CN104946594A - 人胰腺癌耐吉西他滨细胞系的建立方法及该细胞系的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于人胰腺癌耐吉西他滨细胞系的建立方法及该细胞系的应用。它包括以下步骤：取指数生长期的PANC-1细胞株放入培养箱中培养；观察细胞状态，至细胞生长恢复正常；将GEM的终浓度增加25-50nmol/L；逐步增加浓度至最终诱导浓度为1.9-2.1μmol/L；将得到的耐药细胞按有限稀释法行克隆化培养，选取细胞状态较好的单克隆细胞生长孔再行克隆化培养。本发明的优点在于：(1)本发明建立人胰腺癌耐吉西他滨细胞株的方法高效、易行。(2)本发明建立的人胰腺癌耐吉西他滨细胞株耐药指数高，稳定性好。(3)本发明建立的人胰腺癌耐吉西他滨细胞株除对吉西他滨具有一定的耐药性。
Description
技术领域
本发明涉及一种人胰腺癌耐吉西他滨细胞系的建立方法及该细胞系的应用。
背景技术
胰腺癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，由于发病隐匿，导致其手术切除率低、死亡率高、预后差。GEM一直作为胰腺癌化疗的一线药物，多年来未被替代，但由于GEM的原发性与继发性耐药问题，其疗效并不令人满意。胰腺癌对GEM化疗耐药是多因素、多因子共同作用的结果，机理较复杂，尚不清楚。本研究尝试建立对GEM耐药的胰腺癌细胞株，并测定其生物学特性。
发明内容
本发明的目的在于人胰腺癌耐吉西他滨细胞系的建立方法及该细胞系的应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：一种人胰腺癌耐吉西他滨细胞系的建立方法，其特征在于：它包括以下步骤：
(1)取指数生长期的PANC-1细胞株1×108个细胞/L接种于6孔板内，加入含GEM的RPMI1640培养基，置于36.9-37.1℃、含4.9-5.1％CO2、饱和湿度的培养箱中培养；
(2)观察细胞状态，2-3d见细胞状态较差，可见较多死细胞遂予换置不含GEM的相同培养基，至细胞生长恢复正常；重复上述步骤，反复数次后待细胞状态稳定，无出现大量死亡，将GEM的终浓度增加25-50nmol/L；逐步增加浓度至最终诱导浓度为1.9-2.1μmol/L；
(3)制备BARB/C小鼠脾细胞条件培养液，并将(2)得到的耐药细胞按有限稀释法行克隆化培养，选取耐药性较强、细胞状态较好的单克隆细胞生长孔再行克隆化培养，共进行3次克隆孔。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：(1)本发明建立人胰腺癌耐吉西他滨细胞株的方法高效、易行。(2)本发明建立的人胰腺癌耐吉西他滨细胞株耐药指数高，稳定性好。(3)本发明建立的人胰腺癌耐吉西他滨细胞株除对吉西他滨具有一定的耐药性，该细胞株对MTX、GEF、DDP及5-FU存在不同程度的交叉耐药性。
附图说明
图1是本发明GEM对PANC-1和PANC-1RG7皮下种植瘤的抑制作用图。
图2是本发明Western Blot法检测耐药及凋亡相关蛋白的表达差异图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
实施例1：一种建立人胰腺癌耐吉西他滨细胞系的方法，它包括以下步骤：
(1)取指数生长期的PANC-1细胞株1×108个细胞/L接种于6孔板内，加入含GEM(恒达药业有限公司，PBS缓冲液溶解至100mmol/L浓度，过滤除菌后分装，-20℃冻存)终浓度为50nmol/L的RPMI1640培养基(含15％FBS)，置于37℃、含5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养；
(2)观察细胞状态，2-3d见细胞状态较差，可见较多死细胞遂予换置不含GEM的相同培养基，至细胞生长恢复正常(大约为1～2周)；重复上述步骤，反复数次后待细胞状态稳定，无出现大量死亡，将GEM的终浓度增加25-50nmol/L；逐步增加浓度至最终诱导浓度为2μmol/L。
(3)制备BARB/C小鼠脾细胞条件培养液，并将耐药细胞按有限稀释法行克隆化培养，选取耐药性较强、细胞状态较好的单克隆细胞生长孔再行克隆化培养，共进行3次克隆孔。
结果：诱导培养细胞历时3年，初步获得稳定耐受2μmol/L GEM的人胰腺癌PANC-1细胞。经3次克隆化培养后，获得稳定耐受GEM的细胞系，命名为PANC-1RG7。
人胰腺癌耐吉西他滨细胞株关于治疗胰腺癌药物的筛选的应用：
(1)磺酰罗丹明B(SRB)法观察体外GEM的抑制率并计算耐药指数(RI)：分别取处于对数生长期的PANC-1细胞及PANC-1RG7细胞(台盼蓝拒染法计算活细胞数达98％以上)，经0.25％胰酶消化收入离心管中，1500rpm离心10min，弃上清，重悬于培养液中；PANC-1以1000个细胞/150μl×孔、PANC-1RG7以1500个细胞/150μl×孔的密度接种于96孔培养板内，温箱中静置24h待细胞贴壁；实验设GEM、阿霉素(ADM)、丝裂霉素(MMC)、紫杉醇(PTX)、甲氨蝶呤(MTX)、长春新碱(VCR)、吉非替尼(GEF)、顺铂(DDP)及5-氟尿嘧啶(5-FU)干预组和阴性对照组，干预浓度如下表(表1)所列，各设3个平行孔，阴性对照组加培养基补齐体积，使得每孔终体系为200μl。置于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养96h；取出培养板，弃上清，控干水分，加入预冷的10％三氯醋酸(TCA)100μl/孔固定细胞，静置5min后置于4℃冰箱处避光保存1h以上；弃固定液，用双蒸水轻轻洗涤5遍，控干水分；每孔加入50μl 0.4％SRB液染色，静置15min；弃染液，用1％乙酸溶液轻轻洗涤5次，控干水分；加入10mmol/L Tris非缓冲液150μl/孔，静置5min后振荡使染料充分溶解；在酶标仪570nm波长处测吸光度值(OD值)；在Microsoft Office Excel 2007软件中，按以下公式：抑制率(％)＝(1﹣药物干预组OD570/阴性对照组OD570)×100％，计算抑制率并进一步求得50％细胞生存受抑制时的药物浓度(IC50)，方法为：以药物浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制剂量-效应曲线，得到趋势公式y＝ax+b，以y＝50代入公式求得x，其反对数值即为该药物的IC50值。计算耐药指数(RI)：RI＝IC50-PANC-1RG7/IC50-PANC-1。实验重复三次，观察细胞耐GEM程度及是否存在其他药物的交叉耐药现象。
表1 SRB检测耐药细胞株PANC-1RG7耐药程度及交叉耐药实各药物干预溶度
如表2所示：实验检测了常规化疗药物共9种，分别为GEM、ADM、MMC、PTX、MTX、VCR、GEF、DDP及5-FU。各药物分别干预人胰腺癌细胞PANC-1及耐药细胞株PANC-1RG796h后，SRB法检测细胞的生长抑制率并计算IC50值。结果显示GEM、MTX、GEF、DDP及5-FU两细胞的IC50值表现出差异，其中GEM和5-FU差异明显，其余检测药物ADM、MMC、PTX及VCR的两细胞IC50值无统计学差异。分别计算GEM、MTX、GEF、DDP及5-FU五种药物的RI得：39.9、2.24、1.42、2.35、7.00。结果显示本课题组建立的耐药株PANC-1RG7细胞对GEM的耐药指数达39.9，并存在对MTX、GEF、DDP及5-FU不同程度的交叉耐药性。
表2 各化疗药物对PANC-1及PANC-1RG7细胞的IC50值(SRB法)
| 药物名称(单位) | PANC-1 | PANC-1RG7 | P值 |
| GEM(μmol/L) | 0.0081±0.0014 | 0.3233±0.0933 | 0.0023** |
| ADM(nmol/L) | 10.2380±2.4875 | 9.1433±2.4533 | 0.7011 |
| MMC(μmol/L) | 0.5689±0.5180 | 0.2545±0.1543 | 0.4972 |
| PTX(nmol/L) | 2.2618±0.2262 | 2.4840±0.1500 | 0.2682 |
| MTX(nmol/L) | 0.9346±0.1649 | 2.0948±0.1672 | 0.0199* |
| VCR(nmol/L) | 7.0513±2.3578 | 5.4185±1.7090 | 0.4265 |
| GEF(μmol/L) | 7.2575±0.5216 | 10.281±0.2890 | 0.0189* |
| DDP(μmol/L) | 0.6317±0.2159 | 1.4853±0.4649 | 0.0108* |
| 5-FU(μmol/L) | 1.9298±0.4420 | 13.509±2.7563 | 0.0001** |
附：*：p<0.05；**：p<0.01
(2)皮下种植瘤实验观察体内GEM的抑制率：
分别收集取处于对数生长期的PANC-1细胞及PANC-1RG7细胞各5×106个，分别皮下注射于两只裸鼠的右肩背部，待皮下肿瘤生长至直径1cm左右时，颈椎脱臼处死裸鼠，于无菌操作台上剥离皮下肿瘤，切割至1mm3大小，用穿刺针将其接种裸鼠右肩背部，肿瘤生长后，按上法再传代1次。待第三代瘤块生长后，PANC-1细胞及PANC-1RG7各皮下接种20只裸鼠，约15d将动物分为2组(每组瘤块大小相当)；阴性对照组10只：分别于植瘤后第15、18、21、24、27、30天，腹腔注射生理盐水10ml/kg，共6次；GEM干预组10只：分别于植瘤后第15、18、21、24、27、30天，腹腔注射GEM 50mg/kg，共6次；两株细胞的动物分组及药物干预相同。植瘤后第33天脱颈椎处死裸鼠，完整剥离皮下肿瘤并称重，在Microsoft Office Excel 2007软件中，计算各组瘤重平均值，按如下公式计算各组肿瘤抑瘤率：抑制率(％)＝(1-实验组瘤重/阴性对照组瘤重)×100％。
如图1GEM对PANC-1和PANC-1RG7皮下种植瘤的抑制作用以及表3所示：同样干预的两株细胞各组皮下植瘤动物完整剥离出的皮下肿瘤及其瘤重。比较两细胞的阴性对照组瘤重，可见PANC-1细胞肿瘤明显小于PANC-1RG7细胞肿瘤，差异有统计学意义(p<0.05)，表明PANC-1RG7细胞于体内生长速度较其亲本细胞快。PANC-1细胞肿瘤经GEM干预后瘤量较阴性对照组瘤重均显著减小(p<0.05)，而PANC-1RG7细胞肿瘤无显著性差异(p>0.05)，计算两细胞GEM的抑制率分别为82.03％及33.40％，可见GEM对PANC-1RG7肿瘤的体内生长抑制作用明显减弱。
表3 GEM干预PANC-1及PANC-1RG7细胞系皮下种植瘤的瘤重(g)
| 细胞系 | 阴性对照组 | GEM组(50mg/kg) |
| PANC-1 | 0.2118±0.0521 | 0.0381±0.0215* |
| PANC-1RG7 | 0.3247±0.1292# | 0.2163±0.0833 |
附：*与阴性对照组比较，p<0.05；#与PANC-1细胞比较，p<0.05
(3)实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测耐药相关基因表达差异
分别收集处于对数生长期的PANC-1细胞及PANC-1RG7细胞3×106于离心管中，毎管样品中各加入1ml Trizol(美国Life technologies公司)，按说明书方法提取总RNA并进行定量；PANC-1细胞及PANC-1RG7细胞的总RNA分别取20μg，用RNA逆转录试剂盒(美国Thermo Scientific公司，#K1621)，按说明书方法制备成cDNA(体积分别为200μl)；根据dCK、NT5、CDA、ENT1、ENT2、RRM1、RRM2、POLA、MDR1、MRP、BCRP和β-actin的基因序列设计引物(表4)，用无核酶水配成100μmol/L，再取10μl用无核酶水稀释10倍，使得最终引物浓度为10μmol/L；按qPCR试剂盒(TaKaRa公司，#DRR820A)说明书，将各样品在8联管中配制20μl反应体系，每个样品在同一块板上设置3个平行孔，同时设目的和内参基因的阴性对照孔(无模板对照)，快速震荡混合后离心，置于ABI 7500型实时荧光定量PCR仪进行基因定量分析，设置反应条件：95℃30s；95℃5s→60℃34s(40Cycles)；溶解曲线分析：95℃15s→60℃1min→95℃15s→60℃15s；使用ABI 7500software收集分析数据，采用2^-ΔΔCt的方法进行相对定量分析，方法如下：①根据qPCR反应曲线得到每个样品的各目的基因和内参基因β-actin扩增的阈值循环数(Ct)取均值；②应用内参基因对待测标本进行校正：ΔCt＝Ct目的基因–Ct内参基因；③耐药细胞样本和亲本细胞样本的ΔCt进行归一化：ΔΔCt＝耐药细胞PANC-1RG7样本的目的基因ΔCt–亲本细胞PANC-1样本的目的基因ΔCt；④表达差异的计算：计算2^-ΔΔCt，即为耐药细胞PANC-1RG7样品的待测基因表达为亲本细胞PANC-1样本表达的倍数。2^-ΔΔCt值大于2或小于0.5被视为表达有差异。实验重复3次，分析比较两株细胞待测基因表达的差异。
如表4所示：实验共检测GEM耐药相关基因dCK、NT5、CDA、ENT1、ENT2、RRM1、RRM2、POLA、MDR1、MRP、BCRP，以及内参基因β-actin共12个基因。所提取RNA符合实验纯度及浓度要求，OD260nm/OD280nm值均为1.8～2.0；qPCR过程中连续动态监测所得的溶解曲线均呈现令人满意的单一峰。
如表5所示：qPCR结果所得目的基因CT值，计算得相应2^-ΔΔCt值，结果显示除去内参的11个待测基因中，耐药细胞PANC-1RG7的CDA、MRP及BCRP基因的2^-ΔΔCt小于0.5，表明这3种基因表达均较亲本细胞PANC-1明显降低，差别具有统计学意义。
表4 qPCR法检测耐药细胞株PANC-1RG7基因表达差异实验各待测基因引物序列
表5 qPCR法检测各耐药相关基因在PANC-1及PANC-1RG7细胞表达的差异，mean±SD
附：*：2^-ΔΔCt<0.50；**：2^-ΔΔCt>2.00
(4)Western blot法检测耐药相关蛋白表达差异：
分别取处于对数生长期的PANC-1细胞及PANC-1RG7细胞，以预冷的PBS缓冲液洗涤3次，加入适量单去污剂(RIPA)细胞裂解液(约100μl/106个细胞)冰上充分裂解约10min，提取细胞总蛋白并行BCA定量。蛋白变性后以100μg﹒μL-1上样行SDS-PAGE电泳，后250mA恒电流75min转至PVDF膜，用质量分数为3％的BSA封闭4h，一抗4℃孵育过夜，洗膜后加辣根过氧化物酶标记的室温孵育1h，再洗膜，常规暗室内ECL显色、曝光、显影、定影，结果扫描并由Quantity One 4.62软件分析，比较两株细胞待测蛋白表达的差异得。实验重复三次。
如图2所示：受检的14个蛋白中，除BCRP未检出，其余蛋白均有不同程度表达。与其亲本细胞PANC-1相比较，耐药株PANC-1RG7细胞中NT5、RRM1、RRM2蛋白表达增高具统计学差异(p<0.05)，其中RRM1、RRM2增高更为明显，其他受检蛋白包括耐药相关及凋亡相关蛋白的表达均无明显差异。
上述结果表明，本发明已建立了人胰腺癌吉西他滨细胞系PANC-1RG7，该细胞系可用于吉西他滨耐药的人胰腺癌的耐药机制研究及治疗药物的筛选。
尽管本发明采用具体实施例及其替代方式对本发明进行示意和说明，但应当理解，只要不背离本发明的精神范围内的各种变化和修改均可实施。因此，应当理解除了受随附的权利要求及其等同条件的限制外，本发明不受任何意义上的限制。
Claims (2)
1.一种人胰腺癌耐吉西他滨细胞系的建立方法，其特征在于：它包括以下步骤：
(1)取指数生长期的PANC-1细胞株1×108个细胞/L接种于6孔板内，加入含GEM的RPMI1640培养基，置于36.9-37.1℃、含4.9-5.1％CO2、饱和湿度的培养箱中培养；
(2)观察细胞状态，2-3d见细胞状态较差，可见较多死细胞遂予换置不含GEM的相同培养基，至细胞生长恢复正常；重复上述步骤，反复数次后待细胞状态稳定，无出现大量死亡，将GEM的终浓度增加25-50nmol/L；逐步增加浓度至最终诱导浓度为1.9-2.1μmol/L；
(3)制备BARB/C小鼠脾细胞条件培养液，并将(2)得到的耐药细胞按有限稀释法行克隆化培养，选取耐药性较强、细胞状态较好的单克隆细胞生长孔再行克隆化培养，共进行3次克隆孔。
2.权利要求1所述的人胰腺癌耐吉西他滨细胞系作为吉西他滨耐药的人胰腺癌治疗药物的筛选应用。
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