WO2023019638A1 - 人原代急性髓系白血病细胞的培养基及培养方法 - Google Patents
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Abstract
提供一种用于人原代急性髓系白血病细胞的培养基和培养方法。所述的急性髓系白血病原代细胞培养基包含谷氨酰胺添加剂、非必需氨基酸、人白介素-6、人白介素-7、人白介素-3、重组人FLT3 Ligand、重组人巨噬细胞集落刺激因子、和人干细胞因子。使用所述的培养基和培养方法，能够以更高的扩增效率和更长的体外培养时间培养急性髓系白血病细胞。还提供使用该培养基体外培养的人原代急性髓系白血病细胞，用于在药物的疗效评估和筛选中的方法和应用。
Description
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种原代细胞培养基，该培养基用于体外培养人原代急性髓系白血病(AML)细胞，并且涉及采用该培养基培养人原代急性髓系白血病细胞的方法，及其在药物的疗效评估和筛选中的应用。
急性髓系白血病(AML，Acute Myelocytic Leukemia)是造血系统的髓系原始细胞克隆性恶性增殖性血液疾病。AML是一种侵略性和高度异源性疾病，在生物学和预后上都有不同的亚型。AML每年每100,000人感染1至5个人，占所有新白血病病例的30％-40％。AML是最致命的白血球疾病，其预后和生存率最差(5年时<26％)，自1970年代以来没有改善(Hanyang Lin等，Feeder-free and serum-free in vitro assay for measuring the effect of drugs on acute and chronic myeloid leukemia stem/progenitor cells，Experimental Hematology 2020；90:52-64)。
迄今为止，AML干细胞是白血病研究的主要焦点，因为它们具有获得耐药性并介导复发的白血病亚克隆。这项工作通常需要培养AML干细胞。由于AML干细胞群体内的异质性，以及许多患者的细胞生长不良，易于分化并在体外丧失自我更新能力，因此培养AML干细胞具有挑战性。此外，原代AML患者样品可能难以获得，并且与转化的细胞系不同，它们不会无限期地体外扩增。体内异种移植模型允许扩增人AML细胞，但需要大量细胞(>10
6个细胞/小鼠)，并且不支持AML细胞维持。另一方面，与骨髓(BM)衍生的间充质基质细胞(MSCs)或基质细胞系共培养可以帮助保存AML干细胞，但饲养细胞的培养物不适用于高通量药物筛选或适应性试验。
因此，本领域需要一种无需与基质细胞共培养的、长时程、快速扩增的人原代急性髓系白血病细胞的培养基和培养方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于在体外快速扩增人原代急性髓系白血病细胞的培养基及培养方法。
本发明的一个方面在于提供一种人原代急性髓系白血病细胞的培养基，所述培养基包含谷氨酰胺添加剂、非必需氨基酸、人白介素-6(人IL-6)、人白介素-7(人IL-7)、人白介素-3(人IL-3)、重组人FLT3Ligand(人FLT3L)、重组人巨噬细胞集落刺激因子(人M-CSF)、和人干细胞因子(人SCF)。
在本发明的优选方面，所述人原代急性髓系白血病细胞的培养基满足以下任意一项或多项或全部满足：
(1)谷氨酰胺添加剂在培养基中的含量优选为0.5mM～4mM；
(2)非必需氨基酸为选自甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸中的一种或多种，非必需氨基酸在培养基中的含量优选为12.5μM～200μM；
(3)人IL-6在培养基中的含量优选为1.89ng/mL～17ng/mL；
(4)人IL-7在培养基中的含量优选为1.89ng/mL～51ng/mL；
(5)人IL-3在培养基中的含量优选为1.89ng/mL～153ng/mL；
(6)人FLT3L在培养基中的含量优选为3ng/mL～81ng/mL；
(7)人M-CSF在培养基中的含量优选为1ng/mL～81ng/mL；
(8)人SCF在培养基中的含量优选为1ng/mL～81ng/mL。
在另外优选的实施方式中，本发明的人原代急性髓系白血病细胞的培养基还包含基础培养基，所述基础培养基含有选自单核细胞无血清培养基和RPMI-1640的初始培养基、5-10％(v/v)的胎牛血清、以及选自链霉素/青霉素、两性霉素B和Primocin中的一种或多种的抗生素。具体地，当选自链霉素/青霉素时，链霉素浓度范围为25μg/mL～400μg/mL，优选为50μg/mL～200μg/mL，青霉素浓度范围为25U/mL～400U/mL，优选为50U/mL～200U/mL；当选自两性霉素B时，浓度范围为0.25μg/mL～4μg/mL，优选为0.5μg/mL～2μg/mL；当选自Primocin时，浓度范围为25μg/mL～400μg/mL，优选为50μg/mL～200μg/mL。
在另一方面，本发明还提供一种人原代急性髓系白血病细胞的体外培养方法，包括使用本发明的人原代急性髓系白血病细胞培养基对 人原代急性髓系白血病细胞进行体外培养的步骤。
在优选的实施方式中，本发明的人原代急性髓系白血病细胞的体外培养方法包括以下步骤：
1.人原代急性髓系白血病细胞的分离和处理
(1)对急性髓系白血病患者骨髓样本进行离心，离心转速为1200～1600rpm，离心时间为2～6分钟；
(2)离心后吸弃上层血浆，向血细胞沉淀中加入2～3倍量1x PBS稀释，充分混匀；加入6～8mL人外周血淋巴细胞分离液，加入上述稀释的血细胞沉淀，进行离心，离心转速为380～420g，升速1～2，降速0，温度20～28℃，离心时间为25～35分钟；
(3)离心后，离心管中分层，吸取淋巴细胞层至3～6mL 1x PBS中，混匀洗涤细胞后离心，离心转速范围为1200～1600rpm，离心时间范围为2～6分钟；
(4)弃上清，加入红细胞裂解液重悬细胞沉淀，裂解15～20分钟，离心转速为1200～1600rpm，离心时间为2～6分钟；
(5)离心后，弃上清，加入基础培养基备用。
2.使用本发明的人原代急性髓系白血病细胞培养基进行培养
将上述步骤1中获得的人原代急性髓系白血病细胞用本发明的人原代急性髓系白血病细胞培养基重悬并计数，按照细胞密度1×10
5～4×10
6个/cm
2种入培养皿中，直至培养皿中细胞长满90％以上进行传代。
在又一个方面，通过本发明的培养方法获得的细胞可应用于再生医疗、急性髓系白血病细胞的基础医学研究、药物应答的筛选、以及急性髓系白血病的新药研发等。因此，本发明还提供一种人原代急性髓系白血病细胞的药物筛选或疗效评估方法，其包括以下步骤：
(1)使用本发明的人原代急性髓系白血病细胞的培养方法培养人原代急性髓系白血病细胞；
(2)选定需要检测的药物并稀释成不同的浓度梯度；
(3)对(1)中培养得到的细胞添加稀释后的所述药物，并进行细胞活性测试。
本发明的技术方案能够取得以下技术效果：
(1)提高人原代急性髓系白血病细胞培养的成功率，成功率达到 80％以上；
(2)保证体外人原代急性髓系白血病细胞能够保持病人的病理特性；
(3)扩增效率高，只要有10
5级别的细胞数量就可在一周左右时间内成功扩增出10
6数量级的人原代急性髓系白血病细胞，扩增出的人原代急性髓系白血病细胞还可以连续传代；
(5)培养成本可控：培养基无需加入价格昂贵的Wnt激动剂、R-spondin家族蛋白、BMP抑制剂、FGF10等因子；
(6)所述技术培养获得的人原代急性髓系白血病细胞数量大，均一化程度高，适合高通量筛选新候选化合物和为病人提供高通量药物体外敏感性功能测试。
图1为显示不同添加因子组合对人原代急性髓系白血病细胞增殖的影响的图。
图2A-2H为显示各添加因子的不同浓度对人原代急性髓系白血病细胞增殖的影响的图。
图3为使用本发明的人原代急性髓系白血病细胞培养基培养得到的人原代急性髓系白血病细胞在显微镜下拍摄的照片。
图4为显示对使用本发明的人原代急性髓系白血病细胞培养基培养得到的人原代急性髓系白血病细胞进行流式鉴定的结果的图。
图5为使用本发明的人原代急性髓系白血病细胞培养基对人原代急性髓系白血病细胞进行体外培养的细胞生长曲线图。
图6为使用本发明的人原代急性髓系白血病细胞培养基和现有文献培养基对人原代急性髓系白血病细胞进行培养的对比图
图7A-7F为使用本发明的人原代急性髓系白血病细胞培养基培养的不同代数的人原代急性髓系白血病细胞对不同药物的剂量-效应曲线图。
为更好地理解本发明，下面结合实施例及附图对本发明作进一步 描述，以下实施例仅是对本发明进行说明而非对其加以限定。
实施例1 人原代急性髓系白血病细胞培养基中各添加因子对人原代急性髓系白血病细胞增殖的影响
(1)人原代急性髓系白血病细胞培养基的配制
首先配制基础培养基。基础培养基的配方为单核细胞无血清培养基(购自BI公司，05-080-1A)+10％(v/v)胎牛血清(购自依科赛公司，FND500)+100μg/mL Primocin(购自InvivoGen公司，0.2％(v/v)，市售产品浓度50mg/mL)。
在基础培养基内分别加入不同种类的生长因子(参见表1)配制成含有不同添加成分的人原代急性髓系白血病细胞培养基。
(2)人原代急性髓系白血病细胞的分离和处理
1样品选择
骨髓样本由专业医疗机构的专业医务人员从AML患者获取，患者均签署了知情同意书。骨髓样本3～10mL；采用EDTA-K2抗凝管(生产厂家：江苏荣业)存储，4～8℃冷藏运输。
2材料准备
15mL无菌离心管、移液枪、10mL移液管、无菌枪头等表面消毒后放入超净工作台中紫外照射30分钟。提前30分钟从4℃冰箱取出1x PBS。
3样品分离
3.1超净台中，移液枪吹打混匀骨髓样本，转移至15mL离心管中，于1500rpm室温离心4分钟；
3.2在新的15mL离心管中加入6mL人外周血淋巴细胞分离液(购自索莱宝公司，P8610)；骨髓样本离心结束后，吸弃上层血浆，向血细胞沉淀中加入2～3倍量1x PBS稀释，充分混匀；将稀释后的血液沿离心管壁缓缓叠加于分离液层液面上，注意保持液面的清晰；轻轻将骨髓样本混合物离心管放入离心机，400g离心30分钟，升速2，降速0，温度25℃；
3.3离心后，离心管中由上至下细胞分四层(PBS层、环状乳白色淋巴细胞层、分离液层、红细胞层)，移液器环形吸取淋巴细胞层至 预先加入5mL1x PBS的15mL离心管中，轻轻混匀洗涤细胞，1500rpm室温离心5分钟；
3.4弃上清，观察是否有血细胞，若有血细胞，加8mL血细胞裂解液(购自Sigma公司，R7757-100ML)，混匀，4℃裂解20分钟，期间颠倒混匀一次，1500rpm室温离心4分钟；
3.5弃上清，加入2mL基础培养基重悬细胞，备用。
4细胞计数及处理
4.1活细胞计数：取重悬的细胞悬液12μL，12μL台盼蓝染液(生工生物工程(上海)股份有限公司)充分混合后，取20μL加入细胞计数板(Countstar，规格：50片/盒)，细胞计数仪(Countstar，IC1000)下计算出活的大细胞(细胞粒径>10μm)百分率＝活细胞数/总细胞数*100％。
(3)人原代急性髓系白血病细胞的培养
将表1中不同成分的培养基按100μL/孔体积加入96孔板内。将按照上述步骤(2)从两例人原代急性髓系白血病骨髓样本(编号为A17007、A25104，来源于安徽医科大学第一附属医院)分离得到人原代急性髓系白血病细胞，以1×10
4个/孔的细胞密度接种在96孔培养板内，以37℃、5％CO
2浓度的条件进行培养。培养5～8天后，细胞长至70～85％，每孔加入10μL Cell Counting Kit-8(CCK-8，购自MCE)，以37℃、5％CO
2浓度的条件进行孵育2～4小时。混匀，多功能酶标仪(Multi-Mode Detection Platform，美国分子仪器(上海)有限公司)450nm读板。其中，作为实验对照，使用未添加任何添加剂的基础培养基，将实验结果示于表1。
表1 培养基中的添加成分及促细胞增殖效果
其中，“+”表示与基础培养基相比，加入该添加剂的培养基对从人原代急性髓系白血病骨髓样本分离出的人原代急性髓系白血病细胞中的两例有促进增殖的作用；“－”表示添加该添加剂的培养基对从人原代急性髓系白血病骨髓样本分离出的人原代急性髓系白血病细胞中的至少一例显示有促进增殖的作用；“○”表示添加该添加剂的培养基对人原代急性髓系白血病骨髓样本分离出的人原代急性髓系白血病细胞中的至少两例的增殖没有明显的影响。
根据以上结果，拟选人IL-7、人IFN-α、人M-CSF、人SCF、人IL-6、谷氨酰胺添加剂、人FLT3L、人IL-3、和非必需氨基酸等因子进行实施例2的进一步培养实验。
实施例2 人原代急性髓系白血病细胞培养基中不同添加因子的组合对人原代急性髓系白血病细胞增殖的影响
根据表2中的成分配制不同添加因子组合的人原代急性髓系白血病细胞培养基，考察不同添加因子组合对人原代急性髓系白血病细胞的促增殖作用。
表2 不同组分培养基的配制(浓度为终浓度)
按照实施例1的步骤(2)之3的方法从人原代急性髓系白血病骨髓样本(编号为A17151、A17152、A20090、A20101、A21004、A20141)获得人原代急性髓系白血病细胞，将所获得的细胞悬液平均分成11份，1500rpm离心4分钟。离心后分别使用200μL BM、No.1～10号培养基重悬，分别按照活细胞密度2×10
4个/孔接种于48孔板中(每孔2万细胞数)，分别使用对应的培养基补齐48孔板中各孔体积至1mL，充分混匀。表面消毒后置于37℃、5％CO
2培养箱(购自赛默飞)培养。
48孔板中细胞长至85％以上，转移至15mL离心管，1500rpm离心5分钟，加入单核细胞无血清培养基500μL重悬细胞沉淀，取重悬的细胞悬液12μL，12μL台盼蓝染液(生工生物工程(上海)股份有限公司)充分混合后，取20μL加入细胞计数板(Countstar，规格：50片/盒)，细胞计数仪(Countstar，IC1000)下计算出活的大细胞(细胞粒径>10μm)百分率＝活细胞数/总细胞数*100％。将由骨髓样本A17151、A17152、A20090、A20101、A21004、A20141的人原代急性髓系白血病细胞得到的结果示于图1。
根据图1的结果可知，与基础培养基相比，在使用上述No.1～No.10培养基时，均能够不同程度地促进肠癌原代细胞的增殖。No.2的培养基配方不含人IFN-α，反而导致更好的增殖效果。结果显示谷氨酰胺添 加剂、人SCF、人IL-6、人IL-3、人FLT3L、非必需氨基酸、人IL-7和人M-CSF等因子对人原代急性髓系白血病细胞有明显的促增殖作用。
实施例3 所添加因子的不同浓度对人原代急性髓系白血病细胞的促增殖作用
按照实施例1的步骤(2)之3的方法从人原代急性髓系白血病骨髓样本(编号为A23065、A17112)获得人原代急性髓系白血病细胞。并使用基础培养基(单核细胞无血清培养基+10％(v/v)胎牛血清+100μg/mL Primocin)重悬细胞，备用。
接着，在基础培养基中加入实施例2中确定的具有细胞培养增殖作用的因子(按照实施例2的No.2配方配制)构成组合基本培养基，然后配制以下8种配方的培养基进行实验：
配方1：组合基本培养基组分中不含谷氨酰胺添加剂；
配方2：组合基本培养基组分中不含人SCF；
配方3：组合基本培养基组分中不含人IL-6；
配方4：组合基本培养基组分中不含人IL-3；
配方5：组合基本培养基组分中不含人FLT3L；
配方6：组合基本培养基组分中不含非必需氨基酸；
配方7：组合基本培养基组分中不含人IL-7；
配方8：组合基本培养基组分中不含人M-CSF；
每孔加入20μl含4x10
4个细胞的细胞重悬液，分别使用1mL上述配方1～8的培养基来稀释细胞悬液。
