KR20240049857A

KR20240049857A - Actrii 단백질 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20240049857A
Application number: KR1020247005282A
Authority: KR
Inventors: 올리베이라 페나 제니쓰 드
Original assignee: 악셀레론 파마 인코포레이티드
Priority date: 2021-07-19
Filing date: 2022-07-18
Publication date: 2024-04-17
Also published as: IL310141A; WO2023003815A9; AU2022316103A1; CA3225613A1; PE20240777A1; WO2023003815A1; EP4373577A1; CN117957014A; CO2024001551A2

Abstract

일부 양상에서, 본 발명은 치료 유효량의 ActRII 폴리펩티드를 투여받은 환자에서 모세혈관확장증의 위험을 감소시키기 위한 조성물 및 방법, 특히, 치료 유효량의 ActRII 폴리펩티드를 투여받은 환자에서 모세혈관확장증의 위험을 감소시키는 투여 요법에 관한 것이다.

Description

ACTRII 단백질 및 이의 용도

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2021년 7월 19일에 출원된 미국 가출원 번호 63/223,265의 이익을 주장하며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

기술분야

본 출원은 치료 유효량의 ActRII 폴리펩티드를 투여받은 환자에서 모세혈관확장증의 위험을 감소시키는 방법을 기재하고 있다. 본 출원은 또한 서열 번호 1의 잔기 30-110에 상응하는 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 치료 유효량의 ActRII 폴리펩티드를 투여받은 환자에서 모세혈관확장증의 위험을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

배경기술

모세혈관확장증은 확장된 정맥(작은 혈관)이 피부에 실 같은 붉은 선이나 패턴을 일으키는 병태를 말한다. 이러한 패턴 또는 모세혈관확장증은 다양한 조건에서 혈관 활성 물질의 방출 또는 활성화로 인해 발생하는 것으로 생각된다. 모세혈관확장증은 대개 양성이지만 유전성 출혈성 모세혈관확장증(HHT)과 같은 심각한 질환으로 인해 발생할 수 있다. HHT 환자의 경우, 모세혈관확장증이 간과 같은 중요한 기관에 나타날 수 있다. 이러한 모세혈관확장효소가 파열되면 생명을 위협하는 출혈이 발생할 수 있다.

모세혈관확장증은 ALK-1 수용체 융합 단백질(달란터셉트), 엔도글린 중화 항체(TRC105) 및 특정 ActRII 폴리펩티드와 같은 특정 약물 투여 시 부작용으로 나타날 수 있다(Garber K. Nat Biotechnol. 2016;34(5):458-461).

기저 질환의 치료를 위해 하나 이상의 ActRII 폴리펩티드를 투여받는 환자에서 모세혈관확장증의 위험을 감소시키기 위한 효과적인 치료법에 대한 충족되지 않은 높은 수요가 존재한다. 따라서, ActRII 폴리펩티드를 투여받은 환자에서 모세혈관확장증의 위험에 대한 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

요약

특정 양상에서, 본 발명은 치료 유효량의 ActRII 폴리펩티드를 투여받은 환자에서 모세혈관확장증의 위험을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 (i) ActRII 폴리펩티드의 제1 용량을 0.3 mg/kg의 양으로 환자에게 투여하는 단계; 그리고 (ii) ActRII 폴리펩티드의 제2 용량을 0.7 mg/kg의 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 투여 요법에 따라 ActRII 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하고; 여기서 환자가 증상을 보이거나 모세혈관확장증 발병에 대한 위험 인자를 포함하는 경우 제3 용량이 개시되며, 이러한 방법에 의해 모세혈관확장증의 위험이 감소한다. 특정 양상에서, 본 발명은 치료 유효량의 ActRII 폴리펩티드를 투여받은 환자에서 모세혈관확장증의 위험을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 서열 번호 1의 잔기 30-110에 상응하는 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 방법은 (i) ActRII 폴리펩티드의 제1 용량을 0.3 mg/kg의 양으로 환자에게 투여하는 단계; 그리고 (ii) ActRII 폴리펩티드의 제2 용량을 0.7 mg/kg의 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 투여 요법에 따라 ActRII 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하고; 여기서 환자가 증상을 보이거나 모세혈관확장증 발병에 대한 위험 인자를 포함하는 경우 제3 용량이 개시되며, 이러한 방법에 의해 모세혈관확장증의 위험이 감소한다. 일부 실시형태에서, 제3 용량은 환자에게 ActRII 폴리펩티드 용량을 0.3 mg/kg의 양으로 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 용량은 적어도 2-6주의 기간 동안 ActRII 폴리펩티드의 치료를 보류하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 용량은 적어도 3주의 기간 동안 ActRII 폴리펩티드의 치료를 보류하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 용량은 적어도 3주 동안 환자에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 제2 용량은 적어도 21주 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 제2 용량은 적어도 45주 동안 투여된다.

특정 양상에서, 본 발명은 ActRII 폴리펩티드로 환자를 치료할 때 모세혈관확장증의 위험을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 이 방법은 (i) 1회 이상의 ActRII의 제1 용량을 24주의 기간 동안 3주마다 1회 0.3 mg/kg의 양으로 환자에게 투여하는 단계; 그리고 여기서, 환자가 모세혈관확장증 발병에 대한 하나 이상의 증상 또는 위험 인자를 나타내는 경우, ActRII 폴리펩티드의 제2 용량을 제1 용량 양의 적어도 절반으로 감소된 양으로 1회 이상 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 투여 요법에 따라 ActRII 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함한다.

특정 양상에서, 본 발명은 치료 유효량의 ActRII 폴리펩티드를 투여받은 환자에서 모세혈관확장증의 위험을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 이 방법은 (i) ActRII 폴리펩티드를 0.3 mg/kg의 양으로 3주마다 환자에게 투여하는 단계; 그리고 여기서 환자가 증상을 보이거나 모세혈관확장증 발병에 대한 위험 인자를 포함하는 경우 ActRII 폴리펩티드를 0.3 mg/kg의 양으로 6주 마다 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 투여 요법에 따라 ActRII 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하며, 이러한 방법에 의해 모세혈관확장증의 위험이 감소한다. 특정 양상에서, 본 발명은 치료 유효량의 ActRII 폴리펩티드를 투여받은 환자에서 모세혈관확장증의 위험을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 서열 번호 1의 잔기 30-110에 상응하는 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 방법은 (i) ActRII 폴리펩티드를 0.3 mg/kg의 양으로 3주마다 환자에게 투여하는 단계; 그리고 환자가 증상을 보이거나 모세혈관확장증에 대한 위험 인자를 포함하는 경우, ActRII 폴리펩티드를 0.3 mg/kg의 양으로 6주 마다 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 투여 요법에 따라 ActRII 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하며, 이러한 방법에 의해 모세혈관확장증의 위험이 감소한다. 일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드의 치료 유효량은 3주마다 0.7 mg/kg이다.

특정 양상에서, 본 발명은 폐동맥 고혈압을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 이 방법은 (i) ActRII 폴리펩티드의 제1 용량을 0.3mg/kg의 양으로 환자에게 투여하는 단계; 그리고 (ii) ActRII 폴리펩티드의 제2 용량을 환자가 치료를 필요로 하는 한 3주마다 1회 0.7 mg/kg의 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 투여 요법에 따라 ActRII 폴리펩티드를 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하고; 여기서 폴리펩티드는 서열 번호 1의 잔기 30-110에 상응하는 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 모세혈관확장증의 증상은 통증, 가려움증, 피부의 실 모양의 붉은 자국, 피부 점막 확장증, 위장 출혈, 피부 병변, 비출혈(epistaxis), 치은 출혈, 동정맥 기형, 내부 모세혈관확장증 및 피부의 붉은 반점으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 모세혈관확장증의 증상은 피부 병변을 포함한다. 일부 실시형태에서, 모세혈관확장증의 증상은 치은 출혈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 모세혈관확장증의 증상은 비출혈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 모세혈관확장증의 증상은 동정맥 기형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 모세혈관확장증의 증상은 내부 모세혈관확장증을 포함한다. 일부 실시형태에서, 동정맥 기형 또는 내부 모세혈관확장증은 내부 기관(예: 뇌, 간, 폐, 비장, 요로 및 척추)에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 모세혈관확장증 발병에 대한 위험 인자는 낮은 BMP9 수준; 낮은 BMP10 수준; 낮은 VEGF 수준; 유전성 출혈성 모세혈관확장증(HHT); 및 결합 조직 질환(CTD)으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 위험 감소는 모세혈관확장증의 중증도를 완화 또는 개선하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 위험 감소는 모세혈관확장증의 진행을 예방하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 용량은 모세혈관확장증이 1등급 이하로 개선될 때까지 ActRII 폴리펩티드의 치료를 보류하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 모세혈관확장증의 중증도를 2등급에서 1등급으로 개선한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 모세혈관확장증의 중증도를 3등급에서 2등급으로 개선한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 모세혈관확장증의 중증도를 3등급에서 1등급으로 개선한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 1등급에서 2등급으로의 모세혈관확장증의 진행을 예방한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 2등급에서 3등급으로의 모세혈관확장증의 진행을 예방한다. 일부 실시형태에서, 환자는 PH 치료를 위해 ActRII 폴리펩티드를 투여받고 있다. 일부 실시형태에서, 환자는 PAH 치료를 위해 ActRII 폴리펩티드를 투여받고 있다.

일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 1의 잔기 30-110에 상응하는 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 1의 잔기 21-135에 상응하는 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 1의 잔기 21-135에 상응하는 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드는 서열 번호 2의 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드는 서열 번호 3의 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드는 면역글로불린의 Fc 도메인을 추가로 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린의 Fc 도메인은 IgG1 면역글로불린의 Fc 도메인이다. 일부 실시형태에서, Fc 융합 단백질은 ActRII 폴리펩티드 도메인과 면역글로불린의 Fc 도메인 사이에 위치하는 링커 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커 도메인은 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택된다: TGGG (서열 번호 20), TGGGG (서열 번호 18), SGGGG (서열 번호 19), GGGGS (서열 번호 22), GGG (서열 번호 16), GGGG (서열 번호 17), 및 SGGG (서열 번호 21). 일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드는 서열 번호 23의 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드는 서열 번호 40의 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 동결건조된다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 가용성이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 피하 주사를 사용하여 환자에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 매주, 2주마다, 3주마다 및 4주마다로 구성된 그룹으로부터 선택된 일정에 따라 환자에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 3주마다 환자에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 4주마다 환자에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 동종이량체 단백질 복합체의 일부이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 글리코실화되어 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 차이니즈 햄스터 난소 세포에서의 발현에 의해 얻을 수 있는 글리코실화 패턴을 가진다. 일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드는 액티빈 A, 액티빈 B 및 GDF11로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 리간드에 결합한다. 일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드는 액티빈 및/또는 GDF11에 결합한다. 일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드는 BMP10, GDF8 및 BMP6으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 리간드에 추가로 결합한다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 환자에게 추가 활성제 및/또는 지지 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 추가 활성제 및/또는 지지 요법은 베타-차단제, 안지오텐신 전환 효소 억제제(ACE 억제제), 안지오텐신 수용체 차단제(ARB), 이뇨제, 지질 저하 약물, 엔도텔린 차단제, PDE5 억제제, 프로스타사이클린, 또는 좌심실 보조 장치(LVAD)로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 추가 활성제 및/또는 지지 요법은 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택된다: 프로스타사이클린 및 이의 유도체(예를 들어, 에포프로스테놀, 트레프로스티닐, 및 일로프로스트); 프로스타사이클린 수용체 작용제(예를 들어, 셀렉시팍); 엔도텔린 수용체 길항제(예를 들어, 텔린, 암브리센탄, 마시텐탄, 및 보센탄); 칼슘 채널 차단제(예를 들어, 암로디핀, 딜티아젬 및 니페디핀; 항응고제(예를 들어, 와파린); 이뇨제; 산소 요법; 심방 중격 절개술; 폐 혈전 내막 절제술; 포스포디에스테라제 5형 억제제(예를 들어, 실데나필 및 타다라필); 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성화제(예를 들어, 시나시구아트 및 리오시구아트); ASK-1 억제제(예를 들어, CIIA; SCH79797; GS-4997; MSC2032964A; 3H-나프토[1,2,3-데]퀴닐린-2,7-디온, NQDI-1; 2-티옥소-티아졸리딘, 5-브로모-3-(4-옥소-2-티옥소-티아졸리딘-5-일리덴)-1,3-디하이드로-인돌-2-온); NF-κB 길항제(예를 들어, dh404, CDDO-에폭사이드; 2.2-디플루오로프로피온아미드; C28 이미다졸(CDDO-Im); 2-시아노-3,12-디옥소올레안-1,9-디엔-28-오익 애시드 (CDDO); 3-아세틸올레아놀릭 애시드; 3-트리플루오로아세틸올레아놀릭 애시드; 28-메틸-3-아세틸올레아난; 28-메틸-3-트리플루오로아세틸올레아난; 28-메틸옥시올레아놀릭 애시드; SZC014; SCZ015; SZC017; 올레아놀릭 애시드의 페길화 유도체; 3-O-(베타-D-글루코피라노실) 올레아놀릭 애시드; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1→3)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1→2)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1→3)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드 28-O-베타-D-글루코피라노실 에스테르; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1→2)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드 28-O-베타-D-글루코피라노실 에스테르; 3-O-[a-L-람노피라노실-(1→3)-베타-D-글루쿠로노피라노실] 올레아놀릭 애시드; 3-O-[알파-L-람노피라노실-(1→3)-베타-D-글루쿠로노피라노실] 올레아놀릭 애시드 28-O-베타-D-글루코피라노실 에스테르; 28-O-β-D-글루코피라노실-올레아놀릭 애시드; 3-O-β-D-글루코피라노실 (1→3)-β-D-글루코피라노시두로닉 애시드(CS1); 올레아놀릭 애시드 3-O-β-D-글루코피라노실 (1→3)-β-D-글루코피라노시두로닉 애시드(CS2); 메틸 3,11-디옥소올레안-12-엔-28-올레이트(DIOXOL); ZCVI₄-2; 벤질 3-디하이드록시-1,2,5-옥사디아졸로[3',4':2,3]올레아놀레이트); 좌심실 보조 장치(LVAD), 또는 폐 및/또는 심장 이식. 일부 실시형태에서, 환자는 포스포디에스테라제 5형 억제제, 가용성 구아닐레이트 사이클라제 자극제, 프로스타사이클린 수용체 작용제 및 엔도텔린 수용체 길항제로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제제로 치료받았다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 제제는 보센탄, 실데나필, 베라프로스트, 마시텐탄, 셀렉시팍, 에포프로스테놀, 트레프로스티닐, 일로프로스트, 암브리센탄 및 타다라필로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 포스포디에스테라제 5형 억제제, 가용성 구아닐레이트 사이클라제 자극제, 프로스타사이클린 수용체 작용제 및 엔도텔린 수용체 길항제로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제제의 투여를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 제제는 보센탄, 실데나필, 베라프로스트, 마시텐탄, 셀렉시팍, 에포프로스테놀, 트레프로스티닐, 일로프로스트, 암브리센탄 및 타다라필로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 환자는 폴리펩티드 투여 전에 하나 이상의 혈관확장제로 치료를 받았다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 하나 이상의 혈관확장제의 투여를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 혈관확장제는 프로스타사이클린, 에포프로스테놀 및 실데나필로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 혈관확장제는 프로스타사이클린이다. 일부 실시형태에서, 환자는 PAH에 대한 하나 이상의 요법을 받아 오고 있다. 일부 실시형태에서, PAH에 대한 하나 이상의 요법제는 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택된다: 프로스타사이클린 및 이의 유도체(예를 들어, 에포프로스테놀, 트레프로스티닐, 및 일로프로스트); 프로스타사이클린 수용체 작용제(예를 들어, 셀렉시팍); 엔도텔린 수용체 길항제(예를 들어, 텔린, 암브리센탄, 마시텐탄, 및 보센탄); 칼슘 채널 차단제(예를 들어, 암로디핀, 딜티아젬 및 니페디핀; 항응고제(예를 들어, 와파린); 이뇨제; 산소 요법; 심방 중격 절개술; 폐 혈전 내막 절제술; 포스포디에스테라제 5형 억제제(예를 들어, 실데나필 및 타다라필); 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성화제(예를 들어, 시나시구아트 및 리오시구아트); ASK-1 억제제(예를 들어, CIIA; SCH79797; GS-4997; MSC2032964A; 3H-나프토[1,2,3-데]퀴닐린-2,7-디온, NQDI-1; 2-티옥소-티아졸리딘, 5-브로모-3-(4-옥소-2-티옥소-티아졸리딘-5-일리덴)-1,3-디하이드로-인돌-2-온); NF-κB 길항제(예를 들어, dh404, CDDO-에폭사이드; 2.2-디플루오로프로피온아미드; C28 이미다졸(CDDO-Im); 2-시아노-3,12-디옥소올레안-1,9-디엔-28-오익 애시드 (CDDO); 3-아세틸올레아놀릭 애시드; 3-트리플루오로아세틸올레아놀릭 애시드; 28-메틸-3-아세틸올레아난; 28-메틸-3-트리플루오로아세틸올레아난; 28-메틸옥시올레아놀릭 애시드; SZC014; SCZ015; SZC017; 올레아놀릭 애시드의 페길화 유도체; 3-O-(베타-D-글루코피라노실) 올레아놀릭 애시드; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1→3)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1→2)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1→3)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드 28-O-베타-D-글루코피라노실 에스테르; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1→2)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드 28-O-베타-D-글루코피라노실 에스테르; 3-O-[a-L-람노피라노실-(1→3)-베타-D-글루쿠로노피라노실] 올레아놀릭 애시드; 3-O-[알파-L-람노피라노실-(1→3)-베타-D-글루쿠로노피라노실] 올레아놀릭 애시드 28-O-베타-D-글루코피라노실 에스테르; 28-O-β-D-글루코피라노실-올레아놀릭 애시드; 3-O-β-D-글루코피라노실 (1→3)-β-D-글루코피라노시두로닉 애시드(CS1); 올레아놀릭 애시드 3-O-β-D-글루코피라노실 (1→3)-β-D-글루코피라노시두로닉 애시드(CS2); 메틸 3,11-디옥소올레안-12-엔-28-올레이트(DIOXOL); ZCVI₄-2; 벤질 3-디하이드록시-1,2,5-옥사디아졸로[3',4':2,3]올레아놀레이트); 좌심실 보조 장치(LVAD), 또는 폐 및/또는 심장 이식.

도면의 간단한 설명
도 1은 인간 ActRIIB(서열 번호 31) 및 인간 ActRIIA(서열 번호 2)의 세포외 도메인들의 정렬을 보여주며, 다중 ActRIIB 및 ActRIIA 결정 구조의 복합 분석을 기반으로 하여 본원에서 추론된, 리간드와 직접 접촉하는 잔기들이 상자로 표시되어 있다.
도 2는 다양한 척추동물 ActRIIA 단백질과 인간 ActRIIA(서열 번호 6-10 및 36-38)의 다중 서열 정렬을 보여준다.
도 3은 Clustal 2.1을 사용한 인간 IgG 이소형의 Fc 도메인들의 다중 서열 정렬을 보여준다. 힌지 영역은 점선 밑줄로 표시된다. 이중 밑줄은 비대칭 사슬 페어링을 촉진하기 위해 IgG1 Fc(서열 번호 32)에서 조작된 위치들의 예와 다른 이소형 IgG2(서열 번호 33), IgG3(서열 번호 34) 및 IgG4(서열 번호 35)에 대한 상응하는 위치를 나타낸다.
도 4A 및 4B는 CHO 세포에서 발현된 ActRIIA-hFc의 정제를 보여준다. 단백질은 크기 조정 컬럼(도 4A) 및 쿠마시 염색 SDS-PAGE(도 4B)에 의해 시각화된 바와 같이 잘 정의된 단일 피크로 정제된다(왼쪽 열: 분자량 표준, 오른쪽 열: ActRIIA-hFc).
도 5A 및 5B는 Biacore^TM 분석에 의해 측정된 ActRIIA-hFc와 액티빈(도 5A) 및 GDF-11(도 5B)의 결합을 보여준다.

상세한 설명

1. 개요

본 발명은 본원에 기재된 치료 유효량의 ActRII 폴리펩티드를 투여받은 환자에서 모세혈관확장증의 위험을 감소시키는 조성물 및 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 방법은 (i) ActRII 폴리펩티드의 제1 용량을 0.3 mg/kg의 양으로 환자에게 투여하는 단계; 그리고 (ii) ActRII 폴리펩티드의 제2 용량을 0.7 mg/kg의 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 투여 요법에 따라 ActRII 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하고; 여기서 환자가 증상을 보이거나 모세혈관확장증 발병에 대한 위험 인자를 포함하는 경우 제3 용량이 개시되며, 이러한 방법에 의해 모세혈관확장증의 위험이 감소한다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 폐동맥 고혈압(예를 들어, 기능적 분류 II 또는 기능적 분류 III)의 치료를 위해 치료 유효량의 ActRII 폴리펩티드를 투여받은 환자에서 모세혈관확장증의 위험을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 폐동맥 고혈압은 본원에 기술된 ActRII 폴리펩티드의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 치료된다.

