JP2004283183A - 組換えアデノウイルス - Google Patents
組換えアデノウイルス Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004283183A JP2004283183A JP2004210824A JP2004210824A JP2004283183A JP 2004283183 A JP2004283183 A JP 2004283183A JP 2004210824 A JP2004210824 A JP 2004210824A JP 2004210824 A JP2004210824 A JP 2004210824A JP 2004283183 A JP2004283183 A JP 2004283183A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- recombinant adenovirus
- adenovirus
- promoter
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
【解決手段】アデノウイルスゲノムが、外来の目的ポリペプチド配列をコードしているヌクレオチド配列、この配列の発現を制御するサイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、およびウサギβグロビンのスプライシングアクセプターからなるハイブリッドプロモーター(CAGプロモーター)、ならびにポリA配列を有することを特徴とする組換えアデノウイルス。
【選択図】なし
Description
Nature Genetics,VOL.3.1-2, 1993 Science,VOL.259, 988-990, 1993 Nature Genet.VOL.3, 219-223, 1993 ibid,VOL.3, 224-228, 1993 ibid,VOL.3, 229-234, 1993
〔1〕アデノウイルスゲノムが、外来の目的ポリペプチド配列をコードしているヌクレオチド配列、この配列の発現を制御するサイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、およびウサギβグロビンのスプライシングアクセプターからなるハイブリッドプロモーター(CAGプロモーター)、ならびにポリA配列を有することを特徴とする組換えアデノウイルス、
〔2〕アデノウイルスゲノムがE1A遺伝子領域を含む1.3%〜9.3%断片を欠失していることを特徴とする前記〔1〕記載の組換えアデノウイルス、
〔3〕E1A遺伝子領域を含む1.3%〜9.3%断片を欠失している部位に、外来の目的ポリペプチド配列をコードしているヌクレオチド配列およびCAGプロモーターが挿入されていることを特徴とする前記〔2〕記載の組換えアデノウイルス、
〔4〕アデノウイルスゲノムが、さらに当該ゲノムの79.6%〜84.8%断片をE3遺伝子領域から欠失していることを特徴とする前記〔2〕又は〔3〕記載の組換えアデノウイルス、
〔5〕外来の目的ポリペプチド配列をコードしているヌクレオチド配列およびCAGプロモーターが左向きにアデノウイルスゲノムに組み込まれていることを特徴とする前記〔1〕〜〔4〕いずれか記載の組換えアデノウイルス、
〔6〕外来の目的ポリペプチド配列をコードしているヌクレオチド配列が天然の宿主細胞内でのCAGプロモーターの制御下で発現されたとき、該宿主細胞の培地中に分泌されるポリペプチドをコードしていることを特徴とする前記〔1〕〜〔5〕いずれか記載の組換えアデノウイルス、並びに
〔7〕遺伝子治療用である、前記〔1〕〜〔5〕いずれか記載の組換えアデノウイルス、
に関する。
本発明に使用されるヒトアデノウイルスは、ヒトを自然宿主とするウイルスである。アデノウイルスゲノムは、約36kbpの2本鎖線状DNAであって、DNA鎖両端にはおよそ100bpからなる逆方向反復塩基配列があり、そのDNA鎖両端の5’末端にはE2B遺伝子産物が切断加工された55kのタンパク質が共有結合しているという特異な構造をしている。この特異なゲノム構造がアデノウイルスをベクターとして使用する場合に大きな障害となってきたことについては以下に述べるとおりであり、本発明の核心は、かかる障害を克服して完成された新規かつ有用な組換えアデノウイルス並びにその製造方法を提供する点にある。
本発明の組換えアデノウイルスの作成は、前述のとおりウイルスゲノムの両端にタンパク質が共有結合しているため、一般に極めて困難である。
(1) まず、アデノウイルスゲノム(36kb)の全長のうち、複製に不要なE3遺伝子領域(1.9kb)とE1A・E1B遺伝子領域(2.9kb)を欠失させた約31kbのゲノムDNAをもつコスミドを作成し、そのE1A・E1B欠失部位に外来プロモーター、細胞系内で発現させようとする外来の目的ポリペプチド配列をコードしているヌクレオチド配列及びポリA配列を含む目的遺伝子の発現ユニットを組み込む。発現ユニットは好ましくは左向きに組み込まれる。ここで左向きとは、本来のE1A、E1Bの転写の向きと逆向きをいう。
<組換えアデノウイルスの作製>
