CN103502271A - 抗原结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含两个Fc部分的抗原结合蛋白、其生成方法、含有所述抗原结合蛋白的药物组合物及其用途。所述抗原结合蛋白包含：a)特异性结合抗原的抗体的两条经修饰重链，其中每条重链的VH用所述抗体的VL替换，所述经修饰重链经由其Fc部分的CH3域彼此联合；b)所述抗体的两条经修饰重链，其中每条重链的CHI用所述抗体的CL替换，所述经修饰重链经由其Fc部分的CH3域彼此联合；且其中a)的重链的VL域与b)的重链的VH域联合，且a)的重链的CHI域与b)的重链的CL域联合。

Description

抗原结合蛋白
发明领域
本发明涉及包含两个Fc部分的抗原结合蛋白、其生成方法、含有所述抗原结合蛋白的药物组合物及其用途。
发明背景
在过去的20年中，已开发并评估各种单特异性或多特异性的、单价或多价的工程化抗体衍生物(参见例如Holliger,P.等,Nature Biotech.23(2005)1126-1136;Fischer,N.和Léger O.,Pathobiology74(2007)3-14)。
US2004/0033561提述DNA和通过共表达重链和经修饰重链来生成单价抗体。然而，在表达期间，相当大量的不想要的同二聚体作为副产物形成，其难以与期望的异二聚体单抗体(monobody)分开，因为同二聚体和异二聚体具有相同或相似的分子量。WO2007/048037提述单价IgG，其对应于US2004/0033561的异二聚体单抗体，但其可以具有附接于重链的加标签模块，用于从难以分离的同二聚体副产物更容易纯化异二聚体。
发明概述
本发明包括抗原结合蛋白，其包含：
a)特异性结合抗原的抗体的两条经修饰重链，其中每条重链的VH用所述抗体的VL替换，所述经修饰重链经由其Fc部分的CH域彼此联合；
b)所述抗体的两条经修饰重链，其中每条重链的CH1用所述抗体的CL替换，所述经修饰重链经由其Fc部分的CH域彼此联合；
且其中a)的重链的VL域与b)的重链的VH域联合，且a)的重链的CH1域与b)的重链的CL域联合。
在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白的特征在于：a)的经修饰重链的Fc部分的CH3域和b)的经修饰重链的Fc部分的CH3域是相同同种型的。
在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白的特征在于：a)的经修饰重链的Fc部分的CH2和CH3域和b)的经修饰重链的Fc部分的CH2和CH3域是相同同种型的。
在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白的特征在于：a)的经修饰重链的Fc部分的CH2和CH3域和b)的经修饰重链的Fc部分的CH2和CH3域是IgG同种型的。
在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白的特征在于：a)的经修饰重链的Fc部分的CH2和CH3域和b)的经修饰重链的Fc部分的CH2和CH3域是IgG1同种型的。
在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白的特征在于包含：
a)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；和b)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
a)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；和b)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
或
a)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和b)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白的特征在于：a)的两条经修饰重链或b)的两条经修饰重链通过氨基酸取代S364G、L368F、D399K和K409D(其中氨基酸位置依照Kabat的EU索引编号)进一步修饰。
在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白的特征在于：
a)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；和b)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；其中a)的两条经修饰重链或b)的两条经修饰重链通过氨基酸取代S364G、L368F、D399K和K409D(其中氨基酸位置依照Kabat的EU索引编号)进一步修饰；
a)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；和b)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；其中a)的两条经修饰重链或b)的两条经修饰重链通过氨基酸取代S364G、L368F、D399K和K409D(其中氨基酸位置依照Kabat的EU索引编号)进一步修饰；
或
a)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和b)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；其中a)的两条经修饰重链或b)的两条经修饰重链通过氨基酸取代S364G、L368F、D399K和K409D(其中氨基酸位置依照Kabat的EU索引编号)进一步修饰。
在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白的特征在于：a)的经修饰重链的Fc部分的CH3域和b)的经修饰重链的Fc部分的CH3域是不同同种型的。
在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白的特征在于：a)的经修饰重链的Fc部分的CH3域是IgG1同种型的；且b)的经修饰重链的Fc部分的CH3域是IgA同种型的。
在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白的特征在于包含：a)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和b)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白的特征在于包含：a)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；和b)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白的特征在于：a)的经修饰重链的Fc部分的CH2和CH3域是IgG1同种型的；且b)的经修饰重链的Fc部分的CH2和CH3域是IgA同种型的。
在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白的特征在于：a)和b)的Fc部分的CH2域是IgG1同种型的，且抗原结合蛋白是无岩藻糖基化的，岩藻糖量占Asn297处的寡糖(糖)总量的80%或更少(优选65%至5%)，是IgG1同种型的。
本发明还包括一种用于制备依照本发明的抗原结合蛋白的方法，其包括以下步骤：
a)用包含编码依照本发明的抗原结合蛋白的核酸分子的载体转化宿主细胞，
b)在允许所述抗原结合蛋白分子合成的条件下培养所述宿主细胞；并
c)从所述培养物回收所述抗原结合蛋白分子。
本发明还包括编码依照本发明的抗原结合蛋白的核酸。
本发明还包括包含编码依照本发明的抗原结合蛋白的核酸的载体。
本发明还包括包含所述载体的宿主细胞。
本发明还包括依照本发明的抗原结合蛋白的组合物，优选为药物组合物或诊断用组合物。
本发明还包括包含依照本发明的抗原结合蛋白的药物组合物。
本发明还包括用于治疗需要治疗的患者的方法，其特征在于对所述患者施用治疗有效量的依照本发明的抗原结合蛋白。
现已发现，依照本发明的抗原结合蛋白具有有价值的特征，如生物学或药理学活性(如例如相比于亲本抗体增强的ADCC)。可以将它们例如用于治疗疾病如癌症。此外，依照本发明的抗原结合蛋白具有高度有价值的药动学特性(如例如AUC0-无穷、C最大值或C0)。
附图简述
图1A和B：A)具有CH1-CL交换(crossover)的依照本发明的抗原结合蛋白(缩写为MoAb二聚体)的示意性结构。B)具有CH1-CL交换的主要副产物单价抗体单体(MoAb)(缩写为MoAb)的示意图。
图1C:C)两条经修饰重链a和b的联合：两条不同链(a与b)的异二聚化直接产生单价抗体B(路径2)。两条相同链(a与a以及b与b)的同二聚化产生推定的中间体aa和bb(经由路径1)，其可以联合以形成“MoAb二聚体”A。对CH3-CH3接触的修饰可能影响产物A(MoAb二聚体)和B(MoAb)的分配。有利于异二聚化(例如突出入孔(knobs into holes))的修饰会增加经由路径2的化合物B的相对量，而维持相同链之间有吸引力的相互作用但导致不同链排斥的修饰(例如取自不同同种型的a和b的CH3域)会有利于路径1，如此增加A的量。白色：轻链域。虚线：重链域。
图2：MoAb二聚体c-Met(5D5MoAb二聚体(“CH3-wt”))(CH3-wt指未改变的、野生型CH3域)的生化表征。(A)将经蛋白A纯化的抗体在Superdex20026/60柱上分开。(B)将峰级分(1,2,3)合并并进行非还原性和还原性条件下的SDS-PAGE。将聚丙烯酰胺凝胶用考马斯蓝染料染色。各个峰对应于MoAb(3)、MoAb二聚体(2)和更高分子量的聚集物(1)。
图3：MoAb二聚体IGF-1R(IGF-1R AK18MoAb二聚体(“CH3-wt”))(CH3-wt指未改变的、野生型CH3域)的生化表征。(A)将经蛋白A纯化的抗体在Superdex20026/60柱上分开。(B)将峰级分(1,2)合并并进行非还原性和还原性条件下的SDS-PAGE。将聚丙烯酰胺凝胶用考马斯蓝染料染色。各个峰对应于MoAb(2)和MoAb二聚体(1)。C)通过SEC-MALLS调查峰级分1和2的分子质量。
图4：Her3205MoAb二聚体(“CH3-wt”)(CH3-wt指未改变的、野生型CH3域)的生化表征。(A)将经蛋白A纯化的抗体在Superdex20026/60柱上分开。(B)将峰级分(1,2)合并并进行非还原性和还原性条件下的SDS-PAGE。将聚丙烯酰胺凝胶用考马斯蓝染料染色。各个峰对应于MoAb(3)、MoAb二聚体(2)和更高分子量的聚集物(1)。
图5：为了分析IGF-1R结合亲和力应用的表面等离振子共振测定法的示意图。将抗人IgG抗体(JIR109-005-098)固定化于CM5生物传感器芯片的表面上，并随后捕获MoAb或MoAb二聚体抗体。进一步注射重组IGF-1R胞外域确认了MoAb和MoAb二聚体分子中抗原结合位点的功能性。
图6：用流式细胞术分析得到的MoAb二聚体(IGF-1R AK18MoAb二聚体(“CH3-wt”)(B)和亲本抗体Mab IGF-1R(A)对A549细胞的细胞结合。将A549细胞与指定抗体的稀释系列一起温育。用偶联有荧光体的Fc结合性二抗显现结合的抗体。
图7：用非糖工程化改造的(非ge)和经糖工程化改造(ge)的IGF1RMab以及非糖工程化改造的IGF-1R MoAb二聚体(IGF1RAK18MoAb二聚体(“CH3-wt”))进行的ADCC测定法。将供体衍生的外周血单个核细胞(PBMC)与前列腺癌细胞(DU145)在存在非ge IGF1R Mab(1)、ge IGF1R Mab(2)和非ge IGF1RAK18MoAb二聚体(“CH3-wt”)(3)的情况下一起温育。
图8：在与IGF-1R IgG1(Mab IGF-1R)抗体和IGF-1R MoAb二聚体(IGF1R AK18MoAb二聚体(“CH3-wt”))一起温育后，在HT29细胞中评估IGF-1R的内在化。该图绘出了抗体暴露后的总IGF-1R水平，其在基于ELISA的测定法设置中测定。
图9：在将3T3-IGF-1R细胞与IGF-1R IgG1抗体和IGF-1R MoAb二聚体(IGF1R AK18MoAb二聚体(“CH3-wt”))在存在10nMIGF-1的情况下一起温育后，评估IGF-1R的自身磷酸化。该图绘出了抗体暴露后的磷酸IGF-1R水平，其在基于ELISA的测定法设置中测定。
图10：分析获得的MoAb二聚体(=依照本发明的抗原结合蛋白)对MoAb单体(=单价副产物)比率，如通过HPLC测定的。瞬时表达具有野生型CH3(CH3-wt)域和经修饰CH3域的不同抗体，并测定二聚体对单体的比率。
图11：在非还原性条件下且在去糖基化后IGF-1R MoAb二聚体(SEC级分1)的ESI-MS谱。
图12:在去糖基化和还原后IGF-1R MoAb二聚体(SEC级分1)的ESI-MS谱。
发明详述
本发明包括抗原结合蛋白，其包含：
a)特异性结合抗原的抗体的两条经修饰重链，其中每条重链的VH用所述抗体的VL替换，所述经修饰重链经由其Fc部分的CH域彼此联合；
b)所述抗体的两条经修饰重链，其中每条重链的CH1用所述抗体的CL替换，所述经修饰重链经由其Fc部分的CH域彼此联合；
且其中a)的重链的VL域与b)的重链的VH域联合，且a)的重链的CH1域与b)的重链的CL域联合。
在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白的特征在于：a)的经修饰重链的Fc部分的CH3域和b)的经修饰重链的Fc部分的CH3域是相同同种型的。
在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白的特征在于：a)的经修饰重链的Fc部分的CH2和CH3域和b)的经修饰重链的Fc部分的CH2和CH3域是相同同种型的。
在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白的特征在于：a)的经修饰重链的Fc部分的CH2和CH3域和b)的经修饰重链的Fc部分的CH2和CH3域是IgG同种型的。
在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白的特征在于：a)的经修饰重链的Fc部分的CH2和CH3域和b)的经修饰重链的Fc部分的CH2和CH3域是IgG1同种型的。
在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白的特征在于包含：
a)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；和b)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
a)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；和b)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
或
a)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和b)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
为了改善依照本发明的抗原结合蛋白的产率(即为了改善MoAb二聚体对MoAb单体比率(见实施例9))，可以进一步通过突变来修饰a)的IgG1CH3域，使得a)的IgG1CH3域和b)的天然(wt)IgG1CH3域有所不同。必须以维持相同链之间有吸引力的相互作用但导致不同链排斥的方式实施该修饰/突变(亦见图1C)。
在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白的特征在于：a)的两条经修饰重链或b)的两条经修饰重链通过氨基酸取代S364G、L368F、D399K和K409D(其中氨基酸位置依照Kabat的EU索引编号)进一步修饰。
Kabat的EU索引编号系统记载于Kabat等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)。
在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白的特征在于：
a)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；和b)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；其中a)的两条经修饰重链或b)的两条经修饰重链通过氨基酸取代S364G、L368F、D399K和K409D(其中氨基酸位置依照Kabat的EU索引编号)进一步修饰；
a)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；和b)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；其中a)的两条经修饰重链或b)的两条经修饰重链通过氨基酸取代S364G、L368F、D399K和K409D(其中氨基酸位置依照Kabat的EU索引编号)进一步修饰；
或
a)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和b)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；其中a)的两条经修饰重链或b)的两条经修饰重链通过氨基酸取代S364G、L368F、D399K和K409D(其中氨基酸位置依照Kabat的EU索引编号)进一步修饰。
另一种改善依照本发明的抗原结合蛋白的产率(即改善MoAb二聚体对MoAb单体比率(见实施例9))的可能性，a)和b)的CH3域取自不同同种型。如此，维持相同链之间有吸引力的相互作用但排斥不同链(亦见图1C)。
因此，在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白的特征在于：a)的经修饰重链的Fc部分的CH3域和b)的经修饰重链的Fc部分的CH3域是不同同种型的。
在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白的特征在于：a)的经修饰重链的Fc部分的CH3域是IgG1同种型的；而b)的经修饰重链的Fc部分的CH3域是IgA同种型的。
在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白的特征在于包含：a)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和b)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白的特征在于包含：a)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；和b)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白的特征在于：a)的经修饰重链的Fc部分的CH2和CH3域是IgG1同种型的；而b)的经修饰重链的Fc部分的CH2和CH3域是IgA1同种型的。
在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白的特征在于：a)和b)的Fc部分的CH2域是IgG1同种型的，且抗原结合蛋白是无岩藻糖基化的，岩藻糖量占Asn297处的寡糖(糖)总量的80%或更少，是IgG1同种型的。
如本文中使用的，术语“抗体”指由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体(见图1)。全长抗体的重链是在N端至C端方向由以下各项组成的多肽：抗体重链可变域(VH)、抗体重链恒定域1(CH1)、抗体铰链区(HR)、抗体重链恒定域2(CH2)和抗体重链恒定域3(CH3)，缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3；任选地，以及抗体重链恒定域4(CH4)(在IgE类抗体的情况下)。优选地，全长抗体的重链是在N端至C端方向由VH、CH1、HR、CH2和CH3组成的多肽。全长抗体的轻链是在N端至C端方向由抗体轻链可变域(VL)和抗体轻链恒定域(CL)组成的多肽，缩写为VL-CL。抗体轻链恒定域(CL)可以是κ(卡帕)或λ(拉姆达)。抗体链经由CL域和CH1域之间(即轻链和重链之间)以及全长抗体重链的铰链区之间的多肽间二硫键连接在一起。典型全长抗体的例子是天然抗体如IgG(例如IgG1和IgG2)、IgM、IgA、IgD和IgE。依照本发明的抗体可以来自单一物种例如人，或它们可以是嵌合化或人源化的抗体。依照本发明的全长抗体包含两个各由一对VH和VL形成的抗原结合位点，其均特异性结合相同(第一)抗原。
如下从这些全长抗体衍生本发明的抗原结合蛋白：
a)修饰特异性结合抗原的抗体的两条重链，其通过用所述抗体的VL域替换每条重链的VH域进行；
b)修饰所述抗体的两条重链，其通过用所述抗体的CL域替换每条重链的CH1域进行。
抗体或抗原结合蛋白的“Fc部分”不直接牵涉抗体对抗原的结合，但负责a)(经修饰的)抗体链的彼此联合(例如经由其CH3域)和b)各种效应器功能。“抗体的Fc部分”是熟练技术人员公知的术语，并基于抗体的木瓜蛋白酶切割定义。根据其重链恒定区的氨基酸序列，将抗体或免疫球蛋白分成以下类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且可以将这些中的几种进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，IgA1和IgA2。依照重链恒定区，免疫球蛋白的不同类分别称作α、δ、ε、γ和μ。
有5类以希腊字母表示的哺乳动物抗体重链：α、δ、ε、γ和μ(Janeway,C.A.,Jr.等,Immunobiology,5th ed.,Garland Publishing(2001))。存在的重链类型定义了抗体的类；这些链分别在IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体中找到(Rhoades,R.A.和Pflanzer,R.G.,Human Physiology,4th ed.,Thomson Learning(2002))。不同的重链在大小和组成上不同；α和γ含有约450个氨基酸，而μ和ε具有约550个氨基酸。
每条重链具有两个区，即恒定区和可变区。恒定区在相同同种型的所有抗体中是等同的，但在不同同种型的抗体中有所不同。重链γ、α和δ具有由3个恒定域CH1、CH2和CH3(在一条线中)构成的恒定区，和实现添加的柔性的铰链区(Woof,J.和Burton,D.,Nat.Rev.Immunol.4(2004)89-99)；重链μ和ε具有由4个恒定域CH1、CH2、CH3和CH4构成的恒定区(Janeway,C.A.,Jr.等,Immunobiology.,5th ed.,Garland Publishing(2001))。重链的可变区在由不同B细胞生成的抗体中有所不同，但对于由单一B细胞或B细胞克隆所生成的所有抗体是相同的。每条重链的可变区长约110个氨基酸并且由单个抗体域构成。
“Fc部分的CH域”是抗体重链恒定域2(CH2)、和抗体重链恒定域3(CH3)、以及任选地抗体重链恒定域4(CH4)(在IgE类抗体的情况下)。
术语“所述经修饰重链经由其Fc部分的CH域彼此联合”指两条经修饰重链的抗体重链恒定域(CH)彼此的链间域配对，例如两条链的两个CH3域经由例如链间离子相互作用、范德华相互作用或氢键键合彼此配对(见图1A)。在一个实施方案中，所述经修饰重链至少经由其Fc部分的CH3域(以及任选地经由其CH2域，或任选地经由其CH2域和CH4域(若存在的话))彼此联合。
术语“其中a)的重链VL域与b)的重链VH域联合，且a)的重链CH1域与b)的重链CL域联合”指所述抗体域(总是一个a)的和一个b)的)的域配对，如例如在天然抗体中找到的(VL/VH和CH1/CL)，例如经由链间离子相互作用、范德华相互作用、氢键键合或二硫化物相互作用实现(见图1A)。
依照本发明的“抗原结合蛋白”包含两个抗原结合位点并且是二价的。如本文中使用的，术语“结合位点”或“抗原结合位点”指依照本发明的抗原结合蛋白中实际上与配体(例如抗原或其抗原片段)结合，并且自抗体分子或其片段(例如Fab片段)衍生的区域。依照本发明的抗原结合位点包含抗体重链可变域(VH)和抗体轻链可变域(VL)。
特异性结合期望抗原的抗原结合位点(即VH/VL对)可以a)自针对抗原的已知抗体或b)自通过使用抗原蛋白质或核酸或其片段等的重新免疫方法或通过噬菌体展示获得的新抗体或抗体片段衍生。
本发明的抗原结合蛋白的抗原结合位点含有6个互补决定区(CDR)，其在不同程度上促成结合位点对抗原的亲和力。有3个重链可变域CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)和3个轻链可变域CDR(CDRL1、CDRL2和CDRL3)。通过与氨基酸序列的汇编数据库比较来确定CDR和框架区(FR)的范围，在所述数据库中已依照序列间的变异性定义了那些区域。
抗体特异性指抗体对抗原的特定表位的选择性识别。例如，天然抗体是单特异性的。双特异性抗体是具有两种不同的抗原结合特异性的抗体。依照本发明的抗原结合蛋白至少是单特异性的，并且特异性结合相应抗原的表位。
术语“价”用于本申请内指抗体分子中指定数目的结合位点的存在。例如，天然抗体具有两个结合位点并且是二价的。还有，依照本发明的抗原结合蛋白至少是二价的。
如本文中使用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指具有单一氨基酸组成的抗体分子制备物。
术语“嵌合抗体”指包含来自一种来源或物种的可变区(即结合区)以及至少一部分自不同来源或物种衍生的恒定区的抗体，其通常通过重组DNA技术制备。优选包含鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。本发明涵盖的其它优选形式的“嵌合抗体”是那些其中恒定区已经经过修饰或从初始抗体的恒定区改变以生成依照本发明的特性(尤其是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合)的抗体。这类嵌合抗体也称为“类转换抗体”。嵌合抗体是表达的包含编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段的免疫球蛋白基因的产物。用于生成嵌合抗体的方法牵涉常规重组DNA，且基因转染技术是本领域中公知的。见例如Morrison,S.L.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81(1984)6851-6855;US5,202,238和US5,204,244。
术语“人源化抗体”指如下的抗体，其中与亲本免疫球蛋白相比，框架或“互补决定区”(CDR)已经经过修饰以包含不同特异性的免疫球蛋白的CDR。在一个优选的实施方案中，将鼠CDR嫁接到人抗体的框架区中以制备“人源化抗体”。见例如Riechmann,L.等,Nature332(1988)323-327;Neuberger,M.S.等,Nature314(1985)268-270。特别优选的CDR对应于上文针对嵌合抗体所记载的识别抗原的那些代表序列。本发明涵盖的其它形式的“人源化抗体”是那些其中恒定区已经额外经过修饰或从初始抗体的恒定区改变以生成依照本发明的特性(尤其是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合)的抗体。
如本文中使用的，术语“人抗体”意图包括具有自人种系免疫球蛋白序列衍生的可变区和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的(van Dijk,M.A.和van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。还可以在转基因动物(例如小鼠)中生成人抗体，所述转基因动物在缺乏内源性免疫球蛋白生成的情况下在免疫后能够生成人抗体的完整全集或选集。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到这类种系突变体小鼠中会导致抗原攻击后人抗体的生成(参见例如Jakobovits,A.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)2551-2555;Jakobovits,A.等,Nature362(1993)255-258;Bruggemann,M.等,Year Immunol.7(1993)33-40)。还可以在噬菌体展示库中生成人抗体(Hoogenboom,H.R.和Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388;Marks,J.D.等,J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。Cole等和Boerner等的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole等,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985);Boerner,P.等,J.Immunol.147(1991)86-95)。如已对依照本发明的嵌合的和人源化的抗体提述的，如本文中使用的术语“人抗体”也包含其中恒定区经修饰以生成依照本发明的特性(尤其是关于C1q结合和/或FcR结合)的这类抗体，例如通过“类转换”即改变或突变Fc部分(例如从IgG1到IgG4和/或IgG1/IgG4突变)进行。
如本文中使用的，术语“重组人抗体”意图包括通过重组手段制备、表达、创建或分离的所有人抗体，如从宿主细胞如NS0或CHO细胞或从对于人免疫球蛋白基因为转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体，或者使用转染到宿主细胞中的重组表达载体所表达的抗体。这类重组人抗体具有重排形式的可变区和恒定区。依照本发明的重组人抗体已进行体内体细胞超突变。如此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，即尽管自人种系VH和VL序列衍生并与之相关，但是其可以不天然存在于体内人抗体种系全集中。
如本文中使用的，“可变域”(轻链可变域(VL)、重链可变区(VH))指直接牵涉抗体对抗原结合的一对轻链和重链中的每一个。可变人轻链和重链的域具有相同的一般结构，而且每个域包含4个框架(FR)区，其序列广泛保守，由3个“高变区”(或互补决定区，CDR)连接。框架区采用β片层构象，而且CDR可以形成连接β片层结构的环。每条链中的CDR通过框架区保持在其三维结构中，并且与来自另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在依照本发明的抗体的结合特异性/亲和力中起着尤其重要的作用，并因此提供本发明的另一个目的。
术语“高变区”或“抗体的抗原结合部分”在本文中使用时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区是与如本文中所限定的高变区残基不同的那些可变域区。因此，抗体的轻链和重链包含自N至C端的域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、和FR4。每个链上的CDR由这类框架氨基酸分开。特别地，重链的CDR3是对抗原结合贡献最大的区。CDR和FR区依照Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的标准定义来确定。
如本文中所使用的，术语“结合”或“特异性结合”指用纯化的野生型抗原在体外测定法中，优选地在等离振子共振测定法(BIAcore,GE-HealthcareUppsala,Sweden)中抗原结合蛋白对抗原表位的结合。结合亲和力通过术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的结合速率常数)、kD(解离常数)、和KD(kD/ka)限定。结合或特异性结合意指10-8mol/l或更小(例如10-8M至10-13mol/l)，优选地10-9M至10-13mol/l的结合亲和力(KD)。如此，依照本发明的抗原结合蛋白以10-8mol/l或更小(例如10-8M至10-13mol/l)，优选地10-9M至10-13mol/l的结合亲和力(KD)特异性结合其特异性针对的每个抗原。
可以通过BIAcore测定法(GE-Healthcare Uppsala,Sweden)调查抗原结合蛋白对FcγRIII的结合。结合亲和力通过术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的结合速率常数)、kD(解离常数)和KD(kD/ka)限定。
术语“表位”包括任何能够特异性结合抗原结合蛋白的多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括化学活性的表面分子分组如氨基酸、糖侧链、磷酰基、或磺酰基，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征和或特定的电荷特征。表位是由抗原结合蛋白结合的抗原区域。
在某些实施方案中，当抗体在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时，其说成抗体特异性结合抗原。
如本申请内使用的，术语“恒定区”指抗体中除可变区外的域的总和。恒定区不直接牵涉对抗原的结合，但是展现出各种效应器功能。根据其重链恒定区的氨基酸序列，将抗体分成以下类(也称作同种型)：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且可以将这些中的几种进一步分成亚类(也称作同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，IgA1和IgA2。对应于抗体不同类的重链恒定区分别称作α、δ、ε、γ和μ。可以在所有5种抗体类中找到的轻链恒定区(CL)称为κ(卡帕)或λ(拉姆达)。
如本申请内使用的，术语“自人起源衍生的恒定区”指同种型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的人抗体的恒定重链区，和/或恒定轻链κ或λ区。这类恒定区是现有技术中公知的，并且例如由Kabat,E.A.描述(参见例如Johnson,G.和Wu,T.T.,Nucleic Acids Res.28(2000)214-218;Kabat,E.A.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA72(1975)2785-2788)。
术语“补体依赖性细胞毒性(CDC)”指由补体因子C1q对大多数IgG抗体亚类的Fc部分的结合启动的过程。C1q对抗体的结合由所谓的结合位点处限定的蛋白质-蛋白质相互作用引起。这类Fc部分结合位点是现有技术中公知的(见上文)。这类Fc部分结合位点例如特征在于氨基酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(依照Kabat的EU索引编号)。亚类IgG1、IgG2和IgG3的抗体通常显示补体激活，包括C1q和C3结合，而IgG4不激活补体系统且不结合C1q和/或C3。
尽管IgG4亚类的抗体显示降低的Fc受体(FcγRIIIa)结合，但其他IgG亚类的抗体显示强烈结合。然而，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(失去Fc碳水化合物)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435是这样的残基，其在改变时也提供降低的Fc受体结合(Shields,R.L.等,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604;Lund,J.等,FASEB J.9(1995)115-119;Morgan,A.等,Immunology86(1995)319-324;EP0307434)。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体与IgG1抗体相比具有降低的FcR结合，且全长亲本抗体在关于IgG4亚类的或IgG1或IgG2亚类的FcR结合方面具有S228、L234、L235和/或D265中的突变，和/或含有PVA236突变。在一个实施方案中，全长亲本抗体中的突变是S228P、L234A、L235A、L235E和/或PVA236。在另一个实施方案中，全长亲本抗体中的突变在IgG4中是S228P和L235E，而在IgG1中是L234A和L235A。
抗体的恒定区直接牵涉ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和CDC(补体依赖性细胞毒性)。补体激活(CDC)由补体因子C1q对大多数IgG抗体亚类的恒定区的结合启动。C1q对抗体的结合由所谓的结合位点处限定的蛋白质-蛋白质相互作用引起。这类恒定区结合位点是现有技术中公知的，并且例如由Lukas,T.J.等,J.Immunol.127(1981)2555-2560;Bunkhouse,R.和Cobra,J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917;Burton,D.R.等,Nature288(1980)338-344;Thomason,J.E.等,Mol.Immunol.37(2000)995-1004;Idiocies,E.E.等,J.Immunol.164(2000)4178-4184;Hearer,M.等,J.Virol.75(2001)12161-12168;Morgan,A.等,Immunology86(1995)319-324;EP0307434描述。这类恒定区结合位点例如特征在于氨基酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(依照Kabat的EU索引编号，其记载于Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。
术语“抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)”指在存在效应细胞的情况中依照本发明的抗体对人靶细胞的溶解。优选地，通过在存在效应细胞的情况中用依照本发明的抗体处理抗原表达细胞的制备物来测量ADCC，所述效应细胞如新鲜分离的PBMC或从血沉棕黄层(buffy coat)纯化的效应细胞，如单核细胞或天然杀伤(NK)细胞或永久生长的NK细胞系。
令人惊讶地，已发现依照本发明的抗原结合蛋白相比于其亲本全长抗体显示增强的ADCC特性，尤其是在具有较高抗体浓度的区域中。在没有Fc部分的进一步修饰如糖工程化改造的情况中实现这些改善的ADCC效果。
如此，在一个实施方案中，依照本发明的抗原结合蛋白相比于其亲本全长抗体具有增强的ADCC(如实施例4中描述的那样测量的)。
在哺乳动物中，仅有两类轻链型，其称作拉姆达(λ)和卡帕(κ)。轻链具有两个连续域：一个恒定域CL和一个可变域VL。轻链的大概长度为211至217个氨基酸。优选地，轻链是卡帕(κ)轻链，而优选地，恒定域CL自卡帕(κ)轻链(恒定域Cκ)衍生。
单克隆抗体的细胞介导的效应器功能可以例如通过工程化改造其寡糖组分进一步增强，如记载于Umana,P.等,Nature Biotechnol.17(1999)176-180,和US6,602,684的。IgG1型抗体(最常使用的治疗性抗体)是在每个CH2域中的Asn297处具有保守N连接的糖基化位点的糖蛋白。附接于Asn297的两个复杂的双触角(biantennary)寡糖埋在CH2域之间，从而形成与多肽主链的广泛接触，并且它们的存在对于抗体介导效应器功能如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)是必要的(Lifely,M.,R.等,Glycobiology5(1995)813-822;Jefferis,R.等,Immunol.Rev.163(1998)59-76;Wright,A.和Morrison,S.,L.,TrendsBiotechnol.15(1997)26-32)。Umana,P.等,Nature Biotechnol.17(1999)176-180和WO99/54342显示，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中过表达β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII)(一种催化两分型寡糖形成的糖基转移酶)显著提高抗体的体外ADCC活性。Asn297碳水化合物的组成变化或其消除还影响对FcγR和C1q的结合(Umana,P.等,Nature Biotechnol.17(1999)176-180;Davies,J.等,Biotechnol.Bioeng.74(2001)288-294;Mimura,Y.等,J.Biol.Chem.276(2001)45539-45547;Radaev,S.等,J.Biol.Chem.276(2001)16478-16483;Shields,R.,L.等,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604;Shields,R.,L.等,J.Biol.Chem.277(2002)26733-26740;Simmons,L.,C.等,J.Immunol.Methods263(2002)133-147)。
在本发明的一个方面，依照本发明的抗原结合蛋白的特征在于：a)和b)的Fc部分的CH2域是IgG1同种型的，且抗原结合蛋白是无岩藻糖基化的，岩藻糖量占Asn297处的寡糖(糖)总量的80%或更少。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白是无岩藻糖基化的，岩藻糖量占Asn297处的寡糖(糖)总量的65%至5%。
术语“无岩藻糖基化抗原结合蛋白”指在Fc区中在Asn297处具有改变的糖基化样式且具有降低的岩藻糖残基水平的IgG1或IgG3同种型的(优选地IgG1同种型的)抗原结合蛋白。在Asn297处发生人IgG1或IgG3的糖基化，作为以多至2个Gal残基为末端的核心岩藻糖化双触角复合寡糖糖基化。根据末端Gal残基的量，这些结构称为G0、G1(α1,6或α1,3)或G2聚糖残基(Raju,T.S.,BioProcess Int.1(2003)44-53)。抗体Fc部分的CHO型糖基化例如由Routier,F.H.,Glycoconjugate J.14(1997)201-207描述。在非糖修饰的CHO宿主细胞中重组表达的抗体在Asn297处通常以至少85%的量进行岩藻糖基化。应当理解，如本文中所使用的，术语“抗原结合蛋白”包括在其糖基化样式中没有岩藻糖的抗原结合蛋白。通常已知的是，抗体中典型的糖基化残基位置是依照EU编号系统的第297位的天冬酰胺(“Asn297”)。
如此，依照本发明的无岩藻糖基化抗原结合蛋白意指其中的岩藻糖量占Asn297处的寡糖(糖)总量的80%或更少(例如80%至1%)的IgG1或IgG3同种型的(优选地IgG1同种型的)抗原结合蛋白(这意味着在Fc区中Asn297处的寡糖的至少20%或更多是无岩藻糖基化的)。在一个实施方案中，岩藻糖量占Fc区中Asn297处的寡糖的65%或更少(例如65%至1%)，在一个实施方案中，从65%至5%，在一个实施方案中，从40%至20%。依照本发明，“岩藻糖量”意指通过MALDI-TOF质谱术测量的，并以平均值计算的，相对于附着于Asn297的所有寡糖(糖)(例如复合的、杂合的和高甘露糖结构)的总和，Asn297处寡糖(糖)链内所述寡糖(岩藻糖)的量(关于测定岩藻糖量的详细规程，参见例如WO2008/077546)。此外，在一个实施方案中，Fc区的寡糖是两分的。可以在工程化改造为表达至少一种核酸的糖修饰的宿主细胞中表达依照本发明的无岩藻糖基化抗原结合蛋白，所述核酸编码具有GnTIII活性的多肽，其量足以部分岩藻糖基化Fc区中的寡糖。在一个实施方案中，具有GnTIII活性的多肽是融合多肽。或者，可以依照US6,946,292降低或消除宿主细胞的α1,6-岩藻糖基转移酶活性以生成经糖修饰的宿主细胞。可以例如通过发酵条件(例如发酵时间)或者通过组合至少两种具有不同岩藻糖基化量的抗原结合蛋白来预先确定抗原结合蛋白岩藻糖基化的量。此类生成无岩藻糖基化抗原结合蛋白的方法记载于WO2005/044859;WO2004/065540;WO2007/031875;Umana,P.等,Nature Biotechnol.17(1999)176-180;WO99/154342;WO2005/018572;WO2006/116260;WO2006/114700;WO2005/011735;WO2005/027966;WO97/028267;US2006/0134709;US2005/0054048;US2005/0152894;WO2003/035835;WO2000/061739。这些依照本发明的经糖工程化改造的抗原结合蛋白具有升高的ADCC(相比于亲本抗原结合蛋白)。其它产生依照本发明的无岩藻糖基化抗原结合蛋白的糖工程化方法记载于例如Niwa,R.等,J.Immunol.Methods306(2005)151-160;Shinkawa,T.等,J.Biol.Chem,278(2003)3466-3473;WO03/055993;US2005/0249722。
如此，本发明的一个方面是IgG1或IgG3同种型的(优选地IgG1同种型的)，具有占Asn297处的寡糖(糖)总量的60%或更少(例如60%至1%)的岩藻糖量的依照本发明的无岩藻糖基化抗原结合蛋白。
如此，本发明的一个方面是IgG1或IgG3同种型的(优选地IgG1同种型的)，具有占Asn297处的寡糖(糖)总量的60%或更少(例如60%至1%)的岩藻糖量的依照本发明的无岩藻糖基化抗原结合蛋白，其用于治疗癌症。
本发明的另一方面是IgG1或IgG3同种型的(优选地IgG1同种型的)，具有占Asn297处的寡糖(糖)总量的60%或更少的岩藻糖量的依照本发明的无岩藻糖基化抗原结合蛋白用于制造用于治疗癌症的药物的用途。
在一个实施方案中，岩藻糖的量介于Asn297处寡糖(糖)总量的60%和20%之间。在一个实施方案中，岩藻糖的量介于Asn297处寡糖(糖)总量的60%和40%之间。在一个实施方案中，岩藻糖的量介于0%和Asn297处寡糖(糖)总量之间。
“EU编号系统”或“EU索引”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中报告的EU索引，通过提及而将其明确并入本文)。
术语“糖链显示附接于CHO细胞中重组表达抗体的Asn297的N连接聚糖的特征”指依照本发明的全长亲本抗体的Asn297处的糖链与在未修饰的CHO细胞中表达的相同抗体的糖链具有除岩藻糖残基外的相同结构和糖残基序列，例如如那些在WO2006/103100中报告的。
如本申请内使用的，术语“NGNA”指糖残基N-羟乙酰神经氨酸。
在Asn297处发生人IgG1或IgG3的糖基化，作为以多至两个Gal残基为末端的核心岩藻糖化双触角复合寡糖糖基化。IgG1或IgG3亚类的人恒定重链区由Kabat,E.,A.等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)，而且由Brueggemann,M.等,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361;Love,T.,W.等,Methods Enzymol.178(1989)515-527详细报告。根据末端Gal残基的量，这些结构称为G0、G1(α-1,6-或α-1,3-)或G2多糖残基(Raju,T.,S.,Bioprocess Int.1(2003)44-53)。抗体Fc部分的CHO型糖基化例如由Routier,F.H.,Glycoconjugate J.14(1997)201-207记载。在非糖修饰的CHO宿主细胞中重组表达的抗体通常在Asn297处以至少85%的量岩藻糖基化。全长亲本抗体的经修饰寡糖可以是杂合或复合的。优选地，两分型、还原性/非岩藻糖基化的寡糖是杂合的。在另一个实施方案中，两分型、还原性/非岩藻糖基化的寡糖是复合的。
依照本发明，“岩藻糖的量”意指通过MALDI-TOF质谱术测量的，并以平均值计算的，相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如复合的、杂合的和高甘露糖结构)的总和，Asn297处糖链内所述糖的量。岩藻糖的相对量是含有岩藻糖的结构相对于通过MALDI-TOF在经N-糖苷酶F处理的样品中鉴定的所有糖结构(例如分别地复合的、杂合的以及寡甘露糖和高甘露糖结构)的百分比。
通过重组手段生成依照本发明的抗体。如此，本发明的一个方面是编码依照本发明抗体的核酸，而一个进一步的方面是包含所述编码依照本发明抗体的核酸的细胞。用于重组生产的方法是现有技术中广泛已知的，并且包括在原核和真核细胞中的蛋白质表达，随后分离该抗体并通常纯化至药学可接受纯度。对于如前述的那样在宿主细胞中表达抗体，通过标准方法将编码相应的经修饰轻链和重链的核酸插入到表达载体中。表达在合适的原核或真核宿主细胞如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER.C6细胞、酵母或大肠杆菌细胞中实施，且从细胞(上清液或裂解后细胞)回收所述抗体。用于抗体重组生产的一般方法是现有技术中公知的，并且记载于例如Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif.17(1999)183-202;Geisse,S.等,ProteinExpr.Purif.8(1996)271-282;Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-161;Werner,R.G.,Drug Res.48(1998)870-880的综述论文中。
通过常规免疫球蛋白纯化规程如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析将依照本发明的抗原结合蛋白与培养基合适分开。使用常规规程将编码单克隆抗体的DNA和RNA容易地分离并测序。杂交瘤细胞可以充当这类DNA和RNA的来源。一旦分离，就可以将DNA插入到表达载体中，然后将该表达载体转染到原本不生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞如HEK293细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞中以获得宿主细胞中重组单克隆抗体的合成。
制备抗原结合蛋白的氨基酸序列变体(或突变体)，其通过将合适的核苷酸变化引入抗体DNA中，或通过核苷酸合成进行。然而，这类修饰仅可以在非常有限的范围内实施，例如如上文所描述的。例如，所述修饰不改变上文提述的抗体特征如IgG同种型和抗原结合，但可以改善重组生产的产率、蛋白质稳定性或促进纯化。
如本申请内使用的，术语“宿主细胞”指可以工程化改造为生成依照本发明的抗体的任何种类的细胞系统。在一个实施方案中，将HEK293细胞和CHO细胞用作宿主细胞。如本文中使用的，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可交换使用，且所有这类名称均包括后代。如此，词语“转化体”和“经转化的细胞”包括原代主题细胞和自其衍生的培养物(不考虑转移次数)。还应理解，由于有意或无意的突变，所有后代在DNA内容物上可能不是完全相同的。包括具有初始转化细胞中筛选的相同功能或生物学活性的变体后代。
在NS0细胞中的表达由例如Barnes,L.M.等,Cytotechnology32(2000)109-123;Barnes,L.M.等,Biotech.Bioeng.73(2001)261-270描述。瞬时表达由例如Durocher,Y.等,Nucl.Acids.Res.30(2002)E9描述。可变域的克隆由Orlandi,R.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)3833-3837;Carter,P.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)4285-4289;Norderhaug,L.等,J.Immunol.Methods204(1997)77-87描述。优选的瞬时表达系统(HEK293)由Schlaeger,E.-J.和Christensen,K.,于Cytotechnology30(1999)71-83及由Schlaeger,E.-J.,于J.Immunol.Methods194(1996)191-199描述。
适于原核生物的控制序列例如包含启动子、任选地操纵基因序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子和多聚腺苷酸化信号。
核酸在其与另一核酸序列置于功能性关系中时是“可操作连接的”。例如，若前序列(presequence)或分泌前导(secretory leader)的DNA以参与多肽分泌的前蛋白质(preprotein)表达，则它与该多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响序列的转录，则它与编码序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点定位为使得促进翻译，则它与编码序列可操作连接。一般而言，“可操作连接的”意味着相连的DNA序列是连续的，而且在分泌前导的情况中意味着连续的且为符合阅读框方式。然而，增强子不必是连续的。连接可以通过在方便的限制性位点处的连接来实现。若不存在此类位点，则依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
通过标准技术实施抗原结合蛋白的纯化以消除细胞组分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白质(例如图1B的副产物)，所述标准技术包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域中公知的其它技术(参见Ausubel,F.等,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishingand Wiley Interscience,New York(1987))。用于蛋白质纯化的不同方法是完善建立的并广泛使用，如用微生物蛋白质进行的亲和层析(例如蛋白A或蛋白G亲和层析)、离子交换层析(例如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨乙基树脂)和混合模式交换)、亲硫吸附(例如用β-巯基乙醇和其它SH配体进行)、疏水性相互作用或芳香族吸附层析(例如用苯基-Sepharose、亲杂氮芳基(aza-arenophilic)树脂或间-氨基苯基硼酸)、金属螯合物亲和层析(例如用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)、大小排阻层析和电泳方法(如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。纯化的一个例子记载于实施例1和相应图中。
本发明的一个方面是包含依照本发明的抗原结合蛋白的药物组合物。本发明的另一个方面是依照本发明的抗原结合蛋白用于制造药物组合物的用途。本发明的又一个方面是用于制造包含依照本发明的抗原结合蛋白的药物组合物的方法。在另一个方面，本发明提供含有与药用载体配制在一起的依照本发明的抗原结合蛋白的组合物，例如药物组合物。
本发明的一个实施方案是依照本发明的抗原结合蛋白，其用于治疗癌症。
本发明的另一个方面是所述药物组合物，其用于治疗癌症。
本发明的一个实施方案是依照本发明的抗原结合蛋白，其在癌症治疗中使用。
本发明的另一个方面是依照本发明的抗原结合蛋白在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
本发明的另一个方面是治疗患有癌症的患者的方法，其通过对需要此类治疗的患者施用依照本发明的抗原结合蛋白进行。
如本文中所使用的，“药用载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂层材料、抗细菌和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适于静脉内、肌内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注进行)。
可以通过本领域中已知的多种方法来施用本发明的药物组合物。如熟练技术人员会领会的，施用路径和/或模式会随着期望结果而变化。为了通过某些施用路径施用本发明的化合物，用某材料包被该化合物、或将该化合物与某材料共施用以防止其失活可能是必要的。例如，可以在合适的载体(例如脂质体或稀释剂)中将化合物对受试者施用。药学可接受稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。药用载体包括无菌水性溶液或分散体和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。将这类介质和药剂用于药学活性物质是本领域中已知的。
如本文中使用的，短语“胃肠外施用”意指与肠和表面施用不同的施用模式，通常通过注射进行，并且包括而不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
如本文中所使用的，术语癌症指增殖性疾病，如淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、细支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、何杰金(Hodgkin)氏病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆癌(biliary cancer)、中枢神经系统(CNS)赘生物、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme)、星形细胞瘤、神经鞘瘤(schwanoma)、室鼓膜瘤(ependymona)、髓母细胞瘤、脑脊膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤因肉瘤(Ewings sarcoma)，包括任何上述癌症的顽固性型式、或一种或多种上述癌症的组合。
这些组合物还可以含有佐剂如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可以通过灭菌规程(见上)和通过纳入各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯(paraben)、三氯叔丁醇、酚、山梨酸等)两者来确保防止微生物的存在。还可能期望将等张剂如糖、氯化钠等纳入到组合物中。另外，可以通过纳入延迟吸收的药剂如硬脂酸铝和明胶引起可注射药学形式的延长吸收。
不管选定的施用路径，通过本领域技术人员已知的常规方法将可以以合适的水合形式使用的本发明的化合物和/或本发明的药物组合物配制成药学可接受剂量形式。
本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以是变化的，从而获得对于特定患者、组成和施用模式而言有效实现期望的治疗响应而对患者无毒性的活性成分量。选定的剂量水平会取决于多种药动学因素，包括采用的本发明特定组合物的活性、施用路径、施用时间、采用的特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与采用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、重量、状况、一般健康和先前医学史、以及医学领域中公知的类似因素。
所述组合物必须是无菌的，并且流动性达到通过注射器可投递的程度。在水外，载体优选为等张缓冲盐水溶液。
可以例如通过使用涂层材料如卵磷脂、通过维持需要的颗粒大小(在分散的情况中)和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等张剂，例如糖、多元醇如甘露醇或山梨糖醇、和氯化钠。
如本文中使用的，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，且所有这类名称均包括后代。如此，词语“转化体”和“经转化的细胞”包括原代主题细胞和自其衍生的培养物(不考虑转移次数)。还应理解，由于有意或无意的突变，所有后代在DNA内容物上可以不完全相同。包括具有初始转化细胞中筛选的相同功能或生物学活性的变体后代。在意图用不同名称的情况下，它从上下文看会是清楚的。
如本文中使用的，术语“转化”指将载体/核酸转移到宿主细胞中的过程。如果将没有难以应付的细胞壁屏障的细胞用作宿主细胞，那么例如通过磷酸钙沉淀方法来实施转染，如由Graham和Van der Eh,Virology52(1978)546描述的。然而，也可以使用用于将DNA导入细胞中的其它方法，如通过核注射或通过原生质体融合进行。如果使用原核细胞或含有实质性细胞壁构造的细胞，那么例如一种转染方法是使用氯化钙的钙处理，如由Cohen,F.N等,PNAS69(1972)7110描述的。
如本文中使用的，“表达”指核酸转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA(也称为转录物)随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽统称为基因产物。如果多核苷酸自基因组DNA衍生，那么真核细胞中的表达可以包括mRNA的剪接。
“载体”指核酸分子(具体为自主复制型)，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞之中和/或之间。该术语包括主要为了将DNA或RNA插入细胞中(例如染色体整合)而发挥功能的载体、主要为了复制DNA或RNA而发挥功能的载体复制、和为了DNA或RNA的转录和/或翻译而发挥功能的表达载体。还包括提供超过一种所述功能的载体。
“表达载体”指在导入合适的宿主细胞中时可以转录并翻译成多肽的多核苷酸。“表达系统”通常指包含能发挥产生期望表达产物的功能的表达载体的合适的宿主细胞。
提供下列实施例、序列表和图以帮助对本发明的理解，本发明的真实范围在所附权利要求书中列出。应当理解，可以在不背离本发明精神的前提下对所列规程做出修改。
氨基酸序列的描述
SEQ ID NO:1c-Met5D5MoAb二聚体(“CH3-wt”)-经修饰重链a)VL-CH1-CH2-CH3
SEQ ID NO:2c-Met5D5MoAb二聚体(“CH3-wt”)-经修饰重链b)VH-CL-CH2-CH3
SEQ ID NO:3IGF1R AK18MoAb二聚体(“CH3-wt”)-经修饰重链a)VL-CH1-CH2-CH3
SEQ ID NO:4IGF1R AK18MoAb二聚体(“CH3-wt”)-经修饰重链b)VH-CL-CH2-CH3
SEQ ID NO:5Her3205MoAb二聚体(“CH3-wt”)-经修饰重链a)VL-CH1-CH2-CH3
SEQ ID NO:6Her3205MoAb二聚体(“CH3-wt”)-经修饰重链b)VH-CL-CH2-CH3
SEQ ID NO:7IGF1R AK18MoAb二聚体-经修饰重链a)VL-CH1-CH2-CH3，具有IgA-CH3
SEQ ID NO:8IGF1R AK18MoAb二聚体-经修饰重链b)VH-CL-CH2-CH3，具有IgA-CH3域
实验规程
A.材料和方法：
重组DNA技术
使用标准方法来操作DNA，如记载于Sambrook,J.等,Molecular cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)的。依照制造商的用法说明书使用分子生物学试剂。
DNA和蛋白质序列分析以及序列数据管理
关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息参见：Kabat,E.A.等,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIHPublication No91-3242。依照EU编号对抗体链的氨基酸编号(Edelman,G.M.等,PNAS63(1969)78-85;Kabat,E.A.等(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,NIH Publication No91-3242)。使用GCG(Genetics Computer Group,Madison,Wisconsin)的软件包版本10.2和Infomax的Vector NTI Advance套件版本8.0来进行序列创建、匹配、分析、注释和例示。
DNA测序
通过在SequiServe(Vaterstetten,Germany)和Geneart AG(Regensburg,Germany)实施的双链测序来测定DNA序列。
基因合成
由Geneart AG(Regensburg,Germany)通过自动化基因合成从合成的寡核苷酸和PCR产物制备期望的基因区段。将侧翼有单一限制性内切核酸酶切割位点的基因区段克隆到pGA18(ampR)质粒中。从经转化的细菌纯化质粒DNA，并通过UV分光术来测定浓度。通过DNA测序确认亚克隆的基因片段的DNA序列。通过基因合成将编码两条抗体链(VH-CL-CH2-CH3和VL-CH1-CH2-CH3)的DNA序列作为与侧翼5’HpaI和3’NaeI限制性位点一起的完整片段制备。通过基因合成制备基因区段，其编码CH3域中优先导致MoAb二聚体产物的点突变以及用IgA-CH3域(例如SEQ.ID.NO:7)替换编码IgG1部分的基因区段。这些区段侧翼为独特的限制性位点，其允许替换相应的野生型IgG1序列。所有构建体均设计为具有编码前导肽的5’端DNA序列，该前导肽在真核细胞中使蛋白质靶向分泌。
表达质粒的构建
将Roche表达载体用于构建所有抗体链。载体由以下元件构成：
-埃巴病毒(EBV)的复制起点oriP，
-来自载体pUC18的复制起点，其允许此质粒在大肠杆菌中复制，
-赋予在大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因，
-来自人巨细胞病毒(HCMV)的立即早期增强子和启动子，
-人1-免疫球蛋白多聚腺苷酸化(“多聚A”)信号序列，和
-独特的HpaI、BclI和NaeI限制性位点。
通过基因合成制备次序为VH-CL-CH2-CH3和VL-CH1-CH2-CH3的免疫球蛋白基因以及在编码抗体链C端(CH3)的3’区中修饰的构建体，并克隆到pGA18(ampR)质粒中，如描述的。将携带合成的DNA区段的pG18(ampR)质粒和Roche表达载体用HpaI和NaeI、或用BclI和NaeI限制酶(Roche MolecularBiochemicals)消化，并进行琼脂糖凝胶电泳。然后，将纯化的DNA区段连接至分离的Roche表达载体HpaI/NaeI或BclI/NaeI片段，生成最终表达载体。将最终表达载体转化到大肠杆菌细胞中，分离表达质粒DNA(Miniprep)并进行限制酶分析和DNA测序。在150ml LB-Amp培养基中培养正确的克隆，再次分离质粒DNA(Maxiprep)并通过DNA测序确认序列完整性。
HEK293细胞中免疫球蛋白变体的瞬时表达
使用FreeStyleTM293表达系统依照制造商的用法说明书(Invitrogen,USA)通过瞬时转染人胚胎肾293-F细胞来表达重组免疫球蛋白变体。简言之，在FreeStyleTM293表达培养基中以37℃/8%CO2培养悬浮FreeStyleTM293-F细胞。在转染当天，将细胞以1-2x106个活细胞/ml的密度在新鲜培养基中接种。在
Figure BDA0000403187770000261
I培养基(Invitrogen,USA)中制备DNA-293fectinTM复合物，对于250ml终转染体积，其以1:1摩尔比使用325μl293fectinTM(Invitrogen,Germany)和250μg每种质粒DNA进行。在转染后7天，通过以14000g离心30分钟收获含抗体的细胞培养上清液，并过滤通过无菌滤器(0.22μm)。将上清液于-20℃贮存，直至纯化。
或者，通过在HEK293-EBNA细胞中瞬时转染来生成抗体。通过在贴壁生长的HEK293-EBNA细胞(表达埃巴病毒核抗原的人胚胎肾细胞系293；美国典型培养物保藏中心保藏号ATCC#CRL-10852,Lot.959218)中瞬时共转染相应的表达质粒来表达抗体，所述HEK293-EBNA细胞在补充有10%极低IgG FCS(胎牛血清，Gibco)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)和250μg/ml遗传霉素(Gibco)的DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's modifiedEagle's medium)，Gibco)中培养。对于转染，以FuGENETM试剂(μl)对DNA(μg)为4:1(范围为3:1至6:1)的比率使用FuGENETM6转染试剂(Roche MolecularBiochemicals)。使用等摩尔比的质粒从相应质粒表达蛋白质。在第3天，用4mM L-谷氨酰胺、葡萄糖[Sigma]和NAA[Gibco]喂养细胞。在转染后第5天至11天，通过离心收获含有免疫球蛋白变体的细胞培养物上清液，并于-80℃贮存。关于在例如HEK293细胞中人免疫球蛋白的重组表达的一般信息参见：Meissner,P.等,Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203。
抗体的纯化
通过亲和层析从细胞培养物上清液纯化抗体，其使用蛋白A-SepharoseTM(GE Healthcare,Sweden)和Superdex200大小排阻层析进行。简言之，将无菌过滤的细胞培养物上清液应用于用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4,1mMKH2PO4,137mM NaCl和2.7mM KCl,pH7.4)平衡的HiTrap蛋白A HP(5ml)柱。用平衡缓冲液洗掉未结合的蛋白质。将抗体和抗体变体用0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH2.8洗脱，并将含蛋白质的级分用0.1ml1M Tris，pH8.5中和。然后，将洗脱的蛋白质级分合并，用Amicon Ultra离心滤器装置(MWCO:30K,Millipore)浓缩至体积3ml，并加载到用20mM组氨酸、140mM NaCl，pH6.0平衡的Superdex200HiLoad120ml16/60或26/60凝胶过滤柱(GE Healthcare,Sweden)上。合并具有小于5%高分子量聚集物的含纯化抗体的级分，并在-80℃以1.0mg/ml等分试样贮存。
对纯化蛋白质的分析
通过测量280nm处的光密度(OD)来测定纯化蛋白质样品的蛋白质浓度，其使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数进行。通过在存在和缺乏还原剂(5mM1,4-二硫苏糖醇)情况下的SDS-PAGE并用考马斯亮蓝染色分析抗体的纯度和分子量。依照制造商的用法说明书(4-12%Tris-甘氨酸凝胶)使用预制凝胶系统(Invitrogen,USA)。通过高效SEC分析抗体样品的聚集程度，其于25℃在200mM KH2PO4、250mM KCl，pH7.0运行缓冲液中使用Superdex200分析性大小排阻柱(GE Healthcare,Sweden)进行。将25μg蛋白质以0.5ml/分钟的流速注射到柱上，并在50分钟里等度洗脱。对于稳定性分析，将浓度1mg/ml的纯化蛋白质于4℃和40℃温育7天，然后通过高效SEC(例如HP SEC分析(纯化的蛋白质))评估。在通过用肽-N-糖苷酶F(RocheMolecular Biochemicals)酶促处理除去N-聚糖后，通过NanoElectrosprayQ-TOF质谱术验证还原的免疫球蛋白变体链的氨基酸主链的完整性。
质谱术
测定抗体的总去糖基化质量，并经由电喷雾电离质谱法(ESI-MS)确认。简言之，将100μg纯化的抗体用50mU N-糖苷酶F(PNGaseF,ProZyme)在100mM KH2PO4/K2HPO4，pH7中于37℃以高达2mg/ml的蛋白质浓度去糖基化达12-24小时，随后经由在Sephadex G25柱(GE Healthcare)上的HPLC脱盐。在去糖基化和还原后，通过ESI-MS测定相应的抗体链的质量。简言之，将115μl中50μg抗体与60μl1M TCEP和50μl8M盐酸胍一起温育，随后脱盐。经由ESI-MS在装备有NanoMate源的Q-Star Elite MS系统上测定总质量和还原抗体链的质量。记录的质量范围依赖于样品分子量。一般而言，对于经还原的抗体，质量范围设为600-2000m/z，而对于非还原的抗体，设为1000-3600m/z。
SEC-MALLS
使用SEC-MALLS(具有多角度激光散射的大小排阻层析)来测定溶液中蛋白质的近似分子量。依照光散射理论，MALLS允许对大分子的分子量估测而不考虑其分子形状或其它假定。SEC-MALLS基于蛋白质经由SEC层析，接着是浓度和散射光灵敏性检测器依照其大小(流体力学半径)的分离。只要SEC分离是充分的，SEC-MALLS一般产生具有允许清楚分辨单体、二聚体、三聚体等的准确度的分子量估测。
在此工作中，使用下列仪器：Dionex Ultimate3000HPLC；柱：Superose610/300(GE Healthcare)；洗脱液：1x PBS；流速：0.25mL/分；检测器：OptiLabREX(Wyatt Inc.,Dernbach),MiniDawn Treos(Wyatt Inc.,Dernbach)。用Astra软件，版本5.3.2.13计算分子量。在柱上加载介于50和150μg之间的蛋白质量，并将BSA(Sigma Aldrich)用作参照蛋白。
动态光散射(DLS)时程
将20mM His/HisCl、140mM NaCl，pH6.0中浓度约1mg/mL的样品(30μL)经由384孔滤板(0.45μm孔径)过滤到384孔光学板(Corning)中，并用20μL石蜡油(Sigma)覆盖。在5天时段期间用DynaPro DLS读板仪(Wyatt)于40℃的恒定温度重复收集动态光散射数据。用Dynamics V6.10(Wyatt)处理数据。
表面等离振子共振
通过表面等离振子共振(SPR)技术使用Biacore仪(Biacore,GE-Healthcare,Uppsala)分析抗IGF-lR抗原结合蛋白和抗体的结合特性。此系统对于研究分子相互作用是完善建立的。它允许连续实时监测配体/分析物结合，如此测定各种测定法背景中的结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和平衡常数(KD)。SPR技术基于接近经金包被的生物传感器芯片表面的折射率的测量。折射率的变化指示表面上由固定化的配体与溶液中注射的分析物相互作用引起的质量变化。如果分子结合表面上的固定化配体，则质量增加，在解离的情况下质量降低。对于捕捉，使用胺偶联化学将抗人IgG抗体在CM5生物传感器芯片的表面上固定化。将流动池以流速5μl/分钟用0.1M N-羟基琥珀酰亚胺和0.1M3-(N,N-二甲基氨基)丙基-N-乙基碳二亚胺的1:1混合物活化。将抗人IgG抗体以10μg/ml在乙酸钠pH5.0中注射。以相同的方式处理参照对照流动池，但仅用媒介物缓冲液代替捕捉抗体进行。将表面用1M乙醇胺/HCl pH8.5的注射封闭。将IGF-1R抗体在HBS-P中稀释并注射。于25℃(标准温度)实施所有相互作用。在每次结合循环后，将3M氯化镁的再生溶液以5μl/分钟流动注射60秒以除去任何非共价结合的蛋白质。以每秒1个信号的速率检测信号。以递增浓度注射样品。图17绘出应用的测定法形式。选择低加载密度及捕捉抗体密度和IGF-1R抗体以加强结合。
对于亲和力测量，将人FcgIIIa固定化于CM-5传感器芯片，其通过将有His标签的受体捕获到抗His抗体(Penta-His,Qiagen)进行，所述抗His抗体通过在SPR仪(Biacore T100)上的标准胺偶联和封闭化学偶联到表面。在FcgRIIIa捕获后，于25℃以5μL/分钟的流速注射50nM IGF1R抗体。然后，将芯片用10mM甘氨酸-HCl，pH2.0溶液的60秒脉冲再生。
抗体依赖性细胞的细胞毒性测定法(ADCC)
通过抗IGF-IR抗体测定抗体介导的效应器功能。为了测定生成的抗体引发免疫效应器机制的能力，实施抗体依赖性细胞毒性(ADCC)研究。为了研究抗体在ADCC中的效果，将DU145IGF-IR表达细胞(1x106个细胞/ml)用1μl/ml BATDA溶液(Perkin Elmer)于37℃细胞培养箱中标记25分钟。然后，将细胞用10ml RPMI-FM/PenStrep清洗4次，并以200xg向下旋转10分钟。在最后一次离心步骤前，测定细胞数目，然后将细胞在RPMI-FM/PenStrep培养基中从团粒稀释至1x105个细胞/ml。将细胞以每孔5,000个在50μl的体积中在圆底板中分配。在50μl体积的细胞培养基中以范围为25-0.1μg/ml的终浓度将HuMAb抗体添加至50μl细胞悬浮液。随后，以25:1的E:T比率添加50μl效应细胞，即新鲜分离的PBMC。将板以200xg离心1分钟，接着是于37℃的2小时温育步骤。温育后，将细胞以200xg向下旋转10分钟，收获20μl上清液，并转移至Optiplate96-F板。添加200μl铕溶液(Perkin Elmer,于室温)，并将板在摇床上温育15分钟。使用Perkin Elmer的Eu-TDA方案在时间分辨的荧光计(Victor3,Perkin Elmer)中量化荧光。通过ADCC实现的细胞裂解的量级表示为针对来自相应靶细胞的TDA自发释放校正过的，来自通过去污剂裂解的靶细胞的TDA荧光增强剂的最大释放%。
IGF-1R内在化测定法
依照本发明的抗体和抗原结合蛋白对IGF-1R的结合导致该受体的内在化和降解。可以监测此过程，其通过将IGF-1R表达HT29CRC细胞与IGF-1R靶向性抗体一起温育，接着通过ELISA量化细胞裂解物中的剩余IGF-1R蛋白水平进行。
出于此目的，将1.5x104个细胞/孔的HT29细胞在96孔MTP中在有10%FCS的RPMI中于37℃和5%CO2温育过夜以允许细胞的附着。次日上午，吸出培养基并以1:3稀释步骤以从10nM至2pM的浓度添加在RPMI+10%FCS中稀释的100μl抗IGF-1R抗体。将细胞与抗体于37℃一起温育18小时。然后，再次除去培养基，并添加120μl MES裂解缓冲液(25mM MES pH6.5+完全)。
对于ELISA，用在3%BSA/PBST中以1:200稀释（终浓度2.4μg/ml）的100μlMAK<hu IGF-1Rα>hu-1a-IgG-Bi(Ch.10)加载96孔经链霉亲合素包被的聚苯乙烯板(Nunc)，并于室温在恒定搅动下温育1小时。然后，移出孔内容物，并将每个孔用200μl PBST清洗3次。每孔添加100μl细胞裂解物溶液，再次于室温在板摇床上温育1小时，并用200μl PBST清洗3次。在移出上清液后，添加在3%BSA/PBST中以1:750稀释的100μl/孔PAK<人IGF-1Rα>Ra-C20-IgG(Santa Cruz#sc-713)，接着是与上文描述相同的温育和清洗间隔。为了检测结合IGF-1R的特异性抗体，添加在3%BSA/PBST中以1:4000稀释的100μl/孔偶联有辣根过氧化物酶的多克隆家兔抗体(Cell Signaling#7074)。再一小时后，通过彻底清洗6次再次除去未结合的抗体，如上文描述的。对于结合抗体的量化，添加100μl/孔3,3’-5,5’-四甲基联苯胺(Roche,BM-BlueID.-Nr.11484281)并在室温温育30分钟。最终通过添加25μl/孔的1M H2SO4停止生色反应，并在450nm波长处测量光吸收。将未用抗体处理的细胞用作0%下调的对照，将裂解缓冲液作为背景对照。
IGF-1R自身磷酸化测定法(IGF-1刺激)
通过IGF-1R抗体靶向IGF-1R导致对IGF-1诱导的自身磷酸化的抑制。我们调查了相比于亲本IGF-1R IgG1抗体，野生型IGF-1R MoAb二聚体对自身磷酸化的抑制。出于此目的，将3T3-IGF-1R细胞（过表达人IGF-1R的鼠成纤维细胞细胞系）在存在不同浓度的IGF-1R抗体或IGF-1R抗原结合蛋白的情况下用10nM重组人IGF-1处理10分钟。在细胞裂解后，通过组合人IGF-1R特异性捕捉抗体和磷酸-酪氨酸特异性检测抗体的磷酸IGF-1R特异性ELISA测定磷酸化的IGF-1R蛋白的水平。
PK特性的测定：小鼠中的单剂动力学
方法
动物：
NMRI小鼠，雌性，喂养的，在化合物施用的时间点时为23-32g体重。
研究方案：
对于10mg/kg的单次i.v.剂量，将小鼠分配成3组，各2-3只动物。在剂量给药后0.5、168和672小时从组1，24和336小时从组2及48和504小时从组3采集血液样品。
通过眼球后穿刺获得约100μL的血液样品。于室温1小时后通过于室温离心(9300xg)2.5分钟获得至少40μl的血清样品。离心后将血清样品直接冷冻并于-20℃贮存，直至分析。
分析：
使用1%小鼠血清用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定小鼠血清中人抗体的浓度。在第一步中，将生物素化的针对人Fcγ的单克隆抗体(mAb<hFcγPAN>IgG-Bi)结合至经链霉亲合素包被的微量滴定板。在接着的步骤中，分别添加血清样品(以多个稀释度)和参照标准，并结合至固定化的mAb<hFcγPAN>IgG-Bi。然后，添加针对人Fcγ的洋地黄毒苷化的单克隆抗体(mAb<hFcγPAN>IgG-Dig)。经由抗Dig辣根过氧化物酶抗体缀合物检测人抗体。将ABTS溶液用作辣根过氧化物酶的底物。使用的捕捉和检测抗体(其不与小鼠IgG起交叉反应)的特异性使得能够对小鼠血清样品中的人抗体进行定量测定。
计算：
通过非区室(non-compartmental)分析计算药动学参数，其使用药动学评估程序WinNonlinTM，版本5.2.1进行。
表1：计算的药动学参数
Figure BDA0000403187770000311
将下列药动学参数用于评估人抗体：
●针对推注IV模型估测的初始浓度(C0)。
●最大观察浓度(C最大值)，在(T最大值)发生。
●最大观察浓度的时间(T最大值)。
●通过从时间0到无穷的线性梯形法则（有线性内插）计算浓度/时间曲线下的面积AUC(0-inf)。
●从等式T1/2=ln2/λz得到表观终末半衰期(T1/2)。
●总身体清除(CL)以剂量/AUC(0-inf)计算。
●稳态时的分布体积(Vss)，以MRT(0-inf)x CL(MRT(0-inf)计算，定义为AUMC(0-inf)/AUC(0-inf))。
B.实施例：
实施例1：生成MoAb二聚体抗原结合蛋白
基于如图1A中显示的设计原则，我们设计针对c-Met (SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)、IGF-1R (SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)和HER3 (SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)的依照本发明的抗原结合蛋白。如上文描述的那样在HEK293细胞中瞬时表达相应的构建体，随后经由蛋白A亲和层析，接着是大小排阻来纯化。图2-4绘出抗原结合蛋白的3种不同生成的大小排阻层析的层析谱以及在非还原和还原性条件下的相应SDS-PAGE。在图2中的峰3、图3中的峰2、图4中的峰3外，还观察到从图2中的柱峰2、图3中的峰1、图7中的峰4在较早时间点洗脱的蛋白质。基于它们的保留时间，计算出它们展现出对应于依照图1A的抗原结合蛋白的单价抗体(图1B，MoAb)的两倍分子量(MoAb二聚体)。
通过SEC-MALLS确认IGF-1R抗体的两个峰1和2的大小(图3C)，并确实显示对应于峰1的蛋白质展现出单价抗体(峰2)分子量的约两倍。随后通过质谱术确认MoAb二聚体的存在和分离的蛋白质的身份。基于那些发现，我们得到用于图1A中绘出的MoAb二聚体结构的模型。
我们已实施实验如质谱术、还原和蛋白酶消化以确认图1A中显示的推定结构。
如上文描述的，通过动态光散射研究IGF1R AK18 MoAb二聚体(“CH3-wt”)的稳定性。简言之，通过于40℃的DLS时程实验评估IGF1R AK18MoAb二聚体(“CH3-wt”)的聚集趋势。
实施例2：IGF-1R结合亲和力
通过表面等离振子共振(SPR)将IGF1R AK18 MoAb二聚体(“CH3-wt”)对IGF-1R胞外域的结合与亲本<IGF-1R>IgG1抗体的结合进行比较。图5绘出测定亲和力的SPR测定法的方案。分析(双重测定)显示，IGF-1R结合亲和力在IGF1R AK18 MoAb二聚体(“CH3-wt”)中得到保留。
Figure BDA0000403187770000331
实施例3：对IGF-1R表达细胞系的细胞结合
在A549细胞上证明IGF-1R MoAb二聚体的细胞结合。用Accutase (Sigma)将对数生长期中的A549细胞分开，且对于每次单独的抗体温育使用2x10e5个细胞。以3倍稀释系列(100-0.0003μg/mL)添加IGF-1R抗体和MoAb二聚体。用偶联有Alexa488的结合人免疫球蛋白恒定区的二抗(5μg/mL)显现结合的抗体。用7-AAD(BD)染色死亡细胞，并将其从分析排除。在FACS Canto(BDBiosciences)流式细胞仪上测量单细胞的荧光强度。数据显示，MoAb二聚体显示与亲本IGF-1R IgG1抗体相当的非常相似的对细胞的半最大结合。这暗示MoAb二聚体可以以两个臂结合细胞上的IGF-1R，而且展现出亲合效应。然而，总mfi(均值荧光强度)对于MoAb二聚体比单抗IGF-1R更高。这有可能是由于在细胞表面上每分子IGF-1R的Fc部分数目较多所致。结果显示于图6和下文。
                                             半最大结合
IGF-1R(150kDa):                              0.76nM
IGF-1R MoAb二聚体(200kDa):                    1.13nM
实施例4：ADCC诱导
可以使用供体衍生的外周血单个核细胞(PBMC)来测量通过非糖工程化改造的和经糖工程化改造的抗体对癌细胞的效应细胞招募。癌细胞的裂解与NK细胞介导的细胞毒性相关，并且与抗体招募NK细胞的能力成比例。在此特定背景中，在缺乏或存在相应抗体的情况下将DU145前列腺癌细胞与PBMC一起以1:25比率(DU145:PBMC)温育。2小时后，如上文描述的，使用BATDA/铕系统测定细胞裂解。通过ADCC实现的细胞裂解的量级表示为针对来自相应靶细胞的TDA自发释放校正过的，来自通过去污剂裂解的靶细胞的TDA荧光增强剂的最大释放%。数据显示，非糖工程化改造的二价IGF-1RMoAb二聚体在诱导ADCC方面优于非糖工程化改造的IGF-1R抗体。令人惊讶地，非糖工程化改造的IGF-1R MoAb二聚体在高浓度时在诱导ADCC方面甚至优于经糖工程化改造的IGF-1R抗体，所述经糖工程化改造的IGF-1R抗体到高浓度时在ADCC测定法中显示下降。在无糖工程化情况下通过MoAb二聚体的卓越的ADCC诱导可以根据该构建体对NK细胞上FcgRIIIa的较高亲和力（由于针对FcgRIIIa为二价所致）解释(亲合效应)。
非糖工程化改造的IGF1R单抗(1)、经糖工程化改造的、无岩藻糖基化的IGF1R单抗(2)和非ge的IGF1R AK18MoAb二聚体(“CH3-wt”)(3)的结果呈现于图7，其显示MoAb二聚体IGF1R AK18MoAb二聚体(“CH3-wt”)与非糖工程化改造的IGF1R MAb相比以及在较高浓度中甚至与经糖工程化改造的、无岩藻糖基化的IGF1R单抗(2)相比具有改善的ADCC。
实施例5：IGF-1R内在化测定法
通过二价IGF-1R抗体靶向肿瘤细胞上的IGF-1R导致IGF-1R的内在化和溶酶体降解。我们调查了与亲本IGF-1R亲本抗体相比IGF-1R MoAb二聚体的内在化特性。出于此目的，将HT29结肠癌细胞用不同浓度的MoAb二聚体和亲本IGF-1R抗体处理18小时。在细胞裂解后，通过IGF-1R特异性ELISA测定IGF-1R蛋白的剩余水平。
图8中的数据显示，通过MoAb二聚体的IGF-1R内在化与二价亲本IGF-1R亲本抗体实际上是相同的。最大内在化为82.99%(IgG1)对83.7%(MoAb二聚体)，半最大抑制需要的浓度为0.027nM(IgG1)对0.027nM(MoAb二聚体)。
实施例6：IGF-1R自身磷酸化(IGF-1刺激)
通过IGF-1R抗体靶向IGF-1R导致对IGF-1诱导的自身磷酸化的抑制。我们调查相比于亲本IGF-1R IgG1抗体，MoAb二聚体IGF-1R抗体对自身磷酸化的抑制。出于此目的，将3T3-IGF-1R细胞(一种过表达人IGF-1R的鼠成纤维细胞细胞系)用10nM重组人IGF-1在存在不同浓度IGF-1R抗体和抗原结合蛋白的情况下处理10分钟。在细胞裂解后，通过组合人IGF-1R特异性捕捉抗体和磷酸-酪氨酸特异性检测抗体的磷酸IGF-1R特异性ELISA测定磷酸化IGF-1R蛋白的水平。
图9中的数据显示，相比于IGF-1R IgG1亲本分子，IGF-1R MoAb二聚体可以相似或甚至略微更好地抑制IGF-1诱导的自身磷酸化。半最大抑制需要的浓度为1.44nM(亲本IGF-1R IgG1)对3.52nM(MoAb二聚体)，观察到的最大抑制为80.3%(亲本IGF-1R IgG1)对89.1%(MoAb二聚体)。
实施例7：PK特性的测定
在单剂PK研究中在雌性、喂养的、在化合物施用小鼠的时间点时为23-32g体重的NMRI小鼠中测定依照本发明的抗原结合蛋白的药动学特性，如上文所描述的(在方法部分中)。
在随后的表中给出PK特性，且其指示抗原结合蛋白IGF1R AK18MoAb二聚体(“CH3-wt”)具有与亲本<IGF-1R>IgG1抗体相当的高度有价值的PK特性(如例如AUC0-无穷、C最大值或C0)。
表2：PK特性
<IGF-1R>IgG1抗体 <IGF1R>MoAb二聚体
C0 μg/mL 81.9 201.56
C最大值 μg/mL 80.7 195.9
T最大值 h 0.5 0.5
AUC0-无穷 h*μg/mL 9349 12096
终末t1/2 h 106.2 83.5
Cl mL/min/kg 0.018 0.013
Vss L/kg 0.16 0.1
实施例8：ESI-MS实验IGF-1R MoAb二聚体
将IGF-1R MoAb二聚体(IGF1R AK18MoAb(“CH3-wt”))(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)瞬时表达，并经由蛋白A亲和层析和大小排阻层析纯化。在制备性SEC(见图3A)后，抗体在两个分开的峰内洗脱，将其收集。来自第一个峰(级分1)的分析性SEC显示约200kDa的表观分子量，而第二个峰(级分2)对应于100kDa的分子量。不同的分子量可以分别归入作为副产物的限定单体(级分2)和期望的二聚体(级分1)。SEC-MALS确认了初始SEC结果，并且对于级分2(单体)显示99.5kDa的MW及对于级分1(二聚体)显示193.8kDa的MW。
对变性和还原性条件下两个级分的SDS-PAGE分析(见图3B)显示具有表观分子量50-60kDa的一条主要条带。在非还原性条件下，级分2显示100kDaMW左右的一条主要条带，而级分1显示范围为约100-200kDa的非常宽的条带。
级分1=165mL
级分2=190mL
这些初始数据显示二聚体形成。
来自级分1的去糖基化的MoAb二聚体的ESI-MS谱(将样品与60μl1MTCEP和50μl8M盐酸胍一起温育)与MoAb单体级分2显示差异。级分2仅显示一个对应于质量98151Da的单体的峰系列，而级分1显示含有两个主峰系列的2种不同包络(envelop)，这两个主峰系列对应于质量98155Da(单体)和质量196319Da(二聚体)的第二系列。
表3：来自级分1和2的非还原性ESI-MS测量的MS数据的汇总
级分 分子量，单体 分子量，二聚体
(理论上为98162Da) (理论上为196324Da)
级分1 98155Da 196319Da
级分2 98151Da 未检出
级分1中单体的存在可以根据温育条件(与60μl1M TCEP和50μl8M盐酸胍一起温育)和CH1-Ck之间的潜在打开的S-S桥解释。在此情况中，在用于MS的样品制备期间从水性到酸性有机溶剂的转移可以引起二聚体解离成2个单体。
这符合来自CE-SDS(BioAnalyzer)分析的结果。级分1在非还原性条件下含有71%二聚体和16%单体。SDS的使用分开非共价连接的链。级分2在非还原性条件下仅显示一个单体信号(98%)。
在还原性条件下级分1和级分2的MS测量显示正确序列和构建体的表达。来自级分1的MS数据显示两种具有大致相等量的分子量47960Da和50208Da的不同重链。这两条重链在级分2中也以类似的强度找到。
表4：来自级分1和2，在还原性条件下的还原性ESI-MS测量的MS数据汇总
实施例9：对CH3wt和CH3经修饰的IGF1R AK18MoAb二聚体抗原结合蛋白中MoAb二聚体对单价单体比率的分析
抗体链中CH3域的修饰可以改变MoAb二聚体和MoAb单体的比率。将例示性的不同重链修饰与未修饰的重链一起或与其组合在HEK293F细胞中瞬时表达。为了比较，将包含未修饰的重链的抗体平行瞬时转染。在转染后7天收获含有抗体的上清液。使用蛋白A Sepharose沉淀抗体，并用标准pH休克方案从珠洗脱。使用G3000SW(TSKGel)柱对获得的洗脱物进行HPLC分析。计算相应峰下的面积来量化抗体比率。术语“CH3-wt”指具有天然序列的IgG1CH3域(野生型=wt)。
表5：通过HPLC测定的获得的MoAb二聚体(=依照本发明的二价抗原结合蛋白)对MoAb单体(=单价副产物)比率。可以容易地分开期望的二聚体产物和单体副产物两者。自图10中展现的层析谱得到数值。
Figure BDA0000403187770000381
h=在IgG1CH3域中具有突变S364W和L368G的突变体
i=在IgG1CH3域中具有突变S364G、L368W、D399K和K409D的突变体
l=在IgG1CH3域中具有突变S364F和L368G的突变体
m=在IgG1CH3域中具有突变S364G、L368F、D399K和K409D的突变体
CH3-wt=IgG1wt CH3域
CH3-IgA=具有IgG1CH2域和IgA CH3域的嵌合物
实施例10：经糖工程化改造的抗体的生成
对于经糖工程化改造的MoAb抗原结合蛋白的生成，使用磷酸钙方法用4种质粒来转染HEK-EBNA细胞。两种编码抗体链，一种用于融合GnTIII多肽表达(GnT-III表达载体)，一种用于甘露糖苷酶II表达(高尔基体甘露糖苷酶II表达载体)，比率为4:4:1:1。使用补充有10%FCS的DMEM培养基，将细胞在T烧瓶中以贴壁单层培养物培养，并当其介于50和80%之间汇合时进行转染。对于T150烧瓶的转染，在转染前24小时将1500万个细胞接种于补充有FCS(最终为10%V/V)的25ml DMEM培养基中，并将细胞于37℃在具有5%CO2气氛的培养箱中放置过夜。对于要转染的每个T150烧瓶，制备DNA、CaCl2和水的溶液，其通过混合在轻链和重链表达载体之间等分的94μg总质粒载体DNA、至终体积469μl的水和469μl1M CaCl2溶液进行。向此溶液添加938μl50mM HEPES、280mM NaCl、1.5mM Na2HPO4溶液pH7.05，立即混合10秒并于室温保持竖立20秒。将悬浮液用补充有2%FCS的10ml DMEM稀释，并添加到T150替换现有培养基。然后，添加额外的13ml转染培养基。将细胞于37℃、5%CO2温育约17至20小时，然后将培养基用25ml DMEM、10%FCS替换。在培养基更换后约7天通过以210xg离心15分钟收获条件化培养基，将溶液无菌过滤(0.22um滤器)，并添加终浓度0.01%w/v的叠氮化钠，并于4℃保持。
Figure IDA0000403187820000011
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Claims (21)

1.一种抗原结合蛋白，其包含：
a)特异性结合抗原的抗体的两条经修饰重链，其中每条重链的VH用所述抗体的VL替换，所述经修饰重链经由其Fc部分的CH3域彼此联合；
b)所述抗体的两条经修饰重链，其中每条重链的CH1用所述抗体的CL替换，所述经修饰重链经由其Fc部分的CH3域彼此联合；
且其中a)的重链的VL域与b)的重链的VH域联合，且a)的重链的CH1域与b)的重链的CL域联合。
2.依照权利要求1的抗原结合蛋白，其特征在于：
a)的经修饰重链的Fc部分的CH3域与b)的经修饰重链的Fc部分的CH3域是相同同种型的。
3.依照权利要求2的抗原结合蛋白，其特征在于：
a)的经修饰重链的Fc部分的CH2和CH3域与b)的经修饰重链的Fc部分的CH2和CH3域是相同同种型的。
4.依照权利要求3的抗原结合蛋白，其特征在于：
a)的经修饰重链的Fc部分的CH2和CH3域与b)的经修饰重链的Fc部分的CH2和CH3域是IgG同种型的。
5.依照权利要求4的抗原结合蛋白，其特征在于：
a)的经修饰重链的Fc部分的CH2和CH3域与b)的经修饰重链的Fc部分的CH2和CH3域是IgG1同种型的。
6.依照权利要求1的抗原结合蛋白，其特征在于包含：
a)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；和b)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
a)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；和b)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
或
a)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和b)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
7.依照权利要求5的抗原结合蛋白，其特征在于：
a)的两条经修饰重链或b)的两条经修饰重链通过氨基酸取代S364G、L368F、D399K和K409D(其中氨基酸位置依照Kabat的EU索引编号)进一步修饰。
8.依照权利要求1的抗原结合蛋白，其特征在于包含：
a)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；和b)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；其中a)的两条经修饰重链或b)的两条经修饰重链通过氨基酸取代S364G、L368F、D399K和K409D(其中氨基酸位置依照Kabat的EU索引编号)进一步修饰；
a)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；和b)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；其中a)的两条经修饰重链或b)的两条经修饰重链通过氨基酸取代S364G、L368F、D399K和K409D(其中氨基酸位置依照Kabat的EU索引编号)进一步修饰；
或
a)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和b)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；其中a)的两条经修饰重链或b)的两条经修饰重链通过氨基酸取代S364G、L368F、D399K和K409D(其中氨基酸位置依照Kabat的EU索引编号)进一步修饰。
9.依照权利要求1的抗原结合蛋白，其特征在于：
a)的经修饰重链的Fc部分的CH3域与b)的经修饰重链的Fc部分的CH3域是不同同种型的。
10.依照权利要求9的抗原结合蛋白，其特征在于：
a)的经修饰重链的Fc部分的CH3域是IgG1同种型的；且
b)的经修饰重链的Fc部分的CH3域是IgA同种型的。
11.依照权利要求10的抗原结合蛋白，其特征在于包含：
a)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和
b)两条经修饰重链，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
12.依照权利要求10的抗原结合蛋白，其特征在于：
a)的经修饰重链的Fc部分的CH2和CH3域是IgG1同种型的；且
b)的经修饰重链的Fc部分的CH2和CH3域是IgA同种型的。
13.依照权利要求1至11中任一项的单价抗原结合蛋白，其特征在于a)和b)的Fc部分的CH2域是IgG1同种型的，且所述抗原结合蛋白是无岩藻糖基化的，岩藻糖量占Asn297处的寡糖(糖)总量的80%或更少，是IgG1同种型的。
14.一种包含依照权利要求1至13中任一项的抗原结合蛋白的药物组合物。
15.依照权利要求1至13中任一项的抗原结合蛋白，其用于治疗癌症。
16.依照权利要求1至13中任一项的抗原结合蛋白用于制造用于治疗癌症的药物的用途。
17.一种用于治疗需要治疗的患者的方法，其特征在于对所述患者施用治疗有效量的依照权利要求1至13中任一项的抗原结合蛋白。
18.一种用于制备依照权利要求1至13中任一项的抗原结合蛋白的方法，其包括以下步骤：
a)用包含编码依照权利要求1至13中任一项的抗原结合蛋白的核酸分子的载体转化宿主细胞，
b)在允许所述抗原结合蛋白分子合成的条件下培养所述宿主细胞；并
c)从所述培养物回收所述抗原结合蛋白分子。
19.一种编码依照权利要求1至13中任一项的抗原结合蛋白的核酸。
20.一种包含依照权利要求19的核酸的载体。
21.一种包含依照权利要求20的载体的宿主细胞。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106164092A (zh) * 2014-03-21 2016-11-23 瑞泽恩制药公司 表现不同结合特征的vl抗原结合蛋白
CN107987172A (zh) * 2017-11-27 2018-05-04 暨南大学 一种抑制肿瘤血管新生的peptibody多表位疫苗及其应用

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9266967B2 (en) * 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
MX2011010159A (es) * 2009-04-02 2011-10-17 Roche Glycart Ag Anticuerpos multiespecificos que comprenden anticuerpos de longitud completa y fragmentos fab de cadena sencilla.
JP5616428B2 (ja) 2009-04-07 2014-10-29 ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト 三価の二重特異性抗体
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) * 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
WO2011034605A2 (en) 2009-09-16 2011-03-24 Genentech, Inc. Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
AR080793A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos
CN103068846B9 (zh) 2010-08-24 2016-09-28 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含二硫键稳定性Fv片段的双特异性抗体
WO2012085111A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
AR085403A1 (es) * 2011-02-28 2013-09-25 Hoffmann La Roche Proteinas monovalentes que se unen a antigenos
WO2012116926A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding proteins
RU2644341C2 (ru) 2012-02-10 2018-02-08 Дженентек, Инк. Одноцепочечные антитела и другие гетеромультимеры
EP2867253B1 (en) 2012-06-27 2016-09-14 F. Hoffmann-La Roche AG Method for selection and production of tailor-made highly selective and multi-specific targeting entities containing at least two different binding entities and uses thereof
CA2871882A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
WO2014065945A1 (en) * 2012-10-23 2014-05-01 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Antibodies with engineered igg fc domains
WO2014078729A1 (en) 2012-11-15 2014-05-22 Genentech, Inc. IONIC STRENGTH-MEDIATED pH GRADIENT ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY
CA2922912A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific domain exchanged common variable light chain antibodies
EP3119194B1 (en) 2014-03-21 2021-04-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that make single domain binding proteins
CN107001482B (zh) 2014-12-03 2021-06-15 豪夫迈·罗氏有限公司 多特异性抗体
US11111314B2 (en) 2015-03-19 2021-09-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen
CN105461632B (zh) * 2016-01-04 2018-01-09 湖北泓肽生物科技有限公司 一种n‑乙酰‑l‑肌肽的制备方法
US20200040084A1 (en) * 2017-01-06 2020-02-06 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods related to engineered fc-antigen binding domain constructs
US20230242647A1 (en) 2020-05-01 2023-08-03 Novartis Ag Engineered immunoglobulins

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060160184A1 (en) * 2003-05-30 2006-07-20 Merus Biopharmaceuticals, B.V. I.O. Fab library for the preparation of anti VEGF and anti rabies virus fabs
CN101903404A (zh) * 2007-12-21 2010-12-01 霍夫曼-拉罗奇有限公司 二价双特异性抗体
WO2010145792A1 (en) * 2009-06-16 2010-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding proteins

Family Cites Families (300)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4150149A (en) 1976-11-29 1979-04-17 Professional Staff Association Of The Los Angeles County Harbor General Hospital Method and means for the early detection and diagnosis of certain types of cancers
US4361544A (en) 1980-03-03 1982-11-30 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibodies specific to intracellular tumor-associated markers
US4444744A (en) 1980-03-03 1984-04-24 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibodies to cell surface antigens
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
US6511663B1 (en) 1991-06-11 2003-01-28 Celltech R&D Limited Tri- and tetra-valent monospecific antigen-binding proteins
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
CA2116774C (en) 1991-09-19 2003-11-11 Paul J. Carter Expression in e. coli antibody fragments having at least a cysteine present as a free thiol. use for the production of bifunctional f(ab') 2 antibodies
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
CA2123307A1 (en) 1991-11-26 1993-06-10 Phillip M. Friden Process for the preparation of transferrin receptor specific antibody-neuro-pharmaceutical or diagnostic agent conjugates
CA2129663C (en) 1992-02-06 2005-07-05 James S. Huston Biosynthetic binding protein for cancer marker
GB9221657D0 (en) 1992-10-15 1992-11-25 Scotgen Ltd Recombinant bispecific antibodies
HU221343B1 (en) 1992-10-28 2002-09-28 Genentech Inc Use of anti-vegf antibodies for the treatment of cancer
US5747654A (en) 1993-06-14 1998-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US6476198B1 (en) 1993-07-13 2002-11-05 The Scripps Research Institute Multispecific and multivalent antigen-binding polypeptide molecules
UA40577C2 (uk) 1993-08-02 2001-08-15 Мерк Патент Гмбх Біспецифічна молекула, що використовується для лізису пухлинних клітин, спосіб її одержання, моноклональне антитіло (варіанти), фармацевтичний препарат, фармацевтичний набір (варіанти), спосіб видалення пухлинних клітин
WO1995009917A1 (en) 1993-10-07 1995-04-13 The Regents Of The University Of California Genetically engineered bispecific tetravalent antibodies
US5814464A (en) 1994-10-07 1998-09-29 Regeneron Pharma Nucleic acids encoding TIE-2 ligand-2
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
GB9504344D0 (en) 1995-03-03 1995-04-19 Unilever Plc Antibody fragment production
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
BR9606706A (pt) 1995-10-16 1999-04-06 Unilever Nv Análogo de fragmento de anticorpo biespecífico ou bivalente uso processo para produzir o mesmo
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6239259B1 (en) 1996-04-04 2001-05-29 Unilever Patent Holdings B.V. Multivalent and multispecific antigen-binding protein
WO1998010431A2 (en) 1996-09-05 1998-03-12 Adrenaline Research, Inc. High power spark plug wire
DE69842174D1 (de) 1997-04-07 2011-04-21 Genentech Inc Verfahren zur Herstellung humanisierter Antikörper durch randomisierte Mutagenese
ES2273415T3 (es) 1997-04-07 2007-05-01 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-vegf.
EP0971952A2 (en) 1997-04-10 2000-01-19 Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences Diagnosis method and reagents
EP0915987A2 (en) 1997-04-21 1999-05-19 Donlar Corporation POLY-($g(a)-L-ASPARTIC ACID), POLY-($g(a)-L-GLUTAMIC ACID) AND COPOLYMERS OF L-ASP AND L-GLU, METHOD FOR THEIR PRODUCTION AND THEIR USE
DE69830901T2 (de) 1997-05-02 2006-05-24 Genentech Inc., San Francisco ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US7951917B1 (en) 1997-05-02 2011-05-31 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
DE69830315T2 (de) 1997-06-24 2006-02-02 Genentech Inc., San Francisco Galactosylierte glykoproteine enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur deren herstellung
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
DE69922159T2 (de) 1998-01-23 2005-12-01 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Mehrzweck-antikörperderivate
JP2002510481A (ja) 1998-04-02 2002-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗体変異体及びその断片
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ATE458007T1 (de) 1998-04-20 2010-03-15 Glycart Biotechnology Ag Glykosylierungs-engineering von antikörpern zur verbesserung der antikörperabhängigen zellvermittelten zytotoxizität
GB9808619D0 (en) 1998-04-22 1998-06-24 Zeneca Ltd Chemical process
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
US7138103B2 (en) 1998-06-22 2006-11-21 Immunomedics, Inc. Use of bi-specific antibodies for pre-targeting diagnosis and therapy
AU760854B2 (en) 1998-06-22 2003-05-22 Immunomedics Inc. Use of bi-specific antibodies for pre-targeting diagnosis and therapy
US6312689B1 (en) 1998-07-23 2001-11-06 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-CCR2 antibodies and methods of use therefor
FR2783420B1 (fr) 1998-09-22 2000-12-08 Oreal Utilisation d'au moins un derive de l'acide 10-hydroxy-2-decenoique dans une composition destinee a favoriser la desquamation de la peau, et composition le comprenant
US20030035798A1 (en) 2000-08-16 2003-02-20 Fang Fang Humanized antibodies
WO2000035956A1 (fr) 1998-12-16 2000-06-22 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Anticorps monoclonal anti-vegf humain
ES2694002T3 (es) 1999-01-15 2018-12-17 Genentech, Inc. Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
CN1232039A (zh) 1999-04-02 1999-10-20 中国人民解放军海军总医院 一种基因工程双特异抗体及其应用
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
DE60022369T2 (de) 1999-10-04 2006-05-18 Medicago Inc., Sainte Foy Verfahren zur regulation der transkription von fremden genen in gegenwart von stickstoff
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
JP4668498B2 (ja) 1999-10-19 2011-04-13 協和発酵キリン株式会社 ポリペプチドの製造方法
US7449443B2 (en) 2000-03-23 2008-11-11 California Institute Of Technology Method for stabilization of proteins using non-natural amino acids
CA2406993A1 (en) 2000-03-24 2001-09-27 Micromet Ag Multifunctional polypeptides comprising a binding site to an epitope of the nkg2d receptor complex
AU2001247616B2 (en) 2000-04-11 2007-06-14 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
FR2807767B1 (fr) 2000-04-12 2005-01-14 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-d
DE10021678A1 (de) 2000-05-05 2002-04-18 Stefan Duebel Antikörperkonstrukte mit variablen Regionen
EP1299419A2 (en) 2000-05-24 2003-04-09 Imclone Systems, Inc. Bispecific immunoglobulin-like antigen binding proteins and method of production
US6586207B2 (en) 2000-05-26 2003-07-01 California Institute Of Technology Overexpression of aminoacyl-tRNA synthetases for efficient production of engineered proteins containing amino acid analogues
AU2001270609A1 (en) 2000-06-30 2002-01-14 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Heterodimeric fusion proteins
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
HU231090B1 (hu) 2000-10-06 2020-07-28 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antitest-kompozíciót termelő sejt
EP1327681A4 (en) 2000-10-20 2004-09-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Degraded agonist antibodies
RU2430927C2 (ru) * 2000-10-20 2011-10-10 Тугаи Сейяку Кабусики Кайся Агонистическое соединение, способное специфически узнавать и поперечно сшивать молекулу клеточной поверхности или внутриклеточную молекулу
US7319139B2 (en) 2001-01-29 2008-01-15 Biogen Idec, Inc. TAG-72 specific CH2 domain deleted antibodies
US20030099974A1 (en) 2001-07-18 2003-05-29 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel genes, compositions, kits and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
CA2838062C (en) 2001-08-03 2015-12-22 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
WO2003033648A2 (en) 2001-09-05 2003-04-24 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Imaging the activity of extracellular proteases in cells using mutant anthrax toxin protective antigens that are cleaved by specific extracellular proteases
ES2276735T3 (es) 2001-09-14 2007-07-01 Affimed Therapeutics Ag Anticuerpos fv multimericos de cadena sencilla en tandem.
US7138370B2 (en) 2001-10-11 2006-11-21 Amgen Inc. Specific binding agents of human angiopoietin-2
US7658924B2 (en) 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
US7521053B2 (en) 2001-10-11 2009-04-21 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
WO2003033666A2 (en) 2001-10-16 2003-04-24 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Broadly cross-reactive neutralizing antibodies against human immunodeficiency virus selected by env-cd4-co-receptor complexes
US7053202B2 (en) * 2001-10-19 2006-05-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin DNA cassette molecules, monobody constructs, methods of production, and methods of use therefor
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
EP1490677A4 (en) 2002-02-27 2006-01-18 California Inst Of Techn COMPUTER METHOD FOR DESIGNING ENZYMES FOR THE INCORPORATION OF AMINO ACID ANALOGUES INTO PROTEINS
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
AU2003209446B2 (en) 2002-03-01 2008-09-25 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
US7332585B2 (en) 2002-04-05 2008-02-19 The Regents Of The California University Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof
WO2003084570A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Medicament contenant une composition d'anticorps appropriee au patient souffrant de polymorphisme fc$g(g)riiia
BR0309145A (pt) 2002-04-09 2005-02-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk Células das quais o genoma é modificado
JPWO2003085118A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物の製造方法
JPWO2003084569A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物含有医薬
AU2003236020B2 (en) 2002-04-09 2009-03-19 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in GDP-fucose transport
US20040259150A1 (en) 2002-04-09 2004-12-23 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to Fcgamma receptor IIIa
WO2003093318A1 (en) 2002-04-29 2003-11-13 Genpat77 Pharmacogenetics Ag Novel antibody binding tcr and tirc7 and its use in therapy and diagnosis
US7081443B2 (en) 2002-05-21 2006-07-25 Korea Advanced Institutes Of Science And Technology (Kaist) Chimeric comp-ang1 molecule
SE0201863D0 (en) 2002-06-18 2002-06-18 Cepep Ab Cell penetrating peptides
DE60305919T2 (de) 2002-06-28 2007-01-18 Domantis Limited, Cambridge Dual-specifische liganden mit erhöhter halbwertszeit
US7140727B2 (en) 2002-07-10 2006-11-28 Isl Technologies, Llc Eyeglass frame assembly
HUE025086T2 (en) 2002-10-10 2016-02-29 Merck Patent Gmbh Pharmaceutical preparations for ERB-B1 receptor
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
TWI335821B (en) 2002-12-16 2011-01-11 Genentech Inc Immunoglobulin variants and uses thereof
US7534427B2 (en) 2002-12-31 2009-05-19 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B cell malignancies and autoimmune diseases using unconjugated antibodies and conjugated antibodies and antibody combinations and fusion proteins
WO2004063351A2 (en) 2003-01-09 2004-07-29 Macrogenics, Inc. IDENTIFICATION AND ENGINEERING OF ANTIBODIES WITH VARIANT Fc REGIONS AND METHODS OF USING SAME
AU2004205802B2 (en) 2003-01-22 2009-11-05 Roche Glycart Ag Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased Fc receptor binding affinity and effector function
BRPI0407446A (pt) 2003-02-13 2006-01-31 Pharmacia Corp Anticorpos para c-met para o tratamento de cânceres
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
CA2526085A1 (en) 2003-05-30 2005-01-06 Genentech, Inc. Treatment with anti-vegf antibodies
US20050163782A1 (en) 2003-06-27 2005-07-28 Biogen Idec Ma Inc. Modified binding molecules comprising connecting peptides
EP1638510B1 (en) 2003-07-01 2015-09-02 Immunomedics, Inc. Multivalent carriers of bi-specific antibodies
AR046071A1 (es) 2003-07-10 2005-11-23 Hoffmann La Roche Anticuerpos contra el receptor i del factor de crecimiento de tipo insulinico y los usos de los mismos
JP3818277B2 (ja) 2003-07-14 2006-09-06 株式会社日立製作所 化学反応デバイス、化学反応システムおよび化学反応方法
US20050054048A1 (en) 2003-07-29 2005-03-10 Luigi Grasso Antibodies and methods for generating genetically altered antibodies with enhanced effector function
WO2005044853A2 (en) 2003-11-01 2005-05-19 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
CN1871259A (zh) 2003-08-22 2006-11-29 比奥根艾迪克Ma公司 具有改变的效应物功能的经改进的抗体和制备它的方法
US20050152894A1 (en) 2003-09-05 2005-07-14 Genentech, Inc. Antibodies with altered effector functions
US20050064509A1 (en) 2003-09-23 2005-03-24 The Regents Of The University Of California Use of templated self assembly to create novel multifunctional species
CN1326881C (zh) 2003-09-29 2007-07-18 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种三价双特异性抗体，其制备方法及用途
US20080241884A1 (en) 2003-10-08 2008-10-02 Kenya Shitara Fused Protein Composition
EP1705251A4 (en) 2003-10-09 2009-10-28 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd PROCESS FOR PRODUCING ANTIBODY COMPOSITION BY RNA INHIBITION OF FUNCTION OF $ G (A) 1,6-FUCOSYLTRANSFERASE
ES2737837T3 (es) 2003-10-09 2020-01-16 Ambrx Inc Derivados poliméricos
WO2005044859A2 (en) 2003-11-05 2005-05-19 Glycart Biotechnology Ag Cd20 antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function
WO2005051976A2 (en) 2003-11-20 2005-06-09 Ansata Therapeutics, Inc. Protein and peptide ligation processes and one-step purification processes
EP1983000B1 (en) 2003-11-21 2015-09-02 UCB Biopharma SPRL Method for the treatment of multiple sclerosis by inhibiting IL-17 activity
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
PL1718677T3 (pl) * 2003-12-19 2012-09-28 Genentech Inc Jednowartościowe fragmenty przeciwciała stosowane jako środki lecznicze
JP2007519422A (ja) 2004-02-02 2007-07-19 アンブレツクス・インコーポレイテツド 修飾されたヒト四螺旋バンドルポリペプチド及びそれらの使用
US20080187954A1 (en) 2004-03-10 2008-08-07 Lonza Ltd. Method For Producing Antibodies
WO2005092925A2 (en) 2004-03-24 2005-10-06 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
ES2403055T3 (es) 2004-04-13 2013-05-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticuerpos anti-P-selectina
JP2008512352A (ja) 2004-07-17 2008-04-24 イムクローン システムズ インコーポレイティド 新規な四価の二重特異性抗体
BRPI0515230A (pt) 2004-08-19 2008-07-15 Genentech Inc polipeptìdeos, anticorpos e ácidos nucléicos isolados, composições, vetor de expressão, células hospedeiras isoladas, método para a produção de um anticorpo, artigos manufaturados, métodos de tratamento e para o alìvio de disfunções, métodos de produção e de seleção de um polipeptìdeo, anticorpo de ligação cd20 humanizado, anticorpo anti-her2 isolado e usos de um anticorpo
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
WO2006034488A2 (en) 2004-09-23 2006-03-30 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
AU2005335714B2 (en) * 2004-11-10 2012-07-26 Macrogenics, Inc. Engineering Fc antibody regions to confer effector function
CN105085678B (zh) 2004-12-21 2019-05-07 阿斯利康公司 血管生成素-2的抗体及其应用
AR052285A1 (es) 2005-02-07 2007-03-07 Glycart Biotechnology Ag Moleculas de union al antigeno que fijan egfr, vectores que las codifican y usos de las mismas
KR20070114765A (ko) 2005-02-23 2007-12-04 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 생물학적 활성을 조절하기 위한 이특이성 결합제
JP2008531049A (ja) 2005-02-28 2008-08-14 セントカー・インコーポレーテツド ヘテロ二量体タンパク質結合組成物
JP5057967B2 (ja) 2005-03-31 2012-10-24 中外製薬株式会社 ｓｃ（Ｆｖ）２構造異性体
EP3623473A1 (en) 2005-03-31 2020-03-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for production of polypeptide by regulation of assembly
TW200720289A (en) 2005-04-01 2007-06-01 Hoffmann La Roche Antibodies against CCR5 and uses thereof
EP1868650B1 (en) 2005-04-15 2018-10-03 MacroGenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9963510B2 (en) 2005-04-15 2018-05-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
JP5255435B2 (ja) 2005-04-26 2013-08-07 メディミューン，エルエルシー ヒンジドメイン操作による抗体エフェクター機能の調節
WO2006114700A2 (en) 2005-04-26 2006-11-02 Bioren, Inc. Method of producing human igg antibodies with enhanced effector functions
CN101262885B (zh) 2005-06-10 2015-04-01 中外制药株式会社 含有sc(Fv)2的药物组合物
EP1925319B1 (en) 2005-06-10 2018-03-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical compositions containing sc(fv)2
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
BRPI0615026A8 (pt) 2005-08-19 2018-03-06 Abbott Lab imunoglobulina de domínio variável duplo e seus usos
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
BRPI0615397B1 (pt) 2005-08-26 2023-10-03 Roche Glycart Ag Anticorpo anti-cd20, composição farmacêutica que o contém e uso do mesmo
US8142781B2 (en) 2005-10-07 2012-03-27 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for blood-brain barrier delivery
WO2007044887A2 (en) 2005-10-11 2007-04-19 Transtarget, Inc. Method for producing a population of homogenous tetravalent bispecific antibodies
US7666622B2 (en) 2005-10-19 2010-02-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Monomeric self-associating fusion polypeptides and therapeutic uses thereof
TW200732350A (en) * 2005-10-21 2007-09-01 Amgen Inc Methods for generating monovalent IgG
CA2633211A1 (en) 2005-12-15 2007-06-21 Astrazeneca Ab Combination of angiopoietin-2 antagonist and of vegf-a, kdr and/or flt1 antagonist for treating cancer
FR2894959B1 (fr) 2005-12-15 2008-02-29 Galderma Res & Dev Derives biphenyliques agonistes selectifs du recepteur rar-gamma
GB0601513D0 (en) 2006-01-25 2006-03-08 Univ Erasmus Medical Ct Binding molecules 3
AR059066A1 (es) 2006-01-27 2008-03-12 Amgen Inc Combinaciones del inhibidor de la angiopoyetina -2 (ang2) y el inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (vegf)
BRPI0707824A2 (pt) 2006-02-15 2011-05-10 Imclone Systems Inc proteÍna de ligaÇço a antÍgeno, e, mÉtodos de neutralizaÇço da ativaÇço de um receptor de tirosina quinase, de inibiÇço de angiogÊnese, de reduÇço de crescimento de tumor e de produÇço de uma proteÍna de ligaÇço a antÍgeno
EP2006305B1 (en) * 2006-03-03 2016-08-10 The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Modified antibody with enhanced bioactivity
NZ591252A (en) 2006-03-17 2012-06-29 Biogen Idec Inc Methods of designing antibody or antigen binding fragments thereof with substituted non-covarying amino acids
EP1996236A2 (en) 2006-03-22 2008-12-03 National Institute of Immunology Novel bioconjugates as therapeutic agent and synthesis thereof
PT1999154E (pt) 2006-03-24 2013-01-24 Merck Patent Gmbh Domínios proteicos heterodiméricos modificados
US20070274985A1 (en) 2006-05-26 2007-11-29 Stefan Dubel Antibody
EP2395021A1 (en) 2006-06-06 2011-12-14 Oleg Iliich Epshtein Medicinal agent for treating fatness, diabetes, and diseases associated with impaired glucose tolerance
JP2009539412A (ja) 2006-06-12 2009-11-19 レセプター バイオロジックス， インコーポレイテッド 汎細胞表面レセプター特異的な治療薬
WO2007147901A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
WO2008005828A2 (en) 2006-06-30 2008-01-10 Novo Nordisk A/S PHARMACEUTICALLY ACCEPTABLE COMPOSITIONS COMPRISING ANTIBODY MOLECULES SPECIFIC TO LAMININ-5 α3 CHAIN DOMAINS G1G2 AND USE THEREOF
AR062223A1 (es) 2006-08-09 2008-10-22 Glycart Biotechnology Ag Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas
JP5959795B2 (ja) 2006-08-18 2016-08-02 アーメイゲン・テクノロジーズ・インコーポレイテッドＡｒｍａｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． 血液脳関門送達のための物質
US10118970B2 (en) 2006-08-30 2018-11-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
CN101205255A (zh) 2006-12-14 2008-06-25 上海中信国健药业有限公司 抗cd20四价抗体、其制备方法和应用
US20080248033A1 (en) 2006-12-19 2008-10-09 Genentech, Inc. VEGF-specific antagonists for adjuvant and neoadjuvant therapy and the treatment of early stage tumors
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
EP1953526B1 (en) 2007-02-01 2017-08-30 Sysmex Corporation Hematological analyzer, method for analyzing body fluid and computer program product
WO2008100624A2 (en) 2007-02-16 2008-08-21 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Antibodies against erbb3 and uses thereof
US10259860B2 (en) 2007-02-27 2019-04-16 Aprogen Inc. Fusion proteins binding to VEGF and angiopoietin
FR2914078B1 (fr) 2007-03-23 2009-06-26 Cooper Invest S A Unite multisevices (ums), permettant la fourniture de services distants (i) inattaquable par les tiers distants, (ii) non-intrusive, et (iii) independante de la configuration du systeme hote.
CN101952312A (zh) 2007-07-31 2011-01-19 米迪缪尼有限公司 多特异性表位结合蛋白及其应用
EP2178914A2 (en) 2007-08-15 2010-04-28 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Monospecific and multispecific antibodies and method of use
WO2009023843A1 (en) 2007-08-15 2009-02-19 Isp Investments Inc. Polyvinylamide polymers containing polymerizable functionalities
DE102007038753A1 (de) 2007-08-16 2009-02-19 Giesecke & Devrient Gmbh Vorrichtung und Verfahren für die Kalibrierung eines Sensorsystems
AU2008296386A1 (en) 2007-08-28 2009-03-12 Biogen Idec Ma Inc. Compositions that bind multiple epitopes of IGF-1R
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) * 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
DK2235064T3 (en) 2008-01-07 2016-01-11 Amgen Inc A process for the preparation of heterodimeric Fc molecules using electrostatic control effects
JP2009181819A (ja) 2008-01-31 2009-08-13 Hitachi High-Technologies Corp 荷電粒子線装置
JP4438875B2 (ja) 2008-02-27 2010-03-24 三菱自動車工業株式会社 車両の貯蔵燃料量推定装置
WO2009126944A1 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Cd37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof
RU2011104348A (ru) 2008-07-08 2012-08-20 Эбботт Лэборетриз (Us) Иммуноглобулины с двойным вариабельным доменом против простагландина е2 и их применение
KR20110047255A (ko) 2008-09-26 2011-05-06 로슈 글리카트 아게 이중특이적 항-ｅｇｆｒ／항-ｉｇｆ-１ｒ 항체
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
CN110317272A (zh) 2008-10-14 2019-10-11 霍夫曼-拉罗奇有限公司 免疫球蛋白变体及其用途
EP2373692A4 (en) 2008-12-04 2013-11-20 Abbvie Inc IMMUNOGLOBULINE WITH DOUBLE VARIABLE DOMAIN AND ITS USE
SG172977A1 (en) 2009-01-26 2011-08-29 Genmab As Methods for producing mixtures of antibodies
US8940501B2 (en) 2009-01-30 2015-01-27 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods for ligation and uses thereof
CN104447995A (zh) 2009-03-20 2015-03-25 霍夫曼-拉罗奇有限公司 双特异性抗-her抗体
MX2011010159A (es) 2009-04-02 2011-10-17 Roche Glycart Ag Anticuerpos multiespecificos que comprenden anticuerpos de longitud completa y fragmentos fab de cadena sencilla.
WO2010112194A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen-binding polypeptides and multispecific antibodies comprising them
EP2417159A1 (en) 2009-04-07 2012-02-15 Roche Glycart AG Bispecific anti-erbb-3/anti-c-met antibodies
CN102361883A (zh) 2009-04-07 2012-02-22 罗氏格黎卡特股份公司 双特异性抗-ErbB-1/抗-c-Met抗体
JP5616428B2 (ja) 2009-04-07 2014-10-29 ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト 三価の二重特異性抗体
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
EP2435473B1 (en) 2009-05-27 2013-10-02 F.Hoffmann-La Roche Ag Tri- or tetraspecific antibodies
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
US9050375B2 (en) 2009-07-06 2015-06-09 Hoffmann-La Roche, Inc. Bi-specific digoxigenin binding antibodies
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
WO2011034605A2 (en) 2009-09-16 2011-03-24 Genentech, Inc. Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
EP2483310B1 (en) 2009-09-29 2014-08-13 Roche Glycart AG Bispecific death receptor agonistic antibodies
ME02505B (me) 2009-12-29 2017-02-20 Aptevo Res & Development Llc Heterodimerni vezujući proteini i njihove upotrebe
PT2505654T (pt) 2010-02-08 2016-11-18 Regeneron Pharma Rato de cadeia leve comum
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
US20120021409A1 (en) 2010-02-08 2012-01-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
EP2554669B1 (en) 2010-03-26 2018-09-19 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Novel antibody having modification site introduced therein, and antibody fragment
TWI426920B (zh) 2010-03-26 2014-02-21 Hoffmann La Roche 雙專一性、雙價抗－ｖｅｇｆ／抗－ａｎｇ－２抗體
EP2569337A1 (en) 2010-05-14 2013-03-20 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
PT2606064E (pt) 2010-08-16 2015-06-08 Novimmune Sa Processos para a geração de anticorpos poliespecíficos e polivalentes
KR101612999B1 (ko) 2010-08-24 2016-04-15 로슈 글리카트 아게 활성화가능 이중특이적 항체
CN103068846B9 (zh) 2010-08-24 2016-09-28 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含二硫键稳定性Fv片段的双特异性抗体
WO2012045671A1 (en) 2010-10-05 2012-04-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against human tweak and uses thereof
RS59589B1 (sr) 2010-11-05 2019-12-31 Zymeworks Inc Dizajniranje stabilnog heterodimernog antitela sa mutacijama u fc domenu
US20120171120A1 (en) 2010-11-30 2012-07-05 Genentech, Inc. Low affinity blood brain barrier receptor antibodies and uses therefor
CN103429737B (zh) 2010-11-30 2020-07-14 中外制药株式会社 细胞毒诱导治疗剂
AR085403A1 (es) 2011-02-28 2013-09-25 Hoffmann La Roche Proteinas monovalentes que se unen a antigenos
WO2012116926A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding proteins
BR112013023918A2 (pt) 2011-03-25 2016-12-13 Glenmark Pharmaceuticals Sa imunoglobulina hetero-dimérica ou fragmento hetero-dimérico da mesma, método para produzir uma imunoglobulina hetero-dimérica ou fragmento hetero-dimérico da mesma, método para construir uma interface proteína-proteína de um domínio de uma proteína de múltiplos domínios e uso de um domínio doador de um primeiro e de um segundo membro de uma super-família de imunoglobulina de ocorrência natural
WO2012143379A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Roche Glycart Ag Method and constructs for the ph dependent passage of the blood-brain-barrier
CN103764665A (zh) 2011-06-28 2014-04-30 怀特黑德生物医学研究所 使用分选酶安装用于蛋白质连接的点击化学柄
DK2728002T3 (da) 2011-06-30 2022-04-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Heterodimeriseret polypeptid
US9738707B2 (en) 2011-07-15 2017-08-22 Biogen Ma Inc. Heterodimeric Fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto
CN107586340B (zh) 2011-08-23 2022-01-21 罗切格利卡特公司 对t细胞活化性抗原和肿瘤抗原特异性的双特异性抗体及使用方法
BR112014004166A2 (pt) 2011-08-23 2018-05-29 Roche Glycart Ag anticorpo biespecífico compreendendo pelo menos dois fragmentos fab, célula hospedeira procariótica ou eucariótica, metodo de produção de um anticorpo, imunoconjugado e invenção
CA2837975C (en) 2011-08-23 2022-04-05 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
PL2748202T3 (pl) 2011-08-23 2018-12-31 Roche Glycart Ag Dwuswoiste cząsteczki wiążące antygen
CN103890006A (zh) 2011-08-23 2014-06-25 罗切格利卡特公司 抗mcsp抗体
US11851476B2 (en) 2011-10-31 2023-12-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule having regulated conjugation between heavy-chain and light-chain
CN104203981A (zh) 2011-12-19 2014-12-10 合成免疫股份有限公司 双特异性抗体分子
DK2794905T3 (da) 2011-12-20 2020-07-06 Medimmune Llc Modificerede polypeptider til bispecifikke antistofgrundstrukturer
CA2854243A1 (en) 2011-12-21 2013-06-27 Simone HOEGE Rapid method for cloning and expression of cognate antibody variable region gene segments
KR101674784B1 (ko) 2012-04-05 2016-11-09 에프. 호프만-라 로슈 아게 인간 tweak 및 인간 il17에 대한 이중특이적 항체 및 이의 용도
NZ772318A (en) 2012-04-20 2023-06-30 Merus Nv Methods and means for the production of ig-like molecules
CN104379604A (zh) 2012-05-24 2015-02-25 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 多特异性抗体
JP6445429B2 (ja) 2012-06-27 2018-12-26 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 少なくとも２つの異なる標的化実体を含むテーラーメイドで選択的かつ多重特異性治療用分子を選択および作製するための方法およびその使用
CA2871882A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
WO2014012085A2 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Zymeworks Inc. Bispecific asymmetric heterodimers comprising anti-cd3 constructs
RU2646159C2 (ru) 2012-09-14 2018-03-01 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ получения и отбора молекул, включающих по меньшей мере две различные группировки, и их применение
IN2015MN00139A (zh) 2012-09-25 2015-10-16 Glenmark Pharmaceuticals Sa
KR20150064068A (ko) 2012-10-08 2015-06-10 로슈 글리카트 아게 2개의 Fab 단편을 포함하는 FC-부재 항체 및 이용 방법
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
CA2893562C (en) 2012-11-28 2023-09-12 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
WO2014104165A1 (ja) 2012-12-27 2014-07-03 中外製薬株式会社 ヘテロ二量化ポリペプチド
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
WO2014144357A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Merck Patent Gmbh Tetravalent bispecific antibodies
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
KR102306492B1 (ko) 2013-09-05 2021-09-29 아이쥐엠 바이오사이언스 인코포레이티드 불변 쇄 변형된 이특이적, 5가 및 6가 ig-m 항체
CA2922912A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific domain exchanged common variable light chain antibodies
RU2016129517A (ru) 2013-12-20 2018-01-25 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Биспецифические антитела к her2 и способы применения
KR102381685B1 (ko) 2014-01-06 2022-04-01 에프. 호프만-라 로슈 아게 1가 혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈
MX2016008540A (es) 2014-01-15 2016-09-26 Hoffmann La Roche Variantes de region fc con propiedades de union al receptor fc neonatal (fcrn).
CN110903398B (zh) 2014-01-15 2023-08-15 豪夫迈·罗氏有限公司 具有修饰的FCRN和保持的蛋白A结合性质的Fc区变体
KR20160104636A (ko) 2014-01-15 2016-09-05 에프. 호프만-라 로슈 아게 단백질 Ａ-결합이 개선된 Ｆｃ-영역 변이체
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
EP3174897B1 (en) 2014-07-29 2020-02-12 F.Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
EP2982692A1 (en) 2014-08-04 2016-02-10 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
DK3608337T3 (da) 2014-08-04 2024-06-17 Hoffmann La Roche Bispecifikke T-celleaktiverende antigenbindende molekyler
JP6810687B2 (ja) 2014-10-08 2021-01-06 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｆａｐ及びｄｒ５に特異的な二重特異性抗体と化学療法剤との併用療法
CA2963692A1 (en) 2014-10-09 2016-04-14 Engmab Ag Bispecific antibodies against cd3epsilon and ror1
CN107207609B (zh) 2014-11-20 2022-07-19 豪夫迈·罗氏有限公司 共同轻链和使用方法
EA201791121A1 (ru) 2014-11-20 2018-04-30 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Активирующие т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы против folri и cd3
CN107001482B (zh) 2014-12-03 2021-06-15 豪夫迈·罗氏有限公司 多特异性抗体
WO2017055392A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-cd3xcd44v6 bispecific t cell activating antigen binding molecules
MY192202A (en) 2015-10-02 2022-08-06 Hoffmann La Roche Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3
MX2018003820A (es) 2015-10-02 2018-12-10 F Hoffmann ­La Roche Ag Anticuerpos biespecificos especificos para un receptor de tnf coestimulador.
US20170129962A1 (en) 2015-10-02 2017-05-11 Hoffmann-La Roche Inc. Multispecific antibodies
WO2017055318A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Cd33xcd3 bispecific t cell activating antigen binding molecules
WO2017055385A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-cd3xgd2 bispecific t cell activating antigen binding molecules
EP3150636A1 (en) 2015-10-02 2017-04-05 F. Hoffmann-La Roche AG Tetravalent multispecific antibodies
WO2017055391A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules binding mesothelin and cd3
JP2018533930A (ja) 2015-10-02 2018-11-22 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性ｔ細胞活性化抗原結合分子
WO2017055393A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-cd3xtim-3 bispecific t cell activating antigen binding molecules
JP7074665B2 (ja) 2015-10-07 2022-05-24 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 共刺激ｔｎｆ受容体に対する四価の二重特異性抗体発明の分野

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060160184A1 (en) * 2003-05-30 2006-07-20 Merus Biopharmaceuticals, B.V. I.O. Fab library for the preparation of anti VEGF and anti rabies virus fabs
CN101903404A (zh) * 2007-12-21 2010-12-01 霍夫曼-拉罗奇有限公司 二价双特异性抗体
WO2010145792A1 (en) * 2009-06-16 2010-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding proteins

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106164092A (zh) * 2014-03-21 2016-11-23 瑞泽恩制药公司 表现不同结合特征的vl抗原结合蛋白
CN107987172A (zh) * 2017-11-27 2018-05-04 暨南大学 一种抑制肿瘤血管新生的peptibody多表位疫苗及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP2681239A1 (en) 2014-01-08
CA2825081A1 (en) 2012-09-07
CN103502271B (zh) 2016-10-26
BR112013019975A2 (pt) 2017-08-01
US20180312573A1 (en) 2018-11-01
MX2013009661A (es) 2014-02-11
JP2014509198A (ja) 2014-04-17
MX341921B (es) 2016-09-07
US20120237506A1 (en) 2012-09-20
JP5764677B2 (ja) 2015-08-19
US10793621B2 (en) 2020-10-06
WO2012116926A1 (en) 2012-09-07
KR101638224B1 (ko) 2016-07-08
EP2681239B8 (en) 2015-09-09
KR20130111638A (ko) 2013-10-10
RU2013141077A (ru) 2015-04-10
RU2607038C2 (ru) 2017-01-10
EP2681239B1 (en) 2015-07-22
AR085404A1 (es) 2013-09-25
US9982036B2 (en) 2018-05-29
ES2549638T3 (es) 2015-10-30

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