폐동맥 고혈압[세계보건기구(WHO) 그룹 1 PH]은 심각한 혈관 수축과 폐동맥벽 평활근 세포의 비정상적 증식을 특징으로 하는 심각하고 진행성이며 생명을 위협하는 폐 혈관계 질환이다. 폐 혈관이 심하게 수축되면 폐동맥압이 매우 높아진다. 이러한 높은 압력은 심장이 산소를 공급하기 위해 폐를 통해 혈액을 펌핑하는 것을 어렵게 만든다. PAH 환자는 심장이 이러한 높은 압력에 맞서 펌프질을 하기 때문에 극도의 호흡곤란을 겪는다. PAH 환자는 일반적으로 PVR이 크게 증가하고 mPAP가 지속적으로 상승하여 궁극적으로 우심실 부전 및 사망하게 된다. PAH로 진단받은 환자는 예후가 좋지 않고 삶의 질도 마찬가지로 저하되며, 치료하지 않을 경우 평균 기대 수명이 진단 시점으로부터 2 내지 5년이다.

PAH는휴식 시 평균 폐동맥압이 25mmHg 이상(또는 업데이트된 지침에 따라 20mmHg 이상)이고 정상 폐동맥 모세혈관 쐐기압인 경우 진단할 수 있다. PAH는 호흡 곤란, 현기증, 실신 및 기타 증상을 유발할 수 있으며, 이 모든 증상은 운동으로 인해 악화된다. PAH는 운동 내성이 현저히 감소하고 심부전이 발생하는 심각한 질환일 수 있다. PAH의 두 가지 주요 유형에는 특발성 PAH(예: 소인이 확인되지 않은 PAH)와 유전성 PAH(예: BMPR2, ALK1, ENG, SMAD9, CAV1, KCNK3 또는 EIF2AK4의 돌연변이와 관련된 PAH)가 포함된다. 가족성 PAH 사례의 70%에서 돌연변이는 BMPR2 유전자에 위치한다. PAH 발병의 위험 인자로는 PAH 가족력, 약물 및 독소 사용(예: 메스암페타민 또는 코카인 사용), 감염(예: HIV 감염 또는 주혈흡충증), 간경화, 선천성 심장 이상, 문맥 고혈압, 폐정맥-폐색성 질환, 폐 모세혈관종증, 또는 결합 조직/자가면역 질환(예: 피부경화증 또는 루푸스)등이 있다. PAH는 칼슘 채널 차단제에 대한 장기 반응자, 정맥/모세혈관(PVOD/PCH) 관련의 명백한 특징, 신생아 증후군의 지속적인 PH와 관련될 수 있다.

본원에서 사용된 용어는 일반적으로 본 발명의 내용에서 그리고 각 용어가 사용되는 특정 내용에서 당해 분야의 통상적인 의미를 가진다. 본원의 구성 및 방법을 설명하고, 이를 제조하고 사용하는 방법에 대해 숙련된 기술자에게 추가 지침을 제공하기 위해 특정 용어들을 아래 또는 다른 부분에서 논의한다. 용어의 사용 범위나 의미는 해당 용어가 사용되는 특정 맥락에서 명백해질 것이다.

모든 문법적 형태에서 “서열 유사성”이라는 용어는 공통의 진화 기원을 공유하거나 공유하지 않을 수 있는 핵산 또는 아미노산 서열 간의 동일성 또는 일치 정도를 나타낸다.

참조 폴리펩티드(또는 뉴클레오티드) 서열에 대한 “서열 동일성 퍼센트(%)”는, 서열들을 정렬하고 필요에 따라 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입한 후 참조 폴리펩티드(뉴클레오티드) 서열의 아미노산 잔기들(또는 핵산들)과 동일한, 후보 서열의 아미노산 잔기들(또는 핵산들)의 백분율로 정의되며, 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 고려하지 않는다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 해당 분야의 기술 범위에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, BLAST(Basic Local Alignment Search Tool), BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, Clustal Omega, 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 이루어질 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 구현하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열들을 정렬하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 일부 실시형태에서, 아미노산(핵산) 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에서 제작되었으며 소스 코드는 미국 워싱턴 D.C., 20559에 소재한 미국 저작권청에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코에 소재한 Genentech, Inc.사로부터 공개적으로 이용가능하거나 소스 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함한 UNIX 운영 체제에서 사용되도록 컴파일해야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변경되지 않는다. 서열 동일성 또는 상동성을 결정하기 위한 다른 알고리즘으로는 Clustal Omega, LALIGN, FASTA, SIM 및 EMBOSS Needle이 있다. 바람직한 실시형태에서, 서열 동일성을 결정하기 위해 사용되는 알고리즘은 Clustal Omega이다.

“작용시키다”는 모든 문법 형태에서 단백질 및/또는 유전자를 활성화하거나(예를 들어, 해당 단백질의 유전자 발현을 활성화 또는 증폭하거나 비활성 단백질을 활성 상태가 되도록 유도함으로써) 또는 단백질의 및/또는 유전자의 활성을 증가시키는 과정을 의미한다.

“길항시키다”은 모든 문법적 형태에서 단백질 및/또는 유전자를 억제하거나(예를 들어 해당 단백질의 유전자 발현을 억제 또는 감소시키거나 활성 단백질을 비활성 상태가 되도록 유도함으로써) 또는 단백질의 및/또는 유전자의 발성을 감소시키는 과정을 의미한다.

명세서 및 특허청구범위 전반에 걸쳐 수치와 관련하여 사용된 용어 “약” 및 “대략”은 당업자에게 친숙하고 수용 가능한 정확도 구간을 의미한다. 일반적으로 이러한 정확도 구간은 ±10%이다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템에서, 용어 “약” 및 “대략”은 주어진 값의 한 자릿수 이내, 바람직하게는 ≤ 5배, 더욱 바람직하게는 ≤ 2배인 값을 의미할 수 있다.

본원에 개시된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다.

“하나”라는 용어는 해당 용어가 사용된 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 복수형을 포함한다. 용어 “하나”, 뿐만 아니라 용어 “하나 이상” 및 “적어도 하나”는 본 출원에서 호환적으로 사용된다. 또한, 본 출원에서 사용되는 “및/또는”은 둘 이상의 구체적인 특징들 또는 구성요소들 각각에 다른 특징이나 구성요소가 있거나 없는 것을 구체적으로 개시하기 위해 사용되는 것이다. 그러므로, 가령, 본 출원에서 “A 및/또는 B”의 어구에서 사용시 용어 “및/또는”은 “A 및 B,” “A 또는 B,” “A” (단독), 및 “B” (단독)을 포함하는 것으로 한다. 마찬가지로, 가령, “A, B, 및 / 또는 C”의 어구에서 사용시 “및/또는”이라는 용어는 다음 각 양상들을 포함하는 것으로 한다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A와 C; A와 B; B와 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).

본 명세서 전반에 걸쳐, “포함한다(comprise)”라는 단어 또는 “포함하는(comprises)” 또는 “포함하는(comprising)”과 같은 변형은 명시된 정수 또는 정수 그룹을 포함하지만, 다른 정수 또는 정수 그룹을 배제하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.

2. ActRII 폴리펩티드

특정 양상에서, 본 발명은 ActRII 폴리펩티드 및 이의 용도(예를 들어, 치료 유효량의 ActRII 폴리펩티드를 투여받은 환자에서 모세혈관확장증의 위험 감소)에 관한 것이다. 본원에서 사용된 용어 “ActRII”는 II형 액티빈 수용체 계열을 의미한다. 이 계열에는 액티빈 수용체 IIA형(ActRIIA) 및 액티빈 수용체 IIB형(ActRIIB)이 포함된다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 서열 번호 1, 2, 3, 23, 27, 30, 및 40 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가지는 ActRII 폴리펩티드에 관한 것이다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 서열 번호 31에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가지는 ActRII 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 명세서에 사용된 용어 “ActRII”는 액티빈 수용체 IIA형(ActRIIA) 단백질 계열, 액티빈 수용체 IIB형(ActRIIB) 단백질 계열, 또는 이들의 조합 및/또는 변이체를 의미한다. ActRII 폴리펩티드는 임의의 종으로부터 유래될 수 있고 돌연변이 유발 또는 다른 변형에 의해 이러한 ActRII 단백질로부터 유래된 변이체들을 포함한다. 본 명세서에서 ActRII에 대한 언급은 현재 식별된 형태들 중 어느 하나에 대한 언급으로 이해된다. ActRII 계열의 구성원은 일반적으로 시스테인이 풍부한 영역, 막횡단 도메인 및 예측된 세린/트레오닌 키나제 활성을 가지는 세포질 도메인을 포함하는 리간드-결합 세포외 도메인으로 구성된 막횡단 단백질이다.

ActRII 폴리펩티드라는 용어는 유용한 활성을 보유하는 ActRII 계열 구성원의 임의의 자연 발생 폴리펩티드뿐만 아니라 이의 임의의 변이체(돌연변이체, 단편, 융합체 및 펩티드모방체 형태 포함)를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 변이체 ActRII 폴리펩티드의 예는 본 발명 뿐만 아니라 국제 특허 출원 공개공보 WO 2006/012627, WO 2007/062188, WO 2008/097541, WO 2010/151426 및 WO 2011/020045에서 제공되어 있으며, 이들 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 본원에 기술된 모든 ActRII 관련 폴리펩티드에 대한 아미노산 넘버링은 달리 구체적으로 지정되지 않는 한 아래 제공된 인간 ActRII 전구체 단백질 서열(서열 번호 1)의 넘버링을 기반으로 한다.

표준 인간 ActRII 전구체 단백질 서열은 다음과 같다:

1 MGAAAKLAFA VFLISCSSGA ILGRSETQEC LFFNANWEKD RT N QTGVEPC

51 YGDKDKRRHC FATWK N ISGS IEIVKQGCWL DDINCYDRTD CVEKKDSPEV

101 YFCCCEGNMC NEKFSYFPEM EVTQPTSNPV TPKPPYYNIL LYSLVPLMLI

151 AGIVICAFWV YRHHKMAYPP VLVPTQDPGP PPPSPLLGLK PLQLLEVKAR

201 GRFGCVWKAQ LLNEYVAVKI FPIQDKQSWQ NEYEVYSLPG MKHENILQFI

251 GAEKRGTSVD VDLWLITAFH EKGSLSDFLK ANVVSWNELC HIAETMARGL

301 AYLHEDIPGL KDGHKPAISH RDIKSKNVLL KNNLTACIAD FGLALKFEAG

351 KSAGDTHGQV GTRRYMAPEV LEGAINFQRD AFLRIDMYAM GLVLWELASR

401 CTAADGPVDE YMLPFEEEIG QHPSLEDMQE VVVHKKKRPV LRDYWQKHAG

451 MAMLCETIEE CWDHDAEARL SAGCVGERIT QMQRLTNIIT TEDIVTVVTM

501 VTNVDFPPKE SSL (서열 번호 1)

신호 펩티드는 단일 밑줄로 표시되고; 세포외 도메인은 굵은 글꼴로 표시되고; 잠재적인 내인성 N-연결 글리코실화 부위는 이중 밑줄로 표시된다.

처리된(성숙한) 세포외 인간 ActRII 폴리펩티드 서열은 다음과 같다:

ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPP (서열 번호 2)

세포외 도메인의 C-말단 “꼬리”는 단일 밑줄로 표시된다. “꼬리”가 결실된 서열(Δ15 서열)은 다음과 같다:

ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEM (서열 번호 3)

인간 ActRII 전구체 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 다음과 같은 Genbank 참조 서열 NM_001616.4의 뉴클레오티드 159-1700로 아래에 표시된다(서열 번호 4). 신호 서열에 밑줄되어 있다.

1 atgggagctg ctgcaaagtt ggcgtttgcc gtctttctta tctcctgttc

51 ttcaggtgct atacttggta gatcagaaac tcaggagtgt cttttcttta

101 atgctaattg ggaaaaagac agaaccaatc aaactggtgt tgaaccgtgt

151 tatggtgaca aagataaacg gcggcattgt tttgctacct ggaagaatat

201 ttctggttcc attgaaatag tgaaacaagg ttgttggctg gatgatatca

251 actgctatga caggactgat tgtgtagaaa aaaaagacag ccctgaagta

301 tatttttgtt gctgtgaggg caatatgtgt aatgaaaagt tttcttattt

351 tccggagatg gaagtcacac agcccacttc aaatccagtt acacctaagc

401 caccctatta caacatcctg ctctattcct tggtgccact tatgttaatt

451 gcggggattg tcatttgtgc attttgggtg tacaggcatc acaagatggc

501 ctaccctcct gtacttgttc caactcaaga cccaggacca cccccacctt

551 ctccattact aggtttgaaa ccactgcagt tattagaagt gaaagcaagg

601 ggaagatttg gttgtgtctg gaaagcccag ttgcttaacg aatatgtggc

651 tgtcaaaata tttccaatac aggacaaaca gtcatggcaa aatgaatacg

701 aagtctacag tttgcctgga atgaagcatg agaacatatt acagttcatt

751 ggtgcagaaa aacgaggcac cagtgttgat gtggatcttt ggctgatcac

801 agcatttcat gaaaagggtt cactatcaga ctttcttaag gctaatgtgg

851 tctcttggaa tgaactgtgt catattgcag aaaccatggc tagaggattg

901 gcatatttac atgaggatat acctggccta aaagatggcc acaaacctgc

951 catatctcac agggacatca aaagtaaaaa tgtgctgttg aaaaacaacc

1001 tgacagcttg cattgctgac tttgggttgg ccttaaaatt tgaggctggc

1051 aagtctgcag gcgataccca tggacaggtt ggtacccgga ggtacatggc

1101 tccagaggta ttagagggtg ctataaactt ccaaagggat gcatttttga

1151 ggatagatat gtatgccatg ggattagtcc tatgggaact ggcttctcgc

1201 tgtactgctg cagatggacc tgtagatgaa tacatgttgc catttgagga

1251 ggaaattggc cagcatccat ctcttgaaga catgcaggaa gttgttgtgc

1301 ataaaaaaaa gaggcctgtt ttaagagatt attggcagaa acatgctgga

1351 atggcaatgc tctgtgaaac cattgaagaa tgttgggatc acgacgcaga

1401 agccaggtta tcagctggat gtgtaggtga aagaattacc cagatgcaga

1451 gactaacaaa tattattacc acagaggaca ttgtaacagt ggtcacaatg

1501 gtgacaaatg ttgactttcc tcccaaagaa tctagtcta (서열 번호 4)

가공된 가용성(세포외) 인간 ActRII 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 다음과 같다:

1 atacttggta gatcagaaac tcaggagtgt cttttcttta atgctaattg

51 ggaaaaagac agaaccaatc aaactggtgt tgaaccgtgt tatggtgaca

101 aagataaacg gcggcattgt tttgctacct ggaagaatat ttctggttcc

151 attgaaatag tgaaacaagg ttgttggctg gatgatatca actgctatga

201 caggactgat tgtgtagaaa aaaaagacag ccctgaagta tatttttgtt

251 gctgtgaggg caatatgtgt aatgaaaagt tttcttattt tccggagatg

301 gaagtcacac agcccacttc aaatccagtt acacctaagc caccc (서열 번호 5)

ActRII는 척추동물들 간에 잘 보존되며, 상기 세포외 도메인의 넓은 스트레치들은 완전히 보존된다. 예를 들어, 도 2는 다양한 ActRIIA 오솔로그와 비교하여 인간 ActRIIA 세포외 도메인의 다중 서열 정렬을 도시한다. ActRIIA에 결합하는 리간드 중 다수도 고도로 보존되어 있다. 따라서, 이러한 정렬로부터 정상적인 ActRII-리간드 결합 활성에 중요한 리간드-결합 도메인 내의 주요 아미노산 위치를 예측할 수 있을 뿐만 아니라 정상적인 ActRII-리간드 결합 활성을 크게 변경시키지 않고 치환에 내성이 있을 가능성이 있는 아미노산 위치를 예측하는 것이 가능하다. 따라서, 본원에 개시된 방법에 따라 유용한 활성 인간 ActRII 변이체 폴리펩티드는 또 다른 척추동물 ActRII의 서열의 상응하는 위치에 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있거나, 인간 또는 다른 척추동물 서열들의 잔기와 유사한 잔기를 포함할 수 있다.

인간 ActRIIA 세포외 도메인과 인간 ActRIIB 세포외 도메인의 아미노산 서열들의 정렬이 도 1에 도시되어 있다. 이 정렬은 ActRII 리간드와 직접 접촉하는 것으로 여겨지는 두 수용체 내의 아미노산 잔기들을 나타낸다. 예를 들어, 복합 ActRII 구조들은 ActRIIA-리간드 결합 포켓이, 부분적으로, 잔기 F31, N33, N35, K38 내지 T41, E47, Y50, K53 내지 K55, R57, H58, F60, T62, K74, W78 내지 N83, Y85, R87, E92, 및 K94 내지 F101에 의해 정의됨을 나타낸다. 이러한 위치에서는 보존적 돌연변이가 허용될 것으로 예상된다.

제한하고자 하는 것은 아니지만, 다음 예들에서는 활성 ActRII 변이체를 정의하는 이러한 접근 방식을 보여준다. 도 2에 도시된 바와 같이, 인간 세포외 도메인의 F13은 오비스 아리에스(Ovis aries)(서열 번호 7), 갈루스 갈루스(Gallus gallus)(서열 번호 10), 보스 타우루스(Bos Taurus)(서열 번호 36), 타이 토알바(Tyto alba)(서열 번호 37), 및 미오티스 다비디이(Myotis davidii)(서열 번호 38)에서 Y이다. ActRIIA는 이 위치에서 F, W 및 Y를 비롯한 방향족 잔기가 허용된다는 것을 나타낸다. 인간 세포외 도메인의 Q24는 보스 타우루스(Bos Taurus) ActRIIA에서 R이며, 이는 D, R, K, H 및 E를 비롯한 하전된 잔기들이 이 위치에서 허용될 것임을 나타낸다. 인간 세포외 도메인의 S95는 갈루스 갈루스(Gallus gallus) 및 타이토 알바(Tyto alba) ActRIIA에서 F이며, 이는 이 부위가 E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y와 같은 극성 잔기 그리고 아마도 L, I 또는 F와 같은 소수성 잔기를 포함한 다양한 변화에 내성이 있을 수 있음을 나타낸다. 인간 세포외 도메인의 E52는 오비스 아리에스(Ovis aries) ActRIIA에서 D이며 이는 D 및 E를 비롯한 산성 잔기가 이 위치에서 허용됨을 나타낸다. 인간 세포외 도메인의 P29는 비교적 잘 보존되지 않으며, 오비스 아리에스(Ovis aries) ActRIIA에서는 S로 나타나고 미오티스 다비디이(Myotis davidii) ActRIIA에서는 L로 나타나므로, 본질적으로 모든 아미노산이 이 위치에서 허용되어야 한다.

더욱이, 위에서 논의된 바와 같이, ActRII 단백질은 구조적/기능적 특성, 특히, 리간드 결합과 관련하여 당업계에서 특성화되어 왔다[Attisano 외, (1992) Cell 68(1):97-108; Greenwald 외, (1999) Nature Structural Biology 6(1): 18-22; Allendorph 외, (2006) PNAS 103(20: 7643-7648; Thompson 외, (2003) The EMBO Journal 22(7): 1555-1566; 뿐만 아니라 미국 특허 제 7,709,605, 7,612,041, 및 7,842,663]. 예를 들어, 세 손가락 독소 접힘으로 알려진 구조적 모티프를 정의하는 것은 I형 및 II형 수용체에 의한 리간드 결합에 중요하며 각 단량체 수용체의 세포외 도메인 내의 다양한 위치에 위치한 보존된 시스테인 잔기에 의해 형성된다[Greenwald 외, (1999) Nat Struct Biol 6:18-22; 및 Hinck (2012) FEBS Lett 586:1860-1870]. 본원에 개시된 내용들 이외에도, 이들 참고문헌은 하나 이상의 원하는 활성(예를 들어, 리간드-결합 활성)을 유지하는 ActRII 변이체를 생성하는 방법에 대한 충분한 지침을 제공한다.

예를 들어, 세 손가락 독소 접힘으로 알려진 구조적 모티프를 정의하는 것은 I형 및 II형 수용체에 의한 리간드 결합에 중요하며 각 단량체 수용체의 세포외 도메인 내의 다양한 위치에 위치한 보존된 시스테인 잔기에 의해 형성된다[Greenwald 외, (1999) Nat Struct Biol 6:18-22; 및 Hinck (2012) FEBS Lett 586:1860-1870]. 따라서, 이들 보존된 시스테인의 최외각에 의해 구분되는 인간 ActRII의 핵심 리간드-결합 도메인은 서열 번호 1(ActRII 전구체)의 위치 30-110에 해당한다. 따라서, 이들 시스테인으로 구분된 코어 서열들에 양상에 있는 구조적으로 덜 정렬된 아미노산은 N-말단에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29개 잔기 만큼 그리고 C-말단에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 잔기 만큼 절단될 수 있으며 반드시 리간드 결합을 변경하는 것은 아니다. 예시적인 ActRII 세포외 도메인 절단에는 서열 번호 2 및 3이 포함된다.

