TW202246494A - 基因改造肝細胞群 - Google Patents

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邁克爾 福爾摩斯
茗琇 莊
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格倫 邁克希爾
凱倫 佛
斐 易
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Abstract

本揭露提供基因改造肝細胞及/或肝細胞前驅細胞群及其產生方法。亦提供了使用該等基因改造肝細胞及/或前驅細胞群之方法，諸如但不限於治療一個個體或複數個個體的一種病況或複數種病況。在一些情況下，該群體的基因改造肝細胞及/或肝細胞前驅細胞係低免疫原性的，並且該等方法包含產生低免疫原性肝細胞及/或其前驅細胞之方法。亦提供了含有植入的基因改造肝細胞及/或肝細胞前驅細胞群之非人類哺乳動物。亦提供了有用之套組、系統、試劑、細胞及細胞療法劑量。

Description

基因改造肝細胞群
相關申請案之交叉引用
本申請案主張於2021年1月26日申請之美國臨時專利申請案第63/141,769號之權益，該申請案以全文引用的方式併入本文中。
本揭露提供基因改造肝細胞及/或肝細胞前驅細胞群及其產生方法。
僅在美國就有超過100,000名急性肝病患者及超過50萬名失代償期肝硬化患者。肝病在美國每年造成62,000人死亡，在全球造成約200萬人死亡，其中130萬人特別係死於肝硬化。截至2019年，肝硬化係全球第11位最常見的死亡原因，在美國位列係第12位主要原因。全世界約有20億人飲酒，另有約20億成年人肥胖或超重，4億成年人患有糖尿病。飲酒、肝臟脂質沈積及胰島素抵抗均被認為係發生纖維化及最終肝硬化的主要風險因素。此外，藥物誘發的肝損傷不斷增加，成為急性肝炎的主要原因，同時病毒性肝炎的全球流行率仍然很高。
此外，在傳染病死亡率不高的已開發世界，遺傳性病症雖然個別情況下很罕見，但總體上係兒童疾病、殘疾及死亡之一個重要負擔。據估計，多達6%的人在其生命中的某個階段受到單基因疾病的影響。遺傳性病症廣泛地包含可歸因於單個遺傳基因座的疾病（亦即「單基因病症」，包含單基因疾病）以及可歸因於多種遺傳風險因素的集合及/或與某些環境因素的組合的多基因病症。量化遺傳性疾病的總負擔係困難的，雖然已知許多致病基因座，但遺傳諮詢在降低總體盛行率方面的影響微乎其微，也許降低5%（儘管在堅持不懈地應用篩查時對某些疾病非常有效）（參見例如Blencowe等人 《社區遺傳學雜誌（ J Community Genet）》 .2018）。遺傳性疾病包含許多罕見的肝病，諸如苯丙酮尿症、鳥胺酸胺甲醯基轉移酶缺乏症、精胺酸酶-1缺乏症、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、黏多醣貯積病、A型血友病、B型血友病及其類似疾病。遺傳性疾病的巨大集體負擔，加上遺傳諮詢在減輕彼負擔方面的影響很小，體現了此等疾病對全球健康的相當大的持續影響。
肝移植在可行且成功的情況下係一種改變生活的療法，係第二大最常見的實體器官移植。肝移植可用於後天性及遺傳性肝病。然而，對於病情迅速惡化，諸如急性肝衰竭的個體，通常無法以所需的數量或及時獲得合適的肝臟。與上述廣泛的疾病盛行率相比，美國每年進行的肝移植不到9,000例。
儘管最近在免疫抑制劑及使用免疫抑制劑的治療方案方面取得了進展，但排斥仍然係肝移植的常見併發症。根據一些措施，急性同種異體移植排斥的發生率在肝移植的20%到40%之間。預測肝移植排斥反應以及移植後發病率及死亡率之方法係初步的，且此等方法的預測能力係有爭議的。隨著肝移植接受者免疫抑制方案的改進，急性及慢性排斥反應的發生率有所下降。雖然急性排斥反應通常對改進的方案有很好的反應，但慢性排斥反應係一個更困難的情況，因為很大一部分患者對增加的免疫抑制沒有反應，通常導致再移植或死亡。此外，儘管由於改進的免疫抑制方案而取得了進展，但許多患者由於合併症而不能耐受免疫抑制劑，或者由於現有的禁忌症而不能安全地投予免疫抑制劑。
本揭露提供基因改造肝細胞及/或肝細胞前驅細胞群及其產生方法。亦提供了使用該等基因改造肝細胞及/或前驅細胞群之方法，諸如但不限於治療一個個體或複數個個體的一種病況或複數種病況。在一些情況下，該群體的基因改造肝細胞及/或肝細胞前驅細胞係低免疫原性的，並且該等方法包含產生低免疫原性肝細胞及/或其前驅細胞之方法。亦提供了含有植入的基因改造肝細胞及/或肝細胞前驅細胞群之非人類哺乳動物。亦提供了有用之套組、系統、試劑、細胞及細胞療法劑量。
本揭露提供基因改造肝細胞及/或肝細胞前驅細胞群及其產生方法。亦提供了使用該等基因改造肝細胞及/或前驅細胞群之方法，諸如但不限於治療一個個體或複數個個體的一種病況或複數種病況。在一些情況下，該群體的基因改造肝細胞及/或肝細胞前驅細胞係低免疫原性的，並且該等方法包含產生低免疫原性肝細胞及/或其前驅細胞之方法。亦提供了含有植入的基因改造肝細胞及/或肝細胞前驅細胞群之非人類哺乳動物。亦提供了有用之套組、系統、試劑、細胞及細胞療法劑量。
在更詳細地描述本發明之前，應理解，本發明不限於所描述之特定實施例，且因此當然可變化。亦應理解，本文所用之術語僅用於描述特定實施例之目的，且不意欲為限制性的，此係因為本發明之範疇僅受隨附申請專利範圍限制。
在提供一定範圍之值之情況下，應理解，除非上下文另外清楚規定，否則至下限單位之十分之一之在彼範圍之上限及下限與彼所陳述範圍內任何其他陳述值或中間值之間的各中間值均涵蓋於本發明內。此等較小範圍之上限及下限可獨立地包含在較小範圍內，且亦涵蓋於本發明內，受限於所陳述範圍內之任何特定排除之限值。在所陳述範圍包含限值中之一或兩個之情況下，排除彼等所包含限值中之任一個或兩個之範圍亦包含在本發明內。
某些範圍在本文中以術語「約」開頭的數值呈現。術語「約」在本文中用於為其前面的確切數字以及接近或近似於該術語前面的數字的數字提供字面支持。在確定一個數字是否接近或近似於具體列舉的數字時，接近的或近似的未列舉的數字可以係在其呈現的上下文中提供具體列舉的數字的實質等效的數字。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域之一般技術者通常所理解之含義相同之含義。儘管與本文所述之方法及材料類似或等效之任何方法及材料亦可用於本發明之實踐或測試中，但現描述代表性說明性方法及材料。
本說明書中所引用之所有公開案及專利均以引用之方式併入本文中，如同特定地且單獨地指示各個別公開案或專利以引用之方式併入一般，且以引用之方式併入本文中以結合所引用之公開案揭示且描述方法及/或材料。對任何公開案之引用係關於其在申請日期之前之揭示內容，且不應解釋為承認本發明未經授權藉助於先前發明將所述公開案之日期提前。此外，所提供之公開案之日期可能與可能需要獨立確認之實際公開案日期不同。
應注意，除非上下文另外清楚規定，否則如本文及隨附申請專利範圍中所用之單數形式「一（a/an）」及「該」包含複數提及物。應進一步注意，可撰寫排除任何視情況選用之要素的請求項。因此，此陳述意欲與對所主張要素之敍述結合充當使用諸如「僅僅（solely）」、「僅（only）」及其類似者之排他性術語或意欲充當使用「否定性」限制之前提基礎。
如本領域中熟習此項技術者在閱讀本揭露後將清楚的，本文所述且說明之個別實施例中之各者具有離散組成部分及特點，該等組成部分及特點可容易地與任何其他若干實施例之特點分離或組合，而不脫離本發明之範疇或精神。任何所列舉之方法可按所列舉之事件之次序或按邏輯上可能之任何其他次序實施。
儘管為了語法上的流暢性及功能上的解釋，已經或將要對設備及方法進行描述，但應明確理解，除非根據35 USC §112明確表述，否則不得將申請專利範圍解釋為必須以任何方式藉由「手段」或「步驟」限制的解釋進行限制，而應根據司法均等論給予申請專利範圍所提供的定義的全部範圍的意義及等效物，並且在根據35 USC §112明確制定申請專利範圍的情況下，應根據35 USC §112給予完全法定等同物。 定義
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域之一般技術者通常所理解之含義相同之含義。以下的定義在適用時亦旨在包含其各種語法形式。如本文所用，單數形式「一個（a/an）」或「該」包含複數指示物，除非上下文另有明確規定。因此，例如，對「一個細胞」的提及包含複數個此類細胞，對「該試劑」的提及包含對本領域中熟習此項技術者已知的一種或多種試劑的提及，等等。
與參考數值相關的術語「約」可以包含自該值加減10%的值範圍。例如，量「約10」包含自9至11的值，包含9、10及11的值。與參考數值相關的術語「約」亦可以包含自該值加減10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的值範圍。
在描述本揭露的具體實施例之前，闡述用於描述本揭露的定義將係有幫助的。
術語「評定」包含任何形式的量測，並且包含確定要素是否存在。術語「確定」、「量測」、「評估」、「評定」及「分析」可互換使用，且包含定量及定性確定。評定可以係相對的或絕對的。
術語「對照」、「對照分析」、「對照樣本」及其類似術語係指實驗或診斷程序或實驗設計的樣本、測試或其他部分，其預期結果係非常確定的，例如，為了表明自相關實驗樣本獲得的結果是否可靠，表明相關實驗結果指示真實結果的信賴度，及/或允許對實驗結果進行校準。例如，在一些情況下，對照可以係「陰性對照」分析，從而排除分析的必要組成部分，使得實驗者可以高度確定陰性對照分析不會產生陽性結果。在一些情況下，對照可以係「陽性對照」，使得特定分析的所有組成部分均經表徵，並且已知當其組合在一起時，會在所進行的分析中產生特定結果，使得實驗者可以高度確定陽性對照分析不會產生陽性結果。對照亦可以包含「空白」樣本、「標準」樣本（例如，「黃金標準」樣本）、經過驗證的樣本等。
術語「接受體」、「個體（individual）」、「個體（subject）」、「宿主」及「患者」在本文中可互換使用，且係指需要、指示或已進行診斷、治療或療法的任何哺乳動物個體，諸如人類個體。用於治療目的之「哺乳動物」係指被歸類為哺乳動物的任何動物，包含人類、家畜及農畜，以及動物園、運動或寵物動物，諸如狗、馬、貓、牛、綿羊、山羊、豬、駱駝等。在一些實施例中，哺乳動物係人類。在一些情況下，本揭露之方法可用於實驗動物、獸醫應用及/或開發動物模型，包含但不限於嚙齒動物，包含小鼠、大鼠及倉鼠；兔子、狗、貓、非人類靈長類動物及其他動物。
如本文所用，術語「疾病」及「病況」可以互換使用或可以不同，因為特定的病或病症可能沒有已知的致病因素（因此病因尚未研究出來），因此其尚未被確認為一種疾病，而只是一種非所期望的狀況或症候群，其中臨床醫生已經確定了一組或多或少的具體症狀。
本文使用的術語「治療（treatment/treating/treat）」及其類似術語通常係指獲得所期望的藥理學及/或生理學效果。該效果可以係預防性的，亦即完全或部分預防疾病或其一種或多種症狀，及/或可以係治療性的，亦即部分或完全穩定或治癒疾病及/或歸因於該疾病的不利影響。例如，預防性治療（preventative treatment），亦即預防性治療（prophylactic treatment），可以包含有效預防病況（例如肝臟病況）的治療或有效預防或控制病況（例如肝臟病況）進展的治療。在一些情況下，治療可產生治療反應，諸如完全反應或部分反應。術語「治療」涵蓋對哺乳動物，特定言之人類之疾病的任何治療，並且包含：（a）防止疾病及/或一種或多種症狀在可能易患該疾病或一種或多種症狀但尚未被診斷出患有該疾病或一種或多種症狀的個體中發生；（b）抑制疾病及/或一種或多種症狀，亦即阻止疾病及/或相關症狀的發展；或（c）緩解疾病及相關一種或多種症狀，亦即引起疾病及/或一種或多種症狀消退。
需要治療的個體可以包含已經患病的個體（例如，患有病況的個體、患有肝臟病況（例如，急性肝臟病況、慢性肝臟病況等）的個體、患有肝硬化的個體、患有纖維化的個體、患有疾病的個體、患有單基因疾病的個體等）以及期望預防的個體（例如，對病況（例如肝臟病況）的易感性增加的個體；懷疑患有病況（例如肝臟病況）的個體；患病況（例如肝臟病況）風險增加的個體；對導致病況（例如肝臟病況）的實踐或因素的環境暴露增加的個體；懷疑有病況（例如肝臟病況）的遺傳或行為傾向的個體；患有病況（例如肝臟病況）的個體；篩查結果表明病況（例如肝臟病況）風險增加的個體；病況（例如肝臟病況）測試呈陽性的個體；對病況（例如肝臟病況）的一種或多種生物標誌物測試呈陽性的個體等）。
治療性治療係個體在施藥前患病的治療，而預防性治療係個體在施藥前未患病的治療。在一些實施例中，個體具有增加的患病可能性或被懷疑具有增加的患病可能性（例如，相對於標準，例如，相對於普通個體，例如，個體可能具有對病況的遺傳易感性及/或表明風險增加的家族史），在此類情況下，治療可以係預防性治療。
如本文用於描述核酸分子的術語「重組」意謂基因體、cDNA、病毒、半合成及/或合成來源之多核苷酸，該多核苷酸由於其來源或操縱與自然界中與之相關的全部或部分多核苷酸序列不相關。在蛋白質或多肽方面使用的術語重組意謂由重組多核苷酸表現產生的多肽。在宿主細胞或病毒方面使用的術語重組意謂其中已引入重組多核苷酸的宿主細胞或病毒。重組在本文中在材料（例如細胞、核酸、蛋白質或載體）方面亦用於指該材料已藉由引入異源材料（例如細胞、核酸、蛋白質或載體）而經改造。重組核酸、多核苷酸、細胞及其類似物在本文中可稱為工程化核酸、工程化多核苷酸、工程化細胞及其類似物。
如本文可互換使用的術語「核酸」及「多核苷酸」係指任何長度的核苷酸的聚合形式，無論是核糖核苷酸還是脫氧核糖核苷酸，包含其類似物。此等術語僅指分子的一級結構。因此，此術語包含雙股及單股DNA、三聯體DNA以及雙股及單股RNA。其亦包含例如藉由甲基化及/或藉由加帽改造及未改造形式之多核苷酸。該術語亦意謂包含了包含非天然存在的或合成的核苷酸以及核苷酸類似物的分子。核酸及多核苷酸之非限制性實例包含線性及環狀核酸、信使RNA（mRNA）、cDNA、重組多核苷酸、載體、探針、引子、單股、雙股或多股DNA或RNA、基因體DNA、DNA-RNA雜合體；化學或生化改造、非天然或衍生的核苷酸鹼基；含有改造或非天然核苷酸鹼基的寡核苷酸（例如，鎖核酸（LNA）寡核苷酸）及干擾RNA。在一些情況下，多核苷酸可以係自存在於生物體基因體中的相應序列中排除至少一些非編碼序列的連續開讀框多核苷酸。
術語「多肽（polypeptide）」可與術語「多肽（polypeptides）」及「蛋白質」互換使用，且係指胺基酸殘基的聚合物。多肽包含基本上任何長度的功能性蛋白質片段以及全長蛋白質。如本文所用，術語「肽」通常係指40個或更少胺基酸的多肽鏈。「肽治療劑」係具有既定治療功能的肽。「治療性多肽」係具有既定治療功能的多肽。在一些實施例中，多肽及肽，包含治療性多肽及肽，可以自轉殖基因表現。
如本文所用，術語「轉導」一般係指使用病毒載體將外源核酸引入細胞中，且如本文所用，術語「轉染」一般係指藉由非病毒方法將核酸引入細胞之過程。然而，在整體揭露之一些情況下，術語「轉導」及「轉染」可以互換使用，此對於習知技術者來說將係顯而易見的。在一些情況下，使用術語轉導可以排除核酸的非病毒遞送。在一些情況下，使用術語轉染可以排除核酸的病毒遞送。
術語「病毒顆粒」、「病毒」及其類似術語係指感染性病毒因子，包含例如桿狀病毒顆粒、慢病毒顆粒、腺病毒顆粒、及其類似物。病毒及病毒顆粒可以係天然存在的、重組的、工程化的、或合成的。
「載體」能夠將基因序列轉移至目標細胞中。通常，「載體構築體」、「表現載體」及「基因轉移載體」意謂能夠指導感興趣的基因或其他所期望表現產物的表現並且可以將核酸序列轉移至目標細胞的任何核酸構築體。因此，該術語包含選殖及表現載體，以及整合載體。「載體」或「表現載體」亦可以指複製子，諸如質體、噬菌體、病毒或黏接質體，另一個核酸區段，亦即「插入物」可以連接至其上以在細胞中實現所連接區段的表現及/或複製。
如本文所用，術語「逆轉錄病毒」係指將其基因體RNA逆轉錄成線性雙股DNA拷貝並隨後將其基因體DNA共價整合至宿主基因體中的RNA病毒。逆轉錄病毒係基因遞送的常用工具。例示性逆轉錄病毒包含但不限於：莫洛尼鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus，M-MuLV）、莫洛尼鼠肉瘤病毒（MoMSV）、哈維鼠肉瘤病毒（Harvey murine sarcoma virus，HaMuSV）、鼠乳房腫瘤病毒（MuMTV）、長臂猿白血病病毒（GaLV）、貓白血病病毒（FLV）、泡沫病毒（Spumavirus）、弗里德鼠白血病病毒（Friend murine leukemia virus）、鼠幹細胞病毒（MSCV）及勞斯肉瘤病毒（Rous Sarcoma Virus，RSV）及慢病毒。
如本文所用，術語「慢病毒」係指一組（或屬）複雜的逆轉錄病毒。例示性慢病毒包含但不限於：HIV（人類免疫缺乏病毒；包含HIV 1型及HIV 2型）；維斯納-梅迪病毒（visna-maedi，VMV）病毒；山羊關節炎-腦炎病毒（CAEV）；馬傳染性貧血病毒（EIAV）；貓免疫缺乏病毒（FIV）；牛免疫缺乏病毒（BIV）；及猴免疫缺乏病毒（SIV）。在一些實施例中，可以使用基於HIV的載體骨架（亦即，HIV順式作用序列元件）。
如本文所述，可以使用逆轉錄病毒載體，更特定言之，慢病毒載體。如本文所用，術語「逆轉錄病毒」或「逆轉錄病毒載體」意欲分別包含「慢病毒」及「慢病毒載體」。此外，當提及特定類型的逆轉錄病毒或載體，例如慢病毒或慢病毒載體時，習知技術者將容易理解，在一些情況下，其他逆轉錄病毒及/或其他逆轉錄病毒載體及/或逆轉錄病毒通常及/或逆轉錄病毒載體通常可以替代具體列舉的病毒或載體。
如本文所用，術語「生物反應器」通常係指用於在受控條件下生產活生物體或細胞，或自中合成及收集產物的設備、機器或系統。可以製造生物反應器，諸如由鋼、玻璃、塑膠或其他材料製成的一次性或可重複使用的器皿，並組態為維持適合所期望生物活性的受控且視情況均質的環境。所製造的生物反應器可以包含各種控制機制，包含但不限於例如溫度控制器、pH控制器、氣體控制器及交換器（例如，用於控制氧氣、二氧化碳及/或其他氣體含量）及其類似控制機制，其可以包含感測器及致動器的組合以讀取特定信號並驅動信號調整。所製造的生物反應器之非限制性實例包含攪拌罐、搖晃器、氣升式、固定床、旋轉壁、及灌注生物反應器。所製造的生物反應器組件之非限制性實例包含攪拌器、葉輪、鼓泡器、探針、無菌密封件、擋板、進料管線、排放管線、通風孔、加熱器、冷卻器、及其類似組件。生物反應器可用於生長非附著細胞及附著細胞。生物反應器的尺寸範圍可以很大，包含但不限於，例如，15 mL體積或更小至2000 L體積或更大，並且在一些實例下，可以在1公升或幾公升至10、20、50、或100 L或更大的範圍內。生物反應器的進一步描述，包含商業供應商之實例，由Stephenson等人 《F1000研究（ F1000Research）》 (2018)提供；該文獻之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。除了所製造的生物反應器之外，術語生物反應器亦包含活體動物或活體內生物反應器。
如本文所用，術語「活體生物反應器」、「動物生物反應器」及「活體內生物反應器」通常係指活體非人類動物，諸如非人類哺乳動物，向其中引入了外源細胞，諸如肝細胞生成細胞（亦即，產生肝細胞的細胞，諸如肝細胞及/或肝細胞前驅細胞）用於植入及擴增。動物生物反應器可用於產生所期望細胞的擴增群體（其可以包含引入的細胞及/或其後代），諸如由引入的細胞產生的擴增之肝細胞群。將外源細胞，諸如肝細胞生成細胞引入生物反應器通常將涉及異種移植，因此，移植的外源細胞在一些情況下可稱為異種移植物，例如人對嚙齒動物的異種移植物、人對小鼠的異種移植物、人對大鼠的異種移植物、人對豬的異種移植物、小鼠對大鼠的異種移植物、大鼠對小鼠的異種移植物、嚙齒動物對豬的異種移植物等。在一些情況下，可以同種異體移植至生物反應器中，例如嚙齒動物對嚙齒動物、豬對豬等的同種異體移植。生物反應器可以例如在遺傳及/或藥理學上經組態以賦予引入的外源細胞，諸如引入的外源肝細胞生成細胞以選擇優勢，以促進其植入及/或擴增。在一些情況下，生物反應器可以經組態以防止對引入的外源細胞產生排斥，包含但不限於例如經由遺傳及/或藥理學免疫抑制進行。因此，活體內生物反應器可經受外部操縱，例如，經由調節動物的環境、飲食及/或投予一種或多種試劑，例如，以促進植入、防止排斥、防止感染、保持健康等。
術語「離體」用於指在自生物體獲得的樣本（例如 ，組織或細胞等）中或對其進行的處理、實驗及/或量測，該處理、實驗及/或量測在生物體外部的環境中進行。因此，應用於細胞的術語「離體操縱」係指在生物體之外對細胞（例如肝細胞）的任何處理，包含但不限於培養細胞、對細胞進行一種或多種基因改造及/或將細胞暴露於一種或多種試劑。因此，本文可以使用離體操縱來指在動物體外進行的細胞處理，例如在自動物或其器官（例如肝臟）獲得此類細胞之後以及在將此類細胞移植至動物，諸如動物生物反應器或有需要之個體中之前。與「離體」相反，如本文所用，術語「活體內」可指動物或其器官內的細胞，諸如由於在個體內產生細胞及/或將細胞移植至個體中，因此處於個體或其肝臟內的細胞（例如，肝細胞及/或肝細胞前驅細胞）。
如本文所用，術語「收集」，例如當其指擴增的人類肝細胞時，係指自動物（例如，非人類哺乳動物、嚙齒動物、小鼠、大鼠或豬生物反應器）中取出擴增之肝細胞的過程，該動物已經注射或移植了分離的人類肝細胞或其他肝細胞生成細胞，如本文所述。在一些情況下，接受細胞移植之非人類動物，例如基因改造細胞，亦可以稱為接受體動物。在一些情況下，接受移植，例如擴增的基因改造肝細胞的人類個體可以被稱為經治療個體、接受體或其類似者。收集視情況包含將細胞，例如肝細胞自其他細胞類型中分離出來，該等其他細胞類型包含但不限於例如非肝細胞類型（例如血細胞、肝外免疫細胞、血管細胞等）、非肝細胞的肝細胞（例如，肝星狀細胞、柯弗氏細胞（Kupffer cell）及肝竇內皮細胞）。
如本文所用，「冷凍保存的」係指已藉由冷卻至零以下低溫，諸如77 K或-196℃（液氮的沸點）來保存或維持的細胞（諸如肝細胞）或組織。在此等低溫下，任何生物活動，包含會導致細胞死亡的生化反應，均會被有效地阻止。有用的冷凍保存及解凍冷凍保存細胞的方法以及與之相關之製程及試劑包含但不限於例如美國專利第10370638號、第10159244號、第9078430號、第7604929號、第6136525號及第5795711號中描述之彼等；該等專利之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。相反，如本文所用的關於細胞的術語「新鮮」可指尚未冷凍保存且例如可能在自個體或其器官收集之後直接獲得及/或使用（例如，移植、培養等）的細胞。
術語「存活」用於指在活體外或活體內繼續存活的細胞，例如在某些事件之後，諸如移植至動物中、與免疫細胞共培養、與特定試劑接觸等。細胞存活率可使用各種方法評定，包含直接評定（諸如，定性或定量量測含有或預期含有感興趣的細胞的樣本中的細胞生存力）及間接評定（諸如定性或定量量測活細胞存在的一種或多種功能後果）。對細胞（例如，肝細胞）存活率的有用的直接及間接讀出可以包含但不限於，細胞計數（例如，經由血球計、免疫組織化學、流動式細胞測量術等）、量測分泌因子或生物標誌物（例如，經由蛋白質（例如白蛋白）ELISA、西方墨點（Western blot）等）、評定接受體的健康（例如藉由量測生命體徵、功能測試（例如肝功能測試）等）及其類似方法。術語「存活」亦用於指個體，例如患有肝病的個體或其動物模型，在一些治療、干預及/或攻擊後繼續存活的時間長度，該治療、干預及/或攻擊諸如為向個體投予或移植細胞（例如，肝細胞），向個體投予引起疾病（例如，肝病）的藥劑，停用會抑制、延遲、避免或預防疾病（例如，肝病）發展的藥劑。存活率當其指個體時亦可以用群體（如對照組或治療組）在一些治療、干預及/或攻擊後在給定時間段內存活的部分（如百分比）來表示。如本文所用，熟習生物醫學領域的技術者將很容易看出本文所使用的存活率與什麼，例如細胞或個體有關。
術語「植入」係指將細胞或組織植入動物中。如本文所用，人類肝細胞在接受體動物中的植入係指人類肝細胞在投予（例如，注射）後在接受體動物中被植入（例如，在肝臟中）的過程。在某些條件下，植入的人類肝細胞能夠在接受體動物中擴增。如本文所用，與人類肝細胞相關的術語「擴增」係指允許細胞分裂發生以使得人類肝細胞數目增加的過程。術語「活體內擴增」係指允許外源細胞在活宿主（例如，非人類動物生物反應器，諸如嚙齒動物（例如，小鼠或大鼠）生物反應器、豬生物反應器、大鼠生物反應器或其類似生物反應器）中發生細胞分裂的過程，使得活宿主內的外源細胞數目增加。例如，移植至非人類動物生物反應器中的人類肝細胞可在生物反應器內經歷活體內擴增，使得生物反應器內人類肝細胞的數目增加。
術語「肝細胞」係指通常占肝臟細胞質質量的70-80%的一類細胞。肝細胞參與蛋白質合成、蛋白質儲存及碳水化合物的轉化，膽固醇、膽汁鹽及磷脂的合成，以及外源性及內源性物質的解毒、改造及排泄。肝細胞亦啟動膽汁的形成及分泌。肝細胞製造血清白蛋白、纖維蛋白原及凝血因子的凝血酶原組，且係合成脂蛋白、血漿銅藍蛋白、轉鐵蛋白、補體及醣蛋白的主要場所。此外，肝細胞具有代謝、解毒及不活化藥物及殺蟲劑等外源性化合物及類固醇等內源性化合物的能力。
「有效量」或「有效的量」係指化合物及/或細胞在投予（例如，投予於哺乳動物，例如人類，或哺乳動物細胞，例如人類細胞）時足以實現指定的結果（例如，植入、擴增、治療等）的量。例如，「有效量」，諸如「治療有效量」係指本揭露的化合物及/或細胞在投予於哺乳動物，例如人類時足以在哺乳動物，例如人類中實現治療的量。構成「治療有效量」的本揭露的組合物的量將根據化合物及/或細胞、病況及其嚴重程度、投予方式及待治療哺乳動物的年齡而變化，但可以由本領域中一般技術者在考慮到其自身知識及揭示案的情況下按常規確定。 方法、組合物、細胞群及動物
本揭露包含方法、組合物、細胞群及動物，其包含、產生或用於製造或使用基因工程化肝細胞或其前驅細胞。本揭露的基因改造肝細胞可以包含整合的轉殖基因，其編碼基因產物及/或編輯的內源基因座，包含例如內源基因座或其中的基因或基因的一部分（例如，外顯子）的消融或「剔除」。如本文更詳細描述的，基本上任何基因產物均可以由轉殖基因編碼及/或基本上任何基因座可以作為編輯的目標。基因改造肝細胞的產生及最終產生之肝細胞的特徵以及包含所產生之肝細胞的細胞群會有所不同。
在進行本文所述的研究之前，尚不清楚基因改造肝細胞，諸如本文所述之彼等，是否可以在接受體活體內生物反應器的肝臟中產生及擴增，以產生含有大量具有所期望基因改造之肝細胞的治療性細胞群，此對於細胞療法係必需的。仍然未知的是，此類細胞，例如，經改造以編碼異源基因產物及/或包含所描述的基因改變的細胞，是否將有效地植入及重新填充生產生物反應器，諸如大鼠及豬生物反應器，以促進產生包含大量基因改造肝細胞的有用的擴增群體。
在異種移植的情況下，與內源性肝細胞相比，異源肝細胞通常處於生存劣勢。此外，用基因編輯試劑進行基因改造可能對群體細胞產生負面影響，該等群體細胞實際上例如在一個或多個原本正常的內源基因座經編輯及/或經編輯以包含整合的轉殖基因，導致增殖減少、細胞表型損失、細胞脆弱性增加及其類似影響。此等影響可以減少所期望基因改造細胞在細胞群，包含例如為細胞療法或細胞療法生產目的而製造或使用的細胞群中的代表性。此等負面影響，單獨或與宿主免疫反應等其他過程相結合，在採用習知技術時，由於（不受理論約束）內源性細胞超過了引入的基因改造細胞，即使在使用宿主預適應來促進移植物植入的情況下，亦會導致移植的編輯細胞沒有充分的植入、擴增、恢復及/或損失。因此，如本文所示，出乎意料地發現，經由使用本文描述之方法，可以產生含有大量攜帶所期望基因改造的擴增肝細胞的細胞群。此外，令人驚訝地發現，在異種移植及活體內生物反應器擴增之前及之後，工程化細胞群中具有所期望基因改造的肝細胞百分比基本保持不變，此表明在未改造及改造細胞的宿主內具有相當的適應性。
在一些實施例中，基因改造肝細胞可以藉由使含有肝細胞及/或肝細胞前驅細胞的細胞群與包含轉殖基因的整合載體接觸來產生。整合載體以及細胞與整合載體接觸的條件通常經組態為使得轉殖基因在功能上整合至細胞群之肝細胞或肝細胞前驅細胞中。在一些實施例中，可以藉由同源定向修復（HDR）或其他DNA修復過程整合轉殖基因，包含例如經由使用核酸酶促進HDR或其他修復過程，諸如但不限於例如鋅指核酸酶（ZFN）、TAL效應核酸酶（TALEN）、CRISPR相關（Cas）蛋白或其類似物。
為了產生低免疫原性肝細胞，肝細胞及/或其前驅細胞被基因改造以包含編碼自然殺手（NK）細胞誘餌受體的轉殖基因。因此，本文提供了描述編碼NK細胞誘餌受體的轉殖基因的功能整合的具體實例。然而，本揭露不受此限制，並且習知技術者將容易理解，可以使用任何其他感興趣的序列，例如，替換、改造或添加至所描述的轉殖基因中，以提供基本上任何合適及適當的編碼基因產物的功能整合。因此，本文對編碼特定基因產物（諸如NK誘餌受體）的特定轉殖基因的描述將很容易理解為亦對轉殖基因的使用進行了一般性的描述，該轉殖基因基本上編碼任何基因產物。
例如，為了產生可用於治療單基因疾病的工程化肝細胞，肝細胞及/或其前驅細胞被基因改造以包含編碼在單基因疾病中被破壞的基因產物的功能形式的轉殖基因。用於功能整合至基因改造肝細胞及/或肝細胞前驅細胞中以治療單基因疾病的轉殖基因之非限制性實例可以包含彼等編碼以下各者之全長及/或改造及/或變異體形式的轉殖基因：因子IX、因子VIII、馮威里氏因子（von Willebrand factor）、胺甲醯基磷酸合成酶（CPS1）、N-乙醯麩胺酸合成酶（NAGS）、鳥胺酸胺甲醯基轉移酶（OTC）、α-半乳糖苷酶A基因（GLA）、苯丙胺酸羥化酶（PAH）、精胺酸酶-1、α-1抗胰蛋白酶（AAT）、反丁烯二醯乙醯乙酸水解酶（FAH）及其類似物及其組合（包含例如融合物及/或多或雙順反子型式）。
如本文所用，「功能整合」通常意指將轉殖基因整合至細胞基因體中，從而表現編碼的基因產物。編碼基因產物的表現可以全部或部分地由細胞的內源組分或轉殖基因中包含的外源（包含異源）組分控制。例如，在一些情況下，編碼基因產物的表現可以由位於或靠近轉殖基因插入的基因體基因座處的一種或多種內源性調控元件控制，例如啟動子、強化子等。在一些情況下，編碼基因產物的表現可以由一種或多種外源（包含異源）調節元件控制，例如啟動子、強化子等，該等調節元件存在於轉殖基因中，並且在插入之前可操作地連接至編碼基因產物。轉殖基因的整合使細胞，諸如肝細胞或肝細胞前驅細胞，被基因改造，例如，產生基因改造肝細胞或基因改造肝細胞前驅細胞。
轉殖基因的功能整合可以經由多種方式達成，包含經由使用整合載體，包含病毒及非病毒載體。在一些情況下，可以使用逆轉錄病毒載體，例如慢病毒載體。在一些情況下，可以使用非逆轉錄病毒整合載體。整合載體可以在合適的轉導培養基中以合適的濃度（或感染複數）與所靶向的細胞接觸一段合適的時間以使載體感染目標細胞，從而促進轉殖基因的功能整合。
合適的培育及/或轉導（及/或在適用時轉染）時間，例如在合適的培養基中，會有所不同。在一些情況下，合適的培育（或轉導及/或轉染）時間可以係8小時或更短、短於8小時、6小時或更短、短於6小時、5小時或更短、短於5小時、4小時或更短、短於4小時、3小時或更短、短於3小時、2小時或更短。在一些情況下，培育（或轉導及/或轉染）可以在攪拌下進行。可以採用各種攪拌方法，包含但不限於例如搖動，諸如水平搖動/振盪、旋擺，以及以合適的速度及轉導溫度諸如在或大約37℃下進行的類似運動。在一些情況下，8小時或更短、短於8小時、6小時或更短、短於6小時、5小時或更短、短於5小時、4小時或更短、短於4小時、3小時或更短、短於3小時、2小時或更短的培育（或轉導及/或轉染）時間可以防止、限制或以其他方式減輕對所處理細胞的有害影響，例如，經由增強的轉導及/或轉染效率及/或提高的活力（例如，與更長的時間相比），提高所期望的基因改造細胞的數目。
在一些實施例中，用於轉殖基因的功能整合及/或如本文所述的編輯組合物的組分的遞送的有用方法可以包含病毒載體。病毒載體可以係整合的或非整合的。有用的病毒載體之非限制性實例包含逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒（Ad）載體、腺相關病毒（AAV）載體、雜合Ad-AAV載體系統及其類似載體。在一些情況下，病毒載體可用於本文所述方法的其他態樣，例如遞送基因編輯組分，諸如編碼核酸酶（例如ZFN、TALEN、Cas蛋白等）的核酸、核酸酶（例如，ZFN、TALEN、Cas等）蛋白、Cas9編碼核酸、Cas9蛋白、引導RNA（gRNA）、核糖核蛋白（RNP）及其類似組分。
在一些實施例中，用於轉殖基因的功能整合及/或如本文所述的編輯組合物的組分的遞送的有用方法可以包含非病毒載體。有用的非病毒載體會有所不同，通常係指不使用病毒顆粒的遞送方式，通常可以認為分為三類：裸核酸、基於顆粒的（例如，奈米顆粒）或基於化學的。非病毒載體之非限制性實例包含脂質體複合物（lipoplex）（例如，基於陽離子脂質的脂質體複合物）、乳劑（諸如，脂質奈米乳劑）、脂質奈米顆粒（LNP）、固體脂質奈米顆粒、基於肽的載體、基於聚合物的載體（例如，聚合物體（polymersome）、聚合體複合物（polyplex）、基於聚乙烯亞胺（PEI）的載體、基於聚葡萄胺糖的載體、基於聚(DL-丙交酯)（PLA）及基於聚(DL-丙交酯-共-醣苷)（PLGA）的載體、樹枝狀聚合物（dendrimer）、基於乙烯基的聚合物（例如，基於聚甲基丙烯酸酯的載體）及其類似物）、無機奈米顆粒及其類似物。在一些情況下，非病毒載體可用於本文所述方法的其他態樣，諸如遞送基因編輯組分，諸如編碼核酸酶（例如ZFN、TALEN、Cas蛋白等）核酸、核酸酶（例如，ZFN、TALEN、Cas等）蛋白、Cas9編碼核酸、Cas9蛋白、gRNA、RNP及其類似組分。
本揭露的細胞群通常包含肝細胞及/或肝細胞前驅細胞。在一些情況下，細胞群可以高度富集肝細胞及/或肝細胞前驅細胞。「高度富集」係指感興趣的細胞類型將占細胞組合物的70%或更多、75%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多，例如占細胞組合物的約95%或更多，或98%或更多。換言之，群體可以係感興趣的細胞類型的基本上純的組合物。在一些情況下，感興趣的細胞群可能包含粗製備物。在一些情況下，細胞群可以自解離的組織中製備，經過濾或未經過濾。含有肝細胞及/或肝細胞前驅細胞的細胞群可以例如取決於分離及/或製備之方法，包含或排除各種非肝細胞類型，包含但不限於，例如，肝非實質細胞（NPC）、非肝細胞的肝臟相關細胞（例如，星狀細胞、柯弗氏細胞、內皮細胞、膽管細胞等）、免疫細胞（例如，WBC）、RBC等。在一些情況下，細胞群可以係純的或基本上純之肝細胞及/或肝細胞前驅細胞製備物。
在一些情況下，細胞群可以自一種或多種哺乳動物肝臟製備，諸如人類肝臟、非人類哺乳動物肝臟、嚙齒動物肝臟、大鼠肝臟、小鼠肝臟、豬肝臟、非人靈長類動物（NHP）肝臟或其類似肝臟。在一些情況下，一個細胞群或多個細胞群，或工程化細胞，包含由多個細胞群構成的群體的所有工程化細胞，均可以源自或製備自單個人類肝臟，諸如單個屍體供體肝臟。細胞群的細胞可以係一個物種（例如，人類、小鼠、大鼠、豬、NHP等）的所有細胞，或者可以係兩種或更多種物種的混合物（亦即，異種混合物）。異種細胞混合物可以包含但不限於人類細胞與非人類細胞的混合物（例如人類-大鼠混合物、人類-小鼠混合物、人類-豬混合物、人類-NHP混合物、大鼠-小鼠混合物、大鼠-豬混合物等）。肝臟的來源會有所不同並且可以包含但不限於例如切除的肝組織、屍體人類肝臟、嵌合（例如人源化）肝臟、生物反應器肝臟及其類似物。根據任何方便之方法及/或包含任何方便之方法，諸如但不限於例如解離、灌注、過濾、分選及其類似方法，可以自肝臟製備細胞群，包含整個肝臟及肝臟部分。
在一些情況下，細胞群的所有或基本上所有的細胞，包含細胞群的所有或基本上所有之肝細胞或人類肝細胞，可以源自單個供體肝臟或單個供體肝臟的一部分。在一些情況下，細胞群的細胞，包含細胞群的全部或基本上全部之肝細胞或人類肝細胞，可以源自多個不同的供體肝臟或多個不同的供體肝臟的一部分。在一些情況下，多個細胞群可源自單個供體肝臟，包含例如其中自單個人類供體肝臟收集的初代人類肝細胞擴增許多倍，包含2倍或更多倍、5倍或更多倍、10倍或更多倍、20倍或更多倍、50倍或更多倍、100倍或更多倍等以產生複數個細胞群，例如，可用於治療複數個個體。
在一些情況下，可以自培養之肝細胞及/或培養之肝細胞前驅細胞製備細胞群。在一些情況下，可以自初代肝細胞製備物製備細胞群，包含例如自包含初代人類肝細胞（PHH）的人類肝臟製備的細胞群。在某些實施例中，細胞群可以包含使用標準技術針對任何來源，例如自人類供體分離之肝細胞。在某些實施例中，肝細胞係自篩選的屍體供體分離的PHH，包含新鮮的PHH或冷凍保存的PHH。在一些情況下，細胞群的PHH自肝臟分離以來未經歷或經歷最少數目的細胞週期/分裂，包含但不限於例如1個或更少、2個或更少、3個或更少、4個或更少、5個或更少、6個或更少、7個或更少、8個或更少、9個或更少、10個週期/分裂或更少。
在一些情況下，含有肝細胞及/或肝細胞前驅細胞的細胞群可以自並非永生化細胞系或並非以其他方式基本上永久增殖的細胞系的細胞製備。例如，細胞群之肝細胞及/或肝細胞前驅細胞可以源自初代肝細胞及初代肝細胞的後代，包含例如初代肝細胞的非永生化後代。
在一些情況下，細胞群可以包含或可具體排除肝細胞前驅細胞。如本文所用，術語「肝細胞前驅細胞」及「肝細胞的前驅細胞」或其類似術語通常係指衍生肝細胞的細胞及/或分化成肝細胞的細胞。在一些情況下，肝細胞前驅細胞可能係定向前驅細胞，意味著前驅細胞將基本上僅分化為肝細胞。在一些情況下，肝細胞前驅細胞可能具有不同的效力並且可以係例如富潛能、多潛能或全潛能前驅細胞。肝細胞前驅細胞可以包含或衍生自幹細胞、誘導性富潛能幹細胞（iPSC）、胚胎幹（ES）細胞、肝細胞樣細胞（HLC）及其類似物。在一些情況下，肝細胞前驅細胞可以衍生自成熟肝細胞及/或其他非肝細胞，例如經由肝細胞的去分化及/或其他肝或非肝細胞類型的轉分化。
本揭露的細胞群或亞群的細胞，包含肝細胞的擴增細胞群，可以衍生自多個個別細胞或由多個個別細胞轉變而來，包含例如自單個供體獲得的多個個別肝細胞或自多個供體獲得的多個個別肝細胞。當初代細胞群來源於單個供體時，此等多個個別細胞基本上共享相同的供體基因體，但並非選殖衍生的，亦並非單株的，並且在一些情況下可能含有彼此之間的某些差異，包含例如不同的遺傳變異、不同的表觀遺傳變異、供體肝臟中的不同分區、基因表現的差異等。因此，與選殖衍生的細胞群相比，自複數個個別初代肝細胞（包含來自單個供體或多個供體的初代肝細胞）擴增而來的細胞群可以稱為非單株，或者在一些情況下，此類擴增的細胞可以稱為多株或非選殖擴增的。在一些情況下，可以對群體個別初代肝細胞（或其後代）進行本揭露的基因改造以產生工程化肝細胞的非單株群體，並且可以擴增此類細胞以產生非單株工程化肝細胞的擴增群體。在一些情況下，肝細胞群可擴增以產生基本上多株群體，隨後對該多株群體進行基因改造以產生非單株工程化肝細胞的擴增群體。
在一些情況下，肝細胞及/或肝細胞前驅細胞，及/或此等肝細胞及/或肝細胞前驅細胞所源自的肝臟、個體及/或細胞培養物可以係健康肝細胞及/或肝細胞前驅細胞。如本文所用，「健康肝細胞及/或肝細胞前驅細胞」係指細胞呈現出正常之肝細胞表型及/或基因型，基本上沒有功能及/或遺傳缺陷或缺損或會影響正常肝臟及/或肝細胞相關功能的功能及/或遺傳缺陷或缺損。肝細胞相關功能包含主要或專門由肝臟中之肝細胞執行的彼等功能，諸如肝臟代謝（例如肝細胞代謝）、氨代謝、胺基酸代謝（包含生物合成及/或分解代謝）、解毒、肝蛋白（例如白蛋白、纖維蛋白原、凝血酶原、凝血因子（例如因子V、VII、IX、X、XI及XII）、蛋白C、蛋白S、抗凝血酶、脂蛋白、血漿銅藍蛋白、轉鐵蛋白、補體蛋白）合成。肝細胞及/或肝細胞前驅細胞可以在如本文所述的基因改造之前、期間及/或之後係健康的。例如，在一些情況下，在對細胞進行基因改造，例如以功能性整合異源轉殖基因及/或改造一個或多個內源基因座之前及之後，肝細胞及/或肝細胞前驅細胞可以係健康細胞。在一些情況下，肝細胞及/或肝細胞前驅細胞在校正有缺陷的疾病相關對偶基因或基因座之後係健康的。
健康肝細胞及/或肝細胞前驅細胞通常會排除彼等具有與肝臟相關的單基因疾病相關的遺傳異常的細胞，包含但不限於例如遺傳性膽汁鬱積病症、威爾遜病（Wilson's disease）、遺傳性血色素沉著症、酪胺酸血症、α1抗胰蛋白酶缺乏症、尿素循環障礙、克利格勒-納傑爾症候群（Crigler-Najjar syndrome）、家族性類澱粉多發性神經病變、原發性高草酸鹽尿症1型、非典型溶血性尿毒症症候群-1及其類似疾病。因此，健康肝細胞及/或肝細胞前驅細胞可以在與肝臟相關單基因疾病相對應的基因座及/或基因處含有正常基因/對偶基因（亦即，非疾病相關基因/對偶基因，亦即不含有疾病相關基因/對偶基因），諸如但不限於ABCB11（BSEP）、AGXT、ARG、ASL、ASS、ATP7B、ATP8B1（亦稱為FIC1）、CFH、CPS、FAH、HAMP、HFE、JAG1、JH、MDR3（ABCB4）、NAGS、OTC、PI、SLC40A1、TFR2、TTR、UGT1A1及其類似基因。與同肝臟相關的單基因疾病相對應的基因的進一步實例及描述可以見於Fagiuoli等人 《肝臟病學雜誌（ J Hepatol）》 (2013) 59(3):595-612；該文獻之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。具有與肝臟相關的單基因疾病相關的一種或多種遺傳異常的細胞在本文中可以被稱為「疾病」、「患病的」、「疾病相關的」、「功能異常的」或「有缺陷的」細胞等。
細胞群，包含肝細胞及/或肝細胞前驅細胞，可以在活的生物體之外，亦即離體，以各種方式進行操縱。此類操縱可以包含或在一些情況下具體排除冷凍、解凍、培養、過濾、富集、純化、分離、轉染、轉導及其類似操縱。在一些情況下，若細胞被冷凍，則將細胞解凍並放置在任何合適的器皿或培養容器中。在一些情況下，細胞在有或沒有額外的組分的情況下在合適的培養基中培養。
可以使用各種合適的培養基。在某些實施例中，培養基包括肝細胞基礎培養基、FBS及/或ROCK抑制劑，例如肝細胞基礎培養基及Lonza HCM™ Single Quots™、5% FBS及10 μM Rho激酶（ROCK）抑制劑的1:1混合物。各種肝細胞相容培養基均可用的，包含但不限於例如Liebovitz L-15、最低必需培養基（MEM）、DMEM/F-12、RPMI 1640、韋茅斯氏MB 752/1威廉姆斯培養基E（Waymouth's MB 752/1 Williams Medium E）、H 1777、肝細胞解凍培養基（HTM）、凍存肝細胞恢復培養基（CHRM®）、人類肝細胞培養基（Millipore Sigma）、人類肝細胞接種培養基（Millipore Sigma）、人類肝細胞解凍培養基（Millipore Sigma）、Lonza HCM™、Lonza HBM™、HepatoZYME-SFM（Thermo Fisher Scientific）、Cellartis Power初代HEP培養基（Cellartis）及其類似培養基。各種培養補充劑及/或受質可以包含在所期望培養基中或自所期望培養基中排除，包含但不限於例如Lonza Single Quots™補充劑、HepExtend™補充劑、胎牛血清、ROCK抑制劑、地塞米松、胰島素、HEGF、氫化可體松、L-麩醯胺酸、GlutaMAX™、緩衝液（例如，HEPES、碳酸氫鈉緩衝液等）、轉鐵蛋白、硒複合物、BSA、亞麻油酸、膠原、膠原酶、Geltrex™、甲基纖維素、二甲基亞碸、玻尿酸酶、抗壞血酸、抗生素及其類似物。肝細胞相容培養基可以係一般用途的或專門為初級、次級或永生化肝細胞調配的培養基，且此類培養基可含有血清或生長因子，或組態為無血清、無生長因子或具有最少/減少的生長因子。
在一些情況下，包含肝細胞及/或肝細胞前驅細胞的細胞群可以經歷離體操縱，包含但不限於如在美國專利申請案第16/938,059號（美國專利公開案20210024885）及PCT專利申請案第PCT/US2020/043439號（WO2021/021612A1）中所描述之離體操縱；該等申請案之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。此類離體操縱可以在進行時在本文描述之方法中的各個時候使用，諸如但不限於例如在分離之後、移植至生物反應器之前、在投予於個體（例如，以治療個體之病況）之前，及其類似時候。
在一些情況下，新鮮製備之肝細胞及/或肝細胞前驅細胞，或含有肝細胞及/或肝細胞前驅細胞的細胞群，可以與各種試劑、組合物及/或載體，包含例如編碼基因產物的轉殖基因、編輯組合物及其類似物接觸。此類新鮮製備的細胞可以包含新鮮解凍的細胞（例如，若先前冷凍保存）、自活的個體（例如，人類、嚙齒動物、豬等）新鮮分離的細胞，自肝臟或其部分（例如，屍體肝臟或其部分，自活體內生物反應器獲得的肝臟（或其部分））新鮮分離的細胞，或其類似細胞。
可以產生含有複數個基因改造細胞的細胞群，包含其中此類細胞包含單個基因改造或多個改造。例如，在一些情況下，可以產生包含複數個已經基因改造為低免疫原性之肝細胞及/或肝細胞前驅細胞的細胞群，且因此該群體可以包含複數個低免疫原性肝細胞及/或肝細胞前驅細胞。複數個細胞相對於總細胞群的大小可以變化。例如，在一些情況下，複數個細胞可以包括少於該群體的所有細胞，包含但不限於例如，其中複數個細胞構成至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的細胞群。在一些情況下，複數個細胞可以構成特定細胞群的全部或100%。
在一些情況下，細胞群可以包含複數個經改造為低免疫性的細胞，其中例如就總細胞群而言，複數個細胞構成至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的細胞群。
在一些情況下，細胞群可以包含複數個經改造以包含特定轉殖基因的細胞，其中例如就總細胞群而言，複數個細胞構成至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的細胞群。
在一些情況下，在生物反應器中擴增之前及/或之後的細胞群可以包含至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的所期望基因改造肝細胞。在一些情況下，在生物反應器中擴增之前及之後，輸入及輸出細胞群可以各自包含具有所期望基因改造的複數個細胞，其中輸入及輸出群體中的複數個細胞可以包括彼此相差30%或更小、25%或更小、20%或更小、15%或更小、10%或更小、或5%或更小的總輸入及輸出群體的百分比。
可以將含有肝細胞及/或肝細胞前驅細胞，包含基因改造肝細胞及/或肝細胞前驅細胞的細胞群引入或移植至個體中，包含例如用於治療目的之人類或非人類個體，用於擴增及/或研究目的之非人類個體，及其類似個體。當在充分條件下進行時，引入個體之肝細胞及/或肝細胞前驅細胞可以植入，包含植入至個體的肝臟中。在一些情況下，例如經由使用囊封技術可以防止植入。可以經由各種方法遞送非植入治療細胞，包含但不限於例如將囊封之肝細胞施加至腹膜內空間、網膜囊及/或其他合適的位置。
可以採用將肝細胞及/或肝細胞前驅細胞引入肝臟的任何合適之方法。在一些實施例中，將肝細胞及/或肝細胞前驅細胞引入肝臟包括將肝細胞遞送至接受體之脾臟中。在一個非限制性實例中，肝細胞及/或肝細胞前驅細胞可以經由脾注射（例如，剖腹脾注射或經皮脾注射）被引入肝臟。
本揭露亦包含非人類動物，其包含本文所述的植入的肝細胞及/或肝細胞前驅細胞群，包含此類植入的細胞存在於非人類動物的肝臟中的情況。例如，在一些情況下，非人類動物可以包含植入的基因改造肝細胞及/或肝細胞前驅細胞群，包含例如其中植入的細胞可以被基因改造為低免疫原性的，包含治療性轉殖基因，或兩者。有用之非人類動物包含非人類哺乳動物，諸如但不限於嚙齒動物、鼠類動物（例如大鼠、小鼠）、兔類動物（例如兔子）、非人類靈長類動物、犬科動物、貓科動物、有蹄類動物（例如馬、牛、綿羊、豬、山羊）等。
在一些情況下，非人類動物可以用作活體內生物反應器。包含肝細胞及/或肝細胞前驅細胞的細胞群可以藉由移植至活體內生物反應器中並在適合移植細胞擴增之條件下維持生物反應器來擴增。合適的活體內生物反應器包含但不限於例如嚙齒動物生物反應器，諸如小鼠生物反應器及大鼠生物反應器、豬生物反應器及其類似生物反應器。
適合肝細胞擴增的動物生物反應器會有所不同。在某些實施例中，動物在一個或多個基因座處被基因改造。基因改造可以包含剔除或減量以產生在一個或多個基因座處有缺陷的動物或活化一個或多個目標基因。可以以任何組合在多個基因座處進行基因改造（一種或多種抑制性改造及/或一種或多種活化性改造）。活體內生物反應器中有用的基因改造可以包含各種基因的改造，包含免疫基因（例如，導致免疫缺乏）、肝功能基因（例如，導致肝功能缺陷）、代謝基因（例如，導致代謝缺陷）、胺基酸分解代謝基因（例如，導致胺基酸分解代謝不足）及其類似基因。
在某些實施例中，有用的基因改造動物係反丁烯二醯乙醯乙酸水解酶（fah）缺陷型動物，例如美國專利第8,569,573號、第9,000,257號及美國專利公開案第20160249591號中所述，該等專利的揭示內容以全文引用的方式併入本文中。FAH係催化酪胺酸分解代謝的最後一步的代謝酶。具有Fah基因純合缺失的動物展現出肝臟mRNA表現改變及嚴重的肝功能障礙。Fah基因的點突變亦顯示出會導致肝衰竭及產後死亡。缺乏Fah的人類會發展為肝病遺傳性酪胺酸血症1型（HT1）並發展為肝衰竭。Fah缺乏會導致反丁烯二醯乙醯乙酸（一種強效氧化劑）的積累，且此最終導致缺乏Fah之肝細胞的細胞死亡。因此，可以用來自其他物種（包含人類）的含有功能性 fah基因之肝細胞重新填充Fah缺陷動物。許多不同物種的Fah基因體、mRNA及蛋白質序列係公開可用的，諸如在GenBank資料庫中（參見例如基因ID 29383（大鼠Fah）；基因ID 14085（小鼠Fah）；基因ID 610140（狗FAH）；基因ID 415482（雞FAH）；基因ID 100049804（馬FAH）；基因ID 712716（恆河猴FAH）；基因ID 100408895（狨猴FAH）；基因ID 100589446（長臂猿FAH）；基因ID 467738（黑猩猩FAH））；及Gene ID 508721（牛FAH））及其他物種中能容易經由生物資訊學識別的 fah基因體基因座。Fah缺陷動物可能包含基因改造的 fah基因座，並且可能包含或可能不包含在其他基因座處的進一步基因改造，包含例如其中此類動物（例如小鼠、豬或大鼠）缺乏FAH、RAG-1及/或RAG-2及IL-2Rγ（在一些情況下稱為「FRG」動物，如FRG小鼠、FRG豬或FRG大鼠）。
有用的基因改造亦包含導致免疫缺乏之彼等，例如，由於缺乏免疫系統的特定分子或細胞組分、免疫系統的特定分子或細胞組分的功能或其類似基因改造。在一些情況下，有用的遺傳改變包含重組活化基因1（Rag1）基因的遺傳改變。Rag1係參與活化免疫球蛋白V(D)J重組的基因。RAG1蛋白參與DNA受質的識別，但穩定的結合及切割活性亦需要RAG2。已顯示Rag-1缺陷動物沒有成熟的B及T淋巴細胞。在一些情況下，有用的遺傳改變包含重組活化基因2（Rag2）基因的遺傳改變。Rag2係參與免疫球蛋白及T細胞受體基因座重組的基因。Rag2基因缺陷的動物不能進行V(D)J重組，導致功能性T細胞及B細胞完全喪失（參見例如Shinkai等人 細胞《（Cell）》 68:855-867, 1992）。在一些情況下，有用的遺傳改變包含介白素受體的共同γ鏈（Il2rg）的遺傳改變。Il2rg係編碼介白素受體的共同γ鏈的基因。Il2rg係許多介白素受體的組分，包含IL-2、IL-4、IL-7及IL-15（參見例如Di Santo等人 《美國國家科學院院刊（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）》 92:377 -381, 1995）。缺乏Il2rg的動物展現出B細胞及T細胞減少並且缺乏自然殺手細胞。Il2rg亦可稱為介白素2受體γ鏈。
在一些情況下，動物可能受到免疫抑制，包含例如經由投予一種或多種免疫抑制劑實現免疫抑制的情況。可以使用任何合適的免疫抑制劑或有效實現動物免疫抑制的藥劑。免疫抑制劑之實例包含但不限於FK506、環孢素A（cyclosporin A）、氟達拉賓（fludarabine）、黴酚酸酯（mycophenolate）、普賴蘇（prednisone）、雷帕黴素（rapamycin）及硫唑嘌呤（azathioprine.）。亦可以投予免疫抑制劑的組合。在一些情況下，使用免疫抑制劑代替遺傳免疫缺乏。在一些情況下，免疫抑制劑與遺傳免疫缺乏聯合使用。