在使用配方1的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的谷氨酰胺添加剂每孔1mL，谷氨酰胺添加剂的终浓度分别为0.5mM、1mM、2mM、4mM、8mM；并使用配方1的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方2的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的人SCF每孔1mL，人SCF的终浓度分别为1ng/mL、3ng/mL、9ng/mL、27ng/mL、81ng/mL；并使用配方2的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方3的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的人IL-6每孔1mL，人IL-6的终浓度分别为1.89ng/mL、5.67ng/mL、17ng/mL、51ng/mL、153ng/mL；并使用配方3的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方4的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的人IL-3每孔1mL，人IL-3的终浓度分别为1.89ng/mL、5.67ng/mL、17ng/mL、51ng/mL、153ng/mL；并使用配方4的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方5的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的人FLT3L每孔1mL，人FLT3L的终浓度分别为1ng/mL、3ng/mL、9ng/mL、27ng/mL、81ng/mL；并使用配方5的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方6的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的非必需氨基酸每孔1mL，非必需氨基酸的终浓度分别为12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM；并使用配方6的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方7的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的人IL-7每孔1mL，人IL-7的终浓度分别为1.89ng/mL、5.67ng/mL、17ng/mL、51ng/mL、153ng/mL；并使用配方7的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方8的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的人M-CSF每孔1mL，人M-CSF的终浓度分别为1ng/mL、3ng/mL、9ng/mL、27ng/mL、81ng/mL；并使用配方8的培养基设置对照孔(BC)。
待细胞扩增至48孔的85％左右计数，分别参比对照孔(BC)细胞数计算增殖倍数，将结果分别示于图2A～2H。图2A～2H中，比值为使用各培养基培养一代得到的细胞数与对应的对照孔培养一代得到的细胞数的比。比值大于1说明配制的含不同浓度的因子或小分子化合物的培养基促增殖效果优于对照孔培养基；比值小于1，则说明配制的含不同浓度的因子或小分子化合物的培养基促增殖效果较对照孔培养基促增殖效果弱。
根据图2A～2H的结果，谷氨酰胺添加剂、人SCF、人IL-6、人IL-3、人FLT3L、非必需氨基酸、人IL-7、人M-CSF对人原代急性髓系白血病细胞有明显的促增殖作用。根据本实施例的结果，谷氨酰胺添加剂的含量优选为0.5mM～4mM，浓度为0.5mM加入细胞增殖效果最明显；人SCF的含量优选为1ng/ml～81ng/ml，浓度为9ng/mL加入细胞增殖效果最明显；人IL-6的含量优选为1.89ng/ml～17ng/ml，浓度为5.67ng/mL加入细胞增殖效果最明显；人IL-3的含量优选为1.89ng/ml～153ng/ml，浓度为51ng/mL加入细胞增殖效果最明显；人FLT3L的含量优选为3ng/ml～81ng/ml，浓度为27ng/mL加入细胞增殖效果最明显；非必需氨基酸含量优选为12.5μM～200μM，浓度为50μM加入细胞增殖效果最明显；人IL-7的含量优选为1.89ng/ml～51ng/ml，浓度为17ng/mL加入细胞增殖效果最明显；人M-CSF的含量优选为1ng/ml～81ng/ml，浓度为27ng/mL加入细胞增殖效果最明显。
实施例4 人原代急性髓系白血病细胞培养及鉴定
(1)人原代急性髓系白血病细胞培养
按照实施例1的步骤(2)之3的方法从人原代急性髓系白血病骨髓样本(编号为A17030)获得人原代急性髓系白血病细胞，并使用本发明的人原代急性髓系白血病细胞培养基(组成为实施例3确定的最优成分和浓度组合，即包含基础培养基、0.5mM谷氨酰胺添加剂、9ng/mL人SCF、5.67ng/mL人IL-6、51ng/mL人IL-3、27ng/mL人FLT3L、50μM非必需氨基酸、17ng/mL人IL-7、和27ng/mL人M-CSF)进行培养。所获得的人原代急性髓系白血病细胞，按照活细胞密度3×10
6个/孔接种于6孔板中，加入本发明的人原代急性髓系白血病细胞培养基5mL混匀。表面消毒后置于37℃、5％CO
2培养箱(购自赛默飞)培养。
使用显微镜(Invitrogen公司EVOS M500)观察培养得到的人原代急性髓系白血病细胞，图3是10倍物镜下拍摄得到培养1天、4天、7天的照片。根据细胞计数，培养7天后活细胞数增殖至3.58倍。
(2)人原代急性髓系白血病细胞流式鉴定
按照实施例1的步骤(2)之3的方法从人原代急性髓系白血病骨 髓样本(编号为A17014)获得人原代急性髓系白血病细胞，并使用本发明的人原代急性髓系白血病细胞培养基进行培养。具体地，所获得的人原代急性髓系白血病细胞按照活细胞密度1×10
6个/孔接种于12孔板中，加入本发明的培养基3mL混匀。表面消毒后置于37℃、5％CO
2培养箱(购自赛默飞)培养。
将培养前、和培养7天的人原代急性髓系白血病细胞分别转移至15mL离心管中，1500rpm室温离心5分钟；弃上清，用2mL 1x PBS稀释细胞沉淀，平均分成2份于1.5mL离心管中，一份用于实验组标记白细胞(APC Mouse Anti-Human CD45(购自BD，560973))和髓系标记物(BB515Mouse Anti-Human CD33(购自BD，564588))标记双标；另一份做空白对照组。1500rpm室温离心5分钟，弃上清，加入40μL 0.5％BSA(1X PBS配制)，避光按照1:40加入上述抗体，对照组不加抗体，混匀，冰上孵育1～2小时；孵育结束后，每管加入1mL 1X PBS重悬清洗一次，1500rpm室温离心5分钟；弃上清，加入300μL 1X PBS重悬细胞沉淀；使用流式细胞仪(贝克曼公司EVOS M500)分析培养前、培养7天得到的人原代急性髓系白血病细胞髓系标记物的表达。
图4是使用本发明的人原代急性髓系白血病细胞培养基培养得到的人原代急性髓系白血病细胞进行流式鉴定的结果。从图4中可以确认，本发明的培养基培养的人原代急性髓系白血病细胞持续培养7天后，髓系白血病细胞比例提高16％。
实施例5 人原代急性髓系白血病细胞初次培养周期和细胞数统计及Population Doubling(PD)值计算
按照实施例1步骤(2)之3的方法从8例人原代急性髓系白血病细胞骨髓样本(编号为A23123、A15094、A23133、A23123-2、A23023、A14003、A23124、A09169)获得人原代急性髓系白血病细胞。对于所获得的人原代急性髓系白血病细胞，按照活细胞密度1×10
6个/孔将细胞接种在12孔板中并使用本发明的培养基进行培养。待细胞培养5～9天后传代计数，同时记录直至传代时培养的天数，将该直至传代时培养的天数作为一个培养周期。在该实验条件下持续培养，将扩增所得 的细胞进行不同代数扩增，每一代进行传代后计数并记录相应培养的周期，根据公式Population Doubling(PD)＝3.32*log10(消化后细胞总数/初始种入细胞数)计算PD，公式参见Chapman等，Stem Cell Research & Therapy 2014,5:60。
图5显示采用Graphpad Prism软件绘制的、使用本发明的人原代急性髓系白血病细胞基培养的8例原代细胞的生长曲线，横坐标表示细胞培养的天数，纵坐标是累计的细胞增殖倍数，表示细胞在培养周期内扩增的倍数，数值越大表示细胞在一定周期内扩增的次数越多，即扩增得到的细胞数也就越多，斜率代表的是细胞扩增的速率。从图5中可以确认，本发明的培养基培养的人原代急性髓系白血病细胞持续培养扩增至少45天时，细胞扩增速率基本保持不变，仍具有继续扩增的能力。
实施例6 与现有培养基培养效果的比较
(1)对照培养基配制
配制文献对照培养基(Silvia Ravera等，Scientific Reports，(2020)10:16519)，其配方为1640培养基(购自Corning公司，10-040-CVR)+10ng/mL IL-15(购自Sino Biological)+10ng/mL IL-4(购自Sino Biological)+10％FBS(购自excellbio，FND500)(以下简称“对照培养基”)。
(2)人原代急性髓系白血病细胞的获取和培养
按照实施例1的步骤(2)之3的方法从人原代急性髓系白血病骨髓样本(A10093)获得人原代急性髓系白血病细胞，按照活细胞密度1×10
6个/孔接种于12孔板中，分别进行本发明的培养基与对照培养基的培养。
在培养第7天，取出12孔板，转移细胞液于15mL离心管，1500rpm室温离心5分钟，1mL培养基重悬细胞沉淀。取重悬的细胞悬液12μL，12μL台盼蓝染液(生工生物工程(上海)股份有限公司)充分混合后，取20μL加入细胞计数板(Countstar，规格：50片/盒)，细胞计数仪(Countstar，IC1000)计出细胞总数，将计数结果示于图6。
根据图6的结果可知，与对照培养基相比，本发明的人原代急性 髓系白血病培养基能显著促进人原代急性髓系白血病细胞扩增，其效果优于对照培养基。
实施例7 使用本发明培养基扩增得到的人原代急性髓系白血病细胞用于药物筛选和疗效评估
1、细胞培养和铺板
按照实施例1同样的方法分离得到人原代急性髓系白血病细胞(编号为A23170)，作为一代，并使用本发明的人原代急性髓系白血病细胞培养基进行培养，待细胞扩增至85％，进行传代。按照实施例1中步骤将细胞传代计数，将细胞按照活细胞密度1×10
5个/mL细胞置于加样槽(购自康宁公司)中充分混匀后，在384孔不透明白色细胞培养板(购自康宁公司)中进行培养，每孔体积50μL，细胞数目为5000个/孔。从孔板边缘加入本发明的人原代急性髓系白血病培养基封板，板上标注样品名称、加药时间及CellTiter-Glo(购自Promega公司)检测时间。表面75％酒精(购自利尔康)消毒，置37℃、5％CO
2培养箱培养，24小时后加药。分别获取培养第1代、第2代、第3代、第4代、第5代细胞进行药物筛选，测试使用本发明培养基培养的原代细胞连续传代的药物敏感性。
2、筛选药物配制
按照下表配制6个浓度梯度的6种药物(阿糖胞苷、多柔比星、硼替佐米、帕比司他、阿扎胞苷、高三尖杉酯碱；均购自MCE公司)，在384孔药板(购自赛默飞公司)每孔中添加30μL，保存待用。
表3 药物作用浓度设置
3、高通量加药
取出配制好的药板，置于室温，于离心机(贝克曼)中室温1000rpm离心1分钟后取出。采用高通量自动化加样系统(Perkin Elmer公司JANUS)进行高通量加药。对培养有人原代急性髓系白血病细胞的384孔板在每孔加入0.1μL对应浓度的筛选药物。加药结束后，384孔板表面消毒后移至培养箱中，72小时后测定细胞活性。
4、细胞活性测试
4℃冰箱取出CellTiter-Glo发光试剂(购自Promega公司)，取10毫升试剂置于加样槽中。培养箱中取出待检测384孔板，每孔加入10μL CellTiter-Glo发光试剂，静置10分钟后混匀，使用多功能酶标仪(Perkin Elmer公司Envision)检测。
5、数据处理
按照公式细胞抑制率(％)＝100％-加药孔化学发光数值/对照孔化学发光数值*100％，计算得到不同药物作用细胞后的细胞抑制率，使用graphpad prism软件计算药物对细胞作用的半数抑制率(IC
50)。将结果示于图7A-7F。
由图7A-7F可以确认，使用本发明的人原代急性髓系白血病细胞培养基培养得到的人原代急性髓系白血病细胞进行药物筛选，相同药物对于培养的不同代数细胞的抑制效果基本保持一致(抑制曲线基本保持一致)。同一病人的细胞对不同药物在人体内最大血药浓度时的敏感性不同。根据结果可以判断人原代急性髓系白血病患者在临床使用该种药物时的有效性，同时可以说明根据本专利培养方法得到不同代数的肿瘤细胞对药物的敏感性是稳定的。
工业应用性
本发明提供一种用于体外培养人原代急性髓系白血病细胞的原代细胞培养基及培养方法，可将培养得到的细胞应用于药物的疗效评估和筛选。因而，本发明适于工业应用。
尽管本文对本发明作了详细说明，但本发明不限于此，本技术领域的技术人员可以根据本发明的原理进行修改，因此，凡按照本发明的原理进行的各种修改都应当理解为落入本发明的保护范围。
Claims (5)
- 一种人原代急性髓系白血病细胞培养基，其特征在于，包含：谷氨酰胺添加剂、非必需氨基酸、人白介素-6、人白介素-7、人白介素-3、重组人FLT3 Ligand、重组人巨噬细胞集落刺激因子、和人干细胞因子。
- 如权利要求1所述的人原代急性髓系白血病细胞培养基，其特征在于，所述人原代急性髓系白血病细胞的培养基满足以下任意一项或多项或全部满足：(1)所述谷氨酰胺添加剂在培养基中的含量为0.5mM～4mM；(2)所述非必需氨基酸为选自甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸中的一种或多种，所述非必需氨基酸在培养基中的含量为12.5μM～200μM；(3)所述人白介素-6在培养基中的含量为1.89ng/mL～17ng/mL；(4)所述人白介素-7在培养基中的含量为1.89ng/mL～51ng/mL；(5)所述人白介素-3在培养基中的含量为1.89ng/mL～153ng/mL；(6)所述重组人FLT3 Ligand在培养基中的含量为3ng/mL～81ng/mL；(7)所述重组人巨噬细胞集落刺激因子在培养基中的含量为1ng/mL～81ng/mL；(8)所述人干细胞因子在培养基中的含量为1ng/mL～81ng/mL。
- 如权利要求1或2所述的人原代急性髓系白血病细胞培养基，其特征在于，所述人原代急性髓系白血病细胞的培养基还包含基础培养基，所述基础培养基含有选自单核细胞无血清培养基和RPMI-1640的初始培养基、胎牛血清、以及选自链霉素/青霉素、两性霉素B和Primocin中的一种或多种的抗生素。
- 一种人原代急性髓系白血病细胞的培养方法，其特征在于：使用如权利要求1-3中任一项所述的人原代急性髓系白血病细胞培养基对人原代急性髓系白血病细胞进行培养。
- 一种人原代急性髓系细胞白血病的药物筛选或疗效评估方法，其包括以下步骤：(1)使用如权利要求4所述的人原代急性髓系白血病细胞的培养方法培养人原代急性髓系白血病细胞；(2)选定需要检测的药物并稀释成不同的浓度梯度；(3)对(1)中培养得到的细胞添加稀释后的所述药物，并进行细胞活性测试。
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