CN112210541A - 一种胃肠道间质瘤耐药细胞模型及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种胃肠道间质瘤耐药细胞模型及其构建方法和应用。本发明通过间歇浓度梯度倍增法针对胃肠道间质瘤细胞株GIST882进行体外诱导，建立了对于舒尼替尼IC50为127.5±2.15μmol/L，耐药指数为5.30的耐药细胞系，所述细胞系在细胞形态、超微结构、细胞周期均发生了变化，Kit基因测序显示存在17外显子R804L突变，INPP4B基因测序显示存在18外显子V466I突变，除此之外IRS2、SOX9、FLCN、WISP3、SOX10、MYCN也存在突变差异。本发明为进一步研究舒尼替尼的耐药机制和筛选胃肠间质瘤治疗新药物奠定了基础。

Description

一种胃肠道间质瘤耐药细胞模型及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及细胞模型技术领域，具体地说，涉及一种胃肠道间质瘤耐药细胞模型及其构建方法和应用。
背景技术
胃肠间质瘤(Gastrointestinal Stromal Tumors,GIST)作为一种常见的叶源性肿瘤，对放化疗均不敏感，舒尼替尼(Sunitinib)是晚期胃肠间质瘤治疗的主要靶向治疗药物。Sunitinib属于多靶点抑制剂，能够有效抑制KIT、VEGFR、PDGFRa、FLT3以及RET原癌基因编码的受体。而伴随Sunitinib临床使用当中的耐药问题日渐明显，这就需要针对具体耐药机制做出深入研究分析。对于耐药的患者进行二次取材比较困难，并且组织量很难满足我们实验所需，因此可考虑应用耐药细胞株进行舒尼替尼耐药机制的研究。
国内外已有胃肠道间质瘤亲本细胞株和耐伊马替尼耐药细胞株建系的报道。如专利文献CN105062975A公开了一种Imatinib耐药的胃肠道间质瘤细胞系，专利文献CN105349493A公开了一种BRAF继发突变的甲磺酸伊马替尼耐药胃肠道间质瘤细胞系。另外也有格列卫耐药细胞系的报道，如专利文献CN103333858A公开了一种Gleevec耐药的胃肠道间质瘤细胞系。但目前未见舒尼替尼耐药细胞株的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种胃肠道间质瘤耐药细胞模型及其构建方法和应用。
第一方面，本发明提供了一种胃肠道间质瘤舒尼替尼耐药细胞系，所述胃肠道间质瘤舒尼替尼耐药细胞系保藏号为CCTCC NO:C2020190。
作为一个优选例，所述胃肠道间质瘤舒尼替尼耐药细胞系其Kit基因存在17外显子R804L突变，INPP4B基因存在18外显子V466I突变，IRS2存在1外显子A942P突变、SOX9存在3外显子T239P突变、FLCN存在11外显子H429P突变、WISP3存在3外显子V138L突变、SOX10存在4外显子T240P突变、MYCN存在3外显子R322L突变。
第二方面，本发明提供了如上所述的胃肠道间质瘤舒尼替尼耐药细胞系的用途，所述用途选自下列任一种：
a)研究胃肠道间质瘤获得性耐药的机制；
b)寻找胃肠道间质瘤耐药逆转的靶点；
c)筛选治疗胃肠道间质瘤的药物；
d)构建舒尼替尼耐药的胃肠道间质瘤动物模型；
d)研究分析体外、体内药物敏感性及耐药性的相关性。
第三方面，本发明提供了一种胃肠道间质瘤舒尼替尼耐药细胞系的构建方法，即，以胃肠道间质瘤细胞株GIST882为原始细胞系，令所述胃肠道间质瘤细胞株GIST882产生以下突变：Kit基因存在17外显子R804L突变，INPP4B基因存在18外显子V466I突变，IRS2存在1外显子A942P突变、SOX9存在3外显子T239P突变、FLCN存在11外显子H429P突变、WISP3存在3外显子V138L突变、SOX10存在4外显子T240P突变、MYCN存在3外显子R322L突变。
作为一个优选例，通过间歇浓度梯度倍增法针对所述胃肠道间质瘤细胞株GIST882进行体外诱导，使其对舒尼替尼耐药。
更优选地，初次加入的舒尼替尼浓度为1/2IC50浓度。
更优选地，终末次加入的舒尼替尼浓度为22μmol/L。
更优选地，在获得能在终末次加入舒尼替尼的培养基中稳定生长并传代的细胞后，还包括对所述细胞进行基因测序的步骤。
本发明优点在于：
关于本研究，目的：构建胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs。方法：通过间歇浓度梯度倍增法针对胃肠道间质瘤细胞株GIST882进行体外诱导，使其对Sunitinib靶向药物耐药，研究构建的胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs。使用显微镜针对细胞形态进行观察；通过流式细胞仪针对细胞周期变动做出检测；CCK8法计算细胞半数致死浓度(IC50)及耐药指数。观察胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs长期保存的稳定性。结果：(1)耐药细胞在细胞形态方面具有上皮样特征，核浆比增加；在高倍镜之下能够发现多核细胞以及胞质内部的颗粒样物质有所提升。(2)耐药前后细胞周期变化，耐药细胞G0/G1期细胞比例有所提升，而S期比例降低。