따라서, ActRII의 활성 부분(예를 들어, 리간드 결합)에 대한 일반식은 서열 번호 1의 아미노산 30-110을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 구성되는 폴리펩티드이다. 따라서 ActRII 폴리펩티드는, 예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 21-30 중 어느 하나에 상응하는 잔기에서 시작(예를 들어, 아미노산 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 중 어느 하나에서 시작)하여 서열 번호 1의 아미노산110-135 중 어느 하나에 상응하는 위치에서 끝나는(예를 들어, 아미노산 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 또는 135) 중 어느 하나에서 끝나는 ActRII의 위치에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 이들로 구성될 수 있다. 다른 예에는 서열 번호 1의 21-30(예를 들어, 아미노산 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 중 어느 하나에서 시작하여), 22-30(예를 들어, 아미노산 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 중 하나에서 시작하여), 23-30(예를 들어, 아미노산 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 중 어느 하나에서 시작하여), 24-30(예를 들어, 아미노산 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 중 어느 하나에서 시작하여)에서 선택된 위치에서 시작하여, 서열 번호 1의 111-135(예를 들어, 아미노산 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 또는 135 중 어느 하나에서 끝나는), 112-135 (예를 들어, 아미노산 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 또는 135 중 어느 하나에서 끝나는), 113-135 (예를 들어, 아미노산 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 또는 135 중 어느 하나에서 끝나는), 120-135 (예를 들어, 아미노산 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 또는 135 중 어느 하나에서 끝나는), 130-135 (예를 들어, 아미노산 130, 131, 132, 133, 134 또는 135 중 어느 하나에서 끝나는), 111-134 (예를 들어, 아미노산 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134 중 어느 하나에서 끝나는), 111-133 (예를 들어, 아미노산 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 또는 133 중 어느 하나에서 끝나는), 111-132 (예를 들어, 아미노산 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 또는 132 중 어느 하나에서 끝나는), 또는 111-131 (예를 들어, 아미노산 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 또는 131 중 어느 하나에서 끝나는)에서 선택된 위치에서 끝나는 구조체가 포함된다. 이들 범위 내의 변이체들, 특히, 서열 번호 1의 상응하는 부분에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 구성되는 변이체들 또한 고려된다. 따라서 일부 실시형태에서 ActRII 폴리펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 30-110에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드를 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 이들로 구성될 수 있다. 선택적으로, ActRII 폴리펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 30-110에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고, 리간드 결합 포켓에 1, 2, 5, 10 또는 15개 이하의 보존적 아미노산 변화를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드는 동종이량체 단백질 복합체의 일부이다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 ActRII 폴리펩티드(예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드 또는 이들의 조합)에 관한 것이며, 이는 이의 단편, 기능적 변이체 및 변형된 형태뿐만 아니라 이의 용도(예를 들어, 치료 유효량의 ActRII 폴리펩티드를 투여받은 환자에서 모세혈관확장증의 위험 감소)를 포함한다. 바람직하게는, ActRII 폴리펩티드는 가용성이다(예를 들어, ActRII의 세포외 도메인). 일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드는 하나 이상의 GDF/BMP 리간드[예를 들어, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF3, BMP4, BMP6, BMP10 및/또는 BMP15]를 억제한다(예를 들어, Smad 신호전달). 일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드는 하나 이상의 GDF/BMP 리간드[예를 들어, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF3, BMP4, BMP6, BMP10 및/또는 BMP15]에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 21-30 중 어느 하나에 상응하는 잔기에서 시작(예를 들어, 아미노산 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 중 어느 하나에서 시작)하여 서열 번호 1의 아미노산110-135 중 어느 하나에 상응하는 위치에서 끝나는(예를 들어, 아미노산 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 또는 135) 중 어느 하나에서 끝나는 ActRII의 위치에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 이들로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열 30-110에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성된다. 특정 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열 21-135에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드는 서열 번호 1, 2, 3, 23, 27, 30, 및 40 중 어느 하나의 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성된다.

일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드는 서열 번호 23의 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 다른 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드(예를 들어, 서열 번호 23)에는 C-말단 리신이 결여될 수 있다. 일부 실시형태에서, C-말단 리신이 결여된 ActRII 폴리펩티드는 서열 번호 40이다. 일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드는 서열 번호 40의 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 환자에게 서열 번호 23의 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성되는 ActRII 폴리펩티드가 투여된다. 일부 실시형태에서, 환자에게 서열 번호 40의 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성되는 ActRII 폴리펩티드가 투여된다. 일부 실시형태에서, 환자에게 서열 번호 23 및 서열 번호 40의 조합물이 투여된다.

특정 양태에서, 본 발명은 ActRII 폴리펩티드(예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, 또는 이들의 조합)에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 트랩은 변이체 ActRII 폴리펩티드가 상응하는 야생형 ActRII 폴리펩티드 보다 하나 이상의 변경된 리간드 결합 활성을 갖도록 ActRII 폴리펩티드(예를 들어, “야생형” 또는 비변형 ActRII 폴리펩티드)의 세포외 도메인(리간드 결합 도메인으로도 지칭됨)에 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 아미노산 첨가, 결실, 치환 및 이들의 조합)를 포함하는 변이체 ActRII 폴리펩티드(예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드 또는 이들의 조합)이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 변이체 ActRII 폴리펩티드는 상응하는 야생형 ActRII 폴리펩티드와 적어도 하나의 유사한 활성을 보유한다. 예를 들어, 바람직한 ActRII 폴리펩티드는 GDF11 및/또는 GDF8에 결합하여 그 기능을 억제(예를 들어 길항)한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 추가로 하나 이상의 GDF/BMP 리간드[예를 들어, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF3, BMP4, BMP6, BMP10 및/또는 BMP15]에 결합하여 이를 억제한다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 ActRII 리간드에 대해 변경된 결합 특이성을 갖는 ActRII 폴리펩티드를 제공한다.

설명하기 위해, 하나 이상의 ActRII-결합 리간드, 예를 들어, 액티빈(액티빈 A 또는 액티빈 B), 특히 액티빈 A에 비해 GDF11 및/또는 GDF8에 대한 변경된 리간드-결합 도메인의 선택성을 증가시키는 하나 이상의 돌연변이가 선택될 수 있다. 선택적으로, 변경된 리간드-결합 도메인은 GDF11 및/또는 GDF8 결합의 K_d에 대한 액티빈 결합의 K_d의 비율이 야생형 리간드 결합 도메인에 대한 비율에 비해 적어도 2-, 5-, 10-, 20-, 50-, 100- 또는 심지어 1000-배 더 크다. 선택적으로, 변경된 리간드-결합 도메인은 GDF11 및/또는 GDF8의 억제에 관한 IC₅₀에 대한 액티빈의 억제에 관한 IC₅₀의 비율이 야생형 리간드 결합 도메인에 비해 적어도 2-, 5-, 10-, 20-, 50-, 100- 또는 심지어 1000-배 더 크다. 선택적으로, 변경된 리간드-결합 도메인은 액티빈의 억제에 관한 IC₅₀보다 적어도 2배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배 또는 심지어 1000배 더 낮은 IC₅₀으로 GDF11 및/또는 GDF8을 억제한다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 폴리펩티드의 글리코실화를 변경시키기 위해 ActRII 폴리펩티드(예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드 또는 이들의 조합)의 특정 돌연변이를 고려한다. 이러한 돌연변이는 O-연결 또는 N-연결 글리코실화 부위와 같은 하나 이상의 글리코실화 부위를 도입하거나 제거하도록 선택될 수 있다. 아스파라긴 연결된 글리코실화 인식 부위는 일반적으로 적절한 세포 글리코실화 효소에 의해 특이적으로 인식되는 트리펩티드 서열, 아스파라긴-X-트레오닌 또는 아스파라긴-X-세린(이 때 “X”는 임의의 아미노산임)을 포함한다. 이러한 변경은 또한 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우) 폴리펩티드 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 첨가하거나 이에 의한 치환에 의해 이루어질 수 있다. 글리코실화 인식 부위의 첫 번째 또는 세 번째 아미노산 위치 중 하나 또는 둘 모두에서의 다양한 아미노산 치환 또는 결실(및/또는 두 번째 위치에서의 아미노산 결실)은 변형된 트리펩티드 서열에서의 비-글리코실화를 초래한다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 수를 증가시키는 또 다른 방법은 글리코시드를 폴리펩티드에 화학적으로 또는 효소적으로 결합시키는 것이다. 사용된 결합 모드에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘; (b) 유리 카르복실기; (c) 시스테인의 잔기들과 같은 유리 설프히드릴기; (d) 세린, 트레오닌 또는 하이드록시프롤린의 잔기들과 같은 유리 하이드록실기; (e) 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 잔기들과 같은 방향족 잔기; 또는 (f) 글루타민의 아미드기에 부착될 수 있다. 폴리펩티드에 존재하는 하나 이상의 탄수화물 부분은 화학적으로 및/또는 효소적으로 제거될 수 있다. 화학적 탈글리코실화는, 예를 들어, 폴리펩티드를 화합물 트리플루오로메탄술폰산 또는 등가 화합물에 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 이 처리는 아미노산 서열을 그대로 유지하면서 연결 당 (N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분 또는 모든 당의 절단을 초래한다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 Thotakura 외,의 문헌[Meth. Enzymol. (1987) 138:350]에 의해 기술된 바와 같이 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제를 사용하여 달성될 수 있다. 폴리펩티드의 서열은 사용된 발현 시스템의 유형에 따라 적절하게 조정될 수 있는데, 포유동물, 효모, 곤충 및 식물 세포는 모두 펩티드의 아미노산 서열에 의해 영향을 받을 수 있는 서로 다른 글리코실화 패턴을 도입할 수 있기 때문이다. 일반적으로, 인간에게 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드는 적절한 글리코실화를 제공하는 포유동물 세포주, 예를 들어, HEK293 또는 CHO 세포주에서 발현될 수 있지만, 다른 포유동물 발현 세포주도 또한 유용할 것으로 예상된다.

본 발명은 돌연변이체, 특히, ActRII 폴리펩티드의 조합 돌연변이체 세트(예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드 또는 이들의 조합)뿐만 아니라 절단 돌연변이체를 생성하는 방법을 추가로 고려한다. 조합 돌연변이체 풀은 기능적으로 활성인(예를 들어, GDF/BMP 리간드 결합) ActRII 서열을 식별하는 데 특히 유용하다. 이러한 조합 라이브러리를 스크리닝하는 목적은 예를 들어 변경된 약동학 또는 변경된 리간드 결합과 같은 변경된 특성을 가지는 폴리펩티드 변이체를 생성하는 것일 수 있다. 다양한 스크리닝 분석이 아래에 제공되며 이러한 분석은 변이체를 평가하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, ActRII 변이체는 하나 이상의 GDF/BMP 리간드[예를 들어, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF3, BMP4, BMP6, BMP10 및/또는 BMP15]에 결합하여 ActRII 폴리펩티드 및 이의 이종다량체에 대한 GDF/BMP 리간드의 결합을 저해하고/하거나 GDF/BMP 리간드에 의해 발생하는 신호전달을 방해하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다.

ActRII 폴리펩티드(예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드 또는 이들의 조합) 또는 이들의 변이체의 활성은 세포 기반 또는 생체내 분석으로 검사될 수도 있다. 예를 들어, 폐동맥 고혈압 발병에 관련된 유전자의 발현에 대한 ActRII 폴리펩티드의 효과를 평가할 수 있다. 이는, 필요에 따라, 하나 이상의 재조합 리간드 단백질[예를 들어, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF3, BMP4, BMP6, BMP10 및/또는 BMP15]의 존재 하에 수행될 수 있으며, 세포는 ActRII 폴리펩티드 및 선택적으로 GDF/BMP 리간드를 생성하기 위해 형질감염될 수 있다. 마찬가지로, ActRII 폴리펩티드는 마우스 또는 다른 동물에게 투여될 수 있고, 폐고혈압 병인에 대한 효과는 해당 분야에서 인정된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 유사하게, ActRII 폴리펩티드 또는 이의 변이체의 활성은 예를 들어 본원에 기술된 분석법 및 당업계에 공지된 분석법에 의해 이들 세포의 성장에 대한 임의의 효과에 대해 혈액 세포 전구체 세포에서 검사될 수 있다. SMAD-반응성 리포터 유전자는 이러한 세포주에서 하류 신호전달에 대한 효과를 모니터링하는 데 사용될 수 있다.

참조 ActRII 폴리펩티드(예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드 또는 이들의 조합)에 비해 증가된 선택성 또는 일반적으로 증가된 효능을 가지는 조합으로 유래된 변이체들이 생성될 수 있다. 이러한 변이체는 재조합 DNA 구조체들로부터 발현될 때 유전자 요법 프로토콜에 사용될 수 있다. 마찬가지로, 돌연변이 유발은 상응하는 변형되지 않은 ActRII 폴리펩티드와 두드러지게 다른 세포내 반감기를 가지는 변이체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 변형된 단백질은 변형되지 않은 폴리펩티드를 파괴하거나 그렇지 않으면 불활성화시키는 단백질성 분해 또는 기타 세포 과정에 대해 더 안정하거나 덜 안정하게 될 수 있다. 이러한 변이체 및 이를 코딩하는 유전자들은 폴리펩티드의 반감기를 조절함으로써 폴리펩티드 복합체 수준을 변경하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 짧은 반감기는 더 일시적인 생물학적 효과를 일으킬 수 있으며, 유도성 발현 시스템의 일부인 경우 세포 내 재조합 폴리펩티드 복합체 수준을 더 엄격하게 제어할 수 있다. Fc 융합 단백질에서, ActRII 폴리펩티드의 반감기를 변경하기 위해 링커(있는 경우) 및/또는 Fc 부분에 돌연변이가 이루어질 수 있다.

조합 라이브러리는 각각 잠재적인 ActRII 폴리펩티드 서열들의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드들의 라이브러리를 코딩하는 유전자들의 축퇴 라이브러리를 통해 생산될 수 있다. 예를 들어, 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물은 잠재적인 ActRII 코딩 뉴클레오티드 서열의 축퇴 세트가 개별 폴리펩티드로서 또는 대안적으로 더 큰 융합 단백질 세트(예를 들어, 파지 디스플레이용)로서 발현될 수 있도록 유전자 서열들에 효소적으로 결찰될 수 있다.

축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열로부터 잠재적 상동체 라이브러리를 생성할 수 있는 방법은 여러 가지가 있다. 축퇴 유전자 서열들의 화학적 합성은 자동 DNA 합성기에서 수행될 수 있으며, 합성 유전자들은 발현을 위해 적절한 벡터에 연결될 수 있다. 축퇴성 올리고뉴클레오티드의 합성은 당업계에 잘 알려져 있다[Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura 외, (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura 외, (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura 외, (1984) Science 198:1056; 및 Ike 외, (1983) Nucleic Acid Res. 11:477]. 이러한 기술은 다른 단백질의 직접 진화에 사용되었다[Scott 외, (1990) Science 249:386-390; Roberts 외, (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin 외, (1990) Science 249: 404-406; Cwirla 외, (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; 뿐만 아니라 미국 특허 제 5,223,409, 5,198,346, 및 5,096,815호].

대안적으로, 다른 형태의 돌연변이 유발을 활용하여 조합 라이브러리를 생성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드(예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, 또는 이들의 조합)는 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발을 사용하여 스크리닝함으로써 라이브러리로부터 생성되고 단리될 수 있다[Ruf 외, (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang 외, (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint 외, (1993) Gene 137:109-118; Grodberg 외, (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima 외, (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman 외, (1991) Biochemistry 30:10832-10838; and Cunningham 외, (1989) Science 244:1081-1085], by linker scanning mutagenesis [Gustin 외, (1993) Virology 193:653-660; and Brown 외, (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight 외, (1982) Science 232:316], by saturation mutagenesis [Meyers 외, (1986) Science 232:613]; by PCR mutagenesis [Leung 외, (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19]; or by random mutagenesis, including chemical mutagenesis [Miller 외, (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; 및 Greener 외, (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34]. 특히, 조합 환경에서, 링커 스캐닝 돌연변이 유발은 절단된(생물활성) 형태의 ActRII 폴리펩티드를 식별하는 매력적인 방법이다.

점 돌연변이 및 절단에 의해 만들어진 조합 라이브러리의 유전자 생성물을 스크리닝하고, 특정 특성을 가지는 유전자 생성물에 대한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 광범위한 기술이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 기술은 일반적으로 ActRII 폴리펩티드(예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드 또는 이들의 조합)의 조합 돌연변이 유발에 의해 생성된 유전자 라이브러리의 신속한 스크리닝에 적합할 것이다. 대형 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위해 가장 널리 사용되는 기술은 전형적으로 유전자 라이브러리를 복제 가능한 발현 벡터로 클로닝하고, 생성된 벡터 라이브러리로 적절한 세포를 형질전환하고, 원하는 활성의 검출이 생성물이 검출된 유전자를 코딩하는 벡터의 비교적 용이한 분리를 용이하게 하는 조건 하에서 조합 유전자를 발현시키는 것을 포함한다. 바람직한 분석에는 리간드[예를 들어, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF3, BMP4, BMP6, BMP10 및/또는 BMP15] 결합 분석 및/또는 리간드 매개 세포 신호 전달 분석이 포함된다.

당업자가 인식할 수 있는 바와 같이, 본원에 기술된 대부분의 기술된 돌연변이, 변이체 또는 변형은 핵산 수준에서 또는 일부 경우에는 번역 후 변형 또는 화학적 합성에 의해 이루어질 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며 그 중 일부가 본 명세서에 설명되어 있다. 부분적으로, 본 발명은 본원에 제공된 본 발명의 범위에 속하는 다른 변이체 ActRII 폴리펩티드를 생성하고 사용하기 위한 지침으로 사용될 수 있는 ActRII 폴리펩티드(예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드 또는 이들의 조합)의 기능적 활성 부분(단편) 및 변이체를 식별한다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드의 기능적 활성 단편은 ActRII 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 상응하는 단편으로부터 재조합적으로 생산된 폴리펩티드를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 또한, 단편들은 종래의 Merrifield 고체상 f-Moc 또는 t-Boc 화학과 같은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 이들 단편은 (재조합으로 또는 화학적 합성에 의해) 생산되어 ActRII 수용체 및/또는 하나 이상의 리간드[예를 들어, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF3, BMP4, BMP6, BMP10 및/또는 BMP15]의 길항제로서 기능할 수 있는 펩티딜 단편들을 식별하기 위해 검사될 수 있다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드(예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, 또는 이들의 조합)는 ActRII 폴리펩티드에 자연적으로 존재하는 것 외에 번역 후 변형을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 변형에는 아세틸화, 카르복실화, 글리코실화, 인산화, 지질화 및 아실화가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 결과적으로, ActRII 폴리펩티드는 폴리에틸렌 글리콜, 지질, 다당류 또는 단당류 및 인산염과 같은 비아미노산 요소를 함유할 수 있다. 리간드 트랩 폴리펩티드의 기능성에 대한 이러한 비아미노산 요소의 효과는 다른 ActRII 변이체에 대해 본원에 기술된 바와 같이 검사될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드가 초기 형태의 폴리펩티드를 절단함으로써 세포에서 생산되는 경우, 번역 후 가공은 또한 단백질의 올바른 접힘 및/또는 기능을 위해 중요할 수 있다. 다양한 세포(예를 들어, CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 또는 HEK293)는 이러한 번역 후 활동을 위한 특정 세포 기구 및 특징적인 메커니즘을 가지며 ActRII 폴리펩티드의 올바른 변형 및 처리를 보장하도록 선택될 수 있다.

특정 양상에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드(예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, 또는 이들의 조합)는 ActRII 폴리펩티드의 적어도 일부(도메인) 및 하나 이상의 이종 부분(도메인)을 가지는 융합 단백질을 포함한다. 이러한 융합 도메인의 잘 알려진 예에는 폴리히스티딘, Glu-Glu, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 면역글로불린 중쇄 불변 영역(Fc), 말토오스 결합 단백질(MBP) 또는 인간 혈청 알부민이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 융합 도메인은 원하는 특성을 부여하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 일부 융합 도메인은 친화성 크로마토그래피에 의한 융합 단백질의 단리에 특히 유용하다. 친화성 정제를 위해, 글루타티온, 아밀라제, 니켈 또는 코발트 접합 수지와 같은 친화성 크로마토그래피 관련 매트릭스가 사용된다. 이러한 매트릭스 중 다수는 (HIS₆)(서열 번호 39) 융합 파트너와 함께 유용한 Pharmacia GST 정제 시스템 및 QIAexpress^TM 시스템(Qiagen)과 같은 “키트” 형태로 이용 가능하다. 또 다른 예로서, 융합 도메인은 ActRII 폴리펩티드의 검출을 용이하게 하도록 선택될 수 있다. 이러한 검출 도메인의 예로는 다양한 형광 단백질(예를 들어, GFP)뿐만 아니라 일반적으로 특정 항체를 사용할 수 있는 짧은 펩티드 서열인 “에피토프 태그”가 포함된다. 특정 단클론 항체를 쉽게 이용할 수 있는 잘 알려진 에피토프 태그에는 FLAG, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 및 c-myc 태그가 포함된다. 일부 경우에, 융합 도메인은 인자 Xa 또는 트롬빈과 같은 프로테아제 절단 부위를 가지며, 이는 관련 프로테아제가 융합 단백질을 부분적으로 소화하여 그로부터 재조합 단백질을 유리시킬 수 있게 한다. 유리된 단백질은 후속 크로마토그래피 분리에 의해 융합 도메인으로부터 단리될 수 있다. 선택될 수 있는 다른 유형의 융합 도메인에는 다량체화(예를 들어, 이량체화, 사량체화) 도메인 및, 예를 들어, 면역글로불린으로부터의 불변 도메인(예를 들어, Fc 도메인)을 포함하는 기능성 도메인(추가의 생물학적 기능을 부여하는)이 포함된다.

