CN112601812A - 基因疗法 - Google Patents

基因疗法 Download PDF

Info

Publication number
CN112601812A
CN112601812A CN201980055217.3A CN201980055217A CN112601812A CN 112601812 A CN112601812 A CN 112601812A CN 201980055217 A CN201980055217 A CN 201980055217A CN 112601812 A CN112601812 A CN 112601812A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
hematopoietic
cell
gene
e4orf6
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980055217.3A
Other languages
English (en)
Inventor
P.杰诺韦塞
G.希罗利
L.纳尔迪尼
A.雅各布
S.费拉里
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ospedale San Raffaele SRL
Original Assignee
Ospedale San Raffaele SRL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ospedale San Raffaele SRL filed Critical Ospedale San Raffaele SRL
Publication of CN112601812A publication Critical patent/CN112601812A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4746—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used p53
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/179—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties the label being a nucleic acid

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

在造血干细胞和/或祖细胞基因疗法中使用的促进同源定向DNA修复的试剂，其中所述造血干细胞是基因编辑的。促进同源定向DNA修复的试剂在增加基因编辑的造血干细胞和/或祖细胞的存活和/或植入或者提高造血干细胞和/或祖细胞的基因编辑效率中的用途。

Description

基因疗法
发明领域
本发明涉及细胞的遗传修饰。更具体地，本发明涉及试剂改善基因编辑效率和改善已被基因编辑的造血干细胞的存活和/或植入的用途。
发明背景
造血系统是不同成熟细胞谱系的细胞的复杂层次结构。这些包括针对病原体提供保护的免疫系统细胞，贯穿身体携带氧气的细胞，以及参与伤口愈合的细胞。所有这些成熟细胞均源自能够自我更新并分化为任何血细胞谱系的造血干细胞(HSC)合并物。HSC具有补充整个造血系统的能力。
造血细胞移植(HCT)是用于几种遗传性和获得性病症的治愈疗法。然而，同种异体HCT受以下限制：匹配供体的较差可用性，与同种异体程序相关的死亡率，以及由深远且持久的免疫功能障碍状态引发的感染并发症，所述死亡率主要与移植物抗宿主病(GvHD)有关。
基于遗传修饰自体HSC的移植的基因疗法方法相对于同种异体HCT提供了潜在改善的安全性和效力。它们对于缺乏匹配供体的患者尤其相关。
干细胞基因疗法的概念是基于相对少量干细胞的遗传修饰。它们通过经历自我更新在体内长期存在，并产生大量的遗传“校正”后代。这确保在患者的余生中持续供应校正细胞。HSC是基因疗法特别有吸引力的靶标，因为它们的遗传修饰将随着它们分化而传递给所有血细胞谱系。此外，HSC可从例如骨髓、动员的外周血和脐带血中容易且安全地获得。
HSC及其后代的有效长期基因修饰需要允许将校正的DNA稳定整合至基因组而不影响HSC功能的技术。因此，整合型重组病毒系统例如γ-逆转录病毒、慢病毒和泡沫病毒的使用已主导了该领域(Chang，A.H.et al.(2007)Mol.Ther.15：445-456)。在腺苷脱氨酶严重联合免疫缺陷(ADA-SCID；Aiuti，A.et al.(2009)N.Engl.J.Med.360：447-458)，X连锁严重联合免疫缺陷(SCID-X1；Hacein-Bey-Abina，S.et al.(2010)N.Engl.J.Med.363：355-364)和Wiskott-Aldrich综合征(WAS；Boztug，K.et al.(2010)N.Engl.J.Med.363：1918-1927)的基于γ-逆转录病毒的临床试验中已获得了治疗益处。另外，慢病毒已被用作递送载体，用于治疗X连锁肾上腺脑白质营养不良(ALD；Cartier，N.et al.(2009)Science 326：818-823)，并且最近用于异染性脑白质营养不良(MLD；Biffi,A.et al.(2013)Science341:1233158)和WAS(Aiuti,A.et al.(2013)Science 341:1233151)。
除了使用基于逆转录病毒和慢病毒的载体外，还可以利用源自其他病毒(例如腺病毒和腺相关病毒(AAV))的载体来修饰造血干细胞和祖细胞。
遗传工程的范围最近已从基因置换扩展到使用工程化核酸酶的靶向基因编辑，这能够对目标基因座进行精确的序列修饰。基因编辑应用包括基因编码序列的靶向破坏，原位校正突变的精确序列取代，以及靶向转基因插入到预定基因座。基因编辑是基于设计人工内切核酸酶，其将双链断裂(DSB)或切口靶向入基因组中的目标序列中。细胞通过两种主要机制修复DSB，即非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)，尽管最终可以利用其他修复机制。NHEJ通常在靶位点处形成小的插入或缺失(“indel”)，其可能破坏基因的编码序列，而可利用HDR通过提供与DSB侧翼的序列具有同源性的外源模板DNA在靶位点处精确引入新序列。
可将人工内切核酸酶的多个平台用于靶向目标基因座，包括锌指核酸酶(ZFN)，TAL效应物核酸酶(TALEN)和最近开发的基于RNA的CRISPR/Cas9核酸酶。病毒载体是最有效的DNA模板递送载体，例如，AAV6载体能够在人原代细胞如造血干/祖细胞(HSPC)细胞和T淋巴细胞中实现高转导效率。
尽管最近在产生基因编辑的原代细胞方面取得了进展，但在我们能充分受益于由这些新技术所提供的遗传工程的预测安全性和精确性之前，仍需要解决几个障碍。主要问题在于，原代细胞，特别是原始HSPC子集中的基因编辑受到基因转移效率和同源定向DNA修复(HDR)的有限进步的限制，可能是由于HSC静止，由于HDR机制的低水平表达和相反地由于易错非同源末端连接(NHEJ)途径的高活性。因此，提高HSC中的HDR效率而完全保留其长期再定殖活性将是至关重要的。
类似地，腺相关病毒(AAV)作为HDR介导的基因编辑的供体模板来源的影响仍然研究较少，并且该载体在HSPC中的临床用途尚未有报告。已观察到AAV剂量依赖性毒性，这与ITR的G富集区直接相关，该区由于p53介导的凋亡诱导而在S期早期诱导细胞积聚，如hESC模型中所述。
用于造血干细胞和祖细胞的遗传修饰的方法仍然存在巨大困难。特别是，与现有方法相关的需要高载体剂量的多次命中和延长的离体转导时间引起了培养过程中转导的造血干细胞和祖细胞的存活问题，并可能影响其生物学特性。此外，转导细胞植入的改善将大大有益于临床应用。
发明概述
令人惊讶地，发明人发现促进同源定向DNA修复的试剂(例如，p53活化抑制剂或腺病毒蛋白)的使用改善造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞的基因编辑效率，并且改善经处理的基因编辑的造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞的存活和/或植入。
发明人确定了有利地，促进同源定向DNA修复的试剂增强了造血干细胞和祖细胞，特别是更原始CD34+CD133+CD90+级分中的基因靶向效率。此外，该试剂不显著影响造血干细胞和/或祖细胞的分化状态，因而保留了它们的长期再定殖能力。
一方面，本发明提供了促进同源定向DNA修复的试剂，其在造血细胞基因疗法，造血干细胞基因疗法和/或造血祖细胞基因疗法中使用，其中所述基因疗法包括基因编辑。
在一个优选的实施方案中，造血细胞、造血干细胞和造血祖细胞是人细胞。
在一个实施方案中，细胞是HSC。在一个实施方案中，细胞是HSPC。
在一个实施方案中，造血干细胞和/或祖细胞是CD34+细胞。
在一个实施方案中，造血干细胞和/或祖细胞群体包含CD34+细胞，富含CD34+细胞，或基本上由CD34+细胞组成。细胞群体可进一步富集特定的细胞亚群，例如CD34+CD38-细胞。细胞群体可进一步富集特定的细胞亚群，例如CD34+CD133+和CD90+细胞。
在一个优选实施方案中，基因疗法是造血干细胞疗法，并且造血干细胞是基因编辑的。
一方面，本发明提供了促进同源定向DNA修复的试剂，其在增加基因编辑的造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞的存活和/或植入中使用。
在一个实施方案中，当已经将细胞暴露于试剂时而不是在其缺乏时，多至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、50％、75％或90％，优选至少70％的细胞在培养中存活一段时间(例如，约6或12小时，或1、2、3、4、5、6、7或更多天，优选约2天)。优选地，该时间段开始于用病毒载体转导细胞。
本发明可以允许减少用细胞因子对细胞进行预处理/条件化以引发细胞(在其它情况下静止)进行转导的时机。标准时机是3天。此时间可减少至少于3天，或少于2天，或少于1天，例如0天、1天或2天。
在一个实施方案中，该试剂基本上防止或减少了造血干细胞和/或祖细胞的凋亡，特别是在体外培养期间。
在一个实施方案中，当已经将细胞暴露于试剂时而不是在其缺乏时，培养一段时间(例如约6或12小时，或1、2、3、4、5、6、7或更多天，优选约2天)后，少至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％或75％，优选至少25％的细胞变得凋亡。优选地，该时间段开始于用病毒载体转导细胞。
在一个实施方案中，当已经将细胞暴露于试剂时而不是其缺乏时，多至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％或75％，优选至少10％的移植的造血干细胞和/或造血祖细胞和/或它们的后代细胞(如移植物衍生的细胞)植入到宿主受试者中。
另一方面，本发明提供了促进同源定向DNA修复的试剂在增加基因编辑的造血干细胞和/或祖细胞的存活和/或植入或者在提高造血干细胞和/或祖细胞的基因编辑效率中的用途。
在一个实施方案中，试剂是p53活化抑制剂，优选其中抑制剂是p53磷酸化抑制剂，更优选是p53丝氨酸15磷酸化抑制剂。
在一个实施方案中，抑制剂是p53显性负性肽，共济失调毛细血管扩张突变(ATM)激酶抑制剂，和/或共济失调毛细血管扩张和Rad3相关蛋白(ATR)抑制剂。
在一个实施方案中，抑制剂是皮斐松-α或其衍生物。在一个实施方案中，抑制剂是环状皮斐松-α。在一个实施方案中，抑制剂是对硝基皮斐松-α，KU-55933或其衍生物；GSE56或其片段或变体；KU-60019，BEZ235，渥曼青霉素，CP-466722，Torin 2，CGK 733，KU-559403，AZD6738或其衍生物；或者siRNA，shRNA，miRNA或反义DNA/RNA。
在一个实施方案中，在造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞中p53的抑制是瞬时的。
在一个实施方案中，抑制剂是瞬时抑制剂(如具有持续少于约1、2、3、4、5、6、7或14天的抑制作用)，例如可逆抑制剂。优选地，将细胞暴露于抑制剂达约1-48或1-24小时，优选1-24小时。例如，可以与病毒载体同时或在病毒载体之前将细胞暴露于抑制剂。
在一个实施方案中，在将基因编辑机械(gene editing machinery)引入细胞之前、同时和/或之后施用试剂。
在一个实施方案中，p53瞬时抑制发生在造血细胞、造血干细胞和/或祖细胞的基因编辑期间。
在一个实施方案中，将抑制剂以约1-50μM的浓度添加至造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞。
在一个实施方案中，将抑制剂以约1-50、1-40、1-30、1-20或1-15μM，优选约1-15μM的浓度添加至造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞(如在体外或离体培养中)。在另一个实施方案中，将抑制剂以约5-50、5-40、5-30、5-20或5-15μM，优选约5-15μM的浓度添加至造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞。
在一个实施方案中，将抑制剂以约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50μM，优选约10μM的浓度添加至造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞(如在体外或离体培养中)。
在一个实施方案中，试剂包含至少一种腺病毒蛋白。
在一个实施方案中，试剂包含编码至少一种腺病毒蛋白的核酸序列。
优选地，至少一种腺病毒蛋白是E4ORF1，优选其中E4ORF1的氨基酸序列以SEQ IDNo.1或SEQ ID No.57-76所示。至少一种腺病毒蛋白可以是E4ORF1的变体或片段，此时变体或片段基本上保持全长E4ORF1的生物活性，例如增加本文定义的基因编辑的造血干/祖细胞存活和/或植入的能力。
优选地，至少一种腺病毒蛋白是E4ORF6/7，优选其中E4ORF6/7的氨基酸序列以SEQID No.2或SEQ ID No.77-107所示。至少一种腺病毒蛋白可以是E4ORF6/7的变体或片段，此时变体或片段基本上保持全长E4ORF6/7的生物活性，例如增加本文定义的基因编辑的造血干/祖细胞存活和/或植入的能力。
在一个实施方案中，试剂包含腺病毒蛋白E4ORF1，优选其中E4ORF1的氨基酸序列以SEQ ID No.1或SEQ ID No.57-76所示；和腺病毒蛋白E4ORF6/7，优选其中E4ORF6/7的氨基酸序列以SEQ ID No.2或SEQ ID No.77-107所示。
在一个实施方案中，试剂包含编码腺病毒蛋白E4ORF1的核酸序列，优选其中E4ORF1的氨基酸序列以SEQ ID No.1或SEQ ID No.57-76所示，和腺病毒蛋白E4ORF6/7的核酸序列，优选其中E4ORF6/7的氨基酸序列以SEQ ID No.2或SEQ ID No.77-107所示。
腺病毒蛋白不限于特定的腺病毒血清型。例如，在一个实施方案中，至少一种腺病毒蛋白来自血清型4的腺病毒，血清型5的腺病毒，血清型7的腺病毒和/或血清型9的腺病毒。在一个实施方案中，至少一种腺病毒蛋白来自血清型5的腺病毒。
在一个实施方案中，试剂包含促进同源定向修复的如本文定义的两种化合物。在一个实施方案中，试剂包含p53活化抑制剂和腺病毒蛋白，或其编码核苷酸序列。优选地，p53活化抑制剂是GSE56或其变体。
在一个实施方案中，试剂包含：
(a)p53活化抑制剂和腺病毒蛋白E4ORF1(或其编码核苷酸序列)。在一个实施方案中，E4ORF1具有以SEQ ID No.1或SEQ ID No.57-76所示的E4ORF1的氨基酸序列；
(b)p53活化抑制剂和腺病毒蛋白E4ORF6/7(或其编码核苷酸序列)。在一个实施方案中，E4ORF6/7具有以SEQ ID No.2或SEQ ID No.77-107所示的E4ORF6/7的氨基酸序列。
(c)p53活化抑制剂，腺病毒蛋白E4ORF1(或其编码核苷酸序列)，优选其中E4ORF1的氨基酸序列以SEQ ID No.1或SEQ ID No.57-76所示，以及腺病毒蛋白E4ORF6/7(或其编码核苷酸序列)，优选其中E4ORF6/7的氨基酸序列以SEQ ID No.2或SEQ ID No.77-107所示。优选地，p53活化抑制剂是GSE56或其变体。
在一个实施方案中，试剂是包含p53活化抑制剂和腺病毒蛋白或其编码核苷酸序列的组合物。
在一个实施方案中，与腺病毒蛋白或其编码核苷酸序列组合同时、序贯或分开施用p53活化抑制剂。
在一个实施方案中，与p53活化抑制剂组合同时、序贯或分开施用腺病毒蛋白或其编码核苷酸序列。
一方面，本发明提供了产品，其包含：(a)本发明的p53活化抑制剂；和(b)本发明的腺病毒蛋白，作为在疗法中同时、分开或序贯用途的组合制剂，其中所述用途是本公开的用途。
如本文所用，术语“组合”或术语“结合”，“与...组合使用”或“组合制剂”可指两种或多种实体同时、序贯或分开组合施用。
如本文所用，术语“同时”是指同时(即，同一时间)施用实体。
如本文所用，术语“序贯”是指将实体一个接一个地施用。
如本文所用，术语“分开”是指实体彼此独立地但是在使实体显示组合，优选协同效应的时间间隔内施用。因此，“分开”施用可允许一个实体例如在另一实体之后的1分钟、5分钟或10分钟内施用。
在一个实施方案中，编码腺病毒蛋白的核酸是mRNA。
在一个实施方案中，腺病毒蛋白在造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞中瞬时表达，优选瞬时表达发生在造血细胞、造血干细胞和/或祖细胞的基因编辑期间。
在一个实施方案中，基因编辑的靶标选自下组：CD40L，RAG-1，IL-2RG，CYBA，CYBB，NCF1，NCF2和NCF4。在一个实施方案中，基因编辑的靶标是在慢性肉芽肿病中突变的基因或在SCID，非典型SCID和Omenn综合征或高IgM综合征中突变的基因。
优选地，基因编辑的靶标是CD40L。
另一方面，本发明提供了基因编辑造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体的方法，包括将基因编辑机械引入造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体；并且
其中在将基因编辑机械引入造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体之前、同时或之后，使造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体与促进同源定向DNA修复的试剂接触。
另一方面，本发明提供了基因编辑造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体的方法，其包括以下步骤：
(a)使造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体与促进同源定向DNA修复的试剂接触；
(b)将基因编辑机械引入造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体；和
(c)编辑所述造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞的基因组。
另一方面，本发明提供了基因编辑造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体的方法，其包括以下步骤：
(a)将基因编辑机械引入造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体；
(b)使造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体与促进同源定向DNA修复的试剂接触；和
(c)编辑所述造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞的基因组。
另一方面，本发明提供了基因编辑造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体的方法，其包括以下步骤：
(a)将基因编辑机械和促进同源定向DNA修复的试剂引入造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体；
(b)编辑所述造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞的基因组。
在一个实施方案中，离体或体外进行方法步骤(a)和(b)。因此，在基因编辑造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体的方法的一个实施方案中，离体或体外进行步骤(a)和(b)。在一个实施方案中，步骤(a)和(b)可同时进行。在另一个实施方案中，步骤(a)和(b)序贯进行，步骤(a)在步骤(b)之前或者步骤(b)在步骤(a)之前。
在一个实施方案中，基因编辑机械可包含核酸酶，例如锌指核酸酶(ZFN)，转录激活剂样效应物核酸酶(TALEN)，大范围核酸酶或成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas系统。
基因编辑机械(如CRISPR/Cas系统)可包含与细胞中至少一个靶基因互补的一种或多种向导RNA，RNA引导的DNA内切核酸酶或编码所述内切核酸酶的核苷酸序列(如Cas9蛋白或编码Cas9的核苷酸序列)。在一个实施方案中，基因编辑机械可以是CRISPR/Cas系统。
在一个实施方案中，基因编辑机械可由一个或多个核苷酸序列提供。适当地，可将编码基因编辑机械的核苷酸序列序贯或同时引入细胞。在一个实施方案中，可以在与将基因编辑机械引入细胞同时使促进HDR的试剂与细胞接触。在一个实施方案中，通过电穿孔将一种或多种编码基因编辑机械的核苷酸序列引入细胞。在一个实施方案中，通过转导将一种或多种核苷酸序列引入细胞。适当地，可以通过转导病毒载体引入核苷酸序列。例如，可以在AAV6转导递送供体DNA模板之前通过电穿孔将Cas9核糖核酸蛋白引入细胞。
如本文所用，术语“引入”是指用于将外源DNA或RNA插入细胞中的方法。如本文所用，术语引入包括转导和转染方法。转染是通过非病毒方法将核酸引入细胞的过程。转导是通过病毒载体将外源DNA或RNA引入细胞的过程。
在一个实施方案中，使用AAV转导递送供体DNA模板。
在一个实施方案中，使用AAV6转导递送供体DNA模板。
在一个实施方案中，用病毒载体转导细胞群体之前，使造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞(如，基因编辑所述细胞群体的方法的步骤(a)中的细胞群体)与试剂接触约15分钟至约4小时；约15分钟至约3小时；或约15分钟至约2小时。在另一个实施方案中，用病毒载体转导细胞群体之前，使细胞与试剂接触约1-4小时；1-3小时；或1-2小时。
在一个实施方案中，用病毒载体转导细胞群体之前，使造血细胞、造血干细胞和/或造血细胞祖细胞(如，基因编辑本发明细胞群体的方法的步骤(a)中的细胞群体)与试剂接触约15分钟，30分钟，1小时，1.5小时，2小时，2.5小时，3小时，3.5小时或4小时，优选约15分钟。
合适地，试剂在基因编辑期间可以有活性(如，可促进同源定向DNA修复)。
在一个实施方案中，在步骤(b)开始之前，步骤(a)的接触持续约12-60小时，例如24-60、36-60或42-54小时，优选约42-54小时。在一个实施方案中，在步骤(b)开始之前，步骤(a)的接触持续约12、18、24、30、36、42、48、54或60小时，优选约48小时。
在一个实施方案中，开始培养造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体之后(如，细胞从冷冻状态解冻后开始培养)，步骤(b)进行约12-60小时，例如24-60、36-60或42-54小时，优选约42-54小时。在一个实施方案中，在开始培养造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体之后，步骤(b)进行约12、18、24、30、36、42、48、54或60小时，优选约48小时。
在一个实施方案中，在解冻造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体(如，它们已经以冷冻状态贮存)之后，步骤(b)进行约12-60小时，例如24-60、36-60或42-54小时，优选约42-54小时。在一个实施方案中，在解冻造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体之后，步骤(b)进行约12、18、24、30、36、42、48、54或60小时，优选约48小时。
在一个实施方案中，促进同源定向DNA修复的试剂是p53活化抑制剂。
在一个实施方案中，p53活化抑制剂是p53显性负性肽，共济失调毛细血管扩张突变(ATM)激酶抑制剂，或共济失调毛细血管扩张和Rad3相关蛋白(ATR)抑制剂。
在一个实施方案中，p53活化抑制剂是皮斐松-α或其衍生物，包括环状皮斐松-α或对硝基皮斐松-α；KU-55933或其衍生物；GSE56或其变体；KU-60019，BEZ235，渥曼青霉素，CP-466722，Torin 2，CGK 733，KU-559403，AZD6738或其衍生物；或者siRNA，shRNA，miRNA或反义DNA/RNA。优选地，p53活化抑制剂是显性负性肽。优选地，p53活化抑制剂是GSE56或其变体。
在一个实施方案中，将抑制剂以约1-50μM的浓度添加至造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞。
在一个实施方案中，试剂包含编码至少一种腺病毒蛋白的核酸序列。
优选地，至少一种腺病毒蛋白是E4ORF1，优选其中E4ORF1的氨基酸序列以SEQ IDNo.1或SEQ ID No.57-76所示。至少一种腺病毒蛋白可以是E4ORF1的变体或片段，此时变体或片段基本上保持全长E4ORF1的生物活性，如增加本文定义的基因编辑的造血干/祖细胞存活和/或植入的能力。
优选地，至少一种腺病毒蛋白是E4ORF6/7，优选其中E4ORF6/7的氨基酸序列以SEQID No.2或SEQ ID No.77-107所示。至少一种腺病毒蛋白可以是E4ORF6/7的变体或片段，此时变体或片段基本上保留全长E4ORF6/7的生物活性，如增加本文定义的基因编辑的造血干/祖细胞存活和/或植入的能力。
在一个实施方案中，试剂包含腺病毒蛋白E4ORF1，优选其中E4ORF1的氨基酸序列以SEQ ID No.1或SEQ ID No.57-76所示；和腺病毒蛋白E4ORF6/7，优选其中E4ORF6/7的氨基酸序列以SEQ ID No.2或SEQ ID No.77-107所示。
在一个实施方案中，试剂包含编码腺病毒蛋白E4ORF1的核酸序列，优选其中E4ORF1的氨基酸序列以SEQ ID No.1或SEQ ID No.57-76所示；和腺病毒蛋白E4ORF6/7的核酸序列，优选其中E4ORF6/7的氨基酸序列以SEQ ID No.2或SEQ ID No.77-107所示。
腺病毒蛋白不限于特定的腺病毒血清型。例如，在一个实施方案中，至少一种腺病毒蛋白来自血清型4的腺病毒，血清型5的腺病毒，血清型7的腺病毒和/或血清型9的腺病毒。在一个实施方案中，至少一种腺病毒蛋白来自血清型5的腺病毒。
在一个实施方案中，试剂包含促进同源定向修复的本文定义的两种化合物。在一个实施方案中，试剂包含p53活化抑制剂和腺病毒蛋白，或其编码核苷酸序列。优选地，p53活化抑制剂是GSE56或其变体。
在一个实施方案中，试剂包含：