(3)胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs与GIST882相对比而言，针对Sunitinib的IC50有所提升，从23.98±1.85μmol/L提升到127.5±2.15μmol/L，耐药指数为5.30(P<0.05)。(4)对GIST882和胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs进行基因测序，Kit基因测序显示存在17外显子R804L突变，INPP4B基因测序显示存在18外显子V466I突变，除此之外IRS2、SOX9、FLCN、WISP3、SOX10、MYCN也存在突变差异。结论：获取到胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs，其针对Sunitinib靶向治疗所具备的敏感性显著下调，长期保存能够维持耐药特性。
目前GIST治疗领域的难点是基因继发突变导致的耐药问题。探索肿瘤细胞产生耐药的原因以及如何改善肿瘤细胞对化疗药物耐药仍是目前研究的热点。肿瘤细胞耐药的产生是一个复杂的过程，它的机制广泛牵涉到药物代谢学、病理学、生理学等多个学科，这就决定了肿瘤细胞对化疗药物产生耐药的机制是复杂的，因此体外建立化疗药物耐药细胞株仍然是研究肿瘤细胞耐药机制的重要方法。
本发明首次构建了胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs，有望成为研究胃肠间质瘤耐药机制以及耐药逆转剂筛选的重要细胞模型，为探索胃肠间质瘤治疗的新药物、新方法开辟新的道路。
附图说明
附图1：GIST882和胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs细胞的耐药性曲线。*，P<0.05。
附图2：GSIT882细胞的生长周期。
附图3：胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs细胞的生长周期。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
1.材料与方法
1.1培养GIST882细胞：细胞株从ATCC/中科院/协和医院引进，并已进行了细胞STR鉴定。细胞培养基是含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基。把细胞放到37℃、5％CO2并且饱和湿度的培养箱里面进行培养。
1.2耐药细胞株的诱导：采用浓度梯度递增法，建立胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs。取对数生长期之下的GIST882，加入含有舒尼替尼的DMEM培养液，从低浓度(1/2IC50浓度)连续作用24-48h后，敏感细胞开始凋亡，弃去培养液，用PBS缓冲液洗3遍，换新鲜培养液，耐药细胞在培养液(无药物)里面继续培养，直到进入对数期，逐渐提高舒尼替尼浓度，进行反复诱导，并及时换液传代，直到培养获得可于Sunitinib 22μmol/L浓度的培养基里面稳定生长且传代的细胞为止。历时6个月，最终得到耐受22μmol/L舒尼替尼的细胞，于2020年9月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉大学，430072)，保藏号为CCTCC NO:C2020190，培养物名称(分类命名)：胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs。
1.3观察细胞形态学：在细胞爬片之后于倒置显微镜下观察细胞GIST882和胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs的细胞形态。
1.4检测细胞株针对Sunitinib的药物敏感性：选取对数生长期的GIST882以及胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs细胞，于96孔板里面分别接种5×103个/孔，培养24小时之后在96孔板里添加浓度为6.25，12.5，25，50，100μmol/L的Sunitinib溶液，针对各个浓度分别设定六个复孔，同时设定无药对照与空白对照。在同等情况下培养72h。重复试验三次，CCK8法测定各孔吸光度值(A)，根据公式计算生长抑制率，采用SPSS 17.0软件计算药物半数抑制浓度IC50，耐药指数(RI)＝耐药细胞IC50/亲本细胞IC50。
1.5检测细胞周期：取对数生长期细胞GIST882和胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs，样品分为4组：GIST882 control、GIST882 test、GIST882-Rs control、GIST882-Rs test，添加舒尼替尼药物22μM，二氧化碳培养箱培养24小时后，收样上机检测。
1.6对GIST882和胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs进行基因测序，分析其有无不同突变位点。
1.7统计学方法：通过SPSS 17.0统计软件进行分析。结果采用均数±标准差表示，计量资料两个样本比较用t检验，P＜0.05为有显著性差异。
2.结果
2.1观察细胞形态学：通过倒置显微镜进行观察能够发现，亲本GIST882细胞为多边形形态，呈贴壁生长，胞浆透亮；胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs细胞变小，呈圆形，胞质内颗粒增多，并且有较多的悬浮死细胞。
2.2细胞针对药物敏感性出现改变：胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs与亲本细胞株GIST882相比，其针对Sunitinib7的IC50有明显提升，分别为127.5±2.15μmol/L和23.98±1.85μmol/L，胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs耐药指数为5.30，数据符合正态分布，差异具备统计学价值。P＜0.05(见图1)。
2.3细胞周期出现变化：通过流式细胞仪针对细胞周期进行检测，显示耐药前后细胞周期各自是：S期52.51％比39.87％，G0/G1期25.22％比32.21％，G2/M期22.27％比27.92％，耐药细胞G0/G1期细胞比例有所提升，而S期比例降低(见表1，图2)。
表1 GIST882细胞与胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs细胞的周期分布
Figure BDA0002723340740000051
2.4对GIST882和胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs进行基因测序，Kit基因测序显示存在17外显子R804L突变，INPP4B基因测序显示存在18外显子V466I突变，除此IRS2存在1外显子A942P突变、SOX9存在3外显子T239P突变、FLCN存在11外显子H429P突变、WISP3存在3外显子V138L突变、SOX10存在4外显子T240P突变、MYCN存在3外显子R322L突变。
实施例2
我们将胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs扩大后放于-80℃冰箱保存，6和12个月后复苏，检测对Sunitinib7的IC50，以评价细胞系的稳定性。结果保存6个月后IC50为129.61±1.86μmol/L，保存6个月后IC50为126.31±1.10μmol/L，耐药性并未出现大的波动，表明稳定性较好。
实施例3
本课题组采用浓度梯度递增法前后共构建了9株耐Sunitinib7的GIST882细胞系，实施例1的胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs为第3批构建的其中一个株系，耐药性最强，其余8个耐Sunitinib7细胞建成时对Sunitinib7的IC50分别为69.5、51.1、97.2、80.6、66.5、73.9、102.5μmol/L。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种胃肠道间质瘤舒尼替尼耐药细胞系，其特征在于，所述胃肠道间质瘤舒尼替尼耐药细胞系保藏号为CCTCC NO:C2020190。
2.根据权利要求1所述的胃肠道间质瘤舒尼替尼耐药细胞系，其特征在于，所述胃肠道间质瘤舒尼替尼耐药细胞系其Kit基因存在17外显子R804L突变，INPP4B基因存在18外显子V466I突变，IRS2存在1外显子A942P突变、SOX9存在3外显子T239P突变、FLCN存在11外显子H429P突变、WISP3存在3外显子V138L突变、SOX10存在4外显子T240P突变、MYCN存在3外显子R322L突变。
3.权利要求1或2所述的胃肠道间质瘤舒尼替尼耐药细胞系的用途，其特征在于，所述的用途选自下列任一种：
a)研究胃肠道间质瘤获得性耐药的机制；
b)寻找胃肠道间质瘤耐药逆转的靶点；
c)筛选治疗胃肠道间质瘤的药物；
d)构建舒尼替尼耐药的胃肠道间质瘤动物模型；
d)研究分析体外、体内药物敏感性及耐药性的相关性。
4.一种胃肠道间质瘤舒尼替尼耐药细胞系的构建方法，其特征在于，以胃肠道间质瘤细胞株GIST882为原始细胞系，令所述胃肠道间质瘤细胞株GIST882产生以下突变：Kit基因存在17外显子R804L突变，INPP4B基因存在18外显子V466I突变，IRS2存在1外显子A942P突变、SOX9存在3外显子T239P突变、FLCN存在11外显子H429P突变、WISP3存在3外显子V138L突变、SOX10存在4外显子T240P突变、MYCN存在3外显子R322L突变。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，通过间歇浓度梯度倍增法针对所述胃肠道间质瘤细胞株GIST882进行体外诱导，使其对舒尼替尼耐药。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，初次加入的舒尼替尼浓度为1/2IC50浓度。
7.根据权利要求5或6所述的构建方法，其特征在于，终末次加入的舒尼替尼浓度为22μmol/L。
8.根据权利要求5或6所述的构建方法，其特征在于，在获得能在终末次加入舒尼替尼的培养基中稳定生长并传代的细胞后，还包括对所述细胞进行基因测序的步骤。
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