JP2003517839A - 変異HIVgag/pol、SIVgagおよびSIVenv遺伝子を持つ分子クローン - Google Patents
変異HIVgag/pol、SIVgagおよびSIVenv遺伝子を持つ分子クローンInfo
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Abstract
Description
能な、変異HIV-1 gag/polおよびSIV gag遺伝子配列を含む核酸に関する。本発
明はまた、いずれかのSIVまたはHIV制御因子に非依存的に発現されることが可能
な、変異SIV env遺伝子配列を含む核酸にも関する。本発明の好ましい核酸は、
感染性ウイルス粒子を産生することが可能である。 本発明はまた、変異HIV-1 gag、HIV-1 polおよび/またはSIV gag遺伝子配列
を含む、ベクター、ベクター系および宿主細胞にも関する。本発明はまた、これ
らの核酸および/またはベクターまたはベクター系を含む、宿主細胞にも関する
。本発明はまた、遺伝子治療に、またはワクチンとして使用するための、これら
の核酸、ベクター、ベクター系および/または宿主細胞の使用にも関する。 背景 最近まで、遺伝子治療プロトコルは、しばしば、ネズミ白血病ウイルス(MLV
)などのレトロウイルス由来のベクターに頼ってきた。これらのベクターは、形
質導入する遺伝子が、標的細胞のゲノムに組み込まれ、それが長期間発現するた
めに望ましい特徴であるため、有用である。しかし、これらのレトロウイルスベ
クターは、分裂性細胞にのみ形質導入することが可能であり、これは、肝細胞、
筋線維、造血幹細胞、およびニューロンなどの非増殖性細胞におけるin vivo遺
伝子トランスファーのための使用を制限する。
レトロウイルス種である。これらは、動物モデルにおいて、多様な非分裂性細胞
(例えば、ニューロンおよびマクロファージ)で、長期間遺伝子発現(6ヶ月ま
で)を提供するのに非常に効率的であることが立証されている。例えば、Amado
ら(Science 285: 674-676(1999年7月))を参照されたい。最適遺伝子トラン
スファー系は、非増殖性細胞のゲノムに組み込まれることが可能な、HIV、また
は他のレンチウイルスに基づくベクターを含むであろうことが提唱されてきてい
る。レトロウイルスは、標的細胞ゲノムに組み込まれるため、反復形質導入は不
要である。したがって、in vivo遺伝子輸送が可能なアデノウイルスベクターと
対照的に、注入ウイルス抗原に対する体液性反応に関連する問題を避けることが
可能である。例えばNaldiniら(Science, 272: 263-267(1996), p. 263)を参
照されたい。
加え、制御遺伝子(tatおよびrev)およびアクセサリー遺伝子(vpr、vif、vpu
、およびnef)を含む、複雑なゲノムを有する。HIVは、ヒト細胞に効率的に感染
し、そしてその遺伝子を発現するよう進化してきており、そしてその組込み前複
合体が、標的細胞の核の無傷な膜を横切ることが可能であるため、マクロファー
ジなどの非分裂性細胞を感染させることが可能である。この複合体は、ウイルス
DNAに加え、酵素インテグラーゼ、vpr遺伝子の産物、およびマトリックスと称さ
れるgag遺伝子にコードされるタンパク質を含む。マトリックスタンパク質は、
組込み前複合体が、核内に通過し、宿主DNAにアクセスするのを可能にする。レ
ンチウイルスは、真に静止した細胞(G0状態の細胞)に効率的に形質導入できな
い。しかし、ネズミレトロウイルスベクターと異なり、HIVに基づくベクターは
、分裂性細胞を感染させることが可能なのに加え、造血幹細胞などの非分裂性細
胞において、そしてニューロン、網膜光受容器、筋肉、および肝細胞などの最終
分化細胞において、療法遺伝子の有効でそして持続的な形質導入および発現を達
成することが可能である。例えばAmadoら(1999年7月)およびKlimatchevaら(F
rontiers in Bioscience 4: d481-496(1999年6月))、およびそれらに引用さ
れる参考文献を参照されたい。
起源のため、安全性の懸念がある。したがって、この分野では、複製適格(comp
etent)レンチウイルス(RCL)の発生を防ぐため、内蔵の安全性特徴を持つベク
ターおよび産生系の開発に注意が向けられてきている。例えば、ほとんどの実験
室適用において、レンチウイルスベクターは、一般的に、一過性の系で生成され
、この系では、細胞株を3つの別個の構築物:パッケージング構築物、トランス
ファー構築物、およびエンベロープコード構築物でトランスフェクションする。
パッケージング構築物は、ベクターパッケージングに必要な要素(envを除く)
およびベクター粒子を生成するのに必要な酵素を含む。トランスファー構築物は
、ベクターが標的細胞を感染させるのに必要な、そして療法(またはレポーター
)遺伝子のトランスファーに必要な、遺伝子シス作用配列を含む。レンチウイル
スenv遺伝子は、一般的に、パッケージング構築物から削除され、そしてその代
わり、第三のベクター、「envコードベクター」に、異なるウイルスのエンベロ
ープ遺伝子が供給されるが、ベクターがCD4+ T細胞を感染させることが意図され
るのが望ましい場合、レンチウイルスenv遺伝子を用いることも可能である。一
般的に用いられるエンベロープ遺伝子は、非常に多様な細胞を感染させることが
可能であり、そしてさらに、粒子に安定性を与え、そしてベクターが濃縮されて
高力価になることを可能にする、水疱性口内炎ウイルスのG糖タンパク質(VSV-G
)をコードするものである(例えばNaldiniら(Science 272: 263-267(1996)
)およびAkkinaら(J. Virol. 70: 2581(1996))を参照されたい)。3つの別
個の構築物を使用することおよびそれらの間の重複配列が存在しないことは、レ
ンチウイルス(トランスファー)ベクター産生中の組換えの可能性を最小限にす
る。さらに、レンチウイルス(トランスファー)ベクター自体によって、ウイル
スタンパク質はまったく発現されないため、これらのベクターは、動物モデルに
おいて、ベクターを発現している細胞に対する有効な免疫反応(アデノウイルス
に基づくベクターに独特の問題)をまったく誘発しない。例えばAmadoら(Scien
ce 285: 674-676(1999年7月))および該文献に引用される参考文献を参照され
たい。Naldiniら(Science 272: 263-267(1996))もまた参照されたい。
安全性を改善する努力の中で、続くHIVベクターが産生され、このベクターでは
、パッケージングプラスミドはすべてのアクセサリー遺伝子を欠いていた。この
方法は、効率的なベクター産生を干渉せず、そして潜在的なRCLが、ヒトにおけ
るHIVの効率的な複製に必要なアクセサリー遺伝子を欠いているため、系の安全
性を有意に増加させる。これらのベクターは、in vivoで、増殖抑止細胞株およ
びニューロンに形質導入することが可能であるが、マクロファージには効率的に
形質導入しないことが報告されている。アクセサリー遺伝子vprは、これらのHIV
ベクターを用いて、これらの細胞をHIVに感染させるのに必要であると考えられ
ている。Zuffereyら(Nature Biotechnol. 15: 871-875(1997))を参照された
い。対照的に、本明細書において後で論じられるように、HIVに基づく本発明の
レンチウイルスベクターは、ヒトマクロファージおよび試験した他の細胞を感染
させるのを可能にするために、いずれかのHIVアクセサリー遺伝子も必要としな
い。
いる。例えばKafriら(Nature Genet. 17: 314(1997))を参照されたい。これ
らの結果は、効率的なレンチウイルス仲介遺伝子トランスファーのためのアクセ
サリー遺伝子の必要性が、標的として選択された細胞の種類に応じることを示し
、レンチウイルスベクターの将来の適用は、必要に応じ、異なるアクセサリー遺
伝子を含むベクター構築物を伴う可能性があることを示唆する。
した、HIVベクター系を記載する。この多重弱毒ベクターは、培養中の増殖抑止
細胞および単球由来マクロファージに形質導入する能力を維持し、そして成人ニ
ューロン中に、in vivoで遺伝子を効率的に輸送することが可能であった。Zuffe
reyら(1997)およびNaldiniら(1996)に記載されるパッケージングプラスミド
は、GagおよびPolに加え、RevおよびTatをコードする。
れたレンチウイルスもまた、記載されてきている。例えば、Kimら(J. Virol. 7
2: 811-816(1998))およびMiyoshiら(J. Virol. 72: 8150-8157(1998))を
参照されたい。これらのベクターにおいて、tat遺伝子は、パッケージングプラ
スミドから除去されている。Kimらは、連続5' LTRプロモーターが、強い構成的
プロモーターに置き換えられている限り、tatは必要でないと述べている。これ
はまた、HIV療法のため、他の利点も有する。構成的HCMVプロモーターでHIV-1 L
TRを置き換えると、ベクター産生に影響を与えないであろうため、療法剤として
のTatトランスドミナント変異体またはTat活性化反応要素デコイなどの抗Tat分
子の使用が可能になる(p. 814、第2欄を参照されたい)。tat遺伝子の除去は、
ありうるRCLに貢献する可能性がある必須病原性因子を除去する。Kimら(1998)
は、tat、vif、vpr、vpuおよびnefを含まないベクター系を記載する。好ましい
ベクター系には、rev遺伝子が含まれ、著者らは、「RREと共に、この系において
、効率的なRNA取り扱いのため必要である」と述べている(p. 811、第2欄)。し
かし、Kimらはまた、CTEを用いたRev非依存的構築物も構築した。Kimらは、rev
/RRE構成要素は、Mason-Pfizerサルウイルス(MPMV)構成的輸送要素(CTE)な
どの配列を用いることによって除去し、それにより、すべてのアクセサリータン
パク質を除去することが可能であるが、これは力価の有意な減少につながると述
べている。
Rev非依存的方式いずれかで、高レベルのHIV-1構造タンパク質を構成的に発現す
る安定HIV-1パッケージング細胞株を生成することを記載する。これらの細胞株
を用いて、ハイグロマイシンB耐性遺伝子を発現しているHIV-1ベクターを用いる
ことによって、遺伝子トランスファーを評価し、そしてベクター力価に対する、
Rev、Tat、およびNefの影響を研究した。Rev非依存的細胞株は、MPMV CTEを含む
gag-polおよびenv発現ベクターを用いることによって、生成した。この論文は、
とりわけ、4つのプラスミド:HIV-1構造遺伝子発現のためにRev同時発現を必要
とする、CMV gagpol-RREおよびpCMVenv、並びに前記同時発現を必要としない、p
CMV gagpol-CTEおよびpCMVenv-CTEの構築を記載する。Rev含有およびRev非依存
的パッケージング細胞株を生成するため、CMT3細胞に、リン酸カルシウムトラン
スフェクション法を用いて、Gag、Gag-Pol、およびEnvを発現するベクターをト
ランスフェクションした。
造タンパク質を発現するパッケージング細胞株を生成することによって、著者ら
は、完全にRevなしで機能するHIVベクター系を得ることが可能であった。この系
から得られるベクターの力価は、Revを含む平行系から得られるものと、本質的
