尿剂可以降低死亡和HF恶化的风险，并且还可能改善运动能力。通常，袢利尿剂产生比噻嗪类更强烈和更短的利尿，尽管它们协同作用，并且组合可以用于治疗顽固性水肿。
在一些实施方案中，本公开涉及通过施用一种或多种利尿剂来治疗患有心力衰竭的患者的方法。在一些实施方案中，向患者施用选自以下的一种或多种利尿剂：呋塞米、布美他尼、托拉塞米、苄氟噻嗪、氢氯噻嗪、美托拉宗、吲达帕胺、螺内酯/依普利酮、阿米洛利和氨苯蝶啶。
在一些实施方案中，向患者施用选自呋塞米、布美他尼和托拉塞米的一种或多种袢利尿剂。在一些实施方案中，向患者施用呋塞米。在一些实施方案中，向患者施用布美他尼。在一些实施方案中，向患者施用托拉塞米。
在一些实施方案中，向患者施用选自苄氟噻嗪、氢氟噻嗪、美托拉宗和吲达帕胺的一种或多种噻嗪类利尿剂。在一些实施方案中，向患者施用苄氟噻嗪。在一些实施方案中，向患者施用氢氯噻嗪。在一些实施方案中，向患者施用美托拉宗。在一些实施方案中，向患者施用吲达帕胺。
在一些实施方案中，向患者施用选自螺内酯/依普利酮、阿米洛利和氨苯蝶啶的一种或多种保钾利尿剂。在一些实施方案中，向患者施用螺内酯/依普利酮。在一些实施方案中，向患者施用阿米洛利。在一些实施方案中，向患者施用氨苯蝶啶。
在一些实施方案中，当患者显示心力衰竭的体征时，向患者施用利尿剂。在一些实施方案中，当患者显示充血体征时，向患者施用利尿剂。在一些实施方案中，当患者处于冠状动脉疾病(CAD)的高风险中时，向患者施用利尿剂。在一些实施方案中，当患者患有冠状动脉疾病(CAD)时，向患者施用利尿剂。在一些实施方案中，利尿剂延迟患者中的心力衰竭发作。在一些实施方案中，利尿剂预防患者中的心力衰竭发作。在一些实施方案中，利尿剂的施用增加患者的生命长度。在一些实施方案中，利尿剂的施用减少患者的住院时长。在一些实施方案中，利尿剂的施用预防患者的住院治疗。在一些实施方案中，利尿剂的施用改善患者的六分钟步行测试。
其它
在一些实施方案中，向患者施用选自肼屈嗪和硝酸异山梨酯、地高辛、洋地黄、N-3多不饱和脂肪酸(PUFA)、If通道抑制剂(例如伊伐布雷定)和哌克昔林的一种或多种治疗。在一些实施方案中，向患者施用肼屈嗪和硝酸异山梨酯。在一些实施方案中，向患者施用地高辛。在一些实施方案中，向患者施用洋地黄。在一些实施方案中，向患者施用N-3多不饱和脂肪酸(PUFA)。在一些实施方案中，向患者施用If通道抑制剂(例如伊伐布雷定)。在一些实施方案中，向患者施用哌克昔林。
在一些实施方案中，当患者显示心力衰竭的体征时，向患者施用肼屈嗪和硝酸异山梨酯、地高辛、洋地黄、N-3多不饱和脂肪酸(PUFA)、If通道抑制剂(例如伊伐布雷定)中的一种或多种。在一些实施方案中，肼屈嗪和硝酸异山梨酯、地高辛、洋地黄、N-3多不饱和脂肪酸(PUFA)、If通道抑制剂(例如伊伐布雷定)中的一种或多种延迟患者中的心力衰竭发作。在一些实施方案中，肼屈嗪和硝酸异山梨酯、地高辛、洋地黄、N-3多不饱和脂肪酸(PUFA)、If通道抑制剂(例如伊伐布雷定)中的一种或多种预防患者中的心力衰竭发作。在一些实施方案中，肼屈嗪和硝酸异山梨酯、地高辛、洋地黄、N-3多不饱和脂肪酸(PUFA)、If通道抑制剂(例如伊伐布雷定)中的一种或多种的施用增加患者的生命长度。在一些实施方案中，肼屈嗪和硝酸异山梨酯、地高辛、洋地黄、N-3多不饱和脂肪酸(PUFA)、If通道抑制剂(例如伊伐布雷定)中的一种或多种的施用减少患者的住院时长。在一些实施方案中，肼屈嗪和硝酸异山梨酯、地高辛、洋地黄、N-3多不饱和脂肪酸(PUFA)、If通道抑制剂(例如伊伐布雷定)中的一种或多种的施用预防患者的住院治疗。在一些实施方案中，肼屈嗪和硝酸异山梨酯、地高辛、洋地黄、N-3多不饱和脂肪酸(PUFA)、If通道抑制剂(例如伊伐布雷定)中的一种或多种的施用改善患者的六分钟步行测试。
8.并存病
并存病在HF中是重要的，并且可能影响HF治疗的使用(例如，在具有严重肾功能障碍的一些患者中，可能无法使用肾素-血管紧张素系统抑制剂)。此外，用于治疗并存病的药物可能引起HF的恶化(例如，对于关节炎给予的NSAID、一些抗癌药物等)。因此，并存病的管理是HF患者的整体护理的关键组分。在一些实施方案中，HF中考虑的一种或多种并存病选自年龄、贫血、心绞痛、动脉高血压、关节炎、心房颤动、恶病质、癌症、认知功能障碍、冠状动脉疾病(CAD)、勃起功能障碍、痛风、高胆固醇血症、高钾血症、高钾血症、高脂血症、高血压、铁缺乏症、肾功能障碍、代谢综合征、身体失能、钾紊乱、肺疾病(例如，哮喘、COPD)、肌少症、睡眠呼吸暂停、睡眠障碍和心脏瓣膜病(例如，主动脉狭窄、主动脉瓣反流、二尖瓣反流、三尖瓣反流)。
在一些实施方案中，本公开考虑了治疗与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的一种或多种并存病的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)。在一些实施方案中，本公开考虑了治疗心力衰竭的一种或多种并存病(例如，年龄、动脉高血压、心房颤动、认知功能障碍、高胆固醇血症、铁缺乏症、肾功能障碍、代谢综合征、身体失能、钾紊乱、肺疾病(例如，COPD)和睡眠呼吸暂停)的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)。在一些实施方案中，与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的一种或多种并存病得到间接改善。在一些实施方案中，本公开考虑了预防与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的一种或多种并存病的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)。在一些实施方案中，本公开考虑了降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)。在一些实施方案中，本公开考虑了降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的一种或多种并存病的进展速率的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)。在一些实施方案中，本公开考虑了降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)。在一些实施方案中，本公开考虑了降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的一种或多种并存病的严重程度的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)。
9.筛选测定
在某些方面，本公开涉及ActRII-ALK4拮抗剂(例如，ActRII-ALK4配体捕获拮抗剂、ActRII-ALK4抗体拮抗剂、ActRII-ALK4多核苷酸拮抗剂和/或ActRII-ALK4小分子拮抗剂)鉴定化合物(药剂)的用途，所述化合物可以用于治疗、预防或降低与代谢并发症(例如，糖尿病、肥胖)相关的心力衰竭的进展速率和/或严重程度，特别是治疗、预防或降低一种或多种心力衰竭相关并存病的进展速率和/或严重程度。
存在通过靶向一种或多种ActRII-ALK4配体的信号传导(例如，Smad信号传导)来筛选用于治疗心力衰竭的治疗剂的众多方法。在某些实施方案中，可以进行化合物的高通量筛选，以鉴定扰乱ActRII-ALK4配体介导的对所选细胞系的作用的药剂。在某些实施方案中，进行测定以筛选且鉴定特异性地抑制或降低ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、GDF3、BMP6、GDF8、GDF15、GDF11或BMP10)与其结合配偶体，例如II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)的结合的化合物。可替代地，测定可以用于鉴定增强ActRII-ALK4配体与其结合配偶体例如II型受体的结合的化合物。在一个进一步的实施方案中，可以通过其与II型受体相互作用的能力来鉴定化合物。
各种测定形式将是足够的，并且按照本公开，本文中并未明确描述的那些测定形式仍被本领域普通技术人员理解。如本文所述，本发明的测试化合物(药剂)可以通过任何组合化学方法来产生。可替代地，主题化合物可以是在体内或体外合成的天然存在的生物分子。待测试其充当组织生长调节剂的能力的化合物(药剂)可以例如通过细菌、酵母、植物或其它生物产生(例如天然产物)，化学产生(例如小分子，包括肽模拟物)，或重组产生。由本发明考虑的测试化合物包括非肽基有机分子、肽、多肽、肽模拟物、糖、激素和核酸分子。在某些实施方案中，测试药剂是分子量小于约2,000道尔顿的有机小分子。
本公开的测试化合物可以作为单一的离散实体提供，或者在例如通过组合化学制备的更大复杂性的文库中提供。这些文库可以包含例如醇、卤代烃、胺、酰胺、酯、醛、醚和其它类别的有机化合物。向测试系统呈现的测试化合物可以是分离的形式，或作为化合物的混合物，尤其是在初始筛选步骤中。任选地，化合物可以任选地用其它化合物衍生化并且具有促进化合物分离的衍生基团。衍生基团的非限制性实例包括生物素、荧光素、地高辛配基、绿色荧光蛋白、同位素、多组氨酸、磁珠、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、光可活化交联剂或其任何组合。
在测试化合物和天然提取物的文库的许多药物筛选程序中，高通量测定是期望的，以便使在给定时间段内调查的化合物数目达到最大。在无细胞系统中执行，例如可以用纯化或半纯化的蛋白质衍生的测定，经常优选作为“初级”筛选，因为它们可以被生成以允许快速开发和相对容易检测由测试化合物介导的分子靶中的改变。此外，测试化合物的细胞毒性或生物利用度的效应一般可以在体外系统中被忽略，该测定相反主要集中于药物对分子靶的作用，如可能以ActRII-ALK4配体(例如，激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、GDF8、GDF15、GDF11、GDF3、BMP6或BMP10)与其结合配偶体，例如II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)之间的结合亲和力改变体现的。
仅仅为了说明，在本公开的示例性筛选测定中，如对于测定的意图适当的，使感兴趣的化合物与通常能够结合ActRIIB配体结合的分离且纯化的ActRIIB多肽接触。然后向化合物和ActRIIB多肽的混合物中，加入含有ActRIIB配体(例如，GDF11)的组合物中。ActRIIB/ActRIIB-配体复合物的检测和定量提供了用于确定化合物抑制(或加强)ActRIIB多肽与其结合蛋白之间的复合物形成的功效的手段。可以通过从使用各种浓度的测试化合物获得的数据生成剂量应答曲线来评价化合物的功效。此外，还可以执行对照测定以提供用于比较的基线。例如，在对照测定中，将分离且纯化的ActRIIB配体加入含有ActRIIB多肽的组合物中，并且在测试化合物的不存在下定量ActRIIB/ActRIIB配体复合物的形成。应理解，一般而言，其中反应物可以混合的次序可以改变，并且可以同时混合。此外，代替纯化的蛋白质，细胞提取物和裂解物可以用于提供合适的无细胞测定系统。
ActRII-ALK4配体与其结合蛋白之间的复合物形成可以通过各种技术进行检测。例如，通过免疫测定或通过层析检测，可以使用例如可检测标记的蛋白质，例如放射性标记的(例如，32P、35S、14C或3H)、荧光标记的(例如，FITC)或酶促标记的ActRIIB多肽和/或其结合蛋白，来定量复合物形成的调节。
在某些实施方案中，本公开考虑了在直接或间接测量GDF/BMP配体与其结合蛋白之间的相互作用程度中，使用荧光偏振测定和荧光共振能量转移(FRET)测定。此外，其它检测模式，例如基于光波导的那些检测模式(参见例如PCT公开WO 96/26432和美国专利号5,677,196、表面等离子体共振(SPR)、表面电荷传感器和表面力传感器，与本公开的许多实施方案是相容的。
此外，本公开考虑了相互作用捕获测定，也称为“双杂交测定”的使用，用于鉴定破坏或加强ActRII-ALK4配体与其结合配偶体之间的相互作用的药剂。参见例如，美国专利号5,283,317；Zervos等人(1993)Cell 72:223-232；Madura等人(1993)J Biol Chem268:12046-12054；Bartel等人(1993)Biotechniques 14:920-924；以及Iwabuchi等人(1993)Oncogene 8:1693-1696)。在一个具体实施方案中，本公开考虑了反向双杂交系统的使用，以鉴定解离ActRII-ALK4配体与其结合蛋白之间的相互作用的化合物(例如，小分子或肽)[参见例如，Vidal和Legrain，(1999)Nucleic Acids Res 27:919-29；Vidal和Legrain，(1999)Trends Biotechnol 17:374-81；以及美国专利号5,525,490；5,955,280；和5,965,368]。
在某些实施方案中，主题化合物通过其与ActRII-ALK4配体相互作用的能力来鉴定。化合物和ActRII-ALK4配体之间的相互作用可以是共价的或非共价的。例如，可以使用体外生物化学方法在蛋白质水平下鉴定此类相互作用，所述方法包括光交联、放射性标记的配体结合和亲和层析[参见例如，Jakoby WB等人(1974)Methods in Enzymology46:1]。在某些情况下，可以在基于机制的测定，例如检测与ActRII-ALK4配体结合的化合物的测定中筛选化合物。这可以包括固相或液相结合事件。可替代地，编码ActRII-ALK4配体的基因可以用报道系统(例如，β-半乳糖苷酶、荧光素酶或绿色荧光蛋白)转染到细胞内，并且优选通过高通量筛选或用文库的各个成员针对文库进行筛选。可以使用其它基于机制的结合测定；例如，检测自由能变化的结合测定。结合测定可以用固定至孔、珠或芯片的靶执行，或者通过固定抗体捕获，或者通过毛细管电泳解析。通常可以使用比色终点或者荧光或表面等离子体共振来检测结合的化合物。
10.药物组合物
本文所述的治疗剂(例如，ActRII-ALK4拮抗剂)可以配制成药物组合物。用于按照本公开使用的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体或赋形剂以常规方式进行配制。此类制剂一般将是基本上无热原的，遵守大多数监管要求。
在某些实施方案中，本公开的治疗方法包括将组合物全身施用、或者作为植入物或装置局部施用。当施用时，用于本公开的治疗组合物是基本上无热原或无热原的生理学上可接受的形式。也可以任选地包括在如上所述的组合物中，除ActRII-ALK4拮抗剂外的治疗上有用的药剂，可以与本文公开的方法中的主题化合物同时或序贯施用。
通常，本文公开的蛋白质治疗剂将是肠胃外施用的，并且特别是静脉内或皮下施用的。适合于肠胃外施用的药物组合物可以包含与以下组合的一种或多种ActRII-ALK4拮抗剂：一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳状液，或者可以紧在使用前重构成无菌可注射的溶液或分散体的无菌粉末，其可能含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、致使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质、或助悬剂或增稠剂。可以用于本公开的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)及其合适的混合物、植物油例如橄榄油、以及可注射的有机酯例如油酸乙酯。适当的流动性可以例如通过以下得到维持：使用包衣材料例如卵磷脂、在分散体的情况下维持所需的粒度、以及使用表面活性剂。在一些实施方案中，肠胃外施用途径选自肌内、腹膜内、皮内、玻璃体内、硬膜外、大脑内、动脉内、关节内、海绵窦内、病灶内、骨内、眼内、鞘内、静脉内、经皮、经粘膜、羊膜外施用、皮下及其组合。在一些实施方案中，肠胃外施用途径是皮下的。在一些实施方案中，肠胃外施用途径是皮下注射。在一些实施方案中，本公开的组合物通过皮下注射进行施用。
需要时，组合物和制剂可以存在于包装或分配器装置中，其可以包含含有活性成分的一种或多种单位剂型。包装可以例如包含金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分配器装置可能伴随施用说明书
进一步地，组合物可以以用于递送至靶组织部位的形式进行封装或注射。在某些实施方案中，本发明的组合物可以包括这样的基质，其能够将一种或多种治疗化合物(例如，ActRII-ALK4拮抗剂)递送至靶组织部位，对于发育中的组织提供结构并且最佳地能够被再吸收到体内。例如，基质可以提供ActRII-ALK4拮抗剂的缓慢释放。此类基质可以由目前用于其它植入医疗应用中的材料形成。
基质材料的选择基于生物相容性、生物可降解性、机械性能、美容外观和界面性能。主题组合物的特定应用将限定适当的制剂。用于组合物的潜在基质可以是生物可降解的且化学成分确定的硫酸钙、磷酸三钙、羟磷灰石、聚乳酸和聚酸酐。其它潜在的材料是生物可降解的并且是生物学成分确定的，例如骨或真皮胶原。进一步的基质由纯蛋白质或细胞外基质组分构成。其它潜在的基质是生物不可降解的和化学成分确定的，例如烧结羟磷灰石、生物玻璃、铝酸盐或其它陶瓷。基质可以由任何上文提到类型的材料的组合构成，所述材料例如聚乳酸和羟磷灰石或胶原和磷酸三钙。生物陶瓷可以在组成例如钙-铝酸盐-磷酸盐方面改变，并且可以进行加工以改变孔径、粒度、颗粒形状和生物可降解性。
在某些实施方案中，本发明的方法可以用于口服施用，例如以胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用调味基质，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)、粉末、颗粒的形式，或者作为水性或非水性液体中的溶液或悬浮液，或者作为水包油或油包水液体乳状液，或者作为酏剂或糖浆剂，或者作为糖果锭剂(使用惰性基质，例如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶)和/或作为口腔洗剂等等，其各自含有预定量的药剂作为活性成分。药剂还可以作为大丸剂、药糖剂或糊剂施用。
在用于口服施用的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、粉末、颗粒等等)中，本发明的一种或多种治疗化合物可以与一种或多种药学上可接受的载体例如柠檬酸钠或磷酸二钙、和/或下述中的任一种混合：(1)填料或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，例如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，例如石蜡；(6)吸收加速剂，例如季铵化合物；(7)润湿剂，如例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，例如高岭土和膨润土粘土；(9)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠及其混合物；以及(10)着色剂。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可以包含缓冲剂。类似类型的固体组合物也可以用作软填充明胶胶囊和硬填充明胶胶囊中的填料，使用此类赋形剂如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugars)以及高分子量聚乙二醇等等。
用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳状液、微乳状液、溶液、悬浮液、糖浆剂和酏剂。除活性成分之外，液体剂型还可以含有本领域通常使用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。除了惰性稀释剂之外，口服组合物还可以包括佐剂，例如润湿剂、乳化和助悬剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。
除活性化合物之外，悬浮液还可以含有助悬剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminum metahydroxide)、膨润土、琼脂-琼脂和黄蓍胶及其混合物。
本发明的组合物还可以含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等等，可以确保微生物作用的预防。还可能期望在组合物内包括等渗剂，例如糖、氯化钠等等。另外，可以通过包括延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来达到可注射药物形式的延长吸收。
应理解，剂量方案将由主治医生考虑各种因素来确定，所述因素改变本公开的主题化合物(例如，ActRII-ALK4拮抗剂)的作用。各种因素包括但不限于患者的年龄、性别和饮食，疾病的严重程度、施用时间和其它临床因素。任选地，剂量可以随着重构中使用的基质类型和组合物中的化合物类型而变。向最终组合物中添加其它已知的生长因子也可能影响剂量。可以通过例如X射线(包括DEXA)、组织形态计量学确定和四环素标记定期评价骨生长和/或修复来监测进展。
在某些实施方案中，本发明还提供了用于ActRII-ALK4拮抗剂的体内产生的基因疗法。此类疗法通过将ActRII-ALK4拮抗剂多核苷酸序列引入具有如上文列出的病症的细胞或组织内来实现其疗效。ActRII-ALK4拮抗剂多核苷酸序列的递送可以使用重组表达载体例如嵌合病毒或胶体分散系统来实现。对于ActRII-ALK4拮抗剂多核苷酸序列的治疗性递送优选的是靶向脂质体的使用。
可以用于如本文教导的基因疗法的各种病毒载体包括腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒，或优选地RNA病毒例如逆转录病毒。优选地，逆转录病毒载体是鼠或禽逆转录病毒的衍生物。单个外源基因可以插入其中的逆转录病毒载体的实例包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)。许多另外的逆转录病毒载体可以掺入多重基因。所有这些载体都可以转移或掺入用于可选择标记物的基因，使得可以鉴定且生成转导的细胞。逆转录病毒载体可以通过附着例如糖、糖脂或蛋白质而制成靶特异性的。优选的靶向通过使用抗体来完成。本领域技术人员将认识到，可以将特异性多核苷酸序列插入逆转录病毒基因组内或附着至病毒包膜，以允许含有ActRII-ALK4拮抗剂的逆转录病毒载体的靶特异性递送。在一个优选实施方案中，载体靶向骨或软骨。
可替代地，可以通过常规磷酸钙转染，用编码逆转录病毒结构基因gag、pol和env的质粒直接转染组织培养细胞。然后用含有目的基因的载体质粒转染这些细胞。所得到的细胞将逆转录病毒载体释放到培养基内。
用于ActRII-ALK4拮抗剂多核苷酸的另一种靶向递送系统是胶体分散系统。胶体分散系统包括高分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠和基于脂质的系统包括水包油乳状液、胶束、混合胶束和脂质体。本发明优选的胶体系统是脂质体。脂质体是人工膜囊泡，其可用作体外和体内的递送媒介物。RNA、DNA和完整病毒粒子可以封装在水性内部内并以生物活性形式递送至细胞(参见例如，Fraley等人，Trends Biochem.Sci.，6:77，1981)。使用脂质体媒介物用于有效基因转移的方法是本领域已知的，参见例如Mannino等人，Biotechniques，6:682，1988。脂质体的组成通常是磷脂的组合，通常与类固醇尤其是胆固醇组合。也可以使用其它磷脂或其它脂质。脂质体的物理特性取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。
可用于脂质体生产的脂质的实例包括磷脂酰化合物，例如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂。示例性的磷脂包括卵磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱。脂质体的靶向基于例如器官特异性、细胞特异性和细胞器特异性也是可能的，并且是本领域已知的。
本公开提供了这样的制剂，其可以改变以包括酸和碱来调整pH；和缓冲剂以将pH保持在窄范围内。
范例
现在一般描述了本发明，它通过参考下述实施例将更容易理解，所述实施例仅仅包括用于说明本发明的某些实施方案的目的，并不旨在限制本发明。
实施例1：ActRIIA-Fc融合蛋白
构建了可溶性ActRIIA融合蛋白，其具有与人或小鼠Fc结构域融合的人ActRIIA的细胞外结构域，具有在其间的最小接头。构建体分别被称为ActRIIA-hFc和ActRIIA-mFc。
ActRIIA-hFc在下文显示为从CHO细胞系中纯化的(SEQ ID NO:380)：
缺少C末端赖氨酸的另外的ActRIIA-hFc在下文显示为从CHO细胞系中纯化的(SEQID NO:378)：
ActRIIA-hFc和ActRIIA-mFc蛋白在CHO细胞系中进行表达。考虑了三种不同的前导序列：
(i)蜜蜂蜂毒肽(HBML)：MKFLVNVALVFMVVYISYIYA(SEQ ID NO:7)
(ii)组织纤溶酶原激活物(TPA)：MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP(SEQ ID NO:8)
(iii)天然的：MGAAAKLAFAVFLISCSSGA(SEQ ID NO:379)。
所选形式采用TPA前导区并且具有下述未加工的氨基酸序列：
该多肽由下述核酸序列编码：
ActRIIA-hFc和ActRIIA-mFc两者均显著地顺应重组表达。如图14中所示的，蛋白质被纯化为单一、定义明确的蛋白质峰。N末端测序揭示了–ILGRSETQE(SEQ ID NO:383)的单一序列。纯化可以通过一系列柱层析步骤来实现，所述步骤包括例如以任何次序的下述中的三个或更多个：蛋白A层析、Q琼脂糖层析、苯基琼脂糖层析、尺寸排阻层析和阳离子交换层析。纯化可以用病毒过滤和缓冲液交换来完成。ActRIIA-hFc蛋白纯化至如通过尺寸排阻层析确定的>98％的纯度，以及如通过SDS PAGE确定的>95％的纯度。
ActRIIA-hFc和ActRIIA-mFc显示了对于配体的高亲和力。使用标准胺偶联程序，将GDF11或激活素A固定到BiacoreTMCM5芯片上。将ActRIIA-hFc和ActRIIA-mFc蛋白加载到系统上，并测量结合。ActRIIA-hFc以5x 10-12的解离常数(KD)与激活素结合，并且以9.96x10-9的KD与GDF11结合。参见图15A-B。使用类似的结合测定，ActRIIA-hFc确定为对于其它TGF-β超家族配体(包括例如激活素B、GDF8、BMP6和BMP10)具有高至中等亲和力。ActRIIA-mFc类似地表现。
ActRIIA-hFc在药代动力学研究中是非常稳定的。大鼠用1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg的ActRIIA-hFc蛋白进行给药，并且在24、48、72、144和168小时测量该蛋白的血浆水平。在分开的研究中，大鼠以1mg/kg、10mg/kg或30mg/kg进行给药。在大鼠中，ActRIIA-hFc具有11-14天的血清半衰期，并且药物的循环水平在两周后相当高(对于1mg/kg、10mg/kg或30mg/kg的初始施用分别为11μg/ml、110μg/ml或304μg/ml)。在食蟹猴中，血浆半衰期显著大于14天，并且药物的循环水平对于1mg/kg、10mg/kg或30mg/kg的初始施用分别为25μg/ml、304μg/ml或1440μg/ml。
实施例2：ActRIIA-hFc蛋白的表征
使用SEQ ID NO:8的组织纤溶酶原前导序列，在稳定转染的CHO-DUKX B11细胞中从pAID4载体(SV40 ori/增强子、CMV启动子)表达ActRIIA-hFc融合蛋白。如上文实施例1中所述的纯化的蛋白质具有SEQ ID NO:380的序列。Fc部分是人IgG1 Fc序列，如SEQ ID NO:380中所示。蛋白质分析揭示了ActRIIA-hFc融合蛋白形成为具有二硫键合的同二聚体。
CHO细胞表达的材料对于激活素B配体具有的亲和力高于对于人293细胞中表达的ActRIIA-hFc融合蛋白报道的[参见del Re等人(2004)J Biol Chem.279(51):53126-53135]。另外，TPA前导序列的使用提供了比其它前导序列更大的生产，并且与用天然前导区表达的ActRIIA-Fc不同，提供了高度纯的N末端序列。天然前导序列的使用导致ActRIIA-Fc的两个主要种类，各自具有不同的N末端序列。
实施例3：替代的ActRIIA-Fc蛋白
可以根据本文描述的方法使用的各种ActRIIA变体在公开为WO2006/012627的国际专利申请(参见例如第55-58页)中描述，所述国际专利申请通过引用以其整体并入本文。替代的构建体可以具有C末端尾部(ActRIIA的细胞外结构域的最后15个氨基酸)的缺失。关于此类构建体的序列在下文呈现(Fc部分加下划线)(SEQ ID NO:384)：
实施例4.ActRIIB-Fc融合多肽的生成
申请人构建了可溶性ActRIIB融合多肽，其具有与人G1Fc结构域融合的人ActRIIB的细胞外结构域，具有在两者之间的接头(三个甘氨酸氨基酸)。该构建体被称为ActRIIB(20-134)-G1Fc。
ActRIIB(20-134)-G1Fc在下文SEQ ID NO:5(其中接头加下划线)中显示为从CHO细胞系中纯化的：
缺少C末端赖氨酸的另外的ActRIIB(20-134)-G1Fc在下文显示为从CHO细胞系中纯化的(SEQ ID NO:385)：
ActRIIB(20-134)-G1Fc多肽在CHO细胞系中进行表达。考虑了三种不同的前导序列：
(i)蜜蜂蜂毒肽(HBML)：MKFLVNVALVFMVVYISYIYA(SEQ ID NO:7)
(ii)组织纤溶酶原激活物(TPA)：MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP(SEQ ID NO:8)
(iii)天然的：mtapwvalallwgslcag(SEQ ID NO:9)。
所选形式采用TPA前导区并且具有下述未加工的氨基酸序列：
(SEQ ID NO:6)
该多肽由下述核酸序列(SEQ ID NO:10)编码：
CHO细胞产生的材料的N末端测序揭示了–GRGEAE(SEQ ID NO:11)的主要序列。值得注意的是，文献中报道的其它构建体以–SGR…序列开始。
纯化可以通过一系列柱层析步骤来实现，所述步骤包括例如以任何次序的下述中的三个或更多个：蛋白A层析、Q琼脂糖层析、苯基琼脂糖层析、尺寸排阻层析和阳离子交换层析。纯化可以用病毒过滤和缓冲液交换来完成。
