CN102220282A - 从白血病细胞株分选白血病干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从白血病细胞株分选白血病干细胞的方法，其包括如下步骤：（1）对人急性髓系白血病细胞株KG1a细胞进行培养传代；（2）免疫磁珠法分选CD34⁺CD38^-细胞，获得白血病干细胞；所述的白血病干细胞对常规化疗和NK免疫治疗双抵抗。本发明的分选方法操作简单，能够从KG1a细胞中分离出大量高纯度的白血病干细胞，对白血病干细胞的研究具有重大意义。

Description

从白血病细胞株分选白血病干细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种分选白血病干细胞的方法，特别是涉及一种从白血病细胞株分选对常规化疗和NK免疫治疗双抵抗的白血病干细胞的方法。

背景技术

急性骨髓系白血病（AML）是一种获得性造血干细胞恶性克隆性疾病，有各种的基因异常。近年来，AML的治疗经历了许多变革，CD33单克隆抗体应用，新化疗药物和化疗方案的出现，使缓解率和复发后再次缓解率明显提高。异基因造血干细胞移植仍是当前唯一能治愈AML的方法。但因受供者来源、患者年龄和及其他因素的影响，大部分AML患者未能够接受异基因造血干细胞移植，而且还存在移植后的移植物抗宿主病、移植失败、疾病复发等危险因素存在，尤其是高危病人移植后复发的危险性更大。所以AML治疗前景仍不容乐观。因此迫切需要进一步研究AML恶性克隆的起源，明确其复发和耐药的机制，为有效治疗提供新靶标。

现在，已经有确切的证据证明AML包含有白血病干细胞（LSCs），这些细胞是白血病化疗甚至免疫治疗如异基因骨髓移植后复发的主要原因。要最终治愈白血病，必须清除这些细胞。但是，尽管白血病干细胞的概念已经提出许多年，仅仅在最近几年大家才越来越注意到白血病干细胞，但对LSCs的各种特性，如生存通路、凋亡通路和自我更新等了解甚少。对LSCs研究的最大限制是缺乏足够的LSCs。因此，建立一个简单易行的鉴定、分离和获得LSCs的方法至关重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种操作简单的分选方法，从KG1a细胞中分离出大量高纯度的白血病干细胞。

本发明提供一种从白血病细胞株分选白血病干细胞的方法，其包括如下步骤：

（1）对人急性髓系白血病细胞株KG1a细胞进行培养传代；

（2）免疫磁珠法分选CD34⁺CD38^-细胞，获得白血病干细胞;

所述的白血病干细胞对常规化疗和NK免疫治疗双抵抗。因为本细胞株所有细胞均表达CD34，所以只需要作CD38-的选择，不需要作CD34阳性选择

优选的，所述方法还包括（3）对步骤（2）获得的白血病干细胞进行分析鉴定。

作为本发明从白血病细胞株分选白血病干细胞的方法的优选实施方式，所述步骤（1）为用含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液，在37℃, 含5%CO₂ 的饱含湿度的培养箱内对人急性髓系白血病细胞株KG1a细胞培养传代，当生长至70％融合度时按1:3传代。

作为本发明从白血病细胞株分选白血病干细胞的方法的优选实施方式，所述步骤（2）包括如下步骤：

（2a）离心收集待分选细胞，PBS洗涤二次，计数细胞，每10⁷个细胞加入100μl分选液和10μl CD38-FITC抗体，避光4°C孵育30分钟；

（2b）预冷PBS洗涤细胞一次，倒去上清，细胞团重新悬浮，每10⁷个细胞加入90μl分选液和10μl抗FITC的免疫磁珠，混匀后置4°C孵育15分钟；

（2c）预冷PBS洗涤细胞一次，倒去上清，细胞团重新悬浮在500μL分选液中，将LD分离柱安装到磁铁中，预先用2 ml分选液润湿LD柱，细胞悬液加到LD柱中，用一个无菌的试管收集流出未标记的阴性细胞，加入1ml缓冲液冲洗2次，最后一次在缓冲液快要流完时将柱子从磁场取下，放在一个无菌的试管内，在柱子中加入1ml的分选液，用柱子上的推注器将要分选的阳性细胞推出，收集细胞后进行计数。

作为本发明从白血病细胞株分选白血病干细胞的方法的优选实施方式，所述步骤（3）的鉴定分析步骤包括细胞纯度分析、细胞周期分析、流式细胞术细胞表面标记分析、细胞分化功能检测和细胞体外克隆形成实验中的至少一个步骤。

在本发明中，发明人提供了可靠的证据证明，尽管KG1a白血病细胞株已经在体外培养维持了很多年，但仍然有LSCs存在。研究发现KG1a细胞株中，LSCs约占60％，然而，在AML病人的骨髓和外周血中，LSCs仅占0.01%到0.09%。这将极大地克服既往研究LSCs的障碍，促进白血病干细胞研究和临床应用的极大发展。同时，发明人也发现KG1a细胞分选出的CD34+CD38－细胞具有LSCs的各种特征如包括分化功能、增殖功能和自我更新功能。

