JP2024505188A - 遺伝子改変された肝細胞集団 - Google Patents

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Abstract

本開示は、遺伝子改変された肝細胞及び／又は肝前駆細胞の集団並びにそれを産生する方法を提供する。遺伝子改変された肝細胞及び／又は前駆細胞の上記集団を使用する方法、例えば、限定されないが、症状又は複数の症状について対象又は複数の対象を処置する方法もまた提供される。いくつかの例では、この集団の遺伝子改変された肝細胞及び／又は肝前駆細胞は低免疫原性であり、方法は、低免疫原性肝細胞及び／又はその前駆細胞を生成する方法を含む。遺伝子改変された肝細胞及び／又は肝前駆細胞の移植された集団を含む非ヒト哺乳動物もまた提供される。有用なキット、システム、試薬、細胞、及び細胞治療用量もまた提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１月２６日に出願された米国仮特許出願第６３／１４１，７６９号の利益を主張し、この出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
米国だけでも、急性肝疾患の患者は１００，０００人を超え、非代償性肝硬変の患者は５０万人を超える。肝疾患は、米国では年間６２，０００人が死亡し、世界中ではおよそ２００万人が死亡しており、具体的には１３０万人が肝硬変により死亡している。２０１９年現在、肝硬変は世界で１１番目に多い死因であり、米国では１２番目に多い死因であった。世界中では約２０億人がアルコールを消費し、更に約２０億人の成人が肥満又は過体重であり、４億人の成人が糖尿病を患っている。アルコール消費、肝臓脂質沈着、及びインスリン抵抗性は全て、線維症及び最終的に肝硬変の発症における主要な危険因子であると考えられている。更に、薬物誘発性肝損傷は急性肝炎の主な原因として増加し続けているが、ウイルス性肝炎の世界有病率は高いままである。
加えて、伝染病による死亡がまれである先進国では、遺伝的障害が、個々にはまれであるが、集合的に小児期の疾患、身体障害、及び死亡のかなりの負荷を表す。単一遺伝子性疾患は、人生のある時点で最大６％の人々が罹患していると推定される。遺伝的障害には、単一の遺伝子座に起因するもの（すなわち、単一遺伝子性疾患を含む「単一遺伝子障害」）、並びに複数の遺伝的危険因子の集合及び／又は特定の環境因子との組み合わせに起因する多遺伝子性障害が広く含まれる。遺伝子性疾患の総負荷量を定量化することは困難であり、また、多くの原因遺伝子座が知られているが、遺伝カウンセリングは、全体的な有病率をおそらく５％減少させる際に最小限の影響しか有していない（スクリーニングを熱心に適用した場合、特定の症状に対して非常に有効であるにもかかわらず）（例えば、Ｂｌｅｎｃｏｗｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ Ｇｅｎｅｔ．２０１８を参照されたい）。遺伝子性疾患には、フェニルケトン尿症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、アルギナーゼ－１欠損症、α１－アンチトリプシン欠損症、ムコ多糖症、血友病Ａ、血友病Ｂなどの多くの希少な肝疾患が含まれる。遺伝子性疾患の大きな集合的負荷は、その負荷を軽減する際に遺伝カウンセリングが有する低影響と相まって、これらの疾患がグローバルヘルスに与える相当な進行中の影響を例証する。
肝移植は、利用可能で且つ成功すれば、２番目に最も一般的な固形臓器移植を代表する人生を変える治療である。肝移植は、後天性肝疾患及び遺伝性肝疾患の両方において有用である。しかしながら、適切な肝臓は、急性肝不全などの容態が急速に衰えていく対象にとって、必要な量又は時間内に利用可能でないことが多い。上記の広範な疾患有病率と比較して、毎年９，０００件未満の肝臓移植が米国で行われている。
免疫抑制剤、及び免疫抑制薬を使用する処置プロトコルにおける最近の進歩にもかかわらず、拒絶反応は、依然として肝移植の一般的な合併症である。いくつかの尺度により、急性同種移植片拒絶反応の発生率は、肝臓移植の２０％～４０％の範囲である。肝移植拒絶反応、並びに移植後の罹患率及び死亡率を予測する方法は予備的であり、このような方法の予測力は議論の余地がある。急性及び慢性拒絶反応の発生率は、肝移植レシピエントにおける免疫抑制レジメンの改善と共に減少している。急性拒絶反応は通常、改善されたレジメンに良好に応答するが、慢性拒絶反応は、かなりの割合の患者が免疫抑制の増加に応答せず、しばしば再移植又は死をもたらすので、より困難な状況である。また、改善された免疫抑制レジメンによる進歩にもかかわらず、多くの患者は、共存症のために免疫抑制薬に耐えることができないか、又は既存の禁忌のために免疫抑制薬を安全に投与することができない。
本開示は、遺伝子改変された肝細胞及び／又は肝前駆細胞の集団並びにそれを産生する方法を提供する。遺伝子改変された肝細胞及び／又は前駆細胞の上記集団を使用する方法、例えば、限定されないが、症状又は複数の症状について対象又は複数の対象を処置する方法もまた提供される。いくつかの例では、この集団の遺伝子改変された肝細胞及び／又は肝前駆細胞は低免疫原性であり、方法は、低免疫原性肝細胞及び／又はその前駆細胞を生成する方法を含む。遺伝子改変された肝細胞及び／又は肝前駆細胞の移植された集団を含む非ヒト哺乳動物もまた提供される。有用なキット、システム、試薬、細胞、及び細胞治療用量もまた提供される。
本発明は、添付の図面と併せて読むと、以下の詳細な説明から最もよく理解される。一般的な慣行に従って、図面の様々な特徴は縮尺通りではないことが強調される。逆に、様々な特徴の寸法は、明確にするために任意に拡大又は縮小されている。図面には、以下の図が含まれる。
β２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）エクソン１又は対照ＡＡＶＳ１のいずれかを標的とする編集組成物と、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ又はＣＤ４７導入遺伝子送達試薬あり又はなしで接触させた肝細胞集団における標的遺伝子座編集効率を示すグラフであり、インデル（左ｙ軸、斑点棒）及びノックアウト（ＫＯ）スコア（左ｙ軸、斜線棒）によって測定されている。記載の遺伝子改変後の対応する肝細胞集団においてフローサイトメトリーによって測定された（右ｙ軸、黒色ドット）、Ｂ２Ｍ ＫＯを有する細胞のパーセンテージ（「％Ｂ２Ｍ－細胞」）も提供される。
以下を有する生細胞のパーセンテージを示すグラフである：ＣＤ４７導入遺伝子遺伝子改変のみ（％ＣＤ４７）、Ｂ２Ｍ ＫＯ及びＣＤ４７導入遺伝子の両方の遺伝子改変（「％Ｂ２Ｍ－／ＣＤ４７＋」）、Ｂ２Ｍ－ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）融合導入遺伝子遺伝子改変のみ（「％ＨＬＡ－Ｅ」）、並びにＢ２Ｍ ＫＯ及びＢ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合導入遺伝子の両方の遺伝子改変（「％Ｂ２Ｍ／ＨＬＡ－Ｅ」）。これらは、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ又はＣＤ４７導入遺伝子送達試薬あり又はなしで、Ｂ２Ｍエクソン１又は対照ＡＡＶ１を標的とする編集組成物と接触させた肝細胞集団から生じたものであり、フローサイトメトリーによって測定されている。Ｂ２Ｍ ＫＯを有する各試験群の細胞のパーセンテージ（「％Ｂ２Ｍ－」、ドット）も提供される。
図３Ａ～Ｄは、ＤＮＡ解析によって測定されるＢ２Ｍ ＫＯ（図３Ａ）、フローサイトメトリー解析よって測定されるＢ２Ｍ ＫＯ（図３Ｂ）、フローサイトメトリー解析よって測定されるＨＬＡ－Ｅ導入遺伝子発現（図３Ｃ）、及びフローサイトメトリー解析よって測定される二重改変（すなわち、Ｂ２Ｍ ＫＯ及び導入遺伝子発現の両方）（図３Ｄ）を有する、インプット集団及びアウトプット集団内の編集された細胞のパーセンテージを示す一連の移植片（grafts）である。未処置対照（ＮＴＣ）動物（すなわち、改変されていないＰＨＨを移植された動物）からのサンプルも並行して評価した。
第ＩＸ因子レンチウイルスベクター形質導入（ＬＶ－Ｆ９）又はルシフェラーゼレンチウイルスベクター形質導入（ＬＶ－Ｌｕｃ）肝細胞をレシピエントマウスに移植した後の３つの時点（５７日目又は６０日目、８５日目、及び９７日目）で収集した生物発光画像のマトリックスである。
図４に示されるＬＶ－Ｆ９及びＬＶ－Ｌｕｃマウスにおいて検出された生物発光シグナルの全ての時点での定量化を表す。
移植された操作肝細胞によって産生されたヒトアルブミンのレベルを示すグラフであり、移植後１４、２８、４７、及び９８日目にＬＶ－Ｆ９及びＬＶ－Ｌｕｃマウスから収集された末梢血サンプルにおいて測定された。
移植後１４、２８、４７、及び９８日目にＬＶ－Ｆ９及びＬＶ－Ｌｕｃマウスから収集された末梢血サンプルにおいて検出されたヒト第ＩＸ因子のレベルを示すグラフである。検出限界（ＬＯＤ）、第ＩＸ因子の対応する治療レベル、及び第ＩＸ因子の対応する正常な生理学的レベルを示す参照レベルが比較のために提供される。
ＬＶ－Ｆ９及びＬＶ－Ｌｕｃマウスにおける移植後４７日目の、各動物において測定されたヒト第ＩＸ因子レベル対各動物における対応するヒトアルブミンレベルのプロットである。０．１％、１％、及び５％生着に対する、並びに正常な生理学的ヒト第ＸＩ因子の５％及び１００％に対する参照レベルが、それぞれ、垂直及び水平の点線として示されている。
ＬＶ－Ｆ９及びＬＶ－Ｌｕｃマウスにおける移植後９８日目の、各動物において測定されたヒト第ＩＸ因子レベル対各動物における対応するヒトアルブミンレベルのプロットである。０．１％、１％、及び５％生着に対する、並びに正常な生理学的ヒト第ＸＩ因子の５％及び１００％に対する参照レベルが、それぞれ、垂直及び水平の点線として示されている。
本開示は、遺伝子改変された肝細胞及び／又は肝前駆細胞の集団並びにそれを産生する方法を提供する。遺伝子改変された肝細胞及び／又は前駆細胞の上記集団を使用する方法、例えば、限定されないが、症状又は複数の症状について対象又は複数の対象を処置する方法もまた提供される。いくつかの例では、この集団の遺伝子改変された肝細胞及び／又は肝前駆細胞は低免疫原性であり、方法は、低免疫原性肝細胞及び／又はその前駆細胞を生成する方法を含む。遺伝子改変された肝細胞及び／又は肝前駆細胞の移植された集団を含む非ヒト哺乳動物もまた提供される。有用なキット、システム、試薬、細胞、及び細胞治療用量もまた提供される。
本発明をより詳細に説明する前に、本発明は、説明される特定の実施形態に限定されず、したがって、当然ながら変化し得ることを理解されたい。本発明の範囲は添付の「特許請求の範囲」によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないことも理解されたい。
値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、その範囲の上限と下限との間の下限の単位の１０分の１までの各介在値、及びその記載された範囲内の任意の他の記載値又は介在値は、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、より小さい範囲に独立して含まれてもよく、また、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界に従って、本発明に包含される。記載された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか又は両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
特定の範囲は、本明細書において、「約」という用語が先行する数値で示される。「約」という用語は、本明細書では、それが先行する正確な数、並びにその用語が先行する数に近いか又は近似している数に対する文字通りの裏付けを提供するために使用される。ある数が具体的に列挙された数に近いか又は近似しているかどうかを決定する際に、その近いか又は近似している列挙されていない数は、それが提示されている文脈において、具体的に列挙された数の実質的な等価物を提供する数であってもよい。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法及び材料に類似の、又は同等の任意の方法及び材料も、本発明の実施、又は試験に使用され得るが、代表的な例示的な方法及び材料をここに記載する。
本明細書に引用される全ての刊行物及び特許は、個々の刊行物又は特許が具体的且つ個別に参照により組み込まれることが示されているかのように参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用される方法及び／又は材料を開示及び記載するために参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日より前のその開示のためであり、本発明が、先行発明によってそのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。更に、提供される刊行物の日付は、独立して確認される必要があり得る実際の刊行日とは異なり得る。
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。特許請求の範囲は、任意の要素を除外するように作成され得ることに更に留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連して「単独で（solely）」、「のみ（only）」などの排他的な用語の使用、又は「否定的」限定の使用のための先行詞としての役割を果たすことが意図される。
本開示を読んだ当業者には明らかであるように、本明細書に記載及び図示される個々の実施形態の各々は、本発明の範囲又は精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得るか、又は組み合わせられ得る別個の構成要素及び特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙された事象の順序で、又は論理的に可能な任意の他の順序で実行することができる。
装置及び方法は、機能的な説明を伴う文法的な流動性のために記載されているが、特許請求の範囲は、米国特許法第１１２条の下で明示的に定式化されていない限り、「手段」又は「ステップ」の限定の構成によって必ずしも限定されるものと解釈されるべきではなく、均等物の法理論の下で特許請求の範囲によって提供される定義の意味及び均等物の全範囲が与えられるべきであり、特許請求の範囲が米国特許法第１１２条の下で明示的に定式化されている場合には、米国特許法第１１２条の下で完全な法定均等物が与えられるべきであることが明確に理解されるべきである。
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。以下の定義は、適用可能な場合、それらの様々な文法形態も含むことが意図される。本明細書で使用される場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、又は「その（the）」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「薬剤」への言及は、当業者に公知の１つ以上の薬剤への言及などを含む。
参照数値に関する「約」という用語は、その値から±１０％の値の範囲を含むことができる。例えば、量「約１０」は、９、１０、及び１１の値を含む、９～１１の値を含む。参照数値に関する「約」という用語はまた、その値からプラス又はマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％の値の範囲を含み得る。
本開示の特定の実施形態を説明する前に、本開示を説明する際に使用される定義を記載することが有用であろう。
「推定する」という用語は、任意の形態の測定を含み、要素が存在するか否かを決定することを含む。「決定する」、「測定する」、「評価する」、「推定する」及び「アッセイする」という用語は互換的に使用され、定量的及び定性的決定を含む。推定することは、相対的又は絶対的であり得る。
「対照」、「対照アッセイ」、「対照サンプル」などの用語は、例えば、関連する実験サンプルから得られた結果が信頼できるかどうかを示すために、関連する実験結果が真の結果を示す信頼度を示すために、及び／又は実験結果の較正を可能にするために、予想される結果が高い確実性で知られているサンプル、試験、又は実験若しくは診断手順若しくは実験設計の他の部分を指す。例えば、いくつかの例において、対照は、実験者が陰性対照アッセイが陽性結果をもたらさない高い確実性を有し得るように、アッセイの必須成分が除外されるような「陰性対照」アッセイであってもよい。いくつかの例において、対照は、実験者が陽性対照アッセイが陽性結果をもたらさない高い確実性を有し得るように、特定のアッセイの全ての成分が特徴付けられ、組み合わされたときに、実施されるアッセイにおいて特定の結果をもたらすことが知られているような「陽性対照」アッセイであってもよい。対照はまた、「ブランク」サンプル、「標準」サンプル（例えば、「ゴールドスタンダード」サンプル）、検証済みサンプルなどを含んでもよい。
「レシピエント」、「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、診断、処置、又は治療が望まれる、示される、又は行われた任意の哺乳動物対象、例えばヒト対象を指す。処置の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家畜及び農場動物、並びに動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ラクダなどを含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。いくつかの場合において、本開示の方法は、実験動物において、獣医学的適用において、並びに／又はマウス、ラット、及びハムスターを含むげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、及び他の動物を含むがこれらに限定されない動物モデルの開発において使用される。
本明細書で使用される場合、「疾患」及び「状態」という用語は、交換可能に使用され得るか、又は特定の疾患又は状態が既知の原因物質を有さない可能性があるという点で異なる可能性があり（したがって、病因はまだ解明されていない）、したがって、まだ病気として認識されていないが、臨床医によって多かれ少なかれ特定の症状のセットが特定されている、望ましくない状態又は症候群としてのみ認識されている。
「処置」、「処置すること」、「処置する」などの用語は、本明細書において、一般に、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指すために使用される。効果は、疾患若しくはその症候を完全に若しくは部分的に予防するという点で予防的であり得、且つ／又は疾患及び／若しくは疾患に起因する有害作用の部分的若しくは完全な安定化若しくは治癒という点で治療的であり得る。例えば、防止的処置、すなわち、予防的処置は、症状（例えば、肝臓症状）を効果的に予防する処置、又は症状（例えば、肝臓症状）の進行を効果的に予防若しくは制御する処置を含み得る。いくつかの例において、処置は、完全寛解又は部分寛解などの処置応答をもたらし得る。「処置」という用語は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の処置を包含し、（ａ）疾患又は症候に罹患しやすい可能性があるが、まだ罹患していると診断されていない対象において、疾患及び／又は症候が発生するのを予防すること；（ｂ）疾患及び／又は症候を阻害すること、すなわち、疾患及び／又は関連症候の発症を停止させること；（ｃ）疾患及び関連症候を軽減すること、すなわち、疾患及び／又は症候の退行を引き起こすことを含む。
処置を必要とする者としては、既に罹患している者（例えば、症状を有する者、肝臓症状（例えば、急性肝臓症状、慢性肝臓症状など）を有する者、肝硬変を有する者、線維症を有する者、疾患を有する者、単一遺伝子性疾患を有する者など）、並びに予防が所望される者（例えば、症状（例えば、肝臓症状）に対する感受性が増加している者；症状（例えば、肝臓症状）を有することが疑われる者；症状（例えば、肝臓症状）を発症するリスクが増加した者；症状（例えば、肝臓症状）を引き起こす診療又は薬剤への環境曝露が増加した者；症状（例えば、肝臓症状）に対する遺伝的又は行動的素因を有する疑いのある者；症状（例えば、肝臓症状）を有する者；症状（例えば、肝臓症状）のリスクの増加を示すスクリーニングの結果を有する者；症状（例えば、肝臓症状）について陽性と検査された者；症状（例えば、肝臓症状）などの１つ以上のバイオマーカーについて陽性と検査された者）を挙げることができる。
治療的処置は、対象が投与前に罹患している処置であり、予防的処置は、対象が投与前に罹患していない処置である。いくつかの実施形態では、対象は、罹患する可能性が高いか又は罹患する可能性が高いと疑われ（例えば、標準と比較して、例えば、平均的な個体と比較して、例えば、対象は症状に対する遺伝的素因及び／又はリスクの増加を示す家族歴を有し得る）、この場合、処置は予防的処置であってもよい。
「組換え」という用語は、核酸分子を記載するために本明細書で使用される場合、ゲノム、ｃＤＮＡ、ウイルス、半合成、及び／又は合成起源のポリヌクレオチドを意味し、これは、その起源又は操作によって、天然に関連するポリヌクレオチド配列の全部又は一部と関連しない。タンパク質又はポリペプチドに関して使用される組換えという用語は、組換えポリヌクレオチドからの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。宿主細胞又はウイルスに関して使用される組換えという用語は、組換えポリヌクレオチドが導入された宿主細胞又はウイルスを意味する。組換えはまた、本明細書において、材料（例えば、細胞、核酸、タンパク質、又はベクター）に関して、材料が異種材料（例えば、細胞、核酸、タンパク質、又はベクター）の導入によって改変されていることを指すために使用される。組換え核酸、ポリヌクレオチド、細胞などは、本明細書において、操作された核酸、操作されたポリヌクレオチド、操作された細胞などと称され得る。
本明細書で互換的に使用される「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかであり、その類似体を含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。これらの用語は、分子の一次構造のみを指す。したがって、この用語は、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ、三本鎖ＤＮＡ、並びに二本鎖及び一本鎖ＲＮＡを含む。それはまた、例えばメチル化及び／又はキャッピングによって修飾された形態、並びにポリヌクレオチドの非修飾形態を含む。この用語はまた、天然に存在しないヌクレオチド又は合成ヌクレオチド並びにヌクレオチド類似体を含む分子を含むことが意図される。核酸及びポリヌクレオチドの非限定的な例としては、直鎖状及び環状核酸、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、ベクター、プローブ、プライマー、一本鎖、二本鎖、又は多重鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、化学的又は生化学的に修飾された、非天然の、又は誘導体化されたヌクレオチド塩基、修飾された又は非天然のヌクレオチド塩基を含有するオリゴヌクレオチド（例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチド）、及び干渉ＲＮＡが挙げられる。いくつかの例において、ポリヌクレオチドは、生物のゲノム中に存在する対応する配列から少なくともいくつかの非コード配列を除外する連続オープンリーディングフレームポリヌクレオチドであってもよい。
「ポリペプチド」という用語は、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語と互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。ポリペプチドは、本質的に任意の長さの機能的タンパク質フラグメント並びに完全長タンパク質を含む。「ペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、一般に、４０個以下のアミノ酸のポリペプチド鎖を指す。「ペプチド治療薬」は、確立された治療機能を有するペプチドである。「治療用ポリペプチド」は、確立された治療機能を有するポリペプチドである。いくつかの実施形態において、治療用ポリペプチド及びペプチドを含むポリペプチド及びペプチドは、導入遺伝子から発現され得る。
「形質導入」という用語は、本明細書で使用される場合、一般に、ウイルスベクターを使用した細胞への外来核酸の導入を指し、「トランスフェクション」という用語は、本明細書で使用される場合、一般に、非ウイルス法によって細胞に核酸を導入するプロセスを指す。しかしながら、当業者には容易に明らかである本開示全体を通してのいくつかの例において、「形質導入」及び「トランスフェクション」という用語は互換的に使用されてもよい。いくつかの例において、形質導入という用語の使用は、核酸の非ウイルス送達を除外してもよい。いくつかの例において、トランスフェクションという用語の使用は、核酸のウイルス送達を除外してもよい。
「ウイルス粒子」、「ウイルス」などの用語は、例えば、バキュロウイルス粒子、レンチウイルス粒子、アデノウイルス粒子などを含む感染性ウイルス因子を指す。ウイルス及びウイルス粒子は、天然に存在するもの、組換え体、操作されたもの、又は合成のものであってもよい。
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、及び「遺伝子導入ベクター」は、目的の遺伝子の発現又は他の所望の発現産物を誘導することができ、核酸配列を標的細胞に導入することができる任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニング及び発現ビヒクル、並びに組み込みベクターを含む。「ベクター」又は「発現ベクター」はまた、プラスミド、ファージ、ウイルス、又はコスミドなどのレプリコンを指し得、これに別の核酸セグメント、すなわち「インサート」を付着させて、細胞内で付着したセグメントの発現及び／又は複製をもたらすことができる。
本明細書で使用される場合、「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムＲＮＡを直鎖二本鎖ＤＮＡコピーに逆転写し、続いてそのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有結合的に組み込むＲＮＡウイルスを指す。レトロウイルスは、遺伝子送達のための一般的なツールである。例示的なレトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スピューマレトロウイルス属、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））及びレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、複合レトロウイルスの群（又は属）を指す。例示的なレンチウイルスとしては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ １型及びＨＩＶ ２型を含む）；ビスナ－マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス；ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＨＩＶベースのベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用性配列エレメント）が用いられ得る。
レトロウイルスベクター、より具体的には、レンチウイルスベクターが、本明細書に記載されるように使用され得る。本明細書で使用される「レトロウイルス」又は「レトロウイルスベクター」という用語は、それぞれ「レンチウイルス」及び「レンチウイルスベクター」を含むことを意味する。加えて、特定のタイプのレトロウイルス又はベクター、例えば、レンチウイルス又はレンチウイルスベクターが参照される場合、当業者は、いくつかの例において、他のレトロウイルス及び／又は他のレトロウイルスベクター及び／又はレトロウイルス全般及び／又はレトロウイルスベクター全般が、具体的に列挙されたウイルス又はベクターの代わりに使用され得ることを容易に理解するであろう。
「バイオリアクター」という用語は、本明細書で使用される場合、一般に、生きている生物若しくは細胞、又はそれらから合成及び収集される産物の制御された条件下での産生のための装置、機械、又はシステムを指す。バイオリアクターは、鋼、ガラス、プラスチック、又は他の材料で作製された単回使用の又は再利用可能な容器などに製造され、所望の生物活性に適する制御された、任意選択で均質な、環境を維持するように構成され得る。製造されたバイオリアクターは、例えば、温度コントローラー、ｐＨコントローラー、ガスコントローラー及び交換器（例えば、酸素、二酸化炭素、及び／又は他のガスレベルを制御するためのもの）などを含むがこれらに限定されない、様々な制御機構を含み得、これは、特定のシグナルを読み取り、シグナル伝達された調節を駆動する、センサー及びアクチュエーターの組み合わせを含み得る。製造されたバイオリアクターの非限定的な例としては、撹拌タンク、ロッカー、エアリフト、固定床、回転壁、及び灌流バイオリアクターが挙げられる。製造されたバイオリアクター構成要素の非限定的な例としては、撹拌機、インペラー、スパージャー、プローブ、無菌シール、バッフル、供給ライン、排出ライン、通気孔、加熱器、冷却器などが挙げられる。バイオリアクターは、非接着細胞並びに接着細胞を増殖させるために使用され得る。バイオリアクターは、例えば、１５ｍＬ容量以下～２０００Ｌ容量以上を含むがこれらに限定されない広範なサイズにわたり得、いくつかの例では、１リットル若しくは数リットル～１０、２０、５０、若しくは１００Ｌ以上の範囲であり得る。商業的供給業者の例を含む、バイオリアクターの更なる説明は、Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｆ１０００Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１８）によって提供されており、この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。製造されたバイオリアクターに加えて、バイオリアクターという用語はまた、生きている動物又はインビボバイオリアクターも含む。
「生きているバイオリアクター」、「動物バイオリアクター」、及び「インビボバイオリアクター」という用語は、本明細書で使用される場合、一般に、肝細胞生成細胞（すなわち、肝細胞及び／又は肝前駆細胞などの肝細胞を産生する細胞）などの外因性細胞が生着及び増殖のために導入される、非ヒト哺乳動物などの生きている非ヒト動物を指す。動物バイオリアクターは、導入された細胞から生成された、肝細胞の増殖させた集団など、所望の細胞の増殖させた集団（これは、導入された細胞及び／又はそれらの子孫を含み得る）を生成するために使用され得る。肝細胞生成細胞などの外因性細胞のバイオリアクターへの導入は、一般に異種移植を含み、したがって、移植された外因性細胞は、場合によっては、異種移植片、例えば、ヒトからげっ歯類への異種移植片、ヒトからマウスへの異種移植片、ヒトからラットへの異種移植片、ヒトからブタへの異種移植片、マウスからラットへの異種移植片、ラットからマウスへの異種移植片、げっ歯類からブタへの異種移植片などと呼ばれることがある。場合によっては、例えば、げっ歯類からげっ歯類、ブタからブタなどの同種移植など、バイオリアクターへの同種移植を実施することができる。バイオリアクターは、例えば、遺伝的及び／又は薬理学的に、外因性肝細生着及び／又は増殖を促進するために、導入された外因性肝細胞生成細胞などの導入された外因性細胞に選択的利点を与えるように構成され得る。バイオリアクターは、場合によっては、例えば、遺伝的及び／又は薬理学的免疫抑制を含むがこれらに限定されない手段によって、導入された外因性細胞の拒絶反応を防ぐように構成され得る。したがって、インビボバイオリアクターは、例えば、生着を促進するため、拒絶反応を防ぐため、感染を防ぐため、健康を維持するためなどに、例えば、動物の環境、食餌、及び／又は１つ以上の薬剤の投与の調節を介して、外部操作に供され得る。
「エクスビボ」という用語は、生物から得られたサンプル（例えば、組織又は細胞など）内又は上で行われる取り扱い、実験及び／又は測定を指すために使用され、取り扱い、実験及び／又は測定は、生物の外部の環境内で行われる。したがって、細胞に適用されるとき「エクスビボ操作」という用語は、細胞を培養すること、細胞に１つ以上の遺伝子改変を行うこと、及び／又は１つ以上の薬剤に細胞を曝露することを含むがこれらに限定されない、生物の外側で細胞（例えば、肝細胞）を取り扱うことを指す。したがって、エクスビボ操作は、例えば、細胞が動物又は器官（例えば、肝臓）から得られた後、及びそのような細胞が、動物バイオリアクター又は移植を必要とする対象など、動物に移植される前に、動物の外側で行われるそのような細胞の処置を指すために本明細書で使用され得る。「エクスビボ」とは対照的に、本明細書で使用される「インビボ」という用語は、例えば、対象内にある細胞（例えば、肝細胞及び／又は肝前駆細胞）、又は対象の肝臓など、対象内での細胞の生成及び／又は対象への細胞の移植に起因する、動物内にある細胞、又は動物の器官を指し得る。
本明細書で使用される場合、「収集する」という用語は、例えば増殖させたヒト肝細胞を参照するとき、本明細書に記載されるように、単離されたヒト肝細胞、又は他の肝細胞生成細胞を注射又は移植された動物（例えば、非ヒト哺乳動物、げっ歯類、マウス、ラット、又はブタのバイオリアクター）から、増殖させた肝細胞を取り出すプロセスを指す。場合によっては、細胞の移植を受ける非ヒト動物、例えば、遺伝子改変された細胞は、レシピエント動物と呼ばれることもある。場合によっては、移植、例えば、増殖させた、遺伝子改変された肝細胞の移植、を受けるヒト対象は、処置対象、レシピエントなどと呼ばれることがある。収集には、任意選択で、細胞、例えば、肝細胞を、例えば、非肝臓細胞型（例えば、血液細胞、肝外免疫細胞、血管細胞など）、非肝細胞の肝臓細胞（例えば、肝臓星細胞、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞、及び肝臓類洞内皮細胞）を含むがこれらに限定されない、他の細胞型から分離することが含まれる。
本明細書で使用される場合、「凍結保存」とは、７７Ｋ又は－１９６℃などの低氷点下に冷却することにより保存又は維持されている、細胞（肝細胞など）又は組織を指す。（液体窒素の沸点）。これらの低温では、細胞死につながる生化学反応を含むあらゆる生物活性が効果的に停止される。凍結保存及び凍結保存された細胞の解凍の有用な方法、並びにそれに関連するプロセス及び試薬としては、例えば、米国特許第１０３７０６３８号、同第１０１５９２４４号、同第９０７８４３０号、同第７６０４９２９号、同第６１３６５２５号、及び同第５７９５７１１号に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されず、これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。対照的に、本明細書で細胞に関して使用される「新鮮な」という用語は、凍結保存されておらず、例えば、対象又はその器官からの収集後に直接得られ、及び／又は使用された（例えば、移植された、培養されたなど）細胞を指し得る。
