BR112014028944B1

BR112014028944B1 - vetores lentivirais contendo um promotor de mhc classe i

Info

Publication number: BR112014028944B1
Application number: BR112014028944-1A
Authority: BR
Inventors: Emeline SARRY; Cecile Bauche
Original assignee: Theravectys
Priority date: 2010-05-23
Filing date: 2013-04-30
Publication date: 2020-11-10
Also published as: AU2013265586B2; SG11201407732SA; CN104736167A; IN2014DN10123A; BR112014028944A2; EP2678032B1; AU2013265586A1; EP2678032A1; ES2498277T3; IL235705A0; US20140120132A1; WO2013174630A1; HK1211837A1; CA2873473C; EP2666477A1; KR20150014472A; PT2678032E; PL2678032T3; IL235705A; JP5938143B2

Abstract

VETORES LENTIVIRAIS CONTENDO UM PROMOTOR DE MHC CLASSE I. A presente invenção refere-se à inserção de uma sequência promotora de um promotor do gene de MHC classe I em um vetor lentiviral, de forma a direcionar a transcrição de um transgene, que preferivelmente codifica um polipeptídeo imunogênico para ser expresso em um hospedeiro de células de mamífero, preferivelmente APC (DCs). A invenção abrange estes vetores, métodos para produzir os vetores e métodos de utilização destes, incluindo utilizações medicinais.

Description

CAMPO TÉCNICO

[0001] A presente invenção encontra-se no campo da tecnologia de vacina recombinante e refere-se a melhorias de vetores lentivirais, que podem ser utilizados como vacinas terapêuticas e profiláticas. Os vetores contendo promotores de MHC de Classe I (MHCI) fornecem características melhoradas em relação a outros vetores.

ANTECEDENTES

[0002] As vacinas recombinantes têm sido desenvolvidas com o progresso da tecnologia de DNA recombinante, permitindo a modificação de genomas virais para produzir virus modificados. Desta forma, tem sido possivel introduzir sequências genéticas em virus não patogênicos, de modo que estes codifiquem proteínas imunogênicas para serem expressas em células alvo quando da infecção para desenvolver uma resposta imune especifica em seu hospedeiro.

[0003] Essas vacinas constituem um grande avanço na tecnologia de vacinas (Kutzler et al., Nat Rev Genet, 9(10):776-788, 2008). Em particular, elas possuem a vantagem de evitar virus vivos (atenuados) e eliminar os riscos associados à fabricação de vacinas inativadas em relação às vacinas tradicionais.

[0004] A liberação de genes utilizando retrovirus modificados (vetores retrovirais) foi introduzida no inicio de 1980 por Mann et al. {Cell, 33(1): 153-9, 1983). Os vetores retrovirais oncogênicos mais comumente utilizados são baseados no virus da leucemia murina de Moloney (MLV). Eles possuem um genoma simples a partir do qual as poliproteinas Gag, Pol e Env são produzidas e são necessários na forma transpara replicação virai (Breckpot et al., 2007, Gene Ther, 14 (11) : 847-62; He et al. 2007, Expert Rev vaccines,6(6):913-24). As sequências geralmente necessárias na forma cis são as repetições terminais longas (LTRs) e sua vizinhança: as repetições invertidas (sitios att ou IR) necessárias para integração, a sequência de empacotamento ψ, o sitio de transporte de ligação ao RNA (sitio de ligação ao primer, PBS) e algumas sequências adicionais envolvidas na transcrição reversa (a repetição R dentro das LTRs e os tratos de polipurina, PPT, necessários para iniciação da fita positiva). Para gerar vetores retrovirais defeituosos para replicação, os genes gag, pol e env são, em geral, completamente deletados e substituídos por um cassete de expressão.

[0005] Os vetores retrovirais derivados de genomas de lentivirus (isto é, vetores lentivirais) têm emergido como ferramentas promissoras para fins de terapia gênica e de imunoterapia, uma vez que estes apresentam diversas vantagens sobre outros sistemas virais. Em particular, os vetores lentivirais em si são atóxicos e, ao contrário de outros retrovirus, os lentivirus são capazes de transduzir células que não se dividem, em particular, células dendriticas (He et al. 2007, Expert Ver vacines, 6(6):913— 24), permitindo a apresentação de antigeno através da via endógena.

[0006] Os lentivirus estão ligados por similaridade na composição genética, mecanismos moleculares de replicação e interações biológicas com seus hospedeiros. Eles são mais conhecidos como agentes de sindromes de doenças lentas que iniciam insidiosamente após periodos prolongados de infecção subclinica e progridem lentamente; assim, eles são referenciados como os virus "lentos"(Narayan et al., 1989, J Gen Virol,70(7):1617-1639). Eles possuem a mesma organização básica, como todos os retrovirus, mas são mais complexos devido à presença de genes acessórios (por exemplo, vif, vpr, vpu, nef, tat e rev),que desempenham papéis chave na replicação lentiviral in vivo.

[0007] Os lentivirus representam um gênero de virus lentos da familia Retroviridae, que inclui os virus da imunodeficiência humana (HIV), o virus da imunodeficiência simia (SIV), o virus da encefalite equina infecciosa (EIAV), o virus da artrite-encefalite caprina (CAEV), o virus da imunodeficiência bovina (BIV) e o virus da imunodeficiência felina (FIV) . Os lentivirus podem persistir indefinidamente nos seus hospedeiros e replicar continuamente a taxas variáveis durante o curso da infecção ao longo da vida. A replicação persistente dos virus em seus hospedeiros depende da sua capacidade de contornar as defesas do hospedeiro.

[0008] O desenho de vetores lentivirais integrativos recombinantes baseia-se na separação de sequências de atuação cise transdo lentivirus. A transdução eficiente em células que não se dividem requer a presença de duas sequências de atuação cisno genoma lentiviral, o trato central de polipurina (cPPT) e a sequência de terminação central (CTS) . Estes levam à formação de uma estrutura de DNA de fita tripla chamada de "flap"central do DNA, o que maximiza a eficiência da importação de genes para os núcleos de células que não se dividem, incluindo as células dendriticas (DCs) (Zennou et ai., 2000, Cell,101(2) 173-85; Arhel et al., 2007, EMBO J, 26 (12) :3025-37) .

[0009] As células dendriticas são de primordial importância para a apresentação de antigenos, uma vez que constituem a principal classe de células apresentadoras de antigenos (APCs) cuja função principal é apresentar antigenos e iniciar uma resposta imune.

[0010] Para gerar uma resposta imune, as proteínas antigênicas têm de ser processadas por células para peptideos que são apresentados na superfície da célula por proteínas do complexo principal de histocompatibilidade (MHCs). As APCs circulantes apresentam os complexos de peptídeo-MHC às células T nos linfonodos de drenagem, onde eles interagem com receptores de células T e, em conjugação com sinais co-estimulantes, ativam as células T.

[0011] Uma variedade de estudos tem mostrado que a inoculação com vetores lentivirais leva à apresentação de antígeno pelas DCs e à forte ativação de linfócitos T citotóxicos antígeno-específicos (CTLs; células T CD8+) . Portanto, nos últimos 10 anos, os vetores lentivirais foram projetados para aplicações de transferência de genes e imunoterapia.

[0012] Os vetores lentivirais foram aperfeiçoados em sua segurança através da remoção da sequência LTR U3, resultando em vetores de "auto inativação" que são inteiramente desprovidos de sequências promotoras e intensificadoras virais originalmente presentes dentro das LTRs.

[0013] As partículas lentivirais, que compreendem vetores lentivirais, podem ser produzidas por tecnologia recombinante mediante transfecção transitória de células humanas HEK 293T cultivadas por diferentes plasmídeos de DNA: (i) urn plasmideo de empacotamento, que expressa pelo menos Gag, Pol Rev, Tat e, em alguns casos, proteínas estruturais e enzimáticas necessárias para o empacotamento do constructo de transferência; (ii) um plasmídeo de transferência, contendo um cassete de expressão e fatores de atuação cis de HIV necessários para o empacotamento, transcrição reversa e integração; e (iii) um plasmídeo envelope de codificação, na maioria dos casos, a glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSV.G), uma proteína que permite a formação de partículas misturadas (pseudo-tipos) que podem ter como alvo uma ampla variedade de células, especialmente células apresentadoras de antígenos (APCs) do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), incluindo DCs.

[0014] Este procedimento permite a obtenção da produção transiente de vetores de partículas lentivirais pelas células transfectadas. No entanto, os vetores de partículas lentivirais também podem ser produzidos continuamente por células através da inserção estável de genes de empacotamento, do DNA proviral de codificação e do gene envelope no genoma celular. Isto permite a produção contínua de vetores de partículas lentivirais pelas células sem a necessidade de transfecção transitória. Naturalmente, uma combinação destes procedimentos pode ser utilizada, com alguns dos DNAs/plasmideos integrados ao genoma celular e outros fornecidos por transfecção transitória.

[0015] Os vetores lentivirais não integrativos estão sendo projetados para reduzir os riscos de oncogênese potencial associada a eventos de mutagênese insercional, em especial, para fins de vacinação:

[0016] Na vacinação com base em injeção direta de vetores lentivirais integrativos que codificam antigeno, as células transduzidas que expressam o antigeno relevante tornam-se alvos da resposta imune provocada e são eliminadas do organismo vacinado dentro de poucos dias ou semanas.

[0017] Adicionalmente, a deleção na região 03 da LTR 3' das sequências promotoras e intensificadoras virais em vetores lentivirais de auto inativação limita a probabilidade de ativação do promotor endógeno. Esta deleção aborda diretamente as experiências adquiridas com o ensaio de terapia genética SCID-X1 feito entre 1998 e 1999, realizado com vetores retrovirais baseados no virus Moloney em crianças que sofrem de uma forma rara de doença de imunodeficiência severa ligada ao gene X (gene SCID-X1) (Cavazzana-Calvo et al.,2000, Science, 288 (5466) :669-72) . Durante este ensaio, quatro das nove crianças desenvolveram leucemia como um resultado da integração do vetor retroviral derivado de Moloney em estreita proximidade com a proto-oncogene LM02 humana (Hacein-Bey-Abina et al., 2008, J. Clin. Invest., 118 (9) :3132-3142) . Foi demonstrado que a malignidade era consequência da proximidade do promotor/intensificador viral 03 com a proto-oncogene LM02.

[0018] Os intensificadores são sequências de atuação cis, que podem atuar como ativadores da transcrição à distância. Eles têm sido amplamente utilizados em vetores virais derivados, uma vez que parecem ser os mais eficientes para a obtenção de forte expressão transgênica em uma variedade de tipos de células, em particular, DCs (Chinnasamy, Chinnasamy et al., 2000, Hum Gene Ther 11 (13) :1901-9; Rouas et al., 2008, Cancer Gene Ther 9(9):715-24; Kimura et al., 2007, Mol Ther 15 (7) : 1390-9; Gruh et al., 2008, J Gene Med 10(1) 21-32) . No entanto, dada à questão da segurança da mutagênese insercional, tais sequências intensificadoras de transcrição deveriam ser deletadas dos constructos do vetor lentiviral para abolir o risco de mutagênese insercional pelo efeito de proximidade do intensificador. Este efeito de proximidade do intensificador é, de longe, o mais frequente mecanismo de mutagênese insercional e é o único efeito descrito em casos de eventos tumorigênicos em humanos ou em animais após a transferência de genes.

[0019] Assim, existe uma necessidade de se desenvolver vetores retrovirais, particularmente vetores lentivirais, os quais não incluem intensificadores virais e que permitem a expressão suficiente de transgenes que codificam peptideos imunogênicos, se possivel, tanta expressão quanto a observada quando se utiliza o promotor de CMV.

[0020] Um estudo recente relatou a substituição de promotores virais por promotores específicos de DC derivados de genes do complexo principal de histocompatibilidade de classe II (MHC classe II) (Kimura et al., 2007, Mol Ther 15 (7) : 1390-9) e genes de dectina-2 (Lopes et al., 2008, J Virol82 (1) :86-95) . O promotor do gene de dectina-2 utilizado em Lopes et al. contém um intensificador putativo e uma sequência adenoviral conservada (repetições terminais invertidas em promotor de adenovirus) (Bonkabara et al.,2001, J. Immunology, 167:6.893-6.900). O promotor do gene de MHC de classe II utilizado por Kimura et al. não compreende qualquer intensificador conhecido.

[0021] Além disso, sem um intensificador, verificou-se que o promotor de MHC de classe II não forneceu expressão transgênica suficiente em DCs. Em particular, os vetores lentivirais, incluindo os promotores de MHC de classe II, não provocaram uma reação imune em camundongos C57BL/6 imunocompetentes, em contraste com as respostas imunes observadas com promotores/intensificadores de CMV. Embora tenham sido observadas integração e expressão transgênica persistente após injeção em camundongos, os vetores lentivirais transcritos através de promotores de MHC de classe II não conseguiram estimular uma resposta de linfócitos T citotóxicos CD8+ antigeno- especifica, mesmo após vacinação de reforço. Os autores destes estudos, portanto, concluiram que a utilização de promotores de MHC de classe II foi apenas de interesse para aplicações em que a persistência de expressão é buscada, como em terapia de substituição de genes, mas não no contexto de imunoterapia.

[0022] Assim, o promotor de MHC de classe II não é um promotor adequado para vetores lentivirais para a indução de uma resposta imune contra um antigeno. Além disso, o promotor dectina-2 é especifico para células dendriticas, o que não permite a eliminação de vetores que são integrados em outros tipos de células não expressivas. Além disso, o promotor dectina-2 parece conter um intensificador. Assim, o promotor dectina-2 não é um bom promotor para os vetores lentivirais, por razões de segurança.

[0023] Preferivelmente, em imunoterapia, os vetores lentivirais fornecem expressão transgênica eficaz, o que provoca uma resposta imune especifica desejada. Isto requer que a expressão esteja a um nível elevado em APCs, tais como nas células dendriticas.

[0024] Também é preferível que as células transduzidas por vetores lentivirais sejam eliminadas pela resposta imune para fornecer um grau de segurança mais elevado. Ou seja, a resposta imune gerada contra o transgene pode provocar uma resposta imune no hospedeiro suficiente para eliminar as células que são transduzidas pelos vetores lentivirais. A eliminação das células transduzidas elimina a persistência do vetor lentiviral no hospedeiro, e possíveis efeitos colaterais do vetor. Para que as células transduzidas sejam eliminadas, é necessária a expressão em células não dendriticas a um nível que permita a eliminação pela resposta imune.

[0025] Ao mesmo tempo, o promotor deve maximizar o estímulo imune através das células-chave (isto é, células dendriticas) envolvidas na ativação de células T de memória e naive, e deve minimizar o risco de mutagênese insercional e de genotoxicidade em células tronco, levando a malignidades. Assim, o promotor deve possuir uma atividade suficientemente elevada em células dendriticas e em outras células, mas não compreender um intensificador. Com base nestes critérios, os promotores virais, tais como o promotor de CMV, não são ideais devido à presença de intensificadores fortes. Estes critérios são resumidos como se segue: 1. elevada expressão em células apresentadoras de antigenos, incluindo células dendriticas, para induzir respostas imunes máximas; 2. expressão em outros tipos de células transduzidas suficiente para a eliminação pela resposta imune induzida; e 3. falta de um elemento intensificador para evitar efeitos de inserção.

[0026] Desta forma, existe uma necessidade na técnica por vetores melhorados. A presente invenção preenche estas necessidades da técnica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0027] A invenção abrange composições que compreendem vetores lentivirais e métodos de utilização dos vetores. Em uma modalidade, a invenção engloba um vetor lentiviral que compreende uma sequência transgênica que codifica um polipeptideo imunogênico, em que a sequência transgênica está sob o controle transcricional de um promotor de MHC de classe I; em que o vetor induz uma maior resposta de CTL in vivo contra o polipeptideo imunogênico codificado em comparação com um vetor em que a sequência transgênica está sob o controle transcricional de um promotor de CMV.

[0028] Preferivelmente, o promotor de MHC de classe I é um promotor de HLA-A2, um promotor de HLA-B7, um promotor de HLA-Cw5, um promotor de HLA-E ou um promotor de HLA-F.

[0029] Em várias modalidades, a sequência do promotor compreende uma sequência de polinucleotideo que compartilha mais do que 90%, preferivelmente mais do que 95%, mais preferivelmente mais do que 99% de identidade com a sequência promotora da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5.

[0030] Em várias modalidades, o vetor compreende uma LTR que é deletada para o promotor e intensificador de U3, uma sequência de cPPT/CTS de um lentivirus, uma sequência ψ (psi) e/ou duas LTRs lentivirais.

[0031] Em uma modalidade preferencial, o vetor lentiviral não contém um intensificador.

[0032] O polipeptideo imunogênico codificado pelo transgene compreende antigeno(s) de proteinas Gag, Pol e/ou Nef do virus HIV. O antigeno pode ser pelo menos um antigeno tumoral.

[0033] A invenção adicionalmente abrange uma célula hospedeira isolada que compreende o vetor lentiviral da invenção.

[0034] A invenção adicionalmente abrange métodos para produzir uma particula de vetor lentiviral. Tais métodos podem compreender as etapas de transfecção de uma célula hospedeira adequada com o vetor lentiviral; transfecção da célula hospedeira com um vetor plasmidial de empacotamento contendo sequências de DNA virai que codificam pelo menos proteinas estruturais e integrase de um retrovirus; cultura da referida célula hospedeira transfectada para obter expressão e empacotamento do referido vetor lentiviral em particulas de vetor lentiviral; e coleta das particulas de vetor lentiviral resultantes da expressão e do empacotamento nas referidas células hospedeiras cultivadas.

[0035] A invenção adicionalmente abrange particulas de vetor lentiviral que compreendem o vetor lentiviral da invenção. A particula de vetor lentiviral pode compreender uma sequência polinucleotidica de cPPT/CTS; uma LTR que é deletada para o promotor e o intensificador de U3; e/ou uma sequência transgênica sob o controle de um promotor de MHC de classe I. Preferivelmente, a sequência do promotor compreende uma sequência de polinucleotideo que compartilha mais do que 90%, preferivelmente mais do que 95%, mais preferivelmente mais de 99% de identidade com a sequência do promotor da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, ID SEQ NO: 4 ou SEQ ID NO: 5.

[0036] A invenção adicionalmente abrange composições que compreendem um vetor lentiviral ou particula de vetor lentiviral, de acordo com a invenção, para utilização como um medicamento ou vacina.

[0037] A invenção adicionalmente abrange métodos para a indução de uma resposta de células T compreendendo a administração, a um paciente, de uma particula de vetor lentiviral compreendendo uma sequência polinucleotidica de cPPT/CTS; uma LTR que é deletada para o promotor e intensificador de 03; e/ou uma sequência transgênica sob o controle de um promotor de MHC de classe I.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Figura 1. Representação esquemática dos promotores de MHCI e de MHCII

[0038] Os promotores de MHC de Classe I (MHCI) mostram elementos reguladores conservados: kB (sitio de ligação NF-Kb), ISRE (elemento de resposta estimulado por Interferon), SXY (elementos reguladores SXY), TATA (sinal de transcrição) e ATG (códon de iniciação para tradução transgênica) . A familia de promotores de MHCII mostra apenas os elementos reguladores SXY, TATA e ATG.

Figura 2. Expressão de GFP impulsionada por vários promotores em dois diferentes tipos de células

[0039] Construções de lentivetor que possuem vários promotores ligados a um gene de proteina fluorescente verde (GFP) foram utilizadas para transduzir células HEK293T e BDCM, e a capacidade dos promotores para impulsionar a expressão de GFP foi avaliada.

Figuras 3A e 3B. Indução da expressão de GFP por vários Interferons

[0040] Lentivetores que possuem vários promotores foram utilizados para transduzir células HEK293T e BDCM na presença de várias moléculas de interferon. A capacidade dos promotores para impulsionar a expressão de GFP foi então avaliada. MFI é mostrado em células 293T (A) e em células BDCM (B). Versões reduzidas dos promotores de MHCI e β2m também foram testadas, promotores nos quais as sequências regulatórias kB e ISRE foram removidas, transformando-os em promotores do tipo MHCII.

Figura 4. Resposta T-especifica (mediana) em camundongos C57BL/6j

[0041] Camundongos C57BL/6j foram imunizados com 1.106TU de lentivetores, nos quais a expressão do antigeno de HIV é impulsionada pelos promotores indicados. Doze dias após a imunização, as respostas especificas de células T contra o antigeno de HIV foram monitoradas em esplenócitos de camundongos por IFN-y ELISPOT.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0042] Com o intuito de determinar a existência de promotores que pudessem satisfazer os critérios de elevada expressão em células dendriticas para induzir respostas imunes máximas; expressão em outros tipos de células transduzidas suficiente para a eliminação pela resposta imune induzida; e falta de um elemento intensificador para evitar efeitos de inserção, promotores de genes humanos foram investigados quanto à sua utilidade em vetores lentivirais. Os promotores humanos foram analisados quanto aos seus niveis de expressão em células dendriticas e em outros tecidos. Os promotores com altos niveis esperados de expressão de células dendriticas e expressão média em todos os tecidos relativamente alta foram selecionados utilizando uma análise quantitativa. Os promotores foram adicionalmente selecionados quanto à falta de sequências intensificadoras.

[0043] Um grupo de promotores que atende a esses critérios é o grupo de promotores de MHC de Classe I. Os promotores de MHC de Classe I mostram conservação dos sitios de ligação de NF-Kb, um elemento de resposta estimulada por interferon (ISRE) e um módulo regulatório SXY (SXY). A disposição destes elementos promotores de MHC de Classe I está representada na Figura 1.

[0044] Os promotores de MHC de Classe II são considerados como promotores especificos de células apresentadoras de antigenos (incluindo células dendriticas) . Como também pode ser visto na Figura 1, apesar dos promotores de MHC de Classe II conterem um módulo de SXY, eles não contém sitios de ligação NF-Kb ou um ISRE (Van den Helsen et al., 1998, Immunogenetics, 48:208-221). Desta forma, os promotores de MHC de Classe II são bastante diferentes dos promotores de MHC de Classe I.

[0045] Outro promotor especifico de célula apresentadora de antigeno, dectina-2, contém um elemento de resposta estimulado por interferon (ISRE); mas não contém um módulo SXY (Bonkabara et al., 2001, J. Immunology, 167:6893-6900).

[0046] O promotor de β2-microglobulina humana (β2m) apresenta alguma similaridade com os promotores de MHC de Classe I, uma vez que compreende um ISRE, embora à montante de um único sitio de ligação de NF-Kb.

[0047] As sequências de vários promotores de MHC de classe I de mamifero (humano) são mostradas abaixo: HLA-A2 (MHC I): attggggagtcccagccttggggattccccaactccgcagtttcttttctccctctccc aacctatgtagggtccttcttcctggatactcacgacgcggacccagttctcactccca ttgggtgtcgggtttccagagaagccaatcagtgtcgtcgcggtcgcggttctaaagtc cgcacgcacccaccgggactcagattctccccagacgccgagg (SEQ ID NO: 1) HLA-B7 (MHC I): ggggaggcgcagcgttggggattccccactcccctgagtttcacttcttctcccaactt gtgtcgggtccttcttccaggatactcgtgacgcgtccccacttcccactcccattggg tattggatatctagagaagccaatcagcgtcgccgcggtcccagttctaaagtccccac gcacccacccggactcagag (SEQ ID NO: 2) HLA-CW5 (MHC I): cactggggaggcgccgcgttgaggattctccactcccctcagtttcacttcttctccca acctgcgtcgggtccttcttcctgaatactcatgacgcgtccccaattcccactcccat tgggtgtcgggttctagagaagccaatcagcgtctccgcagtcccggtctaaagtcccc agtcacccacccggactcagattctccccagacgccgag (SEQ ID NO: 3) HLA-E (MHC I): taagaactgctgattgctgggaaactctgcagtttcccgttcctctcgtaacctggtca tgtgtccttcttcctggatactcatgacgcagactcagttctcattcccaatgggtgtc gggtttctagagaagccaatcagcgtcgccacgactcccgactataaagtccccatccg gactcaagaagttctcaggactcagagg (SEQ ID NO: 4) HLA-F (MHC I): aggccccgaggcggtgtctggggttggaaggctcagtattgagaattccccatctcccc agagtttctctttctctcccaacccgtgtcaggtccttcatcctggatactcataacgc ggccccatttctcactcccattgggcgtcgcgtttctagagaagccaatcagtgtcgcc gcagttcccaggttctaaagtcccacgcaccccgcgggactcatatttttcccagacgc ggaggttggggtcatg (SEQ ID NO: 5)

[0048] Os promotores de MHCI (HLA-A2, HLA-B7 ou HLA-E) foram inseridos em um vetor lentiviral. Para efeitos de comparação, os promotores dos genes de EFla e de ubiquitina (UBC) ubiquamente expressos também foram inseridos no vetor lentiviral. Os promotores de EFla e de ubiquitina não contêm quaisquer intensificadores identificados e não contêm um módulo SXY, sitios de ligação de NF-Kb ou um ISRE. Pelo contrário, os promotores de EFla e de ubiquitina (UBC) contêm sitios de ligação Spl e Apl. Um vetor contendo o promotor de CMV também foi gerado. promotor de β2m também foram gerados. Nestes vetores, os promotores impulsionam a expressão da proteina fluorescente verde (GFP).

[0049] Para procurar a expressão especifica de células dendriticas, os vetores foram empacotados por co- transfecção em células HEK 293 T com um plasmideo de encapsidação e um plasmideo fornecendo um envelope de VSV.G, essencialmente como descrito em Naldini et al., 1996, Science 272:263-7. Ambas as células HEK 293 T e BDCM (uma linhagem de células do tipo dendriticas) foram então transduzidas com partículas dos diferentes vetores. A expressão foi detectada em células HEK 293 T com todos os vetores.

[0050] Os vetores com um promotor de CMV, um promotor de UBC, ou um promotor de EFla demonstraram maior expressão em células HEK 293 T em comparação com células BDCM (Figura 2). No entanto, os vetores com um promotor de MHCII (HLA-DRa), promotor de MHCI (HLA-A2, HLA-B7 ou HLA- E) , ou promotor de β2-microglobulina (β2m) mostraram maior expressão em células BDCM em comparação com células HEK 293 T. Assim, todos estes promotores exibiram uma super- expressão especifica de células dendriticas.

[0051] A indução de expressão na presença de vários interferons também foi avaliada. Os resultados são induzivel por interferons. No entanto, os promotores de MHCI foram induziveis por interferon y ern ambos os tipos de células e por interferon α em células HEK 293 T. De forma semelhante aos promotores de MHCI, o promotor de β2m também foi induzivel por interferons. A truncagem dos promotores de MHCI ou de β2m para remover o ISRE e os sitios de ligação de NF-Kb (promotor-SXY-GFP) reduziu a capacidade de indução. Desta forma, a versão truncada dos promotores de HLA-A2, HLA-B7, HLA-E e β2m comporta-se como um promotor de MHCII no que se refere à capacidade de indução.

[0052] Em seguida, os camundongos foram imunizados com lentivetores nos quais a expressão do antigeno de HIV é impulsionada por vários promotores (viral, ubiquo, MHCI, MHCII e β2m) . Doze dias após a imunização, as respostas especificas de células T foram monitoradas em esplenócitos camundongos por IFN-y ELISPOT. Tal como mostrado na Figura 4, a imunização com um lentivetor com um promotor de MHCI forneceu a maior resposta especifica de células T.

[0053] Como pode ser visto na Figura 4, a resposta especifica de células T com os promotores de MHCI foi maior em comparação com os promotores de CMV, EFlot, ubiquitina ou MHCII, e mais de 3 vezes maior do que aquela com os promotores de EFla ou de CMV. A resposta especifica de células T com o promotor de β2m foi semelhante a dos promotores de MHCI. Estes resultados indicam que o promotor de MHCI é um promotor inesperadamente superior aos promotores de EFla, ubiquitina, CMV ou MHCII para utilização em lentivetores para maximizar a resposta especifica de células T in vivo.

[0054] A presente invenção abrange vetores lentivirais que compreendem promotores contendo MHC de classe I (MHCI), e sua utilização para a indução de respostas imunes em um hospedeiro.

[0055] A presente invenção possui, portanto, como objetivo principal, um vetor lentiviral que compreende uma sequência promotora de um promotor do gene de MHC de classe I que direciona a transcrição de um transgene, que preferivelmente codifica um polipeptideo imunogênico em uma célula de um hospedeiro, preferivelmente em células dendriticas (DCs).

VETOR LENTIVIRAL

[0056] Dentro do contexto desta invenção, um "vetor lentiviral"significa um vetor não replicante para a transdução de uma célula hospedeira com um transgene que compreende sequências de RNA ou DNA lentivirais de atuação cis,e que exige proteinas lentivirais (por exemplo, Gag, Pol e/ou Env) que são fornecidas na forma trans.0 vetor lentiviral carece da expressão de proteinas Gag, Pol e Env funcionais. O vetor lentiviral pode estar presente na forma de uma molécula de RNA ou DNA, dependendo do estágio de desenvolvimento ou produção dos referidos vetores retrovirais.

[0057] O vetor lentiviral pode estar na forma de uma molécula de DNA recombinante, tal como um plasmideo. O vetor lentiviral pode estar na forma de um vetor de partícula lentiviral, tal como uma(s) molécula (s) de RNA dentro de um complexo lentiviral e outras proteínas. Tipicamente, os vetores de partículas lentivirais, os quais correspondem a partículas de lentivirus modificadas ou recombinantes, compreendem um genoma que é composto por duas cópias de RNA de fita simples. Estas sequências de RNA podem ser obtidas por transcrição de uma sequência de DNA de fita dupla inserida em um genoma de célula hospedeira (DNA de vetor proviral) ou podem ser obtidas a partir da expressão transiente do DNA de plasmideo (DNA do vetor de plasmideo) em uma célula hospedeira transformada.

[0058] Os vetores lentivirais derivam de lentivirus, em particular, do virus da imunodeficiência humana (HIV-1 ou HIV-2), do virus da imunodeficiência simia (SIV), do virus da encefalite equina infecciosa (EIAV), do virus da artrite-encefalite caprina (CAEV), do virus da imunodeficiência bovina (BIV) e do virus da imunodeficiência felina (FIV), que são modificados para remover os determinantes genéticos envolvidos na patogenicidade e introduzir novos determinantes úteis para a obtenção de efeitos terapêuticos.

[0059] Tais vetores são baseados na separação das sequências de atuação cise trans.Com o intuito de gerar vetores de replicação deficiente, as sequências de atuação trans(por exemplo, genes gag, pol, tat, rev e env) podem ser deletadas e substituídas por um cassete de expressão que codifica um transgene.

[0060] A integração e a replicação eficiente em células que não se dividem geralmente requer a presença de duas sequências de atuação cisno centro do genoma lentiviral, no trato de polipurina central (cPPT) e na sequência de terminação central (CTS). Estas levam à formação de uma estrutura de DNA de fita tripla chamada de "flap"do DNA central, que atua como um sinal para o desencapsulamento do complexo de pré-integração no poro nuclear e importação eficiente do cassete de expressão para o núcleo de células que não se dividem, tais como células dendriticas.

[0061] Em uma modalidade, a invenção engloba um vetor lentiviral que compreende um trato de polipurina central e a sequência de terminação central referida como sequência cPPT/CTS, tal como descrito, em particular, no pedido de patente europeu EP 2 169 073.

[0062] Sequências adicionais estão normalmente presentes na forma cis, tais como as repetições terminais longas (LTRs) que estão envolvidas na integração da sequência de DNA proviral do vetor em um genoma de célula hospedeira. Os vetores podem ser obtidos por mutação das sequências de LTR, por exemplo, no dominio U3 da referida LTR (ΔU3) (Miyoshi H et al., 1998, J Virol72(10):8150-7; Zufferey et al., 1998, <J Virol72 (12): 9873-80) , tal como mostrado na Figura 1.

[0063] Preferivelmente, o vetor não contém um intensificador. Em uma modalidade, a invenção abrange um vetor lentiviral que compreende sequências de LTR, preferivelmente com uma região 03 mutada (ΔU3) removendo sequências promotoras e intensificadoras na LTR 3'.

[0064] A sequência de empacotamento ψ (psi) também pode ser incorporada para ajudar a encapsidação da sequência de polinucleotideo nas partículas de vetor (Kessler et al.,2007, Leukemia,21(9) :1859-1874; Paschen et al.,2004, Cancer Immunol Immunother12 (6) :196-203) .

[0065] Em uma modalidade, a invenção engloba um vetor lentiviral que compreende uma sequência ψ (psi) de empacotamento lentiviral.

[0066] Outras sequências funcionais adicionais, tais como um sitio de ligação de transporte de RNA ou sitio de ligação de primer (PBS) ou um Elemento Regulatório Pós- Transcricional de Marmota (WPRE), podem também ser vantajosamente incluídas na sequência polinucleotidica do vetor lentiviral da presente invenção para a obtenção de uma expressão mais estável do transgene in vivo.

[0067] Em uma modalidade, a invenção engloba um vetor lentiviral gue compreende um PBS. Em uma modalidade, a invenção engloba um vetor lentiviral que compreende um WPRE e/ou um IRES.

[0068] Assim, em uma modalidade preferencial, o vetor lentiviral compreende pelo menos uma sequência de cPPT/CTS, uma sequência ψ, uma sequência de LTR (preferivelmente 2), e um cassete de expressão incluindo um transgene sob o controle transcricional de um promotor de MHC de classe I.

[0069] Em várias modalidades, o vetor lentiviral compreende um promotor de MHC de classe I. Preferivelmente, o promotor de MHC de classe I é um promotor de HLA-A2, um promotor de HLA-B7, um promotor de HLA-Cw5, um promotor de HLA-F ou um promotor de HLA-E. Em várias modalidades, a sequência do promotor de MHC de classe I compreende uma sequência polinucleotidica que compartilha mais do que 90%, preferivelmente mais do que 95%, mais preferivelmente mais de 99% de identidade com a sequência do promotor da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5

[0070] Em várias modalidades, o vetor lentiviral maior resposta de CTL in vivo contra o polipeptideo imunogênico codificado em relação a um vetor em que a sequência transgênica está sob o controle transcricional de um promotor de CMV.

[0071] Em várias modalidades, o vetor lentiviral que compreende um promotor de MHC de classe I induz uma maior resposta de CTL in vivo contra o polipeptideo imunogênico codificado em relação a um vetor em que a sequência transgênica está sob o controle transcricional de um promotor de EFla. Preferivelmente, a resposta de CTL com o promotor de MHCI é pelo menos 2 vezes ou 3 vezes mais elevada do que com o promotor de EFla. Dentro do contexto da presente invenção, se um vetor "induz uma maior resposta de CTL in vivo contra o polipeptideo imunogênico codificado em relação a um vetor em que a sequência transgênica está sob o controle transcricional de um promotor de EFla" pode ser determinado utilizando o ensaio apresentado no Exemplo 3. Outros ensaios que fornecem resultados semelhantes também podem ser utilizados.

[0072] Em várias modalidades, o vetor lentiviral que compreende um promotor de MHC de classe I induz uma maior resposta de CTL in vivo contra o polipeptideo imunogênico codificado em relação a um vetor em que a sequência transgênica está sob o controle transcricional de um promotor de ubiquitina. Dentro do contexto da presente invenção, se um vetor "induz uma maior resposta de CTL in vivo contra o polipeptideo imunogênico codificado em relação a um vetor em que a sequência transgênica está sob o controle transcricional de um promotor de ubiquitina" pode ser determinado utilizando o ensaio apresentado no Exemplo 3. Outros ensaios que fornecem resultados semelhantes também podem ser utilizados.

TRANSGENE

[0073] Dentro do contexto da presente invenção, um "transgene" é uma sequência de ácidos nucleicos dentro de um vetor lentiviral que não está normalmente presente em uma célula a ser transduzida com o vetor lentiviral. 0 vetor lentiviral serve para introduzir esta sequência na célula transduzida. O termo "transgene" não incluem as sequências do vetor que facilitem a transdução do transgene. O transgene pode ser uma sequência de ácidos nucleicos de um outro organismo. Alternativamente, o transgene pode ser uma sequência de ácidos nucleicos do mesmo organismo, mas possuindo diferentes sequências reguladoras que controlam a sua expressão. O transgene pode ser uma molécula de ácido nucleico anti-sentido ou de sentido. De acordo com uma modalidade preferencial da invenção, a sequência transgênica codifica um polipeptideo imunogênico.

[0074] Preferivelmente, o polipeptideo imunogênico é viral, bacteriano ou fúngico. Em uma modalidade, o polipeptideo imunogênico é um antigeno tumoral. Em uma modalidade, o polipeptideo imunogênico é um alérgeno.

[0075] Este polipeptideo imunogênico compreende preferivelmente um ou vários epitopos de agentes de doenças infecciosas, por exemplo, antigeno(s) de proteínas Gag, Pol e/ou Nef do HIV.

[0076] Vários epitopos que formam um poli-epitopo também podem ser codificados pelo transgene da invenção.

[0077] Em uma modalidade particular, tal epitopo é derivado de antigenos alvo identificados em tumores, e pode ser escolhido de tal forma que uma resposta imune mediada por células é obtida contra ele. Os antigenos alvo são bem documentados na técnica, os quais podem ser selecionados no que diz respeito a vários tipos de tumores e, em particular, em melanomas ou em carcinomas, incluindo carcinomas renais, carcinomas da bexiga, carcinomas do cólon, carcinomas do pulmão, cânceres da mama, leucemias, linfomas e mielomas.

PROMOTORES de MHCI

[0078] A invenção abrange a inserção de um promotor de MHC de Classe I (MHCI) em um vetor lentiviral. Tal como aqui utilizado, um "promotor de MHC de Classe I (MHCI)"inclui um promotor de MHC de Classe I de ocorrência natural ou sintética. O termo "promotor de MHC de Classe I"inclui um promotor de β2m.

Promotores de MHCI de Ocorrência Natural

[0079] Exemplos de promotores de MHCI de ocorrência natural são os promotores de genes HLA-A2, HLA-B7, HLA-CW5, HLA-E e HLA-F. Estes promotores de MHCI de ocorrência natural são geralmente clonados ou reproduzidos a partir da região promotora de um gene que codifica a proteina de MHC de classe I, ou referidos como codificação putativa de tais proteinas nas bases de dados de genoma (ex: banco de dados de polinucleotideos NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guia/dna-rna). Ambas as proteinas β2m e MHC de classe I entram no Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC).

[0080] As proteinas codificadas por estes genes são encontradas em quase todos os tipos de células. As proteinas de MHCI estão, geralmente, presentes na superfície da membrana de leucócitos, onde estão associadas à β2-microglobulina (β2m). O papel destas proteinas associadas consiste em apresentar peptideos a partir de fontes endógenas às células T CD8+. Assim, elas desempenham um papel central na geração da resposta imune especifica do antigeno. Uma vez que as proteinas de MHC de classe I têm sido amplamente estudadas e descritas durante muitos anos, os seus genes estão bem caracterizados e são detectáveis utilizando ferramentas de comparação de sequências, tal como o método BLAST (Altschul, S.F. et al. (1990). Basic Local Alignment Search Tool. J. Mol. Biol. 215(3) :403-410) .

[0081] Os promotores de MHC de classe I compartilham a capacidade de serem fortemente ativados em células apresentadoras de antigenos, incluindo as células dendriticas, bem como, para diminuir a intensidade, na maioria dos outros tecidos do corpo humano.

[0082] Os promotores de MHC de classe I da invenção podem conter elementos regulatórios adicionais, tais como um ou mais sitios de ligação Spl e ETs. Em uma modalidade preferencial, o promotor de MHC de classe I compreende dois sitios de ligação Spl e um sitio de ligação Ets. Em outras modalidades, os sitios Apl e/ou Ap2 estão adicionalmente contidos no promotor de MHC de classe I.

[0083] Os promotores preferenciais são promotores HLA-A2, HLA-B7, HLA-Cw5, HLA-E e HLA-F humanos.

Promotores de MHC de Classe I Sintéticos

[0084] Os promotores de MHC de Classe I também podem ser sintéticos. Os promotores de MHC de Classe I incluem promotores que são sintetizados utilizando-se técnicas de biologia molecular para montar os componentes individuais de um promotor de MHC de classe I ou que são derivados de promotores de MHC de Classe I de ocorrência natural, utilizando técnicas de biologia molecular.

[0085] Em várias modalidades, o promotor de MHC de Classe I sintético compreende uma sequência polinucleotidica que compartilha mais do que 90%, preferivelmente mais do que 95%, mais preferivelmente mais de 99% de identidade com a sequência promotora de um gene promotor de MHC de classe I (SEQ ID NOs: 1 a 5). ISRE

[0086] A transcrição de genes de classes de MHC é geralmente mediada por dois elementos principais de regulação: elemento de resposta estimulado por Interferon (ISRE) e o módulo SXY (englobando os elementos reguladores W/S, XlX2/Sitio α e Y/intensificador B) (ver Figura 1). Veja também Van den Eisen, Immunogenetics (1998) 48:208- 211.

[0087] Estes elementos promotores reguladores estão localizados em uma região que se estende aproximadamente de nucleotideos -220 a -95 à montante do sitio de iniciação da transcrição. Eles mediam a transcrição induzida por citocinas e especifica para tecido de genes de MHC classe I.

[0088] O ISRE de promotores de genes de MHC de Classe I geralmente compreendem sitios de ligação para membros da familia de fatores reguladores de Interferon (IRF). É, assim, uma propriedade de promotores de MHC de Classe I se ligar aos membros da familia de fatores reguladores de Interferon (IRF). Isto pode ser verificado, por exemplo, através de ensaios de alteração da mobilidade em gel (gel shift).

Sitios de Ligação NF-kB

[0089] Um outro elemento regulador, o intensificador A (contendo sitios de ligação para o fator de transcrição nuclear kB (NF-kB)), está presente na maioria dos casos. É, assim, uma propriedade dos promotores de MHC de classe I se ligar ao fator de transcrição nuclear kB (NF-kB). Isto pode ser verificado, por exemplo, através de ensaios de alteração da mobilidade em gel (gel shift). Módulo SXY

[0090] Além do ISRE, os promotores de MHC de classe I geralmente compartilham um outro conjunto de motivos conservados de sequência à montante, consistindo em três elementos reguladores: a caixa S ou W, as caixas X1/CREX2 ou sitio a e a caixa Y ou intensificador B, que juntos são denominados de módulo SXY. Este módulo SXY está, em geral, cooperativamente ligado por um complexo multiproteico contendo um fator regulador X (RFX; consistindo em RFX5, RFXB/ANK e RFXAP), uma proteina de ligação ao elemento de resposta cAMP (CREB)/fator de ativação de transcrição (ATF) e um fator nuclear Y (NFY), que atua como uma transativação impulsionada por acentuassomo destes genes. É, assim, uma propriedade dos promotores de MHC de classe I se ligarem a estes fatores. Isto pode ser verificado, por exemplo, através de ensaios de alteração da mobilidade em gel (gel shift) .

[0091] Em contraste, os promotores de MHC de classe II não apresentam intensificador A nem elementos ISRE (Van den Eisen, P.J. et al., 1998, Immunogenetics48:208-221). Além disso, foi verificado que RFX e CIITA possuem importância fundamental na regulação de genes de MHC de classe II, conforme ilustrado por estudos com linhagens celulares estabelecidas a partir de pacientes com sindrome do linfócito nu (BLS), uma imunodeficiência combinada grave devido a mutações em uma das subunidades RFX ou CIITA (DeSandro, A. et al. ,1999, Am J Hum Genet,65:279-286). Além disso, a falta de CIITA ou de uma das subunidades RFX afeta o funcionamento e a montagem do acentuassomo de MHC, respectivamente, levando a uma falta de MHC de classe II e niveis reduzidos de transcrição de MHC de classe I (Van den Eisen, P.J. et al., 2004, Current Opinion in Immunology, 16:67-75).

[0092] Em uma modalidade, a invenção engloba um método que compreende a inserção de um promotor de MHC de classe I em um vetor lentiviral para direcionar a expressão de um transgene, o qual preferivelmente codifica um polipeptideo imunogênico, mais preferivelmente, que codifica um antigeno microbiano ou proteina terapêutica. O método pode ainda compreender a inserção de qualquer um dos outros elementos de ácido nucleico aqui mencionados, tais como uma sequência de "flap"de DNA.

PRODUÇÃO DE VETORES DE PARTÍCULAS LENTIVIRAIS

[0093] A presente invenção fornece um método para produzir um vetor de particula lentiviral, que preferivelmente não compreende sequências intensificadoras, mas em vez disso compreende um promotor de MHC de classe I. Um vetor de particula lentiviral (ou partícula de vetor lentiviral) compreende um vetor lentiviral em associação com proteínas virais. O vetor pode ser integrativo ou não integrativo.

[0094] A substituição das sequências intensificadoras virais utilizadas nos vetores da técnica anterior para impulsionar a expressão gênica com um promotor de MHC de classe I pode melhorar a segurança dos vetores retrovirais: 1) Reduz o risco de metagênese insercional ligada a sequências intensificadoras; e 2) Promotores de MHC de classe I são ativados na maioria dos tipos celulares humanos, se não em todos eles, de modo que, uma vez que a resposta imune seja obtida contra o produto do transgene, todas as células em que o vetor estava integrado, seja qual for o tipo de célula, são eliminadas pelo sistema imunológico. Desta forma, depois de um período de tempo, o corpo humano pode não conter quaisquer replicações de tal vetor.

[0095] De acordo com uma modalidade deste método, a particula de vetor é obtida em uma célula hospedeira transformada com um plasmideo de DNA.

[0096] Tal plasmideo de DNA pode compreender: - origem de replicação bacteriana (ex: pUC ori); - gene de resistência a antibióticos (ex: KanR) para seleção; e, mais particularmente: - um vetor lentiviral que compreende pelo menos um transgene transcricionalmente ligado a um promotor de MHC de classe I.

[0097] Tal método permite a produção de uma particula de vetor recombinante de acordo com a invenção, que compreende as seguintes etapas de: i) transfectar uma célula hospedeira adequada com um vetor lentiviral; ii) transfectar a referida célula hospedeira com um vetor plasmidial de empacotamento, contendo sequências de DNA virai que codificam pelo menos atividades estruturais e atividades de polimerase (+/- integrase) de um retrovirus (preferivelmente lentivirus). Tais plasmideos de empacotamento são descritos na técnica (Dull et al., 1998, J Virol,72(11):8463-71; Zufferey et al., 1998, J Virol 72 (12) :9873-80) . transfectada, a fim de obter a expressão e o empacotamento do referido vetor lentiviral em particulas de vetor lentiviral; e iv) coletar as particulas de vetor lentiviral resultantes da expressão e empacotamento da etapa iii) nas referidas células hospedeiras cultivadas.

[0098] Por diferentes razões, pode ser útil pseudotipar as particulas retrovirais obtidas, ou seja, adicionar ou substituir proteinas especificas do envelope de particula. Por exemplo, pode ser vantajoso ter diferentes proteinas do envelope, a fim de distinguir a particula recombinante de particulas naturais ou de outras particulas recombinantes. Em questão de estratégia de vacinação, os vetores de particulas pseudotipadas são mais propensos a escapar do sistema imunológico, quando este já desenvolveu imunidade contra lentivirus. Isto é particularmente útil quando injeções sucessivas de vetores de particulas semelhantes são necessárias para a imunização de um paciente contra uma doença.

[0099] A fim de pseudotipar as particulas retrovirais da invenção, a célula hospedeira pode ser adicionalmente transfectada com um ou vários plasmideos de envelope de DNA que codificam a(s) proteina(s) do envelope virai, preferivelmente, uma proteina do envelope do VSV-G.

[0100] Uma célula hospedeira apropriada é preferivelmente uma linhagem celular humana cultivada como, por exemplo, uma linhagem de células HEK.

[0101] Alternativamente, o método para produzir a particula de vetor é realizado em uma célula hospedeira, na qual o genoma foi transformado de forma estável com um ou mais dos seguintes componentes: uma sequência de DNA do vetor lentiviral, os genes de empacotamento, e o gene envelope. Tal sequência de DNA pode ser considerada como sendo semelhante a um vetor proviral de acordo com a invenção, que compreende um promotor adicional para permitir a transcrição da sequência do vetor e melhorar a taxa de produção de partículas.

[0102] Em uma modalidade preferencial, a célula hospedeira é adicionalmente modificada para ser capaz de produzir partículas virais em um meio de cultura de maneira continua, sem as células incharem totalmente ou morrerem. Pode-se referir a Strang et al.,2005, J Virol79(3):1165- 1171; Relander et al., 2005, Mol Ther ll(3):452-9; Stewart et al., 2009, Gene Ther, 16(6):805-14; e Stuart et al., 2011, Hum Gene Ther (impresso) , com respeito a tais técnicas para a produção de partículas virais.

[0103] Um objeto da presente invenção consiste em uma célula hospedeira transformada com um vetor de particula lentiviral.

[0104] Os vetores de partículas lentivirais podem compreender os seguintes elementos, como anteriormente definido: - sequência polinucleotidica cPPT/CTS; e - uma sequência transgênica sob o controle de um promotor de MHC de classe I, e, opcionalmente, um dos elementos adicionais descritos acima.

MÉTODOS PARA EXPRESSAR UM TRANSGENE EM UMA CÉLULA

[0105] A presente invenção abrange métodos para a expressão de um transgene em uma célula, preferivelmente uma célula que não se divide. O método compreende a transdução de uma célula com um vetor lentiviral ou particulas de vetor lentiviral da invenção sob condições que permitam a expressão do transgene.

[0106] As células são preferivelmente células de mamiferos, particularmente células humanas. Particularmente, as células humanas que não se dividem são preferenciais.

[0107] O transgene preferivelmente codifica um polipeptideo imunogênico. O método pode adicionalmente compreender a coleta ou isolamento do polipeptideo.

[0108] O vetor lentiviral ou vetor de particula lentiviral preferivelmente compreende um promotor de MHC de classe I.

[0109] Em uma modalidade, a invenção engloba um método para a expressão de um transgene que compreende a inserção de um promotor de MHC de classe I em um vetor lentiviral, de tal modo que ele direcione a expressão de um transgene, e a transdução de uma célula com o vetor contendo o promotor de MHC de classe I.

USO TERAPÊUTICO DE VETORES LENTIVIRAIS

[0110] A presente invenção adicionalmente refere-se ao uso dos vetores lentivirais de acordo com a invenção, especialmente sob a forma de vetores de particulas lentivirais, para a preparação de composições terapêuticas ou vacinas, que são capazes de induzir ou contribuir para a ocorrência ou melhoria de uma reação imunológica contra epitopos, mais particularmente aqueles codificados pelo transgene presente nos vetores sob o controle transcricional do promotor de MHC de classe I.

[0111] A presente invenção fornece, assim, vetores que são úteis como um medicamento ou vacina.

[0112] Estes vetores são preferivelmente utilizados para o tratamento ou para a profilaxia de doenças infecciosas, especialmente doenças associadas com infecção por virus e, mais particularmente, com infecção por retrovirus, tais como a AIDS e outras imunodeficiências.

[0113] A invenção também pode ser utilizada em protocolos de tratamento contra tumores e cânceres e, especialmente, poderia ser utilizada em protocolos para imunoterapia ou terapia de vacinação contra tumores.

[0114] Como os vetores da invenção são mais especificamente direcionados às células dendriticas para obtenção de uma resposta imune mediada por células e, especialmente, a resposta de CTL associada ao antigeno expresso pelo transgene nestas células, elas são particularmente úteis como vacinas direcionadas a microorganismos patogênicos lentos ou endógenos, tais como Mycobacteria ou virus HIV.

[0115] Por conseguinte, a invenção refere-se a uma composição imunogênica gue compreende um vetor lentiviral como anteriormente definido.

[0116] As composições imunogênicas da invenção preferivelmente compreendem sequências de cPPT e CTS no vetor e partículas de vetor para induzir ou estimular a importação nuclear do genoma do vetor nas células alvo.

[0117] Durante a transcrição reversa, as sequências de cPPT e CTS induzem a formação de uma estrutura de DNA de fita tripla referida como triplex de DNA, a qual estimula a importação nuclear da sequência do vetor de DNA. Preferivelmente, o vetor compreende um transgene e sinais reguladores de retrotranscrição, expressão e encapsidação de origem retroviral ou de tipo retroviral, em que a composição é capaz de induzir ou estimular uma resposta de CTL (Linfócitos T Citotóxicos) e/ou uma resposta de CD4 contra um ou vários epitopos codificados pela sequência do transgene presente no vetor.

[0118] A expressão transgênica é altamente melhorada pela inclusão de um promotor de MHC de classe I no vetor.

[0119] Desta forma, os vetores lentivirais de acordo com a invenção possuem a capacidade de induzir, melhorar ou, em geral, de estarem associados à ocorrência de uma resposta de CTL de memória. Em outras palavras, eles podem ser utilizados para a preparação de composição terapêutica para o tratamento de alergias, doenças autoimunes, doenças tumorais ou doenças infecciosas, por indução, estimulo ou participação na ocorrência de uma resposta imune mediada por células, especialmente uma resposta de CTL ou uma resposta de memória.

[0120] Os vetores lentivirais da invenção podem ser utilizados em métodos de tratamento e métodos de indução de uma resposta imune que compreende a administração do vetor lentiviral a um hospedeiro e a geração de uma resposta imune especifica contra o transgene no hospedeiro. As células e os anticorpos gerados nestes hospedeiros podem ser utilizados como reagentes de diagnóstico.

[0121] Os vetores lentivirais de acordo com a invenção podem ser administrados diretamente a um paciente através de vias de administração conhecidas, incluindo administração por via sistêmica, local ou cutânea, intradérmica, por exemplo, intratumoral. A administração ex vivo, por exemplo, transdução ex vivo de células alvo seguida por administração das células tratadas ao paciente a ser tratado, está também englobada pela invenção.

[0122] Em uma modalidade particular, a composição imunogênica de acordo com a invenção pode ser administrada diretamente ao paciente, de tal modo que irá induzir, melhorar ou participar in vivo na ocorrência de uma resposta imune mediada por células, especialmente uma resposta imune mediada por CTL.

[0123] Em uma outra modalidade, as composições imunogênicas são utilizadas uma só vez ou mediante administração repetida, de modo que possam permitir a ocorrência de uma resposta mediada por células de memória de longo prazo.

[0124] Uma vantagem particular das composições imunogênicas da invenção é que estas podem ser utilizadas para desencadear ou estimular uma resposta imune mediada por células contra múltiplos epitopos codificados pela sequência de nucleotideos de interesse ou transgene presente no vetor ou particulas de vetor, e elas também podem ser utilizadas para obter ou estimular uma resposta imune mediada por células contra o produto da sequência completa de um gene, por exemplo, um gene de um agente patogênico ou fragmentos do referido gene capazes de codificar pelo menos de 8 a 15 aminoácidos, preferivelmente, de 9 a 12 aminoácidos.

[0125] A invenção adicionalmente abrange um vetor lentiviral que compreende uma sequência nucleotidica que codifica uma múltipla repetição (pelo menos 2 sequências idênticas) da referida sequência de aminoácidos que induz uma resposta celular e/ou uma sequência de aminoácidos que contém pelo menos 2 sequências diferentes correspondendo a 2 epitopos de diferentes agentes patogênicos ou antigenos tumorais.

[0126] Como resultado, a invenção abrange uma composição que poderia ser utilizada em protocolos de vacinação profilática e/ou terapêutica para o tratamento de tumores e, especialmente, como agentes anticancerigenos ou no tratamento de doenças anti-infecciosas.

[0127] Em particular, ela pode ser utilizada em combinação com adjuvantes, outras composições imunogênicas, quimioterapia ou qualquer outro tratamento terapêutico.

[0128] Tendo assim descrito diferentes modalidades da presente invenção, deve ser notado pelos técnicos no assunto que as descrições aqui apresentadas são apenas exemplificativas e que várias outras alternativas, adaptações e modificações podem ser feitas dentro do escopo da presente invenção. Por conseguinte, a presente invenção não está limitada às modalidades especificas, tal como aqui ilustrado.

EXEMPLOS Exemplo 1. Expressão de GFP impulsionada por vários promotores em dois tipos de células diferentes.

[0129] Construções de lentivetor englobando vários promotores foram utilizadas para a transdução de células HEK293T (uma linhagem de células de fibroblastos) e BDCM (uma linhagem de células do tipo dendriticas), e a capacidade dos promotores para impulsionar a expressão de GFP foi avaliada por citometria de fluxo. A MFI (Intensidade Média de Fluorescência) em células BDCM é representada em % da MFI obtida em células 293T.

[0130] Promotores virais (CMV) e ubiquos (UBC e EFloí) parecem ser reprimidos em BDCM, enquanto promotores de MHC I (HLA-A2, HLA-B7 e HLA-E) e de MHC II (HLA-DRa) são super-expressos neste tipo de célula. O promotor de β2m também foi super-expresso neste tipo de célula.

[0131] As células foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de lxlO5 células por poço em meio completo contendo 10% de FBS. Para cada tipo de célula, três poços de lxlO5 células foram transduzidos através da substituição do meio de cultura com 300 pL da diluição de amostras virais que permitiram uma percentagem de células transduzidas incluida entre 5% e 30%. As células foram então incubadas durante 2 horas a 37°C, 5% de CO2 e 1 mL de meio completo foi adicionado por poço. 72 horas após a transdução, as células foram tripsinizadas e ressuspensas, e a MFI de GFP foi medida com um citômetro de fluxo FACScalibur, utilizando o canal FL1.

Exemplo 2. Indução da expressão de GFP por vários Interferons

[0132] Lentivetores abrangendo vários promotores foram utilizados para transduzir células HEK293T e BDCM na presença de várias moléculas de interferon. A capacidade dos promotores de impulsionar a expressão de GFP foi então avaliada. Versões reduzidas de promotores de MHC-I e de β2m também foram testadas, os promotores de HLA-A2-, HLA-B7-, HLA-E- e β2m-SXY (promotores em que as sequências regulatórias kB e ISRE foram removidas, transformando-os em promotores do tipo MHCII).

[0133] Tal como mostrado na Figura 3, o promotor de MHCII não foi induzivel por interferons em células 293 T ou BDCM. No entanto, os promotores de MHCI foram induziveis por interferon y em ambos os tipos de células e por interferon a em células 293 T. De forma semelhante aos promotores de MHCI, o promotor de β2m também foi induzivel por interferons. A truncagem dos promotores de MHCI ou de β2m para remover o ISRE e os sitios de ligação de NF-Kb (promotor-SXY-GFP) reduziu a capacidade de indução. Assim, a versão truncada dos promotores de HLA-A2, HLA-B7, HLA-E, e β2m comportou-se como um promotor de MHCII em relação à capacidade de indução.

[0134] As células foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de lxlO5 células por poço em meio completo contendo 10% de FBS. Para cada tipo de célula, doze poços de lxlO5 células foram transduzidos através da substituição do meio de cultura com 300 pL da diluição de amostras virais, o que permitiu uma percentagem de células transduzidas incluida entre 5% e 30%. As células foram então incubadas durante 2 horas a 37°C, 5% de CO2 e 1 mL de meio completo foi adicionado a três poços, 1 mL de meio completo contendo 650U/mL (500U final) de IFN-y foi adicionado a três outros poços, 1 mL de meio completo contendo 650U/mL (500U final) de IFNa foi adicionado a três outros poços e 1 mL de meio completo contendo 650U/mL (500U final) de IFNβ foi adicionado aos últimos três poços, para cada transdução de vetor. As placas foram então incubadas a 37°C, 5% de CO2. 72 horas após a transdução, as células foram tripsinizadas e ressuspensas, e a MFI de GFP foi medida com um citômetro de fluxo FACScalibur, utilizando o canal FL1.

Exemplo 3. Resposta T especifica (mediana) em camundongos C57BL/6j

[0135] Camundongos C57BL/6j foram imunizados com lxlOθTU de lentivetores em que uma expressão de antigeno de HIV foi impulsionada por vários promotores (virai, ubiquo, MHCI e MHCII). 12 dias após a imunização, as respostas das células T especificas foram monitoradas em esplenócitos de camundongos por IFN-y ELISPOT. Como mostrado na Figura 4, a imunização com lentivetores englobando um promotor de MHCI fornece uma resposta de células T especifica mais elevada do que quaisquer outros lentivetores utilizados, mesmo quando um promotor virai está impulsionando a expressão do antigeno.

[0136] Os esplenócitos foram isolados a partir dos baços de camundongos imunizados com lentivetores 12 dias após a imunização e foram utilizados para os ensaios ELISPOT. Placas de cultura de tecido de noventa e seis poços (Millipore) foram revestidas durante a noite a 4 °C com 50 pL/poço de 5 pg/mL de anticorpo monoclonal (mAb) anti-IFN-y de camundongo (Mouse IFNy Elispot pair; BD Biosciences Pharmingen). As placas foram lavadas três vezes com 200 pL de DPBS/poço e bloqueadas com 200 pL/poço de DPBS/10% de soro fetal bovino durante 2 horas a 37°C. As placas foram lavadas três vezes com 200 pL de DPBS/poço. Esplenócitos foram adicionados às placas, em triplicata, em 2,5, 4,1 ou 5, lxlO5 células/poço e estimulados com 2 pg/mL de peptideos estimuladores (específicos para o antigeno), concanavalina A (5 pg/mL; fonte), ou meio de cultura apenas. As placas foram incubadas durante 18 horas a 37°C e, em seguida, lavadas três vezes com 200 pL/poço de DPBS/0,05% de Tween 20 e três vezes com 200 pL/poço de DPBS. Para a detecção, 50 pL/poço de 2 pg/mL de anticorpo monoclonal anti-IFN-y de camundongo biotinilado (BD Pharmingen) foram adicionados durante 2 horas à temperatura ambiente. As placas foram lavadas e 100 pL/poço de estreptavidina-fosfatase alcalina (Roche) foram diluidos a 1:2000 em PBS de Dulbecco durante 90 minutos à temperatura ambiente. Após a lavagem das placas, manchas (células secretando IFNy) foram visualizadas por adição de 60 pL/poço de solução de BCIP/NBT (Sigma). As placas foram incubadas durante 15 a 30 minutos à temperatura ambiente até manchas azuis serem desenvolvidas e, em seguida, completamente lavadas com água corrente da torneira e secas ao ar durante 24 horas. Finalmente, as manchas foram contadas utilizando-se um Bioreader 2000 (Biosys).

Claims

1. Vetor lentiviral caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência transgênica que codifica um polipeptideo imunogênico, em que a sequência transgênica está sob o controle transcricional de um promotor de MHC classe I, em que o referido promotor de MHC classe I é um promotor de HLA-A2, um promotor de HLA-B7, um promotor de HLA-Cw5, um promotor de HLA-F ou um promotor de HLA-E.

2. Vetor lentiviral, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida sequência promotora compreende uma sequência de polinucleotideo conforme estabelecida na da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5.

3. Vetor lentiviral, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma LTR que é deletada para o promotor e intensificador de U3, uma sequência de cPPT/CTS de um lentivirus, uma sequência ψ (psi) ou duas LTRs lentivirais.

4. Vetor lentiviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o vetor lentiviral não contém um intensificador.

5. Vetor lentiviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptideo imunogênico compreende antigeno(s) de proteinas Gag, Pol e/ou Net do virus HIV ou pelo menos urn antigeno tumoral.

6. Método para produzir uma particula de vetor lentiviral caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) transfectar uma célula hospedeira adequada com o vetor lentiviral conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, em que a referida célula hospedeira é uma linhagem celular humana; b) transfectar a referida célula hospedeira com um vetor plasmidial de empacotamento contendo sequências de DNA virais que codificam pelo menos atividades estruturais e de polimerase de um retrovirus; c) cultivar a referida célula hospedeira transfectada, de forma a obter a expressão e o empacotamento do referido vetor lentiviral em particulas de vetor lentiviral; e d) coletar as particulas de vetor lentiviral resultantes da expressão e do empacotamento da etapa c) nas referidas células hospedeiras cultivadas.

7. Particula de vetor lentiviral caracterizada pelo fato de que compreende o vetor lentiviral conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5.

8. Particula de vetor lentiviral caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos os seguintes elementos de sequência: a) sequência polinucleotidica cPPT/CTS; b) uma LTR a qual é deletada para o promoter e intensificador de U3; e c) uma sequência transqênica sob o controle de urn promotor de MHC classe I.

9. Particula de vetor lentiviral, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a referida sequência promotora compreende uma sequência de polinucleotideo conforme estabelecida na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5.

10. Uso de uma particula de vetor lentiviral compreendendo uma sequência polinucleotidica de cPPT/CTS; uma LTR que é deletada para o promotor e intensificador de U3; e uma sequência transgênica sob o controle de um promotor de MHC classe I caracterizado pelo fato de ser para a produção de um medicamento para induzir uma resposta de células T, em que o referido promotor de MHC classe I é selecionado de um promotor de HLA-A2, um promotor de HLA-B7, um promotor de HLA-Cw5, um promotor de HLA-E ou um promotor de HLA-E.

11. Uso de um vetor lentiviral ou particula de vetor lentiviral, como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 e de 7 a 9, caracterizado pelo fato de ser para a produção de um medicamento ou vacina para o tratamento ou profilaxia de alergias, doenças auto-imunes, tumores, cânceres e doenças infecciosas, mais particularmente, doenças associadas com infecção por retrovírus, tais como AIDS e outras imunodeficiências.