に同一であった。著者らは、この文脈において、CTEは、以前に、Rev依存的構築
物を用いた一過性発現アッセイで観察されたものと同様に、完全にRev-RRE機能
の代理となるようであると述べている。これは、数周期のHIV複製を測定した場
合の状況と対照的である。こうした場合、CTE含有ウイルス由来の力価は、常に
、RevおよびRREを利用したウイルスに比較し、少なくとも1対数単位、減少した
(Srinivasakumarら、p. 5847を参照されたい)。
する細胞内免疫のための輸送ビヒクルとして、このベクターを用いる可能性が開
かれることだと述べる。Rev M10またはRREデコイなどの、HIV複製に劇的な阻害
効果を持つRevアンタゴニストをコードする遺伝子を、HIVベクターに導入し、そ
して通常、HIVに感染可能である細胞に入れることが可能である。「抗Rev」遺伝
子の発現は、HIV感染を低下させると期待されるであろう。残ったいずれかのHIV
複製も、ベクターLTRの活性化(tatによる)を導き、そして感染性ウイルスに由
来するタンパク質によってパッケージングされるであろう、ベクター由来RNAを
生成するはずである。このシナリオでは、野生型ウイルスは、以前に免疫されて
いない細胞に、ベクター粒子を伝播させることが可能なヘルパーとして作用する
であろう。さらなるベクター伝播のため、この種のスキームは、伝統的なレトロ
ウイルスベクターに基づくものより、in vivoでHIV感染を調節するのにより有効
であるであろう。著者らは、モデル系において、このアプローチを現在試験して
いると述べている(Srinivasakumarら、p. 5847を参照されたい)。
である。例えば、Yuら(Proc Natl Acad Sci USA 83: 3194-8(1986))およびM
iyoshiら(J. Virol. 72: 8150(1998))を参照されたい。Yuらの論文において
、レトロウイルス由来ベクター、SINベクターは、哺乳動物細胞に全遺伝子を形
質導入するため、設計された。YuらのSINベクターは、3'長末端反復配列(LTR)
中の299塩基対の欠失を含み、この欠失は、エンハンサーおよびプロモーター機
能をコードする配列を含む。こうしたベクター由来のウイルスを用いてNIH 3T3
細胞を感染させる際、欠失は、5’LTRに移動し、感染細胞において、プロウイル
スの転写不活性化を生じる。SINベクターを介した、細胞へのハイブリッド遺伝
子(ヒトメタロチオネイン促進c-fos)の導入は、再編成と関連せず、そしてあ
る場合ではカドミウムによって誘導される、真のmRNA転写物の形成を導く。Miyo
shiらに記載されるベクターもまた、欠失3'(下流)LTRを含む。上流LTR内の配
列は、その下でウイルスゲノムが発現するプロモーターとして働く。下流LTRに
導入された欠失は、逆転写中、上流LTRに移動する。この欠失はLTRプロモーター
を不活性化し、そしてベクターRNAの産生を除去する。トランスファーされる遺
伝子(または遺伝子類)(例えばレポーターまたは療法遺伝子)は、レンチウイ
ルスベクターに挿入される外因性ウイルスプロモーターまたは細胞プロモーター
から発現される。SINベクターの重要な安全性の特徴は、LTRのプロモーター活性
の不活性化が、宿主ゲノムへの(トランスファーベクターの)挿入変異誘発の可
能性を減少させることである。さらに、(トランスファー)ベクターRNAの発現
が排除されるため、標的細胞におけるRCL産生の可能性は、さらに最小になる。S
INベクターは、哺乳動物細胞における遺伝子の制御された発現を研究するため設
計された遺伝子トランスファー実験で、特に有用であるはずである。組み込まれ
たプロウイルスの両LTRにエンハンサーおよびプロモーター配列が欠けているこ
ともまた、細胞オンコジーンを活性化する可能性を最小にするはずであり、そし
てヒト遺伝子治療で用いられるべき、より安全な代替法を提供する可能性がある
。安全性および特異性を増進する他の修飾には、一時的にあるいは組織または細
胞特異性を持って、遺伝子発現を制御する、特定の内部プロモーターの使用を含
む。
シ免疫不全ウイルス、またはウマ感染性貧血ウイルスなどの非ヒトレンチウイル
スを使用することであろう。これらのうち、ネコ免疫不全ウイルス由来のベクタ
ーは、非分裂ヒト細胞に効率的に形質導入するように、操作されてきている。例
えばPoeschlaら(Nature Med. 4: 354-357(1998))およびWO 99/15641を参照
されたい。さらに、Whiteら(J. Virol. 73: 2832-2840(1999年4月))は、パ
ッケージング構築物およびトランスファー構築物間の組換えの見込みを減少させ
ることによって安全性を改善する試みの中で、ヒトおよびサル免疫不全ウイルス
要素を用いたレンチウイルスベクターを記載する。
タンパク質の発現が、細胞に毒性であるため、困難であることが立証されている
。最近、パッケージング遺伝子およびVSV-Gの発現、およびしたがってベクター
の産生を、随意に行わせることが可能であるように、プロデューサー株が設計さ
れてきている。Kafriら(J. Virol. 73-576-584(1999))。この細胞株は、毒
性遺伝子の発現を停止した際、スケールアップしたベクター産生のため、拡大す
ることが可能である。この細胞株は、RCLを生成することなく、高力価ベクター
を産生する。HIVベクターで形質導入された造血幹細胞を、Donahueら(Blood 92
(suppl. 1), 要旨4648.5(1988))に記載されるように、アカゲザル(rhesus
macaque)に移植し、少なくとも14ヶ月追跡調査した。その時点で、方法は安全
であることが立証され;研究中のすべての動物は、循環HIVまたはベクターの証
拠もなく、健康なままであった。Amadoら(Science 285: 674-676(1999年7月)
)を参照されたい。
代謝、感染性、または悪性疾患を正すために設計されてきている。この細胞は、
自己再生し、そして血液および免疫系の成熟細胞すべてに分化する能力を有する
。これらの系に影響を与える多くの疾患は、幹細胞に療法遺伝子を安定導入する
ことによって、治療することが可能である可能性がある。最近、レンチウイルス
ベクターは、非常に原始的なヒト幹細胞への効率的な遺伝子トランスファーを仲
介することによって、多くの造血細胞系譜を持つSCIDマウス骨髄の安定な長期再
構築に貢献する、ex vivo幹細胞刺激(ネズミレトロウイルスベクターを用いる
際に必要である)の必要性をバイパスすることが示された。例えばMiyoshiら(S
cience 283: 682(1992))を参照されたい。同様に、レンチウイルス形質導入
幹細胞を用いた自家移植のアカゲザルモデルにおいて、多細胞系譜遺伝子発現が
見られ、通常、ネズミレトロウイルスでの形質導入に不十分である最小幹細胞刺
激の条件下で、初期血液細胞前駆細胞が形質導入されることが示唆された。Dona
hueら(Blood 92(suppl. 1), 要旨4648.5(1999))およびAmadoら(Science
285: 674-676(1999年7月))を参照されたい。
は、ウイルスがベクターのパッケージングに必要な要素をすべて供給するため、
感染患者において、HIVに動態化される可能性があることである。これらの動態
化ベクターがHIVエンベロープを含む場合、これらは、その遺伝子(例えばHIVに
対する耐性を与えるように、あつらえて設計した遺伝子)を、効率的にCD4+ T細
胞にトランスファーし、該T細胞をその後のHIV感染から保護することが可能であ
る。レンチウイルスベクターはまた、HIVに感染したCD4+ T細胞においてのみ、
その遺伝子を効率的に発現するように、設計することも可能である(いわゆるta
t誘導性ベクター)。これらのベクターにおいて、tatおよびrevを含むすべてのH
IV遺伝子は除去され;組込み、発現、およびパッケージングに必要なシス作用配
列が保持され、そして発現は、(Tatによる活性化を必要とする)HIV LTRの活性
に依存する。この系において、ベクター発現は、HIV感染に際して効率的に誘導
されることが示されてきている。さらに、HIVに対する耐性を与える遺伝子の非
存在下で、許容細胞株におけるこのベクターの安定組込みは、HIV複製の阻害を
生じた。HIV阻害の機構は、完全には解明されていないが、予備的な結果は、こ
のベクターが、逆転写のレベルで、HIVと競合することを示唆する。Anら(J. Vi
rol., 印刷中)、およびAmadoら(Science 285: 674-676(1999))を参照され
たい。
ある、いくつかの他の潜在的な医学的適用が、探求され始めている。例えば、レ
ンチウイルスベクターが、ラットおよびマウス網膜へのベクターの直接注入によ
って、安定でそして長期の遺伝子トランスファーを仲介することが可能であると
いう知見が、網膜色素変性症の治療のための遺伝子治療の概念を支持してきてい
る。網膜のこの変性疾患は、盲目への緩慢な進行を生じる、光受容器細胞死によ
って特徴付けられる。桿体光受容器のcGMPホスホジエステラーゼβサブユニット
(PDEβ)遺伝子における変異は、ヒトにおいて、そしてこの疾患のrdマウスモ
デルにおいて、網膜色素変性症の常染色体劣性型を導く。先の研究は、アデノウ
イルスおよびアデノ関連ウイルス仲介PDEP網膜下遺伝子トランスファーが光受容
器細胞死の遅延を生じることを示している。最近の研究は、rdマウスモデルを用
いて、ネズミPDEβ遺伝子を含むレンチウイルスベクターを注入した目の50%ま
でで、光受容器を救出することが可能であることを立証した。アデノウイルスベ
クターで以前得られた短期発現と対照的に、この研究におけるPDEβ発現は、少
なくとも24週間持続した。この知見は、現在、有効な治療を欠く疾患における遺
伝子治療の潜在的な成功に注意を向けさせる。Takahashiら(J. Virol., 73: 78
12-7816(1999年9月))およびAmadoら(Science, 285: 674-676(1999))を参
照されたい。
存在に依存する。この依存は、少なくとも部分的に、スプライシングされないmR
NAおよび部分的にスプライシングされたmRNA内に位置する、負に作用する配列(
阻害または不安定性要素(INS))の存在のためである。これらのmRNAにおけるR
evとRev応答配列(RRE)の陽性相互作用は、阻害配列の負の影響を打ち消す。
安定性領域が変異されている、gagおよび/またはpol遺伝子で、該文献に記載さ
れるgagおよび/またはpol遺伝子を置き換えることが可能であることを解説も示
唆もしない。さらに、本明細書に記載される特定のHIV-1 gag/polまたはSIV ga
g変異遺伝子の開示はない。
提出、(発明者、G. PavlakisおよびB. Felber)表題「mRNAから阻害/不安定性
領域を除去する方法」に最初に記載され、そして後に、1993年3月29日、PCT出願
PCT/US93/02908として提出された同時係属(「CIP」)出願、並びに米国特許
第5,972,596号および第5,965,726号に記載されたように、遺伝子から阻害/不安
定性領域を除去する方法を用いて、作成した。CIP適用の開示は、1993年10月14
日、国際公報第WO 93/20212号として公表された(これらの特許および特許出願
の開示は、その全体が、特に本明細書に援用される)。この方法はまた、Schwar
tzら(J. Virol. 66: 7176-7182(1992))にも記載される。
よびpol遺伝子内のさらなるINSを同定しそして性質決定して、そして同様の方式