ActRIIB(20-134)-Fc融合多肽也在HEK293细胞和COS细胞中进行表达。尽管来自所有细胞系的材料和合理的培养条件提供了具有体内肌肉构建活性的多肽，但观察到可能与细胞系选择和/或培养条件有关的在效力中的变异性。
实施例5.计算方法
激活素IIB受体(ActRIIB)结合多重TGFβ超家族配体，包括刺激Smad2/3激活的激活素A、激活素B、GDF8和GDF11，以及刺激Smad1/5/8激活的骨形态发生蛋白(BMP)例如BMP9和BMP10。ActRIIB-Fc融合多肽可以充当配体陷阱，其与可溶性配体结合并通过阻止配体与细胞表面受体结合来阻断Smad激活。已知BMP9介导的Smad1/5/8激活的ActRIIB-Fc拮抗导致不希望有的副作用，包括鼻出血和毛细血管扩张(Campbell，C.等人MuscleNerve 55:458-464，2017)。为了设计在ActRIIB中缩减BMP9结合，同时保留与刺激Smad2/3激活的配体的结合的突变，我们比较了三种ActRIIB配体复合物的晶体结构：(1)BMP9:ActRIIB:Alk1，PDB ID＝4fao，(2)ActRIIB:Activin A，PDB ID:1s4y，以及(3)GDF11:ActRIIB:Alk5，PDBID:6mac(可从蛋白质数据库(Protein Data Bank)(PDB)https://www.rcsb.org/获得)。基于晶体结构在ActRIIB和三种配体之间的接触比较，通过相同的对应ActRIIB残基所接触的配体残基的电荷、极性和疏水性差异，揭示了关于突变焦点的残基。在鉴定靶向用于突变的残基后，Bioluminate生物制剂建模软件平台(版本2017-4：Bioluminate，LLC，NewYork，NY)用于在计算上预测ActRIIB中的突变，其将缩减与BMP9的结合，同时维持其它配体结合活性。
由晶体结构的比较鉴定的所有残基都考虑用于突变。考虑结构复合物中的分子稳定性和亲和力两者执行残基扫描计算，产生关于每个分子(配体和受体)和复合物结构的潜在突变和能量、以及关于野生型和突变体形式两者的能量差异的指定列表。在分析亲和力/稳定性/初始能量等参数后，鉴定了前5％-10％的单一突变。该分析随后为这些突变的潜在组合。所选的单一突变和突变组合在结构上进行分析，以便理解结构差异和形成/丧失的接触。最终，对于每种复合物(ActRIIB:配体)筛选了817个单一突变，并且基于Δ亲和力选择顶部命中，并且还选择性考虑了Δ稳定性(溶剂化)和Δ初始能量。在剔除异常值时还考虑了其它限制。
实施例6.变体ActRIIB-Fc多肽的生成
基于实施例4中描述的发现，申请人生成了在ActRIIB的细胞外结构域中的一系列突变(序列变异)，并且产生了这些变体多肽作为可溶性同二聚体融合多肽，其包含通过任选的接头连接的变体ActRIIB细胞外结构域和Fc结构域。用于生成变体ActRIIB-Fc多肽的背景ActRIIB-Fc融合物是ActRIIB-G1Fc，并且在上文实施例4中显示为SEQ ID NO:5。
将各种取代突变引入背景ActRIIB-G1Fc多肽内。基于实施例4中呈现的数据，预计如果用TPA前导区表达，则这些构建体将缺少N末端丝氨酸。因此，大多数成熟序列可能以甘氨酸(缺少N末端丝氨酸)开始，但一些物种可能呈现有N末端丝氨酸。通过PCR诱变在ActRIIB细胞外结构域中生成突变。在PCR后，片段通过Qiagen柱进行纯化，用SfoI和AgeI进行消化并进行凝胶纯化。将这些片段连接到表达载体pAID4内(参见WO2006/012627)，使得在连接后，它产生与人IgG1的融合嵌合体。在转化到大肠杆菌DH5α内之后，挑取菌落并分离DNA。对于鼠构建体，鼠IgG2a取代了人IgG1。所有突变体都进行序列验证。
未加工的ActRIIB(F82I-N83R)-G1Fc的氨基酸序列显示于下文(SEQ ID NO:276)。信号序列和接头序列通过实线下划线指示，并且F82I和N83R取代通过指示。SEQID NO:276的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
该ActRIIB(F82I-N83R)-G1Fc融合多肽由下述核酸序列(SEQ ID NO:277)编码：
/>
成熟的ActRIIB(F82I-N83R)-G1Fc融合多肽(SEQ ID NO:278)如下，并且可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
(SEQ ID NO:278)
未加工的ActRIIB(F82K-N83R)-G1Fc的氨基酸序列显示于下文(SEQ ID NO:279)。信号序列和接头序列通过实线下划线指示，并且F82K和N83R取代通过指示。SEQID NO:279的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
该ActRIIB(F82K-N83R)-G1Fc融合多肽由下述核酸序列(SEQ ID NO:331)编码：
成熟的ActRIIB(F82K-N83R)-G1Fc融合多肽(SEQ ID NO:332)如下，并且可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
(SEQ ID NO:332)
未加工的ActRIIB(F82T-N83R)-G1Fc的氨基酸序列显示于下文(SEQ ID NO:333)。信号序列和接头序列通过实线下划线指示，并且F82T和N83R取代通过指示。SEQID NO:333的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
该ActRIIB(F82T-N83R)-G1Fc融合多肽由下述核酸序列(SEQ ID NO:334)编码：
成熟的ActRIIB(F82T-N83R)-G1Fc融合多肽(SEQ ID NO:335)如下，并且可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
(SEQ ID NO:335)
未加工的ActRIIB(F82T)-G1Fc的氨基酸序列显示于下文(SEQ ID NO:336)。信号序列和接头序列通过实线下划线指示，并且F82T取代通过指示。SEQ ID NO:336的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
该ActRIIB(F82T)-G1Fc融合多肽由下述核酸序列(SEQ ID NO:337)编码：
/>
成熟的ActRIIB(F82T)-G1Fc融合多肽(SEQ ID NO:338)如下，并且可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
(SEQ ID NO:338)
未加工的ActRIIB(L79H-F82I)-G1Fc的氨基酸序列显示于下文(SEQ ID NO:339)。信号序列和接头序列通过实线下划线指示，并且L79H和F82I取代通过指示。SEQID NO:339的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。/>
该ActRIIB(L79H-F82I)-G1Fc融合多肽由下述核酸序列(SEQ ID NO:340)编码：
成熟的ActRIIB(L79H-F82I)-G1Fc融合多肽(SEQ ID NO:341)如下，并且可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
(SEQ ID NO:341)
未加工的ActRIIB(L79H)-G1Fc的氨基酸序列显示于下文(SEQ ID NO:342)。信号序列和接头序列通过实线下划线指示，并且L79H取代通过指示。SEQ ID NO:342的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
该ActRIIB(L79H)-G1Fc融合多肽由下述核酸序列(SEQ ID NO:343)编码：
/>
成熟的ActRIIB(L79H)-G1Fc融合多肽(SEQ ID NO:344)如下，并且可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
(SEQ ID NO:344)
未加工的ActRIIB(L79H-F82K)-G1Fc的氨基酸序列显示于下文(SEQ ID NO:345)。信号序列和接头序列通过实线下划线指示，并且L79H和F82K取代通过指示。SEQ ID NO:345的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。/>
该ActRIIB(L79H-F82K)-G1Fc融合多肽由下述核酸序列(SEQ ID NO:346)编码：
成熟的ActRIIB(L79H-F82K)-G1Fc融合多肽(SEQ ID NO:347)如下，并且可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
(SEQ ID NO:347)
未加工的ActRIIB(E50L)-G1Fc的氨基酸序列显示于下文(SEQ ID NO:348)。信号序列和接头序列通过实线下划线指示，并且E50L取代通过指示。SEQ ID NO:348的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
该ActRIIB(E50L)-G1Fc融合多肽由下述核酸序列(密码子优化的)(SEQ ID NO:349)编码：
/>
成熟的ActRIIB(E50L)-G1Fc融合多肽(SEQ ID NO:350)如下，并且可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
(SEQ ID NO:350)
未加工的ActRIIB(L38N-L79R)-G1Fc的氨基酸序列显示于下文(SEQ ID NO:351)。信号序列和接头序列通过实线下划线指示，并且L38N和L79R取代通过指示。SEQ ID NO:351的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
/>
该ActRIIB(L38N-L79R)-G1Fc融合多肽由下述核酸序列(SEQ ID NO:352)编码：
成熟的ActRIIB(L38N-L79R)-G1Fc融合多肽(SEQ ID NO:353)如下，并且可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
(SEQ ID NO:353)
未加工的ActRIIB(V99G)-G1Fc的氨基酸序列显示于下文(SEQ ID NO:354)。信号序列和接头序列通过实线下划线指示，并且V99G取代通过指示。SEQ ID NO:354的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
该ActRIIB(V99G)-G1Fc融合多肽由下述核酸序列(密码子优化的)(SEQ ID NO:355)编码：
/>
成熟的ActRIIB(V99G)-G1Fc融合多肽(SEQ ID NO:356)如下，并且可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
(SEQ ID NO:356)
构建体通过瞬时感染在COS或CHO细胞中进行表达，并且通过过滤和蛋白A层析进行纯化。在一些情况下，用条件培养基而不是纯化的多肽执行测定。通过SDS-PAGE和分析型尺寸排阻层析评估用于报道基因测定的样品的纯度。
在下文描述的结合测定和/或生物测定中测试突变体。
可替代地，可以将类似的突变引入具有五个氨基酸的N末端截短和三个氨基酸的C末端截短的ActRIIB细胞外结构域内，如下文所示(SEQ ID NO:357)。基于SEQ ID NO:2中的编号，该截短的ActRIIB细胞外结构域表示为ActRIIB(25-131)。
相应的背景融合多肽ActRIIB(25-131)-G1Fc显示于下文(SEQ ID NO:12)。
实施例7.变体ActRIIB-Fc多肽的活性和配体结合谱
为了确定变体ActRIIB-Fc同二聚体的配体结合谱，基于BiacoreTM的结合测定用于比较某些变体ActRIIB-Fc多肽的配体结合动力学。使用抗Fc抗体，将待测试的ActRIIB-Fc多肽独立地捕获到系统上。然后将配体注入并允许流过捕获的受体蛋白。在37℃下分析的变体ActRIIB-Fc多肽的结果显示于图16A和16B中。ActRIIB-G1Fc用作对照多肽。
为了确定变体ActRIIB-Fc多肽的活性，基于A204细胞的测定用于在变体ActRIIB-Fc多肽中比较与ActRIIB-G1Fc相比，对通过激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP9和BMP10的信号传导的作用。简言之，该测定使用衍生自肌肉的人A204横纹肌肉瘤细胞系(HTB-82TM)和报道载体pGL3(CAGA)12(Dennler等人，1998，EMBO 17:3091-3100)以及海肾报道质粒(pRLCMV)来控制转染效率。CAGA12基序存在于TGF-β响应基因(例如PAI-1基因)中，因此该载体一般用于可以通过Smad2/3发信号的配体，包括激活素A、GDF11和BMP9。
在第1天时，将A204细胞转移到一个或多个48孔板内。在第2天时，用10μg pGL3(CAGA)12或pGL3(CAGA)12(10μg)+pRLCMV(1μg)和Fugene转染这些细胞。在第3天时，使在含有0.1％BSA的培养基中稀释的配体与ActRIIB-Fc多肽一起预温育1小时，然后加入细胞中。大约六小时后，细胞用PBS进行冲洗并裂解。在萤光素酶测定中分析细胞裂解物，以确定Smad激活的程度。
该测定用于筛选变体ActRIIB-Fc多肽对通过激活素A、激活素B、GDF8、GDF11、BMP9和BMP10的细胞信号传导的抑制作用。在人ActRIIB细胞外结构域中掺入氨基酸取代的同二聚体Fc融合多肽的效力与包含未修饰的人ActRIIB细胞外结构域的Fc融合多肽ActRIIB-G1Fc的效力进行比较。对于测试的一些变体，无法计算准确的IC50，但可检测到曲线斜率的抑制征兆。对于这些变体，包括相对IC50的数量级的估计量，即>10nM或>100nM，而不是明确的数字。此类数据点通过下表13中的(*)指示。对于测试的一些变体，在测试的浓度范围内的曲线斜率中不存在可检测到的抑制，其在表13中通过“ND”指示。
表13.同二聚体ActRIIB-Fc构建体的抑制效力。
如上表13以及图16A和16B中所示的，ActRIIB细胞外结构域中的氨基酸取代可以改变各种体外测定中的ActRIIB:配体结合和下游信号传导活性之间的平衡。一般而言，申请人达到了生成在ActRIIB细胞外结构域中的变体的目标，与含有未修饰的ActRIIB细胞外结构域的融合多肽(ActRIIB-G1Fc)相比，所述变体显示出与BMP9减少或无法检测的结合，同时保留其它配体结合性质。
另外，与ActRIIB-G1Fc相比，变体ActRIIB(L79H-F82I)、ActRIIB(L79H)和ActRIIB(L79H-F82K)在证实与BMP9的结合减少的同时，也显示出在激活素A结合中的显著减少，同时保留对于激活素B相对高的亲和力。表13中显示抑制效力的IC50值与该配体结合趋势一致。类似地，变体ActRIIB(F82K-N83R)、ActRIIB(F82I-N83R)和ActRIIB(F82T-N83R)证实了类似的趋势。
此外，与ActRIIB-G1Fc相比，变体ActRIIB(F82K-N83R)、ActRIIB(F82I-N83R)、ActRIIB(F82T-N83R)和ActRIIB(L79H-F82K)在证实与BMP9的结合减少并保留对于激活素B相对高的亲和力的同时，也显示出在GDF8和GDF11结合中的显著减少。表13中显示抑制效力的IC50值与该配体结合趋势一致。
进一步注意到，与ActRIIB-G1Fc相比，变体ActRIIB(L79H-F82I)、ActRIIB(L79H)和ActRIIB(L79H-F82K)在证实与BMP9的结合减少并保留对于激活素B相对高的亲和力的同时，也显示出在BMP10结合中的显著减少。表13中显示抑制效力的IC50值与该配体结合趋势一致。
因此，除达到产生显示出与BMP9的降低结合至无法检测到的结合的ActRIIB变体的目标之外，申请人还已生成了多种多样的新型变体多肽，其中许多的特征部分在于独特的配体结合/抑制谱。相应地，在其中此类选择性拮抗作用有利的某些应用中，这些变体可能比ActRIIB-G1Fc更有用。实例包括其中期望保留激活素B的拮抗作用，同时降低BMP9以及任选地激活素A、GDF8、GDF11和BMP10中的一种或多种的拮抗作用的治疗应用。
实施例8.变体ActRIIB-Fc多肽的生成
申请人生成了在ActRIIB的细胞外结构域中的一系列突变(序列变异)，并且产生了作为可溶性同二聚体融合多肽的这些变体多肽，其包含通过任选的接头连接的变体ActRIIB细胞外结构域和Fc结构域。背景ActRIIB-Fc融合物是如SEQ ID NO:5中所示的ActRIIB-G1Fc。
将各种取代突变引入背景ActRIIB-Fc多肽内。基于实施例4中呈现的数据，预计如果用TPA前导区表达，则这些构建体将缺少N末端丝氨酸。通过PCR诱变在ActRIIB细胞外结构域中生成突变。在PCR后，片段通过Qiagen柱进行纯化，用SfoI和AgeI进行消化并进行凝胶纯化。将这些片段连接到表达载体pAID4内(参见WO2006/012627)，使得在连接后，它产生与人IgG1的融合嵌合体。在转化到大肠杆菌DH5α内之后，挑取菌落并分离DNA。对于鼠构建体，鼠IgG2a取代了人IgG1。所有突变体都进行序列验证。
未加工的ActRIIB(K55A)-G1Fc的氨基酸序列显示于下文(SEQ ID NO:31)。信号序列和接头序列通过实线下划线指示，并且K55A取代通过指示。SEQ ID NO:31的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
该ActRIIB(K55A)-G1Fc融合多肽由下述核酸序列(SEQ ID NO:32)编码：
成熟的ActRIIB(K55A)-G1Fc融合多肽(SEQ ID NO:33)如下，并且可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
(SEQ ID NO:33)
未加工的ActRIIB(K55E)-G1Fc的氨基酸序列显示于下文(SEQ ID NO:34)。信号序列和接头序列通过实线下划线指示，并且K55E取代通过指示。SEQ ID NO:34的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
该ActRIIB(K55E)-G1Fc融合多肽由下述核酸序列(SEQ ID NO:35)编码：
成熟的ActRIIB(K55E)-G1Fc融合多肽(SEQ ID NO:36)如下，并且可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
(SEQ ID NO:36)
未加工的ActRIIB(F82I)-G1Fc的氨基酸序列显示于下文(SEQ ID NO:37)。信号序列和接头序列通过实线下划线指示，并且F82I取代通过指示。SEQ ID NO:37的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
该ActRIIB(F82I)-G1Fc融合多肽由下述核酸序列(SEQ ID NO:38)编码：
成熟的ActRIIB(F82I)-G1Fc融合多肽(SEQ ID NO:39)如下，并且可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
(SEQ ID NO:39)
未加工的ActRIIB(F82K)-G1Fc的氨基酸序列显示于下文(SEQ ID NO:40)。信号序列和接头序列通过实线下划线指示，并且F82K取代通过指示。SEQ ID NO:40的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
该ActRIIB(F82K)-G1Fc融合多肽由下述核酸序列(SEQ ID NO:41)编码：
成熟的ActRIIB(F82K)-G1Fc融合多肽(SEQ ID NO:42)如下，并且可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
(SEQ ID NO:42)
构建体在COS或CHO细胞中进行表达，并且通过过滤和蛋白A层析进行纯化。在一些情况下，用条件培养基而不是纯化的蛋白质执行测定。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析评估用于报道基因测定的样品的纯度。
在下文描述的结合测定和/或生物测定中测试突变体。
可替代地，可以将类似的突变引入具有五个氨基酸的N末端截短和三个氨基酸的C末端截短的ActRIIB细胞外结构域内，如下文所示(SEQ ID NO:53)。基于SEQ ID NO:2中的编号，该截短的ActRIIB细胞外结构域表示为ActRIIB(25-131)。
相应的背景融合多肽ActRIIB(25-131)-G1Fc显示于下文(SEQ ID NO:12)。
实施例9.在基于细胞的测定中变体ActRIIB-Fc同二聚体的配体结合谱和变体 ActRIIB-Fc多肽的活性
为了确定变体ActRIIB-Fc同二聚体的配体结合谱，基于BiacoreTM的结合测定用于比较某些变体ActRIIB-Fc多肽的配体结合动力学。使用抗Fc抗体，将待测试的ActRIIB-Fc多肽独立地捕获到系统上。然后将配体注入并允许流过捕获的受体蛋白。在37℃下分析的变体ActRIIB-Fc多肽的结果显示于图17中。与包含未修饰的ActRIIB细胞外结构域的Fc融合多肽相比，变体多肽ActRIIB(K55A)-Fc、ActRIIB(K55E)-Fc、ActRIIB(F82I)-Fc和ActRIIB(F82K)-Fc显示出在其对于BMP9的亲和力方面比对于GDF11更大的降低。在25℃下分析的另外的变体ActRIIB-Fc多肽的结果显示于图18中。
这些结果确认了K55A、K55E、F82I和F82K作为降低ActRIIB对于BMP9的结合亲和力多于它们降低ActRIIB对于激活素A或GDF11的亲和力的取代。相应地，在其中此类选择性拮抗作用有利的某些应用中，这些变体ActRIIB-Fc多肽可能比未修饰的ActRIIB-Fc多肽更有用。实例包括其中期望保留激活素A、激活素B、GDF8和GDF11中的一种或多种的拮抗作用，同时降低BMP9的拮抗作用的治疗应用。
为了确定变体ActRIIB-Fc多肽的活性，基于A204细胞的测定用于在变体ActRIIB-Fc多肽中比较对通过激活素A、GDF11和BMP9的信号传导的作用。简言之，该测定使用衍生自肌肉的人A204横纹肌肉瘤细胞系(HTB-82TM)和报道载体pGL3(CAGA)12(Dennler等人，1998，EMBO 17:3091-3100)以及海肾报道质粒(pRLCMV)来控制转染效率。CAGA12基序存在于TGF-β响应基因(例如PAI-1基因)中，因此该载体一般用于可以通过Smad2/3发信号的配体，包括激活素A、GDF11和BMP9。
在第1天时，将A-204细胞转移到一个或多个48孔板内。在第2天时，用10μg pGL3(CAGA)12或pGL3(CAGA)12(10μg)+pRLCMV(1μg)和Fugene转染这些细胞。在第3天时，使在含有0.1％BSA的培养基中稀释的配体与ActRIIB-Fc多肽一起预温育1小时，然后加入细胞中。大约六小时后，细胞用PBS进行冲洗并裂解。在萤光素酶测定中分析细胞裂解物，以确定Smad激活的程度。
该测定用于筛选变体ActRIIB-Fc多肽对通过激活素A、GDF11和BMP9的细胞信号传导的抑制作用。在人ActRIIB细胞外结构域中掺入氨基酸取代的同二聚体Fc融合多肽的效力与包含未修饰的人ActRIIB细胞外结构域的Fc融合多肽的效力进行比较。
如上表中所示的，ActRIIB细胞外结构域中的单个氨基酸取代可以改变在基于细胞的报道基因测定中的激活素A或GDF11抑制和BMP9抑制之间的平衡。与含有未修饰的ActRIIB细胞外结构域的融合多肽相比，变体ActRIIB(K55A)-Fc、ActRIIB(K55E)-Fc、ActRIIB(F82I)-Fc和ActRIIB(F82K)-Fc显示了较不有力的BMP9的抑制(增加的IC50值)，同时维持基本上未缩减的激活素A和GDF11的抑制。
这些结果指示了，与包含未修饰的ActRIIB细胞外结构域的Fc融合多肽相比，变体ActRIIB-Fc多肽例如ActRIIB(K55A)-Fc、ActRIIB(K55E)-Fc、ActRIIB(F82I)-Fc和ActRIIB(F82K)-Fc是更具选择性的激活素A和GDF11的拮抗剂。相应地，在其中此类选择性拮抗作用有利的某些应用中，这些变体可能比ActRIIB-Fc更有用。实例包括其中期望保留激活素A、GDF8和GDF11中的一种或多种的拮抗作用，同时降低BMP9和潜在地BMP10的拮抗作用的治疗应用。
实施例10.ActRIIB-Fc:ActRIIB(L79E)-Fc异二聚体的生成
申请人设想了生成可溶性ActRIIB-Fc:ActRIIB(L79E)-Fc异聚复合物，其包含各自分开融合至G1Fc结构域的未修饰的人ActRIIB的细胞外结构域和在位置79处具有亮氨酸至谷氨酸取代的人ActRIIB，具有置于细胞外结构域和G1Fc结构域之间的接头。各个构建体分别被称为ActRIIB-Fc融合多肽和ActRIIB(L79E)-Fc融合多肽，并且下文提供了关于各自的序列。
与ActRIIB-Fc或ActRIIB(L79E)-Fc同二聚体复合物形成对比，用于促进ActRIIB-Fc:ActRIIB(L79E)-Fc异聚复合物形成的方法是在Fc结构域的氨基酸序列中引入改变，以引导不对称异聚复合物的形成。本公开中描述了使用Fc结构域制备不对称相互作用对的许多不同方法。
在一种方法中，分别在SEQ ID NO:43-45和46-48的ActRIIB(L79E)-Fc和ActRIIB-Fc多肽序列中示出的，一个Fc结构域可以进行改变，以在相互作用面处引入阳离子氨基酸，而另一个Fc结构域可以进行改变，以在相互作用面处引入阴离子氨基酸。ActRIIB(L79E)-Fc融合多肽和ActRIIB-Fc融合多肽各自可以采用TPA前导区(SEQ ID NO:8)。
ActRIIB(L79E)-Fc多肽序列(SEQ ID NO:43)显示于下文：
前导(信号)序列和接头是加下划线的，并且L79E取代通过 指示。为了促进ActRIIB-Fc:ActRIIB(L79E)-Fc异二聚体而不是可能的同二聚体复合物中任一的形成，可以将两个氨基酸取代(用酸性氨基酸替换赖氨酸)引入ActRIIB融合多肽的Fc结构域内，如通过上文的/> 指示的。SEQ ID NO:43的氨基酸序列可以任选地提供有加入C末端的赖氨酸。
该ActRIIB(L79E)-Fc融合多肽可以由下述核酸序列(SEQ ID NO:44)编码：
成熟的ActRIIB(L79E)-Fc融合多肽(SEQ ID NO:45)如下，并且可以任选地提供有加入C末端的赖氨酸。
(SEQ ID NO:45)
ActRIIB-Fc融合多肽的互补形式(SEQ ID NO:46)如下：
前导序列和接头序列是加下划线的。为了引导与上文SEQ ID NO:43和45的ActRIIB(L79E)-Fc融合多肽的异二聚体形成，可以将两个氨基酸取代(用赖氨酸替换谷氨酸和天冬氨酸)引入ActRIIB-Fc融合多肽的Fc结构域内，如通过上文的双下划线指示的。SEQ ID NO:46的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
该ActRIIB-Fc融合多肽可以由下述核酸(SEQ ID NO:47)编码：
成熟的ActRIIB-Fc融合多肽序列(SEQ ID NO:48)如下，并且可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸：
(SEQ ID NO:48)
分别地，SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:48的ActRIIB(L79E)-Fc和ActRIIB-Fc多肽可以共表达且从CHO细胞系中纯化，以产生包含ActRIIB-Fc:ActRIIB(L79E)-Fc的异聚多肽复合物。
在促进使用不对称Fc融合多肽的异多聚体复合物形成的另一种方法中，Fc结构域可以进行改变，以引入互补的疏水相互作用和另外的分子间二硫键，如分别在SEQ ID NO:49-50和51-52的ActRIIB(L79E)-Fc和ActRIIB-Fc多肽序列中示出的。ActRIIB(L79E)-Fc融合多肽和ActRIIB-Fc融合多肽各自可以采用TPA前导区(SEQ ID NO:8)。ActRIIB(L79E)-Fc多肽序列(SEQ ID NO:49)显示于下文：
信号序列和接头序列是加下划线的，并且L79E取代通过指示。为了促进ActRIIB-Fc:ActRIIB(L79E)-Fc异二聚体而不是可能的同二聚体复合物中任一的形成，可以将两个氨基酸取代(用半胱氨酸替换丝氨酸且用色氨酸替换苏氨酸)引入融合多肽的Fc结构域内，如通过上文的/>指示的。SEQ ID NO:49的氨基酸序列可以任选地提供有加入C末端的赖氨酸。成熟的ActRIIB(L79E)-Fc融合多肽(SEQ ID NO:50)如下：
(SEQ ID NO:50)
ActRIIB-Fc融合多肽的互补形式(SEQ ID NO:51)如下，并且可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
前导序列和接头是加下划线的。为了引导与上文SEQ ID NO:49-50的ActRIIB(L79E)-Fc融合多肽的异二聚体形成，可以将四个氨基酸取代(用半胱氨酸替换酪氨酸，用丝氨酸替换苏氨酸，用丙氨酸替换亮氨酸且用缬氨酸替换酪氨酸)引入ActRIIB-Fc融合多肽的Fc结构域内，如通过上文的双下划线指示的。SEQ ID NO:51的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
成熟的ActRIIB-Fc融合多肽序列如下，并且可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
(SEQ ID NO:52)
分别地，SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:52的ActRIIB(L79E)-Fc和ActRIIB-Fc多肽可以共表达且从CHO细胞系中纯化，以产生包含ActRIIB-Fc:ActRIIB(L79E)-Fc的异聚多肽复合物。
各种ActRIIB-Fc:ActRIIB(L79E)-Fc复合物的纯化可以通过一系列柱层析步骤来实现，所述步骤包括例如以任何次序的下述中的三个或更多个：蛋白A层析、Q琼脂糖层析、苯基琼脂糖层析、尺寸排阻层析、阳离子交换层析、多模式层析(例如，用含有静电和疏水配体两者的树脂)和基于表位的亲和层析(例如，用针对ActRIIB表位的抗体或功能上等价的配体)。纯化可以用病毒过滤和缓冲液交换来完成。
