CN110753755B - T细胞耗竭状态特异性基因表达调节子及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明是基于发现了T细胞耗竭状态特异性基因表达调节子及其用途。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年3月21日提交的美国临时申请62/310,903和2016年9月23日提交的美国临时申请62/398,948的优先权。前述每个申请的全部内容通过引用并入本申请。
权利声明
本发明是在国立卫生研究院授予的基金号AI115712,AI091493,AI082630,MH105979,和HG007910的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
发明背景
T细胞耗竭是T细胞功能障碍的获得性状态,是癌症和慢性病毒感染的标志(Wherry et al.(2007)Immunity 27:670-684;Zajac et al.(1998)J.Exp.Med.188:2205-2213)。最近,已证明在癌症中逆转T细胞耗竭的治疗非常有效(Barber et al.(2006)Nature 439:682-687; Topalian et al.(2012)New Engl.J.Med.366:2443-2454)。嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法也被证明对血液系统恶性肿瘤非常有效(Porter et al.(2011)New Engl.J.Med. 365:725-733),但是在用于治疗实体瘤的改造的T细胞中,耗竭的发生仍然严重阻碍了其广泛的使用(Long et al.(2015)Nat.Med.21:581-590)。确定调节T细胞耗竭的机制可以提高用于癌症免疫疗法的免疫检查点阻断和过继性T细胞疗法的效力(Barber et al.(2006) Nature 439:682-687;Topalian et al.(2012)NewEngl.J.Med.366:2443-2454;Porter et al. (2011)New Engl.J.Med.365:725-733)。然而,目前用于调节T细胞耗竭的策略依赖于直接调节效应基因表达产物(例如免疫检查点)的表达,并且这种调节会产生不期望得到的副作用,因为这种效应基因表达产物的生理水平通常是正常T细胞功能所需的。此外,这些策略易受耐药性影响,并可导致免疫病理作用。因此,本领域迫切需要鉴定出组合物和方法,以用于调节效应基因表达产物在T细胞中的表达,或者在能影响保留生理相关水平的这些基因表达产物的T细胞的细胞中的表达。
发明概述
本发明至少部分地基于以下发现:耗竭性T细胞,例如由癌症和/或慢性感染引起的耗竭性T细胞,具有独特的基因表达模式,包括抑制性受体PD-1的持续表达。例如,导致这种基因表达模式的耗竭性CD8+ T细胞中,其表观遗传景观(epigenetic landscape)与功能性记忆CD8+ T细胞的表观遗传景观有很大不同。感染期间CD8+ T细胞的分化伴随有可接近染色质区域的大规模重塑,形成增强子功能模块。耗竭性CD8+ T细胞获得了功能性 CD8+ T细胞中所没有的独特的增强子模块,以及获得了广泛的状态特异性转录因子结合网络。例如,一种离Pdcd1基因座-23kb的增强子,其仅被发现于耗竭性T细胞和具有持续 PD-1表达的其他淋巴细胞中。本文描述的基因组编辑证明该增强子是PD-1的高表达所必需的。因此,T细胞耗竭的发生,伴随着对其功能障碍至关重要的基因的状态特异性调节。这些基因表达的状态特异性基因组调节子是调节(例如通过基因组编辑)的靶点,用于优先在耗竭性CD8+T细胞或影响T细胞功能的细胞中改变基因表达。选择性地靶向T细胞耗竭特异性基因组调控元件(例如增强子、抑制子和启动子),可以维持PD-1等基因的正常生理调节,同时防止发生T细胞耗竭,例如在癌症和/或病毒感染中发生的T细胞耗竭。
在一个方面,提供了一种包含基因组区域的改造的哺乳动物T细胞,其1)调节至少一个基因的基因表达,和2)选择性地在来自所述哺乳动物的耗竭性CD8+ T细胞的基因组内是染色质可接近的,其中所述基因组区域经过了遗传修饰并且所述遗传修饰调节所述至少一个基因的表达。
进一步提供了许多实施方案,其可以应用于本发明的任何一个方面和/或与本文描述的任何其他实施方案组合。例如,在一个实施方案中,所述基因组基因表达调控区的活性上调(例如,所述改造的基因组基因表达调控区使得所述哺乳动物T细胞中所述至少一个基因的表达相较于来自没有所述改造的基因组基因表达调控区的哺乳动物的相同T细胞类型的所述至少一个基因的表达上调至少5%)。在另一个实施方案中,所述基因组基因表达调控区的活性下调(例如,所述改造的基因组基因表达调控区使得所述哺乳动物T细胞中所述至少一个基因的表达相较于来自没有所述改造的基因组基因表达调控区的哺乳动物的相同T细胞类型的所述至少一个基因的表达下调至少 5%)。在又一个实施方案中,所述至少一个基因的表达是所述至少一个基因的转录或翻译。在又一个实施方案中,所述基因组基因表达调控区或其部分是缺失的。在另一个实施方案中,所述基因组基因表达调控区或其部分通过基因组编辑缺失,任选地其中所述基因组编辑是组成性地或诱导性地表达(例如,如选自下组的基因组编辑: CRISPR-Cas9 RNA引导性改造核酸酶(RGEN)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物(TALE)、归巢大范围核酸酶和同源重组)。在又一个实施方案中,所述基因组基因表达调控区选自由表1A-1K中所示的调控区组成的组。
在又一个实施方案中,所述哺乳动物是免疫障碍动物模型,任选地其中所述免疫障碍是慢性免疫障碍。在另一个实施方案中,所述动物模型是小鼠模型。在又一个实施方案中,所述哺乳动物是人。在另一个实施方案中,所述人患有免疫障碍,任选地其中所述免疫障碍是慢性免疫障碍。
在又一个实施方案中,所述慢性免疫障碍是慢性感染或癌症。在又一个实施方案中,所述感染由选自下组的试剂引起:人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、腺病毒、巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、人疱疹病毒6、水痘-带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、乳头瘤病毒、细小病毒B19、多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、麻疹病毒、风疹病毒、人 T细胞白血病病毒I、人T细胞白血病病毒II、利什曼原虫属、弓形虫属、锥虫属、疟原虫属、血吸虫属和脑炎微抱子虫属。在另一个实施方案中,所述慢性感染不是潜伏感染。在又一个实施方案中,所述癌症是血液癌症或实体癌症。在又一个实施方案中,所述实体癌症选自下组:肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、皮肤癌、黑色素瘤、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、结肠直肠癌、肝癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、肉瘤、淋巴瘤和脑癌。在另一个实施方案中,所述耗竭性CD8+ T细胞表达T细胞耗竭生物标志物,所述T细胞耗竭生物标志物选自下组:检查点抑制剂、PD-1(Pdcd1)、TIM-3(Havcr2)、LAG-3(Lag3)、CTLA-4(Ctla4)、2B4 (CD244)、CD39(Entpd1)、CD160、脱中胚蛋白(Eomes)、T-BET(Tbx21)、BATF、 BLIMP-1(Prdm1)、NFATC1、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、Foxp1、视黄酸受体α(Rara),及其组合。在又一个实施方案中,所述T细胞是CD8+ T细胞。在又一个实施方案中,所述CD8+ T细胞是非耗竭性T细胞或耗竭性T细胞。在另一个实施方案中,所述非耗竭性CD8+ T细胞是初始细胞、功能性效应细胞或记忆细胞。在另一个实施方案中,所述耗竭性CD8+ T细胞表达T细胞耗竭生物标志物,所述T细胞耗竭生物标志物选自下组:检查点抑制剂、PD-1(Pdcd1)、TIM-3(Havcr2)、LAG-3(Lag3)、CTLA-4(Ctla4)、2B4(CD244)、CD39(Entpd1)、CD160、脱中胚蛋白(Eomes)、 T-BET(Tbx21)、BATF、BLIMP-1(Prdm1)、NFATC1、NR4A2、MAFB、OCT-2 (Pou2f2)、Foxp1、视黄酸受体α(Rara),及其组合。在又一个实施方案中,所述 T细胞是原代T细胞,所述原代T细胞是分离自所述哺乳动物,经过改造,并离体返回至所述哺乳动物。在又一个实施方案中,所述T细胞存在于所述哺乳动物体内或者是在体外培养的。
在另一个方面,提供了一种改造哺乳动物T细胞以调节所述哺乳动物T细胞中至少一个基因的表达的方法,所述方法包括以遗传方式修饰所述基因的基因表达调控区,其中所述基因表达调控区是在来自所述哺乳动物的耗竭性CD8+ T细胞中选择性地对染色质可接近的,并且其中所述遗传修饰调节所述至少一个基因的表达。
如上所述,进一步提供了许多实施方案,其可以应用于本发明的任何方面和/或与本文描述的任何其他实施方案组合。例如,在一个实施方案中,所述基因组基因表达调控区是上调的(例如,所述改造的基因组基因表达调控区使得所述哺乳动物T细胞中所述至少一个基因的表达相较于来自没有所述改造的基因组基因表达调控区的哺乳动物的相同T细胞类型的所述至少一个基因的表达上调至少5%)。在另一个实施方案中,所述基因组基因表达调控区是下调的(例如,所述改造的基因组基因表达调控区使得所述哺乳动物T细胞中所述至少一个基因的表达相较于来自没有所述改造的基因组基因表达调控区的哺乳动物的相同T细胞类型的所述至少一个基因的表达下调至少 5%)。在又一个实施方案中,所述至少一个基因的表达是所述至少一个基因的转录或翻译。在又一个实施方案中,所述基因组基因表达调控区或其部分是缺失的。在另一个实施方案中,所述基因组基因表达调控区或其部分通过基因组编辑缺失,任选地其中所述基因组编辑是组成性地或诱导性地表达。在又一个实施方案中,所述基因组编辑选自下组:CRISPR-Cas9 RNA引导性改造核酸酶(RGEN)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物(TALE)、归巢大范围核酸酶和同源重组。在又一个实施方案中,所述基因组基因表达调控区选自由表1A-1K中所示的调控区组成的组。在又一个实施方案中,所述哺乳动物是免疫障碍动物模型,任选地其中所述免疫障碍是慢性免疫障碍。在又一个实施方案中,所述动物模型是小鼠模型。在又一个实施方案中,所述哺乳动物是小鼠或人。在另一个实施方案中,所述哺乳动物是人。在又一个实施方案中,所述人患有免疫障碍,任选地其中所述免疫障碍是慢性免疫障碍。在又一个实施方案中,所述慢性免疫障碍是慢性感染或癌症。在另一个实施方案中,所述感染由选自下组的试剂引起:人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒 (HBV)、腺病毒、巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、人疱疹病毒6、水痘-带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、乳头瘤病毒、细小病毒B19、多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、麻疹病毒、风疹病毒、人T细胞白血病病毒I、人T细胞白血病病毒II、利什曼原虫属、弓形虫属、锥虫属、疟原虫属、血吸虫属和脑炎微抱子虫属。在又一个实施方案中,所述慢性感染不是潜伏感染。在又一个实施方案中,所述癌症是血液癌症或实体癌症。在另一个实施方案中,所述实体癌症选自下组:肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、皮肤癌、黑色素瘤、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、结肠直肠癌、肝癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、肉瘤、淋巴瘤和脑癌。在又一个实施方案中,所述耗竭性CD8+ T 细胞表达T细胞耗竭生物标志物,所述T细胞耗竭生物标志物选自下组:检查点抑制剂、PD-1(Pdcd1)、TIM-3(Havcr2)、LAG-3(Lag3)、CTLA-4(Ctla4)、2B4(CD244)、 CD39(Entpd1)、CD160、脱中胚蛋白(Eomes)、T-BET(Tbx21)、BATF、BLIMP-1 (Prdm1)、NFATC1、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、Foxp1、视黄酸受体α (Rara),及其组合。在又一个实施方案中,所述T细胞是CD8+ T细胞。在另一个实施方案中,所述CD8+ T细胞是非耗竭性T细胞或耗竭性T细胞。在又一个实施方案中,所述非耗竭性CD8+ T细胞是初始细胞、功能性效应细胞或记忆细胞。在又一个实施方案中,所述耗竭性CD8+ T细胞表达T细胞耗竭生物标志物,所述T细胞耗竭生物标志物选自下组:检查点抑制剂、PD-1(Pdcd1)、TIM-3(Havcr2)、LAG-3(Lag3)、CTLA-4 (Ctla4)、2B4(CD244)、CD39(Entpd1)、CD160、脱中胚蛋白(Eomes)、T-BET(Tbx21)、 BATF、BLIMP-1(Prdm1)、NFATC1、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、Foxp1、视黄酸受体α(Rara),及其组合。在另一个实施方案中,所述T细胞是分离自所述哺乳动物的原代T细胞。在又一个实施方案中,所述T细胞存在于所述哺乳动物体内或者是在体外培养的。在又一个实施方案中,所述至少一个基因为至少2个基因。
在又一个实施方案中,提供了一种防止非耗竭性CD8+ T细胞耗竭的方法,所述方法包括根据本文所述的任何方法改造所述非耗竭性CD8+ T细胞。在一个实施方案中,所述非耗竭性CD8+ T细胞是初始细胞、功能性效应细胞或记忆细胞。在又一个实施方案中,所述方法还包括将所述改造的非耗竭性CD8+ T细胞施用给受试者。
在又一个方面,提供了一种在耗竭性CD8+ T细胞中逆转CD8+ T细胞耗竭的方法,所述方法包括根据本文描述的任何方法改造所述耗竭性CD8+ T细胞。在一个实施方案中,所述耗竭性CD8+ T细胞表达T细胞耗竭生物标志物,所述T细胞耗竭生物标志物选自下组:检查点抑制剂、PD-1(Pdcd1)、TIM-3(Havcr2)、LAG-3(Lag3)、 CTLA-4(Ctla4)、2B4(CD244)、CD39(Entpd1)、CD160、脱中胚蛋白(Eomes)、T-BET (Tbx21)、BATF、BLIMP-1(Prdm1)、NFATC1、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、Foxp1、视黄酸受体α(Rara),及其组合。在另一个实施方案中,所述方法还包括将所述改造的耗竭性CD8+ T细胞施用给受试者。
在另一个方面,提供了一种治疗受试者免疫障碍的方法,所述方法包括向所述受试者施用本申请描述的改造的T细胞。在一个实施方案中,局部地或全身地施用所述改造的T细胞。在另一个实施方案中,所述全身施用是静脉内、肌肉内、腹膜内或关节内施用。在又一个实施方案中,施用于所述受试者的所述改造的T细胞对于所述受试者是自体的、同基因的、同种异体的或异种的。在又一个实施方案中,施用给所述受试者的所述改造的T细胞是以药学上可接受的制剂进行施用的。在另一个实施方案中,所述改造的T细胞在施用给所述受试者后维持所述至少一个基因的至少5%调节性表达。在又一个实施方案中,所述方法还包括向所述受试者施用治疗有效量的药物组合物,所述药物组合物包含一种或多种抗免疫障碍的试剂。在又一个实施方案中,所述方法还包括使所述CD8+ T细胞与一种或多种预防或逆转CD8+ T细胞耗竭的试剂接触。在另一个实施方案中,所述一种或多种试剂是免疫检查点抑制剂。在又一个实施方案中,所述免疫检查点选自下组:PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、TIM-1、CTLA-4、 VISTA、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、2B4、ICOS、HVEM、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、TIM-1、TIM-4、BTLA、SIRP-α(CD47)、CD48、2B4(CD244)、B7.1、 B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT和A2aR。在又一个实施方案中,所述哺乳动物是免疫障碍动物模型,任选地其中所述免疫障碍是慢性免疫障碍。在另一个实施方案中,所述动物模型是小鼠模型。在又一个实施方案中,所述哺乳动物是小鼠或人。在又一个实施方案中,所述哺乳动物是人。在另一个实施方案中,所述人患有免疫障碍,任选地其中所述免疫障碍是慢性免疫障碍。在又一个实施方案中,所述慢性免疫障碍是慢性感染或癌症。在又一个实施方案中,所述感染由选自下组的试剂引起:人类免疫缺陷病毒 (HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、腺病毒、巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、人疱疹病毒6、水痘-带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、乳头瘤病毒、细小病毒B19、多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、麻疹病毒、风疹病毒、人T细胞白血病病毒I、人T细胞白血病病毒II、利什曼原虫属、弓形虫属、锥虫属、疟原虫属、血吸虫属和脑炎微抱子虫属。在另一个实施方案中,所述慢性感染不是潜伏感染。在又一个实施方案中,所述癌症是血液癌症或实体癌症。在又一个实施方案中,所述实体癌症选自下组:肺癌、非小细胞肺癌 (NSCLC)、皮肤癌、黑色素瘤、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、结肠直肠癌、肝癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、肉瘤、淋巴瘤和脑癌。
附图简述
图1包括8个版块,标识为版块A、B、C、D、E、F、G和H,其示出了CD8+ T 细胞耗竭与可接近染色质的广泛变化相关。版块A示出了实验的示意图。版块B示出了Ccr7和Ifng基因座处的代表性ATAC-Seq轨迹。版块C示出了恒定的和变化的染色质可接近区域的分数占比。版块D示出了在每个时间点新区域的发展轨迹。版块 E示出了细胞状态之间染色质可接近区域的重叠。版块F示出了急性和慢性CD8+ T 细胞状态之间非差异性(左)和差异性(右)区域的分布。版块G示出了所有非差异性(浅灰色)和差异性(深灰色)基因间区域到最近TSS的距离。版块H示出了通过基因表达(左)和染色质可接近性(右)测得的状态之间相似性的关联网络。边长对应于相似度(1-Spearman相关系数)。
图2包括9个版块,标识为版块A、B、C、D、E、F、G、H和I,其示出了来自小鼠CD8+ T细胞的染色质可接近区域的特征。版块A示出了每种条件下染色质可接近区域的数量,划分为标识出的重叠转录起始位点(TSS)、外显子、内含子和基因间区域。版块B为散点图,其示出了初始、急性d8、急性d27、慢性d8和慢性d27 状态的生物学重复之间在峰强度方面的相关性。版块C示出了所有43,471个ChAR 中的初始、急性d8、急性d27、慢性d8和慢性d27状态的生物学重复的主要成分分析。版块D示出了来自所有五种细胞状态的ATAC-Seq片段大小。版块E示出了对于所有五种细胞状态,所有基因间染色质可接近区域到最近TSS的距离(占总数的百分比)。版块F示出了对于所有五种细胞状态,针对进化保守性、调控区状态和ATAC峰内组蛋白标记所注释的区域的富集倍数。版块G示出了所有TSS(黑色)、H3K27ac 峰(深灰色)和H3K27me3(浅灰色)的组合的ATAC信号。版块H示出了在初始的 (灰色符号)、CD8+ T细胞以及在急性(白色符号)或慢性(黑色符号)感染后的那些细胞中,染色质可接近区域随时间变化覆盖的基因组分数占比。版块I示出了对于由下方灰色/白色符号表示的组合,来自急性和慢性感染的在第8天和第27天的 CD8+ T细胞中共有的和差异性染色质可接近区域的数目(q<0.05代表差异性的)。
图3包括4个版块,标识为版块A、B、C和D,其示出了CD8+ T细胞中的状态特异性增强子形成模块,定位至功能上不同的基因类别。版块A是峰的热图,其示出了所有差异性的可接近区域的强度(行),其通过细胞状态之间的相似性(列)进行聚类。版块B为热图,其示出了每个细胞状态中版块A的每个模块内相邻基因的按行归一化的平均mRNA表达。每个模块的基因信息在右侧示出。版块C示出了每个细胞状态中每个模块的平均基因表达和平均染色质可接近性之间的相关性。字母符号对应于版块A-B中所示的模块。版块D为热图,其示出了每个模块(列)中基因本体术语(行)的富集。P值(二项式测试)表示为1-log10。
图4示出了状态之间差异性区域的比较。该图显示了使用给定数目的K均值簇得到的间隙统计,应用于所述五个细胞状态间所有差异性区域的信号强度。
图5包括9个版块,标识为版块A、B、C、D、E、F、G、H和I,其示出了CRISPR/Cas9 介导的增强子编辑的结果。版块A示出了基因组编辑方案的示意图。版块B示出了 EL4细胞中使用的CRISPR PD-1靶向性和非靶向性sgRNA。版块C示出了用于筛选基因组缺失和用于Sanger测序的PCR引物。版块D示出了EL4细胞中PD-1表达的直方图,所述EL4细胞转染有靶向-23.8kb区域的对照(浅灰色)或双切口sgRNA。版块E示出了提供PCR筛选结果的凝胶,所述PCR筛选使用来自接受对照sgRNA、单增强子sgRNA和双增强子sgRNA的EL4细胞的基因组DNA。版块F示出了提供 PCR筛选结果的凝胶,所述PCR筛选使用来自45个接受了双增强子靶向性sgRNA 的EL4单细胞克隆的基因组DNA。版块G示出了EL4单细胞克隆中PD-1的表达,所述EL4单细胞克隆为野生型的(WT)(白色柱),或者是缺失-23.8kb增强子的(Del) (p<0.0002,对于PD-1的表达使用了Mann-Whitney秩和检验)。版块H示出了代表性EL4单细胞克隆的增强子处的序列。克隆编号对应于版块A中的编号,并且箭头表示来自sgRNA的预期切割位点。版块I显示了WT或Del克隆中相对的mRNA表达(p<0.005,T-检验)。
图6包括8个版块,标识为版块A、B、C、D、E、F、G和H,其显示对耗竭特异性的增强子的高分辨率功能性定位能识别到调节PD-1的最小序列。版块A示出了来自CD8+ T细胞、EL4细胞系和所示的造血谱系的ATAC-Seq轨迹(Lara-Astiaso等人(2014)Science 345:943-949)。箭头表示各个ChAR。注意版块A分为子版块A和 A′。版块B示出了转导了阴性对照最小启动子(左)、CMV启动子构建体(中)和 Pdcd1-23.8kb增强子构建体(右)的EL4(上部)和活化的CD8+ T细胞(下部)中 GFP报告基因的表达。柱状图显示3-4次重复的平均值。版块C示出了细胞分选门控 (上方版块)和PD-1增强子区域(下方版块)的相应的基因组PCR的结果,其示出了转染有对照(左)或双切口sgRNA(右)的EL4细胞中野生型(WT)或缺失型(Del) 等位基因的比例。版块D示出了代表性EL4野生型(浅灰色)或增强子缺失的单细胞克隆的PD-1表达。版块E示出了在所示位置处高PD-1和低PD-1群体内sgRNA(灰色符号)的归一化的富集。对照非靶向性sgRNA以5bp的间距进行了伪定位。黑色圆圈符号对应于-23.8kb增强子内具有最大效果的21个sgRNA,后来产生了其等基因系。版块F示出了对于-23.8kb增强子中21个评分最高的sgRNA,版块E中归一化的富集评分与单独转染的EL4细胞的PD-1 MFI之间的相关性。版块G显示了-23.8kb 增强子内TF足迹和sgRNA活性的重叠。顶部显示了慢性d27中结合概率>0.9的TF 足迹。线条代表评分最高的sgRNA的切割位点。每个sgRNA相对于转染有对照引导的群体的PD-1 MFI的变化(圆圈符号,左轴)。以黑色示出由sgRNA活性造成的PD-1 MFI变化的10bp运行平均值(右轴)。版块H为急性d27相对于慢性d27 CD8+ T细胞中差异性TF足迹的火山图。
图7包括7个版块,标识为版块A、B、C、D、E、F和G,其示出了PD-1增强子的原位饱和诱变的结果。版块A示出了合并的筛选文库中sgRNA的组成。版块B 示出了相邻sgRNA切割位点之间的间隙分布。版块C示出了与对照转导的EL4(灰色)相比,转导了合并的sgRNA的EL4中的PD-1分布(左)。门控表示高PD-1和低PD-1的分选分数占比。示出了高分选群体和低分选群体中PD-1的分选后分布(右)。版块D示出了质粒库中的sgRNA表达与转导后EL4中的sgRNA表达的相关性。版块E示出了3次重复中高PD-1和低PD-1群体内的sgRNA富集评分。版块F示出了在-23.8kb增强子中,高PD-1和低PD-1群体内所有sgRNA(灰色符号)的归一化的富集,其中sbRNA富集的10bp运行平均值以黑色示出。版块G示出了在-23.8kb增强子内低PD-1部分中富集的32个sgRNA的序列,其被选择用于进行个体验证。左侧示出了距离-23.8kb增强子起点的相对位置。
图8包括4个版块,标识为版块A、B、C和D,其示出了用ChIP-Seq数据评估转录因子足迹的结果。版块A示出了IGV轨迹,其示出了初始、急性d8、急性d27、慢性d8和慢性d27细胞状态的ATAC-Seq峰,以及来自体外活化的CD8+ T细胞的 c-Jun、Batf和IRF4在Gzmb基因座处的ChIP轨迹。版块B示出了所示TF的代表性转录因子(TF)足迹。版块C示出了整个基因组中BATF和IRF4的归一化的ChIP-Seq 读数和Centipede后验概率的相关性。版块D示出了用于调出IRF4和BATF结合存在/不存在的Centipede后验概率的不同截止值的ROC图(ChIP-Seq峰用作识别TF结合的标准)。
图9包括2个版块,标识为版块A和B,其示出了染色质可接近区域中的转录因子足迹。图A显示了7个ChAR模块(列)中100个转录因子(TF)(行)的相对富集倍数。行和列按层级聚类。通过加权急性和慢性感染中的差异性基因表达和差异性TF推断结合,确定了TF排序。版块B示出了对于所有五种状态推断的TF结合事件的总数(上方),或者在d8和d27时急性和慢性之间推断的差异性TF结合事件数的差异(下方)。
图10包括3个版块,标识为版块A、B和C,其示出了染色质可接近区域中转录因子足迹的结果。版块A是初始d8 CD8+ T细胞相对于急性d8 CD8+ T细胞中TF基序处的相对结合活性的火山图。版块B示出了在-23.8kb PD-1增强子中具有足迹的 Sox3、RAR和TBX21的基序。版块C示出了网络图,其提供了在与基因相邻的区域 (正方形节点)中TF基序(圆形节点)处的推断的结合。在感染后第7天(上方) 和第27天(下方),根据mRNA表达将基因在急性和慢性感染之间划分为上调的(左侧)、下调的(右侧)或不变的(中间)。对TF节点着色以指示慢性(左侧)或急性(右侧)感染中状态特异性结合的偏倚。对边缘进行分级以指示状态特异性结合事件相对于3类基因(在急性感染、慢性感染中上调,或者不变)的相对分数占比。代表优先在慢性感染中识别到最多的结合事件的边缘位于最左侧,而代表优先在急性感染中识别到最多的结合事件的边缘位于最右侧。
图11包括5个版块,标识为版块A、B、C、D和E,其示出了人CD8+ T细胞染色质可接近区域和小鼠直系同源区域的特征。版块A示出了在代表性的人样品上对于四聚体+、初始和效应记忆群体的细胞分选方案。版块B示出了对于所有人样品,针对公开的人原代T细胞中组蛋白标记的注释区域在ATAC峰内的富集倍数。版块C 示出了所有NHGRI GWAS SNP的富集。虚线表示p=0.05(超几何测试)。版块D示出了免疫系统疾病相关SNP的富集。图E为热图,其示出了自身免疫疾病SNP在直系同源调节区域中相对于随机选择的区域的富集倍数。列按照层级进行聚类。
图12包括8个版块,标识为版块A、B、C、D、E、F、G和H,其示出了小鼠的耗竭特异性表观遗传谱在HIV和HCV感染中的抗原特异性耗竭性人T细胞中是保守的。版块A示出了在IFNG基因座处来自初始、HIV四聚体+和CMV四聚体+样品的代表性ATAC-Seq轨迹(上方)。示出了小鼠染色质可接近区域定位至人类基因组 IFNG处(两个方块,下方)。注意该版块分为子版块A和A′,并且子版块A′进一步示出了TBX21基因位点处的ATAC-Seq轨迹。版块B示出了针对初始、急性d8、急性d27、慢性d8和慢性d27状态,完全/部分定位至人基因组(hg19)的所有峰的百分比。版块C示出了小鼠直系同源ChAR中PICS SNP的富集。虚线表示p=0.05(超几何测试)。版块D示出了小鼠和人比较性分析的示意图。版块E为热图,其示出了在所示人样品中与小鼠的初始、记忆和耗竭增强子直系同源的区域处的平均染色质可接近性。版块F示出了在来自单一经HCV感染的供体的初始、HCV C63B四聚体+、 HCV 174D四聚体+、流感MP四聚体+和效应记忆CD8+ T细胞群中,通过流式细胞术测得的PD-1和CD39的表达。版块G示出了编码C63B和174D表位的病毒序列。版块H为热图,其显示了在所示来自单一经HCV感染的供体的人样品中,与小鼠的初始、记忆和耗竭增强子直系同源的区域处的平均染色质可接近性。
图13包括3个版块,标识为版块A、B和C,其示出了对PD-1上游-23kb增强子序列种系缺失的小鼠的表征。版块A示出了通过PCR进行该增强子序列种系缺失的示意图。版块B描述了用于将所述种系缺失引入基因组中的显微注射和移植至小鼠的方法。版块C通过凝胶电泳比较了7个可存活后代中含有-23kb增强子序列的ChAR 区域,并证明7个后代中有2个(即ms4和ms6)缺失了所述增强子序列。
图14包括5个版块,标识为版块A、B、C、D和E,其比较了-23kb增强子序列种系缺失的小鼠相对于野生型小鼠的特征。版块A示出了用于产生小鼠的两种混合的过继细胞转移方案的示意图。版块B示出了来自版块A中产生的两种小鼠混合的CD8+ T细胞的表征,以及使用流式细胞术比较其细胞群和转基因TCR和PD-1的表达水平的结果。版块C示出了来自版块A中产生的两种小鼠混合的CD8+ T细胞的表征,以及使用MFI比较其PD-1表达水平的结果。版块D比较了来自d8时的两种小鼠混合的CD8+ T细胞的生长速率(以log2倍数变化表示)。版块E比较了来自d15时的两种小鼠混合的CD8+ T细胞的生长速率(以log2倍数变化表示)。
对于示出柱状直方图、曲线或与结合图例的其他数据的任何附图,对于每一条说明,从左到右呈现的柱、曲线或其他数据直接地并且按顺序对应于图例中从顶部到底部的框。
发明详述
本发明至少部分基于以下发现:耗竭性T细胞,例如由癌症和/或慢性病毒感染引起的耗竭性T细胞,具有独特的基因表达模式,包括抑制性受体PD-1的持续性表达。已经发现染色质可接近的基因组基因调控区域(例如,基因表达增强子或基因表达抑制子,不管是远离启动子或是在启动子自身内部)对于耗竭性T细胞来说是状态特异性的,并且极大地不同于功能性的记忆CD8+ T细胞中的那些。由于这些区域是染色质可接近的,因此转录因子能够物理结合该区域以介导基因表达的调节。在耗竭性T细胞中的这种状态特异性的基因调节对于T细胞的功能障碍非常关键,并且可作为调节的靶点,例如通过基因组编辑来调节,从而优先在耗竭性CD8+ T细胞中或在影响T细胞功能的细胞中改变基因的表达,如本申请所述。在慢性病毒感染的小鼠模型中,耗竭性CD8+ T细胞获得了广泛的状态特异性的增强子模式,其被组织形成功能模块。一种离Pdcd1基因座-23.8kb的增强子,仅被发现于耗竭性T细胞和具有持续的PD-1表达的其他淋巴细胞中。基因组编辑显示该增强子是高PD-1表达所必需的。 Cas9介导的所述增强子的原位饱和诱变确定了关键的最小序列,其对应于耗竭性 CD8+ T细胞中RAR、T-bet和Sox3的结合转录因子基序。在小鼠耗竭性CD8+ T细胞中发现的状态特异性增强子谱在对HIV和HCV感染做出应答的人的耗竭性抗原特异性CD8+ T细胞中是保守的。T细胞耗竭的详细功能增强子图谱揭示了状态特异性调节序列,并提供了基因组编辑的靶点,其可优先在耗竭性CD8+ T细胞中改变基因的表达。
在非耗竭性T细胞中选择性地靶向T细胞耗竭特异性的染色质可接近的基因组调控元件,如增强子、抑制因子和/或启动子,以防止T细胞耗竭和/或在耗竭性T细胞中逆转T细胞耗竭,这样可维持PD-1等基因的正常生理调节,同时调控T细胞耗竭,例如在癌症和/或病毒感染等慢性免疫疾病中发生的T细胞耗竭。靠近基因的转录起始位点并且调节单个基因的基因表达调控区域通常被称为增强或抑制启动子的基因表达调控区域,而远离基因的转录起始位点并且可能调节单个以上基因的基因表达调控区域通常被称为增强子和抑制子。
因此,本发明部分涉及用于改造T细胞的组合物和方法,所述T细胞具有哺乳动物T细胞(例如,非耗竭性或耗竭性T细胞)中至少一个基因的被调节的表达,通过对调节所述至少一个基因表达的基因组区域进行遗传修饰,其中所述基因组区域在耗竭性CD8+ T细胞的基因组内是选择性地染色质可接近的。另外,本发明提供了治疗患有慢性免疫障碍(例如,癌症和/或慢性病毒感染)的受试者的方法。此外,本文还描述了许多其他的预后、诊断和治疗方法。
I.定义
本文使用的冠词“一”和“一种”是指该冠词所指的一个或一个以上(即至少一个)的语法对象。举例来说,“一种元件”表示一个元件或一个以上的元件。
如果标志物的量分别高于或者低于正常水平,差值比评估量所采用的实验的标准误差更大,并且优选至少两倍,更优选三倍,四倍,五倍,十倍或更多倍于该量,则受试者中所述标志物的“量”(例如,标志物的表达或拷贝数,或者标记物的蛋白质水平)“显著”高于或低于所述标志物的正常的量。或者,如果所述标志物的量比所述标志物的正常量分别高或低至少约2倍,并且优选至少约3、4或5倍,则可认为所述受试者中的所述标志物的量“显著”高于或低于所述正常量。
术语标记物的“改变的表达水平”是指测试样品(例如,来自患有癌症的受试者的样品)中标志物的表达水平或拷贝数,其大于或小于评估表达或拷贝数所采用的实验的标准误差,并且优选为对照样品(例如,来自没有相关疾病的健康受试者的样品) 中标志物或染色体区域的表达水平或拷贝数(优选几个对照样品中所述标志物或染色体区域的平均表达水平或拷贝数)的至少两倍,更优选三倍、四倍、五倍或十倍或更多倍。所述改变的表达水平大于或小于评估表达或拷贝数所采用的实验的标准误差,并且优选为对照样品(例如,来自没有所述相关疾病的健康受试者的样品)中所述标志物的表达水平或拷贝数(优选几个对照样品中所述标志物的平均表达水平或拷贝数)的至少两倍,更优选三倍、四倍、五倍或十倍或更多倍。
术语标志物的“改变的活性”是指这样的标志物活性:与正常对照样品中所述标记物的活性相比,其在疾病状态下(例如,在肿瘤或自身免疫样品中)升高或减少。标记物的改变的活性可以是由于,例如,所述标志物的表达改变,所述标志物的蛋白质水平改变,所述标志物的结构改变,或者例如与其他蛋白质的相互作用的改变(所述蛋白质参与与所述标志物相同或不同的通路),或与转录激活因子或抑制因子的相互作用的改变。
生物标志物的术语“改变的结构”是指生物标志物核酸或蛋白质内存在突变或等位基因变体,例如,与正常的或野生型基因或蛋白质相比,影响标志物核酸或蛋白质的表达或活性的突变。例如,突变包括但不限于取代,缺失或插入突变。突变可以存在于所述生物标志物核酸的编码区或非编码区中。
除非本文另有说明,否则术语“抗体”泛指天然存在形式的抗体(例如,IgG, IgA,IgM,IgE)和重组抗体如单链抗体、嵌合和人源化的抗体和多重抗体,以及所有前述的片段和衍生物,所述片段和衍生物至少具有一个抗原结合位点。抗体衍生物可包含与抗体缀合的蛋白质或化学部分。本文所述的抗体和抗体片段的性质也适用于本文所述的Fc融合蛋白。
本文使用的术语“抗体”还包括抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”)。本文使用的术语“抗原结合部分”是指抗体的一个或多个片段,所述片段保留了特异性结合抗原的能力(例如,PD-1多肽或其片段)。已经显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段执行。术语抗体的“抗原结合部分”内涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段,其为由VL,VH,CL和CH1结构域组成的单价片段;(ii)F(ab′)2片段,其为包含两个Fab片段的二价片段,所述Fab片段在铰链区通过二硫键连接; (iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段;(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段,(v)dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature 341:544-546),其由VH结构域组成;和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外,虽然所述Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码,但它们可以通过使用重组方法由合成的接头连接,这使得能够将它们制成单个蛋白质链,其中VL和VH区域配对形成单价多肽(称为单链Fv(scFv);参见例如,Bird et al.(1988)Science 242:423-426;和Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883;和Osbourn et al.(1998)Nat.Biotechnol.16:778)。此类单链抗体也应包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。特定scFv的任意 VH和VL序列可以与人免疫球蛋白恒定区的cDNA或基因组序列连接,以产生编码完整IgG多肽或其他同种型的表达载体。通过使用蛋白质化学或重组DNA技术,也可将VH和VL用于产生Fab、Fv或免疫球蛋白的其他片段。还包括其他形式的单链抗体,例如双抗体。双抗体是二价的双特异性抗体,其中在单个多肽链上表达VH和 VL结构域,但使用的接头太短以至于在同一链上的两个结构域之间无法配对,从而迫使该结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见例如, Holliger,P.,et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448;Poljak,R.J.,et al. (1994)Structure 2:1121-1123)。
更进一步地,抗体或其抗原结合部分可以是更大的免疫粘附多肽的一部分,通过抗体或抗体部分与一个或多个其他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成。此类免疫粘附多肽的实例包括使用链霉抗生物素蛋白核心区来制备四聚体scFv多肽(Kipriyanov, S.M.,et al.(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)和使用半胱氨酸残基、标记肽和C-末端的多聚组氨酸标签来制备二价的和生物素化的scFv多肽(Kipriyanov, S.M.,et al.(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058)。抗体部分如Fab和F(ab′)2片段可以通过使用常规技术(例如分别用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完全抗体)从完全抗体制得。此外,如本文所述,可以使用标准的重组DNA技术获得抗体、抗体部分和免疫粘附多肽。
抗体可以是多克隆的或单克隆的;异种的、同种异体的或同基因的;或其修饰形式(例如,人源化的,嵌合的等)。抗体也可以是完全的人抗体。优选地,本发明所述抗体与PD-1多肽或其片段特异性地或基本上特异性地结合。它们也可以对这些抗原具有选择性,从而使得它们可以将这些抗原与密切相关的抗原(例如其他B7家族成员)区分开。本文使用的术语“单克隆抗体”和“单克隆抗体组合物”是指抗体多肽群,其仅含有一种能够与抗原的特定表位免疫反应的抗原结合位点,而术语“多克隆抗体”和“多克隆抗体组合物”是指含有多种能够与特定抗原相互作用的抗原结合位点的抗体多肽群。单克隆抗体组合物通常对与其发生免疫反应的特定抗原显示出单一的结合亲和力。
本文使用的“阻断剂”或“拮抗剂”是抑制或降低其所结合的抗原的至少一种生物学活性的物质。例如,抗PD-1抗体结合PD-1并抑制PD-1结合一种或多种配体(例如PD-L1和/或PD-L2)的能力。在某些实施方案中,本文所述的阻断抗体或拮抗剂抗体或其片段基本上或完全抑制所述抗原的给定生物学活性。在某些实施方案中,术语“反向激动剂”是指促进与正常相反的作用的试剂。例如,PD-1反向激动剂可以促进免疫应答的共刺激,而不是共抑制。
术语“生物标志物”或“标志物”是指本发明的可测量实体,其已被确定能指示 T细胞的耗竭。例如,本文描述的生物标志物可以是调节T细胞中至少一种基因表达的基因组调控区域。在另一个实施方案中,本文描述的生物标志物可以是效应基因或其由T细胞表达的产物,并且与T细胞活性和/或T细胞耗竭相关(例如,在耗竭性 T细胞中的较高的持续性PD-1表达和/或活性)。生物标志物还可以包括,但不限于,细胞类型(例如,改造的T细胞),细胞比例(例如,改造的T细胞与耗竭性T细胞的比率),核酸(例如,基因组核酸和/或转录核酸)和蛋白质,特别是表1中提供的生物标志物。生物标志物可以进一步包括免疫靶点或试剂,其下调不需要的免疫应答以便如本文进一步描述的那样治疗感兴趣的免疫障碍。生物标志物活性的调节 (例如,升高或减少)可以以任何方式(例如,根据本文描述的方式,包括使用对照,比率,与基线的比较等)进行测量。例如,在耗竭性CD8+ T细胞中改造选择性染色质可接近的基因组调控区域可以降低至少一个基因上的增强子活性,其是通过与来自没有所述改造的基因组调控区域的相同生物体的相同T细胞类型中所述至少一个基因的转录和/或翻译相比,所述至少一个基因的基因表达(基因转录和/或翻译)的减少而测得的。可以随着时间评估基因表达的调节。调节可以表示至少1%、5%、10%、 15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%、95%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、200%、250%、 300%、350%、400%、450%、500%、550%、600%、650%、700%、750%、800%、 850%、900%、950%、1000%或更多,或介于两者之间的任意范围(例如,5%至100%) 的改变。
应注意,本文所述的生物标志物可以指本文所述的有关任何个体的任何特征组合或此类生物标志物的组合。例如,各种生物体的直系同源物的任何组合、序列组成、百分比同一性、序列长度、结构域结构、功能活性、突变状态等可用于描述本发明的生物标志物分子。
“阻断性”抗体或抗体“拮抗剂”是指抑制或降低其所结合的抗原的至少一种生物活性的物质。在某些实施方案中,本文所述的阻断性抗体或拮抗剂抗体或其片段基本上或完全抑制所述抗原的给定生物学活性。
术语“体液”是指从体内排出或分泌出的液体以及通常不排除或分泌出的液体(例如羊水、房水、胆汁、血液和血浆、脑脊液、耳屎和耳垢、考珀液或射精前液、乳糜、食糜、粪便、雌性精液、间质液、细胞内液、淋巴液、月经、母乳、粘液、胸膜液、脓液、唾液、皮脂、精液、血清、汗液、滑液、泪液、尿液、阴道润滑液、玻璃体液和呕吐物)。在某些实施方案中,使用包含淋巴细胞如T淋巴细胞及其亚群的体液。
术语“双特异性抗体”或“多特异性抗体”是指识别一个以上表位的抗体。此类抗体可用于使用相同的试剂靶向不同的蛋白质。制备这种抗体的方法是本领域公知的 (参见,至少美国专利5,798,229;美国专利5,989,830;和Holliger et al.(2005)Nat.Biotech.23:1126-1136)。
术语“癌症”或“肿瘤”或“过度增殖性疾病”是指存在具有致癌细胞典型特征 (如失控的增殖,永生,转移潜能,快速的生长和增殖速率,以及某些特征性的形态特征)的细胞。癌细胞通常为肿瘤形式,但是这些细胞可以单独存在于动物体内,或者可以是非致瘤性癌细胞,例如白血病细胞。术语“癌症”包括恶变前癌症以及恶性癌症。本文所述的术语“恶变前病变”是指虽然不是癌性但有可能变成癌性的病变。它还包括术语“恶变前病症”或“潜在的恶性病症”。特别地,其表示良性的形态学和/或组织学改变的组织,所述组织具有大于正常的恶性转化风险;以及表示疾病或患者的习惯,其不一定会改变局部组织的临床表现,但与该组织中大于正常的癌前病变或癌症发展(白斑病,红斑病,红白斑扁平苔藓(苔藓样反应)和组织学检查显示细胞异常或发育不良的任何病变或区域)的风险相关。
癌症包括,但不限于B细胞癌如多发性骨髓瘤,瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症,重链疾病如α链疾病、γ链疾病和μ链疾病,良性单克隆丙种球蛋白病,以及免疫细胞淀粉样变性,黑素瘤,乳腺癌,肺癌症,支气管癌,结肠直肠癌,前列腺癌,胰腺癌,胃癌,卵巢癌,膀胱癌,大脑或中枢神经系统的癌症,外周神经系统的癌症,食道癌,宫颈癌,子宫或子宫内膜癌,口腔或咽部的癌症,肝癌,肾癌,睾丸癌,胆道癌,小肠或阑尾癌,唾液腺癌,甲状腺癌,肾上腺癌,骨肉瘤,软骨肉瘤,血液组织癌等。适用于本发明所包括的方法的癌症类型的其他非限制性实例包括人的肉瘤和癌症,例如纤维肉瘤,粘液肉瘤,脂肪肉瘤,软骨肉瘤,成骨肉瘤,脊索瘤,血管肉瘤,内皮肉瘤,淋巴管肉瘤,淋巴管内皮细胞瘤,滑膜瘤,间皮瘤,尤文氏瘤,平滑肌肉瘤,横纹肌肉瘤,结肠癌,结直肠癌,胰腺癌,乳腺癌,卵巢癌,前列腺癌,鳞状细胞癌,基底细胞癌,腺癌,汗腺癌,皮脂腺癌,乳头状癌,乳头状腺癌,囊腺癌,髓样癌,支气管肺癌,肾细胞癌,肝细胞瘤,胆管癌,肝癌,绒毛膜癌,精原细胞瘤,胚胎癌,维尔姆斯瘤,宫颈癌,骨癌,脑肿瘤,睾丸癌,肺癌,小细胞肺癌,膀胱癌,上皮癌,胶质瘤,星形胶质细胞瘤,成神经管细胞瘤,颅咽管瘤,室管膜瘤,松果体瘤,血管母细胞瘤,听神经瘤,少突神经胶质瘤,脑膜瘤,黑色素瘤,神经母细胞瘤,视网膜母细胞瘤;白血病如急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞白血病(成髓细胞,早幼粒细胞,髓单核细胞,单核细胞和红白血病);慢性白血病(慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病);以及真性红细胞增多症,淋巴瘤(霍奇金病和非霍奇金病),多发性骨髓瘤,瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和重链疾病。在一些实施方案中,癌症本质上是上皮细胞性的,包括但不限于,膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、妇科癌症、肾癌、喉癌、肺癌、口腔癌、头颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或皮肤癌。在其他实施方案中,所述癌症是乳腺癌、前列腺癌、肺癌或结肠癌。在其他实施方案中,所述上皮癌是非小细胞肺癌、非乳头状肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌(例如浆液性卵巢癌)或乳腺癌。所述上皮癌可以以各种其他方式表征,包括但不限于浆液性、子宫内膜样、粘液性、透明细胞、Brenner或未分化性。
术语“编码区”是指包含翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区,而术语“非编码区”是指不被翻译成氨基酸的核苷酸序列区(例如,5′和3′非翻译区)。
术语“互补的”是一种广义概念,指两条核酸链区域之间的或同一条核酸链的两个区域之间的序列互补性。已知第一核酸区域的腺嘌呤残基能够与第二核酸区域的残基形成特定的氢键(“碱基配对”),如果所述残基是胸腺嘧啶或尿嘧啶的话,则所述第二核酸区域与所述第一区域反向平行。类似地,已知第一核酸链的胞嘧啶残基能够与第二核酸链的残基碱基配对,如果所述残基是鸟嘌呤的话,则所述第二核酸链与所述第一链反向平行。如果当核酸的第一区域与同一个或不同核酸的第二区域以反向平行的方式排列时,所述第一区域的至少一个核苷酸残基能够与所述第二区域的残基进行碱基配对,则所述两个区域是互补的。优选地,所述第一区域包括第一部分并且所述第二区域包括第二部分,由此,当所述第一和第二部分以反向平行的方式排列时,所述第一部分的核苷酸残基的至少约50%,优选至少约75%,至少约90%,或至少约95%能够与所述第二部分中的核苷酸残基进行碱基配对。更优选地,所述第一部分的所有核苷酸残基都能够与所述第二部分中的核苷酸残基碱基配对。
术语“对照”是指适合于提供与测试样品中的调节和/或表达产物的比较的任何参考标准。为了提高效率,描述了表达产物,但该描述同样适用于调节表达产物的元件。在一个实施方案中,上述对照包括获得“对照样品”,从中检测出表达产物水平并将其与来自所述测试样品的表达产物水平进行比较。这样的对照样品可以包括任何合适的样品,包括但不限于来自对照免疫障碍患者的样品(可以是储存的样品或先前的样品测量值),所述患者具有已知的结果;从受试者(例如正常患者或免疫病症患者) 分离得到的正常组织或细胞,培养的分离自受试者(例如正常患者或免疫病症患者) 的原代细胞/组织,从相同的器官或免疫障碍患者的身体位置获得的相邻正常细胞/组织,从正常受试者中分离出的组织或细胞样品,或从保藏中心获得的原代细胞/组织。在另一个优选的实施方案中,所述对照可以包括来自任何合适来源的参考标准的表达产物水平,包括但不限于管家基因,来自正常组织(或其他先前分析的对照样品)的表达产物水平范围,先前确定的来自一组患者的测试样本中的表达产物水平范围,或具有特定结果的(例如,存活一年,两年,三年,四年等)或接受某种治疗(例如,免疫障碍标准护理疗法standard of care immune disorder therapy)的一组患者。本领域技术人员将理解,这些对照样品和参考标准表达产物水平可以组合用作本发明方法中的对照。在一个实施方案中,所述对照可以包括正常的或非免疫障碍的细胞/组织样品。在另一个优选的实施方案中,所述对照可以包括一组患者(例如一组免疫障碍患者)的表达水平,或一组接受某种治疗的免疫病障碍患者的表达水平,或相对于一个结果具有另一个结果的一组患者的表达水平。在前一种情况下,每个患者的特定表达产物水平可以指定成百分位表达水平,或表示为高于或低于所述参考标准表达水平的中值或平均值。在另一个优选的实施方案中,所述对照可以包括正常细胞,来自用组合化疗治疗的患者的细胞,和来自患有免疫障碍的患者的细胞,所述免疫障碍已经对目的治疗有了应答。在另一个实施方案中,所述对照还可以包括测量值,例如,群体中的特定基因相对于同一群体中管家基因的表达水平的平均表达水平。这样的群体可以包括正常受试者,未经历任何治疗的免疫障碍患者(即,未经治疗的),经历标准治疗疗法的免疫障碍患者,或具有已经对目的治疗有了应答的免疫障碍的患者。在另一个优选的实施方案中,所述对照包括表达产物水平的比率转化,包括但不限于测定所述测试样品中两种细胞类型和/或基因的表达产物水平的比率,并将其与参考标准中所述同样的两种细胞类型和/或基因的任何合适的比率相比较;确定所述测试样品中所述两种或更多种细胞类型和/或基因的表达产物水平,并确定任何合适的对照中表达产物水平的差异;以及确定所述测试样品中所述两种或更多种细胞类型和/或基因的表达产物水平,将其表达对所述测试样品中管家细胞类型和/或基因的表达进行基准化,并与任何合适的对照进行比较。在特别优选的实施方案中,所述对照包括对照样品,其与所述测试样品具有相同的谱系和/或类型。在另一个实施方案中,所述对照可以包括这样的表达产物水平:其在一组患者样品内或基于一组患者样品被分组成百分数,所述患者例如所有患有免疫障碍的患者。在一个实施方案中,建立对照表达产物水平,其中将相对于例如特定百分数更高或更低的表达产物水平用作预测结果的基础。在另一个优选的实施方案中,使用来自具有已知结果的免疫障碍对照患者的表达产物水平建立对照表达产物水平,并将来自所述测试样品的表达产物水平与所述对照表达产物水平进行比较,作为预测结果的基础。如下面的数据所证明的,本发明所述方法不限于使用特定的切点来比较所述测试样品中的表达产物水平和对照中的水平。
生物标志物核酸的“拷贝数”是指细胞(例如,胚系细胞和/或体细胞)中编码特定基因产物的DNA序列数。通常,对于给定的基因,哺乳动物对每个基因具有两个拷贝。然而,通过基因扩增或复制可以增加拷贝数,或通过删除减少拷贝数。例如,胚系拷贝数的变化包括一个或多个基因组基因座处的变化,其中所述一个或多个基因组基因座并不体现在对照的胚系拷贝的正常互补序列的拷贝数中(例如,胚系DNA 中的正常拷贝数来自的物种与确定特定胚系DNA和相应拷贝数的物种相同)。体细胞拷贝数的变化包括一个或多个基因组基因座处的变化,其中所述一个或多个基因组基因座并不体现在对照的胚系DNA中的拷贝数中(例如,胚DNA拷贝数来自的受试者与确定出体细胞DNA和相应拷贝数的受试者相同)。
生物标志物核酸的“正常”拷贝数(例如,胚系细胞和/或体细胞)或生物标志物核酸或蛋白质的“正常”表达水平为生物样品中的活性/表达水平或拷贝数。例如,含有组织、全血、血清、血浆、口腔拭子、唾液、脑脊液、尿液、粪便和骨髓的样品,所述样品来自受试者,例如不患有免疫障碍的人,或来自同一个具有免疫障碍的受试者中相应的非免疫障碍组织。
术语“为受试者确定合适的治疗方案”应指针对受试者确定治疗方案(即,单一疗法或不同疗法的组合,其用于预防和/或治疗所述受试者的免疫障碍),其中基于或基本上基于或至少部分地基于本发明的分析结果而开始、修改和/或结束所述治疗方案。一个例子是确定是否要提供改造的T细胞来预防或逆转T细胞耗竭和/或治疗免疫障碍。除了根据本发明的分析结果之外(例如基于基因表达或活性在初始的和/ 或施用后的改造的T细胞群中的调节方式),所述确定还可以基于待治疗的受试者的个体特征。在大多数情况下,将由主治医师或医生实际上地针对所述受试者确定合适的治疗方案。
术语“表达特征信号(expression signature)”或“特征信号”是指含有两个或多个协同表达的生物标志物的组。例如,构成该特征信号的基因、蛋白质等可以表达于特定的细胞系、分化阶段或特定生物应答期间。生物标志物可以反映表达它们的细胞型的生物方面的信息。表达数据和基因表达水平可以存储在计算机可读介质上,例如,与微阵列或芯片读取装置结合使用的计算机可读介质。可以处理这样的表达数据来生成表达特征信号。
如果分子或细胞与底物共价地或非共价地结合,则认为其被“固定”或“附着”到所述底物上,从而使得可以用流体(例如标准柠檬酸盐,pH 7.4)漂洗所述底物而不会造成大部分的所述分子或细胞与所述底物分离。
本文与细胞生物标志物表达相关的术语“高”、“低”、“中等”和“阴性”是指,相比于一种或多种参照细胞的生物标志物细胞表达,所述生物标志物的表达量。生物标志物的表达可以根据本文描述的任何方法确定,包括但不限于分析一种或多种生物标志物基因组核酸、核糖核酸和/或多肽的细胞水平、活性、结构等。在一个实施方案中,所述术语是指分别在表达最高、中间或最低水平生物标志物时的细胞群的明确的百分比。这些百分比可以定义成是高表达或弱表达所述生物标志物的细胞群的前0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、 6.0%、6.5%、7.0%、7.5%、8.0%、8.5%、9.0%、9.5%、10%、11%、12%、13%、14%、 15%或更多,或者介于两者之间的任何范围(包括两端)。术语“低”排除了不能可检测地表达所述生物标志物的细胞,因为这些细胞对于生物标志物的表达是“阴性的”。术语“中等”包括这样的细胞:其表达所述生物标志物,但其水平低于在“高”水平表达它的群体。在另一个实施方案中,所述术语还可以指,或者也可以指,通过定性的或统计学的绘图区域(plot regions)所鉴定出的具有生物标志物表达的细胞群。例如,根据本领域熟知的方法,通过基于可检测部分的分析(例如基于平均荧光强度等)鉴定不同的绘图,从而可以基于生物标记物表达水平区分使用流式细胞术分选出的细胞群。对于所述目的标志物,可以按照本领域中熟知的方法,根据数量、形状、重叠等来细化这样的绘图区域。在另一个实施方案中,还可以根据其他生物标志物表达的存在与否来确定所述术语。
术语“同源的”是指同一核酸链的两个区域之间或两个不同核酸链的区域之间的核苷酸序列相似性。当两个区域中的核苷酸残基位置被相同的核苷酸残基占据时,则所述区域在该位置是同源的。如果每个区域的至少一个核苷酸残基位置被相同的残基占据,则第一区域与第二区域同源。两个区域之间的同源性用两个区域中被相同核苷酸残基占据的核苷酸残基位置的比例表示。举例来说,具有核苷酸序列5′-ATTGCC-3′的区域和具有核苷酸序列5′-TATGGC-3′的区域具有50%的同源性。优选地,所述第一区域包含第一部分并且所述第二区域包含第二部分,由此,每个所述部分的核苷酸残基位置的至少约50%,优选至少约75%,至少约90%,或至少约95%被所述相同的核苷酸残基占据。更优选地,每个所述部分的所有核苷酸残基位置都被所述相同的核苷酸残基占据。
本文使用的术语“免疫检查点”是指CD4+和CD8+ T细胞的细胞表面上的一组分子。这些分子通过下调或抑制抗肿瘤免疫应答来微调免疫应答。免疫检查点蛋白是本领域熟知的,包括但不限于,CTLA-4,PD-1,VISTA,B7-H2,B7-H3,PD-L1,B7-H4, B7-H6,ICOS,HVEM,PD-L2,CD160,gp49B,PIR-B,KIR家族受体,TIM-1,TIM-3, TIM-4,LAG-3,BTLA,SIRPalpha(CD47),CD48,2B4(CD244),B7.1,B7.2,ILT-2,ILT-4, TIGIT和A2aR(参见,例如WO2012/177624)。可作为免疫检查点抑制剂用于本发明方法中的免疫治疗剂包括,但不限于具有效应功能的Fc融合蛋白,例如本领域熟知的某些类型的抗体。
术语“抗免疫检查点疗法”是指抑制免疫检查点核酸和/或蛋白质的试剂的用途。抑制一个或多个免疫检查点可以阻断或中和抑制性信号传导以促进免疫调节。用于抑制免疫检查点的示例性试剂包括抗体、小分子、肽、肽模拟物、天然配体和天然配体的衍生物,所述试剂可以结合和/或灭活或抑制免疫检查点蛋白或其片段;还可以通过RNA干扰、逆转录、核酸适体等下调免疫检查点核酸或其片段的表达和/或活性。用于上调免疫应答的示例性试剂包括针对一种或多种免疫检查点蛋白的抗体,其阻断了所述蛋白质与其天然受体之间的相互作用;非活化形式的一种或多种免疫检查点蛋白(例如显性负性多肽);阻断一种或多种免疫检查点蛋白与其天然受体之间相互作用的小分子或肽;与其天然受体结合的融合蛋白(例如,与抗体或免疫球蛋白的Fc 部分融合的免疫检查点抑制蛋白细胞外部分);阻断免疫检查点核酸转录或翻译的核酸分子等。这些试剂可以直接阻断所述一个或多个免疫检查点与其天然受体(例如抗体)之间的相互作用,以阻止抑制性信号传导并上调免疫应答。或者,试剂可以间接阻断一种或多种免疫检查点蛋白与其天然受体之间的相互作用,以阻止抑制性信号传导并上调免疫应答。例如,免疫检查点蛋白配体的可溶形式,如稳定的细胞外结构域,可以与其受体结合以间接地降低与适当配体结合的所述受体的有效浓度。在一个实施方案中,抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗PD-L2抗体,不论是单独使用还是组合使用,都能用于抑制免疫检查点。这些实施方案也适用于针对特定免疫检查点如PD-1 通路(例如,抗PD-1通路疗法,也称为PD-1途径抑制剂疗法)的特定疗法。
“PD-1”是一种免疫检查点抑制剂,是指能作为共抑制受体并且具有已知配体 PD-L1和PD-L2的免疫球蛋白基因超家族的成员。早前,通过使用基于扣除克隆的方法鉴定了PD-1以选择参与凋亡性细胞死亡的蛋白。鉴于其结合PD-L1的能力,PD-1 是CD28/CTLA-4分子家族的成员。与CTLA-4一样,作为对抗CD3的应答,PD-1在 T细胞表面上被快速诱导出(Agata et al.25(1996)Int.Immunol.8:765)。然而,与 CTLA-4不同,PD-1还能在B细胞表面上被诱导出来(作为对抗-IgM的应答)。PD-1 也在一小部分胸腺细胞和骨髓细胞上有表达(Agata et al.(1996)同上;Nishimura et al. (1996)Int.Immunol.8:773)。
代表性的人PD-1生物标志物的核酸和氨基酸序列可在GenBank数据库的 NM_005018.2和NP_005009.2下公开获得(还可参见Ishida et al.(1992)20 EMBO J 11:3887;Shinohara et al.(1994)Genomics 23:704;美国专利5,698,520)。PD-1具有包含免疫球蛋白超家族结构域的细胞外区域、跨膜结构域和包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的细胞内区域(Ishida et al.(1992)EMBO J.11:3887;Shinohara et al. (1994)Genomics 23:704;和美国专利5,698,520)。这些特征还明确了更大的多肽家族,称为免疫抑制受体,其还包括gp49B,PIR-B和杀伤抑制受体(KIR)(Vivier和Daeron (1997)Immunol.Today 18:286)。通常认为这些受体的酪氨酰磷酸化ITIM基序与含有 SH2结构域的磷酸酶相互作用,这导致产生抑制性信号。一小部分免疫抑制受体与 MHC多肽结合,例如KIR,并且CTLA4能结合B7-1和B7-2。已经有人提出MHC 和B7基因之间存在系统发育关系(Henry et al.(1999)Immunol.Today 20(6):285-8)。除人以外的生物体中,PD-1直向同源物的核酸和多肽序列是公知的并且包括,例如,小鼠PD-1(NM_008798.2和NP_032824.1),大鼠PD-1(NM_001106927.1和 NP_001100397.1),狗PD-1(XM_543338.3和XP_543338.3),牛PD-1(NM_001083506.1 和NP_001076975.1)和鸡PD-1(XM_422723.3和XP_422723.2)。
PD-1多肽是能够将抑制性信号传递给免疫细胞从而抑制免疫细胞效应功能的抑制性受体,或者是例如,当以可溶性单体形式存在时能够促进(例如,通过竞争性抑制促进)免疫细胞的共刺激。优选的PD-1家族成员与PD-1享有序列同一性,并与一个或多个B7家族成员(例如B7-1,B7-2,PD-1配体)和/或抗原呈递细胞上的其他多肽结合。
术语“PD-1活性”包括PD-1多肽调节活化的免疫细胞中抑制性信号的能力,例如通过调动抗原呈递细胞上的天然PD-1配体进行调节。PD-1以类似于CTLA4(传递信号)的方式将抑制性信号传递给免疫细胞。免疫细胞中抑制性信号的调节将导致免疫细胞的增殖和/或其细胞因子的分泌发生变化。因此,术语“PD-1活性”包括PD-1 多肽结合其天然配体的能力、调节免疫细胞共刺激或抑制性信号的能力、以及调节免疫应答的能力。调节PD-1活性的试剂在本领域中是为人熟知的。代表性实例包括,但不限于抗体如MDX-1106,Merck 3475和CT-011。MDX-1106也称为MDX-1106-04、 ONO-4538或BMS-936558,是全人IgG4抗PD-1的单克隆抗体,在PCT公开号 WO2006/121168和美国专利号8,0088,449中有描述。Merck 3475也称为SCH-900475 和派姆单抗(pembrolizumab),是人源化IgG4抗PD-1的单克隆抗体,在专利公开号WO2009/114335、美国专利号8,354,509和Hamid et al.(2013)New Engl.J.Med.369:134-144中有描述。匹他珠单抗(Pidilizumab)(CT-011;CureTech)是与PD-1 结合的人源化IgG1单克隆抗体。匹他珠单抗和其他人源化抗PD-1单克隆抗体在专利公开号WO2009/101611中有公开。类似地,AMP-224(B7-DCIg;Amplimmune)是PD-L2的Fc融合可溶性受体,其阻断PD-1和PD-L1之间的相互作用,并且在专利公开号WO2010/027827和WO2011/066342中有公开。此外,许多其他抗PD-1的Fc融合蛋白是本领域已知的,如美国专利号8,609,089、美国专利公开号2010/028330、美国专利公开号2012-0114649和PCT公开号WO2014/089113中有所描述。
术语“PD-1配体”是指PD-1受体的结合伴侣并且包括PD-L1(Freeman et al.(2000) J.Exp.Med.192:1027)和PD-L2(Latchman et al.(2001)Nat.Immunol.2:261)。存在至少两种类型的人PD-1配体多肽。PD-1配体蛋白包含信号序列,以及IgV结构域、 IgC结构域、跨膜结构域和短的胞质尾区。PD-L1(序列数据参见Freeman et al.(2000)J.Exp.Med.192:1027)和PD-L2(序列数据参见Latchman et al.(2001)Nat.Immunol. 2:261)是B7多肽家族的成员。PD-L1和PD-L2均在胎盘、脾、淋巴结、胸腺和心脏中有表达。只有PD-L2在胰腺,肺和肝脏中有表达,而只有PD-L1在胎肝中有表达。尽管PD-L1的表达更广泛,但两种PD-1配体都在活化的单核细胞和树突细胞上得到上调。例如,已知PD-L1在鼠类造血细胞(例如,T细胞,B细胞,巨噬细胞,树突细胞(DC)和骨髓源肥大细胞)和非造血细胞(例如,内皮细胞,上皮细胞和肌细胞)上组成性地表达并被上调至更高水平,而PD-L2在DC、巨噬细胞和骨髓源肥大细胞上可诱导性地表达(参见Butte et al.(2007)Immunity 27:111)。
PD-1配体包含具有某些保守的结构和功能特征的多肽家族。如本文所定义的,当在表示蛋白质或核酸分子时,术语“家族”旨在表示具有共同结构域或基序且具有足够氨基酸或核苷酸序列同源性的两种或多种蛋白质或核酸分子。这些家族成员可以是天然或非天然存在的,可以来自相同或不同的物种。例如,家族可以含有人源的第一蛋白、以及人源的其他不同蛋白质,或者可以含有非人源的同源物。家庭成员也可能具有共同的功能特征。PD-1配体是B7多肽家族的成员。本文使用的术语“B7家族”或“B7多肽”包括与B7多肽(例如B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、B7-H3、B7-H4、VISTA、B7-H6、B7h,参见Swallow et al.(1999) Immunity 11:423)享有序列同源性的共刺激多肽,和/或PD-1配体(例如,PD-L1或 PD-L2)。例如,当使用NCBI的BLAST程序在默认参数下(Blosum62矩阵,空位罚分设为存在11和延伸1)进行比较时,人B7-1和B7-2享有约26%的氨基酸序列同一性(参见NCBI网站)。术语B7家族还包括这些多肽的变体,其能够调节免疫细胞功能。B7家族的分子共享许多保守区域,包括信号结构域、IgV结构域和IgC结构域。IgV结构域和IgC结构域是本领域认可的Ig超家族成员结构域。这些结构域对应于具有不同折叠模式的结构单元,称为Ig折叠。Ig折叠包括两个β片层的夹层,每个β片层均由具有5-10个氨基酸的反平行β链组成,并且Ig的大多数(但不是全部的)IgC结构域中在所述两个片层之间具有保守的二硫键。TCR和MHC分子共享相同类型的序列模式,称为Ig超家族内的C1-组。其他IgC结构域属于其他组。IgV 结构域也共享序列模式,称为V组结构域。IgV结构域比IgC结构域长并且含有另外一对β链。
术语“免疫障碍”是指以不希望的免疫应答为特征的病症。在一些实施方案中,所述免疫障碍使得想要的抗免疫障碍的应答抑制免疫应答。如本文中的进一步描述,需要下调免疫应答的这些病症是本领域公知的并且包括,但不限于,组织、表皮和器官移植,移植物抗宿主病(GVHD),炎症或自身免疫疾病的情况,如系统性红斑狼疮、多发性硬化、过敏、超敏反应、需要改善疫苗接种效率的病症和需要提升调节性 T细胞的产生或功能的病症。在其他实施方案中,所述免疫障碍使得所想要的应答是增强的免疫应答。需要上调免疫应答的这些病症是本领域中公知的并且包括,但不限于,需要提升CD4+效应T细胞的产生或功能的病症,如对抗癌症、感染(例如,寄生虫、细菌、蠕虫或病毒感染)等。
术语“急性免疫障碍”是指可以通过适当的免疫应答来解决的病症,所述免疫应答根除靶抗原和包含这种靶抗原的宿主,例如癌症或感染剂如病毒、细菌、寄生虫、支原体、真菌等。这些病症相对较短,持续几天到几周的量级。
相反,术语“慢性免疫障碍”是指通过诱导宿主免疫应答不能有效清除或消除的那些病症。在慢性免疫障碍中,靶抗原(和/或包含所述靶抗原的宿主)如感染试剂或癌细胞,与免疫应答达到平衡,使得受试者在很长的一段时间内(即数月到数年甚至一生的时间)维持所述靶抗原或包含所述靶抗原的宿主(例如,仍然具有传染性或患有癌症)而不必表达出症状。慢性免疫障碍可包含沉默的和生产性的靶抗原的维持阶段,此时不会快速杀死宿主细胞或甚至也不会产生宿主细胞的过度损伤。可以根据本领域众多公知方法中的任何一种来进行所述靶抗原或包含所述靶抗原的宿主的检测,所述方法描述于例如美国专利号6,368,832、6,579,854和6,808,710以及美国专利申请公开号20040137577、20030232323、20030166531、20030064380、20030044768、 20030039653、20020164600、20020160000、20020110836、20020107363和200201067 中。在一些实施方案中,慢性免疫障碍是感染的结果,例如病毒的感染,所述病毒包括但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、T细胞白血病病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、巨细胞病毒、疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、麻疹、乳多空病毒、朊病毒、肝炎病毒、腺病毒、细小病毒、乳头瘤病毒、朊病毒等。慢性免疫障碍包括如慢性病症和潜伏病症。本文使用的慢性免疫障碍可以限于慢性病症,潜伏病症,或两者。
在“慢性病症”中,无论疾病的体征和症状是否存在,甚至已长时间不存在,也可以在受试者中始终检测到靶抗原。由感染引起的慢性病症的非限制性实例包括乙型肝炎(由乙型肝炎病毒(HBV)引起)和丙型肝炎(由丙型肝炎病毒(HCV)引起)、腺病毒,巨细胞病毒,爱泼斯坦-巴尔病毒,单纯疱疹病毒1,单纯疱疹病毒2,人疱疹病毒6,水痘-带状疱疹病毒,乙型肝炎病毒,丁型肝炎病毒,乳头瘤病毒,细小病毒B19,多瘤病毒BK,多瘤病毒JC,麻疹病毒,风疹病毒,人免疫缺陷病毒(HIV),人T细胞白血病病毒I和人T细胞白血病病毒II。寄生性持续感染可以由例如利什曼原虫属、弓形虫属、锥虫属、疟原虫属、血吸虫属和脑炎微抱子虫属的感染引起。
涉及感染的特定类型的慢性病症被称为“潜伏病症”,其中感染试剂(例如病毒)看起来是无活性的并且处于休眠状态,使得受试者并不总是表现出体征或症状。在潜伏的病毒感染中,病毒在症状再次出现之前长时间地与宿主保持平衡;然而,在疾病再次发生之前,通常不能检测到实际的病毒。感染潜伏是病原性感染试剂(例如病毒) 在细胞内休眠的能力。例如,潜伏的病毒感染是某些病毒生命周期中的一个阶段,在所述阶段中病毒在最初感染后不再产生。然而,病毒基因组并未完全根除。其结果是,宿主不被新病毒感染时,该病毒也可以被重新激活并开始产生大量的病毒后代(病毒生命周期的裂解部分)。该病毒可能无限期地留在宿主体内。在一个实施方案中,病毒潜伏期与临床潜伏期不同,临床潜伏期中所述病毒正在经历孵化期而非休眠。潜伏感染的非限制性实例包括由单纯疱疹病毒(HSV)-1(发热性水疱)、HSV-2(生殖器疱疹)和水痘带状疱疹病毒VZV(水痘-带状疱疹)引起的感染。
本文使用的术语“免疫治疗剂”可以包括任何可刺激宿主免疫系统以促进受试者免疫调节的分子、肽、抗体或其他试剂。各种免疫治疗剂都可用于本文所述的组合物和方法中。
“诱导型”启动子是一种核苷酸序列,当其与编码或引导基因产物的多核苷酸可操作地连接时,基本上仅在诱导物如化学物、调节元件等存在于细胞中的情况下才会导致所述活细胞中产生所述基因产物。
术语“抑制”包括减少、限制或阻断例如特定的作用、功能或相互作用。在一些实施方案中,如果免疫障碍的至少一种症状得到了缓解、终止、减缓或预防,则“抑制”了所述免疫障碍。如本文所用,如果免疫障碍的复发或扩散被降低、减缓、延迟或预防,则也是“抑制”了所述免疫障碍。
当提及两个分子之间的相互作用时,术语“相互作用”是指所述分子彼此的物理接触(例如,结合)。通常,这种相互作用导致了一种或两种所述分子具有活性(所述活性产生生物学效应)。
“分离的抗体”应指这样的抗体:其基本上不含有具有不同抗原特异性的其他抗体。此外,分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
“分离的蛋白质”是指这样的蛋白质:当其从细胞中分离出来或通过重组DNA 技术产生时基本上不含其他蛋白质、细胞物质、分离介质和培养基,或在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。“分离的”或“纯化的”蛋白质或其具有生物学活性的部分基本上不含细胞物质或来自于细胞或组织来源(其中从所述细胞或组织中来源出了抗体、多肽、肽或融合蛋白)的其他污染蛋白,或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。“基本上不含细胞物质”包括生物标志物多肽或其片段的制备物,其中蛋白质与分离出其的或重组产生其的细胞的细胞组分分离。在一个实施方案中,“基本上不含细胞物质”包括生物标志物蛋白或其片段的制备物,其具有少于约30%(以干重计)的非生物标志物蛋白(在本文中也称为“污染蛋白”),更优选少于约20%的非生物标志物蛋白,还更优选少于约10%的非生物标记蛋白,最优选少于约5%的非生物标志物蛋白。当重组产生抗体、多肽、肽或融合蛋白或其片段 (如其生物活性片段)时,也优选基本上不含培养基,即培养基少于蛋白质制备物体积的约20%,更优选少于约10%,并且最优选少于约5%。
本文使用的术语“KD”应指特定的抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。本发明所述的抗体的结合亲和力可以通过标准的抗体-抗原实验来测得或确定,例如,竞争实验、饱和实验、或标准免疫实验如ELISA或RIA。
“试剂盒”是包含至少一种试剂(例如治疗剂、探针、小分子等)的任意制品(例如包或容器),其用于特异性检测和/或治疗性地影响本发明所述标志物的表达。所述试剂盒可以作为整体进行推广、分发或销售,用于执行本发明所述方法。所述试剂盒可包含一种或多种试剂,所述试剂对用于本发明所述方法的组合物的表达是必需的。在某些实施方案中,所述试剂盒可以进一步包含参考标准,例如,编码不影响或不调节信号通路的蛋白质的核酸,所述信号通路控制免疫应答、细胞生长、分裂、迁移、存活或凋亡。本领域技术人员可以设想许多这样的对照蛋白质,包括但不限于:常见的分子标签(例如,绿色荧光蛋白和β-半乳糖苷酶);通过GeneOntology参考,未在包括细胞生长、分裂、迁移、存活或凋亡的任何通路的分类里的蛋白质;或者普遍存在的管家蛋白质。试剂盒中的试剂可以通过单个容器提供,或者通过单个容器中的两种或更多种试剂的混合物提供。另外,可以包括描述试剂盒中组合物的用途的说明材料。
术语“新辅助疗法”是指在初次治疗之前给予的治疗。新辅助疗法的实例可包括化疗、放射疗法和激素疗法。例如,在治疗乳腺癌时,新辅助疗法能允许患有大乳腺癌的患者进行保乳手术。
生物标志物的“正常”表达水平是与对照相比,所述生物标志物在相关细胞(例如受试者如人类患者的细胞)中的表达水平,所述对照可以为例如未被改造成调节基因组基因表达调控区的细胞和/或来自不患有免疫障碍的受试者的细胞。生物标志物的“过表达”或“显著更高的表达水平”是指测试样品中这样的表达水平:其高于用于评估表达的实验的标准误差,并且优选比对照样品(例如,来自不具有所述生物标志物相关疾病的健康受试者的样品)中所述生物标志物的表达活性或水平(优选生物标志物在几个对照样品中的平均表达水平)高至少10%,以及更优选高1.2、1.3、1.4、 1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、 4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20倍或更多。生物标志物的“显著更低的表达水平”是指测试样品中这样的表达水平:其比对照样品(例如,来自不具有所述生物标志物相关疾病的健康受试者的样品)中所述生物标志物的表达水平(优选生物标志物在几个对照样品中的平均表达水平)低至少10%,以及更优选低1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、 1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、 6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20倍或更多。这种“显著性”水平也可以应用于本文所述的任何其他测量参数,例如用于表达、抑制、细胞毒性、细胞生长、细胞比例等的测量参数。
术语“预先确定的”生物标志物的量和/或活性测量值可以是,仅举例来说,用于评估可以选来进行特定治疗的受试者、评估对治疗的应答、和/或评估疾病状态的生物标记物的量和/或活性测量值。预先确定的生物标志物的量和/或活性测量值可以在具有或不具有免疫障碍的细胞或患者群体中确定。所述预先确定的生物标志物的量和/或活性测量值可以是单个数字,等同地适用于每个患者,或者所述预先确定的生物标志物的量和/或活性测量值可以根据患者的特定亚群而变化。受试者的年龄、体重、身高和其他因素可能会影响个体的预先确定的生物标志物的量和/或活性测量值。此外,可以针对每个细胞、细胞系、受试者等单独确定所述预先确定的生物标志物的量和/或活性测量值。在一个实施方案中,在本文描述的方法中确定和/或比较的量是基于绝对测量值的。在另一个实施方案中,在本文描述的方法中测定和/或比较的量是基于相对测量值的,例如比率(如血清生物标志物对管家生物标志物或其他通常恒定的生物标志物的表达进行基准化)。所述预先确定的生物标志物的量和/或活性测量值可以是任何合适的标准。例如,可以从正在进行患者选择评估的同一个人或不同的人获得所述预先确定的生物标志物的量和/或活性测量值。在一个实施方案中,可以从同一患者的先前评估中获得所述预先确定的生物标志物的量和/或活性测量值。通过这种方式,可以随时监测患者选择的进展。另外,如果受试者是人的话,则可以从另一个人或多个人(例如,选定的人群)的评估中获得所述对照。通过这种方式,可以将正在进行选择评估的人的选择程度与合适的其他人进行比较,例如,与所述进行评估的人处于类似情况的其他人(如患有相似或相同病症的人和/或属于同一种族群体的人)。
术语“预测性的”包括使用生物标志物核酸、蛋白质和/或调控状态如基因表达调控的活性过度或过低,以及在治疗前、治疗期间或治疗后肿瘤的出现、表达、生长、缓解、复发或抗性,来确定T细胞耗竭预防、T细胞耗竭逆转、免疫障碍治疗应答(例如改造的T细胞治疗,可以联合或不联合其他抗免疫障碍疗法如抗免疫检查点抑制剂治疗)的可能性。生物标志物的这种预测性的用途的确认可以通过,例如:(1)增加或减少的拷贝数(例如,通过FISH、FISH加SKY、单分子测序法如本领域中在J. Biotechnol.,86:289-301上描述的单分子测序法、或qPCR),生物标志物核酸的过表达或低表达(例如,通过ISH、Northern印迹或qPCR),生物标志物蛋白(例如通过IHC)和/或生物标志物代谢物的增加或减少,或增加或减少的活性(通过例如在超过约5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%或更多的被测的相关人类慢性免疫障碍类型或样品中的生物标记物的调控来确认);(2)其在生物样品(例如,含有来自患有所述慢性免疫障碍的受试者(如人)的组织、全血、血清、血浆、口腔拭子、唾液、脑脊液、尿液、粪便或骨髓的样品)中的绝对或相对的调控后存在或不存在;(3)其在具有所述免疫障碍的患者(例如,对治疗有应答的或对其产生抗性的患者)的临床亚组中的绝对或相对的调控后存在或不存在。
术语“预防”,“预防”,“预防”,“预防性治疗”等是指降低受试者发生疾病、障碍或病症的可能性,其中所述受试者没有疾病、障碍或病症,但具有易患疾病、障碍或病症的风险。
术语“探针”是指任何这样的分子:其能够选择性地结合特定靶分子,例如,由生物标志物核酸编码的或对应于所述生物标志物核酸的核苷酸转录物或蛋白质。探针可以由本领域技术人员合成,或来源于合适的生物制品。如本文所述,为了检测所述靶分子,可以将探针特异性地设计成是被标记的。可用作探针的分子的实例包括,但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。
术语“预后”包括预测免疫障碍的可能病程和结果或从疾病中恢复的可能性。在一些实施方案中,统计算法的使用为个体提供了所述免疫障碍的预后。例如,所述预后可以是手术、所述免疫障碍(例如,癌症或慢性感染)的临床亚型的发生、一种或多种临床因素的发生、或从疾病中恢复。
术语“抗性”是指免疫障碍样品或哺乳动物对抗免疫障碍疗法的获得性或天然抗性(即,对治疗性处理无应答或对治疗性处理具有减少的或有限的应答),例如对治疗性处理具有减少了25%或更多如30%、40%、50%、60%、70%、80%或更多,或直至2倍,3倍,4倍,5倍,10倍,15倍,20倍或更多的应答。应答的减少可以通过与获得抗性之前的同一免疫障碍样品或哺乳动物比较测得,或通过与不同的免疫障碍样品或已知对所述治疗性处理无抗性的哺乳动物进行比较来测得。典型的获得性化疗抗性被称为“多药耐药性”。所述多药耐药性可以通过P-糖蛋白介导或可以通过其他机制介导,或可以在哺乳动物被多重耐药性微生物或微生物的组合感染时发生。对治疗性处理的抗性的确定是本领域常规的并且在普通熟练的临床医生的技能范围内,例如,可以通过如本文所述的“致敏”的细胞增殖实验和细胞死亡实验来测量。在一些实施方案中,术语“逆转抗性”是指联合使用第二试剂和主要的抗免疫障碍疗法(例如,抗免疫检查点抑制剂、化学治疗和/或放射疗法)能够在免疫障碍组织中产生显著的降低,相比于仅用主要疗法不能产生统计学显著的降低的情况下的免疫障碍组织,其降低的水平具有统计学显著性(例如,p<0.05)。例如,这通常适用于在未治疗的肿瘤以对数方式生长时进行的肿瘤体积测定。
术语“对治疗的应答”是指免疫障碍对治疗的任何反应,例如改造的T细胞疗法,优选症状的改变,例如减少的感染或病毒载量、在开始新辅助或辅助化疗后的肿瘤质量和/或体积等。T细胞功能,例如CD4+和/或CD8+效应功能以及其抗原特异性功能,可以根据本领域公知和/或本文所述的众多实验来评估。可以例如针对功效或在新辅助或辅助的情况下评估过度增殖性障碍的应答,其中可以将全身介入后的肿瘤的大小与通过CT、PET、乳房X线照片、超声波或触诊测得的初始大小和尺寸进行比较。也可以在活组织检查或手术切除后,通过肿瘤的卡尺测量或病理检查来评估应答。可以以定量方式(如肿瘤体积的百分比变化)或以定性方式(如“病理完全应答”(pCR)、“临床完全缓解”(cCR)、“临床部分缓解”(cPR)、“临床稳定疾病”(cSD)、“临床进展性疾病”(cPD)或其他定性标准)来记录应答。过度增殖性障碍应答的评估可以在新辅助治疗或辅助治疗开始后的早期进行,例如在几小时、几天、几周或优选几个月后进行。应答评估的典型终点是在新辅助化疗终止时或在手术切除残留的肿瘤细胞和/或肿瘤床时,这通常是在新辅助治疗开始后三个月。在一些实施方案中,本文所述的治疗性处理的临床功效可通过测定临床受益率(CBR)来确定。所述临床受益率通过确定从治疗结束后至少6个月的时间点上完全缓解(CR)患者的百分比、部分缓解(PR)患者的数量和具有稳定疾病(SD)的患者数量的总和来测得。这个公式简写为在CBR=6个月后的CR+PR+SD。在一些实施方案中,特定癌症治疗方案的CBR为至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%或更多。评估对癌症治疗的应答的其他标准与“存活”有关,其包括以下所有:存活直至死亡,也称为总存活(其中所述死亡可以与病因无关或与肿瘤相关);“无复发存活”(其中术语复发应包括局部复发和远处复发);无转移存活;无病存活(其中术语疾病应包括癌症和与之相关的疾病)。所述存活的长度可以通过参考确定的起始点(例如,诊断时间或治疗开始时间)和终点(例如,死亡、复发或转移) 来计算。此外,治疗功效的标准可以扩展到包括对化疗的反应、存活概率、给定时间段内转移的可能性、以及肿瘤复发的可能性。例如,为了确定合适的阈值,可以将特定的癌症治疗方案施用给受试者群体,并且可以将结果与在施用任何癌症治疗之前所确定的生物标志物测量值关联起来。结果测量值可以是对新辅助治疗中给予的治疗的病理性应答。或者,对于已知生物标志物测量值的受试者,在癌症治疗后,可以监测其一段时间的结果测量值如总体存活和无病存活。在某些实施方案中,癌症治疗剂施用的剂量是本领域已知的标准剂量。监测受试者的时间长度可以变化。例如,可以监测受试者至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55 或60个月。可以使用本领域熟知的方法(例如实施例部分中描述的方法)来确定与癌症治疗结果相关的生物标志物测量阈值。
本文使用的“RNA干扰剂”定义为通过RNA干扰(RNAi)干扰或抑制靶生物标志物基因表达的任何试剂。此类RNA干扰剂包括但不限于核酸分子(所述核酸分子包括与本发明所述靶生物标志物基因同源的RNA分子或其片段)、短干扰RNA (siRNA)和通过RNA干扰(RNAi)干扰或抑制靶生物标志物核酸的表达的小分子。
“RNA干扰(RNAi)”是一种进化上保守的过程,其中表达或引入与靶生物标志物核酸相同的或高度相似的序列的RNA会导致该靶基因转录出的信使RNA (mRNA)的序列特异性降解或特定的转录后基因沉默(PTGS)(参见,Coburn,G. 和Cullen,B.(2002)J.ofVirology 76(18):9225),从而抑制所述靶生物标志物核酸的表达。在一个实施方案中,所述RNA是双链RNA(dsRNA)。所述过程已经在植物、无脊椎动物和哺乳动物细胞中有过描述。在自然状态下,RNAi由dsRNA特异性内切核酸酶Dicer启动,其促进长的dsRNA被进行性切割成称为siRNA的双链片段。将 siRNA被掺入到能够识别和切割靶mRNA的蛋白质复合物中。RNAi还可以通过引入核酸分子(例如合成的siRNA、shRNA或其他RNA干扰剂)来启动,以抑制或沉默靶生物标志物核酸的表达。本文使用的“靶生物标志物核酸表达的抑制”或“标志物基因表达的抑制”包括所述靶生物标志物核酸的表达、或者由所述靶生物标志物核酸编码的蛋白质的蛋白活性或水平的任意降低。与没有被RNA干扰剂靶向的靶生物标志物核酸的表达、或由没有被RNA干扰剂靶向的靶生物标志物核酸编码的蛋白的活性或水平相比,所述降低可以是至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%或更多。
用于检测或确定至少一种生物标志物的存在或水平的术语“样品”通常是全血、血浆、血清、唾液、尿液、粪(例如粪便)、眼泪和任何其他体液(例如,如在“体液”的定义下的描述),或组织样品(例如,活组织检查)如小肠、结肠样品或手术切除组织。在某些情况下,本发明所述方法还包括在检测或确定样品中至少一种标志物的存在或水平之前,从个体中获得所述样品。在一些实施方案中,根据本发明,任何包含T淋巴细胞或其子集的样品都是有用的。
术语“致敏”是指改变免疫障碍细胞,例如感染的细胞或癌细胞,改变的方式使得疗法(例如,改造的T细胞疗法)可以更有效地治疗相关免疫障碍去。在一些实施方案中,正常细胞受影响的程度不会导致所述正常细胞被所述疗法过度损伤。根据下文所述的本领域已知的用于特定治疗和方法的方法,可测量针对治疗性处理的升高的敏感性或降低的敏感性,所述方法包括但不限于细胞增殖实验(Tanigawa N,Kern D H, Kikasa Y,Morton D L,Cancer Res 1982;42:2159-2164)、细胞死亡实验(Weisenthal L M,Shoemaker R H,Marsden J A,Dill P L,Baker J A,Moran E M,Cancer Res 1984;94: 161-173;Weisenthal L M,Lippman M E,Cancer Treat Rep 1985;69:615-632; Weisenthal L M,In:Kaspers G J L,Pieters R,Twentyman P R,Weisenthal L M,Veerman A J P,eds.Drug Resistance in Leukemia and Lymphoma.Langhorne,P A:Harwood AcademicPublishers,1993:415-432;Weisenthal L M,Contrib Gynecol Obstet 1994;19: 82-90)。还可以通过测量一段时间(例如,人6个月,小鼠4-6周)的慢性免疫障碍症状的减少来测量动物中的敏感性或抗性。如果与组合物或方法不存在时的治疗敏感性或抗性相比,存在所述组合物或方法时治疗敏感性的增加或抗性的降低25%或更高,例如30%、40%、50%、60%、70%、80%或更高,直至2倍、3倍、4倍、5倍、 10倍、15倍、20倍或更高,则此类组合物或方法可致敏对治疗性处理的应答。对治疗性处理的敏感性或抗性的确定在本领域是常规的,并且在普通熟练的临床医生的技能范围内。应当理解,本文描述的用于增强癌症治疗功效的任何方法可以同样地应用于使过度增殖性细胞或其他癌细胞(例如,抗性细胞)对癌症治疗敏感的方法。
“短干扰RNA”(siRNA)在本文中也称为“小干扰RNA”,其定义为用作例如通过RNAi抑制靶基因表达的试剂。siRNA可以是化学合成的,可以通过体外转录产生,或者可以在宿主细胞内产生。在一个实施方案中,siRNA是长度为约15至约 40个核苷酸的双链RNA(dsRNA)分子,优选约15至约28个核苷酸,更优选约19 至约25个核苷酸的长度,以及更优选约19、20、21或22个核苷酸的长度,并且每条链上可含有3′和/或5′突出端,所述突出端的长度为约0、1、2、3、4或5个核苷酸。所述突出端的长度在两条链之间是独立的,即,一条链上的突出端的长度不依赖于第二条链上的突出端的长度。优选地,所述siRNA能够通过靶信使RNA(mRNA)的降解或特异性转录后的基因沉默(PTGS)来促进RNA干扰。在另一个实施方案中, siRNA是小发夹(也称为茎环)RNA(shRNA)。在一个实施方案中,这些shRNA 由以下组成:短的(例如,19-25个核苷酸)反义链,然后是5-9个核苷酸的环,以及类似的有义链。或者,所述有义链可以在所述核苷酸环结构之前,反义链可以在其后。这些shRNA可以包含在质粒、逆转录病毒和慢病毒中,并且可以从例如pol III U6 启动子或另一种启动子处表达(参见,例如,Stewart,et al.(2003)RNA Apr;9(4):493-501,其通过引用并入本文)。可以将RNA干扰剂如siRNA分子施用给患有免疫障碍或具有患免疫障碍风险的受试者,以抑制本发明所述标志物基因的表达,例如,其表达或来源必须在免疫障碍中减少的标志物基因(例如表1中列出的标志物),从而治疗、预防或抑制所述受试者中的免疫障碍。
术语“小分子”是本领域的术语,包括小于分子量约1000或小于分子量约500 的分子。在一个实施方案中,小分子不仅仅包含肽键。在另一个实施方案中,小分子不是寡聚的。可以筛选活性的示例性小分子化合物包括但不限于肽、肽模拟物、核酸、碳水化合物、有机小分子(例如,聚酮化合物)(Cane et al.(1998)Science 282:63) 和天然产物提取物库。在另一个实施方案中,所述化合物是小的有机非肽化合物。在进一步的实施方案中,小分子不是生物合成的。
术语“受试者”是指任何健康的动物、哺乳动物或人,或患有免疫障碍的任何动物、哺乳动物或人。所述术语“受试者”可与“患者”互换。
术语“存活”包括以下所有:存活直至死亡,也称为总存活(其中所述死亡可以与病因无关或与肿瘤相关);“无复发存活”(其中术语复发应包括局部复发和远处复发);无病存活(其中术语疾病应包括免疫障碍和与之相关的疾病)。所述存活的长度可以通过参考确定的起始点(例如,诊断时间或治疗开始时间)和终点(例如,死亡、复发或转移)来计算。此外,治疗功效的标准可以扩展到包括对疗法的反应、存活概率、给定时间段内转移的可能性等。
术语“协同效应”是指两种或更多种抗免疫障碍试剂或疗法的组合效应,其可以大于每种这样的药剂或疗法独自存在时的单独效应的总和。在一些实施方案中,它可以提供单一疗法的类似功效,但相对于单一疗法具有其他意想不到的改善,例如减少不想要的副作用。
术语“治疗效应”是指由药理学活性物质引起的动物(特别是哺乳动物,更特别是人)的局部或全身效应。因此,该术语涉及用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防疾病的或用于增强动物和人中所想要的身体或精神发育和状态的任何物质。术语“治疗有效量”是指产生一些期待的局部或全身效应、并以合理的利益/风险比适用于任意治疗的此类疗法或物质的量。在某些实施方案中,化合物的治疗有效量将取决于其治疗指数、溶解度等。例如,通过本发明的方法发现的某些化合物可以以足够的量进行施用,以产生适用于这种治疗的合理的利益/风险比。
本文所用的术语“治疗有效量”和“有效量”是指化合物、物质或包含本发明所述化合物的组合物的量,其能有效地在动物的至少一个亚群细胞中以适用于任何医学治疗的合理的利益/风险比产生一些所需的治疗效应。受试化合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药学方法测定,例如,测定LD50和ED50。优选表现出大治疗指数的组合物。在一些实施方案中,可以测量LD50(致死剂量),并且施用所述试剂的LD50可以是相对于不施用所述试剂的LD50减少了,例如,至少 10%、20%、30%40%50%,60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、 600%、700%、800%、900%、1000%或更多。类似地,可以测量ED50(即,实现症状的半数最大抑制的浓度),并且施用所述试剂的ED50可以是相对于不施用所述试剂的ED50增加了,例如,至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或更多。而且,类似地,可以测量IC50(即达到半数最大效应的浓度,例如对癌细胞的细胞毒性或细胞抑制作用、或对病毒复制或载量的抑制),并且施用所述试剂的IC50可以是相对于不施用所述试剂的IC50增加了,例如,至少10%、20%、30%、40%、50%、 60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、 900%、1000%或更多。在一些实施方案中,实验中的效应可以被抑制至少约10%、15%、 20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%或甚至100%。在另一个实施方案中,可以实现恶性肿瘤或病毒载量的至少约10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或甚至100%的降低。
“组织特异性”启动子是一种核苷酸序列,当其可操作地与编码或指定基因产物的多核苷酸连接时,使得所述基因产物基本上仅在所述细胞是对应于所述启动子的组织类型的细胞的情况下才在该类活的人细胞中产生。例如,Foxp3、CD25或其他Treg 选择性或Treg特异性启动子可用于在Treg细胞内选择性或特异性地表达多核苷酸。
“转录的多核苷酸”或“核苷酸转录物”是多核苷酸(例如mRNA,hnRNA,cDNA 或前述RNA或cDNA的类似物),所述多核苷酸与成熟mRNA的全部或部分互补或同源,所述成熟mRNA通过生物标志物核酸的转录和可能存在的所述RNA转录物的正常的转录后加工(例如剪接),以及所述RNA转录物的逆转录制成。
本文使用的术语“无反应性”(unresponsiveness)或“耐受性”包括免疫细胞对刺激(如经由活化受体或细胞因子的刺激)的顽固性。出现无反应性,可能是因为例如,暴露于免疫抑制剂或暴露于高剂量抗原。本文所用的术语“无应答性”(angery) 或“耐受性”包括对活化受体介导的刺激的顽固性。这种顽固性通常是抗原特异性的,并且在暴露于耐受性抗原结束后持续存在。例如,T细胞中的无应答性(与无反应性相反)的特征在于缺乏细胞因子(如IL-2)的产生。当T细胞暴露于抗原并且在不存在第二信号(例如共刺激信号)的条件下接收到第一信号(T细胞受体或CD-3介导的信号)时,出现T细胞无应答性。在这些条件下,所述细胞再次暴露于所述相同的抗原(即使再次暴露是发生在共刺激多肽存在的条件下)会导致不能产生细胞因子,因此不能增殖。然而,无应答性的T细胞如果与细胞因子(例如IL-2)一起培养的话,则可以增殖。例如,也可以通过ELISA或通过使用指示细胞系的增殖实验检测到的 IL-2产生的缺失,观察到T细胞的无应答性。或者,可以使用报道基因构建体。例如,无应答性T细胞不能在5′IL-2基因增强子的控制下由异源启动子诱导出IL-2的基因转录,也不能由增强子内的AP1序列的多聚体诱导出IL-2的基因转录(Kang et al. (1992)Science 257:1134)。
本文所用的术语“载体”是指能够将与其连接的另一个核酸转运的核酸。一种类型的载体是“质粒”,其是指环状双链DNA环,其内可以连接额外的DNA区段。另一种类型的载体是病毒载体,其中额外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在其被引入进的宿主细胞中自主复制(例如,具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如,非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中,从而与宿主基因组一起复制。此外,某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“重组表达载体”或简称为“表达载体”。通常,在重组DNA技术中,有用的表达载体通常是质粒形式。在本说明书中,“质粒”和“载体”可互换使用,因为质粒是最常用的载体形式。然而,本发明旨在包括其他形式的表达载体,例如具有相同功能的病毒载体(例如,复制缺陷型逆转录病毒,腺病毒和腺相关病毒)。
II.T细胞染色质可接近基因组基因表达调控区
“染色质可接近的”基因组区域表示基因表达的调控区,因为它们为转录因子的结合提供物理空间和介导基因表达的调节。如下文实施例中进一步描述的,分析了不同类型的T细胞(例如,初始CD8+ T细胞、高功能的效应CD8+ T细胞、记忆CD8+ T细胞和耗竭性CD8+T细胞)的各组染色质可接近的调控区,并进行了相互比较。许多染色质可接近的基因组基因表达调控区被确定能选择性地或特异性地存在于给定的感兴趣的T细胞类型中。下面提供的表1A-1K描述了对耗竭性CD8+ T细胞具有选择性和/或特异性的染色质可接近基因组基因表达调控区,并且在本发明描述的实施方案中是有用的。这些区域在耗竭性CD8+ T细胞中选择性地和/或特异性地可用于转录因子的结合和介导基因表达的调节,例如PD-1的过表达。
术语“特定的”是指排他性行为或功能。在一个实例中,特异性存在于耗竭性T 细胞(耗竭性CD8+ T细胞)基因组内的基因组基因表达调控区在初始T细胞、高功能效应T细胞或记忆T细胞的基因组内不存在。在另一个实例中,细胞中基因表达的特异性调节是指所述基因的表达和/或活性在所述细胞群中的排他性调节,而不在其他细胞群中调节。在又一个实例中,抗体与预定抗原的特异性结合是指抗体结合目的抗原而不结合其他抗原的能力。通常,当通过表面等离子体共振(SPR)技术在测定仪器中使用目的抗原作为分析物以及抗体作为配体时,抗体结合的亲和力(KD)约小于1x10-7M,例如约小于10-8M、10-9M、10-10M、10-11M,或甚至更低,并且结合预定抗原的亲和力比结合除所述预定抗原或其密切相关抗原以外的非特异性抗原(例如BSA,酪蛋白)的亲和力高至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、 1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5 倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍或10.0倍或更高。此外,KD与KA相反。短语“识别抗原的抗体”和“特异性针对抗原的抗体”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。
相反,术语“选择性的”是指优先的行为或功能。除非另有说明,否则选择性生物标志物还包括用于本发明目的的特定标志物。例如,“选择性地存在于耗竭性T细胞(如耗竭性CD8+ T细胞)的基因组内”的基因组基因表达调控区在一种或多种初始T细胞、高功能效应T细胞或记忆T细胞的基因组内不存在。作为另一个实例,“选择性结合”是相对性的术语,表示相对于一种抗原,抗体优先区分并结合另一种抗原的能力。双特异性或多特异性抗体可以选择性地靶向某些抗原或细胞群,这是基于多个抗原靶点在单个位点处表达使得结合亲和力更高,因为多抗原靶点的局部有效浓度更高。。术语“选择性的”可以根据特定目的靶点相对于其他靶点的优先效应来量化。例如,与非预期的或不想要的靶点相比,目的靶点中测得的变量(例如,工程化T细胞中的PD-1表达与非工程化T细胞中的PD-1表达)的差异可以是20%、25%、 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、 6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14 倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、 50倍、55倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多或包括性地介于两者之间(例如,50%至16倍)。相同的倍数分析可用于确认给定的组织、细胞群、测量变量、和测量效果等等的效应量级,所述效应例如细胞比率、过度增殖细胞的生长速率或体积、T细胞功能或增殖速率等。
通常,术语“核酸分子”旨在包括DNA分子(即cDNA或基因组DNA)和RNA 分子(即mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。“基因组核酸”通常会具有与宿主基因组相同的核酸类型(例如,对于人基因组DNA的双链DNA,对于丙型肝炎病毒基因组RNA的单链RNA等)。核酸分子可以是单链或双链的,但优选是双链DNA。“分离的”核酸分子是与存在于核酸的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。优选地,“分离的”核酸不含这样的序列:其天然地位于所述核酸所来源的生物的基因组DNA中的核酸的侧翼(即,位于所述核酸的5′和3′末端的序列)。例如,在各种实施方案中,对应于表1中列出的或本文描述的一种或多种生物标志物的分离的核酸分子可含有少于约5kb,4kb,3kb,2kb,1kb,0.5kb或0.1kb 的核苷酸序列,所述核苷酸序列天然地位于所述核酸所来源的细胞(即T细胞)的基因组DNA中的核酸分子的侧翼。此外,“分离的”核酸分子在通过重组技术产生时可以基本上不含其他细胞物质或培养基,或者当化学合成时可以基本上不含化学前体或其他化学物质。
如上所述,除了表中所示的基因组核酸区域之外,本发明还包括了这样的基因组核酸序列:其包括表中所列区域,或除小鼠以外的哺乳动物(包括人)的基因组内的直系同源物。此外,所列出的区域或其直系同源物还包含5′端上的、3′端上的、或在 5′和3′两端上的约1bp、2bp、3bp、4bp、5bp、10bp、15bp、20bp、25bp、30bp、 35bp、40bp、45bp、50bp、55bp、60bp、65bp、70bp、75bp、80bp、85bp、90 bp、95bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900 bp、1000bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp、1500bp、1600bp、1700bp、1800 bp、1900bp、2000bp、2100bp、2200bp、2300bp、2400bp、2500bp、2600bp、2700 bp、2800bp、2900bp或3000bp,或其间的包括性的任何范围(例如,1bp至222bp)。另外,还包括了它们的任何部分或其片段。进一步地,包括了包含以下核酸序列的任意基因组核酸序列或其部分/片段:所述核酸序列在其全长上与上述区域具有至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更多的同一性。所描述的核酸分子可以具有所列区域的核酸的某种功能。
可以使用标准分子生物学技术和本文提供的序列信息分离这些区域。例如,可以通过将全部或部分核酸分子或其片段用作杂交探针以及标准杂交技术从人细胞系中分离人cDNA(即,如Sambrook,J.,Fritsh,E.F.,和Maniatis,T.Molecular Cloning:ALaboratory Manual.2nd,ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989中的描述)。此外,可以使用基于表1 中列出的一种或多种生物标志物的序列或其片段、或其同源核苷酸序列而设计出的寡核苷酸引物,通过聚合酶链式反应分离本发明所述核酸分子。可以根据本领域熟知的方法设计用于PCR扩增的合成的寡核苷酸引物。可以使用基因组DNA作为模板和合适的寡核苷酸引物,根据标准PCR扩增技术扩增出本发明所述核酸。可以将如此扩增出的核酸克隆到合适的载体中,并通过DNA序列分析进行表征。此外,可通过标准合成技术,即使用自动化DNA合成仪制备出对应于表1中列出的一种或多种生物标志物的核苷酸序列的寡核苷酸。
基于表1中列出的一种或多种生物标志物的核苷酸序列的探针可用于检测或确认所需的编码相同或同源蛋白质的转录物或基因组序列。在优选的实施方案中,所述探针还包含与其连接的标记基团,即所述标记基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。此类探针可用作诊断测试试剂盒的一部分,所述试剂盒用于例如通过测量来自受试者的细胞样品中的一种或多种生物标志物核酸的水平,即检测表1中列出的一种或多种生物标志物的mRNA水平,来鉴定表达表1中列出的一种或多种生物标志物的细胞或组织。
本领域技术人员应理解,导致表1中列出的一种或多种生物标志物的氨基酸序列变化的DNA序列多态性可存在于群体(例如哺乳动物和/或人群)中。由于天然等位基因变异,这种遗传多态性可能存在于群体内的个体之间。本文所用的术语“基因”和“重组基因”是指包含开放阅读框的核酸分子,所述开放阅读框编码表1中列出的一种或多种生物标志物,优选哺乳动物如人的蛋白质。这种天然等位基因变异通常可导致表1中列出的一种或多种生物标志物的核苷酸序列中1-5%的变异。表1中列出的一种或多种生物标志物中的任何和所有此类核苷酸变异以及随之产生的氨基酸多态性,如果其是由天然等位基因变异导致的并且不改变表1中列出的一种或多种生物标志物的功能活性,则都属于本发明的范围。此外,编码表1中列出的一种或多种生物标志物的核酸分子也可以来自其他物种。
除了可能存在于群体中的表1中列出的一种或多种生物标志物的天然存在的等位基因变体之外,技术人员应进一步理解:可以通过突变将变化引入核苷酸序列或其片段,从而导致表1中列出的生物标志物的核酸序列的变化,而不改变表1中列出的生物标志物的功能。
可以使用数学算法完成序列的比较和两个序列之间同源性百分比的确定。优选地,可以使用Clustal方法进行比对。多个比对参数包括空位罚分=10,空位长度罚分=10。对于DNA比对,成对的比对参数可以是Htuple=2,空位罚分=5,窗口= 4,保存的对角(Diagonal saved)=4。
最后,本发明所述基因座和生物标志物(例如,表1中列出的生物标记物)的核酸和氨基酸序列信息是本领域公知的,并且可以容易地在公共开放数据库上找到,例如国家生物技术信息中心(NCBI)以及如实施例中描述的那些。
III.T细胞和T细胞基因组基因表达调控区的遗传修饰
本文使用的术语“免疫细胞”是指在免疫应答中起作用的细胞。免疫细胞具有造血起源,并包括淋巴细胞如B细胞和T细胞;自然杀伤细胞;骨髓细胞如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。例如,抗原反应性T 细胞是选择性地结合目的抗原并基于抗原识别来调节免疫应答的T细胞。免疫细胞可以在外周血中找到。术语“外周血细胞亚型”是指通常发现于外周血中的细胞类型,包括但不限于,嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、T细胞、单核细胞、NK细胞、粒细胞和B细胞。一些免疫细胞是“抗原递呈细胞”,包括专职抗原递呈细胞(例如,B 淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞、朗格汉斯细胞),以及其他抗原呈递细胞(例如,角质形成细胞、内皮细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞和少突胶质细胞)。
免疫细胞介导免疫应答。术语“免疫应答”是指免疫系统细胞如B细胞、T细胞 (CD4或CD8)、调节性T细胞、抗原递呈细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、NKT细胞、NK细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或中性粒细胞对刺激的应答。在一个实施方案中,所述应答是特异性针对特定抗原的(“抗原特异性应答”),并且是指CD4 T细胞、CD8 T细胞或B细胞经由其抗原特异性受体的应答。在另一个实施方案中,免疫应答是T细胞应答,例如CD4+应答或CD8+应答。这些细胞的这种应答可以包括,例如,细胞毒性,增殖,细胞因子或趋化因子的产生、运输或吞噬作用,并且可以取决于经历所述应答的免疫细胞的性质。在又一个实施方案中,免疫应答是效应T细胞应答,例如发生在细胞毒性CD8+细胞产生抗原特异性应答时的应答。术语“免疫应答”包括T细胞介导的和/或B细胞介导的免疫应答。示例性免疫应答包括T细胞应答,例如细胞因子的产生和细胞毒性。此外,术语免疫应答包括由 T细胞活化间接影响的免疫应答,例如抗体的产生(体液应答)和细胞因子应答细胞 (例如巨噬细胞)的活化。
T细胞是一类免疫细胞,通常分为两个亚类:调节性T细胞(Tregs)和常规T 细胞(Tconv)。
Tregs是天然存在的CD4+CD25+FOXP3+ T淋巴细胞,其占循环CD4+ T细胞群的约5-10%,主要抑制自身反应性淋巴细胞,并控制先天性和获得性免疫应答 (Piccirillo和Shevach(2004)Semin.Immunol.16:81-88;Fehervari和Sakaguchi(2004)Curr.Opin.Immunol.16:203-208;Azuma et al.(2003) Cancer Res.63:4516-4520;Cederbom et al.(2000)Eur.J.Immunol.30:1538-1543;Maloy et al.(2003)J.Exp.Med.197:111-119;Serra et al.(2003)Immunity 19:877-889;Thornton和Shevach(1998)J.Exp. Med.188:287-296;Janssens et al.(2003)J.Immunol.171:4604-4612;Gasteigeret al. (2013)J.Exp.Med.210:1167-1178;Sitrin et al.(2013)J.Exp.Med.210:1153-1165; Schmitt和Williams(2013)Front.Immunol.4:1-13)。天然Tregs也表达少量的CD127,在胸腺中发育,表达GITR和CTLA-4。诱导的Treg为CD4+ T细胞,其在外周中(例如,粘膜相关淋巴组织(MALT))胸腺外获得CD25的表达,表达低水平的CD45RB 并且不天然地表达Foxp3或CD25。基于TGFβ对外周CD4+初始常规T细胞的影响,诱导的Treg获得Foxp3、CD25,CTLA-4和GITR/AITR的表达。Treg至少部分地通过抑制常规T细胞(Tcons)的增殖、扩增和效应活性来实现这种抑制。Treg通过抑制T细胞的辅助和激活使得细胞-细胞接触、通过释放免疫抑制细胞因子如IL-10或 TGF-β、通过产生细胞毒性分子如颗粒酶B、通过消耗IL-2的水平、或通过改变组织中的营养物质来抑制效应T细胞破坏其(自身)靶点。Treg的消耗能增强IL-2诱导的抗肿瘤免疫力(Imai et al.(2007)Cancer Sci.98:416-23)。
相反,常规T细胞,也称为Tconv或Teff,具有效应功能(例如,细胞因子分泌、细胞毒活性、抗自我识别等),通过它们表达一种或多种T细胞受体来提升免疫应答。 Tcon或Teff通常被定义成不是Treg的任何T细胞群,并且包括例如,初始T细胞、活化的T细胞、记忆T细胞、静息Tcon或已经向例如Th1或Th2系分化的Tcon。在一些实施方案中,Teff是非TregT细胞亚类。在一些实施方案中,Teff是CD4+ Teff 或CD8+ Teff,例如CD4+辅助性T淋巴细胞(例如Th0、Th1、Tfh或Th17)和CD8+ 细胞毒性T淋巴细胞。
“初始Tcon”是这样的CD4+ T细胞或CD8+ T细胞:其已经在骨髓中分化,并成功地在胸腺中进行了中心选择的阳性和阴性过程,但尚未通过暴露于抗原而激活。初始Tcon的特征通常在于表面表达L-选择蛋白(CD62L),缺乏活化标志物如CD25、 CD44或CD69,以及缺乏记忆标志物如CD45RO。因此认为初始Tcon是静止的和不分裂的,其需要白细胞介素-7(IL-7)和白细胞介素-15(IL-15)得以稳态存活(参见,如WO2010/101870)。在抑制免疫应答的背景下,这些细胞的存在和活性是不期望的。
和Treg不同的是,“效应Tcon”不是无应答性的,并且可以在对基于抗原的T 细胞受体激活应答时增殖(Lechler et al.(2001)Philos.Trans.R.Soc.Lond.Biol.Sci. 356:625-637)。效应Tcon可以是CD4+或CD8+ T细胞。它们分别识别与MHC I类或II类分子相关的抗原,通常表达活化标志物如CD25、CD44或CD69,但通常不表达记忆标志物如CD45RO。通常,提升Treg的数量、提升Treg的活性和/或降低Treg 的细胞死亡(例如,细胞凋亡)可用于抑制与一系列免疫障碍(例如,cGVHD)相关的不希望的免疫应答。Treg在抑制炎症方面也很重要。在持续炎症的情况下,治疗可以优先增强Treg而不激活Tcon或其他可能使GVHD恶化的效应物。体内Treg的有效增加也与其他外周耐受受损的疾病(例如,SLE、T1D、MS、牛皮癣、RA、IBD、血管炎等自身免疫性疾病)直接相关,其中Treg功能障碍越来越多地参与其中(Grinberg-Bleyer et al.(2010)J.Exp.Med.207:1871-1878;Buckner(2010)Nat.Rev.Immunol.10:849-859;Humrich et al.(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107:204-209;Carbone et al.(2014)Nat.Med.20:69-74)。
“记忆Tcon”是经历过抗原的T细胞(即先前已经暴露于抗原并对其起应答的T 细胞),由至少三种不同的T细胞亚群代表。记忆Tcon可以快速地再产生,并在重新暴露于所述抗原时引发更强的免疫应答。可以基于趋化因子受体CCR7和L-选择素 (CD62L)表达的差异来区分记忆Tcon亚群(Sallusto et al.(2000)Curr.Top.Microbiol. Immunol.251:167-171)。例如,与初始细胞一样,干记忆T细胞(Tscm)是CD45RO-、 CCR7+、CD45RA+、CD62L+(L-选择素)、CD27+、CD28+和IL-7Rα+的,但它们也表达大量CD95、IL-2Rβ、CXCR3和LFA-1,并显示出与记忆细胞不同的许多功能属性(Gattinoni et al.(2011)Nat.Med.17:1290-1297)。中央记忆细胞(Tcm)表达 L-选择素和CCR7,并分泌IL-2,但不分泌IFNγ或IL-4。效应记忆细胞(Tem)不表达L-选择素或CCR7,但产生效应细胞因子如IFNγ和IL-4。
“耗竭性Tcon”是逐渐丧失T细胞功能的T细胞。“耗竭”或“无反应性”是指细胞的状态,在该状态下,所述细胞在正常的输入信号下不会执行其通常的功能或活性作为应答,同时,该状态还包括免疫细胞对刺激(如经由激活受体或细胞因子的刺激)的顽固性。这种功能或活性包括,但不限于,增殖或细胞分裂、进入细胞周期、细胞因子的产生、细胞毒性、运输、吞噬活性,或其任意组合。正常输入信号可包括,但不限于经由受体(如T细胞受体,B细胞受体,共刺激受体等)的刺激。
相比于对应的相同类型的对照免疫细胞,耗竭性免疫细胞可以在细胞毒性、细胞因子的产生、增殖、运输、吞噬活性或其任意组合方面减少至少10%、15%、20%、 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、95%、99%或更多。在一个实施方案中,耗竭性的细胞是CD8+ T细胞(例如,抗原特异性的效应CD8+ T细胞)。CD8细胞通常在T细胞受体和/或共刺激受体的刺激下,以及在响应细胞因子如IL-2的情形下增殖(例如,克隆性地扩增)。因此,耗竭性CD8 T细胞是在正常输入信号下不会进行增殖和/或产生细胞因子以作为应答的细胞。众所周知,效应功能的耗竭可以根据几个阶段来描述,其最终导致终止或完全耗竭并最终导致缺失(Yi et al.(2010)Immunol.129:474-481;Wherry and Ahmed (2004)J.Virol.78:5535-5545)。在第一阶段,功能性T细胞进入“部分耗竭I”阶段,其特征在于效应子功能子集的丧失,包括产生IL-2能力的丧失,产生TNFα的能力的减弱以及增殖和/或离体溶解能力的降低。在第二阶段,当抗原刺激后,生产IL-2和 TNFα的能力停止,并且产生IFNγ的能力减弱,此时,部分耗竭性T细胞进入“部分耗竭II”阶段。当CD8+ T细胞在抗原刺激后失去所有效应功能(包括缺乏IL-2、 TNFα和IFNγ的产生以及丧失离体溶解能力和增殖潜能),此时,发生“完全耗竭”或“终末耗竭”。完全耗竭的CD8+ T细胞是这样的细胞:在正常输入信号下,其不会增殖、不会裂解靶细胞(细胞毒性)和/或不产生合适的细胞因子(如IL-2、TNF d或IFNγ)以作为应答。当抗原负荷高和/或CD4辅助低时,可能会发生这种效应功能的缺乏。这种功能的等级丧失还与共抑制剂免疫受体如PD-1、TIM-3、LAG-3等 (Day et al.(2006)Nature 443:350-4;Trautmann et al.(2006)Nat.Med.12:1198-202; and Urbani et al.(2006)J.Virol.80:1398-1403)的表达相关。其他分子标志物区分免疫细胞耗竭的分级阶段,例如高中胚层(EOMES)和低TBET的表达作为终末耗竭性T 细胞的标志物(Paley et al.(2012)Science 338:1220-1225)。耗竭性T细胞的其他标志物例如Bcl-b的减少和BLIMP-1(Pdrm1)产生的增加。
另外,Treg和/或Teff可以从单个来源或多个来源(例如,单个受试者或多个受试者)获得。多个是指至少两个(例如,一个以上)。在又一个实施方案中,所述非人哺乳动物是小鼠。从中获得目的细胞类型的动物可以是成年的、新生的(例如,年龄小于48小时)、未成熟的或在子宫内的。目的细胞类型可以是原代细胞、干细胞、建立的癌细胞系、永生化的原代细胞等。
在某些实施方案中,所述目的T细胞可以从特定来源获得。例如,免疫障碍的哺乳动物动物模型可用作目的T细胞的来源。在另一个实例中,宿主受试者的免疫系统可以被改造或以其他方式被选择为与移植细胞免疫相容。例如,在一个实施方案中,所述受试者可以是“人源化的”以使得与人的细胞相容。术语“人源化的免疫系统”是指动物如小鼠,其包含人HSC谱系细胞以及人获得性和先天性免疫细胞,在不被所述宿主动物排斥的情况下存活,从而允许在宿主动物中重建人的造血作用以及获得性和先天性免疫。获得性免疫细胞包括T细胞和B细胞。先天性免疫细胞包括巨噬细胞、粒细胞(嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞)、DC、NK细胞和肥大细胞。代表性的非限制性实例包括SCID-hu、Hu-PBL-SCID、Hu-SRC-SCID、NSG(缺乏先天免疫系统的NOD-SCID IL2r-γ(无),B细胞,T细胞和细胞因子信号传导)、 NOG(NOD-SCID IL2r-γ(短截的))、BRG(BALB/c-Rag2(无)IL2r-γ(无)) 和H2dRG(Stock-H2d-Rag2(无)IL2r-γ(无))小鼠(参见,例如,Shultz et al.(2007)Nat.Rev.Immunol.7:118;Pearson et al.(2008)Curr.Protocol.Immunol.15:21;Brehmet al.(2010)Clin.Immunol.135:84-98;McCune et al.(1988)Science 241:1632-1639,美国专利7,960,175和美国专利公开号2006/0161996),以及免疫相关基因的无效突变体如Rag1(缺乏B和T细胞)、Rag2(缺乏B和T细胞)、TCRα(缺乏T细胞)、穿孔素(cD8+ T细胞缺乏细胞毒性功能)、FoxP3(缺乏功能性CD4+ T调节细胞)、 IL2rg或Prf1,以及PD-1、PD-L1、Tim3和/或2B4的突变体或敲除体,允许人免疫细胞的有效植入和/或提供区室特异性的免疫受损动物如小鼠的模型(参见,例如, PCT公开号WO2013/062134)。此外,NSG-CD34+(NOD-SCIDIL2r-γ(无)CD34+) 人源化小鼠可用于在动物模型(如小鼠)中以研究人的基因和肿瘤活性。
本文使用的从生物材料来源“获得”是指从供体收获或分配生物材料来源的任何常规方法。例如,生物材料可以从实体瘤、血液样品如外周血或脐带血样品中获得,或从另一种体液如骨髓或羊水中获得。获得这种样品的方法是普通技术人员所熟知的。在本发明中,所述样品可以是新鲜的(即,从供体获得并且未经冷冻)。此外,可以进一步操纵所述样品以在其扩增之前除去外来的或不需要的组分。所述样品也可以从保存的库存中获得。例如,在细胞系或流体(例如外周血或脐带血)的情况下,可以从低温地或以其他方式保存的这种细胞系或流体库中取出样品。此类样品可以从任何合适的供体获得。
众所周知的免疫细胞特征可用于纯化、富集和/或分离目的T细胞。“富集的T 细胞”是指包含所需T细胞群(例如,本发明所述改造的T细胞)比其他细胞和/或T 细胞在一定比例的组合物,其中所述组合物具有所需T细胞与其他细胞的比例为至少 1∶2、1∶1.9、1∶1.8、1∶1.7、1∶1.6、1∶1.5、1∶1.4、1∶1.3、1∶1.2、1∶1.1、1∶1、1∶0.9、1∶0.8、 1∶0.7、1∶0.6、1∶0.5、1∶0.4、1∶0.3、1∶0.2、1∶0.1或更多,或其间的任何范围或其间的任意值。这些比例可以通过用各种方法纯化包含T细胞的组合物来实现。例如,可以组合使用CD8+和CD19+共去除以及CD25+细胞的阳性选择来进行Treg的纯化。此类富集的Treg可以进一步根据细胞标志物和/或活力来定义。例如,富集的Treg细胞组合物具有的总细胞活力可大于40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%、95%、99%或更多,或其间的任意范围或其间的任意值。它可以包括大于40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 99%或更多,或其间的任意范围或其间的任意值的CD4+ CD25+细胞。它可以包括大于40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或更多,或其间的任意范围或其间的任意值的FoxP3+细胞。Treg可以以本文所述的任何合适路径施用,例如通过输注施用。Treg也可以在其他免疫调节剂之前、同时或之后施用。可以使用本领域熟知的方法使这些方法和度量适应于任何目的T细胞群。
在一个实施方案中,荧光激活细胞分选(FACS)(也称为流式细胞术)用于分选和分析不同的细胞群。具有细胞标志物或其他感兴趣的特异性标志物的细胞通过结合所述细胞标志物的抗体或通常用抗体混合物来标记。将针对不同标志物的每种抗体与可检测分子特别是荧光染料缀合,所述荧光染料可以与偶联于其他抗体的其他荧光染料区分开。使标记的或“染色”的细胞流通过激发荧光染料的光源并检测来自细胞的发射光谱,以确定特定标记抗体的存在。通过同时检测不同的荧光染料(其在本领域中也称为多色荧光细胞分选),可以鉴定显示为不同类细胞标志物的细胞并将其从群体中的其他细胞中分离出来。其他FACS参数,包括,但不是限制于例如侧向散射 (SSC)、前向散射(FSC)和活体染料染色(例如,用碘化丙啶染色),所述参数允许基于大小和生存力选择细胞。HSC和相关谱系细胞的FACS分选和分析在本领域中是公知的,并且描述于例如美国专利No.5,137,809;5,750,397;5,840,580;6,465,249; Manz et al.(202)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:11872-11877;和Akashi et al. (200)Nature 404:193-197中。荧光激活细胞分选的一般性指导描述于,例如,Shapiro (2003)Practical Flow Cytometry,第4版,Wiley-Liss(2003)和Ormerod(2000)Flow Cytometry:A Practical Approach,第3版,Oxford UniversityPress中。
分离有用细胞群的另一种方法涉及固体或不溶性底物,其结合有与特定细胞表面标志物相互作用的抗体或配体。在免疫吸附技术中,使细胞与含有抗体的底物(例如珠柱、烧瓶、磁性颗粒等)接触,并除去任何未结合的细胞。可以使免疫吸附技术规模化以直接处理临床收获物中的大量细胞。合适的底物包括,但不限于例如塑料、纤维素、葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖和本领域已知的其它物质(例如Pharmacia Sepharose 6MB大珠)。当使用包含磁珠或顺磁珠的固体底物时,通过磁分离器可以容易地分离与珠结合的细胞(例如,Kato和Radbruch(1993)Cytometry 14:384-92)。亲和层析细胞分离通常涉及使细胞悬液通过载体,所述载体带有固定在其表面上的选择性配体。所述配体与细胞上的其特异性靶分子相互作用并被捕获在基质上。通过向柱中运行的缓冲液中加入洗脱剂,结合的细胞被释放,并且,游离细胞通过柱洗涤并被收获为均质群。对于本领域技术人员显而易见的是,吸附技术不限于使用特异性抗体,并且可以使用非特异性吸附。例如,对于从细胞制剂中除去吞噬细胞来说,一个的简单方法是吸附到二氧化硅上。
FACS和大多数分批免疫吸附技术可适用于阳性和阴性选择过程(参见例如美国专利号5,877,299)。在阳性选择中,用抗体标记所需细胞,并从剩余的未标记/不需要的细胞中除去。在阴性选择中,标记并去除不需要的细胞。可以采用的另一种类型的阴性选择是使用抗体/补体治疗或免疫毒素来去除不需要的细胞。
应当理解,细胞的纯化或分离还包括上述方法的组合。典型的组合可包括能有效去除大量不需要的细胞和细胞物质的初始程序,例如白细胞去除法。第二步可包括通过免疫吸附到与底物结合的抗体上来分离表达有标志物的细胞,所述标志物对于一种或多种祖细胞群是常见的。同时还提供针对不同细胞类型的更高分辨率的额外步骤,例如用针对一组特定细胞标志物的抗体进行FACS分选,可用于获得所需细胞的基本上纯的群体。
可以根据本发明对目的细胞进行遗传修饰,其中可以改造生物体或细胞的基因组以修饰本发明所述生物标志物的表达和/或活性。例如,根据本发明所述的“改造的T 细胞”是被遗传修饰成了包含基因组区域的目的T细胞,所述基因组区域1)调节至少一个基因的基因表达和2)选择性地在来自所述哺乳动物的目的T细胞(例如,来自所述哺乳动物的耗竭性CD8+ T细胞)的基因组内是染色质可接近的,其中所述基因组区域经过了遗传修饰并且所述遗传修饰调节所述至少一个基因的表达。例如,可以使用重组技术对CD8+ T细胞进行遗传修饰,通过修饰(例如,删除)实施例中描述的耗竭性CD8+ T细胞选择性的PD-1基因组基因表达增强子,或在另一种哺乳动物中的直系同源物,来调节耗竭性CD8+ T细胞中高水平表达的PD-1的表达和/或活性,其中所述PD-1基因组基因表达增强子选择性地在所述耗竭性CD8+ T细胞中是染色质可接近的。
在一个实施方案中,所述遗传修饰是所述基因组基因表达调控区的全部或部分的缺失。所述缺失可以是本身的缺失或是通过在遗传修饰之前插入不存在于所述基因组基因表达调控区中的序列的有效缺失。如实施例中所述,已知转录因子结合染色质可接近的基因组基因表达调控区,并且该区域或其部分的实际缺失或构建性缺失会破坏转录因子结合和介导目的基因的基因表达调控的能力。可以认为,所述区域的任何部分的缺失都可调节目的基因的基因表达调控。如下所述,用于确定由遗传修饰引起的被调节的基因表达的量的实验是本领域常规的。增强子基因组区域的缺失将减少目的基因的转录,而抑制基因组区域的缺失将提升目的基因的转录。类似地,使增强子基因组区域稳定的基因组修饰,例如通过优化转录因子结合基序的序列来加强与转录因子的接触点,能减少目的基因的增强子基因组区域的转录并降低目的基因在抑制基因组区域中的转录。
基因组编辑方法在本领域中是众所周知的。例如,可以使用靶向或非靶向基因敲除方法,例如在输注进受试者之前,离体重组改造所述受试者的Treg。例如,基因组中的靶DNA可以通过缺失、插入和/或突变来操纵,所述操纵可以是使用逆转录病毒插入、人工染色体技术、基因插入、用组织特异性启动子随机插入、基因靶向、转座因子和/或通过用于引入外源DNA或产生修饰的DNA/修饰的核DNA的任何其他方法。
其他修饰技术包括从基因组中删除DNA序列和/或改变核DNA序列。例如,可以通过使用同源重组进行定点诱变来改变核DNA序列。这些方法通常使用已经导入了本发明所述重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组的宿主细胞”在本文中可互换使用。应当理解,这些术语不仅指特定的受试细胞,还指这种细胞的后代或潜在后代。由于某些修饰可能由于突变或环境影响而在后代中发生,所以这些后代事实上可能与亲本细胞不同,但仍被包括在本文所用术语的范围内。可以通过常规转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。
本文使用的术语“转化”和“转染”意指多种本领域公认的用于将外源核酸引入宿主细胞的技术,包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可以在Sambrook,et al.(同上)中以及在其他实验室手册中找到。为了稳定转染哺乳动物细胞,已经知道的是,根据所用的表达载体和转染技术,只有一小部分细胞可以将外源DNA整合到它们的基因组中。为了鉴定和选择这些整合体,通常将编码选择性标志物(例如,针对抗生素抗性的选择性标志物)的基因与目的基因一起引入宿主细胞。优选的选择性标志物包括赋予药物 (如G418、潮霉素和甲氨蝶呤)抗性的选择性标志物。稳定转染有所述引入的核酸的细胞可以通过药物选择来鉴定(例如,掺入了选择性标记基因的细胞能存活,而其他细胞会死亡)。
类似地,CRISPR-Cas系统可用于精确编辑基因组核酸(例如,用于产生非功能性的或无效的突变)。在此类实施方案中,可以表达CRISPR向导RNA和/或Cas酶。例如,可以将仅含有向导RNA的载体施用给Cas9酶转基因动物或细胞。可以使用类似的策略(例如,锌指设计软件(designer zinc finger)、转录激活因子样效应子(TALE) 或归巢大范围核酸酶)。这种系统在本领域中是公知的(参见,例如,美国专利号 8,697,359;Sander和Joung(2014)Nat.Biotech.32:347-355;Hale et al.(2009)Cell 139:945-956;Karginov和Hannon(2010)Mol.Cell 37:7;美国专利公开号 2014/0087426和2012/0178169;Boch et al.(2011)Nat.Biotech.29:135-136;Boch et al. (2009)Science 326:1509-1512;Moscou和Bogdanove(2009)Science 326:1501;Weber et al.(2011)PLoS One6:e19722;Li et al.(2011)Nucl.Acids Res.39:6315-6325;Zhang et a1.(2011)Nat.Biotech.29:149-153;Miller et al.(2011)Nat.Biotech.29:143-148;Lin et al.(2014)Nucl.Acids Res.42:e47)。根据本领域众所周知的方法,此类遗传策略可以使用组成型表达系统或诱导型表达系统。
获得的细胞群可以直接使用或冷冻以后再使用。用于冷冻保存的各种培养基和方案是本领域已知的。通常,冷冻培养基包含约5-10%的DMSO、10-90%的血清白蛋白和50-90%的培养基。用于保存细胞的其它添加剂包括但不限于例如,二糖如海藻糖(Scheinkoniget al.(2004)Bone Marrow Transplant.34:531-536),或血浆容量膨胀剂如淀粉代血浆(即,羟乙基淀粉)。在一些实施方案中,可以使用等渗缓冲溶液如磷酸盐缓冲盐水。示例性的冷冻保存组合物具有含有4%的HSA、7.5%的二甲基亚砜 (DMSO)和2%的羟乙基淀粉的细胞培养基。用于冷冻保存的其他组合物和方法是本领域公知的并且在本领域中有描述(参见,例如,Broxmeyer et al.(2003)Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.100:645-650)。细胞被保存在低于约-135℃的最终温度下。
IV.分析改造的T细胞的基因表达和功能
可以根据本领域熟知的方法,并且如实施例中举例说明的那样确定至少一种目的基因的基因表达调节以及T细胞功能的调节。例如,可以分析T细胞的活性、增殖、细胞凋亡、细胞因子产生谱、细胞表面标志物表达等。此外,可以如本文进一步的描述,进行淋巴细胞亚群的表型分析,导致免疫应答、血浆细胞因子等降低的免疫调节功能实验等分析。特别地,用于确定本文所述方法的结果的方法是本领域中公知的并且如本文中的描述,所述结果例如免疫应答的调节、转移、疾病缓解、疾病复发、肿瘤复发、死亡、自身免疫、过敏(例如,哮喘、特应性皮炎、过敏性结膜炎、花粉过敏、食物过敏等)、疫苗接种反应、免疫耐受、免疫耗竭、免疫性记忆、免疫性表位反应、细胞因子反应、细胞的相对表示(relativerepresentation of cells)、遗传扰动和 /或其他免疫学效应。例如,可以使用本领域已知的多种测序方法进行靶核酸基因表达和/或目的序列的测定。在优选的实施方案中,特定的遗传扰动的特征在于核酸或其产物(例如mRNA)的量度。可以以多种方式监测标志物的表达,包括通过检测 mRNA水平、蛋白质水平或蛋白质活性,其中任何一种都可以使用标准技术测得(参见,例如,Ausubel et al.,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons, New York 1987-1999)。检测可以涉及基因表达水平(例如,基因组DNA、cDNA、 mRNA、蛋白质或酶活性)的定量,或者,亦或可以是基因表达水平的定性评估,特别是与对照水平相比较。从上下文中可以清楚所检测的级别类型。还可以使用各种扩增和检测方法。例如,在本发明的范围内,可以将mRNA逆转录成cDNA,然后进行聚合酶链反应(RT-PCR);或者,如美国专利号5,322,770中所述,将单一酶用于两个步骤;或将mRNA逆转录成cDNA,然后进行对称间隙连接酶链反应(RT-AGLCR)、实时PCR、NASBA、连接酶链式反应(Barany,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 88:189-193)、自主序列复制(Guatelli etal.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173-1177)、Q-Beta复制酶(Lizardi et al.,1988,Bio/Technology 6:1197)、滚环复制(Lizardi et al.,U.S.Patent No.5,854,033)、靶介导的扩增、自主序列复制(SSR)、转录扩增等。在现有技术中已知许多技术能用于确定基因表达的绝对和相对水平,适用于本发明的常用技术包括原位杂交、微阵列、芯片阵列、基因表达系列分析(SAGE)、 Northern分析、RNase保护实验(RPA)、基于微阵列和PCR的技术(如定量PCR 和差异显示PCR)。例如,Northern印迹涉及在变性琼脂糖凝胶上运行RNA的制备品,并将其转移至合适的支撑物,例如活化的纤维素、硝酸纤维素或玻璃或尼龙膜。然后将放射性标记的cDNA或RNA与所述制剂杂交,洗涤并通过放射自显影进行分析。
在某些实施方案中,可以使用以下方法完成核酸检测,包括但不限于,通过杂交测序(SBH)、通过连接测序(SBL)、定量递增荧光核苷酸添加测序(QIFNAS)、逐步连接和切割、荧光共振能量转移(FRET)、分子信标、报告探针消化、焦磷酸测序、荧光原位测序(FISSEQ)、FISSEQ珠(美国专利号7,425,431),摆动测序(PCT/US05/27695)、多重测序(2008年2月6日提交的美国序列号12/027,039; Porreca et al.(2007)Nat.Methods 4:931)、聚合菌落(POLONY)测序(美国专利号 6,432,360,6,485,944和6,511,803,以及PCT/US05/06425)、纳米网格滚环测序 (ROLONY)(2008年5月14日提交的美国序列号12/120,541)、等位基因特异性寡核苷酸连接实验(例如寡聚实验(OLA)、使用连接线性探针的单模板分子OLA 和滚环扩增(RCA)读数的单模板分子OLA、连接挂锁探针、和/或使用连接圆形挂锁探针和滚环扩增(RCA)读数的单模板分子OLA)等。还可以使用高通量测序方法,例如,使用Roche454,Illumina Solexa或MiSeq或HiSeq,AB-SOLiD,Helicos,Polonator 平台等平台的循环阵列测序。高通量测序方法描述于2009年3月24日提交的美国序列号61/162,913中。多种基于光的测序技术(Landegren et al.(1998)Genome Res. 8:769-76;Kwok(2000)Pharmocogenom.1:95-100;和Shi(2001)Clin.Chem. 47:164-172)(参见,例如,美国专利公开号2013/0274117、2013/0137587和 2011/0039304)是本领域已知。
类似地,可以根据本领域中许多熟知的方法来区分感兴趣的多肽和/或细胞,所述方法包括,但不限于流式细胞术、荧光激活细胞分选(FACS)、荧光显微术、可检测细胞条形码技术(美国专利公开号2011/0263457)、免疫扩散、免疫电泳、放射免疫实验(RIA)、酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫荧光实验、蛋白质印迹、粘合剂-配体实验、免疫组化技术、凝集、补体实验、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱 (TLC)、超扩散色谱等(例如,“Basic andClinical Immunology,”Sites and Terr,eds., Appleton and Lange,Norwalk,Conn.Pp.217-262,1991,其通过引用并入本申请)。优选粘合剂-配体免疫测定方法,所述方法包括使抗体与一个或多个表位反应并竞争性地置换标记的多肽或其衍生物。
另外,改造的T细胞的T细胞功能可以根据实施例中进一步描述的本领域熟知的方法来评估。例如,可以评估改造的T细胞的“减少的耗竭”或“减少的无反应性”,其指的是一种给定治疗或一组条件,其在激活方面产生更高的T细胞活性、应答性和/ 或能力或接受性的给定治疗或一组条件。T细胞活性可以通过使T细胞与回忆抗原接触,在不存在共刺激的条件下与抗CD3接触和/或与离子霉素接触测得。而且,T细胞的增殖可以在所测相关抗原存在的条件下,例如,通过3H-胸苷掺入实验或细胞数来测得。也可以测定暴露于相关抗原后T细胞活化的标志物,例如,用流式细胞术分析指示T细胞活化(例如,CD69、CD30、CD25和HLA-DR)和/或T细胞耗竭的细胞表面标志物。在一些实施方案中,所述实验可以是在体实验,例如通过体内用抗原攻击免疫细胞的实验。例如,可以将表达来自TCR转基因小鼠和其他转基因小鼠的同源T细胞群的动物模型转移到组成性地表达被所述转移的T细胞识别的抗原的宿主中,所述宿主例如,H-Y抗原TCR转基因宿主;鸽细胞色素C抗原TCR转基因宿主;或血凝素(HA)TCR转基因宿主。在此类模型中,表达特异性针对由受体小鼠组成性地或诱导性地表达的抗原的TCR的T细胞通常经历即刻的扩增和增殖期,然后是一段无反应时间,其在所述抗原被去除和/或抗原表达被抑制时得到逆转。因此,如果所述T细胞在实验中(例如,在有或没有其他的免疫调节剂处理的条件下)比对照 T细胞显示出显著更多的增殖或扩增、细胞因子活性等,则T细胞耗竭减少。通过使用标记有BrDU、CFSE或其他活体染料的T细胞(所述活体染料允许在转移至表达所述抗原的受体动物之前追踪增殖),或细胞因子报告T细胞,或使用离体方法分析细胞的增殖和/或细胞因子的产生(例如胸苷增殖实验、ELISA、细胞因子珠实验)等,可以在体内进行这种增殖的测量。此外,可以通过检查从已建立的肿瘤中排出的淋巴结内的肿瘤浸润淋巴细胞或T淋巴细胞来评估免疫细胞耗竭的减少。这样的T细胞通过表达细胞表面分子(例如上述免疫抑制性受体)和减少细胞因子(例如上述细胞因子)的分泌而表现出耗竭的特征。因此,如果观察到T细胞的数量和/或活性增加时还伴有,例如,1)针对肿瘤相关抗原的抗原特异性(例如,由含有肿瘤相关肽的主要组织相容性复合物I类或II类四聚体所确定的抗原特异性)和/或2)能够分泌高水平的适当细胞因子和细胞溶解效应分子如颗粒酶-B,则T细胞耗竭已经有所减少。
V.调节T细胞耗竭和治疗受试者中的免疫障碍的治疗方法
本文证明,遗传改造T细胞使其包含基因组区域,所述基因组区域1)调节至少一个基因的基因表达和2)选择性地在来自所述哺乳动物的耗竭性CD8+ T细胞的基因组内是染色质可接近的,其中所述基因组区域经过了遗传修饰并且所述遗传修饰调节所述至少一个基因的表达。调节这种T细胞耗竭状态特异性的基因表达可以调节 (例如,防止或逆转)T细胞耗竭。调节T细胞耗竭可用于治疗所述受试者中的免疫障碍。所述遗传改造的T细胞可以单独使用或与本文所述的其他T细胞耗竭和/或免疫障碍调节剂组合使用,所述调节剂包括抗体、小分子、肽、肽模拟物、天然配体、小非编码RNA(如miRNA、pre-miRNA、pri-miRNA、miRNA*、抗miRNA、miRNA 结合位点等)、RNA干扰、反义物、核酸适体、核酶等。
a.受试者
在一个实施方案中,所述受试者是哺乳动物(例如小鼠、大鼠、灵长类动物、非人哺乳动物和家畜如狗、猫、牛和马等),并且优选是人。考虑了成人受试者以及小儿受试者。如本文所述,可以使用高至成人受试者所用的治疗剂剂量治疗小儿受试者。在一些实施方案中,受试者是哺乳动物,所述哺乳动物表现为感兴趣的障碍动物模型,例如小鼠免疫障碍模型。
在本发明所述方法的另一个实施方案中,所述受试者未进行治疗,例如抗免疫障碍治疗。在又一个实施方案中,所述受试者已经历了这种治疗。在又一个实施方案中,所述受试者是免疫健全的或免疫功能不全的。
“免疫健全的”受试者是指所述受试者暴露于抗原后,具有建立正常或期望的免疫应答所需的免疫细胞和免疫功能。在一个实施方案中,所述免疫健全的受试者是具有完全完整的免疫系统的野生型受试者。在另一个实施方案中,所述免疫健全的受试者是野生型受试者,其具有完全完整的但尚处于日趋成熟的免疫系统(例如,青少年受试者)。在又一个实施方案中,免疫健全的受试者具有使用免疫系统的特定分支(例如,获得性对先天性和/或体液性对细胞毒性)介导免疫应答所需的完整的免疫系统。
“免疫功能不全”的受试者是这样的受试者:其缺乏一种或多种免疫细胞类型或缺乏对应的免疫功能,以致在暴露于抗原后不能建立正常的或所需水平的至少一种免疫应答。免疫功能不全的受试者更易经受机会性感染,例如病毒感染、真菌感染、原生动物感染或细菌感染、朊病毒疾病和某些肿瘤。“免疫缺陷”受试者不能触发产生天然的宿主免疫应答,就像重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠的这种情况。相对于免疫健全的受试者,“免疫受损”的受试者具有至少一种显著降低的免疫功能。在任一种情况下,可以以许多不同的且熟知的方式产生免疫功能和/或细胞类型的减少或缺失。例如,产生出所有免疫细胞的造血干细胞(HSC)及其任何代,都有可能在发育、功能、分化、存活等方面受到负面影响。
免疫功能不全的受试者可以通过本领域众所周知的许多不同方式产生。它们可以是由以多种组合方式调节各种参数的功能和/或数量而产生的。例如,可以靶向调节静息的、有丝分裂的、终末分化的、有丝分裂后的、未激活的、激活的等免疫细胞群,以达到想要的免疫功能不全。“静息”细胞是指处于非复制状态的非循环细胞。尽管静息细胞可能有能力在激活后复制和分裂,但它们是静止的,因为它们是非循环的。因此,“静息”细胞不是简单地被操纵的免疫细胞,所述被操纵的免疫细胞是指被刺激分裂然后,被改造成恢复到静止的非分裂阶段的免疫细胞。静息细胞可以是“初始的”,这意味着它们是这样的免疫细胞:其在骨髓中分化,在胸腺中成功地经历了阳性和阴性选择,并且是成熟的,但是没有被激活并且不是记忆细胞。初始T细胞通常以以下为特征:L-选择素(CD62L)的表面表达;没有活化标志物CD25,CD44或 CD69;并且缺乏记忆CD45RO同种型。它们还表达功能性IL-7受体,其由亚基IL-7 受体-α、CD127和共-γ链(CD132)组成。在初始状态下,T细胞被认为是静止和非分裂的,需要共γ链细胞因子IL-7和IL-15以用于稳态存活机制。相反,活化的T细胞表达表面标志物CD25、CD44、CD62Llow和CD69或上调前述表面标志物的表达,并可进一步分化成记忆T细胞。初始B细胞未暴露于抗原,因为它们将成为记忆B 细胞或分泌抗体的浆细胞。在一个实施方案中,当静息细胞被触发进入生殖或倍增状态时,其变成“活化的”,并且可包括进入细胞周期、细胞分裂或有丝分裂的细胞。在另一个实施方案中,当静息细胞遇到外部信号(例如抗原或细胞因子)时,其也可以变成“活化的”,所述外部信号启动终末分化的成熟免疫细胞的活性以产生免疫应答(例如,T细胞或B细胞功能)。
在一个实施方案中,通过限定的或未明确的遗传修饰获得前述受试者。上文有关免疫受损动物中描述了此类遗传修饰的代表性但非限制性的实例。此外,术语“重度联合免疫缺陷(SCID)”是指以T细胞的缺乏和B细胞功能的缺失为特征的病症。由遗传修饰引起的SCID的常见形式包括:X连锁的SCID,其特征在于IL2RG基因中的γ链基因突变和淋巴细胞表型T(-)B(+)NK(-);和常染色体的隐性SCID,其特征是 Jak3基因突变和淋巴细胞表型T(-)B(+)NK(-)、ADA基因突变和淋巴细胞表型T(-) B(-)NK(-)、IL-7Rα链突变和淋巴细胞表型T(-)B(+)NK(+)、CD3δ或ε突变和淋巴细胞表型T(-)B(+)NK(+)、RAG1/RAG2突变和淋巴细胞表型T(-)B(-)NK(+)、 Artemis基因突变和淋巴细胞表型T(-)B(-)NK(+)、CD45基因突变和淋巴细胞表型 T(-)B(+)NK(+)。在另一个实例中,经过了遗传修饰的免疫缺陷受试者具有重度联合免疫缺陷突变Prkdcscid,通常称为scid突变(参见,例如,Boama et al.(1989)Immunogenet.29:54-56)。scid突变的纯合的小鼠,其特征在于缺乏功能性T细胞和B细胞,淋巴细胞减少,低球蛋白血症和正常的造血微环境。例如,可以通过使用熟知的方法检测scid突变的标志物来检测scid突变。
在另一个实施方案中,通过免疫细胞功能或数量的非遗传消融来获得前述受试者。其他试剂可用于消融免疫细胞功能或数量。例如,可以用高频电磁辐射,用亚致死辐射或致死辐射来对它们进行条件化。辐射可以是电离辐射。放射疗法也可以是伽马射线、X射线或质子束。放射疗法的实例包括但不限于外束放射疗法、放射性同位素(I-125、钯、铱)的间质植入、放射性同位素如锶-89、胸部放射疗法、腹膜内P-32 放射疗法、和/或全腹和盆腔放射治疗。关于放射疗法的一般概述,参见Hellman,第 16章:Principles of CancerManagement:Radiation Therapy,第6版,2001,DeVita et al., eds.,J.B.LippencottCompany,Philadelphia。放射疗法可以作为体外射束放射或远距离治疗进行施用,其中,所述辐射来自远程源。所述放射治疗还可以作为内部治疗或短程治疗进行施用,其中放射源放置在靠近癌细胞或肿瘤块的体内。还包括使用光动力疗法,其包括施用光敏剂如血卟啉及其衍生物、维替泊芬(BPD-MA)、酞菁、光敏剂Pc4、去甲氧基-竹红菌素A;和2BA-2-DMHA。
类似地,免疫细胞功能或数量的非遗传性消融可以通过用诸如白消安或氮芥的放射性模拟药物治疗来实现。其他免疫细胞的细胞减少药物还包括环磷酰胺、异环磷酰胺、依托泊苷、阿糖胞苷、卡铂和其他化学治疗剂(Montillo et al. (2004)Leukemia 18:57-62;Dasgupta et al.(1996)J.Infusional Chemother.6:12;和 Wright et al.(2001)Blood97:2278-2285)。其他类型的细胞减少药物包括但不限于选自以下化合物组的药物:铂化合物、细胞毒性抗生素、抗代谢物、抗有丝分裂剂、烷化剂、砷化合物、DNA拓扑异构酶抑制剂、紫杉烷类、核苷类似物、植物生物碱和毒素;及其合成衍生物。示例性化合物包括但不限于烷化剂:顺铂、曲奥舒凡和曲磷胺;植物生物碱:长春碱,紫杉醇,多西紫杉醇;DNA拓扑异构酶抑制剂:替尼泊苷,克立那醇(crisnatol)和丝裂霉素;抗叶酸剂:甲氨蝶呤,霉酚酸和羟基脲;嘧啶类似物:5-氟尿嘧啶,去氧氟尿苷和胞嘧啶阿拉伯糖苷;嘌呤类似物:巯嘌呤和硫鸟嘌呤;DNA抗代谢物:2′-脱氧-5-氟尿苷,蚜肠霉素甘氨酸(aphidicolin glycinate) 和吡唑并咪唑;以及抗有丝分裂剂:软海绵素,秋水仙碱和根瘤毒素。还可以使用包含一种或多种化学治疗剂(例如,FLAG,CHOP)的组合物。FLAG包含氟达拉滨、胞嘧啶阿拉伯糖苷(Ara-C)和G-CSF。CHOP包括环磷酰胺、长春新碱、多柔比星和泼尼松。在另一个实施方案中,使用PARP(例如,PARP-1和/或PARP-2)抑制剂,并且此类抑制剂是本领域熟知的(例如,Olaparib,ABT-888,BSI-201,BGP-15(N-Gene Research Laboratories,Inc.);INO-1001(Inotek Pharmaceuticals Inc.);PJ34(Soriano et al.,2001;Pacher et al.,2002b);3-氨基苯甲酰胺(Trevigen);4-氨基-1,8-萘二甲酰亚胺(Trevigen);6(5H)-菲啶酮(Trevigen);苯甲酰胺(美国专利Re.36,397) 和NU1025(Bowman et al.))。作用机制通常与PARP抑制剂结合PARP并降低其活性的能力有关。PARP催化β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)转化为烟酰胺和聚 -ADP-核糖(PAR)。聚(ADP-核糖)和PARP都与转录、细胞增殖、基因组稳定性和致癌作用的调节有关(Bouchard V.J.et.al.Experimental Hematology,第31卷,第6 期,2003年6月,pp.446-454(9);Herceg Z.;Wang Z.-Q.Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis,第477卷,第1期,2001年6月2日,pp. 97-110(14))。聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP1)是修复DNA单链断裂(SSB)的关键分子(de Murcia J.et al.1997.Proc Natl Acad Sci USA 94:7303-7307;Schreiber V,Dantzer F,Ame J C,de Murcia G(2006)Nat Rev Mol Cell Biol 7:517-528;WangZ Q,etal.(1997)Genes Dev11:2347-2358)。通过抑制PARP1功能敲除SSB的修复能诱导 DNA双链断裂(DSB),其可以在具有缺陷性同源引导的DSB修复的癌细胞中触发合成致死性(BryantH E,et al.(2005)Nature 434:913-917;Farmer H,et al.(2005) Nature 434:917-921)。
免疫细胞功能或数量的非遗传性消融可以通过以下方式实现:用诸如抗体的试剂处理,以消耗免疫系统介导的细胞群;或用优先消耗免疫系统介导的细胞群的试剂处理(参见,例如,Hayakawa et al.(2009)Stem Cells 27:175-182)。例如,抗CD4和抗 CD8抗体可分别用于中和和/或消耗CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。同样地,抗CD3 抗体可用于消耗所有T细胞,抗B220和/或抗CD19抗体可用于消耗所有B细胞,抗CD11b抗体可用于消耗巨噬细胞,抗Ly-6G(Gr-1)抗体可用于消耗单核细胞和粒细胞,以及抗-NK1.1抗体可用于消耗天然杀伤(NK)细胞。
用于证实一种或多种免疫细胞类型或功能的免疫功能不全的实验也是本领域熟知的。通常通过将细胞暴露于允许细胞发育成各种终末分化细胞的条件下来确定所述细胞的分化潜能,从而确定免疫细胞群的存在与否。这些条件通常包括使培养基中包含细胞因子和生长因子的混合物,所述混合物允许骨髓或淋巴谱系的发育。菌落形成培养实验依赖于通过有限的稀释在体外培养细胞,并评价由其持续发育产生的细胞类型。这种类型的常见实验是基于补充有细胞因子的甲基纤维素培养基的(例如, MethoCult,Stem CellTechnologies,Vancouver,Canada and Kennedy et al. (1997)Nature 386:488-493)。允许在造血途径中分化的细胞因子和生长因子制剂描述于Manz et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:11872-11877;美国专利号 6,465,249;和Akashi et al.,Nature 404:193-197中。细胞因子包括SCF、FLT-3配体、 GM-CSF、IL-3、TPO和EPO。另一种体外实验是长期培养起始细胞(LTC-IC)实验,其通常使用基质细胞来支持造血功能(参见,例如,Ploemache et al.(1989) Blood 74:2755-2763 and Sutherland et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:3745)。
适用于确定受试者免疫功能不全的状态的另一种类型的实验依赖于将细胞体内施用到宿主动物中并评估造血系统的再增殖。接受方是免疫受损或免疫缺陷的,以限制排斥反应并允许接受同种异体或异种细胞移植。这种有用的动物系统是NOD/SCID (Pflumioet al.(1996)Blood 88:3731;Szilvassym et al.(2002)“Hematopoietic Stem CellProtocol”in Methods in Molecular Medicine,Humana Press;Greiner et al. (1998)Stem Cells 16:166-177;Piacibello et al.(1999)Blood 93:3736-3749)或Rag2缺陷型小鼠(Shinkai et al.(1992)Cell 68:855-867)。以下述方式评价源自输注细胞的细胞:从宿主动物的骨髓、脾或血液中回收细胞,并通常通过FACS分析确定表现特定细胞标志物(即标志物表型)的细胞的存在。检测对移植细胞特异性的标志物可以区分内源细胞和移植细胞。例如,当人细胞被移植到合适的免疫缺陷小鼠中时,特异性针对人类细胞标志物(例如,HLA抗原)的抗体能识别所述人细胞。
本发明所述方法可用于防止或逆转T细胞耗竭、治疗免疫障碍、和/或确定对本文所述的基因改造T细胞的相同施用的应答性。可以通过下调免疫细胞应答、通过诱导免疫细胞中的特异性无应答性、或同时通过前两者来抑制活化的免疫细胞的功能。
例如,本发明所述方法可用于诱导针对特定抗原的耐受性,其通过将抗原与这些方法的治疗组合物共同施用来进行。可以针对特定蛋白质诱导出耐受性。在一个实施方案中,可以抑制对过敏原(例如食物过敏原)或对外来蛋白的免疫应答,其中对所述外来蛋白的免疫应答是不想要的。例如,接受因子VIII的患者经常产生针对该凝血因子的抗体。在本发明所述方法中共同施用重组型因子VIII(或通过物理性地连接因子VIII,如通过交联)可导致免疫应答的下调。以类似的方式,可以诱导出减少的克隆缺失和/或增加的耗竭(例如,T细胞耗竭)。
根据本发明,下调免疫应答对于治疗许多其他“免疫障碍”是有用的,包括但不限于在组织、皮肤和其他实体器官移植的情形中,例如肾、肝、心脏和血管化复合同种异体移植的移植物;在造血干细胞移植排斥反应的情形中,如移植物抗宿主病 (GVHD);在自身免疫性疾病的情形中,如系统性红斑狼疮、多发性硬化、过敏、移植、超敏反应;,在需要增加CD4+ T细胞的产生或功能的障碍的情形中;在需要提高疫苗接种效率的疾病的情形中,以及在需要增加调节性T细胞的产生或功能的障碍的情形中。例如,免疫细胞功能的阻断导致在组织移植时组织破坏的减少。通常,在组织移植物中,对移植物的排斥是通过免疫细胞将该移植物识别为外来物开始的,然后是破坏所述移植物的免疫应答。在移植之前或移植时施用本文所述的试剂可促进抑制信号的产生。此外,抑制作用也可足以使免疫细胞无应答化,从而诱导受试者的耐受性。长期耐受性的诱导避免了重复施用这些封闭试剂的必要。
免疫应答的下调也可用于治疗自身免疫疾病,例如1型糖尿病(T1D)和多发性硬化。许多自身免疫障碍是免疫细胞的不当活化导致的,所述不当活化的免疫细胞对自身组织具有反应性并且促进细胞因子和自身抗体的产生,所述细胞因子和抗体与疾病病理有关。防止自身反应性免疫细胞的活化可以减少或消除疾病症状。本文所述试剂的施用有助于防止产生可能与疾病过程有关的自身抗体或细胞因子。另外,本发明所述方法可以诱导出自身反应性免疫细胞的抗原特异性耐受,这可以导致疾病的长期缓解。试剂在防止或减轻自身免疫障碍中的功效可以通过使用许多充分表征人自身免疫疾病的动物模型来确定。实例包括鼠实验性自身免疫性脑炎、MRL/lpr/lpr小鼠或 NZB杂交小鼠中的系统性红斑狼疮、鼠自身免疫胶原关节炎、NOD小鼠和BB大鼠中的糖尿病、以及鼠实验性重症肌无力(参见,例如,Paul ed.,Fundamental Immunology, Raven Press,New York,第三版1993,第30章)。
在治疗方面,抑制免疫细胞的活化有助于,例如,通过抑制IgE的产生来治疗过敏和过敏反应。过敏反应在性质上可以是全身性或局部性的,这取决于过敏原的进入途径和IgE在肥大细胞或嗜碱性粒细胞上的沉积模式。因此,可根据本发明所述的方法,局部或全身性地抑制免疫细胞介导的过敏反应(例如,对食物的过敏反应)。在一个实施方案中,所述过敏是过敏性哮喘。
在治疗方面,免疫细胞活化的抑制在免疫细胞的寄生和病毒感染中也可能很重要。例如,在获得性免疫缺陷综合征(AIDS)中,通过免疫细胞的活化刺激病毒复制。调节这些相互作用可导致病毒复制的抑制,从而改善AIDS的病程。调节这些相互作用也有助于促进妊娠的维持。由于胚胎或胎儿的免疫排斥反应而处于自然流产风险的女性(例如,先前曾经自然流产过的女性或有过怀孕困难的女性)可以用调节这些相互作用的试剂治疗。
根据本发明所述的方法,下调免疫应答也可用于治疗自体组织的自身免疫攻击。因此,调节由自身免疫攻击加剧的病症,例如自身免疫障碍,以及诸如心脏病、心肌梗塞和动脉粥样硬化的病症,是在本发明的范围内的。
在优选的实施方案中,所述免疫障碍是移植物抗宿主病(例如,慢性GVHD)。对于许多患有血液系统恶性肿瘤的患者,同种异体造血干细胞移植(HSCT)提供了唯一的治愈机会。不幸的是,仍存在重大阻碍,最明显的是疾病复发和GVHD。经历了HSCT的患者中,超过40%的患者发生复发,而超过50%的患者会发展成为cGVHD, cGVHD是一种使人衰弱的疾病,其具有与相当高的发病率和死亡率相关的多系统免疫表现(Kahl et al.(2007)Blood110:2744-2748;Perez-Simon et al.(2008)Biol.Blood Marrow Transplant.14:1163-1171)。虽然儿科人群的发病率较低,但cGVHD仍然是通过同种异体HSCT治疗恶性疾病后非复发性发病率和死亡率的主要原因,在HSCT 后存活超过100天的儿童中,其发生概率为20%-50%(Baird et al.t2010)Pediatr.Clin. North Am.57:297-322)。供体细胞介导的免疫应答是产生GVL和GVHD反应的主要原因。新植入的供体免疫系统对残留的肿瘤细胞的识别和破坏不足,可使患者的恶性肿瘤复发,而对宿主抗原的不受控制的反应导致GVHD(Antin(1993)Blood 82:2273-2277;Ferrara et al.(2009)Lancet 373:1550-1561)。慢性GVHD的发病机制涉及炎性T细胞和B细胞对同种异体(供体/受体多态性的)和自体(供体/受体非多态性的)抗原的应答,并且它仍然是同种异体HSCT后的常见问题和主要治疗挑战,同时,长期存活者往往要经历生活质量受损和晚期死亡率增加(Subramaniam et al. (2007)Leukemia 21:853-859)。越来越多地使用动员的外周血祖细胞而非骨髓作为 HCT干细胞的来源,已经导致cGVHD发病率的明显增加(Cutler et al.(2001)J.Clin. Oncol.19:3685-3691;Lee et al.(2007)Blood 110:4576-4583)。随着同种异体HSCT 越来越多地用于非恶性适应症(如镰状细胞性贫血、免疫缺陷和先天性代谢疾病),儿科患者中cGVHD的发病率预计会上升。在成人和儿童中,与cGVHD相关的炎性或纤维化变化最常涉及皮肤、眼睛、口腔、肝脏和呼吸道。可以在任何过继性细胞疗法(例如干细胞疗法、器官移植等)之前下调PD-1的表达和/或抑制。
与此同时,本发明还提供了用于提升免疫应答的方法,例如通过防止或逆转T细胞耗竭。上调免疫应答的试剂可以增强现有免疫应答或引发初始免疫应答。因此,使用本发明所述组合物和方法能增强免疫应答,其有助于治疗癌症,同时也有助于治疗感染性疾病(例如细菌、病毒或寄生虫)、寄生虫感染和免疫抑制疾病。
示例性的感染性疾病包括病毒性皮肤病,例如疱疹或带状疱疹,在这种情况下,前述试剂可以局部递送至皮肤。此外,通过全身施用这些试剂可以减轻全身性病毒性疾病如流感、普通感冒和脑炎。在一个优选的实施方案中,本文所述的上调免疫应答的试剂有助于在克氏锥虫感染期间调节精氨酸酶/iNOS的平衡,以促进针对寄生虫的保护性免疫应答。
还可以通过离体的方法(例如,通过从患者中移除免疫细胞),在体外使免疫细胞与本文所述的试剂接触,并将所述体外刺激的免疫细胞重新引入患者体内,使得所述感染的患者增强免疫应答。
b.试剂的施用
如上所述,本发明所述调节方法涉及通过调节基因组区域对T细胞进行遗传改造,以调节所述T细胞中至少一个基因的表达,其中所述基因组区域选择性地在耗竭性CD8+ T细胞的基因组内是染色质可接近的,并且所述基因组区域调节所述至少一个基因的表达。改造的T细胞可以在体外或者以离体的方式进行分析(即,从受试者中分离出来并在所述受试者的体外以最小的操作进行操纵,所述最小的操作被设计为尽可能多地保持体内质量,可以只进行这一步或者将所述被操作的细胞施用回所述受试者)。或者,可将所述改造的T细胞施用于上述受试者,以调节T细胞耗竭和/或治疗免疫障碍。
改造的T细胞将与受试者宿主具有免疫相容性关系,并且根据本发明考虑使用任何这样的关系。例如,Treg和/或Teff可以是同源的。术语“同源的”可以指这样的状态:衍生自、起源于遗传相同的相同物种,或者是所述相同物种的成员,特别地在抗原或免疫反应方面更是如此。这些包括具有匹配的MHC类型的全等双生。因此,“同源移植”是指细胞从供体转移到受体,所述受体与所述供体是遗传等同的,或者具有足够的免疫相容性以允许在移植的同时没有不想要的不良免疫原性应答(例如,能阻碍解释本文所述的免疫筛选结果的不良免疫原性应答)。
如果转移的细胞的来源以及移植进的是同一个受试者,则该同源移植可以是“自体的”。“自体移植”是指收获以及再输注或移植受试者自身的细胞或器官。自体细胞的排他性使用或补充使用可消除或减少将细胞施用回宿主的许多不利影响,特别是移植物抗宿主反应。
如果转移的细胞的来源以及移植进的是相同物种的不同成员,但仍具有足够匹配的主要组织相容性复合物(MHC)抗原以避免不利的免疫原性应答,则该同源移植可以是“同种异体匹配的”。确定MHC错配的程度可以根据本领域已知的和使用的标准测试来完成。例如,人类中至少有六种主要类别的MHC基因在移植生物学中被认为是重要的。HLA-A、HLA-B、HLA-C编码HLA I类蛋白,而HLA-DR、HLA-DQ 和HLA-DP编码HLA II类蛋白。如在人群中发现的众多HLA等位基因或变体所体现的,这些组中每一组内的基因是高度多态性的,并且个体间在这些组之间的差异与针对移植细胞的免疫应答的强度相关。用于确定MHC匹配程度的标准方法可用于检查 HLA-B和HLA-DR内的、或HLA-A,HLA-B和HLA-DR组内的等位基因。因此,可以分别在两个或三个HLA组内测试至少4种,甚至5种或6种MHC抗原。在血清学 MHC测试中,将针对每种HLA抗原类型的抗体与来自一个受试者(例如,供体)的细胞反应,以确定能与所述抗体反应的某些MHC抗原是否存在或不存在。将其与其他受试者(例如,受体)的反应性特征进行比较。通常,通过将抗体与细胞一起孵育,然后加入补体以诱导细胞裂解(即淋巴细胞毒性试验)来确定抗体与MHC抗原的反应。可根据反应中裂解的细胞量来检查所述反应并对其进行分级(参见,例如, Mickelson and Petersdorf(1999)HematopoieticCell Transplantation,Thomas,E.D.et al. eds.,pg 28-37,Blackwell Scientific,Malden,Mass.)。其他基于细胞的实验包括使用标记抗体的流式细胞术或酶联免疫测定(ELISA)。用于确定MHC类型的分子方法是众所周知的,并且通常使用合成探针和/或引物来检测编码HLA蛋白的特定基因序列。合成的寡核苷酸可用作杂交探针来检测与特定HLA类型相关的限制性片段长度多态性(Vaughn(2002)Method.Mol.Biol.MHC Protocol.210:45-60)。或者,可用引物来扩增HLA序列(例如,通过聚合酶链反应或连接链反应),其产物可通过直接的DNA 测序、限制性片段多态性分析(RFLP)或与一系列序列特异性寡核苷酸引物(SSOP) 杂交来进行进一步检测(Petersdorf et al.(1998)Blood 92:3515-3520;Morishima et al. (2002)Blood 99:4200-4206;and Middleton and Williams(2002)Method.Mol.Biol.MHC Protocol.210:67-112)。
如果转移的细胞和受试者的细胞在限定的基因座(例如单个基因座)上不同,通常出于近亲繁殖,则同源移植可以是“同类的”。术语“同类的”是指衍生自、起源于同一物种或是同一物种的成员,其中所述成员在遗传上是相同的,但是在小遗传区域上除外,所述小遗传区域通常是单个遗传基因座(即单个基因)。“同类移植”是指将来自供体的细胞或器官转移到接受方中,其中所述接受方在遗传上与所述供体相同,但在单个遗传基因座上除外。例如,CD45以几种等位基因形式存在,并且存在同类小鼠品系,其中所述小鼠品系在是否表达CD45.1或CD45.2等位基因形式方面有所不同。
相反,“错配的同种异体”是指衍生自、起源于具有不同的主要组织相容性复合物(MHC)抗原(即蛋白质)的相同物种,或是所述相同物种的成员,其能足以引发不利的免疫原性反应,所述不同的主要组织相容性复合物(MHC)抗原通常通过本领域中使用的标准实验确定,例如用血清学或分子方法分析确定数量的MHC抗原。“部分错配”是指所测MHC抗原在成员之间(通常为供体和接受方之间)的部分匹配。例如,“半错配”是指50%的MHC抗原被测定为在两个成员之间显示为不同的MHC 抗原类型。“全部”或“完全”错配是指所有MHC抗原被测定为在两个成员之间是不同的。
类似地,相比之下,“异种的”是指衍生自、起源于或者是不同物种的成员,所述不同物种例如人和啮齿动物、人和猪、人和黑猩猩等。“异种移植”是指将来自供体的细胞或器官转移到接受方,其中所述接受方是与所述供体不同的物种。
对于基于细胞的试剂,改造的T细胞可以以0.1x106、0.2x106、0.3x106、0.4x 106、0.5x106、0.6x106、0.7x106、0.8x106、0.9x106、1.0x106、5.0x106、1.0x 107、5.0x107、1.0x108、5.0x108个细胞/千克受试者体重,或更多,或其间的任何范围或其间的任何值来施用。可以基于给定的时间内所需的植入水平来调整移植细胞的数量。通常,可以移植1×105到约1×109个细胞/kg体重、约1×106到约1×108个细胞/kg体重、或约1×107个细胞/kg体重、或必要时更多的细胞。在一些实施方案中,相对于平均大小的小鼠,移植至少约0.1x106、0.5x106、1.0×106、2.0×106、3.0×106、4.0×106、或5.0×106个细胞是有效的。
可以组合并施用两种或更多种细胞类型,例如遗传改造的T细胞和干细胞的过继性细胞转移、遗传改造的T细胞和常规Treg、遗传改造的T细胞和基于细胞的疫苗、遗传改造的T细胞与CAR-T细胞组合等。例如,基于过继细胞的免疫疗法可以与遗传改造的T细胞组合。熟知的基于过继细胞的免疫治疗方式包括但不限于,辐射过的自体或同种异体肿瘤细胞、肿瘤裂解物或凋亡的肿瘤细胞、基于抗原呈递细胞的免疫疗法、基于树突状细胞的免疫疗法、过继性T细胞转移、过继性CAR-T细胞疗法、自体免疫增强疗法(AIET)、癌症疫苗和/或抗原呈递细胞。可以将这种基于细胞的免疫疗法进一步修饰成能表达一种或多种基因产物,从而进一步调节免疫应答,例如表达细胞因子如GM-CSF;和/或表达肿瘤相关抗原(TAA)抗原如Mage-1、gp-100 等。遗传改造的T细胞与其他细胞类型的比例可以是1∶1,但可以调节成任何所需的量(例如,1∶1、1.1∶1、1.2∶1、1.3∶1、1.4∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1、4∶1、4.5∶1、 5∶1、5.5∶1、6∶1、6.5∶1、7∶1、7.5∶1、8∶1、8.5∶1、9∶1、9.5∶1、10∶1或更高)。
移植细胞的植入可以通过各种方法中的任何一种来评估,例如但不限于,肿瘤体积、细胞因子水平、施用时间、在移植后的一个或多个时间点从受试者处获得的目的细胞的流式细胞术分析等。例如,基于时间的分析,等待1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28天或可以指示肿瘤收集的时间。任何这种度量都是可以根据众所周知的参数进行调整的变量,以便确定所述变量对抗免疫障碍疗法的应答的效应。另外,移植的细胞可以与其他试剂共移植,例如细胞因子、细胞外基质、细胞培养支持物等。
此外,本发明所述免疫调节剂可以以适于药物施用的生物相容形式施用于受试者,或者通过其他方式施用于受试者的体外,以调节免疫细胞介导的免疫应答。“适于体内施用的生物相容形式”是指待施用的形式,其中治疗效果超过任何毒性作用。术语“受试者”应包括可以引发出免疫应答的活生物体,例如哺乳动物。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。如本文所述的试剂的施用,其可以是以任何药理学形式进行的,包括单独的治疗活性量的试剂或药学上可接受的运载体组合。
施用治疗活性量的本发明所述治疗组合物被定义为:在必要的剂量和时间段内有效实现所需结果的量。例如,试剂的治疗活性量可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及肽在所述个体中引发所需反应的能力等因素而变化。可以调整剂量方案以提供最佳治疗应答。例如,可以每天施用几个分开的剂量,或者可以按照治疗情况的危急程度按比例减少剂量。
组合剂型或同时施用单一试剂可使患者体内同时存在有效量的每种所需调节剂。
可以使用本领域公知的方法完成施用。可通过直接注射或通过本领域中使用的任何其他手段将包括细胞在内的试剂引入所需部位,包括但不限于血管内、脑内、肠胃外、腹膜内、静脉内、硬膜外、脊柱内、胸骨内、关节内、滑膜内、鞘内、动脉内、心内或肌内施用。例如,目的受试者可以通过各种途径植入移植的细胞。这些途径包括但不限于静脉内施用、皮下施用、施用到特定的组织(如局部移植)、注射到股骨骨髓腔中、注射到脾脏中、施用到胎肝的肾囊下等。细胞可以以一次输注进行施用,或者在足以产生所需效果的限定时间段内通过连续输注进行施用。用于移植、移植物评估和移植细胞的标志物表型分析的示例性方法是本领域熟知的(参见,例如,Pearson et al.(2008)Curr.Protoc.Immunol.81:15.21.1-15.21.21;Ito et al.(2002)Blood 100:3175-3182;Traggiai et al.(2004)Science 304:104-107;Ishikawa et al.Blood(2005) 106:1565-1573;Shultz et al.(2005)J.Immunol.174:6477-6489;和Holyoake et al.(1999) Exp.Hematol.27:1418-1427)。
例如,可以以便捷的方式施用本文所述的治疗剂,例如通过注射(皮下注射、静脉内注射等)、口服施用、吸入、透皮施用或直肠施用。根据施用途径,可以将活性化合物包被在材料中以保护所述化合物免于酶、酸和其它可能使所述化合物失活的天然条件的作用。例如,对于试剂的施用,除了肠胃外施用,所述施用可能需要用材料包被试剂,或试剂与材料共同施用,以防止试剂失活。
可以将试剂放在合适的运载体、稀释剂或佐剂中施用给个体,与酶抑制剂共同施用,或在合适的载体如脂质体中施用。药学上可接受的稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。佐剂以其最广泛的含义使用,包括任何免疫刺激化合物如干扰素。本文考虑的佐剂包括间苯二酚、非离子表面活性剂(如聚氧乙烯油基醚)和正十六烷基聚乙烯醚。酶抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸盐(DEEP)和抑肽酶。脂质体包括水包油包水乳剂以及常规脂质体(Sterna et al.(1984)J.Neuroimmunol.7:27)。
试剂还可以以肠胃外或腹膜内的方式施用。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中,以及在油中制备分散体。在常规的储存和使用条件下,这些制剂可含有防腐剂以防止微生物的生长。
试剂的适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性的)或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下,组合物优选是无菌的并且必须是流动的,其程度为能够易于注射。优选地,所述组合物在制造和储存条件下是稳定的,并且在防止微生物(如细菌和真菌)污染作用的条件下保存。运载体可以是溶剂或分散介质,其含有例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、及其合适的混合物。例如,可以通过使用诸如卵磷脂的涂层、通过在分散的情况下保持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂,例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下,优选在组合物中包含等渗剂,例如糖、多元醇(如甘露醇)、山梨糖醇,氯化钠。可以通过在所述组合物中包括能延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶,来实现可注射组合物的延长吸收。
可以通过以下方式制备无菌可注射溶液:将遗传改造的T细胞和/或本发明所述的其他试剂(例如抗体、肽、融合蛋白或小分子)以所需的量掺入适当的溶剂中,所述溶剂可以根据需要具有上面列举的成分中的一种或某些组合,然后过滤灭菌。通常,通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散体,所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自上面列举的成分中的所需的其他成分。对于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末,优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥,其产生试剂粉末以及来自其先前无菌过滤溶液的任何其他所需成分。
当如上所述适当地保护了试剂时,蛋白质可以以口服的形式施用,例如,用惰性稀释剂或可吸收的食用运载体。本文使用的“药学上可接受的运载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。将这些介质和试剂用于药物活性物质在本领域中是熟知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容,否则考虑将其用于治疗组合物中。补充的活性化合物也可以掺入到组合物中。
特别有利的是,以剂量单位的形式配制肠胃外组合物以便于剂量的施用和均匀化。本文使用的“剂量单位形式”是指物理上离散的单位,其适合用作待治疗哺乳动物受试者的单位剂量;每个单元都含有预定量的活性化合物,其经计算可与所需的药物运载体一起产生所需的治疗效应。本发明所述剂量单位形式的说明取决于并且直接依赖于:(a)活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果,和(b)本领域中,复合这种活性化合物以用于治疗个体的敏感性所固有的局限性。
在一个实施方案中,本发明所述治疗剂是抗体。如本文所定义的,抗体的治疗有效量(即有效剂量)的范围为约0.001至30mg/kg体重,优选约0.01至25mg/kg体重,更优选约0.1至20mg/kg体重,甚至更优选约1至10mg/kg、2至9mg/kg、3至 8mg/kg、4至7mg/kg、或5至6mg/kg体重。技术人员应理解,某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量,包括但不限于疾病或障碍的严重程度、先前的治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄、以及存在的其他疾病。此外,用治疗有效量的抗体治疗受试者可以包括单次治疗,或者优选地,可以包括一系列治疗。在优选的实例中,用约0.1至20mg/kg体重范围的抗体治疗受试者,每周一次,持续约1至10周之间,优选2至8周之间,更优选约3至约7周之间,甚至更优选约4周、5周或6周。还应理解,用于治疗的抗体的有效剂量可在特定治疗过程中增加或减少。剂量的变化可能是由诊断测定的结果引起的。在一些实施方案中,可以在开始施用后的1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天内产生治疗功效,并可直接或间接地测量所述治疗的功效。
在一些实施方案中,生物标志物核酸分子是有用的并且可以被插入载体中用作基因治疗载体。基因治疗载体可以通过,例如,静脉内注射、局部施用(参见美国专利号5,328,470)或通过立体定位注射(参见,例如,Chen et al.(1994)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 91:3054 3057)递送给受试者。基因治疗载体的药物制剂可以包括存在于可接受的稀释剂中的基因治疗载体,或者可以包含嵌入有基因递送载体的缓释基质。或者,当可以从重组细胞中完好地产生完整的基因递送载体(例如逆转录病毒载体)时,药物制剂可以包括一种或多种产生所述基因递送系统的细胞。
用于将多核苷酸引入哺乳动物(人或非人)或其细胞的任何方法都可以适用于本发明实践,所述方法将本发明所述的各种构建体递送到预期的接受者中。在本发明的一个实施方案中,通过转染将所述DNA构建体递送至细胞,即通过递送“裸露的”DNA或与胶体分散系统形成复合物进行递送。胶体系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠子和基于脂质的系统,所述基于脂质的系统包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。本发明优选的胶体系统是脂质复合的或脂质体配制的DNA。在前一种方法中,在配制DNA(例如,用脂质配制)之前,可以首先对质粒的表达进行实验优化(例如,在5′非翻译区包含内含子并消除不必要的序列(Felgner,et al.,Ann NY Acad Sci 126-139,1995)),所述质粒含有具有所需DNA构建体的转基因。然后可以使用已知的方法和材料实现DNA的制剂(例如用各种脂质或脂质体材料制备),并将其递送给受体哺乳动物。参见,例如,Canonico et al,Am J RespirCell Mol Biol 10:24-29,1994;Tsan et al,Am J Physiol 268;Alton et al.,NatGenet.5:135-142,1993 和由Carson等人拥有的美国专利号5,679,647。
可以基于解剖学和机械因素对脂质体的靶向进行分类。解剖学分类是基于选择性水平的,例如器官特异性、细胞特异性和细胞器特异性。机械性靶向可以基于它是被动还是主动来区分。被动靶向利用脂质体分布到器官中网状内皮系统(RES)细胞中的自然趋势,所述器官包含窦状毛细血管。另一方面,主动靶向涉及通过将脂质体偶联至特定配体(例如单克隆抗体、糖、糖脂或蛋白质)或通过改变脂质体的组成或大小来改变脂质体,以实现靶向器官和细胞类型而不是靶向天然存在的定位位点。
可以以各种方式修饰靶向递送系统的表面。对于脂质体靶向递送系统,可以将脂质基团可以掺入脂质体的脂双层中,以保持靶向性配体与脂质体双层的稳定结合。各种连接基团可用于将脂质链连接至靶向性配体。裸露的DNA或与递送媒介物(如脂质体)相关联的DNA,可以施用于受试者的几个部位(见下文)。
可以以任何期望的载体递送核酸。这些载体包括病毒或非病毒载体(包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体和质粒载体)。示例性的病毒类型包括HSV(单纯疱疹病毒)、AAV(腺相关病毒)、HIV(人免疫缺陷病毒)、 BIV(牛免疫缺陷病毒)和MLV(鼠白血病病毒)。核酸可以以能提供足够有效的递送水平的任何所需的形式施用,包括在病毒颗粒中、在脂质体中、在纳米颗粒中以及与聚合物复合的形式。
编码蛋白质的核酸或目的核酸可以是在质粒或病毒载体中,或在本领域已知的其他载体中。这些载体是众所周知的,可以根据具体应用选择任何载体。在本发明的一个实施方案中,所述基因递送媒介物包含启动子和去甲基酶编码序列。优选的启动子是组织特异性启动子和通过细胞增殖活化的启动子,例如胸苷激酶和胸苷酸合成酶启动子。其它优选的启动子包括可通过病毒感染激活的启动子,例如α-和β-干扰素启动子,以及可被激素如雌激素激活的启动子。可以使用的其他启动子包括Moloney病毒 LTR、CMV启动子和小鼠白蛋白启动子。启动子可以是组成型或诱导型的。
在另一个实施方案中,如WO90/11092和美国专利5,580,859中所述,将裸露的多核苷酸分子用作基因递送媒介物。这种基因递送媒介物可以是生长因子DNA或 RNA,并且在某些实施方案中,与杀死的腺病毒连接。Curiel et al.,Hum.Gene.Ther. 3:147-154,1992。可任选使用的其他媒介物包括DNA-配体(Wu et al.,J.Biol.Chem. 264:16985-16987,1989)、脂质-DNA组合物(Felgner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413 7417,1989)、脂质体(Wang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.84:7851-7855,1987) 和微粒(Williams et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.88:2726-2730,1991)。
基因递送媒介物可任选地包含病毒序列,例如病毒复制起点或包装信号。这些病毒序列可选自例如星状病毒、冠状病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒、细小病毒、小核糖核酸病毒、痘病毒、逆转录病毒、披膜病毒或腺病毒。在优选的实施方案中,所述生长因子基因递送媒介物是重组的逆转录病毒载体。重组的逆转录病毒及其各种用途已在许多参考文献中有描述,包括,例如,Mann et al.,Cell 33:153,1983,Cane and Mulligan,Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 81:6349,1984,Miller et al.,Human Gene Therapy 1:5-14,1990,美国专利号4,405,712、4,861,719和4,980,289,以及PCT申请号WO89/02,468、WO89/05,349和WO90/02,806。许多逆转录病毒基因递送媒介物都可用于本发明,包括例如以下描述的媒介物:EP0,415,731;WO90/07936; WO94/03622;WO93/25698;WO93/25234;美国专利号5,219,740;WO9311230; WO9310218;Vile和Hart,Cancer Res.53:3860-3864,1993;Vile和Hart,Cancer Res. 53:962-967,1993;Ram et al.,Cancer Res.53:83-88,1993;Takamiya et al.,J.Neurosci. Res.33:493-503,1992;Baba et al.,J.Neurosurg.79:729-735,1993(美国专利号 4,777,127、GB2200651,EP0345242和WO91/02805)。
可用于递送本发明所述多核苷酸的其他病毒载体系统衍生自:疱疹病毒,例如单纯疱疹病毒(Woo等人的美国专利号5,631,236,1997年5月20日,以及Neurovex的 WO00/08191);牛痘病毒(Ridgeway(1988)Ridgeway,“Mammalian expression vectors,” In:Rodriguez R L,Denhardt D T,ed.Vectors:A survey of molecular cloning vectorsand their uses.Stoneham:Butterworth;Baichwal and Sugden(1986)“Vectors forgene transfer derived from animal DNA viruses:Transient and stable expressionof transferred genes,” In:Kucherlapati R,ed.Gene transfer.New York:PlenumPress;Coupar et al.(1988)Gene,68:1-10);以及几种RNA病毒。优选的病毒包括甲病毒、痘病毒、沙粒病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒等。它们为各种哺乳动物细胞提供了几种有利的特征 (Friedmann(1989)Science,244:1275-1281;Ridgeway,1988,同上;Baichwaland Sugden,1986,同上;Coupar et al.,1988;Horwich et al.(1990)J.Virol.,64:642-650)。
在其他实施方案中,重组的生物标志物多肽及其片段可以施用于受试者。在一些实施方案中,可以构建和施用具有增强的生物学特性的融合蛋白。此外,根据本领域熟知的药理学方法(例如聚乙二醇化、糖基化、寡聚化等)可以对所述生物标志物多肽及其片段进行修饰,以进一步增强所需的生物活性,例如提升生物利用度和减少蛋白水解性降解。
在生物标志物异常下调和/或在生物标志物活性增加可能具有有益效应的情况下,希望刺激生物标志物活性。同样地,在生物标志物异常上调和/或在生物标志物活性降低可能具有有益效应的情况下,希望抑制生物标志物活性。
此外,这些调节剂还可以与例如化学治疗剂、激素、抗血管生成剂、放射性标记的化合物,或与手术、冷冻疗法和/或放射疗法联合施用。前述治疗方法可以与其他形式的常规疗法(例如,技术人员熟知的免疫障碍的标准护理疗法)一起施用,可以与常规疗法连续施用、在其之前施用、或在其之后施用。例如,这些调节剂可以与治疗有效剂量的免疫抑制剂或疗法一起施用。
在另一个实施方案中,可以通过本文描述的方法下调所述免疫应答,以维持预先存在的耐受性、克隆缺失和/或耗竭(例如,T细胞耗竭)。例如,可以维持针对抗原 (例如自体抗原)的免疫应答,对于所述抗原,受试者不能产生显著的免疫应答。
在一个实施方案中,从受试者获得免疫细胞并在本文所述的试剂存在的条件下离体培养,以修饰Treg和/或去除或进一步去除增强免疫细胞活化的免疫细胞群。在进一步的实施方案中,所述过滤的免疫细胞随后被施用于受试者。由于可以通过例如向免疫细胞提供主要激活信号和共刺激信号在体外刺激所述免疫细胞,因此也可以使用各种试剂来减少效应免疫细胞的共刺激和减少其增殖,和/或促进抑制性调节性的免疫细胞。在一个实施方案中,根据PCT申请号WO94/29436中描述的方法离体培养免疫细胞。共刺激多肽可以是可溶的,附着于细胞膜,或附着于固体(如珠子)的表面。类似地,可以使用本领域已知的技术(例如交联或通过重组DNA技术)进一步将用于促进免疫细胞耗竭的试剂与毒素连接或可操作地连接。这些试剂可导致对所需细胞的细胞性破坏。在一个实施方案中,毒素可以与抗体如双特异性抗体缀合。此类抗体可用于,例如,通过使用仅在某种类型细胞上发现的标志物,靶向特定细胞群。免疫毒素的制备通常是本领域公知的(参见,例如,美国专利号4,340,535和EP44167)。已知的许多类型的含二硫键的接头,其可成功用于将毒素部分与多肽缀合。在一个实施方案中,优选含有在空间上“受阻”的二硫键的接头,因为它们在体内具有更高的稳定性,因此能在结合作用部位之前防止毒素部分的释放。已知的多种毒素可与本发明所述多肽或抗体缀合。实例包括:许多有用的来源于植物、真菌或甚至细菌的毒素,例如包括各种A链毒素(特别是蓖麻毒蛋白A链)、核糖体失活蛋白如皂草素或白树毒素、帚曲霉素(α-sarcin)、曲霉素、局限曲菌素、核糖核酸酶例如胎盘核糖核酸酶、血管生成素、白喉毒素和假单胞菌外毒素等。用于本发明的优选的毒素部分是经过处理以修饰或除去碳水化合物残基的毒素A链,即去糖基化的A链。(美国专利5,776,427)。将此类细胞毒性剂中的一种或组合(例如蓖麻毒素融合物)输注到患者体内可导致免疫细胞死亡。
在又一个实施方案中,可以在施用本文所述的试剂之前、同时或之后引入淋巴细胞清除步骤,来增强本文所述治疗方法的功效。例如,通过在淋巴细胞清除后或与其联合施用所述试剂,可以协同地增强这种施用的治疗作用。以各种形式和各种水平来实现淋巴细胞清除的方法是本领域公知的(参见,例如,美国专利7,138,144)。例如,术语“瞬时淋巴细胞清除”是指通常在免疫疗法之前对淋巴细胞和T细胞的破坏。这可以通过多种方式实现,包括“亚致死辐射”,其指的是施用一种或多种剂量的辐射,所述辐射通常对应用该施用的受试者群体的所有成员是非致命的。瞬时淋巴细胞清除通常不是清髓性的,如完全淋巴细胞清除中的情况,从而使得受试者的造血或免疫能力保持足够完整,以使被破坏的淋巴细胞和T细胞群再生。相反,当所述施用通常对受试者群体中的一些但不是所有成员致死时,发生“致死辐射”,并且当施用通常对受试者群体的所有成员致死时发生“超致死辐射”。
根据适用情况和目的,依照标准方案,例如通过辐射、用清髓剂治疗和/或用免疫抑制剂治疗的任何组合可以实现瞬时淋巴细胞清除或完全淋巴细胞清除。例如,生物学方法包括施用免疫抑制细胞或施用能够抑制免疫反应性的生物分子如Fas-配体和 CTLA4-Ig。骨髓清除剂的实例包括白消安(busulfan)、二甲基白消安(dimethyl mileran)、美法仑和硫噻吩。免疫抑制剂的实例包括泼尼松、甲基强的松龙(Methyl prednisolone)、硫唑嘌呤、环孢菌素A、环磷酰胺、氟达拉滨、CTLA4-Ig、抗T细胞抗体等。
关于辐射,亚致死剂量的辐射通常在1至7.5Gy全身辐射的范围内,致死剂量通常在7.5至9.5Gy全身辐射的范围内,超致死剂量在9.5至16.5Gy全身辐射的范围内。
根据目的和适用情况,辐射剂量可以作为单剂量或分次剂量施用。类似地,可以基本上专门针对身体部位或其一部分完成一个或多个辐射剂量的施用,以便基本上仅在所述身体部位或所述其部分中诱导骨髓减少或骨髓清除。如本领域所广泛认可的,受试者可以耐受对身体部位如肢体的亚致死调节性超高水平的选择性辐射,当用于全身辐射时,该水平构成致死或超致死性调节(参见,例如,Breitz(2002)Cancer Biother Radiopharm.17:119;Limit(1997)J.Nucl.Med.38:1374;和Dritschilo和Sherman(1981) Environ.HealthPerspect.39:59)。在治疗免疫疾病中,这种对身体部位或其部分的选择性辐射可有利地用于靶向特定的血液隔室,例如特定的组织或免疫细胞群。
C.用于调节T细胞耗竭和/或免疫紊乱的其他试剂和疗法
本文所述的基因改造的T细胞可以单独使用或与一种或多种其他的治疗剂组合使用。本文所述的调节剂(例如抗体、小分子、肽、融合蛋白或小核酸)可以掺入药物组合物中并在体内施用给受试者。所述组合物可含有单个此类分子或试剂或本文所述试剂的任意组合。根据本文提供的方法和组合物,本文所述的“单一活性剂”可与本领域已知的其他药理学活性化合物(“第二活性剂”)组合。一般认为,某些组合在治疗能受益于免疫应答调节的病症中起协同作用。第二活性剂可以是大分子(例如蛋白质)或小分子(例如合成的无机、有机金属或有机分子)。例如,抗PD-L1和抗 TIM-3抗体可以进一步与抗LAG-3,抗-PD-L2,抗-CTLA4等抗体或其组合物组合。
在某些情况下,可能需要进一步施用能上调免疫应答的其他试剂,例如,经由共刺激受体转导信号的其他B7家族成员的形式,以进一步增强免疫应答。这些其他试剂和疗法将在下面进一步描述。
上调免疫应答的试剂可以预防性地用于针对各种多肽(例如,源自病原体的多肽)的疫苗中。可以通过在合适的佐剂中用病毒蛋白质和上调免疫应答的试剂一起接种来诱导针对病原体(例如病毒)的免疫。
在另一个实施方案中,如本文所述的免疫应答功能的上调或增强可用于诱导肿瘤免疫。
在另一个实施方案中,可以通过本文描述的方法刺激所述免疫应答,从而克服预先存在的耐受性、克隆缺失和/或耗竭(例如,T细胞耗竭)。例如,对于受试者对抗原不能产生显著的免疫应答的,可以通过施用本文所述的上调免疫应答的合适的试剂来诱导受试者对该抗原(例如自体抗原如肿瘤特异性抗原)的免疫应答。在一个实施方案中,可以共同施用自体抗原,例如肿瘤特异性抗原。在另一个实施方案中,所述试剂可以用作佐剂以在主动免疫过程中增强对外来抗原的应答。
在一个实施方案中,从受试者获得免疫细胞并在存在本文所述试剂的条件下离体培养,以扩增免疫细胞群和/或增强免疫细胞活化。在进一步实施方案中,所述免疫细胞随后被施用于受试者。如本领域已知的,可以通过例如向免疫细胞提供主要激活信号和共刺激信号在体外刺激所述免疫细胞。也可以使用各种试剂来共刺激免疫细胞的增殖。在一个实施方案中,根据PCT申请号WO94/29436中描述的方法离体培养免疫细胞。共刺激多肽可以是可溶的,附着于细胞膜,或附着于固体如珠子的表面。
在又一个实施方案中,可以使用本领域已知的技术(例如交联或通过重组DNA 技术)进一步将本文所述的用于上调免疫应答的试剂与毒素连接或可操作地连接。这些试剂可导致对所需细胞的细胞性破坏。在一个实施方案中,毒素可以与抗体如双特异性抗体缀合。此类抗体可用于,例如,通过使用仅在某种类型细胞上发现的标志物,靶向特定的细胞群。免疫毒素的制备通常是本领域公知的(参见,例如,美国专利号 4,340,535和EP44167)。已知的许多类型的含二硫键的接头,其可成功用于将毒素部分与多肽缀合。在一个实施方案中,优选含有在空间上“受阻”的二硫键的接头,因为它们在体内具有更高的稳定性,因此能在结合作用部位之前防止毒素部分的释放。已知的多种毒素可与本发明所述多肽或抗体缀合。实例包括:许多有用的来源于植物、真菌或甚至细菌的毒素,例如,包括各种A链毒素(特别是蓖麻毒蛋白A链)、核糖体失活蛋白如皂草素或白树毒素,帚曲霉素(α-sarcin)、曲霉素、局限曲菌素、核糖核酸酶例如胎盘核糖核酸酶、血管生成素、白喉毒素和假单胞菌外毒素等。用于本发明的优选的毒素部分是经过处理以修饰或除去碳水化合物残基的毒素A链,即去糖基化的A链(美国专利5,776,427)。将此类细胞毒性剂中的一种或组合(例如蓖麻毒素融合物)输注到患者体内可导致免疫细胞死亡。
在另一个实施方案中,某些组合在治疗能受益于免疫应答调节的病症中起协同作用。第二活性剂可以是大分子(例如蛋白质)或小分子(例如合成的无机、有机金属或有机分子)。例如,可以将免疫检查点抑制剂进一步与用于治疗目的病症的其他药剂或疗法组合。
此外,某些免疫疗法可用于促进免疫应答。免疫疗法可以涉及用于短期保护宿主的被动免疫,其通过施用预先形成的针对癌抗原或疾病抗原的抗体来实现(例如,将任选地与化学治疗剂或毒素相关联的单克隆抗体施用至肿瘤抗原)。免疫疗法还可以集中于使用能识别细胞毒性淋巴细胞的癌细胞系表位。或者,可使用反义多核苷酸、核酶、RNA干扰分子、三螺旋多核苷酸等选择性地调节与肿瘤或癌症的起始、进展和/或病理学相关的生物分子。
在一个实施方案中,免疫疗法包括基于过继细胞的免疫疗法。熟知的基于过继细胞的免疫治疗方式包括但不限于,辐射过的自体或同种异体肿瘤细胞、肿瘤裂解物或凋亡的肿瘤细胞、基于抗原呈递细胞的免疫疗法、基于树突状细胞的免疫疗法、过继性T细胞转移、过继性CAR-T细胞疗法自体免疫增强疗法(AIET)、癌症疫苗和/ 或抗原呈递细胞。可以进一步修饰这种基于细胞的免疫疗法以表达一种或多种基因产物,从而进一步调节免疫应答,例如表达细胞因子如GM-CSF;和/或表达肿瘤相关抗原(TAA)的抗原,例如Mage-1、gp-100、患者特异性新抗原疫苗等。
在另一个实施方案中,免疫疗法包括非基于细胞的免疫疗法。大分子活性剂的实例包括但不限于造血生长因子、细胞因子以及单克隆和多克隆抗体。典型的大分子活性剂是生物分子,例如天然存在的或人工制造的蛋白质。在本发明中特别有用的蛋白质包括在体外或体内刺激造血前体细胞和免疫活性致病细胞的存活和/或增殖的蛋白质。其他蛋白质则在体外或体内刺激细胞中定型红细胞祖细胞的分裂和分化。特定的蛋白质包括但不限于:白细胞介素如IL-2(包括重组的IL-2(“rIL2”)和金丝雀痘IL-2)、 IL-10、IL-12、IL-15和IL-18;干扰素如干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、干扰素α-n3、干扰素β-Ia和干扰素γ-Ib;GM-CF和GM-CSF;和EPO。
可用于本文提供的方法和组合物的特定蛋白质包括但不限于:非格司亭(filgrastim),其在美国以商品名(Amgen,Thousand Oaks,加州)出售;沙格司亭(sargramostim),其在美国以商品名/>(Immunex,Seattle,华盛顿州)出售;和重组EPO,其在美国以商品名/>(Amgen,Thousand Oaks,加州)销售。GM-CSF的重组和突变形式可以如美国专利号5,391,485;5,393,870;和 5,229,496中所述进行制备;所有这些都通过引用并入本文。G-CSF的重组和突变形式可以如美国专利号4,810,643;4,999,291;5,528,823;和5,580,755中所述进行制备;所有这些都通过引用并入本文。
在一个实施方案中,使用包含具有或不具有疫苗增强佐剂的抗原的组合物。这些组合物以许多众所周知的形式存在,例如肽组合物、溶瘤病毒、包含融合蛋白的重组抗原等。在又一个实施方案中,使用免疫调节性白细胞介素,例如IL-2、IL-6、IL-7、 IL-12、IL-17、IL-23等,以及其调节剂(例如,阻断抗体、或者更有效或更持久的形式)。在另一个实施方案中,使用免疫调节趋化因子,例如CCL3CCL26和CXCL7 等,以及其调节剂(例如,阻断抗体、或者更有效或更持久的形式)。在另一个实施方案中,使用靶向免疫抑制的免疫调节分子,例如STAT3信号传导调节剂、NFκB信号传导调节剂和免疫检查点调节剂。术语“免疫检查点”和“抗免疫检查点疗法”在上文中有描述。
在又一个实施方案中,使用免疫调节药物,例如免疫细胞抑制药物、糖皮质激素、细胞抑制剂、免疫亲和素及其调节剂(例如,雷帕霉素、钙调神经磷酸酶抑制剂、他克莫司、环孢素(环孢菌素)、吡美莫司、阿贝莫司、胍立莫司、地磷莫司(ridaforolimus)、依维莫司、西罗莫司、佐他莫司等)、氢化可的松(皮质醇)、醋酸可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲基强的松龙、地塞米松、倍他米松、曲安奈德、倍氯米松、醋酸氟氢可的松、醋酸去氧皮质酮(doca)醛固酮、非糖皮质激素类固醇、嘧啶合成抑制剂、来氟米特、特立氟胺、叶酸类似物、甲氨蝶呤、抗胸腺细胞球蛋白、抗淋巴细胞球蛋白、沙利度胺、来那度胺、己酮可可碱、安非他酮、姜黄素、儿茶素、阿片类药物、IMPDH 抑制剂、霉酚酸、球壳菌素、芬戈莫德、NF-xB抑制剂、雷洛昔芬、屈特尔康金 (drotrecogin alfa)、地诺单抗、NF-xB信号级联抑制剂、双硫仑、奥美沙坦、二硫代氨基甲酸酯、蛋白酶体抑制剂、硼替佐米、MG132、Prol、NPI-0052、姜黄素、染料木黄酮、白藜芦醇、小白菊内酯、沙利度胺、来那度胺、弗拉平度、非甾体抗炎药 (NSAID)、三氧化二砷、脱氢甲基喹喔啉(DHMEQ)、13C(吲哚-3-甲醇)/DIM (二吲哚甲烷)(13C/DIM)、Bay11-7082、木犀草素、细胞渗透性肽SN-50、IKBa -超阻遏子过表达、NFκB诱饵寡脱氧核苷酸(ODN)、或者其任何衍生物或类似物。在另一个实施方案中,使用免疫调节抗体或蛋白质。例如,结合CD40、Toll样受体 (TLR)、OX40、GITR、CD27或结合4-1BB的抗体,T细胞双特异性抗体,抗IL-2 受体抗体,抗CD3抗体,OKT3(莫罗单抗),奥昔珠单抗,替利珠单抗,维西珠单抗,抗CD4抗体,克立昔单抗,凯利昔单抗,扎木单抗,抗CD11抗体,依法珠单抗,抗CD18抗体,厄利珠单抗,罗维珠单抗,抗CD20抗体,阿托珠单抗,奥瑞珠单抗,奥法木单抗,帕考珠单抗(pascolizumab),利妥昔单抗(rituximab),抗CD23 抗体,鲁昔单抗(Lumiliximab),抗CD40抗体,替奈昔单抗(Teneliximab),托利珠单抗(Toralizumab),抗CD40L抗体,芦利珠单抗(Ruplizumab),抗CD62L抗体,阿塞珠单抗(Aselizumab),抗CD80抗体,加利昔单抗(Galiximab),抗CD147 抗体,加维莫单抗(Gavilimomab),B淋巴细胞刺激剂(BLyS)抑制抗体,贝利木单抗(Belimumab),CTLA4-Ig融合蛋白,阿巴西普(Abatacept),贝拉西普(belatacept),抗CTLA4抗体,伊匹木单抗(Ipilimumab),曲美木单抗(Tremelimumab),抗eotaxin 1抗体,柏替木单抗(Bertilimumab),抗a4-整合素抗体,那他珠单抗(Natalizumab),抗IL-6R抗体,托珠单抗(Tocilizumab),抗LFA-1抗体,奥度莫单抗(odulimomab),抗CD25抗体,巴利昔单抗(Basiliximab),达克珠单抗(Daclizumab),伊诺莫单抗(Inolimomab),抗CD5抗体,阿佐莫单抗(Zolimomab)抗CD2抗体,西利珠单抗(Siplizumab),奈瑞莫单抗(Nerelimomab),法拉莫单抗(Faralimomab),atlizumab,阿托木单抗(Atorolimumab),西地珠单抗(Cedelizumab),阿托度单抗(dorlimomab aritox),dorlixizumab,芳妥珠单抗(Fontolizumab),更汀芦单抗(Gantenerumab),戈利昔单抗(Gomiliximab),利伯珠单抗(1ebrilizumab),马司莫单抗(maslimomab),莫罗木单抗(morolimumab),派利珠单抗(pexelizumab),瑞利珠单抗(reslizumab),罗维珠单抗(rovelizumab),他利珠单抗(talizumab),阿替莫单抗(telimomab aritox),伐利昔单抗(Vapaliximab),维帕莫单抗(Vepalimomab),阿柏西普(aflibercept),阿法赛特(Alefacept),利纳西普(Rilonacept),IL-1受体拮抗剂,阿那白滞素 (Anakinra),抗IL-5抗体,美泊利单抗(mepolizumab),IgE抑制剂,奥马珠单抗 (omalizumab),他利珠单抗(talizumab),IL12抑制剂,IL23抑制剂,乌司奴单抗(ustekinumab)等。
类似地,化学治疗剂在本领域中是众所周知的。例如,化学治疗剂包括烷化剂如塞替派和环磷酰胺(CytoxanTM);氨基磺酸盐如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡;氮杂氮杂环丙烷如苯并多巴、卡巴醌、美妥替哌(meturedop)和脲多巴(uredopa);乙烯亚胺和甲基胺类(methylamelamines),包括六甲蜜胺、曲他胺(triemylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺和三甲蜜胺(trimethylolomelamine);乙酰精宁(acetogenins)(特别是布拉它辛和布拉它辛酮(bullatacinone));喜树碱(包括合成的类似物拓扑替康);苔藓虫素;卡利他汀(callystatin);CC-1065(包括其阿多来新,卡折来新和比折来新合成类似物);念珠藻环肽(cryptophycin)类(特别是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8);多拉司他汀;倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CBI-TMI);软珊瑚醇 (eleutherobin);水鬼蕉碱(pancratistatin);匍枝珊瑚醇(sarcodictyin);海绵抑制素;氮芥如苯丁酸氮芥、如萘氮芥(chlomaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、二氯甲基二乙胺氧化物盐酸盐(mechlorethamine oxidehydrochloride)、美法仑、新氮芥、苯芥胆留醇、松龙苯芥、曲磷胺、尿嘧啶芥末;亚硝基脲类如卡莫司汀、氯莫索辛、前莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、马来西汀;抗生素类如烯二炔类抗生素(例如加利车霉素,特别是加利车霉素γ和加利车霉素菲利(calicheamicin phili));达内霉素(dynemicin),包括达内霉素A;双膦酸盐如氯膦酸盐;埃斯培拉霉素;以及新制癌菌素发色团 (neocarzinostatin chromophore)和相关的色素蛋白烯二炔抗生素生色团),阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸 (azaserine)、争光霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycini)、更生霉素 (dactinomycin)、道诺霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-侧氧基-L-正亮氨酸、多柔比星(AdramycinTM)(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泼非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、奎那霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代谢药如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物如迪诺特宁(demopterin)、氨甲蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate);嘌呤类似物如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、噻咪嘌呤、硫鸟嘌呤;嘧啶类似物如环胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷;雄激素如卡芦睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone);抗肾上腺药如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦、曲洛司坦(trilostane);叶酸补充剂如亚叶酸(frolinicacid);醋葡醛内酯(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酰丙酸 (aminolevulinic acid);恩尿嘧啶(eniluracil);安吖啶(amsacrine);贝斯布西;比生群;依达曲沙(edatraxate);地磷酰胺(defofamine);秋水仙胺(demecolcine);地吖醌 (diaziquone);依洛尼塞(elfomithine);依利醋铵(elliptinium acetate);埃博霉素 (epothilone);乙环氧啶(etoglucid);硝酸镓;羟基脲;蘑菇多糖(lentinan);氯尼达明 (lonidainine);类美登素(maytansinoid),诸如美登素(maytansine)和安丝菌素 (ansamitocin);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌;莫哌达醇(mopidanmol);二胺硝吖啶(nitraerine);喷司他汀(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);鬼臼酸(podophyllinicacid);2-乙酰肼;丙卡巴肼;PSKTM;雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西佐喃(sizofuran);锗螺胺(spirogermanium);替奴佐酸(tenuazonic acid);三亚胺醌(triaziquone);2,2′,2″-三氯三乙胺;单端孢霉烯 (trichothecene)(特别是T-2毒素、粘液霉素A(verracurinA)、杆孢菌素A(roridinA)和蛇形菌素(anguidine));乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine);达卡巴嗪(dacarbazine);甘露氮芥(mannomustine);二溴甘露醇;二溴卫矛醇(mitolactol);哌泊溴烷 (pipobroman);加西托星(gacytosine);阿糖胞苷(“Ara-C”);环磷酰胺;噻替派;类紫杉醇,例如紫杉醇(TaxolTM,Bristol-MyersSquibb Oncology,Princeton,N.J.)和多西他赛(TaxoteretTM,Rhone-PoulencRorer,Antony,France);苯丁酸氮芥;吉西他滨 (GemzarTM);6-硫鸟嘌呤;巯基嘌呤;氨甲蝶呤;铂类似物如顺铂和卡铂;长春碱;铂;依托泊苷(VP-16);异环磷酰胺;米托蒽醌;长春新碱;长春瑞滨(vinorelbine) (NavelbineTM);诺消灵(novantrone);替尼泊苷(teniposide);依达曲沙;柔红霉素;氨基喋呤;希罗达(xeloda);伊班膦酸盐(ibandronate);CPT-11;拓扑异构酶抑制剂 RFS 2000;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);类视黄素如视黄酸;卡培他滨(capecitabine);和以上各项中的任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。“化学治疗剂”的定义中还包括起调节作用或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂,诸如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM),包括例如他莫西芬(tamoxifen)(包括NolvadexTM)、雷洛昔芬(raloxifene)、曲洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(FarestonTM);芳香酶抑制剂,其调节肾上腺中的雌激素产生,诸如,4(5)-咪唑、氨鲁米特、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)(MegaceTM)、依西美坦(exemestane)、福美斯坦(formestanie)、法屈唑(fadrozole)、伏罗唑(vorozole)(RivisorTM)、来曲唑(letrozole)(FemaraTM)和阿那曲唑(anastrozole)(ArimidexTM);和抗雄激素,诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin);以及以上中的任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方案中,所述抑制剂下调Rac1输出。化学治疗剂和其他抗癌剂的其他实例描述于美国专利号 2013/0239239和2009/0053224中。
增强免疫应答的营养补充剂如维生素A、维生素E、维生素C等,是本领域熟知的(参见,例如美国专利号4,981,844和5,230,902以及PCT公开号WO2004/004483) 并且可用于本文所述的方法中。
类似地,除免疫疗法之外的试剂和疗法或其组合可用于刺激免疫应答,从而治疗能从中受益的病症。例如,化疗、放射、表观遗传修饰剂(例如,组蛋白脱乙酰酶 (HDAC)修饰剂、甲基化修饰剂、磷酸化修饰剂等)、靶向治疗等是本领域熟知的。
在又一个实施方案中,术语“靶向疗法”是指施用能选择性地与所选生物分子相互作用从而治疗癌症的试剂。例如,贝伐单抗是靶向血管内皮生长因子的人源化单克隆抗体(参见,例如,美国专利公开2013/0121999,WO2013/083499 和Presta et al.(1997)Cancer Res.57:4593-4599),以抑制伴随肿瘤生长的血管生成。在某些情况下,靶向疗法可以是免疫治疗的一种形式,具体取决于所述靶标是否调节免疫调节功能。
术语“非靶向疗法”是指施用不会选择性地与所选生物分子相互作用但能治疗癌症的试剂。非靶向疗法的代表性实例包括但不限于化疗、基因疗法和放射疗法。
在另一个实施方案中,使用激素疗法。激素疗法治疗可包括,例如,激素激动剂、激素拮抗剂(例如,氟他胺、比卡鲁胺、他莫昔芬、雷洛昔芬、醋酸亮丙瑞林(LUPRON)、 LH-RH拮抗剂)、激素生物合成和加工的抑制剂、以及类固醇(例如,地塞米松、类维生素A、deltoids、倍他米松、皮质醇、可的松、泼尼松、脱氢睾酮、糖皮质激素、盐皮质激素、雌激素、睾酮、孕激素)、维生素A衍生物(如全反式维甲酸(ATRA));维生素D3类似物;抗孕激素(例如米非司酮、奥那司酮)或抗雄激素(例如醋酸环丙孕酮)。
在又一个实施方案中,治疗方法可以进一步使用阻断共刺激通路活性(例如诸如B7-1、B7-2或B7-3的其他B淋巴细胞抗原的活性)的试剂,以进一步下调免疫应答。可以将下调免疫应答的两种单独的试剂组合为单一组合物或单独(同时地或相继地) 施用,以更有效地下调受试者的免疫细胞介导的免疫应答。此外,治疗活性量的一种或多种所述试剂可以与其他下调性试剂结合使用,以影响免疫应答。其他免疫调节试剂的实例包括但不限于阻断共刺激信号的抗体(例如,针对CD28或ICOS的抗体)、用作CTLA4的激动剂的抗体、和/或针对其他免疫细胞标志物的抗体(例如针对CD40、针对CD40配体或针对细胞因子的抗体)、融合蛋白(例如CTLA4-Fc)和免疫抑制药物(例如,雷帕霉素、环孢菌素A或FK506)。
此外,促进免疫检查点蛋白活性的试剂是有用的。
术语“免疫检查点蛋白”是指CD4+和/或CD8+ T细胞的细胞表面上的一组分子,其通过下调或抑制抗肿瘤免疫应答来微调免疫应答。免疫检查点蛋白是本领域公知的,包括但不限于如上所述的CTLA-4,以及PD-1、VISTA、B7-H2、B7-H3、PD-L1、 B7-H4、B7-H6、ICOS、HVEM、PD-L2、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、 TIM-1、TIM-3、TIM-4、LAG-3、BTLA、SIRP-α(CD47)、CD48、2B4(CD244)、B7.1、 B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT和A2aR(参见,例如,WO2012/177624)。用于促进免疫检查点蛋白的水平和活性的试剂是本领域熟知的。
在又一个实施方案中,可以将任何一线或二线的免疫障碍治疗与本发明所述的方法组合。代表性实例包括但不限于甾体、霉酚酸酯(MMF)和喷司他丁(参见,例如,Busca etal.(2000)Bone Marrow Transplant 25:1067-1071;Berger et al.(2007)J.Pediatr.Hematol.Oncol.29:678-687;Jacobsohn et al.(2009)Blood 114:4354-4360)。
本文还提供了包含一种或多种核酸的组合物,所述核酸包含或能够表达至少1、2、3、4、5、10、20或更多种小核酸或反义寡核苷酸或其衍生物,其中细胞中所述小核酸或反义核酸寡核苷酸或其衍生物特异性地在细胞条件下与细胞核酸(例如,小的非编码RNA如miRNA、pre-miRNA、pri-miRNA、miRNA*、抗miRNA、miRNA结合位点、其变体和/或功能变体、细胞mRNA或其片段)杂交。在一个实施方案中,细胞中所述小核酸或反义寡核苷酸或其衍生物的表达可以抑制细胞核酸和/或蛋白质的表达或生物活性,例如,通过抑制如本发明所述的一种或多种生物标志物(包括表1 中列出的一种或多种生物标志物)或其片段的转录、翻译和/或抑制小核酸加工来抑制(Zeng et al.(2002)Mol.Cell 9:1327-1333;Tuschl(2002)Nat.Biotechnol.20:446-448; Brummelkamp et al.(2002)Science 296:550-553;Miyagishi et al.(2002)Nat.Biotechnol. 20:497-500;Paddison et al.(2002)GenesDev.16:948-958;Lee et al.(2002)Nat. Biotechnol.20:500-505;和Paul et al.(2002)Nat.Biotechnol.20:505-508;美国专利 5,176,996;5,264,564;和5,256,775;van derKrol et al.(1988)BioTechniq.6:958-976; Stein et al.(1988)Cancer Res.48:2659-2668;Wagner(1994)Nature 372:333;Letsinger et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:6553-6556;Lemaitre et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:648-652;PCT公开号WO88/09810和WO89/10134;Zon(1988)Pharm.Res.5:539-549)。
小核酸和/或反义寡核苷酸也可含有中性肽样骨架。这种分子被称为肽核酸(PNA)-低聚物,并描述于例如Perry-O’Keefe et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93:14670;Eglom et al.(1993)Nature 365:566;Gautier et al.(1987)Nucl.Acids Res.15:6625-6641;Inoue et al.(1987)Nucl.Acids Res.15:6131-6148;Inoue et al.(1987)FEBS Lett.215:327-330;Sarin et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:7448-7451; Elbashir et al.(2001)Nature 411:494-498;McManus et al.(2002)RNA 8:842;Xia et al. (2002)Nat.Biotechnol.20:1006;和Brummelkamp et al.(2002)Science296:550中。
被设计成用于催化切割细胞mRNA转录物的核酶分子也可用于预防细胞mRNA 的翻译和细胞多肽的表达,或两者兼而有之(PCT公开号WO90/11364;Sarver et al. (1990)Science 247:1222-1225;和美国专利号5,093,246;Haseloff和Gerlach(1988) Nature334:585-591;Zaug et al.(1984)Science 224:574-578;Zaug et al.(1986)Science231:470-475;Zaug et al.(1986)Nature 324:429-433;WO88/04300;和Been et al.(1986) Cell 47:207-216)。
三螺旋形成物中使用的用于抑制细胞基因转录的核酸分子,优选地是单链的并且由脱氧核糖核苷酸组成。这些寡核苷酸的碱基组成通过Hoogsteen碱基配对规则促进三螺旋的形成,这通常需要在双链体的一条链上存在大段的嘌呤或嘧啶。核苷酸序列可以是基于嘧啶的,其将在所得三螺旋的三个相关链中产生TAT和CGC三联体。富含嘧啶的分子提供了与双链体的单链中富含嘌呤的区域的碱基互补性,其方向与该链平行。另外,可以选择富含嘌呤的核酸分子,例如含有一段G残基的核酸分子。这些分子将与富含GC对的DNA双链体形成三螺旋,其中大多数嘌呤残基位于靶双链体的单链上,导致产生了所述三链体中三条链上的CGC三联体。
或者,可以通过产生所谓的“转向”核酸分子来增加可以被靶向以形成三螺旋的潜在序列。转向分子以交替的5′-3′、3′-5′方式合成得到,从而使得它们与双链体的第一链碱基配对,然后与另一链配对,从而消除了双链体的一条链上存在大段的嘌呤或嘧啶的必要。
本文所述的方法和组合物中的小核酸(例如,miRNA、pre-miRNA、pri-miRNA、miRNA*、抗miRNA、或miRNA结合位点、或其变体)、反义寡核苷酸、核酶和三螺旋分子可以通过本领域已知的用于合成DNA和RNA分子的任何方法来制得。这些包括用于化学合成本领域熟知的寡脱氧核糖核苷酸和寡核糖核苷酸的技术,例如固相亚磷酰胺的化学合成。或者,可以通过编码反义RNA分子的DNA序列的体外和体内转录以产生RNA分子。这些DNA序列可以掺入多种载体中,所述载体掺入了合适的 RNA聚合酶启动子如T7或SP6聚合酶启动子。或者,根据所用的启动子,可以将反义cDNA构建体稳定地引入细胞系,所述反义cDNA构建体能组成或诱导地合成反义 RNA。
此外,可以引入对核酸分子的各种众所周知的修饰作为提升细胞内稳定性和半衰期的手段。可能的修饰包括但不限于在分子的5′和/或3′末端添加核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的侧翼序列,或在寡脱氧核糖核苷酸主链内使用硫代磷酸酯或2′O-甲基而不使用磷酸二酯酶键。本领域技术人员将容易理解,多肽、小核酸和反义寡核苷酸可以进一步与例如,用作蛋白质检测手段的另一种肽或多肽(例如,异源肽)连接。可用于本发明所述的检测的标记肽或多肽部分的非限制性实例包括但不限于合适的酶如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶;表位标签如FLAG、 MYC、HA或HIS标签;荧光团如绿色荧光蛋白;染料;放射性同位素;地高辛;生物素;抗体;聚合物;以及本领域已知的其他技术,例如,Principles of Fluorescence Spectroscopy,Joseph R.Lakowicz(Editor),PlenumPub Corp,第2版(1999年7月)中的技术。
可以将试剂掺入适于施用给受试者的药物组合物中。此类组合物通常包含抗体、肽、融合蛋白、小分子等,和药学上可接受的运载体。本文使用的“药学上可接受的运载体”旨在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。将这些介质和试剂用于药物学活性物质在本领域中是众所周知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容,否则将考虑在组合物中使用它们。也可将补充性的活性化合物掺入组合物中。
可将本发明所述药物组合物配制成与其预期的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外施用,例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如吸入)、透皮(局部)、经粘膜和直肠施用。用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可包括以下组分:无菌稀释剂如注射用水、盐溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂;抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯;抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠;螯合剂如乙二胺四乙酸;缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及调节渗透压的试剂如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱调节pH,例如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器、或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性的)或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用,合适的运载体包括生理盐水、抑菌水、聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor ELTM,BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下,组合物应该是无菌的并且应该是易于注射程度的流体。它必须在制造和储存条件下保持稳定,并且应该在防止微生物(如细菌和真菌) 污染作用的条件下储存。运载体可以是溶剂或分散介质,其含有例如水、乙醇、多元醇(例如,甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等),及其合适的混合物。例如,可以通过使用诸如卵磷脂的涂层、通过在分散的情况下保持所需的粒度和通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂,例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下,优选在组合物中包括等渗剂,例如糖、多元醇(如甘露醇)、山梨糖醇氯化钠。可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可以通过将所需量的活性化合物与上面列举的成分中的一种或组合(如果需要的话)一起掺入适当的溶剂中,然后过滤灭菌来制得。通常,通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散体,所述无菌媒介物包含基础分散介质和来自上面列举的介质的所需其他成分。对于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末,优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥,其产生活性成分的粉末以及来自其先前无菌过滤过的溶液的任何其他所需成分。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用运载体。它们可以封装在明胶胶囊中或压制成片剂。对于口服治疗施用的目的,可以将活性化合物与赋形剂混合并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。也可以使用流体运载体制备口服组合物用作漱口水,其中所述流体载体中的化合物以口服形式施用,漱口并吐出或咽下。可以将药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分包括进来。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有下列任何成分或类似性质的化合物:粘合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶;赋形剂如淀粉或乳糖、崩解剂如海藻酸、Primogel或玉米淀粉;润滑剂如硬脂酸镁或硬脂酸盐(Sterotes);助流剂如胶体二氧化硅;甜味剂如蔗糖或糖精;或调味剂如薄荷、水杨酸甲酯或橙子调味剂。
对于吸入给药,以气溶胶喷雾的形式从加压容器或分配器中递送化合物,所述加压容器或分配器含有合适的推进剂,例如气体(如二氧化碳)或喷雾器。
全身施用也可以通过透粘膜或透皮方式进行。对于透粘膜或透皮施用,在制剂中使用渗透剂,所述渗透剂适合于要渗透的屏障。这些渗透剂通常是本领域已知的,并且包括例如用于透粘膜给药的去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。透粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来完成。对于透皮施用,可将活性化合物配制成本领域公知的软膏、油膏、凝胶或乳膏。
该化合物也可以以栓剂(例如,用常规的栓剂基质如可可脂和其它甘油酯)或保留灌肠剂的形式制备,用于直肠给药。
在一个实施方案中,用运载体制备调节剂,所述运载体将保护所述化合物免于从体内快速消除,所述调节剂例如控释制剂,包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物,例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这些制剂的方法对于本领域技术人员来说应该是显而易见的。该材料也可以从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals,Inc商购获得。脂质体悬浮液(包括脂质体,所述脂质体用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向感染细胞)也可以用作药学上可接受的运载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制得,例如,如美国专利号4,522,811中所述。
以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物以便于施用和剂量均匀化是特别有利的。本文使用的剂量单位形式是指物理上离散的单位,其适合用作待治疗受试者的单位剂量;每个单位含有预定量的活性化合物,所述预定量经计算可与所需的药物运载体一起产生所需的治疗效应。本发明所述剂量单位形式的说明由以下决定,并且直接取决于以下:活性化合物的独特特征、所要实现的特定治疗效应、以及本领域中配制这种活性化合物以用于治疗个人的固有的局限性。
这些化合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准制药程序来确定,例如,用于确定LD50(对50%群体致死的剂量)和ED50(在50%群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效应之间的剂量比为治疗指数,并且可以表示为 LD50/ED50比。优选高治疗指数的化合物。虽然可以使用表现出毒副作用的化合物,但应注意设计能将这些化合物靶向受影响组织部位的递送系统,使得对未感染细胞的潜在损害最小化,从而减少副作用。
从细胞培养实验和动物研究中获得的数据可用于配制用于人类的一系列剂量。这些化合物的剂量优选在一系列循环浓度内,包括ED50且毒性很小或没有毒性。剂量可以在该范围内变化,具体取决于所用的剂型和所用的施用途径。对于本发明方法中使用的任何化合物,最初可以从细胞培养实验中估计治疗有效的剂量。可以在动物模型中配制剂量,以达到包含了在细胞培养中测得的IC50(即,实现症状的半数最大抑制的测试化合物浓度)的循环血浆浓度范围。这些信息可用于更准确地确定人体中的有用剂量。例如,血浆中的水平可以通过高效液相色谱法测得。
上述调节剂可以以编码所述试剂的可表达核酸的形式进行施用。包含所述试剂或调节剂的这些核酸和组合物也包括在本发明中。例如,可以将本发明所述核酸分子插入载体中并用作基因治疗载体。基因治疗载体可以通过例如静脉内注射、局部施用(参见美国专利5,328,470)或通过立体定位注射(参见例如,Chen et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3054-3057)。基因治疗载体的药物制剂可以包括可接受的稀释剂中的基因治疗载体,或者可以包含嵌入有基因递送媒介物的缓释基质。或者,当可以从重组细胞产生完整的基因递送载体(例如逆转录病毒载体)时,药物制剂可以包括一种或多种产生基因递送系统的细胞。
药物组合物可以与施用说明书一起包括在容器、包装或分配器中。
d.临床功效
临床功效可通过本领域已知的任何方法测得。例如,对治疗(例如在另外的治疗剂存在或不存在的情况下施用改造的T细胞)的应答涉及T细胞耗竭和/或免疫障碍 (例如肿瘤)对治疗的任何调节的应答,优选涉及在新辅助或辅助化疗开始后肿瘤质量和/或体积的变化。
例如,治疗由感染性试剂引起的免疫障碍的临床功效可涉及确定受试者中感染性微生物(例如病毒、细菌、真菌、支原体或寄生虫)的负荷相对于未治疗对照中这种负荷的减少。与等效的未治疗对照相比,由任何标准技术测得的这种降低或防止程度为至少5%、10%、20%、40%、50%、60%、80%、90%、95%或100%。通过本领域已知的任何标准方法测定,可以完全清除感染性试剂因素。诊断和监测可以涉及,例如,检测生物样品(例如,组织活检、血液测试或尿液测试)中的微生物负荷水平、检测生物样品中感染性试剂的生物标志物的替代标记物的水平、检测与慢性免疫障碍相关的症状、或检测与慢性免疫障碍的典型免疫应答有关的免疫细胞(例如,检测抗原特异性的耗竭性CD8+ T细胞)。
还可以评估针对癌症的临床功效。可以在新辅助或辅助的情况下评估肿瘤应答,其中,在全身介入后,可以将通过CT、PET、乳房X线照片、超声或触诊测得肿瘤大小与肿瘤的初始大小和尺寸进行比较,并且可以用组织学的方式估计肿瘤的细胞性并与在开始治疗之前取得的肿瘤活组织检查的细胞性进行比较。还可以在活检或手术切除后通过肿瘤的卡尺测量或病理检查来评估应答。可以以定量方式(例如肿瘤体积或细胞构成的百分比变化)、或使用半定量评分系统(如残留癌症负荷或Miller-Payne Score)或以定性方式记录应答。所述半定量评分系统的残留癌症符合(residual cancer burden)可参见Symmans et al.,J.Clin.Oncol.(2007)25:4414-4422,所述Miller-Payne Score可参见Ogston et al.,(2003)Breast(Edinburgh,Scotland)12:320-327。所述定性方式如“病理完全应答”(pCR)、“临床完全缓解”(cCR)、“临床部分缓解”(cPR)、“临床稳定疾病”(cSD)、“临床进展性疾病”(cPD)或其他定性标准。肿瘤应答的评估可以在新辅助治疗或辅助治疗开始后的早期进行,例如在几小时、几天、几周或优选几个月后进行。应答评估的典型终点是在新辅助化疗终止时或在手术切除残留的肿瘤细胞和/或肿瘤床时。
在一些实施方案中,可通过测量临床受益率(CBR)来确定本文所述治疗性治疗的临床功效。所述临床受益率通过确定从治疗结束后至少6个月的时间点上完全缓解 (CR)患者的百分比、部分缓解(PR)患者的数量和具有稳定疾病(SD)的患者数量的总和来测得。这个公式简写为CBR=6个月后的CR+PR+SD。在一些实施方案中,特定的抗免疫检查点抑制剂的治疗方案的CBR为至少25%、30%、35%、40%、 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或更多。
评估对疗法的应答的其他标准与“存活”有关,其包括以下所有内容:存活直至死亡,也称为总存活(其中所述死亡可以与病因无关或与肿瘤相关);“无复发存活” (其中术语复发应包括局部复发和远处复发);无转移存活;无病存活(其中术语疾病应包括癌症和与之相关的疾病)。所述存活的长度可以通过参考确定的起始点(例如,诊断时间或治疗开始时间)和终点(例如,死亡、复发或转移)来计算。此外,治疗功效的标准可以扩展到包括对化疗的反应、存活概率、给定时间段内转移的可能性、以及肿瘤复发的可能性。
例如,为了确定合适的阈值,可以将治疗方案施用给受试者群体,并且可以将结果与在施用所述疗法或任何疗法之前所确定的生物标志物测量值关联起来。结果测量值可以是对新辅助治疗中给予的治疗的病理性应答。或者,对于已知生物标志物测量值的受试者,在抗免疫检查点抑制剂治疗后,可以监测其一段时间的结果测量值,如总体存活和无病存活。在某些实施方案中,向每个受试者施用相同剂量的治疗剂。在相关的实施方案中,所述试剂施用的剂量是本领域已知的标准剂量。监测受试者的时间长度可以是多样的。例如,可以对受试者监测至少2、4、6、8、10、12、14、16、 18、20、25、30、35、40、45、50、55或60个月。可以使用本领域熟知的方法(例如实施例部分中描述的方法)来确定与治疗结果相关的生物标志物测量阈值。
VI.其他方法
如上文关于治疗方法的描述,本发明还提供了通过单独或与其他治疗剂组合施用改造的T细胞来预防受试者中T细胞耗竭和/或免疫病症的预防方法。可以通过例如本领域已知的诊断或预后实验中的任何一种或组合来鉴定具有不期望的T细胞耗竭和/或不期望的免疫病症风险的受试者。预防剂的施用可在表现出与不想要的免疫应答相关的症状之前进行。可以基于临床适应症来确定用于治疗的合适的试剂(例如抗体、肽、融合蛋白或小分子),并且可以使用本领域公知的诊断实验以及本文所述的诊断实验进行鉴定。
本发明还提供以下进一步描述的诊断方法。
在本文描述的任何方法(例如诊断方法、预后方法、治疗方法或其组合)中,所述方法的所有步骤都可以由单个行动者执行,或者由一个以上的行动者执行。例如,诊断可以直接由提供治疗性处理的行动者执行。或者,提供治疗剂的人可以要求执行诊断测定。诊断医师和/或治疗干预者可以解释诊断测定结果以确定治疗策略。类似地,这种替代方法可以应用于其他测定,例如预后测定。
本发明不限于受试者的体内治疗。例如,可以从受试者中分离出T细胞用于离体步骤(例如,体外处理免疫细胞并将细胞重新施用回体内)。类似地,可以在体外培养T细胞及其改造过的形式。可以以在体外、离体地或在体内的方式在T细胞中选择性地调节本发明所述生物标志物(例如PD-1增强子)的表达和/或活性,并且可以在体外、离体地或在体内分析对细胞过程(例如细胞增殖、分化、死亡等)或免疫应答 (例如细胞毒性、细胞因子的产生等)所造成的效应。通过这种方式,改造的T细胞可以在体外单独地或与其他细胞类型(例如调节性T细胞)组合在一起用于测定T细胞耗竭生物学和/或一些操作(例如用测试化合物进行的治疗)。而且,这种操作可以组合地进行。例如,可以从受试者中分离出T细胞,对其进行重组遗传操作,重新施用于受试者,然后提供体内全身施用的治疗剂。
在一个方面,本发明涉及预测医学领域,其中诊断实验、预后实验和监测临床试验用于预后(预测)的目的,从而预防性地治疗个体。因此,本发明的一个方面涉及在生物样品(例如血液、血清、细胞或组织)背景下确定选择性存在于耗竭性CD8+ T 细胞的基因组内的基因组区域的量和/或活性水平的诊断实验,所述基因组区域可以是单独的或与至少一个基因的表达有关,所述至少一个基因的表达由所述基因组区域调节,从而鉴定耗竭性CD8+T细胞的存在和/或患有免疫障碍的个体的状态。此类实验可用于预后或预测的目的,从而在障碍发作之前或复发之后预防性治疗个体,所述障碍的特征为生物标志物多肽、核酸的表达或活性,或与生物标志物多肽、核酸的表达或活性相关。技术人员应理解,任何方法都可以使用表1中列出的一种或多种(例如,组合物)生物标志物。
本发明的另一个方面涉及监测试剂(例如,药物、化合物和基于小核酸的分子) 对表1中列出的生物标志物的表达或活性的效应。例如,在一个方面,本发明提供了用于鉴定试剂的方法,所述试剂能调节T细胞耗竭和/或免疫应答,所述方法需要确定候选试剂促进或抑制改造的T细胞的T细胞功能的能力。在一个实施方案中,所述实验评估所述改造的T细胞与其他细胞类型(例如Treg、Teff、基于细胞的疫苗等) 的物理和/或功能性相互作用。在另一个实施方案中,所述实验评估由遗传修饰产生的基因表达调节的量。所述实验还可以组合1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个基因的分析,所述基因的表达由遗传调节进行调节。
所述实验是基于细胞的实验,且可以包括,例如,使本文所述的修饰过的T细胞与测试试剂接触,并测定所述测试试剂调节(例如刺激或抑制)目的免疫相关细胞之间的物理和/或功能性相互作用的能力。确定多肽彼此结合或相互作用的能力可以通过,例如,测量直接结合或通过测量免疫细胞应答的参数来实现。
例如,在直接结合实验中,可以将多肽与放射性同位素或酶标记偶联,使得可以通过检测复合物中的标记蛋白来确定免疫相关生物分子的结合。例如,可以直接或间接地用125I、35S、14C或3H标记所述多肽,并通过直接计数放射性发射或通过闪烁计数检测放射性同位素。或者,可以用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶来酶促标记所述多肽,并通过测定合适的底物向产物的转化来检测酶标记。
确定化合物调节免疫相关生物分子或目地细胞之间的相互作用的能力也在本发明的范围内,所述确定方法不标记任何相互作用物。例如,微生理记录仪可用于检测免疫相关生物分子多肽的相互作用而不标记任一多肽(McConnell et al.(1992)Science 257:1906-1912)。本文使用的“微生理记录仪”(例如,细胞传感器Cytosensor)是一种分析仪器,其使用光可寻址电位传感器(LAPS)测量细胞酸化其环境的速率。该酸化速率的变化可用作化合物和受体之间相互作用的指标。
在优选的实施方案中,可以通过测定一组免疫相关生物分子多肽中的一个或多个成员的活性来完成确定测试试剂(例如核酸、多肽、抗体、融合蛋白、肽或小分子) 拮抗或激动给定的一组免疫相关生物分子或细胞之间的物理和/或功能性相互作用的能力。例如,可以通过检测对细胞第二信使(例如,PD-1下游信号传导活性)的诱导、检测适当底物的催化/酶活性、检测对报告基因(其包含与编码可检测标志物如氯霉素乙酰转移酶的核酸可操作地连接的靶向反应性调节元件)的诱导、或检测由多肽调节的细胞应答(例如各种自身免疫、过敏(例如,哮喘、特应性皮炎、过敏性结膜炎、花粉过敏、食物过敏等)、疫苗接种、免疫耐受、癌症免疫疗法、免疫耗竭、免疫记忆或免疫表位应答)来确定所述多肽的活性。确定测试试剂结合所述多肽或与所述多肽相互作用的能力可以通过,例如,测量化合物在增殖实验中调节免疫细胞共刺激或抑制的能力,或通过干扰所述多肽与识别其一部分的抗体结合的能力来完成。
可以通过测试试剂调节免疫细胞增殖、和/或效应子功能的能力,或当加入实验时调节无应答性、克隆缺失和/或耗竭的能力来鉴定调节免疫应答的测试试剂。例如,可以在经由活化受体刺激信号转导的试剂存在的条件下培养细胞。许多公认的细胞活化读数都可用于在活化剂存在的条件下测量细胞增殖或效应功能(例如,抗体的产生、细胞因子的产生、吞噬作用)。通过使用本领域已知的技术测量试剂实现增殖减少或效应功能降低的能力,从而可以容易地确定所述测试试剂阻断这种活化的能力。
例如,可以测试本发明所述试剂在T细胞实验中抑制或增强共刺激和/或共抑制的能力,如Freeman et al.(2000)J.Exp.Med.192:1027 and Latchman et al.(2001)Nat.Immunol.2:261中的描述。可以例如用抗CD3抗体激活目的免疫细胞,并用本文所述的修饰过的T细胞进行递呈。可以通过3H胸苷掺入来测量T细胞的增殖。可以在实验中使用或不使用CD28共刺激进行测定。
或者,可以测试本发明所述试剂调节细胞产生细胞因子的能力,所述细胞因子由免疫细胞响应于免疫应答调节而产生,或其在免疫细胞中的产生响应于免疫应答调节而被增强或抑制。例如,可以在体外用初级激活信号对目的免疫细胞进行次优刺激。例如,可以用佛波酯、抗CD3抗体或优选与MHC II类分子关联的抗原刺激改造的T 细胞,并且,例如,通过B7家族抗原的刺激方式(例如通过有转染的核酸的细胞,所述核酸编码B7多肽并在细胞表面表达所述肽;或通过所述肽的可溶性刺激形式) 给予共刺激信号。已知的释放到培养基中的细胞因子可以通过ELISA或通过抗体的能力来鉴定,所述抗体阻断所述细胞因子从而抑制免疫细胞的增殖或抑制由所述细胞因子诱导的其他细胞类型的增殖。例如,可从Genzyme(Cambridge MA)获得的IL-4 ELISA试剂盒,IL-7阻断抗体也是如此。可以评估如本文所述被修饰的并添加到实验中的Treg的效应。然后可以确定刺激或阻断免疫相关生物分子的相互作用对细胞因子谱的效应。
在上述测定方法的一个或多个实施方案中,可能需要固定任一多肽以促进从一种或两种蛋白质的复合形式中分离出未复合形式,以及适应测定的自动化。测试化合物与多肽的结合可以在适合于含有所述反应物的任何容器中完成。这种容器的实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。在一个实施方案中,可以提供添加有结构域的融合蛋白,所述结构域允许所述一种或两种蛋白质与基质结合。例如,可以将谷胱甘肽-S- 转移酶/免疫相关多肽融合蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶/靶融合蛋白吸附到谷胱甘肽琼脂糖珠(SigmaChemical,St.Louis,MO)上,或吸附到谷胱甘肽衍生的微量滴定板上,然后将其与所述测试化合物组合,并在有助于形成复合物的条件下(例如,在盐和pH的生理条件下)温育所述混合物。温育后,洗涤所述珠子或微量滴定板的孔以除去任何未结合的组分,当用珠子时则为固定的基质,如上所述,直接或间接测定复合物。或者,可以将所述复合物与所述基质解离,并使用标准技术测定多肽结合或活性的水平。
在一个选择性的实施方案中,可以通过如上描述的基于细胞的实验来确定测试化合物调节感兴趣的免疫相关多肽的活性的能力,例如通过确定测试化合物调节在所述多肽下游起作用的多肽活性来鉴定该试剂的能力。例如,如前所述,可以确定第二信使的水平、可以确定相互作用多肽在适当靶标上的活性、或者可以确定相互作用物与合适靶标的结合。
在一些实施方案中,可以与对照(上文描述了该术语)进行比较,来完成对感兴趣的免疫相关指标的调节的确定,以及过表达、过度活性、表达不足活性不足等(上文也描述了这些术语)的确定。
在另一个方面,监测试剂对本发明所述一种或多种生物标志物(包括表1、附图和实施例中列出的一种或多种生物标志物)或其片段的表达或活性的影响(例如,对 T细胞耗竭和/或免疫障碍的调节)不仅可用于基础药物筛选,还可用于临床试验。例如,可以在表现出目的基因的调节表达和/或其功能性后果(例如,T细胞耗竭的调节和/或免疫障碍)的受试者的临床试验中,监测通过本文所述的筛选试验确定的试剂调节基因表达(包括表1、附图和实施例中列出的一种或多种生物标志物或其片段) 的有效性。在此类临床试验中,生物标志物的直接表达和/或活性,或调节的T细胞耗竭和/或免疫障碍症状的间接结果可用作特定细胞表型的“读数”或标志物。
在一些实施方案中,本发明提供了监测试剂(例如,改造的T细胞、激动剂、拮抗剂、肽模拟物、多肽、肽、核酸、小分子或通过本文所述的筛选实验鉴定的其他候选药物)对治疗受试者的有效性的方法,所述方法包括以下步骤:(i)在施用所述试剂之前从受试者获得施用前样品;(ii)检测施用前样品中,本发明所述的一种或多种生物标志物(包括表1、附图和实施例中列出的一种或多种生物标志物)或其片段的表达和/或活性水平;(iii)从所述受试者获得一个或多个施用后样品;(iv)检测所述施用后样品中所述生物标志物的表达或活性水平;(v)将施用前样品中所述生物标志物或其片段的表达或活性水平与施用后样品中所述生物标志物的表达或活性水平进行比较;和(vi)相应地改变所述试剂对所述受试者的施用。例如,可能需要增加所述试剂的施用以将一种或多种生物标志物的表达或活性提高至高于检测到的水平(例如,以增加所述试剂的有效性)。或者,可能需要减少所述试剂的施用以将所述生物标志物的表达或活性降低至低于检测到的水平(例如,以降低所述试剂的有效性)。根据这样的实施方案,即使在没有可观察到的表型应答的情况下,也能将生物标志物的表达或活性用作试剂有效性的指标。
本领域技术人员还应当理解,在某些实施方案中,本发明所述方法执行计算机程序和计算机系统。例如,可将计算机程序用于执行本文描述的算法。计算机系统还可以存储和处理由本发明所述方法产生的数据,所述数据包括多个生物标志物信号变化 /谱,计算机系统可以使用这些变化/谱来实施本发明所述方法。在某些实施方案中, (i)计算机系统收到生物标志物表达数据;(ii)存储所述数据;(iii)以本文所述的任何数量的方式比较所述数据(例如,相对于适当的对照进行分析)以确定来自癌性或癌前组织的信息性生物标志物的状态。在其他实施方案中,计算机系统(i)将所述确定的表达生物标志物水平与阈值进行比较;(ii)输出所述生物标志物水平是否被显著调节(例如,高于或低于上升阈值)的指示,或输出基于所述指示的表型。
在某些实施方案中,这种计算机系统也被认为是本发明的一部分。根据生物信息学和/或计算机领域的技术人员所拥有的知识,可以使用许多类型的计算机系统来实施本发明所述分析方法。在这种计算机系统的操作期间,可以将几个软件组件加载到存储器中。所述软件组件可以包括本领域标准的软件组件和本发明特有的组件(例如, Lin et al.(2004)Bioinformatics 20,1233-1240中描述的dCHIP软件;本领域中已知的径向基础机器学习算法(RBM)。
还可以通过数学软件包对本发明所述方法进行编程或建模,所述数学软件包允许方程的符号输入和高级别的规范化处理(包括要使用的特定算法),从而使用户无需程序化地编程单个方程和算法。这种软件包包括例如来自Mathworks(Natick,Mass.) 的Matlab、来自Wolfram Research(Champaign,Ill.)的Mathematica或来自MathSoft (Seattle,Wash.)的S-Plus。
在某些实施方案中,所述计算机包括用于存储生物标志物数据的数据库。可以访问这些存储的文档,并在稍后的时间点将其用于执行目的比较。例如,可以存储源自受试者的非癌组织的样品的生物标志物表达谱和/或相同物种的相关群体中从基于群体的目的基因座的分布产生的谱,并随后将其与源自所述受试者的癌组织的或所述受试者的疑似癌变的组织的样品的谱进行比较。
除了本文描述的示例性程序结构和计算机系统之外,其他替代的程序结构和计算机系统对于本领域技术人员来说应是显而易见的。因此,在所附权利要求中可以理解在主旨或范围上不脱离上述计算机系统和程序结构的替代系统。
VII.试剂盒
本发明还包括试剂盒。例如,所述试剂盒可以包括包装在合适的容器中的单独的或与其他免疫调节剂组合的改造的T细胞,并且可以进一步包括使用这些试剂的说明书。所述试剂盒还可以包含其他组分,例如包装在单独容器中的施用工具。
在以下实施例中描述了本发明的其他实施方案。通过以下实施例进一步阐明本发明,这些实施例不应被解释成是进一步的限制。本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容以及附图均通过引用并入本文。
实施例
实施例1:实施例2-6的材料和方法
a.小鼠
野生型C57/BL/6N(CD45.2+)和同类系的B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ(CD45.1+)小鼠获取自美国国家癌症研究所。C57BL/6N P14小鼠(LCMV特异性T细胞受体转基因小鼠)在本机构内部饲养。雄性小鼠在6至10周龄之间使用。所有动物实验均根据宾夕法尼亚大学的动物护理和使用指南进行。
b.淋巴细胞的感染和分离
如Lara-Astiaso等人(2014)Science 345:943-949;Gupta等人(2015)PLoSPathogens 11:e1005177;Kurachi等人(2014)Nat.Immunol.15:373-383;和Odorizzi等人(2015)J. Exp.Med.212:1125-1137中的描述,产生并滴定LCMV菌株。通过腹腔注射LCMVArmstrong(2×105个噬菌斑形成单位)或静脉注射LCMV克隆13(4×106个噬菌斑形成单位)感染两个组群的小鼠。使用CD8阴性选择(Miltenyi Biotec)从初始脾脏制备所有供体P14细胞。为了产生效应性、记忆性和耗竭性CD8+ T细胞,将约1-2×103个P14细胞转移到受体小鼠中,然后在一天后进行LCMV感染。仅在感染(腹腔注射)后第8天或第27天从接收感染的脾脏收获目标效应性/记忆性/耗竭性P14细胞。在使用CD45.2 FITC抗体和抗FITC微生物(Miltenyi)进行富集后,将细胞染色并通过AriaTM II(BD)分选。通过分别对CD8+ TCRVa2+CD62L+ CD44lo和CD8+ TCRVa2+ CD45.2+ CD45.1-群进行门控,分选出初始的和效应性/记忆性/耗竭性CD8+ T(P14) 细胞。将以下来自BioLegend的荧光染料缀合的抗体用于流式细胞术:抗TCRVα2 (B20.1)、抗CD8α(53-6.7)、抗CD44(IM7)、抗CD45.1(A20)、抗CD45.2 (104)和抗CD62L(MEL14)。
c.ATAC-Seq
将每个生物重复(初始、急性d8、急性d27、慢性d8、慢性d27和EL4)中大约 40-50,000个细胞在冷的PBS中洗涤一次,并在50μL冷的裂解缓冲液(10mM Tris-HCl,pH7.4,10mMNaCl,3mM MgCl2,0.1%CA-630)中裂解。如 Buenrostro等人(2013)NatureMethods 10:1213-1218和Long等人(2015)Nat.Med. 21:581-590中的描述,将裂解的细胞核在Tn5转座反应混合物中温育并使用/>Reaction Cleanup试剂盒(Qiagen)纯化。使用Pippin PrepT M2%琼脂糖凝胶盒和Pippin PrepTM DNA大小选择系统(Sage Science),对来自急性d8、急性d27、慢性d8和慢性d27的一组重复,以及初始细胞和EL4细胞的生物学重复的ATAC-Seq片段进行 115-600碱基对(bp)的大小选择。在大小选择后,扩增ATAC文库并使用聚合酶链式反应(PCR)连接NexteraTM测序引物。最后,使用/>XP珠清理(Beckman Coulter/Agencourt)去除PCR引物,并使用TapeStation机器验证文库质量。使用Illumina HiSeqTM 2000测序系统对高质量的“多重”DNA文库进行测序。
d.ATAC-Seq数据的质量控制以及与基因组的比对
将FASTQC通道(Babraham Bioinformatics)用于读数,用1.1.1版本的bowtie 软件(Langmead等人(2009)Genome Biol.10:R25)将其与参考基因组(mm9)比对。仅保留定位至基因组独特位置的读数[“-m 1”]。使用PICARD软件在bam文件中标记重复读数,并检查引物序列的污染情况。
e.鉴定ATAC-Seq数据中的峰
在将读数与参考基因组比对后,将与正链对齐的读数移动+4个碱基对(bp),并将与负链对齐的读数移动-5bp(Buenrostro等人(2013)Nature Methods 10:1213-1218;Long等人(2015)Nat.Med.21:581-590)。对于五个重复对中的每一对,将两个重复通过使用samtools软件合并,并且使用2.1.0版本的macs2软件调出峰,其中FDR设置为0.001并且使用“nomodel”和默认的小鼠基因组大小选项。为了产生峰集合(universe of peaks),取所有这些峰的并集,同时合并重叠区域。
f.鉴定峰中的差异活性
从数据中提取移位的ATAC-Seq切割位点,并计算落入每个峰区域中的数量。然后使用DESeq2软件鉴定峰之间切割位点的差异丰度。执行了对五种条件所有的成对比较,并且将FDR低于0.05认为是有差异的。
g.ATAC-Seq峰中基因组特征的富集
对每个样品研究了通过MACS2软件计算得到的峰集,用于基因组特征相对于其在小鼠基因组中的覆盖度的富集。对于每个基因组特征,将富集倍数计算为[基因组特征与ATAC-Seq峰区域的重叠/峰区域的总大小]/[基因组特征与小鼠基因组的重叠/ 小鼠基因组的有效大小],所有大小都以碱基对表达。
将小鼠基因组的有效大小设定为2,716,965,481bp。使用二项式测试计算P值,其中n=峰数,x=注释重叠峰数,p=(与小鼠基因组的重叠/小鼠基因组的有效大小)。
使用的基因组特征包括:(i)来自Ensemble数据库的调控性特征注释(Flicek 等人(2011)Nucl.Acids Res.39:6),(ii)通过ORegAnno数据库发现的调控特征 (Griffith等人(2008)Nucl.Acids Res.36:13),(iii)通过multiz30way算法注释的保守区域,这里考虑为具有multiz30way评分>0.7的区域,(iv)由RepeatMasker注释的重复区域(可在万维网repeatmasker.org上获取),(v)推定的启动子区域-取RefSeq 中注释的转录物上游10kb和下游1kb(Pruitt等人(2007)Nucl.Acids Res.35:5),(vi) RefSeq中的基因体注释;(vii)3′近端区域(取至3′端的上游1kb和上游5kb);(viii) 富含BATF、IRF4、c-Jun、JunD和JunB结合的区域,以及组蛋白标记,H3K4me1、 H3K4me3、H3K27ac、H3K36me3和H3K27me3(多梳抑制),以及使用Poised Enhancer、 Active Enhancer、Bivalent Promoter、DevelopmentalEnhancer和Init软件的其他注释。使用了CD8+ T细胞中的启动子(Kurachi等人(2014)Nat.Immunol.15:373-383和 Lara-Astiaso等人(2014)Science 345:943-949)。此外,添加了在本研究中获得的两个 EL4细胞重复的峰。
h.聚类和基因本体(Gene Ontology)分析
使用GENE-E(Broad Institute)软件将K均值聚类应用于所有五种细胞状态的差异性ChAR信号强度。使用MATLAB中的间隙统计确定最佳簇数。使用具有默认设置的GREAT软件(可在万维网beierano.stanford.edu/great/public/html/上获取)确定 ChAR与邻近基因的关联以及模块内基因本体术语的富集度。表1中列举了所有重要的GO术语(term),而选择的GO术语在图3D中作为热图呈现。
i.CRISPR设计
选择指定sgRNA的寡核苷酸序列,基于 broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design-v1万维网上广泛提供的公共工具,使命中靶标效率最大化。如先前Shalem等人(2014)Science 343:84-87和Gjoneska 等人(2015)Nature 518:365-369中的描述,将单链sgRNA寡核苷酸(整合DNA技术) 退火并连接到PXPR003中。使用慢病毒包装或核转染将sgRNA质粒引入细胞系。对于慢病毒生产,将293T细胞接种在含有10%(体积/体积)FBS的DMEM中。使用 TurboFectTM(ThermoFisher)用sgRNA质粒和包装质粒Δ8.9和VSV-g转染细胞。72 小时后收集病毒上清液。对于核转染,将EL4细胞与100μl的NucleofectorTM溶液和2μg 的sgRNA质粒混合。然后使用NucleofectorTM试剂盒L(Lonza)和Amaxa NucleofectorTM I机器上的C-09程序转染细胞。
j.细胞培养
在含有10%(体积/体积)FBS、HEPES、青霉素/链霉素和β-巯基乙醇的RPMI (R10培养基)中培养EL4细胞(ATCC)。使用如上所述慢病毒包装的PLX304质粒产生表达Cas9的细胞系。然后用sgRNA质粒转导或转染表达Cas9的细胞,使用嘌呤霉素选择质粒存在,并用于选择后3-5天的所有后续实验。使用有限稀释来制备主体(bulk)EL4的单细胞克隆。
k.报告子实验
将对应于-23.8kb PD-1增强子(chr1:113 95971119-95971900,mm9)的781bp 核心的DNA序列和CMV启动子克隆到慢病毒构建体内驱动GFP表达的TATA盒最小启动子的上游。如上所述对质粒进行慢病毒包装。通过在20,000xg下超速离心2 小时,将病毒上清液浓缩100倍。
使用CD8阴性选择试剂盒(Miltenyi Biotec)从初始脾脏分离得到CD8+ T细胞,并在R10培养基中培养。在存在重组人IL-2(100 U/ml,R&D Systems)的条件下,用与平板结合的抗CD3(4μg/ml;2C11;BD Pharmingen)和抗CD28(4μg/ml; 37.51;BDPharmingen)刺激初始细胞24小时,用于转导前的体外活化。通过用聚凝胺(5ug/ml)温育以及旋转感染(37℃下2,000 RPM45分钟),用浓缩病毒转导体外活化的T细胞和EL4细胞。转导后48-72小时通过流式细胞术测量GFP的表达。
l.增强子删除
使用侧接所述区域的一对sgRNA靶向序列,删除来自Pdcd1 TSS的-23.8kb区域。对转染了靶向-23.8kb的sgRNA或阴性对照sgRNA(图8A和9A)的EL4细胞基于不同水平的PD-1表达进行分选,并使用基因组PCR检测分选的EL4中的缺失。使用 50ul QuickExtractTM DNA溶液从主体和克隆细胞系中分离出基因组DNA,并根据制造商的说明进行温育。使用缺失筛选引物对对来自每个样品的基因组DNA进行PCR (图8B和9B),并在含有EtBr的1%琼脂糖凝胶上进行电泳。对于克隆系,将双等位基因缺失克隆定义为仅具有缺失带的PCR扩增,而非缺失克隆仅扩增WT带。通过将PCR扩增产物提交用于Sanger测序来验证缺失。
m.RT-qPCR
在RLT中裂解将克隆细胞系以及接受对照sgRNA的主体细胞群,并使用Plus Mini试剂盒(Qiagen)提取RNA。使用ImProm-IITM逆转录酶(Promega)产生 cDNA,并使用/>探针在ViiATM 7定量PCR仪器上分析。
n.原位饱和诱变
使用可公开获取的在线工具(可以在万维网portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design上获取),限于在所有9 个PD-1增强子和所有PD-1外显子中存在的前间隔序列邻近基序,设计所有可能的平铺式sgRNA。非靶向性sgRNA由Broad Institute的Genomics Perturbation Platform设计。如先前Lara-Astiaso等人(2014)Science 345:943-949和Raimondi等人(2006)J. Immunol.176:2808-2816的描述,所有sgRNA寡核苷酸都被合成并克隆到 lentiGuide-Puro载体骨架中。质粒文库如上所述经慢病毒包装,并通过用聚凝胺 (5ug/ml)温育以及旋转感染(37℃下2,000 RPM45分钟)来转导表达Cas9的EL4。进行了对照转导以确保1,000×的文库覆盖率,并且感染的多重性为约0.3。用嘌呤霉素对转导的细胞选择72小时,并在选择后取样品作为文库的起始d0代表。在整个实验过程中培养细胞以确保对文库始终有1,000×的覆盖率。
用抗PD-1荧光抗体对文库转导的细胞进行染色,并分选为高PD-1和低PD群体 (图7C)。选择后在d20-d50之间进行重复分选,并使用血液和组织试剂盒 (Qiagen)从分选的群体中分离出基因组DNA。如先前在Lara-Astiaso等人(2014) Science 345:943-949和Raimondi等人(2006)J.Immunol.176:2808-2816中的描述,对来自选择后的d0的主体细胞、输入质粒池以及分选的群体进行了测序。通过将读数归一化至文库测序深度,在每个样品中定量了SgRNA丰度。如下计算了相对于低PD-1 群体,高PD-1群体中的SgRNA富集度:1)对每个样品中的sgRNA丰度进行对数转换;2)从每个样品中的sgRNA丰度中减去d0处的sgRNA丰度,以考虑sgRNA表达的初始变异;3)将任何在至少一个分选的样品中未检测到的sgRNA作为细胞丢失排除于进一步分析之外;4)对于每个分选的样本(高的和低的单独进行分析),计算相对于对照引导分布的z分数,将靶向增强子和外显子的sgRNA的丰度归一化;5) 将低PD-1区室中每个sgRNA的经归一化的评分从高PD区室中的评分中减去,以产生每个重复的每个sgRNA的归一化富集评分;6)对每个sgRNA的富集分数在重复间取平均数。将靶向增强子和外显子的sgRNA切割位点定位至小鼠基因组(mm9),而对照的非靶向sgRNA以5bp间距进行假性定位。
o.验证个体sgRNA
选择在-23.8kb增强子内富集于PD-1低级分的32个(32)sgRNA用于个体验证。将代表每种sgRNA的寡核苷酸(IDT)分别克隆到Cas9和sgRNA双递送构建体中。然后如前所述将质粒核转染到EL4细胞中以产生32个同基因细胞系。核转染后18-36 小时在嘌呤霉素中选择每种细胞系,并在R10培养基中培养。对细胞进行针对PD-1 的表达或相应的同种型对照的染色。将每个细胞系中PD-1表达的几何平均荧光强度 (MFI)归一化至用同种型对照染色的MFI。
p.识别基因组中的基序
使用了来自可在万维网meme-suite.org/db/motifs上的数据库列表中获取的Jolma 2013(Jolma等人(2013)Cell 152:327-339)、Chen 2008(Chen等人(2008)Cell 133:1106-1117)、UniPROBE(小鼠)(Hume等人(2015)Nucl.Acids Res.43:22),以及 JASPAR2014(核心脊椎动物)的PWM数据库。然后使用FIMO(Grant等人(2011) Bioinformatics 27:1017-1018)以及1×10-5的阈值在小鼠基因组的第9版中调出了基序。开始时最初共有1,446个基序,并且去除了任何具有零个命中、或超过150万个命中的基序。接下来,为每个基序添加了进化性保守以及到TSS的距离。取在每个基序中所发现的平均进化性保守,并使用bedtools软件(Quinlan(2010)Bioinformatics 26:841-842)的“最接近”功能来找到每个基序的最近TSS。自UCSC基因组浏览器创建TSS文件。
q.使用Centipede软件推断转录因子(TF)足迹
使用了Centipede程序来推断每个基序实例中转录因子(TF)结合的后验概率。在两条链上分别运行测算每个基序的进化性保守评分,与TSS的距离和PWM评分,以及在基序周围220bp窗口中的每个位置上发现的ATAC-Seq切割的数量。为了评估模型的准确性,在没有保守、进化性保守的后验概率、与TSS的距离,并且回归了 PWM评分的条件下另运行一例Centipede,并且去除了在至少一个样品中与进化性保守没有强烈的正关联的基序(系数的单侧Z值测试为P<0.05)。
r.识别TF与病症的关联
为了测试给定的TF是否与病症相关,进行了对所有成对的病症组合的超几何测试。相比于其他条件,如果TF在某个给定条件下比随机情况下预期的更经常出现在峰处,则将该TF标记为该条件下是差异性结合的。
s.TF的排序
从先前公开的数据集(Doering等人(2012)Immunity 37:1130-1144;Buenrostro等人(2013)Nat.Methods 10:1213-1218)中获得了每个TF的归一化mRNA表达,并且在第7天(d7)和第30天(d30)计算了急性和慢性感染之间的对数倍数变化的绝对值。然后将TF与量化在d8和d27处的差异性结合的超几何P值相关联(如上所述)。然后,对于这四个注释,将每个TF从最大到最小差异性进行排序,表示在d7-8和d27-30 处基因表达和TF结合的变化。以四个单独分数的平均值确定每个TF的最终排序。
t.TF与区域结合的分析
使用0.90或更高的后验概率截止值由Centipede推断出转录因子与区域的结合。根据排序(如上所述的前100位;表1)和已知的CD8+ T细胞生物学方面的相关性(JUND、RUNX3、JUNB、STAT5A-STAT5B、FOXP1和TCF7),确定出106个转录因子基序,对其中的每一个推测在全基因组范围的结合。基于它们的差异性结合和在CD8+ T细胞转录调节中的已知作用,将这106个TF进一步过滤至50个。然后分析了急性和慢性状态下所述50个TF的每个TF基序处的结合的实例。每个结合事件被分类为仅存在于急性、仅存在于慢性或存在于两个状态下。在d8和d27进行这种急性或慢性感染下基序结合之间的比较。因此,在d8和d27,确定了慢性感染、急性感染独有或共有的每个TF基序的结合事件百分比的计算值。将TF结合的这种仅发生于急性或慢性感染中,而非两种情况下都结合的偏倚性量化为在慢性感染的每个时间点处所见的所有独有结合事件的百分比。此外,使用GREAT软件将每个含有至少一个结合基序的区域与靶基因相关联。然后通过在 d7和d30处的急性和慢性感染之间的mRNA表达,可以将所有靶基因定义为上调的、下调的或未改变的(Doering等人(2012)Immunity37:1130-1144)。因此,将TF基序和邻近的靶基因之间的每个结合事件(其使用更严格的概率截止值即>0.95来定义)分类成靶向在急性感染中上调的基因,在慢性感染中上调的基因或未改变的基因(表1)。
u.受试者
选择西雅图自然进展组群中的四名感染HIV的参与者进行本研究(Sunshine等人(2014) J.Virol.88:1354-1365)。进展者被定义为在上一年具有>10,000 RNA拷贝/ml的中位病毒载量。所有受试者均在慢性感染中进行研究,并且没有接受过抗逆转录病毒治疗。从每个受试者中获取大约4千万至6千万个PBMC。相关的机构审查委员会批准了所有人类受试者的实验方案,并且所有受试者在被招募前都提供了书面知情同意书。从单个HCV感染患者获取了基线样品,所述患者被招募进一项研究来评估成功的抗病毒疗法在1a基因型丙型肝炎病毒感染的先天性和获得性免疫应答方面的效果(NCT02476617)。所述HCV受试者被慢性感染,HCV病毒载量为828,000 IU/ml。基于表达的HLAI类等位基因,使用HLAI 类多聚体筛选了病毒特异性的CD8 T细胞应答。识别了靶向HCV A*02:01 C63B CINGVCWTV、HCV A*24:01 174D VIAPAVQTNW和流感A*02:01 MP GILGFVFTL的应答。通过FACS从经白细胞分离术获得的PBMC中分离出多聚体结合的CD8+ T细胞。患者已同意了这个经机构审查委员会批准的研究。
经由密度离心从正常志愿者中获取了PBMC,并筛选对CMV四聚体阳性的T细胞应答。相关的机构审查委员会批准了人类受试者的实验方案,并且所有受试者在被招募前都提供了书面知情同意书。
v.分离用于ATAC-Seq的人淋巴细胞群
在补充有10%FBS的温热RPMI中快速解冻PBMC。使用CD8负选择试剂盒(Miltenyi Biotec)富集CD8+ T细胞。富集后,将细胞染色并在FACSAriaTM细胞分选仪(BDBiosciences)上分选(细胞分选方案参见图11A)。使用以下来自Biolegend的荧光染料缀合抗体进行流式细胞术:抗CD45RA(HI100)、抗CCR7(G043H7)、抗2B4(C1.7)、抗CD3(OKT3)、抗275 CD39(A1)、抗PD-1(EH12.2H7)和CD8a(SK1)。使用以下荧光染料缀合的多聚体进行流式细胞术:HIV A*03:01 RLRPGGKKK、HIV A*02:01 SLYNTVATL、HIV B*08:01 GEIYKRWII、CMVA*02:01 pp65-NLV NLVPMVATV、HCV A*02:01 C63B CINGVCWTV、HCV A*24:01 174DVIAPAVQTNW和流感A*02:01 MP GILGFVFTL。在补充有10%FBS的PBS中分选最多70,000个细胞,并且如前所述生成 ATAC-Seq文库。由于起始材料有限,在Illumina HiSeq2000测序仪上进行多重测序之前,未对ATAC文库进行大小选择。如前描述的那样进行了测序后的质量控制,人ATAC读数与人类基因组(hg19)的比对,MACS2峰的调出以及DESeq2峰的基准化。
w.将峰值定位至人类基因组以及SNP分析
如Gjoneska等人(2015)Nature 518:365-369和Ernst等人(2011)Nature 473:43-49中的描述,将直系同源小鼠ChAR(mm10)定位至人类基因组(hg19)。由于定位算法需要mm10 中的输入区域,因此将UCSC liftover工具应用于ChAR以将它们从mm9转移到mm10。NHGRI目录(可在万维网ebi.ac.uk/gwas/上获取)中注释为“免疫系统疾病”的GWAS SNP 定义为与免疫相关。进行了超几何测试,其量化了定位的增强子与所有GWAS SNP、免疫相关SNP以及PICS SNP的重叠。
x.小鼠和人类数据的比较分析
基于MACS2调出的峰,将在5种细胞状态(初始、急性d8、急性d27、慢性d8、慢性d27)中识别的所有小鼠峰分为3类:相对于急性和慢性d27,独有地在初始细胞中识别的峰(仅为小鼠初始性的),相对于初始和慢性d27,独有地在急性d27细胞中识别的峰(仅为小鼠记忆性的),以及相对于初始和急性d27,独有地在慢性d27 细胞中识别的峰(仅为小鼠耗竭性的)。所有未被分类到这3类之一中的小鼠峰均被排除在进一步分析之外。将三个类别(初始性、记忆性、耗竭性)内的直系同源小鼠峰定位至人类基因组并过滤,以得到与在所有人类样品中独立调出的至少一个 MACS2人类峰的重叠。然后,对每个人类样品,分别计算3类小鼠直系同源峰(初始性、记忆性、耗竭性)的平均染色质可及性。将每个类别中的平均染色质可接近性归一化,以说明3类峰中染色质可接近性的内在差异。
y.HCV表位的扩增和深度测序
对于HCV表位174D和C63B,使用以下条件产生了围绕这些表位的扩增子。该反应由以下组成:2×第一链缓冲液(First Strand Buffer),0.4μM的正义(A2F:AAC GTT GCG ATCTGG AAG AC或A3F:GCT CTC ATG ACC GGC TTT AC)和反义引物(A2R:GGA AGC GTG GTT GTCTCA AT或A3R:AGA GAT CTC CCG CTC ATC CT),以及Superscript III RT/Platinum Taq混合液(Invitrogen),具有以下条件:在 50℃下cDNA合成30分钟,然后在94℃下热变性2分钟,PCR扩增条件为40×(94℃, 15秒;55℃,30秒;68℃180秒),最终在68℃下延伸5分钟。依照制造商的方案,使用NexteraXT DNA文库制备试剂盒将PCR扩增子片段化和条码化。汇集样品并使用2×250bp V2试剂盒在Illumina MiSeq平台上测序。使用VICUNA从头组装(denovo assembler)软件(Yang等人(2012)BMC Genomics 13:475)将由Illumina MiSeq测序获取的配对末端读数组装成HCV共有序列,并用V-FAT v1.0完成。使用Mosaik v2.1.73软件将读数定位回到该共有序列并使用V-Phaser v2.0软件调出宿主内变体 (Yang等人(2013)BMC Genomics 14:674;Henn等人(2012)PLoS Pathogens 8:e1002529)。所有读数已经保藏在NCBI序列读取档案中,保藏号为SRR3951347。
实施例2:初始CD8+ T细胞的染色质可接近性在分化期间经历大规模的重塑
为了识别耗竭性CD8+ T细胞中的调控区,如增强子和启动子,用ATAC-Seq(Buenrostro等人(2013)Nat.Methods 10:1213-1218)来界定对淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)感染的影响不同的抗原特异性CD8+ T细胞中可接近的染色质的区域 (图1A)。急性LCMV感染在感染后(p.i.)第8天(d8)引发产生高功能性的效应 CD8+ T细胞,其在d27p.i.时分化成保护性记忆CD8+ T细胞。相比之下,慢性LCMV 感染产生耗竭性CD8+ T细胞(Wherry等人(2007)Immunity 27:670-684;Zajac等人 (1998)J.Exp.Med.188:2205-2213;Barber等人(2006)Nature 439:682-687;Doering等人(2012)Immunity 37:1130-1144;Paley等人(2012)Science 338:1220-1225)。对初始 CD8+ T细胞以及d8和d27 p.i.时的CD8+ T细胞的初始分析在每个状态中识别了 22,646和31,969个之间的染色质可接近区域(ChAR)(FDR<0.001;图2A和表1)。生物学重复和预期的片段大小分布之间的高度相关性证实了良好的数据质量 (Buenrostro等人(2013)Nat.Methods 10:1213-1218)(图2B-2D)。ChAR在转录起始位点(TSS)、外显子、内含子和基因间区域之间的分布与先前的报道一致(Thurman 等人(2012)Nature 489:75-82)(图2A和2E)。正如所预期的,来自每个状态的ChAR 对于高度进化保守区域、调节注释区域、激活启动子区域和增强子组蛋白标记区域都是强富集的,但是在Polycomb抑制区域是耗尽的(Thurman等人(2012)Nature 489:75-82;Ernst等人(2011)Nature 473:43-49)(图2F和2G)。
发现初始CD8+ T细胞的染色质可接近性在分化(DE-seq2,FDR<0.05)过程中经历了大规模重塑(图1B-1C)。大多数ChAR(71%,图1C)随着初始CD8+ T细胞经历分化而出现(例如,在Ifng基因座处的ChAR)(图1B)或消失(例如,Ccr7) (图1B)。ChAR的获得和损失是不均衡的;相比于在d8 p.i.瞬时检测到的ChAR(仅 d8;急性为14.9%,慢性为19.6%)(图1D)或从初始细胞中丢失的ChAR(仅初始;急性为总区域的11.3%;慢性为12.6%)(图1D),大得多的一部分区域在d8 p.i. 出现并且持续存在(d8和d27;急性为31.6%,慢性为38.8%)(图1D),或仅在 d27出现(仅d27;急性为14.3%,慢性为16.9%)(图1D)。因此,由初始CD8+ T 细胞状态产生的分化与染色质可接近性的净增加而非减少相关(图2H)。
实施例3:耗竭性CD8+ T细胞中相对于功能性效应或记忆CD8+ T细胞的状态特异性基因组调控区
将来自耗竭性CD8+ T细胞的ChAR与见于功能性效应或记忆CD8+ T细胞中的 ChAR进行比较,并且发现了调控区模式的显著的全局差异。共识别到7,368个ChAR,其存在于d8和/或d27 p.i.时对慢性感染产生应答的CD8+ T细胞中,但在急性感染中不存在(图1E和2I)。此外,识别了4,395个区域,其存在于d8和/或d27 p.i.时的急性感染中,但在耗竭性CD8+ T细胞中缺乏。急性和慢性感染之间的差异性调节区显示了增强子的特征:它们往往耗尽了TSS(5%,相对于非差异区域的14%),富集了基因间和内含子区域(37%,相对于29%以及45%,相对于31%)(图1F),并且在基因启动子远端(图1G)。耗竭性和功能性CD8+T细胞之间在调控区谱上的差异幅度大于基因表达中所见的差异幅度。发现在每个时间点,所有ChAR的44.48%在功能性和耗竭性细胞之间是差异存在的,相比之下,只有9.75%的差异表达基因(两个值均在FDR<0.05下估算)。与该发现一致的是,通过基因表达得到的各T细胞状态之间的等级相关性远高于调控区水平下的等级相关性(图1H)。这些结果表明,CD8+ T细胞分化期间的状态变化伴随着可接近染色质的重组,其大于通过检查基因表达显示出的重组。
无监督聚类识别出具有相似活性模式的差异ChAR“模块”(图4和5A)。识别了代表高状态特异性活性模式的7个调控区模块。模块a-e分别对应于主要在来自初始、急性d8p.i、急性d27 p.i.、慢性d8 p.i.和慢性d27 p.i.的CD8+ T细胞中具有活性的ChAR。模块f识别了初始T细胞和急性d27 p.i.之间共享的ChAR集,而模块g含有初始和慢性d8 p.i之间共享的ChAR(图3B)。发现每个模块内ChAR的平均峰强度与相邻基因的平均基因表达之间具有高度显著的正相关(p<0.001)(图3B-3C)。这些结果表明,平均而言,每个模块中包含的ChAR倾向于与相应基因的激活而非抑制相关。
每个状态特异性模块中的基因包括许多在对应的T细胞状态中具有已知功能的基因。例如,在初始T细胞中最具活性的模块a包含与Ccr7和Lef1相邻的ChAR(图 3D)。在慢性d8和d27 p.i.中有活性的模块d含有与抑制性受体Pdcd1和Havcr2(其编码Tim3)以及转录因子Batf相邻的ChAR,所有这些基因都在耗竭性CD8+ T细胞中上调(Wherry等人(2007)Immunity 27:670-684;Doering等人(2012)Immunity 37:1130-1144)。猜想活性调节区的模块结构会与不同的调节程序相关,并且调查了每个模块内与ChAR相邻的基因的功能。实际上,通过基因本体(Gene Ontology)术语富集度(图3D和表1)测量发现,每个模块中基因的功能类别是不同的。例如,初始相关模块a与参与组蛋白赖氨酸甲基化、IL-2产生的调节和干细胞分裂的基因相关。相比之下,主要在来自急性d8 p.i.的细胞中有活性的模块b与参与细胞趋化和 CD8+α-βT细胞分化的调节的基因有关。与耗竭相关的模块e富集了参与细胞因子产生的负向2650调节、LPS介导的信号传导的负向调节、T细胞活化的负向调节和IL-10 产生的调节的基因。因此,将区分初始的、效应性、记忆性和耗竭性CD8+ T细胞的 ChAR组织成状态特异性的模块,所述模块正向调节功能上不同的基因程序。
实施例4:耗竭性CD8+ T细胞中的状态特异性基因组调控区调节在耗竭性CD8+ T细胞中差异性表达的基因
接下来要测试耗竭性细胞特异性的调控区是否能调节在耗竭性CD8+ T细胞中差异性表达的基因。PD-1的持续表达是耗竭性CD8+ T细胞的主要特征,但在急性LCMV 感染期间效应CD8+ T细胞也可以瞬时表达PD-1(Barber等人(2006)Nature 439:682-687;Doering等人(2012)Immunity 37:1130-1144)。尽管已经在人(Youngblood 等人(2013)J.Immunol.191:540-544)和小鼠(Youngblood等人(2011)Immunity 35:400-412)模型中的耗竭性CD8+ T细胞中观察到了在已知调控区处的持续去甲基化,但是尚不清楚耗竭性CD8+T细胞中的PD-1表达是否受功能性CD8+细胞中所不存在的耗竭特异性调控区的调节。在Pdcd1基因座的45kb内识别到9个ChAR(图 6A),并且发现有几个ChAR对应于先前描述的具有增强子活性的区域(-1.5kb和 -3.7kb)(图6A)(Austin等人(2014)J.Immunol.192:4876-4886);这些在急性和慢性感染中都存在。还识别到位于Pdcd1 TSS上游约-23.8kb的其他区域,其仅在来自慢性感染的d8和d27 p.i时的耗竭性CD8+ T细胞中显示出可观测到的染色质可接近性,而在来自急性感染的初始的、效应性或记忆性CD8+ T细胞中不显示可观测到的染色质可接近性(图6A)。
猜想该ChAR可能起到耗竭性CD8+ T细胞中持续的高水平表达所必需的PD-1 的增强子的作用。与这一想法一致的是,该区域包括两个排序最高的耗竭相关TF的足迹:Runx2(Best等人(2013)Nat.Immunol.14:404-412)和视黄酸受体α(Rara)(Allie 等人(2013)J.Immunol.190:2178-2187;Guo等人(2014)J.Immunol.192:3336-3344)。这促使对小鼠EL4T细胞系中,以及在先前公布的DHS(Vierstra等人(2014)Science 346:1007-1012)或ATAC-Seq数据(Lara-Astiaso等人(2014)Science 345:943-949)中,该区域处的染色质可接近性进行了调查。发现在整个由Lin- Sca+ Kit+细胞产生的造血细胞分化中,没有检测到任何显著水平的染色质可接近性,包括终末分化的细胞类型如粒细胞、单核细胞、B细胞和NK细胞(图6A)。然而,在EL4细胞和调节性T 细胞中的相同区域识别到了ChAR,两者都可以组成性地表达高水平的PD-1(Austin 等人(2014)J.Immunol.192:4876-4886;Raimondi等人(2006)J.Immunol. 176:2808-2816)。为了测试-23.8kb ChAR作为T细胞增强子的功能,将对应于该区域的781bp片段(即mm9构建体的chr1:113 95,971,118-95,971,899)克隆到报告子构建体中,该片段具有以下序列(其通过此引用将完全并入表1中):
相对于仅编码最小启动子的载体,该片段足以诱导报告基因在EL4细胞和体外活化的CD8+ T细胞中的表达增加10-12倍(图6B)。这表明在-23.8kb处的CHAR可以起到增强子的作用。
然后测试了-23.8kb增强子是否是高水平PD-1的表达所必需的。使用CRISPR/Cas9核酸酶在EL4细胞中的该位置处删除了1.2kb的片段,所述EL4细胞在该增强子位点处具有持续的高水平PD-1表达和开放染色质(Shalem等人(2014) Science 343:84-87;Canver等人(2015)Nature 527:192-197)(图5A-5E)。然后使用几种方法测试了-23.8kb区域的丢失是否会影响PD-1的表达。首先,确定了该区域是高水平的PD-1表达所必需的。用一对侧接在所述增强子的sgRNA或用对照引导物转染了表达Cas9的EL4细胞,将所述细胞分选成在PD-1表达方面不同的亚群,并通过基因组PCR测试了每个亚群中所述细胞的增强子缺失的或野生型等位基因的相对丰度(图6C)。在转染有靶向-23.8kb的sgRNA对的EL4细胞中,PD-1表达最低的细胞具有最高的增强子缺失条带丰度,并且具有最低的野生型条带丰度。
其次,产生了大量的来自转染有23.8kb sgRNA对的PD-1lo EL4细胞的单细胞克隆。筛选的45个克隆中有9个克隆(20%)(图5F-5G)被确认为具有-23.8kb区域的缺失,并且进一步发现所述缺失的克隆的几何平均荧光强度(MFI)显著低于未缺失的克隆(Mann-Whitney检验,P<0.002)(图5G)。使用Sanger测序确认了-23.8kb ChAR的缺失(图5H),并且发现所有9个克隆都具有PCR缺失条带,其显示靶标 ChAR的双等位缺失。图5H中所示的序列如下:
该区域的缺失导致PD-1表达降低了63.2%,但没有导致表达的完全丧失,这表明EL4细胞中的其他调节区也参与调节PD-1的表达(图6D)。
第三,通过定量Pdcd1基因座的1.5Mb内的具有可检测表达的所有基因的表达,来评估-23.8kb ChAR的缺失是否特异性地降低PD-1的表达。-23.8kb ChAR的缺失仅显著降低了PD-1 mRNA的表达(图5I)。该结果表明,存在于耗竭性而非功能性CD8+ T细胞中的-23.8kb ChAR充当增强子的作用,是维持高水平的PD-1表达所必需的。
接下来要识别-23.8kb增强子内的特定序列对PD-1表达调节的功能性贡献。使用了Cas9介导的原位饱和诱变。设计了由前间隔序列邻近序列(PAM)限制的、在增强子内所有可能的sgRNA(Canver等人(2015)Nature 527:192-197;Vierstra等人(2015) Nat.Methods12:927-930)。为了比较诱变-23.8kb增强子与邻近Pdcd1基因座的其他调节元件的效果,还设计了一组类似的平铺式sgRNA,以靶向通过ATAC-Seq分析定义的其他8个PD-1调节序列(图6A)。用1,754个靶向增强子的sgRNA,117个靶向Pdcd1外显子的sgRNA(作为阳性对照)和200个非靶向性sgRNA(作为阴性对照)转导表达Cas9的EL4细胞(图7A)。相邻sgRNA之间的中位距离为5bp,其中90%的sgRNA落在彼此的18bp内,从而允许以高分辨率识别破坏PD-1表达的基因组切割位点(图7B)。
基于PD-1表达的高低,将经转导的EL4转导成群体,并通过对提取到的基因组 DNA进行测序来定量两个分组内各个sgRNA的丰度(图7C)。非靶向sgRNA在高 PD-1部分和低PD-1部分之间同等分布,与此相比,靶向Pdcd1外显子的sgRNA如预期的那样在低PD-1部分中高度富集(图6E和7D-7E)。发现靶向9个调控区中的 8个的sgRNA也在不同程度上显著富集于低PD-1部分(p<0.00001到p<0.01),表明8个调控区中的每个影响PD-1表达的关键序列的密集呈现。然而,-35.6kb ChAR 中的sgRNA对PD-1表达没有显著影响,这与先前的观察结果一致,即该区域落在 Pdcd1基因座的CTCF介导的边界之外(Austin等人(2014)J.Immunol.192:4876-4886)。
通过产生表达Cas9的EL4细胞的32个等基因系(每个都转染有在低PD-1部分中富集的增强子内的一个sgRNA),重点关注了-23.8kb增强子内的sgRNA。发现在 PD-1阴性部分中最为富集的sgRNA的合并环境中的预测活性(高PD-1∶低PD-1比率>低于平均值1个标准差的值)与它们对个体细胞系中PD-1 MFI的效应具有强相关性 (p=0.0041)(图6F)。该结果表明,合并筛选识别出以高特异性破坏增强子的关键序列的sgRNA。对预测的切割位点位置的检查揭示了增强子的三个关键区域,在所述关键区域中切割显著影响PD-1的表达(图6G,灰色阴影)。
接下来的问题是-23.8kb增强子中的这些关键区域是否与体内耗竭性CD8+ T细胞中转录因子(TF)结合的不同模式相关。由于TF ChIP实验在稀少的耗竭性CD8+ T 细胞群中不可行,因此分析了来自耗竭性d27 CD8+ T细胞的ATAC-Seq轨迹,以基于已知TF基序上转座酶切割位点的减弱(即TF足迹)来推断TF结合(即TF足迹) (Pique-Regi等人(2011)Genome Res.21:447-455)(图8A-8B和表1)。为了验证数据中的TF足迹,首先证实了该方法可以概括TF结合的ChIP-seq数据。将TF足迹与体外活化的CD8+ T细胞中BATF和IRF4的现有TF ChIP数据进行比较,发现了高水平的灵敏度和特异性(AUC=0.77和0.84)(图8C-8D)。还识别到初始和急性d8 p.i. 细胞中的差异性TF足迹(用后验概率>0.90来调出结合位点)(图8A-8D)。该分析揭示了与效应功能的已知调节子(包括AP-1家族的TF(Batf,Jun和Fos)以及初始 T细胞调节子Lef1)相关的基序(Kaech和Cui(2012)Nat.Rev.Immunol.12:749-761; Kurachi等人(2014)Nat.Immunol.15:373-383)(图10A)。
在验证了ATAC-Seq数据的TF足迹分析后,在慢性d27耗竭性T细胞中识别了 -23.8kb PD-1增强子内的TF足迹。发现在EL4细胞中降低PD-1表达的sgRNA的切割位点显著富集于见于体内耗竭性CD8+细胞的TF结合基序(P=8.63×104,超几何测试)。对破坏具有最大敏感性的三个TF足迹对应于体内耗竭性CD8+ T细胞中Sox3、 T-bet(由Tbx21编码)和视黄酸受体(RAR)的基序(图6G和10B)。基于这些数据,认为在耗竭性CD8+ T细胞中,TF与-23.8kb增强子中的这些基序的结合在调节 PD-1中起关键作用。
为了确定这些基序上的TF结合的增加是否是T细胞耗竭的更加一般性的特征,在d27时比较了慢性和急性感染之间的全基因组TF足迹,并且识别了135个显示了显著差异的推断性结合的TF基序(图6H和表1)。有几个特征表明在这些TF基序处的结合可能在调节T细胞耗竭中起作用,包括发现排序最高的TF在活性调节区的模块之间显示出优先结合的不同模式(图9A)。首先,在d27p.i.时,在慢性与急性感染中的CD8+ T细胞之间差异表达的基因中比在没有差异表达的基因中更频繁地观察到了结合基序(超几何P=9.85×10-3,差异性基因表达FDR<0.05)(图10A)。其次,通过分析揭示的许多结合基序对应于在耗竭中具有已知作用的TF(图6H和10C),包括T-bet(Tbx21;Paley等人(2012)Science 338:1220-1225)、Eomes(Paley等人(2012) Science 338:1220-1225)、Batf(Quigley等人(2010)Nat.Med.16:1147-1151)、Blimp1 (Shin等人(2009)Immunity 31:309-320)、Nfatc1(Martinez等人(2015)Immunity 42:265-278)、Nr4a2(Giordano等人(2015)EMBO J.34:2042-2058)和Mafb(Giordano 等人(2015)EMBO J.34:2042-2058)。第三,其他差异性TF足迹表明了T细胞耗竭的合理的新候选调节子,例如:Pou2f2(也称为Oct-2),其与AP-1家族的TF相互作用(de Grazia等人(1994)J.Exp.Med.180:1485-1497),Foxp1,其调节初始CD8+ T细胞中的静止态(quiescence)(Feng等人(2011)Nature Immunol.12:544-550),以及视黄酸受体α(Rara),其负向调节CD8+ T细胞的记忆发育(Allie等人(2013)J. Immunol.190:2178-2187),同时促进CD8+ T细胞在肿瘤微环境中的功能(Guo等人 (2014)J.Immunol.192:3336-3344)。值得注意的是,发现视黄酸受体α基序(Rara) 处的TF足迹显著富集于耗竭性CD8+ T细胞中(FDR=3.14×10-13),表明该TF家族在耗竭性CD8+ T细胞中的作用超越了PD-1,扩展至调节更大的转录程序。
还发现了慢性感染中TF结合随时间的广泛变化,其主要特征在于在耗竭性CD8+ T细胞中获得新的TF结合事件。如上所述,例如,在d8 p.i,,Tbx21和Eomes在急性感染中比在慢性感染中结合更多的区域,但是到d27 p.i时,两种TF都已经在耗竭性 CD8+ T细胞中获得了大量新的结合位点,这与它们在终末耗竭中的已知作用是一致的(Paley等人(2012)Science 338:1220-1225)(图10C和9B)。更一般来说,观察到从d8到d27 p.i.,TF的结合模式发生显著转变,朝着在d27 p.i.时在慢性感染中的新位点处优先结合的方向(图10C)。这使得与记忆状态相比,耗尽状态中差异性TF 结合事件的数量的相应增加(图9B)。因此,TF结合随时间广泛地重编程,因而发展成T细胞耗竭。
实施例5:耗竭性CD8+ T细胞中的状态特异性基因组调控区与人类疾病相关
对LCMV感染的小鼠模型的分析表明,T细胞耗竭与不同的表观遗传状态相关。为了测试小鼠模型中的耗竭特异性增强子谱是否也是人耗竭性CD8+ T细胞的特征,在来自4名未接受治疗的患有慢性进行性HIV的受试者的HIV特异性的四聚体+ CD8+ T细胞中分析了染色质可接近性的普遍模式(图11A和表1)。将这些模式与见于来自健康供体的巨细胞病毒(CMV)特异性CD8+ T细胞中的模式进行比较。将来自每个供体的初始细胞(CCR7+CD45RA+)和效应记忆细胞(CCR7-CD45RA-)主体细胞群作为对照。发现来自每个供体的ChAR高度富集于激活染色质标记相关的区域,并且耗尽了含有抑制标记的区域,证实了良好的数据质量(图11B)。
将在小鼠模型中识别的ChAR定位至其人类直系同源区域,并且成功地比对了所有小鼠ChAR的80-85%(Gjoneska等人(2015)Nature 518:365-369;Villar等人(2015) Cell160:554-566)(图12A-12B)。自所有五种小鼠CD8+ T细胞状态定位的区域显著富集疾病相关的SNP(PICS SNP,P<2.77×10-8;超几何测试)(Farh等人(2015) Nature 518:337-343)(图12C),特别是免疫相关的NHGRI GWAS SNP(P<3.70×10-3) (图11C-11E),表明定位的区域对应于免疫系统内的重要调控区。但是,如前所述 (Austin等人(2014)J.Immunol.192:4876-4886),PDCD1基因座上的区域并不在自小鼠模型定位的区域之中,这限制了检测小鼠模型中观察到的-23.8kb增强子的直系同源物的能力。
在小鼠中识别了初始性、记忆性(急性d27)或耗竭性细胞(慢性d27)独有的非重叠的ChAR集,并测试了其在每个人类样品中的直系同源区域内的染色质可接近性(图12D)。来自大多数供体的人初始CD8+ T细胞在小鼠中所定义的初始特异性区域中显示出显著高于在记忆或耗竭特异性区域中的染色质可及性。在健康供体中, CMV特异性四聚体+ CD8+ T细胞和效应记忆细胞富集记忆特异性区域(MW测试, P=0.01到P<0.0001)(图12E)。相比之下,来自4名受试者中的3名的HIV特异性四聚体+细胞在耗竭特异性区域中显示出显著高于在记忆特异性区域中的染色质可及性(MW测试,p=0.05到p<0.001)。有趣的是,感染有HIV的受试者中的效应记忆CD8+ T细胞也在耗竭特异性区域中显示出了更高的染色质可及性,这可能是由该区室内的未测量的耗竭性HIV特异性T细胞或具有异常分化的旁观者T细胞所导致的(Stelekati等人(2014)Immunity 40:801-813)。
通过调查来自同一供体的多个四聚体+群体中的耗竭特异性表观遗传模式,在患有慢性HCV感染的受试者中证实了这些发现。分离出了特异于来自HCV的两个不同表位的四聚体+ CD8+ T细胞以及特异于流感病毒(Flu)的四聚体+ CD8+ T细胞,以及主体初始和效应记忆细胞。流式细胞术证实,如预期的那样,初始CD8+ T细胞对耗竭标志物PD-1和CD39均为阴性。如先前对于慢性感染中HCV特异性CD8+ T细胞的描述,对HCV C63B表位具有特异性的大多数四聚体+ CD8+ T细胞表达高水平的 PD-1(Rutebemberwa等人(2008)J.Immunol.181:8215-8225;Kasprowicz等人(2008)J. Virol.82:3154-3160)和CD39(Gupta等人(2015)PLoS Pathogens 11:e1005177)(图 12F)。然而,对174D表位具有特异性的HCV四聚+细胞具有较低的PD-1和CD39,非常类似于功能性Flu四聚体+细胞的染色模式。对该受试者中HCV基因组的测序显示,与C63B表位不同,174D表位经历了广泛的病毒逃逸,并且未能检测到野生型病毒序列。这表明174D四聚体+ T细胞不会再遇到同源抗原(图12G)。与这一观察结果一致的是,确定C63B Tet+细胞在耗竭特异性区域显示出显著高于记忆区域的染色质可接近性(MW测试,p=0.01)。相比之下,174D四聚体+细胞在记忆特异性区域中显示出更高的染色质可接近性,流感特异性CD8+ T细胞也是如此(MW测试,p=0.04)(图12H)。因此,见于小鼠耗竭性CD8+ T细胞的染色质可接近性的状态特异性模式在人耗竭性CD8+ T细胞中是保守的。
实施例6:耗竭性CD8+ T细胞中的状态特异性基因组调控区与人类疾病相关
在发现存在于耗竭性而非功能性CD8+ T细胞中,并且充当维持体外高水平的 PD-1表达所需的增强子的作用的PD-1上游-23kb处的ChAR区域的基础上,进一步表征了该ChAR在体内的作用。产生具有该区域的胚系缺失的小鼠(图13A)。简言之,向C57BL/6J卵中注射Cas9 mRNA以及体外验证的sgRNA,然后将其植入假妊娠雌性中(图13B)。在7个可存活的后代中,有2只小鼠具有ChAR的杂合缺失(图 13C),并且有一只能够将等位基因传递给其后代。将这些小鼠繁育为P14 TCR转基因系,分别在CD45.1单阳性和CD45.1/CD45.2双阳性背景上产生纯合型增强子缺失动物以及WT对照同窝小鼠。然后使用过继细胞转移策略在急性和慢性LCMV感染期间评估该缺失对于CD8+ T细胞的作用(图14A)。产生了两种混合物:一种相对于含有被CD45.1/CD45.2标记的野生型(WT)细胞(DP),含有仅被CD45.1标记的增强子缺失细胞(SP),另一种相对于含有DP背景上的WT细胞,含有SP背景上的WT细胞。将同窝供体小鼠用于每种混合物,而受体小鼠在CD45.2单阳性 C57BL/6J的背景上。出于统计功效的考虑,在进一步分析中将来自Armstrong和Clone 13感染的动物组群的数据进行结合。
数据表明,同类系标记的WT与WT细胞群体相比,并且其有相似的转基因TCR 和抑制性受体PD-1的表达(图14B)。相比之下,增强子缺失的细胞群体在竞争性混合物中胜过WT细胞,因此以更高的速率恢复(图14B)。与WT群体(p=0.36,配对t-检验)相比,它们还具有较低的PD-1表达(对于增强子缺失p=0.02,配对t- 检验)(图14B-14C)。与WT和WT混合物相比,增强子缺失群体相对于WT细胞的log2富集倍数在d8(p<0.001,t-检验)和d15(p=0.0044,t-检验)时显著更高(图 14D-14E))。这些数据结合表明,位于启动子上游-23kb的PD-1增强子的遗传缺失导致了体内急性和慢性病毒感染中较低的PD-1表达,并提升了T细胞的增殖和/或存活。
基于前述内容,发现小鼠和人中的耗竭性CD8+ T细胞显示出与其功能性对应物不同的调控区全局模式。这些数据对我们理解T细胞耗竭具有三大重要意义。
首先,数据显示,耗竭随着重塑的增强子可接近性和新的TF结合的组合而发生,并且支持这样的模型:其中耗竭性CD8+ T细胞不仅仅是“持久的效应子”,更是不同于其功能性对应物的分化状态。鉴定这种状态的可塑性以及是否能或如何将其进行逆转是一个关键性问题。不再识别逃逸表位的HCV特异性CD8+ T细胞中耗竭特异性表观遗传谱的缺失表明,降低抗原负荷可能是挽救耗竭的重要因素,但仍需在纵向研究中进行确认。在不用去除慢性抗原暴露的条件下进行检查点阻断,以用于恢复T细胞耗竭的表观遗传谱,对于癌症的免疫疗法具有重要意义。
其次,本文已经证实,将体外增强子的原位诱变与体内TF足迹结合的方法可用于增强子功能的精确定位。在能分离出很少的相关细胞的情况下,会限制TF ChIP研究的可行性。作为替代方案,在体内使用TF足迹识别在耗竭性CD8+ T细胞中的状态特异性增强子处具有推断的TF结合的基序,并且使用Cas9介导的体外饱和诱变探测出这些TF足迹的功能。虽然这种方法受限于TF基序的简并性(例如,T-bet基序实际上可能受到其他T-box因子如Eomesodermin的限制),但它强调了揭示T细胞耗竭的新型潜在调节子(如RAR家族的TF)的作用的能力。
第三,在耗竭性T细胞中定位状态特异性增强子被认为提供了改善过继性T细胞疗法治疗功效的机会。输注被改造成表达针对癌症的嵌合抗原受体的T细胞较少在实体瘤中成功,部分是由于改造的T细胞产物中T细胞耗竭的发展(Long等人(2015)Nat. Med.21:581-590;Stromnes等人(2015)Cancer Cell 28:638-652)。对治疗性T细胞进行基因组编辑以使其抗耗竭是一个有趣的概念并且引发了最近的探讨PD-1基因基因座的缺失的研究(Hendel等人(2015)Nat.Biotechnol.33:985-989;Schumann等人(2015)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.112:10437-10442)。然而,鉴于PD-1在预防慢性感染中的T细胞过度活化中关键的调节作用,PD-1的不可逆缺失可能是不可取的(Odorizzi 等人(2015)J.Exp.Med.212:1125-1137)。相比之下,对调节损害耗竭性CD8+ T细胞功能的基因的耗竭特异性增强子进行编辑(Canver等人(2015)Nature 527:192-197)被认为提供了另一种调节T细胞功能的方法,该方法比靶向外显子更“可调”并且更具状态特异性。例如,其提供了一种预防使得T细胞抑制的过表达,但保存PD-1的生理性调节的方法。创建特异于人体中耗竭性CD8+ T细胞的增强子的详细的功能性定位被认为提供了用于治疗用途的合理的T细胞改造的关键步骤。
通过引用并入
本文提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用整体并入本文,如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入一样。在有冲突的情况下,以本申请(包括本文中的任何定义)为准。
任何多核苷酸和多肽序列也通过引用整体并入,其参考关联公共数据库中的条目的登录号,例如由万维网上的基因组研究所(TIGR)和/或万维网上的生物技术信息国家中心(NCBI)维护的序列。
等同物
本领域技术人员应认识到或能够使用不超出常规的实验确定许多等同于本文所述的发明的具体实施方案的等同物。这些等同物旨在涵盖在权利要求中。
表1
概括和表注
表1A显示了在第8天或第27天,急性和慢性病症之间的差异性区域。
表1B显示了第27天急性和慢性病症之间的差异性区域。
表1C显示了第8天和第27天,急性和慢性病症之间的差异性区域。
表1D显示了在第27天出现并且具有活性的区域。
表1E显示了在第8天和第27天出现并且具有活性的区域。
表1F显示了仅在第8天和第27天在急性和慢性病症之间存在差异的区域。
表1G显示了仅在第27天在急性和慢性病症之间存在差异的区域。
表1H显示了在大量初始和效应记忆性CD8+ T细胞,以及在对CMV、流感、HIV 或HCV产生应答的抗原特异性CD8+ T细胞中识别到的所有人染色质可接近区域。
表1I仅显示表1H中可与来自小鼠初始、记忆和耗竭性CD8+ T细胞的小鼠直系同源区域相关的人染色质可接近区域。
表1J仅显示表1I中与特异于小鼠耗竭性CD8+ T细胞的小鼠直系同源区域相关的人染色质可接近区域。
表1K显示了所有分析的高分辨率Pdcd1增强子序列的sgRNA序列和基因组位置注释。
表1A-1K中标有缩写的列对应于以下内容:
以下表1A-1K中所示的基因表达术语对应于以下内容:
增强子 | 与基因表达正相关 |
抑制子 | 与基因表达负相关 |
混合的 | 与基因表达既正相关又负相关 |
没有变化 | 与基因表达没有相关性或相关性很弱 |
此外,表1A-1K中所示的区域定位于NCBI小鼠组装MGSCv37(2010年9月23 日)(可在GenBank组装登录号GCA_000000055.16和RefSeq组装登录号GCF_000001635.18下访问)并称为“build mm9”,或者定位于基因组参照序列联盟人类组装GRCh37(2009年3月3日)(可在GenBank组装登录号GCA_000001405.1 和RefSeqGenBank组装登录号GCF_000001405.13下访问)并称为“build hg19”。
*表1中还包括基因组核酸序列,其包括所列区域,或其在除小鼠以外的哺乳动物(包括人)基因组内的直系同源物。此外,所列出的区域或其直系同源物还包含5′端,3′端,或在5′和3′端上的约1bp、2bp、3bp、4bp、5bp、10bp、15bp、20bp、 25bp、30bp、35bp、40bp、45bp、50bp、55bp、60bp、65bp、70bp、75bp、80 bp、85bp、90bp、95bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、 800bp、900bp、1000bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp、1500bp、1600bp、 1700bp、1800bp、1900bp、2000bp、2100bp、2200bp、2300bp、2400bp、2500bp、 2600bp、2700bp、2800bp、2900bp或3000bp,或其间的任何范围,包括端点(例如,1bp至222bp)。还涵盖了其任何部分或片段。进一步涵盖了包含核酸序列的任何基因组核酸序列或其部分/片段,所述核酸序列在其全长上与此类区域具有80%、 81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更多的同一性。所描述的核酸分子可以具有所列区域的核酸的功能。
表1A
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表1B
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表1C
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表1D
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表1E
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表1F
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表1G
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表1H
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表1I
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表1J
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表1K
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Claims (78)
1.一种改造的哺乳动物T细胞,包含在Pdcd1转录起始位点上游约-23.8kb基因组区域中的SEQ ID NO:12所示序列的缺失,所述基因组区域1)调节Pdcd1的基因表达和2)选择性地在来自所述哺乳动物的耗竭性CD8+T细胞的基因组内是染色质可接近的。
2.根据权利要求1所述的改造的T细胞,其中所述在Pdcd1转录起始位点上游约-23.8kb基因组区域中的SEQ ID NO:12所示序列的缺失使得所述哺乳动物T细胞中Pdcd1的表达相较于来自没有所述在Pdcd1转录起始位点上游约-23.8kb基因组区域中的SEQ ID NO:12所示序列的缺失的哺乳动物的相同T细胞类型的Pdcd1的表达下调至少5%。
3.根据权利要求1所述的改造的T细胞,其中Pdcd1的表达是Pdcd1的转录或翻译。
4.根据权利要求1所述的改造的T细胞,其中所述基因组基因表达调控区或其部分通过基因组编辑缺失。
5.根据权利要求4所述的改造的T细胞,其中所述基因组编辑是组成性地或诱导性地表达。
6.根据权利要求4或5所述的改造的T细胞,其中所述基因组编辑选自下组:CRISPR-Cas9 RNA引导性改造核酸酶(RGEN)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物(TALE)、归巢大范围核酸酶和同源重组。
7.根据权利要求1所述的改造的T细胞,其中所述哺乳动物是免疫障碍动物模型。
8.根据权利要求7所述的改造的T细胞,其中所述免疫障碍是慢性免疫障碍。
9.根据权利要求7或8所述的改造的T细胞,其中所述动物模型是小鼠模型。
10.根据权利要求1所述的改造的T细胞,其中所述哺乳动物是小鼠或人。
11.根据权利要求10所述的改造的T细胞,其中所述哺乳动物是人。
12.根据权利要求11所述的改造的T细胞,其中所述人患有免疫障碍。
13.根据权利要求12所述的改造的T细胞,其中所述免疫障碍是慢性免疫障碍。
14.根据权利要求8或13所述的改造的T细胞,其中所述慢性免疫障碍是慢性感染或癌症。
15.根据权利要求14所述的改造的T细胞,其中所述感染由选自下组的试剂引起:人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、腺病毒、巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、人疱疹病毒6、水痘-带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、乳头瘤病毒、细小病毒B19、多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、麻疹病毒、风疹病毒、人T细胞白血病病毒I、人T细胞白血病病毒II、利什曼原虫属、弓形虫属、锥虫属、疟原虫属、血吸虫属和脑炎微抱子虫属。
16.根据权利要求14所述的改造的T细胞,其中所述慢性感染不是潜伏感染。
17.根据权利要求14所述的改造的T细胞,其中所述癌症是血液癌症或实体癌症。
18.根据权利要求17所述的改造的T细胞,其中所述实体癌症选自下组:肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、皮肤癌、黑色素瘤、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、结肠直肠癌、肝癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、肉瘤、淋巴瘤和脑癌。
19.根据权利要求1所述的改造的T细胞,其中所述耗竭性CD8+T细胞表达T细胞耗竭生物标志物,所述T细胞耗竭生物标志物选自下组:检查点抑制剂、PD-1(Pdcd1)、TIM-3(Havcr2)、LAG-3(Lag3)、CTLA-4(Ctla4)、2B4(CD244)、CD39(Entpd1)、CD160、脱中胚蛋白(Eomes)、T-BET(Tbx21)、BATF、BLIMP-1(Prdm1)、NFATC1、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、Foxp1、视黄酸受体α(Rara),及其组合。
20.根据权利要求1所述的改造的T细胞,其中所述T细胞是CD8+T细胞。
21.根据权利要求20所述的改造的T细胞,其中CD8+T细胞是非耗竭性T细胞或耗竭性T细胞。
22.根据权利要求21所述的改造的T细胞,其中所述非耗竭性CD8+T细胞是初始细胞、功能性效应细胞或记忆细胞。
23.根据权利要求21所述的改造的T细胞,其中所述耗竭性CD8+T细胞表达T细胞耗竭生物标志物,所述T细胞耗竭生物标志物选自下组:检查点抑制剂、PD-1(Pdcd1)、TIM-3(Havcr2)、LAG-3(Lag3)、CTLA-4(Ctla4)、2B4(CD244)、CD39(Entpd1)、CD160、脱中胚蛋白(Eomes)、T-BET(Tbx21)、BATF、BLIMP-1(Prdm1)、NFATC1、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、Foxp1、视黄酸受体α(Rara),及其组合。
24.根据权利要求1所述的改造的T细胞,其中所述T细胞是原代T细胞,所述原代T细胞分离自所述哺乳动物,经过改造,并离体返回至所述哺乳动物。
25.根据权利要求1所述的改造的T细胞,其中所述T细胞存在于所述哺乳动物体内或者是在体外培养的。
26.一种改造哺乳动物T细胞以降低Pdcd1表达的体外或离体方法,所述方法包括在来自所述哺乳动物的耗竭性CD8+T细胞中缺失Pdcd1转录起始位点上游约-23.8kb基因组区域中的SEQ ID NO:12所示的序列。
27.根据权利要求26所述的方法,其中所述在Pdcd1转录起始位点上游约-23.8kb基因组区域中的SEQ ID NO:12序列的缺失使得所述哺乳动物T细胞中Pdcd1的表达相较于来自没有所述在Pdcd1转录起始位点上游约-23.8kb基因组区域中的SEQ ID NO:12序列的缺失的哺乳动物的相同T细胞类型的Pdcd1的表达下调至少5%。
28.根据权利要求26所述的方法,其中Pdcd1的表达是Pdcd1的转录或翻译。
29.根据权利要求26所述的方法,其中所述基因组基因表达调控区或其部分通过基因组编辑缺失。
30.根据权利要求29所述的方法,其中所述基因组编辑是组成性地或诱导性地表达。
31.根据权利要求29或30所述的方法,其中所述基因组编辑选自下组:CRISPR-Cas9RNA引导性改造核酸酶(RGEN)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物(TALE)、归巢大范围核酸酶和同源重组。
32.根据权利要求26所述的方法,其中所述哺乳动物是免疫障碍动物模型。
33.根据权利要求32所述的方法,其中所述免疫障碍是慢性免疫障碍。
34.根据权利要求32所述的方法,其中所述动物模型是小鼠模型。
35.根据权利要求26的方法,其中所述哺乳动物是小鼠或人。
36.根据权利要求35所述的方法,其中所述哺乳动物是人。
37.根据权利要求36所述的方法,其中所述人患有免疫障碍。
38.根据权利要求37所述的方法,其中所述免疫障碍是慢性免疫障碍。
39.根据权利要求33或38所述的方法,其中所述慢性免疫障碍是慢性感染或癌症。
40.根据权利要求39所述的方法,其中所述感染由选自下组的试剂引起:人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、腺病毒、巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、人疱疹病毒6、水痘-带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、乳头瘤病毒、细小病毒B19、多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、麻疹病毒、风疹病毒、人T细胞白血病病毒I、人T细胞白血病病毒II、利什曼原虫属、弓形虫属、锥虫属、疟原虫属、血吸虫属和脑炎微抱子虫属。
41.根据权利要求39所述的方法,其中所述慢性感染不是潜伏感染。
42.根据权利要求39所述的方法,其中所述癌症是血液癌症或实体癌症。
43.根据权利要求42所述的方法,其中所述实体癌症选自下组:肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、皮肤癌、黑色素瘤、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、结肠直肠癌、肝癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、肉瘤、淋巴瘤和脑癌。
44.根据权利要求26所述的方法,其中所述耗竭性CD8+T细胞表达T细胞耗竭生物标志物,所述T细胞耗竭生物标志物选自下组:检查点抑制剂、PD-1(Pdcd1)、TIM-3(Havcr2)、LAG-3(Lag3)、CTLA-4(Ctla4)、2B4(CD244)、CD39(Entpd1)、CD160、脱中胚蛋白(Eomes)、T-BET(Tbx21)、BATF、BLIMP-1(Prdm1)、NFATC1、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、Foxp1、视黄酸受体α(Rara),及其组合。
45.根据权利要求26所述的方法,其中所述T细胞是CD8+T细胞。
46.根据权利要求45所述的方法,其中所述CD8+T细胞是非耗竭性T细胞或耗竭性T细胞。
47.根据权利要求46所述的方法,其中所述非耗竭性CD8+T细胞是初始细胞、功能性效应细胞或记忆细胞。
48.根据权利要求46所述的方法,其中所述耗竭性CD8+T细胞表达T细胞耗竭生物标志物,所述T细胞耗竭生物标志物选自下组:检查点抑制剂、PD-1(Pdcd1)、TIM-3(Havcr2)、LAG-3(Lag3)、CTLA-4(Ctla4)、2B4(CD244)、CD39(Entpd1)、CD160、脱中胚蛋白(Eomes)、T-BET(Tbx21)、BATF、BLIMP-1(Prdm1)、NFATC1、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、Foxp1、视黄酸受体α(Rara),及其组合。
49.根据权利要求26所述的方法,其中所述T细胞是分离自所述哺乳动物的原代T细胞。
50.根据权利要求26所述的方法,其中所述T细胞是在体外培养的。
51.一种防止非耗竭性CD8+T细胞耗竭的体外或离体方法,所述方法包括根据权利要求26所述的方法改造所述非耗竭性CD8+T细胞。
52.根据权利要求51所述的方法,其中所述非耗竭性CD8+T细胞是初始细胞、功能性效应细胞或记忆细胞。
53.根据权利要求51或52所述的方法,其中所述改造的非耗竭性CD8+T细胞可施用给受试者。
54.一种在耗竭性CD8+T细胞中逆转CD8+T细胞耗竭的体外或离体方法,所述方法包括根据权利要求26所述的方法改造所述耗竭性CD8+T细胞。
55.根据权利要求54所述的方法,其中所述耗竭性CD8+T细胞表达T细胞耗竭生物标志物,所述T细胞耗竭生物标志物选自下组:检查点抑制剂、PD-1(Pdcd1)、TIM-3(Havcr2)、LAG-3(Lag3)、CTLA-4(Ctla4)、2B4(CD244)、CD39(Entpd1)、CD160、脱中胚蛋白(Eomes)、T-BET(Tbx21)、BATF、BLIMP-1(Prdm1)、NFATC1、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、Foxp1、视黄酸受体α(Rara),及其组合。
56.根据权利要求54或55所述的方法,其中所述改造的耗竭性CD8+T细胞可施用给受试者。
57.权利要求1-25中任一项所述的改造的T细胞在制备用于治疗受试者免疫障碍的药物中的用途。
58.根据权利要求57所述的用途,其中所述改造的T细胞可局部地或全身地施用。
59.根据权利要求58所述的用途,其中所述可全身地施用的途径是静脉内、肌肉内、腹膜内或关节内施用。
60.根据权利要求57所述的用途,其中可施用的所述改造的T细胞对于所述受试者是自体的、同基因的、同种异体的或异种的。
61.根据权利要求57所述的用途,其中可施用的所述改造的T细胞是在药学上可接受的制剂。
62.根据权利要求57所述的用途,其中可施用的所述改造的T细胞维持Pdcd1的至少5%下调表达。
63.根据权利要求57所述的用途,其还包括使用治疗有效量的药物组合物,所述药物组合物包含一种或多种抗免疫障碍的试剂。
64.根据权利要求57所述的用途,其还包括使用一种或多种预防或逆转CD8+T细胞耗竭的试剂。
65.根据权利要求64所述的用途,其中所述一种或多种试剂是免疫检查点抑制剂。
66.根据权利要求65所述的用途,其中所述免疫检查点选自下组:PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、TIM-1、CTLA-4、VISTA、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、2B4、ICOS、HVEM、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、TIM-4、BTLA、SIRP-α(CD47)、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT和A2aR。
67.根据权利要求57所述的用途,其中所述哺乳动物是免疫障碍动物模型。
68.根据权利要求67所述的用途,其中所述免疫障碍是慢性免疫障碍。
69.根据权利要求67所述的用途,其中所述动物模型是小鼠模型。
70.根据权利要求57所述的用途,其中所述哺乳动物是小鼠或人。
71.根据权利要求70所述的用途,其中所述哺乳动物是人。
72.根据权利要求71所述的用途,其中所述人患有免疫障碍。
73.根据权利要求72所述的用途,其中所述免疫障碍是慢性免疫障碍。
74.根据权利要求68或73所述的用途,其中所述慢性免疫障碍是慢性感染或癌症。
75.根据权利要求74所述的用途,其中所述感染由选自下组的试剂引起:人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、腺病毒、巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、人疱疹病毒6、水痘-带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、乳头瘤病毒、细小病毒B19、多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、麻疹病毒、风疹病毒、人T细胞白血病病毒I、人T细胞白血病病毒II、利什曼原虫属、弓形虫属、锥虫属、疟原虫属、血吸虫属和脑炎微抱子虫属。
76.根据权利要求74所述的用途,其中所述慢性感染不是潜伏感染。
77.根据权利要求74所述的用途,其中所述癌症是血液癌症或实体癌症。
78.根据权利要求77所述的用途,其中所述实体癌症选自下组:肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、皮肤癌、黑色素瘤、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、结肠直肠癌、肝癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、肉瘤、淋巴瘤和脑癌。
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