(a)p53活化抑制剂和腺病毒蛋白E4ORF1(或其编码核苷酸序列)。在一个实施方案中，E4ORF1具有SEQ ID No.1或SEQ ID No.57-76所示的E4ORF1的氨基酸序列。
(b)p53活化抑制剂和腺病毒蛋白E4ORF6/7(或其编码核苷酸序列)。在一个实施方案中，E4ORF6/7具有SEQ ID No.2或SEQ ID No.77-107所示的E4ORF6/7的氨基酸序列。
(c)p53活化抑制剂，腺病毒蛋白E4ORF1(或其编码核苷酸序列)，优选其中E4ORF1的氨基酸序列以SEQ ID No.1或SEQ ID No.57-76所示，和腺病毒蛋白E4ORF6/7(或其编码核苷酸序列)，优选其中E4ORF6/7的氨基酸序列以SEQ ID No.2或SEQ ID No.77-107所示。优选地，p53活化抑制剂是GSE56或其变体。
优选地，p53活化抑制剂是GSE56或其变体。
在一个实施方案中，试剂是包含p53活化抑制剂和腺病毒蛋白或其编码核苷酸序列的组合物。
在一个实施方案中，与腺病毒蛋白或其编码核苷酸序列组合同时、序贯或分开施用p53活化抑制剂。
在一个实施方案中，与p53活化抑制剂组合同时、序贯或分开施用腺病毒蛋白或其编码核苷酸序列。
在一个实施方案中，编码腺病毒蛋白的核酸是mRNA。
在一个实施方案中，在造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞中瞬时表达腺病毒蛋白。
在一个实施方案中，基因编辑的靶标选自下组：CD40L、RAG-1、IL-2RG、CYBA、CYBB、NCF1、NCF2和NCF4。优选地，基因编辑的靶标为CD40L。
在一个实施方案中，与基因编辑同时使造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体与促进同源定向DNA修复的试剂接触。
在一个实施方案中，造血干细胞和/或祖细胞群体获自动员的外周血、骨髓或脐带血。
在一个实施方案中，根据本发明的方法包括富集造血干细胞和/或祖细胞群体的进一步步骤。
另一方面，本发明提供了基因疗法的方法，其包括以下步骤：
a)根据本发明的方法基因编辑造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体；和
b)将基因编辑的造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞施用于受试者。
在一个实施方案中，将基因编辑细胞作为自体干细胞移植程序或同种异体干细胞移植程序的一部分施用于受试者。
基因疗法的方法可以是例如治疗选自下组的疾病的方法：I型粘多糖贮积症(MPS-1)、慢性肉芽肿性病症、范可尼贫血(Fanconi anaemia,FA)、镰状细胞病(sickle celldisease)、异染性脑白质营养不良(metachromatic leukodystroph,MLD)、球样细胞脑白质营养不良(globoid cell leukodystrophy,GLD)、GM2神经节苷脂贮积病、地中海贫血和癌症。
基因疗法的方法可以是例如治疗由Rag-1突变引起的疾病的方法，例如SCID、非典型SCID和Omenn综合征。
基因疗法的方法可以是例如治疗高IgM综合征的方法(如，其中基因编辑的靶标是CD40L)。
在一个实施方案中，受试者是哺乳动物受试者，优选人受试者。
一方面，本发明提供了根据本发明的方法制备的基因编辑的造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体。
另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含根据本发明的基因编辑的造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体。
又一方面，本发明提供了根据本发明的基因编辑的造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体，其在疗法中使用，优选在基因疗法中使用。
一方面，将根据本发明使用的基因编辑的造血干细胞和/或祖细胞群体作为自体干细胞移植程序或同种异体干细胞移植程序的一部分施用。
另一方面，本发明提供了促进同源定向DNA修复的试剂在制备用于造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞基因疗法的药物中的用途，其中造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞是基因编辑的。
另一方面，本发明提供了促进同源定向DNA修复的试剂在制备用于增加造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞的存活和/或植入的药物中的用途，其中造血干细胞和/或祖细胞是基因编辑的。
另一方面，本发明提供了包含条形码序列的AAV载体。
另一方面，本发明提供了包含条形码序列的AAV载体，其在基因疗法，优选造血基因疗法中使用。
优选的AAV载体是能够在人原代细胞如HSPC细胞中实现高转导效率的那些载体。AAV载体可以是HDR精通(proficient)的。在一个实施方案中，载体是AAV6载体或源自AAV6载体的载体。优选地，载体是AAV6载体。
条形码序列是充当独特标识符的随机、高度简并的DNA序列。优选地，条形码序列是随机DNA序列。DNA序列可包含以下或由以下组成：至少15bp，或至少18、19或20bp，例如20-40bp，20-30bp，20-25bp或约22bp。优选地，条形码序列不包含任何不期望的限制位点(即，克隆限制性酶的限制位点)。
AAV载体可进一步包含编码目标基因的核苷酸序列。“目标基因”可以是任何基因。该基因可以是标志物基因和/或涉及人类疾病的基因。
AAV载体可包含目标基因和条形码序列，使得条形码序列能够报告目标基因是否正确整合到宿主基因组和/或用于细胞的克隆追踪。换句话说，目标基因和条形码序列的侧翼有同源序列，使得同源定向DNA修复期间目标基因组和条形码序列一起插入宿主基因组中。
目标基因可以可操作地连接至启动子。启动子可以是本领域技术人员已知的任何合适的启动子。在一些实施方案中，启动子是hPGK启动子。
目标基因可以可操作地连接至聚腺苷酸化序列。聚腺苷酸化序列可以是本领域技术人员已知的任何合适的聚腺苷酸化序列。在一些实施方案中，启动子是bGH-pA。
在一些实施方案中，AAV载体靶向安全港基因座，优选AAVS1基因座，IL2RG的内含子1，CD40L或RAG-1，最优选AAVS1基因座。
AAV载体可包含以下所示的核苷酸序列，或具有与以下序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列(条形码序列带下划线)：
Figure BDA0002946865180000141
Figure BDA0002946865180000151
另一方面，本发明提供了本发明的AAV载体在克隆追踪已使用所述载体进行基因编辑的细胞中的用途，优选其中所述细胞是造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞。在一个实施方案中，该用途是体外用途。
另一方面，本发明提供了使用本发明的AAV载体克隆追踪细胞的方法，优选其中所述细胞是造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞。
方法可以包括以下步骤：
(a)提供分离的细胞群体；
(b)使用本发明的AAV载体基因编辑分离的细胞群体；和
(c)使用AAV载体的条形码序列克隆追踪基因编辑细胞。
优选地，方法进一步包括：任选地，扩增基因编辑的细胞的分离的群体；以及将基因编辑的细胞的分离的群体移植至受试者。
因此，在一个优选的实施方案中，方法包括以下步骤：
(a)提供分离的细胞群体；
(b)使用本发明的AAV载体基因编辑分离的细胞群体；
(c)任选地，扩增基因编辑的细胞的分离的群体；
(d)将基因编辑的细胞的分离的群体移植至受试者；以及
(e)使用AAV载体的条形码序列克隆追踪基因编辑的细胞。
更优选地，方法进一步包括：从受试者收获血液和/或组织样品；从血液和/或组织样品中分离基因组DNA；以及定量基因组DNA中的条形码。
因此，在一个优选的实施方案中，方法包括以下步骤：
(a)提供分离的细胞群体；
(b)使用本发明的AAV载体基因编辑分离的细胞群体；
(c)任选地，扩增基因编辑的细胞的分离的群体；
(d)将基因编辑的细胞的分离的群体移植至受试者；
(e)从受试者收获血液和/或组织样品；
(f)从血液和/或组织样品中分离基因组DNA；以及
(g)定量基因组DNA中来自AAV载体的条形码序列。
如本文所述，细胞可以是任何合适的细胞。细胞可以是造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞。细胞可以是例如人或小鼠细胞。优选地，细胞是人细胞，并且受试者是人。细胞可以是CD34+细胞。在一些实施方案中，细胞是HSC。在一些实施方案中，细胞是HSPC。
可以将AAV载体转导至细胞中。优选地，以1x104至5x104vg/细胞进行转导。
血液和/或组织样品可以在至少1、2、3、4、8、12、24、36或48周后收获。例如，血液和/或组织样品可以在约1-100周、1-50周、1-20周、2-20周或5-20周后收获。
优选地，血液和/或组织样品至少约每天、约每周、约每两周或约每月收获。例如，在一些实施方案中，血液和/或组织样品约每天、约每周、约每两周或约每月收获。
在优选的实施方案中，样品是血液样品。
条形码序列的克隆追踪或定量可包括以下步骤：
(i)条形码序列的PCR扩增；和
(ii)测序PCR扩增的条形码序列。
定量可以允许鉴定基因编辑的克隆的数量和分布，即，以允许克隆追踪。
另一方面，本发明提供了条形码序列用于细胞的克隆追踪的用途。
附图简述
图1.HSPC中基因编辑的单细胞转录影响。(A)基因编辑方案和scRNA-Seq分析的示意图。简而言之，针对每种实验条件，将约3000个细胞通过FACS富集CD133+和CD90+表面标志物，然后在电穿孔后24小时，收集进行Drop-seq分析。(B)对scRNA-Seq数据中上调的前100个基因(按对数2倍变化(2FC)排名)进行反应组(Reactome)分析，比较编辑的相对于模拟处理的CD34+细胞。(C)热图显示从M.Fischer 2017 Oncogene 36,3943-3956中检索到的p53激活基因列表在用RNP+AAV6编辑或模拟处理的单细胞中的表达水平。(D)在所示(RNP+ssODN n＝3，其他条件n＝5)处理的CD34+细胞电穿孔后24小时，测量的CDKN1A相对于模拟对照的倍数表达。
图2.皮斐松瞬时抑制p53。(A)基因编辑方案和皮斐松添加时机的示意图。(B)存在或不存在不同的皮斐松-α衍生物时，基因编辑后3天指示的亚群内测量的GFP+细胞百分比(n＝2)。(C)存在或不存在环状皮斐松-α时基因编辑后3天指定亚群内测量的GFP+细胞百分比和对总体细胞(bulk cells)测量的NHEJ百分比(n＝5)。(D)来自(C)的经处理CD34+细胞的亚群组成(n＝5)。
图3.GSE56 mRNA瞬时抑制p53。(A)基因编辑方案±GSE56和细胞分析的示意图。(B)如所示(UT，RNP+AAV6，RNP+AAV6+GSE56，n＝8；模拟电穿孔n＝3)处理的CD34+细胞电穿孔后24小时，测量的所示p53靶基因(CDKN1A、PHLDA3、RPS27L、APOBEC3H)相对于未处理对照(UT)的倍数表达，*P<0.05，**P<0.01；Mann-Whitney检验。(C)(左)存在或不存在GSE56mRNA时AAVS1或IL2RG基因编辑后3天HDR(通过ddPCR测量)或NHEJ(通过异双链体测定测量)的百分比(n＝9)*P<0.05，**P<0.01；Wilcoxon配对符号秩检验(Wilcoxon matched-pairssigned-rank test)。(右)存在或不存在GSE56mRNA时，AAVS1或IL2RG基因编辑后3天指定亚群内测量的GFP+细胞百分比(n＝15)**P<0.01；Wilcoxon配对符号秩检验。(D)存在或不存在GSE56 mRNA时，AAVS1编辑细胞的生长曲线(n＝2)。(E)来自(B)的经处理的CD34+细胞的亚群组成。(F)铺板后CFU-C测定中针对CD133+CD90+或CD133+90-分选的编辑细胞计数的红系或髓系单集落数量(n＝11)ns：P＞0.05，*P＜0.05；Mann-Whitney检验。
图4.抑制由基因编辑诱导的转录标签(signature)增加HSPC长期再定殖能力。(A)基因编辑方案±GSE56和NSG小鼠中移植的示意图。(B)存在(n＝6)或不存在GSE56 mRNA(n＝5)时，在指定时间测量的移植的NSG小鼠PB中IL2RG编辑细胞的人CD45+植入。(C)在来自(B)的小鼠PB中测量的人淋巴样(CD19+和CD3+)和髓系(CD13+)群体的百分比。(D)在来自(B)的小鼠中的所示人PB群体中测量的GFP+细胞的百分比。
图5：腺病毒E4基因的示意图。腺病毒是AAV的天然共辅助物，其提供优化AAV感染过程所需的一组辅助基因功能(E1a、E1b、E2a、E4)。E4基因由编码七种不同蛋白的七个开放ORF组成。我们研究了使用E4orf1和E4orf6/7腺病毒蛋白来改善HSC中的基因编辑效率。
图6：AAVS1基因编辑与腺病毒E4orf1和E4orf6/7蛋白组合。(A)基因编辑方案±E4orf1和/或E4orf6/7和细胞分析的示意图。(B)存在(E4orf6/7)或不存在(标准品)腺病毒蛋白E4orf6/7mRNA(2μg总mRNA)时并使用递增剂量的AAV6作为供体模板，其中MOI＝104vg/细胞(n＝3)，MOI＝5x104vg/细胞(n＝12)，MOI＝105vg/细胞(n＝2)，利用Cas9-RNP(25pmol)对脐带血(CB)衍生的CD34+进行AAVS1编辑后4天的指定亚群内测量的GFP+细胞百分比。(C)使用作为供体模板的AAV6(MOI＝5x104vg/细胞)或IDLV(MOI＝200)，RNP-Cas9(25pmol)并补充有E4orf6/7(2μg总RNA)对CB衍生的CD34+进行AAVS1编辑后4天的指定亚群内测量的GFP+细胞百分比。(D)使用作为供体模板的AAV6(MOI＝5x104vg/细胞)，RNP-Cas9(25pmol)并补充渐增剂量的E4orf1(1至5μg总RNA)或E4orf6/7(1至5μg总RNA)对CB衍生的CD34+进行AAVS1编辑后4天的指定亚群内测量的GFP+细胞百分比。
图7：人D34+中基因编辑方案的E4orf1和E4orf6/7补充。(A)使用作为供体模板的AAV6(MOI＝5x104 vg/细胞)，RNP-Cas9(25pmol)并补充或未补充E4orf1(3μg总RNA)和/或E4orf6/7(2μg总RNA)对CB衍生的CD34+进行AAVS1编辑后4天的指定亚群内测量的GFP+细胞百分比。(B)使用作为供体模板的AAV6(MOI＝5x104 vg/细胞)，RNP-Cas9(25pmol)并补充或未补充E4orf1(3μg总RNA)和/或E4orf6/7(2μg总RNA)对CB衍生的CD34+进行基因编辑后4天，总体内通过对5’载体-基因组连接的ddPCR测量的HDR介导的整合的百分比，以及通过细胞荧光分析测量的GFP+细胞百分比。(C)集落形成细胞测定。铺板后15天测量的红系(n＝3)(为红色)和髓系(n＝3)(为白色)的总数量。(D)电穿孔后的细胞生长曲线(n＝1)。
图8：人CD34+中基因编辑方案的E1B55K和E4orf6补充。(A)使用作为供体模板的AAV6(MOI＝5x104vg/细胞)，RNP-Cas9(25pmol)并补充E1B55K(3μg总RNA)和/或E4orf6(2μg总RNA)进行CB衍生的CD34+的AAVS1编辑后4天的指定亚群内测量的GFP+细胞百分比。(B)使用作为供体模板的AAV6(MOI＝5x104 vg/细胞)，RNP-Cas9(25pmol)并补充E1B55K(3μg总RNA)和/或E4orf6(2μg总RNA)对CB衍生的CD34+进行基因编辑后4天，总体内通过对5’载体-基因组连接的ddPCR测量的HDR介导的整合的百分比，以及通过细胞荧光分析测量的GFP+细胞百分比。(C)集落形成细胞测定。铺板后15天测量的红系(n＝3)(为红色)和髓系(n＝3)(为白色)的总数量。(D)电穿孔后的细胞生长曲线(n＝1)。
图9：使用E4orf6/7对人T细胞进行基因编辑。(A)T细胞基因编辑方案±E4orf6/7和细胞分析的示意图。(B)使用作为供体模板的AAV6(MOI＝5x104vg/细胞)，RNP-Cas9(25pmol)并补充E4orf6/7(2μg总RNA)对刺激的T细胞进行AAVS1编辑后20天的指定亚群内测量的GFP+细胞百分比(n＝3)。
图10：使用E4orf6/7对人CB衍生的CD34+进行AAVS1基因编辑，接着进行NSG小鼠移植。(A)在电穿孔复合体AAVS1特异性RNP-cas9(25pmol)和补充E4orf6/7(2μg总RNA)之前，标准移植程序需要用细胞因子和药物刺激细胞3天。电穿孔程序继之以以5x104个病毒基因组/细胞进行AAV6转导。将总共6x105个处理细胞移植到每只小鼠(尾静脉内注射)；测试了两种实验条件(标准品和补充有E4orf6/7)。(B)使用作为供体模板的AAV6(MOI＝5x104vg/细胞)，RNP-Cas9(25pmol)并补充E4orf6/7(2μg总RNA)对CB衍生的CD34+进行AAVS1编辑后4天的指定亚群内测量的GFP+细胞百分比。(C)来自(B)的经处理的CD34+细胞的培养物组成。(D)通过HDR(液滴数字PCR，ddPCR，介导的5’载体-基因组连接的定量)或通过NHEJ(T7异双链体检测测定)对来自(B)的细胞的AAVS1等位基因进行分子分析，表示为野生型(WT)或修饰等位基因百分比。
图11：使用E4orf6/7进行AAVS1靶向的人CB衍生的CD34+的体内追踪。(A)E4orf6mRNA存在(n＝4)或不存在(n＝5)时，在经移植的NSG小鼠的外周血(PB)中指定时间以及实验结束时在其不同器官(脾脏、胸腺和骨髓)中和骨髓的不同血液谱系内(HSPC＝CD34+；B细胞＝CD19+；髓系细胞＝CD33+；T细胞＝CD3+)测量的编辑细胞的人CD45+植入。(B)PB、造血器官和骨髓谱系中测量的来自(A)的人细胞内测量的GFP+细胞百分比。(C)PB、造血器官和骨髓谱系中测量的来自(A)的编辑等位基因百分比(每个细胞的靶向拷贝数量)。
图12：GSE56瞬时过表达改善AAVS1编辑的再定殖HSPC的体内产率和克隆性。(A)编辑方案后12-24小时，通过FACS测量的总体培养物和通过Hoechst 33342染色得到的CD90+中细胞周期状态百分比[Kruskal-Wallis检验，相对于标准品RNP+AAV6]。(B)用于将人脐带血(CB)衍生的CD34+细胞中的AAVS1靶向基因编辑移植到免疫缺陷NSG小鼠的实验设置的示意图。(C，D)用p53抑制剂处理(+GSE56)或未处理(标准品)的细胞的异种移植后21周，脾脏(SPL)和骨髓(BM)中的人细胞百分比(C)和总人细胞中GFP+百分比(D)[Mann-Withney检验]。(E)用p53抑制剂处理(+GSE56)或未处理(标准品)的细胞移植的小鼠的造血器官中独特显性条形码(unique dominat barcodes)的数量[Mann-Withney检验]。(F)独特显性条形码的数量(X轴)与CD45+GFP+细胞百分比(Y轴)之间的相关性(Spearman相关性)。
图13：GSE56瞬时过表达改善CD40LG编辑的再定殖HSPC的体内产率。(A)用于将人脐带血(CB)衍生的CD34+细胞中的CD40LG靶向基因编辑移植到免疫缺陷NSG小鼠的实验设置的示意图。(B，C)用p53抑制剂处理(+GSE56)或未处理(标准品)的细胞移植的NSG小鼠外周血中人细胞百分比(B)和GFP百分比(C)。(D)来自(B)的小鼠的造血器官中人细胞的百分比。(E)通过液滴数字PCR测量的来自(D)中的小鼠的分选的B细胞(CD19+)，髓系(CD33+)，T细胞(CD3+)和干细胞(CD34+)的靶向整合百分比。
图14：腺病毒蛋白Ad5-E4orf6/7和Ad5-E4orf1均通过靶向HSPC中的AAVS1基因座提高HDR效率。(A)用细胞因子和药物预刺激后以及通过在第3天电穿孔RNP-Cas9(25pmol)和AAV6(2.104vg/ml)作为标准编辑程序±以mRNA递送的GFP，GSE56，Ad5-E4orf1，Ad5-E4orf6/7或GSE56/Ad5-E4orf6/7在人脐带血(CB)衍生的CD34+中的靶向基因编辑方案的示意图。(B)编辑后几天内监测CD34+培养细胞的生长。(C左图和右图)针对标准RNP+AAV6±GSE56，Ad5-E4orf1，Ad5-E4orf6/7或GSE56/Ad5-E4orf6/7的编辑方案后96小时，通过FACS测量的指定亚群内GFP+细胞百分比和相关数值倍数增加[单向ANOVA]。(D)编辑方案后96小时，总体培养物中通过对5’载体-基因组连接的ddPCR测量的由HDR和NHEJ进行AAVS1编辑的等位基因百分比[Kruskal-Wallis检验，相对于标准RNP+AAV6]。(E)编辑方案后96小时，从分化细胞(CD34-)到最原始区室(CD34+CD133+CD90+)的培养物组成[Kruskal-Wallis检验，相对于标准RNP+AAV6]。(F)编辑方案后24小时，总体培养物中通过FACS测量的7-AAD/膜联蛋白染色的细胞状态凋亡百分比。(G)编辑方案后24小时，从总体培养物中铺板的集落数量[Kruskal-Wallis检验，相对于标准RNP+AAV6]。(H)编辑方案后12-24小时，总体培养物中通过FACS测量的Hoechst 33342染色的细胞周期状态百分比[Kruskal-Wallis检验，相对于标准RNP+AAV6]。(I)IL2RG基因座中针对标准RNP+AAV6±Ad5-E4orf6/7进行编辑方案后96小时，通过FACS测量的指定亚群内GFP+细胞百分比和相关数值倍数增加[配对T检验]。(J)通过解冻后第0、1和2天用RNP-Cas9(25pmol)和AAV6(2.104vg/ml)作为标准编辑程序±以mRNA递送的GSE56，Ad5-E4orf6/7或GSE56/Ad5-E4orf6/7进行电穿孔，人脐带血(CB)衍生的CD34+的靶向基因编辑方案的示意图。(K)针对标准RNP+AAV6±GSE56，Ad5-E4orf6/7或GSE56/Ad5-E4orf6/7的编辑方案后96小时，通过FACS测量的指定亚群内GFP+细胞百分比(n＝1)以及总体(左图)和CD90+(右图)中相关数值倍数增加。(L)编辑方案后96小时，总体培养物中通过对5’载体-基因组连接的ddPCR测量的由HDR得到的AAVS1编辑的等位基因的百分比(n＝1)。
图15：腺病毒蛋白Ad5-E1B55K和Ad5-E4orf6的组合增加HSPC中供体模板盒表达但不增加HDR效率。(A)通过使用我们的标准程序RNP+AAV6±Ad5-E1B55K和/或Ad5-E4orf6在hCB衍生的CD34+中进行编辑方案后96小时，通过FACS测量的指定亚群内GFP+细胞百分比[单向ANOVA]。(B)编辑方案后96小时，通过对5’载体-基因组连接的ddPCR测量的总体培养物中由HDR和NHEJ得到的AAVS1编辑的等位基因百分比[Kruskal-Wallis检验，相对于标准RNP+AAV6]。(C)编辑方案后96小时的培养物组成。(D)编辑方案后24小时，通过FACS测量的7-AAD/膜联蛋白染色的总体培养物中细胞状态凋亡百分比。(E)编辑方案后24小时，从总体培养物中铺板的集落数量[Kruskal-Wallis检验，相对于标准RNP+AAV6]。
图16：腺病毒蛋白Ad5-E4orf6/7影响调节HSPC中的细胞周期的E2F靶基因。(A)对标准RNP+AAV6±GFP，GSE56，Ad5-E4orf6/7或GSE56/Ad5-E4orf6/7的编辑方案后24小时，CDK2基因相对于未处理细胞(UT)的倍数表达的TaqMan测定[Kruskal-Wallis检验，相对于标准RNP+AAV6]。(B)对标准RNP+AAV6±GFP，GSE56，Ad5-E4orf6/7或GSE56/Ad5-E4orf6/7的编辑方案后12、24、96和168小时，CDK2基因相对于UT的倍数表达的TaqMan测定。(C)对标准RNP+AAV6±GFP，GSE56，Ad5-E4orf6/7或GSE56/Ad5-E4orf6/7的编辑方案后24小时，CDKN2A基因相对于UT的倍数表达的TaqMan测定[Kruskal-Wallis检验，相对于标准RNP+AAV6]。(D)对标准RNP+AAV6±GFP，GSE56，Ad5-E4orf6/7或GSE56/Ad5-E4orf6/7的编辑方案后12、24、96和168小时CDKN2A基因相对于UT的倍数表达的TaqMan测定。(E)对标准RNP+AAV6±GFP，GSE56，Ad5-E4orf6/7或GSE56/Ad5-E4orf6/7的编辑方案后24小时CDKN1A基因相对于UT的倍数表达的TaqMan测定[Kruskal-Wallis检验，相对于标准RNP+AAV6]。(F)对标准RNP+AAV6±GFP，GSE56，Ad5-E4orf6/7或GSE56/Ad5-E4orf6/7的编辑方案后12、24、96和168小时CDKN1A基因相对于UT的倍数表达的TaqMan测定。(G)对标准RNP+AAV6±GFP，GSE56，Ad5-E4orf6/7或GSE56/Ad5-E4orf6/7的编辑方案后24小时APOBEC3H基因相对于UT的倍数表达的TaqMan测定[Kruskal-Wallis检验，相对于标准RNP+AAV6]。(H)对标准RNP+AAV6±GFP，GSE56，Ad5-E4orf6/7或GSE56/Ad5-E4orf6/7的编辑方案后12、24、96和168小时，APOBEC3H基因相对于UT的倍数表达的TaqMan测定。(I)使用腺病毒蛋白Ad5-E4orf6/7和/或p53抑制剂GSE56进行编辑方案后，HSPC中细胞周期调控机制的示意图。
图17：AAVS1编辑的人CB衍生的CD34+的首次异种移植随访。(A)人脐带血(CB)衍生的CD34+的靶向基因编辑方案以及随后编辑方案后24小时进行NSG异种移植的示意图。(B)移植后几周内监测外周血(PB)中人CD45+细胞植入。(C)移植后几周内PB中植入的hCD45+中GFP+编辑细胞的百分比。(D，E)脾脏和骨髓(BM)中长期的hCD45+植入的百分比和hCD45+内GFP+的百分比两者。(F)用RNP+AAV6±GSE56/Ad5-E4orf6/7处理的细胞移植的小鼠的造血器官中独特显性条形码数量(Mann-Withney检验)。线表示中值。
图18：AAVS1编辑的人CB衍生的CD34+的二次异种移植随访。(A)从BM中选择CD34+细胞后在NSG小鼠中二次移植的示意图。(B)移植后几周内监测外周血(PB)中人CD45+细胞植入。(C)移植后几周内PB中植入的hCD45+中GFP+编辑细胞的百分比。(D，E)脾脏和骨髓(BM)中长期的hCD45+植入的百分比和hCD45+内GFP+的百分比两者。(F，G)脾脏中的血液谱系组成(CD19+，CD33+和CD3+)以及相关的GFP+细胞百分比。线表示中值。
图19：有限剂量的AAVS1编辑的人CB衍生的CD34+时的初次异种移植随访。(A)移植后几周内监测外周血(PB)中人CD45+细胞植入。(B)移植后几周内PB中植入的hCD45+中GFP+编辑细胞的百分比。线表示中值。
图20：IL2RG编辑的人CB衍生的CD34+的首次和二次异种移植随访。(A，B)首次移植后几周内监测外周血(PB)中人CD45+细胞的植入和植入的hCD45+中GFP+编辑的细胞两者。(C，D)二次移植后几周内监测外周血(PB)中人CD45+细胞植入和植入的hCD45+中GFP+编辑的细胞。(E，F)脾脏和骨髓(BM)中长期的hCD45+植入的百分比和hCD45+内GFP+的百分比两者。(G，H)脾脏中血液谱系组成(CD19+，CD33+和CD3+)以及相关的GFP+细胞百分比。线表示中值。(I)来自靶向IL2RG基因座的体外和体内样品的通过ddPCR测量的“X”和“14”染色体之间的易位事件百分比。线表示中值。