で変異させることによって、特許出願およびSchwartzらに記載される研究を拡大
する。Schneiderらは、完全に変異されたHIV-1 gag遺伝子を含むが、部分的にし
か変異されていないHIV-1 pol遺伝子を含む、核酸構築物を開示する。
含む発現ベクターが、他のいずれかのHIVタンパク質の非存在下で、哺乳動物細
胞において、未成熟ウイルス粒子の産生を可能にすることを立証する。プロテア
ーゼ領域におけるさらなる変異の導入は、Gag/プロテアーゼの効率的な産生を
可能にし、これは、Pr55gag前駆体のプロセシングおよびレンチウイルス様円錐
形コア構造を持つ成熟Gag粒子の産生を生じた。
依存救出を支持することが不能な多くの細胞株において、Gagタンパク質の効率
的な発現を可能にすることを開示する。Schneiderらはまた、gag/pol領域が、e
nv領域よりも保存されているため、gag/pol発現ベクターが、HIV-1に対するワ
クチン接種アプローチに重要である可能性があり、そしてHIVに対する有効な免
疫反応および感染に対する保護に重要である可能性があることも開示する。彼ら
はまた、HIVおよび他のレンチウイルスが静止細胞を感染させることが可能であ
るため、多くの細胞における効率的なHIV遺伝子発現はまた、非分裂性細胞また
はゆっくり分裂する細胞においてレンチウイルスベクターを用いる、可能な遺伝
子トランスファー実験のためにも興味深いとも述べている。
91)は、Rev非依存的Gag発現ベクターが、ヒトおよびマウス細胞において、いず
れかの他のHIVタンパク質の非存在下で、ウイルス粒子を生じることが可能であ
り、そしてpol領域中のさらなる変異が、プロテアーゼの発現およびp55 gag前駆
体のプロセシングを可能にしたと述べる。マウス筋肉中のTATおよびRev非依存的
Gag発現ベクターの直接DNA注入は、ELISAおよび抗gag抗体反応によって検出され
るGag発現を生じた。いくつかのRevおよびTat非依存的Gag発現カセットを、レト
ロウイルスベクターに挿入し、そしてHIV-1のドミナントネガティブ阻害剤であ
るGagまたはGag断片を発現する細胞株を構築した。
をコードする変異遺伝子いずれかをコードする変異プラスミドDNAを用いた、マ
ウスおよび非ヒト霊長類のDNAワクチン接種の結果を記載する。gagおよびenvワ
クチンレシピエントは共に、抗原特異的細胞傷害性およびヘルパーTリンパ球(C
TL、Th)反応を示した。結果は、DNAワクチンが、マウスおよび非ヒト霊長類両
方で、リンパ腺中に汎発する、長期生存T細胞反応を引き出したことを立証した
と述べられている。
NO: 1)を含む核酸、並びにこれらの核酸を含むベクターおよびベクター系に関
する。
にこれらの核酸を含むベクターおよびベクター系にも関する。 本発明はまた、図17に示される変異SIV env遺伝子を含む核酸、並びにこれら
の核酸を含むベクターおよびベクター系にも関する。
感染性ウイルス粒子にも関する。 本発明はまた、これらの核酸および/またはその発現産物を含む組成物にも関
する。
にも関する。 本発明はまた、これらの核酸、ベクター系、宿主細胞、発現産物および/また
は組成物を使用して、mRNA、タンパク質、および/または感染性ウイルス粒子を
産生すること、および/または抗体および/または細胞傷害性またはヘルパーT
リンパ球を誘導することにも関する。
疫療法および免疫予防法で使用するための、または遺伝子治療において使用する
ための、これらの核酸構築物、ベクター、ベクター系および/または宿主細胞の
使用にも関する。本発明の核酸構築物は、レンチウイルスベクターまたは他の発
現ベクターを含んでもまたはそれらのベクターに取り込まれていてもよいし、あ
るいは組織細胞に直接注入し、コードされるタンパク質またはタンパク質断片の
効率的な発現を生じてもよい。これらの構築物はまた、例えばin situでの標的
遺伝子との相同組換えによって、in vivoまたはin vitro遺伝子置換に用いても
よい。
みのものであり、そして請求されるような本発明の限定ではないことを理解すべ
きである。本明細書に取り込まれ、そして本明細書の一部を構成する、付随する
図は、本発明の態様を例示し、そして説明と共に、本発明の原理を説明するのに
役立つ。
コードするベクターを含む。本明細書に記載される、こうしたベクターの例は、
Rev非依存的方式で、HIV-1の完全GagおよびPolをコードし、そしてまたカナマイ
シン耐性を与える遺伝子も含む、プラスミドpCMVgagpolBNkanである。このプラ
スミドはTatおよびRev非依存的であり、そして、遺伝子にコードされるタンパク
質のアミノ酸配列を改変することなく、gag/pol mRNAに存在する阻害/不安定
性配列を除去することによって、生成した。
l領域のDNA構築物である。該構築物は、遺伝子治療に、またはワクチンとして使
用するための、新種のレンチウイルスベクターの構成要素として有用であると期
待される。
および構造タンパク質の非存在下で、ヒトおよび他の哺乳動物細胞において、高
発現されることが可能である。gag/pol配列を、VSV Gタンパク質またはHIVエン
ベロープタンパク質などのエンベロープタンパク質をコードする配列と(例えば
同一ベクター中でまたは別の発現ベクター中で)組み合わせると、ヒト細胞への
トランスフェクション後、感染性ウイルスが産生される。非HIVエンベロープタ
ンパク質をコードする遺伝子を、例えばHIV gag/pol遺伝子の存在下で用いる場
合、産生されるウイルス粒子は、HIVタンパク質GagおよびPolのみを含むであろ
う。
、本発明のgag、polまたはgag/pol配列に基づくレンチウイルスベクターまたは
ベクター系を、in vivo(例えば高力価ベクターの非経口接種)またはex vivo(
例えば患者細胞のin vitro形質導入後、形質導入された細胞の患者への再注入)
で、遺伝子治療に用いることが可能である。これらの方法は、すでに、認可され
た、異なる遺伝子治療プロトコルに用いられている。
献として援用される、1992年3月27日出願された米国特許出願第07/858,747号に
、そしてまた、関連する米国特許第5,972,596号および第5,965,726号に記載され
るように、遺伝子から阻害/不安定性領域を除去する方法を用いて作成した。こ
の方法は、INSの正確な位置の同定またはその機能メカニズムの知識を必要とし
ない。一般的に、変異は、mRNAにコードされるアミノ酸配列が変化しないような
ものであるが、変異遺伝子にコードされるタンパク質が、非変異遺伝子にコード
されるタンパク質に実質的に類似である、保存的および非保存的アミノ酸置換も
また、想定される。変異遺伝子は、合成(例えば化学合成によって合成されたも
の)であっても、半合成(例えばゲノムDNA、cDNA、またはPCR増幅DNAと合成DNA
との組み合わせ)であっても、または組換え的に産生されてもよい。遺伝子はま
た、所望により、イントロンを含まなくてもよい。本発明の核酸はまた、望まし
い機能(例えばGagまたはPolの抗原性、粒子形成(Gag)または酵素活性(Pol)
)を保持するこれらの遺伝子のRev非依存的断片も含んでもよいし、またはコー
ドされるタンパク質が、特定の状況で望ましくない機能を喪失するように変異さ
れている、Rev非依存的変異体もまた含んでもよい。後者の場合、例えば、遺伝
子を修飾して、逆転写酵素またはインテグラーゼタンパク質の活性部位に(アミ
ノ酸レベルで)変異をコードして、逆転写または組込みを防いでもよい。gag遺
伝子のRev非依存的断片は、本明細書に参考文献として援用される、1992年3月27
日に出願された米国特許出願第07/858,747号に、そしてまた、関連する米国特
許第5,972,596号および第5,965,726号に記載される。
タンパク質を産生することが可能であるのに加え、本発明のHIV gag/polクロー
ンおよびSIV gagクローンはまた、CTEまたはCTE様要素(本明細書において、集
合的に、RNA輸送要素(RTE)と称される)などのいずれかの付加的シス作用輸送
要素の非存在下で、HIV GagおよびPolタンパク質を産生することも可能である。
実験は、SIV gagに対する本発明の変異ベクターが、CTEを付加するものより、は
るかに優れていることを示す(Qiuら(J Virol. 73: 9145-52(1999))を参照
されたい)。
で、これらのベクターにコードされるタンパク質の発現を監視することが可能で
ある。RNAレベルは、当該技術分野に知られる方法、例えばノーザンブロット、S
1マッピングまたはPCR法によって、定量化する。タンパク質レベルもまた、当該
技術分野に知られる方法、例えばウェスタンブロットまたはELISAまたは蛍光検
出法によって、定量化することが可能である。迅速非放射性ELISAプロトコルを
用いて、gagタンパク質を検出することが可能である(DUPONTまたはCOULTER gag
抗原捕捉アッセイ)。
のgag/pol遺伝子に基づく少なくとも3種類のレンチウイルスベクター、すなわ
ち a)複製周期を持たない(すなわちゼロ複製系) b)1周期の複製を有する c)完全複製系を有する レンチウイルスベクターが想定される。
子、あるいはこれらの遺伝子の断片を、適切な転写単位、例えばCMVプロモータ
ーおよびBGHポリ(A)部位を用いて発現した。これは、ワクチン目的のためのga
g/pol単位(あるいはgagまたはpolまたはそれらの断片(類))の発現を可能に
するであろう。この発現は、適切な変異(類)、例えばミスセンス変異が導入さ
れていれば、いずれかの機能的なレトロウイルス酵素の産生を伴わずに達成する
ことが可能である。ゼロ複製系では、ウイルスストックが目的の細胞または動物
に投与されるであろう。例えば、パッケージングベクターPCMVgagpolBNKan、ト
ランスファー構築物pmBCwCNluciまたはpmBCmCNluci、およびエンベロープ含有ベ
クターpHCMV-Gを用いた典型的な系でウイルスストックを生成し、そして用いる
と、ゼロ複製系が得られる。こうした系によって産生されるウイルス粒子は、細
胞を感染させることが可能であり、そして逆転写されたトランスファー構築物DN
Aが核に入るが、ウイルス構造タンパク質のコード領域が存在しないため、ウイ
ルス発現および複製はまったくないであろう(0周期)。細胞をin vivoで同じ3
つのDNAでトランスフェクションすると、これらは核に入り、ウイルスタンパク
質を発現し、感染性ウイルス粒子を産生し、そして外に出て、そして別の単数ま
たは複数の細胞を感染させるであろう(1周期)。3つのプラスミドのin vivo輸
送は、より低い発現を生じる可能性があるため、少なくとも2つの異なる態様が
想定される。第一の態様では、2つのプラスミド、例えば図5に示されるMV1およ
びpHCMV-Gなどのエンベロープ発現プラスミドを用いることが可能である。HIV、
SIV、または他のレトロウイルス由来の機能するエンベロープをコードする他の
プラスミドもまた、用いることが可能である。2つのプラスミドによるトランス
フェクションは、新規細胞を感染させ、そしてその細胞に組み込まれることが可
能な、感染性ウイルスを生じる(1周期)。感染細胞は、gagpolを生じるが、ウ
イルス増殖は、envがないため、不可能である。
において、遺伝子の組み合わせ、例えばgag/pol遺伝子、envコード遺伝子、お
よび好ましくはレポータータンパク質をコードする遺伝子、あるいは目的の他の
ポリヌクレオチドまたはタンパク質を、in vivoで、目的の細胞に輸送する。典
型的な系に関して、上に論じられたように、in vivoで同じ3つのDNAを用いて細
胞をトランスフェクションした場合、これらは核に入り、ウイルスタンパク質を
発現し、感染性ウイルス粒子を作成し、放出され、そして別の単数または複数の
細胞を感染させるであろう(1周期)。
に異種プロモーター(例えばCMVプロモーター、または誘導性プロモーター、ま
たは組織特異的プロモーター)を用いた、トランスファーベクターを用いること
によって、同じ結果(すなわち複製1周期のみ)を得ることが可能である。3' LT
R中の変異は、逆転写および組込みに際して、このLTRを不活性にする。これは、
組み込まれたプロウイルスの5' LTRおよび3' LTRがどちらも出発(トランスファ
ー)構築物の3' LTRに由来するためである。(これはレトロウイルスすべての公
知の特性であり、そして自己不活性化ベクター(SIN)を作成するのに用いられ
てきている)。入ってくるLTRプロモーターを不活性化したいと望むいくつかの
理由があるが、そのうちの1つは、組み込まれたプロウイルス中の目的の遺伝子
発現のため、異なる組織特異的または制御プロモーターを使用することである。
SINベクターでは、細胞へのトランスフェクションおよび感染性ウイルスの回収
後に、in vitroで作成されたウイルスストックを使用する場合、複製周期はない
であろうことに注目されたい。in vivoで、DNAを用いて細胞をトランスフェクシ
ョンする場合、1周期の複製があるであろう。機能するgag、pol、またはenvがDN
A混合物中に含まれない場合、感染はまったくないであろう(すなわち感染性ウ
イルスは作成されないであろう)。
olおよびenv配列を用いて、機能する系を構築することが可能であると期待され
る。望ましい場合、Revを置き換えて、そして感染性ウイルスを生じることが可
能である、CTE要素(例えばZolotukhinら(J. Virol. 68: 944-7952(1994))
を参照されたい)などの余分の転写後調節要素が含まれる。完全複製系は、1つ
の片に、LTR、パッケージングシグナル、gag/pol、スプライシング部位、env、
tat、1以上のCTEまたはCTE様要素(最適結果のために望ましい場合)、およびLT
Rを含むべきである。Tatは、少なくとも非許容細胞において、この構築物で必要
であると考えられる。こうした系を図5に示す(構築物MV2)。この系では、目的
の細胞または動物(好ましくはヒト)は、その後、増殖するウイルスストックに
感染するであろう。CTEまたはCTE様要素(構築物MV2中にRTE(RNA輸送要素)と
して示される)は、発現を改善することが示されているため、そして多くのレト
ロウイルスが、転写後調節要素の存在を必要とするため、CTEまたはCTE様要素が
望ましい。CTEおよびCTE様要素のいくつかの種類があり、そしてこれらの要素は
、Rev-RRE経路と異なる経路を介して働くようである。例えばTaberneroら(J. V
irol. 71: 95-101(1997))を参照されたい。また、CTEおよびHIV RRE/Revを
置き換えることが可能な、新種の転写後調節要素を記載する、PavlakisおよびNa
ppiのPCT/US99/11082、1999年5月22日提出、1999年12月2日にWO 99/61596と
して公表(そして本明細書に援用される)を参照されたい。Pavlakis-Nappi要素
は、CTEと同じ方式では働かず、そしていずれかの配列または構造相同性も持た
ない。
を含む: 1.構造タンパク質(HIV envを除く)およびベクター粒子を生成するのに必要
な酵素などの、ベクターパッケージングに必要な要素をコードする核酸配列を含
む、パッケージングベクターであって、少なくとも本発明の変異HIVまたはSIV g
ag/pol遺伝子を含む、前記ベクター; 2.標的細胞を感染させるベクターに必要な、そして目的の療法またはレポー
ターまたは他の遺伝子(類)のトランスファーに必要な、遺伝子シス作用配列を
含む、トランスファーベクターであって、キャプシド形成シグナルおよび目的の
遺伝子(類)または目的の遺伝子(類)を挿入するためのクローニング部位を含
む、前記ベクター;および 3.意図されるレシピエント細胞にウイルス粒子を標的化するのに必要な要素
をコードする配列、好ましくは水疱性口内炎のG糖タンパク質(VSV-G)または広
宿主性(amphotrophic)MuLVまたはレンチウイルスenvをコードする遺伝子を含
むベクター。
ロモーターまたは他の強い高効率プロモーターを用いると、いずれかの他のウイ
ルスタンパク質もまったく存在しなくても、gag、pol、またはgag/polの高発現
を達成することが可能である。HIV-1 LTRプロモーターの他のプロモーターとの
交換は、パッケージングベクターまたは他のベクターにおいて、恒常性発現が望
ましい場合、そしてまた、HIV-1プロモーターが弱い、マウス細胞などの他の哺
乳動物細胞における発現のため、有益である。本発明の配列を含むベクターは、
HIV-1 Gag/Pol、HIV-1 Gag、HIV-1 Pol、およびSIV Gagタンパク質のRev非依存
的産生に用いることが可能である。特定の態様において、異種プロモーターの存
在はまた、トランスファーベクターおよびエンベロープコードベクターを用いる
場合、こうしたベクターにおいても望ましいであろう。
治療目的のため、治療するかまたは予防することが望ましい状態に対して活性で
ある遺伝子産物をコードする、少なくとも1つの療法遺伝子があるであろう。あ
るいは、またはさらに、検出可能産物をコードすることによって、マーカーとし
て作用する遺伝子があってもよい。療法遺伝子は、例えば、アンチセンスRNA、
リボザイム、標的タンパク質のトランスドミナントネガティブ変異体、毒素、条
件的毒素、抗体またはヘルパーT細胞または細胞傷害性T細胞を誘導する抗原、一
本鎖抗体または腫瘍抑制タンパク質をコードしてもよい。例えばWO 98/17816を
参照されたい。
のリストは、例えば、WO 99/04026の10ページ20行目から、12ページ7行目に記
載される。Klimatchevaら(1999)の表2もまた、遺伝子治療向きの障害および標
的細胞のリストと共に、他者が用いたいくつかのレンチウイルスベクターを提供
する。このリストは、遺伝子/代謝不全、ウイルス感染および癌を含む。アデノ
シンデアミナーゼ欠損、家族性高コレステロール血症、嚢胞性線維症、VII型ム
コ多糖症、IおよびII型糖尿病、古典的フェニルケトン尿症およびゴシェ病など
の遺伝する遺伝的欠損は、関与する遺伝子が既知である、単一遺伝子欠損を構成
するため、レンチウイルスベクター仲介遺伝子治療によって克服することが可能
であると位置付けされる疾患である。ウイルス病もまた、レンチウイルス遺伝子
輸送の適切な標的を構成すると位置付けられる。特に、HIV感染の治療に、いく
つかの遺伝子治療アプローチが提唱されてきており、そしてこれらの戦略のいく
つかでは、ヒトにおいて、第I相研究が、最近、始まっている。該論文は、予備
研究が、HIV複製に対するアンチセンスRNA、リボザイムおよびトランス-ドミナ
ントタンパク質輸送のための欠損ネズミオンコウイルスを扱ってきていると述べ
る。
いて、挿入される遺伝子は、例えばピコルナウイルスRNA由来の内部リボソーム
進入部位(IRES)を有してもよい。IRESは、同一プロモーターから2つのタンパ
ク質を発現したいと望む状況で用いられるであろう。例えば、目的の1つのタン
パク質およびマーカー遺伝子、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP)、または例え
ばWO 99/04026のp. 58に記載されるようなマーカー遺伝子および薬剤耐性遺伝
子(例えばホタル(firefly)ルシフェラーゼ遺伝子およびネオマイシン・ホス
ホトランスフェラーゼ遺伝子)である。IRESを用いて、2つのタンパク質の発現
が調整される。別個のプロモーターの調節下に、さらなる単数または複数の遺伝
子もまた、存在してもよい。こうした遺伝子は、例えば選択可能マーカー、また
は上に列挙される療法剤の中のものであってもよい、さらなる療法剤をコードし
ていてもよい。この遺伝子の発現は、恒常性であってもよく;選択可能マーカー
の場合、これは、トランスフェクションに成功したパッケージング細胞、または
特に高力価のレトロウイルスベクター粒子を産生するパッケージング細胞を選択
するのに有用である可能性がある。あるいは、またはさらに、選択可能マーカー
は、レンチウイルスベクターでの感染に成功し、そしてそれ自体のゲノムに組み
込まれたプロウイルスを有する細胞を選択するのに有用である可能性がある。
をレンチウイルスベクターに感染させ、そして細胞を患者に再び導入することで
ある。患者に細胞を再び導入する前に、選択可能マーカーを用いて、感染または
形質導入細胞を濃縮するか、あるいは感染したかまたは形質導入された細胞のみ
を陽性選択する手段を提供することが可能である。この方法は、療法が成功する
見込みを増加させる可能性がある。選択可能マーカーは、例えば、薬剤耐性遺伝
子、代謝酵素遺伝子、または当該技術分野に知られる、いずれかの他の選択可能
マーカーであってもよい。典型的な選択遺伝子は、抗生物質および他の毒性物質
、例えばヒスチジノール、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン
、メトトレキセートなどに対する耐性を与えるタンパク質、および細胞表面マー
カーをコードする。
子発現に関する選択は、可能ではないか必要ではない可能性があることが明らか
であろう。実際、選択マーカーの発現は、in vitro研究には好都合であるが、異
質の(foreign)マーカータンパク質に対して向けられる細胞傷害性Tリンパ球(
CTL)が不適切に誘導されるため、in vivoでは有害である可能性がある。また、
in vivo適用では、いずれかの内部プロモーターも持たないベクターが好ましい
可能性がある。内部プロモーターの存在は、例えば、パッケージング細胞株から
得ることが可能な形質導入力価および組み込まれたベクターの安定性に影響を与
える可能性がある。したがって、1つまたは2つまたはそれ以上の療法遺伝子をコ
ードする、二シストロン性または多シストロン性であってもよい単一の転写単位
ベクターが、in vivoでの使用のため設計される好ましいベクターである可能性
がある。例えばWO 98/17816を参照されたい。
公知である。多くのレンチウイルスはすでに複製不全ゲノムおよびパッケージン
グ構成要素に分けられている。まだ分けられていないものに関しては、分ける技
術が利用可能である。プロデューサー細胞は、Gag、PolおよびEnvタンパク質な
どのベクターゲノムにコードされないウイルス構成要素をコードする。gag、pol
およびenv遺伝子は、一過性にプロデューサー細胞に導入してもよいし、または
細胞ゲノムに安定して組み込み、パッケージング細胞株を生じてもよい。その後
、トランスフェクションまたは形質導入によって、レンチウイルスベクターゲノ
ムをパッケージング細胞株に導入して、レンチウイルスベクター粒子を産生する
のに必要なDNA配列すべてを有する安定細胞株を生成する。別のアプローチは、
レンチウイルスベクター粒子を産生するのに必要な異なるDNA配列、例えばenvコ
ード構築物、gag-polコード構築物およびトランスファー構築物を、一過性三重
トランスフェクションによって、同時に細胞に導入することである。
的細胞には、嚢胞性線維症のための気道上皮細胞;網膜色素変性症のための網膜
光受容器細胞;造血障害、鎌形赤血球貧血、β-サラセミア、リソソーム貯蔵障
害、ムコ多糖症、および重症複合免疫不全症候群のための、赤血球、マクロファ
ージ、およびリンパ球の前駆体;ゴシェ病のための骨髄細胞およびマクロファー
ジ;家族性高コレステロール血症のための肝細胞;HIV感染のためのTリンパ球お
よびマクロファージ;パーキンソン病およびアルツハイマー病などの神経変性疾
患のための脳組織、ニューロン、およびグリア細胞;心臓血管疾患のための内皮
細胞および心筋細胞;並びに癌のための多様な組織(例えば肝臓または脳)中の
癌細胞が含まれる。他の疾患のための標的細胞が、当業者に明らかであろう。
入またはトランスフェクション宿主細胞および生理学的に許容しうるキャリアー
を含むワクチンおよび薬剤組成物もまた、本発明の一部である。
ウイルスによる、感染を介した宿主への遺伝子成分のトランスファーを指す。用
語「トランスフェクション」は、一般的に、細胞質膜を横断し、そして遺伝子成
分のある程度を細胞核に輸送する、特定のトランスフェクション剤(例えばリン
酸カルシウム、DEAEデキストラン、脂質配合物、金粒子、および他の微小粒子)
の使用を介した、細胞への単離遺伝子成分のトランスファーを指す。
またはSIV遺伝子に加え、レンチウイルスの要素を用いて、産生することが可能
である。
とも1つの本発明の核酸構築物、ベクター、ベクター系、ウイルス粒子/ウイル
スストック、または宿主細胞(すなわち剤)を含む。本発明の1つの態様におい
て、単位用量あたりの本発明の剤の有効量は、目的の遺伝子の検出可能な発現を
引き起こすのに十分な量である。本発明の別の態様において、単位用量あたりの
剤の有効量は、治療される異常の有害な影響(症状の重症度、期間、または度合
いを含む)に対して予防する、治療するまたは保護するのに十分な量である。単
位用量あたりの剤の有効量は、当該技術分野に公知であるように、とりわけ、接
種される哺乳動物の種、該哺乳動物の体重、および選択された接種措置に応じる
。予防または治療に最も適した療法剤の投薬量もまた、投薬型、選択される特定
の剤、および治療下の特定の患者の生理学的特性で異なるであろう。用量は、少
なくとも1回投与される。続く用量は、示されるように、投与されてもよい。
質発現レベルを測定してもよい。多くの場合、こうした個体から得られる血清ま
たは血漿中の発現レベルを評価すれば十分であろう。別の用量を投与するか、ま
たは個体に投与される組成物の量を変化させるかの決定は、少なくとも部分的に
、発現レベルに基づく可能性がある。
して適した、物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な希釈剤と関連して、
望ましい効果を産生する、計算された、あらかじめ決定された量の活性成分(例
えば核酸、ウイルスストックまたは宿主細胞)を含む。細胞または動物に投与さ
れるウイルスストックの力価は、適用および輸送の種類(例えばin vivoまたはe
x vivo)に応じるであろう。ウイルスストックは、遠心分離などの方法を用いて
濃縮してもよい。ex vivoで投与される力価は、好ましくは、0.001から1感染単
位/細胞の範囲である。ウイルスストックを生成する別の方法は、ウイルスを発
現する安定細胞株と標的細胞を同時培養することである。この方法を用いると、
細胞を長期に渡って感染させることが可能であり、そして細胞が多コピーのベク
ターに感染する見込みがあるため、伝統的なレトロウイルスベクターを用いた際
、より優れた結果が達成されている。
形質導入またはトランスフェクションされている細胞のin vivo投与では、用量
は、用量漸増によって決定され、上部用量は、許容し得ない副作用の開始によっ
て制限される。予備出発用量は、当該技術分野に知られる方法によって、動物モ
デルにおいて、レンチウイルスベクターを用いた実験から推定してもよいし、ま
たは既知のレトロウイルス(例えばアデノウイルス)用量との比較から推定して
もよい。一般的に、最初は少ない投薬量を用い、そして必要に応じ、その状況下
で最適効果に達するまで、少ない増分で増加させるであろう。典型的な投薬量は
、108からおよそ5x1015粒子までの範囲である。
衝生理食塩水およびそれらに匹敵するものなどの生理学的に許容しうるキャリア
ー中の溶液として調製される。
にビヒクルと共に投与する。生理学的に許容しうるキャリアーは、投与に際して
不都合な生理学的反応を引き起こさないもの、およびその中で核酸がその活性を
保持するように十分に可溶性であり、薬学的または治療的に有効な量の化合物を
輸送するものである。薬学的または療法的に有効な量および本発明の剤の投与法
は、個々の患者、治療される適応症、および一般の当業者に明らかな他の判断基
準に基づいて異なる可能性がある。治療的に有効な量の本発明の核酸は、有意な
副作用を引き起こすことなく、治療される異常の有害な影響の重症度、度合いま
たは期間を予防するかまたは減弱するのに十分なものである。特定の適用に有用
な投与経路(類)は、一般の当業者に明らかである。
部位への直接注入が含まれる。非経口投与経路には、限定されるわけではないが
、静脈内、筋内、腹腔内および皮下が含まれる。本発明の剤の投与経路は、典型
的には、非経口であり、そして好ましくは、骨髄内、CSF内、筋内、皮下、皮内
、眼内、頭蓋内、鼻内、およびそれらに匹敵するものである。例えば、処方およ
び投与経路の例として、WO 99/04026を参照されたい。
ないが、薬学的に許容しうる無菌等張溶液を含む。こうした溶液には、限定され
るわけではないが、鼻、静脈内、筋内、腹腔内、皮下、あるいは関節または他の
領域への直接注入のための生理食塩水およびリン酸緩衝生理食塩水が含まれる。
る投薬量は、哺乳動物の年齢、体重、身長、性別、全身の医学的状態、以前の病
歴およびそれらに匹敵するものなどの要因に応じて異なるであろう。
ってもよい。予防的に提供される場合、組成物は、いずれかの症状にも先立って
提供される。組成物の予防的投与は、治療される異常のいずれかの続く有害な影
響(症状の重症度、期間、または度合いを含む)も予防するかまたは改善するよ
うに働く。療法的に提供される際、組成物は、治療される異常の症状開始時に(
またはそれからまもなく)提供される。
よび他の必要な試薬、並びに適切な装置および付属物は、容易に入手可能であり
、そして容易に使用できるように、キットの形で提供してもよい。
などの受容体が結合するであろう、膜(例えばニトロセルロース)、ビーズ、球
体、試験管、ロッドなどの固体支持体を含んでもよい。こうしたキットはまた、
標識化抗体などの第二の受容体も含んでもよい。こうしたキットは、サンドイッ
チアッセイに用いて、毒素を検出することが可能である。競合アッセイのための
キットもまた、想定される。
胞または生物において、発現させてもよい。該変異遺伝子は、プラスミド、コス
ミド、ファージ、ウイルスまたはミニ染色体などのベクターに導入し、そして当
該技術分野に公知の方法によって、宿主細胞または生物に挿入してもよい。一般
的に、該変異遺伝子またはこれらの変異遺伝子を含む構築物は、哺乳動物細胞(
例えばヒト(例えばHeLa)、サル(例えばCos)、ウサギ(例えばウサギ網状赤
血球)、ラット、ハムスター(例えばCHOおよびベビーハムスター腎臓細胞)ま
たはマウス細胞(例えばL細胞))、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞または細菌
細胞(例えば大腸菌(E. coli))を含む、真核または原核いずれの、いずれか
の細胞で利用することも可能である。これらの変異遺伝子をクローン化し、そし
て/または発現させるのに利用することが可能なベクターは、変異遺伝子を複製
し、そして/または発現させることが望ましい宿主細胞において、変異遺伝子を
複製し、そして/または発現させることが可能なベクターである。例えば、多様
な種類の宿主細胞に適したベクターの例に関しては、F. Ausubelら(Current Pr otocols in Molecular Biology , Green Publishing Associates and Wiley-Inte
rscience(1992))およびSambrookら(1989)を参照されたい。こうした遺伝子
の天然プロモーターは、遺伝子を挿入する宿主に適合する強いプロモーターで置
き換えてもよい。これらのプロモーターは誘導性であってもよい。これらの変異
遺伝子を含む宿主細胞を用いて、酵素調製、薬剤、診断試薬、ワクチンおよび療
法剤に有用なタンパク質を多量に発現させることが可能である。
伝子治療に用いることが可能である。例えば、本発明の変異遺伝子は、in situ
でmRNAを生じ、究極的に、発現されるタンパク質の量を増加させるであろう。こ
うした遺伝子には、ウイルス遺伝子および/または細胞遺伝子が含まれる。こう
した変異遺伝子は、例えば、ワクチンおよび/または遺伝子治療の開発に有用で
あると期待される。
用いることによって作成されるタンパク質は、例えば、AIDSおよびAIDS関連疾患
の診断試薬、ワクチンおよび療法の産生に用いることが可能である。HIV-1 gag
遺伝子の阻害/不安定性要素は、宿主における低ウイルス産生状態の確立に関与
する可能性がある。HIV-1および他のレンチウイルスは、免疫系によって一掃さ
れない、慢性活性感染を引き起こす。レンチウイルスゲノムからの阻害/不安定
性配列要素の完全な除去は、恒常的な発現を生じる可能性がある。これは、ウイ
ルスが不顕性の感染を確立し、そして免疫系監視を逃れるのを妨げることが可能
である。阻害配列要素を除去することによって、全gag/pol遺伝子の発現を増加
させるのに成功したことにより、いずれかの負の要素も持たないレンチウイルス
を産生することが可能であると示唆される。こうしたレンチウイルスは、弱毒ワ
クチンに向かう新規のアプローチを提供する可能性がある。
法および免疫予防法に用いることが可能である。こうしたベクターには、レトロ
ウイルスベクターが含まれ、そしてまた、例えばWolffら(Science 247: 1465-1
468(1990))、Wolffら(Human Molecular Genetics 1(6): 363-369(1992)
)およびUlmerら(Science 259: 1745-1749(1993))に記載される技術を用い
て、gagの十分な発現を生じる、筋細胞または他の受容細胞へのDNAの直接注入が
含まれる。さらに、gag構築物は、ヒトへの導入後、HIV発現のトランスドミナン
ト阻害に用いることが可能である。この適用のため、例えば、高レベルのp55gag またはp37gagを発現する適切なベクターまたはDNA分子は、例えばTronoら(Cell 59: 113-120(1989))に記載されるように、トランスドミナントgag変異体を
生成するよう修飾されるであろう。ベクターは、ヒトに導入され、gagトランス
ドミナント阻害および産生されるgagタンパク質による免疫刺激を組み合わせた
機構によって、HIV産生の阻害を生じるであろう。さらに、本発明のgag構築物は
、レンチウイルスgagタンパク質の発現に基づき、新規レトロウイルスベクター
の生成に用いることが可能である。レンチウイルスは、非分裂性細胞の標的化お
よび効率的な感染を可能にする可能性がある、ユニークな特性を有する。類似の
適用は、高レベルのenvを発現するベクターに関して期待される。
試験するのに好適なモデルであることを示す。感染性HIVの生成につながるであ
ろう再編成事象の可能性をさらに最小限にするため、同様に修飾したSIVを、HIV
の代わりに用いることが可能である。
その範囲を限定するとは解釈されるべきではない。先の開示および以下の実施例
の教示の特定の修飾および変化は当業者には明らかであろうし、これらは本発明
の精神および範囲により含まれると意図される。
このDNA配列はHIV-1の完全GagおよびPolをコードして、プロモーターに対して機
能可能に連結されているときにはRev-非依存的様式で発現されうる。Rev-非依存
的gag配列は米国特許番5,972,596および5,965,726に記載されており、Rev-非依
存的pol配列は米国特許番号5,972,596および5,965,726に記載される方法を使用
して阻害/不安定配列を除去することにより生成された。報告によれば、その他
はヒト細胞に対するコドンの使用を最適化することによりRev-非依存的gag配列
をつくった(例えば、WO 98/34640参照)。
ントを示す。図中の位置#1はプラスミドpCMVgagpolBNkanにおける位置2641であ
る。
高レベルの真正HIV-1構造タンパク質を発現させる。 実施例2 Rev-非依存的SIV Gag分子クローン 図3は、Rev-非依存的SIVgag分子クローン、SIVgagDX、のDNA配列を示す。図4
は、野生型(WT)および変異型(SIVgagDX)配列の比較を示す。野生型SIV配列
は、サル(マカーク)免疫不全ウイルス分離体239由来であり、クローンラムダs
iv239-1(GenBank寄託番号M33262)である。
る変異レンチウイルスenv遺伝子配列を含むベクターの例である、“env-コーデ
ィング”ベクターCMVkan/R-R-SIVenvCTEの説明図を示し、図17はそのDNA配列を
示す。“CMV”はサイトメガロウイルスプロモーターを意味する;“SRV-CTE”は
サルレトロウイルス1型の構成的輸送要素(CTE)を意味する;“全-STOP”は全3
つのリーディングフレームにおいて翻訳停止を与える配列を意味する;“BGHタ
ーミネーター”はウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを意味する。その他
の転写後調節要素は望ましいSRV-CTEに代わって使用でき、例えばPavlakis and
Nappiにより記載されたもので、1999年5月22日に出願され、1999年12月2日にWO
99/61596として公開されたPCT/US99/11082であり、(および本明細書中に援用さ
れる)。
ベクターは、ベクターがCD4+T細胞に感染することが望まれるなら使用してもよ
い。また先に上で言及したように、CTE要素(すなわち、ベクターCMVkan/R-R-SI
VenvCTEの場合におけるSRV-CTE)は、CTEおよびHIV RRE/Revを置換することがで
きる、Pavlakis-Nappi要素などの、もう一つの転写後調節要素で置換することが
できる。1999年5月22日に出願され、1999年12月2日にWO 99/61596として公開さ
れた(および本明細書中に参考文献として援用される)Pavlakis and Nappi、PC
T/US99/11082を参照。
備段階のいくつかの成分の概略図であり、使用されうるパッケージング構築物お
よび3つの異なるトランスファーベクターを含む。本明細書中で例示されるレン
チウイルス系では、パッケージング構築物はカナマイシン耐性遺伝子も含有する
。本明細書中で例示されるレンチウイルス系はベクターpHCMV-Gも含有し、それ
は図5に示す。
スプロモーターを意味し、“Gag”はビリオンコアの成分を生成するgag遺伝子を
意味し、“Pro”は“プロテアーゼ”を意味し、“RT”は“逆転写酵素”を意味
し、“Int”は“インテグラーゼ”を意味し、“BGHポリ(A)”はウシ成長ホル
モンポリアデニル化シグナルを意味する。プロテアーゼ、逆転写酵素、およびイ
ンテグラーゼ遺伝子は“pol”遺伝子を含む。トランスファー構築物1において、
“LTR”はHIVプロモーターを含有するHIVの“長い末端反復配列”を意味する;
“mSD”は構築物中に存在するためRNA転写物のスプライシングが起きない“変異
スプライスドナー部位”を意味する;“Ψ”はエンキャプシデーション(encaps
idation)シグナルを意味する;“wGA”はエンキャプシデーションに必要である
と信じられている配列を含有する野生型gag遺伝子の部分を意味する;“X”は部
分的gag遺伝子配列のATGコドンが変異を受けるためこの遺伝子の翻訳が起こらな
いことを示す;“CMV”はサイトメガロウイルスプロモーターを意味し、ルシフ
ェラーゼはレポーター遺伝子として使用される。ルシフェラーゼは目的のいずれ
かの遺伝子で置換することができる。もう一つのHIV LTRはトランスファー構築
物1の3'末端に存在する。トランスファー構築物1、2、あるいは3などの構築物に
おけるこのLTRとプロモーター-エンハンサー欠損HIV LTRとの置換は、組み込み
後のLTRの不活性化をもたらす。トランスファー構築物2はトランスファー構築物
1と似ており、差異はgag遺伝子の変異部分(“mGa”と意味する)がgag遺伝子の
野生型部分の代わりに使用されることである。トランスファー構築物3(pm2BCwC
Nluci)は5'スプライス部位に様々な変異を有しており、未処理のATGコドンを有
しているため変異gag遺伝子の部分的翻訳が起こる。トランスファー構築物3はま
た、5' LTRプロモーターの代わりに5' CMVプロモーターも有している。この構築
物はHIV Tatタンパク質の存在と独立して発現する。LTRプロモーターから発現す
るトランスファー構築物は部分的にTatタンパク質に依存している。293細胞にお
いて、有意な発現はTatの非存在下で達せられる。例えば、Valentin et al., Pr
oc. Natl Acad. Sci. U S A. 95:8886-91(1988)を参照せよ。
ドの番号付けはHXB2R配列のものであり(Genbank寄託番号K03455およびM38432)
、ここでは+1は転写の開始である。
gagの始まりからpol中のBsrGI部位までの断片および断片KE [KpnI(3700)- EcoRI
(4194)]は、先にSchneider et al., J Virol. 71: 4892-4903(1997)および米
国特許番号5,972,596および5,965,726に記載される変異をさせた。
。それらは断片BP [BsrGI(2207)-PflMI(3032)]、断片PK [PflMI(3032)-KpnI(370
0)]および断片EN [EcoRI(4194)-NdeI(4668)]である。変異生成は、Ho et al., G
ene 77: 51-59(1989)により記載される方法の修正版およびDNAシャッフリング
(Zhao and Amold, Nucl. Acid Res. 25(6), 1307-1308(1997))を使用して行
った。3つの断片の完全配列にわたって伸びる16のオリゴヌクレオチドを設計し
た。断片BPに対応する6つのオリゴ、断片PKに対応する6つのオリゴ、および断片
ENに対応する4つのオリゴ(オリゴヌクレオチドは長さ130から195塩基の範囲で
あった;隣接するオリゴは20ヌクレオチドまで重なった)。各々の断片は2つの
ステップで組み合わせた: 1)PCR;反応は最終量50μlにおいて各々10 pmolの精製巨大(big)オリゴ、
各々0.2 mMのdNTPおよび2.5 u pfu DNAポリメラーゼ酵素(Stratagene)を含む
標準pfu緩衝液中で行った。PCRプログラムは:96℃で3分間の後、94℃で1分間、
55℃で1分間、および72℃で1分とサイクル毎に+5秒を50サイクル、および最後に
72℃で7分間、であった。PCRの後、巨大オリゴヌクレオチドは組み立てた変異断
片から除去した。
rプライマーを用いて組み立てた産物を特異的に増幅させた。1マイクロリットル
の組み立てたPCR産物は、最終量50μlにおいて各々50 pmolのプライマー、1×pf
u緩衝液、各々0.2 mMのdNTPおよび2.5 u pfu DNAポリメラーゼ酵素を用いた25サ
イクルの反応においてテンプレートとして使用した。PCRプログラムは:96℃で3
分間で、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で45秒を10サイクルの後、さらに94℃で
30秒、55℃で30秒、72℃で45秒とサイクル毎に+20秒を14サイクル、および最後
に72℃で7分間、であった。このプログラムは、正確なサイズの単一のPCR産物を
与えた。増幅BP、PKおよびEN断片は、PCR-scriptTM Amp SK(+) Cloning Kit(St
ratagene)を使用してPCR-scriptTMベクター中で別々にクローン化した。クロー
ンを無作為に選択して配列決定した。Schneider et alにより以前に変異化され
た断片KEと共に正確なBP、PKおよびEN断片を、p55AM 1 -R5(先にSchneider et
al., J. Virol. 71: 4892-4903(1997)に記載された)のBsrGIおよびKpnI部位
の間に結合して、完全変異gagpol ORFを産生した。完全変異gag/polを含有する
新規プラスミドはpLTRgagpolBNと名付けた。BNはBsrGIおよびNdeIの間の断片の
修飾を表す。次に、変異gag/polをサイトメガロウイルス主要後期プロモーター
(major late promoter)(GenBank寄託番号X17403)およびカナマイシン耐性遺
伝子を含有するCMVkanベクター中でクローン化して、pCMVgagpoIBNkanとした。
プラスミドバックボーンは、Vical Inc.により提供され、Hartikkca et al., Hu
m Gene Ther. 7:1205-17(1996)に記載されるpVR1332由来である。
例えばin vivoで良好な発現を提供できることが理解される。 実施例6 トランスファーベクターpmBCwCNluciおよびpmBCmCMluciの構造 HIV-1配列BC、BssHII(257)からClaI(376)、は主要スプライスドナー部位
およびエンキャプシデーションシグナルを含有する。6つのオリゴ(33から46塩
基)を設計して、スプライスドナー部位およびgagのAUG開始コドンに変異を導入
した。pCMVgagpolBNの構築物に関するセクションに記載するように、BC断片を組
み立てて、増幅して配列決定をした。
REのBssHIIおよびNsiの間に配置して(Schneider et al., J. Virol. 71:4892-4
903(1997))、pmBCwCNを生成した。同時に、p55BM1-10SD+由来の変異gagのCla
I(376)およびNsiI部位の間の断片を使用して、pmBCmCNを生成した。(p55BM1-
10SD+は、Schneider et al.(1997)に記載されるp55BM1-10と似ているが、さら
にgagの上流の未処理のスプライスドナーおよびエンキャプシデーション部位を
含有する。)pmBCwCNおよびpmBCmCNにおけるgagおよびRREの3'部分を含有するNs
iIおよびXhoIの間の領域は、pHR'-CMVluci(D. Trono由来のベクター)由来のCM
Vプロモーターおよびルシフェラーゼ遺伝子を含有するClaI-XhoI断片と置換され
て、pmBCwCNluciおよびpmBCmCNluciを生成する(それらは各々トランスファー構
築物1および2として、図5において示され、図7および8において概略的に描かれ
る)。これらのプラスミドの配列は、各々図10および11に示す。これらのプラス
ミドの様々な版も、標準的な法により、エンキャプシデーション部位の領域、最
初のスプライスドナー部位、およびイニシエーターgag AUGにおける変更を有し
てつくられた。例えば、(図5でトランスファー構築物3として示される)トラン
スファー構築物pm2BcwCNluciは、5'スプライス部位領域において様々な変異を有
しており、未処理のATGを有する。トランスファー構築物1および2(mBCwCN frag
)、トランスファー構築物3(m2BCwCN frag)、HXB2およびNL43のBssHII-Cla I
領域における配列の比較は、図12に示す。
るいはpmBCmCNluci(トランスファーベクター)およびpHCMV-G(Yee et al., Pr
oc. Nad. Acad. Sci., USA, 91:9564-9568(1994)エンベロープVSV-G(水疱性
口内炎ウイルスの糖タンパク質)をコードするプラスミド)、の組み合わせを用
いた293ヒト腎臓細胞の一過性コトランスフェクションにより生成した。
レート上にまいた。プラスミドDNAは、以下の割合:3μgのパッケージング構築
物、6μgのトランスファー構築物および100 ng VSV-Gエンコーディング構築物、
pHCMV-G、においてCa-リン酸沈殿法によりトランスフェクションした。[LTRプロ
モーターは、293細胞においてTatの非存在下で効率の穏やかな減少を伴って発現
させることができることに注目すべきである。トランスファー構築物は、mRNA開
始部位がLTR R領域の開始点であるような方法で、LTRプロモーターをCMV(例え
ば、図5のトランスファー構築物3を参照)あるいはその他のプロモーターに置換
した後は、完全にTat独立性とすることができる。] ウイルス粒子の調製につい
ての本実験では、500 ngのTat発現プラスミドはトランスフェクションに含まれ
る。
した後、上清を回収した。上清は1,200 rpmで7分間回転させて、あらゆる浮遊細
胞を除去した。pCMVgagpolBNkanは、効率的に細胞から放出される高レベルのGag
タンパク質を産生し(図13)、また完全HIV-1の発現の際に見出されるものと同
様なレベルの逆転写酵素活性により判断されるような高レベルの機能的Polも産
生する(図14)。
株(293、Jurkat、U937)および非分裂性ヒト初代マクロファージを形質導入し
た。
3-4時間インキベートすることで行った。上清に存在するレトロウイルスの量は
、(ELISAにより測定した)p24含有量により正規化した。同量のp24 gagタンパ
ク質を細胞の感染のために使用した。このように、様々な調製物の産生における
違いを最小化した。
ナーの末梢血から単離した。細胞はRPMI+20%牛胎児血清(FCS)+10%ヒト血清
(HS)中で培養した。1週間後、非接着細胞をPBSで洗い流し、マクロファージを
ヒト血清の非存在下でさらに1-2週間培養し続けた。細胞は形質導入の前にPBSで
2-4回洗浄した。
質導入効率は培地由来の細胞抽出物中のルシフェラーゼ活性を測定することで決
定した。293、Jurkat、U973および初代マクロファージにおける形質導入実験の
結果は、図15A-Dに示す。これらの結果は、Rev-非依存的gag-HIV-1基本レトロウ
イルスベクターが(A)293細胞、(B)ヒトリンパ系細胞、(C)ヒト骨髄性細胞
(U937)、ならびに(D)初代ヒトマクロファージなどの非分裂性細胞における
高い形質導入効率を示すことを説明する。
すること、それらに新規の遺伝的情報を運ぶウイルスベクターを感染させること
、そしてそれらを身体に再移植すること、などの間接的な手段;あるいはリポソ
ーム内にDNAの製剤を封入すること;ウイルスエンベロープ受容体タンパク質を
含有するプロテオリポソーム内にDNAを取り込むこと;DNAをリン酸カルシウム共
沈殿すること;およびポリリジン-糖蛋白キャリア複合体にDNAをカップリングす
ること、などの直接的な手段により組織に導入された。さらに、リン酸カルシウ
ム沈殿物の形成を伴う、あるいは伴わない直接的な肝臓内への注入の後のクロー
ン化ウイルスDNA配列のin vivoでの感染力も記載された。安定性を亢進させる要
素を含有するmRNA配列はまた、陽イオン脂質小胞を用いて、Xenopus laevisの胚
において効率的に翻訳されることも示した。例えば、J.A. Wolff, et al., Scie nce 247:1465-1468(1990)および本明細書中に引用される参考文献を参照。
子発現を引き起こすことも示された。J.A. Wolff, et al., Science 247:1465-1
468(1990)。粒子-加速(particle-acceleration)(N. -S. Yang, et al. Pro c. Nafl. Acad. Sci. USA 87:9568-9572(1990); S.R. Williams et al., Proc . Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-2730(1991))あるいはウイルス形質導入な
どによるその他の手段により、RNAあるいはDNAを筋細胞に導入させることでも、
DNAあるいはRNAを安定して維持および発現させるはずである。Wolff et al.にお
いて報告される実験では、RNAあるいはDNAベクターを使用して、マウス骨格筋細
胞、特に大腿四頭筋の細胞内でレポーター遺伝子を発現させた。タンパク質発現
は容易に検出され、これらの効果には特別な輸送系は必要とされなかった。ポリ
ヌクレオチド発現は、接種液の組成および量および接種の方法が記載されるプロ
トコールから修飾されるときにも得られた。例えば、レポーター酵素活性は、10
から100μlの低張、等張、および高張のスクロース溶液、Opti-MEM、あるいは2
mMのCaCl2を含有するスクロース溶液を用いて観察されたこと、そしてまた10-か
ら100-μlの注入が1分間以内の代わりにポンプで20分間にわたり行われたときに
も観察されたことが報告された。
あるいはDNAベクターを用いて注入した腹部筋肉内において検出され、その他の
筋肉がポリヌクレオチドを取り込んで発現できることを示した。低量のレポータ
ー酵素もまた、RNAおよびDNAベクターを用いて接種したその他の組織(肝臓、脾
臓、皮膚、肺、脳および血液)において検出された。筋肉内に接種したプラスミ
ドDNAもまた、ヒトでない霊長類の筋肉内で安定して発現することが示された。S
. Jiao et al., Hum. Gene Therapy 3:21-33(1992)。
の可能性のある臨床的適応を有しうることが提案された。筋肉は、筋肉が関与す
る疾患状態に加えて、主に関与しない疾患状態を緩和するであろう導入遺伝子の
異種発現にとって潜在的に適した組織である。例えば、筋肉組織は、循環毒素代
謝を免疫化する、血液内に分泌する、あるいは排泄することのできるタンパク質
の異種発現のために使用できた。くり返し利用できるRNAおよび組織の使用は、
遺伝子トランスファーの可逆型にとって有用であり、従来の医薬的治療と非常に
同じように投与されうる。J.A. Wolff, et al., Science 247:1465-1468(1990
)およびS. Jiao et al., Hum. Gene Therapy 3:21-33(1992)を参照せよ。
プローチを提供しうることが、J.A. Wolff, et al.上記により提案された。この
仮説は、BALB/cマウスの大腿四頭筋に接種されたインフルエンザA核タンパク質
をコードするプラスミドDNAが、ウイルスの肺力価の減少、質量損失の抑制、お
よび生存率の上昇により評価されるように、インフルエンザA核タンパク質-特異
的細胞傷害性T細胞(CTL)の生成、インフルエンザAウイルスの異種株のその後
の攻撃に対する防御をもたらした、という最近の報告により支持された。J. B.
Ulmer et al., Science 259:1745-1749(1993)。
原の内因性発現のために使用して、自己-複製薬剤あるいはアジュバントを必要
とせずに、免疫系に対する提示のためのウイルス抗原を生成させることができ、
抗原-特異的CTLの生成およびウイルスの同種あるいは異種株のその後の攻撃に対
する防御をもたらすようである。
来のエピトープを認識することができ、ウイルスに対する免疫反応において重要
であると考えられている。保存的ウイルスタンパク質由来のエピトープを認識す
ることにより、CTLは交叉株(cross-strain)防御を提供しうる。保存的ウイル
ス抗原に特異的なCTLは、一般的に株-特異的な抗体とは対照的に、様々なウイル
スの株に反応できる。
なペプチド輸送あるいはウイルスベクターのいくつかの制限がないという有利性
を有する。(J.A. Ulmer et al., 上記、および本明細書中の考察および参考文
献を参照せよ。)さらに、DNAの接種後の発現タンパク質に対する高力価の抗体
の生成は、これが、保存的抗原を標的とするCTLワクチンと別々にするあるいは
組み合わせて、保存的あるいは非保存的抗原を標的とする抗体-ベースのワクチ
ンの作製を容易で効果的な手段であり得る、ことを示す。これらはまた、組み合
わせワクチンの生成のために、従来のペプチドワクチンと共に使用されうる。さ
らに、タンパク質発現はDNA接種後に維持されるので、BおよびT細胞の記憶の持
続性を亢進することもでき、それにより長寿命ホルモンおよび細胞-媒介免疫が
生じうる。
ロモーター、あるいはHIV-1などの誘導性プロモーターを使用して、発現ベクタ
ー内に挿入されるであろう。
ヒト細胞へのDNAのエレクトロポレーションあるいはトランスフェクション、所
望される特性のための細胞の選択および身体へのそのような細胞の再導入、(前
記の選択は、前もって選択された適するゲノム領域に対する注入DNAの成功した
同種組換えのために存在することができる);gag遺伝子を含有する感染性粒子
の生成、ex vivoでの細胞の感染および身体へのそのような細胞の再導入;ある
いはin vivoでの前記の粒子による直接的な感染、などのいくつかの技術の一つ
を使用して、医薬的に許容可能なキャリアにおいて動物あるいはヒトに導入され
るであろう。
う。 本発明のもう一つの態様において、記載される構築物は修飾されて、ウイルス
粒子の形成に関与することができない変異Gagタンパク質を発現するであろう。
そのようなGagタンパク質は野生型Gagタンパク質と同程度に免疫系を刺激するで
あろうが、HIV-1産生の増加には寄与できないであろうと期待される。この修飾
は、免疫療法および免疫学的予防のためのより安全なベクターをもたらすはずで
ある。
を使用したHIV-1発現の阻害 DNAの直接的接種あるいはレトロウイルスベクター以外のベクターの使用によ
り、細胞中にて構成的な高レベルなトランスドミナントGag(TDgag)が可能にな
るであろう。さらに、B.K. Felber et al., Science 239:184-187(1988)によ
り採用されるアプローチにより、HIV-1 TDgagをコードするレトロウイルスベク
ター、例えばマウス-由来レトロウイルスベクター、が生成され、それはレトロ
ウイルスベクターによるヒト細胞の感染を干渉しないであろう。Felber, et al.
, 上記のアプローチでは、プロモーターおよびポリAシグナルの部分を含有するH
IV-1 LTRの断片は、有害な効果を伴わずにマウスレトロウイルスベクター内に組
み込むことができ、転写的にサイレントのままでいることができることが示され
た。Tatタンパク質の存在はHIV-1 LTRからの転写を刺激し、HIV-1 LTRと結合す
る遺伝子の高レベルの発現をもたらした。
細胞中の発現ベクターの導入は、HIV-1発現を阻害するであろう2つのタンパク質
を効率的に産生するであろう。同じベクターにおける2つのTDタンパク質の組み
込みは、ウイルス複製に対する各々の効果を増幅することが期待される。B.K. F
elber et al. 上記に記載されるものと同様な内容におけるHIV-1プロモーターの
使用は、感染細胞において高レベルのGagおよびRev発現を可能にするであろう。
感染の非存在下では、発現は実質的には低いであろう。あるいは、その他の強力
なプロモーターの使用により、そのようなタンパク質の構成的な発現が与えられ
るであろう。このアプローチは非常に有益でありうる、なぜなら高い免疫原性の
gagを産生するからであり、それは感染ウイルスの産生に関与できるのではなく
、実際はそのような産生に拮抗する。これはAIDSに対する効率的な免疫学的予防
あるいは免疫療法として使用できる。
に記載される。 1.トランスドミナントGag変異タンパク質をコードする構築物の生成 例えば、Trono et al. 上記に記載されるように、トランスドミナント変異体
として働くことができるGag変異タンパク質は、高い構成的レベルでトランスド
ミナントGagタンパク質を産生するために、ベクターp37M1-10Dあるいはp55M1-13
P0を修飾することにより生成されるであろう。
を阻害するであろうが、感染ウイルスの産生には寄与しないであろう。 このアプローチの付加的な安全性は、それをヒトの応用により受け入れやすく
させる。
ずれかの遺伝子を本発明の例示した方法あるいはその機能的な同等物にしたがっ
て修飾できることを理解するだろう。
にとって明らかな、本発明を実施するための上気した態様の修飾は、以下の請求
の範囲に含まれることを意図する。
として援用する。
)。gagpolターミネーターは、SEQUENCE ID NO: 1の位4305-4397に位置する。
。図中の位置#1は、プラスミドpCMVgagpolBNkan中の位置2641である。比較は、
位置1872のgagイニシエーターATGから開始する。
ンラムダsiv 239-1(GenBankアクセッション番号M33262)由来の野生型SIV配列
と、SIVgagDX中の変異SIV gag DNA配列の比較。
ポリ(A):ウシ成長ホルモン・ポリ(A)シグナル;MSD:変異スプライシング
・ドナー部位;Ψ:キャプシド形成シグナル;SD、スプライシング・ドナー部位
;SA、スプライシング・アクセプター部位;「X」は、この遺伝子の翻訳が生じ
ないように、部分的gag遺伝子配列のATGコドンが変異していることを示す。
されるように、パッケージングシグナル、CMVプロモーターおよびルシフェラー
ゼ遺伝子のコード領域に、5'および3' HIV-1 LTRが隣接し、このLTRがプロモー
ターおよびポリアデニル化シグナルを提供する。3つの連続する矢印は、それぞ
れ、LTRのU5、R、およびU3領域を示す。LTRの転写部分は黒で示す。いくつかの
制限エンドヌクレアーゼ切断部位もまた示す。
おり。
ァー構築物におけるBssHII(711)からClaI(830)の領域のヌクレオチド配列。
Gagタンパク質の翻訳イニシエーターシグナル(ATG)を下線で示す。pmBCwCNluc
iおよびpmBCmCNluci(トランスファー構築物1および2)は、配列mBCwCNを含む。
トランスファー構築物3は、配列m2BCwCNを含む。配列mBCwCNと対照的に、m2BCwC
Nは、5'スプライシング部位領域に異なる変異を有し、そして無傷のGag ATGを有
する。
スフェクションに際し、細胞から放出されるgagタンパク質のレベルを示す棒グ
ラフ。
CMVBNKanと示す)からの逆転写酵素活性を示す棒グラフ。
スベクターで形質導入された細胞において検出されるp24 Gagタンパク質のナノ
グラムあたりのルシフェラーゼ量を示す棒グラフ。結果は、PCMVgagpolBNkanを
用いると、Rev非依存的gag-HIV-1に基づくレトロウイルスベクターが(A)293細
胞、(B)ヒトリンパ球細胞、(C)ヒト骨髄球細胞(U937)と共に、(D)初代
ヒトマクロファージなどの非分裂性細胞において、高い形質導入効率を示すこと
を示す。
図。
an/R-R-SIVenvCTEのDNA配列。
agpolターミネーターは、SEQ ID NO: 1の位置4305-4397に位置する。
領域(SEQ ID NO: 3)の配列の比較。図中の位置#1は、プラスミドpCMVgagpolB
Nkan中の位置2641である。比較は、位置1872のgagイニシエーターATGから開始す
る。
)。
ンラムダsiv 239-1(GenBankアクセッション番号M33262)由来の野生型SIV配列
(SEQ ID NO: 17)と、SIVgagDX中の変異SIV gag DNA配列(SEQ ID NO: 18)の
比較。コンセンサス配列は、SEQ ID NO: 5で示される。
ポリ(A):ウシ成長ホルモン・ポリ(A)シグナル;MSD:変異スプライシング
・ドナー部位;Ψ:キャプシド形成シグナル;SD、スプライシング・ドナー部位
;SA、スプライシング・アクセプター部位;「X」は、この遺伝子の翻訳が生じ
ないように、部分的gag遺伝子配列のATGコドンが変異していることを示す。
されるように、パッケージングシグナル、CMVプロモーターおよびルシフェラー
ゼ遺伝子のコード領域に、5'および3' HIV-1 LTRが隣接し、このLTRがプロモー
ターおよびポリアデニル化シグナルを提供する。3つの連続する矢印は、それぞ
れ、LTRのU5、R、およびU3領域を示す。LTRの転写部分は黒で示す。いくつかの
制限エンドヌクレアーゼ切断部位もまた示す。
おり。
)。相補鎖位置7814〜7002の翻訳物を、SEQ ID NO: 7に示す。
8)。
9)。
(SEQ ID NO: 13)、並びにトランスファー構築物におけるBssHII(711)からCl
aI(830)の領域のヌクレオチド配列。Gagタンパク質の翻訳イニシエーターシグ
ナル(ATG)を下線で示す。pmBCwCNluciおよびpmBCmCNluci(トランスファー構
築物1および2)は、配列mBCwCN(SEQ ID NO: 10)を含む。トランスファー構築
物3は、配列m2BCwCN(SEQ ID NO: 11)を含む。配列mBCwCNと対照的に、m2BCwCN
は、5'スプライシング部位領域に異なる変異を有し、そして無傷のGag ATGを有
する。コンセンサス配列は、SEQ ID NO: 14に示す。
スフェクションに際し、細胞から放出されるgagタンパク質のレベルを示す棒グ
ラフ。
CMVBNKanと示す)からの逆転写酵素活性を示す棒グラフ。
スベクターで形質導入された細胞において検出されるp24 Gagタンパク質のナノ
グラムあたりのルシフェラーゼ量を示す棒グラフ。結果は、PCMVgagpolBNkanを
用いると、Rev非依存的gag-HIV-1に基づくレトロウイルスベクターが(A)293細
胞、(B)ヒトリンパ球細胞、(C)ヒト骨髄球細胞(U937)と共に、(D)初代
ヒトマクロファージなどの非分裂性細胞において、高い形質導入効率を示すこと
を示す。
図。
an/R-R-SIVenvCTEのDNA配列(SEQ ID NO: 15)。翻訳物は、SEQ ID NO: 16とし
て示す。相補鎖位置6547〜5732の翻訳物を、SEQ ID NO: 7に示す。
Claims (35)
- 【請求項1】 図1に示されるgag/pol遺伝子のコード配列を有するHIV-1
gag/pol遺伝子を含む、核酸構築物。 - 【請求項2】 図2に示されるpol遺伝子のコード配列を有するHIV-1 pol
遺伝子を含む、核酸構築物。 - 【請求項3】 図3に示されるgag遺伝子のコード配列を有するSIV-1 gag
遺伝子を含む、核酸構築物。 - 【請求項4】 HIVまたはSIV 5' LTR、パッケージングシグナル、図1に示
される配列を含むgag/pol遺伝子、5'スプライシング部位、3'スプライシング部
位、env遺伝子、tat遺伝子、機能的なRNA輸送要素および3' HIVまたはSIV LTRを
含む核酸構築物であって、機能的なGag、PolおよびEnvビリオン構成要素を産生
することが可能な、前記核酸構築物。 - 【請求項5】 請求項1、2、3または4の核酸構築物を含むベクター。
- 【請求項6】 請求項1、2、3または4の核酸構築物を含む形質転換宿主細
胞。 - 【請求項7】 前記細胞が真核細胞である、請求項6の形質転換宿主細胞
。 - 【請求項8】 前記細胞がヒト細胞である、請求項7の宿主細胞。
- 【請求項9】 前記細胞が原核細胞である、請求項6の形質転換宿主細胞
。 - 【請求項10】 前記細胞が大腸菌(E. coli)である、請求項9の宿主細
胞。 - 【請求項11】 請求項1、2、3または4の核酸構築物および薬学的に許容
しうるキャリアーを含む、薬剤組成物。 - 【請求項12】 哺乳動物において抗体を誘導する方法であって、哺乳動
物に請求項11の組成物を投与することを含み、前記核酸構築物が、前記哺乳動物
において、前記抗体を誘導するのに有効な量で存在する、前記方法。 - 【請求項13】 哺乳動物において、細胞傷害性Tリンパ球を誘導する方
法であって、哺乳動物に請求項11の組成物を投与することを含み、前記核酸構築
物が、前記哺乳動物において、細胞傷害性Tリンパ球を誘導するのに有効な量で
存在する、前記方法。 - 【請求項14】 哺乳動物において、HIV感染に対する免疫を誘導するワ
クチン組成物であって、薬学的に許容しうるキャリアーを含み、そして、in viv
oで細胞において、HIV Rev制御タンパク質の非存在下で、HIV GagおよびPolタン
パク質を産生することが可能な、治療的に有効な量の請求項1の核酸構築物をさ
らに含む、前記ワクチン組成物。 - 【請求項15】 哺乳動物において、HIV感染に対する免疫を誘導するワ
クチン組成物であって、薬学的に許容しうるキャリアーを含み、そして、in viv
oで細胞において、HIV Rev制御タンパク質の非存在下で、HIV Polタンパク質を
産生することが可能な、治療的に有効な量の請求項2の核酸構築物をさらに含む
、前記ワクチン組成物。 - 【請求項16】 前記哺乳動物がヒトである、請求項14記載のワクチン組
成物。 - 【請求項17】 前記哺乳動物がヒトである、請求項15記載のワクチン組
成物。 - 【請求項18】 哺乳動物において、HIV感染に対する免疫を誘導する方
法であって、哺乳動物に、治療的に有効な量の請求項14記載のワクチン組成物を
投与することを含む、前記方法。 - 【請求項19】 哺乳動物において、HIV感染に対する免疫を誘導する方
法であって、哺乳動物に、治療的に有効な量の請求項15記載のワクチン組成物を
投与することを含む、前記方法。 - 【請求項20】 前記哺乳動物がヒトである、請求項18記載の方法。
- 【請求項21】 前記哺乳動物がヒトである、請求項19記載の方法。
- 【請求項22】 レンチウイルス発現系であって: (a)図1に示されるヌクレオチド配列を有するHIV-1 gag/pol遺伝子を含む、パ
ッケージングベクター; (b)トランスファーベクター;および (c)エンベロープコードベクター を含む、前記系。 - 【請求項23】 請求項22のレンチウイルス発現系を含む、形質転換宿主
細胞。 - 【請求項24】 前記細胞が真核細胞である、請求項23の形質転換宿主細
胞。 - 【請求項25】 前記細胞がヒト細胞である、請求項24の宿主細胞。
- 【請求項26】 レンチウイルス粒子を作成する方法であって、宿主細胞
において、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子の存在下で、図1に示さ
れるHIV GagおよびHIV Polをコードするヌクレオチド配列を含むベクターから、
HIV GagおよびHIV Polを発現させることを含む、前記方法。 - 【請求項27】 Rev、Tat、およびいずれかのウイルスRNA輸送要素の非
存在下で機能することが可能なレンチウイルス発現系であって: (a)阻害/不安定性領域を除去するよう変異している、HIV-1 gag/pol遺伝子
を含む、パッケージングベクター; (b)トランスファーベクター;および (c)エンベロープコードベクター を含む、前記系。 - 【請求項28】 請求項27のレンチウイルス発現系を含む、形質転換宿主
細胞。 - 【請求項29】 前記細胞が真核細胞である、請求項28の形質転換宿主細
胞。 - 【請求項30】 前記細胞がヒト細胞である、請求項29の形質転換宿主細
胞。 - 【請求項31】 Rev、Tat、またはいずれかのウイルスRNA輸送要素の非
存在下で、レンチウイルス粒子を作成する方法であって、宿主細胞において、阻
害/不安定性領域を除去するよう変異している、HIV-1 gag/pol遺伝子から、HI
V GagおよびHIV Polを発現させ、そしてその発現が、Rev、Tat、またはいずれか
のウイルスRNA輸送要素に非依存的である、エンベロープコード遺伝子からエン
ベロープタンパク質を発現させることを含む、前記方法。 - 【請求項32】 図16に示されるenv遺伝子のコード配列を有するSIV-1 e
nv遺伝子を含む、核酸構築物。 - 【請求項33】 請求項32の核酸構築物を含む、ベクター。
- 【請求項34】 請求項32の核酸構築物を含む、形質転換宿主細胞。
- 【請求項35】 請求項32の核酸構築物および薬学的に許容しうるキャリ
アーを含む、薬剤組成物。
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