在以前的研究中，用免疫磁珠的方法已经成功地从AML病人骨髓中分离出CD34+CD38-细胞，并且证明这些细胞具有干细胞特性，与AML病人缓解率、化疗敏感性和耐药有关，但细胞数很少，更重要的是由于不同病人之间的个体差异，很难应用这些细胞系统地研究LSCs的一般特性，以找到特异性治疗靶标。这促使发明人寻找更好的研究LSCs的细胞模型。已建立的白血病细胞株可在体外长期培养保持，可能存在LSCs，而且细胞非常容易获得。基于这些假设，在本发明中，从众多的白血病细胞株中，通过反复的预实验，细胞表面的免疫表型分析，确定了KG1a细胞可能处于较早期的阶段，存在LSCs，因为KG1a细胞对细胞生长因子没反应。因此，发明人采用类似的分离纯化及培养方法，从KG1a细胞中分离出纯度高达95％以上的CD34+CD38- 细胞，这些细胞大部分处于G0期，与干细胞大多数处于G0期相一致。分选出的CD34+CD38-细胞在培养基中培养的早期一直处于相对静止期，直到培养后14天，CD34+CD38＋细胞仅占2.3%，这提示LSCs在体外短期内仍维持在静止期，但与正常干细胞不同，这些细胞在体外培养中可以自行进入增殖周期，这说明LSCs在体外的增殖功能比正常HSCs强。软琼脂克隆形成实验中提示该类细胞可以形成21天的克隆，从而提示其具有白血病干细胞的特性。这类细胞在通过尾静脉输入NOD/SCID小鼠体内8周后,各项检测指标均提示已在这些实验小鼠体内成功模拟出了人类所患的AML疾病模型。同时,体内二次移植实验进一步证实了源于KG1a 细胞的CD34+CD38- 细胞具有足够的白血病驱动性。综合体内外的实验,有足够的证据说明从KG1a细胞所分离得到CD34+CD38- 细胞具有白血病干细胞的特性，是AML发生发展的始动细胞。

来自KG1a细胞分选出LSCs细胞可以分化和产生CD34+CD38+ 和CD34+CD38-两种细胞，在体内和体外均显示自我更新功能，在NOD/SCID小鼠中可高效建立白血病模型，以上白血病干细胞的成功分离以及可靠的异种移植检测方法的建立证明白血病干细胞不但具有分化功能，而且能自我更新，这些结果进一步证明了LSCs的存在。更重要的是，可从已经建立的细胞株分选出LSCs的发现提供了一个简单的获得LSCs的总策略。由于LSCs在AML病人中数量通常极少，鉴定很困难，分离出来研究它们的特性更困难。本发明的分离方法将极大地促进白血病干细胞的更深入研究，对开发针对LSCs的靶向治疗新方法，克服白血病耐药和免疫抵抗、复发,实现自体骨髓移植的骨髓净化和清除微小病灶等，均具有一定意义。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。

实施例1从白血病细胞株分离白血病干细胞

一、实验材料

1.       主要溶液和试剂

PRMI1640液体培养基（Gibco, USA）；胎牛血清（四季青，杭州）；组织级别DMSO、碘化丙啶（propidium iodide，PI ）(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO)，CD38-FITC、anti-FITC Microbeads，BSA, EDTA, LD column，MACS separator (Miltenyi Biotec Company，Germany), CD34-APC, CD38-FITC, CD45-perCP，CD11b, CD123-PE ((Pharmingen公司,USA)，Difco Bacto 软琼脂 （Allexis 公司，USA），人特异CD45和CD34抗体（DAKO公司）。

2.       主要试剂溶液配制

① 细胞冻存液：将1份组织级别DMSO加入9份胎牛血清配制成10％DMSO细胞冻存液。

②磷酸盐缓冲液(Phosphate-buffered saline (PBS)：8g Nacl+0.2g KCl+ 2.8g Na₂HPO₄·12H₂O+0.2g KH₂PO₄，超纯水定容至总体积1000ml，调整pH值为7.4，分装后高温灭菌，冷却后放置4℃冰箱备用。

③ 分选液：pH为7.2的PBS＋0.5% bovine serum albumin (BSA)＋2 mM EDTA

④ 瑞氏染液配制：瑞氏染料830 mg＋甲醇500ml。

先称干燥瑞氏染料放置乳钵内，用乳棒轻轻敲碎染料成粉末，再行研磨至细粉末，加少许甘油或甲醇溶解研磨，再加较多量甲醇研磨呈一面镜光亮，静置片刻，将上层液体倒入清洁储存瓶内，再加甲醇研磨，重复数次，直至乳钵内染料及甲醇用完为止，摇匀，密封瓶口，存室温暗处，储存愈久，则染料溶解、分解就越好，一般储存3个月以上为佳。

⑤ 姆萨红染液配制：姬姆萨红染料（粉末）0.5g＋甲醇33ml＋甘油33ml。先将姬姆萨染料放入乳钵中，逐渐倒甘油研磨溶于甘油中，置于56℃水温箱内，90～120分钟，然后加入甲醇，摇匀后放置数天，过滤后或不过滤即可使用。此染液放置室温阴暗处，时间越长越好。

3.       细胞系

人急性髓系白血病细胞株KG1a细胞，美国模式培养物集存库ATCC的保藏号为CCL-246.1，来源于男性急性髓性白血病（acute myeloid leukemia, AML）病人，粒细胞和巨核细胞集落刺激因子对这些细胞没有作用。用含有10%小牛血清的RPMI 1640培养液培养，在37℃, 含5%CO₂ 的饱含湿度的培养箱内培养传代。

4.       实验动物

24只NOD/SCID小鼠分次购自中山大学实验动物中心，4-6周龄，体重17～19克。严格饲养在恒温（20-26℃）、恒湿（50-56%）、无特定病原体（Specific pathogen-free，SPF）的空气洁净层流架内；裸鼠盒、空气过滤罩、垫料、饲料和饮水等均经高压蒸汽灭菌，并在无菌条件下适时更换。

二、实验方法

1.       细胞培养

用含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液，在37℃, 含5%CO₂ 的饱含湿度的培养箱内培养传代，当生长至70％融合度时按1:3传代。

2.       免疫磁珠细胞分选(MACS)

离心收集待分选细胞，PBS洗涤二次，计数细胞，每10⁷个细胞加入100μl分选液和10μl CD38-FITC抗体，避光4°C孵育30分钟。预冷PBS洗涤细胞一次，倒去上清，细胞团重新悬浮，每10⁷个细胞加入90μl分选液和10μl抗FITC的免疫磁珠，混匀后置4°C孵育15分钟。预冷PBS洗涤细胞一次，倒去上清，细胞团重新悬浮在500μL分选液中，将LD分离柱安装到磁铁中，预先用2 ml分选液润湿LD柱，细胞悬液加到LD柱中，用一个无菌的试管收集流出未标记的阴性细胞，加入1ml缓冲液冲洗2次，最后一次在缓冲液快要流完时将柱子从磁场取下，放在一个无菌的试管内，在柱子中加入1ml的分选液，用柱子上的推注器将要分选的阳性细胞推出，收集细胞后进行计数和下一步实验。

3.       CD34⁺CD38^-细胞纯度分析

收集分选的CD34⁺CD38^-的细胞，PBS洗涤2次，计数细胞，分管，按1μg/10⁶细胞加入相应单抗，4℃孵育30min，加入PBS 2ml，1000rpm， 离心10 min，弃上清液，悬浮细胞，同型IgG1作阴性对照，流式细胞术分析。

4.       细胞周期分析

CD34⁺CD38^-细胞用预冷PBS缓冲液漂洗一次，细胞重悬在300 μl的PBS中，用预冷70%乙醇在4℃固定过夜；800 g离心10 min，去上清，PBS漂洗2次，细胞重悬于500 μl预冷PBS缓冲液中，加入50 μl RNase (10 μg/ml)和25 μl PI (1 mg/ml), 避光室温孵育30 min，流式细胞术分析。

5.       流式细胞术细胞表面标记分析

收集细胞，PBS洗涤2次，重悬于预冷PBS，分别加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应（做双标或多标染色，把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入），孵育30分钟后，预冷PBS洗涤，重悬于缓冲液中，流式细胞术分析。

6.       细胞计数

取1×10⁴ CD34⁺CD38^-细胞或CD34⁺CD38^＋细胞，接种于60 cm²培养皿中，此时设定为0 天，每3天取细胞进行台盼兰染色细胞计数。

对应时间点收集细胞1000-2000 r·min-1离心，弃上清，混匀细胞后台盼蓝染色3min；血细胞计数板计数。细胞存活数目＝细胞总数－台盼蓝阳性细胞数。

7.       CD34⁺CD38^-细胞分化功能检测

分选的CD34⁺CD38^-细胞接种到培养皿，分别在7天、14天、21天、28天和35天收集细胞，流式细胞仪检测CD34和CD38的抗原表达，了解CD34⁺CD38^-细胞是否能分化出CD34⁺CD38^＋细胞。

8.       细胞体外克隆形成实验

收集CD34⁺CD38^-细胞悬液，计数细胞，1200rpm/min离心10 min，细胞团悬浮在等量的培养液里，起始密度是5000个细胞/培养皿。培养盘先铺2ml 0.5% Difco Bacto 琼脂基层。等量的细胞悬液和含有0.8% Difco Bacto 琼脂的RPMI 1640培养液铺在0.5%琼脂上。在37^oC培养箱培养，14天和21天时分别用0.005%结晶紫染料染色,数码照相机照相,再用Scion Image (a version of NIH Image adapted for Windows PC) 分析图像，计算克隆数。

9.       NOD/SCID小鼠模型的建立

（1）           NOD/SCID小鼠白血病模型的建立及实验分组

雌性5~6周龄NOD/SCID小鼠，体重17～19g，共12只。实验前2天购买NOD/SCID小鼠，饲养于中山大学实验动物中心。实验前给小鼠称重、观察一般状况，编号，用计算机产生随机数字的方法，随机地把小鼠分为正常对照组3只，放射对照组3只和CD34⁺CD38^-细胞输注组6只。

移植前一天NOD/SCID小鼠给与300rad照射。正常对照组和放射对照组从尾静脉注入0.2 ml PBS，白血病模型组经尾静脉输注2×10⁶ /0.2 ml CD34⁺CD38^-细胞。

1.       每周星期一、星期三和星期五测体重、观察饮食情况和活动能力作为小鼠的一般健康状况指标。动物中心工作人员每天观察小鼠一般情况。

2.       每周进行外周血涂片，Wright－Gimsa染色，观察有无白血病细胞。

3.       小鼠出现下面任何一种情况时予处死：体重下降超过10％、行动迟缓、不能进食和饮水，脱毛等

（2）          标本采集和检测

1.       第8周处死小鼠，处死前留取外周血进行血常规、肝功能和肾功能检测和血涂片检测；

2.       用含肝素的生理盐水冲洗骨髓腔，小鼠的骨髓在RPMI 1640＋10％FCS培养基中进行原代培养。

3.       取骨髓进行骨髓压片，Wright－Gimsa染色了解骨髓白血病细胞侵润情况，切除大脑、肺、肝脏、脾脏、卵巢、双测肾脏，如果有皮下和淋巴结侵润则一并切除；