組換えアデノウイルスの作製は、大別して3つのステップに別れる。即ち、コスミドへの発現ユニットの挿入のステップ、親ウイルスDNA−TPCの作成のステップ、そしてコスミドとDNA−TPCによる293細胞への同時トランスフェクション・分離精製のステップである。以下に各ステップについて説明する。
(1) まず、両端を平滑化した発現ユニット断片の0.2μgとSwaIで切断したpAdex1w DNAの1μgを混合した。
SwaI切断を行う意味は、コスミドが発現ユニットをくわえ込むことなく再結合するとSwaI認識配列が再生されるため、このステップで発現ユニットの組み込まれていないコスミドを再切断し、コロニーをつくらなくするためである。この方法はインサートをもつコスミドだけを選択する強力な方法である。
即ち、ラムダ・イン・ビトロ・パッケージングキットであるギガバックXL(Stratagene社製)を1/4スケールで用い、残りは−80℃に凍結した。ギガバックXLは42kb以下のコスミドのパッケージ効率が低いのでインサートが入って大きくなったコスミドをある程度選択することができる。本実験では、10個のコロニーを拾えば大半はインサートを含んでおり、目的の向き(左向き)のクローンを容易に得ることができた。
即ち、3枚のAp+ (アンピシリン添加)寒天プレートと5mlのAp+ LB(pool)にそれぞれ1/200量、1/20量、1/2量、残り全量を接種し、一晩培養した。
poolのminiprepDNAを抽出・調製し、全酵素切断によりインサートが入ったものの割合を調べた。コロニーを丸ごと取り1.5mlのAp+ LBで、一晩培養し、miniprepDNAを調製した。
なお、NruIとリガーゼを用いて、発現単位を含むが大部分のアデノウイルスDNAを欠失したプラスミドを作製し、DNAを調製して、cDNAクローン化の最終確認を行うとともに、COS細胞での一時的発現により、目的遺伝子であるLacZ遺伝子の発現を確認した。(組換えウイルスの作製にはこのプラスミドではなく、コスミドの方を用いる。)
(1) アデノウイルスDNAとしては、Ad5 dlX(I. Saito et al., J. of Virology, vol.54, 711-719 (1985) )を用いた。Ad5 dlXをHeLa細胞(Roux 10本分)に感染させ、培養を行った。
ウイルスを細胞内から放出させるには5ml以下なら凍結融解5回でもよいが、それ以上の容量ではソニケーターが便利である。ただし、必ず密封型(専用カップのあるもの)を用いる。通常の投げ込み型は、たとえ安全キャビネットの中でも危険性がある。
これらを、35krpm、4℃で一晩超遠心にかけた。次いで、白いウイルスのバンドを分取し、既に勾配ができたチューブに乗せ替えた。さらに、35krpm、4℃4時間以上超遠心にかけた。
なお、DNA−TPCは制限酵素による切断、透析、ゲル濾過はできるが電気泳動・フェノール処理・エタノール沈澱はできなかった。濃縮法は塩化セシウム平衡遠心しかないのでなるべく濃厚状態に保った。10Rouxの感染細胞から約300μg程度のDNA−TPCを得ることができた。
EcoT221切断DNA−TPC中の制限酵素bufferを、遠心ゲル濾過によって除いた後、分注し−80℃に保存した。
(1) 10%FCS添加DMEで培養した293細胞の6cm、10cmシャーレ各1枚用意した。
一晩培養(約16時間)し、午前中に培養液を交換し、夕方、コラーゲンコート96穴3枚(原液・10倍希釈・100倍希釈)に、5%FCS添加DMEを用い、各ウエル当たり0.1mlでまき直した。細胞数が各プレートで大きく違わないように、希釈2枚分には10cmシャーレの293細胞を1/3ずつ混ぜて播いた。
ウイルスが増殖し細胞が死滅したウエルが7〜15日の間に現れた。ウエルの細胞が完全に死滅するごとに滅菌パスツールピペットで培養液(死細胞ごと)を滅菌した1.5mlチューブに無菌的に移して、ドライアイスで急凍して−80℃に保存した。
早めにウイルス増殖が起こったウエルは複数のウイルス株の混合感染の可能性が高いからである。
<本発明の組換えアデノウイルスの簡便力価測定法>
本発明の組換えアデノウイルスは、以下の方法により、簡便に測定することができる。
(1) 293細胞を10cmシャーレ各1枚用意する。
組換えアデノウイルス液(3次ウイルス液)を5%FCS添加DMEを用いて10-1〜10-4まで段階希釈する。例えば0.9mlDME+0.1mlウイルス液。チップをすべて替える。
第1列目に、10-4に希釈した組換えウイルスを25μlずつ加える。
8ウエル用マルチチャンネルピペットを用いて25μlを2列目のウエルに移す。以下同じ操作を11列目まで繰り返し最後の25μlを捨てる。結果として3n の段階希釈列を311×10-4まで作製することができる。12列目は非感染細胞のコントロールとする。
この時用いるチップはその度に替える。
3〜4日後と6〜7日後に各ウエルに50μlの(10%FCS添加DME)をセルセイバー用滅菌チップを用いてそっと加える。
12日後に細胞変性の終末点を顕微鏡で判定する。14日まで細胞が維持できれば判定は誰の目にも明らかであるが、細胞が痛むと判定が難しくなる。
下記ケルバーの式(1)を用いて統計学的に50%細胞変性終末点(TCID50)を計算する。
ケルバーの式:求めるTCID50を10X とすると、
X=log a−(各希釈段階における変性ウエル数/各希釈段階における検体数の総和−0.5)×log(希釈率)
但しa:1列目の希釈度(このプロトコールでは10-4×3-1)
12日後に細胞変性の終末点を顕微鏡で判定して表1の結果が得られた。この場合の力価は次のようになる。
希釈ウイルス液量は50μlであるから、この濃度50μlで1PFUと考えるとウイルス原液の力価は、1ml÷50μl÷10-7.817=20×107.817 =109.118 =1.3×10 9(PFU/ml)となる。つまり8列目が半分変性したら1.3×10 9PFU/mlであり、7列目の半分までならその1/3の4.4×108 PFU/mlとなる。
<pAdex1cとpAdex1wの構築>
(1)E1遺伝子領域を欠失したアデノウイルスゲノム左側末端の17%を含むプラスミド(pUAF0−17D)の調製
5型アデノウイルスDNAをS1処理して平滑末端とし、フェノール抽出、エタノール沈殿で回収した。平滑末端にBamHリンカーを結合させ、その後HindIII 消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。目的のフラグメント(2.8kb、アデノウイルスゲノムの左側末端の8%に当たる)はゲルから電気的に抽出、回収し、BamHI/HindIII 消化したpUC19のBamHI/HindIII 部位へ挿入した。得られた目的のプラスミドをpUAF0−8と名づけた。
5型アデノウイルスDNAをBst1107とEcoRIで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した後、目的の21.6kbのフラグメントを回収した。
pX2S(I. Saito et. al., J. of Virology, vol. 54, p711-719, 1985)のSalI部位をSwaIリンカーを用いてSwaI部位へ変換しpX2Wを得た。pX2WをEcoRIとSwaIで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した後、目的の6.5kbのフラグメントを回収した。
charomid9−11(I. Saito & G. Stark, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 83, p8664-8668, 1986) のKpnI、SmaI、BamHIを除くため、charomid9−11をAsp718とBamHIで消化し、Klenowフラグメントで平滑化後、セルフライゲーションした。これを用いて形質転換し、目的のシャロミドを単離し、charomid6−11と名づけた。charomid6−11のEcoRI部位へBamHIリンカーを挿入し、得られたシャロミドをchdRBR7−11と名づけた。
pUAF0−17DのBamHI−Bst1107フラグメント(2.9kb)とアデノウイルスゲノムのBst1107−EcoRIフラグメント(21.6kb)とpX2WのEcoRI−SwaIフラグメント(6.5kb)をEcoRIとEcl36Iで消化したchdRBR7−11とライゲーションした。その後、in vitroパッケージングし、DH5αへ感染させた。形質転換株から目的のフラグメントをもつものを単離し、pAdex1cと名づけた。
pAdex1cのClaI部位をSwaIリンカーを用いてSwaI部位へ変換し、pAdex1wを得た。
<組換えアデノウイルスによる各種株化細胞に対するLacZ遺伝子の発現に及ぼす各種プロモーターの影響>
本発明の組換えアデノウイルスのプロモーター(CAGプロモーター)をSRαプロモーター(SV40初期プロモーター+HTLV−I LTR)、EF−1αプロモーター(ヒト・ポリペプチド伸長因子遺伝子由来)に代えた組換えアデノウイルスを調製し、本発明の組換えアデノウイルスとLacZ遺伝子の発現に対する活性を調べた。
組換えアデノウイルスゲノムへの発現ユニットの導入は、以下のようにして行った。
これを、SwaIで切断したpAdex1wと結合させて発現コスミドを作成した。
3×105 細胞を24穴プレートの各ウエルに培養し、これに、作成した組換えアデノウイルスをm.o. i. (感染多重度)10で感染させ、2日間インキュベートした。その後、細胞をエッペンチューブに集め、PBSで2回洗浄した。これに、抽出緩衝液0.5mlを加え、30秒間隔で計90秒超音波破砕した後、80%グリセロールを0.5ml加え、15000rpmで10分間遠心分離し、得られた上清を細胞抽出液とした。
吸光度が1を越える時はextraction bufferを用いて細胞抽出液を希釈し再度測定することが望ましい。
Units/ml=(sampleの吸光度-blankの吸光度)/4.51a)x1.4mlb)x1/30minc)x1.0ml/0.05ml d)
ここで、a)、b)、c)、d)はそれぞれ次の意味を表わす。
a)o−Nitrophenol の吸光係数、すなわち1mM水溶液の吸光度で割ることで酵素反応生成物の濃度μmol/mlを求める。
b)反応停止後のvol.をかけることで反応生成物の量μmolを求める。
c)反応時間で割ることにより1分間当たりの反応量を求める。
d)反応に供した酵素液のvol.は0.05ml、1ml当たりの反応量に換算するため。
<LacZ遺伝子又はC型肝炎ウイルス(HCV)遺伝子発現ユニットの挿入方向とウイルス産生量の比較>
異なるプロモーターと遺伝子を用いて、その挿入方向が逆になる組換えアデノウイルスを調製し、そのウイルス産生量を比較検討した。
HCVの307〜2554塩基番号にあたる2.2kbのフラグメントをPCR法で調製し、LacZの場合と同様にpcDL−SRαのPstI−KpnI部位へ挿入した。組換えアデノウイルスは比較例1と同様に調製した。
比較例1と同様に調製した。
293細胞での組換えウイルスの産生量を表2に示した。
表2より、4例中3例では左向きの方が右向きに比べ、約10倍前後高いウイルス産生量を示し、1例では同程度であった。この傾向はプロモーター、遺伝子によらないことも判った。この結果より本組換えアデノウイルスでは、その挿入方向が左向きの方がはるかに高いウイルス産生を示すことが分かった。
Claims (7)
- アデノウイルスゲノムが、外来の目的ポリペプチド配列をコードしているヌクレオチド配列、この配列の発現を制御するサイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、およびウサギβグロビンのスプライシングアクセプターからなるハイブリッドプロモーター(CAGプロモーター)、ならびにポリA配列を有することを特徴とする組換えアデノウイルス。
- アデノウイルスゲノムがE1A遺伝子領域を含む1.3%〜9.3%断片を欠失していることを特徴とする請求項1記載の組換えアデノウイルス。
- E1A遺伝子領域を含む1.3%〜9.3%断片を欠失している部位に、外来の目的ポリペプチド配列をコードしているヌクレオチド配列およびCAGプロモーターが挿入されていることを特徴とする請求項2記載の組換えアデノウイルス。
- アデノウイルスゲノムが、さらに当該ゲノムの79.6%〜84.8%断片をE3遺伝子領域から欠失していることを特徴とする請求項2又は3記載の組換えアデノウイルス。
- 外来の目的ポリペプチド配列をコードしているヌクレオチド配列およびCAGプロモーターが左向きにアデノウイルスゲノムに組み込まれていることを特徴とする請求項1〜4いずれか記載の組換えアデノウイルス。
- 外来の目的ポリペプチド配列をコードしているヌクレオチド配列が天然の宿主細胞内でのCAGプロモーターの制御下で発現されたとき、該宿主細胞の培地中に分泌されるポリペプチドをコードしていることを特徴とする請求項1〜5いずれか記載の組換えアデノウイルス。
- 遺伝子治療用である、請求項1〜5いずれか記載の組換えアデノウイルス。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004210824A JP3713038B2 (ja) | 1994-03-09 | 2004-07-16 | 組換えアデノウイルス |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6681394 | 1994-03-09 | ||
JP2004210824A JP3713038B2 (ja) | 1994-03-09 | 2004-07-16 | 組換えアデノウイルス |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP28139194A Division JP4159620B2 (ja) | 1994-03-09 | 1994-10-19 | 組換えアデノウイルスの製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004283183A true JP2004283183A (ja) | 2004-10-14 |
JP3713038B2 JP3713038B2 (ja) | 2005-11-02 |
Family
ID=33301314
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004210824A Expired - Lifetime JP3713038B2 (ja) | 1994-03-09 | 2004-07-16 | 組換えアデノウイルス |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3713038B2 (ja) |
-
2004
- 2004-07-16 JP JP2004210824A patent/JP3713038B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP3713038B2 (ja) | 2005-11-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5731172A (en) | Recombinant adenovirus and process for producing the same | |
KR100379654B1 (ko) | 동물세포의형질감염을위한재조합dna바이러스벡터 | |
JP3770333B2 (ja) | 組換えdnaウイルスおよびその製造方法 | |
JP3989541B2 (ja) | 分子間相同組換えによるウイルスベクターの作製方法 | |
US6228646B1 (en) | Helper-free, totally defective adenovirus for gene therapy | |
US5891690A (en) | Adenovirus E1-complementing cell lines | |
JP4226071B2 (ja) | 欠陥アデノウイルスおよび対応補足系 | |
US7045344B2 (en) | Adenoviral vector and methods for making and using the same | |
JP3416143B2 (ja) | 組換えウイルスベクター製造用ヘルパーウイルス | |
JP2005503797A (ja) | アデノウイルスベクター及び関連する系、並びに製造及び使用の方法 | |
JP2002543792A (ja) | ベクターによるトランスポゾン配列の供給及び組込み | |
JP2002330786A (ja) | 抗炎症性ベクター | |
AU752148B2 (en) | Chimeric adenoviral vectors | |
JP4159620B2 (ja) | 組換えアデノウイルスの製造方法 | |
Asselbergs et al. | Analysis of expression of adenovirus DNA (fragments) by microinjection in Xenopus oocytes: Independent synthesis of minor early region 2 proteins | |
JP2023543291A (ja) | CRISPR/CAS媒介in vivo末端分離による組換えアデノウイルスのレスキュー | |
JP6795530B2 (ja) | 大きな核酸をクローニングするためのアデノウイルスベクターを作製する手段 | |
JP3713038B2 (ja) | 組換えアデノウイルス | |
AU2003283504A1 (en) | Recombinant adenoviral vectors and applications thereof | |
JP4288259B2 (ja) | 動物細胞感染用の組換えdnaウイルスベクター | |
AU4111099A (en) | Defective adenoviruses and corresponding complementation lines | |
JPH104973A (ja) | 組換えバキュロウイルス及びその利用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040722 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050222 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050421 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20050802 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20050818 |
|
R150 | Certificate of patent (=grant) or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090826 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090826 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090826 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100826 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100826 Year of fee payment: 5 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100826 Year of fee payment: 5 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100826 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110826 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110826 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120826 Year of fee payment: 7 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120826 Year of fee payment: 7 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130826 Year of fee payment: 8 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |