CN107354135A - 从非霍奇金淋巴瘤细胞系中鉴定、分离、培养淋巴瘤干细胞的方法 - Google Patents

从非霍奇金淋巴瘤细胞系中鉴定、分离、培养淋巴瘤干细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种从非霍奇金淋巴瘤细胞系中鉴定、分离、培养淋巴瘤干细胞的方法，涉及细胞技术领域。本发明提供的从非霍奇金淋巴瘤细胞系中鉴定和分离淋巴瘤干细胞的方法，利用套细胞淋巴瘤的起始细胞的表面标志物进行鉴定和分离，特异性强；同时，套细胞淋巴瘤的起始细胞对临床常用的化疗药物表现出较强的耐药性，对利用这些起始细胞的表面标志物鉴定和分离出的淋巴瘤干细胞进行针对性治疗，对于防止淋巴瘤复发和提高病人的生存率，都有着非常重要的意义；本发明从非霍奇金淋巴瘤细胞系中鉴定、分离、培养淋巴瘤干细胞，可为非霍奇金淋巴瘤发生发展的机制研究及治疗药物的开发提供研究方法和技术支持。

Description

从非霍奇金淋巴瘤细胞系中鉴定、分离、培养淋巴瘤干细胞的 方法
技术领域
本发明涉及细胞技术领域，尤其是涉及一种从非霍奇金淋巴瘤细胞系中鉴定、分离、培养淋巴瘤干细胞的方法。
背景技术
淋巴瘤是起源于淋巴结或结外淋巴组织的恶性肿瘤，通常以实体瘤方式生长，特征为无痛性进行性淋巴结肿大，伴随消瘦、发热等症状，并可累及身体其他组织器官。根据国际淋巴瘤会议报道的数据，全球每9分钟就有1个新发病例，我国每年新发病例4-5万人，死亡病例超过2万人，在恶性肿瘤发病率排名中，淋巴瘤占男性肿瘤的第9位，占女性肿瘤的第10位，在儿童恶性肿瘤中位居第3位。最新数据表明，霍奇金淋巴瘤约占我国淋巴瘤的8.54％，非霍奇金淋巴瘤则占91.46％，其中最常见的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。非霍奇金淋巴瘤已成为严重危害我国人民健康的重大疾病。
早在一百六十多年前就有研究者提出，肿瘤的形成与胚胎组织的分化过程相似，即“残余胚胎组织假说”，这是肿瘤干细胞理论的首次提出。随着研究的不断深入，人们对肿瘤干细胞的认识也不断完善，肿瘤干细胞是肿瘤形成和发展的关键“种子”，具有无尽的自我更新的能力和特定的分化能力，正是肿瘤干细胞的这些特点，使肿瘤得以发生、发展、转移和复发。而且，肿瘤干细胞高表达多药耐药蛋白，这也是肿瘤，特别是血液肿瘤常发生耐药的重要原因。
淋巴瘤干细胞的研究始于1963年，研究者发现在淋巴瘤细胞中只有约0.001％-1％的细胞具有致瘤性，这说明淋巴瘤中存在极少数具有无限增殖潜能的具有干细胞特性的细胞，它们维系着淋巴瘤的发生发展，这部分细胞可能就是淋巴瘤干细胞。其后的很长一段时间内，由于缺乏淋巴瘤干细胞表面标志物的相关研究，淋巴瘤干细胞的分离鉴定常通过边缘细胞(SP细胞)分离、有限稀释法、成瘤性检测等，但这些分离方法具有较重的推测成分，分离得到的细胞并不能等同于肿瘤干细胞。淋巴瘤干细胞的分离、鉴定方法亟待建立。
因此，开发一种能够有效鉴定、分离并培养淋巴瘤干细胞的方法尤为重要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种从非霍奇金淋巴瘤细胞系中鉴定淋巴瘤干细胞的方法；
本发明的第二个目的在于提供一种从非霍奇金淋巴瘤细胞系中分离淋巴瘤干细胞的方法；