图21：探索腺病毒蛋白E4orf1血清型变体。(A)E4orf1蛋白序列比对(T-Coffee)，包括高度保守的氨基酸。(B)基于T-Coffee分析的系统发生树，并显示腺病毒血清型中最接近的氨基酸组成。(C)通过使用我们的标准程序RNP+AAV6±Ad4-E4orf1，Ad5-E4orf1，Ad7-E4orf1或Ad9-E4orf1(选定变体)对hCB衍生的CD34+进行编辑方案后96小时，通过FACS测量的指定亚群内GFP+细胞百分比。(D)编辑方案后24小时，从总体培养物中铺板的集落数量。(E)编辑方案后24小时CDK2，CDKN2A和CDKN1A基因相对于未处理细胞(UT)的倍数表达的TaqMan测定。
图22：探索腺病毒蛋白E4orf6/7血清型变体。(A)E4orf6/7蛋白序列比对(T-Coffee)，包括高度保守的氨基酸。(B)基于T-Coffee分析的系统发生树，并显示腺病毒血清型中最接近的氨基酸组成。(C)通过使用我们的标准程序RNP+AAV6±Ad3-E4orf6/7，Ad4-E4orf6/7，Ad5-E4orf6/7或Ad23-E4orf6/7(选定变体)对hCB衍生的CD34+进行编辑方案后96小时，通过FACS测量的指定亚群内GFP+细胞百分比。(D)编辑方案后24小时，从总体培养物中分配的集落数量。(E)编辑方案后24小时，CDK2，CDKN2A和CDKN1A基因相对于未处理细胞(UT)的倍数表达的TaqMan测定。
图23.包含条形码序列的载体。
包含条形码序列的AVV载体设计的示意图。
发明详述
如本文所用，术语“包含”与“包括”或“含有”同义，并且是包括在内或开放式的，并且不排除额外的、未描述的成员、元件或步骤。术语“包含”还包括术语“由……组成”。
细胞存活和植入
术语“存活”是指在体外或离体培养期间造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞保持活着(如，未死亡或变凋亡)的能力。例如，在细胞培养期间，造血干细胞和/或祖细胞用病毒载体转导后可以发生凋亡增加；因此，存活细胞可避免细胞凋亡和/或细胞死亡。
技术人员可容易地分析细胞存活。例如，可在培养开始时和/或培养一段时间后(例如约6或12小时，或1、2、3、4、5、6、7天或更长时间；优选这段时间从用病毒载体转导细胞开始)定量细胞培养中活细胞、死细胞和/或凋亡细胞的数量。试剂(如本发明的抑制剂或腺病毒蛋白)对细胞存活的影响通过在存在和不存在该试剂但其他方面基本相同的条件下进行的实验之间在培养期开始和/或结束时比较活细胞、死细胞和/或凋亡细胞的数量和/或百分比来评估。
可使用本领域已知的多种方法的任何一种定量某些状态(如，活细胞、死细胞或凋亡细胞)中细胞数量和/或百分比，包括使用血球计数器、自动细胞计数器、流式细胞仪和荧光激活细胞分选仪。这些技术可区分活细胞、死细胞和/或凋亡细胞。另外或可选择地，可使用现成的凋亡测定法(如，基于检测细胞膜表面上的磷脂酰丝氨酸(PS)的测定法，如通过使用与暴露的PS结合的膜联蛋白V；凋亡细胞可通过使用荧光标记的膜联蛋白V进行定量)，这可用于补充其他技术。
术语“植入”是指造血干细胞和/或祖细胞在其移植后(即在移植后的短期和/或长期)在受试者中定殖和存活的能力。例如，植入可指在移植后约1天至24周、1天至10周或1-30天或10-30天检测到的从所移植造血干细胞(如，移植物衍生的细胞)传代的造血细胞数量和/或百分比。例如，在人造血干细胞和/或祖细胞植入和再定殖的异种移植模型中，可将外周血中的植入评估为源自人异种移植物(如，CD45表面标志物阳性)的细胞百分比。在一个实施方案中，植入在移植后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30天进行评估。在另一个实施方案中，植入在移植后约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24周进行评估。在另一个实施方案中，植入在移植后约16-24周，优选20周进行评估。
技术人员可容易地分析植入。例如，可对所移植的造血干细胞和/或祖细胞进行工程化改造以包含标志物(如，报告蛋白如荧光蛋白)，其可以用于定量移植物衍生的细胞。可从相关组织中提取用于分析的样品并且离体分析(如，使用流式细胞术)。
适当地，与未使用该试剂的基因编辑相比，根据本发明使用的试剂可改善基因编辑的造血干细胞和/或祖细胞的植入。适当地，与未经处理的基因编辑的造血干细胞和/或祖细胞的移植相比，在特定时间点的植入可增加至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
在一个优选实施方案中，与未经处理的基因编辑的造血细胞、造血干细胞和/或造血细胞相比，根据本发明使用的试剂未不利地影响基因编辑的造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞的生长。
基因编辑效率
一方面，本发明提供了促进同源定向DNA修复的试剂在提高分离的造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体的基因编辑效率(如，被病毒载体转导时)和/或增加基因编辑的造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞的存活和/或植入中的用途。
提高基因编辑效率是指与不存在该试剂但其他方面基本相同的条件下实现的基因编辑相比，在存在试剂的情况下细胞(如，造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞)的基因编辑提高。因此，在使用病毒载体引入基因编辑机械的情况下，提高的效率可使感染复数(MOI)和/或实现有效转导所需的时间减少。
在一个实施方案中，编辑细胞的百分比增加。确定已经编辑的细胞的百分比的方法是本领域已知的。合适的方法包括流式细胞术、荧光激活细胞分选(FACS)和荧光显微术。所采用的技术优选是适于自动化和/或高通量筛选的技术。
例如，细胞群体可用具有报告基因的载体进行编辑。适当地，报告基因可在细胞已经被编辑时表达。合适的报告基因包括编码荧光蛋白的基因，例如绿色、黄色、樱桃红、青色或橙色荧光蛋白。一旦对细胞群体进行了编辑，就可使用合适的技术(如FACS)对表达和不表达报告基因的细胞数量进行定量。然后可计算已经经编辑的细胞的百分比。
可选择地，可将定量PCR(qPCR)用于确定已经经过基因编辑的细胞的百分比，而无需报告基因。例如，可从半固体培养物中挑选细胞的单集落(如，CD34+细胞)，并且可对每个集落分别进行qPCR，以确定在所分析的那些集落中基因编辑的阳性集落的百分比。
用于确定载体拷贝数量的方法在本领域中也是已知的。所采用的技术优选是适于自动化和/或高通量筛选的技术。合适的技术包括定量PCR(qPCR)和基于Southern印记杂交的方法。
提高基因编辑效率可指与不存在试剂但其他方面基本相同的条件下所实现的转导相比，在试剂(如，p53活化抑制剂或腺病毒蛋白)存在下用病毒载体转导细胞群体后，靶基因或位点已以预期方式进行编辑(如，破坏、替换、缺失或具有其内或者其处插入的核酸序列)的细胞(如，造血细胞、造血干细胞或造血祖细胞)的数量增加。因此，提高的基因编辑效率可使感染复数(MOI)和/或实现有效基因编辑所需的转导时间减少。用于确定靶基因或位点是否已被编辑的方法是本领域已知的。
在基因编辑的情况下，例如使用CRISPR/Cas系统，优选用于转导细胞群体的载体是非整合载体(如，整合缺陷型慢病毒载体，IDLV)。
在一个实施方案中，与未使用试剂的基因编辑(即，标准基因编辑)相比，根据本发明使用的试剂提高了基因编辑效率。适当地，基因编辑效率可改善至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、3倍或更多。
适当地，基因编辑效率可在特定细胞区室中改善。适当地，基因编辑在原始HSPC细胞区室中改善。适当地，基因编辑可在CD34+CD133-细胞中得到改善。适当地，基因编辑可在CD34+CD133+细胞中改善。适当地，基因编辑可在CD34+CD133+CD90+细胞中改善。
优选地，CD34+CD133+CD90+细胞的基因编辑效率可改善至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、3倍或更多。
促进同源定向DNA修复的试剂
本发明人已确定改善HSC中HDR效率增加基因编辑的HSC的细胞存活和植入。
原代细胞(特别是HSPC)中的基因编辑可能受基因转移效率和有限的HDR阻碍，这可能是由于HDR机制的低表达水平和NHEJ途径的高活性。
如本文所用，“促进同源定向DNA修复的试剂”是指相对于未经试剂处理细胞的HDR水平，增强和/或提高HDR效率的试剂。
适当地，HDR可增加5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。适当地，HDR可增加1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0倍或更多。
HDR效率可使用本领域中的任何方法来测量。合适地，HDR效率可通过FACS测量供体模板载体中标志物的存在来确定，该标志物通过靶定基因座处HDR介导的整合引入细胞。例如，AAV6供体模板可包含PGK.GFP报告盒。图2B表明，如通过确定GFP+细胞百分比所测量的，通过瞬时p53抑制获得HDR效率的增加。
靶向整合(“中靶”HDR)可使用在载体序列和靶基因座之间的连接处以及用于标准化的对照序列(人TTC5基因)上设计的引物和探针通过数字PCR来确定。
在核酸酶靶位点上通过非同源末端连接(NHEJ)修复途径引入的插入和缺失(indels)的百分比采用错配敏感的内切核酸酶测定法(基于靶定基因座的PCR扩增，然后用T7内切核酸酶I酶切；消化的DNA片段经LabChip GX Touch HT,Perkin Elmer上的毛细管电泳进行解析和定量)。将NHEJ诱导的突变水平用作评分核酸酶活性的替代读数。
优选地，试剂具有低细胞毒性。
优选地，试剂不显著改变基因编辑细胞的组成。
优选地，试剂不显著诱导基因编辑的造血干细胞和/或祖细胞的分化。因此，根据本发明的经基因编辑的造血干细胞和/或祖细胞保持了其长期再定殖能力。
适当地，与未经处理的对照相比，基因编辑细胞的组成或分化的变化小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。
例如，图3E显示，与未经处理的对照相比，基因编辑细胞中在编辑后3天所测量的造血群体的相对组成没有变化。
p53活化
术语“p53活化”是指p53活性的增加，例如通过p53蛋白的翻译后修饰。示例性的翻译后修饰包括磷酸化、乙酰化和甲基化，并且描述于Kruse,J.P.et al.(2008)SnapShot:p53 Posttranslational Modifications Cell 133:930-931。在本发明的上下文中，p53活化优选源自p53(特别优选氨基酸丝氨酸15处)的磷酸化。
用于分析此类翻译后修饰的方法是本领域已知的(本文公开了用于分析激酶活性的示例方法，其他方法包括例如基于质谱法和基于抗体识别的方法)。
可用于提供氨基酸编号惯例的p53的示例氨基酸序列为：
Figure BDA0002946865180000281
(SEQ ID NO:3；NCBI登录号000537.3)
共济失调毛细血管扩张突变(ATM)激酶
共济失调毛细血管扩张突变(ATM)激酶(又被称为“共济失调毛细血管扩张突变”)是丝氨酸/苏氨酸激酶，其被募集到双链DNA断裂并被双链DNA断裂激活。已知ATM激酶使启动DNA损伤检查点活化的许多蛋白(包括p53、CHK2、BRCA1、NBS1和H2AX)磷酸化，从而导致细胞周期停滞、DNA修复或细胞凋亡。
在一个实施方案中，ATM激酶是人ATM激酶。
在一个实施方案中，ATM激酶的氨基酸序列是NCBI登录号NP_000042.3下存放的序列。ATM激酶的示例氨基酸序列为：
Figure BDA0002946865180000291
(SEQ ID NO:4)
编码ATM激酶的示例核酸序列：
Figure BDA0002946865180000301
Figure BDA0002946865180000311
Figure BDA0002946865180000321
(SEQ ID NO:5；NCBI登录号NM_000051.3)
共济失调毛细血管扩张和Rad3相关蛋白(ATR)
共济失调毛细血管扩张和Rad3相关蛋白(ATR)，又被称为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶ATR或FRAP相关蛋白1(FRP1)，是参与DNA损伤传感的丝氨酸/苏氨酸特异性激酶。它可能参与活化DNA损伤检查点，从而导致细胞周期停滞。
在一个实施方案中，ATR是人ATR。
在一个实施方案中，ATR的氨基酸序列是NCBI登录号NP_001175.2下存放的序列。ATR的示例氨基酸序列为：
Figure BDA0002946865180000322
Figure BDA0002946865180000331
(SEQ ID NO:6)
编码ATR的示例核酸序列为:
Figure BDA0002946865180000341
Figure BDA0002946865180000351
Figure BDA0002946865180000361
(SEQ ID NO:7；NCBI登录号NM_001184.3)
激酶抑制剂
一方面，本发明提供了共济失调毛细血管扩张突变(ATM)激酶抑制剂或共济失调毛细血管扩张和Rad3相关蛋白(ATR)抑制剂，其用于造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞基因疗法。
本发明还提供了鉴定能够充当ATM激酶或ATR抑制剂的试剂的方法以及通过这种方法鉴定的试剂。
ATM激酶和ATR的活性可例如通过体外分析ATM激酶或ATR的酶活性进行直接分析。
候选试剂抑制(如，降低活性)ATM激酶或ATR的能力可用IC50值表示，IC50值是引起激酶活性降低50％所需的试剂浓度。优选地，本发明的抑制剂对(如，ATM激酶或ATR的)抑制具有小于100μM，更优选小于10μM，如小于1μM，小于100nM或小于10nM的IC50值(如，KU-55933对ATM激酶具有约13nM的IC50值)。
用于测量激酶活性的许多技术是本领域已知的。优选地，对已从细胞分离的激酶(如，ATM激酶或ATR)进行激酶活性测定。该激酶已使用重组技术表达，并且优选已被纯化。例如，激酶活性可通过监测从[γ-32P]标记的ATP到底物掺入的放射性标记磷酸根来确定。此类测定技术描述于，例如Hastie等(Hastie,C.J.et al.(2006)Nat.Protocols 1:968-971)。
优选地，抑制剂对哺乳动物如人具有低毒性，特别是对造血干细胞和/或祖细胞具有低毒性。
候选抑制剂可使用本文公开的方法进一步分析其增加细胞存活和/或植入的能力。
优选地，抑制剂是瞬时抑制剂(如，具有持续少于约1、2、3、4、5、6、7或14天的抑制作用)。
优选地，抑制剂是药理学抑制剂。
KU-55933
在优选实施方案中，抑制剂是KU-55933或其衍生物。
KU-55933(CAS No.587871-26-9)是选择性竞争ATM激酶抑制剂，其具有以下结构：
Figure BDA0002946865180000371
本发明中使用的KU-55933的溶液可使用本领域已知的常规方法来制备，例如，已知KU-55933可溶于DMSO和乙醇。
可针对不同载体系统调节将KU-55933或其衍生物应用于造血干细胞和/或祖细胞群体的浓度，以优化细胞存活(如，在体外或离体培养期间)和/或植入。
本发明包括KU-55933和KU-55933衍生物的用途。本发明的KU-55933衍生物是增加造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞，特别是由病毒载体转导的细胞的存活(如，在体外或离体培养期间)和/或植入的那些衍生物。
本发明的KU-55933衍生物可以为了例如增加溶解度、增加稳定性和/或减少毒性而开发。
本发明的KU-55933衍生物优选对哺乳动物，特别是人具有低毒性。优选地，本发明的KU-55933衍生物对造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞具有低毒性。
合适的KU-55933衍生物可使用本领域已知的用于确定培养和/或植入中细胞存活的方法来鉴定。这类方法的实例已如上所述。所采用的方法优选是适于自动化和/或高通量筛选候选KU-55933衍生物的方法。候选KU-55933衍生物可形成KU-55933衍生物文库的一部分。
其他抑制剂
可用于本发明的其他激酶抑制剂包括：
KU-60019，其为改进的KU-55933类似物，并且在无细胞测定中对ATM激酶具有6.3nM的IC50。KU-60019具有以下结构：
Figure BDA0002946865180000381
BEZ235(NVP-BEZ235，Dactolisib)，其为针对p110α/γ/δ/β和mTOR(p70S6K)的双重ATP竞争性PI3K和mTOR抑制剂，在3T3TopBP1-ER细胞中以约21nM的IC50抑制ATR。BEZ235具有以下结构：
Figure BDA0002946865180000382
渥曼青霉素，其具有结构：
Figure BDA0002946865180000383
CP-466722,其为有效且可逆的ATM激酶抑制剂，但是不影响ATR。CP-466722具有结构：
Figure BDA0002946865180000391
Torin 2，其对ATM激酶和ATR分别具有28nM和35nM的EC50值。Torin 2具有结构：
Figure BDA0002946865180000392
CGK 733(CAS No.905973-89-9)，其为有效且选择性ATM激酶和ATR抑制剂，具有约200nM的IC50值。CGK 733具有结构：
Figure BDA0002946865180000393
KU-559403(Weber et al.(2015)Pharmacology&Therapeutics 149:124–138)。KU-55940具有结构：
Figure BDA0002946865180000401
AZD6738,其具有结构：
Figure BDA0002946865180000402
具有KU-55933衍生物所述特征的这些抑制剂的衍生物也可用于本发明，并且可使用与对KU-55933衍生物所述的方法相似的方法进行鉴定。
在优选实施方案中，p53抑制剂可以是皮斐松-α，环状皮斐松-α和对硝基皮斐松-α或其衍生物。皮斐松α具有以下结构：
Figure BDA0002946865180000403
siRNA，shRNA，miRNA和反义DNA/RNA
(对例如激酶的)抑制可使用转录后基因沉默(PTGS)来实现。由双链RNA(dsRNA)介导的转录后基因沉默是控制外源基因表达的保守细胞防御机制。认为诸如转座子或病毒的元件的随机整合导致dsRNA的表达，其激活同源单链mRNA或病毒基因组RNA的序列特异性降解。沉默作用被称为RNA干扰(RNAi)(Ralph et al.(2005)Nat.Medicine 11:429-433)。RNAi的机制涉及将长dsRNA加工成约21-25个核苷酸(nt)RNA的双链体。这些产物被称为小干扰或沉默RNA(siRNA)，它们是mRNA降解的序列特异性介体。在分化的哺乳动物细胞中，发现dsRNA>30bp可激活干扰素响应，从而导致蛋白质合成的关闭和非特异性mRNA降解(Starket al.(1998)Ann.Rev.Biochem.67:227-64)。然而，可通过使用21nt siRNA双链体来绕过这种响应(Elbashir et al.(2001)EMBO J.20:6877-88；Hutvagner et al.(2001)Science293:834-8)，允许在培养的哺乳动物细胞中进行基因功能分析。
shRNA由被小环序列分开的短的反向RNA重复序列组成。这些被细胞机械迅速加工成19-22nt siRNA，从而抑制靶基因表达。
微小RNA(miRNA)是小的非编码RNA(长度为22–25个核苷酸)，通过与靶mRNA 3'非翻译区(UTR)结合可有效减少靶mRNA的翻译。微小RNA是在生物体中自然产生的一大类小RNA，至少其中一些调节靶基因的表达。微小RNA家族的创始成员是let-7和lin-4。let-7基因编码小的、高度保守的RNA种类，其在蠕虫发育过程中调节内源蛋白编码基因的表达。将活性RNA种类最初转录为约70nt的前体，其被转录后加工为约21nt的成熟形式。let-7和lin-4均被转录为发夹RNA前体，其可通过Dicer酶加工为其成熟形式。
反义概念是将短的、可能经修饰的DNA或RNA分子与细胞中的信使RNA选择性结合，并阻止编码蛋白的合成。
用于设计siRNA、shRNA、miRNA和反义DNA/RNA来调节靶蛋白表达的方法和用于递送这些试剂至目标细胞的方法是本领域所熟知的。
显性负性肽(dominant negative peptide)
在优选实施方案中，p53活化抑制剂是突变p53肽。
在优选实施方案中，p53活化抑制剂是显性负性肽(如，显性负性p53肽)。
适当地，显性负性肽可包含位于同寡聚化结构域中的突变。适当地，包含位于同寡聚化结构域中的突变的显性负肽可与野生型p53二聚化并阻止野生型p53的激活转录。
在优选实施方案中，显性负性肽是GSE56或其变体。
在一个实施方案中，用于GSE56的mRNA翻译的核苷酸序列以SEQ ID No.8所示。
Figure BDA0002946865180000421
在一个实施方案中，GSE56的氨基酸序列以SEQ ID No.9所示。
Figure BDA0002946865180000422
适当地，p53活化抑制剂可以是编码GSE56的核苷酸序列。适当地，p53活化抑制剂可以是编码GSE56的氨基酸序列。适当地，p53活化抑制剂可以是GSE56 mRNA。
腺病毒蛋白
腺病毒是AAV感染的天然共辅助物且提供优化AAV感染的一组基因：E1a、E1b、E2a和E4。
本发明人已证明，基因编辑期间腺病毒蛋白的递送改善了HSC中HDR的效率，并增强了HSC的长期再定殖活性。不希望受到理论的束缚，腺病毒蛋白可在基因编辑过程中为AAV提供辅助功能。腺病毒蛋白可直接或间接作用于p53途径。
在一个实施方案中，促进同源定向DNA修复的试剂包含编码至少一种腺病毒蛋白的核酸序列。腺病毒蛋白不限于特定的腺病毒血清型。例如，在一个实施方案中，至少一种腺病毒蛋白来自血清型4的腺病毒，血清型5的腺病毒，血清型7的腺病毒和/或血清型9的腺病毒。
在一个实施方案中，至少一种腺病毒蛋白选自E1a、E1b、E2a和E4。
在优选实施方案中，至少一种腺病毒蛋白是E4基因的开放阅读框。
在优选实施方案中，至少一种腺病毒蛋白是E4orf1或其变体。
编码Ad5-E4orf1的核苷酸序列的实例以SEQ ID No.10所示。适当地，至少一种腺病毒蛋白可包含以SEQ ID No.10所示的用于mRNA翻译的核苷酸序列或其变体。
Figure BDA0002946865180000423
Ad5-E4orf1的氨基酸序列的实例以SEQ ID No.1所示。适当地，至少一种腺病毒蛋白可包含以SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或其变体。
Figure BDA0002946865180000431
E4orf1的氨基酸序列的其他实例以SEQ ID No.57至SEQ ID No.76所示。适当地，至少一种腺病毒蛋白可包含以SEQ ID No.57至SEQ ID No.76所示的氨基酸序列或其变体。
Figure BDA0002946865180000432
Figure BDA0002946865180000441
在优选实施方案中，至少一种腺病毒蛋白是E4orf6/7或其变体。
编码E4orf6/7的核苷酸序列的实例以SEQ ID No.11所示。适当地，至少一种腺病毒蛋白可包含以SEQ ID No.11所示的用于mRNA翻译的核苷酸序列或其变体。
Figure BDA0002946865180000451
E4orf6/7的氨基酸序列的实例以SEQ ID No.2所示。适当地，至少一种腺病毒蛋白可包含以SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或其变体。
Figure BDA0002946865180000452
E4orf6/7的氨基酸序列的其他实例以SEQ ID No.77至SEQ ID No.107所示。适当地，至少一种腺病毒蛋白可包含以SEQ ID No.77至SEQ ID No.107所示的氨基酸序列或其变体。
Figure BDA0002946865180000453
Figure BDA0002946865180000461
Figure BDA0002946865180000471
本文所述的SEQ ID NO的变体序列可与参考序列SEQ ID NO具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。优选地，变体序列保持参考序列的一种或多种功能(即，为功能性变体)。
变体序列可包含一个或多个保守取代。可基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似度来进行保守氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的无电荷极性头基团的氨基酸包括亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，甘氨酸，丙氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸。
保守取代如可根据下表进行。第二列同一区块中的氨基酸，优选第三列同一行中的氨基酸可彼此取代：
Figure BDA0002946865180000481
本发明还包括同源取代(在本文中使用取代和置换来表示存在的氨基酸残基与替代残基的互换)变体，即类似的取代，例如碱性取代碱性，酸性取代酸性，极性取代极性等。
除非本文通过提及具体的单个氨基酸另外明确指出，否则可使用如下所述的保守取代来取代氨基酸。
脂肪族非极性氨基酸可以是甘氨酸，丙氨酸，脯氨酸，异亮氨酸，亮氨酸或缬氨酸残基。
脂肪族极性不带电荷的氨基酸可以是半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，蛋氨酸，天冬酰胺或谷氨酰胺残基。
脂肪族极性带电荷的氨基酸可以是天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸或精氨酸残基。
芳香族氨基酸可以是组氨酸，苯丙氨酸，色氨酸或酪氨酸残基。
适当地，可在上表同一行中的氨基酸之间进行保守取代。
编码E4orf6的核苷酸序列的实例以SEQ ID No.12所示。
Figure BDA0002946865180000491
E4orf6的氨基酸序列的实例以SEQ ID No.13所示。
Figure BDA0002946865180000492
编码E1B55K的核苷酸序列的实例以SEQ ID No.14所示。
Figure BDA0002946865180000493
E1B55K的氨基酸序列的实例以SEQ ID No.15所示。
Figure BDA0002946865180000494
在一个实施方案中，至少一种腺病毒蛋白不是E4orf6。在一个实施方案中，至少一种腺病毒蛋白不是E1B55K。在一个实施方案中，至少一种腺病毒蛋白不包含E4orf6或E1B55K。
造血干细胞和祖细胞
干细胞能够分化为多种细胞类型。能够分化为所有细胞类型的细胞被称为全能的。在哺乳动物中，只有合子和早期胚胎细胞是全能的。在大多数(如果不是全部)多细胞生物中都发现了干细胞。它们的特征是能够通过有丝分裂的细胞分裂来更新自身，并分化为多种多样的一批特化的细胞类型。哺乳动物干细胞的两种主要类型是从胚泡的内细胞团中分离的胚胎干细胞，以及在成体组织中发现的成体干细胞。在发育的胚胎中，干细胞可分化为所有特化的胚胎组织。在成年生物体中，干细胞和祖细胞可充当身体的修复系统，补充特化的细胞，还可维持再生器官如血液、皮肤或肠道组织的正常运转。
