CN108866001A - 人胰腺癌神经浸润细胞系 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人胰腺癌神经浸润细胞系，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201622。本发明还提供该细胞系的应用和细胞系建立方法。其优点表现在：本发明提供了人胰腺癌神经浸润细胞系，丰富了人胰腺癌的细胞库。具有成瘤性，接种裸鼠，致瘤性强，组织切片提示移植瘤组织学特点和临床标本相似。可为进一步研究胰腺癌的发生、神经浸润机制提供材料，也可以为筛选治疗胰腺癌，尤其是抑制胰腺癌的神经浸润的药物提供平台。本发明的人胰腺癌神经浸润细胞系性状稳定，可稳定多次传代。
Description
技术领域
本发明涉及细胞系技术领域，具体地说，是人胰腺癌神经浸润细胞系。
背景技术
胰腺癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，我国胰腺癌的年发病率为5.1/10万，较20年前大幅提高。我国胰腺癌的外科治疗水平有了明显进步，胰腺癌的手术切除率从15％以下上升至约40％，术后严重并发症有明显下降。然而，胰腺癌术后5年生存率却没有明显提高，多数报道在5％～10％，其原因一是早期诊断困难，临床诊断的胰腺癌85％以上属于进展期；二是术后腹膜后复发、肝转移常见。这两个因素是制约胰腺癌外科治疗效果的两个亟待解决的难题。
研究发现，胰腺癌有嗜神经生长，沿神经束膜内侵袭扩散的特性。文献报道胰腺癌胰外神经侵犯率64％～100％。神经侵犯与肿瘤位置、大小、组织学类型、淋巴结转移状况均无关系，是术后腹膜后复发的重要原因。因此，对胰腺癌侵犯神经的基础和临床研究，包括神经侵犯的机制、术中神经清扫的方法、范围及术后相关处理成为胰腺癌研究的重要课题。
对胰腺癌侵袭、转移机制的研究一直都是热点问题，而建立良好的细胞实验模型是研究胰腺癌侵袭转移机制的重要方法。提供理想的细胞模型是研究胰腺癌侵袭转移机制亟需解决的问题。
中国专利ZL201010178581.X公开了一种人胰腺癌细胞系。中国专利ZL200610118934.0公开了一种胰腺癌高肝转移细胞系。中国专利ZL201010225741.1公开了一种对吉西他滨耐药的人胰腺癌细胞系。中国专利ZL201110077923.3公开了一种人胰腺腺鳞癌细胞系。中国专利ZL201110383666.6公开了一种淋巴道高转移活性的胰腺癌细胞系。但是关于本发明的人胰腺癌神经浸润细胞系目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种人胰腺癌神经浸润细胞系。
本发明的再一的目的是，提供一种人胰腺癌神经浸润细胞系的应用。
本发明的另一的目的是，提供一种人胰腺癌神经浸润细胞系的建立方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种人胰腺癌神经浸润细胞系，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201622。
所述的人胰腺癌神经浸润细胞系的子代细胞。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
一方面，所述的人胰腺癌神经浸润细胞系在制备非人类的哺乳动物中产生神经浸润的胰腺癌的试剂中的应用。
优选地，所述的哺乳动物为啮齿类动物。
更优选地，所述的啮齿类动物为小鼠。
另一方面，所述的人胰腺癌神经浸润细胞系在筛选抑制胰腺癌的药物中的应用。
优选地，所述的药物抑制胰腺癌神经浸润。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：所述的建立方法包括以下步骤：
(1)获得新鲜的临床手术切除标本，切成小块，接种哺乳动物；
(2)将荷瘤动物处死，取出肿瘤组织，进行癌细胞的原代培养和传代培养。
优选地，所述的临床手术切除标本用无菌HBSS缓冲液漂洗后，再进行接种，所述的无菌HBSS缓冲液含500U/ml青霉素G、500μg/ml硫酸链霉素和1.50μg/ml两性霉素B。
