KR20240035852A - 벡터 제조 프로세스 - Google Patents
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Abstract
본 개시는 바이러스 벡터 제조 및 정제 방법을 제공한다. 특히, 본 개시는 현탁액에서 성장시킨 숙주 세포로부터 렌티바이러스 벡터를 제조하기 위한 개선된 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 개시는 개선된 대규모 렌티바이러스 제조 방법을 제공하며, 본 방법은 세포를 적절한 수로 성장시키고, 렌티바이러스 패키징 플라스미드, 전달 플라스미드, 및 형질감염제로 형질감염시키는 단계; 엔도뉴클레아제로 처리하는 단계; 현탁 배양 상청액을 수확하고 정화하는 단계; 친화도 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 렌티바이러스 벡터를 포획하고 농축시키는 단계; 농축된 렌티바이러스 벡터를 여과하는 단계; 렌티바이러스 벡터를 한외여과하고 정용여과하는 단계; 렌티바이러스 벡터를 제형화하는 단계; 및 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터를 멸균 여과하는 단계를 포함한다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e)에 의거하여 2021년 7월 19일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/223,249호의 이익을 주장하며, 그 전체는 참조로서 본원에 통합된다.
기술 분야
본 발명은 개선된 바이러스 벡터 생산 및 정제 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 개선된 바이러스 벡터 제조 방법에 관한 것이다.
온코레트로바이러스 기원 및 렌티바이러스 기원 모두의 레트로바이러스 벡터는, 아직은 충족되지 않았지만, 유전자 전달 비히클로서의 잠재력이 있다. 임상 등급용 바이러스 유전자 요법 벡터를 대규모로 제조하는 것은, 벡터 생산, 및 벡터 안정성, 역가, 및 효능을 유지하면서 오염물을 제거하는 벡터 정제를 위한 확장 가능한 단위 오퍼레이션을 포함하여 많은 장애물에 직면한다.
일반적으로, 본 개시는 부분적으로 렌티바이러스 벡터를 제조하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다. 특히, 본 개시는 현탁액에서 성장시킨 숙주 세포로부터 렌티바이러스 벡터를 제조하기 위한 개선된 방법을 제공한다.
본 개시의 일 양태에서, 렌티바이러스 벡터(sLVV)를 생산하기 위한 현탁 프로세스가 제공되며, 본 방법은: 대규모 현탁 배양물에 생존 가능(viable) 숙주 세포를 접종하는 단계; 렌티바이러스 패키징 플라스미드, 전달 플라스미드, 및 형질감염제를 포함하는 혼합물로 대규모 현탁 배양물 중의 숙주 세포를 일시적으로 형질감염시키는 단계; 형질감염 후(형질감염 개시 후) 약 36시간 내지 약 48시간차에 현탁 배양 상청액에 엔도뉴클레아제를 첨가하는 단계; 탠덤 심층 필터 및 이중층 필터를 사용하여 현탁 배양 상청액을 수확하고 정화하는 단계; 크로마토그래피를 사용하여, 수확하여 정화한 현탁 배양 상청액으로부터 렌티바이러스 벡터를 포획하고 농축시키는 단계; 농축된 렌티바이러스 벡터를 여과하는 단계; TFF(접선 유동 여과)를 사용하여 렌티바이러스 벡터를 한외여과하고 정용여과하는 단계; 및 렌티바이러스 벡터를 제형화하여 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터를 생산하고, 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터를 멸균 여과하는 단계를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 프로세스는 200L 내지 2000L의 현탁 배양물을 접종하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 프로세스는 200L 내지 1000L의 현탁 배양물을 접종하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 본 프로세스는 200L 내지 500L의 현탁 배양물을 접종하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 본 프로세스는 200L의 현탁 배양물을 접종하는 단계를 포함한다.
다양한 구현예에서, 대규모 현탁 배양물에 약 40.0x108개 내지 약 120.0x108개의 생존 가능 숙주 세포가 접종된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 HEK293 세포, HEK293S 세포, 현탁 배양에 적합한 HEK293T 세포(HEK293Ts), HEK293F 세포, HEK293FT 세포, HEK293FTM 세포, 및 HEK293E 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 HEK293Ts 세포이다.
다양한 구현예에서, 대규모 세포 현탁 배양물은 배양 배지에서 배양된 숙주 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 대규모 세포 현탁 배양물은 약 3일 동안 배양 배지에서 배양된 숙주 세포를 포함하되, 3일 후, 배양 배지는 신선한 배양 배지로 교환된다. 일부 구현예에서, 대규모 세포 현탁 배양물은 약 3일 동안 배양 배지에서 배양된 숙주 세포를 포함하되, 3일 후, 배양 배지는 교번식 접선 유동 여과(ATF, Alternating Tangential Flow Filtration)를 사용하여 신선한 배양 배지로 교환된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 무혈청 합성 세포 배양 배지이다.
다양한 구현예에서, 숙주 세포는 인산칼슘, 양이온성 지질, 및 양이온성 중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 형질감염제를 포함하는 혼합물로 일시적으로 형질감염된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 DEAE-덱스트란, 폴리브렌, 덴드리머, 및 폴리에틸렌이민(PEI)으로 이루어진 군으로부터 선택된 양이온성 중합체인 형질감염제를 포함하는 혼합물로 일시적으로 형질감염된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 PEI를 포함하는 형질감염제를 포함하는 혼합물로 일시적으로 형질감염된다. 일부 구현예에서, 형질감염제는 PEI를 포함하고, 혼합물은 약 5, 약 5.5, 약 6, 약 6.4, 약 6.5, 약 7, 약 7.5, 약 8, 약 8.5, 약 9, 약 9.5, 또는 약 10의 N(PEI 중 NH2 아민):P(DNA 백본 중 인산염기)의 비율을 갖는다.
다양한 구현예에서, 형질감염제는 약 14시간 내지 약 18시간 동안 현탁 배양물에 첨가되며, 임의로 현탁 배양물은 교번식 접선 유동 여과(ATF)를 사용하여 신선한 배양 배지와의 배양 배지 교환을 거친다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 패키징 플라스미드는 렌티바이러스 gag, pol, 및 rev 및 이종 외피 단백질을 암호화한다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 패키징 플라스미드는 베시큘로바이러스(Vesiculovirus) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 파라믹소바이러스(Paramyxoviridae) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 알파바이러스(Alphavirus) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 감마레트로바이러스(Gammaretrovirus) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 오르토헤파드나바이러스(Orthohepadnavirus) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 헤파시바이러스(Hepacivirus) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 및 리사바이러스(Lyssavirus) 외피 단백질 또는 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 이종 외피 단백질을 암호화한다.
특정 구현예에서, 렌티바이러스 패키징 플라스미드는 니파(Nipah) 바이러스 외피 단백질, 센다이(Sendai) 바이러스(SeV) 외피 단백질, 모빌리바이러스(Morbillivirus) 외피 단백질, 개 디스템퍼(CDV) 외피 단백질, 및 홍역 바이러스 외피 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 이종 외피 단백질을 암호화한다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 패키징 플라스미드는 신드비스(Sindbis) 바이러스(SINV) 외피 단백질을 암호화한다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 패키징 플라스미드는 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스(GALV) 외피 단백질, 고양이 백혈병 바이러스(FeLV) 외피 단백질, 고양이 내인성 레트로바이러스(RD114) 외피 단백질, 및 개코원숭이 내인성 레트로바이러스(BaEV) 외피 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 이종 외피 단백질을 암호화한다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 패키징 플라스미드는 B형 간염 바이러스(HBV) 외피 단백질을 암호화한다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 패키징 플라스미드는 C형 간염 바이러스(HCV) 외피 단백질을 암호화한다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 패키징 플라스미드는 라비스 바이러스(RABV)를 암호화한다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 패키징 플라스미드는 소포성 구내염 바이러스(VSV) 외피 단백질 또는 이의 변이체(예를 들어, VSV-G), 코칼 바이러스(COCV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 마라바 바이러스(MARAV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 파이리 바이러스(PIRYV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 니파 바이러스(NiV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 센다이 바이러스(SeV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 모르빌리바이러스 외피 단백질 또는 이의 변이체, 개과 디스템퍼(CDV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 홍역 바이러스(MV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 신드비스 바이러스(SINV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스(GALV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 고양이 내인성 레트로바이러스(RD114) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 고양이 백혈병 바이러스(FeLV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 개코원숭이 내인성 레트로바이러스(BaEV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, B형 간염(HBV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, C형 간염(HCV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 및 라비스 바이러스(RABV) 외피 단백질 또는 이의 변이체를 암호화한다.
바람직한 구현예에서, VSV 외피 단백질은 VSV-G 또는 이의 변이체이다.
다양한 구현예에서, 전달 플라스미드는 패키지형(packageable) 렌티바이러스 벡터 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 전달 플라스미드는 좌측 키메라(5') 렌티바이러스 LTR을 포함하는 패키지형 렌티바이러스 벡터 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 5' LTR의 프로모터는 이종 프로모터; 싸이(Ψ) 패키징 신호; 중앙 폴리퓨린 관/DNA 플랩(cPPT/FLAP); 레트로바이러스 수출 요소(RRE); 관심 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터; 및 우측(3') 자기 불활성화(SIN) 렌티바이러스 LTR로 교환된다.
다양한 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 세라티아마르세센스균(Serratia marcescens)으로부터 유래되며, 임의로 엔도뉴클레아제는 재조합 NucA 엔도뉴클레아제이다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 DNA 및 RNA 절단 활성 둘 모두를 갖는다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 벤조나아제(Benzonase) 또는 데나라아제(Denarase)이다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 약 60U/ml 또는 약 30U/ml의 농도로 첨가된다.
다양한 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 형질감염 후 약 36시간 내지 약 72시간차에 현탁 배양 상청액에 첨가된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 형질감염 후 약 36시간 내지 약 48시간차에 현탁 배양 상청액에 첨가된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 형질감염 후 약 48시간차에 현탁 배양 상청액에 첨가된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 형질감염 후 약 44시간차에 현탁 배양 상청액에 첨가된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 형질감염 후 약 40시간차에 현탁 배양 상청액에 첨가된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 형질감염 후 약 36시간차에 현탁 배양 상청액에 첨가된다.
다양한 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 약 1시간 내지 약 2시간 동안 배양물에 첨가된다.
다양한 구현예에서, 수확하고 정화하는 단계는, 적어도 약 40μm 또는 적어도 약 60μm의 오염물을 거르는 탠덤 심층 필터 및 약 0.45μm 내지 약 0.8μm의 전처리 필터 기공 크기 및 약 0.22μm 내지 약 0.45μm의 최종 필터 기공 크기를 포함하는 이중층 필터를 통해 현탁 배양 상청액을 여과하는 단계를 포함한다.
다양한 구현예에서, 정화된 현탁 배양물은 임의로 1M의 HEPES를 사용하여 약 pH 7.0 또는 약 pH 7.2로 조정된다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 친화도 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여, 수확하여 정화한 현탁 배양 상청액으로부터 포획되고 농축된다. 일부 구현예에서, 상청액은 친화도 크로마토그래피 컬럼 또는 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 통과한다. 일부 구현예에서, 친화도 크로마토그래피는 헤파린 친화도 크로마토그래피이다. 일부 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피는 황산염 양이온 교환 크로마토그래피이다. 일부 구현예에서, 황산염 양이온 교환 크로마토그래피는 약 45μm의 비드 크기 및/또는 약 100nm의 평균 기공 크기를 갖는 컬럼을 포함한다.
다양한 구현예에서, 약 50mM의 HEPES, 약 100mM의 NaCl, pH 7을 포함하는 세척 완충액을 크로마토그래피 컬럼 상으로 펌핑한다.
다양한 구현예에서, 약 50mM의 HEPES, 약 400mM의 NaCl, pH 8을 포함하는 용리 완충액을 크로마토그래피 컬럼 상으로 펌핑한다.
다양한 구현예에서, 약 50mM의 HEPES, 약 300mM의 NaCl, pH 7.2를 포함하는 세척 완충액을 크로마토그래피 컬럼 위로 통과시킨다. 다양한 구현예에서, 약 50mM의 HEPES, 약 1M의 NaCl, pH 7.5를 포함하는 용리 완충액을 크로마토그래피 컬럼 위로 통과시킨다.
다양한 구현예에서, 농축된 벡터의 여과는 약 0.45μm 내지 약 0.8μm의 전처리 필터 기공 크기 및 약 0.2μm 내지 약 0.45μm의 최종 필터 기공 크기를 포함하는 이중층 필터를 통해 농축된 렌티바이러스 벡터를 여과하는 단계를 포함한다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 약 100kDa 내지 약 500kDa 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 포함하는 중공 섬유 접선 유동 여과(TFF) 필터를 사용하여 한외여과되고 정용여과된다. 일부 구현예에서, 중공 섬유 TFF 필터는 약 100kDa의 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 포함한다. 일부 구현예에서, 중공 섬유 TFF 필터는 약 300kDa의 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 포함한다. 일부 구현예에서, 중공 섬유 TFF 필터는 약 500kDa의 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 포함한다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 정용여과 완충액 내로 정용여과되며, 임의로 정용여과 완충액은 약 50mM의 HEPES, 약 100mM의 NaCl, pH 7.50이다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 정용여과 완충액 내로 정용여과되며, 임의로 정용여과 완충액은 약 50mM의 HEPES, pH 7.0이다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 정용여과 완충액 내로 정용여과되며, 임의로 정용여과 완충액은 약 50mM의 L-히스티딘, pH 7.0이다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위해 2X 줄기 세포 성장 배지(SCGM)에서 1:1로 제형화된다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 HEPES 및 수크로오스를 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화되고, 임의로 완충액은 L-프롤린, 폴록사머 188, 또는 NaCl을 추가로 포함한다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 및 약 100mM의 L-프롤린을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화된다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 100mM의 L-프롤린, 및 약 0.2 내지 약 2.0mg/ml의 폴록사머 188을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화된다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 100mM의 L-프롤린, 및 약 150mM의 NaCl을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화된다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 100mM의 L-프롤린, 약 150mM의 NaCl, 및 약 0.2 내지 약 2.0mg/ml의 폴록사머 188을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화된다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 150mM의 NaCl, 및 약 0.2 내지 약 2.0mg/ml의 폴록사머 188을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화된다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 L-히스티딘, 수크로오스, 및 L-프롤린을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화된다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 약 5mM의 L-히스티딘, 약 146mM의 수크로오스, 및 약 100mM의 L-프롤린을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화되고, 임의로 제형은 약 0.2 내지 약 2.0mg/mL의 폴록사머 188을 추가로 포함한다.
다양한 구현예에서, 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터는 임의로 0.45μm 전처리 필터를 포함하는 0.22μm 필터를 통해 멸균 여과된다.
다양한 구현예에서, 본 프로세스는 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터의 충진 마감을 수행하여 최종 렌티바이러스 벡터를 생산하는 단계, 및 최종 렌티바이러스 벡터를 동결하는 단계를 추가로 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 프로세스는 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터를 동결하는 단계를 추가로 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 프로세스는 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터를 해동하는 단계, 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터를 멸균 여과하는 단계, 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터의 충진 마감을 수행하여 최종 렌티바이러스 벡터를 생산하는 단계, 및 최종 렌티바이러스 벡터를 동결하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 최종 렌티바이러스 벡터는 ≤-65℃에서 동결된다.
또 다른 양태에서, 현탁 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 방법이 제공되며, 본 방법은: 약 50mL의 배양 배지를 포함하는 P0 현탁 배양물을 약 10.0x106개 내지 약 15.0x106개의 생존 가능 HEK293Ts 세포로 접종하는 단계; 약 100mL의 배양 배지를 포함하는 P1 현탁 배양물을 P0 현탁 배양물로부터 수득된 약 30.0x106개 내지 약 70.0x106개의 생존 가능 HEK293Ts 세포로 접종하는 단계; 각각 약 200mL의 배양 배지를 포함하는 3개의 P2 현탁 배양물을 P1 현탁 배양물로부터 수득된 약 11.0x107개 내지 약 19.0x107개의 생존 가능 HEK293Ts 세포로 접종하는 단계; 각각 약 1.0L의 배양 배지를 포함하는 3개의 P3 현탁 배양물을 풀링된 P2 현탁 배양물로부터 수득된 약 55.0x107개 내지 약 95.0x107개의 생존 가능 HEK293Ts 세포로 접종하는 단계; 약 20.0L의 배양 배지를 포함하는 P4 현탁 배양물을 풀링된 P3 현탁 배양물로부터 수득된 약 40.0x108개 내지 약 120.0x108개의 생존 가능 HEK293Ts 세포로 접종하는 단계; 약 200.0L의 배양 배지를 포함하는 P5 현탁 배양물을 P4 현탁 배양물로부터 수득된 약 40.0x108개 내지 약 120.0x108개의 생존 가능 HEK293Ts 세포로 접종하는 단계; 약 3일 동안 P5 현탁 배양물을 배양하고, 교번식 접선 유동 여과(ATF)를 사용하여 약 190.0L의 신선한 배양 배지로 P5 현탁 배양물의 배양 배지를 교환하는 단계; 배양 배지 교환 후, P5 현탁 배양물을 형질감염시켜 렌티바이러스 벡터를 생산하는 단계로서, 상기 형질감염 단계는 전달 플라스미드 및 폴리에틸렌이민(PEI)과 복합체를 형성하는 gag, pol, rev, VSV-g를 암호화하는 플라스미드 DNA를 포함하는 약 10.0L의 배양 배지를 첨가하는 단계를 포함하는, 단계; 형질감염 후, ATF를 사용하여 P5 현탁 배양물의 배양 배지를 약 200.0L의 신선한 배양 배지로 교환하는 단계; 형질감염 후 약 36시간 내지 약 48시간 후에, P5 현탁 배양물을 엔도뉴클레아제로 약 1시간 내지 약 2시간 동안 처리하는 단계; 60μm 이상의 입자를 거르는 탠덤 심층 필터, 및 0.8μm 및 0.45μm의 기공 크기를 포함하는 이중층 필터를 사용하여 P5 현탁 배양 상청액을 수확하고 정화하는 단계; 헤파린 크로마토그래피 또는 황산염 양이온 교환 크로마토그래피를 포함하여, 수확하여 정화한 P5 현탁 배양 상청액으로부터 렌티바이러스 벡터를 포획하고 농축시키는 단계; 0.8μm 및 0.45μm의 기공 크기를 포함하는 이중층 필터를 사용하여 농축된 렌티바이러스 벡터를 여과하는 단계; 접선 유동 여과(TFF)를 사용하여 렌티바이러스 벡터를 한외여과하여 렌티바이러스 벡터를 추가로 농축시키고, 정용여과 완충액 내로 렌티바이러스 벡터를 정용여과하여 벌크 렌티바이러스 벡터를 생산하는 단계; 및 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위해 렌티바이러스 벡터를 제형화하는 단계를 포함한다.
다양한 구현예에서, 배양 배지는 무혈청 합성 세포 배양 배지이다.
다양한 구현예에서, PEI/DNA 혼합물에 대한 N(PEI 중 NH2 아민):P(DNA 백본 중 인산염기)의 비율은 약 5, 약 5.5, 약 6, 약 6.4, 약 6.5, 약 7, 약 7.5, 약 8, 약 8.5, 약 9, 약 9.5, 또는 약 10이다.
다양한 구현예에서, PEI는 약 14시간 내지 약 18시간 동안 현탁 배양물에 첨가되며, 임의로 현탁 배양물은 교번식 접선 유동 여과(ATF)를 사용하여 신선한 배양 배지와의 배양 배지 교환을 거친다.
다양한 구현예에서, 전달 플라스미드는 패키지형(packageable) 렌티바이러스 벡터 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 전달 플라스미드는 좌측 키메라(5') 렌티바이러스 LTR을 포함하는 패키지형 렌티바이러스 벡터 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 5' LTR의 프로모터는 이종 프로모터; 싸이(Ψ) 패키징 신호; 중앙 폴리퓨린 관/DNA 플랩(cPPT/FLAP); 레트로바이러스 수출 요소(RRE); 관심 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터; 및 우측(3') 자기 불활성화(SIN) 렌티바이러스 LTR로 교환된다.
다양한 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 세라티아마르세센스균(Serratia marcescens)으로부터 유래되며, 임의로 엔도뉴클레아제는 재조합 NucA 엔도뉴클레아제이다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 DNA 및 RNA 절단 활성 둘 모두를 갖는다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 벤조나아제(Benzonase) 또는 데나라아제(Denarase)이다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 약 60U/ml 또는 약 30U/ml의 농도로 첨가된다.
다양한 구현예에서, 정화된 현탁 배양물은 임의로 1M의 HEPES를 사용하여 약 pH 7.0 또는 약 pH 7.2로 조정된다.
다양한 구현예에서, 황산염 양이온 교환 크로마토그래피는 약 45μm의 비드 크기 및/또는 약 100nm의 평균 기공 크기를 갖는 컬럼을 포함한다.
다양한 구현예에서, 약 50mM의 HEPES, 약 300mM의 NaCl, pH 7.2를 포함하는 세척 완충액을 친화도 크로마토그래피 컬럼 또는 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상으로 펌핑한다.
다양한 구현예에서, 약 50mM의 HEPES, 약 1M의 NaCl, pH 7.5를 포함하는 용리 완충액을 친화도 크로마토그래피 컬럼 또는 양이온 교환 크로마토그래피 상으로 펌핑한다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 약 100kDa, 약 300kDa 또는 약 500kDa의 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 포함하는 중공 섬유 TFF 필터를 사용하여 한외여과되고 정용여과 완충액 내로 정용여과된다.
다양한 구현예에서, 정용여과 완충액은 약 50mM의 HEPES, 약 100mM의 NaCl, pH 7.50이다.
다양한 구현예에서, 정용여과 완충액은 약 50mM의 HEPES, pH 7.0이다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위해 2X 줄기 세포 성장 배지(SCGM)에서 1:1로 제형화된다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 HEPES 및 수크로오스를 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화되고, 임의로 완충액은 L-프롤린, 폴록사머 188, 또는 NaCl을 추가로 포함한다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 및 약 100mM의 L-프롤린을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화된다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 100mM의 L-프롤린, 및 0.2mg/ml의 폴록사머 188을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화된다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 100mM의 L-프롤린, 및 약 150mM의 NaCl을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화된다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 100mM의 L-프롤린, 약 150mM의 NaCl, 및 0.2mg/ml의 폴록사머 188을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화된다.
다양한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 150mM의 NaCl, 및 0.2mg/ml의 폴록사머 188을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화된다.
다양한 구현예에서, 본 방법은 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터의 충진 마감을 수행하여 최종 렌티바이러스 벡터를 생산하는 단계, 및 최종 렌티바이러스 벡터를 동결하는 단계를 추가로 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 방법은 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터를 동결하는 단계를 추가로 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 프로세스는 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터를 해동하는 단계, 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터를 멸균 여과하는 단계, 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터의 충진 마감을 수행하여 최종 렌티바이러스 벡터를 생산하는 단계, 및 최종 렌티바이러스 벡터를 동결하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 최종 렌티바이러스 벡터는 ≤-65℃에서 동결된다.