造血干细胞(HSC)是可存在于例如外周血、骨髓和脐带血的多能干细胞。HSC能够自我更新并分化为任何血液细胞谱系。它们能够再定殖整个免疫系统和所有造血组织(如骨髓、脾脏和胸腺)中的红系和髓系。它们提供了造血细胞所有谱系的终生生产。
造血祖细胞具有分化为特定类型细胞的能力。然而，与干细胞相比，它们已更具特异性：它们被推进分化为“靶”细胞。干细胞与祖细胞之间的区别在于，干细胞可无限复制，而祖细胞只能分裂有限的次数。造血祖细胞只能通过体内功能测定(即，移植并证明它们是否能在延长的时间段内产生所有血液谱系)与HSC严格区分开。
本发明的造血干细胞和祖细胞包含CD34细胞表面标志物(表示为CD34+)。
在一个实施方案中，用于本发明的细胞是HSPC。
在一个实施方案中，用于本发明的细胞是原始HSPC。在一个实施方案中，HSPC的原始亚群是指CD90+的HSC群。在一个实施方案中，HSPC的原始亚群是指CD34+CD133+和CD90+的细胞群体。
在一个实施方案中，用于本发明的细胞是HSC。
造血干细胞和祖细胞(HSPC)来源
造血干细胞和/或祖细胞群体可获自组织样品。
例如，造血干细胞和/或祖细胞群体可获自外周血(如，成人和胎儿外周血)、脐带血、骨髓、肝脏或脾脏。优选地，这些细胞获自外周血或骨髓。它们可在体内通过生长因子处理动员细胞后获得。
可使用例如G-CSF、plerixaphor或其组合来进行动员。其他试剂如NSAID和二肽基肽酶抑制剂也可用作动员剂。
随着干细胞生长因子GM-CSF和G-CSF的可用性，现在使用从外周血而不是从骨髓收集的干细胞进行大多数造血干细胞移植程序。收集外周血干细胞提供更大的移植物，不需要对供体进行全身麻醉即可收集移植物，从而缩短了植入时间，并可提供较低的长期复发率。
骨髓可通过标准抽吸方法(稳态或动员后)或使用下一代收获工具(如MarrowMiner)来收集。
另外，造血干细胞和祖细胞也可源自诱导的多能干细胞。
HSC特征
通过流式细胞术程序，HSC通常具有低正向散射和侧向散射特征。如通过允许测定线粒体活性的若丹明标记所证明，有些是代谢静止的。HSC可包含某些细胞表面标志物，例如CD34、CD45、CD133、CD90和CD49f。它们还可定义为缺乏CD38和CD45RA细胞表面标志物表达的细胞。然而，这些标志物中的一些的表达取决于HSC的发育阶段和组织特异性情况。某些被称为“侧群细胞”的HSC排斥Hoechst 33342染料，如通过流式细胞术所检测的。因此，HSC具有允许对其进行鉴定和分离的描述性特征。
阴性标志物
CD38是人HSC最成熟有用的单阴性标志物。
人HSC对谱系标志物如CD2，CD3，CD14，CD16，CD19，CD20，CD24，CD36，CD56，CD66b，CD271和CD45RA也可以是阴性的。然而，这些标志物可能需要组合使用以富集HSC。
通过“阴性标志物”，应当理解为人HSC缺乏这些标志物的表达。
阳性标志物
CD34和CD133是HSC最有用的阳性标志物。
一些HSC对谱系标志物如CD90、CD49f和CD93也呈阳性。然而，这些标志物可能需要组合使用以富集HSC。
通过“阳性标志物”，应当理解为人HSC表达这些标志物。
在一个实施方案中，造血干细胞和祖细胞是CD34+CD38-细胞。
分化细胞
分化细胞是相比干细胞或祖细胞更加特化的细胞。分化发生在多细胞生物体的发育过程中，因为该生物体从单一合子变为组织和细胞类型的复杂系统。分化也是成体中的常见过程：成体干细胞在组织修复和正常细胞更新过程中分裂并产生完全分化的子代细胞。分化显著改变细胞的大小、形状、膜电位、代谢活性和对信号的响应性。这些变化很大程度上是由于基因表达中的高度控制的修饰。换句话说，分化细胞是具有特定结构并由于涉及特定基因的激活和脱激活的发育过程而执行某些功能的细胞。在此，分化细胞包括造血谱系的分化细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞、T细胞、B细胞和NK细胞。例如，通过检测在未分化细胞上不表达或表达程度较低的细胞表面分子，可将造血谱系的分化细胞与干细胞和祖细胞区分开。适当的人谱系标志物的实例包括CD33、CD13、CD14、CD15(髓系)、CD19、CD20、CD22、CD79a(B)、CD36、CD71、CD235a(红系)、CD2、CD3、CD4、CD8(T)和CD56(NK)。
在一个实施方案中，本文所指的造血细胞是T细胞。
细胞群体的分离和富集
如本文所用，术语细胞的“分离的群体”可指先前已从体内取出的细胞群体。细胞的分离的群体可使用本领域已知的标准技术离体或体外培养和操作。细胞的分离的群体可随后重新引入受试者。所述受试者可以是最初从其分离细胞的同一受试者或不同的受试者。
可针对表现出特定表型或特征的细胞和不表现出该表型或特征或者较小程度表现该表型或特征的其他细胞选择性地纯化细胞群体。例如，可从起始细胞群体中纯化表达特定标志物(如CD34)的细胞群体。可选择地或另外地，可纯化不表达另一标志物(如CD38)的细胞群体。
通过针对某种类型细胞“富集”细胞群体，应当理解，该类型细胞的浓度在群体中增加。其他类型细胞的浓度可能会随之降低。
纯化或富集会导致细胞群体基本上是纯的其他类型细胞。
纯化或富集表达特定标志物(如CD34或CD38)的细胞群体可通过使用结合该标志物，优选基本上特异性地结合该标志物的试剂来实现。
结合细胞标志物的试剂可以是抗体，例如抗CD34或抗CD38抗体。
术语“抗体”是指能够结合所选靶标的完全抗体或抗体片段，包括Fv、ScFv、F(ab')和F(ab')2、单克隆和多克隆抗体、工程化抗体包括嵌合抗体、CDR-移植抗体和人源化抗体，以及使用噬菌体展示或其他技术产生的人工选择的抗体。
另外，经典抗体的替代物也可用于本发明，例如“avibodies”，“avimers”，“anticalins”，“纳米抗体”和“DARPins”。
与特异性标志物结合的试剂可被标记，以便使用本领域已知的多种技术中的任何一种进行鉴定。该试剂可以被固有地标记，或可通过与其缀合标记物进行修饰。通过“缀合”，应当理解试剂和标记物是可操作地连接的。这意味着试剂和标记物以基本不受阻碍地执行其功能(例如结合标志物，允许荧光鉴定或置于磁场时允许分离)的方式连接在一起。适当的缀合方法是本领域所熟知的，并且本领域技术人员容易确定。
标记物可允许例如经标记的试剂和与其结合的任何细胞从其环境中纯化(例如试剂可用磁珠或亲和标签(如，亲合素)标记)、检测或这两者。适合用作标记物的可检测标志物包括荧光团(如，绿色、樱桃红、青色和橙色荧光蛋白)和肽标签(如His标签，Myc标签，FLAG标签和HA标签)。
许多分离表达特异性标志物的细胞群体的技术是本领域已知的。这些方法包括基于磁珠的分离技术(如，基于封闭循环磁珠的分离)，流式细胞术，荧光激活细胞分选(FACS)，亲和标签纯化(如，使用亲和柱或珠如生物素柱来分离亲合素标记的试剂)和基于显微术的技术。
还可使用不同技术的组合来进行分离，如基于磁珠的分离步骤，然后通过流式细胞术针对一种或多种其他(阳性或阴性)标志物来分选所得到的细胞群体。
例如，可使用
Figure BDA0002946865180000531
系统(Miltenyi)进行临床等级分离。这是基于封闭循环磁珠分离技术的实例。
还设想了可将染料排斥特性(如，侧群或若丹明标记)或酶活性(如，ALDH活性)用于富集造血干细胞。
适当地，与未经处理的基因编辑细胞群体相比，该试剂不减少基因编辑细胞群体中的CD34+CD133+CD90+细胞分数。
基因编辑
术语“基因编辑”是指在细胞中插入、缺失或置换核酸的基因工程类型。可使用工程化核酸酶来实现基因编辑，所述工程化核酸酶可靶向多核苷酸(如，基因组)中的期望位点。这类核酸酶可在期望位置形成位点特异性双链断裂，其然后可通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)进行修复，从而导致靶向突变。
这类核酸酶可使用病毒载体来递送至靶细胞。本发明提供了提高基因编辑过程效率的方法。
本领域已知的合适核酸酶的实例包括锌指核酸酶(ZFN)，转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)，以及成簇规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas系统(Gaj,T.et al.(2013)Trends Biotechnol.31:397-405；Sander,J.D.et al.(2014)Nat.Biotechnol.32:347-55)。
还可将大范围核酸酶(Silve,G.et al.(2011)Cur.Gene Ther.11:11-27)用作用于基因编辑的合适的核酸酶。
CRISPR/Cas系统是RNA引导的DNA结合系统(van der Oost et al.(2014)Nat.Rev.Microbiol.12:479-92)，其中可选择引导RNA(gRNA)以使Cas9域能够被靶向至特定序列。设计gRNA的方法是本领域已知的。此外，近来已开发出完全正交的Cas9蛋白以及Cas9/gRNA核糖核蛋白复合物和gRNA结构/组成修饰以结合不同蛋白，从而将不同的效应物域同时且定向靶向到细胞的期望基因组位点(Esvelt et al.(2013)Nat.Methods 10:1116-21；Zetsche,B.et al.(2015)Cell pii:S0092-8674(15)01200-3；Dahlman,J.E.etal.(2015)Nat.Biotechnol.2015Oct 5.doi:10.1038/nbt.3390.[印刷前电子出版]；Zalatan,J.G.et al.(2015)Cell 160:339-50；Paix,A.et al.(2015)Genetics 201:47-54)，并且适用于本发明。
载体
载体是允许或促进实体从一种环境转移到另一环境的工具。本发明中用于转导造血干细胞和/或祖细胞的载体是病毒载体。
优选地，病毒载体为病毒载体颗粒的形式。
例如，病毒载体可以是腺相关病毒(AAV)、腺病毒、逆转录病毒或慢病毒载体。优选地，病毒载体是AAV载体或逆转录病毒或慢病毒载体，更优选是AAV载体。优选地，逆转录病毒载体不是γ-逆转录病毒载体。
通过“源自某种类型病毒的载体”，应当理解，载体包含源自该类型病毒的至少一种组成部分。
腺相关病毒(AAV)载体
腺相关病毒(AAV)是用于本发明的有吸引力的载体系统，因为它具有很高的整合频率并且它可以感染未分裂的细胞。这使得它可用于在组织培养中将基因递送至哺乳动物细胞。
AAV具有广泛的感染宿主范围。关于AAV载体的产生和使用的细节描述于美国专利号5139941和美国专利号4797368。
重组AAV载体已成功用于标志物基因和涉及人类疾病的基因的体外和体内转导。
优选载体是能够在人原代细胞如HSPC细胞中实现高转导效率的载体。
在一个实施方案中，载体是AAV6载体或源自AAV6载体的载体。优选地，载体是AAV6载体。
腺病毒载体
腺病毒是不经历RNA中间体的双链线性DNA病毒。腺病毒有超过50种不同的人血清型，根据基因序列同源性，分为6个亚组。腺病毒的天然靶标是呼吸道和胃肠道上皮，通常仅引起轻度症状。血清型2和5(具有95％的序列同源性)最常用于腺病毒载体系统，通常与年轻人的上呼吸道感染有关。
腺病毒已用作基因疗法和表达异源基因的载体。大型(36kb)基因组最多可容纳8kb的外源插入DNA，并且能够在互补细胞系中高效复制，从而产生高达1012的极高滴度。因此，腺病毒是研究原代非复制型细胞中基因表达的最佳系统之一。
来自腺病毒基因组的病毒或外源基因的表达不需要复制细胞。腺病毒载体通过受体介导的内吞作用进入细胞。一旦在细胞内，腺病毒载体很少整合到宿主染色体。相反，它们作为宿主核中的线性基因组以附加体形式(独立于宿主基因组)起作用。因此，重组腺病毒的使用减轻了与随机整合到宿主基因组相关的问题。
逆转录病毒和慢病毒载体
逆转录病毒载体可源自或可衍生自任何合适的逆转录病毒。已鉴定出许多不同的逆转录病毒。实例包括鼠白血病病毒(MLV)，人T细胞白血病病毒(HTLV)，小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)，劳斯肉瘤病毒(RSV)，Fujinami肉瘤病毒(FuSV)，莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)，FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)，莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)，Abelson鼠白血病病毒(A-MLV)，禽骨髓细胞瘤病毒29(MC29)和禽成红细胞增多症病毒(AEV)。逆转录病毒的详细列表可参见Coffin,J.M.et al.(1997)Retroviruses,Cold Spring Harbour Laboratory Press,758-63。
逆转录病毒可大致分为两类，“简单”和“复杂”。逆转录病毒甚至可以进一步分为七组。这些组中的五组代表具有致癌潜力的逆转录病毒。其余两组是慢病毒和泡沫病毒。对这些逆转录病毒的综述参见Coffin,J.M.et al.(1997)Retroviruses,Cold SpringHarbour Laboratory Press,758-63。
逆转录病毒和慢病毒基因组的基本结构具有许多共同特征，例如5'LTR和3'LTR。在它们之间或之内的是使基因组能够被包装的包装信号、引物结合位点、实现整合到宿主细胞基因组中的整合位点、以及编码包装成分的gag、pol和env基因——这些是组装病毒颗粒所需要的多肽。慢病毒具有其他功能，例如HIV中的rev和RRE序列，它们能够使得将整合的原病毒RNA转录本有效地从细胞核输出到被感染的靶细胞的细胞质。
在原病毒中，这些基因的两端侧翼有被称为长末端重复序列(LTR)的区域。LTR负责原病毒的整合和转录。LTR还充当增强子-启动子序列，并可控制病毒基因的表达。
LTR本身是相同的序列，其可以分为三个元件：U3、R和U5。U3源自RNA3'端的特有序列。R源自RNA两端重复的序列。U5源自RNA 5'端的特有序列。在不同的逆转录病毒之间，这三个元件的大小可能会有很大差异。
在缺陷型逆转录病毒载体基因组中，gag、pol和env可以不存在或不起作用。
在典型的逆转录病毒载体中，可从病毒中除去复制必需的一个或多个蛋白编码区的至少一部分。这使病毒载体成为复制缺陷型。病毒基因组的部分也可用可操作地连接到载体基因组中的调节控制区和报告部分的编码候选调节部分的文库代替，以产生包含候选调节部分的载体，该载体能够转导靶宿主细胞和/或将其基因组整合到宿主基因组。
慢病毒载体是较大组逆转录病毒载体的一部分。慢病毒的详细列表可参见CCoffin,J.M.et al.(1997)Retroviruses,Cold Spring Harbour Laboratory Press,758-63。简而言之，慢病毒可分为灵长类和非灵长类。灵长类慢病毒的实例包括但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)、人获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的病原体；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类慢病毒的实例包括原型“慢病毒”visna/maedi病毒(VMV)、以及相关的山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、以及最近描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。
慢病毒家族与逆转录病毒家族的不同之处在于，慢病毒具有感染分裂细胞和非分裂细胞的能力(Lewis,P et al.(1992)EMBO J.11:3053-8；Lewis,P.F.et al.(1994)J.Virol.68:510-6)。相反地，其他逆转录病毒如MLV不能感染非分裂或缓慢分裂的细胞，例如组成肌肉、脑、肺和肝组织的细胞。
如本文所用，慢病毒载体是包含至少一个可源自慢病毒的组成部分的载体。优选地，该组成部分参与载体感染细胞，表达基因或复制的生物学机制。
慢病毒载体可以是“灵长类”载体。慢病毒载体可以是“非灵长类”载体(即源自并不主要感染灵长类，特别是人的病毒)。非灵长类慢病毒的实例可以是不天然感染灵长类的慢病毒科的任何成员。
作为基于慢病毒的载体的实例，下面描述基于HIV-1和HIV-2的载体。
HIV-1载体包含在简单逆转录病毒中也存在的顺式作用元件。已表明，延伸到gag开放阅读框中的序列对于包装HIV-1很重要。因此，HIV-1载体通常包含gag的相关部分，在该部分中翻译起始密码子已发生突变。此外，大多数HIV-1载体还含有包含RRE的env基因的部分。Rev结合RRE，该RRE允许全长或单剪接的mRNA从细胞核转运到细胞质。在没有Rev和/或RRE的情况下，全长HIV-1RNA积聚于细胞核。可选择地，可使用某些简单的逆转录病毒(如，Mason-Pfizer猴病毒)的组成型转运元件来缓解对Rev和RRE的需求。从HIV-1LTR启动子进行有效转录需要病毒蛋白Tat。
大多数基于HIV-2的载体在结构上与HIV-1载体非常相似。与基于HIV-1的载体相似，HIV-2载体也需要RRE来有效转运全长或单剪接的病毒RNA。
在一个系统中，载体和辅助构建体来自两种不同的病毒，并且降低的核苷酸同源性可以降低重组的可能性。除了基于灵长类慢病毒的载体外，还开发了基于FIV的载体作为源自病原性HIV-1基因组的载体的替代物。这些载体的结构也类似于基于HIV-1的载体。
优选地，用于本发明的病毒载体具有最小的病毒基因组。
通过“最小病毒基因组”，应当理解，病毒载体已被操纵以便去除非必需元件并保留必需元件，从而提供对靶宿主细胞进行感染、转导和递送目标核苷酸序列所需的功能。该策略的更多细节可参见WO 1998/017815。
优选地，用于在宿主细胞/包装细胞内产生病毒基因组的质粒载体将具有足够的慢病毒遗传信息，以允许在包装成分存在的情况下将RNA基因组包装到能够感染靶细胞但不能独立复制的病毒颗粒中，以在最终的靶细胞内产生感染性病毒颗粒。优选地，载体缺乏功能性gag-pol和/或env基因和/或其他复制必需的基因。
然而，用于在宿主细胞/包装细胞内产生病毒基因组的质粒载体还将包括与慢病毒基因组可操作地连接以指导宿主细胞/包装细胞中基因组转录的转录调控序列。这些调节序列可以是与转录的病毒序列相关的天然序列(即5’U3区)，或者它们可以是异源启动子，如另一种病毒启动子(如，CMV启动子)。
载体可以是自失活(SIN)载体，其中病毒增强子和启动子序列已被删除。可产生SIN载体并在体内转导未分裂细胞，其功效与野生型载体相似。SIN前病毒中长末端重复序列(LTR)的转录失活应当阻止具有复制能力的病毒的动员。这还应当通过消除LTR的任何顺式作用来实现内部启动子调控的基因表达。
载体可能是整合缺陷的。整合缺陷型慢病毒载体(IDLV)可通过以下方式产生：例如，通过将载体与无催化活性的整合酶包装在一起(如，在催化位点带有D64V突变的HIV整合酶；Naldini,L.et al.(1996)Science 272:263-7；Naldini,L.et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:11382-8；Leavitt,A.D.et al.(1996)J.Virol.70:721-8)或通过修饰或缺失来自载体LTR的必需att序列(Nightingale,S.J.et al.(2006)Mol.Ther.13:1121-32)，或通过上述方法的组合。
在一个实施方案中，基因编辑靶向造血干细胞和/或祖细胞基因座。在一个实施方案中，供体模板靶向造血干细胞和/或祖细胞基因座。
在一个实施方案中，基因编辑靶向腺相关病毒整合位点1(AAVS1)基因座。在一个实施方案中，供体模板靶向腺相关病毒整合位点1(AAVS1)基因座。
AAVS1的AAV供体盒的实例可包含以下核苷酸序列：3’-ITR
Figure BDA0002946865180000581
同源臂-左侧
Figure BDA0002946865180000591
hPGK启动子(无SA)
Figure BDA0002946865180000592
eGFP
Figure BDA0002946865180000593
bGH-pA
Figure BDA0002946865180000594
同源臂-右侧
Figure BDA0002946865180000595
5’-ITR
Figure BDA0002946865180000596
在另一个实施方案中，基因编辑靶向白细胞介素2受体亚基γ(IL2RG)，优选靶向IL2RG的内含子1。在另一个实施方案中，供体模板靶向白细胞介素2受体亚基γ(IL2RG)，优选靶向IL2RG的内含子1。
IL2RG的AAV供体盒的实例可包含以下核苷酸序列：3’-ITR
Figure BDA0002946865180000601
同源臂-左侧
Figure BDA0002946865180000602
外显子2
Figure BDA0002946865180000603
外显子3
Figure BDA0002946865180000604
外显子4
Figure BDA0002946865180000605
外显子5
Figure BDA0002946865180000606
外显子6
Figure BDA0002946865180000607
外显子7
Figure BDA0002946865180000608
外显子8
Figure BDA0002946865180000609
3’-UTR
Figure BDA0002946865180000611
bGH-pA
Figure BDA0002946865180000612
hPGK启动子
Figure BDA0002946865180000613
eGFP
Figure BDA0002946865180000614
SV40-pA
Figure BDA0002946865180000615
同源臂-右侧
Figure BDA0002946865180000616
5’-ITR
Figure BDA0002946865180000617
在另一个实施方案中，基因编辑靶向CD40L。在另一个实施方案中，供体模板靶向CD40L。
在另一个实施方案中，基因编辑靶向RAG-1。在另一个实施方案中，供体模板靶向RAG-1。
目标核苷酸
用于本发明的载体优选包含一个或多个目标核苷酸。
优选地，目标核苷酸产生治疗作用。
适当地，用于本发明的一种或多种NOI可选自：引导RNA，编码Cas9核糖核蛋白的核苷酸，编码一种或多种腺病毒蛋白的核苷酸序列，编码促进同源定向DNA修复的试剂的核苷酸序列(如，p53活化抑制剂或编码一种或多种腺病毒蛋白的核苷酸序列)。
合适的NOI包括但不限于编码以下的序列：酶，细胞因子，趋化因子，激素，抗体，抗氧化剂分子，工程化免疫球蛋白样分子，单链抗体，融合蛋白，免疫共刺激分子，免疫调节分子，反义RNA，微小RNA，shRNA，siRNA，引导RNA(gRNA，例如与CRISPR/Cas系统结合使用)，核酶，miRNA靶序列，靶蛋白的跨域负突变体，毒素，条件毒素，抗原，肿瘤抑制因子蛋白，生长因子，转录因子，膜蛋白，表面受体，抗癌分子，血管活性蛋白和肽，抗病毒蛋白和核酶及其衍生物(例如具有相关报告基团的衍生物)。NOI也可编码前药活化酶。优选地，NOI是引导RNA(gRNA)。
药物组合物
在一个实施方案中，本发明的细胞可以与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起配制用于施用于受试者。合适的载体和稀释剂包括等张盐溶液，例如磷酸盐缓冲盐水，并潜在含有人血清白蛋白。
细胞疗法产品的操作优选按照FACT-JACIE国际细胞疗法标准进行。
造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞移植
本发明提供了根据本发明的方法制备的造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体，其在疗法中使用，如在基因疗法中使用。
该用途可作为细胞移植程序的一部分，例如造血干细胞移植程序。
造血干细胞移植(HSCT)是源自骨髓(在这种情况下被称为骨髓移植)或血液的血液干细胞的移植。干细胞移植是血液学和肿瘤学领域的医疗程序，通常是针对患有血液或骨髓疾病或某些类型癌症的人进行的。
HSCT的许多接受者是多发性骨髓瘤或白血病患者，他们无法受益于长期化学疗法治疗或已对化学疗法产生抗性。HSCT的候选者包括儿科病例，其中患者患有先天缺陷(如，严重的联合免疫缺陷或伴有缺陷型干细胞的先天性中性粒细胞减少症)，以及还有那些在出生后失去干细胞的再生障碍性贫血的儿童或成人。用干细胞移植物治疗的其他病症包括镰状细胞病，骨髓增生异常综合征，神经母细胞瘤，淋巴瘤，尤因肉瘤，纤维组织增生性小圆细胞肿瘤(Desmoplastic small round cell tumour)和霍奇金氏病。最近，已开发出非清髓性或所谓“微型移植”程序，其需要较小剂量的术前化疗和放疗。这使HSCT可在老年人和在其他情况下会认为太虚弱而无法承受常规治疗方案的其他患者中进行。
在一个实施方案中，将根据本发明方法制备的造血干细胞群体作为自体干细胞移植程序的一部分施用。
在另一个实施方案中，将根据本发明方法制备的造血干细胞群体作为同种异体干细胞移植程序的一部分施用。
如本文所用，术语“自体干细胞移植程序”是指如下的程序，其中起始细胞群体(其接着根据本发明的方法进行转导)获自与施用经转导的细胞群体相同的受试者。自体移植程序是有利的，因为它们避免了与免疫学不相容性相关的问题，并且无论基因匹配的供体的可用性如何都可用于受试者。
如本文所用，术语“同种异体干细胞移植程序”是指如下的程序，其中起始细胞群体(其接着根据本发明的方法进行转导)获自与接受经转导的细胞群体施用的受试者不同的受试者。优选地，供体与接受细胞施用的受试者是遗传匹配的，以使免疫学不相容的风险最小化。
经转导的细胞群体的合适剂量使得达到在治疗和/或预防上有效。待施用的剂量可取决于受试者和待治疗的状况，并且可以由技术人员容易地确定。
造血祖细胞提供短期植入。因此，通过施用经转导的造血祖细胞进行基因疗法将在受试者中提供非永久性作用。例如，作用可限于施用经转导的造血祖细胞后的1-6个月。
此类造血祖细胞基因疗法可适合于治疗获得性病症，例如癌症，其中目标(潜在毒性)抗癌核苷酸的时间限制性表达可能足以根除该疾病。
本发明可用于治疗WO 1998/005635中列出的病症。为了便于参考，现在提供该列表的一部分：癌症，炎症或炎性疾病，皮肤病，发烧，心血管效应，出血，凝固和急性期反应，恶病质，厌食，急性感染，HIV感染，休克状态，移植物抗宿主反应，自身免疫性疾病，再灌注损伤，脑膜炎，偏头痛和阿司匹林依赖性抗血栓形成；肿瘤生长，侵入和扩散，血管生成，转移，恶性，腹水和恶性胸腔积液；脑缺血，缺血性心脏病，骨关节炎，类风湿性关节炎，骨质疏松症，哮喘，多发性硬化症，神经变性，阿尔茨海默氏病，动脉粥样硬化，中风，血管炎，克罗恩病和溃疡性结肠炎；牙周炎，牙龈炎；银屑病，特应性皮炎，慢性溃疡，大疱性表皮松解；角膜溃疡，视网膜病变和手术伤口愈合；鼻炎，变应性结膜炎，湿疹，过敏反应；再狭窄，充血性心力衰竭，子宫内膜异位，动脉粥样硬化或内硬化(endosclerosis)。
另外或可选择地，本发明可用于治疗WO 1998/007859中列出的疾病。为了便于参考，现在提供该列表的一部分：细胞因子和细胞增殖/分化活性；免疫抑制或免疫刺激活性(如用于治疗免疫缺陷，包括感染人免疫缺陷病毒；调节淋巴细胞的生长；治疗癌症和许多自身免疫性疾病，以及防止移植排斥或诱导肿瘤免疫)；调节造血，例如髓系或淋巴样疾病的治疗；促进骨骼、软骨、肌腱、韧带和神经组织的生长，例如用于伤口愈合，烧伤、溃疡和牙周疾病以及神经变性的治疗；抑制或激活促卵泡激素(调节生育力)；趋化/化学增活活性(如用于将特定细胞类型动员至损伤或感染部位)；止血和溶栓活性(如用于治疗血友病和中风)；抗炎活性(用于治疗例如败血性休克或克罗恩病)；作为抗微生物剂；例如代谢或行为的调节剂；作为镇痛药；治疗特定的缺乏病症；在治疗例如银屑病中，在人或兽医学中。