「生存」という用語は、例えば、動物への移植、免疫細胞との共培養、特定の薬剤との接触など、何らかの事象の後に、インビトロ又はインビボで生存し続ける細胞を指すために使用される。細胞生存は、直接評価（例えば、目的の細胞を含有するか又は含有すると予想されるサンプル中の細胞生存率の定性的又は定量的な測定など）及び間接評価（例えば、生存細胞の存在の１つ以上の機能的影響の定性的又は定量的な測定など）を含む様々な方法を使用して評価され得る。細胞（例えば、肝細胞）生存の有用な直接的及び間接的な読み取りには、細胞の計数（例えば、血球計算盤、免疫組織化学、フローサイトメトリーなどによる）、分泌因子又はバイオマーカーの測定（例えば、タンパク質（例えば、アルブミン）ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどによる）、レシピエントの健康を評価する（例えば、バイタル、機能試験（例えば、肝機能試験）などを測定することによって）などが含まれ得るが、これらに限定されない。「生存」という用語はまた、対象、例えば、肝疾患を有する対象又はその動物モデルが、例えば、対象への細胞（例えば、肝細胞）の投与又は移植、対象への疾患（例えば、肝疾患）を引き起こす薬剤の投与、疾患（例えば、肝疾患）の発症を阻害、遅延、回避又は防止する薬剤の中止などの、何らかの処置、介入、及び／又はチャレンジの後に生存し続ける時間の長さを指すために使用される。生存は、対象を指す場合、何らかの処置、介入、及び／又はチャレンジの後に一定期間生存する集団（例えば、対照群又は治療群）の割合（例えば、パーセンテージ）で表すこともできる。生物医学分野の当業者は、本明細書において生存が使用されるとき、生存が関係するもの、例えば、細胞又は対象を容易に認識するであろう。
「生着」という用語は、動物への細胞又は組織の移植を指す。本明細書で使用される場合、レシピエント動物におけるヒト肝細胞の生着は、ヒト肝細胞が投与（例えば、注射）後にレシピエント動物に（例えば、肝臓に）移植されていくプロセスを指す。ある特定の条件下で、移植されたヒト肝細胞は、レシピエント動物において増殖することができる。本明細書で使用される場合、ヒト肝細胞に関する「増殖する」という用語は、ヒト肝細胞の数が増加するように細胞分裂が起こることを可能にするプロセスを指す。「インビボ増殖」という用語は、生きている宿主内で外因性細胞の数が増加するように、外因性細胞の細胞分裂が、生きている宿主（例えば、非ヒト動物バイオリアクター、例として、げっ歯類（例えば、マウス又はラット）バイオリアクター、ブタバイオリアクター、ラットバイオリアクターなど）内で起こることを可能にするプロセスを指す。例えば、非ヒト動物バイオリアクターに移植されたヒト肝細胞は、バイオリアクター内のヒト肝細胞の数が増加するように、バイオリアクター内でインビボ増殖する可能性がある。
「肝細胞」という用語は、一般に肝臓の細胞質質量の７０～８０％を構成する細胞のタイプを指す。肝細胞は、タンパク質合成、タンパク質の貯蔵及び炭水化物の変換、コレステロール、胆汁酸塩及びリン脂質の合成、並びに外因性及び内因性物質の解毒、改変、排泄に関与している。肝細胞はまた、胆汁の形成及び分泌を開始する。肝細胞は、血清アルブミン、フィブリノーゲン、及び凝固因子のプロトロンビングループを製造し、リポタンパク質、セルロプラスミン、トランスフェリン、補体、及び糖タンパク質の合成の主要な部位である。加えて、肝細胞は、薬物や殺虫剤などの外因性化合物、及びステロイドなどの内因性化合物を代謝、解毒、及び不活化する能力を有する。
「有効量」又は「に有効な量」は、投与された場合（例えば、哺乳動物、例えば、ヒトに、又は哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞に）、示される結果（例えば、生着、増殖、処置など）に影響を与えるのに十分である化合物及び／又は細胞の量を指す。例えば、「治療有効量」などの「有効量」は、哺乳動物、例えば、ヒトに投与された場合に、哺乳動物、例えば、ヒトに処置を行うのに十分である、本開示の化合物及び／又は細胞の量を指す。「治療有効量」を構成する本開示の組成物の量は、化合物及び／又は細胞、症状及びその重症度、投与方法、並びに処置される哺乳動物の年齢に応じて変化するが、当業者によって、自身の知識及びこの開示を考慮して、日常的に決定されることができる。
方法、組成物、細胞集団、及び動物
本開示は、遺伝子操作された肝細胞又はその前駆細胞を含む、生成する、又は作製若しくは使用する際に用いられる、方法、組成物、細胞集団、及び動物を含む。本開示の遺伝子改変された肝細胞は、例えば、その中の内因性遺伝子座若しくは遺伝子、又は遺伝子の一部（例えば、エクソン）の破壊又は「ノックアウト」を含む、遺伝子産物及び／又は編集された内因性遺伝子座をコードする組み込まれた導入遺伝子を含み得る。本明細書においてより詳細に記載されるように、本質的に任意の遺伝子産物が導入遺伝子によってコードされてもよく、かつ／又は本質的に任意の遺伝子座が編集のために標的化されてもよい。遺伝子改変された肝細胞の産生、及び最終的に産生される肝細胞の特徴、並びに産生された肝細胞を含む細胞集団は、様々である。
本明細書に記載の研究が行われるまで、本明細書に記載のものなど、遺伝子改変された肝細胞を、レシピエントインビボバイオリアクターの肝臓内で産生及び増殖させて、細胞治療に必要とされるような、所望の遺伝子改変を有する実質的な数の肝細胞を含有する治療用細胞集団を生成することができるかどうかは不明であった。例えば、異種遺伝子産物をコードするように、及び／又は記載の遺伝子変化を含むように改変された、そのような細胞が、例えば、ラット及びブタバイオリアクターなどの産生バイオリアクターに効率的に生着し、再増殖して、実質的な数の遺伝子改変された肝細胞を含む有用な増殖させた集団の生成を容易にするかどうかは不明のままであった。
異種移植の状況において、異種肝細胞は、一般に、内因性肝細胞と比較して生存に不利である。加えて、遺伝子編集試薬による遺伝子改変は、例えば、他の点では正常な１つ以上の内因性遺伝子座において、及び／又は組み込まれた導入遺伝子を含むように、実際に編集される集団の細胞に悪影響を与え、増殖の減少、細胞表現型の喪失、細胞脆弱性の増加などをもたらし得る。これらの影響は、例えば、細胞治療又は細胞治療産生のために作製又は使用される細胞集団を含む、細胞集団内の所望の遺伝子改変された細胞の提示を減少させ得る。これらの悪影響は、従来の技術が使用されるとき、宿主プレコンディショニングが移植片生着を促進するために使用される場合であっても、理論に拘束されることなく、内因性細胞が、導入された遺伝子改変細胞を打ち負かすことに起因して、単独で、又は宿主免疫応答などの他のプロセスと組み合わせて、移植された編集細胞の不十分な生着、増殖、回復、及び／又は喪失をもたらし得る。したがって、本明細書に示されるように、本明細書に記載の方法の使用によって、所望の遺伝子改変を保有する実質的な数の増殖させた肝細胞を含有する細胞集団が産生され得ることが予想外に見出された。更に、操作された細胞集団内での所望の遺伝子改変を有する肝細胞のパーセンテージは、驚くべきことに、異種移植及びインビボバイオリアクター増殖の前及び後で実質的に一定のままであることが見出され、これは、改変されていない細胞及び改変された細胞の宿主内での同等の適合性を示した。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された肝細胞は、肝細胞及び／又は肝前駆細胞を含有する細胞集団を、導入遺伝子を含む組み込みベクターと接触させることによって産生され得る。組み込みベクター、及び細胞が組み込みベクターと接触させられるときの条件は、一般に、導入遺伝子が細胞集団の肝細胞又は肝前駆細胞に機能的に組み込まれるように構成される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、相同組換え修復（ＨＤＲ）又は他のＤＮＡ修復プロセスによって組み込まれてもよく、例えば、ＨＤＲ又は他の修復プロセスが、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質などであるがこれらに限定されないヌクレアーゼの使用によって促進される場合を含む。
低免疫原性肝細胞を産生するために、肝細胞及び／又はその前駆細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞デコイ受容体をコードする導入遺伝子を含むように遺伝子改変される。したがって、ＮＫ細胞デコイ受容体をコードする導入遺伝子の機能的組み込みを記載する特定の例が本明細書に提供される。しかしながら、本開示はそのように限定されず、当業者は、任意の目的の他の配列が、例えば、任意の本質的に好適かつ適切なコードされた遺伝子産物の機能的組み込みを提供するように、記載の導入遺伝子を置換、改変、又はそれに付加するために使用され得ることを容易に理解するであろう。したがって、特定の遺伝子産物、例えば、ＮＫデコイ受容体など、をコードする特定の導入遺伝子の本明細書における説明は、任意の遺伝子産物を本質的にコードする導入遺伝子の使用の説明も一般に提供することが容易に理解される。
例えば、単一遺伝子性疾患を処置するのに有用な操作された肝細胞を産生するために、肝細胞及び／又はその前駆細胞は、単一遺伝子性疾患において破壊される遺伝子産物の機能的バージョンをコードする導入遺伝子を含むように遺伝子改変される。単一遺伝子性疾患を処置するために、遺伝子改変された肝細胞及び／又は肝前駆細胞に機能的に組み込むのに有用な導入遺伝子の非限定的な例としては、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子、カルバモイルリン酸シンターゼ（ＣＰＳ１）、Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ（ＮＡＧＳ）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、α－ガラクトシダーゼＡ遺伝子（ＧＬＡ）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素（ＰＡＨ）、アルギナーゼ－１、α１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（ＦＡＨ）など、及びそれらの組み合わせ（例えば、融合体及び／又は多シストロン性若しくは二シストロン性バージョンを含む）の完全長形態及び／又は改変形態及び／又はバリアント形態をコードするそれらの導入遺伝子を挙げることができる。
「機能的に組み込まれた」とは、本明細書で使用される場合、一般に、コードされた遺伝子産物が発現されるような様式で、導入遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれていることを意味する。コードされた遺伝子産物の発現は、細胞の内因性成分又は導入遺伝子に含まれる外因性（異種を含む）成分によって全体的又は部分的に制御され得る。例えば、いくつかの例では、コードされた遺伝子産物の発現は、導入遺伝子が挿入されるゲノム遺伝子座にある、又はその付近の、１つ以上の内因性調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサーなどによって制御され得る。いくつかの例では、コードされた遺伝子産物の発現は、導入遺伝子中に存在し、かつ挿入前に、コードされた遺伝子産物に作動可能に連結された、１つ以上の外因性（異種を含む）調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサーなどによって制御され得る。導入遺伝子の組込みは、肝細胞又は肝前駆細胞などの細胞を遺伝子改変させ、例えば、遺伝子改変された肝細胞又は遺伝子改変された肝前駆細胞を産生させる。
導入遺伝子の機能的組み込みは、ウイルスベクター及び非ウイルスベクターを含む、組み込みベクターの使用による手段を含む、様々な手段によって達成され得る。いくつかの例では、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターが使用され得る。いくつかの例では、非レトロウイルス組み込みベクターが使用され得る。組み込みベクターは、好適な形質導入培地中で、好適な濃度（又は感染多重度）で、かつベクターが標的細胞に感染するのに好適な時間にわたって、標的細胞と接触させられて、導入遺伝子の機能的組み込みを促進し得る。
例えば好適な培地中での、好適なインキュベーション及び／又は形質導入（及び／又は適用可能な場合にはトランスフェクション）時間は、様々である。いくつかの例では、好適なインキュベーション（又は形質導入及び／又はトランスフェクション）時間は、８時間以下、８時間未満、６時間以下、６時間未満、５時間以下、５時間未満、４時間以下、４時間未満、３時間以下、３時間未満、２時間以下であり得る。いくつかの例では、インキュベーション（又は形質導入及び／又はトランスフェクション）は、撹拌しながら実施され得る。好適な速度及び形質導入温度（例えば、３７℃又は約３７℃など）で行われる、例えば、揺動（例えば、水平揺動／振盪など）、章動、及び同様の運動を含むがこれらに限定されない、様々な撹拌方法が使用され得る。いくつかの例では、８時間以下、８時間未満、６時間以下、６時間未満、５時間以下、５時間未満、４時間以下、４時間未満、３時間以下、３時間未満、２時間以下のインキュベーション（又は形質導入及び／又はトランスフェクション）時間は、処置された細胞への有害な影響を防止、制限、又はそうでなければ軽減し得、例えば、増強された形質導入及び／若しくはトランスフェクション効率並びに／又は改善された生存率（例えば、より長い時間と比較して）によって、所望の遺伝子改変された細胞の数の増加をもたらす。
いくつかの実施形態において、導入遺伝子の機能的組み込み、及び／又は本明細書に記載される編集組成物の成分の送達のための有用な方法は、ウイルスベクターを含み得る。ウイルスベクターは、組み込み型あっても非組み込み型であってもよい。有用なウイルスベクターの非限定的な例としては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ハイブリッドＡｄ－ＡＡＶベクターシステムなどが挙げられる。ウイルスベクターは、いくつかの例では、本明細書に記載の方法の他の態様、例えば、遺伝子編集成分（例えば、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、Ｃａｓタンパク質など）をコードする核酸、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、Ｃａｓなど）タンパク質、Ｃａｓ９をコードする核酸、Ｃａｓ９タンパク質、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）など）の送達などにおいて使用され得る。
いくつかの実施形態において、導入遺伝子の機能的組み込み、及び／又は本明細書に記載される編集組成物の成分の送達のための有用な方法は、非ウイルスベクターを含み得る。有用な非ウイルスベクターは様々であり、一般にウイルス粒子を使用しない送達手段を指し、一般に３つのカテゴリー：裸の核酸、粒子ベース（例えば、ナノ粒子）、又は化学物質ベースに分類されると考えられ得る。非ウイルスベクターの非限定的な例としては、リポプレックス（例えば、カチオン性脂質ベースのリポプレックス）、エマルジョン（例えば、脂質ナノエマルジョンなど）、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、固体脂質ナノ粒子、ペプチドベースのベクター、ポリマーベースのベクター（例えば、ポリマーソーム、ポリプレックス、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ベースのベクター、キトサンベースのベクター、ポリ（ＤＬ－ラクチド）（ＰＬＡ）及びポリ（ＤＬ－ラクチド－コ－グリコシド）（ＰＬＧＡ）ベースのベクター、デンドリマー、ビニルベースのポリマー（例えば、ポリメタクリレートベースのベクター）など）、無機ナノ粒子などが挙げられる。非ウイルスベクターは、いくつかの例では、本明細書に記載の方法の他の態様、例えば、遺伝子編集成分（例えば、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、Ｃａｓタンパク質など）をコードする核酸、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、Ｃａｓなど）タンパク質、Ｃａｓ９をコードする核酸、Ｃａｓ９タンパク質、ｇＲＮＡ、ＲＮＰなど）の送達などにおいて使用され得る。
本開示の細胞集団は、一般に、肝細胞及び／又は肝前駆細胞を含む。いくつかの例では、細胞集団は、肝細胞及び／又は肝前駆細胞について高度に富化され得る。「高度に富化された」とは、目的の細胞型が、細胞組成物の７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、例えば、細胞組成物の約９５％以上、又は９８％以上であることを意味する。言い換えれば、集団は、目的の細胞型の実質的に純粋な組成物であり得る。いくつかの例では、目的の細胞集団は、粗調製物を含み得る。いくつかの例では、細胞集団は、濾過されているか、又は濾過されていない、解離組織から調製され得る。肝細胞及び／又は肝前駆細胞を含有する細胞集団は、例えば、単離及び／又は調製の方法に応じて、例えば、肝非実質細胞（ＮＰＣ）、非肝細胞の肝臓関連細胞（例えば、星細胞、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞、内皮細胞、胆管細胞など）、免疫細胞（例えば、ＷＢＣ）、ＲＢＣなどを含むが、これらに限定されない、様々な非肝細胞の細胞型を含むか又は除外し得る。いくつかの例では、細胞集団は、肝細胞及び／又は肝前駆細胞の純粋な又は本質的に純粋な調製物であり得る。
いくつかの例では、細胞集団は、例えば、ヒト肝臓、非ヒト哺乳動物肝臓、げっ歯類肝臓、ラット肝臓、マウス肝臓、ブタ肝臓、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）肝臓などの１つ以上の哺乳動物肝臓から調製され得る。いくつかの例では、細胞集団若しくは複数の細胞集団、又は複数の細胞集団の集団の全ての操作された細胞を含む操作された細胞は全て、単一の死体ドナー肝臓などの単一のヒト肝臓に由来し得るか、又はそれから調製され得る。細胞集団の細胞は、全て１つの種（例えば、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ＮＨＰなど）であってもよく、又は２つ以上の種の混合物（すなわち、異種混合物）であってもよい。異種細胞混合物には、非ヒト細胞と混合されたヒト細胞（例えば、ヒト－ラット混合物、ヒト－マウス混合物、ヒト－ブタ混合物、ヒト－ＮＨＰ混合物、ラット－マウス混合物、ラット－ブタ混合物など）が含まれ得るが、これらに限定されない。肝臓の供給源は様々であり、例えば、切除された肝臓組織、死体のヒト肝臓、キメラ（例えば、ヒト化）肝臓、バイオリアクター肝臓などを含み得るが、これらに限定されない。細胞集団は、例えば、解離、灌流、濾過、選別などであるがこれらに限定されない任意の好都合な方法に従って、及び／又はそれを含めて、肝臓（全肝臓及び肝臓部分を含む）から調製され得る。
いくつかの例では、細胞集団の肝細胞又はヒト肝細胞の全て又は本質的に全てを含む、細胞集団の細胞の全て又は本質的に全ては、単一のドナー肝臓又は単一のドナー肝臓の一部に由来し得る。いくつかの例では、細胞集団の肝細胞又はヒト肝細胞の全て又は本質的に全てを含む、細胞集団の細胞は、複数の異なるドナー肝臓又は複数の異なるドナー肝臓の一部に由来し得る。いくつかの例では、複数の細胞集団は、例えば、単一のヒトドナー肝臓から収集された初代ヒト肝細胞が、２倍以上、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、５０倍以上、１００倍以上などを含む何倍にも増殖されて、例えば、複数の対象を処置するのに有用な、複数の細胞集団を生成する場合を含む、単一のドナー肝臓に由来し得る。
いくつかの例では、細胞集団は、培養された肝細胞及び／又は培養された肝前駆細胞から調製され得る。いくつかの例では、細胞集団は、例えば、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）を含むヒト肝臓から調製された細胞集団を含む、初代肝臓細胞調製物から調製され得る。ある特定の実施形態において、細胞集団は、任意の供給源（例えば、ヒトドナーからの供給源）のための標準的な技術を使用して単離された肝細胞を含み得る。ある特定の実施形態において、肝細胞は、新鮮なＰＨＨ又は凍結保存されたＰＨＨを含む、スクリーニングされた死体ドナーから単離されたＰＨＨである。いくつかの例では、細胞集団のＰＨＨは、肝臓から単離されてから、細胞周期／分裂を全く受けていないか、又は、例えば、１回以下、２回以下、３回以下、４回以下、５回以下、６回以下、７回以下、８回以下、９回以下、１０回以下のサイクル／分裂を含むがこれらに限定されない、最小限の回数の細胞周期／分裂を受けている。
いくつかの例では、肝細胞及び／又は肝前駆細胞を含有する細胞集団は、不死化細胞株でも、別様で本質的に永続増殖される細胞株でもない細胞から調製され得る。例えば、肝細胞及び／又は肝前駆細胞である細胞集団は、例えば、初代肝臓細胞の非不死化子孫を含む、初代肝臓細胞及び初代肝臓細胞の子孫に由来し得る。
いくつかの例では、細胞集団は、肝前駆細胞を含み得るか、又は特異的に除外し得る。本明細書で使用される場合、用語「肝前駆細胞」及び「肝細胞の前駆細胞」などは、一般に、肝細胞が由来する細胞及び／又は肝細胞に分化する細胞を指す。いくつかの例では、肝前駆細胞は、コミットされた前駆細胞であってもよく、これは、前駆細胞が本質的に肝細胞にのみ分化することを意味する。いくつかの例では、肝前駆細胞は、様々な効力を有してもよく、例えば、万能性、多能性、又は全能性前駆細胞であってもよい。肝前駆細胞は、幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹（ＥＳ）細胞、肝細胞様細胞（ＨＬＣ）などを含み得るか、又はそれらに由来し得る。いくつかの例では、肝前駆細胞は、例えば、肝細胞の脱分化及び／又は他の肝臓細胞型若しくは非肝臓細胞型の分化転換を介して、成熟肝細胞及び／又は他の非肝細胞の細胞に由来し得る。
本開示の細胞集団又は亜集団（肝細胞の増殖させた細胞集団を含む）の細胞は、複数の個々の細胞（例えば、単一のドナーから得られた複数の個々の肝細胞又は複数のドナーから得られた複数の個々の肝細胞を含む）に由来し得るか、又はそれらの子孫であり得る。初代細胞の集団が単一のドナーに由来する場合、そのような複数の個々の細胞は、本質的に同じドナーゲノムを共有するが、一方でクローン由来ではなくて、モノクローナルではなく、またいくつかの例では、互いに特定の差異（例えば、異なる遺伝的変異、異なるエピジェネティック変異、ドナー肝臓における異なるゾーネーション、遺伝子発現の差異などを含む）を含有し得る。したがって、クローン由来の細胞集団とは対照的に、単一のドナー又は複数のドナーからの初代肝細胞を含む、複数の個々の初代肝細胞から増殖させた細胞集団は、非モノクローナルな、と呼ばれることがあり、又は、いくつかの例では、そのような増殖させた細胞は、ポリクローナルな、若しくは非クローン増殖させたと呼ばれることがある。いくつかの例では、本開示の遺伝子改変は、個々の初代肝細胞（又はその子孫）の集団に対して行われて、操作された肝細胞の非モノクローナルな集団を生成し得、そのような細胞は、増殖させて、非モノクローナルな操作された肝細胞の増殖させた集団を生成し得る。いくつかの例では、肝細胞の集団を増殖させて、本質的にポリクローナルな集団を生成し得、これは、続いて遺伝子改変されて、非モノクローナルな操作された肝細胞の増殖させた集団を生成する。
いくつかの例では、肝細胞及び／若しくは肝前駆細胞、並びに／又はそのような肝細胞及び／若しくは肝前駆細胞が由来する肝臓、対象、及び／若しくは細胞培養物は、健康な肝細胞及び／又は肝前駆細胞であり得る。「健康な肝細胞及び／又は肝前駆細胞」とは、本明細書で使用される場合、正常な肝臓及び／若しくは肝細胞関連機能における機能的及び／若しくは遺伝的な欠損若しくは欠陥を本質的に含まない、又は正常な肝臓及び／若しくは肝細胞関連機能に影響を及ぼす、正常な肝細胞表現型及び／又は遺伝子型を、細胞が示すことを意味する。肝細胞関連機能には、例えば、肝臓代謝（例えば、肝細胞代謝）、アンモニア代謝、アミノ酸代謝（生合成及び／又は異化を含む）、解毒、肝臓タンパク質（例えば、アルブミン、フィブリノーゲン、プロトロンビン、凝固因子（例えば、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、Ｘ因子、第ＸＩ因子、及び第ＸＩＩ因子）、プロテインＣ、プロテインＳ、抗トロンビン、リポタンパク質、セルロプラスミン、トランスフェリン、補体タンパク質）合成などの、肝臓において肝細胞によって主に又は排他的に実行される機能が含まれる。肝細胞及び／又は肝前駆細胞は、本明細書に記載されるような遺伝子改変の前、間、及び／又は後に健康であり得る。例えば、いくつかの例では、肝細胞及び／又は肝前駆細胞は、例えば、異種導入遺伝子を機能的に組み込むため、及び／又は１つ以上の内因性遺伝子座を改変するための、細胞の遺伝子改変の前及び後に、健康な細胞であり得る。いくつかの例では、肝細胞及び／又は肝前駆細胞は、欠陥のある疾患関連対立遺伝子又は遺伝子座の修正後に健康である。
健康な肝細胞及び／又は肝前駆細胞は、一般に、例えば、遺伝的胆汁うっ滞障害、ウィルソン病、遺伝性ヘモクロマトーシス、チロシン血症、α１アンチトリプシン欠損症、尿素回路異常症、クリグラー・ナジャール症候群、家族性アミロイドポリニューロパチー、原発性高シュウ酸尿症１型、非典型溶血性尿毒症症候群－１などを含むがこれらに限定されない、肝臓関連単一遺伝子性疾患に関連する遺伝子異常を抱えるものを除外する。したがって、健康な肝細胞及び／又は肝前駆細胞は、例えば、ＡＢＣＢ１１（ＢＳＥＰ）、ＡＧＸＴ、ＡＲＧ、ＡＳＬ、ＡＳＳ、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ８Ｂ１（別名ＦＩＣ１）、ＣＦＨ、ＣＰＳ、ＦＡＨ、ＨＡＭＰ、ＨＦＥ、ＪＡＧ１、ＪＨ、ＭＤＲ３（ＡＢＣＢ４）、ＮＡＧＳ、ＯＴＣ、ＰＩ、ＳＬＣ４０Ａ１、ＴＦＲ２、ＴＴＲ、ＵＧＴ１Ａ１などであるがこれらに限定されない、肝臓関連単一遺伝子性疾患に対応する遺伝子座及び／又は遺伝子において、正常な遺伝子／対立遺伝子を含有し得る（すなわち、非疾患関連遺伝子／対立遺伝子を含有し、すなわち、疾患関連遺伝子／対立遺伝子を含有しない）。肝臓関連単一遺伝子性疾患に対応する遺伝子の更なる例及び説明は、Ｆａｇｉｕｏｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ（２０１３）５９（３）：５９５－６１２に見出すことができ、この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。肝臓関連単一遺伝子性疾患に関連する１つ以上の遺伝子異常を抱える細胞は、本明細書において、「疾患」、「罹患」、「疾患関連」、「機能不全」、又は「欠陥のある」細胞などと称され得る。
肝細胞及び／又は肝前駆細胞などの細胞集団は、生きている生物の外側で、すなわちエクスビボで、様々な方法で操作され得る。そのような操作は、凍結、解凍、培養、濾過、富化、精製、単離、トランスフェクション、形質導入などを含み得るか、又はいくつかの場合においてそれらを特異的に除外し得る。いくつかの例では、細胞は、凍結されている場合は解凍され、任意の好適な容器又は培養容器に入れられる。いくつかの例では、細胞は、更なる成分を含むか又は含まない、好適な培養培地中で培養される。
様々な好適な培養培地を使用することができる。ある特定の実施形態において、培養培地は、肝細胞基礎培地、ＦＢＳ及び／又はＲＯＣＫ阻害剤、例えば、肝細胞基礎培地及びＬｏｎｚａ ＨＣＭ（商標）Ｓｉｎｇｌｅ Ｑｕｏｔｓ（商標）の１：１混合物、５％ＦＢＳ並びに１０μＭ Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む。例えば、Ｌｉｅｂｏｖｉｔｚ Ｌ－１５、最小必須培地（ＭＥＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、ＲＰＭＩ１６４０、ＷａｙｍｏｕｔｈのＭＢ７５２／１Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅ、Ｈ１７７７、肝細胞解凍培地（ＨＴＭ）、凍結保存肝細胞回収培地（ＣＨＲＭ（登録商標））、ヒト肝細胞培養培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、ヒト肝細胞プレーティング培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、ヒト肝細胞解凍培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、Ｌｏｎｚａ ＨＣＭ（商標）、Ｌｏｎｚａ ＨＢＭ（商標）、ＨｅｐａｔｏＺＹＭＥ－ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ Ｐｏｗｅｒ Ｐｒｉｍａｒｙ ＨＥＰ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ）などを含むがそれらに限定されない、様々な肝細胞適合性培養培地が利用可能である。様々な培養サプリメント及び／又は基質を、例えば、Ｌｏｎｚａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｑｕｏｔｓ（商標）サプリメント、ＨｅｐＥｘｔｅｎｄ（商標）サプリメント、ウシ胎児血清、ＲＯＣＫ阻害剤、デキサメタゾン、インスリン、ＨＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、Ｌ－グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、バッファー（例えば、ＨＥＰＥＳ、重炭酸ナトリウムバッファーなど）、トランスフェリン、セレン複合体、ＢＳＡ、リノール酸、コラーゲン、コラゲナーゼ、Ｇｅｌｔｒｅｘ（商標）、メチルセルロース、ジメチルスルホキシド、ヒアルロニダーゼ、アスコルビン酸、抗生物質などを含むがこれらに限定されない、所望の培地に含めたり除外したりすることができる。肝細胞適合性培地は、一般的な用途であるか、一次、二次、又は不死化肝細胞用に特別に処方され、そのような培地は、血清又は成長因子を含むか、無血清、無成長因子、又は最小／減少した成長因子で構成されるように構成され得る。
いくつかの例では、肝細胞及び／又は肝前駆細胞を含む細胞集団は、例えば、米国特許出願第１６／９３８，０５９号（米国特許出願公開第２０２１００２４８８５号）及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４３４３９号（国際公開第２０２１／０２１６１２（Ａ１）号）に記載されるようなエクスビボ操作を含むがこれに限定されないエクスビボ操作に供され得、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。そのようなエクスビボ操作は、実施される場合、本明細書に記載される方法における様々な時点で、例えば、限定されないが、単離後、バイオリアクターへの移植前、（例えば、症状について対象を処置するための）対象への投与前などで使用され得る。
いくつかの例では、新鮮に調製された肝細胞及び／若しくは肝前駆細胞、又は肝細胞及び／若しくは肝前駆細胞を含有する細胞集団は、例えば、遺伝子産物をコードする導入遺伝子、編集組成物などを含む、様々な試薬、組成物、及び／又はベクターと接触させられ得る。そのような新鮮に調製された細胞は、新鮮に解凍された細胞（例えば、以前に凍結保存されている場合）、生きている対象（例えば、ヒト、げっ歯類、ブタなど）から新鮮に単離された細胞、肝臓又はその一部（例えば、死体の肝臓又はその一部、インビボバイオリアクターから得られた肝臓（又はその一部）など）から新鮮に単離された細胞などを含み得る。
複数の遺伝子改変された細胞を含有する細胞集団は、このような細胞が単一の遺伝子改変又は複数の改変を含む場合を含めて、生成され得る。例えば、いくつかの例では、低免疫原性となるように遺伝子改変された複数の肝細胞及び／又は肝前駆細胞を含む細胞集団が生成され得、したがって、集団は、複数の低免疫原性肝細胞及び／又は肝前駆細胞を含み得る。全細胞集団に対する複数の細胞のサイズは、様々であり得る。例えば、いくつかの例では、この複数は、集団の全て未満の細胞を含んでもよく、これは、例えば、この複数が細胞集団の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％を構成する場合を含むが、これらに限定されない。いくつかの例では、複数の細胞は、特定の細胞集団の全て、すなわち、１００％を構成し得る。
いくつかの例では、細胞集団は、低免疫であるように改変された複数の細胞を含み得、例えば、全細胞集団に対して、この複数が細胞集団の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を構成する。
いくつかの例では、細胞集団は、特定の導入遺伝子を含むように改変された複数の細胞を含み得、例えば、全細胞集団に対して、この複数が細胞集団の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を構成する。
いくつかの例では、バイオリアクターにおける増殖の前及び／又は後の細胞集団は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の所望の遺伝子改変された肝細胞を含み得る。いくつかの例では、バイオリアクターにおける増殖の前及び後に、インプット及びアウトプット細胞集団はそれぞれ、所望の遺伝子改変を有する複数の細胞を含み得、インプット及びアウトプット集団におけるこれらの複数は、互いに３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、又は５％以下以内であるインプット及びアウトプット集団全体のパーセンテージを含み得る。
遺伝子改変された肝細胞及び／又は肝前駆細胞を含む、肝細胞及び／又は肝前駆細胞を含有する細胞集団は、例えば、治療目的のためのヒト又は非ヒト対象、増殖及び／又は研究目的のための非ヒト対象などを含む対象に導入又は移植され得る。十分な条件下で実施される場合、対象に導入された肝細胞及び／又は肝前駆細胞は、対象の肝臓に生着することを含めて、生着し得る。いくつかの例では、生着は、例えば、カプセル化技術の使用によって防止され得る。非生着治療細胞は、例えば、腹腔内空間、網嚢、及び／又は他の好適な場所へのカプセル化肝細胞の適用を含むが、これらに限定されない、種々の方法を介して送達され得る。
肝細胞及び／又は肝前駆細胞を肝臓に導入するための任意の好適なアプローチが使用され得る。いくつかの実施形態において、肝細胞及び／又は肝前駆細胞を肝臓に導入することは、肝細胞をレシピエントの脾臓に送達することを含む。１つの非限定的な例において、肝細胞及び／又は肝前駆細胞は、脾臓注射（例えば、開腹脾臓注射又は経皮脾臓注射）を介して肝臓に導入され得る。