또 다른 양태에서, 바이러스 벡터를 생산하기 위해 현탁 프로세스로부터 숙주 세포 단백질(HCP)을 감소시키는 방법이 제공된다. 다양한 구현예에서, HCP를 감소시키기 위한 방법은: (a) 바이러스 벡터(예를 들어, 본원에서 고려되는 제조된 바이러스 벡터)를 포함하는 수확하여 정화한 현탁 배양 상청액을 제공하는 단계; (b) 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여, 수확하여 정화된 현탁 배양 상청액으로부터 바이러스 벡터를 포획하고 농축시키는 단계; (c) 농축된 바이러스 벡터를 여과하는 단계; (d) 접선 유동 여과(TFF)를 사용하여 바이러스 벡터를 한외여과하고 정용여과하는 단계; 및 (e) 제형화된 벌크 바이러스 벡터를 생산하기 위해 바이러스 벡터를 제형화하고, 제형화된 벌크 바이러스 벡터를 멸균 여과하는 단계를 포함한다.
다양한 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
다양한 구현예에서, 바이러스 벡터는 소포성 구내염 바이러스(VSV) 외피 단백질 또는 이의 변이체(예를 들어, VSV-G), 코칼 바이러스(COCV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 마라바 바이러스(MARAV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 파이리 바이러스(PIRYV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 니파 바이러스(NiV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 센다이 바이러스(SeV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 모르빌리바이러스 외피 단백질 또는 이의 변이체, 개과 디스템퍼(CDV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 홍역 바이러스(MV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 신드비스 바이러스(SINV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스(GALV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 고양이 내인성 레트로바이러스(RD114) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 고양이 백혈병 바이러스(FeLV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 개코원숭이 내인성 레트로바이러스(BaEV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, B형 간염(HBV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, C형 간염(HCV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 및 라비스 바이러스(RABV) 외피 단백질 또는 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 이종 외피 단백질로 위형화된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 소포성 구내염 바이러스(VSV) 외피 단백질 또는 이의 변이체(예를 들어, VSV-G)로 이루어진 이종 외피 단백질로 위형화된다.
다양한 구현예에서, 수집하여 정화하는 단계는, 적어도 약 40μm 또는 적어도 약 60μm의 오염물을 거르는 탠덤 심층 필터 및 약 0.45μm 내지 약 0.8μm의 전처리 필터 기공 크기 및 약 0.22μm 내지 약 0.45μm의 최종 필터 기공 크기를 포함하는 이중층 필터를 통해 현탁 배양 상청액을 여과하는 단계를 포함한다.
다양한 구현예에서, 정화된 현탁 배양물은 임의로 1M의 HEPES를 사용하여 약 pH 7.0 또는 약 pH 7.2로 조정된다.
다양한 구현예에서, 상청액은 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 통과한다.
다양한 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피는 황산염 양이온 교환 크로마토그래피이다. 일부 구현예에서, 황산염 양이온 교환 크로마토그래피는 약 45μm의 비드 크기 및/또는 약 100nm의 평균 기공 크기를 갖는 컬럼을 포함한다.
다양한 구현예에서, 약 50mM의 HEPES, 약 300mM의 NaCl, pH 7.2를 포함하는 세척 완충액을 크로마토그래피 컬럼 위로 통과시킨다.
다양한 구현예에서, 약 50mM의 HEPES, 약 1M의 NaCl, pH 7.5를 포함하는 용리 완충액을 크로마토그래피 컬럼 위로 통과시킨다.
다양한 구현예에서, 여과 단계(c)는 약 0.45μm 내지 약 0.8μm의 전처리 필터 기공 크기 및 약 0.2μm 내지 약 0.45μm의 최종 필터 기공 크기를 포함하는 이중층 필터를 통해 농축된 바이러스 벡터를 여과하는 단계를 포함한다.
다양한 구현예에서, 바이러스 벡터는 약 100kDa 내지 약 500kDa 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 포함하는 중공 섬유 접선 유동 여과(TFF) 필터를 사용하여 한외여과되고 정용여과된다. 일부 구현예에서, 중공 섬유 TFF 필터는 약 100kDa의 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 포함한다. 일부 구현예에서, 중공 섬유 TFF 필터는 약 300kDa의 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 포함한다. 일부 구현예에서, 중공 섬유 TFF 필터는 약 500kDa의 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 포함한다.
다양한 구현예에서, 바이러스 벡터는 정용여과 완충액 내로 정용여과되며, 임의로 정용여과 완충액은 약 50mM의 HEPES, pH 7.0이다.
다양한 구현예에서, 바이러스 벡터는 HEPES 및 수크로오스를 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화되고, 임의로 완충액은 L-프롤린, 폴록사머 188, 또는 NaCl을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 및 약 100mM의 L-프롤린을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 100mM의 L-프롤린, 및 약 0.2 내지 약 2.0의 폴록사머 188을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 100mM의 L-프롤린, 및 약 150mM의 NaCl을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 100mM의 L-프롤린, 약 150mM의 NaCl, 및 약 0.2 내지 약 2.0mg/ml의 폴록사머 188을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 150mM의 NaCl, 및 약 0.2 내지 약 2.0mg/ml의 폴록사머 188을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화된다.
다양한 구현예에서, 제형화된 벌크 바이러스 벡터는 임의로 0.45μm 전처리 필터를 포함하는 0.22μm 필터를 통해 멸균 여과된다.
다양한 구현예에서, 본 프로세스는 제형화된 벌크 바이러스 벡터의 충진 마감을 수행하여 최종 바이러스 벡터를 생산하는 단계, 및 최종 바이러스 벡터를 동결하는 단계를 추가로 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 프로세스는 제형화된 벌크 바이러스 벡터를 동결하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 프로세스는 제형화된 벌크 바이러스 벡터를 해동하는 단계, 제형화된 벌크 바이러스 벡터를 멸균 여과하는 단계, 제형화된 벌크 바이러스 벡터의 충진 마감을 수행하여 최종 바이러스 벡터를 생산하는 단계, 및 최종 바이러스 벡터를 동결하는 단계를 추가로 포함한다.
다양한 구현예에서, 최종 바이러스 벡터는 ≤-65℃에서 동결된다.
도 1은 현탁 배양물로부터 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 선행하는(upstream) 프로세스 흐름, 후행하는 프로세스 흐름 및 충진 마감의 일례를 도시한다.
도 2는 현탁 배양물로부터 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 선행하는 프로세스 흐름, 후행하는(downstream) 프로세스 흐름 및 충진 마감의 일례를 도시한다.
도 3a 내지 도 3c는 gag, pol, rev, 및 vsv-g에 대한 플라스미드를 패키징하기 위한 플라스미드 맵을 도시한다.
도 4는 현탁 배양물로부터 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 선행하는 프로세스 흐름, 후행하는 프로세스 흐름 및 충진 마감의 일례를 도시한다.
도 5는 상이한 LVV 제조 방법 간의 총 감염성 역가 수율의 비교를 도시한다.
도 6은 상이한 LVV 제조 방법 간의 감염성 역가의 비교를 도시한다.
도 7은 상이한 LVV 제조 방법 간의 입자 대 감염성 비율의 비교를 도시한다.
도 8은 상이한 LVV 제조 방법 간의 정규화된 숙주 세포 단백질(HCP)의 비교를 도시한다.
도 9는 상이한 LVV 제조 방법 간의 누적 숙주 세포 단백질(HCP) 로그 감소의 비교를 도시한다.
도 10은 상이한 LVV 제조 방법 간의 단계 숙주 세포 단백질(HCP) 로그 감소의 비교를 도시한다.
도 2는 현탁 배양물로부터 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 선행하는 프로세스 흐름, 후행하는(downstream) 프로세스 흐름 및 충진 마감의 일례를 도시한다.
도 3a 내지 도 3c는 gag, pol, rev, 및 vsv-g에 대한 플라스미드를 패키징하기 위한 플라스미드 맵을 도시한다.
도 4는 현탁 배양물로부터 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 선행하는 프로세스 흐름, 후행하는 프로세스 흐름 및 충진 마감의 일례를 도시한다.
도 5는 상이한 LVV 제조 방법 간의 총 감염성 역가 수율의 비교를 도시한다.
도 6은 상이한 LVV 제조 방법 간의 감염성 역가의 비교를 도시한다.
도 7은 상이한 LVV 제조 방법 간의 입자 대 감염성 비율의 비교를 도시한다.
도 8은 상이한 LVV 제조 방법 간의 정규화된 숙주 세포 단백질(HCP)의 비교를 도시한다.
도 9는 상이한 LVV 제조 방법 간의 누적 숙주 세포 단백질(HCP) 로그 감소의 비교를 도시한다.
도 10은 상이한 LVV 제조 방법 간의 단계 숙주 세포 단백질(HCP) 로그 감소의 비교를 도시한다.
A. 개요
일반적으로, 본 개시는 부분적으로 임상적 용도를 위한 레트로바이러스 벡터를 제조하기 위한 개선된 대규모 프로세스에 관한 것이다. 임의의 특정 이론에 구속되고자 함 없이, 본 개시는 우선 임상 등급의 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 제조 프로세스를 제공한다. 본원에서 고려되는 제조 프로세스를 사용하여 생산된 벡터는 당업계에 존재하는 방법과 비교할 수 없는 감염성 및 순도를 갖는 임상 규모로 생산된다. 또한, 본 개시는 제조된 바이러스 벡터 상청액으로부터 숙주 세포 단백질(HCP)을 감소시키는 방법을 제공한다.
당업계에 존재하는 제조 프로세스는 일반적으로 벡터 품질을 희생하여 바이러스 벡터 양을 증가시키는 측면에서 오류를 범한다. 본원에서 고려되는 제조 프로세스는 품질을 양과 맞바꾼다는 당업계의 문제를 해결하고 상업적 규모로 고품질의 임상 등급 벡터의 생산을 가능하게 한다. 실제로, 본원에서 고려되는 프로세스는 더 높은 감염성 역가(TU/ml), 및 일부 구현예에서 동등하거나 더 낮은 숙주 세포 단백질(HCP) 수준을 입증한다.
고려되는 제조 프로세스는 바이러스 벡터를 생산하는 선행하는 프로세스 및 바이러스 벡터를 정제하는 후행하는 프로세스를 포함한다. 고려되는 제조 프로세스는 바이오리액터에서 대규모 숙주 세포 배양물을 확립하는 단계; 바이러스 부속 유전자를 암호화하는 패키징 플라스미드 및 전달 플라스미드를 포함하는 혼합물로 숙주 세포를 일시적으로 형질감염시키는 단계; 형질감염된 숙주 세포를 배양하여 바이러스를 생산하는 단계; 및 미정제 렌티바이러스 벡터를 함유하는 배양 상청액을 수집 및 처리하여 불순물을 제거하고 임상적 용도를 위해 바이러스 벡터를 농축 및 제형화하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 제조 프로세스는, 대규모, 예를 들어 적어도 200L 작업 부피의 바이오리액터를 시딩하기에 충분한 양의 숙주 세포가 될 때까지 점진적으로 더 큰 부피로 숙주 세포를 해동하고 배양하고 증식시키는 단계를 포함하는 선행하는(upstream) 프로세스를 포함한다. 시딩된 숙주 세포를 원하는 밀도로 배양하고, 배지를 교환하고, 형질감염제, 바이러스 부속 유전자를 암호화하는 패키징 플라스미즈 및 치료 이식유전자를 포함하는 패키지형 바이러스 벡터 게놈을 암호화하는 전달 플라스미드를 포함하는 혼합물로 세포를 혐질감염시킨다. 형질감염을 위한 충분한 시간 후, 또 다른 배지 교환을 수행하고, 바이러스 벡터를 생산하기 위해 형질감염된 숙주 세포를 약 1 내지 약 3일 동안 배양한다. 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 무혈청 합성 세포 배양 배지에서 배양된다.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 제조 프로세스는 바이오리액터의 내용물을 DNA 엔도뉴클레아제로 처리하는 단계; 여과에 의해 현탁 배양 상청액을 수확하고 정화하는 단계; 친화도 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 생산된 여액에서 바이러스 벡터를 포획하고 농축시키는 단계; 바이러스 벡터를 포함하는 용리액을 여과하는 단계; 접선 유동 여과(TFF)를 사용하여 바이러스 벡터를 한외여과하고 정용여과하는 단계; 및 배양 배지에서 바이러스 벡터를 제형화하여 제형화된 벌크 바이러스 벡터를 생산하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터는 멸균 여과되고, 충진되고, 동결되며; 이어서 해동되고, 멸균 여과되고, 최종 충진 마감되고, 동결된다. 다른 구현예에서, 벌크 렌티바이러스 벡터는 멸균 여과되고, 최종 충진 마감되고, 동결된다.
바람직한 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이고, 훨씬 더 바람직한 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
재조합((즉, 조작된) DNA, 펩티드 및 올리고뉴클레오티드 합성, 면역검정, 조직 배양, 형질전환((예를 들어, 전기천공, 리포펙션), 효소 반응, 정제를 위한 기술 및 관련 기술과 절차는 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 것과 같이 미생물학, 분자 생물학, 생화학, 분자 유전학, 세포 생물학, 바이러스학, 및 면역학에 있어서의 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참조 문헌에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 예를 들어, Sambrook 등., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, 2008년 7월 업데이트); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford Univ. Press USA, 1985); Current Protocols in Immunology (편집: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NY); Real-Time PCR: Current Technology and Applications, Julie Logan, Kirstin Edwards 및 Nick Saunders 편집, 2009, Caister Academic Press, Norfolk, UK; Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Guthrie and Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press, New York, 1991); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait 편집, 1984); 핵산 The Hybridization (B. Hames & S. Higgins 편집, 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins 편집, 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney 편집, 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Next-Generation Genome Sequencing (Janitz, 2008 Wiley-VCH); PCR Protocols (Methods in Molecular Biology) (Park 편집, 제3판, 2010 인간a Press); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller 및 M. P. Calos 편집, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (편집: Mayer 및 Walker, Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (편집: D. M. Weir 및 CC Blackwell, 1986); Roitt, Essential Immunology, 제6판, (Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988); Current Protocols in Immunology (Q. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach 및 W. Strober 편집, 1991); Annual Review of Immunology; 및 Advances in Immunology과 같은 저널의 논문을 참조한다.
B. 정의
본 개시를 보다 상세히 제시하기에 앞서, 본원에서 사용될 특정 용어의 정의를 제공하는 것이 본 개시를 이해하는 데 도움이 될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당 기술분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 특정 실시예의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 조성물, 방법 및 물질의 바람직한 실시예가 본원에 기술된다. 본 개시의 목적을 위해, 다음의 용어가 아래에 정의된다.
단수 표현(관사 "a", "an", 및 "the")은 단수 표현된 문법적 객체의 하나 또는 둘 이상(즉, 적어도 하나, 또는 하나 이상)을 지칭하도록 본원에서 사용된다. 예를 들어, "일 요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
대안예(예를 들어, "또는")의 사용은 대안예 중 하나, 둘 모두, 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "및/또는"은 대안예 중 어느 하나 또는 둘 모두를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 사용되는 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량, 또는 길이에 대해 많게는 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 만큼 달라지는 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량, 또는 길이를 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량, 또는 길이에 대해 ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2%, 또는 ± 1% 범위인 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량, 또는 길이를 지칭한다.
일 구현예에서, 범위, 예를 들어, 1 내지 5, 약 1 내지 5, 약 1 내지 약 5는 그 범위에 포함되는 각각의 수치 값을 지칭한다. 예를 들어, 하나의 비제한적이고 단지 예시적인 예에서, 범위 "1 내지 5"는 다음의 표현과 동등하다: 1, 2, 3, 4, 5; 또는 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 또는 5.0; 또는 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 또는 5.0.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량, 또는 길이와 비교해 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상인 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량, 또는 길이를 지칭한다. 일 구현예에서, "실질적으로 동일한(substantially the same)"은 기준 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량, 또는 길이와 대략 동일한 효과, 예를 들어 생리학적 효과를 생성하는 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량, 또는 길이를 지칭한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다", "포함한다", 및 "포함하는"은 언급된 단계나 요소 또는 단계나 요소의 군을 포함하는 것을 의미하지만 임의의 다른 단계나 요소 또는 단계나 요소의 군을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다. "~로 이루어지는"은 "~로 이루어지는"이라는 문구와 연결되는 것을 포함하고, 이에 한정됨을 의미한다. 따라서, 문구 "~로 이루어지는"은 열거된 요소가 요구되거나 필수적이며, 다른 요소가 존재할 수 없음을 나타낸다. "~로 본질적으로 이루어지는"은, 해당 문구와 연결되어 열거된 임의의 요소를 포함하고, 열거된 요소에 대해 본 개시에서 명시된 활성 또는 작용을 방해하거나 이에 기여하지 않는 다른 요소로 제한됨을 의미한다. 따라서, 문구 "~로 본질적으로 이루어지는"은 열거된 요소가 요구되거나 필수적이지만, 열거된 요소의 활성 또는 작용에 중대하게 영향을 미치는 다른 요소는 존재하지 않음을 나타낸다.
본 명세서 전반에 걸쳐 "일 실시예", "하나의 실시예", "특정 실시예", "연관된 실시예", "소정의 실시예", "추가의 실시예", 또는 "추가 실시예" 또는 이들의 조합은 해당 실시예와 관련하여 기술된 특정 특징, 구조, 또는 특성이 적어도 하나의 실시예에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 위치에서 나타나는 전술한 문구 모두가 본질적으로 동일한 실시예를 지칭하는 것은 아니다. 또한, 특정 특징, 구조, 또는 특성은 하나 이상의 실시예에서 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있다. 또한, 일 구현예에서 특징을 확실하게 언급하는 것(positive recitation)이 특정 구현예에서 해당 특징을 배제하기 위한 기초의 역할을 한다는 것도 이해가 될 것이다.
용어 "벡터"는 또 다른 핵산 분자를 세포 또는 게놈으로 전달 또는 수송할 수 있는 핵산 분자, 미생물, 또는 바이러스를 지칭하도록 본원에서 사용된다. 벡터의 예시적인 예는, 예를 들어, 플라스미드(예를 들어, DNA 플라스미드 또는 RNA 플라스미드), 트랜스포존(transposon), 코스미드, 박테리아 인공 염색체, 박테리아, 및 바이러스 벡터를 포함한다.
용어 "바이러스 벡터"는 특정 구현예에서, 통상적으로 핵산 분자의 전달 또는 세포 및/또는 게놈 내로의 통합을 용이하게 하는 바이러스 유래 핵산 요소를 포함하는 핵산 분자를 지칭하는 데 사용된다. 용어 "바이러스 벡터"는 또한, 특히 바람직한 구현예에서, 핵산을 세포 및/또는 게놈 내로 전달할 수 있는 변형된 바이러스 또는 바이러스 입자를 지칭한다. 바이러스 벡터는 주로 바이러스로부터 유래된 구조적 및/또는 기능적 유전 요소를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서 사용하기에 적합한 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
레트로바이러스 벡터는 유전자 전달을 위한 일반적인 도구이다(Miller, 2000, Nature . 357: 455~460). 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "레트로바이러스" 또는 "레트로바이러스 벡터"는 그의 게놈 RNA를 선형 이중-가닥 DNA 사본으로 역전사시키고, 이어서 그의 게놈 DNA를 숙주 게놈 내로 공유적으로 통합시키는 바이러스 벡터를 지칭한다. 특정 구현예에서 사용하기에 적합한 예시적인 레트로바이러스 벡터는 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스(M-MuLV), 몰로니 쥣과 육종 바이러스(MoMSV), 하비 쥣과 육종 바이러스(HaMuSV), 쥣과 유방 종양 바이러스(MuMTV), 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스(GaLV), 고양이과 백혈병 바이러스(FLV), 스푸마바이러스, 프렌드 쥣과 백혈병 바이러스, 쥣과 줄기 세포 바이러스(MSCV), 및 라우스 육종 바이러스(RSV), 및 렌티바이러스로부터 유래된 것들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "렌티바이러스"는 복잡한 레트로바이러스로 이루어진 군(또는 종)을 지칭한다. 본원에서 고려되는 특정 구현예에서 사용하기에 적합한 예시적인 렌티바이러스 벡터는 다음으로부터 유래된 것들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: HIV(인간 면역결핍 바이러스; HIV 1형, 및 HIV 2형 포함); Visna-maedi 바이러스(VMV); 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV); 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV); 고양이 면역결핍 바이러스(FIV); 소 면역 결핍 바이러스(BIV); 및 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV).
용어 "프로벡터" 또는 "프로바이러스"는 숙주 게놈에 통합된 바이러스 벡터를 지칭한다. 프로벡터는 바이러스 벡터와 유사하지만, 역전사 동안 생상된 3' LTR의 2개의 사본을 포함하며, 예를 들어, Pluta 및 Kacprzak(2009)를 참조한다.
특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 5' LTR, 패키징 신호, cPPT/FLAP 요소, RNA 수출 요소, 이식유전자, 및 3' LTR을 포함한다. 바이러스 벡터는 임의적으로 전사 후 조절 요소(post-trascriptional regulatory element) 및 폴리아데닐화 신호/서열을 포함할 수 있다.
용어 "긴 말단 반복체(long terminal repeat, LTR)"는 레트로바이러스 게놈의 말단에 위치한 염기쌍의 도메인을 지칭하며, 이들은, 이들의 자연 서열의 맥락에서, 직접 반복체이며 U3, R, 및 U5 영역을 함유한다. LTR은 일반적으로 레트로바이러스 유전자의 발현(예를 들어, 유전자 전사물의 촉진, 개시 및 폴리아데닐화) 및 바이러스 복제에 기초적인 기능을 제공한다. LTR은 바이러스 게놈의 복제 및 통합에 필요한 전사 조절 요소, 폴리아데닐화 신호 및 서열을 포함하는 다수의 조절 신호를 포함한다. 바이러스 LTR은 U3, R 및 U5로 불리는 3개의 영역으로 나누어진다. U3 영역은 인핸서 및 프로모터 요소를 포함한다. U5 영역은 프라이머 결합 부위와 R 영역 사이의 서열이며 폴리아데닐화 서열을 포함한다. R(반복) 영역은 U3 및 U5 영역의 측면에 위치한다. LTR은 U3, R 및 U5 영역으로 구성되고 바이러스 게놈의 5' 및 3' 말단 모두에서 나타난다. 5' LTR에 인접한 서열은 게놈(tRNA 프라이머 결합 부위)의 역전사 및 바이러스 RNA를 입자(Psi 부위)로 효율적으로 패키징하는 데 필요한 서열이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변형된 LTR"은 천연 바이러스 5' LTR 및/또는 3' LTR에서 하나 이상의 뉴클레오티드 첨가, 결실 또는 치환을 지칭한다. 당업자는 LTR이 기준 LTR과 비교하여 변형되는지 여부를 결정할 수 있을 것이다. LTR 중 어느 하나 또는 둘 모두는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 3' LTR의 변형은 종종 바이러스 벡터 시스템의 안전성을 개선하기 위해 이루어지며, 바이러스 벡터 복제-결함의 부여를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "복제-결함"은 감염성 바이러스 입자가 생산되지 않도록 완전하고 효과적인 복제가 불가능한 바이러스 벡터를 지칭한다(예를 들어, 복제-결함 바이러스 자손).
"자가 불활성화(self-inactivation, SIN)" 바이러스 벡터는, U3 영역으로서 알려진 우측(3') LTR 인핸서-프로모터 영역이 1회의 바이러스 복제 이후의 과도한 바이러스 전사를 방지하기 위해 (예를 들어, 결실 또는 치환에 의해) 변형된 복제-결함 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 지칭한다. 이는, 바이러스 복제 동안 우측(3') LTR U3 영역이 좌측(5') LTR U3 영역에 대한 템플릿으로서 사용되고, 따라서 U3 인핸서-프로모터 없이는 바이러스 전사물을 만들 수 없기 때문이다. 자가 불활성화는 바람직하게는 벡터 DNA, 즉, 벡터 RNA를 생산하는 데 사용되는 DNA의 3' LTR의 U3 영역에 결실을 도입함으로써 달성된다. 따라서, 역전사 동안, 이러한 결실은 프로바이러스 DNA의 5' LTR로 전달된다. 렌티바이러스 벡터의 경우, 이러한 벡터는 벡터 역가의 유의한 감소 없이 LTR TATA 박스의 제거(예를 들어, -418 내지 -18의 결실)를 포함하여, 유의한 U3 결실에 내성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
또한 바이러스 역가를 증가시키는 것으로 나타난 추가적인 안전성 강화는 5' LTR의 U3 영역을 이종 프로모터(즉, 키메라 5' LTR)로 교환함으로써 바이러스 벡터를 생산하는 동안 바이러스 벡터 게놈의 전사를 유도함으로써 제공된다. 키메라 5' LTR 프로모터는 Tat-독립적 방식으로 높은 수준의 전사를 유도할 수 있다. 본원에서 고려되는 특정 구현예에서 사용하기에 적합한 이종 프로모터의 예시적인 예는 유인원 바이러스 40(SV40)(예를 들어, 조기 또는 후기), 사이토메갈로바이러스(CMV)(예를 들어, 전초기), 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스(MoMLV), 라우스 육종 바이러스(RSV), 및 단순 포진 바이러스(HSV)(티미딘 키나아제) 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
"R 영역"은 캡핑기의 시작(즉, 전사의 시작)에서 시작하여 폴리 A 경로의 시작 직전에 종료되는 LTR 내의 영역을 지칭한다. R 영역은 또한 U3 및 U5 영역의 측면에 위치하는 것으로 정의된다. R 영역은 역전사 동안 게놈의 일 말단으로부터 다른 말단으로 초기 DNA를 전달하는 것을 허용하는 데 있어서 역할을 한다.
특정 구현예에서 고려되는 바이러스 벡터는 TAR 요소를 포함한다. 용어 "TAR"은 LTR의 R 영역에 위치한 "트랜스-활성 반응(trans-activation response)" 유전 요소를 지칭한다. 이 요소는 트랜스-활성제(tat) 유전 요소와 상호작용하여 바이러스 복제를 향상시킨다. 그러나, 이 요소는 5' LTR의 U3 영역이 이종 프로모터로 교체되는 바이러스 벡터에 필요하지 않다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "패키징 신호" 또는 "패키징 서열"은 바이러스 게놈 내에 위치한 서열을 지칭하며, 이는 바이러스 캡시드 또는 입자 내로 바이러스 RNA를 삽입하는 데 필요하다(예를 들어, Clever 등, 1995. J. of Virology, 69권, No. 4; pp. 2101~2109 참조). 여러 바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 캡슐화에 필요한 최소 패키징 신호(싸이([Ψ] 또는 [Ψ+]) 서열로도 지칭됨)를 사용한다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "패키징 서열", "패키징 신호", "싸이(psi)" 및 부호 "Ψ"는 바이러스 입자가 형성되는 동안 바이러스 RNA 가닥의 캡슐화에 필요한 비암호화 서열을 참조하여 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "FLAP 요소" 또는 "cPPT/FLAP"는 바이러스 벡터의 중앙 폴리퓨린 경로 및 중앙 종결 서열(cPPT 및 CTS)을 포함하는 서열을 갖는 핵산을 지칭한다. 적절한 FLAP 요소는 미국 특허 제6,682,907호 및 Zennou 등, 2000, Cell, 101:173에 기술되어 있다. 바이러스 역전사 동안, 중앙 폴리퓨린 경로(cPPT)에서의 플러스-가닥 DNA의 중앙 개시 및 중앙 종결 서열(CTS)에서의 중앙 종결은 3 가닥 DNA 구조: 중앙 DNA FLAP의 형성을 초래한다. 임의의 이론에 구속되고자 하지 않지만, DNA FLAP는 바이러스 벡터 게놈 핵 수입의 시스-활성 결정인자로서 작용할 수 있고/있거나 바이러스의 역가를 증가시킬 수 있다.
용어 "수출 요소(export element)"는 세포의 핵으로부터 세포질로 RNA 전사물의 수송을 조절하는 시스-작용 전사 후 조절 요소를 지칭한다. RNA 수출 요소의 예는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) rev 반응 요소(RRE)(예를 들어, Cullen 등, 1991. J. Virol. 65: 1053; 및 Cullen 등, 1991. Cell 58: 423 참조)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "전사후 조절 요소" 또는 "PRE"는, 예를 들어 캡핑, 스플라이싱, 폴리(A) 꼬리 첨가, 및 mRNA 안정성을 조절함으로써 mRNA 수준에서 발현을 조절하는 시스-작용 요소를 지칭한다. PTE의 예시적인 예는 우드척(woodchuck) 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE; Zufferey 등, 1999, J. Virol ., 73:2886); B형 간염 바이러스에 존재하는 전사후 조절 요소(HPRE)(Huang 및 Yen, 1995, Mol. Cell. Biol., 5:3864); 및 그 외(Liu 등, 1995, Genes Dev., 9:1766 참조)를 포함하지만, 이에 한정되지 않느다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리(A) 부위" 또는 "폴리(A) 서열"은 RNA 중합효소 II에 의한 초기 RNA 전사의 종결 및 폴리아데닐화 모두를 유도하는 DNA 서열을 지칭한다. 폴리아데닐화 서열은 코딩 서열의 3' 말단에 폴리(A) 꼬리를 첨가함으로써 mRNA 안정성을 촉진할 수 있으므로, 번역 효율의 증가에 기여한다. 절단과 폴리아데닐화는 RNA 내의 폴리(A) 서열에 의해 유도된다. 포유류 mRNA 전구체에 대한 코어 폴리(A) 서열은 절단-폴리아데닐화 부위의 측면에 위치하는 2개의 인식 요소를 갖는다. 일반적으로, 거의 불변인 AAUAAA 육량체가 U 또는 GU 잔기가 풍부한 보다 가변적인 요소로부터 상류로 20 내지 50개의 뉴클레오티드 위치에 놓인다. 초기 전사물의 절단은 이들 두 요소 사이에서 일어나고, 5' 절단 산물에 첨가된 최대 250개의 아데노신에 결합된다. 특정 구현예에서, 코어 폴리(A) 서열은 합성 폴리(A) 서열이다(예를 들어, AATAAA, ATTAAA, AGTAAA).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 및 DNA/RNA 하이브리드를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고 재조합, 합성, 또는 단리된 것일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 다음을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다: 전구체 전령 RNA(pre-mRNA), 전령 RNA(mRNA), RNA, 게놈 RNA(gRNA), 플러스 가닥 RNA(RNA(+)), 마이너스 가닥 RNA(RNA(-)), 합성 RNA, 합성 mRNA, 게놈 DNA(gDNA), PCR 증폭 DNA, 상보적 DNA(cDNA), 합성 DNA, 또는 재조합 DNA. 특정 구현예에서 고려되는 폴리뉴클레오티드의 예시적인 예는 전달 플라스미드, 바이러스 구조적 및/또는 부속 단백질, 예를 들어, gag, 폴리, tat, rev, 및/또는 env를 암호화하는 플라스미드, 및 관심 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드 변이체" 및 "변이체" 등은, 통상적으로 변이체가 기준 서열의 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지하는 경우, 본원에 기술된 임의의 기준 서열 중 어느 하나와 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 하나 이상의 뉴클레오티드가 추가 또는 결실되었거나, 기준 폴리뉴클레오티드에 비해 상이한 뉴클레오티드로 교환된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이와 관련하여, 돌연변이, 추가, 결실, 및 치환을 포함하는 소정의 변경이 기준 폴리뉴클레오티드에 만들어질 수 있고, 이에 의해 변경된 폴리뉴클레오티드가 기준 폴리뉴클레오티드의 생물학적 기능 또는 활성을 보유한다는 것이 당업계에서 잘 이해된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "관심 폴리뉴클레오티드(들)"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 발현시키고자 하는 벡터 내에 삽입된 치료 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드(즉, 관심 폴리펩티드)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 특정 구현예에서, 벡터 및/또는 플라스미드는 하나 이상의 치료 RNA, 예를 들어, shRNA, miRNA, 또는 shmiR, 및/또는 치료 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
폴리뉴클레오티드는, 코딩 서열 자체의 길이에 상관없이 다른 DNA 서열, 예를 들어, 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같은 또는 당업계에 알려진 것과 같은, 프로모터 및/또는 인핸서, 미번역 영역(UTR), 코작 서열, 폴리아데닐화 신호, 추가 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 재조합 효소 인식 부위(예를 들어, LoxP, FRT, 및 Att 부위), 종결 코돈, 전사 종결 신호, 및 자가 절단 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 에피토프 태그와 조합될 수 있으므로, 이들의 전체 길이는 상당히 달라질 수 있다. 따라서, 거의 모든 길이의 폴리뉴클레오티드 단편이 사용될 수 있고, 전체 길이는 바람직하게는 제조의 용이성 및 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서의 사용의 용이성에 의해 제한될 수 있는 것으로 고려된다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 기술된 성분이 의도된 방식으로 기능할 수 있게 하는 관계에 있는 병치 상태를 지칭한다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체 및 이의 변이체 및 합성 유사체를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 따라서, 이들 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 화학적 유사체와 같은 합성 비-자연 발생 아미노산인 아미노산 중합체뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 중합체에도 적용된다. 폴리펩티드의 예시적인 예는 특정 구현예의 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 글로빈 폴리펩티드를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 예를 들어, 미국 특허 제6,051,402호; 제7,901,671호; 및 제9,068,199호를 참조하며, 이의 전체 개시 및 청구범위는 그 전체가 참조로서 본원에 구체적으로 통합된다.
본원에서 고려되는 특정 구현예는 또한 폴리펩티드 "변이체"를 포함한다. 인용 폴리펩티드 "변이체"는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 추가, 결실, 절단, 변형, 및/또는 치환에 의해 기준 폴리펩티드와 구별되고 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩티드를 지칭한다. 소정의 구현예에서, 폴리펩티드 변이체는 당업계에 공지된 바와 같이 보존적 또는 비보존적일 수 있는 하나 이상의 치환에 의해 기준 폴리펩티드와 구별된다. 소정의 구현예에서, 변이체 폴리펩티드는 기준 폴리펩티드의 상응하는 서열과 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, 아미노산 추가 또는 결실은 기준 폴리펩티드의 C-말단 단부 및/또는 N-말단 단부에서 발생한다.
추가의 정의는 본 개시 전체에 걸쳐 제시되어 있다.
C. 선행하는(upstream) 바이러스 벡터 제조 프로세스
본원에서 고려되는 선행하는 제조 프로세스는 대규모 작업 부피의 바이오리액터에서 숙주 세포 집단을 배양하는 단계, 전달 플라스미드, 패키징 플라스미드 및 형질감염제를 포함하는 혼합물로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계; 및 형질감염된 숙주 세포를 배양하여 바이러스 벡터를 생산하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 선행하는 제조 프로세스는 다양한 후행하는 제조 프로세스와 조합하여 사용될 수 있다.
본원의 특정 구현예에서 고려되는 선행하는 제조 프로세스는 작업용 세포 은행의 숙주 세포를 해동하는 단계; 큰 작업 부피의 바이오리액터를 시딩하기에 충분한 양의 숙주 세포가 될 때까지 점진적으로 더 큰 부피로 숙주 세포를 배양 및 증식시키는 단계; 큰 작업 부피의 바이오리액터를 숙주 세포로 시딩하고 숙주 세포가 형질감염을 위한 충분한 밀도에 도달할 때까지 배양하는 단계; 배양 배지를 바이오리액터에서 교환하는 단계; 형질감염제, 바이러스 부속 유전자를 암호화하는 패키징 플라스미드 및 치료 이식유전자를 포함하는 패키지형 바이러스 벡터 게놈을 암호화하는 전달 플라스미드를 포함하는 혼합물로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계; 형질감염을 완료하기에 충분한 기간 동안 형질감염된 세포를 배양하는 단계; 배양 배지를 바이오리액터에서 교환하는 단계; 및 바이러스 벡터를 생산하기 위해 약 1 내지 약 3일 동안 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본원의 특정 구현예에서 고려되는 선행하는 제조 프로세스는 작업용 세포 은행의 숙주 세포를 해동하는 단계; 큰 작업 부피의 바이오리액터를 시딩하기에 충분한 양의 숙주 세포가 될 때까지 점진적으로 더 큰 부피로 숙주 세포를 배양 및 증식시키는 단계; 큰 작업 부피의 바이오리액터를 숙주 세포로 시딩하고 숙주 세포가 형질감염을 위한 충분한 밀도에 도달할 때까지 배양하는 단계; 배양 배지를 바이오리액터에서 교환하는 단계; 형질감염제, 바이러스 부속 유전자를 암호화하는 패키징 플라스미드 및 치료 이식유전자를 포함하는 패키지형 바이러스 벡터 게놈을 암호화하는 전달 플라스미드를 포함하는 혼합물로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계; 형질감염을 완료하기에 충분한 기간 동안 형질감염된 세포를 배양하는 단계; 배양 배지를 바이오리액터에서 교환하는 단계; 및 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위해 약 1 내지 약 3일 동안 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
다양한 구현예에서, 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터에 대한 선행하는 제조 프로세스는 작업용 세포 은행의 숙주 세포를 해동하는 단계, 약 18일의 기간에 걸쳐 무혈청 합성 세포 배양 배지에서 점진적으로 더 큰 부피로 숙주 세포를 증식시키는 단계; 큰 작업 부피, 예를 들어 적어도 200 리터 작업 부피의 바이오리액터를 일정량의 생존 가능 숙주 세포로 접종하고, 숙주 세포를 무혈청 합성 세포 배양 배지에서 약 3일 동안 배양하는 단계; 바이오리액터의 세포 배양 배지를 신선한 무혈청 합성 세포 배양 배지로 교환하는 단계; 형질감염제, 바이러스 부속 유전자를 암호화하는 패키징 플라스미드 및 치료 이식유전자를 포함하는 패키지형 바이러스 벡터 게놈을 암호화하는 전달 플라스미드를 포함하는 혼합물로 세포를 형질감염시키는 단계; 약 12시간 내지 약 20시간의 형질감염 또는 약 14시간 내지 약 18시간의 형질감염으로 바이오리액터의 배양 배지를 신선한 무혈청 합성 세포 배양 배지로 교환하는 단계; 및 레트로바이러스 벡터를 생산하기 위해 약 1일 또는 약 3일 동안 형질감염된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 배양 상청액은 약 1일 또는 약 3일의 레트로바이러스 생산 동안 1회 수집된다. 특정 구현예에서, 배양 상청액은 약 1일 내지 약 3일의 레트로바이러스 벡터 생산 동안 1, 2, 또는 3회 수집된다.
1. 숙주 세포
본원에서 고려되는 대규모 바이러스 벡터 생산 프로세스는 바이러스 구조적 및/또는 부속 유전자, 예를 들어, gag, pol, env, rev, tat, vif, vpr, vpu, vpx, 및/또는 nef 유전자를 암호화하는 전달 벡터 및 플라스미드를 숙주 세포의 집단에 도입하는 단계를 포함한다.
"숙주 세포"는 바이러스 벡터를 생산하도록 변형된 세포를 지칭한다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 패키징 세포 및 생산자 세포를 포함한다. "패키징 세포"는 바이러스 벡터 게놈을 바이러스 벡터 내로 패키징할 수 있게 하는 바이러스 구조적 및/또는 부속 유전자를 발현하도록 변형된 숙주 세포이다. 패키징 세포는 바이러스 벡터 게놈을 바이러스 벡터 내로 패키징하기 위한 패키징 신호를 포함하지 않는다. "생산자 세포"는 바이러스 벡터 게놈을 바이러스 벡터 내로 패키징하기 위한 패키징 신호를 포함하는 바이러스 벡터 게놈을 포함하는 패키징 세포이다.
바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 현탁 배양물에서 배양될 수 있거나 현탁 배양물에 적응될 수 있는 포유류 세포이다.
특정 구현예에서, 특정 구현예에서 사용하기에 적합한 숙주 세포는 CHO 세포, A549 세포, 및 HEK293 세포 및 이의 유도체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: HEK293 세포, HEK293S 세포, 현탁 배양에 적합한 HEK293T 세포(HEK392Ts), HEK293F 세포, HEK293FT 세포, HEK293FTM 세포, 및 HEK293E 세포. 보다 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 HEK293Ts 세포이다.
2. 증식 배양
숙주 세포는 종종 작업용 세포 은행의 일부로서 분취액에 저장된다. 작업용 세포 은행은 숙주 세포 증식 배양에서 재현성을 최대화하기 위해 실질적으로 유사한 숙주 세포 분취액을 저장하는 편리한 방법이다. 특정 구현예에서 고려되는 선행하는 제조 프로세스는 숙주 세포를 해동하는 단계 및 숙주 세포를 점진적으로 더 큰 부피로 배양하여 대규모 바이오리액터를 시딩하기에 충분한 수의 생존 가능 숙주 세포를 생산하는 단계를 고려하였다. 특정 구현예에서 사용하기에 적합한 대규모 바이오리액터는 적어도 100L, 적어도 200L, 적어도 250L, 적어도 500L, 적어도 1000L, 적어도 1500L, 또는 적어도 2000L의 작업 부피를 갖는 바이오리액터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 작업용 세포 은행을 해동시키고, 숙주 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6회 이상의 배양(예를 들어, P0, P1, P2, P3, P4, P5)을 통해 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24일의 총 시간에 걸쳐 점진적으로 더 큰 부피로 증식(또는 계대)된다.
숙주 세포는 합성 세포 배양 배지에서 증식을 위해 배양된다. 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 무혈청 합성 세포 배양 배지에서 배양된다. 특정 구현예에서 사용하기에 적합한 무혈청 합성 세포 배양 배지의 예시적인 예는 Freestyle 293 발현 배지, Ex-세포 293 무혈청 배지, Expi293 발현 배지, 및 Opti-MEM 환원 혈청 배지를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 숙주 세포를 약 37℃ 및 약 pH 7에서 배양한다.
특정 구현예에서, 작업용 세포 은행을 해동하고, 숙주 세포를 숙주 세포 배양물이 적어도 약 5x106 세포/mL, 적어도 약 1x106 세포/mL, 적어도 약 1.5x106 세포/mL, 적어도 약 2x106 세포/mL, 또는 적어도 약 2.5x106 세포/mL의 생존 가능 세포 밀도에서 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%의 생존 가능 세포에 도달할 때까지 약 50mL 부피의 배지(예를 들어, 적어도 250mL의 배양 용기)에서 배양한다. 특정 구현예에서, 50mL 배양물은 P0(제1 계대) 배양물로서 지칭된다.
특정 구현예에서, P0 배양물로부터의 생존 가능 숙주 세포가 충분한 밀도에 도달한 후, 세포는 숙주 세포 배양물이 적어도 약 2.5x106 세포/mL, 적어도 약 3x106 세포/mL, 적어도 약 3.5x106 세포/mL, 적어도 약 4x106 세포/mL, 적어도 약 4.5x106 세포/mL, 적어도 약 5x106 세포/mL, 적어도 약 5.5x106 세포/mL, 적어도 약 6x106 세포/mL, 적어도 약 6.5x106 세포/mL, 적어도 약 7x106 세포/mL, 적어도 약 7.5x106 세포/mL, 적어도 약 8x106 세포/mL, 8.5x106 세포/mL, 적어도 약 9x106 세포/mL, 적어도 약 9.5x106 세포/mL, 적어도 약 10x106 세포/mL, 적어도 약 10.5x106 세포/mL, 적어도 약 11x106 세포/mL, 적어도 약 115x106 세포/mL, 적어도 약 12x106 세포/mL, 적어도 약 12.5x106 세포/mL, 적어도 약 13x106 세포/mL, 적어도 약 13.5x106 세포/mL, 적어도 약 14x106 세포/mL, 적어도 약 14.5x106 세포/mL, 또는 적어도 약 15x106 세포/mL의 생존 가능 세포 밀도에서 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%의 생존 가능 세포에 도달할 때까지 (예를 들어, 적어도 500mL의 배양 용기에서) 배지의 약 100mL 배양 부피까지 증식된다. 특정 구현예에서, 100mL 배양물은 P1(제2 계대) 배양물로서 지칭된다.
특정 구현예에서, P1 배양물로부터의 생존 가능 숙주 세포가 충분한 밀도에 도달한 후, 세포는 1, 2 또는 3개의 배양물로 증식되며. 각각은 숙주 세포 배양물이 적어도 약 2.5x106 세포/mL, 적어도 약 3x106 세포/mL, 적어도 약 3.5x106 세포/mL, 적어도 약 4x106 세포/mL, 적어도 약 4.5x106 세포/mL, 적어도 약 5x106 세포/mL, 적어도 약 5.5x106 세포/mL, 적어도 약 6x106 세포/mL, 적어도 약 6.5x106 세포/mL, 적어도 약 7x106 세포/mL, 적어도 약 7.5x106 세포/mL, 적어도 약 8x106 세포/mL, 8.5x106 세포/mL, 적어도 약 9x106 세포/mL, 적어도 약 9.5x106 세포/mL, 적어도 약 10x106 세포/mL, 적어도 약 10.5x106 세포/mL, 적어도 약 11x106 세포/mL, 적어도 약 115x106 세포/mL, 적어도 약 12x106 세포/mL, 적어도 약 12.5x106 세포/mL, 적어도 약 13x106 세포/mL, 적어도 약 13.5x106 세포/mL, 적어도 약 14x106 세포/mL, 적어도 약 14.5x106 세포/mL, 또는 적어도 약 15x106 세포/mL의 생존 가능 세포 밀도에서 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%의 생존 가능 세포에 도달할 때까지 (예를 들어, 적어도 1L의 배양 용기에서) 배지의 약 200mL 부피를 갖는다. 특정 구현예에서, 200mL 배양물은 P2(제3 계대) 배양물로서 지칭된다.
특정 구현예에서, P2 배양물(들)로부터의 생존 가능 숙주 세포가 충분한 밀도에 도달한 후, 세포는 1, 2 또는 3개의 배양물로 증식되며. 각각은 숙주 세포 배양물이 적어도 약 2.5x106 세포/mL, 적어도 약 3x106 세포/mL, 적어도 약 3.5x106 세포/mL, 적어도 약 4x106 세포/mL, 적어도 약 4.5x106 세포/mL, 적어도 약 5x106 세포/mL, 적어도 약 5.5x106 세포/mL, 적어도 약 6x106 세포/mL, 적어도 약 6.5x106 세포/mL, 적어도 약 7x106 세포/mL, 적어도 약 7.5x106 세포/mL, 적어도 약 8x106 세포/mL, 8.5x106 세포/mL, 적어도 약 9x106 세포/mL, 적어도 약 9.5x106 세포/mL, 적어도 약 10x106 세포/mL, 적어도 약 10.5x106 세포/mL, 적어도 약 11x106 세포/mL, 적어도 약 115x106 세포/mL, 적어도 약 12x106 세포/mL, 적어도 약 12.5x106 세포/mL, 적어도 약 13x106 세포/mL, 적어도 약 13.5x106 세포/mL, 적어도 약 14x106 세포/mL, 적어도 약 14.5x106 세포/mL, 또는 적어도 약 15x106 세포/mL의 생존 가능 세포 밀도에서 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%의 생존 가능 세포에 도달할 때까지 (예를 들어, 적어도 3L의 배양 용기에서) 배지의 약 1L 부피를 갖는다. 특정 구현예에서, 1L 배양물은 P3(제4 계대) 배양물로서 지칭된다.
특정 구현예에서, P3 배양물(들)로부터의 생존 가능 숙주 세포가 충분한 밀도에 도달한 후, 세포는 숙주 세포 배양물이 적어도 약 2.5x106 세포/mL, 적어도 약 3x106 세포/mL, 적어도 약 3.5x106 세포/mL, 적어도 약 4x106 세포/mL, 적어도 약 4.5x106 세포/mL, 적어도 약 5x106 세포/mL, 적어도 약 5.5x106 세포/mL, 적어도 약 6x106 세포/mL, 적어도 약 6.5x106 세포/mL, 적어도 약 7x106 세포/mL, 적어도 약 7.5x106 세포/mL, 적어도 약 8x106 세포/mL, 8.5x106 세포/mL, 적어도 약 9x106 세포/mL, 적어도 약 9.5x106 세포/mL, 적어도 약 10x106 세포/mL, 적어도 약 10.5x106 세포/mL, 적어도 약 11x106 세포/mL, 적어도 약 115x106 세포/mL, 적어도 약 12x106 세포/mL, 적어도 약 12.5x106 세포/mL, 적어도 약 13x106 세포/mL, 적어도 약 13.5x106 세포/mL, 적어도 약 14x106 세포/mL, 적어도 약 14.5x106 세포/mL, 또는 적어도 약 15x106 세포/mL의 생존 가능 세포 밀도에서 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%의 생존 가능 세포에 도달할 때까지 (예를 들어, 적어도 50L의 부피를 갖는 바이오리액터에서) 배지의 약 20L 부피로 바이오리액터에서 배양되도록 증식된다. 특정 구현예에서, 20L 배양물은 P4(제5 계대) 배양물로서 지칭된다.
특정 구현예에서, P4 배양물(들)로부터의 생존 가능 숙주 세포가 충분한 밀도에 도달한 후, 적어도 약 200L의 작업 부피를 갖는 대규모 바이오리액터(P5, 제6 계대 배양물)를 적어도 약 0.1x106 생존 가능 세포/mL, 적어도 약 0.15x106 생존 가능 세포/mL, 적어도 약 0.2x106 생존 가능 세포/mL, 적어도 약 0.25x106 생존 가능 세포/mL, 적어도 약 0.3x106 생존 가능 세포/mL, 적어도 약 0.35x106 생존 가능 세포/mL, 적어도 약 0.4x106 생존 가능 세포/mL, 적어도 약 0.45x106 생존 가능 세포/mL, 또는 적어도 약 0.5x106 생존 가능 세포/mL로 시딩한다.
다양한 구현예에서, 대규모 현탁 바이오리액터는 약 40.0x108개 내지 약 120.0x108개의 생존 가능 숙주 세포로 시딩/접종된다. 일부 구현예에서, 대규모 현탁 바이오리액터는 약 50.0x108개 내지 약 120.0x108개의 생존 가능 숙주 세포로 시딩/접종된다. 일부 구현예에서, 대규모 현탁 바이오리액터는 약 60.0x108개 내지 약 120.0x108개의 생존 가능 숙주 세포로 시딩/접종된다. 일부 구현예에서, 대규모 현탁 바이오리액터는 약 70.0x108개 내지 약 120.0x108개의 생존 가능 숙주 세포로 시딩/접종된다. 일부 구현예에서, 대규모 현탁 바이오리액터는 약 80.0x108개 내지 약 120.0x108개의 생존 가능 숙주 세포로 시딩/접종된다. 일부 구현예에서, 대규모 현탁 바이오리액터는 약 90.0x108개 내지 약 120.0x108개의 생존 가능 숙주 세포로 시딩/접종된다. 일부 구현예에서, 대규모 현탁 바이오리액터는 약 100.0x108개 내지 약 120.0x108개의 생존 가능 숙주 세포로 시딩/접종된다. 일부 구현예에서, 대규모 현탁 바이오리액터는 약 110.0x108개 내지 약 120.0x108개의 생존 가능 숙주 세포로 시딩/접종된다. 일부 구현예에서, 대규모 현탁 바이오리액터는 약 40.0x108개 내지 약 110.0x108개의 생존 가능 숙주 세포로 시딩/접종된다. 일부 구현예에서, 대규모 현탁 바이오리액터는 약 40.0x108개 내지 약 100.0x108개의 생존 가능 숙주 세포로 시딩/접종된다. 일부 구현예에서, 대규모 현탁 바이오리액터는 약 40.0x108개 내지 약 90.0x108개의 생존 가능 숙주 세포로 시딩/접종된다. 일부 구현예에서, 대규모 현탁 바이오리액터는 약 40.0x108개 내지 약 80.0x108개의 생존 가능 숙주 세포로 시딩/접종된다. 일부 구현예에서, 대규모 현탁 바이오리액터는 약 40.0x108개 내지 약 70.0x108개의 생존 가능 숙주 세포로 시딩/접종된다. 일부 구현예에서, 대규모 현탁 바이오리액터는 약 40.0x108개 내지 약 60.0x108개의 생존 가능 숙주 세포로 시딩/접종된다. 일부 구현예에서, 대규모 현탁 바이오리액터는 약 40.0x108개 내지 약 50.0x108개의 생존 가능 숙주 세포로 시딩/접종된다. 일부 구현예에서, 대규모 현탁 바이오리액터는 약 50.0x108개 내지 약 110.0x108개의 생존 가능 숙주 세포로 시딩/접종된다. 일부 구현예에서, 대규모 현탁 바이오리액터는 약 60.0x108개 내지 약 100.0x108개의 생존 가능 숙주 세포로 시딩/접종된다. 일부 구현예에서, 대규모 현탁 바이오리액터는 약 70.0x108개 내지 약 90.0x108개의 생존 가능 숙주 세포로 시딩/접종된다. 일부 구현예에서, 대규모 현탁 바이오리액터는 약 40.0x108개의 생존 가능 숙주 세포로 시딩/접종된다. 일부 구현예에서, 대규모 현탁 바이오리액터는 약 50.0x108개의 생존 가능 숙주 세포로 시딩/접종된다. 일부 구현예에서, 대규모 현탁 바이오리액터는 약 60.0x108개의 생존 가능 숙주 세포로 시딩/접종된다. 일부 구현예에서, 대규모 현탁 바이오리액터는 약 70.0x108개의 생존 가능 숙주 세포로 시딩/접종된다. 일부 구현예에서, 대규모 현탁 바이오리액터는 약 80.0x108개의 생존 가능 숙주 세포로 시딩/접종된다. 일부 구현예에서, 대규모 현탁 바이오리액터는 약 90.0x108개의 생존 가능 숙주 세포로 시딩/접종된다. 일부 구현예에서, 대규모 현탁 바이오리액터는 약 100.0x108개의 생존 가능 숙주 세포로 시딩/접종된다. 일부 구현예에서, 대규모 현탁 바이오리액터는 약 110.0x108개의 생존 가능 숙주 세포로 시딩/접종된다. 일부 구현예에서, 대규모 현탁 바이오리액터는 약 120.0x108개의 생존 가능 숙주 세포로 시딩/접종된다.
형질감염 전 생존 가능 세포 밀도가 적어도 약 2.5x106 세포/mL, 적어도 약 3x106 세포/mL, 적어도 약 3.5x106 세포/mL, 적어도 약 4x106 세포/mL, 적어도 약 4.5x106 세포/mL, 적어도 약 5x106 세포/mL, 적어도 약 5.5x106 세포/mL, 적어도 약 6x106 세포/mL, 적어도 약 6.5x106 세포/mL, 적어도 약 7x106 세포/mL, 또는 적어도 약 7.5x106 세포/mL가 될 때까지, 약 2일, 약 3일, 또는 약 4일 동안 세포를 배양한다.
특정 구현예에서, 대규모 바이오리액터에서 배양된 숙주 세포는 원하는 형질도입 전 생존 가능 세포 밀도에 도달하고, 바이오리액터 내의 세포 배양 배지는 신선한 합성 세포 배양 배지로 교환된다. 특정 구현예에서, 교번식 접선 유동 여과(ATF) 필터 유닛, TFF 필터 유닛, 또는 음향 필터 유닛이 배지 교환을 수행하는 데 사용된다. 일 구현예에서, ATF 필터 유닛이 배지 교환을 수행하는 데 사용된다. 일 구현예에서, TFF 필터 유닛이 배지 교환을 수행하는 데 사용된다. 일 구현예에서, 음향 필터 유닛이 배지 교환을 수행하는 데 사용된다. 바람직한 구현예에서, 바이오리액터 배지를 교환한 후, 숙주 세포가 형질감염을 위해 준비된다.
3. 형질감염
형질감염은 물리적 또는 화학적 방법(비바이러스성)에 의해 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 방법이다. "형질감염"은 비바이러스성 방법에 의해 나출 DNA를 세포 내로 도입하는 프로세스를 지칭한다. 형질감염은 안정적이거나 일시적일 수 있다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 바이러스 벡터 게놈을 패키징하기 위한 하나 이상의 바이러스 구조적 및/또는 부속 유전자를 암호화하는 하나 이상의 플라스미드, 패키징 신호 및 이식유전자(예를 들어, 치료 유전자, 관심 유전자, 또는 관심 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 바이러스 벡터 게놈을 포함하는 전달 플라스미드, 및 형질감염제를 포함하는 혼합물로 일시적으로 형질감염된다.
"형질감염제"는 숙주 세포 내로 DNA의 형질감염을 증가시키는 분자이다. 본원에서 고려되는 특정 구현예에서 사용하기에 적합한 형질감염제의 예시적인 예는 인산칼슘, 양이온성 지질, 및 양이온성 중합체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 고려되는 특정 구현예에서 사용하기에 적합한 양이온성 지질의 예시적인 예는 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로펠]-N,N,N-트리메틸암모늄(DOTMA); 2,3-디올레일옥시-N-[2-스페르민 카르복사미드] 에틸-N,N-디메틸-1-프로판암모늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA, 리포펙타민); 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP); N-[1-(2,3-디미리스틸옥시)프로필]-N,N-디메틸-N-(2-하이드록시에틸) 암모늄 브롬화물(DMRIE), 3-β-[N-(N,N'-디메틸아미노에탄) 카르바모일] 콜레스테롤(DC-콜); 디옥타데실 아미도글리세릴 스페르민(DOGS, 트랜스펙탐); 및 디메틸디옥타데실암모늄 브롬화물(DDAB)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 양이온성 지질은 리포펙타민이다.
본원에서 고려되는 특정 구현예에서 사용하기에 적합한 양이온성 중합체의 예시적인 예는 DEAE-덱스트란, 폴리브렌, 덴드리머, 및 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 대규모 바이오리액터 내의 숙주 세포는 형질감염제, 바이러스 구조적 및/또는 부속 유전자를 암호화하는 하나 이상의 플라스미드, 및 인간 치료 이식유전자를 암호화하는 패키지형 바이러스 벡터 게놈을 포함하는 전달 플라스미드를 포함하는 혼합물로 일시적으로 형질감염된다. 바람직한 구현예에서, 형질감염제는 양이온성 중합체를 포함하고, 보다 바람직한 구현예에서, 양이온성 중합체는 PEI를 포함하고, 보다 더 바람직한 구현예에서, 양이온성 중합체는 선형 PEI를 포함한다.
특정 구현예에서, PEI/DNA 혼합물에 대한 N(PEI 중 NH2 아민):P(DNA 백본 중 인산염기)의 비율은 약 5 내지 약 10, 또는 약 5, 약 5.5, 약 6, 약 6.4, 약 6.5, 약 7, 약 7.5, 약 8, 약 8.5, 약 9, 약 9.5, 또는 약 10이다. 일부 구현예에서, PEI/DNA 혼합물에 대한 N(PEI 중 NH2 아민):P(DNA 백본 중 인산염기)의 비율은 약 5 내지 약 10이다. 일부 구현예에서, PEI/DNA 혼합물에 대한 N(PEI 중 NH2 아민):P(DNA 백본 중 인산염기)의 비율은 약 5 사이이다. 일부 구현예에서, PEI/DNA 혼합물에 대한 N(PEI 중 NH2 아민):P(DNA 백본 중 인산염기)의 비율은 약 5.5 사이이다. 일부 구현예에서, PEI/DNA 혼합물에 대한 N(PEI 중 NH2 아민):P(DNA 백본 중 인산염기)의 비율은 약 6 사이이다. 일부 구현예에서, PEI/DNA 혼합물에 대한 N(PEI 중 NH2 아민):P(DNA 백본 중 인산염기)의 비율은 약 6.4 사이이다. 일부 구현예에서, PEI/DNA 혼합물에 대한 N(PEI 중 NH2 아민):P(DNA 백본 중 인산염기)의 비율은 약 6.5 사이이다. 일부 구현예에서, PEI/DNA 혼합물에 대한 N(PEI 중 NH2 아민):P(DNA 백본 중 인산염기)의 비율은 약 7 사이이다. 일부 구현예에서, PEI/DNA 혼합물에 대한 N(PEI 중 NH2 아민):P(DNA 백본 중 인산염기)의 비율은 약 7.5 사이이다. 일부 구현예에서, PEI/DNA 혼합물에 대한 N(PEI 중 NH2 아민):P(DNA 백본 중 인산염기)의 비율은 약 8 사이이다. 일부 구현예에서, PEI/DNA 혼합물에 대한 N(PEI 중 NH2 아민):P(DNA 백본 중 인산염기)의 비율은 약 9.5 사이이다. 일부 구현예에서, PEI/DNA 혼합물에 대한 N(PEI 중 NH2 아민):P(DNA 백본 중 인산염기)의 비율은 약 10 사이이다.
바람직한 구현예에서, 하나 이상의 플라스미드는 레트로바이러스 gag, pol, rev, 이종 외피 단백질, 및 임의로 tat를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 보다 바람직하게는, 하나 이상의 플라스미드는 렌티바이러스 gag, pol, rev, 및 이종 외피 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
특히 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 플라스미드는 렌티바이러스 gag 및 pol을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 렌티바이러스 rev를 암호화하는 플라스미드, 및 베시큘로바이러스 외피 단백질 또는 이의 변이체, 파라믹소바이러스 외피 단백질 또는 이의 변이체, 알파바이러스 외피 단백질 또는 이의 변이체, 감마레트로바이러스 외피 단백질 또는 이의 변이체, 오르토헤파드나바이러스 외피 단백질 또는 이의 변이체, 헤파시바이러스 외피 단백질 또는 이의 변이체, 및 리사바이러스 외피 단백질 또는 이의 변이체로부터의 외피 당단백질을 포함하지만 이에 한정되지 않는 이종 외피 당단백질을 암호화하는 플라스미드를 포함한다.
특히 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 플라스미드는 렌티바이러스 gag 및 pol을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 렌티바이러스 rev를 암호화하는 플라스미드, 및 소포성 구내염 바이러스(VSV) 외피 단백질 또는 이의 변이체(예를 들어, VSV-G), 코칼 바이러스(COCV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 마라바 바이러스(MARAV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 파이리 바이러스(PIRYV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 니파 바이러스(NiV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 센다이 바이러스(SeV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 모르빌리바이러스 외피 단백질 또는 이의 변이체, 개과 디스템퍼(CDV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 홍역 바이러스(MV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 신드비스 바이러스(SINV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스(GALV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 고양이 내인성 레트로바이러스(RD114) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 고양이 백혈병 바이러스(FeLV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 개코원숭이 내인성 레트로바이러스(BaEV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, B형 간염(HBV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, C형 간염(HCV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 및 라비스 바이러스(RABV) 외피 단백질 또는 이의 변이체로부터의 외피 당단백질을 포함하지만 이에 한정되지 않는 이종 외피 당단백질을 암호화하는 플라스미드를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 전달 벡터는 패키징 서열을 포함하고 인간 치료 이식유전자를 암호화하는 HIV 렌티바이러스 벡터 백본을 포함하고; 바람직하게는, 전달 벡터는 패키징 서열을 포함하고 중증 유전 질환 또는 암의 치료를 위한 인간 치료 이식유전자를 암호화하는 HIV-1 렌티바이러스 벡터 백본을 포함한다. 특정 구현예에서, 전달 벡터는 패키징 서열을 포함하고 헤모글로빈병증의 치료를 위한 인간 치료 글로빈, CALD의 치료를 위한 ABCD1 유전자, 또는 키메라 수용체, 예를 들어, 키메라 항원 수용체, T 세포 수용체, 또는 암의 치료를 위한 DARIC를 암호화하는 HIV-1 렌티바이러스 벡터 백본을 포함한다.
특정 구현예에서, 대규모 바이오리액터 내의 숙주 세포는 선형 PEI, 렌티바이러스 gag 및 pol을 암호화하는 플라스미드, rev를 암호화하는 플라스미드, VSV-G를 암호화하는 플라스미드, 및 인간 치료 이식유전자를 암호화하는 패키지형 HIV-1 기반 렌티바이러스 벡터 게놈을 포함하는 전달 플라스미드를 포함하는 혼합물로 일시적으로 형질감염된다. 특정 구현예에서, 렌티바이러스 gag 및 pol, rev, 및/또는 VSV-G는 인간 세포에서의 발현 및/또는 안정성을 위해 코돈 최적화된다. 특정 구현예에서, 전달 플라스미드 및 패키징 플라스미드는 선택 카세트 또는 유전자를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 전달 플라스미드 및 패키징 플라스미드는 RNAout 선택 카세트(Nature Technology)를 포함한다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 또는 약 20시간 동안 형질감염된다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 또는 약 18시간 동안 형질감염된다. 보다 특정한 구현예에서, 숙주 세포는 약 14시간 내지 약 18시간 동안 형질감염된다.
숙주 세포 형질감염이 완료된 후, 예를 들어 형질감염 후 약 14시간 내지 약 18시간차에, 교번식 접선 유동 여과(ATF) 필터 유닛, TFF 필터 유닛, 또는 음향 필터 유닛이 배지 교환을 수행하는 데 사용된다. 일 구현예에서, ATF 필터 유닛이 배지 교환을 수행하는 데 사용된다. 일 구현예에서, TFF 필터 유닛이 배지 교환을 수행하는 데 사용된다. 일 구현예에서, 음향 필터 유닛이 배지 교환을 수행하는 데 사용된다. 특정 구현예에서, 바이오리액터 배지가 교환된 후, 숙주 세포는 바이러스 벡터 생산을 위해 배양된다.
특정 구현예에서, 바이러스 벡터 생산은 무혈청 합성 세포 배양 배지에서 형질감염 후 약 36시간 내지 약 48시간, 형질감염 후 약 36시간 내지 약 48시간, 형질감염 후 약 36시간 내지 약 46시간, 형질감염 후 약 36시간 내지 약 44시간, 형질감염 후 약 38시간 내지 약 48시간, 형질감염 후 약 38시간 내지 약 46시간, 형질감염 후 약 38시간 내지 약 44시간, 또는 형질감염 후 약 38시간 내지 약 42시간차(예를 들어, 형질감염 후 36시간은 숙주 세포에 형질감염 혼합물을 첨가 후 36시간차임)에 발생한다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터 생산은 무혈청 합성 세포 배양 배지에서 형질감염 후 약 36시간, 약 37시간, 약 38시간, 약 39시간, 약 40시간, 약 41시간, 약 42시간, 약 43시간, 약 44시간, 약 45시간, 약 46시간, 약 47시간 또는 약 48시간까지 발생한다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터 생산은 무혈청 합성 세포 배양 배지에서 형질감염 후 약 38시간, 약 39시간, 약 40시간, 약 41시간, 또는 약 42시간까지 발생한다.
특정 구현예에서, 바이러스 벡터 생산은 무혈청 합성 세포 배양 배지에서 약 12시간 내지 약 48시간, 약 18시간 내지 약 48시간, 약 18시간 내지 약 36시간, 약 18시간 내지 약 30시간, 약 20시간 내지 약 28시간, 또는 약 22시간 내지 약 26시간 동안 발생한다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터 생산은 무혈청 합성 세포 배양 배지에서 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 약 24시간, 약 25시간, 약 26시간, 약 27시간, 약 28시간, 약 29시간, 약 30시간, 약 31시간, 약 32시간, 약 33시간, 약 34시간, 약 35시간, 약 36시간, 약 37시간, 약 38시간, 약 39시간, 약 40시간, 약 41시간, 약 42시간, 약 43시간, 약 44시간, 약 45시간, 약 46시간, 약 47시간 또는 약 48시간 동안 발생한다.
특정 구현예에서, 현탁 배양 상청액은 충분한 바이러스 벡터 생산을 보장하기 위해 1회 이상 샘플링되고 분석된다.
다양한 구현예에서, 현탁 배양 상청액은 바이러스 벡터 생산 기간 동안 1회, 2회, 3회 또는 그 이상 수집된다. 특정 구현예에서, 현탁 배양 상청액은 바이러스 벡터 생산 기간 동안 1회 수집된다. 바람직한 구현예에서, 충분한 바이러스 벡터가 생산된 후, 현탁 배양 상청액은 후행하는 제조 프로세스의 개시 전에 수집되지 않는다.
D. 후행하는(DOWNSTREAM) 바이러스 벡터 제조 프로세스
바이러스 벡터 생산은 선행하는 제조 프로세스의 종료를 나타낸다. 후행하는 제조 프로세스는 바이러스 벡터 생산 기간의 종료 시 시작된다. 본원에서 고려되는 후행하는 제조 프로세스는 바이러스 벡터 생산 기간의 종료 시 뉴클레아제를 현탁 배양 상청액에 첨가하는 단계; 여과를 사용하여 현탁 배양 상청액을 수확하고 정화하는 단계; 크로마토그래피를 사용하여, 수확하여 정화한 현탁 배양 상청액으로부터 바이러스 벡터를 포획하고 농축시키는 단계; 바이러스 벡터를 여과하는 단계; 바이러스 벡터를 한외여과하고 정용여과하는 단계; 및 바이러스 벡터를 제형화하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 제형화된 벌크 바이러스 벡터는 멸균 여과 및 동결되고; 이어서 해동 및 멸균 여과되고; 최종 충진 마감을 거치고; 이어서 동결된다. 다른 특정 구현예에서, 제형화된 벌크 바이러스 벡터는 멸균 여과되고, 최종 충진 마감을 거치고; 이어서 동결된다.
본원의 특정 구현예에서 고려되는 후행하는 제조 프로세스는 바이러스 벡터 생산 기간의 종료 시 현탁 배양 상청액에 엔도뉴클레아제를 첨가하는 단계; 탠덤 심층 여과를 사용하여, 현탁 배양 상청액을 수확하고 정화하는 단계; 친화도 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여, 수확하여 정화한 현탁 배양 상청액으로부터 바이러스 벡터를 포획하고 농축시키는 단계; 바이러스 벡터를 여과하는 단계; 접선 유동 여과를 사용하여 바이러스 벡터를 한외여과하고 정용여과하는 단계; 및 세포 배양 배지에서 바이러스 벡터를 제형화하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 제형화된 벌크 바이러스 벡터는 멸균 여과되고 ≤-65℃에서 동결되고; 이어서 해동 및 멸균 여과되고; 최종 충진 마감을 거치고; 그런 다음 ≤ -65℃에서 동결된다. 다른 특정 구현예에서, 제형화된 벌크 바이러스 벡터는 멸균 여과되고, 최종 충진 마감을 거치고; 그런 다음 ≤-65℃에서 동결된다.
본원의 특정 구현예에서 고려되는 후행하는 제조 프로세스는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터 생산 기간의 종료 시 현탁 배양 상청액에 DNA 엔도뉴클레아제를 첨가하는 단계; 탠덤 심층 여과 및 제2 필터를 사용하여 현탁 배양 상청액을 수확하고 정화하는 단계; 헤파린 친화도 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여, 수집하여 정화한 현탁 배양 상청액으로부터 레트로바이러스 벡터를 포획하고 농축시키는 단계; 농축된 레트로바이러스 벡터를 여과하는 단계; 중공 섬유 접선 유동 여과를 사용하여 레트로바이러스 벡터를 한외여과하고 정용여과하는 단계; 및 레트로바이러스 벡터를 제형화하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 제형화된 벌크 레트로바이러스 벡터는 멸균 여과되고 ≤-65℃에서 동결되고; 이어서 해동 및 멸균 여과되고; 최종 충진 마감을 거치고; 그런 다음 ≤-65℃에서 동결된다. 다른 특정 구현예에서, 제형화된 벌크 레트로바이러스 벡터는 멸균 여과되고, 최종 충진 마감을 거치고; 그런 다음 ≤-65℃에서 동결된다.
다양한 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 생산 및 정제를 위한 후행하는 제조 프로세스는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터 생산 기간의 종료 시 현탁 배양 상청액에 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들어 벤조나아제 또는 데나라아제를 첨가하는 단계; 탠덤 심층 여과 및 제2 필터를 사용하여 현탁 배양 상청액을 수확하고 정화하는 단계로서, 여기서 제2 필터는 전처리 필터막 및 여과막을 포함하는, 단계; 헤파린 친화도 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여, 수확하여 정화한 현탁 배양 상청액으로부터 레트로바이러스 벡터를 포획하고 농축시키는 단계; 농축된 레트로바이러스 벡터를 전처리 필터막 및 여과막을 포함하는 필터로 여과하는 단계; 중공 섬유 접선 유동 여과(hollow fiber tangential flow filtration)를 사용하여 레트로바이러스 벡터를 한외여과하고 정용여과하는 단계로서, 여기서 TFF는 약 100kDa 내지 약 500kDa의 분자량 컷오프를 갖는, 단계; 및 제형화 완충액(예를 들어, 2X 줄기 세포 성장 배지(SCGM))에서, 임의로, 및 일부 구현예에서 바람직하게는 1:1 비율로 레트로바이러스 벡터를 함유하는 용리액을 제형화하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 제형화된 벌크 레트로바이러스 벡터는 멸균 여과되고 ≤-65℃에서 동결되고; 이어서 해동 및 멸균 여과되고; 최종 충진 마감을 거치고; 그런 다음 ≤-65℃에서 동결된다. 다른 특정 구현예에서, 제형화된 벌크 레트로바이러스 벡터는 멸균 여과되고, 최종 충진 마감을 거치고; 그런 다음 ≤-65℃에서 동결된다.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 후행하는 제조 프로세스는 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 또는 적어도 약 100배 이상의 바이러스 벡터 농도를 초래한다.
1. 뉴클레아제 분해(Nuclease Digestion)
선행하는 바이러스 벡터 제조 프로세스는 충분한 바이러스 벡터가 생산된 후에 종결된다. 바이러스 벡터 상청액은 RNA, 숙주 세포 형질감염으로부터의 플라스미드 DNA 및 바이러스 벡터 생산 동안 숙주 세포의 용해로부터의 게놈 DNA를 포함하지만 이에 한정되지 않는 잔류 핵산을 포함할 수 있다. 이러한 잔류 핵산은 잠재적으로 독성이 있고, 본원에서 고려되는 제조 프로세스로부터 생산된 임의의 바이러스 벡터의 효능을 감소시킨다. 뉴클레아제 분해 단계의 목적은 바이러스 벡터 생산 상청액에서 이들 잔류 핵산의 양을 감소시키는 것이다.
다양한 구현예에서, 뉴클레아제는 바이러스 벡터 생산 프로세스의 종료 시 바이러스 벡터 생산 상청액에 첨가된다. 특정 구현예에서, 뉴클레아제는 엔도뉴클레아제이고, 바람직한 구현예에서, 뉴클레아제는 DNA/RNA 엔도뉴클레아제(DNA 및 RNA 둘 다를 절단하는 엔도뉴클레아제)이다. 본원에서 고려되는 후행하는 제조 프로세스의 특정 구현예에서 사용하기에 적합한 엔도뉴클레아제의 예시적인 예는 벤조나아제® 엔도뉴클레아제(EMD Millipore), 데나라아제® 엔도뉴클레아제(c-LEcta GmbH), 디콘타미나아제?? 엔도뉴클레아제(AG Scientific), 및 세라티아마르세센스균(Serratia marcescens) 유래의 재조합 NucA 단백질을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 구현예에서, 벤조나아제® 엔도뉴클레아제 또는 세라티아마르세센스균 유래의 재조합 NucA 단백질은 바이러스 벡터 생산 프로세스의 종료 시 바이러스 벡터 생산 상청액에 첨가된다.
특정 구현예에서, MgCl2는 엔도뉴클레아제와 함께 바이러스 벡터 생산 상청액에 첨가되어 엔도뉴클레아제가 촉매적으로 활성임을 보장한다. 다양한 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 형질감염 후 약 36시간 내지 약 72시간차에 현탁 배양 상청액에 첨가된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 형질감염 후 약 36시간 내지 약 48시간차에 현탁 배양 상청액에 첨가된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 형질감염 후 약 48시간차에 현탁 배양 상청액에 첨가된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 형질감염 후 약 44시간차에 현탁 배양 상청액에 첨가된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 형질감염 후 약 40시간차에 현탁 배양 상청액에 첨가된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 형질감염 후 약 36시간차에 현탁 배양 상청액에 첨가된다.
특정 구현예에서, 후행하는 바이러스 벡터 제조 프로세스의 뉴클레아제 분해 단계는 바이러스 벡터 생산 상청액에 존재하는 오염 핵산을 분해하기에 충분한 시간 동안 적절한 온도에서 수행된다. 특정 구현예에서, 뉴클레아제 분해는 약 2℃ 내지 약 8℃ 에서 밤새 수행된다. 특정 구현예에서, 뉴클레아제 분해는 약 36℃ 내지 약 38℃에서 약 1시간, 약 2시간, 또는 약 3시간 동안 수행된다. 바람직한 구현예에서, 엔도뉴클레아제 분해는 약 36℃, 약 37℃, 또는 약 38℃에서 약 1시간, 약 2시간, 또는 약 3시간 동안 수행된다. 보다 바람직한 구현예에서, 벤조나아제® 엔도뉴클레아제 분해는 약 37℃에서 약 1시간 내지 2시간 동안 수행된다.
다양한 구현예에서, 엔도뉴클레아제 분해는 약 20U/ml 내지 약 70U/ml의 농도로 수행된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제 분해는 약 50U/ml 내지 약 70U/ml의 농도로 수행된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제 분해는 약 55U/ml 내지 약 65U/ml의 농도로 수행된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제 분해는 약 20U/ml 내지 약 40U/ml의 농도로 수행된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제 분해는 약 25U/ml 내지 약 35U/ml의 농도로 수행된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제 분해는 약 50U/ml 내지 약 70U/ml의 농도로 수행된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제 분해는 약 20U/ml의 농도로 수행된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제 분해는 약 25U/ml의 농도로 수행된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제 분해는 약 30U/ml의 농도로 수행된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제 분해는 약 35U/ml의 농도로 수행된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제 분해는 약 40U/ml의 농도로 수행된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제 분해는 약 45U/ml의 농도로 수행된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제 분해는 약 50U/ml의 농도로 수행된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제 분해는 약 55U/ml의 농도로 수행된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제 분해는 약 60U/ml의 농도로 수행된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제 분해는 약 65U/ml의 농도로 수행된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제 분해는 약 70U/ml의 농도로 수행된다.
뉴클레아제가 바이러스 벡터 생산 상청액에 존재하는 세포외 핵산을 충분히 분해한 후, 상청액을 정화 및 여과한다.
2. 정화(Clarification)
특정 구현예에서 고려되는 후행하는 바이러스 벡터 제조 프로세스는 정화 단계를 추가로 포함한다. 정화 단계의 궁극적인 목적은 후행하는 크로마토그래피를 위한 바이러스 벡터 생산 상청액의 제조 및 바이러스 벡터의 정제이다. 정화 단계(들)는 바이러스 벡터 포획, 크로마토그래피, 및 정제 전에 오염물, 예를 들어 숙주 세포 및 세포 잔해를 제거한다.
특정 구현예에서, 정화 단계는 일차 정화 단계 및 이차 정화 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 일차 정화 단계는 심층 여과를 포함하고 이차 정화 단계는 막 여과를 포함한다.
심층 필터는 정의된 기공 크기 또는 구조를 갖지 않는다. 심층 필터는 정의된 크기의 입자를 거르도록 특별히 설계된 구배 밀도 구조를 포함한다. 입자는 여과재(filter media)의 전체 깊이 내에 유지된다. 심층 여과재는 셀룰로오스, 규조토, 또는 특정 크기의 오염물을 거르기에 적합한 다른 물질을 포함할 수 있다. 대조적으로, 막 필터는 막 표면에서 막의 기공 크기에 의해 배제된 특정 크기의 입자를 거른다. 특정 구현예에서, 막 필터는 전처리 여과막 및 여과막을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 전처리 여과막은 여과막보다 더 큰 기공 크기를 가지며 여과막의 막힘 또는 오염을 감소시키는 기능을 한다. 다양한 포맷의 심층 필터 및 막 필터가 상업적으로 이용 가능하다.
다양한 구현예에서, 현탁 배양 상청액을 수확하고 정화하는 단계는 탠덤 심층 여과 단계(일차 정화) 및 막 여과 단계(이차 정화)를 포함한다.
특정 구현예에서, 탠덤 심층 필터는 적어도 약 40μm 내지 약 60μm의 오염물을 거른다. 특정 구현예에서, 탠덤 심층 필터는 적어도 약 40μm, 약 50μm, 또는 약 60μm의 오염물을 거른다. 바람직한 구현예에서, 탠덤 심층 필터는 적어도 약 60μm의 오염물을 거른다. 바람직한 구현예에서, 탠덤 심층 필터는 약 60μm 이상의 오염물을 거른다.
특정 구현예에서, 탠덤 심층 필터는 40μm 내지 약 60μm 보다 큰 크기의 오염물을 거른다. 특정 구현예에서, 탠덤 심층 필터는 약 40μm, 약 50μm, 또는 약 60μm 보다 큰 크기의 오염물을 거른다. 바람직한 구현예에서, 탠덤 심층 필터는 약 60μm 보다 큰 크기의 오염물을 거른다.
특정 구현예에서, 막 여과는 이중층 여과이다. 특정 구현예에서, 이중층 필터는 전처리 필터막 및 여과막을 포함한다. 특정 구현예에서, 이중층 필터는 약 0.45μm 내지 약 0.8μm의 전처리 필터 기공 크기를 포함하는 전처리 필터막 및 약 0.22μm 내지 약 0.45μm의 최종 필터 기공 크기를 포함하는 최종 여과막을 포함한다. 특정 구현예에서, 이중층 필터는 약 0.45μm의 전처리 필터 기공 크기를 포함하는 전처리 필터막 및 약 0.22μm의 최종 필터 기공 크기를 포함하는 최종 여과막을 포함한다. 특정 구현예에서, 이중층 필터는 약 0.8μm의 전처리 필터 기공 크기를 포함하는 전처리 필터막 및 약 0.45μm의 최종 필터 기공 크기를 포함하는 최종 여과막을 포함한다.
다양한 구현예에서, 현탁 배양 상청액을 수확하고 정화하는 단계는 약 40μm, 약 50μm, 또는 약 60μm 보다 큰 크기의 오염물을 거르는 탠덤 심층 필터를 사용하는 탠덤 심층 여과 단계(일차 정화) 및 약 0.45μm 내지 약 0.8μm의 전처리 필터 기공 크기를 갖는 전처리 필터막 및 약 0.22μm 내지 약 0.45μm의 최종 필터 기공 크기를 갖는 최종 여과막을 포함하는 이중층 필터를 사용하는 막 여과 단계(이차 정화)를 포함한다.
특정 구현예에서, 현탁 배양 상청액을 수확하고 정화하는 단계는 약 60μm 이상 크기의 오염물을 거르는 탠덤 심층 필터를 사용하는 탠덤 심층 여과 단계(일차 정화) 및 약 0.45μm의 전처리 필터 기공 크기를 갖는 전처리 필터막 및 약 0.22μm의 최종 필터 기공 크기를 갖는 최종 여과막을 포함하는 이중층 필터를 사용하는 막 여과 단계(이차 정화)를 포함한다.
특정 구현예에서, 현탁 배양 상청액을 수확하고 정화하는 단계는 약 60μm 이상 크기의 오염물을 거르는 탠덤 심층 필터를 사용하는 탠덤 심층 여과 단계(일차 정화) 및 약 0.8μm의 전처리 필터 기공 크기를 갖는 전처리 필터막 및 약 0.45μm의 최종 필터 기공 크기를 갖는 최종 여과막을 포함하는 이중층 필터를 사용하는 막 여과 단계(이차 정화)를 포함한다. 다양한 구현예에서, 정화된 현탁 배양물은 1M의 HEPES를 사용하여 약 pH 7.0 또는 pH 7.2로 조정된다. 일부 구현예에서, 정화된 현탁 배양물은 약 pH 7.0으로 조정된다. 일부 구현예에서, 정화된 현탁 배양물은 약 pH 7.2로 조정된다.
바이러스 벡터 생산 상청액이 수확되어 정화된 후, 임의적으로 이는 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 또는 약 24시간 동안 적절한 온도에서, 예를 들어, 약 4℃ 약 20℃ 약 30℃ 또는 약 37℃에서 보관될 수 있다. 수확되어 정화되고, 임의적인 보관 후, 크로마토그래피를 사용하여 바이러스 벡터를 포획하고 농축시킨다.
3. 크로마토그래피
특정 구현예에서 고려되는 후행하는 바이러스 벡터 제조 프로세스는 크로마토그래피 단계를 추가로 포함한다. 크로마토그래피는 일반적으로 수확되어 정화한 바이러스 벡터 생산 상청액으로부터 바이러스 벡터를 포획하고, 수확되어 정화한 바이러스 벡터 생산 상청액 내의 원치 않는 불순물이 컬럼을 통과할 수 있도록 설계된 수지 또는 비드로 충진된 컬럼 상에서 수행된다. 그런 다음, 포획된 바이러스 벡터를 탈착제를 사용하여 컬럼으로부터 변위시키거나 용리시킨다.
특정 구현예에서, 크로마토그래피는 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 또는 다중양식(multi-modal) 크로마토그래피이다.
이온교환 크로마토그래피(IEX)는 이온화 가능한 분자의 총 전하를 기준으로 분리하는 것을 포함한다. IEX는 음이온 교환 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피 둘 다를 포함한다. 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)는 정제 목적을 위해 바이러스 벡터 입자의 음으로 하전된 표면을 이용한다. AEX는 불활성화된 HIV-1 백신을 제조하고 레트로바이러스, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터를 정제하는 데 사용되었다. 특정 구현예에서, 수확하여 정화한 바이러스 벡터 생산 상청액으로부터의 바이러스 벡터는 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 포획되고 농축된다. 양이온 교환 크로마토그래피는 이온교환 크로마토그래피(IEX)의 또 다른 형태이다. 양이온 교환 크로마토그래피는 순 양의 표면 전하를 갖는 분자에 대한 친화도를 갖는 음으로 하전된 이온 교환 수지를 사용한다. 여기서, 렌티바이러스 상청액의 pH는 LVV 등전점 아래로 조정되어, LVV에 음으로 하전된 수지 비드에 결합하는 전체 순 양의 표면 전하를 제공할 수 있다.
따라서, 다양한 구현예에서, LVV 상청액은 이온교환 크로마토그래피 컬럼 상으로 펌핑된다. 일부 구현예에서, LVV 상청액은 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상으로 펌핑된다. 특정 구현예에서, LVV 상청액은 황산염 양이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, ToyopearlTM 황산염-650F) 상으로 펌핑된다. 일부 구현예에서, 황산염 양이온 교환 크로마토그래피는 약 45μm의 비드 크기 및/또는 약 100nm의 평균 기공 크기를 갖는 컬럼을 포함한다.
크기배제 크로마토그래피(SEC)는 정의된 기공 크기를 갖는 비드를 포함하는 수지를 사용하여 분자의 크기에 기초하여 분자를 분리한다. 분자는 크기에 따라 SEC 수지로부터 용리된다: 비드 기공에 포획되지 않는 큰 분자는 더 짧은 거리를 이동하고 먼저 용리되며, 비드 기공에 의해 느려지는 작은 분자는 마지막으로 용리된다. 원하는 분해도(resolution)를 달성하기 위해 상이한 기공 크기의 비드를 구매할 수 있다. SEC는 야생형 레트로바이러스 및 레트로바이러스 벡터를 정제하는 데 사용되어 왔다. 레트로바이러스 벡터는 큰 크기로 인해 비드 기공으로부터 제외되고 컬럼의 공극 부피에서 용리되는 반면, 더 낮은 분자량의 오염물은 컬럼에 의해 지연되고 나중의 분획에서 용리된다. 특정 구현예에서, 수확되어 정화된 바이러스 벡터 생산 상청액으로부터의 바이러스 벡터는 크기배제 크로마토그래피를 사용하여 포획되고 농축된다.
친화도 크로마토그래피(AC)는 분자의 특정 크로마토그래피 흡착체에 대한 매우 선택적인 친화도에 기초하여 분자를 분리한다. 유감스럽게도, 바이러스 막의 조성에 대해서는 거의 알려져 있지 않으며, 이는 적절한 흡착제의 선택을 어렵게 한다. 바이러스 벡터는 정제를 용이하게 하기 위해 표면 상에 친화도 태그를 발현하도록 조작되었으며, 예를 들어, MoMLV는 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC)에 의해 정제된 헥사히스티딘 친화도 태그를 발현하도록 변형되었다. MoMLV 바이러스 벡터는 또한 스트렙타비딘과 비오틴 간의 상호작용을 이용함으로써 정제되었다. 헤파린 친화도 크로마토그래피는 위형화된 레트로바이러스 벡터, 예를 들어, VSV-G 위형 렌티바이러스 벡터를 포함하여, 세포 표면 수용체로서 헤파란 황산염을 사용하는 바이러스 벡터를 정제하는 데 사용되었다. 특정 구현예에서, 수확되어 정화된 바이러스 벡터 생산 상청액으로부터의 바이러스 벡터는 친화도 크로마토그래피를 사용하여 포획되고 농축된다.
다중양식 또는 혼합모드 크로마토그래피(MMC)는 단일 수지 내에 다수의 크로마토그래피 모드를 포함한다. MMC는 수지의 선택도를 향상시키는데, 이는 분자가 그들의 단 하나만이 아닌 여러 특성에 기초하여 분리될 수 있기 때문이다.
바람직한 구현예에서, 수확되어 정화된 바이러스 벡터 생산 상청액으로부터의 바이러스 벡터는 헤파린 친화도 크로마토그래피를 사용하여 포획되고 농축된다. 특정 구현예에서, 수확되어 정화된 바이러스 벡터 생산 상청액은 필요한 경우 약 7.0의 pH로 조정된다. 수확되어 정화된 바이러스 벡터 생산 상청액을 헤파린 친화도 크로마토그래피 컬럼으로 통과시키고, 컬럼을 세척 완충액(예를 들어, 50mM의 HEPES, 100mM의 NaCl, pH 7.0)으로 1회 이상 세척하고, 용리시킨다(예를 들어, 50mM의 HEPES, 400mM의 NaCl, pH 8.0).
바람직한 구현예에서, 수확되어 정화된 바이러스 벡터 생산 상청액으로부터의 바이러스 벡터는 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 포획되고 농축된다. 다양한 구현예에서, 크로마토그래피는 황산염 양이온 교환 크로마토그래피이다. 특정 구현예에서, 수확되어 정화된 바이러스 벡터 생산 상청액은 필요한 경우 약 7.2의 pH로 조정된다. 수확되어 정화된 바이러스 벡터 생산 상청액을 황산염 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상으로 통과/펌핑하고, 컬럼을 세척 완충액(예를 들어, 약 50mM의 HEPES, 약 300mM의 NaCl, pH 7.2)으로 1회 이상 세척하고, 용리한다(예를 들어, 약 50mM의 HEPES, 약 1M의 NaCl, pH 7.5).
농축된 바이러스 벡터를 포함하는 생산된 용리액을 여과하여 불순물을 추가로 제거한다.
4. 크로마토그래피 후 여과
특정 구현예에서 고려되는 후행하는 바이러스 벡터 제조 프로세스는 바이러스 벡터의 크로마토그래피 정제 후 여과 단계를 추가로 포함한다. 크로마토그래피 후 여과는 바이러스 벡터의 정제를 방해할 수 있는 불순물을 추가로 제거함으로써 크로마토그래피 단계의 후속 부분에서의 단위 작업을 보호한다.
특정 구현예에서, 여과 단계는 약 0.45μm 내지 약 0.8μm의 전처리 필터 기공 크기 및 약 0.22μm 내지 약 0.45μm의 최종 필터 기공 크기를 포함하는 이중층 필터를 통해 농축된 바이러스 벡터를 여과하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 여과 단계는 약 0.45μm의 전처리 필터 기공 크기 및 약 0.22μm의 최종 필터 기공 크기를 포함하는 이중층 필터를 통해 농축된 바이러스 벡터를 여과하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 여과 단계는 약 0.8μm의 전처리 필터 기공 크기 및 약 0.45μm의 최종 필터 기공 크기를 포함하는 이중층 필터를 통해 농축된 바이러스 벡터를 여과하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 농축된 바이러스 벡터가 필터를 통과한 후, 필터를 정용여과 완충액으로 헹궈(chased) 바이러스 벡터 회수를 최대화한다.
그런 다음, 여과된 바이러스 벡터 용액을 추가로 정제하고 한외여과를 사용하여 농축시킨 다음, 정용여과한다.
5. 한외여과/정용여과
특정 구현예에서 고려되는 후행하는 바이러스 벡터 제조 프로세스는 제형형의 제조 시에, 바이러스 벡터를 추가로 정제하고 농축하기 위한 한외여과 단계, 및 농축되고 여과된 바이러스 벡터 완충액의 완충액을 정용여과 완충액(예를 들어, 약 50mM의 HEPES, 약 100mM의 NaCl, pH 7.5; 또는 약 50mM의 HEPES, pH 7.0; 또는 약 50mM의 L-히스티딘, pH 7.0)으로 교환하는 정용여과 단계를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 한외여과되어 불순물을 추가로 제거하고 바이러스 벡터를 농축시킨 다음, 이어서 벌크 바이러스 벡터 제형에 적합한 완충액으로 정용여과된다.
특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 여과되고 농축되고, 이어서 접선 유동 여과를 사용하여 정용여과된다. 바람직한 구현예에서, 바이러스 벡터는 여과되고 농축되고, 이어서 접선 유동 여과를 사용하여 정용여과된다. 중공 섬유 TFF 모듈 또는 필터는 불순물을 동시에 농축하고 제거하여 고활성 레트로바이러스 벡터를 수득하는 데 사용되어 왔다. 중공 섬유 TFF 모듈 또는 필터는 또한, 바이러스 벡터를 벌크 바이러스 벡터 제형에 적합한 완충액으로 정용여과하기 위한 편리한 도구로서 사용되어 왔다.
특정 구현예에서, TFF 시스템은 공급 용액을 함유하는 바이러스 벡터를 중공 섬유 TFF 모듈 내로 펌핑하는 단계를 포함한다. TFF 모듈의 기공 크기는 바이러스 벡터가 기공을 통과하지 않고 농축물 내에 농축되도록 선택되고, 용액은 TFF 모듈에 유지되는 반면; 불순물을 함유하는 투과물은 기공을 통과한다.
특정 구현예에서, TFF 시스템은 바이러스 벡터 함유 용액의 정용여과 또는 완충액 교환을 수행하는 데 사용된다. TFF 시스템은 변화 이온 농도, pH, 염, 당, 비수성 용매를 제거, 변형, 및/또는 교환하고, 미결합 분자를 분리하고, 저 분자량 오염물을 제거하는 효과적인 방법이다.
특정 구현예에서, 중공 섬유 TFF 모듈 또는 필터는 정용여과 및/또는 한외여과를 수행하여 완충액 교환을 추가로 정제, 농축, 및 수행하는 데 사용된다. 본원에서 고려되는 특정 구현예에서 사용하기에 적합한 TFF 시스템은, 예를 들어, EMD Millipore, Sigma, GE Healthcare, Sartorius, 및 Repligen으로부터 상업적으로 이용 가능하다.
특정 구현예에서, 중공 섬유 TFF 모듈 또는 필터는 약 100kDa 내지 약 500kDa의 기공 크기 및 약 0.5m2, 약 1.0m2, 약 2.5m2, 약 5.0m2, 약 10m2, 또는 약 20m2의 표면적을 포함한다. 특정 구현예에서, 중공 섬유 TFF 모듈 또는 필터는 약 100kDa 내지 약 500kDa의 기공 크기 및 약 1.00m2, 약 1.05m2, 약 1.10m2, 약 1.15m2, 약 1.20m2, 약 1.25m2, 약 1.30m2, 약 1.35m2, 약 1.40m2, 1.45m2, 약 1.50m2, 약 1.55m2, 약 1.60m2, 약 1.65m2, 약 1.70m2, 약 1.75m2, 약 1.80m2, 약 1.85m2, 약 1.90m2, 약 1.95m2, 약 2.00m2, 2.00m2, 약 2.05m2, 약 2.10m2, 약 2.15m2, 약 2.20m2, 약 2.25m2, 약 2.30m2, 약 2.35m2, 약 2.40m2, 약 2.45m2, 또는 약 2.50m2의 표면적을 포함한다.
특정 구현예에서, 중공 섬유 TFF 모듈 또는 필터는 약 100kDa, 약 200kDa, 약 300kDa, 약 400kDa 내지 또는 약 500kDa의 기공 크기 및 약 1.00m2, 약 1.05m2, 약 1.10m2, 약 1.15m2, 약 1.20m2, 약 1.25m2, 약 1.30m2, 약 1.35m2, 약 1.40m2, 1.45m2, 약 1.50m2, 약 1.55m2, 약 1.60m2, 약 1.65m2, 약 1.70m2, 약 1.75m2, 약 1.80m2, 약 1.85m2, 약 1.90m2, 약 1.95m2, 약 2.00m2, 2.00m2, 약 2.05m2, 약 2.10m2, 약 2.15m2, 약 2.20m2, 약 2.25m2, 약 2.30m2, 약 2.35m2, 약 2.40m2, 약 2.45m2, 또는 약 2.50m2의 표면적을 포함한다.
특정 구현예에서, 중공 섬유 TFF 모듈 또는 필터는 약 100kDa, 약 200kDa, 약 300kDa, 약 400kDa 내지 또는 약 500kDa의 기공 크기 및 약 1.00m2, 약 1.05m2, 약 1.10m2, 약 1.15m2, 약 1.20m2, 약 1.25m2, 약 1.30m2, 약 1.35m2, 약 1.40m2, 1.45m2, 약 1.50m2, 약 1.55m2, 약 1.60m2, 약 1.65m2, 약 1.70m2, 약 1.75m2, 약 1.80m2, 약 1.85m2, 약 1.90m2, 약 1.95m2, 약 2.00m2, 2.00m2, 약 2.05m2, 약 2.10m2, 약 2.15m2, 약 2.20m2, 약 2.25m2, 약 2.30m2, 약 2.35m2, 약 2.40m2, 약 2.45m2, 또는 약 2.50m2의 표면적을 포함한다.
특정 구현예에서, 중공 섬유 TFF 모듈 또는 필터는 약 100kDa의 기공 크기 및 약 1.25m2, 약 1.30m2, 약 1.35m2, 약 1.40m2, 약 1.45m2, 또는 약 1.50m2의 표면적을 포함한다. 특정 구현예에서, 중공 섬유 TFF 모듈 또는 필터는 약 200kDa의 기공 크기 및 약 1.25m2, 약 1.30m2, 약 1.35m2, 약 1.40m2, 약 1.45m2, 또는 약 1.50m2의 표면적을 포함한다. 특정 구현예에서, 중공 섬유 TFF 모듈 또는 필터는 약 300kDa의 기공 크기 및 약 1.25m2, 약 1.30m2, 약 1.35m2, 약 1.40m2, 약 1.45m2, 또는 약 1.50m2의 표면적을 포함한다. 특정 구현예에서, 중공 섬유 TFF 모듈 또는 필터는 약 400kDa의 기공 크기 및 약 1.25m2, 약 1.30m2, 약 1.35m2, 약 1.40m2, 약 1.45m2, 또는 약 1.50m2의 표면적을 포함한다. 특정 구현예에서, 중공 섬유 TFF 모듈 또는 필터는 약 500kDa의 기공 크기 및 약 1.25m2, 약 1.30m2, 약 1.35m2, 약 1.40m2, 약 1.45m2, 또는 약 1.50m2의 표면적을 포함한다.
특정 구현예에서, 후행하는 바이러스 벡터 제조 프로세스는 약 100kDa, 약 200kDa, 약 300kDa, 약 400kDa, 또는 약 500kDa의 기공 크기를 갖는 중공 섬유 TFF 모듈을 사용하여 수행되는 한외여과 단계를 포함하고, 제형의 제조 시, 바이러스 벡터를 함유하는 완충액을 정용여과 완충액(예를 들어, 50mM의 HEPES, 100mM의 NaCl, pH 7.5; 또는 50mM의 HEPES, pH 7.0)과 교환하기 위한, 중공 섬유 TFF 모듈을 사용하여 수행되는 정용여과 단계를 추가로 포함한다.
6. 제형화
특정 구현예에서 고려되는 후행하는 바이러스 벡터 제조 프로세스는 적절한 완충액 및/또는 약학적으로 허용 가능한 배지에서 바이러스 벡터를 제형화하는 단계를 추가로 포함한다. 바이러스 벡터는 벡터를 안정화시키고 동결/해동 사이클을 통해 벡터 활성을 유지하도록 제형화된다.
특정 구현예에서 고려되는 한외여과하고 정용여과 단계는 정용여과 완충액(예를 들어, 약 50mM의 HEPES, 약 100mM의 NaCl, pH 7.5; 또는 약 50mM의 HEPES, pH 7.0; 또는 약 50mM의 L-히스티딘, pH 7.0) 내로 바이러스 벡터를 정제, 농축 및 정용여과한다.
특정 구현예에서, 바이러스 벡터를 제형화하기 위해, 정용여과된 바이러스 벡터의 부피는 동일한 부피의 2X 농축된 적절한 제형화 완충액 또는 약학적 세포 배양 배지로 희석된다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 동일한 부피의 정용여과된 바이러스 벡터를 2X 농축된 무혈청 합성 세포 배양 배지로 희석함으로써 제형화된다. 적합한 제형화 배지의 예시적인 예는 2X Freestyle 293 발현 배지, 2X Ex-Cell 293 무혈청 배지, 2X Expi293 발현 배지, 2X Opti-MEM 환원 혈청 배지, 및 2X 줄기 세포 성장 배지(SCGM, CellGenix)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 동일한 부피의 정용여과된 바이러스 벡터를 2X 농축된 SCGM으로 희석함으로써 제형화된다. 일부 구현예에서, 50mM의 HEPES, 100mM의 NaCl, pH 7.50에서 정용여과된 바이러스 벡터는 2X SCGM에서 1:1로 희석함으로써 제형화된다. 일부 구현예에서, 약 50mM의 HEPES, pH 7.0에서 정용여과된 바이러스 벡터는 HEPES 및 수크로오스를 포함하는 완충액에서 1:1로 희석함으로써 제형화되고, 임의로 완충액은 L-프롤린, 폴록사머 188, 또는 NaCl을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 약 50mM의 HEPES, pH 7.0에서 정용여과된 바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 및 약 100mM의 L-프롤린을 포함하는 완충액에서 1:1로 희석함으로써 제형화된다. 일부 구현예에서, 약 50mM의 HEPES, pH 7.0에서 정용여과된 바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 100mM의 L-프롤린, 및 약 0.2 내지 약 2.0mg/mL의 폴록사머 188을 포함하는 완충액에서 1:1로 희석함으로써 제형화된다. 일부 구현예에서, 약 50mM의 HEPES, pH 7.0에서 정용여과된 바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 100mM의 L-프롤린, 및 약 150mM의 NaCl을 포함하는 완충액에서 1:1로 희석함으로써 제형화된다. 일부 구현예에서, 약 50mM의 HEPES, pH 7.0에서 정용여과된 바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 100mM의 L-프롤린, 약 150mM의 NaCl, 및 약 0.2 내지 약 2.0mg/mL의 폴록사머 188을 포함하는 완충액에서 1:1로 희석함으로써 제형화된다. 일부 구현예에서, 약 50mM의 HEPES, pH 7.0에서 정용여과된 바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 150mM의 NaCl, 및 약 0.2 내지 약 2.0mg/mL의 폴록사머 188을 포함하는 완충액에서 1:1로 희석함으로써 제형화된다.
다양한 구현예에서, 약 50mM의 L-히스티딘, pH 7.0에서 정용여과된 바이러스 벡터는 L-히스티딘, 수크로오스, 및 L-프롤린을 포함하는 완충액에서 1:1로 희석함으로써 제형화된다. 다양한 구현예에서, 약 50mM의 L-히스티딘, pH 7.0에서 정용여과된 바이러스 벡터는 약 5mM의 L-히스티딘, 약 146mM의 수크로오스, 및 약 100mM의 L-프롤린을 포함하는 완충액에서 1:1로 희석함으로써 제형화되고, 임의로 제형은 약 0.2 내지 약 2.0mg/mL의 폴록사머 188을 추가로 포함한다.
다양한 구현예에서, 1:1 희석을 위한 제형화 완충액은 약 0.2mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 1:1 희석을 위한 제형화 완충액은 약 0.3mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 1:1 희석을 위한 제형화 완충액은 약 0.4mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 1:1 희석을 위한 제형화 완충액은 약 0.5mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 1:1 희석을 위한 제형화 완충액은 약 0.6mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 1:1 희석을 위한 제형화 완충액은 약 0.7mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 1:1 희석을 위한 제형화 완충액은 약 0.8mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 1:1 희석을 위한 제형화 완충액은 약 0.9mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 1:1 희석을 위한 제형화 완충액은 약 1.0mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 1:1 희석을 위한 제형화 완충액은 약 1.1mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 1:1 희석을 위한 제형화 완충액은 약 1.2mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 1:1 희석을 위한 제형화 완충액은 약 1.3mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 1:1 희석을 위한 제형화 완충액은 약 1.4mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 1:1 희석을 위한 제형화 완충액은 약 1.5mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 1:1 희석을 위한 제형화 완충액은 약 1.6mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 1:1 희석을 위한 제형화 완충액은 약 1.7mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 1:1 희석을 위한 제형화 완충액은 약 1.8mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 1:1 희석을 위한 제형화 완충액은 약 1.9mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 1:1 희석을 위한 제형화 완충액은 약 2.0mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다.
바이러스 벡터는 벌크로 제형화되고, 종종, 그리고 특정 구현예에서, 바람직하게는 제형화된 벌크 바이러스 벡터로서 지칭된다.
7. 제형화 후 여과
특정 구현예에서 고려되는 후행하는 바이러스 벡터 제조 프로세스는 바이러스 벡터의 제형화 후 멸균 여과 단계를 추가로 포함한다. 제형화 후 여과는 제형화된 벌크 바이러스 벡터 내의 미립자 및 불순물을 추가로 제거한다.
특정 구현예에서, 여과 단계는 약 0.5μm의 전처리 필터 기공 크기 및 약 0.2μm의 최종 필터 기공 크기를 포함하는 이중층 필터를 통해 제형화된 벌크 바이러스 벡터를 여과하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 제형화된 벌크 바이러스 벡터가 필터를 통과하여 회수된 후, 여과된 제형화된 벌크 바이러스 벡터는 최종 충진 마감이 수행될 수 있을 때까지 동결 보존되거나 유지 단계(동결 보존 없음)를 거친다.
특정 구현예에서, 제형화된 벌크 바이러스 벡터가 필터를 통과하여 회수된 후, 여과된 제형화된 벌크 바이러스 벡터 상에서 최종 충진 마감이 수행되고, 이어서 동결 보존된다.
8. 동결 보존
특정 구현예에서 고려되는 후행하는 바이러스 벡터 제조 프로세스는, 벌크 바이러스 벡터 상에서 최종 충진 마감이 수행될 수 있는 이러한 시간이 될 때까지 여과된 제형화된 벌크 바이러스 벡터를 동결 보존하는 단계를 추가로 포함한다. 제형화된 벌크 바이러스 벡터의 동결 보존은 벡터의 안정성 및 생물학적 활성이 실질적으로 유지되고/되거나 바이러스 벡터 안정성 및 생물학적 활성의 손실이 최소화되도록 수행된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "동결 보존"("cryopreserving" 또는 "cryopreservation")은 영하 온도로 냉각함으로써 바이러스 벡터를 보존하는 것을 지칭한다. 특정 구현예에서, 여과된 제형화된 벌크 바이러스 벡터는 동결보호제를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 동결보호를 제공하도록 제형화된다.
다양한 구현예에서, 여과된 제형화된 벌크 바이러스 벡터는 약 -20℃미만, 약 -21℃ 미만, 약 -22℃ 미만, 약 -23℃ 미만, 약 -24℃ 미만, 약 -25℃ 미만, 약 -26℃ 미만, 약 -27℃ 미만, 약 -28℃ 미만, 약 -29℃ 미만, 약 -30℃ 미만, 약 -31℃ 미만, 약 -32℃ 미만, 약 -33℃ 미만, 약 -34℃ 미만, 약 -35℃ 미만, 약 -36℃ 미만, 약 -37℃ 미만, 약 -38℃ 미만, 약 -39℃ 미만, 약 -40℃ 미만, 약 -41℃ 미만, 약 -42℃ 미만, 약 -43℃ 미만, 약 -44℃ 미만, 약 -45℃ 미만, 약 -46℃ 미만, 약 -47℃ 미만, 약 -48℃ 미만, 약 -49℃ 미만, 약 -50℃ 미만, 약 -51℃ 미만, 약 -52℃ 미만, 약 -53℃ 미만, 약 -54℃ 미만, 약 -55℃ 미만, 약 -56℃ 미만, 약 -57℃ 미만, 약 -58℃ 미만, 약 -59℃ 미만, 약 -60℃ 미만, 약 -61℃ 미만, 약 -62℃ 미만, 약 -63℃ 미만, 약 -64℃ 미만, 약 -65℃ 미만, 약 -66℃ 미만, 약 -67℃ 미만, 약 -68℃ 미만, 약 -69℃ 미만, 약 -70℃ 미만, 약 -71℃ 미만, 약 -72℃ 미만, 약 -73℃ 미만, 약 -74℃ 미만, 약 -75℃ 미만, 약 -76℃ 미만, 약 -77℃ 미만, 약 -78℃ 미만, 약 -79℃ 미만, 또는 약 -80℃ 미만의 온도에서 동결 보존 또는 동결된다. 당업자는 -80℃의 온도가 -20℃의 온도 미만임을 이해한다.
다양한 구현예에서, 여과된 제형화된 벌크 바이러스 벡터는 약 -65℃ 미만, 약 -70℃ 미만, 약 -75℃ 미만, 또는 약 -80℃ 미만의 온도에서 동결 보존 또는 동결된다.
특정 구현예에서, 냉각 속도는 1° 내지 3℃/분이다.
9. 충진 마감
본원에서 고려되는 후행하는 제조 프로세스는 충진 마감 단계를 추가로 포함한다. 바이러스 벡터는 통상적으로 일회용 부피로 분취되고, 벡터의 안정성 및 생물학적 활성을 보호하고 바이러스 벡터 열 불활성화를 최소화하기 위해 동결 보존된다.
"충진 마감" 또는 "충진 및 마감"은, 제형화된 바이러스 벡터로 용기, 예를 들어 바이알, 앰플 등을 충진하는 단계, 및 분배를 위해 바이러스 벡터를 포장하는 프로세스를 마감하는 단계를 포함하는 후행하는 제조 프로세스의 일부를 지칭한다.
특정 구현예에서, 충진 마감은 중간 동결 보존 단계 없이 여과된 제형화된 바이러스 벡터 상에서 수행된다. 충진 마감 후, 바이러스 벡터는 본원에서 고려되는 방법에 따라 동결 보존된다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 약 -65℃ 미만, 약 -70℃ 미만, 약 -75℃ 미만, 또는 약 -80℃ 미만의 온도에서 동결 보존되거나 동결된다.
특정 구현예에서, 충진 마감은 중간 유지 단계는 있지만 중간 동결 보존 단계는 없이, 여과된 제형화된 바이러스 벡터 상에서 수행된다. 충진 마감 후, 바이러스 벡터는 본원에서 고려되는 방법에 따라 동결 보존된다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 약 -65℃ 미만, 약 -70℃ 미만, 약 -75℃ 미만, 또는 약 -80℃ 미만의 온도에서 동결 보존되거나 동결된다.
특정 구현예에서, 동결 보존된 여과된 제형화된 벌크 바이러스 벡터는 충진 마감 전에 해동되고 멸균 여과된다. 특정 구현예에서, 여과 단계는 약 0.5μm의 전처리 필터 기공 크기 및 약 0.2μm의 최종 필터 기공 크기를 포함하는 이중층 필터를 통해 해동된 제형화된 벌크 바이러스 벡터를 여과하는 단계를 포함한다. 여과 후, 제형화된 바이러스 벡터로 충진 마감을 수행한다. 충진 마감 후, 바이러스 벡터는 본원에서 고려되는 방법에 따라 동결 보존된다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 약 -65℃ 미만, 약 -70℃ 미만, 약 -75℃ 미만, 또는 약 -80℃ 미만의 온도에서 동결 보존되거나 동결된다.
E. 조성물
본원에서 고려되는 조성물은 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 조성물은 약학적 조성물을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. "약학적 조성물"은 세포 또는 동물에게 단독으로 투여하거나 하나 이상의 다른 치료법과 조합하여 투여하도록 약학적으로 허용되는 또는 생리학적으로 허용 가능한 용액으로 제형화된 조성물을 지칭한다. 추가 제제가 의도된 요법을 전달하는 조성물의 능력에 악영향을 미치지 않는다면, 조성물에 포함될 수도 있는 다른 성분에는 사실상 제한이 없다.
"약학적으로 허용 가능한"이라는 구절은, 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제나 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여 형태를 지칭하도록 본원에서 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 미국 식품의약국에 의해 인간 또는 가축에게 사용하기에 허용 가능한 것으로 승인된 임의의 보조제, 담체, 부형제, 활택제, 감미제, 희석제, 보존제, 염료/색소, 향미제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정화제, 등장제, 용매, 계면활성제, 또는 유화제를 제한 없이 포함한다. 예시적인 약학적으로 허용 가능한 담체는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 락토오스, 포도당 및 수크로오스와 같은 당; 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; 셀룰로오스 및 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 이의 유도체; 트라가칸스; 몰트; 젤라틴; 탈크; 코코아 버터, 왁스, 동물 및 식물성 지방, 파라핀, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 산화아연; 땅콩 오일, 목화씨 오일, 홍화유, 참기름, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 대두유와 같은 오일; 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; 한천; 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄과 같은 완충제; 알긴산; 발열원이 없는 물; 등장성 식염수; 링거 용액; 에틸 알코올; 인산염 완충액; 및 약학적 제형에 사용되는 임의의 다른 상용성 물질.
특정 구현예에서, 조성물은 바이러스 벡터 및 생리학적으로 허용 가능한 완충액 또는 배지를 포함한다.
특정 구현예에서, 조성물은 바이러스 벡터 및 정용여과 완충액(예를 들어, 약 50mM의 HEPES, 약 100mM의 NaCl, pH 7.5; 또는 약 50mM의 HEPES, pH 7.0; 또는 약 50mM의 L-히스티딘, pH 7.0)을 포함한다.
특정 구현예에서, 조성물은 바이러스 벡터 및 약학적 세포 배양 배지를 포함한다. 적합한 배지의 예시적인 예는 2X Freestyle 293 발현 배지, 2X Ex-Cell 293 무혈청 배지, 2X Expi293 발현 배지, 2X Opti-MEM 환원 혈청 배지, 및 2X 줄기 세포 성장 배지(SCGM, CellGenix)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
소정의 구현예에서, 조성물은 바이러스 벡터, 정용여과 완충액 및 1X SCGM을 포함한다.
소정의 구현예에서, 조성물은 HEPES 기반 제형에 바이러스 벡터를 포함한다.
소정의 구현예에서, 조성물은 L-히스티딘계 제형에 바이러스 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 바이러스 벡터, HEPES, 및 수크로오스를 포함하되, 임의로 완충액은 L-프롤린, 폴록사머 188, 또는 NaCl을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 바이러스 벡터, 약 27.5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 73mM의 수크로오스, 및 약 50mM의 L-프롤린을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 바이러스 벡터, 약 27.5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 73mM의 수크로오스, 약 50mM의 L-프롤린, 및 약 0.1 내지 약 1.0mg/ml의 폴록사머 188을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 바이러스 벡터, 약 27.5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 73mM의 수크로오스, 약 50mM의 L-프롤린, 및 약 75mM의 NaCl을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 바이러스 벡터, 약 27.5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 73mM의 수크로오스, 약 50mM의 L-프롤린, 약 75mM의 NaCl, 및 약 0.1 내지 약 1.0mg/ml의 폴록사머 188을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 바이러스 벡터, 약 27.5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 73mM의 수크로오스, 약 75mM의 NaCl, 및 약 0.1 내지 약 1.0mg/ml의 폴록사머 188을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 바이러스 벡터, L-히스티딘, 수크로오스, 및 L-프롤린을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 바이러스 벡터, 약 27.5mM의 L-히스티딘, 약 73mM의 수크로오스, 및 약 50mM의 L-프롤린을 포함하며, 임의로 제형은 약 0.1 내지 약 1.0mg/mL의 폴록사머 188을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 약 0.1mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.2mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.3mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.4mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.5mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.6mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.7mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.8mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.9mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 1.0mg/mL의 폴록사머 188을 포함한다.
당업자는 본원에서 고려되는 조성물의 특정 구현예가, 약학 분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 다음 문헌에 기술된 것들을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 성분을 포함할 수 있음을 이해할 것이다: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, I권 및 II권. 22nd Edition. Edited by Loyd V. Allen Jr. Philadelphia, PA: Pharmaceutical Press; 2012, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 출원, 및 발행된 특허는 각각의 개별 간행물, 특허 출원, 또는 발행된 특허가 구체적으로 그리고 개별적으로 참조에 의해 포함되는 것으로 표시된 것처럼 본원에 참조로서 통합된다.
전술한 실시예들은 이해를 밝힐 목적으로 예시 및 실시예로서 일부 상세히 기술되었지만, 첨부된 청구범위의 사상 또는 범주로부터 벗어나지 않고도 소정의 변경 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 본원에서 고려된 교시에 비추어 당 기술분야의 숙련자에게 쉽게 명백해질 것이다. 하기 실시예들은 단지 예시로서 제공되며, 제한하기 위한 것은 아니다. 당업자는 본질적으로 유사한 결과를 얻기 위해 변경되거나 수정될 수 있는 중요하지 않은 다양한 파라미터를 쉽게 인식할 것이다.
실시예
실시예 1
렌티바이러스 벡터 현탁 제조 프로세스 2.0
HEK293Ts 작업용 세포 은행을 250mL 배양 용기에서 배양하고, 37.0℃ 및 8.0% CO2에서 무혈청 합성 세포 배양 배지에서 배양하였다. 이러한 P0 배양물의 적절한 생존 가능 세포 밀도가 확인된 후, 배양물을 500mL 배양 용기에 계대시키고, 37.0℃ 및 8.0% CO2에서 무혈청 합성 세포 배양 배지에서 배양하였다. 이러한 P1 배양물의 적절한 생존 가능 세포 밀도가 확인된 후, 배양물을 1L 배양 용기에 계대시키고, 37.0℃ 및 8.0% CO2에서 무혈청 합성 세포 배양 배지에서 배양하였다. 이러한 P2 배양물의 적절한 생존 가능 세포 밀도가 확인된 후, 배양물을 세 개의 3L 배양 용기에 계대시키고, 37.0℃ 및 8.0% CO2에서 무혈청 합성 세포 배양 배지에서 배양하였다. 이러한 P3 배양물의 적절한 생존 가능 세포 밀도가 확인된 후, 배양물을 50L 배양 용기에 계대시키고, 37.0℃ 및 8.0% CO2에서 무혈청 합성 세포 배양 배지에서 배양하였다. 이러한 P4 배양물의 적절한 생존 가능 세포 밀도가 확인된 후, 배양물을 200L 바이오리액터(P5 배양물)에 계대시키고, 37.0℃ 및 pH 7.0에서 무혈청 합성 세포 배양 배지에서 배양하였다. 이러한 P5 배양물의 적절한 생존 가능 세포 밀도가 확인된 후, 교번식 접선 유동 여과(ATF)를 사용하여 배양 배지를 190L의 신선한 무혈청 합성 세포 배양 배지와 교환하였다.
형질감염 전, 패키지형 렌티바이러스 벡터 게놈 및 gag/pol, rev, 및 VSV-G 패키징 플라스미드를 포함하는 전달 플라스미드 및 PEI 성분을 10L의 부피로 무혈청 합성 세포 배양 배지에서 함께 혼합하였다. DNA/PEI 혼합물을 약 14시간 내지 약 18시간 동안 P5 현탁 배양물에 첨가하고, 이어서 ATF를 사용하여 신선한 무혈청 합성 세포 배양 배지와 배양 배지를 교환하였다.
형질감염 후(형질감염 개시 후) 약 36시간 내지 48시간 차에, 무혈청 합성 세포 배양 배지에서 희석된 벤조나아제 엔도뉴클레아제(50 내지 75U/mL의 최종 농도) 및 MgCl2를 200L 바이오리액터 배양물에 첨가하고 37℃ 에서 약 1시간 내지 2시간 동안 인큐베이션하였다.
벤조나아제 처리된 배양물을 약 60μm 초과의 오염물을 거르는 탠덤 심층 필터를 통해 펌핑한 다음, 약 0.8μm의 전처리 필터 기공 크기 및 약 0.45μm의 최종 필터를 갖는 이중층 필터를 통해 펌핑하였다.
유사-친화도 헤파린 크로마토그래피를 사용하여, 정화된 벡터 생산 상청액을 포획하고 농축시켰다. 상청액을 크로마토그래피 컬럼 상으로 펌핑하고, 세척하고, 용리 완충액(예를 들어, 50mM의 HEPES, 400mM의 NaCl, pH 8)에서 용리하였다. 농축된 벡터 용액을 약 0.8μm의 전처리 필터 기공 크기 및 약 0.45μm의 최종 필터를 갖는 이중층 필터를 통해 펌핑하였다.
여과된 농축된 벡터를 약 300kDa 내지 약 500kDa의 분자량 컷오프 또는 기공 크기를 갖는 중공 섬유 TFF 컬럼을 통해 펌핑하였다. 그런 다음, 잔류물을 정용여과 완충액(예를 50mM의 HEPES, 100mM의 NaCl, pH 7.5)에 대해 정용여과하고, 2x/1x SCGM 제형 모액의 1:1 희석물로 제형화하여 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터(LVV)를 형성하였다. 제형화된 벌크 LVV를 멸균 등급 필터로 여과하고, 벌크 보관 용기에 충진하고 충진/마감이 수행될 때까지 ≤-65℃에서 보관하였다.
동결된 제형화된 벌크 LVV를 해동하고, 분취액을 함께 모으고 혼합한 후, 최종 여과를 수행한 다음, West Pharmaceuticals의 즉시 사용 가능한 용기/마개 및 자동화된 충진 라인을 사용하여 충진/마감하였다.
실시예 2
렌티바이러스 벡터 현탁 제조 프로세스 2.5
HEK293Ts 작업용 세포 은행을 250mL 배양 용기에서 배양하고, 37.0℃ 및 8.0% CO2에서 무혈청 합성 세포 배양 배지에서 배양하였다. 이러한 P0 배양물의 적절한 생존 가능 세포 밀도가 확인된 후, 배양물을 500mL 배양 용기에 계대시키고, 37.0℃ 및 8.0% CO2에서 무혈청 합성 세포 배양 배지에서 배양하였다. 이러한 P1 배양물의 적절한 생존 가능 세포 밀도가 확인된 후, 배양물을 1L 배양 용기에 계대시키고, 37.0℃ 및 8.0% CO2에서 무혈청 합성 세포 배양 배지에서 배양하였다. 이러한 P2 배양물의 적절한 생존 가능 세포 밀도가 확인된 후, 배양물을 세 개의 3L 배양 용기에 계대시키고, 37.0℃ 및 8.0% CO2에서 무혈청 합성 세포 배양 배지에서 배양하였다. 이러한 P3 배양물의 적절한 생존 가능 세포 밀도가 확인된 후, 배양물을 50L 배양 용기에 계대시키고, 37.0℃ 및 8.0% CO2에서 무혈청 합성 세포 배양 배지에서 배양하였다. 이러한 P4 배양물의 적절한 생존 가능 세포 밀도가 확인된 후, 배양물을 200L 바이오리액터(P5 배양물)에 계대시키고, 37.0℃ 및 pH 7.0에서 무혈청 합성 세포 배양 배지에서 배양하였다. 이러한 P5 배양물의 적절한 생존 가능 세포 밀도가 확인된 후, 교번식 접선 유동 여과(ATF)를 사용하여 배양 배지를 190L의 신선한 무혈청 합성 세포 배양 배지와 교환하였다.
형질감염 전, 패키지형 렌티바이러스 벡터 게놈 및 gag/pol, rev, 및 VSV-G 패키징 플라스미드를 포함하는 전달 플라스미드 및 PEI 성분을 10L의 부피로 무혈청 합성 세포 배양 배지에서 함께 혼합하였다. DNA/PEI 혼합물을 약 14시간 내지 약 18시간 동안 P5 현탁 배양물에 첨가하고, 이어서 ATF를 사용하여 신선한 무혈청 합성 세포 배양 배지와 배양 배지를 교환하였다.
형질감염 후(형질감염 개시 후) 약 36시간 내지 48시간차에, 무혈청 합성 세포 배양 배지에서 희석된 데나라아제 엔도뉴클레아제(약 30U/ml) 및 MgCl2를 37℃에서 약 1시간 내지 2시간 동안 200L 바이오리액터 배양물에 첨가하였다.
데나라아제 처리된 배양물을 약 60μm 초과의 오염물을 거르는 탠덤 심층 필터를 통해 펌핑한 다음, 약 0.8μm의 전처리 필터 기공 크기 및 약 0.45μm의 최종 필터를 갖는 이중층 필터를 통해 펌핑하였다.
양이온 교환 황산염 크로마토그래피를 사용하여, 정화된 벡터 생산 상청액을 포획하고 농축시켰다. 상청액을 크로마토그래피 컬럼 상으로 펌핑하고, 세척 완충액(예를 들어, 50mM의 HEPES, 300mM의 NaCl, pH 7.2)에서 세척하고, 용리 완충액(예를 들어, 50mM의 HEPES, 1M의 NaCl, pH 7.5)에서 용리하였다. 농축된 벡터 용액을 약 0.8μm의 전처리 필터 기공 크기 및 약 0.45μm의 최종 필터를 갖는 이중층 필터를 통해 펌핑하였다.
여과된 농축된 벡터를 약 300kDa 내지 약 500kDa의 분자량 컷오프 또는 기공 크기를 갖는 중공 섬유 TFF 컬럼을 통해 펌핑하였다. 그런 다음, 잔류물을 정용여과 완충액(예를 들어, 50mM의 HEPES, pH 7.0)에 대해 정용여과하고, 농축된 제형 배지(예를 들어, 5mM의 HEPES, 146mM의 수크로오스, 100mM의 L-프롤린, pH 7.0)의 1:1 희석물로 제형화하여 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터(LVV)를 형성하였다. 제형화된 벌크 LVV를 멸균 등급 필터로 여과하고 충진/마감이 수행될 때까지 2 내지 8℃에서 보관하였다.
냉장된 중간 벌크를 멸균 여과하고, 즉시 사용 가능한 용기/마개(West Pharmaceuticals) 및 자동화된 충진 라인을 사용하여 충진/마감을 수행하였다.
실시예 3
렌티바이러스 벡터 제조 프로세스 비교
실시예 1 및 2에 기술된 현탁 제조 프로세스(즉, 프로세스 sLVV 2.0 및 sLVV 2.5)을 유착 제조 프로세스(aLVV)와 비교하였다. aLVV는 Gorman 등, Molecular Therapy, 23권, 부록 1(2015년 5월)에 기술된 바와 같이 생산되었다. sLVV 2.0은 실시예 1에 기술된 바와 같이 생산된 반면(도 1도 참조), sLVV 2.5는 2L 최종 배양 규모로 생산되었고(적절하게 규모 조정된 부피), 실시예 2에 기술된 바와 같이 중간 벌크 단위 작업 때까지 정제되었다(도 4도 참조). 중간 벌크 단계는 잔류 불순물의 관점에서 최종 LVV 산물을 나타내며, 따라서 2.0 sLVV 프로세스(도 1) 및 aLVV 프로세스에 의해 생산된 최종 LVV 산물과 비교될 것이다. 프로세스 수율은 감염성 역가 수율에 의해 결정되며, 이는 HOS 세포의 바이러스 형질도입에 의해 측정된다. LVV 산물의 순도는 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 측정되는 잔류 숙주 세포 단백질(HCP) 농도에 기초하여 비교된다. 또한, 상대 잔류 p24 캡시드 단백질 농도 대 감염성 역가(입자 대 감염성 비율)를 LVV 순도의 척도로서 플랫폼 간에 비교한다. 잔류 p24 또한 ELISA로 측정한다.
도 5에 도시된 바와 같이, 현탁 2.0 sLVV 프로세스는 부분적으로 생산 세포 배양 규모 증가(2.0 sLVV의 경우 200L 대 aLVV의 경우 40L)뿐만 아니라 도 6에 도시된 바와 같이 더 높은 감염성 역가 농도에 기인하여 aLVV 생산 프로세스에 비해 총 감염성 역가(TU)가 약 10배 증가함을 입증한다. 2.5 sLVV 프로세스는 2.0 sLVV에 대해 유사한 중간 벌크 역가 농도를 수득하고(도 6), 원래의 aLVV 프로세스보다 더 높은 감염성 역가를 유지한다. 또한, 2.0 및 2.5 sLVV 프로세스는 aLVV 프로세스에 비해 입자 대 감염성(VP/TU) 비율에서 보다 일관성을 나타낸다(도 7 참조).
또한, sLVV 2.5 프로세스는 sLVV 2.0 프로세스에 비해 숙주 세포 단백질(HCP) 불순물 감소에서 주요한 개선을 초래한다. sLVV 2.0 프로세스는 aLVV 프로세스에 비해 감염성 역가가 10배 증가한 것으로 나타났지만, 감염성 역가로 정규화했을 때 HCP 수준 또한 프로세스 전반에 걸쳐 10배 초과만큼 증가하였다. 그러나, sLVV 2.5 프로세스는 중간 벌크 LVV로부터 실질적으로 더 높은 숙주 세포 단백질 감소를 달성하면서, aLVV 생산 프로세스에 대해 유사한 정규화된 HCP 수준을 수득할 수 있었다(도 8). HCP 로그 감소 값은 aLVV와 sLVV 2.5 프로세스 간에도 유사하며, 이는 유사한 불순물 제거 성능을 나타낸다(도 9). 임의의 특정 이론에 구속되고자 함 없이, 2.5 sLVV 프로세스 동안의 개선된 HCP 제거에 대한 한 가지 잠재적 이유는 황산염 양이온 포획 크로마토그래피 컬럼의 도입에 기인한다. 도 10에 도시된 바와 같이, 헤파린 친화도 결합 컬럼은 크로마토그래피 단위 작동 단계에 걸쳐 <1.0 로그의 평균 HCP 로그 감소를 달성하는 반면, 황산염 컬럼은 크로마토그래피 동안 약 1.5 로그 감소를 나타내며, 이는 1.0 로그의 HCP의 sLVV 2.5 프로세스에 대한 HCP 감소의 전반적인 증가(중간 벌크에서 HCP 농도의 >10배 감소)에 기여한다.
대체적으로, 다음의 청구범위에서, 사용된 용어는 청구범위를 본 명세서 및 청구범위에 개시된 특정 구현예로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되며, 이러한 청구범위가 부여되는 등가물의 전체 범위와 함께 모든 가능한 구현예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 본 개시에 의해 제한되지 않는다.
Claims (126)
- 렌티바이러스 벡터(sLVV)를 생산하기 위한 현탁 프로세스로서, 상기 프로세스는:
(a) 대규모 현탁 배양물에 생존 가능 숙주 세포를 접종하는 단계;
(b) 렌티바이러스 패키징 플라스미드, 전달 플라스미드, 및 형질감염제를 포함하는 혼합물로 대규모 현탁 배양물 중의 숙주 세포를 일시적으로 형질감염시키는 단계;
(c) 형질감염 후(형질감염 개시 후) 약 36시간 내지 약 48시간차에 현탁 배양 상청액에 엔도뉴클레아제를 첨가하는 단계;
(d) 탠덤 심층 필터 및 이중층 필터를 사용하여 현탁 배양 상청액을 수확하고 정화하는 단계;
(e) 크로마토그래피를 사용하여, 수확하여 정화한 현탁 배양 상청액으로부터 렌티바이러스 벡터를 포획하고 농축시키는 단계;
(f) 농축된 렌티바이러스 벡터를 여과하는 단계;
(g) 접선 유동 여과(TFF)를 사용하여 렌티바이러스 벡터를 한외여과하고 정용여과하는 단계; 및
(h) 렌티바이러스 벡터를 제형화하여 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터를 생산하고, 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터를 멸균 여과하는 단계를 포함하는 프로세스. - 제1항에 있어서, 상기 프로세스는 200L 내지 2000L의 현탁 배양물을 접종하는 단계를 포함하는 프로세스.
- 제1항에 있어서, 상기 프로세스는 200L 내지 1000L의 현탁 배양물을 접종하는 단계를 포함하는 프로세스.
- 제1항에 있어서, 상기 프로세스는 200L 내지 500L의 현탁 배양물을 접종하는 단계를 포함하는 프로세스.
- 제1항에 있어서, 상기 프로세스는 200L의 현탁 배양물을 접종하는 단계를 포함하는 프로세스.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 대규모 현탁 배양물에 약 40.0x108개 내지 약 120.0x108개의 생존 가능 숙주 세포를 접종하는, 프로세스.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 HEK293 세포, HEK293S 세포, 현탁 배양에 적합한 HEK293T 세포(HEK293Ts), HEK293F 세포, HEK293FT 세포, HEK293FTM 세포, 및 HEK293E 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 프로세스.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 HEK293Ts 세포인, 프로세스.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 대규모 세포 현탁 배양물은 배양 배지에서 배양된 숙주 세포를 포함하는, 프로세스.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 대규모 세포 현탁 배양물은 약 3일 동안 배양 배지에서 배양된 숙주 세포를 포함하되, 3일 후, 배양 배지는 신선한 배양 배지로 교환되는, 프로세스.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 대규모 세포 현탁 배양물은 약 3일 동안 배양 배지에서 배양된 숙주 세포를 포함하되, 3일 후, 배양 배지는 교번식 접선 유동 여과(ATF)를 사용하여 신선한 배양 배지로 교환되는, 프로세스.
- 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지는 무혈청 합성 세포 배양 배지인, 프로세스.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 인산칼슘, 양이온성 지질, 및 양이온성 중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 형질감염제를 포함하는 혼합물로 일시적으로 형질감염되는, 프로세스.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 DEAE-덱스트란, 폴리브렌, 덴드리머, 및 폴리에틸렌이민(PEI)으로 이루어진 군으로부터 선택된 양이온성 중합체인 형질감염제를 포함하는 혼합물로 일시적으로 형질감염되는, 프로세스.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 PEI를 포함하는 형질감염제를 포함하는 혼합물로 일시적으로 형질감염되는, 프로세스.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염제는 PEI를 포함하고, 혼합물은 약 5, 약 5.5, 약 6, 약 6.4, 약 6.5, 약 7, 약 7.5, 약 8, 약 8.5, 약 9, 약 9.5, 또는 약 10의 N(PEI 중 NH2 아민):P(DNA 백본 중 인산염기)의 비율을 갖는, 프로세스.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염제는 약 14시간 내지 약 18시간 동안 현탁 배양물에 첨가되며, 임의로 현탁 배양물은 교번식 접선 유동 여과(ATF)를 사용하여 신선한 배양 배지와의 배양 배지 교환을 거치는, 프로세스.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 패키징 플라스미드는 렌티바이러스 gag, pol, 및 rev 및 이종 외피 단백질을 암호화하는, 프로세스.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 패키징 플라스미드는 소포성 구내염 바이러스(VSV) 외피 단백질 또는 이의 변이체(예를 들어, VSV-G), 코칼 바이러스(COCV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 마라바 바이러스(MARAV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 파이리 바이러스(PIRYV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 니파 바이러스(NiV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 센다이 바이러스(SeV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 모르빌리바이러스 외피 단백질 또는 이의 변이체, 개과 디스템퍼(CDV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 홍역 바이러스(MV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 신드비스 바이러스(SINV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스(GALV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 고양이 내인성 레트로바이러스(RD114) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 고양이 백혈병 바이러스(FeLV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 개코원숭이 내인성 레트로바이러스(BaEV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, B형 간염(HBV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, C형 간염(HCV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 및 라비스 바이러스(RABV) 외피 단백질 또는 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 이종 외피 단백질을 암호화하는, 프로세스.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 플라스미드는 패키지형 렌티바이러스 벡터 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 프로세스.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 플라스미드는 좌측 키메라(5') 렌티바이러스 LTR을 포함하는 패키지형 렌티바이러스 벡터 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 5' LTR의 프로모터는 이종 프로모터; 싸이(Ψ) 패키징 신호; 중앙 폴리퓨린 관/DNA 플랩(cPPT/FLAP); 레트로바이러스 수출 요소(RRE); 관심 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터; 및 우측(3') 자기 불활성화(SIN) 렌티바이러스 LTR로 교환되는, 프로세스.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도뉴클레아제는 세라티아마르세센스균(Serratia marcescens)으로부터 유래되며, 임의로 엔도뉴클레아제는 재조합 NucA 엔도뉴클레아제인, 프로세스.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도뉴클레아제는 DNA 및 RNA 절단 활성 둘 다를 갖는, 프로세스.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도뉴클레아제는 벤조나아제 또는 데나라아제인, 프로세스.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도뉴클레아제는 약 60U/ml 또는 약 30U/ml의 농도로 첨가되는, 프로세스.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도뉴클레아제는 형질감염 후 약 36시간 내지 약 72시간차에 현탁 배양 상청액에 첨가되는, 프로세스.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도뉴클레아제는 형질감염 후 약 36시간 내지 약 48시간차에 현탁 배양 상청액에 첨가되는, 프로세스.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도뉴클레아제는 형질감염 후 약 48시간차에 현탁 배양 상청액에 첨가되는, 프로세스.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도뉴클레아제는 형질감염 후 약 44시간차에 현탁 배양 상청액에 첨가되는, 프로세스.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도뉴클레아제는 형질감염 후 약 40시간차에 현탁 배양 상청액에 첨가되는, 프로세스.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도뉴클레아제는 형질감염 후 약 36시간차에 현탁 배양 상청액에 첨가되는, 프로세스.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도뉴클레아제는 약 1시간 내지 약 2시간 동안 배양물에 첨가되는, 프로세스.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수확하고 정화하는 단계는, 적어도 약 40μm 또는 적어도 약 60μm의 오염물을 거르는 탠덤 심층 필터 및 약 0.45μm 내지 약 0.8μm의 전처리 필터 기공 크기 및 약 0.22μm 내지 약 0.45μm의 최종 필터 기공 크기를 포함하는 이중층 필터를 통해 현탁 배양 상청액을 여과하는 단계를 포함하는, 프로세스.
- 제33항에 있어서, 정화된 현탁 배양물은 임의로 1M의 HEPES를 사용하여 약 pH 7.0 또는 약 pH 7.2로 조정되는, 프로세스.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 수확되어 정화한 현탁 배양 상청액으로부터 친화도 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 포획되고 농축되는, 프로세스.
- 제35항에 있어서, 상청액을 친화도 크로마토그래피 컬럼 또는 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 통과시키는, 프로세스.
- 제35항 또는 제36항에 있어서, 친화도 크로마토그래피는 헤파린 친화도 크로마토그래피인, 프로세스.
- 제35항 또는 제36항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피는 황산염 양이온 교환 크로마토그래피인, 프로세스.
- 제38항에 있어서, 황산염 양이온 교환 크로마토그래피는 약 45μm의 비드 크기 및/또는 약 100nm의 평균 기공 크기를 갖는 컬럼을 포함하는, 프로세스.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 약 50mM의 HEPES, 약 100mM의 NaCl, pH 7을 포함하는 세척 완충액을 크로마토그래피 컬럼 상으로 펌핑하는, 프로세스.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 약 50mM의 HEPES, 약 400mM의 NaCl, pH 8을 포함하는 용리 완충액을 크로마토그래피 컬럼 상으로 펌핑하는, 프로세스.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 약 50mM의 HEPES, 약 300mM의 NaCl, pH 7.2를 포함하는 세척 완충액을 크로마토그래피 컬럼을 통과시키는, 프로세스.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 약 50mM의 HEPES, 약 1M의 NaCl, pH 7.5를 포함하는 용리 완충액을 크로마토그래피 컬럼을 통과시키는, 프로세스.
- 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 여과하는 단계(f)는 약 0.45μm 내지 약 0.8μm의 전처리 필터 기공 크기 및 약 0.2μm 내지 약 0.45μm의 최종 필터 기공 크기를 포함하는 이중층 필터를 통해 농축된 렌티바이러스 벡터를 여과하는 단계를 포함하는, 프로세스.
- 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 약 100kDa 내지 약 500kDa의 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 포함하는 중공 섬유 접선 유동 여과(TFF) 필터를 사용하여 한외여과되고 정용여과되는, 프로세스.
- 제45항에 있어서, 중공 섬유 TFF 필터는 약 100kDa의 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 포함하는, 프로세스.
- 제45항에 있어서, 중공 섬유 TFF 필터는 약 300kDa의 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 포함하는, 프로세스.
- 제45항에 있어서, 중공 섬유 TFF 필터는 약 500kDa의 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 포함하는, 프로세스.
- 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 정용여과 완충액 내로 정용여과되며, 임의로 정용여과 완충액은 약 50mM의 HEPES, 약 100mM의 NaCl, pH 7.50인, 프로세스.
- 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 정용여과 완충액 내로 정용여과되며, 임의로 정용여과 완충액은 약 50mM의 HEPES, pH 7.0인, 프로세스.
- 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 정용여과 완충액 내로 정용여과되며, 임의로 정용여과 완충액은 약 50mM의 L-히스티딘, pH 7.0인, 프로세스.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 2X 줄기 세포 성장 배지(SCGM)에서 1:1로 제형화하여 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터를 생산하는, 프로세스.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 HEPES 및 수크로오스를 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화되고, 임의로 상기 완충액은 L-프롤린, 폴록사머 188, 또는 NaCl을 추가로 포함하는, 프로세스.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 및 약 100mM의 L-프롤린을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화되는, 프로세스.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 100mM의 L-프롤린, 및 약 0.2 내지 약 2.0의 폴록사머 188을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화되는, 프로세스.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 100mM의 L-프롤린, 및 150mM의 NaCl을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화되는, 프로세스.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 100mM의 L-프롤린, 150mM의 NaCl, 및 약 0.2 내지 약 2.0mg/ml의 폴록사머 188을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화되는, 프로세스.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 150mM의 NaCl, 및 약 0.2 내지 약 2.0mg/ml의 폴록사머 188을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화되는, 프로세스.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 L-히스티딘, 수크로오스, 및 L-프롤린을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화되는, 프로세스.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 약 5mM의 L-히스티딘, 약 146mM의 수크로오스, 및 약 100mM의 L-프롤린을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화되며, 임의로 제형은 약 0.2 내지 약 2.0mg/mL의 폴록사머 188을 추가로 포함하는, 프로세스.
- 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터는 임의로 0.45μm 전처리 필터를 포함하는 0.22μm 필터를 통해 멸균 여과되는, 프로세스.
- 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로세스는 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터의 충진 마감을 수행하여 최종 렌티바이러스 벡터를 생산하는 단계, 및 최종 렌티바이러스 벡터를 동결하는 단계를 추가로 포함하는 프로세스.
- 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로세스는 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터를 동결하는 단계를 추가로 포함하는 프로세스.
- 제63항에 있어서, 상기 프로세스는 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터를 해동하는 단계, 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터를 멸균 여과하는 단계, 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터의 충진 마감을 수행하여 최종 렌티바이러스 벡터를 생산하는 단계, 및 최종 렌티바이러스 벡터를 동결하는 단계를 더 포함하는 프로세스.
- 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 최종 렌티바이러스 벡터는 ≤ -65℃에서 동결되는, 프로세스
- 현탁 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
(a) 약 50mL의 배양 배지를 포함하는 P0 현탁 배양물에 약 10.0x106개 내지 약 15.0x106개의 생존 가능 HEK293Ts 세포를 접종하는 단계;
(b) 약 100mL의 배양 배지를 포함하는 P1 현탁 배양물에 P0 현탁 배양물로부터 수득된 약 30.0x106개 내지 약 70.0x106개의 생존 가능 HEK293Ts 세포를 접종하는 단계;
(c) 각각 약 200mL의 배양 배지를 포함하는 3개의 P2 현탁 배양물에 P1 현탁 배양물로부터 수득된 약 11.0x107개 내지 약 19.0x107개의 생존 가능 HEK293Ts 세포를 접종하는 단계;
(d) 약 1.0L의 배양 배지를 각각 포함하는 3개의 P3 현탁 배양물에 풀링된 P2 현탁 배양물로부터 수득된 약 55.0x107개 내지 약 95.0x107개의 생존 가능 HEK293Ts 세포를 접종하는 단계;
(e) 약 20.0L의 배양 배지를 포함하는 P4 현탁 배양물에 풀링된 P3 현탁 배양물로부터 수득된 약 40.0x108개 내지 약 120.0x108개의 생존 가능 HEK293Ts 세포를 접종하는 단계;
(f) 약 200.0L의 배양 배지를 포함하는 P5 현탁 배양물에 P4 현탁 배양물로부터 수득된 약 40.0x108개 내지 약 120.0x108개의 생존 가능 HEK293Ts 세포를 접종하는 단계;
(g) 약 3일 동안 P5 현탁 배양물을 배양하고, 교번식 접선 유동 여과(ATF)를 사용하여 약 190.0L의 신선한 배양 배지로 P5 현탁 배양물의 배양 배지를 교환하는 단계;
(h) 배양 배지 교환 후, P5 현탁 배양물을 형질감염시켜 렌티바이러스 벡터를 생산하는 단계로서, 상기 형질감염시키는 단계는 전달 플라스미드 및 gag, pol, rev, VSV-g를 암호화하고 폴리에틸렌이민(PEI)과 복합체를 형성하는 플라스미드 DNA를 포함하는 약 10.0L의 배양 배지를 첨가하는 단계를 포함하는 단계;
(i) 형질감염 후, ATF를 사용하여 P5 현탁 배양물의 배양 배지를 약 200.0L의 신선한 배양 배지로 교환하는 단계;
(j) 형질감염 후 약 36시간 내지 약 48시간차에, P5 현탁 배양물을 엔도뉴클레아제로 약 1시간 내지 약 2시간 동안 처리하는 단계;
(k) 60μm 이상의 입자를 거르는 탠덤 심층 필터, 및 0.8μm 및 0.45μm의 기공 크기를 포함하는 이중층 필터를 사용하여 P5 현탁 배양 상청액을 수확하고 정화하는 단계;
(l) 수확되어 정화된 P5 현탁 배양 상청액으로부터 렌티바이러스 벡터를 포획하고 농축시키는 단계(헤파린 크로마토그래피 또는 황산염 양이온 교환 크로마토그래피를 포함함);
(m) 0.8μm 및 0.45μm의 기공 크기를 포함하는 이중층 필터를 사용하여 농축된 렌티바이러스 벡터를 여과하는 단계;
(n) 접선 유동 여과(TFF)를 사용하여 렌티바이러스 벡터를 한외여과하여 렌티바이러스 벡터를 추가로 농축시키고, 정용여과 완충액 내로 렌티바이러스 벡터를 정용여과하여 벌크 렌티바이러스 벡터를 생산하는 단계; 및
(o) 렌티바이러스 벡터를 제형화하여 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터를 생산하는 단계를 포함하는 방법. - 제66항에 있어서, 배양 배지는 무혈청 합성 세포 배양 배지인, 방법.
- 제66항 또는 제67항에 있어서, PEI/DNA 혼합물에 대한 N(PEI 중 NH2 아민):P(DNA 백본 중 인산염기)의 비율은 약 5, 약 5.5, 약 6, 약 6.4, 약 6.5, 약 7, 약 7.5, 약 8, 약 8.5, 약 9, 약 9.5, 또는 약 10인, 방법.
- 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, PEI는 약 14시간 내지 약 18시간 동안 현탁 배양물에 첨가되며, 임의로 현탁 배양물은 교번식 접선 유동 여과(ATF)를 사용하여 신선한 배양 배지와의 배양 배지 교환을 거치는, 프로세스.
- 제66항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 플라스미드는 패키지형 렌티바이러스 벡터 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 프로세스.
- 제66항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 플라스미드는 좌측 키메라(5') 렌티바이러스 LTR을 포함하는 패키지형 렌티바이러스 벡터 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 5' LTR의 프로모터는 이종 프로모터; 싸이(Ψ) 패키징 신호; 중앙 폴리퓨린 관/DNA 플랩(cPPT/FLAP); 레트로바이러스 수출 요소(RRE); 관심 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터; 및 우측(3') 자기 불활성화(SIN) 렌티바이러스 LTR로 교환되는, 방법.
- 제66항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도뉴클레아제는 세라티아마르세센스균(Serratia marcescens)으로부터 유래되는, 프로세스.
- 제66항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도뉴클레아제는 DNase 및 RNase 활성 둘 다를 갖는, 프로세스.
- 제66항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도뉴클레아제는 벤조나아제 또는 데나라아제인, 방법.
- 제66항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도뉴클레아제는 약 60U/ml 또는 약 30U/ml의 농도로 첨가되는, 프로세스.
- 제66항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 정화된 현탁 배양물은 임의로 1M의 HEPES를 사용하여 약 pH 7.0 또는 약 pH 7.2로 조정되는, 프로세스.
- 제66항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 황산염 양이온 교환 크로마토그래피는 약 45μm의 비드 크기 및/또는 약 100nm의 평균 기공 크기를 갖는 컬럼을 포함하는, 프로세스.
- 제66항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 약 50mM의 HEPES, 약 100mM의 NaCl, pH 7을 포함하는 세척 완충액을 헤파린 크로마토그래피 컬럼 상으로 펌핑하는, 프로세스.
- 제66항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 약 50mM의 HEPES, 약 400mM의 NaCl, pH 8을 포함하는 용리 완충액을 헤파린 크로마토그래피 컬럼 상으로 펌핑하는, 프로세스.
- 제66항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 약 50mM의 HEPES, 약 300mM의 NaCl, pH 7.2를 포함하는 세척 완충액을 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상으로 펌핑하는, 프로세스.
- 제66항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 약 50mM의 HEPES, 약 1M의 NaCl, pH 7.5를 포함하는 용리 완충액을 양이온 교환 크로마토그래피 상으로 펌핑하는, 프로세스.
- 제66항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 약 100kDa, 약 300kDa 또는 약 500kDa의 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 포함하는 중공 섬유 TFF 필터를 사용하여 한외여과되고 정용여과 완충액 내로 정용여과되는, 방법.
- 제66항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 정용여과 완충액은 약 50mM의 HEPES, 약 100mM의 NaCl, pH 7.50인, 방법.
- 제66항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 정용여과 완충액은 약 50mM의 HEPES, pH 7.0인, 프로세스.
- 제66항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 정용여과 완충액 내로 정용여과되며, 임의로 정용여과 완충액은 약 50mM의 L-히스티딘, pH 7.0인, 프로세스.
- 제66항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 2X 줄기 세포 성장 배지(SCGM)에서 1:1로 제형화하여 렌티바이러스 벡터는 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터를 생산하는, 프로세스.
- 제66항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 HEPES 및 수크로오스를 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화되고, 임의로 완충액은 L-프롤린, 폴록사머 188, 또는 NaCl을 추가로 포함하는, 프로세스.
- 제66항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 및 약 100mM의 L-프롤린을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화되는, 프로세스.
- 제66항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 100mM의 L-프롤린, 및 약 0.2 내지 약 2.0mg/ml의 폴록사머 188을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화되는, 프로세스.
- 제66항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 100mM의 L-프롤린, 및 약 150mM의 NaCl을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화되는, 프로세스.
- 제66항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 100mM의 L-프롤린, 약 150mM의 NaCl, 및 약 0.2 내지 약 2.0mg/ml의 폴록사머 188을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화되는, 프로세스.
- 제66항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 150mM의 NaCl, 및 약 0.2 내지 약 2.0mg/ml의 폴록사머 188을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화되는, 프로세스.
- 제66항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 L-히스티딘, 수크로오스, 및 L-프롤린을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화되는, 프로세스.
- 제66항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 약 5mM의 L-히스티딘, 약 146mM의 수크로오스, 및 약 100mM의 L-프롤린을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화되고, 임의로 제형은 약 0.2 내지 약 2.0mg/mL의 폴록사머 188을 추가로 포함하는, 프로세스.
- 제66항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터의 충진 마감을 수행하여 최종 렌티바이러스 벡터를 생산하는 단계, 및 최종 렌티바이러스 벡터를 동결하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제66항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터를 동결하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제96항에 있어서, 프로세스는 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터를 해동하는 단계, 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터를 멸균 여과하는 단계, 제형화된 벌크 렌티바이러스 벡터의 충진 마감을 수행하여 최종 렌티바이러스 벡터를 생산하는 단계, 및 최종 렌티바이러스 벡터를 동결하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제95항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 최종 렌티바이러스 벡터는 ≤-65℃에서 동결되는, 프로세스.
- 바이러스 벡터를 생산하기 위한 현탁 프로세스로부터 숙주 세포 단백질(HCP)을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은:
(a) 바이러스 벡터(예를 들어, 제1항 내지 제98항 중 어느 한 항에 따라 제조된 바이러스 벡터)를 포함하는, 수확하여 정화한 현탁 배양 상청액을 제공하는 단계;
(b) 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여, 수확하여 정화한 현탁 배양 상청액으로부터 바이러스 벡터를 포획하고 농축시키는 단계;
(c) 농축된 바이러스 벡터를 여과하는 단계;
(d) 접선 유동 여과(TFF)를 사용하여 바이러스 벡터를 한외여과하고 정용여과하는 단계; 및
(e) 바이러스 벡터를 제형화하여 제형화된 벌크 바이러스 벡터를 생산하고, 제형화된 벌크 바이러스 벡터를 멸균 여과하는 단계를 포함하는 방법. - 제99항에 있어서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 프로세스.
- 제99항 또는 제100항에 있어서, 바이러스 벡터는 소포성 구내염 바이러스(VSV) 외피 단백질 또는 이의 변이체(예를 들어, VSV-G), 코칼 바이러스(COCV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 마라바 바이러스(MARAV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 파이리 바이러스(PIRYV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 니파 바이러스(NiV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 센다이 바이러스(SeV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 모르빌리바이러스 외피 단백질 또는 이의 변이체, 개과 디스템퍼(CDV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 홍역 바이러스(MV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 신드비스 바이러스(SINV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스(GALV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 고양이 내인성 레트로바이러스(RD114) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 고양이 백혈병 바이러스(FeLV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 개코원숭이 내인성 레트로바이러스(BaEV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, B형 간염(HBV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, C형 간염(HCV) 외피 단백질 또는 이의 변이체, 및 라비스 바이러스(RABV) 외피 단백질 또는 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 이종 외피 단백질로 위형화되는, 프로세스.
- 제99항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터는 소포성 구내염 바이러스(VSV) 외피 단백질 또는 이의 변이체(예를 들어, VSV-G)로 이루어진 이종 외피 단백질로 위형화되는, 프로세스.
- 제99항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 수확하여 정화하는 단계는, 적어도 약 40μm 또는 적어도 약 60μm의 오염물을 거르는 탠덤 심층 필터 및 약 0.45μm 내지 약 0.8μm의 전처리 필터 기공 크기 및 약 0.22μm 내지 약 0.45μm의 최종 필터 기공 크기를 포함하는 이중층 필터를 통해 현탁 배양 상청액을 여과하는 단계를 포함하는, 프로세스.
- 제103항에 있어서, 정화된 현탁 배양물은 임의로 1M의 HEPES를 사용하여 약 pH 7.0 또는 약 pH 7.2로 조정되는, 프로세스.
- 제99항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상청액을 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 통과시키는, 프로세스.
- 제105항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피는 황산염 양이온 교환 크로마토그래피인, 프로세스.
- 제106항에 있어서, 황산염 양이온 교환 크로마토그래피는 약 45μm의 비드 크기 및/또는 약 100nm의 평균 기공 크기를 갖는 컬럼을 포함하는, 프로세스.
- 제99항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 약 50mM의 HEPES, 약 300mM의 NaCl, pH 7.2를 포함하는 세척 완충액을 크로마토그래피 컬럼을 통과시키는, 프로세스.
- 제99항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 약 50mM의 HEPES, 약 1M의 NaCl, pH 7.5를 포함하는 용리 완충액을 크로마토그래피 컬럼을 통과시키는, 프로세스.
- 제99항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 여과 단계(c)는 약 0.45μm 내지 약 0.8μm의 전처리 필터 기공 크기 및 약 0.2μm 내지 약 0.45μm의 최종 필터 기공 크기를 포함하는 이중층 필터를 통해 농축된 바이러스 벡터를 여과하는 단계를 포함하는, 프로세스.
- 제99항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터는 약 100kDa 내지 약 500kDa의 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 포함하는 중공 섬유 접선 유동 여과(TFF) 필터를 사용하여 한외여과되고 정용여과되는, 프로세스.
- 제111항에 있어서, 중공 섬유 TFF 필터는 약 100kDa의 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 포함하는, 프로세스.
- 제111항에 있어서, 중공 섬유 TFF 필터는 약 300kDa의 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 포함하는, 프로세스.
- 제111항에 있어서, 중공 섬유 TFF 필터는 약 500kDa의 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 포함하는, 프로세스.
- 제111항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터는 정용여과 완충액 내로 정용여과되고, 임의로 정용여과 완충액은 약 50mM의 HEPES, pH 7.0인, 프로세스.
- 제99항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터는 HEPES 및 수크로오스를 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화되고, 임의로 완충액은 L-프롤린, 폴록사머 188, 또는 NaCl을 추가로 포함하는, 프로세스.
- 제99항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 및 약 100mM의 L-프롤린을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화되는, 프로세스.
- 제99항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 100mM의 L-프롤린, 및 약 0.2 내지 약 2.0의 폴록사머 188을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화되는, 프로세스.
- 제99항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 100mM의 L-프롤린, 및 약 150mM의 NaCl을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화되는, 프로세스.
- 제99항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 100mM의 L-프롤린, 약 150mM의 NaCl, 및 약 0.2 내지 약 2.0mg/ml의 폴록사머 188을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화되는, 프로세스.
- 제99항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터는 약 5mM의 HEPES(pH 7.0), 약 146mM의 수크로오스, 약 150mM의 NaCl, 및 약 0.2 내지 약 2.0mg/ml의 폴록사머 188을 포함하는 완충액에서 1:1로 제형화되는, 프로세스.
- 제99항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 제형화된 벌크 바이러스 벡터는 임의로 0.45μm 전처리 필터를 포함하는 0.22μm 필터를 통해 멸균 여과되는, 프로세스.
- 제99항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 프로세스는 제형화된 벌크 바이러스 벡터의 충진 마감을 수행하여 최종 바이러스 벡터를 생산하는 단계, 및 최종 바이러스 벡터를 동결하는 단계를 추가로 포함하는 프로세스.
- 제123항에 있어서, 프로세스는 제형화된 벌크 바이러스 벡터를 동결하는 단계를 추가로 포함하는 프로세스.
- 제122항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로세스는 제형화된 벌크 바이러스 벡터를 해동하는 단계, 제형화된 벌크 바이러스 벡터를 멸균 여과하는 단계, 제형화된 벌크 바이러스 벡터의 충진 마감을 수행하여 최종 바이러스 벡터를 생산하는 단계, 및 최종 바이러스 벡터를 동결하는 단계를 추가로 포함하는 프로세스.
- 제123항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 최종 바이러스 벡터는 ≤-65℃에서 동결되는, 프로세스.
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