另外或可选择地，本发明可用于治疗WO 1998/009985中列出的疾病。为了便于参考，现在提供该列表的一部分：巨噬细胞抑制和/或T细胞抑制活性，由此抗炎活性；抗免疫活性，即对细胞和/或体液免疫应答的抑制作用，包括与炎症无关的应答；抑制巨噬细胞和T细胞粘附细胞外基质成分和纤连蛋白的能力，以及上调T细胞受体表达；抑制不需要的免疫反应和炎症，包括关节炎，包括类风湿性关节炎，与超敏反应、变应性反应、哮喘、系统性红斑狼疮、胶原蛋白疾病和其他自身免疫性疾病相关的炎症，与动脉粥样硬化、动脉硬化、动脉粥样硬化性心脏病、再灌注损伤、心脏骤停、心肌梗死、血管炎性疾病、呼吸窘迫综合征或其他心肺疾病相关的炎症，与消化性溃疡、溃疡性结肠炎和其他胃肠道疾病相关的炎症，肝纤维化，肝硬化或其他肝病，甲状腺炎或其他腺体疾病，肾小球肾炎或其他肾脏和泌尿科疾病，中耳炎或其他耳鼻喉科疾病，皮炎或其他皮肤疾病，牙周疾病或其他牙科疾病，睾丸炎或附睾睾丸炎(epididimo-orchitis)，不育/不孕(infertility)，睾丸外伤(orchidaltrauma)或其他与免疫有关的睾丸疾病，胎盘功能障碍，胎盘功能不全，习惯性流产，子痫，先兆子痫和其他与免疫和/或炎症相关的妇科疾病，后葡萄膜炎，中间葡萄膜炎，前葡萄膜炎，结膜炎，脉络膜视网膜炎，葡萄膜视网膜炎，视神经炎，眼内炎症，例如视网膜炎或囊样黄斑水肿，交感性眼炎，巩膜炎，色素性视网膜炎，变性基底疾病的免疫和炎性成分，眼外伤的炎性成分，感染引起的眼部炎症，增生性玻璃体-视网膜病变，急性缺血性视神经病变，过度瘢痕形成，例如青光眼滤过手术后，针对眼植入物的免疫和/或炎症反应和其他与免疫和炎性相关的眼科疾病，与自身免疫性疾病或状况或病症相关的炎症，其中中枢神经系统(CNS)或任何其他器官两者中免疫和/或炎症抑制将是有益的，帕金森氏病，来自帕金森氏病治疗的并发症和/或副作用，AIDS相关的痴呆复合征HIV相关性脑病，德维克(Devic)病，西德纳姆舞蹈病(Sydenham chorea)，阿尔茨海默氏病和CNS的其他变性性疾病、状况或病症，中风的炎症部分，脊髓灰质炎后综合征，精神疾病的免疫和炎症部分，脊髓炎，脑炎，亚急性硬化性全脑炎，脑脊髓炎，急性神经病，亚急性神经病，慢性神经病，Guillaim-Barre综合征，Sydenham chora，重症肌无力，假性脑肿瘤，唐氏综合症，亨廷顿病，肌萎缩性侧索硬化，CNS受压或CNS创伤或CNS感染的炎性部分，肌肉萎缩和营养不良的炎性部分以及与中枢神经系统和周围神经系统的免疫和炎性相关的疾病、状况或病症，创伤后炎症，败血性休克，传染病，手术的炎症并发症或副作用，骨髓移植或其他移植并发症和/或副作用，炎症和/或免疫并发症以及基因疗法的副作用，例如由于感染病毒载体或与AIDS有关的炎症，由于阻抑或抑制体液和/或细胞免疫应答，由于治疗或改善单核细胞或白细胞增生性疾病，例如白血病，通过减少单核细胞或淋巴细胞的数量，用于预防和/或治疗天然或人工细胞、组织和器官(例如角膜，骨髓，器官，晶状体，起搏器，天然或人工皮肤组织)情况下的移植排斥。
另外或可选择地，本发明可用于治疗β地中海贫血，慢性肉芽肿性疾病，异染性脑白质营养不良，粘多糖贮积症和其他溶酶体贮积症。
试剂盒
一方面，本发明提供了试剂盒，其包含本发明的促进同源定向DNA修复的试剂和/或细胞群体。
另一方面，本发明提供了试剂盒，其包含促进同源定向DNA修复的试剂，编码基因编辑机械的一个或多个核苷酸序列，以及用于选择造血干细胞的工具(means)。
促进同源定向DNA修复的试剂和/或细胞群体可在合适的容器中提供。
适当地，试剂盒可包含p53活化抑制剂。
适当地，试剂盒可包含编码至少一种腺病毒蛋白的核酸序列。
试剂盒还可包含使用说明。
治疗方法
应当理解，本文中对治疗的所有提及均包括但不限于治愈、缓解和预防性治疗。尽管在本发明的上下文中提及预防与预防性治疗更相关。在一个实施方案中，优选治疗哺乳动物，特别是人。人和兽医治疗均在本发明范围内。
技术人员将理解，在不脱离所公开的本发明范围的情况下，他们可以组合本文所公开的本发明的所有特征。
施用
尽管在本发明中用途的试剂(特别是通过本发明的方法产生的细胞群体)可以单独施用，但是它们通常与药物载体、赋形剂或稀释剂混合施用，特别是用于人类疗法。
剂量
技术人员可以容易地确定施用于受试者的本发明试剂之一的适当剂量，而无需过度的实验。通常，内科医生会确定最适合单个患者的实际剂量，这取决于多种因素，包括所用特定药物的活性，该药物的代谢稳定性和长度，年龄，体重，总体健康，性别，饮食，施用方式和时间，排泄率，药物组合，特定病症的严重程度以及经历疗法的个体。当然，在个别情况下，更高或更低的剂量范围是值得的，并且这也在本发明的范围之内。
受试者
“受试者”是指人或非人类动物。
非人类动物的实例包括脊椎动物，例如哺乳动物，如非人类灵长类动物(特别是高等灵长类动物)，狗，啮齿动物(如小鼠、大鼠或豚鼠)，猪和猫。非人类动物可以是伴侣动物。
优选地，受试者是人。
现在将通过非限制性实施例描述本发明的优选特征和实施方案。
除非另有说明，否则本发明的实施将采用化学，生物化学，分子生物学，微生物学和免疫学的常规技术，它们在本领域普通技术人员的能力范围内。这些技术在文献中有解释。参见，例如，Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel,F.M.et al.(1995and periodic supplements)Current Protocols in MolecularBiology,Ch.9,13and 16,John Wiley&Sons；Roe,B.,Crabtree,J.and Kahn,A.(1996)DNAIsolation and Sequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons；Polak,J.M.andMcGee,J.O’D.(1990)In Situ Hybridization:Principles and Practice,OxfordUniversity Press；Gait,M.J.(1984)Oligonucleotide Synthesis:A PracticalApproach,IRL Press；and Lilley,D.M.and Dahlberg,J.E.(1992)Methods inEnzymology:DNA Structures Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNA,Academic Press。这些通用教科书中的每一个均通过引用并入本文。
实施例
实施例1：p53活化抑制剂
材料与方法
载体和核酸酶
从含有AAV2反向末端重复序列的构建体生成用于HDR的AAV6供体模板，通过三重转染法生产并通过在氯化铯梯度上超速离心进行纯化，如先前所述(J.Wang etal.2015Nat Biotechnol 33,1256-1263)。先前报告了设计具有AAVS1基因座(编码PGK.GFP报告物盒)或靶向IL2RG内含子1(编码IL2RG校正cDNA，接着是PGK.GFP报告物盒)的同源性的AAV6供体模板(G.Schiroli et al.2017Sci Transl Med 9)。
gRNA的序列使用在线CRISPR设计工具(P.D.Hsu et al.2013DNA targetingspecificity of RNA-guided Cas9 nucleases.Nat Biotechnol 31,827-832)设计，并针对预测的特异性得分和中靶活性进行选择。由gRNA识别的基因组序列在下表中指出。核糖核蛋白(RNP)通过在25℃以1:1.5摩尔比的s.p.Cas9蛋白(Aldevron)与合成的cr:tracrRNA(Integrated DNA Technologies)温育10分钟来组装。根据制造商说明书，在电穿孔之前添加电穿孔增强剂(Integrated DNA Technologies)。
gRNA的序列报道如下。
Figure BDA0002946865180000681
从用于mRNA体外转录的pVax质粒中表达GSE56.WPRE的慢病毒克隆GSE56.WPRE构建体，所述pVax质粒包含T7启动子、β-球蛋白3’UTR和64bp-polyA。
人CD34+细胞的基因编辑
在获得知情同意并经Ospedale San Raffaele生物伦理委员会批准后，从人CB中新鲜纯化CD34+细胞，或从Lonza购买冷冻CD34+细胞。根据先前优化方案(Schiroli etal.2017，同上)对CD34+细胞进行编辑。
简而言之，在补充有青霉素、链霉素、谷氨酰胺、1μM SR-1(Biovision)、50μMUM171(STEMCell Technologies)、仅在培养开始时加入的10μM PGE2(Cayman)和人早期作用细胞因子(SCF 100ng/ml，Flt3-L 100ng/ml，TPO20ng/ml和IL-6 20ng/ml；均购自Peprotech)的无血清StemSpan培养基(StemCell Technologies)中刺激5x105个CD34+细胞/ml。预刺激3天后，细胞用PBS洗涤，并使用P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X试剂盒和程序EO-100(Lonza)进行电穿孔。细胞用2.5-1.25μM RNP进行电穿孔。
电穿孔后15’，以1-2x104 vg/细胞的剂量进行AAV6转导。以150μg/ml指定剂量使用GSE56 mRNA。如先前所述(Schiroli et al.2017，同上)，通过测量表达GFP标志物的细胞百分比的流式细胞术或通过在载体序列与靶定基因座之间的连接处和用作标准化物(normalizer)的对照序列上设计引物和探针的液滴数字PCR分析，测量电穿孔后3天体外培养细胞的基因编辑效率。
NSG小鼠中的CD34+HSPC异种移植研究
NOD-SCID-IL2Rg-/-(NSG)小鼠购自Jackson Laboratory，并保持在无特定病原体(SPF)条件下。涉及动物的程序在San Raffaele医院动物护理和使用委员会(IACUC#749)的批准下设计和执行，并已根据意大利法律告知卫生部和地方当局。
对于移植，在亚致死性辐射(150-180cGy)后，将培养第5天为了编辑而处理的3x105个CD34+细胞经静脉内注射至NSG小鼠。样品大小由可用的处理细胞的总数量确定。将小鼠随机归入各个实验组。通过从小鼠尾部连续采血来监测人CD45+细胞的植入和基因编辑细胞的存在，并在实验结束时(移植后>20周)，收获并分析BM和脾脏。
分子分析
对于分子分析，根据可用的细胞数量，使用DNeasy Blood&Tissue试剂盒或QIAampDNA微型试剂盒(QIAGEN)分离基因组DNA。核酸酶活性(IL2RG内含子1，AAVS1)通过错配敏感的内切核酸酶测定法测量，通过靶定基因座的基于PCR的扩增，然后用T7内切核酸酶I(NEB)按照制造商说明书进行消化进行。在LabChip GX Touch HT(Perkin Elmer)上按照制造商说明书通过毛细管电泳对消化的DNA片段进行解析和定量。
对于液滴数字PCR分析，使用QX200微滴数字PCR系统(Biorad)根据制造商说明书一式两份分析5-50ng的基因组DNA。
对于HDR ddPCR，在载体序列和靶定基因座之间的连接处和用于标准化的对照序列(人TTC5基因)上设计引物和探针。退火和延伸的热条件针对每种特定应用进行了如下调整：AAVS1/内含子1IL2RG HDR 3'整合连接ddPCR：55℃30sec，72℃2min。用于PCR和ddPCR扩增的引物和探针如下所示。
Figure BDA0002946865180000691
Figure BDA0002946865180000701
为了进行基因表达分析，使用RNeasy Plus微型试剂盒(QIAGEN)提取总RNA。cDNA用SuperScript VILO IV cDNA合成试剂盒(Invitrogen)合成，并用于使用TaqMan基因表达测定法(Applied Biosystems)在Viia7实时PCR热循环仪中进行Q-PCR，相对于作为标准化物的CDKN1A，RPS27L，PHLDA3，APOBEC3H以及HPRT进行定位。首先将每个基因的相对表达相对于HPRT表达标准化，然后表示为相对于模拟处理样品的倍数变化。
流式细胞术
对于免疫表型分析(在FACSCanto II；BD Pharmingen上进行)，我们使用了以下列出的抗体。单染色和Fluorescence Minus One染色的细胞用作对照。样品制备物中包含LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain试剂盒(Thermo Fisher)，7-氨基放线菌素(SigmaAldrich)以根据制造商说明书进行流式细胞术，以从分析中排除死细胞。细胞分选使用MoFlo XDP细胞分选仪(Beckman Coulter)或FACSAria Fusion(BD Biosciences)进行。
Figure BDA0002946865180000702
Figure BDA0002946865180000711
单细胞RNA测序和分析
使用Chromium Single Cell 3’试剂盒v2根据制造商说明书，在ChromiumSingle-Cell Controller(10X Genomics)上进行基于液滴的数字3’端scRNA-Seq。编辑处理后24小时，根据CD34+CD133+CD90+和CD34+CD133+CD90-的表面表达分选CD34+细胞；用台盼蓝溶液0.4％(Gibco)计数活细胞，并将5200个活细胞(来自每个群体的2700个)用于后续程序(估计回收率：3000个细胞/样品)。简而言之，将单细胞在乳液中的凝胶珠(Gel Beadsin Emulsion，GEM)中分开并裂解，然后进行RNA条形码编码、反转录和PCR扩增(12-14个循环，根据可用的cDNA数量)。scRNA-Seq文库根据制造商说明书制备，并在LabChip GX TouchHT(Perkin Elmer)和Qubit 3.0(Invitrogen)仪器上进行检查和定量。使用NextSeq 500/550High Output v2试剂盒在NextSeq 500仪(Illumina)上进行测序(75个循环)。
Fastq文件利用使用默认参数的Cell Ranger(v.1.3,https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger)处理。将读段与参考基因组hg19进行比对。
读段处理：用Seurat(v 2.3.1，http：//satijalab.org/seurat/)处理基因计数。弃去表达少于200个独特基因的细胞和在少于3个细胞/样品中表达的基因。计数使用具有默认参数的Seurat函数NormalizeData进行标准化。排除平均表达低于0.01的基因。还排除具有线粒体相对于内源基因表达的比率超过0.15的细胞。表达数据然后使用ScaleData函数进行缩放，对S和G2M得分之间的差异进行回归。细胞周期评分使用CellCycleScoring函数计算。然后对所有样品进行多集典型相关分析(Multi-Set Canonical CorrelationAnalysis,mCCA)(A.Butler et al.2018Nat Biotechnol 36,411-420)。对于mCCA计算，将在培养的CD34+CB衍生的原始细胞和定型细胞之间差异表达的基因列表(I.Fares etal.2017Blood 129,3344-3351)用作输入，并比对前20个维度(dimension)。
差异表达分析：使用MAST检验(G.Finak et al.2015Genome Biol 16,278)和Bonferroni校正，利用FindMarkers函数鉴定在不同条件间差异表达的基因。计算avglogFC，添加到取平均的伪计数表达值0.001，并且仅考虑在至少一个样品中至少1％的细胞中表达的基因。然后使用EnrichR(http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/)对这些基因集进行基因本体论富集分析。
结果
HSPC的基因编辑导致p53相关转录响应的脱调节(deregulation)
为了以无偏见方式剖析基因编辑程序对人HSPC的影响，我们在编辑程序后24小时的时间点对富含CD133和CD90表面标志物的原始HSPC群体进行了单细胞(sc)RNA-Seq(图1A)。
使用基于液滴的方法(G.X.Zhenget al.2017 Nat Commun 8,14049)，我们从用对IL2RG特异的RNP和AAV6作为HDR的DNA模板处理或者模拟处理作为阴性对照的细胞中生成了scRNA-Seq数据。通过对发现在编辑细胞和对照细胞之间差异表达的基因进行途径分析，最富集的途径与p53转录活性有关(图1B-C)。这种p53相关转录响应在由核酸酶诱导的DNADSB后被轻度触发，并且主要与用AAV6载体的转导有关，有报告它们广泛地与宿主细胞DDR机制相互作用(M Fragkos et al.2009 Mol Cell Biol 29,2828-2840)，如通过编辑程序后不久p21表达的诱导所测量的(图1D)。
皮斐松-α或其衍生物对p53的瞬时抑制改善HDR效率并增加原始细胞区室中的基因编辑
由于我们显示经编辑的HSPC中最为脱调节的基因显著会聚到DDR中，且特别会聚到p53信号传导途径中，因而我们进一步研究了该响应对基因编辑细胞中HSPC自我更新、存活和DNA修复选择的功能后果。
因此，我们通过添加皮斐松-α或衍生物(环状皮斐松-α和对硝基皮斐松-α)，报告为抑制p53介导的凋亡和p53依赖性基因转录的分子(P.G.Komarov et al.1999 Science285,1733-1737和K.I.Lenova et al.2010Cell Cycle 9,1434-1443)来测试瞬时p53抑制(图2A)。通过在基因编辑方案中病毒转导前一天添加这些分子，我们能够测量用所有三种化合物的HDR效率增加(图2B)。对于进一步的实验，我们选择具有最低细胞毒性的环状皮斐松-α化合物，并显示在最原始CD34+CD133+CD90+细胞区室(它们基本被赋予了最高p53转录活性(V.Pant et al.2012Blood 120,5118-5127))中基因编辑和通过NHEJ的DNA修复增加两倍，可能是由于编辑细胞的存活率更高(图2C)。
显性负性肽的瞬时p53抑制促进HDR响应，并导致原始子集的扩增而不影响细胞分化
在电穿孔程序期间，我们通过显性负性肽(GSE56)的mRNA过表达来瞬时抑制p53转录活性(M.Milyavsky et al.2010Cell stem cell 7,186-197)(图3A)。
通过添加GSE56，我们能够降低p53依赖性转录响应的幅度，如通过发现通过基因编辑程序高度上调的一些下游靶基因的表达水平所测量的(图3B)。这种处理不负面影响DNA修复的整体效率，并且在靶定基因座处促进HDR介导的整合(图3C，左图)，特别是在最原始细胞区室中(CD34+133+90+级份中的平均值42％；图3D，右图)，与p53介导的DNA修复选择控制一致(23)。用GSE56处理的HSPC显示更高的扩增(图3D)，与细胞周期抑制剂的诱导减少相容，并且相比未经处理的对照，编辑后3天在编辑细胞中测量的造血群体的相对组成没有变化(图3E)，表明原始细胞的有效增殖而未明显诱导分化。在CFU-C测定中接种分选的群体后，红系和髓系克隆形成输出增加，特别是在CD90+级分中(图3F)，表明最原始子集的扩增潜力增加，而不影响处理细胞的细胞分化。
免疫缺陷NSG小鼠中用GSE56处理的编辑细胞显示增加的植入而无偏移分化
然后，我们将编辑细胞移植到免疫缺陷NSG小鼠中，这代表了长期再定殖HSC的替代测定(图4A)。用GSE56处理的编辑细胞显示增强的植入(图4B)，而分化输出没有任何偏移(图4C)。令人感兴趣的是，如先前报道(Schiroli et al.2017同上和S.S.De Ravin2017Science translational medicine 9)，虽然在用常规方案编辑的细胞移植的小鼠中HDR编辑细胞的分数随时间略有下降，但是通过瞬时p53抑制，其长期保持稳定，移植后22周在PB中的平均值达32％(图4D)。
总之，这些结果表明p53依赖的转录响应有助于降低基因编辑细胞的再定殖能力，并且其瞬时减少可有助于更好地保留最原始HSPC区室的长期功能。
实施例2：腺病毒蛋白
材料与方法
载体
在HEK293-T细胞系中，通过三重转染携带以缺失的AAV-ITR、Rep2和Cap6蛋白编码序列和腺病毒辅助基因为框架的目标盒的质粒来产生AVV储备液。48小时后收集转染的细胞，并用氯化铯梯度纯化(Wang,J.et al.(2015)Nat Biotechnol 33:1256-1263)。通过AAV基因组的qPCR确定病毒储备液的滴度(vg/ml)。先前报道了AAV-6供体模板的设计，包括AAVS1基因座(编码PGK-GFP报告物盒)或IL2RG基因座内的内含子1(编码IL2RG校正cDNA，然后是PGK-GFP报告物盒)的同源序列(Schiroli,G.et al.(2017)Sci Transl Med 9和Schiroli,G.2019 Celle stem cell)。
通过将简并序列在聚腺苷酸化序列下游亚克隆到先前报道的AAVS1AAV6转移载体质粒中，获得靶向AAVS1基因座的带条形码的AAV6供体模板。简而言之，从Sigma Aldrich获得嵌入侧翼有独特克隆限制位点(Bsu36I和SphI)的随机序列的ssODN。设计简并区以避免由克隆限制酶的任何不期望的切割。为了产生互补链，使用适当的正向和反向引物根据制造商说明书，利用Easy-A高保真酶(Agilent Technologies)进行10个PCR循环扩增50pmol的ssODN。扩增产物用MinElute PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化，用限制性酶消化并通过毛细管电泳检查。通过将制造商的方案放大，使用T4 DNA连接酶(NEB)将2ug的Bsu36I/SphI消化的AAVS1 HDR供体模板与消化的插入片段(摩尔比为1:7)连接。最后，XL-10Gold超级感受态细胞(Agilent Technologies)用连接产物转化，铺板并于30℃温育12小时，以最小化重组风险。将克隆刮下、混合、在LB培养基中再培养6个小时，并根据制造商说明书用NucleoBondXtra MaxiPrep处理。最终，用限制性酶筛选质粒制备物的ITR和质粒完整性。
核酸酶
使用在线CRISPR设计工具(Hsu,P.D.et al.(2013)Nat Biotechnol 31:827-832)设计gRNA的序列，并针对预测的特异性得分和中靶活性进行选择。下表中指示被gRNA识别的基因组序列。通过将SpCas9蛋白(Aldevron)与合成的cr:tracrRNA(Integrated DNATechnologies)以1:1.5摩尔比温育至少10分钟来组装核糖核蛋白(RNP)。根据制造商说明书，在电穿孔之前添加电穿孔增强剂(Integrated DNA Technologies)。
向导ID 基因组序列(5’-3’)
AAVS1 gRNA GTCACCAATCCTGTCCCTAGTGG(SEQ ID NO:51)
IL2RG gRNA ACTGGCCATTACAATCATGTGGG
蛋白质
从RCSB PDB和UniProt在线数据库收集源自野生型血清型5的E4orf1、E4orf6/7、GSE56/Ad5-E4orf6/7、E4orf6和E1B55K腺病毒蛋白序列。此外，使用T-Coffee算法(Notredame,C.et al.(2000)J.Mol.Biol.doi:10.1006/jmbi.2000.4042)在各种腺病毒血清型之间对每个腺病毒蛋白家族E4orf1和E4orf6/7进行多序列比对来选择一些变体。所有序列均利用智人密码子优化合成(GeneArtTM)。将每个构建体在用于体外mRNA转录的“pVax”质粒中克隆，该质粒含有T7启动子、WPRE或3’UTR和64bp-polyA。pVax用限制性酶(SpeI)线性化，并用酚-氯仿纯化。使用商用5xMEGAscript T7试剂盒(Invitrogen)对RNA进行体外转录，其中通过添加ARCA(BioLabs)对制造商的方案进行了轻微修改。使用RNeasy Plus微型试剂盒(Qiagen)纯化合成的RNA，然后通过HPLC柱纯化去除RNA污染物和试剂。最后使用Amicon Ultra-15(30K)管(Millipore)浓缩RNA。
人HSPC中的基因编辑方案
CD34+细胞从Lonza冷冻购买。CD34+细胞根据先前优化方案(Schiroli,G.et al(2017)Sci Transl Med 9)进行编辑。简而言之，在补充有青霉素、链霉素、谷氨酰胺、1μM芳烃受体拮抗剂SR-1(Biovision)、50μM嘧啶吲哚衍生物UM171(STEMCell Technologies)、仅在培养开始时加入的10μM 15-羟基PGDH竞争性抑制剂dmPGE-2(Cayman)和人早期作用细胞因子(SCF 100ng/ml、Flt3-L 100ng/ml、TPO 20ng/ml和IL-6 20ng/ml；均购自Peprotech)的无血清StemSpan培养基(StemCell Technologies)中刺激1-5x105个CD34+细胞/ml。预刺激3天后，将细胞用PBS洗涤，并使用P3 Primary Cell4D-Nucleofector X试剂盒和程序EO-100(Lonza)进行电穿孔。细胞用1-1.2μM RNP电穿孔。在规定的情况下，电穿孔混合物补充有Ad5-E4orf1、Ad5-E4orf6/7和GSE56/Ad5-E4orf6/7mRNA(分别以120、80和200μg/ml的剂量使用)或Ad5-E1B55K和Ad5-E4orf6 mRNA以120和80μg/ml使用。所有其他腺病毒蛋白变体均以120μg/ml的标准剂量使用。电穿孔后15分钟以1-5x104 vg/细胞的剂量进行AAV-6转导。在规定的情况下，CD34+细胞在培养中刺激更短的时间(0、24或48小时)，并如上所述进行编辑。通过测量表达GFP报告基因的细胞百分比的流式细胞术，或通过在载体序列与靶定基因座之间连接上和用作标准化物的对照序列上设计引物和探针的液滴数字PCR分析，在编辑后4天测量体外培养细胞的基因编辑效率，如先前所述(Schiroli,G.et al(2017)SciTransl Med 9)和Schiroli et al.,Cell Stem Cell2019)。
NSG小鼠中的CD34+异种移植
NOD-SCID-IL2Rg-/-(NSG)小鼠购自Jackson Laboratory，并保持在无特定病原体(SPF)的条件下。涉及动物的程序在San Raffaele医院动物护理和用途委员会(IACUC#749)批准下设计和执行，并已根据意大利法律告知卫生部和地方当局。对于移植，在亚致死性辐射(180cGy)后，在编辑方案后24小时将1.5-3x105(原代)或2x106个(二代)CD34+处理细胞静脉内注射到NSG小鼠中。样品大小由可用的处理细胞的总数量确定。将小鼠随机归入每个实验组。通过移植后几周内从小鼠尾部连续采集血液来监测人CD45+细胞植入和经编辑的GFP+细胞百分比，并且在实验结束时(移植后18-20周)收获并分析脾脏和骨髓。
分子分析
对于分子分析，根据可用的细胞数量，使用DNeasy Blood&Tissue试剂盒或QIAampDNA微型试剂盒(QIAGEN)分离基因组DNA。核酸酶活性(AAVS1)通过错配敏感的内切核酸酶测定法测量，通过靶定基因座的基于PCR的扩增，然后用T7内切核酸酶I(NEB)按照制造商说明书消化进行。在LabChip GX Touch HT(Perkin Elmer)上根据制造商说明书通过毛细管电泳对消化的DNA片段进行解析和定量。
对于数字液滴PCR分析，使用QX200 Droplet数字PCR系统(Biorad)根据制造商说明书一式两份分析5-50ng的基因组DNA。
对于HDR ddPCR，如对于易位ddPCR一样，在载体序列和靶定基因座之间连接和用于标准化的对照序列(人TTC5基因)上设计引物和探针。针对每种特定应用，退火和延伸的热条件调整如下：AAVS1 HDR 3’整合连接ddPCR：55℃30秒，72℃2分钟。用于PCR和ddPCR扩增的引物和探针如下所示。
Figure BDA0002946865180000771
条形码编码分析
使用Taq G2热启动聚合酶(Promega)通过一步PCR生成每个单独样品的PCR扩增子。设计正向引物以结合条形码序列上游2bp的供体模板，而反向引物在同源区外退火，从而扩增出约350bp的中靶整合盒。对引物赋予尾部，其含有P5/P7序列，允许多重测序的i5/i7 Illumina标签和R1/R2引物互补序列。使用MinElute PCR纯化试剂盒(QIAGEN)分别纯化PCR文库扩增子，并通过Agilent Tapestation(Agilent Technologies)评估质量。最后，对扩增子进行多路复用并在Illumina MiSeq配对末端2x75bp上运行。
流式细胞术
对于免疫表型分析(在FACSCanto II(BD Pharmingen)上进行)，我们使用了以下列出的抗体。将单染色和Fluorescence Minus One染色的细胞用作对照。样品制备物中包含LIVE/DEAD固定死细胞染色试剂盒(Thermo Fisher)，7-氨基放线菌素(Sigma Aldrich)以用于根据制造商说明书进行流式细胞术，以从分析中排除死细胞。使用MoFlo XDP细胞分选仪(Beckman Coulter)或FACSAria Fusion(BD Biosciences)进行细胞分选。
Figure BDA0002946865180000781
Figure BDA0002946865180000791
细胞周期分析
通过流式细胞术(CytoFLEX LX；Beckman Coulter)，在编辑后12-24小时通过收集培养的0.5-1x105个总HSPC分析细胞周期。用PBS+2％FBS洗涤细胞，并通过使用PBS+2％FBS中的10μg/ml Hoechst 33342(Sigma-Aldrich)染色0.5-1小时，最终体积等于200μl。
结果
基因编辑期间E4orf1或E4orf6/7的表达提高靶向效率
腺病毒是AAV感染的天然共辅助物，并提供一组辅助基因(E1a、E1b、E2a、E4)，它们的功能是优化AAV感染过程所需的。我们有兴趣具体研究E4基因，该基因由7个开放阅读框(ORF)组成，它们编码7种不同的蛋白(图5)。
我们决定研究使用源自腺病毒血清型5(Ad5)的被称为E4orf1和E4orf6/7的两个腺病毒蛋白，在用于供体DNA模板递送的AAV6转导之前，我们通过电穿孔将所述腺病毒蛋白以mRNA与Cas9核糖核蛋白(RNP)一起递送到人HSPC(脐带血衍生的CD34+细胞)(图6A)。
通过在基因编辑程序期间表达E4orf6/7蛋白，我们测量了供体中存在的表达GFP报告基因的原始HSPC(CD34+CD133+CD90+GFP+)百分比的平均增加1.5倍。这种靶向效率的提高是在用于转导供体载体的AAV6载体的所有不同剂量时获得的(图6B)。
通过整合酶缺陷型慢病毒载体(IDLV；图6C)递送供体模板时，在原始CD90+细胞中也观察到靶向整合的相似提高。
我们在基因编辑程序期间递送不同剂量的E4orf1 mRNA时，我们发现靶向效率呈剂量依赖性增加，并且在最佳表现剂量下，我们测量靶定的原始HSPC百分比平均增加1.5倍，与不同剂量的E4orf6/7mRNA条件下测量的增加相似(图6D)。
单独和组合表达E4orf1或E4orf6/7
然后，我们并行比较了单独或在添加E4orf1、E4orf6/7或两种蛋白的组合情况下的标准基因编辑程序。通过细胞荧光分析，我们观察到相比于标准品，E4orf1增加GFP+细胞分数至1.2倍的均值，并且在所有亚群中是等同的(从最原始的CD90+祖细胞区室到最分化的CD34-区室)；E4orf6/7主要在最原始HSPC区室(CD90+)中增加GFP+细胞分数至1.45倍；并且它们的组合具有累加作用，允许GFP+细胞分数增加1.55倍的均值(图7A)。
靶向效率通过对总体积的数字PCR确认，并与通过细胞荧光分析测量的GFP总百分比并行比较(图7B)。
通过进行克隆形成测定，我们发现与标准程序相比，用E4orf1和E4orf6/7蛋白共同处理分别增加了3倍和2倍的髓系和红系集落形成单位(CFU)数量(图7C)。
令人感兴趣的是，与标准品和单独E4orf6/7的条件相比，编辑期间包括E4orf1的两种条件下，处理细胞的生长曲线高4倍(图7D)。
异种移植实验正在NSG小鼠中进行，以确定用这些条件处理的经编辑的HSPC的长期植入和体内分化能力。
基因编辑期间E1B55K和E4orf6的表达
我们测试了使用E1B55K和E4orf6蛋白以编辑人HSPC，并将它们与E4orf1和E4orf6/7蛋白平行比较。
我们发现E1B55K和E4orf6的组合仅允许主要在最原始HSPC区室中GFP+细胞分数瞬时增加直至1.45倍，这可能是由于导致来自非整合载体的GFP报告物的更高表达的转导增加所致(图8A)。
对从这些处理细胞中提取的基因组DNA进行的分子分析证实，E1B55K和E4orf6蛋白无法有效提高对人HSPC的编辑效率，而E4orf1和E4orf6/7蛋白两者可再现地能够加强这种细胞类型中的编辑(图8B)。
通过进行克隆形成测定，与标准条件相比，我们未观察到髓系和红系集落形成单位(CFU)数量的重大变化(图8C)。
令人感兴趣的是，与标准品相比，用E1B55K和E4orf6组合处理细胞的生长曲线更低，这可表明由于使用这种组合所致的某种毒性(图8D)。
递送E4orf6/7与Cas9改善人原代T细胞中HDR驱动的整合
最后，在递送供体DNA模板的AAV6转导之前，我们测试了E4orf6/7mRNA与Cas9核糖核蛋白(RNP)一起递送至人原代T细胞(外周血衍生的总CD3+细胞)(图9A)。
通过分析处理后20天的细胞，我们发现与标准条件相比，用E4orf6/7处理的细胞中GFP+细胞表达的百分比在总体经处理的CD3+细胞中以及CD4和CD8亚群中均增加了1.5倍(图9B)。
这些结果表明，E4orf6/7蛋白允许加强不同原代人细胞中HDR驱动的整合。
移植到免疫缺陷NSG小鼠中的用E4orf6/7mRNA处理的编辑细胞增加最原始HSPC区室中HDR驱动的整合并保留长期再定殖能力
利用AAV6供体和E4orf6/7mRNA的最佳表现剂量，我们重复了基因编辑实验，目的是将细胞移植到NSG小鼠中，这代表了长期再定殖HSC的替代测定(图10A)。
用E4orf6/7处理的编辑细胞显示靶定的CD90+细胞的百分比增加1.4倍(图10B)，并且培养物组成没有任何偏离(图10C)。
比较E4or6/7和标准条件时，对从处理细胞中提取的基因组DNA进行的分子分析证实了HDR介导的整合的升高水平和类似量的NHEJ诱导的突变(图10D)。
在电穿孔后一天将这些细胞移植到NSG小鼠中，并且它们的植入在纵向上继之以进行系列血液分析。结果表明，虽然与E4orf6/7共同处理不影响人细胞植入的整体水平，但用E4orf6/7处理的细胞移植的小鼠显示血液中、造血器官中和不同血液谱系中编辑细胞的分数显著更高(以GFP+或HDR+细胞百分比所测量)(图11)。
总之，这些结果表明，在基因编辑程序期间，E4orf6/7蛋白的瞬时表达增加了最原始HSPC区室中HDR驱动的整合水平，而保留了它们的长期再定殖能力。
实施例3
我们研究了编辑程序期间p53抑制剂(GSE56)的瞬时过表达是否改变细胞周期S/G2/M期细胞的比例。通过基因编辑程序后24小时进行Hoechst细胞周期分析，我们发现与未处理对照相比标准品中S/G2/M期细胞百分比降低的趋势，这在GSE56存在下对细胞进行编辑时部分挽救(图12A)。为了评估体内HDR编辑细胞的产率改善是否以不依赖于靶定基因座的方式一致，我们移植了用GSE56 mRNA处理或未处理的CD34+细胞的有限剂量(T0eq＝1.5x105个/小鼠)(图12B)。对于本实验，我们使用了我们最近开发的AAV6载体，其靶向AAVS1基因座并且包含22bp高度简并的分子区域(条形码)。该载体允许在体内克隆追踪编辑细胞并鉴定可改善移植物克隆性的基因编辑方案。分析移植的NSG小鼠时，我们发现造血器官中的显著更高的植入(图12C)，尽管基因编辑细胞的分数与标准方案相似(图12D)。为了评估移植物大小的增加是否与GSE56处理存在下编辑细胞的克隆性改善相关，通过我们新的基于条形码编码的克隆追踪分析，我们评估了有助于HDR编辑的细胞再定殖的优势克隆数量。实际上，我们在造血器官中观察到优势克隆的高6.5倍的数量(图12E)，这与通过FACS测量的人编辑细胞的产率直接相关(图12F)。此外，我们还通过靶向与高IgM综合征相关的临床相关CD40LG基因进行了相似的移植实验(图13A)。我们一致发现存在GSE56下用CD40LG编辑细胞移植的小鼠外周血中的人细胞百分比更高(图13B)，其与随时间的基因校正的更加稳定的百分比相关(图13C)。在实验终点时，在所有分析的造血组织和器官中，人细胞百分比趋于改善(图13D)，其中包括CD34+细胞在内的分选细胞类型中，校正细胞百分比高3至6倍(图13E)。总之，这些结果证实并扩展了图3和图4中报道的结果，突出显示了瞬时p53抑制在体内稳健改善编辑细胞产率的相关作用。
我们继续研究腺病毒Ad5-E4orf1和Ad5-E4orf6/7增强HSPC中HDR效率的潜力。在用细胞因子和药物(SR1、dmPGE-2和UM171)预先刺激后，我们在人脐带血(CB)衍生的CD34+中进行了靶向基因编辑方案，并在第3天电穿孔了预先组装的RNP-Cas9，15分钟后接着进行AAV6转导，作为我们的标准编辑程序(RNP+AAV6)。我们通过利用mRNA机制并行测试了GFP(作为mRNA对照)、GSE56、Ad5-E4orf1、Ad5-E4orf6/7或GSE56/Ad5-E4orf6/7的瞬时递送，并在编辑方案后几天内针对每种条件表征了各种参数(图14A)。我们首先观察到，与未处理细胞(UT)相比，标准编辑方案RNP+AAV6减少了细胞扩增。Ad5-E4orf6/7与标准品具有相似的趋势，而GSE56和Ad5-E4orf1两者增加多约2倍的细胞生长，这与图3D和图7D的结果相关。GSE56/Ad5-E4orf6/7的组合在编辑后直到第7天显示中间模式，且在第10天达到了GSE56和Ad5-E4orf1两者的水平(图14B)。通过测量HSPC亚群内GFP表达来评估编辑效率(图14C左图和右图)。与标准RNP+AAV6相比，GSE56显示GFP表达增加1.1倍，尤其是在最原始区室(CD34+133+90+)中，其是轻微但显著的，如图3C右图所示。类似地，Ad5-E4orf1或Ad5-E4orf6/7±GSE56显示进入CD90+细胞中的GFP表达分别增加了多达1.3倍和1.5倍。我们在总体培养物中通过数字PCR观察靶定的AAVS1基因座处促进的HDR介导的整合来验证这些结果(图14D)。使用Ad5-E4orf6/7±GSE56，HDR编辑的等位基因显著增加，而NHEJ分数在任何条件下均保持相似。此外，我们仅通过添加Ad5-E4orf6/7±GSE56观察到CD90+分数的显著偏移，这可以表明可能的毒性作用或细胞分化(图14E)。然后，我们进行了7-AAD/膜联蛋白染色，以评估我们编辑方案的毒性。尽管在标准品中我们看到与UT相比活细胞数量减少，但我们通过添加RNA并没有观察到额外的毒性(图14F)。令人感兴趣的是，通过进行CFU-C测定，与标准方案相比，红系和髓系克隆形成输出在以作为mRNA对照递送GFP或Ad5-E4orf6/7的情况下不受影响。在GSE56(如图3F所述)和Ad5-E4orf1的情况下它甚至得到改善。但是，使用Ad5-E4orf6/7±GSE56似乎负面影响克隆形成特性，甚至可与培养物组成中CD90+分数减少相关仍然是一种趋势并且不是显著的(图14G)。最后，我们评估根据编辑方案的HSPC的细胞周期状态。使用Ad5-E4orf6/7清楚显示，主要通过将其与GSE56组合扩增的总体处理细胞从G1期到S/G2/M期的明显转变。通过观察最原始区室，我们观察到了类似的模式。通过使用GSE56或Ad5-E4orf1，这种作用较低且不明显(图14H)。为了证实以前由靶向双等位基因AAVS1基因座获得的结果，我们还通过靶向另一基因组单等位基因IL2RG基因座而开发了编辑策略。通过测量HSPC亚群中的GFP表达，我们通过使用Ad5-E4orf6/7±GSE56仍然具有显著的编辑效率提高，即使与标准RNP+AAV6相比倍数降低。我们可以推测这是由于该基因座的单等位基因形式(图14I)。此外，考虑到Ad5-E4orf6/7正在推进细胞周期，我们审查了离体培养期间编辑方案的时间安排，以进一步保留HSCP特性。我们评估了从解冻后第0天到第2天进行编辑方案的不同时间点(图14J)。令人感兴趣的是，我们观察到从第0天到第2天，在Ad5-E4orf6/7存在下，在总体积和CD90+细胞级分两者中的编辑效率均是升高的(图14K)。我们通过在总体培养物中由数字PCR观察靶定的AAVS1基因座处促进的HDR介导的整合证实了这些结果(图14L)。我们用Ad5-E1B55K和Ad5-E4orf6蛋白进行类似的表征(图15A，B，C，D和E)。如先前所述(Gwiazda,K.S.et al.(2016)Mol.Ther.24:1–11)，这两种蛋白的组合显著增加了来自AAV6供体的GFP表达，而与标准程序相比，它减少靶定的AAVS1基因座处HDR介导的整合，如我们已观察到的(图8)。
我们通过细胞周期分析证明了Ad5-E4orf6/7诱导HSPC中的细胞周期进程。1989年，Huang等(Huang,M.M.et al.(1989)Genes Dev.3:1699–1710)描述了Ad5-E4orf6/7与E2F转录因子家族之间的直接相互作用。我们决定在HSPC中的RNA水平上探索E2F相关基因的表达。我们选择了已知涉及细胞周期调控和p53相关的特定基因靶标。我们使用TaqMan基因表达测定来定量几种编辑方案上的特定转录本。已知CDK2是细胞周期进展的标志物，它对从G1期至S/G2期转换是特异的。我们注意到，在Ad5-E4orf6/7±GSE56存在下，CDK2在编辑后24小时显著上调(图16A)，并且它可在12至24小时的时间窗内检测到，然后在96小时降低(图16B)，而在RNP+AAV6±GSE56的情况下始终保持在基础水平。CDKN2A被称为“p14ARF”，通过抑制其主要阻遏物MDM2被描述为p53调节剂。再一次，我们看到在Ad5-E4orf6/7±GSE56存在下，CDKN2A在编辑后24小时显著上调(图16C)，并且与CDK2类似，它可在12到24小时的时间窗检测到，然后在96小时降低(图16D)，而RNP+AAV6±GSE56仍保持在基础水平。然后，我们研究了可能由E2F激活的为CDKN1A和APOBEC3H的p53下游效应物。第一个被称为“p21”，并且它是参与细胞周期阻滞的p53直接靶标。实际上，编辑后24小时，CDKN1A在标准方案RNP+AAV6中高度上调，这是编辑方案的直接结果(图16E)。使用p53抑制剂GSE56允许减少p21激活的幅度，比RNP+AAV6小约3倍，如图3B所示。然而，通过使用Ad5-E4orf6/7，我们注意到编辑后12小时CDKN1A表达下降，比标准品高约2倍。令人感兴趣的是，当组合GSE56/Ad5-E4orf6/7时，这种下降是检测不到的，这可能是由于抵销通过Ad5-E4orf6/7介导的p21过表达的GSE56特性所致(图16F)。最后，CDKN1A在编辑后168小时回到了基础水平。我们最终测试了APOBEC3H，它通过诱导病毒基因组中C到T突变参与抗病毒细胞应答。APOBEC3H在编辑方案后高度上调，这主要是由于HSPC中的AAV6转导所致(图3B)。然而，Ad5-E4orf6/7和/或GSE56存在下，其在编辑后24小时显著下调(图16G)。但是，我们注意到APOBEC3H在96小时上升，然后在168小时下降(图16H)。总之，我们证明了Ad5-E4orf6/7与E2F之间的相互作用是参与HSPC细胞周期进程和编辑方案后HDR事件增加的机制。我们还突出显示了使细胞周期受控制的p53介导的反馈环的存在。但是，通过瞬时阻断p53活性，我们能够进一步推进细胞周期进程(图16I)，尤其是进入最原始CD90+细胞。
然后，我们计划通过在编辑后24小时对免疫缺陷的NSG小鼠模型使用大量处理细胞(T0eq＝3x105个/小鼠)的首次移植(图17A)。在移植后的几周内，监测血液中人CD45+细胞的植入，并且在几组RNP+AAV6±Ad5-E4orf1，Ad5-E4orf6/7或GSE56/Ad5-E4orf6/7之间均未显示任何统计学显著性，这可能是由于这些接受者的植入能力的饱和所致(图17B)。令人感兴趣的是，HDR编辑的GFP+细胞分数在一段时间内略有下降，如图4D所示，这可能是由于靶定的祖细胞的损失所致。但是，我们注意到，方案RNP+AAV6+Ad5-E4orf6/7或GSE56/Ad5-E4orf6/7分别增加循环的编辑细胞分数1.5倍和2倍。通过使用Ad5-E4orf1进行编辑仍然类似于标准模式(图17C)。我们在实验结束时通过分析小鼠的脾脏和骨髓器官证实了这些结果(图17D和图17E)。此外，我们通过使用我们的AAV6盒内的条形码序列进行了克隆追踪。与原代移植物一致，与标准品相比，通过用GSE56/Ad5-E4orf6/7处理细胞，我们检测到多直至3倍的编辑克隆(图17F)。
为了进一步研究最原始细胞的长期再定殖能力，我们决定通过收集和纯化来自首次接受者的骨髓的CD34+细胞来进行二次移植。为了避免小鼠依赖的异质性，我们在同一组内移植来自纯化CD34+合并物的约2x106个细胞/小鼠，并对于一个二次接受者考虑两个首次接受者(图18A)。虽然各组中植入很高并且相似，但是我们仍然观察到循环的经编辑的人细胞方面的显著差异，尤其是比较标准RNP+AAV6±GSE56/Ad5-E4orf6/7与升高超过2倍的GFP表达细胞(图18B和图18C)。在我们分析的所有区室(骨髓和脾脏)以及所有血液谱系CD19+、CD33+和CD3+中也是如此(图18D，图18E和图18F)。总之，这些结果表明，通过编辑方案期间诱导细胞周期进程并可能减少有助于更好地保留最原始HSPC区室的长期功能的p53依赖性转录响应，GSE56/Ad5-E4orf6/7使移植小鼠模型中编辑细胞的分数显著增加。
我们进行了限度细胞剂量移植(T0eq＝1x105个/小鼠)以进一步阐明最后这点，并包括平行用GSE56处理的新组。在这些设置中，编辑细胞的分数与之前实验相似，但是我们更好地理解了条件之间植入能力方面的差异(图19A和图19B)。如所预期，与标准方案相比，GSE56导致处理细胞的植入高5-6倍(同样参见图4B)。奇怪的是，GSE56/Ad5-E4orf6/7的组合产生比标准品高约2倍的植入，但与单独的GSE56处理相比仍然更低。然后，我们可以推测两种假说：一方面，我们知道编辑方案期间Ad5-E4orf6/7诱导瞬时p53过表达，这甚至可以对处理细胞造成更大损害。因而，它需要更高的GSE56剂量来抵消它。在另一方面，我们知道p53抑制剂的使用诱导反馈环的丧失，该反馈环控制细胞周期的，并且被Ad5-E4orf6/7推高。然后，我们可以想到知道，干细胞更倾向于执行HDR，但作为对应物，也影响小鼠的大致长期植入能力。
为了巩固前面的数据，我们决定通过比较RNP+AAV6±GSE56/Ad5-E4orf6/7进行另一项体内实验，通过与图17类似靶向RIL2RG基因座并移植NSG小鼠(T0eq＝3x105个/小鼠)进行。我们证实了NSG小鼠中首次和二次移植后的先前结果。与标准方案相比，使用组合GSE56/Ad5-E4orf6/7，我们观察到甚至在二次移植中，器官和血液谱系中的编辑细胞增加2/3倍(图20A，图20B，图20C，图20，图20D，图20E，图20F，图20G和图20H)。为了通过与GSE56和Ad5-E4orf6/7两者互补来评估编辑程序的潜在基因毒性，我们通过用我们的试剂靶向IL2RG基因座进行了易位分析，其中我们鉴定了一个主要的脱靶。令人感兴趣的是，与标准方案相比，我们通过ddPCR没有观察到基因组易位事件频率增加。此外，对于体内样品，没有检测到事件，表明分化的细胞可能更倾向于这种现象(图20I)。
最后，我们还研究了源自腺病毒家族的各种血清型的E4orf1和E4orf6/7两者的腺病毒蛋白变体的用途。我们使用T-coffee算法进行蛋白序列比对，并我们鉴定出特定的保守氨基酸(>95％共有)。我们选择沿共同祖先的系统发生树呈现最高序列变异性的最佳候选者。然后，我们为每个蛋白选择三个变体，并评估HSPC中的编辑效率(图21/22A和B)。与Ad5-E4orf1相比，E4orf1变体在HSPC亚群中显示GFP表达增加多达2倍(图21C)。然而，Ad5-E4orf1仍然是表现出最高集落数量的(图21D)。令人惊讶的是，无论E4orf1变体如何，TaqMan分析未显示对E2F靶基因的任何影响，表明刺激处理细胞的细胞周期活性的替代机制(图21E)。关于E4orf6/7，只有一种变体对最原始区室的编辑效率提高多达2倍，而其他两种仍然类似于Ad5-E4orf6/7(图22C)。然而，通过观察集落形成细胞测定，所有这些变体在处理细胞的克隆形成能力上似乎是受损的(图22D)。在RNA水平上，与使用Ad5-E4orf6/7相比，已显示这些变体极大地诱导CDKN1A和CDKN2A反馈环响应，揭示出一种毒性(图22E)。
讨论
我们证明了GSE56和Ad5-E4orf6/7两者的瞬时表达能够改善我们在HSPC中的标准靶向基因编辑方案。一方面，GSE56通过调节p53响应来减少编辑方案期间的编辑细胞损害。我们观察到NSG小鼠中移植后更高的植入能力和增加数量的丰富克隆。尽管HDR效率方面有持续但较低的增加，但它揭示了编辑细胞分数比标准方案在长期上更稳定，这表明编辑方案期间最原始细胞由于GSE56受到的影响较小。此外，p53的瞬时抑制可能不会选择天然缺乏p53的HSPC，从而避免遗留移植下假定的肿瘤易感性克隆。另一方面，我们发现Ad5-E4orf6/7腺病毒蛋白能够提升细胞周期进程，导致HSPC的AAVS1基因座中HDR事件整合增加1.5倍。与GSE56组合，可直接靶向最原始细胞，绕过p53介导的反馈环。因此，与单独使用GSE56相比，我们能够在体内增加长期编辑的HSC分数多达50％，并增加总的丰富克隆数量，甚至部分影响这种特定情况下的植入能力。最后这点可通过会引起一种细胞分化为最原始区室的细胞周期推进来解释。然后，我们提出通过调节GSE56和Ad5-E4orf6/7剂量两者，我们可以平衡HDR相对于植入能力。
总之，我们可区分两种策略：一方面，通过单独使用GSE56的编辑方案，我们获得处理细胞的更高的植入，以及在体内小分数的归巢和循环的编辑细胞两者的长期稳定性。另一方面，与单独GSE56相比，通过使用GSE56/Ad5-E4orf6/7，我们改善编辑细胞的百分比2/3倍，而减少了植入。总之，已知在移植期间接受者容量是有限的，并且在归巢过程期间新移植的细胞之间存在竞争。因此，我们可以说编辑细胞的分数更高，并且它们可以达到骨髓小生境，克服与未编辑细胞的竞争的概率也更高。最后，对于需要高水平编辑细胞的疾病，GSE56/Ad5-E4orf6/7的组合可以是最佳选择。
实施例4
描述
基于逆转录病毒和慢病毒载体(LV)的基因疗法可通过监测整合位点来进行克隆追踪研究(Biffi et al.，2013)，而HDR介导的靶向插入的位点特异性和高保真性性质阻碍定量和监测经编辑的克隆。除了少数基于NHEJ的追踪分析(Wu et al.，2019)，尚无关于个别HDR编辑的长期再定殖HSPC的多谱系再定殖能力以及人移植物中克隆多样性的数据。因此，针对基因编辑细胞而开发新型且广泛的克隆追踪途径将允许：i)剖析再定殖动力学；ii)比较不同HSPC基因编辑方案之间的克隆丰富度，以及iii)为在翻译环境中追踪经编辑的HSPC铺平道路。先前的工作突出显示了将短随机序列(条形码)引入病毒载体基因组以追踪载体整合到细胞基因组后条形码标记细胞的命运的价值(Naik et al.，2014)。整合条形码载体在以前已应用于不同领域，例如研究造血(Verovskaya et al.，2013)，T细胞行为(Schepers et al.，2008)和乳腺组织发育(Nguyen et al.，2014)。最近，一些报道突出显示了将基因组编辑与条形码编码技术结合以追踪CRISPR编辑的酿酒酵母(S.cerevisiae)克隆的命运的可能性(Roy et al.,2018)。
结果和讨论
为了能够在体外和体内克隆追踪靶定的HSPC，我们将22bp高度简并的分子条形码克隆到靶向AAVS1基因座的HDR精通的AAV载体中(参见图23和方法)。理论上，序列设计允许多达4.53*108个不同的条形码。由于较短的插入物可在克隆程序期间优先连接到骨架上并降低文库的复杂性，因此使用3个固定碱基避免在简并插入物的克隆程序期间被期望的限制性酶(Bsu36I和SphI)切割。将盒位点特异性整合到AAVS1基因座后，包含条形码的靶序列可通过PCR扩增并通过深度测序分析来鉴定HDR编辑克隆的数量和分布。
这种AAV载体/质粒潜在地可以用于临床前和临床应用的任何细胞类型(小鼠/人HSPC，T细胞等)中进行克隆追踪。此外，简并条形码序列也可克隆到不同类型的载体中(短或长的裸DNA片段，IDLV等)，或靶向其他目标基因组区域(如IL2RG、CD40LG、RAG1、HBB等)的构建体。
方法
通过将简并序列在聚腺苷酸化序列下游亚克隆到非条形码编码的AAVS1 HDR供体模板中，获得靶向AAVS1基因座的条形码编码的AAV6供体模板(Schiroli et al.,2017)。简而言之，从Sigma Aldrich购买嵌入侧翼有独特克隆限制位点(Bsu36I和SphI)的随机序列的ssODN。设计简并区以避免克隆限制性酶的任何不期望的切割。为了产生互补链，使用适当的正向和反向引物利用Easy-A高保真酶(Agilent Technologies)根据制造商说明书进行10个循环的PCR，扩增50pmol ssODN。扩增产物用MinElute PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化，用限制性酶消化，并通过毛细管电泳检查。使用T4 DNA连接酶(NEB)，通过放大制造商方案，将2ug的Bsu36I/SphI消化的AAVS1 HDR供体模板与消化的插入物(摩尔比为1:7)连接。最后，XL-10Gold超感受态细胞(Agilent Technologies)用连接产物转化，普板并于30℃温育12小时，以最小化重组风险。将菌落刮下，混合，在LB培养基中再培养6小时，并用NucleoBond Xtra MaxiPrep根据制造商说明书进行处理。最终，用限制性酶筛选质粒制备物的ITR和质粒完整性。
序列
条形码编码的AAV的基因组插入物(带下划线＝条形码序列)
Figure BDA0002946865180000891
Figure BDA0002946865180000901
ssODN扩增引物
Bar AAVS1正义5’-AGACTAGGAAGGAGGAGGCCTAAGGATG-3’
Bar AAVS1反义5’-ACAATAGCAGGCATGCTGGGGATG-3’
ssODN
Figure BDA0002946865180000902
以上说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明范围和精神的情况下，本发明公开的用途、方法、细胞和组合物的各种修改和变化对本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合特定的优选实施方案公开了本发明，但是应当理解，要求保护的本发明不应不适当地限制于这样的特定实施方案。实际上，对于本领域技术人员显而易见的是，用于实施本发明的所公开方式的各种修改都在所附权利要求的范围之内。

Claims (64)

1.促进同源定向DNA修复的试剂，其在造血细胞基因疗法、造血干细胞基因疗法和/或造血祖细胞基因疗法中使用，其中所述基因疗法包括基因编辑。
2.促进同源定向DNA修复的试剂，其在增加基因编辑的造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞的存活和/或植入中使用。
3.促进同源定向DNA修复的试剂在增加基因编辑的造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞的存活和/或植入，或者提高造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞的基因编辑效率中的用途。
4.根据权利要求1或权利要求2使用的试剂或权利要求3的用途，其中所述试剂是p53活化抑制剂，优选其中所述抑制剂是p53磷酸化抑制剂，更优选是p53丝氨酸15磷酸化抑制剂。
5.根据权利要求4使用的试剂或者权利要求4的用途，其中所述抑制剂是p53显性负性肽，共济失调毛细血管扩张突变(ATM)激酶抑制剂或共济失调毛细血管扩张和Rad3相关蛋白(ATR)抑制剂。
6.根据权利要求4或5中任一项使用的试剂或者权利要求4或5的用途，其中所述抑制剂是皮斐松-α或其衍生物；KU-55933或其衍生物；GSE56或其变体；KU-60019，BEZ235，渥曼青霉素，CP-466722，Torin 2，CGK 733，KU-559403，AZD6738或其衍生物；或者siRNA，shRNA，miRNA或反义DNA/RNA。
7.根据权利要求4至6中任一项使用的试剂或者权利要求4至6中任一项的用途，其中所述造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞中p53的抑制是瞬时的。
8.根据权利要求4至7中任一项使用的试剂或者权利要求4至7中任一项的用途，其中p53的瞬时抑制发生在所述造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞的基因编辑期间。
9.根据权利要求4至8中任一项使用的试剂或者权利要求4至8中任一项的用途，其中所述抑制剂以约1-50μM的浓度添加至所述造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞。
10.根据权利要求1、2或4至9中任一项使用的试剂或者权利要求3至9中任一项的用途，其中所述试剂包括编码至少一种腺病毒蛋白的核酸序列。
11.根据权利要求10使用的试剂或者权利要求10的用途，其中所述至少一种腺病毒蛋白来自血清型4的腺病毒，血清型5的腺病毒，血清型7的腺病毒和/或血清型9的腺病毒，优选地所述至少一种腺病毒蛋白来自血清型5的腺病毒。
12.根据权利要求10或权利要求11使用的试剂或者权利要求10或权利要求11的用途，其中所述至少一种腺病毒蛋白是E4ORF1，优选其中E4ORF1的氨基酸序列以SEQ ID No.1，57-76所示。
13.根据权利要求10或权利要求11使用的试剂或者权利要求10或权利要求11的用途，其中所述至少一种腺病毒蛋白是E4ORF6/7，优选其中E4ORF6/7的氨基酸序列以SEQ IDNo.2，77-107所示。
14.根据权利要求1、2或4至13中任一项使用的试剂或者权利要求4至13中任一项的用途，其中所述试剂包括：腺病毒蛋白E4ORF1，优选其中E4ORF1的氨基酸序列以SEQ ID No.1，57-76所示；和腺病毒蛋白E4ORF6/7，优选其中E4ORF6/7的氨基酸序列以SEQ ID No.2，77-107所示。
15.根据权利要求1、2或4至14中任一项使用的试剂或者权利要求4至14中任一项的用途，其中所述试剂包括：
(a)所述p53活化抑制剂和腺病毒蛋白；
(b)所述p53活化抑制剂和腺病毒蛋白E4ORF1，优选其中E4ORF1的氨基酸序列以SEQ IDNo.1，57-76所示；
(c)所述p53活化抑制剂和腺病毒蛋白E4ORF6/7，优选其中E4ORF6/7的氨基酸序列以SEQ ID No.2，77-107所示；或者
(d)所述p53活化抑制剂，腺病毒蛋白E4ORF1，优选其中E4ORF1的氨基酸序列以SEQ IDNo.1，57-76所示，和腺病毒蛋白E4ORF6/7，优选其中E4ORF6/7的氨基酸序列以SEQ IDNo.2，77-107所示，
优选地，其中所述p53活化抑制剂是GSE56或其变体。
16.根据权利要求10至15中任一项使用的试剂或者权利要求10至15中任一项的用途，其中所述编码腺病毒蛋白的核酸为mRNA。
17.根据权利要求10至16中任一项使用的试剂或者权利要求10至16中任一项的用途，其中所述腺病毒蛋白在所述造血细胞、造血干细胞或造血祖细胞中瞬时表达，优选其中所述瞬时表达发生在所述造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞的基因编辑期间。
18.根据权利要求1、2或4至17中任一项使用的试剂或者权利要求4至17中任一项的用途，其中所述基因编辑的靶标选自下组：CD40L、RAG-1、IL-2RG、CYBA、CYBB、NCF1、NCF2和NCF4，优选CD40L。
19.基因编辑造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体的方法，其包括以下步骤：
(a)使所述造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体与促进同源定向DNA修复的试剂接触；
(b)用一种或多种载体将基因编辑机械引入所述造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体中；以及
(c)编辑所述造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞的基因组。
20.权利要求19的方法，其中离体或在体外进行步骤(a)和(b)。
21.权利要求19或20的方法，其中所述促进同源定向DNA修复的试剂是p53活化抑制剂。
22.权利要求22的方法，其中所述p53活化抑制剂是p53显性负性肽，共济失调毛细血管扩张突变(ATM)激酶抑制剂或共济失调毛细血管扩张和Rad3相关蛋白(ATR)抑制剂。
23.权利要求22的方法，其中所述p53活化抑制剂是皮斐松-α或其衍生物；KU-55933或其衍生物；GSE56或其变体；KU-60019，BEZ235，渥曼青霉素，CP-466722，Torin 2，CGK 733，KU-559403，AZD6738或其衍生物；或者siRNA，shRNA，miRNA或反义DNA/RNA。
24.权利要求23的方法，其中所述抑制剂以约1-50μM的浓度添加至所述造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞。
25.根据权利要求19至24中任一项的方法，其中所述试剂包括编码至少一种腺病毒蛋白的核酸序列。
26.根据权利要求25的方法，其中所述至少一种腺病毒蛋白来自血清型5的腺病毒。
27.根据权利要求25或权利要求26的方法，其中所述至少一种腺病毒蛋白是E4ORF1，优选其中E4ORF1的氨基酸序列以SEQ ID No.1，57-76所示。
28.根据权利要求25或权利要求26的方法，其中所述至少一种腺病毒蛋白是E4ORF6/7，优选其中E4ORF6/7的氨基酸序列以SEQ ID No.2，77-107所示。
29.根据权利要求19至28中任一项的方法，其中所述试剂包括：腺病毒蛋白E4ORF1，优选其中E4ORF1的氨基酸序列以SEQ ID No.1，57-76所示；和腺病毒蛋白E4ORF6/7，优选其中E4ORF6/7的氨基酸序列以SEQ ID No.2，77-107所示。
30.根据权利要求19至29中任一项的方法，其中所述试剂包括：
(a)所述p53活化抑制剂和腺病毒蛋白E4ORF1，优选其中E4ORF1的氨基酸序列以SEQ IDNo.1，57-76所示；
(b)所述p53活化抑制剂和腺病毒蛋白E4ORF6/7，优选其中E4ORF6/7的氨基酸序列以SEQ ID No.2，77-107所示；或
(c)所述p53活化抑制剂，腺病毒蛋白E4ORF1，优选其中E4ORF1的氨基酸序列以SEQ IDNo.1，57-76所示，和腺病毒蛋白E4ORF6/7，优选其中E4ORF6/7的氨基酸序列以SEQ IDNo.2，77-107所示，优选其中所述p53活化抑制剂是GSE56或其变体。
31.根据权利要求25至30中任一项使用的方法，其中所述编码腺病毒蛋白的核酸是mRNA。
32.根据权利要求25至31中任一项的方法，其中所述腺病毒蛋白在所述造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞中瞬时表达。
33.根据权利要求19至32中任一项的方法，其中与基因编辑同时使所述造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体与所述促进同源定向DNA修复的试剂接触。
34.权利要求19至33中任一项的方法，其中所述造血干细胞和/或祖细胞群体获自动员的外周血、骨髓或脐带血。
35.权利要求19至34中任一项的方法，其包括富集所述造血干细胞和/或祖细胞群体的进一步步骤。
36.权利要求19至35中任一项的方法，其中所述基因编辑的靶标选自下组：CD40L、RAG-1、IL-2RG、CYBA、CYBB、NCF1、NCF2和NCF4，优选CD40L。
37.基因疗法的方法，其包括以下步骤：
(a)根据权利要求19至36中任一项的方法基因编辑造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体；和
(b)将所述基因编辑的造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞施用于受试者。
38.权利要求37的方法，其中所述基因编辑的细胞作为自体干细胞移植程序或同种异体干细胞移植程序的一部分施用于受试者。
39.根据权利要求19至38中任一项的方法制备的基因编辑的造血细胞、造血干细胞或造血祖细胞群体。
40.药物组合物，其包含权利要求39的基因编辑的造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体。
41.权利要求40的基因编辑的造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞群体，其在疗法中使用。
42.根据权利要求41使用的基因编辑的造血干细胞和/或造血祖细胞群体，其中所述群体作为自体干细胞移植程序或同种异体干细胞移植程序的一部分施用。
43.AAV载体，其包含条形码序列。
44.根据权利要求43的AAV载体，其中所述AAV载体还包含编码目标基因的核苷酸序列。
45.根据权利要求44的AAV载体，其中所述目标基因与启动子和/或聚腺苷酸化序列可操作地连接，任选地，其中所述条形码序列在所述聚腺苷酸化序列的下游。
46.根据权利要求43至45中任一项的AAV载体，其中所述AAV载体是AAV6载体。
47.根据权利要求43至46中任一项的AAV载体，其中所述AAV载体靶向安全港基因座，优选AAVS1基因座，IL2RG的内含子1，CD40L或RAG-1，最优选AAVS1基因座。
48.根据权利要求43至47中任一项的AAV载体，其中所述条形码序列是简并和/或随机序列，优选随机序列。
49.根据权利要求43至48中任一项的AAV载体，其中所述条形码序列的长度为20-40bp，优选长度为20-30bp，最优选长度为20-25bp或长度为约22bp。
50.根据权利要求43至49中任一项的AAV载体，其在基因疗法，优选造血基因疗法中使用。
51.根据权利要求43至48中任一项的AAV载体在克隆追踪已经使用所述AAV载体进行基因编辑的细胞中的用途。
52.用于细胞的克隆追踪的方法，其包括以下步骤：
(a)提供分离的细胞群体；
(b)通过用根据权利要求43至49中任一项的AAV载体转导来基因编辑所述分离的细胞群体；以及
(c)使用所述AAV载体的所述条形码序列克隆追踪所述基因编辑的细胞。
53.根据权利要求52的方法，其中所述方法还包括以下步骤：
扩增基因编辑的细胞的分离的群体；和/或
将所述基因编辑的细胞的分离的群体移植至受试者中。
54.根据权利要求52或权利要求53的方法，其中所述方法还包括：
从所述受试者收获血液和/或组织样品；
从所述血液和/或组织样品中分离基因组DNA；以及
定量所述基因组DNA中的所述条形码序列。
55.根据权利要求51的用途或者根据权利要求52至54中任一项的方法，其中所述细胞是造血细胞、造血干细胞和/或造血祖细胞。
56.根据权利要求51或55的用途或者根据权利要求52至55中任一项的方法，其中所述细胞是人细胞和/或所述受试者是人。
57.根据权利要求51、55或56中任一项的用途或者根据权利要求52至56中任一项的方法，其中所述细胞是CD34+细胞。
58.根据权利要求54至57中任一项的方法，其中每天、每周、每两周或每月收获血液和/或组织样品。
59.根据权利要求54至58中任一项的方法，其中至少1、2、3、4、8、12、24、36或48周后收获血液和/或组织样品。
60.根据权利要求54至59中任一项的方法，其中所述样品是血液样品。
61.根据权利要求54至60中任一项的方法，其中定量所述条形码包括以下步骤：
(i)PCR扩增所述条形码序列
(ii)测序所述PCR扩增的条形码序列。
62.条形码序列在克隆追踪细胞中的用途。
63.根据权利要求62的用途，其中所述条形码序列是简并和/或随机序列，优选随机序列。
64.根据权利要求62或权利要求63的用途，其中所述条形码序列的长度为20-40bp，优选长度为20-30bp，最优选长度为20-25bp或长度为约22bp。
CN201980055217.3A 2018-06-25 2019-06-25 基因疗法 Pending CN112601812A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18305807.2 2018-06-25
EP18305807 2018-06-25
PCT/EP2019/066915 WO2020002380A1 (en) 2018-06-25 2019-06-25 Gene therapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112601812A true CN112601812A (zh) 2021-04-02

Family

ID=62904395

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980055217.3A Pending CN112601812A (zh) 2018-06-25 2019-06-25 基因疗法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20210260216A1 (zh)
EP (1) EP3810638A1 (zh)
JP (1) JP2021529184A (zh)
KR (1) KR20210030941A (zh)
CN (1) CN112601812A (zh)
AU (1) AU2019294294A1 (zh)
CA (1) CA3104948A1 (zh)
IL (1) IL279685A (zh)
SG (1) SG11202012978VA (zh)
WO (1) WO2020002380A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20230365996A1 (en) 2020-10-12 2023-11-16 Ospedale San Raffaele S.R.L. Replacement of rag1 for use in therapy
IL312062A (en) 2021-10-12 2024-06-01 Fond Telethon Ets Polynucleotides useful for correcting mutations in the RAG1 gene
GB202114972D0 (en) 2021-10-19 2021-12-01 Ospedale San Raffaele Srl Gene therapy
WO2024073606A1 (en) * 2022-09-28 2024-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibody resistant modified receptors to enhance cell-based therapies
WO2024112945A1 (en) * 2022-11-23 2024-05-30 Csl Behring L.L.C. Methods for enhancing editing efficiency - ii

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998001563A2 (en) * 1996-07-05 1998-01-15 Branton Philip E Adenovirus e4 proteins for inducing cell death
WO2003099859A2 (de) * 2002-05-27 2003-12-04 Per Sonne Holm Neue verwendung von adenoviren und dafür codierenden nukleinsäuren
WO2004035616A2 (de) * 2002-10-15 2004-04-29 Per Sonne Holm Adenovirus mit umgekehrter reihenfolge der expression von genen und verwendung davon
WO2005052143A2 (de) * 2003-11-14 2005-06-09 Per Sonne Holm Neue adenoviren, dafür codierende nukleinsäuren und deren verwendung
WO2005051430A1 (de) * 2003-11-14 2005-06-09 Per Sonne Holm Neue verwendung von adenoviren und dafür codierenden nukleinsäuren
US20160333377A1 (en) * 2015-05-13 2016-11-17 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Enhancing endonuclease based gene editing in primary cells
WO2018083606A1 (en) * 2016-11-01 2018-05-11 Novartis Ag Methods and compositions for enhancing gene editing

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5723315A (en) 1996-08-23 1998-03-03 Genetics Institute, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
DE69729007T2 (de) 1996-08-07 2005-04-07 Darwin Discovery Ltd., Slough Hydroxamsäure- und carbonsäure-derivate mit mmp und tnf hemmender wirkung
US6126939A (en) 1996-09-03 2000-10-03 Yeda Research And Development Co. Ltd. Anti-inflammatory dipeptide and pharmaceutical composition thereof
DE69703974T2 (de) 1996-10-17 2001-07-19 Oxford Biomedica (Uk) Ltd., Oxford Retrovirale vektoren

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998001563A2 (en) * 1996-07-05 1998-01-15 Branton Philip E Adenovirus e4 proteins for inducing cell death
WO2003099859A2 (de) * 2002-05-27 2003-12-04 Per Sonne Holm Neue verwendung von adenoviren und dafür codierenden nukleinsäuren
CN1655827A (zh) * 2002-05-27 2005-08-17 佩尔·松内·霍尔姆 腺病毒和编码其的核酸的新应用
CN101843641A (zh) * 2002-05-27 2010-09-29 佩尔·松内·霍尔姆 腺病毒和编码其的核酸的新应用
WO2004035616A2 (de) * 2002-10-15 2004-04-29 Per Sonne Holm Adenovirus mit umgekehrter reihenfolge der expression von genen und verwendung davon
WO2005052143A2 (de) * 2003-11-14 2005-06-09 Per Sonne Holm Neue adenoviren, dafür codierende nukleinsäuren und deren verwendung
WO2005051430A1 (de) * 2003-11-14 2005-06-09 Per Sonne Holm Neue verwendung von adenoviren und dafür codierenden nukleinsäuren
US20160333377A1 (en) * 2015-05-13 2016-11-17 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Enhancing endonuclease based gene editing in primary cells
CN108136047A (zh) * 2015-05-13 2018-06-08 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 提高原代细胞中基于核酸内切酶的基因编辑
WO2018083606A1 (en) * 2016-11-01 2018-05-11 Novartis Ag Methods and compositions for enhancing gene editing

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAROLINE Y. KUO等: "Site-Specific Gene Editing of Human Hematopoietic Stem Cells for X-Linked Hyper-IgM Syndrome", CELL REPORTS, vol. 23, no. 9, 29 May 2018 (2018-05-29), pages 2606, XP055554129, DOI: 10.1016/j.celrep.2018.04.103 *
GIULIA SCHIROLI等: "Preclinical modeling highlights the therapeutic potential of hematopoietic stem cell gene editing for correction of SCID-X1", SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE, vol. 9, no. 411, 11 October 2017 (2017-10-11), pages 1, XP055567383, DOI: 10.1126/scitranslmed.aan0820 *
孙婷;罗砚曦;阎辉;: "腺病毒E4orf4蛋白诱导的肿瘤特异性细胞死亡及其在癌症治疗中的应用", 中国生物化学与分子生物学报, no. 10, 20 October 2018 (2018-10-20), pages 1045 - 1051 *
秦臻;刘霞;: "肿瘤靶向治疗的新思路", 中国肿瘤生物治疗杂志, no. 06, 20 December 2014 (2014-12-20), pages 712 - 720 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA3104948A1 (en) 2020-01-02
AU2019294294A1 (en) 2021-02-11
SG11202012978VA (en) 2021-01-28
US20210260216A1 (en) 2021-08-26
IL279685A (en) 2021-03-01
JP2021529184A (ja) 2021-10-28
WO2020002380A1 (en) 2020-01-02
EP3810638A1 (en) 2021-04-28
KR20210030941A (ko) 2021-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112601812A (zh) 基因疗法
JP6691048B2 (ja) 方法
US11964027B2 (en) Method for improving retroviral transduction and gene editing in hematopoietic stem cells using cyclosporine h (CsH)
CA3235572A1 (en) Gene therapy
US20220056484A1 (en) Selection by means of artificial transactivators
US20240218330A1 (en) Compositions for improving the transduction of cells by viral vectors
JP7320950B2 (ja) 遺伝子治療
WO2023209225A1 (en) Gene therapy

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination