KR101434070B1

KR101434070B1 - 인간 ｃｓｆ-1ｒ 세포외 도메인 4에 우선적으로 결합하는 항체 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101434070B1
Application number: KR1020127017818A
Authority: KR
Inventors: 니콜라오스 디모우디스; 게오르그 페르티그; 알렉산더 피들러; 클라우스 칼루자; 마를렌 피클; 카롤라 리스; 스테판 시버; 마틴 란젠되르퍼
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2009-12-10
Filing date: 2010-12-07
Publication date: 2014-08-25
Also published as: AU2010329934A1; US20170320953A1; DK2510010T3; PT2949670T; MX353706B; EP2510010A1; CN105218672A; HK1219739A1; CR20120215A; KR20120098872A; BR112012013717A2; SI2510010T1; IL219595A0; PL2949670T3; LT2949670T; PT2510010E; RS54596B1; US10072087B2; US20180208662A1; DK2949670T3

Abstract

본 발명은 인간 CSF-1R에 대한 항체(항-CSF-1R 항체), 그의 생산 방법, 상기 항체를 포함하는 약학 조성물, 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

인간 ＣＳＦ-1Ｒ 세포외 도메인 4에 우선적으로 결합하는 항체 및 그의 용도{ANTIBODIES BINDING PREFERENTIALLY HUMAN CSF1R EXTRACELLULAR DOMAIN 4 AND THEIR USE}

본 발명은 인간 CSF-1R에 대한 항체(항-CSF-1R 항체), 그의 생산 방법, 상기 항체를 함유하는 약학 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.

인간 CSF-1 수용체(CSF-1R; 콜로니 자극 인자 1 수용체; 유의어: M-CSF 수용체; 대식세포 콜로니-자극 인자 1 수용체, Fms 원 종양 형성 유전자, c-fms, 서열번호 62)는 1986년 이래로 공지되어 있다(문헌[Coussens, L., et al., Nature 320 (1986) 277-280]). CSF-1R은 성장 인자이며 c-fms 원 종양 형성 유전자에 의해 암호화된다(예를 들어 문헌[Roth, P., and Stanley, E.R., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 181 (1992) 141-67]에서 검토되었다).

CSF-1R은 CSF-1(콜로니 자극 인자 1, 또한 M-CSF, 대식세포 콜로니-자극 인자라 칭한다)에 대한 수용체이며 상기 사이토킨의 생물 효과를 매개한다(문헌[Sherr, C.J., et al., Cell 41 (1985) 665-676]). 콜로니 자극 인자-1 수용체(CSF-1R)(또한 c-fms라 칭한다)의 클로닝은 문헌[Roussel, M.F., et al., Nature 325 (1987) 549-552]에 최초로 개시되었다. 상기 발행물에서, CSF-1R은, Cb1에 결합하고 이에 의해 수용체 하향 조절을 조절하는 억제성 타이로신 969 인산화의 상실을 포함하여 단백질의 C-말단 꼬리의 변화에 따른 형질전환 잠재력을 갖는 것으로 입증되었다(문헌[Lee, P.S., et al., Embo J. 18 (1999) 3616-3628]). 최근에 인터류킨-34(IL-34)라 칭하는 CSF-1R에 대한 제 2 리간드가 동정되었다(문헌[Lin, H., et al, Science 320 (2008) 807-811]).

상기 사이토킨 CSF-1(콜로니 자극 인자 1, 또한 M-CSF, 대식세포라 칭한다)은 다이설파이드-결합된 동종이량체로서 세포외에서 발견된다(문헌[Stanley, E.R. et al., Journal of Cellular Biochemistry 21 (1983) 151-159], 문헌[Stanley, E.R. et al., Stem Cells 12 Suppl. 1 (1995) 15-24]).

CSF-1R 신호전달의 주요 생물 효과는 조혈 전구 세포의 대식세포 계통(파골세포 포함)으로의 분화, 증식, 이동 및 생존이다. CSF-1R의 활성화는 그의 리간드, CSF-1(M-CSF) 및 IL-34에 의해 매개된다. CSF-1R에 대한 CSF-1(M-CSF)의 결합은 동종이량체의 형성 및 타이로신 인산화에 의한 키나제의 활성화를 유도한다(문헌[Li, W. et al, EMBO Journal.10 (1991) 277-288], 문헌[Stanley, E.R., et al., Mol. Reprod. Dev. 46 (1997) 4-10]).

생물학적으로 활성인 동종이량체 CSF-1은 CSF-1 수용체의 세포외 도메인(CSF-1R-ECD)의 서브도메인 D1 내지 D3 내의 CSF-1R에 결합한다. CSF-1R-ECD는 5개의 면역글로불린-형 서브도메인(D1 내지 D5로 표시됨)을 포함한다. 세포외 도메인(CSF-1R-ECD)의 서브도메인 D4 또는 D5는 CSF-1 결합에 관련되지 않는다(문헌[Wang, Z., et al Molecular and Cellular Biology 13 (1993) 5348-5359]). 서브도메인 D4는 이량체화에 관련된다(문헌[Yeung, Y-G., et al Molecular & Cellular Proteomics 2 (2003) 1143-1155], 문헌[Pixley, F. J., et al., Trends Cell Biol 14 (2004) 628-638]).

추가의 신호전달은 각각 PI3K/AKT 및 Ras/MAPK 경로에 연결된 PI3K 및 Grb2의 p85 서브유닛에 의해 매개된다. 이들 2개의 중요한 신호전달 경로는 증식, 생존 및 세포자멸사를 조절할 수 있다. CSF-1R의 인산화된 세포내 도메인에 결합하는 다른 신호전달 분자는 STAT1, STAT3, PLCy 및 Cb1을 포함한다(문헌[Bourette, R.P. and Rohrschneider, L.R., Growth Factors 17 (2000) 155-166]).

CSF-1R 신호전달은 면역 반응, 뼈 리모델링 및 생식계에서 생리학적 역할을 한다. CSF-1(문헌[Pollard, J.W., Mol. Reprod. Dev. 46 (1997) 54-61]) 또는 CSF-1R(문헌[Dai, X.M., et al., Blood 99 (2002) 111-120])에 대한 녹아웃 동물들은 각각의 세포 유형들에서 CSF-1R에 대한 역할과 일치하는 골화석화, 조혈, 조직 대식세포 및 생식 표현형을 갖는 것으로 나타났다.

문헌[Sherr, C.J., et al., Blood 73 (1989) 1786-1793]은 CSF-1 활성을 억제하는 CSF-1R에 대한 일부 항체에 관한 것이다(문헌[Sherr, C.J. et al., Blood 73 (1989) 1786-1793] 참조). 문헌[Ashmun, R.A., et al., Blood 73 (1989) 827-837]은 CSF-1R 항체에 관한 것이다. 문헌[Lenda, D., et al., Journal of Immunology 170 (2003) 3254-3262]은 신장 염증 동안 관(tubular) 세포자멸사를 감소시키는 CSF-1-결함 마우스에서의 감소된 대식세포 보충, 증식 및 활성화에 관한 것이다. 문헌[Kitaura, H., et al., Journal of Dental Research 87 (2008) 396-400]은 치과 교정 중 치아 이동을 억제하는 항-CSF-1 항체에 관한 것이다. 국제특허출원공개 제2001/030381호는 CSF-1 안티센스 뉴클레오타이드만을 개시하면서 안티센스 뉴클레오타이드 및 항체를 포함하는 CSF-1 활성 억제제를 언급한다. 국제특허출원공개 제2004/045532호는 길항물질로서 항-CSF-1-항체만을 개시하는, CSF-1 길항물질에 의한 전이암의 전이 및 골 손실 예방 및 치료에 관한 것이다. 국제특허출원공개 제2005/046657호는 항-CSF-1-항체에 의한 염증성 장 질병의 치료에 관한 것이다. 미국특허출원공개 제2002/0141994호는 콜로니 자극 인자의 억제제에 관한 것이다. 국제특허출원공개 제2006/096489호는 항-CSF-1-항체에 의한 류마티스성 관절염의 치료에 관한 것이다. 국제특허출원공개 제2009/026303호 및 국제특허출원공개 제2009/112245호는 세포외 도메인(CSF-1R-ECD)의 처음 3개 서브도메인(D1 내지 D3) 내의 CSF-1R에 결합하는 일부 항-CSF-1R 항체에 관한 것이다.

본 발명은 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 포함하되, 상기 항체는 인간 CSF-1R 단편 delD4(서열번호 65) 및 인간 CSF-1R 세포외 도메인(서열번호 64)에 1:50 이하의 비로 결합함을 특징으로 한다.

본 발명은 또한

a) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 7이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 8이며,

b) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 15이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 16이며,

c) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 75이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 76이며,

d) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 83이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 84임

을 특징으로 하는 본 발명에 따른 항체 또는 그의 인간화된 버전을 포함한다.

본 발명은 또한

b) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 15이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 16임

하나의 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는

a) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 23이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 24이거나, 또는

b) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 31이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 32이거나, 또는

c) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 39이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 40이거나, 또는

d) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 47이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 48이거나, 또는

e) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 55이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 56임

을 특징으로 한다.

본 발명은 또한

a) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 1의 CDR3 영역, 서열번호 2의 CDR2 영역 및 서열번호 3의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 4의 CDR3 영역, 서열번호 5의 CDR2 영역 및 서열번호 6의 CDR1 영역을 포함하거나, 또는

b) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 9의 CDR3 영역, 서열번호 10의 CDR2 영역 및 서열번호 11의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 12의 CDR3 영역, 서열번호 13의 CDR2 영역 및 서열번호 14의 CDR1 영역을 포함하거나, 또는

c) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 17의 CDR3 영역, 서열번호 18의 CDR2 영역 및 서열번호 19의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 20의 CDR3 영역, 서열번호 21의 CDR2 영역 및 서열번호 22의 CDR1 영역을 포함하거나, 또는

d) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 25의 CDR3 영역, 서열번호 26의 CDR2 영역 및 서열번호 27의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 28의 CDR3 영역, 서열번호 29의 CDR2 영역 및 서열번호 30의 CDR1 영역을 포함하거나, 또는

e) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 33의 CDR3 영역, 서열번호 34의 CDR2 영역 및 서열번호 35의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 36의 CDR3 영역, 서열번호 37의 CDR2 영역 및 서열번호 38의 CDR1 영역을 포함하거나, 또는

f) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 41의 CDR3 영역, 서열번호 42의 CDR2 영역 및 서열번호 43의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 44의 CDR3 영역, 서열번호 45의 CDR2 영역 및 서열번호 46의 CDR1 영역을 포함하거나, 또는

g) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 49의 CDR3 영역, 서열번호 50의 CDR2 영역 및 서열번호 51의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 52의 CDR3 영역, 서열번호 53의 CDR2 영역 및 서열번호 54의 CDR1 영역을 포함하거나, 또는

h) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 69의 CDR3 영역, 서열번호 70의 CDR2 영역 및 서열번호 71의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 72의 CDR3 영역, 서열번호 73의 CDR2 영역 및 서열번호 74의 CDR1 영역을 포함하거나, 또는

i) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 77의 CDR3 영역, 서열번호 78의 CDR2 영역 및 서열번호 79의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 80의 CDR3 영역, 서열번호 81의 CDR2 영역 및 서열번호 82의 CDR1 영역을 포함함

을 특징으로 하는 본 발명에 따른 항체를 포함한다.

바람직하게는 본 발명에 따른 항체는 인간 IgG1 하위 부류의 것이거나 또는 인간 IgG4 하위 부류의 것이다.

본 발명의 추가의 실시양태는 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물이다.

본 발명은 CSF-1R 매개된 질병의 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 또한 포함한다.

본 발명은 암의 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 또한 포함한다.

본 발명은 골 손실의 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 또한 포함한다.

본 발명은 전이의 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 또한 포함한다.

본 발명은 염증성 질병의 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 또한 포함한다.

본 발명은 CSF-1R 매개된 질병의 치료를 위한 본 발명에 따른 항체를 또한 포함한다.

본 발명은 암의 치료를 위한 본 발명에 따른 항체를 또한 포함한다.

본 발명은 골 손실의 치료를 위한 본 발명에 따른 항체를 또한 포함한다.

본 발명은 전이의 치료를 위한 본 발명에 따른 항체를 또한 포함한다.

본 발명은 염증성 질병의 치료를 위한 본 발명에 따른 항체를 또한 포함한다.

본 발명의 추가의 실시양태는

을 특징으로 하는 본 발명에 따른 항체를 암호화하는 핵산이다.

본 발명의 추가의 실시양태는

을 특징으로 하는 본 발명에 따른 항체 또는 그의 인간화된 버전을 암호화하는 핵산이다.

본 발명의 추가의 실시양태는

본 발명은 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 본 발명에 따른 핵산을 발현할 수 있는 핵산을 함유하는 발현 벡터, 및 본 발명에 따른 항체의 재조합 생산을 위한 상기와 같은 벡터를 함유하는 숙주 세포를 또한 제공한다.

본 발명은 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포를 또한 포함한다.

본 발명은 본 발명에 따른 핵산을 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 발현시키고 상기 세포 또는 세포 배양 상청액으로부터 본 발명에 따른 재조합 인간 또는 인간화된 항체를 회수함을 특징으로 하는, 상기 항체의 생산 방법을 또한 포함한다. 본 발명은 상기와 같은 재조합 방법에 의해 수득된 항체를 또한 포함한다.

본 발명에 따른 항체는 CSF-1R 표적화 요법이 필요한 환자에게 이점을 나타낸다. 본 발명에 따른 항체는 리간드-독립적인 증식 및 리간드-의존적인 증식에 대해 효율적인 증식 억제 활성을 나타내며, 따라서 암 및 전이의 치료에 특히 유용하다.

본 발명은 암에 걸린 것으로 진단된 환자(및 따라서 상기 암의 치료가 필요한 환자)에게 유효량의 본 발명에 따른 항체를 투여함을 포함하는, 상기 환자의 치료 방법을 또한 제공한다. 항체를 바람직하게는 약학 조성물로서 투여한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 암을 앓고 있는 환자에게 본 발명에 따른 항체를 투여함을 특징으로 하는, 상기 환자의 치료 방법이다.

놀랍게도, 인간 CSF-1R-ECD의 D4 서브도메인이 결실된 인간 CSF-1R 단편 delD4(서열번호 65)를 사용하여, 본 발명에 따른 신규의 항-CSF-1R 항체가 선택될 수 있음을 발견하였다. 상기 항체는, 전장 야생형 CSF-1R(서열번호 62) 또는 돌연변이 CSF-1R L301S Y969F(서열번호 63)(이에 의해 돌연변이 CSF-1R 재조합 세포는 CSF-1 리간드와 독립적인 회전타원체를 형성할 수 있다)에 대한 어느 한 발현 벡터에 의해 레트로바이러스 감염된 NIH 3T3 세포의 탁월한 리간드-의존적인 세포 성장 억제 및 동시에 리간드 독립적인 세포 성장 억제와 같은 귀중한 성질을 나타낸다.

도 1은 10 ㎍/㎖의 농도에서 상이한 항-CSF-1R 단클론 항체들에 의한 처리 하의 3D 배양물 중의 BeWo 종양 세포의 성장 억제를 도시한다.
X 축: 세포의 ATP-함량에 상응하는 생육력 표준화된 평균 상대 광 단위(RLU)(셀티터글로(CellTiterGlo) 분석).
Y 축: 시험된 탐침: 최소 배지(0.5% FBS), 마우스 IgG1(mIgG1, 10 ㎍/㎖), 마우스 IgG2a(mIgG2a 10 ㎍/㎖), CSF-1 단독, Mab 2F11, Mab 2E10, Mab2H7, Mab1G10 및 SC 2-4A5.
CSF-1 유도된 성장의 최고 억제는 본 발명에 따른 항-CSF-1R 항체에 대해 관찰되었다.
도 2a는 고정화된 인간 CSF-1R 단편 delD4(세포외 서브도메인 D1 내지 D3 및 D5를 포함한다)(서열번호 65)에 대한 상이한 항-CSF-1R 항체들의 결합에 대한 비아코어 센소그램(Biacore sensogram)을 도시한다(y-축: 결합 신호(반응 단위(RU)), 기준선 = 0 RU, x-축: 시간(초)): 항체 Mab 3291 및 sc 2-4A5는 상기 delD4 단편에 대한 결합을 명백히 나타내는 반면, 본 발명에 따른 항체, 예를 들어 Mab 2F11 및 Mab 2E10은 CSF-1R 단편 delD4에 결합하지 않았다. 대조용 항-CCR5 항체 m<CCR5>Pz03.1C5가 또한 CSF-1R 단편 delD4에 결합하지 않았다.
도 2b는 고정화된 인간 CSF-1R 세포외 도메인(CSF-1R-ECD)(세포외 서브도메인 D1 내지 D5를 포함한다)(서열번호 64)에 대한 상이한 항-CSF-1R 항체들의 결합에 대한 비아코어 센소그램을 도시한다(y-축: 결합 신호(반응 단위(RU)), 기준선 = 0 RU, x-축: 시간(초)):: 모든 항-CSF-1R 항체들이 CSF-1R-ECD에 대한 결합을 나타낸다. 대조용 항-CCR5 항체 m<CCR5>Pz03.1C5는 상기 CSF-1R-ECD에 결합하지 않았다.
도 2c는 고정화된 인간 CSF-1R 단편 delD4(세포외 서브도메인 D1 내지 D3 및 D5를 포함한다)(서열번호 65)에 대한 상이한 항-CSF-1R 항체들의 결합에 대한 비아코어 센소그램을 도시한다(y-축: 결합 신호(반응 단위(RU)), 기준선 = 0 RU, x-축: 시간(초)): Mab 1G10, Mab 2H7 및 인간화된 hMab 2F11-e7은 상기 CSF-1R 단편 delD4에 결합하지 않았다. 대조용 항-CCR5 항체 m<CCR5>Pz03.1C5가 또한 상기 CSF-1R 단편 delD4에 결합하지 않았다.
도 2d는 고정화된 인간 CSF-1R 세포외 도메인(CSF-1R-ECD)(세포외 서브도메인 D1 내지 D5를 포함한다)(서열번호 64)에 대한 상이한 항-CSF-1R 항체들의 결합에 대한 비아코어 센소그램을 도시한다(y-축: 결합 신호(반응 단위(RU)), 기준선 = 0 RU, x-축: 시간(초)): 모든 항-CSF-1R 항체들 Mab 1G10, Mab 2H7 및 인간화된 hMab 2F11-e7은 CSF-1R-ECD에 대한 결합을 나타내었다. 대조용 항-CCR5 항체 m<CCR5>Pz03.1C5는 상기 CSF-1R-ECD에 결합하지 않았다.
도 2e는 고정화된 인간 CSF-1R 단편 delD4(세포외 서브도메인 D1 내지 D3 및 D5를 포함한다)(서열번호 65)에 대한 상이한 항-CSF-1R 항체들의 결합에 대한 비아코어 센소그램을 도시한다(y-축: 결합 신호(반응 단위(RU)), 기준선 = 0 RU, x-축: 시간(초)): 모든 항-CSF-1R 항체들 1.2.SM, CXIIG6, ab10676 및 MAB3291은 CSF-1R 단편 delD4에 대한 결합을 나타내었다. 대조용 항-CCR5 항체 m<CCR5>Pz03.1C5는 또한 상기 CSF-1R 단편 delD4에 결합하지 않았다.
도 2f는 고정화된 인간 CSF-1R 세포외 도메인(CSF-1R-ECD)(세포외 서브도메인 D1 내지 D5를 포함한다)(서열번호 64)에 대한 상이한 항-CSF-1R 항체들의 결합에 대한 비아코어 센소그램을 도시한다(y-축: 결합 신호(반응 단위(RU)), 기준선 = 0 RU, x-축: 시간(초)):: 모든 항-CSF-1R 항체들 1.2.SM, CXIIG6, ab10676 및 MAB3291은 CSF-1R-ECD에 대한 결합을 나타내었다. 대조용 항-CCR5 항체 m<CCR5>Pz03.1C5는 또한 상기 CSF-1R-ECD에 결합하지 않았다.
도 3a 내지 d는 상이한 투여량의 본 발명에 따른 항-CSF-1R 항체의 적용 후 사이노몰구스 원숭이에 있어서 CSF-1 수준을 도시한다.
도 4는 생체 내 효능 - 유방암 BT20 이종이식편에 있어서 본 발명에 따른 항-CSF-1R 항체의 종양 성장 억제를 도시한다.

본 발명은 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 포함하되, 상기 항체가 인간 CSF-1R 단편 delD4(세포외 서브도메인 D1 내지 D3 및 D5를 포함한다)(서열번호 65) 및 인간 CSF-1R 세포외 도메인(CSF-1R-ECD)(세포외 서브도메인 D1 내지 D5를 포함한다)(서열번호 64)에 1:50 이하의 비로 결합함을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 중쇄 가변 도메인 CDR3 영역으로서 서열번호 1, 서열번호 9, 서열번호 23, 서열번호 31, 서열번호 39, 서열번호 47 또는 서열번호 55의 CDR3 영역을 포함함을 특징으로 하는 본 발명에 따른 항체를 포함한다.

본 발명은 또한

본 발명은 또한 중쇄 가변 도메인이 서열번호 7이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 8임을 특징으로 하는 본 발명에 따른 항체 또는 그의 인간화된 버전을 포함한다.

하나의 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는

을 특징으로 한다.

하나의 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는

d) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 47이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 48임

을 특징으로 한다.

하나의 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 중쇄 가변 도메인이 서열번호 23이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 24임을 특징으로 한다.

하나의 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 중쇄 가변 도메인이 서열번호 31이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 32임을 특징으로 한다.

하나의 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 중쇄 가변 도메인이 서열번호 39이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 40임을 특징으로 한다.

하나의 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 중쇄 가변 도메인이 서열번호 47이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 48임을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 중쇄 가변 도메인이 서열번호 15이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 16임을 특징으로 하는 본 발명에 따른 항체 또는 그의 인간화된 버전을 포함한다.

본 발명은 또한 중쇄 가변 도메인이 서열번호 75이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 76임을 특징으로 하는 본 발명에 따른 항체 또는 그의 인간화된 버전을 포함한다.

본 발명은 또한 중쇄 가변 도메인이 서열번호 83이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 84임을 특징으로 하는 본 발명에 따른 항체 또는 그의 인간화된 버전을 포함한다.

본 발명은 또한

g) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 49의 CDR3 영역, 서열번호 50의 CDR2 영역 및 서열번호 51의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 52의 CDR3 영역, 서열번호 53의 CDR2 영역 및 서열번호 54의 CDR1 영역을 포함함

을 특징으로 하는 본 발명에 따른 항체를 포함한다.

본 발명은 또한

을 특징으로 하는 본 발명에 따른 항체를 포함한다.

하나의 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는

a) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 69의 CDR3 영역, 서열번호 70의 CDR2 영역 및 서열번호 71의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 72의 CDR3 영역, 서열번호 73의 CDR2 영역 및 서열번호 74의 CDR1 영역을 포함하거나, 또는

b) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 77의 CDR3 영역, 서열번호 78의 CDR2 영역 및 서열번호 79의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 80의 CDR3 영역, 서열번호 81의 CDR2 영역 및 서열번호 82의 CDR1 영역을 포함함

을 특징으로 한다.

하나의 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는

a) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 17의 CDR3 영역, 서열번호 18의 CDR2 영역 및 서열번호 19의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 20의 CDR3 영역, 서열번호 21의 CDR2 영역 및 서열번호 22의 CDR1 영역을 포함하거나, 또는

b) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 25의 CDR3 영역, 서열번호 26의 CDR2 영역 및 서열번호 27의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 28의 CDR3 영역, 서열번호 29의 CDR2 영역 및 서열번호 30의 CDR1 영역을 포함하거나, 또는

c) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 33의 CDR3 영역, 서열번호 34의 CDR2 영역 및 서열번호 35의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 36의 CDR3 영역, 서열번호 37의 CDR2 영역 및 서열번호 38의 CDR1 영역을 포함하거나, 또는

d) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 41의 CDR3 영역, 서열번호 42의 CDR2 영역 및 서열번호 43의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 44의 CDR3 영역, 서열번호 45의 CDR2 영역 및 서열번호 46의 CDR1 영역을 포함하거나, 또는

e) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 49의 CDR3 영역, 서열번호 50의 CDR2 영역 및 서열번호 51의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 52의 CDR3 영역, 서열번호 53의 CDR2 영역 및 서열번호 54의 CDR1 영역을 포함함

을 특징으로 한다.

하나의 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는

d) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 41의 CDR3 영역, 서열번호 42의 CDR2 영역 및 서열번호 43의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 44의 CDR3 영역, 서열번호 45의 CDR2 영역 및 서열번호 46의 CDR1 영역을 포함함

을 특징으로 한다.

하나의 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 중쇄 가변 도메인이 서열번호 17의 CDR3 영역, 서열번호 18의 CDR2 영역 및 서열번호 19의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 20의 CDR3 영역, 서열번호 21의 CDR2 영역 및 서열번호 22의 CDR1 영역을 포함함을 특징으로 한다.

하나의 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 중쇄 가변 도메인이 서열번호 25의 CDR3 영역, 서열번호 26의 CDR2 영역 및 서열번호 27의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 28의 CDR3 영역, 서열번호 29의 CDR2 영역 및 서열번호 30의 CDR1 영역을 포함함을 특징으로 한다.

하나의 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 중쇄 가변 도메인이 서열번호 33의 CDR3 영역, 서열번호 34의 CDR2 영역 및 서열번호 35의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 36의 CDR3 영역, 서열번호 37의 CDR2 영역 및 서열번호 38의 CDR1 영역을 포함함을 특징으로 한다.

하나의 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 중쇄 가변 도메인이 서열번호 41의 CDR3 영역, 서열번호 42의 CDR2 영역 및 서열번호 43의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 44의 CDR3 영역, 서열번호 45의 CDR2 영역 및 서열번호 46의 CDR1 영역을 포함함을 특징으로 한다.

하나의 실시양태에서 인간 CSF-1R에 결합하는 항체가 인간 CSF-1R 단편 delD4(서열번호 65) 및 인간 CSF-1R-ECD(서열번호 64)에 1:50 이하의 비로 결합함을 특징으로 하는 상기 항체는 인간 CSF-1R 단편 D1 내지 D3(서열번호 66)에 결합하지 않음을 또한 특징으로 한다.

"항체"란 용어는 비 제한적으로 완전 항체, 항체 단편, 인간 항체, 인간화된 항체, 키메릭 항체, T 세포 에피토프 고갈된 항체, 및 추가로 본 발명에 따른 특징적인 성질들을 유지하는 유전자 조작된 항체를 포함한 다양한 형태의 항체들을 포함한다. "항체 단편"은 전장 항체의 일부, 바람직하게는 그의 가변 도메인, 또는 적어도 그의 항원 결합 부위를 포함한다. 항체 단편의 예는 다이아바디, 단쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. scFv 항체는 예를 들어 문헌[Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88]에 개시되어 있다. 또한, 항체 단편은 CSF-1R에 결합하는, 즉 작용성 항원 결합 부위에 대해 V_L 도메인과 함께 조립할 수 있고 이에 의해 상기 성질을 제공할 수 있는 V_H 도메인, 또는 CSF-1R에 결합하는, 즉 작용성 항원 결합 부위에 대해 V_H 도메인과 함께 조립할 수 있고 이에 의해 상기 성질을 제공할 수 있는 V_L 도메인의 특징을 갖는 단쇄 폴리펩타이드를 포함한다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "단클론 항체" 또는 "단클론 항체 조성물"이란 용어는 단일 아미노산 조성의 항체 분자 제제를 지칭한다.

"키메릭 항체"란 용어는 통상적으로 재조합 DNA 기법에 의해 제조된, 마우스로부터의 가변 영역, 즉 결합 영역 및 상이한 출처 또는 종으로부터 유도된 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 단클론 항체를 지칭한다. 마우스 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메릭 항체가 특히 바람직하다. 상기와 같은 래트/인간 키메릭 항체는 래트 면역글로불린 가변 영역을 암호화하는 DNA 구획 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 DNA 구획을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 산물이다. 본 발명에 의해 포함되는 "키메릭 항체"의 다른 형태들은 상기 부류 또는 하위 부류가 원래 항체의 것으로부터 변형되거나 변화된 것들이다. 상기와 같은 "키메릭" 항체를 또한 "부류-변환된 항체"라 지칭한다. 키메릭 항체의 생산 방법은 현재 당해 분야에 널리 공지된 통상적인 재조합 DNA 및 유전자 형질감염 기법들을 포함한다. 예를 들어 문헌[Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855], 미국특허 제5,202,238호 및 미국특허 제5,204,244호를 참조한다.

"인간화된 항체"란 용어는 프레임워크 또는 "상보성 결정 영역"(CDR)이 모 면역글로불린의 경우에 비해 상이한 특이성의 면역글로불린의 CDR을 포함하도록 변형된 항체를 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 쥐의 CDR을 인간 항체의 프레임워크 영역에 이식하여 "인간화된 항체"를 제조한다. 문헌[Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327] 및 문헌[Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270]을 참조한다. 선택적으로 프레임워크 영역이 추가의 돌연변이에 의해 변형될 수 있다. 또한 CDR은 예를 들어 문헌[Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327] 및 문헌[Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033]에 개시된 바와 같은 분자 모델링 등에 근거한 돌연변이유발에 의해 본 발명에 따른 항체를 생성하도록 하나 이상의 돌연변이에 의해 변형될 수 있다. 특히 바람직한 CDR은 키메릭 항체에 대해 상기 나타낸 항원을 인식하는 서열들을 나타내는 것들에 상응한다. "본 발명에 따른 항체의 인간화된 버전"(예를 들어 마우스 기원의 것)은, V_H 및 V_L이 표준 기법(CDR 그래프트화 및 선택적으로 후속적인 프레임워크 영역 및 CDR 중의 일부 아미노산의 돌연변이유발을 포함한다)에 의해 인간화된 마우스 항체 서열을 기본으로 하는 항체를 지칭한다. 바람직하게는 상기와 같은 인간화된 버전을 인간 불변 영역(예를 들어 서열번호 57 내지 61 참조)으로 키메라화(chimerizing)한다.

본 발명에 의해 포함되는 "인간화된 항체"의 다른 형태들은, 불변 영역이 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합에 관하여, 본 발명에 따른 성질을 생성하도록 원래 항체의 것으로부터 추가로 변형되거나 변화된 것들이다.

하기의 실시예에서 "Mab" 또는 "muMab"란 용어는 쥐 단클론 항체, 예를 들어 Mab 2F11 또는 Mab 2E10을 지칭하는 반면, "hMab"란 용어는 상기와 같은 쥐 항체의 인간화된 단클론 버전, 예를 들어 hMab 2F11-c11, hMab 2F11-d8, hMab 2F11-e7, hMab 2F11-f12 등을 지칭한다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "인간 항체"란 용어는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함함을 의미한다. 인간 항체는 당해 분야의 발달 수준으로 널리 공지되어 있다(문헌[van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374]). 인간 항체를 또한, 면역화 시 내생적인 면역글로불린 생산의 부재 하에서 전체 레퍼토리를 생성시킬 수 있거나 또는 인간 항체의 선택이 가능한 트랜스제닉 동물(예를 들어 마우스)에서 생성시킬 수 있다. 상기와 같은 생식계열 돌연변이 마우스에서 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 배열의 전달은 항원 투여 시 인간 항체를 생성시킬 것이다(예를 들어 문헌[Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555]; 문헌[Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258]; 문헌[Brueggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40] 참조). 인간 항체를 또한 파지 디스플레이 라이브러리에서 생성시킬 수 있다(문헌[Hoogenboom, H.R., and Winter, G.J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388]; 문헌[Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597] 참조). 콜(Cole) 등 및 베르너(Boerner) 등의 기법을 또한 인간 단클론 항체의 제조에 이용할 수 있다(문헌[Cole, S.P.C., et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)] 및 문헌[Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95] 참조). 본 발명에 따른 키메릭 및 인간화된 항체에 대해 이미 언급한 바와 같이, 본 발명에 사용된 바와 같은 "인간 항체"란 용어는, 특히 C1q 결합 및/또는 FcR 결합에 관하여, 본 발명에 따른 성질, 예를 들어 "부류 변환", 즉 Fc 부분의 변화 또는 돌연변이(예를 들어 IgG1으로부터 IgG4로 및/또는 IgG1/IgG4 돌연변이)에 의해 생성시키도록 불변 영역에서 변형시킨 상기와 같은 항체를 또한 포함한다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "재조합 인간 항체"란 용어는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 단리된 모든 인간 항체, 예를 들어 NS0 또는 CHO 세포와 같은 숙주 세포, 또는 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현시킨 인간 면역글로불린 유전자 또는 항체에 대해 트랜스제닉인 동물(예를 들어 마우스)로부터 단리된 항체를 포함하고자 한다. 상기와 같은 재조합 인간 항체는 재배열된 형태로 가변 및 불변 영역들을 갖는다. 본 발명에 따른 재조합 인간 항체를 생체 내 체세포 초돌연변이시켰다. 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유도되고 이와 관련되었지만, 생체 내에서 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 천연으로 존재하지 않을 수도 있다.

본 발명에 따른 항체는 또한 "보존적인 서열 변형", 즉 본 발명에 따른 항체의 상기 언급한 특징에 영향을 미치지 않거나 상기 특징을 변경시키지 않는 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열 변형을 갖는 상기와 같은 항체를 포함한다. 변형을 당해 분야에 공지된 표준 기법, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발에 의해 도입시킬 수 있다. 보존적인 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환된 것들을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리들은 당해 분야에서 한정되었다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 타이로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄(예를 들어 쓰레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산들을 포함한다. 따라서, 인간 항-CSF-1R 항체 중의 예견되는 불필수 아미노산 잔기를 바람직하게는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 치환시킬 수 있다.

아미노산 치환을 문헌[Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327] 및 문헌[Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033]에 개시된 바와 같이 분자 모델링에 근거한 돌연변이유발에 의해 수행할 수 있다.

인간 CSF-1R(CSF-1 수용체; 유의어: M-CSF 수용체; 대식세포 콜로니-자극 인자 1 수용체, Fms 원 종양 형성 유전자, c-fms, 서열번호 22)은 1986년 이래로 공지되어 있다(문헌[Coussens, L., et al., Nature 320 (1986) 277-280]). CSF-1R은 성장 인자이며 c-fms 원 종양 형성 유전자에 의해 암호화된다(예를 들어 문헌[Roth, P. and Stanley, E.R., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 181 (1992) 141-67]에서 검토되었다).

CSF-1R은 CSF-1(대식세포 콜로니 자극 인자, 또한 M-CSF라 칭한다) 및 IL-34에 대한 수용체이며 이들 사이토킨의 생물학적 효과를 매개한다(문헌[Sherr, C.J., et al., Cell 41 (1985) 665-676], 문헌[Lin, H., et al., Science 320 (2008) 807-811]). 콜로니 자극 인자-1 수용체(또한 c-fms라 칭함)의 클로닝이 최초로 문헌[Roussel, M.F., et al., Nature 325 (1987) 549-552]에 개시되었다. 상기 문헌에서, CSF-1R은, Cb1에 결합하고 이에 의해 수용체 하향 조절을 조절하는 억제성 타이로신 969 인산화의 상실을 포함하여 단백질의 C-말단 꼬리의 변화에 따른 형질전환 잠재력을 갖는 것으로 나타났다(문헌[Lee, P.S., et al., Embo J. 18 (1999) 3616-3628]).

CSF-1R은 단일 쇄의 막통과 수용체 타이로신 키나제(RTK)이며 수용체의 세포외 도메인(ECD) 중의 5개의 반복된 Ig-형 서브도메인 D1 내지 D5를 특징으로 하는 면역글로불린(Ig) 동기 함유 RTK 패밀리의 일원이다(문헌[Wang, Z., et al Molecular and Cellular Biology 13 (1993) 5348-5359]). 인간 CSF-1R 세포외 도메인(CSF-1R-ECD)(서열번호 64)은 5개의 세포외 Ig-형 서브도메인 D1 내지 D5를 모두 포함한다. 인간 CSF-1R 단편 delD4(서열번호 65)는 세포외 Ig-형 서브도메인 D1 내지 D3 및 D5를 포함하지만, D4 서브도메인은 빠져 있다. 인간 CSF-1R 단편 D1 내지 D3(서열번호 66)은 각각의 서브도메인 D1 내지 D3을 포함한다. 서열들은 신호 펩타이드 MGSGPGVLLL LLVATAWHGQ G(서열번호 67) 없이 목록화되어 있다.

세포내 단백질 타이로신 키나제 도메인은 독특한 삽입 도메인에 의해 중단되며, 상기 삽입 도메인은 혈소판 유도된 성장 인자 수용체(PDGFR), 줄기 세포 성장 인자 수용체(c-키트) 및 지느러미-형 사이토킨 수용체(FLT3)를 포함하는 다른 관련된 RTK 부류 III 패밀리 구성원들 중에 또한 존재한다. 이러한 성장 인자 수용체 패밀리 가운데 구조적 상동성에도 불구하고, 이들은 독특한 조직-특이성 작용을 갖는다.

CSF-1R은 단핵구 계통 및 여성 생식관 및 태반 중의 세포 상에서 주로 발현된다. 또한 CSF-1R의 발현은 평활근 세포의 부분집합인 랑게르한스 세포(문헌[Inaba, T., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 5693-5699]), B 세포(문헌[Baker, A.H., et al., Oncogene 8 (1993) 371-378]) 및 미세아교세포(문헌[Sawada, M., et al., Brain Res. 509 (1990) 119-124])에서 보고되었다. 돌연변이 인간 CSF-1R(서열번호 23)을 갖는 세포는 리간드 자극과 독립적으로 증식하는 것으로 공지되어 있다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "인간 CSF-1R에 결합하는" 또는 "인간 CSF-1R에 특이적으로 결합하는"은 인간 CSF-1R 항원에 35 ℃에서 1.0 x 10^-8 mol/l 이하의 KD-값, 하나의 실시양태에서 35 ℃에서 1.0 x 10^-9 mol/l 이하의 KD-값의 결합 친화성으로 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 결합 친화성은 35 ℃에서 표준 결합 분석, 예를 들어 표면 플라스몬 공명 기법(비아코어(BIAcore)(등록상표), GE-헬쓰케어(Healthcare), 스웨덴 웁살라 소재)에 의해 측정된다. 결합 친화성의 KD-값을 측정하기 위한 방법은 실시예 9에 개시되어 있다. 따라서, 본 발명에 사용된 바와 같은 "인간 CSF-1R에 결합하는 항체"는 인간 CSF-1R 항원에 35 ℃에서 1.0 x 10^-8 mol/l 이하(바람직하게는 1.0 x 10^-8 mol/l 내지 1.0 x 10^-12 mol/l)의 KD, 바람직하게는 35 ℃에서 1.0 x 10^-9 mol/l 이하(바람직하게는 1.0 x 10^-9 mol/l 내지 1.0 x 10^-12 mol/l)의 KD의 결합 친화성으로 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "인간 CSF-1R 단편 delD4(서열번호 65) 및 인간 CSF-1R 세포외 도메인(서열번호 64)에 대한 결합"은 실시예 4에 개시된 바와 같은 표면 플라스몬 공명 분석(바이아코어 분석)에 의해 측정된다. 인간 CSF-1R 단편 delD4(서열번호 65) 또는 인간 CSF-1R 세포외 도메인(서열번호 64)을 각각 상기 표면에(각각 별도의 표면에) 포획하고 시험 항체들을 첨가하고(각각 별도의 측정에서) 각각의 결합 신호(반응 단위(RU))를 측정하였다. 기준 신호(블랭크 표면)를 감하였다. 결합하지 않은 시험 항체의 신호가 0보다 약간 아래인 경우, 상기 값을 0으로 설정하였다. 이어서 각각의 결합 신호의 비(인간 CSF-1R 단편 delD4에 대한 결합/인간 CSF-1R 세포외 도메인(CSF-1R-ECD)에 대한 결합)를 측정한다. 본 발명에 따른 항체는 1:50 이하, 바람직하게는 1:100 이하의 결합 신호 비(RU(delD4)/RU(CSF-1R-ECD))(하한은 0이다, 예를 들어 RU가 0인 경우, 비는 0:50 또는 0:100이다)를 갖는다.

이는 본 발명에 따른 상기와 같은 항-CSF-1R 항체가 인간 CSF-1R 단편 delD4에 결합하지 않고(항-CCR5 항체 m<CCR5>Pz03.1C5(DSMZ에 2004년 8월 18일자로 DSM ACC 2683으로서 기탁됨)와 같이) 항-CCR5 항체 m<CCR5>Pz03.1C5 범위의 인간 CSF-1R 단편 delD4에 대한 결합에 대한 결합 신호(상기는 실시예 4에 나타낸 바와 같은 표면 플라스몬 공명(비아코어) 분석에서 20 RU(반응 단위) 이하, 바람직하게는 10 RU 이하이다)를 가짐을 의미한다.

"인간 CSF-1R 단편 D1 내지 D3에 대한 결합"이라는 용어는 표면 플라스몬 공명 분석(비아코어 분석)에 의한 결합 친화성 측정을 지칭한다. 시험 항체를 표면에 포획하고 인간 CSF-1R 단편 D1 내지 D3(서열번호 66)을 첨가하고 각각의 결합 친화성을 측정하였다. "인간 CSF1-1R 단편 D1 내지 D3에 결합하지 않음"이란 용어는 상기와 같은 분석에서 검출된 신호가 배경 신호의 1.2 배 이하의 영역에 있고 따라서 현저한 결합이 검출될 수 없으며 결합 친화성을 측정할 수 없음을 나타낸다(실시예 10 참조).

본 발명의 하나의 실시양태는

a) 인간 CSF-1R 단편 delD4(서열번호 65) 및 인간 CSF-1R 세포외 도메인(CSF-1R-ECD)(서열번호 64)에 대한 항-CSF-1R 항체의 결합 신호(반응 단위(RU))를 표면 플라스몬 공명 분석(비아코어 분석)에 의해 측정하는 단계; 및

b) 50:1 이하의 결합 신호의 비(인간 CSF-1R 단편 delD4/인간 CSF-1R 세포외 도메인(CSF-1R-ECD))를 갖는 항체를 선택하는 단계

를 포함하는, 본 발명에 따른 항체를 선택하기 위한 선별 방법이다.

하나의 실시양태에서 측정을 25 ℃에서 수행한다.

하나의 실시양태에서 선별 방법은 추가의 단계로서 인간 CSF-1R 단편 D1 내지 D3(서열번호 66)(D1-D3)에 대한 항-CSF-1R 항체의 결합을 측정하고 상기 단편에 대해 결합을 나타내지 않는 항체들을 선택함을 포함한다.

"에피토프"란 용어는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 인간 CSF-1R의 단백질 결정인자를 나타낸다. 에피토프는 통상적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자들의 화학적으로 활성인 표면 무리들로 이루어지며, 통상적으로 에피토프는 특정한 3 차원 구조 특징뿐만 아니라 특정 전하 특징을 갖는다. 형태상 및 비형태상 에피토프는 상기 형태상 에피토프에 대한 결합이 변성 용매의 존재 하에서 상실되지만 상기 비형태상 에피토프는 그렇지 않다는 점에서 구별된다. 바람직하게는 본 발명에 따른 항체는 고유 및 변성된 CSF-1R에 특이적으로 결합한다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "가변 도메인"(경쇄의 가변 도메인(V_L), 중쇄의 가변 도메인(V_H))은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관련되는 경쇄 및 중쇄 도메인 쌍의 각각을 나타낸다. 가변 경쇄 및 중쇄 도메인은 동일한 일반 구조를 가지며 각각의 도메인은, 서열들이 광범위하게 보존되고 3개의 "초 가변 영역"(또는 상보성 결정 영역, CDR)에 의해 연결되는 4개의 프레임워크(FR) 영역을 포함한다. 프레임워크 영역은 β-시트 형태를 채용하며 CDR은 β-시트 구조를 연결하는 고리를 형성할 수도 있다. 각 쇄 중에서 CDR은 프레임워크 영역에 의해 그의 3차원 구조를 유지하며 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역은 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화성에 특히 중요한 역할을 하며 따라서 본 발명의 추가의 목적을 제공한다.

"항체의 항원 결합 부분"이란 용어는 본 발명에 사용되는 경우 항원 결합을 맡고 있는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 항체의 항원 결합 부분은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 영역은 본 발명에서 정의한 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 영역들이다. 따라서, 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 N-말단에서부터 C-말단까지 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 특히, 상기 중쇄의 CDR3은 항원 결합에 가장 기여하는 영역이며 항체의 성질을 한정한다. CDR 및 FR 영역은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]의 표준 정의 및/또는 "초 가변 고리"로부터의 잔기들에 따라 결정된다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "핵산" 또는 "핵산 분자"란 용어는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함함을 의미한다. 핵산 분자는 단일 가닥이거나 또는 이중 가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다.

본 출원 내에 사용된 바와 같은 "아미노산"이란 용어는 알라닌(3 글자 코드: ala, 한 글자 코드: A), 아르기닌(arg, R), 아스파라긴(asn, N), 아스파르트산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루타민(gln, Q), 글루탐산(glu, E), 글리신(gly, G), 히스티딘(his, H), 아이소류신(ile, I), 류신(leu, L), 리신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 쓰레오닌(thr, T), 트립토판(trp, W), 타이로신(tyr, Y) 및 발린(val, V)을 포함하는 천연 카복시 α-아미노산의 그룹을 나타낸다.

하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 CSF-1R에 대한 CSF-1 결합을 억제한다. 하나의 실시양태에서 200 ng/㎖ 이하의 IC50을 가지며, 하나의 실시양태에서 50 ng/㎖ 이하의 IC50을 갖는다. CSF-1R에 대한 CSF-1 결합의 억제의 IC50을 실시예 2에 나타낸 바와 같이 측정할 수 있다.

하나의 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 CSF-1-유도된 CSF-1R 인산화(NIH3T3-CSF-1R 재조합 세포)를 억제한다.

하나의 실시양태에서 800 ng/㎖ 이하의 IC50을 가지며, 하나의 실시양태에서 600 ng/㎖ 이하의 IC50을 가지며, 하나의 실시양태에서 250 ng/㎖ 이하의 IC50을 갖는다. CSF-1-유도된 CSF-1R 인산화의 IC50을 실시예 3에 나타낸 바와 같이 측정할 수 있다.

하나의 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 인간 CSF-1R(서열번호 62)을 발현하는 재조합 NIH3T3 세포의 성장을 억제한다. 하나의 실시양태에서 10 ㎍/㎖ 이하의 IC50을 가지며, 하나의 실시양태에서 5 ㎍/㎖ 이하의 IC50을 가지며, 하나의 실시양태에서 2 ㎍/㎖ 이하의 IC50을 갖는다. 하나의 실시양태에서 10 ㎍/㎖ 이하의 IC30을 가지며, 하나의 실시양태에서 5 ㎍/㎖ 이하의 IC30을 가지며, 하나의 실시양태에서 2 ㎍/㎖ 이하의 IC30을 갖는다. 상기 IC50 값, IC30 값 또는 성장 억제%를 실시예 5에 나타낸 바와 같이 측정한다.

하나의 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 인간 돌연변이 CSF-1R L301S Y969F(서열번호 63)를 발현하는 재조합 NIH3T3 세포의 성장을 억제한다. 하나의 실시양태에서 15 ㎍/㎖ 이하의 IC50을 가지며, 하나의 실시양태에서 10 ㎍/㎖ 이하의 IC50을 갖는다. 하나의 실시양태에서 10 ㎍/㎖ 이하의 IC30을 가지며, 하나의 실시양태에서 5 ㎍/㎖ 이하의 IC50을 가지며, 하나의 실시양태에서 2 ㎍/㎖ 이하의 IC50을 갖는다. IC50 값, IC30 값 또는 성장 억제%를 실시예 5에 나타낸 바와 같이 측정한다.

하나의 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 BeWo 종양 세포(ATCC CCL-98)의 성장을 65% 이상(10 ㎍/㎖의 항체 농도에서; 및 항체의 부재에 비해)까지 억제한다. 성장 억제%를 실시예 8에 나타낸 바와 같이 측정한다. 예를 들어 Mab 2F11은 70%의 BeWo 종양 세포의 성장 억제를 나타낸다.

하나의 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 인간 및 사이노몰구스 원숭이 대식세포 분화를 (모두) 억제한다(이는 실시예 7 및 8에 나타낸 바와 같은 인간 및 사이노몰구스 원숭이 대식세포의 생존의 억제에 의해 지시된다). 하나의 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 인간 단핵구의 생존을 0.15 ㎍/㎖ 이하의 IC50으로, 하나의 실시양태에서 0.10 ㎍/㎖ 이하의 IC50으로 억제한다. 인간 단핵구의 생존의 억제를 실시예 7에 나타낸 바와 같이 측정한다. 하나의 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 사이노몰구스 원숭이 대식세포의 생존을 80% 이상까지, 하나의 실시양태에서 90% 이상까지(5 ㎍/㎖의 항체 농도에서 및 항체의 부재에 비해) 억제한다. 인간 단핵구의 생존의 억제를 실시예 8에 나타낸 바와 같이 측정한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 본 발명에 따른 인간 CSF-1R에 결합하는 인간 IgG1 부류 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산, 상기 변형된 핵산 및 상기 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산의 서열을 발현 벡터에 삽입하고, 상기 벡터를 진핵생물 숙주 세포에 삽입하고, 암호화된 단백질을 발현시키고 숙주세포 또는 상청액으로부터 회수함을 특징으로 하는, CSF-1R에 대한 항체의 생산 방법이다.

본 발명에 따른 항체를 바람직하게는 재조합 수단에 의해 생산한다. 따라서 항체는 바람직하게는 단리된 단클론 항체이다. 상기와 같은 재조합 방법은 당해 분야의 발달 수준으로 널리 공지되어 있으며 원핵생물 및 진핵생물 세포에서의 단백질 발현에 이어서 상기 항체 폴리펩타이드를 단리하고 통상적으로 약학적으로 허용 가능한 순도로 정제함을 포함한다. 단백질 발현을 위해서, 경쇄 및 중쇄 또는 그의 단편을 암호화하는 핵산을 표준 방법에 의해 발현 벡터에 삽입시킨다. 발현을 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, 효모, 또는 에스케리키아 콜라이 세포와 같은 적합한 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 수행하고, 상기 세포(상청액 또는 용해 후 세포)로부터 항체를 회수한다.

항체의 재조합 생산은 당해 분야의 발달 수준으로 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202]; 문헌[Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282]; 문헌[Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161]; 문헌[Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880]에 개시되어 있다.

항체들은 완전 세포 중에, 세포 용해물 중에, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 정제를 다른 세포 성분 또는 다른 오염물질, 예를 들어 다른 세포 핵산 또는 단백질을 제거하기 위해서, 표준 기법, 예를 들어 알칼리성/SDS 처리, CsCl 분염법(banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 젤 전기영동 및 당해 분야에 널리 공지된 다른 기법들에 의해 수행한다. 문헌[Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)]을 참조한다.

NS0 세포에서의 발현은 예를 들어 문헌[Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123] 및 문헌[Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270]에 개시되어 있다. 일시적인 발현은 예를 들어 문헌[Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9]에 개시되어 있다. 가변 도메인의 클로닝은 문헌[Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837]; 문헌[Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289] 및 문헌[Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87]에 개시되어 있다. 바람직한 일시적인 발현 시스템(HEK 293)은 문헌[Schlaeger, E.-J. and Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83] 및 문헌[Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199]에 개시되어 있다.

원핵생물에 적합한 조절 서열은 예를 들어 프로모터, 선택적인 작동 유전자 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵생물 세포는 프로모터, 인헨서 및 폴리아데닐화 신호를 사용하는 것으로 공지되어 있다.

핵산은 또 다른 핵산 서열과 작용 관계에 놓일 때 "작동적으로 결합된다". 예를 들어 전-서열 또는 분비 리더용 DNA가 폴리펩타이드의 분비에 관여하는 전구 단백질로서 발현되는 경우, 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동적으로 결합되거나; 또는 프로모터 또는 인헨서가 서열의 전사에 영향을 미치는 경우, 서열에 작동적으로 결합되거나; 또는 리보솜 결합 부위가 번역을 촉진하기 위해서 위치되는 경우, 암호화 서열에 작동적으로 결합된다. 일반적으로 "작동적으로 결합된"은 결합되는 DNA 서열이 연속적이고, 분비 리더의 경우에, 연속적이고 판독 프레임 중에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 연속적일 필요는 없다. 결합은 편리한 제한 부위에서의 결합에 의해 수행된다. 상기와 같은 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커가 통상적인 실시에 따라 사용된다.

단클론 항체를 통상적인 면역글로불린 정제 과정, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지로부터 적합하게 분리시킨다. 단클론 항체를 암호화하는 DNA 또는 RNA를 쉽게 단리하고 통상적인 과정을 사용하여 서열화한다. 하이브리도마 세포는 상기와 같은 DNA 및 RNA의 공급원으로서 작용할 수 있다. DNA가, 일단 단리되면, 발현 벡터에 삽입시킬 수 있고, 이어서 달리 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예를 들어 HEK 293 세포, CHO 세포, 또는 골수종 세포에 형질감염시켜 숙주 세포에서 재조합 단클론 항체의 합성을 획득한다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "세포", "세포 주" 및 "세포 배양물"이란 표현은 호환적으로 사용되며 모든 상기와 같은 명칭들은 자손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"란 단어는 1차 주인 세포 및 전이 수에 관계없이 상기로부터 유래한 배양물을 포함한다. 모든 자손이, 계획적이거나 우연한 돌연변이로 인해, DNA 함량이 정확하게 동일할 수는 없는 것으로 또한 생각된다. 원래 형질전환된 세포에 대해 선별된 바와 동일한 작용 또는 생물 활성을 갖는 변체 자손들이 포함된다.

항체의 "Fc 부분"은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관련되지 않지만, 다양한 효과기 작용을 나타낸다. "항체의 Fc 부분"은 숙련가에게 널리 공지된 용어이며 항체의 파파인 절단을 기초로 하여 정의된다. 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 항체 또는 면역글로불린을 소정 부류들(IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM)로 분류하며, 이들 중 여러 개를 하위 부류들(아이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가 분류할 수도 있다. 중쇄 불변 영역에 따라, 상이한 부류의 면역글로불린들을 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 칭한다. 항체의 Fc 부분은 보체 활성화, C1q 결합 및 Fc 수용체 결합을 근거로 하여 ADCC(항체-의존성 세포-매개된 세포독성) 및 CDC(보체-의존성 세포독성)에 직접 관여한다. 보체 활성화(CDC)는 대부분의 IgG 항체 하위 부류의 Fc 부분에 대한 보체 인자 C1q의 결합에 의해 개시된다. 보체 시스템에 대한 항체의 영향이 일부 조건들에 의존하는 반면, C1q에 대한 결합은 Fc 부분 중의 한정된 결합 부위들에 의해 유발된다. 상기와 같은 결합 부위들은 당해 분야의 발달 수준으로 공지되어 있으며 문헌[Boackle, R.J., et al., Nature 282 (1979) 742-743], 문헌[Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560], 문헌[Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917], 문헌[Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344], 문헌[Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004], 문헌[Idusogie, E.E., et al., J. Immunol.164 (2000) 4178-4184], 문헌[Hezareh, M., et al., J. Virology 75 (2001) 12161-12168], 문헌[Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324], 유럽특허 제0307434호에 개시되어 있다. 상기와 같은 결합 부위는 예를 들어 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329(넘버링은 카밧 이에이(Kabat, E.A.)(하기 참조)의 EU 인덱스에 따른다)이다. 하위 부류 IgG1, IgG2 및 IgG3의 항체들은 일반적으로 보체 활성화 및 C1q 및 C3 결합을 나타내는 반면, IgG4는 보체 시스템을 활성화하지 않고 C1q 및 C3에 결합하지 않는다.

하나의 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 인간 기원으로부터 유도된 Fc 부분 및 바람직하게는 인간 불변 영역의 모든 다른 부분을 포함한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "인간 기원으로부터 유도된 Fc 부분"이란 용어는 하위 부류 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 인간 항체의 Fc 부분, 바람직하게는 인간 IgG1 하위 부류의 Fc 부분, 인간 IgG1 하위 부류로부터의 돌연변이된 Fc 부분(바람직하게는 L234A + L235A에 대해 돌연변이된), 인간 IgG4 하위 부류로부터의 Fc 부분이거나 또는 인간 IgG4 하위 부류로부터의 돌연변이된 Fc 부분(S228P에 대해 돌연변이된)인 Fc 부분을 나타낸다. 대개 서열번호 58(인간 IgG1 하위 부류), 서열번호 59(L234A 및 L235A 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 하위 부류), 서열번호 60(인간 IgG4 하위 부류) 또는 서열번호 61(S228P 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 하위 부류)의 인간 중쇄 불변 부위가 바람직하다.

바람직하게는 본 발명에 따른 항체는 인간 IgG1 하위 부류 또는 인간 IgG4 하위 부류의 것이다. 하나의 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 인간 IgG1 하위 부류의 것이다. 하나의 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 인간 IgG4 하위 부류의 것이다.

하나의 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 불변 쇄가 인간 기원의 것임을 특징으로 한다. 상기와 같은 불변 쇄는 현재의 발달 수준으로 널리 공지되어 있으며 예를 들어 카밧 이에이에 의해 개시되어 있다(예를 들어 문헌[Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218] 참조). 예를 들어, 유용한 인간 중쇄 불변 영역은 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 유용한 인간 경쇄 불변 영역은 서열번호 57의 카파-경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 또 다른 양상은

을 특징으로 하는, 인간 CSF-1R에 결합하는 항체 또는 그의 인간화된 버전이다.

본 발명의 또 다른 양상은

본 발명의 또 다른 양상은 중쇄 가변 도메인이 서열번호 7이고 경쇄 가변 도메인이 8임을 특징으로 하는, 인간 CSF-1R에 결합하는 항체 또는 그의 인간화된 버전이다.

본 발명의 또 다른 양상은

을 특징으로 하는, 인간 CSF-1R에 결합하는 항체이다.

본 발명의 또 다른 양상은

을 특징으로 하는, 인간 CSF-1R에 결합하는 항체이다.

본 발명의 또 다른 양상은 중쇄 가변 도메인이 서열번호 23이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 24임을 특징으로 하는, 인간 CSF-1R에 결합하는 항체이다.

본 발명의 또 다른 양상은 중쇄 가변 도메인이 서열번호 31이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 32임을 특징으로 하는, 인간 CSF-1R에 결합하는 항체이다.

본 발명의 또 다른 양상은 중쇄 가변 도메인이 서열번호 39이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 40임을 특징으로 하는, 인간 CSF-1R에 결합하는 항체이다.

본 발명의 또 다른 양상은 중쇄 가변 도메인이 서열번호 47이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 48임을 특징으로 하는, 인간 CSF-1R에 결합하는 항체이다.

본 발명의 또 다른 양상은 중쇄 가변 도메인이 서열번호 15이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 16임을 특징으로 하는, 인간 CSF-1R에 결합하는 항체 또는 그의 인간화된 버전이다.

본 발명의 또 다른 양상은 중쇄 가변 도메인이 서열번호 75이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 76임을 특징으로 하는, 인간 CSF-1R에 결합하는 항체 또는 그의 인간화된 버전이다.

본 발명의 또 다른 양상은 중쇄 가변 도메인이 서열번호 83이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 84임을 특징으로 하는, 인간 CSF-1R에 결합하는 항체 또는 그의 인간화된 버전이다.

본 발명의 또 다른 양상은

을 특징으로 하는, 인간 CSF-1R에 결합하는 항체이다.

본 발명의 또 다른 양상은

을 특징으로 하는, 인간 CSF-1R에 결합하는 항체이다.

본 발명의 또 다른 양상은

을 특징으로 하는, 인간 CSF-1R에 결합하는 항체이다.

본 발명의 또 다른 양상은 중쇄 가변 도메인이 서열번호 17의 CDR3 영역, 서열번호 18의 CDR2 영역 및 서열번호 19의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 20의 CDR3 영역, 서열번호 21의 CDR2 영역 및 서열번호 22의 CDR1 영역을 포함함을 특징으로 하는, 인간 CSF-1R에 결합하는 항체이다.

본 발명의 또 다른 양상은 중쇄 가변 도메인이 서열번호 25의 CDR3 영역, 서열번호 26의 CDR2 영역 및 서열번호 27의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 28의 CDR3 영역, 서열번호 29의 CDR2 영역 및 서열번호 30의 CDR1 영역을 포함함을 특징으로 하는, 인간 CSF-1R에 결합하는 항체이다.

본 발명의 또 다른 양상은 중쇄 가변 도메인이 서열번호 33의 CDR3 영역, 서열번호 34의 CDR2 영역 및 서열번호 35의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 36의 CDR3 영역, 서열번호 37의 CDR2 영역 및 서열번호 38의 CDR1 영역을 포함함을 특징으로 하는, 인간 CSF-1R에 결합하는 항체이다.

본 발명의 또 다른 양상은 중쇄 가변 도메인이 서열번호 41의 CDR3 영역, 서열번호 42의 CDR2 영역 및 서열번호 43의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 44의 CDR3 영역, 서열번호 45의 CDR2 영역 및 서열번호 46의 CDR1 영역을 포함함을 특징으로 하는, 인간 CSF-1R에 결합하는 항체이다.

본 발명은 치료가 필요한 환자에게 치료 유효량의 본 발명에 따른 항체를 투여함을 특징으로 하는, 상기 환자의 치료 방법을 포함한다.

본 발명은 치료를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다.

본 발명의 하나의 바람직한 실시양태는 "CSF-1R 매개된 질병"의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 CSF-1R 항체 또는 "CSF-1R 매개된 질병"의 치료에 대한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 CSF-1R 항체이며, 이는 하기와 같이 개시될 수 있다:

CSF-1R 신호전달이 종양 성장 및 전이에 관여하는 듯한 3개의 독특한 기전들이 존재한다. 첫번째는 CSF-리간드 및 수용체의 발현이 여성 생식계(유방, 난소, 자궁내막, 경부)에서 기원하는 종양 세포에서 발견되었고(문헌[Scholl, S.M., et al., J. Natl. Cancer Inst. 86 (1994) 120-126]; 문헌[Kacinski, B.M., Mol. Reprod. Dev. 46 (1997) 71-74]; 문헌[Ngan, H.Y., et al., Eur. J. Cancer 35 (1999) 1546-1550]; 문헌[Kirma, N., et al., Cancer Res 67 (2007) 1918-1926]) 발현이 유방암 이종이식편 성장뿐만 아니라 유방암 환자에게서의 불량한 예후와 관련되었다는 것이다. 2개의 점 돌연변이가 한 연구에서 시험된 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 골수이형성 환자의 약 10 내지 20%에서 CSF-1R에서 발견되었고, 상기 돌연변이 중 하나는 수용체 턴오버를 붕괴시키는 것으로 밝혀졌다(문헌[Ridge, S.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87 (1990) 1377-1380]). 그러나, 돌연변이의 발생률은 나중의 연구들에서 입증될 수 없었다(문헌[Abu-Duhier, F.M., et al., Br. J. Haematol. 120 (2003) 464-470]). 돌연변이는 또한 간세포암(문헌[Yang, D.H., et al., Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int. 3 (2004) 86-89]) 및 특발성 골수 섬유증(문헌[Abu-Duhier, F.M., et al., Br. J. Haematol. 120 (2003) 464-470])의 일부 사례에서 발견되었다. 최근에, 골수단핵구아성 백혈병 환자로부터 유도된 GDM-1 세포 주에서, CSF-1R에서의 Y571D 돌연변이가 확인되었다(문헌[Chase, A., et al., Leukemia 23 (2009) 358-364]).

색소성 융모결절성 활막염(PVNS) 및 건초 거대세포 종양(TGCT)이, M-CSF 유전자가 콜라겐 유전자 COL6A3에 융합하여 M-CSF의 과발현을 생성시키는 전좌의 결과로서 발생할 수 있다(문헌[West, R.B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 690-695]). 조망(landscape) 효과는 M-CSF를 발현하는 세포들에 의해 유인된 단핵구 세포들로 이루어진 생성된 종양 덩어리들에 기여하는 것으로 제안된다. TGCT는 상기 종양이 주로 발생하는 손가락으로부터 비교적 쉽게 제거될 수 있는 보다 작은 종양이다. PVNS는 큰 관절에서 재발할 수 있고 수술에 의해서 쉽게 제어되지 않으므로 보다 공격적이다.

두번째 기전은 파골세포 발생, 뼈 재흡수 및 골용해성 골 병변이 유발된 뼈의 전이 부위에서 M-CSF/CSF-1R을 통한 신호전달의 차단을 기본으로 한다. 유방, 다발성 골수종 및 폐암이 상기 뼈로의 전이 및 골격 합병증을 생성시키는 골용해성 골 질병을 유발하는 것으로 밝혀진 암의 예이다. 종양 세포 및 간질에 의해 방출되는 M-CSF는 핵 인자 카파-B 리간드-RANKL의 수용체 활성화제와 협력하여 조혈 골수성 단핵구 선조의 성숙한 파골세포로의 분화를 유도한다. 이 과정 동안, M-CSF는 파골세포에 생존 신호를 제공함으로써 허용 인자로서 작용한다(문헌[Tanaka, S., et al., J. Clin. Invest. 91 (1993) 257-263]). 파골세포 분화 및 성숙 동안 항-CSF-1R 항체에 의한 CSF-1R 활성의 억제는 골용해성 질병 및 전이성 질병에서 관련된 골격 관련 사건을 유발하는 파골세포의 불균형한 활성을 예방하는 듯하다. 유방, 폐암 및 다발성 골수종이 전형적으로 골용해성 병변을 생성시키는 반면, 전립선암에서 뼈로의 전이는 처음에, 증가된 골 형성 활성이 정상적인 뼈의 전형적인 라멜라 구조와 상이한 '직골(woven bone)'을 생성시키는 조골성 외관을 갖는다. 질병이 진행하는 동안 골 병변은 현저한 골용해성 성분뿐만 아니라 높은 혈청 수준의 골 재흡수를 나타내고 이는 재흡수 억제 요법이 유용할 수 있음을 암시한다. 비스포스포네이트는 골용해성 병변의 형성을 억제하는 것으로 나타났으며 호르몬-무반응성 전이성 전립선암이 있는 남성에게서만 골격-관련된 사건의 수를 감소시켰으나, 지금은 조골성 병변에 대한 효과가 논쟁의 대상이 되고 있으며 지금까지로는 비스포스포네이트는 골 전이 또는 호르몬 반응성 전립선암의 예방에 유리하지 않다. 복합된 골용해성/조골성 전립선암에 있어서 재흡수 억제제의 효과는 여전히 임상에서 연구중에 있다(문헌[Choueiri, M.B., et al., Cancer Metastasis Rev. 25 (2006) 601-609]; 문헌[Vessella, R.L. and Corey, E., Clin. Cancer Res. 12 (20 Pt 2) (2006) 6285s-6290s]).

세번째 기전은 종양 관련된 대식세포(TAM)가 불량한 예후와 상관 있는 유방, 전립선, 난소 및 경부 암의 고형 종양에서 발견된다는 최근의 관찰을 기본으로 한다(문헌[Bingle, L., et al., J. Pathol. 196 (2002) 254-265]; 문헌[Pollard, J.W., Nat. Rev. Cancer 4 (2004) 71-78]). 대식세포는 M-CSF 및 다른 케모카인들에 의해 종양으로 모인다. 이어서 대식세포는 혈관형성 인자, 프로테아제 및 다른 성장 인자 및 사이토킨의 분비를 통해 종양 진행에 기여할 수 있으며 CSF-1R 신호전달의 억제에 의해 차단될 수도 있다. 최근에 진(Zins) 등에 의해(문헌[Zins, K., et al., Cancer Res. 67 (2007) 1038-1045]) 종양 괴사 인자 알파(TNF 알파), M-CSF 또는 이 둘의 조합의 siRNA의 발현이 마우스 이종이식 모델에서 종양 성장을 각각의 siRNA의 종양 내 주사 후 34% 내지 50% 감소시킴을 입증되었다. 인간 SW620 세포에 의해 분비된 TNF 알파를 표적화하는 siRNA는 마우스 M-CSF 수준을 감소시켰으며 종양 중 대식세포의 감소를 이끌어냈다. 또한 M-CSF에 대한 항원 결합 단편에 의한 MCF7 종양 이종이식의 치료는 40% 종양 성장 억제를 생성시켰고, 화학요법에 대한 내성을 역전시켰으며, 화학요법제와 함께 제공 시 상기 마우스의 생존을 개선시켰다(문헌[Paulus, P., et al., Cancer Res. 66 (2006) 4349-4356]).

TAM은 만성 염증과 암 사이에 최근에 만들어진 연계의 유일한 예이다. 다수의 만성 질병들이 암의 증가된 위험성과 관련 있고, 암이 만성 염증 부위에서 발생하며, 염증의 화학적 매개물질들이 많은 암에서 발견되고; 염증의 세포 또는 화학적 매개물질의 삭제가 실험상 암의 발병을 억제하며 소염제의 장기적인 사용이 일부 암의 위험성을 감소시키는 것과 같은 염증과 암 간의 연계에 대한 추가적인 증거가 존재한다. 암에 대한 연계는 다수의 염증 상태에 대해 존재한다, 즉 위암의 경우 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 유발된 위염, 방광암의 경우 주혈흡충증, 카포시 육종의 경우 HHVX, 난소암의 경우 자궁내막증 및 전립선암의 경우 전립선염(문헌[Balkwill, F., et al., Cancer Cell 7 (2005) 211-217])이다. 대식세포는 만성 염증에 핵심 세포이며 미세환경에 차별적으로 반응한다. 작용 상태의 연속성에 있어서 극단으로 간주되는 2가지 유형의 대식세포가 존재한다, 즉 M1 대식세포는 1형 반응에 관련된다. 상기 반응은 미생물 생성물에 의한 활성화 및 반응성 산소 중간체를 생성시키는 병원성 미생물의 결과적인 살해를 포함한다. 극단의 다른 끝은 세포 증식을 촉진하고 염증 및 적응 면역을 조율하며 조직 리모델링, 혈관형성 및 보수를 촉진하는 2형 반응에 관련된 M2 대식세포이다(문헌[Mantovani, A., et al., Trends Immunol. 25 (2004) 677-686]). 확립된 종양 형성을 생성시키는 만성 염증은 대개 M2 대식세포와 관련이 있다. 염증 반응을 매개하는 중추적인 사이토킨은 TNF 알파이며 그 이름에 충실하게 고 용량에서 종양 억제 면역 및 출혈성 괴사를 자극할 수 있으나 또한 최근에 종양 세포에 의해 발현되고 종양 촉진제로서 작용하는 것으로 밝혀졌다(문헌[Zins, K., et al., Cancer Res. 67 (2007) 1038-1045]; 문헌[Balkwill, F., Cancer Metastasis Rev. 25 (2006) 409-416]). 작용에 대한 잠재적인 공간적, 시간적 의존성 및 특정 종양 유형에 대한 관련성을 포함하여 상기 종양에 대한 대식세포의 구체적인 역할은 여전히 더 잘 이해되어야할 필요가 있다.

따라서 본 발명의 하나의 양태는 암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 CSF-1R 항체이다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "암"이란 용어는 예를 들어 폐암, 비 소세포 폐(NSCL)암, 기관지폐포 세포 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항분 부위 암, 위암, 위선암, 결장암, 유방암, 자궁암, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 경부 암종, 질 암종, 외음부암, 호지킨(Hodgkin)병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 고환암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신세포 암종, 신우 암종, 중피종, 간세포암, 담즙 암, 중추 신경계(CNS)의 종양, 척추 종양, 뇌간 교세포종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 시반종, 상의세포종, 수모세포종, 뇌수막종, 편평세포 암종, 뇌하수체 선종, 림프종, 림프구성 백혈병, 상기 암들 중 임의의 암의 난치성 버전들, 또는 상기 암들 중 하나 이상의 조합일 수 있다. 바람직하게는 상기와 같은 암은 유방암, 난소암, 경부암, 폐암 또는 전립선암이다. 바람직하게는 상기와 같은 암은 CSF-1 또는 CSF-1R 발현 또는 과발현을 추가의 특징으로 한다. 본 발명의 하나의 추가의 실시양태는 원발성 종양 및 신생 전이의 동시 치료에 사용하기 위한 본 발명의 CSF-1R 항체이다.

따라서 본 발명의 또 다른 실시양태는 치주염, 조직구 증식증 X, 골다공증, 뼈의 파제트(Paget) 병(PDB), 암 치료로 인한 골 손실, 삽입물 주위 골용해, 글루코코르티코이드-유도된 골다공증, 류마티스성 관절염, 건선 관절염, 골관절염, 염증성 관절염 및 염증의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 CSF-1R 항체이다.

문헌[Rabello, D., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 347 (2006) 791-796]은 CSF1 유전자 중의 SNP가 공격성 치주염, 즉 치조골의 재흡수로 인한 치아 손실을 유발하는 치주 조직의 염증 질병과 긍정적인 관련을 나타냄을 입증하였다.

조직구 증식증 X(또한 랑게르한스(Langerhans) 세포 조직구 증식증, LCH라 칭함)는 뼈 및 여분의 골 LCH 병변에서 파골세포로 분화하는 것으로 보이는 랑게르한스 수지상 세포의 증식성 질병이다. 랑게르한스 세포는 순환하는 단핵구로부터 유래한다. 혈청 및 병변에서 측정된 M-CSF의 증가된 수준은 질병 증증도와 상관 있는 것으로 밝혀졌다(문헌[da Costa, C.E., et al., J. Exp. Med. 201 (2005) 687-693]). 질병은 주로 소아과 환자 집단에서 발생하며 상기 질병이 전신적으로 되거나 재발하는 경우에 화학요법으로 치료되어야 한다.

골다공증의 병태 생리학은 골 형성 조골세포의 상실 및 증가된 파골세포 의존성 골 재흡수에 의해 매개된다. 지지 데이터는 항-M-CSF 항체 주사가 골 밀도를 보존하고 난소절제된 마우스에서 골 재흡수를 억제함을 보인 센치(Cenci) 등에 의해 개시되었다(문헌[Cenci, S., et al., J. Clin. Invest. 105 (2000) 1279-1287]). 최근에 에스트로젠 결핍으로 인한 폐경 후 골 손실 간의 잠재적인 연계가 확인되었으며 TNF 알파 생산 T-세포의 존재가 골 대사에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다(문헌[Roggia, C., et al., Minerva Med. 95 (2004) 125-132]). 가능한 기전은 생체 내에서 TNF 알파에 의한 M-CSF의 유도일 수 있다. TNF-알파-유도된 파골세포 형성에 있어서 M-CSF의 중요한 역할이, 마우스에서 TNF 알파 유도된 골용해를 차단하고 이에 의해 염증성 관절염에 대한 CSF-1R 신호전달 잠재성 표적의 억제제를 만드는 M-CSF에 대한 항체의 효과에 의해 확인되었다(문헌[Kitaura, H., et al., J. Clin. Invest. 115 (2005) 3418-3427]).

뼈의 파제트병(PDB)은 증가된 골 턴오버의 집중 이상이 골 통증, 기형, 병적인 골절 및 난청과 같은 합병증에 이르게 하는, 골다공증 후 두 번째로 가장 통상적인 골 대사 질환이다. 정상적인 파골세포 작용을 조절하고 개인을 PDB 및 관련된 질환에 걸리기 쉽게 만드는 4개 유전자의 돌연변이가 확인되었다: 핵 인자(NF) 카파B(RANK)-파골세포 작용의 중요한 조절 인자의 수용체 활성화제를 암호화하는 TNFRSF11A의 삽입 돌연변이, 오스테오프로테제린(RANK 리간드에 대한 유인 수용체)을 암호화하는 TNFRSF11B의 불활성화 돌연변이, NF카파B 경로에서 중요한 골격 단백질을 암호화하는 세퀘스토솜 1 유전자(SQSTM1)의 돌연변이 및 발로신-함유 단백질(VCP) 유전자의 돌연변이. 상기 유전자는 프로테오솜에 의한 분해에 대한 NF카파B의 억제제를 표적화함에 있어서 한 역할을 하는 VCP를 암호화한다(문헌[Daroszewska, A. and Ralston, S.H., Nat. Clin. Pract. Rheumatol. 2 (2006) 270-277]). 표적화된 CSF-1R 억제제는 상기 RANKL 신호전달의 조절 해제를 간접적으로 차단할 기회를 제공하며 현재 사용되는 비스포스포네이트에 대한 추가적인 치료 선택권을 더한다.

특히 유방 및 전립선암 환자들에게서 암 요법 유발된 골 손실은 표적화된 CSF-1R 억제제가 골 손실을 예방할 수 있다는 추가의 적응증이다(문헌[Lester, J.E., et al., Br. J. Cancer 94 (2006) 30-35]). 초기 유방암에 대한 개선된 예후와 함께, 보조 요법들의 장기적인 결과는, 화학 요법, 방사선, 아로마타제 억제제 및 난소절제를 포함한 상기 요법들 중 일부가 골 무기질 밀도를 감소시켜 골다공증 및 관련된 골절의 위험성을 증가시킴으로써 골 대사에 영향을 미치기 때문에 보다 중요해 지고 있다(문헌[Lester, J.E., et al., Br. J. Cancer 94 (2006) 30-35]). 유방암에서 보조적인 아로마타제 억제제 요법에 상당하는 것은 전립선암에서 안드로젠 절제이며 이는 골 무기질 밀도의 손실에 이르게 하고 골다공증 관련된 골절의 위험성을 현저하게 증가시킨다(문헌[Stoch, S.A., et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 86 (2001) 2787-2791]).

CSF-1R 신호전달의 표적화된 억제는 다른 적응증들에서뿐만 아니라 표적화된 세포 유형이 파골세포 및 대식세포를 포함하는 경우, 예를 들어 류마티스성 관절염의 결과로서 관절 치환에 대한 특정한 합병증의 치료에 유용한 듯하다. 인공관절 주위 골 손실로 인한 이식 실패 및 결과적인 인공관절의 느슨함이 관절 치환의 주 합병증이며 이는 개인 환자 및 의료보험제도에 큰 사회경제적 부담이 되는 반복된 수술을 요한다. 지금까지, 인공관절 주위 골 용해를 예방하거나 억제하는데 승인된 약물 요법은 없다(문헌[Drees, P., et al., Nat. Clin. Pract. Rheumatol. 3 (2007) 165-171]).

글루코코르티코이드-유발된 골다공증(GIOP)은, CSF-1R 억제제가 다양한 병들, 특히 만성 폐색성 폐 질병, 천식 및 류마티스성 관절염의 결과로서 제공되는 장기간 글루코코르티코스테로이드 사용 후의 골 손실을 예방할 수 있는 또 다른 적응증이다(문헌[Guzman-Clark, J.R., et al., Arthritis Rheum. 57 (2007) 140-146]; 문헌[Feldstein, A.C., et al., Osteoporos. Int. 16 (2005) 2168-2174]).

류마티스성 관절염, 건선 관절염 및 염증성 관절염은 본질적으로, 대식세포 성분 및 다양한 정도의 골 파괴로 이루어진다는 점에서 CSF-1R 신호전달 억제제에 대한 잠재적인 적응증이다(문헌[Ritchlin, C.T., et al., J. Clin. Invest. 111 (2003) 821-831]). 골관절염 및 류마티스성 관절염은 결합 조직 중 대식세포의 축적 및 관절낭액 내로의 대식세포의 침윤(적어도 부분적으로 M-CSF에 의해 매개된다)에 의해 유발되는 염증성 자가면역 질병이다. 문헌[Campbell, I., K., et al., J. Leukoc. Biol. 68 (2000) 144-150]은 M-CSF가 시험관 내에서 인간-관절 조직 세포(연골세포, 활막 섬유아세포)에 의해 생산되며 류마티스성 관절염이 있는 환자의 관절낭액에서 발견됨을 입증하였으며, 이는 상기 M-CSF가 상기 질병의 병인과 관련 있는 활액 조직 염증 및 대식세포 침윤에 기여함을 암시한다. CSF-1R 신호전달의 억제는 관절 중 대식세포의 수를 조절하고 관련된 골 파괴로부터의 통증을 경감시키는 듯하다. 부작용을 최소화하고 상기 적응증들에서 CSF-1R 신호전달의 영향을 더 이해하기 위한 하나의 방법은 무수히 많은 다른 키나제들, 예를 들어 Raf 키나제를 표적화하지 않고 CSF-1R을 특이적으로 억제하는 것이다.

최근의 문헌 보고서들은 만성적인 관상 동맥 질병에서 죽상 동맥경화증의 진행과 불량한 예후를 갖는 증가된 순환하는 M-CSF를 연관시키며(문헌[Saitoh, T., et al., J. Am. Coll. Cardiol. 35 (2000) 655-665]; 문헌[Ikonomidis, I., et al., Eur. Heart. J. 26 (2005) p. 1618-1624]); M-CSF는 CSF-1R을 발현하고 초기 플라크를 나타내는 거품 세포(섭취된 산화된 LDL을 갖는 대식세포)의 형성을 도움으로써 상기 죽상 동맥경화증 과정에 영향을 미친다(문헌[Murayama, T., et al., Circulation 99 (1999) 1740-1746]).

M-CSF 및 CSF-1R의 발현 및 신호전달은 활성화된 미세아교세포에서 발견된다. 상기 중추 신경계의 내재하는 대식세포인 미세아교세포는 감염 및 외상성 상해를 포함한 다양한 손상에 의해 활성화될 수 있다. M-CSF는 뇌에서의 염증 반응의 핵심 조절 인자로 간주되며 M-CSF 수준은 HIV-1, 뇌염, 알쯔하이머병(AD) 및 뇌 종양에서 증가한다. M-CSF/CSF-1R에 의한 자가분비 신호전달의 결과로서 미세아교세포종은, 예를 들어 실험적인 신경 손상 모델을 사용함으로써 입증된 바와 같이 염증성 사이토킨의 유도 및 질소 산화물 방출을 발생시킨다(문헌[Hao, A.J., et al., Neuroscience 112 (2002) 889-900]; 문헌[Murphy, G.M., Jr., et al., J. Biol. Chem. 273 (1998) 20967-20971]). CSF-1R의 증가된 발현을 갖는 미세아교세포는 AD 및 AD의 아밀로이드 전구체 단백질 V717F 트랜스제닉 마우스 모델에서 플라크를 둘러싸는 것으로 밝혀졌다(문헌[Murphy, G.M., Jr., et al., Am. J. Pathol. 157 (2000) 895-904]). 다른 다르게는 뇌 중에 보다 적은 미세아교세포를 갖는 op/op 마우스는 정상 대조군에 비해 A-베타의 근원섬유 침착 및 신경세포 손실을 발생시켰으며, 이는 미세아교세포가 op/op 마우스에 없는 AD의 발병에 있어서의 신경보호 작용을 가짐을 암시한다(문헌[Kaku, M., et al., Brain Res. Brain Res. Protoc. 12 (2003) 104-108]).

M-CSF 및 CSF-1R의 발현 및 신호전달은 염증성 장 질병(IBD)과 관련이 있다(국제특허출원공개 제2005/046657호). "염증성 장 질병"이란 용어는 위장관의 다양한 부위에서 만성 염증을 특징으로 하는 상기 장관의 심한 만성 질환을 지칭하며, 구체적으로 궤양성 대장염(UC) 및 크론병을 포함한다.

본 발명은 암의 치료를 위한 상기 언급한 에피토프 결합 성질 또는 다르게는 상기 언급한 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편을 특징으로 하는 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 포함한다.

본 발명은 골 손실의 치료를 위한 상기 언급한 에피토프 결합 성질 또는 다르게는 상기 언급한 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편을 특징으로 하는 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 포함한다.

본 발명은 전이의 예방 또는 치료를 위한 상기 언급한 에피토프 결합 성질 또는 다르게는 상기 언급한 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편을 특징으로 하는 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 포함한다.

본 발명은 염증성 질병의 치료를 위한 상기 언급한 에피토프 결합 성질 또는 다르게는 상기 언급한 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편을 특징으로 하는 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 포함한다.

본 발명은 암의 치료를 위한 또는 다르게는 암의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 상기 언급한 에피토프 결합 성질 또는 다르게는 상기 언급한 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편을 특징으로 하는 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 포함함을 특징으로 하는 상기 항체의 용도를 포함한다.

본 발명은 골 손실의 치료를 위한 또는 다르게는 골 손실의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 상기 언급한 에피토프 결합 성질 또는 다르게는 상기 언급한 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편을 특징으로 하는 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 포함함을 특징으로 하는 상기 항체의 용도를 포함한다.

본 발명은 전이의 예방 또는 치료를 위한 또는 다르게는 전이의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조를 위한 상기 언급한 에피토프 결합 성질 또는 다르게는 상기 언급한 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편을 특징으로 하는 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 포함함을 특징으로 하는 상기 항체의 용도를 포함한다.

본 발명은 염증성 질병의 치료를 위한 또는 다르게는 염증성 질병의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 상기 언급한 에피토프 결합 성질 또는 다르게는 상기 언급한 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편을 특징으로 하는 인간 CSF-1R에 결합하는 항체를 포함함을 특징으로 하는 상기 항체의 용도를 포함한다.

본 발명에 따른 항체를 바람직하게는 재조합 수단에 의해 생산한다. 상기와 같은 방법은 당해 분야의 발달 수준으로 널리 공지되어 있으며 원핵생물 및 진핵생물 세포에서의 단백질 발현에 이어서 상기 항체 폴리펩타이드를 단리하고 대개는 약학적으로 허용 가능한 순도로 정제함을 포함한다. 단백질 발현을 위해서, 경쇄 및 중쇄 또는 그의 단편을 암호화하는 핵산을 표준 방법에 의해 발현 벡터에 삽입시킨다. 발현을 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, 효모, 또는 에스케리키아 콜라이 세포와 같은 적합한 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 수행하고 상기 세포(상청액 또는 용해 후 세포)로부터 항체를 회수한다.

항체들은 완전 세포 중에, 세포 용해물 중에, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 정제를 다른 세포 성분 또는 다른 오염물질, 예를 들어 다른 세포 핵산 또는 단백질을 제거하기 위해서, 표준 기법, 예를 들어 알칼리성/SDS 처리, CsCl 분염법, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동, 및 당해 분야에 널리 공지된 다른 기법들에 의해 수행한다. 문헌[Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)]을 참조한다.

NS0 세포에서의 발현이 예를 들어 문헌[Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123]; 문헌[Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270]에 개시되어 있다. 일시적인 발현이 예를 들어 문헌[Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9]에 개시되어 있다. 가변 도메인의 클로닝이 문헌[Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837]; 문헌[Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289]; 문헌[Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87]에 개시되어 있다. 바람직한 일시적인 발현 시스템(HEK 293)이 문헌[Schlaeger, E.-J. and Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83] 및 문헌[Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199]에 개시되어 있다.

항-CSF-1R 항체의 아미노산 서열 변체를 암호화하는 핵산 분자를 당해 분야에 공지된 다양한 방법들에 의해 제조한다. 이들 방법은 비제한적으로 천연 공급원으로부터의 단리(천연 아미노산 서열 변체의 경우에) 또는 올리고뉴클레오타이드-매개된(또는 부위-지정된) 돌연변이, PCR 돌연변이 및 인간화된 항-CSF-IR 항체의 보다 초기에 제조된 변체 또는 비-변체 버전의 카세트 돌연변이를 포함한다.

본 발명에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 프로모터, 번역 개시, 불변 영역, 3' 번역되지 않은 영역, 폴리아데닐화 및 전사 종결의 서열들과 결합시켜 발현 벡터 구조물을 형성시킨다. 상기 중쇄 및 경쇄 발현 구조물을 단일 벡터로 결합하거나, 숙주 세포 내로 함께 형질감염시키거나, 연속적으로 형질감염시키거나, 또는 별도로 형질감염시키고 이어서 융합시켜 상기 두 쇄를 모두 발현하는 단일 숙주 세포를 형성시킬 수 있다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화된, 본 발명의 단클론 항체들 중 하나 또는 이들의 조합, 또는 이들의 항원-결합 부분을 함유하는 조성물, 예를 들어 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 생리학적으로 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수/재흡수 지연제 등을 포함한다.

본 발명의 조성물을 당해 분야에 공지된 다양한 방법들에 의해 투여할 수 있다. 숙련가에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 변할 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 담체는 멸균 수성 용액 또는 분산액 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 상기와 같은 매질 및 작용제의 약학적으로 활성인 물질에 대한 용도는 당해 분야에 공지되어 있다. 물 이외에, 담체는 예를 들어 등장성 완충 염수 용액일 수 있다.

선택된 투여 경로와 상관없이, 적합한 수화된 형태로 사용될 수도 있는 본 발명의 화합물 및/또는 본 발명의 약학 조성물을, 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 통상적인 방법에 의해 약학적으로 허용 가능한 투여형으로 제형화한다.

본 발명의 약학 조성물 중의 활성 성분의 실제 투여량 수준을 환자에 대한 독성 없이, 특정 환자의 목적하는 치료 반응, 조성물, 및 투여 방식을 성취하기에 유효한 활성 성분의 양(유효량)을 획득하기 위해 변화시킬 수 있다. 선택된 투여량 수준은 다양한 약동학적 인자들, 예를 들어 사용되는 본 발명의 특정 조성물, 또는 그의 에스터, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 사용되는 특정 조성물과 병용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 조건, 일반적인 건강 및 선행 의료 병력및 의학 분야에 널리 공지된 유사한 인자들에 따라 변할 수 있다.

본 발명은 암, 특히 결장, 폐 또는 췌장암을 앓고 있는 환자의 치료를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다.

본 발명은 또한 상기와 같은 질병을 앓고 있는 환자의 치료 방법을 포함한다.

본 발명은 또한 유효량의 본 발명에 따른 항체를 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함하는 약학 조성물의 제조 방법 및 상기와 같은 방법을 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 암을 앓고 있는 환자의 치료를 위한, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 약제의 제조를 위한 유효량의 본 발명에 따른 항체의 용도를 제공한다.

본 발명의 이해를 돕기 위해 하기의 실시예, 서열 목록 및 도면을 제공하며, 본 발명의 진정한 범주는 첨부된 청구의 범위에 나타나 있다. 본 발명의 진의로부터 이탈됨 없이 나열된 과정에 변형을 수행할 수 있는 것으로 생각된다.

서열의 설명

서열번호 1 중쇄 CDR3, Mab 2F11

서열번호 2 중쇄 CDR2, Mab 2F11

서열번호 3 중쇄 CDR1, Mab 2F11

서열번호 4 경쇄 CDR3, Mab 2F11

서열번호 5 경쇄 CDR2, Mab 2F11

서열번호 6 경쇄 CDR1, Mab 2F11

서열번호 7 중쇄 가변 도메인, Mab 2F11

서열번호 8 경쇄 가변 도메인, Mab 2F11

서열번호 9 중쇄 CDR3, Mab 2E10

서열번호 10 중쇄 CDR2, Mab 2E10

서열번호 11 중쇄 CDR1, Mab 2E10

서열번호 12 경쇄 CDR3, Mab 2E10

서열번호 13 경쇄 CDR2, Mab 2E10

서열번호 14 경쇄 CDR1, Mab 2E10

서열번호 15 중쇄 가변 도메인, Mab 2E10

서열번호 16 경쇄 가변 도메인, Mab 2E10

서열번호 17 중쇄 CDR3, hMab 2F11-c11

서열번호 18 중쇄 CDR2, hMab 2F11-c11

서열번호 19 중쇄 CDR1, hMab 2F11-c11

서열번호 20 경쇄 CDR3, hMab 2F11-c11

서열번호 21 경쇄 CDR2, hMab 2F11-c11

서열번호 22 경쇄 CDR1, hMab 2F11-c11

서열번호 23 중쇄 가변 도메인, hMab 2F11-c11

서열번호 24 경쇄 가변 도메인, hMab 2F11-c11

서열번호 25 중쇄 CDR3, hMab 2F11-d8

서열번호 26 중쇄 CDR2, hMab 2F11-d8

서열번호 27 중쇄 CDR1, hMab 2F11-d8

서열번호 28 경쇄 CDR3, hMab 2F11-d8

서열번호 29 경쇄 CDR2, hMab 2F11-d8

서열번호 30 경쇄 CDR1, hMab 2F11-d8

서열번호 31 중쇄 가변 도메인, hMab 2F11-d8

서열번호 32 경쇄 가변 도메인, hMab 2F11-d8

서열번호 33 중쇄 CDR3, hMab 2F11-e7

서열번호 34 중쇄 CDR2, hMab 2F11-e7

서열번호 35 중쇄 CDR1, hMab 2F11-e7

서열번호 36 경쇄 CDR3, hMab 2F11-e7

서열번호 37 경쇄 CDR2, hMab 2F11-e7

서열번호 38 경쇄 CDR1, hMab 2F11-e7

서열번호 39 중쇄 가변 도메인, hMab 2F11-e7

서열번호 40 경쇄 가변 도메인, hMab 2F11-e7

서열번호 41 중쇄 CDR3, hMab 2F11-f12

서열번호 42 중쇄 CDR2, hMab 2F11-f12

서열번호 43 중쇄 CDR1, hMab 2F11-f12

서열번호 44 경쇄 CDR3, hMab 2F11-f12

서열번호 45 경쇄 CDR2, hMab 2F11-f12

서열번호 46 경쇄 CDR1, hMab 2F11-f12

서열번호 47 중쇄 가변 도메인, hMab 2F11-f12

서열번호 48 경쇄 가변 도메인, hMab 2F11-f12

서열번호 49 중쇄 CDR3, hMab 2F11-g1

서열번호 50 중쇄 CDR2, hMab 2F11-g1

서열번호 51 중쇄 CDR1, hMab 2F11-g1

서열번호 52 경쇄 CDR3, hMab 2F11-g1

서열번호 53 경쇄 CDR2, hMab 2F11-g1

서열번호 54 경쇄 CDR1, hMab 2F11-g1

서열번호 55 중쇄 가변 도메인, hMab 2F11-g1

서열번호 56 경쇄 가변 도메인, hMab 2F11-g1

서열번호 57 인간 카파 경쇄 불변 영역

서열번호 58 IgG1로부터 유도된 인간 중쇄 불변 영역

서열번호 59 L234A 및 L235A 상에서 돌연변이된 IgG1로부터 유도된 인 간 중쇄 불변 영역

서열번호 60 IgG4로부터 유도된 인간 중쇄 불변 영역

서열번호 61 S228P 상에서 돌연변이된 IgG4로부터 유도된 인간 중쇄 불변 영역

서열번호 62 인간 야생형 CSF-1R (wt CSF-1R)

서열번호 63 인간 돌연변이체 CSF-1R L301S Y969F

서열번호 64 인간 CSF-1R 세포외 도메인

서열번호 65 인간 CSF-1R 단편 delD4

서열번호 66 인간 CSF-1R 단편 D1-D3

서열번호 67 신호 펩타이드

서열번호 68 프라이머

서열번호 69 중쇄 CDR3, Mab 1G10

서열번호 70 중쇄 CDR2, Mab 1G10

서열번호 71 중쇄 CDR1, Mab 1G10

서열번호 72 경쇄 CDR3, Mab 1G10

서열번호 73 경쇄 CDR2, Mab 1G10

서열번호 74 경쇄 CDR1, Mab 1G10

서열번호 75 중쇄 가변 도메인, Mab 1G10

서열번호 76 경쇄 가변 도메인, Mab 1G10

서열번호 77 중쇄 CDR3, Mab 2H7

서열번호 78 중쇄 CDR2, Mab 2H7

서열번호 79 중쇄 CDR1, Mab 2H7

서열번호 80 경쇄 CDR3, Mab 2H7

서열번호 81 경쇄 CDR2, Mab 2H7

서열번호 82 경쇄 CDR1, Mab 2H7

서열번호 83 중쇄 가변 도메인, Mab 2H7

서열번호 84 경쇄 가변 도메인, Mab 2H7

본 발명의 이해를 돕기 위해 실시예, 서열 목록 및 도면을 제공하며, 본 발명의 진정한 범주는 첨부된 청구의 범위에 나타나 있다. 본 발명의 진의로부터 이탈됨 없이 나열된 과정에 변형을 수행할 수 있는 것으로 생각된다.