4.       小鼠的内脏标本一半加入冻存液冻存于－80℃，一半在10%甲醛中固定；

（3）           标本固定、石蜡包埋、切片、HE染色

标本10%甲醛固定过夜；脱水：从70％酒精开始，依次为70％酒精、80％酒精、90％酒精、95％酒精（Ⅰ）、95％酒精（Ⅱ）、无水酒精（Ⅰ）、无水酒精（Ⅱ）、无水酒精（Ⅲ）各30min；透明：依次置入二甲苯（Ⅰ）、二甲苯（Ⅱ）、二甲苯（Ⅲ）各20分钟；浸蜡：在高于石蜡熔点2℃～3℃的烤箱内将石蜡熔化，将透明后的标本置入蜡（Ⅰ）30min、蜡（Ⅱ）120min、蜡（Ⅲ）150min；包埋：一个组织一个蜡块；

切片：4mm厚连续切片。

HE染色：①切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯（Ⅰ）5min→二甲苯（Ⅱ）5min→100％乙醇2 min→95％乙醇1 min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min；②苏木素染色5min，自来水冲洗；③盐酸乙醇分化30 s（提插数下）；④自来水浸泡15min或温水（约50℃）5min；⑤置伊红液2min；⑥常规脱水，透明，封片：95％乙醇（I）min→95％乙醇（Ⅱ）1min→100％乙醇（Ⅰ）1 min→100％乙醇（Ⅱ）1 min→二甲苯石碳酸（3:1）1 min→二甲苯（Ⅰ）1 min→二甲苯（Ⅱ）1 min→中性树脂封固；

根据HE染色，进行病理学诊断。

（4）           免疫组化检测

按即用型SABC免疫组化染色试剂盒说明书进行，检测组织标本人特异性的CD45和CD34抗原，设立阳性对照，DAB显色。

脱蜡与水化：

1）将玻片放入60℃恒温箱中烘烤30 min，使石蜡软化；

2）二甲苯Ⅰ中浸泡10 min，在二甲苯Ⅱ中在浸泡10 min，脱蜡；

3）梯度酒精水化：无水乙醇Ⅰ中浸泡5min，无水乙醇Ⅱ中再浸泡5 min；95%乙醇中浸泡5 min，80%乙醇5 min；75％乙醇中浸泡5 min；

4）蒸馏水浸洗3次，分别为5 min，8 min，8 min。

免疫组织化学染色SABC法：

1）用蒸馏水配置新鲜的3％的过氧化氢（H₂O₂）室温浸泡10分钟，蒸馏水冲洗1次；

2）PBS液浸洗5分钟×3次，擦干边缘；

3）滴加正常兔血清封闭液，室温10-20min；甩去多余液体；

4）加入一抗，覆盖组织切片；4度冰箱孵育过夜，第二天取出放室内30分钟；

5）PBS冲洗5分钟×3次；

6）擦干周边，每张切片加试剂SABC复合物，覆盖组织切片，37℃孵育20分钟；

7）PBS冲洗5分钟×3次；

8）DAB显色：擦干周边，每张切片滴加新鲜配制的DAB溶液，显色3分钟，显微镜下观察2～5分钟，细胞染色呈棕色为阳性，并中断显色，清水冲洗终止染色；

9）苏木素复染，自来水冲洗；

10）烘干玻片；

11）二甲苯透明，中性树脂封片＋盖玻片。

（5）           Wright-Giemsa染色细胞形态学检测

应用细胞甩片机进行细胞悬液甩片。通过1000 rpm离心10 min， KG1a细胞和来自小鼠骨髓的原代培养细胞永久固定在载波片上。波片自然风干后，先用瑞氏染液将涂膜面充分覆盖；稍等片刻再加姬姆萨染液2～3滴； 1-2分钟后，再缓慢加磷酸盐缓冲液在涂片膜上，直至膜面上染色液形成表面张力而终止染色液加入；染色30～40分钟；自来水缓缓冲洗，待干后在光学显微镜下观察细胞形态。

（6）           流式细胞术细胞表面标记分析

收集原代培养细胞和KG1a细胞，PBS洗涤2次，重新悬浮于预冷PBS，再分别加入连接有荧光素的抗体，孵育30分钟后，预冷PBS洗涤，加入缓冲液重悬，上机检测。

（7）           荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）

FISH按常规方法进行，作了轻微改动。细胞在甲醇：醋酸液（3：1）中固定后，滴到载波片上，0.01 pg/mL 蛋白酶K在37°C中处理30 min，2×SSC冲洗，加入RNAse处理。

探针及标本的变性：

探针变性：探针在75℃怛温水浴中温育5min，立即置0℃5～10min，使双链DNA探针变性。标本变性：①将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3h。②取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70%甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min。③立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5min，然后空气干燥。

杂交：将已变性或预退火的DNA探针10mL滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18×18盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜（约15～17h）。由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。

洗脱：杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5min。在已预热42～50℃的1×SSC中洗涤3次，每次5min。在室温下，将玻片标本2×SSC中轻洗一下。

杂交信号的放大

在玻片的杂交部位加150mL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。去掉保鲜膜，再加150mL avidin-FITC于标本上，用保鲜膜覆盖，37℃继续温育40min。取出标本，将其放入已预热42～50℃的洗脱液中洗涤3次，每次5min。在玻片标本的杂交部位加150mL封闭液II，覆盖保鲜膜，37℃温育20min。去掉保鲜膜，加150mL antiavidin于标本上，覆盖新的保鲜膜，37℃温育40min。取出标本，将其放入已预热42～50℃的新洗脱液中，洗涤3次，每次5min。取出玻片，自然干燥。取200mL PI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。

封片

可采用不同类型的封片液。如果封片中不含有Mowiol（可使封片液产生自封闭作用），为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持数月之久。

荧光显微镜观察FISH结果

先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490nm。细胞被PI染成红色，而经FITC标记的探针的探针所在位置发出绿色荧光。由于本实验使用的是Y染色体上的特异序列，因此在男性外周血染色体标本的杂交中呈阳性，即使在末分裂的细胞中，也可以观察到明显的杂交信号。

附录 FISH相关溶液的配制

1)       20×SSC：175.3g NaCl＋882.g柠檬酸钠，加水至1000mL（用10mol/L NaOH调pH至7.0）。

2)       去离子甲酰胺（DF）：将10g混合床离子交换树脂加入100mL甲酰胺中。电磁搅拌30min，用Whatmanl号滤纸过滤。

3)       体积分数70%甲酰胺/2×SSC：35mL甲酰胺，5mL 20×SSC，10mL水。

4)       体积分数50%甲酰胺/2×SSC：100mL甲酰胺，20mL 20×SSC，80mL水。

5)       体积分数50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。

6)       杂交液：8mL体积分数25%DS， 20mL 20×SSC混合。（或40mL体积分数50%DS，20mL 20×SSC，40mL ddH2O混合）取上述混合液50mL，与5mL DF混合即成。其终浓度为体积分数10% DS 2×SSC，体积分数50% DF。

PI/antifade溶液

1)       PI原液：先以双蒸水配置溶液，浓度为100mg/mL，取出1mL，加39mL双蒸水，使终浓度为2.5mg /mL。

2)       Antifade原液：以PBS缓冲液配制该溶液，使其浓度为10mg/mL，用0.5mmol/L的NaHCO3调pH值为8.0。取上述溶液1mL，加9mL甘油，混匀。

3)       I/antifade溶液：PI与antifade原液按体积比1：9比例充分混匀，-20℃保存备用。

4)       DAPI/antifade溶液：用去离子水配制1mL/mg DAPI储存液，按体积比1:300,以antifade溶液稀释成工作液。

5)       封闭液I：体积分数5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，dd H2O 1mL, Tween 20 5mL混合。

6)       封闭液II：体积分数5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250mL, dd H2O 750mL, Tween 20 5mL混合。

7)       荧光检测试剂稀释液：体积分数5% BSA 1mL，20×SSC 1mL，dd H2O 3mL, Tween 20 5mL混合。

8)       洗脱液：100mL 20×SSC，加水于500mL，加Tween20 500 mL。

9)       TE缓冲液：pH8.0: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA；

pH7.6： 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA；

pH7.4： 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA。

溶液I： 25mmol/L Tris HCl(pH 7.4), 10mmol/L EDTA。

溶液II：10% SDS，0.2M NaOH。

溶液III：Kac 14.7g, HAc 5.8mL, 加水至50mL。

LB培养基

胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g, NaCl 10g, 加水至1000mL，用5mmol/L NaOH调pH值至7.0。

第二次转种实验同第一次动物模型实验。

（8）           统计学处理方法

应用SPSS13.0软件进行数据处理，数据以均值±标准差（±s）表示，分化功能检测不同时间点组间CD34⁺CD38^＋细胞数的比较采用单向方差（one-way ANOVA）分析；不同时间CD34⁺CD38^-细胞和CD34⁺CD38^＋细胞的细胞数比较采用析因设计的方差分析。方差齐时，组间多重比较采用LSD法，方差不齐时，组间多重比较采用Tamhane’s T2法，P<0.05表示差异有统计学意义。

三、实验结果

1.       急性髓性白血病细胞株含有CD34⁺CD38^-CD123⁺白血病细胞

目前普遍认为CD34⁺CD38^-CD123⁺是LSC的表面标记，为了明确已建立的白血病细胞株是否含有LSCs，我们收集KG1a细胞进行CD34、CD38和CD123标记，使用流式细胞术进行分析。结果显示，KG1a细胞含有CD34⁺CD38^-CD123⁺细胞，CD34⁺CD38^-细胞占(54.167± 6.57)％，CD123⁺细胞占(86.13±2.84)%。这些结果提示KG1a细胞可能含有LSCs，可能可以作为白血病干细胞研究的细胞模型。

2.         CD34⁺CD38^-细胞纯度检测

流式细胞仪检测结果显示分选后CD34⁺CD38^-细胞的纯度达95%以上。

3.       大多数CD34⁺CD38^－细胞处于G0期

流式细胞术的方法检测KG1a细胞分选出的CD34⁺CD38^-细胞的周期状态，结果显示，(69.03±3.25)％的CD34⁺CD38^-细胞处于G0期。

4.         CD34⁺CD38^－细胞的分化功能

AML由LSCs启动、含有不同等级的细胞。为研究来源于KG1a细胞的CD34⁺CD38^-细胞是否具有分化功能，分选出的CD34⁺CD38^-细胞分别培养1周、2周、3周、4周和5周，流式细胞术分析CD34⁺CD38^＋的细胞数。结果显示，0周、1周、2周、3周、4周和5周CD34⁺CD38^＋的细胞数分别是(0.25±0.11)%、(1.83±0.15)%、(2.30±0.12)％、(16.90±0.58)％、(34.97±0.61)％和(56.45±0.74)％，CD34⁺CD38^-细胞在体外培养体系中不同时间点CD34⁺CD38^＋细胞数的差异有显著意义（F＝711.645，P=0.000）。可见，分选后的细胞是未分化的CD34⁺CD38^-细胞。分选后第二周，97.74%的细胞仍是CD34⁺CD38^－细胞，仅有2.30％是CD34⁺

CD38^＋细胞；3周后，CD34⁺CD38^＋细胞快速增加，大约在第5周达到KG1a细胞株CD34⁺CD38^＋的细胞数水平。因此，CD34⁺CD38^－细胞在体外培养中能产生CD34⁺CD38^＋细胞。

5.       CD34⁺CD38^－细胞的增殖功能

明确了CD34⁺CD38^－细胞具有分化功能，接着评价CD34⁺CD38^－细胞是否具有增殖功能。结果显示，在培养的前6天，两种细胞的生长都很慢，种植9天后，两种细胞都进入快速增长期，CD34⁺CD38^－细胞比CD34⁺CD38^＋细胞生长快，提示CD34⁺CD38^－细胞具有增殖功能，可产生白血病细胞，且在早期CD34⁺CD38^－细胞处于相对静止状态。

如表1所示，CD34⁺CD38^－和CD34⁺CD38^＋两种细胞间增殖的差异有显著意义(F=238.85，P=0.000)，CD34⁺CD38^－细胞增殖较明显，均数为43.84×10⁴，比CD34⁺CD38^＋细胞的28.72×10⁴高；不同时间点细胞数间的差异有显著意义(F= 891.883，P=0.000)。

表1 CD34⁺CD38^－和CD34⁺CD38^＋细胞增殖比较(                                                ±s, n=3)

* 组间主效应，^&时间组效应，＃时间与主效应的交互效应

7.         CD34⁺CD38^－细胞的体外克隆形成功能

干细胞最主要的且必需的特性是自我更新功能。为进一步明确分选的CD34⁺CD38^－细胞是否为LSCs，在体外应用克隆形成测定进行细胞功能评价。结果显示，细胞在14天时可以形成克隆，21天后，克隆仍然存在，且克隆增大，CD34⁺CD38^－细胞体外长期克隆形成的能力提示这些细胞在体外具有自我更新能力。

8.       CD34⁺CD38^－细胞在NOD/SCID小鼠体内自我更新功能测定

体内NOD/SCID小鼠模型和系列转种是评价自我更新能力最好的指标，为进一步验证CD34⁺CD38^－细胞的自我更新能力，通过尾静脉注射CD34⁺CD38^－细胞建立NOD/SCID小鼠动物模型评价CD34⁺CD38^－细胞的自我更新功能。

（1）           CD34⁺CD38^－细胞的白血病模型的形态

尾静脉注射CD34⁺CD38^－细胞后4到8周，发现小鼠形成白血病，在骨髓和外周血均可发现白血病细胞，且细胞形态与原始的KG1a细胞形态高度一致，这些结果提示从KG1a细胞分离出的CD34⁺CD38^－细胞具有肿瘤原性。

（2）           CD34⁺CD38^－细胞的白血病模型多器官浸润

为进一步明确CD34⁺CD38^－细胞成功移植到小鼠体内，同时进行组织学和免疫组化分析。结果显示，骨髓、肝脏、脾、皮肤、淋巴结和肾脏均有白血病细胞浸润，而且免疫组化结果显示浸润的白血病细胞表达人特异性CD45和CD34抗原。提示浸润的细胞来自移植到小鼠体内的人白血病细胞。

（3）           来自荷CD34⁺CD38^－KG1a细胞小鼠骨髓白血病细胞原代培养研究

明确荷白血病细胞小鼠骨髓有白血病细胞浸润后，为进一步研究移植到小鼠体内的CD34⁺CD38^－KG1a细胞的特性，我们对小鼠的原代细胞进行培养，经过大约4周反复传代培养后，原代细胞体外培养稳定，且细胞形态与KG1a细胞相似

（4）           来自荷CD34⁺CD38^－KG1a细胞小鼠骨髓白血病原代细胞特性研究

荧光原位杂交的结果显示来自移植CD34⁺CD38^－KG1a细胞小鼠的骨髓培养细胞有Y染色体存在，与KG1a细胞相似，然而，没移植CD34⁺CD38^－KG1a细胞小鼠的骨髓细胞没有Y染色体存在。因为KG1a细胞来自男性AML病人，这结果提示CD34⁺CD38^－KG1a细胞成功移植到小鼠体内。

（5）           来自荷CD34⁺CD38^－KG1a细胞小鼠骨髓白血病原代细胞表面抗原研究

流式细胞术比较分析KG1a细胞和移植CD34⁺CD38^－KG1a细胞小鼠的骨髓培养细胞一系列膜抗原的表达。结果显示，小鼠骨髓原代培养细胞都表达人类特异抗原CD45，提示这些细胞来自移植进去的人白血病细胞。另外，这些细胞表达CD34、CD123和CD11b，与KG1a细胞的膜抗原表达基本一致。但是，这些细胞CD38的表达却意外的非常低，经过体内传代和体外培养传代，CD34⁺CD38^－KG1a细胞绝大部分仍维持在干细胞水平。体内功能研究明确了CD34⁺CD38^－细胞具有自我更新功能。

（6）           来自荷CD34⁺CD38^－KG1a细胞小鼠骨髓白血病原代细胞二级系列转种

系列转种是确证自我更新功能最好的指标，来自移植CD34⁺CD38^－KG1a细胞的小鼠骨髓培养细胞系列转种到二级的NOD/SCID小鼠，结果显示同样能在小鼠体内形成白血病，与首次接种基本一致。

实施例二

分选的白血病干细胞对常规化疗药物和NK细胞杀伤抵抗

一、实验材料

PRMI 1640液体培养基（Gibco, USA）；胎牛血清（四季青，杭州）；柔红霉素（Daunorubicin, DNR，深圳万乐制药厂））和米托蒽醌（Mitoxantrone, Mito，浙江瑞新药业股份有限公司）、组织级别DMSO、噻唑蓝（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium，MTT） (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO)，LDH杀伤活性检测试剂盒(Promega公司)。CD38-FITC、anti-FITC Microbeads，抗CD56免疫磁珠，BSA, EDTA, LD column，MACS separator（Miltenyi Biotec Company，Germany）。

二、实验方法

1.       外周血单个核细胞的分离

采用常规密度梯度离心法分离：无菌抽取外周静脉血，肝素抗凝（20U/ml血），用PBS按3:1体积稀释，沿管壁小心叠加到预先加有等体积的Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液的离心管中，20℃1200rpm离心30 min，小心吸取白膜层细胞，放入另一个试管，PBS洗涤，1200rpm离心10min，弃上清，重复2次，细胞用于以下实验。

2.       NK细胞的分离纯化

取分离出的外周血单个核细胞，经PBS洗涤二次，计数细胞，每10⁷细胞加入80μl磷酸盐缓冲液，按每10⁷细胞加入20μl抗NK细胞免疫磁珠，4-8℃孵育15min后，然后每10⁷细胞加入1 ml的缓冲液，离心（300g，10min），去上清，每10⁸细胞加入500μl的缓冲液，将悬浮好的细胞倒入MiniMACS磁场中，进行磁珠分离，用一个无菌的试管收集流出的阴性细胞，加入500μl的缓冲液冲洗分选的细胞，共3次，最后一次在缓冲液快要流完时将柱子从磁场取下，放在一个无菌的试管内，在柱子中加入1ml的培养基，用柱子上的推注器将要分选的阳性细胞推出。

3.       细胞介导的细胞毒性试验的LDH法

分析板设置：

a. 效应细胞自发LDH释放：不同效靶比，取相应数量效应细胞加至反应板。

b. 实验孔：不同效靶比细胞混合。

c. 靶细胞最大LDH释放孔

d. 靶细胞自发LDH释放孔

e. 培养液背景

加样完成后，离心250g 离心4min以保证效靶细胞充分接触。

细胞培养和上清获取：

置反应板于培养箱中4小时。在获取上清前45分钟，加10ul裂解液至最大释放孔中。裂解完成后，250g 4min离心。

LDH测定：

1.       转上清50ul至酶联板

2.       解冻分析缓冲液，取12ml，可37℃水浴以解冻，但不应时间太长。若有沉淀，可离心取12ml上清

3.       12ml分析缓冲液加温至室温，避光。室温的分析缓冲液12ml加至一瓶底物混合物。轻柔颠倒混匀。1瓶可用于2个96孔板。一旦重悬，避光并迅速使用。

4.       每孔加50ul重组底物混合液，避光，室温孵育30min。未用完的重组底物混合液可－20℃保存6－8周。

5.       每孔加入50ul终止液

6.       吸管去除大气泡，1小时内测吸光度490 或492处均可。

7.       以背景培养液吸光度的2倍以上吸光度所对应的靶细胞浓度设置靶细胞浓度。

计算

a. 实验孔、效应细胞自发释放孔、靶细胞自发释放孔均吸光度均减去培养液背景吸光度。

b. 靶细胞最大释放孔 减去容积控制孔吸光度

c. 计算细胞死亡率

4.       MTT比色法测定细胞活性

细胞悬液接种到96孔板过夜，起始密度是5000个细胞/孔，加入不同的处理48h后，每孔加入3mg/mL MTT试剂20μl，继续在培养箱培育4h，随后用700×g的转速离心细胞15min，弃去培养液，每孔加入200μl DMSO溶解细胞团，测定570nm时的（吸光度）值（A值）。

三、实验结果

1.       LSCs 对常规化疗药的敏感性

目前白血病化疗药物主要以蒽环类为主，其中最常用的是DNR和Mito，因此，我们首先研究LSCs对这两个药的敏感性。

对DNR的敏感性

MTT细胞毒性的结果显示，LSCs对DNR抵抗，检验的各种浓度对LSCs均无细胞毒作用，即使在DNR的浓度为100ng/ml时，LSCs相对于对照组的活性为1.05±0.05。而作为DNR杀伤的阳性对照，DNR对CD34⁺CD38^＋的细胞和HL-60细胞均有细胞毒作用，且其作用呈剂量依赖性。各种DNR浓度处理后，LSCs、CD34⁺CD38^＋细胞和HL-60细胞活性的差异有显著性意义（F=987.658，P=0.000）；细胞活性均数由高到底分别为1.10％、0.86%和0.66%，各水平间的差异有显著性意义（P=0.000， P=0.000， P=0.000）。不同DNR浓度间细胞活性的差异有显著性意义（F= 218.727，P=0.000）（表2）。

表2不同DNR浓度对LSCs、Non-LSCs和HL-60的细胞毒作用

(

±s, n=4)

* 组间主效应，^&浓度主效应，＃组间与浓度主效应的交互效应

3.       LSCs 对Mito的敏感性

MTT细胞毒性的结果显示，LSCs对Mito抵抗，当Mito的浓度≤50ng/mL时，对LSCs均无细胞毒作用。100ng/ml Mito处理与对照组相比，LSCs活性的差异有显著性意义（P＝0.038）。而作为Mito杀伤的阳性对照，Mito对CD34⁺CD38^＋细胞和HL-60细胞均有细胞毒作用，且其作用呈剂量依赖性。在各种mito浓度处理时，LSCs、CD34⁺CD38^＋细胞和HL-60细胞活性的差异有显著性意义（F=2054.640，P=0.000）；细胞活性均数由高到底分别为1.02％、0.87%和0.58%，各水平间的差异有显著性意义（P=0.000， P=0.000， P=0.000）。不同的Mito浓度间细胞活性的差异有显著性意义（F=543.833，P=0.000）（表3）。

表3  Mito对LSCs、Non-LSCs和HL-60细胞的细胞毒作用(±s, n=4)

* 组间主效应，^&浓度主效应，＃组间与浓度主效应的交互效应

4.       NK细胞纯度检测

流式细胞仪检测结果显示分选后阳性部分CD3^－CD16⁺CD56⁺细胞的纯度达90%以上。

对NK细胞杀伤的敏感性研究

LDH释放测定法结果显示，NK细胞对两种细胞的杀伤在各种效靶比时，LSCs和CD34⁺CD38^＋细胞两种细胞活性间的差异有显著性意义（F= 2009.883, P=0.000）；细胞活性均数分别为91.03%和48.82%。提示LSCs对NK细胞的杀伤不敏感；不同的效靶比间细胞活性的差异有显著性意义（F= 376.998，P=0.000）（表4），NK细胞对LSCs和非LSCs的杀伤作用随着效靶比的增加而增强。结果显示，不同效靶比时NK细胞对非LSCs的作用曲线明显左移，提示非LSCs细胞对NK细胞更敏感，增加效靶比时，对非LSCs的杀伤增强更明显。

表4不同效靶比时NK细胞杀伤后LSCs和非LSCs的细胞存活率(

±s, n=4,%)

* 组间主效应，^&效靶比主效应，＃组间与效靶比主效应的交互效应。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.一种从白血病细胞株分选白血病干细胞的方法，其包括如下步骤：

（1）对人急性髓系白血病细胞株KG1a细胞进行培养传代；

（2）免疫磁珠法分选CD34⁺CD38^-细胞，获得白血病干细胞;

所述的白血病干细胞对常规化疗和NK免疫治疗双抵抗。

2.根据权利要求1所述的从白血病细胞株分选白血病干细胞的方法，其特征在于，所述方法还包括

（3）对步骤（2）获得的白血病干细胞进行分析鉴定。

3.根据权利要求1所述的从白血病细胞株分选白血病干细胞的方法，其特征在于，所述步骤（1）为用含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液，在37℃, 含5%CO₂ 的饱含湿度的培养箱内对人急性髓系白血病细胞株KG1a细胞培养传代，当生长至70％融合度时按1:3传代。

4.根据权利要求1所述的从白血病细胞株分选白血病干细胞的方法，其特征在于，所述步骤（2）包括如下步骤：

（2a）离心收集待分选细胞，PBS洗涤二次，计数细胞，每10⁷个细胞加入100μl分选液和10μl CD38-FITC抗体，避光4°C孵育30分钟；

（2b）预冷PBS洗涤细胞一次，倒去上清，细胞团重新悬浮，每10⁷个细胞加入90μl分选液和10μl抗FITC的免疫磁珠，混匀后置4°C孵育15分钟；

（2c）预冷PBS洗涤细胞一次，倒去上清，细胞团重新悬浮在500μL分选液中，将LD分离柱安装到磁铁中，预先用2 ml分选液润湿LD柱，细胞悬液加到LD柱中，用一个无菌的试管收集流出未标记的阴性细胞，加入1ml缓冲液冲洗2次，最后一次在缓冲液快要流完时将柱子从磁场取下，放在一个无菌的试管内，在柱子中加入1ml的分选液，用柱子上的推注器将要分选的阳性细胞推出，收集细胞后进行计数。

5.根据权利要求2所述的从白血病细胞株分选白血病干细胞的方法，其特征在于，所述步骤（3）的鉴定分析步骤包括细胞纯度分析、细胞周期分析、流式细胞术细胞表面标记分析、细胞分化功能检测和细胞体外克隆形成实验中的至少一个步骤。