优选地，所述的哺乳动物为裸小鼠。
本发明优点在于：
1、本发明提供了人胰腺癌神经浸润细胞系，丰富了人胰腺癌的细胞库。
2、本发明的人胰腺癌神经浸润细胞系具有成瘤性，接种裸鼠，致瘤性强，组织切片提示移植瘤组织学特点和临床标本相似。可为进一步研究胰腺癌的发生、神经浸润机制提供材料，也可以为筛选治疗胰腺癌，尤其是抑制胰腺癌的神经浸润的药物提供平台。
3、本发明的人胰腺癌神经浸润细胞系性状稳定，可稳定多次传代。
附图说明
附图1：HPNI-1细胞的形态学观察。
附图2：HPNI-1细胞的染色体分析。A：HPNI-1细胞，B：裸小鼠染色体。
附图3：HPNI-1细胞免疫组化染色。A：细胞角蛋白，B：CA19-9，C：癌胚抗原。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
生物材料保藏信息
本发明的人胰腺癌神经浸润细胞系于2016年5月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072)，保藏编号：CCTCC NO:C201622，培养物名称：人胰腺癌神经浸润细胞系HPNI-1。
实施例1HPNI-1细胞系的制备
裸小鼠：5只，雌性，体重16.0±1.0g，鼠龄5周，饲养于SPF环境。
从上海长海医院获得新鲜的临床胰腺癌神经浸润切除标本(男，56岁，胰腺癌神经浸润)，立即浸入预冷的无菌HBSS缓冲液中(含500U/ml青霉素G、500μg/ml硫酸链霉素和1.50μg/ml两性霉素B)。在生物安全柜中，用新鲜的该无菌HBSS缓冲液冲洗标本，切成20～50mg的小块，穿刺接种裸小鼠腋背部皮下。动物接种后，健康状态良好，行为正常。接种40天后，通过触摸发现在接种部位皮下有肿瘤小结节，小结节接种50天后开始生长明显，至接种后70天时，肿瘤体积超过300mm3。
原代培养：皮下穿刺接种人胰腺癌70～90天后，将荷瘤小鼠用过量二氧化碳气体麻醉处死，无菌解剖，取出肿瘤组织，进行原代培养，方法如下：用HBSS缓冲液漂洗肿瘤组织块3次，去除结缔组织和坏死组织，用无菌手术刀片将肿瘤组织剪成约1mm3小块；将剪切好的组织块用接种针送入培养瓶，并均匀摆置，间隔0.5cm，盖好瓶盖；轻轻翻转培养瓶，使瓶底向上，于37℃孵箱5％CO2条件下培养；次日，将培养瓶慢慢翻转平放，向瓶内加入10mlDMEM/F12培养液(含5％胎牛血清，10μg/ml重组人胰岛素，7.5ng/ml亚硒酸钠，6.5μg/ml转铁蛋白，2μg/ml乙醇胺，100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸链霉素和0.25μg/ml两性霉素B)，静置培养；原代培养每3天换液一次，去除已漂浮的组织块和残留的血细胞。
传代培养：当由组织块中长出的细胞布满培养瓶底部后，进行细胞传代，具体步骤如下：吸弃旧培养液，向瓶中加入1ml新鲜的0.05％胰蛋白酶溶液，轻轻润洗贴壁细胞层，吸弃，再加入1ml新鲜的0.05％胰蛋白酶溶液，于37℃孵箱中孵育，观察到细胞质回缩、细胞间隙增大，待细胞脱落后，加入3ml新鲜的DMEM/F12培养液，仔细吹打，使之脱离瓶壁形成细胞悬液；少量在瓶壁上变圆但没有脱落的细胞，用无菌细胞刮刀轻轻挂擦培养瓶表面，收集全部细胞，离心，计数，分别接种于新的培养瓶。当细胞传代到底5代以后，将培养液逐步更换为RPMI 1640培养液(含10％胎牛血清，10μg/ml重组人胰岛素，100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸链霉素)，细胞生长良好，形态较为均一。传代至50代以上。
实施例2HPNI-1细胞系的生物学特性
本发明采用含有胎牛血清和胰岛素的RPMI 1640培养液培养HPNI-1细胞，使其能体外长期生长和稳定传代。当细胞传至20代以上，细胞性状逐渐稳定，进行相关的生物学、遗传学和组织来源鉴定，直至第50代都具有相同的稳定的性状。经实验观察与验证，体外生长的细胞呈上皮样，倒置显微镜下细胞贴壁生长，分散均匀，大小不等，形状呈铺路石样，细胞具有典型的上皮样形态，失去接触生长抑制，呈恶性生长。遗传学研究证实该细胞为异倍体，染色体数目和结构畸变严重，符合恶性肿瘤的遗传学特征。