本发明的第三个目的在于提供一种从非霍奇金淋巴瘤细胞系中分离出的淋巴瘤干细胞的培养方法。
本发明提供的从非霍奇金淋巴瘤细胞系中鉴定淋巴瘤干细胞的方法，包括：
利用荧光活化细胞分选同时鉴定所述非霍奇金淋巴瘤细胞系中表面展示出可检测水平的特定的细胞表面标志物的细胞，根据鉴定结果得出所述非霍奇金淋巴瘤细胞系中的淋巴瘤干细胞。
进一步地，所述特定的细胞表面标志物为CD45+和CD19-。
本发明还提供了一种从非霍奇金淋巴瘤细胞系中分离淋巴瘤干细胞的方法，利用磁珠法进行分离。
进一步地，所述磁珠法为采用磁珠分选系统进行阳性分选和去除分选，并由此分离出所述非霍奇金淋巴瘤细胞系中的淋巴瘤干细胞。
进一步地，所述阳性分选分离出的细胞为CD45+细胞。
进一步地，所述去除分选分离出的细胞为CD45+CD19-细胞。
另外，本发明还提供了一种从非霍奇金淋巴瘤细胞系中分离出的淋巴瘤干细胞的培养方法，包括：
将所述淋巴瘤干细胞接种如下(a)或(b)的培养液中，待长成第一代细胞球后，吹打成单个细胞，继续培养，由此得到增殖的所述淋巴瘤干细胞；
(a)无血清培养基；
(b)含有生长因子的无血清培养基。
进一步地，所述生长因子为SCF、TPO、Flt-3L和IL-3中的一种或多种。
进一步地，在所述吹打成单个细胞后，还包括将所述单个细胞按1：2的比例重新接种于所述(a)或所述(b)中。
进一步地，所述继续培养的时间为10-14天。
本发明提供的从非霍奇金淋巴瘤细胞系中鉴定和分离淋巴瘤干细胞的方法，利用霍奇金淋巴瘤的一种致死性亚型：套细胞淋巴瘤(MCL)的起始细胞的表面标志物进行鉴定和分离，特异性强；同时，套细胞淋巴瘤(MCL)的起始细胞对临床常用的化疗药物表现出较强的耐药性，对利用这些起始细胞的表面标志物鉴定和分离出的淋巴瘤干细胞进行针对性治疗，对于防止淋巴瘤复发和提高病人的生存率，都有着非常重要的意义；本发明从非霍奇金淋巴瘤细胞系中鉴定、分离、培养淋巴瘤干细胞，可为非霍奇金淋巴瘤发生发展的机制研究及治疗药物的开发提供研究方法和技术支持。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的通过流式细胞术鉴定非霍奇金淋巴瘤细胞系中各象限细胞CD45、CD19的比例结果图；
图2为本发明实施例3提供的非霍奇金淋巴瘤干细胞经两周培养后形成的悬浮细胞球形态结果图；
图3A为本发明实施例4提供的流式细胞术检测CD45+CD19-标记的细胞亚群中ABCB1蛋白表达水平结果图；
图3B为本发明实施例4提供的流式细胞术检测CD45-CD19+标记的细胞亚群中ABCB1蛋白表达水平结果图；
图3C为本发明实施例4提供的流式细胞术检测CD45+CD19+标记的细胞亚群中ABCB1蛋白表达水平结果图；
图3D为本发明实施例4提供的流式细胞术检测CD45-CD19-标记的细胞亚群中ABCB1蛋白表达水平结果图；
图4A为本发明实施例5提供的通过RT-PCR实验检测各CD45、CD19标记的细胞亚群中干性相关基因的mRNA水平结果图；
图4B为本发明实施例5提供的通过Western blot实验检测各CD45、CD19标记的细胞亚群中干性相关基因的蛋白水平结果图；
图5A为本发明实施例6提供的CD45+CD19-细胞悬液和非CD45+CD19-形成的裸鼠移植瘤数量和重量统计结果图；