특정 양상에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드(예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, 또는 이들의 조합)는 폴리펩티드를 “안정화”할 수 있는 하나 이상의 변형을 함유한다. “안정화”란 파괴 감소, 신장에 의한 청소율 감소, 또는 제제의 다른 약동학적 효과로 인한 것인지 여부에 관계없이 시험관 내 반감기, 혈청 반감기를 증가시키는 모든 것을 의미한다. 예를 들어, 이러한 변형은 폴리펩티드의 저장 수명을 향상시키고, 폴리펩티드의 순환 반감기를 향상시키고/시키거나 폴리펩티드의 단백질 분해를 감소시킨다. 이러한 안정화 변형에는 융합 단백질(예를 들어 ActRII 폴리펩티드 도메인과 안정화제 도메인을 포함하는 융합 단백질 포함), 글리코실화 부위의 변형(예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 글리코실화 부위의 추가를 포함), 및 탄수화물 모이어티의 변형(예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드로부터 탄수화물 모이어티의 제거를 포함함)이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 본 명세서에 사용된 용어 “안정화제 도메인”은 융합 단백질의 경우와 같이 융합 도메인(예를 들어, 면역글로불린 Fc 도메인)을 의미할 뿐만 아니라, 탄수화물 모이어티와 같은 비단백질성 변형, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 비단백질성 변형도 포함한다. 바람직한 특정 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드는 폴리펩티드를 안정화시키는 이종 도메인(“안정화제” 도메인), 바람직하게는 생체내에서 폴리펩티드의 안정성을 증가시키는 이종 도메인과 융합된다. 면역글로불린의 불변 도메인(예를 들어, Fc 도메인)과의 융합은 광범위한 단백질에 바람직한 약동학적 특성을 부여하는 것으로 알려져 있다. 마찬가지로, 인간 혈청 알부민에 대한 융합은 바람직한 특성을 부여할 수 있다.

인간 IgG1의 Fc 부분(G1Fc)에 사용될 수 있는 천연 아미노산 서열의 예는 하기에 제시되어 있다(서열 번호 11). 점선 밑줄은 힌지 영역을 나타내고 실선 밑줄은 자연적으로 발생하는 변이체가 있는 위치를 나타낸다. 부분적으로, 본 발명은 서열 번호 11에 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열들을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나 이들로 구성된 폴리펩티드를 제공한다. G1Fc에서 자연적으로 발생하는 변이체에는 서열 번호 11에 사용된 넘버링 체계에 따라 E134D 및 M136L이 포함된다(Uniprot P01857 참조).

1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE

51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK

101 VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF

151 YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV

201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (서열 번호 11)

선택적으로, IgG1 Fc 도메인은 Asp-265, 리신 322 및 Asn-434와 같은 잔기에서 하나 이상의 돌연변이를 가진다. 특정 경우에, 이들 돌연변이 중 하나 이상(예를 들어 Asp-265 돌연변이)을 가지는 돌연변이 IgG1 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인에 비해 Fcγ 수용체에 대한 결합 능력이 감소되었다. 다른 경우에, 이들 돌연변이 중 하나 이상(예를 들어, Asn-434 돌연변이)을 가지는 돌연변이 Fc 도메인은 야생형 IgG1 Fc 도메인에 비해 MHC 클래스 I 관련 Fc-수용체(FcRN)에 대한 결합 능력이 증가되었다.

인간 IgG2의 Fc 부분(G2Fc)에 사용될 수 있는 천연 아미노산 서열의 예는 하기에 제시되어 있다(서열 번호 12). 점선 밑줄은 힌지 영역을 나타내고 이중 밑줄은 UniProt P01859에 따라 해당 서열에서 데이터베이스 충돌이 있는 위치를 나타낸다. 부분적으로, 본 발명은 서열 번호 12에 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열들을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나 이들로 구성된 폴리펩티드를 제공한다.

1 VECPPCPAPP VAGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVQ

51 FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTFRVVS VLTVVHQDWL NGKEYKCKVS

101 NKGLPAPIEK TISKTKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP

151 SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPMLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS

201 CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK (서열 번호 12)

인간 IgG3의 Fc 부분(G3Fc)에 사용될 수 있는 아미노산 서열의 두 가지 예가 아래에 나와 있다. G3Fc의 힌지 영역은 다른 Fc 사슬보다 최대 4배 길 수 있으며 유사한 17개 잔기 세그먼트 앞에 3개의 동일한 15개 잔기 세그먼트가 포함되어 있다. 아래 제시된 첫 번째 G3Fc 서열(서열 번호 13)은 단일 15개 잔기 세그먼트로 구성된 짧은 힌지 영역을 포함하는 반면, 두 번째 G3Fc 서열(서열 번호 14)은 전장 힌지 영역을 포함한다. 각 경우에, 점선 밑줄은 힌지 영역을 나타내고 실선 밑줄은 UniProt P01859에 따라 자연적으로 발생하는 변이가 있는 위치를 나타낸다. 부분적으로, 본 발명은 서열 번호 13 및 14에 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열들을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나 이들로 구성된 폴리펩티드를 제공한다.

1 EPKSCDTPPP CPRCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD

51 VSHEDPEVQF KWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTFRVVSV LTVLHQDWLN

101 GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKTKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL

151 TCLVKGFYPS DIAVEWESSG QPENNYNTTP PMLDSDGSFF LYSKLTVDKS

201 RWQQGNIFSC SVMHEALHNR FTQKSLSLSP GK (서열 번호 13)

1 ELKTPLGDTT HTCPRCPEPK SCDTPPPCPR CPEPKSCDTP PPCPRCPEPK

51 SCDTPPPCPR CPAPELLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH

101 EDPEVQFKWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TFRVVSVLTV LHQDWLNGKE

151 YKCKVSNKAL PAPIEKTISK TKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL

201 VKGFYPSDIA VEWESSGQPE NNYNTTPPML DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ

251 QGNIFSCSVM HEALHNRFTQ KSLSLSPGK (서열 번호 14)

G3Fc의 자연 발생 변이체(예를 들어, Uniprot P01860 참조)에는 서열 번호 13에 사용된 넘버링 체계로 전환하면 E68Q, P76L, E79Q, Y81F, D97N, N100D, T124A, S169N, S169del, F221Y가 포함되며, 본 발명은 이러한 변이들 중 하나 이상을 포함하는 G3Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 또한, 인간 면역글로불린 IgG3 유전자(IGHG3)는 다양한 힌지 길이를 특징으로 하는 구조적 다형성을 보여준다[Uniprot P01859 참조]. 특히 변이체 WIS에는 대부분의 V 영역과 모든 CH1 영역이 결여되어 있다. 이는 힌지 영역에 일반적으로 존재하는 11번 위치에 추가로 7번 위치에 추가의 사슬 간 이황화 결합을 가지고 있다. 변이체 ZUC에는 대부분의 V 영역, 모든 CH1 영역 및 힌지 일부가 결여되어 있다. 변이체 OMM은 대립유전자 형태 또는 다른 감마 사슬 하위 클래스를 나타낼 수 있다. 본 발명은 이들 변이체 중 하나 이상을 함유하는 G3Fc 도메인을 포함하는 추가적인 융합 단백질을 제공한다.

인간 IgG4의 Fc 부분(G4Fc)에 사용될 수 있는 천연 아미노산 서열의 예는 하기에 제시되어 있다(서열 번호 15). 점선 밑줄은 힌지 영역을 나타낸다. 부분적으로, 본 발명은 서열 번호 15에 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열들을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나 이들로 구성된 폴리펩티드를 제공한다.

1 ESKYGPPCPS CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ

51 EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE

101 YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL

151 VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ

201 EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLGK (서열 번호 15)

Fc 도메인의 다양한 조작된 돌연변이가 G1Fc 서열(서열 번호 11)과 관련하여 본원에 제시되어 있으며, G2Fc, G3Fc 및 G4Fc의 유사한 돌연변이는 도 3의 G1Fc와의 정렬로부터 유래될 수 있다. 동일하지 않은 힌지 길이로 인해, 이소형 정렬(도 3)에 기초한 유사한 Fc 위치는 서열 번호 11, 12, 13, 14 및 15에서 서로 다른 아미노산 번호를 보유한다. 힌지, C_H2 및 C_H3 영역(예를 들어, 서열 번호 11, 12, 13, 14 및 15)으로 구성된 면역글로불린 서열에서 주어진 아미노산 위치는, 넘버링이 전체 IgG1 중쇄 불변 도메인(C_H1, 힌지, C_H2 및 C_H3 영역으로 구성)을 포함하는 경우 Uniprot 데이터베이스에서와 같은 동일한 위치와 다른 번호로 식별될 것임 또한 이해될 수 있다. 예를 들어, 인간 G1Fc 서열(서열 번호 11), 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인(Uniprot P01857) 및 인간 IgG1 중쇄에서 선택된 C_H3 위치들 사이의 대응성은 다음과 같다.

허용 가능한 수율로 바람직한 비대칭 융합 단백질을 생산하기 위해 단일 세포주에서 Fc 함유 융합 폴리펩티드 사슬의 원하는 페어링을 증가시키는 다양한 방법이 관련 기술 분야에 알려져 있다[Klein et al (2012) mAbs 4:653-663; 및 Spiess et al (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106]. Fc 함유 사슬들의 원하는 페어링을 얻는 방법에는 전하 기반 페어링(정전기 조정), “놉-인투-홀” 입체 페어링, SEEDbody 페어링 및 류신 지퍼 기반 페어링이 포함되나 이에 제한되지는 않는다[Ridgway et al (1996) Protein Eng 9:617-621; Merchant et al (1998) Nat Biotech 16:677-681; Davis et al (2010) Protein Eng Des Sel 23:195-202; Gunasekaran et al (2010); 285:19637-19646; Wranik et al (2012) J Biol Chem 287:43331-43339; US5932448; WO 1993/011162; WO 2009/089004, 및 WO 2011/034605].

융합 단백질(예를 들어, 면역글로불린 Fc 융합 단백질)의 다양한 요소는 원하는 기능성과 일치하는 임의의 방식으로 배열될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, ActRII 폴리펩티드 도메인은 이종 도메인에 대해 C-말단에 위치할 수 있거나, 대안적으로 이종 도메인은 ActRII 폴리펩티드 도메인에 대해 C-말단에 위치할 수 있다. ActRII 폴리펩티드 도메인과 이종성 도메인은 융합 단백질에서 인접할 필요가 없으며, 추가 도메인 또는 아미노산 서열은 도메인 중 하나에 대한 C- 또는 N-말단에 또는 도메인 사이에 포함될 수 있다.

예를 들어, ActRII 수용체 융합 단백질은 아미노산 서열을 식 A-B-C에 제시된 바와 같이 포함할 수 있다. B 부분은 ActRII 폴리펩티드 도메인(예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드 또는 이들의 조합)에 해당한다. A 및 C 부분은 독립적으로 0개, 1개 또는 1개 초과의 아미노산일 수 있고, 존재하는 경우 A 및 C 부분은 모두 B에 이종성이다. A 및/또는 C 부분은 링커 서열을 통해 B 부분에 부착될 수 있다. 링커는 글리신(예를 들어, 2-10, 2-5, 2-4, 2-3개의 글리신 잔기) 또는 글리신 및 프롤린 잔기가 풍부할 수 있으며, 예를 들어 트레오닌/세린 및 글리신의 단일 서열 또는 트레오닌/세린 및/또는 글리신의 반복 서열, 예를 들어 GGG(서열 번호 16), GGGG(서열 번호 17), TGGGG(서열 번호 18), SGGGG(서열 번호 19), TGGG(서열 번호 20), SGGG(서열 번호 21), 또는 GGGGS(서열 번호 22) 단일항 또는 반복을 함유할 수 있다. 특정 실시형태에서, ActRII 융합 단백질은 아미노산 서열을 식 A-B-C에 제시된 바와 같이 포함하며, 이 때 A는 리더(신호) 서열이고, B는 ActRII 폴리펩티드 도메인으로 구성되고, C는 생체내 안정성, 생체내 반감기, 흡수/투여, 조직 국재화 또는 분포, 단백질 복합체 형성 및/또는 정제 중 하나 이상을 향상시키는 폴리펩티드 부분이다. 특정 실시형태에서, ActRII 융합 단백질은 아미노산 서열을 식 A-B-C에 제시된 바와 같이 포함하며, 이 때 A는 TPA 리더 서열이고, B는 ActRII 수용체 폴리펩티드 도메인으로 구성되고, C는 면역글로불린 Fc 도메인이다. 바람직한 융합 단백질은 서열 번호 23, 27, 30 및 40 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.

바람직한 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용될 ActRII 폴리펩티드는 단리된 폴리펩티드이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 단리된 단백질 또는 폴리펩티드는 자연 환경의 구성요소로부터 분리된 것이다. 일부 실시형태들에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드는, 예를 들면, 전기영동(예로써, SDS-PAGE, 등전초점조절 (IEF), 모세관전기영동) 또는 크로마토그래프 (예로써, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정되었을 때 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 순도이상으로 정제된다. 순도 평가 방법은 당업계에 잘 알려져 있다[예를 들어, Flatman 외, (2007) J. Chromatogr. B 848:79-87]. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 ActRII 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드이다.

본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 당업계에 공지된 다양한 기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) and Grant G. A. (ed.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company, New York (1992).에 기술된 것과 같은 표준 단백질 화학 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 또한 자동화된 펩티드 합성기는 시중에서 구입할 수 있다(예를 들어, Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600). 대안적으로, 본 발명의 폴리펩티드(이의 단편 또는 변이체 포함)는 당업계에 널리 공지된 바와 같이 다양한 발현 시스템(예를 들어, 대장균, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, COS 세포, 배큘로바이러스)을 사용하여 재조합적으로 생산될 수 있다. 추가 실시형태에서, 본 발명의 변형 또는 비변형 폴리펩티드는 예를 들어 프로테아제, 예를 들어 트립신, 써모리신, 키모트립신, 펩신 또는 쌍을 이룬 염기성 아미노산 전환효소(PACE)를 사용하여 재조합적으로 생산된 전장 ActRII 폴리펩티드를 소화시킴으로써 생산될 수 있다. 컴퓨터 분석(상업적으로 이용 가능한 소프트웨어, 예를 들어 MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc. 사용)을 사용하여 단백질 분해 절단 부위를 확인할 수 있다. 대안적으로, 이러한 폴리펩티드는 화학적 절단(예를 들어, 브롬화시아노겐, 히드록실아민 등)을 사용하여 재조합적으로 생성된 전장 ActRII 폴리펩티드로부터 생산될 수 있다.

3. ActRII 폴리펩티드를 코딩하는 핵산

특정 실시형태에서, 본 발명은 단편, 기능적 변이체 및 융합 단백질을 비롯한 ActRII 폴리펩티드(예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드 또는 이들의 조합)를 코딩하는 단리된 및/또는 재조합 핵산을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 단리된 핵산(들)은 자연 환경의 구성 요소로부터 분리된 핵산 분자를 의미한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 보통 포함하는 세포 안에 있는 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 자연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재하거나 또는 염색체외부에 존재한다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 서열 번호 4, 5, 또는 28 중 어느 하나의 변이체인 핵산을 포함하는 것으로 이해된다. 변이체 뉴클레오티드 서열은 대립유전자 변이체를 포함하여 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 첨가 또는 결실만큼 다른 서열들을 포함하므로, 서열 번호 4, 5 또는 28 중 어느 하나로 지정된 뉴클레오티드 서열과 다른 코딩 서열을 포함할 것이다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 서열 번호 4, 5 또는 28 중 어느 하나에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열에 의해 코딩된다. 당업자는 서열 번호 4, 5 또는 28에 상보적인 서열 및 이의 변이체에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열도 본 발명의 범위에 속함을 이해할 것이다. 추가 실시형태에서, 본 발명의 핵산 서열은 이종 뉴클레오티드 서열과 단리되고, 재조합되고/되거나 융합될 수 있거나 DNA 라이브러리 내에 있을 수 있다.

다른 실시형태에서, 본 발명의 핵산은 또한 매우 엄격한 조건 하에 서열 번호 4, 5 또는 28에 지정된 뉴클레오티드 서열, 서열 번호 4, 5 또는 28의 상보 서열, 또는 그 단편들에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열들을 포함할 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 당업자는 DNA 혼성화를 촉진하는 적절한 엄격성 조건이 다양할 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 당업자는 DNA 혼성화를 촉진하는 적절한 엄격성 조건이 다양할 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 예를 들어, 약 45°C에서 6.0 x 염화나트륨/구연산나트륨(SSC)에서 혼성화 후, 50°C에서 2.0 x SSC로 세척하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 세척 단계에서 염 농도는 50°에서 약 2.0 x SSC의 낮은 엄격도부터 50°C에서 약 0.2 x SSC의 높은 엄격도까지에서 선택될 수 있다. 또한, 세척 단계의 온도는 약 22°C 실온의 낮은 엄격도 조건에서 약 65°C의 높은 엄격도까지 증가될 수 있다. 온도와 염은 모두 달라질 수 있으며, 온도나 염분 농도는 일정하게 유지되고 다른 변수는 변할 수도 있다. 한 실시형태에서, 본 발명은 실온에서 6 x SSC의 낮은 엄격도 조건 하에 혼성화한 후 실온에서 2 x SSC로 세척한 핵산을 제공한다.

서열 번호 4, 5 또는 28에 제시된 핵산과 유전자 코드의 축퇴성이 다른 단리된 핵산도 본 발명의 범위에 속한다. 예를 들어, 다수의 아미노산은 하나 이상의 삼중항으로 지정된다. 동일한 아미노산을 지정하는 코돈 또는 동의어들(예를 들어, CAU 및 CAC는 히스티딘의 동의어)은 단백질의 아미노산 서열에 영향을 주지 않는 “침묵” 돌연변이를 초래할 수 있다. 그러나, 대상 단백질의 아미노산 서열의 변화를 초래하는 DNA 서열 다형성이 포유동물 세포들 중에는 존재할 것으로 예상된다. 당업자는 특정 단백질을 코딩하는 핵산의 하나 이상의 뉴클레오티드(뉴클레오티드의 최대 약 3-5%)의 이러한 변이가 자연적 대립유전자 변이로 인해 주어진 종의 개체들 사이에 존재할 수 있음을 알고 있을 것이다. 임의의 그리고 모든 이러한 뉴클레오티드 변이 및 생성된 아미노산 다형성은 본 발명의 범위에 속한다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 재조합 핵산은 발현 구조체 내의 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 조절 뉴클레오티드 서열들은 일반적으로 발현에 사용되는 숙주 세포에 적합할 것이다. 다양한 유형의 적절한 발현 벡터 및 적절한 조절 서열이 관련 기술분야에 공지되어 있으며 다양한 숙주 세포에서 사용될 수 있다. 전형적으로, 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열, 리더 또는 신호 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 시작 및 종결 서열, 번역 시작 및 종결 서열, 및 인핸서 또는 활성화인자 서열을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 당업계에 공지된 항시성 또는 유도성 프로모터가 본 발명에서 고려된다. 프로모터는 자연 발생 프로모터일 수도 있고, 하나 이상의 프로모터 요소를 결합한 하이브리드 프로모터일 수도 있다. 발현 구조체는 플라스미드와 같은 에피솜 상의 세포에 존재할 수 있거나, 발현 구조체는 염색체에 삽입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포의 선택을 가능하게 하는 선택가능한 마커 유전자를 함유한다. 선택가능한 마커 유전자는 당업계에 잘 알려져 있으며 사용되는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있다.

특정 양상에서, 본 명세서에 개시된 대상 핵산은 적어도 하나의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 ActRII 폴리펩티드(예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, 또는 이들의 조합)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터로 제공된다. 조절 서열은 당업계에 알려져 있으며 ActRII 폴리펩티드의 발현을 지시하도록 선택된다. 따라서, 조절 서열이라는 용어에는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소가 포함된다. 예시적인 조절 서열은 Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990)에 기재되어 있다. 예를 들어, DNA 서열에 작동적으로 연결될 때 DNA 서열의 발현을 제어하는 다양한 발현 제어 서열 중 어느 하나가 이들 벡터에 사용되어 ActRII 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 발현할 수 있다. 이러한 유용한 발현 제어 서열에는, 예를 들어, SV40의 초기 및 후기 프로모터, tet 프로모터, 아데노바이러스 또는 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 프로모터, RSV 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T7 프로모터가 포함되며, 파지 람다의 주요 작동자 및 프로모터 영역인 T7 RNA 폴리머라제, fd 외피 단백질의 제어 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 해당 효소의 프로모터, 산 포스파타제의 프로모터(예를 들어, Pho5), 효모 α-교배 인자, 배큘로바이러스 시스템의 다면체 프로모터 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 기타 서열, 및 이들의 다양한 조합이 포함된다. 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택 및/또는 발현시키고자 하는 단백질의 유형과 같은 인자에 따라 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 더욱이, 벡터의 복제 수, 해당 복제 수를 제어하는 능력 및 항생제 마커와 같이 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질의 발현도 고려해야 한다.

본 발명의 재조합 핵산은 클로닝된 유전자 또는 이의 일부를 원핵 세포, 진핵 세포(효모, 조류, 곤충 또는 포유동물), 또는 둘 모두에서의 발현에 적합한 벡터에 결찰시킴으로써 생산될 수 있다. 재조합 ActRII 폴리펩티드 생산을 위한 발현 비히클에는 플라스미드 및 기타 벡터가 포함된다. 예를 들어, 적합한 벡터에는 E. coli와 같은 원핵 세포에서의 발현을 위한 pBR322 유래 플라스미드, pEMBL 유래 플라스미드, pEX 유래 플라스미드, pBTac 유래 플라스미드 및 pUC 유래 플라스미드 유형의 플라스미드가 포함됩니다.

일부 포유류 발현 벡터는 박테리아에서 벡터의 증식을 촉진하기 위한 원핵생물 서열과 진핵생물 세포에서 발현되는 하나 이상의 진핵생물 전사 유닛을 모두 포함한다. pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo 및 pHyg-유도된 벡터는 진핵 세포의 형질감염에 적합한 포유류 발현 벡터의 예들이다. 이러한 벡터 중 일부는 pBR322와 같은 박테리아 플라스미드의 서열로 변형되어 원핵 세포와 진핵 세포 모두에서 복제 및 약물 내성 선택을 촉진한다. 대안으로, 바이러스, 예를 들어, 소의 유두종 바이러스 (BPV-1), 또는 Epstein-Barr 바이러스 (pHEBo, pREP-유도된 그리고 p205)의 유도체들이 진핵 세포에서 단백질의 일시적 발현에 이용될 수 있다. 다른 바이러스(레트로바이러스 포함) 발현 시스템의 예는 아래의 유전자 치료 전달 시스템 설명에서 찾을 수 있다. 플라스미드의 제조 및 숙주 유기체의 형질전환에 사용되는 다양한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 원핵 세포와 진핵 세포 모두에 대한 기타 적합한 발현 시스템 및 일반 재조합 절차에 관하여, 예를 들어, Sambrook, Fritsch 및 Maniatis의 Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)를 참고하라. 어떤 경우에는 배큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 재조합 폴리펩티드를 발현하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 배큘로바이러스 발현 시스템의 예에는 pVL 유래 벡터(예를 들어, pVL1392, pVL1393 및 pVL941), pAcUW 유래 벡터(예를 들어, pAcUW1) 및 pBlueBac 유래 벡터(예를 들어, pBlueBac III을 포함하는 β-gal)이 포함된다.

바람직한 실시형태에서, CHO 세포에서 대상 ActRII 폴리펩티드의 생산을 위해 Pcmv-Script 벡터(Stratagene, La Jolla, CA), pcDNA4 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 pCI-neo 벡터(Promega, Madison, Wisc.)와 같은 벡터가 설계될 것이다. 명백한 바와 같이, 대상 유전자 구조체들은 배양물에서 증식된 세포에서 대상 ActRII 폴리펩티드의 발현을 유발하기 위해, 예를 들어, 융합 단백질 또는 변이체 단백질을 비롯한 정제용 단백질을 생산하는 데 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 하나 이상의 대상 ActRII 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함하는 재조합 유전자로 형질감염된 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 임의의 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 대장균, 곤충 세포(예를 들어, 배큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여), 효모 또는 포유동물 세포[예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주]와 같은 박테리아 세포에서 발현될 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포는 당업자에게 공지되어 있다.

따라서, 본 발명은 또한 대상 ActRII 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, ActRII 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포는 ActRII 폴리펩티드의 발현이 일어나도록 하는 적절한 조건 하에서 배양될 수 있다. 폴리펩티드는 폴리펩티드를 함유하는 세포와 배지의 혼합물로부터 분비되고 단리될 수 있다. 대안적으로, ActRII 폴리펩티드는 세포질에 또는 막 분획에 보유될 수 있고, 이러한 세포는 수확되고, 용해되고, 단백질이 단리될 수 있다. 세포 배양물에는 숙주 세포, 배지 및 기타 부산물이 포함된다. 세포 배양에 적합한 배지는 해당 분야에 잘 알려져 있다. 대상 폴리펩티드는 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 한외여과, 전기영동, ActRII 폴리펩티드의 특정 에피토프에 특이적인 항체를 이용한 면역친화성 정제, 및 ActRII 폴리펩티드에 융합된 도메인에 결합하는 제제를 사용한 친화성 정제(예를 들어, 단백질 A 컬럼을 사용하여 ActRII-Fc 융합 단백질을 정제할 수 있음)를 포함하여 단백질을 정제하기 위해 당업계에 공지된 기술을 사용하여 세포 배양 배지, 숙주 세포 또는 둘 다로부터 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드는 이의 정제를 촉진하는 도메인을 함유하는 융합 단백질이다.

일부 실시형태에서, 정제는 예를 들어 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로스 크로마토그래피, 페닐세파로스 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피 중 3개 이상을 임의의 순서로 포함하는 일련의 컬럼 크로마토그래피 단계에 의해 달성된다. 바이러스 여과 및 완충액 교환으로 정제를 완료할 수 있다. ActRII 단백질은 크기 배제 크로마토그래피로 측정 시 >90%, >95%, >96%, >98% 또는 >99%, SDS PAGE로 측정 시 >90%, >95%, >96%, > 98% 또는 >99%의 순도로 정제될 수 있다. 목표 순도 수준은 포유류 체계, 특히 인간이 아닌 영장류, 설치류(마우스) 및 인간에서 원하는 결과를 달성하기에 충분한 수준이어야 한다.

다른 실시형태에서, 재조합 ActRII 폴리펩티드의 원하는 부분의 N-말단에 있는 폴리-(His)/엔테로키나제 절단 부위 서열과 같은 정제 리더 서열을 코딩하는 융합 유전자는 발현된 융합 단백질을 Ni²⁺ 금속 수지를 이용한 친화성 크로마토그래피로 정제하게 할 수 있다. 이어서 정제 리더 서열은 엔테로키나제 처리에 의해 제거되어 정제된 ActRII 폴리펩티드를 제공할 수 있다. 예를 들어, Hochuli 외, (1987) J.　Chromatography 411:177; 및 Janknecht 외, (1991) PNAS USA 88:8972를 참고한다.

융합 유전자를 만드는 기술은 잘 알려져 있다. 기본적으로 서로 다른 폴리펩티드 서열을 코딩하는 다양한 DNA 단편의 결합은 기존 기술에 따라 수행되는데, 결찰을 위해 무딘 말단 또는 스태거 말단을 사용하고, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 분해, 적절히 응집성 단부들을 채우기, 바람직하지 않은 결합을 방지하기 위한 알칼리 포스파타제 처리 및 효소 결찰이 이루어진다. 다른 실시형태에서, 융합 유전자는 자동화된 DNA 합성기를 포함하는 통상적인 기술에 의해 합성될 수 있다. 대안적으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은 후속적으로 어닐링되어 키메라 유전자 서열을 생성할 수 있는 2개의 연속 유전자 단편 사이에 상보적인 오버행을 발생시키는 앵커 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel 외, John Wiley & Sons: 1992를 참고한다.

4. 사용 방법

부분적으로, 본 발명은 본원에 기재된 치료 유효량의 ActRII 폴리펩티드를 투여받은 환자에서 모세혈관확장증의 위험을 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 방법은 (i) ActRII 폴리펩티드의 제1 용량을 0.3 mg/kg의 양으로 환자에게 투여하는 단계; 그리고 (ii) ActRII 폴리펩티드의 제2 용량을 0.7 mg/kg의 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 투여 요법에 따라 ActRII 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하고; 여기서 환자가 증상을 보이거나 모세혈관확장증 발병에 대한 위험 인자를 포함하는 경우, 제3 용량이 개시되며, 이러한 방법에 의해 모세혈관확장증의 위험이 감소한다. 일부 실시형태에서, 환자는 폐동맥 고혈압(PAH)의 치료를 위해 본원에 기재된 치료 유효량의 ActRII 폴리펩티드를 투여받고 있다.

이러한 방법은 특히 동물, 더욱 특히 인간의 치료 및 예방적 치료를 목표로 한다. “대상체”, “개체” 또는 “환자”라는 용어는 명세서 전반에 걸쳐 상호 교환 가능하며 인간 또는 인간이 아닌 동물을 지칭한다. 이러한 용어에는 인간, 인간이 아닌 영장류, 실험 동물, 가축 동물(소, 돼지, 낙타 등 포함), 반려 동물(예를 들어, 개, 고양이, 기타 가축 동물 등) 및 설치류(예를 들어, 마우스와 랫트)가 포함된다. 특정 실시형태에서, 환자, 대상체 또는 개체는 인간이다.

용어 “치료”, “치료하는”, “완화하는” 등은 일반적으로 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미하기 위해 사용되며, 또한 치료 중인 병태의 하나 이상의 임상적 합병증의 중증도를 개선, 경감 및/또는 감소(예를 들어, 치료 유효량의 ActRII 폴리펩티드를 투여받은 환자에서 모세혈관확장증의 위험 감소)시키는 것을 지칭하기 위해 사용될 수도 있다. 이러한 효과는 질환, 질환 또는 그 합병증의 발병이나 재발을 완전히 또는 부분적으로 지연시키는 양상에서는 예방적일 수 있으며/있거나 질환이나 병태 및/또는 해당 질환 또는 병태로 인한 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 치유 양상에서는 치료적일 수 있다. 본원에 사용된 “치료”는 포유동물, 특히, 인간의 질환 또는 병태의 모든 치료를 포괄한다. 본원에서 사용되는 장애 또는 병태를 “예방하는” 요법제는 통계적 샘플에서 장애 또는 병태의 발생을 비치료 대조군 샘플에 비해 치료된 샘플에서 감소시키거나 질환의 발병을 비치료 대조군 샘플에 비해 지연시키는 화합물을 의미한다.

일반적으로, 본 발명에 기재된 질환 또는 병태의 치료 또는 예방(예를 들어, 치료 유효량의 ActRII 폴리펩티드를 투여받은 환자에서 모세혈관확장증의 위험 감소)은 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드를 “유효량”으로 투여함으로써 달성된다. 제제의 유효량은 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량으로 그리고 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 본 발명의 제제의 “치료 유효량”은 개체의 질환 상태, 나이, 성별 및 체중과 같은 인자 및 개체에서 원하는 반응을 유도하는 제제의 능력에 따라 달라질 수 있다. “예방적 유효량”은 원하는 예방적 결과를 달성하기 위해 필요한 기간 동안 그리고 투여량에서 효과적인 양을 지칭한다.

특정 양상들에서, 본 발명은 질환 또는 병태를 치료 또는 예방(예를 들어, 치료 유효량의 ActRII 폴리펩티드를 투여받은 환자에서 모세혈관확장증의 위험 감소)하기 위한 하나 이상의 추가 활성제 또는 다른 지지 요법과 ActRII 폴리펩티드의 병용을 고려한다. 본원에서 사용되는 “~와 병용하여, “~의 병용”, “~와 조합된” 또는 “공동” 투여는 추가 활성제 또는 지지 요법(예를 들어, 2차, 3차, 4차 등)이 신체에서 여전히 효과적이도록 하는 임의의 투여 형태를 의미한다(예를 들어, 여러 화합물이 일정 기간 동안 환자에게 동시에 효과적이며, 해당 화합물들의 상승작용 효과가 포함될 수 있다). 유효성은 혈액, 혈청 또는 혈장 내 측정 가능한 약물 농도와 상관관계가 없을 수 있다. 예를 들어, 다양한 치료 화합물은 동일한 제형으로 또는 별도의 제형으로, 동시에 또는 순차적으로, 그리고 다양한 일정에 따라 투여될 수 있다. 따라서, 이러한 치료를 받는 대상체는 다양한 활성제 또는 요법의 병용 효과로부터 이점을 얻을 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 ActRII 폴리펩티드는 본원에 개시된 것들과 같은 하나 이상의 다른 추가 제제 또는 지지 요법과 동시에, 그 전에, 또는 그 후에 투여될 수 있다. 일반적으로, 각각의 활성제 또는 요법은 해당 특정 제제에 대해 결정된 용량 및/또는 시간 일정에 따라 투여될 것이다. 요법에 사용하기 위한 특정 조합은 본 발명의 ActRII 폴리펩티드와 추가 활성제 또는 요법의 상용성 및/또는 원하는 효과를 고려할 것이다.

WHO 분류 개요

본원에 기술된 방법으로 치료되는 폐동맥 고혈압 병태는 세계보건기구(WHO)에 따라 인정된 병태 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, Simonneau (2019) Eur Respir J: 53:1801913을 참고한다.

표 1: 폐동맥 고혈압의 임상적 분류

PAH 분류의 임상적 목적은 PAH와 관련된 임상 상태를 병태생리학적 기전, 임상 증상, 혈류역학적 특성 및 치료 전략에 따라 특정 하위 그룹으로 분류하는 것이다. 이러한 임상 분류는 상기 특성들에 대한 새로운 데이터가 제공되거나 추가적인 임상 실체가 고려될 때 업데이트될 수 있다.

본원에 사용된 용어 “폐 혈류역학 매개변수”는 심장 및 폐 맥관구조를 통한 혈류를 기술하거나 평가하는 데 사용되는 임의의 매개변수를 의미한다. 폐 혈류역학 매개변수의 예에는 평균 폐동맥압(mPAP), 이완기 폐동맥압(dPAP)[폐동맥 이완기압(PADP)으로도 알려짐], 수축기 폐동맥압(sPAP)[폐동맥 수축기압(PASP)으로 알려져 있음], 평균 우심방압(mRAP), 폐모세혈관 쐐기압(PCWP) [폐동맥 쐐기압(PAWP)로도 알려져 있음], 폐혈관 저항(PVR) 및 심박출량(CO)이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.

위에서 설명한 많은 폐 혈류역학 매개변수는 서로 관련되어 있다. 예를 들어, PVR은 다음 방정식에 따라 mPAP, PCWP 및 CO와 관련된다:

PVR= (mPAPPCWP)/CO [Wood 유닛]

PVR은 좌측 충전압의 영향 없이 폐 혈관계에 의해 부과된 흐름에 대한 저항을 측정한다. PVR은 다음 방정식에 따라 측정될 수도 있다:

PVR= TPG × 80/CO [단위: dynes-sec-cm^-5] 또는 PVR = (mPAP - PCWP) × 80/CO [단위: dynes-sec-cm^-5]

일부 실시형태에서, 전체 말초 저항(TPR)은 다음 방정식을 사용하여 측정될 수 있다:

TPR= mPAP/CO.

일부 실시형태에 따르면, PH에 대한 전모세혈관성 폐동맥 기여는 상승된 PVR에 의해 반영될 수 있다. 일부 실시형태에서, 정상 PVR은 20-130 dynes-sec-cm^-5 또는 0.5-1.1 Wood 유닛이다. 일부 실시형태에 따르면, 상승된 PVR은 2 Wood 유닛 초과, 2.5 Wood 유닛 초과, 3 Wood 유닛 초과 또는 3.5 Wood 유닛 초과의 PVR을 의미할 수 있다.

또 다른 예로서, mPAP는 다음 방정식에 따라 dPAP 및 sPAP와 관련된다:

mPAP= (⅔)dPAP+(⅓)sPAP.

또한 dPAP 및 sPAP를 사용하면 다음 방정식을 사용하여 맥압(mmHg)을 계산할 수 있다:

맥압=sPAP-dPAP

맥압은 다음 방정식을 사용하여 폐동맥 순응도를 계산하는 데 사용할 수 있다:

폐동맥 순응도(mI.mmHg^-1) = 박출량/맥압

일부 실시형태에서, 폐 혈류역학 매개변수는 직접, 예를 들어, 우심실 도관술 동안 측정된다. 다른 실시형태에서, 폐 혈류역학 매개변수는 자기공명영상(MRI) 또는 심장초음파검사와 같은 다른 기술을 통해 추정 및/또는 평가된다.

예시적인 폐 혈류역학 매개변수에는 mPAP, PAWP 및 PVR이 포함된다. 하나 이상의 폐 혈류역학 매개변수는 우심 카테터 삽입 또는 심장 초음파 검사와 같은 임의의 적절한 절차에 의해 측정될 수 있다. PH와 PAH의 다양한 혈류역학 특성은 표 2에 나와 있다.

표 2. 폐고혈압(PH)과 PAH의 혈류역학적 특성

본 문서에 기술된 PAH의 임상적 분류 또는 혈류역학적 특성 및 관련 진단 매개변수는 신규 또는 기존 데이터 소스의 가용성에 따라 또는 추가 임상 실체가 고려되는 경우 업데이트되거나 변경될 수 있다.

PAH의 특성

폐동맥 고혈압(WHO 그룹 1 PH)은 심각한 혈관 수축과 폐동맥벽 평활근 세포의 비정상적 증식을 특징으로 하는 심각하고 진행성이며 생명을 위협하는 폐 혈관계 질환이다. 폐 혈관이 심하게 수축되면 폐동맥압이 매우 높아진다. 이러한 높은 압력은 심장이 산소를 공급하기 위해 폐를 통해 혈액을 펌핑하는 것을 어렵게 만든다. PAH 환자는 심장이 이러한 높은 압력에 맞서 펌프질을 하기 때문에 극도의 호흡곤란을 겪는다. PAH 환자는 일반적으로 PVR이 크게 증가하고 mPAP가 지속적으로 상승하여 궁극적으로 우심실 부전 및 사망하게 된다. PAH로 진단받은 환자는 예후가 좋지 않고 삶의 질도 마찬가지로 저하되며, 치료하지 않을 경우 평균 기대 수명이 진단 시점으로부터 2 내지 5년이다.

혈관 재형성(즉, 증식)에 기여할 수 있는, 폐세포의 증식을 비롯한 다양한 인자들이 폐고혈압의 발병에 기여한다. 예를 들어, 폐 혈관 재형성은 주로 폐고혈압 환자의 동맥 내피 세포와 평활근 세포의 증식에 의해 발생한다. 다양한 사이토카인의 과발현은 폐고혈압을 촉진시키는 것으로 여겨진다. 또한, 폐동맥 평활세포 및 폐내피세포의 과다증식으로 인해 폐고혈압이 상승할 수 있음이 밝혀졌다. 또한, 진행성 PAH는 원위 폐세동맥의 근육화, 동심 내막 비후 및 내피 세포 증식에 의한 혈관 내강 폐쇄를 특징으로 할 수 있다. Pietra 외, J. Am. Coll. Cardiol., 43:255-325 (2004).

PAH 진단

PAH의 진단은 기능적 그룹을 포함하여 혈류역학 및 기타 기준이 충족되는지 결정하기 위해 종합적인 매개변수 세트 검토를 사용한 증상 및 신체 검사에 기반하여 결정할 수 있다. 고려할 수 있는 일부 기준에는 환자의 임상 증상(예를 들어, 숨가쁨, 피로, 쇠약, 협심증, 실신, 마른 소파, 운동으로 인한 메스꺼움 및 구토), 심전도(ECG) 결과, 흉부 방사선 사진 결과, 폐 기능 검사, 동맥혈 가스, 심장초음파 검사 결과, 환기/관류 폐 스캔 결과, 고해상도 컴퓨터 단층촬영 결과, 조영증강 컴퓨터 단층촬영 결과, 폐혈관 조영술 결과, 심장 자기공명영상, 혈액 검사(예를 들어, BNP 또는 NT-proBNP와 같은 바이오마커), 면역학, 복부 초음파 검사, 우심장 카테터 삽입(RHC), 혈관 반응 및 유전자 검사가 있다. 예를 들어, Galie N., et al Euro Heart J. (2016) 37, 67-119를 참고한다.

일부 실시형태에서, 바이오마커는 PAH 진단을 돕기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 바이오마커는 혈관 기능장애의 마커(예를 들어, 비대칭 디메틸아르기닌(ADMA), 엔도텔린-1, 안지오포에이틴 또는 폰빌레브란트 인자)이다. 일부 실시형태에서, 바이오마커는 염증의 마커(C-반응성 단백질, 인터루킨 6, 케모카인)이다. 일부 실시형태에서, 바이오마커는 심근 스트레스의 마커[예를 들어, 심방 나트륨 이뇨 펩티드, 뇌 나트륨 이뇨 펩티드(BNP)/NT-proBNP 또는 트로포닌]이다. 일부 실시형태에서, 바이오마커는 낮은 CO 및/또는 조직 저산소증(예를 들어, pCO2, 요산, 성장 분화 인자 15(GDF15) 또는 오스테오폰틴)의 마커이다. 일부 실시형태에서, 바이오마커는 2차 기관 손상의 마커(예를 들어, 크레아티닌 또는 빌리루빈)이다. 예를 들어, Galie N., et al Euro Heart J. (2016) 37, 67-119를 참고한다.

PH 측정

특정 양상에서, 본 발명은 폐동맥 고혈압(PAH)의 치료 및/또는 진행을 위해 치료 유효량의 ActRII 폴리펩티드(예를 들어, 서열 번호 1의 잔기 30-110에 상응하는 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열)를 투여받은 환자에서 모세혈관확장증의 위험을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 특발성 PAH를 갖는 PAH 환자를 치료하는 것에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 유전성 PAH(예를 들어, BMPR2, ALK-1, ENG, SMAD9, CAV1 및 KCNK3 내의 하나 이상의 돌연변이로 인한 PAH)를 갖는 PAH 환자의 치료에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 알려지지 않은 돌연변이로 인해 유전성 PAH를 갖는 PAH 환자를 치료하는 것에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 약물 또는 독소 유발 PAH를 갖는 PAH 환자를 치료하는 것에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 결합 조직 질환과 연관된 PAH를 갖는 PAH 환자를 치료하는 것에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 HIV 감염과 연관된 PAH를 갖는 PAH 환자를 치료하는 것에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 문맥 고혈압과 연관된 PAH를 갖는 PAH 환자를 치료하는 것에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 주혈흡충증과 연관된 PAH를 갖는 PAH 환자를 치료하는 것에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 칼슘 채널 차단제에 대한 장기 반응자로 분류된 PAH 환자를 치료하는 것에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 명백한 정맥/모세혈관(PVOD/PCH) 침범 특징을 갖는 PAH 환자를 치료하는 것에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 신생아 증후군의 지속적인 폐고혈압(PH)을 갖는 PAH 환자를 치료하는 것에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 션트 수리 후 적어도 1년에 단순 선천성 전신-폐 션트와 연관된 PAH를 갖는 PAH 환자를 치료하는 것에 관한 것이다.

기능적 분류

기준선에서 PAH는, 예를 들어, 세계보건기구(WHO)의 기능적 분류(폐고혈압 환자의 질환 중증도를 측정하는 기준임)로 측정 시 경증, 중등도 또는 중증일 수 있다. WHO 기능적 분류는 뉴욕 심장 협회(NYHA) 체계를 적용한 것이며, 예를 들어, 질환 진행 및 치료 반응을 모니터링하는 등 활동 내성을 질적으로 평가하는 데 일상적으로 사용된다(Rubin(2004) Chest 126:7-10). WHO 쳬계에서는 다음과 같은 네 가지 기능적 분류가 인정된다: 기능적 분류 I: 신체 활동의 제한이 없는 폐고혈압; 일반적인 신체 활동은 과도한 호흡 곤란이나 피로, 흉통 또는 거의 실신을 유발하지 않음; 기능적 분류 II: 신체 활동에 약간의 제한을 초래하는 폐고혈압; 환자가 편안하게 쉴 수 있음; 일반적인 신체 활동은 과도한 호흡 곤란이나 피로, 흉통 또는 거의 실신을 유발함; 기능적 분류 III: 신체 활동의 현저한 제한을 초래하는 폐고혈압; 환자가 편안하게 쉴 수 있음; 일반적인 활동보다 적은 활동은 과도한 호흡 곤란이나 피로, 흉통 또는 거의 실신을 유발함; 기능적 분류 IV: 증상 없이 신체 활동을 수행할 수 없게 되는 폐고혈압; 환자는 우심부전의 징후를 나타냄; 휴식 중에도 호흡곤란 및/또는 피로가 나타날 수 있다; 신체 활동으로 인해 불편함이 증가함.

PAH에 대한 알려진 치료법

PAH에 대한 알려진 치료법은 없다; 현재의 치료 방법은 환자의 수명을 연장하고 환자의 삶의 질을 향상시키는 데 중점을 두고 있다. 이는 일반적으로 우수한 운동 능력, 우수한 우심실 기능 및 낮은 사망 위험(예: 환자를 WHO 기능 등급 I 또는 기능 등급 II로 변경 및/또는 유지)과 관련이 있다. PAH 치료의 현재 방법에는 프로스타사이클린, 에포프로스테놀 및 실데나필과 같은 혈관확장제; 보센탄과 같은 엔도텔린 수용체 길항제; 암로디핀, 딜티아젬, 및 니페디핀과 같은 칼슘 채널 차단제; 와파린과 같은 항응고제; 그리고 이뇨제의 투여가 포함될 수 있다. PAH 치료는 또한 산소요법, 심방 중격절개술, 폐 혈전내막절제술, 폐 및/또는 심장 이식을 사용하여 수행되었다. 그러나 이들 방법 각각은 효율성 부족, 심각한 부작용, 낮은 환자 순응도 및 높은 비용을 포함할 수 있는 하나 이상의 단점을 안고 있다. 특정 양상에서, 상기 방법은 PAH를 치료하기 위해 치료 유효량의 ActRII 폴리펩티드(예를 들어, 서열 번호 1의 잔기 30-110에 상응하는 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열)를, 하나 이상의 추가 활성제 및/또는 지지 요법(예: 프로스타사이클린, 에포프로스테놀 및 실데나필과 같은 혈관 확장제; 보센탄과 같은 엔도텔린 수용체 길항제; 암로디핀, 딜티아젬 및 니페디핀과 같은 칼슘 채널 차단제; 와파린과 같은 항응고제; 이뇨제; 산소 요법; 심방 중격절제술; 폐 혈전 내막 절제술; 및 폐 및/또는 심장 이식; 바독솔론 메틸 또는 이의 유도체; 올레아놀산 또는 이의 유도체)와 조합하여 투여받은 환자에서 모세혈관확장증의 위험을 감소시키는 것에 관한 것이다.

모세혈관확장증 위험 감소를 위한 투여 요법

환자가 모세혈관확장증을 가질 확률은 ActRII 폴리펩티드를 사용한 초기 치료 동안 더 높을 수 있다. 특정 실시형태에서, 모세혈관확장증의 증상을 예방, 개선 또는 감소시키기 위한 투여 요법을 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 투여 요법을 사용하여 투여된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 본원에 개시된 바와 같은 치료 유효량의 ActRII 폴리펩티드의 투여 요법을 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 이러한 투여 요법은 제1 기간 동안 0.1 mg/kg 내지 1.0 mg/kg의 상기 폴리펩티드의 제1 용량 그리고 후속적으로 제2 기간 동안 투여되는 0.1 mg/kg 내지 1.0 mg/kg의 상기 폴리펩티드의 제2 용량을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 본원에 개시된 바와 같은 치료 유효량의 ActRII 폴리펩티드의 투여 요법을 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 이러한 투여 요법은 제1 기간 동안 0.1 mg/kg 내지 1.0 mg/kg의 상기 폴리펩티드의 제1 투여, 제2 기간 동안 투여되는 0.1 mg/kg 내지 1.0 mg/kg의 상기 폴리펩티드의 제2 투여, 후속적으로 제3 기간 동안 투여되는 0.1 mg/kg 내지 1.0 mg/kg의 상기 폴리펩티드의 제3 용량을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 본원에 개시된 바와 같은 치료 유효량의 ActRII 폴리펩티드의 투여 요법을 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 이러한 투여 요법은 제1 기간 동안 0.1 mg/kg 내지 1.0 mg/kg의 상기 폴리펩티드의 제1 용량, 제2 기간 동안 투여되는 0.1 mg/kg 내지 1.0 mg/kg의 상기 폴리펩티드의 제2 용량, 제3 용량(ActRII 폴리펩티드 치료가 제3 기간 동안 보류됨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드의 제1 용량은 약 0.2 mg/kg 내지 약 0.4 mg/kg의 양으로 환자에게 투여된다. 일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드의 제1 용량은 0.3 mg/kg의 용량으로 환자에게 투여된다. 일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드의 제2 용량은 약 0.5 mg/kg 내지 약 0.8 mg/kg의 양으로 환자에게 투여된다. 일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드의 제2 용량은 0.7 mg/kg의 용량으로 환자에게 투여된다. 일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드의 제3 용량은 약 0.2 mg/kg 내지 약 0.4 mg/kg의 양으로 환자에게 투여된다. 일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드의 제3 용량은 0.3 mg/kg의 용량으로 환자에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 제3 용량은 소정의 시기 동안 ActRII 폴리펩티드의 치료를 보류하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드 치료는 적어도 2-6주의 기간 동안 보류된다. 일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드 치료는 적어도 3주의 기간 동안 보류된다. 일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드 치료는 적어도 6주의 기간 동안 보류된다. 일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드 치료는 적어도 9주의 기간 동안 보류된다. 일부 실시형태에서, ActRII 폴리펩티드 치료는 ActRII 폴리펩티드 치료가 보류된 기간 이후에 재개된다.

일부 실시형태에서, 투여 요법은 0.3 mg/kg의 양으로 ActRII 폴리펩티드의 제1 용량을 환자에게 투여한 후, 0.7 mg/kg의 양으로 ActRII 폴리펩티드의 제2 용량을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 투여 요법은 ActRII 폴리펩티드의 제1 용량을 0.3 mg/kg의 양으로 환자에게 투여하고, ActRII 폴리펩티드의 제2 용량을 0.7 mg/kg의 양으로 환자에게 투여하고, ActRII 폴리펩티드의 제3 용량을 0.3mg/kg의 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 투여 요법은 ActRII 폴리펩티드의 제1 용량을 0.3 mg/kg의 양으로 환자에게 투여하고, ActRII 폴리펩티드의 제2 용량을 0.7 mg/kg의 양으로 환자에게 투여하고, ActRII 폴리펩티드의 제3 용량을 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 제3 용량은 적어도 3주의 기간 동안 ActRII 폴리펩티드의 치료를 보류하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 투여 요법은 ActRII 폴리펩티드의 제1 용량을 0.3 mg/kg의 양으로 환자에게 투여하고, ActRII 폴리펩티드의 제2 용량을 0.3mg/kg의 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 제2 용량은 적어도 3주의 기간 동안 ActRII 폴리펩티드의 치료를 보류하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 투여 요법은 ActRII 폴리펩티드의 제1 용량을 0.3 mg/kg의 양으로 환자에게 투여하고, ActRII 폴리펩티드의 제2 용량을 0.7 mg/kg의 양으로 환자에게 투여하고, ActRII 폴리펩티드의 제3 용량을 0.3mg/kg의 양으로 환자에게 투여하고(여기서 제3 용량은 적어도 3주의 기간 동안 ActRII 폴리펩티드의 치료를 보류하는 것을 포함함), 그리고 ActRII 폴리펩티드의 제4 용량을 0.3 mg/kg의 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 용량은 제1 용량을 초과한다. 일부 실시형태에서, 제1 용량은 제2 용량을 초과한다. 일부 실시형태에서, 제3 용량은 제2 용량을 초과한다. 일부 실시형태에서, 제2 용량은 제3 용량을 초과한다. 일부 실시형태에서, 제3 용량은 환자에게 ActRII 폴리펩티드 용량을 0.3 mg/kg의 양으로 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 용량은 적어도 2-6주의 기간 동안 ActRII 폴리펩티드의 치료를 보류하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 용량은 적어도 2-6주의 기간 동안 ActRII 폴리펩티드의 치료를 보류하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 용량은 적어도 3주의 기간 동안 ActRII 폴리펩티드의 치료를 보류하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 용량은 적어도 3주의 기간 동안 ActRII 폴리펩티드의 치료를 보류하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 기간은 적어도 3주이다. 일부 실시형태에서, 제2 기간은 적어도 3주이다. 일부 실시형태에서, 제3 기간은 적어도 3주이다. 일부 실시형태에서, 제2 기간은 적어도 21주이다. 일부 실시형태에서, 제2 기간은 적어도 45주이다. 일부 실시형태에서, 제2 기간은 제1 기간을 초과한다. 일부 실시형태에서, 제3 기간은 제1 기간을 초과한다. 일부 실시형태에서, 제3 기간은 제2 기간을 초과한다. 일부 실시형태에서, 제1 용량은 적어도 3주 동안 환자에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 제2 용량은 적어도 21주 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 제2 용량은 적어도 45주 동안 투여된다.

일부 실시형태에서, 제1 용량과 제2 용량 사이의 용량 변화는 다양한 인자(예를 들어, 모세혈관확장증의 증상 및/또는 위험 인자)를 고려하여 주치의에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서, 제2 용량과 제3 용량 사이의 용량 변화는 다양한 인자(예를 들어, 모세혈관확장증의 증상 및/또는 위험 인자)를 고려하여 주치의에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서, 제3 용량과 제4 용량 사이의 용량 변화는 다양한 인자(예를 들어, 모세혈관확장증의 증상 및/또는 위험 인자)를 고려하여 주치의에 의해 결정된다.

일부 실시형태에서, 다양한 인자에는 모세혈관확장증 발병에 대한 환자의 위험 인자가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 모세혈관확장증 발병에 대한 위험 인자는 낮은 BMP9 수준, 낮은 BMP10 수준, 낮은 VEGF 수준, 유전성 출혈성 모세혈관확장증(HHT), 및 결합 조직 질환(CTD)으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 환자는 ActRII 폴리펩티드로 치료하기 전에 이들 위험 인자 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 환자는 ActRII 폴리펩티드로 치료하는 동안 이들 위험 인자 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 모세혈관확장증 발병에 대한 위험 인자는 유전성 출혈성 모세혈관확장증(HHT) 및/또는 결합 조직 질환(CTD)과 연관된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 환자이다. 일부 실시형태에서, HHT와 연관된 하나 이상의 돌연변이는 ENG, ACVRL1, EPHB4, SMAD4, GDF2, BMPR9 및 RASA1로 구성된 그룹으로부터 선택된 유전자에서의 돌연변이이다. 일부 실시형태에서, CTD와 연관된 하나 이상의 돌연변이는 ABCC6, ACTA2, ADAMTS2, ADAMTS10, ADAMTSL2, ALDH18A1, ATP6V0A2, ATP7A, B3GALT6, B4GALT7, BGN, C1R, C1S, CBS, CHST14, COL1A1, COL1A2, COL2A1, COL3A1, COL5A1, COL5A2, COL9A1, COL9A2, COL9A3, COL11A1, COL11A2, DSE, EFEMP2 (FBLN4), ELN, FBLN5, FBN1, FBN2, FKBP14, FLCN, FLNA, FOXE3, GORAB, LOX, LTBP4, MED12, MFAP5, MYH11, MYLK, NOTCH1, NOTCH2, PKD1, PKD2, PLOD1, PRDM5, PRKG1, PTDSS1, PYCR1, RIN2, SKI, SLC2A10, SLC39A13, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD6, TAB2, TGFB2, TGFB3, TGFBR1, TGFBR2, TNXB, 및 ZNF469로 구성된 그룹으로부터 선택된 유전자에서의 돌연변이이다. 일부 실시형태에서, 치료 전 또는 치료 동안 환자의 증상 또는 위험 인자 중 하나 이상이 비정상적인 경우, 본원에 개시된 ActRII 폴리펩티드의 환자 용량은 유지될 것이다(예를 들어, 0.3 mg/kg 또는 0.7 mg/kg으로 유지).

일부 실시형태에서, 투여 요법은 ActRII 폴리펩티드의 부작용을 예방, 개선 또는 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 투여 요법에 따른 ActRII 폴리펩티드의 투여는 모세혈관확장증의 위험을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 투여 요법에 따른 ActRII 폴리펩티드의 투여는 제2 기간 동안 모세혈관확장증의 위험을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 투여 요법에 따른 ActRII 폴리펩티드의 투여는 제3 기간 동안 모세혈관확장증의 위험을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 투여 요법에 따른 ActRII 폴리펩티드의 투여는 제4 기간 동안 모세혈관확장증의 위험을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 투여 요법에 따른 ActRII 폴리펩티드의 투여는 첫 21주 치료 이후 모세혈관확장증의 위험을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 투여 요법에 따른 ActRII 폴리펩티드의 투여는 첫 45주 치료 이후 모세혈관확장증의 위험을 감소시킨다.

모세혈관확장증의 증상 및 위험 인자

모세혈관확장증은 거미 정맥, 하이픈 웹, 실 정맥, 햇살 정맥, 별 모양 정맥 및 정맥 발적으로도 알려져 있다. 모세혈관확장증은 넓어진 정맥(작은 혈관)으로 구성되어 피부에 실 같은 붉은 선이나 패턴이 나타난다. 이러한 패턴 또는 모세혈관확장증은 다양한 조건에서 혈관 활성 물질의 방출 또는 활성화로 인해 발생하는 것으로 생각된다. 모세혈관확장증의 증상은 통증, 가려움증, 피부의 실 모양의 붉은 자국, 피부 점막 확장증, 위장 출혈, 피부 병변, 비출혈(epistaxis), 치은 출혈, 동정맥 기형, 내부 모세혈관확장증 및 피부의 붉은 반점을 포함한다.

모세혈관확장증은 대개 양성이지만 유전성 출혈성 모세혈관확장증(HHT)과 같은 심각한 질환으로 인해 발생할 수 있다. HHT 환자의 경우, 모세혈관확장증이 간과 같은 중요한 기관에 나타날 수 있다. 이러한 모세혈관확장효소가 파열되면 생명을 위협하는 출혈이 발생할 수 있다.

특정 양상에서, 본 발명은 치료 유효량의 ActRII 폴리펩티드(예를 들어, 서열 번호 1의 잔기 30-110에 상응하는 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열)를 투여받은 환자에서 모세혈관확장증의 위험을 감소시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 환자가 증상을 보이거나 모세혈관확장증 발병에 대한 위험 인자를 포함하는 경우 소정의 투여 요법에 따라 ActRII 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하며, 이러한 방법에 의해 모세혈관확장증의 위험이 감소한다. 일부 실시형태에서, 모세혈관확장증의 증상은 통증, 가려움증, 피부의 실 모양의 붉은 자국, 피부 점막 확장증, 위장 출혈, 피부 병변, 비출혈(epistaxis), 치은 출혈, 동정맥 기형, 내부 모세혈관확장증 및 피부의 붉은 반점으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 모세혈관확장증의 증상은 피부 병변이다. 일부 실시형태에서, 모세혈관확장증의 증상은 치은 출혈이다. 일부 실시형태에서, 모세혈관확장증의 증상은 비출혈이다. 일부 실시형태에서, 모세혈관확장증의 증상은 동정맥 기형이다. 일부 실시형태에서, 모세혈관확장증의 증상은 내부 모세혈관확장증이다. 일부 실시형태에서, 동정맥 기형 또는 내부 모세혈관확장증은 내부 기관(예: 뇌, 간, 폐, 비장, 요로 및 척추)에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 모세혈관확장증 발병에 대한 위험 인자는 낮은 BMP9 수준; 낮은 BMP10 수준; 낮은 VEGF 수준; 유전성 출혈성 모세혈관확장증(HHT); 및 결합 조직 질환(CTD)으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 1회 이상의 ActRII 폴리펩티드(예를 들어, 서열 번호 1의 잔기 30-110에 상응하는 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열)로 치료 받았던, 또는 치료할 후보자인 환자에서 모세혈관확장증의 하나 이상의 증상 또는 위험 인자를 측정함으로써 이러한 환자를 관리하는 방법을 제공한다. 모세혈관확장증의 하나 이상의 증상 및/또는 위험 인자는 본 발명의 하나 이상의 ActRII 폴리펩티드로 치료할 후보자인 환자에 대한 적절한 투여량을 평가하고, 치료 동안 모세혈관확장증의 증상 및/또는 위험 인자를 모니터링하여, 본 발명의 하나 이상의 ActRII 폴리펩티드로 치료하는 동안 투여량을 조정할지 여부를 평가하고/하거나 본 발명의 하나 이상의 ActRII 폴리펩티드의 적절한 유지 용량을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 모세혈관확장증의 증상 및/또는 위험 인자 중 하나 이상이 비정상인 경우, 1회 이상의 ActRII 폴리펩티드의 투여가 감소, 지연 또는 종료될 수 있다.

한 실시형태에서, 1회 이상의 ActRII 폴리펩티드로 치료할 후보자인 환자에서 모세혈관확장증의 하나 이상의 증상 및/또는 위험 인자가 비정상인 경우, 모세혈관확장증의 증상 및/또는 위험 인자가 자연적으로 또는 치료적 개입을 통해 정상 또는 허용 가능한 수준으로 돌아올 때까지 본 발명의 하나 이상의 ActRII 폴리펩티드의 투여 개시가 지연될 수 있다.

특정 실시형태에서, 하나 이상의 ActRII 폴리펩티드로 치료할 후보자인 환자에서 모세혈관확장증의 하나 이상의 증상 및/또는 위험 인자가 비정상인 경우, 투여 개시가 지연되지 않을 수 있다. 그러나, 본 발명의 하나 이상의 ActRII 폴리펩티드의 투여량 또는 투여 빈도는 본 발명의 하나 이상의 ActRII 폴리펩티드의 투여 시 발생하는 모세혈관확장증의 위험을 감소시키는 양으로 설정될 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 ActRII 폴리펩티드를 모세혈관확장증의 위험을 다루는 치료제와 조합한, 환자를 위한 치료 요법이 개발될 수 있다.

환자의 모세혈관확장증의 중증도

모세혈관확장증과 그 중증도 수준은 다양한 분류를 사용하여 설명하고 측정할 수 있다. 예를 들어, 만성 정맥 장애에 대한 임상-병인학-해부학-병태생리학(CEAP) 분류에서는 정맥 질환의 중증도가 높은 순서로 등급화한다. CEAP는 모세혈관확장증을 가장 심각한 범주(C1)로 분류하는데, 이는 구경 1mm 미만의 확장된 피내 정맥의 컨플루언스를 기술한다. 예를 들어, 아래 표 3을 참고한다.

표 3. 만성 정맥 질환에 대한 CEAP 임상 분류

모세혈관확장증은 특정 등급의 중증도로 더 자세히 정의될 수 있다. 예를 들어, 모세혈관확장증은 정맥의 비틀림 및 돌출 정도와 범위에 따라 세 가지 등급으로 분류될 수 있다. 예를 들어, Ruckley CV, 외, European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 2008;36(6):719-724를 참고한다.

특정 양상에서, 본 발명은 치료 유효량의 ActRII 폴리펩티드(예를 들어, 서열 번호 1의 잔기 30-110에 상응하는 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열)를 투여받은 환자에서 모세혈관확장증의 위험을 감소시키는 방법에 관한 것으로, 여기서 환자는 임상-병인-해부-병태생리학(CEAP)에 의해 분류된 C1 모세혈관확장증을 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 CEAP 분류 C1에서 C0으로 모세혈관확장증을 개선한다.

특정 양상에서, 본 발명은 치료 유효량의 ActRII 폴리펩티드(예를 들어, 서열 번호 1의 잔기 30-110에 상응하는 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열)를 투여받은 환자에서 모세혈관확장증의 위험을 감소시키는 방법에 관한 것으로, 여기서 환자는 1등급, 2등급 또는 3등급 모세혈관확장증을 가진다. 일부 실시형태에서, 환자는 1등급 모세혈관확장증을 가진다. 일부 실시형태에서, 환자는 2등급 모세혈관확장증을 가진다. 일부 실시형태에서, 환자는 3등급 모세혈관확장증을 가진다. 일부 실시형태에서, 모세혈관확장증의 위험은 모세혈관확장증 중증도를 완화 또는 개선함으로써 감소된다. 일부 실시형태에서, 모세혈관확장증의 위험은 모세혈관확장증의 등급을 개선함으로써 감소된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 모세혈관확장증을 2등급에서 1등급으로 개선한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 모세혈관확장증을 3등급에서 2등급으로 개선한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 모세혈관확장증을 3등급에서 1등급으로 개선한다. 일부 실시형태에서, 모세혈관확장증의 위험은 모세혈관확장증의 진행을 방지함으로써 감소된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 모세혈관확장증의 1등급에서 2등급으로의 진행을 방지한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 모세혈관확장증의 2등급에서 3등급으로의 진행을 방지한다.

특정 양상에서, 본 발명은 치료 유효량의 ActRII 폴리펩티드(서열 번호 1의 잔기 30-110에 상응하는 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열)를 투여받은 환자에서 모세혈관확장증의 위험을 감소시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (i) ActRII 폴리펩티드의 제1 용량을 0.3 mg/kg의 양으로 환자에게 투여하는 단계; 그리고 (ii) ActRII 폴리펩티드의 제2 용량을 0.7 mg/kg의 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 투여 요법에 따라 ActRII 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하고; 여기서 환자가 증상을 보이거나 모세혈관확장증 발병에 대한 위험 인자를 포함하는 경우, 제3 용량이 개시되며, 이러한 방법에 의해 모세혈관확장증의 위험이 감소한다. 일부 실시형태에서, 제3 용량은 모세혈관확장증이 1등급 이하로 개선될 때까지 ActRII 폴리펩티드의 치료를 보류하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 용량은 모세혈관확장증이 2등급 이하로 개선될 때까지 ActRII 폴리펩티드의 치료를 보류하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 용량은 모세혈관확장증이 3등급 이하로 개선될 때까지 ActRII 폴리펩티드의 치료를 보류하는 것을 포함한다.

5. 약학 조성물 및 투여 방식

특정 실시형태에서, 본 발명의 치료 방법은 조성물을 전신 투여하거나, 임플란트 또는 장치로서 국소적으로 투여하는 것을 포함한다. 투여될 때, 본 발명에 사용하기 위한 치료 조성물은 실질적으로 발열원이 없는 또는 발열원이 없는 생리학적으로 허용되는 형태이다. 상기 기재된 바와 같이 조성물에 선택적으로 포함될 수도 있는 ActRII 폴리펩티드 이외의 치료적으로 유용한 제제들은 본원에 개시된 방법에서 대상 화합물과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

전형적으로, 본원에 개시된 단백질 치료제는 비경구로, 특히, 정맥내 또는 피하로 투여될 것이다. 비경구 투여에 적합한 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 멸균 등장성 수성 또는 비-수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀전과 조합된 하나 이상의 ActRII 폴리펩티드, 또는 사용 직전에 멸균 주사 용액 또는 분산액으로 재구성되는 멸균 분말을 포함할 수 있으며, 이러한 약학 조성물은 항산화제, 완충액, 정균제, 의도한 수용자의 혈액과 등장성인 제제를 생성하는 용질, 또는 현탁제 또는 증점제를 포함할 수 있다. 상기 약학 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 그리고 이의 적절한 혼합물, 식물성 오일, 가령, 올리브 오일, 그리고 주사가능한 유기 에스터, 가령, 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅 물질, 가령, 레시틴의 사용, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지 그리고 계면 활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 상기 제형은 단위-용량 또는 다회-용량 밀봉 용기, 가령, 앰플 및 바이얼에 제공될 수 있으며, 및 용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들면, 주사용수의 추가만을 필요로 하는 동결-건조된(동결건조, lyophilised) 조건에서 보관될 수 있다. 임시 주사 용액 및 현탁액은 본원에 기재된 종류의 멸균 분말, 과립, 및 정제로부터 제조될 수 있다.

원하는 경우, 조성물 및 제형은 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 함유할 수 있는 팩 또는 디스펜서 장치에 제공될 수 있다. 팩은 예를 들어, 금속 또는 플라스틱 호일, 예를 들어, 블리스터 팩을 포함할 수 있다. 팩이나 디스펜서 장치에는 투여 지침이 첨부될 수 있다.

또한, 상기 조성물은 표적 조직 부위로 전달하기 위한 형태로 캡슐화되거나 주사될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 치료 화합물(예를 들어, ActRII 폴리펩티드)을 표적 조직 부위에 전달하여 발달 중인 조직에 구조체를 제공하며 최적으로 신체에 재흡수될 수 있는 매트릭스를 포함할 수 있다. 예를 들어, 매트릭스는 ActRII 폴리펩티드의 느린 방출을 제공할 수 있다. 이러한 매트릭스는 현재 다른 이식 의료 응용 분야에 사용되는 재료로 형성될 수 있다.

매트릭스 재료는 생체 적합성, 생분해성, 기계적 특성, 외관 및 인터페이스 특성을 기반으로 선택된다. 대상 조성물의 특정 응용분야에 따라 적절한 제형이 정의될 것이다. 조성물을 위한 가능한 매트릭스는 생분해성이고 화학적으로 정의된 황산칼슘, 인산삼칼슘, 수산화인회석, 폴리유산 및 폴리무수물일 수 있다. 뼈나 피부 콜라겐과 같은 다른 가능한 물질은 생분해성이고 생물학적으로 잘 정의되어 있다. 추가 매트릭스는 순수한 단백질 또는 세포외 매트릭스 성분으로 구성된다. 소결된 수산화인회석, 바이오유리, 알루미네이트 또는 기타 세라믹과 같은 다른 가능한 매트릭스는 비-생분해성이고 화학적으로 정의되지 않는다. 매트릭스는 폴리락트산과 수산화인회석 또는 콜라겐과 인산삼칼슘과 같은 위에서 언급한 물질 유형 중 임의의 조합으로 구성될 수 있다. 바이오세라믹은 조성면에서, 예를 들어, 칼슘-알루미네이트-인산염 그리고 기공 크기, 입자 크기, 입자 모양 및 생분해성을 변경하기 위한 가공에 있어서 변경될 수 있다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 경구적으로, 예를 들어, 캡슐, 카세, 알약, 정제, 로젠지제(보통 수크로스와 아카시아 또는 트라가칸트와 같은 향이 나는 베이스 사용), 분말, 과립의 형태일 수 있고, 또는 수성 또는 비수성 액체 중의 용액 또는 현탁액으로서, 또는 수중유 또는 유중수 액체 에멀젼으로서, 엘릭서나 시럽으로서, 또는 향정(젤라틴 및 글리세린과 같은 불활성 염기, 또는 수크로스 및 아카시아 사용) 및/또는 구강 세정제 등으로서 존재할 수 있으며, 각각 소정량의 제제를 활성 성분으로 함유한다. 제제는 또한 볼루스, 연약 또는 페이스트로 투여될 수 있다.

경구 투여를 위한 고체 투약 형태 (캡슐, 정제, 알약, 당의정, 분말, 과립, 등)에서, 본 발명의 하나 이상의 치료 화합물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 가령, 소듐 시트레이트 또는 다이칼슘 포스페이트, 및/또는 다음 중 어느 하나와 혼합될 수 있다: (1) 충전제 또는 증량제, 가령, 전분, 락토스, 설탕, 글루코스, 만니톨, 및/또는 규산; (2) 결합제, 가령, 예를 들면, 카르복시메틸셀룰로오스, 알긴산, 젤라틴, 폴리비닐 파이롤리돈, 설탕, 및/또는 아카시아; (3) 보습제, 가령, 글리세롤; (4) 붕해제, 가령, 한천-한천, 칼슘 카보네이트, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트, 및 소듐 카보네이트; (5) 용액 지체제, 가령, 파라핀; (6) 흡수 가속화제, 가령, 4차 암모늄 화합물; (7) 습윤제, 가령, 예를 들어, 세틸 및 글리세롤 모노스테아레이트; (8) 흡수제, 가령, 카올린 및 벤토나이트 점토; (9) 윤활제, 가령, 활석, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 설페이트, 및 이의 혼합물; 및 (10) 착색제. 캡슐, 정제 및 알약의 경우, 약학 조성물은 또한 완충제를 포함할 수 있다. 유사한 유형의 고체 조성물은 또한 유당 또는 유당뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용하여 연질 및 경질-충전된 젤라틴 캡슐의 충전제로 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 액체 투약형태는 약학적으로 허용되는 에멀전, 마이크로에멀전, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭서제를 포함할 수 있다. 활성 성분들 이외에도, 액체 투약형은 기술 분야에서 흔히 사용되는 비활성 희석제, 예를 들어, 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-뷰틸렌 글리콜, 오일 (특히, 목화씨, 땅콩, 옥수수, 배아, 올리브, 피마자, 및 참깨 오일), 글리세롤, 테트라하이드로퍼퓨릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스터, 및 이의 혼합물을 함유할 수 있다. 불활성 희석제 외에, 경구 조성물은 또한 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 향미제, 착색제, 향료 및 보존제와 같은 보조제를 포함할 수 있다.

현탁액은 활성 화합물 외에도 현탁제, 예를 들어, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미정질 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가-아가 및 트라가칸트, 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 보조제, 예를 들어, 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물의 작용 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 포함에 의해 확실히 방지될 수 있다. 또한, 당, 염화나트륨 등과 같은 등장화제를 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 주사가능한 약학적 형태의 장기간 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 물질들을 포함시킴에 의해 유발될 수 있다.

투여 요법은 본 발명의 대상 화합물(예를 들어, ActRII 폴리펩티드)의 작용을 변형시키는 다양한 인자를 고려하여 주치의에 의해 결정될 것으로 이해된다. 다양한 인자에는 환자의 나이, 성별, 식이요법, 질환의 중증도, 투여 시기 및 기타 임상적 인자가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 선택적으로, 투여량은 재구성에 사용되는 매트릭스 유형과 조성물 내 화합물 유형에 따라 달라질 수 있다. 일부 실시형태에서, 환자의 혈액학적 매개변수는 이들이 정상 적혈구 수준 및/또는 헤모글로빈 수준(예를 들어, 헤모글로빈 수준 > 16.0g/dL 또는 헤모글로빈 수준 > 18.0g/dL)보다 높은지 여부를 결정하기 위해 주기적인 평가에 의해 모니터링될 수 있다. 일부 실시형태에서, 정상 적혈구 수준 및/또는 헤모글로빈 수준보다 높은 환자의 경우 해당 수준이 정상 또는 허용 가능한 수준으로 돌아올 때까지 지연되거나 감소된 용량을 받을 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg의 투여량 범위로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 0.1 mg/kg으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 0.2 mg/kg으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 0.3 mg/kg으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 0.4 mg/kg으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 0.5 mg/kg으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 0.6 mg/kg으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 0.7 mg/kg으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 0.8 mg/kg으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 0.9 mg/kg으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 1.0 mg/kg으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 1.1 mg/kg으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 1.2 mg/kg으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 1.3 mg/kg으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 1.4 mg/kg으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 1.5 mg/kg으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 1.6 mg/kg으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 1.7 mg/kg으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 1.8 mg/kg으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 1.9 mg/kg으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 2.0 mg/kg으로 투여된다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 1일 1회 투여된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 1일 2회 투여된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 주 1회 투여된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 주 2회 투여된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 주 3회 투여된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 2주마다 투여된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 3주마다 투여된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 4주마다 투여된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 ActRII 폴리펩티드는 매월 투여된다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 또한 ActRII 폴리펩티드의 생체내 생산을 위한 유전자 요법을 제공한다. 이러한 요법은 상기 나열된 장애를 가지는 세포 또는 조직에 ActRII 폴리펩티드 폴리뉴클레오티드 서열을 도입함으로써 치료 효과를 달성할 것이다. ActRII 폴리펩티드 폴리뉴클레오티드 서열의 전달은 재조합 발현 벡터, 예를 들어, 키메라 바이러스 또는 콜로이드 분산 시스템을 사용하여 달성될 수 있다. ActRII 폴리펩티드 폴리뉴클레오티드 서열의 치료학적 전달을 위해 바람직한 것은 표적화된 리포솜의 사용이다.

본 명세서에 개시된 유전자 요법에 사용될 수 있는 다양한 바이러스 벡터에는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아, 또는 바람직하게는 레트로바이러스와 같은 RNA 바이러스가 포함된다. 바람직하게는, 레트로바이러스 벡터는 뮤린 또는 조류 레트로바이러스의 유도체이다. 단일 외래 유전자가 삽입될 수 있는 레트로바이러스 벡터의 예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMuLV), 하비 뮤린 육종 바이러스(HaMuSV), 뮤린 유방 종양 바이러스(MuMTV) 및 라우스 육종 바이러스(RSV). 다수의 추가 레트로바이러스 벡터가 여러 유전자를 통합할 수 있다. 이들 벡터 모두는 형질도입된 세포가 확인되고 생성될 수 있도록 선택 가능한 마커에 대한 유전자를 전달하거나 통합할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는, 예를 들어, 당, 당지질 또는 단백질을 부착하여 표적 특이적으로 만들어질 수 있다. 바람직한 표적화는 항체를 사용하여 이루어진다. 당업자는 특정 폴리뉴클레오티드 서열이 레트로바이러스 게놈에 삽입되거나 바이러스 외피에 부착되어 ActRII 폴리펩티드를 함유하는 레트로바이러스 벡터의 표적 특이적 전달을 허용할 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 한 바람직한 실시형태에서, 벡터는 뼈 또는 연골을 표적으로 한다.

대안적으로, 조직 배양 세포는 통상적인 인산칼슘 형질감염에 의해 레트로바이러스 구조 유전자 gag, pol 및 env를 코딩하는 플라스미드로 곧바로 형질감염될 수 있다. 그런 다음 이들 세포를 관심 유전자를 포함하는 벡터 플라스미드로 형질감염시킨다. 생성된 세포는 레트로바이러스 벡터를 배양 배지로 방출한다.

ActRII 폴리펩티드 폴리뉴클레오티드에 대한 또 다른 표적 전달 시스템은 콜로이드 분산 시스템이다. 콜로이드 분산 시스템에는 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미세구, 비드 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜을 포함한 지질 기반 시스템이 포함된다. 본 발명의 바람직한 콜로이드 시스템은 리포솜이다. 리포솜은 시험관 내 및 생체 내 전달 수단으로 유용한 인공 막 소포이다. RNA, DNA 및 온전한 비리온은 수성 내부 내에 캡슐화될 수 있고 생물학적 활성 형태로 세포에 전달될 수 있다(예를 들어, Fraley, 외, Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981 참고). 리포솜 비히클을 사용한 효율적인 유전자 전달 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Mannino, 외, Biotechniques, 6:682, 1988 참조). 리포솜의 구성은 일반적으로 인지질의 조합이며 일반적으로 스테로이드, 특히 콜레스테롤과 결합된다. 다른 인지질이나 다른 지질도 사용될 수 있다. 리포솜의 물리적 특성은 pH, 이온 강도 및 2가 양이온의 존재 여부에 따라 달라진다.

리포솜 생산에 유용한 지질의 예에는 포스파티딜 화합물, 예를 들어, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고지질, 세레브로사이드 및 강글리오사이드가 포함된다. 예시적인 인지질에는 에그 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린 및 디스테아로일포스파티딜콜린이 포함된다. 리포솜의 표적화는, 예를 들어, 기관 특이성, 세포 특이성, 소기관 특이성에 기초하여 가능하며 이는 당업계에 공지되어 있다.

본 발명은 pH를 조정하는 산 및 염기; 그리고 pH를 좁은 범위 내로 유지하는 완충제를 포함하는, 변화될 수 있는 제형을 제공한다.

6. 실시예

지금까지 본 발명을 일반적으로 설명하였으며, 오직 본 발명의 특정 실시형태를 설명하기 위한 목적으로만 포함되고 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아닌 다음 실시예를 참조하면 더 쉽게 이해될 것이다.

실시예 1: ActRIIA-Fc 융합 단백질

인간 ActRIIa의 세포외 도메인이 인간 또는 마우스 Fc 도메인에 융합되고 이들 사이에 최소의 링커가 있는 가용성 ActRIIA 융합 단백질이 제작되었다. 이러한 구조체는 각각 ActRIIA-hFc 및 ActRIIA-mFc라 지칭한다.

ActRIIA-hFc는 CHO 세포주로부터 정제되며 아래 제시된다(서열 번호 23):

ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

C-말단 리신이 결여된 추가 ActRIIA-hFc는 CHO 세포주로부터 정제되며 아래 제시된다(서열 번호 40):

ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

ActRIIA-hFc 및 ActRIIA-mFc 단백질은 CHO 세포주에서 발현되었다. 다음과 같은 세 가지 다른 리더 서열들이 고려되었다:

(i) 꿀벌 멜리틴(HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (서열 번호 24)

(ii) 조직 플라스미노겐 활성화제(TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (서열 번호 25)

(iii) 천연: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (서열 번호 26)

선택된 형태는 TPA 리더를 사용하며 다음과 같은 가공되지 않은 아미노산 서열을 가진다:

MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGAAILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열 번호 27)

이 폴리펩티드는 다음 핵산 서열에 의해 코딩된다:

ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCGGCGCCGCTATACTTGGTAGATCAGAAACTCAGGAGTGTCTTTTTTTAATGCTAATTGGGAAAAAGACAGAACCAATCAAACTGGTGTTGAACCGTGTTATGGTGACAAAGATAAACGGCGGCATTGTTTTGCTACCTGGAAGAATATTTCTGGTTCCATTGAATAGTGAAACAAGGTTGTTGGCTGGATGATATCAACTGCTATGACAGGACTGATTGTGTAGAAAAAAAAGACAGCCCTGAAGTATATTTCTGTTGCTGTGAGGGCAATATGTGTAATGAAAAGTTTTCTTATTTTCCGGAGATGGAAGTCACACAGCCCACTTCAAATCCAGTTACACCTAAGCCACCCACCGGTGGTGGAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGTCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGAATTC (서열 번호 28)

ActRIIA-hFc와 ActRIIA-mFc는 모두 재조합 발현에 매우 적합했다. 도 4A 및 4B에서 보는 바와 같이, 단백질은 잘 정의된 단일 단백질 피크로 정제되었다. N-말단 시퀀싱을 통해 -ILGRSETQE(서열 번호 29)의 단일 서열이 밝혀졌다. 정제는 예를 들어 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로스 크로마토그래피, 페닐세파로스 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피 중 3개 이상을 임의의 순서로 포함하는 일련의 컬럼 크로마토그래피 단계에 의해 달성될 수 있다. 바이러스 여과 및 완충액 교환으로 정제를 완료할 수 있다. ActRIIA-hFc 단백질은 크기 배제 크로마토그래피로 측정했을 때 >98%, SDS PAGE로 측정했을 때 >95%의 순도로 정제되었다.

ActRIIA-hFc 및 ActRIIA-mFc는 리간드에 대해 높은 친화성을 나타냈다. GDF11 또는 액티빈 A는 표준 아민 커플링 절차를 사용하여 Biacore™ CM5 칩에 고정되었다. ActRIIA-hFc 및 ActRIIA-mFc 단백질을 시스템에 로딩하고 결합을 측정했다. ActRIIA-hFc는 5 x 10^-12의 해리 상수(K_D)로 액티빈에, 그리고 9.96 x 10^-9의 (K_D)로 GDF11에 결합했다. 도 5A 및 도 5B를 참고한다. 유사한 결합 분석을 사용하여, ActRIIA-hFc는, 예를 들어, 액티빈 B, GDF8, BMP6 및 BMP10을 포함하는 다른 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드에 대해 높은 내지 중간 정도의 친화성을 가지는 것으로 결정되었다. ActRIIA-mFc도 유사하게 거동했다.

ActRIIA-hFc는 약동학 연구에서 매우 안정적이었다. 래트에게 1 mg/kg, 3 mg/kg 또는 10 mg/kg의 ActRIIA-hFc 단백질을 투여하고, 단백질의 혈장 수준을 24, 48, 72, 144 및 168시간에 측정했다. 별도의 연구에서, 래트에게 1mg/kg, 10mg/kg 또는 30mg/kg을 투여했다. 래트에서, ActRIIA-hFc의 혈청 반감기는 11-14일이었고, 약물의 순환 수준은 2주 후에 상당히 높았다(1 mg/kg, 10mg/kg 또는 30mg/kg의 초기 투여에 대해 각각 11μg/ml, 110μg/ml 또는 304μg/ml). 시노몰구스 원숭이에서 혈장 반감기는 실질적으로 14일보다 길었고, 약물의 순환 수준은 1mg/kg, 10mg/kg, 또는 30mg/kg의 초기 투여에 대해 각각 25μg/ml, 304μg/ml 또는 1440μg/ml였다.

실시예 2: ActRIIA-hFc 단백질의 특성화

ActRIIA-hFc 융합 단백질은 서열 번호 25의 조직 플라스미노겐 리더 서열을 사용하여 pAID4 벡터(SV40 ori/인핸서, CMV 프로모터)로부터 안정적으로 형질감염된 CHO-DUKX B11 세포에서 발현되었다. 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 정제된 단백질은 서열 번호 23의 서열을 가졌다. Fc 부분은 서열 번호 23에 제시된 인간 IgG1 Fc 서열이다. 단백질 분석은 ActRIIA-hFc 융합 단백질이 이황화 결합을 가지는 동종이량체로 형성됨을 보여준다.

CHO 세포 발현 물질은 인간 293 세포에서 발현된 ActRIIA-hFc 융합 단백질에 대해 보고된 것보다 액티빈 B 리간드에 대해 더 높은 친화성을 가지고 있다[del Re 외, (2004) J Biol Chem. 279(51):53126-53135를 참고한다]. 또한, TPA 리더 서열의 사용은 다른 리더 서열보다 더 많은 생산을 제공했으며, 천연 리더로 발현된 ActRIIA-Fc와는 달리 매우 순수한 N-말단 서열을 제공했다. 천연 리더 서열을 사용하면 각각 서로 다른 N-말단 서열을 가지는 두 가지 주요 ActRIIA-Fc 종이 생성되었다.

실시예 3: 대체 ActRIIA-Fc 단백질

본 명세서에 기술된 방법에 따라 사용될 수 있는 다양한 ActRIIA 변이체는 WO2006/012627로 공개된 국제 특허 출원(예를 들어, 55-58페이지 참조)에 기술되어 있으며, 이는 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함된다. 대체 구조체는 C-말단 꼬리(ActRIIA의 세포외 도메인의 마지막 15개 아미노산)가 결실이 있을 수 있다. 이러한 구조체의 서열은 아래 제시되어 있다(Fc 부분에 밑줄)(서열 번호 30):

ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Claims

ActRII 폴리펩티드로 환자를 치료할 때 모세혈관확장증의 위험을 감소시키는 방법으로서, ActRII 폴리펩티드를 다음을 포함하는 투여 요법에 따라 투여하는 것을 포함하는 방법:
(i) 1회 이상의 ActRII 폴리펩티드의 제1 용량을 24주의 기간 동안 3주마다 1회 0.3 mg/kg의 양으로 환자에게 투여하는 단계; 그리고
(ii) 환자가 모세혈관확장증 발병에 대한 하나 이상의 증상 또는 위험 인자를 나타내는 경우, ActRII 폴리펩티드의 제2 용량을 제1 용량의 양의 적어도 절반으로 감소된 양으로 1회 이상 환자에게 투여하는 단계.
ActRII 폴리펩티드로 환자를 치료할 때 모세혈관확장증의 위험을 감소시키는 방법으로서, ActRII 폴리펩티드를 다음을 포함하는 투여 요법에 따라 투여하는 것을 포함하는 방법:
(i) 1회 이상의 용량의 ActRII 폴리펩티드를 24주 동안 3주마다 1회 0.3 mg/kg의 양으로 환자에게 투여하는 단계;
(ii) 환자가 모세혈관확장증 발병에 대한 하나 이상의 증상 또는 위험 인자를 나타내는 경우, 투여를 건너뛰는 단계, 이 때 단계 (i) 이후 6주 동안 환자는 치료받지 않으며; 그리고
(iii) 1회 이상의 용량의 ActRII 폴리펩티드를 적어도 24주 동안 3주마다 1회 0.3 mg/kg의 양으로 환자에게 투여하는 단계를 재개하는 단계.
폐동맥 고혈압을 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 환자에게 ActRII 폴리펩티드를 다음을 포함하는 투여 요법에 따라 투여하는 것을 포함하고:
(i) 환자에게 ActRII 폴리펩티드의 제1 용량을 0.3 mg/kg의 양으로 투여하는 단계; 그리고
(ii) 환자가 치료를 필요로 하는 한 ActRII 폴리펩티드의 제2 용량을 3주마다 1회 0.7 mg/kg의 양으로 환자에게 투여하는 단계;
여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1의 잔기 30-110에 상응하는 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
ActRII 폴리펩티드로 환자를 치료할 때 모세혈관확장증의 위험을 감소시키는 방법으로서, ActRII 폴리펩티드를 다음을 포함하는 투여 요법에 따라 투여하는 것을 포함하고:
(i) 1회 이상의 ActRII 폴리펩티드의 제1 용량을 24주의 기간 동안 3주마다 1회 0.3 mg/kg의 양으로 환자에게 투여하는 단계;
(ii) 환자가 치료를 필요로 하는 한 1회 이상의 ActRII 폴리펩티드의 제2 용량을 3주마다 1회 0.7 mg/kg의 양으로 환자에게 투여하는 단계; 그리고
(iii) 환자가 모세혈관확장증 발병에 대한 하나 이상의 증상 또는 위험 인자를 나타내는 경우, 1회 이상의 제3 용량의 ActRII 폴리펩티드를 투여하는 단계, 여기서 제3 용량은 증상이 개선될 때까지 3주마다 1회 0.3 mg/kg의 양으로 투여되고;
여기서 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1의 잔기 30-110에 상응하는 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 이러한 방법에 의해 모세혈관확장증의 위험이 감소되는, 방법.
제4항에 있어서, 단계 (iii)은 1회 이상의 용량의 ActRII 폴리펩티드를 적어도 24주 동안 3주마다 1회 0.3 mg/kg의 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
제4항에 있어서, 환자는 단계 (ii)와 단계 (iii) 사이에 적어도 2-6주의 기간 동안 ActRII 폴리펩티드로 치료되지 않는, 방법.
제4항 또는 제6항에 있어서, 환자는 단계 (ii)와 단계 (iii) 사이에 적어도 3주의 기간 동안 ActRII 폴리펩티드로 치료되지 않는, 방법.
제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i)은 환자에게 제1 용량을 적어도 3주 동안 투여하는 것을 포함하는, 방법.
제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)는 환자에게 제2 용량을 적어도 21주 동안 투여하는 것을 포함하는, 방법.
제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)는 환자에게 제2 용량을 적어도 45주 동안 투여하는 것을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제2항 및 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 모세혈관확장증의 하나 이상의 증상은 통증, 가려움증, 피부의 실 모양의 붉은 자국, 피부 점막 확장증, 위장 출혈, 피부 병변, 비출혈(epistaxis), 치은 출혈, 동정맥 기형, 내부 모세혈관확장증 및 피부의 붉은 반점으로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제2항 및 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 모세혈관확장증의 하나 이상의 증상은 피부 병변을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제2항 및 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 모세혈관확장증의 하나 이상의 증상은 치은 출혈을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제2항 및 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 모세혈관확장증의 하나 이상의 증상은 비출혈을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제2항 및 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 모세혈관확장증의 하나 이상의 증상은 동정맥 기형을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제2항 및 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 모세혈관확장증의 하나 이상의 증상은 내부 모세혈관확장증을 포함하는, 방법.
제11항, 제15항 또는 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 동정맥 기형 또는 내부 모세혈관확장증은 내부 기관에서 발생하는, 방법.
제1항 내지 제2항 및 제4항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 모세혈관확장증 발병에 대한 위험 인자는 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 방법:
i. 낮은 BMP9 수준;
ii. 낮은 BMP10 수준;
iii. 낮은 VEGF 수준;
iv. 유전성 출혈성 모세혈관확장증(HHT); 그리고
v. 결합 조직 질환(CTD).
제1항 내지 제2항 및 제4항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 환자의 모세혈관확장증의 중증도를 완화 또는 개선시키는, 방법.
제1항 내지 제2항 및 제4항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 환자에서 모세혈관확장증의 진행을 방지하는, 방법.
제2항 또는 제4항에 있어서, 단계 (iii)은 모세혈관확장증이 1등급 이하로 개선될 때까지 ActRII 폴리펩티드의 치료를 보류하는 것을 포함하는, 방법.
제19항에 있어서, 상기 방법은 모세혈관확장증의 중증도를 2등급에서 1등급으로 개선하는, 방법.
제19항에 있어서, 상기 방법은 모세혈관확장증의 중증도를 3등급에서 2등급으로 개선하는, 방법.
제19항에 있어서, 상기 방법은 모세혈관확장증의 중증도를 3등급에서 1등급으로 개선하는, 방법.
제20항에 있어서, 상기 방법은 모세혈관확장증의 1등급에서 2등급으로의 진행을 방지하는, 방법.
제20항에 있어서, 상기 방법은 모세혈관확장증의 2등급에서 3등급으로의 진행을 방지하는, 방법.
제1항 내지 제2항 및 제4항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 폐고혈압 치료를 위해 ActRII 폴리펩티드를 투여받고 있는, 방법.
제1항 내지 제2항 및 제4항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 폐동맥 고혈압 치료를 위해 ActRII 폴리펩티드를 투여받고 있는, 방법.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1의 잔기 30-110에 상응하는 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1의 잔기 21-135에 상응하는 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 1의 잔기 21-135에 상응하는 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, ActRII 폴리펩티드는 서열 번호 2의 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, ActRII 폴리펩티드는 서열 번호 3의 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, ActRII 폴리펩티드는 면역글로불린의 Fc 도메인을 추가로 포함하는 융합 단백질인, 방법.
제34항에 있어서, 면역글로불린의 Fc 도메인은 IgG1 면역글로불린의 Fc 도메인인, 방법.
제34항 또는 제35항에 있어서, Fc 융합 단백질은 ActRII 폴리펩티드 도메인과 면역글로불린의 Fc 도메인 사이에 위치하는 링커 도메인을 추가로 포함하는, 방법.
제36항에 있어서, 링커 도메인은 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 방법: TGGG (서열 번호 20), TGGGG (서열 번호 18), SGGGG (서열 번호 19), GGGGS (서열 번호 22), GGG (서열 번호 16), GGGG (서열 번호 17), 및 SGGG (서열 번호 21).
제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, ActRII 폴리펩티드는 서열 번호 23의 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, ActRII 폴리펩티드는 서열 번호 40의 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 동결건조 후 재구성되는, 방법.
제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 가용성인, 방법.
제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 피하 주사를 사용하여 환자에게 투여되는, 방법.
제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 매주, 2주마다, 3주마다 및 4주마다로 구성된 그룹으로부터 선택된 일정에 따라 환자에게 투여되는, 방법.
제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 환자에게 3주마다 투여되는, 방법.
제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 환자에게 4주마다 투여되는, 방법.
제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 동종이량체 단백질 복합체의 일부인, 방법.
제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 글리코실화된 것인, 방법.
제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 차이니즈 햄스터 난소 세포에서의 발현에 의해 얻을 수 있는 글리코실화 패턴을 가지는 것인, 방법.
제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, ActRII 폴리펩티드는 액티빈 A, 액티빈 B 및 GDF11로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 리간드에 결합하는 것인, 방법.
제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, ActRII 폴리펩티드는 액티빈 및/또는 GDF11에 결합하는 것인, 방법.
제49항 또는 제50항에 있어서, ActRII 폴리펩티드는 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 리간드에 추가로 결합하는 것인, 방법: BMP10, GDF8, 및 BMP6.
제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에게 추가 활성제 및/또는 지지 요법을 추가로 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제52항에 있어서, 추가 활성제 및/또는 지지 요법은 베타-차단제, 안지오텐신 전환 효소 억제제(ACE 억제제), 안지오텐신 수용체 차단제(ARB), 이뇨제, 지질 저하 약물, 엔도텔린 차단제, PDE5 억제제, 프로스타사이클린, 및 좌심실 보조 장치(LVAD)로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 방법.
제52항에 있어서, 추가 활성제 및/또는 지지 요법은 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 방법: 프로스타사이클린 및 이의 유도체(예를 들어, 에포프로스테놀, 트레프로스티닐, 및 일로프로스트); 프로스타사이클린 수용체 작용제(예를 들어, 셀렉시팍); 엔도텔린 수용체 길항제(예를 들어, 텔린, 암브리센탄, 마시텐탄, 및 보센탄); 칼슘 채널 차단제(예를 들어, 암로디핀, 딜티아젬 및 니페디핀; 항응고제(예를 들어, 와파린); 이뇨제; 산소 요법; 심방 중격 절개술; 폐 혈전 내막 절제술; 포스포디에스테라제 5형 억제제(예를 들어, 실데나필 및 타다라필); 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성화제(예를 들어, 시나시구아트 및 리오시구아트); ASK-1 억제제(예를 들어, CIIA; SCH79797; GS-4997; MSC2032964A; 3H-나프토[1,2,3-데]퀴닐린-2,7-디온, NQDI-1; 2-티옥소-티아졸리딘, 5-브로모-3-(4-옥소-2-티옥소-티아졸리딘-5-일리덴)-1,3-디하이드로-인돌-2-온); NF-κB 길항제(예를 들어, dh404, CDDO-에폭사이드; 2.2-디플루오로프로피온아미드; C28 이미다졸(CDDO-Im); 2-시아노-3,12-디옥소올레안-1,9-디엔-28-오익 애시드 (CDDO); 3-아세틸올레아놀릭 애시드; 3-트리플루오로아세틸올레아놀릭 애시드; 28-메틸-3-아세틸올레아난; 28-메틸-3-트리플루오로아세틸올레아난; 28-메틸옥시올레아놀릭 애시드; SZC014; SCZ015; SZC017; 올레아놀릭 애시드의 페길화 유도체; 3-O-(베타-D-글루코피라노실) 올레아놀릭 애시드; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1→3)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1→2)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1→3)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드 28-O-베타-D-글루코피라노실 에스테르; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1→2)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드 28-O-베타-D-글루코피라노실 에스테르; 3-O-[a-L-람노피라노실-(1→3)-베타-D-글루쿠로노피라노실] 올레아놀릭 애시드; 3-O-[알파-L-람노피라노실-(1→3)-베타-D-글루쿠로노피라노실] 올레아놀릭 애시드 28-O-베타-D-글루코피라노실 에스테르; 28-O-β-D-글루코피라노실-올레아놀릭 애시드; 3-O-β-D-글루코피라노실 (1→3)-β-D-글루코피라노시두로닉 애시드(CS1); 올레아놀릭 애시드 3-O-β-D-글루코피라노실 (1→3)-β-D-글루코피라노시두로닉 애시드(CS2); 메틸 3,11-디옥소올레안-12-엔-28-올레이트(DIOXOL); ZCVI₄-2; 벤질 3-디하이드록시-1,2,5-옥사디아졸로[3',4':2,3]올레아놀레이트); 좌심실 보조 장치(LVAD), 및 폐 및/또는 심장 이식.
제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 포스포디에스테라제 5형 억제제, 가용성 구아닐레이트 사이클라제 자극제, 프로스타사이클린 수용체 작용제 및 엔도텔린 수용체 길항제로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제제로 치료받은, 방법.
제55항에 있어서, 하나 이상의 제제는 보센탄, 실데나필, 베라프로스트, 마시텐탄, 셀렉시팍, 에포프로스테놀, 트레프로스티닐, 일로프로스트, 암브리센탄 및 타다라필로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인, 방법.
제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 포스포디에스테라제 5형 억제제, 가용성 구아닐레이트 사이클라제 자극제, 프로스타사이클린 수용체 작용제 및 엔도텔린 수용체 길항제로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제제의 투여를 추가로 포함하는, 방법.
제57항에 있어서, 하나 이상의 제제는 보센탄, 실데나필, 베라프로스트, 마시텐탄, 셀렉시팍, 에포프로스테놀, 트레프로스티닐, 일로프로스트, 암브리센탄 및 타다라필로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인, 방법.
제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 폴리펩티드 투여 전 하나 이상의 혈관확장제로 치료받은, 방법.
제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 하나 이상의 혈관확장제의 투여를 추가로 포함하는, 방법.
제59항 또는 제60항에 있어서, 하나 이상의 혈관확장제는 프로스타사이클린, 에포프로스테놀 및 실데나필로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인, 방법.
제61항에 있어서, 혈관확장제는 프로스타사이클린인, 방법.
제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 PAH에 대한 하나 이상의 요법을 받아 오고 있는, 방법.
제63항에 있어서, PAH에 대한 하나 이상의 치료제는 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 방법: 프로스타사이클린 및 이의 유도체(예를 들어, 에포프로스테놀, 트레프로스티닐, 및 일로프로스트); 프로스타사이클린 수용체 작용제(예를 들어, 셀렉시팍); 엔도텔린 수용체 길항제(예를 들어, 텔린, 암브리센탄, 마시텐탄, 및 보센탄); 칼슘 채널 차단제(예를 들어, 암로디핀, 딜티아젬 및 니페디핀; 항응고제(예를 들어, 와파린); 이뇨제; 산소 요법; 심방 중격 절개술; 폐 혈전 내막 절제술; 포스포디에스테라제 5형 억제제(예를 들어, 실데나필 및 타다라필); 가용성 구아닐레이트 사이클라제의 활성화제(예를 들어, 시나시구아트 및 리오시구아트); ASK-1 억제제(예를 들어, CIIA; SCH79797; GS-4997; MSC2032964A; 3H-나프토[1,2,3-데]퀴닐린-2,7-디온, NQDI-1; 2-티옥소-티아졸리딘, 5-브로모-3-(4-옥소-2-티옥소-티아졸리딘-5-일리덴)-1,3-디하이드로-인돌-2-온); NF-κB 길항제(예를 들어, dh404, CDDO-에폭사이드; 2.2-디플루오로프로피온아미드; C28 이미다졸(CDDO-Im); 2-시아노-3,12-디옥소올레안-1,9-디엔-28-오익 애시드 (CDDO); 3-아세틸올레아놀릭 애시드; 3-트리플루오로아세틸올레아놀릭 애시드; 28-메틸-3-아세틸올레아난; 28-메틸-3-트리플루오로아세틸올레아난; 28-메틸옥시올레아놀릭 애시드; SZC014; SCZ015; SZC017; 올레아놀릭 애시드의 페길화 유도체; 3-O-(베타-D-글루코피라노실) 올레아놀릭 애시드; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1→3)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1→2)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1→3)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드 28-O-베타-D-글루코피라노실 에스테르; 3-O-[베타-D-글루코피라노실-(1→2)-베타-D-글루코피라노실] 올레아놀릭 애시드 28-O-베타-D-글루코피라노실 에스테르; 3-O-[a-L-람노피라노실-(1→3)-베타-D-글루쿠로노피라노실] 올레아놀릭 애시드; 3-O-[알파-L-람노피라노실-(1→3)-베타-D-글루쿠로노피라노실] 올레아놀릭 애시드 28-O-베타-D-글루코피라노실 에스테르; 28-O-β-D-글루코피라노실-올레아놀릭 애시드; 3-O-β-D-글루코피라노실 (1→3)-β-D-글루코피라노시두로닉 애시드(CS1); 올레아놀릭 애시드 3-O-β-D-글루코피라노실 (1→3)-β-D-글루코피라노시두로닉 애시드(CS2); 메틸 3,11-디옥소올레안-12-엔-28-올레이트(DIOXOL); ZCVI₄-2; 벤질 3-디하이드록시-1,2,5-옥사디아졸로[3',4':2,3]올레아놀레이트); 좌심실 보조 장치(LVAD), 및 폐 및/또는 심장 이식.