JP2002532087A - 初期のｃｄ３４＋ｃｄ３８−骨髄幹細胞の増大のためのヒト脳内皮細胞及び増殖培地並びに方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＰＭＶＥＣ系と一致する、ヒトＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の増大を促進するヒト脳内皮細胞（ＨＵＢＥＣ）を用いる新規の共培養系を開示する。ＨＵＢＥＣは死体の提供者から単離し、一次培養を通し、クローン化し、そしてフォンウィルブランド因子ポジティブであることが明らかとなった。ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−３＋ＩＬ−６＋ＳＣＦ＋ｆｌｔ−３リガンドを添加したＨＵＢＥＣの単層上での精製した骨髄ＣＤ３４⁺ 細胞の培養は、全細胞における１４．５倍の増加、ＣＤ３４⁺ 細胞における６．６倍の増加、及び、最も著しくは、ＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^-細胞における４４０倍の増加を７日後にもたらした。更に、ＣＦＵ−ＧＭの産生は１５．１倍に増加し、ＢＦＵ−Ｅは８倍に増加し、そしてＣＦＵ−ミックスは５．２倍に増加した。最適な生成は、連続した外因性のサイトカインの存在に依存した。対照的に、同様に処理したストロマ無しの懸濁培養は、全細胞の１０．２倍の増大、ＣＤ３４⁺ 細胞における３倍の増加を支持し、そして培養７日後のＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞プールを維持した。更に、我々は前記と同一の提供者から単離したヒト非脳内皮細胞が、ヒトＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞の増大も維持も支持しなかったことを明らかにした。わずかな定常状態のＣＤ３４⁺ ＣＤ３８ ^- 細胞がメチルセルロース培養液中での生存可能なコロニー形成細胞をもたらすが、我々のＦＡＣＳに基づく細胞周期及びソーティング実験は、サイトカイン処理したＨＵＢＥＣ上でのｅｘ ｖｉｖｏ培養の間の、高度にクローン原性のＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 集団（２４％のクローニング効率）の活性化を示した。これらの結果は、骨髄ＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞が最適な増大のためにストロマ細胞の微小環境を必要とし、そしてＨＵＢＥＣ培養系で生成した、ｅｘ ｖｉｖｏで増大したＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞が、ある程度の初期の「幹細胞の性質」を保持する様であることを示した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明の背景 関連出願 引用によって本明細書に組み入れられる、１９９８年１２月４日に提出した米
国仮出願６０／１１２，０４２号の恩恵を記載する。

【０００２】 本発明の分野 本発明は骨髄幹細胞を増大させるための、ヒト脳内皮細胞（ＨＵＢＥＣ）由来
の増殖培地及び前記増殖培地を利用する方法に関する。

【０００３】 従来技術の説明 最も初期の造血幹細胞（ＨＳＣ）の増殖及び増大を支持するｅｘ ｖｉｖｏ系
の発展は、遺伝子治療及び幹細胞の移植の分野への直接的な利用をもたらしたで
あろう。長期間再増殖する細胞の増大のための至適な培養条件の同定及び特徴づ
けは、遺伝子治療のプロトコール及び他の幹細胞に基づいた治療にとって必要で
ある。

【０００４】 様々なサイトカインの組み合わせ及び液体培養の方法が、ＣＤ３４⁺ ＨＰＣの
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖を支持するために示されてきたが、最も初期のＣＤ３
４⁺ ＣＤ３８^- 細胞は、分化及び細胞死によってしばしば失われる〔１−６〕。
対照的に、他の研究が、ヒトＨＰＣを自己、同種、及び異種の骨髄ストロマと接
触させて共培養した場合に、長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）を数週間にわた
って維持することができることを証明した〔７−９〕。同様に、他の研究者が、
外来のサイトカインを添加した骨髄ストロマの培養物由来の条件培地を用いての
、ストロマを含まない液体懸濁培養物中でのＬＴＣ−ＩＣ及びＣＦＣの増大及び
分化を報告してきた〔１０−１２〕。最も最近では、ヒト臍帯血ＣＤ３４⁺ 細胞
が、ストロマを含まない液体培地において、ｆｌｔ−３リガンド、巨核球増殖及
び発生因子（ＭＧＤＦ）、ＳＣＦ、並びにＩＬ−６の存在下で、最大１０週間Ｎ
ＯＤ／ＳＣＩＤマウスを再増殖させる自身の能力を失うことなく維持することが
できたと報告された〔１３〕。

【０００５】 全ての型の血管内皮、細網内皮性因子、及び造血細胞は、血管芽細胞、中胚葉
起源の初期の胚細胞から生じることが仮定されてきた〔１４，１５〕。哺乳類の
胚の造血の最も初期（性交後７〜８日）の間に、初期の造血幹細胞が、胚の卵黄
嚢を集合化した中胚葉細胞の集合体に由来する血島に覆われることが見出されて
いる〔１６〕。骨髄、臍静脈、及びマウスの卵黄嚢内皮細胞系が、初期の造血を
制御する増殖因子の多くを産生することが示されてきた〔１７−２０〕。更に、
骨髄、赤芽球、及び巨核球前駆細胞の長期増殖及び分化は、成体の骨髄及び胎性
の卵黄嚢に由来する微小血管の内皮細胞を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで証明され
てきた〔１８，１９〕。しかし、内皮細胞の単層と共培養した後の、最も初期の
ＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 前駆細胞の多くの運命はほとんど証明されてこなかった。
以前、我々は一次ブタ微小血管内皮細胞系（ＰＭＶＥＣ）が、初期のＣＤ３４⁺
ＣＤ３８^- 表現型を示すヒト造血細胞の素速い及び強い増大を支持することを報
告した〔２１，２２〕。他の報告されている共培養系と異なり、我々は脳の内皮
上で増大したＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞が、ＳＣＩＤ−Ｈｕの骨モデル〔２３〕
及び致死的に照射したヒヒ〔２４〕、その両方において、移植を成功させる能力
を保持していることを証明した。

【０００６】 ヒト脳血管内皮細胞は、それらがｉｎ ｖｉｔｒｏで丸石様の形態で発生し〔
２５〕、そしてそれらが白血球の「回転（ｒｏｌｌｉｎｇ）」、接着、及び輪送
を媒介する細胞接着分子（セレクチン、インテグリン）を発現する〔２６，２７
〕、内皮細胞の他の源に類似している。ＰＭＶＥＣの造血能の我々の観察及びヒ
トの臨床的な研究におけるブタ内皮細胞の利用の制限の認識に基づいて、我々は
一次ヒト脳内皮細胞（ＨＵＢＥＣ）を単離し、そしてヒトＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^-
細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの増大を支持するそれらの能力を評価した。我々の結果
は、ヒト脳内皮細胞が、ブタ内皮細胞を用いた我々の観察と比較可能なレベルで
、最も初期のＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- ＨＰＣの独特な増大及び見かけの自己複製を
支持することを示唆する。ＨＵＢＥＣが増大させるＨＰＣのｉｎ ｖｉｖｏで再
増殖する可能性を評価する更なる研究は、将来の遺伝子治療、臍帯血の増大、及
び幹細胞の移植プロトコールの実施に重要であるだろう。