图5B为本发明实施例6提供的CD45+CD19-细胞悬液和非CD45+CD19-形成的裸鼠移植瘤CD45免疫组化结果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供的一种从非霍奇金淋巴瘤细胞系中鉴定淋巴瘤干细胞的方法，包括：
利用荧光活化细胞分选同时鉴定非霍奇金淋巴瘤细胞系中表面展示出可检测水平的特定的细胞表面标志物的细胞，根据鉴定结果得出非霍奇金淋巴瘤细胞系中的淋巴瘤干细胞。
其中，非霍奇金淋巴瘤细胞系例如可以为，但不限于人Burkitt’s淋巴瘤细胞Raji。
在本发明中，特定的细胞表面标志物为CD45+和CD19-。
本发明还提供了一种从非霍奇金淋巴瘤细胞系中分离淋巴瘤干细胞的方法，利用磁珠法进行分离。
在本发明中，磁珠法为采用磁珠分选系统进行阳性分选和去除分选，并由此分离出非霍奇金淋巴瘤细胞系中的淋巴瘤干细胞。
在本发明中，阳性分选分离出的细胞为CD45+细胞。
在本发明中，去除分选分离出的细胞为CD45+CD19-细胞。
另外，本发明还提供了一种从非霍奇金淋巴瘤细胞系中分离出的淋巴瘤干细胞的培养方法，包括：
将淋巴瘤干细胞接种如下(a)或(b)的培养液中，待长成第一代细胞球后，吹打成单个细胞，继续培养，由此得到增殖的所述淋巴瘤干细胞；
(a)无血清培养基；
(b)含有生长因子的无血清培养基。
其中，无血清培养基为RPMI-1640培养基。
在本发明中，生长因子为SCF、TPO、Flt-3L和IL-3中的一种或多种。
其中，生长因子SCF的浓度为：100μg/mL；
生长因子TPO的浓度为：20μg/mL；
生长因子Flt-3L的浓度为：50μg/mL；
生长因子IL-3的浓度为：0.1μg/mL。
在本发明中，在吹打成单个细胞后，还包括将单个细胞按1：2的比例重新接种于(a)或(b)中。
在本发明中，继续培养的时间为10-14天。
其中，继续培养的时间例如可以为，但不限于10天、11天、12天、13天、14天或15天。
本发明提供的从非霍奇金淋巴瘤细胞系中鉴定和分离淋巴瘤干细胞的方法，利用霍奇金淋巴瘤的一种致死性亚型：套细胞淋巴瘤(MCL)的起始细胞的表面标志物进行鉴定和分离，特异性强；同时，套细胞淋巴瘤(MCL)的起始细胞对临床常用的化疗药物表现出较强的耐药性，对利用这些起始细胞的表面标志物鉴定和分离出的淋巴瘤干细胞进行针对性治疗，对于防止淋巴瘤复发和提高病人的生存率，都有着非常重要的意义；本发明从非霍奇金淋巴瘤细胞系中鉴定、分离、培养淋巴瘤干细胞，可为非霍奇金淋巴瘤发生发展的机制研究及治疗药物的开发提供研究方法和技术支持。
为了有助于更清楚的理解本发明的内容，现结合具体的实施例详细介绍如下。如未明确指出，以下实施例中涉及的实验操作方法为本领域常规的分子生物学操作方法，涉及的试剂均为分析纯级试剂，涉及的试剂或仪器均可从正规渠道商购获得。
实施例1从非霍奇金淋巴瘤细胞系中鉴定淋巴瘤干细胞
从非霍奇金淋巴瘤细胞系中鉴定淋巴瘤干细胞含量，它们可能是CD45+CD19-集群。将非霍奇金淋巴瘤细胞做常规培养，培养基为RPMI-1640培养基，其中含10％的胎牛血清。在37℃，5％CO2的环境中培养。细胞每三天传代一次，按照1:4的比例接种。调整好细胞状态后，进行细胞膜表面CD45和CD19的流式鉴定。将细胞数量调整为2×105个/mL，分别加入CD45-PE，CD19-FITC流式抗体，避光染色30min后，用PBS缓冲液洗涤三次。用PBS缓冲液重悬细胞，用流式细胞仪测定各象限细胞比例，细胞总数为10000个。Raji细胞中CD marker的比例如图1所示，各象限中细胞比例分别为Q1：9.3％，Q2：62.4％，Q3:3.1％，Q4:25.2％。
实施例2从非霍奇金淋巴瘤细胞系中分离淋巴瘤干细胞
从非霍奇金淋巴瘤细胞系中分离淋巴瘤干细胞利用磁珠法。采用MultiSort MACS磁珠分选系统进行阳性分选(CD45+)和去除分选(CD45+CD19-)，最终得到CD45+CD19-细胞亚群。
将非霍奇金淋巴瘤细胞调整至2×108个/mL，用预冷的PBS缓冲液洗涤两次，经70μm的筛网筛去细胞团块后，离心，加入600μL PBS缓冲液重悬。向细胞悬液中加入FCR阻断剂以消除背景染色，之后加入200μL CD45Micro Beads标记的免疫磁珠抗体，冰上孵育45min。用PBS洗涤细胞两次，离心弃上清，加入500μL PBS重悬。将分离柱至于磁力架上，将细胞悬液加入分离柱中，静置使CD45+细胞吸附于柱上，未被标记的细胞流出。用PBS洗涤柱子三次后，加入1mL PBS缓冲液，活塞加压冲洗，将CD45+的细胞洗脱下来。向CD45+细胞悬液中加入20μL MACS MultiSort Release Reagent，冰上孵育30min。将细胞悬液加入分离柱中，PBS缓冲液洗涤三次，收集流出液，离心弃上清后，加入50μL PBS重悬。向细胞悬液中加入30μLMultiSort Stop Reagent，再加入100μL CD19-FITC MicroBead，冰上孵育45min后，将细胞悬液加入分离柱中，静置使未标记的细胞流出，PBS洗涤三次，收集洗脱液，为最终得到的CD45+CD19-细胞亚群。
实施例3从非霍奇金淋巴瘤细胞系中分离出的淋巴瘤干细胞的培养
将本发明实施例2提供的非霍奇金淋巴瘤干细胞进行无血清培养无血清培养。具体操作为：将细胞浓度调整为500个/mL，向六孔板每孔中加入2mL细胞悬液。向每孔中加入SCF、TPO、Flt-3L和IL-3四种生长因子使其总浓度分别为100μg/mL、20μg/mL、50μg/mL和0.1μg/mL。将六孔板置于37℃、5％CO2培养箱中培养，待悬浮细胞球形成后观察拍照，此过程约需要1-2周。图2所示为非霍奇金淋巴瘤干细胞经两周培养后形成的悬浮细胞球，可见细胞形成球状克隆集群，边界清晰，折光性好，说明细胞均处于存活状态。
实施例4多药耐药蛋白ABCB1的检测
用PBS将流式分选出的不同细胞亚群洗涤两次，加入ABCB1的抗体，以IgG-FITC作为对照，4℃避光孵育30min，经200目筛网过滤后，用流式细胞术检测ABCB1的比例，每个样本检测细胞总数为10000个。结果如图3A、3B、3C和3D所示。实验结果表明，CD45+CD19-细胞亚群特异性高表达ABCB1蛋白，显著高于其他三个细胞亚群，这与文献报道的肿瘤干细胞的细胞膜表面特异性表达耐药蛋白的结果是一致的，说明本发明所分离的非霍奇金淋巴瘤干细胞具有耐药的特征。
实施例5非霍奇金淋巴瘤干细胞干性相关基因检测
通过RT-PCR检测本发明实施例3提供的非霍奇金淋巴瘤干细胞CD45+CD19-细胞中干性相关基因Oct-4、Sox-2、Nanog和Bmi-1的mRNA水平。消化细胞，离心弃上清，加入1mLTrizol，室温放置10min以裂解细胞。向Trizol中加入200μL氯仿，剧烈震荡均匀后，4℃12000rpm离心15min，取上清到一个新的离心管中。向离心管中加入600μL异丙醇以沉淀其中的RNA，颠倒混匀后，4℃12000rpm离心15min。弃上清，用100μL 75％乙醇(0.1％DEPC水配制)洗涤沉淀，4℃12000rpm离心1min。挥干乙醇后，用DEPC水溶解RNA沉淀，用超微量紫外分光光度计检测RNA的浓度和纯度。参照Prime ScriptTM RT reagen Kit(Perfect RealTime)试剂盒的说明进行逆转录反应。反应体系如表1所示。
表1.RT-PCR反应体系配制表
逆转录程序为37℃15min(逆转录过程)和85℃5s(逆转录酶失活过程)。取cDNA进行荧光定量PCR反应。反应体系如表2所示，引物序列如表3所示。
表2.荧光定量PCR反应体系配制表
表3.引物序列表
PCR反应程序为95℃5min(预变性过程)、95℃30s(变性过程)、60℃35s(扩增过程)和12℃30s(冷却过程)，共进行40个循环，结果如图4A所示。实验结果表明，CD45+CD19-细胞特异性高表达干性相关基因Oct-4、Sox-2、Nanog和Bmi-1，说明本发明分离到的CD45+CD19-细胞具有肿瘤干细胞的特性。
通过Western Blot检测本发明实施例3提供的非霍奇金淋巴瘤干细胞CD45+CD19-细胞中干性相关基因Oct-4、Sox-2、Nanog、Bmi-1和ABCB1的蛋白水平。CD45+CD19-细胞和非CD45+CD19-细胞分别经1000rpm离心5min后，弃上清，用PBS洗涤两次。细胞团块中加入含PMSF的通用裂解液，冰上孵育30min以裂解细胞。4℃12000rpm离心15min后，取上清即为蛋白样品，用BCA法测定蛋白浓度。向蛋白样品中加入上样缓冲液，100℃煮沸10min，取上清(总蛋白含量为40μg)进行SDS-PAGE电泳，电泳条件为100V至溴酚蓝到达凝胶底部停止。裁取相应大小的PVDF膜，经甲醇活化30s后，放入转膜缓冲液中备用。剥离凝胶，将滤纸、凝胶、PVDF膜逐层放置成三明治样，小心除去气泡，放入转膜槽中，转膜条件为100V 150min。转膜之后将PVDF膜放入TBST中漂洗三次，放入5％脱脂奶粉封闭液中，室温封闭2h。用TBST将PVDF膜漂洗三次，加入稀释后的一抗(稀释比例1:1000，β-actin为内参)，4℃孵育过夜。次日取出PVDF膜，用TBST漂洗三次，加入稀释后的二抗(稀释比例1:3000)，室温孵育2h。用TBST漂洗PVDF膜三次，将ECL发光液均匀地加在膜表面，用化学发光仪拍照，结果如图4B所示。实验结果表明，CD45+CD19-细胞中干性相关蛋白Oct-4、Sox-2、Nanog和Bmi-1的水平是特异性升高的，说明本发明分离到的CD45+CD19-细胞具有肿瘤干细胞的特性。
实施例6裸鼠淋巴瘤模型的建立
将本发明实施例3提供的非霍奇金淋巴瘤干细胞CD45+CD19-细胞移植到裸鼠体内，并在不同时间点做淋巴瘤监测。选用4-5周龄、体重18-22g的裸鼠共15只，分为A、B、C三组，称重并编号，饲养于SPF级的动物房中。将非霍奇金淋巴瘤细胞Raji培养至对数期，通过磁珠分选法筛选出CD45+CD19-细胞和非CD45+CD19-细胞，调整浓度为1×106个/mL。A组裸鼠每只裸鼠通过尾静脉注射0.2mL CD45+CD19-细胞悬液，B组每只裸鼠注射0.2mL非CD45+CD19-细胞悬液，C组每只裸鼠注射0.2mL PBS。每天观察裸鼠生存状态，如活动状态、饮水饮食、肿块形成情况、精神状态等，每两天称重一次。处死并解剖移植前和发病后的裸鼠，观测其胸腹腔、淋巴结及脏器中淋巴瘤的累及情况。肿瘤组织经10％中性福尔马林固定，对肿瘤组织切片通过LSAB法进行CD45的免疫组织化学染色，于光镜观察。A组和B组裸鼠出现精神萎靡、食欲不振、体重下降等症状，在其腹腔、尾部及后肢发现肿块，重要脏器中有淋巴瘤细胞浸润，且A组的肿瘤数量和重量均大于B组，如图5A所示。免疫组织化学染色可见肿瘤细胞中CD45染色阳性，且A组中CD45表达量高于B组，如图5B所示。
综上所述，本发明提供的从非霍奇金淋巴瘤细胞系中鉴定和分离淋巴瘤干细胞的方法，特异性强；对利用本发明提供的分离方法分离出非霍奇金淋巴瘤干细胞进行针对性研究，对于防止淋巴瘤复发和提高病人的生存率，都有着非常重要的意义；本发明从非霍奇金淋巴瘤细胞系中鉴定、分离、培养淋巴瘤干细胞，可为非霍奇金淋巴瘤发生发展的机制研究及治疗药物的开发提供研究方法和技术支持。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
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Claims (10)

1.一种从非霍奇金淋巴瘤细胞系中鉴定淋巴瘤干细胞的方法，其特征在于，包括：
利用荧光活化细胞分选同时鉴定所述非霍奇金淋巴瘤细胞系中表面展示出可检测水平的特定的细胞表面标志物的细胞，根据鉴定结果得出所述非霍奇金淋巴瘤细胞系中的淋巴瘤干细胞。
2.根据权利要求1所述的鉴定淋巴瘤干细胞的方法，其特征在于，所述特定的细胞表面标志物为CD45+和CD19-。
3.一种从非霍奇金淋巴瘤细胞系中分离淋巴瘤干细胞的方法，其特征在于，利用磁珠法进行分离。
4.根据权利要求3所述的分离淋巴瘤干细胞的方法，其特征在于，所述磁珠法为采用磁珠分选系统进行阳性分选和去除分选，并由此分离出所述非霍奇金淋巴瘤细胞系中的淋巴瘤干细胞。
5.根据权利要求4所述的分离淋巴瘤干细胞的方法，其特征在于，所述阳性分选分离出的细胞为CD45+细胞。
6.根据权利要求4所述的分离淋巴瘤干细胞的方法，其特征在于，所述去除分选分离出的细胞为CD45+CD19-细胞。
7.一种从非霍奇金淋巴瘤细胞系中分离出的淋巴瘤干细胞的培养方法，其特征在于，包括：
将所述淋巴瘤干细胞接种如下(a)或(b)的培养液中，待长成第一代细胞球后，吹打成单个细胞，继续培养，由此得到增殖的所述淋巴瘤干细胞；
(a)无血清培养基；
(b)含有生长因子的无血清培养基。
8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述生长因子为SCF、TPO、Flt-3L和IL-3中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，在所述吹打成单个细胞后，还包括将所述单个细胞按1：2的比例重新接种于所述(a)或所述(b)中。
10.根据权利要求9所述的培养方法，其特征在于，所述继续培养的时间为10-14天。
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