实施例11.ActRIIB-Fc:ActRIIB(L79E)-Fc异聚体的配体结合谱
基于BiacoreTM的结合测定用于比较ActRIIB-Fc:ActRIIB(L79E)-Fc异二聚体与未修饰的ActRIIB-Fc同二聚体的配体结合动力学。使用抗Fc抗体，将融合蛋白捕获到系统上。然后在37℃下将配体注入并允许流过捕获的受体蛋白。结果概括于下表中，其中最指示有效配体陷阱的配体解离速率(kd)以粗体表示。
在该实施例中，两条ActRIIB多肽链之一中的单个氨基酸取代改变了Fc融合多肽相对于未修饰的ActRIIB-Fc同二聚体的配体结合选择性。与ActRIIB-Fc同二聚体相比，ActRIIB(L79E)-Fc异二聚体在很大程度上保留了与激活素B、GDF8、GDF11和BMP6的高亲和力结合，但显示出对于激活素A和BMP10快大约十倍的解离速率，以及在与BMP9的结合强度方面甚至更大的降低。相应地，在其中此类选择性拮抗作用有利的某些应用中，变体ActRIIB-Fc异聚体可能比未修饰的ActRIIB-Fc同二聚体更有用。实例包括其中期望保留激活素B、GDF8、GDF11和BMP6中的一种或多种的拮抗作用，同时降低激活素A、BMP9或BMP10的拮抗作用的治疗应用。9.ActRIIB突变体的生成：
生成了在ActRIIB的细胞外结构域中的一系列突变，并且这些突变体多肽作为在细胞外ActRIIB和Fc结构域之间的可溶性融合多肽产生。激活素和细胞外ActRIIB的共晶结构并未显示细胞外结构域的最后(C末端)15个氨基酸(本文中被称为“尾部”)在配体结合中的任何作用。该序列未能在晶体结构上解析，提示了这些残基存在于在晶体中并非均匀地包裹的柔性环中。Thompson EMBO J.2003年4月1日；22(7):1555-66。该序列在ActRIIB和ActRIIA之间也是弱保守的。相应地，在基本或背景ActRIIB-Fc融合构建体中省略了这些残基。另外，在该实施例中，在背景形式中的位置64被丙氨酸占据。因此，在该实施例中的背景ActRIIB-Fc融合物具有以下序列(Fc部分加下划线)(SEQ ID NO:54)：
令人惊讶的是，如下文讨论的，发现C末端尾部增强激活素和GDF-11结合，因此ActRIIB-Fc的优选形式具有以下序列(Fc部分加下划线)(SEQ ID NO:55)：
将各种突变引入背景ActRIIB-Fc多肽内。通过PCR诱变在ActRIIB细胞外结构域中生成突变。在PCR后，片段通过Qiagen柱进行纯化，用SfoI和AgeI进行消化并进行凝胶纯化。将这些片段连接到表达载体pAID4内，使得在连接后，它产生与人IgG1的融合嵌合体。分离DNA。所有突变体都通过瞬时转染在HEK293T细胞中产生。总之，在500ml旋转器中，HEK293T细胞以6x105个细胞/ml设置在250ml体积的Freestyle(Invitrogen)培养基中，并且生长过夜。第二天，用DNA:PEI(1:1)复合物以0.5ug/ml最终DNA浓度处理这些细胞。在4小时后，添加250ml培养基并且使细胞生长7天。通过使细胞向下旋转并浓缩来收获条件培养基。
所有突变体都在蛋白A柱上纯化，并且用低pH(3.0)甘氨酸缓冲液洗脱。在中和后，这些针对PBS进行透析。
突变体也通过类似的方法在CHO细胞中产生。
在下文描述的结合测定和生物测定中测试突变体。在CHO细胞和HEK293细胞中表达的蛋白质在结合测定和生物测定中无法区分。
实施例12：ActRIIB-ALK4异二聚体的生成
构建了ActRIIB-Fc:ALK4-Fc异聚复合物，其包含各自分开融合至Fc结构域的人ActRIIB和人ALK4的细胞外结构域，具有置于细胞外结构域和Fc结构域之间的接头。各个构建体分别被称为ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽，并且下文提供了关于各自的序列。
与ActRIIB-Fc或ALK4-Fc同二聚体复合物形成对比，用于促进ActRIIB-Fc:ALK4-Fc异聚复合物形成的方法是在Fc结构域的氨基酸序列中引入改变，以引导不对称异聚复合物的形成。本公开中描述了使用Fc结构域制备不对称相互作用对的许多不同方法。
在一种方法中，分别在SEQ ID NO:396和398以及SEQ ID NO:88和89的ActRIIB-Fc和ALK4-Fc多肽序列中示出的，一个Fc结构域进行改变，以在相互作用面处引入阳离子氨基酸，而另一个Fc结构域进行改变，以在相互作用面处引入阴离子氨基酸。ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽各自采用组织纤溶酶原激活物(TPA)前导区。
ActRIIB-Fc多肽序列(SEQ ID NO:396)显示于下文：
前导(信号)序列和接头是加下划线的。为了促进ActRIIB-Fc:ALK4-Fc异二聚体而不是可能的同二聚体复合物中任一的形成，可以将两个氨基酸取代(用赖氨酸替换酸性氨基酸)引入ActRIIB融合蛋白的Fc结构域内，如通过上文的指示的。SEQ ID NO:396的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸(K)。
该ActRIIB-Fc融合蛋白由下述核酸序列(SEQ ID NO:397)编码：
/>
成熟的ActRIIB-Fc融合多肽(SEQ ID NO:398)如下，并且可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸(K)。
(SEQ ID NO:398)
ALK4-Fc融合多肽的互补形式(SEQ ID NO:88)如下：
前导序列和接头是加下划线的。为了引导与上文SEQ ID NO:396和398的ActRIIB-Fc融合多肽的异二聚体形成，可以将两个氨基酸取代(用天冬氨酸替换赖氨酸)引入ALK4-Fc融合多肽的Fc结构域内，如通过上文的指示的。SEQ ID NO:88的氨基酸序列可以任选地提供有在C末端处加入的赖氨酸(K)。
该ALK4-Fc融合蛋白由下述核酸(SEQ ID NO:243)编码：
/>
成熟的ALK4-Fc融合蛋白序列(SEQ ID NO:89)如下，并且可以任选地提供有在C末端处加入的赖氨酸(K)。
分别地，SEQ ID NO:398和SEQ ID NO:89的ActRIIB-Fc和ALK4-Fc蛋白可以共表达且从CHO细胞系中纯化，以产生包含ActRIIB-Fc:ALK4-Fc的异聚复合物。
在促进使用不对称Fc融合蛋白的异多聚体复合物形成的另一种方法中，Fc结构域进行改变，以引入互补的疏水相互作用和另外的分子间二硫键，如分别在SEQ ID NO:402和403以及SEQ ID No:92和93的ActRIIB-Fc和ALK4-Fc多肽序列中示出的。ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽各自采用组织纤溶酶原激活物(TPA)前导区：MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP(SEQ ID NO:8)。
ActRIIB-Fc多肽序列(SEQ ID NO:402)显示于下文：
前导(信号)序列和接头是加下划线的。为了促进ActRIIB-Fc:ALK4-Fc异二聚体而不是可能的同二聚体复合物中任一的形成，可以将两个氨基酸取代(用半胱氨酸替换丝氨酸且用色氨酸替换苏氨酸)引入融合蛋白的Fc结构域内，如通过上文的指示的。SEQ ID NO:402的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸(K)。
成熟的ActRIIB-Fc融合多肽如下：
(SEQ ID NO:403)
ALK4-Fc融合多肽的互补形式(SEQ ID NO:92)如下，并且可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸(K)。
前导序列和接头是加下划线的。为了引导与上文SEQ ID NO:402和403的ActRIIB-Fc融合多肽的异二聚体形成，可以将四个氨基酸取代引入ALK4融合多肽的Fc结构域内，如通过上文的指示的。SEQ ID NO:92的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸(K)。
成熟的ALK4-Fc融合蛋白序列如下，并且可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸(K)。
分别地，SEQ ID NO:403和SEQ ID NO:93的ActRIIB-Fc和ALK4-Fc蛋白可以共表达且从CHO细胞系中纯化，以产生包含ActRIIB-Fc:ALK4-Fc的异聚复合物。
各种ActRIIB-Fc:ALK4-Fc复合物的纯化可以通过一系列柱层析步骤来实现，所述步骤包括例如以任何次序的下述中的三个或更多个：蛋白A层析、Q琼脂糖层析、苯基琼脂糖层析、尺寸排阻层析和阳离子交换层析。纯化可以用病毒过滤和缓冲液交换来完成。
在促进使用不对称Fc融合蛋白的异多聚体复合物形成的另一种方法中，Fc结构域进行改变，以引入互补的疏水相互作用、另外的分子间二硫键、以及用于促进基于净分子电荷的纯化在两个Fc结构域之间的静电差异，如分别在SEQ ID NO:118-121和122-125的ActRIIB-Fc和ALK4-Fc多肽序列中示出的。ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽各自采用组织纤溶酶原激活物(TPA)前导区。
ActRIIB-Fc多肽序列(SEQ ID NO:406)显示于下文：
前导序列和接头是加下划线的。为了促进ActRIIB-Fc:ALK4-Fc异二聚体而不是可能的同二聚体复合物中任一的形成，可以将两个氨基酸取代(用半胱氨酸替换丝氨酸且用色氨酸替换苏氨酸)引入融合蛋白的Fc结构域内，如通过上文的指示的。为了促进ActRIIB-Fc:ALK4-Fc异二聚体的纯化，还可以将两个氨基酸取代(用酸性氨基酸替换赖氨酸)引入融合蛋白的Fc结构域内，如通过上文的/>指示的。SEQ ID NO:118的氨基酸序列可以任选地提供有在C末端处加入的赖氨酸。
该ActRIIB-Fc融合蛋白由下述核酸(SEQ ID NO:407)编码：
/>
成熟的ActRIIB-Fc融合多肽如下(SEQ ID NO:408)，并且可以任选地提供有加入C末端的赖氨酸。
(SEQ ID NO:408)
该ActRIIB-Fc融合多肽由下述核酸(SEQ ID NO:409)编码：
/>
ALK4-Fc融合多肽的互补形式(SEQ ID NO:247)如下，并且可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
前导序列和接头是加下划线的。为了引导与上文SEQ ID NO:406和408的ActRIIB-Fc融合多肽的异二聚体形成，可以将四个氨基酸取代(用半胱氨酸替换酪氨酸，用丝氨酸替换苏氨酸，用丙氨酸替换亮氨酸且用缬氨酸替换酪氨酸)引入ALK4融合多肽的Fc结构域内，如通过上文的指示的。为了促进ActRIIB-Fc:ALK4-Fc异二聚体的纯化，还可以将两个氨基酸取代(用精氨酸替换天冬酰胺且用精氨酸替换天冬氨酸)引入ALK4-Fc融合多肽的Fc结构域内，如通过上文的/> 指示的。SEQ ID NO:247的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
该ALK4-Fc融合多肽由下述核酸(SEQ ID NO:248)编码：
成熟ALK4-Fc融合多肽序列如下(SEQ ID NO:249)，并且可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
该ALK4-Fc融合多肽由下述核酸(SEQ ID NO:250)编码：
(SEQ ID NO:250)
分别地，SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:249的ActRIIB-Fc和ALK4-Fc蛋白可以共表达且从CHO细胞系中纯化，以产生包含ALK4-Fc:ActRIIB-Fc的异聚复合物。
在某些实施方案中，ALK4-Fc融合多肽是SEQ ID NO:92(上文显示的)，其含有四个氨基酸取代以引导本文公开的某些Fc融合多肽的异二聚体形成，并且可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
该ALK4-Fc融合多肽由下述核酸(SEQ ID NO:251)编码：
/>
成熟的ALK4-Fc融合多肽序列是SEQ ID NO:93(上文显示的)，并且可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
该ALK4-Fc融合多肽由下述核酸(SEQ ID NO:252)编码：
/>
(SEQ ID NO:252)
各种ActRIIB-Fc:ALK4-Fc复合物的纯化可以通过一系列柱层析步骤来实现，所述步骤包括例如以任何次序的下述中的三个或更多个：蛋白A层析、Q琼脂糖层析、苯基琼脂糖层析、尺寸排阻层析、阳离子交换层析、基于表位的亲和层析(例如，用针对ALK4或ActRIIB上的表位的抗体或功能上等价的配体)和多模式层析(例如，用含有静电和疏水配体两者的树脂)。纯化可以用病毒过滤和缓冲液交换来完成。
实施例13.ActRIIB-Fc:ALK4-Fc异二聚体与ActRIIB-Fc同二聚体和ALK4-Fc同二 聚体相比的配体结合谱
基于BiacoreTM的结合测定用于比较上文所述的ActRIIB-Fc:ALK4-Fc异二聚体复合物与ActRIIB-Fc和ALK4-Fc同二聚体复合物的配体结合选择性。使用抗Fc抗体，将ActRIIB-Fc:ALK4-Fc异二聚体、ActRIIB-Fc同二聚体和ALK4-Fc同二聚体独立地捕获到系统上。将配体注入并允许流过捕获的受体蛋白。结果概括于下表中，其中最指示有效配体陷阱的配体解离速率(kd)通过粗体字体表示。
这些比较结合数据证实了，ActRIIB-Fc:ALK4-Fc异二聚体相对于ActRIIB-Fc或ALK4-Fc同二聚体具有改变的结合谱/选择性。ActRIIB-Fc:ALK4-Fc异二聚体展示与任一同二聚体相比与激活素B的增强结合，保留了如对于ActRIIB-Fc同二聚体观察到的与激活素A、GDF8和GDF11的强结合，并且显示出与BMP9、BMP10和GDF3基本上降低的结合。特别地，BMP9展示对于ActRIIB-Fc:ALK4-Fc异二聚体的低亲和力或无法观察到的亲和力，而该配体与ActRIIB-Fc同二聚体强结合。如同ActRIIB-Fc同二聚体，异二聚体保留了与BMP6的中等水平结合。参见图19。
另外，A-204报道基因测定用于评估ActRIIB-Fc:ALK4-Fc异二聚体和ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同二聚体对通过激活素A、激活素B、GDF11、GDF8、BMP10和BMP9的信号传导的作用。细胞系：人横纹肌肉瘤(衍生自肌肉)。报道载体：pGL3(CAGA)12(如Dennler等人1998，EMBO 17:3091-3100中所述的)。CAGA12基序存在于TGFβ响应基因(PAI-1基因)中，因此该载体一般用于通过Smad2和3传导信号的因子。下文概述了示例性A-204报道基因测定。
第1天：将A-204细胞拆分到48孔板内。
第2天：用10ug pGL3(CAGA)12或pGL3(CAGA)12(10ug)+pRLCMV(1ug)和Fugene转染A-204细胞。
第3天：添加因子(稀释到培养基+0.1％BSA内)。在加入细胞之前，抑制剂需要与因子预温育约一小时。大约六小时后，细胞用PBS进行冲洗，然后裂解。
遵循上文步骤，执行萤光素酶测定。
在该测定中，ActRIIB-Fc:ALK4-Fc异二聚体和ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同二聚体两者均确定为激活素A、激活素B、GDF11和GDF8的有力抑制剂。特别地，如图20中示出的比较同二聚体/异二聚体IC50数据中可以看出的，ActRIIB-Fc:ALK4-Fc异二聚体与ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同二聚体类似地抑制激活素A、激活素B、GDF8和GDF11信号传导途径。然而，与ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同二聚体相比，BMP9和BMP10信号传导途径的ActRIIB-Fc:ALK4-Fc异二聚体抑制显著降低。该数据与上文讨论的结合数据一致，其中观察到ActRIIB-Fc:ALK4-Fc异二聚体和ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同二聚体两者均展示与激活素A、激活素B、GDF8和GDF11的强结合，但与ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同二聚体相比，BMP10和BMP9对于ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体具有显著降低的亲和力。
因此，这些数据一起证实了，与ActRIIB-Fc同二聚体相比，ActRIIB-Fc:ALK4-Fc异二聚体是激活素A、激活素B、GDF8和GDF11的更具选择性的拮抗剂。相应地，在其中此类选择性拮抗作用有利的某些应用中，ActRIIB-Fc:ALK4-Fc异二聚体将比ActRIIB-Fc同二聚体更有用。实例包括其中期望保留激活素A、激活素B、激活素AC、GDF8和GDF11中的一种或多种的拮抗作用，但使BMP9、BMP10、GDF3和BMP6中的一种或多种的拮抗作用降到最低的治疗应用。
实施例14.ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异二聚体的生成
申请人构建了可溶性ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异聚复合物，其包含各自融合至Fc结构域的人ActRIIB和人ALK7的细胞外结构域，具有置于细胞外结构域和Fc结构域之间的接头。各个构建体分别被称为ActRIIB-Fc和ALK7-Fc。
与ActRIIB-Fc或ALK7-Fc同二聚体复合物形成对比，用于促进ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异聚复合物形成的方法是在Fc结构域的氨基酸序列中引入改变，以引导不对称异聚复合物的形成。本公开中描述了使用Fc结构域制备不对称相互作用对的许多不同方法。
在一种方法中，分别在下文公开的ActRIIB-Fc和ALK7-Fc多肽序列中示出的，一个Fc结构域进行改变，以在相互作用面处引入阳离子氨基酸，而另一个Fc结构域进行改变，以在相互作用面处引入阴离子氨基酸。ActRIIB-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽各自采用组织纤溶酶原激活物(TPA)前导区：MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP(SEQ ID NO:8)。
ActRIIB-Fc多肽序列(SEQ ID NO:396)显示于下文：
前导(信号)序列和接头是加下划线的。为了促进ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异二聚体而不是可能的同二聚体复合物中任一的形成，可以将两个氨基酸取代(用赖氨酸替换酸性氨基酸)引入ActRIIB融合蛋白的Fc结构域内，如通过上文的指示的。SEQ ID NO:396的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸(K)。
该ActRIIB-Fc融合蛋白由下述核酸序列(SEQ ID NO:397)编码：
成熟的ActRIIB-Fc融合多肽(SEQ ID NO:398)如下，并且可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
/>
(SEQ ID NO:398)
ALK7-Fc融合蛋白的互补形式(SEQ ID NO:129)如下：
(SEQ ID NO:129)
信号序列和接头序列是加下划线的。为了促进ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异二聚体而不是可能的同二聚体复合物中任一的形成，可以将两个氨基酸取代(用天冬氨酸替换赖氨酸)引入融合蛋白的Fc结构域内，如通过上文的指示的。SEQ ID NO:129的氨基酸序列可以任选地提供有在C末端处加入的赖氨酸。
该ALK7-Fc融合蛋白由下述核酸(SEQ ID NO:255)编码：
成熟的ALK7-Fc融合蛋白序列(SEQ ID NO:130)预计如下，并且可以任选地提供有在C末端处加入的赖氨酸。
分别地，SEQ ID NO:396和SEQ ID NO:129的ActRIIB-Fc和ALK7-Fc融合蛋白可以共表达且从CHO细胞系中纯化，以产生包含ActRIIB-Fc:ALK7-Fc的异聚复合物。
在促进使用不对称Fc融合蛋白的异多聚体复合物形成的另一种方法中，Fc结构域进行改变，以引入互补的疏水相互作用和另外的分子间二硫键，如下文公开的ActRIIB-Fc和ALK7-Fc多肽序列中示出的。
ActRIIB-Fc多肽序列(SEQ ID NO:402)显示于下文：
前导序列和接头是加下划线的。为了促进ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异二聚体而不是可能的同二聚体复合物中任一的形成，可以将两个氨基酸取代(用半胱氨酸替换丝氨酸且用色氨酸替换苏氨酸)引入融合蛋白的Fc结构域内，如通过上文的指示的。SEQ IDNO:402的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
成熟的ActRIIB-Fc融合多肽(SEQ ID NO:403)如下，并且可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
(SEQ ID NO:403)
ALK7-Fc融合多肽的互补形式(SEQ ID NO:133)如下：
(SEQ ID NO:133)
前导序列和接头序列是加下划线的。为了引导与上文SEQ ID NO 130和403的ActRIIB-Fc融合多肽的异二聚体形成，可以将四个氨基酸取代引入ALK7融合多肽的Fc结构域内，如通过上文的指示的。SEQ ID NO:133的氨基酸序列可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
成熟的ALK7-Fc融合蛋白序列(SEQ ID NO:134)预计如下，并且可以任选地提供有从C末端去除的赖氨酸。
分别地，SEQ ID NO:402和SEQ ID NO:133的ActRIIB-Fc和ALK7-Fc蛋白可以共表达且从CHO细胞系中纯化，以产生包含ActRIIB-Fc:ALK7-Fc的异聚复合物。
各种ActRIIB-Fc:ALK7-Fc复合物的纯化可以通过一系列柱层析步骤来实现，所述步骤包括例如以任何次序的下述中的三个或更多个：蛋白A层析、Q琼脂糖层析、苯基琼脂糖层析、尺寸排阻层析和阳离子交换层析。纯化可以用病毒过滤和缓冲液交换来完成。
实施例15.ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异二聚体与ActRIIB-Fc同二聚体和ALK7-Fc同二 聚体相比的配体结合谱
基于BiacoreTM的结合测定用于比较上文所述的ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异二聚体复合物与ActRIIB-Fc和ALK7-Fc同二聚体复合物的配体结合选择性。使用抗Fc抗体，将ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异二聚体、ActRIIB-Fc同二聚体和ALK7-Fc同二聚体独立地捕获到系统上。将配体注入并允许流过捕获的受体蛋白。结果概括于下表中，其中最指示有效配体陷阱的配体解离速率(kd)通过粗体字体表示。
这些比较结合数据证实了，ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异二聚体相对于ActRIIB-Fc同二聚体或ALK7-Fc同二聚体具有改变的结合谱/选择性。有趣的是，与ActRIIB-Fc同二聚体具有最强结合的五种配体中的四种(激活素A、BMP10、GDF8和GDF11)显示出与ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异二聚体的降低结合，例外是保留了与异二聚体的紧密结合的激活素B。类似地，与ActRIIB-Fc同二聚体具有中等结合的四种配体中的三种(GDF3、BMP6且特别是BMP9)显示出与ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异二聚体的降低结合，而与激活素AC的结合增加，以成为整体与异二聚体的第二强的配体相互作用。最后，激活素C和BMP5出乎意料地以中等强度结合ActRIIB-Fc:ALK7异二聚体，尽管与ActRIIB-Fc同二聚体没有结合(激活素C)或弱结合(BMP5)。净结果是ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异二聚体具有与ActRIIB-Fc同二聚体或ALK7-Fc同二聚体明显不同的配体结合谱，后者不结合任何前述配体。参见图21。
因此，这些结果证实了，与ActRIIB-Fc同二聚体相比，ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异二聚体是激活素B和激活素AC的更具选择性的拮抗剂。此外，ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异二聚体显示出与激活素C的稳固结合的不寻常性质。相应地，在其中此类选择性拮抗作用有利的某些应用中，ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异二聚体将比ActRIIB-Fc同二聚体更有用。实例包括其中期望保留激活素B或激活素AC的拮抗作用，但减少激活素A、GDF3、GDF8、GDF11、BMP9或BMP10中的一种或多种的拮抗作用的治疗应用。还包括的是治疗、诊断或分析应用，其中期望拮抗激活素C，或者基于激活素C和激活素E之间的相似性，拮抗激活素E。
实施例16.ActRIIB-Fc:ALK4-Fc对较年轻小鼠中的糖尿病性心肌病的心脏保护作 用
在糖尿病性心肌病的鼠模型中检查了ActRIIB-Fc:ALK4-Fc对心脏保护的作用，所述鼠模型是一种转基因瘦素受体缺陷小鼠模型，称为db/db。除了典型的糖尿病表型例如高血糖之外，db/db小鼠还呈现肥厚性心肌病的独特表型(例如，射血分数保留型心力衰竭(HFpEF)的表型)，包括独特的LV舒张功能障碍(参见Mori等人，2014；Venardos等人，2015；Ji等人，2017；Jia等人，2018；Pant等人，2019)。进行了使用db/db小鼠的研究，以评价ActRIIB-Fc:ALK4-Fc是否能够恢复在重塑下的心脏改变。
研究了20只14周龄的db/db雄性小鼠和10只年龄匹配的野生型(WT)小鼠。所有小鼠都接受了(i)每周两次的皮下媒介物(磷酸盐缓冲盐水，PBS)，共8周，或(ii)每周两次的皮下ActRIIB-Fc:ALK4-Fc(10mg/kg)，共8周。所施用的媒介物或ActRIIB-Fc:ALK4-Fc的体积是相同的。
通过心尖4腔切面中的(E)舒张早期跨二尖瓣血流最大速度的脉搏波多普勒记录和早期(e')跨二尖瓣瓣膜环峰值速度的多普勒组织成像记录来评价舒张功能。跨二尖瓣血流峰值速度/跨二尖瓣瓣膜环峰值速度的比值(E/e')的变化用于估计舒张功能。在小鼠处于麻醉下的同时，通过将ECG导联连接到前爪和后爪两者的真皮层来测量体表心电图(ECG)。ECG的记录通过Power实验室数据采集系统(Chart v8.1.8AD Instruments)进行分析。紧在超声心动图和ECG后，对所有小鼠实施安乐死。将LV速冻用于RNA分析。收集每只小鼠的血液，并且经由高灵敏度ELISA测量血清B型利钠肽(BNP)表达。
数据呈现为平均值±平均值的标准误。执行了统计检验(使用用于多重比较的Tukey氏检验的伴事后分析的单因素ANOVA)，其中显著性水平设定为p<0.05。特别地，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
到研究结束时，db/db小鼠展示肥厚性心肌病的特有特征，例如舒张功能障碍(图23)以及异常ECG(图24A-图24B)。
糖尿病心脏中的心脏重塑(即，LV肥厚)改变了机械(图23)和电(图24A-B)功能两者。“db/db-媒介物”小鼠并未展示降低的射血分数。与“WT-媒介物”小鼠相比，“db/db-媒介物”小鼠呈现了显著增加的E/e'，临床实践中的充盈压指标(图23)，指示了糖尿病心脏中的LV舒张受损。引人注目的是，在“db/db-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc”小鼠中，ActRIIB-Fc:ALK4-Fc治疗显著减少了如通过E/e'测量的舒张功能(图23)。
LV舒张功能障碍导致代偿性左心房肥大，具有在ECG上的左心房扩大的体征(参见Beltrame等人，2018；Gupta等人，2018；Bohne等人，2020)。与“WT-媒介物”小鼠相比，“db/db-媒介物”小鼠呈现了显著更大的正P波(图24A)和负P波(图24B)两者的P振幅。与“db/db-媒介物”小鼠相比，ActRIIB-Fc:ALK4-Fc显著降低了“db/db ActRIIB-Fc:ALK-Fc”小鼠中的正P振幅，并且与“db/db-媒介物”小鼠相比，在“db/db ActRIIB-Fc:ALK-Fc”小鼠中也存在负P振幅的降低趋势。
另外，与“WT-媒介物”小鼠相比，“db/db-媒介物”小鼠呈现了显著增加的BNP表达，指示了糖尿病心脏中的压力升高。ActRIIB-Fc:ALK4-Fc治疗在“db/db-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc”小鼠中呈现了BNP表达的减少趋势。
总的来说，这些数据证实了ActRIIB-Fc:ALK4-Fc有效改善HFpEF的鼠模型(db/db模型)中的左心重塑过程中的缺陷。特别地，与未治疗的组相比，E/e'在ActRIIB-Fc:ALK4-Fc治疗的小鼠中显著降低，指示了ActRIIB-Fc:ALK4-Fc改善LV舒张。数据进一步提示了，除ActRIIB:ALK4异多聚体之外，其它ActRII-ALK4拮抗剂可能可用于治疗心力衰竭。
实施例17.ActRIIB-Fc:ALK4-Fc对较年老小鼠中的糖尿病性心肌病的心脏保护作 用