【０００７】 本発明の要約 従って、本発明の目的はヒト脳内皮細胞（ＨＵＢＥＣ）に基づいた増殖培地に
ある。

【０００８】 本発明の別の目的は、ＨＵＢＥＣによって産生され、そして初期のＣＤ３４＋
ＣＤ３８−骨髄幹細胞の増大を促進する、前記の培地中に含まれる増殖因子にあ
る。

【０００９】 本発明の更なる目的は、初期の骨髄幹細胞集団を増大するための方法にある。

【００１０】 本発明の更に別の目的は、増殖因子を含む増殖培地の、処理し、濃縮した生成
物にある。

【００１１】 本発明の追加の目的は、増大した細胞のＧＭＰ生成に使用されうる増殖培地に
ある。

【００１２】 これら及び本発明の追加の目的は、独特な補助的造血微小環境を務めうるヒト
脳内皮細胞（ＨＵＢＥＣ）によって果たされる。

【００１３】好ましい態様の説明 骨髄ＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏでの長期増殖の原因である
多分化能の前駆細胞に高度に富むが〔３１−３３〕、治療としての使用のための
、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞を増殖する試みは、これらの
初期の細胞がサイトカインに暴露されるときに頻繁に起こる分化及び細胞死によ
り、成功を非常に限定したものとされた〔３，６，３４〕。長期の再増殖細胞集
団を増大する能力を有し、同時にそれらのＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 表現型を維持し
ているｅｘ ｖｉｖｏの共培養系は、遺伝子治療、臍帯血の増大、及び幹細胞の
移植プロトコールにおける即時の臨床的応用を有するだろう。

【００１４】 この研究において、我々は、初期の造血前駆／幹細胞があらかじめ形成したＨ
ＵＢＥＣ単層と直接的に関連して活発に増殖し、そして増大することを示してお
り、これはブタ内皮細胞系を用いた我々の以前の観察と一致している〔２１〕。
液体懸濁培養及び非ＣＮＳ由来内皮細胞培養と異なり、ＨＵＢＥＣとの共培養は
、初期のＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- サブセットの増大（７日で４４０倍）と同時に、
それらの初期の表現型及び未成熟な非分化芽細胞の形態を維持するのに必須であ
る。更に、ＨＵＢＥＣ共培養におけるＣＤ３４⁺ 細胞の増殖は、ＣＤ３４⁺ ＣＤ
３８^- 細胞集団において最大であると思われる。ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−３，ＩＬ
−６，ＳＣＦ及びｆｌｔ３リガンドを含む外因性の増殖因子の添加がＣＤ３４⁺
細胞の活性化及び増大に重要であると同時に、追加のまた分化していない内皮細
胞の因子がＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞の「自己複製」過程において必須の役割を
最も果たす様である〔３５〕。対照的に、ストロマ無し及び非脳内皮細胞培養の
結果は、培養したＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- が有意に増殖し、素速く分化するのに失
敗し、そして全体的なＣＦＣ細胞の増大が限定され、そして短命であることを示
している。これらの結果は、脳由来の内皮細胞が、初期のＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^-
集団の細胞分割及びみかけの自己複製を促進する、独特な微小環境を提供するこ
とを示唆している。

【００１５】 我々は、定常状態の骨髄ＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞の多くが静止状態であり、
そして主に細胞周期のＧ₀ にあることを確信している〔２３，３６，３７〕。最
も初期のＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 集団における細胞サイクリングの誘導の欠如は、
レトロウイルスに基づいた遺伝子ベクターを用いる、これらの細胞の形質導入の
成功に対する主要な障害として明らかにされてきた〔３６，３８〕。我々は、Ｃ
Ｄ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞が、ブタ脳内皮細胞（ＰＭＶＥＣ）上で培養した場合、
容易に細胞周期に補充されることを既に決定していた〔２２〕。現在の研究にお
いて、我々は、多くの提供者に由来する一次ＨＵＢＥＣ培養が、外因性のサイト
カインと一緒に、多くの（＞７０％）の既に静止状態のＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 集
団を、７日後に細胞周期のＧ₁ 又はＧ₂ ／Ｓ／Ｍ期へと進む様に誘導した。ＣＤ
３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞の素速い増大の機構は不明であるが、ＨＵＢＥＣは、外因
性のサイトカインと一緒に素速いサイクリングを誘導し、そして非常に初期のＨ
ＰＣ（培養を開始するのに使用する全ＣＤ３４⁺ 細胞の２％未満）の「幹細胞の
性質（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）」を維持するのに必要な、微小環境を提供し、そして
アポトーシス性の細胞死を防ぐこともあることを発見した。対照的に、我々は、
ＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞の高レベルの細胞分割が、ＧＭＣＳＦ＋ＩＬ−３＋Ｉ
Ｌ−６＋ＳＣＦ＋ｆｌｔ−３リガンドを添加した、ストロマ無しの液体及びヒト
の非脳内皮の共培養物において達成不可能であることを発見した。他のストロマ
を基にした培養系と異なり〔１０，１１〕、我々は、ＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- の増
大に対する内皮細胞の接触の阻害効果を認めていない。事実、ＨＵＢＥＣ系にお
いて、細胞と細胞の接触は、外因性の増殖因子を組合わせたものの添加に依存し
、そしておそらく直接的な内皮細胞の阻害効果を無効にすると思われる、ＣＤ３
４⁺ ＣＤ３８^- 細胞集団の最大の増大を促進する。これらの発見は、ＣＤ３４⁺
ＣＤ３８^- 細胞の増大が、細胞３４⁺ 細胞を直接的にＰＭＶＥＣの単層と接触さ
せて培養する場合、トランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）の挿入を用いて、内
皮支持細胞と別々に培養する場合よりもむしろ最適であるという、我々の既に報
告した観察と一致している〔２１〕。ＨＵＢＥＣが、高レベルの細胞サイクリン
グを支持し、そして初期のＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 集団を増大する微小環境を提供
するので、この培養系は更に、標準的なレトロウイルスベクターを用いる、移植
可能な細胞内への遺伝子移入のより高い効率を促進しうる。

