CN102791738A - 优先结合人csf1r胞外域4的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及针对人CSF-1R的抗体（抗CSF-1R抗体），它们的生产方法，含有所述抗体的药物组合物，及其用途。

Description

优先结合人CSF1R胞外域4的抗体及其用途
本发明涉及针对人CSF-1R的抗体（抗CSF-1R抗体），它们的生产方法，含有所述抗体的药物组合物，及其用途。
发明背景
自1986年起就知道人CSF-1受体（CSF-1R；集落刺激因子1受体；同义词：M-CSF受体；巨噬细胞集落刺激因子1受体，Fms原癌基因，c-fms，SEQID NO:62）（Coussens，L.，等人，Nature 320（1986）277-280）。CSF-1R是一种生长因子且由c-fms原癌基因编码（综述见例如Roth，P.，和Stanley，E.R.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.181（1992）141-67）。
CSF-1R是CSF-1（集落刺激因子1，也称作M-CSF，巨噬细胞集落刺激因子）的受体且介导此细胞因子的生物学效应（Sherr，C.J.，等人，Cell 41（1985）665-676）。集落刺激因子-1受体（CSF-1R）（也称作c-fms）的克隆第一次记载于Roussel，M.F.，等人，Nature 325（1987）549-552。在该出版物中，显示了CSF-1R具有依赖于该蛋白的C端尾中的变化（包括抑制性酪氨酸969磷酸化的丧失，其结合Cbl并由此调节受体下调）的转化潜力（Lee，P.S.，等人，Embo J.18（1999）3616-3628）。最近，鉴定出CSF-1R的第二种配体，称作白介素-34（IL-34）（Lin，H.，等人，Science 320（2008）807-811）。
细胞因子CSF-1（集落刺激因子1，也称作M-CSF，巨噬细胞）在细胞外作为二硫化物连接的同二聚体找到（Stanley，E.R.，等人，Journal of CellularBiochemistry 21（1983）151-159；Stanley，E.R.，等人，Stem Cells 12 Suppl.1（1995）15-24）。
CSF-1R信号传导的主要生物学效应是造血前体细胞至巨噬细胞谱系（包括破骨细胞）的分化、增殖、迁移、和存活。CSF-1R的活化由其配体CSF-1（M-CSF）和IL-34介导。CSF-1（M-CSF）对CSF-1R的结合诱导同二聚体的形成和激酶通过酪氨酸磷酸化的活化（Li，W.，等人，EMBO Journal.10（1991）277-288；Stanley，E.R.，等人，Mol.Reprod.Dev.46（1997）4-10）。
生物学活性同二聚体CSF-1在CSF-1受体胞外域（CSF-1R-ECD）的亚域D1至D3内结合CSF-1R。CSF-1R-ECD包含五个免疫球蛋白样亚域（命名为D1至D5）。胞外域（CSF-1R-ECD）的亚域D4至D5不涉及CSF-1结合（Wang，Z.，等人，Molecular and Cellular Biology 13（1993）5348-5359）。亚域D4涉及二聚化（Yeung，Y-G.，等人，Molecular&Cellular Proteomics 2（2003）1143-1155；Pixley，F.J.，等人，Trends Cell Biol 14（2004）628-638）。
别的信号传导由分别连接PI3K/AKT和Ras/MAPK途径的PI3K之p85亚基和Grb2介导。这两种重要信号传导途径能调节增殖、存活和凋亡。其它结合磷酸化CSF-1R胞内域的信号传导分子包括STAT1、STAT3、PLCy、和Cb1（Bourette，R.P.和Rohrschneider，L.R.，Growth Factors 17（2000）155-166）。
CSF-1R信号传导在免疫应答中、在骨再建中及在生殖系统中具有生理学作用。已经显示了CSF-1（Pollard，J.W.，Mol.Reprod.Dev.46（1997）54-61）或CSF-1R（Dai，X.M.，等人，Blood 99（2002）111-120）任一敲除的动物具有骨石化、造血、组织巨噬细胞、和生殖表型，与CSF-1R在各种细胞类型中的作用一致。
Sherr，C.J.，等人，Blood 73（1989）1786-1793涉及一些针对CSF-1R的抗体，它们抑制CSF-1活性（参见Sherr，C.J.等人，Blood 73（1989）1786-1793）。Ashmun，R.A.，等人，Blood 73（1989）827-837涉及CSF-1R抗体。Lenda，D.，等人，Journal of Immunology 170（2003）3254-3262涉及CSF-1缺陷小鼠中降低的巨噬细胞募集，增殖，和活化，导致肾炎症期间降低的管凋亡。Kitaura，H.，等人，Journal of Dental Research 87（2008）396-400提及一种抗CSF-1抗体，其抑制正牙牙齿移动。WO 2001/030381提及CSF-1活性抑制剂，包括反义核苷酸和抗体，虽然仅仅披露CSF-1反义核苷酸。WO2004/045532涉及通过CSF-1拮抗剂的转移和骨丢失预防和转移癌治疗，仅仅披露拮抗性抗CSF-1抗体。WO 2005/046657涉及通过抗CSF-1抗体对炎性肠病的治疗。US 2002/0141994涉及集落刺激因子的抑制剂。WO 2006/096489涉及通过抗CSF-1抗体对类风湿性关节炎的治疗。WO 2009/026303和WO2009/112245涉及某些抗CSF-1R抗体，它们在胞外域（CSF-1R-ECD）的头三个亚域（D1至D3）内结合CSF-1R。
发明概述
本发明包含一种结合人CSF-1R的抗体，特征在于该抗体以1:50或更低的比率结合人CSF-1R片段delD4（SEQ ID NO:65）和人CSF-1R胞外域（SEQ IDNO:64）。
本发明进一步包含依照本发明的抗体，特征在于
a）重链可变域为SEQ ID NO:7且轻链可变域为SEQ ID NO:8；
b）重链可变域为SEQ ID NO:15且轻链可变域为SEQ ID NO:16；
c）重链可变域为SEQ ID NO:75且轻链可变域为SEQ ID NO:76；
d）重链可变域为SEQ ID NO:83且轻链可变域为SEQ ID NO:84；
或其人源化形式。
本发明进一步包含依照本发明的抗体，特征在于
a）重链可变域为SEQ ID NO:7且轻链可变域为SEQ ID NO:8；
b）重链可变域为SEQ ID NO:15且轻链可变域为SEQ ID NO:16；
或其人源化形式。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体特征在于
a）重链可变域为SEQ ID NO:23且轻链可变域为SEQ ID NO:24，或
b）重链可变域为SEQ ID NO:31且轻链可变域为SEQ ID NO:32，或
c）重链可变域为SEQ ID NO:39且轻链可变域为SEQ ID NO:40，或
d）重链可变域为SEQ ID NO:47且轻链可变域为SEQ ID NO:48，或
e）重链可变域为SEQ ID NO:55且轻链可变域为SEQ ID NO:56。
本发明进一步包含依照本发明的抗体，特征在于
a）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:1、CDR2区SEQ ID NO:2、和CDR1区SEQ ID NO:3，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:4、CDR2区SEQ IDNO:5、和CDR1区SEQ ID NO:6，或
b）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:9、CDR2区SEQ ID NO:10、和CDR1区SEQ ID NO:11，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:12、CDR2区SEQID NO:13、和CDR1区SEQ ID NO:14，或
c）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:17、CDR2区SEQ ID NO:18、和CDR1区SEQ ID NO:19，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:20、CDR2区SEQID NO:21、和CDR1区SEQ ID NO:22，或
d）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:25、CDR2区SEQ ID NO:26、和CDR1区SEQ ID NO:27，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:28、CDR2区SEQID NO:29、和CDR1区SEQ ID NO:30，或
e）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:33、CDR2区SEQ ID NO:34、和CDR1区SEQ ID NO:35，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:36、CDR2区SEQID NO:37、和CDR1区SEQ ID NO:38，或
f）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:41、CDR2区SEQ ID NO:42、和CDR1区SEQ ID NO:43，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:44、CDR2区SEQID NO:45、和CDR1区SEQ ID NO:46，或
g）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:49、CDR2区SEQ ID NO:50、和CDR1区SEQ ID NO:51，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:52、CDR2区SEQID NO:53、和CDR1区SEQ ID NO:54，或
h）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:69、CDR2区SEQ ID NO:70、和CDR1区SEQ ID NO:71，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:72、CDR2区SEQID NO:73、和CDR1区SEQ ID NO:74，或
i）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:77、CDR2区SEQ ID NO:78、和CDR1区SEQ ID NO:79，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:80、CDR2区SEQID NO:81、和CDR1区SEQ ID NO:82。
优选地，依照本发明的抗体属于人IgG1亚类或人IgG4亚类。
本发明的又一个实施方案是一种药物组合物，其包含依照本发明的抗体。
本发明进一步包含依照本发明的抗体制造用于治疗CSF-1R介导的疾病的药物的用途。
本发明进一步包含依照本发明的抗体制造用于治疗癌症的药物的用途。
本发明进一步包含依照本发明的抗体制造用于治疗骨丢失的药物的用途。
本发明进一步包含依照本发明的抗体制造用于治疗转移的药物的用途。
本发明进一步包含依照本发明的抗体制造用于治疗炎性疾病的药物的用途。
本发明进一步包含依照本发明的抗体，其用于治疗CSF-1R介导的疾病。
本发明进一步包含依照本发明的抗体，其用于治疗癌症。
本发明进一步包含依照本发明的抗体，其用于治疗骨丢失。
本发明进一步包含依照本发明的抗体，其用于治疗转移。
本发明进一步包含依照本发明的抗体，其用于治疗炎性疾病。
本发明的又一个实施方案是一种编码依照本发明的抗体的核酸，特征在于
a）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:1、CDR2区SEQ ID NO:2、和CDR1区SEQ ID NO:3，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:4、CDR2区SEQ IDNO:5、和CDR1区SEQ ID NO:6，或
b）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:9、CDR2区SEQ ID NO:10、和CDR1区SEQ ID NO:11，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:12、CDR2区SEQID NO:13、和CDR1区SEQ ID NO:14，或
c）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:17、CDR2区SEQ ID NO:18、和CDR1区SEQ ID NO:19，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:20、CDR2区SEQID NO:21、和CDR1区SEQ ID NO:22，或
d）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:25、CDR2区SEQ ID NO:26、和CDR1区SEQ ID NO:27，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:28、CDR2区SEQID NO:29、和CDR1区SEQ ID NO:30，或
e）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:33、CDR2区SEQ ID NO:34、和CDR1区SEQ ID NO:35，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:36、CDR2区SEQID NO:37、和CDR1区SEQ ID NO:38，或
f）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:41、CDR2区SEQ ID NO:42、和CDR1区SEQ ID NO:43，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:44、CDR2区SEQID NO:45、和CDR1区SEQ ID NO:46，或
g）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:49、CDR2区SEQ ID NO:50、和CDR1区SEQ ID NO:51，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:52、CDR2区SEQID NO:53、和CDR1区SEQ ID NO:54，或
h）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:69、CDR2区SEQ ID NO:70、和CDR1区SEQ ID NO:71，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:72、CDR2区SEQID NO:73、和CDR1区SEQ ID NO:74，或
i）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:77、CDR2区SEQ ID NO:78、和CDR1区SEQ ID NO:79，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:80、CDR2区SEQID NO:81、和CDR1区SEQ ID NO:82。
本发明的又一个实施方案是编码依照本发明的抗体的核酸，特征在于
a）重链可变域为SEQ ID NO:7且轻链可变域为SEQ ID NO:8；
b）重链可变域为SEQ ID NO:15且轻链可变域为SEQ ID NO:16；
c）重链可变域为SEQ ID NO:75且轻链可变域为SEQ ID NO:76；
d）重链可变域为SEQ ID NO:83且轻链可变域为SEQ ID NO:84；
或其人源化形式。
本发明的又一个实施方案是编码依照本发明的抗体的核酸，特征在于
a）重链可变域为SEQ ID NO:23且轻链可变域为SEQ ID NO:24，或
b）重链可变域为SEQ ID NO:31且轻链可变域为SEQ ID NO:32，或
c）重链可变域为SEQ ID NO:39且轻链可变域为SEQ ID NO:40，或
d）重链可变域为SEQ ID NO:47且轻链可变域为SEQ ID NO:48，或
e）重链可变域为SEQ ID NO:55且轻链可变域为SEQ ID NO:56。
本发明进一步提供含有依照本发明的核酸，能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸的表达载体，及含有此类载体，用于重组生产依照本发明的抗体的宿主细胞。
本发明进一步包含原核或真核宿主细胞，其包含依照本发明的载体。
本发明进一步包含一种用于生产依照本发明的重组人或人源化抗体的方法，特征在于在原核或真核宿主细胞中表达依照本发明的核酸并自所述细胞或细胞培养物上清液回收所述抗体。本发明进一步包含通过此类重组方法获得的抗体。
依照本发明的抗体对需要CSF-1R靶向疗法的患者显示好处。依照本发明的抗体针对不依赖配体的和依赖配体的增殖显示有效抗增殖活性且因此在癌症和转移的治疗中尤其有用。
本发明进一步提供一种用于治疗患有癌症的患者的方法，包括对诊断为具有此类疾病（且因此需要此类疗法）的患者施用有效量的依照本发明的抗体。该抗体优选在药物组合物中施用。
本发明的又一个实施方案是一种用于治疗患有癌症的患者的方法，特征在于对该患者施用依照本发明的抗体。
令人惊讶地，已经发现了使用人CSF-1R-ECD的D4亚域被删除的人CSF-1R片段delD4（SEQ ID NO:65），能选择出依照本发明的新抗CSF-1R抗体。这些抗体显示有价值的特性，像对通过逆转录病毒经全长野生型CSF-1R（SEQ ID NO:62）或突变型CSF-1R L301S Y969F（SEQ ID NO:63）任一的表达载体感染的NIH 3T3细胞卓越的依赖配体的细胞生长抑制和同时不依赖配体的细胞生长抑制，其中突变型CSF-1R重组细胞能够不依赖CSF-1配体而形成球状体。而且，依照本发明的抗体抑制人和猕猴（二者）巨噬细胞分化，正如它们抑制人和猕猴单核细胞的存活。
发明详述
本发明包含一种结合人CSF-1R的抗体，特征在于该抗体以1:50或更低的比率结合人CSF-1R片段delD4（包含胞外亚域D1-D3和D5）（SEQ ID NO:65）和人CSF-1R胞外域（CSF-1R-ECD）（包含胞外亚域D1-D5）（SEQ ID NO:64）。
本发明进一步包含一种依照本发明的抗体，特征在于包含CDR3区SEQID NO:1、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:55作为重链可变域CDR3区。
本发明进一步包含依照本发明的抗体，特征在于
a）重链可变域为SEQ ID NO:7且轻链可变域为SEQ ID NO:8；
b）重链可变域为SEQ ID NO:15且轻链可变域为SEQ ID NO:16；
或其人源化形式。
本发明进一步包含依照本发明的抗体，特征在于
a）重链可变域为SEQ ID NO:7且轻链可变域为SEQ ID NO:8；
b）重链可变域为SEQ ID NO:15且轻链可变域为SEQ ID NO:16；
c）重链可变域为SEQ ID NO:75且轻链可变域为SEQ ID NO:76；
d）重链可变域为SEQ ID NO:83且轻链可变域为SEQ ID NO:84；
或其人源化形式。
本发明进一步包含依照本发明的抗体，特征在于
重链可变域为SEQ ID NO:7且轻链可变域为SEQ ID NO:8，或其人源化形式。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体特征在于
a）重链可变域为SEQ ID NO:23且轻链可变域为SEQ ID NO:24，或
b）重链可变域为SEQ ID NO:31且轻链可变域为SEQ ID NO:32，或
c）重链可变域为SEQ ID NO:39且轻链可变域为SEQ ID NO:40，或
d）重链可变域为SEQ ID NO:47且轻链可变域为SEQ ID NO:48，或
e）重链可变域为SEQ ID NO:55且轻链可变域为SEQ ID NO:56。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体特征在于
a）重链可变域为SEQ ID NO:23且轻链可变域为SEQ ID NO:24，或
b）重链可变域为SEQ ID NO:31且轻链可变域为SEQ ID NO:32，或
c）重链可变域为SEQ ID NO:39且轻链可变域为SEQ ID NO:40，或
d）重链可变域为SEQ ID NO:47且轻链可变域为SEQ ID NO:48。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体特征在于
重链可变域为SEQ ID NO:23且轻链可变域为SEQ ID NO:24。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体特征在于
重链可变域为SEQ ID NO:31且轻链可变域为SEQ ID NO:32。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体特征在于
重链可变域为SEQ ID NO:39且轻链可变域为SEQ ID NO:40。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体特征在于
重链可变域为SEQ ID NO:47且轻链可变域为SEQ ID NO:48。
本发明进一步包含依照本发明的抗体，特征在于
重链可变域为SEQ ID NO:15且轻链可变域为SEQ ID NO:16；或其人源化形式。
本发明进一步包含依照本发明的抗体，特征在于
重链可变域为SEQ ID NO:75且轻链可变域为SEQ ID NO:76；或其人源化形式。
本发明进一步包含依照本发明的抗体，特征在于
重链可变域为SEQ ID NO:83且轻链可变域为SEQ ID NO:84；或其人源化形式。
本发明进一步包含依照本发明的抗体，特征在于
a）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:1、CDR2区SEQ ID NO:2、和CDR1区SEQ ID NO:3，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:4、CDR2区SEQ IDNO:5、和CDR1区SEQ ID NO:6，或
b）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:9、CDR2区SEQ ID NO:10、和CDR1区SEQ ID NO:11，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:12、CDR2区SEQID NO:13、和CDR1区SEQ ID NO:14，或
c）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:17、CDR2区SEQ ID NO:18、和CDR1区SEQ ID NO:19，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:20、CDR2区SEQID NO:21、和CDR1区SEQ ID NO:22，或
d）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:25、CDR2区SEQ ID NO:26、和CDR1区SEQ ID NO:27，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:28、CDR2区SEQID NO:29、和CDR1区SEQ ID NO:30，或
e）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:33、CDR2区SEQ ID NO:34、和CDR1区SEQ ID NO:35，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:36、CDR2区SEQID NO:37、和CDR1区SEQ ID NO:38，或
f）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:41、CDR2区SEQ ID NO:42、和CDR1区SEQ ID NO:43，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:44、CDR2区SEQID NO:45、和CDR1区SEQ ID NO:46，或
g）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:49、CDR2区SEQ ID NO:50、和CDR1区SEQ ID NO:51，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:52、CDR2区SEQID NO:53、和CDR1区SEQ ID NO:54。
本发明进一步包含依照本发明的抗体，特征在于
a）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:1、CDR2区SEQ ID NO:2、和CDR1区SEQ ID NO:3，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:4、CDR2区SEQ IDNO:5、和CDR1区SEQ ID NO:6，或
b）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:9、CDR2区SEQ ID NO:10、和CDR1区SEQ ID NO:11，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:12、CDR2区SEQID NO:13、和CDR1区SEQ ID NO:14，或
c）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:17、CDR2区SEQ ID NO:18、和CDR1区SEQ ID NO:19，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:20、CDR2区SEQID NO:21、和CDR1区SEQ ID NO:22，或
d）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:25、CDR2区SEQ ID NO:26、和CDR1区SEQ ID NO:27，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:28、CDR2区SEQID NO:29、和CDR1区SEQ ID NO:30，或
e）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:33、CDR2区SEQ ID NO:34、和CDR1区SEQ ID NO:35，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:36、CDR2区SEQID NO:37、和CDR1区SEQ ID NO:38，或
f）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:41、CDR2区SEQ ID NO:42、和CDR1区SEQ ID NO:43，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:44、CDR2区SEQID NO:45、和CDR1区SEQ ID NO:46，或
g）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:49、CDR2区SEQ ID NO:50、和CDR1区SEQ ID NO:51，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:52、CDR2区SEQID NO:53、和CDR1区SEQ ID NO:54，或
h）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:69、CDR2区SEQ ID NO:70、和CDR1区SEQ ID NO:71，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:72、CDR2区SEQID NO:73、和CDR1区SEQ ID NO:74，或
i）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:77、CDR2区SEQ ID NO:78、和CDR1区SEQ ID NO:79，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:80、CDR2区SEQID NO:81、和CDR1区SEQ ID NO:82。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体特征在于
a）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:69、CDR2区SEQ ID NO:70、和CDR1区SEQ ID NO:71，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:72、CDR2区SEQID NO:73、和CDR1区SEQ ID NO:74，或
b）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:77、CDR2区SEQ ID NO:78、和CDR1区SEQ ID NO:79，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:80、CDR2区SEQID NO:81、和CDR1区SEQ ID NO:82。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体特征在于
a）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:17、CDR2区SEQ ID NO:18、和CDR1区SEQ ID NO:19，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:20、CDR2区SEQID NO:21、和CDR1区SEQ ID NO:22，或
b）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:25、CDR2区SEQ ID NO:26、和CDR1区SEQ ID NO:27，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:28、CDR2区SEQID NO:29、和CDR1区SEQ ID NO:30，或
c）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:33、CDR2区SEQ ID NO:34、和CDR1区SEQ ID NO:35，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:36、CDR2区SEQID NO:37、和CDR1区SEQ ID NO:38，或
d）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:41、CDR2区SEQ ID NO:42、和CDR1区SEQ ID NO:43，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:44、CDR2区SEQID NO:45、和CDR1区SEQ ID NO:46，或
e）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:49、CDR2区SEQ ID NO:50、和CDR1区SEQ ID NO:51，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:52、CDR2区SEQID NO:53、和CDR1区SEQ ID NO:54。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体特征在于
a）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:17、CDR2区SEQ ID NO:18、和CDR1区SEQ ID NO:19，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:20、CDR2区SEQID NO:21、和CDR1区SEQ ID NO:22，或
b）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:25、CDR2区SEQ ID NO:26、和CDR1区SEQ ID NO:27，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:28、CDR2区SEQID NO:29、和CDR1区SEQ ID NO:30，或
c）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:33、CDR2区SEQ ID NO:34、和CDR1区SEQ ID NO:35，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:36、CDR2区SEQID NO:37、和CDR1区SEQ ID NO:38，或
d）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:41、CDR2区SEQ ID NO:42、和CDR1区SEQ ID NO:43，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:44、CDR2区SEQID NO:45、和CDR1区SEQ ID NO:46。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体特征在于
重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:17、CDR2区SEQ ID NO:18、和CDR1区SEQ ID NO:19，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:20、CDR2区SEQID NO:21、和CDR1区SEQ ID NO:22。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体特征在于
重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:25、CDR2区SEQ ID NO:26、和CDR1区SEQ ID NO:27，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:28、CDR2区SEQID NO:29、和CDR1区SEQ ID NO:30。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体特征在于
重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:33、CDR2区SEQ ID NO:34、和CDR1区SEQ ID NO:35，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:36、CDR2区SEQID NO:37、和CDR1区SEQ ID NO:38。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体特征在于
重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:41、CDR2区SEQ ID NO:42、和CDR1区SEQ ID NO:43，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:44、CDR2区SEQID NO:45、和CDR1区SEQ ID NO:46。
在一个实施方案中，结合人CSF-1R，特征在于以1:50或更低的比率结合人CSF-1R片段delD4（SEQ ID NO:65）和人CSF-1R-ECD（SEQ ID NO:64）的抗体进一步特征在于不结合人CSF-1R片段D1-D3（SEQ ID NO:66）。
术语“抗体”涵盖各种形式的抗体，包括但不限于完整抗体、抗体片段、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、T细胞表位消减抗体、和别的遗传工程抗体，只要依照本发明的特征性特性得到保留。“抗体片段”包含全长抗体的一部分，优选其可变域，或至少其抗原结合位点。抗体片段的例子包括双抗体、单链抗体分子、和自抗体片段形成的多特异性抗体。scFv抗体例如记载于Houston，J.S.，Methods in Enzymol.203（1991）46-88。另外，抗体片段包含单链多肽，其具有结合CSF-1R的VH域（即能够与VL域一起装配）或结合CSF-1R的VL域（即能够与VH域一起装配）装配成功能性抗原结合位点并由此提供该特性的特征。
如本文中使用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一氨基酸组成的抗体分子的制备物。
术语“嵌合抗体”指通常通过重组DNA技术制备的，包含来自小鼠的可变区，即结合区和自不同来源或物种衍生的恒定区的至少一部分的单克隆抗体。包含小鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体是尤其优选的。此类大鼠/人嵌合抗体是表达的包含编码大鼠免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码人免疫球蛋白恒定区的DNA区段的免疫球蛋白基因的产物。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它形式是那些其中类或亚类已经相对于初始抗体修饰或改变的。此类“嵌合”抗体也称作“类转换抗体”。用于生成嵌合抗体的方法涉及本领域现在公知的常规重组DNA和基因转染技术。参见例如Morrison，S.L.，等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA 81（1984）6851-6855；US 5,202,238和US 5,204,244。
术语“人源化”抗体指其中框架或“互补决定区”（CDR）已经修饰成包含特异性与亲本免疫球蛋白不同的免疫球蛋白的CDR的抗体。在一个优选的实施方案中，将鼠CDR嫁接入人抗体的框架区以制备“人源化抗体”。参见例如Riechmann，L.，等人，Nature 332（1988）323-327；及Neuberger，M.S.，等人，Nature 314（1985）268-270。任选地，可以通过别的突变来修饰框架区。而且，可以通过一处或多处突变来修饰CDR以生成依照本发明的抗体，例如通过基于分子建模的诱变，如记载于Riechmann，L.，等人，Nature332（1988）323-327及Queen，C.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86（1989）10029-10033，或其它。特别优选的CDR对应于那些呈现识别上文为嵌合抗体所述的抗原的序列的。依照本发明的抗体（其例如是小鼠起源的）的人源化形式指基于小鼠抗体序列，其中VH和VL通过标准技术（包括CDR嫁接和任选随后框架区和CDR中某些氨基酸的诱变）人源化的抗体。优选地，此类人源化形式是与人恒定区（见例如序列SEQ ID NO:57-61）嵌合化的。