실시예 1

항- CSF -1R 항체를 생산하는 하이브리도마 세포 주의 생성

NMRI 마우스의 면역화 과정

NMRI 마우스를 전기천공법을 사용함으로써 huCSF-1R의 세포외 도메인을 암호화하는 발현 벡터 p디스플레이(pDisplay: 상표)(인비트로젠(Invitrogen), 미국 소재)로 면역시켰다. 모든 마우스를 100 ㎍의 DNA로 4회 면역시켰다. 항-huCSF-1R의 혈청 역가가 충분한 것으로 밝혀졌으면, 마우스를 주입 전 4 및 3일째에 PBS 200 ㎕ 중의 50 ㎍의 huCSF-1R ECD/huCSF-1R ECDhuFc 키메라 1:1 혼합물로 정맥 내(i.v.)로 1회 추가 접종하였다.

항원 특이적 ELISA

인간화된 마우스의 혈청 중 항-CSF-1R 역가를 항원 특이적 ELISA에 의해 측정하였다.

0.3 ㎍/㎖의 huCSF-1R-huFc 키메라(용해성 세포외 도메인)를 0.1 ㎎/㎖의 비오틴화된 항 Fcγ(잭슨 이뮤노리써치(Jackson ImmunoResearch), 카탈로그 번호 109-066-098)와 함께 스트렙트아비딘 플레이트(맥시솔브(MaxiSorb); 마이크로코트(MicroCoat), 독일 소재, 카탈로그 번호 11974998/MC1099) 상에 포획하고 PBS/0.05% 트윈(Tween)20/0.5% BSA 중에서 1/800 희석한 양고추 냉이 퍼옥시다제(HRP)-접합된 F(ab')₂ 항 마우스 IgG(GE 헬쓰케어, 영국 소재, 카탈로그 번호 NA9310V)를 첨가하였다. 모든 탭(tap)으로부터의 혈청을 PBS/0.05% 트윈20/0.5% BSA에서 1/40 희석하고 1/1638400까지 연속해서 희석하였다. 희석된 혈청을 웰에 첨가하였다. 프리-탭(pre-tap) 혈청을 음성 대조군으로서 사용하였다. 500 ng/㎖ 내지 0.25 ng/㎖의 일련의 마우스 항-인간 CSF-1R Mab3291(R&D 시스템스(Systems), 영국 소재)의 희석물을 양성 대조군으로서 사용하였다. 모든 성분들을 1.5시간 동안 함께 배양하고, 웰을 PBST(PBS/0.2% 트윈20)로 6회 세척하고 새로 제조한 ABTS(등록상표) 용액(1 ㎎/㎖)(ABTS: 2,2'-아지노 비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산)으로 실온에서 10분간 분석을 전개시켰다. 흡광도를 405 ㎚에서 측정하였다.

하이브리도마 생성

마우스 림프구를 단리하고 PEG 기재 표준 프로토콜을 사용하여 마우스 골수종 세포 주와 융합시켜 하이브리도마를 생성시킬 수 있다. 이어서 생성되는 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 생산에 대해 선별한다. 예를 들어, 면역된 마우스로부터의 비장 유도된 림프구의 단세포 현탁액을 50% PEG와 함께 Ag8 비-분비 마우스 골수종 세포 P3X63Ag8.653(ATCC, CRL-1580)에 융합시킨다. 세포를 편평 바닥 96 웰 미세 적정 플레이트 중에 대략적으로 10⁴으로 도말한 다음, 선택성 배지 중에서 약 2주간 배양한다. 이어서 개별적인 웰을 인간 항-CSF-1R 단클론 IgM 및 IgG 항체에 대해 ELISA에 의해 선별한다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 일어났으면, 항체 분비 하이브리도마를 재 도말하고, 다시 선별하고, 인간 IgG에 대해 여전히 양성인 경우, 항-CSF-1R 단클론 항체를 FACS에 의해 서브클로닝할 수 있다. 이어서 안정한 서브클론들은 시험관 내에서 배양되어 특성화를 위한 조직 배양 배지에 항체를 생산한다. 본 발명에 따른 항체를, 실시예 4에 개시된 바와 같은 인간 CSF-1R 단편 delD4 및 인간 CSF-1R 세포외 도메인(CSF-1R-ECD)에 대한 항-CSF-1R 항체의 결합의 측정뿐만 아니라 실시예 5에 개시된 바와 같은 항-CSF-1R 단클론 항체에 의한 처리 하에 야생형 CSF-1R(리간드 의존성 신호전달) 또는 돌연변이 CSF-1R L301S Y969F(리간드 독립적인 신호전달)로 형질감염시킨 NIH3T3의 성장 억제의 측정을 사용하여 선택할 수 있다.

하이브리도마의 배양

생성된 muMAb 하이브리도마를 37 ℃ 및 5% CO₂에서 2 mM L-글루타민(깁코(GIBCO) - 카탈로그 번호 35050-038), 1 mM Na-피루배트(Pyruvat)(깁코 - 카탈로그 번호 11360-039), 1x NEAA (깁코 - 카탈로그 번호 11140-035), 10% FCS (PAA - 카탈로그 번호 A15-649), 1x 펜 스트렙(Pen Strep)(로슈(Roche) - 카탈로그 번호 1074440), 1x 뉴트리도마(Nutridoma) CS(로슈 - 카탈로그 번호 1363743), 50 μM 머캅토에탄올(깁코 - 카탈로그 번호 31350-010) 및 50 U/㎖ IL 6 마우스(로슈 - 카탈로그 번호 1 444 581)가 보충된 RPMI 1640(PAN - 카탈로그 번호 PO4-17500)에서 배양하였다. 생성되는 마우스 항체들 중 일부를 인간화하였으며(예를 들어 Mab 2F11) 재조합에 의해 발현시켰다.

실시예 2

CSF -1R에 대한 CSF -1 결합의 억제( ELISA )

본 분석을 먼저 CSF-1R-ECD에 대한 항-CSF-1R 항체 결합을 허용한 다음 상기 수용체에 결합하지 않은 리간드의 검출을 허용하도록 설정함으로써 두 항체, 즉 리간드 치환 항체 및 이량체화 억제제 항-CSF-1R 항체를 모두 시험할 수 있다. 시험을 실온에서 384 웰 미세적정 플레이트(마이크로코트, 독일 소재, 카탈로그 번호 464718) 상에서 수행하였다. 각각의 배양 단계 후에 플레이트를 PBST로 3회 세척하였다.

초기에, 플레이트를 0.5 ㎎/㎖의 염소 F(ab')₂ 비오틴화된 항 Fcγ(잭슨 이뮤노리써치, 카탈로그 번호 109-006-170)로 1시간 동안 코팅하였다.

그 후에 웰을 0.2% 트윈(등록상표)-20 및 2% BSA(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH), 독일 소재)가 보충된 PBS로 0.5시간 동안 차단하였다. 75 ng/㎖의 huCSF-1R-huFc 키메라(huCSF-1R의 이량체성 용해성 세포외 도메인을 형성한다)를 플레이트에 1시간 동안 고정화시켰다. 이어서 PBS/0.05% 트윈20/0.5% BSA 중 정제된 항체의 희석물을 1시간 동안 배양하였다. 3 ng/㎖의 CSF-1(바이오몰(Biomol), 독일 소재, 카탈로그 번호 60530), 50 ng/㎖의 비오틴화된 항 CSF-1 클론 BAF216(R&D 시스템스, 영국 소재) 및 1:5000 희석된 스트렙트아비딘 HRP(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일 소재, 카탈로그 번호 11089153001)의 혼합물을 1시간 동안 가한 후에, 플레이트를 PBST로 6회 세척하였다. 리간드-수용체 상호작용을 억제하는 항 CSF-1R SC 2-4A5(산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology), 미국 소재)를 양성 대조군으로서 사용하였다. 플레이트를 새로 제조한 BM 블루(blue)(등록상표) POD 기질 용액(BM 블루(등록상표): 3,3'-5,5'-테트라메틸벤지딘, 로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일 소재, 카탈로그 번호 11484281001)으로 실온에서 30분간 전개시켰다. 흡광도를 370 ㎚에서 측정하였다. 항-CSF-1R 항체가 이량체성 복합체로부터 CSF-1의 방출을 일으키는 경우, 흡광도의 감소가 발견된다. 모든 항-CSF-1R 항체는 CSF-1R과의 CSF-1 상호작용의 현저한 억제를 나타내었다(표 1 참조). 리간드-수용체 상호작용을 억제하는 항 CSF-1R SC 2-4A5(산타 크루즈 바이오테크놀로지, 미국 소재, 또한 문헌[Sherr, C.J. et al., Blood 73(1989) 1786-1793] 참조)를 비교 대조군으로서 사용하였다.

[표 1]

실시예 3

NIH3T3 - CSF -1R 재조합 세포에서 CSF -1-유도된 CSF -1R 인산화의 억제

전장 CSF-1R에 대한 발현 벡터로 레트로바이러스에 의해 감염된 4.5 x 10³ NIH 3T3 세포를 합류에 도달할 때까지 DMEM(PAA 카탈로그 번호 E15-011), 2 mM L-글루타민(시그마, 카탈로그 번호 G7513), 2 mM 나트륨 피루베이트, 1 x 불필수 아미노산, 10% FKS(PAA, 카탈로그 번호 A15-649) 및 100 ㎍/㎖ 펜스트렙(시그마, 카탈로그 번호 P4333[10 ㎎/㎖] 중에서 배양하였다. 그 후에 세포를 나트륨 셀레나이트[5 ng/㎖](시그마, 카탈로그 번호 S9133), 트랜스페린[10 ㎍/㎖](시그마, 카탈로그 번호 T8158), BSA[400 ㎍/㎖](로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 카탈로그 번호 10735078), 4 mM L-글루타민(시그마, 카탈로그 번호 G7513), 2 mM 나트륨 피루베이트(깁코, 카탈로그 번호 11360), 1 x 불필수 아미노산(깁코, 카탈로그 번호 11140-035), 2-머캅토에탄올[0.05 mM](머크(Merck), 카탈로그 번호 M7522), 100 ㎍/㎖ 및 펜스트렙(시그마, 카탈로그 번호 P4333)이 보충된 무혈청 DMEM 배지(PAA 카탈로그 번호 E15-011)로 세척하고, 30 ㎕의 동일한 배지에서 16시간 동안 배양하여 수용체 상향조절을 허용하였다. 10 ㎕의 희석된 항-CSR-1R 항체를 세포에 1.5시간 동안 첨가하였다. 이어서 세포를 10 ㎕의 100 ng/㎖의 huM-CSF-1(바이오몰 카탈로그 번호 60530)으로 5분간 자극하였다. 배양 후에, 상청액을 제거하고, 세포를 80 ㎕의 빙냉 PBS로 2회 세척하고 50 ㎕의 새로 제조한 빙냉 용해 완충제(150 mM NaCl/20 mM 트리스 pH 7.5/1 mM EDTA/1 mM EGTA/1% 트리톤 X-100/1 프로테아제 억제제 정제(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하 카탈로그 번호 1 836 170)/완충제 10 ㎖/10 ㎕/㎖ 포스파타제 억제제 칵테일 1(시그마 카탈로그 번호 P-2850, 100 x 스톡)/10 ㎕/㎖ 프로테아제 억제제 1(시그마 카탈로그 번호 P-5726, 100 x 스톡)/10 ㎕/㎖ 1M NaF)를 첨가하였다. 얼음 상에서 30분 후에 상기 플레이트를 플레이트 진탕기 상에서 3분간 격렬히 진탕하고 이어서 2200 rpm에서 10분간 원심분리하였다(헤래우스 메가퓨즈(Heraeus Megafuge) 10).

세포 용해물 중의 인산화된 수용체 및 전체 CSF-1 수용체의 존재를 ELISA에 의해 분석하였다. 상기 인산화된 수용체의 검출을 위해서 R&D 시스템스(카탈로그 번호 DYC3268-2)로부터의 키트를 공급자의 설명에 따라 사용하였다. 전체 CSF-1R의 검출을 위해서 10 ㎕의 상기 용해물을 상기 키트 중에 함유된 포획 항체의 사용에 의해 상기 플레이트 상에 고정화시켰다. 그 후에 1:750 희석된 비오틴화된 항 CSF-1R 항체 BAF329(R&D 시스템스) 및 1:1000 희석된 스트렙트아비딘-HRP 접합체를 가하였다. 60분 후에 플레이트를 새로 제조한 ABTS(등록상표) 용액으로 전개시키고 흡광도를 검출하였다. 데이터를 항체 부재 하의 양성 대조군의 %로서 계산하였으며 포스포/전체 수용체 비 값으로 나타내었다. 음성 대조군을 M-CSF-1이 첨가되지 않은 것으로 정의하였다. 리간드-수용체 상호작용을 억제하는 항 CSF-1R SC 2-4A5(산타 크루즈 바이오테크놀로지, 미국 소재, 문헌[Sherr, C.J. et al., Blood 73 (1989) 1786-1793] 참조)를 비교 대조군으로서 사용하였다.

[표 2]

실시예 4

인간 CSF -1R 단편 delD4 및 인간 CSF -1R 세포외 도메인( CSF -1R- ECD )에 대한 항- CSF -1R 항체의 결합의 측정

서열번호 64의 인간 CSF -1R 세포외 도메인( CSF -1R- ECD )( 세포외 서브도메인 D1 내지 D5 , hCSF -1R- ECD 를 포함한다)의 제조:

pCMV-preS-Fc-hCSF-1R-ECD(7836bp)는 CMV 프로모터의 조절 하에서 프리시전(PreScission) 프로테아제 절단 부위에 이어서 인간 IgG1의 aa100 내지 330 및 6xHis-Tag에 C-말단 융합된 인간 CSF-1R(서열번호 64)의 완전한 ECD를 암호화한다. 천연 신호 펩타이드를, BamHI 제한 부위를 생성시키기 위해서, 첫 번째 M 다음에 아미노산 G 및 S의 삽입에 의해 변화시켰다.

서열번호 65의 인간 CSF -1R 단편 delD4( 세포외 서브도메인 D1 내지 D3 및 D5, hCSF -1R- delD4 를 포함한다)의 제조:

hCSF1R-delD4-V1-PreSc-hFc-His를 순방향 프라이머로서 서열 CACCTCCATGTTCTTCCGGTACCCCCCAGAGGTAAG(서열번호 68)을 갖는 delD4-for 및 역방향 프라이머로서 역방향 보체 서열을 갖는 delD4-rev을 사용하여, 스트라타진 퀵체인지(Stratagene QuikChange) XL 부위 지정 돌연변이 프로토콜에 의해 pCMV-preS-Fc-hCSF-1R-ECD로부터 클로닝하였다. 문헌[BioTechniques 26 (1999) 680]에 공개된 프로토콜 변화를 사용하여 상기 두 프라이머를 모두 정규 스트라타진 프로토콜에 선행하는 3개의 주기에서 별도의 반응으로 연장하였다:

2개의 별도의 50 ㎕ 반응 혼합물을 제조사의 설명서에 따라 확립시켰으며, 이들 혼합물은 각각 주형으로서 10 ng의 플라스미드 pCMV-preS-Fc-hCSF1R-ECD 및 10 pM의 상기 프라이머 delD4-for 및 delD4-rev 중 하나 및 0.5 ㎕의 상기 키트와 함께 제공된 바와 같은 Pfu DNA 폴리머라제를 함유하였다. 3개의 PCR 주기 95 ℃ 30초/55 ℃ 60초/68 ℃ 8분을 실행시켰으며, 이어서 상기 2개의 반응 혼합물 각각 25 ㎕를 새로운 튜브에서 합하고 0.5 ㎕의 새로운 Pfu DNA 폴리머라제를 가하였다. 상기 키트 설명서에서 스트라타진에 의해 명시된 바와 같은 18 온도 주기에 따른 정규 PCR 프로토콜을 수행한 다음, 상기 키트와 함께 제공된 Dpn1 제한 효소에 의한 2시간의 최종 절단을 수행하였다. 상기 결실을 갖는 클론들을 Cel II 및 NotI에 의한 절단에 의해 검출하고 서열화에 의해 확인하였다.

단백질을 제조사의 명세서에 따라 Hek293 프리스타일(FreeStyle) 현탁액 세포 시스템(인비트로젠)에서 일시적인 형질감염에 의해 제조하였다. 1주일 후에, 500 ㎖의 상청액을 여과하고 1 ㎖ 하이트랩 맵셀렉트 엑스트라(HiTrap MabSelect Xtra)(GE 헬쓰케어) 단백질 A 컬럼(0.2 ㎖/분) 상에 로딩하였다. 상기 컬럼을 먼저 PBS로 세척하고, 이어서 50 mM 트리스/150 mM NaCl/1 mM EDTA/pH 7.3으로 세척하였다. 375 ㎕의 동일한 완충제 중에서 희석된 75 ㎕의 프리시전 프로테아제(GE #27-0843-01)를 상기 컬럼 상에 로딩하고 폐쇄된 컬럼을 4 ℃에서 굴리면서 밤새 배양하였다. 상기 컬럼을 1 ㎖ GSTrap FF 컬럼(GE 헬쓰케어)의 상단에 올려놓고 목적하는 단백질을 용리시켰다(0.2 ㎖/분, 0.2 ㎖ 분획). 모은 분획을 3k 나노셉(Nanosep)을 통해 원심분리 여과에 의해 1.8 ㎖에서 0.4 ㎖로 농축시키고 PBS(0.5 ㎖/분) 중의 S200 HR SEC 상에서 크로마토그래피시켰다.

인간 CSF-1R 단편 delD4를 이량체성 분자(풀 1, V = 1.5 ㎖; c = 0.30 ㎎/㎖; SDS 페이지 상의 겉보기 질량 83 kDa, 감소된 것 62 kDa) 및 단량체(풀 2, V = 1.4 ㎖; c = 0.25 ㎎/㎖ SDS 페이지 상의 겉보기 질량 62 kDa)로서 2개의 분획으로 수득하였다. 상기 이량체성 형태를 모든 실험에 사용하였다.

인간 CSF -1R 단편 delD4 및 인간 CSF -1R 세포외 도메인( CSF -1R- ECD )에 대한 항- CSF -1R 항체의 결합의 측정(반응 단위( RU )로서 결합 신호):

장비: 비아코어 T100(GE 헬쓰케어)

소프트웨어: T100 대조용, 버전 2.0.1

T100 평가, 버전 2.0.2

분석포맷 칩: CM5

온도: 25 ℃

CSF-1R 단편을 아민 커플링을 통해 고정화시켰다. 본 발명에 따른 상이한 항-CSF-1R 항체의 결합을 비교하기 위해서 1가지 농도의 시험 항체를 주입하였다. 항 CSF-1R Mab3291(R&D-시스템스) 및 SC 2-4A5(산타 크루즈 바이오테크놀로지, 미국 소재, 또한 문헌[Sherr, C.J. et al., Blood 73 (1989) 1786-1793] 참조)를 비교 대조군으로서 사용하고, 항-CCR5 m<CCR5>Pz03.1C5(DSMZ에 2004년 8월 18일자로 DSM ACC 2683으로서 기탁되었다)를 음성 대조군으로서 사용하였으며, 모두 본 발명에 따른 항-CSF-1R 항체와 동일한 조건 하에서 사용되었다.

CSF -1R 단편의 아민 커플링

제조사의 설명에 따른 표준 아민 커플링: 실험 완충제: PBS-T(로슈: 11 666 789 + 0.05% 트윈 20: 11 332 465), EDC/NHS의 혼합물에 의해 활성화, 인간 CSF-1R 단편 delD4(세포외 서브도메인 D1 내지 D3 및 D5를 포함한다)(서열번호 65) 및 인간 CSF-1R 세포외 도메인(CSF-1R-ECD)(세포외 서브도메인 D1 내지 D5를 포함한다)(서열번호 64)을 600초간 10 ㎕/분의 유속으로 주입; 커플링 완충제 NaAc, pH 5.0, c = 10 ㎍/㎖ 중에서 희석; 최종적으로 나머지 활성화된 카복실 그룹을 1M 에탄올아민의 주입에 의해 차단하였다.

25 ℃에서 인간 CSF -1R 단편 delD4 및 인간 CSF -1R 세포외 도메인( CSF -1R-ECD)에 대한 < CSF -1R> Mab 2F11, Mab 2 E10 , Mab 3291 및 sc2 -4A5 및 다른 항- CSF -1R 항체의 결합

실행 완충제: PBS-T(로슈: 11 666 789 + 0.05% 트윈 20: 11 332 465)

분석물 샘플:

결합을 농도 c = 10 nM로 분석물의 1회 주입에 의해 30 ㎕/분의 유속에서 측정하였다. (두 번째 실험에서 Mab 1G10, Mab 2H7 및 인간화된 hMab 2F11-e7의 경우) 각 주입은 700초의 길이였고, 이어서 180초의 해리 단계가 있었다. 최종 재생을 50 mM NaOH, 접촉 시간 60초, 유속 30 μL/분을 사용하여 각 주기 후에 수행하였다.

신호를 주입이 끝난 후에 10초의 기록 포인트에 의해 측정하였다. 기준 신호(블랭크 기준 유동 세포(EDC/NHS 및 에탄올아민에 의해서만 처리되었다)로부터의 신호를 감하여 결합 신호(RU로서)를 제공하였다. 결합하지 않은 항체의 결합 신호가 0보다 약간 아래인 경우(Mab 2F11 = -3; Mab 2E10 = -2; Mab 1G10 = -6, Mab 2H7 = -9; 및 인간화된 hMab 2F11-e7 = -7) 상기 값들을 0으로서 설정하였다.

[표 3a]

Mab 2F11 및 Mab 2E10은 인간 CSF-1R 세포외 도메인(CSF-1R-ECD)에 대해 결합을 나타내었으나(도 2b 참조); CSF-1R 단편 delD4에 대한 결합은 검출되지 않았다(도 2a 참조).

Sc2-4A5 및 MAB3291은 CSF-1R-ECD 및 delD4에 대해 결합을 나타내었다(도 2b 및 2a 참조).

따라서 CSF1R 단편 delD4/CSF-1R-ECD에 대한 항-CSF1R 항체 Mab 2F11 및 Mab 2E10의 결합비는 명백히 1:50(=0.02) 이하인 반면, MAB3291 및 Sc-4A5의 결합비는 각각 1.61 및 1.50이고 1:50(=0.02) 훨씬 이상이다. 음성 대조용 항체 m<CCR5>Pz03.1C5는 어떠한 결합도 나타내지 않았다(예상된 바와 같다).

Mab 1G10, Mab 2H7 및 인간화된 hMab 2F11-e7은 인간 CSF-1R 세포외 도메인(CSF-1R-ECD)에 대해 결합을 나타내었으나(도 2d 참조); CSF-1R 단편 delD4에 대한 결합은 검출되지 않았다(도 2c 참조). 따라서 CSF1R 단편 delD4/CSF-1R-ECD에 대한 항-CSF1R 항체 Mab 1G10, Mab 2H7 및 인간화된 hMab 2F11-e7의 결합비는 명백히 1:50 이하(=0.02)이었다.

추가의 실험에서 항-CSF-1R 항체 1.2.SM(국제특허출원공개 제2009/026303호에 개시된 리간드 치환 CSF-1R 항체), CXIIG6(국제특허출원공개 제2009/112245호에 개시된 리간드 치환 CSF-1R 항체), 염소 다클론 항-CSF-1R 항체 ab10676(abcam)을 조사하였다. 항-CSF-1R 항체 Mab3291(R&D 시스템스)을 비교 대조군으로서 사용하였다. 항-CCR5 m<CCR5>Pz03.1C5(DSMZ에 2004년 8월 18일자로 DSM ACC 2683으로서 기탁되었다)를 음성 대조군으로서 사용하였다.

[표 3b]

1.2.SM, CXIIG6, ab10676 및 MAB3291은 CSF-1R-ECD 및 delD4에 대해 결합을 나타내었다(도 2f 및 2e 참조).

1.2SM, CXIIG6, ab10676 및 MAB3291의 결합비는 1:50(=0.02) 훨씬 이상이었다. 음성 대조용 항체 m<CCR5>Pz03.1C5는 어떠한 결합도 나타내지 않았다(예상된 바와 같다).

실시예 5

항- CSF -1R 단클론 항체에 의한 처리 하에 3D 배양물에서 NIH3T3 - CSF -1R 재조합 세포의 성장 억제( 셀티터글로 분석)

전장 야생형 CSF-1R(서열번호 62) 또는 돌연변이 CSF-1R L301S Y969F(서열번호 63)에 대한 발현 벡터 중 어느 하나로 레트로바이러스에 의해 감염된 NIH 3T3 세포를, 플라스틱 표면에 대한 부착을 방지하기 위해 폴리-HEMA(폴리(2-하이드록시에틸메트아크릴레이트))(폴리사이언스(Polysciences) 미국 펜실베니아주 워링톤 소재) 코팅된 접시 상의, 2 mM L-글루타민, 2 mM 나트륨 피루베이트 및 불필수 아미노산 및 10% 소 태아 혈청(시그마, 독일 타우프키르켄 소재)이 보충된 DMEM 고 글루코스 배지(PAA, 오스트리아 파칭 소재)에서 배양하였다. 세포를 5 ng/㎖의 나트륨 셀레나이트, 10 ㎎/㎖의 트랜스페린, 400 ㎍/㎖의 BSA 및 0.05 mM 2-머캅토에탄올로 혈청을 대신한 배지에 시딩(seeding)하였다. 100 ng/㎖의 huCSF-1(바이오몰, 독일 함부르크 소재)로 처리 시, wtCSF-1R 발현 세포는 3차원으로 성장하는 치밀한 회전 타원체를 형성하며, 상기 성질을 부착 비의존성이라 칭한다. 이러한 회전 타원체는 원위치의 고형 종양의 3차원 구조 및 구성을 근접하게 닮는다. 돌연변이 CSF-1R 재조합 세포는 상기 CSF-1 리간드의 회전 타원체 비의존성을 형성할 수 있다. 회전 타원체 배양물을 IC50(세포 생육력을 50% 억제하는 농도)의 측정을 위해서 상이한 농도의 항체의 존재 하에서 3일간 배양하였다. 셀티터글로 분석을 사용하여 세포의 ATP 함량을 측정함으로써 세포 생육력을 검출하였다.

[표 5a]

비교 대조용 Mab R&D 시스템스 3291은 돌연변이 CSF-1R 재조합 세포 증식의 억제를 보이지 않았다.

추가의 실험에서 본 발명에 따른 항-CSF-1R 항체 hMab 2F11-e7 및 항-CSF-1R 항체 1.2.SM(국제특허출원공개 제2009/026303호에 개시된 리간드 치환 CSF-1R 항체), CXIIG6(국제특허출원공개 제2009/112245호에 개시된 리간드 치환 CSF-1R 항체), 염소 다클론 항-CSF-1R 항체 ab10676(에이비캠(abcam))및 SC 2-4A5(산타 크루즈 바이오테크놀로지, 미국 소재, 또한 문헌[Sherr, C.J. et al., Blood 73 (1989) 1786-1793] 참조)을 조사하였다.

회전 타원체 배양물을 IC30(세포 생육력을 30% 억제하는 농도)의 측정을 위해서 상이한 농도의 항체의 존재 하에서 3일간 배양하였다. 최대 농도는 20 ㎍/㎖이었다. 셀티터글로 분석을 사용하여 세포의 ATP 함량을 측정함으로써 세포 생육력을 검출하였다.

[표 5b]

실시예 6

항- CSF -1R 단클론 항체에 의한 처리 하에 3D 배양물에서 BeWo 종양 세포의 성장 억제( 셀티터글로 분석)

BeWo 융모암 세포(ATCC CCL-98)를 10% FBS(시그마) 및 2mM L-글루타민이 보충된 F12K 배지(시그마, 독일 스타인하임 소재)에서 배양하였다. 5 x 10⁴ 세포/웰을 0.5% FBS 및 5% BSA가 보충된 F12K 배지를 함유하는 96-웰 폴리-HEMA(폴리(2-하이드록시에틸메트아크릴레이트)) 코팅된 플레이트에 시딩하였다. 동시에, 200 ng/㎖의 huCSF-1 및 10 ㎍/㎖의 상이한 항-CSF-1R 단클론 항체를 가하고 6일간 배양하였다. 셀티터글로 분석을 사용하여 상대 광 단위(RLU)로 상기 세포의 ATP 함량을 측정함으로써 세포 생육력을 검출하였다. BeWo 회전 타원체 배양물을 상이한 항-CSF-1R 항체(10 ㎍/㎖)로 처리했을 때, CSF-1 유도된 성장의 억제가 관찰되었다. 항체-매개된 억제를 계산하기 위해서, 자극되지 않은 BeWo 세포의 평균 RLU 값을 모든 샘플로부터 감하였다. CSF-1 자극된 세포의 평균 RLU 값을 임의로 100%로 설정하였다. CSF-1으로 자극되고 항-CSF-1R 항체로 처리된 세포의 평균 RLU 값을 CSF-1 자극된 RLU의 %로 계산하였다. 표 6은 항-CSF-1R 단클론 항체에 의한 처리 하에 3D 배양물에서 BeWo 종양 세포의 성장 억제에 대해 계산된 데이터를 나타내며; 도 1a 및 b는 표준화된 평균 RLU 값을 도시한다.

[표 6]

실시예 7

항- CSF -1R 단클론 항체에 의한 처리 하에 인간 대식세포 분화의 억제( 셀티터글로 분석)

인간 단핵구를 로세트셉(RosetteSep: 상표) 인간 단핵구 풍부 칵테일(스템셀 테크.(StemCell Tech.) - 카탈로그 번호 15028)을 사용하여 말초 혈액으로부터 단리하였다. 농축된 단핵구 집단을 10% FCS(깁코 - 카탈로그 번호 011 - 090014M), 4 mM L-글루타민(깁코 - 카탈로그 번호 25030) 및 1 x 펜스트렙(로슈 카탈로그 번호 1 074 440)이 보충된 100 ㎕의 RPMI 1640(깁코 - 카탈로그 번호 31870) 중의 96 웰 미세적정 플레이트(2.5 x 10⁴ 세포/웰) 내로 37 ℃ 및 5% CO₂에서 가습 분위기 하에 시딩하였다. 150 ng/㎖의 huCSF-1을 배지에 첨가했을 때, 부착성 대식세포로의 분명한 분화가 관찰될 수 있었다. 이러한 분화는 항-CSF-1R 항체의 첨가에 의해 억제될 수 있었다. 또한, 단핵구 생존이 영향을 받으며 이를 셀티터글로(CTG) 분석에 의해 분석할 수 있었다. 항체 처리에 의한 단핵구의 생존의 농도 의존적인 억제로부터 IC₅₀을 계산하였다(표 7 참조).

[표 7]

별도의 시험으로 Mab 2 F11의 일련의 인간화된 버전들, 예를 들어 hMab 2F11-c11, hMab 2F11-d8, hMab 2F11-e7, hMab 2F11-f12는 0.07 ㎍/㎖ (hMab 2F11-c11), 0.07 ㎍/㎖ (hMab 2F11-d8), 0.04 ㎍/㎖ (hMab 2F11-e7) 및 0.09 ㎍/㎖ (hMab 2F11-f12)의 IC50 값을 보였다.

실시예 8

항- CSF -1R 단클론 항체에 의한 처리 하에 사이노몰구스 원숭이 대식세포 분화의 억제( 셀티터글로 분석)

사이노몰구스 원숭이 단핵구를 제조사 설명에 따라 CD14 마이크로비즈(Microbeads) 비-인간 영장류 키트(밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec) - 카탈로그 번호 130-091-097)를 사용하여 말초 혈액으로부터 단리하였다. 농축된 단핵구 집단을 10% FCS(깁코 - 카탈로그 번호 011 - 090014M), 4 mM L-글루타민(깁코 - 카탈로그 번호 25030) 및 1 x 펜스트렙(로슈 카탈로그 번호 1 074 440)이 보충된 100 ㎕의 RPMI 1640(깁코 - 카탈로그 번호 31870) 중의 96 웰 미세적정 플레이트(1 내지 3 x 10⁴ 세포/웰) 내로 37 ℃ 및 5% CO₂에서 가습 분위기 하에 시딩하였다. 150 ng/㎖의 huCSF-1을 배지에 첨가했을 때, 부착성 대식세포로의 분명한 분화가 관찰될 수 있었다. 이러한 분화는 항-CSF-1R 항체의 첨가에 의해 억제될 수 있었다. 또한, 단핵구 생존이 영향을 받으며 이를 셀티터글로(CTG) 분석에 의해 분석할 수 있었다. 상기 생육력을 5 ㎍/㎖ 항체 처리 농도에서 분석하였다(표 8 참조).

[표 8]

실시예 9

인간 CSF -1R에 대한 항- CSF -1R 항체의 결합 친화성의 측정

장비: 비아코어(등록상표) A100

칩: CM5(비아코어 BR-1006-68)

커플링: 아민 커플링

완충제: PBS(비아코어 BR-1006-72), pH 7.4, 35 ℃

친화성 측정을 위해서 36 ㎍/㎖의 항 마우스 Fcγ 항체(염소로부터, 잭슨 임뮤노 리써치 JIR115-005-071)를 CSF-1R에 대한 항체를 포획하기 위해서 칩 표면에 커플링시켰다. 인간 CSF-1R 세포외 도메인(CSF-1R-ECD)(세포외 서브도메인 D1 내지 D5를 포함한다)(서열번호 64)(R&D 시스템스 329-MR 또는 서브클로닝된 pCMV-presS-HisAvitag-hCSF-1R-ECD)를 용액 중의 다양한 농도로 가하였다. 35 ℃에서 1.5분의 CSF-1R-주입에 의해 회합을 측정하고; 상기 칩 표면을 35 ℃에서 10분간 완충제로 세척함으로써 해리를 측정하였다. 동역학적 매개변수의 계산을 위해서 랭뮤어 1:1 모델을 사용하였다.

[표 9]

CSF-1R ECD를 사용하는 별도의 비아코어 결합 분석(데이터 도시 안됨)에서 상기 항체 Mab 2F11 및 Mab 2E10과 항체 Ab SC-2-4A5와의 약간의 경쟁이 나타났다. 그러나 Mab 2F11/Mab 2E10은 인간 CSF-1R 단편 delD4에 결합하지 않는 반면, Ab SC-2-4A5는 delD4 단편에 결합한다(실시예 4 및 도 2a 참조). 따라서 Mab 2F11/Mab 2E10의 결합 영역은 Ab SC-2-4A5의 결합 영역과 분명히 다르지만, 추정 상 부근 구역에 위치한다. 상기와 같은 경쟁 분석에서 두 항체 Mab 2F11 및 Mab 2E10은 모두 R&D 시스템스로부터의 Mab3291과 경쟁하지 않았다(데이터 도시 안 됨).

실시예 10

인간 CSF -1R 단편 D1 내지 D3 에 대한 항- CSF -1R 항체의 결합의 측정

장비: 비아코어 T100(GE 헬쓰케어)

소프트웨어: T100 대조용, 버전 1.1.11

B3000 평가, 버전 4.01

스크러버(Scrubber), 버전 2.0a

분석포맷 칩: CM5-칩

CSF-1R에 대한 항체를 아민 커플링된 포획 분자를 통해 포획하였다. 단일 주기 동역학을 사용하여 5개의 증가하는 농도의 인간 CSF-1R 단편 D1 내지 D3(서열번호 66)을 주입하였다. 인간 CSF-1R 단편 D1 내지 D3을 pCMV-PresS-HisAvitag 발현 벡터에 서브클로닝하였다.

리간드-수용체 상호작용을 억제하는 항 CSF-1R SC 2-4A5(산타 크루즈 바이오테크놀로지, 미국 소재, 문헌[Sherr, C.J. et al., Blood 73 (1989) 1786-1793]) 및 Mab3291(R&D 시스템스)를 비교 대조군으로서 사용하였다.

포획 분자: 본 발명에 따른 항체 및 R&D 시스템스 대조용 Mab 3291에 대한 항 마우스 Fcγ 항체(염소로부터, 잭슨 이뮤노 리써치 JIR115-005-071) 및 비교 대조용 항 CSF-1R SC 2-4A5에 대한 항 래트 Fcγ 항체(염소로부터, 잭슨 이뮤노 리써치 JIR112-005-071).

포획 분자들의 아민 커플링

제조사의 설명에 따른 표준 아민 커플링: 실행 완충제: HBS-N 완충제, EDC/NHS의 혼합물에 의한 활성화, 2000 RU의 리간드 밀도 겨냥; 포획-Ab를 커플링 완충제 NaAc, pH 4.5, c = 10 ㎍/㎖ 중에서 희석하였으며; 최종적으로 나머지 활성화된 카복실 그룹들은 1M 에탄올아민의 주입에 의해 차단하였다.

37 ℃에서 MAb < CSF -1R>에 대한 인간 CSF -1R 단편 D1 내지 D3 결합에 대한 동역학적 특성화

실행 완충제: PBS(비아코어 BR-1006-72)

유동 세포 2 내지 4 상의 Mab <CSF-1R>의 포획: 유속 20 ㎕/분, 접촉 시간 90초, c(Ab<CSF-1R>) = 50 nM, 실행 완충제 + 1 ㎎/㎖의 BSA로 희석하였음.

분석물 샘플:

단일 주기 동역학을, 재생 없이 c = 7.8, 31.25, 125, 500 및 2000 nM의 농도를 갖는 5개의 연속적인 분석물의 주입에 의해 30 ㎕/분의 유속에서 측정하였다. 각각의 주입은 30초 길이였고 이어서 처음 4회의 주입에 대해 120초의 해리 단계 및 최종적으로 최고 농도(=최종 주입)에 대해 1200초의 해리 단계가 있었다.

최종 재생을, 10 mM 글리신 pH 1.5(비아코어 BR-1003-54), 접촉 시간 60초, 유속 30 ㎕/분을 사용하는 각 주기 후에 수행하였다.

동역학적 매개변수들을 통상적인 이중 참조(대조용 기준: 포획 분자에 대한 분석물의 결합; 유동 세포: 블랭크로서 서브도메인 CSF-1R 농도 "0") 및 '드래프트와 적정 동역학 1:1 결합' 모델에 의한 계산을 사용함으로써 계산하였다.

[표 10]

항체 Mab 2F11, Mab 2E10 및 Mab 1G10은 인간 CSF-1R 단편 D1 내지 D3에 대한 결합을 나타내지 않았다.

또한 비교 대조군-Ab SC-2-4A5는 인간 CSF-1R 단편 D1 내지 D3에 대해 결합하지 않았다.

비교 대조군 Mab R&D-시스템스 3291은 인간 CSF-1R 단편 D1 내지 D3에 대해 결합을 나타내었다.

실시예 11

사이노몰구스 원숭이에 있어서 CSF -1R 억제 동안 CSF -1 수준이 증가한다

혈청 CSF-1 수준은 항-인간 CSF-1R 이량체화 억제제 hMab 2F11-e7의 CSF-1R 중화 활성의 약역학 마커를 제공한다. 투여량 그룹(1 및 10 ㎎/㎏)당 한 마리의 수컷 및 한 마리의 암컷 사이노몰구스 원숭이에게 항-CSF1R 항체 hMab 2F11-e7을 정맥 내 투여하였다. CSF-1 수준의 분석을 위한 혈액 샘플을 처리 1주일 전(투여 전), 투여 후 2, 24, 48, 72, 96, 168시간째 및 추가로 2주간 매주 수집하였다. CSF-1 수준을 제조사의 설명(R&D 시스템스, 영국 소재)에 따라 상업적으로 입수할 수 있는 ELISA 키트(콴티카인(Quantikine)(등록상표) 인간 M-CSF)를 사용하여 측정하였다. 원숭이 CSF-1 수준을 키트에 제공된 CSF-1 표준 곡선 샘플과의 비교에 의해 측정하였다.

hMab 2F11-e7의 투여는 CSF-1의 약 1000 배까지의 극적인 증가를 유도하였으며, 상기 증가는 투여된 용량에 따라 48시간(1 ㎎/㎏) 또는 15일(10 ㎎/㎏) 동안 지속되었다. 따라서, CSF-1R에 대한 이량체화 억제제는 리간드 치환 항체와 대조적으로 상기 수용체에 대한 결합에 대해 대단히 상향조절된 리간드와 직접 경쟁하지 않는다는 이점을 제공한다.

실시예 12

생체 내 효능 - SCID 베이지 마우스에서 유방암 BT20 이종이식 종양 세포에서의 항- CSF -1R 항체의 종양 성장 억제

인간 유방암 세포 주 BT-20은 인간 CSF-1R을 발현하지만 CSF-1 발현은 결여된다(문헌[Sapi, E. et al Cancer Res 59 (1999) 5578-5585]). 상기 마우스 유도된 CSF-1은 상기 종양 세포 상의 인간 CSF-1R을 활성화하지 못하므로, 재조합 인간 CSF-1(바이오몰, 독일 함부르크 소재)이 삼투압 소형펌프(ALZET, 캐나다 쿠퍼티노 소재)를 통해 보충되어 2 ㎍/일의 연속적인 CSF-1 주입속도를 제공하였다(문헌[Martin, T.A., Carcinogenesis 24 (2003) 1317-1323]).

리간드 치환 CSF-1R 항체와 CSF-1R의 이량체화를 방해하는 항체의 효능을 직접 비교하기 위해서, 우리는 상기 BT-20 이종이식 모델에서 키메릭 항-CSF-1R Mab 2F11(CSF-1R의 이량체화를 방해하는 항체) 및 1.2.SM(국제특허출원공개 제2009/026303호에 개시된 리간드 치환 CSF-1R 항체)을 시험하였다.

SCID 베이지 마우스(찰스 리버(Charles River), 독일 슐츠펠트 소재)에게 1 x 107 세포 BT-20 세포(ATCC HTB-19) 및 100 ㎕의 매트리겔(Matrigel)을 피하로 함께 주입하였다. 동물의 처리를 100 mm3의 평균 종양 부피로 무작위로 시작하였다. 마우스를 매주 1회 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl pH 6.0 완충제 중의 각각의 항체(도 4 참조)로 복강내 처리한다. 종양 치수를 시작일에 시작하여 후속적으로 전체 처리기간 동안 주당 2회 캘리퍼스에 의해 측정한다. 종양 부피를 NCI 프로토콜(종양 중량 = 1/2ab2, 이때 "a" 및 "b"는 각각 종양의 길고 짧은 직경이다)에 따라 계산한다.

종양 성장 분석을 도 4에 나타낸다. 키메릭 항-CSF-1R Mab 2F11에 의한 종양 세포 상의 인간 CSF-1R의 억제는 항-CSF-1R 항체 1.2.SM(국제특허출원공개 제2009/026303호에 개시된 CSF-1R 항체)보다 종양 성장 억제를 매개함에 있어서 통계학적으로 보다 효능이 있었다.

<110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Antibodies binding preferentially human CSF1R extracellular domain 4 and their use <130> 26143 WO <140> PCT/EP2010/069090 <141> 2010-12-07 <150> EP09015310.7 <151> 2009-12-10 <150> EP10173407.7 <151> 2010-08-19 <160> 84 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Asp Gln Arg Leu Tyr Phe Asp Val 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Val Ile Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Pro Phe Met Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Thr Tyr Asp Ile Ser 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Gly Gln Ser Phe Ser Tyr Pro Thr 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Lys Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Pro Phe Met 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Arg Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Arg Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Asp Gln Arg Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Gly Gly Ser Thr Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gly Gln Ser Phe Ser Tyr Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Asp Pro Arg Leu Tyr Phe Asp 1 5 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Gly Phe Met Ser 1 5 10 15 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Ser Phe Asp Ile Ser 1 5 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Gly Gln Thr Phe Ser Tyr Pro Thr 1 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Lys Ala Ser Glu Asp Val Val Thr Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 15 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Lys 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Ser Ser Leu Asp Ser Phe 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Gly Phe Met 50 55 60 Ser Arg Leu Arg Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Leu Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Asp Pro Arg Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asp Val Val Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Gln Thr Phe Ser Tyr Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR3, hMab 2F11-c11 <400> 17 Asp Gln Arg Leu Tyr Phe Asp Val 1 5 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR2, hMab 2F11-c11 <400> 18 Val Ile Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Pro Phe Met Ser 1 5 10 15 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR1, hMab 2F11-c11 <400> 19 Thr Tyr Asp Ile Ser 1 5 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR3, hMab 2F11-c11 <400> 20 Gly Gln Ser Phe Ser Tyr Pro Thr 1 5 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR2, hMab 2F11-c11 <400> 21 Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR1, hMab 2F11-c11 <400> 22 Arg Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 23 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain variable domain, hMab 2F11-c11 <400> 23 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Pro Phe Met 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Thr Lys Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Asp Gln Arg Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain variable domain, hMab 2F11-c11 <400> 24 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Phe Ser Tyr Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR3, hMab 2F11-d8 <400> 25 Asp Gln Arg Leu Tyr Phe Asp Val 1 5 <210> 26 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR2, hMab 2F11-d8 <400> 26 Val Ile Trp Thr Asp Gly Gly Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly 1 5 10 15 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR1, hMab 2F11-d8 <400> 27 Thr Tyr Asp Ile Ser 1 5 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR3, hMab 2F11-d8 <400> 28 Gly Gln Ser Phe Ser Tyr Pro Thr 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR2, hMab 2F11-d8 <400> 29 Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR1, hMab 2F11-d8 <400> 30 Lys Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 31 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain variable domain, hMab 2F11-d8 <400> 31 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Trp Thr Asp Gly Gly Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 50 55 60 Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gln Arg Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain variable domain, hMab 2F11-d8 <400> 32 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Phe Ser Tyr Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR3, hMab 2F11-e7 <400> 33 Asp Gln Arg Leu Tyr Phe Asp Val 1 5 <210> 34 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR2, hMab 2F11-e7 <400> 34 Val Ile Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln Gly 1 5 10 15 <210> 35 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR1, hMab 2F11-e7 <400> 35 Ser Tyr Asp Ile Ser 1 5 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR3, hMab 2F11-e7 <400> 36 Gln Gln Ser Phe Ser Tyr Pro Thr 1 5 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR2, hMab 2F11-e7 <400> 37 Ala Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR1, hMab 2F11-e7 <400> 38 Arg Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 39 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain variable domain, hMab 2F11-e7 <400> 39 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln 50 55 60 Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gln Arg Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 40 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain variable domain, hMab 2F11-e7 <400> 40 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Ser Tyr Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR3, hMab 2F11-f12 <400> 41 Asp Gln Arg Leu Tyr Phe Asp Val 1 5 <210> 42 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR2, hMab 2F11-f12 <400> 42 Val Ile Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Pro Phe Met Ser 1 5 10 15 <210> 43 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR1, hMab 2F11-f12 <400> 43 Thr Tyr Asp Ile Ser 1 5 <210> 44 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR3, hMab 2F11-f12 <400> 44 Gly Gln Ser Phe Ser Tyr Pro Thr 1 5 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR2, hMab 2F11-f12 <400> 45 Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR1, hMab 2F11-f12 <400> 46 Arg Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 47 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain variable domain, hMab 2F11-f12 <400> 47 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Pro Phe Met 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Thr Lys Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Asp Gln Arg Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 48 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain variable domain, hMab 2F11-f12 <400> 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Phe Ser Tyr Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 49 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR3, hMab 2F11-g1 <400> 49 Asp Gln Arg Leu Tyr Phe Asp Val 1 5 <210> 50 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR2, hMab 2F11-g1 <400> 50 Val Ile Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Pro Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 51 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR1, hMab 2F11-g1 <400> 51 Thr Tyr Asp Ile Ser 1 5 <210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR3, hMab 2F11-g1 <400> 52 Gly Gln Ser Phe Ser Tyr Pro Thr 1 5 <210> 53 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR2, hMab 2F11-g1 <400> 53 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR1, hMab 2F11-g1 <400> 54 Arg Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 55 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain variable domain, hMab 2F11-g1 <400> 55 Gln Val Gln Leu Gln Glu 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Gln Cys Ser Ala 145 150 155 160 Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg Leu Lys Val 165 170 175 Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val Pro Ala Glu 180 185 190 Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys Ser Ala Ser 195 200 205 Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn Asn Thr Lys 210 215 220 Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg Tyr Gln Lys 225 230 235 240 Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His Ala Gly Asn 245 250 255 Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser Thr Ser Met 260 265 270 Phe Phe Arg Tyr Pro Pro Glu Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn 275 280 285 Gly Ser Gly Thr Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn 290 295 300 Val Thr Trp Leu Gln Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala 305 310 315 320 Gln Val Leu Gln Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln 325 330 335 Glu Pro Phe His Lys Val Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr 340 345 350 Leu Glu His Asn Gln Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly 355 360 365 Ser Gly Ser Trp Ala Phe Ile Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His 370 375 380 Pro Pro Asp Glu 385 <210> 66 <211> 292 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> human CSF-1R fragment D1-D3 <400> 66 Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val Glu Trp Asp 20 25 30 Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly Ser Ser Ser 35 40 45 Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly Thr Tyr Arg 50 55 60 Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala Ile His Leu 65 70 75 80 Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala Gln Glu Val 85 90 95 Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu Leu Thr Asp 100 105 110 Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg Gly Arg Pro 115 120 125 Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His Gly Phe Thr 130 135 140 Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln Cys Ser Ala 145 150 155 160 Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg Leu Lys Val 165 170 175 Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val Pro Ala Glu 180 185 190 Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys Ser Ala Ser 195 200 205 Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn Asn Thr Lys 210 215 220 Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg Tyr Gln Lys 225 230 235 240 Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His Ala Gly Asn 245 250 255 Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser Thr Ser Met 260 265 270 Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser Ser Glu Gln 275 280 285 Asn Leu Ile Gln 290 <210> 67 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> signal peptide <400> 67 Met Gly Ser Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala 1 5 10 15 Trp His Gly Gln Gly 20 <210> 68 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 68 cacctccatg ttcttccggt accccccaga ggtaag 36 <210> 69 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 69 Asp Leu Arg Leu Tyr Phe Asp Val 1 5 <210> 70 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 70 Val Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Pro Phe Met Ser 1 5 10 15 <210> 71 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 71 Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Asp Ile Ser 1 5 10 <210> 72 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 72 Gly Gln Ser Phe Thr Tyr Pro Thr 1 5 <210> 73 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 73 Gly Ser Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 74 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 74 Lys Ala Ser Glu Asp Val Gly Thr Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 75 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 75 Arg Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Pro Phe Met 50 55 60 Ser Arg Leu Arg Ile Ser Lys Asp Asp Ser Arg Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Val Asn Arg Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Asp Leu Arg Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 76 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 76 Lys Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asp Val Gly Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ser Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Ser Cys Gly Gln Ser Phe Thr Tyr Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 77 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 77 Asp Pro Arg Leu Tyr Phe Asp Val 1 5 <210> 78 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 78 Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Gly Phe Met Ser 1 5 10 15 <210> 79 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 79 Gly Ser Ser Leu Asp Ser Phe Asp Ile Ser 1 5 10 <210> 80 <211> 8 <212> PRT 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Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asp Val Val Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Ile Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Gln Thr Phe Ser Tyr Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105

Claims

a) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 7이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 8이거나, 또는
b) 그의 인간화된 버전임
을 특징으로 하는, 인간 CSF-1R에 결합하는 항체.
삭제
a) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 23이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 24이거나, 또는
b) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 31이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 32이거나, 또는
c) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 39이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 40이거나, 또는
d) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 47이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 48이거나, 또는
e) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 55이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 56임
을 특징으로 하는, 인간 CSF-1R에 결합하는 항체.
a) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 1의 CDR3 영역, 서열번호 2의 CDR2 영역 및 서열번호 3의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 4의 CDR3 영역, 서열번호 5의 CDR2 영역 및 서열번호 6의 CDR1 영역을 포함하거나, 또는
b) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 17의 CDR3 영역, 서열번호 18의 CDR2 영역 및 서열번호 19의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 20의 CDR3 영역, 서열번호 21의 CDR2 영역 및 서열번호 22의 CDR1 영역을 포함하거나, 또는
c) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 25의 CDR3 영역, 서열번호 26의 CDR2 영역 및 서열번호 27의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 28의 CDR3 영역, 서열번호 29의 CDR2 영역 및 서열번호 30의 CDR1 영역을 포함하거나, 또는
d) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 33의 CDR3 영역, 서열번호 34의 CDR2 영역 및 서열번호 35의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 36의 CDR3 영역, 서열번호 37의 CDR2 영역 및 서열번호 38의 CDR1 영역을 포함하거나, 또는
e) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 41의 CDR3 영역, 서열번호 42의 CDR2 영역 및 서열번호 43의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 44의 CDR3 영역, 서열번호 45의 CDR2 영역 및 서열번호 46의 CDR1 영역을 포함하거나, 또는
f) 중쇄 가변 도메인이 서열번호 49의 CDR3 영역, 서열번호 50의 CDR2 영역 및 서열번호 51의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 52의 CDR3 영역, 서열번호 53의 CDR2 영역 및 서열번호 54의 CDR1 영역을 포함함
을 특징으로 하는, 인간 CSF-1R에 결합하는 항체.
제 1 항, 제 3 항 및 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 IgG1 하위 부류의 것이거나 또는 인간 IgG4 하위 부류의 것임을 특징으로 하는 항체.
제 1 항, 제 3 항 및 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함함을 특징으로 하는, 암, 골 손실, 암의 전이 또는 염증성 질병의 치료를 위한 약학 조성물.
제 1 항, 제 3 항 및 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
암의 치료에 사용되는 항체.
제 1 항, 제 3 항 및 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
골 손실의 치료에 사용되는 항체.
제 1 항, 제 3 항 및 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
암의 전이의 예방 또는 치료에 사용되는 항체.
제 1 항, 제 3 항 및 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
염증성 질병의 치료에 사용되는 항체.
제 1 항, 제 3 항 및 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 암호화하는 핵산.
원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 항체의 발현을 위한 제 11 항에 따른 핵산을 포함함을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 12 항에 따른 벡터를 포함하는 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포.
원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 제 11 항에 따른 핵산을 발현시키고 상기 세포 또는 세포 배양 상청액으로부터 재조합 항체를 회수함을 특징으로 하는, 재조합 항체의 생산 방법.
제 6 항에 있어서,
암의 치료를 위한 약학 조성물.
제 6 항에 있어서,
골 손실의 치료를 위한 약학 조성물.
제 6 항에 있어서,
암의 전이의 치료를 위한 약학 조성물.
제 6 항에 있어서,
염증성 질병의 치료를 위한 약학 조성물.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
제 1 항, 제 3 항 및 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 IgG1 하위 부류의 것임을 특징으로 하는 항체.
삭제