在糖尿病性心肌病的鼠模型中检查了ActRIIB-Fc:ALK4-Fc对心脏保护的作用，所述鼠模型是一种转基因瘦素受体缺陷小鼠模型，称为db/db。除了典型的糖尿病表型例如高血糖之外，db/db小鼠还呈现肥厚性心肌病的独特表型(例如，射血分数保留型心力衰竭(HFpEF)的表型)，包括独特的LV舒张功能障碍(参见Mori等人，2014；Venardos等人，2015；Ji等人，2017；Jia等人，2018；Pant等人，2019)。进行了使用db/db小鼠的研究，以评价ActRIIB-Fc:ALK4-Fc是否能够恢复在重塑下的心脏改变。
研究了19只19周龄的db/db雄性小鼠和10只年龄匹配的野生型(WT)小鼠。所有小鼠都接受了(i)每周两次的皮下媒介物(磷酸盐缓冲盐水，PBS)，共8周，或(ii)每周两次的皮下ActRIIB-Fc:ALK4-Fc(10mg/kg)，共8周。所施用的媒介物或ActRIIB-Fc:ALK4-Fc的体积是相同的。
通过心尖4腔切面中的(E)舒张早期跨二尖瓣血流最大速度的脉搏波多普勒记录和早期(e')跨二尖瓣瓣膜环峰值速度的多普勒组织成像记录来评价舒张功能。跨二尖瓣血流峰值速度/跨二尖瓣瓣膜环峰值速度的比值(E/e')的变化用于估计舒张功能。在小鼠处于麻醉下的同时，通过将ECG导联连接到前爪和后爪两者的真皮层来测量体表心电图(ECG)。ECG的记录通过Power实验室数据采集系统(Chart v8.1.8AD Instruments)进行分析。
数据呈现为平均值±平均值的标准误。执行了统计检验(使用用于多重比较的Tukey氏检验的伴事后分析的单因素ANOVA)，其中显著性水平设定为p<0.05。特别地，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
到研究结束时，db/db小鼠展示肥厚性心肌病的特有特征，例如舒张功能障碍(图25A)以及异常ECG(图25B)。
糖尿病心脏中的心脏重塑(即，LV肥厚)改变了机械(图25A)和电(图25B)功能两者。“db/db-媒介物”小鼠并未展示降低的射血分数。与“WT-媒介物”小鼠相比，“db/db-媒介物”小鼠呈现了显著增加的E/e'，临床实践中的充盈压指标(图25A)，指示了糖尿病心脏中的LV舒张受损。引人注目的是，在“db/db-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc”小鼠中，ActRIIB-Fc:ALK4-Fc治疗显著减少了如通过E/e'测量的舒张功能(图25A)。LV肥厚呈现异常ECG(参见Beltrame等人，2018；Gupta等人，2018；Bohne等人，2020)。与“WT-媒介物”小鼠相比，“db/db-媒介物”小鼠呈现了显著更大的R波振幅(图25B)。与“db/db-媒介物”小鼠相比，ActRIIB-Fc:ALK4-Fc显著降低了“db/db ActRIIB-Fc:ALK-Fc”小鼠中的R波振幅。
总的来说，这些数据证实了ActRIIB-Fc:ALK4-Fc有效改善HFpEF的鼠模型(db/db模型)中的左心重塑过程中的缺陷。特别地，与未治疗的组相比，E/e'在ActRIIB-Fc:ALK4-Fc治疗的小鼠中显著降低，指示了ActRIIB-Fc:ALK4-Fc改善LV舒张。数据进一步提示了，除ActRIIB:ALK4异多聚体之外，其它ActRII-ALK4拮抗剂可能可用于治疗心力衰竭。
实施例18.ActRIIB-Fc:ALK4-Fc对糖尿病性心肌病中的心脏保护的作用
在糖尿病性心肌病的鼠模型中检查了ActRIIB-Fc:ALK4-Fc对心脏保护的作用，所述鼠模型是一种转基因瘦素受体缺陷小鼠模型，称为db/db。除了典型的糖尿病表型例如高血糖之外，db/db小鼠还呈现肥厚性心肌病的独特表型(例如，射血分数保留型心力衰竭(HFpEF)的表型)，包括独特的LV舒张功能障碍(参见Mori等人，2014；Venardos等人，2015；Ji等人，2017；Jia等人，2018；Pant等人，2019)。进行了使用db/db小鼠的研究，以评价ActRIIB-Fc:ALK4-Fc是否能够恢复在重塑下的心脏改变。
研究了39只14周龄(“中年db/db小鼠”)和19周龄(“老年db/db小鼠”)的db/db雄性小鼠。包括20只年龄匹配的野生型(WT)小鼠作为对照(“中年WT–媒介物”和“老年WT–媒介物”)。所有db/db小鼠都接受了(i)每周两次的皮下媒介物(磷酸盐缓冲盐水，PBS)，共8周(“媒介物”)，或(ii)每周两次的皮下ActRIIB-Fc:ALK4-Fc(10mg/kg)，共8周(“ActRIIB-Fc:ALK4-Fc”)。所施用的媒介物或ActRIIB-Fc:ALK4-Fc的体积是相同的。
在研究结束时，在对动物实施安乐死之前，在小鼠处于麻醉下的同时，通过经胸超声心动图(VisualSonics Vevo3100，30MHz换能器；Fujifilm)评价体内心脏功能。具体而言，通过在乳头肌水平下的胸骨旁短轴切面中的M模式测量LV收缩功能。测量LV舒张末期容积(LVEDV)和LV收缩末期容积(LVESV)，并且用于使用下式EF＝100％×[(EDV-ESV)/EDV]计算射血分数。通过心尖4腔切面中的(E)舒张早期跨二尖瓣血流最大速度的脉搏波多普勒记录和早期(e')跨二尖瓣瓣膜环峰值速度的多普勒组织成像记录来评价LV舒张功能。跨二尖瓣血流峰值速度/跨二尖瓣瓣膜环峰值速度的比值(E/e')的变化用于估计舒张功能。在小鼠处于麻醉下的同时，通过将ECG导联连接到前爪和后爪两者的真皮层来测量体表心电图(ECG)。ECG的记录通过Power实验室数据采集系统(Chart v8.1.8AD Instruments)进行分析。
到研究结束时，与分别的WT–媒介物对照相比，db/db小鼠(“中年db/db–媒介物”和“老年db/db–媒介物”)展示肥厚性心肌病的特有特征，例如舒张功能障碍(图26A)以及异常ECG(图26B)。
糖尿病心脏中的心脏重塑(即，LV肥厚)改变了机械(图26A)和电(图26B)功能两者。“中年db/db-媒介物”和“老年db/db-媒介物”小鼠两者均并未展示降低的射血分数。与年龄匹配的“中年WT-媒介物”和“老年WT-媒介物”小鼠相比，“中年db/db-媒介物”和“老年db/db-媒介物”小鼠两者均呈现了显著增加的E/e'，临床实践中的充盈压指标(图26A)。结果指示了糖尿病心脏中的LV舒张受损。在“中年db/db-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc”和“老年db/db-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc”小鼠两者中，ActRIIB-Fc:ALK4-Fc治疗减少了如通过E/e'测量的舒张功能，展示了越早治疗将产生越显著的疗效的趋势(图26A)。
LV肥厚呈现异常ECG(参见Beltrame等人，2018；Gupta等人，2018；Bohne等人，2020)。与年龄匹配的“中年WT-媒介物”和“老年WT-媒介物”小鼠相比，“中年db/db-媒介物”和“老年db/db-媒介物”小鼠两者均呈现了更大的R波振幅(图26B)。分别与“中年db/db-媒介物”和“老年db/db-媒介物”小鼠相比，ActRIIB-Fc:ALK4-Fc治疗显著降低了“中年db/db-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc”和“老年db/db-ActRIIB-Fc:ALK4-Fc”小鼠两者中的R波振幅。
总的来说，这些数据证实了ActRIIB-Fc:ALK4-Fc有效改善HFpEF的鼠模型(db/db模型)中的左心重塑过程中的缺陷。特别地，与未治疗的组相比，E/e'在ActRIIB-Fc:ALK4-Fc治疗的小鼠中显著降低，指示了ActRIIB-Fc:ALK4-Fc改善LV舒张。数据进一步提示了，除ActRIIB:ALK4异多聚体之外，其它ActRII-ALK4拮抗剂可能可用于治疗心力衰竭。
实施例19.ActRIIB(K55E)-Fc对较年老小鼠中的糖尿病性心肌病的心脏保护作用
在糖尿病性心肌病的鼠模型中检查了ActRIIB(K55E)-Fc对心脏保护的作用，所述鼠模型是一种转基因瘦素受体缺陷小鼠模型，称为db/db。除了典型的糖尿病表型例如高血糖之外，db/db小鼠还呈现肥厚性心肌病的独特表型(例如，射血分数保留型心力衰竭(HFpEF)的表型)，包括独特的LV舒张功能障碍(参见Mori等人，2014；Venardos等人，2015；Ji等人，2017；Jia等人，2018；Pant等人，2019)。进行了使用db/db小鼠的研究，以评价ActRIIB(K55E)-Fc是否能够恢复在重塑下的心脏改变。
研究了40只19周龄的db/db雄性小鼠(“老年db/db小鼠”)。包括20只年龄匹配的野生型(WT)小鼠作为对照(“老年WT-媒介物”)。所有小鼠都接受了(i)每周两次的皮下媒介物(磷酸盐缓冲盐水，PBS)，共8周(“媒介物”)，或(ii)每周两次的皮下ActRIIB(K55E)-Fc(10mg/kg)，共8周(“ActRIIB(K55E)-Fc”)。所施用的媒介物或ActRIIB(K55E)-Fc的体积是相同的。
在研究结束时，在对动物实施安乐死之前，在小鼠处于麻醉下的同时，通过经胸超声心动图(VisualSonics Vevo3100，30MHz换能器；Fujifilm)评价体内心脏功能。具体而言，通过在乳头肌水平下的胸骨旁短轴切面中的M模式测量LV收缩功能。测量LV舒张末期容积(LVEDV)和LV收缩末期容积(LVESV)，并且用于使用下式EF＝100％×[(EDV-ESV)/EDV]计算射血分数。通过心尖4腔切面中的(E)舒张早期跨二尖瓣血流最大速度的脉搏波多普勒记录和早期(e')跨二尖瓣瓣膜环峰值速度的多普勒组织成像记录来评价LV舒张功能。跨二尖瓣血流峰值速度/跨二尖瓣瓣膜环峰值速度的比值(E/e')的变化用于估计舒张功能。在小鼠处于麻醉下的同时，通过将ECG导联连接到前爪和后爪两者的真皮层来测量体表心电图(ECG)。ECG的记录通过Power实验室数据采集系统(Chart v8.1.8AD Instruments)进行分析。
到研究结束时，与分别的WT–媒介物对照相比，db/db小鼠展示肥厚性心肌病的特有特征，例如舒张功能障碍(图27A)以及异常ECG(图27B)。
糖尿病心脏中的心脏重塑(即，LV肥厚)改变了机械(图27A)和电(图27B)功能两者。“老年db/db-媒介物”小鼠并未展示降低的射血分数。与“老年WT-媒介物”小鼠相比，“老年db/db-媒介物”小鼠呈现了显著增加的E/e'，临床实践中的充盈压指标(图27A)，指示了糖尿病心脏中的LV舒张受损。与“老年db/db–媒介物”小鼠相比，在“老年db/db-ActRIIB(K55E)-Fc”小鼠中，ActRIIB(K55E)-Fc治疗显著减少了如通过E/e'测量的舒张功能(图27A)。
LV肥厚呈现异常ECG(参见Beltrame等人，2018；Gupta等人，2018；Bohne等人，2020)。与“老年WT-媒介物”小鼠相比，“老年db/db-媒介物”小鼠呈现了显著更大的R波振幅(图27B)。与“老年db/db-媒介物”小鼠相比，ActRIIB(K55E)-Fc显著降低了“老年db/db-ActRIIB(K55E)-Fc”小鼠中的R波振幅。
总的来说，这些数据证实了ActRIIB(K55E)-Fc有效改善HFpEF的鼠模型(db/db模型)中的左心重塑过程中的缺陷。特别地，与未治疗的组相比，E/e'在ActRIIB(K55E)-Fc治疗的小鼠中显著降低，指示了ActRIIB(K55E)-Fc改善LV舒张。
实施例20.ActRIIBL79S-Fc对较年老小鼠中的糖尿病性心肌病的心脏保护作用
在糖尿病性心肌病的鼠模型中检查了ActRIIBL79S-Fc对心脏保护的作用，所述鼠模型是一种转基因瘦素受体缺陷小鼠模型，称为db/db。除了典型的糖尿病表型例如高血糖之外，db/db小鼠还呈现肥厚性心肌病的独特表型(例如，射血分数保留型心力衰竭(HFpEF)的表型)，包括独特的LV舒张功能障碍(参见Mori等人，2014；Venardos等人，2015；Ji等人，2017；Jia等人，2018；Pant等人，2019)。进行了使用db/db小鼠的研究，以评价ActRIIBL79S-Fc是否能够恢复在重塑下的心脏改变。
研究了18只14周龄的db/db雄性小鼠和10只年龄匹配的野生型(WT)小鼠。所有小鼠都接受了(i)每周两次的皮下媒介物(磷酸盐缓冲盐水，PBS)，共8周，或(ii)每周两次的皮下ActRIIBL79S-Fc(10mg/kg)，共8周。所施用的媒介物或ActRIIBL79S-Fc的体积是相同的。
在研究结束时，在对动物实施安乐死之前，在小鼠处于麻醉下的同时，通过经胸超声心动图(VisualSonics Vevo3100，30MHz换能器；Fujifilm)评价体内心脏功能。具体而言，通过在乳头肌水平下的胸骨旁短轴切面中的M模式测量LV收缩功能。测量LV舒张末期容积(LVEDV)和LV收缩末期容积(LVESV)，并且用于使用下式EF＝100％×[(EDV-ESV)/EDV]计算射血分数。通过心尖4腔切面中的(E)舒张早期跨二尖瓣血流最大速度的脉搏波多普勒记录和早期(e')跨二尖瓣瓣膜环峰值速度的多普勒组织成像记录来评价LV舒张功能。跨二尖瓣血流峰值速度/跨二尖瓣瓣膜环峰值速度的比值(E/e')的变化用于估计舒张功能。在小鼠处于麻醉下的同时，通过将ECG导联连接到前爪和后爪两者的真皮层来测量体表心电图(ECG)。ECG的记录通过Power实验室数据采集系统(Chart v8.1.8AD Instruments)进行分析。
到研究结束时，db/db小鼠展示肥厚性心肌病的特有特征，例如舒张功能障碍(图29A)以及异常ECG(图29B)。
糖尿病心脏中的心脏重塑(即，LV肥厚)改变了机械(图29A)和电(图29B)功能两者。“db/db-媒介物”小鼠并未展示降低的射血分数。与“WT-媒介物”小鼠相比，“db/db-媒介物”小鼠呈现了显著增加的E/e'，临床实践中的充盈压指标(图29A)，指示了糖尿病心脏中的LV舒张受损。引人注目的是，在“db/db-ActRIIBL79S-Fc”小鼠中，ActRIIBL79S-Fc治疗显著减少了如通过E/e'测量的舒张功能(图29A)。LV肥厚呈现异常ECG(参见Beltrame等人，2018；Gupta等人，2018；Bohne等人，2020)。与“WT-媒介物”小鼠相比，“db/db-媒介物”小鼠呈现了显著更大的R波振幅(图29B)。与“db/db-媒介物”小鼠相比，ActRIIBL79S-Fc看起来并不影响“db/db-ActRIIBL79S-Fc”小鼠中的R波振幅。
总的来说，这些数据证实了ActRIIBL79S-Fc有效改善HFpEF的鼠模型(db/db模型)中的左心重塑过程中的缺陷。特别地，与未治疗的组相比，E/e'在ActRIIBL79S-Fc治疗的小鼠中显著降低，指示了ActRIIBL79S-Fc改善LV舒张。
通过引用并入
本文提到的所有出版物和专利都在此通过引用以其整体并入，如同每个个别的出版物或专利具体地且个别地指示通过引用并入一样。
虽然已讨论了主题的具体实施方案，但上文说明书是说明性而不是限制性的。在回顾本说明书和下文权利要求后，许多变化对于本领域技术人员将变得显而易见。本发明的完整范围应该通过参考权利要求连同其等价物的完整范围，以及说明书连同此类变化一起进行确定。

Claims (53)

1.一种治疗与糖尿病性心肌病相关的心力衰竭的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的ActRII-ALK4拮抗剂。
2.权利要求1的方法，其中所述患者是肥胖的。