如本文所概述的，基因改造動物可以包含一種或多種（亦即，組合的）基因改造。例如，此類動物可以包含rag1基因改造、rag2基因改造、IL2rg基因改造，或者此類動物可以包含rag1或rag2基因改造及Il2rg基因的遺傳改變，使得遺傳改變相應地導致喪失功能性RAG1蛋白、RAG2蛋白、IL-2rg蛋白或RAG-1/RAG-2蛋白及IL-2rg蛋白的表現。在一個實例中，一種或多種遺傳改變包含Rag2基因的遺傳改變及Il2rg基因的遺傳改變。在一個實例中，一種或多種遺傳改變包含Rag1基因的遺傳改變及Il2rg基因的遺傳改變。在一些情況下，有用的遺傳改變包含例如SCID、NOD、SIRPα、穿孔素或裸的。改變的基因座可能係基因缺失（亦即剔除）或其他導致相應基因座處基因產物缺陷的改造。免疫系統的特定細胞（自然巨噬細胞或NK細胞）亦可能被耗乏。可以使用任何耗乏特定細胞類型的方便方法。
應當理解，為肝細胞異種移植物創建選擇性生長優勢的各種肝損傷模型可用於動物生物反應器（例如大鼠、小鼠、兔、豬）中，以促進肝細胞植入及擴增，包含但不限於誘導性損傷、選擇性栓塞、短暫性缺血、倒千里光鹼（retrorsine）、野百合鹼（monocrotoline）、硫代乙醯胺、用γ射線照射、四氯化碳及/或基因改造（例如，Fah破壞、uPA、TK-NOG（Washburn等人, 《胃腸學（Gastroenterology）》, 140(4):1334-44, 2011）、白蛋白AFC8、白蛋白白喉毒素、威爾遜病等）。亦可以使用肝損傷技術的組合。
在一些實施例中，在注射異源肝細胞之前，向動物投予編碼尿激酶基因（例如 ，尿激酶纖維蛋白溶酶原活化物（uPA））的載體（例如，Ad載體）。肝細胞中uPA的表現導致肝損傷，因此允許肝細胞異種移植物在移植後選擇性擴增。在一個實施例中，尿激酶基因係人類尿激酶並且可以係分泌的或非分泌的。參見例如美國專利第8,569,573號、第9,000,257號及美國專利公開案第20160249591號。
在一些情況下，TK-NOG肝損傷模型（亦即，白蛋白胸苷激酶轉殖基因-NOD-SCID-介白素共同γ鏈剔除）可用作本文所述的動物生物反應器。TK-NOG動物包含單純疱疹病毒胸苷激酶肝毒性轉殖基因，其可藉由投予更昔洛韋（ganciclovir）有條件地活化。在投予更昔洛韋期間由轉殖基因活化引起的肝損傷為肝細胞異種移植物提供了選擇性優勢，促進了將此類動物用作活體內生物反應器以擴增本文所述的移植肝細胞。
在一些情況下，AFC8肝損傷模型（特徵為具有由白蛋白啟動子驅動的FKBP-凋亡蛋白酶8基因）可用作本文所述的動物生物反應器。AFC8動物包含FK508-凋亡蛋白酶8融合肝毒性轉殖基因，其可以藉由投予AP20187有條件地活化。投予AP20187期間轉殖基因活化導致的肝損傷為肝細胞異種移植物提供了選擇性優勢，促進了使用此類動物作為活體內生物反應器以擴增本文所述的移植肝細胞。
在一些情況下，NSG-PiZ肝損傷模型（特徵為具有α-1抗胰蛋白酶（AAT）缺乏與免疫缺乏（NGS）相結合）可用作本文所述的動物生物反應器。NSG-PiZ動物的AAT分泌受損，導致錯誤摺疊的PiZ突變AAT蛋白的積累，從而引發肝細胞損傷。此類肝損傷為肝細胞異種移植物提供了選擇性優勢，促進了使用此類動物作為活體內生物反應器以擴增本文所述的移植肝細胞。免疫缺乏使動物能夠在沒有明顯排斥的情況下進行異種移植。
在一些情況下，可以對動物進行預處理以提高接受體肝臟支持移植細胞的能力。可以採用各種預處理方案，包含但不限於例如照射預處理（例如，部分肝臟照射）、栓塞預處理、缺血預處理、化學/病毒預處理（使用例如uPA、環磷醯胺、小紅莓（doxorubicin）、一氧化氮、倒千里光鹼、野百合鹼、有毒膽汁鹽、四氯化碳、硫代乙醯胺及其類似物）、肝切除預處理及其類似預處理。在一些情況下，可以在不存在預處理的情況下引入肝細胞生成細胞及/或程序將具體排除預處理方案或特定試劑的一種、全部或一些組合，包含例如本文所述的彼等中的一種或多種。在一些情況下，經由停止NTBC或投予更昔洛韋或AP20187誘導肝損傷可用於預處理。在採用時，預處理可以在肝細胞生成細胞移植之前的某個時間進行，包含數小時、數天或數週或更長時間，包含例如至少在移植前至少6小時、至少12小時、至少24小時、至少36小時、至少48小時、至少60小時、至少72小時、至少4天、至少5天、至少6天、至少一週或至少兩週。
在對動物進行視情況選用之預處理（例如 ，用uPA預處理）之後（例如 ，在預處理後24小時），可以經由任何合適之方法將異源肝細胞及/或肝細胞前驅細胞遞送至動物。在某些實施例中，將本文所述之肝細胞及/或肝細胞前驅細胞直接投予至肝臟（例如，經由門靜脈注射）及/或經由脾內注射，其中肝細胞及/或前驅細胞將穿過脈管系統到達肝臟。在某些實施例中，將1×10 5及1×10 9之間的任何數目（例如，5×10 5/小鼠、5-10×10 6/大鼠等）個肝細胞及/或肝細胞前驅細胞引入動物（例如，FRG動物）中，視情況進行預處理（例如，投予前24小時），例如，用腺病毒uPA（例如，1.25×10 9PFU/25公克小鼠體重）進行預處理。引入生物反應器中之肝細胞及/或肝細胞前驅細胞的數目會有所不同，並且例如視各種因素，包含接受細胞的動物的物種及大小而定，可以在1×10 5個或更少至1×10 9個或更多範圍內，包含但不限於例如，1×10 5個至1×10 9個、1×10 6個至1×10 9個、1×10 7個至1×10 9個、1×10 8個至1×10 9個、1×10 5個至1×10 6個、1×10 5個至1×10 7個、1×10 5個至1×10 8個、1×10 6個至1×10 7個、1×10 7個至1×10 8個、1×10 6個至1×10 8等。在一些情況下，投予的細胞數目可為1×10 9個或更少，包含例如0.5×10 9個或更少、1×10 8個或更少、0.5×10 8個或更少、1×10 7個或更少、0.5×10 7個或更少、1×10 6個或更少、0.5×10 6個或更少、1×10 5個或更少等。引入生物反應器（或通常為非人類動物）之肝細胞及/或肝細胞前驅細胞可能會有所不同，並且此類細胞對於生物反應器（或通常為非人類動物）可能係同種異體或異種的。
此外，可以視情況在移植之前、期間及/或之後將免疫抑制藥物給予動物以消除來自異種移植的異源肝細胞的動物（例如，小鼠、豬或大鼠）中的宿主抗移植物反應。在一些情況下，藉由在規定的時間段內使動物停止使用免疫抑制劑，肝細胞變得靜止，並且植入的細胞將具有增殖優勢，導致內源性肝細胞（例如 ，小鼠、豬或大鼠肝細胞）被替換為異源肝細胞（例如 ，人類肝細胞）。在人類肝細胞的情況下，此產生肝臟高度人源化的動物，亦即人源化肝臟。異源肝細胞重新填充量可以經由各種量度來確定，包含但不限於例如人類血清白蛋白含量的定量，視情況與來自移植動物的肝切片的免疫組織化學相關。
在一些實施例中，抑制、延遲、避免或預防肝病發展的藥劑在所投予之肝細胞擴增期間投予至動物生物反應器。在用健康的（例如，表現FAH的）異源肝細胞重新填充動物生物反應器（例如小鼠、大鼠或豬生物反應器）之前，投予此類試劑會避免（或防止）動物生物反應器（例如小鼠、大鼠或豬生物反應器）的肝功能障礙及/或死亡。藥劑可以係在與生物反應器相關的疾病模型中抑制肝病的任何化合物或組合物。一種此類試劑係2-(2-硝基-4-三氟-甲基-苯甲醯基)-1,3環己二酮（NTBC），但亦可以使用苯丙酮酸雙加氧酶的其他藥理學抑制劑，植入甲基-NTBC。投予NTBC以調節Fah缺陷動物肝病的發展。在Fah缺陷動物生物反應器中，劑量、給藥方案及/或投予方法可以根據需要進行調整及/或循環，以避免災難性肝功能障礙，同時促進肝細胞異種移植物的擴增。在一些實施例中，在如本文所述之肝細胞移植後向Fah缺陷動物投予NTBC至少兩天、至少三天、至少四天、至少五天或至少六天。在一些實施例中，進一步向Fah缺陷動物投予NTBC至少約一週、至少約兩週、至少約三週、至少約四週、至少約一個月、至少約兩個月，至少約三個月、至少約四個月、至少約五個月或至少約六個月。在一些實施例中，在肝細胞移植後約兩天、約三天、約四天、約五天、約六天或約七天停用NTBC（或另一種具有肝臟保護作用的化合物）。
投予於Fah缺陷動物的NTBC劑量可以變化。在一些實施例中，劑量為每天約0.5 mg/kg至約30 mg/kg，例如每天約1 mg/kg至約25 mg/kg、每天約10 mg/kg至每天約20 mg/kg，或每天約20 mg/kg。NTBC可以藉由任何合適的方式投予，諸如但不限於在飲用水中、在食物中或藉由注射。在一個實施例中，在飲用水中投予的NTBC濃度為約1至約30 mg/L，例如約10至約25 mg/L、約15至約20 mg/L、或約20 mg/L。在某些實施例中，NTBC投予係自移植前至移植後4至8週或更長時間循環的。
可以在移植後的任何時間段，包含但不限於7至180天（或其間的任何一天）或更長的時間後，自動物生物反應器收集源自移植之肝細胞及/或肝細胞前驅細胞的擴增之肝細胞。
在收集時，動物生物反應器的肝臟可以不同程度地重新填充引入之肝細胞、肝細胞前驅細胞及/或其後代（包含例如基因改造肝細胞、肝細胞前驅細胞及/或其後代）。例如，在一些情況下，重新填充的動物的肝臟可以被重新填充至少30%或更多，包含但不限於例如被重新填充至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。因此，在一些情況下，重新填充的動物之肝細胞可以包含至少30%或更多如本文所述的基因改造肝細胞，包含但不限於例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的基因改造肝細胞。因此，收集的細胞群可以包含相似百分比的基因改造肝細胞（包含引入的細胞（例如，基因改造肝細胞及/或肝細胞前驅細胞）及/或其後代），包含例如30%或更多、40%或更多、50%或更多、60%或更多、70%或更多、75%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、或95%或更多基因改造肝細胞。
在某些實施例中，在移植後28至56天（或其間的任何一天）收集擴增之肝細胞。在一些情況下，在1週、2週或更早、3週或更早、4週前、4週或更早、5週或更早、6週或更早、7週或更早、8週前、8週或更早、9週或更早、10週或更早、11週或更早、12週前、12週或更早、13週或更早、14週前、或14週或更早收集肝細胞。
此外，可以使用多種技術中的任何一種自動物收集擴增之肝細胞。例如，可以藉由動物肝臟的酶消化收集肝細胞，接著輕輕切碎、過濾及離心。此外，可以使用各種方法將肝細胞與其他細胞類型、組織及/或碎片分離，諸如藉由使用特異性識別植入的肝細胞物種的細胞類型的抗體。此類抗體包含但不限於特異性結合I類主要組織相容性抗原的抗體，諸如抗人類HLA-A、B、C（Markus等人. (1997) 《細胞移植（ Cell Transplantation）》 6:455-462）。接著可以藉由淘選（其利用連接至固體基質的單株抗體）、螢光活化細胞分選（FACS）、磁珠分離或其類似方法來分離抗體結合之肝細胞。亦可以使用收集肝細胞的替代方法。
在一些情況下，可以將收集之肝細胞連續移植一次或多次至另外的動物生物反應器中。連續移植可以在相同或不同物種的動物中進行兩次、三次、四次或更多次，例如使用大鼠、豬、小鼠或兔進行所有連續移植，或者使用合適的動物生物反應器的任何組合進行連續移植（一種或多種大鼠，一種或多種豬等）。
此外，在自動物生物反應器收集肝細胞之後，可以對肝細胞進行如本文所述的各種遺傳操縱。例如，自生物反應器收集之肝細胞可以在投予於個體之前進行基因改造，例如藉由引入轉殖基因及/或編輯一個或多個基因座。收集的及視情況分離的擴增之肝細胞可以新鮮使用或可以在使用前冷凍保存。
在某些實施例中，可以囊封肝細胞及/或肝細胞前驅細胞，包含基因改造肝細胞及/或肝細胞前驅細胞。可以使用任何方法囊封肝細胞及/或其前驅細胞，通常在投予於個體之前進行。參見例如 ，Jitraruch等人 (2014) 《公共科學圖書館：綜合（ PLOS One）》 9:10；Dhawan等人 (2020) 《肝臟病學雜誌》 72(5):877-884；Bochenek等人 .(2018) 《自然-生物醫學工程（ Nature Biomedical Engineering）》 2:810-821。細胞囊封在半透水凝膠內代表了一種基於細胞的療法的局部免疫隔離策略，無需全身免疫抑制。水凝膠球促進細胞功能所需的受質、營養物質及蛋白質的擴散，同時排除會排斥同種異體細胞的免疫細胞。海藻酸鹽球係研究最廣泛的細胞囊封材料之一，因為此種陰離子多醣在細胞友好條件下在二價陽離子存在下形成水凝膠。在一些情況下，例如，由於基因改造使肝細胞及/或肝細胞前驅細胞具有低免疫原性，可以在沒有囊封的情況下投予細胞，因此細胞可以在未囊封或裸露的情況下使用。
本文亦提供了去細胞肝臟或其他非細胞化支架（包含天然及合成支架），其用藉由本文所述方法產生之肝細胞及/或肝細胞前驅細胞群接種及/或重新填充。例如，可以將包含如本文所述的基因改造肝細胞及/或其前驅細胞的細胞群引入（有或沒有其他支持細胞類型）至去細胞肝臟或其部分或其他無細胞支架中，隨後將其維持在足以利用細胞群之肝細胞及/或由細胞群產生的肝細胞重新填充去細胞肝或其部分的條件下。
可以獲得肝臟，諸如人類肝臟或非人類哺乳動物，諸如豬，或其部分，並且視情況進行手術處理（例如，以分離肝臟的一個或多個部分或一個或多個肝葉）。接著藉由任何方便及適當的方式使肝臟或其部分去細胞，包含例如機械性細胞損傷、冷凍/解凍、插管及逆行灌注一種或多種去細胞試劑（例如，一種或多種蛋白酶（例如胰蛋白酶）、一種或多種核酸酶（例如DNA酶）、一種或多種界面活性劑（例如十二烷基硫酸鈉、Triton X-100或其類似物）、一種或多種低滲試劑、一種或多種高滲試劑、其組合或其類似物）。去細胞肝臟或其一部分可以儲存及/或預浸泡在肝細胞相容的培養基中。含有如本文所述的離體操縱的肝細胞生成細胞的細胞懸浮液接著可以藉由任何方便的機制，諸如注射、灌注、局部施加（例如，逐滴）或其組合施加至去細胞肝臟或其部分中。在一些情況下，離體操縱之肝細胞生成細胞可以任何方便及適當的濃度存在於細胞懸浮液中，以便接種至製備的支架中，包含例如每50 µL 1×10 5個或更少至1×10 7個或更多細胞的濃度，包含但不限於例如每50 µL 1-2×10 6個細胞。接種的去細胞肝臟、其部分及/或其他去細胞支架可以維持在適合之條件下以用於所引入的細胞的植入/附著及/或擴增，其中此等條件可以包含適合的濕度、溫度、氣體交換、營養物等。在一些情況下，可以將接種的肝臟、其部分及/或其他去細胞支架保持在合適的培養基中，亦即具有5% CO 2的37℃或約37℃的潮濕環境。在將接種的及/或產生之肝細胞附著及/或擴增至去細胞肝臟、其部分或其他去細胞支架上或在其內部擴增之後，該材料可以用於各種用途，包含例如移植至有需要之個體中，諸如肝功能下降及/或患肝病之人類個體。與肝臟（包含人類肝臟）的去細胞化以及肝細胞接受性無細胞支架的產生有關之方法及試劑描述於例如Mazza等人. 《科學報告（Sci Rep）》 5, 13079 (2015)；Mango等人. 《先進功能材料（Adv. Funct. Mater.）》2000097 (2020)；Shimoda等人. 《科學報告》 9, 1543 (2019)；Croce等人. 《生物分子（Biomolecules）》.2019, 9(12):813；以及美國專利第10,688,221號中，該等文獻之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。
藉由本文所述之方法產生的收集的細胞群及其治療或醫藥組合物可以存在於任何合適的容器（例如，培養器皿、試管、燒瓶、小瓶、冷凍管、冷凍袋等）中並且可以利用任何合適的遞送方法及/或裝置使用（例如，投予於個體）。此類肝細胞群及醫藥組合物可以新鮮製備及/或使用，或者可以冷凍保存。在一些情況下，肝細胞群及其醫藥組合物可以「即用（ready-to-use）」形式製備，包含例如，其中細胞存在於合適的稀釋劑及/或處於所期望的遞送濃度（例如，呈單位劑型形式）或易於稀釋至所期望遞送濃度的濃度（例如，用合適的稀釋劑或介質稀釋）。肝細胞群及其醫藥組合物可以遞送裝置或與期望的遞送機制或期望的遞送途徑相容的裝置的形式製備，諸如但不限於例如注射器、輸液袋或其類似物。
在一些情況下，本揭露包含複數個細胞療法劑量，例如，每個均容納在合適的容器中，包含例如，其中複數個劑量的基因改造肝細胞均衍生自、包含擴增自肝細胞群，該肝細胞群例如為主細胞庫，由單個人類供體肝臟創建。在一些情況下，本揭露包含複數個細胞療法劑量，例如，每個均容納在合適的容器中，包含例如，其中複數個劑量的基因改造肝細胞均衍生自、包含擴增自單個肝細胞群，該單個肝細胞群例如為主細胞庫，由複數個（例如，2個、2個或更多個、3個或更少個、3個、3個或更多個、4個或更少個、4個、4個或更多個、5個或更少個、5個、5個或更多個、6個或更少個、6個、6個或更多個、7個或更少個、7個、7個或更多個、8個或更少個、8個、8個或更多個、9個或更少個、9個、9個或更多個、10個或更少個、10個或更多個，等）人類供體肝臟創建。
可以經由多種方法產生複數個細胞療法劑量。在一些情況下，人類肝細胞被基因改造並且基因改造肝細胞在一個或多個活體內生物反應器中擴增以產生用於調配複數個劑量的基因改造人類肝細胞的擴增群體。在一些情況下，自一個或多個活體內生物反應器獲得的擴增的人類肝細胞被基因改造以產生用於調配複數個劑量的基因改造人類肝細胞的擴增群體。基因改造人類肝細胞的擴增群體可以藉由多種方式等分成複數個肝細胞療法劑量，並且可以產生含有多種不同數目之肝細胞的多種不同總量的單位劑量。例如，在一些情況下，可以產生至少2個劑量，包含例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、500、750或1000個單位劑量，包含例如，其中此等劑量各自包含例如至少1000萬、至少2500萬、至少5000萬、至少7500萬、至少1億、至少2.5億、至少5億、至少7.5億、至少10億、至少20億、至少30億、至少40億、至少50億、至少60億、至少70億、至少80億、至少90億、至少100億、至少150億、至少200億、至少300億、至少400億、至少500億、至少600億、至少700億、至少800億、至少900億、或至少1000億個肝細胞。
本揭露之方法可以包含用本文描述的細胞療法劑量治療複數個個體，包含在此類劑量中含有之肝細胞例如來源於單個人類供體肝臟或多個人類供體肝臟的情況。例如，在一些情況下，例如，其中複數個劑量包含至少10個劑量，每個劑量至少10億個（或至少100億個）肝細胞，此種方法可以包含用至少10個劑量治療至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個單獨的個體。在一些情況下，例如，其中複數個劑量包含至少100個劑量，每個劑量至少10億（或至少100億）個肝細胞，此種方法可以包含用至少100個劑量治療至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100個單獨的個體個體。此類劑量可以投予於有需要之個體，包含具有相同病況的多個個體以及具有不同病況的多個個體，以治療個體的病況。因此，經由採用本文所述之方法，需要治療的多個個體，並且在一些情況下許多個體，可以使用衍生自及擴增自單個人類供體肝臟收集的細胞群的基因改造肝細胞進行治療。
如上所述，肝細胞及/或肝細胞前驅細胞的基因改造可以包含編碼基因產物的轉殖基因的功能整合。基本上可以使用任何編碼的基因產物。編碼的基因產物可以係蛋白質的重組形式，包含例如原核或真核蛋白質，諸如哺乳動物（例如人類、非人類靈長類動物、豬、大鼠、小鼠等）或非哺乳動物蛋白質、蛋白質片段、肽、合成蛋白質、融合蛋白質等，或非編碼核酸，及其類似物。
在一些情況下，細胞群之肝細胞及/或肝細胞前驅細胞可以被基因改造以表現一種或多種免疫抑制蛋白，包含例如T細胞抑制蛋白、NK細胞抑制蛋白或其類似物。例如，在一些情況下，肝細胞及/或肝細胞前驅細胞可以被基因改造以包含編碼基因產物的轉殖基因，該基因產物係NK細胞誘餌受體。如本文所用，術語「NK細胞誘餌受體」通常係指哺乳動物（例如人類）蛋白受體或其部分、重組或合成受體或其部分或其類似物，其當在細胞表面上表現時，提供免於被NK細胞殺傷的保護，例如，藉由充當NK抑制性受體（諸如，KIR、HLA-cl I特異性受體、NKG2抑制性受體（例如，CD94/NKG2A異二聚體、NKG2B受體）、LIR-1、檢查點受體、SIRPα、PD-1（CD279）、Siglec-7（CD328）、IRP60（CD300a）、Tactile（CD96）、IL1R8、TIGIT、TIM-3、NKG2A/KLRD1（CD159a/CD94）、KIR2DL1（CD158a）、KIR2DL2/3（CD158b）、（CD158d）a、KIR2DL5（CD158f）、KIR3DL1（CD158e1）、KIR3DL2（CD158k）、ILT2/LIR-1（CD85J）、LAG-3（CD223）及類似物）的配位體。NK細胞抑制受體可以係HLA特異性或非HLA特異性的，因此，NK細胞誘餌受體包含HLA衍生的多肽及非HLA衍生的多肽。
有用的NK細胞誘餌受體之非限制性實例包含但不限於例如HLA I類蛋白及其片段（例如HLA 1a類蛋白（例如HLA-A、HLA-B、HLA-C）及其片段、HLA 1b類蛋白質（HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H）及其片段）、合成的HLA I類蛋白質融合物（包含例如HLA 1a類融合物、HLA 1b類融合物、HLA 1a/1b類融合物，及其類似物）、CD47、PD-L1（CD274）、PD-L2（CD273）、PVR（CD155）、IL-37、Gal-9、PtdSer、HMGB1、CEACAM1、HLA-E、HLA-G、HLA-C1、HLA-C2、HLA-A-Bw4、HLA-B-Bw4、HLA-A*03、HLA-A*11、MHC-I蛋白、MHC-2蛋白、CD80及CD86（CTLA-4）、LSECtin（LAG3）、CD112（TIGIT）、CXADR（JAML/AMICA1）、HVEM（BTLA）及其類似物。有用的HLA基因、對偶基因及其蛋白質包含例如Marsh等人 (2010) 《組織抗原（Tissue Antigens）》 75:291–455所述之彼等；該文獻之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。在一些情況下，有用的NK細胞誘餌受體可以僅包含例如本文所述的例示性NK細胞誘餌受體蛋白的一部分或片段，或者可以包含兩種或更多種蛋白質及/或蛋白質片段的融合物，例如本文描述的兩種或更多種例示性NK細胞誘餌受體蛋白及/或其片段的融合物。
在一些情況下，有用的NK細胞誘餌受體可以包含HLA 1b類融合蛋白，其包含例如直接或間接與HLA-E、HLA-F、HLA-G或HLA-H中的一種或多種或其一個或多個部分融合的β-2-微球蛋白（B2M）蛋白。有用的HLA 1b類融合蛋白可以包含或可以不包含肽抗原，視情況可切割的肽抗原，例如，在切割後可以佔據融合蛋白的肽結合裂隙。可以包含在HLA 1b類融合蛋白中的B2M及/或HLA Ib類蛋白的有用部分包含但不必限於例如細胞外域、跨膜域、細胞質域、信號肽、信號序列、α1域、α2域、α3域、α鏈及其類似部分。在一些情況下，HLA 1b類融合蛋白可以包含一個或多個非HLA及/或非B2M部分（亦即，並非源自HLA蛋白及/或B2M蛋白的部分），諸如一個或多個連接子部分，諸如合成連接子，諸如甘胺酸連接子、甘胺酸-絲胺酸連接子或其類似連接子。
以下提供的係各種NK細胞誘餌受體中單獨或組合、全部或部分有用的蛋白質的非限制性實例。例示性人類B2M序列（UniProtKB ID: P61769；NCBI RefSeq: NP_004039.1）係SEQ ID NO:032。
例示性人類HLA-E序列（UniProtKB ID: P13747；NCBI RefSeq: NP_005507.3）係SEQ ID NO:033。
例示性人類HLA-G序列（UniProtKB ID: P17693；NCBI RefSeq: NP_002118.1）係SEQ ID NO:034。
在一些情況下，有用的B2M-HLA-E融合物包含例如全長或部分長度的B2M與HLA-E片段的融合，例如經由GS-連接子融合，視情況具有HLA-G信號序列，諸如但不限於例如SEQ ID NO:035。
在一些情況下，有用的B2M-HLA-E融合物可以包含信號序列（例如，視情況B2M信號序列），視情況具有經由連接子接合至經由連接子與HLA-E片段接合的全長或部分長度B2M序列的可切割HLA-G肽，諸如但不限於SEQ ID NO:036（其編碼序列在本文中亦稱為「B2M-HLA-E融合物」） 。
顯而易見，在HLA I類、1b類、HLA-E-B2M及HLA-E/G-B2M融合物及其類似物中可以製備及使用全長或部分長度的HLA I類蛋白質序列以及全長或部分長度的B2M序列的其他配置，具有或沒有其他組件或取代組件，諸如連接子、信號序列、肽抗原序列等。在一些情況下，有用的蛋白質、融合物、序列、其部分及其類似物可以包含美國專利申請公開案第US20140134195A1號中描述之彼等；該公開案之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。
例示性人類CD47（hCD47）序列係SEQ ID NO:037。
例示性截短hCD47序列係SEQ ID NO:038。
在一些情況下，如將容易理解的，有用的序列，包含胺基酸及核酸序列，諸如但不限於本文所述之彼等此類序列，可以如所描述般使用或可以改變並且例如可以包含一個或多個取代、缺失、插入及/或截短，或其他改造。例如，胺基酸序列，例如但不限於本文所述的胺基酸序列，可以包含至少1個、1個、至少2個、2個或更少、至少3個、3個或更少、至少4個、4個或更少、至少5個、5個或更少、至少6個、6個或更少、至少7個、7個或更少、至少8個、8個或更少、至少9個、9個或更少、至少10個、10個或更少、或多於10個胺基酸取代。在一些情況下，核酸序列可以具有編碼相同胺基酸序列的替代序列，諸如密碼子最佳化序列。在一些情況下，可以改造核酸序列的一個或多個鹼基或一個或多個密碼子以引入一個或多個取代，諸如在所得編碼多肽中引入至少1個、1個、至少2個、2個或更少、至少3個、3個或更少、至少4個、4個或更少、至少5個、5個或更少、至少6個、6個或更少、至少7個、7個或更少、至少8個、8個或更少、至少9個、9個或更少、至少10個、10個或更少、或多於10個胺基酸取代。在一些情況下，有用的序列，包含胺基酸及核酸序列，諸如但不限於本文所述之彼等序列，可以與本文所述的序列共享100%的序列一致性。在一些情況下，有用的序列，包含胺基酸及核酸序列，諸如但不限於本文所述之彼等序列，可以與本文所述的序列共享小於100%的序列一致性，包含例如與本文所述的序列，包含但不限於例如胺基酸或核酸序列至少99%、至少98%、至少97%、至少96%、至少95%、至少94%、至少93%、至少92%、至少91%、至少90%、至少89%、至少88%、至少87%、至少86%、至少85%、至少84%、至少83%、至少82%、至少81%、至少80%、至少79%、至少78%、至少77%、至少76%、至少75%、至少74%、至少73%、至少72%、至少71%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%、至少50%、至少45%、至少40%、至少35%、或至少30%的序列一致性。
編碼存在於轉殖基因上的基因產物的有用核酸將變化並且可以提供多種功能，包含例如校正宿主細胞或生物體中的缺陷基因、在細胞中編碼及/或表現異源基因產物、在細胞中編碼及/或表現內源基因產物的一個或多個額外拷貝、在細胞中抑制基因或基因產物的表現，或其類似功能。有用的核酸包含但不限於例如表現匣、重組mRNA、重組載體基因體（諸如重組病毒基因體）、重組質體、小環質體、迷你基因、微基因、人工染色體、干擾核酸（例如siRNA、shRNA等）及其類似核酸。
有用的基因產物，例如功能整合轉殖基因的基因產物，包含但不限於例如非編碼核酸及編碼一種或多種蛋白質及/或肽的核酸。在一些實施例中，轉殖基因的基因產物或載體的編碼區可以包含編碼酶的核酸序列，例如核酸酶、DNA鹼基編輯器、RNA編輯器或其類似物。在一些實施例中，編碼基因產物的序列可以單獨或與其他有效負載元件一起包含非編碼核酸，例如微小RNA（亦即，miRNA）、shRNA、siRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA、lncRNA、引導RNA（gRNA、sgRNA等）或其類似非編碼核酸。
在一些情況下，可以在目標基因座處編輯包含肝細胞及/或肝細胞前驅細胞的細胞群。基本上可以靶向任何基因座，包含但不限於例如包含肝臟相關基因及/或其調節元件的基因座、包含免疫相關基因及/或其調節元件的基因座及其類似基因座。在目標基因座處引入的編輯可以變化，其中有用的編輯包含但不限於例如缺失、插入、取代、框移及其類似編輯。
有用的缺失之非限制性實例包含：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個鹼基的缺失；基因的1個或更多個、2個或更多個、或3個或更多個功能域及/或其部分的缺失；基因的1個或更多個、2個或更多個、或3個或更多個外顯子及/或其部分的缺失，基因的全部、除1個以外的全部、除2個以外的全部、或除3個以外的全部外顯子及/或其部分的缺失；基因調控元件（例如，啟動子、強化子等）的缺失；及其類似缺失。有用的插入之非限制性實例包含：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個鹼基的插入；基因的1個或更多個、2個或更多個、或3個或更多個功能域及/或其部分的插入；基因的1個或更多個、2個或更多個、或3個或更多個外顯子及/或其部分的插入，基因的全部、除1個以外的全部、除2個以外的全部、或除3個以外的全部外顯子及/或其部分的插入；基因調控元件（例如，啟動子、強化子等）的插入；及其類似插入。引入的缺失及/或插入的尺寸會有所不同，且可以在1個鹼基至500個鹼基或更多鹼基的範圍內，包含但不限於例如1至400、1至350、1至300、1至250、1至200、1至150、1至100、1至50、10至400、10至350、10至300、10至250、10至200、10至150、10至100、10至50、25至400、25至350、25至300、25至250、25至200、25至150、25至100、25至50、50至400、50至350、50至300、50至250、50至200、50至150、50至100、100至400、100至350、100至300、100至250、100至200、100至500、200至500、300至500、400至500、至少1、至少2、至少10、至少25、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、500或更少、400或更少、350或更少、300或更少、250或更少、200或更少、150或更少、100或更少、或50或更少個鹼基。
有用取代之非限制性實例包含：引入過早終止密碼子的取代；消融終止密碼子的取代；導致胺基酸變化的取代；及其類似取代。在核酸層面上的一個或多個取代（例如，1、2或3個鹼基的取代）可用於根據需要在多肽層面上引入基本上任何胺基酸對胺基酸的取代。
在一些情況下，有用的編輯可以使全部或部分內源基因消融或缺失或以其他方式使一個或多個內源基因（諸如但不限於一個或多個免疫相關基因）或此類基因的編碼產物（諸如免疫相關蛋白）失去功能。此類基因或其一部分的缺失，使該基因及/或編碼產物失去功能，可稱為剔除。在一些情況下，基因或其基因產物可以經由引入插入而變得無功能，例如引起框移或產生錯誤摺疊或其他無功能的蛋白質。
在一些情況下，有用的編輯可以校正功能異常基因，包含例如單基因疾病的功能異常基因。在一些情況下，單基因疾病係肝臟相關的單基因疾病（亦即，由作為肝臟相關或作為肝細胞相關基因的功能異常基因引起的單基因疾病）。在一些情況下，單基因疾病係非肝臟相關單基因疾病（亦即，由並非肝臟相關或肝細胞相關基因的功能異常基因引起的單基因疾病）。在一些情況下，編輯係對有缺陷的內源基因座的校正編輯。在一些情況下，編輯並非對有缺陷的內源基因座的校正編輯。
在一些情況下，可以將編輯引入非肝細胞及/或非肝臟相關基因座中，使得編輯位於與肝細胞及/或肝臟功能不相關的基因座中。如本文所用，「與肝細胞功能相關的基因座」或「肝細胞基因座」或類似術語意指該基因座包含與肝細胞功能及/或主要在肝臟中進行的功能相關的基因的編碼（例如，外顯子）或非編碼調節區（例如，內含子、啟動子、強化子等），諸如肝臟代謝（例如肝細胞代謝）、氨代謝（包含例如尿素循環）、胺基酸代謝、胺基酸生物合成、胺基酸分解代謝、解毒、肝臟（例如肝細胞）蛋白質（包含例如白蛋白、纖維蛋白原、凝血酶原、凝血因子（例如因子V、VII、IX、X、XI及XII）、蛋白C、蛋白S、抗凝血酶、脂蛋白、血漿銅藍蛋白、轉鐵蛋白、補體蛋白、肝細胞蛋白質體及/或分泌體的蛋白質（諸如，在Franko等人 《營養素（ Nutrients）》 (2019) 11(8):1795中描述之彼等；該文獻之揭示內容以全文引用的方式併入本文中））的合成，及其類似功能。
在一些情況下，可以將多個基因編輯引入單個細胞。例如，在一些情況下，單元可以包含超過一個缺失、插入、取代或其某種組合，包含例如其中細胞包含2、3、4或5個此類編輯。可以引入任何有用的編輯組合，包含例如單個基因中的多個編輯、單個蛋白質的兩個或更多個多肽或鏈中的編輯、家族或途徑的兩個或更多個不同蛋白質中的編輯、兩個或更多個功能上的蛋白（例如，兩種或更多種免疫相關蛋白、兩種或更多種肝臟相關蛋白等）中的編輯及其類似編輯。
在引入多重編輯及/或以多種方式對細胞進行基因改造的情況下，諸如經由在內源基因座處引入編輯及轉殖基因的功能整合，或在多個內源基因座處引入多重編輯，或其組合；此類多個編輯/改造可以同時及/或以任何方便及適當的順序執行。例如，在一些情況下，細胞群可以同時或基本上同時與試劑接觸以進行兩種不同的基因改造。在一些情況下，細胞群將與第一試劑或試劑組接觸以進行第一次改造，接著與第二試劑或試劑組接觸以進行第二次改造。在一些情況下，在順序進行步驟的情況下，可以進行一種或多種干預操作，包含但不限於例如分離、純化、富集、細胞培養、擴增、分析、冷凍保存及/或其類似操作。在一些情況下，不執行干預操作，諸如分離、純化、富集、細胞培養、擴增、分析、冷凍保存及/或其類似操作。
可以採用使細胞群與一種或多種編輯試劑接觸的各種方便之方法，包含但不限於例如轉染編輯試劑或編碼此類試劑的核酸、編輯試劑的轉導、編輯試劑的核轉染及/或電穿孔，及其類似方法。在一些情況下，可以使用載體，例如病毒載體或非病毒載體。在一些情況下，載體的組分可以包含核酸、蛋白質或其組合。可以使用任何方便的病毒或非病毒載體，包含但不限於例如脂質奈米顆粒（LNP）載體。
載體可以經組態為含有執行所期望編輯所需的全部或少於全部的組分。例如，在一些情況下，載體可以包含足以在目標基因座處執行編輯的所有組分。在一些情況下，載體可以包含少於執行編輯所需的所有組分，並且其餘組分可以藉由其他方式遞送，例如藉由另一種不同的載體、轉導、轉染或其類似方式。在一些情況下，靶向系統的組分，例如核酸及蛋白質組分，可以在遞送之前預先複合，包含此等組分在遞送載體中預先複合的情況。例如，在一些情況下，編輯系統的核酸（例如，gRNA等）及蛋白質（例如，一種或多種核酸酶或一種或多種鹼基編輯蛋白等）編輯試劑可以複合為核糖核蛋白（RNP）用於遞送至細胞群中以進行編輯。
可以使用任何方便及適當的基因編輯系統來引入本文所述的一種或多種編輯。定點引入所期望編輯之方法會有所不同，並且可以包含引入一種或多種定點切割事件，例如經由使用一種或多種定點核酸酶（例如，CRISPR/Cas9核酸酶、TALEN核酸酶、ZFN及其類似核酸酶）。若適用，定點切割可以包含雙股及/或單股斷裂。在一些情況下，定點切割之後係在被定點核酸酶切割的位點處的特定修復事件，例如以引入所期望的編輯，諸如取代、插入、缺失或其類似編輯。此類特定修復方法可以包含例如同源重組，包含同源定向修復（HDR），例如在包含引導修復的同源區域的核酸存在的情況下。在一些情況下，可以使用定點切割來引入基因破壞及/或剔除，例如，不使用特定修復事件，例如經由定點切割後的細胞過程，諸如非同源末端接合（NHEJ）。在一些情況下，所期望編輯的定點引入可以採用不引入雙股切割事件的鹼基編輯系統，諸如但不限於基於CRISPR蛋白質引導的編輯系統，諸如包含胞嘧啶鹼基編輯器（CBE）及腺嘌呤鹼基編輯器（ABE）系統的dCas9-脫胺酶融合蛋白系統。在一些情況下，有用的鹼基編輯系統引入單個鹼基改變，例如，不切割磷酸二酯核酸骨架。
可以使用各種編輯組合物並且此類組合物將例如基於所使用的編輯系統、所期望編輯的類型、靶向的一個或多個基因座的序列等而變化。有用的編輯組合物可以包含例如CRISPR/Cas9編輯組合物，例如，包含Cas9蛋白或編碼Cas9蛋白的核酸，以及gRNA或sgRNA或編碼gRNA或sgRNA的核酸；TALEN編輯組合物，包含例如TALEN核酸酶或TALEN核酸酶對，或編碼TALEN核酸酶或TALEN核酸酶對的核酸；ZFN編輯組合物，包含例如ZFN核酸酶或ZFN核酸酶對，或編碼ZFN核酸酶或ZFN核酸酶對的核酸；編輯鹼基的編輯組合物，例如，包含CRISPR-蛋白質引導的鹼基編輯蛋白質，或編碼CRISPR-蛋白質引導的鹼基編輯蛋白質的核酸，以及gRNA或sgRNA或編碼gRNA或sgRNA的核酸；及其類似物。
將更詳細地描述基於CRISPR-Cas的編輯組合物，以及採用基於CRISPR-Cas的編輯組合物之方法。然而，此類描述以及組合物及方法不限於此，並且將容易理解的是，此類描述的要素、目標及/或概念可以在適當的情況下相應地調整或應用於其他編輯系統的使用。
在一些情況下，有用的編輯組合物將包含CRISPR-Cas蛋白，諸如Cas9蛋白，或編碼CRISPR-Cas蛋白及引導RNA（gRNA）之多核苷酸或編碼gRNA之多核苷酸。如本文所用，除非不適當及/或另有說明，否則術語「gRNA」通常涵蓋雙組分引導系統（例如，兩個gRNA）以及單個引導RNA（sgRNA）系統。在一些情況下，gRNA或多個gRNA可以經組態及使用以靶向如本文所述的期望基因座或其一種或多種元件，例如存在於基因座處的基因的一個或多個外顯子。例如，在一些情況下，gRNA或多個gRNA可以經組態及使用以靶向B2M基因座或其一種或多種元件，諸如B2M基因座的一個或多個外顯子（例如，外顯子1、外顯子2、或外顯子3）。
在一些情況下，本發明的編輯方法可以包含使用Cas9核酸酶，包含天然及工程化Cas9核酸酶，以及編碼其的核酸序列。有用的Cas9核酸酶包含但不限於例如釀膿鏈球菌（ Streptococcus pyogenes）Cas9及其變異體、金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus）Cas9及其變異體、納士放線菌（ Actinomyces naeslundii）Cas9及其變異體，Cas9核酸酶亦包含在PCT公開案第WO 2013/176772號及第WO2015/103153號中論述之彼等以及在例如Makarova等人 (2011) 《自然綜述：微生物學（Nature Reviews Microbiology）》 9:467-477、Makarova等人 (2011) 《生物學指南（Biology Direct）》 6:38、Haft等人 (2005) PLOS 《公共科學圖書館：計算生物學（Computational Biology）》 1:e60及Chylinski等人 (2013) 《RNA生物學（RNA Biology）》 10:726-737中綜述之彼等，此等文獻之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。在一些情況下，可以使用非Cas9 CRISPR核酸酶（或其工程化變異體），包含但不限於例如Cpf1或Cpf1變異體。
Cas9核酸酶用於基因編輯的CRISPR/Cas9系統，且改造的Cas9蛋白（例如，具有或不具有附加功能的Cas9切口酶及dCas9蛋白）可用於各種編輯方法。在CRISPR/Cas9系統中，兩個獨立的引導組分（亦即crRNA及tracrRNA）或含有目標序列的嵌合RNA（亦即「引導RNA」或「單引導RNA（sgRNA）」，其共同含有crRNA及tracrRNA）會引導Cas9核酸酶在由gRNA或sgRNA定義的特定目標序列處切割DNA。在使用時，經由組合使用各種同源定向修復策略及CRISPR核酸酶，HDR靶向及替代的特異性、效率及多功能性得到了極大的改善（參見例如，Gratz等人 (2014) 《遺傳學（Genetics）》. 196(4)961-971；Chu等人 (2015) 《自然（Nature）》.33:543-548；Hisano等人 (2015) 《科學報告（Scientific Reports）》 5: 8841；Farboud及Meyer (2015) 《遺傳學》, 199:959-971；Merkert及Martin (2016) 《幹細胞研究（Stem Cell Research）》 16(2):377-386；該文獻之揭示內容以全文引用的方式併入本文中）。
CRISPR系統在基因編輯方面提供了顯著的多功能性，部分原因係宿主基因體中必要的序列靶向元件尺寸小且頻率高。CRISPR引導的Cas9核酸酶需要存在原間隔子相鄰基序（PAM），其序列取決於衍生Cas9的細菌物種（例如，對於釀膿鏈球菌，PAM序列係「NGG」），但此類序列在各種目標核酸中係常見的。直接位於目標序列下游的PAM序列並非引導RNA的一部分，但對於切割DNA股係必需的。已生成具有新型PAM識別的合成Cas9核酸酶，進一步增加了靶向的多功能性，並可用於本文所述之方法中。亦開發了僅切割一股目標核酸的Cas9切口酶（例如，Cas9（D10A）及其類似物），以及內切核酸酶缺陷的（亦即，「死型」）dCas9變異體，該變異體具有由連接的融合蛋白所增加的額外酶活性。
在一些實施例中，肝細胞及/或肝細胞前驅細胞的免疫相關基因座可以被靶向以用於編輯，例如，以使編輯之肝細胞及/或肝細胞前驅細胞具有低免疫原性。例如，在一些情況下，一個或多個編碼HLA I類蛋白質或相關蛋白質（例如，HLA 1a類或相關蛋白質）的基因座、一個或多個編碼HLA II類蛋白質或相關蛋白質（例如，可以引起HLA II類基因表現的「HLA-D」蛋白質、轉錄因子及/或輔活化物，或其類似物）或其組合可以經靶向。藉由在HLA I類及/或HLA II類蛋白中引入此類破壞，如本文所示，可以使肝細胞及/或肝細胞前驅細胞具有低免疫原性。例如，此類破壞可導致免疫細胞，諸如淋巴細胞，諸如細胞毒性T淋巴細胞（CTL）對編輯之肝細胞的殺傷減少。用於靶向的有用基因座包含但不限於例如HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、B2M、CIITA、NLRC5、RFX5、RFXANK、RFXAP及其類似基因座。在一些情況下，所期望的編輯可以破壞特定類別的所有基因，例如，藉由引入導致例如HLA-A、HLA-B及HLA-C破壞的一種或多種編輯及/或引入HLA-A、HLA-B及HLA-C所共有的組分（例如B2M）的一種或多種編輯。類似的策略可以經改編且用於其他目標及基因座，諸如HLA II類蛋白。有用的HLA基因、對偶基因、基因座及其蛋白質包含例如Marsh等人 (2010) 《組織抗原（Tissue Antigens）》 75:291–455所述之彼等；該文獻之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。
在一些情況下，可用於編輯如本文所述的B2M基因座的有用的基於CRISPR Cas9的B2M靶向序列及相應的PAM序列包含例如：B2M外顯子1靶向序列「B2M_Ex1_7」），其具有序列GGCCACGGAGCGAGACATCT（SEQ ID NO:039）（PAM，CGG）；B2M外顯子1靶向序列「B2M_Ex1_3」，其具有序列CGCGAGCACAGCTAAGGCCA（SEQ ID NO:040）（PAM，CGG）；B2M外顯子2靶向序列「B2M_Ex2_4」，其具有序列AAGTCAACTTCAATGTCGGA（SEQ ID NO:041）（PAM，TGG）；及其類似序列。
在一些情況下，編輯組合物可以係HLA I類靶向組合物及/或HLA II類靶向組合物，導致一種或多種HLA I類蛋白、一種或多種HLA II類蛋白及/或一種或多種相關蛋白的產生及/或功能中斷，該一種或多種相關蛋白諸如為但不限於B2M，引起HLA I類及/或II類基因或蛋白質表現的轉錄因子，及/或引起HLA I類及/或II類基因或蛋白質表現的輔活化物。
此類編輯組合物可以在足以產生所期望編輯之條件下與細胞群接觸，包含例如其中此類條件足以用於引入、遞送、轉染、轉導、靶向、酶活性及/或修復（在適用時），以及細胞的生存及必要的生物活動。足以產生所期望編輯的條件可以包含但不限於例如合適的培養條件，包含例如在有助於編輯反應的合適的培養基中維持在合適的環境條件（例如溫度、氣體交換等）下及其類似條件。此外，編輯反應可以進行足夠長的時間以使編輯反應發生並達到所期望的完成此等，其中足夠長的時間會有所不同。此外，在一些情況下，可以將暴露於編輯試劑的時間縮至最短，例如，其中編輯反應或其組分可能對細胞群具有一種或多種有害影響，諸如細胞生存力降低、細胞脆性增加及其類似影響。
在一些情況下，基因編輯方法可能包含使用鋅指核酸酶（ZFN）。ZFN由與鋅指蛋白（ZFP）融合的不依賴序列的Fokl核酸酶域組成。可以改變ZFP以改變其序列特異性。靶向dsDNA的切割涉及將兩個ZFN（指定為左及右）以正確的取向及間距結合到相反股上的相鄰半位點，從而形成Fokl二聚體。二聚化顯著增加了ZFN特異性。三個或四個指狀ZFP的目標係每個ZFN約9或12個鹼基，或ZFN對約18或24個鹼基。經由組合使用各種同源定向修復策略及ZFN，同源重組的靶向及替代的特異性、效率及多功能性得到了極大的改善（參見例如Urnov等人 (2005) 《自然》.435(7042):646-5；Beumer等人 (2006) 《遺傳學》.172(4):2391-2403；Meng等人 (2008) 《自然-生物技術（Nat Biotechnol）》. 26(6):695-701；Perez等人. (2008) 《自然-生物技術》. 26(7):808-816；Hockemeyer等人. (2009) 《自然-生物技術》. 27(9):851-7；該等文獻之揭示內容以全文引用的方式併入本文中）。一般來說，視組裝方法而定，隨機基因體序列的每125-500 bp可以找到一個ZFN位點。用於識別合適的ZFN靶向位點之方法包含計算機介導之方法，例如Cradick等人. (2011) 《BMC生物資訊學（BMC Bioinformatics）》 12:152所述之方法，該文獻之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。
在一些情況下，基因編輯方法可能包含使用轉錄類活化因子效應核酸酶（TALEN）。與ZFN核酸酶原則上相似，TALEN利用與轉錄類活化因子效應子（TALE）蛋白融合的不依賴序列的Fokl核酸酶域，與ZNF不同，TALE單獨識別單個核苷酸。TALE通常含有特徵性的DNA結合串聯重複序列中心域、核定位信號及C端轉錄活化域。一個典型的重複序列長度為33-35個胺基酸，且在12位及13位含有兩個高變胺基酸殘基，稱為「重複可變二殘基」（RVD）。RVD能夠識別一個特定的DNA鹼基對，並且連續重複序列匹配連續的DNA序列。目標DNA特異性基於RVD的簡單代碼，因此能夠預測目標DNA序列。視所期望的靶向而定，原生TALE或工程化/改造的TALE可用於TALEN。TALEN可以設計用於幾乎任何序列串（sequence stretch）。僅需要在DNA識別位點的每個5'末端存在一個胸腺嘧啶。經由組合使用各種同源定向修復策略及TALEN，同源重組的靶向及替代的特異性、效率及多功能性得到了極大的改善（參見例如，Zu等人. (2013) 《自然-方法（Nature Methods）》. 10:329-331；Cui等人. (2015) 《科學報告》 5:10482；Liu等人. (2012) 《遺傳學和基因組學雜誌（J. Genet. Genomics）》.39:209-215、Bedell等人. (2012) 《自然（Nature）》.491:114-118、Wang等人. (2013) 《自然-生物技術》. 31:530-532；Ding等人. (2013) 《細胞-幹細胞（Cell Stem Cell）.12:238-251；Wefers等人. (2013) 《美國國家科學院院刊》, 110:3782-3787；該等文獻之揭示內容以全文引用的方式併入本文中）。
在一些情況下，基因編輯之方法可以包含使用鹼基編輯器系統，包含但不限於例如使用包括可程式化DNA結合蛋白、核鹼基編輯器及gRNA及其類似物的融合蛋白的鹼基編輯器系統。鹼基編輯通常不依賴HDR及/或NHEJ，並且通常不會導致或需要切割dsDNA的兩個主鏈上的磷酸二酯鍵。因此，在一些情況下，鹼基編輯可以使用不引起雙股斷裂的RNA引導的（亦即，「可程式化的」）DNA結合蛋白，諸如Cas核酸酶，諸如核酸酶缺陷型或核酸酶缺陷型Cas蛋白，諸如dCas9或Cas9切口酶。鹼基編輯器及鹼基編輯系統的有用實例，包含編碼核酸的鹼基編輯器，包含但不限於BE1、BE2、BE3（Komor等人, 2016）；Target-AID（Nishida等人, 2016）；SaBE3、BE3 PAM變異體、BE3編輯窗口變異體（Kim等人, 2017）；HF-BE3（Rees等人, 2017）；BE4及BE4-Gam；AID、CDA1及APOBEC3G BE3變異體（Komor等人, 2017）；BE4max、ArcBe4max、ABEmax（Koblan等人, 2018）；腺嘌呤鹼基編輯器（ABE7.10）（Gaudelli等人, 2017）；ABE8（Richter等人, 2020）；ABE8e（Gaudelli等人, 2020）；A&C-BEmax（Zhang等人, 2020）；SPACE（Grünewald等人, 2020）；及其類似物；前述參考文獻以全文引用的方式併入本文中。
有用的鹼基編輯器系統及其組件之非限制性實例包含但不限於例如以下各者中描述之彼等：PCT專利申請公開案第WO2020236936A1號、第WO2020231863A1號、第WO2020168135A1號、第WO2020168122A1號、第WO2020168088A1號、第WO2020168132A9號、第WO2020168133A1號、第WO2020168075A9號、第WO2020168051A9號、第WO2020160514A1號、第WO2020160517A1號、第WO2020150534A9號、第WO2020051562A3號、第WO2020051562A3號、第WO2020028823A1號、第WO2019217941A1號、第WO2019217942A1號及第WO2019217943A1號以及美國專利申請公開案第US20200399626A1號；該等公開案之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。
在一些情況下，可以驗證所期望編輯的存在，例如，藉由測試在目標基因座處是否存在編輯（或不存在所期望缺失）的分析，藉由測試是否不存在用於破壞的目標基因座上編碼的基因產物以及是否存在由引入的序列編碼的基因產物的分析或其類似分析。進行此類分析的有用方法包含但不限於例如基於基因座及/或基因座處編碼的RNA的PCR（例如PCR、qPCR、rt-PCR等）之方法、基於用基因座處編碼的蛋白質的抗體探測的細胞裂解物的西方墨點之方法、基於流動式細胞測量術之方法、定序（例如單細胞定序）及其類似方法。
其他有用的組分，例如轉殖基因、表現匣、編輯組合物、載體或其類似物的組分，可以包含啟動子序列（例如，組成型、組織特異性等）、信號肽序列、poly(A)序列、終止子、轉譯調控序列諸如核醣體結合位點及內部核醣體進入位點、強化子、緘默子、絕緣子、邊界元件、複製起點、基質附著位點及/或基因座控制區。此外，可以自一種核酸表現多種基因產物，例如藉由在一個開讀框中連接個別組分（轉殖基因），例如藉由自切割2A肽或IRES序列分開。
有用的啟動子之實例包含例如病毒猿猴病毒40（SV40）（例如，早期或晚期）、巨細胞病毒（CMV）（例如，立即早期）、莫洛尼鼠類白血病病毒（Moloney murine leukemia virus，MoMLV）、MND（骨髓增殖性肉瘤病毒強化子、陰性對照區缺失，dl587rev引子結合位點取代）、勞斯肉瘤病毒（RSV）、單純疱疹病毒（HSV）、脾臟病灶形成病毒（SFFV）啟動子及其類似啟動子。在某些實施例中，啟動子可以係可誘導的，使得全部或部分病毒基因體的轉錄將僅在一種或多種誘導因素存在時發生。誘導因素包含但不限於在其中培養宿主細胞的一種或多種化合物或生理條件，例如溫度或pH。在一些情況下，啟動子可以係組成型的。在一些情況下，啟動子可以導致在期望的細胞類型或組織中優先表現，例如，啟動子可以係細胞類型或組織特異性的。
