MXPA03007909A - Metodos de combinacion para inhibir el crecimiento de tumores con un antagonista receptor del factor de crecimiento endotelial vascular. - Google Patents

Abstract

La presente invencion provee un metodo de reduccion o inhibicion del crecimiento de tumores en un mamifero, que comprende tratar al mamifero con una cantidad eficaz de una combinacion de un antagonista receptor de VEGF y radiacion quimioterapia, y/o un antagonista receptor adicional.

Description

MÉTODOS DE COMBINACIÓN PARA INHIBIR EL CRECIMIENTO DE TUMORES CON UN ANTAGONISTA RECEPTOR DEL FACTOR DE CRECIMIENTO ENDOTELIAL VASCULAR CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos de tratamiento de tumores utilizando antagonistas receptores del factor de crecimiento endotelial vascular (VBGF) en combinación con un agente quimioterapéutico, radiación y/o un antagonista receptor del factor de crecimiento diferente.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se sabe que la angiogénesis , que se refiere a la formación de vasos capilares desde vasos preexistentes en el organismo embrionario y adulto, es el elemento clave en el crecimiento, supervivencia y metástasis de los tumores. Se piensa que los factores de crecimiento y sus receptores, incluyendo el factor de crecimiento epidérmico (EGF) , el factor-a de crecimiento transformador (TGF-cc) , el factor-ß de crecimiento transformador (TGF-ß) , el factor de crecimiento de fibroblasto ácido y básico (aFGF y bFGF) , el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) , y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , juegan un papel en la angiogénesis de los tumores. Ver Kagsbrun & D'Amore, Annual Rev. Physiol . , 53: 217-239 (1991). La unión de estos factores de crecimiento a sus receptores de la superficie de la célula induce la activación del receptor, que inicia y modifica las vías de transducción de señales y lleva a la proliferación y diferenciación de las células. El VEGF, un mitogen específico de las células endoteliales , se distingue entre estos factores en que actúa como un inductor de la angiogénesis promoviendo específicamente la proliferación de las células endoteliales.

El VEGF es una glicoproteína homodimérica formada por dos subunidades de 23 kD y es un fuerte inductor de la permeabilidad vascular, un estimulador de la migración y proliferación de las células endoteliales y un importante factor de la supervivencia para los vasos sanguíneos formados nuevos. Existen cuatro isoformas monoméricas diferentes del VEGF, derivadas del empalme alternativo del mARN. Éstas incluyen dos formas unidas a la membrana (VEGF20s y VEGFi89) y dos formas solubles (VBGF165 y VEGF121) . En todos los tejidos humanos excepto la placenta, el VEGF165 es la isoforma más abundante.

El VEGF es el regulador clave de la vasculogénesis , que es el novo desarrollo de vasos sanguíneos nuevos desde la diferenciación de precursores endoteliales (angioblastos) in situ, y se expresa en tejidos embriónicos (Breier et al, Desarrollo (Camb.), 114:521 (1992)), macrofagos, queratinocitos epidérmicos proliferantes durante la curación de heridas (Brown et al, J.Exp. Med., 176:1375 (1992)), y puede ser el responsable del edema del tejido asociado con la inflamación (Ferrara et al, Endocr. Rev., 13:18 (1992)). Los estudios de hibridación in situ han demostrado la alta expresión de VEGF en un número de líneas de tumores humanos que incluyen glioblastoma multiforme, hemangioblastorna, neoplasmas del sistema nervioso central y sarcoma de Kaposi asociado con el SIDA (Píate et al (1992) Nature 359:845-848; Píate et al (1993) Cáncer Res. 53: 5822-5827; Berkman et al (1993) J. Clin. Invest. 91: 153-159; Nakamara et al (1952) AIDS Weekly, 13(1)). También se observaron niveles elevados de VEGF en la angiogénesis inducida por hipoxia (Shweiki et al (1992) Nature 359:843-845).

La respuesta biológica del VEGF se media a través de sus receptores de alta afinidad, que se expresan selectivamente en las células endoteliales durante la embriogénesis (Millauer, Cell, 72:835-846 (1993)) y durante la formación del tumor. Los receptores de VEGF (VEGFR) típicamente son las tirosina cinasas del tipo de receptor de la clase III caracterizadas porque tienen varios, generalmente 5 o 7, bucles similares a inmunoglobulina en sus dominios de unión a ligandos de receptores extracelulares de extremidad de amino (Kaipainen et al, J. Exp . Med., 178:2077-2088 (1993)). Las otras dos regiones incluyen una región de transmembrana y un dominio catalítico intracelular de extremidad de carboxi interrumpido por una inserción de secuencias de intercinasa hidrófila de longitudes variables, denominadas dominio de inserción de cinasa (Terman et al, Oncogene, 6:1677-1683 (1991). Los VEGFR incluyen el receptor de tirosina cinasa similar a aletas (flt-1) , o VEGFR- 1 , colocado en secuencia por Shibuya et al, Oncogene, 5: 519-524 (1990) , receptor que contiene el dominio de inserción de cinasa / cinasa de hígado fetal (KDR/flk-1) , o VEGFR-2 , descrito en WO 92/14248, presentada el 20 de febrero de 1992, y Terman et al, Oncogene, 6: 1677-1683 (1991) y colocado en secuencia por Matthews et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88: 9026-9030 (1991), aunque otros receptores, tales como neuropilina-1 y -2, también se pueden unir a VEGF. Otro receptor de tirosina cinasa, VEGFR-3 (flk-4) , une los VEGF homólogos VEGF-C y VEGF-D y es más importante en el desarrollo de los vasos linfáticos.

Los niveles altos de Flk-1 son expresados por las células endoteliales que infiltran gliomas (Píate et al, (1992) Nature 359: 845-848). Los niveles de Flk-1 son específicamente regulados ascendentemente por el VEGF producido por glioblastomas humanos (Píate et al (1993) Cáncer Res. 53:5822-5827). El hallazgo de niveles altos de la expresión de Flk-1 en células endoteliales asociadas con glioblastoma (GAEC) indica que la actividad del receptor es probablemente inducida durante laformación del tumor ya que las transcripciones de Flk-1 son escasamente detectables en células endoteliales cerebrales normales. Esta regulación ascendente se confina a las células endoteliales vasculares en proximidad estrecha al tumor. El bloqueo de la actividad del VEGF con anticuerpos monoclonales anti-VEGF neutralizadores (mAB) derivó en una inhibición del crecimiento de xenoinjertos de tumores humanos en ratones desnudos (Kim et al (1993) Nature 362: 841-844), lo cual indica un rol directo para VEGF en la angiogénesis relacionada con los tumores.

Aunque el ligando de VEGF se regula ascendentemente en células de tumores, y sus receptores son regulados ascendentemente en células endoteliales vasculares infiltradas de tumores, la expresión del ligando de VEGF y sus receptores es baja en células normales que no están asociadas con la angiogénesis. En consecuencia, tales células normales no serían afectadas por el bloqueo de la interacción entre el VEGF y sus receptores para inhibir la angiogénesis, y en consecuencia el crecimiento de los tumores .

Un objetivo de la presente invención es proveer antagonistas receptores de VEGF. Otro objetivo de esta invención es proporcionar métodos para inhibir la angiogénesis y así inhibir o reducir el crecimiento de tumores en los mamíferos usando tales antagonistas receptores de VEGF y, en particular, usando tales antagonistas receptores de VEGF combinados con radiación, quimioterapia, u otro antagonista receptor .

BREVE RESEñA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee métodos de reducción o inhibición del crecimiento de tumores en un mamífero mediante la administración de una cantidad eficaz de una combinación de un antagonista receptor de VEGF y otro antagonista receptor. La presente invención también provee métodos, de reducción o inhibición del crecimiento de tumores en un mamífero mediante la "-administración de una cantidad eficaz de una combinación de un antagonista receptor de VEGF" y radiación. Además, la presente invención provee métodos de reducción o inhibición del i crecimiento de tumores en un mamífero mediante la administración de una cantidad eficaz de una combinación de un antagonista receptor de VEGF y un agente quimioterapéutico .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: Inmuno ransferencia de flk-1 de inmunoprecipitación de (VEGFR-2) /SEAPS con anticuerpo monoclonal DC-101 que demuestra que DC-101 inmunoprecipita flk-1: SEAPS de ratón pero no SEAPS solo .

Figuras 2a y 2b: Figura 2a: Ensayo de inhibición competitiva que indica el efecto del anticuerpo monoclonal anti-flk-2 (VEGFR-2) DC-101 sobre la fosforilación inducida por VEGF1S5 del receptor de flk-1 (VEGFR-2) /fms en células 3T3 transfectadas . Figura 2b: Sensibilidad de la fosforilación inducida por VEGF del receptor de flk-1 (VEGFR-2 ) /fms a la inhibición por el anticuerpo monoclonal DC-101. Las células C441 se ensayaron a las concentraciones estimuladoras máximas de VEGFi6s (40 ng/ml) combinadas con niveles variables del anticuerpo.

"-Figuras 3a y 3b: Figura 3a: Titulación de fosforilación inducida" por VEGF del receptor de flk-~l "T ÉGFR-2 ) / fms en la presencia de DC-101 de mAb. Las células C441 fueron estimuladas con las i concentraciones de VEGF indicadas en la presencia (Carriles 1 a 4) o la ausencia (Carriles 5 a 8) de 5 µ9/p?1 de DC-101 de mAb. Las células sin estimular ensayadas en la presencia del anticuerpo (Carril 9) sirven como el control. Figura 3b: Exploraciones de densitometría del nivel de receptor fosforilado en cada carril de la Figura 3a en relación con cada concentración de VEGF graficada para mostrar la magnitud de la inhibición de mAb a la concentración de ligando en exceso. Se prepararon Usados de células para la detección por anti -fosfotirosina descrita en los Ejemplos a continuación.

Figura 4: Inhibición de la activación de VEGF-flkl (VEGFR-2 ) fms por DC-101 de mAb preunido. Las células C441 fueron estimuladas con las concentraciones de VEGF indicadas en la ausencia (Carriles 3 y 4) y la presencia (Carriles 5 y 6) de DC-101. Las células sin estimular (Carriles 1 y 2) sirven como controles. Se ensayó MAb usando dos conjuntos de condiciones. Para P, las células se preunieron con mAb seguido por la estimulación con VEGF durante 15 minutos a temperatura ambiente. Para C, mAb y "-ligando se agregaron simultáneamente y se ensayaron como anteriormente.

Figura 5: Fosforilación inducida por VEGF del receptor de flk-1 (VEGFR-2) /fms mediante tratamientos con concentraciones variables del anticuerpo monoclonal DC-101 y medios acondicionados desde células de glioblastoma (GB CM) .

Figura 6: Análisis FACS de la unión de mAb anti-flk-1 (VEGFR-2) a células 3T3 transfectadas de flk-1 (VEGFR-2 ) /fms (C441) . Las células 3T3 de flk-1 (VEGFR-2 ) /fms se incubaron sobre hielo durante 60 minutos con 10 µg/ml de DC-101 de mAb anti-flk-1 (VEFGR-2) o el isotipo mAb 23H7 anti-flk-1 irrelevante igualado. Las células se lavaron y reincubaron con 5 µg de IgG anti-ratón conjugada a FITC, se lavaron y se analizaron mediante citometría de flujo para determinar la unión del anticuerpo. Los datos muestran el nivel de fluorescencia para DG-101 a células C441 en relación con la detectada con 23H7 de mAb irrelevante.

Figura 7: Unión de saturación de DC-101 de mAb al receptor de flk-1 (VEGFR-2 ) / fms sobre la línea de células 3T3 transfectadas . Las células C441 confluentes se incubaron en placas de 24 receptáculos con concentraciones crecientes de DC-101 de mAb (50 ng/ml a 2 µ9/p?1) durante dos horas, a 4°C. Las células se lavaron e incubaron con 5 µg de conjugado de IgG-biotina anti-rata. Para detectar la unión, las células se lav.aron, se incubaron con una dilución de 1:1.000 de estreptavidina-HRP , se lavaron e incubaron en un sistema de detección colorimétrico (TMB) . Los datos representan la absorbencia a 540 nm contra concentraciones crecientes de DC-101 de mAb. La unión del anticuerpo secundario a células solas se restó de cada determinación para ajustar la unión no específica. Los datos representan el promedio de tres experimentos independientes .

Figura 8: Inmunoprecipitación de flk-1 (VEGFR-2 ) /fms fosforilado desde células 3T3 transfectadas de flk-1 (VEGFR-2) /fms estimuladas con VEGF. Las células fueron estimuladas con VEGF como se describe en Procedimientos Experimentales y los lisados se inmunoprecipitaron con anticuerpos irrelevantes o relevantes de la siguiente manera: 1. IgG2a (mAb 2a13) anti-FLK2 de rata; 2. IgGl (mAb DC-101) anti-flk-1 (VEGFR-2) de rata; 3. IgGl (mAb 23H7) anti-FLK2 de rata; 4. anticuerpo policlonal anti-fms de conejo. La proteína inmunoprecipitada se sometió a SDS PAGE seguido por inmunotransferencia . La inmunoprecipitación del receptor activado por VEGF se detectó sondeando las manchas con un anticuerpo anti-fosfotirosina .

Figura 9: Sensibilidad de fosforilación inducida por VEGF del receptor flk-1 (VEGFR-2) /fms a la inhibición por DC-101 de mAb.

Se realizaron ensayos preunidos y competitivos con 40 ng/ml de VEGF a las concentraciones del anticuerpo indicadas. Se prepararon lisados de células para la detección del receptor con anti-fosfotirosina como se describe en los Ejemplos a continuación .

Figura 10: Efecto de DC-101 de mAb sobre la fosforilación inducida por CSF-1 del receptor fms. En (B) , la línea de células transfectada con fms/FLK-2 , 10A2, se estimuló con niveles estimulatorios óptimos de CSF-1 en la ausencia (Carriles 3 y 4) y presencia (Carriles 5 y 6) de 5 µg/ml de DC-101 de mAb. Células sin estimular ensayadas en la ausencia (Carril 1) o presencia (Carril 2) del anticuerpo sirven como controles. Se prepararon lisados de células para la detección por anti-fosfotirosina como se describe en los Ejemplos a continuación.

Figura 11: Especificidad de la neutralización de DC-101 de mAb del receptor flk-1 (VEGFR-2 ) /fms activado. Células C441 fueron estimuladas con 20 o 40 ng/ml de VEGF en la presencia de DC-101 (IgGl) o los anticuerpos monoclonales de rata anti-FLK-2 "-irrelevantes 2?13 (IgG2a) o 23H7 (IgGl) . Se realizaron ensayos' con cada anticuerpo en la auséncTa ' de VEGF (Carriles 1 a 3) y en la presencia de vEGF en condiciones competitivas (carriles 4 a 8) y preunidas (carriles 9 a 11) . Se prepararon lisados para la detección por anti-fosfotirosina como se describe en los Ejemplos a continuación. Las manchas se rasparon y se sondearon nuevamente para detectar el receptor flk-1 (VEGFR-2 ) /fms usando un anticuerpo policlonal de conejo a la región de extremidad del receptor fms .

Figura 12 : Inmunoprecipitación de bandas de receptores fosforilados desde células HUVEC estimuladas con VEGF. Las células HUVEC crecieron hasta la subconfluencia en un medio de crecimiento endotelial (EGM) durante tres días sin cambiar el medio. Las formas del receptor se inmunoprecipitaron con' DC-101 de mAb desde lisados de células sin estimular (Carril 1) , células estimuladas con VEGF (carril 2), y células estimuladas con VEGF en la presencia de 1 9/t?1 de heparina (Carril 3) . Se realizaron ensayos de fosforilación, inmunoprecipitación y detección délas formas de receptor fosforilado como se describe en los procedimientos Experimentales.

Figura 13: Efecto de DC-101 de mAb sobre la proliferación de células HUVEC en respuesta a VEGF. Las células crecieron durante "'48 horas como se describe en la. - leyenda de la Figura 6. Las células luego se sometieron a las siguientes condiciones de ensayo: ningún agregado al medio (sin tratar) un cambio de medio de crecimiento endotelial nuevo (medio compelto) ; el agregado de 10 ng/ml de VEGF en la ausencia o presencia de 1 µg/ml de DC-101. Se ensayaron las células por la proliferación mediante detección colorimétrica a 550 nm usando un kit de ensayo de proliferación de células (Promega) .

Figuras 14a y 14b. Figura 14a: Reducción en el crecimiento del tumor de animales individuales con DC-101 (anticuerpo monoclonal anti-flk-1 de rata) . Figura 14b: Reducción en el crecimiento del tumor en animales individuales con el grupo control 2A13 (anticuerpo monoclonal anti-flk-2 de rata)..

Figura 15: Se inyectaron ratones desnudos atímicos por vía subcutánea con la línea de células de glioblastoma humano GBM-18 y se los dividió en tres grupos: control PBS, un control 23H7 IgGl de rata irrelevante, y DC-101. Se administraron tratamientos simultáneamente con xenoinjertos de tumores y se continuó durante cuatro semanas .

Figura 16: Un gráfico que muestra la unión directa de diferentes "anticuerpos scFv (plCll, plF12, p2A6 y p2A7) a KDR inmovilizado VEGFR-2) . " í Figura 17: Un gráfico que muestra la inhibiciónde la unión de KDR (VEGFR-2) a VEGF165 inmovilizado por diferentes anticuerpos scFv (plCll, plF12, p2A6 y p2A7) .

Figura 18: Un gráfico que muestra la inhibición de la proliferación de HUVEC inducida por VEGF por los anticuerpos sc"Fv (p2A6 y plCll) .

Figura 19: Lasecuencia de nucleótiods y aminoácidos deducidos de las cadenas VH y VL de c-plCll.

Figura 20: Un gráfico que muestra la unión directa de los anticuerpos (c-plCll, plCll, p2A6) a KDR inmovilizado (VEGFR-2) .

Figura 21: Un gráfico que muestra el análisis FACS de la unión de c-plCll a KDR- (VEGFR-2) que expesa HUVEC.

Figura 22: Un gráfico que muestra la inhibición de la unión del receptor de KDR (VEGFR-2) a VEGFi65 inmovilizado por diferentes anticuerpos (c-plCll, plCll y p2A6) .

•¿Figura 23: Un gráfico que muestra la inhibición de la unión de' VEGFiss radiorotulado al' receptoftte KDR (VEGFR-2) por c-plCll y VEGFiss frío.

Figura 24: Un gráfico que muestra la inhibición de la proliferación inducida por VEGF por anticuerpos anti- KDR (VEGFR- 2) (c-plCll, plCll) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee métodos de reducción o inhibición del crecimiento de tumores en mamíferos con radiación, quimioterapia, y/o un antagonista receptor adicional en combinación antagonistas receptores de VEGF.

En una realización preferida, existe sinergia cuando los tumores, incluyendo tumores humanos, son tratados con un antagonista receptor de VEGF en conjunto con agentes quimioterapéuticos , radiación o un antagonista receptor adicional o combinaciones de ellos. En otras palabras, la inhibición del crecimiento del tumor por un antagonista receptor de VEGF se aumenta más que. lo esperado cuando se combina con agentes quimioterapeúticos , radiación o un antagonista receptor adicional o combinaciones de "¾llos . Se puede mostrar sinergia, por ejemplo, con una mayor' inhibición del crecimiento del" tumor con el tratamiento combinado que la que se esperarxa del efecto aditivo del tratamiento con un i antagonista receptor de VEGF y un agente quimioterapéutico , radiación o un antagonista receptor adicional. Preferentemente, la sinergia se demuestra mediante la remisión del cáncer donde no se espera la remisión del tratamiento con una combinación de un antagonista receptor de VEGF y un agente quimioterapéutico, radiación o un antagonista receptor adicional (Ver el Ejemplo VIII) .

El antagonista receptor de VEGF se administra antes, durante o después de comenzar la quimioterapia o la terapia de radiación, así como cualquier combinación de ellas, es decir antes y durante, antes y después, durante y después, o antes, durante y después de comenzar la quimioterapia y/o la terapia de radiación.

Por ejemplo, cuando el antagonista receptor de VEGF es un anticuerpo, el anticuerpo típicamente se administra entre 1 y 30 días, preferentemente entre 3 y 20 días, más preferentemente entre 5 y 12 días antes de comenzar la terapia de radiación y/o quimioterapia.

Radiación "-La fuente de radiación, usada en combinación con el antagonista' receptor de VEGF, puede ser externa o interna al paciente al cual se está tratando. Cuando la fuente es externa al paciente, la terapia se denomina terapia de radiación de rayo externo (EBRT) . Cuando la fuente de radiación es interna al paciente, el tratamiento se denomina braquiterapia (BT) .

La radiación se administra de acuerdo con técnicas' comunes conocidas usando el equipos fabricados con este propósito, tales como AECL Theraton y Varían Clinac. La dosis de radiación depende de numerosos factores como se sabe bien en el arte. "Tales factores incluyen el órgano que se está tratando, los órganos sanos en el camino de la radiación que podrían ser afectados en forma adversa inadvertidamente, la tolerancia del paciente para la terapia de radiación, y el área del cuerpo que necesita el tratamiento. La dosis típicamente es entre 1 y 100 Gy, y más particularmente entre 2 y 80 Gy. Algunas dosis que se han informado incluyen 33 Gy a la médula espinal, 15 Gy a los ríñones, 20 Gy al hígado, y 65-80 Gy a la próstata. Se deberá resaltar, sin embargo, que la invención no se limita a ninguna dosis particular. La dosis será determinada por el médico tratante y de acuerdo con los factores particulares en una situación dada, incluyendo los factores mencionados anteriormente .

La distancia entre la fuente "de Radiación externa y el punto de entrada en el paciente puede ser cualquier distancia que representa un equilibrio aceptable entre eliminar células blanco y minimizar efectos colaterales. Típicamente, la fuente de la radiación externa es entre 70 y 100 cm desde el punto de entrada en el paciente.

La braquiterapia generalmente se lleva a cabo colocando la fuente de radiación en el paciente. Típicamente, la fuente de radiación se coloca aproximadamente a 0-3 cm del tejido que se está tratando. Técnicas conocidas incluyen, braquiterapia intersticial, intercavitaria y de superficie. Las semillas radioactivas se pueden implantar permanente o temporariamente. Algunos átomos radioactivos típicos que se han usado en implantes permanentes incluyen yodo 125 y radón. Algunos átomos radioactivos típicos que se han usado en implantes temporarios incluyen radio, cesio 137, e iridio 192. Algunos átomos radioactivos adicionales que se han usado en la braquiterapia incluyen americio 241 y oro 198.

La dosis de radiación para la braquiterapia puede ser la misma que la mencionada anteriormente para la terapia de radiación de rayo externo. Además de los factores mencionados anteriormente "para determinar la dosis de la terapia de radiación de rayo externo, la naturaleza del átomo*"de radiación usado también se toma en cuenta en la determinación de la dosis de braquiterapia.

Quim oterapia Los agentes quimioterapéuticos incluyen todos los compuestos químicos que son eficaces en la inhibición del crecimiento de tumores .

La administración de agentes quimioterapéuticos se puede lograr en una variedad de formas que incluyen sistémicamente por vías parenteral y enteral . En una -realización, el antagonista receptor de VEGF y el agente quimiterapéutico se administran como moléculas separadas. En otra realización, el antagonista receptor de VEGF se une, como tal, por ejemplo, por conjugación, a un agente quimioterapéutico .

Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes de alquilación, por ejemplo, gas mostaza, compuestos de etilenimina y sulfonatos de alquilo antimetabolitos , por ejemplo, antagonistas de ácido fólico, purina o pirimidina; inhibidores mitóticos, por ejemplo, alcaloides de vincapervinca y derivados ":de podofilotoxina; antibióticos citotóxicos; compuestos que dañan' o interfieren con la expresión" del* ADN.

Además, los agentes quimioterapéuticos incluyen anticuerpos, moléculas biológicas y moléculas pequeñas, que se describen aquí.

Ejemplos particulares de agentes quimioterapéuticos o de quimioterapia incluyen cisplatina, dacarbazina (DTIC) , dactinomicina, mecloretamina (gas mostaza) , estreptozocina, ciclofosf mida, carmustina (BCNU) , lomustina (CCNU) , doxorubicina (adriamicina) , daunorubicina, procarbazina, mitomicina, citarabina, etoposida, metotrexato, 5-flüorouracil , vinblastina, vincristina, bleomicina, paclitaxel (taxol) , docetaxel (taxótero) , aldesleucina, asparaginasa , busulfan, carboplatina, cladribina, dacarbazina, floxuridina, fludarabina, hidroxiurea, ifosfa ida, interferón alfa, leuprolida, megestrol, melfalan, mercaptopurina, plicamicina, mitotano, pegaspargasa, pentostatina, pipobroman, plicamicina, estreptozocina , tamoxifen, teniposida, testolactona, tioguanina, tiotepa, uracil mostaza, vinorelbina, clorambucil, taxol y combinaciones de ellos.

Antagonistas Receptores del Factor de Crecimiento Los antagonistas receptores del factor de crecimiento (excepto -los antagonistas receptores del VEGF) que pueden usarse en el contexto de la presente invención"" incluyen todas las sustancias que inhiben la estimulación de un factor de crecimiento por un i ligando receptor del factor de crecimiento. Tal inhibición de la estimulación inhibe el crecimiento de células que expresan la respuesta del factor de crecimiento.

Algunos ejemplos de receptores del factor de crecimiento involucrados en la tumorigénesis son los receptores para "el factor dé crecimiento epidérmico (EGFR) , el f ctor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGFR) , el factor de crecimiento similar a insulina (IGFR) , el factor de crecimiento de nervios (NGFR) , y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) .

Preferentemente, el antagonista receptor del factor de crecimiento que se debe usar en esta invención es un antagonista EGFR. Un antagonista EGFR, en el contexto de la presente invención, es una molécula biológica, una molécula pequeña, o cualquier otra sustancia que inhibe la activación del EGFR, inhibiendo así la actividad de tirosina cinasa de EGFR, e 5 impidiendo la autofosforilación del receptor y la fosforilación de otras proteínas involucradas en las diferentes vías de señalización de EGFR. Por la inhibición de la activación del EGFR se entiende toda reducción en la activación del EGFR, que no "-necesariamente impide o detiene la activación del EGFR. ??' - — M s aún, la inhibición de la activación de EGFR, definida por la i presente invención, significa la inhibición del EGFR derivada de la interacción del antagonista EGFR y el receptor. Por interacción se entiende suficiente interacción física o química 15 entre el antagonista EGFR y el receptor, de manera tal que se inhibe la actividad de tirosina cinasa. Un experto en el arte apreciaría que los ejemplos de tales interacciones, que incluyen la asociación o enlace, son conocidos en el arte e incluyen enlace covalente, enlace iónico, enlace de hidrógeno, etc., 20 entre el antagonista EGFR y el receptor. Esto difiere de un antagonista EGFR, que interactúa con el ligando, inhibiendo así la activación.

Como en el caso de otros factores de crecimiento, la activación aumentada de EGFR puede derivar de niveles más altos de ligando, amplificación del gen de EGFR, transcripción aumentada del receptor o mutaciones que producen la señalización del receptor no regulado. La amplificación del gen que codifica EGFR deriva en un número aumentado de ligandos que se unen al EGFR, que pueden estimular más la proliferación de células. El .EGFR puede también sobreexpresarse en la ausencia de amplificación del gen, "-presumiblemente a través de mutaciones que aumentan la'' transcripción de EGFR, la traducción de mARN, o la estabilidad de la proteína. Se han identificado EGFR mutantes en gliomas, carcinomas de pulmón de células no pequeñas, carcinomas ováricos y carcinomas de próstata que tienen una tirosina cinasa constitutivamente activa, lo cual sugiere un rol para la actividad de EGFR de alto nivel en lugar de la sobreexpresión de EGFR en estos cánceres. Ver, por ejemplo, Pedersen et al, Ann. Oncol., 12 (6): 745-60 (2001). (La mutación de EFGR de Tipo III, denominada en forma diferente EGFRvIII, de 2-7 EGFR o AEFGR, carece de una porción del dominio de unión del ligando extracelular codificada por los exones 2-7) ; ver también ikstrand et al, Cáncer Res., 55:3140-3148 (1995).

En una realización de la presente invención, el antagonista EFGR inhibe la unión de EGFR a su ligando. La unión de un ligando a un dominio extracelular, externo de EGFR estimula la dimerización del receptor, la autofosforilación del EGFR, la activación del dominio de tirosina cinasa citoplásmica, interna del receptor, y la iniciación de varias vías de transducción de señales involucrada en la regulación de la síntesis del ADN y la división de las células. Los ligandos para EGFR incluyen, por ejemplo, EGF, TGF-cc, . anfiregulina, EGF de unión a heparina (HB-EGF) y betarecululina . Se piensa que EGF y TGF-a son los principales ligandos endógenos que derivan en- la estimulación mediada por EGFR, aunque se ha demostrado que la clase de TGF-a es más potente en la prevención de la angiogénesis .

En otra realización de la presente invención, el antagonista EFGR se une a EGFR. Se deberá apreciar que el antagonista EGFR puede unirse externamente a la porción extracelular de EGFR, que puede o no inhibir la unión del ligando, o internamente al dominio de tirosina cinasa. Ejemplos de antagonistas EGFR que se unen a EGFR incluyen, sin limitaciones, moléculas biológicas, e inhibidores de cinasa sintética que actúan directamente sobre el dominio citoplásmico de EGFR, tal como moléculas pequeñas.

El antagonista EGFR de la presente invención es preferentemente una molécula biológica, más preferentemente un anticuerpo, o un equivalente funcional de él, específico para EGFR. Se puede hallar una descripción de los anticuerpos útiles en la presente invención en la sección titulada "Anticuerpos" . Más aún, después de la unión al anticuerpo, el complejo de EGFR-anticuerpo preferentemente se internaliza y degrada, impidiendo la reutilización del receptor por la célula.

Un antagonista EGFR de molécula biológica conocido es ERBITUX® '-(IMC-C225) , que es un anticuerpo monoclonal quimérico (humano/de" ratón) específico para EGFR". ~*V"ér, por ejemplo, la Patente Estadounidense N° 4.943.533 (Mendelsohn et al); Patente Estadounidense N° 6.217.866 (Schlessinger et al); Solicitudes Estadounidenses N° 08/973.065 (Goldstein et al) y 09/635.974 (Teufel) ; WÓ 99/60023 (Waksal et al) y WO 00/69459 {Waksal). El anticuerpo monoclonal ERBITUX® se une específicamente a EGFR y bloquea la unión a un ligando, por ejemplo EGF. Este bloqueo deriva en la inhibición del crecimiento del tumor, que incluye "la inhibición de la invasión del tumor, metástasis, reparación de células y angiogénesis , interfiriendo con los efectos de la activación de EFGR. Además, o como alternativa, el anticuerpo monoclonal ERBITUX® puede promover la internalización del complejo de anticuerpo-receptor, impidiendo una nueva estimulación del tumor por su ligando o cualquier otro mecanismo.

Otro ejemplo de un antagonista EGFR de molécula biológica es ABX- EGF, que es un anticuerpo monoclonal de IgG2 completamente humano específico de EGFR. ABX-EGF se une al EGFR con alta especificidad, bloqueando la unión de EGFR a ambos de sus ligandos, EGF y TGF-a. Ver, por ejemplo, Figlin et al, Resumen 1102 presentado en la 37a Reunión Anual de ASCO, San Francisco, CA, del 12 al 15 de mayo de 2001. La secuencia y caracterización de ABX-EGF, que anteriormente se denominaba clon E7.6.3, se "revela en la Patente Estadounidense N° 6.235.883 (Abgenix, Inc.) en la columna 28 , línea 62 a columna 29 , línea 36 , y en las Figuras 29-34. Ver Yang et al, Critical Rev. Oncol . /Hematol . , 38 (1) : 17-23, 2001.

En una realización alternativa, pero también preferida, el antagonista EGFR de la presente invención es un inhibidor de tirosina cinasa de molécula pequeña. Se puede hallar una descripción de moléculas pequeñas en la sección titulada "Moléculas Pequeñas" . Se han descrito numerosas moléculas pequeñas como útiles para inhibir EGFR.

Por ejemplo, Spada et al, Patente Estadounidense 5.656.655, revela compuestos heteroarilo estirilo sustituidos que inhiben EGFR. El grupo heteroarilo es un anillo monocíclico con un o dos heteroátomos , o un anillo bicíclico con 1 a 4 heteroátomos , el compuesto es optativamente sustituido o polisustituido . Los compuestos revelados en la Patente Estadounidense N° 5.656.655 se incorporan aquí como referencia.

Spada et al, Patente Estadounidense 5.646.153 revela compuestos arilo bis mono y/o bicíclico, carbocíclico y hterocarbocíclico que inhiben EGFR. Los compuestos revelados en la Patente '-Estadounidense N° 5.645.153 se incorporan aquí como referencia. " """" Bridges et al, Patente Estadounidense N° 5.679.683 revela i compuestos pirimidina tricíclica que inhiben EGFR. Los compuestos son derivados de pirimidina heterocíclica fusionada descritos en la columna 3, línea 35 a columna 5, línea 6. La descripción de estos compuestos en la columna 3, línea 35 a columna 5, línea 6 se incorpora aquí como referencia.

Barker, Patente Estadounidense 5.616.582, revela derivados de quinazolina que tienen actividad inhibidora de tirosina cinasa receptor. Los compuestos revelados en la Patente Estadounidense 5.616.582 se incorporan aquí como referencia.

Fry et al, Science, 265: 1093-1095 (1994) revela un compuesto que tiene una estructura que inhibe EGFR. La estructura se muestra en la Figura 1. El compuesto mostrado en la Figura 1 del artículo de Fry et al, se incorpora aquí como referencia.

Osherov et al, J. Biol . Chem. , 268(15): 11.134-42 (1993) revelan tirfostinas que inhiben EGFR/HER1 y HER2. Los compuestos revelados en el artículo de Osherov et al y, en particular, aquellos de las Tablas I, II, III y IV se incorporan aquí como referencia .

Levitzki et al, Patente "Estadounidense 5.196.446, revela compuestos heteroariletenodiilo o heteroariletenodiilarilo que inhiben EGFR. Los compuestos revelados en la Patente Estadounidense 5.196.446 de la columna 2, línea 42 a columna 3, línea 40 se incorporan aquí como referencia.

Panek et al, J. Pharma . Exp. Thera., 283: 1433-1444 (1997) revelan un compuesto identificado como PD166285 que inhibe las familias de receptores EGFR, PDGFR y FGFR . PD166285 se identifica como 6- (2 , 6-diclorofenil) -2- (4- (2-dietilaminoetoxi) fenilamino) -8-metil -8H-pirido (2 , 3-d) pirimidin- 7-ona que tiene la estructura mostrada en la Figura 1 en la página 1436. El compuesto descrito en la Figura 1 en la página 1436 del artículo de Panek et al se incorpora aquí como referencia.

Un ejemplo de un antagonista EGFR de molécula pequeña es IRESSA® (ZD1939) , que es un derivado de quinazolina que funciona como un ATP-mimético para inhibir EGFR. Ver Patente Estadounidense N° 5.616.582 (Zeneca Limited); WO 96/33980 (Zeneca Limited) en la página 4; ver también, Rowinski et al, Resumen 5 presentado en la 37a Reunión Anual de ASCO, San Francisco, CA, del 12 al 15 de mayo de 2001; Anido et al, Resumen 1712 presentado en la 37 a Reunión Anual de ASCO, San Francisco, CA, del 12 al 15 de mayo de '•2001.

TARCEVA® es otro ejemplo de un antagonista EGFR de molécula i pequeña. TARCEVA® (OSI-774) es un derivado de fenilamino quinazolina 4-sustituida clorhidrato de [6, 7-Bis (2-metoxi-etoxi) - quinazolin-4-il] - (3-etinil-fenil) amina inhibidor de EGFR, que se describe en WO 96/30347 (Pfizer et al) en, por ejemplo, página 2, línea 12 a página 4, línea 34 y página 19, líneas 14-17. Ver también Moyer et al, Cáncer Res., 57; 4838-48 (1997); Pollack "et al, J. Pharmacol . , 291: 739-48 (1999). TARCEVA® puede funcionar inhibiendo la fosforilación de EGFR y sus vías de transducción de señales de PI3/Akt y MAP (proteína activada mitógena) cinasa descendentes que derivan en la parada del ciclo de células mediado por p27. Ver Hidalgo et al, Resumen 281 presentado en la 37a Reunión Anual de ASCO, San Francisco, CA, del 12 al 15 de mayo de 2001.

Se sabe que muchas otras moléculas pequeñas inhiben EGFR. Algunos ejemplos de antagonistas EGFR de molécula pequeña descritos en WO 91/116051 y WO 96/30347, WO 96/33980, WO 97/27199 (Zeneca Limited), WO 97/30054 (Zeneca Limited), WO 97/42187 (Zeneca Limited), WO 97/49688 (Pfizer Inc.), WO 98/33798 (Warner Lambert Company) , WO 00/18761 (American Cyanamid Company) , y WO 00/31048 (Warner Lambert Company) . Ejemplos de antagonistas EGFR de "Molécula pequeña específicos incluyen CI-1033, que es un" inhibidor de quinazolina (NJ [4!* 3-cloro-4-fluoro-fenilamino) -7- (3-morfolin-4-il-propoxi) -quinazolin-6-il] -acrilamida) de í tirosina cinasas, particularmente EGFR y se describe en WO 00/31048 (Warner-Lambert Company) en la página 8, líneas 22-6,-. PKI166, que es un inhibidor de pirrolpirimidina de EGFR y se describe en WO 97/27199 (Novartis AG) en las páginas 10-12; GW2016, que es un inhibidor de EGFR y HER2 ; y ExB569.

Antagonistas EGFR adicionales pueden determinarse fácilmente usando métodos conocidos. Los antagonistas EGFR de la presente invención inhiben la actividad de tirosina cinasa de EGFR, que generalmente consiste en eventos de osforilación. Por consiguiente, los ensayos de fosforilación son útiles en la determinación de antagonistas útiles en el contexto de la presente invención. Algunos ensayos para la actividad de tirosina cinasa se describen en Panek et al (1997) y Batley et al, Life Sci . , 62: 143-50 (1998). Además, se pueden utilizar métodos específicos para la detección la expresión de EGFR. Éstos incluyen inmunohistoquímica (IHC) para la detección de la expresión de proteínas, hibridación in situ de fluorescencia (FISH) para la detección de la amplificación de genes, ensayos competitivos de unión a radioligandos , técnicas de inmunotransferencia de matriz sólida, tales como "Northern y '-Southern blot", reacción de cadena de transcriptasa polimerasa" inversa (RT-PCR) y ELISA. VerT^por ejemplo, Grandis et al, Cáncer, 78: 1284-1292 (1996); Shimizu et al, Japan J. Cáncer Res., 85: 567-571 (1994); Santer et al, Am. J. Path., 148:1047- 1053 (1996); Collins, Glia, 15:289-296 (1995); Radinsky et al, Clin. Cáncer Res., 1: 19-31 (1995); Petrides et al, Cáncer Res., 50 :: 3934-3939 (1990); Hoffmann et al, Anticancer Res., 17:4419- 4426 (1997); Wikstrand et al, Cáncer Res., 55:3140-3148 (1995).

Antagonistas Receptores de VEGF En una realización, el antagonista receptor de VEGF se une específicamente a un epítope en el dominio extracelular de un receptor de VEGF. El dominio extracelular de un receptor de VEGF es el dominio de unión al ligando. El dominio de unión al ligando se puede hallar en cualquier extremo del receptor, pero normalmente se halla en el extremo terminado en amino.

Algunos ejemplos de receptores de VEGF incluyen los receptores de proteína tirosina cinasa denominados en la bibliografía flt-1 (VEGFR-1) , KDR y flk-1 (VEGFR-2) . A menos que se diga lo contrario o que el contexto sugiera lo contrario, esta memoria descriptiva sigue la nomenclatura habitual de la bibliografía de '-los receptores de VEGF. KDR (VEGFR-2) se citará como la forma' humana de un receptor de VEGF "que""" tiene peso molecular de 180 kD (Terman et al, anterior) . Flk-1 (VEGFR-2) se cita como el homólogo de ratón de KDR (Matthews et al, anterior) . Flt-1 (VEGFR-1) se cita como una forma del receptor de VEGF diferente de, pero relacionada con, el receptor KDR/flk-1 (VEGFR-2) . Ver Shibuya et al, anterior.

Otros receptores de VEGF incluyen aquellos que pueden rotularse entrecruzados con VEGF, o que pueden co-inmunoprecipitarse con KDR (VEGFR-2) . Algunas formas conocidas de estos receptores de VEGF tienen pesos moleculares de aproximadamente 170 KD, 150 KD, 130-135 KD, 120-125 KD y 85 KD . Ver, por ejemplo, Quinn et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci . USA, 90: 7533-7537 (1993); Scher et al, J. Biol. Chem., 271: 5761-5767 (1996).

El receptor de VEGF generalmente se une a una célula, tal como una célula endotelial. El receptor de VEGF también se puede unir a un célula no endotelial, tal como una célula de tumor. Alternativamente, el receptor de VEGF puede estar libre de la célula, preferentemente en forma soluble.

Los antagonistas de la presente invención neutralizan receptores de VEGF. En esta memoria descriptiva, neutralizar un receptor "-significa desactivar la actividad de cinasa intrínseca del" receptor para transducir una "seña*l . Un ensayo confiable para la neutralización del receptor de VEGF es la inhibición de la fosforilación del receptor.

La presente invención no está limitada por ningún mecanismo particular de neutralización de receptor de VEGF. A la fecha de la presentación de esta solicitud, el mecanismo de neutralización del receptor de VEGF por los anticuerpos no se entendía bien,- y el mecanismo seguido por un antagonista no es necesariamente el mismo que el seguido por otro antagonista. Algunos mecanismos posibles incluyen impedir la unión del ligando de VEGF al dominio de unión extracelular del receptor de VEGF, e impedir la dimerización o la oligomerización de los receptores. Sin embargo, no se pueden excluir otros mecanismos.

Un antagonista receptor de VEGF (o VEGFR) , en el contexto de la presente invención, es una molécula biológica, molécula pequeña, o cualquier otra sustancia que inhibe la subfamilia de receptores VEGFR. Por inhibición de la activación de la subfamilia de receptores VEGFR, se entiende toda reducción en la activación del VEGFR. Es decir, la prevención de la activación no necesariamente detiene completamente la activación del VEGFR. Más aún, la inhibición de la activación de VEGFR, definida por la presente ''-invención, significa la inhibición del antagonista VEGFR después' de la interacción del antagonista" VEGFR y VEGFR. Por asociación se entiende suficiente interacción física o química entre el antagonista VEGFR y el VEGFR para que se inhiba la actividad de tirosina cinasa del receptor. Un experto en el arte apreciará que los ejemplos de tales interacciones, que incluyen la asociación o enlace, son conocidos en el arte e incluyen enlace covalente, enlace iónico, enlace de hidrógeno, etc. Por consiguiente, los antagonistas VEGFR de la presente invención inhiben la actividad de tirosina cinasa del receptor, que impide la autofosforilación del receptor y la fosforilación de otras diferentes proteínas involucradas en las vías de señalización de VEGFR. Tales vías, que están involucradas en la regulación de la vasculogénesis y angiogénesis , incluyen cualquiera de las siguientes: vía de fosfolipasa Cy (PLCy) o la vía de fosfatidilinositol 3' cinasa (PI3-K)/Akt y proteína cinasa activada mitógena (MAPK) . Ver, por ejemplo, Int'l. Mol. Med. , 5: 447-56 (2000).

La subfamilia de receptores VEGFR se caracteriza por la pesencia de siete bucles similares a inmunoglobulina en el dominio extracelular, una sola región transmembrana y un dominio de tirosina cinasa dividido en la región intracelular (tirosina cinasas receptor de clase III) . Hay varios miembros conocidos de ¦""la subfamilia de receptores VEGFR, ejemplos de . los cuales incluyen VEGFR- 1, VEGFR-2 , y VEGFR-3. En general se cree que KDR (VEGFR-2 ) es el principal transductor de señales de VEGF que deriva en la proliferación, migración, diferenciación de células endoteliales , formación de tubos, aumento de permeabilidad vascular, y mantenimiento de la integridad vascular. VEGFR- 1 posee una actividad de cinasa mucho más débil, y no puede generar una respuesta mitogénica cuando es estimulado por VEGF, aunque se une a VEGF con una afinidad que es aproximadamente 10 veces más alta que la de KDR (VEGFR-2) . VEGFR-1 también ha sido implicado en la migración inducida por VEGF y el factor de crecimiento de placenta (P1GF) de monocitos y macrofagos y la producción de tejido de tumor.

Como es el caso de los EGFR descritos aquí, la activación aumentada de VEGFR puede derivar de niveles más altos de ligando, amplificación de genes de VEGFR, transcripción aumentada del receptor o mutaciones que producen la señalización del receptor sin regular.

En una realización de la presente invención, el antagonista VEGFR inhibe la unión de VEGFR a su ligando. La unión de un ligando a un dominio extracelular, externo de VEGFR estimula la dimerización del receptor, la autofosforilación de VEGFR, la "-activación del dominio de tirosina cinasa citoplásmica interna" del receptor, y la iniciación de~*"varias vías de transducción de señales involucradas en la regulación de la vasculogénesis y i angiogénesis .

Ligandos para VEGFR incluyen VEGF y sus homólogos PlGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, y VEGF-E. Por ejemplo, PlGF, que es un factor segregado dimérico que se une solamente a VEGFR- 1, es producido en grandes cantidades por el citotrofoblasto velloso, sincitiotrofoblasto y trofoblasto extravelloso y tiene una homología de aminoácido cercana a VEGF. Existen tres isoformas en humanos, PlGF-1, P1GF-2, y PlGF-3. Los estudios con ratones con deficiencias de PlGF demuestran que este factor de crecimiento no está involucrada en la angiogénesis per se, sino que antes bien, modula específicamente los efectos angigénicos y de permeabilidad de VEGF durante las situaciones patológicas. Además, VEGF-D está cercanamente relacionado con VEGF-C en virtud de la presencia de las extensiones de extremidades de N y C que no se hallan en otro miembros de la familia de VEGF. En tejidos humanos adultos, el mARN de VEGF-D es el más abundante en el corazón, pulmones, músculo esquelético, colon e intestino delgado. Los análisis de la especificidad del receptor VEGF-D revelaron que VEGF-D es un ligando tanto para VEGFR-2 (Flkl) y VEGFR-3 (Flt4) y pueden activar estos receptores; sin embargo, VEGF-D no se une a VEGFR-"-1.· Además, VEGF-D es un mitógeno para células endoteliales . " ' En otra realización de la presente invención, el antagonista VEGFR se une a VEGFR. Se debe apreciar que el antagonista VEGFR puede unirse externamente a la porción extracelular de VEGFR, que puede o no inhibir la unión del ligando, o internamente al dominio de tirosina cinasa. Ejemplos de antagonista VEGFR que se unen a VEGFR incluyen, sin limitación, moléculas biológicas, tales como ribozomas de receptores y anticuerpos (o equivalentes funcionales de ellos) específicos para VEGFR, e inhibidores de tirosina cinasa que actúan directamente sobre el dominio citoplásmico de VEGFR, tales como moléculas pequeñas. Preferentemente, el antagonista PEGFR de la presente invención es una molécula biológica y más preferentemente, un anticuerpo, o un equivalente funcional de él, específico para VEGFR, cuyos detalles se describen más detalladamente a continuación.

Alternativamente, el antagonista VEGFR de la presente invención es un inhibidor de cinasa de molécula pequeña, cuyos detalles se describen a continuación.

En una realización preferida, el antagonista receptor de VEGF se une específicamente a VEGFR-1. Son particularmente preferidas las proteínas que se unen al antígeno que se. unen al dominio extracelular de VEGFR-1 y bloquean la unión por uno o ambos ¦"-ligandos , VEGF y PlGF, y/o neutralizan la activación inducida por' VEGF o inducida por PlGF de VEGF -1. Por ejemplo, mAb 6.12 es un csFv que se une a VEGFR-1 soluble y expresado en la superficie de la célula. ScFv 6.12 comprende los dominios de VL y VH del anticuerpo monoclonal de ratón mAb 6.12. Una línea de células de hibridoma que produce mAb 6.12 se ha depositado como ATCC número PTA-3344. El depósito se hizo según las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos de Procedimientos de Patentes y las reglamentaciones de acuerdo con él (Tratado de Budapest) . Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable durante 30 años desde la fecha del depósito. Los organismos serán puestos a disposición por ATCC conforme a las cláusulas del Tratado de Budapest, y sujetos a un contrato entre los Solicitantes y ATCC, que asegura la disponibilidad irrestricta al concederse la patente estadounidense pertinente. La disponibilidad de las cepas depositadas no se debe interpretar como una licencia para poner en práctica la invención violando los derechos concedidos bajo la autoridad de un gobierno de acuerdo con su leyes de patentes . Otros anticuerpos preferidos se describen en los Ejemplos, específicamente los Ejemplos XII, XIII y XIV, y en SEQ ID NO: 1-83. Más aún, algunos de estos antagonistas anticuerpos VEGFR también se describen en Lu et al, Int'l. J. Cáncer, 97: 393-399 (2002) .

También existen diferentes híbrüflbmas que producen anticuerpos VEGFR-2. Por ejemplo, una línea de células de hibridomas que producen el anticuerpo monoclonal VEGFR-2 anti-ratón de rata (DC101) se depositó como ATCC HB 11534; una línea de células de hibridomas (M25.18A1) que producen el anticuerpo monoclonal VEGFR-2 anti-ratón de ratón mAb 25 se depositó como ATCC HB 12152; una línea de células de hibridoma (M73.24) que producen el anticuerpo monoclonal VEGFR-2 anti-ratón de ratón mAb 73 'se depositó como ATCC HB 12153.

Además, hay diferentes hibridomas que producen anticuerpos anti-VEGFR-1 que incluyen, en forma no taxativa, hibridomas KM1730 (depositado como FERM BP-5697) , KM1731 (depositado como FERM BP-5718) , KM1732 (depositado como FERM BP-5698) , KM1748 (depositado como FERM BP-5699) , KM1750 (depositado como FERM BP-5700) revelados en WO 98/22616, WO 99/59636, Solicitud de Patente Australiana N° AU 1998 50666 B2 , y en la Solicitud Canadiense N° CA 2328893.

Muchos otros antagonistas VEGFR son conocidos en el arte. Algunos ejemplos de antagonistas VEGFR se describen en las Solicitudes Nos. 07/813.593; 07/906.397; 07/946.507; 07/977.451; 08/055.269; 08/252,517; 08/601.891; 09/021.324; 09/208.786; y 09/919.408 ''-(todas de Lemischka et al); Patente Estadounidense N° 5.840.301 (Rockwell et al); Solicitudes cte*"" Patentes Estadounidenses Nos. 08/706.804; 08/866.969; 08/967.113; 09/047.807; 09/401.163; y 09/798.689 (todas de Rockwell et al); Solicitud de Patente Estadounidense N° 09/540.770 ( itte et al); y PCT/US01/06966 (Liao et al). La Patente Estadounidense N" 5.861.301 (Terman et al), Terman et al, Oncogene 6: 1677-1683 (septiembre de 1991), WO 94/10202 (Ferrara et al) y WO 95/21865 (Ludwig) revelan antagonistas VEGFR y, específicamente, anticuerpos anti-VEGFR-2. Además, PCT/US95/01678 (Kyowa Hakko) , describe anticuerpos anti- VEGFR-2. Los anticuerpos anti-VEGFR-2 también se describen en la Solicitud Estadounidense N° 09/976.787 (Zhu et al). Las Patentes Estadounidenses Nos. 6.177.. 01 (Ullrich et al), 5.712.395 (App et al) y 5.981.569 (App et al) describen antagonistas VEGFR que son moléculas orgánicas. Además, los anticuerpos bi -específicos (BsAbs) , que son anticuerpos que tienen dos especificidades o sitios de unión al antígeno diferentes, dirigidos a KDR (VEGFR-2 ) y VEGFR-1 son conocidos. Ver, por ejemplo, la Solicitud Estadounidense NI 09/865..198 (Zhu) ; 60/301.299 (Zhu) . Hennequin et al en J. Med. Chem. 42, 5369-5389 (1999) revelan ciertas quinazolinas, quinolinas y cinolinas que son útiles como antagonistas receptores de VEGF. Ver también Annie et al, Diario de Síndromes de Inmunodeficiencia Adquirida, y Retrovirología Humana 17, A41 (1998) . Los antagonistas receptores de VEGF ^revelados en el artículo de Hennequin et al se incorporan aquí" * como referencia. - "—·-" Además, App et al (Patente Estadounidense N° 5.849.742) revela derivados de moléculas pequeñas de compuestos quinazolina, quinoxilina, anilina sustituida, isoxazoles, acrilonitrilo, y fenilacrilonitrilo que actúan como inhibidores de tirosina cinasa. Las moléculas pequeñas descritas por Hennequin et al, Annie et al y App et al se incluyen en la presente invención como antagonistas receptores de VEGF. ' , Más aún, los ensayos para la determinación de antagonistas VEGFR son conocidos en el arte, y, en consecuencia, se pueden identificar rápidamente antagonistas alternativos adecuados para su uso en la presente invención. Los antagonistas VEGFR de la presente invención inhiben la actividad de tirosina cinasa de VEGFR, que generalmente involucra eventos de fosforilación. Por consiguiente, los ensayos de fosforilación son útiles en la determinación de antagonistas VEGFR en el contexto de la presente invención. Algunos ensayos para la actividad de tirosina cinasa se describen en Panek et al, J. Pharmacol . Exp. Thera., 283: 1433-44 (1997) y Batley et al, Life Sci . , 62:143-50 (1998) . Además, se pueden utilizar métodos específicos para la detección de la expresión de VEGFR.

Anticuerpos ' Los anticuerpos de la presente invención pueden producirse mediante métodos conocidos en el arte. Estos métodos incluyen el método inmunológico descrito por Kohler y ilstein, Nature, 256: 495-497 (1975) y Campbell, Tecnología de Anticuerpos Monoclonales, La Producción y Caracterización de Hibridomas de Roedores y Humanos, Burdon et al, Eds . , Técnicas de Laboratorio en Bioquímica y Biología Molecular, Volumen 13, Elsevier Science Publishers, Ámsterdam (1985) ; así como mediante el método del ADN recombinante descrito por Huse et al, Science, 246, 1275-1281 (1989) .

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos monoclonales o policlonales o cualquier otro tipo de anticuerpo, tal como un fragmento o un derivado de un anticuerpo, un anticuerpo de una sola cadena (scFv) o un homólogo sintético del anticuerpo, siempre que el anticuerpo tenga las mismas características de unión que, o que tenga características de unión comparables con, aquellas del anticuerpo entero. Como se usa aquí, a menos que se indique lo contrario o esté claro a partir del contexto, los dominios, regiones y. fragmentos de los anticuerpos están de acuerdo con definiciones estándar conocidas ' rjen el arte. Ver, por ejemplo, Abbas et al, Inmunología Celular y * Molecular, W.B. Saunders Comp¾rty, Philadelphia, PA (1991). Preferentemente, los anticuerpos de la presente invención son i anticuerpos monoclonales.

Los fragmentos de anticuerpos pueden producirse rompiendo un anticuerpo entero, o expresando el ADN que codifica el fragmento. Los fragmentos de anticuerpos pueden prepararse mediante métodos descritos por Lamoyi et al, Immunol . Methods, 56: 235-243 (198-3) y por Parham, J. Immunol. 131: 2895-2902 (1983). Tales fragmentos pueden contener uno ambos fragmentos Fab o el fragmento F(ab' )2- Tales fragmentos pueden también contener anticuerpos de región variable de fragmentos de una sola cadena, es decir scFv, diacuerpos, u otros fragmentos de anticuerpos. Los métodos de producción de tales equivalentes funcionales se revelan en la Solicitud PCT WO 93/21319, Solicitud de Patente Europea N° 239.400; Solicitud PCT WO 89/09622; Solicitud de Patente Europea 338.745; y Solicitud de Patente Europea EP 332.424.

Los anticuerpos de una sola cadena (scFv) son polipéptidos que consisten en la región variable de la cadena pesada del anticuerpo conectado a la región variable de la cadena liviana con o sin un conector interconector . Por lo tanto, el scFv comprende el sitio de combinación del anticuerpo entero. Estas ^•cadenas pueden producirse en bacterias, o en células' eucarióticas . Un ejemplo de un anticuerpo de una sola cadena es plCll. (Ver el Ejemplo IX a continuación). Se mostró que P1C11 i bloquea la interacción de VEGF-KDR (VEGF-VEGFR-2 ) e inhibe la fosforilación y la mutagénesis del receptor estimulado por VEGF de HUVEC. Este scFv se une tanto al KDR (VEGFR-2) como al KDR expresado en la superficie de la célula (VEGFR-2) en HUVEC. La secuencia plCll se muestra como la SEQ ID NO: 21. Los anticuerpos de una sola cadena descritos anteriormente pueden construirse 'en un anticuerpo hecho quimérico o humanizado mediante métodos conocidos en el arte; por ejemplo, ver el Ejemplo IX-3 a continuación. Un ejemplo de un scFv hecho quimérico es plCll hecho quimérico, es decir, c-plCll.

Preferentemente, los fragmentos de anticuerpos contienen las seis regiones que determinan la complementariedad del anticuerpo entero, aunque los fragmentos que contienen menos de la totalidad de tales regiones, tales como tres, cuatro o cinco CDR, pueden también ser funcionales. Si el fragmento de anticuerpo es demasiado corto para ser inmunógeno, se lo puede conjugar a una molécula de portador. Algunas moléculas de portadores adecuadas incluyen hemocianina de lapa de ojo de cerradura y albumen de suero bovino. La conjugación se puede llevar a cabo mediante métodos conocidos en el arte. . · Los anticuerpos de la presente" invención también incluyen aquellos para los cuales se han mejorado las características de unión por mutación directa, métodos de maduración de afinidad, presentación de fago, o mezcla de cadena. La afinidad y especificidad pueden modificarse o mejorarse mutando CDR y evaluando los sitios de unión al antígeno que tienen las características deseadas (ver, por ejemplo, Yang et al, J. Mol. Bio. 254: 392-403 (1995)). Las CDR se mutan en una variedad 'de formas. Una forma es distribuir al azar residuos individuales o combinaciones de residuos de manera que en una población de sitios de unión al antígeno de lo contrario idénticos, los veinte aminoácidos estén en posiciones particulares. Alternativamente, las mutaciones se pueden inducir en una gama de residuos de CDR mediante métodos de PCR propensa a error (ver, por ejemplo, Hawkins et al, J. Med. Bio., 226: 889-896 (1992)). Los vectores de presentación de fago que contienen genes de región variable de cadena pesada y liviana se propagan en cepas imitantes de E. coli (ver, por ejemplo, Lo et al, J. Mol. Bio., 250: 359-368 (11996) ) . Estos métodos de mutagénesis son ilustrativos de los numerosos métodos conocidos para el experto en el arte.

Los anticuerpos de la presente invención también pueden ser anticuerpos quiméricos que tienen una región variable de un "-anticuerpo de una especie, por ejemplo, un ratón, y una región' constante de un anticuerpo de ~unaT*especie diferente, por ejemplo, un humano. Alternativamente, los anticuerpos de la presente i invención pueden ser anticuerpos humanizados que tienen regiones hipervariables o que determinan la complementariedad (CDR) de un anticuerpo de una especie, por ejemplo, un ratón, y regiones variables marco y una región constante de un anticuerpo humano. También alternativamente, los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos humanos que tienen tanto Una región constante como una región variable de un anticuerpo humano .

Los anticuerpos, y particularmente los anticuerpos monoclonales, pueden producirse mediante métodos conocidos en el arte. Ejemplos para la producción de anticuerpos incluyen, en forma no taxativa, la producción en células de hibridoma y la transformación de células de mamíferos con el ADN que codifica el antagonista receptor. Estos métodos se describen en diferentes publicaciones, que incluyen el método inmunológico descrito por Kohler y Milstein, Nature, 256: 495-497. (1975) y Campbell en "Tecnología de la Actividad Monoclonal, La Producción y Caracterización de Hibridomas de Roedores y Humanos" en Burdon et al, Eds . Técnicas de Laboratorio en Bioquímica y Biología Molecular, Volumen 13, Elsevier Science Publishers, Ámsterdam (1985) ; así como mediante 'métodos de ADN recombinante descritos por Huse et al en Science, 246: 1275-1281 (1989). ~ También se preparan equivalentes de anticuerpos mediante métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, se pueden preparar fragmentos de anticuerpos enzimáticamente desde anticuerpos enteros. Preferentemente, se preparan equivalentes de anticuerpos desde el ADN que codifica tales equivalentes. El ADN que codifica fragmentos de anticuerpos se puede preparar detectando todas salvo la porción deseada del ADN que codifica el anticuerpo de longitud completa. El ADN que codifica anticuerpos hechos quiméricos se puede preparar recombinando el ADN que codifica regiones constantes humanas, derivadas sustancial o exclusivamente de las regiones de anticuerpos humanos correspondientes, y el ADN que codifica regiones variables, derivadas sustancial o exclusivamente de la secuencia de la región variable de un mamífero que no es humano. El ADN que codifica anticuerpos humanizados se puede preparar recombinando el ADN que codifica regiones constantes y regiones variables que no son las regiones que determinan la complementariedad (CDR) , derivadas sustancial o exclusivamente de las regiones de anticuerpos humanos correspondientes, y el ADN que codifica las CDR, derivadas sustancial o exclusivamente de un mamífero que no es un humano .

Las fuentes adecuadas de la"s "moléculas de ADN que codifican fragmentos de anticuerpos incluyen células, tales como hibridomas, que expresan el anticuerpo de longitud completa. Los fragmentos pueden usarse solos como equivalentes de anticuerpos, o pueden combinarse en equivalentes, como se describió anteriormente. Las eliminaciones y recombinaciones del ADN descritas en esta sección se pueden llevar a cabo mediante métodos conocidos, tales como aquellos descritos en las solicitudes de patentes publicadas enumeradas anteriormente en la sección titulada "Equivalentes Funcionales de Anticuerpos" y/u otras técnicas de ADN recombinante comunes, tales como aquellas descritas a continuación.

Las células huésped preferidas para la transformación de vectores y expresión de antagonistas receptores de la presente invención son células de mamíferos, por ejemplo, células COS-7, células de ovario de hámster chino (CHO) , y líneas de células de origen linfoide tales como células de linfoma, mieloma, o hibridoma. Alternativamente, se pueden usar otros huéspedes eucarióticos , tales como levaduras. Por ejemplo, la línea de células estromáticas de hígado fetal de ratón 2018 se une a las proteínas de fusión Aptag-flk 1 y a Aptag-flk-2, es decir contiene ligandos de VEGFR-2 y flk-2 (ATCC, Manassas, VA, CRL 10907), la línea de "-células de bazo fetal humano Fs 62891 contiene el ligando de flk-2 (ATCC CRL 1093.5) y la Tíhea de células de timo fetal estromático humano, F.thy 62891, contiene el ligando de VEGFR-2 (ATCC CRL 10936) .

Las células huésped transformadas se cultivan mediante métodos conocidos en el arte en un medio líquido que contiene fuentes asimilables de carbono (carbohidratos tales como glucosa o lactosa) , nitrógeno (aminoácidos, péptidos, proteínas o sus productos de degradación tales como peptoñas, sales de amonio o similares), y sales inorgánicas (sulfatos, fosfatos y/o carbonatos de sodio, potasio, magnesio y calcio) . El medio además contiene, por ejemplo, sustancias que promueven el crecimiento, tales como elementos vestigio, por ejemplo, hierro, zinc, manganeso y similares.

Cuando se desea expresar una construcción de genes en levadura, un gen de selección adecuado para su uso en levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7. Stinchcomb et al Nature, 282: 39 (1979); Kingsman et al, Gene, 7: 141 (1979). El gen trpl provee un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptofano, por ejemplo, ATCC N° 44076 o PEP4-1. La presencia de la lesión de trpl en el genoma de la célula huésped de levadura luego provee '•un medio eficaz para detectar transformaciones mediante el" crecimiento en la ausencia de" tíiptofano. En forma similar, las cepas de levadura con deficiencia de Leu2 (ATCC 20.622 o 38.626) se complementan con plásmidos conocidos que transportan el gen de Leu2.

También alternativamente, el ADN que codifica el antagonista receptor se puede clonar en vectores derivados de virus tales como adenovirus, virus adeno-asociados , virus del herpes, retrovirus o virus lento. La expresión de genes está controlada por secuencias regulatorias inducibles o no inducibles.

En síntesis, se selecciona una fuente adecuada de células que contienen moléculas de ácido nucleico que expresan el ADN deseado, tales como un anticuerpo, un equivalente de anticuerpo o un receptor de VEGF. El ARN total se prepara mediante procedimientos comunes desde una fuente adecuada. El ARN total se usa para dirigir una síntesis de cADN. Los métodos comunes para aislar el ARN y sintetizar el cADN se proveen en manuales comunes de biología molecular tales como, por ejemplo, aquellos descritos anteriormente.

El cADN puede amplificarse mediante métodos conocidos. Por ejemplo, el cADN puede usarse como una plantilla para la "amplificación mediante reacción de cadena de polimerasa (PCR);" ver Saiki et al, Science, 239," 43*7" (1988) o Mullís et al, Patente Estadounidense 4.683.195. Las secuencias de los iniciadores de oligonucleótidos para la amplificación mediante PCR se obtienen de la secuencia conocida que se debe amplificar. Los oligonucleótidos se sintetizan mediante métodos conocidos en el arte. Métodos adecuados incluyen aquellos descritos por Caruthers en Science 230, 281-285 (1985) .

Se usa una mezcla de oligonucleótidos ascendentes y descendentes en la amplificación mediante PCR. Las condiciones se optimizan para cada par iniciador particular de acuerdo con procedimientos comunes. El producto de la PCR se analiza, por ejemplo, mediante electroforeses para el cADN que tiene el tamaño correcto, que corresponde a la secuencia entre los iniciadores. Alternativamente, la región codificadora se puede amplificar en dos o más fragmentos superpuestos . Los fragmentos superpuestos se diseñan para incluir un sitio de restricción que permite la unión del cADN intacto de los fragmentos.

Para aislar las regiones que codifican proteínas enteras para los receptores de VEGF, por ejemplo, el iniciador de oligonucleótido de PCR ascendente es complementario de la secuencia en el extremo 5' , que preferentemente abarca el codón de inicio de ATG y al '-menos 5-110 nucleótidos arriba del codón de inicio. El iniciador' de oligonucleótido de PCR descendente es complementario de la secuencia en el extremo 3' de la secuencia de ADN deseada. La secuencia de ADN deseada preferentemente codifica la porción extracelular entera del receptor de VEGF, y optativamente codifica todo o parte de la región transmembrana, y/o todo o parte de la región intracelular, que incluye el codón de parada.

El ADN que se debe amplificar, tal como el que codifica los anticuerpos, los equivalentes de anticuerpos, o los receptores de VEGF, también se puede replicar en una amplia variedad de vectores de clonación en una amplia variedad de células huésped. La célula huésped puede ser procariótica o eucariótica.

El vector en el cual se empalma el ADN puede comprender segmentos de secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas o sintéticas.

Algunos vectores de clonación procarióticos adecuados incluyen los plásmidos de E. coli, tales como colEl, pCRl , pBR322, pMB9, pUC, pKSM, y RP4. Los vectores procarióticos también incluyen derivados del ADN de fago tales como M13 y otros fagos de ADN de una sola hebra filamentoso. Un vector preferido para clonar el ácido nucleico que codifica el receptor de VEGF es el vector de Baculovirus .

"-El vector que contiene el ADN que_ debe expresarse se transfecta' en una célula huésped adecuada. ~TTá. célula huésped se mantiene en un medio de cultivo apropiado, y se somete a condiciones en las cuales las células y el vector se replican. El vector se puede recuperar de la célula. El ADN que debe expresarse se puede recuperar del vector.

El ADN que debe expresarse, tal como aquel que codifica anticuerpos, equivalentes de anticuerpos, o receptores, se puéde insertar en un vector de expresión adecuado y se expresa en una célula huésped procariótica o eucariótica.

Por ejemplo, el ADN insertado en una célula huésped puede codificar la porción extracelular entera del receptor de VEGF, o un fragmento soluble de la porción extracelular del receptor de VEGF. La porción extracelular del receptor de VEGF codificado por el ADN se une optativamente en uno o ambos extremos 5' y/o 3' a las secuencias de aminoácidos adicionales. Las secuencias de aminoácidos adicionales pueden unirse a la región extracelular del receptor de VEGF de carácter, tal como la secuencia inicial, la región transmembrana y/o la región intracelular del receptor de VEGF. Las secuencias de aminoácidos adicionales también pueden ser secuencias no unidas al receptor de VEGF de carácter. Preferentemente, tales secuencias de aminoácidos adicionales -:-cumplen un propósito particular, tal como mejorar los niveles de expresión, la secreción, solubilíctád o inmunogenicidad.

Los vectores para expresar proteínas en bacterias, especialmente E. coli, son conocidos. Tales vectores incluyen los vectores PATH descritos por Dieckmann y Tzagoloff en J. Biol . Chem. 260, 1513- 1520 (1985) . Estos vectores contienen secuencias de ADN que codifican la antranilato cintaza (TrpE) seguida por un policonector a la extremidad de carboxi . Otros sistemas 'de vectores de expresión se basan en beta-galactosidasa (pEX) ; lambda PL; prqteína de unión a maltosa (pMAL) ; y glutationa S- transferasa (pGST) , ver Gene 67, 31 (1988) e Investigación de Péptidos 3, 167 (1990).

Los vectores útiles en la levadura están disponibles. Un ejemplo adecuado es el 2µ plásmido.

Los vectores adecuados para la expresión en células de mamíferos son también conocidos. Tales vectores incluyen derivados conocidos de SV-40, adenovirus, secuencias de ADN derivadas de retrovirus y vectores de lanzamiento derivados de la combinación de vectores de mamíferos funcionales, tales como aquellos descritos anteriormente, y plásmidos funcionales y ADN de fago.

'-Otros vectores de expresión eucarióticos son conocidos en el arte (por ejemplo, P.J. Southern y PT'Berg, J. Mol. Appl . Genet . , 1, 327-341 (1982); Subramani et al, Mol. Cel . Biol . , 1, 854-864 (1981) ; Kaufmann y Sharp, "Amplificación y expresión de Secuencias Cotransfectadas con un Gen de ADN Complementario de Dihidrofolato Reductasa Modular", J. Mol. Biol., 159, 601-621 (1982); Kaufmann y Sharp, Mol. Cell . Biol, 159, 601-664 (1982); Scahill et al, "Expresión y Caracterización del Producto de un Gen de ADN de Interferón Inmune Humano en Células de Ovarios* de Hámster Chino", Proc. Nat'l Acad. Sci . Estados Unidos 80, 4654- 4659 (1983); Urlaub y Chasin, Proc. Nat'l Acad. Sci. Estados Unidos 77, 4216-4220 (1980) .

Los vectores de expresión útiles en la presente invención contienen al menos una secuencia de control de expresión que está unida operativamente a la secuencia de ADN o fragmento que se debe expresar. La secuencia de control es inserta en el 'vector para controlar y para regular la expresión de la secuencia de ADN clonada. Ejemplos de secuencias de control de expresión útiles son el sistema lac, el sistema trp, el sistema tac, el sistema trc, las regiones operadoras y promotoras principales del fago lambda, la región de control de la proteína de membrana fd, los promotores glicolíticos de levadura, por ejemplo, el promotor para 3-fosfoglicerato cinasa, los promotores de fosfatasa ácida -de levadura, por ejemplo, Pho5, los promotores de los factores dé acoplamiento a levadura alfa, los promotores derivados de polioma, adenovirus, retrovirus, y virus de simios, por ejemplo, los promotores precoces y tardíos de SV40, y otras secuencias que se sabe que controlan la expresión de genes de células procarióticas o eucarióticas y sus virus o combinaciones de ellos .

Los vectores que contienen señales de control y el ADN que1 se debe expresar, tales como aquellos que codifican anticuerpos, equivalentes de anticuerpos, o receptores de VEGF, se insertan en una célula huésped para la expresión. Algunas células huésped de expresión útiles incluyen células procarióticas y eucarióticas conocidas. Algunos huéspedes procarióticos adecuados incluyen, por ejemplo, E. coli, tal como E. coli SG-936, E. coli HB 101, E. coli W3110, E . coli X1776, E. coli X2282, E. coli DH1 , y E. coli MRC1, Pseudomonas, Bacillus, tales como Bacillus subtilis, y Streptomyces . Las células eucarióticas adecuadas incluyen levadura y otros hongos, insectos células de animales, tales como células de COS y células de CHO, células humanas y células de plantas en cultivos de tejidos.

Después de la expresión en una célula huésped mantenida en un medio adecuado, el polipéptido o péptido que debe expresarse, tal - como el que codifica anticuerpos, equivalentes de anticuerpos, receptores de VEGF, se puecle """"aislar del medio, y purificar mediante métodos conocidos en el arte. Si el polipéptido o péptido no se segrega en el medio de cultivo, las células huésped se lisan antes de la aislación o purificación.

Además, los anticuerpos de la invención pueden prepararse inmunizando un mamífero con un receptor soluble. Los receptores solubles pueden usarse solos como inmunógenos , o pueden unirse a una proteína de portador o a otros objetos, tales como cuentas, es decir cuentas de sefarosa. Después de que el mamífero ha producido anticuerpos, se aisla una mezcla de células que producen anticuerpos, tales como esplenocitos . Los anticuerpos monoclonales pueden producirse aislando células que producen anticuerpos individuales desde la mezcla y haciendo a las células inmortales, por ejemplo, fusionándolas con células de tumores. tales como células de mielomas . Los hibridomas resultantes se preservan en cultivo, y expresan anticuerpos monoclonales , que se cosechan del medio de cultivo.

Los anticuerpos también pueden prepararse desde receptores unidos a la superficie de células que expresan el receptor específico de interés . La célula a la cual se unen los receptores puede ser una célula que expresa naturalmente el receptor, tal como una célula endotelial vascular para VEGFR. Alternativamente, la célula a lá cual se une el receptor puede ser una célula en la cual el ADN que codifica el receptor se ha transíectado, tales como células í 3T3 , que se han transfectado con VEGFR.

Se puede usar un receptor como un inmunógeno para cultivar un anticuerpo de la invención. El péptido receptor se puede obtener de fuentes naturales, tales como de células que expresan los receptores. Por ejemplo, el péptido receptor de VEGF se pu¾de obtener de células endoteliales vasculares. Alternativamente, los péptidos receptores sintéticos se pueden usando máquinas comercialmente disponibles. En tal realización, la secuencia de aminoácidos del receptor de VEGF puede ser provista, por ejemplo, por Shibuya et al, Oncogene 5, 519-524 (1990) para flt-1 (VEGFR-1); PCT/US92/01300 y Terman et al, Oncogene 6: 1677-1683 (1991) para KDR (VEGFR-2) ; y Matthe s et al, Proc. Nat'l Acad. Sci. Estados Unidos, 88:9026-9030 (1991) para flk-1.

Como otra alternativa, el ADN que codifica el receptor, tal como el cADN o un fragmento de él, puede clonarse y expresarse y el polipéptido resultante puede recuperarse y usarse como un inmunógeno para cultivar un anticuerpo de .la invención. Por ejemplo, para preparar los receptores de VEGF contra los cuales "- se fabrican los anticuerpos, las moléculas de ácido nucleico qué codifican los receptores de VEGF*""de la invención, o porciones de ellos, especialmente las porciones extracelulares de ellos, pueden insertarse en vectores conocidos para la expresión en células huésped usando técnicas de ADN recombinante comunes, tales como aquellas descritas a continuación. Las fuentes adecuadas de tales moléculas de ácido nucleico incluyen células que expresan receptores de VEGF, es decir células endoteliales vasculares .

El anticuerpo se puede preparar en cualquier mamífero; mamíferos adecuados excepto un humano incluyen, por ejemplo, un conejo, ratón, caballo, cabra o primate. Los ratones son los preferidos. El anticuerpo puede ser un miembro de una de las siguientes clases de inmunoglobulinas : IgG, Ig , IgA, IgD, o IgE, y las subclases de ellas, y preferentemente es un anticuerpo de IgG.

Los anticuerpos de la invención y sus equivalentes funcionales pueden ser o pueden combinar miembros de cualquiera de la clases de inmunoglobulinas .

Antagonistas VEGFR que no son Anticuerpos Además de los anticuerpos, o equivalentes funcionales de los anticuerpos, discutidos anteriormente, los antagonistas receptores útiles en la presente invención pueden también ser otras moléculas biológicas y "pequeñas, especialmente en relación con los tratamientos descritos anteriormente.

Las moléculas biológicas incluyen todos los lípidos y polímeros de monosacáridos , aminoácidos y nucleótidos que tienen un peso molecular superior a 450. Por lo tanto, las moléculas biológicas incluyen, por ejemplo, oligosacáridos y polisacáridos ; oligopéptidos , polipéptidos , péptidos y proteínas; oligonucleótidos y polinucleotidos. Los oligonucleótidos y polinucleotidos incluyen, por ejemplo, ADN y ARN.

Las moléculas biológicas incluyen además derivados de cualquiera de las moléculas descritas anteriormente. Por ejemplo, los derivados de moléculas biológicas incluyen derivados de lípidos y de glicosilación de · oligopéptidos, polipéptidos, péptidos y proteínas. Los derivados de moléculas biológicas además incluyen derivados de lípidos de oligosacáridos y polisacáridos , por ej emplo , lipopolisacáridos .

Cualquier molécula que no sea una molécula biológica se considera en esta memoria descriptiva que es una molécula pequeña. Las moléculas pequeñas de la presente invención, son entidades que tienen átomos de carbono e hidrógeno, así como heteroátomos , que -incluyen, en forma no taxativa, nitrógeno, azufre, oxígeno y fósforo. Los átomos de las moléculas pequeñas están conectados juntos a través de enlaces covalentes y iónicos; los últimos son típicos de los compuestos orgánicos pequeños, por ejemplo, inhibidores de tirosina cinasa de molécula pequeña tales como Iressa® y Tarceva® y los últimos son típicos de compuestos inorgánicos de moléculas pequeñas . La disposición de los átomos en una molécula pequeña puede representar una cadena, por ejemplo, una cadena de carbono-carbono o una cadena de carbono- heteroátomo, o un anillo que contiene átomos de carbono, por ejemplo, benceno, o una combinación de átomos de carbono y heteroátomos, es decir, heterociclos , por ejemplo, pirimidina o quinazolina. Una combinación de una o más cadenas en una molécula orgánica pequeña unida a un sistema de anillo constituye un sistema de anillo sustituido y la fusión de dos anillos constituye un sistema policíclico fusionado, que se puede denominar simplemente como un sistema policíclico, uno de cuyos ejemplos en andamiaje parental de Iressa®. Las moléculas pequeñas incluyen tanto compuestos hallados en la naturaleza como hormonas, neurotransmisores , nucleótidos, aminoácidos, azúcares, lípidos y sus derivados, y aquellos compuestos hechos sintéticamente, mediante síntesis orgánica tradicional, síntesis bio-mediada, o una combinación de ellas. Ver, por ejemplo, Ganesan, Drug Discov. Todeay, 7(1): 47-55 (enero de 2002); Lou, - Drug Discov. Today, 6 (24): 1288-1294 (diciembre de 2001).

Ejemplos adecuados de moléculas pequeñas incluyen compuestos orgánicos, compuestos organometálicos, sales de compuestos orgánicos y organometálicos, sacáridos, aminoácidos, nucleósidos y nucleótidos . Se resalta que las moléculas pequeñas pueden tener cualquier peso molecular. Simplemente se las denomina moléculas pequeñas porque típicamente tienen pesos moleculares inferiores a 450. Las moléculas pequeñas incluyen compuestos que se hallan- en la naturaleza así como compuestos sintéticos.

La administración de drogas de moléculas pequeñas y biológicas a pacientes humanos se logra mediante métodos conocidos en el arte . Ejemplos de tales métodos para moléculas pequeñas se describen en Spada, Patente Estadounidense 5.646.153 en la columna 57, línea 47 a columna 59, línea 67. Esta descripción de la administración de moléculas pequeñas se incorpora aquí como referencia.

Neutralización de la Activación de VEGF de Receptores de VEGF La neutralización de la activación de un receptor de VEGF en una muestra de células endoteliales o no endoteliales , tales como células de tumores, se puede realizar in vitro o in vivo. La '-neutralización de la activación del VEGF de un receptor de VEGF en una muestra de células "que ""expresan el receptor de VEGF comprende poner a las células en contacto con un antagonista, por ejemplo un anticuerpo, de la invención. Las células se ponen en contacto in vitro con el antagonista, por ejemplo, el anticuerpo, antes, simultáneamente con, o después de agregar el VEGF a la muestra de células.

In vivo, un antagonista, por ejemplo, un anticuerpo, de ' la invención se pone en contacto con un receptor de VEGF mediante la administración a un mamífero. Los métodos de administración a un mamífero incluyen, por ejemplo, administración oral, intravenosa, intraperitoneal , subcutánea o intramuscular.

Este método de neutralización in vivo es útil para inhibir la angiogénesis en un mamífero. La inhibición de la angiogénesis es un método terapéutico útil, tal como para prevenir o inhibir la angiogenesis asociada con condiciones patológicas tales como el crecimiento de tumores. Por consiguiente, les antagonistas, por ejemplo, los anticuerpos, de la invención son agentes inmunoterapéuticos anti-angiogénicos y anti-tumores.

La palabra mamífero significa cualquier mamífero. Algunos ejemplos de mamíferos incluyen animales domésticos, tales como ^perros y gatos; animales de granja tales como cerdos, ganado vacuno, ovejas y cabras; animá és de laboratorio, tales como ratones y ratas; primates, tales como monos, simios y chimpancés; i y humanos .

Los receptores de VEGF se hallan en algunas células no endoteliales , tales como células de tumores, lo cual indica la presencia inesperada de un bucle autocrina y/o paracrina en estas células. Los antagonistas, por ejemplo, los anticuerpos, de esta invención son útiles en la neutralización de la actividad de los receptores de VEGF en tales células, bloqueando de este modo el bucle de autocrina y/o paracrina, e inhibiendo el crecimiento de tumores .

Los métodos de inhibición de la angiogénesis y de inhibición de condiciones patológicas tales como el crecimiento de tumores en un mamífero comprenden una cantidad eficaz de cualquiera de los antagonistas de la invención, por ejemplo, anticuerpos, que incluyen cualquiera de los equivalentes funcionales de ellos, sistémicamente a un mamífero, o directamente a un tumor dentro del mamífero. El mamífero es preferentemente humano. Este método es eficaz para tratar sujetos tanto con tumores sólidos, preferentemente tumores altamente vasculares, como tumores no sólidos .

La inhibición o reducción del crecimiento de tumores incluye la prevención o inhibición del avance del tumor, que incluye tumores cancerosos y no cancerosos . El avance de un tumor incluye el carácter invasivo, la metástasis, la recurrencia y el aumento del tamaño del tumor. La inhibición o reducción del crecimiento de tumores también incluye la destrucción de un tumor.

Todos los tipos de tumores se pueden tratar con los métodos de" la presente invención. Los tumores pueden ser sólidos o no sólidos.

Algunos ejemplos de tumores sólidos que pueden tratarse con los antagonistas de la presente invención incluyen carcinomas, sarcomas, blastomas o gliomas. Algunos ejemplos de tales tumores incluyen tumores epidermoides , tales como tumores de cabeza y cuello, tumores colorectales , tumores de próstata, tumores de mamas, tumores de pulmón, que incluyen tumores de pulmón de células pequeñas o no pequeñas, tumores pancreáticos, tumores de tiroides, tumores ováricos, y tumores de hígado. Otros ejemplos incluyen sarcoma de Kaposi, neoplasmas del sistema nervioso central, neuroblastomas , hemangioblastomas de vasos capilares, meningiomas y metástasis cerebrales, melanoma, carcinomas y sarcomas gastrointestinales y renales,. rabdomiosarcoma, glioblastoma , preferentemente glioblastoma multiforme, y leiomiosarcoma . Ejemplos de cánceres de piel vascularizados pará los cuales los antagonistas de represente invención son eficaces incluyen carcinoma de células escamosas, carcinoma de células i básales y cánceres de piel que se pueden tratar suprimiendo el crecimiento de queratinocitos malignos, tales como queratinocitos malignos humanos.

Algunos ejemplos de tumores no sólidos incluyen leucemia, mielomas múltiples y linfornas. Algunos ejemplos de leucemias incluyen leucemia mielocítica aguda (AML) , leucemia mielocítica crónica (CML) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , leucemia linfocítica crónica (CLL) , leucemia eritrocítica o leucemia monocí ica. Algunos ejemplos de linfornas incluyen linfornas asociados con la enfermedad de Hodgkin y enfermedad no de Hodgkins .

Los resultados experimentales descritos más adelante demuestran que los anticuerpos de la invención bloquean específicamente la fosforilación inducida por VEGF de un receptor quimérico flk-1 (VEGFR-2) (VEGFR-2) extracelular de ratón / fms intracelular expresado en células 3T3 transíectadas . Los anticuerpos no tuvieron ningún efecto sobre un receptor fms extracelular quimérico completamente estimulado / FLK-2 intracelular por CSF- 1. Los estudios in vivo también descritos a continuación muestran '-'que los anticuerpos pudieron inhibir significativamente el crecimiento de tumores en ratones" desnudos .

Un cóctel de antagonistas receptores de VEGF, por ejemplo, anicuerpos monoclonales, provee un tratamiento especialmente eficiente para inhibir el crecimiento de células de tumores. El cóctel puede incluir tan pocos como 2, 3 o 4 anticuerpos y tantos como 6, 8 o 10 anticuerpos.

La prevención o inhibición de la angiogénesis es también útil para tratar condiciones patológicas no neoplásicas caracterizadas por excesiva angiogénesis, tales como glaucoma neovascular, retinopatía proliferativa que incluye retinopatía diabética proliferativa, artritis, degeneración macular, hemangiomas, angiofibromas y soriasis.

Uso de los Antagonistas de la Invención para Aislar y Purificar el Receptor de VEGF Los antagonistas de la presente invención se pueden usar para aislar y purificar el receptor de VEGF usando métodos convencionales tales como cromatografía de afinidad (Dean et al, Cromatografía de Afinidad: Un Enfoque Práctico, IRL Press, Arlington, VA (1985)). Otros métodos conocidos en el arte ^ incluyen . la separación magnética con cuentas magnéticas recubiertas con anticuerpos, ""lavado" con un anticuerpo unido a una matriz sólida, y citometría de flujo.

La fuente del receptor de VEGF son típicamente células vasculares, y especialmente células endoteliales vasculares, que expresan el receptor de VEGF. Fuentes adecuadas de células endoteliales vasculares son los vasos sanguíneos, tales como glóbulos sanguíneos del cordón umbilical, células endoteliales vasculares del cordón umbilical humano (HUVEC) .

Los receptores de VEGF pueden usarse como material inicial para producir otros materiales, tales como antígenos para fabricar anticuerpos monoclonales y policlonales adicionales que reconocen y se unen al receptor de VEGF u otros antígenos sobre la superficie de las células que expresan el VEGF.

Uso de los Antagonistas de la invención para Aislar y Purificar Células de Tumores Positivas flk-1 (VEGFR-2) Los antagonistas de la presente invención pueden usarse para aislar y purificar células de tumores positivos flk-1 (VEGFR- 2) (VEGFR-2), es decir células de tumores que expresan el receptor flk-1 (VEGFR-2) , usando métodos convencionales tales como "-cromatografía de afinidad (Dean, P.D.G. et al, Cromatografía dé Afinidad: Un Enfoque Práctico, T£L Press, Arlington, VA (1985)). Otros métodos conocidos en el arte incluyen la separación i magnética con cuentas magnéticas recubiertas con anticuerpos, agentes citotóxicos, tales como complemento, conjugado al anticuerpo, "lavado" con un anticuerpo unido a una matriz sólida, y citometría de flujo.

Monitoreo de Niveles de VEGF y Receptores de VEGF In Vi tro o- In Vivo Los antagonistas, por ejemplo, anticuerpos, de la invención, pueden usarse para monitorear los niveles de VEGF o receptores de VEGF in vitro o in vivo en muestras biológicas usando ensayos comunes y métodos conocidos en el arte. Algunos ejemplos de muestras biológicas incluyen fluidos corporales, tales como sangre. Los ensayos comunes incluyen, por ejemplo, rotulado de los anticuerpos y realización de inmunoensayos comunes, tales como radioinmunoensayos, que son conocidos en el arte.

Las técnicas de ADN recombinante comunes útiles para llevar a cabo la presente invención se describen en Sambrook et al, "Clonación Molecular" , Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) y por Ausubel et al (Eds.) "Protocolos Actuales en Biología Molecular" , Green Publishing Associates/ Wiley-Interscience, Nueva York ?-"990) .

Administración Los presentes antagonistas receptores pueden administrarse para tratamientos terapéuticos a un paciente que sufre de un tumor en una cantidad suficiente para impedir, inhibir o reducir el avance del tumor, por ejemplo, el crecimiento, carácter invasivo, metástasis y/o recurrencia del tumor. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una dosis terapéuticamente eficaz. Cantidades eficaces para este uso dependen de la severidad de la enfermedad y del estado general del sistema inmune del paciente. Los programas de dosificación también varían con el estado de enfermedad y el estado del paciente, y generalmente están en la gama de una sola dosis de bolo o una infusión continua para varias administraciones por día (por ejemplo, cada 4-6 horas) , o según lo que indique el médico tratante y la condición del paciente. Se debería señalar, sin embargo, que la presente invención no se limita a ninguna dosis particular.

La presente invención se puede usar para tratar cualquier tumor adecuado, que incluye, por ejemplo, tumores, de mama, corazón, pulmón, intestino delgado, colon, bazo, riñon, vejiga, cabeza y cuello, ovario, próstata, cerebro, páncreas , piel, huesos, médula ósea, sangre, timo, útero, testículos, cuello de útero o hígado. Preferentemente, los presentes métodos se usan cuando el tumor es un tumor del colon o cuando el tumor es un carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) .

Más aún, los tumores de la presente invención preferentemente sobreexpresan el EFGR. Se ha detectado una expresión aumentada del EFGR en un porcentaje significativo de muchos tumores humanos; por ejemplo, cabeza y cuello (80%-100%) , colorectal (25%-77%), pancreático (30%-50%) , pulmón (40%-80%), esofágico (43%-89%), células renales (50%-90%) , próstata (65%), vejiga (31%-48%) , cuello de útero/útero (90%), ovárico (35%-70%) y mamas (14%- 91%) . También se ha demostrado que la expresión del EGFR es un indicador de un mal pronóstico, una supervivencia reducida, y metástasis aumentadas en ciertos tipos de tumores.

Más aún, los tumores de la presente invención preferentemente tienen una expresión o señalización aberrante de VEGFR. Se ha observado una señalización mejorada por VEGFR en muchos cánceres humanos diferentes. Los niveles altos de VEGFR-2 son expresados por células endoteliales que infiltran gliomas (Píate et al, (1992) Nature 359:845-848). Los niveles de VEGFR-2 son específicamente regulados ' ascendentemente por VEGF producido por glioblastomas humanos (Píate et al (1993) Cáncer Res. 53:5822-5827) . El hallazgo de altos niveles de expresión de VEGFR-2 en el glioblastoma asociado con células endoteliales (GABC) indica que la actividad del receptor está probablemente inducida durante la formación del tumor ya- que las transcripciones de VEGFR-2 son escasamente detectables en células endoteliales cerebrales normales. Esta regulación ascendente se confina a las células endoteliales vasculares en estrecha proximidad al tumor.

La presente invención es útil para la inhibición o reducción del crecimiento de tumores. Por inhibición o reducción del crecimiento de tumores se entiende la prevención, inhibición, o reducción del avance del tumor, por ejemplo, el crecimiento, carácter invasivo, metástasis y/o recurrencia del tumor. Además, la presente invención también puede ser útil en el tratamiento de una condición angiogénica, tal como aterosclerosis , artritis, degeneración macular y soriasis. La identificación de aquellos pacientes que tienen condiciones para las cuales la presente invención es útil está dentro de la capacidad y conocimientos de un experto en el arte.

En la presente invención, se puede usar cualquier método o vía adecuada para administrar el antagonista de EGFR y/o el antagonista VEGFR, por ejemplo, administración oral, intravenosa, intraperitoneal , subcutánea, o intramuscular. La dosis del antagonista administrada dépencfe de numerosos factores, que incluyen, por ejemplo, el tipo de antagonistas, el tipo y severidad del tumor que se está tratando y la vía de administración de los antagonistas. Se debería resaltar, sin embargo, que la presente invención no se limita a ningún método o vía particular de administración.

En una realización alternativa, el antagonista EGFR y ' el antagonista VEGFR pueden administrarse en combinación con uno o más agentes antineoplásicos . Ver, por ejemplo, la Patente Estadounidense N° 6.217.866 (Schlessinger et al) (Anticuerpos anti-EGFR en combinación con agentes antineoplásicos) ; Solicitud de Patente Estadounidense N° 09/312.286 (Waksal et al) (Anticuerpos anti-EGFR en combinación con radiación) . Se puede usar cualquier agente antineoplásico adecuado, tal como un agente quimioterapéutica- o radiación. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen, en forma no taxativa, cisplatina, doxorubicina, paclitaxel, irinotecan (CPT-11) , topotecan o una combinación de ellos. Cuando el agente antineoplásico es radiación, la fuente de la radiación puede ser externa (terapia de radiación de rayo externo, EBRT) o interna (braquiterapia, BT) al paciente que se está tratando. La dosis del agente antineoplásico administrado depende de numerosos factores, que incluyen, por ejemplo, el tipo de agente, el tipo y severidad del tumor que se está tratando y la "Vía de administración del agente. Se debe resaltar, sin embargo, que la presente invención no se limita a ninguna dosis particular.

En una realización alternativa adicional, el antagonista EGFR y el antagonista VEGFR se pueden administrar en combinación con uno o más coadyuvantes adecuados, tales como, por ejemplo, citocinas (IL-10 y IL-13, por ejemplo) u otros estimuladores inmunes. Ver, por ejemplo, Larrivée et al, arriba. Se debe apreciar, sin embargo, que la administración de solamente un antagonista EGFR y un antagonista VEGFR es suficiente para prevenir, inhibir o reducir el avance del tumor en una forma terapéuticamente eficaz.

Además, el antagonista EGFR y/o el antagonista VEGFR se pueden administrar como un conjugado de ligando, que se une específicamente al receptor y suministra una carga letal, tóxica después de la internalización de la toxina del ligando. Los conjugados entre toxinas y los receptores se diseñaron con el objetivo de desarrollar agentes tóxicos específicos para células de tumores que sobreexpresan EGFR o VEGFR mientras minimizan la toxicidad no específica. Por ejemplo, se mostró que un conjugado compuesto de EGF y endotoxina de Pseudomonas (PE) es tóxico hacia las células HeLa que expresan EGFR in vitro. Diferentes agentes, que incluyen tioridazina y adenovirus, pueden aumentar la absorción celular del conjugado, así como aumentar la citotoxicidad del conjugado.

Se entiende que los antagonistas EGFR y/o VEGFR de la invención, cuando se usan en un mamífero con propósitos de profilaxis o tratamiento, se administran en la forma de una composición que además comprende un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, uno o más de agua, solución salina, solución salina con tampón de fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de ellos . Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden comprender además cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionadores , conservantes o tampones, que aumentan la vida en el estante o la eficacia de las proteínas de unión. Las composiciones de la inyección pueden, como se sabe en el arte, se formulan de manera tal que proveen la liberación rápida, sostenida o retardada del ingrediente activo después de la administración al mamífero.

Los antagonistas EGFR y/o VEGFR de esta invención pueden estar en una variedad de formas. Éstas incluyen, por. ejemplo, formas de dosificación sólidas, semisólidas y líquidas tales como tabletas, pildoras, polvos, soluciones _ líquidas, dispersiones o suspensiones, liposomas, supositorios, soluciones inyectables e infusibles. La forma preferida depende de la forma de i administración y la aplicación terapéutica deseadas.

Tales antagonistas pueden prepararse en una forma conocida en el arte farmacéutico. En la fabricación de la composición el ingrediente activo generalmente se mezcla con un portador, o es diluida por un portador, y/o encerrada dentro de un portador 'que puede, por ejemplo, estar en la forma de una cápsula, sachet, papel, u otro recipiente. Cuando el portador sirve como diluyente, puede ser un material sólido, semisólido, o líquido, que actúa como vehículo, excipiente o medio para el ingrediente activo. Por lo tanto, la composición puede estar en la forma de tabletas, sachets, cápsulas, elíxires, suspensiones, aerosoles (como un sólido o en un medio líquido) , ungüentos que contienen por. ejemplo hasta el 10% en peso del compuesto activo, cápsulas de gelatina blanda y dura, supositorios, soluciones para inyección, suspensiones, polvos empaquetados estériles y como un parche tópico.

Kits para la Inhibición del Crecimiento de Tumores La presente invención también incluye kits para inhibir el crecimiento de tumores que. comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un ^antagonista EGFR y una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista VEGFR. El antagonista EGFR o VEGFR de los presentes kits puede ser cualquier antagonista adecuado, ejemplos de los cuales se han descrito anteriormente. Preferentemente, el antagonista EGFR del kit comprende un anticuerpo, o equivalentes funcionales de él, específico para EGFR. Alternativamente, y también preferentemente, el antagonista EGFR del kit comprende "una molécula pequeña específica para EGFR. El antagonista VEGFR del kit preferentemente comprende un anticuerpo, o un equivalente funcional de él, específico para VEGFR. Alternativamente, el antagonista VEGFR del kit preferentemente comprende una molécula pequeña específica para VEGFR. Además, los kits déla presente invención pueden comprender además un agente antineoplásico . Ejemplos de agentes antineoplásicos adecuados en el contexto de la presente invención se describen aquí. Los kits de la presente invención además pueden comprender un coadyuvante, ejemplos de los cuales se han descrito anteriormente.

Por consiguiente, los presentes antagonistas receptores se pueden usar in vivo e in vitro para métodos de investigación, diagnóstico o tratamiento, que son conocidos en el arte. Naturalmente, se debe entender y esperar que los expertos en el -arte pueden hacer variaciones en los principios de la invención revelados y se desea que áqueTlas modificaciones se incluyan dentro del alcance de la presente invención.

Todas las referencias mencionadas aquí se incorporan en su totalidad .

Los Ejemplos siguientes se dan para ayudar a comprender la invención pero no se desea, ni se debería interpretar que limitan su alcance de ninguna manera. Los Ejemplos no incluyen descripciones detalladas de métodos convencionales, tales como aquellos empleados en la construcción de vectores y plásmidos, la inserción de genes que codifican polipéptidos en tales vectores y plásmidos, o la introducción de plásmidos en células huésped. Tales métodos son conocidos para los expertos en el arte y se describen en numerosas publicaciones que incluyen Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989) Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press .

EJEMPLO I. LÍNEAS DE CÉLULAS Y MEDIOS Se obtuvieron células NIH 3T3 de la Colección de Cultivos de Tipo Estadounidense (Rockville, MD) . La línea de células C441 se ":- construyó transfectando células 3T3 con el receptor quimérico flk-1 (VEGFR-2) de ratón / fms~*¾umano. 10A2 es un transfectante que contiene el receptor quimérico fms humano / FLK-2 de ratón, i cuya aislación y caracterización se ha descrito (Dosil et al, Mol. Cell. Biol.. 13:6572-6585 (1993)) . Las células se mantuvieron rutinariamente en el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DME) con suplemento de 10% de suero de ternero (CS) , 1 mM L-glutamina, antibióticos, y 600 µg ml de G418 (Geneticina; Sigma, St . Louis MO) .

Una línea de células de glioblastoma, CBM-18, se mantuvo en DME con suplemento de 5% de suero de ternero, 1 mM L-glutamina, y antibióticos .

Una línea de 3T3 adecuada que segrega la proteína quimérica soluble, flk-1 (VEGF -2 ) de ratón : SEAP (fosfatasa alcalina secretoria) , se generó y mantuvo en DMEM y 10% de suero de ternero. Se recogió el medio acondicionado. Flk-1 soluble (VEGFR- 2) : SEAP se aisla del medio acondicionado.

EJEMPLO II. AISLACIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES ''- Ejemplo II-l. Anticuerpo monoclonal flk-1 (VEGFR-2) de ratón anti-rata DC-101 (IgGl) ' Ratas de Lewis (Charles River Labs) se hiperinmunizaron con un complejo inmune que consistía en el receptor soluble flk-1 de ratón : SEAP, un anticuerpo policlonal anti- fosfatasa alcalina de conejo y cuentas de Proteína G sefarosa. Los animales recibieron 7 inyecciones intraperitoneales de este complejo repartidas durante tres meses (los días 0, 14, 21, 28, 49, 63, 77)." En diferentes momentos, los animales sangraron de la vena de la cola y los sueros inmunes se evaluaron mediante ELISA en cuanto a la unión de alto título a mflk-1 (VEGFR-2) : SEAP. Cinco días después de la última inyección, las ratas fueron sacrificadas y los bazos se removieron asépticamente. Los esplenocitos se lavaron, se contaron y se fusionaron a una relación de 2:1 con la línea de células de mieloma de ratón NS1. Se seleccionaron hibridomas en el medio de HAT y se evaluaron colonias mediante ELISA en cuanto a la unión específica a mflk-l (VEGFR-2) : SEAP pero no la proteína SEAP. Numerosos hibridomas positivos se expandieron y clonaron tres veces limitando la dilución. Un subclon, denominado DC-101, se caracterizó nuevamente.

Ejemplo II-2. Anticuerpos monoclonales flk-1 (VEGFR-2) de ratón anti-rata Mab 25 y Mab 73 Anticuerpos monoclonales anti-fT£-l (VEGFR-2) de ratón (Mab) se produjeron usando un protocolo similar al empleado para DC-101. En síntesis, los ratones inyectados con un complejo de receptor soluble flk-1 (VEGFR-2 ) /SEAP unido a un complejo de Proteína anti-SEAP/Sefarosa A o germen de trigo aglutinina Sefarosa desde el medio acondicionado de célula NIH 3T3 transfectada . Los ratones se hiperinmunizaron con intervalos periódicos durante un período de 6 meses. Los esplenocitos inmunes se combinaron y fusionaron con la línea de células de mieloma de ratón, NSI . Se seleccionaron hibridomas en el medio HAT y después de la incubación, se evaluaron colonias en cuanto a la producción de Mab. A diferencia del protocolo empleado para DC-101, los sobrenadantes positivos se evaluaron inicialmente en cuanto a la unión al receptor flk-1 (VEGFR-2 ) /fms capturado de los lisados de células ¦ C441 en las placas del ELISA recubiertas con un anticuerpo policlonal generado por péptidos contra la región de la extremidad de C de fms . Los Mab reactivos luego se ensayaron mediante ELISA en cuanto a la unión a células C441 intactas y a flk-1 (VEGF -2) /SEAP purificado contra SEAP sola. Los sobrenadantes de los hibridomas que presentaron unión a C441 y reactividad con flk-1 (VEGFR-2 ) /SEAP pero no con SEAP se expandieron, crecieron en ascitis, y se purificaron (EZ-PREP, Pharmacia) . Los Mab purificados se sometieron a ensayos en células C441 para determinar su unión a la superficie celular por FACS y su capacidad de inhibir"1a activación de flk-1 (VEGFR-2)/fms inducida por VEGF en ensayos de fosforilación. Los resultados de estos estudios derivaron en la clonación de Mab 25 y 73 (IgGl isotipo) para una nueva caracterización basada en sus capacidades de unirse específicamente a flk-1 (VEGFR-2) y bloquear la activación del receptor a niveles comparables con aquel observado para DC-101.

EJEMPLO III. ENSAYOS Ejemplo III-1. Métodos ELISA Los anticuerpos se evaluaron mediante ELISA en estado sólido en el cual se compararon las características de la unión de los diferentes mAb a flk-1 (VEGFR-2 ): SEAP y proteína SEAP. Las placas de microtítulos se recubrieron con 50-100 ng/receptáculo de flk- 1 : SEAP o AP en tampón carbonato a pH 9,6 toda la noche a 4°C. La placas se bloquearon con solución salina con tampón fosfato con suplemento de 10% de suero de ternero recién nacido (NB10) durante una hora a 37 °C. Los sobrenadantes de hibridomas o anticuerpos purificados se agregaron a las placas durante dos horas a 37 °C y luego IgG anti-rata de cabra conjugada a peroxidasa de rábano picante (Tago) se agregó durante otra hora a 37°C. Después de un lavado extenso, se agregó TMB (Kirkegaard y *·- Perry, Gaithersburg MD) más peróxido de hidrógeno como el cromógeno y las placas se leyéronla 450 nm en un lector de ELISA.

Ejemplo III-2. Formación de Isotipos La formación de isotipos de diferentes anticuerpos monoclonales se hizo como se describió previamente (Songsakphisarn, R. Y Goldstein, N.I., Hibridoma 12: 343-348, 1993) usando reactivos específicos de isotipos de ratas (Zymed Labs, South San Franci'sco CA) .

Ejemplo III-3. Ensayos de Fosforilación, In unoprecipitación e Inmunotransferencia Los ensayos de fosforilación y análisis de inmunotransferencia (Western blot) con células C441 y 10A2 se realizaron como se describió previamente (Tessler et al, 1994) con algunas modificaciones. En resumen, las células crecieron al 90% de confluencia en DME-10% CS y luego el suero en DME-0,5% CS durante 24 horas antes de la experimentación. Células HUVEC crecieron a por debajo de la confluencia en medios básales de EGM. Para los análisis de neutralización, se estimuló a las células con diferentes concentraciones del ligando apropiado en condiciones sin suero (DEM-0,1% BSA) en la presencia y ausencia de mAb DC-101 durante 15 minutos a temperatura ambiente . Los ligandos, VEGF y CSF-1, fueron analizados a concentraciones de 10-80 ng/ml y de 20-40 ng/ml, respectivamente. Los anticuerpos monoclonales fueron ensayados a concentraciones en la gama de 0,5 µ9/p?1 a 10 µ9/p?1. Para evaluar los efectos de mAb DC-101 sobre la activación del receptor flk-1 (VEGFR-2 ) -fms inducida por el VEGF, el anticuerpo se agregó simultáneamente (inhibición competitiva) o previamente unido a células durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de al agregado del ligando. Las células incubadas en un medio sin suero en la ausencia y presencia de DC-101 sirvieron como controles para la autofosforilación del receptor en la ausencia del ligando y en la presencia del anticuerpo, respectivamente. Una línea de células control que expresa el receptor quimérico fms/FLK-2 (10A2) fue estimulada con 20 ng/ml y 40 ng/ml de CSF-1 y ensayada en la presencia y ausencia de 15 µ /?1 de DC-101.

Después de la estimulación, las monocapas se lavaron con PBS congelado que contenía 1 mM ortovanadato de sodio. Luego las células se lisaron en tampón de lisis (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% Tritón X-100, 137 mM NaCl, 10% de glicerol, 10 mM EDTA, 2 mM ortovanadato de sodio, 100 mM NaF, 100 mM pirofosfato de sodio, 5 mM Pefabloc (Boehringer Mannheim Biochemicals., Indianapolis IN) , 100 µg de aprotinina y 100 µg/ml de leupeptina) y se ''centrifugaron a 14.000 x g durante 10 minutos. La proteína se inmunoprecipitó desde lisados aclarados de células transfectadas usando anticuerpos policlonales generados para péptidos correspondientes a la región de la extremidad de C del receptor fms humano (Tessler et al, J. Biol . Chem. 269, 12456-12461, 1994) o el dominio de interleucina FLK-2 de ratón (Small et al, Proc . Nat'l Acad. Sci. USA, 91, 459-463, 1994) acoplado a cuentas de Sefarosa de Proteína A. Cuando se indicó, las inmunoprecipitaciones con DC-101 o IgG de rata irrelevante' se realizaron con 10 µg de anticuerpo acoplado a cuentas de Proteína G. Las cuentas luego se lavaron una vez con 0,2% de Tritón X-100, 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA (Tampón A), dos veces con Tampón A que contiene 500 mM NaCl y dos veces con Tris-HCl, a pH 8,0. Las cuentas drenadas se mezclaron con 30 µ? en 2x tampón de carga SDS y se sometieron a SDS PAGE en 4%-12% de gradiente de geles (Novex, San Diego CA) . Después de la electroforesis , las proteínas se inmunotransfirieron a filtros de nitrocelulosa para el análisis. Los filtros se bloquearon toda la noche en tampón de bloqueo (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl (TBS) que contiene 5% de albúmina de suero bovino y 10% de leche deshidratada sin grasa (Biorad, CA) . Para detectar el receptor fosforilado, se sondearon manchas con un anticuerpo monoclonal dirigido a fosfotirosina (UBI, Lake Placid, NY) en tampón de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. Las manchas se lavaron luegó extensamente con 0,5 x TBS qúe "contiene 0,1% de Tween 20 (TBS-T) y se incubaron con Ig anti-ratón de cabra conjugada a peroxidasa de rábano picante (Amersham) . Las manchas se lavaron con TBS y se incubaron durante 1 minuto con un reactivo de quimiolumininscencia (ECL, Amersham) . La anti - fosfotirosina que reacciona con proteínas fosforiladas se detectó mediante la exposición a una película de detección de luminiscencia de alto rendimiento (Hyperfilm-ECL, Amersham) durante 0,5 a 10 minutos'.

Para detectar flk-1 (VEGFR-2 ) /fms en niveles de receptor de células C441, las manchas se rasparon de acuerdo con los protocolos del fabricante (Amersham) y se sondearon nuevamente con anticuerpo policlonal de conejo anti-fms.

Ejemplo III-4. Ensayos de Unión Citó etro de Flujo Células C441 crecieron hasta cerca de la confluencia en placas de 10 cm. Las células se removieron con un tampón de disociación no enzimático (Sigma) , se lavaron en un medio sin suero frío y se suspendieron nuevamente en una solución de sal equilibrada de Hanks con suplemento de 1% de BSA (HBSS-BSA) a una concentración de 1 millón de células por tubo. DC-101 de Ab monoclonal o un anticuerpo anti FLK-2 23H7 irrelevante emparejado de isotipo se '""agregó a 10 µg por tubo durante 60 minutos sobre hielo. Después de lavar, 5 µ? de IgG anti-ratón de cabra conjugado a FITC (TAGO) se agregó durante otros 30 minutos sobre hielo. Las células se lavaron tres veces, se suspendieron nuevamente en 1 mi de HBSS- BSA, y se analizaron sobre un Citómetro Coulter Epics Elite. La unión no específica del anticuerpo secundario fluorescente se* determinó desde muestras que no tenían el anticuerpo principal.

Ejemplo III-5. Análisis de Unión a Células Intactas Los ensayos con células C441 se realizaron con células crecidas hasta la confluencia en cubetas de 24 receptáculos. Las células HUVEC crecieron hasta la confluencia en cubetas de 6 receptáculos. Las monocapas se incubaron a 4°C durante 2 horas con diferentes cantidades de DC-101 de mAb en tampón de unión (DME , 50 mM HEPES a pH 7,0, 0,5% de albúmina de usero bovino). Las células luego se lavaron con solución salina con tampón de fosfato fría (PBS) y se incubaron con un anticuerpo IgG anti-rata secundario conjugado con biotina a una concentración final de 2,5 µg/ml . Después de 1 hora a 4°C la células se lavaron e incubaron con un complejo de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante durante 30 minutos a 4°C. Después del lavado, el anticuerpo unido a las células se determinó midiendo la absorbencia a 540 nm ''obtenida con un sistema de detección colorimétrico (TMB, Kirkegaard y Perry) . La OD a 540 nm del anticuerpo secundario solo servio como el control para la unión no específica.

Ejemplo III-6. Ensayos de proliferación de células Se realizaron ensayos mitogénicos usando el Kit del Ensayo de Proliferación de Células No Radioactivo Cell Titer 96 (Promega Corp. , Madison, WI) . En este ensayo la proliferación se mide clorimétricamente como el valor obtenido de la reducción de una sal de tetrazolio por células viables para un producto formazan. En resumen, células HUVEC crecieron en placas recubiertas con gelatina de 24 receptáculos en medios básales de EGM a 1.000 células/receptáculo. Después de una incubación de 48 horas, se agregaron diferentes componentes a los receptáculos. Se agregó VEGF a 10 ng/ml a los medios en la presencia y ausencia de 1 µg/ml de DC-101 de mAb. Cuando se indicó, se agregó heparina (Sigma) a una concentración final de 1 µg/ml . Las células luego se incubaron durante otros 3 días. Para medir el crecimiento de las células, se agregó una alícuota de colorante de colorante de tratazolio de 20 µ? a cada receptáculo y las células se incubaron durante 3 horas a 37°C. Las células se solubilizaron y la absorbencia (OD570) cleJ^ producto formazan se midió como una. cuantificación de la proliferación! EJEMPLO IV. ENSAYOS DE ACTIVIDAD IN VITRO Ejemplo IV-1. Los Mab 25 y 73 anti-flk-1 (VEGFR-2) de ratón producen una neutralización específica de la activación del receptor flk-1 (VEGFR-2) /fms inducida por VEGF Los ensayos se realizaron con receptores FLK/fms y de PDGF inmunoprecipitados desde concentraciones iguales de la línea de células 3T3 transfectadas con flk-1 (VEGFR-2 ) /fms, C441 mientras que el EGFR humano se inmunoprecipitó desde la línea de células de tumor, KB. Las células se estimularon con RPMI-0,5% BSA que contiene 20 ng/ml de VEGF (flk l/fms) , DMEM-10% de suero de ternero (PDGFR) , o 10 ng/ml de EGF (EGFR) , en la presencia y ausencia de 10 g/ml de los Mab 25 y 73 anti-flk-1 de ratón. Después de la estimulación, las células se lavaron con PBS-1 m ortovanadato de sodio y se lisaron. Flk-l/fms y PDGFR se inmunoprecipitaron desde lisados con anticuerpos policlonales generados por péptidos contra la región de extremidad de C de los receptores c-fms (IM 133) y PDGF (UBI), respectivamente. EGFR se inmunoprecipitó con un Mab (C225) creado contra la región de extremidad de N del receptor humano. Los lisados inmunoprecipitados se sometieron a electroforesis de SDS pliacrilamida seguida por inmunotransferencia . Las manchas se sondearon con un Mab anti-PTyr (UBI) para detectar la activación del receptor. La neutralización del receptor de células estimuladas se evaluó en relación con un Mab irrelevante y el control sin estimulación.

Ejemplo IV-2. Detección del receptor flk-2 (VEGFR-2) /fms mediante inmunotransf rencia usando Mab 25 y Mab 73 como sondas El receptor fue detectado por los Mab anti-flk-1 (VEGFR-2) de ratón en inmunotransferencias del receptor flk-1 (VEGFR-2 ) /fms inunoprecipitado por un anticuerpo policlonal generado por péptidos contra la región de extremidad de C del receptor fms desde lisados preparados desde concentraciones iguales de la línea de células 3T3 transfectadas C441. Después del análisis mediante electroforesis de gel SDS e inmunotransferencia, la mancha se dividió en cuatro partes y cada sección se sondeó con 50 µ9/p?1 de los Mab 25 y 73 anti-flk-11 (VEGFR-2) . Las manchas luego se rasparon y se sondearon nuevamente con el anticuerpo policlonal anti-fms para verificar que las bandas detectadas por cada Mab representaban el" receptor flk-1 (VEGFR-2 ) /fms .

''Ejemplo IV-3. Detección de KDR (VEGFR-2) activado desde células HUVEC y OVCAR-3 estimuladas por VEGF mediante inmunoprecipitacion con Mab 25 y 73 anti-flk-1 (VEGFR-2) Las proteínas fueron inmunoprecipitadas por diferentes anticuerpos desde un lisado de HUVEC recién aisladas. Antes de la lisis, las células fueron estimuladas con 20 ng/ml de VEGF durante 10 minutos a temperatura ambiente en RPMI-0,5% BSA y se lavaron con PBS que contiene 1 mM ortovanadato de sodio. Las inmunoprecipitaciones individuales se realizaron con volúmenes iguales de lisado y luego se sometieron a electroforesis de poliacrilamida de SDS seguida por inmunotransferencia . La mancha se sondeó inicialmente con un Mab anti-PTyr (UBI) y luego se rasparon consecutivamente y se sondearon nuevamente con un anticuerpo policlonal generado por péptidos contra la intercinasa de flk-l/KDR (VEGFR- 1/VEGFR-2 , IM 142) , seguida por un anticuerpo policlonal contra la región de extremidad de C de flk-1 (VEGFR-1 ) (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Las inmunoprecipitaciones se realizaron con un Mab de rata irrelevante, 23H7, un ab de ratón irrelevante, DAB 8( contra los Mab anti-flk-1 (VEGFR-2 ) , DC-101, 73, 25 y un anticuerpo policlonal anti-flk-l/KDR (VEGFR-1/VEGFR- 2) , 1M 142. En algunos casos las manchas se rasparon y se sondearon nuevamente con los Mab 73 y 25 anti-flk-1 para detectar '-bandas reactivas cruzadas. - ^ Se empleó un protocolo similar para detectar la forma (s) de receptor KDR (VEGFR-2 ) en la línea de células de carcinoma de ovario OVCAR-3.

EJEMPLO V. ACTIVIDAD DE LOS ANTICUERPOS Ejemplo V-l. ELISA e Inmune/precipitación con DC-101 Se halló que DC-101 de anticuerpo monoclonal IgGl de rata es específico para el receptor de tirosina cinasa de ratón flk-1 (VEGFR-2 ) . Los datos del ELISA mostraron que el anticuerpo se unió a flk-1 (VEGFR-2) : SEAP purificado pero no a fosfatasa alcalina u otras tirosina cinasas receptoras como FLK-2. Como se ve en la Figura 1, DC-101 inmunoprecipita flk-1 (VEGFR-2) : SEAP pero no SEAP sola.

Ejemplo V-2. Inhibición de la Fosforilación del Receptor Flk-1 (VEGFR-2) con DC-101 Luego se realizaron experimentos para determinar si DC-101 podía neutralizar la fosforilación de flk-1 (VEGFR-2) en células C441 con su ligando análogo, VEGFn65 . En estos estudios, el anticuerpo monoclonal y VEGF se agregaron simultáneamente a monocapas '-durante 15 minutos a temperatura ambiente. Estas condiciones se diseñaron para determinar los erectos competitivos (inhibición competitiva) del anticuerpo sobre la unión de receptor/1igando .

Los resultados de estos ensayos, mostrados en la Figura 2a, indican que la fosforilación del receptor flk-1 (VEGFR- 2 ) /fms inducida por VEGFi65 se redujo marcadamente cuando las células se ensayaron en la presencia de DC-101. Además, estos datos sugieren que Mab compite con VEGF165 para prevenir una activación completa del receptor por el ligando. Para determinar la sensibilidad 'de la interacción VEGF- flk-1 (VEGFR-2) a la inhibición por DC-101, se ensayaron células C4411 a las concentraciones estimuladoras máximas de VEGFi6s (40 ng/ml) combinadas con niveles variables del anticuerpo. Los resultados de estos títulos de Mab se muestran en la Figura 2b. Se observó una reducción marcada en la fosforilación de flk-1 (VEGFR-2) por VEGF16S cuando DC-101 se incluyó a concentraciones superiores a 0,5 µg/ml . Estos datos muestran que concentraciones relativamente bajas del anticuerpo (<1 µ9/?t?1) son suficientes para inhibir la activación del receptor por el ligando. A 5 µg/ml el anticuerpo puede neutralizar la estimulación por VEGF1S5 de flk-1 (VEGFR-2) en la presencia de exceso de ligando a 80 ng/ml (Figura 3a y 3b) . Como control, el efecto de DC-101 se ensayó en el receptor fms/FLK-2 (línea de células 10A2) completamente estimulado usando CSF-1. En estas condiciones, DC-101 mostró no ningún efecto sobre la activación del receptor.

Ejemplo V-3. Estudios de Inhibición con DC-101 La magnitud y especificidad de la inhibición de Mab se evaluó también mediante estudios en los cuales DC-101 se preincubó con células antes de agregar el ligando para permitir la interacción máxima del anticuerpo con el receptor. En estos experimentos, las monocapas se incubaron con 5 g/ml de DC-101, un Mab anti-FLK-2 de rata (2A13) preparado mediante técnicas convencionales (ImClone, NY) e IgGl de rata control (Zymed Labs) durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de agregar 40 ng/ml de VEGFi65 durante otros 15 minutos. Para la comparación, se realizaron ensayos en los cuales DC-101 y VEGFi65 se agregaron simultáneamente (inhibición competitiva) . Los resultados de estos estudios (Figura 4) muestran que la preincubación del anticuerpo monoclonal anti-flk-1 (VEGFR-2) con células transíectadas con flk-1 (VEGFR-2 ) /fms anula completamente la activación del receptor por VEGFi6S. Se observaron resultados similares usando VEGF121 para la estimulación. Si bien la fosforilación de flk-1 (VEGFR-2) por VEGF no se ve afectada por el agregado de anticuerpos de rata emparejados de isotipo irrelevante, la reactividad de la misma mancha sondeada con el anticuerpo --policlonal anti-fms muestra un nivel igual de proteína recetorá' por carril. Estos datos indic¾n que la inhibición de la fosforilación observada con DC-101 se debió al bloqueo de la i activación del receptor en lugar de la falta de proteína receptora en la muestras de ensayo.

Ejemplo V-4. Unión de DC-101 a células C441 mediante análisis FACS El mAb se ensayó mediante análisis FACS para la unión a células 3T3 transíectadas con el receptor flk-1 (VEGFR- 2 ) /fms (células C441) . Los resultados, que se muestran en la Figura 6, demuestran que el flk-1 (VEGFR-2 ) /fms quimérico expresado en la superficie de las células C441 es específicamente reconocido por DC-101 de mAb y no por un anticuerpo del mismo isotipo creado contra el receptor de tirosina cinasa relacionado, FLK-2. La eficacia de la interacción de mAb-receptor en la superficie de la célula se determinó desde ensayos en los cuales los niveles variables de la unión de mAb se midieron en células C441 intactas. Estos resultados, que se muestran en la Figura 7, indican que mAb se une al receptor flk-l (VEGFR-2 ) /fms con una afinidad aparente relativa de aproximadamente 500 ng/ml. Estos resultados indican que el mAb tiene una fuerte afinidad para el flk-l (VEGFR-2) expresado en la superficie de la célula.

Ejemplo V-5. Reactividad de DC-lDl mediante inmunoprecipitación La magnitud de la reactividad de DC-101 con el receptor flk-l (VEGFR-2 ) /fms sé evaluó además determinando la capacidad del anticuerpo de inmunoprecipitar el receptor después de la activación por VEGF . La Figura 8 muestra una inmunoprecipitación por DC-101 de mAb del receptor flk-l (VEGFR-2 ) /fms fosfroilado desde células C441 estimuladas por VEGF. Los resultados muestran que los anticuerpos monoclonal DC-101 y policlonal anti-fms presentan niveles similares de interacción del receptor mientras que los anticuerpos anti FLK-2 de rata 2H37 (IgGl) y 2A13 (IgG2a) no muestran ninguna reactividad. Luego se realizaron experimentos para determinar si DC-101 de mAb podían neutralizar la fosforilación inducida por VEGF de flk-l (VEGFR-2 ) /fms a la concentración estimuladora máxima del ligando (40 ng/ml) . En estos estudios, el anticuerpo monoclonal se agregó a monocapas simultáneamente con el ligando o antes de la estimulación del ligando y se ensayó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Estas condiciones se estudiaron para determinar tanto los efectos competitivos (inhibición competitiva) del anticuerpo sobre la unión receptor/ligando como la eficacia del anticuerpo unido previamente para prevenir la activación del receptor. Los resultados de estos ensayos, que se muestran en la Figura 4, '-indican que la fosforilación del flk-1 (VEGFR-2 ) /fms es reducida por el agregado simultáneo" de"*"mAb con VEGF y marcadamente inhibida por el anticuerpo unido previamente al receptor. Una exploración de densitometría de estos datos reveló que DC-101 de mAb interactúa con flk-1 (VEGFR-2 ) /fms para inhibir la fosforilación a un nivel que es del 6% (carril 5, P) y del 40% (carril 6, C) del receptor estimulado completamente control (carril 4) . A partir de estos datos deducimos que DC-101 de mAb compite fuertemente con la interacción ligando-receptor para neutralizar la activación del receptor flk-1. Para determinar la sensibilidad de la interacción VEGF- flk-1 (VEGFR-2) a la inhibición por DC-101 de mAb, las células C441 se ensayaron con niveles máximoas de VEGF en la presencia de concentraciones crecientes del anticuerpo. Los ensayos se realizaron con el mAb en condiciones competitivas y de unión previa. Los resultados de estos títulos de mAb se muestran en la Figura 9. Se observa una reducción marcada en la fosforilación de flk-1 (VEGFR-2) cuando DC-101 de mAb compite con el anticuerpo de VEGF a concentraciones superiores a 0,5 µ9/?t?1. Estos datos también muestran que concentraciones relativamente bajas del anticuerpo unido previamente (<1 µ9/½1) son suficientes para inhibir completamente la activación del receptor por el ligando.

Ejemplo V-6. Actividad de DC-101 mediante ensayo de fosforilación Para evaluar adicionalmente el comportamiento antagonista de DC-101 de mAb sobre la activación de,l receptor, se realizaron ensayos de fosforilación en los cuales una cantidad fija del anticuerpo (5 µg/ml) se agregó a las células C441 estimuladas con cantidades crecientes de ligando (Figura 3a) . El nivel de fosforilación inducido por cada concentración del ligando en la presencia y ausencia de DC-101 de mAb también se cuantificó mediante lecturas de densitometría . El gráfico de estos datos dados en la Figura 3b indica que el anticuerpo pudo neutralizar parcialmente la fosforilación del receptor en la presencia de cantidades excesivas de VEGF. Para evaluar la especificidad de DC-101 de mAb sobre la activación del receptor, el anticuerpo se ensayó en cuanto a su capacidad de inhibir competitivamente la activación inducida por CSF-1 del receptor fms/FLK- 2 en la línea de células transfectada con 3T3 , 10A2. En estos experimentos 5 µ9/p?1 de DC-101 de mAb se ensayó junto con concentraciones de CSF-1 (20-40 ng/ml) que se sabe que derivan en la activación total del receptor. Estos resultados, que se muestran en la Figura 10, indican que DC-101 de mAb no tiene ningún efecto sobre la fosforilación mediada por CSF-1 del recepto fms/FLK-2.

Ejemplo V-7. Inhibición de DC-101 mediante estudios de *~preincubacion La magnitud y especificidad de la inhibición de anticuerpos se evaluó adicionalmente mediante estudios en los cuales DC-101 o un anticuerpo irrelevante se preincubó con células antes de agregar el ligando para asegurar la interacción máxima del anticuerpo con el receptor. En estos experimentos, las monocapas se preincubaron con 5 µg/ml de DC-101, un mAb anti-FLK-2 de rata (2A13) o una IgGl de rata control (Zymed Labs) antes de agregar 40 ng/ml de VEGF. Para la comparación, se realizaron ensayos competitivos en los cuales los anticuerpos y VEGF se agregaron simultáneamente. Los resultados de estos estudios muestran que solmente la preincubacion del anticuerpo monoclonal anti-flk-1 (VEGFR-2) con células transfectdas con flk-1 (VEGFR-2) /fms anula completamente la activación del receptor por VEGF mientras que la fosforilación de flk-1 (VEGFR-2 ) por VEGF no se ve afectada por el agregado de anticuerpos de rata emparejados de isotipo irrelevante. La reactividad de la misma mancha sondeada con el anticuerpo policlonal anti-fms (Figura 11) muestra un nivel igual de proteína receptora por carril. Estos datos indican que la falta de fosforilación observada con las células tratadas con DC-101 de mAb se debió al bloqueo de una fosforilación inducida por VEGF de cantidades iguales del receptor expresado.

Ejemplo V-8. Interacción de anticuerpos con formas homologas del receptor i Luego se realizaron experimentos para determinar si los anticuerpos monoclonales anti-flk-1 (VEGFR-2) interactúan con formas homologas del receptor en células endoteliales humanas. Un título de concentraciones crecientes de DC-101 en células HUVEC clonadas (ATCC) indicó que el anticuerpo presentó ' un comportamiento de unión al complejo. Los datos representan interacciones diferenciales del anticuerpo con receptores de VEGF que se informa que ocurren en células endoteliales (Abi'sman et al, J. Biol. Chem. 265, 19461- 19466 , 1990 ) . La especificidad de la interacción de DC-101 con células HUVEC estimuladas por VEGF luego se enfrentó usando ensayos de fosforilación en condiciones similares a las informadas para la Figura 8. En estos estudios las bandas de proteínas de inmunoprecipitados de DC-101 de células HUVEC que tienen pesos moleculares similares a aquellos informados para bandas de receptor de VEGF entrecruzadas cuando se resta el componente del ligando (Figura 12) . Estas bandas presentan una fosforilación aumentada cuandó las células son estimuladas por VEGF (comparar los carriles 1. y 2 en la Figura 12) . Además, la fosforilación inducida por VEGF de las bandas del receptor es potenciada por la inclusión de 1 µg/ml de heparina en el ensayo (carril 3 en la Figura 12) . Estos hallazgos son coherentes con los informes previos de unión de VEGF aumentada a las células endoteliales en la presencia de bajas concentraciones de heparina (Gitay-Goren et al, J. Biol . Chem. 267, 6093-6098, 1992) .

Es difícil determinar qué proteína inmunoprecipitada interactúa con DC-101 para generar el complejo de bandas fosforiladas que se observa en la Figura 12 dadas las diferentes formas que se muestra que se unen a VEGF en HUVEC y la posibilidad de su asociación al estimularlas. Se ha informado que formas de receptores expresadas en la superficie de la célula con pesos moleculares de aproximadamente 180 (KDR ( EGFR-2 ) ) , 155, 130-135, 120-125 y 85 se unen a VEGF en HUVEC. Tales hallazgos enfrentan la posibilidad de que varias formas de receptores diferentes puedan heterodimerizarse al estimular el ligando en una forma similar a aquella informada para KDR-flk-1 (VEGFR-2/VEGFR- 1 ) . Sin embargo, con la excepción de KDR (VEGFR-2) , aún se debe definir la naturaleza y el rol preciso de estas formas de receptor. En consecuencia, la reactividad del anticuerpo puede derivar de la interacción (es) con uno de varios receptores de VEGF independientes de KDR (VEGFR-2) .

"^DC-lOl no reacciona con KDR humano (VEGFR-2) en un formato de ELISA ni se une a HUVEC recien""aisladas mediante el análisis de FACS . Estos resultados sugieren que es altamente improbable una interacción directa de DC-101 con KDR humano (VEGFR-2) .

A diferencia de DC-101, Mab 25 y Mab 73 ambos reaccionan con KDR humano (VEGFR-2) en un formato de ELISA y se unen a HUVEC recién aisladas mediante el análisis de FACS.

Ejemplo V-9. Ensayos mitógenos de HUVEC Se observó un efecto inhibidor de DC-101 sobre las células endoteliales cuando el anticuerpo se ensayó en ensayos mitogénicos de células HUVEC (ATCC) estimuladas con VEGF en la presencia y en la ausencia del anticuerpo (Figura 12). Estos resultados muestran que un marcado aumento en la proliferación de células por VEGF es reducido aproximadamente un 35% por DC-101. Heparina no muestra ningún efecto diferencial sobre el crecimiento celular en las condiciones de crecimiento empleadas en estos días.

Dado que DC-101 puede ejercer efectos sobre la proliferación inducida por VEGF la fosforilación del receptor de HUVEC es concebible que estos resultados se deban a una interacción de Mab con una forma de receptor indefinida que es pobremente accesible en la superficie celular, pero"*"que juega algún papel, aunque menor, en el crecimiento de HUVEC. Además, la inmunoprecipitación de bandas fosforiladas del peso molecular correcto por DC-101 desde HUVEC estimuladas por VEGF también apoya la noción de que DC-101 puede interactuar con un flk-1 (VEGFR-2) indefinido como la proteína que se asocia con un complejo de receptor activado.

Ejemplo V-10. Unión de Mab 25 y Mab 73 a células C441 y HUVEC ' Los Mab 25 y 73 se unen a C441 y HUVEC mediante el análisis FACS y muestran la internalización en ambas líneas de células. Los resultados de las inmunotransferencias muestran que ambo Mab anti- flk-1 pueden detectar la band (s) para el receptor FLK/fms en inmunoprecipitados por un anticuerpo policlonal anti-fms desde células C441. (Ver el ejemplo IV-2 anterior para el protocolo).

Estos anticuerpos producen una neutralización específica de la activación inducida por VEGF del receptor flk-1 (VEGFR-2) /fms y no tienen ningún efecto sobre la fosforilación del receptor de PDGF por PDEGF o el receptor de EGF humano por EGF . (Ver el ejemplo IV- 1 precedente para el protocolo) . Tienen la capacidad de inhibir HUVEC estimuladas por VEGF en ensayos de proliferación al 50% mientras que DC-101 afecta el crecimiento en una magnitud mucho mayor.

Ejemplo V-ll. Inmunoprecipitácioñ' de KDR (VEGFR-2) con Mab 25 y Mab 73 KDR (VEGFR-2) representa una de las fosfoproteínas inmunoprecipitadas por el Mab 25 y el Mab 73 desde HUVEC activadas. KDR (VEGFR-2) se detectó en los análisis inmunotransferencia y de inmunoprecipitácioñ usando un anticuerpo policlonal anti-flk-l/KDR (VEGFR-2/VEGFR- 1) (IM142) desde HUVEC del primer paso estimuladas por VEGF. A la inversa, las bandas inmunoprecipitadas por estos anticuerpos desde HUVEC estimuladas por VEGF . son reactivas cruzadas con IM142 pero no con un anticuerpo policlonal anti-flk-1 (anti -VEGFR- 1 ) . Estos hallazgos deducen que los Mab pueden afectar la actividad de KDR (VEGFR-2) en HUVEC basado en las pruebas experimentales que implican a KDR (VEGFR-2) como el receptor de VEGF responsable de la respuesta proliferativa en células endoteliales activadas. (Ver el ejemplo IV-3 anterior para el protocolo.) EJEMPLO VI. PRESENCIA DE FORMAS DE RECEPTOR DE VEGF EN CÉLULAS NO ENDOTE IALES (TUMORES) Se evaluaron varias líneas de tumores para la reactividad con DC-101 mediante inmunoprecipitación y detección con antifosfotirosina . Las inmunotransferencias desde líneas de células 8161 (melanoma) y Á43 " (carcinoma epidermoide) dieron bandas fosforiladas con pesos moleculares de aproximadamente 170 y 120 kD. Estos resultados indican que una forma de receptor de VEGF humano se expresa en células no endoteliales, tales como células de tumores.

Experimentos similares han demostrado que un receptor similar a KDR (VEGFR-2) se expresa en una línea de células de carcinoma ovárico, OVCAR-3. Estas células también parecen segregar VEGF. Las bandas fosforiladas son inmunoprecipitadas por un anticuerpo policlonal anti-KDR (VEGFR-2) desde células de OVCAR-3 estimuladas por VEGF que son reactivas con Mab anti-flk-1 (VEGFR-2) mediante inmunotransferencia . Además, las bandas inmunoprecipitadas por Mab de ratón desde estas células muestran reactividad cruzada con el mismo anticuerpo policlonal. Más aún, ciertos Mab anti-flk-1 (VEGFR-2 ) de ratón producen un efecto inhibidor sobre estas células en ensayos de proliferación. Estos resultados demuestran la expresión no endotelial (es decir, en células de tumores) de formas de receptores de VEGF humanos. Los datos de los ensayos de fosforilación y proliferación también sugieren que VEGF puede modular la actividad del receptor en una forma autocrina y paracrina durante la tumorigénesis . (Ver el Ejemplo IV-3 anterior para el protocolo) .

EJEMPLO VII. ESTUDIOS IN VIVO' USANDO DC-101 i Ejemplo VII-1. Inhibición in vivo de angiogénesis por DC-101 Se diseñaron estudios in vivo para determinar si un anticuerpo monoclonal anti-flk-1 (VEGFR-2) bloquearía el crecimiento de las células de tumores que expresan VEGF. En estos experimentos, se usó una línea de células mutivorme de glioblastoma hmano que tiene elevados niveles de mensaje de VEGF y segrega 5 ng/ml del factor de crecimiento VEGF después de un acondicionamiento de 24 horas en un medio sin suero (Figura 5) .

El día cero, ratones desnudos atínicos (nu/nu; Charles River Labs) fueron inyectados en el costado con 1-2 millones de células de glioblastoma. Comenzando el mismo día, los animales recibieron inyecciones intraperitoneales de DC-101 y anticuerpos control (100 µg animal). Los ratones recibieron tratamientos con anticuerpos posteriores los días 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17, 19 y 21. Los animales recibieron inyecciones de 100 µg de DC-101 o un anticuerpo de rata control al receptor FLK-2 (2A13) de rata los días 0, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17, 19 y 21 para . una inoculación total de 1 mg/animal. Los tumores empezaron á aparecer hacia el día 5 y continuaron durante 50 días. El tamaño de los tumores se midió diariamente con un calibre y el volumen de los tumores se alculó mediante la siguiente fórmula: p/6 x diámetro mayor x (diámetro menor)2 (Baselga J. Nat'l Qancer Inst. 85: 1327-1333). Las mediciones se tomaron al menos tres veces por semana y el volumen de los tumores se calculó como se describió anteriormente. Un animal que tenía tumores del grupo DC-101 murió temprano en el estudio y no se lo usó para determinar la significación estadística entre los grupos.

Las Figuras 14a y 14b muestran una comparación entre el grupo DC-101 y el grupo 2A13 control de la reducción en el crecimiento de los tumores durante 38 días en animales individuales. Aunque todos los animales desarrollaron tumores de tamaños y cantidad variables durante el transcurso del estudio, los ratones tratados con DC-101 mostraron un retardo total en el avance de los tumores. Un ratón del grupo DC-101 se mantuvo sin tumores hasta el día 49 cuando se observó un crecimiento pequeño. Aún entonces, el crecimiento del tumor fue marcadamente suprimido. El análisis estadístico de los datos se hizo para evaluar las diferencias en el tamaño de los tumores entre los dos grupos . Los datos se sometieron a un análisis de covariancia estándar en el cual el tamaño de los tumores decreció a tiempo con el tratamiento como covariable . Los resultados mostraron que la reducción en el - tamaño de los tumores en el tiempo para el grupo DC-101 fue significativamente diferente" (p"<Ó,0001) desde aquel observado para los ratones inyectados con 2A13.

La Figura 15 muestra la eficacia terapéutica de DC-101 en ratones desnudos atínicos a los cuales se transplantó una línea de células de tumores de glioblastoma humano GMB-18, que segrega VEGF . Se inyectó a los ratones desnudos en forma subcutánea con células GBM-18 y se los dividió en tres grupos de tratamiento:' un control PBS, un control IgGl de rata irrelevante, y DC-101. Los tratamientos se admimistraron simultáneamente con xenoinjertos de tumores y continuaron durante cuatro semanas. Los resultados mostraron que el crecimiento de los tumores de GBM-18 en ratones desnudos tratados con DC-101 se redujo significativamente en relación con los controles. Este experimento indica que DC-101 suprime el crecimiento de tumores bloqueando la activación por VEGF de flk-1 (VEGFR-2) en células endoteliales vasculares asociadas con tumores, y que DC-101 tiene valor terapéutico como reactivo antiangiogénico contra tumores vascularizados que segregan VEGF.

Los anticuerpos monoclonales para tirosina cinasa receptor flk-1 (VEGFR-2) inhiben la invasión de tumores eliminando la angiogénesis . El crecimiento invasivo y la angiogénesis son características esenciales de los tumores malignos. Ambos fenómenos demostraron ser " acTécuados para discriminar los queratinocitos benignos de los malignos en un ensayo de i transplante de superficie. Después del transplante de una monocapa de células unida a gel colágeno sobre el músculo posterior de ratones desnudos, todas las células de tumores inicialmente formaron epitelios escamosos organizados, pero solamente los queratinocitos malignos crecieron en forma invasiva dentro de 2-3 semanas. Tanto las células benignas como las malignas indujeron la angiogénesis. La respuesta angiogénica a las células malignas, sin embargo, ocurrió antes, es mucho más fuerte, y el crecimiento capilar se dirigió hacia los epitelios malignos. Más aún, en los transplantes de células de tumores benignos, los vasos capilares decrecieron después de 2-3 semanas, mientras que los queratinocitos malignos mantienen el nivel de angiogénesis continua. El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y su receptor análogo juegan un papel pivotal en la angiogénesis de tumores. La administración de DC-101 interrumpió la angiogénesis continua derivando en la inhibición de la invasión de tumores. El anticuerpo impidió la maduración y la mayor expansión de la red vascular formada nueva, pero no interfiró significativamente con la inducción inicial de la angiogénesis. Estos resultados ofrecen pruebas de que la invasión de tumores requiere la angiogénesis previa, y que los receptores de VEGF son cruciales para mantener la angiogénesis en esté sistema modelo. * ~""*~ Ejemplo VII-2. Efecto de diferentes concentraciones de DC-101 sobre tumores de glioblastoma establecidos (gbm-18) Ratones atínicos (nu/nu) fueron inoculados en forma subcutánea con GBM-18 (glioblastoma multiforme humano) . La terapia de anticuerpos se inició cuando los tumores alcanzaron un volumen promedio de 100-200 mm3. El tratamiento consitió en seis inyecciones (dos veces por semana durante 3 semanas) de lo siguiente: (i) DC-101 a 200, 400 o 800 µg/inyección; (ii) una IgG de rata emparejada de isotipo irrelevante (400 µg/inyección) ; o (iii) PBS . Los volúmenes de los tumores se midieron con un calibre. Se halló que la inhibición de los tumores en los grupos DC-101 fue significabiva (*) comparada con los grupos PBS y anticuerpo monoclonal irrelevante.

Otro experimento demuestra los efectos del anticuerpo monoclonal anti-flk-1 (VEGFR-2) de rata DC-101 sobre el crecimiento de los tumores de GBM-18 en ratones desnudos. Los animales (nu/nu; Charles River Labs; diez animales por grupo) fueron inyectados en forma subcutánea con células GBM-18 (glioblastoma humano *[100] ; 1 "-millón por animal) el día 0. Los . tratamientos con PBS o DC-101 (200 µg por inyección) se iniciaron el día 7 y continuaron dos veces por semana durante 3 semanas (6x) . Los gráficos muestran un gráfico de los volúmenes de tumores medios y los datos de regresión para cada grupo con el tiempo con sus respectivos índices de crecimiento de tumor (las pendientes se dan como ?; líneas llenas) y límites de confianza del 99% (líneas de puntos) . La pendiente de la línea para lo animales tratados con DC-101 fue significativamente diferente de la de PBS (p<0,01). Es importante indicar que un anticuerpo monoclonal IgGl de rata irrelevante (IgA anti-ratón; Pharmigen) no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento de los xenoinjertos de GBM-18 y dio resultados similares a aquellos observados con PBS (no se muestran datos) .

EJEMPLO VIII. EL ANTICUERPO ANTI-flk-1 (VEGFR-2) AUMENTA SELECTIVAMENTE EL ÍNDICE DE CURA INDUCIDO POR RADIACIÓN DE LOS XENOINJERTOS DE TUMORES HUMANOS EN RATONES DESNUDOS Este ejemplo evalúa si el anticuerpo monoclonal DC-101 que bloquea el receptor-2 de VEGF crucial, flk-1 (VEGFR-2), en células endoteliales de vasos de tumores de ratones aumenta la curabilidad de los xenoinjertos de tumores por la radioterapia "-fraccionada (RT) , y si el anticuerpo modula concurrentemente la reacción a la radiación del téj icto" normal (piel de ratón).

Materiales y Métodos: El carcinoma de pulmón de células pequeñas humano 54A y el glioblastoma multiforme U87 se implantaron en forma subcutánea en la pata trasera de ratones desnudos . El tratamiento comenzó cuando un tumor alcanzó 8 mm de diámetro (día 0) . DC-101 se inyectó en forma intraperitoneal cada 3 días a una dosis de 20 o 40 mg/kg de peso corporal, durante un total dé 6 inyecciones. Las dosis totales graduadas de radiación se aplicaron en fracciones diarias iguales en 5 días consecutivos. El día 0, un ratón recibió la primera inyección del anticuerpo, o se inició la radioterapia. Para el tratamiento combinado, la administración de DC-101 comenzó el día 0 y la radioterapia se inició el día 1. El tamaño de los tumores se midió 2-3 veces por semana después del tratamiento. Los ratones con tumores controlados localmente tuvieron un seguimiento durante 90 días después de que se observó la última recurrencia de tumor en algún grupo. La reacción aguda de la piel en el campo de la irradiación de tumores se evaluó usando una escala de calificación durante lo primeros 30 días después de iniciar la radioterapia.

Resultados: El anticuerpo usado solo indujo la inhibición del crecimiento (pero no la regresión) de ambos tumores en forma ^-dependiente de las dosis. El efecto fue más pronunciado en los xenoinjertos de 54A que en los~"~de U87. En combinación con las dosis más bajas de radiación (25-30 Gy totales), DC-101 proporcionó un retardo del crecimiento de los tumores adicinal comparado con la radioterapia sola, en cualquier modelo. El anticuerpo, también en forma dependiente de la dosis, aumentó el efecto curativo de la radioterapia. Por ejemplo, a su dosis más alta, DC-101 redujo la dosis de radiación necesaria para controlar el 50% de los tumores localmente: 1,7 veces 'en xenoinjertos de 54A (de 67,6 Gy para la radioterapia sola a 39,1 Gy para la terapia combinada), y 1,3 veces en U87 (de 97,8 a 74,8 Gy) . Es decir, no se detectó ningún cambio paralelo de la reacción a la radiación de la piel por el anticuerpo. Como se evaluó en experimentos adicionales, el aumento inducido por DC- 101 de la respuesta a la radiación de los tumores no estuvo asociado con su radiosensibilización o cambios en la oxigenación, mientras se correlacionó con una reducción significativa de la presión del fluido intersticial por el anticuerpo.

Conclusión: Los resultados colectivamente sugieren que el bloqueo de las vías de señalización de VEGF por un anticuerpo contra el receptor principal a estas moléculas de factro de crecimiento puede potenciar selectivamente la respuesta curativa del tumor a la radioterapia fraccionada; y por lo tanto provee un aumento '¦terapéutico. " EJEMPLO IX. PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS DE UNA SOLA CADENA Ejemplo IX-1. Materiales Ejemplo IX-1 (a) . Líneas de Células y Proteínas HUVEC cultivadas principales se mantuvieron en el medio EB -2 a 37°C, 5% C02. Las células se usaron entre los pasos 2-5 para todos los ensayos . La proteína VEGF1S5 se expresó en baculovirus y se purificó. El ADN complementario que codifica el dominio extracelular de KDR (VEGFR-2) se aisló mediante RT-PCR del mARN de riñon fetal humano y se subclonó en los sitios Bgl II y RspE del vector AP-Marcador. En este plásmido el cADN para el dominio extracelular de KDR (VEGFR-2) se fusiona en cuadro con el cADN para el AP placentario. El plásmido se sometió a electroforesis en células NIH 3T3 junto con el vector de expresión de neomicina pSV-Neo y los clones de células estables se seleccionaron con G418. La proteína de fusión soluble KDR-AP se purificó del sobrenadante del cultivo mediante cromatografía de afinidad usando anticuerpos monoclonales inmovilizados de AP.

Ejemplo IX-1 (b) . Inmunización de Ratones y construcción de r-biblioteca de presentación de fagos de anticuerpos de una sola ' cadena " ^**- Se aplicó a ratones BALB/C hembra dos inyecciones intraperitoneales (i.p.) de 10 µg de KDR-AP en 200 µ? del Sistema de Coadyuvante RIBI seguida por una inyección intraperitoneal sin coadyuvante RIBI durante un período de dos meses. También se aplicó a los ratones una inyección subcutánea (s.c.) de 10 µg de KDR-AP en 200 µ? de RIBI en el momento de la primera inmunización. Los ratones recibieron una inyección de refuerzo intraperitoneal de 20 µg de KDR-AP tres días antes de la eutanasia. Se removieron los bazos de los ratones donantes y la células se aislaron. Se extrajo el ARN y el mARN se purificó del ARN total de los esplenocitos . Una biblioteca de presentación de fago scFv se construyó usando el raARN que se presentó en la superficie del fago filamentoso M13.

Al presentar el scFv en la superficie del fago filamentoso, los dominios VH y VL del anticuerpo se unieron por un conector de 15 aminoácidos de longitud (GGGGS)3 y se fusionaron en la extremidad de N de la proteína III del fago. Un marcador E de 15 aminoácidos de longitud, que está seguido por un codón ámbar (TAG) , se '-insertó entre la extremidad de C de VL ' y la proteína III con propósitos de detección y con ~otros propósitos analíticos. El codón ámbar situado entre el marcador E y la proteína III permite i que la constrcción haga scFv en el formato de presentación en la superficie cuando se transforma en un huésped supresor (tal como las células TG1) y scFv en forma soluble cuando se transforma en un huésped no supresor (tal como las células HB2151) .

El ADN de scFv reunido se ligó en el vector pCANTAB 5E. Las células TG1 se colocaron sobre placas de 2YTAG y se incubaron. Las colonias se rasparon en 10 mi del medio 2YT, se mezclaron con 5% y 50% de glicerol y se almacenaron a -70°C como material de biblioteca .

Ejemplo IX-l(c). Biolavado El material de biblioteca creció hacia la fase de registro, se rescató con el fago helper M13K07 y se amplificó toda la noche en el medio 2YTAK (2YT que contiene 100 µg/ml de ampicilina y 50 µg/ml de kanamicina) a 30°C. La preparación de fago se precipitó en 4% PEG/0,5 M NaCl, se suspendió nuevamente en 3% de leche sin grasa/PBS que contiene 500 µg/ml de proteína AP y se incubó a 37°C durante 1 hora para capturar el scFv anti-AP de presentación de fago y para bloquear^jDtra unión no específica.

Tubos Maxisorp recubiertos con KDR-AP (10 µg/ml) (Nunc, Dinamarca) se bloquearon primero con 3% de leche/PBS a 37 °C durante 1 hora, y luego se incubaron con la preparación de fago, a temperatura ambiente durante 1 hora. Los tubos e lavaron 10 veces con PBST y luego 10 veces con PBS (PBS que contiene 0,1% de Tween 20) . El fago unido se eluyó a temperatura ambiente durante 10 minutos con 1 mi de una solución recién preparada de 100 mM trietilamina . El fago eluido se incubó con 10 mi de células TG1 en la mitad de la fase de registro a 37°C durante 30 minutos estacionarias y 30 minutos agitando. Las células TG1 infectadas luego se clocaron sobre placas de 2YTAG y se incubaron toda la noche a 30 °C.

Un 99% (185/186) de los clones evaluados después del tercer ciclo de lavado se halló que eran uniones a KDR (VEGFR-2) específicos. Sin embargo solamente 15 (8%) de estas uniones pudieron bloquear la unión a KDR (VEGFR-2) a VEGF inmovilazado . El ADN de la impresión digital de BstN I de estos 15 clones indicó la presencia de 2 modelos de digestión diferentes; mientras que 21 no bloqueadores de VEGF escogidos al azar . dieron 4 modelos diferentes. Todos los modelos de digestión se observaron también '-en clones identificados después del segundo ciclo de lavado. Los clones representativos de cada modelo de digestión se escogieron de clones recuperados después del segundo ciclo de lavado y se sometieron a la formación de secuencias de ADN. De los 15 clones colocados en secuencia se identificaron 2 bloqueadores de VEGF únicos y 3 no bloqueadores. Un scFv, p2A7 , que no se une a KDR (VEGFR-2) ni bloquea la unión de VEGF a KDR (VEGFR-2), se seleccionó como control negativo para todos los estudios.

Ejemplo IX-1 (d) . ELISA de Fago Los clones de TG1 individuales crecieron a 37 °C en placas de 96 receptáculos y se rescataron con el fago helper M13K07 como se describió anteriormente. La preparación de fago amplificada se bloqueó con 1/6 de volumen de 18% de leche/PBS a temperatura ambiente durante 1 hora y se agregó a placas de microtítulo de 96 receptáculos Maxisorp (Nunc) recubiertas con KDR-AP o AP (1 µ /t?1 x 100 µ?) . Después de la incubación a temperatura ambiente durante 1 hora, las placas se lavaron 3 veces con PBST y se incubaron con un conjugado de fago anti-M13 de conejo Ab-HRP. Las placas se lavaron 5 veces, se agregó sustrato de T B peroxidasa, y la OD a 450 nm se leyó usando un lector de microplacas y anticuerpos scFv se identificaron y colocaron en secuencia.

Ejemplo IX-1 (e) . Preparación de scFv soluble Se usaron fagos de clones individuales para infectar un HB2151 huésped de E.coli no supresor y el infectante se seleccionó en placas de 2YTAG-N. La expresión de scFv en células HB2 151 se indujo cultivando las células en el medio 2YTA que contiene 1 mM isopropil-l-tio-B-D-galactopiranosida a 30°C. Un extracto periplásmico de las células se preparó suspendiendo nuevamente la pelotilla de célula en 25 mM Tris (pH 7,5) que contiene 20% (p/v) de sucrosa, 200 mM NaCl , 1 mM EDTA, y 0,1 mM PMSF, luego se incubó a 4°C agitando suavemente durante 1 hora. Después de la centrifugación a 15.000 rpm durante 15 minutos, el scFv soluble se purificó del sobrenadante mediante cromatografía de afinidad usando el Módulo de Purificación RPAS (Pharmacia Biotech) . Ejemplo IX-2. Ensayos Ejemplo IX-2 (a) . Ensayo de unión a KDR (VEGFR-2) Cuantitativo Se emplearon dos ensayos para examinar cuantitativamente la unión del scFv soluble purificado a KDR (VEGFR-2) . ' Cuatro clones diferentes, que incluyen los dos bloqueadores de VEGF, plCll y plF12, un no bloqueador, el clon dominante p2A6 y el no ligante p2A7, se expresaron en matraces agitadores usando "-células HB2151 de E.coli huésped no supresoras . El scFv soluble se purificó desde extractos" periplásmicos de E.coli mediante cromatografía de afinidad anti-marcador E. El rendimiento del scFv purificado de estos clones estuvo en la gama de 100-400 ug/litro de cultivo.

En el ensayo de unión directa, diferentes cantidades de scFv soluble se agregaron a placas de microtítulo Maxisorp de 96 receptáculos recubiertas con KDR (VEGFR-2) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora, después de lo cual las placas se lavaron 3 veces con PBST. Las placas luego se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con 100 µ? de anticuerpo anti-marcador E de ratón y luego se incubaron con 100 µ? de conjugado de anticuerpo anti-ratón de conejo-HRP. Las placas se lavaron y se depositaron siguiendo el procedimiento descrito anteriormente para el ELISA de fago.

En otro ensayo, es decir el ensayo de bloqueo de VEGF competitivo, diferentes cantidades de scFv soluble se mezclaron con una cantidad fija de KDR-AP (50 ng) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla luego se transfirió a placas de microtítulo de 96 receptáculos recubiertas -con VEGFi6s (200 ng/receptáculo) y se incubaron a temparatura ambiente durante otras 2 horas, " espués de lo cual las placas se lavaron 5 veces y se agregó el sustrato para AP para cuantificar las moléculas de KDR-AP unidas. Luego se calculó IC50, es decir la concentración de scFv requerida para el 50% de inhibición de la unión de KDR (VEGFR-2) a VEGF.

La Figura 16 muestra la unión dependiente de la dosis de scFv a KDR (VEGFR-2) inmovilizado ensayada mediante un ELISA de unión directa. Los clones plCll y plF12, pero no p2A6, también bloquean la unión de KDR (VEGFR-2) a VEGF inmovilizado como se muestra en la Figura 17. Los datos que se muestran en la Figura 17 son los medios ± SD de la determinación por triplicado. El clon control negativo, p2A7, no se unió a KDR (VEGFR-2) ni bloqueó la unión de KDR (VEGFR-2) a VEGF (Figuras 16 y 17) . El clon plCll, el clon dominante después de cada ciclo de lavado, mostró la capacidad de unión a DR (VEGFR-2) más alta y la potencia más alta en el bloqueo de la unión de VEGF a KDR (VEGFR-2) (Tabla 1) . La concentración del anticuerpo del clon plClll requerida para el 50% de unión máxima a KDR (VEGFR-2) y para el 50% de inhibición de la unión a KDR (VEGFR-2) (Figura 17) fueron 0,3 mM y 3 mM, respectivamente (Ver la Tabla 1). El análisis FACS demostró que plCll, plF12 y p2A6 también pudieron unir el receptor expresado "¾n la superficie de la célula en HUVEC.

Ejemplo IX-2 (b) . Análisis de BIAnúcleo del scFv soluble Las cinéticas de la unión del scFv soluble a KDR (FEGFR-2) se midieron usando el biosensor de BIAnúcleo (Biosensor de Pharmacia) . La proteína de fusión KDR-AP se inmovilizó en un chip del sensor y se inyectaron scFv solubles a concentraciones en la gama de 62,5 nM a 1.000 nM. Se obtuvieron gráficos del sensor a cada concentración y se los evaluó usando un programa, BIA Evaluation 2.0, para determinar el índice constante kon y koff. Kd se calculó a partir de la relación de los índices constantes koff/kon.

La Tabla 1 muestra los resultados de la resonancia de plasmon de superficie en un instrumento de BIAnúcleo. Los scFv que bloquean VEGF, plCll y plF2, se unieron a KDR (VEGFR-2) con Kd de 2,1 y 5,9 nM, respectivamente. El scFv no bloqueador, p2A6 , se unió a KDR (VEGFR-2) con una afinidad aproximadamente 6 veces más débil (Kd, 11,2 nM) que el mejor conector plClll, principalmente debido a un índice de disociación mucho más rápida. Como se anticipó, p2A7 no se unió a KDR (VEGFR-2) inmovilizado en el BIAnúcleo.

Ejemplo IX-2 (c) . Ensayo de Fosforilación Se realizaron ensayos de fosfo~rilación con HUVEC de paso temprano siguiendo un protocolo descrito previamente. En resumen, se incubaron HUVEC en el medio de base EBM-2 sin suero con suplemento de 0,5% de albúmina de suero bovino a temperatura ambiente durante 10 minutos en presencia o ausencia de anticuerpos scFv a 5 µg/ml , luego mediante estimulación con 20 ng/ml de VEGF165 a temperatura ambiente durante otros 15 minutos. Las células se Usaron y el receptor KDR (VEGFR-2) se inmunoprecipitó de los lisados de células con cuentas de Proteína A Sefarosa acopladas a un anticuerpo policlonal anti-KDR (anti-VEGFR^2) de conejo (ImClone Systems Incorporated) . Las cuentas se lavaron, se mezclaron con tampón de carga SDS, y el sobrenadante se sometió al análisis de inmunotransferencia . Para detectar la fosforilación de KDR (VEGFR-2), las manchas se sondearon con Mab anti-fosfotirosina, 4G10. Para el ensayo de la actividad de MAP cinasa, los lisados de células se resolvieron con SDS-PAGE y luego mediante análisis de inmunotransferencia usando un anticuerpo MAP cinasa fosfo-específico . Todas las señales se detectaron usando ECL.

Los resultados mostraron que el scFv que bloquea VEGF, plCll, pero no el scFv no bloqueador, p2A6 , pudieron inhibir la -fosforilación del receptor KDR (VEGFR-2) estimulada por VEGF." Además, plCll también inhibió eficazmente la activación de MAP cinasas p44/p42 estimulada por VEGF. En cambio, ni plClll, ni p2A6 inhibieron la activación de MAP cinasas p44/p42 estimulada por FGF.

Ejemplo IX-2 (d) . Ensayo anti -mitogénico Se colocaron HUVEC (5 x 103 células/receptáculo) sobre placas 'de cultivo de tejido de 96 receptáculos (Wallach, Inc., Gaithersburg, MD) en 200 µ?.?e medio EBM-2 sin VEGF, bFGF o EGF y se incubaron a 37°C durante 72 horas. Se agregaron diferentes cantidades de anticuerpos a receptáculos por duplicado y se preincubaron a 37°C durante 1 hora, después de lo cual VEGF165 se agregó a una concentración final de 16 ng/ml. Después 18 horas de incubación, se agregó 0,25 µ? de [3H] -TdR (Amersham) a cada receptáculo y se incubó durante otras 4 horas . La células se colocaron sobre hielo, se lavaron dos veces con un medio que contiene suero, luego se incubaron durante 10 minutos a 4°C con 10% TCA. Las células luego se lavaron una vez con agua y se solubilizaron en 25 µ? de 2% SDS . Se agregó fluido de centelleo (150 µ?/receptáculo) y la radiactividad incorporada del ADN se determinó sobre un contador de centelleo (Wallach, Contador de Centelleo Microbeta Modelo 1450) .

La capacidad de los anticuerpos scFv de bloquear la actividad mitogénica estimulada por VEGF en HUVEC se muestra en la Figura 18. El scFv que bloquea VEGF plCll inhibió fuertemente la síntesis del ADN indcida por VEGF en HUVEC con una EC50, es decir la concentración del anticuerpo que inhibió el 50% de la mitogénesis estimulada por VEGF de HUVEC, de aproximadamente 5 nM. El scFv no bloqueador p2A6 no mostró ningún efecto inhibidor sobre la actividad mitogénica de VEGF. Ni plCll ni p2A6 inhibieron la síntesis del ADN inducida por bFGF en HUVEC (que no se muestra) . Los datos que se muestran en la Figura 18 son representativos de por lo menos tres experimentos separados. (¡) VEGF solamente; (V) sin VEGF.

Ejemplo IX-3. Producción de Anticuerpos Quiméricos desde plCll Ejemplo IX-3 (a) . Líneas de Células y Proteínas Células endoteliales de la vena umbilical humanas cultivadas principales (HUVEC) se mantuvieron en el medio EBM-2 a 37 °C, 5% C02. Se usaron células entre los pasos 2-5 para todos los ensayos. Las proteínas de fusión VEGF165 y KDR (VEGFR-2 ) -fosfatasa alcalina (KDR-AP) se expresaron en baculovirus y células NIH 3T3 , "-respectivamente, y se purificaron siguiendo los procedimientos' descritos anteriormente. Los scFv"anti-KDR (anti-VEGFR-2) plCll y scFv p2A6, un anticuerpo que se une a KDR (VEGFR-2) pero no bloquea la interacción de KDR (VEGFR-2 ) -VEGF, se aislaron de la biblioteca de presentación de fago construida desde un ratón inmunizado con KDR (VEGFR-2) como se describió anteriormente. C225 es un anticuerpo IgGl quimérico dirigido contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) . Ver arriba.

E emplo IX-3 (b) . Clonación de dominios variables de scFv plCll Lso dominios variables de las cadenas liviana (VL) (SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 16) y pesada (VH) (SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 15) de plCll se clonaron desde el vector de expresión de scFv mediante PCR usando los iniciadores 1 y 2, y los iniciadores 3 y 4, respectivamente. La secuencia de péptido inicial para la secreción de proteína en células de mamíferos luego se agregó al 5' de la VL y la VH mediante PCR usando los iniciadores 5 y 2 y los iniciadores 5 y 4, respectivamente. Iniciador 1: 5'CTA GTA GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA GAC ATC GAG CTC3 ' [SEQ ID NO: 37] Iniciador 2: 5'TCG ATC TAG AAG GAT CCA CTC ACG TTT TAT TTC CAG3 ' BaHI [SEQ ID NO: 38] Iniciador 3: 5'CTA GTA GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA CAG GTC AAG CTG3 ' [SEQ ID NO: 39] Iniciador 4: 5'TCG AAG GAT CCA CTC ACC TGA GGA GAC GGT3 ' BamHI [SEQ ID NO: 40] Iniciador 5: 5'GGT CAA AAG CTT ATG GGA TGG TCA TGT ATC ATC CTT TTT Hind III CTA GTA GCA ACT3 ' [SEQ ID NO: 41] Ejemplo IX-3(c). Construcción de los vectores de expresión para plCll IgG quimérico Se construyeron vectores separados para la expresión de la cadena liviana y cadenas pesadas de IgG quimérica. El gen de VL clonado fue digerido con Hind III y BamH I y ligado en el vector pKNlOO que contiene la región constante de cadena liviana ? humana (CL) para crear el vector de expresión para la cadena liviana de plCll quimérico, c-plCll-L. El gen de VH clonado fue digerido con Hind III y BamH I y ligado al vector pGID105 que contiene el dominio constante de cadena pesada (CH) de IgGl (?) para crear el vector de expresión para la cadena pesada de plCll quimérico, c-plCll-H. Ambas construcciones se examinaron mediante digestión de enzima de restricción y se verificaron mediante formación de secuencias de didesoxinucleótido .

Como se observa en la Figura 19, tanto el dominio de VH como el de VL se fusionan con recisión en sus extremos 5' en un segmento del gen que codifica una secuencia de péptido inicial (SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24) marcadas. Los dominios de VH y VL se ligan a través de los sitios Hind II/BamH I en el vector de expresión pGlD105, que contiene una versión del cADN del gen de la región constante ?? humano, y pKNlOO, que contiene una versión del cADN del gen de la región constante de cadena ? humano, respectiamente . En cada caso, la expresión está bajo el control del promotor HCMVi y es terminada por la secuencia de finalización artificial. Los residuos de la región que determina complementariamente (CDR) la cadena liviana y pesada, definidos de acuerdo con la definición de la secuencia hipervariable de abat et al, están subrayados y rotulados CDR-Hl para H3 y CDR-Ll para L3 , respectivamente. CDR-Hl (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 9); CDR-H2 (SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 10); CDR-H3 (SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 11); CDR-Ll (SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 12); CDR-L2 (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 13); CDR-L3 (SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 14).

Ejemplo IX-3 (3) .Expresión y purificación de IgG '-Las células COS se co-transfectaron con cantidades iguales de los plásmidos c-plCll-L y c-plCll-H ~f»ara la expresión transitoria de IgG. Las células COS por debajo de la confluencia que crecieron en DMEM/10% FCS en cubetas de cultivo de 150 mm se enjuagaron una vez con 20 mi de DMEM que contiene 40 mM Tris (pH 7,4), luego se incubaron a 37°C durante 4,5 horas con 4 mi de mezcla de DMEM / DEAE-Dextran/ADN (DMEM contiene 40 mM Tris, 0,4 mg/ml de DEAE- Dextran (Sigma) , y 20 µ9 cada uno de los plásmidos c-plCll-L y c- plCll-H) . Las células se incubaron a 37°C durante 1 hora con 4 'mi de DMEM/2% FCS que contiene 100 nM de cloroquina (Sigma) , luego se incubaron con 1,5 mi de 20% glicerol / PBS a temperatura ambiente durante 1 minuto. Las células se lavaron dos veces con DMEM/5% FCS y se incubaron en 20 mi del mismo medio a 37°C toda la noche. El medio de cultivo de las células se mudó a DMEM/HEPES sin suero después de que las células se lavaron dos veces con DMEM puro. El sobrenadante del cultivo de células se recogió 48 horas y 120 hors después de la transfección. La IgG quimérica se purificó desde el sobrenadante combinado mediante cromatografía de afinidad usanso una columna de Proteína G siguieno el protocolo descrito por el fabricante (Pharmacia Biotech) . Las fracciones que contienen IgG se combinaron, el tampón se intercambió en PBS y se concentró usando concentradores Centricon 10 (Amicon Corp., Beverly, MA) . La pureza de la IgG se analizó 'mediante SDS-PAGE. La concentración del anticuerpo purificado se" determinó mediante ELISA us~an<3cT el anticuerpo específico de cadena ? antihumano de cabra como el agente de captura y el anticuerpo de cadena ? antihumano de cabra conjugado a H P como el agente de detección. La curva estándar se calibró usando un anticuerpo de nivel clínico, C225.

Después de la purificación por afinidad por la Proteína G, se observó una sola banda de proteína de 150 kD En el SDS-PAGE. El análisis de inmunotransferencia usando el anticuerpo específico IgGl Fe antihumano conjugdo a HRP confirmó la presencia de la porción de IgG Fe humana en la proteína purificada (no se muestra) .

Los resultados del ELISA muestran que el s-plCll se une más eficientemente a KDR (VEGFR-2) inmovilizado que al scFv parental (Figura 20) .

Ejemplo IX-4. Ensayos y Análisis Ejemplo IX-4 (a) . Análisis FACS Las células HUVEC de los primeros pasos crecieron en el medio "???-2 con el factor de crecimiento agotado toda la noche para inducir la expresión de KDR (VEGF*R-2) . Las células se cosecharon y se lavaron tres veces con PBS, se incubaron con c-plCll IgG (5 µ9/p?1) durante 1 hora a 4°C, luego se incubaron con un anticuerpo Fe antihumano rotulado con FITC (Capper, Organon Teknika Corp., West Chester, PA) durante otros 60 minutos. Las células se lavaron y se analizaron con un citómetro de flujo (Modelo EPICS®, Coulter Corp., Edison, NJ) .

La Figura 21 es un gráfico que muestra el análisis FACS de la unión de c-plCll a HUVEC que expresa KDR (VEGFR-2) . Como se observó previamente con el plCll de scFv parental, c-plCll se une específicamente a KDR (VEGFR-3) expresado en HUVEC de primeros pasos .

Ejemplo IX-4 (b) . Ensayo de unión a KDR (VEGFR-2) Cuantitativo Se agregaron diferentes cantidades de anticuerpos a placas de microtítulo Maxisorp de 96 receptáculos recubiertas con KDR (VEGFR-2) (Nunc, Dinamarca) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora, después de lo cual las placas se lavaron 3 veces con PBS que contiene 0,1% de Tween-20. Las placas luego se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con 100 mi del ''-conjugado de anticuerpo anti-marcador E de ratón - HRP (Pharmacia Biotech) para el scFv, o "el~**anticuerpo específico IgG Fe antihumano de conejo (Cappel, Organon Teknika Corp.) para la IgG quimérica. Las placas se lavaron 5 veces, se agregó sustrato de TMB peroxidasa (KPL, Gaithersburg, MD) , y la OD a 450 nm se leyó usando un lector de microplacas (Molecular Device, Sunnyvale, CA) .

La Figura 20 es un gráfico que muestra la unión directa de los anticuerpos a KDR (VEGFR-2) inmovilazdo. Se muestra que c-plCll se une más eficientemente al receptor KDR (VEGFR-2) inmovilizado que al scFv parental .

Ejemplo IX-4 (c) . Análisis de BIA núcleo Las cinéticas de unión de los anticuerpos a KD (VEGFR-2) se midieron suando el biosensor de BIAnúcleo (Biosensor Pharmacia) . La proteína de fusión KDR (VEGFR-2) -AP se inmovilizó en un chip del sensor, y los anticuerpos o VEGF se inyectó a concentraciones en la gama de 25 nM a 200 nM. Los gráficos del sensor se obtuvieron a cada concentración y se evaluaron usando un programa, BIA Evaluation 2.0, para determinar los índices constantes kon y koff. Kd se calculó como la relación de los '-índices constantes koff/kon. El análisis de BIAnúcleo revela ^¾üe c-plCll se une a KDR (VEGFR- 2) con una afinidad más alta que el scFv parental (Tabla 2) . La Kd de c-plCll es 0,82 nM, comparada con 2,1 nM para el scFv. La afinidad aumentada de c-plCll se debe principalmente a un índice de disociación más lento (koff) de la IgG quimérica bivalente. Es importante señalar que la afinidad (Kd) de c-plCll para la unión a KDR (VEGFR-2) es similar a la del VEGF del ligando natural para la unión a KDR (VEGFR-2), que es 0,93 nM determinada en nuestro análisis de BIAnúcleo (Tabla 2) .

Ejemplo IX-4 (d) . Ensayo de unión a VEGF competitivo En el primer ensayo, se mezclaron diferentes cantidades de anticuerpos con una cantidad fija de KDR (VEGF-2)-AP (50 ng) y se incubaron a temperatura ambient edurante 1 hora. Las mezclas luego se transfirieron a placas de microtítulo de 96 receptáculos recubiertas con VEGFi55 (200 ng/receptáculo) y se incubaron a temperatura ambiente durante otras 2 horas, después de lo cual las placas se lavaron 5 veces y el sustrato para AP (fosfato de p-nitrofenilo, Sigma) se agregó para cuantificar las moléculas de KDR (VEGFR-2)-AP unidas. Luego se calculó EC50, , es decir la concentración del anticuerpo requerida para el 50% de la inhibición de la unión de KDR (VEGFR-2) a VEGF. '-La Figura 22 muestra que c-plCll bloquea la unión del receptor' KDR (VEGFR-2) a VEGF inmovilizado"' en una forma dependiente de la dosis. El anticuerpo quimérico es más potente en el bloqueo de la i interacción VEGF-KDR (VEGFR-2) con una IC50 (es decir la concentración del anticuerpo requerida para inhibir el 50% de la unión de KDR (VEGFR-2) a VEGF) de 0,8 nM, comprarada con la de 2,0 nM para el scFv. El scFv p2A6 control también se une a KDR (VEGFR-2) (Figura 20) pero no bloquea la interacción de VEGF-KDR (VEGFR-2) (Figura 22) .

En el segundo ensayo, se mezclaron diferentes cantidades del anticuerpo c-plCll con una cantidad fija de VEGF165 rotulado con 1251 y se agregaron a placas de microtítulo de 96 receptáculos recubiertas con receptor KDR (VEGFR-2) . Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas, se lavaron 5 veces y se contaron las cantidades de VEGF165 radiorotuladas que se unieron a KDR (VEGFR-2) imovilizado . See determinaron las concentraciones de c-plCll y VEGFie5 requeridas para bloquear el 50% de la unión del VEGF radiorotulado al receptor KDR (VEGFR-2) inmovilizado.

Los resultados de la inhibición de la unión de VEGF165 radiorotulado se muestran en la Figura 23. Los datos que se muestran son los valores medios de determinaciones por triplicado. Se muestra que c-plCll compite eficientemente con el ''-VEGF rotulado con 125I para la unión al receptor KDR (VEGFR-2)" inmovilizado en forma dependiente * de la dosis. Como se esperaba, C225, un anticuerpo quimérico dirigido contra el receptor EGF no se une al receptor KDR (VEGFR-2) ni bloquea la interacción de VEGF-KDR (VEGFR-2) (que no se muestra) .

Ejemplo IX-4 (e) . Ensayo de Fosforilación Las células HUVEC por debajo de la confluencia crecieron en medio EBM-2 con el factor de crecimiento agotado durante 24 a 48 horas antes de la experimentación. Después del pretratamiento con 50 nM de ortovanadato de sodio durante 30 minutos, la células se incubaron en la presencia o ausencia de anticuerpos durante 15 minutos, luego se estimularon con 20 ng/ml de VEGF 65/ o 10 ng/ml de FGF a temperartura ambiente durante otros 15 minutos. Las células luego se lisaron en un tampón de lisis (50 nM Tris, 150 nM NaCl, 1% NP-40, 2 mM EDTA, 0,25% de desoxicolato , 1 mM PMSF, 1 µ9 de leupeptina, 10 µ de aprotinina, a pH 7,5) y el lisado de células se usó para ambos ensayos de fosforilación de KDR (VEGFR- 2) y MAP cinasa. El receptor KDR (VEGFR-2) se inmunoprecipi ó desde los lisados de células con cuentas de Sefarosa de Proteína A (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA) acoplada a un anticuerpo anti-KDR (VEGFR-2), Mab 4.13 (ImClone Systems). Las proteínas se resolvieron con SDS-PAGE y se sometieron al análisis de ""irimunotransferencia . Para detecter la fosforilación de KDR (VEGFR-2) , las manchas se sondearon con un Mab antifosfotirosina , PY20 (ICN Biomedicals, Inc., Aurora, OH). Para el ensayo de la actividad de MAP cinasa, los lisados de células se resolvieron con SDS-PAGE y luego con el análisis de inmunotransferencia usando un anticuerpo de MAP cinasa fosfo-específico (New England BioLabs, Beverly, MA) . Todas las señales se detectaron usando ECL (Amersham, Arlingon Heights, IL) . En ambos ensayos, las manchas se sondearon nuevamente con un anticuerpo anti-KDR (VEGFR-2) policlonal (ImClone Systems) para asegurar que se cargó igual cantidad de proteína en cada carril de los geles de SDS-PAGE.

C-plCll inhibe efiazmente la fosforilación estimulada por VEGF del receptor KDR (VEGFR-2) y la activación de p44/p42 MAP cinasas. En cambio, C225 no muestra ninguna inhibición de la activación estimulada por VEGF del receptor KDR (VEGFR-2) y MAP cinasas. Ni c-plCll, ni C225 solo tiene ningún efecto sobre la actividad del receptor KDR (VEGFR-2) y p44/p42 MAP cinasas. Como se observó previamente con el scFv plCll, c-plCll no inhibe la activación estimulada por FGF de p44/p42 MAP cinasas (no se muestra) . Más aún, ni scFv p2A6, ni la forma de IgG quimérica de p2A6 (c-p2A6) , inhibe la activación estimulada por VEGF del receptor KDR (VEGFR-2) y MAP cinasas (no se muestra) . "-Ejemplo IX-4 (f) . Ensayo Antimitogénico ' El efecto de los anticuerpos anti-KDR (VEGFR-2) sobre la i mitogénesis estimulada por VEGF de células endoteliales humanas se determinó con el ensayo de incorporación del ADN de [3H] -TdR usando HUVEC . Se colocaron HUVEC (5 x 103 células/receptáculo) en placas de cultivo de tejidos de 96 receptáculos en 200 µ? de medio EBM-2 sin VEGF, bFGF o EGF y se incubaron a 37 °C durante 72 horas. Se agregaron diferentes cantidades de anticuerpos a receptáculos por duplicado y se preincubaron a 37 °C durante 1 hora, después de lo cual se agregó VEGFi65 a una concentración final de 16 ng/ml . Despue's de 18 horas de incubación, se agregó 0,25 µ?? de [3H] -TdR a cada receptáculo y se incubó durante otras 4 horas. Se determinó la radioactividad incorporada por el ADN con un contador de centelleo. Los datos que se muestran en la Figura 24 son representativos de por lo menos tres experimentos separados .

Tanto c-plCll como scFv plCll inhiben en forma eficaz la mitogénesis de HUVEC estimulada por VEGF (Figura 24) . C-plCll es un inhibidor más fuerte de la mitogénesis de HUVEC inducida por VEGF que el scFv parental . Las concentraciones de anticuerpos requeridas para inhibir el 50% de la mitogénesis inducida por -••VEGF de HUVEC son 0,8 nM para c-plCll y 6 nM para el csFv, " respectivamente. Como se espéraBa, scFv p2A6 no muestra ningún efecto inhibidor sobre la proliferación de células endoteliales estimulada por VEGF.

La invención reivindicada está permitida de acuerdo con la memoria descriptiva precedente y las referencias y los materiales iniciales fácilmente disponibles. Sin embargo, los Solicitantes han depositado en la Colección de Cultivos de Tipo Estadounidense, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md, 20852, Estados Unidos (ATCC) las líneas de células de los hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales enumerados a continuación: Línea de Células de Hibridoma DC-101 que produce el anticuerpo monoclonal flk-1 (VEGFR-2) anti-ratón de rata depositado el 26 de enero de 1994 (ATCC Acceso Número HB 11534) .

Línea de Células de Hibridoma M25.18A1 que produce el anticuerpo monoclonal flk-1 (VEGFR-2) anti-ratón de ratón Mab 25 depositado el 19 de julio de 1996 (ATCC Acceso Número HB 12152) .

Línea de Células de Hibridoma M73.24 que produce el anticuerpo monoclonal flk-1 (VEGFR-2) anti-ratón de ratón Mab 73 depositado el 19 de julio de 1996 (ATCC Acceso Número HB 12153) .

Estos depósitos se hicieron de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con Fines de Procedimientos de Patentes y las reglamentaciones conforme a ellas (Tratado de Budapest) . Esto garantiza el mantenimiento de un cultivo viable durante 30 años desde la fecha del depósito. El organismo estará disponible por la ATCC conforme a las cláusulas del Tratado de Budapest, y sujeto a un contrato entre los Solicitantes y 'la ATCC, que garantiza la disponibilidad irrestricta al concederse la Patente Estadounidense pertinente. La disponibilidad de las cepas depositadas no debe interpretarse como una licencia para poner en práctica la invención violando los derechos otorgados bajo la autoridad de algún gobierno de acuerdo con las leyes de patentes .

TABLA 1. ANÁLISIS DE UNIÓN A KDR (VEGFR-2) DE ANTICUERPOS ANTI KDR (VEGFR-2) scFv Unión a KDR1 Unión a VEGF Cinéticas de las Uniones" Clon de ScFv (ED50 nM) (IC50 nM) Kon Koff Kd fc. (105 M'V1) (ÍO'V1) (10"9 M) P1C11 Sí (0,3) Sí (3,0) 1,1 2 , 3 2,1 P1F12 Sí (1,0 Sí (15) 0, 24 1,4 5,9 F^ÁS Sí (5,0) No (>300) 4,1 46, 1 11,2 P2A7 No (N/A) No (>30Ó) N/A N/A N/A e 5 paréntesis representan las concentraciones de scFv que dan un 50% de unión máxima; 2. Determinada mediante ELISA de bloqueo de VEGF competitivo, los números entre paréntesis representan las concentraciones de scFv requeridas para el 50% de inhibición de la unión de KDR a VEGF 10 inmovilizado; 3. Determinada mediante análisis de BIAnúcleo. NA= no aplicable.

TABLA 2. CINÉTICAS DE UNIONES DE P1C11 SCFV Y C-P1C11 AL RECEPTOR KDR (VEGFR-2 ) * Anticuerpo Kon off Kd (105 M'V1) (10'V1) (10"9 M) plCll scFv 1, 11 2,27 2~¡1 C-plCll 0,63 0,52 0,82 VEGF 1,87 1,81 0,93 " *Todos los índices se determinan mediante resonancia de plasmon de superficie usando el sistema de BIAnúcleo, y son valores medios de por lo menos tres determinaqiiones separadas .

EJEMPLO X El presente ejemplo demuestra la producción de un antagonista VEGFR, a saber, un anticuerpo monoclonal anti-flk-1 (anti-VEGFR- 1) .

El anticuerpo monoclonal anti -VEGFR-1 de rata se desarrolló a través de una técnica de hibridoma estándar. · Se administró a ratas de ocho semanas en forma intraperitoneal (i.p.) con 100 µ9 de proteína recombinante de Fe de VEGFR-1 (región constante) (R&D Systems, Minneapolis, MN) mezclada con coadyuvante de Freund completo. Luego se inyectó a las ratas tres veces antes de la fusión con la misma proteína mezclada con coadyuvante de Freund incompleto.

Las células del hibridoma se generaron fusionando células de mieloma P3x6Ag8.653 con células de bazo y células de médula ósea de ratas inmunizadas. Se seleccionaron clones específicos anti- VEGFR-1 usando VEGFR-l proteína recombinante fosfatasa alcalina - (AP) en ensayos de unión y bloqueo basados en ELISA. Los clones positivos se subclonaron limitando" la dilución.

Se obtuvieron anticuerpos monoclonales anti-VEGFR-1 (mAb) de hibridomas a través de la fermentación de alimentación continua en el medio sin suero. Los mAb se purificaron desde medios acondicionados sin suero mediante cromatografía de afinidad usando la proteína G-Sefarosa de unión Gamma. Los mAb usados en los estudios in vivo se ensayaron para endotoxina usando el Kit de Lisado de Amebocito de Límulo Pyrogent plus® (Bio whittaker, Walkersville, MD) . Todas las preparaciones de anticuerpos usadas en estudios de animales contenían < 1,25 EU/ml de endotoxina. Los anticuerpos policlonales anti-VEGFR-1 se generaron desde conejo inmunizado con proteína AP de VEGFR-l recombinante y se purificaron mediante columna de proteína G de unión de Gamma (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) .

Las propiedades inmunoquímicas de los mAb anti-VEGFR-1 se caracterizaron en ensayos de unión y bloqueo basados en ELISA así como el análisis de BIAnúcleo para la afinidad. Los ensayos de unión se realizaron recubriendo placas de microtítulo de 96 receptáculos (placa flexible Falcon, Becton Dickinson, Bedford, --MA) con 50 ng/receptáculo de proteína VEGFR-1 AP o VEGFR-2 AP" toda la noche a 4°C. Los receptáculos se bloquearon agregando 200 µ? de solución salina con tampón de fosfato que contiene 5% de suero bovino, 0,05% de Tween 20 (tampón bloqueante) e incubando durante 2 horas a temperatura ambiente (RT) . Los receptáculos luego se lavaron (5x) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con diferentes concentraciones de mAb a 50 µ? diluidas en tampón bloqueante. Los receptáculos se lavaron nuevamente (5x) y se incubaron con 50 µ? de IgG-HRP anti-rata de cabra (BioSource International, Camarillo, CA) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los receptáculos se lavaron (5x) durante un tiempo final y luego se incubaron con 50 µ? de sustrato de 3,3', 5,5'- tetra-metilbencidina (TMB) (Kirkegaard and Perry Lab Inc., Gaithersburg , MD) durante 15 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo agregando 50 µ? de 1 M Ácido Fosfórico (H3P04) y los receptáculos se leyeron a 450 nm en un lector de placas de microtítulo.

Para los ensasyos de bloqueo de VEGFR-1/VEGF o P1GF, los receptáculos se recubrieron con 100 ng de VEGF o PlGF (R & D Systems, Minneapolis, MN) toda la noche a 4°C. Los receptáculos se bloquean como se describí 'anteriormente y luego se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente con 100 ng de VEGFR-1 AP que habían sido preincubados durante 1 hora con diferentes concentraciones de mAb. Los receptáculos se lavaron e incubaron con fosfato de p-nitrofenilo (PNPP, Sigma, St . Louis, MO) . El color se desarrolló durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego se leyó a 405 nm en un lector de placas de microtítulo.

La cinética de la unión de mAb anti-VEGFR-1 a VEGFR- 1 se determinó usando el biosensor de BIAnúcleo (Biosensor Pharmacia) . La proteína de fusión VEGFR-1 Fe se inmovilizó en un chip del sensor y los mAb se inyectaron a concentraciones en la gama de 3,125 nM a 50 nM. Los gráficos del sensor se obtuvieron a cada concentración y se evaluaron usando el programa BIA Evaluation 2.0, para determinar la relación del índice constante kon/koff para el valor Kd.

EJEMPLO XI El presente ejemplo demuestra la inhibición del crecimiento de tumores después de la administración de un antagonista receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) , el naticuerp monoclonal ERBITUX® (tabién denominado IMC-C225 o C225) y una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista receptor del factor de creimieneto endoteila lvascular (VEGFR) , el anticuerpo monoclonal anti-VGFR-1 DC101.

Los anticuerpos para el análisis"*inmunohistoquímico y la terapia antiangiogénica se obtuvieron de la siguiente manera: anticuerpo CD31/PECAM-1 anti-ratón de Pharmigen (San. Diego, CA) ; clon de antígeno nuclear de células antiproliferantes de ratón (PCNA) PC10 DAKO A/S de DAKO Corp. (Carpintería, CA) ; inmunoglobulina (IgG) anti-rata de cabra conjugadaa peroxidasa (H+L) e IgG antirata de cabra conjugada a Rojo Texas de Jackson Research Laboratories (West Grove, PA) ; IgGA2 antiratón de rata conjugada a preoxidasa de Serotec Harían Bioproducts for Science, Inc. (Indianapolis , IN) ; y anticuerpo monoclonal de receptor 2 de VEGF anti-ratón de rata (Prewett et al, 1999; Witte et al, 1998) y anticuerpo monoclonal de receptor de EGF antihumano quimérico (Goldstein et al, 1995) de ImClone Systems, Inc. (Nueva York, NY) (Prewett et al, 1999; Witte et al, 1998) .

Se administró a ratones desnudos atínicos machos de ocho semanas (Instituto Nacional del Cáncer, Área de Producción de Animales, Frederick, MD) , una inyección intraperitoneal de 1,0 x 106 células de cáncer de colon KM12L4 en 500 µ? de HBSS con una aguja calibre 30 unida a una jeringa de 1 mi. Los ratones luego se distribuyeron aleatoriamente en uno de cuatro grupos (10 ratones por grupo): control, DC101, C225, o DC101 y C225. Todos los estudios de animales se realizaron según las pautas aprobadas por la Comisión de Protección y Uso de Animales del Centro del Cáncer Anderson de MD y UKCCCR, 1998) . i Comenzando 3 días después de la inyección de las células de tumores, se dieron a los ratones inyecciones intraperitoneales (i.p.) cada tercer día del vehículo control (solución salina con tampón fosfato [PBS] ) , DC101 (0,8 mg) , C225 (1,0 mg) , o DC101 (0,8 mg) y C225 (1,0 mg) (cada inyección se dio en un volumen total de 700 µ?) con una aguja de calibre 27 unida a una jeringa de 1 mi. Los ratones fueron pesados semanalmente . Se mató a los ratones cuando el grupo control estaba moribundo (30 días después de que comenzó la terapia) y se realizaron necropsias completas, se cuantificó la carga de tumores, y se cosecharon los tumores y se los analizó como se describe a continuación.

Para cada ratón, se realizó la necropsia, se midió el tamaño de los tumores peritoneales con calibres, se determinó el tamaño medio del tumor y se extirparon lesiones representativas. La magnitud de la ascitis fue evaluada por un investigador que desconocía la asignación del grupo de tratamiento de la siguiente manera: nivel 0, ninguna ascitis; nivel 1, pequeña ascitis; nivel 2, ascitis moderada; nivel 3, gran ascitis; nivel 4, ascitis masiva con abdomen tenso (Aparicio et al, 1999) . Las secciones de tumores se incrustaron en el compuesto OCT y se congelaron a -70 °C en formalina y luego se incrustaron en parafina.

Las seccione de tejido se trataron mediante desparafinación estándar (para tejidos fijados en formalina e incrustados en parafina) o mediante fijación en acetona y cloroformo (para teidos congelados en OCT) , y los análisis inmuno-histoquímicos se realizaron como se describió previamente (Shaheen et al, 1999) . En resumen, las peroxidasas endógenas se bloquearon con 3% * de ¾02 en metanol, y los portaobjetos se lavaron con PBS, se incubaron durante 20 minutos en una solución bloqueadora de proteína (PBS con suplemento de 1% de suero de cabra normal y 5% de suero de caballo normal) , y se incubaron toda la noche a 4°C con con anticuerpos principales contra CD31 o PCNA. Luego, los portaobjetos se lavaron, se incubaron con una solución de bloqueo de proteína, se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios conjugados a peroxidasa, se lavaron, se incubaron con DAB, se lavaron, se contracolorearon con hematoxilina, se lavaron y se montaron con Universal Mount y se secaron sobre una placa caliente a 56°C. Las secciones congeladas que debían mancharse para CD31 se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado Rojo Texas (fluorescencia roja) en lugar del anticuerpo conjugado a peroxidasa. La omisión del anticuerpo principal sirvió como control negativo.

La coloración de rotulado dé" extremo de muesca de dUTP mediado por desoxinucletidil transferasa terminal (TUNEL) se realizó de i acuerdo con el protocolo del fabricante. En resumen, la secciones se fijaron con 4% de paraformaldehído sin metanol, se lavaron, se permeabilizaron con 0,2% Tritón X-100, se lavaron, se incubaron con el tampón de equilibrio del kit, se incubaron con una mezcla de reacción que contiene el tampón de equilibrio, una mezcla de nucleótidos, y la enzima TdT a 37 °C durante 1 hora, se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente con 2x citrato de solución salina estándar para parar la reacción de TdT, se lavaron, se incubaron con un portaobjetos DAPI (para visualizar los núcleos) y se aplicaron cubiertas de vidrio.

Se evaluaron las cantidades de vasos de tumores y células positivas para PCNA mediante microscopio de luz (contados en cinco campos aleatorios de 0,159 mm2 a una magnificación de ????) , se realizaron imágenes digitales, y se procesaron con el software de Análisis de Imágenes Optimas (Biscan, Edmond, VA) . Las células apoptóticas se visualizaron con inmunofluorescencia de la siguiente manera. Se hicieron imágenes digitales de las secciones y se procesaron con el software Adobe Photoshop (Adobe Systems, Mountain Valley, CA) . Se detectaron las células endoteliales positivas para CD311 (EC) mediante fluorescencia ''-'roja localizada usando un filtro de rodamina . La apoptosis se determinó mediante fluorescencia verde localizada para las células de tumores (TC) o verde con fluorescencia roja para las EC usando un filtro de fluorescencia. Se detectaron los núcleos mediante la fluorescencia azul del DAPI con su filtro. Se contaron las células en cinco campos no superpuestos, consecutivos de 0,011 mm2 por portaobjeto a una magnificación de 400x con el primer campo seleccionado al azar en la porción no necrótica del tumor. Los porcentajesde EC y TC apotóticas por cada campo se calcularon luego como [% de células apoptóticas = (número de células apoptóticas / número total de células) xlOO] .

La medición del diámetro para las lesiones peritoneales 30 días después de que empezó la terapia se usó para evaluar la carga bruta de tumores. El tamaño medio de los tumores peritoneales fue menor en el grupo DC101 (50,3% menor) y en el grupo combinación de DC101+C225 (66,7% menor) que en el grupo control. Aunque el 100% del control y los ratones con C225 tuvieron enfermedad peritoneal al final del estudio, solamente el 10% de los ratones con DC101 y el 30% de los ratones con terapia de combinación no mostraron ningua evidencia de enfermedad. Finalmente, el nivel medio de ascitis fue más bajo tanto para el grupo con DC101 (66,7% menor) como para el grupo con terapia de combinación (100% menor) que los ratones control. Más aún, el grupo con DC101+C225 tuvo significativamente menos ascitis que el grupo con DC101; no se halló virtualmente ninguna" ascitis en el grupo combinación.

Las células de tumores se colorearon para PCNA mediante el análisis inmunohistoquímico para evaluar la proliferación de células de tumores. Los tumores peritoneales fueron más pequeños en los grupos DC101 (50,3% menores) y DC101+C225 (66,7% menores) que en el grupo control .

La sección de las lesiones peritoneales para ratones también se coloreó para la inmunofluorescencia para detectar el número de EC como una medida de la angiogénesis . Se observaron significativamente menos EC en los grupos con DC101 y DC101+C225 que en el grupo control .

La coloración de TUNEL inmunofluorescente , con o sin coloración concurrente para CD31, se realizó en secciones de metástasis peritoneales para cuantificar la apoptosis de TC y EC. Se observaron más TC y EC apoptóticas en el grupo DC101 (14,3 veces más para TC y 226 veces más para EC) y en el grupo DC101+C225 (23,6 veces más para TC y 331 veces más para EC) que en el grupo control, y se observaron más TC y EC apotóticas en el grupo DC101+C225 que en el grupo control (1,7 veces más para TC y 1,46 veces más para EC) . " EJEMPLO XII. PRODUCCIÓN DE FAB HUMANO Ejemplo XII(a). Proteínas y Líneas de Células Se obtuvieron HUVEC cultivadas principales del Dr. S. Rafii en el Centro Médico Cornell, Nueva York, y se mantuvieron en el medio EBM-2 (Clonetics, Walkersville , MD) a 37°C, 5% C02. Las proteínas de fusión solubles, KDR (VEGFR-2 ) -AP, sus variantes "de eliminación de dominio de inmunoglobulina (Ig) , y Flk-l-AP, se expresaron en NIH 3T3 transíectadas establemente y se purificaron desde sobrenadantes de cultivo de células mediante cromatografía de afinidad usando el anticuerpo monoclonal inmovilizado a AP decrito por Lu et al, J. Biol. Chem. 275: 14321-30 (2000). La proteína VEGFi6s se expresó en baculovirus y se purificó siguiendo los procedimientos descritos en Zhu et al, Cáncer Res. 58: 3209- 14 (1998) . Las líneas de células de leucemia, HL60 y HEL, se mantuvieron en RPMI que contiene 10% de suero de ternero fetal.

Ejemplo XII (b) . ELISA de Fago Los clones de TG1 individuales se recogieron y crecieron a 37 °C en placas de 96 receptáculos y se rescataron con el fago helper M13K07 como se describió anteriormente. La preparación de fago "-amplificada se bloqueó con 1/6 de volumen de 18% de leche/PBS á temperatura ambiente durante" l~""hora y se agregó en placas de microtítulo de 96 receptáculos Maxisorp (Nunc) recubiertas con DR (VEGFR-2)-AP o AP (1 µ?/p?? x 100 µ?) . Después de la incubación a temperatura ambiente durante 1 hora las placas se lavaron 3 veces con PBST y se incubaron con un conjugado de fago anti-M13 de . conejo-HRP (Amersham Pharmacia Biotec, Piscataway, NJ) . Las placas se lavaron 5 veces, se agregó sustrato de TMB peroxidasa (KPL, Gaithersburg, MD) y se leyó la absorbencia a 450 nm usando un lector de micotítulos (Molecular Devices., Sunnyvale, CA) .

Ejemplo XII (c) . Análisis de modelo de BstN I de ADN y formación de secuencias de nucleótidos La diversidad de los clones Fab ani-KDR (VEGFR-2) después de cada ciclo de selección se analizó mediante patrones de digestión de enzimas de restricción (es decir, impresiones digitales de ADN) . La inserción del gen Fab de clones individuales se amplificó por PCR usando iniciadores: PUC19 inversa, 5' AGCGGATAACAATTTCACACAGG 3'; y fdtet siguiente, 5' GTCGTCTTTCCAGACGTTAGT 3'. El producto amplificado fue digerido con una enzima de corte frecuente, BstN I, y se analizó en 3% gel de agarosa. Las secuencias del ADN de clones representativos de cada patrón de digestión se determinaron mediante formación de secuencias de didesoxinucleótido.

Ejemplo XII (d) . Expresión y purificación de fragmentos Fab solubles Los plásmidos de clones individuales se usaron para transformar un HB2151 huésped de E.coli no supresor. La expresión ' de fragmentos Fab en HB2151 se indujo cultivando las células en el medio 2YTA que contiene 1 mM isopropil-l-tio-p-D-galactopiranosida (IPTG, Sigma) a 30°C. Se preparó un extracto periplásmico de las células suspendiendo nuevamente la pelotilla de célula en 25 mM Tris (pH 7,5) que contiene 20% (p/v) de sucrosa, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA y 0 , 1 mM PMSF, luego se incubó a marcadores de hexahistidina y c-myc pueden usarse para la purificación o detección. El codón ámbar permite la presentación del fago usando huéspedes supresores (tales como células TG1) o la producción de fragmentos Fab en forma soluble cuando se transforman en un huésped no supresor (tal como las células HB2151) .

El material de la biblioteca creció en la fase de registro, se ''-rescató con el fago helper M13-K07 y se amplificó toda la noche en el medio 2YTAK (2YT que contiene 100 µg/ml· de ampicilina y 50 µg/ml de kanamicina) a 30 °C. La preparación del fago se precipitó en 4% PEG/0,5 M NaCl, se suspendió nuevamente en 3% de leche sin grasa/PBS que contiene 500 µg/ml de proteína AP y se incubó a 37 °C durante 1 hora para capturar fragmentos de Fab anti-AP de presentación de fago y para bloquear otra nión no específica. , Tubos Maxisorp. Star recubiertos con KDR (VEGFR-2)-AP (10 µ9/p?1 en PBS) (Nunc, Rosklide, Dinamarca) se bloquearon primero con 3% de leche/PBS a 37 °C durante 1 hora, y luego se incubaron con la preparación de fago a temperatura ambiente durante 1 hora. Los tubos se lavaron 10 veces con PBST (PBS que contiene 0,1% de Tween 20) y luego 10 veces con PBS. Los fagos unidos se eluyeron a temperatura ambiente durante 10 minutos con 1 mi de una solución recién preparada de 100 mM trietilamina (Sigma, St . Louis, MO) . Los fagos eluidos se incubaron con 10 mi de células TG1 en la mitad de la fase de registro a 37°C durante 30 minutos estacionarias y 30 mnutos agitando. Se formaron pelotillas con las células TG1 infectadas y se las colocó en varias placas de 2YTAG grandes y se incubaron toda la noche a 37 °C. Todas las colonias que crecieron en las placas se rasparon en 3 a 5 mi del medio 2YTA, se mezclaron con glicerol (10% de concentración final), se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -70 °C. Para la selección del siguiente ciclo, 100 µ? del material de fago se agregaron a 25 mi del medio 2YTAG y crecieron a la mitad de la fase de registro. El cultivo se rescató con el fago helper M13K07, se amplificó, se precipitó, y se usó para la selección siguiendo el procedimiento descrito anteriormente, con concentraciones reducidas de KDR (VEGFR-2)-AP inmovilizado en el inmunotubo y el número de de lavados aumentado después del proceso de unión.

Se realizaron un total de tres ciclos de selección en KDR (VEGFR-2) inmovilizado, con concentraciones de proteína y números de lavados variables después del proceso de unión inicial. Después de cada ciclo de selección, se recogieron 93 clones al azar y se los ensayó mediante ELISA de fago para la unión a KDR (VEGFR-2) .

Se recogieron 70 de los 93 clones (75%) después del segundo ciclo, y más del 90% de los clones recuperados después de la tercera selección fueron positivos en la unión a KDR (VEGFR-2) , sugiriendo una alta eficiencia del proceso de selección. Los segmentos del ADN que codifica el Fab desde todas las 70 uniones identificadas en la segunda selección se amplificaron, fueron digeridas con BstN I y se compararon para lo patrones de impresiones digitales. Se observaron un total de 42 partonres diferentes, lo cual indica una excelente diversidad del Fab anti- DR (VEGFR-2) aislado. El exámen*de reactividad cruzada demostró que 19 de los 42 anticuerpos fueron uniones a FLT-1 (VEGFR-1) específicas, mientras que los restantes 23 anticuerpos se unieron tanto a KDR (VEGFR-2) como a su homólogo de ratón, Flk-1. Se logró otra selección con un ensayo de unión a VEGF competitivo en el cual se determinó la unión del KDR (VEGFR-2) soluble a VEGF inmóviliazdo en la presencia o ausencia de los fragmentos de Fab anti-KDR (VEGFR-2) . El ensayo identificó cuatro clones que fue'ron capaces de bloquear la unión entre VEGF y KDR (VEGFR-2) . Tres eran -uniones específicas a KDR (VEGFR-2) y una reacconó en forma cruzada con Flk-1. El análisis de impresión digital del ADN y de la formación de secuencias confirmó que los cuatro anticuerpos que bloquean KDR (VEGFR-2 ) /VEGF eran diferentes con secuencias de ADN y aminoácidos únicas .

Las secuencias de aminoácidos para CDR1 , CDR2 , y CDR3 de VH y VL para los cuatro clones se dan en la Tabla 3.

TABLA 3 - SECUENCIAS DE CDR DE FAB HUMANOS DE UNIÓN A KDR (VEGFR- 2 ) SELECCIONADOS Clon CDR1 CDR2 CDR3 Cadena Liviana D2C6 RASQSVSSYLA DSSNRAT LQHNTFPPT (SEQ ID N0:1) (SEQ ID NO: 2) (SEQ ID NO: 3) D2H2 RASQGISSRLA AASSLQT QQANRFPPT (SEQ ID NO: 4) (SEQ ID NO: 5) (SEQ ID NO: 6) D1H4 AGTTTDLTYYDLSVS DGNKRPS NSYVSSRFYV (SEQ ID NO: 7) (SEQ ID NO: 8) (SEQ ID NO: 9) D1F7 SGSTSNIGTNTAN NNNQRPS AAWDDSLNGHWV (SEQ ID NO:10) (SEQ ID NO: 11) (SEQ ID NO: 1*2) Cadena Pesada D2C6 GFTFSSYSMN SISSSSSYIYYADSVKG VTDAFDI (SEQ ID NO: 13) (SEQ ID NO: 14) . (SEQ ID NO: 15) D2H2 GFTFSSYSMN SISSSSSYIYYADSVKG VTDAFDI D1H4 GFTFSSYSMN SISSSSSYIYYADSVKG VTDAFDI GGTFSSYAIS GGIIPIFGTANYAQKFQG GYDYYDSSGVASPFDY (SEQ ID NO: 16) (SEQ ID NO:17) (SEQ ID NO:18) Las secuencias completas para las cadenas de VH y VL se presentan en el Listado de Secuencias. Para D1F7, las secuencias de nucleótido y aminoácido para VH están representadas por las SEQ ID NO: 19 y 20, respectivamente, y la secuencias de nucleótido y aminoácido para VL están representadas por las SEQ ID NO: 21 y '--22.

Para D2C6, las secuencias de nucleótido y aminoácido para VH están representadas por las SEQ ID NO: 23 y 24, respectivamente, y la secuencias de nucleótido y aminoácido para VL están representadas por las SEQ ID NO: 25 y 26.

Para D2H2, las secuencias de nucleótido y aminoácido para VH están representadas por las SEQ ID NO: 30 y 31, respectivamente, y la secuencias de nucleótido y aminoácido para VL están representadas por las SEQ ID NO: 32 y 33.

Para D1H4 , las secuencias de nucleótido y aminoácido para VH están representadas por las SEQ ID NO: 27 y 24, respectivamente, y la secuencias de nucleótido y aminoácido para VL están representadas por las SEQ ID NO: 28 y 29.

Se creó una segunda biblioteca que combina la cadena pesada única de D2C6 con una población diversa de cadenas livianas derivadas de la biblioteca original. Se identificaron 10 Fab adicionales, denominados SAI, SA3 , SB10, SB5 , SC7 , SD2 , SD5, SF2 , SF7 y 1121. Las secuencias de nucleótido y aminoácido para VL de los 10 Fab están representadas de la siguiente manera. Para SAI, las secuencias de nucleótidos para VL están representadas por las SEQ '-ID NO: 34 y 35. Para SA3 , las secuencias de nucleótidos para VL están representadas por las SEQ~ID NO: 36 y 37. Para SB10, las secuencias de nucleótidos para VL están representadas por las SEQ i ID NO: 38 y 39. Para SB5, las secuencias de nucleótidos para VL están representadas por las SEQ ID NO: 40 y 41. Para SC7 , las secuencias de nucleótidos para VL están representadas por las SEQ ID NO: 42 y 43. Para SF2 , las secuencias de nucleótidos para VL están representadas por las SEQ ID NO: 44 y 45. Para SD5, las secuencias de nucleótidos para VL están representadas por las SEQ ID NO: 46 y 47. Para SF2, las secuencias de nucleótidos para VL están representadas por las SEQ ID NO: 48 y 49. Para SF7, las secuencias de nucleótidos para VL están representadas por las SEQ ID NO: 50 y 51. Para 1121, las secuencias de nucleótidos para VL están representadas por las SEQ ID NO: 52 y 53.

Las secuencias de CDR de VL se presentan en la Tabla 4.

TABLA 4 - SECUENCIAS DE CDR DE CADENA LIVIANA DE FAB HUMANOS UNIÓN A KDR (VEGFR-2) Clon CDR1 CDR2 CDR3 SAI TGSHSNFGAGTDV GDSNRPS QSYDYGLRG V (SEQ ID NO: 54) (SEQ ID NO: 55) (SEQ ID NO: 56) SA3 RASQNINNYLN AASTLQS QQYSRYPPT (SEQ ID NO: 57) (SEQ ID NO: 58) (SEQ ID NO:59) SB10 TGSSTDVGNYNYIS DVTSRPS NSYSATDTLV (SEQ ID NO: 60) (SEQ ID NO: 61) (SEQ ID NO: 62) SB5 TGQSSNIGADYDVH GHNNRPS QSYDSSLSGLV (SEQ ID NO: 63) (SEQ ID NO:64) (SEQ ID NO:65) SC7 RASQDIS LA AASLLQS QQADSFPPT (SEQ ID NO: 66) (SEQ ID NO:67) (SEQ ID NO: 68) SD2 RASQSIKRWLA AASTLQS QQANSFPPT (SEQ ID NO:69) (SEQ ID NO: 70) (SEQ ID NO: 71) SD5 SGSRSNIGAHYEVQ GDTNRPS QSYDTSLRGPV (SEQ ID NO: 72) (SEQ ID NO: 73) (SEQ ID NO: 74)' SF2 TGSSSNIGTGYDVH AYTNRPS QSFDDSLNGLV (SEQ ID NO:75) (SEQ ID NO: 76) (SEQ ID NO: 77) SF7 TGSHSNFGAGTDVH GDTHRPS QSYDYGLRGWV (SEQ ID NO:78) (SEQ ID NO: 79) (SEQ ID NO: 80) 1121 RASQGIDNWLG DASNLDT QQAKAFPPT (SEQ ID NO: 81) (SEQ ID NO: 82) (SEQ ID NO: 83) EJEMPLO XIII. ENSAYOS Ejemplo XIII (a). Unión a KDR (VEGFR-2) Cuantitativa y bloqueo de la interacción de KDR (VEGFR-2) /VEGF En un ensayo de unión directa, se agregaron diferentes cantidades de proteínas Fab solubles a placas de microtítulo axisorp de 96 receptáculos recubiertas con KDR (VEGFR-2) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora, después de lo cual las placas se lavaron 3 veces" con PBST. Las placas luego se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con 100 µ? de conjugado de anticuerpo Fab antihumano de conejo - HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratory Inc., West Grove, PA) . Las placas se lavaron y se desarrollaron siguiendo el procedimiento descrito anteriormente para el ELISA de fago. En un ensayo de bloqueo de KDR (VEGFR-2) /VEGF competitivo, se mezclaron diferentes cantidades de proteína Fab con una cantidad fija de KDR (VEGFR-2)-AP (100 ng) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las mezclas luego se transfirieron a placas de microtítulo de 96 receptáculos previamente recubiertas con VEGFiS5 (200 ng/receptáculo) y se incubaron a temperatura ambiente durante otras 2 horas, después de lo cual las placas se lavaron 5 veces y se agregó el sustrato para AP (fosfato de p-nitrofenilo , Sigma) .

Se midió la absorbencia a 405 nm para cuantificar las moléculas (8) de KDR (VEGFR-2)-AP unidas. Luego se calculó la IC50, es decir la concentración de proteína Fab necesaria para un 50% de inhibición de la unión de KDR (VEGFR-2) a VEGF.

Los cuatro clones que bloquean VEGF (D2C6, D2H2, D2H4 , D1F7) se expresaron como Fab soluble y se purificaron desde extractos periplásmicos de E.coli mediante cromatografía de afinidad de Proteína G. El rendimiento de las proteína Fab purificadas de estos clones estuvo en la gama de 60 a 400 µg/litro de cultivo. El análisis SDS-PAGE de cada preparación de Fab purificada dio una sola banda de proteína con el tamaño molecular esperado.

Los clones D2C6 y D2H2 son uniones más eficientes, seguidos por los clones D1H4 y D1F7. Los cuatro Fab también bloquean la unión de KDR (VEGFR-2) a VEGF inmovilizado. Las concentracione de los anticuerpos requeridas para un 50% de inhibición de la unión de KDR (VEGFR-2) a VEGF son aproximadamente 2 nM para los clones D2C6, D2H2 y D1H4 y 20 nM para el clon D1F7. Solamente el clon D1F7 bloquea la unión de VEGF a Flk-1, con una IC50 de aproximadamente 15 nM.

Ejemplo XIII (b) . Análisis de BIAnúcleo del scFv soluble Las cinéticas de la unión de proteínas Fab solubles a KDR (VEGFR-2) se midieron mediante resonancia de plasmon de superficie usando un biosensor de BIAnúcleo (Biosensor Pharmacia) . La proteína de fusión KDR (VEGFR-2)-AP se inmovilizó en un chip del sensor y se inyectaron proteínas Fab solubles a concentraciones en la gama de 1,5 nM a 100 nM. Los gráficos del sensor se obtuvieron a cada concentración y se evaluaron usando un progrma, BIA Evaluation 2.0, para determinar los índices constanates kon y koff. Kd se calculó como la "relación de los índices constantes koff/kon . i Los tres fragmentos de Fab específicos de KDR (VEGFR-2) se unen al receptor inmovilizado con Kd de 2 a 4 nM (Tabla 5) . El clon reactivo cruzado, D1F7, tiene .una Kd de 45 nM, que es de 10 a 15 veces más débil que aquellas de los clones específicos de KDR (VEGFR-2) . Es digno de mencionarse que, aunque la Kd general para los tres fragmentos de Fab específicos de KDR (VEGFR-2) son similares, la cinéticas de las uniones individuales, es decir kon y koff, para estos anticuerpos son bastante diferentes, por ejemplo D2C6 posee el índice más rápido, mientras que D1H4 tiene el índice más lento (Tabla 5) .

TABLA 5 - CINÉTICAS DE UNIONES DE LOS CUATRO FRAGMENTOS DE FAB ANTI-KDR (VEGFR-2) HUMANOS NEUTRALIZADORES Todos los números se determinan mediante el análisis BIAnúcleo y representan el medio + SE de por lo menos tres - determinaciones separadas .

Ejemplo XIII (c). Mapeo de Epítopes de Unión La producción de variantes de eliminación de dominios similares a Ig extracelulares de KDR (VEGFR-2) se ha descrito previamente (Lu et al (2000)). En un ensayo de mapeo de epítopes, KDR (VEGFR-2) -AP de longitud completa, fusiones de Ap de dos variantes de eliminación de dominio de KDR (VEGFR-2) Ig, y Flk-l-AP se inmovilizaron primero en una placa de 96 receptáculos (Nunc) usando un anticuerpo anti-AP de conejo ( inmunoglobulinas de DAKO, Glostrup, Dinamarca) como el reactivo de captura. La placa luego se incubó con diferentes proteínas Fab anti-KDR (VEGFR-2) a temperatura ambiente durante 1 hora, luego se incubaron con un conjugado de anticuerpo Fab antihumano de conejo-HRP. La placa se lavó y se desarrolló como se describió anteriormente.

Los epítopes de unión de los fragmentos de Fab anti-KDR (VEGFR-2) se mapearon usando el KDR (VEGFR-2) de longitud completa y dos ariantes de eliminación de dominio KDR (VEGFR-2 ) /Ig . KDR (VEGFR-2) (1-3) es una variante dé K¾R (VEGFR-2) que contiene los primeros tres dominios de Ig de extremidad de N. KDR (VEGFR-2) (3) i es una variante que contiene solamente el tercer dominio de Ig. Los clones D2C6 y D1H4 se unen igualmente bien a KDR (VEGFR-2), KDR (VEGFR-2 (1-3) y KDR (VEGFR-2 ) (3 ) , ubicando así su epítope(s) de unión 'dentro del dominio 3 de Ig. Los clones D2H2 y D1F7 se unen mucho más eficientemente a KDR (VEGFR-2) de longitud completa y a KDR (VEGFR-2) (1-3), lo cual indica un epítope (s) ' de unión más ancho dentro de los dominios 1 a 3 de Ig KDR (VEGFR-2) . Solamente el clon D1F7 reacciona en forma cruzada con Flk-1.

Ejemplo XIII (d). Ensayos anti -mitogénicos Se colocaron HUVEC (5 x 103 células/receptáculo) en placas de cultivo de tejidos de 96 receptáculos (Wallach, Inc., Gaithersburg, MD) en 200 µ? del medio EBM-2 sin VEGF, factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF) o factor de crecimiento epidérmico (EGF) y se incubaron a 37°C durante 72 horas. Se agregaron diferentes cantidades de proteínas Fab a receptáculos por duplicado y se preincubaron a 37°C durante 1 hora, después de lo cual se agregó VEGFi65 a una concentración final de 16 ng/ml . Después de 18 horas de incubación, se agregó 0,25 µ? de [3H] Td (Amersham) a cada receptáculo y se incubó durante otras 4 horas . Las células se lavaron una vez con PBS, se agregó tripsina y se cosecharon en un filtro de vidrio (Esterilla de Filtro Impresa A, Walach) con un cosechador de células, (Cosechador 96, MACH III, TOMTEC, Orange, CT) . La membrana se lavó tres veces con H20 y se secó con aire. Se agregó fluido de centelleo y la radioactividad incorporada del ADN se determinó en un contador de centelleo (Wallach, Contador de Centelleo Microbeta Modelo 1450) .

La capacidad de Fab anti-KDR (VEGFR-2) humano de bloquear la actividad mitogénica estimulada por VEGF sobre HUVEC. Los cuatro fragmentos Fab humanos inhibieron la síntesis del ADN inducida por VEGF en HUVEC en una forma dependiente de la dosis. La concentración de Fab que indujo el 50% (ECS0) de la incorporación de [3H] -TdR estimulada por VEGF en HUVEC, es aproximadamente 0,5 nM para los clones D2C6 y D1H , 0,8 nM para el clon D2H2 y 15 nM para el clon D1F7. Los controles ipcluyeron VEGF solamente (1.500 cpm) y el medio puro (60 cpm) . Se ensayaron receptáculos por duplicado. Los datos mostrados son representativos de por lo menos tres experimentos separados .

Ejemplo XIII (e). Ensayo de migración de leucemia Se lavaron células HL60 y HEL tres veces con un medio RPMI 1640 '-puro sin suero y se suspendieron en el medio a 1 x 106/ml. Se agregaron alícuotas de 100 µ? de suspensión de células a inserciones a través de los receptácµlos de poros de 3 µp? para las células HL60, o inserciones a través de los receptáculos de poros de 8 µtt? para las células HEL (Costar®, Corning Incorporated, Corning, NY) y se incubaron con las proteínas Fab anti-KDR (VEGFR-2) (5 µ9/p?1) durante 30 minutos a 37°C. Las inserciones se colocaron luego en los receptáculos de placas de 24 receptáculos que contienen 0,5 mi de RPMI 1540 sin suero con o sin VEGF165. La migración se llevó a cabo a 37 °C, 5% C02 durante 16-18 horas para las células HL60, o durante 4 horas para la células HEL. Las células que migraron se recogieron de los compartimientos inferiores y se contaron con un contador Coulter (Modelo Zl, Coulter Electronics Ltd., Luton, Inglaterra).

VEGF indujo la migración de las células HL60 y HEL en una forma dependiente de la dosis con estimulación máxima lograda a 200 ng. Todos los fragmentos Fab anti-KDR (VEGFR-2) inhibieron significativamente la migración estimulada por VEGF de las células HL60 y HEL. Como control, un fragmento Fab de C225, un anticuerpo dirigido contra el receptor de EGF, no mostró un efecto inhibidor significativo en este ensayo.

"¦¦EJEMPLO XIV. PRODUCCIÓN DE IgG " Ejemplo XIV(a) . Construcción de vectores para la expresión de IgG Se construyeron vectores separados para la expresión la cadena liviana y la cadena pesada de IgG. Los genes de VL clonados fueron digeridos y ligados en el vector KNlOO. Los genes de VH clonados fueron digeridos y ligados en el vector pGID105 que contiene el dominio constante de cadena pesada de IgG I (?) . Las construcciones se examinaron mediante digestión de enzima de restricción y se verificaron mediante la formación de secuencias de didesoxinucleótido . En ambos casos, la expresión está bajo el control del promotor de HCMV y es terminada por una secuencia de terminación artificial.

Los genes de cadena pesada y liviana unidos luego se clonaron en los vectores de expresión pEE6.1 y pEE12.1 de Lonza GS . Los vectores de cadena pesada y liviana se recombinaron en un solo vector para la transfección estable de las células de CHO y las células de NSO. Las células transfectadas se cultivan en el medio glutamina menos y expresan anticuerpos a niveles tan altos como 1 g/L.

Claims (39)

REIVINDICACIONES

1. Un método de inhibición del crecimiento de tumores, que comprende administrar a un humano una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) .

2. Un método de inhibición del crecimiento de tumores, que comprende administrar a un humano una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y radiación.

3. Un método de inhibición del crecimiento de tumores, que comprende administrar a un humano una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y un agente quimioterapéutico .

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1- 3, en donde el tumor sobreexpresa el VEGFR.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1- 4, en donde el tumor es un tumor de mama, corazón, pulmón, 2 intestino delgado, colon, bazo, riñon, vejiga, cabeza y cuello, ovarios, próstata, cerebro, páncreas, piel, huesos, médula ósea, sangre, timo, útero, testículos, cuello de útero o hígado.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el tumor es un tumor del colon.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el tumor es un carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) .

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicacione 1- 7, en donde el antagonista receptor de VEGF se administra en forma intravenosa.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1- 8, en donde el antagonista receptor de VEGF se administra oralmente .

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el antagonista receptor de VEGF inhibe la unión de VEGFR a su ligando. 3

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el antagonista receptor de VEGF une a VEGFR.

12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el antagonista receptor de VEGF comprende un anticuerpo, o un equivalente funcional de él, específico para VEGFR .

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el antagonista receptor de VEGF comprende una molécula pequeña específica para VEGFR.

14. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde el antagonista receptor de VEGF es un antagonista del receptor de tirosina cinasa similar a fms (flt-1) VEGFR-1.

15. El método de acuerdo con cualquiera de las reivinedicaciones 1-14, en donde el método además comprende administrar un agente antineoplásico .

16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el agente antineoplásico es un agente quimioterapéutico o radiación.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el método además comprende administrar un coadyuvante. 4

18. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en donde el tumor sobreexpresa EGFR.

19. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 4-18, en donde el antagonista EGFR se administra en forma intravenosa .

20. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 4-19, en donde el antagonista EGFR se administra oralmente.

21. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 4-20, en donde el antagonista EGFR inhibe la unión de EGFR a su ligando.

22. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 4-21, en donde el antagonista EGFR se une a EGFR.

23. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 4-24, en donde el antagonista EGFR inhibe la unión de EGFR a

ATP. 24. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 4-22, en donde el antagonista EGFR comprende un anticuerpo, o un equivalente funcional de él, específico para EGFR. 5

25. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 4-23, en donde el antagonista EGFR comprende una molécula pequeña específica para EGFR.

26. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 4-25, en donde el anticuerpo comprende una región constante de un anticuerpo humano.

27. El método de acuerdo con la reivindicación 26, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico que comprende una región variable de un anticuerpo de ratón.

28. El método de acuerdo con la reivindicación 26, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado que comprende una región variable que tiene regiones de determinación de complementariedad (CDR) de un anticuerpo de ratón y regiones de estructura de un anticuerpo humano.

29. El método de acuerdo con la reivindicación 26, en dfonde el anticuerpo es un anticuerpo humano que comprende una región variable de un anticuerpo humano.

30. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-29, en donde el agente quimioterapeutico no se conjuga al antagonista receptor de VEGF.

31. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-30, en donde el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo formado por cisplatina, dicarbazina, dactinomicina , mecloretamina, estreptozocina, ciclofosfamida, carmustina, lomustina, doxorubicina, daunorubicina ( procarbazina, mitomicina, citarabina, etoposida, metotexato, 5-fluorouracil , vinblastina, vincristina, bleomicina, paclitaxel, docetaxel, aldesleucina , asparaginasa, busulfan, carboplatina , cladribina, dacarbazina, floxuridina, fludarabina, hidroxiurea, ifosfamida, interferón alfa, leuprolida, megestrol, melfalan, mercaptopurina, plicamicina, mitotano, pegaspargasa, pentostatina , pipobroman, plicamicina, estreptozocina, tamoxifeno, teniposida, testolactona , tioguanina, tiotepa, uracil mostaza, vinorelbina, clorambucil, y taxol y combinaciones de ellos.

32. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-31, en donde el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo formado por cisplatina, doxorubicina, taxol y combinaciones de ellos. 7

33. Un kit para inhibir el crecimiento de tumores que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) .

34. El kit de acuerdo con la reivindicación 33, en donde el antagonista EGFR comprende un anticuerpo, o un equivalente funcional de él, específico para EGFR.

35. El kit de acuerdo con la reivindicación 33, en donde el antagonista EGFR comprende una molécula pequeña específica para EGFR.

36. El kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33-35, en donde el antagonista VEGFR comprende un anticuerpo, o un equivalente funcional de él, específico para VEGFR.

37. El kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33-35, en donde el antagonista VEGFR comprende una molécula pequeña específica para VEGFR.

38. El kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33-37, en donde el kit además comprende un agente antineoplásico . 8

39. El kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33-38, en donde el kit además comprende un coadyuvante.