【００１６】 骨髄ＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞は、ストロマ支持層で培養した場合に６週間に
及んでＣＦＣを生じさせる、長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）を含む〔２９，
３９〕。この研究における我々のクローン原性のデータは、定常状態のＣＤ３４ ⁺ ＣＤ３８^- 細胞が、直接１４日目のメチルセルロース培養物＋サイトカイン中
で培養した場合に、有意な数のＣＦＣを生まないことを示した、他のものによっ
て報告されていることと一致している〔２９，３９〕。その様な理由から、ＣＤ
３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞は、限定されるＣＦＣ活性を有するとして特徴づけられて
きた。ヒトＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞の１０日目の無血清液体培地が、ｆｌｔ−
３リガンド、ＳＣＦ、及びＩＬ−３を含む最適なサイトカインの組合わせと一緒
に、増大した集団によって、ＬＴＣ−ＩＣの産生における３０倍の増大を促進し
た〔３０〕。筆者はその研究において増大した集団の表現型を述べなかったが、
１０日間サイトカインに暴露したインプットのＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞の多く
が、有意な分化及び細胞系の拘束を受けている様である。対照的に、我々は本研
究において、あらかじめ形成したＨＵＢＥＣの単層＋サイトカインとの、ヒトＣ
Ｄ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞の共培養がＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- サブセットの表現型的
に初期のＨＰＣの素速いサイクリング及びｅｘ ｖｉｖｏでの増大を支持するこ
とを示す。ＨＵＢＥＣの共培養がＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞のこの明白な増加を
支持するので、我々は、共培養７日後のそれらの生物学を問うために、長期再増
殖細胞のこのまれなサブセットを回収し、そして試験することが容易に出来た。
定常状態におけるＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞と異なり、ＨＵＢＥＣ単層上で増大
したＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞は、直接的に骨髄、赤芽球、及び混合した細胞系
の何百ものコロニーを、メチルセルロース中で２４％のクローニング効率で生じ
させる。このことは、ＨＵＢＥＣ共培養物＋サイトカイン中でのプレインキュベ
ーションの期間が、ストロマ無しの微小環境において、通常サイトカイン非応答
性であろうＨＰＣ（ストロマ細胞応答性前駆細胞）を初期に刺激しうることを示
唆している。以前の研究において、我々は、ＰＭＶＥＣ共培養物中で増大したＨ
ＳＣが、ＳＣＩＤ−ｈｕの骨にインプラントされ、そして致死的に照射したヒヒ
に移植された場合に、競合的に骨髄性及びリンパ性の髄を再増殖することができ
ることを示してきた〔２３，２４〕。これらの発見は共に、ＨＰＣの生存、増大
、及びＨＰＣ機能の維持をｅｘ ｖｉｖｏの培養条件下で最適化し、そして移植
の質を維持するための、直接的な幹細胞−ストロマ細胞の相互作用の必要性を示
している。更に、短時間の間隔におけるストロマ細胞依存のＣＦＣの頻度を決定
する能力は、ＨＵＢＥＣ培養系を、他の長期のｉｎ ｖｉｔｒｏでの定量方法学
に代わる魅力的なものにする。同様に、ＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 前駆細胞プールを
活性化し、そして有意に増大させる能力は、臨床的な幹細胞の増大研究において
潜在的な効果を有する。

【００１７】 近年、骨髄の微小血管及びヒト臍静脈内皮系は、ヒトＣＤ３４⁺ 前駆細胞の短
期間の成長及び増殖を支持するために使用されてきた〔１８，２０〕。しかし、
初期のＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- の亜集団の結果は、これらの共培養系において詳細
にされてこなかった。更に最近、マウスの胎児の肝臓に由来するストロマ細胞系
、ＡＦＴ０２４は、３〜１０日間の共培養に及んで低い割合のＣＤ３４⁺ ＣＤ３
８^- の維持を支持することが示されてきた〔４０〕。筆者はこの研究において、
ＡＦＴ０２４細胞系が、これらのＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞の細胞サイクリング
及び分化を阻害することによって、延長した長期間培養開始細胞（ＥＬＴＣ−Ｉ
Ｃ）を維持しうると仮定した。これらの観察と反対に、ＨＵＢＥＣの共培養は静
止状態のＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- サブセットにおける高レベルの細胞サイクリング
を誘導し、そしてＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞の絶対的な割合が維持されるだけで
なく、７日で〜４４０倍に増加する（０日で０．３％〜１０．５％）。これらの
データは、ヒト脳内皮細胞が、胎児の肝臓、骨髄、又は臍静脈内皮細胞系由来の
独特のものである他の造血的信号、例えば可溶性増殖因子、膜結合型増殖因子、
細胞外マトリックスタンパク質、又は細胞接着分子を提供することがあることを
示唆している。

【００１８】 ヒト脳内皮細胞が、初期のＨＰＣの見かけの自己複製及び増大を支持するが、
同一の提供者由来の非脳内皮細胞が支持しないので、我々は、脳内皮細胞の生物
学が、胚形成の間の造血幹細胞の産生に臨床的に関与する胚及び胚外の内皮細胞
に類似している様であると推測する〔１４−１６〕。最近、マウスの大動脈−生
殖腺−中腎（ＡＧＭ）の領域に由来する内皮細胞系（ＤＡＳ １０４−４）が、
マウスのＣＤ３４⁺ Ｓｃａ−Ｉ⁺ ｃ−ｋｉｔ⁺ ｌｉｎ^- 細胞の小画分を、７日間
の共培養に及んで維持することができ、そしてこれらの造血細胞がそれらのｉｎ
ｖｉｖｏでの再構成能を保持していたことが報告された〔４１〕。それらの発
見に基づき、筆者はＤＡＳ １０４−４ ＡＧＭ由来の細胞系が、低い割合の造
血幹細胞の自己複製を支持することができると仮定した〔４１〕。初期の造血前
駆細胞をｅｘ ｖｉｖｏで維持するためのそれらの類似の能力に基づいて、ヒト
脳内皮細胞が、ＡＧＭ由来の内皮細胞と類似の造血特性を有するであろうと思わ
れる。更に、ＨＵＢＥＣの単層上で観察されるＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 亜集団の細
胞サイクリング及び増大の十分な誘導は、脳内皮細胞が新規の造血的信号も提供
しうることを示唆する。

【００１９】 他のｅｘ ｖｉｖｏ培養系と比較して、我々はヒト脳内皮細胞（ＨＵＢＥＣ）
培養系が、将来の臨床的な幹細胞の増大及び遺伝子治療の研究において有用であ
ることを証明するであろう複数の主要な利点を有していると信じている。第１に
、非常に多くのサイクリングＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞の素速い増幅及び回収は
、培養１週間以内に起こりうる。第２に、造血前駆細胞の増大は、確立し、そし
て維持するのが容易な、あらかじめ形成した内皮の単層、加えて、限定した市販
のサイトカインの組合わせのみを必要とする。第３に、我々は、ＣＤ３４⁺ ＣＤ
３８^- 細胞の増大が、異種のストロマ細胞系と比較して、造血の生物学が容易に
分析されるべきヒト脳内皮細胞（単細胞型）のみを必要とすることを示した。第
４に、我々は、ブタ脳内皮細胞の単層上で増大したＨＰＣが、見かけの移植の欠
陥の無い、ｉｎ ｖｉｖｏの骨髄及びリンパ球、その両方の再増殖の潜在性を保
持していることを以前示した〔２３，２４〕。ＨＵＢＥＣの単層上で増大した初
期のＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞を利用する、進行中のＳＣＩＤ−Ｈｕ及び霊長類
の骨髄移植の研究の結果は、将来の治療的な応用のために、この系を評価するの
に重要であるだろう。

【００２０】 定義 １．ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）：様々な造血組織（限定しないが、末
梢血、骨髄、臍帯血、脾臓、及び肝臓）から単離されるＣＤ３４＋細胞であって
、致死的に照射される受容者への移植の後に、完全かつ永久的なリンパ球、赤芽
球及び骨髄の再構成が可能なもの。これらの細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＨＰ
Ｃ集団のサブセットである。 ２．ＨＰＣ：造血前駆細胞 ３．ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋造血前駆細胞：細胞系に拘束される表面マーカーＣＤ
３８を発現し、そして短期間の造血的再構成のみをｉｎ ｖｉｖｏで有するとし
て機能的に評される、拘束された／分化したＣＤ３４＋造血前駆細胞。 ４．ＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞：ＣＤ３８の発現を欠き、そして長期間
の造血的再構成が機能的に可能な造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む、ＣＤ３４＋ＨＰ
Ｃ細胞の未分化のサブセット。ＨＳＣは細胞の集団の中に位置する。 ５．ＳＣＦ：幹細胞因子 ６．ＩＬ−６：インターロイキン−６ ７．ＭＧＤＦ：巨核球増殖及び発生因子 ８．長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）：ストロマに基づいた培養系において、
外因性のサイトカイン無しに５〜７週間の培養に及んで成長し、増殖し、そして
維持されるそれらの潜在性によって定義されるＨＳＣ。 ９．コロニー形成細胞（ＣＦＣ）：培養１４日後に、骨髄、赤芽球、又はリンパ
球の細胞系のいずれかの、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイ可能なコロニーを生じさ
せる、拘束される前駆細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋）。 １０．ＨＵＢＥＣ：ヒト脳由来内皮細胞 １１．ＧＭ−ＣＳＦ：顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 １２．ＩＬ−３：インターロイキン−３ １３．ＭｏＡｂ：モノクローナル抗体 １４．ＦＡＣＳ：蛍光活性化セルソーティング １５．ＰＥ−ＣＤ３８：フィコエリトリンと結合した抗ＣＤ３８抗体 １６．ＦＩＴＣ−ＣＤ３４：フルオレセインイソチオシアネート抗ＣＤ３４抗体
１７．ＳＩＤ：表面細胞内ＤＮＡ解析 １８．７−ＡＡＤ：７−アミノアクチノマイシン １９．ＦＣＳ：ウシ胎児血清 ２０．ＣＤ３４＋Ｓｃａ−１＋ｃ−ｋｉｌ＋ｌｉｎ−細胞：完全かつ長期の造血
的再構成の潜在性をｉｎ ｖｉｖｏで有する、初期のマウス造血幹細胞。 ２１．Ｆｌｔ３（Rosnet et al. Oncogene, 6, 1641-1650, 1991）及びｆｌｋ−
２（Matthews et al., Cell, 65, 1143-1152, 1991）は、ｃ−ｆｍｓ及びｃ−ｋ
ｉｔ受容体に関連しているＴＫＲの変異型である。ｆｌｋ−２遺伝子の生成物は
、造血細胞及び前駆細胞上で発現し、一方、ｆｌｔ３遺伝子の生成物は更に一般
的な組織分布を有する。ｆｌｔ−３及びｆｌｋ−２受容体タンパク質はアミノ酸
配列が類似しており、そして細胞外ドメインの２つのアミノ酸残基が変化してお
り、そしてＣ末端付近に位置する３１アミノ酸のセグメントが異なる（Lyman et
al., Oncogene, 8, 815-822, 1993）。 ２２．Ｆｌｔ３−リガンド（“ｆｌｔ３−Ｌ”）は、前駆細胞及び幹細胞の成長
及び分化を制御することが見出されており、そして造血性の障害、特に再生不良
性貧血及び脊髄形成異常症候群の処置において有用性を有するようである。更に
、ｆｌｔ３−Ｌは細胞減少性の治療、及び細胞増大を受ける患者における異種、
同種又は自己の骨髄移植に有用だろう。Ｆｌｔ３−Ｌは更に、遺伝子治療並びに
前駆細胞及び幹細胞動員系において有用だろう。

【００２１】 例 初期のヒト脳内皮細胞（ＨＵＢＥＣ）の単離及び培養 中枢神経系に含まれる血管の短いセグメント（＜１０cm）（ウィリアム環から
派生する前大脳動脈及び椎骨脳底動脈のセグメント）及びＣＮＳの外側由来の血
管のセグメント（内腸骨動脈及び腎動脈）は、インフォームドコンセントを得た
後に、死後１２時間以内に検死した検体から得た。血管のセグメントを１０％熱
不活性化ＦＢＳ（Hyclone, Logan, UT）、１００ mcg／mL Ｌ−グルタミン、５
０ mcg／mLヘパリン、３０ mcg／mL内皮細胞増殖因子添加物（Sigma, St. Louis
, MO）及び１００ mcg／mLペニシリン／ストレプトマイシン溶液を添加したＭ１
９９（Gibco BRL, Grand Island, NY)から成る、４℃の完全内皮細胞培養培地に
据えた。

【００２２】 脳からの最初の解剖から６時間以内に、血管をＰＢＳ（Ｃａ²⁺，Ｍｇ²⁺無し）
でおだやかに２回洗浄し、そして２mLの完全内皮細胞増殖培地を含むゼラチンコ
ートした（必要なサイズの）組織培養皿に移した。滅菌した＃１０のメスを用い
て、１mmの断面の切断を、血管の長さに沿って行った。より大きな血管は最初に
、血管を開き、そして平らにするために、縦に３つの切れ目で切断し、そして次
に前記の組織培養皿に対して血管内腔を向けるために反転させた。解剖後すぐに
、追加の２mLの完全内皮細胞培地を各皿に加えた。培養物を、加湿した、３７℃
、５％ ＣＯ₂ の大気に据えた。

【００２３】 明白な肉眼で見える丸いＨＵＢＥＣコロニーは、７〜１４日の培養の間明らか
だった。集密的な単層の確立の後（〜３０日）、懸濁した培養培地を回収し、そ
して内皮細胞の単層をＰＢＳ（Ｃａ²⁺，Ｍｇ²⁺無し）で激しく洗浄し、トリプシ
ン処理し（０．２５mgトリプシン／mL、５mmol／Ｌ ＥＤＴＡ、３７℃、１０分
；ＧＩＢＣＯ）、そして２０mLの完全内皮細胞培養培地を含むゼラチンコートし
た７５cm² のフラスコ（Costar, Cambridge, MA)内に１：５の比率で継代培養し
た。ＨＵＢＥＣの単層に毎週完全培地を与え、そして一次細胞の複数回継代した
ものを確立し、そして保存した。

【００２４】 ヒト脳内皮細胞の特徴 １〜１０回継代したものに由来するＨＵＢＥＣは、注目した成長速度において
明らかな差異が無く、形態学的に同一の様であった。培養物は、８０〜１００％
集密的なときに、典型的な均一の内皮細胞の単層を丸い形態に発達させた（図１
Ａ）。５〜１０回の継代のときの細胞は、５mM ＥＤＴＡを用いて収集し、そし
てヒトのフォンウィルブランド（Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子に対する
モノクローナル抗体で染色し、そして次にフローサイトメトリーで解析した。図
１Ｂに示す様に、フォンウィルブランド因子はＨＵＢＥＣ上で高度に発現してい
る。ＨＵＢＥＣはＣＤ３４又はＣＤ３８抗原のいずれも、有意なレベル（＜５％
、データは示さない）で発現しない。

【００２５】 ＨＵＢＥＣの単層上での骨髄ＣＤ３４＋細胞の発現 ヒトＣＤ３４⁺ 細胞は、正常なヒトの死体の骨髄から、上述した様に〔２１〕
、９６％超の純度で単離した。ＣＤ３４⁺ 細胞の増殖及びＣＦＣの発生に対する
ＨＵＢＥＣ共培養の効果は、最初に同一の死体の提供者から単離したヒト非脳内
皮細胞を利用して、ストロマ無しの液体懸濁培養物及び共培養物と比較した。全
ての培養物が、あらかじめ最適なＣＤ３４⁺ 細胞増殖を支持することが示された
５つの刺激性のサイトカインの組み合わせたもの（ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−３＋Ｉ
Ｌ−６＋ＳＣＦ＋ｆｌｔ−３リガンド）を用いて同じ様に処理された〔２１〕。
共培養の７日後、大きな肉眼で見えるコロニー（＞２０００個の細胞）がＨＵＢ
ＥＣ上で発達し、この中で多くの細胞が、培養培地を用いてＨＵＢＥＣの単層の
おだやかな洗浄によって分散し、そして回収されうる。残りの細胞（＜１０％）
は、ＨＵＢＥＣの単層内に強固に接着し、そして埋め込まれている様であり、こ
れは「丸石様の造血性病巣」に似ていた（図２Ａ及び２Ｂ）。外部から供給した
増殖因子無しに、非常に小さな細胞の増殖が観察された。ＨＵＢＥＣの共培養の
７日目に、合計の非接着及びＣＤ３４⁺ 細胞の平均数は、それぞれ１３．４及び
６．４倍に増加し、ＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞の数は４５３倍に増大した（表１
）。ＨＵＢＥＣの共培養の７日後に採集した非接着細胞の４８％が、ＣＤ３４抗
原を発現した。ＣＤ３８ＰＥの蛍光を、ＰＥイソ型コントロールより少なくとも
半分以下発現したＣＤ３４⁺ 細胞として定義されるＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 亜集団
は、０日目に平均０．３％の集団だったものが、７日目に１０．５％の合計の非
接着細胞集団へと増加し、そして７日目に増大したＣＤ３４⁺ 細胞プールの２１
％を構成した（表１）。図３Ａ及び３Ｂは、０日目（３Ａ）及びＨＵＢＥＣの共
培養の７日後（３Ｂ）の、骨髄ＣＤ３４⁺ 細胞の代表的な表現型を示す。図４に
示す様に、７日目のＨＵＢＥＣの共培養物からセルソーティングによって単離し
たＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞は、細胞質に対して高い核の比率、はっきりとした
クロマチンパターン、及び顕著な核小体を有する、主に無顆粒の芽球である。

【００２６】 我々は更に、ストロマ無しの液体懸濁培養物及び非脳内皮細胞培養物により、
外因性のサイトカインの同一の組み合わせを用いて、７〜１４日の培養に及んで
ＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞及び複数の系列のＣＦＣを増大させるためのＨＵＢＥ
Ｃ共培養系の能力を比較した。最大の非接着（２３３倍）及び合計のＣＤ３４⁺
細胞の増大（２１倍）が、ＨＵＢＥＣの共培養系を用いた培養の１４日後に検出
され（表２）、無名数のＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞が１６９０倍に増大した。更
に、ＣＦＵ−ＧＭ，ＣＦＵ−Ｍｉｘ及びＢＦＵ−Ｅ ＣＦＣ前駆体は、それぞれ
５５８，１２９、及び１８０倍に増加した（表３）。比較において、全部の細胞
及びＣＦＣの収率は、ストロマ無しの液体懸濁液及び非脳内皮細胞の共培養物に
おいて有意に低かった（表２及び３）。合計のＣＤ３４⁺ 細胞の数は、ｅｘ ｖ
ｉｖｏ培養の７日後に検出されるＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞集団の増幅が少ない
か又は全く無い、これらの培養条件下で、１４日に及び維持したか又は増加した
（≦７倍）。液体懸濁培養物及び非脳内皮細胞培養物中で増大した造血細胞の代
表的な７日目の表現型を、図３Ｃ及び３Ｄに示す。

【表１】

【表２】

【表３】

【００２７】 細胞周期解析 別の一連の実験において、我々はｅｘ ｖｉｖｏで増大したＣＤ３４⁺ 細胞の
細胞周期の状態に対するＨＵＢＥＣの共培養の役割を研究した。０日目のＣＤ３
４⁺ ＣＤ３８^- 細胞の解析は、９２．９％の細胞がＧ₀ にあり、５．９％がＧ₁
にあり、そして１．２％がＧ₂ ／Ｓ／Ｍ期にあることを示した（図５Ａ）。ＨＵ
ＢＥＣの共培養の７日後、５５．２％のＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞がＧ₁ に進み
、３８．７％がＧ₂ ／Ｓ／Ｍ期にあり、そしてわずかに５．８％がＧ₀ に留まっ
た（図５Ｂ）。ＣＤ３４⁺ ＣＤ３８⁺ サブセットの類似の解析は、２９．８％、
５２．５％、及び１７．２％のＣＤ３８⁺ 細胞が、それぞれ７日目にＧ₀ ，Ｇ₁
、及びＧ₂ ／Ｓ／Ｍ期にあったことを示した。ストロマ無し及び非ＣＮＳ内皮細
胞の培養物由来のＣＤ３４⁺ 細胞の解析は、培養７日後の比較的低い／検出不可
能な頻度により行わなかった。

【００２８】 メチルセルロースＣＦＣ培養物中のＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞のクローン原性能
に対するｅｘ ｖｉｖｏでのＨＵＢＥＣの共培養の効果 ７日目のＨＵＢＥＣ共培養物が、ＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞のｉｎ ｖｉｔｒ
ｏでのクローン原性能を増強しうるかどうかを決定するために、我々はＦＡＣＳ
選別し、そしてＨＵＢＥＣの共培養の前及び７日後のＣＤ３４⁺ ，ＣＤ３４⁺ Ｃ
Ｄ３８^- 、及びＣＤ３４⁺ ＣＤ３８⁺ 細胞集団を回収した。ＣＤ３４⁺ ＣＤ３８ ^- 及びＣＤ３４⁺ ＣＤ３８⁺ 細胞は、解析した全ての試料において容易に回収さ
れうる。ソートウィンドウは、ＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 及びＣＤ３４⁺ ＣＤ３８（
明）細胞の明らかな分離を与えるために設置し、そしてその結果、多くのＣＤ３
４⁺ ＣＤ３８（暗）細胞は解析から排除された。各細胞集団由来の５００個の細
胞は、最適な濃度のＥＰＯ，ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−３，ＩＬ−６、及びＳＣＦを
添加した、１％メチルセルロースを含むＩｓｃｏｖｅの修飾ダルベッコ培地中に
播種され、そしてインキュベーションの１４日後に合計のＣＦＣ形成が計算され
た。表４に示した様に、そして以前の研究と一致して〔２９，３０〕、非常に少
ない定常状態のＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞（０．０３５％）が、存在していた場
合に、標準的なメチルセルロースに基づいたクローン原性培地中でコロニーを形
成することが可能であった。ＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞由来のコロニーは、同一
の培養条件下で培養した定常状態のＣＤ３４⁺ ＣＤ３８⁺ 細胞由来のコロニー（
クローニング効率１１．９％）より、平均的に小さかった。予想される様に、Ｃ
Ｄ３４⁺ ＣＤ３８⁺ サブセットは、全体的に定常状態のＣＤ３４⁺ の集団（〜９
８％のＣＤ３４⁺ ＣＤ３８⁺ 細胞から成る）のクローニング効率に近似のクロー
ニング効率を示し、それによって定常状態のＣＤ３４⁺ 細胞から生じるほとんど
のコロニーは、ＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- サブセットからの寄与がほとんど又は全く
無いＣＤ３４⁺ ＣＤ３８⁺ サブセットに起因することを確認した。

【００２９】 定常状態のＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 前駆細胞を培養して得た結果と対照的に、活
性化した／増大したＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞を、共培養の７日後のＨＵＢＥＣ
の単層から厳密に再選択した場合、ＣＦＣの６８５倍の増大（０日目の０．０３
５％のクローニング効率が、７日目に２４．０％のクローニング効率となった）
が検出された。アッセイ可能なＣＦＣの数は、ＣＤ３４⁺ ＣＤ３８（明）細胞で
開始した培養より（１６．８％）、ＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 細胞で開始した培養の
方が大きかったが（２４．０％のクローニング効率）、選別しなかったＣＤ３４ ⁺ 細胞（４０．１％）と比べて低かった。これは、高いクローン原性の潜在性を
有するＣＤ３４⁺ ＣＤ３８（暗）細胞が、有意な割合の７日目のＣＤ３４⁺ 細胞
プールを含んで成るという事実に起因すると思われ、そしてこれらは厳密なソー
トウィンドウの設定における我々の解析から除外される。増加したコロニー数に
加えて、コロニーのサイズの増大も、ＣＤ３４⁺ ＣＤ３８⁺ 細胞と比べて、増大
し、そして選別したＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- で開始した培養で観察された。ＨＵＢ
ＥＣの共培養物から選別したＣＤ３４^- 細胞の評価は、この集団が事実上ＣＦＣ
を欠いていること（０．３％）を示した。これらのプレーティング効率は、ＨＵ
ＢＥＣの共培養の７日後に産生したＣＦＣの多くが、ＣＤ３４⁺ ＣＤ３８（明）
サブセットからの寄与が有意に少ないＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^- 及びＣＤ３４⁺ ＣＤ
３８（暗）集団に起因することを示している。

【表４】

【００３０】 参考文献

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】

【表１０】

【００３１】 明らかに、本発明の多くの変更及び組み合わせが上文の具体例から読みとれる
。上文の例は、本発明者が現在知っている最良の形態を開示することを意図して
おり、そして本発明を限定することは意図していない。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 図１Ａは一次培養におけるＨＵＢＥＣの表現型を示す。集密時の典型的な丸石
形態のＨＵＢＥＣ（継代１０回）（４０倍の拡大率）は、フローサイトメトリー
解析によって解析した。イソ型適合コントロールＡｂを太い実線で示し、一方、
ＦＩＴＣ結合抗ヒトフォンウィルブランド染色を点線で示す。

【図１Ｂ】 図１Ｂは初期培養におけるＨＵＢＥＣの表現型を示す。培養したＨＵＢＥＣ（
継代１０回）によるフォンウィルブランドの発現は、フローサイトメトリー解析
で解析した。イソ型適合コントロールＡｂを太い実線で示し、一方、ＦＩＴＣ結
合抗ヒトフォンウィルブランド染色を点線で示す。

【図２Ａ】 図２Ａは、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）＋インターロイキン−
３（ＩＬ−３）＋インターロイキン−６（ＩＬ−６）＋幹細胞因子（ＳＣＦ）＋
胎児肝臓チロシンキナーゼ−３リガンド（ｆｌｔ−３リガンド）で処理したＨＵ
ＢＥＣの単層上でのヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞の共培養の７日後の、造血細胞の典
型的な接着性コロニーの形態を示す。激しい洗浄後に、ＨＵＢＥＣの単層に対し
て接着性の造血細胞のコロニーを分散した（４０×）。

【図２Ｂ】 図２Ｂは、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）＋インターロイキン−
３（ＩＬ−３）＋インターロイキン−６（ＩＬ−６）＋幹細胞因子（ＳＣＦ）＋
胎児肝臓チロシンキナーゼ−３リガンド（ｆｌｔ−３リガンド）で処理したＨＵ
ＢＥＣの単層上でのヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞の共培養の７日後の、造血細胞の典
型的な接着性コロニーの形態を示す。ＨＵＢＥＣの単層上の造血細胞の接着性コ
ロニーを、ライトのギムザ染色で染色した（×１００）。

【図３Ａ】 図３Ａは、ＨＵＢＥＣの共培養対ストロマ無しの液体培養対ヒト非脳内皮細胞
の共培養の後の、増大したＣＤ３４＋骨髄細胞のフローサイトメトリー解析を示
す。精製したヒトＣＤ３４＋細胞は、ＧＭＣＳＦ＋ＩＬ−３＋ＩＬ−６＋ＳＣＦ
＋ｆｌｔ−３リガンドの存在下でＨＵＢＥＣの単層上又はストロマ無しの液体培
養液中又は非脳内皮細胞の単層との共培養物中に播種し、そして７日間培養した
。０日目の精製した骨髄ＣＤ３４＋細胞の表現型（インプット）を（Ａ）に示す
。７日後、非接着性の造血細胞は、ＨＵＢＥＣの共培養物（Ｂ）、液体懸濁培養
物（Ｃ）、及び非脳内皮細胞培養物（Ｄ）から採集し、そしてＦＩＴＣ結合ＣＤ
３４ ＭｏＡｂ及びＰＥ結合ＣＤ３８ ＭｏＡｂで染色し、そしてフローサイト
メトリーで解析した。ＣＤ３４発現のログ蛍光分布をＸ軸に沿って示し、そして
ＣＤ３８発現はＹ軸に沿って示した。各結果をそのイソ型コントロールと一緒に
示す。

【図３Ｂ】 図３Ｂは、ＨＵＢＥＣの共培養対ストロマ無しの液体培養対ヒト非脳内皮細胞
の共培養の後の、増大したＣＤ３４＋骨髄細胞のフローサイトメトリー解析を示
す。精製したヒトＣＤ３４＋細胞は、ＧＭＣＳＦ＋ＩＬ−３＋ＩＬ−６＋ＳＣＦ
＋ｆｌｔ−３リガンドの存在下でＨＵＢＥＣの単層上又はストロマ無しの液体培
養液中又は非脳内皮細胞の単層との共培養物中に播種し、そして７日間培養した
。０日目の精製した骨髄ＣＤ３４＋細胞の表現型（インプット）を（Ａ）に示す
。７日後、非接着性の造血細胞は、ＨＵＢＥＣの共培養物（Ｂ）、液体懸濁培養
物（Ｃ）、及び非脳内皮細胞培養物（Ｄ）から採集し、そしてＦＩＴＣ結合ＣＤ
３４ ＭｏＡｂ及びＰＥ結合ＣＤ３８ ＭｏＡｂで染色し、そしてフローサイト
メトリーで解析した。ＣＤ３４発現のログ蛍光分布をＸ軸に沿って示し、そして
ＣＤ３８発現はＹ軸に沿って示した。各結果をそのイソ型コントロールと一緒に
示す。

【図３Ｃ】 図３Ｃは、ＨＵＢＥＣの共培養対ストロマ無しの液体培養対ヒト非脳内皮細胞
の共培養の後の、増大したＣＤ３４＋骨髄細胞のフローサイトメトリー解析を示
す。精製したヒトＣＤ３４＋細胞は、ＧＭＣＳＦ＋ＩＬ−３＋ＩＬ−６＋ＳＣＦ
＋ｆｌｔ−３リガンドの存在下でＨＵＢＥＣの単層上又はストロマ無しの液体培
養液中又は非脳内皮細胞の単層との共培養物中に播種し、そして７日間培養した
。０日目の精製した骨髄ＣＤ３４＋細胞の表現型（インプット）を（Ａ）に示す
。７日後、非接着性の造血細胞は、ＨＵＢＥＣの共培養物（Ｂ）、液体懸濁培養
物（Ｃ）、及び非脳内皮細胞培養物（Ｄ）から採集し、そしてＦＩＴＣ結合ＣＤ
３４ ＭｏＡｂ及びＰＥ結合ＣＤ３８ ＭｏＡｂで染色し、そしてフローサイト
メトリーで解析した。ＣＤ３４発現のログ蛍光分布をＸ軸に沿って示し、そして
ＣＤ３８発現はＹ軸に沿って示した。各結果をそのイソ型コントロールと一緒に
示す。

【図３Ｄ】 図３Ｄは、ＨＵＢＥＣの共培養対ストロマ無しの液体培養対ヒト非脳内皮細胞
の共培養の後の、増大したＣＤ３４＋骨髄細胞のフローサイトメトリー解析を示
す。精製したヒトＣＤ３４＋細胞は、ＧＭＣＳＦ＋ＩＬ−３＋ＩＬ−６＋ＳＣＦ
＋ｆｌｔ−３リガンドの存在下でＨＵＢＥＣの単層上又はストロマ無しの液体培
養液中又は非脳内皮細胞の単層との共培養物中に播種し、そして７日間培養した
。０日目の精製した骨髄ＣＤ３４＋細胞の表現型（インプット）を（Ａ）に示す
。７日後、非接着性の造血細胞は、ＨＵＢＥＣの共培養物（Ｂ）、液体懸濁培養
物（Ｃ）、及び非脳内皮細胞培養物（Ｄ）から採集し、そしてＦＩＴＣ結合ＣＤ
３４ ＭｏＡｂ及びＰＥ結合ＣＤ３８ ＭｏＡｂで染色し、そしてフローサイト
メトリーで解析した。ＣＤ３４発現のログ蛍光分布をＸ軸に沿って示し、そして
ＣＤ３８発現はＹ軸に沿って示した。各結果をそのイソ型コントロールと一緒に
示す。

【図４】 図４は、ＨＵＢＥＣの共培養の７日後の、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の形態を
示す。ＧＭＣＳＦ＋ＩＬ−３＋ＩＬ−６＋ＳＣＦ＋ｆｌｔ−３リガンドで処理し
たＨＵＢＥＣの単層上でのヒトＣＤ３４＋細胞の共培養の７日後、非接着性の細
胞を採集し、そしてＦＩＴＣ結合ＣＤ３４及びＰＥ結合ＣＤ３８で染色した。蛍
光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）によって回収し、そしてライトのギムザ染色
で染色した代表的なＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞を１００倍で示す。

【図５Ａ】 図５Ａは、ＨＵＢＥＣの共培養の０日目及び７日後の骨髄ＣＤ３４＋ＣＤ３８
−細胞の細胞周期の状態を示す。骨髄ＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３４ＡＰＣ，ＣＤ
３８ＰＥ，Ｋｉ６７ＦＩＴＣ、及び７ＡＡＤを用いて、細胞周期の状態を評価す
るために染色した。骨髄ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞は、Ｋｉ６７ＦＩＴＣ及び７
ＡＡＤのそれらの染色に基づいて示す。

【図５Ｂ】 図５Ｂは、ＨＵＢＥＣの共培養の０日目及び７日後の骨髄ＣＤ３４＋ＣＤ３８
−細胞の細胞周期の状態を示す。骨髄ＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３４ＡＰＣ，ＣＤ
３８ＰＥ，Ｋｉ６７ＦＩＴＣ、及び７ＡＡＤを用いて、細胞周期の状態を評価す
るために染色した。ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞は、前記のものと同一の染色を用
いて示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 シュート，デニス ジェイ． アメリカ合衆国，メリーランド 20814， ベセスダ，アパートメント 41，ウッドモ ント アベニュ 75000 (72)発明者 デイビス，トーマス エー． アメリカ合衆国，バージニア 20171，オ ークヒル，タッカウェイ ドライブ 13211 Ｆターム(参考） 4B065 AA93X AA94X AC20 BB19 BB34 BC50 CA44 4C087 AA01 AA03 BB44 BB64 MA66 NA14 ZA51

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 初期の幹細胞を含む、ヒト骨髄ＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前
   駆細胞の増大方法であって； ｉ）単離したＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞を、ヒト脳内皮細胞と接触さ
   せ；そして ii）接触させたＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞及び内皮細胞を、前記のＣ
   Ｄ３４＋幹細胞及び前駆細胞の増幅／増大を支持するのに十分な量の少なくとも
   １つのサイトカインの存在下で共培養する、 段階を含んで成る方法。
2. 【請求項２】 初期の幹細胞を含む、ヒト骨髄ＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前
   駆細胞の増大方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで； ｉ）前記のＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞を、ヒト骨髄から単離し； ii）単離したＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞を、ヒト脳内皮細胞と接触さ
   せ；そして iii ）接触させたＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞及び内皮細胞を、前記の
   ＣＤ３４＋幹細胞及び前駆細胞の増幅／増大を支持するのに十分な量の少なくと
   も１つのサイトカインの存在下で共培養する、 段階を含んで成る方法。
3. 【請求項３】 前記の増大がｉｎ ｖｉｔｒｏである、請求項１又は２に記
   載の方法。
4. 【請求項４】 前記の増大がｅｘ ｖｉｖｏである、請求項１又は２に記載
   の方法。
5. 【請求項５】 前記のＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞が、前記内皮細胞
   の半集密的な単層と接触する、請求項１又は２に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記サイトカインが、顆粒球−マクロファージコロニー刺激
   因子及び幹細胞因子の混合物；インターロイキン−３、幹細胞因子、及びインタ
   ーロイキン−６の混合物；顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、インター
   ロイキン−３、幹細胞因子、及びインターロイキン−６の混合物；並びにこれら
   の混合物の組み合わせ、から成る群から選択される、請求項１又は２に記載の方
   法。
7. 【請求項７】 前記サイトカインが、顆粒球−マクロファージコロニー刺激
   因子、インターロイキン−３、幹細胞因子及びインターロイキン−６の混合物で
   ある、請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記サイトカインが顆粒球−マクロファージコロニー刺激因
   子である、請求項６に記載の方法。
9. 【請求項９】 ヒト骨髄ＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞をヒトにおいて
   移植する方法であって； ｉ）単離したＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞を、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−造
   血前駆細胞を増大させる１又は複数の因子を含むヒト脳内皮細胞と接触させ； ii）接触させたＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞及び内皮細胞を、前記のＣ
   Ｄ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞の増幅／増大を支持するのに十分な量の少なく
   とも１つのサイトカインの存在下で共培養し； iii ）増幅した／増大したＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞を培養物から単
   離し；そして iv）増幅した／増大したＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞を、前記のヒトに
   注入する、 段階を含んで成る方法。
10. 【請求項１０】 ヒト骨髄ＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞をヒトにおい
    て移植する方法であって； ｉ）ＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞をヒト骨髄から単離し； ii）単離したＣＤ３４＋ＣＤ３４−造血前駆細胞を、前記のＣＤ３４＋ＣＤ３
    ８−造血前駆細胞を増大させる１又は複数の因子を含むヒト脳内皮細胞と接触さ
    せ； iii ）接触させたＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞及び内皮細胞を、前記の
    ＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞の増幅／増大を支持するのに十分な量の少な
    くとも１つのサイトカインの存在下で共培養し； iv）増幅した／増大したＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞を培養物から単離
    し；そして ｖ）増幅した／増大したＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞を、前記のヒトに
    注入する、 段階を含んで成る方法。
11. 【請求項１１】 前記細胞がヒトの骨髄細胞から単離される、請求項９又は
    １０に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記細胞が、前記のＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞を
    必要とするヒトの骨髄から単離される、請求項９又は１０に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記のＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞が、提供者の骨
    髄から単離される、請求項９又は１０に記載の方法。
14. 【請求項１４】 ヒトＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞を増幅／増大する
    方法であって； ｉ）単離したＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞を、ヒト脳内皮細胞と接触さ
    せ；そして ii）接触させたＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞及び内皮細胞を、前記のＣ
    Ｄ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞を増幅／増大させるのに十分な量の、顆粒球−
    マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン−３、幹細胞因子及びイン
    ターロイキン−６の混合物の存在下で共培養する、段階を含んで成る方法。
15. 【請求項１５】 ヒトＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞を増幅／増大する
    方法であって； ｉ）ＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞を、ヒト骨髄から単離し； ii）単離したＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞を、ヒト脳内皮細胞と接触さ
    せ；そして iii ）接触させたＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞及び内皮細胞を、前記Ｃ
    Ｄ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞を増幅／増大させるのに十分な量の、顆粒球−
    マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン−３、幹細胞因子及びイン
    ターロイキン−６の混合物の存在下で共培養する、 段階を含んで成る方法。
16. 【請求項１６】 前記増大がｉｎ ｖｉｔｒｏである、請求項１４又は１５
    に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記増大がｅｘ ｖｉｖｏである、請求項１４又は１５に
    記載の方法。
18. 【請求項１８】 ヒト脳内皮細胞並びに、顆粒球−マクロファージコロニー
    刺激因子、インターロイキン−３、幹細胞因子及びインターロイキン−６から成
    る群から選択されるサイトカイン、ｆｌｔ３−リガンド並びにそれらの組み合わ
    せを含んで成る、細胞の増大のための増殖培地。
19. 【請求項１９】 更に、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、インタ
    ーロイキン−３、幹細胞因子及びインターロイキン−６から成る群から選択され
    るサイトカイン、ｆｌｔ３−リガンド並びにそれらの組み合わせを含んで成る、
    請求項１８に記載の増殖培地。
20. 【請求項２０】 前記培地がヒト脳内皮細胞の単層を含んで成る、請求項１
    ８に記載の増殖培地。