在一些情況下，轉殖基因、表現匣、載體等可以包含編碼信號肽的序列。信號肽係位於蛋白質N端的短肽。在蛋白質定位中起作用的信號肽可用於將相關蛋白質引導至分泌途徑並驅動蛋白質的分泌。
載體，包含逆轉錄病毒載體，例如慢病毒載體，可以包含（或在適當時按照期望排除）各種元件，包含順式作用元件，諸如啟動子、長末端重複序列（LTR）及/或其元件，包含5' LTRs及3' LTRs及其元件、中央多聚嘌呤束（cPPT）元件、DNA瓣（FLAP）元件、輸出元件（例如，rev反應元件（RRE）、B型肝炎病毒轉錄後調節元件（HPRE）等）、轉錄後調控元件（例如土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件（WPRE）、B型肝炎病毒調控元件（HPRE）等）、多聚腺苷酸化位點、轉錄終止信號、絕緣子元件（例如β-珠蛋白絕緣子，例如，雞HS4）及其類似元件。各種載體中可能存在或不存在的其他元件包含但不限於強化子、非轉譯區（UTR）、Kozak序列、多聚腺苷酸化信號、額外的限制酶位點、多選殖位點、內部核醣體進入位點（IRES）、重組酶識別位點（例如LoxP、FRT及Att位點）、終止密碼子、轉錄終止信號及編碼自切割多肽之多核苷酸、表位標籤、可用於同源定向修復（HDR）的同源區及其類似元件。
有用的LTR包含但不限於例如含有U3、R及/或U5區及其部分的彼等LTR。LTR為逆轉錄病毒基因的表現（例如，基因轉錄本的促進、起始及多腺苷酸化）及病毒複製提供功能。LTR可以含有許多調節信號，包含轉錄控制元件、多聚腺苷酸化信號及病毒基因體複製及整合所需的序列。U3區可能含有強化子及啟動子元件。U5區可以含有多聚腺苷酸化序列。R（重複）區通常位於U3及U5區的兩側。由U3、R及U5區構成的LTR可能出現在病毒基因體的5'及3'末端。病毒基因體可以包含與5' LTR相鄰的序列，其在基因體的逆轉錄中起作用（例如，tRNA引子結合位點），用於將病毒RNA有效包裝成顆粒（例如，Psi位點），等。
有用的LTR包含改造的5' LTR及/或3' LTR。3' LTR的改造通常藉由使病毒出現複製缺陷來提高慢病毒或逆轉錄病毒系統的安全性。如本文所用，術語「複製缺陷型」係指不能完全、有效複製從而不產生感染性病毒體的病毒（例如，複製缺陷型慢病毒後代）。術語「複製勝任型」係指能夠複製的野生型病毒或突變病毒，使得病毒的病毒複製能夠產生感染性病毒體（例如，複製勝任型慢病毒後代）。
在一些實施例中，有用的載體可以係自不活化的。關於載體的術語「自不活化」（SIN）係指複製缺陷型載體，例如逆轉錄病毒或慢病毒載體，其中右（3'）LTR強化子-啟動子區，包含例如U3區，具有經改造（例如，藉由缺失及/或取代）以防止病毒轉錄超過第一輪病毒複製。在進一步的實施例中，可以改造3' LTR，使得U5區被替代，例如，用異源或合成的poly(A)序列、一個或多個絕緣子元件及/或誘導型啟動子。習知技術者將容易明白，當提及LTR，例如3' LTR或5' LTR，可以包含改造的LTR或對LTR的改造，例如對3' LTR、5' LTR或3'及5' LTR兩者的改造。
在一些實施例中，病毒載體可以包括TAR元件。術語「TAR」係指位於慢病毒（例如HIV）LTR的R區的「反式活化反應」遺傳元件。此元件與慢病毒反式活化因子（tat）遺傳元件相互作用以增強病毒複製。在一些實施例中，載體可以不包含TAR元件，包含例如其中5' LTR的U3區被異源啟動子取代。
在一些情況下，載體可以係假型載體。如本文所用，術語「假型」或「假型化」係指具有一種或多種病毒套膜蛋白的病毒，該等病毒套膜蛋白已被具有較佳特徵的另一種病毒的套膜蛋白取代。例如，可以用水泡性口炎病毒G蛋白（VSV-G）套膜蛋白對HIV進行假型化。在一些實施例中，慢病毒套膜蛋白用VSV-G假型化。在一些實施例中，可以使用產生重組逆轉錄病毒，例如慢病毒，用VSV-G套膜醣蛋白假型化的包裝細胞。
病毒及非病毒的載體可以包含衍生自病毒的結構及/或遺傳元件，或其部分。逆轉錄病毒載體可以包含衍生自逆轉錄病毒的結構及/或遺傳元件，或其部分。慢病毒載體可以包含主要衍生自慢病毒的結構及功能遺傳元件或其部分，包含LTR。在一些情況下，可以使用雜合載體，包含例如其中雜合載體包含LTR或其他含有逆轉錄病毒（例如慢病毒）序列及非逆轉錄病毒（例如非慢病毒）序列兩者的核酸。在一些實施例中，雜合載體可以包含包括用於逆轉錄、複製、整合及/或包裝的逆轉錄病毒（例如慢病毒）序列的載體。
細胞群及/或肝細胞及/或其肝細胞前驅細胞可用於治療個體的病況，其中投予有效量的細胞將具有所期望的治療效果。在一些情況下，期望的治療效果將係所投予之肝細胞的一種或多種內源性功能（例如，健康肝細胞的一種或多種內源性功能、低免疫原性肝細胞的一種或多種內源性肝細胞功能及其類似內源性功能）的結果，包含但不限於例如肝細胞代謝、解毒、肝細胞蛋白質（包含例如白蛋白、纖維蛋白原、凝血酶原、凝血因子（例如因子V、VII、IX、X、XI及XII）、蛋白C、蛋白S、抗凝血酶、脂蛋白、血漿銅藍蛋白、轉鐵蛋白、補體蛋白、肝細胞蛋白質體及/或分泌體的蛋白質（諸如，在Franko等人 《營養素》 (2019) 11(8):1795中描述之彼等；該文獻之揭示內容以全文引用的方式併入本文中））的合成，及其類似功能。在一些情況下，所期望的治療效果將係所投予之肝細胞的一種或多種異源功能的結果，例如由功能整合的轉殖基因編碼的基因產物的異源功能。在一些情況下，當個體之病況係血友病（例如，A型血友病或B型血友病）並且該等方法包含向個體投予有效量的基因改造人類肝細胞，該等基因改造人類肝細胞包括編碼用於治療血友病的基因產物（例如，因子VIII、因子IX及/或其類似物）的轉殖基因，該等方法可以進一步包含調節個體的凝血，例如藉由投予抗凝劑（例如苯甲香豆醇（warfarin）、利伐沙班（rivaroxaban）、達比加群（dabigatran）、阿哌沙班（apixaban）、依度沙班（edoxaban）及/或其類似物）以有效調節個體凝血的量投予於個體。
如本文所述的包含肝細胞及/或其前驅細胞的細胞群可用於治療及/或預防任何肝臟疾病或病症。例如，藉由引入肝細胞重建患者的肝組織對於患有任何一種或多種肝臟病況（例如 ，急性肝衰竭、慢性肝病及/或代謝或單基因疾病）的患者來說係一種潛在的治療選擇，包含藉由用本文所述的基因改造細胞重新填充個體的肝臟來永久治療此等病症。例如，肝細胞重建可用於引入基因改造肝細胞用於基因療法或替代因疾病、物理或化學損傷或惡性腫瘤而喪失之肝細胞。此外，擴增的人類肝細胞可用於填充人工肝臟輔助裝置。
本文揭示了用於各種目的之產生（包含擴增）肝細胞之方法。在一些情況下，本方法提供適合移植至有需要之個體的人類肝細胞的產生及/或擴增，包含適合移植的人類肝細胞，包含例如原位肝移植。根據本文所述之方法產生之肝細胞，包含人類肝細胞，可以在移植或輸注之前進行純化、冷凍保存及/或廣泛表徵。在其他用途中，根據本文所述方法產生之肝細胞可以為患有一種或多種嚴重肝病的患者提供依需求之療法。
在一些情況下，所期望的治療效果將係由整合的轉殖基因編碼的基因產物賦予所投予肝細胞的一種或多種異源功能的結果。因此，基本上任何可以經由遞送異源基因產物（諸如分泌的異源基因產物）來治療的病況均可以使用如本文所述產生的基因改造肝細胞來治療。例如，可以經由投予有效量之肝細胞來治療導致蛋白質缺乏的單基因疾病，該等肝細胞經過基因改造以含有編碼該蛋白質的整合轉殖基因，從而減少該蛋白質的缺乏。
用於治療單基因病況的有用轉殖基因包含但不限於例如編碼以下各者之全長或改造形式的轉殖基因：銅轉運ATP酶2（ATP7B）、遺傳性血色素沉著症蛋白（HFE）、血幼素、鐵調素（HAMP）、轉鐵蛋白受體蛋白2（TFR2）、溶質載體家族40成員1（SLC40A1）、因子IX、因子VIII、馮威里氏因子、胺甲醯基磷酸合成酶（CPS1）、N-乙醯麩胺酸合成酶（NAGS）、鳥胺酸胺甲醯基轉移酶（OTC）、α-半乳糖苷酶A基因（GLA）、苯丙胺酸羥化酶（PAH）、精胺酸酶（ARG，包含ARG1）、α-1抗胰蛋白酶（AAT）、反丁烯二醯乙醯乙酸水解酶（FAH）、精胺醯琥珀酸裂解酶（ASL）、精胺醯琥珀酸合成酶（ASS，包含ASS1）、鳥胺酸移位酶（ORNT1）、檸檬素、UDP-葡萄醣醛酸轉移酶1A1（UGT1A1）、轉甲狀腺素蛋白（TTR）、絲胺酸-丙酮酸胺基轉移酶（AGXT）、補體因子H（CFH）及其類似物，及其組合。
在一些情況下，治療的疾病係肝病及/或肝臟相關的單基因疾病，包含例如轉殖基因的基因產物係肝臟相關蛋白的情況。在一些情況下，治療的疾病係肝病及/或肝臟相關的單基因疾病，包含例如轉殖基因的基因產物並非肝臟相關蛋白的情況。在一些情況下，治療的單基因疾病並非肝臟相關的單基因疾病，包含例如整合轉殖基因的基因產物並非肝臟相關蛋白的情況。在一些情況下，治療的疾病並非肝病，包含例如整合轉殖基因的基因產物並非肝臟相關蛋白的情況。
包含如本文所述之肝細胞及/或肝細胞前驅細胞的細胞群及包括如本文所述的此類細胞的組合物可以藉由任何合適的方式投予於個體以及投予於個體的任何部分、器官或組織。投予方式之非限制性實例包含門靜脈輸注、臍靜脈輸注、脾囊直接注射、脾動脈輸注、網膜囊輸注及/或腹膜內注射（輸注、移植）。在某些實施例中，組合物包括藉由輸注移植至腹膜內空間及/或網膜囊中的囊封肝細胞。在某些實施例中，組合物包括無細胞/去細胞支架，包含例如合成支架、去細胞肝臟及其類似物，其如本文所述用肝細胞播種及/或重新填充並以手術方式移植至有需要之個體中。
除了向個體（患者）投予（移植）之外或作為其替代方案，如本文所述之肝細胞亦可用於將肝細胞供應至可用於治療患有肝病之個體的裝置或組合物。可以使用本揭露之肝細胞的此類裝置或組合物之非限制性實例包含生物人工肝（BAL）（用於患有急性肝衰竭的個體的體外支持裝置）及/或去細胞肝（再細胞化器官支架以提供個體中的肝功能）。參見例如 ，Shaheen等人 (2019) 《自然-生物醫學工程（ Nat Biomed Eng）》. doi: 10.1038/s41551-019-0460-x；Glorioso等人 (2015) 《肝臟病學雜誌》 63(2):388-98。
在一些情況下，接受本文所述治療的個體可能不接受免疫抑制劑，例如，個體在治療時可能係非免疫抑制的及/或免疫正常的，例如在投予如本文所述肝細胞之前、期間及/或之後。例如，此類個體可能對免疫抑制、免疫抑制劑及/或特定免疫抑制療法具有一種或多種禁忌症，或者可能由於不同的原因而未投予免疫抑制劑。在一些情況下，可以向非免疫抑制個體及/或具有免疫抑制禁忌症的個體投予細胞群，該細胞群的大部分（包含全部或基本上全部）係低免疫原性肝細胞。
免疫抑制禁忌症之非限制性實例包含：肝病或病症、纖維化、肝硬化、腎臟疾病或病症、血液疾病或病症、帶狀疱疹及/或水痘病史、感染（例如，結核病、BK多瘤病毒、單純疱疹、真菌、寄生蟲（例如類圓蟲屬線蟲（roundworm Strongyloides））、水痘帶狀疱疹病毒、麻疹等）、接觸感染媒介物（例如麻疹、水痘等）、癌症、惡性腫瘤、糖尿病、高膽固醇、高血壓、高血三酸甘油酯、溶血性尿毒症症候群、貧血、血小板減少、白血球計數低、心包膜積液、血栓性血小板減少性紫癜病、肺水腫、間質性肺炎、口腔炎、口腔炎、急性腎衰竭、腎動脈閉塞（例如腎動脈血栓形成）、可見水腫、腹水、蛋白尿、創傷癒合受損、妊娠、哺乳及母乳哺育、惡性淋巴瘤、血栓形成（例如，肝移植後血栓形成）、心臟移植、激素缺乏的內分泌病（例如甲狀腺激素缺乏症、下丘腦功能不全、垂體功能不全）、低血鉀、精神病症、肌病變、青光眼、白內障、潰瘍、胃炎、憩室炎、腸吻合術、肌腱斷裂、骨質疏鬆症、低骨鈣化或密度、癲癇發作、精胺醯琥珀酸裂解酶缺乏症、胺甲醯基磷酸合成酶缺乏症、瓜胺酸血症、鳥胺酸胺甲醯基轉移酶缺乏症、精胺酸酶缺乏症、肌酸激酶升高、因疾病或生病引起的骨折、骨壞死、肌肉萎縮、高氨血症（例如，與N-乙醯麩胺酸合成酶缺乏症有關）；對以下各者過敏：免疫抑制劑（諸如，皮質類固醇（例如，普賴蘇、布地奈德（budesonide）、普賴蘇穠（prednisolone））、janus激酶抑制劑（例如，托法替尼（tofacitinib））、鈣調神經磷酸酶抑制劑（例如，環孢素、他克莫司（tacrolimus））、mTOR抑制劑（例如，西羅莫司（sirolimus）、依維莫司（everolimus））、IMDH抑制劑（例如，硫唑嘌呤、來氟米特（leflunomide）、黴酚酸酯）、免疫抑制生物製劑（例如，阿巴西普（abatacept，Orencia）、阿達木單抗（adalimumab，Humira）、阿那白滯素（anakinra，Kineret）、塞妥珠單抗（certolizumab，Cimzia）、依那西普（etanercept，Enbrel）、戈利木單抗（golimumab，Simponi）、英夫利昔單抗（infliximab，Remicade）、依奇珠單抗（ixekizumab，Taltz）、那他珠單抗（natalizumab，Tysabri）、利妥昔單抗（rituximab，Rituxan）、蘇金單抗（secukinumab，Cosentyx）、托珠單抗（tocilizumab，Actemra）、優特克單抗（ustekinumab，Stelara）、維多珠單抗（vedolizumab，Entyvio）、巴西利昔單抗（basiliximab，Simulect）、達珠單抗（daclizumab，Zinbryta）等）；及其類似禁忌症。自標籤資訊、藥物及藥物相互作用資料庫、藥物製造商及/或相關監管機構（諸如美國食品及藥物管理局（FDA））中可以很容易地確定其他禁忌症，例如特定免疫抑制劑的禁忌症。
在一些情況下，投予的細胞群可能係80%或更多的低免疫原性肝細胞，包含例如81%或更多、82%或更多、83%或更多、84%或更多、85%或更多、86%或更多、87%或更多、88%或更多、89%或更多、90%或更多、91%或更多、92%或更多、93%或更多、94%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、或99%或更多的低免疫原性肝細胞。在一些情況下，可以向對用一種或多種免疫抑制劑治療有一種或多種禁忌症的個體投予具有80%或更多的低免疫原性肝細胞的細胞群，包含例如其中此類低免疫原性肝細胞包含一種或多種，包含兩種或多種，包含至少三種如本文所述的基因改造。
可以使用本文所述之方法及/或細胞群治療之疾病及病症，包含在具有或不具有對免疫抑制的一種或多種禁忌症的個體中，包含但不限於克利格勒-納傑爾症候群1型；家族性高膽固醇血症；因子VII缺陷；肝醣貯積病第一型；嬰兒型雷弗素姆疾病（infantile Refsum's disease）；進行性家族性肝內膽汁鬱積2型；遺傳性酪胺酸血症1型；以及各種尿素循環缺陷；急性肝衰竭，包含患有急性藥物引發之肝衰竭的青少年及成人患者；病毒引發之急性肝衰竭；特發性急性肝衰竭；蘑菇中毒引發之急性肝衰竭；術後急性肝衰竭；妊娠期急性脂肪肝引發之急性肝衰竭；慢性肝病，包含肝硬化及/或纖維化；由以下急性事件之一引起的慢加急性肝病：飲酒、藥物攝入及/或B型肝炎發作。因此，患者可能患有一種或多種此等或其他肝臟病況。
在一些情況下，根據本文所述之方法治療的疾病及病症可以包含肝細胞特異性（肝細胞內生性）功能障礙。例如，功能障礙以及疾病及/或病症的病因可能係由於或主要歸因於個體內存在的內源性肝細胞的功能障礙。在一些情況下，肝細胞特異性功能障礙可能係遺傳的或個體先天的。在一些情況下，疾病或病症的病因基本上不涉及肝細胞以外的細胞類型。在一些情況下，疾病或病症導致肝功能下降、肝病（急性或慢性）或源自內源性肝細胞的其他不利病況。因此，在一些情況下，例如，當疾病係內源性肝細胞群固有的時，有效的治療可以包含如本文所述的用肝細胞替代、補充、移植或再增殖。不受理論的束縛，在肝細胞內生性疾病/病症中，內源性肝細胞的替代及/或補充可導致顯著的臨床改善，而疾病/病症不會對移植之肝細胞產生負面影響。例如，當個體患有影響肝細胞功能（例如，肝細胞內胺基酸代謝，諸如高酪胺酸血症）的遺傳性疾病時，同種異體移植肝細胞可能係基本上不受個體內存在的疾病/病症的影響。因此，移植之肝細胞可以在個體內基本上移植、存活、擴增及/或重新填充，從而產生顯著的積極臨床結果。
以肝細胞特異性（肝細胞內生性）功能障礙為特徵的疾病及病症可以與具有非肝細胞特異性的病因並且涉及肝細胞外在因素的疾病及病症形成對比。具有肝細胞外在因素及/或病因的疾病之實例包含但不限於例如酒精性脂肪變性肝炎、酒精性肝病（ALD）、肝脂肪變性/非酒精性脂肪肝（NAFLD）及其類似疾病。肝細胞外源性疾病涉及外部的或源自內源性肝細胞外部的肝損傷，諸如酒精、飲食、感染等。在一些情況下，根據本文所述方法治療的疾病及病症可以包含非肝細胞特異性（肝細胞內生性）功能障礙之疾病及病症。
肝細胞內生性疾病及肝細胞相關疾病之實例包含肝臟相關酶缺乏症、肝細胞相關轉運疾病及其類似疾病。此類肝臟相關的缺陷可以係後天性或先天性疾病，並且可以包含代謝性疾病（諸如基於肝臟的代謝失調）。基於肝臟的遺傳性代謝失調可稱為「遺傳性肝臟代謝疾病」，諸如但不限於例如Ishak, 《臨床肝病（Clin Liver Dis）》 (2002) 6:455-479中描述之彼等疾病。在一些情況下，肝臟相關的缺陷可能導致急性及/或慢性肝病，包含例如，其中急性及/或慢性肝病係未治療或治療不充分時缺陷之結果的情況。遺傳性肝臟相關酶缺乏、肝細胞相關轉運疾病及其類似疾病之非限制性實例包含克利格勒-納傑爾症候群1型；家族性高膽固醇血症、因子VII缺陷、肝醣貯積病第一型、嬰兒型雷弗素姆疾病、進行性家族性肝內膽汁鬱積2型、遺傳性酪胺酸血症（例如遺傳性酪胺酸血症1型）、遺傳性尿素循環缺陷、苯丙酮尿症（PKU）、遺傳性血色素沉著症、α-I抗胰蛋白酶缺乏症（AATD）、威爾遜病及其類似疾病。肝臟遺傳性代謝疾病之非限制性實例，包含具有至少一些肝臟表型、病理學及/或肝臟相關症狀的代謝疾病，包含5-β-還原酶缺乏症、AACT缺乏症、阿斯科格症候群（Aarskog syndrome）、無β脂蛋白血症、腎上腺腦白質失養症、阿爾珀斯氏病（Alpers disease）、阿爾珀斯氏症候群（Alpers syndrome）、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、抗凝血酶III缺乏症、精胺酸酶缺乏症、精胺醯琥珀酸尿症、小動脈肝臟發育不良、自體免疫性淋巴球增生症候群、良性復發性膽汁鬱積、β-地中海貧血、布盧姆症候群（Bloom syndrome）、布加症候群（Budd-Chiari syndrome）、碳水化合物缺乏醣蛋白症候群、神經醯胺酶缺乏症、類蠟脂褐質病、膽固醇酯貯積病、膽固醇基酯貯積病、慢性肉芽腫、慢性C型肝炎、克利格勒-納傑爾症候群、囊腫纖維化、胱胺酸病、糖尿病、杜賓-強森二氏症候群（Dubin-Johnson syndrome）、地方性蒂羅爾肝硬化（endemic Tyrolean cirrhosis）、紅血球生成性原紫質病、法布里病（Fabry disease）、家族性高膽固醇血症、家族性脂肪變性肝炎、纖維蛋白原貯積病、半乳糖血症、神經節苷脂症、高歇氏病（Gaucher disease）、遺傳性血色素沉著症、肝醣貯積症1a型、肝醣貯積症2型、肝醣貯積症3型、肝醣貯積症4型、肉芽腫病、肝家族性類澱粉變性、遺傳性果糖不耐受症、遺傳性球形紅血球症、哈布二氏症候群（Hermansky-Pudlak syndrome）、高胱胺酸尿症、高草酸鹽尿症、低β脂蛋白血症、低纖維素原血症、妊娠肝內膽汁鬱積、拉弗拉病（Lafora disease）、硫辛醯胺脫氫酶缺乏症、脂蛋白病症、莫里亞克症候群（Mauriac syndrome）、異染性白質失養症、粒線體細胞病變、納瓦荷神經肝病（Navajo neurohepatopathy）、尼曼-匹克二氏病（Niemann-Pick disease）、非症候群性膽管缺乏症、北美印度兒童肝硬化、鳥胺酸胺甲醯基轉移酶缺乏症、部分脂失養、皮爾遜症候群（Pearson syndrome）、緩發性皮膚病變紫質症、進行性家族性肝內膽汁鬱積、進行性家族性肝內膽汁鬱積1型、進行性家族性肝內膽汁鬱積2型、蛋白C缺乏症、舒瓦克曼症候群（Shwachman syndrome）、丹吉爾病（Tangier disease）、血小板減少性紫癜病、全身脂失養、1型肝醣貯積症、蒂羅爾肝硬化、酪胺酸血症、尿素循環障礙、靜脈閉塞性疾病、威爾遜病、伍爾曼病（Wolman disease）、X性聯高IgM症候群及齊威格症候群（Zellweger syndrome）。
根據本文所述之方法治療個體可產生各種臨床益處及/或可量測的結果，包含但不限於例如延長存活期、延遲疾病進展（例如延遲肝衰竭）、預防肝衰竭、改善及/或正常化肝功能、改善及/或正常化胺基酸含量、改善及/或正常化氨含量、改善及/或正常化白蛋白含量、改善及/或正常化膽紅素、自成長遲緩表型中恢復、嗜睡減少、反應遲鈍減少、癲癇發作減少、黃疸減少、改善及/或正常化血清葡萄糖、改善及/或正常化INR、改善及/或正常化尿液測試結果及類似情況。
例如，在一些情況下，如本文所述的基因改造肝細胞及/或肝細胞前驅細胞的投予引起如與例如根據護理標準治療及/或投予未如本文所述進行基因改造的肝細胞及/或肝細胞前驅細胞的個體相比，患有肝病及/或導致肝衰竭的病況的個體的存活率提高至少5%。在此類個體中觀察到的增強的存活率水準可以變化並且可以在至少5%至60%或更大提高的範圍內，包含但不限於例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%或更大的存活率提高。在一些情況下，投予如本文所述的基因改造肝細胞及/或其前驅細胞的個體可能經歷疾病進展及/或一種或多種疾病症狀發作的延遲，諸如但不限於例如肝衰竭及/或任何歸因於此的症狀。此類疾病進展及/或症狀發作的延遲可以持續數天、數週、數月或數年，包含但不限於例如至少一週、至少一個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月，至少5個月，至少6個月，至少一年或更長時間。投予於患者的本文所述之肝細胞隨時間在患者中產生有益的治療反應。
可以治療的肝臟病況之非限制性實例包含急性間歇性紫質症、急性肝衰竭、阿拉吉歐症候群（alagille syndrome）、酒精性脂肪肝病、酒精性肝炎、酒精性肝硬化、酒精性肝病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、阿米巴肝膿腫、自體免疫肝炎、膽汁性肝硬化、布加症候群、化學及藥物引發之肝損傷、膽汁鬱積、慢性肝炎、慢性B型肝炎、慢性C型肝炎、慢性D型肝炎、終末期肝病、紅血球生成性原紫質病、片吸蟲症、脂肪肝病、侷限性結節狀增生、肝包蟲病、肝性腦病、肝梗塞、肝功能不全、肝紫質症、肝結核、肝臟靜脈阻塞病、肝炎、肝細胞癌、肝造紅血球性吡咯紫質沉著病、肝臟豆狀核變性、肝腫大、肝肺症候群、肝腎症候群、遺傳性糞紫質症、肝臟膿腫、肝細胞腺瘤、肝硬化、肝衰竭、肝贅瘤、大面積肝壞死、非酒精性脂肪肝病、寄生蟲性肝病、肝紫癜、緩發性皮膚病變紫質症、門靜脈高壓症、化膿性肝膿腫、雷伊氏症候群（reye syndrome）、斑駁紫質沉著病、病毒性肝炎、病毒性A型肝炎、病毒性B型肝炎、病毒性C型肝炎、病毒性D型肝炎、病毒性E型肝炎及齊威格症候群及其類似病況。在一些情況下，可以治療個體的纖維化或纖維化病況。在一些情況下，可以治療個體的肝硬化或肝硬化病況。
遺傳性病況之非限制性實例包含：1p36缺失症候群、1q21.1缺失症候群、2q37缺失症候群、5q缺失症候群、5,10-亞甲基四氫葉酸合成酶缺乏症、17q12微缺失症候群、17q12微複製症候群、18p缺失症候群、21-羥化酶缺乏症、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、AAA症候群（弛緩不能-艾迪森氏症-無淚症候群（achalasia-addisonianism-alacrima syndrome））、阿-斯症候群（Aarskog-Scott syndrome）、ABCD症候群、銅藍蛋白血症（Aceruloplasminemia）、無手足畸形、軟骨發育不全II型、軟骨發育不全、急性間歇性紫質症、腺苷醯琥珀酸裂解酶缺乏症、腎上腺腦白質失養症、阿拉吉歐症候群、ADULT症候群、艾卡迪-古特雷斯症候群（Aicardi-Goutières syndrome）、白化病、亞歷山大病（Alexander disease）、阿爾菲症候群（Alfi's syndrome）、黑尿症、奧爾波特症候群（Alport syndrome）、兒童交替性偏癱、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症-額顳葉型癡呆、阿爾斯特倫症候群（Alström syndrome）、阿茲海默症（Alzheimer's disease）、牙釉質形成不全、胺乙醯丙酸脫水酶缺乏紫質症、雄性激素失敏症候群、安格曼症候群（Alzheimer's disease）、阿帕特症候群（Apert syndrome）、關節彎曲-腎功能障礙-膽汁鬱積病症候群、共濟失調毛細血管擴張症、阿克森費爾德症候群（Axenfeld syndrome）、比爾-史蒂文生皮膚回旋症候群（Beare–Stevenson cutis gyrata syndrome）、凸眼-大舌-巨人症症候群（Beckwith–Wiedemann syndrome）、本傑明症候群（Benjamin syndrome）、生物素酶缺乏症、布約恩斯塔德症候群（Björnstad syndrome）、布盧姆症候群、伯特-霍格-杜布症候群（Birt-Hogg-Dubé syndrome）、布洛地肌病變（Brody myopathy）、布倫納症候群（Brunner syndrome）、CADASIL症候群、貓眼症候群、CRASIL症候群、慢性肉芽腫病症、短指發育不良（Campomelic dysplasia）、康納丸氏病（Canavan disease）、卡本特症候群（Carpenter Syndrome）、CDKL5缺乏病症、腦發育不全-神經病變-魚鱗癬-角皮病症候群（CEDNIK）、囊腫纖維化、夏馬杜三氏病（Charcot-Marie-Tooth disease）、CHARGE症候群、闕東二氏症候群（Chédiak-Higashi syndrome）、格里布型軟骨發育不全（Chondrodysplasia, Grebe type）、顱骨鎖骨發育不全、柯凱因氏症候群（Cockayne syndrome）、科芬-勞里症候群（Coffin-Lowry syndrome）、科恩症候群（Cohen syndrome）、II型及XI型膠原病變、先天性痛覺不敏感伴無汗症（CIPA）、先天性肌肉失養症、狄蘭氏症候群（Cornelia de Lange syndrome，CDLS）、多發性缺陷瘤症候群（Cowden syndrome）、CPO缺乏症（糞紫質症）、顱豆骨縫發育不良（Cranio-lenticulo-sutural dysplasia）、貓叫症（Cri du chat）、克羅恩氏病（Crohn's disease）、克魯宗症候群（Crouzon syndrome）、克魯宗德爾莫骨骼症候群（Crouzonodermoskeletal syndrome）（克魯宗症候群伴黑色棘皮病）、庫拉里諾症候群（Currarino syndrome）、達里埃氏病（Darier's disease）、登特氏病（Dent's disease）（遺傳性高鈣尿症）、丹尼斯-德魯什症候群（Denys-Drash syndrome）、德-格羅烏稀症候群（De Grouchy syndrome）、唐氏症（Down Syndrome）、帝喬治症候群（DiGeorge syndrome）、多種類型的遠端遺傳性運動神經病變（Distal hereditary motor neuropathies, multiple types）、遠端肌肉失養症、杜興氏肌肉失養症（Duchenne muscular dystrophy）、卓飛症候群（Dravet syndrome）、愛德華氏症候群（Edwards Syndrome）、艾登二氏症候群（Ehlers-Danlos syndrome）、伊曼紐爾症候群（Emanuel syndrome）、埃默里-德雷弗斯症候群（Emery-Dreifuss syndrome）、大皰性表皮鬆解症、紅血球生成性原紫質病、范康尼氏貧血（Fanconi anemia，FA）、法布里病、萊頓因子V易栓症（Factor V Leiden thrombophilia）、致死性家族性失眠症、家族性腺瘤性息肉病、家族性自主神經機能障礙、家族性庫賈氏病（Familial Creutzfeld-Jakob Disease）、費因戈德症候群（Feingold syndrome）、FG症候群、X染色體脆裂症、弗里德賴希共濟失調（Friedreich's ataxia）、G6PD缺乏症、半乳糖血症、高歇氏病（Gaucher disease）、格斯特曼-斯特勞斯勒-申克症候群（Gerstmann-Sträussler-Scheinker syndrome）、吉列斯匹症候群（Gillespie syndrome）、I型及2型戊二酸尿症（Glutaric aciduria, type I and type 2）、GRACILE症候群、格里塞利症候群（Griscelli syndrome）、海利-海利病（Hailey-Hailey disease）、哈樂昆型魚鱗癬（Harlequin type ichthyosis）、1型血色素沉著症、2A型血色素沉著症、2B型血色素沉著症、3型血色素沉著症、4型血色素沉著症、5型血色素沉著症、A型血友病、B型血友病、肝造紅血球性吡咯紫質沉著病、遺傳性糞紫質症、遺傳性出血性毛細血管擴張症（奧斯勒-韋伯-蘭杜症候群（Osler-Weber-Rendu syndrome））、遺傳性包涵體肌病變、遺傳性多發性外生骨疣、遺傳性痙攣性截癱（嬰兒發病的上行遺傳性痙攣性麻痹）、哈布二氏症候群、遺傳性壓力易感性神經病變（Hereditary neuropathy with liability to pressure palsies，HNPP）、內臟異位、高胱胺酸尿症、杭丁頓氏症（Huntington's disease）、亨特症候群（Hunter syndrome）、霍勒症候群（Hurler syndrome）、何奇森-吉爾福德早衰症候群（Hutchinson-Gilford progeria syndrome）、高離胺酸血症、原發性高草酸鹽尿症、高苯丙胺酸血症、低α脂蛋白血症（丹吉爾病）、軟骨生成低下（Hypochondrogenesis）、軟骨生成減退（Hypochondroplasia）、免疫缺乏-著絲粒不穩定性-面部異常症候群（ICF症候群）、色素失禁症、髖髕骨發育不良（Ischiopatellar dysplasia）、等雙中心15（Isodicentric 15）、傑克遜-韋斯症候群（Jackson-Weiss syndrome）、雅各布森症候群（Jacobsen syndrome）、茹貝爾症候群（Joubert syndrome）、青少年原發性脊髓側索硬化症（JPLS）、瘢痕疙瘩病症、KIF1A相關神經系統病症、克里夫斯特拉症候群（Kleefstra syndrome）、克尼斯特發育不良（Kniest dysplasia）、科薩基過度生長症候群（Kosaki overgrowth syndrome）、克拉培氏病（Krabbe disease）、庫福-瑞科波症候群（Kufor-Rakeb syndrome）、LCAT缺乏症、乃罕氏症候群（Lesch-Nyhan syndrome）、李-佛美尼症候群（Li-Fraumeni syndrome）、肢帶肌肉失養症、林奇症候群（Lynch syndrome）、脂蛋白脂肪酶缺乏症、惡性高熱、楓糖漿尿病、馬凡氏症候群（Marfan syndrome）、馬-拉氏症候群（Maroteaux-Lamy syndrome）、馬科恩-亞百特氏症候群（McCune-Albright syndrome）、麥克勞症候群（McLeod syndrome）、MEDNIK症候群、家族性地中海熱、孟克斯氏病（Menkes disease）、變性血紅素血症、甲基丙二酸血症、微症候群（Micro syndrome）、小頭畸形、米勒-迪克症候群（Miller-Dieker syndrome）、莫耳奎症候群（Morquio syndrome）、莫瓦特-威爾遜症候群（Mowat-Wilson syndrome）、明克症候群（Muenke syndrome）、1型多發性內分泌贅瘤形成（維爾莫氏症候群（Wermer's syndrome））、2型多發性內分泌贅瘤形成、肌肉失養症、杜興型及貝克型肌肉失養症（Muscular dystrophy, Duchenne and Becker type）、肌肉生長抑制素相關的肌肉肥大（Myostatin-related muscle hypertrophy）、肌強直性營養不良、納托維茨症候群（Natowicz syndrome）、I型神經纖維瘤病、II型神經纖維瘤病、尼曼-匹克二氏病、非酮症性高甘胺酸血症、非症候群性耳聾、努南氏症候群（Noonan syndrome）、諾曼-羅伯茨症候群（Norman-Roberts syndrome）、奧格登症候群（Ogden syndrome）、奧門症候群（Omenn syndrome）、成骨不全症、泛酸激酶相關神經系統退化症、巴陶氏症候群（Patau syndrome）（三染色體13）、PCC缺乏症（丙酸血症）、緩發性皮膚病變紫質症（PCT）、彭德雷德症候群（Pendred syndrome）、珀茨-傑格斯症候群（Peutz-Jeghers syndrome）、菲佛氏症候群（Pfeiffer syndrome）、菲蘭-麥克德米特症候群（Phelan-McDermid syndrome）、苯丙酮尿症、2-哌啶甲酸血症（Pipecolic acidemia）、皮特-霍普金斯症候群（Pitt-Hopkins syndrome）、多囊腎病、多囊性卵巢症侯群（PCOS）、紫質症、普威二氏症候群（Prader-Willi syndrome）、原發性纖毛運動障礙（PCD）、原發性肺性高血壓、蛋白C缺乏症、蛋白S缺乏症、近端18q缺失症候群、假性高歇氏病（Pseudo-Gaucher disease）、彈性纖維假黃瘤、色素性視網膜炎、雷特氏症候群（Rett syndrome）、羅伯茨症候群（Roberts syndrome）、魯賓斯坦-泰必症候群（Rubinstein-Taybi syndrome，RSTS）、山多夫氏病（Sandhoff disease）、聖菲利波症候群（Sanfilippo syndrome）、施-詹二氏症候群（Schwartz-Jampel syndrome）、鳩拉二氏症候群（Sjogren-Larsson syndrome）、先天性脊椎骨骺發育不良（SED）、什普林茨恩-戈德堡症候群（Shprintzen-Goldberg syndrome）、鐮狀細胞貧血症、西得里烏斯X性聯智能遲緩症候群（Siderius X-linked mental retardation syndrome）、含鐵芽細胞性貧血、斯萊症候群（Sly syndrome）、史密斯-萊姆利-奧普茲症候群（Smith-Lemli-Opitz syndrome）、史密斯-馬吉利症候群（Smith-Magenis syndrome）、斯奈德-羅賓遜症候群（Snyder-Robinson syndrome）、脊髓性肌肉萎縮症、脊髓小腦性失調症（1-29型）、SSB症候群（SADDAN）、斯塔加特病（Stargardt disease）（黃斑變性）、斯蒂克勒症候群（Stickler syndrome）（多種形式）、斯特魯德威克症候群（Strudwick syndrome）（脊椎骨端發育不全，斯特魯德威克型）、戴-薩克斯病（Tay-Sachs disease）、四氫生物喋呤缺乏症、致死性軟骨發育不全、特雷徹-柯林斯症候群（Treacher Collins syndrome）、結節性硬化症（Tuberous sclerosis complex，TSC）、特納氏症候群（Turner syndrome）、亞瑟症候群（Usher syndrome）、斑駁紫質沉著病、馮希佩爾-林道病（von Hippel-Lindau disease）、馮威里氏病（von Willebrand disease）、華氏症候群（Waardenburg syndrome）、華卡尼症候群2（Warkany syndrome 2）、魏森巴赫爾-紮維穆勒症候群（Weissenbacher-Zweymüller syndrome）、威廉氏症候群（Williams syndrome）、威爾遜病、伍德豪斯-薩卡蒂症候群（Woodhouse-Sakati syndrome）、沃夫-賀許宏氏症候群（Wolf-Hirschhorn syndrome）、著色性乾皮症、X性聯智能障礙及大睪丸症（X染色體脆裂症）、X性聯脊髓-延髓肌肉萎縮（脊髓及延髓肌萎縮）、Xp11.2複製症候群、X性聯嚴重合併性免疫不全病（X-SCID）、X性聯含鐵芽細胞性貧血（XLSA）、47,XXX（三染色體X症候群）、XXXX症候群（48，XXXX）、XXXXX症候群（49，XXXXX）、XXXXY症候群（49，XXXXY）、XYY症候群（47，XYY）、XXYY症候群（48，XXYY）、XYYY症候群（48，XYYY）、XXXY症候群（48，XXXY）、XYYYY症候群（49，XYYYY）及齊威格症候群。
遺傳性病況包含許多胞溶體貯積症。胞溶體貯積症之非限制性實例包含神經節苷脂症（包含例如GM2神經節苷脂症（A型、O型、AB型）及GM1神經節苷脂症1型、2型及3型）；尼曼-匹克二氏病A、B及C；高歇氏病1、2及3型；法布里病；異染性白質失養症；腦白質球狀細胞營養障礙；多種硫酸酯酶缺乏症；α甘露糖症；辛德勒病（Schindler disease）；天門冬葡萄糖胺尿；岩藻糖沈積症；霍勒症候群；沙伊氏症候群（Scheie syndrome）；霍勒-沙伊症候群（Hurler-Scheie syndrome）；亨特症候群；聖菲利波症候群A、B、C及D；莫耳奎症候群A及B；馬-拉氏症候群；斯萊症候群；神經性類蠟脂褐質病；半乳糖唾液酸貯積症（Galactosialidosis）；嬰兒唾液酸貯積病；薩拉病（Salla disease）；唾液酸尿症；唾液酸沈積症I及II；I細胞疾病；假性霍勒-多發性營養不良（Pseudo-Hurler-Polydystrophy）；黏脂貯積病IV；溶酶體酸性脂肪酶缺乏症；龐貝症（Pompe disease）；達農病（Danon disease）；胱胺酸病；及其類似疾病。遺傳性胞溶體貯積症的致病突變，以及與個體胞溶體貯積症相關的基因及缺陷酶，係已知的並且已經在例如Rajkumar & Dumpa. (2021) 於: StatPearls.Treasure Island (FL): StatPearls Publishing（可在www(dot)ncbi(dot)nlm(dot)nih(dot)gov/books/NBK563270/獲得）中描述過。
遺傳病況包含許多尿素循環障礙（UCD）。UCD之非限制性實例包含N-乙醯麩胺酸合成酶缺乏症（NAGS缺乏症）、胺甲醯基磷酸合成酶I缺乏症（CPS1缺乏症）、鳥胺酸胺甲醯基轉移酶缺乏症（OTC缺乏症）、瓜胺酸血症I型（ASS1缺乏症）、精胺醯琥珀酸尿症（ASL缺乏症）、精胺酸酶缺乏症（高精胺酸血症、ARG1缺乏症）、鳥胺酸移位酶缺乏症（ORNT1缺乏症、高鳥胺酸血症-高氨血症-高瓜胺酸尿症症候群）及檸檬素缺乏症。
本文所述的治療可以長期（亦即，連續）或非長期（亦即，非連續）進行，並且可以包含長期（亦即，連續）或非長期（亦即，非連續）投予一種或多種藥劑。根據本文所述方法的一種或多種藥劑的長期投予可用於各種情況，包含例如個體患有慢性病況，包含例如慢性肝臟病況（例如慢性肝病、肝硬化、酒精性肝病）、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD/NASH）、慢性病毒性肝炎等）、慢性遺傳性肝臟病況（α1抗胰蛋白酶缺乏症、遺傳性血色素沉著症、威爾遜病等）、慢性肝臟相關自體免疫病況（例如，原發性膽管性肝硬化（PBC）、原發性硬化性膽管炎（PSC）、自體免疫性肝炎（AIH）等）等。投予一種或多種藥物用於慢性病況可以包含但不限於投予該藥劑持續多個月、一年或更長時間、多年等。此類長期投予可以任何方便及適當的給藥方案進行，包含但不限於例如每天一次、每天兩次、每週一次、每週兩次、每月一次、每月兩次等。在一些情況下，例如，在校正遺傳性病況或其他持續性基因療法的情況下，可以藉由單次或幾次（例如，2、3、4或5次）治療來治療慢性病況。一種或多種藥劑的非長期投予可以包含但不限於例如投予一個月或更短時間，包含例如幾週、一週、幾天、有限數目的劑量（例如，少於10個劑量，例如9個劑量或更少、8個劑量或更少、7個劑量或更少等，包含單個劑量）。
治療細胞組合物的有效量將至少取決於特定的使用方法、被治療的個體、疾病的嚴重程度、組合物的投予方式以及治療細胞的作用機制.組合物的「治療有效量」係足以在所治療的個體中實現所期望效果的特定試劑，例如治療細胞的量。
在一些情況下，投予於個體的基因改造肝細胞的量可以包含例如至少1000萬、至少2500萬、至少5000萬、至少7500萬、至少1億、至少2.5億、至少5億、至少7.5億、至少10億、至少20億、至少30億、至少40億、至少50億、至少60億、至少70億、至少80億、至少90億、至少100億、至少150億、至少200億、至少300億、至少400億、至少500億、至少600億、至少700億、至少800億、至少900億、或至少1000億個肝細胞。基因改造肝細胞可以單劑量或多劑量遞送至有需要之個體。
任何特定個體的具體劑量水準及給藥頻率可以變化，並取決於多種因素，包含一種或多種組合物的細胞的活性；組合物的細胞的穩定性及作用時間；個體的年齡、體重、一般健康狀況、性別及飲食；投予方式及時間、共同投予的一種或多種藥物組合以及接受療法的宿主的病況嚴重程度。
上面列出的療法的實例不應被解釋為限制性的，並且基本上可以採用任何合適的療法在如所述鑑定的個體中產生期望的治療結果。 套組及系統
本揭露的各態樣亦包含與其一起使用或在其中使用的套組及系統，並且在一些情況下，亦包含裝置。套組及/或系統可以包含例如一個或多個以上關於本揭露的組合物及方法描述的任何組分。套組及/或系統可經組態用於本文所述之方法。編碼的元件可以單獨提供，例如作為單獨的編碼多肽之多核苷酸，或者可以在適當時組合，例如作為編碼兩種或更多種單獨的多肽或非編碼核酸的單個多核苷酸。因此，可以在單個或多個載體上提供多個編碼組分，包含例如，其中此類多個編碼組分在共享（例如，單個或單個組）或單獨（例如，單個或單獨組）調節元件的控制下。藥劑可以在單獨的器皿中，或者可以根據任何描述的或適當的組合來合併至共享器皿中。有用的器皿包含小瓶、管、注射器、瓶子、袋子、安瓿及其類似物。在一些實施例中，有用的套組可以進一步包含裝置。
在一些情況下，本揭露之套組及/或系統可以包括一種或多種改造試劑，諸如一種或多種用於細胞基因改造的試劑，例如一種或多種基因編輯組合物、一種或多種轉殖基因試劑及/或類似物。
在一些情況下，套組及/或系統可以包含載體，諸如包含編碼基因產物之轉殖基因的載體。有用的載體可以係整合的或非整合的。在一些情況下，使用的載體可以係整合載體，其中整合載體足以將轉殖基因功能整合至肝細胞或其前驅細胞中。在一些情況下，套組及/或系統可以包含編輯組合物，諸如其中編輯組合物足以在肝細胞或其前驅細胞中產生HLA I類缺陷。在一些情況下，套組及/或系統可以經組態用於改造肝細胞或前驅細胞，例如，經由套組及/或系統的組分的特定組態，諸如器皿、設計元素、說明書、網際網路可存取的媒體的指示及其類似物，及/或其組合。此類特定組態可以指導用戶使用套組的組分，諸如套組中提供的一種或多種改造試劑來產生基因改造肝細胞及/或其前驅細胞，並例如在生物反應器中擴增產生的基因改造細胞。在一些情況下，套組可以包含用於保存及/或製備基因改造細胞以運輸至例如可以在活體內生物反應器中擴增細胞的設施的組分及/或說明。在一些情況下，套組可以包含編輯組合物，該編輯組合物包含非病毒載體，諸如LNP，包含例如載體足以產生HLA I類缺陷的情況。在一些情況下，套組可以包含一種或多種用於冷凍保存基因改造肝細胞及/或其前驅細胞的試劑，包含在基因改造肝細胞擴增之前及/或之後進行這種冷凍保存的情況。
除了上述組件之外，套組及/或系統可以進一步包含（在某些實施例中）用於實施此等方法的說明。此等說明可以多種形式存在於套組中及/或隨系統提供，其中一種或多種形式可以存在於套組中及/或隨系統提供。此等說明可以存在的一種形式係在合適的介質或基材上印刷的資訊，例如，在其上印刷資訊的一張或多張紙，在套組及/或系統的包裝中，在藥品說明書（package insert）中，及其類似形式。此等說明的又一種形式係上面記錄資訊的電腦可讀取媒體，例如磁片、光碟（CD）、快閃驅動器及其類似形式。可能存在的此等說明的另一種形式係網站地址，該地址可用於經由網際網路存取已刪除站點上的資訊。
儘管有隨附申請權利範圍，本揭露亦由以下實施例限定。 1.    一種產生低免疫原性肝細胞或其前驅細胞之方法，該方法包括： 使包括人類肝細胞或其前驅細胞的細胞群與編輯組合物在足以在該等肝細胞或其前驅細胞中產生人類白血球抗原（HLA）I類缺陷之條件下接觸；及 使該細胞群與編碼至少一種NK細胞誘餌受體的轉殖基因在足以由該等肝細胞或其前驅細胞表現該轉殖基因之條件下接觸， 從而產生低免疫原性肝細胞或其前驅細胞群。 2.    如實施例1之方法，其中該編輯組合物係β-2-微球蛋白（B2M）編輯組合物。 3.    如實施例1或2之方法，其中該等人類肝細胞或其前驅細胞係初代人類肝細胞。 4.    如前述實施例中任一項之方法，其進一步包括將所產生的低免疫原性肝細胞或其前驅細胞群引入生物反應器中。 5.    如實施例4之方法，其中該生物反應器係活體內生物反應器，並且該活體內生物反應器維持在足以產生低免疫原性肝細胞的擴增群體之條件下，視情況其中該活體內生物反應器係小鼠、大鼠或豬。 6.    如前述實施例中任一項之方法，其進一步包括在生物反應器中擴增人類肝細胞或其前驅細胞並在擴增後自該生物反應器中提取細胞以獲得包括人類肝細胞或其前驅細胞的細胞群，視情況其中該生物反應器係小鼠、大鼠或豬。 7.    如實施例6之方法，其中在該生物反應器中擴增的該等人類肝細胞或其前驅細胞係初代人類肝細胞。 8.    如前述實施例中任一項之方法，其中該細胞群同時與該編輯組合物及該轉殖基因接觸。 9.    如實施例1至7中任一項之方法，其中該細胞群在與該轉殖基因接觸之前與該編輯組合物接觸，視情況其中該細胞群之該等肝細胞或其前驅細胞在與該編輯組合物接觸及與該轉殖基因接觸之間擴增。 10.  如實施例1至7中任一項之方法，其中該細胞群在與該編輯組合物接觸之前與該轉殖基因接觸，視情況其中該細胞群之該等肝細胞或其前驅細胞在與該轉殖基因接觸及與該編輯組合物接觸之間擴增。 11.  如前述實施例中任一項之方法，其中該至少一種NK細胞誘餌受體包括CD47、B2M-HLA-E融合物或、其組合。 12.  如前述實施例中任一項之方法，其中使該細胞群與該轉殖基因接觸包括使該細胞群與包括該轉殖基因的整合載體接觸，視情況其中該整合載體係慢病毒載體。 13.  如前述實施例中任一項之方法，其中該編輯組合物包括CRISPR-Cas蛋白或編碼該CRISPR-Cas蛋白之多核苷酸及引導RNA（gRNA）或編碼該gRNA之多核苷酸。 14.  如前述實施例中任一項之方法，其中與該編輯組合物接觸包括使該細胞群與包括足以破壞該等肝細胞或前驅細胞的B2M基因座的試劑的載體接觸，視情況其中該載體係非病毒載體，視情況其中該非病毒載體係脂質奈米顆粒（LNP）。 15.  如實施例14之方法，其中該載體： 編碼靶向該B2M基因座的Cas9蛋白及引導RNA（gRNA）；或 包括包含該Cas9蛋白及該gRNA的核糖核蛋白（RNP）。 16.  如前述實施例中任一項之方法，其中該方法進一步包括使該細胞群與HLA II類靶向組合物在足以在該等肝細胞或前驅細胞中產生HLA II類缺陷之條件下接觸。 17.  如實施例16之方法，其中該HLA II類靶向組合物包括編輯組合物，該編輯組合物在充分條件下編輯編碼引起HLA II類基因表現的轉錄因子或輔活化物的基因座。 18.  如實施例17之方法，其中該HLA II類靶向組合物包括II類主要組織相容性複合物反式活化因子（CIITA）編輯組合物，其編輯CIITA基因座。 19.  如實施例18之方法，其中該CIITA編輯組合物包括CRISPR-Cas蛋白或編碼該CRISPR-Cas蛋白之多核苷酸及靶向該CIITA基因座的gRNA或編碼該gRNA之多核苷酸。 20.  如實施例17至19中任一項之方法，其中與該編輯組合物接觸包括使該細胞群與載體接觸，該載體包括足以破壞編碼該轉錄因子或輔活化物的該基因座的試劑，視情況其中該載體係非病毒載體，視情況其中該非病毒載體係脂質奈米粒子（LNP）。 21.  如實施例20之方法，其中該載體： 編碼靶向該基因座的Cas9蛋白及引導RNA（gRNA）；或 包括包含該Cas9蛋白及該gRNA的RNP。 22.  如前述實施例中任一項之方法，其進一步包括冷凍保存所產生的低免疫原性肝細胞或其前驅細胞。 23.  一種治療個體之病況之方法，該方法包括： 向該個體投予有效量的低免疫原性肝細胞或前驅細胞，其中該等低免疫原性肝細胞或前驅細胞各自包括HLA I類缺陷及編碼至少一種NK細胞誘餌受體的轉殖基因，視情況其中該病況係肝臟病況。 24.  如實施例23之方法，其中該個體具有免疫抑制禁忌症。 25.  如實施例23或24之方法，其中該等低免疫原性肝細胞或其前驅細胞係根據如實施例1至22中任一項之方法產生的。 26.  一種非人類哺乳動物，其包括植入的細胞群，該細胞群包括複數個低免疫原性人類肝細胞或其前驅細胞，其中該複數個肝細胞或前驅細胞中之每個肝細胞或前驅細胞包括HLA I類缺陷及編碼至少一種NK細胞誘餌受體的轉殖基因。 27.  如實施例26之非人類哺乳動物，其中該植入的細胞群係相對於該非人類哺乳動物的同種異體或異種細胞群。 28.  如實施例26或27之非人類哺乳動物，其中該非人類哺乳動物係活體內生物反應器，視情況其中該活體內生物反應器係小鼠、大鼠或豬。 29.  如實施例26至28中任一項之非人類哺乳動物，其中該低免疫原性人類肝細胞或其前驅細胞係初代人類肝細胞。 30.  如實施例26至29中任一項之非人類哺乳動物，其中該HLA I類缺陷包括B2M缺陷。 31.  如實施例26至30中任一項之非人類哺乳動物，其中該至少一種NK細胞誘餌受體包括CD47、B2M-HLA-E融合物、或其組合。 32.  如實施例26至31中任一項之非人類哺乳動物，其中該複數個肝細胞或前驅細胞中之每個肝細胞或前驅細胞進一步包括HLA II類缺陷，視情況其中該HLA II類缺陷包括引起HLA II類基因表現的轉錄因子或輔活化物的缺陷，視情況其中該轉錄因子或輔活化物係CIITA。 33.  一種肝細胞或其前驅細胞群，其包括自如實施例26至32中任一項之非人類哺乳動物分離的低免疫原性人類肝細胞或其前驅細胞的擴增群體。 34.  如實施例33之肝細胞或其前驅細胞群，其中該肝細胞或其前驅細胞群被冷凍保存。 35.  一種細胞群，其包括複數個低免疫原性初代人類肝細胞，其中該複數個肝細胞中之每個肝細胞包括HLA I類缺陷及編碼至少一種NK細胞誘餌受體的轉殖基因。 36.  如實施例35之細胞群，其中該HLA I類缺陷包括B2M缺陷。 37.  如實施例35或36中任一項之細胞群，其中該至少一種NK細胞誘餌受體包括CD47、B2M-HLA-E融合物、或其組合。 38.  如實施例35至37中任一項之細胞群，其中該複數個肝細胞中之每個肝細胞進一步包括HLA II類缺陷，視情況其中該HLA II類缺陷包括引起HLA II類基因表現的轉錄因子或輔活化物的缺陷，視情況其中該轉錄因子或輔活化物係CIITA。 39.  一種產生基因改造人類肝細胞之方法，該方法包括： 使包括人類肝細胞或其前驅細胞的細胞群與包括編碼基因產物的轉殖基因的整合載體在足以使該轉殖基因功能整合之條件下接觸，以產生包括經整合轉殖基因的基因改造肝細胞或其前驅細胞；及 將該等基因改造肝細胞或其前驅細胞移植至活體內生物反應器中，並將該活體內生物反應器維持在足以擴增該等基因改造肝細胞或前驅細胞之條件下，以產生表現該基因產物的基因改造人類肝細胞的擴增群體，視情況其中該活體內生物反應器係小鼠、大鼠或豬。 40.  如實施例39之方法，其中該等人類肝細胞或其前驅細胞係初代人類肝細胞。 41.  如實施例39或40之方法，其進一步包括冷凍保存該基因改造人類肝細胞的擴增群體。 42.  如實施例39至41中任一項之方法，其中該轉殖基因編碼選自由以下組成之群組的基因產物：銅轉運ATP酶2（ATP7B）、遺傳性血色素沉著症蛋白（HFE）、血幼素、鐵調素（HAMP）、轉鐵蛋白受體蛋白2（TFR2）、溶質載體家族40成員1（SLC40A1）、因子IX、因子VIII、馮威里氏因子、胺甲醯基磷酸合成酶（CPS1）、N-乙醯麩胺酸合成酶（NAGS）、鳥胺酸胺甲醯基轉移酶（OTC）、α-半乳糖苷酶A基因（GLA）、苯丙胺酸羥化酶（PAH）、精胺酸酶（ARG）、α-1抗胰蛋白酶（AAT）、反丁烯二醯乙醯乙酸水解酶（FAH）、精胺醯琥珀酸裂解酶（ASL）、精胺醯琥珀酸合成酶（ASS）、鳥胺酸移位酶（ORNT1）、檸檬素、UDP-葡萄醣醛酸轉移酶1A1（UGT1A1）、轉甲狀腺素蛋白（TTR）、絲胺酸-丙酮酸胺基轉移酶（AGXT）、補體因子H（CFH）及其組合。 43.  一種治療個體之病況之方法，該方法包括： 向該個體投予有效量的根據如實施例39至42中任一項之方法產生的基因改造人類肝細胞。 44.  如實施例43之方法，其中該病況係肝臟病況。 45.  如實施例43或實施例44之方法，其中該病況係遺傳性疾病，視情況係單基因疾病。 46.  如實施例45之方法，其中該病況係因子VIII缺乏且該轉殖基因編碼因子VIII。 47.  如實施例46之方法，其中該病況係A型血友病。 48.  如實施例45之方法，其中該病況係因子IX缺乏且該轉殖基因編碼因子IX。 49.  如實施例48之方法，其中該轉殖基因編碼帕度亞變異體因子IX（Padua variant Factor IX）。 50.  如實施例48或49之方法，其中該病況係B型血友病。 51.  如實施例46至50中任一項之方法，其進一步包括調節該個體之凝血。 52.  如實施例43之方法，其中該病況係尿素循環障礙（UCD）且該轉殖基因編碼一種或多種尿素循環多肽。 53a.       如實施例52之方法，其中該轉殖基因編碼一種或多種尿素循環多肽，其在氮廢物的代謝中係限速的。 53b.      如實施例43之方法，其中該病況係胞溶體貯積症，視情況法布里病，且該轉殖基因編碼與該胞溶體貯積症相關的酶，視情況α-半乳糖苷酶A多肽。 54.  一種包括植入的細胞群之非人類哺乳動物，該細胞群包括複數個基因改造人類肝細胞，其中該複數個肝細胞中之每個肝細胞包括編碼基因產物的功能整合的轉殖基因。 55.  如實施例54之非人類哺乳動物，其中該植入的細胞群係活體內擴增的細胞群，並且該非人類哺乳動物進一步包括該等基因改造人類肝細胞之肝細胞後代。 56.  如實施例54或55之非人類哺乳動物，其中該基因改造人類肝細胞進一步包括HLA I類缺陷及編碼至少一種NK細胞誘餌受體的轉殖基因。 57.  如實施例56之非人類哺乳動物，其中該複數個肝細胞中之每個肝細胞進一步包括HLA II類缺陷，視情況其中該HLA II類缺陷包括引起HLA II類基因表現的轉錄因子或輔活化物的缺陷，視情況其中該轉錄因子或輔活化物係CIITA。 58.  如實施例54至57中任一項之非人類哺乳動物，其中該轉殖基因編碼選自由以下組成之群組的基因產物：銅轉運ATP酶2（ATP7B）、遺傳性血色素沉著症蛋白（HFE）、血幼素、鐵調素（HAMP）、轉鐵蛋白受體蛋白2（TFR2）、溶質載體家族40成員1（SLC40A1）、因子IX、因子VIII、馮威里氏因子、胺甲醯基磷酸合成酶（CPS1）、N-乙醯麩胺酸合成酶（NAGS）、鳥胺酸胺甲醯基轉移酶（OTC）、α-半乳糖苷酶A基因（GLA）、苯丙胺酸羥化酶（PAH）、精胺酸酶（ARG）、α-1抗胰蛋白酶（AAT）、反丁烯二醯乙醯乙酸水解酶（FAH）、精胺醯琥珀酸裂解酶（ASL）、精胺醯琥珀酸合成酶（ASS）、鳥胺酸移位酶（ORNT1）、檸檬素、UDP-葡萄醣醛酸轉移酶1A1（UGT1A1）、轉甲狀腺素蛋白（TTR）、絲胺酸-丙酮酸胺基轉移酶（AGXT）、補體因子H（CFH）及其組合。 59.  如實施例54至58中任一項之非人類哺乳動物，其中該非人類哺乳動物係活體內生物反應器。 60.  如實施例59之非人類哺乳動物，其中該活體內生物反應器係嚙齒動物。 61.  如實施例59之非人類哺乳動物，其中該嚙齒動物活體內生物反應器係大鼠活體內生物反應器。 62.  如實施例59之非人類哺乳動物，其中該活體內生物反應器係豬。 63.  如實施例60至62中任一項之非人類哺乳動物，其中該嚙齒動物活體內生物反應器缺乏介白素2受體次單元γ（IL2rg）、重組活化基因1（RAG1）、重組活化基因2（RAG2）或其組合。 64.  如實施例60至63中任一項之非人類哺乳動物，其中該嚙齒動物活體內生物反應器缺乏反丁烯二醯乙醯乙酸水解酶（FAH）。 65.  如實施例54至62中任一項之非人類哺乳動物，其中其基因改造人類肝細胞為改造的初代人類肝細胞。 66.  一種肝細胞或其前驅細胞群，其包括自如實施例54至65中任一項之非人類哺乳動物分離的基因改造人類肝細胞的擴增群體。 67.  如實施例66之肝細胞或其前驅細胞群，其中該肝細胞群被冷凍保存。 68.  如實施例66或67之肝細胞或其前驅細胞群，其中該群體包括1億至200億個肝細胞或其前驅細胞。 69.  如實施例66至68中任一項之肝細胞或其前驅細胞群，其中該等肝細胞或其前驅細胞存在於容器中，視情況其中該容器係培養器皿、試管、燒瓶、小瓶、冷凍小瓶或冷凍袋。 70.  一種細胞群，其包括複數個低免疫原性初代人類肝細胞，其中該複數個肝細胞中之每個肝細胞包括HLA I類缺陷及編碼至少一種NK細胞誘餌受體的轉殖基因。 71.  如實施例70之細胞群，其包括1億至200億個該等低免疫原性初代人類肝細胞。 72.  如實施例70或實施例71之細胞群，其中該細胞群存在於容器中，視情況其中該容器係培養器皿、試管、燒瓶、小瓶、冷凍小瓶或冷凍袋。 73.  一種產生複數個肝細胞療法劑量之方法，該方法包括： （1a）基因改造人類肝細胞並在一個或多個活體內生物反應器中擴增該等基因改造人類肝細胞，以產生基因改造人類肝細胞的擴增群體，或 （1b）對自一個或多個活體內生物反應器獲得的擴增的人類肝細胞進行基因改造，以產生基因改造人類肝細胞的擴增群體；及 （2）將1a或1b的該基因改造人類肝細胞的擴增群體等分成複數個肝細胞療法劑量。 74.  如實施例73之方法，其中該複數個肝細胞治療劑量包含各自至少10億個肝細胞的至少10個劑量，視情況各自至少100億個肝細胞的至少10個劑量，視情況各自至少10億個細胞的至少100個劑量。 75.  如實施例73或74之方法，其中該等人類肝細胞來源於單個人類肝臟。 76.  一種治療患有病況之複數個個體之方法，該方法包括： 根據實施例73至75中任一項產生複數個肝細胞療法劑量；及 向該等個體中之每個個體投予該複數個劑量中之一個或多個劑量以治療該等個體之該病況。 77.  如實施例76之方法，其中該複數個個體包括至少10個個體，視情況至少100個個體。 78.  如實施例76或77之方法，其中該複數個個體中之每個個體因相同的病況而接受治療。 79.  如實施例76或77之方法，其中該複數個個體中之兩個或更多個個體因不同的病況而接受治療。 80.  一種套組或系統，其包括： 一種或多種改造試劑，其包括： 包括編碼基因產物之轉殖基因的載體，該載體足以將該轉殖基因功能整合至肝細胞或其前驅細胞中；及/或 足以在該肝細胞或其前驅細胞中產生HLA I類缺陷的編輯組合物；及 視情況，使用該一種或多種改造試劑改造肝細胞或其前驅細胞以產生基因改造肝細胞或其前驅細胞並在生物反應器中擴增經基因改造細胞的說明書。 81.  如實施例80之套組或系統，其中該載體係足以將該轉殖基因功能整合至肝細胞或其前驅細胞中的整合載體。 82.  如實施例80或81之套組或系統，其中該編輯組合物包括足以產生該HLA I類缺陷的非病毒載體，視情況LNP。 83.  如實施例80至82中任一項之套組或系統，其進一步包括一種或多種用於冷凍保存該等基因改造肝細胞或其前驅細胞的試劑。 實例
提出以下實例以向本領域中一般技術者提供關於如何製造及使用本發明的完整揭示及描述；其並非旨在限制本發明人認為係其發明的範圍。除非另有說明，否則份係重量份，分子量係平均分子量，溫度係攝氏度，且壓力係大氣壓或接近大氣壓。
分子及細胞生物化學的一般方法可以見於諸如以下之標準教科書：《分子選殖：實驗室手冊第4版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Ed.）》（Sambrook等人，冷泉港實驗室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press） 2012）；《分子生物學簡短方案第4版（Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed.）》（Ausubel等人編, 約翰·威利父子出版公司（John Wiley & Sons） 1999）；《蛋白質方法（Protein Methods）》（Bollag等人, 約翰·威利父子出版公司 1996）；及《細胞及組織培養：生物技術實驗室程序（Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology）》（Doyle及Griffiths, 約翰·威利父子出版公司 1998），該等文獻之揭示內容以引用的方式併入本文中。本揭露中提及的試劑、抗體、細胞、組織樣本等及套組可自商業供應商處獲得，諸如但不限於本文確定之彼等供應商。 實例 1 ：產生通用人類肝細胞
通用人類肝細胞藉由初代人類肝細胞（PHH）的離體工程化產生為（1）缺乏人類白血球抗原（HLA）I類，從而阻斷活體內細胞毒性T細胞（CTL）的識別，以及（2）表現NK細胞的誘餌受體，從而抑制活體內自然殺手（NK）細胞的殺傷。HLA I類缺陷係藉由CRISPR/Cas9靶向剔除β-2-微球蛋白（B2M）來實現的，且NK細胞誘餌受體表現係藉由用攜帶編碼CD47或B2M-HLA-E融合物構築體的轉殖基因的慢病毒載體轉導來實現的。
採用及評估了各種將基因編輯試劑遞送至PHH之方法，包含但不限於產生含有Cas9及合成化學改造gRNA（Synthego）的核糖核蛋白（RNP）且藉由轉染或核轉染遞送至細胞。例如，根據製造商的說明，使用CRISPRMAX™ Cas9系統（賽默飛世爾科技公司（ThermoFishser Scientific））進行RNP轉染。簡而言之，將TrueCut™ Cas9蛋白v2（賽默飛世爾科技公司）及合成化學改造sgRNA（Synthego）複合成RNP，接著與CRISPRMAX™試劑一起直接添加至剛解凍的PHH中，接著在37℃培育箱中搖動2小時。根據製造商的說明，使用P3初代細胞4D-Nucleofector套組在Lonza 4D-Nucleofector™ X裝置上進行RNP核轉染。
本實例中使用的靶向B2M基因座的外顯子1的例示性gRNA序列如下：
名稱 目標序列 PAM序列
B2M_Ex1_7 GGCCACGGAGCGAGACATCT（SEQ ID NO:039） CGG
作為對照，不相關的安全港基因座AAVS1使用上述相同的CRISPR/Cas9系統進行靶向，但使用具有以下序列的AAVS1靶向gRNA：
名稱 目標序列 PAM序列
AAVS1 GGGGCCACTAGGGACAGGAT（SEQ ID NO:042） TGG
編輯後，用含有CD47或B2M-HLA-E融合物轉殖基因的慢病毒載體（LVV）在37℃在搖動下轉導接受核轉染或轉染方案的細胞2小時。使用的轉殖基因之序列如下：
名稱 序列
hsCD47 SEQ ID NO:043（編碼SEQ ID NO:037）
截短CD47 SEQ ID NO:045（編碼SEQ ID NO:038）
B2M-HLA-E融合物 SEQ ID NO:047（編碼SEQ ID NO:036）
亦進行了在不添加LVV的情況下搖動兩小時的陰性對照模擬轉導，允許在沒有LVV轉導的情況下評定B2M或對照基因座編輯。
評定了所靶向的B2M基因座或AAVS1對照基因座的編輯效率。簡而言之，自細胞樣本中提取基因體DNA（gDNA），並對感興趣的區域進行PCR擴增。藉由桑格方法（Sanger method）對擴增的DNA進行定序，並對所得讀段進行藉由分解追蹤插入或缺失（Tracking of Indels by Decomposition，TIDE）分析。使用抗HLA-ABC、抗HLA-E及/或抗CD47特異性抗體藉由流動式細胞測量術評估在進行靶向或對照編輯的細胞中產生的B2M及/或表現的轉殖基因的所得蛋白質表現量。
如圖1所示，在B2M目標基因座及AAVS1對照基因座上，分別觀察到了80%或更高的編輯效率，此係藉由插入或缺失（左側y軸，黑色條柱）或基因剔除（KO）分數（左側y軸，灰色條柱）量測的。單獨使用B2M外顯子1靶向試劑（「僅B2Mex1-7 RNP」）或單獨使用對照基因座靶向試劑（「僅AAVS1 RNP」）的編輯效率與包含NK細胞誘餌受體LVV轉導（亦即B2M-HLA-E融合物）（「B2Mex1-7 HLA-E」；「AAVS1 HLA-E」）或CD47（「B2Mex1-7 CD47」；「AAVS1 CD47」）時觀察到的效率相似。此外，藉由流動式細胞測量術（右側y軸，紅點）量測的B2M陰性細胞（「B2M-」）的百分比表明，B2M編輯樣本（「B2Mex1-7 HLA-E」、「B2Mex1-7 CD47」及「僅B2Mex1-7 RNP」）中至少80%的細胞不表現B2M蛋白。相比之下，在AAVS1對照樣本（「AAVS1 HLA-E」、「AAVS1 CD47」及「僅AAVS1 RNP」）中，B2M陰性的細胞少於30%，在一些情況下少於20%。此等數據表明經由所描述的編輯過程成功產生了B2M陰性PHH，此在基因體及蛋白質層面上實現了B2M KO的高編輯效率及特異性。
除B2M KO外，亦在處理過的PHH中評定了引入的NK誘餌受體轉殖基因CD47及HLA-E的表現。上述組（「B2Mex1-7 HLA-E」；「B2Mex1-7 CD47」；「僅B2Mex1-7 RNP」；「AAVS1 HLA-E」；「AAVS1 CD47」；「僅AAVS1 RNP」）中B2M陰性以及HLA-E或CD47表現的流動式細胞測量術分析結果在圖2中提供。如所示，在接受B2M靶向編輯及誘餌受體轉導的組中觀察到同時對B2M呈陰性及對誘餌受體表現呈陽性的較高量的細胞（「B2M-/HLA-E%」或「B2M-/CD47+%」）。相應地，在對照編輯反應（「AAVS1 HLA-E」；「AAVS1 CD47」；「僅AAVS1 RNP」）中觀察到低水準的B2M陰性，並且在未用LVV處理的反應中基本上不存在誘餌受體（「僅B2Mex1-7 RNP」；「僅AAVS1 RNP」）。此等數據表明成功且有效地產生了B2M陰性並表現兩種不同NK細胞誘餌受體之一的PHH。
此外，此等數據表明，上述方法導致PHH群體含有超過50%，在一些情況下，至少60%、至少70%或至少80%的缺乏HLA I類同時表現NK細胞誘餌受體的雙工程化PHH。此類百分比不被認為係限制性的，且因此，具有大於80%的雙工程化肝細胞的群體可以經由本文描述的此等及其他方法容易地實現。 實例 2 ：雙工程化初代人類肝細胞係低免疫原性的
基本上如上所述產生具有B2M KO並表現CD47或B2M-HLA-E融合物轉殖基因的雙工程化PHH。將雙工程化細胞與各種免疫細胞組合物以各種比率混合，並進行存活率分析。簡而言之，將工程化細胞與免疫細胞混合，該等免疫細胞包含細胞毒性T淋巴細胞（CTL）及自然殺手（NK）細胞，藉由細胞介素刺激活化並具有強效應功能，並評估雙工程化細胞隨著時間推移的存活率（亦即生存力）。
例如，針對四種不同的目標細胞組評定了2:1免疫細胞與目標細胞共培養物中的存活率：（1）雙工程化B2M外顯子1 KO+B2M-HLA-E轉殖基因細胞，（2）雙工程化B2M外顯子1 KO+CD47轉殖基因細胞，（3）僅單工程化B2M外顯子1 KO RNP細胞，及（4）僅AAVS1 RNP對照細胞。免疫細胞包含主要由CTL製成的效應細胞混合物，並藉由定量的基於成像的細胞生存力分析法經72小時評定存活率。與對照組（4）相比，在所有時間點（24小時、48小時及72小時）的所有B2M剔除（B2M-；第1組、第2組、第3組）PHH中均觀察到存活率顯著增加。
在另一實例中，針對四組不同的目標細胞，評定2:1免疫細胞與目標細胞共培養物（其中免疫細胞混合物主要含有NK細胞）中的存活率：（1）雙工程化B2M外顯子1 KO+B2M-HLA-E轉殖基因細胞，（2）雙工程化B2M外顯子1 KO+CD47轉殖基因細胞，（3）僅單工程化B2M外顯子1 KO RNP細胞，及（4）僅AAVS1 RNP對照細胞。與對照組（4）相比，雙工程化組（1）及（2）在24、48及72小時時間點的存活率水準均有所提高；而單工程化組（3）與對照組相比，由於B2M剔除導致NK細胞的「缺失自我識別」增加，因此存活率下降。
此等數據表明，與在非工程化細胞及僅用B2M KO工程化的細胞中看到的免疫細胞殺傷水準相比，經過雙重工程化為B2M陰性並表現NK細胞誘餌受體轉殖基因的PHH的免疫細胞殺傷降低。總的來說，此等分析表明，將HLA I類缺陷及NK細胞誘餌受體表現工程化至PHH中會產生低免疫原性PHH，在活化的免疫效應細胞群（包含含有活化的CTL及NK細胞亞群的群體）存在下顯示出存活率增加。 實例 3 ：用低免疫原性工程化初代人類肝細胞進行肝臟重新填充
工程化PHH由B2M的CRISPR/Cas9 KO經由RNP轉染或核轉染在有或沒有LVV轉殖基因轉導的情況下產生，基本上如上所述。四組不同的工程化細胞，（1）Cas9 B2M KO RNP經由轉染，（2）Cas9 B2M KO RNP經由轉染+LVV，（3）Cas9 B2M KO RNP經由核轉染，及（4）Cas9 B2M KO RNP經由核轉染+LVV，分別經由脾內注射以每隻動物5×10 5個活細胞移植至接受體FRGN小鼠中。用NTBC對動物進行循環以引入選擇性壓力並促進移植細胞的植入。在移植後2、4及8週評定人類白蛋白含量（hALB），作為移植工程化PHH植入及擴增的替代指標。
在所有三個時間點觀察到所有組的hALB含量均增加，表明所有組（1）-（4）的工程化細胞均能夠在接受體動物中植入及擴增。此外，在相應的時間點，RNP遞送的轉染及核轉染模式之間的hALB含量係可比的，表明編輯組件的任何一種遞送方法均可以成功地用於生成能夠進行肝臟植入及重新填充的功能性工程化PHH。此外，將在輸入群體（亦即用於移植至FRGN生物反應器中的離體工程化PHH）中具有所期望工程化特徵（亦即B2M KO、HLA-E轉殖基因表現、或KO及轉殖基因表現）的細胞的代表與輸出群體（亦即在活體內擴增後自重新填充的FRGN生物反應器中純化之肝細胞）相比較。圖3A-3D提供來自輸入及輸出群體的所期望工程化細胞（使用轉染或核轉染產生）的百分比，藉由DNA分析量測為具有B2M KO（圖3A），藉由流動式細胞測量術分析量測為具有B2M KO（圖3B），藉由流動式細胞測量術分析量測為具有HLA-E轉殖基因表現（圖3C），以及藉由流動式細胞測量術分析量測為具有雙重改造（亦即B2M KO及轉殖基因表現）（圖3D）。亦平行評定了來自未處理對照（NTC）動物（亦即移植了未經改造的PHH的動物）的樣本。如所示，此等比較揭示了輸入及輸出群體之間所期望工程化細胞的驚人相似表示，表明工程化肝細胞及未改造肝細胞之間的植入、擴增及重新填充動力學相當。此外，在研究終止時（移植後24週），移植了工程化PHH的宿主FRGN肝臟顯示出與接受未改造PHH的NTC動物相比相似的重新填充及人源化水準（藉由肝臟免疫組織化學針對FAH及hAlb ELISA所量測）。例如，與代表性NTC動物中觀察到的90.81% FAH+細胞及11,607 μg/mL hAlb相比，移植了工程化細胞的兩隻代表性動物顯示出89.76%及89.54%的FAH+細胞重新填充率及12,489 μg/mL及11,615 μg/mL的hAlb量。
總的來說，此等數據顯示根據本文描述之方法用基因體編輯及/或整合的轉殖基因工程化的低免疫原性PHH以及一般的PHH係有功能的並且能夠重新填充接受體肝臟。此類重新填充被認為係以與未經編輯/未經改造的細胞相當的動力學發生的，表明以此種方式工程化之肝細胞及其後代將在宿主肝臟中持續存在。因此，如本文所述，通用肝細胞及通常用任何編輯或轉殖基因工程化之肝細胞可以例如在活體內生物反應器中移植並成功擴增，移植至個體中用於治療目的等。 實例 4 ：轉殖基因工程化的 PHH 在活體內植入、擴增及產生生理相關量的治療性轉殖基因產物
活體內FRG大鼠擴增的人類肝細胞（huFRG）被分離及冷凍保存。對於冷凍保存，將肝細胞懸浮液等分至器皿中並藉由離心沈澱。在低溫條件下將細胞沈澱輕輕重懸於冷凍保存培養基中以達到所期望的最終濃度，諸如每毫升1000萬個活細胞，並將重懸的細胞保持在4-8℃下。為冷凍保存準備之肝細胞被等分至冷凍容器中並使用可控速率冷凍機冷凍。在控制速率冷凍完成後，將冷凍保存之肝細胞轉移至氣相液氮中儲存。將冷凍保存的huFRG肝細胞解凍並經由慢病毒載體轉導，其中編碼人類因子IX（亦即F9或FIX）或螢火蟲螢光素酶（亦即Luc）的表現匣作為標誌物/對照。
本實例中使用的慢病毒載體（LakePharma/Curia）F9表現構築體包含MND啟動子（SEQ ID NO:001），其可操作地連接至F9編碼序列（SEQ ID NO:002）（編碼F9帕度亞變異體多肽（SEQ ID NO:003）），可操作地連接至3'LTR（SEQ ID NO:004）。
本實例中採用的慢病毒載體（Imanis LV050L）Luc表現構築體包含SFFV啟動子（SEQ ID NO:005），其可操作地連接至Luc編碼序列（SEQ ID NO:006）（編碼Luc多肽（SEQ ID NO:007））及EmGFP編碼序列（SEQ ID NO:008）（編碼EmGFP多肽（SEQ ID NO:009）），可操作地連接至3'LTR（SEQ ID NO:004）。
轉導後，將轉導的huFRG肝細胞經由脾內注射移植至FRGN接受體小鼠中，並將小鼠維持在足以植入及擴增移植的huFRG肝細胞之條件下。隨後使用IVIS活體動物生物發光成像系統（珀金埃爾默公司（PerkinElmer），美國麻薩諸塞州沃爾瑟姆沃爾珊（Waltham, Massachusetts, USA）），在移植細胞在宿主小鼠肝臟內擴增期間的不同時間點分析移植了編碼F9的慢病毒載體（以下稱「LV-F9小鼠」）或編碼螢光素酶的慢病毒載體（以下稱「LV-Luc小鼠」）的小鼠的螢光素酶生物發光。圖4提供了LV-F9及LV-Luc小鼠在移植後第57天-第60天、第85天及第97天的代表性IVIS影像，顯示了LV-Luc小鼠中的顯著生物發光，在隨後的時間點強度增加。在此分析中，LV-F9小鼠用作有用的陰性對照，因為LV-F9載體不編碼螢光素酶，因此預計在LV-F9小鼠中不會偵測到生物發光。
對在IVIS上量測的生物發光進行定量，且圖5提供了在移植後第57天或第60天、第85天及第97天對個別LV-F9及LV-Luc小鼠的此類定量（量測為每秒光子的總通量；p/s）。定量證實了上述定性觀察結果，亦即LV-Luc動物顯示出顯著的生物發光，例如，與LV-F9動物相比，並且與早期的第57天或第60天時間點相比，在後期時間點的生物發光強度更大。總的來說，此等發現證明了轉導的huFRG肝細胞在宿主小鼠中的有效植入，並且在此種情況下，引入的轉殖基因螢光素酶在移植後至少幾個月內自植入之肝細胞及/或其後代中成功且持續地表現。
採用與上述類似之方法，用慢病毒載體轉導huFRG肝細胞，其含有編碼人類F9的帕度亞變異體的表現匣（又名「R338L」替代（Simioni等人 《新英格蘭醫學雜誌（N Engl J Med）》 2009;361:1671-5）對應於R384L替代（與野生型UniProt P00740相比；RefSeq NP_000124.1；SEQ ID NO:010），其顯示出高於正常生理水準八倍（8×）的凝血活性（參見Lozier. 《血液（ Blood）》 (2012) 120(23):4452-4453）。將500,000個轉導的huFRG肝細胞經由脾內注射移植至FRGN接受體小鼠中，並將小鼠維持在足以植入及擴增移植的huFRG肝細胞之條件下。在移植後不同時間點自LV-F9小鼠收集的血液樣本中量測人類白蛋白及人類F9量。將移植了經LV-Luc轉導的huFRG肝細胞的小鼠用作對照，並自LV-Luc對照動物收集相應的人類白蛋白及人類F9量測值。
圖6提供了在移植後14、28、47及98天收集的來自LV-F9及LV-Luc小鼠的周邊血液樣本中量測的異源人類白蛋白含量（以微克/毫升為單位，對數標度）。可以很容易地看出，兩個組中的人類白蛋白含量穩步增加，表明LV-F9及LV-Luc huFRG工程化肝細胞在各別宿主肝臟中的植入及擴增量相似。此外，到98天，人類白蛋白含量最終達到與至少70-80%人源化一致的量，此表明離體工程化肝細胞的活體內移植及擴增係穩健的。
圖7提供了在移植後14、28、47及98天收集的來自LV-F9及LV-Luc小鼠的周邊血液樣本中量測的異源人類F9量（以奈克/毫升為單位，對數標度）。分析的偵測下限（LOD）由水平虛線表示。作為評估工程化huFRG肝細胞在臨床缺陷（例如，在單基因疾病中觀察到臨床缺陷）方面的治療潛力的替代指標，對應於（1）在F9缺陷的人類個體中實現所期望治療效果所必需的量（亦即，5%的正常生理量，250 ng/mL，「5%正常F9」）或（2）人類個體的正常生理量（亦即100%的正常生理量，5000 ng/mL，「100%正常F9」）的F9量亦用水平虛線表示。
正如在圖7中可以很容易地看到的那樣，至少早在移植後評估的第一個時間點（亦即14天），LV-F9小鼠就達到超過所期望治療效果所需的人類F9量。此外，到移植後至少第28天，LV-F9小鼠的人類F9量超過了100%的正常生理量。此等小鼠在隨後的所有時間點繼續表現出超生理量的人類F9。
總的來說，此等研究結果表明，經離體工程化以表現人類F9的huFRG肝細胞很容易在接受體周邊血液中植入、擴增並產生可偵測量的人類F9。此外，移植的小鼠周邊血液中的人類F9量迅速達到足以對人類F9缺陷產生治療效果的量。此外，達到了對應於甚至超過100%的正常人類生理F9量的量，並持續至最後量測的時間點。
移植至LV-Luc小鼠中的HuFRG肝細胞含有編碼因子IX的內源人類基因。因此，儘管此等細胞不像LV-F9 huFRG肝細胞那樣攜帶異源F9轉殖基因，但Luc肝細胞仍然自內源基因座表現人類F9。雖然自LV-Luc小鼠收集的周邊血液中人類F9的初始（亦即移植後第14天及第28天）量處於或低於LOD（參見例如圖7），但在huFRG細胞在宿主肝臟內大量擴增後的較晚時間點（參見例如圖7，LV-F9 d47及d98），人類F9量最終確實達到顯著量（如藉由量測人類白蛋白含量所證實）。與LV-Luc小鼠中的此類人類F9產生相比，LV-F9小鼠中的人類F9產生在每個時間點顯著更高，表明在最終量測的時間點達到治療及生理量的速度更快以及總體量更高。例如，雖然LV-F9小鼠在第28天達到F9的100%正常生理量，但LV-Luc小鼠直到第98天時間點才達到100%正常生理量。因此，此等數據表明F9轉殖基因的存在在治療效果的啟動及效力方面提供了顯著優勢。
圖8提供了在第47天時間點每隻動物中量測的人類F9量與每隻動物中相應人類白蛋白含量的關係圖。0.1%、1%及5%植入以及5%及100%的正常生理人類F9的參考量分別顯示為垂直及水平虛線。在所有情況下，當比較具有基本相似的植入量的小鼠時，與相應的LV-Luc小鼠相比，彼等接受了經帕度亞F9轉殖基因離體工程化的huFRG肝細胞的小鼠在周邊血液中具有更高的人類F9量。因此，該數據進一步支持例如與自內源基因座表現F9的細胞相比，在接受F9轉殖基因的彼等細胞中更高的每細胞F9表現量。此外，此分析表明，離體經工程化以表現人類F9轉殖基因的huFRG肝細胞的不到1%的植入，甚至低至0.2%的植入就足以在周邊血液中實現人類F9的治療濃度甚至正常生理濃度。
圖9提供了對於第96天時間點的動物與圖8對應的圖。儘管LV-Luc及LV-F9動物中的植入量相似（由所有數據點的x軸上基本相似的位置表示），但與來自LV-Luc動物的周邊血液相比，LV-F9動物的周邊血液含有高約60倍（60×）的人類F9。考慮到帕度亞變異體的此高表現量及增強的凝血活性，LV-F9小鼠的理論凝血活性比LV-Luc對照動物高490倍（490×）。
總的來說，此等數據證明了經工程化以含有及表現治療性轉殖基因的人類肝細胞在宿主肝臟中的成功植入及擴增。此外，此等數據表明，攜帶轉殖基因（無論轉殖基因的屬性如何）的工程化肝細胞的植入及擴增至少與在不攜帶轉殖基因的對照細胞中看到的植入及擴增相當。此外，鑒於觀察到來自轉殖基因工程化肝細胞的治療因子的高表現量（例如，與相關內源性因子在非工程化細胞中的相應表現相比），如本文所述，此類工程化肝細胞的植入及擴增提供了快速達到治療相關水準的轉殖基因表現產物，該表現產物隨時間的推移（包含歷經多個月）增加並持續存在。 實例 5 ：產生及擴增因子 IX 工程化的人類肝細胞以用於 B 型血友病
以下表現構築體經設計以用於引入人類肝細胞中，從而促進移植至有需要之個體中的工程化肝細胞表現治療性轉殖基因產物，該有需要之個體諸如係患有因子IX缺陷，諸如B型血友病的人類個體。
本實例中採用的F9表現構築體包含合適的啟動子（諸如MND啟動子（SEQ ID NO:001）），其可操作地連接至F9編碼序列（諸如全長F9編碼序列（SEQ ID NO:011），編碼全長F9多肽（SEQ ID NO:010））、帕度亞變異體F9編碼序列（SEQ ID NO:002）（編碼F9帕度亞變異體多肽（SEQ ID NO:003））或其類似序列，可操作地連接至合適的3'序列（包含例如多腺苷酸化信號（polyA））。
如將容易理解的，在一些情況下，可以在上述構築體中進行取代，包含例如將所描述的啟動子取代為另一個合適的啟動子，將轉殖基因編碼序列取代為另一個編碼相同轉殖基因或該轉殖基因變異體的編碼序列，將轉殖基因的3'序列交換為另一個3'序列（例如，包含替代的polyA或其他3'組分）或其類似取代。將表現構築體引入合適的慢病毒載體以轉導至肝細胞中。
用上述表現構築體之一轉導新鮮分離的人類肝細胞或最近解凍的冷凍保存之肝細胞。有用的新鮮分離的人類肝細胞包含自屍體供體肝組織分離之彼等以及在活體內生物反應器中擴增及分離之彼等。有用的冷凍保存之肝細胞包含自屍體供體肝組織分離後冷凍保存之彼等以及在活體內生物反應器中擴增及分離後冷凍保存之彼等。因此，在人類肝細胞在活體內生物反應器諸如嚙齒動物生物反應器中擴增之前或之後進行轉導。
用任何上述構築體轉導的人類肝細胞可以係在其他方面未經改造的，例如，上述構築體的引入係唯一進行的基因改造。或者，可以改造用任何上述構築體轉導的人類肝細胞以包含額外的基因改造並且可以例如係低免疫性的，包含例如藉由破壞HLA I類基因座（諸如B2M基因座）及引入NK細胞誘餌受體轉殖基因（諸如CD47、HLA-E或B2M-HLA-E融合物轉殖基因）而使肝細胞具有低免疫性。在用上述鑑定的表現構築體轉導之前、期間或之後使人類肝細胞與誘導低免疫性的試劑（例如，B2M編輯組合物及NK細胞誘餌受體轉殖基因）接觸。
在肝細胞擴增之前進行轉導的情況下，將轉導之肝細胞經由脾內或門靜脈注射移植至一個或多個接受體嚙齒動物生物反應器（諸如FRG大鼠、FRGN小鼠或其類似生物反應器）中，且一隻或多隻嚙齒動物被維持在足以植入及擴增移植的工程化肝細胞之條件下。在一個或多個生物反應器中擴增後，採集一個或多個生物反應器肝臟並對其進行灌注以回收工程化人類肝細胞的擴增群體。回收的工程化人類肝細胞經由富集、純化及/或分離程序進行處理。所得到的經處理的細胞群隨後準備用於遞送或冷凍保存以供以後遞送至有需要之個體。
在肝細胞擴增後進行轉導的情況下，在進一步處理以富集、分離、純化及/或分離所期望的肝細胞（有或沒有在任何方便之時進行冷凍保存）之前或之後，自一個或多個嚙齒動物生物反應器中回收擴增之肝細胞，並用上述鑑別之構築體進行轉導。所得到的經轉導及處理的細胞群隨後準備用於遞送或冷凍保存以供以後遞送至有需要之個體。
在合適的遞送介質中將製備的工程化肝細胞群調配成劑量調配物。製備的劑量調配物經由醫學上合適的途徑遞送至有需要之個體，諸如經由脾內或門靜脈注射或輸注，以治療個體的因子IX缺陷及B型血友病。 實例 6 ：產生及擴增因子 VIII 工程化的人類肝細胞以用於 A 型血友病
評估了使用LVV方法將外源因子VIII（F8）轉殖基因引入初代人類肝細胞以產生F8工程化肝細胞的可行性，例如，在轉殖基因轉導之前或之後在活體內生物反應器中擴增。作為初步測試，用市售的過表現人類F8的LVV（相應臨床構築體的未最佳化替代物）以各種感染複數（MOI）離體轉導初代人類肝細胞，並在活體外維持該等細胞。作為對照，未轉導的初代人類肝細胞（亦即未處理的對照，NTC）保持在相同的活體外培養條件下。在培養第4天、第5天及第6天自MOI 2轉導樣本、MOI 7轉導樣本及NTC樣本收集上清液，並使用市售套組（Chromogenix Coatest SP4因子VIII套組；DiaPharma，俄亥俄州西赤斯特（West Chester, OH））量測F8活性。在培養第6天收集上清液後，採集並裂解細胞，並對細胞裂解物進行F8活性分析。
MOI 2及MOI 7樣本中的F8活性量在第4天、第5天及第6天時間點顯示活性增加。相比之下，NTC樣本中的F8活性在所有三個時間點均處於基線。到第6天時間點，在MOI 7上清液樣本中量測的F8活性至少係NTC基線水準的四倍（4×）。重要的是，F8活性的偵測表明外源F8由工程化細胞表現及分泌。在第6天的細胞裂解物中，人類F8活性相應較高。此等數據證明了產生工程化人類肝細胞的能力，該工程化人類肝細胞過表現人類F8並顯示出顯著高於相應的非工程化人類肝細胞的F8活性，即使使用未最佳化的替代F8-LVV進行轉導亦係如此。
在證明了產生過表現F8的人類肝細胞的能力後，設計了以下改進的表現構築體以用於引入人類肝細胞中，以促進藉由移植至有需要之個體（諸如患有因子VIII缺陷，諸如A型血友病的人類個體）中的工程化肝細胞表現治療性轉殖基因產物。
本實例中使用的F8表現構築體包含合適的啟動子，諸如MND啟動子（SEQ ID NO:001），其可操作地連接至F8編碼序列（諸如全長F8編碼序列（SEQ ID NO:012），編碼全長F8多肽（SEQ ID NO:013））、B域缺失的F8（亦即BDDrFVIII）編碼序列（SEQ ID NO:014）（編碼BDDrFVIII變異體多肽（SEQ ID NO :015））、FVIII-Fc融合蛋白（亦即F8.Fc）編碼序列（SEQ ID NO:016）（編碼F8.Fc多肽（SEQ ID NO:017））或其類似序列，可操作地連接至合適的3'序列，包含例如polyA信號。
有用的構築體包含編碼多種多肽的彼等構築體，諸如F8多肽及馮威里氏因子（vWF）多肽（諸如vWF Fc融合物（亦即，由SEQ ID NO:018編碼的vWF.Fc SEQ ID NO:019），包含例如其中此類多肽自經由2A自切割序列可操作地連接至vWF編碼序列的F8編碼序列表現，該自切割序列諸如為含有弗林蛋白酶及甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸的2A序列，諸如弗林蛋白酶.GSG.T2A（SEQ ID NO:020）或弗林蛋白酶.GSG.P2A（SEQ ID NO:021）。當使用多個多肽，諸如vWF及F8時，編碼序列以任何順序配置。
有用的表現匣配置包含例如： [MND啟動子]-[F8全長]-[polyA], [MND啟動子]-[F8 (B域缺失)]-[polyA], [MND啟動子]-[F8.Fc]-[弗林蛋白酶.GSG.T2A]-[VWF.Fc]-[polyA], [MND啟動子]-[VWF.Fc]-[弗林蛋白酶.GSG.T2A]-[F8.Fc]-[polyA]及其類似配置。
如將容易理解的，在一些情況下，可以在上述構築體中進行取代，包含例如將所描述的啟動子取代為另一個合適的啟動子，將轉殖基因編碼序列取代為另一個編碼相同轉殖基因或該轉殖基因變異體的編碼序列，將轉殖基因的3'序列交換為另一個3'序列（例如，包含替代的polyA或其他3'組分）或其類似取代。將表現構築體引入合適的慢病毒載體以轉導至肝細胞中。
肝細胞基本上如實例5中所述製備、擴增及轉導，用上述構築體取代實例5中描述的彼等構築體。
在合適的遞送介質中將製備的工程化肝細胞群調配成劑量調配物。製備的劑量調配物經由醫學上合適的途徑遞送至有需要之個體，諸如經由脾內或門靜脈注射或輸注，以治療個體的因子VIII缺陷及A型血友病。 實例 7 ：產生及擴增用尿素循環基因工程化的人類肝細胞以用於尿素循環障礙（ UCD ）
以下表現構築體經設計以用於引入人類肝細胞中，從而促進移植至有需要之個體中的工程化肝細胞表現治療性轉殖基因產物（或多種轉殖基因產物），該有需要之個體諸如係患有UCD的人類個體。
在此實例中使用的表現構築體包含合適的啟動子，諸如MND啟動子（SEQ ID NO:001），其可操作地連接至一種或多種尿素循環基因（諸如在氮廢物的代謝中限速的彼等尿素循環基因），可操作地連接至合適的3'序列，包含例如polyA信號。
有用的編碼尿素循環基因的序列，包含例如： 胺甲醯基磷酸合成酶（CPS1）編碼序列，諸如密碼子最佳化的CPS1編碼序列（SEQ ID NO:022），編碼CPS1多肽（SEQ ID NO:023）； N-乙醯麩胺酸合成酶（NAGS）編碼序列，諸如密碼子最佳化的NAGS編碼序列（SEQ ID NO:024），編碼NAGS多肽（SEQ ID NO:025）； 鳥胺酸胺甲醯基轉移酶（OTC）編碼序列，諸如密碼子最佳化的OTC編碼序列（SEQ ID NO:026），編碼OTC多肽（SEQ ID NO:027），或其類似序列。
有用的構築體包含編碼多種多肽的彼等構築體，諸如CPS1及NAGS、CPS1及OTC、NAGS及OTC，或CPS1、NAGS及OCT，包含例如，其中此類多肽自經由2A-自切割序列可操作地連接至第二編碼序列的第一編碼序列表現，該自切割序列諸如為含有弗林蛋白酶及甘胺酸-絲胺酸-甘胺酸的2A序列，諸如弗林蛋白酶.GSG.T2A（SEQ ID NO:020）或弗林蛋白酶.GSG.P2A（SEQ ID NO:021）。當使用多個多肽，諸如編碼第一多肽的第一尿素循環編碼序列及編碼第二多肽的第二尿素循環編碼序列時，編碼序列以任何順序配置。
有用的表現匣配置包含例如： [MND啟動子]-[CPS1]-[polyA] [MND啟動子]-[NAGS]-[polyA] [MND啟動子]-[OTC]-[polyA] [MND啟動子]-[CPS1]-[polyA]-[弗林蛋白酶.GSG.T2A]-[OTC]-[polyA] [MND啟動子]-[OTC]-[polyA]-[弗林蛋白酶.GSG.T2A]-[CPS1]-[polyA] [MND啟動子]-[NAGS]-[polyA]-[弗林蛋白酶.GSG.T2A]-[CPS1]-[polyA] [MND啟動子]-[CPS1]-[polyA]-[弗林蛋白酶.GSG.T2A]-[NAGS]-[polyA] [MND啟動子]-[NAGS]-[polyA]-[弗林蛋白酶.GSG.T2A]-[CPS1]-[弗林蛋白酶.GSG.P2A]-[OTC]-[polyA]
如將容易理解的，在一些情況下，可以在上述構築體中進行取代，包含例如將所描述的啟動子取代為另一個合適的啟動子，將轉殖基因編碼序列取代為另一個編碼相同轉殖基因或該轉殖基因變異體的編碼序列，將轉殖基因的3'序列交換為另一個3'序列（例如，包含替代的polyA或其他3'組分）或其類似取代。將表現構築體引入合適的慢病毒載體以轉導至肝細胞中。
肝細胞基本上如實例5中所述製備、擴增及轉導，用上述構築體取代實例5中描述的彼等構築體。
在合適的遞送介質中將製備的工程化肝細胞群調配成劑量調配物。製備的劑量調配物經由醫學上合適的途徑遞送至有需要之個體，諸如經由脾內或門靜脈注射或輸注，以治療個體之尿素循環障礙。 實例 8: 產生及擴增 GLA 基因工程化的人類肝細胞以用於法布里病
評估了使用LVV方法將外源性α-半乳糖苷酶A（GLA）轉殖基因引入初代人類肝細胞以產生GLA工程化肝細胞的可行性，該等肝細胞例如在轉殖基因轉導之前或之後在活體內生物反應器中擴增。作為初始測試，用市售的過表現人類GLA的LVV（相應臨床構築體的未最佳化替代物）以各種感染複數（MOI）離體轉導初代人類肝細胞，並在活體外維持該等細胞。作為對照，未轉導的初代人類肝細胞（亦即未處理的對照，NTC）保持在相同的活體外培養條件下。在培養第5天自MOI 2轉導樣本、MOI 12轉導樣本及NTC樣本中收集細胞，接著裂解並勻漿。α-半乳糖苷酶（α-Gal）活性使用市售分析法（Abcam，英國劍橋（Cambridge, UK））量測，該分析法使用特定合成受質，在α-Gal裂解後釋放螢光團（其可在Ex/Em 360/445 nm下定量）。亦使用了包含在上述套組中的陽性對照樣本。
在所有MOI 2及MOI 12樣本中量測的α-Gal活性量至少係NTC中觀察到的最高活性水準的五倍（5×）。此外，在一些具有最高活性的轉導樣本中量測的α-Gal活性係在陽性對照樣本中觀察到的最高活性的十倍（10×）或更大。總的來說，此等數據證明了產生工程化人類肝細胞的能力，該工程化人類肝細胞過表現人類GLA並顯示顯著高於相應的非工程化人類肝細胞的α-Gal活性，即使使用未最佳化的替代GLA-LVV進行轉導亦係如此。
在證明了產生過表現F8的人類肝細胞的能力後，設計了以下改進的表現構築體以用於引入人類肝細胞中，以促進藉由移植至有需要之個體（諸如患有胞溶體貯積症，諸如法布里病的人類個體）中的工程化肝細胞表現治療性轉殖基因產物。
本實例中使用的表現構築體包含合適的啟動子，諸如MND啟動子（SEQ ID NO:001），其可操作地連接至α-半乳糖苷酶A基因（GLA）（諸如GLA（1）編碼序列（SEQ ID NO:028），編碼GLA（1）多肽（SEQ ID NO: 029））或GLA（2）編碼序列（SEQ ID NO: 030）（編碼GLA（2）多肽（SEQ ID NO: 029））或其類似編碼序列，可操作地連接至合適的3'序列，包含例如polyA信號。
有用的表現匣配置包含，例如： [MND啟動子-[GLA (1)]-[polyA] [MND啟動子-[GLA (2)]-[polyA]
如將容易理解的，在一些情況下，可以在上述構築體中進行取代，包含例如將所描述的啟動子取代為另一個合適的啟動子，將轉殖基因編碼序列取代為另一個編碼相同轉殖基因或該轉殖基因變異體的編碼序列，將轉殖基因的3'序列交換為另一個3'序列（例如，包含替代的polyA或其他3'組分）或其類似取代。將表現構築體引入合適的慢病毒載體以轉導至肝細胞中。
肝細胞基本上如實例5中所述製備、擴增及轉導，用上述構築體取代實例5中描述的彼等構築體。
在合適的遞送介質中將製備的工程化肝細胞群調配成劑量調配物。製備的劑量調配物經由醫學上合適的途徑遞送至有需要之個體，諸如經由脾內或門靜脈注射或輸注，以治療個體的胞溶體貯積症及法布里病。
儘管為了清楚地理解，已經藉助於說明及實例的方式對上述發明進行了一些詳細的描述，但對於本領域中一般技術者來說，根據本發明的教導，很容易看出在不背離隨附申請專利範圍的精神或範疇之情況下可以對其進行某些改變及修改。
因此，前面僅說明本發明之原理。應當理解，本領域中熟習此項技術者將能夠設計出各種配置，儘管在此沒有明確地描述或示出，但此等配置體現了本發明的原理並且被包含在其精神及範疇內。此外，本文中所敍述之所有實例及條件語言大體上意欲輔助讀者理解本發明之原理及由本發明人貢獻之概念以促進此項技術，且解釋為不限於所述特定敍述之實例及條件。此外，本文中敍述本發明之原理、態樣及實施例以及其特定實例之所有陳述意欲涵蓋其結構等效物及功能等效物兩者。另外，希望此類等效物包含目前已知之等效物及未來研發之等效物（亦即不管結構如何，執行相同功能之所研發之任何要素）兩者。此外，本文所揭示的任何內容均不意欲獻給公眾，無論該揭示內容是否在申請專利範圍中明確提及。
因此，本發明之範疇不意欲限於本文所顯示且描述之例示性實施例。相反，本發明之範疇及精神係藉由隨附申請專利範圍體現。在申請專利範圍中，35 U.S.C. § 112(f)或35 U.S.C. §112(6)被明確定義為只有在申請專利範圍中的某一限制的開頭引用了確切的片語「手段（means for）」或確切的片語「步驟（step for）」時，才會對該限制進行援引；若該申請專利範圍中的限制沒有使用此類確切片語，則35 U.S.C. § 112 (f)或35 U.S.C. §112(6)不會被援引。
當結合附圖閱讀時，自以下實施方式中可以最好地理解本發明。需要強調的是，根據慣例，附圖的各種特徵並非按比例繪製的。相反，為了清楚起見，各種特徵的尺寸被任意擴大或縮小。附圖中包含以下圖式。
圖 1係顯示在有或沒有B2M-HLA-E或CD47轉殖基因遞送試劑的情況下與靶向β-2-微球蛋白（B2M）外顯子1或對照AAVS1的編輯組合物接觸之肝細胞群中的目標基因座編輯效率的圖式，如藉由插入或缺失（indel）（左側y軸，斑點條柱）及剔除（KO）分數（左側y軸，散列條柱）。亦提供了在所描述基因改造後的相應肝細胞群中藉由流動式細胞測量術（右側y軸，黑點）量測的具有B2M KO的細胞百分比（「B2M-細胞%」）。
圖 2係描繪由在有或沒有B2M-HLA-E或CD47轉殖基因遞送試劑的情況下與靶向B2M外顯子1或對照AAVS1的編輯組合物接觸之肝細胞群產生的具有以下的活細胞百分比的圖式：僅CD47轉殖基因的基因改造（「CD47%」）；B2M KO及CD47轉殖基因的基因改造（「B2M-/CD47+%」）；僅B2M-人類白血球抗原E（HLA-E）融合物轉殖基因的基因改造（「HLA-E%」）；以及B2M KO及B2M-HLA-E融合物轉殖基因的基因改造（「B2M/HLA-E%」），如藉由流動式細胞測量術所量測。亦提供了每個測試組具有B2M KO的細胞百分比（「B2M-%」，點）。
圖 3A-3D係一系列圖式，描繪了藉由DNA分析量測的輸入及輸出群體中具有B2M KO的編輯細胞的百分比（圖3A）、藉由流動式細胞測量術分析量測的B2M KO（圖3B）、藉由流動式細胞測量術分析量測的HLA-E轉殖基因表現（圖3C），以及藉由流動式細胞測量術分析量測的雙重改造（亦即，B2M KO及轉殖基因表現）（圖3D）。亦平行評定了來自未處理對照（NTC）動物（亦即移植了未經改造的PHH的動物）的樣本。
圖 4係在將因子IX慢病毒載體轉導的（LV-F9）或螢光素酶慢病毒載體轉導的（LV-Luc）肝細胞移植至接受體小鼠中之後，在三個時間點（第57天或第60天、第85天及第97天）收集的生物發光影像的矩陣。
圖 5表示在圖4所示的LV-F9及LV-Luc小鼠中偵測到的生物發光信號在所有時間點的定量。
圖 6係描繪在移植後14、28、47及98天自LV-F9及LV-Luc小鼠收集的周邊血液樣本中量測的，由移植的工程化肝細胞產生的人類白蛋白含量的圖式。
圖 7係描繪在移植後14、28、47及98天自LV-F9及LV-Luc小鼠收集的周邊血液樣本中偵測到的人類因子IX含量的圖式。提供指示偵測極限（LOD）的參考含量、因子IX的相應治療量及因子IX的相應正常生理量以用於比較。
圖 8係在LV-F9及LV-Luc小鼠中移植後第47天，在每隻動物中量測的人類因子IX含量與每隻動物中相應人類白蛋白含量的關係圖。0.1%、1%及5%植入以及5%及100%正常生理人類因子XI的參考含量分別顯示為垂直及水平虛線。
圖 9係在LV-F9及LV-Luc小鼠中移植後第98天，在每隻動物中量測的人類因子IX含量與每隻動物中相應人類白蛋白含量的關係圖。0.1%、1%及5%植入以及5%及100%正常生理人類因子XI的參考含量分別顯示為垂直及水平虛線。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Claims (20)

  1. 一種產生低免疫原性肝細胞或其前驅細胞之方法，該方法包括： 使包括人類肝細胞或其前驅細胞的細胞群與編輯組合物在足以在該等肝細胞或其前驅細胞中產生人類白血球抗原（HLA）I類缺陷之條件下接觸；及 使該細胞群與編碼至少一種NK細胞誘餌受體的轉殖基因在足以由該等肝細胞或其前驅細胞表現該轉殖基因之條件下接觸， 從而產生低免疫原性肝細胞或其前驅細胞群。
  2. 如請求項1之方法，其中該編輯組合物係β-2-微球蛋白（B2M）編輯組合物。
  3. 如請求項1或請求項2之方法，其進一步包括將所產生的低免疫原性肝細胞或其前驅細胞群引入生物反應器中。
  4. 如請求項3之方法，其中該生物反應器係活體內生物反應器，並且該活體內生物反應器維持在足以產生低免疫原性肝細胞的擴增群體之條件下，視情況其中該活體內生物反應器係小鼠、大鼠或豬。
  5. 如前述請求項中任一項之方法，其中該至少一種NK細胞誘餌受體包括CD47、B2M-HLA-E融合物、或其組合。
  6. 一種治療個體之病況之方法，該方法包括： 向該個體投予有效量的低免疫原性肝細胞或前驅細胞，其中該等低免疫原性肝細胞或前驅細胞各自包括HLA I類缺陷及編碼至少一種NK細胞誘餌受體的轉殖基因，視情況其中該病況係肝臟病況。
  7. 如請求項6之方法，其中該等低免疫原性肝細胞或其前驅細胞係根據如請求項1至5中任一項之方法產生的。
  8. 一種非人類哺乳動物，其包括植入的細胞群，該細胞群包括複數個低免疫原性人類肝細胞或其前驅細胞，其中該複數個肝細胞或前驅細胞中之每個肝細胞或前驅細胞包括HLA I類缺陷及編碼至少一種NK細胞誘餌受體的轉殖基因，視情況其中該HLA I類缺陷包括B2M缺陷並且該至少一種NK細胞誘餌受體包括CD47、B2M-HLA-E融合物、或其組合。
  9. 一種肝細胞或其前驅細胞群，其包括自如請求項8之非人類哺乳動物分離的低免疫原性人類肝細胞或其前驅細胞的擴增群體。
  10. 一種細胞群，其包括複數個低免疫原性初代人類肝細胞，其中該複數個肝細胞中之每個肝細胞包括HLA I類缺陷及編碼至少一種NK細胞誘餌受體的轉殖基因，視情況其中該HLA I類缺陷包括B2M缺陷並且該至少一種NK細胞誘餌受體包括CD47、B2M-HLA-E融合物、或其組合。
  11. 一種產生基因改造人類肝細胞之方法，該方法包括： 使包括人類肝細胞或其前驅細胞的細胞群與包括編碼基因產物的轉殖基因的整合載體在足以使該轉殖基因功能整合之條件下接觸，以產生包括經整合轉殖基因的基因改造肝細胞或其前驅細胞；及 將該等基因改造肝細胞或其前驅細胞移植至活體內生物反應器中，並將該活體內生物反應器維持在足以擴增該等基因改造肝細胞或前驅細胞之條件下，以產生表現該基因產物的基因改造人類肝細胞的擴增群體，視情況其中該活體內生物反應器係小鼠、大鼠或豬。
  12. 如請求項11之方法，其中該轉殖基因編碼選自由以下組成之群組的基因產物：銅轉運ATP酶2（ATP7B）、遺傳性血色素沉著症蛋白（HFE）、血幼素、鐵調素（HAMP）、轉鐵蛋白受體蛋白2（TFR2）、溶質載體家族40成員1（SLC40A1）、因子IX、因子VIII、馮威里氏因子（von Willebrand factor）、胺甲醯基磷酸合成酶（CPS1）、N-乙醯麩胺酸合成酶（NAGS）、鳥胺酸胺甲醯基轉移酶（OTC）、α-半乳糖苷酶A基因（GLA）、苯丙胺酸羥化酶（PAH）、精胺酸酶（ARG）、α-1抗胰蛋白酶（AAT）、反丁烯二醯乙醯乙酸水解酶（FAH）、精胺醯琥珀酸裂解酶（ASL）、精胺醯琥珀酸合成酶（ASS）、鳥胺酸移位酶（ORNT1）、檸檬素、UDP-葡萄醣醛酸轉移酶1A1（UGT1A1）、轉甲狀腺素蛋白（TTR）、絲胺酸-丙酮酸胺基轉移酶（AGXT）、補體因子H（CFH）、及其組合。
  13. 一種治療個體之病況之方法，該方法包括： 向該個體投予有效量的根據如請求項11或12中任一項之方法產生的基因改造人類肝細胞。
  14. 如請求項13之方法，其中該病況係肝臟病況或遺傳性疾病，視情況其中該遺傳性疾病係單基因疾病，視情況其中該病況係：因子VIII缺乏且該轉殖基因編碼因子VIII；因子IX缺乏且該轉殖基因編碼因子IX；尿素循環障礙（UCD）且該轉殖基因編碼一種或多種尿素循環多肽；或胞溶體貯積症且該轉殖基因編碼與該胞溶體貯積症相關的酶。
  15. 一種包括植入的細胞群之非人類哺乳動物，該細胞群包括複數個基因改造人類肝細胞，其中該複數個肝細胞中之每個肝細胞包括編碼基因產物的功能整合的轉殖基因。
  16. 如請求項15之非人類哺乳動物，其中該植入的細胞群係活體內擴增的細胞群，並且該非人類哺乳動物進一步包括該等基因改造人類肝細胞之肝細胞後代。
  17. 一種肝細胞或其前驅細胞群，其包括自如請求項15或16之非人類哺乳動物分離的基因改造人類肝細胞的擴增群體。
  18. 一種細胞群，其包括複數個低免疫原性初代人類肝細胞，其中該複數個肝細胞中之每個肝細胞包括HLA I類缺陷及編碼至少一種NK細胞誘餌受體的轉殖基因。
  19. 一種產生複數個肝細胞療法劑量之方法，該方法包括： （1a）基因改造人類肝細胞並在一個或多個活體內生物反應器中擴增該等基因改造人類肝細胞，以產生基因改造人類肝細胞的擴增群體，或 （1b）對自一個或多個活體內生物反應器獲得的擴增的人類肝細胞進行基因改造，以產生基因改造人類肝細胞的擴增群體；及 （2）將1a或1b的該基因改造人類肝細胞的擴增群體等分成複數個肝細胞療法劑量。
  20. 一種治療患有病況之複數個個體之方法，該方法包括： 根據請求項19產生複數個肝細胞療法劑量；及 向該等個體中之每個個體投予該複數個劑量中之一個或多個劑量以治療該等個體之該病況，視情況其中該等人類肝細胞來源於單個人類肝臟。
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