CN109467603B - 抗pd-1抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

抗pd-1抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本申请提供了包括新的可变区组合的抗PD‑1抗体分子，还提供了编码抗PD‑1抗体分子的核酸分子、相应的表达载体、宿主细胞以及使用噬菌体库筛选抗PD‑1抗体的方法。提供了包括抗PD‑1抗体分子的免疫缀合物、双或多‑特异性抗体分子和药物组合物。还提供了使用抗PD‑1抗体分子或其偶联物、缀合物、衍生物、组合物治疗各种疾病，如癌症疾病以及传染病的方法，以及使用抗PD‑1抗体分子检测PD‑1的方法。

Description

抗PD-1抗体及其制备方法和应用
技术领域
本申请涉及抗原抑制和抗体领域，特别地涉及调节受程序性死亡1(PD-1)受体调控的免疫应答以及通过PD-1抗原结合物治疗肿瘤。
背景技术
适应性免疫应答涉及称为T细胞和B细胞的两大类淋巴细胞的激活、选择和克隆增殖。在遭遇抗原之后，T细胞增殖并分化为抗原特异性效应细胞，而B细胞增殖并分化为抗体分泌性细胞。
T细胞激活是需要T细胞和抗原呈递细胞(APC)之间的数个信号传导事件的多步过程。为使T细胞激活，必须将两类信号递送给静息T细胞。第一类是由抗原特异性T细胞受体(TCR)介导的，并赋予免疫应答特异性；第二类信号是共刺激型的，通过T细胞上的辅助受体递送并调控应答的量级。初级共刺激信号是通过活化的共刺激分子CD28与其配体B7-1或B7-2的结合而递送的。相反，抑制性受体如细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)与相同配体B7-1或B7-2的结合却导致T细胞应答的削弱。可见，CTLA-4信号拮抗由CD28所介导的共刺激信号通路。在高抗原浓度下，CD28共刺激强于CTLA-4的抑制效应。CD28和CTLA-4表达的时序调节维持了激活和抑制信号之间的平衡，并确保了有效免疫应答的形成，同时预防了自身免疫性的发展。
本领域已鉴定了CD28和CTLA-4及其B-7样配体的分子同系物。PD-1为抑制性受体CTLA-4相似物。PD-1为50-55kDa的I型跨膜受体，其最初是在经历激活诱导的细胞凋亡的T细胞系中鉴定到的。PD-1是免疫球蛋白(Ig)超家族成员，在其胞外区含有单个IgV-样结构域，有4个重要的N连接糖基化位点并被高度糖基化，可能在与配体结合中发挥重要作用。PD-1的胞浆结构域含有两个酪氨酸，其中接近膜的酪氨酸(小鼠PD-1中的VAYEEL)位于基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)之内。PD-1上ITIM的存在预示着该分子通过募集胞浆磷酸酶发挥作用以削弱抗原受体的信号传导。胞浆区中的ITIM以及羧基末端酪氨酸(人和小鼠中的TEYATI)周围的ITIM-样基序在人和鼠直系同源物(orthologue)之间是保守的。
PD-1表达于活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞和单核细胞表面。PD-1的配体为B7家族成员PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)。本领域文献中的实验数据暗示了PD-1与其配体在下调中枢和外周免疫应答中的相互作用。PD-1缺陷型小鼠表现自身免疫表型，导致慢性进行性狼疮样肾小球肾炎和关节炎，且由于心组织中特异性自身反应性抗体的存在而引起严重的心肌病。
PD-1还是调节免疫应答的重要的免疫检查点，本领域需要研发新的PD-1活性的调节剂，由此激活免疫系统。这样的活性调节剂可以用于例如癌症免疫治疗和其他病症的治疗，例如慢性感染。PD-1途径的治疗性阻断将有助于克服免疫耐受性且有助于癌症或感染的治疗并加强疫苗接种(预防性的或治疗性的)期间的免疫性。
因此，本领域存在对用于治疗免疫紊乱的安全且有效的药物和方法的需要，所述免疫紊乱例如自身免疫病、炎性疾病、变态反应、移植物排斥、癌症、免疫缺陷症以及其它免疫系统相关紊乱。对这些紊乱中所涉及的免疫应答的调节可通过操纵PD-1通路而实现。
发明内容
目前，尚需要开发新的具有更高的结合效率的抗PD-1抗体，以有效地阻断PD-1与PD-L1的结合。因此，研发新的抗PD-1抗体使其临床药效更佳以用于癌症的免疫治疗将给患者提供更多的药物选择。
本申请的发明人经过深入的研究和创造性的劳动，通过对大量样本的噬菌体抗体库进行筛选，获得了全人源化的具有高亲和力的抗PD-1抗体。该抗体既可以以高亲和力靶向结合人的PD-1蛋白而作为具有临床应用前景的抗肿瘤抗体将被进一步开发为抗肿瘤药物，同时又能够在ELISA、Western blot、免疫组化等应用中用作检测PD-1的抗体，大大节约科研成本和时间。
本申请提供了包括新的可变区的组合，例如，轻链可变区(例如，VL1、VL2、VL3、VL4、VL5和VL6)和/或重链可变区(例如，VH1、VH2、VH3、VH4和VH5)的抗PD-1抗体分子。本申请还提供了编码抗PD-1抗体分子的核酸分子、包含该核酸分子的表达载体、包含该表达载体的宿主细胞和使用噬菌体库制备PD-1抗体的方法。还提供了包括抗体分子的免疫缀合物、双或多-特异性抗体分子和药物组合物。本文公开的抗PD-1抗体分子可以单独地或以结合其他活性剂或治疗形式治疗、预防和/或诊断疾病，如癌症(例如，实体和软组织肿瘤)，以及传染病(例如，慢性感染性疾病或脓毒症)。相应地，本文公开了使用抗PD-1抗体分子或其抗原结合片段、偶联物、缀合物、衍生物、组合物治疗疾病，如癌症疾病(例如，实体和软组织肿瘤)，以及传染病(例如，慢性感染性疾病或脓毒症)的方法。此外，还提供了使用抗PD-1抗体分子检测PD-1的方法以及检测组合物。
本申请通过人源噬菌体抗体库筛选法筛选出多个抗PD-1抗体的特异性轻链(分别为L1、L2、L3、L4、L5或L6，其各自包含3个LCDR，其中LCDR1包含SEQ NO.:1～5中的任一个，LCDR2包含SEQ NO.:6～10中的任一个，LCRD3包含SEQ NO.11～16中的任一个)和多个抗PD-1抗体的特异性重链(分别为H1，H2，H3，H4或H5，其各自包含3个HCDR，其中HCDR1包含SEQNO.17～21中的任一个，HCDR2包含SEQ NO.22～26中的任一个，HCRD3包含SEQ NO.27～31中的任一个)，并进一步获得多种具备高的PD-1结合活性的抗PD-1抗体。
以上抗体是全人源抗体或鼠源抗体，其(i)以高亲和力，例如，至少约107M-1，通常约108M-1，并且更常见地，约109M-1至1010M-1的亲和力常数、或更强的亲和力结合PD-1；(ii)以高特异性结合PD-1，同时基本上不结合CD28、CTLA-4、诱导型T细胞共刺激物(ICOS)或B细胞和T细胞衰减器(BTLA)；(iii)抑制或降低PD-1与PD-1配体(例如，PD-L1或PD-L2，或两者)的结合。
传统的抗体制备方法无法得到全人源抗体。本申请开发的人源化的高亲和力的PD-1抗体，对于肿瘤、传染病、免疫应答性疾病的临床治疗具有重要意义。
示例性地，本申请提供了以下实施方案：
1.一种分离的抗体或其功能性片段，包括特异性识别和结合免疫细胞表面抗原PD-1的结构域和来自免疫球蛋白恒定区(Fc)的恒定区域，所述特异性识别和结合免疫细胞表面抗原PD-1的结构域包括具有3个CDR的轻链可变区(抗PD-1VL)和具有3个CDR的重链可变区(抗PD-1VH)，其中，所述轻链可变区(抗PD-1VL)包含选自SEQ ID NO：1-16所示的氨基酸序列的轻链CDR(LCDR)；并且所述重链可变区(抗PD-1VH)包含选自SEQ ID NO：17-31所示的氨基酸序列的重链CDR(HCDR)。
2.根据实施方案1所述的抗体或其功能性片段，其中所述轻链可变区包括：
LCDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1、2、3、4和5中任一个所列，
LCDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6、7、8、9和10中任一个所列，和
LCDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO：11、12、13、14、15和16中任一个所列；并且
所述重链可变区包括：
HCDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：17、18、19、20和21中任一个所列，
HCDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：22、23、24、25和26所列中任一个所列，和
HCDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO：27、28、29、30和31中任一个所列。
3.根据实施方案1或2所述的抗体或其功能性片段，包括选自下组的轻链可变区：
a)轻链可变区VL1，其包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:13；
b)轻链可变区VL2，其包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:12；
c)轻链可变区VL3，其包括SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:16；
d)轻链可变区VL4，其包括SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:11；
e)轻链可变区VL5，其包括SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:13；以及
f)轻链可变区VL6，其包括SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:14。
4.根据实施方案1或2所述的抗体或其功能性片段，包括选自下组的重链可变区：
g)重链可变区VH1，其包括SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:27；
h)重链可变区VH2，其包括SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:30；
i)重链可变区VH3，其包括SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:29；
j)重链可变区VH4，其包括SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:25和SEQID NO:30；
k)重链可变区VH5，其包括SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:31。
5.根据实施方案1或2所述的抗体或其功能性片段，包括选自VL1、VL2和VL3、VL4、VL5和VL6中的任一个的轻链可变区和选自VH1、VH2、VH3、VH4和VH5中的任一个的重链可变区。
6.根据实施方案1所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段包含
分别为SEQ ID NO:1、7和11所示的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3以及分别为SEQ ID NO:17、22和27所示的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；或
分别为SEQ ID NO:4、9和15所示的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3以及分别为SEQ ID NO:18、23和28所示的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；或
分别为SEQ ID NO:5、10和16所示的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3以及分别为SEQ ID NO:19、24和29所示的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；或
分别为SEQ ID NO:2、6和12的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3；以及分别为SEQ ID NO:21、26和31的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；或
分别为SEQ ID NO:3、7和13所示的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3以及分别为SEQ ID NO:21、26和31所示的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3，并且
其中所述抗体或其功能性片段特异性地结合位于人PD-1的胞外结构域内的表位。
7.如实施方案3-6任一项所述的抗体或其功能性部分，其中，所述抗体包含一个或更多个氨基酸置换、添加和/或缺失，或在非CDR区域内的残基中具有一个或更多个保守氨基酸置换。
8.如实施方案7所述的抗体或其功能性部分，其中，所述抗体的氨基酸序列与其所来源的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。
9.一种分离的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段与根据实施方案1-8中任一项所述的抗体或其功能性片段结合的表位相同，或所述抗体或其功能性片段结合的表位与根据实施方案1-8中任一项所述的抗体或其功能性片段结合的表位重叠。
10.如实施方案1-9任一项所述的抗体或其功能性片段，其编码氨基酸序列包含SEQ ID NO:59-63任一所示序列。
11.如实施方案10所述的抗体或其功能性片段，其编码氨基酸序列轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:64所示序列，重链氨基酸序列如SEQ ID NO:65所示。
12.如实施方案11所述的抗体或其功能性片段，其编码轻链核苷酸序列如SEQ IDNO:66所示序列，编码重链氨基酸序列如SEQ ID NO:67所示。
13.如实施方案1-12任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体含有糖基化修饰。
14.如实施方案1-13任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体为天然人源的或人源化的。
15.实施方案1-14任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述重链由衍生自人VH种系的氨基酸序列构成；且所述轻链由衍生自人Vκ种系或Vλ种系的氨基酸序列构成。
16.实施方案1-14任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述恒定区域是人恒定区域，例如人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的恒定区域，优选是人IgG的恒定区域，更优选是人IgG1或IgG4的恒定区域。
17.实施方案1-16任一项所述的抗体或其功能性片段，所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、纳米抗体、单域抗体或双价抗体或其抗原结合部分，所述抗原结合部分选自Fab、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd或dAb。
18.实施方案1-16任一项所述的抗体或其功能性片段，所述抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体或三特异性抗体。
19.实施方案1～18任一项所述的抗体或其功能性片段，其具备以下功能：
(a)结合PD-1，阻断PD-L1与PD-1结合；
(b)拮抗PD-1介导的信号转导；
(c)增加T细胞增殖；
(d)增强IFN-γ的产生；或
(e)以上功能的任意组合。
20.实施方案19所述的抗体或其功能性片段，其中所述功能通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、流式细胞术或表面等离子体共振(SPR)测定来测量，所述Kd值通过等离子共振结合法测定。
21.实施方案1-18任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段结合PD-1，其对PD-1具有10-9mol/L的亲和力。
22.一种分离的核酸，其编码实施方案1所述的抗体或其功能性片段或实施方案3-6中任一项所述的重链可变区和轻链可变区或实施方案17所述的scFv。
23.实施方案22所述的核酸序列包含SEQ ID NO:54-58任一所示核苷酸序列。
24.一种包含实施方案22所述的核酸的表达载体。
25.一种包含实施方案24所述的表达载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自大肠杆菌、HEK293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞和NSO细胞。
26.一种免疫缀合物或其衍生物，包含与治疗剂偶联的根据实施方案1至13中任一项所述的抗体或其功能性片段，所述治疗剂为毒素、放射性同位素、药物或细胞毒剂。
27.一种药物组合物，包含实施方案1-21任一项的抗体或其功能性片段或实施方案25所述的免疫缀合物或其衍生物，以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
28.实施方案1-21任一项所述的抗体或其功能性片段或实施方案26所述的免疫缀合物或衍生物或实施方案27所述的药物组合物在制备用于调控受试者中的免疫应答、治疗或预防受试者中与PD-1相关的状况或PD-1介导的疾病或病症的药物中的用途。
29.根据实施方案28所述的用途，所述药物包括阻断PD-1与PD-L1结合的药物，所述阻断PD-1与PD-L1结合的药物包括通过PD-1抗体结合PD-1抗原，解除PD-1对T细胞活性的弱化调控的药物、解除PD-1对机体免疫抑制的药物或者提高T淋巴细胞中IFN-γ表达的药物。
30.实施方案1～21任一项所述的抗体或其功能性片段或实施方案26所述的免疫缀合物或其衍生物或实施方案27所述的药物组合物在制备用于治疗或预防受试者中选自自身免疫紊乱、针对移植物的免疫应答、变态反应和癌症的紊乱的药物中的用途。
31.一种治疗受试者中与PD-1相关的状况或PD-1介导的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据实施方案1-21中任一项所述的分离的抗体或其功能性片段或如实施方案26所述的免疫缀合物或其衍生物或者如实施方案27所述的药物组合物。
32.一种偶联物，包含实施方案1～21任一项所述的抗体或其功能性片段和偶联部分，其中所述偶联部分为可检测的标记；所述偶联部分为放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。
33.一种试剂盒，包括实施方案1至21中任一项所述的抗体或其功能性片段，或实施方案32所述的偶联物，所述试剂盒还包括第二抗体，所述第二抗体特异性识别所述抗体或其功能性片段；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。
34.一种增强T细胞活化的方法，所述方法包括使T细胞与根据实施方案1-21中任一项所述的抗体或其功能性片段接触。
35.一种减少受试者的肿瘤或抑制受试者的肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据实施方案1-21中任一项所述的抗体或其功能性片段。
36.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据实施方案1-21中任一项所述的抗体或其功能性片段。
37.根据实施方案28-30任一项所述的用途或实施方案34-36任一项所述的方法，其中所述受试者被鉴定为患有可能对PD-1拮抗剂响应的病症或状况，或者在来自所述个体的待测生物样品中呈PD-L1阳性或PD-L1水平上调。
38.一种治疗会从上调的免疫响应中获益的受试者的状况的方法，包括对所述受试者施用治疗有效量的根据实施方案1-21中任意一项所述的抗体或其功能性片段。
39.根据实施方案28-30任一项所述的用途或实施方案34-37任一项所述的方法，用于治疗选自癌症，感染性疾病和炎性疾病的状况。
40.根据实施方案39所述的用途或方法，其中所述癌症，感染性疾病和炎性疾病与PD-1相关。
41.根据实施方案39所述的用途或方法，其中所述癌症选自胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、食道癌、小肠癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、黑素瘤、肾癌、前列腺癌、乳癌、结肠癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肾上腺癌、肛区癌、阴户癌、尿道癌、阴茎癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、表皮样癌、鳞状细胞癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、内分泌系统的癌症、软组织肉瘤、中枢神经系统的赘生物、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、T细胞淋巴瘤、慢性或急性白血病(其包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童期实体瘤和淋巴细胞性淋巴瘤中的一种或更多种。
42.根据实施方案39所述的用途或方法，其中所述感染性疾病选自HIV，流行性感冒，疱疹，贾第虫病，疟疾，利什曼病，或以下病毒引起的感染：肝炎病毒(例如甲型、乙型或丙型肝炎病毒)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II、CMV或埃巴二氏病毒)、腺病毒、流感病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、黄病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、JC病毒和虫媒病毒性脑炎病毒，或以下细菌引起的感染：肺炎球菌、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、脑膜炎球菌、淋球菌、沙雷氏菌、克雷伯氏菌、变形菌、假单胞菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、白喉杆菌、肉毒杆菌、炭疽杆菌、破伤风梭菌、军团菌、鼠疫杆菌、钩端螺旋体病或莱姆氏病细菌，或以下真菌引起的感染：曲霉(例如烟曲霉、黑曲霉等)、假丝酵母(例如白色假丝酵母)、克鲁斯假丝酵母、光滑假丝酵母、热带假丝酵母、新型隐球酵母、皮炎芽酵母、毛霉目的属(例如毛霉属，犁头霉属或根霉属)、申克氏孢子丝菌、巴西副球孢子菌、粗球孢菌或加膜组织胞浆菌，或以下寄生虫引起的感染：痢疾内变形虫、结肠肠袋虫、福纳氏虫、棘变形虫、间日疟原虫、田鼠巴贝虫、吸吮贾第虫、隐孢子虫、卡氏肺囊虫、布鲁斯锥虫、克鲁兹锥虫、多氏利什曼虫、鼠弓浆虫或巴西日圆线虫。
43.根据实施方案39所述的用途或方法，其中所述疾病为癌症，所述癌症包括肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌或头颈癌、肠癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、；所述感染性疾病为慢性病毒感染、细菌感染或寄生虫感染疾病，所述慢性病毒为HIV、HBV或HCV。
44.实施方案28～30任一项所述的用途或实施方案34-37任一项所述的方法，其中所述用途或方法是预防性的，并在癌症、自身免疫疾病、传染病或影响T细胞数目或影响健康的疾病的任何症状出现之前被提供。
45.实施方案1至21中任一项所述的抗体或其功能性片段或实施方案32所述的偶联物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测PD-1在样品中的存在或其水平。
46.一种检测样品中的PD-1的存在的方法，所述方法包括使实施方案1-21中任一项所述的抗体或其功能性片段或权利要求26所述的免疫缀合物或其衍生物或权利要求32所述的偶联物与所述样品接触。
47.一种用于检测样品中的PD-1的存在的组合物，所述组合物包含实施方案1-21中任一项所述的抗体或其功能性片段。
48.一种制备实施方案1-21中任一项所述的抗体的方法，所述方法是噬菌体展示法。
附图说明
图1是扩增的天然人源抗体的VH基因和VL基因的电泳图。
图2是天然人源scFv的DNA电泳图。
图3是插入天然人源scFv基因后的pCANTAB-5E载体图。
图4是扩增αPD-1scFv的VH和VL基因的电泳图。
图5是αPD-1scFv的DNA电泳图。
图6是噬菌体库技术筛选包含BXOS抗PD-1scFv的单克隆候选噬菌体的ELISA结果。
图7示出了第16号包含BXOS抗PD-1scFv的单克隆候选噬菌体阻断PD-1/PD-L1结合的实验结果。
图8是用于BXOS抗PD-1全抗体表达的载体pBudCE4.1的图谱。
图9是BXOS抗PD-1全抗体与PD-1抗原的亲和力测定的结果。
图10A-图10C分别是成熟的DC细胞表面、流式细胞术检测的DC细胞纯度及DC细胞表面上PD-L1的表达的图像。
图11A-图11C是流式细胞术检测T细胞表面的PD-1表达的图像。
图12A-图12B是流式细胞术检测T细胞凋亡的图像。
图13显示了BXOS抗PD-1全抗体对PD-L1/293T-PD-1细胞的结合的阻断作用。
图14显示了BXOS抗PD-1全抗体促进PBMC杀伤HepG2-luc肿瘤细胞的作用。
具体实施方式
下面通过实施例来描述本申请的实施方式，本领域的技术人员应当认识到，这些具体的实施例仅表明为了达到本申请的目的而选择的实施技术方案，并不是对技术方案的限制。根据本申请的教导，结合现有技术对本申请技术方案的改进是显然的，均属于本申请保护的范围。
以下实施例中所使用的药品和试剂，无特别说明，均为普通市售商品。
实施例1：天然人源噬菌体抗体库的建立
所用的引物及其序列如表1，划线部分为限制性内切酶位点。
表1.引物及其序列
Figure GDA0002133701830000141
人外周血淋巴细胞的分离及总RNA的提取
分别采集50份年龄分布在20～50周岁之间的健康志愿者的新鲜外周血40ml，装入抗凝管，加入等体积的淋巴细胞分离液(购自天津灏洋生物公司)，按照厂家说明书进行淋巴细胞的分离，在水平离心机中于800g下离心15分钟，用移液枪吸取淋巴细胞层到新离心管中，加PBS缓冲液洗涤1次后用PBS重悬淋巴细胞，细胞计数确定每份外周血获得的淋巴细胞数量约为5×107。使用TRIzol Reagent(Invitrogen，15596026)从所获得的淋巴细胞中提取总RNA。
人源抗体重链和轻链可变区基因的扩增
按照SuperscriptTM III First strand Synthesis system(Invitrogen，18080051)产品说明书以Oligo dT为反转录引物进行逆转录PCR反应，将淋巴细胞总RNA逆转录成cDNA。以该cDNA为模板，经PCR对人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因进行扩增，其中VL又分为Kappa(Vκ)和Lambda(Vλ)两种类型，通过将编码接头序列(Gly4Ser)3的DNA的一部分作为重叠互补部分将VH与VL基因进行拼接，形成单链可变区基因片段(scFv)。采用一组能够覆盖全部VH或VL编码序列的特异性引物Library F(SEQ ID NO:68)和Library R(SEQ ID NO:69)(见以上表1)，使用Prime STAR
Figure GDA0002133701830000161
DNA Polymerase(TAKARA，R405A)进行PCR基因扩增反应。扩增条件为：98℃5s；98℃5s，56℃5s，72℃5s，共30个循环；72℃90s。VH基因的正向引物引入Sfi I酶切位点，反向引物引入部分接头序列。VL的正向引物引入与重链反向引物互补的接头序列，反向引物引入Not I酶切位点。待反应结束后，将PCR产物经2.0％的DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示扩增得到的VH基因长度为390bp左右，VL基因长度为350bp左右(图1)。使用QIAquick胶回收试剂盒(QIAGEN,28706)对目的基因条带进行回收。参照人抗体胚系基因各亚型出现比例分别混合扩增所得的VH和VL基因片段，并利用VH和VL基因片段中的添加的接头序列经重叠延伸PCR拼接为scFv基因库(图2)。
天然人源scFv噬菌体抗体库的构建
将如上获得的scFv基因插入噬菌体载体pCANTAB-5E中。分别用限制性内切酶SfiI(NEB，R0123S)和Not I(NEB，R3198L)对scFv和pCANTAB-5E进行双酶切，纯化后将scFv基因的酶切产物与酶切处理的pCANTAB-5E载体使用T4DNA连接酶(NEB，M0202L)连接(图3)。连接分批进行，共进行10批，每批50个连接体系，经乙酸钠乙醇沉淀法浓缩后，溶于50μL无菌水中，经电击转化至5mL XL1-BLUE感受态细胞(购自Stratagen)后取适量转化菌均匀涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的2YT平板上，以计算库容量，其余的转化菌培养至对数生长期，加入辅助噬菌体M13KO7，于37℃220rpm培养1h，加入50μg/mL卡那霉素，30℃培养过夜。次日，用PEG8000/NaCl将制备的噬菌体进行沉淀以浓缩纯化，用1％初始体积的15％甘油溶液重悬，即得到天然人源scFv噬菌体抗体库，取1μL进行滴度测定，其余-80℃保存。经10批连接产物的转化，获得天然人源scFv噬菌体抗体库，库容量为1x109，滴度为1x1012。
天然人源scFv噬菌体抗体库的多样性分析
以获得的噬菌体抗体库感染XL1-BLUE活化菌涂布平板37℃孵箱过夜，随机挑取20个菌落增菌培养，提取质粒测定基因序列，对测序结果进行Blast和比对分析。结果发现，20条基因序列都属于抗体序列，但各不相同，表明该噬菌体抗体库多样性很好。
实施例2 抗PD-1单克隆抗体的筛选
1.PD-1抗原对噬菌体抗体库淘选
以10μg/mL的人PD-1重组蛋白(Acro Biosystems，PD-1-H5221)1mL包被免疫管，抗原包被量为10μg/1mL/管，4℃包被过夜；经PBS洗涤1遍后加4mL 3％脱脂奶粉/PBS(MPBS)封闭免疫管，室温3h；加1mL实施例1中制备得到的天然人源噬菌体抗体库，投入量为109-1012个/管，室温孵育3h。PBST-PBS洗涤20遍，0.1M PH2.2的Glycine-HCl洗脱，用1.0M PH8.8的Tris-HCl中和洗脱下来的噬菌体溶液至pH7.0左右，用于感染1mL XL1-BLUE活化菌，37℃培养箱中静置20min，补足2YTA培养基到20mL，吸取10μL菌液涂布于2YTA平板上，用于计数噬菌体抗体产出量；剩余菌液37℃振荡培养1h，用2YTA培养液补至100mL，摇至对数期后加入M13KO7辅助噬菌体，37℃，220rpm，孵育1h。加入50μg/mL卡那霉素，30℃培养过夜。次日，用PEG8000/NaCl进行沉淀以浓缩纯化，用1mL 15％甘油水溶液重悬。浓缩的噬菌体用于下一轮筛选。共进行三轮噬菌体库富集筛选，获得本发明的包含BXOS抗PD-1scFv的噬菌体库。
2.阳性对照αPD-1scFv噬菌体的制备
参照已上市的抗PD-1单抗Nivolumab的基因序列，分别化学合成其VH和VL基因。利用实施例1中的VH/VL基因扩增引物进行PCR扩增，产物经2.0％的DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定，显示VH基因长度为390bp左右，VL基因长度为350bp左右(图4)。使用QIAquick胶回收试剂盒对目的基因条带进行回收。利用VH和VL基因的接头重叠互补序列经PCR反应拼接为抗PD-1scFv阳性对照基因，指定为αPD-1scFv(图5)。将αPD-1scFv阳性对照基因插入噬菌体载体pCANTAB-5E中，分别用限制性内切酶SfiI和NotI对αPD-1scFv基因和pCANTAB-5E载体进行双酶切，纯化后将αPD-1scFv基因的酶切产物与酶切处理的pCANTAB-5E载体使用T4DNA连接酶进行连接。经电击转化转入XL1-BLUE感受态细胞，取适量转化菌均匀涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的2YTAG平板上，37℃倒置过夜培养。次日挑取单克隆，震荡培养至对数生长期，加入辅助噬菌体M13KO7，37℃感染培养1h后加50μg/mL卡那霉素，30℃培养过夜。次日离心取上清液即得到αPD-1scFv抗体阳性对照噬菌体，取1μL上清液进行滴度测定，滴度约为1x1012。
3.包含BXOS抗PD-1scFv的单克隆候选噬菌体的ELISA筛选
(1)将步骤1经三轮淘筛获得的噬菌体感染对数生长期的XL1-BLUE菌，室温20min，涂2YTA板37℃培养过夜。挑取单菌落增菌培养，至对数生长期后加入M13KO7辅助噬菌体，30℃振荡培养过夜，离心取上清即为噬菌体抗体。
(2)以50μL 2μg/mL的人PD-1重组蛋白包被ELISA板，4℃过夜。用200μL 3％的MPBS封闭，37℃3h。将50μL(1)得到的噬菌体抗体加入ELISA板孔，37℃孵育1.5h；PBST洗板3遍，加入抗M13单克隆抗体/HRP(北京义翘神州科技有限公司,11973-MM05-50)进行孵育，37℃1h；TMB显色剂显色，2M硫酸终止后测A450值。同时用步骤2得到的αPD-1scFv阳性对照噬菌体作为阳性对照。筛选结果见表2和图6。
表2抗PD-1scFv的单克隆候选噬菌体与PD-1的结合
Figure GDA0002133701830000181
Figure GDA0002133701830000191
Figure GDA0002133701830000201
4.测序：
根据3的结果，确认高亲和力的scFv1、scFv2、scFv3、scFv4、scFv5，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.54、55、56、57和58所示，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.59、60、61、62和63所示。
表3
Figure GDA0002133701830000202
Figure GDA0002133701830000211
实施例3 包含BXOS抗PD-1scFv的单克隆候选噬菌体16号对PD-1/PD-L1结合的阻断作用
利用生物素标记的PD-1:PD-L1抑制剂筛选试剂盒(AcroBiosystems，EP-101)检测实施例2步骤3筛选所得的BXOS抗PD-1噬菌体候选单克隆16号对PD-1/PD-L1结合的阻断作用。参照产品说明书进行，简要来说，以100μL/孔2μg/mL的PD-L1包被ELISA板4℃过夜；加200μL/孔3％MPBS 37℃封闭3h。在离心管中加入0.6μL生物素化PD-1(100μg/mL)和不同稀释度待测样品溶液100μL，37℃孵育1.5h，同时设置实施例2步骤2制备的噬菌体为阳性对照，将M13KO7噬菌体设置为阴性对照。将测试样品和对照样品加入ELISA板，37℃孵育1.5h；PBST洗涤4遍，加100μL/孔HRP标记的链霉亲和素(0.4μg/mL)进行孵育，37℃1h。PBST洗涤4遍后显色测A450值(图7)。
阻断结果见下表4。
表4抗PD-1scFv的单克隆候选噬菌体对PD-1/PD-L1的阻断率
阻断率
噬菌体16号原液 46.1％
噬菌体16号稀释2倍 32.3％
噬菌体16号稀释5倍 13.8％
噬菌体16号稀释10倍 16.9％
阳性对照αPD-1scFv噬菌体 47.7％
阳性对照αPD-1单克隆抗体 70.7％
阳性对照αPD-1单克隆抗体：Anti-PD1mAb，Human(IgG4)Lot No.B52-63NS1-AS,ACRO Biosystems
结果表明：16号噬菌体原液可以明显阻断PD1/PDL1的结合，阻断率为46.1％，与阳性对照αPD-1scFv噬菌体(阻断率为47.7％)相当，且存在剂量依赖关系，浓度越大，阻断率越高。
实施例4 16号BXOS抗PD-1全抗体的制备
将包含BXOS抗PD-1scFv的单克隆候选噬菌体16号的VH和VL(Vκ)基因分别与人类抗体重链恒定区(Cγ4)基因和轻链恒定区(Cκ1)基因融合，形成完整的重链和轻链基因，通过PCR获得在重链基因两端引入HindⅢ和XbaI酶切位点，轻链基因两端引入NotI和XhoI酶切位点的BXOS抗PD-1全抗体的编码核苷酸序列，将该全抗体的编码核苷酸序列插入表达载体pBUdCE4.1(图8)。
将构建好的表达载体经电穿孔导入HEK293T/17细胞，进行全抗体表达，得到16号BXOS抗PD-1全抗体。
BXOS抗PD-1全抗体的轻链氨基酸序列如SEQ.ID.NO.64所示，核苷酸序列如SEQ.ID.NO.66所示，LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:3，LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:7，LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:13；重链氨基酸序列如SEQ.ID.NO.65所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.67所示，HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO.21，HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:26，HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:31。
实施例5：等离子共振法测定实施例4所得的16号BXOS抗PD-1全抗体的亲和力
仪器和试剂：
仪器：Reichert 4SPR(表面等离子体共振仪)
芯片:Planar Mixed SAM,13206061
反应温度:25℃
缓冲液:PBST(0.05％Tween-20,5％DMSO)
再生液：10mM Gly PH2.0
1.抗原固定：
1)取商品化PD-1抗原(PD-1-PE，货号：329906，厂家：biolegend)，使用PH4.5 10mM乙酸钠将其稀释成1μg/mL的浓度，以25μL/min流速进样40s将其负载到表面等离子体共振仪(Reichert4SPR，赫航科学仪器(上海)有限公司)，使最终芯片抗原结合量达到50RU。
2)使用0.05％PBST缓冲液稀释阳性对照抗PD-1抗体(China/T&L，TL-106，北京同立海源生物科技有限公司)配制成100nM、30nM、10nM三个浓度，均以流速25μl/min进样结合2min，解离3min，观察到这3个浓度均有反映值并且100nM对应的反映值接近饱和，由此确定PD-1抗原的固定量50RU能满足试验需求。
2.对照抗体进样：使用0.05％PBST缓冲液稀释对照抗体，将其配制成3.125nM、6.25nM、12.5nM、25nM、50nM和100nM的浓度梯度，以流速25μl/min进样，结合2min，解离3min。传感器芯片的再生条件为PH2.0 10mM Gly溶液，流速30μl/min，进样时间30s。
3.BXOS抗PD-1全抗体(HEK293T表达纯化的抗PD-1单抗(分子量约为150KD))进样：方法同2。
实验结果参见图9，其中本申请的BXOS抗-PD-1全抗体的Ka(1/(M*s))为1.24E+05，Kd(1/s)为6.57E-04，KD(M)为5.32E-9。结果显示，本申请的抗PD-1抗体与抗原的亲和力可满足治疗需求。
实施例6 16号BXOS抗PD-1抗体对流式细胞抗PD-1抗体与T细胞表面PD-1结合的阻断作用
实验方案：
1、成熟DC培养
(1)抽取50mL志愿者A捐献的外周血。
(2)使用淋巴分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，LTS1077)按照厂家说明分离外周血单核细胞(PBMC)。
(3)使用1640无血清培养基重悬PBMC，调整细胞密度2×106个/mL，加入到细胞培养瓶，于37℃，5％CO2培养箱孵育1.5-2h。弃去悬浮细胞和培养基，使用培养基洗涤2遍，然后加入完全培养基(含10％FBS、10ng/mL IL-4、20ng/mL GM-CSF)。
(4)在第1、3、5天每天加入IL-4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以保持IL-4浓度为10ng/mL，GM-CSF浓度为20ng/mL。
(5)在第7天加入成熟因子TNF-α(终浓度10ng/mL)。
(6)继续培养至第9天，加入终浓度10μg/mL的脂多糖(LPS)以促进树突状细胞(Dendritic Cells,DC)表达PD-L1分子。
(7)加入LPS后24h，流式细胞术分析DC表面B7-H1(PD-L1)的表达。
结果参见图10。DC细胞为体内最重要的抗原呈递细胞(APC)，成熟的DC细胞表面有许多树突状突起(参见图10A)。成熟的DC细胞高表达CD80和CD86分子，通过流式细胞术检测CD80和CD86等分子，可以计算出DC细胞纯度及成熟程度。图10B显示CD11c+CD86+细胞占比例为97.32％，说明培养的成熟DC细胞纯度达到97.32％。图10C使用PE抗-human CD274(B7-H1,PD-L1)(KeMinbio，SZB12619)，检测DC细胞表面PD-L1分子表达，显示所有的DC细胞都高表达PD-L1分子。
2、混合淋巴细胞培养
(1)抽取志愿者B的外周血，提取单核细胞(MNC)，将所得MNC与成熟的DC按照10:1的比例加入到96孔板(U型底)，每孔MNC0.1×106个，每孔终体积200μl。
(2)将混合培养的MNC分为2组，一组加入实施例2第3步筛选得到的BXOS抗-PD-1(5μg/mL)，一组加入PBS。
(3)混合培养第3天流式细胞术检测MNC中T细胞的PD-1表达。
3、16号BXOS抗PD-1抗体对流式细胞抗-PD-1抗体与T细胞表面PD-1结合的阻断作用：
(1)收集混合培养的T细胞，使用冷的PBS洗涤2次。
(2)用冷的PBS重悬混合培养的T细胞，调整细胞密度1×106个/mL。
(3)每管取100μL(1×105个)细胞悬浮液。
(4)加入CD3-APC(1mg/ml)和PD-1-PE(1mg/ml)各1μL。
(5)冰上避光孵育30min。
(6)PBS洗涤2次，100μL PBS重悬浮细胞。
(7)流式细胞术检测T细胞表面PD-1表达。
结果参见图11A-11C。图11A显示，单独培养MNC 3天后，T细胞表面PD-1表达量为26.21％；图11B显示，当MNC与DC混合培养后，PD-1表达量为32.65％(图B)，因为DC细胞表面高表达PD-L1，促进T细胞表面PD-1分子的表达；图11C显示，MNC与DC混合培养并同时添加BXOS-抗-PD-1全抗体，PD-1表达量减少为0.25％。图11A-11C说明，在本申请的BXOS抗-PD-1全抗体存在的情况下，商品化的抗PD-1的流式抗体PD-1-PE(biolegend，329906)不能与T细胞表面的PD-1分子结合，这表明本申请的BXOS抗PD-1全抗体已经与T细胞表面PD-1分子的结合。
实施例7 16号BXOS抗PD-1抗体减少了DC细胞表面PD-L1诱导的T细胞凋亡
流式抗体：
CD3-APC，货号：300312，厂家：biolegend
PD-1-PE，货号：329906，厂家：biolegend
凋亡试剂盒：ANNEXIN V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(索莱宝生物科技有限公司，CA1020-50T)
操作步骤：
(1)使用27mL的去离子水稀释3ml结合缓冲液(10×)至30mL，每次用3mL。
(2)收集细胞(1×106个/次)，然后使用冷的PBS洗涤。
(3)使用1mL 1×的结合缓冲液悬浮细胞，300g离心10min，弃上清。
(4)使用1mL 1×的结合缓冲液重悬细胞，使细胞密度达到1×106个/mL。
(5)每管加入100μL细胞(1X105个)和CD3-APC(1mg/mL)1μL，避光冰浴30min。
(6)冷PBS洗涤2次，100μl PBS重悬细胞，加入5μL Annexin V-FITC，室温，避光10min。
(7)加入5μL PI，室温，避光孵育5min。
(8)加PBS至体积为500μL，混匀。
(9)在1h内在流式细胞仪上完成检测。
结果参见图12。从图12A我们可以看出，AnnexinV-FITC+PI+双阳性细胞占11.72％(晚期凋亡T细胞)，而在图12B中AnnexinV-FITC+和PI+双阳性细胞占5.41％，说明本申请的BXOS抗PD-1全抗体通过与T细胞表面PD-1分子结合，阻止了DC细胞表面PD-L1分子与PD-1分子的结合，减少了T细胞的凋亡。
实施例8 16号BXOS抗PD-1全抗体对PD-L1/293T-PD-1细胞的结合的阻断作用
通过流式细胞术(FACS)检测BXOS抗PD-1全抗体与293T-PD-1细胞的结合。293T-PD-1细胞系是由申请人自行构建的可以稳定表达PD-1抗原的细胞系。
方法如下：
1)取293T-PD-1细胞，1.5E+5细胞/50μL/管，每管加入2μL PD-L1(ACROBiosystems,PD1-H5229)(0.4μg/μL)，分别加入BXOS抗PD1全抗体(0.95μg/μL)0、0.3、0.5、1、2、4、8μl，于4℃孵育60min；
2)PBS洗涤两遍；
3)每管加入1.5μL Anti-PD-L1antibody APC流式抗体(Biolegend,329707)，混匀，4℃孵育35min
4)PBS洗涤2次，并在流式细胞仪上测定结果。
结果如图13所示。随着BXOS抗PD-1全抗体加入量越高，PD-L1与293-PD-1细胞的结合能力越弱，且呈剂量依赖关系，说明BXOS抗PD-1全抗体对PD-1/PD-L1的结合有明显的阻断作用。
实施例9 16号BXOS抗PD-1全抗体促进PBMC杀伤HepG2-luc肿瘤细胞的作用
测定了16号BXOS抗PD-1全抗体对PBMC杀伤epG2-luc肿瘤细胞的作用。方法如下：
1)PBMC的分离：淋巴细胞分离液Ficoll分离人外周血单个核细胞PBMC；
2)细胞计数：计数PBMC，调整浓度至107/mL；计数HepG2-luc细胞，调整浓度至2×105/mL；
3)将PBMC以50μL/孔的浓度加入圆底96孔板中，向50μL PBMC细胞中加入20nMBXOS抗PD1全抗体样品50μL(终浓度10nM)，共三个复孔；阴性对照加入等体积的PBS溶液；
4)将HepG2-luc细胞以50μL/孔的浓度加入圆底96孔板中，同样按照实验分组加入20nM BXOS抗PD1全抗体样品50μL(终浓度10nM)，共三个复孔；
5)将3和4步骤的细胞分别于37℃培养箱静置10min；
6)把4步骤的HepG2-luc细胞移至3步骤的PBMC中，混合均匀，制备成效靶比为10:1的杀伤孔，每孔终体积为200μL，置于37℃培养箱培养；
7)16h后取出96孔板，每孔加入100μL D-luc底物，用小动物成像仪检测生物发光的荧光强度。
结果如下表5和图14所示。
表5
H+P BXOS抗PD1全抗体10nM
杀伤率％ 43.25 62.66
40.66 51.52
43.62 63.00
平均值 42.51 59.06
表5和图14的数据表明，BXOS抗PD-1全抗体在10nM浓度下将PBMC对HepG2的杀伤率由42.51％提高到了59.06％，显著促进了PBMC细胞对肿瘤细胞HepG2-luc的杀伤。
虽然本申请所披露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本申请而采用的实施方式，并非用以限定本申请。任何本申请所属领域内的技术人员，在不脱离本申请所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本申请的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。
序列表
<110> 拜西欧斯（北京）生物技术有限公司
<120> 抗PD-1抗体及其制备方法和应用
<150> 201711123026.5
<151> 2017-11-14
<160> 69
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
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1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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1 5 10
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Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Val Ser
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<211> 11
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<211> 7
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<211> 7
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1 5
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Ser Ile Ser Arg Ser Ser Asp Tyr Ile
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Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
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<210> 25
<211> 16
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Pro Ile Ile Pro Ile His Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
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Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg
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Asp Ser Trp Ile Tyr Asp Gly Ser
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Gln Ala His Tyr Tyr Asn Tyr Ser
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Pro Leu Pro Lys Asn Gly Val Tyr Pro
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Gly Asp Asp Ile Ala Thr Gly Gly Ile Arg Arg Tyr Tyr Tyr Asn Gly
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Asn Asp Asp Tyr
1
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccsaggtsc agctggtrca gtctgg 56
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<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 33
gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccsaggtgc agctgktgga g 51
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 34
gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccagrtca ccttgaagga gtct 54
<210> 35
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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agagccacct ccgcctgaac cgcctccacc tgaggagacr gtgaccaggg tkcc 54
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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agagccacct ccgcctgaac cgcctccacc tgaggagacr gtgaccaggg tkcc 54
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<212> DNA
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agagccacct ccgcctgaac cgcctccacc tgaagagacg gtgaccattg t 51
<210> 38
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 38
agagccacct ccgcctgaac cgcctccacc tgaggagacg gtgaccgtgg t 51
<210> 39
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 39
ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg gmcatccrgw tgacccagtc tcc 53
<210> 40
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 40
ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg gatattgtga tgacycagwc tcc 53
<210> 41
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 41
ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg gaaattgtgw tgacrcagtc tcc 53
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<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 42
ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg gaaacgacac tcacgcagtc t 51
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 43
gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatytccasc ttggtccc 48
<210> 44
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 44
gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatatccact ttggtccc 48
<210> 45
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 45
gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt aatctccagt cgtgtccc 48
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 46
ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg cagtctgtgy tgackcagcc 50
<210> 47
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 47
ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg cagtctgccc tgactcagcc 50
<210> 48
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 48
ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg tcctmtgagc tgacwcag 48
<210> 49
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 49
ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg cagtytgtgc tgactcaatc 50
<210> 50
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 50
ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg cagrctgtgg tgacycagga g 51
<210> 51
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 51
ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg cagkmtgrgc tgaygcagcc accctc 56
<210> 52
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 52
ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg cagkmtgrgc tgaygcagcc accctc 56
<210> 53
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 53
gagtcattct cgacttgcgg ccgcacctar racggtsasc tkggtccc 48
<210> 54
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
caggtccagc tggtacagtc tgggggagac ctggtcaagc cgggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcga cgtctggatt caccttcagt acctataaca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcg attagtcgta gcagtgatta catttattac 180
gcagactcag tgaagggccg attcaccatg tccagagaca acgccaagac gtcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgacgac acggctgtgt attattgtgc gagagattca 300
tggatctatg atggtagtgg ttattcctct gatgcttttg atatctgggg ccaagggaca 360
atggtcaccg tctctggtgg aggcggttca ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg 420
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 480
ctctcctgca gggccagtca gagcattagc agctacttat cctggtatca gcagaaacct 540
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 600
aggttcagtg gcggtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 660
gaggattttg cagtttatta ctgtcaacag cgtaacagct ggccgctcac tttcggcgga 720
gggaccaagg tggagatcaa acgt 744
<210> 55
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaagtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt cagtttccgt aattatgaca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaggg ggctggagtg ggtggcagtt acatggtatg atggaagtaa caaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca actccaagaa cacagtatat 240
ctgcacataa acagcctgag agccgaggac acggctgtat attactgtgc gaaagatcaa 300
gctcattatt acaattattc tactggtcat ttttcctact attttgactc ctggggccag 360
ggaaccctgg tcactgtctc cggtggaggc ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc 420
ggatcggaaa ttgtgttgac gcagtctcca gccaccctgt ctttgtctcc agggcaaaga 480
gccaccctct cctgcaggac cagtcagact attaggaaac acttagcctg gtatcaacaa 540
aaacctgggc aggctccccg tctcctcgtt tatgatattt ctagtagggc cacaggcatc 600
ccagccaggt ttagtggcag tgggtctggg acagacttca ctctcaccat cagcagcctg 660
caacctgatg attttgcaac ttattactgc caacgatatg atacatatcc gcggacgttc 720
ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgt 750
<210> 56
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 56
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240
aaggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc ggcacccctc 300
ccgaaaaatg gggtttaccc ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcaggtgga 360
ggcggttcag gtggaggcgg ttcaggcgga ggtggctctg gcggtggcgg atcggaaatt 420
gtgatgacac agtctccagc taccctgtct tcctctccag gggaaagagt caccctctcc 480
tgcagggcca gtcagagcgt tactagtcac ttagcctggt accaacaaag acctggccag 540
gctcccaggc tcctcattta tgatgcatcc aagagggcca ctggcatccc agccaggttc 600
agtggcagtg gatccgggac agacttcact ctcaccatca gcagcctaga gcctgaagat 660
tttgcaactt attactgtct acaggattac agataccccc ggacgttcgg ccaagggacc 720
aaggtggaaa tcaaacgt 738
<210> 57
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 57
caggtccagc tggtacagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgtag cgtctggatt caccttcagt aactctggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atttggtatg atggaagtaa aagatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgttt 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gacaaacgac 300
gactactggg gccagggcac cctggtcact gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga 360
ggtggctctg gcggtggcgg atcggaaatt gtgatgacgc agtctccagc caccctgtct 420
ttgtctccag gggaaagagc caccctctcc tgcagggcca gtcagagtgt tagcagcaac 480
ttagcctggt accagcaaaa acctggccag gctcccagac tcctcatcta tgatgcttcg 540
acccgggcca ctggcatccc agccaggttc agcggcagtg gatctggcac cgatttcact 600
ctcaccatca gcagcctaca gcctgaagat tttgcgactt attactgtct gcaagattac 660
aattaccctc ggacgttcgg ccaggggacc aagctggaaa tcaaacgt 708
<210> 58
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 58
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
gactgtaaag cgtctggaat caccttcagt aactctggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atttggtatg atggaagtaa aagatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgttt 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gacaaacgac 300
gactactggg gccagggaac cctggtcact gtctcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga 360
ggtggctctg gcggtggcgg atcggaaatt gtgatgacac agtctccagc caccctgtcc 420
ttgtctccag gtgaaagagc caccctctcc tgcagggcca gtcagagtgt tagcagctcc 480
gtatcctggt accaacagaa acttggccag gctcccaggc tcctcatcta tgatgcatcc 540
aacagggcca ctggcatccc agccaggttc agtggcagtg ggtctgggac agacttcact 600
ctcaccatca gcagcctaga gcctgaagat tttgcagttt attactgtca gcagcgtagc 660
aagtggccgc tcactttcgg cgcagggacc aaggtggaga tcaaacgt 708
<210> 59
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Arg Ser Ser Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Trp Ile Tyr Asp Gly Ser Gly Tyr Ser Ser Asp Ala
100 105 110
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr
145 150 155 160
Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ser Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser
180 185 190
Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala
210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Asn Ser Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly
225 230 235 240
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
245
<210> 60
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Arg Asn Tyr
20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Thr Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu His Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gln Ala His Tyr Tyr Asn Tyr Ser Thr Gly His Phe Ser
100 105 110
Tyr Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile
130 135 140
Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gln Arg
145 150 155 160
Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Gln Thr Ile Arg Lys His Leu Ala
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Val Tyr Asp
180 185 190
Ile Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp
210 215 220
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asp Thr Tyr Pro Arg Thr Phe
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
245 250
<210> 61
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 61
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Lys Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Pro Leu Pro Lys Asn Gly Val Tyr Pro Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ser Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser
145 150 155 160
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser His Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Arg
180 185 190
Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
195 200 205
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
210 215 220
Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Arg Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Lys Val Glu Ile Lys Arg
245
<210> 62
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 62
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
130 135 140
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
145 150 155 160
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
165 170 175
Tyr Asp Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
195 200 205
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Arg
210 215 220
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
225 230 235
<210> 63
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 63
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
130 135 140
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
145 150 155 160
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
165 170 175
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
195 200 205
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Leu
210 215 220
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
225 230 235
<210> 64
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 65
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
115 120 125
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
180 185 190
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala
210 215 220
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
245 250 255
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
260 265 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
305 310 315 320
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
325 330 335
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
340 345 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
355 360 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
370 375 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
385 390 395 400
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
405 410 415
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
420 425 430
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 66
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
gagatcgtga tgacccagag ccctgccacc ctgagcctga gccctggcga gagggccacc 60
ctgagctgca gggccagcca gagcgtgagc agcagcgtga gctggtacca gcagaagctg 120
ggccaggccc ctaggctgct gatctacgac gccagcaaca gggccaccgg catccctgcc 180
aggttcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctggagccc 240
gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag aggagcaagt ggcccctgac cttcggcgct 300
ggcaccaagg tggagatcaa gaggaccgtg gccgctccca gcgtgttcat cttccctccc 360
agcgacgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420
cccagggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480
gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600
ctgagcagcc ccgtgaccaa gagcttcaac aggggcgagt gc 642
<210> 67
<211> 1320
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
caggtgcagc tggtggagtc cggcggaggc gtggtgcagc ccggacgcag cctgcgcctg 60
gactgcaagg ccagcggcat caccttcagc aacagcggca tgcactgggt gaggcaggcc 120
cctggcaagg gcctggagtg ggtggccgtg atctggtacg acggctccaa gaggtactac 180
gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgttc 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caccaacgac 300
gactactggg gccagggcac cctggtgacc gtgagcagcg ccagcaccaa gggccccagc 360
gtgttccccc tggccccctg cagcaggagc accagcgaga gcaccgccgc cctgggctgc 420
ctggtgaagg actacttccc cgagcccgtg accgtgagct ggaacagcgg cgccctgacc 480
agcggcgtgc acaccttccc cgccgtgctg cagagcagcg gcctgtacag cctgagcagc 540
gtggtgaccg tgcccagcag cagcctgggc accaagacct acacctgcaa cgtggaccac 600
aagcccagca acaccaaggt ggacaagagg gtggagagca agtacggccc tccctgcccc 660
agctgccctg ctcccgagtt cctgggaggc cccagcgtgt tcctgttccc tcccaagccc 720
aaggacaccc tgatgatcag caggaccccc gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc 780
caggaggacc ccgaggtgca gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc 840
aagaccaagc ccagggagga gcagttcaac agcacctaca gggtggtgag cgtgctgacc 900
gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtgag caacaagggc 960
ctgcccagca gcatcgagaa gaccatcagc aaggccaagg gccagcccag ggagccccag 1020
gtgtacaccc tgcctcccag ccaggaggag atgaccaaga accaggtgag cctgacctgc 1080
ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc 1140
gagaacaact acaagaccac ccctcccgtg ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac 1200
agcaggctga ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggca acgtgttcag ctgcagcgtg 1260
atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc cagaagagcc tgagcctgag cctgggcaag 1320
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 68
gagtcattct cgacttgcgg 20
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 69
gagtcattct cgacttgcgg 20

Claims (32)

1.一种分离的抗体或其功能性片段，包括特异性识别和结合免疫细胞表面抗原PD-1的结构域和来自免疫球蛋白恒定区(Fc)的恒定区域，所述特异性识别和结合免疫细胞表面抗原PD-1的结构域包括
分别为SEQ ID NO:3、7和13所示的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3以及分别为SEQID NO:21、26和31所示的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3。
2.如权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其编码氨基酸序列由SEQ ID NO:63组成。
3.如权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:64所示序列，重链氨基酸序列如SEQ ID NO:65所示。
4.如权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其编码轻链核苷酸序列如SEQ ID NO:66所示序列，编码重链氨基酸序列如SEQ ID NO:67所示。
5.如权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体为人源化的。
6.如权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其中所述重链由人VH种系的氨基酸序列构成；且所述轻链由人Vκ种系或Vλ种系的氨基酸序列构成。
7.如权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其中所述恒定区域是人恒定区域，所述人恒定区域选自人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的恒定区域。
8.根据权利要求7所述的抗体或其功能性片段，其中所述人恒定区域是人IgG的恒定区域。
9.根据权利要求7所述的抗体或其功能性片段，其中所述人恒定区域是人IgG1或IgG4的恒定区域。
10.如权利要求1所述的抗体或其功能性片段，所述抗体是嵌合抗体、人抗体或双价抗体或其抗原结合部分，所述抗原结合部分选自纳米抗体、单域抗体、Fab、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd或dAb。
11.如权利要求1所述的抗体或其功能性片段，所述抗体是双特异性抗体或三特异性抗体。
12.如权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段结合PD-1，其对PD-1具有10-9mol/L的亲和力。
13.如权利要求1-12任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体含有糖基化修饰。
14.一种分离的核酸，编码权利要求1所述的抗体或其功能性片段或权利要求10中的scFv。
15.如权利要求14所述的核酸序列由SEQ ID NO:58组成。
16.一种包含权利要求15所述的核酸的表达载体。
17.一种包含权利要求16所述的表达载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自大肠杆菌、HEK293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞和NSO细胞。
18.一种免疫缀合物，包含与治疗剂偶联的根据权利要求1至13中任一项所述的抗体或其功能性片段，所述治疗剂为放射性同位素或药物。
19.根据权利要求18所述的免疫缀合物，其中所述药物是毒素。
20.根据权利要求19所述的免疫缀合物，其中所述毒素是细胞毒剂。
21.一种药物组合物，包含权利要求1-13任一项的抗体或其功能性片段以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
22.权利要求1-13任一项所述的抗体或其功能性片段或或权利要求18-20所述的免疫缀合物或权利要求21所述的药物组合物在制备用于调控受试者中的免疫应答、治疗或预防受试者中与PD-1相关的状况或PD-1介导的疾病或病症的药物中的用途，其中所述与PD-1相关的状况或PD-1介导的疾病或病症是癌症。
23.如权利要求22所述的用途，其中所述癌症选自子宫癌、鳞状细胞癌、内分泌系统的癌症、非何杰金氏淋巴瘤和慢性或急性白血病。
24.如权利要求22所述的用途，其中所述癌症选自肝癌、胃癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、食道癌、小肠癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、黑素瘤、肾癌、前列腺癌、乳癌、结肠癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肾上腺癌、肛区癌、阴户癌、尿道癌、阴茎癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、表皮样癌、何杰金氏病、软组织肉瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、T细胞淋巴瘤、急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性淋巴细胞性白血病和慢性淋巴细胞性白血病中的一种或更多种。
25.如权利要求22所述的用途，其中所述癌症选自儿童期实体瘤和淋巴细胞性淋巴瘤。
26.一种偶联物，包含权利要求1～13任一项所述的抗体或其功能性片段和偶联部分，其中所述偶联部分为可检测的标记。
27.一种试剂盒，包括权利要求1至13中任一项所述的抗体或其功能性片段，或权利要求26所述的偶联物，所述试剂盒还包括第二抗体，所述第二抗体特异性识别所述抗体或其功能性片段。
28.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述第二抗体还包括可检测的标记。
29.根据权利要求28所述的试剂盒，其中所述可检测的标记是放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。
30.权利要求1至13中任一项所述的抗体或其功能性片段或权利要求26所述的偶联物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测PD-1在样品中的存在或其水平。
31.一种检测样品中的PD-1的存在的方法，所述方法包括使权利要求1-2中任一项所述的抗体或其功能性片段或权利要求18-20所述的免疫缀合物或权利要求26所述的偶联物与所述样品接触。
32.一种用于检测样品中的PD-1的存在的组合物，所述组合物包含权利要求1-13中任一项所述的抗体或其功能性片段。
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