(1)形态学观察
将培养的HPNI-1细胞的培养瓶置于倒置显微镜下，HPNI-1细胞失去了接触抑制，呈恶性生长，具有重叠生长的特点，贴壁生长部分呈扁平状，以不规则铺路石样为主，符合上皮样细胞的特点。
(2)染色体的鉴定
将培养的HPNI-1细胞置于4℃孵育12小时后，加入秋水仙素，使其终浓度为0.4μg/ml，再于37℃孵箱中继续培养10小时。采集分裂中期的细胞，用固定液进行固定，然后细胞悬液滴于预冷的载物片上，用Giemas染色液染色，于显微镜下计数染色体数。HPNI-1细胞连续传代后，染色体仍保持人源性肿瘤细胞染色体的特征，表现在多倍体，染色体众数集中在76～84之间，存在多数中央及亚中央着丝粒染色体。HPNI-1细胞为异倍体，染色体数目和结构畸变严重，符合恶性肿瘤的遗传学特征。
(3)组织来源鉴定
将HPNI-1细胞接种在盖玻片上培养，待细胞伸展后，用4％甲醛固定，进行免疫组化染色。结果显示，细胞角蛋白和CA19-9为强阳性，癌胚抗原为弱阳性，结合病理诊断，该细胞为胰腺癌细胞。
(4)细胞动力学
将HPNI-1细胞以2000/孔的密度接种于96孔板中，进行培养，分别在24小时，36小时，48小时，72小时和96小时固定细胞，并进行PI染色，用高内涵细胞筛选仪测量每孔细胞数。细胞动力学研究结果显示，HPNI-1细胞的群体倍增时间为48.36小时。
实施例3HPNI-1细胞系应用于建立动物模型
体外培养和收集HPNI-1细胞，皮下接种BALB/C裸小鼠(每只动物接种5.0×106个细胞，细胞悬液和Matrigel以1:1混合，共接种7只动物)，每周两次调查动物体重和肿瘤大小。接种约5天后，肿瘤开始形成并生长。绘制肿瘤生长曲线，其中肿瘤体积＝(长×宽×宽)÷2。在第39天结束实验，这时的肿瘤体积为2013.9±263.5mm3，并且安乐死处死动物，肿瘤重量为1.89±0.75g。可见HPNI-1细胞能在裸小鼠体内形成肿瘤，具有致瘤性。
将实施例1的切除标本、HPNI-1细胞在裸小鼠皮下接种20天后形成的肿瘤，进行石蜡包埋切片和HE染色。病理诊断结果显示，临床标本、HPNI-1细胞在裸小鼠体内所形成的肿瘤的结构类似，形成对应关系。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种人胰腺癌神经浸润细胞系，其特征在于，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201622。
2.根据权利要求1所述的人胰腺癌神经浸润细胞系的子代细胞。
3.根据权利要求1或2所述的人胰腺癌神经浸润细胞系在制备非人类的哺乳动物中产生神经浸润的胰腺癌的试剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的哺乳动物为啮齿类动物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的啮齿类动物为小鼠。
6.根据权利要求1所述的人胰腺癌神经浸润细胞系在筛选抑制胰腺癌的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的药物抑制胰腺癌神经浸润。
8.一种如权利要求1的人胰腺癌神经浸润细胞系的建立方法，其特征在于，所述的建立方法包括以下步骤：
(1)获得新鲜的临床手术切除标本，切成小块，接种哺乳动物；
(2)将荷瘤动物处死，取出肿瘤组织，进行癌细胞的原代培养和传代培养。
9.根据权利要求8所述的建立方法，其特征在于，所述的临床手术切除标本用无菌HBSS缓冲液漂洗后，再进行接种，所述的无菌HBSS缓冲液含500U/ml青霉素G、500μg/ml硫酸链霉素和1.50μg/ml两性霉素B。
10.根据权利要求9所述的建立方法，其特征在于，所述的哺乳动物为裸小鼠。
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