本開示はまた、本明細書に記載される肝細胞及び／又は肝前駆細胞の移植された集団を含む非ヒト動物も含み、これは、そのような移植された細胞が非ヒト動物の肝臓に存在する場合を含む。例えば、いくつかの例では、非ヒト動物は、遺伝子改変された肝細胞及び／又は肝前駆細胞の移植された集団を含み得、これは、例えば、移植された細胞が、低免疫原性となるように、治療用導入遺伝子を含むように、又はその両方となるように遺伝的に改変され得る場合を含む。有用な非ヒト動物としては、例えば、げっ歯類、ネズミ類（例えば、ラット、マウス）、ウサギ類（例えば、ウサギ）、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、有蹄類（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などであるがこれらに限定されない、非ヒト哺乳動物が挙げられる。
いくつかの例では、非ヒト動物は、インビボバイオリアクターとして機能し得る。肝細胞及び／又は肝前駆細胞を含む細胞集団は、インビボバイオリアクターへの移植、及び移植された細胞の増殖に適した条件下のバイオリアクターの維持によって増殖され得る。好適なインビボバイオリアクターとしては、例えば、げっ歯類バイオリアクター（例えば、マウスバイオリアクター及びラットバイオリアクターなど）、ブタバイオリアクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
肝細胞の増殖に適した動物バイオリアクターは様々である。ある特定の実施形態では、動物は、１つ以上の遺伝子座で遺伝子改変されている。遺伝子改変には、１つ以上の遺伝子座又は１つ以上の標的遺伝子の活性化が欠損している動物を生成するためのノックアウト又はノックダウンが含まれ得る。遺伝子改変は、任意の組み合わせで複数の遺伝子座で行うことができる（１つ以上の抑制的改変及び／又は１つ以上の活性化改変）。インビボバイオリアクターにおける有用な遺伝子改変には、免疫遺伝子（例えば、免疫不全をもたらす）、肝機能遺伝子（例えば、肝機能不全をもたらす）、代謝遺伝子（例えば、代謝欠損をもたらす）、アミノ酸異化遺伝子（例えば、不十分なアミノ酸異化をもたらす）などを含む様々な遺伝子の改変が含まれ得る。
ある特定の実施形態において、有用な遺伝子改変された動物は、例えば、米国特許第８，５６９，５７３号、同第９，０００，２５７号、及び米国特許出願公開第２０１６０２４９５９１号に記載されているようなフマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（ｆａｈ）欠損動物であり、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＦＡＨは、チロシン異化作用の最後のステップを触媒する代謝酵素である。Ｆａｈ遺伝子のホモ接合性欠失を有する動物は、肝臓のｍＲＮＡ発現の変化及び重度の肝機能障害を示す。Ｆａｈ遺伝子の点突然変異は、肝不全及び出生後の致死を引き起こすことも示されている。Ｆａｈが欠損しているヒトは、肝疾患の遺伝性高チロシン血症１型（ＨＴ１）を発症し、肝不全を発症する。Ｆａｈ欠損は、強力な酸化剤であるフマリルアセトアセタートの蓄積を引き起こし、これは最終的にＦａｈ欠損肝細胞の細胞死を引き起こす。したがって、Ｆａｈ欠損動物は、機能するｆａｈ遺伝子を含有する、ヒトを含む他の種からの肝細胞で再増殖することができる。複数の異なる種についてのＦａｈゲノム配列、ｍＲＮＡ配列及びタンパク質配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて公開されており（例えば、遺伝子ＩＤ ２９３８３（ラットＦａｈ）、遺伝子ＩＤ １４０８５（マウスＦａｈ）、遺伝子ＩＤ ６１０１４０（イヌＦＡＨ）、遺伝子ＩＤ ４１５４８２（ニワトリＦＡＨ）、遺伝子ＩＤ １０００４９８０４（ウマＦＡＨ）、遺伝子ＩＤ ７１２７１６（アカゲザルＦＡＨ）、遺伝子ＩＤ １００４０８８９５（マーモセットＦＡＨ）、遺伝子ＩＤ １００５８９４４６（テナガザルＦＡＨ）、遺伝子ＩＤ ４６７７３８（チンパンジーＦＡＨ）、及び遺伝子ＩＤ ５０８７２１（ウシＦＡＨ）を参照されたい）、他の種におけるｆａｈゲノム遺伝子座は、バイオインフォマティクスを介して容易に同定可能である。Ｆａｈ欠損動物は、遺伝子改変されたｆａｈ遺伝子座を含み得、かつ例えばそのような動物（例えば、マウス、ブタ又はラット）がＦＡＨ、ＲＡＧ－１及び／又はＲＡＧ－２、並びにＩＬ－２Ｒγの欠損（場合によっては、ＦＲＧマウス、ＦＲＧブタ、又はＦＲＧラットなどの「ＦＲＧ」動物と呼ばれる）を含む、他の遺伝子座における更なる遺伝子改変を含み得る又は含まない。
有用な遺伝子改変には、例えば、免疫系の特定の分子又は細胞成分、免疫系の特定の分子又は細胞成分の機能の欠如などから、免疫不全をもたらすものも含まれる。場合によっては、有用な遺伝的変化には、組換え活性化遺伝子１（Ｒａｇ１）遺伝子の遺伝的変化が含まれる。Ｒａｇ１は、免疫グロブリンＶ（Ｄ）Ｊ組換えの活性化に関与する遺伝子である。ＲＡＧ１タンパク質はＤＮＡ基質の認識に関与しているが、安定した結合及び切断活性にはＲＡＧ２も必要である。Ｒａｇ－１欠損動物は、成熟したＢ及びＴリンパ球を持たないことが示されている。場合によっては、有用な遺伝的変化には、組換え活性化遺伝子２（Ｒａｇ２）遺伝子の遺伝的変化が含まれる。Ｒａｇ２は、免疫グロブリンとＴ細胞受容体遺伝子座の組換えに関与する遺伝子である。Ｒａｇ２遺伝子が欠損している動物は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えを受けることができず、機能的なＴ細胞とＢ細胞が完全に失われる（例えば、Ｓｈｉｎｋａｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ６８：８５５－８６７，１９９２を参照されたい）。場合によっては、有用な遺伝的変化には、インターロイキン受容体（Ｉｌ２ｒｇ）の共通γ鎖の遺伝的変化が含まれる。Ｉｌ２ｒｇは、インターロイキン受容体の共通γ鎖をコードする遺伝子である。Ｉｌ２ｒｇは、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、及びＩＬ－１５を含む、複数のインターロイキンに対する受容体の構成要素である（例えば、Ｄｉ Ｓａｎｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：３７７－３８１，１９９５を参照されたい）。Ｉｌ２ｒｇを欠損した動物は、Ｂ細胞及びＴ細胞の減少を示し、ナチュラルキラー細胞を欠いている。Ｉｌ２ｒｇは、インターロイキン２受容体ガンマ鎖とも呼ばれ得る。
場合によっては、例えば、１つ以上の免疫抑制剤の投与によって免疫抑制が達成される場合を含めて、動物は免疫抑制され得る。動物において免疫抑制を達成するために有効な任意の適切な免疫抑制剤（複数可）を使用することができる。免疫抑制剤の例には、ＦＫ５０６、シクロスポリンＡ、フルダラビン、ミコフェノール酸塩、プレドニゾン、ラパマイシン、及びアザチオプリンが含まれるが、これらに限定されない。免疫抑制剤の組み合わせも投与することができる。場合によっては、遺伝的免疫不全の代わりに免疫抑制剤が使用される。場合によっては、免疫抑制剤が遺伝的免疫不全と組み合わせて使用される。
本明細書に要約されるように、遺伝子改変された動物は、１つ以上の（すなわち、組み合わせた）遺伝子改変を含み得る。例えば、そのような動物は、ｒａｇ１遺伝子改変、ｒａｇ２遺伝子改変、ＩＬ２ｒｇ遺伝子改変を含み得るか、又はそのような動物は、ｒａｇ１若しくはｒａｇ２遺伝子改変、並びに遺伝子変化が対応して機能的なＲＡＧ１タンパク質、ＲＡＧ２タンパク質、ＩＬ－２ｒｇタンパク質、若しくはＲＡＧ－１／ＲＡＧ－２タンパク質及びＩＬ－２ｒｇタンパク質の発現の喪失を生じるようなＩｌ２ｒｇ遺伝子の遺伝子変化を含み得る。一例では、１つ以上の遺伝子変化には、Ｒａｇ２遺伝子の遺伝子変化及びＩｌ２ｒｇ遺伝子の遺伝子変化が含まれる。一例では、１つ以上の遺伝子変化には、Ｒａｇ１遺伝子の遺伝子変化及びＩｌ２ｒｇ遺伝子の遺伝子変化が含まれる。場合によっては、有用な遺伝子変化には、例えば、ＳＣＩＤ、ＮＯＤ、ＳＩＲＰα、パーフォリン、又はヌードが含まれる。変更された遺伝子座は、対応する遺伝子座での遺伝子産物の欠損をもたらす遺伝的ヌル（すなわち、ノックアウト）又は他の改変である可能性がある。免疫系の特定の細胞（マクロファージやＮＫ細胞など）も枯渇する可能性がある。特定の細胞型を枯渇させる任意の便利な方法を使用することができる。
誘発性傷害、選択的塞栓症、一過性虚血、レトロシン、モノクロトリン、チオアセトアミド、ガンマ線照射、四塩化炭素、及び／又は遺伝子改変（例えば、Ｆａｈ破壊、ｕＰＡ、ＴＫ－ＮＯＧ（Ｗａｓｈｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１４０（４）：１３３４－４４，２０１１）、アルブミンＡＦＣ８、アルブミンジフテリア毒素、ウィルソン病など）を含むが、それらに限定されない肝細胞異種移植片の選択的増殖の利点を生み出す肝臓損傷の様々なモデルを動物バイオリアクター（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ブタ）で使用して、肝細胞の生着及び増殖を促進することができることが理解されるであろう。肝障害技術の組み合わせも使用できる。
いくつかの実施形態において、動物は、異種肝細胞の注射の前に、ウロキナーゼ遺伝子（例えば、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ））をコードするベクター（例えば、Ａｄベクター）を投与される。肝細胞におけるｕＰＡの発現は肝損傷を引き起こし、したがって移植時に肝細胞異種移植片の選択的増殖を可能にする。一実施形態では、ウロキナーゼ遺伝子はヒトウロキナーゼであり、分泌されていても分泌されていなくてもよい。例えば、米国特許第８，５６９，５７３号、同第９，０００，２５７号、及び米国特許出願公開第２０１６０２４９５９１号を参照されたい。
場合によっては、ＴＫ－ＮＯＧ肝損傷モデル（すなわち、アルブミンチミジンキナーゼトランスジェニック－ＮＯＤ－ＳＣＩＤ－インターロイキン共通ガンマ鎖ノックアウト）を、本明細書に記載の動物バイオリアクターとして使用することができる。ＴＫ－ＮＯＧ動物には、ガンシクロビルの投与によって条件付きで活性化できる、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ肝毒性導入遺伝子が含まれる。ガンシクロビルの投与中の導入遺伝子の活性化に起因する肝損傷は、肝細胞異種移植片に選択的な利点を提供し、本明細書に記載されるような移植された肝細胞の増殖のためのインビボバイオリアクターとしてのそのような動物の使用を容易にする。
場合によっては、ＡＦＣ８肝損傷モデル（アルブミンプロモーターによって駆動されるＦＫＢＰ－カスパーゼ８遺伝子を有することを特徴とする）を、本明細書に記載の動物バイオリアクターとして使用することができる。ＡＦＣ８動物には、ＡＰ２０１８７の投与によって条件付きで活性化できるＦＫ５０８－カスパーゼ８融合肝毒性導入遺伝子が含まれている。ＡＰ２０１８７の投与中の導入遺伝子の活性化に起因する肝損傷は、肝細胞異種移植片に選択的な利点を提供し、本明細書に記載されるような移植された肝細胞の増殖のためのインビボバイオリアクターとしてのそのような動物の使用を容易にする。
場合によっては、ＮＳＧ－ＰｉＺ肝損傷モデル（免疫不全（ＮＧＳ）と組み合わせたα－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠損を有することを特徴とする）を、本明細書に記載の動物バイオリアクターとして使用することができる。ＮＳＧ－ＰｉＺ動物は、ＡＡＴの分泌が損なわれ、誤って折りたたまれたＰｉＺ変異体ＡＡＴタンパク質が蓄積し、肝細胞の損傷を引き起こす。そのような肝損傷は、肝細胞異種移植片に選択的な利点を提供し、本明細書に記載されるような移植された肝細胞の増殖のためのインビボバイオリアクターとしてのそのような動物の使用を容易にする。免疫不全により、動物は有意な拒絶反応なしに異種移植片をホストできるようにする。
場合によっては、動物をプレコンディショニングして、移植された細胞を支持するレシピエントの肝臓の能力を改善することができる。例えば、照射プレコンディショニング（例えば、部分肝臓照射）、塞栓プレコンディショニング、虚血プレコンディショニング、化学的／ウイルスプレコンディショニング（例えば、ｕＰＡ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、一酸化窒素、レトロシン、モノクロタリン、有毒な胆汁塩、四塩化炭素、チオアセトアミドなどを使用する）、肝臓切除プレコンディショニングなどを含むがこれらに限定されない様々なプレコンディショニングレジメンを使用することができる。場合によっては、肝細胞生成細胞は、プレコンディショニングなしで導入され得、かつ／又は手順は、例えば、本明細書に記載されるものの１つ以上を含む、プレコンディショニングレジメン又は特定の試薬の１つ、全て、又はいくつかの組み合わせを具体的に除外する。場合によっては、ＮＴＢＣの中止又はガンシクロビル又はＡＰ２０１８７の投与による肝損傷の誘発が、プレコンディショニングに使用されることがある。使用される場合、プレコンディショニングは、少なくとも移植の、例えば、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１週間、又は少なくとも２週間前を含む、肝細胞生成細胞の移植の、数時間、数日、又は数週間以上前を含むある時点で実施され得る。
動物の任意のプレコンディショニング（例えば、ｕＰＡによる）の後（例えば、プレコンディショニングの２４時間後）、異種肝細胞及び／又は肝前駆細胞は、任意の好適な方法を介して動物に送達することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の肝細胞及び／又は肝前駆細胞は、肝臓に直接投与され（例えば、門脈注射を介して）、かつ／又は肝細胞及び／若しくは前駆細胞が血管系を通って肝臓に到達する脾臓内注射を介して投与される。ある特定の実施形態では、１×１０５～１×１０９個（例えば、５×１０５個／マウス、５～１０ｘ１０６個／ラットなど）の肝細胞及び／又は肝前駆細胞が、任意選択で、例えば、アデノウイルスｕＰＡ（例えば、１．２５ｘ１０９ ＰＦＵ／２５グラムのマウス体重）でプレコンディショニングされて（例えば、投与前２４時間）、動物（例えば、ＦＲＧ動物）に導入される。バイオリアクターに導入される肝細胞及び／又は肝前駆細胞の数は様々であり、例えば、細胞を受ける動物の種及び大きさを含む様々な要因に応じて、例えば、１ｘ１０５～１ｘ１０９、１ｘ１０６～１ｘ１０９、１ｘ１０７～１ｘ１０９、１ｘ１０８～１ｘ１０９、１ｘ１０５～１ｘ１０６、１ｘ１０５～１ｘ１０７、１ｘ１０５～１ｘ１０８、１ｘ１０６～１ｘ１０７、１ｘ１０７～１ｘ１０８、１ｘ１０６～１ｘ１０８などを含むが、それらに限定されない、１×１０５以下～１×１０９以上までの範囲であり得る。いくつかの例では、投与される細胞の数は、例えば、０．５×１０９以下、１×１０８以下、０．５×１０８以下、１×１０７以下、０．５×１０７以下、１×１０６以下、０．５×１０６以下、１×１０５以下などを含む、１×１０９以下であり得る。バイオリアクター（又は非ヒト動物全般）に導入される肝細胞及び／又は肝前駆細胞は様々であり得、そのような細胞は、バイオリアクター（又は非ヒト動物全般）に対して同種又は異種であり得る。
加えて、任意選択で、免疫抑制薬を移植前、移植中、及び／又は移植後に動物に与えて、異種移植された異種肝細胞から動物（例えば、マウス、ブタ、又はラット）における宿主対移植片応答を排除することができる。場合によっては、定義された期間、動物に免疫抑制剤をサイクリングさせないことにより、肝臓細胞は静止状態になり、移植された細胞は、内因性肝細胞（例えば、マウス、ブタ、又はラット肝細胞）の異種肝細胞（例えば、ヒト肝細胞）への置換につながる増殖上の利点を有する。ヒト肝細胞の場合、これは、高レベルの肝臓のヒト化、すなわち、ヒト化肝臓を有する動物を生成する。異種肝細胞の再増殖レベルは、例えば、移植された動物からの肝臓切片の免疫組織化学と任意に相関するヒト血清アルブミンレベルの定量化を含むがこれに限定されない、様々な測定によって決定することができる。
いくつかの実施形態において、肝疾患の発症を阻害、遅延、回避又は防止する薬剤は、投与された肝細胞の増殖の期間中に動物バイオリアクターに投与される。そのような薬剤の投与は、健康な（例えば、ＦＡＨを発現する）異種肝細胞を有する動物バイオリアクター（例えば、マウス、ラット、又はブタバイオリアクター）の再増殖の前に、動物バイオリアクター（例えば、マウス、ラット、又はブタバイオリアクター）の肝機能障害及び／又は死を回避（又は防止）する。薬剤は、バイオリアクターに関連する疾患モデルにおいて肝疾患を阻害する任意の化合物又は組成物であり得る。そのような薬剤の１つは２－（２－ニトロ－４－トリフルオロ－メチル－ベンゾイル）－１，３シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）であるが、メチル－ＮＴＢＣなどの他のフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの薬理学的阻害剤を使用することもできる。ＮＴＢＣは、Ｆａｈ欠損動物の肝疾患の発症を調節するために投与される。Ｆａｈ欠損動物バイオリアクターでは、肝細胞異種移植片の増殖を促進しながら、壊滅的な肝機能障害を回避するために、必要に応じて、用量、投与スケジュール、及び投与方法を調整及び／又はサイクルさせることができる。いくつかの実施形態において、Ｆａｈ欠損動物は、本明細書に記載されるように、肝細胞の移植後、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、又は少なくとも６日間、ＮＴＢＣを投与される。いくつかの実施形態において、Ｆａｈ欠損動物は、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約１ヶ月、少なくとも約２ヶ月間、少なくとも約３ヶ月、少なくとも約４ヶ月、少なくとも約５ヶ月、又は少なくとも約６ヶ月、ＮＴＢＣを更に投与される。いくつかの実施形態において、ＮＴＢＣ（又は肝臓保護効果を有する別の化合物）は、肝細胞移植後約２日、約３日、約４日、約５日、約６日又は約７日で中止される。
Ｆａｈ欠損動物に投与されるＮＴＢＣの用量は変動する可能性がある。いくつかの実施形態において、用量は、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ／日、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ／日～約２０ｍｇ／ｋｇ／日、又は約２０ｍｇ／ｋｇ／日である。ＮＴＢＣは、飲料水、食品中、注射などの適切な手段で投与できるが、これらに限定されない。一実施形態では、飲料水中に投与されるＮＴＢＣの濃度は、約１～約３０ｍｇ／Ｌ、例えば、約１０～約２５ｍｇ／Ｌ、約１５～約２０ｍｇ／Ｌ、又は約２０ｍｇ／Ｌである。ある特定の実施形態において、ＮＴＢＣ投与は、移植前から移植後４～８週間以上まで周期的である。
移植された肝細胞及び／又は肝前駆細胞に由来する増殖させた肝細胞は、移植後７～１８０日（又はそれらの間の任意の日）又はそれ以上を含むがこれらに限定されない任意の期間後に動物バイオリアクターから収集することができる。
収集時に、動物バイオリアクターの肝臓に、導入された肝細胞、肝前駆細胞、及び／又はその子孫（例えば、遺伝子改変された肝細胞、肝前駆細胞、及び／又はその子孫を含む）を様々な程度で再増殖させてもよい。例えば、いくつかの例では、再増殖させた動物の肝臓は、少なくとも３０％以上再増殖してもよく、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％再増殖してもよいが、これらに限定されない。したがって、再増殖させた動物の肝細胞は、いくつかの例では、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の遺伝子改変された肝細胞を含むが、これらに限定されない、本明細書に記載の少なくとも３０％以上の遺伝子改変された肝細胞を含み得る。よって、収集された細胞集団は、例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の遺伝子改変された肝細胞を含む、同様のパーセンテージの遺伝子改変された肝細胞（導入された細胞（例えば、遺伝子改変された肝細胞及び／又は肝前駆細胞）及び／又はその子孫を含む）を含み得る。
ある特定の実施形態において、増殖した肝細胞は、移植後２８～５６日（又はそれらの間の任意の日）に収集される。場合によっては、肝細胞は、１週間、２週間以前、３週間以前、４週間前、４週間以前、５週間以前、６週間以前、７週間以前、８週間前、８週間以前、９週間以前、１０週間以前、１１週間以前、１２週間前、１２週間以前、１３週間以前、１４週間前、又は１４週間以前に収集される。
更に、増殖した肝細胞は、複数の技術のいずれかを使用して動物から収集することができる。例えば、肝細胞は、動物の肝臓を酵素消化した後、穏やかに細かく切り刻み、濾過し、遠心分離することで収集できる。更に、肝細胞は、移植された肝細胞種の細胞型を特異的に認識する抗体を使用するなどの様々な方法を使用して、他の細胞型、組織及び／又は破片から分離することができる。そのような抗体には、抗ヒトＨＬＡ－Ａ、Ｂ、ＣなどのクラスＩ主要組織適合抗原に特異的に結合する抗体が含まれるが、これらに限定されない（Ｍａｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６：４５５－４６２）。次に、抗体に結合した肝細胞を、パニング（固体マトリックスに付着したモノクローナル抗体を利用する）、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、磁気ビーズ分離などによって分離することができる。肝細胞を収集する別の方法も使用できる。
場合によっては、収集された肝細胞は、追加の動物バイオリアクターに１回以上連続的に移植され得る。連続移植は、同じ又は異なる種の動物で２、３、４回、又はそれ以上、例えば、全ての連続移植にラット、ブタ、マウス、又はウサギを使用して、あるいは連続移植に適切な動物バイオリアクターの任意の組み合わせを使用して実施することができる。（ラットでは１回以上、ブタでは１回以上など）。
更に、動物バイオリアクターから肝細胞を収集した後、肝細胞は、本明細書に記載されるような種々の遺伝子操作に供され得る。例えば、バイオリアクターから収集された肝細胞は、対象への投与前に、例えば、導入遺伝子の導入及び／又は１つ以上の遺伝子座の編集によって、遺伝子改変され得る。収集され、必要に応じて単離された増殖した肝細胞は、新鮮なまま使用することも、使用前に凍結保存することもできる。
ある特定の実施形態において、遺伝子改変された肝細胞及び／又は肝前駆細胞を含む、肝細胞及び／又は肝前駆細胞は、カプセル化され得る。肝細胞及び／又はその前駆細胞は、典型的には対象への投与の前に、任意の方法を使用してカプセル化され得る。例えば、Ｊｉｔｒａｒｕｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ９：１０；Ｄｈａｗａｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ．７２（５）：８７７－８８４；Ｂｏｃｈｅｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２：８１０－８２１を参照されたい。半透性ヒドロゲル内の細胞カプセル化は、全身性免疫抑制を必要としない細胞ベースの治療のための局所免疫分離戦略を表している。ヒドロゲル球は、同種異系細胞を拒絶するであろう免疫細胞を排除しながら、細胞機能に必要な基質、栄養素、及びタンパク質の拡散を促進する。アルギン酸塩球は、この陰イオン性多糖類が細胞に優しい条件下で二価陽イオンの存在下でヒドロゲルを形成するため、最も広く研究されている細胞カプセル化材料の１つである。いくつかの例では、例えば、肝細胞及び／又は肝前駆細胞を低免疫原性にする遺伝子改変に起因して、細胞は、カプセル化されずに投与され得、したがって、細胞は、カプセル化されずに又は裸で使用され得る。
本明細書に記載の方法によって産生された肝細胞及び／又は肝前駆細胞の集団を播種及び／又は再増殖させた、脱細胞化肝臓、又は他の無細胞化足場（天然及び合成足場を含む）も本明細書で提供される。例えば、本明細書に記載の遺伝子改変された肝細胞及び／又はその前駆細胞を含む細胞集団は、脱細胞化肝臓、若しくはその一部、又は他の無細胞化足場に（他の支持細胞型の有無にかかわらず）導入され得、その後、細胞集団の肝細胞及び／又は細胞集団から生成された肝細胞による脱細胞化肝臓又はその一部の再増殖に十分な条件下で維持される。
ヒト肝臓又はブタなどの非ヒト哺乳動物などの肝臓、又はその一部を取得し、任意選択で外科的に処理することができる（例えば、肝臓の１つ以上の部分又は葉を単離するために）。次に、肝臓又はその一部は、例えば、機械的細胞損傷、凍結／解凍、カニューレ挿入及び１つ以上の脱細胞化試薬（例えば、１つ以上のプロテアーゼ（例えば、トリプシン）、１つ以上のヌクレアーゼ（例えば、ＤＮａｓｅ）、１つ以上の界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、トリトンＸ－１００など）、１つ以上の低張試薬、１つ以上の高張試薬の逆行灌流（retrograde profusion）、それらの組み合わせなどを含む、任意の便利で適当な手段で脱細胞化される。脱細胞化された肝臓、又はその一部は、肝細胞適合性培地に保存及び／又は事前に浸され得る。次に、本明細書に記載のエクスビボで操作された肝細胞生成細胞を含有する細胞懸濁液を、例えば、注射、灌流、局所適用（例えば、一滴ずつ）などの任意の便利なメカニズム又はそれらの組み合わせによって、脱細胞化肝臓又はその一部に適用することができる。いくつかの例では、エクスビボで操作された肝細胞生成細胞は、例えば、５０μＬ当たり１～２ｘ１０６個の細胞が含まれるがこれらに限定されない、例えば、５０μＬ当たり１×１０５個以下～１×１０７個以上の細胞の濃度を含む、任意の好都合かつ適切な濃度で、調製された足場に播種するために、細胞懸濁液中に存在し得る。播種された脱細胞化肝臓、その一部、及び／又は他の無細胞化足場は、導入された細胞の生着／付着及び／又は増殖のための好適な条件下で維持され得、そのような条件は、好適な湿度、温度、ガス交換、栄養素などを含み得る。場合によっては、播種された肝臓、その一部、及び／又は他の無細胞化足場は、好適な培養培地において、５％ＣＯ２を含む３７℃又は約３７℃の湿度の高い環境で維持され得る。播種及び／又は生成された肝細胞の脱細胞化肝臓、その一部、又は他の無細胞化足場へ、又はその内部への付着及び／又は増殖に続いて、材料は、例えば、肝機能の低下及び／又は肝疾患のあるヒト対象などのそれを必要とする対象への移植を含む、様々な用途に使用され得る。ヒト肝臓を含む肝臓の脱細胞化、及び肝細胞受容性無細胞足場の生成に関連する方法及び試薬は、例えば、Ｍａｚｚａ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５，１３０７９（２０１５）；Ｍａｎｇｏ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２００００９７（２０２０）；Ｓｈｉｍｏｄａ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ９，１５４３（２０１９）；Ｃｒｏｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１９，９（１２）：８１３；並びに米国特許第１０，６８８，２２１号に記載されており、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の方法によって産生された、収集された細胞集団、及びその治療用又は薬学的組成物は、任意の好適な容器（例えば、培養容器、チューブ、フラスコ、バイアル、クライオバイアル、クライオバッグなど）に存在し得、任意の好適な送達方法及び／又はデバイスを使用して使用され得る（例えば、対象に投与される）。肝細胞及び薬学的組成物のそのような集団は、新鮮に調製及び／又は使用することができ、あるいは凍結保存することができる。場合によっては、肝細胞の集団及びその薬学的組成物は、例えば、細胞が好適な希釈剤中に及び／若しくは所望の送達濃度で（例えば、単位剤型で）存在する場合を含む、「すぐに使用できる」形式で、又は所望の送達濃度に（例えば、好適な希釈剤又は培地を用いて）容易に希釈することができる濃度で、調製され得る。肝細胞の集団及びその薬学的組成物は、送達デバイス、又は所望の送達メカニズム若しくは所望の送達経路と互換性があるデバイス、例えば、限定するものではないが、注射器、注入バッグなどに調製され得る。
いくつかの例では、本開示は、例えば、複数の用量の遺伝子改変された肝細胞が全て、単一のヒトドナー肝臓から作製された肝細胞集団（例えば、マスター細胞バンク）に由来する（増殖されることを含む）場合を含む、複数の細胞治療用量（例えば、それぞれが好適な容器に入っている）を含む。いくつかの例では、本開示は、例えば、複数の用量の遺伝子改変された肝細胞が全て、複数（例えば、２個、２個以上、３個以下、３個、３個以上、４個以下、４個、４個以上、５個以下、５個、５個以上、６個以下、６個、６個以上、７個以下、７個、７個以上、８個以下、８個、８個以上、９個以下、９個、９個以上、１０個以下、１０個以上など）のヒトドナー肝臓から作製された単一の肝細胞集団（例えば、マスター細胞バンク）に由来する（増殖されることを含む）場合を含む、複数の細胞治療用量（例えば、それぞれが好適な容器に入っている）を含む。
複数の細胞治療用量は、種々の方法によって生成され得る。いくつかの例では、ヒト肝細胞が遺伝子改変され、遺伝子改変された肝細胞は、１つ以上のインビボバイオリアクター中で増殖させられ、複数の用量を製剤化する際に使用される遺伝子改変されたヒト肝細胞の増殖させた集団を生成する。いくつかの例では、１つ以上のインビボバイオリアクターから得られた、増殖させたヒト肝細胞が、遺伝子改変されて、複数の用量を製剤化する際に使用される遺伝子改変されたヒト肝細胞の増殖させた集団を生成する。遺伝子改変されたヒト肝細胞の増殖させた集団を複数の肝細胞治療用量に分割することが、種々の手段によって行われ得、種々の異なる数の肝細胞を含有する、種々の異なる総量の単位用量をもたらし得る。例えば、いくつかの例では、例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、５００、７５０、又は１０００個の単位用量を含む、少なくとも２個の用量が生成され得、例えば、そのような用量がそれぞれ、例えば、少なくとも１０００万、少なくとも２５００万、少なくとも５０００万、少なくとも７５００万、少なくとも１億、少なくとも２億５０００万、少なくとも５億、少なくとも７億５０００万、少なくとも１０億、少なくとも２０億、少なくとも３０億、少なくとも４０億、少なくとも５０億、少なくとも６０億、少なくとも７０億、少なくとも８０億、少なくとも９０億、少なくとも１００億、少なくとも１５０億、少なくとも２００億、少なくとも３００億、少なくとも４００億、少なくとも５００億、少なくとも６００億、少なくとも７００億、少なくとも８００億、少なくとも９００億、又は少なくとも１０００億個の肝細胞を含む場合を含む。
本開示の方法は、本明細書に記載の細胞治療用量で複数の対象を処置することを含み得、そのような用量に含有される肝細胞が、例えば、単一のヒトドナー肝臓又は複数のヒトドナー肝臓に由来する場合を含む。例えば、いくつかの例では、例えば、複数の用量が、それぞれ少なくとも１０億（又は少なくとも１００億）個の肝細胞の少なくとも１０個の用量を含む場合、そのような方法は、少なくとも１０個の用量で２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０体の別個の対象を処置することを含み得る。いくつかの例では、例えば、複数の用量が、それぞれ少なくとも１０億（又は少なくとも１００億）個の肝細胞の少なくとも１００個の用量を含む場合、そのような方法は、少なくとも１００個の用量で少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００体の別個の対象を処置することを含み得る。そのような用量は、対象の症状を処置するために、同じ症状を有する複数の対象並びに異なる症状を有する複数の対象を含む、それを必要とする対象に投与され得る。したがって、本明細書に記載の方法を用いることにより、治療を必要とする複数の対象、場合によっては多数の対象が、単一のヒトドナー肝臓から収集された細胞の集団に由来し、増殖させられた、遺伝子改変された肝細胞を用いて処置され得る。
上記に要約したように、肝細胞及び／又は肝前駆細胞の遺伝子改変は、遺伝子産物をコードする導入遺伝子の機能的組み込みを含み得る。本質的に、任意のコードされた遺伝子産物が使用され得る。コードされた遺伝子産物は、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ラット、マウスなど）若しくは非哺乳動物タンパク質などの原核生物若しくは真核生物タンパク質、タンパク質フラグメント、ペプチド、合成タンパク質、融合タンパク質などを含む、タンパク質の組換えバージョン、又は非コード核酸などであり得る。
いくつかの例では、細胞集団の肝細胞及び／又は肝前駆細胞は、例えば、Ｔ細胞阻害タンパク質、ＮＫ細胞阻害タンパク質などを含む、１つ以上の免疫阻害タンパク質を発現するように遺伝子改変され得る。例えば、いくつかの例では、肝細胞及び／又は肝前駆細胞は、ＮＫ細胞デコイ受容体である遺伝子産物をコードする導入遺伝子を含むように遺伝子改変され得る。「ＮＫ細胞デコイ受容体」という用語は、本明細書で使用される場合、一般に、細胞の表面上に発現された場合に、例えば、ＮＫ阻害受容体（例えば、ＫＩＲ、ＨＬＡ－ｃｌ Ｉ特異的受容体、ＮＫＧ２阻害受容体（例えば、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａヘテロ二量体、ＮＫＧ２Ｂ受容体）、ＬＩＲ－１、チェックポイント受容体、ＳＩＲＰα、ＰＤ－１（ＣＤ２７９）、Ｓｉｇｌｅｃ－７（ＣＤ３２８）、ＩＲＰ６０（ＣＤ３００ａ）、Ｔａｃｔｉｌｅ（ＣＤ９６）、ＩＬ１Ｒ８、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＮＫＧ２Ａ／ＫＬＲＤ１（ＣＤ１５９ａ／ＣＤ９４）、ＫＩＲ２ＤＬ１（ＣＤ１５８ａ）、ＫＩＲ２ＤＬ２／３（ＣＤ１５８ｂ）、（ＣＤ１５８ｄ）ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５（ＣＤ１５８ｆ）、ＫＩＲ３ＤＬ１（ＣＤ１５８ｅ１）、ＫＩＲ３ＤＬ２（ＣＤ１５８ｋ）、ＩＬＴ２／ＬＩＲ－１（ＣＤ８５Ｊ）、ＬＡＧ－３（ＣＤ２２３）など）に対するリガンドとして働くことによって、ＮＫ細胞による死滅からの保護を提供する、哺乳動物（例えば、ヒト）タンパク質受容体又はその一部、組換え若しくは合成受容体又はその一部などを指す。ＮＫ細胞阻害受容体は、ＨＬＡ特異的又は非ＨＬＡ特異的であり得、したがって、ＮＫ細胞デコイ受容体は、ＨＬＡ由来ポリペプチド及び非ＨＬＡ由来ポリペプチドの両方を含む。
有用なＮＫ細胞デコイ受容体の非限定的な例としては、例えば、ＨＬＡクラスＩタンパク質及びそのフラグメント（例えば、ＨＬＡクラス１ａタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ）及びそのフラグメント、ＨＬＡクラス１ｂタンパク質（ＨＬＡ－Ｅ、－Ｆ、－Ｇ、－Ｈ）及びそのフラグメント）、合成ＨＬＡクラスＩタンパク質融合体（例えば、ＨＬＡクラス１ａ融合体、ＨＬＡクラス１ｂ融合体、ＨＬＡクラス１ａ／１ｂ融合体などを含む）、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）、ＰＤ－Ｌ２（ＣＤ２７３）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ＩＬ－３７、Ｇａｌ－９、ＰｔｄＳｅｒ、ＨＭＧＢ１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｃ１、ＨＬＡ－Ｃ２、ＨＬＡ－Ａ－Ｂｗ４、ＨＬＡ－Ｂ－Ｂｗ４、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＭＨＣ－Ｉタンパク質、ＭＨＣ－２タンパク質、ＣＤ８０及びＣＤ８６（ＣＴＬＡ－４）、ＬＳＥＣｔｉｎ（ＬＡＧ３）、ＣＤ１１２（ＴＩＧＩＴ）、ＣＸＡＤＲ（ＪＡＭＬ／ＡＭＩＣＡ１）、ＨＶＥＭ（ＢＴＬＡ）などが挙げられるが、これらに限定されない。有用なＨＬＡ遺伝子、対立遺伝子、及びそれらのタンパク質としては、例えば、Ｍａｒｓｈ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ７５：２９１－４５５に記載されるものが挙げられ、この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの例では、有用なＮＫ細胞デコイ受容体は、例えば、本明細書に記載される例示的なＮＫ細胞デコイ受容体タンパク質の、一部若しくはフラグメントのみを含み得るか、又は２つ以上のタンパク質及び／若しくはタンパク質フラグメントの融合体、例えば、本明細書に記載される２つ以上の例示的なＮＫ細胞デコイ受容体タンパク質及び／若しくはそのフラグメントの融合体を含み得る。
いくつかの例では、有用なＮＫ細胞デコイ受容体は、例えば、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、若しくはＨＬＡ－Ｈのうちの１つ以上又はその１つ以上の部分に直接又は間接的に融合されたβ２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）タンパク質又はその部分を含むＨＬＡクラス１ｂ融合タンパク質を含み得る。有用なＨＬＡクラス１ｂ融合タンパク質は、ペプチド抗原、任意選択で、例えば、切断時に融合タンパク質のペプチド結合クレフトを占有することができる、切断可能なペプチド抗原、を含んでもよく、又は含まなくてもよい。ＨＬＡクラス１ｂ融合タンパク質に含まれ得るＢ２Ｍ及び／又はＨＬＡクラスＩｂタンパク質の有用な部分としては、例えば、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、シグナルペプチド、シグナル配列、α１ドメイン、α２ドメイン、α３ドメイン、α鎖などが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。いくつかの例では、ＨＬＡクラス１ｂ融合タンパク質は、例えば、１つ以上のリンカー部分など（例えば、合成リンカーなど（例えば、グリシンリンカー、グリシン－セリンリンカーなど））の１つ以上の非ＨＬＡ及び／又は非Ｂ２Ｍ部分（すなわち、ＨＬＡタンパク質及び／又はＢ２Ｍタンパク質に由来しない部分）などを含み得る。
以下は、種々のＮＫ細胞デコイ受容体において、単独で又は組み合わせて、全体的に又は部分的に有用なタンパク質の非限定的な例として提供される。例示的なヒトＢ２Ｍ配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ：Ｐ６１７６９；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００４０３９．１）は、配列番号０３２である。
例示的なヒトＨＬＡ－Ｅ配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ：Ｐ１３７４７；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００５５０７．３）は、配列番号０３３である。
例示的なヒトＨＬＡ－Ｇ配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ：Ｐ１７６９３；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００２１１８．１）は、配列番号０３４である。
いくつかの例では、有用なＢ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合体は、例えば、ＨＬＡ－Ｇシグナル配列（例えば、配列番号０３５などであるが、これに限定されない）を任意選択で有する、例えば、ＧＳリンカーを介して、ＨＬＡ－Ｅフラグメントに融合した完全長又は部分長Ｂ２Ｍを含む。
いくつかの例では、有用なＢ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合体は、配列番号０３６（そのコード配列は、本明細書において「Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合体」とも称される）などであるがこれに限定されない、ＨＬＡ－Ｅフラグメントにリンカーを介して連結された完全長又は部分長Ｂ２Ｍ配列にリンカーを介して連結された切断可能なＨＬＡ－Ｇペプチドを任意選択で有する、シグナル配列（例えば、任意選択でＢ２Ｍシグナル配列）を含み得る。
容易に明らかであるように、他の成分又は代替成分（例えば、リンカー、シグナル配列、ペプチド抗原配列など）を含むか又は含まない、完全長又は部分長のＨＬＡクラスＩタンパク質配列並びに完全長又は部分長Ｂ２Ｍ配列の他の構成が作製され、ＨＬＡクラスＩ、クラス１ｂ、ＨＬＡ－Ｅ－Ｂ２Ｍ、及びＨＬＡ－Ｅ／Ｇ－Ｂ２Ｍ融合体などにおいて使用され得る。いくつかの例では、有用なタンパク質、融合体、配列、それらの部分などは、米国特許出願公開第２０１４０１３４１９５（Ａ１）号に記載されているものを含み得、この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
例示的なヒトＣＤ４７（ｈＣＤ４７）配列は、配列番号０３７である。
例示的な短縮型ｈＣＤ４７配列は、配列番号０３８である。
いくつかの例では、容易に理解されるように、本明細書に記載される配列などであるがこれらに限定されないアミノ酸及び核酸配列を含む有用な配列は、記載されるように使用され得るか、又は様々であり得、例えば、１つ以上の置換、欠失、挿入、及び／若しくは短縮化、又は他の改変を含み得る。例えば、限定されないが、本明細書に記載されるアミノ酸配列などのアミノ酸配列は、少なくとも１つ、１つ、少なくとも２つ、２つ以下、少なくとも３つ、３つ以下、少なくとも４つ、４つ以下、少なくとも５つ、５つ以下、少なくとも６つ、６つ以下、少なくとも７つ、７つ以下、少なくとも８つ、８つ以下、少なくとも９つ、９つ以下、少なくとも１０個、１０個以下、又は１０個を超えるアミノ酸置換を含み得る。いくつかの例では、核酸配列は、同じアミノ酸配列をコードする代替配列（例えば、コドン最適化配列など）を有し得る。いくつかの例では、核酸配列の１つ以上の塩基又は１つ以上のコドンは、例えば、得られるコードされたポリペプチドにおいて、少なくとも１つ、１つ、少なくとも２つ、２つ以下、少なくとも３つ、３つ以下、少なくとも４つ、４つ以下、少なくとも５つ、５つ以下、少なくとも６つ、６つ以下、少なくとも７つ、７つ以下、少なくとも８つ、８つ以下、少なくとも９つ、９つ以下、少なくとも１０個、１０個以下、又は１０個を超えるアミノ酸置換など、１つ以上の置換を導入するように改変され得る。いくつかの例では、限定されないが、本明細書に記載されるものなどのアミノ酸配列及び核酸配列を含む、有用な配列は、本明細書に記載される配列と１００％の配列同一性を共有し得る。いくつかの例では、本明細書に記載の配列などであるがこれらに限定されないアミノ酸配列及び核酸配列を含む、有用な配列は、本明細書に記載の配列と１００％未満の配列同一性を有し得、例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列又は核酸配列を含むがこれらに限定されない配列との少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８９％、少なくとも８８％、少なくとも８７％、少なくとも８６％、少なくとも８５％、少なくとも８４％、少なくとも８３％、少なくとも８２％、少なくとも８１％、少なくとも８０％、少なくとも７９％、少なくとも７８％、少なくとも７７％、少なくとも７６％、少なくとも７５％、少なくとも７４％、少なくとも７３％、少なくとも７２％、少なくとも７１％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも３５％、又は少なくとも３０％の配列同一性を含む。
導入遺伝子上に存在する遺伝子産物をコードする有用な核酸は様々であり、例えば、宿主細胞又は生物における欠陥のある遺伝子の修正、細胞における異種遺伝子産物のコード及び／又は発現、細胞における内因性遺伝子産物の１つ以上の更なるコピーのコード及び／又は発現、細胞における遺伝子又は遺伝子産物の発現の阻害などを含む、様々な機能を提供し得る。有用な核酸としては、例えば、発現カセット、組換えｍＲＮＡ、組換えベクターゲノム（例えば、組換えウイルスゲノムなど）、組換えプラスミド、ミニサークルプラスミド、ミニ遺伝子、マイクロ遺伝子、人工染色体、干渉核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）などが挙げられるが、これらに限定されない。
例えば、機能的に組み込まれた導入遺伝子の、有用な遺伝子産物としては、例えば、非コード核酸、並びに１つ以上のタンパク質及び／又はペプチドをコードする核酸が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、導入遺伝子又はベクターのコード領域の遺伝子産物は、例えば、ヌクレアーゼ、ＤＮＡ塩基エディター、ＲＮＡエディターなどの酵素をコードする核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、遺伝子産物をコードする配列は、単独で又は他のペイロードエレメントと共に、例えば、マイクロＲＮＡ（すなわち、ｍｉＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡなど）などの非コード核酸を含み得る。
いくつかの例では、肝細胞及び／又は肝前駆細胞を含む細胞集団は、標的遺伝子座において編集され得る。本質的に、例えば、肝臓関連遺伝子及び／又はその調節エレメントを含む遺伝子座、免疫関連遺伝子及び／又はその調節エレメントを含む遺伝子座などを含むがこれらに限定されない任意の遺伝子座が、標的とされ得る。標的遺伝子座に導入される編集は様々であり得、有用な編集としては、例えば、欠失、挿入、置換、フレームシフトなどが挙げられるが、これらに限定されない。
有用な欠失の非限定的な例としては、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれより多い塩基の欠失；遺伝子の１つ以上、２つ以上、若しくは３つ以上の機能ドメイン、及び／又はその部分の欠失；遺伝子の、１つ以上、２つ以上、若しくは３つ以上のエクソン、及び／又はその部分の欠失、全て、１つを除く全て、２つを除く全て、若しくは３つを除く全てのエクソン、及び／又はその部分の欠失；遺伝子の調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）の欠失などが挙げられる。有用な挿入の非限定的な例としては、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれより多い塩基の挿入；遺伝子の１つ以上、２つ以上、若しくは３つ以上の機能ドメイン、及び／又はその部分の挿入；遺伝子の、１つ以上、２つ以上、若しくは３つ以上のエクソン、及び／又はその部分の挿入、全て、１つを除く全て、２つを除く全て、若しくは３つを除く全てのエクソン、及び／又はその部分の挿入；遺伝子の調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）の挿入などが挙げられる。導入される欠失及び／又は挿入のサイズは様々であり、１塩基～５００塩基以上の範囲であり得、例えば、１～４００塩基、１～３５０塩基、１～３００塩基、１～２５０塩基、１～２００塩基、１～１５０塩基、１～１００塩基、１～５０塩基、１０～４００塩基、１０～３５０塩基、１０～３００塩基、１０～２５０塩基、１０～２００塩基、１０～１５０塩基、１０～１００塩基、１０～５０塩基、２５～４００塩基、２５～３５０塩基、２５～３００塩基、２５～２５０塩基、２５～２００塩基、２５～１５０塩基、２５～１００塩基、２５～５０塩基、５０～４００塩基、５０～３５０塩基、５０～３００塩基、５０～２５０塩基、５０～２００塩基、５０～１５０塩基、５０～１００塩基、１００～４００塩基、１００～３５０塩基、１００～３００塩基、１００～２５０塩基、１００～２００塩基、１００～５００塩基、２００～５００塩基、３００～５００塩基、４００～５００塩基、少なくとも１塩基、少なくとも２塩基、少なくとも１０塩基、少なくとも２５塩基、少なくとも５０塩基、少なくとも７５塩基、少なくとも１００塩基、少なくとも１５０塩基、少なくとも２００塩基、５００塩基以下、４００塩基以下、３５０塩基以下、３００塩基以下、２５０塩基以下、２００塩基以下、１５０塩基以下、１００塩基以下、又は５０塩基以下を含むがこれらに限定されない。
有用な置換の非限定的な例としては、未成熟終止コドンを導入する置換、終止コドンを破壊する置換、アミノ酸変化をもたらす置換などが挙げられる。核酸レベルでの１つ又は複数の置換（例えば、１、２、又は３塩基の置換）を用いて、所望によりポリペプチドレベルでの任意のアミノ酸からアミノ酸への置換を本質的に導入することができる。
いくつかの例では、有用な編集は、内因性遺伝子の全部若しくは一部を破壊若しくは欠失させ得、又はそうでなければ、例えば、１つ以上の免疫関連遺伝子などであるがこれらに限定されない、１つ以上の内因性遺伝子、若しくは免疫関連タンパク質など、そのような遺伝子のコードされた産物を非機能的にし得る。遺伝子及び／又はコードされた産物を非機能的にする、遺伝子又はその一部のこのような欠失は、ノックアウトと呼ばれ得る。いくつかの例では、遺伝子又はその遺伝子産物は、例えば、フレームシフトを引き起こすか、又は誤って折り畳まれたタンパク質若しくはそうでなければ非機能的タンパク質を生成する、挿入の導入によって、非機能的にされ得る。
いくつかの例では、有用な編集は、例えば、単一遺伝子性疾患の機能不全遺伝子を含む、機能不全遺伝子を修正し得る。いくつかの例では、単一遺伝子性疾患は、肝臓関連単一遺伝子性疾患（すなわち、肝臓関連遺伝子又は肝細胞関連遺伝子である機能不全遺伝子から生じる単一遺伝子性疾患）である。いくつかの例では、単一遺伝子性疾患は、非肝臓関連単一遺伝子性疾患（すなわち、肝臓関連遺伝子でも肝細胞関連遺伝子でもない機能不全遺伝子から生じる単一遺伝子性疾患）である。いくつかの例では、編集は、欠陥のある内因性遺伝子座の修正編集である。いくつかの例では、編集は、欠陥のある内因性遺伝子座の修正編集ではない。
いくつかの例では、編集は、編集が肝細胞及び／又は肝機能と関連しない遺伝子座にあるように、非肝細胞関連及び／又は非肝臓関連遺伝子座に導入され得る。本明細書で使用される場合、「肝細胞機能に関連する遺伝子座」若しくは「肝細胞遺伝子座」又は同様の用語は、遺伝子座が、例えば、肝臓代謝（例えば、肝細胞代謝）、アンモニア代謝（例えば、尿素回路を含む）、アミノ酸代謝、アミノ酸生合成、アミノ酸異化、解毒、肝臓（例えば、肝細胞）タンパク質（例えば、アルブミン、フィブリノーゲン、プロトロンビン、凝固因子（例えば、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、及び第ＸＩＩ因子を含む）、プロテインＣ、プロテインＳ、抗トロンビン、リポタンパク質、セルロプラスミン、トランスフェリン、補体タンパク質、肝細胞プロテオーム及び／又はセクレトームのタンパク質（例えば、Ｆｒａｎｋｏ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ．（２０１９）１１（８）：１７９５に記載されるものなどであり、この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））など、肝細胞機能及び／又は主に肝臓で行われる機能に関連する遺伝子のコード領域（例えば、エクソン）又は非コードレギュレーター領域（例えば、イントロン、プロモーター、エンハンサーなど）を含むことを意味する。
いくつかの例では、複数の遺伝子編集が単一の細胞に導入され得る。例えば、いくつかの例では、細胞は、２つ以上の欠失、挿入、置換、又はそれらのいくつかの組み合わせを含み得、例えば、細胞が２つ、３つ、４つ、又は５つのそのような編集を含む場合を含む。例えば、単一の遺伝子における複数の編集、単一のタンパク質の２つ以上のポリペプチド又は鎖における編集、ファミリー又はパスウェイの２つ以上の異なるタンパク質における編集、２つ以上の機能的に関連するタンパク質（例えば、２つ以上の免疫関連タンパク質、２つ以上の肝臓関連タンパク質など）における編集などを含む、任意の有用な編集の組み合わせが導入され得る。
複数の編集が導入され、かつ／又は細胞が複数の方法で遺伝子改変される場合（例えば、内因性遺伝子座における編集の導入及び導入遺伝子の機能的組み込み、若しくは複数の内因性遺伝子座における複数の編集の導入、又はそれらの組み合わせによってなど）、そのような複数の編集／改変は、同時に、及び／又は任意の好都合かつ適切な順序で実行され得る。例えば、いくつかの例では、細胞集団は、２つの異なる遺伝子改変を行うために、同時に、又は本質的に同時に試薬と接触させられ得る。いくつかの例では、細胞集団は、第１の改変を行うために第１の試薬又は試薬のセットと接触させられ、その後、第２の改変を行うために第２の試薬又は試薬のセットと接触させられる。いくつかの例では、ステップが連続して行われる場合、例えば、単離、精製、富化、細胞培養、増殖、解析、凍結保存などを含むがこれらに限定されない１つ以上の介入行為が行われ得る。いくつかの例では、例えば、単離、精製、富化、細胞培養、増殖、解析、凍結保存などの介入行為は行われない。
例えば、編集試薬又はそのような薬剤をコードする核酸のトランスフェクション、編集試薬の形質導入、編集試薬のヌクレオフェクション及び／又はエレクトロポレーションなどを含むがこれらに限定されない、細胞集団を１つ以上の編集試薬と接触させる様々な好都合な方法が使用され得る。いくつかの例では、ベクター、例えば、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターが使用され得る。いくつかの例では、ベクターの成分は、核酸、タンパク質、又はそれらの組み合わせを含み得る。例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ベクターを含むがこれらに限定されない、任意の好都合なウイルス又は非ウイルスベクターが使用され得る。
ベクターは、所望の編集を実行するために必要な成分の全て、又は全て未満を含有するように構成され得る。例えば、いくつかの例では、ベクターは、標的遺伝子座で編集を行うのに十分な全ての成分を含み得る。いくつかの例では、ベクターは、編集を行うために必要とされる成分の全て未満を含み得、残りの成分は、他の手段、例えば、別の異なるベクター、形質導入、トランスフェクションなどによって送達され得る。いくつかの例では、標的化システムの成分、例えば、核酸及びタンパク質成分は、このような成分が送達ベクター内で予め複合体化される場合を含めて、送達の前に予め複合体化され得る。例えば、いくつかの例では、編集システムの核酸（例えば、ｇＲＮＡなど）及びタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ又は塩基編集タンパク質など）編集試薬は、編集用の細胞集団に送達するためのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）として複合体化され得る。
本明細書に記載される編集の１つ以上を導入するために、任意の好都合かつ適切な遺伝子編集システムが使用され得る。所望の編集の部位特異的導入の方法は様々であり、例えば、１つ以上の部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、ＺＦＮなど）の使用によって、１つ以上の部位特異的切断事象を導入することを含み得る。部位特異的切断は、適用可能な場合、二本鎖及び／又は一本鎖切断を含み得る。いくつかの例では、部位特異的切断の後に、部位特異的ヌクレアーゼによって切断された部位における特異的修復事象が続いて、例えば、所望の編集（例えば、置換、挿入、欠失など）を導入する。特異的修復のそのような方法は、例えば、修復をガイドするための相同性領域を含む核酸の存在下での、例えば、相同組換え（相同組換え修復（ＨＤＲ）を含む）を含み得る。いくつかの例では、部位特異的切断は、例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などの部位特異的切断に続く細胞プロセスを介して、例えば、特異的修復事象を用いることなく、遺伝子破壊及び／又はノックアウトを導入するために用いられ得る。いくつかの例では、所望の編集の部位特異的導入は、二本鎖切断事象を導入しない塩基編集システムを使用し得、例えば、限定されないが、ＣＲＩＳＰＲタンパク質ガイドに基づく編集システムなど、例えば、シトシン塩基エディター（ＣＢＥ）及びアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）システムを含むｄＣａｓ９－デアミナーゼ融合タンパク質システムなどを使用し得る。いくつかの例では、有用な塩基編集システムは、例えば、ホスホジエステル核酸骨格の切断を伴わずに、単一の塩基変化を導入する。
様々な編集組成物が使用され得、そのような組成物は、例えば、使用される編集システム、所望の編集のタイプ、１つ又は複数の標的遺伝子座の配列などに基づいて、変化する。有用な編集組成物としては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集組成物（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、又はＣａｓ９タンパク質をコードする核酸、及びｇＲＮＡ若しくはｓｇＲＮＡ又はｇＲＮＡ若しくはｓｇＲＮＡをコードする核酸を含む）、ＴＡＬＥＮ編集組成物（例えば、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ若しくはＴＡＬＥＮヌクレアーゼ対、又はＴＡＬＥＮヌクレアーゼ若しくはＴＡＬＥＮヌクレアーゼ対をコードする核酸を含む）、ＺＦＮ編集組成物（例えば、ＺＦＮヌクレアーゼ若しくはＺＦＮヌクレアーゼ対、又はＺＦＮヌクレアーゼ若しくはＺＦＮヌクレアーゼ対をコードする核酸を含む）、塩基を編集する編集組成物（例えば、ＣＲＩＳＰＲタンパク質ガイド型塩基編集タンパク質、又はＣＲＩＳＰＲタンパク質ガイド型塩基編集タンパク質をコードする核酸、及びｇＲＮＡ若しくはｓｇＲＮＡ又はｇＲＮＡ若しくはｓｇＲＮＡをコードする核酸を含む）などが挙げられ得る。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベースの編集組成物、及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベースの編集組成物を使用する方法は、より詳細に説明される。しかしながら、そのような説明並びに組成物及び方法は、そのように限定されず、そのような説明の要素、標的、及び／又は概念が、適宜、他の編集システムの使用に対応して適合又は適用されてもよいことは容易に理解されるであろう。
いくつかの例では、有用な編集組成物は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質など）又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、「ｇＲＮＡ」という用語は、一般に、不適切でない限り、及び／又は別様に示されない限り、二成分ガイドシステム（例えば、２つのｇＲＮＡ）並びに単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）システムのいずれかを包含する。いくつかの事例では、ｇＲＮＡ又は複数のｇＲＮＡは、本明細書に記載される所望の遺伝子座又はその１つ以上の要素（遺伝子座に存在する遺伝子のより多くのエクソンのうちの１つなど）を標的とするように構成及び使用され得る。例えば、いくつかの例では、ｇＲＮＡ又は複数のｇＲＮＡは、Ｂ２Ｍ遺伝子座又はその１つ以上の要素（例えば、Ｂ２Ｍ遺伝子座の１つ以上のエクソン（例えば、エクソン１、エクソン２、又はエクソン３の１つ以上）など）を標的とするように構成及び使用され得る。
いくつかの例では、本編集方法は、天然及び操作されたＣａｓ９ヌクレアーゼを含むＣａｓ９ヌクレアーゼ、並びにそれをコードする核酸配列の使用を含み得る。有用なＣａｓ９ヌクレアーゼとしては、例えば、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９及びそのバリアント、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９及びそのバリアント、アクチノミセス・ネスルンディＣａｓ９及びそのバリアントが挙げられるが、これらに限定されず、Ｃａｓ９ヌクレアーゼとしてはまた、ＰＣＴ国際公開第２０１３／１７６７７２号及び同第２０１５／１０３１５３号において論じられているもの、並びに例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ９：４６７－４７７、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｄｉｒｅｃｔ ６：３８、Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）ＰＬＯＳ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １：ｅ６０及びＣｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：７２６－７３７においてレビューされているものが挙げられ、これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの例では、例えば、Ｃｐｆ１又はＣｐｆ１バリアントを含むがこれらに限定されない、非Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（又はその操作されたバリアント）が使用され得る。
Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、遺伝子編集のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにおいて使用され、改変されたＣａｓ９タンパク質（例えば、追加の機能性を有するか又は有さない、Ｃａｓ９ニッカーゼ及びｄＣａｓ９タンパク質）は、様々な編集方法論において使用され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムでは、２つの別個のガイド成分（すなわち、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）又は標的配列を含有するキメラＲＮＡ（すなわち、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを集合的に含有する、「ガイドＲＮＡ」又は「単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）」）が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをガイドして、ｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡによって定義される特定の標的配列でＤＮＡを切断する。使用される場合、ＨＤＲによる標的化及び置換の特異性、効率及び汎用性は、様々な相同組換え修復戦略及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例えば、Ｇｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９６（４）９６１－９７１；Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ．３３：５４３－５４８；Ｈｉｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：８８４１；Ｆａｒｂｏｕｄ ＆ Ｍｅｙｅｒ（２０１５）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９：９５９－９７１；Ｍｅｒｋｅｒｔ ＆ Ｍａｒｔｉｎ（２０１６）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６（２）：３７７－３８６を参照し、これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）の併用によって大幅に改善される。
ＣＲＩＳＰＲシステムは、一部には、宿主ゲノム内の必要な配列標的化エレメントの小さいサイズ及び高い頻度により、遺伝子編集において有意な汎用性を提供する。ＣＲＩＳＰＲガイド型Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在を必要とし、その配列は、Ｃａｓ９が由来する細菌種に依存するが（例えば化膿レンサ球菌の場合、ＰＡＭ配列は「ＮＧＧ」である）、そのような配列は、様々な標的核酸全体にわたって共通である。標的配列のすぐ下流のＰＡＭ配列は、ガイドＲＮＡの一部ではないが、ＤＮＡ鎖を切断するために必須である。合成Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、新規なＰＡＭ認識を用いて生成されていて、標的化の汎用性を更に増大させており、本明細書に記載される方法において使用され得る。標的核酸の一方の鎖のみを切断するＣａｓ９ニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ）など）、並びに付加された融合タンパク質によって追加の酵素活性が加えられたエンドヌクレアーゼ欠損（すなわち、「死んだ」）ｄＣａｓ９バリアントも開発されている。
いくつかの実施形態において、肝細胞及び／又は肝前駆細胞の免疫関連遺伝子座は、編集のために、例えば、編集された肝細胞及び／又は肝前駆細胞を低免疫原性にするために、標的化され得る。例えば、いくつかの例では、ＨＬＡクラスＩタンパク質若しくは関連タンパク質（例えば、ＨＬＡクラス１ａ又は関連タンパク質）をコードする１つ以上の遺伝子座、ＨＬＡクラスＩＩタンパク質若しくは関連タンパク質（例えば、「ＨＬＡ－Ｄ」タンパク質、ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子の発現を引き起こす転写因子及び／又はコアクチベーターなど）をコードする１つ以上の遺伝子座、又はそれらの組み合わせが標的化され得る。ＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩタンパク質にこのような破壊を導入することによって、肝細胞及び／又は肝前駆細胞は、本明細書に示されるように、低免疫原性にされ得る。例えば、そのような破壊は、例えば、リンパ球など（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などの）の免疫細胞による編集された肝細胞の死滅の低減をもたらし得る。標的化に有用な遺伝子座としては、例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、所望の編集は、例えば、例えばＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、及び－Ｃ破壊をもたらす１つ以上の編集を導入すること、並びに／又は例えばＢ２ＭなどのＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、及び－Ｃによって共有される構成要素の１つ以上の編集を導入することによって、特定のクラスの全ての遺伝子を破壊し得る。同様の戦略が、例えば、ＨＬＡクラスＩＩタンパク質など、他の標的及び遺伝子座に適合させられ、使用され得る。有用なＨＬＡ遺伝子、対立遺伝子、遺伝子座、及びそれらのタンパク質としては、例えば、Ｍａｒｓｈ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ７５：２９１－４５５に記載されるものが挙げられ、この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの例では、本明細書に記載されるＢ２Ｍ遺伝子座を編集するために使用され得る有用なＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ベースのＢ２Ｍ標的化配列及び対応するＰＡＭ配列としては、例えば、配列ＧＧＣＣＡＣＧＧＡＧＣＧＡＧＡＣＡＴＣＴ（配列番号０３９）を有するＢ２Ｍエクソン１標的化配列「Ｂ２Ｍ＿Ｅｘ１＿７」（ＰＡＭ、ＣＧＧ）、配列ＣＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＡＡＧＧＣＣＡ（配列番号０４０）を有するＢ２Ｍエクソン１標的化配列「Ｂ２Ｍ＿Ｅｘ１＿３」（ＰＡＭ、ＣＧＧ）、配列ＡＡＧＴＣＡＡＣＴＴＣＡＡＴＧＴＣＧＧＡ（配列番号０４１）を有するＢ２Ｍエクソン２標的化配列「Ｂ２Ｍ＿Ｅｘ２＿４」（ＰＡＭ、ＴＧＧ）などが挙げられる。
いくつかの例では、編集組成物は、１つ以上のＨＬＡクラスＩタンパク質、１つ以上のＨＬＡクラスＩＩタンパク質、及び／又は１つ以上の関連タンパク質（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡクラスＩ及び／若しくはＩＩ遺伝子若しくはタンパク質の発現を引き起こす転写因子、並びに／又はＨＬＡクラスＩ及び／若しくはＩＩ遺伝子若しくはタンパク質の発現を引き起こすコアクチベーターなどであるがこれらに限定されない）の産生及び／又は機能の破壊をもたらす、ＨＬＡクラスＩ標的化組成物及び／又はＨＬＡクラスＩＩ標的化組成物であり得る。
そのような編集組成物は、所望の編集を生成するのに十分な条件下で細胞集団と接触させられ得、例えば、そのような条件が、細胞の、導入、送達、トランスフェクション、形質導入、標的化、酵素活性、及び／又は修復（適用可能な場合）、並びに生存及び必要な生物活性に十分である場合を含む。所望の編集を生成するのに十分な条件としては、例えば、編集反応の助けとなる好適な培養培地における好適な環境条件（例えば、温度、ガス交換など）での維持などを含む、例えば、好適な培養条件が挙げられ得るが、これらに限定されない。加えて、編集反応は、編集反応が起こり、所望の完了レベルに達するのに十分な時間にわたって行われ得、そのような十分な時間は様々である。また、いくつかの例では、例えば、編集反応又はその構成要素が細胞集団に対して１つ以上の有害な影響（例えば、細胞生存率の低下、細胞脆弱性の増加など）を有し得る場合、編集試薬への曝露時間は最小限にされ得る。
いくつかの例では、遺伝子編集の方法は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の使用を含み得る。ＺＦＮは、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）に融合された配列非依存性Ｆｏｋｌヌクレアーゼドメインからなる。ＺＦＰは、それらの配列特異性を変化させるように変更され得る。標的化されたｄｓＤＮＡの切断は、２つのＺＦＮ（左及び右と称される）の、正しい配向及び間隔を有する反対鎖上の隣接する半部位への結合を伴い、したがって、Ｆｏｋｌ二量体を形成する。二量体化は、ＺＦＮ特異性を有意に増加させる。３又は４フィンガーＺＦＰは、ＺＦＮ当たり約９若しくは１２塩基、又はＺＦＮ対について約１８若しくは２４塩基を標的とする。相同組換えの標的化及び置換の特異性、効率及び汎用性は、様々な相同組換え修復戦略及びＺＦＮ（例えば、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ．４３５（７０４２）：６４６－５、Ｂｅｕｍｅｒ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１７２（４）：２３９１－２４０３、Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ（２００８）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（６）：６９５－７０１、Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（７）：８０８－８１６、Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７（９）：８５１－７を参照し、これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）の併用によって大幅に改善される。一般に、１つのＺＦＮ部位は、アセンブリ方法に応じて、ランダムゲノム配列の１２５～５００ｂｐ毎に見出すことができる。適切なＺＦＮ標的化部位を同定するための方法としては、例えば、Ｃｒａｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．１２：１５２に記載されるような、コンピュータ介在方法が挙げられ、この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの例では、遺伝子編集の方法は、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の使用を含み得る。ＺＦＮヌクレアーゼと原理的に同様であるが、ＴＡＬＥＮは、ＺＮＦとは異なり、単一ヌクレオチドを個々に認識する転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質に融合された配列非依存性Ｆｏｋｌヌクレアーゼドメインを利用する。ＴＡＬＥは一般に、ＤＮＡ結合タンデム反復の特徴的な中央ドメイン、核局在化シグナル、及びＣ末端転写活性化ドメインを含有する。典型的な反復は、３３～３５アミノ酸長であり、「反復可変二残基」（ＲＶＤ）として知られる、１２位及び１３位における２つの超可変アミノ酸残基を含有する。ＲＶＤは、１つの特定のＤＮＡ塩基対を認識することができ、連続した反復は、連続したＤＮＡ配列に一致する。標的ＤＮＡ特異性は、ＲＶＤの単純なコードに基づいており、したがって、標的ＤＮＡ配列の予測を可能にする。所望の標的化に応じて、ネイティブＴＡＬＥ又は操作された／改変されたＴＡＬＥがＴＡＬＥＮに使用され得る。ＴＡＬＥＮは、ほとんど任意の配列ストレッチ用に設計することができる。ＤＮＡ認識部位の各５’末端におけるチミンの存在のみが必要とされる。相同組換えの標的化及び置換の特異性、効率及び汎用性は、様々な相同組換え修復戦略及びＴＡＬＥＮ（例えば、Ｚｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１０：３２９－３３１、Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：１０４８２、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．３９：２０９－２１５、Ｂｅｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ．４９１：１１４－１１８、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０－５３２、Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．１２：２３８－２５１、Ｗｅｆｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，１１０：３７８２－３７８７を参照し、これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）の併用によって大幅に改善される。
いくつかの例では、遺伝子編集の方法は、例えば、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質を含む融合タンパク質、核酸塩基エディター及びｇＲＮＡなどを用いる塩基エディターシステムを含むがこれらに限定されない、塩基エディターシステムの使用を含み得る。塩基編集は、一般に、ＨＤＲ及び／又はＮＨＥＪに依存せず、一般に、ｄｓＤＮＡの両方の骨格上のホスホジエステル結合の切断をもたらすことも、それを必要とすることもない。したがって、ベースの編集は、いくつかの例では、二本鎖切断を引き起こさない、ＣａｓヌクレアーゼなどのＲＮＡガイド型（すなわち、「プログラム可能な」）ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ欠損又はヌクレアーゼ欠陥のＣａｓタンパク質など（例えば、ｄＣａｓ９又はＣａｓ９ニッカーゼなど））を使用し得る。塩基エディター及び塩基編集システム（塩基エディターをコードする核酸を含む）の有用な例としては、ＢＥ１、ＢＥ２、ＢＥ３（Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）；Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ（Ｎｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）；ＳａＢＥ３、ＢＥ３ ＰＡＭバリアント、ＢＥ３編集ウィンドウバリアント（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１７）；ＨＦ－ＢＥ３（Ｒｅｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）；ＢＥ４及びＢＥ４－Ｇａｍ；ＡＩＤ、ＣＤＡ１及びＡＰＯＢＥＣ３Ｇ ＢＥ３バリアント（Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）；ＢＥ４ｍａｘ、ＡｒｃＢｅ４ｍａｘ、ＡＢＥｍａｘ（Ｋｏｂｌａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）；アデニン塩基エディター（ＡＢＥ７．１０）（Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）；ＡＢＥ８（Ｒｉｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０２０）；ＡＢＥ８ｅ（Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０２０）；Ａ＆Ｃ－ＢＥｍａｘ（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０２０）；ＳＰＡＣＥ（Ｇｒｕｎｅｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０２０）などが挙げられるが、これらに限定されず、上記参照は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
有用な塩基エディターシステム及びその構成要素の非限定的な例としては、例えば、ＰＣＴ国際公開第２０２０２３６９３６（Ａ１）号、同第２０２０２３１８６３（Ａ１）号、同第２０２０１６８１３５（Ａ１）号、同第２０２０１６８１２２（Ａ１）号、同第２０２０１６８０８８（Ａ１）号、同第２０２０１６８１３２（Ａ９）号、同第２０２０１６８１３３（Ａ１）号、同第２０２０１６８０７５（Ａ９）号、同第２０２０１６８０５１（Ａ９）号、同第２０２０１６０５１４（Ａ１）号、同第２０２０１６０５１７（Ａ１）号、同第２０２０１５０５３４（Ａ９）号、同第２０２００５１５６２（Ａ３）号、同第２０２００５１５６２（Ａ３）号、同第２０２００２８８２３（Ａ１）号、同第２０１９２１７９４１（Ａ１）号、同第２０１９２１７９４２（Ａ１）号、及び同第２０１９２１７９４３（Ａ１）号、並びに米国特許出願公開第２０２００３９９６２６（Ａ１）号に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されず、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの例では、所望の編集の存在は、例えば、標的遺伝子座において編集が存在する（又は所望の欠失が存在しない）かどうかを試験するためのアッセイによって、破壊のために標的化された遺伝子座においてコードされる遺伝子産物が存在しないかどうか、導入された配列によってコードされる遺伝子産物が存在することなどを試験するためのアッセイによって、検証され得る。このようなアッセイを実施するための有用な方法としては、例えば、遺伝子座及び／又は遺伝子座でコードされるＲＮＡのＰＣＲ（例えば、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ｒｔ－ＰＣＲなど）に基づく方法、遺伝子座でコードされるタンパク質に対する抗体でプローブした細胞溶解物のウエスタンブロットに基づく方法、フローサイトメトリーに基づく方法、配列決定（例えば、単一細胞配列決定）などが挙げられるが、これらに限定されない。
例えば、導入遺伝子のもの、発現カセットのもの、編集組成物のもの、ベクターのものなど、他の有用な成分としては、プロモーター配列（例えば、構成的、組織特異的など）、シグナルペプチド配列、ポリ（Ａ）配列、ターミネーター、リボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位及び／又は遺伝子座制御領域が挙げられ得る。更に、複数の遺伝子産物は、例えば、自己切断２Ａペプチド又はＩＲＥＳ配列によって分離された１つのオープンリーディングフレーム中の個々の成分（導入遺伝子）を連結することによって、１つの核酸から発現され得る。
有用なプロモーターの例としては、例えば、ウイルス性シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期又は後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、最初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ＭＮＤ（骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、陰性対照領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーターなどが挙げられる。ある特定の実施形態において、プロモーターは誘導性であり得、そのため、１つ以上の誘導因子が存在する場合にのみウイルスゲノムの全部又は一部の転写が生じる。誘導因子としては、宿主細胞が培養される１つ以上の化合物又は生理学的条件、例えば、温度又はｐＨが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、プロモーターは構成的であり得る。いくつかの例では、プロモーターは、所望の細胞型又は組織において優先的な発現を引き起こし得、例えば、プロモーターは、細胞型特異的又は組織特異的であり得る。
いくつかの例では、導入遺伝子、発現カセット、ベクターなどは、シグナルペプチドをコードする配列を含み得る。シグナルペプチドは、タンパク質のＮ末端に位置する短いペプチドである。タンパク質局在化において機能するシグナルペプチドは、関連タンパク質を分泌経路に誘導し、タンパク質の分泌を促進するのに有用である。
レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターを含むベクターは、プロモーターなどのシス作用性エレメント、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲ及びそのエレメントを含む末端反復配列（ＬＴＲ）及び／又はそのエレメント、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）エレメント、ＤＮＡフラップ（ＦＬＡＰ）エレメント、エクスポートエレメント（例えば、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）など）、転写後調節エレメント（例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、Ｂ型肝炎ウイルス調節エレメント（ＨＰＲＥ）など）、ポリアデニル化部位、転写終結シグナル、インスレーターエレメント（例えば、β－グロビンインスレーター、例えば、ニワトリＨＳ４）などを含む様々なエレメントを含んでもよい（又は必要に応じて除外してもよい）。種々のベクター中に存在し得るか又は存在し得ない他のエレメントとしては、エンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化シグナル、更なる制限酵素部位、マルチクローニング部位、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、及びＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、及び自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグ、相同組換え修復（ＨＤＲ）において有用な相同性領域などが挙げられるが、これらに限定されない。
有用なＬＴＲとしては、例えば、Ｕ３領域、Ｒ領域及び／又はＵ５領域、並びにそれらの部分を含むＬＴＲが挙げられるが、これらに限定されない。ＬＴＲは、レトロウイルス遺伝子の発現（例えば、遺伝子転写物の促進、開始及びポリアデニル化）並びにウイルス複製のための機能を提供する。ＬＴＲは、転写制御エレメント、ポリアデニル化シグナル、並びにウイルスゲノムの複製及び組み込みに必要な配列を含む多数の調節シグナルを含み得る。Ｕ３領域は、エンハンサーエレメント及びプロモーターエレメントを含み得る。Ｕ５領域は、ポリアデニル化配列を含み得る。Ｒ（反復）領域は、一般に、Ｕ３及びＵ５領域に隣接している。Ｕ３、Ｒ及びＵ５領域から構成されるＬＴＲは、ウイルスゲノムの５’及び３’末端の両方に出現し得る。ウイルスゲノムは、ウイルスＲＮＡの粒子への効率的なパッケージング（例えば、Ｐｓｉ部位）などのために、ゲノムの逆転写において機能する５’ＬＴＲに隣接する配列（例えば、ｔＲＮＡプライマー結合部位）を含み得る。
有用なＬＴＲとしては、改変された５’ＬＴＲ及び／又は３’ＬＴＲが挙げられる。３’ＬＴＲの改変は、しばしば、ウイルスを複製欠損にすることによって、レンチウイルス系又はレトロウイルス系の安全性を改善するために行われる。本明細書で使用される場合、「複製欠損」という用語は、感染性ビリオンが産生されないように、完全で効果的な複製ができないウイルス（例えば、複製欠損レンチウイルス子孫）を指す。「複製コンピテント」という用語は、ウイルスのウイルス複製が感染性ビリオン（例えば、複製コンピテントレンチウイルス子孫）を産生することができるように、複製することができる野生型ウイルス又は突然変異ウイルスを指す。
いくつかの実施形態では、有用なベクターは、自己不活性化型であり得る。ベクターに関する「自己不活性化」（ＳＩＮ）という用語は、例えば、Ｕ３領域を含む右（３’）ＬＴＲエンハンサー－プロモーター領域が、ウイルス複製の第１ラウンド以降のウイルス転写を防止するように改変されている（例えば、欠失及び／又は置換によって）、複製欠損ベクター、例えば、レトロウイルス又はレンチウイルスベクターを指す。更なる実施形態では、３’ＬＴＲは、Ｕ５領域が、例えば、異種又は合成ポリ（Ａ）配列、１つ以上のインスレーターエレメント、及び／又は誘導性プロモーターで置き換えられるように改変され得る。ＬＴＲ、例えば、３’ＬＴＲ又は５’ＬＴＲへの言及が、改変されたＬＴＲ又はＬＴＲへの改変、例えば、３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、又は３’ＬＴＲ及び５’ＬＴＲの両方への改変を含み得ることは、当業者に容易に明らかである。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはＴＡＲエレメントを含み得る。「ＴＡＲ」という用語は、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）ＬＴＲのＲ領域に位置する「トランス活性化応答」遺伝子エレメントを指す。このエレメントは、レンチウイルストランス活性化因子（ｔａｔ）遺伝子エレメントと相互作用して、ウイルス複製を増強する。いくつかの実施形態では、ベクターは、例えば、５’ＬＴＲのＵ３領域が異種プロモーターによって置き換えられている場合を含めて、ＴＡＲエレメントを含まなくてもよい。
いくつかの例において、ベクターはシュードタイプ化ベクターであってもよい。本明細書で使用される「シュードタイプ」又は「シュードタイピング」という用語は、好ましい特徴を有する別のウイルスのエンベロープタンパク質で置換された１つ以上のウイルスエンベロープタンパク質を有するウイルスを指す。例えば、ＨＩＶは、水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）エンベロープタンパク質でシュードタイプ化することができる。いくつかの実施形態では、レンチウイルスエンベロープタンパク質は、ＶＳＶ－Ｇでシュードタイプ化される。いくつかの実施形態では、ＶＳＶ－Ｇエンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化された組換えレトロウイルス、例えばレンチウイルスを産生するパッケージング細胞を使用することができる。
ベクター（ウイルス及び非ウイルスの両方）は、ウイルス由来の構造エレメント及び／若しくは遺伝子エレメント、又はそれらの部分を含み得る。レトロウイルスベクターは、レトロウイルス由来の構造エレメント及び／若しくは遺伝子エレメント、又はそれらの部分を含み得る。レンチウイルスベクターは、主にレンチウイルスに由来するＬＴＲを含む、構造的及び機能的遺伝子エレメント、又はその部分を含み得る。いくつかの例において、例えば、ハイブリッドベクターが、レトロウイルス、例えば、レンチウイルス配列及び非レトロウイルス、例えば、非レンチウイルスウイルス配列の両方を含むＬＴＲ又は他の核酸を含む場合を含めて、ハイブリッドベクターが使用され得る。いくつかの実施形態では、ハイブリッドベクターは、逆転写、複製、組み込み及び／又はパッケージングのためのレトロウイルス配列、例えばレンチウイルス配列を含むベクターを含み得る。
細胞集団、並びに／又は肝細胞及び／若しくはその肝前駆細胞は、有効量の細胞の投与が所望の治療効果を有する症状について対象を処置するために使用することができる。いくつかの例では、所望の治療効果は、例えば、肝細胞代謝、解毒、肝細胞タンパク質の合成（例えば、アルブミン、フィブリノーゲン、プロトロンビン、凝固因子（例えば、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、及び第ＸＩＩ因子）、プロテインＣ、プロテインＳ、抗トロンビン、リポタンパク質、セルロプラスミン、トランスフェリン、補体タンパク質、肝細胞プロテオーム及び／又はセクレトームのタンパク質（例えば、Ｆｒａｎｋｏ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ．（２０１９）１１（８）：１７９５に記載されているものなどであり、この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））などを含むがこれらに限定されない、投与された肝細胞の１つ以上の内因性機能（例えば、健康な肝細胞の内因性機能、低免疫原性肝細胞の内因性肝細胞機能など）の結果である。いくつかの例では、所望の治療効果は、投与された肝細胞の１つ以上の異種機能（例えば、機能的に組み込まれた導入遺伝子によってコードされる遺伝子産物の異種機能）の結果である。いくつかの例では、対象の症状が血友病（例えば、血友病Ａ又は血友病Ｂ）であり、かつ方法が、血友病を処置するための遺伝子産物（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子など）をコードする導入遺伝子を含む有効量の遺伝子改変されたヒト肝細胞を対象に投与することを含む場合、方法は、例えば、対象における凝固を調節するのに有効な量で抗凝固剤（例えば、ワルファリン、リバーロキサバン、ダビガトラン、アピキサバン、エドキサバンなど）を対象に投与することによって、対象における凝固を調節することを更に含み得る。
本明細書に記載の肝細胞及び／又はその前駆細胞を含む細胞集団は、任意の肝疾患又は肝障害の処置及び／又は予防に使用することができる。例えば、肝細胞の導入による患者の肝組織の再構成は、任意の肝臓症状（例えば、急性肝不全、慢性肝疾患及び／又は代謝性若しくは単一遺伝子性疾患）を有する患者のための潜在的な治療選択肢であり、本明細書に記載されるように遺伝子改変された細胞を対象の肝臓に再増殖させることによるこれらの症状の恒久的な処置としてのものを含む。肝細胞の再構成は、例えば、遺伝子治療のために遺伝子改変された肝細胞を導入するため、又は疾患、物理的又は化学的損傷、又は悪性腫瘍の結果として失われた肝細胞を置き換えるために使用され得る。加えて、増殖させたヒト肝細胞を使用して、人工肝臓補助装置を満たすことができる。
様々な目的のために肝細胞を増殖させることを含む、産生する方法が本明細書で開示される。場合によっては、本発明の方法は、移植（例えば、同所性肝移植を含む）に適したヒト肝細胞を含む、肝細胞を必要とする対象への移植に適したヒト肝細胞の産生及び／又は増殖を提供する。本明細書に記載の方法に従って産生されたヒト肝細胞を含む肝細胞は、移植又は注入前に精製、凍結保存、及び／又は広範囲に特徴付けることができる。他の用途の中で、本明細書に記載の方法に従って産生された肝細胞は、１つ以上の重度の肝疾患を有する患者にオンデマンド治療を提供し得る。
いくつかの例では、所望の治療効果は、組み込まれた導入遺伝子によってコードされている遺伝子産物によって与えられる、投与された肝細胞の１つ以上の異種機能の結果である。したがって、分泌された異種遺伝子産物など、異種遺伝子産物の送達を介して処置され得る本質的に任意の症状が、本明細書に記載されるように生成された遺伝子改変された肝細胞を使用して処置され得る。例えば、タンパク質の欠損をもたらす単一遺伝子性疾患は、タンパク質をコードする組み込まれた導入遺伝子を含有するように遺伝子改変された有効量の肝細胞の投与を介して処置され得、それにより、タンパク質の欠損が減少する。
単一遺伝子性症状を処置するために有用な導入遺伝子としては、例えば、銅輸送ＡＴＰアーゼ２（ＡＴＰ７Ｂ）、遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質（ＨＦＥ）、ヘモジュベリン、ヘプシジン（ＨＡＭＰ）、トランスフェリン受容体タンパク質２（ＴＦＲ２）、溶質キャリアファミリー４０メンバー１（ＳＬＣ４０Ａ１）、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子、カルバモイルリン酸シンターゼ（ＣＰＳ１）、Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ（ＮＡＧＳ）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、α－ガラクトシダーゼＡ遺伝子（ＧＬＡ）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素（ＰＡＨ）、アルギナーゼ（ＡＲＧ、ＡＲＧ１を含む）、α１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（ＦＡＨ）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、アルギニノコハク酸シンターゼ（ＡＳＳ、ＡＳＳ１を含む）、オルニチントランスロカーゼ（ＯＲＮＴ１）、シトリン、ＵＤＰ－グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、セリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ）、補体因子Ｈ（ＣＦＨ）など、及びそれらの組み合わせ、の完全長及び改変された形態をコードする導入遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの例では、処置される疾患は、例えば、導入遺伝子の遺伝子産物が肝臓関連タンパク質である場合を含む、肝疾患及び／又は肝臓関連単一遺伝子性疾患である。いくつかの例では、処置される疾患は、例えば、導入遺伝子の遺伝子産物が肝臓関連タンパク質でない場合を含む、肝疾患及び／又は肝臓関連単一遺伝子性疾患である。いくつかの例では、処置される単一遺伝子性疾患は、例えば、組み込まれた導入遺伝子の遺伝子産物が肝臓関連タンパク質でない場合を含む、肝臓関連単一遺伝子性疾患ではない。いくつかの例では、処置される疾患は、例えば、組み込まれた導入遺伝子の遺伝子産物が肝臓関連タンパク質でない場合を含む、肝疾患ではない。
本明細書に記載の肝細胞及び／又は肝前駆細胞を含む細胞集団並びに本明細書に記載のそのような細胞を含む組成物は、任意の好適な手段によって対象に、及び対象の任意の部分、器官、又は組織に投与することができる。投与手段の非限定的な例には、門脈注入、臍帯静脈注入、直接脾臓カプセル注射、脾動脈注入、網嚢への注入及び／又は腹腔内注射（注入、移植）が含まれる。ある特定の実施形態において、組成物は、腹腔内空間及び／又は網嚢への注入によって移植されるカプセル化された肝細胞を含む。ある特定の実施形態では、組成物は、本明細書に記載のように肝細胞を播種及び／又は再増殖させ、それを必要とする対象に外科的に移植する、例えば、合成足場、脱細胞化肝臓などを含む無細胞／脱細胞化足場を含む。
対象（患者）への投与（移植）に加えて、又はその代替として、本明細書に記載の肝細胞は、肝疾患を有する対象を処置するのに有用なデバイス又は組成物に肝細胞を供給するために使用することもできる。本開示の肝細胞を使用することができるそのようなデバイス又は組成物の非限定的な例には、バイオ人工肝臓（ＢＡＬ）（急性肝不全に苦しむ対象のための体外支持デバイス）及び／又は脱細胞化肝臓（対象の肝臓を提供するための再細胞化器官足場）が含まれる。例えば、Ｓｈａｈｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｎａｔ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５５１－０１９－０４６０－ｘ、Ｇｌｏｒｉｏｓｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ ６３（２）：３８８－９８を参照されたい。
いくつかの例では、本明細書に記載される処置を受ける対象は、免疫抑制剤を受けなくてもよく、例えば、対象は、治療時に、例えば、本明細書に記載される肝細胞の投与前、投与中、及び／又は投与後に、免疫抑制されず、かつ／又は免疫学的に正常であり得る。例えば、このような対象は、免疫抑制、免疫抑制薬、及び／若しくは特定の免疫抑制療法に対する１つ以上の禁忌を有し得るか、又は異なる理由のために免疫抑制薬を投与されなくてもよい。いくつかの例では、免疫抑制されない対象及び／又は免疫抑制に対する禁忌を有する対象は、集団のかなりの部分（全て又は本質的に全てを含む）が低免疫原性肝細胞である細胞集団を投与され得る。
免疫抑制に対する禁忌の非限定的な例としては、肝疾患又は症状、線維症、肝硬変、腎疾患又は症状、血液疾患又は症状、帯状疱疹及び／又は水痘の病歴、感染（例えば、結核、ＢＫポリオーマウイルス、単純ヘルペス、真菌、寄生虫（例えば、回虫・ストロンギロイデス）、水痘帯状疱疹ウイルス、はしかなど）、感染症（例えば、はしか、水痘など）への曝露、癌、悪性腫瘍、糖尿病、高コレステロール、高血圧、高血中トリグリセリド、溶血性尿毒症症候群、貧血症、血小板減少、低白血球数、心嚢液貯留、血栓性血小板減少性紫斑病、肺水腫、間質性肺炎、口内炎、口内炎、急性腎不全、腎動脈閉塞症（例えば、腎動脈血栓症）、目に見える浮腫、腹水、蛋白尿、創傷治癒障害、妊娠、授乳及び母乳哺育、悪性リンパ腫、血栓症（例えば、肝移植後の血栓症）、心臓移植、ホルモン欠損症の内分泌障害（例えば、甲状腺ホルモン欠損症、視床下部不全、脳下垂体不全）、低血中カリウム、精神障害、ミオパチー、緑内障、白内障、潰瘍、胃炎、憩室炎、腸管吻合、腱断裂、骨粗鬆症、骨の低石灰化及び低密度、発作、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症、カルバモイルリン酸シンターゼ欠損症、シトルリン血症、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ欠損症、アルギナーゼ欠損症、クレアチンキナーゼ上昇、疾患又は疾病に起因する骨折、骨壊死、筋消耗、高アンモニア血症（例えば、Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ欠損症に関連するものとして）、免疫抑制薬（例えば、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン、ブデソニド、プレドニゾロン）、ヤヌスキナーゼ阻害剤（例えば、トファシチニブ）、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、シロリムス、エベロリムス）、ＩＭＤＨ阻害剤（例えば、アザチオプリン、レフルノミド、ミコフェノラート、免疫抑制薬生物製剤（例えば、アバタセプト（Orencia）、アダリムマブ（Humira）、アナキンラ（Kineret）、セルトリズマブ（Cimzia）、エタネルセプト（Enbrel）、ゴリムマブ（Simponi）、インフリキシマブ（Remicade）、イキセキズマブ（Taltz）、ナタリズマブ（Tysabri）、リツキシマブ（Rituxan）、セクキヌマブ（Cosentyx）、トシリズマブ（Actemra）、ウステキヌマブ（Stelara）、ベドリズマブ（Entyvio）、バシリキシマブ（Simulect）、ダクリズマブ（Zinbryta））など）へのアレルギーなどが挙げられる。他の禁忌（例えば、特定の免疫抑制薬に対するもの）は、ラベル情報、薬物及び薬物相互作用データベース、薬物製造業者、及び／又は、例えば、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）などの関連規制機関から容易に確認可能である。
いくつかの例では、投与される細胞集団は、例えば、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の低免疫原性肝細胞を含む、８０％以上の低免疫原性肝細胞であり得る。いくつかの例では、１つ以上の免疫抑制薬による処置に対して１つ以上の禁忌を有する対象に、８０％以上の低免疫原性肝細胞を有する細胞集団が投与され得、例えば、そのような低免疫原性肝細胞が、本明細書に記載される１つ以上、例えば２つ以上、例えば少なくとも３つの遺伝子改変を含む場合を含む。
本明細書に記載の方法及び／又は細胞集団を使用して処置することができる、免疫抑制に対する１つ以上の禁忌を有するか又は有さない対象における疾患及び障害としては、クリグラー・ナジャール症候群１型、家族性高コレステロール血症、第ＶＩＩ因子欠乏症、糖原病Ｉ型、乳児レフサム病、進行性家族性肝内胆汁うっ滞２型、遺伝性チロシン血症１型、及び様々な尿素回路欠損、急性肝不全（薬物誘発性急性肝不全、ウイルス誘発性急性肝不全、突発性急性肝不全、キノコ中毒誘発性急性肝不全、手術後急性肝不全、急性妊娠脂肪肝に誘発された急性肝不全を有する若年及び成人患者を含む）、慢性肝疾患（肝硬変及び／又は線維症を含む）、アルコール消費、薬物摂取、及び／又はＢ型肝炎フレアのうちの１つの急性事象によって引き起こされた急性増悪した肝疾患が挙げられるが、これに限定されない。したがって、患者はこれら又は他の肝臓症状の１つ以上を有する可能性がある。
場合によっては、本明細書に記載の方法に従って治療される疾患及び障害は、肝細胞特異的（肝細胞固有の）機能不全を含み得る。例えば、機能不全、並びに疾患及び／又は障害の病因は、対象内に存在する内因性肝細胞の機能不全に起因するか、又は主に起因する可能性がある。場合によっては、肝細胞特異的機能不全は遺伝的であるか、又は対象によって遺伝する可能性がある。場合によっては、疾患又は障害の病因は、肝細胞以外の細胞型を実質的に含まない。場合によっては、疾患又は障害は、肝機能の低下、肝疾患（急性又は慢性）、又は内因性肝細胞に由来する他の有害な状態をもたらす。したがって、場合によっては、例えば、疾患が内因性肝細胞集団に内在する場合、効果的な治療には、本明細書に記載の肝細胞の置換、補充、移植、又は再増殖が含まれ得る。理論に拘束されることなく、肝細胞固有の疾患／障害では、内因性肝細胞の置換及び／又は補充は、移植された肝細胞に悪影響を与える疾患／障害なしに、有意な臨床的改善をもたらすことができる。例えば、対象が肝細胞機能に影響を与える遺伝的障害（例えば、高チロシン血症などの肝細胞内のアミノ酸代謝）を有する場合、同種移植された肝細胞は、対象内の疾患／障害の存在によって本質的に影響を受けない可能性がある。したがって、移植された肝細胞は、対象内で実質的に生着、生存、増殖、及び／又は再増殖する可能性があり、有意な陽性の臨床転帰をもたらす。
肝細胞特異的（肝細胞固有）機能障害を特徴とする疾患及び障害は、肝細胞特異的ではなく、肝細胞外因性因子が関与する病因を有する疾患及び障害とは対照的である可能性がある。肝細胞外因性である因子及び／又は病因を有する疾患の例には、例えば、アルコール性脂肪性肝炎、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）、肝脂肪症／非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）などが含まれるが、これらに限定されない。肝細胞外因性の疾患は、外的であるか、又は内因性肝細胞の外側（アルコール、食餌、感染など）に由来する、肝損傷を含む。いくつかの例では、本明細書に記載される方法に従って処置される疾患及び障害は、肝細胞特異的（肝細胞固有の）機能不全ではない疾患及び障害を含み得る。
肝細胞固有及び肝細胞関連疾患の例には、肝関連酵素欠損症、肝細胞関連輸送疾患などが含まれる。このような肝臓関連の欠損症は、後天性又は遺伝性の疾患である可能性があり、代謝性疾患（例えば、肝臓に基づく代謝障害など）が含まれる可能性がある。遺伝性の肝臓に基づく代謝障害は、例えば、Ｉｓｈａｋ，Ｃｌｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ（２００２）６：４５５－４７９に記載されているそれらの疾患などであるがこれらに限定されない「肝臓の遺伝性代謝性疾患」と呼ばれることがある。肝臓関連の欠損症は、いくつかの例では、急性及び／又は慢性肝疾患をもたらし得、例えば、急性及び／又は慢性肝疾患が、処置せずに放置されたか又は処置が不十分なときの欠損症の結果である場合を含む。遺伝性の肝関連酵素欠損症、肝細胞関連輸送疾患などの非限定的な例としては、クリグラー・ナジャール症候群１型、家族性高コレステロール血症、第ＶＩＩ因子欠乏症、糖原病Ｉ型、乳児レフサム病、進行性家族性肝内胆汁うっ滞２型、遺伝性チロシン血症（例えば、遺伝性チロシン血症１型）、遺伝性尿素回路欠損症、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、遺伝性ヘモクロマトーシス、アルファＩアンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）、ウィルソン病などが挙げられる。少なくともいくつかの肝表現型、病状、及び／又は肝関連症状を有する代謝性疾患を含む、肝の遺伝性代謝性疾患の非限定的な例には、５－ベータ－レダクターゼ欠損症、ＡＡＣＴ欠損症、Ａａｒｓｋｏｇ症候群、アベタリポタンパク血症、副腎白質ジストロフィー、アルパース病、アルパース症候群、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症、抗トロンビンＩＩＩ欠乏症、アルギナーゼ欠乏症、アルギニノコハク酸尿症、動脈肝異形成症、自己免疫性リンパ増殖性症候群、良性再発性胆汁うっ滞、ベータサラセミア、ブルーム症候群、バッド－キアリ症候群、糖タンパク質糖鎖不全症候群、セラミダーゼ欠損症、セロイドリポフスチン症、コレステロールエステル蓄積症、コレステリルエステル蓄積症、慢性肉芽腫性、慢性Ｃ型肝炎、クリグラー・ナジャール症候群、嚢胞性線維症、シスチン症、真性糖尿病、デュビン・ジョンソン症候群、風土性チロル性肝硬変、赤血球生成性プロトポルフィリン症、ファブリー病、家族性高コレステロール血症、家族性脂肪性肝炎、フィブリノーゲン蓄積症、ガラクトセミア、ガングリオシドーシス、ゴーチャー病、遺伝性ヘモクロマトーシス、グリコーゲン症１ａ型、グリコゲノーシス２型、グリコゲノーシス３型、グリコゲノーシス４型、肉芽腫性疾患、肝家族性アミロイドーシス、遺伝性フルクトース不耐性、遺伝性球状赤血球症候群、ヘルマンスキー－パドラック症候群、ホモシスチン尿症、高シュウ酸尿症、低ベータリポタンパク血症、低フィブリノーゲン血症、妊娠肝内胆汁うっ滞、ラフォラ病、リポアミドデヒドロゲナーゼ欠損症、リポタンパク障害、モーリアック症候群、異染性白質ジストロフィー、ミトコンドリア細胞障害、ナバホ神経肝障害、ニーマン－ピック病、非症候性胆管不足、北米インディアン小児肝硬変、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、部分脂肪異栄養症、ピアソン症候群、皮膚ポルフィリン症、進行性家族性肝内胆汁うっ滞、進行性家族性肝内胆汁うっ滞１型、進行性家族性肝内胆汁うっ滞２型、プロテインＣ欠乏症、シュワッハマン症候群、タンジール病、血小板減少性紫斑病、総脂肪異栄養症、１型グリコーゲン症、チロル性肝硬変、チロシン血症、尿素回路異常症、静脈閉塞性疾患、ウィルソン病、ウォルマン病、Ｘ連鎖ハイパーＩｇＭ症候群、及びゼルウェーガー症候群、が含まれる
本明細書に記載の方法による対象の処置は、例えば、生存期間の延長、疾患進行の遅延（例えば、肝不全の遅延）、肝不全の予防、改善された及び／又は正常化された肝機能、改善された及び／又は正常化されたアミノ酸レベル、改善された及び／又は正常化されたアンモニアレベル、改善された及び／又は正常化されたアルブミンレベル、改善された及び／又は正常化されたビリルビン、表現型の繁栄の失敗からの回復、嗜眠の減少、昏睡の減少、発作の減少、黄疸の減少、改善された及び／又は正常化された血清グルコース、改善された及び／又は正常化されたＩＮＲ、改善された及び／又は正常化された尿検査結果などを含むがこれらに限定されない、様々な臨床的利益及び／又は測定可能な結果をもたらし得る。
例えば、いくつかの例では、本明細書に記載されるような遺伝子改変された肝細胞及び／又は肝前駆細胞の投与は、例えば、標準的なケアに従って処置された対象並びに／又は本明細書に記載されるように遺伝子改変されていない肝細胞及び／若しくは肝前駆細胞を投与された対象と比較して、肝疾患、及び／又は肝不全をもたらす症状を有する対象において少なくとも５％の生存率増加をもたらす。そのような対象における増強された生存の観察されたレベルは変動し得、かつ少なくとも５％から６０％以上の増加に及ぶ可能性があり、これには、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％以上の生存の増加を含むが、それに限定されない。場合によっては、本明細書に記載されるような遺伝子改変された肝細胞及び／又はその前駆細胞を投与された対象は、疾患の進行並びに／又は、例えば、肝不全及び／若しくはそれに起因する症状などであるがそれらに限定されない、１つ以上の疾患症状の発生、の遅延を経験し得る。疾患の進行及び／又は症状の発生におけるそのような遅延は、例えば、少なくとも１週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年以上を含むがこれらに限定されない、数日、数週間、数ヶ月又は数年続く可能性がある。患者に投与される本明細書に記載の肝細胞は、経時的に患者に有益な治療反応をもたらす。
処置され得る肝臓症状の非限定的な例としては、急性間欠性ポルフィリン症、急性肝不全、アラジール症候群、アルコール性脂肪性肝疾患、アルコール性肝炎、アルコール性肝硬変、アルコール性肝疾患、α１－アンチトリプシン欠乏症、アメーバ性肝膿瘍、自己免疫性肝炎、胆汁性肝硬変、バッド・キアリ症候群、化学物質及び薬物誘発性肝損傷、胆汁うっ滞、慢性肝炎、慢性Ｂ型肝炎、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｄ型肝炎、末期肝疾患、赤芽球性プロトポルフィリン症、肝蛭症、脂肪性肝疾患、限局性結節性過形成、肝包虫症、肝性脳症、肝梗塞、肝不全、肝性ポルフィリン症、肝結核、肝静脈閉塞性疾患、肝炎、肝細胞癌、肝造血性ポルフィリン症、肝レンズ核変性症、肝腫大、肝肺症候群、肝腎症候群、遺伝性コプロポルフィリン症、肝膿瘍、肝細胞腺腫、肝硬変、肝不全、肝腫瘍、広範性肝壊死、非アルコール性脂肪性肝疾患、寄生虫性肝疾患、肝紫斑病、晩発性皮膚ポルフィリン症、門脈圧亢進症、化膿性肝膿瘍、ライ症候群、異型ポルフィリン症、ウイルス性肝炎、Ａ型ウイルス性肝炎、Ｂ型ウイルス性肝炎、Ｃ型ウイルス性肝炎、Ｄ型ウイルス性肝炎、Ｅ型ウイルス性肝炎、及びツェルウェガー症候群を挙げることができる。いくつかの例において、対象は、線維症又は線維症症状について処置され得る。いくつかの例において、対象は、肝硬変又は肝硬変症状について処置され得る。
遺伝的症状の非限定的な例としては、１ｐ３６欠失症候群、１ｑ２１．１欠失症候群、２ｑ３７欠失症候群、５ｑ欠失症候群、５，１０－メテニルテトラヒドロ葉酸シンターゼ欠損症、１７ｑ１２微小欠失症候群、１７ｑ１２微小重複症候群、１８ｐ欠失症候群、２１－ヒドロキシラーゼ欠損症、α１－アンチトリプシン欠損症、ＡＡＡ症候群（ａｃｈａｌａｓｉａ－ａｄｄｉｓｏｎｉａｎｉｓｍ－ａｌａｃｒｉｍａ症候群）、Ａａｒｓｋｏｇ－Ｓｃｏｔｔ症候群、ＡＢＣＤ症候群、無セルロプラスミン血症、無手足症、軟骨無発生症ＩＩ型、軟骨無形成症、急性間欠性ポルフィリン症、アデニロコハク酸リアーゼ欠損症、副腎白質ジストロフィー、アラジール症候群、ＡＤＵＬＴ症候群、エカルディ・グティエール症候群、白化症、アレキサンダー病、Ａｌｆｉ症候群、アルカプトン尿症、アルポート症候群、小児交互性片麻痺、筋萎縮性側索硬化症－前頭側頭型認知症、アルストレーム症候群、アルツハイマー病、遺伝性エナメル質形成不全症、アミノレブリン酸デヒドラターゼ欠損性ポルフィリン症、アンドロゲン非感受性症候群、アンジェルマン症候群、アペール症候群、関節拘縮症－腎機能不全－胆汁うっ滞症候群、毛細血管拡張性運動失調症、アクセンフェルト症候群、Ｂｅａｒｅ－Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｃｕｔｉｓ ｇｙｒａｔａ症候群、ベックウィズ－ヴィーデマン症候群、ベンジャミン症候群、ビオチニダーゼ欠損症、Ｂｊｏｒｎｓｔａｄ症候群、ブルーム症候群、Ｂｉｒｔ－Ｈｏｇｇ－Ｄｕｂｅ症候群、Ｂｒｏｄｙミオパチー、Ｂｒｕｎｎｅｒ症候群、ＣＡＤＡＳＩＬ 症候群、ネコ眼症候群、ＣＲＡＳＩＬ症候群、慢性肉芽腫性障害、屈曲肢異形成症、カナバン病、カーペンター症候群、ＣＤＫＬ５欠損性障害、大脳形成異常－神経障害－魚鱗癬－角皮症症候群（ＣＥＤＮＩＫ）、嚢胞性繊維症、シャルコー・マリー・トゥース病、ＣＨＡＲＧＥ症候群、チェディアック・東症候群症候群、Ｇｒｅｂｅ型軟骨異形成症、鎖骨頭蓋異骨症、コケイン症候群、コフィン・ローリー症候群、コーエン症候群、コラーゲン異常症関連疾患ＩＩ型及びＸＩ型、先天性無痛無汗症（ＣＩＰＡ）、先天性筋ジストロフィー、コルネリア・デ・ランゲ症候群（ＣＤＬＳ）、カウデン症候群、ＣＰＯ欠損症（コプロポルフィリン症）、頭蓋・水晶体・縫合異形成症、ネコ鳴き症候群、クローン病、クルーゾン症候群、クルーゾン皮膚骨格症候群（黒色表皮腫を伴うクルーゾン症候群）、クラリーノ症候群、ダリエー病、デント病（遺伝的高カルシウム尿症）、デニス・ドラッシュ症候群、Ｄｅ Ｇｒｏｕｃｈｙ症候群、ダウン症候群、ディジョージ症候群、遠位型遺伝性運動ニューロパチー多型、遠位型筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ドラベ症候群、エドワーズ症候群、エーラス・ダンロス症候群、エマヌエル症候群、エメリー・ドレイフス症候群、表皮水疱症、骨髄性プロトポルフィリン症、ファンコニー貧血（ＦＡ）、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン血栓形成傾向、致死性家族性不眠症、家族性大腸腺腫症、家族性自律神経失調症、家族性Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄ－Ｊａｋｏｂ病、ファインゴールド症候群、ＦＧ症候群、脆弱Ｘ症候群、フリードライヒ運動失調症、Ｇ６ＰＤ欠損症、ガラクトース血症、ゴーシェ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、ガレスピー症候群、グルタル酸尿症Ｉ型及び２型、ＧＲＡＣＩＬＥ症候群、グリセリ症候群、ヘイリーヘイリー病、道化師様魚鱗癬、ヘモクロマトーシス１型、ヘモクロマトーシス２Ａ型、ヘモクロマトーシス２Ｂ型、ヘモクロマトーシス３型、ヘモクロマトーシス４型、ヘモクロマトーシス５型、血友病Ａ、血友病Ｂ、骨髄肝性ポルフィリン症、遺伝性コプロポルフィリン症、遺伝性出血性末梢血管拡張症（Ｏｓｌｅｒ－Ｗｅｂｅｒ－Ｒｅｎｄｕ症候群）、遺伝性封入体ミオパチー、遺伝性多発性外骨腫症、遺伝性痙性対麻痺（乳児期発症上行性遺伝性痙性対麻痺）、ヘルマンスキー・パドラック症候群、遺伝性圧脆弱性ニューロパチー（ＨＮＰＰ）、内臓転位、ホモシスチン尿症、ハンチントン病、ハンター症候群、ハーラー症候群、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群、高リジン血症、原発性高シュウ酸尿症、高フェニルアラニン血症、低αリポ蛋白血症（タンジール病）、低軟骨形成、軟骨低形成症、免疫不全－動原体不安定性－顔面奇形症候群（ＩＣＦ症候群）、色素失調症、坐骨膝蓋骨異形成症、同腕二動原体１５、ジャクソン・ワイス症候群症候群、ヤコブセン症候群、ジュベール症候群、若年性原発性側索硬化症（ＪＰＬＳ）、ケロイド障害、ＫＩＦ１Ａ関連神経障害、クリーフストラ症候群、クニースト骨異形成症、小崎過成長症候群、クラッベ病、Ｋｕｆｏｒ－Ｒａｋｅｂ症候群、ＬＣＡＴ欠損症、レッシュ・ナイハン症候群、リー・フラウメニ症候群、肢帯型筋ジストロフィー、リンチ症候群、リポタンパク質リパーゼ欠損症、悪性高熱症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、マロトー・ラミー症候群、マッキューン・オールブライト症候群、マクラウド症候群、ＭＥＤＮＩＫ症候群、家族性地中海熱、メンケス病、メトヘモグロビン血症、メチルマロン酸血症、ミクロ症候群、小頭症、ミラー・ディーカー症候群、モルキオ症候群、モワット・ウィルソン症候群、ムエンケ症候群、多発性内分泌腫瘍症１型（ウェルマー症候群）、多発性内分泌腫瘍症２型、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型及びベッカー型筋ジストロフィー、ミオスタチン関連筋肥大、筋緊張性ジストロフィー、Ｎａｔｏｗｉｃｚ症候群、神経線維腫症Ｉ型、神経線維腫症ＩＩ型、ニーマン・ピック病、非ケトーシス型高グリシン血症、非症候性難聴、ヌーナン症候群、Ｎｏｒｍａｎ－Ｒｏｂｅｒｔｓ症候群、オグデン症候群、オーメン症候群、骨形成不全症、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、パトー症候群（１３トリソミー）、ＰＣＣ欠損症（プロピオン酸血症）、晩発性皮膚ポルフィリン症（ＰＣＴ）、ペンドレッド症候群、ポイツ・ジェガース症候群、パイフェル症候群、フェラン－マクダーミド症候群、フェニルケトン尿症、ピペコリン酸血症、ピット・ホプキンス症候群、多発性嚢胞腎疾患、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、ポルフィリン症、プラダー・ウィリー症候群、原発性線毛機能不全症（ＰＣＤ）、原発性肺高血圧症、プロテインＣ欠損症、プロテインＳ欠損症、１８ｑ近位欠失症候群、偽ゴーシェ病、弾性線維性仮性黄色腫、網膜色素変性症、レット症候群、ローベルト症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群（ＲＳＴＳ）、サンドホフ病、サンフィリポ症候群、シュワルツ・ヤンペル症候群、シェーグレン・ラルソン症候群、先天性脊椎－骨端骨異形成症（ＳＥＤ）、シュプリンツェン・ゴールドバーグ症候群、鎌状赤血球貧血、Ｓｉｄｅｒｉｕｓ型Ｘ連鎖精神遅滞症候群、鉄芽球性貧血、スライ症候群、スミス・レムリ・オピッツ症候群、スミス・マゲニス症候群、シュナイダー・ロビンソン症候群、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症（１～２９型）、ＳＳＢ症候群（ＳＡＤＤＡＮ）、シュタルガルト病（黄斑変性症）、スティックラー症候群（多型）、Ｓｔｒｕｄｗｉｃｋ症候群（脊椎骨端骨幹端異形成、Ｓｔｒｕｄｗｉｃｋ型）、テイ・サックス病、テトラヒドロビオプテリン欠損症、致死性骨異形成症、トリーチャー・コリンズ症候群、結節性硬化症（ＴＳＣ）、ターナー症候群、アッシャー症候群、異型ポルフィリン症、フォンヒッペル・リンダウ病、フォン・ヴィルブランド病、ワールデンブルグ症候群、Ｗａｒｋａｎｙ症候群２、Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈｅｒ－Ｚｗｅｙｍｕｌｌｅｒ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、Ｗｏｏｄｈｏｕｓｅ－Ｓａｋａｔｉ症候群、ウォルフ・ヒルショルン症候群、色素性乾皮症、Ｘ連鎖知的障害及び巨精巣症（脆弱Ｘ症候群）、Ｘ連鎖球脊髄性筋萎縮症（球脊髄性筋萎縮症）、Ｘｐ１１．２重複症候群、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症（Ｘ－ＳＣＩＤ）、Ｘ連鎖鉄芽球性貧血（ＸＬＳＡ）、４７，ＸＸＸ（トリプルＸ症候群）、ＸＸＸＸ症候群（４８，ＸＸＸＸ）、ＸＸＸＸＸ症候群（４９，ＸＸＸＸＸ）、ＸＸＸＸＹ症候群（４９，ＸＸＸＸＹ）、ＸＹＹ症候群（４７，ＸＹＹ）、ＸＸＹＹ症候群（４８，ＸＸＹＹ）、ＸＹＹＹ症候群（４８，ＸＹＹＹ）、ＸＸＸＹ症候群（４８，ＸＸＸＹ）、ＸＹＹＹＹ症候群（４９，ＸＹＹＹＹ）、並びにゼルウェーガー症候群が挙げられる。
遺伝的症状は、多くのリソソーム蓄積症を含む。リソソーム蓄積症の非限定的な例としては、ガングリオシドーシス（例えば、ＧＭ２ガングリオシドーシス（Ａ型、Ｏ型、ＡＢ型）並びにＧＭ１ガングリオシドーシス１型、２型、及び３型を含む）；ニーマン・ピック病Ａ、Ｂ、及びＣ；ゴーシェ病１型、２型、及び３型；ファブリー病；異染性白質ジストロフィー；グロボイド白質ジストロフィー；多発性スルファターゼ欠損症；αマンノース症；シンドラー病；アスパルチルグルコサミン尿症；フコース症；ハーラー症候群；シャイエ症候群；ハーラー・シャイエ症候群；ハンター症候群；サンフィリポ症候群Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ；モルキオ症候群Ａ及びＢ；マロトー・ラミー症候群；スライ症候群；神経系セロイドリポフスチン症；ガラクトシアリドーシス；乳児シアル酸蓄積症；サラ病；シアル酸尿症；シアリドーシスＩ及びＩＩ；Ｉ細胞病；偽性ハーラー・ポリジストロフィー；ムコリビドーシスＩＶ；リソソーム酸リパーゼ欠損症；ポンペ病；ダノン病；シスチン症などが挙げられる。遺伝的リソソーム蓄積症における原因突然変異、並びに個々のリソソーム蓄積症に関連する遺伝子及び欠損酵素は公知であり、例えば、Ｒａｊｋｕｍａｒ ＆ Ｄｕｍｐａ．（２０２１）Ｉｎ：ＳｔａｔＰｅａｒｌｓ．Ｔｒｅａｓｕｒｅ Ｉｓｌａｎｄ（ＦＬ）：ＳｔａｔＰｅａｒｌｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｏｏｋｓ／ＮＢＫ５６３２７０／で入手可能）に記載されている。
遺伝的症状は、多くの尿素回路異常症（ＵＣＤ）を含む。ＵＣＤの非限定的な例としては、Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ欠損症（ＮＡＧＳ欠損症）、カルバモイルリン酸シンテターゼＩ欠損症（ＣＰＳ１欠損症）、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症（ＯＴＣ欠損症）、シトルリン血症Ｉ型（ＡＳＳ１欠損症）、アルギニノコハク酸尿症（ＡＳＬ欠損症）、アルギナーゼ欠損症（高アルギニン血症、ＡＲＧ１欠損症）、オルニチントランスロカーゼ欠損症（ＯＲＮＴ１欠損症、高オルニチン血症－高アンモニア血症－ホモシトルリン尿症症候群）、及びシトリン欠損症が挙げられる。
本明細書に記載の処置は、慢性的に（すなわち、連続的に）又は非慢性的に（すなわち、非連続的に）行われてもよく、慢性的に（すなわち、連続的に）又は非慢性的に（すなわち、非連続的に）１つ以上の薬剤の投与を含んでもよい。本明細書に記載の方法による１つ以上の薬剤の慢性投与は、例えば、対象が、例えば、慢性肝臓症状（例えば、慢性肝疾患、肝硬変、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ）、慢性ウイルス性肝炎などである。）、慢性遺伝的肝臓症状（α１－アンチトリプシン欠損症、遺伝性ヘモクロマトーシス、ウィルソン病など）、慢性肝臓関連自己免疫症状（例えば、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、自己免疫性肝炎（ＡＩＨ）など）などを含む慢性症状を有する場合を含めて、様々な例において使用され得る。慢性症状のための１つ以上の薬剤の投与は、数ヶ月、１年又はそれを超える、数年にわたる薬剤の投与を含み得るが、これらに限定されない。このような慢性投与は、例えば、毎日、１日２回、毎週、週２回、毎月、毎月２回などを含むが、これらに限定されない任意の好都合且つ適切な投与スケジュールで行われ得る。いくつかの例では、例えば、遺伝的症状又は他の持続的遺伝子治療の場合、慢性症状は、１回又は数回（例えば、２、３、４、若しくは５回）の処置によって処置され得る。１つ以上の薬剤の非慢性的な投与は、限定されないが、１ヶ月以下の投与、例えば、数週間、１週間、数日間、限定された回数の用量（例えば、単回用量を含めて、１０用量未満、例えば、９用量以下、８用量以下、７用量以下など）を含む投与を含み得る。
治療細胞の組成物の有効量は、少なくとも、特定の使用方法、処置される対象、苦痛の重症度、組成物の投与様式、及び治療細胞の作用機序に依存する。組成物の「治療有効量」は、処置される対象において所望の効果を達成するのに十分な特定の試薬、例えば、治療細胞の量である。
いくつかの例では、対象に投与される遺伝子改変された肝細胞の量は、例えば、少なくとも１０００万、少なくとも２５００万、少なくとも５０００万、少なくとも７５００万、少なくとも１億、少なくとも２億５０００万、少なくとも５億、少なくとも７億５０００万、少なくとも１０億、少なくとも２０億、少なくとも３０億、少なくとも４０億、少なくとも５０億、少なくとも６０億、少なくとも７０億、少なくとも８０億、少なくとも９０億、少なくとも１００億、少なくとも１５０億、少なくとも２００億、少なくとも３００億、少なくとも４００億、少なくとも５００億、少なくとも６００億、少なくとも７００億、少なくとも８００億、少なくとも９００億、又は少なくとも１０００億個の肝細胞を含み得る。遺伝子改変された肝細胞は、それを必要とする対象に単回用量又は複数回用量で送達され得る。
任意の特定の対象に対する特定の用量レベル及び投薬頻度は様々であり得、組成物の細胞の活性、組成物の細胞の安定性及び作用の長さ、対象の年齢、体重、全身の健康状態、性別及び食事、投与の様式及び時間、同時投与する薬物の組み合わせ、並びに治療を受ける宿主の症状の重篤度を含む種々の因子に依存する。
上記に列挙した治療の例は、限定するものとして解釈されるべきではなく、本質的に、記載されるように同定された対象において所望の治療結果を生じる任意の適切な治療が用いられ得る。
キット及びシステム
本開示の態様はまた、キット及びシステム、並びにいくつかの例では、それらと共に又はそれらの中で使用するためのデバイスを含む。キット及び／又はシステムは、例えば、本開示の組成物及び方法に関して上述した構成要素のいずれかのうちの１つ以上を含み得る。キット及び／又はシステムは、本明細書に記載される方法における使用のために構成され得る。コードされたエレメントは、例えば、別々のポリペプチドコードポリヌクレオチドとして別々に提供され得るか、又は適切な場合、例えば、２つ以上の別々のポリペプチド若しくは非コード核酸をコードする単一のポリヌクレオチドとして組み合わされ得る。したがって、複数のコードされた成分が、単一又は複数のベクター上に提供され得、例えば、そのような複数のコードされた成分が、共有された（例えば、単一若しくは単一セットの）又は別個の（例えば、又は個別若しくは別個のセットの）調節エレメントの制御下にある場合を含む。薬剤は、別個の容器中にあってもよく、又は任意の記載された組み合わせ若しくは適切な組み合わせに従って、共有容器中に組み合わされてもよい。有用な容器としては、バイアル、チューブ、シリンジ、ボトル、バッグ、アンプルなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、有用なキットは、デバイスを更に含み得る。
いくつかの例では、本開示のキット及び／又はシステムは、細胞の遺伝子改変のための１つ以上の試薬（例えば、１つ以上の遺伝子編集組成物など）、１つ以上の導入遺伝子試薬など、１つ以上の改変試薬を含み得る。
いくつかの例では、キット及び／又はシステムは、例えば、遺伝子産物をコードする導入遺伝子を含むベクターなど、ベクターを含み得る。有用なベクターは、組み込み型であっても非組み込み型であってもよい。いくつかの例では、使用されるベクターは、組み込みベクターであり得、この組み込みベクターは、肝細胞又はその前駆細胞への導入遺伝子の機能的組み込みに十分なものである。いくつかの例では、キット及び／又はシステムは、例えば、編集組成物が、肝細胞又はその前駆細胞においてＨＬＡクラスＩ欠損を生じさせるのに十分である場合など、編集組成物を含み得る。いくつかの例では、キット及び／又はシステムは、例えば、キット及び／又はシステムの構成要素（容器、設計要素、説明書、インターネットアクセス可能媒体への指示など、及び／又はそれらの組み合わせなど）の特定の構成を通じて、肝細胞又は前駆細胞を改変するように構成され得る。そのような特定の構成は、キット中に提供される１つ以上の改変試薬などのキットの構成要素を使用して、遺伝子改変された肝細胞及び／又はその前駆細胞を生成し、産生した遺伝子改変された細胞を、例えば、バイオリアクター中で増殖させるように、ユーザーを誘導し得る。いくつかの例では、キットは、細胞がインビボバイオリアクター内などで増殖され得る施設などに輸送するための、遺伝子改変された細胞の保存及び／又は調製のための構成要素及び／又は説明書を含み得る。いくつかの例では、キットは、例えば、ベクターがＨＬＡクラスＩ欠損を生じさせるのに十分である場合を含む、例えば、ＬＮＰなどの非ウイルスベクターを含む編集組成物を含み得る。いくつかの例では、キットは、遺伝子改変された肝細胞及び／又はその前駆細胞の凍結保存のための１つ以上の試薬を含み得、そのような凍結保存が、遺伝子改変された肝細胞の増殖の前及び／又は後に行われる場合を含む。
上記の構成要素に加えて、キット及びシステムは、（特定の実施形態では）本方法を実施するための説明書を更に含み得る。これらの説明書は、様々な形態でキット中に存在し、かつ／又はシステムと共に提供されてもよく、そのうちの１つ以上がキット中に存在し、かつ／又はシステムと共に提供されてもよい。これらの説明書が存在し得る１つの形態は、キット及び／又はシステムの包装、パッケージ挿入物などにおける、好適な媒体又は基材（例えば、情報が印刷される１枚以上の紙）上の印刷された情報である。これらの説明書の更に別の形態は、情報が記録されているコンピュータ可読媒体、例えば、ディスケット、コンパクトディスク（ＣＤ）、フラッシュドライブなどである。存在し得るこれらの説明書の更に別の形態は、離れた場所で情報にアクセスするためにインターネットを介して使用され得るウェブサイトアドレスである。
添付の特許請求の範囲にかかわらず、本開示は、以下の実施形態によっても定義される。
１．低免疫原性肝細胞又はその前駆細胞を生成する方法であって、この方法が、
ヒト肝細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団を、肝細胞又はその前駆細胞においてヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ欠損を生じさせるのに十分な条件下で編集組成物と接触させることと、
細胞集団を、肝細胞又はその前駆細胞による導入遺伝子の発現に十分な条件下で少なくとも１つのＮＫ細胞デコイ受容体をコードする導入遺伝子と接触させることと、を含み、
それにより、低免疫原性肝細胞又はその前駆細胞の集団を生成する、方法。
２．編集組成物が、β２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）編集組成物である、実施形態１に記載の方法。
３．ヒト肝細胞又はその前駆細胞が初代ヒト肝細胞である、実施形態１又は２に記載の方法。
４．生成された低免疫原性肝細胞又はその前駆細胞の集団をバイオリアクターに導入することを更に含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。
５．バイオリアクターがインビボバイオリアクターであり、インビボバイオリアクターが、増殖させた低免疫原性肝細胞の集団を産生するのに十分な条件下で維持され、任意選択で、インビボバイオリアクターがマウス、ラット、又はブタである、実施形態４に記載の方法。
６．ヒト肝細胞又はその前駆細胞をバイオリアクター中で増殖させ、増殖後にバイオリアクターから細胞を抽出して、ヒト肝細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団を得ることを更に含み、任意選択で、バイオリアクターがマウス、ラット、又はブタである、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。
７．バイオリアクター中で増殖されるヒト肝細胞又はその前駆細胞が初代ヒト肝細胞である、実施形態６に記載の方法。
８．細胞集団を、編集組成物及び導入遺伝子と同時に接触させる、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。
９．細胞集団を、導入遺伝子と接触させる前に編集組成物と接触させ、任意選択で、細胞集団の肝細胞又はその前駆細胞を、編集組成物との接触と導入遺伝子との接触との間に増殖させる、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。
１０．細胞集団を、編集組成物と接触させる前に導入遺伝子と接触させ、任意選択で、細胞集団の肝細胞又はその前駆細胞を、導入遺伝子との接触と編集組成物との接触との間に増殖させる、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。
１１．少なくとも１つのＮＫ細胞デコイ受容体が、ＣＤ４７、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合体、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．細胞集団を導入遺伝子と接触させることが、細胞集団を、導入遺伝子を含む組み込みベクターと接触させることを含み、任意選択で、組み込みベクターがレンチウイルスベクターである、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．編集組成物が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと、を含む、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．編集組成物と接触させることが、細胞集団を、肝細胞又は前駆細胞のＢ２Ｍ遺伝子座を破壊するのに十分な試薬を含むベクターと接触させることを含み、任意選択で、ベクターが非ウイルスベクターであり、任意選択で、非ウイルスベクターが脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．ベクターが、
Ｃａｓ９タンパク質と、Ｂ２Ｍ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とをコードするか、又は
Ｃａｓ９タンパク質及びｇＲＮＡを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を含む、実施形態１４に記載の方法。
１６．肝細胞又は前駆細胞においてＨＬＡクラスＩＩ欠損を生じさせるのに十分な条件下で細胞集団をＨＬＡクラスＩＩ標的化組成物と接触させることを更に含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．ＨＬＡクラスＩＩ標的化組成物が、十分な条件下で、ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子の発現を引き起こす転写因子又はコアクチベーターをコードする遺伝子座を編集する編集組成物を含む、実施形態１６に記載の方法。
１８．ＨＬＡクラスＩＩ標的化組成物が、クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子座を編集するＣＩＩＴＡ編集組成物を含む、実施形態１７に記載の方法。
１９．ＣＩＩＴＡ編集組成物が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ＣＩＩＴＡ遺伝子座を標的とするｇＲＮＡ又はこのｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと、を含む、実施形態１８に記載の方法。
２０．編集組成物と接触させることが、細胞集団を、転写因子又はコアクチベーターをコードする遺伝子座を破壊するのに十分な試薬を含むベクターと接触させることを含み、任意選択で、ベクターが非ウイルスベクターであり、任意選択で、非ウイルスベクターが脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、実施形態１７～１９のいずれか１つに記載の方法。
２１．ベクターが、
Ｃａｓ９タンパク質と、遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とをコードするか、又は
Ｃａｓ９タンパク質及びｇＲＮＡを含むＲＮＰを含む、実施形態２０に記載の方法。
２２．生成された低免疫原性肝細胞又はその前駆細胞を凍結保存することを更に含む、実施形態１～２１のいずれか１つに記載の方法。
２３．対象の症状を処置する方法であって、この方法が、
有効量の低免疫原性肝細胞又は前駆細胞を対象に投与することを含み、低免疫原性肝細胞又は前駆細胞がそれぞれ、ＨＬＡクラスＩ欠損、及び少なくとも１つのＮＫ細胞デコイ受容体をコードする導入遺伝子を含み、任意選択で、症状が肝臓症状である、方法。
２４．対象が免疫抑制に対する禁忌を有する、実施形態２３に記載の方法。
２５．低免疫原性肝細胞又はその前駆細胞が、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の方法に従って生成される、実施形態２３又は２４に記載の方法。
２６．移植された細胞集団を含む非ヒト哺乳動物であって、細胞集団が複数の低免疫原性ヒト肝細胞又はその前駆細胞を含み、この複数の肝細胞又は前駆細胞のそれぞれが、ＨＬＡクラスＩ欠損、及び少なくとも１つのＮＫ細胞デコイ受容体をコードする導入遺伝子を含む、非ヒト哺乳動物。
２７．移植された細胞集団が、非ヒト哺乳動物に対して同種又は異種の細胞集団である、実施形態２６の非ヒト哺乳動物。
２８．非ヒト哺乳動物がインビボバイオリアクターであり、任意選択で、インビボバイオリアクターがマウス、ラット、又はブタである、実施形態２６又は２７に記載の非ヒト哺乳動物。
２９．低免疫原性ヒト肝細胞又はその前駆細胞が初代ヒト肝細胞である、実施形態２６～２８のいずれか１つに記載の非ヒト哺乳動物。
３０．ＨＬＡクラスＩ欠損がＢ２Ｍ欠損を含む、実施形態２６～２９のいずれか１つに記載の非ヒト哺乳動物。
３１．少なくとも１つのＮＫ細胞デコイ受容体が、ＣＤ４７、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合体、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態２６～３０のいずれか１つに記載の非ヒト哺乳動物。
３２．複数の肝細胞又は前駆細胞のそれぞれがＨＬＡクラスＩＩ欠損を更に含み、任意選択で、ＨＬＡクラスＩＩ欠損が、ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子の発現を引き起こす転写因子又はコアクチベーターにおける欠損を含み、任意選択で、転写因子又はコアクチベーターがＣＩＩＴＡである、実施形態２６～３１のいずれか１つに記載の非ヒト哺乳動物。
３３．実施形態２６～３２のいずれか１つに記載の非ヒト哺乳動物から単離された、増殖させた低免疫原性ヒト肝細胞又はその前駆細胞の集団を含む、肝細胞又はその前駆細胞の集団。
３４．肝細胞又はその前駆細胞の集団が凍結保存されている、実施形態３３に記載の肝細胞又はその前駆細胞の集団。
３５．複数の低免疫原性初代ヒト肝細胞を含む細胞集団であって、この複数の肝細胞のそれぞれが、ＨＬＡクラスＩ欠損、及び少なくとも１つのＮＫ細胞デコイ受容体をコードする導入遺伝子を含む、細胞集団。
３６．ＨＬＡクラスＩ欠損がＢ２Ｍ欠損を含む、実施形態３５に記載の細胞集団。
３７．少なくとも１つのＮＫ細胞デコイ受容体が、ＣＤ４７、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合体、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態３５又は３６に記載の細胞集団。
３８．複数の肝細胞のそれぞれがＨＬＡクラスＩＩ欠損を更に含み、任意選択で、ＨＬＡクラスＩＩ欠損が、ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子の発現を引き起こす転写因子又はコアクチベーターにおける欠損を含み、任意選択で、転写因子又はコアクチベーターがＣＩＩＴＡである、実施形態３５～３７のいずれか１つに記載の細胞集団。
３９．遺伝子改変されたヒト肝細胞を生成する方法であって、方法が、
ヒト肝細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団を、遺伝子産物をコードする導入遺伝子を含む組み込みベクターと、導入遺伝子の機能的組み込みに十分な条件下で接触させて、組み込まれた導入遺伝子を含む遺伝子改変された肝細胞又はその前駆細胞を産生することと、
遺伝子改変された肝細胞又はその前駆細胞をインビボバイオリアクターに移植し、遺伝子改変された肝細胞又は前駆細胞の増殖に十分な条件下でインビボバイオリアクターを維持して、遺伝子産物を発現する遺伝子改変されたヒト肝細胞の増殖させた集団を生成することと、を含み、任意選択で、インビボバイオリアクターがマウス、ラット、又はブタである、方法。
４０．ヒト肝細胞又はその前駆細胞が初代ヒト肝細胞である、実施形態３９に記載の方法。
４１．遺伝子改変されたヒト肝細胞の増殖させた集団を凍結保存することを更に含む、実施形態３９又は４０に記載の方法。
４２．導入遺伝子が、銅輸送ＡＴＰアーゼ２（ＡＴＰ７Ｂ）、遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質（ＨＦＥ）、ヘモジュベリン、ヘプシジン（ＨＡＭＰ）、トランスフェリン受容体タンパク質２（ＴＦＲ２）、溶質キャリアファミリー４０メンバー１（ＳＬＣ４０Ａ１）、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子、カルバモイルリン酸シンターゼ（ＣＰＳ１）、Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ（ＮＡＧＳ）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、α－ガラクトシダーゼＡ遺伝子（ＧＬＡ）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素（ＰＡＨ）、アルギナーゼ（ＡＲＧ）、α１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（ＦＡＨ）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、アルギニノコハク酸シンターゼ（ＡＳＳ）、オルニチントランスロカーゼ（ＯＲＮＴ１）、シトリン、ＵＤＰ－グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、セリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ）、補体因子Ｈ（ＣＦＨ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子産物をコードする、実施形態３９～４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．対象の症状を処置する方法であって、この方法が、
実施形態３９～４２のいずれか１つに記載の方法に従って生成された有効量の遺伝子改変されたヒト肝細胞を対象に投与すること、を含む、方法。
４４．症状が肝臓症状である、実施形態４３に記載の方法。
４５．症状が、遺伝子性疾患、任意選択で単一遺伝子性疾患である、実施形態４３又は実施形態４４に記載の方法。
４６．症状が第ＶＩＩＩ因子欠損症であり、導入遺伝子が第ＶＩＩＩ因子をコードする、実施形態４５に記載の方法。
４７．症状が血友病Ａである、実施形態４６に記載の方法。
４８．症状が第ＩＸ因子欠損症であり、導入遺伝子が第ＩＸ因子をコードする、実施形態４５に記載の方法。
４９．導入遺伝子がＰａｄｕａバリアント第ＩＸ因子をコードする、実施形態４８に記載の方法。
５０．症状が血友病Ｂである、実施形態４８又は４９に記載の方法。
５１．対象における凝固を調節することを更に含む、実施形態４６～５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．症状が尿素回路異常症（ＵＣＤ）であり、導入遺伝子が１つ以上の尿素回路ポリペプチドをコードする、実施形態４３に記載の方法。
５３ａ．導入遺伝子が、窒素老廃物の代謝において律速である１つ以上の尿素回路ポリペプチドをコードする、実施形態５２に記載の方法。
５３ｂ．症状が、リソソーム蓄積症、任意選択でファブリー病であり、導入遺伝子が、リソソーム蓄積症に関連する酵素、任意選択のα－ガラクトシダーゼＡポリペプチドをコードする、実施形態４３に記載の方法。
５４．移植された細胞集団を含む非ヒト哺乳動物であって、細胞集団が複数の遺伝子改変されたヒト肝細胞を含み、この複数の肝細胞のそれぞれが、遺伝子産物をコードする機能的に組み込まれた導入遺伝子を含む、非ヒト哺乳動物。
５５．移植された細胞集団が、インビボで増殖させた細胞集団であり、非ヒト哺乳動物が、遺伝子改変されたヒト肝細胞の子孫肝細胞を更に含む、実施形態５４に記載の非ヒト哺乳動物。
５６．遺伝子改変されたヒト肝細胞が、ＨＬＡクラスＩ欠損、及び少なくとも１つのＮＫ細胞デコイ受容体をコードする導入遺伝子を更に含む、実施形態５４又は５５に記載の非ヒト哺乳動物。
５７．複数の肝細胞のそれぞれがＨＬＡクラスＩＩ欠損を更に含み、任意選択で、ＨＬＡクラスＩＩ欠損が、ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子の発現を引き起こす転写因子又はコアクチベーターにおける欠損を含み、任意選択で、転写因子又はコアクチベーターがＣＩＩＴＡである、実施形態５６に記載の非ヒト哺乳動物。
５８．導入遺伝子が、銅輸送ＡＴＰアーゼ２（ＡＴＰ７Ｂ）、遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質（ＨＦＥ）、ヘモジュベリン、ヘプシジン（ＨＡＭＰ）、トランスフェリン受容体タンパク質２（ＴＦＲ２）、溶質キャリアファミリー４０メンバー１（ＳＬＣ４０Ａ１）、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子、カルバモイルリン酸シンターゼ（ＣＰＳ１）、Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ（ＮＡＧＳ）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、α－ガラクトシダーゼＡ遺伝子（ＧＬＡ）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素（ＰＡＨ）、アルギナーゼ（ＡＲＧ）、α１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（ＦＡＨ）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、アルギニノコハク酸シンターゼ（ＡＳＳ）、オルニチントランスロカーゼ（ＯＲＮＴ１）、シトリン、ＵＤＰ－グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、セリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ）、補体因子Ｈ（ＣＦＨ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子産物をコードする、実施形態５４～５７のいずれか１つに記載の非ヒト哺乳動物。
５９．非ヒト哺乳動物がインビボバイオリアクターである、実施形態５４～５８のいずれか１つに記載の非ヒト哺乳動物。
６０．インビボバイオリアクターがげっ歯類である、実施形態５９の非ヒト哺乳動物。
６１．げっ歯類インビボバイオリアクターがラットインビボバイオリアクターである、実施形態５９の非ヒト哺乳動物。
６２．インビボバイオリアクターがブタである、実施形態５９の非ヒト哺乳動物。
６３．げっ歯類インビボバイオリアクターが、インターロイキン２受容体サブユニットガンマ（ＩＬ２ｒｇ）、組換え活性化遺伝子１（ＲＡＧ１）、組換え活性化遺伝子２（ＲＡＧ２）、又はそれらの組み合わせを欠損している、実施形態６０～６２のいずれか１つに記載の非ヒト哺乳動物。
６４．げっ歯類インビボバイオリアクターが、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（ＦＡＨ）を欠損している、実施形態６０～６３のいずれか１つに記載の非ヒト哺乳動物。
６５．実施形態５４～６２のいずれか１つに記載の非ヒト哺乳動物であって、その遺伝子改変されたヒト肝細胞が、改変された初代ヒト肝細胞である、非ヒト哺乳動物。
６６．実施形態５４～６５のいずれか１つに記載の非ヒト哺乳動物から単離された、遺伝子改変されたヒト肝細胞の増殖させた集団を含む、肝細胞又はその前駆細胞の集団。
６７．肝細胞の集団が凍結保存されている、実施形態６６に記載の肝細胞又はその前駆細胞の集団。
６８．集団が、１億～２００億個の肝細胞又はその前駆細胞を含む、実施形態６６又は６７に記載の肝細胞又はその前駆細胞の集団。
６９．肝細胞又はその前駆細胞が容器中に存在し、任意選択で、容器が培養容器、チューブ、フラスコ、バイアル、クライオバイアル、又はクライオバッグである、実施形態６６～６８のいずれか１つに記載の肝細胞又はその前駆細胞の集団。
７０．複数の低免疫原性初代ヒト肝細胞を含む細胞集団であって、この複数の肝細胞のそれぞれが、ＨＬＡクラスＩ欠損、及び少なくとも１つのＮＫ細胞デコイ受容体をコードする導入遺伝子を含む、細胞集団。
７１．１億～２００億個の低免疫原性初代ヒト肝細胞を含む、実施形態７０に記載の細胞集団。
７２．細胞集団が容器中に存在し、任意選択で、容器が培養容器、チューブ、フラスコ、バイアル、クライオバイアル、又はクライオバッグである、実施形態７０又は実施形態７１に記載の細胞集団。
７３．複数の肝細胞治療用量を生成する方法であって、方法が、
（１ａ）ヒト肝細胞を遺伝子改変し、遺伝子改変されたヒト肝細胞を１つ以上のインビボバイオリアクター中で増殖させて、遺伝子改変されたヒト肝細胞の増殖させた集団を生成すること、又は
（１ｂ）１つ以上のインビボバイオリアクターから得られた増殖させたヒト肝細胞を遺伝子改変して、遺伝子改変されたヒト肝細胞の増殖させた集団を生成することと、
（２）１ａ又は１ｂの遺伝子改変されたヒト肝細胞の増殖させた集団を複数の肝細胞治療用量に分割することと、を含む、方法。
７４．複数が、それぞれ少なくとも１０億個の肝細胞の少なくとも１０回の投与、任意選択でそれぞれ少なくとも１００億個の肝細胞の少なくとも１０回の投与、任意選択でそれぞれ少なくとも１０億個の細胞の少なくとも１００回の投与を含む、実施形態７３に記載の方法。
７５．ヒト肝細胞が単一のヒト肝臓に由来する、実施形態７３又は７４に記載の方法。
７６．症状を有する複数の対象を処置する方法であって、方法が、
実施形態７３～７５のいずれか１つに記載の複数の肝細胞治療用量を生成することと、
この複数のうちの１つ以上の用量を対象の各々に投与して、症状について対象を処置することと、を含む、方法。
７７．複数の対象が、少なくとも１０体の対象、任意選択で少なくとも１００体の対象を含む、実施形態７６に記載の方法。
７８．複数の対象のそれぞれが、同じ症状について処置される、実施形態７６又は７７に記載の方法。
７９．複数の対象のうちの２体以上が、異なる症状について処置される、実施形態７６又は７７に記載の方法。
８０．キット又はシステムであって、
１つ以上の改変試薬であって、
遺伝子産物をコードする導入遺伝子を含むベクターであって、肝細胞若しくはその前駆細胞への導入遺伝子の機能的組み込みに十分なベクター、及び／又は
肝細胞若しくはその前駆細胞におけるＨＬＡクラスＩ欠損を生じさせるのに十分な編集組成物、を含む、１つ以上の改変試薬と、
任意選択で、１つ以上の改変試薬を使用して肝細胞又はその前駆細胞を改変して、遺伝子改変された肝細胞又はその前駆細胞を生成し、遺伝子改変された細胞をバイオリアクター中で増殖させるための説明書と、を含む、キット又はシステム。
８１．ベクターが、肝細胞又はその前駆細胞への導入遺伝子の機能的組み込みに十分な組み込みベクターである、実施形態８０に記載のキット又はシステム。
８２．編集組成物が、ＨＬＡクラスＩ欠損を生じさせるのに十分な非ウイルスベクター、任意選択でＬＮＰを含む、実施形態８０又は８１に記載のキット又はシステム。
８３．遺伝子改変された肝細胞又はその前駆細胞の凍結保存のための１つ以上の試薬を更に含む、実施形態８０～８２のいずれか１つに記載のキット又はシステム。
以下の実施例は、当業者に、本発明の作製及び使用方法の完全な開示及び説明を提供するために提示される。本発明者らが本発明とみなす範囲を限定することを意図するものではない。別段の指示がない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧又は大気圧付近である。
分子生化学及び細胞生化学における一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２０１２）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ ｔｈ Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９９）；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９６）；及びＣｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８）などの標準的な教科書に見出すことができ、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。本開示において言及される試薬、抗体、細胞、組織サンプルなど、及びキットは、限定されないが、本明細書において特定される供給業者などの商業的供給業者から入手可能である。
実施例１：ユニバーサルヒト肝細胞の生成
（１）ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩを欠損し、それによってインビボで細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による認識を遮断するように、及び（２）ＮＫ細胞に対するデコイ受容体を発現し、それによってインビボでナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による死滅を阻害するように、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）をエクスビボで操作することによって、ユニバーサルヒト肝細胞を生成した。ＨＬＡクラスＩ欠損は、β２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的化ノックアウトによって達成され、ＮＫ細胞デコイ受容体発現は、ＣＤ４７又はＢ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合構築物のいずれかをコードする導入遺伝子を保有するレンチウイルスベクターによる形質導入によって達成された。
遺伝子編集試薬をＰＨＨに送達するための様々な方法を採用し、評価した。これには、トランスフェクション又はヌクレオフェクションによって細胞に送達されるリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を含有するＣａｓ９及び合成化学修飾ｇＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）の産生が含まれるが、これに限定されない。例えば、ＲＮＰトランスフェクションは、ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）Ｃａｓ９システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｓｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の指示に従って使用して実施した。簡潔には、ＴｒｕｅＣｕｔ（商標）Ｃａｓ９ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｖ２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び合成化学修飾ｓｇＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）をＲＮＰに複合体化し、次いで、ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）試薬と共に、新鮮に解凍したＰＨＨに直接添加し、次いで、３７℃のインキュベーター内で２時間揺動させた。Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔを製造業者の指示に従って使用して、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｘ Ｕｎｉｔ上でＲＮＰヌクレオフェクションを行った。
本実施例で使用されるＢ２Ｍ遺伝子座のエクソン１を標的とする例示的なｇＲＮＡ配列は、以下の通りである。
Figure 2024505188000001
対照として、無関係なセーフハーバー遺伝子座であるＡＡＶＳ１を、上記と同じＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して標的化したが、以下の配列を有するＡＡＶＳ１標的化ｇＲＮＡを用いた。
Figure 2024505188000002
編集後、ヌクレオフェクション又はトランスフェクションプロトコルに供した細胞に、ＣＤ４７又はＢ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合導入遺伝子のいずれかを含有するレンチウイルスベクター（ＬＶＶ）を用いて、３７℃で揺動しながら２時間形質導入した。使用した導入遺伝子の配列は以下の通りである。
Figure 2024505188000003
ＬＶＶを添加せずに２時間揺動させた陰性対照模擬形質導入も実施し、ＬＶＶ形質導入の非存在下でのＢ２Ｍ又は対照遺伝子座編集の評価を可能にした。
標的化Ｂ２Ｍ遺伝子座又はＡＡＶＳ１対照遺伝子座における編集効率を評価した。簡潔には、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を細胞サンプルから抽出し、目的の領域をＰＣＲ増幅した。増幅されたＤＮＡをサンガー法によって配列決定し、得られたリードを、分解によるインデルの追跡（ＴＩＤＥ）解析に供した。標的化編集又は対照編集のいずれかに供された細胞における、Ｂ２Ｍ及び／又は発現された導入遺伝子の、得られたタンパク質発現レベルを、抗ＨＬＡ－ＡＢＣ、抗ＨＬＡ－Ｅ、及び／又は抗ＣＤ４７特異的抗体を使用するフローサイトメトリーによって評価した。
図１に示されるように、インデル（左ｙ軸、黒色バー）又はノックアウト（ＫＯ）スコア（左ｙ軸、灰色バー）によって測定される８０％以上の編集効率が、それぞれ、Ｂ２Ｍ標的遺伝子座及びＡＡＶＳ１対照遺伝子座の両方で観察された。Ｂ２Ｍエクソン１標的化試薬単独（「Ｂ２Ｍｅｘ１－７ ＲＮＰのみ」）又は対照遺伝子座標的化試薬単独（「ＡＡＶＳ１ ＲＮＰのみ」）による編集効率は、ＮＫ細胞デコイ受容体ＬＶＶ形質導入、すなわち、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合体（「Ｂ２Ｍｅｘ１－７ ＨＬＡ－Ｅ」、「ＡＡＶＳ１ ＨＬＡ－Ｅ」）又はＣＤ４７（「Ｂ２Ｍｅｘ１－７ ＣＤ４７」、「ＡＡＶＳ１ ＣＤ４７」）が含まれるときに観察された効率と同様であった。更に、フローサイトメトリーによって測定されたＢ２Ｍ陰性細胞（「Ｂ２Ｍ－」）のパーセンテージ（右ｙ軸、赤色ドット）は、Ｂ２Ｍ編集サンプル（「Ｂ２Ｍｅｘ１－７ ＨＬＡ－Ｅ」、Ｂ２Ｍｅｘ１－７ ＣＤ４７」、及び「Ｂ２Ｍｅｘ１－７ ＲＮＰのみ」）中の細胞の少なくとも８０％がＢ２Ｍタンパク質を発現していないことを示した。比較すると、ＡＡＶＳ１対照サンプル（「ＡＡＶＳ１ ＨＬＡ－Ｅ」、「ＡＡＶＳ１ ＣＤ４７」、及び「ＡＡＶＳ１ ＲＮＰのみ」）中の細胞の３０％未満、場合によっては２０％未満がＢ２Ｍ陰性であった。これらのデータは、ゲノムレベル及びタンパク質レベルの両方でＢ２Ｍ ＫＯの高い編集効率及び特異性を達成する、記載された編集プロセスによるＢ２Ｍ陰性ＰＨＨの産生の成功を実証する。
Ｂ２Ｍ ＫＯに加えて、導入されたＮＫデコイ受容体導入遺伝子、ＣＤ４７及びＨＬＡ－Ｅの発現もまた、処置されたＰＨＨにおいて評価した。前述の群（「Ｂ２Ｍｅｘ１－７ ＨＬＡ－Ｅ」、「Ｂ２Ｍｅｘ１－７ ＣＤ４７」、「Ｂ２Ｍｅｘ１－７ ＲＮＰのみ」、「ＡＡＶＳ１ ＨＬＡ－Ｅ」、「ＡＡＶＳ１ ＣＤ４７」、「ＡＡＶＳ１ ＲＮＰのみ」）におけるＢ２Ｍ陰性並びにＨＬＡ－Ｅ又はＣＤ４７発現の両方のフローサイトメトリー解析の結果を図２に示す。示されるように、Ｂ２Ｍ標的化編集及びデコイ受容体形質導入の両方に供された群において、Ｂ２Ｍに対して陰性であると同時にデコイ受容体発現に対して陽性である、高レベルの細胞（「％Ｂ２Ｍ－／ＨＬＡ－Ｅ」又は「％Ｂ２Ｍ－／ＣＤ４７＋」）が観察された。対応して、低レベルのＢ２Ｍ陰性が対照編集反応（「ＡＡＶＳ１ ＨＬＡ－Ｅ」、「ＡＡＶＳ１ ＣＤ４７」、「ＡＡＶＳ１ ＲＮＰのみ」）において観察され、デコイ受容体は、ＬＶＶで処置しなかった反応（「Ｂ２Ｍｅｘ１－７ ＲＮＰのみ」、「ＡＡＶＳ１ ＲＮＰのみ」）において本質的に存在しなかった。これらのデータは、Ｂ２Ｍ陰性であり、かつ２つの異なるＮＫ細胞デコイ受容体のうちの１つを発現する、ＰＨＨの成功した効率的な産生を実証する。
加えて、これらのデータは、上記のアプローチが、ＮＫ細胞デコイ受容体を発現しながらＨＬＡクラスＩが欠損している、５０％超、場合によっては少なくとも６０％、少なくとも７０％、又は少なくとも８０％の二重操作されたＰＨＨを含有するＰＨＨの集団をもたらすことを実証する。そのようなパーセンテージは限定的であるとは考えられず、したがって、８０％を超える二重操作肝細胞を有する集団は、本明細書に記載されるこれら及び他の方法によって容易に達成することができる。
実施例２：低免疫原性である二重操作された初代ヒト肝細胞
Ｂ２Ｍ ＫＯを有し、ＣＤ４７又はＢ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合導入遺伝子のいずれかを発現する二重操作されたＰＨＨを、本質的に上記のように産生した。二重操作された細胞を様々な比率で様々な免疫細胞組成物と混合し、生存アッセイを行った。簡潔には、操作された細胞を、サイトカイン刺激によって活性化され、強力なエフェクター機能を有する、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む、免疫細胞と混合し、二重操作された細胞の生存（すなわち、生存率）を経時的に評価した。
例えば、２：１の免疫細胞対標的細胞共培養における生存を、４つの異なる標的細胞群、すなわち、（１）二重操作されたＢ２Ｍエクソン１ ＫＯ＋Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ導入遺伝子細胞、（２）二重操作されたＢ２Ｍエクソン１ ＫＯ＋ＣＤ４７導入遺伝子細胞、（３）単一操作されたＢ２Ｍエクソン１ ＫＯ ＲＮＰのみの細胞、及び（４）ＡＡＶＳ１ ＲＮＰのみの対照細胞について評価した。免疫細胞は、主にＣＴＬから作製されたエフェクター細胞の混合物を含み、生存を、７２時間にわたる定量的画像処理ベースの細胞生存率アッセイによって評価した。対照群（４）と比較して、全ての時点（２４時間、４８時間、及び７２時間）にわたって全てのＢ２Ｍノックアウト（Ｂ２Ｍ－；群１、２、３）ＰＨＨにおいて生存の実質的な増加が観察された。
別の例では、免疫細胞混合物が主にＮＫ細胞を含有する、２：１の免疫細胞対標的細胞共培養における生存を、標的細胞の４つの異なる群、すなわち、（１）二重操作されたＢ２Ｍエクソン１ ＫＯ＋Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ導入遺伝子細胞、（２）二重操作されたＢ２Ｍエクソン１ ＫＯ＋ＣＤ４７導入遺伝子細胞、（３）単一操作されたＢ２Ｍエクソン１ ＫＯ ＲＮＰのみの細胞、及び（４）ＡＡＶＳ１ ＲＮＰのみの対照細胞について評価した。二重操作された群（１）及び（２）の両方が、対照群（４）と比較して、２４時間、４８時間、及び７２時間の時点にわたって生存レベルの増加を示したが、一方、単一操作された群（３）は、Ｂ２Ｍノックアウトによって引き起こされるＮＫ細胞による「非自己認識」の増加により、対照群と比較して生存の減少を示した。
これらのデータは、Ｂ２Ｍ陰性となり、かつＮＫ細胞デコイ受容体導入遺伝子を発現するように二重操作されたＰＨＨが、操作されていない細胞及びＢ２Ｍ ＫＯのみで操作された細胞において見られる免疫細胞死滅のレベルと比較して、免疫細胞死滅の低下を受けることを示す。まとめると、これらのアッセイは、ＰＨＨへのＨＬＡクラスＩ欠損及びＮＫ細胞デコイ受容体発現の操作が、活性化されたＣＴＬ及びＮＫ細胞亜集団を含有する集団を含む、活性化された免疫エフェクター細胞集団の存在下で生存の増加を示す低免疫原性ＰＨＨを生成することを実証する。
実施例３：低免疫原性の操作された初代ヒト肝細胞を用いた肝臓再増殖
操作されたＰＨＨを、本質的に上記のように、ＬＶＶ導入遺伝子形質導入あり又はなしで、ＲＮＰトランスフェクション又はヌクレオフェクションを介してＢ２ＭのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＫＯによって生成した。操作された細胞の４つの異なる群、（１）トランスフェクションを介したＣａｓ９ Ｂ２Ｍ ＫＯ ＲＮＰ、（２）トランスフェクション＋ＬＶＶを介したＣａｓ９ Ｂ２Ｍ ＫＯ ＲＮＰ、（３）ヌクレオフェクションを介したＣａｓ９ Ｂ２Ｍ ＫＯ ＲＮＰ、及び（４）ヌクレオフェクション＋ＬＶＶを介したＣａｓ９ Ｂ２Ｍ ＫＯ ＲＮＰを、動物当たり５×１０５個の生存細胞で脾臓内注射を介してレシピエントＦＲＧＮマウスに別々に移植した。選択圧を導入し、移植された細胞の生着を促進するために、動物をＮＴＢＣによるサイクルに供した。移植された操作されたＰＨＨの生着及び増殖の代わりとして、ヒトアルブミンレベル（ｈＡＬＢ）を移植後２、４、及び８週目に評価した。
ｈＡＬＢのレベルは、３つ全ての時点にわたって全ての群において増加することが観察され、全ての群（１）～（４）の操作された細胞がレシピエント動物において生着し、増殖することができたことを示した。更に、ｈＡＬＢレベルは、対応する時点において、ＲＮＰ送達のトランスフェクションモードとヌクレオフェクションモードとの間で同等であったが、これは、肝臓生着及び再増殖が可能な、機能的な操作されたＰＨＨを生成するために、編集構成要素のいずれかの送達方法を成功裏に用いることができることを示している。加えて、インプット集団（すなわち、ＦＲＧＮバイオリアクターへの移植のために使用されるエクスビボ操作されたＰＨＨ）内の所望の操作された特徴（すなわち、Ｂ２Ｍ ＫＯ、ＨＬＡ－Ｅ導入遺伝子発現、又はＫＯ及び導入遺伝子発現の両方）を有する細胞の提示を、アウトプット集団（すなわち、インビボ増殖後の再増殖させたＦＲＧＮバイオリアクターから精製された肝細胞）と比較した。図３Ａ～図３Ｄは、ＤＮＡ解析によってＢ２Ｍ ＫＯ（図３Ａ）、フローサイトメトリー解析によってＢ２Ｍ ＫＯ（図３Ｂ）、フローサイトメトリー解析によってＨＬＡ－Ｅ導入遺伝子発現（図３Ｃ）、及びフローサイトメトリー解析によって二重改変（すなわち、Ｂ２Ｍ ＫＯ及び導入遺伝子発現の両方）（図３Ｄ）を有すると測定された、インプット集団及びアウトプット集団からの所望の操作された細胞（トランスフェクション又はヌクレオフェクションを使用して生成されたもの）のパーセントを提供する。未処置対照（ＮＴＣ）動物（すなわち、改変されていないＰＨＨを移植された動物）からのサンプルも並行して評価した。示されるように、これらの比較は、インプット集団とアウトプット集団との間で所望の操作された細胞の驚くほど類似した提示を明らかにし、操作された肝細胞と改変されていない肝細胞との間で同等の生着、増殖、及び再増殖動態を示した。加えて、研究終了時（移植後２４週）に、操作されたＰＨＨを移植された宿主ＦＲＧＮ肝臓は、改変されていないＰＨＨを受けたＮＴＣ動物と比較して、同様のレベルの再増殖及びヒト化を示した（ＦＡＨ及びｈＡｌｂ ＥＬＩＳＡについての肝臓免疫組織化学によって測定された）。例えば、操作された細胞を移植された２匹の代表的な動物は、代表的なＮＴＣ動物において観察された９０．８１％のＦＡＨ＋細胞及び１１，６０７μｇ／ｍＬのｈＡｌｂと比較して、８９．７６％及び８９．５４％のＦＡＨ＋細胞の再増殖、並びに１２，４８９μｇ／ｍＬ及び１１，６１５μｇ／ｍＬレベルのｈＡｌｂを示した。
まとめると、これらのデータは、本明細書に記載される方法に従ってゲノム編集及び／又は組み込まれた導入遺伝子を用いて操作された、低免疫原性ＰＨＨ、並びにＰＨＨ全般が、機能的であり、レシピエント肝臓を再増殖させることができることを示す。そのような再増殖は、編集されていない／改変されていない細胞に匹敵する動態で起こることが見られたが、これは、このようにして操作された肝細胞及びそれらの子孫が宿主肝臓において存続することを示す。したがって、本明細書に記載されるように任意の編集又は導入遺伝子で操作されたユニバーサル肝細胞及び肝細胞全般が、例えば、インビボバイオリアクターに移植されて増殖に成功したり、治療目的のために対象に移植されたりなどし得る。
実施例４：インビボで生着し、増殖し、生理学的に適切な量の治療用導入遺伝子産物を産生する、導入遺伝子操作されたＰＨＨ
インビボＦＲＧラット増殖させたヒト肝細胞（ｈｕＦＲＧ）を単離し、凍結保存した。凍結保存のために、肝細胞細胞懸濁液を容器に分割し、遠心分離によってペレット化した。細胞ペレットを低温条件下で凍結保存培地に穏やかに再懸濁して、所望の最終濃度（例えば、１ｍＬ当たり１０００万個の生細胞など）に到達させ、再懸濁した細胞を４～８℃で維持した。凍結保存のために調製した肝細胞を凍結容器に分割し、速度制御フリーザーを用いて凍結した。速度制御された凍結が完了した後、凍結保存された肝細胞を貯蔵のために気相液体窒素に移した。凍結保存したｈｕＦＲＧ肝細胞を解凍し、レンチウイルスベクターを介して、マーカー／対照としてヒト第ＩＸ因子（すなわち、Ｆ９又はＦＩＸ）又はホタルルシフェラーゼ（すなわち、Ｌｕｃ）のいずれかをコードする発現カセットを形質導入した。
本実施例で使用したレンチウイルスベクター（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ／Ｃｕｒｉａ）Ｆ９発現構築物は、３’ＬＴＲ（配列番号００４）に作動可能に連結された、Ｆ９ Ｐａｄｕａバリアントポリペプチド（配列番号００３）をコードする、Ｆ９コード配列（配列番号００２）に作動可能に連結されたＭＮＤプロモーター（配列番号００１）を含んでいた。
本実施例で使用したレンチウイルスベクター（Ｉｍａｎｉｓ ＬＶ０５０Ｌ）Ｌｕｃ発現構築物は、Ｌｕｃポリペプチド（配列番号００７）をコードする、Ｌｕｃコード配列（配列番号００６）に作動可能に連結されたＳＦＦＶプロモーター（配列番号００５）、及び３’ＬＴＲ（配列番号００４）に作動可能に連結された、ＥｍＧＦＰポリペプチド（配列番号００９）をコードする、ＥｍＧＦＰコード配列（配列番号００８）を含んでいた。
形質導入後、形質導入されたｈｕＦＲＧ肝細胞を、脾臓内注射を介してＦＲＧＮレシピエントマウスに移植し、移植されたｈｕＦＲＧ肝細胞の生着及び増殖に十分な条件下でマウスを維持した。続いて、Ｆ９をコードするレンチウイルスベクターを移植したマウス（以下、「ＬＶ－Ｆ９マウス」）又はルシフェラーゼをコードするレンチウイルスベクターを移植したマウス（以下、「ＬＶ－Ｌｕｃマウス」）のいずれかを、ＩＶＩＳ生存動物生物発光イメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を使用して、宿主マウス肝臓内の移植された細胞の増殖中の様々な時点でルシフェラーゼ生物発光についてアッセイした。図４は、移植後５７～６０日目、８５日目及び９７日目のＬＶ－Ｆ９及びＬＶ－Ｌｕｃマウスの代表的なＩＶＩＳ画像を提供し、ＬＶ－Ｌｕｃマウスにおいて実質的な生物発光を示し、後の時点で強度が増加している。このアッセイにおいて、ＬＶ－Ｆ９ベクターはルシフェラーゼをコードせず、したがってＬＶ－Ｆ９マウスにおいて生物発光が検出されないと予想されるため、ＬＶ－Ｆ９マウスは有用な陰性対照として機能する。
ＩＶＩＳで測定された生物発光は定量化されており、図５は、移植後５７日目又は６０日目、８５日目及び９７日目における個々のＬＶ－Ｆ９マウス及びＬＶ－Ｌｕｃマウスのそのような定量化（１秒当たりの光子の総フラックス（ｐ／ｓ）として測定される）を提供する。定量化により、上記の定性的観察、すなわち、ＬＶ－Ｌｕｃ動物が、例えば、ＬＶ－Ｆ９動物と比較して、実質的な生物発光を示し、生物発光強度が、初期の５７日目又は６０日目の時点と比較して、後期の時点でより大きかったことが確認される。まとめると、これらの知見は、宿主マウスにおける形質導入されたｈｕＦＲＧ肝細胞の有効な生着、並びに導入された導入遺伝子（この場合、ルシフェラーゼ）が、移植後少なくとも数ヶ月間、生着肝細胞及び／又はそれらの子孫から首尾よくかつ持続的に発現されたことを実証する。
上記と同様の方法を用いて、ｈｕＦＲＧ肝細胞に、ヒトＦ９のＰａｄｕａバリアント（別名「Ｒ３３８Ｌ」置換（Ｓｉｍｉｏｎｉ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００９；３６１：１６７１－５）、Ｒ３８４Ｌ置換に対応する（野生型ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ００７４０；ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０００１２４．１；配列番号０１０と比較して）をコードする発現カセットを含有するレンチウイルスベクターを形質導入した。これは、正常な生理学的レベルの８倍（８ｘ）の凝固活性を示す（Ｌｏｚｉｅｒ．Ｂｌｏｏｄ（２０１２）１２０（２３）：４４５２－４４５３を参照されたい）。５００，０００個の形質導入されたｈｕＦＲＧ肝細胞を、脾臓内注射を介してＦＲＧＮレシピエントマウスに移植し、移植されたｈｕＦＲＧ肝細胞の生着及び増殖に十分な条件下でマウスを維持した。ヒトアルブミン及びヒトＦ９レベルを、移植後の様々な時点でＬＶ－Ｆ９マウスから収集した血液サンプルにおいて測定した。ＬＶ－Ｌｕｃを形質導入したｈｕＦＲＧ肝細胞を移植したマウスを対照として使用し、対応するヒトアルブミン及びヒトＦ９測定値をＬＶ－Ｌｕｃ対照動物から収集した。
図６は、移植後１４、２８、４７、及び９８日目に収集したＬＶ－Ｆ９及びＬＶ－Ｌｕｃマウスからの末梢血サンプルにおいて測定された異種ヒトアルブミンのレベル（マイクログラム／ミリリットル、対数スケール）を提供する。容易に分かるように、ヒトアルブミンのレベルは、両方のコホートにおいて着実に増加し、それぞれの宿主肝臓において同様のレベルのＬＶ－Ｆ９及びＬＶ－Ｌｕｃ ｈｕＦＲＧ操作肝細胞の生着及び増殖を示した。加えて、ヒトアルブミンレベルは、９８日までに少なくとも７０～８０％のヒト化と一致するレベルに最終的に達し、これは、エクスビボ操作された肝細胞の頑強なインビボ生着及び増殖を示す。
図７は、移植後１４、２８、４７、及び９８日目に収集したＬＶ－Ｆ９及びＬＶ－Ｌｕｃマウスからの末梢血サンプルにおいて測定された異種ヒトＦ９のレベル（ナノグラム／ミリリットル、対数スケール）を提供する。アッセイの検出下限（ＬＯＤ）を水平の点線で示す。臨床欠損症（例えば、単一遺伝子性疾患において観察されるようなもの）における操作されたｈｕＦＲＧ肝細胞の治療可能性を評価するための代用として、（１）Ｆ９欠損ヒト対象において所望の治療効果を達成するために必要なレベル（すなわち、正常な生理学的レベルの５％、２５０ｎｇ／ｍＬ、「５％正常Ｆ９」）又は（２）ヒト対象における正常な生理学的レベル（すなわち、正常な生理学的レベルの１００％、５０００ｎｇ／ｍＬ、「１００％正常Ｆ９」）に対応するＦ９レベルもまた、水平の点線によって示される。
図７に容易に見られるように、ＬＶ－Ｆ９マウスは、移植後に評価された最初の時点（すなわち、１４日目）と少なくとも同じくらい早く、所望の治療効果に必要なレベルを超えるヒトＦ９レベルに達した。更に、ＬＶ－Ｆ９マウスは、移植後少なくとも２８日目までに正常な生理学的レベルの１００％を超えるヒトＦ９レベルに達した。このようなマウスは、後続の全ての時点で生理学的レベルを超えるヒトＦ９を示し続けた。
まとめると、これらの知見は、ヒトＦ９を発現するようにエクスビボ操作されたｈｕＦＲＧ肝細胞が、レシピエント末梢血中に容易に生着し、増殖し、検出できるレベルのヒトＦ９を産生することを実証する。更に、移植されたマウスは、ヒトＦ９欠損症における治療効力について十分なレベルに相当する末梢血中のヒトＦ９のレベルに急速に達した。加えて、正常なヒト生理学的Ｆ９レベルの１００％に相当するレベル、更にはそれを超えるレベルが達成され、最後に測定された時点まで持続した。
ＬＶ－Ｌｕｃマウスに移植されたＨｕＦＲＧ肝細胞は、第ＩＸ因子をコードする内因性ヒト遺伝子を含有する。したがって、これらの細胞は、ＬＶ－Ｆ９ ｈｕＦＲＧ肝細胞のように異種Ｆ９導入遺伝子を保有してはいないが、Ｌｕｃ肝細胞は、それにもかかわらず、内因性遺伝子座からヒトＦ９を発現する。ＬＶ－Ｌｕｃマウスから収集された末梢血中のヒトＦ９の初期（すなわち、移植後１４日目及び２８日目の）レベルはＬＯＤ以下であったが（例えば、図７を参照されたい）、ヒトＦ９レベルは、宿主肝臓内でのｈｕＦＲＧ細胞の実質的な増殖後（ヒトアルブミンレベルを測定することによって確認される）、後の時点で最終的に有意なレベルに達した（例えば、図７、ＬＶ－Ｆ９ ｄ４７及びｄ９８を参照されたい）。ＬＶ－ＬｕｃマウスにおけるそのようなヒトＦ９産生と比較して、ＬＶ－Ｆ９マウスにおけるヒトＦ９産生は、各時点で実質的により高く、治療レベル及び生理学的レベルのより迅速な達成並びに測定された最終時点での全体的により高いレベルを示した。例えば、ＬＶ－Ｆ９マウスは２８日目までにＦ９の正常な生理学的レベルの１００％に達したが、ＬＶ－Ｌｕｃマウスは９８日目の時点までに正常な生理学的レベルの１００％に達しなかった。したがって、これらのデータは、Ｆ９導入遺伝子の存在が、治療効果の開始及び効力の両方において有意な利点を提供することを示す。
図８は、４７日目の時点での各動物において測定されたヒトＦ９レベル対各動物における対応するヒトアルブミンレベルのプロットを提供する。０．１％、１％、及び５％生着に対する、並びに正常な生理学的ヒトＦ９の５％及び１００％に対する参照レベルが、それぞれ、垂直及び水平の点線として示されている。全ての場合において、実質的に同様のレベルの生着を有するマウスを比較した場合、Ｐａｄｕａ Ｆ９導入遺伝子を用いてエクスビボ操作されたｈｕＦＲＧ肝細胞を受けたマウスは、対応するＬＶ－Ｌｕｃマウスと比較して、末梢血においてより高いヒトＦ９レベルを有した。したがって、データは、例えば、内因性遺伝子座からＦ９を発現する細胞と比較して、Ｆ９導入遺伝子を受容した細胞における細胞当たりのＦ９発現のレベルがより高いことを更に裏付ける。更に、この分析は、ヒトＦ９導入遺伝子を発現するようにエクスビボ操作されたｈｕＦＲＧ肝細胞の１％未満の生着、更には０．２％の低い生着が、末梢血中のヒトＦ９の治療濃度及び更には正常な生理学的濃度の両方を達成するのに十分であることを実証する。
図９は、９６日目の時点での動物に対する、図８に対応するプロットを提供する。ＬＶ－Ｌｕｃ及びＬＶ－Ｆ９動物において生着のレベルが同様であるにもかかわらず（全てのデータ点がｘ軸上で実質的に同様の位置にあることによって示される）、ＬＶ－Ｆ９動物の末梢血は、ＬＶ－Ｌｕｃ動物からの末梢血と比較して約６０倍（６０ｘ）多いヒトＦ９を含有した。Ｐａｄｕａバリアントのこの高レベルの発現及び増強された凝固活性を考慮すると、ＬＶ－Ｆ９マウスは、ＬＶ－Ｌｕｃ対照動物よりも４９０倍（４９０ｘ）大きい理論的凝固活性を示す。
まとめると、これらのデータは、治療用導入遺伝子を含有及び発現するように操作されたヒト肝細胞の、宿主肝臓内での生着及び増殖の成功を実証する。更に、これらのデータは、導入遺伝子を保有する操作された肝細胞の生着及び増殖が（導入遺伝子の同一性を問わず）、導入遺伝子を保有しない対照細胞において見られる生着及び増殖に少なくとも匹敵することを実証する。更に、導入遺伝子操作肝細胞からの治療因子の観察された高レベルの発現（例えば、操作されていない細胞における関連する内因性因子の対応する発現と比較して）を考慮すると、このような操作肝細胞の生着及び増殖は、本明細書に記載されるように、数ヶ月にわたることを含む時間にわたって増加及び持続する治療的に適切なレベルの導入遺伝子発現産物の迅速な達成を提供する。
実施例５：血友病Ｂのための第ＩＸ因子操作ヒト肝細胞の生成及び増殖
ヒト肝細胞への導入が、血友病Ｂなどの第ＩＸ因子欠損症を有するヒト対象など、それを必要とする対象に移植された操作された肝細胞によって治療用導入遺伝子産物の発現を促進するように、以下の発現構築物を設計した。
本実施例において使用されるＦ９発現構築物は、例えば、ポリアデニル化シグナル（ポリＡ）を含む好適な３’配列に作動可能に連結された、例えば、完全長Ｆ９ポリペプチド（配列番号０１０）をコードする完全長Ｆ９コード配列（配列番号０１１）、Ｆ９ Ｐａｄｕａバリアントポリペプチド（配列番号００３）をコードするＰａｄｕａバリアントＦ９コード配列（配列番号００２）などのＦ９コード配列に作動可能に連結された、例えば、ＭＮＤプロモーター（配列番号００１）などの好適なプロモーターを含む。
容易に理解されるように、いくつかの例では、例えば、記載されるプロモーターの別の適切なプロモーターへの交換、導入遺伝子コード配列の、同じ導入遺伝子又は導入遺伝子のバリアントをコードする別のコード配列への交換、導入遺伝子の配列３’の別の３’配列（例えば、代替的なポリＡ又は他の３’成分を含む）への交換などを含む置換が、上記の構築物において行われ得る。発現構築物は、肝細胞への形質導入のために、好適なレンチウイルスベクターに導入される。
新鮮に単離されたヒト肝細胞、又は最近解凍された凍結保存肝細胞に、上記の発現構築物の１つが形質導入される。有用な新鮮に単離されたヒト肝細胞としては、死体ドナー肝組織から単離されたもの、並びにインビボバイオリアクター中で増殖され、インビボバイオリアクターから単離されたものが挙げられる。有用な凍結保存肝細胞としては、死体ドナー肝組織からの単離後に凍結保存されたもの、並びにインビボバイオリアクター中での増殖及びインビボバイオリアクターからの単離後に凍結保存されたものが挙げられる。したがって、形質導入は、インビボバイオリアクター（例えば、げっ歯類バイオリアクターなど）におけるヒト肝細胞の増殖の前又は後に行われる。
上記構築物のいずれかを形質導入されたヒト肝細胞は、例えば、上記構築物の導入が、行われる唯一の遺伝子改変である場合、他の点では改変されていなくてもよい。あるいは、上記構築物のいずれかを形質導入されたヒト肝細胞は、更なる遺伝子改変を含むように改変され得、例えば、低免疫であり得る（例えば、ＨＬＡクラスＩ遺伝子座（Ｂ２Ｍ遺伝子座など）での破壊及びＮＫ細胞デコイ受容体導入遺伝子（例えば、ＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｅ、又はＢ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合導入遺伝子など）の導入によって低免疫にされた肝細胞を含む）。ヒト肝細胞を、低免疫性を誘導するための試薬（例えば、Ｂ２Ｍ編集組成物及びＮＫ細胞デコイ受容体導入遺伝子）と接触させることは、上記の同定された発現構築物による形質導入の前、間、又は後に行われる。
形質導入が肝細胞増殖の前に行われる場合、形質導入された肝細胞は、脾臓内注射又は門脈注射を介して１つ以上のレシピエントげっ歯類バイオリアクター（例えば、ＦＲＧラット、ＦＲＧＮマウスなど）に移植され、げっ歯類は、移植した操作された肝細胞の生着及び増殖に十分な条件下で維持される。バイオリアクター内での増殖後、バイオリアクター肝臓を採取し、灌流して、操作されたヒト肝細胞の増殖させた集団を回収する。回収した操作されたヒト肝細胞は、富化、精製、及び／又は単離手順によって処理される。得られた処理済み細胞集団は、続いて送達用に調製されるか、又はそれを必要とする対象への後での送達用に凍結保存される。
形質導入が肝細胞の増殖後に行われる場合、増殖させた肝細胞は、１つ以上のげっ歯類バイオリアクターから回収され、所望の肝細胞の富化、単離、精製及び／又は単離のための更なる処理の前又は後に、上記で同定された構築物の１つを形質導入される（任意の都合のよい時点における凍結保存があってもなくてもよい）。結果として得られた、形質導入済みかつ処理済みの細胞集団は、続いて送達用に調製されるか、又はそれを必要とする対象への後での送達用に凍結保存される。
調製した操作された肝細胞の集団は、好適な送達培地中で用量製剤に製剤化される。調製された用量製剤は、第ＩＸ因子欠損症及び血友病Ｂについて対象を処置するために、例えば、脾臓内注射若しくは注入又は門脈注射若しくは注入を介してなど、医学的に適切な経路によって、それを必要とする対象に送達される。
実施例６：血友病Ａのための第ＶＩＩＩ因子操作ヒト肝細胞の生成及び増殖
ＬＶＶアプローチを使用して外因性第ＶＩＩＩ因子（Ｆ８）導入遺伝子を初代ヒト肝細胞に導入して、例えば、導入遺伝子形質導入の前又は後にインビボバイオリアクターで増殖させた、Ｆ８操作肝細胞を生成することの実現可能性を評価した。最初の試験として、初代ヒト肝細胞を、様々な感染多重度（ＭＯＩ）で、市販のＬＶＶ過剰発現ヒトＦ８（対応する臨床構築物の最適化されていない代用物）を用いてエクスビボで形質導入し、細胞をインビトロで維持した。対照として、形質導入されていない初代ヒト肝細胞（すなわち、未処置対照、ＮＴＣ）を、同じインビトロ培養条件下で維持した。培養４日目、５日目、及び６日目にＭＯＩ２形質導入サンプル、ＭＯＩ７形質導入サンプル、及びＮＴＣサンプルから上清を収集し、市販のキット（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｔｅｓｔ ＳＰ４ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ Ｋｉｔ；ＤｉａＰｈａｒｍａ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＯＨ）を使用してＦ８活性を測定した。培養６日目の上清収集後、細胞を採取して溶解し、細胞溶解物に対してもＦ８活性アッセイを行った。
ＭＯＩ２及びＭＯＩ７サンプルの両方におけるＦ８活性の量は、４日目、５日目及び６日目の時点にわたって増加する活性を示した。比較すると、ＮＴＣサンプルにおけるＦ８活性は、３つの時点全てにおいてベースラインであった。６日目の時点までに、ＭＯＩ７上清サンプルにおいて測定されたＦ８活性は、ＮＴＣベースラインレベルよりも少なくとも４倍（４ｘ）大きかった。重要なことに、Ｆ８活性の検出は、外因性Ｆ８が、操作された細胞によって発現及び分泌されていることを示す。ヒトＦ８活性は、６日目の細胞溶解物において相応に高かった。これらのデータは、形質導入のために最適化されていない代用Ｆ８－ＬＶＶを使用しても、ヒトＦ８を過剰発現し、対応する操作されていないヒト肝細胞よりも実質的に高いＦ８活性を示す、操作されたヒト肝細胞を生成する能力を実証する。
Ｆ８過剰発現ヒト肝細胞を生成する能力を実証したので、ヒト肝細胞への導入用に以下の改善された発現構築物を設計して、例えば、血友病Ａなどの第ＶＩＩＩ因子欠損症を有するヒト対象など、それを必要とする対象に移植した操作された肝細胞による治療用導入遺伝子産物の発現を促進した。
本実施例で使用されるＦ８発現構築物は、例えば、ポリＡシグナルを含む、好適な３’配列に作動可能に連結された、例えば、完全長Ｆ８ポリペプチド（配列番号０１３）をコードする完全長Ｆ８コード配列（配列番号０１２）、ＢＤＤｒＦＶＩＩＩバリアントポリペプチド（配列番号０１５）をコードするＢドメイン欠失Ｆ８（すなわち、ＢＤＤｒＦＶＩＩＩ）コード配列（配列番号０１４）、Ｆ８．Ｆｃポリペプチド（配列番号０１７）をコードするＦＶＩＩＩ－Ｆｃ融合タンパク質（すなわち、Ｆ８．Ｆｃ）コード配列（配列番号０１６）など、Ｆ８コード配列に作動可能に連結された、例えば、ＭＮＤプロモーター（配列番号００１）など、好適なプロモーターを含む。
有用な構築物としては、Ｆ８ポリペプチド及びフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）ポリペプチド（例えば、ｖＷＦ Ｆｃ融合体（すなわち、配列番号０１８によってコードされたｖＷＦ．Ｆｃ配列番号０１９）など）などの複数のポリペプチドをコードするものが挙げられ、例えば、このようなポリペプチドが、２Ａ自己切断配列（フリン．ＧＳＧ．Ｔ２Ａ（配列番号０２０）又はフリン．ＧＳＧ．Ｐ２Ａ（配列番号０２１）などのフリン及びグリシン－セリン－グリシン含有２Ａ配列など）を介してｖＷＦコード配列に作動可能に連結されたＦ８コード配列から発現される場合を含む。ｖＷＦ及びＦ８などの複数のポリペプチドが使用される場合、コード配列は、任意の順序で配置される。
有用な発現カセット配置としては、例えば、以下のものが挙げられる。
［ＭＮＤプロモーター］－［Ｆ８完全長］－［ポリＡ］、
［ＭＮＤプロモーター］－［Ｆ８（Ｂドメイン欠失）］－［ポリＡ］、
［ＭＮＤプロモーター］－［Ｆ８．Ｆｃ］－［フリン．ＧＳＧ．Ｔ２Ａ］－［ＶＷＦ．Ｆｃ］－［ポリＡ］、
［ＭＮＤプロモーター］－［ＶＷＦ．Ｆｃ］－［フリン．ＧＳＧ．Ｔ２Ａ］－［Ｆ８．Ｆｃ］－［ポリＡ］など。
容易に理解されるように、いくつかの例では、例えば、記載されるプロモーターの別の適切なプロモーターへの交換、導入遺伝子コード配列の、同じ導入遺伝子又は導入遺伝子のバリアントをコードする別のコード配列への交換、導入遺伝子の配列３’の別の３’配列（例えば、代替的なポリＡ又は他の３’成分を含む）への交換などを含む置換が、上記の構築物において行われ得る。発現構築物は、肝細胞への形質導入のために、好適なレンチウイルスベクターに導入される。
実施例５に記載した構築物の代わりに上記構築物を用いて、本質的に実施例５に記載したように、肝細胞の調製、増殖、及び形質導入を行う。
調製した操作された肝細胞の集団は、好適な送達培地中で用量製剤に製剤化される。調製された用量製剤は、第ＶＩＩＩ因子欠損症及び血友病Ａについて対象を処置するために、例えば、脾臓内注射若しくは注入又は門脈注射若しくは注入を介してなど、医学的に適切な経路によって、それを必要とする対象に送達される。
実施例７：尿素回路異常症（ＵＣＤ）のための尿素回路遺伝子で操作されたヒト肝細胞の生成及び増殖
ヒト肝細胞への導入が、例えば、ＵＣＤを有するヒト対象など、それを必要とする対象に移植された操作された肝細胞によって治療用導入遺伝子産物（又は複数の導入遺伝子産物）の発現を促進するように、以下の発現構築物を設計した。
本実施例で使用される発現構築物は、例えば、ポリＡシグナルを含む、好適な３’配列に作動可能に連結された、例えば、窒素廃棄物の代謝において律速である尿素回路遺伝子など、１つ以上の尿素回路遺伝子に作動可能に連結された、例えば、ＭＮＤプロモーター（配列番号００１）など、好適なプロモーターを含む。
尿素回路遺伝子をコードする有用な配列としては、例えば以下のものが挙げられる。
例えば、ＣＰＳ１ポリペプチド（配列番号０２３）をコードする、コドン最適化ＣＰＳ１コード配列（配列番号０２２）など、カルバモイルリン酸シンターゼ（ＣＰＳ１）コード配列、例えば、ＮＡＧＳポリペプチド（配列番号０２５）をコードする、コドン最適化ＮＡＧＳコード配列（配列番号０２４）など、Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ（ＮＡＧＳ）コード配列、例えば、ＯＴＣポリペプチド（配列番号０２７）をコードする、コドン最適化ＯＴＣコード配列（配列番号０２６）など、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）コード配列、など。
有用な構築物としては、例えば、ＣＰＳ１及びＮＡＧＳ、ＣＰＳ１及びＯＴＣ、ＮＡＧＳ及びＯＴＣ、又はＣＰＳ１、ＮＡＧＳ、及びＯＣＴなどの複数のポリペプチドをコードするものが挙げられ、例えば、このようなポリペプチドが、２Ａ自己切断配列（フリン．ＧＳＧ．Ｔ２Ａ（配列番号０２０）又はフリン．ＧＳＧ．Ｐ２Ａ（配列番号０２１）などのフリン及びグリシン－セリン－グリシン含有２Ａ配列など）を介して第２のコード配列に作動可能に連結された第１のコード配列から発現される場合を含む。第１のポリペプチドをコードする第１の尿素回路コード配列及び第２のポリペプチドをコードする第２の尿素回路コード配列など、複数のポリペプチドが使用される場合、コード配列は、任意の順序で配置される。
有用な発現カセット配置としては、例えば、以下のものが挙げられる。
［ＭＮＤプロモーター］－［ＣＰＳ１］－［ポリＡ］
［ＭＮＤプロモーター］－［ＮＡＧＳ］－［ポリＡ］
［ＭＮＤプロモーター］－［ＯＴＣ］－［ポリＡ］
［ＭＮＤプロモーター］－［ＣＰＳ１］－［ポリＡ］－［フリン．ＧＳＧ．Ｔ２Ａ］－［ＯＴＣ］－［ポリＡ］
［ＭＮＤプロモーター］－［ＯＴＣ］－［ポリＡ］－［フリン．ＧＳＧ．Ｔ２Ａ］－［ＣＰＳ１］－［ポリＡ］
［ＭＮＤプロモーター］－［ＮＡＧＳ］－［ポリＡ］－［フリン．ＧＳＧ．Ｔ２Ａ］－［ＣＰＳ１］－［ポリＡ］
［ＭＮＤプロモーター］－［ＣＰＳ１］－［ポリＡ］－［フリン．ＧＳＧ．Ｔ２Ａ］－［ＮＡＧＳ］－［ポリＡ］
［ＭＮＤプロモーター］－［ＮＡＧＳ］－［ポリＡ］－［フリン．ＧＳＧ．Ｔ２Ａ］－［ＣＰＳ１］－［フリン．ＧＳＧ．Ｐ２Ａ］－［ＯＴＣ］－［ポリＡ］
容易に理解されるように、いくつかの例では、例えば、記載されるプロモーターの別の適切なプロモーターへの交換、導入遺伝子コード配列の、同じ導入遺伝子又は導入遺伝子のバリアントをコードする別のコード配列への交換、導入遺伝子の配列３’の別の３’配列（例えば、代替的なポリＡ又は他の３’成分を含む）への交換などを含む置換が、上記の構築物において行われ得る。発現構築物は、肝細胞への形質導入のために、好適なレンチウイルスベクターに導入される。
実施例５に記載した構築物の代わりに上記構築物を用いて、本質的に実施例５に記載したように、肝細胞の調製、増殖、及び形質導入を行う。
調製した操作された肝細胞の集団は、好適な送達培地中で用量製剤に製剤化される。調製された用量製剤は、尿素回路異常症について対象を処置するために、例えば、脾臓内注射若しくは注入又は門脈注射若しくは注入を介してなど、医学的に適切な経路によって、それを必要とする対象に送達される。
実施例８：ファブリー病のためのＧＬＡ遺伝子操作ヒト肝細胞の生成及び増殖
ＬＶＶアプローチを使用して外因性α－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）導入遺伝子を初代ヒト肝細胞に導入して、例えば、導入遺伝子形質導入の前又は後にインビボバイオリアクターで増殖させた、ＧＬＡ操作肝細胞を生成することの実現可能性を評価した。最初の試験として、初代ヒト肝細胞を、様々な感染多重度（ＭＯＩ）で、市販のＬＶＶ過剰発現ヒトＧＬＡ（対応する臨床構築物の最適化されていない代用物）を用いてエクスビボで形質導入し、細胞をインビトロで維持した。対照として、形質導入されていない初代ヒト肝細胞（すなわち、未処置対照、ＮＴＣ）を、同じインビトロ培養条件下で維持した。培養５日目のＭＯＩ２形質導入サンプル、ＭＯＩ１２形質導入サンプル、及びＮＴＣサンプルから細胞を収集し、次いで溶解し、ホモジナイズした。α－ガラクトシダーゼ（α－Ｇａｌ）活性を、α－Ｇａｌ切断時にフルオロフォア（３６０／４４５ｎｍのＥｘ／Ｅｍにおいて定量化することができる）を放出する特異的合成基質を用いる市販のアッセイ（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を使用して測定した。前述のキットに含まれる陽性対照サンプルも使用した。
全てのＭＯＩ２及びＭＯＩ１２サンプルにおいて測定されたα－Ｇａｌ活性の量は、ＮＴＣにおいて観察された最高レベルの活性よりも少なくとも５倍（５ｘ）大きかった。更に、最も高い活性を有する形質導入サンプルのいくつかにおいて測定されたα－Ｇａｌ活性は、陽性対照サンプルにおいて観察された最も高い活性の１０倍（１０ｘ）以上であった。まとめると、これらのデータは、形質導入のために最適化されていない代用ＧＬＡ－ＬＶＶを使用しても、ヒトＧＬＡを過剰発現し、対応する操作されていないヒト肝細胞よりも実質的に高いα－Ｇａｌ活性を示す、操作されたヒト肝細胞を生成する能力を実証する。
Ｆ８過剰発現ヒト肝細胞を生成する能力を実証したので、ヒト肝細胞への導入用に以下の改善された発現構築物を設計して、例えば、ファブリー病などのリソソーム蓄積障害を有するヒト対象など、それを必要とする対象に移植した操作された肝細胞による治療用導入遺伝子産物の発現を促進した。
本実施例において使用される発現構築物は、例えば、ポリＡシグナルを含む、好適な３’配列に作動可能に連結された、例えば、ＧＬＡ（１）ポリペプチド（配列番号０２９）をコードするＧＬＡ（１）コード配列（配列番号０２８）又はＧＬＡ（２）ポリペプチド（配列番号０２９）をコードするＧＬＡ（２）コード配列（配列番号０３０）などのα－ガラクトシダーゼＡ遺伝子（ＧＬＡ）に作動可能に連結された、例えば、ＭＮＤプロモーター（配列番号００１）など、好適なプロモーターを含む。
有用な発現カセット配置としては、例えば、以下のものが挙げられる。
［ＭＮＤプロモーター］－［ＧＬＡ（１）］－［ポリＡ］
［ＭＮＤプロモーター］－［ＧＬＡ（２）］－［ポリＡ］
容易に理解されるように、いくつかの例では、例えば、記載されるプロモーターの別の適切なプロモーターへの交換、導入遺伝子コード配列の、同じ導入遺伝子又は導入遺伝子のバリアントをコードする別のコード配列への交換、導入遺伝子の配列３’の別の３’配列（例えば、代替的なポリＡ又は他の３’成分を含む）への交換などを含む置換が、上記の構築物において行われ得る。発現構築物は、肝細胞への形質導入のために、好適なレンチウイルスベクターに導入される。
実施例５に記載した構築物の代わりに上記構築物を用いて、本質的に実施例５に記載したように、肝細胞の調製、増殖、及び形質導入を行う。
調製した操作された肝細胞の集団は、好適な送達培地中で用量製剤に製剤化される。調製された用量製剤は、リソソーム蓄積障害及びファブリー病について対象を処置するために、例えば、脾臓内注射若しくは注入又は門脈注射若しくは注入を介してなど、医学的に適切な経路によって、それを必要とする対象に送達される。
前述の発明は、理解を明確にする目的で例示及び実施例によっていくらか詳細に記載されているが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく特定の変更及び改変がなされ得ることが、当業者に容易に明らかである。
したがって、上記は単に本発明の原理を説明するものである。当業者であれば、本明細書に明示的に記載又は図示されていないが、本発明の原理を具現化し、その趣旨及び範囲内に含まれる様々な構成を考案することができることが理解されよう。更に、本明細書に列挙された全ての例及び条件付き言語は、主に、本発明の原理及び本発明者らが当該技術を促進するのに寄与した概念を読者が理解するのを助けることを意図しており、そのような具体的に列挙された例及び条件に限定されないと解釈されるべきである。更に、本発明の原理、態様、及び実施形態、並びにそれらの特定の例を記載する本明細書における全ての記述は、それらの構造的均等物及び機能的均等物の両方を包含することが意図される。更に、そのような均等物は、現在知られている均等物及び将来開発される均等物、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を実行する開発された任意の要素の両方を含むことが意図される。更に、本明細書で開示されるものは、そのような開示が特許請求の範囲に明示的に記載されているかどうかにかかわらず、公衆に捧げられることを意図されていない。
したがって、本発明の範囲は、本明細書に示され説明された例示的な実施形態に限定されるものではない。むしろ、本発明の範囲及び精神は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。特許請求の範囲において、米国特許法第１１２条（ｆ）又は米国特許法第１１２条（６）は、正確な語句「～のための手段（means for）」又は正確な語句「～のためのステップ（step for）」が特許請求の範囲におけるそのような限定の始めに記載されている場合にのみ、特許請求の範囲における限定のために呼び出されるものとして明示的に定義される。そのような正確な語句が請求項における限定において使用されない場合、米国特許法第１１２条（ｆ）又は米国特許法第１１２条（６）は行使されない。

Claims (20)

  1. 低免疫原性肝細胞又はその前駆細胞を生成する方法であって、前記方法が、
    ヒト肝細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団を、前記肝細胞又はその前駆細胞においてヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ欠損を生じさせるのに十分な条件下で編集組成物と接触させることと、
    前記細胞集団を、少なくとも１つのＮＫ細胞デコイ受容体をコードする導入遺伝子と、前記肝細胞又はその前駆細胞による前記導入遺伝子の発現に十分な条件下で接触させることと、を含み、
    それにより、低免疫原性肝細胞又はその前駆細胞の集団を生成する、方法。
  2. 前記編集組成物が、β２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）編集組成物である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記生成された低免疫原性肝細胞又はその前駆細胞の集団をバイオリアクターに導入することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記バイオリアクターがインビボバイオリアクターであり、前記インビボバイオリアクターが、増殖させた低免疫原性肝細胞の集団を産生するのに十分な条件下で維持され、任意選択で、前記インビボバイオリアクターがマウス、ラット、又はブタである、請求項３に記載の方法。
  5. 前記少なくとも１つのＮＫ細胞デコイ受容体が、ＣＤ４７、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合体、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 対象の症状を処置する方法であって、前記方法が、
    有効量の低免疫原性肝細胞又は前駆細胞を前記対象に投与すること、を含み、前記低免疫原性肝細胞又は前駆細胞がそれぞれ、ＨＬＡクラスＩ欠損、及び少なくとも１つのＮＫ細胞デコイ受容体をコードする導入遺伝子を含み、任意選択で、前記症状が肝臓症状である、方法。
  7. 前記低免疫原性肝細胞又はその前駆細胞が、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法に従って生成される、請求項６に記載の方法。
  8. 移植された細胞集団を含む非ヒト哺乳動物であって、前記細胞集団が複数の低免疫原性ヒト肝細胞又はその前駆細胞を含み、前記複数の肝細胞又は前駆細胞のそれぞれが、ＨＬＡクラスＩ欠損、及び少なくとも１つのＮＫ細胞デコイ受容体をコードする導入遺伝子を含み、任意選択で、前記ＨＬＡクラスＩ欠損がＢ２Ｍ欠損を含み、前記少なくとも１つのＮＫ細胞デコイ受容体がＣＤ４７、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合体、又はそれらの組み合わせを含む、非ヒト哺乳動物。
  9. 請求項８に記載の非ヒト哺乳動物から単離された、増殖させた低免疫原性ヒト肝細胞又はその前駆細胞の集団を含む、肝細胞又はその前駆細胞の集団。
  10. 複数の低免疫原性初代ヒト肝細胞を含む細胞集団であって、前記複数の肝細胞のそれぞれが、ＨＬＡクラスＩ欠損、及び少なくとも１つのＮＫ細胞デコイ受容体をコードする導入遺伝子を含み、任意選択で、前記ＨＬＡクラスＩ欠損がＢ２Ｍ欠損を含み、前記少なくとも１つのＮＫ細胞デコイ受容体がＣＤ４７、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合体、又はそれらの組み合わせを含む、細胞集団。
  11. 遺伝子改変されたヒト肝細胞を生成する方法であって、前記方法が、
    ヒト肝細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団を、遺伝子産物をコードする導入遺伝子を含む組み込みベクターと、前記導入遺伝子の機能的組み込みに十分な条件下で接触させて、前記組み込まれた導入遺伝子を含む遺伝子改変された肝細胞又はその前駆細胞を産生することと、
    前記遺伝子改変された肝細胞又はその前駆細胞をインビボバイオリアクターに移植し、前記遺伝子改変された肝細胞又は前駆細胞の増殖に十分な条件下で前記インビボバイオリアクターを維持して、前記遺伝子産物を発現する遺伝子改変されたヒト肝細胞の増殖させた集団を生成することと、を含み、任意選択で、前記インビボバイオリアクターがマウス、ラット、又はブタである、方法。
  12. 前記導入遺伝子が、銅輸送ＡＴＰアーゼ２（ＡＴＰ７Ｂ）、遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質（ＨＦＥ）、ヘモジュベリン、ヘプシジン（ＨＡＭＰ）、トランスフェリン受容体タンパク質２（ＴＦＲ２）、溶質キャリアファミリー４０メンバー１（ＳＬＣ４０Ａ１）、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子、カルバモイルリン酸シンターゼ（ＣＰＳ１）、Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ（ＮＡＧＳ）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、α－ガラクトシダーゼＡ遺伝子（ＧＬＡ）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素（ＰＡＨ）、アルギナーゼ（ＡＲＧ）、α１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（ＦＡＨ）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、アルギニノコハク酸シンターゼ（ＡＳＳ）、オルニチントランスロカーゼ（ＯＲＮＴ１）、シトリン、ＵＤＰ－グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、セリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ）、補体因子Ｈ（ＣＦＨ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子産物をコードする、請求項１１に記載の方法。
  13. 対象の症状を処置する方法であって、前記方法が、
    請求項１１又は１２に記載の方法に従って生成された有効量の遺伝子改変されたヒト肝細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
  14. 前記症状が肝臓症状又は遺伝子性疾患であり、任意選択で、前記遺伝子性疾患が単一遺伝子性疾患であり、任意選択で、前記症状は、第ＶＩＩＩ因子欠損症であって、前記導入遺伝子が第ＶＩＩＩ因子をコードするか、第ＩＸ因子欠損症であって、前記導入遺伝子が第ＩＸ因子をコードするか、尿素回路異常症（ＵＣＤ）であって、前記導入遺伝子が１つ以上の尿素回路ポリペプチドをコードするか、又はリソソーム蓄積症であって、前記導入遺伝子がリソソーム蓄積症に関連する酵素をコードする、請求項１３に記載の方法。
  15. 移植された細胞集団を含む非ヒト哺乳動物であって、前記細胞集団が複数の遺伝子改変されたヒト肝細胞を含み、前記複数の肝細胞のそれぞれが、遺伝子産物をコードする機能的に組み込まれた導入遺伝子を含む、非ヒト哺乳動物。
  16. 前記移植された細胞集団が、インビボで増殖させた細胞集団であり、前記非ヒト哺乳動物が、前記遺伝子改変されたヒト肝細胞の子孫肝細胞を更に含む、請求項１５に記載の非ヒト哺乳動物。
  17. 請求項１５又は１６に記載の非ヒト哺乳動物から単離された、遺伝子改変されたヒト肝細胞の増殖させた集団を含む、肝細胞又はその前駆細胞の集団。
  18. 複数の低免疫原性初代ヒト肝細胞を含む細胞集団であって、前記複数の肝細胞のそれぞれが、ＨＬＡクラスＩ欠損、及び少なくとも１つのＮＫ細胞デコイ受容体をコードする導入遺伝子を含む、細胞集団。
  19. 複数の肝細胞治療用量を生成する方法であって、前記方法が、
    （１ａ）ヒト肝細胞を遺伝子改変し、前記遺伝子改変されたヒト肝細胞を１つ以上のインビボバイオリアクター中で増殖させて、遺伝子改変されたヒト肝細胞の増殖させた集団を生成すること、又は
    （１ｂ）１つ以上のインビボバイオリアクターから得られた増殖させたヒト肝細胞を遺伝子改変して、遺伝子改変されたヒト肝細胞の増殖させた集団を生成すること、と、
    （２）１ａ又は１ｂの前記遺伝子改変されたヒト肝細胞の増殖させた集団を複数の肝細胞治療用量に分割することと、を含む、方法。
  20. 症状を有する複数の対象を処置する方法であって、前記方法が、
    請求項１９に記載の複数の肝細胞治療用量を生成することと、
    前記複数の用量のうちの１つ以上を前記対象の各々に投与して、前記症状について前記対象を処置することと、を含み、任意選択で、前記ヒト肝細胞が単一のヒト肝臓に由来する、方法。
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