本发明涵盖的“人源化抗体”的其它形式是那些其中恒定区已经相对于初始抗体额外修饰或改变以生成依照本发明的特性的，尤其在C1q结合和/或Fc受体（FcR）结合方面。
在下面的实施例中，术语“Mab”或“muMab”指鼠单克隆抗体，诸如Mab 2F11或Mab 2E10，而术语“hMab”指此类鼠抗体的人源化单克隆型式，诸如hMab 2F11-c11、hMab 2F11-d8、hMab 2F11-e7、hMab 2F11-f12、等。
如本文中使用的，术语“人抗体”意图包括具有自人种系免疫球蛋白序列衍生的可变和恒定区的抗体。人抗体是本领域现有技术中熟知的（vanDijk，M.A.，和van de Winkel，J.G.，Curr.Opin.Chem.Biol.5（2001）368-374）。人抗体也可在转基因动物（例如小鼠）中生成，该转基因动物能够在免疫时生成人抗体全集或选集，没有内源免疫球蛋白生成。在此类种系突变型小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因系列会导致在抗原攻击时生成人抗体（参见例如Jakobovits，A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90（1993）2551-2555；Jakobovits，A.，等人，Nature 362（1993）255-258；Brueggemann，M.，等人，Year Immunol.7（1993）33-40）。人抗体也可在噬菌体展示文库中生成（Hoogenboom，H.R.，和Winter，G.J.Mol.Biol.227（1992）381-388；Marks，J.D.，等人，J.Mol.Biol.222（1991）581-597）。Cole等人，和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体（Cole，S.P.C.，等人，Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77（1985）；及Boerner，P.，等人，J.Immunol.147（1991）86-95）。正如关于依照本发明的嵌合和人源化抗体早就提及的，如本文中使用的，术语“人抗体”也包含恒定区中经过修饰以生成依照本发明的特性的此类抗体，尤其在C1q结合和/或FcR结合方面，例如通过“类转换”即Fc部分的改变或突变（例如自IgG1至IgG4和/或IgG1/IgG4突变）。
如本文中使用的，术语“重组人抗体”意图包括所有通过重组手段制备、表达、创建或分离的人抗体，诸如自宿主细胞诸如NS0或CHO细胞或自对于使用转染入宿主细胞中的重组表达载体表达的人免疫球蛋白基因或抗体为转基因的动物（例如小鼠）分离的抗体。此类重组人抗体具有重排形式的可变和恒定区。依照本发明的重组人抗体已经进行体内体细胞超突变。如此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是如下的序列，虽然自人种系VH和VL序列衍生及与人种系VH和VL序列有关，但是在体内可以不天然存在于人抗体种系集合内。
另外，依照本发明的抗体包括如下的抗体，其具有“保守序列修饰”，不影响或改变上文所述依照本发明的抗体的特征的核苷酸和氨基酸序列修饰。可以通过本领域已知的标准技术来引入修饰，诸如定点诱变和PCR介导的诱变。保守氨基酸替代包括将某个氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替换。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链（例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、酸性侧链（例如天冬氨酸、谷氨酸）、不带电荷的侧链（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸）、非极性侧链（例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸）、β-分支侧链（例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和芳香族侧链（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）的氨基酸。如此，优选地，人抗CSF-1R抗体中的预测非必需氨基酸残基可以用来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基替换。
可以基于分子建模通过诱变来实施氨基酸替代，如记载于Riechmann，L.，等人，Nature 332（1988）323-327及Queen，C.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86（1989）10029-10033。
自1986年起就知道人CSF-1R（CSF-1受体；同义词：M-CSF受体；巨噬细胞集落刺激因子1受体，Fms原癌基因，c-fms，SEQ ID NO:22）（Coussens，L.，等人，Nature 320（1986）277-280）。CSF-1R是一种生长因子且由c-fms原癌基因编码（综述见例如Roth，P.和Stanley，E.R.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.181（1992）141-67）。
CSF-1R是CSF-1（巨噬细胞集落刺激因子，也称作M-CSF）IL-34的受体且介导这些细胞因子的生物学效应（Sherr，C.J.，等人，Cell 41（1985）665-676及Lin，H.，等人，Science 320（2008）807-811）。集落刺激因子-1受体（也称作c-fms）的克隆第一次记载于Roussel，M.F.，等人，Nature 325（1987）549-552。在该出版物中，显示了CSF-1R具有依赖于该蛋白的C端尾中的变化（包括抑制性酪氨酸969磷酸化的丧失，其结合Cbl并由此调节受体下调）的转化潜力（Lee，P.S.，等人，Embo J.18（1999）3616-3628）。
CSF-1R是一种单链，跨膜受体酪氨酸激酶（RTK）及含有免疫球蛋白（Ig）基序的RTK家族的成员，特征在于该受体的胞外域（ECD）中5个重复的Ig样亚域D1-D5（Wang，Z.，等人，Molecular and Cellular Biology 13（1993）5348-5359）。人CSF-1R胞外域（CSF-1R-ECD）（SEQ ID NO:64）包含所有五个胞外Ig样亚域D1-D5。人CSF-1R片段delD4（SEQ ID NO:65）包含胞外Ig样亚域D1-D3和D5，但是缺失D4亚域。人CSF-1R片段D1-D3（SEQ ID NO:66）包含各个亚域D 1-D3。列出了没有信号肽MGSGPGVLLL LLVATAWHGQG（SEQ ID NO:67）的序列。
胞内蛋白质酪氨酸激酶域被独特的插入域中断，该插入域也存在于其它相关RTK III类家族成员中，包括血小板衍生生长因子受体（PDGFR）、干细胞生长因子受体（c-Kit）和fins样细胞因子受体（FLT3）。不管这个生长因子受体家族中的结构同源性，它们具有截然不同的组织特异性功能。
CSF-1R主要在单核细胞谱系的细胞上及在雌性生殖道和胎盘中表达。另外，已经报告了皮肤中的Langerhans细胞（一个平滑肌细胞子集）（Inaba，T.，等人，J.Biol.Chem.267（1992）5693-5699）、B细胞（Baker，A.H.，等人，Oncogene 8（1993）371-378）和小胶质细胞（Sawada，M.，等人，BrainRes.509（1990）119-124）中的CSF-1R表达。已知具有突变型人CSF-1R（SEQID NO:23）的细胞增殖不依赖配体刺激。
如本文中使用的，“结合人CSF-1R”或“特异性结合人CSF-1R”指抗体在35°C以KD值1.0x10-8mol/l或更低（在一个实施方案中，在35°C以KD值1.0x10-9mol/l或更低）的结合亲和力特异性结合人CSF-1R抗原。结合亲和力在35°C用标准结合测定法测定，诸如表面等离振子共振技术（
Figure BDA00001991065500151
GE-Healthcare，Uppsala，Sweden）。实施例9中描述了一种用于测定结合亲和力的KD值的方法。如此，如本文中使用的，“结合人CSF-1R的抗体”指在35°C以KD 1.0x10-8mol/l或更低（优选地，1.0x10-8mol/l-1.0x10-12mol/l），优选地，在35°C以KD 1.0x10-9mol/l或更低（优选地，1.0x10-9mol/l-1.0x10-12mol/l）的结合亲和力特异性结合人CSF-1R抗原的抗体。
如本文中使用的，通过实施例4中描述的表面等离振子共振测定法（Biacore测定法）测量“对人CSF-1R片段delD4（SEQ ID NO:65）和对人CSF-1R胞外域（SEQ ID NO:64）的结合”。分别将人CSF-1R片段delD4（SEQID NO:65）或人CSF-1R胞外域（SEQ ID NO:64）捕捉至表面（各自至分开的表面）并添加测试抗体（各自在分开的测量中）并测定各自结合信号（响应单位（RU））。减去参照信号（空白表面）。如果非结合性测试抗体的信号略微低于0，那么将该数值设置为0。然后，确定各自结合信号（对人CSF-1R片段delD4的结合信号（RU）/对人CSF-1R胞外域（CSF-1R-ECD）的结合信号（RU））的比值。依照本发明的抗体具有1:50或更低，优选1:100或更低的结合信号比（RU（delD4）/RU（CSF-1R-ECD）（包括的下限为0（例如如果RU为0，那么比值为0:50或0:100））。
这意味着此类依照本发明的抗CSF-1R抗体不结合人CSF-1R片段delD4（像抗CCR5抗体m<CCR5>Pz03.1C5（于2004年8月18日作为DSM ACC 2683保藏于DSMZ））且对于对人CSF-1R片段delD4的结合具有抗CCR5抗体m<CCR5>Pz03.1C5的范围中的结合信号，其在实施例4所示表面等离振子共振（BIAcore）测定法中低于20RU（响应单位），优选低于10RU。
术语“结合人CSF-1R片段D1-D3”指通过表面等离振子共振测定法（Biacore测定法）进行的结合亲和力测定。将测试抗体捕捉至表面，添加人CSF-1R片段D1-D3（SEQ ID NO:66），并测定各自结合亲和力。术语“不结合人CSF-1R片段D1-D3”表示在此类测定法中，检测到的信号在不超过背景信号的1.2倍的范围中，且因此检测不到显著的结合及无法测定结合亲和力（见实施例10）。
本发明的一个实施方案是用于选择依照本发明的抗体的筛选方法，包括下述步骤：
a）通过表面等离振子共振测定法（Biacore测定法）测定抗CSF-1R抗体对人CSF-1R片段delD4（SEQ ID NO:65）和对人CSF-1R胞外域（CSF-1R-ECD）（SEQ ID NO:64）的结合信号（响应单位（RU））。
b）选择结合信号比值（人CSF-1R片段delD4/人CSF-1R胞外域（CSF-1R-ECD））为50:1或更低的抗体。
在一个实施方案中，该测定在25°C实施。
在一个实施方案中，作为额外的步骤，该筛选方法包括测量抗CSF-1R抗体对人CSF-1R片段D1-D3（SEQ ID NO:66）（D1-D3）的结合并选择显示出不结合所述片段的抗体。
术语“表位”表示人CSF-1R中能够特异性结合抗体的蛋白质决定簇。表位通常由分子诸如氨基酸或糖侧链的化学活性表面聚组组成，而且表位通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。构象性和非构象性表位的区别在于对前者而非后者的结合在变性溶剂存在下丧失。优选地，依照本发明的抗体特异性结合天然的CSF-1R和变性的CSF-1R。
如本文中使用的，“可变域”（轻链的可变域（VL），重链的可变域（VH））表示轻和重链域对中的每一个，它们直接涉及抗体对抗原的结合。可变轻和重链域具有相同的整体结构，而且每个域包含四个框架（FR）区，它们的序列是广泛保守的，由三个“高变区”（或互补决定区，CDR）连接。框架区采取β-片层构象，而且CDR可以形成连接β-片层结构的环。每条链中的CDR通过框架区保持其三维结构，并且与来自另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。抗体的重和轻链CDR3区在依照本发明的抗体的结合特异性/亲和力中发挥特别重要的作用，而且因此提供本发明的又一个目的。
术语“抗体的抗原结合部分”在本文中使用时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区是可变域中那些与本文中定义的高变区残基不同的区。因此，抗体的轻和重链可变域自N至C端包含域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、和FR4。尤其地，重链的CDR3是对抗原结合贡献最大且限定抗体特性的区。CDR和FR区依照Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD（1991）的标准定义和/或那些来自“高变环”的残基来确定。
如本文中使用的，术语“核酸”或“核酸分子”意图包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链的或双链的，但是优选是双链DNA。
如本本申请内使用的，术语“氨基酸”表示天然存在的羧基α-氨基酸组，包括丙氨酸（三字母代码：ala，单字母代码：A）、精氨酸（arg，R）、天冬酰胺（asn，N）、天冬氨酸（asp，D）、半胱氨酸（cys，C）、谷氨酰胺（gln，Q）、谷氨酸（glu，E）、甘氨酸（gly，G）、组氨酸（his，H）、异亮氨酸（ile，I）、亮氨酸（leu，L）、赖氨酸（lys，K）、甲硫氨酸（met，M）、苯丙氨酸（phe，F）、脯氨酸（pro，P）、丝氨酸（ser，S）、苏氨酸（thr，T）、色氨酸（trp，W）、酪氨酸（tyr，Y）、和缬氨酸（val，V）。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体抑制CSF-1结合CSF-1R。在一个实施方案中，具有200ng/ml或更低的IC50，在一个实施方案中，具有50ng/ml或更低的IC50。可以如实施例2中所示测定对CSF-1结合CSF-1R的抑制的IC50。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体抑制CSF-1诱导的CSF-1R磷酸化（在NIH3T3-CSF-1R重组细胞中）。
在一个实施方案中，具有800ng/ml或更低的IC50，在一个实施方案中，具有600ng/ml或更低的IC50，在一个实施方案中，具有250ng/ml或更低的IC50。可以如实施例3中所示测定CSF-1诱导的CSF-1R磷酸化的IC50。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体抑制表达人CSF-1R（SEQ ID NO:62）的重组NIH3T3细胞的生长。在一个实施方案中，具有10μg/ml或更低的IC50，在一个实施方案中，具有5μg/ml或更低的IC50，在一个实施方案中，具有2μg/ml或更低的IC50。在一个实施方案中，具有10μg/ml或更低的IC30，在一个实施方案中，具有5μg/ml或更低的IC30，在一个实施方案中，具有2μg/ml或更低的IC30。如实施例5中所示测定IC50值、IC30值或%生长抑制。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体抑制表达人突变型CSF-1R L301SY969F（SEQ ID NO:63）的重组NIH3T3细胞的生长。在一个实施方案中，具有15μg/ml或更低的IC50，在一个实施方案中，具有10μg/ml或更低的IC50。在一个实施方案中，具有10μg/ml或更低的IC30，在一个实施方案中，具有5μg/ml（ng/ml）或更低的IC50；在一个实施方案中，具有2μg/ml或更低的IC50。如实施例5中所示测定IC50值、IC30值或%生长抑制。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体将BeWo肿瘤细胞（ATCCCCL-98）的生长抑制65%或更多（在10μg/ml的抗体浓度；而且与抗体缺失下相比）。如实施例8中所示测定%生长抑制。例如，Mab 2F11显示70%的对BeWo肿瘤细胞的生长抑制。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体抑制人和猕猴（二者）巨噬细胞分化（通过实施例7和8中所示对人和猕猴单核细胞的存活的抑制来表示）。在一个实施方案中，依照本发明的抗体以0.15μg/ml或更低的IC50，在一个实施方案中，以0.10μg/ml或更低的IC50抑制人单核细胞的存活。如实施例7中所示测定对人单核细胞的存活的抑制。在一个实施方案中，依照本发明的抗体将猕猴单核细胞的存活抑制80%或更多，在一个实施方案中，90%或更多（在5μg/ml的抗体浓度；而且与抗体缺失下相比）。如实施例8中所示测定对人单核细胞的存活的抑制。
本发明的又一个实施方案是用于生成针对CSF-1R的抗体的方法，特征在于将编码依照本发明的结合人CSF-1R的人IgG1类抗体的重链的核酸（所述经修饰核酸）和编码所述抗体的轻链的核酸的序列插入表达载体中，将所述载体插入真核宿主细胞中，表达编码的蛋白质并自宿主细胞或上清液回收。
优选地，通过重组手段来生成依照本发明的抗体。因此，优选地，抗体是分离的单克隆抗体。此类重组方法是本领域现有技术中广泛知道的，而且包括原核和真核细胞中的蛋白质表达及随后分离抗体多肽和通常纯化至药学可接受纯度。为了蛋白质表达，通过标准方法将编码轻和重链或其片段的核酸插入表达载体中。在适宜的原核或真核宿主细胞中实施表达，像CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、酵母、或大肠杆菌细胞，并自细胞（上清液或细胞，在裂解后）回收抗体。
抗体的重组生成是本领域现有技术中公知的，而且记载于例如综述性论文Makrides，S.C.，Protein Expr.Purif.17（1999）183-202；Geisse，S.，等人，Protein Expr.Purif.8（1996）271-282；Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16（2000）151-161；Werner，R.G.，Drug Res.48（1998）870-880。
抗体可以存在于完整细胞中、细胞溶胞物中、或部分纯化的或实质性纯的形式。通过标准技术，包括碱/SDS处理、CsCl成带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳、和本领域公知的其它技术实施纯化，以消除其它细胞成分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白质。参见Ausubel，F.，等人编，Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York（1987）。
NS0细胞中的表达记载于例如Barnes，L.M.，等人，Cytotechnology 32（2000）109-123；及Barnes，L.M.，等人，Biotech.Bioeng.73（2001）261-270。瞬时表达记载于例如Durocher，Y.，等人，Nucl.Acids.Res.30（2002）E9。可变域的克隆记载于Orlandi，R.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86（1989）3833-3837；Carter，P.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89（1992）4285-4289；及Norderhaug，L.，等人，J.Immunol.Methods 204（1997）77-87。一种优选的瞬时表达系统（HEK 293）记载于Schlaeger，E.-J.，和Christensen，K.，Cytotechnology 30（1999）71-83及Schlaeger，E.-J.，J.Immunol.Methods 194（1996）191-199。
适合于原核生物的控制序列包括例如启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子和聚腺苷酸化信号。
在将核酸放置在与另一种核酸序列的功能性关系中时，它是“可操作连接的”。例如，若前序列或分泌前导的DNA以参与多肽分泌的前蛋白表达，则它与多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响序列的转录，则它与编码序列可操作连接；或者若核糖体结合位点定位为使得便于翻译，则它与编码序列可操作连接。一般而言，“可操作连接的”意指所连接的DNA序列是连续的，而且在分泌前导的情况中，是连续的且在读码框中。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性位点处的连接来实现连接。若不存在此类位点，则依照常规的实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
通过常规免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析，恰当地将单克隆抗体与培养液分开。使用常规规程，容易分离编码单克隆抗体的DNA和RNA及测序。杂交瘤细胞可充当此类DNA和RNA的来源。一旦分离，可以将该DNA插入表达载体中，然后将该表达载体转染入不另外生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞（诸如HEK 293细胞、CHO细胞、或骨髓瘤细胞）中，以获得该宿主细胞中重组单克隆抗体的合成。
如本文中使用的，表述“细胞”、“细胞系”、和“细胞培养物”可互换使用，而且所有此类名称包括后代。如此，词语“转化子”和“经转化细胞”包括原代受试细胞及自其衍生的培养物，不管转移的次数。还理解，由于有意的或无意的突变，所有后代的DNA内容可以不是精确相同的。包括具有在初始转化细胞所筛选的相同功能或生物学活性的变异后代。
抗体的“Fc部分”不直接涉及抗体对抗原的结合，但是展现出多种效应器功能。“抗体的Fc部分”是熟练技术人员公知的术语，而且基于木瓜蛋白酶对抗体的切割定义。根据其重链恒定区的氨基酸序列，抗体或免疫球蛋白分成类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的数种可以进一步分成亚类（同种型），例如IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4、IgA1、和IgA2。依照重链恒定区，不同类的免疫球蛋白分别称作α、δ、ε、γ、和μ。抗体的Fc部分直接涉及基于补体激活、C1q结合和Fc受体结合的ADCC（抗体依赖性细胞介导的细胞毒性）和CDC（补体依赖性细胞毒性）。补体激活（CDC）是通过补体因子C1q结合大多数IgG抗体亚类的Fc部分启动的。虽然抗体对补体系统的影响依赖于某些条件，但是对C1q的结合是由Fc部分中的限定结合位点引起的。此类结合位点是本领域现有技术中已知的，而且记载于例如Boackle，R.J.，等人，Nature 282（1979）742-743，Lukas，T.J.，等人，J.Immunol.127（1981）2555-2560，Brunhouse，R.，和Cebra，J.J.，Mol.Immunol.16（1979）907-917，Burton，D.R.，等人，Nature 288（1980）338-344，Thommesen，J.E.，等人，Mol.Immunol.37（2000）995-1004，Idusogie，E.E.，等人，J.Immunol.164（2000）4178-4184，Hezareh，M.，等人，J.Virology 75（2001）12161-12168，Morgan，A.，等人，Immunology 86（1995）319-324，EP 0307434。此类结合位点是例如L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329（依照Kabat，E.A.的EU索引的编号方式，参见下文）。亚类IgG1、IgG2和IgG3的抗体通常显示补体激活及C1q和C3结合，而IgG4不激活补体系统，而且不结合C1q和C3。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体包含自人起源衍生的Fc部分和优选地，人恒定区的所有其它部分。如本文中使用的，术语“自人起源衍生的Fc部分”表示如下的Fc部分，其是属于亚类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的人抗体的Fc部分，优选来自人IgG1亚类的Fc部分、来自人IgG1亚类的突变型Fc部分（优选具有L234A+L235A上的突变）、来自人IgG4亚类的Fc部分或来自人IgG4亚类的突变型Fc部分（优选具有S228P上的突变）。最优选人重链恒定区SEQ ID NO:58（人IgG1亚类）、SEQ ID NO:59（具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类）、SEQ ID NO:60（人IgG4亚类）、或SEQ ID NO:61（具有突变S228P的人IgG4亚类）。
优选地，依照本发明的抗体属于人IgG1亚类或人IgG4亚类。在一个实施方案中，依照本发明的抗体属于人IgG1亚类。在一个实施方案中，依照本发明的抗体属于人IgG4亚类。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体特征在于恒定链是人起源的。此类恒定链是本领域现有技术公知的，而且记载于例如Kabat，E.A.，（参见例如Johnson，G.和Wu，T.T.，Nucleic Acids Res.28（2000）214-218）。例如，一种有用的人重链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO:58。例如，一种有用的人轻链恒定区包含κ轻链恒定区氨基酸序列SEQ ID NO:57。
本发明的另一个方面是结合人CSF-1R的抗体，特征在于
a）重链可变域为SEQ ID NO:7且轻链可变域为SEQ ID NO:8，
b）重链可变域为SEQ ID NO:15且轻链可变域为SEQ ID NO:16；
或其人源化形式。
本发明的另一个方面是结合人CSF-1R的抗体，特征在于
a）重链可变域为SEQ ID NO:7且轻链可变域为SEQ ID NO:8，
b）重链可变域为SEQ ID NO:15且轻链可变域为SEQ ID NO:16；
c）重链可变域为SEQ ID NO:75且轻链可变域为SEQ ID NO:76；
d）重链可变域为SEQ ID NO:83且轻链可变域为SEQ ID NO:84；
或其人源化形式。
本发明的另一个方面是结合人CSF-1R的抗体，特征在于
重链可变域为SEQ ID NO:7且轻链可变域为SEQ ID NO:8，或其人源化形式。
本发明的另一个方面是结合人CSF-1R的抗体，特征在于
a）重链可变域为SEQ ID NO:23且轻链可变域为SEQ ID NO:24，或
b）重链可变域为SEQ ID NO:31且轻链可变域为SEQ ID NO:32，或
c）重链可变域为SEQ ID NO:39且轻链可变域为SEQ ID NO:40，或
d）重链可变域为SEQ ID NO:47且轻链可变域为SEQ ID NO:48，或
e）重链可变域为SEQ ID NO:55且轻链可变域为SEQ ID NO:56。
本发明的另一个方面是结合人CSF-1R的抗体，特征在于
a）重链可变域为SEQ ID NO:23且轻链可变域为SEQ ID NO:24，或
b）重链可变域为SEQ ID NO:31且轻链可变域为SEQ ID NO:32，或
c）重链可变域为SEQ ID NO:39且轻链可变域为SEQ ID NO:40，或
d）重链可变域为SEQ ID NO:47且轻链可变域为SEQ ID NO:48。
本发明的另一个方面是结合人CSF-1R的抗体，特征在于
重链可变域为SEQ ID NO:23且轻链可变域为SEQ ID NO:24，或
本发明的另一个方面是结合人CSF-1R的抗体，特征在于
重链可变域为SEQ ID NO:31且轻链可变域为SEQ ID NO:32。
本发明的另一个方面是结合人CSF-1R的抗体，特征在于
重链可变域为SEQ ID NO:39且轻链可变域为SEQ ID NO:40。
本发明的另一个方面是结合人CSF-1R的抗体，特征在于
重链可变域为SEQ ID NO:47且轻链可变域为SEQ ID NO:48。
本发明的另一个方面是结合人CSF-1R的抗体，特征在于
重链可变域为SEQ ID NO:15且轻链可变域为SEQ ID NO:16，或其人源化形式。
本发明的另一个方面是结合人CSF-1R的抗体，特征在于
重链可变域为SEQ ID NO:75且轻链可变域为SEQ ID NO:76；
或其人源化形式。
本发明的另一个方面是结合人CSF-1R的抗体，特征在于
重链可变域为SEQ ID NO:83且轻链可变域为SEQ ID NO:84；
或其人源化形式。
本发明的另一个方面是结合人CSF-1R的抗体，特征在于
a）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:1、CDR2区SEQ ID NO:2、和CDR1区SEQ ID NO:3，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:4、CDR2区SEQ ID NO:5、和CDR1区SEQ ID NO:6，或
b）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:9、CDR2区SEQ ID NO:10、和CDR1区SEQ ID NO:11，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:12、CDR2区SEQ ID NO:13、和CDR1区SEQ ID NO:14，或
c）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:17、CDR2区SEQ ID NO:18、和CDR1区SEQ ID NO:19，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:20、CDR2区SEQ ID NO:21、和CDR1区SEQ ID NO:22，或
d）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:25、CDR2区SEQ ID NO:26、和CDR1区SEQ ID NO:27，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:28、CDR2区SEQ ID NO:29、和CDR1区SEQ ID NO:30，或
e）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:33、CDR2区SEQ ID NO:34、和CDR1区SEQ ID NO:35，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:36、CDR2区SEQ ID NO:37、和CDR1区SEQ ID NO:38，或
f）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:41、CDR2区SEQ ID NO:42、和CDR1区SEQ ID NO:43，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:44、CDR2区SEQ ID NO:45、和CDR1区SEQ ID NO:46，
g）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:49、CDR2区SEQ ID NO:50、和CDR1区SEQ ID NO:51，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:52、CDR2区SEQ ID NO:53、和CDR1区SEQ ID NO:54，
h）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:69、CDR2区SEQ ID NO:70、和CDR1区SEQ ID NO:71，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:72、CDR2区SEQ ID NO:73、和CDR1区SEQ ID NO:74，或
i）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:77、CDR2区SEQ ID NO:78、和CDR1区SEQ ID NO:79，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:80、CDR2区SEQ ID NO:81、和CDR1区SEQ ID NO:82。
本发明的另一个方面是结合人CSF-1R的抗体，特征在于
a）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:17、CDR2区SEQ ID NO:18、和CDR1区SEQ ID NO:19，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:20、CDR2区SEQ ID NO:21、和CDR1区SEQ ID NO:22，或
b）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:25、CDR2区SEQ ID NO:26、和CDR1区SEQ ID NO:27，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:28、CDR2区SEQ ID NO:29、和CDR1区SEQ ID NO:30，或
c）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:33、CDR2区SEQ ID NO:34、和CDR1区SEQ ID NO:35，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:36、CDR2区SEQ ID NO:37、和CDR1区SEQ ID NO:38，或
d）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:41、CDR2区SEQ ID NO:42、和CDR1区SEQ ID NO:43，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:44、CDR2区SEQ ID NO:45、和CDR1区SEQ ID NO:46，或
e）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:49、CDR2区SEQ ID NO:50、和CDR1区SEQ ID NO:51，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:52、CDR2区SEQ ID NO:53、和CDR1区SEQ ID NO:54。
本发明的另一个方面是结合人CSF-1R的抗体，特征在于
a）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:17、CDR2区SEQ ID NO:18、和CDR1区SEQ ID NO:19，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:20、CDR2区SEQ ID NO:21、和CDR1区SEQ ID NO:22，或
b）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:25、CDR2区SEQ ID NO:26、和CDR1区SEQ ID NO:27，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:28、CDR2区SEQ ID NO:29、和CDR1区SEQ ID NO:30，或
c）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:33、CDR2区SEQ ID NO:34、和CDR1区SEQ ID NO:35，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:36、CDR2区SEQ ID NO:37、和CDR1区SEQ ID NO:38，或
d）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:41、CDR2区SEQ ID NO:42、和CDR1区SEQ ID NO:43，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:44、CDR2区SEQ ID NO:45、和CDR1区SEQ ID NO:46。
本发明的另一个方面是结合人CSF-1R的抗体，特征在于
重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:17、CDR2区SEQ ID NO:18、和CDR1区SEQ ID NO:19，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:20、CDR2区SEQ ID NO:21、和CDR1区SEQ ID NO:22。
本发明的另一个方面是结合人CSF-1R的抗体，特征在于
重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:25、CDR2区SEQ ID NO:26、和CDR1区SEQ ID NO:27，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:28、CDR2区SEQ ID NO:29、和CDR1区SEQ ID NO:30。
本发明的另一个方面是结合人CSF-1R的抗体，特征在于
重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:33、CDR2区SEQ ID NO:34、和CDR1区SEQ ID NO:35，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:36、CDR2区SEQ ID NO:37、和CDR1区SEQ ID NO:38。
本发明的另一个方面是结合人CSF-1R的抗体，特征在于
重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:41、CDR2区SEQ ID NO:42、和CDR1区SEQ ID NO:43，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:44、CDR2区SEQ ID NO:45、和CDR1区SEQ ID NO:46。
本发明包含用于治疗需要治疗的患者的方法，特征在于对该患者施用治疗有效量的依照本发明的抗体。
本发明包含依照本发明的抗体用于治疗的用途。
本发明的一个优选实施方案是本发明的CSF-1R抗体，其用于治疗“CSF-1R介导的疾病”，或本发明的CSF-1R抗体，其用于制备治疗“CSF-1R介导的疾病”的药物，可以如下描述：
CSF-1R信号传导有可能通过3种独特机制涉及肿瘤生长和转移。第一种是在源自雌性生殖系统（乳房/乳腺、卵巢、子宫内膜、宫颈）的肿瘤细胞中找到CSF配体和受体的表达（Scholl，S.M.，等人，J.Natl.Cancer Inst.86（1994）120-126；Kacinski，B.M.，Mol.Reprod.Dev.46（1997）71-74；Ngan，H.Y.，等人，Eur.J.Cancer 35（1999）1546-1550；Kirma，N.，等人，Cancer Res 67（2007）1918-1926），而且该表达与乳腺癌异种移植物生长以及乳腺癌患者中的较差预后有关。在一项研究中测试的急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病和脊髓发育不良患者的约10-20%中看到CSF-1R中的两处点突变，而且发现突变之一破坏受体周转（Ridge，S.A.，等人，Proc.Natl.Acad.SciUSA 87（1990）1377-1380）。然而，没能在稍后的研究中确认突变的发生率（Abu-Duhier，F.M.，等人，Br.J.Haematol.120（2003）464-470）。还在一些肝细胞癌（Yang，D.H.，等人，Hepatobiliary Pancreat.Dis.Int.3（2004）86-89）和特发性骨髓纤维变性（Abu-Duhier，F.M.，等人，Br.J.Haematol.120（2003）464-470）病例中发现突变。最近，在自髓单核母细胞性白血病患者衍生的GDM-1细胞系中鉴定出CSF-1R中的Y571D突变（Chase，A.，等人，Leukemia 23（2009）358-364）。
色素沉着绒毛结节性滑膜炎（PVNS）和腱鞘巨细胞瘤（TGCT）可以因使M-CSF基因与胶原基因COL6A3融合并导致M-CSF过表达的易位而发生（West，R.B.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103（2006）690-695）。有人提出景观效应（landscape effect）负责由受表达M-CSF的细胞吸引的单核细胞组成的所致肿瘤块。TGCT是较小的肿瘤，能相对容易地自指（主要发生处）切除。PVNS更具攻击性，因为它能在大关节中重现，而且不易通过手术来控制。
第二种机制基于阻断骨中的转移位点处经由M-CSF/CSF-1R的信号传导，其诱导破骨细胞发生、骨再吸收和溶骨性骨损害。乳腺癌、多发性骨髓瘤和肺癌是已经发现转移至骨并引起溶骨性骨病导致骨骼并发症的癌症的例子。由肿瘤细胞和基质释放的M-CSF与受体活化剂核因子κ-B配体-RANKL合作诱导造血髓样单核细胞祖先分化成成熟破骨细胞。在此过程中，M-CSF通过给予破骨细胞以存活信号来起许可因子的作用（Tanaka，S.，等人，J.Clin.Invest.91（1993）257-263）。在破骨细胞分化和成熟期间用抗CSF-1R抗体抑制CSF-1R活性有可能预防转移性疾病中引起溶骨性疾病及有关骨骼相关事件的破骨细胞活性失衡。虽然乳腺癌、肺癌和多发性骨髓瘤通常导致溶骨性损害，但是在前列腺癌中，转移至骨最初具有成骨细胞性外观，其中升高的骨形成活性产生与正常骨的典型层状结构不同的“编织骨”。在疾病进展期间，骨损害展示显著的溶骨成分以及高血清水平的骨再吸收，而且提示抗再吸收疗法可能是有用的。二膦酸盐已经显示出抑制溶骨性损害形成及减少骨骼相关事件数目（只在具有激素不应性转移性前列腺癌的男性中），但是在这点上，它们对成骨细胞损害的效果是有争议的，而且二膦酸盐至今未显示在预防骨转移或激素响应性前列腺癌中是有益的。抗再吸收剂在混合型溶骨/成骨细胞前列腺癌中的效果仍在进行临床研究（Choueiri，M.B.，等人，CancerMetastasis Rev.25（2006）601-609；Vessella，R.L.和Corey，E.，Clin.CancerRes.12（20Pt 2）（2006）6285s-6290s）。
第三种机制基于最近在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和宫颈癌的实体瘤中找到的肿瘤相关巨噬细胞（TAM）与较差的预后有关联的观察结果（Bingle，L.，等人，J.Pathol.196（2002）254-265；Pollard，J.W.，Nat.Rev.Cancer 4（2004）71-78）。巨噬细胞被M-CSF和其它趋化因子募集至肿瘤。然后巨噬细胞可经由分泌血管发生性因子、蛋白酶和其它生长因子和细胞因子来促进肿瘤进展，而且可通过抑制CSF-1R信号传导来阻断。最近，Zins等人（Zins，K.，等人，Cancer Res.67（2007）1038-1045）显示了肿瘤坏死因子α（TNFα）、M-CSF或二者组合的siRNA的表达会在小鼠异种移植物模型中在肿瘤内注射相应siRNA后将肿瘤生长降低34%到50%。由人SW620细胞分泌的靶向TNFα的siRNA降低小鼠M-CSF水平并导致肿瘤中的巨噬细胞减少。另外，用针对M-CSF的抗原结合片段处理MCF7肿瘤异种移植物在与化疗剂组合给予时确实导致40%肿瘤生长抑制，逆转对化疗剂的抗性及改善小鼠存活（Paulus，P.，等人，Cancer Res.66（2006）4349-4356）。
TAM是慢性炎症和癌症之间出现的联系的唯一例子。炎症和癌症之间的联系有别的证据，如许多慢性病与升高的癌症风险有关，在慢性炎症位点处发生癌症，在许多癌症中发现炎症的化学介导物；消除炎症的细胞或化学介导物则抑制实验性癌症的发生，而且长期使用抗炎剂降低一些癌症的风险。许多炎性状况存在与癌症的联系，其中有幽门螺旋杆菌（H.pylori）诱导的胃炎对于胃癌，血吸虫病对于膀胱癌，HHVX对于卡波西（Kaposi）氏肉瘤，子宫内膜异位对于卵巢癌和前列腺炎对于前列腺癌（Balkwill，F.，等人，Cancer Cell 7（2005）211-217）。巨噬细胞是慢性炎症中的关键细胞且有差异地响应其微环境。有两类巨噬细胞被认为是连续的功能状态的极端：M1巨噬细胞涉及1型反应。这些反应涉及微生物产物引起的激活及因此对致病性微生物的杀伤，产生反应氧中介物。另一个极端是M2巨噬细胞，其涉及2型反应，促进细胞增殖，调节炎症和适应性免疫及促进组织重塑、血管发生和修复（Mantovani，A.，等人，Trends Immunol.25（2004）677-686）。导致瘤形成建立的慢性炎症通常与M2巨噬细胞有关。介导炎性反应的一种关键细胞因子是TNFα，顾名思义能在高剂量刺激抗肿瘤免疫和出血性坏死，但最近还发现由肿瘤细胞表达且起肿瘤促进物的作用（Zins，K.，等人，Cancer Res.67（2007）1038-1045；Balkwill，F.，Cancer Metastasis Rev.25（2006）409-416）。仍然需要更好地了解巨噬细胞关于肿瘤的具体作用，包括对其功能的潜在空间和时间依赖性及与特定肿瘤类型的关联。
如此，本发明的一个实施方案是本发明的CSF-1R抗体，用于治疗癌症。如本文中使用的，术语“癌症”可以是例如肺癌、非小细胞肺（NSCL）癌、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、胃的癌症、结肠癌、乳腺癌、子宫的癌症、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴门癌、何杰金（Hodgkin）氏病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆囊癌、中枢神经系统（CNS）新生物、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、施旺细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、脑脊膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤、淋巴瘤、淋巴细胞性白血病，包括任何上述癌症的顽固形式，或一种或多种上述癌症的组合。优选地，此类癌症是乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌或前列腺癌。优选地，此类癌症进一步特征在于CSF-1或CSF-1R表达或过表达。本发明的又一个实施方案是本发明的CSF-1R抗体，用于同时治疗原发性肿瘤和新转移。
如此，本发明的另一个方面是本发明的CSF-1R抗体，用于治疗牙周炎、组织细胞增多病X、骨质疏松症、佩吉特（Paget）氏骨病（PDB）、癌症治疗所致骨丢失、假体周围骨质溶解、糖皮质激素诱导的骨质疏松、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、骨关节炎、炎性关节病（inflammatory arthridities）、和炎症。
Rabello，D.，等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.347（2006）791-796证明了CSF1基因中的SNP展现与攻击性牙周炎（由于牙槽骨的再吸收引起牙丧失的一种牙周组织炎性疾病）的正关联。
组织细胞增多病X（也称作朗格汉斯（Langerhans）氏细胞组织细胞增多病，LCH）是朗格汉斯树突细胞（其表现出在骨和额外的骨LCH损伤中分化成破骨细胞）的一种增殖性疾病。朗格汉斯细胞衍生自循环中的单核细胞。发现在血清和损伤中测量到的升高的M-CSF水平与疾病严重性有关联（daCosta，C.E.，等人，J.Exp.Med.201（2005）687-693）。该疾病主要发生于儿科患者群，而且在该疾病变成系统性或复发时不得不用化疗来治疗。
骨质疏松的病理生理学是由形成骨的成骨细胞损失和破骨细胞依赖性骨再吸收升高介导的。支持性数据记载于Cenci等人，显示了抗M-CSF抗体注射在切除了卵巢的小鼠中保持骨密度且抑制骨再吸收（Cenci，S.，等人，J.Clin.Invest.105（2000）1279-1287）。最近，鉴定出雌激素缺乏所致绝经后骨丢失之间的一种潜在联系，而且发现生成TNFα的T细胞的存在影响骨代谢（Roggia，C.，等人，Minerva Med.95（2004）125-132）。一种可能的机制是在体内TNFα对M-CSF的诱导。M-CSF在TNF-α诱导的破骨细胞发生中的重要作用得到了下述效果的证实，即针对M-CSF的抗体在小鼠中阻断TNFα诱导的骨质溶解，由此使得CSF-1R信号传导的抑制剂成为炎性关节炎的潜在靶物（Kitaura，H.，等人，J.Clin.Invest.115（2005）3418-3427）。
佩吉特氏骨病（PDB）是骨质疏松之后第二位最常见的骨代谢病症，其中骨周转升高的灶性异常导致并发症诸如骨痛、畸形、病理性骨折和耳聋。已经鉴定了四种基因中的突变调节正常破骨细胞功能且使个体易患PDB及相关病症：编码核因子（NF）κB的受体激活物（RANK）-（破骨细胞功能的关键调节物）的TNFRSF11A中的插入突变，编码骨保护素（RANK配体的的诱饵受体）的TNFRSF11B的失活突变，编码NFκB途径中的一种重要支架蛋白的隔离体（sequestosome）1基因（SQSTM1）的突变，和含缬酪肽蛋白（VCP）基因中的突变。此基因编码VCP，其在使NFκB抑制剂靶向蛋白酶体所致降解中具有作用（Daroszewska，A.和Ralston，S.H.，Nat.Clin.Pract.Rheumatol.2（2006）270-277）。靶向CSF-1R抑制剂提供机会来间接阻断RANKL信号传导的失调及对当前使用的二膦酸盐添加另外的治疗选项。
癌症治疗诱导的骨丢失（尤其是在乳腺癌和前列腺癌患者中）是靶向CSF-1R抑制剂能预防骨丢失的另一种适应证（Lester，J.E.，等人，Br.J.Cancer94（2006）30-35）。随着早期乳腺癌的预后改善，辅助疗法的长期后果变得更加重要，因为一些疗法（包括化疗、照射、芳香酶抑制剂和卵巢切除）通过降低骨矿物质密度而影响骨代谢，导致骨质疏松及相关骨折风险升高（Lester，J.E.，等人，Br.J.Cancer 94（2006）30-35）。与乳腺癌中的辅助芳香酶抑制剂疗法等同的是前列腺癌中的雄激素消融疗法，其导致骨矿物质密度损失和骨质疏松相关骨折风险显著升高（Stoch，S.A.，等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.86（2001）2787-2791）。
CSF-1R信号传导的靶向抑制在其它适应证中以及在靶定细胞类型包括破骨细胞和巨噬细胞（例如治疗响应类风湿性关节炎所致关节置换术的特定并发症）时可能是有益的。假体周骨丢失及因此假体松动所致植入失败是关节置换术的一种主要并发症，而且需要反复手术，给患者个人和保健系统带来较高的社会经济负担。至今，没有批准的药物疗法来预防或抑制假体周骨质溶解（Drees，P.，等人，Nat.Clin.Pract.Rheumatol.3（2007）165-171）。
糖皮质激素诱导的骨质疏松（GIOP）是另一种适应证，其中CSF-1R抑制剂能预防因各种状况（例如慢性阻塞性肺病、哮喘和类风湿性关节炎）而给予长期使用糖皮质类固醇后的骨丢失（Guzman-Clark，J.R.，等人，ArthritisRheum.57（2007）140-146；Feldstein，A.C.，等人，Osteoporos.Int.16（2005）2168-2174）。
类风湿性关节炎、银屑病关节炎和炎性关节病本身是CSF-1R信号传导抑制剂的潜在适应证，原因在于它们由巨噬细胞成分组成及不同程度的骨破坏（Ritchlin，C.T.，等人，J.Clin.Invest.111（2003）821-831）。骨关节炎和类风湿性关节炎是由巨噬细胞在结缔组织中积累和巨噬细胞浸润入滑液（这至少部分是由M-CSF介导的）引起的炎性自身免疫病。Campbell，I.，K.，等人，J.Leukoc.Biol.68（2000）144-150证明了M-CSF在体外由人关节组织细胞（软骨细胞、滑液成纤维细胞）生成，而且发现于类风湿性关节炎患者的滑液，提示它有助于滑膜组织增殖和巨噬细胞浸润，这与该疾病的发病机制有关。抑制CSF-1R信号传导有可能控制关节中的巨噬细胞数目及减轻来自有关骨破坏的疼痛。为了使不利影响最小化及进一步了解CSF-1R信号传导在这些适应证中的影响，一种方法是特异性抑制CSF-1R，而不靶向无数的其它激酶，诸如Raf激酶。
最近的文献报告将升高的循环M-CSF与慢性冠状动脉病中的动脉粥样硬化进展和较差的预后关联起来（Saitoh，T.，等人，J.Am.Coll.Cardiol.35（2000）655-665；Ikonomidis，I.，等人，Eur.Heart.J.26（2005）p.1618-1624）；M-CSF通过帮助形成表达CSF-1R且代表初始斑的泡沫细胞（摄入了氧化型LDL的巨噬细胞）来影响动脉粥样硬化过程（Murayama，T.，等人，Circulation99（1999）1740-1746）。
在激活的小胶质中发现M-CSF和CSF-1R的表达和信号传导。小胶质（即中枢神经系统的驻留巨噬细胞）可被多种损伤激活，包括感染和外伤。M-CSF被认为是脑中炎症应答的一种关键调节物，而且M-CSF水平在HIV-1、脑炎、阿尔茨海默（Alzheimer）氏病（AD）和脑瘤中升高。小胶质增生（microgliosis）（作为通过M-CSF/CSF-1R的自分泌信号传导的后果）导致对炎性细胞因子和氮氧化物释放的诱导，如通过例如使用实验性神经元损害模型证明的（Hao，A.J.，等人，Neuroscience 112（2002）889-900；Murphy，G.M.，Jr.，等人，J.Biol.Chem.273（1998）20967-20971）。发现CSF-1R表达升高的小胶质在AD中及在AD的淀粉样前体蛋白V717F转基因小鼠模型的中包围斑（Murphy，G.M.，Jr.，等人，Am.J.Pathol.157（2000）895-904）。另一方面脑中小胶质较少的op/op小鼠导致与正常对照相比A-β的小纤维沉积和神经元损失，提示小胶质确实在op/op小鼠中的AD缺失的发生中具有神经保护功能（Kaku，M.，等人，Brain Res.Brain Res.Protoc.12（2003）104-108）。
M-CSF和CSF-1R的表达和信号传导与炎性肠病（IBD）有关（WO2005/046657）。术语“炎性肠病”指严重的、慢性的肠道病症，特征在于胃肠道中多个位点处的慢性炎症，而且具体包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩（Crohn）氏病。
本发明包含结合人CSF-1R的抗体，特征在于上文所述表位结合特性或在于上文所述氨基酸序列和氨基酸序列片段，用于治疗癌症。
本发明包含结合人CSF-1R的抗体，特征在于上文所述表位结合特性或在于上文所述氨基酸序列和氨基酸序列片段，用于治疗骨丢失。
本发明包含结合人CSF-1R的抗体，特征在于上文所述表位结合特性或在于上文所述氨基酸序列和氨基酸序列片段，用于预防或治疗转移。
本发明包含结合人CSF-1R的抗体，特征在于上文所述表位结合特性或在于上文所述氨基酸序列和氨基酸序列片段，用于治疗炎性疾病。
本发明包含抗体（特征在于包含结合人CSF-1R的抗体，其特征在于上文所述表位结合特性或在于上文所述氨基酸序列和氨基酸序列片段）用于治疗癌症或用于制备治疗癌症的药物的用途。
本发明包含抗体（特征在于包含结合人CSF-1R的抗体，其特征在于上文所述表位结合特性或在于上文所述氨基酸序列和氨基酸序列片段）用于治疗骨丢失或用于制备治疗骨丢失的药物的用途。
本发明包含抗体（特征在于包含结合人CSF-1R的抗体，其特征在于上文所述表位结合特性或在于上文所述氨基酸序列和氨基酸序列片段）用于预防或治疗转移或用于制备预防或治疗转移的药物的用途。
本发明包含抗体（特征在于包含结合人CSF-1R的抗体，其特征在于上文所述表位结合特性或在于上文所述氨基酸序列和氨基酸序列片段）用于治疗炎性疾病或用于制备治疗炎性疾病的药物的用途。
本发明的又一个实施方案是用于生产针对CSF-1R的抗体的方法，特征在于将编码依照本发明的结合人CSF-1R的人IgG1类抗体的重链的核酸（所述经修饰核酸）和编码所述抗体的轻链的核酸的序列插入表达载体中，将所述载体插入真核宿主细胞中，表达并自宿主细胞或上清液回收编码的蛋白质。
优选通过重组手段来生产依照本发明的抗体。此类方法是现有技术广泛知道的，而且包括原核和真核细胞中的蛋白质表达，随后分离抗体多肽且通常纯化至药学可接受纯度。为了蛋白质表达，通过标准方法将编码轻和重链或其片段的核酸插入表达载体中。在适宜的原核或真核宿主细胞中实施表达，诸如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、酵母、或大肠杆菌细胞，并自细胞（自上清液或在细胞裂解后）回收抗体。
抗体的重组生产是现有技术公知的，而且记载于例如综述性论文Makrides，S.C.，Protein Expr.Purif.17（1999）183-202；Geisse，S.，等人，Protein Expr.Purif.8（1996）271-282；Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16（2000）151-161；Werner，R.G.，Drug Res.48（1998）870-880。
抗体可以存在于完整细胞中、细胞裂解物中、或部分纯化的或实质性纯的形式。通过标准技术实施纯化以消除其它细胞成分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白质，标准技术包括碱/SDS处理、CsCl成带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳、和本领域公知的其它技术。参见Ausubel，F.，等人，ed.CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，NewYork（1987）。
NS0细胞中的表达记载于例如Barnes，L.M.，等人，Cytotechnology 32（2000）109-123；Barnes，L.M.，等人，Biotech.Bioeng.73（2001）261-270。瞬时表达记载于例如Durocher，Y.，等人，Nucl.Acids.Res.30（2002）E9。可变域的克隆记载于Orlandi，R.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86（1989）3833-3837；Carter，P.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89（1992）4285-4289；Norderhaug，L.，等人，J.Immunol.Methods 204（1997）77-87。一种优选的瞬时表达系统（HEK 293）记载于Schlaeger，E.-J.和Christensen，K.，Cytotechnology 30（1999）71-83，及Schlaeger，E.-J.，J.Immunol.Methods 194（1996）191-199。
通过本领域已知的多种技术来制备编码抗CSF-1R抗体氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但不限于自天然来源分离（在天然存在氨基酸序列变体的情况中）或通过对先前制备的变体或非变体形式的人源化抗CSF-1R抗体进行的寡核苷酸介导的（或定点）诱变、PCR诱变、和盒式诱变来制备。
将依照本发明的重和轻链可变域与启动子、翻译起始、恒定区、3′非翻译区、聚腺苷酸化、和翻译终止的序列组合以形成表达载体构建物。可以将重和轻链表达构建物组合入单一载体中，共转染，序贯转染，或分开转染入宿主细胞中，然后融合以形成表达双链的单一宿主细胞。
在另一个方面，本发明提供含有一种或一组本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分，与药学可接受载体一起配制的组合物，例如药物组合物。
如本文中使用的，“药学可接受载体”包括任何和所有生理学相容的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等张和吸收/再吸收延迟剂、等等。优选地，载体适合于注射或输注。
可以通过本领域已知的多种方法来施用本发明的组合物。正如技术人员会领会的，施用的路径和/或模式会随期望的结果而变化。
药学可接受载体包括无菌水溶液或分散体和用于制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。此类介质和药剂对药学活性物质的使用是本领域已知的。在水之外，载体可以是例如等张缓冲盐水溶液。
不管选择的施用路径，通过本领域技术人员知道的常规方法将可以以合适水合形式使用的本发明的化合物和/或本发明的药物组合物配制成药学可接受剂量形式。
本发明的药物组合物中活性组分的实际剂量水平可以变化以获得对特定患者、组合物、和施用模式有效实现期望治疗响应，对患者没有毒性的活性组分量（有效量）。选择的剂量水平会取决于多种药动学因素，包括采用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用路径、施用时间、采用的特定化合物的排泄速率、与采用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、治疗的患者的年龄、性别、重量、状况、一般健康和在先医学史、及医学领域公知的类似因素。
本发明包含依照本发明的抗体用于治疗患有癌症（尤其是结肠、肺或胰腺癌）的患者的用途。
本发明还包含一种用于治疗患有此类疾病的患者的方法。
本发明进一步提供一种用于制备包含有效量的依照本发明的抗体以及药学可接受载体的药物组合物的方法及依照本发明的抗体对此类方法的用途。
本发明进一步提供有效量的依照本发明的抗体用于制备药物制剂的用途，优选地，与药学可接受载体一起，用于治疗患有癌症的患者。
本发明还提供有效量的依照本发明的抗体用于制备药物制剂的用途，优选地，与药学可接受载体一起，用于治疗患有癌症的患者。
提供下面的实施例、序列表和附图来帮助理解本发明，所附权利要求书列出本发明的真实范围。本领域技术人员理解，可以在所列规程中进行更改而不偏离本发明的精神。
序列表说明
SEQ ID NO:1    重链CDR3，Mab 2F11
SEQ ID NO:2    重链CDR2，Mab 2F11
SEQ ID NO:3    重链CDR1，Mab 2F11
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SEQ ID NO:5    轻链CDR2，Mab 2F11
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SEQ ID NO:7    重链可变域，Mab 2F11
SEQ ID NO:8    轻链可变域，Mab 2F11
SEQ ID NO:9    重链CDR3，Mab 2E10
SEQ ID NO:10   重链CDR2，Mab 2E10
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SEQ ID NO:15   重链可变域，Mab 2E10
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SEQ ID NO:29   轻链CDR2，hMab 2F11-d8
SEQ ID NO:30   轻链CDR1，hMab 2F11-d8
SEQ ID NO:31   重链可变域，hMab 2F11-d8
SEQ ID NO:32   轻链可变域，hMab 2F11-d8
SEQ ID NO:33   重链CDR3，hMab 2F11-e7
SEQ ID NO:34   重链CDR2，hMab 2F11-e7
SEQ ID NO:35   重链CDR1，hMab 2F11-e7
SEQ ID NO:36   轻链CDR3，hMab 2F11-e7
SEQ ID NO:37   轻链CDR2，hMab 2F11-e7
SEQ ID NO:38   轻链CDR1，hMab 2F11-e7
SEQ ID NO:39   重链可变域，hMab 2F11-e7
SEQ ID NO:40   轻链可变域，hMab 2F11-e7
SEQ ID NO:41   重链CDR3，hMab 2F11-f12
SEQ ID NO:42   重链CDR2，hMab 2F11-f12
SEQ ID NO:43   重链CDR1，hMab 2F11-f12
SEQ ID NO:44   轻链CDR3，hMab 2F11-f12
SEQ ID NO:45   轻链CDR2，hMab 2F11-f12
SEQ ID NO:46   轻链CDR1，hMab 2F11-f12
SEQ ID NO:47   重链可变域，hMab 2F11-f12
SEQ ID NO:48   轻链可变域，hMab 2F11-f12
SEQ ID NO:49   重链CDR3，hMab 2F11-g1
SEQ ID NO:50   重链CDR2，hMab 2F11-g1
SEQ ID NO:51   重链CDR1，hMab 2F11-g1
SEQ ID NO:52   轻链CDR3，hMab 2F11-g1
SEQ ID NO:53   轻链CDR2，hMab 2F11-g1
SEQ ID NO:54   轻链CDR1，hMab 2F11-g1
SEQ ID NO:55   重链可变域，hMab 2F11-g1
SEQ ID NO:56   轻链可变域，hMab 2F11-g1
SEQ ID NO:57   人κ轻链恒定区
SEQ ID NO:58   自IgG1衍生的人重链恒定区
SEQ ID NO:59   L234A和L235A上突变的自IgG1衍生的人重链恒定区
SEQ ID NO:60   自IgG4衍生的人重链恒定区
SEQ ID NO:61   S228P上突变的自IgG4衍生的人重链恒定区
SEQ ID NO:62   人野生型CSF-1R（wt CSF-1R）
SEQ ID NO:63   人突变型CSF-1R L301S Y969F
SEQ ID NO:64   人CSF-1R胞外域
SEQ ID NO:65   人CSF-1R片段delD4
SEQ ID NO:66   人CSF-1R片段D1-D3
SEQ ID NO:67   信号肽
SEQ ID NO:68   引物
SEQ ID NO:69   重链CDR3，Mab 1G10
SEQ ID NO:70   重链CDR2，Mab 1G10
SEQ ID NO:71   重链CDR1，Mab 1G10
SEQ ID NO:72   轻链CDR3，Mab 1G10
SEQ ID NO:73   轻链CDR2，Mab 1G10
SEQ ID NO:74   轻链CDR1，Mab 1G10
SEQ ID NO:75   重链可变域，Mab 1G10
SEQ ID NO:76   轻链可变域，Mab 1G10
SEQ ID NO:77   重链CDR3，Mab 2H7
SEQ ID NO:78   重链CDR2，Mab 2H7
SEQ ID NO:79   重链CDR1，Mab 2H7
SEQ ID NO:80   轻链CDR3，Mab 2H7
SEQ ID NO:81   轻链CDR2，Mab 2H7
SEQ ID NO:82   轻链CDR1，Mab 2H7
SEQ ID NO:83   重链可变域，Mab 2H7
SEQ ID NO:84   轻链可变域，Mab 2H7
提供下面的实施例、序列表和附图来帮助理解本发明，所附权利要求书列出本发明的真实范围。本领域技术人员理解，可以在所列规程中进行更改而不偏离本发明的精神。
附图说明
图1  10μg/ml浓度的不同抗CSF-1R单克隆抗体的处理下对3D培养物中BeWo肿瘤细胞的生长抑制。
X轴：与细胞的ATP含量（CellTiterGlo测定法）对应的存活力标准化均值相对光单位（RLU）。
Y轴：测试探针：极限培养基（0.5%FBS），小鼠IgG1（mIgG1，10μg/ml），小鼠IgG2a（mIgG2a 10μg/ml），仅CSF-1，Mab 2F11，Mab 2E10，Mab 2H7，Mab 1G10和SC 2-4A5。
用依照本发明的抗CSF-1R抗体观察到最高的对CSF-1诱导的生长的抑制。
图2a  不同抗CSF-1R抗体对固定化人CSF-1R片段delD4（包含胞外亚域D1-D3和D5）（SEQ ID NO:65）的结合的Biacore传感图（y轴：结合信号，以响应单位（RU）计，基线=0RU，x轴：时间，以秒（s）计）：虽然抗体Mab 3291和sc 2-4A5清楚地显示结合此delD4片段，依照本发明的抗体例如Mab 2F11和Mab 2E10不结合CSF-1R片段delD4。对照抗CCR5抗体m<CCR5>Pz03.1C5也不结合CSF-1R片段delD4。
图2b  不同抗CSF-1R抗体对固定化人CSF-1R胞外域（CSF-1R-ECD）（包含胞外亚域D1–D5）（SEQ ID NO:64）的结合的Biacore传感图（y轴：结合信号，以响应单位（RU）计，基线=0RU，x轴：时间，以秒（s）计）：所有抗CSF-1R抗体显示结合CSF-1R-ECD。对照抗CCR5抗体m<CCR5>Pz03.1C5不结合CSF-1R-ECD。
图2c  不同抗CSF-1R抗体对固定化人CSF-1R片段delD4（包含胞外亚域D1–D3和D5）（SEQ ID NO:65）的结合的Biacore传感图（y轴：结合信号，以响应单位（RU）计，基线=0RU，x轴：时间，以秒（s）计）：Mab 1G10、Mab 2H7和人源化hMab 2F11-e7不结合CSF-1R片段delD4。对照抗CCR5抗体m<CCR5>Pz03.1C5也不结合CSF-1R片段delD4。
图2d  不同抗CSF-1R抗体对固定化人CSF-1R胞外域（CSF-1R-ECD）（包含the胞外亚域D1–D5）（SEQ ID NO:64）的结合的Biacore传感图（y轴：结合信号，以响应单位（RU）计，基线=0RU，x轴：时间，以秒（s）计）：所有抗CSF-1R抗体Mab 1G10、Mab 2H7和人源化hMab 2F11-e7显示结合CSF-1R-ECD。对照抗CCR5抗体m<CCR5>Pz03.1C5不结合CSF-1R-ECD。
图2e  不同抗CSF-1R抗体对固定化人CSF-1R片段delD4（包含胞外亚域D1–D3和D5）（SEQ ID NO:65）的结合的Biacore传感图（y轴：结合信号，以响应单位（RU）计，基线=0RU，x轴：时间，以秒（s）计）：所有抗CSF-1R抗体1.2.SM、CXIIG6、ab10676和MAB3291显示结合CSF-1R片段delD4。对照抗CCR5抗体m<CCR5>Pz03.1C5也不结合CSF-1R片段delD4。
图2f  不同抗CSF-1R抗体对固定化人CSF-1R胞外域（CSF-1R-ECD）（包含胞外亚域D1–D5）（SEQ ID NO:64）的结合的Biacore传感图（y轴：结合信号，以响应单位（RU）计，基线=0RU，x轴：时间，以秒（s）计）：所有抗CSF-1R抗体1.2.SM，CXIIG6，ab10676和MAB3291显示结合CSF-1R-ECD。对照抗CCR5抗体m<CCR5>Pz03.1C5不结合CSF-1R-ECD。
图3a-d  应用不同剂量的依照本发明的抗CSF-1R抗体后猕猴中的CSF-1水平
图4  体内功效-乳腺癌BT20异种移植物中依照本发明的抗CSF-1R抗体所致肿瘤生长抑制
实施例1
生成抗CSF-1R抗体的杂交瘤细胞系的产生
NMRI小鼠的免疫规程
利用电穿孔用编码huCSF-1R之胞外域的表达载体pDisplayTM（Invitrogen，USA）免疫NMRI小鼠。每只小鼠用100μg DNA免疫4次。当发现抗huCSF-1R的血清滴度足够时，在融合前4天和3天另外用200μl PBS中的50μg的huCSF-1R ECD/huCSF-1R ECDhuFc嵌合体1∶1混合物对小鼠进行静脉内（i.v.）增强免疫一次。
抗原特异性ELISA
通过抗原特异性ELISA测定受免疫小鼠的血清中的抗CSF-1R滴度。
用0.1mg/ml生物素化的抗Fcγ（Jackson ImmunoResearch.，Cat.No.109-066-098）将0.3μg/ml huCSF 1R-huFc嵌合体（可溶性胞外域）捕捉到链霉亲合素板（MaxiSorb；MicroCoat，DE，Cat.No.11974998/MC1099）上，然后加入1/800稀释于PBS/0.05%Tween20/0.5%BSA中的辣根过氧化物酶（HRP）-缀合的F(ab’)2抗小鼠IgG（GE Healthcare，UK，Cat.No.NA9310V）。将来自所有取血（tap）的血清1/40稀释于PBS/0.05%Tween20/0.5%BSA并系列稀释至1/1638400。将稀释后的血清加入孔中。取血前的（pre-tap）血清用作阴性对照。从500ng/ml至0.25ng/ml的小鼠抗人CSF-1R Mab3291（R&DSystems，UK）系列稀释液用作阳性对照。将所有组分一起保温1.5小时。将孔用PBST（PBS/0.2%Tween20）清洗6次，然后用新鲜制备的
Figure BDA00001991065500391
溶液（1mg/ml）（ABTS：2,2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)）对测定进行室温显色10分钟。测量405nm的吸光度。
杂交瘤产生
可基于产生杂交瘤的标准方案将小鼠淋巴细胞分离并用PEG与小鼠骨髓瘤细胞系融合。然后针对抗原特异抗体的产生筛选所产生的杂交瘤。例如，用50%PEG将来自受免疫小鼠之脾衍生淋巴细胞的单细胞悬浮液与Ag8非分泌性小鼠骨髓瘤细胞P3X63Ag8.653（ATCC，CRL-1580）融合。将细胞以大约104接种于平底96孔微量滴定板，然后在选择性培养基上保温约两周。然后通过针对人抗CSF-1R单克隆IgM和IgG抗体的ELISA筛选各个孔。一旦出现广泛的杂交瘤生长，就将分泌抗体的杂交瘤重接种，再次筛选，然后若对于人IgG，抗CSF-1R单克隆抗体仍然是阳性的，则可通过FACS进行亚克隆。然后将稳定的亚克隆体外培养以在组织培养基中产生抗体供表征。可通过如实施例4中所述测定抗CSF-1R抗体对人CSF-1R片段delD4和对人CSF-1R胞外域（CSF-1R-ECD）的结合以及如实施例5中所述在用抗CSF-1R单克隆抗体处理的条件下测定对以野生型CSF-1R（配体依赖性信号传导）或突变型CSF-1R L301S Y969F（配体不依赖性信号传导）转染的NIH3T3细胞的生长抑制来选择依照本发明的抗体。
杂交瘤的培养
将所产生的muMAb杂交瘤在补充有2mM L-谷氨酰胺（GIBCO-Cat.No.35050-038）、1mM丙酮酸钠（GIBCO-Cat.No.11360-039）、1xNEAA（GIBCO-Cat.No.11140-035）、10%FCS（PAA-Cat.No.A15-649）、1xPenStrep（Roche-Cat.No.1074440）、1xNutridoma CS（Roche-Cat.No.1363743）、50μM巯基乙醇（GIBCO-Cat.No.31350-010）和50U/ml小鼠IL-6（Roche-Cat.No.1444581）的RPMI 1640（PAN-Cat.No.PO4-17500）中于37°C和5%CO2进行培养。所产生小鼠抗体中的一些已被人源化（例如Mab 2F11）并重组表达。
实施例2
对CSF-1结合CSF-1R的抑制（ELISA）
通过建立此测定法以便首先使得抗CSF-1R抗体结合CSF-1R-ECD，随后检测不与受体结合的配体，可测试取代配体的抗体和二聚化抑制物抗CSF-1R抗体二者。在384孔微量滴定板（MicroCoat，DE，Cat.No.464718）上于室温进行测试。在每一保温步骤之后平板均用PBST清洗3次。
开始，用0.5mg/ml山羊F(ab')2生物素化抗Fcγ（Jackson ImmunoResearch.，Cat.No.109-006-170）包被平板1小时（h）。
此后将孔用补充有0.2%
Figure BDA00001991065500401
-20和2%BSA（Roche DiagnosticsGmbH，DE）的PBS封闭0.5小时。将75ng/ml的huCSF-1R-huFc嵌合体（它形成了huCSF-1R的二聚可溶性胞外域）固定化至平板上1小时。然后将稀释于PBS/0.05%Tween20/0.5%BSA中的纯化抗体保温1小时。在加入3ng/mlCSF-1（Biomol，DE，Cat.No.60530）、50ng/ml生物素化抗CSF-1克隆BAF216（R&D Systems，UK）和1:5000稀释之链霉亲合素HRP（Roche DiagnosticsGmbH，DE，Cat.No.11089153001）的混合物1小时后，将平板用PBST清洗6次。抑制配体-受体相互作用的抗CSF-1R SC 2-4A5（Santa CruzBiotechnology，US）被用作阳性对照。将平板用新鲜配制的BM
Figure BDA00001991065500402
POD底物溶液（BM
Figure BDA00001991065500411
：3,3′-5,5′-四甲基联苯胺，Roche Diagnostics GmbH，DE，Cat.No.11484281001）在室温显色30分钟。测量370nm处的吸光度。若抗CSF-1R抗体引起CSF-1从二聚复合物中释放，则会发现吸光度降低。所有的抗CSF-1R抗体均显示了对CSF-1与CSF-1R的相互作用的显著抑制（见表1）。抑制配体-受体相互作用的抗CSF-1R SC 2-4A5（Santa CruzBiotechnology，US，也可参阅Sherr，C.J.等人，Blood 73（1989）1786-1793）被用作参照对照。
表1：对CSF-1/CSF-1R相互作用的抑制的IC50计算值
  CSF-1R Mab   IC50 CSF-1/CSF-1R抑制[ng/ml]
  Mab 2F11   19.3
  Mab 2E10   20.6
  Mab 2H7   18.2
  Mab 1G10   11.8
  SC-2-4A5   35.2
实施例3
对NIH3T3-CSF-1R重组细胞中CSF-1-诱导之CSF-1R磷酸化的抑制
4.5x103个用全长CSF-1R的表达载体以逆转录病毒方式感染的NIH 3T3细胞在DMEM（PAA Cat.No.E15-011）、2mM L-谷氨酰胺（Sigma，Cat.No.G7513）、2mM丙酮酸钠、1x非必需氨基酸、10%FKS（PAA，Cat.No.A15-649）和100μg/ml PenStrep（Sigma，Cat.No.P4333[10mg/ml]）中培养至它们达到汇合。此后用补充有亚硒酸钠[5ng/ml]（Sigma，Cat.No.S9133）、运铁蛋白[10μg/ml]（Sigma，Cat.No.T8158）、BSA[400μg/ml]（RocheDiagnostics GmbH，Cat.No.10735078）、4mM L-谷氨酰胺（Sigma，Cat.No.G7513）、2mM丙酮酸钠（Gibco，Cat.No.11360）、1x非必需氨基酸（Gibco，Cat:11140-035）、2-巯基乙醇[0,05mM]（Merck，Cat.No.M7522）、100μg/ml和PenStrep（Sigma，Cat.No.P4333）的无血清DMEM培养液（PAA Cat.No.E15-011）清洗细胞并在30μl相同培养基中保温16小时以使受体上调。将10μl的已稀释抗CSR-1R抗体加至细胞中1.5小时。然后用10μl的100ng/mlhuM-CSF-1（Biomol Cat.No.60530）刺激细胞5分钟。保温后，去除上清液，将细胞用80μl的冰冷PBS漂洗2次并加入50μl新鲜配制的冰冷裂解缓冲液（150mM NaCl/20mM Tris pH 7.5/1mM EDTA/1mM EGTA/1%TritonX-100/1片蛋白酶抑制剂片剂（Roche Diagnostics GmbH，Cat.No.1836170）每10ml缓冲液/10μl/ml磷酸酶抑制剂鸡尾酒1（Sigma，Cat.No.P-2850，100x储液）/10μl/ml蛋白酶抑制剂1（Sigma，Cat.No.P-5726，100x储液）/10μl/ml 1M NaF）。冰置30分钟后，将平板在平板摇床上剧烈振荡3分钟，然后以2200rpm离心10分钟（Heraeus Megafuge 10）。
用ELISA分析细胞裂解物中磷酸化的和总的CSF-1受体的存在。使用来自R&D Systems（Cat.No.DYC3268-2）的试剂盒依照供应商的说明书检测磷酸化的受体。为了检测总的CSF-1R，用试剂盒中所包含的捕捉抗体将10μl的裂解物固定化在平板上。之后加入1:750稀释的生物素化抗CSF-1R抗体BAF329（R&D Systems）和1∶1000稀释的链霉亲合素-HRP缀合物。60分钟后将平板用新鲜配制的
Figure BDA00001991065500421
溶液显色并检测吸光度。数据计算为无抗体下阳性对照的百分率和所表达的磷酸化/总受体比例值。阴性对照限定为不加入M-CSF-1。抗CSF-1R SC 2-4A5（Santa Cruz Biotechnology，US，也可参阅Sherr，C.J.等人，Blood 73（1989）1786-1793），抑制配体-受体相互作用，被用作参照对照。
表2：对CSF-1受体磷酸化的抑制的IC50计算值。
  CSF-1R Mab   IC50 CSF-1R磷酸化[ng/ml]
  Mab 2F11   219.4
  Mab 2E10   752.0
  Mab 2H7   703.4
  Mab 1G10   56.6
  SC-2-4A5   1006.6
实施例4
抗CSF-1R抗体对人CSF-1R片段delD4和对人CSF-1R胞外域（CSF-1R-ECD）之结合的测定
SEQ ID NO:64之人CSF-1R胞外域（CSF-1R-ECD）（包含胞外亚域D1–D5，hCSF-1R-ECD）的制备：
pCMV-preS-Fc-hCSF-1R-ECD（7836bp）编码人CSF-1R之完整ECD（SEQID NO:64），其C-末端与PreScission蛋白酶切割位点融合，随后是人IgG1的第100-330位氨基酸和6xHis标签，在CMV启动子的控制之下。为了建立BamHI限制性位点，已通过在第一个M之后插入氨基酸G和S改变了天然信号肽。
SEQ ID NO:65之人CSF-1R片段delD4（包含胞外亚域D1–D3和D5，hCSF-1R-delD4）的制备：
通过Stratagene QuikChange XL定点诱变方案从pCMV-preS-Fc-hCSF-1R-ECD克隆hCSF1R-delD4-V1-PreSc-hFc-His，使用具有序列CACCTCCATGTTCTTCCGGTACCCCCCAGAGGTAAG（SEQ ID NO:68）的delD4-for作为正向引物而具有反向互补序列的delD4-rev作为反向引物。用BioTechniques 26（1999）680中公布的方案变化来在常规Stratagene方案之前的三个循环中在分开的反应中延伸这两个引物：
依照制造商的指南建立两份分开的50μl反应混合物，每一份含有10ng质粒pCMV-preS-Fc-hCS F1R-ECD作为模板以及10pM的引物delD4-for或delD4-rev之一，以及试剂盒所提供的0.5μl Pfu DNA聚合酶。进行三个PCR循环95°C 30秒钟/55°C 60秒钟/68°C 8分钟，然后将这两种反应混合物各25μl在一新的管中合并，然后加入0.5μl新鲜的Pfu DNA聚合酶。如Stratagene在试剂盒指南中所详列的进行18个温度循环的常规PCR方案，随后用试剂盒所提供的Dpn1限制酶最终消化2小时。用Cel II和Not I消化来检测携带删除的克隆并通过测序证实。
依照制造商的说明书通过在Hek293FreeStyle悬浮细胞系统（Invitrogen）中进行瞬时转染制备蛋白质。1周后过滤500ml上清液并加载至1ml HiTrapMabSelect Xtra（GE healthcare）蛋白A柱（0.2ml/min）上。首先用PBS然后用50mM Tris/150mM NaCl/1mM EDTA/pH 7.3清洗柱子。将稀释于375μl相同缓冲液中的75μl PreScission蛋白酶（GE#27-0843-01）加载到柱子上并关闭柱子在4°C转动保温过夜。将柱子安装到1ml GSTrap FF柱（GE helthcare）的顶端，洗脱目的蛋白（0.2ml/min，0.2ml级分）。将合并的级分通过3kNanosep离心超滤从1.8ml浓缩至0.4ml并在PBS中经过S200HR SEC进行层析（0.5ml/min）。
在两个级分中作为二聚物分子（合并1，V=1.5ml；c=0.30mg/ml；在SDSPAGE上的表观质量是83kDa，还原62kDa）以及作为单体（合并2，V=1.4ml；c=0.25mg/ml，在SDS PAGE上的表观质量是62kDa）获得人CSF-1R片段delD4。将二聚形式用于所有实验中。
抗CSF-1R抗体对人CSF-1R片段delD4和对人CSF-1R胞外域（CSF-1R-ECD）之结合的测定（结合信号作为响应单位（RU）:
仪器：Biacore T100（GE Healthcare）
      软件：T100控制，版本2.0.1
            T100评估，版本2.0.2
测定格式芯片：CM5
温度：25°C
通过胺偶联固定化CSF-1R片段。为了比较依照本发明的不同抗CSF-1R抗体的结合，注射一个浓度的测试抗体。抗CSF-1R Mab3291（R&D-Systems）和SC 2-4A5（Santa Cruz Biotechnology，US-还可参见Sherr，C.J.等人，Blood73（1989）1786-1793）用作参照对照，抗CCR5 m<CCR5>Pz03.1C5（2004年8月18日以DSM ACC 2683保藏于DSMZ）作为阴性对照，所有均处于与本发明抗CSF-1R抗体相同的条件之下。
CSF-1R片段的胺偶联
依照制造商的说明书进行标准的胺偶联：运行缓冲液：PBS-T（Roche：11666789+0.05%Tween20：11332465），通过EDC/NHS混合物活化，以流速10μl/min注射人CSF-1R片段delD4（包含胞外亚域D1–D3和D5）（SEQ IDNO:65）和人CSF-1R胞外域（CSF-1R-ECD）（包含胞外亚域D1-D5）（SEQID NO:64）600秒；稀释于偶联缓冲液NaAc pH 5.0中，c=10μg/mL；通过注射1M乙醇胺封闭最终残余的活化羧基。
在25°C<CSF-1R>Mab 2F11、Mab 2E10、Mab 3291和sc2-4A5和其它抗CSF-1R抗体对人CSF-1R片段delD4和人CSF-1R胞外域（CSF-1R-ECD）的结合
运行缓冲液：PBS-T（Roche：11666789+0.05%Tween20：11332465）
分析物样品：
通过以流速30μL/min注射浓度c=10nM的分析物来对结合进行测量。（在第二个实验中是针对Mab 1G10、Mab 2H7和人源化hMab 2F11-e7）每次注射时长是700秒，随后是180秒的解离期。每个循环后用50mM NaOH进行最后的再生，接触时间60秒，流速30μL/min。
以注射结束后10秒的报告点测量信号。扣除参照信号（来自空白参照流动室（只用EDC/NHS和乙醇胺处理））以得到结合信号（作为RU）。若非结合抗体的结合信号稍微低于0（Mab 2F11=-3；Mab 2E10=-2；Mab 1G10=-6，Mab 2H7=-9；及人源化hMab 2F11-e7=-7），则将所述数值设为0。
表3a：在25°C<CSF-1R>MAb对人CSF-1R片段delD4和CSF-1R-ECD的结合及比例，通过SPR测量
Figure BDA00001991065500451
Mab 2F11和Mab 2E10显示了结合人CSF-1R胞外域（CSF-1R-ECD）（见图2b）；不过未检测到对CSF-1R片段delD4的结合（见图2a）。
Sc2-4A5和MAB3291显示出结合CSF-1R-ECD和del D4（见图2b和2a）。
因此抗CSF1R抗体Mab 2F11和Mab 2E10对CSF1R片段delD4/对CSF-1R-ECD的结合比例明显低于1:50（=0.02），而MAB3291和Sc2-4A5的结合比例分别是1.61和1.50，并且远高于1:50（=0.02）。阴性对照抗体m<CCR5>Pz03.1C5未显示任何结合（如所预期的）。
Mab 1G10、Mab 2H7和人源化hMab 2F11-e7显示出结合人CSF-1R胞外域（CSF-1R-ECD）（见图2d）；不过未检测到对CSF-1R片段delD4的结合。（见图2c）。因此抗CSF1R抗体Mab 1G10、Mab 2H7和人源化hMab 2F11-e7对CSF1R片段delD4/对CSF-1R-ECD的结合比例明显低于1:50（=0.02）。
在进一步的实验中调查了抗CSF-1R抗体1.2.SM（WO2009026303中所述的配体置换性CSF-1R抗体）、CXIIG6（WO 2009/112245中所述的配体置换性CSF-1R抗体）、山羊多克隆抗CSF-1R抗体ab10676（abcam）。抗CSF-1R抗体Mab3291（R&D-Systems）用作参照对照。抗CCR5m<CCR5>Pz03.1C5（2004年8月18日以DSM ACC 2683保藏于DSMZ）用作阴性对照。
表3b：在25°C<CSF-1R>MAb对人CSF-1R片段delD4和CSF-1R-ECD的结合及比例，通过SPR测量
Figure BDA00001991065500461
1.2.SM、CXIIG6、ab10676和MAB3291显示出结合CSF-1R-ECD和del D4（见图2f和2e）。
1.2.SM、CXIIG6、ab10676和MAB3291的结合比例远高于1:50（=0.02）。阴性对照抗体m<CCR5>Pz03.1C5未显示出任何结合（如所预期的）。
实施例5
在用抗CSF-1R单克隆抗体处理下对3D培养中的NIH3T3-CSF-1R重组细胞的生长抑制（CellTiterGlo测定法）
用全长野生型CSF-1R（SEQ ID NO:62）或突变型CSF-1R L301S Y969F（SEQ ID NO:63）的表达载体经逆转录病毒感染的NIH 3T3细胞在poly-HEMA（聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯（poly(2-hydroxyethylmethacrylate)））（Polysciences，Warrington，PA，USA））包被（以防止粘附至塑料表面）的平皿上培养于补充有2mM L-谷氨酰胺、2mM丙酮酸钠和非必需氨基酸和10%胎牛血清（Sigma，Taufkrchen，Germany）的DMEM高葡萄糖培养基（PAA，Pasching，Austria）中。细胞接种于用5ng/ml亚硒酸钠、10mg/ml运铁蛋白、400μg/ml BSA和0.05mM 2-巯基乙醇替换血清的培养基中。在用100ng/ml huCSF-1（Biomol，Hamburg，Germany）处理时，表达wtCSF-1R的细胞形成三维生长的密集椭球体，被称为停泊独立的特性。这些椭球体近似于原位实体肿瘤的三维结构和组织。突变型CSF-1R重组细胞能够不依赖于CSF-1配体而形成椭球体。在不同浓度的抗体存在下将椭球体培养物保温3天以测定IC50（细胞生存能力被50%抑制的浓度）。用CellTiterGlo测定法通过测量细胞的ATP含量来检测细胞的生存能力。
表5a：
Figure BDA00001991065500471
参照对照Mab R&D-Systems 3291未显示对突变型CSF-1R重组细胞增殖的抑制。
在进一步的实验中调查了依照本发明的抗CSF-1R抗体hMab 2F11-e7和抗CSF-1R抗体1.2.SM（WO2009026303中所述的配体置换性CSF-1R抗体）、CXIIG6（WO 2009/112245中所述的配体置换性CSF-1R抗体）、山羊多克隆抗CSF-1R抗体ab10676（abcam）、和SC 2-4A5（Santa Cruz Biotechnology，US-还可参见Sherr，C.J.等人，Blood 73（1989）1786-1793）。
在不同浓度的抗体存在下将椭球体培养物保温3天以测定IC30（细胞生存能力被30%抑制的浓度）。最大浓度是20μg/ml。用CellTiterGlo测定法通过测量细胞的ATP含量来检测细胞的生存能力。
表5b:
Figure BDA00001991065500472
实施例6
在用抗CSF-1R单克隆抗体处理下对3D培养中的BeWo肿瘤细胞的生长抑制（CellTiterGlo-测定法）
将BeWo绒毛膜癌细胞（ATCC CCL-98）培养于补充有10%FBS（Sigma）和2mM L-谷氨酰胺的F12K培养基（Sigma，Steinheim，Germany）中。将5x104个细胞/孔接种于装有补充了0.5%FBS和5%BSA之F12K培养基的96孔poly-HEMA（聚甲基丙稀酸-2-羟乙酯）包被的平板中。伴随地加入200ng/mlhuCSF-1和10μg/ml不同抗CSF-1R单克隆抗体并保温6天。用CellTiterGlo测定法通过以相对光单位（RLU）测量细胞的ATP含量来检测细胞的生存能力。当用不同抗CSF-1R抗体（10μg/ml）处理BeWo椭球体培养物时，观察到了对CSF-1诱导的生长的抑制。为了计算抗体介导的抑制作用，从所有样品中减去未刺激BeWo细胞的RLU均值。CSF-1刺激细胞的RLU均值任意设置为100%。将用CSF-1刺激和用抗CSF-1R抗体处理的细胞的RLU均值计算为CSF-1刺激RLU的百分率。表6显示了在用抗CSF-1R单克隆抗体处理下对3D培养中的BeWo肿瘤细胞的生长抑制的计算数据；图1a和b描述了标准化RLU均值。
表6：
  CSF-1R Mab   %抑制10μg/ml抗体浓度
  只用CSF-1   0
  Mab 2F11   70
  Mab 2E10   102
  Mab 2H7   103
  Mab 1G10   99
  SC 2-4A5   39
实施例7
在用抗CSF-1R单克隆抗体处理下对人巨噬细胞分化的抑制（CellTiterGlo测定法）
用RosetteSepTM人单核细胞富集鸡尾酒（Stemcell Tech.-Cat.No.15028）从外周血中分离人单核细胞。将富集的单核细胞群在37°C和5%CO2的增湿气氛中接种于96孔微量滴定板（2.5x104个细胞/孔）内补充了10%FCS（GIBCO-Cat.No.011-090014M）、4mM L-谷氨酰胺（GIBCO-Cat.No.25030）和1x PenStrep（Roche Cat.No.1074440）的100μl RPMI 1640（Gibco-Cat.No.31870）中。当在培养基中加入150ng/ml huCSF-1时，可观察到清楚地分化成粘附性巨噬细胞。此分化通过添加抗CSF-1R抗体可被抑制。此外，单核细胞的生存受影响并可通过CellTiterGlo（CTG）分析进行分析。从抗体处理对单核细胞生存的浓度依赖性抑制，计算IC50（见表7）。
表7：
  CSF-1R Mab   IC50[μg/ml]
  Mab 2F11   0.08
  Mab 2E10   0.06
  Mab 2H7   0.03
  Mab 1G10   0.06
  SC 2-4A5   0.36
在分开的测试中，系列人源化形式的Mab 2F11，例如hMab 2F11-c11、hMab 2F11-d8、hMab 2F11-e7、hMab 2F11-f12，显示了0.07μg/ml（hMab2F11-c11）、0.07μg/ml（hMab 2F11-d8）、0.04μg/ml（hMab 2F11-e7）和0.09μg/ml（hMab 2F11-f12）的IC50值。
实施例8
在用抗CSF-1R单克隆抗体处理下对猕猴巨噬细胞分化的抑制（CellTiterGlo测定法）
用CD14微珠非人灵长类动物试剂盒（Miltenyi Biotec-Cat.No.130-091-097）依照制造商的说明从外周血中分离猕猴单核细胞。将富集的单核细胞群在37°C和5%CO2的增湿气氛中接种于96孔微量滴定板（1-3x104个细胞/孔）内补充有10%FCS（GIBCO-Cat.No.011-090014M）、4mM L-谷氨酰胺（GIBCO-Cat.No.25030）和1x PenStrep（Roche Cat.No.1074440）的100μl RPMI 1640（Gibco-Cat.No.31870）中。当在培养基中加入150ng/mlhuCSF-1时，可观察到清楚地分化成粘附性巨噬细胞。此分化通过添加抗CSF-1R抗体可被抑制。此外，单核细胞的生存受影响并可通过CellTiterGlo（CTG）分析进行分析。在浓度5μg/ml抗体处理下分析生存能力（见表8）。
表8：
  CSF-1R Mab   %生存   %抑制（生存的）=（100%-%生存）
  Mab 2F11   4*   96
  Mab 2E10   17**   83
  Mab 2H7   8   92
  Mab 1G10   2   98
  SC 2-4A5   31   69
*四次实验的均值（3次实验用鼠的，1次实验用嵌合的mAb）
**只用鼠mAb的两次实验的均值
实施例9
抗CSF-1R抗体对人CSF-1R的结合亲和力的测定
仪器：
Figure BDA00001991065500501
A100
芯片：    CM5（Biacore BR-1006-68）
偶联：    胺偶联
缓冲液：  PBS（Biacore BR-1006-72），pH 7.4，35°C
为了亲和力测量，将36μg/ml抗小鼠Fcγ抗体（来自山羊，JacksonImmuno Reasearch JIR115-005-071）偶联至芯片表面上以捕捉针对CSF-1R的抗体。以溶液中不同浓度添加人CSF-1R胞外域（CSF-1R-ECD）（包含胞外亚域D1–D5）（SEQ ID NO:64）（R&D-Systems 329-MR或亚克隆的pCMV-presS-HisAvitag-hCSF-1R-ECD）。通过在35°C 1.5分钟的CSF-1R注射测量结合；通过在35°C用缓冲液清洗芯片表面10分钟来测量解离。为了计算动力学参数使用了Langmuir 1:1模型。
表9：
通过SPR测量的亲和力数据
  CSF-1R Mab   KD(nM)   ka（1/Ms）   kd（1/s）   t1/2(min)
  Mab 2F11   0.29   1.77E+05   5.18E-05   223
  Mab 2E10   0.2   1.52E+05   2.97E-05   389
  Mab 2H7   0.21   1.47E+05   3.12E-05   370
  Mab 1G10   0.36   1.75E+05   6.28E-05   184
在使用CSF-1R ECD的分开的Biacore结合测定中（数据未显示），显示了抗体Mab 2F11和Mab 2E10与抗体Ab SC-2-4A5的一些竞争。不过Mab2F11/Mab 2E10不结合人CSF-1R片段delD4，而Ab SC-2-4A5结合此delD4片段（见实施例4和图2a）。因此Mab 2F11/Mab 2E10的结合区显然不同于AbSC-2-4A5的结合区，但可能位于邻近的区域内。在此类竞争测定法中，抗体Mab 2F11和Mab 2E10二者均不与来自R&D-Systems的Mab3291竞争（数据未显示）。
实施例10
抗CSF-1R抗体对人CSF-1R片段D1-D3的结合的测定
仪器：Biacore T100（GE Healthcare）
      软件：T100控制，版本1.1.11
            B3000评估，版本4.01
            Scrubber，版本2.0a
测定格式芯片：CM5-芯片
通过胺偶联的捕捉分子捕捉针对CSF-1R的抗体。利用单循环动力学注射5个逐渐增加之浓度的人CSF-1R片段D1-D3（SEQ ID NO:66）。将人CSF-1R片段D1-D3亚克隆入pCMV-presS-HisAvitag表达载体中。
将抑制配体-受体相互作用的抗CSF-1R SC 2-4A5（Santa CruzBiotechnology，US；Sherr，C.J.等人，Blood 73（1989）1786-1793）和Mab 3291（R&D-Systems）用作参照对照。
捕捉分子：抗小鼠Fcγ抗体（来自山羊，Jackson Immuno ReasearchJIR115-005-071）针对依照本发明的抗体和R&D-Systems对照Mab 3291，而抗大鼠Fcγ抗体（来自山羊，Jackson Immuno Reasearch JIR112-005-071）针对参照对照抗CSF-1R SC 2-4A5。
捕捉分子的胺偶联
依照制造商说明书进行标准胺偶联：运行缓冲液：HBS-N缓冲液，用EDC/NHS混合物活化，目标是2000RU的配体密度；将捕捉抗体稀释于偶联缓冲液NaAc pH 4.5中，c=10μg/mL；通过注射1M乙醇胺封闭最终残余的活化羧基。
在37°C人CSF-1R片段D1-D3结合MAb<CSF-1R>的动力学表征
运行缓冲液：PBS（Biacore BR-1006-72）
在流动室2至4上捕捉Mab<CSF-1R>：流速20μL/min，接触时间90秒，c（Ab<CSF-1R>）=50nM，用运行缓冲液+1mg/mL BSA稀释；
分析物样品：
以30μL/min的流速通过5次连续注射浓度c=7.8、31.25、125、500和2000nM的分析物来测量单循环动力学，无再生。每次注射是30秒时长，随后是用于头四次注射的120秒解离期，及最终用于最高浓度（=最后一次注射）的1200秒解离期。
在每一循环后用10mM甘氨酸pH 1.5（Biacore BR-1003-54）进行最后的再生，接触时间60秒，流速30μL/min。
通过使用通常的双重参照（对照参照：分析物对捕捉分子的结合；流动室：亚域CSF-1R浓度“0”作为空白）及用模型“滴定动力学1:1结合负荷物(draft)”的计算来计算动力学参数。
表10：
通过SPR测量的关于人CSF-1R片段D1-D3结合的亲和力数据
  CSF-1R Mab   亚域   KD(nM)   ka(1/Ms)   kd(1/s)  t1/2(min)
  Mab 2F11   D1-D3   无结合
  Mab 2E10   D1-D3   无结合
  Mab 2H7   D1-D3   未测定
  Mab 1G10   D1-D3   无结合
  SC-2-4A5   D1-D3   无结合
  R&D-Systems 3291   D1-D3   5.4   2.2E+5   1.2E-3  9.6
抗体Mab 2F11、Mab 2E10和Mab 1G10显示出不结合人CSF-1R片段D1-D3。
参照对照Ab SC-2-4A5也不结合人CSF-1R片段D1-D3。
参照对照Mab R&D-Systems 3291显示出结合人CSF-1R片段D1-D3。
实施例11
猕猴中CSF-1R抑制期间CSF-1的水平升高
血清CSF-1水平提供了抗人CSF-1R二聚化抑制物hMab 2F11-e7之CSF-1R中和活性的药效标志。对每一剂量组（1和10mg/kg）一只雄性和一只雌性猕猴静脉内施用抗CSF1R抗体hMab 2F11-e7。在处理之前（用药前）、用药后2、24、48、72、96、168小时以及另外再两周的每周收集血液样品，供分析CSF-1水平。用商品化的ELISA试剂盒（
Figure BDA00001991065500521
人M-CSF）依照制造商的说明书（R&D Systems，UK）测定CSF-1水平。通过与试剂盒中所提供的CSF-1标准曲线样品进行比较来确定猴CSF-1水平。
施用hMab 2F11-e7诱导CSF-1显著升高约1000倍，这取决于持续48小时（1mg/kg）或15天（10mg/kg）施用的剂量。因此，与配体置换性抗体相反，针对CSF-1R的二聚化抑制物提供的优势在于不直接与显著上调的配体竞争对受体的结合。
实施例12
体内功效–在SCID米色小鼠中乳腺癌BT20异种移植物肿瘤细胞中抗CSF-1R抗体的肿瘤生长抑制作用
人乳腺癌细胞系BT-20表达人CSF-1R但没有CSF-1表达（Sapi，E.等人，Cancer Res 59（1999）5578-5585）。由于小鼠衍生CSF-1不能活化肿瘤细胞上的人CSF-1R，经由渗透压微泵（ALZET，Cupertino，CA）以2μg/天的速率提供连续的CSF-1输注补充重组人CSF-1（Biomol，Hamburg，Germany）（Martin，T.A.，Carcinogenesis 24（2003）1317-1323）。
为了将干扰CSF-1R二聚化之抗体的功效与配体置换性CSF-1R抗体进行直接比较，我们在BT-20异种移植物模型中测试了嵌合抗CSF-1R Mab 2F11（干扰CSF-1R二聚化的抗体）和1.2.SM（WO2009026303中所述的配体置换性CSF-1R抗体）。
给SCID米色小鼠（Charles River，Sulzfeld，Germany）皮下共注射1x107个细胞的BT-20细胞（ATCC HTB-19）和100μl的Matrigel。在平均肿瘤体积100mm3时随机化日开始动物的处理。用在20mM组氨酸、140mM NaCl pH6.0缓冲液中的各抗体（见图4）每周腹膜内（i.p.）处理小鼠一次。在分级日开始并且随后在整个处理期期间每周两次用测径器测量肿瘤尺寸。依照NCI方案计算肿瘤体积（肿瘤重量=1/2ab2，其中“a”和“b”分别是肿瘤的长和短直径）。
肿瘤生长分析如图4中所示。嵌合抗CSF-1R Mab 2F11对肿瘤细胞上人CSF-1R的抑制作用就统计学而言在介导肿瘤生长抑制上比抗CSF-1R抗体1.2.SM（WO2009026303中所述的CSF-1R抗体）更有效。
Figure IDA00001991065900011
Figure IDA00001991065900021
Figure IDA00001991065900031
Figure IDA00001991065900051
Figure IDA00001991065900061
Figure IDA00001991065900081
Figure IDA00001991065900091
Figure IDA00001991065900101
Figure IDA00001991065900111
Figure IDA00001991065900121
Figure IDA00001991065900141
Figure IDA00001991065900151
Figure IDA00001991065900171
Figure IDA00001991065900181
Figure IDA00001991065900191
Figure IDA00001991065900201
Figure IDA00001991065900211
Figure IDA00001991065900221
Figure IDA00001991065900231
Figure IDA00001991065900241
Figure IDA00001991065900251
Figure IDA00001991065900261
Figure IDA00001991065900271
Figure IDA00001991065900281
Figure IDA00001991065900291
Figure IDA00001991065900311
Figure IDA00001991065900321
Figure IDA00001991065900341

Claims (27)

1.一种结合人CSF-1R的抗体，特征在于该抗体以1:50或更低的比率结合人CSF-1R片段delD4（SEQ ID NO:65）和人CSF-1R胞外域（SEQ ID NO:64）。
2.依照权利要求1的抗体，特征在于
a）重链可变域为SEQ ID NO:7且轻链可变域为SEQ ID NO:8；
b）重链可变域为SEQ ID NO:15且轻链可变域为SEQ ID NO:16；
c）重链可变域为SEQ ID NO:75且轻链可变域为SEQ ID NO:76；
d）重链可变域为SEQ ID NO:83且轻链可变域为SEQ ID NO:84；
或其人源化形式。
3.依照权利要求1的抗体，特征在于
a）重链可变域为SEQ ID NO:23且轻链可变域为SEQ ID NO:24，或
b）重链可变域为SEQ ID NO:31且轻链可变域为SEQ ID NO:32，或
c）重链可变域为SEQ ID NO:39且轻链可变域为SEQ ID NO:40，或
d）重链可变域为SEQ ID NO:47且轻链可变域为SEQ ID NO:48，或
e）重链可变域为SEQ ID NO:55且轻链可变域为SEQ ID NO:56。
4.依照权利要求1的抗体，特征在于
a）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:1、CDR2区SEQ ID NO:2、和CDR1区SEQ ID NO:3，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:4、CDR2区SEQ IDNO:5、和CDR1区SEQ ID NO:6，或
b）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:9、CDR2区SEQ ID NO:10、和CDR1区SEQ ID NO:11，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:12、CDR2区SEQID NO:13、和CDR1区SEQ ID NO:14，或
c）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:17、CDR2区SEQ ID NO:18、和CDR1区SEQ ID NO:19，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:20、CDR2区SEQID NO:21、和CDR1区SEQ ID NO:22，或
d）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:25、CDR2区SEQ ID NO:26、和CDR1区SEQ ID NO:27，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:28、CDR2区SEQID NO:29、和CDR1区SEQ ID NO:30，或
e）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:33、CDR2区SEQ ID NO:34、和CDR1区SEQ ID NO:35，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:36、CDR2区SEQID NO:37、和CDR1区SEQ ID NO:38，或
f）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:41、CDR2区SEQ ID NO:42、和CDR1区SEQ ID NO:43，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:44、CDR2区SEQID NO:45、和CDR1区SEQ ID NO:46，或
g）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:49、CDR2区SEQ ID NO:50、和CDR1区SEQ ID NO:51，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:52、CDR2区SEQID NO:53、和CDR1区SEQ ID NO:54，或
h）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:69、CDR2区SEQ ID NO:70、和CDR1区SEQ ID NO:71，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:72、CDR2区SEQID NO:73、和CDR1区SEQ ID NO:74，或
i）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:77、CDR2区SEQ ID NO:78、和CDR1区SEQ ID NO:79，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:80、CDR2区SEQID NO:81、和CDR1区SEQ ID NO:82。
5.依照权利要求1至4任一项的抗体，特征在于所述抗体属于人IgG1亚类或属于人IgG4亚类。
6.一种药物组合物，特征在于包含依照权利要求1至5的抗体。
7.依照权利要求1至5的抗体，用于癌症的治疗。
8.依照权利要求1至5的抗体，用于骨丢失的治疗。
9.依照权利要求1至5的抗体，用于转移的预防或治疗。
10.依照权利要求1至5的抗体，用于炎性疾病的治疗。
11.一种编码结合CSF-1R的抗体的重链的核酸，特征在于所述抗体包含依照权利要求2或3的可变域。
12.一种表达载体，特征在于包含依照权利要求11的核酸，用于在原核或真核宿主细胞中表达依照权利要求1至5的抗体。
13.一种原核或真核宿主细胞，包含依照权利要求12的载体。
14.一种用于生产依照权利要求1至5的重组抗体的方法，特征在于在原核或真核宿主细胞中表达依照权利要求11的核酸并自所述细胞或细胞培养物上清液回收所述抗体。
15.依照权利要求1至5的抗体制造用于治疗癌症的药物的用途。
16.依照权利要求1至5的抗体制造用于治疗骨丢失的药物的用途。
17.依照权利要求1至5的抗体制造用于治疗转移的药物的用途。
18.依照权利要求1至5的抗体制造用于治疗炎性疾病的药物的用途。
19.一种用于治疗患有癌症的患者的方法，特征在于对该患者施用依照权利要求1至5的抗体。
20.一种用于治疗患有骨丢失的患者的方法，特征在于对该患者施用依照权利要求1至5的抗体。
21.一种用于治疗患有转移的患者的方法，特征在于对该患者施用依照权利要求1至5的抗体。
22.一种用于治疗患有炎性疾病的患者的方法，特征在于对该患者施用依照权利要求1至5的抗体。
23.一种结合人CSF-1R的抗体，特征在于
a）重链可变域为SEQ ID NO:7且轻链可变域为SEQ ID NO:8；
b）重链可变域为SEQ ID NO:15且轻链可变域为SEQ ID NO:16；
c）重链可变域为SEQ ID NO:75且轻链可变域为SEQ ID NO:76；
d）重链可变域为SEQ ID NO:83且轻链可变域为SEQ ID NO:84；
或其人源化形式。
24.一种结合人CSF-1R的抗体，特征在于
a）重链可变域为SEQ ID NO:23且轻链可变域为SEQ ID NO:24，或
b）重链可变域为SEQ ID NO:31且轻链可变域为SEQ ID NO:32，或
c）重链可变域为SEQ ID NO:39且轻链可变域为SEQ ID NO:40，或
d）重链可变域为SEQ ID NO:47且轻链可变域为SEQ ID NO:48，或
e）重链可变域为SEQ ID NO:55且轻链可变域为SEQ ID NO:56。
25.一种结合人CSF-1R的抗体，特征在于
a）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:1、CDR2区SEQ ID NO:2、和CDR1区SEQ ID NO:3，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:4、CDR2区SEQ IDNO:5、和CDR1区SEQ ID NO:6，或
b）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:9、CDR2区SEQ ID NO:10、和CDR1区SEQ ID NO:11，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:12、CDR2区SEQID NO:13、和CDR1区SEQ ID NO:14，或
c）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:17、CDR2区SEQ ID NO:18、和CDR1区SEQ ID NO:19，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:20、CDR2区SEQID NO:21、和CDR1区SEQ ID NO:22，或
d）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:25、CDR2区SEQ ID NO:26、和CDR1区SEQ ID NO:27，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:28、CDR2区SEQID NO:29、和CDR1区SEQ ID NO:30，或
e）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:33、CDR2区SEQ ID NO:34、和CDR1区SEQ ID NO:35，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:36、CDR2区SEQID NO:37、和CDR1区SEQ ID NO:38，或
f）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:41、CDR2区SEQ ID NO:42、和CDR1区SEQ ID NO:43，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:44、CDR2区SEQID NO:45、和CDR1区SEQ ID NO:46，或
g）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:49、CDR2区SEQ ID NO:50、和CDR1区SEQ ID NO:51，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:52、CDR2区SEQID NO:53、和CDR1区SEQ ID NO:54，或
h）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:69、CDR2区SEQ ID NO:70、和CDR1区SEQ ID NO:71，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:72、CDR2区SEQID NO:73、和CDR1区SEQ ID NO:74，或
i）重链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:77、CDR2区SEQ ID NO:78、和CDR1区SEQ ID NO:79，且轻链可变域包含CDR3区SEQ ID NO:80、CDR2区SEQID NO:81、和CDR1区SEQ ID NO:82。
26.依照权利要求23至25任一项的抗体，特征在于所述抗体属于人IgG1亚类。
27.一种药物组合物，特征在于包含依照权利要求23至26的抗体。
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