3.权利要求1或2的方法，其中所述患者患有糖尿病。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述心力衰竭是与射血分数保留相关的心力衰竭(HFpEF)。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述患者患有左心室(LV)肥厚。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述方法减少患者中的LV肥厚。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述患者患有舒张功能障碍。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述方法改善患者的舒张功能障碍。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述患者具有减少的心室舒张和增加的充盈压。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述方法增加患者中的心室舒张并减少充盈压。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述方法减少患者的舒张早期跨二尖瓣血流速度/二尖瓣环组织舒张早期速度的比值(E/e’比值)。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述方法减少患者中的脑利钠肽(BNP)水平。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述ActRII-ALK4拮抗剂包含ActRIIA多肽。
14.权利要求13的方法，其中所述ActRIIA多肽包含的氨基酸序列与如下的氨基酸序列具有至少70％同一性，所述氨基酸序列在SEQ ID NO：366的氨基酸21、22、23、24、25、26、27、28、29或30中的任何一个处开始，并且在SEQ ID NO：366的氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135中的任何一个处结束。
15.权利要求13的方法，其中所述ActRIIA多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：367的氨基酸序列具有至少70％同一性。
16.权利要求13的方法，其中所述ActRIIA多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：368的氨基酸序列具有至少70％同一性。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述ActRIIA多肽是包含ActRIIA多肽结构域和一个或多个异源结构域的融合多肽。
18.权利要求17的方法，其中所述融合多肽是ActRIIA-Fc融合多肽。
19.权利要求17或18中任一项的方法，其中所述融合多肽进一步包含置于所述ActRIIA多肽结构域和i)所述一个或多个异源结构域或ii)Fc结构域之间的接头结构域。
20.权利要求19的方法，其中所述接头结构域选自：TGGG(SEQ ID NO：265)、TGGGG(SEQID NO：263)、SGGGG(SEQ ID NO：264)、GGGGS(SEQ ID NO：267)、GGG(SEQ ID NO：261)、GGGG(SEQ ID NO：262)和SGGG(SEQ ID NO：266)。
21.权利要求18-20中任一项的方法，其中所述融合多肽包含的氨基酸序列与SEQ IDNO：380的氨基酸序列具有至少75％同一性。
22.权利要求18-20中任一项的方法，其中所述融合多肽包含的氨基酸序列与SEQ IDNO：378的氨基酸序列具有至少75％同一性。
23.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述ActRII-ALK4拮抗剂是异多聚体多肽。
24.权利要求23的方法，其中所述异多聚体多肽包含ActRIIB多肽和ALK4多肽。
25.权利要求23的方法，其中所述异多聚体多肽包含ActRIIB多肽和ALK7多肽。
26.权利要求24的方法，其中所述ALK4多肽包含的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：84、85、86、87、88、89、92、93、247、249、421和422的氨基酸序列具有至少75％同一性。
27.权利要求25的方法，其中所述ALK7多肽包含的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、133和134的氨基酸序列具有至少75％同一性。
28.权利要求24或26中任一项的方法，其中所述ALK4多肽是包含ALK4多肽结构域和一个或多个异源结构域的融合多肽。
29.权利要求25或27中任一项的方法，其中所述ALK7多肽是包含ALK7多肽结构域和一个或多个异源结构域的融合多肽。
30.权利要求28的方法，其中所述融合多肽是ALK4-Fc融合多肽。
31.权利要求29的方法，其中所述融合多肽是ALK7-Fc融合多肽。
32.权利要求30的方法，其中所述ALK4-Fc融合多肽进一步包含置于所述ALK4多肽结构域和i)所述一个或多个异源结构域或ii)Fc结构域之间的接头结构域。
33.权利要求31的方法，其中所述ALK7-Fc融合多肽进一步包含置于所述ALK7多肽结构域和i)所述一个或多个异源结构域或ii)Fc结构域之间的接头结构域。
34.权利要求32-33中任一项的方法，其中所述接头结构域选自：TGGG、TGGGG、SGGGG、GGGGS、GGG、GGGG、SGGG和GGGGS。
35.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述ActRII-ALK4拮抗剂包含ActRIIB多肽。
36.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述ActRII-ALK4是包含ActRIIB多肽的异多聚体。
37.权利要求1-12或35中任一项的方法，其中所述ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与如下的氨基酸序列具有至少75％同一性，所述氨基酸序列在SEQ ID NO：2的氨基酸残基20、21、22、23、24、25、26、27、28或29中的任何一个处开始，并且在SEQ ID NO：2的氨基酸残基109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中的任何一个处结束。
38.权利要求1-12或35-37中任一项的方法，其中所述ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸29-109具有至少75％同一性。
39.权利要求1-12或35-38中任一项的方法，其中所述ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸25-131具有至少75％同一性。
40.权利要求1-12或35-39中任一项的方法，其中所述ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸20-134具有至少75％同一性。
41.权利要求1-12或35-39中任一项的方法，其中所述ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：53的氨基酸序列具有至少75％同一性。
42.权利要求1-12或35-39中任一项的方法，其中所述ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：388的氨基酸序列具有至少75％同一性。
43.权利要求1-12或35-39中任一项的方法，其中所述ActRIIB多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：389的氨基酸序列具有至少75％同一性。
44.权利要求1-12或35-43中任一项的方法，其中所述ActRIIB多肽是包含ActRIIB多肽结构域和一个或多个异源结构域的融合多肽。
45.权利要求1-12或35-44中任一项的方法，其中所述融合多肽是ActRIIB-Fc融合多肽。
46.权利要求44或45中任一项的方法，其中所述融合多肽进一步包含置于所述ActRIIB多肽结构域和所述一个或多个异源结构域或Fc结构域之间的接头结构域。
47.权利要求46的方法，其中所述接头结构域选自：TGGG、TGGGG、SGGGG、GGGGS、GGG、GGGG、SGGG和GGGGS。
48.权利要求45-47中任一项的方法，其中所述融合多肽包含的氨基酸序列与SEQ IDNO：5的氨基酸序列至具有少90％同一性。
49.权利要求45-47中任一项的方法，其中所述融合多肽包含的氨基酸序列与SEQ IDNO：12的氨基酸序列具有至少90％同一性。
50.权利要求1-12或35-49中任一项的方法，其中所述ActRIIB多肽包含相对于SEQ IDNO：2的氨基酸序列的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代选自：A24N、S26T、N35E、E37A、E37D、L38N、R40A、R40K、S44T、L46V、L46I、L46F、L46A、E50K、E50P、E50L、E52A、E52D、E52G、E52H、E52K、E52N、E52P、E52R、E52S、E52T、E52Y、Q53R、Q53K、Q53N、Q53H、D54A、K55A、K55D、K55E、K55R、R56A、L57E、L57I、L57R、L57T、L57V、Y60D、Y60F、Y60K、Y60P、R64A、R64H、R64K、R64N、N65A、S67N、S67T、G68R、K74A、K74E、K74F、K74I、K74R、K74Y、W78A、W78Y、L79A、L79D、L79E、L79F、L79H、L79K、L79P、L79R、L79S、L79T、L79W、D80A、D80F、D80G、D80I、D80K、D80M、D80N、D80R、F82A、F82D、F82E、F82I、F82K、F82L、F82S、F82T、F82W、F82Y、N83A、N83R、T93D、T93E、T93G、T93H、T93K、T93P、T93R、T93S、T93Y、E94K、Q98D、Q98E、Q98K、Q98R、V99E、V99G、V99K、E105N、F108I、F108L、F108V、F108Y、E111D、E111H、E111K、111N、E111Q、E111R、R112H、R112K、R112N、R112S、R112T、A119P、A119V、G120N、E123N、P129N、P129S、P130A、P130R和A132N。
51.权利要求50的方法，其中所述ActRIIB多肽包含相对于SEQID NO：2的氨基酸序列的氨基酸取代，其为K55E。
52.权利要求50或51的方法，其中所述ActRIIB多肽包含相对于SEQ ID NO：2的氨基酸序列的氨基酸取代，其为L79S。
53.权利要求1-12或35-49中任一项的方法，其中所述ActRIIB多肽包含相对于SEQ IDNO：2的氨基酸序列的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代选自：L38N、E50L、E52D、E52N、E52Y、L57E、L57I、L57R、L57T、L57V、Y60D、G68R、K74E、W78Y、L79E、L79F、L79H、L79R、L79S、L79T、L79W、F82D、F82E、F82I、F82K、F82L、F82S、F82T、F82Y、N83R、E94K和V99G。
CN202280034549.5A 2021-03-10 2022-03-09 ActRII-ALK4拮抗剂和治疗心力衰竭的方法 Pending CN117295757A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US63/159051 2021-03-10
US202163227149P 2021-07-29 2021-07-29
US63/227149 2021-07-29
PCT/US2022/019570 WO2022192411A1 (en) 2021-03-10 2022-03-09 Actrii-alk4 antagonists and methods of treating heart failure

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117295757A true CN117295757A (zh) 2023-12-26

Family

ID=89241216

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280034549.5A Pending CN117295757A (zh) 2021-03-10 2022-03-09 ActRII-ALK4拮抗剂和治疗心力衰竭的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117295757A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7391139B2 (ja) 肺高血圧症を処置するための組成物および方法
JP7144428B2 (ja) 心不全を処置するための組成物および方法
JP2020176139A (ja) 癌患者における骨成長を促進するためのアクチビン−ａｃｔｒｉｉａアンタゴニストおよびその使用
JP2021151266A (ja) アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストおよび骨成長を促進するための使用
JP2021143207A (ja) 熱発生性脂肪細胞を増加させるための方法
US11813308B2 (en) Treatment of cardiovascular disease using ActRII ligand traps
EP1806147B1 (en) Use of immunesuppressant receptor
CN116113440A (zh) Actrii-alk4拮抗剂和治疗心力衰竭的方法
CN115989035A (zh) 用于治疗肺动脉高压(pah)的actrii蛋白
WO2019213442A1 (en) MULTISPECIFIC BINDERS OF TGFβ-SUPERFAMILY LIGANDS AND USES THEREOF
CN117295757A (zh) ActRII-ALK4拮抗剂和治疗心力衰竭的方法
CN117396224A (zh) ActRII-ALK4拮抗剂和治疗心力衰竭的方法
EP4274600A1 (en) Compositions and methods for treating pulmonary hypertension
JP2024511316A (ja) Ａｃｔｒｉｉ－ａｌｋ４アンタゴニスト及び心不全の治療方法
KR20240049857A (ko) Actrii 단백질 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination